BR112020022620A2 - conjugados de oligonucleotídeos que compreendem nucleosídeos de açúcar 7'-5'-alfa-anomérico-bicíclicos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a um conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois resíduos biciclo-DNA alfa anoméricos conectados por uma ligação fosfodiéster, e em que o grupo lipídico está ligado ao oligonucleotídeo por meio de um ligante. A invenção também fornece métodos de modulação de expressão gênica usando um conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CON- JUGADOS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS QUE COMPREENDEM NU- CLEOSÍDEOS DE AÇÚCAR 7'-5'-ALFA-ANOMÉRICO-BICÍCLICOS".
CAMPO DA TÉCNICA
[001] A invenção refere-se a conjugados de oligonucleotídeos e ao uso dos mesmos para modular a expressão de genes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Oligonucleotídeos antissenso influenciam o processamento de RNA e modulam a expressão de proteínas. Em certos casos, os compostos antissenso resultam na transcrição ou tradução alterada de um alvo. Tal modulação de expressão pode ser alcançada, por exem- plo, por degradação de mRNA alvo ou inibição baseada em ocupa- ção. Os análogos de oligonucleotídeos que exibem forte ligação espe- cífica para a sequência a um alvo de fita simples ou dupla e são resis- tentes à degradação química são potencialmente úteis como agentes terapêuticos. Os oligonucleotídeos quimicamente modificados foram projetados para usos terapêuticos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[003] A invenção fornece oligonucleotídeos que compreendem nucleosídeos abc-DNA e conjugados a um grupo lipídico. Os nucleosí- deos abc-DNA são preferencialmente conectados por meio de uma ligação fosfodiéster.
[004] A invenção fornece um conjugado de grupo lipídico e oligo- nucleotídeo em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois resíduos biciclo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fosfodiéster, e em que o grupo lipídico é covalentemente ligado ao oligonucleotídeo.
[005] Em uma modalidade, o grupo lipídico é covalentemente li- gado ao oligonucleotídeo por meio de um ligante.
[006] Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende 12 a
24 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende de 14 a 20 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreen- de de 14 a 19 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende 15 a 19 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotí- deo compreende 15 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotí- deo compreende 16 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotí- deo compreende 17 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotí- deo compreende 18 resíduos. Em outra modalidade, o oligonucleotí- deo compreende 19 resíduos.
[007] Em outra modalidade, o resíduo abc-DNA tem a Fórmula (V) T3
O 5' Bx 7' T4 (V) em que independentemente para cada um dos pelo menos dois resí- duos de abc-DNA de Fórmula (IV), um dentre T3 ou T4 é um grupo de ligação nucleosídica; o outro dentre T3 e T4 é OR1, OR2, um grupo de terminal 5', um grupo de terminal 7' ou um grupo de ligação nucleosí- dica, e em que R1 é H ou um grupo protetor de hidroxila, e R2 é uma porção química de fósforo; e Bx é uma nucleobase, em que preferencialmente Bx é sele- cionado dentre uma base de purina ou base de pirimidina, e em que ainda preferencialmente Bx é selecionado dentre uracila, timina, citosi- na, 5-metilcitosina, adenina ou guanina.
[008] Assim, em outra modalidade, o resíduo abc-DNA tem a Fórmula (V)
T3
O 5' Bx 7' T4 (V), em que (i) T3 é um grupo de ligação nucleosídica e T4 é um grupo de terminal 7', OR1 ou OR2, de preferência T4 é um grupo de terminal 7' ou OR1; ou (ii) T3 é um grupo de terminal 5', OR1 ou OR2, de preferên- cia T3 é um grupo de terminal 5' ou OR2; e T4 é um grupo de ligação nucleosídica; ou (iii) T3 e T4 são, independentemente um do outro, um grupo de ligação nucleosídica; e em que R1 é H ou um grupo protetor de hidroxila, e R2 é uma porção química de fósforo; e Bx é uma nucleobase, em que preferencialmente Bx é sele- cionado dentre uma base de purina ou base de pirimidina, e em que ainda preferencialmente Bx é selecionado dentre uracila, timina, citosi- na, 5-metilcitosina, adenina ou guanina.
[009] Em outra modalidade, todos os resíduos são resíduos abc- DNA.
[0010] Em outra modalidade, os pelo menos dois resíduos abc- DNA são conectados por meio de ligações fosfodiéster a resíduos ad- jacentes. Em outra modalidade, os pelo menos dois resíduos abc-DNA são conectados através de ligações fosfodiéster a resíduos adjacentes e cada outro grupo de ligação nucleosídica é independentemente um do outro selecionado dentre um grupo de ligação fosfodiéster, um gru- po de ligação fosfotriéster, um grupo de ligação fosforotioato, um gru- po de ligação fosforoditioato, um grupo de ligação fosfonato, um grupo de ligação fosfonotioato, um grupo de ligação fosfinato, um grupo de ligação fosfortioamidato ou um grupo de ligação fosforamidato
[0011] Em outra modalidade, todos os resíduos são resíduos abc- DNA e estão conectados por meio de ligações fosfodiéster. Assim, em outra modalidade, cada grupo de ligação nucleosídica é um grupo de ligação fosfodiéster.
[0012] Em outra modalidade, o grupo lipídico é covalentemente ligado a um resíduo terminal do oligonucleotídeo.
[0013] Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende resí- duos conectados por meio de um grupo de ligação nucleosídica con- tendo fósforo selecionado a partir do grupo que consiste em: um grupo de ligação fosfodiéster, um grupo de ligação fosfotriéster, um grupo de ligação fosforotioato, um grupo de ligação fosforoditioato, um grupo de ligação fosfonato, um grupo de ligação fosfonotioato, um grupo de li- gação fosfinato, um grupo de ligação fosforotioamidato e um grupo de ligação fosforamidato.
[0014] Em outra modalidade, o ligante é um ligante de hidrocarbo- neto ou um ligante de polietilenoglicol (PEG).
[0015] Em outra modalidade, o ligante é selecionado do grupo que consiste em: um ligante amino-alquil-fosforotioato, um ligante amino- PEG-fosforotioato, um ligante alfa-carboxilato-amino-alquil fosforotioa- to e um ligante alfa-carboxilato-amino-PEG-fosforotioato.
[0016] Em outra modalidade, o ligante compreende um grupo cli- vável.
[0017] Em outra modalidade, o grupo lipídico é um grupo derivado de ácido graxo.
[0018] Em uma modalidade, o ácido graxo é saturado ou insatura- do.
[0019] Em outra modalidade, o ácido graxo tem um comprimento de 4 a 28 átomos de carbono.
[0020] Em outra modalidade, o grupo derivado de ácido graxo compreende um grupo de ácido carboxílico.
[0021] Em outra modalidade, o grupo derivado de ácido graxo é derivado de um ácido dicarboxílico.
[0022] Em outra modalidade, o ácido graxo é selecionado a partir dos ácidos graxos apresentados na Tabela 1 ou Tabela 2.
[0023] Em outra modalidade, o ácido graxo é ácido hexadecanoi- co.
[0024] Em uma modalidade, o grupo lipídico está ligado ao ligante por meio de um grupo tiofosfato.
[0025] Em uma modalidade, o grupo lipídico está ligado ao oligo- nucleotídeo por meio de um grupo tiofosfato.
[0026] Em outra modalidade, o conjugado de oligonucleotídeo se liga ao pré-mRNA correspondente a uma porção do éxon 51 do gene da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).
[0027] Em outra modalidade, o conjugado de oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 404 e 414 a 425. Em ou- tra modalidade, o conjugado de oligonucleotídeo compreende a se- quência de SEQ ID NO: 417 ou SEQ ID NO: 418.
[0028] Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 3.
[0029] Em uma modalidade, o conjugado de oligonucleotídeo se liga ao pré-mRNA correspondente a uma porção do éxon 53 do gene DMD.
[0030] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende qual- quer uma das sequências fornecidas na Tabela 4.
[0031] Em outra modalidade, o conjugado de oligonucleotídeo se liga ao pré-mRNA correspondente a uma porção do éxon 45 do gene DMD.
[0032] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende qual-
quer uma das sequências fornecidas na Tabela 5.
[0033] A invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende um conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois resíduos bici- clo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fos- fodiéster, e em que o grupo lipídico está covalentemente ligado ao oli- gonucleotídeo, em combinação com um veículo adequado.
[0034] A invenção também fornece um método para alterar a ex- pressão de um gene permitindo a hibridização de um conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo, em que o oligonucleotídeo compre- ende pelo menos dois resíduos biciclo-DNA alfa anoméricos (abc- DNA) conectados por uma ligação fosfodiéster e em que o grupo lipí- dico está covalentemente ligado ao oligonucleotídeo, a um RNA ex- presso a partir do gene, sendo que o oligonucleotídeo compreende uma sequência que é complementar a uma porção do RNA.
[0035] A invenção também fornece um método para induzir o salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina humana em um indivíduo com Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) ou Distrofia Muscular de Bec- ker (BMD), ou em uma célula derivada do indivíduo, sendo que o mé- todo compreende fornecer um conjugado de grupo lipídico e oligonu- cleotídeo, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois resíduos biciclo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fosfodiéster, e em que o grupo lipídico está covalentemente ligado ao oligonucleotídeo, que compreende uma sequência selecio- nada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 404 e 414 a 425, de preferência SEQ ID NO: 417 ou SEQ ID NO: 418, em que o conjugado de oligonucleotídeo induz salto do éxon no indivíduo ou na célula, e em que o mRNA produzido a par- tir do salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina codifica uma proteí- na distrofina funcional ou uma proteína distrofina de um indivíduo com
Becker.
[0036] A invenção também fornece um método para tratar Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) ou Distrofia Muscular de Becker (BMD) em um indivíduo ou em uma célula derivada do indivíduo induzindo o salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina humana, sendo que o mé- todo compreende fornecer um conjugado de grupo lipídico e oligonu- cleotídeo, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois resíduos biciclo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fosfodiéster, e em que o grupo lipídico está covalentemente ligado ao oligonucleotídeo, que compreende uma sequência selecio- nada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 404 e 414 a 425, de preferência SEQ ID NO: 417 ou SEQ ID NO: 418, em que o conjugado de oligonucleotídeo induz salto do éxon no indivíduo ou na célula, e em que o mRNA produzido a par- tir do salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina codifica uma proteí- na distrofina funcional ou uma proteína distrofina de um indivíduo com Becker.
[0037] A invenção também fornece um método para induzir o salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina humana em um indivíduo com Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) ou Distrofia Muscular de Bec- ker (BMD), ou em uma célula derivada do indivíduo, sendo que o mé- todo compreende fornecer um conjugado de grupo lipídico e oligonu- cleotídeo em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois re- síduos biciclo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fosfodiéster, e em que o grupo lipídico está covalentemente ligado ao oligonucleotídeo, que compreende qualquer uma das se- quências apresentadas na Tabela 3, em que preferencialmente todos os resíduos são resíduos abc-DNA, em que o conjugado de oligonu- cleotídeo induz o salto do éxon no indivíduo ou na célula, e em que mRNA produzido a partir de salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofi-
na codifica uma proteína distrofina funcional ou uma proteína distrofina de um indivíduo com Becker.
[0038] A invenção também fornece um método para tratar Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) ou Distrofia Muscular de Becker (BMD) em um indivíduo ou em uma célula derivada do indivíduo induzindo o salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina humana, sendo que o mé- todo compreende fornecer ao indivíduo ou à célula uma composição que compreende um conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois resíduos bici- clo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fos- fodiéster, e em que o grupo lipídico está covalentemente ligado ao oli- gonucleotídeo, que compreende qualquer um dos apresentados na Tabela 3, em que, de preferência, todos os resíduos são resíduos abc- DNA, em que o conjugado de oligonucleotídeo induz salto do éxon no indivíduo ou na célula, e em que mRNA produzido a partir do salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina codifica uma proteína distrofina funcional ou uma proteína distrofina de um indivíduo com Becker.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0039] Figura 1A: Avaliação da estabilidade ácida de oligonucleo- tídeos alfa anoméricos por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LS-MS). Cromatograma LS-MS de ON1 não tratado.
[0040] Figura 1B: Padrão de fragmentação LS-MS de ON1 não tratado.
[0041] Figura 1C: Cromatograma LS-MS de ON1 tratado por 24 horas em condições ácidas.
[0042] Figura 1D: Padrão de fragmentação LS-MS de ON1 tratado por 24 horas em condições ácidas.
[0043] Figura 2A: Avaliação da estabilidade térmica de oligonucle- otídeos alfa anoméricos por LS-MS. Cromatograma LS-MS de ON1 não tratado.
[0044] Figura 2B: Padrão de fragmentação LS-MS de ON1 não tratado.
[0045] Figura 2C: Cromatograma LS-MS de ON1 aquecido a 95 °C durante 60 min.
[0046] Figura 2D: Padrão de fragmentação LS-MS de ON1 aque- cido a 95 °C durante 60 min.
[0047] Figura 3: Avaliação da estabilidade da bioestabilidade de oligonucleotídeos alfa anoméricos por PAGE desnaturante a 20%. PAGE de ON1 e o oligonucleotídeo natural correspondente do mesmo incubado em soro de camundongo.
[0048] Figura 4: Ensaio de mudança de mobilidade de ON1 incu- bado em diferentes equivalentes de albumina.
[0049] Figura 5: Comparação de ON1 não complexado incubado em diferentes equivalentes de albumina. Os valores foram obtidos por meio de experimentos de ultrafiltração.
[0050] Figura 6: Ensaio de mudança de mobilidade de ON1 incu- bado em diferentes volumes de soro de camundongo.
[0051] Figura 7: Intensidade de nanopartículas presentes em solu- ções ON1.
[0052] Figura 8: Gel de agarose para eficiência de salto do éxon 23 de camundongo em células C2C12 detectadas por RT-PCR de ani- nhamento.
[0053] Figura 9A: Gel de agarose para a eficiência de salto do éxon 51 humano em células KM155 detectadas por RT-PCR de ani- nhamento.
[0054] Figura 9B: Gel de agarose para a eficiência de salto do éxon 51 humano em células KM155 detectadas por RT-PCR de ani- nhamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0055] A invenção fornece conjugados de oligonucleotídeo que compreendem pelo menos um (um ou mais) nucleosídeos de biciclo- DNA alfa anomérico (abc-DNA), um grupo fosfodiéster ligando os nu- cleosídeos do oligonucleotídeo e um grupo lipídico conectado ao oli- gonucleotídeo por meio de um ligante. A invenção fornece oligonucleo- tídeos que compreendem nucleosídeos abc-DNA, conectados por meio de ligações internucleosídicas de fosfodiéster e conjugados a um grupo ligante.
[0056] Os oligonucleotídeos da invenção modulam a expressão gênica interferindo-se na transcrição, tradução, splicing e/ou degrada- ção e/ou inibindo-se a função de um RNA não codificador. DEFINIÇÕES:
[0057] Conforme utilizado no presente documento, "nucleosídeo de biciclo-DNA alfa anomérico (abc-DNA)" significa um análogo de nu- cleosídeo contendo uma porção química açúcar bicíclica e tendo a es- trutura geral mostrada abaixo.
O 7' Base 5'
O O
[0058] A estrutura de 7'-5'-alfa-anomérico-biciclo-DNA é mostrada abaixo.
[0059] Conforme utilizado no presente documento, uma "porção química de açúcar bicíclico" compreende dois sistemas de anéis inter- conectados, por exemplo nucleosídeos bicíclicos em que a porção química de açúcar tem um grupo 2'-O-CH(alquil)-4' ou 2'-O-CH2-4', ácido nucleico bloqueado (LNA), xilo-LNA, alfa-L-LNA, beta-D-LNA, cEt (etila restringida por 2'-O,4'-C) LNA, cMOEt (metoexietila restringi- da por 2'-O,4'-C) LNA, ou ácido nucleico com ponte de etileno.
[0060] Conforme utilizado no presente documento, "nucleosídeo" se refere a uma nucleobase ligada covalentemente a um açúcar.
[0061] "Ribonucleosídeo" se refere a uma base ligada à ribose; "desoxirribonucleosídeo" se refere a uma base ligada a uma 2'- desoxirribose.
[0062] Conforme utilizado no presente documento, "nucleotídeo" significa um nucleosídeo que compreende ainda uma porção química de fósforo covalentemente ligada ao açúcar do nucleosídeo.
[0063] Conforme utilizado no presente documento, o termo "resí- duo" se refere ao nucleosídeo ou aos monômeros de nucleotídeo que formam as unidades de um oligômero - um polímero de oligonucleotí- deo.
[0064] Conforme utilizado no presente documento, um "oligonu- cleotídeo" é um oligômero que pode ser de fita simples ou dupla, mas se liga como uma molécula de ácido nucleico de fita simples a um áci- do nucleico complementar em uma célula ou organismo. Um oligonu- cleotídeo compreende pelo menos dois nucleosídeos conectados um ao outro por um grupo de ligação nucleosídica conforme definido no presente documento. Um oligonucleotídeo pode compreender ribonu- cleotídeos, desoxirribonucleotídeos, nucleotídeos modificados (por exemplo, nucleotídeos com modificações no terminal 2', análogos de base sintética, etc.) ou combinações dos mesmos. Esses oligonucleo- tídeos modificados podem ser preferenciais em relação às formas na- tivas por causa de propriedades como, por exemplo, absorção celular aumentada e estabilidade aumentada na presença de nucleases. Um oligonucleotídeo inclui compostos que compreende nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos modificados ou miméticos de nucleo- tídeos e oligonucleotídeos com modificações feitas no açúcar e/ou nu- cleobase e/ou grupo de ligação nucleosídica conforme conhecido na técnica e descrito no presente documento.
[0065] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo da invenção tem um comprimento de 10 nucleotídeos, 11 nucleotídeos, 12 nucleo- tídeos, 13 nucleotídeos, 14 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 16 nucleotí- deos, 17 nucleotídeos, 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotí- deos ou mais, por exemplo 12 a 50 nucleotídeos, ou 12 a 40 ou 12 a 24 nucleotídeos, por exemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50 nucleotídeos.
[0066] O termo "oligômero", por exemplo, um oligonucleotídeo, conforme utilizado no presente documento, se refere a um composto que compreende duas ou mais subunidades de monômero ligadas por grupos de ligação nucleosídica. Um oligômero da invenção tem um comprimento de até 50 subunidades de monômero, por exemplo, até 40 subunidades de monômero, por exemplo, até 30 subunidades de monômero, até 20 subunidades de monômero ou até 15 subunidades de monômero. Um oligômero pode compreender de 5 a 40 subunida- des monoméricas, de 8 a 30 subunidades monoméricas, de 8 a 25 su- bunidades monoméricas ou de 8 a 20 subunidades monoméricas.
[0067] Conforme utilizado no presente documento, o termo "ácido nucleico" se refere a desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou nu- cleotídeos modificados e polímeros dos mesmos na forma de cadeia simples ou dupla. O termo abrange ácidos nucleicos contendo análo- gos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos ou ligações de estrutura modificados, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e que, em certos casos, são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosforodiamidatos, fosforodiamidatos, metilfosfonatos, quiral-metil fos- fonatos, 2'-O-metila ribonucleotídeos e peptídeos-ácidos nucleicos (PNAs).
[0068] A invenção fornece oligonucleotídeos que são conjugados por meio de uma ligação covalente a um grupo lipídico. Conforme utili- zado no presente documento, um "grupo lipídico" é qualquer grupo de ácido graxo ou grupo derivado de ácido graxo, qualquer grupo deriva- do de esteroide e qualquer grupo de vitamina solúvel em lipídeo. Um conjugado de grupo lipídeo e oligonucleotídeo abc-DNA pode exibir uma meia-vida longa in vivo. Um grupo lipídico também pode aumen- tar a ligação de um oligonucleotídeo abc-DNA à albumina e/ou outros receptores ou veículos de ácido graxo. A estrutura de um oligonucleo- tídeo da invenção conjugado a um grupo lipídico é tal que o grupo lipí- dico é exposto para facilitar a ligação à albumina e/ou outros veículos. Em outra modalidade da invenção, um grupo lipídico contém ainda um ou dois grupos de ácido carboxílico, aumentando ainda mais a intera-
ção com a albumina e/ou outros receptores ou veículos de ácido gra- xo. Em uma modalidade, um grupo lipídico é um grupo derivado de ácido graxo. Em outra modalidade, um grupo lipídico é um grupo deri- vado de ácido graxo a partir de um ácido dicarboxílico. Os ácidos gra- xos incluem qualquer ácido graxo saturado ou insaturado com uma cadeia de hidrocarboneto de 2 a 28 átomos de carbono e pode conter um ou dois grupos carboxílicos. Um ou dois ligantes de ácido graxo podem ser ligados ao oligonucleotídeo por meio de ligantes nas ex- tremidades 5' e/ou 7' de um oligonucleotídeo abc-DNA como descrito no presente documento. Os grupos lipídicos úteis de acordo com a in- venção são fornecidos nas Tabelas 1 e 2.
[0069] Um grupo lipídico da invenção pode incluir colesterol, vita- mina E (tocoferol) ou ácido biliar.
[0070] Conforme utilizado no presente documento, um "ligante" significa uma porção química que conecta um oligonucleotídeo da in- venção a um grupo lipídico. Ligantes úteis de acordo com a invenção incluem, porém sem limitação, hidrocarbonetos e ligantes PEG, por exemplo: ligantes amino-alquil-fosforotioato, ligantes alfa-carboxilato- amino-alquil-fosforotioato, ligantes amino-PEG-fosforotioato e ligantes alfa-carboxilato-amino-PEG-fosforotioato. Um ligante de acordo com a invenção típica e preferencialmente não diminui ou evita a ligação do oligonucleotídeo ao seu alvo. Um ligante pode incluir um grupo clivá- vel.
[0071] Conforme utilizado no presente documento, um "grupo de ligação de nucleosídeo" significa um grupo de ligação que conecta os nucleosídeos abc-DNA de um oligonucleotídeo. Os grupos de ligação de nucleosídeo da invenção são predominantemente ligações ou liga- ções químicas internucleosídicas de fosfodiéster. O termo "grupo de ligação nucleosídica" inclui grupos de ligação fósforo que não são liga- ções de fosfodiéster, bem como grupos de ligação de não fósforo.
[0072] A invenção fornece um oligonucleotídeo conjugado a um grupo lipídico em que todas as ligações internucleosídicas são liga- ções fosfodiéster. Em certas modalidades, os grupos de ligação inter- nucleosídica do oligonucleotídeo conjugado com grupo lipídico são predominantemente ligações fosfodiéster. Conforme utilizado no pre- sente documento, "predominantemente" significa 50% ou mais, por exemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e 100% dos grupos de ligação internucleosídica são ligações fosfodiés- ter. Por exemplo, um oligonucleotídeo pode incluir 1 ou mais, e até 50%, ligações de fosforotioato. Os nucleosídeos dos oligonucleotídeos da invenção são predominantemente nucleosídeos abc-DNA. Predo- minantemente, no que se refere a nucleosídeos abc-DNA, significa que 50% ou mais, por exemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e 100% dos nucleosídeos são nucleosídeos abc-DNA. Por exemplo, um oligonucleotídeo da invenção pode incluir 1 ou mais, e até 50%, nucleosídeos com um açúcar que não é um nu- cleosídeo abc-DNA.
[0073] A invenção fornece nucleosídeos conectados por meio de uma ligação internucleosídica contendo fósforo, ou uma ligação fosfo- diéster. A invenção também fornece nucleosídeos conectados por meio de ligações predominantemente fosfodiéster, porém incluindo, um "grupo de ligação de nucleosídeo contendo fósforo" selecionado a partir de um grupo de ligação fosfotriéster, um grupo de ligação fosfo- rotioato, um grupo de ligação fosforoditioato, um grupo de ligação fos- fonato, por exemplo, um grupo de ligação H-fosfonato ou um grupo de ligação metilfosfonato, um grupo de ligação fosfonotioato, por exem- plo, um grupo de ligação H-fosfonotioato, um grupo de ligação metil fosfonotioato, um grupo de ligação fosfinato, um grupo de ligação fos- fortioamidato ou um grupo de ligação fosforamidato.
[0074] Conforme utilizado no presente documento, um "nucleosí-
deo" ou "nucleotídeo" abrange nucleosídeos de ocorrência natural ou modificados ou miméticos de nucleosídeos, ou nucleotídeos de ocor- rência natural ou modificados ou miméticos de nucleotídeos, respecti- vamente, que podem ser incorporados em um oligômero da invenção por meio de métodos químicos ou não químicos para a síntese de oli- gômeros. Conforme utilizado no presente documento, "natural" ou "de ocorrência natural" significa origem natural.
[0075] O termo "nucleosídeos modificados" inclui nucleosídeos com modificações no açúcar e/ou nucleobase de um nucleosídeo con- forme conhecido na técnica e descrito neste documento. O termo "nu- cleotídeos modificados" inclui nucleotídeos com modificações no açú- car e/ou nucleobase e/ou grupo de ligação nucleosídica ou porção química de fósforo de um nucleotídeo conforme conhecido na técnica e descrito no presente documento.
[0076] Conforme utilizado no presente documento, "mimético de nucleosídeo" inclui estruturas usadas para substituir o açúcar e a nu- cleobase. O termo "mimético de nucleotídeo" inclui nucleotídeos usa- dos para substituir o açúcar e o grupo de ligação nucleosídica. Exem- plos de miméticos de nucleotídeos incluem ácidos nucleicos de peptí- deo (PNA) ou morfolinos.
[0077] Um "nucleosídeo" ou "nucleotídeo" da invenção pode incluir uma combinação de modificações, por exemplo, mais de uma modifi- cação de nucleobase, mais de uma modificação de açúcar ou pelo menos uma nucleobase e pelo menos uma modificação de açúcar.
[0078] Os oligonucleotídeos da invenção compreendem predomi- nantemente nucleosídeos tendo um açúcar bicíclico.
[0079] No entanto, os oligonucleotídeos podem incluir um nucleo- sídeo que tem um açúcar que é um sistema de anel monocíclico ou tricíclico, um sistema tricíclico ou bicíclico ou uma ribose ou de(s)oxirribose monocíclica. As modificações do açúcar incluem ainda,
porém sem limitação, configurações estereoquímicas modificadas, pe- lo menos uma substituição de um grupo ou pelo menos uma deleção de um grupo. Um açúcar modificado inclui uma versão modificada da porção química ribosil como ocorre naturalmente no RNA e DNA (ou seja, a porção química furanosil), tetra-hidropiranos, açúcares 2'- modificados, açúcares 3'-modificados, açúcares 4'-modificados, açúca- res 5'-modificados ou açúcares 4'-substituídos. Exemplos de modifica- ções de açúcar adequadas são conhecidos pelo indivíduo versado e incluem, porém sem limitação, nucleosídeos 2', 3' e/ou 4'substituídos (por exemplo, nucleosídeos 4'-S-modificados); resíduos de nucleotídeo de RNA 2'-O-modificados, como 2'-O-alquil ou 2'-O- (substituído)alquila, por exemplo, 2'-O-metila, 2'-O-(2-cianoetil), 2'-O- (2-metóxi)etila (2'-MOE), 2'-O-(2-tiometil)etila, 2'-O-(haloalcóxi) metila, por exemplo, 2'-O-(2-cloroetóxi)metila (MCEM), 2'-O-(2,2- dicloroetóxi)metila (DCEM), 2'-O-alcoxicarbonil, por exemplo, 2'-O-[2- (metoxicarbonil)etil] (MOCE), 2'-O-[2 -(N-metilcarbamoil)etil] (MCE), 2'- O-[2-(N,N-dimetilcarbamoil)etil] (DMCE), por exemplo, uma modifica- ção 2'-O-metila ou um 2′-O-metoxietila (2'-O-MOE), ou outras porções químicas de açúcar modificadas, como morfolino (PMO), morfolino ca- tiônico (PMOPlus) ou um grupo morfolino modificado, como PMO-X. O termo "PMO-X" se refere a um grupo morfolino modificado que com- preende pelo menos uma modificação de terminal 3' ou 5', tal como a etiqueta 3'-fluorescente, silenciador de terminal 3' (por exemplo, 3'- carboxifluoresceína, 3'-Gene Tools Blue, 3'-lissamina, 3'-dabcil), eti- queta e grupos funcionais para ligação química de afinidade de termi- nal 3' (por exemplo, 3'-biotina, 3'-amina primária, 3'-dissulfeto amida, 3'-piridil ditio), modificações de extremidade 5' (5'-amina primária, 5'- dabcil), 3'-azida, 3'-alquina, 5'-azida, 5'-alquina, ou como divulgado nos documentos WO2011/150408 e US2012/0065169.
[0080] Conforme utilizado no presente documento, o termo "ribo-
nucleotídeo" abrange ribonucleotídeos naturais e sintéticos, não modi- ficados e modificados. As modificações incluem alterações na porção química de açúcar, na porção química de base e/ou nas ligações entre os ribonucleotídeos no oligonucleotídeo. Conforme utilizado no presen- te documento, o termo "ribonucleotídeo" exclui especificamente um desoxirribonucleotídeo, que é um nucleotídeo que tem um único grupo de prótons na posição 2' do anel de ribose.
[0081] Conforme utilizado no presente documento, o termo "deso- xirribonucleotídeo" abrange desoxirribonucleotídeos naturais e sintéti- cos, não modificados e modificados. As modificações incluem altera- ções na porção química de açúcar, na porção química de base e/ou nas ligações entre o desoxirribonucleotídeo no oligonucleotídeo. Con- forme utilizado no presente documento, o termo "desoxirribonucleotí- deo" também inclui um ribonucleotídeo modificado, por exemplo, um 2'-O-metila ribonucleotídeo, um resíduo de ribonucleotídeo modificado com fosforotioato, etc...
[0082] Conforme utilizado no presente documento, o termo "PS- NA" se refere a um resíduo de nucleotídeo modificado com fosforotioa- to. O termo "PS-NA" abrange, portanto, ribonucleotídeos modificados com fosforotioato ("PS-RNAs") e desoxirribonucleotídeos modificados com fosforotioato ("PS-DNAs").
[0083] Conforme utilizado no presente documento, "fita antissen- so" se refere a uma molécula de ácido nucleico de fita simples que tem uma sequência complementar à de um RNA alvo.
[0084] Conforme utilizado no presente documento, "fita senso" se refere a uma molécula de ácido nucleico de cadeia simples que tem uma sequência complementar à de uma fita antissenso.
[0085] A invenção também fornece oligonucleotídeos acoplados a um composto não nucleosídeo.
[0086] A invenção fornece oligonucleotídeos acoplados a um su-
porte sólido. Um suporte sólido inclui, porém sem limitação, grânulos, polímeros ou resina.
[0087] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é modificado por ligação covalente de um ou mais grupos, além do grupo lipídico, ao terminal 5'ou 7' do oligômero, ou em qualquer posição do oligôme- ro. Um grupo que pode ser conjugado ao grupo de terminal 5' ou grupo de terminal 7' inclui, porém sem limitação, um grupo com cap, difosfa- to, trifosfato, identificação, tal como uma identificação fluorescente (por exemplo fluoresceína ou rodamina), corante, grupo repórter adequado para rastrear o oligômero, suporte sólido, nanopartícula, grupo não nu- cleosídico, grupo de anticorpo ou conjugado. Em geral, os grupos de conjugado modificam uma ou mais propriedades do composto ao qual estão ligados. Essas propriedades incluem, sem limitação, estabilidade de nuclease, afinidade de ligação, farmacodinâmica, farmacocinética, ligação, absorção, distribuição celular, absorção celular, entrega, carga e eliminação. Os grupos de conjugado são usados rotineiramente nas artes químicas e são ligados diretamente ou por meio de um grupo de ligação opcional a um composto parental, como um oligômero. O ter- mo "grupo de conjugado" inclui, sem limitação, um grupo lipídico, inter- caladores, poliaminas, poliamidas, polietilenoglicóis, tioéteres, poliéte- res, colesteróis, tiocolesteróis, porções químicas de ácido cólico, fola- to, lipídios, fosfolipídios, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, porções químicas lipofílicas, cumarinas, peptí- deos, anticorpos, nanocorpos e oligossacarídeos, por exemplo N- acetilgalactosamina.
[0088] Conforme utilizado no presente documento, "término" (ter- minus) se refere à extremidade ou ao término do oligômero, sequência de ácido nucleico ou qualquer um dos compostos descritos no presen- te documento, em que o número inteiro (3', 5' ou 7', etc.) designa o átomo de carbono do açúcar incluído no nucleotídeo do oligômero, se-
quência de ácido nucleico ou composto. Conforme utilizado no presen- te documento, "grupo do terminal 5'" ou "grupo do terminal 7'" se refere a um grupo localizado no terminal 5' ou terminal 7', respectivamente, do açúcar incluído em qualquer um dos compostos fornecidos no pre- sente documento.
[0089] Em certas modalidades, o oligômero compreende pelo me- nos uma subunidade de monômero que é um composto da Fórmula (IV), Fórmula (V) ou um composto da Fórmula (VI), conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, o oligômero compreende pelo menos um composto de Fórmula (IV), (V) ou (VI) e pelo menos um ri- bonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo. Em outra modalidade, o oli- gômero compreende pelo menos um composto de Fórmula (IV), (V) ou (VI) e pelo menos um desoxirribonucleotídeo.
[0090] Por "complementar" ou "complementaridade", entende-se que um ácido nucleico pode formar ligações de hidrogênio com outra sequência de ácido nucleico por qualquer pareamento de bases Wat- son-Crick ou Hoogsteen tradicional. Em referência às moléculas de ácido nucleico da presente divulgação, a energia livre de ligação para uma molécula de ácido nucleico com sua sequência complementar é suficiente para permitir que a função relevante do ácido nucleico pros- siga, por exemplo, com salto de éxon. A determinação de energias li- vres de ligação para moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica (consultar, por exemplo, Turner, et al., CSH Symp. Quant. Biol. LII, p. 123 a 133, 1987; Frier, et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:
9.373 a 9.377, 1986; Turner, et al., J. Am. Chem. Soc. 109: 3.783 a
3.785, 1987). Uma complementaridade percentual indica a porcenta- gem de resíduos contíguos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, pareamento de base Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de um total de 10 nucleotí-
deos no primeiro oligonucleotídeo sendo emparelhado em base com uma segunda sequência de ácido nucleico com 10 nucleotídeos repre- sentam 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% de complementar, respec- tivamente). Para determinar que uma complementaridade percentual é de pelo menos uma certa porcentagem, a porcentagem de resíduos contíguos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar liga- ções de hidrogênio (por exemplo, pareamento de base Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico é calculada e arredon- dada para o número inteiro mais próximo (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 nucleotídeos de um total de 23 nucleotídeos no primeiro oli- gonucleotídeo sendo pareado em base com uma segunda sequência de ácido nucleico tendo 23 nucleotídeos representa 52%, 57%, 61 %, 65%, 70% e 74%, respectivamente; e tem pelo menos 50%, 50%, 60%, 60%, 70% e 70% de complementaridade, respectivamente). Conforme utilizado no presente documento, "substancialmente com- plementar" se refere à complementaridade entre as fitas de modo que sejam capazes de hibridizar sob condições biológicas. Sequências substancialmente complementares têm 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mesmo 100% de complementaridade. Além disso, as técnicas para determinar se duas fitas são capazes de hibridizar sob condições bio- lógicas, examinando suas sequências de nucleotídeos, são bem co- nhecidas na técnica.
[0091] A invenção também fornece pareamento de base oscilante entre dois nucleotídeos em moléculas de RNA que não seguem as re- gras de par de bases de Watson-Crick. Os quatro principais pares de bases oscilantes são guanina-uracila (G-U), hipoxantina-uracila (I-U), hipoxantina-adenina (I-A) e hipoxantina-citosina (I-C). A estabilidade termodinâmica de um par de bases oscilantes é comparável à de um par de bases Watson-Crick.
[0092] Os ácidos nucleicos de fita simples que formam pares de bases em várias bases são chamados de "hibridizam". A hibridização é tipicamente determinada sob condições fisiológicas ou biologicamente relevantes (por exemplo, intracelular: pH 7,2, íon potássio a 140 mM; pH extracelular 7,4, íon sódio a 145 mM). As condições de hibridização geralmente contêm um cátion monovalente e um tampão biologica- mente aceitável e podem ou não conter um cátion divalente, ânions complexos, por exemplo gluconato proveniente de gluconato de potás- sio, espécies não carregadas, como sacarose, e polímeros inertes pa- ra reduzir a atividade de água na amostra, por exemplo, PEG. Tais condições incluem condições sob as quais os pares de bases podem se formar.
[0093] A hibridação é medida pela temperatura na qual 50% de um ácido nucleico é de fita simples e 50% é de fita dupla, ou seja, (a tem- peratura de fusão; Tm). A Tm é frequentemente usada como uma me- dida de estabilidade do duplex de um composto antissenso em relação a um ácido nucleico complementar.
[0094] As condições de hibridização também são condições sob as quais os pares de bases podem se formar. Várias condições de res- tringência podem ser usadas para determinar a hibridização (consultar, por exemplo, Wahl, GM e SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507). Condições de temperatura restringentes irão normalmente incluir temperaturas de pelo menos cerca de 30 °C, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 37 °C, e mais preferencialmente de pelo menos cerca de 42 °C. A temperatura de hibridização para híbridos que se prevê serem menores que 50 pares de bases de comprimento deve ser 5 a 10 °C menor que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido, em que Tm é de- terminada de acordo com as seguintes equações. Para híbridos com menos de 18 pares de bases de comprimento, Tm °C) = 2 (# de bases A + T) + 4 (# de bases G + C). Para híbridos entre 18 e 49 pares de bases de comprimento, Tm (°C) = 81,5 + 16,6 (log 10 [Na+]) + 0,41 (% de G + C)-(600/N), em que N é o número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons de sódio no tampão de hibridização ([Na+] para 1 X SSC = 0,165 M).
[0095] Variações úteis nas condições de hibridação serão pronta- mente aparentes para os especialistas na técnica. As técnicas de hi- bridação são bem conhecidas dos especialistas na técnica e são des- critas, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei., USA 72: 3.961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Intersci- ence, Nova York, 2001); Berger e Kimmel (Antisense to Molecular Clo- ning Techniques, 1987, Academic Press, Nova York); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo- ratory Press, Nova York.
[0096] Conforme utilizado no presente documento, "alterar" signifi- ca aumentar ou diminuir a expressão, por exemplo expressão gênica. Uma diminuição na expressão significa uma diminuição de 10% ou mais, por exemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100%. Uma diminuição também significa uma diminuição de 2 vezes ou mais, por exemplo, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 500 vezes ou mais.
[0097] Um aumento na expressão significa um aumento de 10% ou mais, por exemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100%. Um au- mento também significa um aumento de 2 vezes ou mais, por exem- plo, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 ve- zes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 500 vezes ou mais.
[0098] Um aumento ou diminuição na expressão de um gene é relativo ao nível de expressão de um controle ou nível de referência, por exemplo, o nível de expressão do gene na ausência de um conju- gado de grupo lipídico e oligonucleotídeo da invenção.
[0099] Conforme utilizado no presente documento, "RNA alvo" se refere a um RNA que seria submetido a modulação por um oligonucle- otídeo da invenção.
[00100] Conforme utilizado no presente documento, "alvo" se refere a qualquer sequência de ácido nucleico cuja expressão ou atividade deve ser modulada por um oligonucleotídeo da invenção.
[00101] Como utilizado no presente documento, "referência" signifi- ca um padrão ou controle. Como é aparente para um especialista na técnica, uma referência apropriada é quando apenas um elemento é alterado a fim de determinar o efeito de um elemento.
[00102] Conforme utilizado no presente documento, uma "porção de um RNA" significa um comprimento que é equivalente ao oligonucleo- tídeo ao qual se liga, e que tem uma sequência que é complementar àquela do oligonucleotídeo ao qual se liga.
[00103] O termo "in vitro" tem seu significado reconhecido na técni- ca, por exemplo, envolvendo reagentes ou extratos purificados, por exemplo extratos celulares. O termo "in vivo" também tem seu signifi- cado reconhecido na técnica, por exemplo, envolvendo células vivas, por exemplo células imortalizadas, células primárias, linhas celulares e/ou células em um organismo.
[00104] Como utilizado no presente documento, "aumentar" ou "me- lhorar" pretende alterar positivamente em pelo menos 5% em compa- ração com uma referência em um ensaio. Uma alteração pode ser de 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75% ou mesmo de 100% em comparação com uma referência em um ensaio. Por "aumentar o salto de éxon", entende-se aumento da quantidade de um determinado produto que é o resultado do salto de éxon.
[00105] Conforme utilizado no presente documento, "reduzir" signi- fica alterar negativamente em pelo menos 5% em comparação com uma referência em um ensaio. Uma alteração pode ser de 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75% ou mesmo de 100% em comparação com uma referência em um ensaio.
[00106] Conforme utilizado no presente documento, "célula" preten- de incluir células procarióticas (por exemplo, bacterianas) e eucarióti- cas (por exemplo, de mamíferos ou de plantas). As células podem ser de origem somática ou germinativa, podem ser totipotentes ou pluripo- tentes e podem ser divididas ou não. As células também podem ser derivadas de ou podem compreender um gameta ou um embrião, uma célula-tronco ou uma célula totalmente diferenciada. Assim, o termo "célula" é destinado a reter seu significado biológico usual e pode estar presente em qualquer organismo como, por exemplo, um pássaro, uma planta e um mamífero, incluindo, por exemplo, um ser humano, uma vaca, uma ovelha, um macaco, um macaco, um porco, um ca- chorro e um gato. Em certos aspectos, o termo "célula" se refere espe- cificamente a células de mamíferos, como células humanas.
[00107] Conforme utilizado no presente documento, "animal" signifi- ca um organismo eucariótico multicelular, incluindo um mamífero, par- ticularmente um ser humano. Os métodos da invenção em geral com- preendem a administração de uma quantidade eficaz do oligonucleotí- deo no presente documento a um indivíduo (por exemplo, animal, ser humano) em necessidade do mesmo, incluindo um mamífero, particu- larmente um ser humano. Tal tratamento será administrado adequa- damente a indivíduos, particularmente seres humanos que sofrem de, têm, são suscetíveis a ou estão em risco de uma doença ou um sinto- ma da mesma.
[00108] Por "veículo farmaceuticamente aceitável" entende-se uma composição ou formulação que permite a distribuição eficaz das molé-
culas de ácido nucleico da presente divulgação no local físico mais adequado para sua atividade desejada.
[00109] Os agentes oligonucleotídicos da presente invenção podem aumentar os seguintes atributos de tais agentes em relação aos agen- tes oligonucleotídicos sem nucleosídeos abc-DNA, ou oligonucleotí- deos que compreendem nucleosídeos abc-DNA, mas sem a combina- ção de ligações internucleosídicas de fosfato e um grupo lipídico: efi- cácia in vitro (por exemplo, potência e duração do efeito), eficácia in vivo (por exemplo, potência, duração do efeito, farmacocinética, far- macodinâmica, captação intracelular, toxicidade reduzida).
[00110] Conforme utilizado no presente documento, o termo "far- macocinética" se refere ao processo pelo qual um fármaco é absorvi- do, distribuído, metabolizado e eliminado pelo corpo.
[00111] Conforme utilizado no presente documento, o termo "far- macodinâmica" se refere à ação ou ao efeito de um fármaco em um organismo vivo.
[00112] Conforme utilizado no presente documento, o termo "estabi- lização" se refere a um estado de persistência aumentada de um agente em um ambiente selecionado (por exemplo, em uma célula ou organismo). Estabilidade aprimorada pode ser alcançada por meio de resistência aprimorada de tais agentes a enzimas degradantes (por exemplo, nucleases) ou outros agentes.
[00113] Conforme utilizado no presente documento, "nucleotídeo modificado" se refere a um nucleotídeo que tem uma ou mais modifi- cações no nucleosídeo, na nucleobase, no anel furanose ou no grupo fosfato. Por exemplo, os nucleotídeos modificados excluem ribonucleo- tídeos contendo monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosi- na, monofosfato de uridina e monofosfato de citidina e desoxirribonu- cleotídeos contendo monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxiguanosina, monofosfato de desoxitimidina e desoxicitidina. As modificações incluem aquelas de ocorrência natural que resultam da modificação por enzimas que modificam nucleotídeos, como metil- transferases. Os nucleotídeos modificados também incluem nucleotí- deos sintéticos ou de ocorrência não natural. Modificações sintéticas ou de ocorrência não natural em nucleotídeos incluem aquelas com modificações no terminal 2', por exemplo, 2'-metoxietóxi, 2'-fluoro, 2'- alil, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetil], 4'-tio, 4'-CH2--O-2'-ponte, 4'-(CH2)2- -O-2'-ponte, 2'-LNA e 2'-O-(N-metilcarbamato) ou aqueles que com- preendem análogos de base. Em conexão com os nucleotídeos modi- ficados no terminal 2' tal como descrito para a presente revelação, por "amino" entende-se 2'-NH2 ou 2'-O-NH2, que podem ser modificados ou não modificados. Esses grupos modificados são descritos, por exemplo, em Eckstein et al., Pat. no US 5.672.695 e Matulic-Adamic et al., Pat. no US 6.248.878.
[00114] Conforme utilizado no presente documento, "análogo de base" se refere a uma porção química heterocíclica que está localiza- da na posição 1' de uma porção química de açúcar de nucleotídeo em um nucleotídeo modificado que pode ser incorporado em um duplex de ácido nucleico (ou a posição equivalente em uma substituição de por- ção química de açúcar de nucleotídeo que pode ser incorporada em um duplex de ácido nucleico). Um análogo de base é geralmente uma base de purina ou pirimidina excluindo as bases comuns guanina (G), citosina (C), adenina (A), timina (T) e uracila (U). Os análogos de base podem duplexar com outras bases ou análogos de base em dsRNAs. Os análogos de base incluem aqueles úteis nos compostos e métodos da invenção, por exemplo, aqueles divulgados nas Pat. nos US
5.432.272 e 6.001.983, cedidas a Benner, e na Publicação de Patente no US 20080213891, cedida a Manoharan, que são incorporadas na presente invenção a título de referência. Exemplos não limitantes de bases incluem 2,6-diaminopurina, hipoxantina (I), xantina (X), 3--D-
ribofuranosil-(2,6-diaminopirimidina) (K), 3--D-ribofuranosil-(1-metil- pirazolo[4,3-d]pirimidina-5,7(4H,6H)-d-iona) (P), iso-citosina (iso-C), iso-guanina (iso-G), 1--D-ribofuranosil-(5-nitroindol), 1--D- ribofuranosil-(3-nitropirrol), 5-bromouracila, 2-aminopurina, 4-tio-dT, 7- (2-tienil)-imidazo[4,5-b]piridina (Ds) e pirrol-2-carbaldeído (Pa), 2- amino-6-(2-tienil)purina (S), 2-oxopiridina (Y), difluorotolila, 4-fluoro-6- metilbenzimidazol, 4-metilbenzimidazol, 3-metila isocarbostilila, 5- metila isocarbostilila, e 3-metil-7-propinil isocarbostilila, 7-azaindolila, 6-metil-7-azaindolila, imidizopiridinila, 9-metil-imidizopiridinila, pirrolopi- rizinila, isocarboestilila, propinil-7-azaindolila, 2,4,5-trimetilfenila, 4- metilindolila, 4,6-dimetilindolila, fenila, naftalenila, antracenila, fenan- tracenila, pirenila, estilbenzila, tetracenila, pentacenila e derivados es- truturais dos mesmos (Schweitzer et al., J. Org. Chem. 59: 7.238 a
7.242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28 (15): 2.911 a
2.914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Chem. Soc. 119: 2.056 a
2.057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 2.323 a 2.324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Chem. Soc., 118: 8.182 a 8.183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122 (6): 1.001 a 1.007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 1.1585 a 1.1586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem. 63: 9.652 a 9.656 (1998); Moran et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 94:1.0506 a 1.0511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 197 a 206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1.605 a 1.611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122 (32): 7.621 a 7.632 (2000); O'Neill et al., J. Org. Chem. 67: 5.869 a 5.875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117: 10.434 a 10.442 (1995); e Pat. no US 6.218.108.). Os análogos de base também podem ser uma base universal.
