JP2024518564A - 中枢神経系のニューロンを標的とするための脂質コンジュゲーション - Google Patents
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Abstract
中枢神経系のニューロンにおける標的遺伝子の発現を阻害するかまたは低下させるオリゴヌクレオチドコンジュゲートが本明細書に提供される。また、それを含む組成物およびその使用、特にＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害および／または状態を治療することに関する使用も提供される。
Description
相互関連出願
本出願は、２０２１年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１８７，２５０号、および２０２１年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２７６，４０４号の利益を主張する。それらの内容全体は、この参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１８７，２５０号、および２０２１年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２７６，４０４号の利益を主張する。それらの内容全体は、この参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年５月９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＤＩＣＮ＿００７＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５と命名され、サイズは４７，０５９バイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年５月９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＤＩＣＮ＿００７＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５と命名され、サイズは４７，０５９バイトである。
本開示は、中枢神経系のニューロンにおける標的遺伝子の阻害に有用な脂質部分に結合されたオリゴヌクレオチドに関する。具体的には、本開示は、オリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート、その調製方法、その化学構成、および本明細書に提供される説明に従ってコンジュゲートされた核酸およびオリゴヌクレオチドを使用して、中枢神経系（以下「ＣＮＳ」と略す）のニューロン（例えば、ＣＮＳの組織または領域）における標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害または低減する）方法に関する。本開示はまた、本明細書のコンジュゲートを含む薬学的に許容可能な組成物、および様々な疾患または障害の治療において当該組成物を使用する方法を提供する。
修飾核酸による遺伝子発現の調節は、研究室における研究ツールとしても、クリニックにおける治療的アプローチとしても大きな可能性を示している。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）、アプタマー、リボザイム、エクソンスキッピングおよびスプライス改変オリゴヌクレオチド、免疫調節オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲを含む、いくつかのクラスのオリゴヌクレオチドまたは核酸ベースの治療剤が臨床調査中である。様々な組織、器官、および／または細胞型における機能性を可能にするための関連分子における化学修飾は、ヌクレアーゼ安定性、ＲＮＡ結合親和性、および薬物動態の改善を含む、オリゴヌクレオチド治療剤の課題を克服するのに重要な役割を果たす。性能および治療有効性を改善し最適化するための糖類、核酸塩基、およびホスホジエステル主鎖の修飾を含む、オリゴヌクレオチドに対する様々な化学修飾戦略が過去３０年間に開発されてきた（
、および ）。
、および ）。
ｓｉＲＮＡまたは二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含むＲＮＡｉオリゴヌクレオチドベースの治療剤によって媒介される治療遺伝子サイレンシングは、創薬可能な標的空間の相当な拡大の可能性、および他の薬剤モダリティ（例えば、抗体および／または小分子）によって治療に近づき難い希少疾患を治療する可能性を提供する。肝臓における特定の標的遺伝子の発現を阻害または低減するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドベースの治療剤が開発されており、現在臨床使用されている（
）。肝外細胞、組織、および器官（例えば、中枢神経系またはＣＮＳ）におけるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの開発および臨床使用のための技術的ハードルが依然として残されている。ＣＮＳにおけるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドベースの治療剤によって媒介される治療遺伝子サイレンシングは、神経疾患を治療するために特に興味深いものである（ ）。したがって、肝外細胞、組織、および／または器官（例えば、ＣＮＳ）における標的遺伝子の発現を調節するために、新規かつ有効なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの開発を成功させるための継続的な必要性が当技術分野で存在する。これは、肝外における細胞型のバリアントの性質、ならびに循環パターンおよび受容体型などの細胞膜成分に関する懸念によって複雑化される。
）。肝外細胞、組織、および器官（例えば、中枢神経系またはＣＮＳ）におけるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの開発および臨床使用のための技術的ハードルが依然として残されている。ＣＮＳにおけるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドベースの治療剤によって媒介される治療遺伝子サイレンシングは、神経疾患を治療するために特に興味深いものである（ ）。したがって、肝外細胞、組織、および／または器官（例えば、ＣＮＳ）における標的遺伝子の発現を調節するために、新規かつ有効なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの開発を成功させるための継続的な必要性が当技術分野で存在する。これは、肝外における細胞型のバリアントの性質、ならびに循環パターンおよび受容体型などの細胞膜成分に関する懸念によって複雑化される。
Ｄｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｒｍａ，ＣＨＥＭ．ＢＩＯＬ．２０１２，１９（８）：９３７－５４、Ｗａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．ＭＥＤ．ＣＨＥＭ．２０１６，５９（２１）：９６４５－６７
Ｅｇｌｉ ａｎｄ Ｍａｎｏｈａｒａｎ，ＡＣＣ．ＣＨＥＭ ＲＥＳ．２０１９，５４（４）：１０３６－４７
Ｓｅｈｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ ５９：１３５４－５９
Ｂｏｕｄｒｅａｕ ＆ Ｄａｖｉｄｓｏｎ（２０１０）ＢＲＡＩＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １３３８：１１２－２１
哺乳類ＣＮＳは、細胞、流体および化学物質を含む複雑な組織の系であり、それらが協働して相互作用することで、動き、ナビゲーション、認知、発話、視覚、および感情を含む幅広い機能を可能にする。残念なことに、ＣＮＳの様々な疾患および障害（例えば、神経障害）が公知であり、これらの機能の一部または全てに影響を及ぼし、または破壊する。典型的には、ＣＮＳの疾患および障害に対する治療は、小分子薬剤、抗体、および／または適応療法または行動療法に限定されている。不適切な遺伝子発現に関連するＣＮＳの疾患および障害の治療を開発する継続的な必要性が存在する。
本開示は、少なくとも部分的に、ＣＮＳのニューロンにおける標的遺伝子発現を効果的に低減する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの発見に基づいている。本明細書に提供される例示的な脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、単回投与後、ＣＮＳにおけるニューロン特異的ｍＲＮＡの標的遺伝子発現の低減を実証している。さらに、本明細書に提供される例示的な脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、海馬および前頭皮質などの到達が困難な領域を含む、ＣＮＳ全体にわたる複数の領域における薬理活性を実証している。理論に拘束されるものではないが、疎水性部分（例えば、脂質）は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのＣＮＳへの送達および分布を促進し、それによってニューロンにおける遺伝子ノックダウンの有効性および持続性を増加させる。したがって、本開示は、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドおよびその薬学的に許容可能な組成物を使用して、ＣＮＳにおけるニューロン遺伝子の発現を調節することによって、疾患または障害を治療する方法を提供する。本開示はさらに、ＣＮＳにおけるニューロン遺伝子の発現を調節することによって疾患または障害を治療するための医薬の製造において、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖、および１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、１５～３０個の塩基対の二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、センス鎖は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの脂質部分を含む。
本開示はさらに、部分的に、ＣＮＳの特定の組織のニューロンにおける標的遺伝子発現を効果的に低減するステム－ループを有する、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの発見に基づいている。具体的には、ステム－ループを有する例示的な脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの他の組織（例えば、髄質、小脳、海馬、前頭皮質）において標的遺伝子の発現を同じレベルまで低減することなく、単回投与後の脊髄におけるニューロン特異的ｍＲＮＡの標的遺伝子発現の低減を実証した。理論に拘束されるものではないが、脊髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を優先的に低減するステム－ループを有する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの能力は、そのようなオリゴヌクレオチドが、ＣＮＳの他の領域に影響を与えることなく脊髄の疾患を治療するのに有用であることを示す。したがって、本開示は、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドおよびその薬学的に許容可能な組成物を使用して、脊髄におけるニューロン遺伝子の発現を調節することによって、疾患または障害を治療する方法を提供する。本開示はさらに、脊髄におけるニューロン遺伝子の発現を調節することによって疾患または障害を治療するための医薬の製造において、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖、および１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、１５～３０個の塩基対の二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、センス鎖は、（ｉ）センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの脂質部分と、（ｉｉ）ステム－ループとを含み、ステム－ループは、式：５’－Ｓ１－Ｌ－Ｓ２－３’によって表されるヌクレオチド配列を含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間にループを形成する。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、脂質部分は、以下から選択される。
いくつかの態様では、脂質部分は、炭化水素鎖である。いくつかの態様では、炭化水素鎖は、Ｃ８－Ｃ３０炭化水素鎖である。いくつかの態様では、炭化水素鎖は、Ｃ１６炭化水素鎖である。いくつかの態様では、Ｃ１６炭化水素鎖は、
によって表される。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、脂質部分は、５’末端ヌクレオチドのリボース環の２’炭素にコンジュゲートされている。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、平滑末端である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端で平滑末端である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、平滑末端を含む。いくつかの態様では、平滑末端は、センス鎖の３’末端を構成する。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、アンチセンス鎖は、３’末端に１～４ヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの態様では、オーバーハングは、プリンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、オーバーハング配列は、２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、オーバーハングは、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択される。いくつかの態様では、オーバーハングは、ＧＧまたはＡＡである。いくつかの態様では、オーバーハングは、ＧＧである。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖は、２０～２２個のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、２２～２４個のヌクレオチドである。いくつかの態様では、二本鎖領域は、２０～２２個の塩基対である。いくつかの態様では、センス鎖は、２０個のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドであり、二本鎖領域は、２０個の塩基対である。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖は、３６～３８個のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、２２～２４個のヌクレオチドである。いくつかの態様では、センス鎖は、３６個のヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドであり、二本鎖領域は、２０個の塩基対である。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖は、３６個のヌクレオチドであり、５’から３’に１～３６位を含み、脂質部分は、１位、７位、９位、１０位、１６位、２０位、２３位、２８位、２９位、または３０位でコンジュゲートされている。いくつかの態様では、脂質部分は、２８位でコンジュゲートされている。いくつかの態様では、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドであり、二本鎖領域は、２０個の塩基対である。
他の態様では、本開示は、２２～２４個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、オリゴヌクレオチドの５’末端に２ヌクレオチドオーバーハングおよびオリゴヌクレオチドの３’末端に平滑末端を有する、２０～２２個の塩基対の非対称二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、センス鎖は、センス鎖の５’末端の位置にコンジュゲートされた少なくとも１つの脂質部分を含む。いくつかの態様では、本開示は、２２～２４個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、ならびにセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端を含む平滑末端を有する、２０～２２個の塩基対の非対称二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、センス鎖は、センス鎖の５’末端の位置にコンジュゲートされた少なくとも１つの脂質部分を含む。
いくつかの態様では、脂質部分は、Ｃ１６炭化水素鎖である。いくつかの態様では、Ｃ１６炭化水素鎖は、
によって表される。いくつかの態様では、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドであり、センス鎖は、２０個のヌクレオチドである。いくつかの態様では、２－ヌクレオチドオーバーハングは、プリンを含む。いくつかの態様では、オーバーハングは、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択される。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、相補性の領域は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに対して完全に相補的である。いくつかの態様では、相補性の領域は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに対して完全に相補的である。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾を含む。いくつかの態様では、センス鎖の５’末端ヌクレオチドを除いて、センス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、２’－修飾を含む。いくつかの態様では、脂質にコンジュゲートされたヌクレオチドを除いて、センス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、２’－修飾を含む。いくつかの態様では、２’－修飾は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である。いくつかの態様では、センス鎖のヌクレオチドの約１０～２０％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、センス鎖は、５’から３’に１～２０位を有する２０個のヌクレオチドを含み、８～１１位の各々は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、センス鎖は、５’から３’に１～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８～１１位の各々は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、センス鎖は、５’から３’に１～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８、１０、および１１位の各々は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、センス鎖は、５’から３’に１～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８、９、および１１位の各々は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、アンチセンス鎖は、５’から３’に１～２２位を有する２２個のヌクレオチドを含み、２、３、４、５、７、１０、および１４位の各々は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの態様では、センス鎖の５’末端ヌクレオチドを除いて、残りのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの態様では、脂質部分にコンジュゲートされたヌクレオチドを除いて、残りのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの態様では、アンチセンス鎖は、（ｉ）１位と２位との間、および２位と３位との間、または（ｉｉ）１位と２位との間、２位と３位との間、および３位と４位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置は、５’から３’に１～４とナンバリングされる。いくつかの態様では、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２０位と２１位との間、および２１位と２２位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置は、５’から３’に１～２２とナンバリングされる。いくつかの態様では、センス鎖は、１位と２位との間にホスホロチオエート結合を含み、位置は、５’から３’に１～２とナンバリングされる。いくつかの態様では、センス鎖は、２０個のヌクレオチドの長さであり、センス鎖は、１８位と１９位との間、および１９位と２０位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置は、５’から３’に１～２２とナンバリングされる。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、アンチセンス鎖は、５’末端にリン酸化ヌクレオチドを含み、リン酸化ヌクレオチドは、ウリジンおよびアデノシンから選択される。いくつかの態様では、リン酸化ヌクレオチドは、ウリジンである。いくつかの態様では、アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素は、リン酸類似体を含む。いくつかの態様では、リン酸類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、相補性の領域は、アンチセンス鎖のヌクレオチド２～８位でニューロンｍＲＮＡ標的配列に対して完全に相補的であり、ヌクレオチド位置は、５’から３’にナンバリングされる。いくつかの態様では、相補性の領域は、アンチセンス鎖のヌクレオチド２～１１位でニューロンｍＲＮＡ標的配列に対して完全に相補的であり、ヌクレオチド位置は、５’から３’にナンバリングされる。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、脂質部分は、センス鎖のヌクレオチドのリボース環の２’炭素にコンジュゲートされている。いくつかの態様では、脂質部分は、ループのヌクレオチドのリボース環の２’炭素にコンジュゲートされている。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、ダイサー基質である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、内因性ダイサープロセシングの際に、哺乳動物細胞におけるニューロンｍＲＮＡ発現を低減することができる１９～２１個のヌクレオチドの長さの二本鎖核酸を産生するダイサー基質である。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、中枢神経系（ＣＮＳ）の領域内に位置する。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄、腰髄、腰部後根神経節、頸髄、胸髄、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの領域は、脊髄である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄である。いくつかの態様では、脊髄は、腰髄、胸髄、および頸髄を含む。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、腰髄である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、腰部後根神経節である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、胸髄である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、頸髄である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、髄質である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、海馬である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、体性感覚皮質である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、前頭皮質である。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、
インビトロおよび／またはインビボでのニューロンまたはニューロン集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する。
インビトロおよび／またはインビボでのニューロンまたはニューロン集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する。
前述または関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、脊髄のニューロンまたはニューロン集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの他の領域内の標的ｍＲＮＡの発現と比較して、脊髄のニューロンまたはニューロン集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する。
いくつかの態様では、本開示は、医薬組成物、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤を提供する。
他の態様では、本開示は、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法を提供し、方法は、治療有効量の本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を対象に投与し、それによって対象を治療することを含む。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、急性または慢性の疼痛である。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、神経変性疾患である。
さらにいくつかの態様では、本開示は、オリゴヌクレオチドを対象におけるニューロンまたはニューロン集団に送達する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ニューロンまたはニューロン集団は、ＣＮＳの領域内に位置する。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄、腰髄、胸髄、頸髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄である。いくつかの態様では、脊髄は、腰髄、胸髄、および頸髄を含む。
さらなる態様では、本開示は、細胞、細胞集団、または対象におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減するための方法を提供し、方法は、
ｉ．細胞もしくは細胞集団を、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物と接触させる工程であって、任意選択で、細胞もしくは細胞集団が、ニューロンもしくはニューロン集団である、工程、または
ｉｉ．本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様では、ニューロンｍＲＮＡの発現を低減することは、ｍＲＮＡの量もしくはレベル、タンパク質の量もしくはレベル、またはその両方を低減することを含む。いくつかの態様では、対象は、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、急性または慢性の疼痛である。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、神経変性疾患である。いくつかの態様では、細胞または細胞集団は、ＣＮＳの領域内に位置する。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、投与は、くも膜下腔内である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄、腰髄、腰部後根神経節、胸髄、頸髄、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄である。いくつかの態様では、脊髄は、腰髄、胸髄、および頸髄を含む。
ｉ．細胞もしくは細胞集団を、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物と接触させる工程であって、任意選択で、細胞もしくは細胞集団が、ニューロンもしくはニューロン集団である、工程、または
ｉｉ．本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様では、ニューロンｍＲＮＡの発現を低減することは、ｍＲＮＡの量もしくはレベル、タンパク質の量もしくはレベル、またはその両方を低減することを含む。いくつかの態様では、対象は、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、急性または慢性の疼痛である。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、神経変性疾患である。いくつかの態様では、細胞または細胞集団は、ＣＮＳの領域内に位置する。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、投与は、くも膜下腔内である。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄、腰髄、腰部後根神経節、胸髄、頸髄、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、ＣＮＳの領域は、脊髄である。いくつかの態様では、脊髄は、腰髄、胸髄、および頸髄を含む。
他の態様では、本開示は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドと、任意選択の薬学的に許容可能な担体と、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象への投与のための説明書を含む添付文書とを含む、キットを提供する。いくつかの態様では、添付文書は、くも膜下腔内投与のための説明書を含む。
さらなる態様では、本開示は、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の使用を提供する。いくつかの態様では、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態の治療。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、急性または慢性の疼痛である。いくつかの態様では、疾患、障害、または状態は、神経変性疾患である。
いくつかの態様では、本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンにおいて発現される標的遺伝子の発現を低減するオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート）を提供する。他の態様では、本開示は、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患または障害（例えば、ＣＮＳの疾患）を治療する方法を提供する。他の態様では、本開示は、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な組成物を使用して、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患または障害（例えば、神経疾患および／または不適切な遺伝子発現による）を治療する方法を提供する。他の態様では、本開示は、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患または障害を治療するための医薬の製造において、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。他の態様では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳにおける神経疾患または障害に関連するニューロン標的遺伝子の発現を調節する（例えば、阻害または低減する）ことによって、神経疾患または障害を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示は、ＣＮＳにおける（例えば、ＣＮＳの細胞、組織、または領域における）神経疾患または障害に関連するニューロン標的遺伝子の発現を低減することによって、神経疾患または障害を治療する方法を提供する。
脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド
本開示は、特に、ＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子の発現を低減する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート）を提供する。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡを標的とする。標的遺伝子をコードし、本開示の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによって標的化されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、本明細書では「標的ｍＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳ（例えば、体性感覚皮質（ＳＳ皮質）、海馬（ＨＰ）、線条体、前頭皮質、小脳、髄質、視床下部（ＨＹ）、頸髄（ＣＳＣ）、胸髄（ＴＳＣ）、腰部後根神経節（ＤＲＧ）、および／または腰髄（ＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの外側の標的ｍＲＮＡの発現を低減することなく、ＣＮＳ（例えば、ＳＳ皮質、ＨＰ、ＨＹ、ＣＳＣ、ＴＳＣ、ＤＲＧ、および／またはＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝臓における標的ｍＲＮＡの発現を低減することなく、ＣＮＳ（例えば、ＳＳ皮質、ＨＰ、ＨＹ、ＣＳＣ、ＴＳＣ、および／またはＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝臓における標的ｍＲＮＡの発現を、ＣＮＳにおける場合と同様または類似のレベルまで低減しない。
本開示は、特に、ＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子の発現を低減する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート）を提供する。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡを標的とする。標的遺伝子をコードし、本開示の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによって標的化されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、本明細書では「標的ｍＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳ（例えば、体性感覚皮質（ＳＳ皮質）、海馬（ＨＰ）、線条体、前頭皮質、小脳、髄質、視床下部（ＨＹ）、頸髄（ＣＳＣ）、胸髄（ＴＳＣ）、腰部後根神経節（ＤＲＧ）、および／または腰髄（ＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの外側の標的ｍＲＮＡの発現を低減することなく、ＣＮＳ（例えば、ＳＳ皮質、ＨＰ、ＨＹ、ＣＳＣ、ＴＳＣ、ＤＲＧ、および／またはＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝臓における標的ｍＲＮＡの発現を低減することなく、ＣＮＳ（例えば、ＳＳ皮質、ＨＰ、ＨＹ、ＣＳＣ、ＴＳＣ、および／またはＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝臓における標的ｍＲＮＡの発現を、ＣＮＳにおける場合と同様または類似のレベルまで低減しない。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳ（例えば、体性感覚皮質（ＳＳ皮質）、海馬（ＨＰ）、前頭皮質、小脳、髄質、腰部後根神経節（ＤＲＧ）、および／または腰髄（ＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの外側の標的ｍＲＮＡの発現を低減することなく、ＣＮＳ（例えば、ＳＳ皮質、ＨＰ、前頭皮質、小脳、髄質、ＤＲＧ、および／またはＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝臓における標的ｍＲＮＡの発現を低減することなく、ＣＮＳ（例えば、ＳＳ皮質、ＨＰ、前頭皮質、小脳、髄質、ＤＲＧ、および／またはＬＳＣ）における標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝臓における標的ｍＲＮＡの発現を、ＣＮＳにおける場合と同様または類似のレベルまで低減しない。
ｍＲＮＡ標的配列
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ニューロンｍＲＮＡを含む標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ニューロンｍＲＮＡ内の標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその一部分、断片、もしくは鎖（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖もしくはガイド鎖）は、標的ニューロンｍＲＮＡを含む標的配列に結合またはアニールし、それによって標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、インビボでニューロン標的遺伝子の発現を低減する目的で、標的ニューロンｍＲＮＡを含む標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、特定のニューロン標的配列を標的とする脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによる標的遺伝子発現の低減の量または程度は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの効力と相関する。いくつかの実施形態では、特定のニューロン標的配列を標的とする脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによる標的遺伝子発現の低減の量または程度は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで治療される標的遺伝子発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象または患者における治療効果の量または程度と相関する。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ニューロンｍＲＮＡを含む標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ニューロンｍＲＮＡ内の標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその一部分、断片、もしくは鎖（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖もしくはガイド鎖）は、標的ニューロンｍＲＮＡを含む標的配列に結合またはアニールし、それによって標的遺伝子発現を低減する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、インビボでニューロン標的遺伝子の発現を低減する目的で、標的ニューロンｍＲＮＡを含む標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、特定のニューロン標的配列を標的とする脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによる標的遺伝子発現の低減の量または程度は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの効力と相関する。いくつかの実施形態では、特定のニューロン標的配列を標的とする脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによる標的遺伝子発現の低減の量または程度は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで治療される標的遺伝子発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象または患者における治療効果の量または程度と相関する。
複数の異なる種（例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、およびラット）のｍＲＮＡを含む、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列の検査を通して、ならびにインビトロおよびインビボ試験の結果として、特定のヌクレオチド配列およびそれらのオリゴヌクレオチドに対する特定の系統的修飾が、他のヌクレオチド配列よりもＲＮＡｉオリゴヌクレオチド媒介性の低減を受けやすく、したがって、そうでなければ特定の遺伝子標的配列を標的とするオリゴヌクレオチドの一部として有用であることが発見された。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのセンス鎖、またはその一部分もしくは断片は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列と類似（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）または同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の一部分または領域は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列を含む。
いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、急性または慢性の疼痛に関連する。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、神経障害に関連する。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、ＣＮＳの少なくとも１つの領域のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、脊髄のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、腰髄のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、胸髄のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、頸髄のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、腰部後根神経節のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、髄質のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、海馬のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、体性感覚皮質のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、前頭皮質のニューロンにおいて発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ニューロンｍＲＮＡ標的配列は、ＣＮＳの疾患、障害、または状態に関連するｍＲＮＡである。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド標的化配列
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的化配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「標的化配列」は、ｍＲＮＡ（例えば、ニューロン標的ｍＲＮＡ）を含む特定のヌクレオチド配列に対する相補性の領域を有するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの標的配列を含むヌクレオチド配列に対する相補性の領域を有する遺伝子標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列である。
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的化配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「標的化配列」は、ｍＲＮＡ（例えば、ニューロン標的ｍＲＮＡ）を含む特定のヌクレオチド配列に対する相補性の領域を有するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの標的配列を含むヌクレオチド配列に対する相補性の領域を有する遺伝子標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、ニューロンｍＲＮＡ標的配列である。
