JP2021522862A - ７’−５’−アルファ−アノマー二環式糖ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドコンジュゲート - Google Patents

７’−５’−アルファ−アノマー二環式糖ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドコンジュゲート Download PDF

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Abstract

本発明は、オリゴヌクレオチド脂質基コンジュゲートを提供し、該オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ残基を含み、該脂質基は、リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合している。本発明はまた、オリゴヌクレオチド脂質基コンジュゲートを使用して遺伝子発現を調節する方法を提供する。【選択図】図９Ａ

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、および遺伝子発現を調節するためのその使用に関する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡプロセシングに影響を与え、タンパク質発現を調節する。特定の例では、アンチセンス化合物は、標的の転写または翻訳の変化をもたらす。そのような発現の調節は、例えば、標的ｍＲＮＡの分解または占有に基づく阻害によって達成することができる。一本鎖または二本鎖標的への強力な配列特異的結合を示し、化学的分解に耐性であるオリゴヌクレオチド類似体は、治療剤として潜在的に有用である。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが治療用途のために設計されている。
本発明は、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドを含み、脂質基にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを提供する。ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドは、好ましくは、ホスホジエステル結合を介して結合されている。
本発明は、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートであって、オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、脂質基が、オリゴヌクレオチドに共有結合している、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートを提供する。
一実施形態では、脂質基は、リンカーを介してオリゴヌクレオチドに共有結合している。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２〜２４個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１４〜２０個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１４〜１９個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５〜１９個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１７個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８個の残基を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１９個の残基を含む。
別の実施形態では、ａｂｃ−ＤＮＡ残基は、式（Ｖ）を有し、
Figure 2021522862
 式中、式（ＩＶ）の少なくとも２個のａｂｃ−ＤＮＡ残基の各々について独立して、Ｔ３またはＴ４の一方は、ヌクレオシド結合基であり、Ｔ３およびＴ４の他方は、ＯＲ１、ＯＲ２、５’末端基、７’末端基、またはヌクレオシド結合基であり、
Ｒ１は、Ｈまたはヒドロキシル保護基であり、
Ｒ２は、リン部分であり、
Ｂｘは、核酸塩基であり、好ましくは、Ｂｘは、プリン塩基またはピリミジン塩基から選択され、さらに好ましくは、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンから選択される。
したがって、別の実施形態では、ａｂｃ−ＤＮＡ残基は、式（Ｖ）を有し、
Figure 2021522862
 、式中、
（Ｉ）Ｔ３は、ヌクレオシド結合基であり、Ｔ４は、７’末端基、ＯＲ１、もしくはＯＲ２であり、好ましくは、Ｔ４は、７’末端基もしくはＯＲ１であり、または
（ｉｉ）Ｔ３は、５’末端基、ＯＲ１、もしくはＯＲ２であり、好ましくは、Ｔ３は、５’末端基もしくはＯＲ２であり、
Ｔ４は、ヌクレオシド結合基であり、または
（ｉｉｉ）Ｔ３およびＴ４は、互いに独立して、ヌクレオシド結合基であり、
Ｒ１は、Ｈまたはヒドロキシル保護基であり、
Ｒ２は、リン部分であり、
Ｂｘは、核酸塩基であり、好ましくは、Ｂｘは、プリン塩基またはピリミジン塩基から選択され、さらに好ましくは、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンから選択される。
別の実施形態では、残基のすべては、ａｂｃ−ＤＮＡ残基である。
別の実施形態では、少なくとも２個のａｂｃ−ＤＮＡ残基は、ホスホジエステル結合を介して隣接する残基に結合している。別の実施形態では、少なくとも２個のａｂｃ−ＤＮＡ残基は、ホスホジエステル結合を介して隣接する残基に結合され、それぞれのさらなるヌクレオシド結合基は、互いに独立して、ホスホジエステル結合基、ホスホトリエステル結合基、ホスホロチオエート結合基、ホスホロジチオエート結合基、ホスホネート結合基、ホスホノチオエート結合基、ホスフィネート結合基、ホスホルチオアミデート結合、またはホスホルアミデート結合基から選択される。
別の実施形態では、残基のすべては、ａｂｃ−ＤＮＡ残基であり、ホスホジエステル結合を介して結合されている。したがって、別の実施形態では、各ヌクレオシド結合基は、ホスホジエステル結合基である。
別の実施形態では、脂質基は、オリゴヌクレオチドの末端残基に共有結合している。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合基、ホスホトリエステル結合基、ホスホロチオエート結合基、ホスホロジチオエート結合基、ホスホネート結合基、ホスホノチオエート結合基、ホスフィネート結合基、ホスホルチオアミデート結合、およびホスホルアミデート結合基からなる群から選択される、リン含有ヌクレオシド結合基を介して結合している残基を含む。
別の実施形態では、リンカーは、炭化水素リンカーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。
別の実施形態では、リンカーは、アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカー、アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカー、アルファ−カルボキシレート−アミノ−アルキルホスホロチオエートリンカー、およびアルファ−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカーからなる群から選択される。
別の実施形態では、リンカーは、切断可能な基を含む。
別の実施形態では、脂質基は、脂肪酸由来基である。
一実施形態では、脂肪酸は、飽和または不飽和である。
別の実施形態では、脂肪酸は、４〜２８個の炭素原子の長さを有する。
別の実施形態では、脂肪酸由来基は、カルボン酸基を含む。
別の実施形態では、脂肪酸由来基は、ジカルボン酸に由来する。
別の実施形態では、脂肪酸は、表１または表２に提示される脂肪酸から選択される。
別の実施形態では、脂肪酸は、ヘキサデカン酸である。
一実施形態では、脂質基は、チオホスフェート基を介してリンカーに結合している。
一実施形態では、脂質基は、チオホスフェート基を介してオリゴヌクレオチドに結合している。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン５１の一部に対応するプレｍＲＮＡに結合する。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、４０４、および４１４〜４２５からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列番号４１７または配列番号４１８の配列を含む。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表３に提供される配列のうちのいずれか１つを含む。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の一部に対応するプレｍＲＮＡに結合する。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表４に提供される配列のうちのいずれか１つを含む。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の一部に対応するプレｍＲＮＡに結合する。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表５に提供される配列のうちのいずれか１つを含む。
本発明はまた、好適な担体と組み合わせた、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートを含む医薬組成物であって、オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、脂質基が、オリゴヌクレオチドに共有結合している、医薬組成物を提供する。
本発明はまた、遺伝子から発現されるＲＮＡへの、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートのハイブリダイゼーションを可能にすることによって遺伝子の発現を変化させる方法であって、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、脂質基は、オリゴヌクレオチドに共有結合しており、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、方法を提供する。
本発明はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を有する対象において、または対象に由来する細胞において、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導する方法であって、該方法は、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートを提供することを含み、オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、脂質基が、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、４０４および４１４〜４２５、好ましくは配列番号４１７または配列番号４１８からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドに共有結合し、オリゴヌクレオチド結合が、対象または細胞においてエクソンのスキッピングを誘導し、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングから生成されたｍＲＮＡが、機能的ジストロフィンタンパク質またはベッカー対象のジストロフィンタンパク質をコードする、方法を提供する。
本発明はまた、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導することにより、対象においてまたは対象に由来する細胞において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を処置する方法であって、該方法は、対象または細胞に、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートを含む組成物を提供することを含み、オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、脂質基が、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、４０４、および４１４〜４２５、好ましくは配列番号４１７または配列番号４１８からなる群から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドと共有結合しており、オリゴヌクレオチド結合は、対象または細胞においてエクソンのスキッピングを誘導し、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングから生成されたｍＲＮＡは、機能的ジストロフィンタンパク質またはベッカー対象のジストロフィンタンパク質をコードする、方法を提供する。
本発明はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を有する対象において、または対象に由来する細胞において、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導するための方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートを提供することを含み、オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、脂質基が、表３に示す配列のうちのいずれか１つを含むオリゴヌクレオチドに共有結合しており、好ましくは、残基のすべてが、ａｂｃ−ＤＮＡ残基であり、オリゴヌクレオチド結合が、対象または細胞においてエクソンのスキッピングを誘導し、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングから生成されたｍＲＮＡが、機能性ジストロフィンタンパク質またはベッカー対象のジストロフィンタンパク質をコードする、方法を提供する。
本発明はまた、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導することにより、対象においてまたは対象に由来する細胞において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を処置する方法であって、該方法は、対象または細胞に、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートを含む組成物を提供することを含み、オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、脂質基が、表３に示されたいずれか１つを含むオリゴヌクレオチドに共有結合しており、好ましくは、残基のすべてが、ａｂｃ−ＤＮＡ残基であり、オリゴヌクレオチド結合が、対象または細胞においてエクソンのスキッピングを誘導し、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングから生成されたｍＲＮＡは、機能的ジストロフィンタンパク質またはベッカー対象のジストロフィンタンパク質をコードする、方法を提供する。
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＳ−ＭＳ）によるアルファアノマーオリゴヌクレオチドの酸性安定性の評価。未処理ＯＮ１のＬＳ−ＭＳクロマトグラム。 未処理ＯＮ１のＬＳ−ＭＳ断片化パターン。 酸性条件で２４時間処理したＯＮ１のＬＳ−ＭＳクロマトグラム。 酸性条件下で２４時間処理したＯＮ１のＬＳ−ＭＳ断片化パターン。 ＬＳ−ＭＳによるアルファアノマーオリゴヌクレオチドの熱安定性の評価。未処理ＯＮ１のＬＳ−ＭＳクロマトグラム。 未処理ＯＮ１のＬＳ−ＭＳ断片化パターン。 ９５℃で６０分間加熱したＯＮ１のＬＳ−ＭＳクロマトグラム。 ９５℃で６０分間加熱したＯＮ１のＬＳ−ＭＳ断片化パターン。 ２０％変性ＰＡＧＥによるアルファアノマーオリゴヌクレオチドの生体安定性安定性の評価。マウス血清中でインキュベートされたＯＮ１およびその対応する天然オリゴヌクレオチドのＰＡＧＥ。 異なるアルブミン当量でインキュベートされたＯＮ１の移動度シフトアッセイ。 異なるアルブミン当量でインキュベートされた非複合体化ＯＮ１の比較。限外濾過実験によって値を得た。 異なるマウス血清量でインキュベートされたＯＮ１の移動度シフトアッセイ。 ＯＮ１溶液中に存在するナノ粒子の強度。 ネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）ＲＴ−ＰＣＲにより検出された、Ｃ２Ｃ１２細胞へのマウスエクソン２３スキッピング効率（ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のためのアガロースゲル。 ネスティングＲＴ−ＰＣＲにより検出された、ＫＭ１５５細胞におけるヒトエクソン５１スキッピング効率のためのアガロースゲル。 ネスティングＲＴ−ＰＣＲにより検出された、ＫＭ１５５細胞におけるヒトエクソン５１スキッピング効率のためのアガロースゲル。
本発明は、少なくとも１つの（１つ以上の）アルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）ヌクレオシド、オリゴヌクレオチドのヌクレオシドを結合するホスホジエステル基、およびリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合した脂質基を含む、オリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。本発明は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して結合され、リガンド基にコンジュゲートされた、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、転写、翻訳、スプライシング、および／もしくは分解を妨害することによって、ならびに／または非コードＲＮＡの機能を阻害することによって、遺伝子発現を調節する。
定義：
本明細書で使用する場合、「アルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含み、以下に示される一般構造を有するヌクレオシド類似体を意味する。
Figure 2021522862
 ７’−５’−アルファ−アノマー−ビシクロ−ＤＮＡの構造を以下に示す。
Figure 2021522862
本明細書で使用するように、「二環式糖部分」は、２つの相互結合された環系、例えば、二環式ヌクレオシドを含み、糖部分が、２’−Ｏ−ＣＨ（アルキル）−４’もしくは２’−Ｏ−ＣＨ２−４’基、ロックド核酸（ＬＮＡ）、キシロ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−ＬＮＡ、ｃＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル）ＬＮＡ、ｃＭＯＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束メトキシエチル）ＬＮＡ、またはエチレン架橋核酸を有する。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」は、糖に共有結合した核酸塩基を指す。
「リボヌクレオシド」は、リボースに結合した塩基を指す。「デオキシリボヌクレオシド」は、２’−デオキシリボースに結合した塩基を指す。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖に共有結合したリン部分をさらに含むヌクレオシドを意味する。
本明細書で使用する場合、「残基」という用語は、オリゴマー（オリゴヌクレオチドポリマー）の単位を形成するヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーを指す。
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖であり得るが、一本鎖核酸分子として細胞または生物中の相補核酸に結合するオリゴマーである。オリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるヌクレオシド結合基によって互いに結合された少なくとも２個のヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば、２’修飾を有するヌクレオチド、合成塩基類似体など）、またはそれらの組み合わせを含み得る。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞取り込みおよびヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などの特性のために、天然型よりも好ましいものであり得る。オリゴヌクレオチドには、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド模倣体、ならびに当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される、糖および／または核酸塩基および／またはヌクレオシド結合基に改変が加えられたオリゴヌクレオチドを含む化合物が含まれる。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または以上、例えば、１２〜５０ヌクレオチド、もしくは１２〜４０もしくは１２〜２４ヌクレオチド、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０ヌクレオチドの長さを有する。
本明細書で使用される「オリゴマー」という用語、例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド結合基によって結合された２つ以上のモノマーサブユニットを含む化合物を指す。本発明のオリゴマーは、最大５０個のモノマーサブユニット、例えば、最大４０個のモノマーサブユニット、例えば、最大３０個のモノマーサブユニット、最大２０個のモノマーサブユニット、または最大１５個のモノマーサブユニットの長さを有する。オリゴマーは、５〜４０個のモノマーサブユニット、８〜３０個のモノマーサブユニット、８〜２５個のモノマーサブユニット、または８〜２０個のモノマーサブユニットを含むことができる。
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、およびそれらのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含む核酸を含み、これらは、該核酸は、合成によるものであり、天然に存在し、および天然には存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、特定の場合では、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。そのような類似体の例には、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。
本発明は、共有結合を介して脂質基にコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書で使用する場合、「脂質基」は、任意の脂肪酸基または脂肪酸由来基、任意のステロイド由来基、および任意の脂溶性ビタミン基である。ａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートは、インビボで長い半減期を示すことができる。脂質基はまた、アルブミンおよび／または他の脂肪酸受容体もしくは輸送体へのａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの結合を増加させることができる。脂質基にコンジュゲートされた本発明のオリゴヌクレオチドの構造は、脂質基が露出されてアルブミンおよび／または他の輸送体への結合を促進するようなものである。本発明の別の実施形態では、脂質基は、１つまたは２つのカルボン酸基をさらに含み、アルブミンおよび／または他の脂肪酸受容体もしくは輸送体との相互作用をさらに増加させる。一実施形態では、脂質基は、脂肪酸由来基である。別の実施形態では、脂質基は、ジカルボン酸に由来する脂肪酸由来基である。脂肪酸には、２〜２８個の炭素原子の炭化水素鎖を有する飽和または不飽和脂肪酸が含まれ、１つまたは２つのカルボン酸基を含むことができる。１つまたは２つの脂肪酸リガンドは、本明細書に記載されるａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’および／または７’末端上のリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合することができる。本発明による有用な脂質基を表１および２に提供する。
本発明の脂質基には、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）、または胆汁酸が含まれ得る。
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、本発明のオリゴヌクレオチドを脂質基に結合する部分を意味する。本発明による有用なリンカーには、炭化水素およびＰＥＧリンカー、例えば、アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカー、アルファ−カルボキシレート−アミノ−アルキル−ホスホロチエートリンカー、アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカー、およびアルファ−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカーが含まれるが、これらに限定されない。本発明によるリンカーは、典型的かつ好ましくは、オリゴヌクレオチドのその標的への結合を低減せず、または妨げない。リンカーは、切断可能な基を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド結合基」は、オリゴヌクレオチドのａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドを結合する結合基を意味する。本発明のヌクレオシド結合基は、主に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ｌｉｎｋａｇｅ）または結合（ｂｏｎｄ）である。「ヌクレオシド結合基」という用語は、ホスホジエステル結合ではないリン結合基、および非リン結合基を含む。
本発明は、ヌクレオシド間結合のすべてがホスホジエステル結合である、脂質基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、脂質基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合基は、主にホスホジエステル結合である。本明細書で使用する場合、「主に」は、ヌクレオシド間結合基の５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％がホスホジエステル結合であることを意味する。例えば、オリゴヌクレオチドは、１つ以上、および最大５０％のホスホロチオエート結合を含むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは、主に、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドである。主には、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドを指す場合、ヌクレオシドの５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％がａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドであることを意味する。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上、および最大５０％の、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドではない糖を有するヌクレオシドを含むことができる。
本発明は、リン含有ヌクレオシド間結合またはホスホジエステル結合を介して結合されたヌクレオシドを提供する。本発明はまた、主にホスホジエステル結合を介して結合されるが、ホスホトリエステル結合基、ホスホロチオエート結合基、ホスホロジチオエート結合基、ホスホネート結合基から選択される「リン含有ヌクレオシド結合基」、例えば、Ｈ−ホスホネート結合基もしくはメチルホスホネート結合基、ホスホノチオエート結合基、例えば、Ｈ−ホスホノチオエート結合基、メチルホスホノチオエート結合基、ホスフィネート結合基、ホスホルチオアミデート結合基、またはホスホルアミデート結合基を含む、ヌクレオシドを提供する。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」または「ヌクレオチド」は、それぞれ、化学的または非化学的なオリゴマー合成方法によって本発明のオリゴマーに組み込むことができる、天然に存在するもしくは修飾されたヌクレオシドもしくはヌクレオシド模倣体、または天然に存在するもしくは修飾されたヌクレオチドもしくはヌクレオチド模倣体を包含する。本明細書で使用する場合、「天然」または「天然に存在する」は、天然起源であることを意味する。
「修飾ヌクレオシド」という用語は、当該技術分野で既知であり、かつ、本明細書に記載されるような、ヌクレオシドの糖および／または核酸塩基に修飾を有するヌクレオシドを含む。「修飾ヌクレオチド」という用語は、当該技術分野で既知であり、かつ、本明細書に記載されるような、ヌクレオチドの糖および／もしくは核酸塩基ならびに／またはヌクレオシド結合基もしくはリン部分に修飾を有するヌクレオチドを含む。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド模倣体」は、糖および核酸塩基を置き換えるために使用される構造を含む。「ヌクレオチド模倣体」という用語は、糖およびヌクレオシド結合基を置き換えるために使用されるヌクレオチドを含む。ヌクレオチド模倣体の例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノが含まれる。
本発明の「ヌクレオシド」または「ヌクレオチド」は、修飾の組み合わせ、例えば、２つ以上の核酸塩基修飾、２つ以上の糖修飾、または少なくとも１つの核酸塩基、および少なくとも１つの糖修飾を含むことができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、主に、ビシクロ糖を有するヌクレオシドを含む。
しかしながら、オリゴヌクレオチドは、単環式もしくは三環式環系、三環式もしくは二環式系、または単環式リボースもしくはデオキシリボースである糖を有するヌクレオシドを含み得る。糖の修飾には、修飾された立体化学的配置、基の少なくとも１つの置換、または基の少なくとも１つの欠失がさらに含まれるが、これらに限定されない。修飾糖には、ＲＮＡおよびＤＮＡ中に天然に存在するリボシル部分（すなわち、フラノシル部分）の修飾型、テトラヒドロピラン、２’修飾糖、３’修飾糖、４’修飾糖、５’修飾糖、または４’−置換糖が含まれる。好適な糖修飾の例は、当業者に既知であり、２’，３’および／または４’置換ヌクレオシド（例えば、４’−Ｓ修飾ヌクレオシド）、２’−Ｏ修飾ＲＮＡヌクレオチド残基、例えば、２’−Ｏ−アルキルまたは２’−Ｏ−（置換）アルキル、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−シアノエチル）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−（２−チオメチル）エチル、２’−Ｏ−（ハロアルコキシ）メチル、例えば、２’−Ｏ−（２−クロロエトキシ）メチル（ＭＣＥＭ）、２’−Ｏ−（２，２−ジクロロエトキシ）メチル（ＤＣＥＭ）、２’−Ｏ−アルコキシカルボニル、例えば、２’−Ｏ−［２−（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＭＣＥ）、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、または他の修飾糖部分、例えば、モルホリノ（ＰＭＯ）、カチオン性モルホリノ（ＰＭＯＰｌｕｓ）、または修飾モルホリノ基、例えば、ＰＭＯ−Ｘを含むが、これらに限定されない。「ＰＭＯ−Ｘ」という用語は、少なくとも１つの３’または５’末端修飾、例えば、３’−蛍光タグ、３’クエンチャー（例えば、３’−カルボキシフルオレセイン、３’−ＧｅｎｅＴｏｏｌｓＢｌｕｅ、３’−リサミン、３’−ダブシル）、３’−親和性タグ、および化学結合のための官能基（例えば、３’−ビオチン、３’−第一級アミン、３’−ジスルフィドアミド、３’−ピリジルジチオ）、５’末端修飾（５’−第一級アミン、５’−ダブシル）、３’−アジド、３’−アルキン、５’−アジド、５’−アルキンを含む、またはＷＯ２０１１／１５０４０８およびＵＳ２０１２／００６５１６９に開示されている、修飾モルホリノ基を指す。
本明細書で使用する場合、「リボヌクレオチド」という用語は、天然および合成の未修飾および修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチド間の結合の変化が含まれる。本明細書で使用する場合、「リボヌクレオチド」という用語は、２’リボース環位置に単一のプロトン基を有するヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチドを特に除外する。
本明細書で使用する場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然および合成の未修飾および修飾されたデオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチド間の結合の変化が含まれる。本明細書で使用する場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語はまた、修飾リボヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド残基などを含む。
本明細書で使用する場合、「ＰＳ−ＮＡ」という用語は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド残基を指す。したがって、「ＰＳ−ＮＡ」という用語は、ホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡ」）およびホスホロチオエート修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡ」）の両方を包含する。
本明細書で使用する場合、「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列に相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。
本明細書で使用する場合、「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。
本発明はまた、非ヌクレオシド化合物に結合したオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを提供する。固体支持体には、ビーズ、ポリマー、または樹脂が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、脂質基に加えて、オリゴマーの５’または７’末端への１つ以上の基の共有結合によって、またはオリゴマーの任意の位置で修飾される。５’末端基または７’末端基にコンジュゲートすることができる基には、キャッピング基、ジホスフェート、トリホスフェート、蛍光標識（例えば、フルオレセインまたはローダミン）などの標識、色素、オリゴマー、固体支持体、ナノ粒子、非ヌクレオシド基、抗体、またはコンジュゲート基を追跡するのに工程なレポーター基が含まれるが、これらに限定されない。一般に、コンジュゲート基は、それらが結合している化合物の１つ以上の特性を修飾する。そのような特性には、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、送達、電荷、および除去が含まれるが、これらに限定されない。コンジュゲート基は、化学技術において日常的に使用されており、直接にまたは任意の結合基を介して、オリゴマーなどの親化合物に結合されている。「コンジュゲート基」という用語には、脂質基、インターカレーター、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、親油性部分、クマリン、ペプチド、抗体、ナノボディ、およびオリゴ糖、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「末端」は、オリゴマー、核酸配列、または本明細書に記載の化合物のいずれか１つの末端（ｅｎｄ）または末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を指し、整数（３’、５’、または７’など）は、オリゴマーのヌクレオチド、核酸配列、または化合物に含まれる糖の炭素原子を示す。本明細書で使用する場合、「５’末端基」または「７’末端基」は、それぞれ、本明細書で提供される化合物のいずれか１つに含まれる糖の５’末端または７’末端に位置する基を指す。
特定の実施形態では、オリゴマーは、本明細書に記載される式（ＩＶ）、式（Ｖ）の化合物、または式（ＶＩ）の化合物である少なくとも１つのモノマーサブユニットを含む。一実施形態では、オリゴマーは、式（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の少なくとも１つの化合物、および少なくとも１つのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。別の実施形態では、オリゴマーは、式（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の少なくとも１つの化合物および少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。
「相補的」または「相補性」とは、核酸が、従来のワトソン−クリックまたはフーグスティーン型塩基対形成のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成できることを意味する。本開示の核酸分子に関して、その相補的配列を有する核酸分子の結合自由エネルギーは、核酸の関連する機能が例えばエクソンスキッピングを進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨ ＳｙｍｐＱｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ、ｐｐ．１２３−１３３，１９８７；Ｆｒｉｅｒｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７，１９８６；Ｔｕｒｎｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５，１９８７を参照のこと）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成することができる核酸分子における連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、１０ヌクレオチドを有する第２の核酸配列と対形成している第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドのうちの５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補性を示す）。相補性パーセントが少なくとも特定のパーセントであることを決定するために、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子における連続する残基のパーセンテージが計算され、四捨五入して最も近い整数とする（例えば、２３ヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対形成している第１のオリゴヌクレオチドにおける合計２３ヌクレオチドのうちの１２、１３、１４、１５、１６、または１７ヌクレオチドは、それぞれ、５２％、５７％、６１％、６５％、７０％、および７４％の相補性をそれぞれ表し、それぞれ、少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％、および７０％の相補性を有する。本明細書で使用する場合、「実質的に相補的」とは、鎖が生物学的条件下でハイブリダイズすることができるような鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには１００％の相補性を有する。さらに、２つの鎖が生物学的条件下でハイブリダイズすることができるかどうかを、それらのヌクレオチド配列を調べることによって決定する技術は、当該技術分野で周知である。
本発明はまた、ワトソン−クリック塩基対規則に従わないＲＮＡ分子中の２つのヌクレオチド間のゆらぎ塩基対を提供する。４つの主なゆらぎ塩基対は、グアニン−ウラシル（Ｇ−Ｕ）、ヒポキサンチン−ウラシル（Ｉ−Ｕ）、ヒポキサンチン−アデニン（Ｉ−Ａ）、およびヒポキサンチン−シトシン（Ｉ−Ｃ）である。ゆらぎ塩基対の熱力学的安定性は、ワトソン−クリック塩基対のものに匹敵する。
いくつかの塩基にわたって塩基対を形成する一本鎖核酸は、「ハイブリダイズする」と言われる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、生理学的または生物学的に関連する条件下（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）で決定される。ハイブリダイゼーション条件は、一般に、一価カチオンおよび生物学的に許容される緩衝液を含み、二価カチオン、複合アニオン、例えば、グルコン酸カリウムからのグルコン酸、スクロースなどの非荷電種、および試料中の水の活性を低下させるための不活性ポリマー、例えばＰＥＧを含んでもよいしまたは含まなくてもよい。このような条件には、塩基対が形成される条件が含まれる。
ハイブリダイゼーションは、核酸の５０％が一本鎖であり、５０％が二本鎖になる温度、すなわち（融解温度；Ｔｍ）で測定される。Ｔｍは、相補核酸に対するアンチセンス化合物の二本鎖安定性の尺度としてしばしば使用される。
ハイブリダイゼーション条件はまた、塩基対が形成される条件である。ストリンジェンシーの様々な条件を、ハイブリダイゼーションを決定するために使用することができる（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７）を参照のこと）。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が含まれる。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くする必要があり、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さが１８〜４９塩基対のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１Ｘ ＳＳＣ＝０．１６５Ｍについて［Ｎａ＋］）。
ハイブリダイゼーション条件の有用な変動は、当業者には容易に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；および Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
本明細書で使用する場合、「変化させる」は、発現、例えば遺伝子発現の増加または減少を意味する。発現の減少は、１０％以上、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の減少を意味する。減少とは、２倍以上、例えば、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍も意味する。折り、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍以上の減少を意味する。
発現の増加は、１０％以上、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の増加を意味する。増加はまた、２倍以上、例えば、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、折り、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍以上の増加を意味する。
遺伝子の発現の増加または減少は、対照または参照レベルの発現のレベル、例えば、本発明のオリゴヌクレオチド脂質基コンジュゲートの非存在下での遺伝子発現のレベルに対するものである。
本明細書で使用する場合、「標的ＲＮＡ」は、本発明のオリゴヌクレオチドによる調節を受けるであろうＲＮＡを指す。
本明細書で使用する場合、「標的」は、発現または活性が本発明のオリゴヌクレオチドによって調節される任意の核酸配列を指す。
本明細書で使用する場合、「参照」は、標準または対照を意味する。当業者には明らかであるように、適切な参照は、１つの要素の効果を決定するために、１つの要素のみが変更される場合である。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡの部分」は、それが結合するオリゴヌクレオチドと同等であり、かつ、それが結合するオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する長さを意味する。
「インビトロ」という用語は、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば、細胞抽出物を含む、当該技術分野で認識されている意味を有する。「インビボ」という用語はまた、例えば、生細胞、例えば、不死化細胞、一次細胞、細胞株、および／または生物中の細胞を含む、当該技術分野で認識されている意味を有する。
本明細書で使用する場合、「増加する」または「増強する」は、アッセイにおける参照と比較して少なくとも５％プラスに変化することを意味する。変化は、アッセイにおける参照と比較して、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、またはさらに１００％であり得る。「エクソンスキッピングを強化する」とは、エクソンスキッピングの結果である特定の生成物の量を増やすことを意味する。
本明細書で使用する場合、「低減する」は、アッセイにおける参照と比較して少なくとも５％マイナスに変化することを意味する。変化は、アッセイにおける参照と比較して、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、またはさらに１００％であり得る。
本明細書で使用する場合、「細胞」は、原核生物（例えば、細菌）および真核生物（例えば、哺乳動物または植物）細胞の両方を含むことを意味する。細胞は、体細胞または生殖系列由来であり得、全能性または多能性であり得、および分裂性または非分裂性であり得る。細胞はまた、配偶子もしくは胚、幹細胞、または十分に分化した細胞に由来するか、またはそれらを含むことができる。したがって、「細胞」という用語は、その通常の生物学的意味を保持することを意味し、例えば、鳥、植物、および例えば、ヒト、ウシ、ヒト、ヒツジ、サル（ａｐｅ）、サル（ｍｏｎｋｅｙ）、ブタ、イヌ、ネコを含む哺乳動物などの任意の生物に存在することができる。特定の態様において、「細胞」という用語は、具体的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞を指す。
本明細書で使用する場合、「動物」は、哺乳動物、特にヒトを含む多細胞真核生物を意味する。本発明の方法は、一般に、哺乳動物、特にヒトを含む、それを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）への本明細書の有効量のオリゴヌクレオチドの投与を含む。そのような処置は、疾患またはその症状を患っている、それに罹患している、それにかかりやすい、またはそのリスクがある対象、特にヒトに好適に投与されるであろう。
「薬学的に許容される担体」とは、それらの所望の活性に最も好適な物理的位置における本開示の核酸分子の効果的な分布を可能にする組成物または製剤を意味する。
本発明のオリゴヌクレオチド剤は、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドを欠くオリゴヌクレオチド剤、またはａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドを含むがリン酸ヌクレオシド間結合および脂質基の組み合わせを欠くオリゴヌクレオチドと比較して、そのような薬剤の以下の属性を増強することができる：インビトロでの有効性（例えば、効力および効果の持続時間）、インビボでの有効性（例えば、効力、効果の持続時間、薬物動態、薬力学、細胞内取り込み、毒性の低下）。
本明細書で使用する場合、「薬物動態」という用語は、薬物が身体によって吸収され、分配され、代謝され、および排除されるプロセスを指す。
本明細書で使用する場合、「薬力学」という用語は、生物に対する薬物の作用または効果を指す。
本明細書で使用する場合、「安定化」という用語は、選択された環境（例えば、細胞または生物）における薬剤の増強された持続性の状態を指す。増強された安定性は、分解酵素（例えば、ヌクレアーゼ）または他の薬剤に対するそのような薬剤の増強された耐性により達成することができる。
本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、フラノース環、またはホスフェート基に対して１つ以上修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、およびデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼなどのヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じる天然に存在する修飾が含まれる。修飾ヌクレオチドには、合成または天然に存在しないヌクレオチドも含まれる。ヌクレオチドにおける合成または天然に存在しない修飾には、２’修飾を有するもの、例えば、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−−（Ｎ−メチルカルバメート）または塩基類似体を含むものが含まれる。本開示について記載される２’修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは、２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、これらは、修飾または非修飾であり得る。そのような修飾された基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６７２，６９５号およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
本明細書で使用する場合、「塩基類似体」は、核酸二本鎖に組み込むことができる修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位置（または核酸二本鎖に組み込むことができるヌクレオチド糖部分置換中の同等の位置）に位置する複素環部分を指す。塩基類似体は、一般的な塩基であるグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を除いて、一般にプリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡにおける他の塩基または塩基類似体と二本鎖を形成することができる。塩基類似体には、本発明の化合物および方法において有用なもの、例えば、Ｂｅｎｎｅｒの米国特許第５，４３２，２７２号および同第６，００１，９８３号、ならびにＭａｎｏｈａｒａｎの米国特許公開第２００８／０２１３８９１号に開示されているものが含まれ、これらは参照により本明細書に組み入れられる。塩基の非限定的な例には、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ｄ−ジオン）（Ｐ）、イソシトシン（イソ−Ｃ）、イソグアニン（イソ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、およびピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、および３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、ならびにそれらの構造誘導体が含まれる（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：７２３８−７２４２（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）；Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２０５６−２０５７（１９９７）；Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：２３２３−２３２４（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１８２−８１８３（１９９６）；Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（６）：１００１−１００７（２０００）；ＭｃＭｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１１５８５−１１５８６（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：９６５２−９６５６（１９９８）；Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）；Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：１９７−２０６（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：１６０５−１６１１（２００１）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：５８６９−５８７５（２００２）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）；および米国特許第６，２１８，１０８）。塩基類似体はまた、ユニバーサル塩基であり得る。
本明細書で使用する場合、「ユニバーサル塩基」は、修飾ヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の１’位置またはヌクレオチド糖部分置換における同等の位置に位置し、核酸二本鎖に存在する場合、二重らせん構造（例えば、ホスフェート骨格の構造）を変えることなく、２種以上の塩基の反対側に配置することができる、複素環部分を指す。さらに、ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドの能力を破壊しない。標的核酸と二本鎖を形成する、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の能力は、当該技術分野で明らかな方法（例えば、ＵＶ吸光度、円二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など）によってアッセイすることができる。さらに、温度などの、二本鎖形成が観察される条件は、融解温度（Ｔｍ）が核酸二本鎖の安定性と相関するので、二本鎖の安定性または形成を決定するために変化させてもよい。標的核酸に正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補核酸で形成される二本鎖よりも低いＴｍを有する標的核酸と二本鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が塩基で置き換えられて単一のミスマッチを生じている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチの塩基を有する核酸で形成された二本鎖よりも高いＴｍを有する標的核酸と二本鎖を形成する。
いくつかのユニバーサル塩基は、対形成条件下でユニバーサル塩基と、塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）のすべてと、の間で水素結合を形成することにより、塩基対形成することができる。ユニバーサル塩基は、１つのみの単一の相補的塩基と塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖では、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対側の鎖上のものと反対側にあるＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ、およびＵの各々と、水素結合を形成しない、１つの水素結合を形成する、または２つ以上の水素結合を形成し得る。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対側の鎖上のものと反対側にある塩基と相互作用しない。二本鎖では、ホスフェート骨格の二重らせん構造を変えることなく、ユニバーサル塩基間の塩基対形成が起こる。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）相互作用によって、同じ核酸鎖上の隣接するヌクレオチドの塩基と相互作用し得る。このようなスタッキング相互作用は、特に、ユニバーサル塩基が、二本鎖の反対側の鎖上のものと反対側に配置された塩基と水素結合を形成しない状況において二本鎖を安定化する。ユニバーサル結合（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ）ヌクレオチドの非限定的な例には、イノシン、１−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、および／または１−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロール（Ｑｕａｙらの米国特許出願公開第２００７／０２５４３６２号；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ａｃｙｃｌｉｃ ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ａｓ ａｍｂｉｇｕｏｕｓ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５ Ｎｏｖ．１１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ ａｎｄ ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５ Ｊｕｌ．１１；２３（１３）：２３６１−６；Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ａｓ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｏｃｔ．１１；２２（２０）：４０３９−４３）が含まれる。
「立体異性体」という用語は、同一の化学構成を有するが、空間における原子または基の配置に関して異なる化合物を指す。
「ジアステレオマー」は、化合物が互いの鏡像ではない、２つ以上のキラリティー中心を有する立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理的特性、例えば、融点、沸点、スペクトル特性、ならびに化学的および生物学的反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動およびクロマトグラフィーなどの高分解能分析手順下で分離され得る。
「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である化合物の２つの立体異性体を指す。
本明細書で使用される立体化学の定義および規則は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．ＭｃＲａｗ−Ｈｉｆｆ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅ，ｌＥ．ａｎｄ ＷｉｌｅｎＳ．“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に従う。
別段で定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段で明記しない限り、以下のそれらに帰する意味を有する。
本発明は、本発明の以下の詳細な説明およびこれに含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解することができる。
本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられている刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供されている。本明細書のいかなるものも、本発明が先行する発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書で提供される発行日は、実際の発行日とは異なることがあり得、独立した確認が必要になり得る。
アルファアノマービシクロ−ＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）ヌクレオシド
アルファ二環式（「ａｂｃ」）ＤＮＡは、例えば、エクソンスキッピングを引き起こすことによって疾患を処置するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）において有用である二環式糖部分を含むヌクレオシド類似体である。ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドは、以下の一般的な構造を有する。
Figure 2021522862
７’−５’−アルファ−アノマー−ビシクロ−ＤＮＡの構造を以下に示す。
Figure 2021522862
ＲＮＡに対する高い選択性に加えて、７’５’−ａｂｃ−ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡと比較してミスマッチな識別を改善し、ホスホロチオエート修飾と適合し、完全な生体安定性を与え、低い補体活性化を誘導し、高いインビトロエクソンスキッピングを示す。
本発明は、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドのいずれか１つを含み、本明細書に開示される置換基のいずれかを有するオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物を含むオリゴヌクレオチドを提供し、
Figure 2021522862
 式中、Ｔ１およびＴ２の一方がＯＲ１またはＯＲ２であり、
Ｔ１およびＴ２の他方は、ＯＲ１またはＯＲ２であり、
Ｒ１は、Ｈまたはヒドロキシル保護基であり、
Ｒ２は、リン部分であり、
Ｂｘは、核酸塩基である。
一実施形態では、本発明の式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物であり、
Figure 2021522862
 式中、
（ｉ）Ｔ１は、ＯＲ１であり、Ｔ２は、ＯＲ１またはＯＲ２であるか、あるいは
（ＩＩ）Ｔ１は、ＯＲ１またはＯＲ２であり、Ｔ２は、ＯＲ１であり、
Ｔ１は、ＯＲ１またはＯＲ２であり、Ｔ２は、ＯＲ１である。
式（ＩＩ）の化合物は、１’末端の第１の炭素のキラル中心におけるＢｘの空間配置がベータアノマーとは異なる、アルファアノマーまたはアルファアノマーモノマーである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物であり、
Figure 2021522862
 式中、
（ｉ）Ｔ１は、ＯＲ１であり、Ｔ２は、ＯＲ１またはＯＲ２であるか、あるいは
（ＩＩ）Ｔ１は、ＯＲ１またはＯＲ２であり、Ｔ２は、ＯＲ１であり、
Ｔ１は、ＯＲ１であり、Ｔ２は、ＯＲ１またはＯＲ２である。
式（ＩＩＩ）の化合物は、１’末端の第１の炭素のキラル中心におけるＢｘの空間配置がアルファアノマーとは異なる、ベータアノマーまたはベータアノマーモノマーである。
別の実施形態では、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物において、Ｂｘは、プリン塩基またはピリミジン塩基から選択され、Ｂｘは、（ｉ）アデニン（Ａ）、（ｉｉ）シトシン（Ｃ）、（ｉｉｉ）５−メチルシトシン（ＭｅＣ）、（ｉｖ）グアニン（Ｇ）、（ｖ）ウラシル（Ｕ）、（ｖｉ）チミン、もしくは（ｖｉｉ）２，６−ジアミノプリン、または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、もしくは（ｖｉｉ）の誘導体から選択される。別の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物において、Ｂｘは、チミン、５−メチルシトシン、ウラシル、アデニン、またはグアニンから選択される。別の実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物において、Ｂｘは、チミン、５−メチルシトシン、アデニン、またはグアニンから選択される。
本明細書で使用され、Ｂｘと略される「核酸塩基」という用語は、未修飾または天然に存在する核酸塩基、ならびに修飾されたまたは天然に存在しない核酸塩基およびそれらの合成模倣体を指す。核酸塩基は、核酸の複素環式塩基に水素結合することができる１つ以上の原子または原子群を含む、任意の複素環式塩基である。