[00115] Conforme utilizado no presente documento, "base univer- sal" se refere a uma porção química heterocíclica localizada na posi- ção 1' de uma porção química de açúcar de nucleotídeo em um nucle-
otídeo modificado, ou a posição equivalente em uma substituição de porção química de açúcar de nucleotídeo, que, quando presente em um duplex de ácido nucleico, pode ser posicionado em frente a mais de um tipo de base sem alterar a estrutura helicoidal dupla (por exem- plo, a estrutura do esqueleto de fosfato). Além disso, a base universal não destrói a capacidade do oligonucleotídeo no qual reside para du- plexar para um ácido nucleico alvo. A capacidade de um ácido nuclei- co de fita simples contendo uma base universal para duplicar um ácido nucleico alvo pode ser avaliada por métodos aparentes para alguém na técnica (por exemplo, absorvância de UV, dicroísmo circular, mu- dança de gel, sensibilidade à nuclease de fita simples, etc.). Além dis- so, as condições sob as quais a formação do duplex é observada po- dem ser variadas para determinar a estabilidade ou formação do du- plex, por exemplo, temperatura, conforme a temperatura de fusão (Tm) se correlaciona com a estabilidade dos duplexos de ácido nucleico. Comparado a um ácido nucleico de fita simples de referência que é exatamente complementar a um ácido nucleico alvo, o ácido nucleico de fita simples contendo uma base universal forma um duplex com o ácido nucleico alvo que tem um Tm menor do que um duplex formado com o ácido nucleico complementar. No entanto, em comparação com um ácido nucleico de fita simples de referência em que a base univer- sal foi substituída por uma base para gerar uma única incompatibilida- de, o ácido nucleico de fita simples contendo a base universal forma um duplex com o ácido nucleico alvo que tem um Tm maior que um duplex formado com o ácido nucleico tendo a base incompatível.
[00116] Algumas bases universais são capazes de pareamento de bases formando ligações de hidrogênio entre a base universal e todas as bases guanina (G), citosina (C), adenina (A), timina (T) e uracila (U) sob a formação de par de bases condições. Uma base universal não é uma base que forma um par de bases com apenas uma única base complementar. Em um duplex, uma base universal pode formar ne- nhuma ligação de hidrogênio, uma ligação de hidrogênio ou mais de uma ligação de hidrogênio com cada um dentre G, C, A, T e U em frente à mesma na fita oposta de um duplex. De preferência, as bases universais não interagem com a base em frente à mesma na fita opos- ta de um duplex. Em um duplex, o pareamento de bases entre uma base universal ocorre sem alterar a estrutura helicoidal dupla da estru- tura de fosfato. Uma base universal também pode interagir com bases em nucleotídeos adjacentes na mesma fita de ácido nucleico por inte- rações de empilhamento. Essas interações de empilhamento estabili- zam o duplex, especialmente em situações em que a base universal não forma qualquer ligação de hidrogênio com a base posicionada em frente à mesma na fita oposta do duplex. Exemplos não limitantes de nucleotídeos de ligação universal incluem inosina, 1-beta-D- ribofuranosil-5-nitroindol e/ou 1-beta-D-ribofuranosil-3-nitropirrol (Pu- blicação de Pedido de Patente no US 20070254362, cedida a Quay et al.; Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 11 de novembro de 1995; 23 (21): 4.363 a 4.370; Loakes et al., 3-nitropirrol e 5-nitroindol como bases universais em iniciadores para sequenciamento de DNA e PCR. Nucleic Acids Res. 11 de julho de 1995; 23 (13): 2.361 a 2.366; Loakes e Brown, 5-Nitroindol como análogo de base universal. Nucleic Acids Res. 11 de outubro de 1994; 22 (20): 4.039 a 4.043).
[00117] O termo "estereoisômeros" se refere a compostos, que têm constituição química idêntica, mas diferem no que diz respeito ao ar- ranjo dos átomos ou grupos no espaço.
[00118] "Diastereômero" se refere a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade em que os compostos não são imagens espelhadas um do outro. Os diastereômeros têm diferentes proprieda- des físicas, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propri-
edades espectrais e reatividades químicas e biológicas. As misturas de diastereômeros podem ser separadas por procedimentos analíticos de alta resolução, como eletroforese e cromatografia.
[00119] "Enantiômeros" se referem a dois estereoisômeros de um composto que são imagens de espelho não são passíveis de sobrepo- sição um do outro.
[00120] As definições e convenções estereoquímicas utilizadas na presente invenção geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McRaw-Hiff Dictionary of Chemical Terms (1984), McGraw-Hill Book Company, Nova York; e Eliel, E. e Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Com- pounds", John Wiley & Sons, Inc., Nova York, 1994.
[00121] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados que são comumente entendidos por uma pessoa de habi- lidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. As seguintes referências fornecem aos versados uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbio- logy and Molecular Biology (2ª ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Edição, R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Conforme utilizado no presente documento, os termos a seguir têm os significa- dos atribuídos aos mesmos abaixo, a menos que especificado de outra forma.
[00122] A presente invenção pode ser compreendida mais facilmen- te a título de referência à seguinte descrição detalhada da invenção e aos Exemplos incluídos na mesma.
[00123] Todas as publicações mencionadas no presente documento são incorporadas ao presente documento a título de referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas. As publicações discutidas neste do- cumento são fornecidas apenas para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser inter- pretado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de anteceder tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas neste documento po- dem ser diferentes das datas de publicação reais, o que pode exigir confirmação independente. NUCLEOSÍDEOS BICICLO-DNA ALFA ANOMÉRICOS (ABC-DNA)
[00124] O DNA alfa-bicíclico ("abc") é um análogo de nucleosídeo contendo uma porção química de açúcar bicíclica, útil em oligonucleo- tídeos antissenso (AONs), por exemplo, para tratar doenças causando salto de éxon. Os nucleosídeos abc-DNA têm a estrutura geral mos- trada abaixo.
O 7' Base 5'
O O
[00125] A estrutura de 7'-5'-alfa-anomérico-biciclo-DNA é mostrada abaixo.
Estrutura do 7'-5'-alfa-anomérico-biciclo-DNA
[00126] Além de ter alta seletividade para RNA, a modificação de 7',5'-abc-DNA melhorou a discriminação de incompatibilidade em comparação com o DNA, é compatível com modificações de fosforoti- oato, confere uma bioestabilidade completa, induz baixa ativação do complemento e exibe alto salto de éxon in vitro.
[00127] A invenção fornece oligonucleotídeos que compreendem qualquer um dos nucleosídeos abc-DNA e que têm qualquer um dos substituintes divulgados no presente documento.
[00128] A invenção fornece um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um composto de Fórmula (I): T1
O 5' Bx 7' T2 (I) em que um dentre T1 e T 2 é OR1 ou OR2; e o outro dentre T1 e T2 é OR1 ou OR2; em que R1 é H ou um grupo protetor de hidroxila, e R2 é um radical de fósforo; e em que Bx é uma nucleobase.
[00129] Em uma modalidade, o composto de Fórmula (I) da inven- ção é um composto de Fórmula (II) T1
O 5' Bx 7' T2 (II) em que (i) T1 é OR1 e T2 é OR1 ou OR2; ou (ii) T1 é OR1 ou OR2, T2 é OR1: em que T1 é OR1 ou OR2, T2 é OR1.
[00130] O composto de Fórmula (II) é um anômero alfa ou um mo-
nômero alfa anomérico que difere do anômero beta na configuração espacial de Bx no centro quiral do primeiro carbono no terminal 1'.
[00131] Em outra modalidade, o composto da Fórmula (I) é um composto da Fórmula (III) T1
O 5' Bx 7' T2 (III) em que (i) T1 é OR1 e T2 é OR1 ou OR2; ou (ii) T1 é OR1 ou OR2, T2 é OR1: em que T1 é OR1 e T2 é OR1 ou OR2.
[00132] O composto de Fórmula (III) é um anômero beta ou um monômero anomérico beta que difere do anômero alfa na configuração espacial de Bx no centro quiral do primeiro carbono no terminal 1'.
[00133] Em outra modalidade, no composto de Fórmula (I) ou (II), Bx é selecionado a partir de uma base de purina ou base de pirimidina, em que Bx é selecionado dentre (i) adenina (A), (ii) citosina (C), (iii) 5- metilcitosina (MeC), (iv) guanina (G), (v) uracila (U), (vi) timina ou (vii) 2,6-diaminopurina ou um derivado de (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) ou (vii). Em outra modalidade, no composto de Fórmula (I), (II) ou (III), Bx é selecionado dentre timina, 5-metilcitosina, uracila, adenina ou guanina. Em outra modalidade, no composto de Fórmula (I), (II) ou (III), Bx é selecionado dentre timina, 5-metilcitosina, adenina ou guanina.
[00134] O termo "nucleobase", conforme utilizado no presente do- cumento, e abreviado como Bx, se refere a nucleobases não modifica- das ou de ocorrência natural, bem como nucleobases modificadas ou de ocorrência não natural e miméticos sintéticos das mesmas. Uma nucleobase é qualquer base heterocíclica que contém um ou mais átomos ou grupos de átomos capazes de se ligar a uma base hetero-
cíclica de um ácido nucleico.
[00135] Em uma modalidade, a nucleobase é uma base purina ou uma base pirimidina, em que preferencialmente a dita base purina é purina ou purina substituída, e a dita base pirimidina é pirimidina ou pirimidina substituída. Mais preferencialmente, a nucleobase é (i) ade- nina (A), (ii) citosina (C), (iii) 5-metilcitosina (MeC), (iv) guanina (G), (v) uracila (U), ou (vi) 5-metiluracila (MeU), ou um derivado de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi). Os termos "derivado de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi)" e "derivado de nucleobase" são usados na presente invenção de forma intercambiável. Derivados de (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi), e derivados de nucleobase, respectivamente, são conhecidos pelos versados na téc- nica e são descritos, por exemplo, em Sharma VK et al., Med. Chem. Commun., 2014, 5, 1.454 a 1.471, e incluem, sem limitação, 5- hidroximetila citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, alquil adenina, como 6-metila adenina, 2-propila adenina, alquil guanina, como 6-metila guanina, 2-propila guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halo uracila, 5-halo citosina, bases de alquinil pirimidina, como 5-propinila (-C=C-CH3)uracila, 5-propinila (-C=C-CH3) citosina, 6- azo uracila, 6-azo citosina, 6-azo timina, pseudo-uracila, 4-tiouracila; bases de purina 8-substituídas, tais como 8-halo-, 8-amino-, 8-tiol-, 8- tioalquil-, 8-hidroxil-adenina ou guanina, bases de pirimidina 5- substituídas, tais como 5-halo-, particularmente 5-bromo-, 5- trifluorometil-uracila ou -citosina; 7-metilguanina, 7-metiladenina, 2-F- adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7- desazaguanina, 7-desaadenina, 3-desazaguanina, 3-desazaadenina, bases hidrofóbicas, bases promíscuas, bases de tamanho expandido ou bases fluoradas. Em certas modalidades, a nucleobase inclui, sem limitação, pirimidinas tricíclicas, tais como 1,3-diazafenoxazina-2-ona, 1,3-diazafenotiazina-2-ona ou 9-(2-aminoetóxi)-1,3-diazafenoxazina-2- ona (grampo G). O termo "derivado de nucleobase" também inclui aqueles em que a base purina ou pirimidina é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2- aminopiridina ou 2-piridona. Outras nucleobases da invenção incluem, sem limitação, aquelas conhecidas pelos versados na técnica (por exemplo, patente US 3.687.808; Swayze et al., The Medicinal Chemis- try of Oligonucleotides, em Antisense a Drug Technology, Capítulo 6, p. 143 a 182 (Crooke, S. T., ed., 2008); The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, JI, Ed., John Wiley & Sons, 1990, p. 858 a 859; Englisch et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, Vol. 30 (6), p. 613 a 623; Sanghvi, Y. S., Antisen- se Research and Applications, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, p. 273 a 302).
[00136] Os derivados de nucleobase preferenciais incluem adenina metilada, guanina, uracila e citosina e derivados de nucleobase, de preferência de (i), (ii), (iii) ou (iv), em que os respectivos grupos amino, de preferência os grupos amino exocíclicos, são protegidos por grupos protetores de acila ou dialquilformamidino, de preferência dimetilfor- mamidino (DMF), e ainda incluem derivados de nucleobase, tais como 2-fluorouracila, 2-fluorocitosina, 5-bromouracila, 5-iodouracila, 2,6- diaminopurina, azacitosina e análogos de pirimidina, como pseudoiso- citosina e pseudacila.
[00137] Em outra modalidade preferencial, o dito derivado de nu- cleobase é selecionado a partir de adenina metilada, guanina metilada, uracila metilada e citosina metilada, e de um derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv), em que os respectivos grupos amino, preferenci- almente os grupos amino exocíclicos, são protegidos por um grupo protetor.
[00138] Em outra modalidade preferencial, o dito derivado de nu- cleobase é selecionado a partir de adenina metilada, guanina metilada, uracila metilada e citosina metilada, e de um derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv), em que os respectivos grupos amino, preferenci- almente os grupos amino exocíclicos, são protegidos por grupos prote- tores de acila ou dialquilformamidino, preferencialmente dimetilforma- midino (DMF).
[00139] Em outra modalidade preferencial, o dito derivado de nu- cleobase é selecionado a partir de um derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv), em que os respectivos grupos amino, de preferência os grupos amino exocíclicos, são protegidos por um grupo protetor.
[00140] Em uma outra modalidade preferencial, o dito derivado de nucleobase é um derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv), em que os grupos amino exocíclicos são protegidos por grupos protetores de acila ou dialquilformamidino, de preferência dimetilformamidino (DMF).
[00141] Em uma outra modalidade muito preferencial, o dito grupo protetor de acila do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv) é -C(O)-R11, em que, independente- mente um do outro, R11 é selecionado a partir de C1-C10alquila, C6- C10arila, C6-C10 arilC1-C10alquileno, ou C6-C10ariloxiC1-C10alquileno e em que o dito grupo protetor dialquilformamidino é =C(H)-NR12R13, em que R12 e R13 são, independentemente um do outro, selecionados de C1-C4alquila.
[00142] Em uma outra modalidade muito preferencial, o dito grupo protetor de acila do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv) é -C(O)-R14, em que, independente- mente um do outro, R14 é selecionado a partir de C1-C4alquila; fenila; fenila substituída por halogênio, C1-C6alquila, C3-C6cicloalquila, C1- C4alcóxi; benzila; benzila substituída por halogênio, C1-C6alquila, C3- C6cicloalquila, C1-C4alcóxi; ou fenilóxiC1-C2alquileno opcionalmente substituído por halogênio, C1-C6alquila, C1-C4alcóxi; e em que o dito grupo protetor dialquilformamidino é =C(H)-NR12R13, em que R12 e R13 são, independentemente um do outro, selecionados de C1-C4alquila.
[00143] Em uma outra modalidade muito preferencial, o dito grupo protetor de acila do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv) é -C(O)-R15, em que, independente- mente um do outro, R15 é selecionado a partir de C1-C4alquila; fenila; fenila substituída por halogênio, C1-C4alquila, C5-C6cicloalquila, C1- C4alcóxi; benzila; benzila substituída por halogênio, C1-C4alquila, C1- C4alcóxi; ou fenilaximetileno (CH2-OC6H5) em que a fenila é opcional- mente substituída por halogênio, C1-C4alquila, C5-C6cicloalquila, C1- C4alcóxi; e em que o dito grupo protetor dialquilformamidino é =C(H)- NR12R13, em que R12 e R13 são, independentemente um do outro, sele- cionados de C1-C4alquila.
[00144] Em uma outra modalidade muito preferencial, o dito grupo protetor de acila do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv) é -C(O)-R16, em que, independente- mente um do outro, R16 é selecionado a partir de C1-C3alquila; fenila; fenila substituída por C1-C3alquila, metóxi; benzila; benzila substituída por C1-C3alquila, metóxi; ou fenilaximetileno (CH2-OC6H5) em que o C6H5 é opcionalmente substituído por C1-C3alquila, metóxi; e em que o dito grupo protetor dialquilformamidino é =C(H)-NR12R13, em que R12 e R13 são, independentemente um do outro, selecionados de C1- C4alquila.
[00145] Em uma outra modalidade muito preferencial, o dito grupo protetor de acila do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv) é -C(O)-R17, em que, independente- mente um do outro, R17 é selecionado a partir de C1-C3alquila; fenila; fenila substituída por C1-C3alquila, metóxi; benzila; benzila substituída por C1-C3alquila, metóxi; ou fenilaximetileno (CH2-OC6H5) em que o C6H5 é opcionalmente substituído por C1-C3alquila, metóxi; e em que o dito grupo protetor dialquilformamidino é dimetilformamidino (DMF).
[00146] Em uma outra modalidade muito preferencial, o dito grupo protetor de acila do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv) é -C(O)-R18, em que, independente- mente um do outro, R18 é selecionado a partir de metila, iso-propila, fenila, benzila ou fenilaximetileno (CH2-OC6H5) em que o C6H5 é opci- onalmente substituído por C1-C3alquila, metóxi; e em que o dito grupo protetor dialquilformamidino é dimetilformamidino (DMF).
[00147] Em uma outra modalidade muito preferencial, o dito grupo protetor de acila do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleobase de (i), (ii), (iii) ou (iv) é -C(O)-R19, em que, independente- mente um do outro, R19 é selecionado a partir de metila, iso-propilaila, fenila, benzila ou feniloximetileno (CH2-OC6H5) em que o C6H5 é opci- onalmente substituído por metila, iso-propila; e em que o dito grupo protetor dialquilformamidino é dimetilformamidino (DMF).
[00148] O termo "dialquilformamidino", conforme utilizado no pre- sente documento, se refere a =C(H)-NR12R13, em que R12 e R13 são, independentemente um do outro, selecionados a partir de C1-C4 alqui- la. Em modalidades preferenciais, o dito dialquilformamidino é um gru- po protetor do dito grupo amino exocíclico do dito derivado de nucleo- base de (i), (ii), (iii) ou (iv). Os compostos resultantes podem ser de configuração (E) ou (Z), e ambas as formas, e misturas dos mesmos em qualquer razão, devem ser incluídas no âmbito da presente inven- ção. Em uma modalidade preferencial, os compostos da invenção compreendem o dialquilformamidino, de preferência dimetilformamidi- no (DMF), na configuração (Z).
[00149] De acordo com uma modalidade, Bx é selecionado dentre uracila, timina, citosina, 5-metilcitosina, adenina e guanina. De prefe- rência, Bx é selecionado dentre timina, 5-metilcitosina, adenina e gua- nina. De acordo com uma modalidade, Bx é uma porção química hete- rocíclica aromática capaz de formar pares de bases quando incorpora- da em oligômeros de DNA ou RNA em vez das bases uracila, timina,
citosina, 5-metilcitosina, adenina e guanina.
[00150] O termo "porção química de fósforo", conforme utilizado no presente documento, é, independentemente em cada ocorrência, sele- cionado dentre uma porção derivada de fosfonatos, fosfito triéster, monofosfato, difosfato, trifosfato, fosfato triéster, fosfato diéster, éster tiofosfato, éster di-tiofosfato ou fosforamiditas.
[00151] Em outra modalidade, no composto de Fórmula (I), a por- ção química de fósforo R2 é selecionada a partir de uma porção quími- ca de fosfato, uma porção química de fosforamidato e uma porção química de fosforamidita. Em outra modalidade, no composto de Fór- mula (II), o fósforo radical R2 é selecionado a partir de uma porção química de fosfato, uma porção química de fosforamidato e uma por- ção química de fosforamidita. Em outra modalidade, no composto de Fórmula (III), a porção química de fósforo R2 é selecionada a partir de uma porção química de fosfato, uma porção química de fosforamidato e uma porção química de fosforamidita.
[00152] O termo "porção química de fósforo", conforme utilizado no presente documento, se refere a uma porção química que compreende um átomo de fósforo no estado de valência PIII ou PV e que é represen- tado pela Fórmula (VII) R3
P W R4 (VII), em que W representa O, S ou Se ou W representa um par de elé- trons ou W representa BH2; R3 e R4 são, independentemente um do outro, H, halogênio, OH, OR5, NR6R7, SH, SR8, C1-C6alquila, C1-C6haloalquila, C1-C6alcóxi, C1-C6haloalcóxi, C1-C6aminoalquila; em que R5 é C1-C9alquila, C1- C6alcóxi, cada um, independentemente uns dos outros, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, -NHC(O)C1-C3alquila, - NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; arila, C1- C6alquilenoarila, C1-C6alquilenodiarila, cada uma, independentemente umas das outras, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogê- nio, C1-C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, NHC(O)C1- C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; acetila; um grupo protetor de hidroxila; em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C2-C6alquenila, C3-C6cicloalquila, C1-C3alcóxi; arila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1- C3alquila, C1-C3alcóxi; um grupo protetor de amino; ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual os mesmos são ligados formam um anel heterocíclico, em que o anel heterocíclico é selecionado a partir de pi- rolidinila, piperidinila, morfolinila, piperazinila e homopiperazina, em que o anel heterocíclico é opcionalmente substituído por C1-C3 alquila; e em que R8 é um grupo protetor de tiol; e em que a linha ondulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2. Quando W representa O, S ou Se, então o átomo P dentro da porção química de fósforo está em seu estado de valência PV.
Quando W representa um par de elétrons, o átomo P dentro da porção química de fósforo está em sua valência PIII.
A porção química de Fórmula (VII) inclui qualquer estereoisômero possível.
Ainda incluídos nas porções químicas representadas pela Fórmula (VII) estão os seus sais, em que os sais podem ser formados após tratamento com bases inorgânicas ou aminas, e podem ser sais derivados da reação com os grupos OH ou SH sendo (independente- mente um do outro) o R3 e o R4.Bases inorgânicas ou aminas que le- vam à formação de sal com os grupos OH ou SH são bem conhecidas na técnica e incluem trimetilamina, dietilamina, metilamina ou hidróxido de amônio.
Essas porções químicas de fósforo incluídas na presente invenção são, se apropriado, também abreviadas como "O-HB+", em que HB+ se refere ao contra-cátion formado.
[00153] Em uma modalidade, na "porção química de fósforo", R3 e R4 são, independentemente um do outro, H, OH, OR5, NR6R7, C1- C6alquila, C1-C6alquila, C1-C6 haloalquila, C1-C6alcóxi, C1-C6haloalcóxi, C1C6aminoalquila; em que R5 é C1-C9alquila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio; arila, C1-C6alquileno, cada um, independen- temente uns dos outros, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio; acetila; um grupo protetor de hidroxila; em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila opcional- mente substituída por ciano, nitro, halogênio; arila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C3alquila, C1-C3alcóxi; um grupo de proteção de amino; e em que R8 é um grupo protetor de tiol; e em que a linha ondulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00154] O termo "porção química de fósforo", conforme utilizado no presente documento, inclui uma porção química derivada de fosfona- tos, fosfito triéster, monofosfato, difosfato, trifosfato, fosfato triéster, fosfato diéster, tiofosfato éster, éster di-tiofosfato ou fosforamiditas.
[00155] Assim, em uma modalidade, o OR2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado a partir de fosfonatos, fosfito triéster, monofosfato, difosfato, trifosfato, fosfato triéster, fosfato diéster, tiofos- fato éster, di-tiofosfato éster ou fosforamiditas, e em que o OR2 é uma fosforamidita ou um fosfato triéster.
[00156] Em uma modalidade, a porção química de fósforo é deriva- da a partir de um fosfonato representado pela fórmula geral (VII), em que W é O, R3 é selecionado a partir de C1-C6alquila, C1-C6haloalquila, C1-C6alcóxi, C1-C6haloalcóxi, C1-C6aminoalquila, e R4 é OH ou O-HB+; e em que a linha ondulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2. Em outra modalidade, a porção química de fósforo de Fórmula (VII) é um H-fosfonato, em que W é O, R3 é hidrogênio e R4 é OH ou O-HB+; e em que O-HB+ é HNEt3+. Em uma outra modalidade, a porção quími-
ca de fósforo de Fórmula (VII) é um alquil-fosfonato, em que W repre- senta O, R3 é um grupo alquila, e R4 é OH ou O-HB+; e em que O-HB+ é HNEt3+. Em uma modalidade, a porção química de fósforo de Fórmu- la (VII) é metil-fosfonato, em que W é O, R3 é hidrogênio e R4 é OH ou O-HB+; e em que O-HB+ é HNEt3+). Em outra modalidade, a porção química de fósforo de Fórmula (VII) é um fosfonocarboxilato, em que R3 ou R4 são, independentemente um do outro, um ácido carboxílico. O fosfonocarboxilato pode ser ácido fosfonoacético ou ácido fosfono- fórmico. Em uma outra modalidade, a porção química de fósforo de Fórmula (VII) é um 2-aminoetil-fosfonato.
[00157] Em outra modalidade, R3 e R4 da porção química de fósforo de Fórmula (VII) são, independentemente um do outro, H, OH, halogê- nio, OR5, NR6R7, SH, SR8, C1-C4alquila, por exemplo, C1-C2alquila, C1- C4haloalquila, C1-C2haloalquila, C1-C4alcóxi, C1-C2alcóxi, C1- C4haloalcóxi, C1-C2haloalcóxi, C1-C4aminoalquila, C1-C2aminoalquila; e em que R5 é C1-C6alquila, por exemplo, C1-C3alquila, cada um, inde- pendentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, ni- tro, halogênio, NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1- C3alquilsulfonila; arila, C1-C3alquilenoarila, C1-C3alquilenodiarila, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, C1-C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; acetila; um grupo protetor de hidroxila; e em que R6 e R7 são, inde- pendentemente um do outro, hidrogênio, C1-C6alquila, por exemplo, C1-C4alquila, cada um, independentemente um do outro, opcionalmen- te substituído por ciano, nitro, halogênio, C2-C4alquenila, C3- C6cicloalquila, C1-C3alcóxi; arila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 alquila, C1-C3alcóxi; um grupo protetor de ami- no; ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual os mesmos estão liga- dos formam um anel heterocíclico, em que o anel heterocíclico é sele-
cionado a partir de pirolidinila, piperidinila, morfolinila, piperazinila e homopiperazina, em que o anel heterocíclico é opcionalmente substitu- ído por C1-C3 alquila; e em que R8 é um grupo protetor de tiol; e em que a linha ondulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00158] Em outra modalidade, R3 ou R4 da porção química de fósfo- ro de Fórmula (VII) é, independentemente em cada ocorrência e um do outro, halogênio, por exemplo, cloro, ou OR5, em que R5 é um grupo protetor de hidroxila. Porções químicas de fósforo adicionais documen- to usadas na invenção são divulgadas no Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage e Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2.223 a 2.311).
[00159] O termo "porção química de fósforo", conforme utilizado no presente documento, inclui um grupo R 2 que compreende um átomo de fósforo no estado de valência PIII ou PV e que é representado inde- pendentemente em cada ocorrência pela Fórmula (VIII), Fórmula (IX) ou Fórmula (X), R5 R6 R7 O N R6
P Y P Y N P R7
O O O R5'(VIII) R5 (IX) R5 (X), em que Y é O, S ou Se; e em que R5 e R5' são, independentemente em cada ocorrência e um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila, C1- C6alcóxi, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, -NHC(O)C1-C3alquila, - NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; arila, C1- C6alquilenoarila, C1-C6alquilenodiarila, cada uma independentemente um do outro opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, C1- C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, -NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; um grupo protetor de hidroxila; em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidro- gênio, C1-C9alquila opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogê-
nio, C2-C6alquenila, C3-C6cicloalquila, C1-C3alcóxi; arila, por exemplo, fenila, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 al- quila, C1-C3alcóxi; um grupo protetor de amino; ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual os mesmos estão ligados formam a anel hetero- cíclico, em que o anel heterocíclico é selecionado a partir de pirolidini- la, piperidinila, morfolinila, piperazinila e homopiperazina, em que o anel heterocíclico é opcionalmente substituído por C1-C3 alquila; e em que R8 é um grupo protetor de tiol; e em que a linha ondulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00160] Em uma modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (VIII) R5
O P Y
O R5'(VIII), em que Y é O, S ou Se, em que Y é O ou S, ou Y é O; e em que R5 e R5' são independentemente em cada ocorrência e um do outro, hidro- gênio, C1-C9alquila, C1-C6alcóxi, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, - NHC(O)C1-C3alquila, -NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; arila, C1-C6alquilenoarila, C1-C6alquilenodiarila, cada uma, indepen- dentemente uma da outra, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, -NHC(O)C1- C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; um grupo pro- tetor de hidroxila; P(O)(OR9)(OR9'), P(O)OP(O)(OR9)(OR9'); em que R9 e R9' são, independentemente em cada ocorrência e um do outro, hi- drogênio, C1-C9alquila opcionalmente substituído por ciano, nitro, ha- logênio, -NHC(O)C1-C3alquila, -NHC(O)C1-C3haloalquila, C1- C3alquilsulfonila; arila, C1-C6alquilenoarila, C1-C6alquilenodiarila cada uma, independentemente umas das outras, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1- C4haloalcóxi, -NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1- C3alquilsulfonila; um grupo protetor de hidroxila; e em que a linha on- dulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00161] Em outra modalidade, R5 e R5' de Fórmula (VIII) são, inde- pendentemente em cada ocorrência e um do outro, hidrogênio, C1- C6alquila, C1-C3alquila, C1-C4alcóxi, C1-C2alcóxi, cada um, indepen- dentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, -NHC(O)C1-C3alquila, -NHC(O)C1-C3haloalquila, C1- C3alquilsulfonila; arila, por exemplo fenila, C1-C4alquilenoarila, C1- C4alquilenodiarila cada uma, independentemente uma da outra, opcio- nalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C4alcóxi, C1- C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, -NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1- C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; um grupo protetor de hidroxila.
[00162] Em outra modalidade, R5 e R5' da Fórmula (VIII) são, inde- pendentemente um do outro, alquila C 1-C4 ou arila, por exemplo, feni- la. Em outra modalidade, R5 e R5' da Fórmula (VIII) são, independen- temente um do outro, metila ou etila. Em outra modalidade, R5 e R5' da Fórmula (VIII) são, independentemente um do outro, fenila ou benzila. Em outra modalidade, R5 e R5' são, independentemente em cada ocor- rência e um do outro, hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxila. Em outra modalidade, na Fórmula (VIII), R5 e R5' são, independentemente em cada ocorrência e um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila, C1- C6alcóxi, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio; arila, C1-C6alquilenoarila, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio; ou um grupo protetor de hidroxila. Em uma mo- dalidade, a porção química de fósforo R2 representada pela Fórmula (VIII) é referida no presente documento como "porção química de fos- fato".
[00163] Em uma modalidade, a porção química de fósforo R 2 é re- presentada pela Fórmula (IX) R6 R7
N P Y
O R5 (IX), em que em que Y é O, S ou Se, e em que Y é O ou S; e em que R5 é, independentemente em cada ocorrência, hidrogênio, C1-C9alquila, C1-C6alcóxi, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, -NHC(O)C1- C3alquila, -NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; arila, C1- C6alquilenoarila, C1-C6alquilenodiarila, cada uma, independentemente uma da outra, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, -NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; um grupo protetor de hidroxila; em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C2- C6alquenila, C3-C6cicloalquila, C1-C3alcóxi; arila, por exemplo, fenila, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 alquila, C1- C3alcóxi; um grupo protetor de amino; ou junto com o átomo de nitro- gênio ao qual os mesmos estão ligados formam um anel heterocíclico, em que o anel heterocíclico é selecionado a partir de pirolidinila, pipe- ridinila, morfolinila, piperazinila e homopiperazina, em que o anel hete- rocíclico é opcionalmente substituído por C1-C3 alquila; e em que a li- nha ondulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2. Em uma mo- dalidade, a porção química de fósforo R2 representada pela Fórmula (IX) é referida neste documento como "porção química de fosforamida- to" ou, usado de forma intercambiável, "porção química de fosforoami-
dato".
[00164] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X) R6
N P R7
O R5 (X), em que R5 é hidrogênio, C1-C9alquila, C1-C6alcóxi, cada um, inde- pendentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, ni- tro, halogênio, -NHC(O)C1-C3alquila, -NHC(O)C1-C3haloalquila, C1- C3alquilsulfonila; arila, C1-C6alquilenoarila, C1-C6alquilenodiarila inde- pendentemente uma da outra opcionalmente substituída por ciano, ni- tro, halogênio, C1-C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, - NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila, um grupo protetor de hidroxila; e em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, C2- C6alquenila, C3-C6cicloalquila, C1-C3alcóxi, arila, por exemplo fenila, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 alquila, C1- C3alcóxi; ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual os mesmos estão ligados formam um anel heterocíclico, em que o anel heterocíclico é selecionado a partir de pirolidinila, piperidinila, morfolinila, piperazinila e homopiperazina, em que o anel heterocíclico é opcionalmente substi- tuído por C1-C3 alquila, e em que a linha ondulada indica a ligação ao oxigênio do grupo OR2. Tipicamente e em que a porção química de fósforo R2 representada pela Fórmula (X) é referida neste documento como "porção química de fosforamidita" ou, usado de modo intercam- biável, "porção química fosforoamidita".
[00165] Em outra modalidade, na Fórmula (IX) o Y é O; o R5 é, in- dependentemente em cada ocorrência, hidrogênio, C1-C9alquila, C1-
C6alcóxi, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio; arila, C1-C6alquilenoarila, cada uma, independentemente uma da outra, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio; um grupo protetor de hidroxila; em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila opcio- nalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C2-C6alquenila; arila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 alquila, C1- C3alcóxi; um grupo protetor de amino; e em que a linha ondulada indi- ca a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00166] Em uma modalidade, na Fórmula (X) o R5 é, independen- temente em cada ocorrência, hidrogênio, C1-C9alquila, C1-C6alcóxi, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio; arila, C1-C6alquilenoarila, cada uma, inde- pendentemente uma da outra, opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio; um grupo protetor de hidroxila; em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidrogênio, C1-C9alquila opcional- mente substituída por ciano, nitro, halogênio, C2-C6alquenila; arila op- cionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 alquila, C1- C3alcóxi; um grupo protetor de amino; e em que a linha ondulada indi- ca a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00167] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionada dentre uma por- ção química de fosfato, uma porção química de fosforamidato e uma porção química de fosforamidita.
[00168] Em outra modalidade, o R5 é, independentemente em cada ocorrência, hidrogênio, C1-C6alquila, C1-C4alquila, C1-C4alcóxi, cada um, independentemente um do outro, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, -NHC(O)C1-C3alquila, -NHC(O)C1- C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; arila, C1-C4alquilenoarila, C1- C4alquilenodiarila cada uma, independentemente uma da outra, opcio-
nalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C1-C4alcóxi, C1- C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, -NHC(O)C1-C3alquila, NHC(O)C1- C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; um grupo protetor de hidroxila; em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, hidrogênio, C1- C6alquila opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, C2- C4alquenila, C3-C6cicloalquila, C1-C3alcóxi; arila opcionalmente substi- tuída por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 alquila, C1-C3alcóxi; um grupo protetor de amino; ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual os mesmos estão ligados formam um anel heterocíclico, em que o anel heterocíclico é selecionado a partir de pirolidinila, piperidinila, morfolini- la, piperazinila e homopiperazina, em que o anel heterocíclico é opcio- nalmente substituído por C1-C3 alquila; e em que a linha ondulada indi- ca a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00169] Em outra modalidade, o R5 é C 1-C3alquila opcionalmente substituída por ciano, cloro, flúor ou bromo; arila, C1-C3alquileno, C1- C3alquilenodiarila, cada uma, independentemente umas das outras, opcionalmente substituídas por ciano, nitro, cloro, flúor, bromo, C1- C2alcóxi, C1haloalquila. Em outra modalidade, o R5 é uma C 1-C3alquila opcionalmente substituída por ciano, cloro, flúor ou bromo. Em outra modalidade, o R5 é uma C2alquila substituída por ciano, por exemplo, - CH2CH2-CN.
[00170] Em outra modalidade, o R5 é C1-C4alquila, por exemplo, metila ou etila; arila, por exemplo, fenila ou benzila; cloreto ou um gru- po protetor de hidroxila. Em outra modalidade, o R5 é metila ou um grupo protetor de hidroxila.
[00171] Em outra modalidade, o R5 é C1-C6alcóxi opcionalmente substituído por ciano, cloro, flúor ou bromo.
[00172] Em outra modalidade, o R6 e R7 são, independentemente um do outro, H ouC1-C3 alquila; ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico, em que o anel hete-
rocíclico é selecionado a partir de pirolidinila, piperidinila, morfolinila, piperazinila em que o anel heterocíclico é opcionalmente substituído por metila. Em uma modalidade, R6 e R7 são, independentemente um do outro, C1-C3alquila, alcóxi ou arila, em que a arila é fenila ou benzi- la, opcionalmente substituída por ciano, nitro, cloro, flúor, bromo. Em outra modalidade, R6 é hidrogênio, e R7 é (i) C1-C9alquila ou (ii) arila, (i) ou (ii) opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, arila, em que R7 é C1-C3alquila, fenila ou benzila.
[00173] Em outra modalidade, R6 e R7 são, independentemente um do outro, selecionados dentre metila, etila, isopropila ou isobutila. Em outra modalidade, R6 e R7 são isoproprila, independentemente um do outro.
[00174] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentado pela Fórmula (X), em que o R5 é (i) C1-C9alquila; (ii) arila, por exemplo, fenila; ou (iii) a (i) ou a (ii) opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, arila; e em que R6 e R7 são, independentemen- te um do outro, C1-C9alquila, por exemplo, isopropila.
[00175] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que R5 é C1-C9alquila opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, -NHC(O)C1-C3alquila, - NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; arila, C1- C6alquilenoarila, C1-C6alquilenodiarila, independentemente umas das outras, opcionalmente substituídas por ciano, nitro, halogênio, C1- C4alcóxi, C1-C4haloalquila, C1-C4haloalcóxi, -NHC(O)C1-C3alquila, - NHC(O)C1-C3haloalquila, C1-C3alquilsulfonila; e R6 e R7 são, indepen- dentemente um do outro, C1-C9alquila opcionalmente substituída por ciano, nitro, halogênio, C2-C6alquenila, C3-C6cicloalquila, C1-C3alcóxi, fenila opcionalmente substituídos por ciano, nitro, halogênio, C1-C3 al- quila, C1-C3alcóxi; ou junto com o átomo de nitrogênio ao qual os mesmos estão ligados formam um anel heterocíclico, em que o anel heterocíclico é selecionado a partir de pirolidinila, piperidinila, morfolini- la, piperazinila e homopiperazina, em que o anel heterocíclico é opcio- nalmente substituído por C1-C3alquila; e em que a linha ondulada indi- ca a ligação ao oxigênio do grupo OR2.
[00176] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que R5 é C1-C9alquila opcionalmente substituída por ciano, nitro, cloro, flúor, bromo, -NHC(O)C1-C3alquila, - NHC(O)C1-C3haloalquila; arila, C1-C6alquileno, C1-C6alquilenodiarila, independentemente uns dos outros, opcionalmente substituídos por ciano, nitro, cloro, flúor, bromo, C1-C4alcóxi, C1-C4haloalquila.
[00177] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que R5 é C1-C3alquila opcionalmente substituída por ciano, cloro, flúor e bromo; arila, C1-C3alquileno, C1- C3alquilenodiarila, independentemente uns dos outros, opcionalmente substituídos por ciano, nitro, cloro, flúor, bromo, C1-C2 alcóxi, C1 halo- alquila.
[00178] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que R5 é C1-C3alquila, 2-cianoetila, 2,2,2-tricloroetila, 2,2,2-tribromoetila, -(CH2)nNHC(O)CF3, em que n = 3 a 6; fenila, C1-C3alquilenofenila, benzidrila, independentemente umas das outras, opcionalmente substituídas por ciano, nitro, cloro, flúor, bromo, C1-C2alcóxi, -CF3.
[00179] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que o R5 é metila, etila, 2-cianoetila, por exemplo, 2-cianoetila (CH2)2CN).
[00180] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que R6 e R7 são, independentemente um do outro, C1-C3alquila ou em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual os mesmos estão ligados formam um anel heterocíclico, em que o anel heterocíclico é selecionado a partir de pirolidina, piperidina,
morfolina, em que o anel heterocíclico é opcionalmente substituído por C1-C3alquila, e em que o anel heterocíclico é opcionalmente substituí- do por metila.
[00181] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que R6 é igual a R7 e R6 e R7 são iso- propila ou metila.
[00182] Em outra modalidade, a porção química de fósforo R2 é re- presentada pela Fórmula (X), em que R5 é metila, etila, 2-cianoetila, e em que R6 é igual a R7 e R6 e R7 são iso-propila ou metila.
[00183] Cada porção de alquila, isoladamente ou como parte de um grupo maior, tal como alcóxi ou alquileno, é uma cadeia linear ou rami- ficada e pode ser = C1-C6alquila, por exemplo, C1-C3alquila. Exemplos incluem metila, etila, n-propila, prop-2-ila (iso-propila; abreviado de modo intercambiável no presente documento como iPr ou Pri, em par- ticular na fórmula química desenhada), n-butila, but-2-ila, 2-metil-prop- 1-ila ou 2-metil-prop-2-ila. Exemplos de um grupo alcóxi incluem metó- xi, etóxi, propóxi, iso-propóxi, n-butóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, n- pentóxi, neo-pentóxi, n-hexóxi. Conforme descrito no presente docu- mento, alcóxi pode incluir outros substituintes, tais como átomos de halogênio, levando a porções de haloalcóxi.
[00184] Cada porção de alquileno é uma cadeia linear ou ramificada e é, particularmente, por exemplo, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2- CH2-CH2-, -CH(CH3)-CH2- ou -CH(CH2CH3)-.
[00185] Cada unidade alquenila, quer isoladamente ou como parte de um grupo maior, tais como alquenilóxi ou alquenileno de cadeia li- near ou ramificada e é C2-C6alquenila, por exemplo, C2-C4alquenila. Cada porção pode ser de configuração (E) ou (Z). Os exemplos inclu- em vinila e alila. Um composto da presente invenção que compreende uma porção química alquenila, portanto, pode incluir, se aplicável, o composto com a porção química de alquenila em sua configuração (E),
o composto com a porção química de alquenila em sua configuração (Z) e misturas das mesmas em qualquer razão.
[00186] Cada porção alquinila, quer isoladamente ou como parte de um grupo maior, tais como alquinilóxi, é uma cadeia linear ou ramifica- da, por exemplo C2-C6alquinila ou C2-C4alquinila. Os exemplos são etinila e propargila.
[00187] Halogênio é flúor, cloro, bromo ou iodo.
[00188] Cada porção química de haloalquila, isoladamente ou como parte de um grupo maior, tal como haloalcóxi, é um grupo alquila subs- tituído por um ou mais dos mesmos átomos de halogênio ou diferentes átomos de halogênio. Os exemplos incluem difluorometila, trifluorome- tila, clorodifluorometila e 2,2,2-trifluoroetila.
[00189] Em outra modalidade, o composto de Fórmula (I) ou (II) es- tá ligado a um composto não nucleosídico, por exemplo, uma fase só- lida.
[00190] Em outra modalidade, o composto de Fórmula (I) é selecio- nado a partir de: DMTrO DMTrO O
O N O N O NH
NH O O P OCH2CH2CN
HO O (Pri)2N 11 12 DMTrO DMTrO O O N NHBz N NHBz N
N O O O P OCH2CH2CN
HO (Pri)2N 13 14
DMTrO
O N
N HO NHBz
O N O N
N N P N(iPr)2 NHBz OCH2CH2CN
TBDPSO N
N 16 19
HO HO O N O N N
N O Cl TBDPSO N
NH TBDPSO N N
N 21 22 N H2N DMTrO
O N N O HO O N
NH O P N(iPr)2 OCH2CH2CN N N O
NH N DMTrO O 25 38 (Pri)2N P OCH2CH2CN
O HO
O O N O N NHBz
NH N O DMTrO O DMTrO 39 40 (Pri)2N P OCH2CH2CN HO
O O O N
O N N N NHBz NHBz
TBDPSO N DMTrO N 41 42 (Pri)2N HO P OCH2CH2CN O
O N
N O N Cl
N TBDPSO N NHBz N DMTrO N 47 N 48 H 2N
(Pri)2N P OCH2CH2CN
HO O O N O N N N
O O TBDPSO N DMTrO N
NH NH H2N N 49 54 N
O O O O O O
N O N O O 2N NH O2 N NH
TBDPSO O HO O 56 ou 57 .
[00191] A invenção fornece um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um composto de Fórmula (IV) T3
O 5' Bx 7' T4 (IV) em que independentemente para cada um do pelo menos um compos- to de Fórmula (IV) um dentre T3 ou T4 é um grupo de ligação nucleosídica; o outro dentre T3 e T4 é OR1, OR2, um grupo de terminal 5', um grupo de terminal 7' ou um grupo de ligação nucleosídica, em que R1 é H ou um grupo de proteção de hidroxila, e R2 é uma porção quí- mica de fósforo; e Bx é uma nucleobase.
[00192] Em outra modalidade, o oligonucleotídeo da invenção com- preende pelo menos um composto de Fórmula (IV), em que o compos- to de Fórmula (IV) é um composto de Fórmula (V): T3
O 5' Bx 7' T4 (V)
em que (i) T3 é um grupo de ligação nucleosídica e T4 é um grupo de terminal 7', OR1 ou OR2, preferencialmente T4 é um grupo de termi- nal 7'ou OR1; ou (ii) T3 é um grupo de terminal 5' ou OR1, ou OR2, de prefe- rência T3 é um grupo de terminal 5' ou OR2; e T4 é um grupo de liga- ção nucleosídica; ou (iii) T3 e T4 são, independentemente um do outro, um grupo de ligação nucleosídica.
[00193] Em outra modalidade, o oligonucleotídeo da invenção com- preende pelo menos um composto de Fórmula (IV), em que o dito composto de Fórmula (IV) é um composto de Fórmula (VI): T3
O 5' Bx 7' T4 (VI) em que (i) T3 é um grupo de ligação nucleosídica e T4 é um grupo de terminal 7', OR1 ou OR2, preferencialmente T4 é um grupo de termi- nal 7' ou OR2; ou (ii) T3 é um grupo de terminal 5', OR1, ou OR2, de preferên- cia T3 é um grupo de terminal 5' ou OR1; e T4 é um grupo de ligação nucleosídica; ou (iii) T3 e T4 são, independentemente um do outro, um grupo de ligação nucleosídica.
[00194] Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende um composto de Fórmula (V). Em outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende um composto de Fórmula (VI). Em outra modalidade, o oligonucleotídeo que compreende pelo menos um composto de Fór- mula (IV), (V) ou (VI) é um DNA ou um RNA.
[00195] A linha ondulada dentro das Fórmulas (I) e (IV) que simboli- za a ligação entre o Bx e o núcleo bicíclico dos compostos da invenção indica que qualquer orientação espacial da nucleobase Bx é coberta pela Fórmula (I) ou (IV). Isso significa que as Fórmulas (I) e (IV) co- brem a conformação alfa ou beta ou qualquer mistura de anômeros alfa e beta dos compostos da invenção.