標的化配列は、相補的（ワトソン－クリック）塩基対合によって標的ｍＲＮＡを含む標的配列に結合またはアニールすることによって、ｍＲＮＡを特異的に標的化する能力を脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドに付与する。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（またはその鎖、例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）は、相補的な（ワトソン・クリック）塩基対合によってニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に結合またはアニールする相補性の領域を有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（またはその鎖、例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）は、相補的な（ワトソン・クリック）塩基対合によってニューロン標的ｍＲＮＡ内の標的配列に結合またはアニールする相補性の領域を有する標的化配列を含む。標的化配列は、一般に、標的遺伝子発現を阻害する目的で、特定の標的ｍＲＮＡ（例えば、ニューロンｍＲＮＡ）への脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（またはその鎖）の結合またはアニーリングを可能にするための好適な長さおよび塩基含有量である。いくつかの実施形態では、標的化配列は、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、または少なくとも約３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、または少なくとも約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、約１２～約３０（例えば、１２～３０、１２～２２、１５～２５、１７～２１、１８～２７、１９～２７、または１５～３０）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２４個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的な標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ニューロン標的ｍＲＮＡ内の標的配列に対して完全に相補的な標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、標的ｍＲＮＡを含む標的配列と部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡ内の標的配列に対して部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、標的化配列は、アンチセンス鎖を含む連続したヌクレオチドの領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ニューロン標的ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続した配列に対して相補的である標的化配列を含み、ヌクレオチドの連続した配列は、約１２～約３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２８、１２～２６、１２～２４、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１４～２２、１６～２０、１８～２０、または１８～１９個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ニューロン標的ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続した配列に対して相補的である標的化配列を含み、ヌクレオチドの連続した配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続した配列に対して相補的である標的化配列を含み、ヌクレオチドの連続した配列は、１５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続した配列に対して相補的である標的化配列を含み、ヌクレオチドの連続した配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ニューロン標的ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続した配列に対して相補的である標的化配列を含み、ヌクレオチドの連続した配列は、１５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ニューロン標的ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続した配列に対して相補的である標的化配列を含み、ヌクレオチドの連続した配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的であり（例えば、ミスマッチを有しない）、アンチセンス鎖の全長を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的であり（例えば、ミスマッチを有しない）、アンチセンス鎖の全長の一部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的であり（例えば、ミスマッチを有しない）、アンチセンス鎖の１０～２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的であり（例えば、ミスマッチを有しない）、アンチセンス鎖の１５～１９個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的であり（例えば、ミスマッチを有しない）、アンチセンス鎖の１５個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、または２２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的であり（例えば、ミスマッチを有しない）、アンチセンス鎖の１９個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して完全に相補的であり（例えば、ミスマッチを有しない）、アンチセンス鎖の２０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して部分的に相補的であり（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）、アンチセンス鎖の全長を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して部分的に相補的であり（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）、アンチセンス鎖の全長の一部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して部分的に相補的であり（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）、アンチセンス鎖の１０～２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して部分的に相補的であり（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）、アンチセンス鎖の１５～１９個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して部分的に相補的であり（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）、アンチセンス鎖の１５個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、または２２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して部分的に相補的であり（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）、アンチセンス鎖の１９個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的化配列は、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む標的配列に対して部分的に相補的であり（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）、アンチセンス鎖の２０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む対応する標的配列と１つ以上の塩基対（ｂｐ）ミスマッチを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列に結合もしくはアニールする標的化配列の能力、および／または標的遺伝子発現を阻害または低減する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの能力が維持される限り（例えば、生理学的条件下で）、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む対応する標的配列との１ｂｐのミスマッチ、２ｂｐのミスマッチ、３ｂｐのミスマッチ、４ｂｐのミスマッチ、または５ｂｐのミスマッチを有する。あるいは、いくつかの実施形態では、標的化配列は、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列に結合またはアニールする標的化配列の能力および／または標的遺伝子発現を阻害または低下させる脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの能力が維持される限り、ニューロン標的ｍＲＮＡを含む対応する標的配列との１ｂｐを超えないミスマッチ、２ｂｐを超えないミスマッチ、３ｂｐを超えないミスマッチ、４ｂｐを超えないミスマッチ、または５ｂｐを超えないミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と１つのミスマッチを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２つのミスマッチを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と３つのミスマッチを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と４つのミスマッチを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と５つのミスマッチを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態で、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２つ以上のミスマッチ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のミスマッチ）を有する標的化配列を含み、少なくとも２つ（例えば、全て）のミスマッチが連続して位置付けられる（例えば、連続して２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上のミスマッチ）か、またはミスマッチが標的化配列全体を通して任意の位置に点在する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２つ以上のミスマッチ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のミスマッチ）を有する標的化配列を含み、少なくとも２つ（例えば、全て）のミスマッチが連続して位置付けられる（例えば、連続して２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上のミスマッチ）か、または少なくとも１つ以上の非ミスマッチ塩基対が、ミスマッチの間に位置するか、またはそれらの組み合わせである。
オリゴヌクレオチドのタイプ
様々なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドタイプおよび／または構造が、本明細書の方法において標的遺伝子発現を低減する（例えば、ニューロンにおいて発現される標的遺伝子の発現を低減する）のに有用である。本明細書または他の場所に記載されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドタイプのいずれも、ＣＮＳのニューロンにおける対応する標的遺伝子発現を阻害または低減する目的で、本明細書の標的化配列を組み込むためのフレームワークとしての使用が企図される。
様々なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドタイプおよび／または構造が、本明細書の方法において標的遺伝子発現を低減する（例えば、ニューロンにおいて発現される標的遺伝子の発現を低減する）のに有用である。本明細書または他の場所に記載されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドタイプのいずれも、ＣＮＳのニューロンにおける対応する標的遺伝子発現を阻害または低減する目的で、本明細書の標的化配列を組み込むためのフレームワークとしての使用が企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ダイサーの介入の上流または下流でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与することによって標的遺伝子発現を阻害する。例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、各鎖が、１～５個のヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを有する約１９～２５個のヌクレオチドのサイズを有するように開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照されたい）。ダイサーによって処理されて活性ＲＮＡｉ産物を生成する、より長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照されたい）。さらなる研究により、少なくとも１本の鎖の少なくとも一端が、二本鎖標的化領域を超えて伸長され、鎖のうちの１本が熱力学的に安定化するテトラループ構造を含む構造を含む、伸長された二重鎖オリゴヌクレオチドが生成される（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号および同第８，９２７，７０５号、ならびに国際特許出願公開第２０１０／０３３２２５号を参照されたい）。そのような構造は、（分子の片側または両側に）一本鎖伸長ならびに二本鎖伸長を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ダイサーの介入（例えば、ダイサー切断）の下流でＲＮＡｉ経路に関与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、ダイサー基質である。いくつかの実施形態では、内因性ダイサー処理により、ニューロン標的ｍＲＮＡの発現を低減することができる１９～２３個のヌクレオチドの長さの二本鎖核酸が産生される。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端にオーバーハング（例えば、１、２、または３個のヌクレオチドの長さ）を有する。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡコンジュゲート）は、ニューロン標的ｍＲＮＡに対してアンチセンスである２１ヌクレオチドのガイド鎖、および相補的なパッセンジャー鎖を含み、両方の鎖がアニールして、１９ｂｐの二本鎖、およびいずれか一方または両方の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。２３個のヌクレオチドのガイド鎖および２１個のヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有するオリゴヌクレオチドを含む、より長いオリゴヌクレオチド設計も企図され、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）、および分子の左側に２ヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）が存在する。そのような分子には、２１ｂｐの二本鎖領域が存在する。例えば、米国特許第９，０１２，１３８号、同第９，０１２，６２１号、および同第９，１９３，７５３号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、両方が約１７～２６個（例えば、１７～２６、２０～２５、または２１～２３個）のヌクレオチドの長さの範囲であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、両方が約１９～２２個のヌクレオチドの長さの範囲であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、等しい長さである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に３’オーバーハングが存在するように、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、両方が約２１～２３個のヌクレオチドの長さの範囲であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドについて、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方での３’オーバーハングは、１個または２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドのガイド鎖および２０個のヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）、および分子の左側に２ヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）が存在する。そのような分子には、２０ｂｐの二本鎖領域が存在する。
本明細書の組成物および方法とともに使用するための他のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド設計には、１６－ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（ｅｄ．），ＲＯＹＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ ＯＦ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２００６を参照されたい）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐまたはそれより短いステムを有する；例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＭＥＴＨＯＤＳ ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．６２９：１４１－５８を参照されたい）、平滑ｓｉＲＮＡ（例えば、１９ｂｐの長さである；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ ＆ Ｂａｋｅｒ（２００６）ＲＮＡ １２：１６３－７６を参照されたい）、非対称性ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ；例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．２６：１３７９－８２を参照されたい）、非対称の短い二本鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＭＯＬ．ＴＨＥＲ．１７：７２５－３２を参照されたい）、フォークｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ（２００４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５５７：１９３－９８を参照されたい）、および低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３５：５８８６－９７を参照されたい）が含まれる。標的遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害するために、いくつかの実施形態で使用され得るオリゴヌクレオチド構造のさらなる非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびショートｓｉＲＮＡである（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ Ｊ．２１：４６７１－７９を参照されたく、また、米国特許出願公開第２００９／００９９１１５号も参照されたい）。
アンチセンス鎖
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる。例えば、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に関与し、Ａｇｏ２などのアルゴノートタンパク質と結合するか、または１個以上の類似因子に関与もしくは結合し、標的遺伝子のサイレンシングを指示して、アンチセンス鎖はガイド鎖と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖に対して相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる。例えば、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に関与し、Ａｇｏ２などのアルゴノートタンパク質と結合するか、または１個以上の類似因子に関与もしくは結合し、標的遺伝子のサイレンシングを指示して、アンチセンス鎖はガイド鎖と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖に対して相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、最大約５０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大５０、最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、最大１５、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも３８個のヌクレオチドの長さ）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書は、約１２～約４０個（例えば、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～３０、１５～２８、１７～２２、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、または３２～４０個）のヌクレオチドの長さの範囲のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つのアンチセンス鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１９～２３個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１９個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２１個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２３個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。
センス鎖
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、最大約５０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大５０、最大４０、最大３６、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６、または少なくとも３８個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、約１２～約５０個（例えば、１２～５０、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２１、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、または３２～４０個）のヌクレオチドの長さの範囲のセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１８～３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１７～２１個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１７個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１８個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１９個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２１個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２３個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２４個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２５個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２７個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２８個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２９個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３１個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３２個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３３個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３４個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３５個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、最大約５０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大５０、最大４０、最大３６、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６、または少なくとも３８個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、約１２～約５０個（例えば、１２～５０、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２１、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、または３２～４０個）のヌクレオチドの長さの範囲のセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１８～３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１７～２１個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１７個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１８個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１９個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２１個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２３個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２４個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２５個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２７個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２８個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２９個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３１個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３２個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３３個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３４個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３５個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、その３’末端にステム－ループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループは、鎖内塩基対合によって形成される。いくつかの実施形態では、センス鎖は、その５’末端にステム－ループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のヌクレオチドの長さの二本鎖である。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、２個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、３個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、５個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、６個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、７個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、８個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、９個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１０個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１１個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１２個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１３個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ステム－ループは、分解（例えば、酵素分解）に対する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド保護を提供し、標的細胞、組織、もしくは器官への標的化および／もしくは送達を促進もしくは改善するか、またはその両方である。例えば、いくつかの実施形態では、ステム－ループのループは、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＣＮＳにおいて発現される標的ｍＲＮＡ）への標的化、標的遺伝子発現の阻害、および／または標的細胞、組織、もしくは器官（例えば、ＣＮＳ）への送達、またはそれらの組み合わせを促進、改善、または増加させる１つ以上の修飾を含むヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ステム－ループ自体またはステム－ループへの修飾は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの本質的な遺伝子発現阻害活性に実質的に影響を与えないが、安定性（例えば、分解に対する保護を提供する）、および／または標的細胞、組織、もしくは器官（例えば、ＣＮＳ）への脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの送達を促進する、改善する、または増加させる。特定の実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステム－ループを（例えば、その３’末端に）含むセンス鎖を含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間に最大約１０個のヌクレオチドの長さ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの長さ）の一本鎖ループを形成する。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、１０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、テトラループは、配列５’－ＧＡＡＡ－３’を含む。いくつかの実施形態では、ステムループは、配列５’－ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ－３’（配列番号２１）を含む。
いくつかの実施形態では、上述の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステム－ループのループ（Ｌ）は、トリループである。いくつかの実施形態では、トリループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、送達リガンド、およびそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、上述の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステム－ループのループ（Ｌ）は、テトラループである（例えばニックの入った（ｎｉｃｋｅｄ）テトラループ構造内）。いくつかの実施形態では、テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、送達リガンド、およびそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、上述の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステム－ループのループ（Ｌ）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１３１，９１２号に記載されるテトラループである（例えばニックの入ったテトラループ構造内）。
二本鎖の長さ
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１２個（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１５～３０個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１７～２１個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１７個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１８個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１９個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、２０個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、２１個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１２個（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１５～３０個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１７～２１個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１７個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１８個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１９個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、２０個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、２１個の塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１個以上（例えば、１、２、３、４、または５個）のミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に２個以上のミスマッチが存在する場合、それらは連続して位置付けられ得る（例えば、２、３個、もしくはそれ以上が並んでいる）か、または相補性の領域全体にわたって散在し得る。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、１つ以上のミスマッチを含む。一実施形態では、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのセンス鎖の３’末端でのセグメントの塩基ミスマッチ、または不安定化は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの効力および／または有効性を改善するか、または増加させる。
オリゴヌクレオチド末端
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に３’－オーバーハングが存在するように、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、他の５’末端と比較して熱力学的に低い安定性である一方の５’末端を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端を含み、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを含む、非対称の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、約１～４個のヌクレオチドの長さ（例えば、１、２、３、または４個のヌクレオチドの長さ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に３’－オーバーハングが存在するように、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、他の５’末端と比較して熱力学的に低い安定性である一方の５’末端を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端を含み、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを含む、非対称の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、約１～４個のヌクレオチドの長さ（例えば、１、２、３、または４個のヌクレオチドの長さ）である。
いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、約１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または約１～２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、（１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハングは、２０個のヌクレオチドの長さである。
典型的には、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端上に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～４個のヌクレオチド、任意選択で、１～４、１～３、１～２、２～４、２～３、または１、２、３、もしくは４個のヌクレオチドの長さを含む３’オーバーハングである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～４個のヌクレオチド、任意選択で、１～４、１～３、１～２、２～４、２～３、または１、２、３、もしくは４個のヌクレオチドの長さを含む５’オーバーハングである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の５’末端は、１個以上のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む５’－オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、約１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または約１～２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、（１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’－オーバーハングは、２０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端の１個以上の（例えば、２、３、または４個）の末端ヌクレオチドは、修飾されている。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１または２個の末端ヌクレオチドは、修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドは、修飾され、例えば、２’修飾、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１または２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１または２個のヌクレオチドは、標的と相補的ではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、センス鎖の３’末端にステム－ループ構造を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２個の末端オーバーハングヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ニックの入ったテトラループ構造を含み、センス鎖の３’末端は、ステム－テトラループ構造を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２個の末端オーバーハングヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択される。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ＡＡである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ＡＧである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ＧＡである。いくつかの実施形態では、２個の末端オーバーハングヌクレオチドは、ＧＧである。典型的には、アンチセンス鎖の２つの末端ＧＧヌクレオチドの一方または両方は、標的と相補的ではない。
いくつかの実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端および／または３’末端は、逆位キャップヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）の修飾されたヌクレオチド間結合が、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端の末端ヌクレオチド間に提供される。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合が、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端のオーバーハングヌクレオチド間に提供される。
オリゴヌクレオチド修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、１つ以上の修飾を含む。オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、特異性、安定性、送達、バイオアベイラビリティ、ヌクレアーゼ分解からの耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布および細胞取り込み、ならびに治療研究用途と関連する他の特徴を改善または制御するために、様々な方法で修飾され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、１つ以上の修飾を含む。オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、特異性、安定性、送達、バイオアベイラビリティ、ヌクレアーゼ分解からの耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布および細胞取り込み、ならびに治療研究用途と関連する他の特徴を改善または制御するために、様々な方法で修飾され得る。
いくつかの実施形態では、修飾は、修飾糖である。いくつかの実施形態では、修飾は、５’末端リン酸基である。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾塩基である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される修飾のうちのいずれか１つまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾糖、５’末端リン酸基、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、および少なくとも１つの修飾塩基を含む。
オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）での修飾の数、およびそれらのヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を与え得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または類似の担体とそれらをコンジュゲートさせるか、またはそれらを取り囲むことによってインビボで送達され得る。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰまたは類似の担体によって保護されていない場合、ヌクレオチドのうちの少なくともいくつかが修飾されることが有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てまたは実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、半分を超えるヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、半分未満のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを含む全てのヌクレオチドの糖部分は、２’位で修飾されている。いくつかの実施形態では、脂質にコンジュゲートされたヌクレオチド（例えば、センス鎖の５’末端ヌクレオチド）を除いて、オリゴヌクレオチドを含む全てのヌクレオチドの糖部分は、２’位で修飾されている。修飾は、可逆的または不可逆的であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素分解からの保護、インビボ投与後に所望の細胞を標的化する能力、および／または熱力学的安定性）を引き起こすのに十分な数およびタイプの修飾ヌクレオチドを有する。
糖修飾