一実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基またはピリミジン塩基であり、好ましくは、該プリン塩基は、プリンまたは置換プリンであり、該ピリミジン塩基は、ピリミジンまたは置換ピリミジンである。より好ましくは、核酸塩基は、（ｉ）アデニン（Ａ）、（ｉｉ）シトシン（Ｃ）、（ｉｉｉ）５−メチルシトシン（ＭｅＣ）、（ｉｖ）グアニン（Ｇ）、（ｖ）ウラシル（Ｕ）、もしくは（ｖｉ）５−メチルウラシル（ＭｅＵ）、または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、もしくは（ｖｉ）の誘導体である。「（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、または（ｖｉ）の誘導体」および「核酸塩基誘導体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、または（ｖｉ）の誘導体および核酸塩基誘導体は、それぞれ、当業者に既知であり、例えば、Ｓｈａｒｍａ Ｖ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４，５，１４５４−１４７１に記載され、限定されないが、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アルキルアデニン、例えば、６−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、アルキルグアニン、たとえば、６−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、アルキニルピリミジン塩基、たとえば、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）シトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、擬ウラシル（ｐｓｅｕｄｏ−ｕｒａｃｉｌ）、４−チオウラシル、８−置換プリン塩基、たとえば、８−ハロ−、８−アミノ−、８−チオール−、８−チオアルキル−、８−ヒドロキシル−アデニンもしくはグアニン、５−置換ピリミジン塩基、たとえば、５−ハロ−、特に、５−ブロモ−、５−トリフルオロメチル−ウラシルもしくは−シトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、疎水性塩基、広域塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｂａｓｅ）、サイズ拡張塩基（ｓｉｚｅ−ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂａｓｅ）、またはフッ素化塩基を含む。特定の実施形態では、核酸塩基には、限定されないが、三環系ピリミジン、例えば、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン、または９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｇ−クランプ）が含まれる。「核酸塩基誘導体」という用語にはまた、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、または２−ピリドンによって置き換えられているものが含まれる。本発明のさらなるヌクレオベーゼには、限定されないが、当業者に既知であるものが含まれる（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｓｗａｙｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａ Ｄｒｕｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｈａｐｔｅｒ，６ｐｐ．１４３−１８２（ＣｒｏｏｋｅＳ．Ｔ．ｅｄ．２００８）；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＫｒｏｓｃｈｗｉｔｚＪ．Ｉ．Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０ｐｐ．８５８−８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ ＣｈｅｍｉｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１Ｖｏｌ．３０（６）ｐｐ．６１３−６２３；ＳａｎｇｈｖｉＹ．Ｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＣｒｏｏｋｅＳ．Ｔ．ａｎｄ ＬｅｂｌｅｕＢ．Ｅｄｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３ｐｐ．２７３−３０２）。
好ましい核酸塩基誘導体には、メチル化アデニン、グアニン、ウラシル、およびシトシン、ならびに核酸塩基誘導体、好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の核酸塩基誘導体が含まれ、それぞれのアミノ基、好ましくは、環外アミノ基は、アシル保護基またはジアルキルホルムアミジノ、好ましくは、ジメチルホルムアミジノ（ＤＭＦ）によって保護され、核酸塩基誘導体、例えば、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、ならびにピリミジン類似体、例えば擬イソシトシンおよび擬ウラシルをさらに含む。
さらに好ましい実施形態では、上記核酸塩基誘導体は、メチル化アデニン、メチル化グアニン、メチル化ウラシル、およびメチル化シトシン、ならびに（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の核酸塩基誘導体から選択され、それぞれのアミノ基、好ましくは、環外アミノ基は、保護基によって保護されている。
さらに好ましい実施形態では、上記核酸塩基誘導体は、メチル化アデニン、メチル化グアニン、メチル化ウラシルおよびメチル化シトシンから、ならびに（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の核酸塩基誘導体から選択され、それぞれのアミノ基、好ましくは、環外アミノ基は、アシル保護基またはジアルキルホルムアミジノ、好ましくはジメチルホルムアミジノ（ＤＭＦ）によって保護されている。
さらに好ましい実施形態では、上記核酸塩基誘導体は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の核酸塩基誘導体から選択され、それぞれのアミノ基、好ましくは、環外アミノ基は、保護基によって保護されている。
さらに好ましい実施形態では、上記核酸塩基誘導体は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の核酸塩基誘導体であり、環外アミノ基は、アシル保護基またはジアルキルホルムアミジノ、好ましくはジメチルホルムアミジノ（ＤＭＦ）によって保護されている。
さらに非常に好ましい実施形態では、上記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の上記アシル保護基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１１であり、互いに独立して、Ｒ１１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、Ｃ６−Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ１０アルキレン、またはＣ６−Ｃ１０アリールオキシＣ１−Ｃ１０アルキレンから選択され、上記ジアルキルホルムアミジノ保護基は、＝Ｃ（Ｈ）−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２およびＲ１３は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される。
さらに非常に好ましい実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の上記核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の上記アシル保護基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１４であり、互いに独立して、Ｒ１４は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニル、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシで置換されたフェニル、ベンジル、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシで置換されたベンジル、またはハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシで任意選択により置換されたフェニルオキシＣ１−Ｃ２アルキレンから選択され、上記ジアルキルホルムアミジノ保護基は、＝Ｃ（Ｈ）−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２およびＲ１３は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される。
さらに非常に好ましい実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の上記核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の上記アシル保護基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１５であり、互いに独立して、Ｒ１５は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニル、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ５−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシで置換されたフェニル、ベンジル、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシで置換されたベンジル、またはフェニルオキシメチレン（ＣＨ２−ＯＣ６Ｈ５）から選択され、フェニルは、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ５−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシで任意選択により置換され、上記ジアルキルホルムアミジノ保護基は、＝Ｃ（Ｈ）−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２およびＲ１３は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される。
さらに非常に好ましい実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の上記核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の上記アシル保護基は、互いに独立して、Ｒ１６は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、フェニル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、メトキシで置換されたフェニル、ベンジル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、メトキシで置換されたベンジル、またはフェニルオキシメチレン（ＣＨ２−ＯＣ６Ｈ５）から選択され、Ｃ６Ｈ５は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、メトキシで任意選択により置換され、上記ジアルキルホルムアミジノ保護基は、＝Ｃ（Ｈ）−ＮＲ１２Ｒ１３であり、Ｒ１２およびＲ１３は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される。
さらに非常に好ましい実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の上記核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の上記アシル保護基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１７であり、互いに独立して、Ｒ１７は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、フェニル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、メトキシで置換されたフェニル、ベンジル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、メトキシで置換されたベンジル、またはフェニルオキシメチレン（ＣＨ２−ＯＣ６Ｈ５）から選択され、Ｃ６Ｈ５は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、メトキシで任意選択により置換され、上記ジアルキルホルムアミジノ保護基は、ジメチルホルムアミジノ（ＤＭＦ）である。
さらに非常に好ましい実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の上記核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の上記アシル保護基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１８であり、互いに独立して、Ｒ１８は、メチル、イソプロピル、フェニル、ベンジル、またはフェニルオキシメチレン（ＣＨ２−ＯＣ６Ｈ５）から選択され、Ｃ６Ｈ５は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、メトキシで任意選択により置換され、上記ジアルキルホルムアミジノ保護基は、ジメチルホルムアミジノ（ＤＭＦ）である。
さらに非常に好ましい実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の上記核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の上記アシル保護基は、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１９であり、互いに独立して、Ｒ１９は、メチル、イソプロピル、フェニル、ベンジル、またはフェニルオキシメチレン（ＣＨ２−ＯＣ６Ｈ５）から選択され、Ｃ６Ｈ５は、メチル、イソプロピルで任意選択により置換され、上記ジアルキルホルムアミジノ保護基は、ジメチルホルムアミジノ（ＤＭＦ）である。
本明細書で使用する「ジアルキルホルムアミジノ」という用語は、＝＝Ｃ（Ｈ）−ＮＲ１２Ｒ１３を指し、Ｒ１２およびＲ１３は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される。好ましい実施形態では、上記ジアルキルホルムアミジノは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）の上記核酸塩基誘導体の上記環外アミノ基の保護基である。得られる化合物は、（Ｅ）または（Ｚ）配置のいずれか、および両方の形態であり得、任意の比率のそれらの混合物が、本発明の範囲内に含まれるべきである。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、（Ｚ）配置の、ジアルキルホルムアミジノ、好ましくはジメチルホルムアミジノ（ＤＭＦ）を含む。
一実施形態によれば、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、およびグアニンから選択される。好ましくは、Ｂｘは、チミン、５−メチルシトシン、アデニン、およびグアニンから選択される。一実施形態によれば、Ｂｘは、塩基ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、およびグアニンの代わりに、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーに組み込まれたときに、塩基対を形成することができる芳香族複素環部分である。
本明細書で使用される「リン部分」という用語は、独立して、各々の場合において、ホスホネート、ホスファイトリエステル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスフェートトリエステル、ホスフェートジエステル、チオホスフェートエステル、ジチオホスフェートエステル、またはホスホルアミダイトに由来する部分から選択される。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物において、リン部分Ｒ２は、ホスフェート部分、ホスホルアミデート部分、およびホスホルアミダイト部分から選択される。別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物において、リン部分Ｒ２は、ホスフェート部分、ホスホルアミデート部分、およびホスホルアミダイト部分から選択される。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物において、リン部分Ｒ２は、ホスフェート部分、ホスホルアミデート部分、およびホスホルアミダイト部分から選択される。
本明細書で使用される「リン部分」という用語は、ＰＩＩＩまたはＰＶ原子価状態のリン原子を含み、式（ＶＩＩ）によって表される部分を指し、
Figure 2021522862
 、式中、
Ｗは、Ｏ、Ｓ、もしくはＳｅを表し、またはＷは、電子対を表し、またはＷは、ＢＨ２を表し、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ５、ＮＲ６Ｒ７、ＳＨ、ＳＲ８、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルであり、Ｒ５は、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリール；アセチル；ヒドロキシル保護基であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル；アミノ保護基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびホモピペラジンから選択され、複素環は、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換され、Ｒ８は、チオール保護基であり、波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。ＷがＯ、Ｓ、またはＳｅを表す場合、リン部分内のＰ原子はＰＶ原子価状態である。Ｗが電子対を表す場合、リン部分内のＰ原子はＰＩＩＩ原子価である。式（ＶＩＩ）の部分には、任意の可能な立体異性体が含まれる。式（ＶＩＩ）の塩が、式（ＶＩＩ）によって表される部分にさらに含まれ、該塩は、無機塩基またはアミンでの処理時に形成することができ、（互いに独立して）Ｒ３およびＲ４であるＯＨ基またはＳＨ基との反応から誘導される塩であり得る。ＯＨ基またはＳＨ基との塩形成をもたらす無機塩基またはアミンは、当該技術分野で周知であり、トリメチルアミン、ジエチルアミン、メチルアミン、または水酸化アンモニウムを含む。本発明に含まれるこれらのリン部分は、適切な場合、「Ｏ−ＨＢ＋」とも略され、ＨＢ＋は、形成された対カチオンを指す。
一実施形態では、「リン部分」において、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ５、ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルであり、Ｒ５は、シアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ９アルキル；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール；アセチル；ヒドロキシル保護基であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ９アルキル：シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換されたアリール；アミノ保護基であり、Ｒ８は、チオール保護基であり、上記波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
本明細書で使用される「リン部分」という用語には、ホスホネート、ホスファイトリエステル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスフェートトリエステル、ホスフェートジエステル、チオホスフェートエステル、ジチオホスフェートエステル、またはホスホルアミダイトに由来する部分が含まれる。
したがって、一実施形態では、ＯＲ２は、各々の場合において、ホスホネート、ホスファイトトリエステル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスフェートトリエステル、ホスフェートジエステル、チオホスフェートエステル、ジチオホスフェートエステル、またはホスホルアミダイトから選択され、ＯＲ２は、ホスホルアミダイトまたはホスフェートトリエステルである。
一実施形態では、リン部分は、式（ＶＩＩ）によって表されるホスホネートに由来し、式中、Ｗは、Ｏであり、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルから選択され、Ｒ４は、ＯＨまたはＯ−ＨＢ＋であり、上記波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。別の実施形態では、式（ＶＩＩ）のリン部分は、Ｈ−ホスホネートであり、式中、Ｗは、Ｏであり、Ｒ３は、水素であり、Ｒ４は、ＯＨまたはＯ−ＨＢ＋であり、Ｏ−ＨＢ＋は、ＨＮＥｔ３ ＋である。さらなる実施形態では、式（ＶＩＩ）のリン部分は、アルキルホスホネートであり、式中、Ｗは、Ｏであり、Ｒ３は、アルキルであり、Ｒ４は、ＯＨまたはＯ−ＨＢ＋であり、Ｏ−ＨＢ＋は、ＨＮＥｔ３ ＋である。一実施形態では、式（ＶＩＩ）のリン部分は、メチルホスホネートであり、式中、Ｗは、Ｏであり、Ｒ３は、水素であり、Ｒ４は、ＯＨまたはＯ−ＨＢ＋であり、Ｏ−ＨＢ＋は、ＨＮＥｔ３ ＋である。別の実施形態では、式（ＶＩＩ）のリン部分は、ホスホノカルボキシレートであり、式中、Ｒ３またはＲ４は、互いに独立して、カルボン酸である。ホスホノカルボキシレートは、ホスホノ酢酸またはホスホノギ酸であり得る。さらなる実施形態では、式（ＶＩＩ）のリン部分は、２−アミノエチル−ホスホネートである。
別の実施形態では、式（ＶＩＩ）のリン部分のＲ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＯＲ５、ＮＲ６Ｒ７、ＳＨ、ＳＲ８、Ｃ１−Ｃ４アルキル、例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ２ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ２ハロアルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ２アミノアルキルであり、Ｒ５は、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ６アルキル、例えば、Ｃ１−Ｃ３アルキル；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ３アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ３アルキレンジアリール；アセチル；ヒドロキシル保護基であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換されたた、Ｃ１−Ｃ６アルキル、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル；シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、アリール；アミノ保護基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびホモピペラジンから選択され、複素環は、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換され、Ｒ８は、チオール保護基であり、波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
別の実施形態では、式（ＶＩＩ）のリン部分のＲ３またはＲ４は、独立して各々の場合においておよび互いに独立して、ハロゲン、例えば、塩素、またはＯＲ５であり、Ｒ５は、ヒドロキシル保護基である。本発明で使用される追加のリン部分は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ３０９（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１）に開示されている。
本明細書で使用される「リン部分」という用語には、ＰＩＩＩまたはＰＶ原子価状態のリン原子を含み、かつ、式（ＶＩＩＩ）、式（ＩＸ）、または式（Ｘ）のいずれかによって独立して各々の場合において表される、Ｒ２基が含まれ、
Figure 2021522862
 式中、Ｙは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｒ５およびＲ５’は、独立して各々の場合においておよび互いに独立して、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリール；ヒドロキシル保護基であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル；シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、アリール、例えば、フェニル；またはアミノ保護基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびホモピペラジンから選択され、複素環は、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換され、Ｒ８は、チオール保護基であり、波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
一実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（ＶＩＩＩ）によって表され、
Figure 2021522862
 式中、Ｙは、Ｏ、Ｓ、もしくはＳｅであり、Ｙは、ＯもしくはＳであり、またはＹは、Ｏであり、Ｒ５およびＲ５’は、独立して各々の場合においておよび互いに独立して、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリール；ヒドロキシル保護基；Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ９’）、Ｐ（Ｏ）ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ９’）であり、Ｒ９およびＲ９’は、独立して各々の場合においておよび互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリール；ヒドロキシル保護基であり、上記波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）のＲ５およびＲ５’は、独立して各々の場合においておよび互いに独立して、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、例えば、フェニル、Ｃ１−Ｃ４アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ４アルキレンジアリール；ヒドロキシル保護基である。
別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）のＲ５およびＲ５’は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリール、例えば、フェニルである。別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）のＲ５およびＲ５’は、互いに独立して、メチルまたはエチルである。別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）のＲ５およびＲ５’は、互いに独立して、フェニルまたはベンジルである。別の実施形態では、Ｒ５およびＲ５’は、独立して各々の場合においておよび互いに独立して、水素またはヒドロキシル保護基である。別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）において、Ｒ５およびＲ５’は、独立して各々の場合においておよび互いに独立して、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール；またはヒドロキシル保護基である。一実施形態では、式（ＶＩＩＩ）によって表されるリン部分Ｒ２は、本明細書では「ホスフェート部分」と称される。
一実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（ＩＸ）によって表され、
Figure 2021522862
 式中、
Ｙは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、Ｙは、ＯまたはＳであり、
Ｒ５は、独立して各々の場合において、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリール；ヒドロキシル保護基であり、
Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル；シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、アリール、例えば、フェニル；アミノ保護基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環が、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびホモピペラジンから選択され、複素環が、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換された、波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。一実施形態では、式（ＩＸ）によって表されるリン部分Ｒ２は、本明細書では「ホスホルアミデート部分」または互換的に使用される「ホスホロアミデート部分」と称される。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、
Figure 2021522862
 、式中、
Ｒ５は、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニル、ヒドロキシル保護基で任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリールであり、
Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、アリール、例えば、フェニルであるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環が、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびホモピペラジンから選択され、複素環が、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換された、波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。典型的にはかつ上記において、式（Ｘ）によって表されるリン部分Ｒ２は、本明細書では「ホスホルアミダイト部分」または互換的に使用される「ホスホロアミダイト部分」と称される。
別の実施形態では、式（ＩＸ）において、ＹはＯであり、Ｒ５は、独立して各々の場合において、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール；ヒドロキシル保護基であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル；シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、アリール；アミノ保護基である、上記波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
一実施形態では、式（Ｘ）において、Ｒ５は、独立して各々の場合において、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲンで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール；ヒドロキシル保護基であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル；シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、アリール；アミノ保護基であり、上記波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、独立して各々の場合において、ホスフェート部分、ホスホルアミデート部分、およびホスホルアミダイト部分から選択される。
別の実施形態では、Ｒ５は、独立して各々の場合において、水素、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ４アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ４アルキレンジアリール；ヒドロキシル保護基であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ６アルキル；シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、アリール；アミノ保護基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびホモピペラジンから選択され、複素環は、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換され、波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
別の実施形態では、Ｒ５は、シアノ、塩素、フッ素、または臭素で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキル；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、塩素、フッ素、臭素、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ１ハロアルキルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ３アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ３アルキレンジアリールである。別の実施形態では、Ｒ５は、シアノ、塩素、フッ素、または臭素で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキルである。別の実施形態では、Ｒ５は、シアノ置換Ｃ２アルキル、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＮである。
別の実施形態では、Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、例えば、メチルもしくはエチル；アリール、例えば、フェニルもしくはベンジル；塩化物、またはヒドロキシル保護基である。別の実施形態では、Ｒ５は、メチルまたはヒドロキシル保護基である。
別の実施形態では、Ｒ５は、シアノ、塩素、フッ素、または臭素で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシである。
別の実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルであるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニルから選択され、複素環は、メチルで任意選択により置換されている。一実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アルコキシ、またはアリールであり、アリールは、シアノ、ニトロ、塩素、フッ素、臭素で任意選択により置換された、フェニルまたはベンジルである。別の実施形態では、Ｒ６は、水素であり、Ｒ７は、（ｉ）Ｃ１−Ｃ９アルキルまたは（ｉｉ）アリールであり、（ｉ）または（ｉｉ）はシアノ、ニトロ、ハロゲン、アリールで任意選択により置換され、Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、フェニル、またはベンジルである。
別の実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、メチル、エチル、イソプロピル、またはイソブチルから選択される。別の実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、イソプロピルである。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ５は、（ｉ）Ｃ１−Ｃ９アルキル、（ｉｉ）アリール、例えば、フェニル、または（ｉｉｉ）シアノ、ニトロ、ハロゲン、アリールで任意選択により置換された、（ｉ）もしくは（ｉｉ）であり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ９アルキル、例えば、イソプロピルである。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ５は、シアノ、ニトロ、ハロゲン、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルスルホニルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリールであり、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、Ｃ１−Ｃ９アルキル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシで任意選択により置換された、フェニルであるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびホモピペラジンから選択され、複素環は、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換され、波線は、ＯＲ２基の酸素への結合を示している。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ５は、シアノ、ニトロ、塩素、フッ素、臭素、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ３ハロアルキルで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ９アルキル；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、塩素、フッ素、臭素、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキレンジアリールである。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ５は、シアノ、塩素、フッ素、および臭素で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキル；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、塩素、フッ素、臭素、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ１ハロアルキルで任意選択により置換された、アリール、Ｃ１−Ｃ３アルキレンアリール、Ｃ１−Ｃ３アルキレンジアリールである。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、２−シアノエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ３（ｎ＝３〜６である）；各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、塩素、フッ素、臭素、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、−ＣＦ３で任意選択により置換された、フェニル、Ｃ１−Ｃ３アルキレンフェニル、ベンズヒドリルである。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ５は、メチル、エチル、２−シアノエチル、例えば、２−シアノエチル（ＣＨ２）２ＣＮ）である。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、Ｃ１−Ｃ３アルキルであるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒に複素環を形成し、複素環は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンから選択され、複素環は、Ｃ１−Ｃ３アルキルで任意選択により置換され、複素環は、メチルで任意選択により置換されている。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ６は、Ｒ７に等しく、Ｒ６およびＲ７は、イソプロピルまたはメチルである。
別の実施形態では、リン部分Ｒ２は、式（Ｘ）によって表され、式中、Ｒ５は、メチル、エチル、２−シアノエチルであり、Ｒ６は、Ｒ７に等しく、Ｒ６およびＲ７は、イソプロピルまたはメチルである。
各アルキル部分は、単独で、またはアルコキシもしくはアルキレンなどのより大きな基の一部として、直鎖または分枝鎖であり、＝Ｃ１−Ｃ６アルキル、例えば、Ｃ１−Ｃ３アルキルであり得る。例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、プロプ−２−イル（イソプロピル；本明細書では、特に示される化学式において、ｉＰｒまたはＰｒｉと互換的に省略される）、ｎ−ブチル、ブト−２−イル、２−メチル−プロプ−１−イル、または２−メチル−プロプ−２−イルが含まれる。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎｅｏ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシが含まれる。本明細書に記載されるように、アルコキシは、ハロアルコキシ部分をもたらすハロゲン原子などのさらなる置換基を含み得る。
各アルキレン部分は、直鎖または分枝鎖であり、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、または−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−である。
各アルケニル部分は、単独で、またはアルケニルオキシもしくはアルケニレンなどのより大きな基の一部として、直鎖または分枝鎖であり、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、例えば、Ｃ２−Ｃ４アルケニルである。各部分は、（Ｅ）配置または（Ｚ）配置のいずれかであり得る。例には、ビニルおよびアリルが含まれる。したがって、アルケニル部分を含む本発明の化合物には、該当する場合、（Ｅ）配置でのアルケニル部分を有する化合物、（Ｚ）配置でのアルケニル部分を有する化合物、および任意の比のそれらの混合物が含まれる。
各アルキニル部分は、単独で、またはアルキニルオキシなどのより大きな基の一部として、直鎖または分枝鎖であり、例えば、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、またはＣ２−Ｃ４アルキニルである。例は、エチニルおよびプロパルギルである。
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である。
各ハロアルキル部分は、単独で、またはハロアルコキシなどのより大きな基の一部として、１つ以上の同じまたは異なるハロゲン原子で置換されたアルキル基である。例には、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、および２，２，２−トリフルオロエチルが含まれる。
別の実施形態では、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、非ヌクレオシド化合物、例えば、固相に結合されている。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、以下から選択される。
Figure 2021522862
Figure 2021522862
 。
本発明は、少なくとも１つの式（ＩＶ）の化合物を含むオリゴヌクレオチドを提供し、
Figure 2021522862
 式中、少なくとも１つの式（ＩＶ）の化合物の各々について独立して、
Ｔ３またはＴ４のうちの一方は、ヌクレオシド結合基であり、
Ｔ３およびＴ４は、ＯＲ１、ＯＲ２であり、５’末端基、７’末端基、またはヌクレオシド結合基であり、Ｒ１は、Ｈまたはヒドロキシル保護基であり、Ｒ２は、リン部分であり、Ｂｘは、核酸塩基である。
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの式（ＩＶ）の化合物を含み、式（ＩＶ）の化合物は、式（Ｖ）の化合物であり、
Figure 2021522862
 式中、
（Ｉ）Ｔ３は、ヌクレオシド結合基であり、Ｔ４は、７’末端基またはＯＲ１、またはＯＲ２であり、好ましくは、Ｔ４は、７’末端基またはＯＲ１であるか、あるいは
（ｉｉ）Ｔ３は、５’末端基、ＯＲ１、またはＯＲ２であり、好ましくはＴ３は、５’末端基またはＯＲ２であり、Ｔ４は、ヌクレオシド結合基であるか、あるいは
（ｉｉｉ）Ｔ３およびＴ４は、互いに独立して、ヌクレオシド結合基である。
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの式（ＩＶ）の化合物を含み、上記式（ＩＶ）の化合物は、式（ＶＩ）の化合物であり、
Figure 2021522862
 式中、
（Ｉ）Ｔ３は、ヌクレオシド結合基であり、Ｔ４は、７’末端基、ＯＲ１、またはＯＲ２であり、好ましくはＴ４は、７’末端基またはＯＲ２であるか、あるいは
（ｉｉ）Ｔ３は、５’末端基、ＯＲ１、またはＯＲ２であり、好ましくはＴ３は、５’末端基またはＯＲ１であり、
Ｔ４は、ヌクレオシド結合基であるか、あるいは
（ｉｉｉ）Ｔ３およびＴ４は、互いに独立して、ヌクレオシド結合基である。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（Ｖ）の化合物を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＶＩ）の化合物を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの式（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物を含むオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
Ｂｘと本発明化合物の二環式コアとの間の結合を示す式（Ｉ）および（ＩＶ）内の波線は、核酸塩基Ｂｘの任意の空間的配向が式（Ｉ）または（ＩＶ）によって包含されることを示す。これは、式（Ｉ）および（ＩＶ）が、本発明の化合物のアルファもしくはベータ立体配座、またはアルファおよびベータアノマーの任意の混合物のいずれかを包含することを意味する。
本明細書で使用する「アリール」という用語は、親芳香族環系の単一の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって誘導される６〜１４個の炭素原子（Ｃ６−Ｃ１４）の一価芳香族炭化水素基、ならびに、１つ以上の置換基、典型的にかつ好ましくは、以下に記載される１つまたは２つの置換基で独立して任意選択で置換された、上記アリールを意味する。アリールには、飽和、部分的不飽和の環、芳香環または芳香族炭素環または複素環に縮合した二環式基が含まれる。アリール基は、１つ以上の置換基で、典型的には例えば１つまたは２つの置換基で任意選択により独立して置換され、上記置換基は、独立して各々の場合において、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、ＣＦ３、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、ＮＲ２０Ｒ２１、Ｃ６Ｈ５、ハロゲンで置換されたＣ６Ｈ５、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、ＮＲ２０Ｒ２１から選択され、Ｒ２０、Ｒ２１は、独立して各々の場合において、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキルである。典型的なアリール基には、ベンゼン（フェニル）、置換フェニル、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルなどに由来する基が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「アリール」という用語は、好ましくは、１〜３のＲ２２で任意選択により置換されたフェニルを指し、Ｒ２２は、独立して各々の場合において、ハロゲン、−ＯＨ、１つまたは２つのＯＨで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ２フルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２アルコキシＣ１−Ｃ３アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、−ＮＨ２、ＮＨＣＨ３またはＮ（ＣＨ３）２である。
本明細書で互換的に使用される「アミノの保護基」、「アミノ基の保護基」、または「アミノ保護基」という用語は、当該技術分野で周知であり、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９，Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０１４、およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．０６／２０１２における現在のプロトコル、および特に第２章で詳細に記載されているものを含む。本発明のための好適な「アミノ保護基」には、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、および２，４，６−トリメチルベンジルカルバメート、ならびにホルムアミド、アセトアミド、ベンズアミドが含まれ、典型的にはかつ好ましくは、独立して各々の場合において、それらから選択される。
本明細書で互換的に使用される「ヒドロキシルの保護基」、「ヒドロキシル基の保護基」、または「ヒドロキシル保護基」という用語は、当該技術分野で周知であり、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９；Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０１４、およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．０６／２０１２における現在のプロトコル、および特に第２章で詳細に記載されているものを含む。特定の実施形態では、本発明の「ヒドロキシル保護基」は、独立して各々の場合において、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴｒ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）、シリルエーテル、例えば、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル、メチルエーテル、エトキシエチルエーテル（ＥＥ）から選択される。
一実施形態では、本発明の「ヒドロキシル保護基」は、独立して各々の場合において、アセチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル（トリチル）、４，４’−ジメトキシトリチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリフェニルシリル、トリイソプロピルシリル、ベンゾイルホルメート、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、９−フルオレニルメチルカーボネート、メシレート、トシレート、トリフレート、４−モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、４，４’−ジメトキシトリチル、（ＤＭＴｒ）および４，４’，４’’−トリメトキシトリチル（ＴＭＴｒ）、２−シアノエチル（ＣＥまたはＣｎｅ）、２−（トリメチルシリル）エチル（ＴＳＥ）、２−（２−ニトロフェニル）エチル、２−（４−シアノフェニル）エチル ２−（４−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エチル、３，５−ジクロロフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４，６−トリメチルフェニル、２−（２−ニトロフェニル）エチル、ブチルチオカルボニル、４，４’，４’’−トリス（ベンゾイルオキシ）トリチル、ジフェニルカルバモイル、レブリニル、２−（ジブロモメチル）ベンゾイル（Ｄｂｍｂ）、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル（Ｐｔｍｔ）、９−フェニルキサンテン−９−イル（ピキシル）、または９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−ｙ−１（ＭＯＸ）から選択される。
いくつかの実施形態では、ヒドロキシル保護基は、独立して各々の場合において、アセチル、ベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル、４−モノメトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４−トリメトキシトリチル（ＴＭＴｒ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（ピキシル）、および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）から選択される。
いくつかの実施形態では、ヒドロキシル保護基は、独立して各々の場合において、トリフェニルメチル（トリチル）、４−モノメトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチル（ＴＭＴｒ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（ピキシル）、および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）から選択される。
さらなる実施形態では、ヒドロキシル保護基は、独立して各々の場合において、トリチル、４−モノメトキシトリチル、および４，４’−ジメトキシトリチル基から選択される。
別の実施形態では、ヒドロキシル保護基は、独立して各々の場合において、トリフェニルメチル（トリチル）、４−モノメトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチル（ＴＭＴｒ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（ピキシル）、および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）から選択される。
別の実施形態では、本発明のヒドロキシル保護基は、アセチル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、またはｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＰＳ）である。別の実施形態では、ヒドロキシル保護基は、独立して各々の場合において、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）または４−モノメトキシトリチルから選択される。別の実施形態では、ヒドロキシル保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）である。
基が任意選択により置換されていると言う場合、１〜５個の置換基、１〜３個の置換基、または１個もしくは２個の置換基があり得る。基が任意選択により置換されていると言う場合、および２つ以上の置換基が存在する場合、２つ以上の置換基は同じでもまたは異なってもよい。
ヌクレオシド間リン含有結合基
本発明のオリゴヌクレオチドは、主に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を含み、例えば、ヌクレオシド間結合基の５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％は、ホスホジエステル結合基である。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、主にホスホジエステルヌクレオシド間結合に加えて、ホスホトリエステル結合基、ホスホロチオエート結合基、ホスホロジチオエート結合基、ホスホネート結合基、ホスホノチオエート結合基、ホスフィネート結合基、ホスホルチオアミデート結合、またはホスホルアミデート結合基から選択されるヌクレオシド結合基を含むことができる。
「ヌクレオシド結合基」という用語には、リン結合基および非リン結合基が含まれる。
一実施形態では、ヌクレオシド結合基は、リン結合基であり、リン結合基は、ホスホジエステル結合基、ホスホトリエステル結合基、ホスホロチオエート結合基、ホスホロジチオエート結合基、ホスホネート結合基、例えば、Ｈ−ホスホネート結合基またはメチルホスホネート結合基、ホスホノチオエート結合基、例えば、Ｈ−ホスホノチオエート結合基、メチルホスホノチオエート結合基、ホスフィネート結合基、ホスホルチオアミデート結合、ホスホルアミデート結合基、またはホスホロジアミデート結合基から選択される。別の実施形態では、ヌクレオシド結合基は、リン結合基であり、リン結合基は、ホスホジエステル結合基、ホスホトリエステル結合基、ホスホロチオエート結合基、またはホスホネート結合基から選択され、ホスホネートは、Ｈ−ホスホネート結合基またはメチルホスホネート結合基である。
別の実施形態では、ヌクレオシド結合基は、リン結合基であり、リン結合基は、ホスホジエステル結合基である。別の実施形態では、ヌクレオシド結合基は、リン結合基であり、リン結合基は、ホスホロチオエート結合基である。
リン結合基は、アルキルホスホジエステル結合基、アルキレンホスホジエステル結合基、チオノアルキルホスホジエステル結合基またはアミノアルキルホスホジエステル結合基、アルキルホスホトリエステル結合基、アルキレンホスホトリエステル結合基、チオノアルキルホスホトリエステル結合基またはアミノアルキルホスホトリエステル結合基、アルキルホスホネート結合基、アルキレンホスホネート結合基、アミノアルキルホスホネート結合基、チオノアルキルホスホネート結合基またはキラルホスホネート結合基から選択することができる。本発明のヌクレオシド結合基は、リン結合基を含み、リン結合基は、ホスホジエステル結合基−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−または対イオンとして［ＨＢ＋］を有する−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−であり、ホスホロチオエート−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）Ｏ−または対イオンとして［ＨＢ＋］を有する−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（Ｏ−）Ｏ−、メチルホスホネート−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＣＨ３）Ｏ−である。リン結合基の様々な塩、混合塩、および遊離酸形態が含まれる。
ヌクレオシド結合基は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを、さらなるヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドと結合することができる。
非リン結合基は、リン原子を含まず、非リン結合基の例には、各々が互いに独立してシアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシル、アミド、アミン、アミノ、イミン、チオール、スルフィド、スルホキシド、スルホン、スルファメート、スルホネート、スルホンアミド、シロキサン、またはそれらの混合物で任意選択により置換された、アルキル、アリール、好ましくは、フェニル、ベンジル、またはベンゾイル、シクロアルキル、アルキレンアリール、アルキレンジアリール、アルコキシ、アルコキシアルキレン、アルキルスルホニル、アルキン、エーテルが含まれる。非リン結合基には、アミノプロピル、長鎖アルキルアミン基、ビニル、アセチルアミド、アミノメチル、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、チオホルムアセタール、チオホルムアセチル、リボアセチル、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、または中性非イオン性ヌクレオシド結合基、例えば、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）またはアミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’）が含まれる。非リン結合基には、アルキル、アリール、好ましくは、フェニル、ベンジル、またはベンゾイル、シクロアルキル、アルキレン、アルキレンジアリール、アルコキシ、アルコキジアルキレン、アルキルスルホニル、アルキン、またはエーテルから選択される化合物が含まれ、化合物は、Ｃ１−Ｃ９、Ｃ１−Ｃ６、またはＣ１−Ｃ４を含む。
脂質基
本発明は、リンカーを介して結合したａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドおよび脂質基を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。脂質基がコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの構造は、脂質基、例えば脂肪酸の炭化水素鎖が露出し、それによって炭化水素鎖と、アルブミンおよび／または脂肪酸受容体または輸送体と、の相互作用を可能となり、それによってインビボでの長い半減期を有するオリゴヌクレオチドを提供するようなものである。脂質基は、リンカーを介して、オリゴヌクレオチドの５’末端または７’末端のヒドロキシル基にコンジュゲートされている。
特定の実施形態では、脂質基は、脂肪酸由来基である。特定の実施形態では、脂肪酸由来基は、カルボキシ基を含む。脂肪酸には、４〜２８個の炭素原子の炭化水素鎖を有する任意の飽和または不飽和脂肪酸が含まれ、脂肪酸は、１つまたは２つのカルボン酸基を含むことができる。２つのカルボン酸基を含む脂肪酸は、ジカルボン酸である。１つまたは２つの脂肪酸リガンドは、本明細書に記載されるように、ａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’および／または７’末端上のリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合することができる。
特定の実施形態では、脂質基は、脂肪酸由来基であり、脂肪酸は、表１および２に示される脂肪酸のうちのいずれか１つである。
Figure 2021522862
Figure 2021522862
本発明に従って有用な追加の脂質基には、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）、および胆汁酸が含まれる。
一実施形態では、上記脂質基は、８〜２４個の炭素原子の炭化水素鎖を有する飽和脂肪酸由来基である。特定の実施形態では、上記脂質基は、飽和脂肪酸由来基であり、該脂肪酸は、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、およびテトラコサン酸からなる群から選択される。一実施形態では、上記脂質基は、飽和脂肪酸由来基であり、該脂肪酸は、ヘキサデカン酸である。一実施形態では、上記脂肪酸由来基は、ａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端でリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合している。一実施形態では、上記脂肪酸由来基は、ａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの７’末端でリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合している。
一実施形態では、上記脂質基は、８〜２４個の炭素原子の炭化水素鎖を有する不飽和脂肪酸由来基である。特定の実施形態では、上記脂質基は、不飽和脂肪酸由来基であり、該脂肪酸は、ミリストレイン酸、パルミトリン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。
リンカー
本発明のオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して脂質基に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミド結合を介して脂質基に結合されている。炭化水素リンカーの場合、リンカーは、２〜２０個の炭素、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素を含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーの場合、リンカーは、１〜２０個のエチレングリコールサブユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のエチレングリコール反復を含む。リンカーは、炭化水素リンカーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーであり得る。ａｂｃＤＮＡが、リンカーのリン部分に結合し、脂質基、例えば脂肪酸由来基が、Ｙに結合している、本発明によるリンカーは、例えば、以下に示す一般的な構造を有することができ、
Figure 2021522862
 式中、
Ｙ＝ＮＨの場合、脂肪酸由来基は、アミド結合を介して結合され、
ｎ＝１の場合、Ｒ１は、例えば、ＣＯ２Ｈであり、Ｒ２は、例えば、Ｈであり得、
Ｔ’は、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏであり得、ｍは、エチレングリコール反復の数であり、
Ｔは、ジスルフィド基などの生体切断可能な部分であり得、ｋは、１に等しく、特定の実施形態では、
Ｘは、酸素またはＮＨであり得、
Ｚは、ＯまたはＳであり得、
ＷＲ５は、ＯＨまたはＳＨであり得る。
本発明よる有用なリンカーには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカー：
Figure 2021522862
 式中、ｎは、好ましくは２〜１２の整数、好ましくは４〜１０の整数である。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の整数である。一実施形態では、ｎは、６である。
アルファ−カルボキシレート−アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカー：
Figure 2021522862
 式中、ｎは、好ましくは２〜１２の整数、好ましくは４〜１０の整数である。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の整数である。一実施形態では、ｎは、６である。
アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカー：
Figure 2021522862
 式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である。一実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。
および
アルファ−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカー：
Figure 2021522862
 式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である。一実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。
したがって、一実施形態では、上記リンカーは、以下からなる群から選択される：
（ｉ）アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカー；
（ｉｉ）アルファ−カルボキシレート−アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカー；