[00196] O termo "arila", conforme utilizado no presente documento, se refere a um radical de hidrocarboneto aromático monovalente de 6 a 14 átomos de carbono (C6-C14) derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático de origem como bem como a dita arila opcionalmente subs- tituída independentemente por um ou mais substituintes, típica e prefe- rencialmente por um ou dois substituintes como descrito abaixo. Arila inclui radicais bicíclicos que compreende um anel aromático fundido a um anel saturado, parcialmente insaturado, ou anel carbocíclico ou heterocíclico aromático. Os grupos arila são opcionalmente substituí- dos independentemente por um ou mais substituintes, tipicamente, por exemplo, por um ou dois substituintes, em que os ditos substituintes são, independentemente em cada ocorrência, selecionados de C1- C4alquila, halogênio, CF3, OH, C1-C3alcóxi, NR20R21, C6H5, C6H5 subs- tituídos por halogênio, C1-C3alquila, C1-C3alcóxi, NR20R21, em que R20, R21 são, independentemente em cada ocorrência, H, C1-C3alquila. Grupos arila típicos incluem, porém sem limitação, radicais derivados de benzeno (fenila), fenilas substituídas, naftaleno, antraceno, bifenila, indenila, indanila, 1,2-di-hidronaftaleno, 1,2,3,4-tetra-hidronaftila e se- melhantes. O termo "arila", conforme utilizado no presente documento, se refere preferencialmente a fenila opcionalmente substituída por 1 a 3 R22, em que R22 é, independentemente em cada ocorrência, halogê- nio, -OH, C1-C3alquila opcionalmente substituída por um ou dois OH, C1-C2fluoroalquila, C1-C2alcóxi, C1-C2 alcóxiC1-C3 alquila, C3-
C6cicloalquila, -NH2, NHCH3 ou N(CH3)2.
[00197] Os termos "grupo de proteção para um amino", "grupo de proteção para um grupo amino" ou "grupo de proteção de amino", con- forme utilizado neste documento de forma intercambiável, são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em detalhes em Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3ª edição, John Wiley & Sons, 1999, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, P. G. M. Wuts, 5ª edição, John Wiley & Sons, 2014, e em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, editado por S. L. Beaucage et al. 06/2012, e por meio deste em particular no Capítulo
2."Grupos protetores de amino" adequados para a presente invenção e são, típica e preferencialmente independentemente em cada ocor- rência, selecionados a partir de carbamato de metila, carbamato de etila, carbamato de 9-fluorenilmetila (Fmoc), carbamato de 9-(2- sulfo)fluorenilmetila, carbamato de 2,7-di-t-butil-[9-(10,10-dioxo- 10,10,10,10-tetraidrotioxanil)]metila (DBD-Tmoc), carbamato de 4- metoxifenacila (Phenoc), carbamato de 2,2,2-tricloroetila (Troc), car- bamato de 2-trimetilasililetila (Teoc), carbamato de 2-feniletila (hZ), carbamato de 1,1-dimetila-2,2-dibromoetila (DB-t-BOC), carbamato de 1,1-dimetila-2,2,2-tricloroetila (TCBOC), carbamato de benzila (Cbz), carbamato de p-metoxibenzila (Moz) e carbamato de 2,4,6- trimetilabenzila; bem como formamida, acetamida, benzamida.
[00198] Os termos "grupo de proteção para uma hidroxila", "grupo de proteção para um grupo hidroxila" ou "grupo de proteção de hidroxi- la", conforme utilizado neste documento de forma intercambiável, são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em detalhes em Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3ª edição, John Wiley & Sons, 1999, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, P. G. M. Wuts, 5ª edição, John Wiley & Sons, 2014, e em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, editado por S.
L. Beaucage et al. 06/2012, e por meio deste em particular no Capítulo
2.Em uma certa modalidade, os "grupos protetores de hidroxila" da presente invenção são, independentemente em cada ocorrência, sele- cionados a partir de, acetila, benzoíla, benzila, éter β- metoxietoximetílico (MEM), dimetoxitritila, [bis-(4- metoxifenil)fenilmetila] (DMTr), éter metoximetílico (MOM), metoxitritila [(4-metoxifenil)difenilmetila] (MMT), éter p-metoxibenzílico (PMB), éter metilatiometílico, pivaloíla (Piv), tetraidropiranila (THP), tetraidrofurano (THF), tritila (trifenilmetila, Tr), éter silílico, tais como éteres t- butildifenilsilílicos (TBDPS), trimetilasilílicos (TMS), terc- butildimetilasilílicos (TBDMS), tri-iso-propilsililoximetílicos (TOM), e tri- isopropilsilílicos (TIPS); éteres metílicos, éteres etoxietílicos (EE).
[00199] Em uma modalidade, os "grupos protetores de hidroxila" da presente invenção são, independentemente em cada ocorrência, sele- cionados a partir de, acetila, t-butila, t-butoximetila, metoximetila, te- traidropiranila, 1-etoxietila, 1-(2-cloroetóxi)etila, 2-trimetilasililetila, p- clorofenila, 2,4-dinitrofenila, benzila, benzoíla, p-fenilbenzoíla, 2,6- diclorobenzila, difenilmetila, p-nitrobenzila, trifenilmetila (tritila), 4,4'- dimetoxitritila, trimetilasilila, trietilasilila, t-butildimetilasilila (TBDMS), t- butildifenilsilila (TBDPS), trifenilsilila, tri-isopropilsilila, benzoilformato, cloroacetila, tricloroacetila, trifiuoroacetila, pivaloíla, 9-fluorenilmetila carbonato, mesilato, tosilato, triflato, 4-monometoxitritila (MMTr), 4,4'- dimetoxitritila, (DMTr) e 4,4',4"-trimetoxitritila (TMTr), 2-cianoetila (CE ou Cne), 2-(trimetilasilil)etila (TSE), 2-(2-nitrofenil)etila, 2-(4-cianofenil)- etila 2-(4-nitrofenil)etila (NPE), 2-(4-nitrofenilsulfonil)etila, 3,5-diclorofe- nila, 2,4-dimetilafenila, 2-nitrofenila, 4-nitrofenila, 2,4,6-trimetilafenila, 2-(2-nitrofenil)etila, butiltiocarbonila, 4,4',4"-tris(benzoilóxi)tritila, difenil- carbamoíla, levulinila, 2-(dibromometila)benzoíla (Dbmb), 2- (isopropiltiometoximetila)benzoíla (Ptmt), 9-fenilxanten-9-ila (pixila) ou 9-(p-metoxifenil)xantina-9-i-1 (MOX).
[00200] Em algumas modalidades, o grupo protetor de hidroxila é, independentemente em cada ocorrência, selecionado a partir de aceti- la, benzila, t-butildimetilasilila, t-butildifenilsilila, tritila, 4- monometoxitritila, 4,4'-dimetoxitritila (DMTr), 4,4',4-trimetoxitritila (TMTr), 9-fenilxantin-9-ila (Pixila) e 9-(p-metoxifenil)xantin-9-ila (MOX).
[00201] Em algumas modalidades, o grupo protetor de hidroxila, é independentemente em cada ocorrência, selecionado a partir de trife- nilmetila (tritila), 4-monometoxitritila, 4,4'-dimetoxitritila (DMTr), 4,4',4"- trimetoxitritila (TMTr), 9-fenilxantin-9-ila (Pixila) e 9-(p- metoxifenil)xantin-9-ila (MOX).
[00202] Em modalidades adicionais, o grupo protetor de hidroxila é, independentemente em cada ocorrência, selecionado a partir de grupo tritila, 4-monometoxitritila e 4,4'-dimetoxitritila.
[00203] Em outra modalidade, o grupo protetor de hidroxila é, inde- pendentemente em cada ocorrência, selecionado a partir de trifenilme- tila (tritila), 4-monometoxitritila, 4,4'-dimetoxitritila (DMTr), 4,4',4"- trimetoxitritila (TMTr), 9-fenilxantin-9-ila (Pixila) e 9-(p- metoxifenil)xantin-9-ila (MOX).
[00204] Em outra modalidade, os grupos protetores de hidroxila da presente invenção é acetila, dimetoxitritila (DMTr), éteres terc- butildimetilasilílicos (TBDMS), tri-iso-propilsililoximetílicos (TOM) ou t- butildifenilsilílicos (TBDPS). Em outra modalidade, o grupo protetor de hidroxila é, independentemente em cada ocorrência, selecionado den- tre 4,4'-dimetoxitritila (DMTr) ou 4-monometoxitritila. Em outra modali- dade, o grupo protetor de hidroxila é 4,4'-dimetoxitritila (DMTr).
[00205] Quando se diz que um grupo está opcionalmente substituí- do, pode haver 1 a 5 substituintes, 1 a 3 substituintes ou 1 ou 2 substi- tuintes. Quando se diz que um grupo está opcionalmente substituído, e quando há mais de um substituinte, mais de um substituinte pode ser igual ou diferente.
GRUPOS DE LIGAÇÃO CONTENDO FÓSFORO INTERNUCLEOSÍ- DICAS
[00206] O oligonucleotídeo da invenção compreende predominan- temente ligações internucleosídicas fosfodiéster, por exemplo, 50% ou mais, por exemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e 100% dos grupos de ligação internucleosídica são grupos de ligação fosfodiéster.
[00207] O oligonucleotídeo da invenção também pode incluir, além das ligações internucleosídicas predominantemente fosfodiéster, um grupo de ligação nucleosídica selecionado a partir de um grupo de li- gação fosfotriéster, um grupo de ligação fosforotioato, um grupo de ligação fosforoditioato, um grupo de ligação fosfonato, um grupo de ligação fosfonotioato, um grupo de ligação fosfinato, uma ligação fosfo- rotioamidato ou um grupo de ligação fosforamidato.
[00208] O termo "grupo de ligação nucleosídica" inclui grupos de ligação fósforo e grupos de ligação não fósforo.
[00209] Em uma modalidade, o grupo de ligação nucleosídica é um grupo de ligação fósforo, e o grupo de ligação fósforo é selecionado a partir de um grupo de ligação fosfodiéster, um grupo de ligação fosfo- triéster, um grupo de ligação fosforotioato, um grupo de ligação fosfo- roditioato, um grupo de ligação fosfonato, por exemplo, um grupo de ligação H-fosfonato ou um grupo de ligação metilfosfonato; um grupo de ligação fosfonotioato, por exemplo, um grupo de ligação H- fosfonotioato, um grupo de ligação metil fosfonotioato; um grupo de ligação fosfinato, uma ligação fosforotioamidato um grupo de ligação fosforamidato ou um grupo de ligação fosforodiamidato. Em outra mo- dalidade, o grupo de ligação nucleosídica é um grupo de ligação fósfo- ro, e em que o grupo de ligação fósforo é selecionado a partir de um grupo de ligação fosfodiéster, um grupo de ligação fosfotriester, um grupo de ligação fosforotioato ou um grupo de ligação fosfonato, em que o fosfonato é um grupo de ligação H-fosfonato ou grupo de ligação metilfosfonato.
[00210] Em outra modalidade, o grupo de ligação nucleosídica é um grupo de ligação fósforo e o grupo de ligação fósforo é um grupo de ligação fosfodiéster. Em outra modalidade, o grupo de ligação nucleo- sídica é um grupo de ligação fósforo e o grupo de ligação fósforo é um grupo de ligação fosforotioato.
[00211] O grupo de ligação fósforo pode ser selecionado a partir de um grupo de ligação alquil fosfodiéster, um grupo de ligação alquileno fosfodiéster, um grupo de ligação tionoalquil fosfodiéster ou um grupo de ligação aminoalquil fosfodiéster, um grupo de ligação alquil fosfotri- éster, um grupo de ligação alquileno fosfotriéster, um grupo de ligação tionoalquil fosfotriéster ou um grupo de ligação aminoalquil fosfotriés- ter, um grupo de ligação alquil fosfonato, um grupo de ligação alquile- no fosfonato, um grupo de ligação aminoalquil fosfonato, um grupo de ligação tionoalquil fosfonato ou um grupo de ligação quiral fosfonato. Um grupo de ligação nucleosídica de acordo com a invenção inclui um grupo de ligação fósforo, e em que o grupo de ligação fósforo é um grupo de ligação fosfodiéster -O-P(=O)(OH)O- ou -O-P(=O)(O-)O- com [HB+] como contraíon, um fosforotioato -O-P(=S)(OH)O- ou -O- P(=S)(O-)O- com [HB+] como contraíon, um metilfosfonato -O- P(=O)(CH3)O-. Vários sais, sais misturados e formas de ácido livre do grupo de ligação fósforo estão incluídos.
[00212] O grupo de ligação nucleosídica pode ligar um nucleosídeo, um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo com outro nucleosídeo, nucle- otídeo ou oligonucleotídeo.
[00213] Grupos de ligação sem fósforo não contêm um átomo de fósforo e exemplos de grupos de ligação sem fósforo incluem alquila, arila, de preferência, fenila, benzila ou benzoíla, cicloalquila, alquilene- arila, alquilenodiarila, alcóxi, alcoxialquileno, alquilsulfonila, alquino,
éter, cada um, independentemente uns dos outros, opcionalmente substituído por ciano, nitro, halogênio, carboxila, amida, amina, amino, imina, tiol, sulfeto, sulfóxido, sulfona, sulfamato, sulfonato, sulfonami- da, siloxano ou misturas dos mesmos. Um grupo de ligação sem fósfo- ro inclui amino propil, grupo alquil amina de cadeia longa, vinil, aceti- lamida, aminometila, formacetal, tioformacetal, tioformacetal, tioforma- cetila, riboacetila, metileneimino, metileno-hidrazino ou um grupo de ligação de nucleosídeo neutro não iônico, como amida-3 (3'-CH2- C(=O)-N(H)-5') ou amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'. Um grupo de não- ligação fósforo inclui um composto selecionado a partir de alquila, ari- la, de preferência fenila, benzila, ou benzoíla, cicloalquila, alquileno, alquilenodiarila, alcóxi, alcoxialquileno, alquilsulfonila, alquino, ou éter, em que o composto inclui C1-C9, C1-C6 ou C1-C4.
GRUPOS DE LIPÍDIOS
[00214] A invenção fornece oligonucleotídeos que compreendem um nucleosídeo abc-DNA e um grupo lipídico ligados por meio de um ligante. A estrutura do conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo é tal que a cadeia de hidrocarboneto do grupo lipídico, por exemplo um ácido graxo, é exposta, permitindo assim a interação da cadeia de hi- drocarboneto com receptores ou veículos de albumina e/ou ácido gra- xo, proporcionando assim um oligonucleotídeo com uma meia-vida longa in vivo. O grupo lipídico é conjugado através de um ligante ao grupo hidroxila na extremidade 5' ou 7' do oligonucleotídeo.
[00215] Em certas modalidades, o grupo lipídico é um grupo deriva- do de ácido graxo. Em certas modalidades, o grupo derivado de ácido graxo compreende um grupo carbóxi. Os ácidos graxos incluem qual- quer ácido graxo saturado ou insaturado com uma cadeia de hidrocar- boneto de 4 a 28 átomos de carbono e podem conter um ou dois gru- pos de ácido carboxílico. Um ácido graxo que contém dois grupos de ácido carboxílico é um ácido dicarboxílico. Um ou dois ligantes de áci-
do graxo podem ser ligados ao oligonucleotídeo por meio de ligantes nas extremidades 5' e/ou 7' de um oligonucleotídeo abc-DNA como descrito no presente documento.
[00216] Em certas modalidades, o grupo lipídico é um grupo deriva- do de ácido graxo, em que o ácido graxo é qualquer um dos ácidos graxos apresentados nas Tabelas 1 e 2. TABELA 1. ÁCIDOS GRAXOS SATURADOS Ácido butírico Ácido butanoico CH3(CH2)2COOH C4:0 Ácido valérico Ácido pentanoico CH3(CH2)3COOH C5:0 Ácido caproico Ácido hexanoico CH3(CH2)4COOH C6:0 Ácido enântico Ácido heptanoico CH3(CH2)5COOH C7:0 Ácido caprílico Ácido octanoico CH3(CH2)6COOH C8:0 Ácido pelargônico Ácido nonanoico CH3(CH2)7COOH C9:0 Ácido cáprico Ácido decanoico CH3(CH2)8COOH C10:0 Ácido undecílico Ácido undecanoico CH3(CH2)9COOH C11:0 Ácido Láurico Ácido dodecanoico CH3(CH2)10COOH C12:0 Ácido tridecílico Ácido tridecanoico CH3(CH2)11COOH C13:0 Ácido mirístico Ácido tetradecanoico CH3(CH2)12COOH C14:0 Ácido pentadecílico Ácido pentadecanoico CH3(CH2)13COOH C15:0 Ácido palmítico Ácido hexadecanoico CH3(CH2)14COOH C16:0 Ácido margárico Ácido heptadecanoico CH3(CH2)15COOH C17:0 Ácido esteárico Ácido octadecanoico CH3(CH2)16COOH C18:0 Ácido não adecílico Ácido não adecanoico CH3(CH2)17COOH C19:0 Ácido araquídico Ácido eicosanoico CH3(CH2)18COOH C20:0 Ácido heneicosílico Ácido heicosanoico CH3(CH2)19COOH C21:0 Ácido beênico Ácido docosanoico CH3(CH2)20COOH C22:0 Ácido tricosilico Ácido tricosanoico CH3(CH2)21COOH C23:0 Ácido lignocérico Ácido tetracosanoico CH3(CH2)22COOH C24:0 Ácido pentacosílico Ácido pentacosanoico CH3(CH2)23COOH C25:0 Ácido cerótico Ácido hexacosanoico CH3(CH2)24COOH C26:0 Ácido heptacosílico Ácido heptacosanoico CH3(CH2)25COOH C27:0 Ácido montânico Ácido octacosanoico CH3(CH2)26COOH C28:0
TABELA 2: ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS ω−3 ácido α- C18:3 Δ9,12,15 CH3CH2CH=CHCH2CH=CH cis linolênico CH2CH=CH(CH2)7COOH ω−3 Ácido es- C18:4 Δ6,9,12,15 CH3CH2CH=CHCH2CH=CH cis tearidônico CH2CH=CHCH2CH=CH(CH 2)4COOH ω−3 Ácido ei- C20:5 Δ5,8,11,14,17 CH3CH2CH=CHCH2CH=CH cis cosapen- CH2CH=CHCH2CH=CHCH2 taenoico CH=CH(CH2)3COOH ω−3 Ácido do- C22:6 Δ4,7,10,13,16,19 CH3CH2CH=CHCH2CH=CH cis cosahexa- CH2CH=CHCH2CH=CHCH2 enoico CH=CHCH2CH=CH(CH2)2C
OOH ω−6 Ácido lino- C18:2 Δ 9,12 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=C cis leico H(CH2)7COOH ω−6 Ácido li- C18:2 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=C trans nolelaídico H(CH2)7COOH ω−6 ácido γ- C18:3 Δ6,9,12 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=C cis linolênico HCH2CH=CH(CH2)4COOH ω−6 Ácido di- C20:3 Δ8,11,14 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=C cis homo-γ- HCH2CH=CH(CH2)6COOH linolênico ω−6 Ácido ara- C20:4 Δ5,8,11,14 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=C cis quidônico HCH2CH=CHCH2CH=CH(C H2)3COOH ω−6 Ácido do- C22:4 Δ7,10,13,16 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=C cis cosatetra- HCH2CH=CHCH2CH=CH(C enoico H2)5COOH ω−7 Ácido C16:1 Δ9 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7CO cis palmitolei- OH co ω−7 Ácido va- C18:1 Δ11 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9CO trans cênico OH ω−7 Ácido pau- C20:1 Δ13 CH3(CH2)5CH=CH(CH2)11C cis línico OOH ω−9 Ácido olei- C18:1 Δ9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO cis co OH ω−9 Ácido ela- C18:1 Δ9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO trans ídico OH ω−9 Ácido C20:1 Δ11 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)9CO cis gondoico OH ω−9 Ácido erú- C22:1 Δ13 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11C cis cico OOH ω−9 Ácido ner- C24:1 Δ15 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)13C cis vônico OOH ω−9 Ácido de C20:3 Δ5,8,11 CH3(CH2)7CH=CHCH2CH=C cis Mead HCH2CH=CH(CH2)3COOH
[00217] Grupos lipídicos adicionais úteis de acordo com a invenção incluem colesterol, vitamina E (tocoferol) e ácido biliar.
[00218] Em uma modalidade, o dito grupo lipídico é um grupo deri- vado de ácido graxo saturado com uma cadeia de hidrocarboneto de 8 a 24 átomos de carbono. Em certas modalidades, o dito grupo lipídico é um grupo derivado de ácido graxo saturado, em que o dito ácido graxo é selecionado do grupo que consiste em ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico, ácido hexadeca- noico, ácido octadecanoico, ácido eicosanoico, ácido docosanoico e ácido tetracosanoico. Em uma modalidade, o dito grupo lipídico é um grupo derivado de ácido graxo saturado, em que o dito ácido graxo é o ácido hexadecanoico. Em uma modalidade, o dito grupo derivado de ácido graxo é ligado ao oligonucleotídeo por meio do ligante na extre- midade 5' do oligonucleotídeo abc-DNA. Em uma modalidade, o dito grupo derivado de ácido graxo é ligado ao oligonucleotídeo por meio do ligante na extremidade 7' do oligonucleotídeo abc-DNA.
[00219] Em uma modalidade, o dito grupo lipídico é um grupo deri- vado de ácido graxo insaturado que tem uma cadeia de hidrocarbone- to de 8 a 24 átomos de carbono. Em certas modalidades, o dito grupo lipídico é um grupo derivado de ácido graxo insaturado, em que o dito ácido graxo é selecionado do grupo que consiste em m ácido miristo- leico, ácido palmitoleico, ácido sapiênico, ácido oleico, ácido elaídico,
ácido vacênico, ácido linoleico, ácido linoelaídico, ácido α-linolênico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenoico, ácido erúcico e ácido docosahexaenoico.
LIGANTE
[00220] Os oligonucleotídeos da invenção são conectados a um grupo lipídico por meio de um ligante. Em algumas modalidades, o li- gante é conectado ao grupo lipídico por meio de uma ligação amida. Para ligantes de hidrocarbonetos, o ligante compreende 2 a 20 carbo- nos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 carbonos. Para ligantes de polietilenoglicol (PEG), o ligante compreende 1 a 20 subunidades de etilenoglicol, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 repetições de etilenoglicol. Um ligante pode ser um ligante de hidrocarboneto ou um ligante de polietilenoglicol (PEG). Um ligante de acordo com a inven- ção, em que o abcDNA está ligado à porção química de fósforo do li- gante e o grupo lipídico, por exemplo, um grupo derivado de ácido graxo, está ligado a Y, pode ter, por exemplo, a estrutura geral mos- trada abaixo: Z R3 R1 O P X T C T' C Y k l m n WR5 R4 R2 em que Se Y = NH, então o grupo derivado de ácido graxo é conec- tado por meio de uma ligação amida; Se n = 1, R1 pode ser, por exemplo, CO2H e R2 pode ser, por exemplo, H; T' pode ser –CH2-CH2-O com m sendo o número de repeti- ções de etilenoglicol; T pode ser uma entidade bioclivável, como um grupo dissul- feto, e k é igual a 1, em que, em certas modalidades, X pode ser oxigênio ou NH;
Z pode ser O ou S; e WR5 pode ser OH ou SH.
[00221] Os ligantes úteis de acordo com a invenção incluem, porém sem limitação, o seguinte:
[00222] Ligante amino-alquil-fosforotioato: em que n é de preferência um número inteiro de 2 a 12, de preferência de 4 a 10. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em uma modalidade, n é 6.
[00223] Ligante alfa-carboxilato-amino-alquil-fosforotioato: em que n é de preferência um número inteiro de 2 a 12, de preferência de 4 a 10. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em uma modalidade, n é 6.
[00224] Ligante de amino-PEG-fosforotioato: em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. e Ligante alfa-carboxilato-amino-PEG-fosforotioato:
em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[00225] Assim, em uma modalidade, o dito ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em (i) um ligante amino-alquil-fosforotioato; (ii) um ligante alfa-carboxilato-amino-alquil-fosforotioato; (iii) um ligante amino-PEG-fosforotioato, e (iv) ligante alfa-carboxilato-amino-PEG-fosforotioato tudo conforme definido acima na fórmula fornecida.
[00226] Em uma modalidade, o dito ligante é um ligante amino- alquil-fosforotioato da fórmula em que n é um número inteiro de 2 a 12, de preferência de 4 a 10. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em uma modalidade, n é 6.
[00227] Assim, a invenção proporciona um ligante amino alquil fos- forotioato tendo a estrutura apresentada abaixo.
em que n é um número inteiro de 2 a 12, de preferência de 4 a 10. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em uma modalidade, n é 6.
[00228] Um exemplo de um oligonucleotídeo da invenção que com- preende a SEQ ID NO: 10 conectado a um grupo lipídico através de um ligante amino alquil fosforotioato tem a estrutura: em que n é um número inteiro de 2 a 12, de preferência de 4 a 10, mais preferencialmente n é 6. De preferência, todos os resíduos da SEQ ID NO: 10 são resíduos abc-DNA correspondentes à SEQ ID NO:
418.
[00229] Outro exemplo de um oligonucleotídeo da invenção (SEQ ID NO: 412) conectado a um grupo lipídico através de um ligante ami- no alquil fosforotioato tem a estrutura:
[00230] A invenção também fornece um ligante amino-PEG- fosforotioato que tem a estrutura fornecida abaixo.
em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[00231] Um exemplo de um oligonucleotídeo da invenção que com- preende a SEQ ID NO: 10 conectado a um grupo lipídico por meio de um ligante amino-PEG-fosforotioato tem a estrutura: em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. De prefe- rência, todos os resíduos da SEQ ID NO: 10 são resíduos abc-DNA correspondentes à SEQ ID NO: 418.
[00232] A invenção também fornece um ligante alfa-carboxilato- amino-alquil-fosforotioato com a estrutura fornecida abaixo.
em que n é de preferência um número inteiro de 2 a 12, de preferência de 4 a 10. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em uma modalidade, n é 6.
[00233] Um exemplo de um oligonucleotídeo da invenção que com- preende a SEQ ID NO: 10 conectado a um grupo lipídico por meio de um ligante alfa-carboxilato-amino-alquil-fosforotioato tem a estrutura: em que n é um número inteiro de 2 a 12, de preferência de 4 a 10, mais preferencialmente n é 6. De preferência, todos os resíduos da SEQ ID NO: 10 são resíduos abc-DNA correspondentes à SEQ ID NO:
418.
[00234] A invenção também fornece um ligante alfa-carboxilato- amino-PEG-fosforotioato com a estrutura fornecida abaixo.
em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[00235] Um exemplo de um oligonucleotídeo da invenção que com- preende a SEQ ID NO: 10 conectado a um grupo lipídico por meio de um ligante alfa-carboxilato-amino-PEG-fosforotioato tem a estrutura:
em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. De prefe- rência, todos os resíduos da SEQ ID NO: 10 são resíduos abc-DNA correspondentes à SEQ ID NO: 418; ou a estrutura: em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. De prefe- rência, todos os resíduos da SEQ ID NO: 10 são resíduos abc-DNA correspondentes à SEQ ID NO: 418.
[00236] Em uma modalidade, a invenção fornece um ligante que é conformacionalmente restrito, por exemplo, com base em hidroxiproli- na, por exemplo, em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[00237] O ligante pode ser ligado ao grupo OH do terminal 5' e/ou 7' do oligonucleotídeo por meio, por exemplo, de um grupo tiofosfato. Em uma modalidade, o ligante é ligado ao grupo OH do terminal 5' do oli- gonucleotídeo por meio, por exemplo, de um grupo tiofosfato. Em uma modalidade, o ligante é ligado ao grupo OH do terminal 7' do oligonu- cleotídeo por meio, por exemplo, de um grupo tiofosfato. Grupos adici- onais que podem ser usados para conectar um ligante a um oligonu- cleotídeo incluem um grupo fosfato.
[00238] Em algumas modalidades, uma fosforamidita conjugada com ácido graxo pode ser usada para o acoplamento de um ácido gra- xo ao abc-DNA em qualquer um dos terminais 5', 7' ou ambos os ter- minais 5' e 7'. Um exemplo de uma fosforamidita que pode ser usada para o acoplamento de um ácido graxo ao abc-DNA tem a estrutura: em que R-CO é uma porção química de ácido graxo.
[00239] Em outras modalidades, o ligante é um ligante alfa- carboxilato-amino tendo, por exemplo, a estrutura: em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[00240] Em sua forma mais simples, o ligante é um ligante de ácido 2-amino-6-hidróxi-4-oxahexanoico em que n = 1. Alternativamente, um ligante com a estrutura acima em que a estereoquímica em C2 corres- ponde à da serina, é um ligante O-(2-hidroxietil)-L-serina. No contexto de um conjugado de ácido graxo abcDNA, a função hidroxila do ligante é conectada por meio de uma ligação fosforotioato ao abcDNA e o grupo amino é conectado ao grupo carboxila da entidade de ácido gra- xo por meio de uma ligação amida.
[00241] Em outra modalidade, o reagente de fosforamidita alfa- carboxilato-amino-PEG conjugado com ácido graxo tem a estrutura abaixo, em que R é um grupo protetor adequado, tal como 2-
clorotritila, usado na etapa final da síntese de fase sólida de um conju- gado abcDNA-ligante-ácido graxo: em que n é preferencialmente um número inteiro de 1 a 8. Em uma modalidade, n é um número inteiro de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
[00242] Em outras modalidades, uma fosforamidita que pode ser usada para o acoplamento de um ácido graxo ao abc-DNA tem a es- trutura (AM Chemicals, LLC, Oceanside, CA): em que R é uma porção química de ácido graxo.
[00243] Em algumas modalidades, um suporte de fase sólida con- jugado com ácido graxo pode ser usado para o acoplamento de um ácido graxo ao abc-DNA no terminal 5'. Um exemplo de um suporte de fase sólida que pode ser usado para o acoplamento de um ácido graxo ao abc-DNA tem a estrutura: em que R-CO é uma porção química de ácido graxo e o círculo som- breado é o suporte de fase sólida.
[00244] Em outras modalidades, um suporte de fase sólida que po-
de ser usado para o acoplamento de um ácido graxo ao abc-DNA tem a estrutura (AM Chemicals, LLC, Oceanside, CA): em que R é uma porção de ácido graxo e o círculo sombreado é o su- porte de fase sólida.
[00245] Em certas modalidades, o ligante contém uma ligação cli- vável, por exemplo, uma ligação dissulfeto, uma ligação hidrazona cli- vável com ácido ou uma porção química clivável por protease.
MÉTODOS DE SÍNTESE
[00246] Métodos de síntese bem conhecidos na técnica são usados para sintetizar nucleosídeos abc-DNA e oligonucleotídeos que com- preendem nucleosídeos abc-DNA. Em algumas modalidades, para oli- gonucleotídeos conjugados a um grupo lipídico na extremidade 5', o ligante da invenção é ligado a um suporte sólido antes da síntese do oligonucleotídeo e da ligação. Em certas modalidades, para oligonu- cleotídeos em que o grupo lipídico é conjugado com a extremidade 7' do oligonucleotídeo, a conjugação ocorre durante a síntese em fase sólida. Em outras modalidades, para os oligonucleotídeos em que o grupo lipídico é conjugado à extremidade 7' do oligonucleotídeo, a con- jugação ocorre após a síntese ser concluída.
PROCEDIMENTOS GERAIS
[00247] Todas as reações são realizadas em vidraria seca e sob uma atmosfera inerte de Argônio. Os solventes anidros para reações são obtidos por filtração através de alumina ativada ou por armazena- mento em peneiras moleculares (4 Å). A cromatografia em coluna (CC) é realizada em gel de sílica (SiliaFlash P60, 40 a 63 m, 60 Å). O me- tanol usado para CC é de grau HPLC, todos os outros solventes usa- dos para CC são de grau técnico e destilados antes do uso. A croma-
tografia em camada fina é realizada em placas de sílica gel (Mache- rey-Nagel, placas de TLC pré-revestidas com sil G-25 UV254). Os compostos são visualizados sob luz ultravioleta ou por imersão em uma solução de coloração de p-anisaldeído [p-anisaldeído (3,7 ml), ácido acético glacial (3,7 ml), ácido sulfúrico concentrado (5 ml), etanol (135 ml)] seguido por aquecimento com pistola de ar quente. Os es- pectros de NMR são registrados a 300 ou 400 MHz (1H), a 75 ou 101 MHz (13C) e a 122 MHz (31P) em CDCl3, CD3OD ou CD3CN. Os desvi- os químicos (δ) são relatados em relação ao pico de solvente não tra- tado residual [CDCl3: 7,26 ppm (1H), 77,16 ppm (13C); CD3OD: 3,31 ppm (1H), 49,00 ppm (13C)]. As atribuições de sinais são baseadas em APT e DEPT e em experimentos de correlação 1H,1H e 1H,13C (COSY, HSQC, HMBC). Dados de massa de alta resolução são obtidos por ionização por electrospray no modo positivo (ion trap, ESI+).
TEMPERATURA DE FUSÃO
[00248] Os experimentos de fusão por UV são registrados em um espectrofotômetro Varian Cary Bio 100 UV/vis. Os experimentos são realizados na concentração de duplex de 2 μM, NaH2PO4 a 10 mM, NaCl a entre 0 M e 150 mM (anômero alfa) ou NaCl a entre 0,05 M e 1,00 M (anômero beta) e pH ajustado para 7,0. As amostras são pro- tegidas da evaporação por uma camada de cobertura de dimetilpoli- siloxano. A absorvância é monitorada a 260 nm. Para cada experimen- to, três ciclos de resfriamento-aquecimento são realizados com um gradiente de temperatura de 0,5 °C/min. Os máximos da primeira deri- vada das curvas são extraídos com o software Varian WinUV e os va- lores de Tm são relatados como a média das seis rampas.
ESPECTROSCOPIA DE DICROÍSMO CIRCULAR
[00249] Os espectros de CD são registrados em um espectropola- rímetro Jasco J-715 equipado com um controlador de temperatura Jasco PFO-350S. As condições da amostra são iguais às dos experi-
mentos de fusão por UV. Os espectros são registrados entre 210 e 320 nm a uma taxa de 50 nm/min e a temperatura é medida direta- mente da amostra. Para cada experimento, uma substância bruta con- tendo as mesmas concentrações de sal que a amostra é registrada. Os espectros relatados são obtidos tomando uma média suavizada de três varreduras e subtraindo o espectro em branco correspondente.
SÍNTESE DE NUCLEOSÍDEOS ABCDNA
[00250] As estruturas bicíclicas 7 e 10 previstas para a síntese de nucleosídeos subsequentes são construídas a partir do intermediário 1 previamente descrito (Tarköy, M.; Bolli, M.; Schweizer, B.; Leumann, C. Helv. Chim. Acta 1993, 76, 481) (Esquema 1). O anel epóxido em 1 é eficientemente aberto por eliminação intramolecular mediada por Li- HMDS a -78 °C, produzindo o éster insaturado 2 com bom rendimento. A redução subsequente de NaBH4 catalisada por níquel de 2 procede estereoespecificamente do lado convexo da estrutura do núcleo bicí- clico, resultando no éster 3 como o único diastereoisômero identificá- vel. A função hidroxila em 3 é, então, protegida por TBDPS, gerando 4 em rendimento quantitativo. O intermediário 4 é consequentemente reduzido com DIBAL a -78 °C, levando ao aldeído 5. O grupo protetor de acetonida em 5 é, então, hidrolisado sob condições suaves com In(OTf)3 como catalisador (Golden, K. C.; Gregg, B. T.; Quinn, J. F. Tetrahedron Lett. 2010, 51, 4010), em uma mistura de MeCN e H2O, e o hemiacetal bicíclico resultante convertido no metil glicosídeo 6 sim- plesmente mudando o solvente para MeOH. O composto 6 é, então, acetilado para gerar o precursor protegido 7 que é usado para a sínte- se dos nucleosídeos de purina correspondentes por meio da química de Vorbrüggen.
Esquema 1: (a) LiHMDS, THF, -78 °C, 2 h, 74%; (b) NaBH4, NiCl2, EtOH, 0 °C → temperatura ambiente, 2 h, 90%; (c) TBDPSCl, I2, N- metilimidazol, THF, temperatura ambiente, 3 h, quant; (d) DiBAL-H, CH2Cl2, -78 °C, 90 min, 89%; (e) i) In(OTf)3, MeCN/H2O, temperatura ambiente, 48 h, ii) MeOH, 6 h, 81%; (f) Ac2O, DMAP, DCM, temperatu- ra ambiente, 2 h, 96%; (g) i) TMSOTf, 2,6-lutidina, DCM, temperatura ambiente, 60 min, ii) TBAF, THF, 0 °C, 20 min, 92 %; (h) DMTr-Cl, AgOTf, DCM/lutidina, temperatura ambiente, 4h, 93%; (i) TBAF, THF, temperatura ambiente, 20 h, quant.
[00251] A síntese de nucleosídeos de pirimidina da presente inven- ção consiste na aplicação bem estabelecida da adição induzida por NIS -estereosseletivo das nucleobases a um glical bicíclico corres- pondente (Medvecky, M.; Istrate, A.; Leumann, C. J. J. Org. Chem. 2015, 80, 3.556; Dugovic, B.; Leumann, C. J. Journal of Organic Che- mistry 2014, 79, 1271; Lietard, J.; Leumann, C. J. J. Org. Chem. 2012, 77, 4.566). Em primeiro lugar, para introduzir a timina nucleobase, a nucleosidação induzida por N-iodosuccinimida (NIS) é realizada no precursor direto de glical 8, em que R1 = TMS, que é facilmente obtido de 6 por tratamento apenas com TMSOTf. Essa abordagem resulta na formação estereosseletiva do -nucleosídeo correspondente, no en- tanto, com uma contaminação significativa de 7% do anômero α que permaneceu inseparável por técnicas de cromatografia padrão. É ar- gumentado que a-seletividade pode ser aumentada aumentando o volume estérico em R1 e diminuindo-o em R2, como em glical 10. Isso favoreceria -ataque inicial do iodo eletrofílico em C(4). Para esse fim, o composto 6 é convertido em glical 8 com TMSOTf seguido por um curto tratamento com TBAF para remover seletivamente o grupo TMS recém-introduzido. O intermediário 8 é, então, elaborado no composto de dimetoxitritila 9 que é finalmente submetido à remoção do grupo protetor TBDPS com TBAF para gerar o componente de açúcar dese- jado 10.
[00252] NIS-nucleosidação no glical 10 protegido por TMS in situ, seguido pela redução radical do iodeto intermediário com Bu3SnH, produz o derivado de timidina protegido por DMTr 11 com bom rendi- mento contendo apenas vestígios (<2% por RMN de 1H) do anômero α (Esquema 2). A fosfitilação final com 2-cianoetil N,N,N',N'- tetraisopropilfosforodiamidita leva ao bloco de construção de fosfora- midita de timidina 12. A síntese do nucleosídeo 5-metilcitosina é obtida pela conversão da base timina. Para esse fim, o nucleosídeo 11 é pro- tegido por TMS e convertido no triazolídeo correspondente por trata- mento com 1,2,4-triazol e POCl3. O tratamento subsequente desse triazolídeo em uma mistura de amoníaco e 1,4-dioxano rende o nu- cleosídeo 5-metilcitosina correspondente, que é diretamente protegido com Bz2O para gerar 13 em 88% de rendimento ao longo de três eta- pas. A fosforamidita 14 é obtida por uma fosfitilação como descrito acima.
DMTrO DMTrO DMTrO O a O b O
N O N O NH NH
HO HO O O O 10 11 P OCH2CH2CN (Pri)2N 12 c DMTrO DMTrO
O O b N NHBz N NHBz
N N
HO O O O 13 P OCH2CH2CN (Pri)2N 14 Esquema 2: (a) i) Timina, BSA, NIS, DCM, temperatura ambiente, 7 h; ii) Bu3SnH, AIBN, tolueno, 70 °C, 30 min, 73%; (b) 2-Cianoetil N,N,N′,N′-tetraisopropilfosforodiamidita, ETT, DCM, temperatura ambi- ente, 30 min, 70% for 12, 75% for 14; (c) i) BSA, triazol, POCl3, Et3N, CH3CN, temperatura ambiente, 5 h, ii) 1,4-dioxano/NH4OH, temperatu- ra ambiente, 2 h, iii) Bz2O, Et3N, DMF, temperatura ambiente, 20h, 88%.
[00253] A nucleosidação clássica de Vorbrüggen é aplicada para a introdução de nucleobases de purina, resultando geralmente na preva- lência de -nucleosídeos. A conversão do precursor 7 com N6- benzoiladenina ou 2-amino-6-cloropurina leva às misturas anoméricas inseparáveis 15 e 20, resp. em razões α/β de 4:1 e 7:3 (Esquema 3). A separação dos anômeros é possível após a desacetilação, levando aos -anômeros puros 16 e 21. A partir daqui, o bloco de construção de adenina 19 é obtido por dimetoxitritilação padrão (→ 17) seguido por clivagem mediada por TBAF do grupo protetor de silila (→ 19) e fosfitilação. A síntese do bloco de construção da guanina requer a conversão da nucleobase 2-amino-6-cloropurina. Isso é alcançado pe- lo tratamento de 21 com 3-hidroxipropionitrila e TBD e subsequente proteção do grupo 2-amino com DMF, originando os derivados de guanosina protegidos 22. Seguindo a mesma via química como acima, a síntese do bloco de construção de guanina 25 é alcançada por dime- toxitritilação (→ 23) seguida pela remoção do grupo protetor silila (→ 24) e por fosfitilação. R1O DMTrO
O N O a e N
N N NHBz NHBz R2O N O N
N N AcO P N(iPr)2 b 15 R1 = Ac, R2 = TBDPS OCH2CH2CN
O 16 R1 = H, R2 = TBDPS OMe c 17 R1 = DMTr, R2 = TBDPS d 18 R1 = DMTr, R2 = H 19 TBDPSO 7 RO R1O O i O N f N l
N N Cl O TBDPSO N R2O N
N NH H2N N
N g 20 R = Ac 22 R1 = H, R2 = TBDPS 21 R = H j k 23 R1 = DMTr, R2 = TBDPS 24 R1 = DMTr, R2 = H DMTrO
O N N O O N
NH P N(iPr)2 OCH2CH2CN N
N 25 Esquema 3: (a) N6-Benzoiladenina, BSA, TMSOTf, MeCN, 70 °C, 20 min, 64%; (b) NaOH, THF/MeOH/H2O, 0 °C, 20 min, 69%; (c) DMTr-Cl, piridina, temperatura ambiente, 24 h, 87%; (d) TBAF, THF, temperatu- ra ambiente, 48 h, 87%; (e) CEP-Cl, DIPEA, THF, temperatura ambi- ente, 2 h, 71%; (f) 2-amino-6-cloropurina, BSA, TMSOTf, MeCN, 55 °C, 50 min, 77%; (g) NaOH, THF/MeOH/H2O, 0 °C, 20 min, 85%; (i) i) TBD, 3-hidroxipropionitrila, DCM, 48h, ii) N,N-dimetilformamida dimeti- lacetal, DMF, 55 °C, 2 h, 73%; (j) DMTr-Cl, piridina, temperatura ambi- ente, 18 h, 70%; (k) TBAF, THF, temperatura ambiente, 7 h, 87%; (l) 2- Cianoetil N,N,N′,N′-tetraisopropilfosforodiamidita, ETT, DCM, tempera-
tura ambiente, 50 min, 69%.
[00254] A partir do açúcar protegido 7, é desenvolvida a síntese de quatro blocos de construção de fosforamidita preferenciais da presente invenção. O tratamento de uma mistura de açúcar 7 e timina sililada in situ com TMSOTf resulta na formação suave do nucleosídeo 35, com uma razão anomérica favorável α/β de aproximadamente 85:15 (de- terminada por RMN de 1H) (Esquema 4). A via química que leva à ti- midina fosforamidita com o grupo DMTr na posição 5' não permite a separação de anômeros por cromatografia padrão. Portanto, e para introduzir a modificação com reversão de polaridade nas fitas de DNA, o grupo DMTr é introduzido na posição 7'. Para esse fim, o grupo silila de 35 é removido por um curto tratamento com TBAF (→ 36) seguido por dimetoxitritilação padrão (→ 37). A separação dos dois anômeros é possível após a desacetilação padrão, levando ao anômero α 38 pu- ro. O bloco de construção de timidina 39 é finalmente obtido por fosfo- rilação com 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita na pre- sença de 5-(etiltio)-1H-tetrazol. O intermediário 38 também oferece acesso curto ao nucleosídeo 5-metilcitosina, por conversão do nucleo- sídeo protegido por TMS in situ 38 no triazolídeo correspondente com POCl3 e 1,2,4-triazol, seguido por tratamento com uma mistura de amônia e 1,4-dioxano. A proteção direta com Bz2O em DMF resulta na formação eficiente do nucleosídeo 40, o grupo protetor silila lábil sendo clivado durante o processo. A fosfitilação final nas condições descritas acima proporciona a 5-metilcitidina fosforamidita 41.
(Pri)2N P OCH2CH2CN AcO R1O O
O O O a e OMe N O N O
NH NH TBDPSO 7 R2O O DMTrO O 39 b 35 R1 = Ac, R2 = TBDPS c 36 R1 = Ac, R2 = H d 37 R1 = Ac, R2 = DMTr 38 R1 = H, R2 = DMTr f (Pri)2N P OCH2CH2CN
HO O O
O O N e N NHBz N NHBz
N DMTrO O DMTrO 40 41 Esquema 4: (a) Timina, BSA, TMSOTf, MeCN, temperatura ambiente, 18 h, 82%; (b) TBAF, THF, 2 h, 75%; (c) DMTr-Cl, piridina, temperatu- ra ambiente, 24 h, 96%; (d) K2CO3, MeOH, 3 h, 86%; (e) 2-Cianoetil N,N,N′,N′-tetraisopropilfosforodiamidita, ETT, DCM, temperatura ambi- ente, 1h, 81% for 39, 30 min, 80% for 41; f) i) BSA, 1,2,4-triazol, POCl3, Et3N, MeCN, temperatura ambiente, 7 h, ii) 1,4-Dioxano/NH4OH, tem- peratura ambiente, 3h, iii) Bz2O, Et3N, DMF, temperatura ambiente, 18 h, 83%.
[00255] Para as nucleobases de purinas, a introdução das purinas é realizada por uma curta nucleosidação a temperatura ligeiramente ele- vada com N6-benzoiladenina ou 2-amino-6-cloropurina, levando aos nucleosídeos 15 e 20, resp. em razões α/β de 4:1 e 7:3 (Esquema 5). Para separar os anômeros, os grupos acetila são removidos sob con- dições suaves, produzindo os anômeros α42 e 48 puros. A formação do bloco de construção de adenosina continua com a reintrodução do grupo de proteção acetila (→ 43), a remoção do grupo de proteção TBDPS com TBAF (→ 44) seguido por dimetoxitritilação padrão (→ 45). A desproteção seletiva do grupo acetila (→ 46) seguida por fosfiti- lação sob as condições descritas acima produz o bloco de construção de adenina 47.