いくつかの実施形態では、糖におけるヌクレオチド修飾は、２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、２’－修飾は、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、または２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｆ、２’－ＯＭｅ、または２’－ＭＯＥである。いくつかの実施形態では、糖における修飾は、糖環の１個以上の炭素の修飾を含み得る、糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’－酸素が糖の１’－炭素もしくは４’－炭素に結合されること、または２’－酸素が、エチレンもしくはメチレン架橋を介して１’－炭素もしくは４’－炭素に結合されることを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－炭素から３’－炭素への結合を欠く非環式糖を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態では、糖におけるヌクレオチド修飾は、２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、２’－修飾は、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、または２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｆ、２’－ＯＭｅ、または２’－ＭＯＥである。いくつかの実施形態では、糖における修飾は、糖環の１個以上の炭素の修飾を含み得る、糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’－酸素が糖の１’－炭素もしくは４’－炭素に結合されること、または２’－酸素が、エチレンもしくはメチレン架橋を介して１’－炭素もしくは４’－炭素に結合されることを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－炭素から３’－炭素への結合を欠く非環式糖を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０個、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのセンス鎖は、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０個、またはそれ以上）を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方）が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾（例えば、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅ、２’－ＭＯＥ、および２’－デオキシ－２’－ルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、異なる修飾パターンを有する脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、修飾脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、実施例および配列表に示される修飾パターンを有するセンス鎖配列、ならびに実施例および配列表に示される修飾パターンを有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖のヌクレオチドの約１０～２５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％が２’－フルオロ修飾を含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、約１１％のセンス鎖のヌクレオチドが、２－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、約２０％のセンス鎖のヌクレオチドが、２－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖のヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が２’－フルオロ修飾を含む、アンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの約３２％が、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１５～２５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％の、２’－フルオロ修飾を含むそのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの約１９％が、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの約２６％が、２’－フルオロ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖の８位、９位、１０位、または１１位のうちの１つ以上が、２’－Ｆ基で修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における２’－Ｆ基で修飾されていないか、または脂質にコンジュゲートされていないヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～２０位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における２～７位および１２～２０位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～６位および１２～２０位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における２～７位および１２～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～６位および１２～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～１５位および１７～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～１９位および２１～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～２２位および２４～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～２７位および２９～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～２８位および３０～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドについて、センス鎖における１～７位および１２～２９位および３１～３６位のヌクレオチドの各々における糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つの２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含み、２’－Ｆ基で修飾されていないか、または脂質にコンジュゲートされていない残りのヌクレオチドは、２’－ＯＭｅで修飾されている。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、糖部分の２’位において２’－Ｆで修飾された７個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２、３、４、５、７、１０、および１４位における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、糖部分の２’位において２’－ＯＭｅで修飾された１４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の６、８、９、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、および２２位における糖部分は、２’－ＯＭｅで修飾されている。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、糖部分の２’位において２’－Ｆで修飾された４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、センス鎖の２、３、８、９、１０、および１１位における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖は、糖部分の２’位において２’－ＯＭｅで修飾された１５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の６、８、９、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、および２２位における糖部分は、２’－ＯＭｅで修飾されている。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、糖部分の２’位において２’－Ｆで修飾された３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、２、５、および１４位における糖部分、ならびに任意選択で、アンチセンス鎖の１、３、７、および１０位におけるヌクレオチドの最大３個が、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２、５、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖の１、２、５、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖の２、４、５、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の１、２、３、５、７、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２、３、４、５、７、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の１、２、３、５、１０、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２、３、４、５、１０、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２、３、４、５、７、１０、および１４位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、糖部分の２’位において２’－Ｆで修飾された９個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２、３、４、５、７、１０、１４、１６、および１９位の位置の各々における糖部分は、２’－Ｆで修飾されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２、５、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２、３、４、５、７、１０、１４、１６、および１９位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の１、２、５、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の１、２、３、５、７、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の１、２、３、５、１０、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２、３、５、７、１０、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２、３、４、５、７、１０、１４、１６、および１９位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖の２、３、４、５、７、１０、および１４位のヌクレオチドの各々の糖部分と、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドの各々の糖部分とを有する、アンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位における糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－ＯＭｅで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位における糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位における糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された８～１１位における糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された３、５、８、１０、１２、１３、１５、および１７位における糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１～７位および１２～１７位または１２～２０位における糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された２～７位および１２～１７位または１２～２０位における糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１～６位および１２～１７位または１２～２０位における糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１、２、４、６、７、９、１１、１４、１６、および１８～２０位における糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の１～７位および１２～１７位または１２～２０位におけるヌクレオチドの各々の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の２～７位および１２～１７位または１２～２０位におけるヌクレオチドの各々の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の１～６位および１２～１７位または１２～２０位におけるヌクレオチドの各々の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の１、２、４、６、７、９、１１、１４、１６、および１８～２０位における糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位における糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－ＯＭｅで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位における糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位における糖部分を有するセンス鎖を含む。
５’末端リン酸
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、５’末端リン酸を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、Ａｇｏ２との相互作用を増強する。しかしながら、５’－リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼまたは他の酵素を介した分解の影響を受けやすい場合があり、それにより、インビボでそれらのバイオアベイラビリティが制限され得る。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性のある５’リン酸の類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、もしくはマロニルホスホネート、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然の５’－リン酸基の静電特性および立体特性を模倣する化学部分（「リン酸模倣物」）に付着している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、５’末端リン酸を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、Ａｇｏ２との相互作用を増強する。しかしながら、５’－リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼまたは他の酵素を介した分解の影響を受けやすい場合があり、それにより、インビボでそれらのバイオアベイラビリティが制限され得る。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性のある５’リン酸の類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、もしくはマロニルホスホネート、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然の５’－リン酸基の静電特性および立体特性を模倣する化学部分（「リン酸模倣物」）に付着している。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートはＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、糖の４’－炭素位置にリン酸類似体を有する（「４’－リン酸類似体」と呼ばれる）。例えば、国際特許出願公開第２０１８／０４５３１７号を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’－リン酸類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチル基の酸素原子が（例えば、その４’－炭素における）糖部分またはその類似体に結合している、オキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’－リン酸類似体は、チオメチルホスホネートまたはアミノメチルホスホネートであり、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子は、糖部分またはその類似体の４’－炭素に結合している。いくつかの実施形態では、４’－リン酸類似体は、オキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯ（ＯＨ）２、－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯ（ＯＲ）２、または－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯＯＨ（Ｒ）によって表され、式中、Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３、アルキル基、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択される。いくつかの実施形態では、アルキル基は、ＣＨ２ＣＨ３である。より典型的には、Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒは、ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、４’－リン酸類似体は、５’－メトキシホスホネート－４’－オキシである。いくつかの実施形態では、４’－リン酸類似体は、４’－オキシメチルホスホネートである。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’－リン酸類似体を含むアンチセンス鎖を含み、５’末端ヌクレオチドは、以下の構造を含む。
修飾されたヌクレオチド間結合
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、リン酸修飾または置換が、少なくとも約１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも５個）の修飾されたヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つは、約１～約１０個（例えば、１～１０、２～８、４～６、３～１０、５～１０、１～５、１～３、または１～２個）の修飾されたヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾されたヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、リン酸修飾または置換が、少なくとも約１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも５個）の修飾されたヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つは、約１～約１０個（例えば、１～１０、２～８、４～６、３～１０、５～１０、１～５、１～３、または１～２個）の修飾されたヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾されたヌクレオチド間結合を含む。
修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオンアルキルホスホトリエステル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合、ホスホラミダイト結合、ホスホネート結合またはボラノホスフェート結合であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つの、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、およびアンチセンス鎖の２１位と２２位のうちの１つ以上の間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、およびアンチセンス鎖の２１位と２２位の各々との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、およびアンチセンス鎖の２１位と２２位の各々との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、センス鎖の１８位と１９位、センス鎖の１９位と２０位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、およびアンチセンス鎖の２１位と２２位の各々の間にホスホロチオエート結合を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡは、糖－リン酸骨格が、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシン単位から構成される疑似ペプチド骨格によって置換されたオリゴヌクレオチド模倣体である。核酸塩基は、二原子カルボキシメチルスペーサーを介してこの骨格に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環のヌクレオチド間結合骨格を含むモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。
塩基修飾
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉコンジュゲートは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に結合されている。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２７４４６２号を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（脱塩基）。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉコンジュゲートは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に結合されている。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２７４４６２号を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（脱塩基）。
いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位、またはヌクレオチド糖部分置換中の同等の位置に位置する複素環部分であり、二本鎖で存在する場合、二本鎖の構造を実質的に改変することなく、２つ以上のタイプの塩基の反対側に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、標的核酸と完全に相補的である参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的な核酸で形成される二本鎖よりも低いＴｍを有する、標的核酸との二本鎖を形成する。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基が単一のミスマッチを生成する塩基で置き換えられた参照一本鎖核酸と比較すると、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸で形成される二本鎖よりも高いＴｍを有する、標的核酸との二本鎖を形成する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例には、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール、および／または１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロールが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２５４３６２号、Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２３：４３６３－４３７０、Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２３：２３６１－６６、およびＬｏａｋｅｓ ＆ Ｂｒｏｗｎ（１９９４）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２２：４０３９－４３を参照されたい）。
可逆的修飾
標的細胞に到達する前にインビボ環境からオリゴヌクレオチドを保護するための特定の修飾が行われ得るが、それらは、オリゴヌクレオチドが標的細胞の細胞質ゾルに到達すると、オリゴヌクレオチドの効力または活性を低減し得る。分子が細胞の外部で望ましい特性を保持し、次いで、細胞の細胞質環境に入ると除去されるような可逆的修飾が行われ得る。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用によって、または細胞内の化学条件によって（例えば、細胞内グルタチオンによる還元を介して）除去され得る。
標的細胞に到達する前にインビボ環境からオリゴヌクレオチドを保護するための特定の修飾が行われ得るが、それらは、オリゴヌクレオチドが標的細胞の細胞質ゾルに到達すると、オリゴヌクレオチドの効力または活性を低減し得る。分子が細胞の外部で望ましい特性を保持し、次いで、細胞の細胞質環境に入ると除去されるような可逆的修飾が行われ得る。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用によって、または細胞内の化学条件によって（例えば、細胞内グルタチオンによる還元を介して）除去され得る。
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート結合によって作られる負電荷をマスクし、細胞取り込みおよびヌクレアーゼ耐性を改善するように、環状ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号、国際特許出願公開第２０１４／０８８９２０号および同第２０１５／１８８１９７号、ならびにＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．３２：１２５６－６３を参照されたい。ヌクレオチド間ジホスフェート結合のこの可逆的修飾は、細胞質ゾル（例えば、グルタチオン）の還元環境によって細胞内で切断されるように設計されている。先の例には、細胞内で切断可能であると報告された中和ホスホトリエステル修飾が含まれる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５：９４０－５０を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、そのような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼおよび他の厳しい環境条件（例えば、ｐＨ）に曝されるインビボ投与（例えば、細胞の血液および／またはリソソーム／エンドソーム区画の通過）中の保護を可能にする。細胞外空間と比較してグルタチオンのレベルがより高い細胞の細胞質ゾル内に放出されると、修飾は逆転し、結果として切断されたオリゴヌクレオチドとなる。不可逆的化学修飾を使用して利用可能な選択肢と比較して、可逆的なグルタチオン感受性部分を使用して、立体的により大きい化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これは、これらのより大きい化学基が細胞質ゾル内で除去され、したがって、細胞の細胞質ゾル内部のオリゴヌクレオチドの生物学的活性に干渉しないはずであるためである。結果として、これらのより大きい化学基は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ耐性、親油性、荷電、熱安定性、特異性、および低減された免疫原性などの様々な利点を付与するように操作され得る。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分の構造は、その放出の動態を修飾するように操作され得る。
いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に付着している。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’－炭素に付着している。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドである場合、糖の５’－炭素に位置する。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドである場合に、糖の３’－炭素に位置する。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、２０１６年８月２３日に出願された、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆと題する米国仮特許出願第６２／３７８，６３５号を参照されたい。
標的化リガンド
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を、中枢神経系（ＣＮＳ）の１つ以上の細胞または組織に標的化することが望ましい。このような戦略は、他の器官における望ましくない影響を回避するか、またはオリゴヌクレオチドから利益を得ないであろう細胞、組織もしくは器官へのオリゴヌクレオチドの必要以上の損失を回避するのに役立ち得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、または器官への標的化および／または送達を促進するように（例えば、ＣＮＳへのコンジュゲートの送達を促進するように）修飾されている。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンドにコンジュゲートされた少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を、中枢神経系（ＣＮＳ）の１つ以上の細胞または組織に標的化することが望ましい。このような戦略は、他の器官における望ましくない影響を回避するか、またはオリゴヌクレオチドから利益を得ないであろう細胞、組織もしくは器官へのオリゴヌクレオチドの必要以上の損失を回避するのに役立ち得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、または器官への標的化および／または送達を促進するように（例えば、ＣＮＳへのコンジュゲートの送達を促進するように）修飾されている。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンドにコンジュゲートされた少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のヌクレオチドは、各々、別個の標的化リガンドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの１個のヌクレオチドは、別個の標的化リガンドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの２～４個のヌクレオチドは、各々、別個の標的化リガンドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、標的化リガンドが歯ブラシの毛に似ており、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが歯ブラシに似ているように、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端上で２～４個のヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長部にコンジュゲートされている）。例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’または３’末端のいずれかにステム－ループを含み得、ステムのループの１、２、３、または４個のヌクレオチドは、標的化リガンドに個別にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、本開示によって提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端にステム－ループを含み、ステム－ループのループは、トリループまたはテトラループを含み、トリループまたはテトラループを含む３または４個のヌクレオチドは、丁重に（ｒｅｓｐｅｃｔｆｕｌｌｙ）、標的化リガンドに個別にコンジュゲートされている。
ＧａｌＮＡｃは、ＡＳＧＰＲの高親和性リガンドであり、これは主に肝細胞の類洞表面上に発現し、末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基（アシアロ糖タンパク質）を含む循環糖タンパク質の結合、内在化、およびその後の除去に主要な役割を果たしている。本開示のオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ部分のコンジュゲーション（間接的または直接的のいずれか）を使用して、これらのオリゴヌクレオチドを細胞上に発現するＡＳＧＰＲに対して標的化することができる。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個以上のＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされ、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを、ヒト肝臓細胞（例えば、ヒト肝細胞）上に発現するＡＳＧＰＲに対して標的化する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを肝臓に対して標的化する。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価ＧａｌＮＡｃ部分と直接的または間接的にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個を超える一価ＧａｌＮＡｃと直接的または間接的にコンジュゲートされている（すなわち、２、３、または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされ、典型的には、３または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされている）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個以上の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、または四価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のヌクレオチドは、各々、ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、テトラループの２～４個のヌクレオチドは、各々、別個のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、トリループの１～３ヌクレオチドは、各々、別個のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似ているように、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の両端で２～４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端上で２～４個のヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長部にコンジュゲートされている）。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドとコンジュゲートされている。例えば、４個のＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のテトラループ内のヌクレオチドにコンジュゲートされ得、各ＧａｌＮＡｃ部分は、１ヌクレオチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、テトラループは、アデニンヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、テトラループ（Ｌ）は、以下に示すように、本明細書に記載される任意のリンカーを介してテトラループの任意の１個以上のグアニンヌクレオチドに付着した一価ＧａｌＮＡｃ部分を有する（Ｘ＝ヘテロ原子）。
いくつかの実施形態では、テトラループ（Ｌ）は、以下に示すように、本明細書に記載される任意のリンカーを介してテトラループの任意の１個以上のアデニンヌクレオチドに付着した一価ＧａｌＮＡｃを有する（Ｘ＝ヘテロ原子）。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下に示すように、［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－グアニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれるグアニンヌクレオチドに付着した一価ＧａｌＮＡｃを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下に示すように、［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれるアデニンヌクレオチドと付着した一価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。
そのようなコンジュゲーションの例は、５’から３’にヌクレオチド配列ＧＡＡＡ（Ｌ＝リンカー、Ｘ＝ヘテロ原子）を含むループについて以下に示される。そのようなループは、例えば、センス鎖の２７～３０位に存在し得る。化学式では、
は、オリゴヌクレオチド鎖への付着点を記述するために使用される。
適切な方法または化学（例えば、クリックケミストリ）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、アセタール系リンカーを使用して、標的化リガンドを本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つのヌクレオチドとコンジュゲートする。アセタール系リンカーは、例えば、国際特許出願公開第２０１６／１００４０１号に開示されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、安定している。ＧａｌＮＡｃ部分がアセタールリンカーを使用してループのヌクレオチドに付着している、５’から３’にヌクレオチドＧＡＡＡを含むループについて、例が以下に示される。そのようなループは、例えば、センス鎖の２７～３０位に存在し得る。化学式では、
は、オリゴヌクレオチド鎖への付着点である。
上述のように、様々な適切な方法または化学合成技術（例えば、クリックケミストリ）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドとコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、アセタール系リンカーを使用して、標的化リガンドを本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つのヌクレオチドとコンジュゲートする。アセタール系リンカーは、例えば、国際特許出願公開第２０１６／１００４０１号に開示されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、安定リンカーである。
いくつかの実施形態では、標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）と脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドとの間に二本鎖伸長（例えば、最大３、４、５、または６ｂｐの長さ）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、それにコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃを有していない。
脂質コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質部分のいずれかは、オリゴヌクレオチドのセンス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、オリゴヌクレオチドの末端位置にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の３’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質部分のいずれかは、オリゴヌクレオチドのセンス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、オリゴヌクレオチドの末端位置にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の３’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖上の内部ヌクレオチドにコンジュゲートされている。内部位置は、センス鎖の各末端からの２つの末端位置以外の任意のヌクレオチド位置である。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、または２０位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の１位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の７位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の１６位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の２０位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の２３位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の２８位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の２９位にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質部分は、センス鎖の３０位にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１つ以上の脂質部分とコンジュゲートされた少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質部分は、同じヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質部分は、異なるヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの脂質部分が、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、脂質部分は、炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は飽和している。いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は不飽和である。いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は、分岐鎖である。いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は、直鎖である。いくつかの実施形態では、脂質部分は、Ｃ８－Ｃ３０炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、脂質部分は、Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１１：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１７：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ２２：５、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０、Ｃ２６：０、Ｃ２２：６、Ｃ２４：１、ジアシルＣ１６：０、またはジアシルＣ１８：１である。
いくつかの実施形態では、脂質部分は、Ｃ１６炭化水素鎖である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列および１つ以上の標的化リガンドを含み、ヌクレオチド配列は、式ＩＩ－ａ：
またはその薬学的に許容可能な塩
式中、
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ＲＡ、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）Ｒ２、もしくは－ＳｉＲ３であるか、または
同じ炭素上のＲ１およびＲ２が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する３～７員の飽和もしくは部分不飽和環を形成し、
各ＲＡは、独立して、Ｃ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であり、
各Ｒは、独立して、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であるか、あるいは、
同じ原子上の２つのＲ基が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、ケイ素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和、部分不飽和、またはヘテロアリール環を形成し、
各ＬＣは、脂質コンジュゲート部分であり、各ＬＣは、独立して、飽和もしくは不飽和、直鎖、または分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖を含む脂質コンジュゲート部分であり、ここで、炭化水素鎖の０～１０メチレン単位は、独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）－ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置換されており、
各－Ｃｙ－は、独立して、フェニレニル；８～１０員の二環式アリーレニル；４～７員の飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロカルボシクリレニル；８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリーレニル、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１～５個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式ヘテロアリーレニル、から選択される任意選択で置換された二価の環であり、
ｎは、１～１０であり、
Ｌは、共有結合、または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、ここで、炭化水素鎖の０～１０メチレン単位は、独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、－Ｖ１ＣＲ２Ｗ１－または
によって置換されており、
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１、Ｖ１、およびＷ１は、独立して、－Ｃ（Ｒ）２－、－ＯＲ、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、または－ＮＲ－であり、
Ｙは、水素、好適なヒドロキシル保護基、
であり、
Ｒ３は、水素、好適な保護基、好適なプロドラッグ、またはＣ１－６脂肪族、フェニル、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される任意選択で置換された基であり、
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＢＨ２－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、好適な保護基、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－、または－ＣＲ２－である）によって表される、１つ以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた１つ以上のヌクレオシド（核酸）を含む。
式中、
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、ハロゲン、ＲＡ、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）Ｒ２、もしくは－ＳｉＲ３であるか、または
同じ炭素上のＲ１およびＲ２が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する３～７員の飽和もしくは部分不飽和環を形成し、
各ＲＡは、独立して、Ｃ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であり、
各Ｒは、独立して、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であるか、あるいは、
同じ原子上の２つのＲ基が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、ケイ素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和、部分不飽和、またはヘテロアリール環を形成し、
各ＬＣは、脂質コンジュゲート部分であり、各ＬＣは、独立して、飽和もしくは不飽和、直鎖、または分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖を含む脂質コンジュゲート部分であり、ここで、炭化水素鎖の０～１０メチレン単位は、独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）－ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置換されており、
各－Ｃｙ－は、独立して、フェニレニル；８～１０員の二環式アリーレニル；４～７員の飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロカルボシクリレニル；８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリーレニル、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１～５個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式ヘテロアリーレニル、から選択される任意選択で置換された二価の環であり、
ｎは、１～１０であり、
Ｌは、共有結合、または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、ここで、炭化水素鎖の０～１０メチレン単位は、独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、－Ｖ１ＣＲ２Ｗ１－または
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１、Ｖ１、およびＷ１は、独立して、－Ｃ（Ｒ）２－、－ＯＲ、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、または－ＮＲ－であり、
Ｙは、水素、好適なヒドロキシル保護基、
Ｒ３は、水素、好適な保護基、好適なプロドラッグ、またはＣ１－６脂肪族、フェニル、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される任意選択で置換された基であり、
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＢＨ２－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、好適な保護基、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－、または－ＣＲ２－である）によって表される、１つ以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた１つ以上のヌクレオシド（核酸）を含む。
いくつかの実施形態では、脂質部分は、リンカーを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、式ＩＩ－ｂもしくはＩＩ－ｃ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
Ｌ１は、共有結合、一価または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－または
により置き換えられており、
Ｒ４は、水素、ＲＡ、または好適なアミン保護基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲによって置き換えられている）によって表される。
Ｌ１は、共有結合、一価または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－または
Ｒ４は、水素、ＲＡ、または好適なアミン保護基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲによって置き換えられている）によって表される。
脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、Ｒ５は、以下から選択される。
脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの特定の実施形態では、
Ｒ５は、以下から選択される。
Ｒ５は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は
である。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は
である。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、式ＩＩ－ＩｂもしくはＩＩ－Ｉｃ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１は、－Ｏ－、または－Ｓ－であり、