（ｉｉｉ）アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカー、および
（ｉｖ）アルファ−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカー
すべて、提供した式において上記で定義された通りである。
一実施形態では、上記リンカーは、以下の式のアミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカーであり、
Figure 2021522862
 式中、ｎは、２〜１２の整数、好ましくは４〜１０の整数である。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の整数である。一実施形態では、ｎは、６である。
したがって、本発明は、以下に示される構造を有するアミノアルキルホスホロチオエートリンカーを提供する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、２〜１２の整数、好ましくは４〜１０の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の整数である。一実施形態では、ｎは、６である。
アミノアルキルホスホロチオエートリンカーを介して脂質基に結合された配列番号１０を含む本発明のオリゴヌクレオチドの例は、以下の構造を有する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、２〜１２の整数、好ましくは４〜１０の整数であり、より好ましくは、ｎは６である）。好ましくは、配列番号１０の残基のすべては、配列番号４１８に対応するａｂｃ−ＤＮＡ残基である。
アミノアルキルホスホロチオエートリンカーを介して脂質基に結合された本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号４１２）の別の例は、以下の構造を有する。
Figure 2021522862
本発明はまた、以下に提供される構造を有するアミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカーを提供する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。
アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカーを介して脂質基に結合された配列番号１０を含む本発明のオリゴヌクレオチドの例は、以下の構造を有する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。好ましくは、配列番号１０の残基のすべては、配列番号４１８に対応するａｂｃ−ＤＮＡ残基である。
本発明はまた、以下に提供される構造を有するアルファ−カルボキシレート−アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカーを提供する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは２〜１２の整数、好ましくは４〜１０の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の整数である。一実施形態では、ｎは、６である。
アルファ−カルボキシレート−アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカーを介して脂質基に結合された配列番号１０を含む本発明のオリゴヌクレオチドの例は、以下の構造を有する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、２〜１２の整数、好ましくは４〜１０の整数であり、より好ましくは、ｎは６である）。好ましくは、配列番号１０の残基のすべては、配列番号４１８に対応するａｂｃ−ＤＮＡ残基である。
本発明はまた、以下に提供される構造を有するアルファ−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカーを提供する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。
アルファ−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカーを介して脂質基に結合された配列番号１０を含む本発明のオリゴヌクレオチドの例は、以下の構造：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。好ましくは、配列番号１０の残基のすべては、配列番号４１８に対応するａｂｃ−ＤＮＡ残基である）
または以下の構造を有する：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。好ましくは、配列番号１０の残基のすべては、配列番号４１８に対応するａｂｃ−ＤＮＡ残基である。
一実施形態では、本発明は、例えばヒドロキシプロリンに基づいて、立体配座的に制限されたリンカーを提供する。
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。
リンカーは、例えば、チオホスフェート基を介して、オリゴヌクレオチドの５’および／または７’末端ＯＨ基に結合することができる。一実施形態では、リンカーは、例えばチオホスフェート基を介して、オリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ基に結合している。一実施形態では、リンカーは、例えばチオホスフェート基を介して、オリゴヌクレオチドの７’末端ＯＨ基に結合している。リンカーをオリゴヌクレオチドに結合するために使用することができる追加の基には、ホスフェート基が含まれる。
いくつかの実施形態では、脂肪酸コンジュゲートホスホルアミダイトは、脂肪酸を５’末端、７’末端のいずれか、または５’末端および７’末端の両方でａｂｃ−ＤＮＡに結合するために使用され得る。脂肪酸のａｂｃ−ＤＮＡへの結合に使用することができるホスホルアミダイトの例は、以下の構造を有し、
Figure 2021522862
 式中、Ｒ−ＣＯは、脂肪酸部分である。
他の実施形態では、リンカーは、例えば、以下の構造を有するアルファ−カルボキシレート−アミノリンカーである：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。
最も簡単な形態では、リンカーは、ｎ＝１である、２−アミノ−６−ヒドロキシ−４−オキサヘキサン酸リンカーである。あるいは、Ｃ２における立体化学がセリンのものと一致する上記の構造を有するリンカーは、Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−セリンリンカーである。ａｂｃＤＮＡ脂肪酸コンジュゲートの関連では、リンカーのヒドロキシル機能は、ホスホロチオエート結合を介してａｂｃＤＮＡに結合され、アミノ基は、アミド結合を介して脂肪酸部分のカルボキシル基に結合される。
別の実施形態では、脂肪酸コンジュゲートα−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧホスホルアミダイト試薬は、以下の構造を有し、Ｒは、ａｂｃＤＮＡ−リンカー−脂肪酸結合の固相合成の最終段階で使用される、２−クロロトリチルなどの好適な保護基である：
Figure 2021522862
 （式中、ｎは、好ましくは１〜８の整数である）。一実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、または８の整数である。
他の実施形態では、脂肪酸のａｂｃ−ＤＮＡへの結合に使用し得るホスホルアミダイトは、以下の構造を有し（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＬＬＣ、カリフォルニア州オーシャンサイド）、
Figure 2021522862
 式中、Ｒは、脂肪酸部分である。
いくつかの実施形態では、脂肪酸コンジュゲート固相支持体は、５’末端において脂肪酸をａｂｃ−ＤＮＡに結合するために使用され得る。脂肪酸のａｂｃ−ＤＮＡへの結合に使用することができる固相支持体の例は、以下の構造を有し、
Figure 2021522862
 式中、Ｒ−ＣＯは、脂肪酸部分であり、影付きの円は、固相支持体である。
他の実施形態では、脂肪酸のａｂｃ−ＤＮＡへの結合に使用することができる固相支持体は、以下の構造を有し（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＬＬＣ、カリフォルニア州オーシャンサイド）、
Figure 2021522862
 式中、Ｒは、脂肪酸部分であり、影付きの円は、固相支持体である。
特定の実施形態では、リンカーは、切断可能な結合、例えば、ジスルフィド結合、酸切断可能なヒドラゾン結合、またはプロテアーゼ切断可能な部分を含む。
合成方法
当該技術分野で周知の合成方法を使用して、ａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドおよびａｂｃ−ＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを合成する。いくつかの実施形態では、５’末端で脂質基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドについて、本発明のリンカーは、オリゴヌクレオチドの合成および付加の前に、固体支持体に付加される。特定の実施形態では、脂質基がオリゴヌクレオチドの７’末端にコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドの場合、コンジュゲーションは、固相合成中に起こる。他の実施形態では、脂質基がオリゴヌクレオチドの７’末端にコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドの場合、コンジュゲーションは、合成が完了した後に起こる。
一般的な手順
すべての反応は、乾燥したガラス器具中およびアルゴンの不活性雰囲気下で行われる。反応のための無水溶媒は、活性アルミナを通して濾過するか、またはモレキュラーシーブ（４Å）で保存することにより得る。カラムクロマトグラフィー（ＣＣ）は、シリカゲル（Ｓｉｌｉａ Ｆｌａｓｈ Ｐ６０、４０〜６３μｍ、６０Å）で行う。ＣＣに使用されるメタノールは、ＨＰＬＣグレードであり、ＣＣに使用される他のすべての溶媒は、テクニカルグレードであり、使用前に蒸留される。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲルプレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、プレコートしたＴＬＣプレートｓｉｌＧ−２５ＵＶ２５４）上で行う。化合物は、ＵＶ光の下で、またはｐ−アニスアルデヒド染色溶液［ｐ−アニスアルデヒド（３．７ｍＬ）、氷酢酸（３．７ｍＬ）、濃硫酸（５ｍＬ）、エタノール（１３５ｍＬ）］に浸し、続いてヒートガンで加熱することより、視覚化する。ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３またはＣＤ３ＯＤ、ＣＤ３ＣＮ中、３００または４００ＭＨｚ（１Ｈ）、７５または１０１ＭＨｚ（１３Ｃ）、および１２２ＭＨｚ（３１Ｐ）で記録される。化学シフト（δ）は、未処理の溶媒ピーク［ＣＤＣｌ３：７．２６ｐｐｍ（１Ｈ），７７．１６ｐｐｍ（１３Ｃ）；ＣＤ３ＯＤ：３．３１ｐｐｍ（１Ｈ），４９．００ｐｐｍ（１３Ｃ）］に対して報告される。シグナルの帰属は、ＡＰＴおよびＤＥＰＴならびに１Ｈ、１Ｈ、および１Ｈ、１３Ｃ相関実験（ＣＯＳＹの、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ）に基づく。高分解能質量データは、ポジティブモードでのエレクトロスプレーイオン化（イオントラップ、ＥＳＩ＋）によって得られる。
融解温度
ＵＶ融解実験は、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｂｉｏ １００ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計で記録される。実験は、２μＭの２つの濃度である１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０Ｍ〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ（アルファアノマー）または０．０５Ｍ〜１．００Ｍ ＮａＣｌ（ベータアノマー）、および７．０に調整したｐＨで行う。メチルポリシロキサンのカバー層によって、試料を蒸発から保護する。吸光度を２６０ｎｍでモニターする。すべての実験において、０．５℃／分の温度勾配で３回の冷却−加熱サイクルを行う。曲線一次導関数の最大値は、ＶａｒｉａｎＷｉｎＵＶソフトウェアで導き出され、Ｔｍ値は、６つのランプ（ｒａｍｐ）の平均として報告される。
円二色性分光法
ＣＤスペクトルは、ＪａｓｃｏＰＦＯ−３５０Ｓ温度コントローラーを備えたＪａｓｃｏＪ−７１５分光偏光計で記録される。試料条件は、ＵＶ融解実験と同じである。スペクトルは５０ｎｍ／分の速度で２１０〜３２０ｎｍで記録され、温度は試料から直接測定される。各実験について、試料と同じ塩濃度を含むブランクが記録される。報告されたスペクトルは、３回のスキャンの平滑化された平均を取り、対応するブランクスペクトルを差し引くことによって得られる。
ａｂｃＤＮＡヌクレオシドの合成
後のヌクレオシド合成のために企図される二環式足場７および１０を前述の中間体１から構築する（Ｔａｒｋｏｙ，Ｍ．；ＢｏｌｌｉＭ．；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｂ．；Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９３，７６，４８１）（スキーム１）。１におけるエポキシド環を−７８℃においてＬｉＨＭＤＳ媒介の分子内脱離によって効率的に開環し、不飽和エステル２が良好な収率で生成される。その後の２のニッケル触媒によるＮａＢＨ４還元が、二環式コア構造の凸側から立体特異的に進み、エステル３が唯一同定可能であるジアステレオ異性体としてもたらされる。３におけるヒドロキシル官能基をＴＢＤＰＳで保護し、４を定量的収率で得る。その結果、中間体４が−７８℃においてＤＩＢＡＬで還元され、アルデヒド５になる。次いで、５のアセトニド保護基を、触媒としてのＩｎ（ＯＴｆ）３を用いて（Ｇｏｌｄｅｎ，Ｋ．Ｃ．；Ｇｒｅｇｇ，Ｂ．Ｔ．；Ｑｕｉｎｎ，Ｊ．Ｆ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２０１０，５１，４０１０）、穏やかな条件下で、ＭｅＣＮおよびＨ２Ｏの混合物中で加水分解し、溶媒を単にＭｅＯＨに変えることによって、得られた二環式ヘミアセタールをメチルグリコシド６に変換する。次いで、化合物６をアセチル化して、保護された前駆体７を生成し、これをＶｏｒｂｒｕｇｇｅｎ化学による対応するプリンヌクレオシドの合成に使用する。
Figure 2021522862
 スキーム１：（ａ）ＬｉＨＭＤＳ、ＴＨＦ、−７８℃、２時間、７４％、（ｂ）ＮａＢＨ４、ＮｉＣｌ２、ＥｔＯＨ、０℃→室温、２時間、９０％、（ｃ）ＴＢＤＰＳＣｌ、Ｉ２、Ｎ−メチルイミダゾール、ＴＨＦ、室温、３時間、定量的、（ｄ）ＤｉＢＡＬ−Ｈ、ＣＨ２Ｃｌ２、−７８℃、９０分間、８９％、（ｅ）ｉ）Ｉｎ（ＯＴｆ）３、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ、室温、４８時間、ｉｉ）ＭｅＯＨ、６時間、８１％、（ｆ）Ａｃ２Ｏ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ、室温、２時間、９６％、（ｇ）ｉ）ＴＭＳＯＴｆ、２，６−ルチジン、ＤＣＭ、室温、６０分間、ｉｉ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、０℃、２０分間、９２％、（ｈ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ＡｇＯＴｆ、ＤＣＭ／ルチジン、室温、４時間、９３％、（ｉ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、２０時間、定量的。
本発明のピリミジンヌクレオシドの合成は、対応する二環式グリカルへの、核酸塩基のβ−立体選択的ＮＩＳ誘導付加の十分に確立された適用からなる（Ｍｅｄｖｅｃｋｙ，Ｍ．；Ｉｓｔｒａｔｅ，Ａ．；Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ．Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１５，８０，３５５６；Ｄｕｇｏｖｉｃ，Ｂ．；Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ．Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，７９，１２７１；Ｌｉｅｔａｒｄ，Ｊ．；Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ．Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２，７７，４５６６）。まず、チミン核酸塩基を導入するために、Ｎ−ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）誘導ヌクレオシド化を、ＴＭＳＯＴｆのみで処理することで６から簡単に得られる、グリカル８の直接前駆体（式中、Ｒ１＝ＴＭＳ）に対して行う。このアプローチにより、対応するβ−ヌクレオシドの立体選択的形成をもたらすが、標準的なクロマトグラフィー技術では分離されないままであったα−アノマーのうちの７％が著しく汚染される。グリカル１０のように、Ｒ１において立体的嵩高さを増加させ、Ｒ２において立体的嵩高さを減少させることにより、β選択性を高め得ると考えられる。これは、Ｃ（４）における求電子性ヨウ素の最初のα攻撃に有利となるであろう。この目的のために、化合物６をＴＭＳＯＴｆでグリカル８に変換し、続いてＴＢＡＦで短時間処理して、新しく導入されたＴＭＳ基を選択的に除去する。次いで、中間体８をジメトキシトリチル化合物９に精緻化し、これをＴＢＡＦによりＴＢＤＰＳ保護基の除去に最終的に供して、所望の糖成分１０を得る。
インサイチュのＴＭＳ保護グリカル１０上のＮＩＳヌクレオシド化、続いてＢｕ３ＳｎＨによるヨウ化物中間体のラジカル還元により、ほんの微量の（１Ｈ−ＮＭＲにより２％未満）のα−アノマーを含むＤＭＴｒ保護チミジン誘導体１１を良好な収率で得る（スキーム２）。２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイトによる最終的なホスフィチル化により、チミジンホスホルアミダイトビルディングブロック１２が生ずる。５−メチルシトシンヌクレオシドの合成を塩基性チミンの変換によって達成する。この目的のために、１，２，４−トリアゾールおよびＰＯＣｌ３で処理することにより、ヌクレオシド１１をＴＭＳで保護し、対応するトリアゾリドに変換される。このトリアゾリドをアンモニアおよび１，４−ジオキサンの混合物中でその後に処理することにより、対応する５−メチルシトシンヌクレオシドが生じ、これをＢｚ２Ｏで直接保護して、３工程で８８％の収率で１３を得る。ホスホルアミダイト１４を上記のホスフィチル化によって得る。
Figure 2021522862
 スキーム２：（ａ）ｉ）チミン、ＢＳＡ，ＮＩＳ、ＤＣＭ、室温、７時間、ｉｉ）Ｂｕ３ＳｎＨ、ＡＩＢＮ、トルエン、７０℃、３０分間、７３％、（ｂ）２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト、ＥＴＴ、ＤＣＭ、室温、３０分間、１２について７０％、１４について７５％、（ｃ）ｉ）ＢＳＡ、トリアゾール、ＰＯＣｌ３、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ３ＣＮ、室温、５時間、ｉｉ）１，４−ジオキサン／ＮＨ４ＯＨ、室温、２時間、ｉｉｉ）Ｂｚ２Ｏ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ、室温、２０時間、８８％。
プリン核酸塩基を導入するために古典的なＶｏｒｂｒｕｇｇｅｎヌクレオシド化を適用し、これにより、一般にα−ヌクレオシドが広く存在することとなる。前駆体７をＮ６−ベンゾイルアデニンまたは２−アミノ−６−クロロプリンのいずれかで変換することにより、それぞれ、分離不可能なアノマー混合物１５および２０が４：１および７：３のα／β比で生じる（スキーム３）。脱アセチル化後にアノマーの分離が可能であり、純粋なβ−アノマー１６および２１が生ずる。ここから、標準的なジメトキシトリチル化（→１７）、続いてシリル保護基のＴＢＡＦ媒介開裂（→１９）およびホスフィチル化によって、アデニンビルディングブロック１９を得る。グアニンビルディングブロックの合成には、２−アミノ−６−クロロプリン核酸塩基の変換が必要である。これは、２１を３−ヒドロキシプロピオニトリルおよびＴＢＤで処理し、その後に２−アミノ基をＤＭＦで保護することにより達成され、保護されたグアノシン誘導体２２を得る。上記と同じ化学的経路に従って、ジメトキシトリチル化（→２３）、続いてシリル保護基の除去（→２４）およびホスフィチル化によって、グアニンビルディングブロック２５の合成を達成する。
Figure 2021522862
 スキーム３：（ａ）Ｎ６−ベンゾイルアデニン、ＢＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、ＭｅＣＮ、７０℃、２０分間、６４％、（ｂ）ＮａＯＨ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、０℃、２０分間、６９％、（ｃ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温、２４時間、８７％、（ｄ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、４８時間、８７％、（ｅ）ＣＥＰ−Ｃｌ、ＤＩＰＥＡ、ＴＨＦ、室温、２時間、７１％、（ｆ）２−アミノ−６−クロロプリン、ＢＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、ＭｅＣＮ、５５℃、５０分間、７７％、（ｇ）ＮａＯＨ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、０℃、２０分間、８５％、（ｉ）ｉ）ＴＢＤ、３−ヒドロキシプロピオニトリル、ＤＣＭ、４８時間、ｉｉ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール、ＤＭＦ、５５℃、２時間、７３％、（ｊ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温、１８時間、７０％、（ｋ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、７時間、８７％、（ｌ）２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト、ＥＴＴ、ＤＣＭ、室温、５０分間、６９％。
保護された糖７から出発して、本発明の４つの好ましいホスホルアミダイトビルディングブロックの合成を開発する。糖７およびインサイチュのシリル化チミンの混合物をＴＭＳＯＴｆで処理ことにより、約８５：１５の好ましいアノマー比α／β（１Ｈ−ＮＭＲにより決定）を有するヌクレオシド３５が速やかに形成される（スキーム４）。５’位置にＤＭＴｒ基を有するチミジンホスホルアミダイトを生ずる化学的経路によって、標準的なクロマトグラフィーによりアノマーを分離することはできない。したがって、極性の反転による修飾をＤＮＡ鎖に導入するために、ＤＭＴｒ基を７’位に導入する。この目的のために、ＴＢＡＦでの短時間の処理（→３６）、続いて標準的なジメトキシトリチル化（→３７）によって、３５のシリル基を除去する。標準的な脱アセチル化の後、２つのアノマーの分離が可能となり、純粋なα−アノマー３８が生ずる。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールの存在下での２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイトによるホスフィチル化によって、チミジンビルディングブロック３９を最終的に得る。中間体３８はまた、インサイチュのＴＭＳ保護ヌクレオシド３８を、ＰＯＣｌ３および１，２，４−トリアゾールを用いて、対応するトリアゾリドに変換し、続いてアンモニアおよび１，４−ジオキサンの混合物で処理することにより、５−メチルシトシンヌクレオシドへの短いアクセスを提供する。ＤＭＦ中のＢｚ２Ｏによる直接的な保護により、ヌクレオシド４０が効率的に形成され、不安定なシリル保護基はプロセス中に切断される。上記の条件下での最終的なリン酸化により、５−メチルシチジンホスホルアミダイト４１が得られる。
Figure 2021522862
 スキーム４：（ａ）チミン、ＢＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、ＭｅＣＮ、室温、１８時間、８２％、（ｂ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、２時間、７５％、（ｃ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温、２４時間、９６％、（ｄ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ、３時間、８６％、（ｅ）２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト、ＥＴＴ、ＤＣＭ、室温、１時間、３９について８１％、３０分間、４１について８０％、ｆ）ｉ）ＢＳＡ、１，２，４−トリアゾール、ＰＯＣｌ３、Ｅｔ３Ｎ、ＭｅＣＮ、室温、７時間、ｉｉ）１，４−ジオキサン／ＮＨ４ＯＨ、室温、３時間、ｉｉｉ）Ｂｚ２Ｏ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ、室温、１８時間、８３％。
プリン核酸塩基の場合、プリンの導入は、Ｎ６−ベンゾイルアデニンまたは２−アミノ−６−クロロプリンのいずれかを用いた、わずかに高温における短いヌクレオシド化によって行い、それぞれ、４：１および７：３のα／β比のヌクレオシド１５および２０が生ずる（スキーム５）。アノマーを分離するために、穏やかな条件下でアセチル基を除去し、純粋なα−アノマー４２および４８を得る。アデノシンビルディングブロックの形成を、アセチル保護基の再導入（→４３）、ＴＢＡＦによるＴＢＤＰＳ保護基の除去（→４４）、続いて標準的なジメトキシトリチル化（→４５）を用いて継続する。アセチル基の選択的脱保護（→４６）、続いて上記の条件下でのリン酸化により、アデニンビルディングブロック４７が得られる。
グアニンビルディングブロックの場合、２つのアノマーを分離した後、ＴＢＤおよび３−ヒドロキシプロピオニトリルで処理することにより、６−クロロプリンをグアニン核酸塩基に変換し、グアノシンヌクレオシド４９を得る。４８時間にわたるアセチル化により、５’−ヒドロキシ基および２−アミノ基の同時保護が可能であり、保護されたヌクレオシド５０が得られる。上記と同様に、ＴＢＡＦによるシリル保護基の除去（→５１）、続いてジメトキシトリチル化（→５２）によって、ＤＭＴｒ基を導入する。２つのアセチル基をＫ２ＣＯ３で処理することにより除去し、得られた極性生成物をＤＭＦで直接保護し、グアノシンヌクレオシド５３を得る。最終的なリン酸化により、ビルディングブロック５４を得た。
Figure 2021522862
 スキーム５：ａ）Ｎ６−ベンゾイルアデニン、ＢＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、ＭｅＣＮ、７０℃、２０分、６４％、（ｂ）ＮａＯＨ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、０℃、２０分、５１％α−アノマー、１８％β−アノマー、（ｃ）Ａｃ２Ｏ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ、室温、１８時間、９０％、（ｄ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、３．５時間、９０％、（ｅ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温、２４時間、８９％、（ｆ）ＮａＯＨ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、０℃、３０分、９４％、（ｇ）２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピル−ホスホルジアミダイト、ＥＴＴ、ＤＣＭ、室温、１時間、４７について７７％、５０分、５４について６７％、（ｈ）２−アミノ−６−クロロプリン、ＢＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、ＭｅＣＮ、５５℃、５０分、７７％、（ｉ）ＮａＯＨ、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、０℃、２０分、８５％、（ｊ）ＴＢＤ、３−ヒドロキシプロピオニトリル、ＤＣＭ、４８時間、８７％（ｋ）Ａｃ２Ｏ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ、室温、４８時間、７６％、（ｌ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、４時間、８７％、（ｍ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温、４８時間、９９％、（ｎ）ｉ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ、室温、７時間、ｉｉ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール、ＤＭＦ、５５℃、２時間、７７％。
エチル（ＥおよびＺ、１’Ｒ，５’Ｓ，７’Ｒ）−（７’−ヒドロキシ−３’，３’−ジメチル−２’，４’−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクト−６’−イリデン）アセテート（２ａ／ｂ）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のエポキシド１（４．４６ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却する。次いで、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、２２．１ｍＬ、２２．１ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加する。溶液を−７８℃で２時間撹拌した後、室温に温め、１Ｍ ＨＣｌ水溶液（２２．１ｍＬ）を添加して中和する。次いで、混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、ＴＨＦを減圧下で除去する。次いで、混合物を０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（５０ｍＬ）で洗浄し、水相をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１）により精製して、２つの異性体２ａ／ｂ（３．３０ｇ、７４％）を淡黄色の固体として得る。
２ａのデータ：Ｒｆ＝０．３７（ＥｔｏＡｃ／ヘキサン１：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ６．０７−５．９８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、５．５９（ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．９４−４．８１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．６５（ｔ、Ｊ＝５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、４．１８（ｑ、Ｊ＝７．１ Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２）、２．６７（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、２．３７（ｄｄ、Ｊ＝１３．５、７．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．５５−１．４２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．４０、１．３３（２ｓ、６Ｈ、（ＣＨ３）２Ｃ）、１．２６（ｔ、Ｊ＝７．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ２ＣＨ３）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６５．７５（Ｃ（１））、１６１．６１（Ｃ（６’））、１１６．５３（Ｃ（２））、１１０．６９（Ｃ（３’））、７６．５５（Ｃ（５’））、７５．５２（Ｃ（１’））、７１．６３（Ｃ（７’））、６０．５１（ＣＨ２ＣＨ３）、３７．４６（Ｃ（８’））、２６．４４、２４．１１（（ＣＨ３）２Ｃ）、１４．２７（ＣＨ２ＣＨ３）．
Ｃ１２Ｈ１９Ｏ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値２４３．１２２７、実測値２４３．１２３１。
２ｂのデータ：Ｒｆ＝０．５２（ＥｔｏＡｃ／ヘキサン１：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ６．１５−６．０５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、５．３７−５．０２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’）、ＯＨ）、４．８７（ｄ、Ｊ＝３．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．６７（ｔ、Ｊ＝４．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、４．２０（ｑｄ、Ｊ＝７．１、０．９ Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２）、２．５５（ｄｄ、Ｊ＝１４．６、８．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．９４−１．７７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．３９−１．２５（ｍ、９Ｈ、（ＣＨ３）２Ｃ、ＣＨ２ＣＨ３）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６７．９１（Ｃ（１））、１６７．４３（Ｃ（６’））、１２０．１３（Ｃ（２））、１１１．７５（Ｃ（３’））、８１．６２（Ｃ（５’））、７８．０８（Ｃ（１’））、７０．８５（Ｃ（７’））、６１．２５（ＣＨ２ＣＨ３）、３６．５３（Ｃ（８’））、２７．３８、２５．４５（（ＣＨ３）２Ｃ）、１４．１９（ＣＨ２ＣＨ３）．
Ｃ１２Ｈ１９Ｏ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値２４３．１２２７、実測値２４３．１２２７。
エチル（１’Ｒ，５’Ｓ，６’Ｓ，７’Ｒ）−（７’−ヒドロキシ−３’，３’−ジメチル−２’，４’−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクト−６’−イル）アセテート（３）
Figure 2021522862
 ＥｔＯＨ（３００ｍＬ）中のアルコール２ａ／ｂ（１２．６５ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）および塩化ニッケル六水和物（２．４８ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（９．８８ｇ、２６１ｍｍｏｌ）を０℃で少しずつ添加する。得られた暗色の溶液を０℃で３０分間、室温で９０分間撹拌する。次いで、ＥｔＯＨを減圧下で注意深く除去し、得られた固体をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、過剰のＮａＢＨ４を０℃で水（１００ｍＬ）を添加してクエンチし、続いて室温で３０分間撹拌する。次いで、２つの相を分離する。有機相を水（１００ｍＬ）で洗浄する。次いで、水相を合わせ、濾過し、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮する。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：１）により精製して、３（１１．４ｇ、９０％）を白色固体として得る。
３のデータ：Ｒｆ＝０．４０（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ４．６５−４．５２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’）、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１５（ｑｄ、Ｊ＝７．１、１．４ Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ ）、４．０５（ｄｄｄ、Ｊ＝１０．０、９．９９、６．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．８６（ｂｒ、ｓ、１Ｈ、ＯＨ）、２．６５（ｑｄ、Ｊ＝１６．９、７．１ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、２．２４（ｄｄ、Ｊ＝１３．７、６．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．９３（ｄｔ、Ｊ＝１２．７、７．１ Ｈｚ、１Ｈ．Ｈ−Ｃ（６’））、１．５６（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．９、１０．２、５．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．３８（ｓ、３Ｈ、（ＣＨ３）２ Ｃ）、１．３０〜１．２１（ｍ、６Ｈ、（ＣＨ３）２Ｃ、ＣＨ２ＣＨ３）。
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７４．３８（Ｃ（１））、１０９．０６（Ｃ（３’））、７９．６５（Ｃ（５’））、７７．１９（Ｃ（１’）、７４．３２（Ｃ（７’）、６０．８０（ＣＨ２ＣＨ３）、４６．６６（Ｃ（６’））、４０．３８（Ｃ（８’））、３２．４３（Ｃ（２））、２６．００、２３．６９（（ＣＨ３）２Ｃ）、１４．１７（ＣＨ２ＣＨ３）．
Ｃ１２Ｈ２１Ｏ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値２４５．１３８４、実測値２４５．１３８８。
エチル（１’Ｒ，５’Ｓ，６’Ｓ，７’Ｒ）−（７’−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ）−３’，３’−ジメチル−２’，４’−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクト−６’−イル）アセテート（４）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のアルコール３（２．５０ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１２．６ｇ、１５３ｍｍｏｌ）、およびヨウ素（７．８０ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（３．０ｍＬ、１１．２ｍｍｏｌ）を室温（ｒｔ）で滴下して添加する。溶液を室温で３時間撹拌し、次いで、ＴＨＦを蒸発させ、混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、１０％Ｎａ２Ｏ３Ｓ２水溶液（２×４０ｍＬ）で洗浄する。次いで、水相を合わせ、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１０）により精製して、４（５．０１ｇ、定量的収率）を白色固体として得る。
４のデータ：Ｒｆ＝０．８７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ １０：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．７７−７．５９（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５１−７．３２（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、４．６１（ｔ、Ｊ＝５．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．４９（ｔ、Ｊ＝５．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．１５（ｑ、Ｊ＝６．９ Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２）、３．９６（ｄｄ、Ｊ＝１５．５、９．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．６４−２．３２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、２．１５（ｔｔ、Ｊ＝９．０、４．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．８３（ｄｄ、Ｊ＝１２．７、５．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．６１−１．４５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．２７（ｔｄ、Ｊ＝７．１、１．９ Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ２ＣＨ３）、１．１８（ｓ、６Ｈ、（ＣＨ３）２Ｃ）、１．０９、１．０８（２ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７３．０７（Ｃ（１））、１３５．８７、１３５．８５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３４．０８、１３３．７３（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．８０、１２９．７５、１２７．６７、１２７．５８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０８．８２（Ｃ（３’））、７７．９２（Ｃ（５’））、７６．９６（Ｃ（１’））、７４．９３（Ｃ（７’））、６０．２４（ＣＨ２ＣＨ３）、４７．２７（Ｃ（６’））、４０．２７（Ｃ（８’））、３１．１０（Ｃ（２））、２７．０４（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２５．８６（（ＣＨ３）２Ｃ）、２３．８３（（ＣＨ３）２Ｃ）、１９．２３（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１４．２４（ＣＨ２−ＣＨ３）．
Ｃ２８Ｈ３９Ｏ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４８３．２５６１、実測値４８３．２５６２。
（１’Ｒ，５’Ｓ，６’Ｓ，７’Ｒ）−（７’−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ）−３’，３’−ジメチル−２’，４’−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクト−６’−イル）アセトアルデヒド（５）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１２０ｍＬ）中のエステル４（８．５６ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃に冷却し、次いでＤｉＢＡＬ−Ｈ（シクロヘキサン中１Ｍ、１８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加する。溶液をさらに−７８℃で９０分間撹拌してから、室温に温める。０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（１００ｍＬ）を添加することにより、反応物をクエンチする。有機相を分離し、水相をさらにＤＣＭ（２Ｘ１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：１０〜２：１）によって精製して、アルデヒド５（６．３６ｇ、８９％）およびアルコール３４（０．６３７ｇ、９％）を得る。
５のデータ：Ｒｆ＝０．６５（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．７２（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１））、７．６５（ｔｄ、Ｊ＝８．０、１．６ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４７−７．３３（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、４．５７（ｔ、Ｊ＝５．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．５１（ｔ、Ｊ＝５．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、３．９９（ｔｄ、Ｊ＝１０．０、５．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．５８−２．４３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、２．２０−２．０８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．８７（ｄｄ、Ｊ＝１３．５、５．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．５３（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．５、１０．１、５．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８’））、１．１６（ｄ、Ｊ＝３．５ Ｈｚ、６Ｈ、（（ＣＨ３）２Ｃ）、１．０５（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ２０１．８７（Ｃ（１））、１３５．９３、１３５．９０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．９６、１３３．７３（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．９６、１２９．８９、１２７．７９、１２７．６８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０８．８９（Ｃ（３’））、７７．７６（Ｃ（５’））、７７．１７（Ｃ（１’））、７４．９６（Ｃ（７’）、４５．４４（Ｃ（６’））、４１．３１（Ｃ（２））、４０．１６（Ｃ（８’））、２７．０８（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２５．８７（（ＣＨ３）２Ｃ）、２３．７９（（ＣＨ３）２Ｃ）、１９．２５（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ２６Ｈ３５Ｏ４Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４３９．２２９９、実測値４３９．２２９７。
（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ）−２−メトキシヘキサヒドロ−２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−６−オール（６）
Figure 2021522862
 ＭｅＣＮ（１７０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１９ｍＬ）中のアルデヒド５（１３．７３ｇ、３１．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸インジウム（ＩＩＩ）（７０３ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加する。溶液をさらに４８時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去し、トルエンと共蒸発させる。残渣を乾燥ＭｅＯＨに溶解し、６時間撹拌する。溶媒を蒸発させた後、粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１０）により精製して、アノマー比α／β
Figure 2021522862
 ４：１の６（１０．５０ｇ、８１％）の混合物を無色の油状物として得る。
６のデータ：Ｒｆ＝０．５３（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．６３（ｄｄ、Ｊ＝７．１、０．６ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４６−７．３４（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、４．９８（ｄ、Ｊ＝４．８ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、４．９１（ｄｄ、Ｊ＝５．９、１．３ Ｈｚ、０．２ Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、４．６３−４．５４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６ａ））、４．５３−４．３７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、４．０９（ｍ、０．２ Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．９２（ｂｒ、０．８ Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．２９、３．２７（２ｓ、３ Ｈ、ＭｅＯ）、２．７９（ｄｄ、Ｊ＝１７．０、８．２ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、２．６４−２．５１（ｍ、０．２ Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、２．２９（ｄ、Ｊ＝８．１ Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、２．１０−１．８０（ｍ、２．４ Ｈ、Ｈ−Ｃ（３）、Ｈ−Ｃ（５））、１．６５（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．２、９．１、４．４ Ｈｚ、０．８ Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、１．４４−１．３４（ｍ、０．２ Ｈ、Ｈ−Ｃ（３））、１．２２（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．２、８．１、４．９ Ｈｚ、０．８ Ｈ、Ｈ−Ｃ（３））、１．０５（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １３５．７８、１３５．７４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．９６、１３３．８４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．７８、１２７．７２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０７．２１、１０６．５０（Ｃ（２））、８５．３７、８１．７６（Ｃ（６ａ））、７８．１１、７７．１９（Ｃ（４））、７３．０３、７２．４４（Ｃ（６））、５５．３０、５４．４６（ＭｅＯ）、５０．９１、４９．６７（Ｃ（３ａ））、４１．１３、４０．２９（Ｃ（３））、３８．１６、３７．９８（Ｃ（５））、２６．９６、２６．９２（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０７（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ２６Ｈ３５Ｏ４Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４３５．１９６２、実測値４３５．１９５０。
（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ）−２−メトキシヘキサヒドロ−２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−６−イルアセテート（７）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の糖６（３．３５ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（１．２９ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（３．８ｍＬ、４１ｍｍｏｌ）を室温で添加する。２時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）をゆっくりと添加することにより反応物をクエンチする。次いで、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：２）によって精製して、アノマー比α／β
Figure 2021522862
 ４：１の７（３．５３ｇ、９６％）の混合物を無色の油状物として得る。
７のデータ：Ｒｆ＝０．４２（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：２）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．７０−７．５９（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４８−７．３４（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．４１（ｄｔ、Ｊ＝１１．０、５．６ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、５．２８（ｄｄｄ、Ｊ＝１１．７、６．６、５．２ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、４．９９（ｄ、Ｊ＝４．８ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、４．８９−４．８１（ｍ、０．４Ｈ、Ｈ−Ｃ（２）、Ｈ−Ｃ（６ａ））、４．７６−４．６９（ｍ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（６ａ））、４．１１（ｄ、Ｊ＝５．１ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．９０（ｄ、Ｊ＝４．０ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．２７、３．２４（２ｓ、３Ｈ、ＭｅＯ）、２．８１（ｄｄ、Ｊ＝１６．６、７．６ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、２．６０（ｄｄ、Ｊ＝１０．１、７．０ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、２．３０−２．１８（ｍ、０．２ Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、２．１２、２．１０（２ｓ、Ｊ＝４．７ Ｈｚ、３Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０７−１．８２（ｍ、２．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（５）、Ｈ−Ｃ（３））、１．２４（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．９、７．６、３．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３））、１．０７（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．７５、１７０．６６（ＭｅＣＯ２）、１３５．７７、１３５．７３、１３５．７２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．７５、１３３．６５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．８２、１２９．７４、１２７．７６、１２７．７５、１２７．７１（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０６．１９、１０６．１５（Ｃ（２））、８３．１７、７９．８０（Ｃ（６ａ））、７７．４９、７６．４６（Ｃ（４））、７５．６４、７４．４１（Ｃ（６））、５４．３４、５４．２５（ＭｅＯ）、５１．４８、５０．１７（Ｃ（３ａ））、３８．０５、３７．９８（Ｃ（３））、３６．９６、３６．２１（Ｃ（５））、２６．９５、２６．９０（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２１．０９、２１．０４（ＭｅＣＯ２）、１９．０４（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ２６Ｈ３４Ｏ５ＮａＳｉ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４７７．２０６８、実測値４７７．２０６３。
（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−４−（（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ）−３ａ，５，６，６ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−６−オール（８）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（３５ｍＬ）中の糖６（２．０８ｇ、５．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、２，６−ルチジン（２．９５ｍＬ、２５．２ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。０℃で２０分間撹拌した後、ＴＭＳＯＴｆ（２．７３ｍＬ、１５．１ｍｍｏｌ）を滴下して加え、次いで、溶液を室温に温め、さらに６０分間撹拌する。次いで、飽和ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）を添加することにより反応物をクエンチする。有機相を分離し、水相をさらにＤＣＭ（３Ｘ３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
得られた生成物を乾燥ＴＨＦ（３５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、５．６ｍＬ、５．６ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を１０分間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：４）によって精製して、グリカル８（１．７６ｇ、９２％）を得る。
８のデータ：Ｒｆ＝０．４９（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：２）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．６６（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４２（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．２２（ｔ、Ｊ＝２．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、４．９１（ｄｄ、Ｊ＝８．２、５．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３））、４．７０（ｄｔ、Ｊ＝１１．１、５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、４．５６（ｔ、Ｊ＝２．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６ａ））、３．９７（ｄ、Ｊ＝４．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．２４（ｄ、Ｊ＝８．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、２．３０（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、２．０３（ｄｄ、Ｊ＝１２．６、５．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、１．５１（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．７、１１．２、４．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、１．０８（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４６．２４（Ｃ（２））、１３５．７２、１３５．６９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３４．０３、１３３．７４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．８０、１２９．７８、１２７．７３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０１．８４（Ｃ（３））、８４．５９（Ｃ（６ａ））、７６．７９（Ｃ（４））、７４．１０（Ｃ（６））、５５．５６（Ｃ（３ａ））、３９．３８（Ｃ（５））、２６．９３（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０８（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ２３Ｈ２９Ｏ３Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値３８１．１８８０、実測値３８１．１８９３。
（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３ａ，５，６，６ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−４−イル）オキシ）（ｔｅｒｔ−ブチル）ジフェニルシラン（９）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）および乾燥２，６−ルチジン（１５ｍＬ）の混合物中のグリカル８（１．３４ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）およびＤＭＴｒ−Ｃｌ（１．４３ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、銀トリフラート（１．１３ｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、濃赤色の懸濁液となる。室温で２時間撹拌した後、ＤＭＴｒ−Ｃｌの追加の部分（２３９ｍｇ、０．７０５ｍｍｏｌ）を添加する。懸濁液をさらに２時間撹拌し、次いで濾過する。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で洗浄し、水相をＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：７＋０．５％ Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、保護されたグリカル９（２．２４、９３％）を白色フォームとして得る。
９のデータ：Ｒｆ＝０．５９（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：２）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．７６（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．６９−７．６０（ｍ、Ｊ＝９．３、５．９、４．６ Ｈｚ、８Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５６−７．３９（ｍ、８Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３３（ｔ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．００−６．９３（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．４７−６．３７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、４．６７−４．５８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、４．５８−４．５０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３）、Ｈ−Ｃ（６ａ））、３．８６、３．８５（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ ）、３．８２（ｄ、Ｊ＝４．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．０８（ｄ、Ｊ＝８．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、１．６７（ｔｄ、Ｊ＝１２．４、４．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、１．２８（ｄｄ、Ｊ＝１２．７、５．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、１．１１（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．６７（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１４７．６１（Ｃ（２））、１４６．２６、１３７．３６、１３７．２１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．８１、１３５．７８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３４．１７、１３４．０４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．４８、１２９．８３、１２９．８１、１２８．３７、１２７．９８、１２７．７６、１２７．７３、１２６．７９、１１３．３２、１１３．２８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１００．２９（Ｃ（３））、８６．９６（Ｃ（Ｐｈ）３）、８４．９５（Ｃ（６ａ））、７６．１７（Ｃ（６））、７６．０７（Ｃ（４））、５５．２６（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５５．１１（Ｃ（３ａ））、３７．３２（Ｃ（５））、２７．０４（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．２１（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ４４Ｈ４６Ｏ５ＮａＳｉ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値７０５．３００７、実測値７０５．３０２１。