[00256] Para o bloco de construção da guanina, após a separação dos dois anômeros, a 6-cloropurina é convertida na guanina nucleoba- se por tratamento com TBD e 3-hidroxipropionitrila produzindo o nu- cleosídeo de guanosina 49. A acetilação ao longo de 48 h permitiu a proteção concomitante dos grupos 5'-hidróxi e 2-amino, produzindo o nucleosídeo protegido 50. Da mesma forma como acima, o grupo DMTr é introduzido pela remoção do grupo protetor de silila com TBAF (→ 51) seguido por dimetoxitritilação (→ 52). Os dois grupos acetila são removidos por tratamento com K2CO3 e o produto polar resultante é diretamente protegido com DMF para fornecer o nucleosídeo de guanosina 53. A fosfitilação final rendeu o bloco de construção 54. (Pri)2N P OCH2CH2CN AcO R1O O
O N O N O N b g
N N N NHBz NHBz NHBz R2O 15 N R2O N DMTrO N N N 47 N a 42 R1 = H, R2 = TBDPS c AcO 43 R1 = Ac, R2 = TBDPS d 44 R1 = Ac, R2 = H O e 45 R1 = Ac, R2 = DMTr OMe f 46 R1 = H, R2 = DMTr TBDPSO 7 h (Pri)2N P OCH2CH2CN RO R1O O
O N O N O N j g
N N N Cl O O TBDPSO N R2O N DMTrO N
N NH NH H2N R3HN N 54 N i 20 R = Ac k 49 R1 = H, R2 = TBDPS, R3 = H 48 R = H 50 R1 = Ac, R2 = TBDPS, R3 = Ac l 51 R1 = Ac, R2 = H, R3 = Ac m 52 R1 = Ac, R2 = DMTr, R3 = Ac n 53 R1 = H, R2 = DMTr, R3 = DMF Esquema 5: a) N6-Benzoiladenina, BSA, TMSOTf, MeCN, 70 °C, 20 min, 64%; (b) NaOH, THF/MeOH/H2O, 0 °C, 20 min, anômero α a 51%, anômero β a 18%; (c) Ac2O, DMAP, DCM, temperatura ambien- te, 18 h, 90%; (d) TBAF, THF, temperatura ambiente, 3,5 h, 90%; (e) DMTr-Cl, piridina, temperatura ambiente, 24 h, 89%; (f) NaOH, THF/MeOH/H2O, 0 °C, 30 min, 94% (g) 2-Cianoetil N,N,N′,N′- tetraisopropil-fosforodiamidita, ETT, DCM, temperatura ambiente, 1 h,
77% for 47, 50 min, 67% for 54; (h) 2-amino-6-cloropurina, BSA, TMSOTf, MeCN, 55 °C, 50 min, 77%; (i) NaOH, THF/MeOH/H2O, 0 °C, 20 min, 85%; (j) TBD, 3-hidroxipropionitrila, DCM, 48h, 87% (k) Ac2O, DMAP, DCM, temperatura ambiente, 48 h, 76%; (l) TBAF, THF, tempe- ratura ambiente, 4 h, 87%; (m) DMTr-Cl, piridina, temperatura ambien- te, 48 h, 99%; (n) i) K2CO3, MeOH, temperatura ambiente, 7h, ii) N,N- dimetilformamida dimetilacetal, DMF, 55 °C, 2 h, 77%. (E e Z, 1'R,5'S,7'R)-(7'-hidróxi-3',3'-dimetil-2',4'- dioxabiciclo[3.3.0]oct-6'-ilideno)acetato de etila (2a/b)
[00257] Uma solução do epóxido 1 (4,46 g, 18,4 mmol) em THF se- co (100 ml) é resfriada até -78 °C. Em seguida, LiHMDS (a 1 M em THF, 22,1 ml, 22,1 mmol) é adicionada lentamente. A solução é agita- da durante 2 horas a -78 °C antes de ser deixada aquecer até à tem- peratura ambiente e neutralizada com a adição de HCl aquoso a 1 M (22,1 ml). A mistura é, então, diluída com EtOAc (100 ml) e o THF é removido sob pressão reduzida. A mistura é, então, lavada com NaH2PO4 a 0,5 M (50 ml) e a fase aquosa extraída com EtOAc (2 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 3:1) para produzir os dois isômeros 2a/b (3,30 g, 74%) como um sólido amarelo pálido.
[00258] Dados para 2a: Rf = 0,37 (EtOAc/hexano 1:1):
[00259] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 6,07 – 5,98 (m, 1H, H- C(2)), 5,59 (d, J = 6,0 Hz, 1H, H-C(5')), 4,94 – 4,81 (m, 1H, H-C(1')), 4,65 (t, J = 5,6 Hz, 1H, H-C(7')), 4,18 (q, J = 7,1 Hz, 2H, CH3CH2), 2,67 (br, 1H, OH), 2,37 (dd, J = 13,5, 7,5 Hz, 1H, H-C(8')), 1,55 – 1,42 (m,
1H, H-C(8')), 1,40, 1,33 (2s, 6H, (CH3)2C), 1,26 (t, J = 7,1 Hz, 3H, CH2CH3). 13
[00260] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 165,75 (C(1)), 161,61 (C(6')), 116,53 (C(2)), 110,69 (C(3')), 76,55 (C(5')), 75,52 (C(1')), 71,63 (C(7')), 60,51 (CH2CH3), 37,46 (C(8')), 26,44, 24,11 ((CH3)2C), 14,27 (CH2CH3).
[00261] ESI+-HRMS m/z calculado para C12H19O5 ([M + H]+) 243,1227, encontrado 243,1231.
[00262] Dados para 2b: Rf = 0,52 (EtOAc/hexano 1:1):
[00263] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 6,15 – 6,05 (m, 1H, H- C(2)), 5,37 – 5,02 (m, 2H, H-C(5'), OH), 4,87 (d, J = 3,4 Hz, 1H, H- C(1')), 4,67 (t, J = 4,9 Hz, 1H, H-C(7')), 4,20 (qd, J = 7,1, 0,9 Hz, 2H, CH3CH2), 2,55 (dd, J = 14,6, 8,1 Hz, 1H, H-C(8')), 1,94 – 1,77 (m, 1H, H-C(8')), 1,39 – 1,25 (m, 9H, (CH3)2C, CH2CH3). 13
[00264] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 167,91 (C(1)), 167,43 (C(6')), 120,13 (C(2)), 111,75 (C(3')), 81,62 (C(5')), 78,08 (C(1')), 70,85 (C(7')), 61,25 (CH2CH3), 36,53 (C(8')), 27,38, 25,45 ((CH3)2C), 14,19 (CH2CH3).
[00265] ESI+-HRMS m/z calculado para C12H19O5 ([M + H]+) 243,1227, encontrado 243,1227. (1'R,5'S,6'S,7'R)-(7'-hidróxi-3',3'-dimetil-2',4'-dioxabiciclo[3.3.0]oct- 6'-il)acetato de etila (3)
[00266] A uma solução dos álcoois 2a/b (12,65 g, 52,2 mmol) e clo- reto de níquel hexa-hidratado (2,48 g, 10,4 mmol) em EtOH (300 ml) é adicionado borohidreto de sódio em porções (9,88 g, 261 mmol) a 0 °C. A solução escura resultante é agitada durante 30 min a 0 °C e 90 min à temperatura ambiente. Em seguida, EtOH é cuidadosamente removido sob pressão reduzida, o sólido resultante diluído com EtOAc (200 ml) e o excesso de NaBH4 extinto pela adição de água (100 ml) a 0 °C seguido por agitação à temperatura ambiente durante 30 min. As duas fases são então separadas. A fase orgânica é lavada com água (100 ml). As fases aquosas são então combinadas, filtradas e extraí- das com EtOAc (2 x 100 ml). As fases orgânicas combinadas são se- cas sobre MgSO4, filtradas se e concentradas. O produto bruto é puri- ficado por CC (EtOAc/hexano 2:1) para produzir 3 (11,4 g, 90%) como um sólido branco.
[00267] Dados para 3: Rf = 0,40 (EtOAc/hexano 1:1):
[00268] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 4,65 – 4,52 (m, 2H, H-C(1'), H-C(5')), 4,15 (qd, J = 7,1, 1,4 Hz, 2H, CH3CH2), 4,05 (ddd, J = 10,0, 9,99, 6,2 Hz, 1H, H-C(7')), 2,86 (br, s, 1H, OH), 2,65 (qd, J = 16,9, 7,1 Hz, 2H, H-C(2)), 2,24 (dd, J = 13,7, 6,2 Hz, 1H, H-C(8')), 1,93 (dt, J = 12,7, 7,1 Hz, 1H. H-C(6')), 1,56 (ddd, J = 13,9, 10,2, 5,5 Hz, 1H, H- C(8')), 1,38 (s, 3H, (CH3)2C), 1,30 - 1,21 (m, 6H, (CH3)2C, CH2CH3). 13
[00269] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 174,38 (C(1)), 109,06 (C(3')), 79,65 (C(5')), 77,19 (C(1'), 74,32 (C(7'), 60,80 (CH2CH3), 46,66 (C(6')), 40,38 (C(8')), 32,43 (C(2)), 26,00, 23,69 ((CH3)2C), 14,17 (CH2CH3).
[00270] ESI+-HRMS m/z calculado para C12H21O5 ([M + H]+) 245,1384, encontrado 245,1388. (1'R,5'S,6'S,7'R)-(7'-(terc-butildifenilsilil)óxi)-3',3'-dimetil-2',4'- dioxabiciclo[3.3.0]oct-6'-il)acetato de etila (4)
[00271] A uma solução do álcool 3 (2,50 g, 10,2 mmol), N-
metilimidazol (12,6 g, 153 mmol) e iodo (7,80 g, 30,6 mmol) em THF seco (60 ml) é adicionado gota a gota terc-butil(cloro)difenilsilano (3,0 ml, 11,2 mmol) à temperatura ambiente (rt). A solução é agitada duran- te 3 horas à temperatura ambiente e depois o THF é evaporado, a mis- tura foi diluída com EtOAc (50 ml) e lavada com solução aquosa a 10% de Na2O3S2 (2 X 40 ml). As fases aquosas são então combinadas e extraídas com EtOAc (50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purifi- cado por CC (EtOAc/hexano 1:10) para produzir 4 (5,01 g, rendimento quantitativo) como um sólido branco.
[00272] Dados para 4: Rf = 0,87 (DCM/MeOH 10:1):
[00273] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,77 – 7,59 (m, 4H, H- arom), 7,51 – 7,32 (m, 6H, H-arom), 4,61 (t, J = 5,7 Hz, 1H, H-C(5')), 4,49 (t, J = 5,7 Hz, 1H, H-C(1')), 4,15 (q, J = 6,9 Hz, 2H, CH3CH2), 3,96 (dd, J = 15,5, 9,5 Hz, 1H, H-C(7')), 2,64 – 2,32 (m, 2H, H-C(2)), 2,15 (tt, J = 9,0, 4,3 Hz, 1H, H-C(6')), 1,83 (dd, J = 12,7, 5,2 Hz, 1H, H- C(8')), 1,61 – 1,45 (m, 1H, H-C(8')), 1,27 (td, J = 7,1, 1,9 Hz, 3H, CH2CH3), 1,18 (s, 6H, (CH3)2C), 1,09, 1,08 (2s, 9H, (CH3)3-C-Si) 13
[00274] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 173,07 (C(1)), 135,87, 135,85 (CH-arom), 134,08, 133,73 (C-arom), 129,80, 129,75, 127,67, 127,58 (CH-arom), 108,82 (C(3')), 77,92 (C(5')), 76,96 (C(1')), 74,93 (C(7')), 60,24 (CH2CH3), 47,27 (C(6')), 40,27 (C(8')), 31,10 (C(2)), 27,04 (CH3)3-C-Si), 25,86 ((CH3)2C), 23,83 ((CH3)2C), 19,23 (CH3)3-C- Si), 14,24 (CH2-CH3).
[00275] ESI+-HRMS m/z calculado para C28H39O5Si ([M + H]+) 483,2561, encontrado 483,2562. (1'R,5'S,6'S,7'R)-(7'-(terc-butildifenilsilil)óxi)-3',3'-dimetil-2',4'- dioxabiciclo[3.3.0]oct-6'-il)acetaldeído (5)
[00276] Uma solução do éster 4 (8,56 g, 16,3 mmol) em DCM seco (120 ml) é resfriada até -78 °C e então DiBAL-H (a 1 M em ciclohexa- no, 18 ml, 18 mmol) é adicionado lentamente. A solução é adicional- mente agitada a -78 °C durante 90 min antes de ser deixada aquecer até à temperatura ambiente. A reação é bruscamente arrefecida pela adição de solução aquosa a 0,5 M de NaH2PO4 (100 ml). A fase orgâ- nica é separada e a fase aquosa é ainda extraída com DCM (2 x 100 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 2:10 a 2:1) para render o aldeído 5 (6,36 g, 89%) e álcool 34 (0,637 g, 9%).
[00277] Dados para 5: Rf = 0,65 (EtOAc/hexano 2:1):
[00278] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,72 (s, 1H, H-C(1)), 7,65 (td, J = 8,0, 1,6 Hz, 4H, H-arom), 7,47 – 7,33 (m, 6H, H-arom), 4,57 (t, J = 5,7 Hz, 1H, H-C(5')), 4,51 (t, J = 5,7 Hz, 1H, H-C(1')), 3,99 (td, J = 10,0, 5,9 Hz, 1H, H-C(7')), 2,58 – 2,43 (m, 2H, H-C(2)), 2,20 – 2,08 (m, 1H, H-C(6')), 1,87 (dd, J = 13,5, 5,9 Hz, 1H, H-C(8')), 1,53 (ddd, J = 13,5, 10,1, 5,5 Hz, 1H, H-C(8')), 1,16 (d, J = 3,5 Hz, 6H, ((CH3)2C), 1,05 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00279] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 201,87 (C(1)), 135,93, 135,90 (CH-arom), 133,96, 133,73 (C-arom), 129,96, 129,89, 127,79, 127,68 (CH-arom), 108,89 (C(3')), 77,76 (C(5')), 77,17 (C(1')), 74,96 (C(7'), 45,44 (C(6')), 41,31 (C(2)), 40,16 (C(8')), 27,08 (CH3)3-C-Si), 25,87 ((CH3)2C), 23,79((CH3)2C), 19,25 (CH3)3-C-Si).
[00280] ESI+-HRMS m/z calculado para C26H35O4Si ([M + H]+) 439,2299, encontrado 439,2297.
(3aR,4R,6R,6aS)-4-((terc-butildifenilsilil)óxi)-2-metóxi-hexahidro- 2H-ciclopenta[b]furan-6-ol (6)
[00281] A uma solução do aldeído 5 (13,73 g, 31,31 mmol) em MeCN (170 ml) e H2O (19 ml), é adicionado trifluorometanossulfonato de índio(III) (703 mg, 1,25 mmol). A solução é posteriormente agitada durante 48 horas e, em seguida, os solventes são removidos sob pressão reduzida e coevaporados com tolueno. O resíduo é dissolvido em MeOH seco e agitado durante 6 horas. Após evaporação do sol- vente, o produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 3:10) para render uma mistura de 6 (10,50 g, 81%) em uma razão anomérica α/β aproximadamente 4:1 como um óleo incolor.
[00282] Dados para 6: Rf = 0,53 (EtOAc/hexano 1:1):
[00283] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,63 (dd, J = 7,1, 0,6 Hz, 4H, H-arom), 7,46 – 7,34 (m, 6H, H-arom), 4,98 (d, J = 4,8 Hz, 0,8H, H- C(2)), 4,91 (dd, J = 5,9, 1,3 Hz, 0,2 H, H-C(2)), 4,63 – 4,54 (m, 1H, H- C(6a)), 4,53 – 4,37 (m, 1H, H-C(6)), 4,09 (m, 0,2 H, H-C(4)), 3,92 (br, 0,8 H, H-C(4)), 3,29, 3,27 (2s, 3 H, MeO), 2,79 (dd, J = 17,0, 8,2 Hz, 0,8H, H-C(3a)), 2,64 – 2,51 (m, 0,2 H, H-C(3a)), 2,29 (d, J = 8,1 Hz, 1H, OH), 2,10 – 1,80 (m, 2,4 H, H-C(3), H-C(5)), 1,65 (ddd, J = 13,2, 9,1, 4,4 Hz, 0,8 H, H-C(5)), 1,44 – 1,34 (m, 0,2 H, H-C(3)), 1,22 (ddd, J = 13,2, 8,1, 4,9 Hz, 0,8 H, H-C(3)), 1,05 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00284] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 135,78, 135,74 (CH-arom), 133,96, 133,84 (C-arom), 129,78, 127,72 (CH-arom), 107,21, 106,50 (C(2)), 85,37, 81,76 (C(6a)), 78,11, 77,19 (C(4)), 73,03, 72,44 (C(6)), 55,30, 54,46 (MeO), 50,91, 49,67 (C(3a)), 41,13, 40,29 (C(3)), 38,16, 37,98 (C(5)), 26,96, 26,92 (CH3)3-C-Si), 19,07 (CH3)3-C-Si).
[00285] ESI+-HRMS m/z calculado para C26H35O4Si ([M + H]+) 435,1962, encontrado 435,1950. (3aR,4R,6R,6aS)-4-((terc-butildifenilsilil)óxi)-2-metóxi-hexahidro- 2H-ciclopenta[b]furan-6-il acetato (7)
[00286] A uma solução de açúcar 6 (3,35 g, 8,12 mmol) e 4- dimetilaminopiridina (1,29 g, 10,6 mmol) em DCM seco (100 ml) é adi- cionado anidrido acético (3,8 ml, 41 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitar durante 2 h, a reação é bruscamente arrefecida pela adição lenta de NaHCO3 saturado (10 ml). A mistura é, em seguida, diluída com NaHCO3 saturado (50 ml) e extraída com DCM (3 X 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 1:2) para produzir uma mistura de 7 (3,53 g, 96%) em uma razão anoméri- ca α/β aproximadamente 4:1 como um óleo incolor.
[00287] Dados para 7: Rf = 0,42 (EtOAc/hexano 1:2):
[00288] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,70 – 7,59 (m, 4H, H- arom), 7,48 – 7,34 (m, 6H, H-arom), 5,41 (dt, J = 11,0, 5,6 Hz, 0,8H, H- C(6)), 5,28 (ddd, J = 11,7, 6,6, 5,2 Hz, 0,2H, H-C(6)), 4,99 (d, J = 4,8 Hz, 0,8H, H-C(2)), 4,89 – 4,81(m, 0,4H, H-C(2), H-C(6a)), 4,76 – 4,69 (m, 0,8H, H-C(6a)), 4,11 (d, J = 5,1 Hz, 0,2H, H-C(4)), 3,90 (d, J = 4,0 Hz, 0,8H, H-C(4)), 3,27, 3,24 (2s, 3H, MeO), 2,81 (dd, J = 16,6, 7,6 Hz, 0,8H, H-C(3a)), 2,60 (dd, J = 10,1, 7,0 Hz, 0,2H, H-C(3a)), 2,30 – 2,18 (m, 0,2 H, H-C(5)), 2,12, 2,10 (2s, J = 4,7 Hz, 3H, MeCO2), 2,07 – 1,82 (m, 2,8H, H-C(5), H-C(3)), 1,24 (ddd, J = 12,9, 7,6, 3,7 Hz, 1H, H-C(3)), 1,07 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00289] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 170,75, 170,66 (MeCO2), 135,77, 135,73, 135,72 (CH-arom), 133,75, 133,65 (C-arom), 129,82,
129,74, 127,76, 127,75, 127,71 (CH-arom), 106,19, 106,15 (C(2)), 83,17, 79,80 (C(6a)), 77,49, 76,46 (C(4)), 75,64, 74,41 (C(6)), 54,34, 54,25 (MeO), 51,48, 50,17 (C(3a)), 38,05, 37,98 (C(3)), 36,96, 36,21 (C(5)), 26,95, 26,90 (CH3)3-C-Si), 21,09, 21,04 (MeCO2), 19,04 (CH3)3- C-Si).
[00290] ESI+-HRMS m/z calculado para C26H34O5NaSi ([M + Na]+) 477,2068, encontrado 477,2063. (3aR,4R,6R,6aS)-4-((terc-butildifenilsilil)óxi)-3a,5,6,6a-tetraidro-4H- ciclopenta[b]furan-6-ol (8)
[00291] A uma solução do açúcar 6 (2,08 g, 5,04 mmol) em DCM seco (35 ml) é adicionada 2,6-lutidina (2,95 ml, 25,2 mmol) a 0 °C. Após agitação durante 20 min a 0 °C, TMSOTf (2,73 ml, 15,1 mmol) é adicionado gota a gota e, em seguida, a solução é deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante mais 60 min. A reação é, então, bruscamente arrefecida por adição de NaHCO3 saturado (40 ml). A fase orgânica é separada e a fase aquosa é ainda extraída com DCM (3 x 30 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00292] O produto resultante é dissolvido em THF seco (35 ml), res- friado a 0 °C e é adicionado TBAF (a 1 M em THF, 5,6 ml, 5,6 mmol). A solução é agitada durante 10 min e, em seguida, diluída com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (4 x 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evapora- das. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 1:4) para produzir o glical 8 (1,76 g, 92%).
[00293] Dados para 8: Rf = 0,49 (EtOAc/hexano 1:2):
[00294] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,66 (m, 4H, H-arom), 7,42 (m, 6H, H-arom), 6,22 (t, J = 2,1 Hz, 1H, H-C(2)), 4,91 (dd, J = 8,2, 5,3 Hz, 1H, H-C(3)), 4,70 (dt, J = 11,1, 5,6 Hz, 1H, H-C(6)), 4,56 (t, J = 2,8 Hz, 1H, H-C(6a)), 3,97 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C(4)), 3,24 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-C(3a)), 2,30 (br, 1H, OH), 2,03 (dd, J = 12,6, 5,4 Hz, 1H, H- C(5)), 1,51 (ddd, J = 12,7, 11,2, 4,2 Hz, 1H, H-C(5)), 1,08 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00295] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 146,24 (C(2)), 135,72, 135,69 (CH-arom), 134,03, 133,74 (C-arom), 129,80, 129,78, 127,73 (CH-arom), 101,84 (C(3)), 84,59 (C(6a)), 76,79(C(4)), 74,10 (C(6)), 55,56 (C(3a)), 39,38 (C(5)), 26,93 (CH3)3-C-Si), 19,08 (CH3)3-C-Si).
[00296] ESI+-HRMS m/z calculado para C23H29O3Si ([M + H]+) 381,1880, encontrado 381,1893. (((3aR,4R,6R,6aS)-6-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metóxi)-3a,5,6,6a- tetraidro-4H-ciclopenta[b]furan-4-il)óxi)(terc-butil)difenilsilano (9)
[00297] A uma solução de glical 8 (1,34 g, 3,52 mmol) e DMTr-Cl (1,43 g, 4,23 mmol) em uma mistura de DCM seco (15 ml) e 2,6- lutidina seca (15 ml) é adicionado triflato de prata em porções (1,13 g, 4,40 mmol), resultando em uma suspensão vermelha escura. Após agitação durante 2 horas à temperatura ambiente, uma porção adicio- nal de DMTr-Cl (239 mg, 0,705 mmol) é adicionada. A suspensão é adicionalmente agitada durante 2 horas e, em seguida, é filtrada. A fase orgânica é lavada com NaHCO3 saturado (100 ml) e as fases aquosas são extraídas com DCM (3 x 30 ml). As fases orgânicas com- binadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 1:7, Et3N a 0,5%) produzir o glical protegido 9 (2,24, 93%) como uma espuma branca.
[00298] Dados para 9: Rf = 0,59 (EtOAc/hexano 1:2):
[00299] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,76 (d, J = 7,4 Hz, 2H, H- arom), 7,69 – 7,60 (m, J = 9,3, 5,9, 4,6 Hz, 8H, H-arom), 7,56 – 7,39 (m, 8H, H-arom), 7,33 (t, J = 7,3 Hz, 1H, H-arom), 7,00 – 6,93 (m, 4H, H-arom), 6,47 – 6,37 (m, 1H, H-C(2)), 4,67 – 4,58 (m, 1H, H-C(6)), 4,58 – 4,50 (m, 2H, H-C(3), H-C(6a)), 3,86, 3,85 (2s, 6H, MeO), 3,82 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-C(4)), 3,08 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-C(3a)), 1,67 (td, J = 12,4, 4,2 Hz, 1H, H-C(5)), 1,28 (dd, J = 12,7, 5,4 Hz, 1H, H-C(5)), 1,11 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00300] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 158,67 (MeO-C-arom), 147,61 (C(2)), 146,26, 137,36, 137,21 (C-arom), 135,81, 135,78 (CH- arom), 134,17, 134,04 (C-arom), 130,48, 129,83, 129,81, 128,37, 127,98, 127,76, 127,73, 126,79, 113,32, 113,28 (CH-arom), 100,29 (C(3)), 86,96 (C(Ph)3), 84,95 (C(6a)), 76,17 (C(6)), 76,07(C(4)), 55,26 (MeO-DMTr), 55,11 (C(3a)), 37,32 (C(5)), 27,04 (CH3)3-C-Si), 19,21 (CH3)3-C-Si).
[00301] ESI+-HRMS m/z calculado para C44H46O5NaSi ([M + Na]+) 705,3007, encontrado 705,3021. (3aS,4R,6R,6aS)-6-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metóxi)-3a,5,6,6a- tetraidro-4H-ciclopenta[b]furan-4-ol (10)
[00302] A uma solução de glical 9 (2,23 g, 3,27 mmol) em THF seco (20 ml), é adicionado TBAF (a 1 M em THF, 20 ml, 20 mmol) à tempe- ratura ambiente. A solução é agitada durante 20 h e, em seguida, é diluída com NaHCO3 saturado (100 ml) e extraída com DCM (3 x 80 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (0,5% de MeOH em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 10 (1,45 g, quant.) como uma espuma branca.
[00303] Dados para 10: Rf = 0,44 (EtOAc/hexano 1:1):
[00304] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,53 – 7,46 (m, 2H, H- arom), 7,43 – 7,35 (m, 4H, H-arom), 7,21 (dd, J = 10,7, 5,3 Hz, 2 H, H- arom), 7,16 – 7,08 (m, 1H, H-arom), 6,80 – 6,71 (m, 4H, H-arom), 6,30 (t, J = 2,1 Hz, 1H, H-C(2)), 4,68 (t, J = 2,8 Hz, 1H, H-C(3)), 4,29 – 4,14 (m, 2H, H-C(6), H-C(6a)), 3,71 (s, 6H, MeO), 3,65 (d, J = 3,5 Hz, 1H, H-C(4)), 2,87 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-C(3a)), 1,59 (ddd, J = 13,2, 11,6, 4,3 Hz, 1H, H-C(5)), 1,05 – 0,95 (m, 2H, H-C(5), OH). 13
[00305] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 158,54 (MeO-C-arom), 147,64 (C(2)), 145,82, 137,12, 137,08 (C-arom), 130,26, 128,29, 127,81, 126,71, 113,13 (CH-arom), 100,17 (C(3)), 86,75 (C(Ph)3), 84,42 C(6a)), 75,54 (C(6)), 74,59 (C(4)), 55,22 (MeO-DMTr), 54,25 (C(3a)), 37,56 (C(5)).
[00306] ESI+-HRMS m/z calculado para C30H27O5 ([M + H]+) 467,1853, encontrado 467,1844. (3'S,5'R,7'R)-1-{2',3'-Didesóxi-3',5'-etano-7'-hidróxi-5'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} timina (11)
[00307] A uma solução de glical 10 (1,45 g, 3,27 mmol) em DCM seco (45 ml), a 0 °, é adicionado gota a gota BSA (2,0 ml, 8,18 mmol) e, em seguida, a solução é deixada aquecer até à temperatura ambi- ente. Após agitação durante 45 min, timina (595 mg, 4,91 mmol) é adi- cionada e a reação é ainda agitada durante 60 min à temperatura am- biente. A mistura é, então, resfriada até 0 °C e N-iodosuccinimida (875 mg, 3,92 mmol) é adicionada. Após agitação por 3 h a 0 °C e por 4 h à temperatura ambiente, a mistura de reação é diluída com EtOAc (100 ml) e subsequentemente lavada com uma solução aquosa a 10% de Na2S2O3 (100 ml) e NaHCO3 saturado (100 ml). As fases aquosas são combinadas e extraídas com DCM (3 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00308] O produto bruto é dissolvido em tolueno seco (45 ml) e, em seguida, Bu3SnH (1,32 ml, 4,91 mmol) e azoisobutironitrila (AIBN, 53 mg, 0,33 mmol) são adicionados à temperatura ambiente. Após aque- cimento a 70 °C durante 30 min, a mistura é resfriada até a temperatu- ra ambiente e TBAF é adicionado (a 1 M em THF, 6,5 ml, 6,5 mmol). A solução é adicionalmente agitada durante 25 min e diluída com NaHCO3 saturado (100 ml) e extraída com DCM (4 x 70 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evapora- das. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 3% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 11 (1,45 g, 73% ao longo de dois etapas) como uma espuma branca.
[00309] Dados para 11: Rf = 0,29 (MeOH a 6% em DCM):
[00310] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,37 (br, 1H, H-N(3)), 7,83 (d, J = 1,1 Hz, 1H, H-C(6)), 7,58 – 7,52 (m, 2H, H-arom), 7,48 – 7,41 (m, 4H, H-arom), 7,28 (t, J = 7,7 Hz, 2H, H-arom), 7,21 (t, J = 7,2 Hz, 1H, H-arom), 6,84 (dd, J = 8,9, 1,2 Hz, 4H, H-arom), 5,91 (dd, J = 8,0, 5,5 Hz, 1H, H-C(1')), 4,25 (dt, J = 10,8, 6,0 Hz, 1H, H-C(5')), 4,13 – 4,08 (m, 1H, H-C(4')), 3,86 (d, J = 3,4 Hz, 1H, H-C(7'), 3,79 (s, 6H, MeO), 2,70 (ddd, J = 12,8, 10,2, 5,5 Hz, 1H, H-C(2')), 2,61 (dd, J = 16,9, 8,2 Hz, 1H, H-C(3')), 1,84 (d, J = 0,8 Hz, 3H, Me-C(5)), 1,80 (br, 1H, OH), 1,60 (ddd, J = 14,2, 10,5, 4,2 Hz, 1H, H-C(6')), 1,33 (dt, J = 12,9, 8,0 Hz, 1H, H-C(2')), 1,14 (dd, J = 13,7, 6,1 Hz, 1H, H-C(6')). 13
[00311] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 164,17 (C(4)), 158,64 (MeO-C-arom), 150,47 (C(2)), 145,65, 136,85, 136,71 (C-arom), 135,52 (C(6)), 130,20, 128,12, 127,91, 126,90, 113,22, 113,21 (CH- arom), 110,69 (C(5)), 87,21 (C(Ph)3), 86,57 (C(1')), 82,02 (C(4')), 74,19
(C(5')), 74,13 (C(7')), 55,25 (MeO-DMTr), 49,40 (C(3')), 38,51 (C(6')), 37,64 (C(2')), 12,58 (Me-C(5)).
[00312] ESI+-HRMS m/z calculado para C33H34O7N2Na ([M + Na]+) 593,2258, encontrado 593,2250. (3'R,5'R,7'R)-1-{7'-O-[(2-Cianoetóxi)-di-isopropilaminofosfanil]- 2',3'-didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D- ribofuranosil} timina (12)
[00313] A uma solução do nucleosídeo 11 (232 mg, 0,406 mmol) e 5-(etiltio)-1H-tetrazol (90 mg, 0,69 mmol) em DCM seco (10 ml), é adi- cionado gota a gota 2-cianoetil N,N,N′,N'-tetraisopropilfosforodiamidita (0,26 ml, 0,81 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação du- rante 30 min, a mistura de reação é diluída com DCM (50 ml) e lavada com NaHCO3 (2 x 30 ml) e solução saturada de NaCl saturada (30 ml). As fases aquosas são combinadas e extraídas com DCM (50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e eva- poradas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 1,8% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 12 (219 mg, mistura de dois isômeros, 70%) como uma espuma branca.
[00314] Dados para 11: Rf = 0,68 (MeOH a 6% em DCM):
[00315] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,93 (br, 1H, H-N(3)), 7,85 (d, J = 1,2 Hz, 1H, H-C(6)), 7,65 – 7,52 (m, 2H, H-arom), 7,52 – 7,40 (m, 4H, H-arom), 7,40 – 7,21 (m, 3H, H-arom), 6,96 – 6,81 (m, 4H, H- arom), 6,00, 5,94 (2dd, J = 8,3, 5,2 Hz, 1H, H-C(1')), 4,29 – 4,17 (m, 1H, H-C(5')), 4,12 – 3,89 (m, 2H, H-C(4'), H-C(7')), 3,85, 3,84 (2s, 6H, MeO), 3,81 – 3,63 (m, 2H, OCH2CH2CN), 3,56 – 3,41 (m, 2H,
(Me2CH)2N), 2,88 – 2,69 (m, 2H, H-C(3'), H-C(2')), 2,61, 2,56 (dt, J = 12,9 6,3 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 1,92, 1,82 (2d, J = 0,8 Hz, 3H, Me- C(5)), 1,75 – 1,56 (m, 1H, H-C(6')), 1,52 – 1,36 (m, 2H, H-C(6'), H- C(2')), 1,22 – 1,01 (m, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00316] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 163,86 (C(4)), 158,66, 158,64 (MeO-C-arom), 150,29, 150,27 (C(2)), 145,58, 145,52, 136,76, 136,71, 136,69, 136,60 (C-arom), 135,49, 135,35 (C(6)), 130,21, 130,16, 128,17, 128,13, 127,88, 126,91, 126,89 (CH-arom), 117,49 (OCH2CH2CN), 113,18 (CH-arom), 110,74 (C(5)), 87,27, 87,25 (C(Ph)3), 86,58, 86,45 (C(1')), 81,79, 81,68 (C(4')), 76,02, 75,50 (JC,P = 16,5, 15,7 Hz, C(7')), 74,22 (C(5')), 58,26, 58,06, 57,87 (OCH2CH2CN), 55,26, 55,22 (MeO-DMTr), 48,85, 48,62 (JC,P = 2,6, 5,0 Hz, C(3')), 43,10, 43,04 (JC,P = 12,3, 12,4 Hz (Me2CH)2N), 37,78 (JC,P = 5,3 Hz C(6')), 37,62, 37,48 (C(2')), 37,41 (JC,P = 3,6 Hz C(6')), 24,57, 24,53, 24,50, 24,46, 24,44, 24,39, 24,37 (Me2CH)2N), 20,35, 20,25 (JC,P = 7,1, 7,0 Hz, OCH2CH2CN), 12,58, 12,41 (7s, Me-C(5)).
[00317] RMN de 31P (122 MHz, CDCl3) δ 147,32, 146,98.
[00318] ESI+-HRMS m/z calculado para C42H52O8N4P ([M + H]+) 771,3517, encontrado 771,3512. (3'S,5'R,7'R)-N4-Benzoil-1-{2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-hidróxi-5'-O- [(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil}-5-metilcitosina (13)
[00319] A uma solução do nucleosídeo 11 (302 mg, 0,530 mmol) em MeCN seco (5 ml) é adicionado gota a gota BSA (0,31 ml, 1,27 mmol) a 0 °C e, em seguida, a solução é agitada durante a noite à temperatura ambiente. Em outro frasco, uma suspensão de 1,2,4- triazol (1,28 g, 18,55 mmol) em MeCN seco (50 ml) é resfriada a 0 °C e POCl3 (0,40 ml, 4,2 mmol) e Et3N (2,96 ml, 21,2 mmol) são adiciona- dos. A suspensão é agitada durante 30 min a 0 °C e, em seguida, a solução previamente preparada do composto sililado 11 é adicionada à suspensão e a mistura é ainda agitada durante 5 h à temperatura am- biente. A reação é bruscamente arrefecida com a adição de NaHCO3 saturado (10 ml), MeCN é removido sob pressão reduzida e a mistura resultante diluída com NaHCO3 saturado (35 ml) e extraída com DCM (3 x 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00320] O produto bruto é, então, dissolvido em uma mistura de 1,4- dioxano (10 ml) e NH4OH concentrado (10 ml). Depois de agitação du- rante 2 h à temperatura ambiente, a mistura é reduzida para metade do volume sob vácuo, diluída com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (4 x 30 ml). As fases orgânicas combinadas são secas so- bre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00321] O produto bruto é, então, dissolvido em DMF seco (13 ml), Et3N (90 μl, 0,64 mmol) seguido por Bz2O (300 mg, 1,33 mmol) são adicionados à temperatura ambiente e a solução é agitada durante a noite. A solução marrom resultante é bruscamente arrefecida por adi- ção cuidadosa de NaHCO3 saturado (50 ml) e extraída com DCM (4 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtra- das e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (hexano/EtOAc 1:2, Et3N a 0,5%) para produzir 13 (315 mg, 88%) como uma espuma branca.
[00322] Dados para 13: Rf = 0,57 (MeOH a 4% em DCM):
[00323] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 13,39 (br, 1H, NH), 8,46 – 8,26 (m, 2H, H-arom), 8,13 (d, J = 0,5 Hz, 1H, C(6)), 7,61 (d, J = 7,3 Hz, 2H, H-arom), 7,58 – 7,43 (m, 7H, H-arom), 7,34 (t, J = 7,4 Hz, 2H, H-arom), 7,30 – 7,23 (m, 1H, H-arom), 6,89 (d, J = 8,8 Hz, 4H, H- arom), 5,96 (dd, J = 7,5, 5,8 Hz, 1H, H-C(1')), 4,38 – 4,25 (m, 1H, H-
C(5')), 4,22 – 4,12 (m, 1H, H-C(4')), 3,90 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-C(7')), 3,83 (s, 6H, MeO), 2,82 (ddd, J = 13,3, 10,2, 5,7 Hz, 1H, H-C(2')), 2,66 (dd, J = 17,0, 8,1 Hz, 1H, H-C(3')), 2,08 (s, 3H, Me-C(5)), 1,77 (br, 1H, OH), 1,71 – 1,57 (m, 1H, H-C(6')), 1,49 – 1,36 (m, 1H, H-C(2')), 1,21 (dd, J = 13,7, 6,2 Hz, 1H, H-C(6')). 13
[00324] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 179,56 (CONH), 160,01 (C(4)), 158,70 (MeO-C-arom), 147,96 (C(2)), 145,65 (C-arom), 137,26 (C(6)), 136,99, 136,83, 136,71 (C-arom), 132,41, 130,22, 129,89, 128,16, 128,14, 127,95, 126,94, 113,25 (CH-arom), 111,57 (C(5)), 87,34 (C(Ph)3), 87,32 (C(1')), 82,57 (C(4')), 74,30 (C(5')), 74,16 (C(7')), 55,27 (MeO-DMTr), 49,56 (C(3')), 38,52 (C(6')), 38,00 (C(2')), 13,63 (Me-C(5)).
[00325] ESI+-HRMS m/z calculado para C40H40O7N3 ([M + H]+) 674,2861, encontrado 674,2862. (3'R,5'R,7'R)-N4-Benzoil-1-{7'-O-[(2-cianoetóxi)-di- isopropilaminofosfanil]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil}-5-metilcitosina (14)
[00326] A uma solução do nucleosídeo 13 (276 mg, 0,409 mmol) e 5-(etiltio)-1H-tetrazol (69 mg, 0,53 mmol) em DCM seco (10 ml), é adi- cionado gota a gota 2-cianoetil N,N,N',N′-tetraisopropilfosforodiamidita (0,20 ml, 0,61 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação du- rante 60 min, a mistura de reação é diluída com DCM (50 ml) e lavada com NaHCO3 saturado (2 x 30 ml) e NaCl (30 ml) saturado. As fases aquosas são combinadas e extraídas com DCM (50 ml). As fases or- gânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 2:3, Et3N a 0,5%)
para produzir 14 (268 mg, mistura de dois isômeros, 75%) como uma espuma branca.
[00327] Dados para 14: Rf = 0,77 (MeOH a 5% em DCM):
[00328] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 13,32 (s, 1H, NH), 8,41 – 8,28 (m, 2H, H-arom), 8,13 – 8,04 (m, 1H, C(6)), 7,61 – 7,51 (m, 3H, H- arom), 7,51 – 7,40 (m, 6H, H-arom), 7,37 – 7,29 (m, 2H, H-arom), 7,29 – 7,20 (m, 1H, H-arom), 6,92 – 6,82 (m, 4H, H-arom), 6,07 – 5,87 (m, 1H, H-C(1')), 4,24 (dq, J = 11,7, 5,8 Hz, 1H, H-C(5')), 4,13 – 4,00 (m, 1H, H-C(4')), 3,94 (ddd, J = 14,5, 10,5, 2,8 Hz, 1H, H-C(7')), 3,83, 3,82 (2s, 6H, MeO), 3,69 (m, 2H, OCH2CH2CN), 3,53 – 3,40 (m, 2H, (Me2CH)2N), 2,91 – 2,70 (m, 2H, H-C(2'), H-C(3')), 2,57, 2,53 (2t, J = 6,3 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 2,08, 1,99 (2d, J = 0,6 Hz, 3H, Me-C(5)), 1,72 – 1,56 (m, 1H, H-C(6')), 1,54 – 1,36 (m, 2H, H-C(2'), H-C(6')), 1,10 (m, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00329] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 179,54 (CONH), 159,98 (C(4)), 158,69 (MeO-C-arom), 147,90 (C(2)), 145,58, 145,54 (C-arom), 137,30, 136,93 (C(6)), 136,81, 136,80, 136,73, 136,70, 136,67, 136,60 (C-arom), 132,37, 132,35, 130,22, 130,17, 129,89, 128,17, 128,15, 128,11, 127,93, 126,94 (CH-arom), 117,49 (OCH2CH2CN), 113,23 (CH-arom), 111,60 (C(5)), 87,36, 87,35 (C(Ph)3), 87,33, 87,25 (C(1')), 82,33, 82,25 (C(4')), 76,05, 75,52 (JC,P = 16,4, 15,6 Hz, C(7')), 74,32 (C(5')), 58,18, 57,98 (JC,P = 19,5 Hz OCH2CH2CN), 55,28, 55,24 (MeO- DMTr), 48,93, 48,72 (JC,P = 2,7, 4,9 Hz, C(3')), 43,11, 43,05 (JC,P = 12,4 Hz (Me2CH)2N), 38,02, 37,88 (C(2')), 37,74, 37,40 (JC,P = 5,3, 3,4 Hz, C(6')), 24,58, 24,54, 24,50, 24,47, 24,40, 24,38 (6s, Me2CH)2N), 20,36, 20,26 (JC,P = 7,1 Hz, OCH2CH2CN),), 13,66, 13,49 (Me-C(5)).
[00330] RMN de 31P (122 MHz, CDCl3) δ 147,37, 147,07.
[00331] ESI+-HRMS m/z calculado para C49H57O8N5P ([M + H]+) 874,3939, encontrado 874,3937. (3'R,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{5'-O-acetil-7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-
2',3'-didesóxi-3',5'-etano-α,β-D-ribofuranosil} adenina (15)
[00332] A uma suspensão de açúcar 7 (1,86 g, 4,10 mmol) e N6- benzoiladenina (1,96 g, 8,20 mmol) em MeCN seco (40 ml), é adicio- nado BSA (4,00 ml, 16,4 mmol) à temperatura ambiente. Após agita- ção durante 25 min, a suspensão se tornou uma solução límpida e, em seguida, foi aquecida a 70 °C. TMSOTf (1,48 ml, 8,20 mmol) é adicio- nado gota a gota e a solução é adicionalmente agitada durante 20 min a 70 °C. A solução é, então, resfriada até à temperatura ambiente, bruscamente arrefecida com adição de solução saturada de NaHCO3 (100 ml) e extraída com EtOAc (4 x 50 ml). As fases orgânicas combi- nadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bru- to é purificado por CC (2% de MeOH em DCM) para produzir uma mis- tura de 15 (1,74 g, 64%) em uma razão anomérica α/β aproximada- mente 4:1 como uma espuma branca.
[00333] Dados para 15: Rf = 0,33 (EtOAc/hexano 4:1):
[00334] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,33 (br, 1H, NH), 8,68 (d, J = 5,4 Hz, 0,8H, H-C(2)), 8,64 (d, J = 5,6 Hz, 0,2H, H-C(2)), 8,10 (d, J = 1,5 Hz, 0,2H. H-C(8)), 7,99 (d, J = 7,3 Hz, 2H, H-arom), 7,95 (s, 0,8H, H-C(8)), 7,63 (t, J = 8,7 Hz, 4H, H-arom), 7,55 (dd, J = 13,0, 6,4 Hz, 1H, H-arom), 7,50 – 7,34 (m, 8H, H-arom), 6,20 (dd, J = 6,3, 2,5 Hz, 0,8H, H-C(1')), 6,05 (t, J = 6,5 Hz, 0,2H, H-C(1')), 5,43 – 5,32 (m, 1H, H-C(5')), 5,03 – 4,97 (m, 0,8H, H-C(4')), 4,83 (t, J = 6,0 Hz, 0,2H, H-C(4')), 4,14 (br, 0,2H, H-C(7')), 4,08 (d, J = 3,7 Hz, 0,8H, H-C(7')), 3,02 (dd, J = 16,1, 6,6 Hz, 0,8H, H-C(3')), 2,83 (dd, J = 16,9, 7,7 Hz, 0,2H, H-C(3')), 2,59 – 2,39 (m, 1H, H-C(2')), 2,18 – 2,11 (m, 1H, H- C(6')), 2,07 (d, J = 1,6 Hz, 2,4H, MeCO2), 2,02 (d, J = 1,9 Hz, 0,6H, MeCO2), 2,01 – 1,92 (m, 1H, H-C(6')), 1,91 – 1,80 (m, 1H, H-C(3')),
1,07 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00335] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 170,57, 170,49 (MeCO2), 164,82 (CONH), 152,50 (C(2)), 151,27 (C(4)), 149,56 (C(6)), 141,37, 141,06 (C(8)), 135,72, 135,68, 135,66 (CH-arom), 133,67, 133,57, 133,24, 133,22 (C-arom), 132,73, 130,03, 129,98, 128,80, 128,78, 127,92, 127,86, 127,85 (CH-arom), 123,61 (C(5)), 87,19, 86,17 (C(1')), 83,22, 80,96 (C(4'), 76,50, 76,04 (C(7')), 74,38 (C(5')), 51,07 (C(3')), 37,29, 37,15, 36,80, 36,60 (C(2'), C(6')), 26,89 (CH3)3-C-Si), 20,97, 20,90 (MeCO2), 19,01 (CH3)3-C-Si).
[00336] ESI+-HRMS m/z calculado para C37H40O5N5Si ([M + H]+) 662,2793, encontrado 662,2787. (3'R,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'- didesóxi-3',5'-etano-β-D-ribofuranosil} adenina (16):
[00337] O nucleosídeo 15 (1,74 g, 2,64 mmol) é dissolvido em Na- OH a 0,15 M em THF/metanol/H2O (5:4:1, 80 ml) a 0 °C. A reação é agitada durante 20 min e bruscamente arrefecida pela adição de NH4Cl (1,06 g). Os solventes são, então, removidos sob pressão redu- zida e o produto purificado por CC (isopropanol a 5% em DCM) para produzir 16 (287 mg, 18%) e espumas brancas de anômero α corres- pondente do mesmo (836 mg, 51%).
[00338] Dados para 16: Rf = 0,44 (MeOH a 6% em DCM):
[00339] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,70 (s, 1H, H-C(2)), 8,09 – 7,98 (m, 2H, H-arom), 7,97 (s, 1H, H-C(8)), 7,63 (ddd, J = 7,4, 5,7, 1,5 Hz, 4H, H-arom), 7,59 – 7,55 (m, 1H, H-arom), 7,51 (m, 2H, H-arom), 7,44 – 7,33 (m, 6H, H-arom), 6,02 (dd, J = 9,4, 5,5 Hz, 1H, H-C(1')), 4,57 (dd, J = 8,1, 5,0 Hz, 1H, H-C(4')), 4,43 (dd, J = 11,8, 5,3 Hz, 1H, H-C(5')), 4,26 (br, 1H, H-C(7')), 2,78 (q, J = 8,9 Hz, 1H, H-C(3')), 2,32 –
1,80 (m, 5H, H-C(2'), H-C(6'), OH), 1,06 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00340] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 164,85 (CONH), 152,56 (C(2)), 151,17 (C(4)), 149,86 (C(6)), 141,25 (C(8)), 135,68 (CH-arom), 133,87, 133,39 (C-arom), 132,78, 129,92, 128,78, 128,01, 127,78 (CH- arom), 123,51 (C(5)), 87,65 (C(1')), 82,91 (C(4')), 76,66 (C(7')), 72,54 (C(5')), 50,44 (C(3')), 41,42 (C(6')), 36,17 (C(2')), 26,89 (CH3)3-C-Si), 19,03 (CH3)3-C-Si).
[00341] ESI+-HRMS m/z calculado para C35H38O4N5Si ([M + H]+) 620,2688, encontrado 620,2671. (3'R,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'- didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D- ribofuranosil} adenina (17)
[00342] A uma solução de nucleosídeo 16 (307 mg, 0,495 mmol) em piridina seca (6 ml), é adicionado DMTr-Cl (503 mg, 1,49 mmol) à temperatura ambiente. A solução é agitada durante 1 dia e, em segui- da, diluída com NaHCO3 saturado (50 ml) e extraída com DCM (3 X 70 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 1,5% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 17 (395 mg, 87%) como uma espu- ma amarela.