Ｙは、水素、
であり、
Ｒ３は、水素、または好適な保護基であり、
Ｘ２は、Ｏ、またはＳであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
Ｒは、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基である）によって表される。
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１は、－Ｏ－、または－Ｓ－であり、
Ｙは、水素、
Ｒ３は、水素、または好適な保護基であり、
Ｘ２は、Ｏ、またはＳであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
Ｒは、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基である）によって表される。
いくつかの実施形態では、脂質は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は
である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、二本鎖分子である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ分子である。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ステムループを含む。いくつかの実施形態では、ステムループは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として示され、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間でループを形成する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループのループ内のヌクレオチドのいずれかにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループのステム内のヌクレオチドのいずれかにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ループにおいて５’から３’の第１のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ループにおいて５’から３’の第２のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ループにおいて５’から３’の第３のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ループにおいて５’から３’の第４のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ループ内のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのうちの３個にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ステムループは、１６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第３のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第８のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第９のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第１０のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのうちの３個にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、５’から３’に１～２０とナンバリングされた位置を有する２０個のヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチドセンス鎖の１位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチドセンス鎖の７位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、５’から３’に１～３６とナンバリングされた位置を有する３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の１位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の７位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の１６位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２０位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２３位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２８位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２９位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の３０位にコンジュゲートされた脂質を含む。
例示的なオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脂肪酸とコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脂質とコンジュゲートされたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、脂質は、炭素鎖である。いくつかの実施形態では、炭素鎖は、飽和している。いくつかの実施形態では、炭素鎖は、不飽和である。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１６炭素（Ｃ１６）脂質とコンジュゲートされたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１６脂質は、少なくとも１個の二重結合を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脂肪酸とコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脂質とコンジュゲートされたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、脂質は、炭素鎖である。いくつかの実施形態では、炭素鎖は、飽和している。いくつかの実施形態では、炭素鎖は、不飽和である。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１６炭素（Ｃ１６）脂質とコンジュゲートされたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１６脂質は、少なくとも１個の二重結合を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、以下に示すようにＣ１６脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、２０個のヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖、および２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、２０個の塩基対の二本鎖領域を形成する。
いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、平滑末端である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端は、オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ＧＧである。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、２’修飾は、２’－フルオロおよび２’－メチルから選択される。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、センス鎖は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、センス鎖は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハング、およびオリゴヌクレオチドの３’末端に平滑末端を有する２０～２２個の塩基対の非対称二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハング、およびオリゴヌクレオチドの３’末端に平滑末端を有する２０～２２個の塩基対の非対称二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、センス鎖は、センス鎖の内部ヌクレオチド（例えば、７位のヌクレオチド）にコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、センス鎖は、センス鎖の内部ヌクレオチド（例えば、７位のヌクレオチド）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、全ての内部ヌクレオチドが、ＣＮＳのニューロンへのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの送達のための脂質コンジュゲーションに適しているわけではない。例えば、いくつかの実施形態では、５’から３’にナンバリングされたセンス鎖の９位または１０位のコンジュゲーションは、ＣＮＳのニューロンへのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの送達には適していない。いくつかの実施形態では、５’から３’にナンバリングされたセンス鎖の内部位置での脂質コンジュゲーションは、９位および１０位を除外する。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の内部ヌクレオチド（例えば、７位のヌクレオチド）にコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の内部ヌクレオチド（例えば、７位のヌクレオチド）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハング、およびオリゴヌクレオチドの３’末端に平滑末端を有する２０～２２個の塩基対の非対称二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の内部ヌクレオチド（例えば、７位のヌクレオチド）にコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハング、およびオリゴヌクレオチドの３’末端に平滑末端を有する２０～２２個の塩基対の非対称二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の内部ヌクレオチド（例えば、７位のヌクレオチド）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着したＣ１６脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着したＣ１６脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、３６個のヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖、および２２個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、２０個の塩基対の二本鎖領域を形成する。
いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、ステム－ループを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、テトラループを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、配列番号２１の配列を含むステム－ループを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端は、オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ＧＧである。
いくつかの実施形態では、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含むセンス鎖を含む、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脊髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減する。いくつかの実施形態では、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含むセンス鎖を含む、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減する。いくつかの実施形態では、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含むセンス鎖を含む、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、胸髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減する。いくつかの実施形態では、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含むセンス鎖を含む、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、頸髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減する。
いくつかの実施形態では、脊髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、腰髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、胸髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、頸髄におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つの炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、その３’末端におけるステム－ループと、センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、テトラループと、テトラループのヌクレオチドにコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖とを含む、センス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第１のヌクレオチド（５’から３’の１位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第７のヌクレオチド（５’から３’の７位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第１６のヌクレオチド（５’から３’の１６位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第２０のヌクレオチド（５’から３’の２０位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第２３のヌクレオチド（５’から３’の２３位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第２８のヌクレオチド（５’から３’の２８位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第２９のヌクレオチド（５’から３’の２９位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される２２～２４個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および２０～３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、２０～２２個の塩基対の二本鎖領域を形成し、センス鎖は、センス鎖の第３０のヌクレオチド（５’から３’の３０位）にコンジュゲートされた少なくとも１つのＣ１６炭化水素鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｌ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｌｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着した脂質であり、［ａｄｅｍＸ－Ｌ］は、ヌクレオチドに付着した脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合したヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現を低減するための脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンを含み、
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
センス鎖：５’－［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］－３’
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’－［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］－３’
式中、［ｍＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸｓ］は、隣接するヌクレオチドにホスホロチオエート結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［ｍＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ｆＸ］は、隣接するヌクレオチドにホスホジエステル結合した２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］は、４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］は、ヌクレオチドに付着したＣ１６脂質である。
核酸およびその類似体を提供する一般的な方法
本明細書に記載される脂質コンジュゲートを含む核酸およびその類似体は、標準的なホスホラミダイト方法を含む、当技術分野で公知の様々な合成方法を使用して作製することができる。任意のホスホラミダイト合成方法を使用して、本開示の提供される核酸を合成することができる。特定の実施形態では、ホスホラミダイトは、固相合成法において使用され、反応性中間体ホスフィト化合物が得られ、これはその後、公知の方法を使用して酸化されて、典型的にはホスホジエステルまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するホスホン酸修飾オリゴヌクレオチドを生成する。本開示のオリゴヌクレオチド合成は、当技術分野の公知の方法を使用して、５’から３’へ、または３’から５’へのいずれかの方向で実施される。
本明細書に記載される脂質コンジュゲートを含む核酸およびその類似体は、標準的なホスホラミダイト方法を含む、当技術分野で公知の様々な合成方法を使用して作製することができる。任意のホスホラミダイト合成方法を使用して、本開示の提供される核酸を合成することができる。特定の実施形態では、ホスホラミダイトは、固相合成法において使用され、反応性中間体ホスフィト化合物が得られ、これはその後、公知の方法を使用して酸化されて、典型的にはホスホジエステルまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するホスホン酸修飾オリゴヌクレオチドを生成する。本開示のオリゴヌクレオチド合成は、当技術分野の公知の方法を使用して、５’から３’へ、または３’から５’へのいずれかの方向で実施される。
特定の実施形態では、提供される核酸を合成するための方法は、（ａ）共有結合を介して、ヌクレオシドまたはその類似体を固体支持体に付着させることと、（ｂ）工程（ａ）のヌクレオシドまたはその類似体上で、ヌクレオシドホスホラミダイトまたはその類似体を反応性ヒドロキシル基に結合させて、その間にヌクレオチド間結合を形成することであって、固体支持体上の任意の非結合ヌクレオシドまたはその類似体は、キャッピング試薬でキャッピングされる、形成することと、（ｃ）前述のヌクレオチド間結合を酸化剤で酸化することと、（ｄ）工程（ｂ）～（ｃ）を、後続のヌクレオシドホスホラミダイトまたはその類似体と反復して繰り返して、核酸またはその類似体を形成することと、を含み、工程（ａ）の少なくともヌクレオシドもしくはその類似体、工程（ｂ）のヌクレオシドホスホラミダイトもしくはその類似体、または工程（ｄ）の後続のヌクレオシドホスホラミダイトもしくはその類似体のうちの少なくとも１つが、本明細書に記載される脂質コンジュゲート部分を含む。典型的には、カップリング、キャッピング／酸化工程、および任意選択で、脱保護工程は、オリゴヌクレオチドが所望の長さおよび／または配列に到達するまで繰り返され、その後、固体支持体から切断される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、テトラループ上の脂質コンジュゲート単位を含む１～３個の核酸またはその類似体を含むように調製される。
以下のスキームＡでは、特定の保護基、脱離基、または変換条件が示されるが、当業者は、他の保護基、脱離基、および変換条件も適切であり、かつ企図されていることを理解するであろう。追加の保護基戦略を必要とするスキームＡの属で想定される特定の反応性官能基（例えば、－Ｎ（Ｈ）－、－ＯＨなど）も企図されており、当業者によって理解される。このような基および変換は、Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊ．Ｍａｒｃｈ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００１、ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ，（Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）、およびＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ，ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）で詳しく説明されており、これらの各々の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示の核酸およびその類似体は、一般に、以下に記載されるスキームＡ、スキームＡ１およびスキームＢに従って調製される。
スキームＡ：本開示のリガンドコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの合成
スキームＡ１：本開示の脂質コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの合成
スキームＡ：本開示のリガンドコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの合成
上記スキームＡおよびスキームＡ１に示すように、式Ｉ－１の核酸またはその類似体は、１つ以上のリガンド／親油性化合物とコンジュゲートされ、１つ以上のリガンド／脂質コンジュゲートを含む式ＩまたはＩａの化合物を形成する。典型的には、コンジュゲーションは、当技術分野の公知の技法によって、式Ｉ－１またはＩ－１ａの核酸またはその類似体と、１つ以上のアダマンチル化合物および／または親油性化合物（例えば、脂肪酸）との間のエステル化またはアミド化反応を介して、直列または並列に行われる。次いで、式ＩまたはＩａの核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｉ－２またはＩ－２ａの化合物を形成し、好適なヒドロキシル保護基（例えば、ＤＭＴｒ）で保護して、式Ｉ－３またはＩ－３ａの化合物を形成することができる。一態様では、式Ｉ－３またはＩ－３ａの核酸－リガンドコンジュゲートは、（例えば、コハク酸連結基を介して）固体支持体に共有結合して、１つ以上のアダマンチルおよび／または脂質コンジュゲートを含む式Ｉ－４またはＩ－４ａの固体支持体核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成することができる。別の態様では、式Ｉ－３またはＩ－３ａの核酸－リガンドコンジュゲートは、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬（例えば、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジ－イソプロピルクロロホスホラミダイト）と反応して、Ｐ（ＩＩＩ）基を含む式Ｉ－５またはＩ－５ａの核酸またはその類似体を形成することができる。次いで、式Ｉ－５またはＩ－５ａの核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用して予め形成されるオリゴマー化形成条件に供することができる。例えば、式Ｉ－５またはＩ－５ａの化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸リガンドコンジュゲートまたはその類似体に結合される。さらなる工程では、式ＩＩ－１またはＩＩ－Ｉａの化合物によって表される１つ以上の脂質コンジュゲートヌクレオチド単位を含む、様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および／または固体支持体からの切断を含み得る。Ｂ、Ｅ、Ｌ、リガンド、ＬＣ、ｎ、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＺの各々は、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
スキームＢ：本開示のオリゴヌクレオチドの合成後の脂質コンジュゲーション
上記スキームＢに示すように、式Ｉ－１の核酸またはその類似体は、脱保護されて式Ｉ－６の化合物を形成し、好適なヒドロキシル保護基（例えば、ＤＭＴｒ）で保護して式Ｉ－７の化合物を形成し、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬（例えば、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジ－イソプロピルクロロホスホラミダイト）と反応させて、Ｐ（ＩＩＩ）基を含む式Ｉ－８の核酸またはその類似体を形成することができる。次に、式Ｉ－８の核酸またはその類似体を、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用して予め形成されるオリゴマー化形成条件に供することができる。例えば、式Ｉ－８の化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸またはその類似体に結合される。さらなる工程は、式ＩＩ－２の化合物によって表される、様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および／または固体支持体からの切断を含み得る。次に、式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のリガンド、例えば、アダマンチル、または親油性化合物（例えば、脂肪酸）とコンジュゲートされて、１つ以上のリガンドコンジュゲートを含む式ＩＩ－１の化合物を形成することができる。典型的には、コンジュゲーションは、当技術分野の公知の技法によって、式ＩＩ－２の核酸もしくはその類似体と、１つ以上のアダマンチル化合物または脂肪酸との間のエステル化またはアミド化反応を介して、直列または並列に行われる。Ｂ、Ｅ、Ｌ、リガンド、ＬＣ、ｎ、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＺの各々は、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
特定の実施形態では、本開示の核酸およびその類似体は、以下に記載されるスキームＣおよびスキームＤに従って調製される。
スキームＣ：本開示の脂質コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの合成
スキームＣ：本開示の脂質コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの合成
上記スキームＣに描写されるように、式Ｃ１の核酸またはその類似体は、式Ｃ２の化合物を形成するために保護される。次いで、式Ｃ２の核酸またはその類似体は、アルキル化され（例えば、プメラー転位を介してＤＭＳＯおよび酢酸を使用して）、式Ｃ３のモノチオアセタール化合物を形成する。次に、式Ｃ３の核酸またはその類似体は、適切な条件（例えば、穏やかな酸化条件）下でＣ４と結合させて、式Ｃ５の核酸またはその類似体を形成する。次いで、式Ｃ５の核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｃ６の化合物を形成し、適切なアミド形成条件（例えば、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ）下で、式Ｃ７のリガンド（アダマンチルまたは親油性化合物（例えば、脂肪酸））と結合させて、本開示の脂質コンジュゲートを含む式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成することができる。次いで、式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を脱保護して、式Ｃ８の化合物を形成し、好適なヒドロキシル保護基（例えば、ＤＭＴｒ）で保護して、式Ｃ９の化合物を形成することができる。一態様では、式Ｃ９の核酸またはその類似体は、（例えば、コハク酸連結基を介して）固体支持体に共有結合して、本開示のリガンドコンジュゲート（アダマンチルまたは脂質部分）を含む式Ｃ１０の固体支持体核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成することができる。別の態様では、式Ｃ９の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体は、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬（例えば、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジ－イソプロピルクロロホスホラミダイト）と反応させて、Ｐ（ＩＩＩ）基を含む式Ｃ１１の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成することができる。次いで、式Ｃ１１の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用して予め形成されるオリゴマー化形成条件に供することができる。例えば、式Ｃ１１の化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸リガンドコンジュゲートまたはその類似体に結合される。さらなる工程は、式ＩＩ－ｂ－３の化合物によって表される１つ以上のアダマンチルおよび／または脂質コンジュゲートヌクレオチド単位を含む、様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および／または固体支持体からの切断を含み得る。Ｂ、Ｅ、Ｌ２、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｖ、Ｗ、およびＺの各々は、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
スキームＤ：本開示のオリゴヌクレオチドの合成後の脂質コンジュゲーション
Ｂ、Ｅ、Ｌ２、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｖ、Ｗ、およびＺの各々は、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。上記スキームＤに示すように、式Ｃ５の核酸またはその類似体は、選択的に脱保護されて、式Ｄ１の化合物を形成し、好適なヒドロキシル保護基（例えば、ＤＭＴｒ）で保護して式Ｄ２の化合物を形成し、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬（例えば、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジ－イソプロピルクロロホスホラミダイト）と反応させて、式Ｄ３の核酸またはその類似体を形成することができる。次に、式Ｄ３の核酸またはその類似体を、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用して予め形成されるオリゴマー化形成条件に供することができる。例えば、式Ｄ３の化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸またはその類似体に結合される。さらなる工程は、式Ｄ４の化合物によって表される、様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および／または固体支持体からの切断を含み得る。次いで、式Ｄ４のオリゴヌクレオチドは、脱保護されて、式Ｄ５の化合物を形成し、疎水性リガンド（例えば、アダマンチルまたは親油性部分）と結合されて、適切なアミド形成条件（例えば、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ）下で、式Ｃ７の化合物（例えば、アダマンチルまたは脂肪酸）を形成し、本開示のリガンド（例えば、脂肪酸）コンジュゲートを含む、式ＩＩ－ｂ－３のオリゴヌクレオチドを形成することができる。
当業者であれば、脂肪族基、アルコール、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ハロゲン、およびニトリルなどの本開示の核酸またはその類似体に存在する様々な官能基が、還元、酸化、エステル化、加水分解、部分酸化、部分還元、ハロゲン化、脱水、部分水和、および水和を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の技法によって相互変換され得ることを理解するであろう。例えば、“ＭＡＲＣＨ’Ｓ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ”，（５ｔｈ Ｅｄ．，Ｅｄ．：Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２００１）を参照されたい。これらの各々の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。こうした相互変換は、前述の技法のうちの１つ以上を必要としてもよく、本開示の提供される核酸を合成するための特定の方法は、以下に例証として記載される。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の脂質コンジュゲートを含むオリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供し、前述の脂質コンジュゲート単位は、式ＩＩ－ａ－１によって表されるか、
またはその薬学的に許容可能な塩であり、方法が、
（ａ）式Ｉ－５ａの核酸もしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）前述の式Ｉ－５ａの化合物をオリゴマー化して、式ＩＩ－１ａの化合物を形成する工程と、を含み、式中、Ｂ、Ｅ、Ｌ、ＬＣ、ｎ、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｅ、およびＺの各々が、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
（ａ）式Ｉ－５ａの核酸もしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｉ－５ａの化合物をオリゴマー化して、式ＩＩ－１ａの化合物を形成する工程と、を含み、式中、Ｂ、Ｅ、Ｌ、ＬＣ、ｎ、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｅ、およびＺの各々が、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
上記の工程（ｂ）では、オリゴマー化とは、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用してオリゴマー化形成条件を予備形成することを指す。例えば、式Ｉ－５ａの化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸またはその類似体に結合される。さらなる工程は、本開示の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－１ａの化合物によって表される、様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および固体支持体からの切断を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の脂質コンジュゲートを含むオリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供し、方法が、式Ｉ－５ａの核酸もしくはその類似体、
またはその塩を調製することをさらに含み、
（ａ）式Ｉａの核酸もしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）前述の式Ｉａの核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｉ－２ａの化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｃ）前述の式Ｉ－２の核酸またはその類似体を保護して、式Ｉ－３ａの化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｄ）前述の式Ｉ－３ａの核酸またはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｉ－５ａの核酸またはその類似体を形成する工程と、を含み、式中、Ｂ、Ｅ、Ｌ、ＬＣ、ｎ、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｅ、およびＺの各々は、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
（ａ）式Ｉａの核酸もしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｉａの核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｉ－２ａの化合物、
（ｃ）前述の式Ｉ－２の核酸またはその類似体を保護して、式Ｉ－３ａの化合物、
（ｄ）前述の式Ｉ－３ａの核酸またはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｉ－５ａの核酸またはその類似体を形成する工程と、を含み、式中、Ｂ、Ｅ、Ｌ、ＬＣ、ｎ、ＰＧ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｅ、およびＺの各々は、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
上記の工程（ｂ）では、式Ｉａの化合物のＰＧ１およびＰＧ２は、酸性条件下でまたはフッ化物アニオンを用いて除去することができるシリルエーテルまたは環状シリレン誘導体を含む。ケイ素系保護基の除去のためのフッ化物アニオンを提供する試薬の例としては、フッ化水素酸、フッ化水素ピリジン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド、テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムフルオリド、およびこれに類するものが挙げられる。
上記の工程（ｃ）では、式Ｉ－２ａの化合物は、好適なヒドロキシル保護基で保護される。特定の実施形態では、式Ｉ－２ａの化合物の５’－ヒドロキシル基の保護に使用される保護基ＰＧ４は、トリチル、４－メチオキシトリチル、４，４’－ジメチオキシトリチル、４，４’，４’‘－トリメチオキシトリチル、９－フェニル－キサンテン－９－イル、９－（ｐ－トリル）キサンテン－９－イル、ピキシル（ｐｉｘｙｌ）、２，７－ジメチルピキシル、およびこれに類するものの酸不安定保護基を含む。特定の実施形態では、酸不安定保護基は、例えば、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を使用した、酸感受性核酸またはその類似体の溶液相合成および固相合成の両方における脱保護に適している。
上記の工程（ｄ）では、式Ｉ－３ａの化合物を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｉ－５ａの化合物を得る。本開示の文脈において、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、反応させてリン（ＩＩＩ）化合物を得るリン試薬である。いくつかの実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトまたは２－シアノエチルホスホロジクロリデートである。特定の実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトである。当業者であれば、式Ｉ－３ａの化合物のＸ１による、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬における脱離基の置換が、好適な塩基の存在下または非存在下で達成されることを認識するであろう。こうした好適な塩基は、当技術分野で周知であり、有機塩基および無機塩基を含む。特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの三級アミンである。他の実施形態では、上記の工程（ｄ）は、Ｐ（Ｖ）形成試薬としてＮ，Ｎ－ジメチルホスホラミックジクロリドを使用して、予め形成される。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の脂質コンジュゲートを含むオリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供し、方法が、式Ｉａの核酸－脂質コンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を調製することをさらに含み、
（ａ）式Ｉ－１の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）１つ以上の親油性化合物を式Ｉ－１の核酸またはその類似体にコンジュゲートさせて、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式Ｉａの核酸またはその類似体を形成する工程と、を含み、式中、Ｂ、Ｅ、Ｌ、ＬＣ、ｎ、ＰＧ１、ＰＧ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｘ１、およびＺの各々が、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
（ａ）式Ｉ－１の核酸もしくはその類似体、
（ｂ）１つ以上の親油性化合物を式Ｉ－１の核酸またはその類似体にコンジュゲートさせて、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式Ｉａの核酸またはその類似体を形成する工程と、を含み、式中、Ｂ、Ｅ、Ｌ、ＬＣ、ｎ、ＰＧ１、ＰＧ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｘ１、およびＺの各々が、上記に定義され、本明細書に記載されるとおりである。
上記の工程（ｂ）では、式Ｉ－１ａの核酸またはその類似体は、１つ以上の親油性化合物とコンジュゲートされて、本開示の１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式Ｉａの化合物を形成する。典型的には、コンジュゲーションは、当技術分野の公知の技法によって、式Ｉ－１ａの核酸もしくはその類似体と、１つ以上の脂肪酸との間のエステル化またはアミド化反応を介して、直列または並列に行われる。特定の実施形態では、コンジュゲーションは、好適なアミド形成条件下で行われ、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式Ｉの化合物が得られる。好適なアミド形成条件としては、限定されるものではないが、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＢＯＰ、ＢＯＰ－Ｃｌ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３Ｐ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、またはＴＤＢＴＵなどの当技術分野で公知のアミドカップリング試薬の使用を挙げることができる。あるいは、親油性化合物のコンジュゲーションは、本明細書の表Ａに記載されるクロスカップリング技術のいずれか１つによって達成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の脂質コンジュゲートを含むオリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供し、前述の脂質コンジュゲート単位は、式ＩＩ－１によって表されるか、
またはその薬学的に許容可能な塩であり、方法が、
（ａ）式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチド、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）１つ以上の親油性化合物を式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートして、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－１のオリゴヌクレオチドを形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の親油性化合物とコンジュゲートして、本開示の１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－１のオリゴヌクレオチドを形成する。典型的には、コンジュゲーションは、当技術分野の公知の技法によって、式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチドと、１つ以上の脂肪酸との間のエステル化またはアミド化反応を介して直列または並列に行われる。特定の実施形態では、コンジュゲーションは、好適なアミド形成条件下で行われ、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－１のオリゴヌクレオチドが得られる。好適なアミド形成条件としては、限定されるものではないが、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＢＯＰ、ＢＯＰ－Ｃｌ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３Ｐ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、またはＴＤＢＴＵなどの当技術分野で公知のアミドカップリング試薬の使用を挙げることができる。あるいは、親油性化合物のコンジュゲーションは、本明細書の表Ａに記載されるクロスカップリング技術のいずれか１つによって達成され得る。
（ａ）式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）１つ以上の親油性化合物を式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートして、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－１のオリゴヌクレオチドを形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の親油性化合物とコンジュゲートして、本開示の１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－１のオリゴヌクレオチドを形成する。典型的には、コンジュゲーションは、当技術分野の公知の技法によって、式ＩＩ－２のオリゴヌクレオチドと、１つ以上の脂肪酸との間のエステル化またはアミド化反応を介して直列または並列に行われる。特定の実施形態では、コンジュゲーションは、好適なアミド形成条件下で行われ、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－１のオリゴヌクレオチドが得られる。好適なアミド形成条件としては、限定されるものではないが、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＢＯＰ、ＢＯＰ－Ｃｌ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３Ｐ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、またはＴＤＢＴＵなどの当技術分野で公知のアミドカップリング試薬の使用を挙げることができる。あるいは、親油性化合物のコンジュゲーションは、本明細書の表Ａに記載されるクロスカップリング技術のいずれか１つによって達成され得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、式ＩＩ－２によって表される単位：
を含むオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩を調製するための方法を提供し、方法が、
（ａ）式Ｉ－８の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）前述の式Ｉ－８の化合物をオリゴマー化して、式ＩＩ－２の化合物を形成する工程と、を含む。
（ａ）式Ｉ－８の核酸もしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｉ－８の化合物をオリゴマー化して、式ＩＩ－２の化合物を形成する工程と、を含む。
