WO2021157730A1 - 核酸医薬とその使用 - Google Patents

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WO2021157730A1
WO2021157730A1 PCT/JP2021/004450 JP2021004450W WO2021157730A1 WO 2021157730 A1 WO2021157730 A1 WO 2021157730A1 JP 2021004450 W JP2021004450 W JP 2021004450W WO 2021157730 A1 WO2021157730 A1 WO 2021157730A1
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oligonucleotide
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gene
disease
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慎吾 中村
えら 森下
遼平 ▲高▼田
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株式会社Ｖｅｒｉｔａｓ Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to the regulation of gene expression using oligonucleotides. More specifically, it relates to a pharmaceutical composition containing a relatively short oligonucleotide for regulating gene expression and treatment of a disease using the same. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing an antisense oligonucleotide targeting the p53 gene and a method for preventing or treating a disease using the pharmaceutical composition.
  • nucleic acid drugs are expected as a new modality (drug discovery method).
  • Non-Patent Document 1 As basic research, research on antisense nucleic acids and RNAi (RNA interference) has been carried out (Non-Patent Document 1), drug development based on that technology has been carried out, and some products have begun to be put on the market. Furthermore, the function of nucleic acids that do not encode proteins is being clarified, and application to drug discovery as a gene expression regulation technique as miRNA (microRNA) is being promoted (Non-Patent Document 2).
  • miRNA miRNA
  • Acute renal failure (also called acute renal failure (AKI)) is a condition in which the homeostasis of body fluid cannot be maintained due to a rapid decline in renal function.
  • ARF is a clinical syndrome characterized by rapid deterioration of renal function within a few days and is generally based on a rapid rise in serum creatinine levels or a rapid rise in serum creatinine and BUN.
  • Acute renal failure (acute renal injury) is diagnosed. In general, 170-200 severe ARF cases per million people occur each year.
  • Acute renal failure due to ischemia due to shock, nephrotoxic substances such as cisplatin, aminoglycoside, and contrast media may develop due to tubule necrosis related to medical procedures such as surgery, contrast examination, and administration of anticancer drugs.
  • Acute kidney injury often develops as a result of renal ischemia-reperfusion injury (IRE) in patients undergoing major surgery such as heart surgery.
  • IRE renal ischemia-reperfusion injury
  • Acute renal failure due to surgery, contrast examination, administration of antineoplastic drugs or antibiotics is likely to occur when the extracellular fluid volume is low, and it can be caused by sufficient fluid replacement in advance. It is known that the frequency is reduced and the degree of renal failure can be reduced.
  • there is no specific treatment method for ARF there is no specific treatment method for ARF, and further improvement is required for the prevention and treatment method of acute renal failure.
  • US Pat. No. 9,334,499 provides a method for treating patients at risk of developing acute renal failure or those who develop acute renal failure, which down-regulates the expression of the p53 gene.
  • Disclosed methods include administering to a patient a double-stranded siRNA compound for an effective amount of the p53 gene.
  • the document also discloses that downregulation of p53 gene expression can be effective against alopecia caused by cancer chemotherapy and radiation therapy.
  • US Pat. No. 7,910,566 describes acute renal failure after renal ischemia-reperfusion, characterized in that a double-stranded siRNA compound having a specific nucleotide sequence targeting the p53 gene is used at a specific time. Treatment methods for patients at risk are disclosed. This document shows that in a rat ischemia-reperfusion-induced ARF model, p53-targeted siRNA can protect renal tissue from the effects of ischemia-reperfusion injury and reduce the severity of ARF.
  • the present invention comprises a pharmaceutical composition containing a relatively short oligonucleotide (antisense oligonucleotide; hereinafter also referred to as ASO) for regulating the expression of the p53 gene, and a method for preventing or treating a disease or condition using the pharmaceutical composition.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • One of the purposes is to provide.
  • Another object of the present invention is to provide an ASO having a high knockdown efficiency for the expression of the p53 gene and a high intracellular uptake efficiency.
  • the present inventors have identified an ASO that acts on a transcript of the p53 gene for the purpose of regulating the expression of the p53 gene. It is considered that p53-related diseases such as acute renal failure can be treated and prevented by suppressing the translation of the p53 gene from the transcript using these ASOs.
  • the present invention is based on these nucleic acid drugs developed by the present inventors and includes the following aspects:
  • a pharmaceutical composition for inhibiting the expression of the p53 gene in cells wherein an oligonucleotide containing a complementary region substantially complementary to at least a part of mRNA encoding the p53 gene is used as an active ingredient.