[00343] Dados para 17: Rf = 0,65 (MeOH a 5% em DCM):
[00344] RMN de 1H (300 MHz, MeOD) δ 8,64 (s, 1H, H-C(2)), 8,61 (s, 1H, H-C(8)), 8,08 (d, J = 7,2 Hz, 2H, H-arom), 7,68 – 7,17 (m, 22H, H-arom), 6,86 – 6,75 (m, 4H, H-arom), 6,14 (dd, J = 7,4, 6,3 Hz, 1H, H- C(1')), 4,48 – 4,31 (m, 1H, H-C(5')), 4,28 – 4,15 (m, 1H, H-C(4')), 3,88 (d, J = 3,8 Hz, 1H, H-C(7')), 3,75, 3,74 (2s, 6H, MeO), 2,67 (dd, J = 16,6, 6,7 Hz, 1H, H-C(3')), 2,47 (ddd, J = 13,3, 10,2, 6,1 Hz, 1H, H-
C(2')), 2,15 – 1,94 (m, 1H, H-C(6')), 1,71 (ddd, J = 13,0, 11,3, 4,4 Hz, 1H, H-C(2')), 1,11 (dd, J = 12,2, 4,9 Hz, 1H, H-C(6')), 0,95 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00345] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 164,69 (CONH), 158,61, 158,60 (MeO-C-arom), 152,42 (C(2)), 151,27 (C(4)), 149,41 (C(6)), 145,81 (C-arom), 141,25 (C(8)), 137,00, 136,85 (C-arom), 135,60, 135,57 (CH-arom), 133,80, 133,69, 133,43 (C-arom), 132,70, 130,28, 130,25, 129,85, 129,81, 128,84, 128,18, 127,89, 127,71, 127,65, 126,78 (CH-arom), 123,52 (C(5)), 113,22, 113,19 (CH-arom), 87,09 (C(Ph)3), 86,41 (C(1')), 83,52 (C(4')), 76,05 (C(7')), 74,78 (C(5')), 55,20 (MeO-DMTr), 50,43 (C(3')), 38,10 (C(2'), C(6')), 26,84 (CH3)3-C-Si), 19,00 (CH3)3-C-Si).
[00346] ESI+-HRMS m/z calculado para C56H56O6N5Si ([M + H]+) 922,3994, encontrado 922,3953. (3'S,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-hidróxi-5'-O- [(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} adenina (18)
[00347] A uma solução de nucleosídeo 17 (376 mg, 0,408 mmol) em THF seco (9 ml), é adicionado TBAF (1 M em THF, 1,22 ml, 1,22 mmol) à temperatura ambiente. A solução é agitada durante 2 dias e em seguida é diluída com NaHCO3 saturado (25 ml) e extraída com DCM (4 x 25 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 4% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 18 (242 mg, 87%) como uma espuma branca.
[00348] Dados para 18: Rf = 0,33 (MeOH a 5% em DCM):
[00349] RMN de 1H (300 MHz, CD3CN) δ 9,35 (br, 1H, NH), 8,67 (s, 1H, C(2)), 8,46 (s, 1H, C(8)), 8,01 (d, J = 7,4 Hz, 2H, H-arom), 7,54 (m,
5H, H-arom), 7,35 (m, 4H, H-arom), 7,30 – 7,17 (m, 3H, H-arom), 6,84 (d, J = 8,9 Hz, 4H, H-arom), 6,09 (dd, J = 7,8, 6,2 Hz, 1H, H-C(1')), 4,12 (dt, J = 11,2, 5,8 Hz, 1H, C(5')), 3,87 – 3,79 (m, 2H, C(4'), C(7')), 3,75 (s, 6H, MeO), 2,83 – 2,64 (m, 2H, C(2'), OH), 2,58 – 2,46 (m, 1H, C(3')), 2,21 (dd, J = 13,9, 7,1 Hz, 1H, C(2')), 1,92 – 1,82 (m, 1H, C(6')), 1,29 – 1,17 (m, 1H, C(6')). 13
[00350] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 165,03 (CONH), 158,57 (MeO-C-arom), 152,40 (C(2)), 151,23 (C(4)), 149,52 (C(6)), 145,68 (C- arom), 141,49 (C(8)), 136,86, 136,84, 133,77 (C-arom), 132,77, 130,22, 128,81, 128,16, 128,02, 127,89, 126,84 (CH-arom), 123,40 (C(5)), 113,19 (CH-arom), 87,06 (C(Ph)3), 86,74 (C(1')), 83,58 (C(4')), 74,62 (C(5')), 74,38 (C(8')), 55,25 (MeO-DMTr), 49,77 (C(3')), 38,55, 38,32 (C(6'), C(2')).
[00351] ESI+-HRMS m/z calculado para C40H38O6N5 ([M + H]+) 684,2817, encontrado 684,2830. (3'R,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{7'-O-[(2-cianoetóxi)-di- isopropilaminofosfanil]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} adenina (19)
[00352] A uma solução do nucleosídeo 18 (173 mg, 0,253 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (0,18 ml, 1,0 mmol) em THF seco (8 ml), é adicionado N,N-di-isopropilclorofosforamidita (0,11 ml, 0,50 mmol) à temperatura ambiente. A solução é agitada durante 2 horas e, em se- guida, é diluída com saturada de NaHCO3 (40 ml) e extraída com DCM (4 x 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc,
Et3N a 0,5%) para produzir 19 (177 mg, mistura de dois isômeros, 71%) como uma espuma branca.
[00353] Dados para 19: Rf = 0,38, 0,44 (EtOAc):
[00354] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,05 (br, 1H, NH), 8,70, 8,70 (2s, 1H, H-C(2)), 8,47, 8,46(2s, 1H, H-C(8)), 7,97 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-arom), 7,57 – 7,50 (m, 1H, H-arom), 7,49 – 7,41 (m, 4H, H- arom), 7,39 – 7,31 (m, 4H, H-arom), 7,24 – 7,17 (m, 5,4 Hz, 2H, H- arom), 7,13 (dt, J = 12,5, 6,2 Hz, 1H, H-arom), 6,83 – 6,70 (m, 4H, H- arom), 6,14 – 5,97 (m, 1H, H-C(1')), 4,14 (ddd, J = 11,1, 7,8, 3,4 Hz, 1H, H-C(5')), 3,91 – 3,74 (m, 2H, H-(4'), H-C(7')), 3,71, 3,70 (2s, 6H, MeO), 3,65 – 3,50 (m, 2H, OCH2CH2CN), 3,37 (ddq, J = 13,9, 10,2, 6,8 Hz, 2H, (Me2CH)2N), 2,90 – 2,76 (m, 1H, H-C(2')), 2,75 – 2,60 (m, 1H, H-C(3')), 2,47, 2,42 (2t, J = 6,3 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 2,11 (dt, J = 12,7, 6,1 Hz, 1H, H-C(2')), 1,73 (ddt, J = 13,6, 10,4, 5,1 Hz, 1H, H- C(6')), 1,39 (ddd, J = 50,2, 13,4, 6,2 Hz, 1H, H-C(6')), 1,10 – 0,89 (m, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00355] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 164,66 (CONH), 158,57 (MeO-C-arom), 152,46 (C(2)), 151,32, 151,26 (C(4)), 149,45, 149,43 (C(6)), 145,60, 145,59 (C-arom), 141,52, 141,47 (C(8)), 136,88, 136,83, 136,81, 133,78 (C-arom), 132,75, 132,73, 130,22, 130,21, 130,19, 130,17, 128,87, 128,17, 127,87, 126,82, 126,80 (CH-arom), 123,59 (C(5)), 117,53, 117,50 (OCH2CH2CN), 113,17 (CH-arom), 87,10, 87,07 (C(Ph)3), 86,72, 86,68 (C(1')), 83,36, 83,25 (C(4')), 76,55, 75,81 (JC,P = 16,9, 15,7 Hz, C(7')), 74,63, 74,60 (C(5')), 58,24, 57,86 (JC,P = 19,1, 19,2 Hz OCH2CH2CN), 55,25, 55,21 (MeO-DMTr), 49,29, 49,08 (JC,P = 2,6, 4,7 Hz, C(3')), 43,12, 43,00 (JC,P = 2,4, 2,3 Hz (Me2CH)2N), 38,27, 38,23 (C(2')), 37,41, 37,22 (JC,P = 5,3, 3,5 Hz, C(6')) 24,56, 24,53, 24,49, 24,47, 24,43, 24,41, 24,36, 24,33 (8s, Me2CH)2N), 20,36, 20,25 (JC,P = 7,2, 7,0 Hz, OCH2CH2CN).
[00356] RMN de 31P (122 MHz, CDCl3) δ 147,64, 146,87.
[00357] ESI+-HRMS m/z calculado para C49H55O7N7 ([M + H]+) 884,3895, encontrado 884,3898. (3'R,5'R,7'R)-2-Amino-6-cloro-9-{5'-O-acetil-7'-[(terc-butildifenilsi- lil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-α,β-D-ribofuranosil} purina (20)
[00358] A uma suspensão de açúcar 7 (1,75 g, 3,85 mmol) e 2- amino-6-cloropurina (1,05 g, 6,17 mmol) em MeCN seco (20 ml), é adicionado BSA (3,80 ml, 15,4 mmol) à temperatura ambiente. A sus- pensão é aquecida a 55 °C e agitada durante 30 min. Em seguida, TMSOTf (1,05 ml, 5,78 mmol) é adicionado gota a gota e a solução é adicionalmente agitada durante 50 min a 55 °C. A solução é resfriada até a temperatura ambiente, bruscamente arrefecida com adição de NaHCO3 saturado (10 ml), diluída com EtOAc (50 ml) e filtrada através de uma pequena almofada de SiO2. O SiO2 é lavado com EtOAc adici- onal. A mistura é, em seguida, lavada com NaHCO3 saturado (2 x 80 ml), as fases aquosas são combinadas e extraídas com EtOAc (3 X 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 2,5% em DCM) para produzir uma mistura de 20 (1,77 g, 77%) em uma razão anomérica α/β aproximadamente 7:3 como uma espuma branca.
[00359] Dados para 20: Rf = 0,54 (EtOAc/hexano 5:1):
[00360] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,86 (s, 0,3H, H-C(8)), 7,69 (s, 0,7H, H-C(8)), 7,68 – 7,60 (m, 4H, H-arom), 7,47 – 7,34 (m, 6H, H- arom), 6,04 (dd, J = 6,9, 3,0 Hz, 0,7H, H-C(1')), 5,87 (dd, J = 8,0, 6,2 Hz, 0,3H, H-C(1')), 5,37 (dt, J = 14,2, 4,6 Hz, 1H, H-C(5')), 5,16 (br, 2H, NH2), 4,91 (dd, J = 6,5, 5,1 Hz,0,7H, H-C(4')), 4,79 (dd, J = 6,9, 5,2 Hz, 0,3H, H-C(4')), 4,13 (br, 0,3H, H-C(7')), 4,06 (d, J = 4,0 Hz, 0,7H, H-
C(7')), 2,95 (dd, J = 16,3, 6,6 Hz, 0,7H, H-C(3')), 2,81 (dd, J = 17,0, 7,4 Hz, 0,3H, H-C(3')), 2,49 – 2,30 (m, 1H, H-C(2')), 2,14 (dd, J = 13,1, 6,7 Hz, 1H, H-C(6')), 2,08 (s, 2,1H, MeCO2), 2,02 (s, 0,9H, MeCO2), 2,02 – 1,91 (m, 1H, H-C(6')), 1,80 (td, J = 13,4, 6,8 Hz, 1H, H-C(2')), 1,07, 1,06 (2s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00361] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 170,55, 170,44 (MeCO2), 158,98, 158,91 (C(2)), 153,18, 152,95 (C(4)), 151,40, 151,34 (C(6)), 140,38, 140,14 (C(8)), 135,73, 135,70 (CH-arom), 133,78, 133,62, 133,24, 133,17 (C-arom), 130,03, 130,00, 127,88, 127,86 (CH-arom), 125,65, 125,57 (C(5)), 86,59, 85,74 (C(1')), 82,93, 80,99 (C(4')), 76,57, 76,14 (C(7')), 74,34, 74,32 (C(5')), 51,15, 51,10 (C(3')), 37,19, 36,99 (C(6')), 36,70, 36,25 (C(2')), 26,87 (CH3)3-C-Si), 20,95, 20,86 (MeCO2), 19,00 (CH3)3-C-Si).
[00362] ESI+-HRMS m/z calculado para C30H35O4N5ClSi ([M + H]+) 592,2141, encontrado 592,2158. (3'R,5'R,7'R)-2-Amino-6-cloro-9-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'- didesóxi-3',5'-etano-β-D-ribofuranosil} purina (22b)
[00363] O nucleosídeo 20 (1,78 g, 3,01 mmol) é dissolvido em Na- OH a 0,5 M em THF/metanol/H2O (5:4:1, 15 ml) a 0 °C. A reação é agi- tada durante 20 min a 0 °C e bruscamente arrefecida pela adição de NH4Cl (484 mg). A suspensão é, em seguida, diluída com NaHCO3 saturado (100 ml) e extraída com DCM (4 x 75 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produ- to bruto é purificado por CC (MeOH a 3% em DCM) para produzir 21 (428 mg, 25%) e o anômero α correspondente do mesmo (992 mg, 60%) como espumas brancas.
[00364] Dados para 21: Rf = 0,43 (MeOH a 5% em DCM):
[00365] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,71 (s, 1H, H-C(8)), 7,68 – 7,60 (m, 4H, H-arom), 7,44 – 7,33 (m, 6H, H-arom), 5,85 (dd, J = 9,3, 5,8 Hz, 1H, H-C(1')), 5,33 (br, 2H, NH2), 4,62 (dd, J = 8,4, 4,9 Hz, 1H, H-C(4')), 4,44 (dd, J = 10,7, 5,3 Hz, 1H, H-C(5')), 4,40 – 4,15 (m, 2H, H-C(7'), OH), 2,79 (q, J = 8,7 Hz, 1H, H-C(3')), 2,22 (dd, J = 15,2, 9,3 Hz, 1H, H-C(6')), 2,11 – 2,02 (m, 1H, H-C(6')), 2,02 – 1,85 (m, 2H, H- C(2')), 1,06 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00366] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 158,73 (C(2)), 152,78 (C(4)), 151,94 (C(6)), 140,70 (C(8)), 135,70 (CH-arom), 133,91, 133,48 (C-arom), 129,90, 127,78 (CH-arom), 125,97 (C(5)), 87,96 (C(1')), 82,88 (C(5')), 76,85 (C(7')), 72,36 (C(5')), 50,41 (C(3')), 41,96 (C(6')), 35,73 (C(2')), 26,90 (CH3)3-C-Si), 19,02 (CH3)3-C-Si).
[00367] ESI+-HRMS m/z calculado para C28H33O3N5ClSi ([M + H]+) 550,2036, encontrado 550,2015. (3'R,5'R,7'R)-N2-(N,N-Dimetilformamidino)-9-{7'-[(terc- butildifenilsilil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-β-D-ribofuranosil} guanina (22)
[00368] A uma solução de 21 (380 mg, 0,645 mmol) e 3- hidroxipropionitrila (0,22 ml, 3,23 mmol) em DCM seco (15 ml), é adici- onado 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (400 mg, 2,87 mmol) a 0 °C. A solução é agitada durante 3 horas a 0 °C e depois durante 2 dias à temperatura ambiente. A reação é interrompida pela adição de sílica. Após evaporação do solvente, o pó de SiO2 é filtrado, lavado com MeOH, e o solvente é evaporado para produzir uma espuma marrom.
[00369] O produto bruto é dissolvido em DMF seco (5 ml) e N,N- dimetilformamida dimetil acetal (0,43 ml, 3,2 mmol) é adicionado. A solução é agitada durante 2 horas a 55 °C e, em seguida, os solventes são removidos sob pressão reduzida. O produto bruto é purificado por CC (6% MeOH em DCM) para produzir 23 (274 mg, 73%) como uma espuma amarelada.
[00370] Dados para 22: Rf = 0,45 (MeOH a 12% em DCM):
[00371] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,52 (s, 1H, NH), 8,46 (s, 1H, NCHN(CH3)2), 7,63 (dd, J = 7,7, 1,5 Hz, 4H, H-arom), 7,50 (s, 1H, H-C(8)), 7,44 – 7,30 (m, 6H, H-arom), 5,83 (dd, J = 9,3, 6,0 Hz, 1H, H- C(1')), 4,61 (dd, J = 8,7, 5,0 Hz, 1H, H-C(4')), 4,43 – 4,32 (m, 1H, H- C(5')), 4,29 (dd, J = 7,0, 4,8 Hz, 1H, H-C(7')), 3,95 (d, J = 5,1 Hz, 1H, OH), 2,98 (s, 6H, NCHN(CH3)2), 2,79 (dd, J = 18,0, 7,0 Hz, 1H, H- C(3')), 2,20 (dt, J = 12,8, 5,4 Hz, 1H, H-C(6')), 2,09 – 1,88 (m, 3H, H- C(6'), H-C(2')), 1,05 (s, 9H, (CH3)3-C-Si)). 13
[00372] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 158,73 (C(2)), 157,79 (C(6)), 156,91 (NCHN(CH3)2), 149,84 (C(4)), 137,00 (C(8)), 135,70, 135,67 (CH-arom), 133,78, 133,60 (C-arom), 129,93, 129,86, 127,78, 127,72 (CH-arom), 121,61 (C(5)), 88,04 (C(1')), 82,21 (C(4')), 77,49 (C(7')), 71,94 (C(5')), 50,13 (C(3')), 42,23 (C(6')), 41,20 (NCHN(CH3)2), 35,50 (C(2')), 34,97 (NCHN(CH3)2), 26,87 (CH3)3-C-Si), 19,02 (CH3)3- C-Si).
[00373] ESI+-HRMS m/z calculado para C31H38O4N6Si ([M + H]+) 586,2718, encontrado 586,2703. (3'R,5'R,7'R)-N2-(N,N-Dimetilformamidino)-9-{7'-[(terc- butildifenilsilil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} guanina (23)
[00374] A uma solução de 22 (139 mg, 0,237 mmol) em piridina se- ca (2 ml), é adicionado DMTr-Cl (240 mg, 0,708 mmol) em seis por- ções ao longo de 3 horas à temperatura ambiente. Depois de agitação durante a noite, a solução cor de laranja é diluída com NaHCO3 satu- rado (20 ml) e extraída com DCM (3 X 20 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produ- to bruto é purificado por CC (MeOH a 4% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 23 (148 mg, 70%) como uma espuma amarelada.
[00375] Dados para 23: Rf = 0,52 (MeOH a 10% em DCM):
[00376] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,49 (s, 1H, NH), 8,38 (s, 1H, NCHN(CH3)2), 7,80 (s, 1H, C(8)), 7,50 – 7,43 (m, 2H, H-arom), 7,42 – 7,27 (m, 10H, H-arom), 7,26 – 7,15 (m, 6H, H-arom), 7,14 – 7,08 (m, 1H, H-arom), 6,77 – 6,68 (m, 4H, H-arom), 5,78 (dd, J = 8,2, 5,9 Hz, 1H, H-C(1')), 4,25 (dt, J = 11,0, 5,6 Hz, 1H, H-C(5')), 4,14 – 4,03 (m, 1H, H-C(4')), 3,70 – 3,64 (m, 7H, MeO, H-C(7')), 3,00 (s, 3H, NCHN(CH3)2), 2,97 (s, 3H, NCHN(CH3)2), 2,43 (dd, J = 16,7, 7,5 Hz, 1H, H-C(3')), 2,24 (ddd, J = 13,3, 10,1, 5,8 Hz, 1H, H-C(2')), 1,62 (td, J = 13,1, 4,3 Hz, 1H, H-C(6')), 1,43 (dt, J = 13,5, 8,0 Hz, 1H, H-C(2')), 0,99 (dd, J = 13,3, 6,2 Hz, 1H), 0,86 (s, 9H, (CH3)3-C-Si)). 13
[00377] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 158,51, 158,49 (MeO-C- arom), 158,04 (C(2)), 157,91 (C(6)), 156,60 (NCHN(CH3)2), 149,76 (C(4)), 145,83, 137,12, 136,94 (C-arom), 136,01 (C(8)), 135,60, 135,59 (CH-arom), 133,81, 133,47 (C-arom), 130,32, 130,26, 129,77, 128,24, 127,82, 127,65, 127,62, 126,67 (CH-arom), 120,65 (C(5)), 113,13, 113,09 (CH-arom), 86,82 (C(Ph)3), 85,01 (C(1')), 82,26 (C(4')), 76,14 (C(7')), 74,61 (C(5')), 55,19 (MeO-DMTr), 50,18 (C(3')), 41,29 (NCHN(CH3)2), 38,01 (C(6')), 37,76 (C(2')), 35,14 (NCHN(CH3)2) 26,81 87 (CH3)3-C-Si), 19,01 (CH3)3-C-Si).
[00378] ESI+-HRMS m/z calculado para C52H57O6N6Si ([M + H]+) 889,4103, encontrado 889,4128.
(3'S,5'R,7'R)-N2-(N,N-Dimetilformamidino)-9-{2',3'-didesóxi-3',5'- etano-7'-hidróxi-5'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D- ribofuranosil} guanina (24)
[00379] A uma solução de 23 (243 mg, 0,273 mmol) em THF seco (2 ml), é adicionado TBAF (1 M em THF, 1,65 ml, 1,63 mmol) à tempe- ratura ambiente. A solução é agitada durante 7 horas e depois é diluí- da com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (4 x 30 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e eva- poradas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 7% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 24 (155 mg, 87%) como uma espuma branca contendo ainda vestígios de TBAF.
[00380] Dados para 24: Rf = 0,44 (MeOH a 10% em DCM):
[00381] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,55 (s, 1H, NH), 8,45 (s, 1H, NCHN(CH3)2), 8,00 (s, 1H, H-C(8)), 7,60 – 7,50 (m, 2H, H-arom), 7,49 – 7,39 (m, 4H, H-arom), 7,31 – 7,23 (m, 2H, H-arom), 7,21 – 7,12 (m, 1H, H-arom), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 4H, H-arom), 5,93 (dd, J = 7,5, 6,1 Hz, 1H, H-C(1')), 4,26 (dt, J = 11,1, 5,8 Hz, 1H, H-C(5')), 4,07 – 3,98 (m, 1H, H-C(4')), 3,91 (d, J = 4,3 Hz, 1H, H-C(7')), 3,77 (s, 6H, MeO), 3,14 (s, 3H, NCHN(CH3)2), 3,04 (s, 3H, NCHN(CH3)2), 2,73 (ddd, J = 13,3, 10,1, 6,0 Hz, 1H, H-C(2')), 2,63 – 2,48 (m, 1H, H-C(3')), 2,12 (br, 1H, OH), 1,95 – 1,82 (m, 2H, H-C(6'), H-C(2')), 1,14 (dd, J = 13,4, 6,1 Hz, 1H, H-C(6')). 13
[00382] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 158,52 (MeO-C-arom), 158,12 (C(2)), 157,88 (C(6)), 156,65 (NCHN(CH3)2), 149,78 (C(4)), 145,69, 137,02, 136,99 (C-arom), 136,07 (C(8)), 130,26, 128,26,
127,82, 126,74 (CH-arom), 120,53 (C(5)), 113,12 (CH-arom), 86,81 (C(Ph)3), 85,35 (C(1')), 82,64 (C(4')), 74,61 (C(7')), 74,48 (C(5')), 55,23 (MeO-DMTr), 49,63 (C(3')), 41,37 (NCHN(CH3)2), 38,55 (C(6')), 38,23 (C(2')), 35,14 (NCHN(CH3)2).
[00383] ESI+-HRMS m/z calculado para C36H39O6N6 ([M + H]+) 651,2926, encontrado 651,2912. (3'R,5'R,7'R)-N2-(N,N-Dimetilformamidino)-9-{7'-O-[(2-cianoetóxi)- di-isopropilaminofosfanil]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} guanina (25)
[00384] A uma solução do nucleosídeo 24 (143 mg, 0,220 mmol) e 5-(etiltio)-1H-tetrazol (43 mg, 0,33 mmol) em DCM seco (10 ml), é adi- cionado gota a gota 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita (0,12 ml, 0,38 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação du- rante 50 min, a mistura de reação é diluída com NaHCO3 saturado (20 ml) e extraída com DCM (3 X 20 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é pu- rificado por CC (MeOH a 3,5% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 25 (130 mg, mistura de dois isômeros, 69%) como uma espuma bran- ca.
[00385] Dados para 25: Rf = 0,60 (MeOH a 10% em DCM):
[00386] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,54, 9,47 (2s, 1H, NH), 8,54, 8,52 (2s, 1H, NCHN(CH3)2), 8,02. 8,00 (2s, 1H, H-C(8)), 7,58 – 7,49 (m, 2H, H-arom), 7,46 – 7,36 (m, 4H, H-arom), 7,25 (dd, J = 11,0, 3,5 Hz, 2H, H-arom), 7,21 – 7,13 (m, 1H, H-arom), 6,80 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 4H, H-arom), 6,00 – 5,82 (m, 1H, H-C(1')), 4,16 (dd, J = 10,7, 5,4 Hz, 1H, H-C(5')), 4,00 – 3,82 (m, 2H, H-C(4'), H-C(7')), 3,77, 3,77
(2s, 6H, MeO), 3,62 (dt, J = 12,2, 6,1 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 3,51 – 3,33 (m, 2H, (Me2CH)2N), 3,15, 3,14 (2s, 3H, NCHN(CH3)2), 3,07 (s, 3H, NCHN(CH3)2), 2,85 – 2,61 (m, 2H, C(2'), C(3')), 2,59 – 2,44 (m, 2H, OCH2CH2CN), 2,00 – 1,79 (m, 2H, H-(C2'), H-C(6')), 1,53 – 1,26 (m, 1H, H-C(6')), 1,10, 1,01 (2t, J = 6,4 Hz, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00387] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 158,50 (MeO-C-arom), 158,04, 158,00 (C(2)), 157,93 (C(6)), 156,61, 156,60 (NCHN(CH3)2), 149,73, 149,72 (C(4)), 145,62, 145,62, 136,97, 136,94 (C-arom), 136,14 (C(8)), 130,27, 130,24, 130,22, 128,26, 127,81, 126,73 (CH- arom), 120,81, 120,76 (C(5)), 117,67, 117,56 (OCH2CH2CN), 113,10 (CH-arom), 86,88, 86,85 (C(Ph)3), 85,58, 85,37 (C(1')), 82,41, 82,07 (C(4')), 77,08, 76,01 (JC,P = 37,0, 15,1 Hz, C(7')), 74,52, 74,46 (C(5')), 58,19, 57,74 (JC,P = 18,9, 19,0 Hz OCH2CH2CN), 55,25, 55,21 (MeO- DMTr), 49,10, 48,83 (JC,P = 2,2, 4,8 Hz, C(3')), 43,12, 43,00 ((Me2CH)2N), 41,34, 41,33 (NCHN(CH3)2), 38,48, 38,41 (C(2')), 37,23, 36,92 (JC,P = 5,7, 3,3 Hz C(6')), 35,17 ((Me2CH)2N), 24,56, 24,53, 24,48, 24,47, 24,43, 25,36, 24,35 (7s, Me2CH)2N), 20,39, 20,28 (JC,P = 7,1, 6,9 Hz, OCH2CH2CN).
[00388] RMN de 31P (122 MHz, CDCl3) δ 147,69, 146,37.
[00389] ESI+-HRMS m/z calculado para C45H56O7N8P ([M + H]+) 851,4004, encontrado 851,4018. (3'S,5'R,7'R)-1-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'- etano-β-D-ribofuranosil} uracila (26)
[00390] A uma solução do açúcar 6 (669 mg, 1,62 mmol) em DCM seco (13 ml), é adicionada 2,6-lutidina (0,94 ml, 8,10 mmol) a 0 °C. Após agitação durante 20 min a 0 °C, TMSOTf (0,89 ml, 4,86 mmol) é adicionado gota a gota e, em seguida, a solução é deixada aquecer até à temperatura ambiente e é agitada durante mais 3 h. A reação é, então, bruscamente arrefecida por adição de NaHCO3 saturado (20 ml). A fase orgânica é separada e a fase aquosa é adicionalmente ex- traída com DCM (2 x 20 ml). As fases orgânicas combinadas são se- cas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00391] O produto bruto é dissolvido em DCM seco (12 ml) e, em seguida, uracila (545 mg, 4,86 mmol) e BSA (1,8 ml, 7,29 mmol) são adicionados à temperatura ambiente. Após agitação durante 60 min à temperatura ambiente, a suspensão fina resultante é resfriada até 0 °C e N-iodosuccinimida (578 mg, 2,52 mmol) é adicionada. Após agitação por 30 min a 0 °C e por 4 h à temperatura ambiente, a mistura de rea- ção é diluída com EtOAc (50 ml) e subsequentemente lavada com uma solução aquosa a 10% de Na2S2O3 (30 ml) e NaHCO3 saturado (30 ml). As fases aquosas são combinadas e extraídas com DCM (2 x 20 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtra- das e evaporadas.
[00392] O produto bruto é dissolvido em tolueno seco (15 ml) e, em seguida, Bu3SnH (0,65 ml, 2,43 mmol) e azoisobutironitrila (AIBN, 13 mg, 0,081 mmol) são adicionados à temperatura ambiente. Após aquecimento a 95 °C durante 2 h, a mistura é resfriada até a tempera- tura ambiente e MeOH (7 ml) e HCl (a 1 M em água, 1,6 ml, 1,6 mmol) são adicionados. A solução é adicionalmente agitada durante 15 min e em seguida é diluída com NaHCO3 saturado (50 ml) e extraída com DCM (3 X 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 4:1) para render 26 (490 mg, 61% em três etapas) co- mo uma espuma branca.
[00393] Dados para 26: Rf = 0,15 (EtOAc/hexano 2:1):
[00394] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,95 (br, 1H, H-N(3)), 7,69 (d, J = 6,4 Hz, 4H, H-arom), 7,54 – 7,39 (m, 7H, H-C(6), H-arom), 5,98
(dd, J = 9,3, 5,6 Hz, 1H, H-C(1')), 5,71 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-C(5)), 4,51 (dd, J = 13,7, 6,3 Hz, 2H, H-C(4'), H-C(5')), 4,14 (br, 1H, H-C(7')), 3,25 (br, 1H, OH), 2,74 (dd, J = 17,1, 8,7 Hz, 1H, H-C(3')), 2,26 – 1,87 (m, 3H, H-C(2'), H-C(6')), 1,49 – 1,19 (m, 1H, H-C(2')), 1,12 (s, 9H, (CH3)3- C-Si). 13
[00395] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 163,65 (C(4)), 150,46 (C(2)), 139,85 (C(6)), 135,69, 135,66 (CH-arom), 133,71, 133,42 (C- arom), 129,98, 129,93, 127,85, 127,81 (CH-arom), 102,84 (C(5)), 86,17 (C(1')), 81,83 (C(4')), 76,94 (C(7')), 72,45 (C(5')), 50,09 (C(3')), 40,93 (C(6')), 35,83 (C(2')), 26,91 (CH3)3-C-Si), 19,03 (CH3)3-C-Si).
[00396] ESI+-HRMS m/z calculado para C27H32O5N2NaSi ([M + Na]+) 515,1973, encontrado 515,1963. (3'S,5'R,7'R)-1-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'- etano-5'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} uracila (27)
[00397] A uma solução de nucleosídeo 26 (438 mg, 0,889 mmol) em piridina seca (7 ml), é adicionado DMTr-Cl (1,20 g, 3,55 mmol) à temperatura ambiente. A solução é agitada durante 1 dia à temperatu- ra ambiente e, em seguida, diluída com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (3 X 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purifi- cado por CC (MeOH a 1,5% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 27 (601 mg, 80%) como uma espuma amarela.
[00398] Dados para 27: Rf = 0,48 (EtOAc/hexano 2:1):
[00399] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,26 (br, 1H, H-N(3)), 7,84 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-C(6)), 7,40 – 7,08 (m, 19H, H-arom), 6,69 (dd, J =
8,8, 4,9 Hz, 4H, H-arom), 5,70 (dd, J = 7,8, 5,8 Hz, 1H, H-C(1')), 5,49 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H, H-C(5)), 4,24 – 4,11 (m, 1H, H-C(5')), 4,05 – 3,95 (m, 1H, H-C(4')), 3,65 (d, J = 1,7 Hz, 6H, MeO), 3,62 (d, J = 3,0 Hz, 1H, H-C(7')), 2,41 (dd, J = 17,2, 8,5 Hz, 1H, H-C(3')), 2,24 (ddd, J = 13,5, 10,2, 5,7 Hz, 1H, H-C(2')), 1,39 – 1,24 (m, 1H, H-C(6')), 1,04 (dd, J = 13,1, 5,7 Hz, 1H, H-C(6')), 0,89 (dt, J = 13,8, 8,3 Hz, 1H, H-C(2')), 0,81 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00400] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 163,58 (C(4)), 158,66 (MeO-C-arom), 150,38 (C(2)), 145,61 (C-arom), 139,92 (C(6)), 136,71, 136,56 (C-arom), 135,61, 135,55 (CH-arom), 133,55, 133,41 (C-arom), 130,30, 129,92, 129,84, 128,16, 127,90, 127,74, 127,67, 126,90, 113,19, 113,15 (CH-arom), 102,12 (C(5)), 87,41 (C(Ph)3), 86,80 (C(1')), 82,32 (C4')), 75,54 (C(7')), 74,41 (C(5')), 55,23 (MeO-DMTr), 50,05 (C(3')), 38,49 (C(6')), 37,53 (C(2')), 26,81 (CH3)3-C-Si), 18,99 (CH3)3-C- Si).
[00401] ESI+-HRMS m/z calculado para C48H50O7N2NaSi ([M + Na]+) 817,3279, encontrado 817,3286. (3'S,5'R,7'R)-1-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'- etano-5'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} citosina (28)
[00402] A uma suspensão de 1,2,4-triazol (1,83 g, 26,5 mmol) em MeCN seco (70 ml), a 0 °C, são adicionados POCl3 (0,57 ml, 6,05 mmol) seguido por Et3N (4,2 ml), 30,2 mmol). A suspensão é agitada durante 30 min a 0 °C e, em seguida, uma solução do nucleosídeo 27 (601 mg, 0,756 mmol) em MeCN seco (4 ml) é adicionada a 0 °C. Após 4 h de agitação à temperatura ambiente, a reação é bruscamen-
te arrefecida com adição de NaHCO3 saturado (20 ml), MeCN removi- do sob pressão reduzida e a mistura resultante diluída com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (3 x 60 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00403] O produto bruto é, então, dissolvido em uma mistura de 1,4- dioxano (18 ml) e NH4OH concentrado (18 ml). Depois de agitação du- rante 3 h à temperatura ambiente, a mistura é reduzida para metade do volume sob vácuo, diluída com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (3 X 30 ml). As fases orgânicas combinadas são secas so- bre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 5% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 28 (520 mg, 87%) como uma espuma branca.
[00404] Dados para 28: Rf = 0,41 (MeOH a 10% em DCM):
[00405] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,96 (d, J = 7,4 Hz, 1H,H- C(6)), 7,45 (d, J = 7,4 Hz, 2H, H-arom), 7,38 – 7,08 (m, 17H, H-arom), 6,73 (dd, J = 8,7, 4,7 Hz, 4H, H-arom), 5,73 (t, J = 8,6 Hz, 2H, H-C(5), H-C(1')), 4,32 – 4,16 (m, 1H, H-C(5')), 4,03 (t, J = 5,6 Hz, 1H, H-C(4')), 3,66 (d, J = 0,9 Hz, 6H, MeO), 3,61 (d, J = 2,9 Hz, 1H, H-C(7')), 2,50 – 2,33 (m, 2H, H-C(2'), H-C(3')), 1,47 – 1,28 (m, 1H, H-C(6')), 1,03 (dd, J = 12,9, 5,6 Hz, 1H, H-C(6')), 0,92 – 0,75 (m, 10H, H-C(2'), (CH3)3-C-Si). 13
[00406] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 165,78 (C(4)), 158,59 (MeO-C-arom), 155,94 (C(2)), 145,88 (C-arom), 140,68 (C(6)), 136,93, 136,78 (C-arom), 135,59, 135,53 (CH-arom), 133,60, 133,54 (C-arom), 130,31, 129,86, 129,77, 128,15, 127,88, 127,71, 127,64, 126,79, 113,18, 113,14 (CH-arom), 94,53 (C(5)), 87,55 (C(Ph)3), 87,22 (C(1')), 82,23 (C(4')), 75,76 (C(7')), 74,68 (C(5')), 55,21 (MeO-DMTr), 50,18 (C(3')), 38,25 (C(6')), 38,08 (C(2')), 26,83 (CH3)3-C-Si), 19,00 (CH3)3-C- Si).
[00407] ESI+-HRMS m/z calculado para C48H52O6N3Si ([M + H]+) 794,3620, encontrado 794,3649.
(3'S,5'R,7'R)-N4-Benzoil-1-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'- didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D- ribofuranosil} citosina (29)
[00408] A uma solução de nucleosídeo 28 (519 mg, 0,653 mmol) em DMF seco (15 ml), são adicionados Et3N (110 μl, 0,784 mmol) se- guido por Bz2O (370 mg, 1633 mmol) à temperatura ambiente e a so- lução é agitada durante a noite. Em seguida, a solução é bruscamente arrefecida por adição cuidadosa de NaHCO3 saturado (60 ml) e extraí- da com DCM (3 x 70 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (hexano/EtOAc 2:3, Et3N a 0,5%) para produzir 29 (580 mg, 99%) como uma espuma branca.
[00409] Dados para 29: Rf = 0,51 (EtOAc):
[00410] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,61 (d, J = 7,4 Hz, 1H, H- C(6)), 7,81 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-arom), 7,49 – 7,13 (m, 24H, H-arom, H-C(5)), 6,77 (dd, J = 8,5, 4,4 Hz, 4H, H-arom), 5,73 (t, J = 6,4 Hz, 1H, H-C(1')), 4,39 – 4,20 (m, 1H, H-C(5')), 4,05 (t, J = 6,1 Hz, 1H, H-C(4')), 3,70 (s, 6H, MeO), 3,63 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-C(7')), 2,72 – 2,55 (m, 1H, H-C(2')), 2,48 (dd, J = 16,0, 8,4 Hz, 1H, H-C(3')), 1,42 – 1,29 (m, 1H, H-C(6')), 1,19 – 1,11 (m, 1H, H-C(6')), 1,07 – 0,96 (m, 1H, H-C(2')), 0,85 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00411] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 166,64 (CONH), 162,25 (C(4)), 158,70 (MeO-C-arom), 154,84 (C(2)), 145,71 (C-arom), 144,84 (C(6)), 136,74, 136,67 (C-arom), 135,59, 135,51 (CH-arom), 133,52, 133,42, 133,24 (C-arom), 133,11, 130,30, 129,92, 129,85, 129,02, 128,12, 127,97, 127,76, 127,68, 127,61, 126,94, 113,25, 113,22(CH-
arom), 96,22 (C(5)), 89,07 (C(Ph)3), 87,53 (C(1')), 83,46 (C(4')), 75,59 (C(7')), 74,71 (C(5')), 55,24 (MeO-DMTr), 50,35 (C(3')), 38,61 (C(6')), 38,15 (C(2')), 26,82 (CH3)3-C-Si), 19,00 (CH3)3-C-Si).
[00412] ESI+-HRMS m/z calculado para C55H56O7N3Si ([M + H]+) 898,3882, encontrado 898,3898. (3'S,5'R,7'R)-N4-Benzoil-1-{-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-hidróxi-5'- O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} citosina (30)
[00413] A uma solução de 29 (580 mg, 0,648 mmol) em THF seco (14 ml) é adicionado TBAF (1 M em THF, 3,25 ml, 3,25 mmol) à tem- peratura ambiente. A solução é agitada durante 1 dia e, em seguida, é diluída com saturada de NaHCO3 (50 ml) e extraída com DCM (3 X 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 3% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 30 (366 mg, 85%) como uma espu- ma branca.
[00414] Dados para 30: Rf = 0,31 (MeOH a 5% em DCM):
[00415] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,90 (br, 1H, NH), 8,73 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-C(6)), 7,82 (d, J = 7,3 Hz, 2H, H-arom), 7,55 – 7,31 (m, 10H, H-arom, H-C(5)), 7,28 – 7,09 (m, 3H, H-arom), 6,76 (dd, J = 8,8, 1,7 Hz, 4H, H-arom), 5,73 (t, J = 6,3 Hz, 1H, H-C(1')), 4,28 – 4,13 (m, 1H, H-C(5')), 3,83 (t, J = 6,0 Hz, 1H, H-C(4')), 3,75 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-C(7')), 3,70 (s, 6H, MeO), 2,86 (d, J = 14,7 Hz, 1H, H-C-(2')), 2,54 (dd, J = 17,4, 7,4 Hz, 1H, H-C(3')), 1,68 – 1,55 (m, 1H, H-C(6')), 1,45 – 1,13 (m, 3H, H-C(2'), H-C(6'), OH). 13
[00416] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 166,63 (CONH), 162,34 (C(4)), 158,65 (MeO-C-arom), 155,00 (C(2)), 145,62 (C-arom), 145,11
(C(6)), 136,72, 136,64, 133,16 (C-arom), 130,25, 129,02, 128,12, 127,93, 127,61, 126,95, 113,20 (CH-arom), 96,24 (C(5)), 89,20 (C(Ph)3), 87,48 (C(1')), 83,40 (C(4')), 74,50, (C(5')) 73,90 (C(7')), 55,25 (MeO-DMTr), 50,05 (C(3')), 38,90 (C(6')), 38,40 (C(2')).
[00417] ESI+-HRMS m/z calculado para C39H38O7N3 ([M + H]+) 660,2704, encontrado 660,2707. (3'S,5'R,7'R)-N4-Benzoil-1-{7'-O-[(2-cianoetóxi)-di- isopropilaminofosfanil]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-5'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} citosina (31)
[00418] A uma solução do nucleosídeo 30 (67 mg, 0,101 mmol) e 5- (etiltio)-1H-tetrazol (22 mg, 0,17 mmol) em DCM seco (3 ml), é adicio- nada gota a gota 2-cianoetil N,N,N',N′-tetraisopropilfosforodiamidita (65 μL, 0,20 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação durante 40 min, a mistura de reação é diluída com DCM (20 ml) e lavada com NaHCO3 saturado (2 x 15 ml) e NaCl (15 ml) saturado. As fases aquo- sas são combinadas e extraídas com DCM (20 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produ- to bruto é purificado por CC (EtOAc, Et3N a 0,5%) para produzir 31 (75 mg, mistura de dois isômeros, 86%) como uma espuma branca.
[00419] Dados para 31: Rf = 0,67 (MeOH a 4% em DCM):
[00420] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,88 (s, 1H, NH), 8,79 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-C(6)), 7,93 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-arom), 7,67 – 7,40 (m, 10H, H-arom, H-C(5)), 7,39 – 7,22 (m, 3H, H-arom), 6,93 – 6,79 (m, 4H, H-arom), 5,97 – 5,77 (m, 1H, H-C(1')), 4,22 (dt, J = 14,5, 5,6 Hz, 1H, H-(5')), 3,98 – 3,84 (m, 2H, H-C(4'), H-C(7')), 3,82 (s, 6H, MeO), 3,66 (ddd, J = 16,8, 13,5, 6,7 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 3,53 – 3,37 (m,
2H, (Me2CH)2N), 3,14 – 2,93 (m, 1H, H-C(2')), 2,84 – 2,66 (m, 1H, H- C(3')), 2,53 (dt, J = 12,4, 6,3 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 1,83 – 1,56 (m, 2H, H-C(6')), 1,46 (td, J = 14,1, 7,0 Hz, 1H, H-C(2')), 1,18 – 0,97 (m, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00421] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 166,70 (CONH), 162,32, 162,28 (C(4)), 158,68 (MeO-C-arom), 154,93 (C(2)), 145,53 (C-arom), 144,95, 144,89 (C(6)), 136,69, 136,63, 136,56, 136,52, 133,24 (C- arom), 133,10, 130,24, 130,20, 129,01, 128,10, 127,94, 127,60, 126,96 (CH-arom), 117,53 (OCH2CH2CN), 113,20 (CH-arom), 96,24 (C(5)), 89,15, 89,10 (C(Ph)3), 87,55, 87,54 (C(1')), 83,11, 83,04 (C(4')), 75,93, 75,37 (JC,P = 16,7, 15,5 Hz, C(7')), 74,48 (C(5')), 58,25, 57,99 (JC,P = 17,9, 18,1 Hz OCH2CH2CN), 55,27, 55,24 (MeO-DMTr), 49,27, 49,03 (JC,P = 3,1, 4,8 Hz, C(3')), 43,15, 42,98 ((Me2CH)2N), 38,89, 38,80 (C(2')), 37,44, 37,24 (JC,P = 5,2, 3,2 Hz, C(6')), 24,58, 24,54, 24,48, 24,45, 24,35 (5s, Me2CH)2N), 20,33, 20,24 (JC,P = 5,8, 5,7 Hz, OCH2CH2CN).
[00422] RMN de 31P (121 MHz, CDCl3) δ 147,19, 146,94.
[00423] ESI+-HRMS m/z calculado para C48H55O8N5P ([M + H]+) 860,3783, encontrado 860,3791. (3'S,5'R,7'R)-1-{2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-(4-nitrobenzoil)-5'-O- [(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-β-D-ribofuranosil} timina (32)
[00424] A uma solução de nucleosídeo 11 (100 mg, 0,175 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (26 mg, 0,21 mmol) em DCM seco (8 ml), é adi- cionado cloreto de 4-nitrobenzoíla (59 mg, 0,315 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação durante 6 h, a reação é bruscamente arrefecida por adição de NaHCO3 saturado (5 ml). A mistura é, então, diluída com NaHCO3 saturado (15 ml) e extraída com DCM (3 x 15 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 2,5% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 32 (98 mg, 78%) como uma espuma branca, contendo vestígios de Et3N.
[00425] Dados para 32: Rf = 0,42 (MeOH a 5% em DCM):
[00426] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,26 (t, J = 7,3 Hz, 3H, H- arom, HN(3)), 8,00 (d, J = 8,9 Hz, 2H, H-arom), 7,72 (d, J = 1,0 Hz, 1H, H-C(6)), 7,55 (d, J = 6,9 Hz, 2H, H-arom), 7,44 (dd, J = 8,8, 6,6 Hz, 4H, H-arom), 7,35 – 7,18 (m, 3H, H-arom), 6,83 (dd, J = 9,0, 2,6 Hz, 4H, H- arom), 6,01 (dd, J = 8,2, 5,2 Hz, 1H, H-C(1')), 4,96 (d, J = 3,3 Hz, 1H, H-C(7')), 4,33 – 4,24 (m, 1H, H-C(4')), 4,24 – 4,13 (m, 1H, H-C(5')), 3,78 (d, J = 0,9 Hz, 6H, MeO), 2,92 – 2,72 (m, 2H, H-C(3'), H-C(2')), 1,81 (d, J = 0,6 Hz, 3H, Me-C(5)), 1,79 – 1,62 (m, 2H, H-C(6')), 1,22 (d, J = 5,9 Hz, 1H, H-C(2')). 13
[00427] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 164,05, 163,84 (C(4), CO2R), 158,81 (MeO-C-arom), 150,64, 150,52 (O2N-C-arom, C(2)), 145,29, 136,43, 136,34 (C-arom), 135,18 (C(6)), 130,62, 130,20, 130,17, 128,16, 128,01, 127,15, 123,58, 113,30, 113,27 (C-arom), 111,17 (C(5)), 87,53 (C(Ph)3), 86,29 (C(1')), 81,59 (C(4')), 78,65 (C(7')), 74,16 (C(5')), 55,26 (MeO-DMTr), 47,07 (C(3')), 37,35 (C(2')), 35,71 (C(6')), 12,51 (Me-C(5)).