上記の工程（ｂ）では、オリゴマー化とは、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用してオリゴマー化形成条件を予備形成することを指す。例えば、式Ｉ－８の化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸またはその類似体に結合される。さらなる工程は、式ＩＩ－２の化合物によって表される、様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および固体支持体からの切断を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む核酸またはその類似体を調製する方法を提供し、この方法は、式Ｉ－８の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を調製することをさらに含み、
（ａ）式Ｉ－１の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）前述の式Ｉ－１の核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｉ－６の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｃ）前述の式Ｉ－６の核酸またはその類似体を保護して、式Ｉ－７の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｄ）前述の式Ｉ－７の核酸またはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｉ－８の核酸またはその類似体を形成する工程とを含み、上記の工程（ｂ）では、式Ｉ－１の化合物のＰＧ１およびＰＧ２は、酸性条件下でまたはフッ化物アニオンを用いて除去することができるシリルエーテルまたは環状シリレン誘導体を含む。ケイ素系保護基の除去のためのフッ化物アニオンを提供する試薬の例としては、フッ化水素酸、フッ化水素ピリジン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド、テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムフルオリド、およびこれに類するものが挙げられる。
（ａ）式Ｉ－１の核酸もしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｉ－１の核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｉ－６の化合物、
（ｃ）前述の式Ｉ－６の核酸またはその類似体を保護して、式Ｉ－７の化合物、
（ｄ）前述の式Ｉ－７の核酸またはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｉ－８の核酸またはその類似体を形成する工程とを含み、上記の工程（ｂ）では、式Ｉ－１の化合物のＰＧ１およびＰＧ２は、酸性条件下でまたはフッ化物アニオンを用いて除去することができるシリルエーテルまたは環状シリレン誘導体を含む。ケイ素系保護基の除去のためのフッ化物アニオンを提供する試薬の例としては、フッ化水素酸、フッ化水素ピリジン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド、テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムフルオリド、およびこれに類するものが挙げられる。
上記の工程（ｃ）では、式Ｉ－６の化合物は、好適なヒドロキシル保護基で保護される。特定の実施形態では、式Ｉ－６の化合物の５’－ヒドロキシル基の保護に使用される保護基ＰＧ４は、トリチル、４－メチオキシトリチル、４，４’－ジメチオキシトリチル、４，４’，４’’－トリメチオキシトリチル、９－フェニル－キサンテン－９－イル、９－（ｐ－トリル）キサンテン－９－イル、ピキシル、２，７－ジメチルピキシル、およびこれに類するものの酸不安定保護基を含む。特定の実施形態では、酸不安定保護基は、例えば、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を使用した、酸感受性核酸またはその類似体の溶液相合成および固相合成の両方における脱保護に適している。
上記の工程（ｄ）では、式Ｉ－７の化合物をＰ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｉ－８の化合物を得る。本開示の文脈において、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、反応させてリン（ＩＩＩ）化合物を得るリン試薬である。いくつかの実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトまたは２－シアノエチルホスホロジクロリデートである。特定の実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトである。当業者であれば、式Ｉ－７の化合物のＸ１による、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬における脱離基の置換が、好適な塩基の存在下または非存在下で達成されることを認識するであろう。こうした好適な塩基は、当技術分野で周知であり、有機塩基および無機塩基を含む。特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの三級アミンである。他の実施形態では、上記の工程（ｄ）は、Ｐ（Ｖ）形成試薬としてＮ，Ｎ－ジメチルホスホラミックジクロリドを使用して、予め形成される。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のアダマンチルおよび／または脂質部分を含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを調製するための方法を提供し、前述のコンジュゲート単位は、式ＩＩ－ｂ－３によって表されるか、
またはその薬学的に許容可能な塩であり、方法が、
（ａ）式Ｃ１１の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）前述の式Ｃ１１の化合物をオリゴマー化して、式ＩＩ－ｂ－３の化合物を形成する工程と、を含み、上記の工程（ｂ）では、オリゴマー化は、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用してオリゴマー化形成条件を予備形成することを指す。例えば、式Ｃ１１の化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸またはその類似体に結合される。さらなる工程は、１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を有する様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および固体支持体からの切断を含み、各単位は、本開示のアダマンチルまたは脂質部分を含む式ＩＩ－ｂ－３の化合物によって表される。
（ａ）式Ｃ１１の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｃ１１の化合物をオリゴマー化して、式ＩＩ－ｂ－３の化合物を形成する工程と、を含み、上記の工程（ｂ）では、オリゴマー化は、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用してオリゴマー化形成条件を予備形成することを指す。例えば、式Ｃ１１の化合物は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸またはその類似体に結合される。さらなる工程は、１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を有する様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および固体支持体からの切断を含み、各単位は、本開示のアダマンチルまたは脂質部分を含む式ＩＩ－ｂ－３の化合物によって表される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む式ＩＩ－ｂ－３のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、式Ｃ１１の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を調製することをさらに含み、
（ａ）式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）前述の式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を脱保護して、式Ｃ８の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｃ）前述の式Ｃ８の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を脱保護して、式Ｃ９の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｄ）前述の式Ｃ９の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｃ１１の核酸またはその類似体を形成することと、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｉ－ｂの化合物のＰＧ１およびＰＧ２は、酸性条件下でまたはフッ化物アニオンを用いて除去することができるシリルエーテルまたは環状シリレン誘導体を含む。ケイ素系保護基の除去のためのフッ化物アニオンを提供する試薬の例としては、フッ化水素酸、フッ化水素ピリジン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド、テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムフルオリド、およびこれに類するものが挙げられる。
（ａ）式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を脱保護して、式Ｃ８の化合物、
（ｃ）前述の式Ｃ８の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を脱保護して、式Ｃ９の化合物、
（ｄ）前述の式Ｃ９の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｃ１１の核酸またはその類似体を形成することと、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｉ－ｂの化合物のＰＧ１およびＰＧ２は、酸性条件下でまたはフッ化物アニオンを用いて除去することができるシリルエーテルまたは環状シリレン誘導体を含む。ケイ素系保護基の除去のためのフッ化物アニオンを提供する試薬の例としては、フッ化水素酸、フッ化水素ピリジン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド、テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムフルオリド、およびこれに類するものが挙げられる。
上記の工程（ｃ）では、式Ｃ８の化合物は、好適なヒドロキシル保護基で保護される。特定の実施形態では、式Ｃ８の化合物の５’－ヒドロキシル基の保護に使用される保護基ＰＧ４は、トリチル、４－メチオキシトリチル、４，４’－ジメチオキシトリチル、４，４’，４’’－トリメチオキシトリチル、９－フェニル－キサンテン－９－イル、９－（ｐ－トリル）キサンテン－９－イル、ピキシル、２，７－ジメチルピキシル、およびこれに類するものの酸不安定保護基を含む。特定の実施形態では、酸不安定保護基は、例えば、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を使用した、酸感受性核酸またはその類似体の溶液相合成および固相合成の両方における脱保護に適している。
上記の工程（ｄ）では、式Ｃ９の化合物をＰ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｃ１１の化合物を得る。本開示の文脈において、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、反応させてリン（ＩＩＩ）化合物を得るリン試薬である。いくつかの実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトまたは２－シアノエチルホスホロジクロリデートである。特定の実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトである。当業者であれば、式Ｃ９の化合物のＸ１による、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬における脱離基の置換が、好適な塩基の存在下または非存在下で達成されることを認識するであろう。こうした好適な塩基は、当技術分野で周知であり、有機塩基および無機塩基を含む。特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの三級アミンである。他の実施形態では、上記の工程（ｄ）は、Ｐ（Ｖ）形成試薬としてＮ，Ｎ－ジメチルホスホラミックジクロリドを使用して、予め形成される。
いくつかの実施形態では、本開示は、各々が１つ以上のアダマンチルまたは脂質部分を含む１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を含む式ＩＩ－ｂ－３のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを調製するための方法を提供し、方法は、式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を調製することをさらに含み、
（ａ）式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）親油性化合物を式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体にコンジュゲートして、１つ以上のアダマンチルおよび／または脂質コンジュゲートを含む、式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、好適なアミド形成条件下でコンジュゲーションが行われ、アダマンチルおよび／または脂質コンジュゲートを含む式Ｉ－ｂの化合物が得られる。好適なアミド形成条件としては、限定されるものではないが、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＢＯＰ、ＢＯＰ－Ｃｌ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３Ｐ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、またはＴＤＢＴＵなどの当技術分野で公知のアミドカップリング試薬の使用を挙げることができる。特定の実施形態では、アミド形成条件は、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡまたはＴＥＡを含む。
（ａ）式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
（ｂ）親油性化合物を式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体にコンジュゲートして、１つ以上のアダマンチルおよび／または脂質コンジュゲートを含む、式Ｉ－ｂの核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、好適なアミド形成条件下でコンジュゲーションが行われ、アダマンチルおよび／または脂質コンジュゲートを含む式Ｉ－ｂの化合物が得られる。好適なアミド形成条件としては、限定されるものではないが、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＢＯＰ、ＢＯＰ－Ｃｌ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３Ｐ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、またはＴＤＢＴＵなどの当技術分野で公知のアミドカップリング試薬の使用を挙げることができる。特定の実施形態では、アミド形成条件は、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡまたはＴＥＡを含む。
特定の実施形態では、式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体は、塩形態（例えば、フマル酸塩）で提供され、コンジュゲーション工程を予め予備形成する前に、最初に遊離塩基に変換される（例えば、重炭酸ナトリウムを使用して）。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を含む式ＩＩ－ｂ－３のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを調製するための方法を提供し、方法は、式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を調製することをさらに含み、
（ａ）式Ｃ１の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）前述の式Ｃ１の核酸またはその類似体を保護して、式Ｃ２の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｃ）前述の式Ｃ２の核酸またはその類似体をアルキル化して、式Ｃ３の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｄ）前述の式Ｃ３の核酸またはその類似体を式Ｃ４の化合物、
またはその塩により置換して、式Ｃ５の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｅ）前述の式Ｃ５の核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｃ２のＰＧ１およびＰＧ２基は、それらの介在する原子と一緒になって、環状アセタールまたはケタールなどの環状ジオール保護基を形成する。そのような基としては、メチレン、エチリデン、ベンジリデン、イソプロピリデン、シクロヘキシリデン、およびシクロペンチリデン、ジ－ｔ－ブチルシリレンおよび１，１，３，３－テトライソプロピリジシロキサニリデンなどのシリレン誘導体、環状カーボネート、環状ボロネート、および環状アデノシン一リン酸（すなわち、ｃＡＭＰ）に基づく環状一リン酸誘導体が挙げられる。特定の実施形態では、環状ジオール保護基は、塩基性条件下で、式Ｃ１のジオールと１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサンとの反応から調製された１，１，３，３－テトライソプロピリジシロキサニリデンである。
（ａ）式Ｃ１の核酸もしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｃ１の核酸またはその類似体を保護して、式Ｃ２の化合物、
（ｃ）前述の式Ｃ２の核酸またはその類似体をアルキル化して、式Ｃ３の化合物、
（ｄ）前述の式Ｃ３の核酸またはその類似体を式Ｃ４の化合物、
（ｅ）前述の式Ｃ５の核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体を形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｃ２のＰＧ１およびＰＧ２基は、それらの介在する原子と一緒になって、環状アセタールまたはケタールなどの環状ジオール保護基を形成する。そのような基としては、メチレン、エチリデン、ベンジリデン、イソプロピリデン、シクロヘキシリデン、およびシクロペンチリデン、ジ－ｔ－ブチルシリレンおよび１，１，３，３－テトライソプロピリジシロキサニリデンなどのシリレン誘導体、環状カーボネート、環状ボロネート、および環状アデノシン一リン酸（すなわち、ｃＡＭＰ）に基づく環状一リン酸誘導体が挙げられる。特定の実施形態では、環状ジオール保護基は、塩基性条件下で、式Ｃ１のジオールと１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサンとの反応から調製された１，１，３，３－テトライソプロピリジシロキサニリデンである。
上記の工程（ｃ）では、式Ｃ２の核酸またはその類似体は、酸性条件下でＤＭＳＯと無水酢酸の混合物を用いてアルキル化される。特定の実施形態において、－Ｖ－Ｈがヒドロキシル基である場合、ＤＭＳＯと無水酢酸の混合物は、酢酸の存在下でプメラー転位を介してインサイチュで（メチルチオ）酢酸メチルを形成し、次いでそれが、式Ｃ２の核酸またはその類似体のヒドロキシル基と反応して、式Ｃ３のモノチオアセタール官能化断片核酸またはその類似体を提供する。
上記の工程（ｄ）では、式Ｃ４の核酸またはその類似体を使用した、式Ｃ３の核酸またはその類似体のチオメチル基の置換は、式Ｃ４の核酸またはその類似体をもたらす。特定の実施形態では、置換は、穏やかな酸化および／または酸性条件下で発生する。いくつかの実施形態では、Ｖは酸素である。いくつかの実施形態では、穏やかな酸化試薬には、ヨウ素元素と過酸化水素の混合物、尿素過酸化水素複合体、硝酸銀／硫酸銀、臭素酸ナトリウム、ペルオキソ二硫酸アンモニウム、ペルオキソ二硫酸テトラブチルアンモニウム、オキソン（登録商標）、クロラミンＴ、Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（登録商標）ＩＩ、次亜塩素酸ナトリウム、またはヨウ化カリウム／過ヨウ素酸ナトリウムが含まれる。特定の実施形態では、軽度の酸化剤には、Ｎ－ヨードスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－クロロスクシンイミド、１，３－ジヨード－５，５－ジメチルヒダントイン、ピリジニウムトリブロミド、一塩化ヨウ素またはそれらの錯体などが含まれる。穏やかな酸化条件下で通常使用される酸としては、硫酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、およびトリフルオロ酢酸が挙げられる。特定の実施形態では、穏やかな酸化試薬としては、Ｎ－ヨードスクシンイミドとトリフルオロメタンスルホン酸の混合物を含む。
上記の工程（ｅ）では、式Ｃ５の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体のＰＧ３および任意選択でＲ４の除去（Ｒ４が好適なアミン保護基である場合）により、式Ｃ６の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体またはその塩が得られる。いくつかの実施形態では、ＰＧ３および／またはＲ４は、酸性または塩基性条件下で除去され得るカルバメート誘導体を含む。特定の実施形態では、式Ｃ５の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体の保護基（例えば、ＰＧ３およびＲ４の両方、またはＰＧ３またはＲ４のいずれかを独立して）は、酸加水分解によって除去される。当然のことながら、式Ｃ５の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体の保護基の酸加水分解によって、その式Ｃ６の塩が形成される。例えば、式Ｃ５の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体の酸不安定保護基が、塩酸などの酸で処理することによって除去される場合、得られたアミン化合物は、その塩酸塩として形成される。当業者であれば、多種多様な酸が、酸不安定性であるアミノ保護基を除去するために有用であり、それゆえに、式Ｃ６の核酸またはその類似体の多種多様な塩形態が企図されることを認識するであろう。
他の実施形態では、式Ｃ５の核酸またはその類似体の保護基（例えば、ＰＧ３およびＲ４の両方、またはＰＧ３もしくはＲ４のいずれかが独立して）は、塩基加水分解によって除去される。例えば、Ｆｍｏｃおよびトリフルオロアセチル保護基は、塩基で処理することによって除去することができる。当業者であれば、多種多様な塩基が、塩基不安定性であるアミノ保護基を除去するために有用であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、塩基はピペリジンである。いくつかの実施形態では、塩基は、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）である。特定の実施形態では、式Ｃ５の核酸－リガンドコンジュゲートまたはその類似体は、塩基性条件下で脱保護され、続いて酸で処理されて式Ｃ６の塩を形成する。特定の実施形態では、酸はフマル酸であり、式Ｃ６の塩はフマル酸塩である。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲートを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを調製するための方法を提供し、前述の核酸－リガンドコンジュゲート単位は、式ＩＩ－ｂ－３で表されるか、
またはその薬学的に許容可能な塩であり、方法が、
（ａ）式Ｄ５のオリゴヌクレオチド、
またはその塩を提供する工程と、
（ｂ）１つ以上のアダマンチル化合物または親油性化合物を式Ｄ５のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートして、１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を含む式ＩＩ－ｂ－３のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、好適なアミド形成条件下でコンジュゲーションが行われ、アダマンチルまたは脂質コンジュゲートを含む式Ｄ５の化合物が得られる。好適なアミド形成条件としては、限定されるものではないが、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＢＯＰ、ＢＯＰ－Ｃｌ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３Ｐ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、またはＴＤＢＴＵなどの当技術分野で公知のアミドカップリング試薬の使用を挙げることができる。特定の実施形態では、アミド形成条件は、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡまたはＴＥＡを含む。
（ａ）式Ｄ５のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）１つ以上のアダマンチル化合物または親油性化合物を式Ｄ５のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートして、１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を含む式ＩＩ－ｂ－３のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、好適なアミド形成条件下でコンジュゲーションが行われ、アダマンチルまたは脂質コンジュゲートを含む式Ｄ５の化合物が得られる。好適なアミド形成条件としては、限定されるものではないが、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＢＯＰ、ＢＯＰ－Ｃｌ、ＤＥＰＢＴ、Ｔ３Ｐ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、またはＴＤＢＴＵなどの当技術分野で公知のアミドカップリング試薬の使用を挙げることができる。特定の実施形態では、アミド形成条件は、ＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡまたはＴＥＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、式Ｄ５によって表される単位を含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート
またはその塩を調製する方法を提供し、方法は、
（ａ）式Ｄ４の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
またはその塩を形成する工程と、
（ｂ）前述の式Ｄ４の化合物を脱保護して、式Ｄ５の化合物を形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｄ４のオリゴヌクレオチドのＰＧ３および任意選択でＲ４の除去（Ｒ４が適切なアミン保護基である場合）により、式Ｄ５のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたはその塩をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＧ３および／またはＲ４は、酸性または塩基性条件下で除去され得るカルバメート誘導体を含む。特定の実施形態では、式Ｄ４のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの保護基（例えば、ＰＧ３およびＲ４の両方、またはＰＧ３またはＲ４のいずれかを独立して）は、酸加水分解によって除去される。当然のことながら、式Ｄ４のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの保護基の酸加水分解により、その式Ｄ５の塩が形成される。例えば、式Ｄ４のオリゴヌクレオチドの酸不安定保護基が、塩酸などの酸で処理することによって除去される場合、得られたアミン化合物は、その塩酸塩として形成される。当業者であれば、多種多様な酸が、酸不安定性であるアミノ保護基を除去するために有用であり、それゆえに、式Ｄ５の核酸－リガンドコンジュゲート単位またはその類似体の多種多様な塩形態が企図されることを認識するであろう。
（ａ）式Ｄ４の核酸－リガンドコンジュゲートもしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｄ４の化合物を脱保護して、式Ｄ５の化合物を形成する工程と、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｄ４のオリゴヌクレオチドのＰＧ３および任意選択でＲ４の除去（Ｒ４が適切なアミン保護基である場合）により、式Ｄ５のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたはその塩をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＧ３および／またはＲ４は、酸性または塩基性条件下で除去され得るカルバメート誘導体を含む。特定の実施形態では、式Ｄ４のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの保護基（例えば、ＰＧ３およびＲ４の両方、またはＰＧ３またはＲ４のいずれかを独立して）は、酸加水分解によって除去される。当然のことながら、式Ｄ４のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの保護基の酸加水分解により、その式Ｄ５の塩が形成される。例えば、式Ｄ４のオリゴヌクレオチドの酸不安定保護基が、塩酸などの酸で処理することによって除去される場合、得られたアミン化合物は、その塩酸塩として形成される。当業者であれば、多種多様な酸が、酸不安定性であるアミノ保護基を除去するために有用であり、それゆえに、式Ｄ５の核酸－リガンドコンジュゲート単位またはその類似体の多種多様な塩形態が企図されることを認識するであろう。
他の実施形態では、式Ｄ４のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの保護基（例えば、ＰＧ３およびＲ４の両方、またはＰＧ３もしくはＲ４のいずれかが独立して）は、塩基加水分解によって除去される。例えば、Ｆｍｏｃおよびトリフルオロアセチル保護基は、塩基で処理することによって除去することができる。当業者であれば、多種多様な塩基が、塩基不安定性であるアミノ保護基を除去するために有用であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、塩基はピペリジンである。いくつかの実施形態では、塩基は、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）である。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のアダマンチルおよび／または脂質部分を有する１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを調製するための方法を提供し、前述のコンジュゲート単位は式Ｄ４によって表されるか、
またはその薬学的に許容可能な塩であり、方法が、
（ａ）式Ｄ３の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を形成する工程と、
（ｂ）前述の式Ｄ３の化合物をオリゴマー化して、式Ｄ４の化合物を形成する工程と、を含む、
（ａ）式Ｄ３の核酸もしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｄ３の化合物をオリゴマー化して、式Ｄ４の化合物を形成する工程と、を含む、
上記の工程（ｂ）では、オリゴマー化とは、当技術分野でオリゴヌクレオチドを調製するための公知のおよび一般的に適用されるプロセスを使用してオリゴマー化形成条件を予備形成することを指す。例えば、式Ｄ３の核酸またはその類似体は、５’－ヒドロキシル基を有する固体に支持された核酸またはその類似体に結合される。さらなる工程は、本開示のアダマンチルまたは脂質コンジュゲートを含む式Ｄ４の化合物によって表される、様々なヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供するために、１つ以上の、脱保護、カップリング、ホスファイト酸化、および固体支持体からの切断を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の脂質コンジュゲートを含む核酸またはその類似体を調製する方法を提供し、この方法は、式Ｄ３の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を調製することをさらに含み、
（ａ）式Ｃ５の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を形成する工程と、
（ｂ）前述の式Ｃ５の核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｄ１の化合物、
またはその塩を形成する工程と、
（ｃ）前述の式Ｄ１の核酸またはその類似体を保護して、式Ｄ２の核酸もしくはその類似体、
またはその塩を形成する工程と、
（ｄ）前述の式Ｄ２の核酸またはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｄ３の核酸またはその類似体を形成することと、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｃ５の核酸またはその類似体のＰＧ１およびＰＧ２は、酸性条件下でまたはフッ化物アニオンを用いて除去することができるシリルエーテルまたは環状シリレン誘導体を含む。ケイ素系保護基の除去のためのフッ化物アニオンを提供する試薬の例としては、フッ化水素酸、フッ化水素ピリジン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド、テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムフルオリド、およびこれに類するものが挙げられる。
（ａ）式Ｃ５の核酸もしくはその類似体、
（ｂ）前述の式Ｃ５の核酸またはその類似体を脱保護して、式Ｄ１の化合物、
（ｃ）前述の式Ｄ１の核酸またはその類似体を保護して、式Ｄ２の核酸もしくはその類似体、
（ｄ）前述の式Ｄ２の核酸またはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｄ３の核酸またはその類似体を形成することと、を含む。上記の工程（ｂ）では、式Ｃ５の核酸またはその類似体のＰＧ１およびＰＧ２は、酸性条件下でまたはフッ化物アニオンを用いて除去することができるシリルエーテルまたは環状シリレン誘導体を含む。ケイ素系保護基の除去のためのフッ化物アニオンを提供する試薬の例としては、フッ化水素酸、フッ化水素ピリジン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド、テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムフルオリド、およびこれに類するものが挙げられる。
上記の工程（ｃ）では、式Ｄ１の核酸またはその類似体は、好適なヒドロキシル保護基で保護される。特定の実施形態では、式Ｄ１の化合物の５’－ヒドロキシル基の保護に使用される保護基ＰＧ４は、トリチル、４－メチオキシトリチル、４，４’－ジメチオキシトリチル、４，４’，４’’－トリメチオキシトリチル、９－フェニル－キサンテン－９－イル、９－（ｐ－トリル）キサンテン－９－イル、ピキシル、２，７－ジメチルピキシル、およびこれに類するものの酸不安定保護基を含む。特定の実施形態では、酸不安定保護基は、例えば、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を使用した、酸感受性核酸またはその類似体の溶液相合成および固相合成の両方における脱保護に適している。
上記の工程（ｄ）では、式Ｄ２の核酸またはその類似体を、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬で処理して、式Ｄ３の化合物を得る。本開示の文脈において、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、反応させてリン（ＩＩＩ）化合物を得るリン試薬である。いくつかの実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトまたは２－シアノエチルホスホロジクロリデートである。特定の実施形態では、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬は、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトである。当業者であれば、式Ｄ２の化合物のＸ１による、Ｐ（ＩＩＩ）形成試薬における脱離基の置換が、好適な塩基の存在下または非存在下で達成されることを認識するであろう。こうした好適な塩基は、当技術分野で周知であり、有機塩基および無機塩基を含む。特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの三級アミンである。他の実施形態では、上記の工程（ｄ）は、Ｐ（Ｖ）形成試薬としてＮ，Ｎ－ジメチルホスホラミックジクロリドを使用して、予め形成される。
製剤
オリゴヌクレオチドの使用を促進するために、様々な製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、分解を最小限にするか、送達および／もしくは取り込みを促進するか、または製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象または細胞環境に送達され得る。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＣＮＳのニューロンにおいて発現される標的ｍＲＮＡ）の発現を低減するオリゴヌクレオチド（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含む組成物が、本明細書に提供される。そのような組成物は、標的細胞の周囲の環境内または全身的のいずれかで対象に投与されるとき、オリゴヌクレオチドの十分な部分が細胞に入り、標的遺伝子発現を低下させるように、好適に製剤化され得る。任意の様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤が、本明細書に開示されるニューロン標的遺伝子発現の低減のためのオリゴヌクレオチドを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、およびカプシド中に製剤化される。
オリゴヌクレオチドの使用を促進するために、様々な製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、分解を最小限にするか、送達および／もしくは取り込みを促進するか、または製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象または細胞環境に送達され得る。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡ（例えば、ＣＮＳのニューロンにおいて発現される標的ｍＲＮＡ）の発現を低減するオリゴヌクレオチド（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）を含む組成物が、本明細書に提供される。そのような組成物は、標的細胞の周囲の環境内または全身的のいずれかで対象に投与されるとき、オリゴヌクレオチドの十分な部分が細胞に入り、標的遺伝子発現を低下させるように、好適に製剤化され得る。任意の様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤が、本明細書に開示されるニューロン標的遺伝子発現の低減のためのオリゴヌクレオチドを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、およびカプシド中に製剤化される。
いくつかの実施形態では、本明細書の製剤は、賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、活性成分の改善された安定性、改善された吸収、改善された溶解度、および／または治療的増強を組成物に付与する。いくつかの実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム）、またはビヒクル（例えば、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、もしくは鉱油）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その保存寿命を延長するために凍結乾燥され、次いで、使用（例えば、対象への投与）前に溶液にされる。したがって、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン）、または崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、もしくはゼラチン）であり得る。同様に、本明細書のオリゴヌクレオチドは、それらの遊離酸の形態で提供されてもよい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、くも膜下腔内）、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、中枢神経系（例えば、くも膜下腔内、硬膜外）への送達のために製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、眼（例えば、眼部、眼内、結膜下、硝子体内、眼球後部、前房内）への送達のために製剤化される。
注射可能な使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散体、および滅菌注射可能溶液または分散体の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、およびこれに類するもの）、およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。滅菌注射可能溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１個または組み合わせを含む選択された溶媒に必要な量のオリゴヌクレオチドを組み込み、続いて、濾過滅菌することによって調製することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％の治療剤（例えば、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）またはそれ以上を含有し得るが、活性成分の割合は、全組成物の重量または体積の約１％～約８０％以上であり得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品保存寿命などの要因、および他の薬理学的考慮事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な用量および治療レジメンが望ましい場合がある。
使用方法
標的遺伝子発現の低下
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＮＳのニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減するために、有効量の本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいずれかを、細胞もしくは細胞集団に接触させるか、またはそれに送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、ＣＮＳの領域において低減される。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの領域には、大脳、前頭前野、前頭皮質、運動皮質、側頭皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、体性感覚皮質、海馬、尾状核、線条体、淡蒼球、視床、中脳、被蓋、黒質、脳橋、脳幹、小脳白質、小脳、歯状核、髄質、頸髄、胸髄、腰髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、仙骨後根神経節、節状神経節、大腿神経、坐骨神経、腓腹神経、扁桃体、視床下部、被殻、脳梁、および脳神経が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの領域は、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの領域は、脊髄、腰髄、腰部後根神経節、胸髄、頸髄、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脊髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、胸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、頸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰部後根神経節のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、髄質のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、海馬のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、体性感覚皮質のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、前頭皮質のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。
標的遺伝子発現の低下
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＮＳのニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減するために、有効量の本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいずれかを、細胞もしくは細胞集団に接触させるか、またはそれに送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、ＣＮＳの領域において低減される。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの領域には、大脳、前頭前野、前頭皮質、運動皮質、側頭皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、体性感覚皮質、海馬、尾状核、線条体、淡蒼球、視床、中脳、被蓋、黒質、脳橋、脳幹、小脳白質、小脳、歯状核、髄質、頸髄、胸髄、腰髄、頸部後根神経節、胸部後根神経節、腰部後根神経節、仙骨後根神経節、節状神経節、大腿神経、坐骨神経、腓腹神経、扁桃体、視床下部、被殻、脳梁、および脳神経が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの領域は、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの領域は、脊髄、腰髄、腰部後根神経節、胸髄、頸髄、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脊髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、胸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、頸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰部後根神経節のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、髄質のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、海馬のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、体性感覚皮質のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、前頭皮質のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脊髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、胸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、頸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰部後根神経節のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脊髄のみのニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰髄のみのニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、胸髄のみのニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、頸髄のみのニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、腰部後根神経節のみのニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも脊髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも腰髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも胸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも頸髄におけるニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも腰部後根神経節のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの他の組織（例えば、髄質、海馬、および前頭皮質）と比較して、脊髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの他の組織（例えば、髄質、海馬、および前頭皮質）と比較して、腰髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの他の組織（例えば、髄質、海馬、および前頭皮質）と比較して、胸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの他の組織（例えば、髄質、海馬、および前頭皮質）と比較して、頸髄のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの他の組織（例えば、髄質、海馬、および前頭皮質）と比較して、腰部後根神経節のニューロンにおける標的遺伝子の発現を低減する。