  • Aspect 2 The pharmaceutical composition according to Aspect 1, wherein the p53 gene is a human p53 gene.
  • Aspect 3 The pharmaceutical composition according to Aspect 1 or 2, wherein the p53 gene has the sequence of SEQ ID NO: 62.
  • Aspect 4 The pharmaceutical composition according to any one of aspects 1 to 3, wherein the oligonucleotide is essentially a single-stranded molecule.
  • Aspect 5 The pharmaceutical composition according to any one of aspects 1 to 4, wherein the oligonucleotide is an antisense oligonucleotide (ASO).
  • Aspect 6 The pharmaceutical composition according to Aspect 5, wherein the antisense oligonucleotide (ASO) is a gapmer.
  • Aspect 7 The pharmaceutical composition according to any one of aspects 1 to 6, wherein the oligonucleotide has a length of 12 to 18 bases.
  • Aspect 8 The pharmaceutical composition according to Aspect 7, wherein the oligonucleotide has a length of 14 bases.
  • Aspect 9 The pharmaceutical composition according to Aspect 8, wherein the oligonucleotide is a 3-8-3 gapmer.
  • Aspect 10 The pharmaceutical composition according to any one of aspects 1 to 9, wherein the base in the oligonucleotide is 80% or more complementary to the p53 gene.
  • Aspect 11 The pharmaceutical composition according to any one of aspects 1 to 10, wherein the base in the oligonucleotide is 100% complementary to the p53 gene.
  • Aspect 12 The pharmaceutical composition according to any one of aspects 1 to 11, wherein the oligonucleotide contains a modified nucleoside and / or a bond between modified nucleosides.
  • Aspect 13 The pharmaceutical composition according to Aspect 12, wherein the modified nucleoside is a bridged nucleic acid.
  • oligonucleotide is an oligonucleotide containing any one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 59.
  • oligonucleotide is an oligonucleotide consisting of any one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 59.
  • the oligonucleotide is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or any one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 59.
  • the disease or symptom is ischemic-reperfusion disorder, hearing loss, hearing disorder, balance disorder, hearing loss, chemotherapy-induced alopecia, radiation therapy-induced alopecia, acute renal failure, acute renal disorder, Chronic kidney disease (CKD), side effects associated with anticancer drug therapy, late transplant function (DGF) in kidney transplant patients, spinal cord injury, brain injury, stroke, stroke, neurodegenerative disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, tumor, burn Selected from the group consisting of wounds, hyperthermia, hypoxia, ischemia, organ transplantation, bone marrow transplantation (BMT), myocardial infarction / heart attack, cardiotoxicity, p53-positive cancer, and acute liver failure, aspect 26 or 27.
  • the pharmaceutical composition is ischemic-reperfusion disorder, hearing loss, hearing disorder, balance disorder, hearing loss, chemotherapy-induced alopecia, radiation therapy-induced alopecia, acute renal failure, acute renal disorder, Chronic kidney disease (CKD), side effects associated with anticancer drug therapy, late transplant function (DGF
  • a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a disease or symptom in a subject which comprises a complementary region that is substantially complementary to at least a portion of the mRNA encoding the p53 gene. It contains a single-stranded oligonucleotide as an active ingredient, the oligonucleotide is a 14-base long gapmer, and the wing regions on the 5'side and 3'side of the gapmer each consist of 2 bases of LNA.
  • a pharmaceutical composition in which all nucleoside linkages of Gapmer are phosphorothioate linkages.
  • a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a disease or symptom in a subject which is 0123-14007, 0123-14003, 0123-15021, 0123-15022, 0123-15038, 0123-16039, 0123-.
  • a pharmaceutical composition comprising an oligonucleotide selected from the group consisting of 16040 and 0123-16401 as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the human p53 gene (NM_000546.5) (SEQ ID NO: 62).
  • FIG. 2 is a graph showing that the addition of ASO (14mer) with a transfection reagent using HeLa cells lowers the mRNA level of p53. The vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53. Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • FIG. 3 is a graph showing that the addition of ASO (13 to 15 mer) with a transfection reagent using HeLa cells reduces the mRNA level of p53. The vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53.