[00428] ESI+-HRMS m/z calculado para C40H37O10N3Na ([M + Na]+) 742,2371, encontrado 742,2375 ((3'S,5'R,7'R)-1-{2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-(4-nitrobenzoil)-β-D- ribofuranosil} timina (33)
[00429] A uma solução de 32 (60 mg, 0,083 mmol) em uma mistura de DCM seco (1 ml) e MeOH (0,4 ml), é adicionado gota a gota ácido dicloroacético (0,2 ml) à temperatura ambiente. Depois de agitação durante 3 h, a mistura é, em seguida, diluída com NaHCO3 saturado (15 ml) e extraída com DCM (3 X 10 ml). As fases orgânicas combina- das são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 5% em DCM) para produzir 33 (29 mg, 84%) como uma espuma branca. Cristais apropriados para análise de raios-X são obtidos por recristalização em uma mistura de H2O/MeOH.
[00430] Dados para 33: Rf = 0,18 (MeOH a 5% em DCM):
[00431] RMN de 1H (400 MHz, DMSO) δ 11,33 (s, 1H, H-N(3)), 8,34 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H-arom), 8,27 – 8,13 (m, 2H, H-arom), 7,78 (s, 1H, H-C(6)), 5,96 (dd, J = 9,3, 5,6 Hz, 1H, H-C(1')), 5,18 (t, J = 3,8 Hz, 1H, H-C(7')), 5,12 (d, J = 6,0 Hz, 1H, OH), 4,33 (dd, J = 7,3, 4,7 Hz, 1H, H- C(4')), 4,27 (td, J = 10,5, 5,5 Hz, 1H, H-C(5')), 2,90 (dd, J = 17,2, 8,5 Hz, 1H, H-C(3')), 2,58 – 2,46 (m, 1H, H-C(2')), 2,30 (ddd, J = 13,8, 8,8, 5,3 Hz, 1H, H-C(6')), 2,03 (dd, J = 9,6, 4,2 Hz, 1H, H-C(6')), 1,92 – 1,76 (m, 4H, H-C(2'), Me-C(5)). 13
[00432] RMN de C (101 MHz, DMSO) δ 164,33, 164,23 (C(4), CO2R), 150,91, 150,75 (O2N-C-arom, C(2)), 136,79 (C-arom), 135,69 (C(6)), 131,20, 124,32 (CH-arom), 109,89 (C(5)), 85,31 (C(1')), 81,48 (C(4')), 80,07 (C(7')), 71,72 (C(5')), 47,18 (C(3')), 37,77 (C(6')), 35,48 (C(2')), 12,66 12,58 (Me-C(5)).
[00433] ESI+-HRMS m/z calculado para C19H20O8N3 ([M + H]+) 418,1245, encontrado 418,1242. (3'R,5'R,7'R)-1-{5'-O-Acetil-7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'- didesóxi-3',5'-etano-α,β-D-ribofuranosil} timina (35)
[00434] A uma solução do açúcar 7 (933 mg, 2,05 mmol) e timina (372 mg, 3,08 mmol) em MeCN seco (12 ml), é adicionado gota a gota BSA (1,5 ml, 6,15 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação du- rante 50 min à temperatura ambiente, a solução é resfriada até 0 °C e TMSOTf (0,45 ml, 2,5 mmol) é adicionado gota a gota. Depois de agi- tação durante mais 3 h a 0 °C e durante 15 h à temperatura ambiente, a mistura de reação é diluída com NaHCO3 saturado (100 ml) e extraí- da com DCM (4 x 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (isopropanol a 2,5% em DCM) para produzir uma mistura de 35 (924 mg, 82%) em uma razão anomérica α/β aproximadamente 85:15 como uma espuma branca.
[00435] Dados para 35: Rf = 0,56 (MeOH a 7% em DCM):
[00436] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,14 (br, 1H, H-N(3)), 7,53 (dd, J = 7,7, 1,6 Hz, 4H, H-arom), 7,39 – 7,23 (m, 6H, H-arom), 7,09 (d, J = 1,0 Hz, 0,15 H, H-C(6)), 6,87 (d, J = 1,0 Hz, 0,85 H, H-C(6)), 5,83 (t, J = 6,2 Hz, 0,85 H, H-C(1')), 5,80 – 5,70 (m, 0,15H, H-C(1')), 5,36 – 5,04 (m, 1H, H-C(5')), 4,89 (dd, J = 6,3, 5,2 Hz, 1H, H-C(4')), 4,62 (dd, J = 7,1, 5,6 Hz, 0,15H, H-C(4')), 4,01 – 3,85 (m, 1H, H-C(7')), 2,76 – 2,55 (m, 1H, H-C(3')), 2,09 – 1,91 (m, 4H, H-C(6'), MeCO2), 1,90 – 1,58 (m, 6H, H-C(6'), H-C(2'), Me-C(5)), 0,96 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00437] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 170,70 (MeCO2), 163,87
(C(4)), 150,29 (C(2)), 135,69, 135,67 (CH-arom), 134,99 (C(6)), 133,58, 133,18 (C-arom), 130,03, 127,87 (CH-arom), 111,05 (C(5)), 87,56 (C(1')), 82,85 (C(4')), 76,50 (C(7')), 74,76 (C(5')), 50,72 (C(3')), 37,79 (C(6')), 36,94 (C(2')), 26,88 ((CH3)3-C-Si), 20,95 (MeCO2), 19,01 ((CH3)3-C-Si), 12,63 (Me-C(5)).
[00438] ESI+-HRMS m/z calculado para C30H37O6N2Si ([M + H]+) 549,2415, encontrado 549,2401. (3'S,5'R,7'R)-1-{5'-O-Acetil-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-hidróxi-α,β- D-ribofuranosil} timina (36)
[00439] A uma solução do nucleosídeo 35 (924 mg, 1,68 mmol) em THF seco (10 ml), é adicionado TBAF (1 M em THF, 3,4 ml, 3,4 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação durante 2 h à temperatura ambiente, a mistura de reação é diluída com NaHCO3 saturado (80 ml) e extraída com EtOAc (3 X 80 ml) e DCM (2 X 80 ml). As fases orgâni- cas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 5% em DCM) para produ- zir uma mistura anomérica de 36 (391 mg, 75%).
[00440] Dados para 36: Rf = 0,24 (MeOH a 7% em DCM):
[00441] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,66 (br, 0,15H, H-N(3)), 9,63 (br, 0,85H, H-N(3)), 7,27 (d, J = 1,0 Hz, 0,15H, H-C(6)), 7,06 (d, J = 1,0 Hz, 0,85H, H-C(6)), 6,00 (t, J = 6,1 Hz, 0,85H, H-C(1')), 5,91 (dd, J = 8,8, 5,5 Hz, 0,15H, H-C(1')), 5,26 – 5,10 (m, 1H, H-C(5')), 4,92 (dd, J = 6,5, 5,3 Hz, 0,85H, H-C(4')), 4,65 (dd, J = 6,9, 5,7 Hz, 0,15H, H- C(4')), 4,19 – 4,03 (m, 1H, H-C(7')), 2,91 – 2,72 (m, 2H, H-C(3'), OH), 2,64 (ddd, J = 13,3, 9,8, 5,5 Hz, 0,15H, H-C(2')), 2,25 – 2,15 (m, 1,70H, H-C(2')), 2,05 (s, 0,45H, MeCO2), 2,04 (s, 2,55H, MeCO2), 2,03 – 1,89 (m, 2H, H-C(6')), 1,88 (d, J = 0,7 Hz, 0,45H, Me-C(5)), 1,85 (d, J = 0,6
Hz, 2,55H, Me-C(5)), 1,42 – 1,28 (m, 0,15H, H-C(2')). 13
[00442] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 170,87 (MeCO2), 164,26 (C(4)), 150,66 (C(2)), 135,54 (C(6)), 111,22 (C(5)), 87,97 (C(1')), 82,97 (C(4')), 75,08 (C(7')), 74,52 (C(5')), 50,07 (C(3')), 37,81 (C(2')), 37,23 (C(6')), 21,02 (MeCO2), 12,67 (Me-C(5)).
[00443] ESI+-HRMS m/z calculado para C14H19O6N2 ([M + H]+) 311,1238, encontrado 311,1234. (3'S,5'R,7'R)-1-{5'-O-Acetil-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-α,β-D-ribofuranosil} timina (37)
[00444] A uma solução do nucleosídeo 36 (364 mg, 1,17 mmol) em piridina seca (7 ml) é adicionado DMTr-Cl (1,19 g, 3,51 mmol) à tem- peratura ambiente. A solução é agitada durante 1 dia e depois é diluí- da com NaHCO3 saturado (50 ml) e extraída com DCM (3 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e eva- poradas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 2:1, Et3N a +0,5%) para produzir uma mistura anomérica de 37 (690 mg, 96%) como uma espuma amarela.
[00445] Dados para 37: Rf = 0,70 (MeOH a 8% em DCM):
[00446] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,17 (br, 0,85H, H-N(3)), 8,56 (br, 0,15H, H-N(3)), 7,38 – 7,32 (m, 2H, H-arom), 7,29 – 7,15 (m, 7H, H-arom), 6,82 (d, J = 1,1 Hz, 1H, H-C(6)), 6,76 (d, J = 8,9 Hz, 4H, H-arom), 5,86 (t, J = 6,0 Hz, 0,85H, H-C(1')), 5,71 (dd, J = 8,9, 5,4 Hz, 0,15H, H-C(1')), 5,25 (dd, J = 10,2, 5,6 Hz, 0,15H, H-C(5')), 5,21 – 5,11 (m, 0,85H, H-(C5')), 4,78 (dd, J = 6,7, 4,8 Hz, 0,85H, H-C(4')), 4,49 (dd, J = 7,1, 5,3 Hz, 0,15H, H-C(4')), 3,84 (br, 1H, H-C(7')), 3,72, 3,71 (2s, 6H, MeO), 2,34 – 2,23 (m, 1H, H-C(3')), 2,01, 1,99 (2s, 3H, MeCO2),
1,82 (d, J = 0,5 Hz, Me-C(5)), 1,80 – 1,56 (m, 4H, H-C(2'), H-C(6')). 13
[00447] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 170,69 (MeCO2), 163,91 (C(4)), 158,82 (MeO-C-arom), 150,33 (C(2)), 145,34, 136,64, 136,58 (C-arom), 135,00 (C(6)), 130,25, 128,39, 128,07, 127,15, 113,41 (CH- arom), 111,04 (C(5)), 87,70 (C(Ph)3), 87,31 (C(1')), 83,15 (C(4')), 77,16 (C(7')), 74,96 (C(5')), 55,37 (MeO-DMTr), 49,12 (C(3')), 37,55 (C(2')), 36,82 (C(6')), 21,07 (MeCO2), 12,66 (Me-C(5)).
[00448] ESI+-HRMS m/z calculado para C35H36O8N2 ([M + H]+) 612,2466, encontrado 612,2453. (3'S,5'R,7'R)-1-{2',3'-Didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil} timina (38)
[00449] A uma solução do nucleosídeo 37 (690 mg, 1,12 mmol) em MeOH seco (10 ml) é adicionado K2CO3 (467 mg, 3,36 mmol) à tempe- ratura ambiente. A solução é agitada durante 3 h e depois diluída com NaCl saturado (60 ml) e extraída com DCM (3 x 60 ml). As fases orgâ- nicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (3% de isopropanol em Et2O, Et3N a +0,5%) para produzir o anômero α 38 (550 mg, 86%) como um sólido branco.
[00450] Dados para 38: Rf = 0,39 (MeOH a 5% em DCM):
[00451] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,37 (br, s, 1H, H-N(3)), 7,39 – 7,31 (m, 2H, H-arom), 7,25 (d, J = 8,3 Hz, 4H, H-arom), 7,20 (t, J = 7,7 Hz, 2H, H-arom), 7,16 – 7,08 (m, 1H, H-arom), 6,78 (d, J = 1,1 Hz, 1H, H-C(6)), 6,74 (d, J = 8,8 Hz, 4H, H-arom), 5,91 (dd, J = 6,5, 4,9 Hz, 1H, H-C(1')), 4,57 (dd, J = 7,2, 4,4 Hz, 1H, H-C(4')), 4,35 – 4,18 (m, 1H, H-C(5')), 3,86 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H-C(7')), 3,69 (s, 6H, MeO), 2,53 (br, 1H, OH), 2,22 (dd, J = 15,3, 6,3 Hz, 1H, H-C(3')), 1,85 – 1,69 (m,
5H, Me-C(5), H-C(2'), H-C(6')), 1,66 – 1,49 (m, 2H, H-C(2'), H-C(6')). 13
[00452] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 163,98 (C(4)), 158,67 (MeO-C-arom), 150,47 (C(2)), 145,48, 136,80, 136,75 (C-arom), 134,94 (C(6)), 130,19, 130,18, 128,35, 127,97, 127,01, 113,31 (CH- arom), 111,04 (C(5)), 87,82 (C(Ph)3), 87,05 (C(1')), 85,74 (C(4')), 78,26 (C(7')), 73,33 (C(5')), 55,31 (MeO-DMTr), 48,81 (C(3')), 40,21 (C(6')), 37,68 (C(2')), 12,65 (Me-C(5)).
[00453] ESI+-HRMS m/z calculado para C33H35O7N2 ([M + H]+) 571,2439, encontrado 571,2421. (3'S,5'R,7'R)-1-{5'-O-[(2-Cianoetóxi)-di-isopropilaminofosfanil]2',3'- didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-α-D- ribofuranosil} timina (39)
[00454] A uma solução do nucleosídeo 38 (200 mg, 0,350 mmol) e 5-(etiltio)-1H-tetrazol (59 mg, 0,46 mmol) em DCM seco (7 ml), é adici- onado gota a gota 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita (0,17 ml, 0,53 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação du- rante 1 h, a mistura de reação é diluída com DCM (50 ml) e lavada com NaHCO3 saturado (2 x 25 ml) e NaCl (25 ml) saturado. As fases aquosas são combinadas e extraídas com DCM (30 ml). As fases or- gânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 2% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 39 (220 mg, mistura de dois isômeros, 81%) como um sólido branco.
[00455] Dados para 39: Rf = 0,44 (MeOH a 4% em DCM):
[00456] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,03 (br, 1H, H-N(3)), 7,36 (d, J = 8,1 Hz, 2H, H-arom), 7,30 – 7,07 (m, 7H, H-arom), 6,84 (s, 1H,
H-C(6)), 6,80 – 6,69 (m, 4H, H-arom), 5,95, 5,88 (2dd, J = 6,6, 4,8 Hz, 1H, H-C(1')), 4,70, 4,61 (2dd, J = 7,3, 4,3 Hz, 1H, H-C(4')), 4,41 – 4,20 (m, 1H, H-C(5')), 3,94 – 3,82 (m, 1H, H-C(7')), 3,81 – 3,62 (m, 8H, MeO, OCH2CH2CN), 3,59 – 3,40 (m, 2H, (Me2CH)2N), 2,61 – 2,46 (m, 2H, OCH2CH2CN), 2,28 (ddd, J = 14,1, 13,2, 7,3 Hz, 1H, H-C(3')), 1,91 – 1,73 (m, 5H, Me-C(5), H-C(6'), H-C(2')), 1,72 – 1,46 (m, 2H, H-C(6'), H-C(2')), 1,16 – 1,00 (m, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00457] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 164,01, 163,98 (C(4)), 158,70 (MeO-C-arom), 150,39, 150,17 (C(2)), 145,52, 136,84, 136,78 (C-arom), 135,44, 135,39 (C(6)), 130,21, 128,36, 128,32, 128,00, 127,03 (CH-arom), 118,02, 117,76 (OCH2CH2CN), 113,32 (CH-arom), 110,91, 110,59 (C(5)), 88,31, 88,06 (C(Ph)3), 87,11, 87,06 (C(1')), 85,44, 85,39 (JC,P = 4,6, 3,1 Hz, C(4')), 78,25, 78,13 (C(7')), 74,70, 74,34 (JC,P = 13,5, 18,5 Hz, C(5')), 58,73, 58,47(JC,P = 18,9, 20,1 Hz, (OCH2CH2CN)), 55,35, 55,32 (MeO-DMTr), 48,80, 48,64 (C(3')), 43,22, 43,06 (JC,P = 12,4, 11,0 Hz (Me2CH)2N), 39,68, 39,63 (C(6')), 38,06, 37,93 (C(2')), 24,81, 24,74, 24,71, 24,68, 24,65, 24,59 (6s, Me2CH)2N), 20,37, 20,35 (JC,P = 7,1, 6,8 Hz, OCH2CH2CN), 12,66 (Me-C(5)).
[00458] RMN de 31P (122 MHz, CDCl3) δ 148,18, 147,80.
[00459] ESI+-HRMS m/z calculado para C42H52O8N4P ([M + H]+) 771,3517, encontrado 771,3517. (3'S,5'R,7'R)-N4-Benzoil-1-{2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil}-5-metilcitosina (40)
[00460] A uma solução do nucleosídeo 38 (268 mg, 0,470 mmol) em MeCN seco (5 ml), é adicionado gota a gota BSA (0,28 ml, 1,13 mmol) a 0 ° e, em seguida, a solução é agitada durante a noite à tem- peratura ambiente. Em outro frasco, uma suspensão de 1,2,4-triazol
(1,14 g, 16,5 mmol) em MeCN seco (50 ml) é resfriada a 0 °C, e POCl3 (0,35 ml, 3,8 mmol) seguido de Et3N (2,62 ml, 18,8 mmol) são adicio- nados. A suspensão é agitada durante 30 min a 0 °C e, em seguida, a solução previamente preparada do composto sililado 38 é adicionada à suspensão e a mistura é adicionalmente agitada durante 7 h à tempe- ratura ambiente. A reação é bruscamente arrefecida com a adição de NaHCO3 saturado (10 ml), MeCN removido sob pressão reduzida e a mistura resultante diluída com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (3 x 30 ml). As fases orgânicas combinadas são secas so- bre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00461] O produto bruto é, então, dissolvido em uma mistura de 1,4- dioxano (10 ml) e NH4OH concentrado (10 ml). Depois de agitação du- rante 3 h à temperatura ambiente, a mistura é reduzida à metade do seu volume sob vácuo, diluída com NaHCO3 saturado (25 ml) e extraí- da com DCM (4 x 30 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas.
[00462] O produto bruto é, então, dissolvido em DMF seco (10 ml). Et3N (80 μl, 0,56 mmol) seguido por Bz2O (266 mg, 1,18 mmol) são adicionados à temperatura ambiente e a solução é agitada durante a noite. A solução acastanhada resultante é resfriada bruscamente por adição cuidadosa de solução saturada de NaHCO3 (40 ml) e extraída com DCM (4 x 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas so- bre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 1:1, Et3N a 0,5%) para produzir 40 (263 mg, 83%) como uma espuma branca.
[00463] Dados para 40: Rf = 0,53 (EtOAc/hexano 3:1):
[00464] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 13,11 (br, 1H, NH), 8,30 – 8,10 (m, 2H, H-arom), 7,47 – 7,29 (m, 5H, H-arom), 7,28 – 7,06 (m, 7H, H-arom), 7,00 (d, J = 0,8 Hz, 1H, H-C(6)), 6,74 (d, J = 8,6 Hz, 4H, H-arom), 5,89 (dd, J = 6,3, 4,6 Hz, 1H, H-C(1')), 4,61 (dd, J = 7,2, 4,5
Hz, 1H, H-C(4')), 4,33 – 4,20 (m, 1H, H-C(5')), 3,87 (br, 1H, H-C(7')), 3,69 (s, 6H, MeO), 2,32 – 2,13 (m, 2H, H-C(3'), OH), 1,99 (s, 3H, Me- C(5)), 1,87 – 1,73 (m, 2H, H-C(2'), H-C(6')), 1,66 – 1,47 (m, 2H, H- C(2'), H-C(6')). 13
[00465] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 179,61 (CONH), 159,76 (C(4)), 158,74 (MeO-C-arom), 147,87 (C(2)), 145,47 (C-arom), 137,17 (C(6)), 136,77, 136,68, 136,03 (C-arom), 132,55, 130,21, 129,98, 128,34, 128,21, 128,03, 127,07, 113,35 (CH-arom), 111,81 (C(5)), 88,74 (C(Ph)3), 87,13 (C(1')), 86,12 (C(4')), 78,17 (C(7')), 73,31 (C(5')), 55,35 (MeO-DMTr), 48,63 (C(3')), 40,35 (C(6')), 38,06 (C(2')), 13,78 (Me-C(5)).
[00466] ESI+-HRMS m/z calculado para C40H40O7N3 ([M + H]+) 674,2861, encontrado 674,2877. (3'S,5'R,7'R)-N4-Benzoil-1-{5'-O-[(2-cianoetóxi)-di- isopropilaminofosfanil]2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil}-5-metilcitosina (41)
[00467] A uma solução do nucleosídeo 40 (250 mg, 0,371 mmol) e 5-(etiltio)-1H-tetrazol (73 mg, 0,56 mmol) em DCM seco (8 ml) é adici- onado gota a gota 2-cianoetil N,N,N',N′-tetraisopropilfosforodiamidita (0,20 ml, 0,63 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação du- rante 30 min, a mistura de reação é diluída com DCM (30 ml) e lavada com NaHCO3 saturado (2 x 20 ml) e NaCl (20 ml) saturado. As fases aquosas são combinadas e extraídas com DCM (20 ml). As fases or- gânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 1:1, Et3N a 0,5%) para produzir 41 (260 mg, mistura de dois isômeros, 80%) como uma espuma branca.
[00468] Dados para 41: Rf = 0,57 (EtOAc/hexano 1:1):
[00469] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 13,26 (br, 1H, NH), 8,32 (d, J = 7,2 Hz, 2H, H-arom), 7,58 – 7,39 (m, 5H, H-arom), 7,38 – 7,14 (m, 8H, H-arom, H-C(6)), 6,88 – 6,77 (m, 4H, H-arom), 6,01, 5,96 (2dd, J = 6,3, 4,6 Hz, 1H, H-C(1')), 4,82, 4,74 (2dd, J = 7,3, 4,3 Hz, 1H, H-C(4')), 4,42 (td, J = 10,6, 6,0 Hz, 1H, H-C(5')), 3,97 (br, 1H, H-C(7')), 3,91 – 3,68 (m, 8H, MeO, OCH2CH2CN), 3,59 (dtd, J = 16,7, 6,7, 3,4 Hz, 2H, (Me2CH)2N)), 2,62 (dt, J = 15,5, 6,4 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 2,49 – 2,23 (m, 1H, H-C(3')), 2,11, 2,09 (2d, J = 0,5 Hz, 3H, Me-C(5)), 2,00 – 1,82 (m, 2H, H-C(6'), H-C(2')), 1,82 – 1,55 (m, 2H, H-C(6'), H-C(2')), 1,17 (dd, J = 16,3, 6,8 Hz, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00470] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 179,60 (CONH), 159,97 (C(4)), 158,76 (MeO-C-arom), 147,81, 147,70 (C(2)), 145,54 (C-arom), 137,34, 136,83 (C(6)), 136,77, 136,72, 136,65, 136,55 (C-arom), 132,45, 130,22, 130,20, 129,96, 128,34, 128,31, 128,18, 128,00, 127,04 (CH-arom), 117,89, 117,71 (OCH2CH2CN), 113,35 (CH-arom), 111,60, 111,36 (C(5)), 89,24, 89,01 (C(Ph)3), 87,16, 87,12 (C(1')), 85,78, 85,62 (JC,P = 4,3, 3,2 Hz, C(4')), 78,20, 77,98 (C(7')), 74,68, 74,37(JC,P = 13,4, 18,2 Hz, C(5')), 58,70, 58,44 (JC,P = 18,5, 20,0 Hz, (OCH2CH2CN)), 55,36, 55,33 (MeO-DMTr), 48,65, 48,44 (C(3')), 43,27, 43,14 (JC,P = 12,4, 12,3 Hz (Me2CH)2N), 39,87, 39,64 (JC,P = 3,4, 3,7 Hz (C(6')), 38,30, 38,22 (C(2')), 24,80, 24,72, 24,70, 24,67, 24,63 (Me2CH)2N), 20,39, 20,37 (JC,P = 7,2, 6,8 Hz, OCH2CH2CN), 13,72 (Me-C(5)).
[00471] RMN de 31P (121 MHz, CDCl3) δ 148,18, 147,96.
[00472] ESI+-HRMS m/z calculado para C49H57O8N5P ([M + H]+) 874,3939, encontrado 874,3946. (3'R,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'- didesóxi-3',5'-etano-α-D-ribofuranosil} adenina (42)
[00473] O nucleosídeo 15 (1,74 g, 2,64 mmol) é dissolvido em Na- OH a 0,15 M em THF/metanol/H2O (5:4:1, 80 ml) a 0 °C. A reação é agitada durante 20 min e bruscamente arrefecida pela adição de NH4Cl (1,06 g). Os solventes são, então, removidos sob pressão redu- zida e o produto purificado por CC (isopropanol a 5% em DCM) para render 42 (anômero α, 836 mg, 51%) e 16 (anômero β, 287 mg, 18%) como espumas brancas.
[00474] Dados para 42: Rf = 0,35 (MeOH a 5% em DCM):
[00475] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,34 (s, 1H, NH), 8,71 (s, 1H, H-C(2)), 8,02 (d, J = 7,4 Hz, 2H, H-arom)), 7,92 (s, 1H, H-C(8)), 7,68 – 7,58 (m, 4H, H-arom), 7,58 – 7,31 (m, 9H, H-arom), 6,23 (dd, J = 6,7, 2,4 Hz, 1H, H-C(1')), 4,74 (dd, J = 6,6, 4,9 Hz, 1H, H-C(4')), 4,49 (dt, J = 12,5, 6,3 Hz, 1H, H-C(5')), 4,10 (br, 1H, H-C(7')), 3,07 (d, J = 6,7 Hz, 1H, OH), 2,92 (dd, J = 15,4, 7,3 Hz, 1H, H-C(3')), 2,52 – 2,35 (m, 1H, H-C(2')), 2,10 – 1,97 (m, 1H, H-C(6')), 1,94 – 1,77 (m, 2H, H- C(2'), H-C(6')), 1,06 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00476] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 164,98 (CONH), 152,65 (C(2)), 151,31 (C(4)), 149,69 (C(6)), 140,93 (C(8)), 135,74 (CH-arom), 133,82, 133,68, 133,39 (C-arom), 132,77, 130,02, 129,98, 128,76, 128,06, 127,87, 127,85 (CH-arom), 123,38 (C(5)), 87,16 (C(1')), 85,35 (C(4')), 77,40 (C(7')), 72,79 (C(5')), 50,63 (C(3')), 40,86 (C(6')), 37,25 (C(2')), 26,94 ((CH3)3-C-Si), 19,05 ((CH3)3-C-Si).
[00477] ESI+-HRMS m/z calculado para C35H38O4N5Si ([M + H]+) 620,2688, encontrado 620,2671. (3'R,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{5'-O-acetil-7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]- 2',3'-didesóxi-3',5'-etano-α-D-ribofuranosil} adenina (43)
[00478] A uma solução do nucleosídeo 42 (1,09 g, 1,75 mmol) e 4- dimetilaminopiridina (321 mg, 2,63 mmol) em DCM seco (50 ml), é adi- cionado anidrido acético (0,83 ml, 8,8 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação durante a noite, a reação é bruscamente arrefecida por adição de NaHCO3 saturado (50 ml). As fases são separadas e a fase aquosa é posteriormente extraída com DCM (2 x 80 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evapora- das. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 2,5% em DCM) pa- ra render 43 (1,04 g, 90%) como uma espuma branca.
[00479] Dados para 43: Rf = 0,33 (EtOAc/hexano 4:1):
[00480] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,99 (br, 1H, NH), 8,73 (s, 1H, H-C(2)), 8,09 – 7,99 (m, 2H, H-arom), 7,98 (s, 1H, H-C(8)), 7,70 – 7,58 (m, 5H, H-arom), 7,57 – 7,48 (m, 2H, H-arom), 7,47 – 7,34 (m, 6H, H-arom), 6,22 (dd, J = 6,8, 3,2 Hz, 1H, H-C(1')), 5,45 – 5,35 (m, 1H, H-C(5')), 5,01 (dd, J = 6,7, 5,0 Hz, 1H, H-C(4')), 4,09 (d, J = 4,1 Hz, 1H, H-C(7')), 3,02 (dt, J = 9,5, 6,5 Hz, 1H, H-C(3')), 2,55 (ddd, J = 13,5, 10,0, 3,2 Hz, 1H, H-C(2')), 2,15 (dd, J = 13,2, 6,2 Hz, 1H, H-C(6')), 2,09 (s, 3H, MeCO2), 2,01 (dt, J = 8,0, 3,5 Hz, 1H, H-C(2')), 1,88 (dt, J = 13,6, 5,3 Hz, 1H, H-C(6')), 1,08 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00481] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 170,61 (MeCO2), 164,75 (CONH), 152,67 (C(2)), 151,37 (C(4)), 149,64 (C(6)), 141,41 (C(8)), 135,85 (CH-arom), 133,71, 133,38 (C-arom), 132,91, 130,15, 130,10, 128,99, 128,02, 127,99, 127,97 (CH-arom), 123,64 (C(5)), 87,37 (C(1')), 83,37 (C(4')), 76,63 (C(7')), 74,51 (C(5')), 51,19 (C(3')), 37,44 (C(2')), 37,32 (C(6')), 27,01 ((CH3)3-C-Si), 21,08 (MeCO2), 19,14 ((CH3)3-C-Si).
[00482] ESI+-HRMS m/z calculado para C37H40O5N5Si ([M + H]+)
662,2793, encontrado 662,2787. (3'S,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{5'-O-acetil-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'- hidróxi-α-D-ribofuranosil} adenina (44)
[00483] A uma solução do nucleosídeo 43 (990 mg, 1,50 mmol) em THF seco (50 ml), é adicionado TBAF (1 M em THF, 3,0 ml, 3,0 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação durante 3,5 horas à temperatu- ra ambiente, a solução é diluída com EtOAc (30 ml) e o THF é removi- do sob pressão reduzida. A mistura é, em seguida, diluída com NaHCO3 saturado (50 ml) e extraída com DCM (4 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evapora- das. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 6% em DCM) para produzir 44 (570 mg, 90%) como uma espuma branca, contendo tra- ços de TBAF.
[00484] Dados para 44: Rf = 0,33 (MeOH a 10% em DCM):
[00485] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 9,60 (br, 1H, NH), 8,67 (s, 1H, H-C(2)), 8,09 (s, 1H, H-C(8)), 7,96 (d, J = 7,4 Hz, 2H, H-arom), 7,51 (t, J = 7,4 Hz, 1H, H-arom), 7,42 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H-arom), 6,33 (dd, J = 6,7, 3,1 Hz, 1H, H-C(1')), 5,25 (ddd, J = 9,7, 6,4, 5,3 Hz, 1H, H- C(5')), 4,92 (dd, J = 6,4, 5,4 Hz, 1H, H-C(1')), 4,14 (br, 2H, H-C(7'), OH), 3,06 (dd, J = 16,0, 6,6 Hz, 1H, H-C(3')), 2,87 (ddd, J = 13,2, 9,9, 3,0 Hz, 1H, H-C(2')), 2,26 – 2,17 (m, 1H, H-C2')), 2,10 – 1,98 (m, 5H, H-C(6'), MeCO2). 13
[00486] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 170,64 (MeCO2), 165,27 (CONH), 152,49 (C(2)), 151,26 (C(4)), 149,58 (C(6)), 141,64 (C(8)), 133,60 (C-arom), 132,82, 128,76, 128,06 (CH-arom), 123,30 (C(5)), 87,30 (C(1')), 83,17 (C(4')), 74,67 (C(7')), 74,20 (C(5')), 50,41 (C(3')), 37,43 (C(2')), 36,92 (C(6')), 20,96 (MeCO2).
[00487] ESI+-HRMS m/z calculado para C21H22O5N5 ([M + H]+) 424,1615, encontrado 424,1623. (3'S,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{5'-O-acetil-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'- O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil} adenina (45)
[00488] A uma solução de nucleosídeo 44 (570 mg, 1,35 mmol) em piridina seca (16 ml), é adicionado DMTr-Cl (1,37 g, 4,04 mmol) à tem- peratura ambiente. A solução é agitada durante 1 dia e, em seguida, é diluída com saturada de NaHCO3 (100 ml) e extraída com DCM (3 X 80 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtra- das e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 2% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 45 (876 mg, 89%) como uma es- puma amarela.
[00489] Dados para 45: Rf = 0,81 (MeOH a 5% em DCM):
[00490] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,42 (d, J = 14,6 Hz, 1H, NH), 8,73 (s, 1H, H-C(2)), 8,03 (d, J = 7,6 Hz, 2H, H-arom), 7,93 (s, 1H, H-C(8)), 7,66 – 7,55 (m, 1H, H-arom), 7,55 – 7,45 (m, 4H, H-arom), 7,45 – 7,22 (m, 7H, H-arom), 6,87 (d, J = 8,7 Hz, 4H, H-arom), 6,25 (dd, J = 6,6, 2,4 Hz, 1H, H-C(1')), 5,47 – 5,33 (m, 1H, H-C(5')), 4,89 (dd, J = 6,7, 4,9 Hz, 1H, H-C(4')), 4,02 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H-C(7')), 3,79 (s, 6H, MeO), 2,58 (dd, J = 16,0, 6,9 Hz, 1H, H-C(3')), 2,38 (ddd, J = 12,7, 10,0, 2,4 Hz, 1H, H-C(2')), 2,11 (s, 3H, MeCO2), 2,09 – 1,87 (m, 3H, H-C(2'), H-C(6')). 13
[00491] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 170,40 (MeCO2), 164,84 (CONH), 158,66 (MeO-C-arom), 152,45 (C(2)), 151,22 (C(4)), 149,51 (C(6)), 145,23 (C-arom), 141,23 (C(8)), 136,51, 133,65 (C-arom), 132,68, 130,12, 128,75, 128,33, 127,95, 127,90, 127,03 (CH-arom), 123,55 (C(5)), 113,27 (CH-arom), 87,19 (C(Ph)3), 87,12 (C(1')), 83,25
(C(4')), 77,16 (C(7')), 74,41 (C(5')), 55,23 (MeO-DMTr), 49,23 (C(3')), 37,61 (C(2')), 36,22 (C(6')), 20,98 (MeCO2).
[00492] ESI+-HRMS m/z calculado para C42H40O7N5 ([M + H]+) 726,2922, encontrado 726,2905. (3'S,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil} adenina (46)
[00493] O nucleosídeo 45 (870 mg, 1,20 mmol) é dissolvido em NaOH a 0,1 M em THF/metanol/H2O (5:4:1, 50 ml) a 0 °C. A reação é agitada durante 30 min a 0 °C e então bruscamente arrefecida pela adição de NH4Cl (321 mg). A solução é diluída com NaHCO3 saturado (100 ml) e extraída com DCM (4 x 80 ml). As fases orgânicas combi- nadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bru- to é purificado por CC (MeOH a 3% em DCM, Et3N a 0,5%) para pro- duzir 46 (777 mg, 94%) como uma espuma branca.
[00494] Dados para 46: Rf = 0,26 (MeOH a 5% em DCM):
[00495] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,39 (s, 1H, NH), 8,61 (s, 1H, H-C(2)), 7,93 (d, J = 7,4 Hz, 2H, H-arom), 7,75 (s, 1H, H-C(8)), 7,46 (t, J = 7,3 Hz, 1H, H-arom), 7,40 – 7,31 (m, 4H, H-arom), 7,29 – 7,16 (m, 6H, H-arom), 7,11 (t, J = 7,2 Hz, 1H, H-arom), 6,73 (d, J = 8,7 Hz, 4H, H-arom), 6,12 (dd, J = 6,5, 1,9 Hz, 1H, H-C(1')), 4,53 (dd, J = 7,5, 4,5 Hz, 1H, H-C(4')), 4,32 (br, 1H, H-C(5')), 3,90 (t, J = 4,5 Hz, 1H, H-C(7')), 3,66, 3,65 (2s, 6H, MeO), 3,31 (br, 1H, OH), 2,36 (dd, J = 16,5, 8,1 Hz, 1H, H-C(3')), 2,04 (ddd, J = 12,0, 9,9, 2,0 Hz, 1H, H- C(2')), 1,92 – 1,69 (m, 3H, H-C(2'), H-C(6')). 13
[00496] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 164,92 (CONH), 158,64 (MeO-C-arom), 152,60 (C(2)), 151,28 (C(4)), 149,61 (C(6)), 145,44 (C- arom), 140,71 (C(8)), 136,77, 133,65 (C-arom), 132,72, 130,15,
130,12, 128,73, 128,39, 128,04, 127,96, 127,02 (CH-arom), 123,27 (C(5)), 113,28 (CH-arom), 87,11 (C(1')), 87,01 (C(Ph)3), 85,60 (C(4')), 78,16 (C(7')), 72,72 (C(5')), 55,28 (MeO-DMTr), 48,89 (C(3')), 39,93 (C(6')), 37,55 (C(2')).
[00497] ESI+-HRMS m/z calculado para C40H38O6N5 ([M + H]+) 684,2817, encontrado 684,2800. (3'S,5'R,7'R)-N6-Benzoil-9-{5'-O-[(2-cianoetóxi)-di- isopropilaminofosfanil]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil} adenina (47)
[00498] A uma solução do nucleosídeo 46 (199 mg, 0,290 mmol) e 5-(etiltio)-1H-tetrazol (57 mg, 0,44 mmol) em DCM seco (7 ml), é adici- onado gota a gota 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita (0,16 ml, 0,49 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação du- rante 60 min, a mistura de reação é diluída com NaHCO3 saturado (20 ml) e extraída com DCM (3 X 20 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é pu- rificado por CC (EtOAc, Et3N a 0,5%) para produzir 47 (197 mg, mistu- ra de dois isômeros, 77%) como uma espuma branca.
[00499] Dados para 47: Rf = 0,75 (MeOH a 5% em DCM):
[00500] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,98 (br, 1H, NH), 8,68, 8,67 (2s, 1H, C(2)), 7,94 (d, J = 7,6 Hz, 2H, H-arom), 7,90, 7,84 (2s, 1H, C(8)), 7,56 – 7,49 (m, 1H, H-arom), 7,48 – 7,34 (m, 4H, H-arom), 7,30 – 7,10 (m, 7H, H-arom), 6,80 – 6,69 (m, 4H, Harom), 6,21, 6,15 (2dd, J = 6,8, 2,2 Hz, 1H, H-C(1')), 4,69, 4,59 (2dd, J = 7,3, 4,5 Hz, 1H, H-C(4')), 4,44 (tt, J = 12,3, 6,3 Hz, 1H, H-C(5')), 3,90 (dd, J = 9,0, 3,8 Hz, 1H, H-C(5')), 3,82 – 3,63 (m, 8H, MeO, OCH2CH2CN), 3,59 – 3,43
(m, 2H, (Me2CH)2N), 2,61 – 2,49 (m, 2H, OCH2CH2CN), 2,47 – 2,07 (m, 2H, H-C(3'), H-C(2')), 1,98 – 1,66 (m, 3H, H-C(2'), H-C(6')), 1,15 – 1,03 (m, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00501] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 164,67 (CONH), 158,77 (MeO-C-arom), 152,58 (C(2)), 151,34, 151,29 (C(4)), 149,46 (C(6)), 145,55, 145,54 (C-arom), 141,58, 141,50 (C(8)), 136,87, 136,85, 136,84, 133,85 (C-arom), 132,85, 130,26, 130,23, 130,20, 128,97, 128,47, 128,43, 128,02, 127,96, 127,08 (CH-arom), 123,62, 123,58 (C(5)), 117,91, 117,70 (OCH2CH2CN), 113,37 (CH-arom), 87,80, 87,67 (C(1')), 87,20, 87,14 (C(Ph)3), 85,29, 85,22 ((JC,P = 4,2, 3,1 Hz, C(4')), 78,16, 77,96 (C(7')), 74,28, 73,98 (JC,P = 14,8, 18,4 Hz, C(5')), 58,80, 58,61 (JC,P = 16,2, 17,3 Hz OCH2CH2CN), 55,37, 55,35 (MeO-DMTr), 49,02, 48,91 (C(3')), 43,29, 43,16 (JC,P = 8,9, 9,0 Hz, ((Me2CH)2N), 39,09 (C(6')), 37,99, 37,95 (C(2')), 24,82, 24,77, 24,74, 24,70, 24,64 ((Me2CH)2N), 20,43, 20,42 (JC,P = 1,4, 1,9 Hz, OCH2CH2CN).
[00502] RMN de 31P (121 MHz, CDCl3) δ 148,14, 148,11.
[00503] ESI+-HRMS m/z calculado para C45H56O7N8P ([M + H]+) 884,3895, encontrado 884,3904. (3'R,5'R,7'R)-2-Amino-6-cloro-9-{7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]-2',3'- didesóxi-3',5'-etano-α-D-ribofuranosil} purina (48)
[00504] O nucleosídeo 20 (1,78 g, 3,01 mmol) é dissolvido em Na- OH a 0,5 M em THF/metanol/H2O (5:4:1, 15 ml) a 0 °C. A reação é agi- tada durante 20 min a 0 °C e é bruscamente arrefecida pela adição de NH4Cl (484 mg). A suspensão é, em seguida, diluída com NaHCO3 saturado (100 ml) e extraída com DCM (4 x 75 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produ- to bruto é purificado por CC (MeOH a 3% em DCM) para produzir 48
(anômero α, 992 mg, 60%) e 21 (anômero β, 428 mg, 25%) como es- pumas brancas.
[00505] Dados para 48: Rf = 0,34 (MeOH a 5% em DCM):
[00506] RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,71 – 7,60 (m, 5H, H- arom, H-(C(8)), 7,49 – 7,34 (m, 6H, H-arom), 6,08 (dd, J = 6,9, 2,6 Hz, 1H, H-C(1')), 5,26 (s, 2H, NH2), 4,70 (dd, J = 7,5, 4,8 Hz, 1H, H-C(4')), 4,47 (dt, J = 10,0, 5,1 Hz, 1H, H-C(5')), 4,11 (t, J = 3,3 Hz, 1H, H-C(7')), 2,87 (dd, J = 16,5, 7,7 Hz, 1H, H-C(3')), 2,57 (br, 1H, OH), 2,27 (ddd, J = 14,0, 9,9, 2,6 Hz, 1H, H-C(2')), 2,10 – 2,01 (m, 1H, H-C(6')), 1,92 – 1,76 (m, 2H, H-C(2'), H-C(6')), 1,06 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00507] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 159,09 (C(2)), 153,05 (C(4)), 151,46 (C(6)), 139,91 (C(8)), 135,71 (CH-arom), 133,96, 133,27 (C-arom), 130,00, 129,96, 127,86, 127,83 (CH-arom), 125,52 (C(5)), 86,46 (C(1')), 84,92 (C(4')), 77,40 (C(7')), 72,63 (C(5')), 50,55 (C(3')), 40,92 (C(6')), 36,78 (C(2')), 26,88 ((CH3)3-C-Si), 19,01 ((CH3)3-C-Si).
[00508] ESI+-HRMS m/z calculado para C28H33O3N5ClSi ([M + H]+) 550,2036, encontrado 550,2019. (3'R,5'R,7'R)-9-{7'-[(terc-Butildifenilsilil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'- etano-α-D-ribofuranosil} guanina (49)
[00509] A uma solução do nucleosídeo 48 (610 mg, 1,03 mmol) em DCM seco (15 ml), são adicionados 3-hidroxipropionitrila (0,28 ml, 4,12 mmol) seguida por 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (287 mg, 2,06 mmol) à temperatura ambiente. Após 4 horas de agitação à temperatu- ra ambiente, uma segunda porção de 3-hidroxipropionitrila (0,28 ml, 3,23 mmol) seguida por 1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno (287 mg, 2,06 mmol) são adicionados. A reação é adicionalmente agitada du- rante 2 dias e, em seguida, é diretamente purificada por CC (MeOH a
10% em DCM) para produzir 49 (500 mg, 87%) como espuma branca.
[00510] Dados para 49: Rf = 0,30 (MeOH a 10% em DCM):
[00511] RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ 7,73 – 7,61 (m, 5H, H- arom, H-C(8)), 7,53 – 7,32 (m, 6H, H-arom), 6,06 (dd, J = 6,9, 3,7 Hz, 1H, H-C(1')), 4,74 (dd, J = 7,0, 4,6 Hz, 1H, H-C(4')), 4,46 – 4,36 (m, 1H, H-C(5')), 4,11 (br, 1H, H-C(7')), 2,91 (dd, J = 16,2, 6,6 Hz, 1H, H- C(3')), 2,31 (ddd, J = 13,8, 10,0, 3,7 Hz, 1H, H-C(2')), 1,98 – 1,78 (m, 3H, H-C(2'), H-C(3')), 1,07 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00512] RMN de C (101 MHz, MeOD) δ 159,30 (C(2)), 155,14 (C(6)), 152,38 (C(4)), 137,28 (C(8)), 136,93, 136,88 (CH-arom), 135,13, 134,78 (C-arom), 131,07, 131,06, 128,91, 128,89 (CH-arom), 117,98 (C(5)), 87,72 (C(1')), 86,25 (C(4')), 79,21, (C(7')) 73,87 (C(5')), 52,13 (C(3')), 41,44 (C(6')), 38,35 (C(2')), 27,42 ((CH3)3-C-Si), 19,82 ((CH3)3-C-Si)).
[00513] ESI+-HRMS m/z calculado para C28H34O4N5Si ([M + H]+) 532,2386, encontrado 532,2367. (3'R,5'R,7'R)-N2-Acetil-9-{5'-O-acetil-7'-[(terc-butildifenilsilil)óxi]- 2',3'-didesóxi-3',5'-etano-α-D-ribofuranosil} guanina (50)
[00514] A uma solução de nucleosídeo 49 (500 mg, 0,940 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (276 mg, 2,4 mmol) em DCM seco (15 ml), é adicionado anidrido acético (1,0 ml, 10,3 mmol) à temperatura ambien- te. Depois de agitação durante 2 dias, a reação é bruscamente arrefe- cida por adição de NaHCO3 saturado (30 ml). A mistura é, então, ex- traída com DCM (3 x 30 ml). As fases orgânicas combinadas são se- cas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 3,5% em DCM) para produzir 50 (441 mg, 76%) co-
mo espuma branca.
[00515] Dados para 50: Rf = 0,62 (MeOH a 10% em DCM):
[00516] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 12,11 (br, 1H, NH-C(4)), 9,94 (br, 1H, H-N(1)), 7,62 (d, J = 6,7 Hz, 5H, H-arom, H-C(8)), 7,46 – 7,31 (m, 6H, H-arom), 6,03 (dd, J = 6,7, 2,7 Hz, 1H, H-C(1')), 5,31 (dt, J = 10,3, 5,2 Hz, 1H, H-(C5')), 4,99 – 4,81 (m, 1H, H-C(4')), 4,02 (d, J = 3,8 Hz, 1H, H-C(7')), 2,88 (dd, J = 16,0, 6,6 Hz, 1H, H-C(3')), 2,44 – 2,20 (m, 4H, MeCONH, H-C(2')), 2,12 – 1,73 (m, 6H, MeCO2, H-C(6'), H-C(2')), 1,04 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00517] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 172,73 (MeCONH), 170,46 (MeCO2), 155,87 (C(6)), 148,09 (C(4)), 147,47 (C(2)), 137,13 (C(8)), 135,74 (CH-arom), 133,62, 133,29 (C-arom), 130,13, 130,09, 127,96, 127,93 (CH-arom), 121,54 (C(5)), 86,47 (C(1')), 82,81 (C(4')), 76,60 (C(7')), 74,37 (C(5')), 51,23 (C(3')), 37,04, 37,01, (C(2'), C(6')) 26,92 ((CH3)3-C-Si), 24,46 (MeCONH), 21,00 (MeCO2), 19,05 ((CH3)3-C-Si).
[00518] ESI+-HRMS m/z calculado para C32H38O6N5Si ([M + H]+) 616,2586, encontrado 616,2580. (3'S,5'R,7'R)-N2-Acetil-9-{5'-O-acetil-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'- hidróxi-α-D-ribofuranosil} guanina (51)
[00519] A uma solução de nucleosídeo 50 (440 mg, 0,714 mmol) em THF seco (5 ml), é adicionado TBAF (1 M em THF, 1,1 ml, 1,1 mmol) à temperatura ambiente. A solução é agitada durante 4 horas à temperatura ambiente e, em seguida, é diretamente purificada por CC (MeOH a 13% em DCM) para produzir 51 (235 mg, 87%) como uma espuma branca. Cristais apropriados para análise de raios-X são obti-
dos por recristalização a partir de uma mistura de H2O/MeOH.