いくつかの実施形態では、対象の脊髄におけるニューロン標的遺伝子の発現は、他のＣＮＳ組織における標的遺伝子発現と比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの１つ以上の組織における脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによって低減された遺伝子発現と比較して、脊髄のニューロンにおける標的遺伝子発現を約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、または約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減する。
いくつかの実施形態では、対象の腰髄におけるニューロン標的遺伝子の発現は、他のＣＮＳ組織における標的遺伝子発現と比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの１つ以上の組織における脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによって低減された遺伝子発現と比較して、腰髄のニューロンにおける標的遺伝子発現を約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、または約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減する。
いくつかの実施形態では、対象の頸髄におけるニューロン標的遺伝子の発現は、他のＣＮＳ組織における標的遺伝子発現と比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの１つ以上の組織における脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによって低減された遺伝子発現と比較して、頸髄のニューロンにおける標的遺伝子発現を約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、または約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減する。
いくつかの実施形態では、対象の胸髄におけるニューロン標的遺伝子の発現は、他のＣＮＳ組織における標的遺伝子発現と比較して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステム－ループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの１つ以上の組織における脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによって低減された遺伝子発現と比較して、胸髄のニューロンにおける標的遺伝子発現を約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、または約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減する。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、細胞における標的ｍＲＮＡ、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質、または標的遺伝子（ｍＲＮＡもしくはタンパク質）活性の量またはレベルの低減を測定することによって決定される。これらの方法は、本明細書に記載され、当業者に公知であるものを含む。
本明細書に提供される方法は、任意の適切な細胞型に有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、ニューロン標的ｍＲＮＡを発現する任意の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から取得された初代ニューロン細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、細胞がその天然の表現型特性を実質的に維持するように限られた数の継代を受けている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、エクスビボまたはインビトロである（すなわち、培養中の細胞または細胞が常在する生物に送達され得る）。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含有する溶液または医薬組成物の注射、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによって覆われた粒子による衝撃、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含有する溶液への細胞もしくは細胞集団の曝露、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の核酸送達方法を使用して、細胞または細胞集団（例えば、ニューロン）に送達される。脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、およびリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクション、ならびにその他などのオリゴヌクレオチドを細胞に送達するための当技術分野で公知の他の方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現に関連する細胞もしくは細胞集団の１個以上の分子、特性、もしくは特徴を評価するアッセイもしくは技法によって、または細胞もしくは細胞集団における標的遺伝子発現を直接的に示す分子（例えば、標的ｍＲＮＡもしくはタンパク質）を評価するアッセイもしくは技法によって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドがニューロンにおける標的遺伝子発現を低減する程度は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させたニューロンまたはニューロン集団における標的遺伝子発現を、対照細胞または細胞集団（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させていないか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させたニューロンまたはニューロン集団）と比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、対照細胞または細胞集団における標的遺伝子発現の対照量またはレベルは、アッセイまたは技法が行われる全ての事例において対照量またはレベルを測定する必要がないように、予め決定される。所定のレベルまたは値は、様々な形態を取ることができる。いくつかの実施形態では、所定のレベルまたは値は、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドをニューロンまたはニューロン集団に接触させるか、またはそれに送達することにより、ニューロン標的遺伝子の発現の低減が生じる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させなかったか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させた細胞または細胞集団における標的遺伝子発現の対照量またはレベルに対するものである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の対照量またはレベルは、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させていない細胞または細胞集団における標的ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の量またはレベルである。いくつかの実施形態では、本明細書の方法による細胞または細胞集団への本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの送達の効果は、任意の有限期間または時間量（例えば、分、時間、日、週、月）後に評価される。例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団に接触させるか、またはそれに送達してから、少なくとも約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、または少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約２１日、約２８日、約３５日、約４２日、約４９日、約５６日、約６３日、約７０日、約７７日、もしくは約８４日以上後に、細胞または細胞集団において決定される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団と接触させるか、またはそれに送達してから、少なくとも約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、もしくは約６ヶ月以上後に、細胞または細胞集団において決定される。
遺伝子発現の組織特異的調節
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団に接触させるか、またはそれに送達するための方法を提供し、細胞または細胞集団は、対象の１つ以上の標的組織に存在する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、コンジュゲートは、対象の１つ以上の標的組織に分布し、コンジュゲートは、１つ以上の標的組織内の細胞または細胞集団に接触するか、またはそれに送達される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞もしくは細胞集団に接触させるか、またはそれに送達するための方法を提供し、細胞または細胞集団は、対象の１つ以上の標的組織に存在する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、コンジュゲートは、対象の１つ以上の標的組織に分布し、コンジュゲートは、１つ以上の標的組織内の細胞または細胞集団に接触するか、またはそれに送達される。
本明細書で使用される場合、「標的組織」は、組織内の細胞または細胞集団による標的遺伝子の発現の低減が、１つ以上の望ましい生理学的転帰をもたらす、対象の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、１つ以上の標的組織内の細胞または細胞集団において異常な発現を有し、異常な発現は、対象における疾患または障害の病理の原因となる。いくつかの実施形態では、標的組織内の細胞または細胞集団による標的遺伝子の発現の低下は、対象の疾患または障害を治療、緩和、予防、または軽減するために機能する。
標的組織内の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの分布および／または機能は、標的組織内に存在する細胞または細胞集団内の標的遺伝子発現を低減するのに望ましいが、非標的組織へのコンジュゲートの分布および／または機能は、有害な影響を引き起こす可能性がある。例えば、非標的組織へのコンジュゲートの分布は、標的組織への分布に対するその利用可能性を制限する可能性があり、これにより、標的組織内に存在する細胞または細胞集団内の標的遺伝子発現を低下させるためのコンジュゲートの効力および／または活性が制限される。別の例として、標的組織は、標的遺伝子の異常な発現を有する可能性があり、正常な生理機能を回復させるために標的遺伝子発現を低下させることが有益である一方、非標的組織は正常な生理学的機能のために標的遺伝子の発現を必要とする可能性がある。こうした状況下では、非標的組織内のコンジュゲートの分布および／または機能により、望ましくないまたは有害な病理が生じることになる様式で標的遺伝子の発現が損なわれる。したがって、多数のインビボ治療的状況について、対象における１つ以上の非標的組織（例えば、肝臓）内でのその分布および／または機能を制限しながら、対象における標的組織に脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを分布させることが有益である。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象において１つ以上の標的組織に関連する細胞集団における標的遺伝子の発現を低減または阻害するための方法であって、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、対象の１つ以上の非標的組織への分布は最小限での、対象の１つ以上の標的組織へのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートの分布を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対象の１つ以上の非標的組織中に存在する細胞または細胞集団への接触または送達を最小限にして、対象の１つ以上の標的組織中に存在する細胞または細胞集団に接触するか、または送達される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、１つ以上の非標的組織において同様または類似のレベルに低下することなく、１つ以上の標的組織において低下させる。
いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）標的遺伝子の対照発現と比較して、１つ以上の標的組織における細胞または細胞集団による標的遺伝子の発現の低下と、（ｉｉ）標的遺伝子の対照発現に対して、１つ以上の非標的組織における細胞または細胞集団による標的遺伝子の実質的に同等の発現と、をもたらす。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の対照発現は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させなかったか、または対照ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートと接触させた同等の組織からの細胞または細胞集団における標的遺伝子の発現の量またはレベルに対応する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低下は、標的遺伝子から転写された標的ｍＲＮＡの量もしくはレベル、または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量もしくはレベルの低下として測定される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）対照と比較して、１つ以上の標的組織における標的ｍＲＮＡの発現の低下と、（ｉｉ）対照と比較して、１つ以上の非標的組織における標的ｍＲＮＡの実質的に同等の発現と、をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）対照と比較して、１つ以上の標的組織における標的タンパク質のレベルの低下と、（ｉｉ）対照と比較して、１つ以上の非標的組織における標的タンパク質の実質的に同等のレベルと、をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＣＮＳと関連する細胞集団における標的遺伝子の発現を低減または阻害するための方法であって、本明細書に記載される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、対象の１つ以上の非標的組織（例えば、肝臓）への分布は最小限での、対象におけるＣＮＳへのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートの分布を含む。いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、対象の１つ以上の非標的組織（例えば、肝臓）に存在する細胞または細胞集団への接触または送達を最小限にして、対象のＣＮＳに存在する細胞または細胞集団に接触するか、または送達される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、１つ以上の非標的組織（例えば、肝臓）においては同様のレベルに低下させることなく、対象のＣＮＳにおいて低下させる。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、１つ以上の非標的組織においては同様のレベルに低下させることなく、ＣＮＳにおいて低下させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の非標的組織は、肝臓組織を含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）標的遺伝子の対照発現と比較して、ＣＮＳの細胞または細胞集団における標的遺伝子の発現の低下と、（ｉｉ）標的遺伝子の対照発現と比較して、１つ以上の非標的組織の細胞または細胞集団における標的遺伝子の実質的に同等の発現と、をもたらす。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の対照発現は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させなかったか、または対照ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲートと接触させた同等の組織からの細胞または細胞集団における標的遺伝子の発現の量またはレベルに対応する。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）標的遺伝子の対照発現と比較した、ＣＮＳの細胞または細胞集団における標的遺伝子の発現の低減（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させていないか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させたＣＮＳの細胞または細胞集団における標的遺伝子の発現）と、（ｉｉ）標的遺伝子の対照発現と比較した、肝臓の細胞または細胞集団における標的遺伝子の実質的に同等な発現（例えば、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させていないか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと接触させた肝臓の細胞または細胞集団における標的遺伝子の発現）とをもたらす。いくつかの実施形態では、この方法により、ＣＮＳの細胞または細胞集団における標的遺伝子の発現が、標的遺伝子の対照発現と比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下となる。いくつかの実施形態では、肝臓における標的遺伝子の発現は、標的遺伝子の対照発現に匹敵する（例えば、約±３０％、約±２５％、約±２０％、約±１５％、約±１０％、約±５％、約±４％、約±３％、約±２％、または約±１％以下の差を有する）。いくつかの実施形態では、ＣＮＳにおける標的遺伝子発現の低下は、標的遺伝子から転写された標的ｍＲＮＡの量もしくはレベル、または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量もしくはレベルの低下として測定される。
治療方法
本開示は、医薬として使用するため、特にＣＮＳに関連する疾患、障害、および状態を治療するための方法で使用するための、オリゴヌクレオチドを提供する。本開示はまた、ニューロン標的遺伝子の発現を低減することから利益を受けるであろうニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象（例えば、ヒト）を治療するために使用するための、または使用するために適合された、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ニューロン標的遺伝子発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するために使用するための、または使用するために適合された、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。本開示はまた、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を治療するための医薬または医薬組成物の製造における使用のための、または使用するために適合された、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、使用するための、または使用するために適合された脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを標的とし、ニューロン標的遺伝子の発現を低減する（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）。いくつかの実施形態では、使用するための、または使用するために適合された脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを標的とし、ニューロン標的ｍＲＮＡ、タンパク質、および／または活性の量またはレベルを低減する。
本開示は、医薬として使用するため、特にＣＮＳに関連する疾患、障害、および状態を治療するための方法で使用するための、オリゴヌクレオチドを提供する。本開示はまた、ニューロン標的遺伝子の発現を低減することから利益を受けるであろうニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象（例えば、ヒト）を治療するために使用するための、または使用するために適合された、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ニューロン標的遺伝子発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するために使用するための、または使用するために適合された、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。本開示はまた、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を治療するための医薬または医薬組成物の製造における使用のための、または使用するために適合された、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、使用するための、または使用するために適合された脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを標的とし、ニューロン標的遺伝子の発現を低減する（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）。いくつかの実施形態では、使用するための、または使用するために適合された脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを標的とし、ニューロン標的ｍＲＮＡ、タンパク質、および／または活性の量またはレベルを低減する。
加えて、本明細書の方法のいくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、もしくは状態を有するか、またはそれにかかりやすい対象が、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを用いた治療のために選択される。いくつかの実施形態では、方法は、標的ｍＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、もしくは状態のマーカー（例えば、バイオマーカー）を有するか、またはそれにかかりやすい個体を選択することを含む。同様に、以下に詳述するように、本開示によって提供される方法のいくつかの実施形態は、例えば、ニューロン標的遺伝子の発現のマーカーのベースライン値を測定または取得する工程と、次いで、そのように得られた値を、１つ以上の他のベースライン値、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを対象に投与した後に取得される値と比較して、治療の有効性を評価する工程とを含む。
本開示はまた、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、もしくは状態を有する、有する疑いがある、または発症するリスクがある対象を、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用して、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、もしくは状態を治療するか、またはその発症もしくは進行を軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用して、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象において、１つ以上の治療的利益を達成する方法を提供する。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を投与することによって治療される。いくつかの実施形態では、治療は、（例えば、ＣＮＳにおける）ニューロン標的遺伝子の発現を低減することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、治療的に処置される。いくつかの実施形態では、対象は、予防的に処置される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、標的遺伝子発現が対象において低減され、それによって対象を治療するように、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡの量またはレベルは、対象において低下する。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の量またはレベルが、対象において低下する。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書に提供される脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、標的遺伝子発現が、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前の標的遺伝子発現と比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減されるように、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、医薬組成物、もしくは治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における標的遺伝子発現と比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、標的ｍＲＮＡの量またはレベルが、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前の標的ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減されるように、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡの量またはレベルは、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、医薬組成物、もしくは治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における標的ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ニューロン標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量またはレベルが、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前の標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減されるように、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量またはレベルは、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、医薬組成物、もしくは治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、標的遺伝子活性の量またはレベルが、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前の標的遺伝子活性の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減されるように、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子活性の量またはレベルは、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、医薬組成物、もしくは治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における標的遺伝子活性の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
対象において、または対象からの試料において、標的遺伝子発現、標的ｍＲＮＡの量またはレベル、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量またはレベル、および／または標的遺伝子活性の量またはレベルを決定するための好適な方法は、当技術分野で公知である。さらに、本明細書に記載される実施例は、標的遺伝子発現を決定するための例示的な方法を説明する。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現、標的遺伝子ｍＲＮＡの量もしくはレベル、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量もしくはレベル、標的遺伝子活性の量もしくはレベル、またはそれらの任意の組み合わせは、細胞（例えば、ニューロン）、細胞集団もしくは細胞群（例えば、オルガノイド）、器官（例えば、ＣＮＳ）、血液もしくはその画分（例えば、血漿）、組織（例えば、脳組織）、試料（例えば、ＣＳＦ試料または脳生検試料）、または対象から取得もしくは単離された任意の他の生体物質において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現、標的遺伝子ｍＲＮＡの量もしくはレベル、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量もしくはレベル、標的遺伝子活性の量もしくはレベル、またはそれらの任意の組み合わせは、２つ以上のタイプの細胞（例えば、ニューロン）、２つ以上の細胞群、２つ以上の器官（例えば、脳および１つ以上の他の器官）、２つ以上の血液の画分（例えば、血漿および１つ以上の他の血液画分）、２つ以上のタイプの組織（例えば、脳組織および１つ以上の他のタイプの組織）、対象から取得または単離された２つ以上のタイプの試料（例えば、脳生検試料および１つ以上の他のタイプの生検試料）において低減される。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、腰髄、腰部後根神経節（ＤＲＧ）、髄質、海馬、体性感覚皮質、または前頭皮質のうちの１つ以上において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、脊髄、腰髄、胸髄、頸髄、腰部後根神経節（ＤＲＧ）、髄質、海馬、体性感覚皮質、または前野皮質のうちの１つ以上において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、脊髄において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、腰髄において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、胸髄において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、頸髄において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、腰部後根神経節において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、髄質において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、海馬において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、体性感覚皮質において低減される。いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、前頭皮質において低減される。
ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害または状態の例には、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒症（ＡＧＤ）、球状グリア性タウオパチー（ＧＧＴ）、加齢関連タウアストログリオパチー（ＡＲＴＡＧ）、家族性前頭側頭型認知症１７（ＦＴＤ－１７）、呼吸不全を伴うタウオパチー、発作を伴う認知症、ピック病、筋強直性ジストロフィー１または２（ＭＤ１またはＭＤ２）、ダウン症候群、痙性対麻痺（ＳＰ）、ニーマン・ピック病Ｃ型、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、レビー小体型嚥下障害、レビー小体病、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄性筋萎縮症Ｖ（ＳＭＡＶ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１０（脊髄小脳失調症１型、２型、３型、７型または１０型）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ、ケネディ病）、フリードライヒ運動失調症、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、Ｘ染色体連鎖性精神遅滞（ＸＬＭＲ）、パーキンソン病、ジストニア、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、神経因性疼痛障害、脊髄傷害、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、劣性ＣＮＳ障害、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、Ｍ２ＤＳ（ＭＥＣＰ２重複症候群）、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、プリオン病、成人発症型白質ジストロフィー、アレクサンダー病、クラッベ病、慢性外傷性脳症、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）、ラフォラ病、脳卒中、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、および異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現は、ニューロン標的遺伝子の異常発現に関連する疼痛障害を治療するのに十分、ＤＲＧにおいて低減される。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、または状態は、神経変性疾患である。
いくつかの実施形態では、ニューロン標的遺伝子は、ヒトなどの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であり得る。本明細書に記載される方法に従って、任意のニューロン遺伝子がサイレンシングされ得る。
本明細書に記載される方法は、典型的には、治療有効量の本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、すなわち、望ましい治療結果を生じ得る量を対象に投与することを含む。治療上許容される量は、疾患または障害を治療的に治療できる量であり得る。いずれか１つの対象に対する適切な用量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される組成物、組成物中の活性成分、投与の時間および経路、一般的な健康状態、ならびに同時投与される他の薬剤を含む、特定の因子に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書の組成物のうちのいずれか１つを、経腸的に（例えば、経口的に、胃栄養管によって、十二指腸栄養管によって、胃瘻造設を介して、または直腸に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射または注入、動脈内注射または注入、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、くも膜下腔内）、局所的に（例えば、経皮、吸入、点眼薬を介して、または粘膜を介して）、または標的器官（例えば、対象の脳）への直接注射によってのいずれかで投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、脳脊髄液（ＣＳＦ）内にくも膜下腔内投与される（例えば、くも膜下腔内の体液への注射または注入）。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物のくも膜下腔内投与は、くも膜下腔内へのボーラス注射として行われる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物のくも膜下腔内投与は、くも膜下腔への注入として行われる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物のくも膜下腔内投与は、カテーテルを介してくも膜下腔に行われる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物のくも膜下腔内投与は、ポンプを介して行われる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物のくも膜下腔内投与は、埋め込み型ポンプを介して行われる。いくつかの実施形態では、投与は、リザーバーを動作または機能させる埋め込み型デバイスを介して実行される。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、小脳延髄槽（大槽とも呼ばれる）内にくも膜下腔内投与される。大槽内へのくも膜下腔内投与は、「槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）投与」または「大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｍａｇｎａ）（ｉ．ｃ．ｍ．）投与）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、腰髄のくも膜下腔内にくも膜下腔内投与される。腰髄のくも膜下腔へのくも膜下腔内投与は、「腰部くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）投与」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、頸髄のくも膜下腔内にくも膜下腔内投与される。頸髄のくも膜下腔へのくも膜下腔内投与は、「頸部くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）投与」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、胸髄のくも膜下腔内にくも膜下腔内投与される。胸髄のくも膜下腔へのくも膜下腔内投与は、「胸部くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）投与」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、脳室内への脳室内注射または注入によって投与される。脳室腔への脳室内投与は、「脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、オンマヤリザーバーが、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたはその組成物を脳室内注射または注入によって投与するために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたはその組成物は、眼投与、眼内投与、結膜下投与、硝子体内投与、球後投与、または前房内投与を介して投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、硬膜外投与を介して投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、年に１回、６ヶ月に１回、４ヶ月に１回、四半期（３ヶ月に１回）、隔月（２ヶ月に１回）、毎月、または毎週投与される。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、毎週、または２週間もしくは３週間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物の１回以上の負荷用量が投与され、その後、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物の１回以上の維持用量が投与される。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ヒトもしくは非ヒト霊長類または他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象には、イヌおよびネコなどの家畜化動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜、ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの動物が含まれる。
キット
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物と、使用説明書とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、もしくはその組成物と、キットおよび／またはその任意の構成要素の使用説明書を含む添付文書とを含む。いくつかの実施形態では、キットは、好適な容器内に、本明細書に記載される、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物、１つ以上の対照、ならびに当技術分野で周知の様々な緩衝液、試薬、酵素、および他の標準成分を含む。いくつかの実施形態では、容器は、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物が配置される、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含み、一部の事例では、適切にアリコートされる。追加の構成要素が提供されるいくつかの実施形態では、キットは、この構成要素が配置される追加の容器を含む。キットはまた、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物、および任意の他の試薬を商業販売のために厳重に閉じ込めて収容するための手段を含むことができる。そのような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。容器および／またはキットは、使用のための指示および／または警告を記載したラベルを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物と、使用説明書とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、もしくはその組成物と、キットおよび／またはその任意の構成要素の使用説明書を含む添付文書とを含む。いくつかの実施形態では、キットは、好適な容器内に、本明細書に記載される、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物、１つ以上の対照、ならびに当技術分野で周知の様々な緩衝液、試薬、酵素、および他の標準成分を含む。いくつかの実施形態では、容器は、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物が配置される、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含み、一部の事例では、適切にアリコートされる。追加の構成要素が提供されるいくつかの実施形態では、キットは、この構成要素が配置される追加の容器を含む。キットはまた、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはその組成物、および任意の他の試薬を商業販売のために厳重に閉じ込めて収容するための手段を含むことができる。そのような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。容器および／またはキットは、使用のための指示および／または警告を記載したラベルを含むことができる。
いくつかの実施形態では、キットは、ニューロン標的遺伝子の発現に関連する疾患、障害、もしくは状態の治療、またはその進行の遅延を必要とする対象においてそれを行うための、本明細書に記載される、本明細書の脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、もしくはその組成物、および薬学的に許容可能な担体、または脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、ならびに説明書を含む。
定義
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１個以上のいずれかおよび全ての組み合わせを含む。さらに、単数形、および冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明示的な定めのない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、当然のことながら、本明細書で使用される場合、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、および／または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１個以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を除外しない。さらに、当然のことながら、構成要素またはサブシステムを含む要素は、別の要素に接続または結合されていると言及および／または示される場合、それは、他の要素に直接的に接続もしくは結合され得るか、または介在する要素が存在してもよい。
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１個以上のいずれかおよび全ての組み合わせを含む。さらに、単数形、および冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明示的な定めのない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、当然のことながら、本明細書で使用される場合、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、および／または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１個以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を除外しない。さらに、当然のことながら、構成要素またはサブシステムを含む要素は、別の要素に接続または結合されていると言及および／または示される場合、それは、他の要素に直接的に接続もしくは結合され得るか、または介在する要素が存在してもよい。
別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の方法および組成物の実践において使用することができるが、例示的な方法および材料が本明細書に記載されている。