（３ａＳ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−６−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３ａ，５，６，６ａ−テトラヒドロ−４Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−４−オール（１０）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のグリカル９（２．２３ｇ、３．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、２０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を２０時間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×８０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中０．５％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１０（１．４５ｇ、定量的）を白色フォームとして得る。
１０のデータ：Ｒｆ＝０．４４（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．５３−７．４６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４３−７．３５（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２１（ｄｄ、Ｊ＝１０．７、５．３ Ｈｚ、２ Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．１６−７．０８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８０−６．７１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．３０（ｔ、Ｊ＝２．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、４．６８（ｔ、Ｊ＝２．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３））、４．２９−４．１４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６）、Ｈ−Ｃ（６ａ））、３．７１（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６５（ｄ、Ｊ＝３．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、２．８７（ｄ、Ｊ＝７．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、１．５９（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．２、１１．６、４．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、１．０５−０．９５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（５）、ＯＨ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．５４（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１４７．６４（Ｃ（２））、１４５．８２、１３７．１２、１３７．０８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．２６、１２８．２９、１２７．８１、１２６．７１、１１３．１３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１００．１７（Ｃ（３））、８６．７５（Ｃ（Ｐｈ）３）、８４．４２ Ｃ（６ａ））、７５．５４（Ｃ（６））、７４．５９（Ｃ（４））、５５．２２（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５４．２５（Ｃ（３ａ））、３７．５６（Ｃ（５））．
Ｃ３０Ｈ２７Ｏ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４６７．１８５３、実測値４６７．１８４４。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（１１）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（４５ｍＬ）中のグリカル１０（１．４５ｇ、３．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＳＡ（２．０ｍＬ、８．１８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加し、次いで、溶液を室温に温める。４５分間撹拌した後、チミン（５９５ｍｇ、４．９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに室温で６０分間撹拌する。次いで、混合物を０℃に冷却し、Ｎ−ヨードスクシンイミド（８７５ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）を添加する。０℃で３時間および室温で４時間撹拌した後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、続いて、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）の１０％水溶液で洗浄する。水相を合わせ、ＤＣＭ（３Ｘ５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
粗生成物を乾燥トルエン（４５ｍＬ）に溶解し、次いで、Ｂｕ３ＳｎＨ（１．３２ｍＬ、４．９１ｍｍｏｌ）およびアゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、５３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を室温で添加する。７０℃で３０分間加熱した後、混合物を室温まで冷却し、ＴＢＡＦを添加する（ＴＨＦ中１Ｍ、６．５ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）。溶液をさらに２５分間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×７０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１１（１．４５ｇ、２工程で７３％）を白色フォームとして得る。
１１のデータ：Ｒｆ＝０．２９（ＤＣＭ中６％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．３７（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．８３（ｄ、Ｊ＝１．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．５８−７．５２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４８−７．４１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２８（ｔ、Ｊ＝７．７ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２１（ｔ、Ｊ＝７．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８４（ｄｄ、Ｊ＝８．９、１．２ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９１（ｄｄ、Ｊ＝８．０、５．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．２５（ｄｔ、Ｊ＝１０．８、６．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１３−４．０８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．８６（ｄ、Ｊ＝３．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’）、３．７９（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．７０（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．８、１０．２、５．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．６１（ｄｄ、Ｊ＝１６．９、８．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、１．８４（ｄ、Ｊ＝０．８ Ｈｚ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．８０（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、１．６０（ｄｄｄ、Ｊ＝１４．２、１０．５、４．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．３３（ｄｔ、Ｊ＝１２．９、８．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．１４（ｄｄ、Ｊ＝１３．７、６．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．１７（Ｃ（４））、１５８．６４（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５０．４７（Ｃ（２））、１４５．６５、１３６．８５、１３６．７１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．５２（Ｃ（６））、１３０．２０、１２８．１２、１２７．９１、１２６．９０、１１３．２２、１１３．２１（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１０．６９（Ｃ（５））、８７．２１（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．５７（Ｃ（１’））、８２．０２（Ｃ（４’））、７４．１９（Ｃ（５’））、７４．１３（Ｃ（７’））、５５．２５（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．４０（Ｃ（３’））、３８．５１（Ｃ（６’））、３７．６４（Ｃ（２’））、１２．５８（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ３３Ｈ３４Ｏ７Ｎ２Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５９３．２２５８、実測値５９３．２２５０。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛７’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（１２）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のヌクレオシド１１（２３２ｍｇ、０．４０６ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（９０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．２６ｍＬ、０．８１ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。３０分間撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２Ｘ３０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３０ｍＬ）で洗浄する。水相を合わせ、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中１．８％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１２（２１９ｍｇ、２つの異性体の混合物、７０％）を白色フォームとして得る。
１１のデータ：Ｒｆ＝０．６８（ＤＣＭ中６％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．９３（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．８５（ｄ、Ｊ＝１．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．６５−７．５２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５２−７．４０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４０−７．２１（ｍ、３Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．９６−６．８１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．００、５．９４（２ｄｄ、Ｊ＝８．３、５．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．２９−４．１７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１２−３．８９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’）、Ｈ−Ｃ（７’））、３．８５、３．８４（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．８１−３．６３（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５６−３．４１（ｍ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２．８８−２．６９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’）、Ｈ−Ｃ（２’））、２．６１、２．５６（ｄｔ、Ｊ＝１２、９ ６．３ Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１．９２、１．８２（２ｄ、Ｊ＝０．８ Ｈｚ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．７５−１．５６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．５２−１．３６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．２２−１．０１（ｍ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６３．８６（Ｃ（４））、１５８．６６、１５８．６４（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５０．２９、１５０．２７（Ｃ（２））、１４５．５８、１４５．５２、１３６．７６、１３６．７１、１３６．６９、１３６．６０（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．４９、１３５．３５（Ｃ（６））、１３０．２１、１３０．１６、１２８．１７、１２８．１３、１２７．８８、１２６．９１、１２６．８９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１７．４９（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．１８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１０．７４（Ｃ（５））、８７．２７、８７．２５（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．５８、８６．４５（Ｃ（１’））、８１．７９、８１．６８（Ｃ（４’））、７６．０２、７５．５０（ＪＣ、Ｐ＝１６．５、１５．７ Ｈｚ、Ｃ（７’））、７４．２２（Ｃ（５’））、５８．２６、５８．０６、５７．８７（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、５５．２６、５５．２２（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４８．８５、４８．６２（ＪＣ、Ｐ＝２．６、５．０ Ｈｚ、Ｃ（３’））、４３．１０、４３．０４（ＪＣ、Ｐ＝１２．３、１２．４ Ｈｚ（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３７．７８（ＪＣ、Ｐ＝５．３ Ｈｚ Ｃ（６’））、３７．６２、３７．４８（Ｃ（２’））、３７．４１（ＪＣ、Ｐ＝３．６ Ｈｚ Ｃ（６’））、２４．５７、２４．５３、２４．５０、２４．４６、２４．４４、２４．３９、２４．３７（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３５、２０．２５（ＪＣ、Ｐ＝７．１、７．０ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１２．５８、１２．４１（７ｓ、Ｍｅ−Ｃ（５））．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４７．３２、１４６．９８．
Ｃ４２Ｈ５２Ｏ８Ｎ４Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値７７１．３５１７、実測値７７１．３５１２。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ４−ベンゾイル−１−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−５’−Ｏ−［（４ ４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝−５−メチルシトシン（１３）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＣＮ（５ｍＬ）中のヌクレオシド１１（３０２ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＳＡ（０．３１ｍＬ、１．２７ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加し、次いで、溶液を室温で一晩撹拌する。別のフラスコ中で、乾燥ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）中の１，２，４−トリアゾール（１．２８ｇ、１８．５５ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃に冷却し、ＰＯＣｌ３（０．４０ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２．９６ｍＬ、２１．２ｍｍｏｌ）を添加する。懸濁液を０℃で３０分間撹拌し、次いで、事前に調製したシリル化化合物１１の溶液を懸濁液に添加し、混合物をさらに室温で５時間撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）を添加することにより反応物をクエンチし、ＭｅＣＮを減圧下で除去し、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（３５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
次いで、粗生成物を１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）および濃ＮＨ４ＯＨ（１０ｍＬ）の混合物に溶解する。室温で２時間撹拌した後、混合物を真空中で体積の半分に減少させ、飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
次いで、粗生成物を乾燥ＤＭＦ（１３ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（９０μＬ、０．６４ｍｍｏｌ）、続いてＢｚ２Ｏ（３００ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）を室温で添加し、溶液を一晩撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）を注意深く添加することにより、得られた褐色溶液をクエンチし、ＤＣＭ（４×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：２、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１３（３１５ｍｇ、８８％）を白色フォームとして得る。
１３のデータ：Ｒｆ＝０．５７（ＤＣＭ中４％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １３．３９（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．４６−８．２６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、８．１３（ｄ、Ｊ＝０．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（６））、７．６１（ｄ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５８−７．４３（ｍ、７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３４（ｔ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３０−７．２３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８９（ｄ、Ｊ＝８．８ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９６（ｄｄ、Ｊ＝７．５、５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．３８−４．２５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．２２−４．１２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．９０（ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．８３（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．８２（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．３、１０．２、５．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．６６（ｄｄ、Ｊ＝１７．０、８．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．０８（ｓ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．７７（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、１．７１−１．５７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．４９−１．３６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．２１（ｄｄ、Ｊ＝１３．７、６．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７９．５６（ＣＯＮＨ）、１６０．０１（Ｃ（４））、１５８．７０（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１４７．９６（Ｃ（２））、１４５．６５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３７．２６（Ｃ（６））、１３６．９９、１３６．８３、１３６．７１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．４１、１３０．２２、１２９．８９、１２８．１６、１２８．１４、１２７．９５、１２６．９４、１１３．２５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．５７（Ｃ（５））、８７．３４（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．３２（Ｃ（１’））、８２．５７（Ｃ（４’））、７４．３０（Ｃ（５’））、７４．１６（Ｃ（７’））、５５．２７（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．５６（Ｃ（３’））、３８．５２（Ｃ（６’））、３８．００（Ｃ（２’））、１３．６３（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ４０Ｈ４０Ｏ７Ｎ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６７４．２８６１、実測値６７４．２８６２。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ４−ベンゾイル−１−｛７’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝−５−メチルシトシン（１４）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のヌクレオシド１３（２７６ｍｇ、０．４０９ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（６９ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．２０ｍＬ、０．６１ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。６０分間撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２Ｘ３０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３０ｍＬ）で洗浄する。水相を合わせ、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：３、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１４（２６８ｍｇ、２つの異性体の混合物、７５％）を白色フォームとして得る。
１４のデータ：Ｒｆ＝０．７７（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １３．３２（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．４１−８．２８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、８．１３−８．０４（ｍ、１Ｈ、Ｃ（６））、７．６１−７．５１（ｍ、３Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５１−７．４０（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３７−７．２９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２９−７．２０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．９２−６．８２（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０７−５．８７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．２４（ｄｑ、Ｊ＝１１．７、５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１３−４．００（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．９４（ｄｄｄ、Ｊ＝１４．５、１０．５、２．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．８３、３．８２（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６９（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５３−３．４０（ｍ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２．９１−２．７０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（３’））、２．５７、２．５３（２ｔ、Ｊ＝６．３ Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、２．０８、１．９９（２ｄ、Ｊ＝０．６ Ｈｚ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．７２−１．５６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．５４−１．３６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．１０（ｍ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７９．５４（ＣＯＮＨ）、１５９．９８（Ｃ（４））、１５８．６９（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１４７．９０（Ｃ（２））、１４５．５８、１４５．５４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３７．３０、１３６．９３（Ｃ（６））、１３６．８１、１３６．８０、１３６．７３、１３６．７０、１３６．６７、１３６．６０（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．３７、１３２．３５、１３０．２２、１３０．１７、１２９．８９、１２８．１７、１２８．１５、１２８．１１、１２７．９３、１２６．９４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１７．４９（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．２３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．６０（Ｃ（５））、８７．３６、８７．３５（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．３３、８７．２５（Ｃ（１’））、８２．３３、８２．２５（Ｃ（４’））、７６．０５、７５．５２（ＪＣ、Ｐ＝１６．４、１５．６ Ｈｚ、Ｃ（７’））、７４．３２（Ｃ（５’））、５８．１８、５７．９８（ＪＣ、Ｐ＝１９．５ Ｈｚ ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、５５．２８、５５．２４（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４８．９３、４８．７２（ＪＣ、Ｐ＝２．７、４．９ Ｈｚ、Ｃ（３’））、４３．１１、４３．０５（ＪＣ、Ｐ＝１２．４ Ｈｚ（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３８．０２、３７．８８（Ｃ（２’））、３７．７４、３７．４０（ＪＣ、Ｐ＝５．３、３．４ Ｈｚ、Ｃ（６’））、２４．５８、２４．５４、２４．５０、２４．４７、２４．４０、２４．３８（６ｓ、Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３６、２０．２６（ＪＣ、Ｐ＝７．１ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、）、１３．６６、１３．４９（Ｍｅ−Ｃ（５））．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４７．３７、１４７．０７．
Ｃ４９Ｈ５７Ｏ８Ｎ５Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８７４．３９３９、実測値８７４．３９３７。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛５’−Ｏ−アセチル−７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α，β−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（１５）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＣＮ（４０ｍＬ）中の糖７（１．８６ｇ、４．１０ｍｍｏｌ）およびＮ６−ベンゾイルアデニン（１．９６ｇ、８．２０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＢＳＡ（４．００ｍＬ、１６．４ｍｍｏｌ）を室温で添加する。２５分間撹拌した後、懸濁液は透明な溶液になり、次いで、７０℃に加熱する。ＴＭＳＯＴｆ（１．４８ｍＬ、８．２０ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、溶液をさらに７０℃で２０分間撹拌する。次いで、溶液を室温に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）を添加してクエンチし、ＥｔＯＡｃ（４×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ）によって精製して、アノマー比α／β
Figure 2021522862
 ４：１の１５（１．７４ｇ、６４％）の混合物を白色フォームとして得る。
１５のデータ：Ｒｆ＝０．３３（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン４：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．３３（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．６８（ｄ、Ｊ＝５．４ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．６４（ｄ、Ｊ＝５．６ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．１０（ｄ、Ｊ＝１．５ Ｈｚ、０．２Ｈ．Ｈ−Ｃ（８））、７．９９（ｄＪ＝７．３ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．９５（ｓ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６３（ｔ、Ｊ＝８．７ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５５（ｄｄ、Ｊ＝１３．０、６．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５０−７．３４（ｍ、８Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．２０（ｄｄ、Ｊ＝６．３、２．５ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、６．０５（ｔ、Ｊ＝６．５ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．４３−５．３２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、５．０３−４．９７（ｍ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．８３（ｔ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．１４（ｂｒ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、４．０８（ｄ、Ｊ＝３．７ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．０２（ｄｄ、Ｊ＝１６．１、６．６ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．８３（ｄｄ、Ｊ＝１６．９、７．７ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．５９−２．３９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１８−２．１１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．０７（ｄ、Ｊ＝１．６ Ｈｚ、２．４Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０２（ｄ、Ｊ＝１．９ Ｈｚ、０．６Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０１−１．９２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．９１−１．８０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、１．０７（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．５７、１７０．４９（ＭｅＣＯ２）、１６４．８２（ＣＯＮＨ）、１５２．５０（Ｃ（２））、１５１．２７（Ｃ（４））、１４９．５６（Ｃ（６））、１４１．３７、１４１．０６（Ｃ（８））、１３５．７２、１３５．６８、１３５．６６（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．６７、１３３．５７、１３３．２４、１３３．２２（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．７３、１３０．０３、１２９．９８、１２８．８０、１２８．７８、１２７．９２、１２７．８６、１２７．８５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．６１（Ｃ（５））、８７．１９、８６．１７（Ｃ（１’））、８３．２２、８０．９６（Ｃ（４’）、７６．５０、７６．０４（Ｃ（７’））、７４．３８（Ｃ（５’））、５１．０７（Ｃ（３’））、３７．２９、３７．１５、３６．８０、３６．６０（Ｃ（２’）、Ｃ（６’））、２６．８９（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２０．９７、２０．９０（ＭｅＣＯ２）、１９．０１（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３７Ｈ４０Ｏ５Ｎ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６６２．２７９３、実測値６６２．２７８７。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−β−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（１６）：
Figure 2021522862
 ヌクレオシド１５（１．７４ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：４：１、８０ｍＬ）中の０．１５Ｍ ＮａＯＨに０℃で溶解する。反応物を２０分間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌ（１．０６ｇ）を添加することによりクエンチする。次いで、溶媒を減圧下で除去し、生成物をＣＣ（ＤＣＭ中５％イソプロパノール）によって精製して、１６（２８７ｍｇ、１８％）およびその対応するαアノマー（８３６ｍｇ、５１％）の白色フォームを得る。
１６のデータ：Ｒｆ＝０．４４（ＤＣＭ中６％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．７０（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．０９−７．９８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．９７（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６３（ｄｄｄ、Ｊ＝７．４、５．７、１．５ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５９−７．５５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４４−７．３３（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０２（ｄｄ、Ｊ＝９．４、５．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．５７（ｄｄ、Ｊ＝８．１、５．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４３（ｄｄ、Ｊ＝１１．８、５．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．２６（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．７８（ｑ、Ｊ＝８．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．３２−１．８０（ｍ、５Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’）、ＯＨ）、１．０６（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．８５（ＣＯＮＨ）、１５２．５６（Ｃ（２））、１５１．１７（Ｃ（４））、１４９．８６（Ｃ（６））、１４１．２５（Ｃ（８））、１３５．６８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．８７、１３３．３９（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．７８、１２９．９２、１２８．７８、１２８．０１、１２７．７８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．５１（Ｃ（５））、８７．６５（Ｃ（１’））、８２．９１（Ｃ（４’））、７６．６６（Ｃ（７’））、７２．５４（Ｃ（５’））、５０．４４（Ｃ（３’））、４１．４２（Ｃ（６’））、３６．１７（Ｃ（２’））、２６．８９（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０３（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３５Ｈ３８Ｏ４Ｎ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６２０．２６８８、実測値６２０．２６７１。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（１７）
Figure 2021522862
 乾燥ピリジン（６ｍＬ）中のヌクレオシド１６（３０７ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（５０３ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を１日間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×７０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中１．５％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１７（３９５ｍｇ、８７％）を黄色フォームとして得る。
１７のデータ：Ｒｆ＝０．６５（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ ８．６４（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．６１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、８．０８（ｄ、Ｊ＝７．２ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．６８−７．１７（ｍ、２２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８６−６．７５（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．１４（ｄｄ、Ｊ＝７．４、６．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．４８−４．３１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．２８−４．１５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．８８（ｄ、Ｊ＝３．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．７５、３．７４（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．６７（ｄｄ、Ｊ＝１６．６、６．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．４７（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．３、１０．２、６．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１５−１．９４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．７１（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．０、１１．３、４．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．１１（ｄｄ、Ｊ＝１２．２、４．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、０．９５（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．６９（ＣＯＮＨ）、１５８．６１、１５８．６０（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５２．４２（Ｃ（２））、１５１．２７（Ｃ（４））、１４９．４１（Ｃ（６））、１４５．８１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４１．２５（Ｃ（８））、１３７．００、１３６．８５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．６０、１３５．５７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．８０、１３３．６９、１３３．４３（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．７０、１３０．２８、１３０．２５、１２９．８５、１２９．８１、１２８．８４、１２８．１８、１２７．８９、１２７．７１、１２７．６５、１２６．７８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．５２（Ｃ（５））、１１３．２２、１１３．１９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．０９（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．４１（Ｃ（１’））、８３．５２（Ｃ（４’））、７６．０５（Ｃ（７’））、７４．７８（Ｃ（５’））、５５．２０（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５０．４３（Ｃ（３’））、３８．１０（Ｃ（２’）、Ｃ（６’））、２６．８４（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．００（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ５６Ｈ５６Ｏ６Ｎ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値９２２．３９９４、実測値９２２．３９５３。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（１８）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（９ｍＬ）中のヌクレオシド１７（３７６ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、１．２２ｍＬ、１．２２ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を２日間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×２５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中４％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１８（２４２ｍｇ、８７％）を白色フォームとして得る。
１８のデータ：Ｒｆ＝０．３３（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）δ ９．３５（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．６７（ｓ、１Ｈ、Ｃ（２））、８．４６（ｓ、１Ｈ、Ｃ（８））、８．０１（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５４（ｍ、５Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３５（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３０−７．１７（ｍ、３Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８４（ｄ、Ｊ＝８．９ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０９（ｄｄ、Ｊ＝７．８、６．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．１２（ｄｔ、Ｊ＝１１．２、５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（５’））、３．８７−３．７９（ｍ、２Ｈ、Ｃ（４’）、Ｃ（７’））、３．７５（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．８３−２．６４（ｍ、２Ｈ、Ｃ（２’）、ＯＨ）、２．５８−２．４６（ｍ、１Ｈ、Ｃ（３’））、２．２１（ｄｄ、Ｊ＝１３．９、７．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（２’））、１．９２−１．８２（ｍ、１Ｈ、Ｃ（６’））、１．２９−１．１７（ｍ、１Ｈ、Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６５．０３（ＣＯＮＨ）、１５８．５７（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５２．４０（Ｃ（２））、１５１．２３（Ｃ（４））、１４９．５２（Ｃ（６））、１４５．６８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４１．４９（Ｃ（８））、１３６．８６、１３６．８４、１３３．７７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．７７、１３０．２２、１２８．８１、１２８．１６、１２８．０２、１２７．８９、１２６．８４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．４０（Ｃ（５））、１１３．１９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．０６（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．７４（Ｃ（１’））、８３．５８（Ｃ（４’））、７４．６２（Ｃ（５’））、７４．３８（Ｃ（８’））、５５．２５（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．７７（Ｃ（３’））、３８．５５、３８．３２（Ｃ（６’）、Ｃ（２’））．
Ｃ４０Ｈ３８Ｏ６Ｎ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６８４．２８１７、実測値６８４．２８３０。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛７’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（１９）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（８ｍＬ）中のヌクレオシド１８（１７３ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．１１ｍＬ、０．５０ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を２時間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、１９（１７７ｍｇ、２つの異性体の混合物、７１％）を白色フォームとして得る。
１９のデータ：Ｒｆ＝０．３８、０．４４（ＥｔＯＡｃ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．０５（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７０、８．７０（２ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．４７、８．４６（２ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．９７（ｄ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５７−７．５０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４９−７．４１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３９−７．３１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２４−７．１７（ｍ、５．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．１３（ｄｔ、Ｊ＝１２．５、６．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８３−６．７０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．１４−５．９７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．１４（ｄｄｄ、Ｊ＝１１．１、７．８、３．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．９１−３．７４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−（４’）、Ｈ−Ｃ（７’））、３．７１、３．７０（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６５−３．５０（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．３７（ｄｄｑ、Ｊ＝１３．９、１０．２、６．８ Ｈｚ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２．９０−２．７６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．７５−２．６０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．４７、２．４２（２ｔ、Ｊ＝６．３ Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、２．１１（ｄｔ、Ｊ＝１２．７、６．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．７３（ｄｄｔ、Ｊ＝１３．６、１０．４、５．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．３９（ｄｄｄ、Ｊ＝５０．２、１３．４、６．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．１０−０．８９（ｍ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．６６（ＣＯＮＨ）、１５８．５７（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５２．４６（Ｃ（２））、１５１．３２、１５１．２６（Ｃ（４））、１４９．４５、１４９．４３（Ｃ（６））、１４５．６０、１４５．５９（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４１．５２、１４１．４７（Ｃ（８））、１３６．８８、１３６．８３、１３６．８１、１３３．７８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．７５、１３２．７３、１３０．２２、１３０．２１、１３０．１９、１３０．１７、１２８．８７、１２８．１７、１２７．８７、１２６．８２、１２６．８０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．５９（Ｃ（５））、１１７．５３、１１７．５０（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．１７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．１０、８７．０７（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．７２、８６．６８（Ｃ（１’））、８３．３６、８３．２５（Ｃ（４’））、７６．５５、７５．８１（ＪＣ、Ｐ＝１６．９、１５．７ Ｈｚ、Ｃ（７’））、７４．６３、７４．６０（Ｃ（５’））、５８．２４、５７．８６（ＪＣ、Ｐ＝１９．１、１９．２ Ｈｚ ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、５５．２５、５５．２１（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．２９、４９．０８（ＪＣ、Ｐ＝２．６、４．７ Ｈｚ、Ｃ（３’））、４３．１２、４３．００（ＪＣ、Ｐ＝２．４、２．３ Ｈｚ（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３８．２７、３８．２３（Ｃ（２’））、３７．４１、３７．２２（ＪＣ、Ｐ＝５．３、３．５ Ｈｚ、Ｃ（６’））２４．５６、２４．５３、２４．４９、２４．４７、２４．４３、２４．４１、２４．３６、２４．３３（８ｓ、Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３６、２０．２５（ＪＣ、Ｐ＝７．２、７．０ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４７．６４、１４６．８７．
Ｃ４９Ｈ５５Ｏ７Ｎ７（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８８４．３８９５、実測値８８４．３８９８。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−２−アミノ−６−クロロ−９−｛５’−Ｏ−アセチル−７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α，β−Ｄ−リボフラノシル｝プリン（２０）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）中の糖７（１．７５ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）および２−アミノ−６−クロロプリン（１．０５ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＢＳＡ（３．８０ｍＬ、１５．４ｍｍｏｌ）を室温で添加する。懸濁液を５５℃に加熱し、３０分間撹拌する。次いで、ＴＭＳＯＴｆ（１．０５ｍＬ、５．７８ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、溶液を５５℃でさらに５０分間撹拌する。溶液を室温に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）を添加してクエンチし、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、ＳｉＯ２のショートパッドを通して濾過する。ＳｉＯ２を追加のＥｔＯＡｃで洗浄した。次いで、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２×８０ｍＬ）で洗浄し、水相を合わせ、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２．５％ＭｅＯＨ）によって精製して、アノマー比α／β
Figure 2021522862
 ７：３の２０（１．７７ｇ、７７％）の混合物を白色フォームとして得る。
２０のデータ：Ｒｆ＝０．５４（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン５：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．８６（ｓ、０．３Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６９（ｓ、０．７Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６８−７．６０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４７−７．３４（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０４（ｄｄ、Ｊ＝６．９、３．０ Ｈｚ、０．７Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．８７（ｄｄ、Ｊ＝８．０、６．２ Ｈｚ、０．３Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．３７（ｄｔ、Ｊ＝１４．２、４．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、５．１６（ｂｒ、２Ｈ、ＮＨ２）、４．９１（ｄｄ、Ｊ＝６．５、５．１ Ｈｚ、０．７Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．７９（ｄｄ、Ｊ＝６．９、５．２ Ｈｚ、０．３Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．１３（ｂｒ、０．３Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、４．０６（ｄ、Ｊ＝４．０ Ｈｚ、０．７Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．９５（ｄｄ、Ｊ＝１６．３、６．６ Ｈｚ、０．７Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．８１（ｄｄ、Ｊ＝１７．０、７．４ Ｈｚ、０．３Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．４９−２．３０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１４（ｄｄ、Ｊ＝１３．１、６．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．０８（ｓ、２．１Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０２（ｓ、０．９Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０２−１．９１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．８０（ｔｄ、Ｊ＝１３．４、６．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．０７、１．０６（２ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．５５、１７０．４４（ＭｅＣＯ２）、１５８．９８、１５８．９１（Ｃ（２））、１５３．１８、１５２．９５（Ｃ（４））、１５１．４０、１５１．３４（Ｃ（６））、１４０．３８、１４０．１４（Ｃ（８））、１３５．７３、１３５．７０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．７８、１３３．６２、１３３．２４、１３３．１７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．０３、１３０．００、１２７．８８、１２７．８６（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２５．６５、１２５．５７（Ｃ（５））、８６．５９、８５．７４（Ｃ（１’））、８２．９３、８０．９９（Ｃ（４’））、７６．５７、７６．１４（Ｃ（７’））、７４．３４、７４．３２（Ｃ（５’））、５１．１５、５１．１０（Ｃ（３’））、３７．１９、３６．９９（Ｃ（６’））、３６．７０、３６．２５（Ｃ（２’））、２６．８７（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２０．９５、２０．８６（ＭｅＣＯ２）、１９．００（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３０Ｈ３５Ｏ４Ｎ５ＣｌＳｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５９２．２１４１、実測値５９２．２１５８。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−２−アミノ−６−クロロ−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−β−Ｄ−リボフラノシル｝プリン（２２ｂ）