[00520] Dados para 51: Rf = 0,25 (MeOH a 13% em DCM):
[00521] RMN de 1H (300 MHz, MeOD) δ 8,03 (s, 1H, H-C(8)), 6,28 (dd, J = 7,0, 3,8 Hz, 1H, H-C(1')), 5,21 (ddd, J = 9,2, 6,8, 5,1 Hz, 1H, H- C(5')), 4,98 (dd, J = 6,7, 5,0 Hz, 1H, H-(4')), 4,13 – 4,05 (m, 1H, H- C(7')), 3,17 – 3,05 (m, 1H, H-C(3')), 2,86 (ddd, J = 13,8, 10,0, 3,8 Hz, 1H, H-C(2')), 2,39 – 2,27 (m, 1H, H-C(2')), 2,24 (s, 3H, MeCONH), 2,16 – 2,00 (m, 5H, MeCO2, H-C(6')). 13
[00522] RMN de C (101 MHz, MeOD) δ 174,95 (MeCONH), 172,32 (MeCO2), 157,50 (C(6)), 149,96 (C(4)), 149,38 (C(2)), 139,66 (C(8)), 121,76 (C(5)), 88,23 (C(1')), 84,23 (C(4')), 75,83 (C(5'), C(7')), 51,65 (C(3')), 38,04, 37,93 (C(2'), C(6')), 23,83 (MeCONH), 20,71 (Me- CO2).
[00523] ESI+-HRMS m/z calculado para C16H20O6N5 ([M + H]+) 378,1408, encontrado 378,1419. (3'S,5'R,7'R)-N2-Acetil-9-{5'-O-acetil-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O- [(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil} guanina (52)
[00524] A uma solução do nucleosídeo 51 (186 mg, 0,492 mmol) em piridina seca (10 ml), é adicionado DMTr-Cl (501 mg, 1,48 mmol) à temperatura ambiente. A solução é agitada durante 2 dias e, em se- guida, é diluída com saturada de NaHCO3 (40 ml) e extraída com DCM (3 X 30 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 3% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 52 (333 mg, 99%) como uma espuma amarela.
[00525] Dados para 52: Rf = 0,56 (MeOH a 10% em DCM):
[00526] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 12,05 (br, 1H, NH-C(4)), 9,90 (br, 1H, H-N(1)), 7,40 (s, 1H, H-C(8)), 7,38 – 7,31 (m, 2H, H- arom), 7,28 – 7,08 (m, 7H, H-arom), 6,75 (dd, J = 9,0, 2,7 Hz, 4H, H- arom), 5,95 – 5,85 (m, 1H, H-C(1')), 5,30 – 5,10 (m, 1H, H-C(5')), 4,70 – 4,58 (m, 1H, H-C(4')), 3,81 (br, 1H, H-C(7')), 3,68, 3,68 (2s, 6H, MeO), 2,25 – 2,07 (m, 5H, MeCONH, H-C(3'), H-C(2')), 1,96 – 1,79 (m, 5H, MeCO2, H-C(2'), H-C(6')), 1,74 – 1,59 (m, 1H, H-C(6')). 13
[00527] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 172,65 (MeCONH), 170,42 (MeCO2), 158,73, 158,70 (MeO-C-arom), 155,86 (C(6)), 147,96 (C(4)), 147,43 (C(2)), 145,31 (C-arom), 137,17 (C(8)), 136,69, 136,44 (C- arom), 130,32, 130,21, 128,29, 128,05, 127,09 (CH-arom), 121,53 (C(5)), 113,38, 113,35 (CH-arom), 87,25 (C(Ph)3), 86,73 (C(1')), 82,77 (C(4')), 77,19 (C(7')), 74,37 (C(5')), 55,38 (MeO-DMTr), 49,28 (C(3')), 37,25 (C(2')), 36,06 (C(6')), 24,40 (MeCONH), 21,01 (MeCO2).
[00528] ESI+-HRMS m/z calculado para C37H38O8N5 ([M + H]+) 680,2715, encontrado 680,2718 (3'S,5'R,7'R)-N2-(N,N-Dimetilformamidino)-9-{2',3'-didesóxi-3',5'- etano-7'-O-[(4,4'-dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil} guanina (53)
[00529] A uma solução do nucleosídeo 52 (333 mg, 0,490 mmol) em MeOH seco (10 ml), é adicionado K2CO3 (305 mg, 2,20 mmol) à temperatura ambiente. A suspensão é agitada durante 7 h à tempera- tura ambiente, em seguida, NH4Cl (78 mg, 1,46 mmol) é adicionado e a mistura resultante é filtrada através de uma pequena almofada de SiO2. O SiO2 é lavada com MeOH adicional e, em seguida, o solvente é evaporado.
[00530] O produto bruto é dissolvido em DMF seco (10 ml) e N,N- dimetilformamida dimetil acetal (0,33 ml, 2,5 mmol) é adicionado. A solução é agitada durante 2 horas a 55 °C e, em seguida, os solventes são removidos sob pressão reduzida. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 7% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 53 (245 mg, 77%) como uma espuma branca contendo vestígios de Et3N.
[00531] Dados para 53: Rf = 0,32 (MeOH a 12% em DCM):
[00532] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,75 (br, 1H, H-N(1)), 8,25 (s, 1H, NCHN(CH3)2), 7,37 (d, J = 7,3 Hz, 2H, H-arom), 7,29 – 7,08 (m, 8H, H-arom, H-C(8)), 6,74 (d, J = 8,1 Hz, 4H, H-arom), 6,03 (dd, J = 6,7, 2,8 Hz, 1H, H-C(1')), 4,57 (dd, J = 7,5, 4,6 Hz, 1H, H-C(4')), 4,37 – 4,26 (m, 1H, H-C(5')), 3,89 (t, J = 3,9 Hz, 1H, H-C(7')), 3,67, 3,67 (2s, 6H, MeO), 3,24 (br, 1H, OH), 2,94 (s, 3H, NCHN(CH3)2), 2,87 (s, 3H, NCHN(CH3)2), 2,35 (dd, J = 15,9, 7,6 Hz, 1H, H-C(3')), 1,94 – 1,68 (m, 4H, H-C(2'), H-C(6')). 13
[00533] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 158,61 (MeO-C-arom), 158,28 (C(2)), 157,92 (NCHN(CH3)2), 156,69 (C(6)), 149,90 (C(4)), 145,52, 136,86, 136,77 (C-arom), 135,50 (C(8)), 130,15, 128,32, 127,92, 126,95 (CH-arom), 120,27 (C(5)), 113,24 (CH-arom), 86,92 (C(Ph)3), 85,57 (C(1')), 85,12 (C(4')), 78,31 (C(7')), 72,69 (C(5')), 55,28 (MeO-DMTr), 49,28 (C(3')), 41,38 (NCHN(CH3)2), 39,77 (C(6')), 37,58 (C(2')), 35,04 (NCHN(CH3)2).
[00534] ESI+-HRMS m/z calculado para C36H39O6N6 ([M + H]+) 651,2926, encontrado 651,2921. (3'S,5'R,7'R)-N2-(N,N-Dimetilformamidino)-9-{5'-O-[(2-cianoetóxi)- di-isopropilaminofosfanil]-2',3'-didesóxi-3',5'-etano-7'-O-[(4,4'- dimetoxitrifenil)metil]-α-D-ribofuranosil} guanina (54)
[00535] A uma solução do nucleosídeo 53 (245 mg, 0,377 mmol) e 5-(etiltio)-1H-tetrazol (74 mg, 0,57 mmol) em DCM seco (15 ml), é adi- cionado gota a gota 2-cianoetil N,N,N',N′-tetraisopropilfosforodiamidita (0,20 ml, 0,64 mmol) à temperatura ambiente. Depois de agitação du- rante 50 min, a mistura de reação é diluída com NaHCO3 saturado (25 ml) e extraída com DCM (3 X 25 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é pu- rificado por CC (MeOH a 3% em DCM, Et3N a 0,5%) para produzir 54 (212 mg, mistura de dois isômeros, 67%) como uma espuma branca.
[00536] Dados para 54: Rf = 0,42 (MeOH a 7% em DCM):
[00537] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,35 (br, 1H, H-N(1)), 8,51, 8,49 (2s, 1H, NCHN(CH3)2), 7,41 – 7,10 (m, 10H, H-arom, H-C(8)), 6,83 – 6,70 (m, 4H, H-arom), 6,15 – 6,00 (m, 1H, H-C(1')), 4,64 – 4,36 (m, 2H, H-C(4'), H-C(5')), 3,90 – 3,82 (m, 1H, H-C(7')), 3,80 – 3,62 (m, 8H, MeO, OCH2CH2CN), 3,59 – 3,43 (m, 2H, (Me2CH)2N), 3,04, 3,02 (2s, 6H, NCHN(CH3)2), 2,67 – 2,48 (m, 2H, OCH2CH2CN), 2,32 (ddd, J = 24,1, 15,1, 6,7 Hz, 1H, H-C(3')), 2,02 – 1,63 (m, 4H, H-C(2'), H-C(6')), 1,14 – 1,03 (m, 12H, (Me2CH)2N). 13
[00538] RMN de C (101 MHz, CDCl3) δ 158,76 (MeO-C-arom), 158,17, 158,12 (C(2)), 158,03 (NCHN(CH3)2), 156,66, 156,59 (C(6)), 149,85, 149,79 (C(4)), 145,51, 145,49, 136,84, 136,77, 136,73, 136,71 (C-arom), 135,76, 135,59 (C(8)), 130,24, 130,20, 128,41, 128,33, 128,02, 127,10, 127,08 (CH-arom), 120,74, 120,70 (C(5)), 117,98, 117,72 (OCH2CH2CN), 113,34 (CH-arom), 87,16, 87,10 (C(Ph)3), 86,00, 85,72 (C(1')), 84,13, 84,10 (JC,P = 3,6, 2,5 Hz, C(4')), 78,02,
77,67 (C(7')), 74,15, 73,74 (JC,P = 15,3, 18,7 Hz, C(5')), 58,90, 58,67 (JC,P = 18,7, 19,7 Hz OCH2CH2CN), 55,38, 55,36 (MeO-DMTr), 49,20, 49,09 (C(3')), 43,20, 43,15 (JC,P = 12,4, 12,6 Hz, ((Me2CH)2N), 41,42, 41,38 (NCHN(CH3)2), 38,68, 38,65 (C(6')), 37,97, 37,84 (C(2')), 35,25 (NCHN(CH3)2), 24,83, 24,75, 24,68, 24,60, 24,53 ((Me2CH)2N), 20,35, 20,28 (OCH2CH2CN).
[00539] RMN de 31P (121 MHz, CDCl3) δ 148,21, 148,01.
[00540] ESI+-HRMS m/z calculado para C45H56O7N8P ([M + H]+) 851,4004, encontrado 851,4013. (3aR,4R,6R,6aS)-4-((Terc-butildifenilsilil)óxi)-2-metóxi-hexahidro- 2H-ciclopenta[b]furan-6-il (4-nitrobenzoato) (55)
[00541] A uma solução do açúcar 6 (195 mg, 0,437 mmol) e 4- dimetilaminopiridina (70 mg, 0,568 mmol) em DCM seco (10 ml), é adi- cionado cloreto de 4-nitrobenzoíla (158 mg, 0,850 mmol) à temperatu- ra ambiente. Depois de agitação durante a noite, a reação é brusca- mente arrefecida por adição lenta de NaHCO3 saturado (3 ml). A mis- tura é, então, diluída com NaHCO3 saturado (15 ml) e extraída com DCM (3 x 15 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (EtOAc/hexano 1:5) para produzir uma mistura de 55 (260 mg, 98%) em uma razão anomérica α/β aproximadamente 4:1 como um sólido branco.
[00542] Dados para 55: Rf = 0,62 (EtOAc/hexano 1:2):
[00543] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,33 – 8,17 (m, 4H, H- arom), 7,72 – 7,61 (m, 4H, H-arom), 7,51 – 7,32 (m, 6H, H-arom), 5,65 – 5,47 (m, 1H, H-C(6)), 4,97 (dd, J = 9,2, 5,6 Hz, 1H, H-C(2)), 4,87 (t, J
= 5,8 Hz, 1H, H-C(6a)), 4,18 (d, J = 5,0 Hz, 0,2H, H-C(4)), 3,98 (d, J = 3,5 Hz, 0,8H, H-C(4)), 3,21 (d, J = 15,1 Hz, 3H, MeO), 2,88 (dd, J = 16,6, 7,9 Hz, 0,8H, H-C(3a)), 2,75 – 2,62 (m, 0,2H, H-C(3a)), 2,49 – 2,34 (m, 0,2H, H-C(5)), 2,24 – 1,83 (m, 2,8H, H-(5), H-C(3)), 1,28 (ddd, J = 13,0, 7,9, 4,9 Hz, 1H, H-C(3)), 1,09 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00544] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 164,46, 164,41 (CO2R), 150,63 (O2N-C-arom), 135,87, 135,82 (CH-arom), 134,07, 133,75, 133,69 (CH-arom), 130,98, 130,89, 129,98, 129,96, 129,91, 127,89, 127,87, 127,85, 123,59 (CH-arom), 106,49, 106,39 (C(2)), 83,21, 79,87 (C(6a)), 76,54 (C(4)), 76,09 (C(6)), 54,55, 54,47 (MeO), 51,69, 50,30 (C(3a), 38,07 (C(3)), 37,17, 36,65 (C(5)), 27,04, 26,99 90 ((CH3)3-C- Si), 19,14 ((CH3)3-C-Si).
[00545] ESI+-HRMS m/z calculado para C31H35O7NaSi ([M + Na]+) 584,2075, encontrado 584,2085. (3'R,5'R,7'R)-1-{7'-[(terc-Butildifenilsilil)óxi]-2',3'-didesóxi-3',5'- etano-5'-O-(4-nitrobenzoato)-α,β-D-ribofuranosil} timina (56)
[00546] A uma solução do açúcar 55 (260 mg, 0,463 mmol) e timina (84 mg, 0,695 mmol) em MeCN seco (3 ml), é adicionado gota a gota BSA (0,34 ml, 1,4 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação por 30 min à temperatura ambiente, a solução é resfriada até 0 °C e TMSOTf (0,10 ml, 1,3 mmol) é adicionado gota a gota. Depois de agi- tação durante mais 2 h a 0 °C e durante 18 h à temperatura ambiente, a mistura de reação é diluída com NaHCO3 saturado (30 ml) e extraída com DCM (4 x 40 ml). As fases orgânicas combinadas são secas so- bre MgSO4, filtradas e evaporadas. O produto bruto é purificado por CC (2% MeOH em DCM) para produzir uma mistura de 56 (240 mg,
79%) em uma razão anomérica α/β aproximadamente 88:12 como es- puma branca.
[00547] Dados para 56: Rf = 0,56 (DCM + MeOH a 3%):
[00548] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 9,38 (br, 1H, (s, 1H, H- N(3)), 8,32 – 8,23 (m, 2H, H-arom), 8,22 – 8,11 (m, 2H, H-arom), 7,65 (dd, J = 7,7, 1,5 Hz, 4H, H-arom), 7,50 – 7,36 (m, 6H, H-arom), 6,95 (d, J = 0,9 Hz, 1H, H-C(6)), 5,96 (t, J = 6,3 Hz, 1H, H-C(1')), 5,55 (dt, J = 9,9, 6,0 Hz, 1H, H-C(5')), 5,13 (dd, J = 6,4, 5,4 Hz, 1H, H-C(4')), 4,20 – 4,05 (m, 1H, H-C(7')), 2,94 – 2,78 (m, 1H, H-C(3')), 2,22 (dd, J = 13,3, 6,4 Hz, 1H, H-C(6')), 2,09 – 1,73 (m, 6H, H-C(6'), H-C(2'), Me-C(5)), 1,09 (s, 9H, (CH3)3-C-Si). 13
[00549] RMN de C (75 MHz, CDCl3) δ 164,32, 163,79 (C(4), CO2R), 150,65, 150,39 (O2N-C-arom, C(2)), 135,70, 135,68 (CH- arom), 135,13 (C-arom), 134,83 (C(6)), 133,46, 133,10 (C-arom), 130,91, 130,73, 130,11, 127,93, 123,60 (CH-arom), 111,30 (C(5)), 87,26 (C(1')), 82,44 (C(4')), 76,40 (C(7')), 76,07 (C(5')), 50,76 (C(3')), 37,94 (C(6')), 36,68 (C(2')), 26,89 ((CH3)3-C-Si), 19,03 ((CH3)3-C-Si), 12,62 (Me-C(5)).
[00550] ESI+-HRMS m/z calculado para C35H37O8N3NaSi ([M + Na]+) 678,2242, encontrado 678,2254. (3'R,5'R,7'R)-1-{2',3'-Didesóxi-3',5'-etano-7'-hidróxi-5'-O-(4- nitrobenzoil)-α,β-D-ribofuranosil} timina (57)
[00551] A uma solução do nucleosídeo 56 (220 mg, 0,335 mmol) em THF seco (2 ml), é adicionado TBAF (a 1 M em THF, 0,84 ml, 0,84 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação durante 4 h à tempera- tura ambiente, a mistura de reação é diluída com NaHCO3 saturado (20 ml) e extraída com EtOAc (3 X 20 ml) e DCM (2 X 80 ml). As fases orgânicas combinadas são secas sobre MgSO4, filtradas e evapora- das. O produto bruto é purificado por CC (MeOH a 5% em DCM) para produzir uma mistura anomérica de 57 (101 mg, 72%). Cristais ade- quados para análise de raios-X são obtidos por recristalização em EtOAc.
[00552] Dados para 57: Rf = 0,50 (DCM + MeOH a 7%):
[00553] RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 8,96 (br, 1H, H-N(3)), 8,34 – 8,17 (m, 4H, H-arom), 7,07 (d, J = 1,1 Hz, 1H, H-C(6)), 6,11 (t, J = 6,3 Hz, 1H, H-C(1')), 5,57 – 5,45 (m, 1H, H-C(5')), 5,15 (dd, J = 6,6, 5,4 Hz, 1H, H-C(4')), 4,38 – 4,23 (m, 1H, H-C(7')), 2,96 (dd, J = 13,5, 6,9 Hz, 1H, H-C(3')), 2,26 (ddd, J = 13,1, 10,3, 5,4 Hz, 4H, H-C(2'), H- C(6')), 1,91 (d, J = 0,9 Hz, 3H, Me-C(5)).
[00554] ESI+-HRMS m/z calculado para C19H19O8N3Na ([M + Na]+) 440,1064, encontrado 440,1072. PROCESSO DE SÍNTESE, DESPROTEÇÃO E PURIFICAÇÃO DE
OLIGONUCLEOTÍDEOS ALFA ANOMÉRICOS
[00555] Um oligonucleotídeo que compreende pelo menos dois re- síduos biciclo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fosfodiéster pode ser sintetizado em um sintetizador, por exemplo um sintetizador de DNA Pharmaci-Gene-Assembler-Plus, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e descritos no pre- sente documento abaixo. As etapas de síntese de um oligonucleotídeo abc-DNA da invenção são mostradas abaixo:
[00556] As sínteses de oligonucleotídeos são realizadas em um sin- tetizador de DNA Pharmaci-Gene-Assembler-Plus em uma escala de 1,3 μmol, seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante do Gene Assembler.
Fosforamiditas de DNA natural (dT, dC4bz, dG2DMF, dA6Bz) e suporte sólido (Glen Unysupport 500) são adquiri- dos junto à Glen Research.
Fosforamiditas de DNA natural são prepa- radas como solução a 0,1 M em MeCN e são acopladas usando uma etapa de 4 min.
As fosforamiditas abc-DNA são preparadas como so- luções a 0,1 M em 1,2-dicloroetano e são acopladas usando uma eta- pa de 12 min prolongada usando 5-(etiltio)-1H-tetrazol (a 0,25 M em MeCN) como agente de acoplamento.
A destilação do nucleosídeo modificado é realizada com uma solução de ácido dicloroacético a 5% em dicloroetano.
A oxidação é realizada com uma solução de iodo a 0,01 M em MeCN/água/colidina (32:3:15) e com um tempo de reação de 1 min.
A sulfurização é realizada com uma solução de dissulfeto de fenilacetila a 0,2 M em MeCN/piridina (1:1) e com um tempo de reação de 3,5 min.
A cobertura é realizada com condições padrão.
A clivagem do suporte sólido e a desproteção de oligonucleotídeos é alcançada por tratamento com amoníaco concentrado a 55 °C durante 16 h.
Após centrifugação, o sobrenadante é recolhido, as microesferas adicional- mente lavadas com H2O (0,5 ml X 2) e as soluções resultantes são evaporadas até à secura. Os oligonucleotídeos brutos são purificados por HPLC de troca iônica (Dionex - DNAPac PA200). Soluções tampão de Trizma a 25 mM em H2O, pH 8,0, são usadas como a fase móvel "A", e Trizma a 25 mM, NaCl a 1,25 M em H2O, pH 8,0, foram usados como a fase móvel "B". Para a fita de fosforotioato, uma solução tam- pão de NaOH a 10 mM em H2O, pH 12,0, foi usada como a fase móvel "A" e NaOH a 10 mM, NaCl a 2,50 M em H2O, pH 12,0, foram usados como a fase móvel "B". Os oligonucleotídeos purificados são então dessalinizados com cartuchos Sep-pak C-18. As concentrações são determinadas medindo a absorvância a 260 nm com um espectrofotô- metro Nanodrop, usando o coeficiente de extinção dos oligonucleotí- deos de DNA naturais correspondentes. As caracterizações de oligo- nucleotídeos são realizadas por espectrometria de massa ESI- ou por LC-MS.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00557] Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o oligonucleotídeo da pre- sente invenção. A amostra de oligonucleotídeo pode ser adequada- mente formulada e introduzida no ambiente da célula por qualquer meio que permita que uma porção suficiente da amostra entre na célu- la para induzir um efeito, por exemplo, salto de éxon. Em certas moda- lidades, o oligonucleotídeo é pré-carregado na albumina e administra- do como um complexo oligonucleotídeo-albumina. Muitas formulações para oligonucleotídeos são conhecidas na técnica e podem ser usadas desde que o oligonucleotídeo ganhe entrada na célula alvo para que possa agir. Por exemplo, o agente oligonucleotídeo da presente inven- ção pode ser formulado em soluções tampão, tais como soluções sali- nas tamponadas com fosfato, lipossomas, estruturas micelares e cap-
sídeos. As formulações do agente oligonucleotídeo com lipídeos catiô- nicos podem ser utilizadas para facilitar a transfecção do agente oligo- nucleotídeo em células. Por exemplo, podem ser usados lipídios catiô- nicos, tais como lipofectina (Pat. no US 5.705.188), derivados catiôni- cos de glicerol e moléculas policatiônicas, tais como polilisina (pedido internacional PCT publicado WO 97/30731). Os lípidos adequados in- cluem Oligofectamina, Lipofectamina (Life Technologies), NC388 (Ri- bozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colorado) ou FuGene 6 (Ro- che), todos os quais podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante.
[00558] Essas composições incluem tipicamente a molécula de áci- do nucleico e um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme utili- zado no presente documento, a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui soro fisiológico, solventes, meios de dispersão, reves- timentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, e semelhantes, compatíveis com a ad- ministração farmacêutica. Os compostos ativos suplementares tam- bém podem ser incorporados nas composições.
[00559] Uma composição farmacêutica é formulada para ser com- patível com a via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem parenteral, por exemplo, intravenosa, intradér- mica, subcutânea, oral, intranasal, transdérmica (tópica), transmucosa, intratecal, intracerebroventricular, intraperitoneal e administração retal. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intra- dérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéti- cos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil para- benos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonici- dade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A prepa- ração parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartá- veis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.
[00560] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetá- vel incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de solu- ções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intraveno- sa, os veículos adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostáti- ca, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tam- ponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista fácil seringabilidade. A mesma deve ser estável nas condições de fabricação e armazena- mento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micror- ganismos, como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhan- tes) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dis- persão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrga- nismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e anti- fúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como ma- nitol, sorbitol e cloreto de sódio na composição. A absorção prolonga- da das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo-se na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoes- tearato de alumínio e gelatina.
[00561] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas in- corporando o composto ativo na quantidade necessária em um solven- te apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumera- dos acima, conforme necessário, seguido por esterilização por filtra- ção. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o com- posto ativo em um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetá- veis estéreis, os métodos de preparação preferenciais são a secagem a vácuo e a liofilização que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução do mesmo previamente esterilizada por filtração.
[00562] As composições orais geralmente incluem um diluente iner- te ou um veículo comestível. Para o propósito de administração tera- pêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, trociscos ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. As composições orais também podem ser prepa- radas usando um veículo fluido para uso como líquido para limpeza bucal. Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou mate- riais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de natureza semelhante: um aglutinante, tal como celulose microcristalina, goma adragante ou gelatina; um excipiente, como amido ou lactose, um agente desintegrante, como ácido algínico, Primogel ou amido de mi- lho; um lubrificante como o estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante como o dióxido de silício coloidal; um agente adoçante co- mo a sacarose ou a sacarina; ou um agente aromatizante como horte- lã-pimenta, salicilato de metila ou aroma de laranja.
[00563] Para administração por inalação, os compostos são admi-
nistrados na forma de um dispersor aerossol a partir de um recipiente ou distribuidor pressurizado que contém um propelente adequado, por exemplo, um gás como dióxido de carbono ou um nebulizador. Tais métodos incluem aqueles descritos na Pat. no US 6.468.798.
[00564] A administração sistêmica também pode ser por meios transmucosais ou transdérmicos. Para administração transmucosa ou transdérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhe- cidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmu- cosal, detergentes, sais biliares e derivados do ácido fusídico. A admi- nistração transmucosa pode ser realizada através do uso de disperso- res nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os com- postos ativos são formulados em pomadas, unguentos, géis ou cremes como geralmente conhecido na técnica.
[00565] A invenção também fornece métodos de distribuição de pó seco.
[00566] Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositório convencionais, como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para administração retal.
[00567] Os compostos também podem ser administrados por trans- fecção ou infecção usando métodos conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, os métodos descritos em McCaffrey et al. (2002), Nature, 418 (6893), 38 a 39 (transfecção hidrodinâmica); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20 (10), 1.006 a 1.010 (entrega mediada por vírus); ou Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53 (2), 151 a 160, errata na alt. J. Health Syst. Pharm. 53 (3), 325 (1996).
[00568] Os compostos também podem ser administrados por qual- quer método adequado para a administração de agentes de ácido nu- cleico, como uma vacina de DNA. Esses métodos incluem armas ge-
néticas, bioinjetores e adesivos para a pele, bem como métodos sem agulha, como a tecnologia de vacina de micropartículas de DNA divul- gada na Pat. no US 6.194.389, e a vacinação transdérmica sem agulha em mamíferos com vacina em pó conforme divulgado na Patente no US 6.168.587. Além disso, a entrega intranasal é possível, conforme descrito em, entre outros, Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88 (2), 205 a 210. Lipossomas (por exemplo, conforme descrito na Patente no US 6.472.375) e microencapsulação também podem ser usados. Os sistemas de distribuição de micropartículas di- recionáveis biodegradáveis também podem ser usados (por exemplo, como descrito na Patente no US 6.471.996).
[00569] Em uma modalidade, os compostos ativos são preparados com veículos que irão proteger o composto contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno- acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoés- teres e ácido polilático. Essas formulações podem ser preparadas usando técnicas padrão. Os materiais também podem ser obtidos co- mercialmente junto à Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossomais (incluindo lipossomas direcionados a célu- las infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) tam- bém podem ser usadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, como descrito na Pat. no US 4.522.811.
[00570] A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais compostos po- dem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para de- terminar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expres- so como a razão LD50/ED50. Os compostos que apresentam índices terapêuticos elevados são preferenciais. Embora os compostos que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usados, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de entrega que direcione tais com- postos para o local do tecido afetado a fim de minimizar o dano poten- cial às células não infectadas e, assim, reduzir os efeitos colaterais.
[00571] Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais compos- tos se encontra preferencialmente dentro de uma gama de concentra- ções de circulação que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxici- dade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da for- ma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuti- camente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma gama de concentração no plasma circulante que in- clui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição semimáxima dos sintomas) como determinado em cultura celular. Essas informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta resolução.
[00572] Conforme definido no presente documento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico (isto é, uma dosagem eficaz) depende do ácido nucleico selecionado. Por exemplo, podem ser administradas quantidades de dose única na ga- ma de aproximadamente 1 pg a 1.000 mg; em algumas modalidades,
10, 30, 100 ou 1.000 pg, ou 10, 30, 100 ou 1.000 ng, ou 10, 30, 100 ou 1000 g ou 10, 30, 100 ou 1.000 mg podem ser administrados. Em algumas modalidades, 1 a 5 g das composições podem ser adminis- trados. As composições podem ser administradas uma ou mais vezes por dia a uma ou mais vezes por semana; incluindo uma vez a cada dois dias ou uma ou mais vezes por mês. O indivíduo versado na téc- nica apreciará que certos fatores podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, po- rém sem limitação, gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos an- teriores, a saúde geral e/ou idade do indivíduo, e outros doenças pre- sentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo da invenção pode in- cluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma série de tratamentos.
[00573] Em certas modalidades, a dosagem de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção está na faixa de 5 mg/kg/semana a 500 mg/kg/semana, por exemplo 5 mg/kg/semana, 10 mg/kg/semana, 15 mg/kg/semana, 20 mg/kg/semana, 25 mg/kg/semana, 30 mg/kg/semana, 35 mg/kg/semana, 40 mg/kg/semana, 45 mg/kg/semana, 50 mg/kg/semana, 55 mg/kg/semana, 60 mg/kg/semana, 65 mg/kg/semana, 70 mg/kg/semana, 75 mg/kg/semana, 80 mg/kg/semana, 85 mg/kg/semana, 90 mg/kg/semana, 95 mg/kg/semana, 100 mg/kg/semana, 150 mg/kg/semana, 200 mg/kg/semana, 250 mg/kg/semana, 300 mg/kg/semana, 350 mg/kg/semana, 400 mg/kg/semana, 450 mg/kg/semana e 500 mg/kg/semana. Em certas modalidades, a dosa- gem de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção está na faixa de 10 mg/kg/semana a 200 mg/kg/semana, 20 mg/kg/semana a 150 mg/kg/semana ou 25 mg/kg/semana a 100 mg/kg/semana. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é administrado 1 x por semana por uma duração de 2 semanas a 6 meses, por exemplo, 2 semanas, 3 semanas, 4, semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 sema- nas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 26 semanas, 6 meses, 8 meses, 10 meses ou 1 ano ou mais. Em cer- tas modalidades, o oligonucleotídeo é administrado 2 x por semana. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo é administrado a cada du- as semanas. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é administra- do por via intravenosa.
[00574] Pode ser observado que o método de introdução de agen- tes oligonucleotídeos no ambiente da célula dependerá do tipo de cé- lula e da composição de seu ambiente. Por exemplo, quando as célu- las são encontradas dentro de um líquido, uma formulação preferencial é com uma formulação lipídica como em lipofectamina e os agentes oligonucleotídicos podem ser adicionados diretamente ao ambiente líquido das células. As formulações lipídicas também podem ser admi- nistradas a animais, tais como por injeção intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal, ou oralmente ou por inalação ou outros métodos como são conhecidos na técnica. Quando a formulação é adequada para administração em animais, tais como mamíferos e mais especifi- camente humanos, a formulação também é farmaceuticamente aceitá- vel. As formulações farmaceuticamente aceitáveis para administração de oligonucleotídeos são conhecidas e podem ser usadas. Em alguns casos, pode ser preferencial formular agentes oligonucleotídicos em um tampão ou solução salina e injetar diretamente os agentes oligonu- cleotídicos formulados nas células, como em estudos com oócitos. A injeção direta de oligonucleotídeos também pode ser feita.
[00575] Devem ser introduzidas quantidades adequadas de um agente oligonucleotídeo e essas quantidades podem ser determinadas empiricamente usando métodos padrão. Normalmente, as concentra- ções eficazes de espécies de agentes oligonucleotídicos individuais no ambiente de uma célula serão de cerca de 50 nanomolar ou menos, 10 nanomolar ou menos, ou composições nas quais concentrações de cerca de 1 nanomolar ou menos podem ser usadas. Em outra modali- dade, os métodos que utilizam uma concentração de cerca de 200 pi- comolar ou menos, e mesmo uma concentração de cerca de 50 pico- molar ou menos, cerca de 20 picomolar ou menos, cerca de 10 pico- molar ou menos, ou cerca de 5 picomolar ou menos podem ser usados em muitas circunstâncias.
[00576] O método pode ser realizado por adição das composições do agente oligonucleotídico a qualquer matriz extracelular na qual as células podem viver desde que a composição do agente oligonucleotí- dico seja formulada de modo que uma quantidade suficiente do agente oligonucleotídico possa entrar na célula para exercer o seu efeito. Por exemplo, o método é adequado para uso com células presentes em um líquido, como uma cultura líquida ou meio de crescimento celular, em explantes de tecido ou em organismos inteiros, incluindo animais, como mamíferos e especialmente seres humanos.
[00577] O agente oligonucleotídeo pode ser formulado como uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaco- logicamente eficaz de um agente oligonucleotídeo e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Uma quantidade farmacologicamente ou tera- peuticamente eficaz se refere à quantidade de um agente oligonucleo- tídico eficaz para produzir o resultado farmacológico, terapêutico ou preventivo pretendido. As frases "quantidade farmacologicamente efi- caz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" ou simplesmente "quanti- dade eficaz" se referem à quantidade de um oligonucleotídeo eficaz para produzir o resultado farmacológico, terapêutico ou preventivo pre- tendido. Por exemplo, se um determinado tratamento clínico é consi- derado eficaz quando há pelo menos uma redução de 20% em um pa- râmetro mensurável associado a uma doença ou distúrbio, uma quan-
tidade terapeuticamente eficaz de um fármaco para o tratamento des- sa doença ou distúrbio é a quantidade necessária para efetuar pelo menos uma redução de 20% nesse parâmetro.
[00578] As composições farmacêuticas adequadamente formuladas desta invenção podem ser administradas por qualquer meio conhecido na técnica, como por vias parenterais, incluindo administração intrave- nosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica, via aé- rea (aerossol), retal, vaginal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são administra- das por infusão ou injeção intravenosa ou intraparenteral.
[00579] Em geral, uma unidade de dosagem adequada de oligonu- cleotídeo estará na faixa de 0,001 a 0,25 miligramas por quilograma de peso corporal do receptor por dia, ou na faixa de 0,01 a 20 microgra- mas por quilograma de peso corporal por dia, ou na faixa de 0,01 a 10 microgramas por quilograma de peso corporal por dia, ou no intervalo de 0,10 a 5 microgramas por quilograma de peso corporal por dia, ou no intervalo de 0,1 a 2,5 microgramas por quilograma de peso corporal por dia. Em certas modalidades, a dosagem está na faixa de 0,1 mg/kg de peso corporal por dia a 5 mg/kg de peso corporal por dia, por exemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 e 5 mg/kg de peso corporal. A composição farmacêutica que compreende o oli- gonucleotídeo pode ser administrada uma vez ao dia. No entanto, o agente terapêutico também pode ser administrado em unidades de dosagem contendo duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas em intervalos apropriados ao longo do dia. Nesse caso, o oligonucleotídeo contido em cada subdose deve ser corresponden- temente menor a fim de atingir a unidade de dosagem diária total. A unidade de dosagem também pode ser composta para uma dose úni- ca ao longo de vários dias, por exemplo, usando uma formulação de liberação sustentada convencional que fornece liberação sustentada e consistente do oligonucleotídeo ao longo de um período de vários dias. As formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técni- ca. Nessa modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo cor- respondente da dose diária. Independentemente da formulação, a composição farmacêutica deve conter oligonucleotídeo em uma quan- tidade suficiente para ser ativa, por exemplo, para causar salto de éxon ou inibir a expressão de um gene alvo no animal ou ser humano tratado. A composição pode ser composta de tal forma que a soma das unidades múltiplas de oligonucleotídeo contenha uma dose sufici- ente.
[00580] Os dados podem ser obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais para formular uma faixa de dosagem adequada para seres humanos. A dosagem de composições da inven- ção se encontra dentro de uma gama de concentrações que incluem a ED50 (tal como determinado por métodos conhecidos) com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa de- pendendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma gama de concentração em circula- ção no plasma do composto que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição semimáxima dos sinto- mas) como determinado em cultura celular. Essas informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em se- res humanos. Os níveis de oligonucleotídeo no plasma podem ser me- didos por métodos padrão, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.
[00581] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um kit, recipiente, embalagem ou dispensador juntamente com instruções para administração.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
[00582] A presente invenção fornece métodos profiláticos e tera- pêuticos de tratamento de um indivíduo em risco de (ou suscetível a) uma doença ou distúrbio causado, no todo ou em parte, pela expres- são de um RNA alvo e/ou a presença de tal RNA alvo.
[00583] "Tratamento", ou "tratar" como utilizado no presente docu- mento, é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico (por exemplo, um agente ou vetor de oligonucleotídeo ou transgene que codifica o mesmo) a um paciente, ou aplicação ou ad- ministração de um agente terapêutico a um tecido ou linha celular iso- lada de um paciente que tem a doença ou distúrbio, um sintoma de doença ou distúrbio ou uma predisposição para uma doença ou distúr- bio, com o propósito de curar, sarar, suavizar, aliviar, alterar, remediar, melhorar, aprimorar ou afetar a doença ou a distúrbio, os sintomas da doença ou do distúrbio, ou a predisposição para a doença.
[00584] Em um aspecto, a invenção fornece um método para pre- venir em um indivíduo uma doença ou distúrbio como descrito acima administrando-se ao indivíduo um agente terapêutico (por exemplo, um agente ou vetor de oligonucleotídeo ou transgene que codifica o mesmo). Os indivíduos com risco da doença podem ser identificados por, por exemplo, qualquer um dentre ou uma combinação de ensaios de diagnóstico ou prognóstico como descrito no presente documento. A administração de um agente profilático pode ocorrer antes da detec- ção de, por exemplo, partículas virais em um indivíduo, ou a manifes- tação de sintomas característicos da doença ou distúrbio, de modo que a doença ou distúrbio é prevenida ou, alternativamente, retardada em sua progressão.
[00585] Outro aspecto da invenção se refere a métodos de trata- mento terapêutico de indivíduos, isto é, alterar o início dos sintomas da doença ou distúrbio. Esses métodos podem ser realizados in vitro (por exemplo, por cultura da célula com o agente oligonucleotídeo) ou, al- ternativamente, in vivo (por exemplo, por administração do agente oli- gonucleotídeo a um indivíduo).
[00586] No que diz respeito aos métodos profiláticos e terapêuticos de tratamento, tais tratamentos podem ser especificamente adaptados ou modificados, com base no conhecimento obtido no campo da far- macogenômica. "Farmacogenômica", conforme utilizado no presente documento, se refere à aplicação de tecnologias genômicas, como se- quenciamento de genes, genética estatística e análise de expressão gênica, a fármacos em desenvolvimento clínico e no mercado. Mais especificamente, o termo se refere ao estudo de como os genes de um paciente determinam sua resposta a um fármaco (por exemplo, o "fe- nótipo de resposta ao fármaco" de um paciente ou "genótipo de res- posta ao fármaco"). A farmacogenômica permite que um clínico ou médico direcione os tratamentos profiláticos ou terapêuticos aos paci- entes que mais se beneficiarão com o tratamento e evite o tratamento de pacientes que apresentarão efeitos colaterais tóxicos relacionados aos fármacos.
[00587] Os agentes terapêuticos podem ser testados em um mode- lo animal apropriado. Por exemplo, um agente (ou vetor de expressão) de oligonucleotídeo (ou transgene que codifica o mesmo), conforme descrito neste documento, pode ser usado em um modelo animal para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos colaterais do tratamento com o agente. Alternativamente, um agente terapêutico pode ser usa- do em um modelo animal para determinar o mecanismo de ação de tal agente. Por exemplo, um agente pode ser usado em um modelo ani- mal para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos colaterais do tra- tamento com tal agente. Alternativamente, um agente pode ser usado em um modelo animal para determinar o mecanismo de ação de tal agente.
[00588] Além disso, o efeito terapêutico de um oligonucleotídeo conjugado com um grupo lipídico abc-DNA é determinado avaliando a função muscular, força de preensão, função respiratória, função cardí- aca por MRI, fisiologia muscular. A ativação do complemento e a coa- gulação do sangue também são determinadas para investigar os efei- tos colaterais negativos do oligonucleotídeo.
DOENÇAS
[00589] Os oligonucleotídeos da invenção são úteis para modular a expressão gênica interferindo-se na transcrição, tradução, splicing e/ou degradação e/ou inibindo-se a função de RNA não codificante, para tratamento ou prevenção de uma doença com base em níveis aberrantes de um mRNA ou RNA não codificante. Um indivíduo é con- siderado tratado para uma doença se, após a administração das célu- las da invenção, um ou mais sintomas da doença forem diminuídos ou eliminados.
[00590] O oligonucleotídeos conjugados com grupo lipídico abc- DNA da invenção pode modular o nível ou atividade de um RNA alvo. O nível ou atividade de um RNA alvo pode ser determinado por qual- quer método adequado agora conhecido na técnica ou que seja de- senvolvido posteriormente. Pode ser apreciado que o método usado para medir um RNA alvo e/ou a expressão de um RNA alvo pode de- pender da natureza do RNA alvo. Por exemplo, se o RNA alvo codifica uma proteína, o termo "expressão" pode se referir a uma proteína ou o RNA/transcrição derivada do RNA alvo. Em tais casos, a expressão de um RNA alvo pode ser determinada medindo a quantidade de RNA correspondente ao RNA alvo ou medindo a quantidade do produto de proteína. A proteína pode ser medida em ensaios de proteína, como por coloração ou imunoblotting ou, se a proteína catalisa uma reação que pode ser medida, medindo as taxas de reação. Todos esses mé-
todos são conhecidos na técnica e podem ser usados. Quando os ní- veis de RNA alvo tiverem que ser medidos, quaisquer métodos reco- nhecidos na técnica para detectar os níveis de RNA podem ser usados (por exemplo, RT-PCR, Northern Blotting, etc.). Qualquer uma das medições acima pode ser feita em células, extratos de células, tecidos, extratos de tecidos ou qualquer outro material de origem adequado.
[00591] Os oligonucleotídeos conjugados com lipídio abc-DNA da invenção são usados para modular a expressão de um microRNA ou outro RNA não codificador que modula a expressão de mRNA.
[00592] MicroRNAs são pequenos RNAs não codificantes que dire- cionam a regulação pós-transcricional da expressão gênica e têm aproximadamente 20 a 25 nucleotídeos de comprimento. Os mesmos regulam a expressão de múltiplos genes alvo por meio de hibridização específica de sequência para a região 3' não traduzida de RNAs men- sageiros. Esses microRNAs podem bloquear a tradução ou podem causar degradação direta de seus RNAs mensageiros alvo.
[00593] Oligonucleotídeos conjugados com grupo lipídico abc-DNA da invenção que se ligam a um miRNA de interesse são sintetizados. Esses oligonucleotídeos são projetados para se ligar ao miRNA e im- pedir a ligação do miRNA ao seu mRNA alvo. Oligonucleotídeos con- jugados com grupo lipídico abc-DNA são usados para modular a liga- ção de miRNA in vitro e in vivo conforme descrito nos exemplos acima.
[00594] Os RNAs não codificantes longos (lncRNAs) são uma clas- se grande e diversa de moléculas de RNA transcritas com um compri- mento de mais de 200 nucleotídeos que não codificam proteínas (ou que não têm > 100 aminoácidos na estrutura de leitura aberta). Os lncRNAs são reguladores importantes da expressão gênica, e acredi- ta-se que os lncRNAs tenham uma ampla gama de funções nos pro- cessos celulares e de desenvolvimento. Os lncRNAs podem realizar tanto a inibição quanto a ativação do gene por meio de uma variedade de mecanismos diversos. Funções validadas de lncRNAs sugerem que eles são reguladores mestres da expressão gênica e frequentemente exercem suas influências por meio de mecanismos epigenéticos mo- dulando a estrutura da cromatina.
[00595] Oligonucleotídeos conjugados com grupo lipídico abc-DNA da invenção complementares a um lncRNA alvo de interesse são sin- tetizados. No núcleo, os mesmos hibridizam com lncRNAs direciona- dos para formar heteroduplexos.
[00596] A invenção fornece tratamento ou prevenção de uma doen- ça, incluindo, porém sem limitação, a Distrofia Muscular de Duchenne, Atrofia Muscular Espinhal (inclusão do éxon 7 no gene SMN2), Distro- fia Miotônica (transcrição de CUGexp-DMPK alvo com CAGn), Doença de Huntington (abordagens seletivas e não seletivas de alelo direcio- nadas à expansão de tripleto CAG), Esclerose lateral amiotrófica (dis- túrbio geneticamente heterogêneo com vários genes causadores), e Doença de Pompé (mutação de splice alvo c.-32 IVS1-13T> G, que é encontrada em mais da metade de todos os pacientes caucasianos.
SEQUÊNCIAS
[00597] A invenção fornece qualquer oligonucleotídeo abc-DNA, com ligações internucleosídicas predominantemente de fosfato, um ou dois ligantes e um grupo lipídico. A sequência pode ser projetada para qualquer alvo. A sequência de oligonucleotídeos abc-DNA exemplifica- tivos da invenção são fornecidos abaixo.
[00598] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos têm um com- primento de 10 nucleotídeos, 11 nucleotídeos, 12 nucleotídeos, 13 nu- cleotídeos, 14 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 16 nucleotídeos, 17 nu- cleotídeos, 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotídeos ou mais, por exemplo 21-50 nucleotídeos, por exemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50 nucleotídeos. Em uma modalidade, os oligonucleo-
tídeos têm um comprimento de 14 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 16 nucleotídeos, 17 nucleotídeos, 18 nucleotídeos ou 19 nucleotídeos. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos têm um comprimento de 15 nucleotídeos. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos têm um com- primento de 16 nucleotídeos. Em uma modalidade, os oligonucleotí- deos têm um comprimento de 17 nucleotídeos. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos têm um comprimento de 18 nucleotídeos. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos têm um comprimento de 19 nu- cleotídeos.
OLIGONUCLEOTÍDEOS DIRECIONADOS PARA DMD
[00599] A distrofia muscular de Duchenne (DMD) afeta 1 em 3.500 recém-nascidos do sexo masculino, enquanto a distrofia muscular de Becker (DMD) afeta 1 em 20.000. Tanto a DMD quanto a BMD são causadas por mutações no gene DMD, que está localizado no cro- mossomo X e codifica a distrofina. Os pacientes com DMD sofrem de fraqueza muscular progressiva, vão à cadeira de rodas antes dos 13 anos e muitas vezes morrem antes da terceira década de vida. A DMO é geralmente mais leve e os pacientes costumam permanecer ambu- lantes por mais de 40 anos e têm expectativa de vida mais longa em comparação com os pacientes com DMD.
[00600] A distrofina é um componente essencial do complexo dis- trofina-glicoproteína (DGC). Entre outras coisas, o DGC mantém a es- tabilidade da membrana das fibras musculares. Mutações de desloca- mento de quadro no gene DMD resultam em deficiência de distrofina nas células musculares, que é acompanhada por níveis reduzidos de outras proteínas DGC e resulta no fenótipo grave encontrado em paci- entes com DMD. Mutações no gene DMD que mantêm o quadro de leitura intacto, geram distrofinas mais curtas, mas parcialmente funcio- nais, e estão associadas à DMO menos severa. Em pacientes com Distrofia Muscular de Duchnenne (DMD), mutações de deslocamento de quadro no gene DMD fazem com que um mRNA fora do quadro seja produzido, resultando em uma proteína distrofina truncada e não funcional. Esse mRNA maduro em quadro codifica uma proteína dis- trofina em quadro que ainda é parcialmente funcional e resulta em um fenótipo de Distrofia Muscular de Becker (BMD) mais suave.