  • FIG. 4 is a graph showing the decrease in p53 mRNA level when ASO named 0123-14007 was added at various concentrations. The vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53. Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • FIG. 5 is a graph showing that the addition of ASO (12-16 mer) with a transfection reagent using HeLa cells reduces the mRNA level of p53. The vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53. Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • FIG. 6 is a graph showing that the addition of ASO (14mer) with a transfection reagent using HeLa cells lowers the mRNA level of p53.
  • the vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53.
  • Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • FIG. 7 is a graph showing that the addition of ASO (14mer) with a transfection reagent using HeLa cells lowers the mRNA level of p53.
  • the vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53.
  • Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • FIG. 8 is a graph showing that the addition of 0123-14003 ASO and HDO with a transfection reagent using HeLa cells reduces p53 mRNA levels.
  • the vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53.
  • Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • FIG. 9 is a graph showing that the addition of ASO and HDO of 0123-14007 with a transfection reagent using HeLa cells reduces the mRNA level of p53.
  • the vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53.
  • Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • FIG. 10 is a graph showing the decrease in p53 mRNA level when ASO named 0123-14003 was added at various concentrations.
  • the vertical axis shows the relative value of the mRNA level of p53.
  • Day 1 (left side) and Day 2 (right side) show data 24 and 48 hours after transfection, respectively.
  • the present inventors have developed a method for efficiently regulating the expression of the p53 gene in cells using a relatively short oligonucleotide (ASO).
  • ASO oligonucleotide
  • the p53 gene is involved in intracellular DNA repair, cell proliferation arrest, cell proliferation cycle suppression, etc., and is a gene that is thought to cause apoptosis when cells become cancerous.
  • p53 is one of the so-called tumor suppressor genes, and it is thought that cancer occurs when the function of this gene is impaired. It is thought that changes in multiple oncogenes and tumor suppressor genes are necessary for cells to become cancerous, but p53 is the gene with the highest frequency of abnormalities in malignant tumors.
  • the p53 polypeptide responds to cell stress by converting various different stimuli, such as DNA damage conditions such as gamma irradiation, transcription or replication dysregulation, and transformation by oncogenes, into cell proliferation arrest and apoptosis.
  • p53 polypeptide induces apoptosis, or programmed cell death, in response to such stimuli.
  • p53 has important roles such as maintaining cell homeostasis and inducing apoptosis.
  • Most anti-cancer therapies also damage normal cells with p53, causing serious side effects associated with damage or death of healthy cells. Such side effects are often attributed to p53-induced cell death of normal cells, and temporary suppression of p53 during the acute phase of anticancer therapy is a therapeutic strategy to avoid these serious toxicities. has been proposed as.
  • a disease or symptom associated with induction of apoptosis can be treated or prevented by controlling the expression of the p53 protein by allowing a drug such as ASO to act on the transcript of the p53 gene.
  • a drug such as ASO
  • the amount of protein synthesized from the p53 gene through transcription and translation is 75% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 25, as compared with the case where no drug is allowed to act. It can be done by reducing to% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less, or 3% or less.
  • One aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a disease or condition associated with the expression of the p53 gene in a subject.
  • the targeted disease or symptom is ischemia-reperfusion injury, hearing loss, hearing impairment, balance disorder, hearing loss, chemotherapy-induced alopecia, radiation therapy-induced alopecia, acute renal failure.
  • kidney injury Acute kidney injury, Chronic kidney disease (CKD), Side effects associated with anticancer drug therapy, Delayed transplantation function (DGF) in patients with kidney transplantation, Spinal cord injury, Brain injury, Attack, Stroke, Neurodegenerative disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease Disease, tumor, burn, wound, hyperthermia, hypoxia, ischemia, organ transplant, bone marrow transplant (BMT), myocardial infarction / heart attack, cardiotoxicity, p53-positive cancer, or acute liver failure, but the target is Not limited to these.
  • DGF Delayed transplantation function
  • the base sequence of the p53 gene and its mRNA is known and can be easily obtained from a database such as GenBank.
  • GenBank a database such as GenBank.
  • the sequence of NCBI accession number NM_000546.5 (FIG. 1; SEQ ID NO: 62) can be used.
  • Antisense oligonucleotide (also called ASOs) Antisense oligonucleotides (also called ASOs) have sequences that are substantially complementary to at least a portion of the target nucleobase and are Watson-Crick, Hoogsteen, or inverse Hoogsteen between the corresponding nucleobases. Refers to a single-stranded oligonucleotide that hybridizes by a Gusteen-type hydrogen bond. Antisense oligonucleotides can exhibit detectable or measurable antisense activity due to hybridization to their target nucleic acid.