Figure 2021522862
 ヌクレオシド２０（１．７８ｇ、３．０１ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：４：１、１５ｍＬ）中の０．５Ｍ ＮａＯＨに０℃で溶解する。反応物を０℃で２０分間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌ（４８４ｍｇ）の添加によりクエンチする。次いで、懸濁液を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×７５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨ）によって精製して、２１（４２８ｍｇ、２５％）およびその対応するαアノマー（９９２ｍｇ、６０％）を白色フォームとして得る。
２１のデータ：Ｒｆ＝０．４３（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．７１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６８−７．６０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４４−７．３３（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．８５（ｄｄ、Ｊ＝９．３、５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．３３（ｂｒ、２Ｈ、ＮＨ２）、４．６２（ｄｄ、Ｊ＝８．４、４．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４４（ｄｄ、Ｊ＝１０．７、５．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．４０−４．１５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’）、ＯＨ）、２．７９（ｑ、Ｊ＝８．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．２２（ｄｄ、Ｊ＝１５．２、９．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．１１−２．０２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．０２−１．８５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．０６（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．７３（Ｃ（２））、１５２．７８（Ｃ（４））、１５１．９４（Ｃ（６））、１４０．７０（Ｃ（８））、１３５．７０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．９１、１３３．４８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．９０、１２７．７８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２５．９７（Ｃ（５））、８７．９６（Ｃ（１’））、８２．８８（Ｃ（５’））、７６．８５（Ｃ（７’））、７２．３６（Ｃ（５’））、５０．４１（Ｃ（３’））、４１．９６（Ｃ（６’））、３５．７３（Ｃ（２’））、２６．９０（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０２（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ２８Ｈ３３Ｏ３Ｎ５ＣｌＳｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５５０．２０３６、実測値５５０．２０１５。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−β−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（２２）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の２１（３８０ｍｇ、０．６４５ｍｍｏｌ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．２２ｍＬ、３．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デス−５−エン（４００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。溶液を０℃で３時間撹拌し、次いで室温で２日間撹拌する。シリカを添加することにより反応を停止させる。溶媒を蒸発させた後、ＳｉＯ２粉末を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を蒸発させて、褐色フォームを得る。
粗生成物を乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（０．４３ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を５５℃で２時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去する。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中６％ＭｅＯＨ）によって精製して、２３（２７４ｍｇ、７３％）を黄色がかったフォームとして得る。
２２のデータ：Ｒｆ＝０．４５（ＤＣＭ中１２％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．５２（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．４６（ｓ、１Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、７．６３（ｄｄ、Ｊ＝７．７、１．５ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５０（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．４４−７．３０（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．８３（ｄｄ、Ｊ＝９．３、６．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．６１（ｄｄ、Ｊ＝８．７、５．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４３−４．３２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．２９（ｄｄ、Ｊ＝７．０、４．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．９５（ｄ、Ｊ＝５．１ Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、２．９８（ｓ、６Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．７９（ｄｄ、Ｊ＝１８．０、７．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．２０（ｄｔ、Ｊ＝１２．８、５．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．０９−１．８８（ｍ、３Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．０５（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．７３（Ｃ（２））、１５７．７９（Ｃ（６））、１５６．９１（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、１４９．８４（Ｃ（４））、１３７．００（Ｃ（８））、１３５．７０、１３５．６７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．７８、１３３．６０（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．９３、１２９．８６、１２７．７８、１２７．７２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２１．６１（Ｃ（５））、８８．０４（Ｃ（１’））、８２．２１（Ｃ（４’））、７７．４９（Ｃ（７’））、７１．９４（Ｃ（５’））、５０．１３（Ｃ（３’））、４２．２３（Ｃ（６’））、４１．２０（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３５．５０（Ｃ（２’））、３４．９７（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２６．８７（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０２（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３１Ｈ３８Ｏ４Ｎ６Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５８６．２７１８、実測値５８６．２７０３。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（２３）
Figure 2021522862
 乾燥ピリジン（２ｍＬ）中の２２（１３９ｍｇ、０．２３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（２４０ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）を室温で３時間にわたって６回に分けて添加する。一晩撹拌した後、オレンジ色の溶液を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中４％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、２３（１４８ｍｇ、７０％）を黄色がかったフォームとして得る。
２３のデータ：Ｒｆ＝０．５２（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．４９（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．３８（ｓ、１Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、７．８０（ｓ、１Ｈ、Ｃ（８））、７．５０−７．４３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４２−７．２７（ｍ、１０Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２６−７．１５（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．１４−７．０８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．７７−６．６８（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．７８（ｄｄ、Ｊ＝８．２、５．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．２５（ｄｔ、Ｊ＝１１．０、５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１４−４．０３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．７０−３．６４（ｍ、７Ｈ、ＭｅＯ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．００（ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．９７（ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．４３（ｄｄ、Ｊ＝１６．７、７．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．２４（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．３、１０．１、５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．６２（ｔｄ、Ｊ＝１３．１、４．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．４３（ｄｔ、Ｊ＝１３．５、８．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、０．９９（ｄｄ、Ｊ＝１３．３、６．２ Ｈｚ、１Ｈ）、０．８６（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ））．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．５１、１５８．４９（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５８．０４（Ｃ（２））、１５７．９１（Ｃ（６））、１５６．６０（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、１４９．７６（Ｃ（４））、１４５．８３、１３７．１２、１３６．９４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３６．０１（Ｃ（８））、１３５．６０、１３５．５９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．８１、１３３．４７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．３２、１３０．２６、１２９．７７、１２８．２４、１２７．８２、１２７．６５、１２７．６２、１２６．６７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２０．６５（Ｃ（５））、１１３．１３、１１３．０９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８６．８２（Ｃ（Ｐｈ）３）、８５．０１（Ｃ（１’））、８２．２６（Ｃ（４’））、７６．１４（Ｃ（７’））、７４．６１（Ｃ（５’））、５５．１９（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５０．１８（Ｃ（３’））、４１．２９（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３８．０１（Ｃ（６’））、３７．７６（Ｃ（２’））、３５．１４（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）２６．８１ ８７（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０１（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ５２Ｈ５７Ｏ６Ｎ６Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８８９．４１０３、実測値８８９．４１２８。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）−９−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（２４）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（２ｍＬ）中の２３（２４３ｍｇ、０．２７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、１．６５ｍＬ、１．６３ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を７時間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中７％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、２４（１５５ｍｇ、８７％）を未だ微量のＴＢＡＦを含む白色フォームとして得る。
２４のデータ：Ｒｆ＝０．４４（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．５５（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．４５（ｓ、１Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、８．００（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６０−７．５０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４９−７．３９（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３１−７．２３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２１−７．１２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８１（ｄ、Ｊ＝８．５ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９３（ｄｄ、Ｊ＝７．５、６．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．２６（ｄｔ、Ｊ＝１１．１、５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．０７−３．９８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．９１（ｄ、Ｊ＝４．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．７７（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．１４（ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３．０４（ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．７３（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．３、１０．１、６．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．６３−２．４８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．１２（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、１．９５−１．８２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．１４（ｄｄ、Ｊ＝１３．４、６．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．５２（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５８．１２（Ｃ（２））、１５７．８８（Ｃ（６））、１５６．６５（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、１４９．７８（Ｃ（４））、１４５．６９、１３７．０２、１３６．９９（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３６．０７（Ｃ（８））、１３０．２６、１２８．２６、１２７．８２、１２６．７４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２０．５３（Ｃ（５））、１１３．１２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８６．８１（Ｃ（Ｐｈ）３）、８５．３５（Ｃ（１’））、８２．６４（Ｃ（４’））、７４．６１（Ｃ（７’））、７４．４８（Ｃ（５’））、５５．２３（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．６３（Ｃ（３’））、４１．３７（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３８．５５（Ｃ（６’））、３８．２３（Ｃ（２’））、３５．１４（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）．
Ｃ３６Ｈ３９Ｏ６Ｎ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６５１．２９２６、実測値６５１．２９１２。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）−９−｛７’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（２５）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のヌクレオシド２４（１４３ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（４３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．１２ｍＬ、０．３８ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。５０分間撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３．５％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、２５（１３０ｍｇ、２つの異性体の混合物、６９％）を白色フォームとして得る。
２５のデータ：Ｒｆ＝０．６０（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．５４、９．４７（２ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．５４、８．５２（２ｓ、１Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、８．０２．８．００（２ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．５８−７．４９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４６−７．３６（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２５（ｄｄ、Ｊ＝１１．０、３．５ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２１−７．１３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８０（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．２ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．００−５．８２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．１６（ｄｄ、Ｊ＝１０．７、５．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．００−３．８２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’）、Ｈ−Ｃ（７’））、３．７７、３．７７（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６２（ｄｔ、Ｊ＝１２．２、６．１ Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５１−３．３３（ｍ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３．１５、３．１４（２ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３．０７（ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．８５−２．６１（ｍ、２Ｈ、Ｃ（２’）、Ｃ（３’））、２．５９−２．４４（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、２．００−１．７９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−（Ｃ２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．５３−１．２６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．１０、１．０１（２ｔ、Ｊ＝６．４ Ｈｚ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．５０（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５８．０４、１５８．００（Ｃ（２））、１５７．９３（Ｃ（６））、１５６．６１、１５６．６０（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、１４９．７３、１４９．７２（Ｃ（４））、１４５．６２、１４５．６２、１３６．９７、１３６．９４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３６．１４（Ｃ（８））、１３０．２７、１３０．２４、１３０．２２、１２８．２６、１２７．８１、１２６．７３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２０．８１、１２０．７６（Ｃ（５））、１１７．６７、１１７．５６（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．１０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８６．８８、８６．８５（Ｃ（Ｐｈ）３）、８５．５８、８５．３７（Ｃ（１’））、８２．４１、８２．０７（Ｃ（４’））、７７．０８、７６．０１（ＪＣ、Ｐ＝３７．０、１５．１ Ｈｚ、Ｃ（７’））、７４．５２、７４．４６（Ｃ（５’））、５８．１９、５７．７４（ＪＣ、Ｐ＝１８．９、１９．０ Ｈｚ ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、５５．２５、５５．２１（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．１０、４８．８３（ＪＣ、Ｐ＝２．２、４．８ Ｈｚ、Ｃ（３’））、４３．１２、４３．００（（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、４１．３４、４１．３３（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３８．４８、３８．４１（Ｃ（２’））、３７．２３、３６．９２（ＪＣ、Ｐ＝５．７、３．３ Ｈｚ Ｃ（６’））、３５．１７（（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２４．５６、２４．５３、２４．４８、２４．４７、２４．４３、２５．３６、２４．３５（７ｓ、Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３９、２０．２８（ＪＣ、Ｐ＝７．１、６．９ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４７．６９、１４６．３７．
Ｃ４５Ｈ５６Ｏ７Ｎ８Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８５１．４００４、実測値８５１．４０１８。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−β−Ｄ−リボフラノシル｝ウラシル（２６）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１３ｍＬ）中の糖６（６６９ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、２，６−ルチジン（０．９４ｍＬ、８．１０ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。０℃で２０分間撹拌した後、ＴＭＳＯＴｆ（０．８９ｍＬ、４．８６ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、次いで溶液を室温に温め、さらに３時間撹拌する。次いで、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）を添加することにより反応物をクエンチする。有機相を分離し、水相をさらにＤＣＭ（２Ｘ２０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
粗生成物を乾燥ＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶解し、次いでウラシル（５４５ｍｇ、４．８６ｍｍｏｌ）およびＢＳＡ（１．８ｍＬ、７．２９ｍｍｏｌ）を室温で添加する。室温で６０分間撹拌した後、得られた微細な懸濁液を０℃に冷却し、Ｎ−ヨードスクシンイミド（５７８ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を添加する。０℃で３０分間および室温で４時間撹拌した後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、続いてＮａ２Ｓ２Ｏ３（３０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）の１０％水溶液で洗浄する。水相を合わせ、ＤＣＭ（２Ｘ２０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
粗生成物を乾燥トルエン（１５ｍＬ）に溶解し、次いで、Ｂｕ３ＳｎＨ（０．６５ｍＬ、２．４３ｍｍｏｌ）およびアゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、１３ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を室温で添加する。９５℃で２時間加熱した後、混合物を室温に冷却し、ＭｅＯＨ（７ｍＬ）およびＨＣｌ（水中１Ｍ、１．６ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を添加する。溶液をさらに１５分間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン４：１）により精製して、２６（４９０ｍｇ、３工程で６１％）を白色フォームとして得る。
２６のデータ：Ｒｆ＝０．１５（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．９５（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．６９（ｄ、Ｊ＝６．４ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５４−７．３９（ｍ、７Ｈ、Ｈ−Ｃ（６）、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９８（ｄｄ、Ｊ＝９．３、５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．７１（ｄ、Ｊ＝８．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、４．５１（ｄｄ、Ｊ＝１３．７、６．３ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’）、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１４（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．２５（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、２．７４（ｄｄ、Ｊ＝１７．１、８．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．２６−１．８７（ｍ、３Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．４９−１．１９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．１２（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６３．６５（Ｃ（４））、１５０．４６（Ｃ（２））、１３９．８５（Ｃ（６））、１３５．６９、１３５．６６（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．７１、１３３．４２（Ｃ−ａｒｏｍ）、１２９．９８、１２９．９３、１２７．８５、１２７．８１（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０２．８４（Ｃ（５））、８６．１７（Ｃ（１’））、８１．８３（Ｃ（４’））、７６．９４（Ｃ（７’））、７２．４５（Ｃ（５’））、５０．０９（Ｃ（３’））、４０．９３（Ｃ（６’））、３５．８３（Ｃ（２’））、２６．９１（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０３（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ２７Ｈ３２Ｏ５Ｎ２ＮａＳｉ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５１５．１９７３、実測値５１５．１９６３。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝ウラシル（２７）
Figure 2021522862
 乾燥ピリジン（７ｍＬ）中のヌクレオシド２６（４３８ｍｇ、０．８８９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（１．２０ｇ、３．５５ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を室温で１日間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中１．５％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、２７（６０１ｍｇ、８０％）を黄色フォームとして得る。
２７のデータ：Ｒｆ＝０．４８（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．２６（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．８４（ｄ、Ｊ＝８．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．４０−７．０８（ｍ、１９Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．６９（ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．９ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．７０（ｄｄ、Ｊ＝７．８、５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．４９（ｄｄ、Ｊ＝８．１、１．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、４．２４−４．１１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．０５−３．９５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．６５（ｄ、Ｊ＝１．７ Ｈｚ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６２（ｄ、Ｊ＝３．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．４１（ｄｄ、Ｊ＝１７．２、８．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．２４（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．５、１０．２、５．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．３９−１．２４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．０４（ｄｄ、Ｊ＝１３．１、５．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、０．８９（ｄｔ、Ｊ＝１３．８、８．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、０．８１（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６３．５８（Ｃ（４））、１５８．６６（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５０．３８（Ｃ（２））、１４５．６１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３９．９２（Ｃ（６））、１３６．７１、１３６．５６（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．６１、１３５．５５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．５５、１３３．４１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．３０、１２９．９２、１２９．８４、１２８．１６、１２７．９０、１２７．７４、１２７．６７、１２６．９０、１１３．１９、１１３．１５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０２．１２（Ｃ（５））、８７．４１（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．８０（Ｃ（１’））、８２．３２（Ｃ４’））、７５．５４（Ｃ（７’））、７４．４１（Ｃ（５’））、５５．２３（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５０．０５（Ｃ（３’））、３８．４９（Ｃ（６’））、３７．５３（Ｃ（２’））、２６．８１（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１８．９９（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ４８Ｈ５０Ｏ７Ｎ２ＮａＳｉ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８１７．３２７９、実測値８１７．３２８６。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝シトシン（２８）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＣＮ（７０ｍＬ）中の１，２，４−トリアゾール（１．８３ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＯＣｌ３（０．５７ｍＬ、６．０５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、続いてＥｔ３Ｎ（４．２ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ）を添加する。懸濁液を０℃で３０分間撹拌し、次いで乾燥ＭｅＣＮ（４ｍＬ）中のヌクレオシド２７（６０１ｍｇ、０．７５６ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で添加する。室温で４時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）を添加して反応物をクエンチし、ＭｅＣＮを減圧下で除去し、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×６０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
次いで、粗生成物を１，４−ジオキサン（１８ｍＬ）および濃ＮＨ４ＯＨ（１８ｍＬ）の混合物に溶解する。室温で３時間撹拌した後、混合物を真空中で体積の半分に減少させ、飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、２８（５２０ｍｇ、８７％）を白色フォームとして得る。
２８のデータ：Ｒｆ＝０．４１（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．９６（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．４５（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３８−７．０８（ｍ、１７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．７３（ｄｄ、Ｊ＝８．７、４．７ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．７３（ｔ、Ｊ＝８．６ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（５）、Ｈ−Ｃ（１’））、４．３２−４．１６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．０３（ｔ、Ｊ＝５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．６６（ｄ、Ｊ＝０．９ Ｈｚ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６１（ｄ、Ｊ＝２．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．５０−２．３３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（３’））、１．４７−１．２８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．０３（ｄｄ、Ｊ＝１２．９、５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、０．９２−０．７５（ｍ、１０Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６５．７８（Ｃ（４））、１５８．５９（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５５．９４（Ｃ（２））、１４５．８８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４０．６８（Ｃ（６））、１３６．９３、１３６．７８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．５９、１３５．５３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．６０、１３３．５４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．３１、１２９．８６、１２９．７７、１２８．１５、１２７．８８、１２７．７１、１２７．６４、１２６．７９、１１３．１８、１１３．１４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、９４．５３（Ｃ（５））、８７．５５（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．２２（Ｃ（１’））、８２．２３（Ｃ（４’））、７５．７６（Ｃ（７’））、７４．６８（Ｃ（５’））、５５．２１（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５０．１８（Ｃ（３’））、３８．２５（Ｃ（６’））、３８．０８（Ｃ（２’））、２６．８３（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．００（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ４８Ｈ５２Ｏ６Ｎ３Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値７９４．３６２０、実測値７９４．３６４９。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ４−ベンゾイル−１−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝シトシン（２９）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のヌクレオシド２８（５１９ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１１０μＬ、０．７８４ｍｍｏｌ）を室温で添加し、続いてＢｚ２Ｏ（３７０ｍｇ、１６３３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を一晩撹拌する。次いで、飽和ＮａＨＣＯ３（６０ｍＬ）を注意深く添加することにより溶液をクエンチし、ＤＣＭ（３×７０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ ２：３、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、２９（５８０ｍｇ、９９％）を白色フォームとして得る。
２９のデータ：Ｒｆ＝０．５１（ＥｔＯＡｃ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．６１（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．８１（ｄ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４９−７．１３（ｍ、２４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（５））、６．７７（ｄｄ、Ｊ＝８．５、４．４ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．７３（ｔ、Ｊ＝６．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．３９−４．２０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．０５（ｔ、Ｊ＝６．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．７０（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６３（ｄ、Ｊ＝２．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．７２−２．５５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．４８（ｄｄ、Ｊ＝１６．０、８．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、１．４２−１．２９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．１９−１．１１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．０７−０．９６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、０．８５（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６６．６４（ＣＯＮＨ）、１６２．２５（Ｃ（４））、１５８．７０（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５４．８４（Ｃ（２））、１４５．７１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４４．８４（Ｃ（６））、１３６．７４、１３６．６７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．５９、１３５．５１（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．５２、１３３．４２、１３３．２４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３３．１１、１３０．３０、１２９．９２、１２９．８５、１２９．０２、１２８．１２、１２７．９７、１２７．７６、１２７．６８、１２７．６１、１２６．９４、１１３．２５、１１３．２２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、９６．２２（Ｃ（５））、８９．０７（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．５３（Ｃ（１’））、８３．４６（Ｃ（４’））、７５．５９（Ｃ（７’））、７４．７１（Ｃ（５’））、５５．２４（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５０．３５（Ｃ（３’））、３８．６１（Ｃ（６’））、３８．１５（Ｃ（２’））、２６．８２（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．００（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ５５Ｈ５６Ｏ７Ｎ３Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８９８．３８８２、実測値８９８．３８９８。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ４−ベンゾイル−１−｛−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝シトシン（３０）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（１４ｍＬ）中の２９（５８０ｍｇ、０．６４８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、３．２５ｍＬ、３．２５ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を１日間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、３０（３６６ｍｇ、８５％）を白色フォームとして得る。
３０のデータ：Ｒｆ＝０．３１（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．９０（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７３（ｄ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．８２（ｄ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５５−７．３１（ｍ、１０Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（５））、７．２８−７．０９（ｍ、３Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．７６（ｄｄ、Ｊ＝８．８、１．７ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．７３（ｔ、Ｊ＝６．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．２８−４．１３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．８３（ｔ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．７５（ｄ、Ｊ＝３．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．７０（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．８６（ｄ、Ｊ＝１４．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ−（２’））、２．５４（ｄｄ、Ｊ＝１７．４、７．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、１．６８−１．５５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．４５−１．１３（ｍ、３Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’）、ＯＨ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６６．６３（ＣＯＮＨ）、１６２．３４（Ｃ（４））、１５８．６５（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５５．００（Ｃ（２））、１４５．６２（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４５．１１（Ｃ（６））、１３６．７２、１３６．６４、１３３．１６（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．２５、１２９．０２、１２８．１２、１２７．９３、１２７．６１、１２６．９５、１１３．２０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、９６．２４（Ｃ（５））、８９．２０（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．４８（Ｃ（１’））、８３．４０（Ｃ（４’））、７４．５０、（Ｃ（５’））７３．９０（Ｃ（７’））、５５．２５（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、５０．０５（Ｃ（３’））、３８．９０（Ｃ（６’））、３８．４０（Ｃ（２’））．
Ｃ３９Ｈ３８Ｏ７Ｎ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６６０．２７０４、実測値６６０．２７０７。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ４−ベンゾイル−１−｛７’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝シトシン（３１）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（３ｍＬ）中のヌクレオシド３０（６７ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（６５μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。４０分間撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２Ｘ１５ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１５ｍＬ）で洗浄する。水相を合わせ、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、３１（７５ｍｇ、２つの異性体の混合物、８６％）を白色フォームとして得る。
３１のデータ：Ｒｆ＝０．６７（ＤＣＭ中４％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．８８（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７９（ｄ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．９３（ｄ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．６７−７．４０（ｍ、１０Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（５））、７．３９−７．２２（ｍ、３Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．９３−６．７９（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９７−５．７７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．２２（ｄｔ、Ｊ＝１４．５、５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−（５’））、３．９８−３．８４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’）、Ｈ−Ｃ（７’））、３．８２（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．６６（ｄｄｄ、Ｊ＝１６．８、１３．５、６．７ Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５３−３．３７（ｍ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３．１４−２．９３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．８４−２．６６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．５３（ｄｔ、Ｊ＝１２．４、６．３ Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１．８３−１．５６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．４６（ｔｄ、Ｊ＝１４．１、７．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．１８−０．９７（ｍ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６６．７０（ＣＯＮＨ）、１６２．３２、１６２．２８（Ｃ（４））、１５８．６８（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５４．９３（Ｃ（２））、１４５．５３（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４４．９５、１４４．８９（Ｃ（６））、１３６．６９、１３６．６３、１３６．５６、１３６．５２、１３３．２４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３３．１０、１３０．２４、１３０．２０、１２９．０１、１２８．１０、１２７．９４、１２７．６０、１２６．９６（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１７．５３（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．２０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、９６．２４（Ｃ（５））、８９．１５、８９．１０（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．５５、８７．５４（Ｃ（１’））、８３．１１、８３．０４（Ｃ（４’））、７５．９３、７５．３７（ＪＣ、Ｐ＝１６．７、１５．５ Ｈｚ、Ｃ（７’））、７４．４８（Ｃ（５’））、５８．２５、５７．９９（ＪＣ、Ｐ＝１７．９、１８．１ Ｈｚ ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、５５．２７、５５．２４（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．２７、４９．０３（ＪＣ、Ｐ＝３．１、４．８ Ｈｚ、Ｃ（３’））、４３．１５、４２．９８（（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３８．８９、３８．８０（Ｃ（２’））、３７．４４、３７．２４（ＪＣ、Ｐ＝５．２、３．２ Ｈｚ、Ｃ（６’））、２４．５８、２４．５４、２４．４８、２４．４５、２４．３５（５ｓ、Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３３、２０．２４（ＪＣ、Ｐ＝５．８、５．７ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４７．１９、１４６．９４．
Ｃ４８Ｈ５５Ｏ８Ｎ５Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８６０．３７８３、実測値８６０．３７９１。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−（４−ニトロベンゾイル）−５’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（３２）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（８ｍＬ）中のヌクレオシド１１（１００ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（２６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ニトロベンゾイルクロリド（５９ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）を室温で添加する。６時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３（５ｍＬ）を添加することにより反応物をクエンチする。次いで、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２．５％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、３２（９８ｍｇ、７８％）を微量のＥｔ３Ｎを含む白色フォームとして得る。
３２のデータ：Ｒｆ＝０．４２（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．２６（ｔ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ、３Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、ＨＮ（３））、８．００（ｄ、Ｊ＝８．９ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝１．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．５５（ｄ、Ｊ＝６．９ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４４（ｄｄ、Ｊ＝８．８、６．６ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３５−７．１８（ｍ、３Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８３（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．６ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０１（ｄｄ、Ｊ＝８．２、５．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．９６（ｄ、Ｊ＝３．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、４．３３−４．２４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．２４−４．１３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．７８（ｄ、Ｊ＝０．９ Ｈｚ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．９２−２．７２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．８１（ｄ、Ｊ＝０．６ Ｈｚ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．７９−１．６２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．２２（ｄ、Ｊ＝５．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．０５、１６３．８４（Ｃ（４）、ＣＯ２Ｒ）、１５８．８１（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５０．６４、１５０．５２（Ｏ２Ｎ−Ｃ−ａｒｏｍ、Ｃ（２））、１４５．２９、１３６．４３、１３６．３４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．１８（Ｃ（６））、１３０．６２、１３０．２０、１３０．１７、１２８．１６、１２８．０１、１２７．１５、１２３．５８、１１３．３０、１１３．２７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１１１．１７（Ｃ（５））、８７．５３（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．２９（Ｃ（１’））、８１．５９（Ｃ（４’））、７８．６５（Ｃ（７’））、７４．１６（Ｃ（５’））、５５．２６（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４７．０７（Ｃ（３’））、３７．３５（Ｃ（２’））、３５．７１（Ｃ（６’））、１２．５１（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ４０Ｈ３７Ｏ１０Ｎ３Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値７４２．２３７１、実測値７４２．２３７５