ベクター、プロモーター、および他の多くの関連トピックの使用を含む、本明細書において有用な分子生物学的技術を記載する一般的なテキストには、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ １５２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（”Ｂｅｒｇｅｒ”）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ－－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）、およびＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａ ＪＯＩＮＴ ＶＥＮＴＵＲＥ ＢＥＴＷＥＥＮ ＧＲＥＥＮＥ ＰＵＢＬＩＳＨＩＮＧ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＳ，ＩＮＣ．ＡＮＤ ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＡＮＤ ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９９年を通して補足）（”Ａｕｓｕｂｅｌ”）が含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ．ベータ．－レプリカーゼ増幅、および例えば、本開示の相同核酸の産生のための他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む、インビトロ増幅方法を通して当業者を指示するのに十分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）、ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（”Ｉｎｎｉｓ”）、Ａｒｎｈｅｉｍ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔ．１，１９９０）ＣａｎｄＥＮ ３６－４７、Ｊ．ＮＩＨ ＲＥＳ．（１９９１）３：８１－９４、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８６：１１７３、Ｇｕａｔｅｌｌｉｅｔ ａｌ（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８７：１８７４、Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ ３５：１８２６、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＳＣＩＥＮＣＥ ２４１：１０７７－８０、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ８：２９１－９４、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）ＧＥＮＥ ４：５６０、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＧＥＮＥ ８９：１１７、およびＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ（１９９５）ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ １３：５６３－５６４に見られる。インビトロで増幅された核酸をクローニングするための改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。ＰＣＲによって大きい核酸を増幅するための改善された方法は、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ ３６９：６８４－８５、およびその中で引用されている参考資料に要約され、そこで、最大４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成される。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示のない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２個以上のそのような担体の混合物、およびこれに類するものを含む。
範囲は、本明細書において「約」ある値から、および／または「約」別の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、一方の値から、および／または他方の値までを含む。同様に、当然のことながら、値が近似値として表される場合、先行する「約」の使用によって、その値は、別の実施形態を形成する。さらに、当然のことながら、範囲の各々の端点は、他方の端点との関連で、および他方の端点とは独立しての両方において重要である。また、本明細書に開示されるいくつかの値が存在すること、および各値が、その値自体に加えて「約」その値としても本明細書に開示されていることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。また、当業者によって適切に理解されるように、値が開示される場合、その値「未満またはそれに等しい」、「その値よりも大きいまたはそれに等しい」、および値の間の可能な範囲も開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満またはそれに等しい」ならびに「１０よりも大きいまたはそれに等しい」も開示される。また、本出願全体を通して、データがいくつかの異なる形式で提供されること、およびこのデータが、端点および開始点、ならびにデータ点の任意の組み合わせの範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示される場合、１０および１５よりも大きい、１０および１５よりも大きいまたはそれに等しい、１０および１５よりも小さい、１０および１５よりも小さいまたはそれに等しい、ならびに１０および１５に等しいが、１０～１５と同様に開示されるとみなされる。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることが理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
本明細書で使用される場合、「相補的」は、２個のヌクレオチドが互いに塩基対合することを可能にする２個のヌクレオチド間の構造的関係（例えば、２個の対向する核酸上または単一の核酸鎖の対向する領域上）を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドに対して相補的である１個の核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することによって一緒に塩基対合し得る。いくつかの実施形態では、相補的なヌクレオチドは、ワトソン・クリック法または安定な二本鎖の形成を可能にする任意の他の方法で塩基対合することができる。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載されるように、互いに相補的であり、相補性の領域を形成する複数のヌクレオチドの領域を有し得る。
本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較すると、そのペントース糖の２’位でヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、リン酸基、もしくは塩基中またはそれらの修飾あるいは置換を含む、２’位以外の原子の１個以上の修飾または置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡ」、または「ｄｓＲＮＡｉ」は、実質的に二本鎖形態であるＲＮＡオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの二本鎖領域の相補的な塩基対合は、共有結合的に分離された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの二本鎖領域の相補的な塩基対合は、共有結合された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域の相補的な塩基対合は、折り畳まれて（例えば、ヘアピンを介して）、一緒に塩基対合するヌクレオチドの相補的な逆平行配列を提供する単一の核酸鎖から形成される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、互いに完全に二本鎖化された２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、部分的に二本鎖化された（例えば、一方または両方の末端にオーバーハングを有する）２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、部分的に相補的であるヌクレオチドの逆平行配列を含み、したがって、内部ミスマッチまたは末端ミスマッチを含み得る１個以上のミスマッチを有し得る。
本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する「二本鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合を通して形成される構造を指す。
本明細書で使用される場合、「賦形剤」は、例えば、所望の稠度もしくは安定化効果を提供または寄与するために、組成物に含まれ得る治療剤ではないものを指す。
本明細書で使用される「ループ」は、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、細胞内、リン酸緩衝液中）で、不対領域に隣接する２つの逆平行領域がハイブリダイズして二本鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成するように、互いに十分に相補的である核酸の２つの逆平行領域に隣接する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対領域を指す。
本明細書で使用される「修飾されたヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較すると、１個以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、非自然発生の結合である。典型的には、修飾されたヌクレオチド間結合は、修飾されたヌクレオチド間結合が存在する核酸に１個以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低減などを改善し得る。
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、およびチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較すると、１個以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、非自然発生のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、および／またはリン酸基に１個以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドとコンジュゲートされた１個以上の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１個以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低減などを改善し得る。
本明細書で使用される場合、「ニューロンｍＲＮＡ」および「ニューロン遺伝子」は、中枢神経系のニューロンにおける任意の遺伝子、ｍＲＮＡ、および／または遺伝子によってコード／発現されるタンパク質を指す。ニューロンは、神経系の主要細胞であり、体内の異なる細胞にシグナルを伝達する機能を果たす。
本明細書で使用される「ニックの入ったテトラループ構造」は、センス鎖がアンチセンス鎖と相補的な領域を有し、鎖のうちの少なくとも１つ、一般にはセンス鎖が、少なくとも１つの鎖内に形成された隣接するステム領域を安定化するように構成されたテトラループを有する、別個のセンス（パッセンジャー）およびアンチセンス（ガイド）鎖によって特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造を指す。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、短い核酸（例えば、約１００個未満のヌクレオチドの長さ）を指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であり得る。オリゴヌクレオチドは、二本鎖領域を有していても有していなくてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオシド、またはその両方の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。一連の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、またはｓｓ ｓｉＲＮＡであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
「脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート」という用語は、互換的に使用され、１個以上の標的化リガンド（例えば、脂質）とコンジュゲートされた１個以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、一方の鎖または領域が二本鎖を形成する相補鎖の末端を越えて延びる一方の鎖または領域から生じる末端非塩基対合ヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端で二本鎖領域から延びる１個以上の不対ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。
本明細書で使用される「リン酸類似体」は、リン酸基の静電特性および／または立体特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、５’－リン酸の代わりにオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに位置付けられ、これはしばしば酵素除去の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、５’リン酸類似体は、ホスファターゼ耐性結合を含む。リン酸類似体の例には、５’メチレンホスホネート（５’－ＭＰ）および５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）などの５’ホスホネートが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’炭素位置にリン酸類似体（「４’リン酸類似体」と呼ばれる）を５’末端ヌクレオチドに有する。４’－リン酸類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）またはその類似体と結合しているオキシメチルホスホネートである。例えば、米国仮特許出願第６２／３８３，２０７号（２０１６年９月２日出願）および同第６２／３９３，４０１号（２０１６年９月１２日出願）を参照されたい。オリゴヌクレオチドの５’末端に対して他の修飾が開発されている（例えば、国際特許出願第２０１１／１３３８７１号、米国特許第８，９２７，５１３号、およびＰｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．４３：２９９３－３０１１を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、標的遺伝子の「発現の低下」とは、適切な参照（例えば、参照細胞、参照細胞集団、参照試料、または参照対象）と比較した場合の、ＲＮＡ転写物（例えば、標的ｍＲＮＡ）もしくは標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量またはレベルの減少、および／または細胞、細胞集団、試料、もしくは対象における遺伝子の活性の量またはレベルの減少を指す。例えば、本明細書のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート（例えば、標的ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む脂質ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲート）と細胞を接触させる行為は、二本鎖オリゴヌクレオチドで処置されていない細胞と比較して、標的ｍＲＮＡの量もしくはレベル、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量もしくはレベル、および／または標的遺伝子活性の量もしくはレベルの減少をもたらし得る（例えば、ＲＮＡｉ経路による標的ｍＲＮＡの不活化および／または分解による）。同様に、本明細書で使用される場合、「発現を低減する」とは、標的遺伝子の発現の低減をもたらす作用を指す。
本明細書で使用される「相補性の領域」は、ヌクレオチドの逆平行配列と十分に相補的であり、適切なハイブリダイゼーション条件下で（例えば、リン酸緩衝液中、細胞中などで）ヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にする核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的配列に対して相補的な領域を有する標的配列を含む。
本明細書で使用される「リボヌクレオチド」は、その２’位にヒドロキシル基を含む、そのペントース糖としてリボースを有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、リボース、リン酸基、もしくは塩基中またはそれらの修飾あるいは置換を含む、２’位以外の原子の１個以上の修飾または置換を有するリボヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）アンチセンス鎖、もしくはアンチセンス鎖の一部が、標的ｍＲＮＡの切断においてアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって使用される、センス鎖（パッセンジャー）およびアンチセンス鎖（ガイド）を有するｄｓＲＮＡ、または（ｂ）アンチセンス鎖（もしくはそのアンチセンス鎖の一部）が、標的ｍＲＮＡの切断においてＡｇｏ２エンドヌクレアーゼによって使用される、単一のアンチセンス鎖を有するｓｓオリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「鎖」は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合）を通して一緒に結合されたヌクレオチドの単一の連続する配列を指す。いくつかの実施形態では、鎖は、２つの自由末端（例えば、５’末端および３’末端）を有する。
本明細書で使用される場合、「対象」は、マウス、ウサギ、およびヒトを含む、任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。さらに、「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「合成」は、人工的に合成される（例えば、機械（例えば、固体核酸合成器）を使用して）か、もしくは通常、分子を産生する天然源（例えば、細胞または生物）に別様に由来しない、核酸または他の分子を指す。
本明細書で使用される「標的化リガンド」は、目的の組織もしくは細胞の同族分子（例えば、受容体）に選択的に結合し、かつ／または目的の組織もしくは細胞に他の物質を標的とする目的で、別の物質にコンジュゲート可能である、分子または「部分」（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質）を指す。例えば、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、目的の特定の組織または細胞にオリゴヌクレオチドを標的とする目的で、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞表面受容体と選択的に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた場合、細胞の表面上に発現された受容体との選択的な結合、ならびにオリゴヌクレオチド、標的化リガンド、および受容体を含む複合体の細胞によるエンドソーム内在化を通じて、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドが細胞内で標的化リガンドから放出されるように、細胞内部移行後または細胞内在化中に切断されるリンカーを介して、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされている。
本明細書で使用される場合、「ループ」、「トリループ」、または「テトラループ」は、ヌクレオチドの隣接する配列のハイブリダイゼーションによって形成される隣接する二本鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、ランダムに選択されたヌクレオチドの配列から成る同等の長さのループのセットから、平均的に予想される隣接するステム二本鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも高い、隣接するステム二本鎖のＴｍの増加として検出可能である。例えば、ループは、少なくとも２塩基対（ｂｐ）の長さの二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨＰＯ４中で少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７５℃のＴｍを付与することができる。いくつかの実施形態では、ループ（例えば、テトラループ）は、相互作用をスタッキングすることによって、隣接するステム二本鎖のｂｐを安定化することができる。さらに、テトラループ中のヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン・クリック塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＮＡＴＵＲＥ ３４６：６８０－８２、Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐａｒｄｉ（１９９１）ＳＣＩＥＮＣＥ ２５３：１９１－９４）。いくつかの実施形態では、ループは、３～６個のヌクレオチドを含むか、またはそれらから成り、典型的には、４～５個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、ループは、修飾されていてもされていなくてもよい（例えば、標的化部分にコンジュゲートされていてもいなくてもよい）３、４、５、または６個のヌクレオチドを含むか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、テトラループは、３～６個のヌクレオチドを含むかまたはそれらから成り、典型的には４～５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、テトラループは、修飾されていてもされていなくてもよい（例えば、標的化部分にコンジュゲートされていてもいなくてもよい）３、４、５、または６個のヌクレオチドを含むか、またはそれらから成る。一実施形態では、テトラループは、４ヌクレオチドから成る。任意のヌクレオチドが、テトラループに使用され得、そのようなヌクレオチドの標準的なＩＵＰＡＣ－ＩＵＢシンボルが、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ（（１９８５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１３：３０２１－３０３０）に記載されるように使用され得る。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用され得、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）がその位置にあり得ることを示すために使用され得、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、またはＴ（チミン）がその位置にあり得ることを示すために使用され得る。テトラループの例には、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、ＣＵＵＧテトラループが含まれる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８７：８４６７－７１、Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１９：５９０１－０５）。ＤＮＡテトラループの例には、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、テトラループのｄ（ＧＴＴＡ）、ｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、およびテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる。（例えば、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ＢＩＯＣＨＥＭ．４１：４２８１－９２、Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．，（２０００）ＮＩＰＰＯＮ ＫＡＧＡＫＫＡＩ ＫＯＥＮ ＹＯＫＯＳＨＵ ７８：７３１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、テトラループは、ニックの入ったテトラループ構造内に含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」は、既存の状態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康および／もしくは福利を改善する、または状態の発生の可能性を予防するか、もしくは減少させる目的で、例えば、対象に治療剤（例えば、本明細書のオリゴヌクレオチド）を投与することによって、治療を必要とする対象にケアを提供する行為を指す。いくつかの実施形態では、治療は、対象が経験する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、もしくは寄与因子の頻度または重症度を低減することを伴う。
［実施例１］
二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの一般的な調製方法
オリゴヌクレオチドの合成および精製
前述の実施例に記載される二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドを、本明細書に記載される方法を使用して化学的に合成する。一般に、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、公知のホスホラミダイト合成方法の使用に加えて（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（２０１７）ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢ ＰＥＲＳＰＥＣＴ ＢＩＯＬ．９（１）：ａ０２３８１２、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．ＳＴＵＤＩＥＳ ＯＮ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖ：Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ－Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ．（１９８１）；２２：１８５９－６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０３９（０１）９０４６１－７、米国仮出願第６３／１４２，８７７号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／４２４６９号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、１９～２３ｍｅｒのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドについて記載された固相オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成される（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１８：５４３３－４１、およびＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５－７８４５を参照されたい。また、米国特許第５，８０４，６８３号、同第５，８３１，０７１号、同５，９９８，２０３号、同第６，００８，４００号、同第６，１１１，０８６号、同第６，１１７，６５７号、同第６，３５３，０９８号、同第６，３６２，３２３号、同第６，４３７，１１７号、および同第６，４６９，１５８号も参照されたい）。
二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの一般的な調製方法
オリゴヌクレオチドの合成および精製
前述の実施例に記載される二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドを、本明細書に記載される方法を使用して化学的に合成する。一般に、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、公知のホスホラミダイト合成方法の使用に加えて（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（２０１７）ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢ ＰＥＲＳＰＥＣＴ ＢＩＯＬ．９（１）：ａ０２３８１２、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．ＳＴＵＤＩＥＳ ＯＮ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖ：Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ－Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ．（１９８１）；２２：１８５９－６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０３９（０１）９０４６１－７、米国仮出願第６３／１４２，８７７号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／４２４６９号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、１９～２３ｍｅｒのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドについて記載された固相オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成される（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１８：５４３３－４１、およびＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５－７８４５を参照されたい。また、米国特許第５，８０４，６８３号、同第５，８３１，０７１号、同５，９９８，２０３号、同第６，００８，４００号、同第６，１１１，０８６号、同第６，１１７，６５７号、同第６，３５３，０９８号、同第６，３６２，３２３号、同第６，４３７，１１７号、および同第６，４６９，１５８号も参照されたい）。
個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣを標準的な方法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に従って精製した。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、固相ホスホラミダイト化学を使用して合成し、標準的な技法（Ｄａｍｈａ ＆ Ｏｌｇｉｖｉｅ（１９９３）ＭＥＴＨＯＤＳ ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２０：８１－１１４、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２３：２６７７－２６８４）を使用して、ＮＡＰ－５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で脱保護および脱塩し、ホスホラミダイト合成は、以下に示されるとおりである。
２－（２－（（（（６ａＲ，８Ｒ，９Ｒ，９ａＲ）－８－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２，４，４－テトライソプロピルテトラヒドロ－６Ｈ－フルオロ［３，２－ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン－９－イル）オキシ）メトキシ）エトキシ）エタン－１－アンモニウムギ酸塩の合成（１－６）
２－（２－（（（（６ａＲ，８Ｒ，９Ｒ，９ａＲ）－８－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２，４，４－テトライソプロピルテトラヒドロ－６Ｈ－フルオロ［３，２－ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン－９－イル）オキシ）メトキシ）エトキシ）エタン－１－アンモニウムギ酸塩の合成（１－６）
２０ｍＬのＤＭＦ中の化合物１－１（２５．００ｇ、６７．３８ｍｍｏｌ）の溶液を、ピリジン（１１ｍＬ、１３４．６７ｍｍｏｌ）およびテトライソプロピルジシロキサンジクロリド（２２．６３ｍＬ、７０．７５ｍｍｏｌ）で１０℃において処理した。得られた混合物を、２５℃で３時間攪拌し、２０％クエン酸（５０ｍＬ）でクエンチした。水層をＥｔＯＡｃ（３Ｘ５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を真空中で濃縮した。粗残渣を、ＭＴＢＥとｎ－ヘプタンの混合物（１：１５、３２０ｍＬ）から再結晶して、化合物１－２（３７．２０ｇ、９０％）を白色油状固体として得た。
２０ｍＬのＤＭＳＯ中の化合物１－２（３７．００ｇ、６０．３３ｍｍｏｌ）の溶液を、ＡｃＯＨ（２０ｍＬ、３１７．２０ｍｍｏｌ）およびＡｃ２Ｏ（１５ｍＬ、１５６．６８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を２５℃で１５時間攪拌した。反応物を、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和Ｋ２ＣＯ３（５０ｍＬ）でクエンチした。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、ＡＣＮ（３０ｍＬ）で再結晶させて、化合物１－３（１５．６５ｇ、３８．４％）を白色固体として得た。
１２０ｍＬのＤＣＭ中の化合物１－３（２０．００ｇ、２９．７２ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｆｍｏｃ－アミノ－エトキシエタノール（１１．６７ｇ、３５．６６ｍｍｏｌ）で２５℃において処理した。混合物を攪拌して、透明な溶液を得、次いで４Åモレキュラーシーブ（２０．０ｇ）、Ｎ－ヨードスクシンイミド（８．０２ｇ、３５．６６ｍｍｏｌ）、およびＴｆＯＨ（５．２５ｍＬ、５９．４４ｍｍｏｌ）で処理した。ＨＰＬＣ分析が化合物１－３の９５％超の消費を示すまで、混合物を３０℃で攪拌した。反応物を、ＴＥＡ（６ｍＬ）でクエンチし、濾過した。濾液を、ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）、飽和Ｎａ２ＳＯ３（２×１００ｍＬ）、および水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮して、粗化合物１－４（２６．３４ｇ、９３．９％）を黄色固体として得、これをさらに精製することなく次の工程に直接使用した。
ＤＣＭ／水（１０：７、１７０ｍＬ）の混合物中の化合物１－４（２６．３４ｇ、２７．６２ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＢＵ（７．００ｍＬ、４５．０８ｍｍｏｌ）で５℃において処理した。混合物を、５～２５℃で１時間攪拌した。次いで、有機層を分離し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＤＣＭ（１３０ｍＬ）で希釈した。溶液を、フマル酸（７．０５ｇ、６０．７６ｍｍｏｌ）および４Åモレキュラーシーブ（２６．３４ｇ）で４回に分けて処理した。混合物を１時間攪拌し、濃縮し、ＭＴＢＥおよびＤＣＭ（５：１）の混合物から再結晶させて、化合物１－６（１４．７４ｇ、６２．９％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）８．７３（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），８．１５－８．０２（ｍ，２Ｈ），７．６５－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），６．５２（ｓ，２Ｈ），６．１５（ｓ，１Ｈ），５．０８－４．９０（ｍ，３Ｈ），４．８３－４．７８（ｍ，１Ｈ），４．１５－３．９０（ｍ，３Ｈ），３．７９－３．６５（ｍ，２Ｈ），２．９８－２．８５（ｍ，６Ｈ），１．２０－０．９５（ｍ，２８Ｈ）。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－（（２－（２－［脂質］－アミドエトキシ）エトキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホラミダイトの合成（２－４ａ～２－４ｅ）
１５０ｍＬの２－メチルテトラヒドロフラン中の化合物１－６（５０．００ｇ、５９．０１ｍｍｏｌ）の溶液を、氷冷Ｋ２ＨＰＯ４水溶液（６％、１００ｍＬ）および食塩水（２０％、２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、ヘキサン酸（１０．３３ｍＬ、８２．６１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３３．６６ｇ、８８．５２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１０．８１ｇ、１４７．５２ｍｍｏｌ）で０℃において処理した。得られた混合物を、２５℃に加温し、１時間攪拌した。溶液を、水（２×１００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮して、粗残渣を得た。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン／アセトン）により、化合物２－１ａ（３４．９５ｇ、７１．５％）を白色固体として得た。
８０ｍＬのＴＨＦ中の化合物２－１ａ（３４．９５ｇ、４２．１９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（９．２８ｍＬ、１２６．５８ｍｍｏｌ）の混合物を、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（２０．６１ｍＬ、１２６．５８ｍｍｏｌ）を１０℃で滴下して処理した。混合物を、２５℃に加温し、２時間攪拌した。反応物を濃縮し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（５×２０ｍＬ）、および食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を真空中で濃縮し、粗化合物２－２ａ（２４．７２ｇ、９９％）を得、これをさらに精製することなく次の工程に直接使用した。
５０ｍＬのＤＣＭ中の化合物２－２ａ（２４．７２ｇ、４２．１８ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ－メチルモルホリン（１８．５４ｍＬ、１６８．６７ｍｍｏｌ）およびＤＭＴｒ－Ｃｌ（１５．６９ｇ、４６．３８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を、２５℃で２時間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）でクエンチした。有機層を分離し、水で洗浄し、濃縮して、スラリー粗物を得た。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン／アセトン）により、化合物２－３ａ（３０．０５ｇ、３３．８ｍｍｏｌ、７９．９％）を白色固体として得た。
５０ｍＬのＤＣＭ中の化合物２－３ａ（２５．００ｇ、２８．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下でＮ－メチルモルホリン（３．１０ｍＬ、２８．１７ｍｍｏｌ）およびテトラゾール（０．６７ｍＬ、１４．０９ｍｍｏｌ）で処理した。ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（９．０２ｇ、３３．８０ｍｍｏｌ）を溶液に滴下で加え、得られた混合物を２５℃で４時間攪拌した。反応物を水（１５ｍＬ）でクエンチし、水層をＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮して、粗固体を得、それをＤＣＭ／ＭＴＢＥ／ｎ－ヘキサン（１：４：４０）の混合物から再結晶させて、化合物２－４ａ（２５．５２ｇ、８３．４％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２５（ｓ，１Ｈ），８．６５－８．６０（ｍ，２Ｈ），８．０９－８．０２（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８５－６．７９（ｍ，４Ｈ），６．２３－６．２０（ｍ，１Ｈ），５．２３－５．１４（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．３３－４．２３（ｍ，２Ｈ），３．９０－３．７８（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８２－２．８０（ｍ，１Ｈ），２．６５－２．６０（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９６（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３９（ｍ，２Ｈ），１．３１－１．１０（ｍ，１４Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２Ｈ），０．８５－０．７９（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４３，１４９．１８。
化合物２－４ｂ、２－４ｃ、２－４ｄ、および２－４ｅを、化合物２－４ａについて上述したものと同様の手順を使用して調製した。化合物２－４ｂを、白色固体として得た（２５．５０ｇ、８５．４％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２３（ｓ，１Ｈ），８．６５－８．６０（ｍ，２Ｈ），８．０５－８．０２（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２３－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９７（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３１－１．１０（ｍ，１８Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２Ｈ），０．８５－０．７８（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４３，１４９．１９。
化合物２－４ｃを、オフホワイト固体として得た（３６．６０ｇ、６６．３％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．６４－８．５９（ｍ，２Ｈ），８．０５－８．００（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２５－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５０（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３３－１．１２（ｍ，３８Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２Ｈ），０．８６－０．８０（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４２，１４９．１７。
化合物２－４ｄを、オフホワイト固体として得た（２６．６０ｇ、７２．９％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．６４－８．５９（ｍ，２Ｈ），８．０５－８．００（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２２－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．０８（ｍ，３８Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２Ｈ），０．８５－０．７９（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４７，１４９．２２。
化合物２－４ｅを、白色固体として得た（３８．１０ｇ、５４．０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２１（ｓ，１Ｈ），８．６４－８．５９（ｍ，２Ｈ），８．０５－８．００（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２３－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．４７－３．２２（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．０６（ｍ，４６Ｈ），１．０８－１．０６（ｍ，２Ｈ），０．８５－０．７７（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４１，１４９．１５。
オリゴマーを、１５分間のステップ直線勾配を使用して、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ）を使用して精製した。勾配は、９０：１０緩衝液Ａ：Ｂから５２：４８緩衝液Ａ：Ｂまで変化し、緩衝液Ａは１００ｍＭトリスｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは１００ｍＭトリスｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌである。試料を２６０ｎｍでモニターし、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを収集し、プールされ、ＮＡＰ－５カラム上で脱塩し、凍結乾燥させた。
各オリゴマーの純度を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＡＣＥ ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）上のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍの内径を有し、ｓｓＤＮＡ １００Ｒ Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有する。典型的には、約０．６ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場で実行し、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。変性トリス－ボレート－７Ｍ－尿素ランニング緩衝液を、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。以下に記載する実験で使用するためのＣＥによって評価されるように、少なくとも９０％純粋であるオリゴリボヌクレオチドを得た。製造元の推奨プロトコルに従って、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ（商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析により、化合物同一性を確認した。全てのオリゴマーの相対分子質量を、多くの場合、予想される分子質量の０．２％以内で取得した。
二本鎖の調製
一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５から成る二本鎖緩衝液中に再懸濁した（例えば、１００μＭ濃度で）。相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合して、例えば、５０μＭの二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で５’の１００℃に加熱し、使用前に室温まで冷却させた。ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを－２０℃で貯蔵した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥させて、またはヌクレアーゼを含まない水中で－８０℃において貯蔵した。
一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５から成る二本鎖緩衝液中に再懸濁した（例えば、１００μＭ濃度で）。相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合して、例えば、５０μＭの二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で５’の１００℃に加熱し、使用前に室温まで冷却させた。ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを－２０℃で貯蔵した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥させて、またはヌクレアーゼを含まない水中で－８０℃において貯蔵した。
本明細書に記載される合成方法を使用して、実施例３に記載される脂質コンジュゲートオリゴヌクレオチドを生成する。
［実施例２］
脂質コンジュゲートオリゴヌクレオチドの合成
以下の概略図は、５’末端にＣ１６－脂質を有する平滑末端オリゴヌクレオチドの合成を示す。本明細書に記載される脂質コンジュゲート平滑末端オリゴヌクレオチドは、米国仮出願第６３／１４２，８７７号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／４２４６９号に詳細に記載される合成後方法を使用して合成され得る。具体的には、オリゴヌクレオチドは、以下に示されるような合成後コンジュゲーションアプローチを使用して合成され得るエッペンドルフ管１では、ＤＭＡ中のパルミチン酸の溶液を、室温においてＨＡＴＵで処理した。エッペンドルフ管２では、Ｈ２Ｏ中のオリゴセンス鎖の溶液をＤＩＰＥＡで処理した。エッペンドルフ管１の溶液をエッペンドルフ管２に加え、室温でＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒを使用して混合した。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、反応混合物を５ｍＬの水で希釈し、ＡＣＮおよびＨ２Ｏ中の１００ｍＭ ＴＥＡＡの５～９５％の勾配を使用して逆相ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラムにより精製した。生成物画分を、Ｇｅｎｅｖａｃを使用して減圧下で濃縮した。合わせた残留溶媒を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ（３Ｋ）を使用して、水（１×）、生理食塩水（１×）、および水（３×）に対して透析した。Ａｍｉｃｏｎ膜を水（３×２ｍＬ）で洗浄し、次いで合わせた溶媒を凍結乾燥して、非晶質白色固体を得た。