[00601] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos da invenção são complementares a porções do gene DMD, por exemplo, Éxon 51, Éxon 53 e Éxon 45. ÉXON 51
[00602] A sequência do éxon 51 do gene DMD (SEQ ID NO: 401) é mostrada abaixo:
[00603] A sequência de transcrição correspondente da parte desta- cada é: 5' CC AAA CTA GAA ATG CCA TCT TCC TTG ATG T 3' (SEQ ID NO: 402).
[00604] Os oligonucleotídeos complementares ao Éxon 51 do gene DMD, úteis de acordo com a invenção incluem, porém sem limitação: 5' GG TTT GAT CTT TAC GGT AGA AGG AAC TAC A 7' (SEQ ID NO: 403) e os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 3: TABELA 3 - ÉXON 51 Sequência (5' a 7') SEQ ID NO: GGTTTGATCTTTACGGTA 1 GTTTGATCTTTACGGTAG 2 TTTGATCTTTACGGTAGA 3 TTGATCTTTACGGTAGAA 4 TGATCTTTACGGTAGAAG 5 GATCTTTACGGTAGAAGG 6
Sequência (5' a 7') SEQ ID NO: ATCTTTACGGTAGAAGGA 7 TCTTTACGGTAGAAGGAA 8 CTTTACGGTAGAAGGAAC 9 TTTACGGTAGAAGGAACT 10 TTACGGTAGAAGGAACTA 11 TACGGTAGAAGGAACTAC 12 ACGGTAGAAGGAACTACA 13 GGTTTGATCTTTACGGT 14 GTTTGATCTTTACGGTA 15 TTTGATCTTTACGGTAG 16 TTGATCTTTACGGTAGA 17 TGATCTTTACGGTAGAA 18 GATCTTTACGGTAGAAG 19 ATCTTTACGGTAGAAGG 20 TCTTTACGGTAGAAGGA 21 CTTTACGGTAGAAGGAA 22 TTTACGGTAGAAGGAAC 23 TTACGGTAGAAGGAACT 24 TACGGTAGAAGGAACTA 25 ACGGTAGAAGGAACTAC 26 CGGTAGAAGGAACTACA 27 GGTTTGATCTTTACGG 28 GTTTGATCTTTACGGT 29 TTTGATCTTTACGGTA 30 TTGATCTTTACGGTAG 31 TGATCTTTACGGTAGA 32 GATCTTTACGGTAGAA 33 ATCTTTACGGTAGAAG 34 TCTTTACGGTAGAAGG 35 CTTTACGGTAGAAGGA 36 TTTACGGTAGAAGGAA 37 TTACGGTAGAAGGAAC 38
Sequência (5' a 7') SEQ ID NO: TACGGTAGAAGGAACT 39 ACGGTAGAAGGAACTA 40 CGGTAGAAGGAACTAC 41 GGTAGAAGGAACTACA 42 GGTTTGATCTTTACG 43 GTTTGATCTTTACGG 44 TTTGATCTTTACGGT 45 TTGATCTTTACGGTA 46 TGATCTTTACGGTAG 47 GATCTTTACGGTAGA 48 ATCTTTACGGTAGAA 49 TCTTTACGGTAGAAG 50 CTTTACGGTAGAAGG 51 TTTACGGTAGAAGGA 52 TTACGGTAGAAGGAA 53 TACGGTAGAAGGAAC 54 ACGGTAGAAGGAACT 55 CGGTAGAAGGAACTA 56 GGTAGAAGGAACTAC 57 GTAGAAGGAACTACA 58 GGTTTGATCTTTAC 59 GTTTGATCTTTACG 60 TTTGATCTTTACGG 61 TTGATCTTTACGGT 62 TGATCTTTACGGTA 63 GATCTTTACGGTAG 64 ATCTTTACGGTAGA 65 TCTTTACGGTAGAA 66 CTTTACGGTAGAAG 67 TTTACGGTAGAAGG 68 TTACGGTAGAAGGA 69 TACGGTAGAAGGAA 70
Sequência (5' a 7') SEQ ID NO: ACGGTAGAAGGAAC 71 CGGTAGAAGGAACT 72 GGTAGAAGGAACTA 73 GTAGAAGGAACTAC 74 TAGAAGGAACTACA 75
[00605] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 a 20 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compre- ende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 a 19 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 a 19 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 15 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 16 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonu- cleotídeo tem um comprimento de 17 nucleotídeos. Em uma modali- dade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 18 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 19 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 20 nucleotídeos.
[00606] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 19 nu- cleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 19-mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência 5' CTTTACGGTAGAAGGAACT 7' (SEQ ID NO: 404; 19 mer). Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 404.
[00607] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 18 nu- cleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 18-mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma se- quência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 13. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma se- quência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 13. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a se- quência de SEQ ID NO: 4 ou de SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 4 ou de SEQ ID NO: 5. Em uma modali- dade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 5.
[00608] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 17 nu- cleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 17-mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma se- quência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14 a 27. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma se- quência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14 a 27. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 ou de SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo com- preende a sequência de SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 ou de SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 23. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 24.
[00609] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 16 nu- cleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 16-mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma se- quência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 a 42. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 a 42. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreen- de a sequência de SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou de SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo com- preende a sequência de SEQ ID NO: 36. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 37. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 38. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, o dito oligonucleo- tídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 ou de SEQ ID NO: 39. Em uma modalidade, o dito oligonu- cleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 36. Em uma modali- dade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO:
37. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 38. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo con- siste na sequência de SEQ ID NO: 39.
[00610] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 15 nu- cleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 15-mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma se- quência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 43 a 58. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 43 a 58. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreen- de a sequência de SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 ou de SEQ ID NO: 55. Em uma modalidade, o dito oli- gonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 51. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 52. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 53. Em uma modalidade, o dito oligonucleo- tídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 54. Em uma modalida- de, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO:
55. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 ou de SEQ ID NO: 55. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 51. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 52. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 53. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na se- quência de SEQ ID NO: 54. Em uma modalidade, o dito oligonucleotí- deo consiste na sequência de SEQ ID NO: 55.
[00611] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 75, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 nu- cleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 14-mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma se- quência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 59 a 75. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma se- quência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 59 a 75. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 ou de SEQ ID NO:
70. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a se- quência de SEQ ID NO: 67. Em uma modalidade, o dito oligonucleotí- deo compreende a sequência de SEQ ID NO: 68. Em uma modalida- de, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO:
69. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a se- quência de SEQ ID NO: 70. Em uma modalidade, o dito oligonucleotí- deo consiste na sequência de SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 ou de SEQ ID NO: 70. Em uma modalidade, o dito oligonu- cleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 67. Em uma modali- dade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO:
68. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 69. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo con- siste na sequência de SEQ ID NO: 70.
[00612] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 67 a 70 e SEQ ID NO: 404. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 67 a 70 e SEQ ID NO: 404, em que todos os re- síduos são resíduos abc-DNA. Em uma modalidade, o dito oligonucle- otídeo consiste na sequência selecionada a partir do grupo que consis- te nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 67 a 70 e SEQ ID
NO: 404. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na se- quência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 67 a 70 e SEQ ID NO: 404, em que to- dos os resíduos são resíduos abc-DNA. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55 e SEQ ID NO: 404. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55 e SEQ ID NO: 404, em que todos os resíduos são resíduos abc-DNA. Em uma modalidade, o dito oligo- nucleotídeo consiste na sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55 e SEQ ID NO: 404. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na se- quência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55 e SEQ ID NO: 404, em que todos os resíduos são resíduos abc-DNA. Em uma modalidade, o dito oligonu- cleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que con- siste na SEQ ID NO: 417 e SEQ ID NO: 418. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 417. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 418. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo con- siste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 417 e SEQ ID NO: 418. Em uma modalidade, o dito oligo- nucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 417. Em uma mo- dalidade, o dito oligonucleotídeo consiste na sequência de SEQ ID NO: 418. ÉXON 53
[00613] A sequência do Éxon 53 do gene DMD (SEQ ID NO: 405) é mostrada abaixo: Éxon 53
[00614] A sequência de transcrição correspondente da parte desta- cada é: 5' GTA CAA GAA CAC CTT CAG AAC CGG AGG CAA CAG TTG AAT GAA ATG TTA A (SEQ ID NO: 406).
[00615] Os oligonucleotídeos complementares ao Éxon 53 do gene DMD, úteis de acordo com a invenção incluem, porém sem limitação:
[00616] 5' CAT GTT CTT GTG GAA GTC TTG GCC TCC GTT GTC AAC TTA CTT TAC AAT 7' (SEQ ID NO: 407) e os oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 4. TABELA 4 - ÉXON 53 Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: CATGTTCTTGTGGAAGTC 76 ATGTTCTTGTGGAAGTCT 77 TGTTCTTGTGGAAGTCTT 78 GTTCTTGTGGAAGTCTTG 79 TTCTTGTGGAAGTCTTGG 80 TCTTGTGGAAGTCTTGGC 81 CTTGTGGAAGTCTTGGCC 82 TTGTGGAAGTCTTGGCCT 83 TGTGGAAGTCTTGGCCTC 84 GTGGAAGTCTTGGCCTCC 85 TGGAAGTCTTGGCCTCCG 86 GGAAGTCTTGGCCTCCGT 87 GAAGTCTTGGCCTCCGTT 88 AAGTCTTGGCCTCCGTTG 89 AGTCTTGGCCTCCGTTGT 90 GTCTTGGCCTCCGTTGTC 91
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: TCTTGGCCTCCGTTGTCA 92 CTTGGCCTCCGTTGTCAA 93 TTGGCCTCCGTTGTCAAC 94 TGGCCTCCGTTGTCAACT 95 GGCCTCCGTTGTCAACTT 96 GCCTCCGTTGTCAACTTA 97 CCTCCGTTGTCAACTTAC 98 CTCCGTTGTCAACTTACT 99 TCCGTTGTCAACTTACTT 100 CCGTTGTCAACTTACTTT 101 CGTTGTCAACTTACTTTA 102 GTTGTCAACTTACTTTAC 103 TTGTCAACTTACTTTACA 104 TGTCAACTTACTTTACAA 105 GTCAACTTACTTTACAAT 106 CATGTTCTTGTGGAAGT 107 ATGTTCTTGTGGAAGTC 108 TGTTCTTGTGGAAGTCT 109 GTTCTTGTGGAAGTCTT 110 TTCTTGTGGAAGTCTTG 111 TCTTGTGGAAGTCTTGG 112 CTTGTGGAAGTCTTGGC 113 TTGTGGAAGTCTTGGCC 114 TGTGGAAGTCTTGGCCT 115 GTGGAAGTCTTGGCCTC 116 TGGAAGTCTTGGCCTCC 117 GGAAGTCTTGGCCTCCG 118 GAAGTCTTGGCCTCCGT 119 AAGTCTTGGCCTCCGTT 120 AGTCTTGGCCTCCGTTG 121 GTCTTGGCCTCCGTTGT 122 TCTTGGCCTCCGTTGTC 123
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: CTTGGCCTCCGTTGTCA 124 TTGGCCTCCGTTGTCAA 125 TGGCCTCCGTTGTCAAC 126 GGCCTCCGTTGTCAACT 127 GCCTCCGTTGTCAACTT 128 CCTCCGTTGTCAACTTA 129 CTCCGTTGTCAACTTAC 130 TCCGTTGTCAACTTACT 131 CCGTTGTCAACTTACTT 132 CGTTGTCAACTTACTTT 133 GTTGTCAACTTACTTTA 134 TTGTCAACTTACTTTAC 135 TGTCAACTTACTTTACA 136 GTCAACTTACTTTACAA 137 TCAACTTACTTTACAAT 138 CATGTTCTTGTGGAAG 139 ATGTTCTTGTGGAAGT 140 TGTTCTTGTGGAAGTC 141 GTTCTTGTGGAAGTCT 142 TTCTTGTGGAAGTCTT 143 TCTTGTGGAAGTCTTG 144 CTTGTGGAAGTCTTGG 145 TTGTGGAAGTCTTGGC 146 TGTGGAAGTCTTGGCC 147 GTGGAAGTCTTGGCCT 148 TGGAAGTCTTGGCCTC 149 GGAAGTCTTGGCCTCC 150 GAAGTCTTGGCCTCCG 151 AAGTCTTGGCCTCCGT 152 AGTCTTGGCCTCCGTT 153 GTCTTGGCCTCCGTTG 154 TCTTGGCCTCCGTTGT 155
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: CTTGGCCTCCGTTGTC 156 TTGGCCTCCGTTGTCA 157 TGGCCTCCGTTGTCAA 158 GGCCTCCGTTGTCAAC 159 GCCTCCGTTGTCAACT 160 CCTCCGTTGTCAACTT 161 CTCCGTTGTCAACTTA 162 TCCGTTGTCAACTTAC 163 CCGTTGTCAACTTACT 164 CGTTGTCAACTTACTT 165 GTTGTCAACTTACTTT 166 TTGTCAACTTACTTTA 167 TGTCAACTTACTTTAC 168 GTCAACTTACTTTACA 169 TCAACTTACTTTACAA 170 CAACTTACTTTACAAT 171 CATGTTCTTGTGGAA 172 ATGTTCTTGTGGAAG 173 TGTTCTTGTGGAAGT 174 GTTCTTGTGGAAGTC 175 TTCTTGTGGAAGTCT 176 TCTTGTGGAAGTCTT 177 CTTGTGGAAGTCTTG 178 TTGTGGAAGTCTTGG 179 TGTGGAAGTCTTGGC 180 GTGGAAGTCTTGGCC 181 TGGAAGTCTTGGCCT 182 GGAAGTCTTGGCCTC 183 GAAGTCTTGGCCTCC 184 AAGTCTTGGCCTCCG 185 AGTCTTGGCCTCCGT 186 GTCTTGGCCTCCGTT 187
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: TCTTGGCCTCCGTTG 188 CTTGGCCTCCGTTGT 189 TTGGCCTCCGTTGTC 190 TGGCCTCCGTTGTCA 191 GGCCTCCGTTGTCAA 192 GCCTCCGTTGTCAAC 193 CCTCCGTTGTCAACT 194 CTCCGTTGTCAACTT 195 TCCGTTGTCAACTTA 196 CCGTTGTCAACTTAC 197 CGTTGTCAACTTACT 198 GTTGTCAACTTACTT 199 TTGTCAACTTACTTT 200 TGTCAACTTACTTTA 201 GTCAACTTACTTTAC 202 TCAACTTACTTTACA 203 CAACTTACTTTACAA 204 AACTTACTTTACAAT 205 CATGTTCTTGTGGA 206 ATGTTCTTGTGGAA 207 TGTTCTTGTGGAAG 208 GTTCTTGTGGAAGT 209 TTCTTGTGGAAGTC 210 TCTTGTGGAAGTCT 211 CTTGTGGAAGTCTT 212 TTGTGGAAGTCTTG 213 TGTGGAAGTCTTGG 214 GTGGAAGTCTTGGC 215 TGGAAGTCTTGGCC 216 GGAAGTCTTGGCCT 217 GAAGTCTTGGCCTC 218 AAGTCTTGGCCTCC 219
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: AGTCTTGGCCTCCG 220 GTCTTGGCCTCCGT 221 TCTTGGCCTCCGTT 222 CTTGGCCTCCGTTG 223 TTGGCCTCCGTTGT 224 TGGCCTCCGTTGTC 225 GGCCTCCGTTGTCA 226 GCCTCCGTTGTCAA 227 CCTCCGTTGTCAAC 228 CTCCGTTGTCAACT 229 TCCGTTGTCAACTT 230 CCGTTGTCAACTTA 231 CGTTGTCAACTTAC 232 GTTGTCAACTTACT 233 TTGTCAACTTACTT 234 TGTCAACTTACTTT 235 GTCAACTTACTTTA 236 TCAACTTACTTTAC 237 CAACTTACTTTACA 238 AACTTACTTTACAA 239 ACTTACTTTACAAT 240
[00617] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 a 20 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreen- de uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 a 19 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oli-
gonucleotídeo tem um comprimento de 15 nucleotídeos. Em uma mo- dalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 16 nucleotí- deos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um compri- mento de 17 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotí- deo tem um comprimento de 18 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 19 nucleotídeos.
[00618] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 18 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 18- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 106. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 106.
[00619] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 17 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 17- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107 a
138. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107 a
138.
[00620] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 16 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 16- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 139 a
171. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 139 a
171.
[00621] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 15 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 15- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 172 a
205. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 172 a 205.
[00622] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 76 a 240, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 14- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 206 a
240. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 206 a
240. ÉXON 45
[00623] A sequência do Éxon 45 do gene DMD (SEQ ID NO: 408) é mostrada abaixo: Éxon 45
[00624] A sequência de transcrição correspondente da parte desta- cada é:
5' GG TATCTTACAG GAACTCCAGG ATGGCATTGG GCAGCGGCAA ACTGT 3' (SEQ ID NO: 409).
[00625] Os oligonucleotídeos complementares ao Éxon 45 do gene DMD, úteis de acordo com a invenção incluem, porém sem limitação: 5' CC ATAGAATGTC CTTGAGGTCC TACCGTAACC CGTCGCCGTT TGACA 7' (SEQ ID NO: 410) e qualquer uma das sequências apresen- tadas na Tabela 5. TABELA 5 - ÉXON 45 Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: CCATAGAATGTCCTTGAG 241 CATAGAATGTCCTTGAGG 242 ATAGAATGTCCTTGAGGT 243 TAGAATGTCCTTGAGGTC 244 AGAATGTCCTTGAGGTCC 245 GAATGTCCTTGAGGTCCT 246 AATGTCCTTGAGGTCCTA 247 ATGTCCTTGAGGTCCTAC 248 TGTCCTTGAGGTCCTACC 249 GTCCTTGAGGTCCTACCG 250 TCCTTGAGGTCCTACCGT 251 CCTTGAGGTCCTACCGTA 252 CTTGAGGTCCTACCGTAA 253 TTGAGGTCCTACCGTAAC 254 TGAGGTCCTACCGTAACC 255 GAGGTCCTACCGTAACCC 256 AGGTCCTACCGTAACCCG 257 GGTCCTACCGTAACCCGT 258 GTCCTACCGTAACCCGTC 259 TCCTACCGTAACCCGTCG 260 CCTACCGTAACCCGTCGC 261 CTACCGTAACCCGTCGCC 262 TACCGTAACCCGTCGCCG 263
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: ACCGTAACCCGTCGCCGT 264 CCGTAACCCGTCGCCGTT 265 CGTAACCCGTCGCCGTTT 266 GTAACCCGTCGCCGTTTG 267 TAACCCGTCGCCGTTTGA 268 AACCCGTCGCCGTTTGAC 269 ACCCGTCGCCGTTTGACA 270 CCATAGAATGTCCTTGA 271 CATAGAATGTCCTTGAG 272 ATAGAATGTCCTTGAGG 273 TAGAATGTCCTTGAGGT 274 AGAATGTCCTTGAGGTC 275 GAATGTCCTTGAGGTCC 276 AATGTCCTTGAGGTCCT 277 ATGTCCTTGAGGTCCTA 278 TGTCCTTGAGGTCCTAC 279 GTCCTTGAGGTCCTACC 280 TCCTTGAGGTCCTACCG 281 CCTTGAGGTCCTACCGT 282 CTTGAGGTCCTACCGTA 283 TTGAGGTCCTACCGTAA 284 TGAGGTCCTACCGTAAC 285 GAGGTCCTACCGTAACC 286 AGGTCCTACCGTAACCC 287 GGTCCTACCGTAACCCG 288 GTCCTACCGTAACCCGT 289 TCCTACCGTAACCCGTC 290 CCTACCGTAACCCGTCG 291 CTACCGTAACCCGTCGC 292 TACCGTAACCCGTCGCC 293 ACCGTAACCCGTCGCCG 294 CCGTAACCCGTCGCCGT 295
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: CGTAACCCGTCGCCGTT 296 GTAACCCGTCGCCGTTT 297 TAACCCGTCGCCGTTTG 298 AACCCGTCGCCGTTTGA 299 ACCCGTCGCCGTTTGAC 300 CCCGTCGCCGTTTGACA 301 CCATAGAATGTCCTTG 302 CATAGAATGTCCTTGA 303 ATAGAATGTCCTTGAG 304 TAGAATGTCCTTGAGG 305 AGAATGTCCTTGAGGT 306 GAATGTCCTTGAGGTC 307 AATGTCCTTGAGGTCC 308 ATGTCCTTGAGGTCCT 309 TGTCCTTGAGGTCCTA 310 GTCCTTGAGGTCCTAC 311 TCCTTGAGGTCCTACC 312 CCTTGAGGTCCTACCG 313 CTTGAGGTCCTACCGT 314 TTGAGGTCCTACCGTA 315 TGAGGTCCTACCGTAA 316 GAGGTCCTACCGTAAC 317 AGGTCCTACCGTAACC 318 GGTCCTACCGTAACCC 319 GTCCTACCGTAACCCG 320 TCCTACCGTAACCCGT 321 CCTACCGTAACCCGTC 322 CTACCGTAACCCGTCG 323 TACCGTAACCCGTCGC 324 ACCGTAACCCGTCGCC 325 CCGTAACCCGTCGCCG 326 CGTAACCCGTCGCCGT 327
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: GTAACCCGTCGCCGTT 328 TAACCCGTCGCCGTTT 329 AACCCGTCGCCGTTTG 330 ACCCGTCGCCGTTTGA 331 CCCGTCGCCGTTTGAC 332 CCGTCGCCGTTTGACA 333 CCATAGAATGTCCTT 334 CATAGAATGTCCTTG 335 ATAGAATGTCCTTGA 336 TAGAATGTCCTTGAG 337 AGAATGTCCTTGAGG 338 GAATGTCCTTGAGGT 339 AATGTCCTTGAGGTC 340 ATGTCCTTGAGGTCC 341 TGTCCTTGAGGTCCT 342 GTCCTTGAGGTCCTA 343 TCCTTGAGGTCCTAC 344 CCTTGAGGTCCTACC 345 CTTGAGGTCCTACCG 346 TTGAGGTCCTACCGT 347 TGAGGTCCTACCGTA 348 GAGGTCCTACCGTAA 349 AGGTCCTACCGTAAC 350 GGTCCTACCGTAACC 351 GTCCTACCGTAACCC 352 TCCTACCGTAACCCG 353 CCTACCGTAACCCGT 354 CTACCGTAACCCGTC 355 TACCGTAACCCGTCG 356 ACCGTAACCCGTCGC 357 CCGTAACCCGTCGCC 358 CGTAACCCGTCGCCG 359
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: GTAACCCGTCGCCGT 360 TAACCCGTCGCCGTT 361 AACCCGTCGCCGTTT 362 ACCCGTCGCCGTTTG 363 CCCGTCGCCGTTTGA 364 CCGTCGCCGTTTGAC 365 CGTCGCCGTTTGACA 366 CCATAGAATGTCCT 367 CATAGAATGTCCTT 368 ATAGAATGTCCTTG 369 TAGAATGTCCTTGA 370 AGAATGTCCTTGAG 371 GAATGTCCTTGAGG 372 AATGTCCTTGAGGT 373 ATGTCCTTGAGGTC 374 TGTCCTTGAGGTCC 375 GTCCTTGAGGTCCT 376 TCCTTGAGGTCCTA 377 CCTTGAGGTCCTAC 378 CTTGAGGTCCTACC 379 TTGAGGTCCTACCG 380 TGAGGTCCTACCGT 381 GAGGTCCTACCGTA 382 AGGTCCTACCGTAA 383 GGTCCTACCGTAAC 384 GTCCTACCGTAACC 385 TCCTACCGTAACCC 386 CCTACCGTAACCCG 387 CTACCGTAACCCGT 388 TACCGTAACCCGTC 389 ACCGTAACCCGTCG 390 CCGTAACCCGTCGC 391
Sequência (5 'a 7') SEQ ID NO: CGTAACCCGTCGCC 392 GTAACCCGTCGCCG 393 TAACCCGTCGCCGT 394 AACCCGTCGCCGTT 395 ACCCGTCGCCGTTT 396 CCCGTCGCCGTTTG 397 CCGTCGCCGTTTGA 398 CGTCGCCGTTTGAC 399 GTCGCCGTTTGACA 400
[00626] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 400. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 270, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 a 20 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreen- de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 400, em que o oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 a 19 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 15 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 16 nucle- otídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um compri- mento de 17 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotí- deo tem um comprimento de 18 nucleotídeos. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 19 nucleotídeos.
[00627] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 400, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 18 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 18- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a
270. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 270.
[00628] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 400, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 17 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 17- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 271 a
301. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 271 a
301.
[00629] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 400, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 16 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 16- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 302 a
333. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 302 a
333.
[00630] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 400, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 15 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 15- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 334 a 366. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID
NOs: 334 a 366.
[00631] Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 241 a 400, em que o dito oligonucleotídeo tem um comprimento de 14 nucleotídeos. Em tais modalidades, o dito oligonucleotídeo é um 14- mer. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 367 a
240. Em uma modalidade, o dito oligonucleotídeo consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 367 a 240.
[00632] A invenção também fornece oligonucleotídeos que são complementares ao silenciador de splicing intrônico N1 (ISS-N1) em Atrofia Muscular Espinhal, por exemplo TCACTTTCATAATGCTGG (SEQ ID NO: 411).
[00633] A prática da presente invenção emprega, a menos que indi- cado de outra forma, técnicas convencionais de química, biologia mo- lecular, microbiologia, DNA recombinante, genética, imunologia, biolo- gia celular, cultura celular e biologia transgênica, que estão dentro da habilidade na técnica. Consultar, por exemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2ª Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); Sambrook e Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Labora- tory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie e Fink, 1991; Harlow e Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby e Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller e M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer e Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I a IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6a Edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipula- ting the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A gui- de for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4ª Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000).
[00634] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados que são comumente entendidos por uma pessoa de habi- lidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora mé- todos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente in- venção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas no presente documento são incorporadas a título de re- ferência em sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especifica- ção, incluindo definições, prevalecerá.
[00635] Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a limitar as várias modalidades da invenção descritas no presente documento.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
AFINIDADE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ALFA ANOMÉRICOS EM RELAÇÃO A RNA PARALELO COMPLEMENTAR
[00636] A afinidade em relação ao RNA paralelo complementar foi avaliada para vários oligonucleotídeos alfa anoméricos por experimen- tos de fusão de UV (Tabela 1).
[00637] As temperaturas de fusão variam de 53,3 °C a 77,0 °C, de- monstrando a boa afinidade de alfa oligonucleotídeos anoméricos para seus complementos de RNA. TABELA 1: Dados de Tm de curvas de fusão de UV (260 nm) de oligo- nucleotídeos alfa anoméricos em duplex com RNA paralelo comple- mentar. Entrada SEQ ID NO: Sequência a Tm (°C) vs. RNA paralelo ON1 b,c 412 5'-(tccattcggctccaa*palm)-7' 76,2 ON2 b,c 413 5′-(t*c*c*a*t*t*c*g*g*c*t*c*c*a*a)-7′ 77,0 ON3 d 414 5'-(gatctttacggtagaagg)-7' 72,5 ON4 d 415 5'-(atctttacggtagaagga)-7' 70,2 ON5 d 416 5'-(tctttacggtagaaggaa)-7' 69,1 ON6 d 417 5'-(ctttacggtagaaggaac)-7' 68,7 ON7 d 418 5'-(tttacggtagaaggaact)-7' 69,3 ON8 d 419 5'-(ttacggtagaaggaacta)-7' 70,8 ON9 d 420 5'-(tacggtagaaggaactac)-7' 71,0 ON10 d 421 5'-(aactagttcaatatttta)-7' 53,3 ON11 d 422 5'-(ctagttcaatattttagt)-7' 54,7 ON12 d 423 5'-(agttcaatattttagtgt)-7' 57,4 ON13 d 424 5'-(ttcaatattttagtgtct)-7' 54,7 ON14 d 425 5'-(caatattttagtgtctcc)-7' 60,4 a a, g, t, c correspondem a adenina, guanina, timina e metilcitosina modificadas por abc-DNA respectivamente, * denota uma ligação fosfo- rotioato, palma corresponde a um ácido palmítico conjugado através de um ligante alquila ao oligonucleotídeo b conc. total da fita 2 µM em NaH2PO4 a 10 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,0 c Tm de duplexos não modificados, DNA/RNA: 67,4 °C d conc. total da fita 2 µM em NaH2PO4 a 10 mM, NaCl a 75 mM, pH 7,0 EXEMPLO 2
ESTABILIDADE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ALFA ANOMÉRICOS EM CONDIÇÕES ÁCIDAS
[00638] A estabilidade ácida de ON1 foi avaliada diluindo ON1 em 10 µM com uma solução tampão de acetato (a 0,1 M, pH = 4,5) e in- cubando a solução resultante durante 24 horas a 37 °C. O ON1 não tratado foi usado como referência. A integridade de ON1 foi medida por LC-MS. Nenhuma diferença pode ser observada entre o cromato- grama e o padrão de fragmentação de ON1 não tratado (Figura 1A, Figura 1B) e o cromatograma e o padrão de fragmentação de ON1 tra- tado por 24 horas em condições ácidas (Figura 1C, Figura 1D). A ex- periência demonstra a estabilidade de oligonucleotídeos alfa anoméri- cos em condições ácidas que podem ser encontradas, por exemplo, em compartimentos de lisossomas de células. EXEMPLO 3 ESTABILIDADE TÉRMICA DE ALFA OLIGONUCLEOTÍDEOS ANO-
MÉRICOS
[00639] A estabilidade térmica de ON1 foi avaliada diluindo ON1 em 10 µM com uma solução de PBS (NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, pH = 7,4) e incubando a solu- ção resultante durante 60 min a 95 °C. O ON1 não tratado foi usado como referência. A integridade de ON1 foi medida por LC-MS. Ne- nhuma diferença pode ser observada entre o cromatograma e o pa- drão de fragmentação de ON1 não tratado (Figura 2A, Figura 2B) e o cromatograma e o padrão de fragmentação de ON1 aquecido a 95 °C
(Figura 2C, Figura 2D). O experimento demonstra a estabilidade quí- mica de oligonucleotídeos alfa anoméricos em soluções aquosas. EXEMPLO 4 BIOESTABILIDADE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ALFA ANOMÉRI-
COS
[00640] ON1 e seu oligonucleotídeo natural correspondente foram diluídos em 10 μM em uma mistura 1:1 de H2O e soro de camundongo (Sigma). As reações foram realizadas em escala de 20 μl e incubadas a 37 °C. As reações de controle foram realizadas incubando os oligo- nucleotídeos a 10 μM em H2O a 37 °C por 24 horas. As reações foram interrompidas em momentos específicos (1 h, 2 h, 4 h e 24 h) por adi- ção de formamida (20 μl). As misturas resultantes foram armazenadas a -20 °C antes de serem desnaturadas por calor durante 5 min a 90 °C e depois analisadas por PAGE desnaturante a 20% (Figura 3). A vi- sualização foi realizada com uma solução stains-all de acordo com o protocolo padrão. O resultado do experimento mostra a digestão com- pleta da fita de DNA natural já após 4 horas, em que ON1 permaneceu completamente estável mesmo após 24 horas. EXEMPLO 5 LIGAÇÃO À ALBUMINA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS ALFA ANOMÉ-
RICOS CONJUGADOS A GRUPOS LIPÍDICOS
[00641] A ligação de ON1 à albumina foi avaliada por um ensaio de mudança de mobilidade (Figura 4). As soluções de teste foram prepa- radas incubando ON1 a 40 µM por uma hora a 37 °C, em soluções de PBS (NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, pH = 7,4) contendo 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0 e 1,5 de equi- valente de albumina (albumina de soro de camundongo, pó liofilizado, ≥ 96% (Sigma-Aldrich)). 10 µl de cada amostra foram analisados por PAGE nativo a 10% (40 V, 170 min, em execução a 7 °C). A visualiza- ção foi realizada com uma solução stains-all de acordo com o protoco-
lo padrão. As bandas inferiores indicam a presença de ON1 não com- plexado e as bandas superiores indicam a presença de ON1 no com- plexo com albumina. O experimento demonstra que ON1 pode se ligar de forma eficiente à albumina em uma concentração de albumina ≥ 0,3 equivalente.
[00642] A quantificação da ligação de albumina de ON1 foi avaliada por experimentos de ultrafiltração (Figura 5). Resumidamente, as solu- ções de teste foram preparadas incubando ON1 a 55 µM durante uma hora a 37 °C, em soluções de PBS (NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, pH = 7,4) contendo 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,4, 0,6 e 0,7 de equivalente de albumina (albumina de soro de camundongo, pó liofilizado, ≥96% (Sigma-Aldrich)). As soluções foram então filtradas com Spin Column (Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (Sigma-Aldrich)). A porcentagem de ON1 não complexado foi calculada medindo a absorbância de ON1 nos filtrados com um es- pectrofotômetro Nanodrop e tomando a solução com 0 equivalente de albumina como referência. O resultado da experiência mostra que, com 0,3 de equivalente de albumina, apenas 14% do oligonucleotídeo permanece não complexado em solução.
[00643] A ligação de ON1 à albumina no soro de camundongo (Sigma-Aldrich) foi avaliada por um ensaio de mudança de mobilidade (Figura 6). As soluções de teste foram preparadas incubando ON1 a 40 µM por uma hora a 37 °C, em soluções de PBS (NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, pH = 7,4) con- tendo glicerol a 25% e volume a 0%, 1,25%, 5,0%, 12,5% e 25,0% de soro de camundongo. A solução de controle foi preparada incubando ON1 a 40 µM por uma hora a 37 °C, em soluções de PBS contendo glicerol a 25% e albumina de camundongo a 80 µM. 10 µl de cada amostra foram analisados por PAGE nativo a 15% (60 V, 260 min). A visualização foi realizada com uma solução stains-all de acordo com o protocolo padrão. As bandas inferiores indicam a presença de ON1 não complexado e as bandas superiores indicam a presença de ON1 no complexo com albumina. O resultado da experiência demonstra que ON1 pode ligar-se de forma eficiente à albumina no soro. EXEMPLO 6
PRESENÇA E DISSOLUÇÃO DE AGREGADOS
[00644] A formação e dissolução dos agregados foram analisadas com um Zetasizer Nano ZS (Figura 7). ON1 foi dissolvido em uma so- lução de PBS (NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, pH = 7,4) e a uma concentração de 7,5mg/ml. A presença inicial de nanopartículas foi registrada (0 min). A solução foi, então, aquecida a 95 °C e a presença de nanopartículas foi registrada após 10 min, 20 min e 30 min de aquecimento. A solução foi, então, deixada em temperatura ambiente por 24 horas e então a presença de nanopartículas foi novamente registrada. Inicialmente, um sinal forte pode ser medido para partículas com um tamanho em torno de 1.000 nm. O aquecimento da solução levará ao desaparecimento do sinal. O resultado da experiência demonstra que um oligonucleotídeo conjuga- do a uma porção química lipofílica formará agregados em uma solução aquosa. No entanto, o aquecimento da solução por pelo menos 20 min a 95 °C garantirá a dispersão dos agregados. Os agregados não rea- parecerão após permanecerem à temperatura ambiente por 24 horas. EXEMPLO 7
DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE SALTO DE ÉXON
[00645] O salto de éxon envolve o uso de oligonucleotídeos antis- senso para fazer com que um ou mais éxons sejam excluídos do mRNA maduro. Através do uso de salto de éxon, pode-se fazer com que um ou mais éxons sejam excluídos do mRNA maduro, resultando em um mRNA maduro que está na estrutura. O salto de um éxon pode ser induzido pela ligação de oligonucleotídeos antissenso direcionados a um ou ambos os locais de splice, ou sequências de éxon internas. Uma vez que um éxon só será incluído no mRNA quando ambos os locais de splice forem reconhecidos pelo complexo spliceosome, os locais de splice são alvos óbvios para oligonucleotídeos antissenso.
[00646] Para se determinar se um oligonucleotídeo conjugado com grupo lipídico abc-DNA da invenção causa salto de éxon do pré-mRNA de um gene de interesse, as células são incubadas com o conjugado de oligonucleotídeo direcionado a um determinado éxon (ou éxons) por um período de tempo. Em certas modalidades, as células são transfectadas com lipofectamina. O salto de éxon é detectado por meio da reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) ou sequenciamento de DNA. O RNA total é extraído das células e o RT-PCR é realizado no éxon-alvo e o tamanho do produto de RT-PCR é avaliado por eletroforese em gel. Se o salto de éxon tiver ocorrido, o produto não conterá o éxon-alvo, e o tamanho deste produto será de um tamanho previsivelmente menor, em comparação com um produto contendo o éxon-alvo. Da mesma forma, pode-se sequenciar o mRNA maduro através do éxon-alvo para determinar se a sequência do éxon- alvo está ausente do mRNA maduro.
[00647] Para se determinar ainda mais o efeito de um oligonucleotí- deo conjugado de um grupo de lipídeo abc-DNA da invenção, a restau- ração da distrofina é validada por western blot de uma amostra retira- da de uma biópsia muscular, e a % de fibras musculares positivas para distrofina são determinadas por microscopia.
[00648] Pelo salto direcionado de um éxon específico, um fenótipo DMD pode ser convertido no fenótipo BMD mais suave. O salto de éxon é detectado pela incubação de uma célula de mioblasto humano diferenciado, uma célula muscular derivada de um paciente com DMD ou um paciente saudável com um oligonucleotídeo antissenso abc- DNA conjugado com grupo de lipídios que se liga ao pré-mRNA do gene DMD, conforme descrito neste Exemplo. Alternativamente, e também como descrito neste exemplo, as células são derivadas de um camundongo MDX, um modelo de camundongo para DMD. Além de comparar o nível de salto de éxon em uma célula normal com o nível de salto de éxon em uma célula DMD, o nível de salto de éxon em uma célula derivada de um paciente DMD ou camundongo MDX é comparado ao nível de salto de éxon na ausência do oligonucleotídeo conjugado com o grupo abc-DNA lipídico. Em certas modalidades, a atividade do oligonucleotídeo conjugado do grupo abc-DNA lipídico de interesse é comparada ao nível de salto de éxon após a administração de eteplirsen ou drisapersen.
[00649] No presente exemplo, a concentração do oligonucleotídeo antissenso foi estimada medindo a absorvância de uma alíquota diluí- da a 260 nm. Quantidades especificadas dos oligonucleotídeos antis- senso (AON) foram então testadas quanto à sua capacidade de induzir salto de éxon em um ensaio in vitro, conforme descrito abaixo.
[00650] Resumidamente, os experimentos foram conduzidos em culturas de mioblasto imortalizadas de controle de camundongos (C2C12) ou em culturas de mioblastos imortalizadas de controle hu- mano (KM155). As células foram propagadas e diferenciadas em mio- tubos usando técnicas de cultura padrão. As células foram transfecta- das com os AONs usando, como reagente de transfecção, Lipofecta- mina para cultura de células de camundongo e oligofectamina para cultura de células humanas. AON complementar com um esqueleto 2'- OMe-fosforoditioato (2OMePS) e um 2OMePS embaralhado (não fun- cional) foram usados como controles positivo e negativo, respectiva- mente.
[00651] Após 24 horas, o RNA total foi extraído e a análise molecu- lar foi conduzida. A amplificação da transcriptase reversa (RT-PCR), usando uma reação de PCR de duas etapas (aninhada), foi realizada para estudar as regiões-alvo do pré-mRNA da distrofina ou rearranjos exônicos induzidos.
[00652] Para a análise dos AONs com o objetivo de induzir o salto do éxon 23, o RT-PCR foi realizado na região que abrange o éxon 23. Após a síntese de cDNA, a primeira rodada de PCR foi realizada usando iniciadores específicos nos éxons de camundongo 21 e 26 (re- gião 21 a 26) e a segunda rodada de PCR foi realizada usando inicia- dores específicos nos éxons de camundongo 22 e 24 (região 22 a 24)
[00653] Para analisar os AONs com o objetivo de induzir o salto do éxon 51, o RT-PCR foi conduzido na região que abrange o éxon 51. Após a síntese de cDNA, a primeira rodada de PCR foi realizada usando iniciadores específicos nos éxons humanos 48 e 53 (região 48 a 53) e a segunda rodada de PCR foi realizada usando iniciadores es- pecíficos nos éxons humanos 49 e 52 (região 49 a 52).
[00654] Os tamanhos de produto esperados para os produtos não saltados e saltados foram calculados. A intensidade dos produtos da reação foi estimada em um gel de agarose, incluindo um padrão de tamanho. Por meio disso, uma tendência potencial deve ser conside- rada, uma vez que produtos mais curtos ou ignorados por éxon ten- dem a ser amplificados com mais eficiência do que produtos maiores, levando a uma superestimativa da eficiência de salto. Bandas indican- do produto de salto de éxon podem ser medidas em células de ca- mundongo (Figura 8) ou em células humanas (Figura 9A, Figura 9B). O resultado da experiência demonstra a capacidade dos oligonucleotí- deos alfa anoméricos para modular a expressão gênica in vitro. A ca- pacidade de salto de éxon do conjugado inventivo foi confirmada in vivo no modelo de camundongo mdx de distrofia muscular. Por meio disso, os camundongos mdx23 receberam 12 injeções intravenosas semanais (50 mg/kg/semana) do oligonucleotídeo conjugado ao grupo lipídico abc-DNA da invenção tendo uma sequência que compreende a
SEQ ID NO: 412. Após o tratamento, os tecidos do diafragma e gas- trocnêmico foram isolados e o salto de éxon determinado. EXEMPLO 8
SALTO DE ÉXON EM UM MODELO DE CAMUNDONGO HDMDDEL52/MDX
[00655] A eficácia de salto de éxon é determinada no modelo de camundongo hDMDdel52/mdx de distrofia muscular. Os camundongos recebem injeções intravenosas de um oligonucleotídeo conjugado com um grupo lipídico abc-DNA que tem uma sequência que compreende a SEQ ID NO: 418, um oligômero fosforodiamidato morfolino (PMO) cor- respondente ou solução salina. Os camundongos recebem doze inje- ções semanais (50 mg/kg/semana) do oligonucleotídeo. Após o trata- mento, os seguintes tecidos são isolados: coração, diafragma, tibial anterior, gastrocnêmico, quadríceps, tríceps, cérebro, fígado e rim, e o salto de éxon é determinado. Em certas modalidades, os camundon- gos são tratados com etiplersen ou drisapersen no lugar do oligonu- cleotídeo conjugado com grupo lipídeo abc-DNA. O salto de éxon é determinado por RT-PCR, Western blot, imunofluoresência e/ou PCR digital.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo caracteri- zado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende pelo menos dois resíduos biciclo-DNA alfa anoméricos (abc-DNA) conectados por uma ligação fosfodiéster e em que o dito grupo lipídico é covalentemente ligado ao oligonucleotídeo.
2. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito grupo lipídico é cova- lentemente ligado ao oligonucleotídeo por meio de um ligante.
3. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a reivin- dicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende de 12 a 24 resíduos.
4. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito oli- gonucleotídeo compreende de 14 a 19 resíduos.
5. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito re- síduo abc-DNA tem a Fórmula (V) T3
O 5' Bx 7' T4 (V) em que independentemente para cada um dos pelo menos dois resíduos abc-DNA de Fórmula (IV) um dentre T3 ou T4 é um grupo de ligação nucleosídica; o outro dentre T3 e T4 é OR1, OR2, um grupo de terminal 5', um grupo de terminal 7' ou um grupo de ligação nucleosídica, em que R1 é H ou um grupo protetor de hidroxila, e R2 é uma porção química de fósforo; e Bx é uma nucleobase.
6. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que todos os resíduos são resíduos abc-DNA.
7. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os ditos pelo menos dois resíduos abc-DNA são conectados por meio de liga- ções fosfodiéster a resíduos adjacentes.
8. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que todos os resíduos são resíduos abc-DNA e estão conectados por meio de liga- ções fosfodiéster.
9. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito grupo lipídico está covalentemente ligado a um resíduo terminal do oligonucleotídeo.
10. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende resíduos conectados através de um gru- po de ligação nucleosídica contendo fósforo selecionado do grupo que consiste em: um grupo de ligação fosfodiéster, um grupo de ligação fosfotriéster, um grupo de ligação fosforotioato, um grupo de ligação fosforoditioato, um grupo de ligação fosfonato, um grupo de ligação fosfonotioato, um grupo de ligação fosfinato, uma ligação fosfortioami- dato e um grupo de ligação fosforamidato.
11. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 2 a 10, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante de hidrocarboneto ou um ligante de polietilenogli- col (PEG).
12. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de que o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em: um ligante amino-alquil-fosforotioato, um ligante amino-PEG-fosforotioato, um li- gante alfa-carboxilato-amino-alquil fosforotioato, e um ligante alfa- carboxilato-amino-PEG-fosforotioato.
13. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 2 a 12, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um grupo clivável.
14. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o grupo lipídico é um grupo derivado de ácido graxo.
15. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a reivin- dicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é saturado ou insaturado.
16. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a reivin- dicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo tem um comprimento de 4 a 28 átomos de carbono.
17. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o grupo derivado de ácido graxo compreende um grupo de ácido carbo- xílico.
18. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é selecionado a partir dos ácidos graxos apresentados na Tabela 1 ou Tabela 2.
19. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ácido hexadecanoico.
20. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o grupo lipídico está ligado ao oligonucleotídeo por meio de um grupo tiofosfato.
21. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o conjugado de oligonucleotídeo se liga ao pré-mRNA correspondente a uma porção do éxon 51 do gene da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).
22. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a reivin- dicação 21, caracterizado pelo fato de que o conjugado de oligonu- cleotídeo compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 404 e 414 a 425.
23. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende qualquer uma das sequências forneci- das na Tabela 3.
24. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o conjugado de oligonucleotídeo se liga ao pré-mRNA correspondente a uma porção do éxon 53 do gene DMD.
25. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a reivin- dicação 24, caracterizado pelo fato de que o conjugado de oligonu- cleotídeo compreende qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 4.
26. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o conjugado de oligonucleotídeo se liga ao pré-mRNA correspondente a uma porção do éxon 45 do gene DMD.
27. Conjugado de oligonucleotídeo, de acordo com a reivin- dicação 26, caracterizado pelo fato de que o conjugado de oligonu- cleotídeo compreende qualquer uma das sequências fornecidas na
Tabela 5.
28. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de grupo lipídico e oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, em combi- nação com um veículo adequado.
29. Método para alterar a expressão de um gene caracteri- zado pelo fato de que é mediante permissão de hibridização de um conjugado de oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, com um RNA expresso a partir do dito gene, sendo que o dito oligonucleotídeo compreende uma sequência que é complementar a uma porção do dito RNA.
30. Método para induzir o salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina humana em um indivíduo com Distrofia Muscular de Du- chenne (DMD) ou Distrofia Muscular de Becker (BMD), ou em uma cé- lula derivada do indivíduo, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um conjugado de oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, que com- preende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 404 e 414 a 425, em que o conjugado de oligonucleotídeo induz salto do éxon no indivíduo ou na célula, e em que o mRNA produzido a partir do salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina codifica uma proteína distrofina funcional ou uma proteína distrofina de um indivíduo com Becker.
31. Método de tratamento de Distrofia Muscular de Du- chenne (DMD) ou Distrofia Muscular de Becker (BMD) em um indiví- duo ou em uma célula derivada do indivíduo induzindo o salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina humana, sendo que o método é caracte- rizado pelo fato de que compreende fornecer ao indivíduo ou à célula uma composição que compreende um conjugado de oligonucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, que com-
preende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5, 22 a 24, 36 a 39, 51 a 55, 404 e 414 a 425, em que o conjugado de oligonucleotídeo induz o salto do éxon no indiví- duo ou na célula, e em que o mRNA produzido a partir do salto do éxon 51 do pré-mRNA da distrofina codifica uma proteína distrofina funcional ou uma proteína distrofina de um indivíduo com Becker.
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