（（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−（４−ニトロベンゾイル）−β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（３３）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＭｅＯＨ（０．４ｍＬ）の混合物中の３２（６０ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）の溶液に、ジクロロ酢酸（０．２ｍＬ）を室温で滴下して添加する。３時間撹拌した後、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製して、３３（２９ｍｇ、８４％）を白色フォームとして得る。Ｘ線分析に好適な結晶を、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨの混合物中の再結晶によって得る。
３３のデータ：Ｒｆ＝０．１８（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ １１．３３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、８．３４（ｄ、Ｊ＝８．８ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、８．２７−８．１３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．７８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、５．９６（ｄｄ、Ｊ＝９．３、５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．１８（ｔ、Ｊ＝３．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、５．１２（ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、４．３３（ｄｄ、Ｊ＝７．３、４．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．２７（ｔｄ、Ｊ＝１０．５、５．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、２．９０（ｄｄ、Ｊ＝１７．２、８．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．５８−２．４６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．３０（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．８、８．８、５．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．０３（ｄｄ、Ｊ＝９．６、４．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．９２−１．７６（ｍ、４Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｍｅ−Ｃ（５））．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ １６４．３３、１６４．２３（Ｃ（４）、ＣＯ２Ｒ）、１５０．９１、１５０．７５（Ｏ２Ｎ−Ｃ−ａｒｏｍ、Ｃ（２））、１３６．７９（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．６９（Ｃ（６））、１３１．２０、１２４．３２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０９．８９（Ｃ（５））、８５．３１（Ｃ（１’））、８１．４８（Ｃ（４’））、８０．０７（Ｃ（７’））、７１．７２（Ｃ（５’））、４７．１８（Ｃ（３’））、３７．７７（Ｃ（６’））、３５．４８（Ｃ（２’））、１２．６６ １２．５８（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ１９Ｈ２０Ｏ８Ｎ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４１８．１２４５、実測値４１８．１２４２。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛５’−Ｏ−アセチル−７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α，β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（３５）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＣＮ（１２ｍＬ）中の糖７（９３３ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）およびチミン（３７２ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＳＡ（１．５ｍＬ、６．１５ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。室温で５０分間撹拌した後、溶液を０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（０．４５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。さらに０℃で３時間および室温で１５時間撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２．５％イソプロパノール）によって精製して、アノマー比α／β
Figure 2021522862
 ８５：１５の３５（９２４ｍｇ、８２％）の混合物を白色フォームとして得る。
３５のデータ：Ｒｆ＝０．５６（ＤＣＭ中７％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．１４（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．５３（ｄｄ、Ｊ＝７．７、１．６ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３９−７．２３（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．０９（ｄ、Ｊ＝１．０ Ｈｚ、０．１５ Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、６．８７（ｄ、Ｊ＝１．０ Ｈｚ、０．８５ Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、５．８３（ｔ、Ｊ＝６．２ Ｈｚ、０．８５ Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．８０−５．７０（ｍ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．３６−５．０４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．８９（ｄｄ、Ｊ＝６．３、５．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．６２（ｄｄ、Ｊ＝７．１、５．６ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．０１−３．８５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．７６−２．５５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．０９−１．９１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、ＭｅＣＯ２）、１．９０−１．５８（ｍ、６Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｍｅ−Ｃ（５））、０．９６（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．７０（ＭｅＣＯ２）、１６３．８７（Ｃ（４））、１５０．２９（Ｃ（２））、１３５．６９、１３５．６７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３４．９９（Ｃ（６））、１３３．５８、１３３．１８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．０３、１２７．８７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．０５（Ｃ（５））、８７．５６（Ｃ（１’））、８２．８５（Ｃ（４’））、７６．５０（Ｃ（７’））、７４．７６（Ｃ（５’））、５０．７２（Ｃ（３’））、３７．７９（Ｃ（６’））、３６．９４（Ｃ（２’））、２６．８８（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２０．９５（ＭｅＣＯ２）、１９．０１（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１２．６３（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ３０Ｈ３７Ｏ６Ｎ２Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５４９．２４１５、実測値５４９．２４０１。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛５’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−α，β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（３６）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のヌクレオシド３５（９２４ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、３．４ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を室温で添加する。室温で２時間撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（８０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×８０ｍＬ）およびＤＣＭ（２×８０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製して、３６（３９１ｍｇ、７５％）のアノマー混合物を得る。
３６のデータ：Ｒｆ＝０．２４（ＤＣＭ中７％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．６６（ｂｒ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、９．６３（ｂｒ、０．８５Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．２７（ｄ、Ｊ＝１．０ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、７．０６（ｄ、Ｊ＝１．０ Ｈｚ、０．８５Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、６．００（ｔ、Ｊ＝６．１ Ｈｚ、０．８５Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．９１（ｄｄ、Ｊ＝８．８、５．５ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．２６−５．１０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．９２（ｄｄ、Ｊ＝６．５、５．３ Ｈｚ、０．８５Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．６５（ｄｄ、Ｊ＝６．９、５．７ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．１９−４．０３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．９１−２．７２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’）、ＯＨ）、２．６４（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．３、９．８、５．５ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．２５−２．１５（ｍ、１．７０Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．０５（ｓ、０．４５Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０４（ｓ、２．５５Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０３−１．８９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．８８（ｄ、Ｊ＝０．７ Ｈｚ、０．４５Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．８５（ｄ、Ｊ＝０．６ Ｈｚ、２．５５Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．４２−１．２８（ｍ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．８７（ＭｅＣＯ２）、１６４．２６（Ｃ（４））、１５０．６６（Ｃ（２））、１３５．５４（Ｃ（６））、１１１．２２（Ｃ（５））、８７．９７（Ｃ（１’））、８２．９７（Ｃ（４’））、７５．０８（Ｃ（７’））、７４．５２（Ｃ（５’））、５０．０７（Ｃ（３’））、３７．８１（Ｃ（２’））、３７．２３（Ｃ（６’））、２１．０２（ＭｅＣＯ２）、１２．６７（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ１４Ｈ１９Ｏ６Ｎ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値３１１．１２３８、実測値３１１．１２３４。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛５’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α，β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（３７）
Figure 2021522862
 乾燥ピリジン（７ｍＬ）中のヌクレオシド３６（３６４ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（１．１９ｇ、３．５１ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を１日間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２：１、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、３７（６９０ｍｇ、９６％）のアノマー混合物を黄色フォームとして得る。
３７のデータ：Ｒｆ＝０．７０（ＤＣＭ中８％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．１７（ｂｒ、０．８５Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、８．５６（ｂｒ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．３８−７．３２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２９−７．１５（ｍ、７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８２（ｄ、Ｊ＝１．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、６．７６（ｄ、Ｊ＝８．９ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．８６（ｔ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、０．８５Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．７１（ｄｄ、Ｊ＝８．９、５．４ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．２５（ｄｄ、Ｊ＝１０．２、５．６ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、５．２１−５．１１（ｍ、０．８５Ｈ、Ｈ−（Ｃ５’））、４．７８（ｄｄ、Ｊ＝６．７、４．８ Ｈｚ、０．８５Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４９（ｄｄ、Ｊ＝７．１、５．３ Ｈｚ、０．１５Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．８４（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３、７２、３．７１（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．３４−２．２３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．０１、１．９９（２ｓ、３Ｈ、ＭｅＣＯ２）、１．８２（ｄ、Ｊ＝０．５ Ｈｚ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．８０−１．５６（ｍ、４Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．６９（ＭｅＣＯ２）、１６３．９１（Ｃ（４））、１５８．８２（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５０．３３（Ｃ（２））、１４５．３４、１３６．６４、１３６．５８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．００（Ｃ（６））、１３０．２５、１２８．３９、１２８．０７、１２７．１５、１１３．４１（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．０４（Ｃ（５））、８７．７０（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．３１（Ｃ（１’））、８３．１５（Ｃ（４’））、７７．１６（Ｃ（７’））、７４．９６（Ｃ（５’））、５５．３７（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．１２（Ｃ（３’））、３７．５５（Ｃ（２’））、３６．８２（Ｃ（６’））、２１．０７（ＭｅＣＯ２）、１２．６６（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ３５Ｈ３６Ｏ８Ｎ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６１２．２４６６、実測値６１２．２４５３。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（３８）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のヌクレオシド３７（６９０ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（４６７ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を３時間撹拌し、次いで飽和ＮａＣｌ（６０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×６０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（Ｅｔ２Ｏ中の３％イソプロパノール、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、α−アノマーである３８（５５０ｍｇ、８６％）を白色固体として得る。
３８のデータ：Ｒｆ＝０．３９（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．３７（ｂｒ、ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．３９−７．３１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２５（ｄ、Ｊ＝８．３ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２０（ｔ、Ｊ＝７．７ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．１６−７．０８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．７８（ｄ、Ｊ＝１．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、６．７４（ｄ、Ｊ＝８．８ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９１（ｄｄ、Ｊ＝６．５、４．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．５７（ｄｄ、Ｊ＝７．２、４．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．３５−４．１８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．８６（ｄ、Ｊ＝４．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．６９（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．５３（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、２．２２（ｄｄ、Ｊ＝１５．３、６．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、１．８５−１．６９（ｍ、５Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５）、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．６６−１．４９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６３．９８（Ｃ（４））、１５８．６７（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５０．４７（Ｃ（２））、１４５．４８、１３６．８０、１３６．７５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３４．９４（Ｃ（６））、１３０．１９、１３０．１８、１２８．３５、１２７．９７、１２７．０１、１１３．３１（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．０４（Ｃ（５））、８７．８２（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．０５（Ｃ（１’））、８５．７４（Ｃ（４’））、７８．２６（Ｃ（７’））、７３．３３（Ｃ（５’））、５５．３１（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４８．８１（Ｃ（３’））、４０．２１（Ｃ（６’））、３７．６８（Ｃ（２’））、１２．６５（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ３３Ｈ３５Ｏ７Ｎ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５７１．２４３９、実測値５７１．２４２１。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛５’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（３９）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（７ｍＬ）中のヌクレオシド３８（２００ｍｇ、０．３５０ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（５９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．１７ｍＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。１時間撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×２５ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２５ｍＬ）で洗浄する。水相を合わせ、ＤＣＭ（３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、３９（２２０ｍｇ、２つの異性体の混合物、８１％）を白色固体として得る。
３９のデータ：Ｒｆ＝０．４４（ＤＣＭ中４％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．０３（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、７．３６（ｄ、Ｊ＝８．１ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３０−７．０７（ｍ、７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８４（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、６．８０−６．６９（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９５、５．８８（２ｄｄ、Ｊ＝６．６、４．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．７０、４．６１（２ｄｄ、Ｊ＝７．３、４．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４１−４．２０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．９４−３．８２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．８１−３．６２（ｍ、８Ｈ、ＭｅＯ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５９−３．４０（ｍ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２．６１−２．４６（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、２．２８（ｄｄｄ、Ｊ＝１４．１、１３．２、７．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、１．９１−１．７３（ｍ、５Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５）、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．７２−１．４６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．１６−１．００（ｍ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．０１、１６３．９８（Ｃ（４））、１５８．７０（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５０．３９、１５０．１７（Ｃ（２））、１４５．５２、１３６．８４、１３６．７８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．４４、１３５．３９（Ｃ（６））、１３０．２１、１２８．３６、１２８．３２、１２８．００、１２７．０３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１８．０２、１１７．７６（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．３２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１０．９１、１１０．５９（Ｃ（５））、８８．３１、８８．０６（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．１１、８７．０６（Ｃ（１’））、８５．４４、８５．３９（ＪＣ、Ｐ＝４．６、３．１ Ｈｚ、Ｃ（４’））、７８．２５、７８．１３（Ｃ（７’））、７４．７０、７４．３４（ＪＣ、Ｐ＝１３．５、１８．５ Ｈｚ、Ｃ（５’））、５８．７３、５８．４７（ＪＣ、Ｐ＝１８．９、２０．１ Ｈｚ、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ））、５５．３５、５５．３２（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４８．８０、４８．６４（Ｃ（３’））、４３．２２、４３．０６（ＪＣ、Ｐ＝１２．４、１１．０ Ｈｚ（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３９．６８、３９．６３（Ｃ（６’））、３８．０６、３７．９３（Ｃ（２’））、２４．８１、２４．７４、２４．７１、２４．６８、２４．６５、２４．５９（６ｓ、Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３７、２０．３５（ＪＣ、Ｐ＝７．１、６．８ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１２．６６（Ｍｅ−Ｃ（５））．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２２ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４８．１８、１４７．８０．
Ｃ４２Ｈ５２Ｏ８Ｎ４Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値７７１．３５１７、実測値７７１．３５１７。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ４−ベンゾイル−１−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝−５−メチルシトシン（４０）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＣＮ（５ｍＬ）中のヌクレオシド３８（２６８ｍｇ、０．４７０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＳＡ（０．２８ｍＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加し、次いで、溶液を室温で一晩撹拌する。別のフラスコ中で、乾燥ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）中の１，２，４−トリアゾール（１．１４ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃に冷却し、ＰＯＣｌ３（０．３５ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）、続いてＥｔ３Ｎ（２．６２ｍＬ、１８．８ｍｍｏｌ）を添加する。懸濁液を０℃で３０分間撹拌し、次いで、事前に調製したシリル化化合物３８の溶液を懸濁液に添加し、混合物をさらに室温で７時間撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）を添加することにより反応物をクエンチし、ＭｅＣＮを減圧下で除去し、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
次いで、粗生成物を１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）および濃ＮＨ４ＯＨ（１０ｍＬ）の混合物に溶解する。室温で３時間撹拌した後、混合物を真空中でその体積の半分に減少させ、飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。
次いで、粗生成物を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解する。Ｅｔ３Ｎ（８０μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）、続いてＢｚ２Ｏ（２６６ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を室温で添加し、溶液を一晩撹拌する。得られた褐色がかった溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）を注意深く添加することによりクエンチし、ＤＣＭ（４×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、４０（２６３ｍｇ、８３％）を白色フォームとして得る。
４０のデータ：Ｒｆ＝０．５３（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １３．１１（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．３０−８．１０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４７−７．２９（ｍ、５Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２８−７．０６（ｍ、７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．００（ｄ、Ｊ＝０．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、６．７４（ｄ、Ｊ＝８．６ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．８９（ｄｄ、Ｊ＝６．３、４．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．６１（ｄｄ、Ｊ＝７．２、４．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．３３−４．２０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．８７（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．６９（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．３２−２．１３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’）、ＯＨ）、１．９９（ｓ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．８７−１．７３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．６６−１．４７（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７９．６１（ＣＯＮＨ）、１５９．７６（Ｃ（４））、１５８．７４（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１４７．８７（Ｃ（２））、１４５．４７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３７．１７（Ｃ（６））、１３６．７７、１３６．６８、１３６．０３（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．５５、１３０．２１、１２９．９８、１２８．３４、１２８．２１、１２８．０３、１２７．０７、１１３．３５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．８１（Ｃ（５））、８８．７４（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．１３（Ｃ（１’））、８６．１２（Ｃ（４’））、７８．１７（Ｃ（７’））、７３．３１（Ｃ（５’））、５５．３５（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４８．６３（Ｃ（３’））、４０．３５（Ｃ（６’））、３８．０６（Ｃ（２’））、１３．７８（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ４０Ｈ４０Ｏ７Ｎ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６７４．２８６１、実測値６７４．２８７７。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ４−ベンゾイル−１−｛５’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝−５−メチルシトシン（４１）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（８ｍＬ）中のヌクレオシド４０（２５０ｍｇ、０．３７１ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（７３ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．２０ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。３０分間撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２Ｘ２０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２０ｍＬ）で洗浄する。水相を合わせ、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、４１（２６０ｍｇ、２つの異性体の混合物、８０％）を白色フォームとして得る。
４１のデータ：Ｒｆ＝０．５７（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １３．２６（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．３２（ｄ、Ｊ＝７．２ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５８−７．３９（ｍ、５Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３８−７．１４（ｍ、８Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（６））、６．８８−６．７７（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０１、５．９６（２ｄｄ、Ｊ＝６．３、４．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．８２、４．７４（２ｄｄ、Ｊ＝７．３、４．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４２（ｔｄ、Ｊ＝１０．６、６．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．９７（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．９１−３．６８（ｍ、８Ｈ、ＭｅＯ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５９（ｄｔｄ、Ｊ＝１６．７、６．７、３．４ Ｈｚ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ））、２．６２（ｄｔ、Ｊ＝１５．５、６．４ Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、２．４９−２．２３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．１１、２．０９（２ｄ、Ｊ＝０．５ Ｈｚ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））、２．００−１．８２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．８２−１．５５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．１７（ｄｄ、Ｊ＝１６．３、６．８ Ｈｚ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７９．６０（ＣＯＮＨ）、１５９．９７（Ｃ（４））、１５８．７６（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１４７．８１、１４７．７０（Ｃ（２））、１４５．５４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３７．３４、１３６．８３（Ｃ（６））、１３６．７７、１３６．７２、１３６．６５、１３６．５５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．４５、１３０．２２、１３０．２０、１２９．９６、１２８．３４、１２８．３１、１２８．１８、１２８．００、１２７．０４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１７．８９、１１７．７１（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．３５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．６０、１１１．３６（Ｃ（５））、８９．２４、８９．０１（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．１６、８７．１２（Ｃ（１’））、８５．７８、８５．６２（ＪＣ、Ｐ＝４．３、３．２ Ｈｚ、Ｃ（４’））、７８．２０、７７．９８（Ｃ（７’））、７４．６８、７４．３７（ＪＣ、Ｐ＝１３．４、１８．２ Ｈｚ、Ｃ（５’））、５８．７０、５８．４４（ＪＣ、Ｐ＝１８．５、２０．０ Ｈｚ、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ））、５５．３６、５５．３３（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４８．６５、４８．４４（Ｃ（３’））、４３．２７、４３．１４（ＪＣ、Ｐ＝１２．４、１２．３ Ｈｚ（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３９．８７、３９．６４（ＪＣ、Ｐ＝３．４、３．７ Ｈｚ（Ｃ（６’））、３８．３０、３８．２２（Ｃ（２’））、２４．８０、２４．７２、２４．７０、２４．６７、２４．６３（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３９、２０．３７（ＪＣ、Ｐ＝７．２、６．８ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１３．７２（Ｍｅ−Ｃ（５））．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４８．１８、１４７．９６．
Ｃ４９Ｈ５７Ｏ８Ｎ５Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８７４．３９３９、実測値８７４．３９４６。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（４２）
Figure 2021522862
 ヌクレオシド１５（１．７４ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：４：１、８０ｍＬ）中の０．１５Ｍ ＮａＯＨに０℃で溶解する。反応物を２０分間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌ（１．０６ｇ）を添加することによりクエンチする。次いで、溶媒を減圧下で除去し、生成物をＣＣ（ＤＣＭ中５％イソプロパノール）によって精製して、４２（α−アノマー、８３６ｍｇ、５１％）および１６（β−アノマー、２８７ｍｇ、１８％）を白色フォームとして得る。
４２のデータ：Ｒｆ＝０．３５（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．３４（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．０２（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ））、７．９２（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６８−７．５８（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５８−７．３１（ｍ、９Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．２３（ｄｄ、Ｊ＝６．７、２．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．７４（ｄｄ、Ｊ＝６．６、４．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４９（ｄｔ、Ｊ＝１２．５、６．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１０（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．０７（ｄ、Ｊ＝６．７ Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、２．９２（ｄｄ、Ｊ＝１５．４、７．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．５２−２．３５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１０−１．９７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．９４−１．７７（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．０６（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．９８（ＣＯＮＨ）、１５２．６５（Ｃ（２））、１５１．３１（Ｃ（４））、１４９．６９（Ｃ（６））、１４０．９３（Ｃ（８））、１３５．７４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．８２、１３３．６８、１３３．３９（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．７７、１３０．０２、１２９．９８、１２８．７６、１２８．０６、１２７．８７、１２７．８５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．３８（Ｃ（５））、８７．１６（Ｃ（１’））、８５．３５（Ｃ（４’））、７７．４０（Ｃ（７’））、７２．７９（Ｃ（５’））、５０．６３（Ｃ（３’））、４０．８６（Ｃ（６’））、３７．２５（Ｃ（２’））、２６．９４（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０５（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３５Ｈ３８Ｏ４Ｎ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６２０．２６８８、実測値６２０．２６７１。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛５’−Ｏ−アセチル−７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（４３）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のヌクレオシド４２（１．０９ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（３２１ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（０．８３ｍＬ、８．８ｍｍｏｌ）を室温で添加する。一晩撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）を添加することにより反応物をクエンチする。相を分離し、水相をさらにＤＣＭ（２Ｘ８０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２．５％ＭｅＯＨ）によって精製して、４３（１．０４ｇ、９０％）を白色フォームとして得る。
４３のデータ：Ｒｆ＝０．３３（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン４：１）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．９９（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．０９−７．９９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．９８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．７０−７．５８（ｍ、５Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５７−７．４８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４７−７．３４（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．２２（ｄｄ、Ｊ＝６．８、３．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．４５−５．３５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、５．０１（ｄｄ、Ｊ＝６．７、５．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．０９（ｄ、Ｊ＝４．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．０２（ｄｔ、Ｊ＝９．５、６．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．５５（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．５、１０．０、３．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１５（ｄｄ、Ｊ＝１３．２、６．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．０９（ｓ、３Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０１（ｄｔ、Ｊ＝８．０、３．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．８８（ｄｔ、Ｊ＝１３．６、５．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．０８（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．６１（ＭｅＣＯ２）、１６４．７５（ＣＯＮＨ）、１５２．６７（Ｃ（２））、１５１．３７（Ｃ（４））、１４９．６４（Ｃ（６））、１４１．４１（Ｃ（８））、１３５．８５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．７１、１３３．３８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．９１、１３０．１５、１３０．１０、１２８．９９、１２８．０２、１２７．９９、１２７．９７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．６４（Ｃ（５））、８７．３７（Ｃ（１’））、８３．３７（Ｃ（４’））、７６．６３（Ｃ（７’））、７４．５１（Ｃ（５’））、５１．１９（Ｃ（３’））、３７．４４（Ｃ（２’））、３７．３２（Ｃ（６’））、２７．０１（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２１．０８（ＭｅＣＯ２）、１９．１４（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３７Ｈ４０Ｏ５Ｎ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６６２．２７９３、実測値６６２．２７８７。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛５’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−α−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（４４）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のヌクレオシド４３（９９０ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、３．０ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を室温で添加する。室温で３．５時間撹拌した後、溶液をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、ＴＨＦを減圧下で除去する。次いで、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中６％ＭｅＯＨ）によって精製して、４４（５７０ｍｇ、９０％）を微量のＴＢＡＦを含む白色フォームとして得る。
４４のデータ：Ｒｆ＝０．３３（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．６０（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．６７（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．０９（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．９６（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５１（ｔ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４２（ｔ、Ｊ＝７．５ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．３３（ｄｄ、Ｊ＝６．７、３．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．２５（ｄｄｄ、Ｊ＝９．７、６．４、５．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．９２（ｄｄ、Ｊ＝６．４、５．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．１４（ｂｒ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’）、ＯＨ）、３．０６（ｄｄ、Ｊ＝１６．０、６．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．８７（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．２、９．９、３．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．２６−２．１７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ２’））、２．１０−１．９８（ｍ、５Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、ＭｅＣＯ２）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．６４（ＭｅＣＯ２）、１６５．２７（ＣＯＮＨ）、１５２．４９（Ｃ（２））、１５１．２６（Ｃ（４））、１４９．５８（Ｃ（６））、１４１．６４（Ｃ（８））、１３３．６０（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．８２、１２８．７６、１２８．０６（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．３０（Ｃ（５））、８７．３０（Ｃ（１’））、８３．１７（Ｃ（４’））、７４．６７（Ｃ（７’））、７４．２０（Ｃ（５’））、５０．４１（Ｃ（３’））、３７．４３（Ｃ（２’））、３６．９２（Ｃ（６’））、２０．９６（ＭｅＣＯ２）．
Ｃ２１Ｈ２２Ｏ５Ｎ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４２４．１６１５、実測値４２４．１６２３。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛５’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（４５）
Figure 2021522862
 乾燥ピリジン（１６ｍＬ）中のヌクレオシド４４（５７０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（１．３７ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を１日間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×８０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、４５（８７６ｍｇ、８９％）を黄色フォームとして得る。
４５のデータ：Ｒｆ＝０．８１（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．４２（ｄ、Ｊ＝１４．６ Ｈｚ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、８．０３（ｄ、Ｊ＝７．６ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．９３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．６６−７．５５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５５−７．４５（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４５−７．２２（ｍ、７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８７（ｄ、Ｊ＝８．７ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．２５（ｄｄ、Ｊ＝６．６、２．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．４７−５．３３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．８９（ｄｄ、Ｊ＝６．７、４．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．０２（ｄ、Ｊ＝２．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．７９（ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．５８（ｄｄ、Ｊ＝１６．０、６．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．３８（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．７、１０．０、２．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１１（ｓ、３Ｈ、ＭｅＣＯ２）、２．０９−１．８７（ｍ、３Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７０．４０（ＭｅＣＯ２）、１６４．８４（ＣＯＮＨ）、１５８．６６（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５２．４５（Ｃ（２））、１５１．２２（Ｃ（４））、１４９．５１（Ｃ（６））、１４５．２３（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４１．２３（Ｃ（８））、１３６．５１、１３３．６５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．６８、１３０．１２、１２８．７５、１２８．３３、１２７．９５、１２７．９０、１２７．０３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．５５（Ｃ（５））、１１３．２７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．１９（Ｃ（Ｐｈ）３）、８７．１２（Ｃ（１’））、８３．２５（Ｃ（４’））、７７．１６（Ｃ（７’））、７４．４１（Ｃ（５’））、５５．２３（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．２３（Ｃ（３’））、３７．６１（Ｃ（２’））、３６．２２（Ｃ（６’））、２０．９８（ＭｅＣＯ２）．
Ｃ４２Ｈ４０Ｏ７Ｎ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値７２６．２９２２、実測値７２６．２９０５。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（４６）
Figure 2021522862
 ヌクレオシド４５（８７０ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中０．１Ｍ ＮａＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：４：１、５０ｍＬ）に０℃で溶解する。反応物を０℃で３０分間撹拌し、次いでＮＨ４Ｃｌ（３２１ｍｇ）を添加することによりクエンチする。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×８０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、４６（７７７ｍｇ、９４％）を白色フォームとして得る。
４６のデータ：Ｒｆ＝０．２６（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．３９（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．６１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、７．９３（ｄ、Ｊ＝７．４ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．７５（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．４６（ｔ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４０−７．３１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２９−７．１６（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．１１（ｔ、Ｊ＝７．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．７３（ｄ、Ｊ＝８．７ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．１２（ｄｄ、Ｊ＝６．５、１．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．５３（ｄｄ、Ｊ＝７．５、４．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．３２（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．９０（ｔ、Ｊ＝４．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．６６、３．６５（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．３１（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、２．３６（ｄｄ、Ｊ＝１６．５、８．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．０４（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．０、９．９、２．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．９２−１．６９（ｍ、３Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．９２（ＣＯＮＨ）、１５８．６４（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５２．６０（Ｃ（２））、１５１．２８（Ｃ（４））、１４９．６１（Ｃ（６））、１４５．４４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４０．７１（Ｃ（８））、１３６．７７、１３３．６５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．７２、１３０．１５、１３０．１２、１２８．７３、１２８．３９、１２８．０４、１２７．９６、１２７．０２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．２７（Ｃ（５））、１１３．２８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．１１（Ｃ（１’））、８７．０１（Ｃ（Ｐｈ）３）、８５．６０（Ｃ（４’））、７８．１６（Ｃ（７’））、７２．７２（Ｃ（５’））、５５．２８（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４８．８９（Ｃ（３’））、３９．９３（Ｃ（６’））、３７．５５（Ｃ（２’））．