脂質コンジュゲートオリゴヌクレオチドの合成
以下の概略図は、５’末端にＣ１６－脂質を有する平滑末端オリゴヌクレオチドの合成を示す。本明細書に記載される脂質コンジュゲート平滑末端オリゴヌクレオチドは、米国仮出願第６３／１４２，８７７号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／４２４６９号に詳細に記載される合成後方法を使用して合成され得る。具体的には、オリゴヌクレオチドは、以下に示されるような合成後コンジュゲーションアプローチを使用して合成され得るエッペンドルフ管１では、ＤＭＡ中のパルミチン酸の溶液を、室温においてＨＡＴＵで処理した。エッペンドルフ管２では、Ｈ２Ｏ中のオリゴセンス鎖の溶液をＤＩＰＥＡで処理した。エッペンドルフ管１の溶液をエッペンドルフ管２に加え、室温でＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒを使用して混合した。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、反応混合物を５ｍＬの水で希釈し、ＡＣＮおよびＨ２Ｏ中の１００ｍＭ ＴＥＡＡの５～９５％の勾配を使用して逆相ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラムにより精製した。生成物画分を、Ｇｅｎｅｖａｃを使用して減圧下で濃縮した。合わせた残留溶媒を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ（３Ｋ）を使用して、水（１×）、生理食塩水（１×）、および水（３×）に対して透析した。Ａｍｉｃｏｎ膜を水（３×２ｍＬ）で洗浄し、次いで合わせた溶媒を凍結乾燥して、非晶質白色固体を得た。
［実施例３］
脂質コンジュゲート平滑末端ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子発現を低減する
中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンにおいて最も高い選択性を有するｍＲＮＡ発現を低減することができる脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを特定するために、実施例１に記載される方法によって、一連のＣ１６コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成した。具体的には、３’末端に平滑末端、および５’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを、以下のパターンに示されるように、センス鎖の異なる位置（１、７、９、１０、１６、および２０位）でコンジュゲートされたＣ１６脂質を有して生成した。比較のために、ステム－ループの２８位でコンジュゲートされたＣ１６脂質を有するニックの入ったテトラループ構造を有するオリゴヌクレオチドを、以前の研究に基づいて対照として生成した。試験された各オリゴヌクレオチドは、チューブリンベータ３クラスＩＩＩ（Ｔｕｂｂ３）をコードするｍＲＮＡに対する相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含んだ。Ｔｕｂｂ３は、主にニューロンにおいて発現されるタンパク質であり、本明細書では、ＣＮＳのニューロンへの脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの送達を実証するために標的化される。非修飾センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、配列番号１および２に提供され、修飾鎖は、表１に示される。試験されたオリゴヌクレオチドの概略図は、図１に提供され、修飾は、以下に示される：
Ｐ２８センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１センス鎖：
［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ７センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ９センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ１０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ１６センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ２０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ａｄｅｍＸｓ－Ｃ１６］
Ｐ２８、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１６、およびＰ２０の各々が、以下の修飾パターンを有するアンチセンス鎖にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
脂質コンジュゲート平滑末端ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子発現を低減する
中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンにおいて最も高い選択性を有するｍＲＮＡ発現を低減することができる脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを特定するために、実施例１に記載される方法によって、一連のＣ１６コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成した。具体的には、３’末端に平滑末端、および５’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを、以下のパターンに示されるように、センス鎖の異なる位置（１、７、９、１０、１６、および２０位）でコンジュゲートされたＣ１６脂質を有して生成した。比較のために、ステム－ループの２８位でコンジュゲートされたＣ１６脂質を有するニックの入ったテトラループ構造を有するオリゴヌクレオチドを、以前の研究に基づいて対照として生成した。試験された各オリゴヌクレオチドは、チューブリンベータ３クラスＩＩＩ（Ｔｕｂｂ３）をコードするｍＲＮＡに対する相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含んだ。Ｔｕｂｂ３は、主にニューロンにおいて発現されるタンパク質であり、本明細書では、ＣＮＳのニューロンへの脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの送達を実証するために標的化される。非修飾センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、配列番号１および２に提供され、修飾鎖は、表１に示される。試験されたオリゴヌクレオチドの概略図は、図１に提供され、修飾は、以下に示される：
Ｐ２８センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１センス鎖：
［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ７センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ９センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ１０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ１６センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
Ｐ２０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ａｄｅｍＸｓ－Ｃ１６］
Ｐ２８、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１６、およびＰ２０の各々が、以下の修飾パターンを有するアンチセンス鎖にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
表１のオリゴヌクレオチドを評価するために、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウスに、５００μｇのオリゴヌクレオチドまたは人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を単回くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）脳脊髄液注射した。標的ノックダウンを、注射の７日後に評価した。
ＲＮＡを、腰髄、腰部後根神経節（ＤＲＧ）、髄質、海馬、体性感覚皮質、および前頭皮質の組織試料から抽出して、ｑＰＣＲによってマウスＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡレベルを決定した（示されるように内因性ハウスキーピング遺伝子Ｒｐｌ２３に対して正規化した）。マウスのＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡのレベルを、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（商標）ｑＰＣＲプローブアッセイ（ＩＤＴ）を使用して決定した。ｑＰＣＲを、プライマー対、およびマウスＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡに特異的な蛍光標識された５’ヌクレアーゼプローブから構成されるＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（商標）ｑＰＣＲプローブアッセイを使用して行った。２－ΔΔＣｔ（「デルタ－デルタＣｔ」）法（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１）ＭＥＴＨＯＤＳ ２５：４０２－４０８）を使用して、処置されたマウスからの試料中に残存するマウスＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡの割合を決定した。
Ｔｕｂｂ３ ｍＲＮＡ発現は、ＣＮＳのいくつかの組織において低減された（図２Ａ～２Ｆ）。具体的には、Ｐ１またはＰ７での脂質コンジュゲーションは、腰椎において最も高いレベルのＴｕｂｂ３ノックダウンを示し（図２Ａ）、Ｐ１での脂質コンジュゲーションは、腰部ＤＲＧにおいて最も高いレベルのＴｕｂｂ３ノックダウンを示し（図２Ｂ）、Ｐ１またはＰ７での脂質コンジュゲーションは、髄質、海馬、体性感覚皮質、および前頭皮質において最も高いレベルのＴｕｂｂ３ノックダウンを示した（図２Ｃ～２Ｆ）。図３Ａ～３Ｂは、図２Ａ～２Ｆのデータをコンパイルする。全体として、１または７位での脂質コンジュゲーションは、２８位でコンジュゲートされた脂質を有する対照のニックの入ったテトラループオリゴヌクレオチドと比較して、ニューロンにおいてより高いレベルのｍＲＮＡノックダウンをもたらし、一方で９、１０、１６、および２０位での脂質コンジュゲーションは、２８位でコンジュゲートされた脂質を有する対照のニックの入ったテトラループオリゴヌクレオチドと同じレベル、またはそれよりも低いｍＲＮＡノックダウンをもたらす。
注射の７日後の各オリゴヌクレオチドの濃度を、ＣＮＳのいくつかの組織において測定した。センス鎖上のヌクレオチドにコンジュゲートされた脂質を有する平滑末端オリゴヌクレオチドは、２８位でコンジュゲートされた脂質を有する対照のニックの入ったテトラループオリゴヌクレオチドと類似の組織曝露を示した（図４Ａ～４Ｂ）。しかしながら、２８位でコンジュゲートされた脂質を有する対照のニックの入ったテトラループオリゴヌクレオチドと比較して、Ｐ１０、Ｐ１６、およびＰ２０オリゴヌクレオチドでは、最も遠い脳領域（前頭皮質および体性感覚皮質）においてより低いレベルの曝露が観察された。全体的なノックダウン効率（図２Ａ～２Ｆに示される）を、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドへの組織曝露のノックダウン効率（図４Ａ～４Ｂに示される）と比較すると、センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートされた脂質を有する平滑末端オリゴヌクレオチドは、２８位でコンジュゲートされた脂質を有する対照のニックの入ったテトラループオリゴヌクレオチドの同様の曝露レベルと比較して、ノックダウンの増加を示した（図５Ａ～５Ｆ）。特に、Ｐ２８テトラループ構造、ならびに平滑末端パッセンジャー鎖におけるパルミチン酸の他の位置変化と比較して、Ｐ１またはＰ７でコンジュゲートされた脂質を有するオリゴヌクレオチドにおいて効力の増強が観察された。これらの結果は、脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、前頭皮質および海馬などの到達が困難な組織を含む、ＣＮＳの複数の異なる解剖学的領域に見られるニューロンにおいて、標的遺伝子発現を低減する能力を示すことを実証する。
［実施例４］
脂質コンジュゲートテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子発現を低減する
テトラループを含み、センス鎖の様々な位置で脂質にコンジュゲートされたＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、ＣＮＳにおけるニューロン標的発現を低減する能力について評価した。Ｃ１６脂質にコンジュゲートされたテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、実施例３に記載されるように生成した。具体的には、Ｃ１６脂質を、以下の修飾パターンに示されるように、センス鎖のヌクレオチド位置（Ｐ）１、７、９、１０、１６、２０、２３、２８、２９、および３０のうちの１つでコンジュゲートした。試験された各オリゴヌクレオチドは、Ｔｕｂｂ３をコードするｍＲＮＡに対する相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含んだ。非修飾センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、配列番号２０および２に提供され、修飾鎖は、表２に示される。試験されたオリゴヌクレオチドの概略図は、図６に提供される：
脂質コンジュゲートテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子発現を低減する
テトラループを含み、センス鎖の様々な位置で脂質にコンジュゲートされたＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、ＣＮＳにおけるニューロン標的発現を低減する能力について評価した。Ｃ１６脂質にコンジュゲートされたテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、実施例３に記載されるように生成した。具体的には、Ｃ１６脂質を、以下の修飾パターンに示されるように、センス鎖のヌクレオチド位置（Ｐ）１、７、９、１０、１６、２０、２３、２８、２９、および３０のうちの１つでコンジュゲートした。試験された各オリゴヌクレオチドは、Ｔｕｂｂ３をコードするｍＲＮＡに対する相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含んだ。非修飾センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、配列番号２０および２に提供され、修飾鎖は、表２に示される。試験されたオリゴヌクレオチドの概略図は、図６に提供される：
テトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチド修飾パターン：
Ｐ１センス鎖：
［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ７センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ９センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１６センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２３センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２８センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２９センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ３０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１６、Ｐ２０、Ｐ２３、Ｐ２８、Ｐ２９、およびＰ３０の各々が、以下の修飾パターンを有するアンチセンス鎖にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：
［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
修飾キー：実施例３に提供される
Ｐ１センス鎖：
［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６ｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ７センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ９センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１６センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２３センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２８センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ２９センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ３０センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ１６］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
Ｐ１、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１６、Ｐ２０、Ｐ２３、Ｐ２８、Ｐ２９、およびＰ３０の各々が、以下の修飾パターンを有するアンチセンス鎖にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：
［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
修飾キー：実施例３に提供される
表２のテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートを評価するために、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウスを、くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）腰椎注射を介して、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中に製剤化された５００μｇの脂質コンジュゲートテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドで処置した。対照動物にはＣＳＦのみを注射した。標的ノックダウンを、注射の７日後に評価した。
ＲＮＡを、腰髄、腰部後根神経節（ＤＲＧ）、髄質、小脳、海馬、および前頭皮質の組織試料から抽出して、実施例３に記載されるように、ｑＰＣＲによってマウスＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡレベルを決定した。Ｔｕｂｂ３ ｍＲＮＡ発現は、位置Ｐ１、Ｐ７、Ｐ１６、Ｐ２０、Ｐ２３、Ｐ２８、Ｐ２９、またはＰ３０でコンジュゲートされたＣ１６脂質を有するテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの注射の７日後、腰髄からの試料において約５０％以上低減された（図７Ａ）。ＣＮＳの他の領域では、観察されたＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡ発現の低減はより少なかった（図７Ｂ～７Ｆ）。これらの結果は、テトラループを含む脂質コンジュゲートＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、ＣＮＳニューロンにおける標的（例えば、Ｔｕｂｂ３）遺伝子発現を低減する能力を示すことを実証する。さらに、これらの結果は、ニューロンにおける標的遺伝子発現を低減する脂質コンジュゲートテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの能力が、くも膜下腔内（ｉ．ｔ．）腰椎注射後の投与部位またはその近くのＣＮＳの領域に近位であり得る、局在化され得る、および／または制限され得ることを示唆する。
本実施例および実施例３で観察されたＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡの平均インビボ低減を比較した（図８Ａ～８Ｄ）。平滑末端ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートは、概して、注射部位の近位（例えば、腰髄）および遠位（例えば、髄質、海馬、前頭皮質）の両方のＣＮＳ領域において活性を有した（図８Ａ～８Ｄ）。センス鎖の５’末端の位置（Ｐ１）またはセンス鎖の内部Ｐ７位置に脂質コンジュゲートを有する平滑末端オリゴヌクレオチドは、腰髄（図８Ａ）、髄質（図８Ｂ）、海馬（図８Ｃ）、および前頭皮質（図８Ｄ）においてニューロンＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡの最も高いレベルの低減をもたらした。これらの結果は、センス鎖の５’末端の位置（Ｐ１）、センス鎖の内部位置（例えば、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１６）、またはセンス鎖の３’末端の位置（Ｐ２０）のいずれかでコンジュゲートされた脂質を有する平滑末端ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートが、ＣＮＳにおけるニューロン標的遺伝子（例えば、Ｔｕｂｂ３）発現を低減する能力を実証する。
本実施例に記載されるテトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートは、注射部位の近位のＣＮＳ領域である腰髄（図８Ａ）におけるニューロンＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡ発現を低減した。テトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートは、概して、位置Ｐ２０コンジュゲートを除いて、髄質における平滑末端ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートよりも低い程度まで、ニューロンＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡ発現を低減した（図８Ｂ）。テトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートは、注射部位の遠位のＣＮＳ領域（例えば、海馬、前頭皮質）における平滑末端ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートよりも低い程度まで、Ｔｕｂｂ３ ｍＲＮＡ発現を低減した。理論に拘束されることを望むものではないが、テトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートが、投与部位の近位にあるＣＮＳの領域（例えば、脊髄）におけるニューロン標的遺伝子発現（例えば、Ｔｕｂｂ３発現）を低減するという観察が、こうしたＲＮＡｉオリゴヌクレオチド脂質－コンジュゲートが、特定の疾患または障害（例えば、脊髄疾患または障害）を治療するのに有用であり得、対応する疾患もしくは障害関連標的遺伝子または標的ｍＲＮＡの低減をＣＮＳの特定の領域（例えば、脊髄、または後根神経節などの脊髄構造）に局在化および／または制限することが望ましい、有用である、または必要であることを示唆する。
実施例５：平滑末端およびテトラループのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートのインビトロ活性に対する脂質コンジュゲーションの位置の効果
平滑末端またはテトラループを含むＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートがＴｕｂｂ３発現を低減する能力を、インビトロで評価した。具体的には、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、表１および２に提供されるように、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１６、もしくはＰ２０位でＣ１６脂質にコンジュゲートされた平滑末端もしくはテトラループのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと、またはＰ２８でコンジュゲートされた参照テトラループオリゴヌクレオチドと、１００ｎＭ～１００ｐＭのモル濃度で２４時間培養した。処置後、Ｔｕｂｂ３ ｍＲＮＡを実施例３に記載されるように測定した。
平滑末端またはテトラループを含むＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートがＴｕｂｂ３発現を低減する能力を、インビトロで評価した。具体的には、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、表１および２に提供されるように、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１６、もしくはＰ２０位でＣ１６脂質にコンジュゲートされた平滑末端もしくはテトラループのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと、またはＰ２８でコンジュゲートされた参照テトラループオリゴヌクレオチドと、１００ｎＭ～１００ｐＭのモル濃度で２４時間培養した。処置後、Ｔｕｂｂ３ ｍＲＮＡを実施例３に記載されるように測定した。
位置Ｐ１、Ｐ７、Ｐ１６、もしくはＰ２０位でＣ１６脂質にコンジュゲートされた平滑末端もしくはテトラループのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、またはＰ２８でコンジュゲートされた参照テトラループオリゴヌクレオチドを用いた、培養されたＮｅｕｒｏ２ａ細胞の処置は、濃度依存的にＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡを低減した（図９Ａ～９Ｂ）。位置Ｐ９またはＰ１０でＣ１６脂質にコンジュゲートされた平滑末端またはテトラループのいずれかのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを用いた、培養されたＮｅｕｒｏ２ａ細胞の処置は、試験された濃度のいずれにおいても、Ｔｕｂｂ３ ｍＲＮＡの有意な低減をもたらさなかった。
これらの結果は、位置Ｐ１、Ｐ７、Ｐ１６、またはＰ２０でＣ１６脂質とコンジュゲートされた平滑末端およびテトラループのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、ならびにＰ２８でコンジュゲートされた参照テトラループオリゴヌクレオチドが、同等のモル濃度で試験された場合、培養されたＮｅｕｒｏ２ａ細胞中のＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡを同様の程度まで低減することを実証する。さらに、これらの結果は、位置Ｐ９およびＰ１０での平滑末端またはテトラループのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのいずれかへの脂質コンジュゲーションが、これらのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートで処置された場合の、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＴｕｂｂ３ ｍＲＮＡの有意な低減の欠如によって示されるように、細胞における標的遺伝子発現を低減する能力が減少したＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートをもたらすことを示唆する。まとめると、図９Ａ～９Ｂに示される結果は、テトラループＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのセンス鎖の５’末端の位置（例えば、Ｐ１）、センス鎖の内部位置（例えば、Ｐ７、Ｐ１６、Ｐ２０）、またはセンス鎖の位置Ｐ２８のいずれかでコンジュゲートされた脂質を有する平滑末端またはテトラループのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド脂質コンジュゲートが、細胞における標的遺伝子発現を低減する能力が、ほぼ同等であることを実証する。さらに、図９Ａ～９Ｂに示される結果は、センス鎖上の特定の位置（例えば、Ｐ９、Ｐ１０）でのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの脂質コンジュゲーションが、細胞における標的遺伝子発現を低減する能力を破壊する（例えば、細胞ＲＮＡｉ経路で機能する能力に対する効果に起因する可能性がある）ことを実証する。
［配列表］
Claims (95)
- １５～３０個のヌクレオチド長のアンチセンス鎖、および１５～５０個のヌクレオチド長のセンス鎖を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンス鎖およびセンス鎖が、１５～３０個の塩基対の二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、前記センス鎖が、前記センス鎖の５’末端ヌクレオチドにコンジュゲートした少なくとも１つの脂質部分を含む、二本鎖オリゴヌクレオチド。
- １５～３０個のヌクレオチド長のアンチセンス鎖、および１５～５０個のヌクレオチド長のセンス鎖を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンス鎖およびセンス鎖が、１５～３０個の塩基対の二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、前記センス鎖が、（ｉ）前記センス鎖のヌクレオチドにコンジュゲートした少なくとも１つの脂質部分と、（ｉｉ）ステム－ループとを含み、前記ステム－ループが、式：５’－Ｓ１－Ｌ－Ｓ２－３’によって表されるヌクレオチド配列を含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間にループを形成する、二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記脂質部分が、以下：
- 前記脂質部分が、炭化水素鎖である、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記炭化水素鎖が、Ｃ８－Ｃ３０炭化水素鎖である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記炭化水素鎖が、Ｃ１６炭化水素鎖である、請求項４または５に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記Ｃ１６炭化水素鎖が、
- 前記脂質部分が、５’末端ヌクレオチドのリボース環の２’炭素とコンジュゲートしている、請求項１および３～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、平滑末端である、請求項１および３～８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端で平滑末端である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、平滑末端を含む、請求項１および３～８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記平滑末端が、センス鎖の３’末端を構成する、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、３’末端に１～４個のヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オーバーハングが、プリンヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オーバーハングの配列が、２個のヌクレオチド長である、請求項１３または１４に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オーバーハングが、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択される、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オーバーハングが、ＧＧまたはＡＡである、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オーバーハングが、ＧＧである、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、２０～２２個のヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖が、２２～２４個のヌクレオチドである、請求項１および３～１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記二本鎖領域が、２０～２２個の塩基対である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、２０個のヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドであり、前記二本鎖領域が、２０個の塩基対である、請求項１および３～２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、３６～３８個のヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖が、２２～２４個のヌクレオチドである、請求項１～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、３６個のヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドであり、前記二本鎖領域が、２０個の塩基対である、請求項１～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、３６個のヌクレオチドであり、５’から３’に１～３６位を含み、前記脂質部分が、１位、７位、９位、１０位、１６位、２０位、２３位、２８位、２９位、または３０位でコンジュゲートしている、請求項２～８および１３～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記脂質部分が、２８位でコンジュゲートしている、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドであり、前記二本鎖領域が、２０個の塩基対である、請求項２４または２５に記載のオリゴヌクレオチド。
- ２２～２４個のヌクレオチド長のアンチセンス鎖、および２０～２２個のヌクレオチド長のセンス鎖を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンス鎖およびセンス鎖が、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に２個のヌクレオチドオーバーハングおよび前記オリゴヌクレオチドの３’末端に平滑末端を有する、２０～２２個の塩基対の非対称二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、前記センス鎖が、前記センス鎖の５’末端の位置にコンジュゲートした少なくとも１つの脂質部分を含む、二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記脂質部分が、Ｃ１６炭化水素鎖である、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記Ｃ１６炭化水素鎖が、
- 前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドであり、前記センス鎖が、２０個のヌクレオチドである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記２個のヌクレオチドオーバーハングが、プリンを含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オーバーハングが、ＡＡ、ＧＧ、ＡＧ、およびＧＡから選択される、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記相補性の領域が、前記ニューロンｍＲＮＡ標的配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに対して相補的である、請求項１～３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記相補性の領域が、前記ニューロンｍＲＮＡ標的配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに対して相補的である、請求項１～３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾を含む、請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖の５’末端ヌクレオチドを除いて、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの各々が、２’－修飾を含む、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記脂質部分にコンジュゲートしたヌクレオチドを除いて、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの各々が、２’－修飾を含む、請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記２’－修飾が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項３６または３７に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖のヌクレオチドの約１０～２０％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、５’から３’で１～２０位となる２０個のヌクレオチドを含み、８～１１位の各々が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、５’から３’で１～３６位となる３６個のヌクレオチドを含み、８～１１位の各々が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、５’から３’で１～３６位となる３６個のヌクレオチドを含み、８、１０、および１１位の各々が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、５’から３’で１～３６位となる３６個のヌクレオチドを含み、８、９、および１１位の各々が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、５’から３’で１～２２位となる２２個のヌクレオチドを含み、２、３、４、５、７、１０、および１４位の各々が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項３６～４６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖の５’－末端ヌクレオチドを除いて、残りのヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記脂質部分にコンジュゲートしたヌクレオチドを除いて、残りのヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、（ｉ）１位と２位との間、および２位と３位との間、または（ｉｉ）１位と２位との間、２位と３位との間、および３位と４位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’に１～４とナンバリングされる、請求項５１に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、２０位と２１位との間、および２１位と２２位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’に１～２２とナンバリングされる、請求項５１または５２に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、１位と２位との間にホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’に１～２とナンバリングされる、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、２０個のヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、１８位と１９位との間、および１９位と２０位との間に、ホスホロチオエート結合を含み、位置が、５’から３’に１～２０とナンバリングされる、請求項５１～５４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、５’末端にリン酸化ヌクレオチドを含み、リン酸化ヌクレオチドが、ウリジンおよびアデノシンから選択される、請求項１～５５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記リン酸化ヌクレオチドが、ウリジンである、請求項５６に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記リン酸類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである、請求項５８に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記相補性の領域が、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド２～８位で前記ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対して完全に相補的であり、ヌクレオチド位置が、５’から３’にナンバリングされる、請求項１～５９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記相補性の領域が、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド２～１１位で前記ニューロンｍＲＮＡ標的配列に対して完全に相補的であり、ヌクレオチド位置が、５’から３’にナンバリングされる、請求項１～５９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記脂質部分が、前記センス鎖のヌクレオチドのリボース環の２’炭素にコンジュゲートしている、請求項２～７、１３～１８、２０、２２～２６、および３３～６１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、内因性ダイサープロセシングの際に、哺乳動物細胞におけるニューロンｍＲＮＡ発現を低減することができる１９～２１個のヌクレオチド長の二本鎖核酸を産生するダイサー基質である、請求項１～６１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ニューロンｍＲＮＡ標的配列が、中枢神経系（ＣＮＳ）の領域に位置する、請求項１～６３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ＣＮＳの領域が、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ＣＮＳの領域が、脊髄である、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記脊髄が、腰髄、胸髄、および頸髄を含む、請求項６６に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、インビトロおよび／またはインビボでのニューロンまたはニューロン集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する、請求項１～６７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、脊髄のニューロンまたはニューロン集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する、請求項２～８、１１～２６、および３１～６７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ＣＮＳの他の領域内の標的ｍＲＮＡの発現と比較して、脊髄のニューロンまたはニューロン集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する、請求項２～８、１１～２６、および３１～６７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項１～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項７１に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象を治療することを含む、方法。
- 前記疾患、障害、または状態が、急性または慢性の疼痛である、請求項７２に記載の方法。
- 前記疾患、障害、または状態が、神経変性疾患である、請求項７２に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドを対象におけるニューロンまたはニューロン集団に送達する方法であって、前記方法が、請求項７１の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記ニューロンまたはニューロン集団が、ＣＮＳの領域内に位置する、請求項７５に記載の方法。
- 前記ＣＮＳの領域が、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項７６に記載の方法。
- 前記ＣＮＳの領域が、脊髄である、請求項７６に記載の方法。
- 前記脊髄が、腰髄、胸髄、および頸髄を含む、請求項７８に記載の方法。
- 細胞、細胞集団、または対象におけるニューロンｍＲＮＡの発現を低減するための方法であって、前記方法が、
ｉ．前記細胞もしくは前記細胞集団を、請求項１～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくは請求項７１に記載の医薬組成物と接触させる工程であって、任意選択で、前記細胞もしくは前記細胞集団が、ニューロンもしくはニューロン集団である、工程、または
ｉｉ．請求項１～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項７１に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - ニューロンｍＲＮＡの発現を低減することが、ｍＲＮＡの量もしくはレベル、タンパク質の量もしくはレベル、またはその両方を低減することを含む、請求項８０に記載の方法。
- 前記対象が、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する、請求項８０または８１に記載の方法。
- 前記疾患、障害、または状態が、急性または慢性の疼痛である、請求項８２に記載の方法。
- 前記疾患、障害、または状態が、神経変性疾患である、請求項８２に記載の方法。
- 前記細胞または細胞集団が、ＣＮＳの領域内に位置する、請求項８０～８４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＣＮＳの領域が、腰髄、腰部後根神経節、髄質、海馬、体性感覚皮質、前頭皮質、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項８５に記載の方法。
- 前記ＣＮＳの領域が、脊髄である、請求項８５に記載の方法。
- 前記脊髄が、腰髄、胸髄、および頸髄を含む、請求項８７に記載の方法。
- 投与が、くも膜下腔内投与である、請求項６７～８１のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、任意選択の薬学的に許容可能な担体と、ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象への投与のための説明書を含む添付文書とを含む、キット。
- 前記添付文書が、くも膜下腔内投与のための説明書を含む、請求項９０に記載のキット。
- ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態の治療のための医薬の製造における、請求項１～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項７１に記載の医薬組成物の使用。
- ニューロンｍＲＮＡの発現に関連する疾患、障害、または状態の治療における使用のための、または使用に適合された、請求項１～７０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項７１に記載の医薬組成物。
- 前記疾患、障害、または状態が、急性または慢性の疼痛である、請求項９０もしくは９１に記載のキット、請求項９２に記載の使用、または請求項９３に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
- 前記疾患、障害、または状態が、神経変性疾患である、請求項９０もしくは９１に記載のキット、請求項９２に記載の使用、または請求項９３に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
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