Ｃ４０Ｈ３８Ｏ６Ｎ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６８４．２８１７、実測値６８４．２８００。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ６−ベンゾイル−９−｛５’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝アデニン（４７）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（７ｍＬ）中のヌクレオシド４６（１９９ｍｇ、０．２９０ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（５７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．１６ｍＬ、０．４９ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。６０分間撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、４７（１９７ｍｇ、２つの異性体の混合物、７７％）を白色フォームとして得る。
４７のデータ：Ｒｆ＝０．７５（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．９８（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）、８．６８、８．６７（２ｓ、１Ｈ、Ｃ（２））、７．９４（ｄ、Ｊ＝７．６ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．９０、７．８４（２ｓ、１Ｈ、Ｃ（８））、７．５６−７．４９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．４８−７．３４（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．３０−７．１０（ｍ、７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．８０−６．６９（ｍ、４Ｈ、Ｈａｒｏｍ）、６．２１、６．１５（２ｄｄ、Ｊ＝６．８、２．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．６９、４．５９（２ｄｄ、Ｊ＝７．３、４．５ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４４（ｔｔ、Ｊ＝１２．３、６．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．９０（ｄｄ、Ｊ＝９．０、３．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．８２−３．６３（ｍ、８Ｈ、ＭｅＯ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５９−３．４３（ｍ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２．６１−２．４９（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、２．４７−２．０７（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．９８−１．６６（ｍ、３Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．１５−１．０３（ｍ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．６７（ＣＯＮＨ）、１５８．７７（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５２．５８（Ｃ（２））、１５１．３４、１５１．２９（Ｃ（４））、１４９．４６（Ｃ（６））、１４５．５５、１４５．５４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１４１．５８、１４１．５０（Ｃ（８））、１３６．８７、１３６．８５、１３６．８４、１３３．８５（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３２．８５、１３０．２６、１３０．２３、１３０．２０、１２８．９７、１２８．４７、１２８．４３、１２８．０２、１２７．９６、１２７．０８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２３．６２、１２３．５８（Ｃ（５））、１１７．９１、１１７．７０（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．３７（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．８０、８７．６７（Ｃ（１’））、８７．２０、８７．１４（Ｃ（Ｐｈ）３）、８５．２９、８５．２２（（ＪＣ、Ｐ＝４．２、３．１ Ｈｚ、Ｃ（４’））、７８．１６、７７．９６（Ｃ（７’））、７４．２８、７３．９８（ＪＣ、Ｐ＝１４．８、１８．４ Ｈｚ、Ｃ（５’））、５８．８０、５８．６１（ＪＣ、Ｐ＝１６．２、１７．３ Ｈｚ ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、５５．３７、５５．３５（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．０２、４８．９１（Ｃ（３’））、４３．２９、４３．１６（ＪＣ、Ｐ＝８．９、９．０ Ｈｚ、（（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３９．０９（Ｃ（６’））、３７．９９、３７．９５（Ｃ（２’））、２４．８２、２４．７７、２４．７４、２４．７０、２４．６４（（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．４３、２０．４２（ＪＣ、Ｐ＝１．４、１．９ Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４８．１４、１４８．１１．
Ｃ４５Ｈ５６Ｏ７Ｎ８Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８８４．３８９５、実測値８８４．３９０４。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−２−アミノ−６−クロロ−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α−Ｄ−リボフラノシル｝プリン（４８）
Figure 2021522862
 ヌクレオシド２０（１．７８ｇ、３．０１ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：４：１、１５ｍＬ）中の０．５Ｍ ＮａＯＨに０℃で溶解する。反応物を０℃で２０分間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌ（４８４ｍｇ）の添加によりクエンチする。次いで、懸濁液を飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×７５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨ）によって精製して、４８（α−アノマー、９９２ｍｇ、６０％）および２１（β−アノマー、４２８ｍｇ、２５％）を白色フォームとして得る。
４８のデータ：Ｒｆ＝０．３４（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ７．７１−７．６０（ｍ、５Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−（Ｃ（８））、７．４９−７．３４（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０８（ｄｄ、Ｊ＝６．９、２．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．２６（ｓ、２Ｈ、ＮＨ２）、４．７０（ｄｄ、Ｊ＝７．５、４．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４７（ｄｔ、Ｊ＝１０．０、５．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１１（ｔ、Ｊ＝３．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．８７（ｄｄ、Ｊ＝１６．５、７．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．５７（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、２．２７（ｄｄｄ、Ｊ＝１４．０、９．９、２．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１０−２．０１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、１．９２−１．７６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．０６（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５９．０９（Ｃ（２））、１５３．０５（Ｃ（４））、１５１．４６（Ｃ（６））、１３９．９１（Ｃ（８））、１３５．７１（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．９６、１３３．２７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．００、１２９．９６、１２７．８６、１２７．８３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２５．５２（Ｃ（５））、８６．４６（Ｃ（１’））、８４．９２（Ｃ（４’））、７７．４０（Ｃ（７’））、７２．６３（Ｃ（５’））、５０．５５（Ｃ（３’））、４０．９２（Ｃ（６’））、３６．７８（Ｃ（２’））、２６．８８（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０１（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ２８Ｈ３３Ｏ３Ｎ５ＣｌＳｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５５０．２０３６、実測値５５０．２０１９。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−９−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（４９）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のヌクレオシド４８（６１０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．２８ｍＬ、４．１２ｍｍｏｌ）、続いて１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デス−５−エン（２８７ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を室温で添加する。室温で４時間撹拌した後、３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．２８ｍＬ、３．２３ｍｍｏｌ）の第２の部分、続いて１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デス−５−エン（２８７ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を添加する。反応物をさらに２日間撹拌し、次いでＣＣ（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）によって直接精製して、４９（５００ｍｇ、８７％）を白色フォームとして得る。
４９のデータ：Ｒｆ＝０．３０（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ ７．７３−７．６１（ｍ、５Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（８））、７．５３−７．３２（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０６（ｄｄ、Ｊ＝６．９、３．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．７４（ｄｄ、Ｊ＝７．０、４．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．４６−４．３６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．１１（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．９１（ｄｄ、Ｊ＝１６．２、６．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．３１（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．８、１０．０、３．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、１．９８−１．７８（ｍ、３Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（３’））、１．０７（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ １５９．３０（Ｃ（２））、１５５．１４（Ｃ（６））、１５２．３８（Ｃ（４））、１３７．２８（Ｃ（８））、１３６．９３、１３６．８８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３５．１３、１３４．７８（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３１．０７、１３１．０６、１２８．９１、１２８．８９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１７．９８（Ｃ（５））、８７．７２（Ｃ（１’））、８６．２５（Ｃ（４’））、７９．２１、（Ｃ（７’））７３．８７（Ｃ（５’））、５２．１３（Ｃ（３’））、４１．４４（Ｃ（６’））、３８．３５（Ｃ（２’））、２７．４２（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．８２（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ））．
Ｃ２８Ｈ３４Ｏ４Ｎ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５３２．２３８６、実測値５３２．２３６７。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−アセチル−９−｛５’−Ｏ−アセチル−７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−α−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（５０）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のヌクレオシド４９（５００ｍｇ、０．９４０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（２７６ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（１．０ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を室温で添加する。２日間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）を添加することにより反応物をクエンチする。次いで、混合物をＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３．５％ＭｅＯＨ）によって精製して、５０（４４１ｍｇ、７６％）を白色フォームとして得る。
５０のデータ：Ｒｆ＝０．６２（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １２．１１（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ−Ｃ（４））、９．９４（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（１））、７．６２（ｄ、Ｊ＝６．７ Ｈｚ、５Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（８））、７．４６−７．３１（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０３（ｄｄ、Ｊ＝６．７、２．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．３１（ｄｔ、Ｊ＝１０．３、５．２ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ５’））、４．９９−４．８１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．０２（ｄ、Ｊ＝３．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．８８（ｄｄ、Ｊ＝１６．０、６．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．４４−２．２０（ｍ、４Ｈ、ＭｅＣＯＮＨ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．１２−１．７３（ｍ、６Ｈ、ＭｅＣＯ２、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．０４（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７２．７３（ＭｅＣＯＮＨ）、１７０．４６（ＭｅＣＯ２）、１５５．８７（Ｃ（６））、１４８．０９（Ｃ（４））、１４７．４７（Ｃ（２））、１３７．１３（Ｃ（８））、１３５．７４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３３．６２、１３３．２９（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．１３、１３０．０９、１２７．９６、１２７．９３（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２１．５４（Ｃ（５））、８６．４７（Ｃ（１’））、８２．８１（Ｃ（４’））、７６．６０（Ｃ（７’））、７４．３７（Ｃ（５’））、５１．２３（Ｃ（３’））、３７．０４、３７．０１、（Ｃ（２’）、Ｃ（６’））２６．９２（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、２４．４６（ＭｅＣＯＮＨ）、２１．００（ＭｅＣＯ２）、１９．０５（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３２Ｈ３８Ｏ６Ｎ５Ｓｉ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６１６．２５８６、実測値６１６．２５８０。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−アセチル−９−｛５’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−α−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（５１）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中のヌクレオシド５０（４４０ｍｇ、０．７１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、１．１ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を室温で４時間撹拌し、次いでＣＣ（ＤＣＭ中１３％ＭｅＯＨ）によって直接精製して、５１（２３５ｍｇ、８７％）を白色フォームとして得る。Ｘ線分析に好適な結晶を、Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨの混合物からの再結晶によって得る。
５１のデータ：Ｒｆ＝０．２５（ＤＣＭ中１３％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ ８．０３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、６．２８（ｄｄ、Ｊ＝７．０、３．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．２１（ｄｄｄ、Ｊ＝９．２、６．８、５．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．９８（ｄｄ、Ｊ＝６．７、５．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−（４’））、４．１３−４．０５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．１７−３．０５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．８６（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．８、１０．０、３．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．３９−２．２７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’））、２．２４（ｓ、３Ｈ、ＭｅＣＯＮＨ）、２．１６−２．００（ｍ、５Ｈ、ＭｅＣＯ２、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）δ １７４．９５（ＭｅＣＯＮＨ）、１７２．３２（ＭｅＣＯ２）、１５７．５０（Ｃ（６））、１４９．９６（Ｃ（４））、１４９．３８（Ｃ（２））、１３９．６６（Ｃ（８））、１２１．７６（Ｃ（５））、８８．２３（Ｃ（１’））、８４．２３（Ｃ（４’））、７５．８３（Ｃ（５’）、Ｃ（７’））、５１．６５（Ｃ（３’））、３８．０４、３７．９３（Ｃ（２’）、Ｃ（６’））、２３．８３（ＭｅＣＯＮＨ）、２０．７１（ＭｅＣＯ２）．
Ｃ１６Ｈ２０Ｏ６Ｎ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値３７８．１４０８、実測値３７８．１４１９。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−アセチル−９−｛５’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（５２）
Figure 2021522862
 乾燥ピリジン（１０ｍＬ）中のヌクレオシド５１（１８６ｍｇ、０．４９２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（５０１ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を室温で添加する。溶液を２日間撹拌し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、５２（３３３ｍｇ、９９％）を黄色フォームとして得る。
５２のデータ：Ｒｆ＝０．５６（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １２．０５（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ−Ｃ（４））、９．９０（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（１））、７．４０（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（８））、７．３８−７．３１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２８−７．０８（ｍ、７Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．７５（ｄｄ、Ｊ＝９．０、２．７ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．９５−５．８５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．３０−５．１０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、４．７０−４．５８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、３．８１（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．６８、３．６８（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、２．２５−２．０７（ｍ、５Ｈ、ＭｅＣＯＮＨ、Ｈ−Ｃ（３’）、Ｈ−Ｃ（２’））、１．９６−１．７９（ｍ、５Ｈ、ＭｅＣＯ２、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．７４−１．５９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １７２．６５（ＭｅＣＯＮＨ）、１７０．４２（ＭｅＣＯ２）、１５８．７３、１５８．７０（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５５．８６（Ｃ（６））、１４７．９６（Ｃ（４））、１４７．４３（Ｃ（２））、１４５．３１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３７．１７（Ｃ（８））、１３６．６９、１３６．４４（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．３２、１３０．２１、１２８．２９、１２８．０５、１２７．０９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２１．５３（Ｃ（５））、１１３．３８、１１３．３５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．２５（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．７３（Ｃ（１’））、８２．７７（Ｃ（４’））、７７．１９（Ｃ（７’））、７４．３７（Ｃ（５’））、５５．３８（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．２８（Ｃ（３’））、３７．２５（Ｃ（２’））、３６．０６（Ｃ（６’））、２４．４０（ＭｅＣＯＮＨ）、２１．０１（ＭｅＣＯ２）．
Ｃ３７Ｈ３８Ｏ８Ｎ５（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６８０．２７１５、実測値６８０．２７１８。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）−９−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（５３）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のヌクレオシド５２（３３３ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（３０５ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を室温で添加する。懸濁液を室温で７時間撹拌し、次いでＮＨ４Ｃｌ（７８ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物をＳｉＯ２のショートパッドを通して濾過する。ＳｉＯ２を追加のＭｅＯＨで洗浄した後、溶媒を蒸発させる。
粗生成物を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（０．３３ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を５５℃で２時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去する。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中７％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、５３（２４５ｍｇ、７７％）を微量のＥｔ３Ｎを含む白色フォームとして得る。
５３のデータ：Ｒｆ＝０．３２（ＤＣＭ中１２％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．７５（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（１））、８．２５（ｓ、１Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、７．３７（ｄ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．２９−７．０８（ｍ、８Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（８））、６．７４（ｄ、Ｊ＝８．１ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．０３（ｄｄ、Ｊ＝６．７、２．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．５７（ｄｄ、Ｊ＝７．５、４．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．３７−４．２６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、３．８９（ｔ、Ｊ＝３．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．６７、３．６７（２ｓ、６Ｈ、ＭｅＯ）、３．２４（ｂｒ、１Ｈ、ＯＨ）、２．９４（ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．８７（ｓ、３Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．３５（ｄｄ、Ｊ＝１５．９、７．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、１．９４−１．６８（ｍ、４Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．６１（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５８．２８（Ｃ（２））、１５７．９２（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、１５６．６９（Ｃ（６））、１４９．９０（Ｃ（４））、１４５．５２、１３６．８６、１３６．７７（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．５０（Ｃ（８））、１３０．１５、１２８．３２、１２７．９２、１２６．９５（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２０．２７（Ｃ（５））、１１３．２４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８６．９２（Ｃ（Ｐｈ）３）、８５．５７（Ｃ（１’））、８５．１２（Ｃ（４’））、７８．３１（Ｃ（７’））、７２．６９（Ｃ（５’））、５５．２８（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．２８（Ｃ（３’））、４１．３８（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３９．７７（Ｃ（６’））、３７．５８（Ｃ（２’））、３５．０４（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）．
Ｃ３６Ｈ３９Ｏ６Ｎ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６５１．２９２６、実測値６５１．２９２１。
（３’Ｓ，５’Ｒ，７’Ｒ）−Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジノ）−９−｛５’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）−ジイソプロピルアミノホスファニル］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−α−Ｄ−リボフラノシル｝グアニン（５４）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のヌクレオシド５３（２４５ｍｇ、０．３７７ｍｍｏｌ）および５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（７４ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．２０ｍＬ、０．６４ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。５０分間撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×２５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中３％ＭｅＯＨ、＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって精製して、５４（２１２ｍｇ、２つの異性体の混合物、６７％）を白色フォームとして得る。
５４のデータ：Ｒｆ＝０．４２（ＤＣＭ中７％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．３５（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（１））、８．５１、８．４９（２ｓ、１Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、７．４１−７．１０（ｍ、１０Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ、Ｈ−Ｃ（８））、６．８３−６．７０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．１５−６．００（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、４．６４−４．３６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’）、Ｈ−Ｃ（５’））、３．９０−３．８２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、３．８０−３．６２（ｍ、８Ｈ、ＭｅＯ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、３．５９−３．４３（ｍ、２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、３．０４、３．０２（２ｓ、６Ｈ、ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２．６７−２．４８（ｍ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、２．３２（ｄｄｄ、Ｊ＝２４．１、１５．１、６．７ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．０２−１．６３（ｍ、４Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．１４−１．０３（ｍ、１２Ｈ、（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １５８．７６（ＭｅＯ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１５８．１７、１５８．１２（Ｃ（２））、１５８．０３（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、１５６．６６、１５６．５９（Ｃ（６））、１４９．８５、１４９．７９（Ｃ（４））、１４５．５１、１４５．４９、１３６．８４、１３６．７７、１３６．７３、１３６．７１（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．７６、１３５．５９（Ｃ（８））、１３０．２４、１３０．２０、１２８．４１、１２８．３３、１２８．０２、１２７．１０、１２７．０８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１２０．７４、１２０．７０（Ｃ（５））、１１７．９８、１１７．７２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、１１３．３４（ＣＨ−ａｒｏｍ）、８７．１６、８７．１０（Ｃ（Ｐｈ）３）、８６．００、８５．７２（Ｃ（１’））、８４．１３、８４．１０（ＪＣ、Ｐ＝３．６、２．５ Ｈｚ、Ｃ（４’））、７８．０２、７７．６７（Ｃ（７’））、７４．１５、７３．７４（ＪＣ、Ｐ＝１５．３、１８．７ Ｈｚ、Ｃ（５’））、５８．９０、５８．６７（ＪＣ、Ｐ＝１８．７、１９．７ Ｈｚ ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）、５５．３８、５５．３６（ＭｅＯ−ＤＭＴｒ）、４９．２０、４９．０９（Ｃ（３’））、４３．２０、４３．１５（ＪＣ、Ｐ＝１２．４、１２．６ Ｈｚ、（（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、４１．４２、４１．３８（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、３８．６８、３８．６５（Ｃ（６’））、３７．９７、３７．８４（Ｃ（２’））、３５．２５（ＮＣＨＮ（ＣＨ３）２）、２４．８３、２４．７５、２４．６８、２４．６０、２４．５３（（Ｍｅ２ＣＨ）２Ｎ）、２０．３５、２０．２８（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）．
３１Ｐ ＮＭＲ（１２１ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １４８．２１、１４８．０１．
Ｃ４５Ｈ５６Ｏ７Ｎ８Ｐ（［Ｍ＋Ｈ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値８５１．４００４、実測値８５１．４０１３。
（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＳ）−４−（（Ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ）−２−メトキシヘキサヒドロ−２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−６−イル（４−ニトロベンゾエート）（５５）
Figure 2021522862
 乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の糖６（１９５ｍｇ、０．４３７ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（７０ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ニトロベンゾイルクロリド（１５８ｍｇ、０．８５０ｍｍｏｌ）を室温で添加する。一晩撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３（３ｍＬ）をゆっくりと添加することにより反応物をクエンチする。次いで、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１５ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：５）により精製して、アノマー比α／β
Figure 2021522862
 ４：１の５５（２６０ｍｇ、９８％）の混合物を白い固体として得る。
５５のデータ：Ｒｆ＝０．６２（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：２）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．３３−８．１７（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．７２−７．６１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５１−７．３２（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、５．６５−５．４７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、４．９７（ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．６ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（２））、４．８７（ｔ、Ｊ＝５．８ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６ａ））、４．１８（ｄ、Ｊ＝５．０ Ｈｚ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．９８（ｄ、Ｊ＝３．５ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（４））、３．２１（ｄ、Ｊ＝１５．１ Ｈｚ、３Ｈ、ＭｅＯ）、２．８８（ｄｄ、Ｊ＝１６．６、７．９ Ｈｚ、０．８Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、２．７５−２．６２（ｍ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（３ａ））、２．４９−２．３４（ｍ、０．２Ｈ、Ｈ−Ｃ（５））、２．２４−１．８３（ｍ、２．８Ｈ、Ｈ−（５）、Ｈ−Ｃ（３））、１．２８（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．０、７．９、４．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３））、１．０９（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．４６、１６４．４１（ＣＯ２Ｒ）、１５０．６３（Ｏ２Ｎ−Ｃ−ａｒｏｍ）、１３５．８７、１３５．８２（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３４．０７、１３３．７５、１３３．６９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３０．９８、１３０．８９、１２９．９８、１２９．９６、１２９．９１、１２７．８９、１２７．８７、１２７．８５、１２３．５９（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１０６．４９、１０６．３９（Ｃ（２））、８３．２１、７９．８７（Ｃ（６ａ））、７６．５４（Ｃ（４））、７６．０９（Ｃ（６））、５４．５５、５４．４７（ＭｅＯ）、５１．６９、５０．３０（Ｃ（３ａ）、３８．０７（Ｃ（３））、３７．１７、３６．６５（Ｃ（５））、２７．０４、２６．９９ ９０（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．１４（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
Ｃ３１Ｈ３５Ｏ７ＮａＳｉ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値５８４．２０７５、実測値５８４．２０８５。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛７’−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−５’−Ｏ−（４−ニトロベンゾエート）−α，β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（５６）
Figure 2021522862
 乾燥ＭｅＣＮ（３ｍＬ）中の糖５５（２６０ｍｇ、０．４６３ｍｍｏｌ）およびチミン（８４ｍｇ、０．６９５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＳＡ（０．３４ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）を室温で滴下して添加する。室温で３０分間撹拌した後、溶液を０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（０．１０ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。さらに０℃で２時間および室温で１８時間撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（４×４０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ）によって精製して、アノマー比α／β
Figure 2021522862
 ８８：１２の５６（２４０ｍｇ、７９％）の混合物を白色フォームとして得る。
５６のデータ：Ｒｆ＝０．５６（ＤＣＭ＋３％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ９．３８（ｂｒ、１Ｈ、（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、８．３２−８．２３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、８．２２−８．１１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．６５（ｄｄ、Ｊ＝７．７、１．５ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．５０−７．３６（ｍ、６Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、６．９５（ｄ、Ｊ＝０．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、５．９６（ｔ、Ｊ＝６．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．５５（ｄｔ、Ｊ＝９．９、６．０ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、５．１３（ｄｄ、Ｊ＝６．４、５．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．２０−４．０５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．９４−２．７８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．２２（ｄｄ、Ｊ＝１３．３、６．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’））、２．０９−１．７３（ｍ、６Ｈ、Ｈ−Ｃ（６’）、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｍｅ−Ｃ（５））、１．０９（ｓ、９Ｈ、（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（７５ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １６４．３２、１６３．７９（Ｃ（４）、ＣＯ２Ｒ）、１５０．６５、１５０．３９（Ｏ２Ｎ−Ｃ−ａｒｏｍ、Ｃ（２））、１３５．７０、１３５．６８（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１３５．１３（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３４．８３（Ｃ（６））、１３３．４６、１３３．１０（Ｃ−ａｒｏｍ）、１３０．９１、１３０．７３、１３０．１１、１２７．９３、１２３．６０（ＣＨ−ａｒｏｍ）、１１１．３０（Ｃ（５））、８７．２６（Ｃ（１’））、８２．４４（Ｃ（４’））、７６．４０（Ｃ（７’））、７６．０７（Ｃ（５’））、５０．７６（Ｃ（３’））、３７．９４（Ｃ（６’））、３６．６８（Ｃ（２’））、２６．８９（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１９．０３（（ＣＨ３）３−Ｃ−Ｓｉ）、１２．６２（Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ３５Ｈ３７Ｏ８Ｎ３ＮａＳｉ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値６７８．２２４２、実測値６７８．２２５４。
（３’Ｒ，５’Ｒ，７’Ｒ）−１−｛２’，３’−ジデオキシ−３’，５’−エタノ−７’−ヒドロキシ−５’−Ｏ−（４−ニトロベンゾイル）−α，β−Ｄ−リボフラノシル｝チミン（５７）
Figure 2021522862
 乾燥ＴＨＦ（２ｍＬ）中のヌクレオシド５６（２２０ｍｇ、０．３３５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、０．８４ｍＬ、０．８４ｍｍｏｌ）を室温で添加する。室温で４時間撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）およびＤＣＭ（２×８０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＣＣ（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製して、５７（１０１ｍｇ、７２％）のアノマー混合物を得る。Ｘ線分析に好適な結晶を、ＥｔＯＡｃ中の再結晶によって得る。
５７のデータ：Ｒｆ＝０．５０（ＤＣＭ＋７％ＭｅＯＨ）：
１Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ８．９６（ｂｒ、１Ｈ、Ｈ−Ｎ（３））、８．３４−８．１７（ｍ、４Ｈ、Ｈ−ａｒｏｍ）、７．０７（ｄ、Ｊ＝１．１ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（６））、６．１１（ｔ、Ｊ＝６．３ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（１’））、５．５７−５．４５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（５’））、５．１５（ｄｄ、Ｊ＝６．６、５．４ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（４’））、４．３８−４．２３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（７’））、２．９６（ｄｄ、Ｊ＝１３．５、６．９ Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ（３’））、２．２６（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．１、１０．３、５．４ Ｈｚ、４Ｈ、Ｈ−Ｃ（２’）、Ｈ−Ｃ（６’））、１．９１（ｄ、Ｊ＝０．９ Ｈｚ、３Ｈ、Ｍｅ−Ｃ（５））．
Ｃ１９Ｈ１９Ｏ８Ｎ３Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）についてのＥＳＩ＋−ＨＲＭＳ ｍ／ｚ 計算値４４０．１０６４、実測値４４０．１０７２。
アルファアノマーオリゴヌクレオチドの合成、脱保護、および精製のプロセス
ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含むオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法に従い、以下に説明するように、合成装置、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉ−Ｇｅｎｅ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ−ＰｌｕｓＤＮＡ合成装置で合成することができる。本発明のａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成の工程を以下に示す：
Figure 2021522862
オリゴヌクレオチド合成は、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒの製造元が推奨するプロトコルに従い、Ｐｈａｒｍａｃｉ−Ｇｅｎｅ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ−Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成装置で１．３μｍｏｌスケールで行われる。天然ＤＮＡホスホルアミダイト（ｄＴ、ｄＣ４ｂｚ、ｄＧ２ＤＭＦ、ｄＡ６Ｂｚ）および固体支持体（Ｇｌｅｎ Ｕｎｙｓｕｐｐｏｒｔ ５００）をＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入する。天然ＤＮＡホスホルアミダイトをＭｅＣＮ中の０．１Ｍ溶液として調製し、４分間の工程を使用して結合する。ａｂｃ−ＤＮＡホスホルアミダイトを１，２−ジクロロエタン中の０．１Ｍ溶液として調製し、結合剤として５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（ＭｅＣＮ中０．２５Ｍ）を使用して１２分の伸長工程を使用して結合する。修飾ヌクレオシドの脱トリチル化を、ジクロロエタン中の５％ジクロロ酢酸の溶液を使用して行う。酸化は、ＭｅＣＮ／水／コリジン（３２：３：１５）中の０．０１Ｍヨウ素の溶液中で、１分の反応時間で行う。硫化は、ＭｅＣＮ／ピリジン（１：１）中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィドの溶液を使用して、３．５分の反応時間で行う。キャッピングは、標準状態を使用して行う。固体支持体からの切断およびオリゴヌクレオチドの脱保護は、５５℃で１６時間にわたる濃アンモニアでの処理によって達成される。遠心分離後、上清を回収し、ビーズをさらにＨ２Ｏ（０．５ｍＬＸ２）で洗浄し、得られた溶液を蒸発乾固させる。粗オリゴヌクレオチドを、イオン交換ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ−ＤＮＡ ＰａｃＰＡ２００）によって精製する。Ｈ２Ｏ、ｐＨ８．０中の２５ｍＭ Ｔｒｉｚｍａの緩衝液を移動相「Ａ」として使用し、Ｈ２Ｏ、ｐＨ８．０中の２５ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ、１．２５Ｍ ＮａＣｌを移動相「Ｂ」として使用した。ホスホロチオエート鎖については、Ｈ２Ｏ、ｐＨ１２．０中の１０ｍＭ ＮａＯＨの緩衝液を移動相「Ａ」として使用し、Ｈ２Ｏ、ｐＨ１２．０中の１０ｍＭ ＮａＯＨ、２．５０Ｍ ＮａＣｌを移動相「Ｂ」として使用した。次いで、精製されたオリゴヌクレオチドをＳｅｐ−ｐａｋ Ｃ−１８カートリッジで脱塩する。対応する天然ＤＮＡオリゴヌクレオチドの減衰係数を使用し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することによって、濃度を決定する。オリゴヌクレオチドの特徴付けは、ＥＳＩ−質量分析またはＬＣ−ＭＳによって行う。
医薬組成物
特定の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。オリゴヌクレオチド試料は、試料の十分な部分が細胞に入り、効果、例えば、エクソンスキッピングを誘発することを可能にする任意の手段によって、適切に製剤化され、細胞の環境に導入することができる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アルブミンに事前に装填され、オリゴヌクレオチド−アルブミン複合体として投与される。オリゴヌクレオチドの多くの製剤は、当該技術分野で既知であり、オリゴヌクレオチドが標的細胞に侵入して作用できる限り、使用することができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、およびキャプシド中で製剤化することができる。カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチド剤の製剤は、細胞へのオリゴヌクレオチド剤のトランスフェクションを促進するために使用することができる。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（公開されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ９７／３０７３１号）などのポリカチオン性分子を使用することができる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，コロラド州ボールダー）、またはＦｕＧｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれ、これらはすべて製造元の説明書に従って使用することができる。
そのような組成物は、典型的には、核酸分子および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語には、医薬投与と適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助活性化合物も、組成物に組み込むことができる。
医薬組成物は、意図した投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内、経皮（局所）、経粘膜、髄腔内、脳室内、腹腔内、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分：滅菌希釈液、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩な、および張性調整剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが含まれ得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨て可能な注射器、または複数回投与バイアルに入れることができる。
注射可能な使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。製造および保存条件下で安定している必要があり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。好適な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合で必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上記で列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらにより、活性成分の粉末、および以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分が得られる。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用され得る。うがい薬として使用するための流体担体を使用して、経口組成物を調製することもできる。医薬的に適合する結合剤および／または補助物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチン、賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチ、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス、流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素、甘味料、例えば、ショ糖もしくはサッカリン、またはフレーバー剤、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバー。
吸入による投与の場合、化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。そのような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記載される方法が含まれる。
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によることができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般に既知であり、例えば、経粘膜投与用の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤の使用により行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野で一般に既知であるように軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに製剤化される。
本発明はまた、乾燥粉末送達方法を提供する。
化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを用いて）または保持浣腸の形態で調製することができる。
化合物はまた、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０）１００６−１０（ｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）；またはＰｕｔｎａｍ（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍ ａｔ Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）に記載される方法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法を使用するトランスフェクションまたは感染によって投与することができる。
化合物はまた、ＤＮＡワクチンなどの核酸剤の投与に好適な任意の方法によって投与することができる。これらの方法には、遺伝子銃、バイオインジェクター、皮膚パッチ、ならびに米国特許第６，１９４，３８９号に開示されている微粒子ＤＮＡワクチン技術などの注射針を使わない方法、および米国特許第６，１６８，５８７号に開示されている粉末形態ワクチンによる哺乳動物の注射針を使わない経皮ワクチン接種が含まれる。さらに、特に、Ｈａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０に記載されるような、鼻腔内送達が可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に記載される）およびマイクロカプセル化も使用することができる。生分解性の標的化可能な微粒子送達システム（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に記載される）も使用することができる。
一実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの身体からの急速な排除から化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性かつ生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。これらの材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いた感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、製薬上許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような当業者に既知の方法に従って調製することができる。
このような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療有効用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果および治療効果の間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することもできるが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を減らすために、罹患組織の部位にそのような化合物を標的とする送達システムを設計するように注意する必要がある。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を策定するのに使用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんどないかまたは全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルにおいて処方し得る。そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
本明細書で定義するように、治療有効量の核酸分子（すなわち、有効投与量）は、選択された核酸に依存する。例えば、約１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単回投与量を投与し得、いくつかの実施形態では、１０、３０、１００、もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｍｇを投与し得る。いくつかの実施形態では、１〜５ｇの組成物を投与することができる。組成物は、１日おきにまたは１ヶ月に１回以上を含む、１日に１回以上〜週に１回以上で投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全身の健康および／または年齢、ならびに他の存在する他の疾患などを含むがこれらに限定されない、特定の要因が対象を効果的に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドによる対象の処置は、単一の処置を含むことができ、または好ましくは一連の処置を含むことができる。
特定の実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドの投与量は、５ｍｇ／ｋｇ／週〜５００ｍｇ／ｋｇ／週、例えば、５ｍｇ／ｋｇ／週、１０ｍｇ／ｋｇ／週、１５ｍｇ／ｋｇ／週、２０ｍｇ／ｋｇ／週、２５ｍｇ／ｋｇ／週、３０ｍｇ／ｋｇ／週、３５ｍｇ／ｋｇ／週、４０ｍｇ／ｋｇ／週、４５ｍｇ／ｋｇ／週、５０ｍｇ／ｋｇ／週、５５ｍｇ／ｋｇ／週、６０ｍｇ／ｋｇ／週、６５ｍｇ／ｋｇ／週、７０ｍｇ／ｋｇ／週、７５ｍｇ／ｋｇ／週、８０ｍｇ／ｋｇ／週、８５ｍｇ／ｋｇ／週、９０ｍｇ／ｋｇ／週、９５ｍｇ／ｋｇ／週、１００ｍｇ／ｋｇ／週、１５０ｍｇ／ｋｇ／週、２００ｍｇ／ｋｇ／週、２５０ｍｇ／ｋｇ／週、３００ｍｇ／ｋｇ／週、３５０ｍｇ／ｋｇ／週、４００ｍｇ／ｋｇ／週、４５０ｍｇ／ｋｇ／週、および５００ｍｇ／ｋｇ／週の範囲である。特定の実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドの投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ／週〜２００ｍｇ／ｋｇ／週、２０ｍｇ／ｋｇ／週〜１５０ｍｇ／ｋｇ／週、または２５ｍｇ／ｋｇ／週〜１００ｍｇ／ｋｇ／週の範囲である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２週間〜６ヶ月の期間、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、２６週間、６ヶ月、８ヶ月、１０ヶ月、または１年以上にわたり、週に１回投与される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、週に２回投与される。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは隔週で投与される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは静脈内投与される。
オリゴヌクレオチド剤を細胞の環境に導入する方法は、細胞の種類およびその環境の構成に依存することが理解され得る。例えば、細胞が液体内に見出される場合、１つの好ましい製剤は、リポフェクタミンなどの脂質製剤であり、オリゴヌクレオチド剤は、細胞の液体環境に直接添加することができる。脂質製剤はまた、静脈内、筋肉内、もしくは腹腔内注射などによって、または経口的に、または吸入により、または当該技術分野で既知の他の方法により、動物に投与することができる。製剤が哺乳動物、より具体的にはヒトなどの動物への投与に好適である場合、製剤はまた薬学的に許容される。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤が、既知であり、使用することができる。いくつかの場合では、卵母細胞を用いた研究のように、緩衝液または生理食塩水中でオリゴヌクレオチド剤を製剤化し、製剤化されたオリゴヌクレオチド剤を細胞に直接注射することが好ましいことがあり得る。オリゴヌクレオチドの直接注射を行ってもよい。
好適な量のオリゴヌクレオチド剤を導入する必要があり、これらの量は、標準的な方法を使用して経験的に決定することができる。典型的には、細胞環境における個々のオリゴヌクレオチド剤種の有効濃度は、約５０ナノモル以下、１０ナノモル以下、または約１ナノモル以下の濃度を使用することができる組成物であろう。別の実施形態では、約２００ピコモル以下の濃度、さらには約５０ピコモル以下、約２０ピコモル以下、約１０ピコモル以下、または約５ピコモル以下の濃度を利用する方法を多くの状況で使用することができる。
方法は、オリゴヌクレオチド剤組成物が、十分な量のオリゴヌクレオチド剤が細胞に入ってその効果を発揮することができるように製剤化されるという条件で、細胞が生きることができる任意の細胞外マトリックスにオリゴヌクレオチド剤組成物を添加することによって実施することができる。例えば、方法は、液体培養物または細胞増殖培地などの液体中、組織外植片、または哺乳動物、特にヒトなどの動物を含む全生物に存在する細胞での使用に適している。
オリゴヌクレオチド剤は、薬理学的有効量のオリゴヌクレオチド剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化することができる。薬理学的有効量または治療有効量は、意図された薬理学的、治療的、または予防的結果を生ずるのに有効なオリゴヌクレオチド剤の量を指す。「薬理学的有効量」および「治療的有効量」または単に「有効量」という語句は、意図された薬理学的、治療的、または予防的結果を生ずるのに有効なオリゴヌクレオチドの量を指す。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータが少なくとも２０％減少したときに、所与の臨床処置が有効であるとみなされる場合、その疾患または障害の処置のための薬剤の治療有効量は、そのパラメータを少なくとも２０％減少するのに必要な量である。
好適に製剤化された本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣、および局所（口腔および舌下を含む）投与を含む、非経口経路などの当該技術分野で既知の任意の手段によって投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内または非経口注入もしくは注射によって投与される。
一般に、オリゴヌクレオチドの好適な投与量単位は、１日あたりレシピエントの体重１キログラムあたり０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲、もしくは１日あたり体重１キログラムあたり０．０１〜２０マイクログラムの範囲、もしくは１日あたり体重１キログラムあたり０．０１〜１０マイクログラム、もしくは１日あたり体重１キログラムあたり０．１０〜５マイクログラムの範囲、または１日あたり体重１キログラムあたり０．１〜２．５マイクログラムの範囲であろう。特定の実施形態では、投与量は、１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日あたり５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、１日１回投与することができる。しかしながら、治療剤はまた、１日を通して適切な間隔で投与される２、３、４、５、６またはそれ以上のサブ用量を含む投与量単位で投与され得る。その場合、各サブ用量に含まれるオリゴヌクレオチドは、１日の総投与単位を達成するために、相応して小さくする必要がある。投与単位はまた、例えば、数日間にわたってオリゴヌクレオチドの持続的で一貫した放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる単回投与のために配合することができる。徐放性製剤は、当該技術分野で周知である。この実施形態では、投与量単位は、対応する１日用量の倍数を含む。製剤に関係なく、医薬組成物は、活性である、例えば、処置される動物またはヒトにおいてエクソンスキッピングを引き起こし、または標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量のオリゴヌクレオチドを含む必要がある。組成物は、オリゴヌクレオチドの複数ユニットの合計が一緒に十分な用量を含むように配合することができる。
データを細胞培養アッセイおよび動物実験から取得して、ヒトでの好適な投与量範囲を策定することができる。本発明の組成物の投与量は、毒性がほとんどないかまたは全くない、ＥＤ５０（既知の方法によって決定される）を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物について、処置上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で決定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで処方することができる。このような情報は、ヒトの有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のオリゴヌクレオチドのレベルは、標準的な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
医薬組成物は、投与説明書と共にキット、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
処置方法
本発明は、標的ＲＮＡの発現および／またはそのような標的ＲＮＡの存在によって全体的または部分的に引き起こされる疾患または障害のリスクがある（またはそれらにかかりやすい）対象を処置する、予防的および治療的方法の両方を提供する。
本明細書で使用される「処置」または「処置すること」は、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド剤もしくはベクターまたはそれらをコードする導入遺伝子）を患者に適用または投与すること、あるいは治療剤を、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害に対する素因を治療する、治癒する、和らげる、緩和する、変化させる、治す、良くする、改善する、または影響を与えることを目的として、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者から単離された組織または細胞株に適用または投与することとして定義される。
一態様では、本発明は、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子）を対象に投与することによって、対象において上記の疾患または障害を予防するための方法を提供する。疾患のリスクのある対象は、例えば、本明細書に記載の診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定することができる。予防剤の投与は、疾患もしくは障害が予防されるか、あるいはその進行が遅れるように、対象における例えばウイルス粒子の検出前、または疾患もしくは障害に特徴的な症状の発現前に行うことができる。
本発明の別の態様は、対象を治療的に処置する方法、すなわち、疾患または障害の症状の発症を変化させる方法に関する。これらの方法は、インビトロで（例えば、細胞をオリゴヌクレオチド剤と共に培養することによって）、またはインビボで（例えば、オリゴヌクレオチド剤を対象に投与することによって）行うことができる。
予防的および治療的処置方法の両方に関して、そのような処置は、ファーマコゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて特定的に調整または修正され得る。本明細書で使用される「ファーマコゲノミクス」は、ゲノミクス技術、例えば、遺伝子配列決定、統計遺伝学、および遺伝子発現分析を臨床開発中および上市の薬物への適用することを指す。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子が薬物に対する応答をどのように決定するか（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）の研究を指す。ファーマコゲノミクスにより、臨床医または医師は、処置から最も恩恵を受ける患者に対して、予防的または治療的処置を標的化し、毒性の薬物関連副作用を経験する患者の処置を回避することができる。
治療剤は、適切な動物モデルで試験することができる。例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤（またはそれをコードする発現ベクターまたは導入遺伝子）を動物モデルで使用して、薬剤による処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、治療剤を動物モデルで使用して、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。例えば、薬剤を動物モデルで使用して、そのような薬剤による処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、薬剤を動物モデルで使用して、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。
さらに、ａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドの治療効果は、筋肉機能、握力、呼吸機能、ＭＲＩによる心臓機能、筋肉生理学を評価することによって決定される。補体の活性化および血液凝固がまた、オリゴヌクレオチドの負の副作用を調べるために決定される。
疾患
本発明のオリゴヌクレオチドは、異常なレベルのｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡに基づく疾患の処置または予防のために、転写、翻訳、スプライシング、および／もしくは分解を妨害することにより、ならびに／または非コードＲＮＡの機能を阻害することにより、遺伝子発現を調節するのに有用である。本発明の細胞の投与後に１つ以上の疾患症状が減少または排除される場合、対象は、疾患について処置されると言われる。
本発明のａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのレベルまたは活性を調節することができる。標的ＲＮＡのレベルまたは活性は、当該技術分野で現在既知であるか、または後に開発される任意の好適な方法によって決定することができる。標的ＲＮＡおよび／または標的ＲＮＡの発現を測定するために使用される方法は、標的ＲＮＡの性質に依存し得ることが理解され得る。例えば、標的ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、「発現」という用語は、標的ＲＮＡに由来するタンパク質またはＲＮＡ／転写物を指すことができる。そのような場合、標的ＲＮＡの発現は、標的ＲＮＡに対応するＲＮＡの量を測定することによって、またはタンパク質産物の量を測定することによって決定することができる。タンパク質は、染色もしくはイムノブロッティングなどのタンパク質アッセイにより、またはタンパク質が測定することができる反応を触媒する場合には反応速度を測定することにより、測定することができる。そのような方法はすべて、当該技術分野で既知であり、使用することができる。標的ＲＮＡレベルを測定する場合、ＲＮＡレベルを検出するための当該技術分野で認められている任意の方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなど）を使用することができる。上記の測定のいずれも、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、または任意の他の好適な供給源材料に対して行うことができる。
本発明のａｂｃ−ＤＮＡ脂質コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ発現を調節するマイクロＲＮＡまたは他の非コードＲＮＡの発現を調節するために使用される。
マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の転写後調節を指示する小さな非コードＲＮＡであり、長さは約２０〜２５ヌクレオチドである。それらは、メッセンジャーＲＮＡの３’非翻訳領域への配列特異的ハイブリダイゼーションを介して複数の標的遺伝子の発現を調節する。これらのマイクロＲＮＡは、翻訳をブロックすることができ、または標的メッセンジャーＲＮＡを直接分解することができる。
目的のｍｉＲＮＡに結合する本発明のａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドが合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡに結合し、ｍｉＲＮＡがその標的ｍＲＮＡに結合するのを防止するように設計されている。上記の例で説明したように、ａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、インビトロおよびインビボでｍｉＲＮＡ結合を調節するために使用することができる。
長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、タンパク質をコードしない（または１００アミノ酸超のオープンリーディングフレームを欠く）タンパク質をコードしない、２００ヌクレオチド超の長さを有する、大きく多様なクラスの転写されたＲＮＡ分子である。ｌｎｃＲＮＡは、遺伝子発現の重要な調節因子であり、ｌｎｃＲＮＡは、細胞および発生プロセスにおいて広範な機能を有すると考えられている。ｌｎｃＲＮＡは、様々な機序を介して遺伝子阻害および遺伝子活性化の両方を行い得る。ｌｎｃＲＮＡの検証された機能は、ｌｎｃＲＮＡが、遺伝子発現の主要調節因子であり、しばしば、クロマチン構造を調節することによってエピジェネティックな機序を介して影響を与えることを示唆している。
目的の標的ｌｎｃＲＮＡに相補的な本発明のａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドが合成される。核内では、それらは標的とされるｌｎｃＲＮＡとハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成する。
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＮ２遺伝子におけるエクソン７含入）、筋強直性ジストロフィー症（ＣＡＧｎを有する標的ＣＵＧｅｘｐ−ＤＭＰＫ転写物）、ハンチントン病（ＣＡＧ三塩基伸長を標的とする対立遺伝子選択的および非選択的アプローチ）、筋萎縮性側索硬化症（いくつかの原因遺伝子による遺伝的に不均一な障害）、およびポンペ病（すべての白人患者の半数超に見られる、標的スプライス変異ｃ．−３２ＩＶＳ１−１３Ｔ＞Ｇ）を含むがこれらに限定されない、疾患の処置または予防を提供する。
配列
本発明は、主にリン酸ヌクレオシド間結合、１つまたは２つのリンカー、および脂質基を有する任意のａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。配列は、任意の標的に対して設計できる。本発明の例示的なａｂｃ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を以下に提供する。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド以上、例えば２１〜５０ヌクレオチド、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、または１９ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１９ヌクレオチドの長さを有する。
ＤＭＤ標的化オリゴヌクレオチド
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、新生児男児の３５００人に１人に罹患し、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は２０，０００人に１人に罹患する。ＤＭＤおよびＢＭＤはどちらも、Ｘ染色体上に位置し、かつ、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされる。ＤＭＤ患者は、進行性の筋力低下を患い、１３歳未満で車椅子に拘束され、しばしば３０歳より前に死亡する。ＢＭＤは、一般的により軽度であり、患者は、ＤＭＤ患者と比較して、４０年超にわたって歩行可能であり、平均余命が長いことがよくある。
ジストロフィンは、ジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の必須成分である。特に、ＤＧＣは、筋線維の膜の安定性を維持する。ＤＭＤ遺伝子におけるフレームシフト変異は、筋肉細胞でのジストロフィン欠損症を引き起こし、これは、他のＤＧＣタンパク質のレベルの低下を伴い、ＤＭＤ患者に見られる重度の表現型をもたらす。リーディングフレームを無傷に保つＤＭＤ遺伝子での変異は、より短いが部分的に機能的なジストロフィンを生成し、重症度が低いＢＭＤに関連する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者では、ＤＭＤ遺伝子のフレームシフト変異により、フレーム外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）ｍＲＮＡが生成され、切断型非機能的ジストロフィンタンパク質が生成される。このインフレーム成熟ｍＲＮＡは、未だ部分的に機能し、より穏やかなベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）表現型をもたらすインフレームジストロフィンタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＭＤ遺伝子の部分、例えば、エクソン５１、エクソン５３、およびエクソン４５に相補的である。
エクソン５１
ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の配列（配列番号４０１）を以下に示す：
配列表１
Figure 2021522862
強調表示された部分の対応する転写配列は次の通りである。
５’ ＣＣ ＡＡＡ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＴＧ Ｔ ３’（配列番号４０２）。
本発明に従って有用なＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に相補的なオリゴヌクレオチドには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
５’ＧＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＴＴ ＴＡＣ ＧＧＴ ＡＧＡ ＡＧＧ ＡＡＣ ＴＡＣ Ａ ７’（配列番号４０３）および表３に提供されるオリゴヌクレオチド：
Figure 2021522862
Figure 2021522862
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、オリゴヌクレオチドは、１４〜２０ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、オリゴヌクレオチドは、１４〜１９ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１４〜１９ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１９ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１９ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１９量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列５’ＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴ ７’（配列番号４０４；１９量体）を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４０４の配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１８量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１３からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１３からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４または配列番号５の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４または配列番号５の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５の配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１７量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１４〜２７からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１４〜２７からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２２の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２３の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２２の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２３の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４の配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１６量体である。一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２８から４２からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２８〜４２からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３６の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３７の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３８の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３９の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３６の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３７の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３８の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３９の配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１５量体である。一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号４３から５８からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４３〜５８からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４または配列番号５５の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５１の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５２の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５３の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５４の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５５の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５１の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５２の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５３の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５４の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５５の配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７５からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１４量体である。一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号５９から７５からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜７５からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６７の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６８の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６９の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７０の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６７の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６８の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号６９の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７０の配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、６７〜７０、および配列番号４０４からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、６７〜７０、および配列番号４０４からなる群から選択される配列を含み、残基のすべては、ａｂｃ−ＤＮＡ残基である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、６７〜７０、および配列番号４０４からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、６７〜７０、および配列番号４０４からなる群から選択される配列からなり、残基のすべては、ａｂｃ−ＤＮＡ残基である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、および配列番号４０４からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、および配列番号４０４からなる群から選択される配列を含み、残基のすべては、ａｂｃ−ＤＮＡ残基である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６から３９、５１〜５５、および配列番号４０４からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、および配列番号４０４からなる群から選択される配列からなり、残基のすべては、ａｂｃ−ＤＮＡ残基である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４１７および配列番号４１８からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４１７の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４１８の配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４１７および配列番号４１８からなる群から選択される配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４１７の配列からなる。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号４１８の配列からなる。
エクソン５３
ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の配列（配列番号４０５）を以下に示す：
配列表２
Figure 2021522862
強調表示された部分の対応する転写配列は次の通りである。
配列表３
Figure 2021522862
本発明に従って有用なＤＭＤ遺伝子のエクソン５３に相補的なオリゴヌクレオチドには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
５’ＣＡＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＴＴＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＴＴＡ ＣＴＴ ＴＡＣ ＡＡＴ ７’（配列番号４０７）および表４に提供されているオリゴヌクレオチド。
Figure 2021522862
Figure 2021522862
Figure 2021522862
Figure 2021522862
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含み、オリゴヌクレオチドは、１４〜２０ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含み、オリゴヌクレオチドは、１４〜１９ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１９ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１８量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜１０６からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜１０６からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１７量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１０７〜１３８からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１０７〜１３８からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１６量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１３９〜１７１からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１３９〜１７１からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１５量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１７２〜２０５からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１７２〜２０５からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号７６〜２４０からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１４量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２０６〜２４０からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２０６〜２４０からなる群から選択される配列からなる。
エクソン４５
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の配列（配列番号４０８）を以下に示す：
配列表４
Figure 2021522862
強調表示された部分の対応する転写配列は次の通りである。
配列表５
Figure 2021522862
本発明に従って有用なＤＭＤ遺伝子のエクソン４５に相補的なオリゴヌクレオチドには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
５’ＣＣ ＡＴＡＧＡＡＴＧＴＣ ＣＴＴＧＡＧＧＴＣＣ ＴＡＣＣＧＴＡＡＣＣ ＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴ ＴＧＡＣＡ ７’（配列番号４１０）および表５に示されている配列のいずれか１つ。
Figure 2021522862
Figure 2021522862
Figure 2021522862
Figure 2021522862
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜４００からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜２７０からなる群から選択される配列を含み、オリゴヌクレオチドは、１４〜２０ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜４００からなる群から選択される配列を含み、オリゴヌクレオチドは、１４〜１９ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、１９ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜４００からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１８ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１８量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜２７０からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜２７０からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜４００からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１７量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２７１〜３０１からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２７１〜３０１からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜４００からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１６量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３０２〜３３３からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３０２〜３３３からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜４００からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１５量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３３４〜３６６からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３３４〜３６６からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号２４１〜４００からなる群から選択される配列を含み、上記オリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは１４量体である。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３６７〜２４０からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号３６７〜２４０からなる群から選択される配列からなる。
本発明はまた、脊髄性筋萎縮症におけるイントロンスプライシングサイレンサー（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｉｌｅｎｃｅｒ）Ｎ１（ＩＳＳ−Ｎ１）に相補的なオリゴヌクレオチド、例えば、ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号４１１）を提供する。
本発明の実施は、別段で明記しない限り、当該技術分野の技術範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、およびトランスジェニック生物学の従来の技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＮ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ ＰｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ．Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照のこと。
別段で定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
さらに、材料、方法、および例は、単なる例示であり、本明細書に記載の本発明の様々な実施形態に限定することを意図するものではない。
実施例１
相補的パラレルＲＮＡ（ｐａｒａｌｌｅｌ ＲＮＡ）に対するアルファアノマーオリゴヌクレオチドの親和性
相補的パラレルＲＮＡに対する親和性を、ＵＶ融解実験により、いくつかのアルファアノマーオリゴヌクレオチドについて評価した（表１）。
融解温度は、５３．３℃〜７７．０℃の範囲であり、ＲＮＡ相補体に対するアルファアノマーオリゴヌクレオチドの良好な親和性を示している。
Figure 2021522862
実施例２
酸性条件におけるアルファアノマーオリゴヌクレオチドの安定性
ＯＮ１を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．５）で１０μＭに希釈し、得られた溶液を３７℃で２４時間インキュベートすることによって、ＯＮ１の酸性安定性を評価した。未処理のＯＮ１を参照として使用した。ＯＮ１の完全性をＬＣ−ＭＳによって測定した。未処理ＯＮ１のクロマトグラムおよび断片化パターン（図１Ａ、図１Ｂ）と、酸性条件で２４時間処理したＯＮ１のクロマトグラムおよび断片化パターン（図１Ｃ、図１Ｄ）と、の間に違いは見られない。この実験は、例えば細胞のリソソーム区画で遭遇し得る酸性条件におけるアルファアノマーオリゴヌクレオチドの安定性を示している。
実施例３
アルファアノマーオリゴヌクレオチドの熱安定性
ＯＮ１をＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）で１０μＭに希釈し、得られた溶液を９５℃で６０分間インキュベートすることによって、ＯＮ１の熱安定性を評価した。未処理のＯＮ１を参照として使用した。ＯＮ１の完全性をＬＣ−ＭＳによって測定した。未処理ＯＮ１のクロマトグラムおよび断片化パターン（図２Ａ、図２Ｂ）と、９５℃で加熱したＯＮ１のクロマトグラムおよび断片化パターン（図２Ｃ、図２Ｄ）と、の間に違いは見られない。この実験は、水溶液中のアルファアノマーオリゴヌクレオチドの化学的安定性を示している。
実施例４
アルファアノマーオリゴヌクレオチドの生体安定性
ＯＮ１およびその対応する天然オリゴヌクレオチドを、Ｈ２Ｏおよびマウス血清（Ｓｉｇｍａ）の１：１混合液で１０μＭに希釈した。反応は２０μＬスケールで行い、３７℃でインキュベートした。Ｈ２Ｏ中の１０μＭのオリゴヌクレオチドを３７℃で２４時間インキュベートすることにより、対照反応を行った。ホルムアミド（２０μＬ）の添加により、特定の時間（１時間、２時間、４時間、および２４時間）に反応を停止させた。得られた混合物を−２０℃で保存した後、９０℃で５分間熱変性させ、次いで２０％変性ＰＡＧＥによって分析した（図３）。標準的なプロトコルに従い、ステインスオール（ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ）溶液の染色により視覚化を行った。実験結果は、天然ＤＮＡ鎖が４時間後にはすでに完全に消化され、ＯＮ１が２４時間後でも完全に安定していることを示している。
実施例５
脂質基にコンジュゲートしたアルファアノマーオリゴヌクレオチドの、アルブミンへの結合
ＯＮ１のアルブミンへの結合を移動度シフトアッセイによって評価した（図４）。０、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、および１．５アルブミン当量（マウス血清由来のアルブミン、凍結乾燥粉末、９６％以上（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を含むＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）中、４０μＭでＯＮ１を３７℃で１時間、インキュベートすることによって、試験溶液を調製した。１０μＬの各試料を１０％ネイティブＰＡＧＥ（４０Ｖ、１７０分、７℃で実行）で分析した。標準的なプロトコルに従い、すべての溶液の染色により視覚化を行った。下のバンドは複合体を形成していないＯＮ１の存在を示し、上のバンドはアルブミンと複合体を形成したＯＮ１の存在を示す。この実験は、ＯＮ１が０．３当量以上のアルブミン濃度でアルブミンに効率的に結合できることを示している。
ＯＮ１のアルブミン結合の定量化を限外濾過実験によって評価した（図５）。簡潔に述べると、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．４、０．６、および０．７アルブミン当量（マウス血清由来のアルブミン、凍結乾燥粉末、９６％以上（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を含むＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）中、５５ μＭでＯＮ１を３７℃で１時間インキュベートすることによって、試験溶液を調製した。次いで、溶液をＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で濾過した。濾液中のＯＮ１の吸光度をＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計で測定し、０当量のアルブミンを含む溶液を参照することにより、複合体を形成していないＯＮ１の割合を計算した。実験結果は、０．３当量のアルブミンでは、わずか１４％のオリゴヌクレオチドが溶液中で複合体を形成していないことを示している。
マウス血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中のアルブミンへのＯＮ１の結合を、移動度シフトアッセイによって評価した（図６）。２５％グリセロールならびに０％、１．２５％、５．０％、１２．５％、おび２５．０％マウス血清を含むＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）中、４０μＭでＯＮ１を３７℃で１時間インキュベートすることによって、試験溶液を調製した。２５％グリセロールおよび８０μＭマウスアルブミンを含むＰＢＳ溶液中、４０μＭでＯＮ１を３７℃で１時間インキュベートすることによって、対照溶液を調製した。１０μＬの各試料を１５％ネイティブＰＡＧＥ（６０Ｖ、２６０分）で分析した。標準的なプロトコルに従い、すべての溶液の染色により視覚化を行った。下のバンドは複合体を形成していないＯＮ１の存在を示し、上のバンドはアルブミンと複合体を形成したＯＮ１の存在を示す。実験の結果は、ＯＮ１が血清中のアルブミンに効率的に結合できることを示している。
実施例６
凝集体の存在および溶解
凝集体の形成および溶解をＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳで分析した（図７）。ＯＮ１を、７．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）に溶解した。ナノ粒子の最初の存在を記録した（０分）。次いで、溶液を９５℃に加熱し、１０分、２０分、および３０分の加熱後にナノ粒子の存在を記録した。次いで、溶液を室温で２４時間放置し、次いで、ナノ粒子の存在を再び記録した。最初は、約１０００ｎｍのサイズを有する粒子について強い信号を測定することができる。溶液を加熱することにより、シグナルが消える。実験結果は、親油性部分にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドが水溶液中で凝集体を形成することを示している。しかしながら、溶液を９５℃で少なくとも２０分間加熱することにより、確実に凝集体が分散する。室温で２４時間放置した後、凝集体は再び出現しない。
実施例７
エクソンスキッピング効率の決定
エクソンスキッピングは、１つ以上のエクソンを成熟ｍＲＮＡから除去するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を含む。エクソンスキッピングを使用することにより、１つ以上のエクソンを成熟ｍＲＮＡから除去し、インフレームである成熟ｍＲＮＡを得ることができる。エクソンのスキッピングは、スプライス部位の一方もしくは両方、または内部エクソン配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合によって誘導することができる。エクソンは、両方のスプライス部位がスプライセオソーム複合体によって認識される場合においてのみｍＲＮＡに含まれるため、スプライス部位は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの明らかな標的である。
本発明のａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドが、目的の遺伝子のプレｍＲＮＡのエクソンスキッピングを引き起こすかどうかを決定するために、細胞を、所与のエクソンを標的とするオリゴヌクレオチド結合体と共に、一定期間インキュベートする。特定の実施形態では、細胞をリポフェクタミンでトランスフェクトする。エクソンスキッピングは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはＤＮＡシーケンシングを使用することにより検出される。全ＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを標的エクソン全体について行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物のサイズをゲル電気泳動によって評価する。エクソンスキッピングが生じた場合、生成物は標的とされたエクソンを含まれず、この生成物のサイズは、対象のエクソンを含む生成物と比較して、予想どおりに短くなる。同様に、標的エクソン全体で成熟ｍＲＮＡを配列決定して、標的エクソンの配列が成熟ｍＲＮＡに存在しないかどうかを決定することができる。
本発明のａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドの効果をさらに決定するために、ジストロフィン回復は、筋肉生検から採取された試料のウエスタンブロットによって検証され、％ジストロフィン陽性筋線維は顕微鏡検査によって決定される。
特定のエクソンを標的を絞ってスキッピングすることにより、ＤＭＤ表現型をより穏やかなＢＭＤ表現型に変換できる。エクソンスキッピングは、分化したヒト筋芽細胞、ＤＭＤ患者または健康な患者に由来する筋細胞をＤＭＤ遺伝子のプレｍＲＮＡに結合するアンチセンスａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドとインキュベートすることによって検出される。あるいは、この実施例にも記載されているように、細胞は、ＤＭＤのマウスモデルであるＭＤＸマウスに由来する。正常細胞のエクソンスキッピングのレベルをＤＭＤ細胞のエクソンスキッピングのレベルと比較することに加えて、ＤＭＤ患者またはＭＤＸマウスに由来する細胞のエクソンスキッピングのレベルを、ａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドの欠如したエクソンスキッピングのレベルと比較する。特定の実施形態では、目的のａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドの活性は、エテプリルセンまたはドリサペルセンの投与後のエクソンスキッピングのレベルと比較される。
この例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、２６０ｎｍで希釈されたアリコートの吸光度を測定することによって推定された。次いで、特定量のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を、以下に説明するように、インビトロアッセイでエクソンスキッピングを誘導するそれらの能力について試験した。
簡単に説明すると、実験は、マウス対照の不死化筋芽細胞培養物（Ｃ２Ｃ１２）またはヒト対照の不死化筋芽細胞培養物（ＫＭ１５５）で実施された。標準的な培養技術を使用して、細胞を増殖させ、筋管に分化させた。トランスフェクション試薬として、マウス細胞培養用のリポフェクタミンおよびヒト細胞培養用のオリゴフェクタミンを使用することにより、細胞にＡＯＮをトランスフェクトした。２’−ＯＭｅ−ホスホロジチオエート（２ＯＭｅＰＳ）骨格とスクランブル（非機能）２ＯＭｅＰＳ ＡＯＮを備えた相補的ＡＯＮを、それぞれ正の対照と負の対照として使用した。
２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、分子分析を行なった。ジストロフィンプレｍＲＮＡまたは誘導されたエクソン再配列の標的領域を研究するために、２段階（ネステッド）ＰＣＲ反応を使用した逆転写酵素増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。
エクソン２３のスキッピングを誘導することを目的としたＡＯＮを分析するために、ＲＴ−ＰＣＲをエクソン２３にまたがる領域で実施した。ｃＤＮＡ合成後、マウスエクソン２１および２６（領域２１−２６）で特定のプライマーを使用して１回目のＰＣＲを実行し、マウスエクソン２２および２４（領域２２−２４）で特定のプライマーを使用して２回目のＰＣＲを実行した。
エクソン５１のスキッピングを誘発することを目的としたＡＯＮを分析するために、ＲＴ−ＰＣＲをエクソン５１にまたがる領域で実施した。ｃＤＮＡ合成後、ヒトエクソン４８および５３（領域４８〜５３）で特定のプライマーを使用して第１ラウンドのＰＣＲを実施し、ヒトエクソン４９および５２（領域４９〜５２）で特定のプライマーを使用して第２ラウンドのＰＣＲを実施した。
スキッピングされていない製品とスキッピングされた製品の予想製品サイズを計算した。反応生成物の強度は、サイズ標準を含むアガロースゲルで推定した。これにより、潜在的なバイアスを考慮する必要がある。これは、短い製品またはエクソンスキッピングされた製品は、大きな製品よりも効率的に増幅される傾向があり、スキッピング効率の過大評価につながるためである。エクソンスキッピング産物を示すバンドは、マウス細胞（図８）またはヒト細胞（図９Ａ、図９Ｂ）で測定できる。実験の結果は、インビトロで遺伝子発現を調節するアルファアノマーオリゴヌクレオチドの能力を示している。本発明のコンジュゲートのエクソンスキッピング能力は、筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいてインビボで確認されている。これにより、ｍｄｘ２３マウスは、配列番号４１２を含む配列を有する本発明のａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドの１２週間の静脈内注射（５０ｍｇ／ｋｇ／週）を受けた。処置後、横隔膜と腓腹筋の組織を分離し、エクソンスキッピングを測定した。
実施例８
ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘマウスモデルでのエクソンスキッピング
エクソンスキッピングの有効性は、筋ジストロフィーのｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘマウスモデルで決定される。マウスは、配列番号４１８、対応するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）または生理食塩水を含む配列を有するａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドの静脈内注射を受ける。マウスは、オリゴヌクレオチドの週１２回の注射（５０ｍｇ／ｋｇ／週）を受ける。処置後、次の組織が分離される：心臓、横隔膜、前脛骨筋、腓腹筋、大腿四頭筋、上腕三頭筋、脳、肝臓、腎臓、およびエクソンスキッピングが決定される。特定の実施形態では、マウスは、ａｂｃ−ＤＮＡ脂質基コンジュゲートオリゴヌクレオチドの代わりにエチプラーセンまたはドリサペルセンで処置される。エクソンスキッピングは、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、免疫蛍光および／またはデジタルＰＣＲによって決定される。

Claims (31)

  1. オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートであって、前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のアルファアノマービシクロＤＮＡ（ａｂｃ−ＤＮＡ）残基を含み、前記脂質基が、前記オリゴヌクレオチドに共有結合している、オリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲート。
  2. 前記脂質基が、リンカーを介して前記オリゴヌクレオチドに共有結合している、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  3. 前記オリゴヌクレオチドが、１２〜２４個の残基を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  4. 前記オリゴヌクレオチド前記オリゴヌクレオチドが、１４〜１９個の残基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  5. 前記ａｂｃ−ＤＮＡ残基が、式（Ｖ）を有し、
    Figure 2021522862
     式中、式（ＩＶ）の前記少なくとも２個のａｂｃ−ＤＮＡ残基の各々について独立して、
    Ｔ３またはＴ４の一方は、ヌクレオシド結合基であり、Ｔ３およびＴ４の他方は、ＯＲ１、ＯＲ２、５’末端基、７’末端基、またはヌクレオシド結合基であり、
    Ｒ１は、Ｈまたはヒドロキシル保護基であり、
    Ｒ２は、リン部分であり、
    Ｂｘは、核酸塩基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  6. 前記残基のすべてが、ａｂｃ−ＤＮＡ残基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  7. 前記少なくとも２個のａｂｃ−ＤＮＡ残基が、ホスホジエステル結合を介して隣接する残基に結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  8. 前記残基のすべてが、ａｂｃ−ＤＮＡ残基であり、ホスホジエステル結合を介して結合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  9. 前記脂質基が、前記オリゴヌクレオチドの末端残基に共有結合している、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  10. 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合基、ホスホトリエステル結合基、ホスホロチオエート結合基、ホスホロジチオエート結合基、ホスホネート結合基、ホスホノチオエート結合基、ホスフィネート結合基、ホスホルチオアミデート結合、およびホスホルアミデート結合基からなる群から選択される、リン含有ヌクレオシド結合基を介して結合している残基を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  11. 前記リンカーが、炭化水素リンカーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  12. 前記リンカーが、アミノ−アルキル−ホスホロチオエートリンカー、アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカー、アルファ−カルボキシレート−アミノ−アルキルホスホロチオエートリンカー、およびアルファ−カルボキシレート−アミノ−ＰＥＧ−ホスホロチオエートリンカーからなる群から選択される、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  13. 前記リンカーが、切断可能な基を含む、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  14. 前記脂質基が、脂肪酸由来基である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  15. 前記脂肪酸が、飽和または不飽和である、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  16. 前記脂肪酸が、４〜２８個の炭素原子の長さを有する、請求項１４または１５に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  17. 前記脂肪酸由来基が、カルボン酸基を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  18. 前記脂肪酸が、表１または表２に提示される脂肪酸から選択される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  19. 前記脂肪酸が、ヘキサデカン酸である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  20. 前記脂質基が、チオホスフェート基を介して前記オリゴヌクレオチドに結合している、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  21. 前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン５１の一部に対応するプレｍＲＮＡに結合する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  22. 前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、４０４、および４１４〜４２５からなる群から選択される配列を含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  23. 前記オリゴヌクレオチドが、表３に提供される配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  24. 前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の一部に対応するプレｍＲＮＡに結合する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  25. 前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、表４に提供される配列のうちのいずれか１つを含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  26. 前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の一部に対応するプレｍＲＮＡに結合する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  27. 前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、表５に提供される配列のうちのいずれか１つを含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  28. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド−脂質基コンジュゲートを好適な担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
  29. 遺伝子から発現されたＲＮＡへの、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲートのハイブリダイゼーションを可能することにより、前記遺伝子の発現を変化させる方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、前記ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、方法。
  30. デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を有する対象において、または前記対象に由来する細胞において、ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導する方法であって、前記方法は、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、４０４、および４１４〜４２５からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供することを含み、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、前記対象または前記細胞において前記エクソンのスキッピングを誘導し、前記ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングから生成されたｍＲＮＡが、機能的ジストロフィンタンパク質またはベッカー対象のジストロフィンタンパク質をコードする、方法。
  31. ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導することにより、対象においてまたは前記対象に由来する細胞において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を処置する方法であって、前記方法は、前記対象または前記細胞に、配列番号４、５、２２〜２４、３６〜３９、５１〜５５、４０４、および４１４〜４２５からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む組成物を提供することを含み、前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、前記対象または前記細胞において前記エクソンのスキッピングを誘導し、前記ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングから生成されたｍＲＮＡが、機能的ジストロフィンタンパク質またはベッカー対象のジストロフィンタンパク質をコードする、方法。
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