  • antisense activity is a reduction in the amount or expression of a target nucleic acid, or a reduction in the amount or expression of a protein encoded by such a target nucleic acid.
  • antisense activity in certain embodiments, is antisense inhibition by degradation (cleave) of the target, which reduces the level of the target nucleic acid in the presence of antisense oligonucleotides complementary to the target nucleic acid. means.
  • antisense oligonucleotides containing at least a part of continuous DNA of 4 bases or more hybridize with the target RNA and become a substrate for intracellular RNase H, which induces specific degradation (cleavage) of the target RNA.
  • antisense activity is a protein binding inhibition due to steric hindrance due to target occupation, resulting in translational repression and splicing regulation (eg, exon skipping).
  • Antisense oligonucleotides are single-stranded oligomers mainly composed of deoxyribonucleosides (DNA), ribonucleosides (RNAs), modified nucleosides, and nucleoside mimics (morpholinon nucleic acids, peptide nucleic acids, etc.). It has an outer region having one or more nucleosides (eg, sugar-modified nucleosides such as LNA) on both sides or one side of an internal region having multiple nucleosides (eg, deoxyribonucleosides of 4 or more consecutive bases) that induce RNase H cleavage. Chimeric antisense oligonucleotides are called gapmers.
  • nucleosides eg, sugar-modified nucleosides such as LNA
  • an external region consisting entirely of LNA is called an LNA gapmer.
  • Chimeric antisense oligonucleotides that have an external region on only one side are also called hemi-gapmers, in particular.
  • the nucleosides contained in the inner region are chemically different from the nucleosides contained in the outer region.
  • the inner area is sometimes called the "gap” and the outer area is sometimes called the "wing".
  • a 14-base long gapmer having a wing region of 3 bases on the 5'side and a gap region of 8 bases on the 5'side and a gap region of 8 bases is sometimes called a 3-8-3 gapmer.
  • the antisense oligonucleotides are 2-10-2 gapmers, 2-9-3 gapmers, 3-9-2 gapmers, 3-8-3 gapmers, 3-7-4 gaps. It can be any of Mar, 4-7-3 Gap Mar, and 4-6-4 Gap Mar. In certain embodiments, the antisense oligonucleotides are 2-10-2 LNA gapmer, 2-9-3 LNA gapmer, 3-9-2 LNA gapmer, 3-8-3 LNA gapmer, 3-7-4 LNA gapmer. It can be either a mer, a 4-7-3 LNA gap mer, or a 4-6-4 LNA gap mer.
  • the number of bases in the internal region can be 1 or more, for example, 2,3,4,5,6,7,8,9, or 10 bases, but is not limited thereto.
  • the number of bases in the external region can be 0 bases or more, for example, 1, 2, 3, 4, 5, or 6 bases independently on the 5'side and 3'side, but the number is limited to these. Not done.
  • the 5'side and 3'side wing regions may have different numbers of bases.
  • the wing region may be composed of the same or different sugar-modified nucleosides, and the sugar-modified nucleoside in the wing region can be, for example, LNA, but is not limited thereto.
  • Antisense oligonucleotides can, in certain embodiments, include modified nucleoside and / or modified nucleoside linkages. Further, in a specific embodiment, the antisense oligonucleotide may be modified with one or both of the terminal hydroxyl groups of the oligonucleotide, for example, a phosphate group is added to one or both of the terminal hydroxyl groups of the oligonucleotide. May be. In certain embodiments, the antisense oligonucleotide is, for example, at least 8 bases long or longer, eg, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21. It can be base length, but is not limited to these. In some embodiments, an ASO of about 14 bases is preferably used.
  • the antisense oligonucleotide according to the present invention in a specific embodiment, is 0123-14007, 0123-14003, 0123-1502, 0123-15022, 0123-15038, 0123-16039, 0123-16040 disclosed in Examples. , And 0123-16401.
  • Oligonucleotide 0123-14007 has a sequence complementary to bases 1338 to 1351 of SEQ ID NO: 62.
  • Oligonucleotide 0123-14003 has a sequence complementary to bases 1334 to 1347 of SEQ ID NO: 62.
  • Oligonucleotides 0123-15021 have a sequence complementary to bases 1337 to 1351 of SEQ ID NO: 62.
  • Oligonucleotides 0123-15022 have a sequence complementary to bases 1338 to 1352 of SEQ ID NO: 62.
  • Oligonucleotides 0123-15038 have a sequence complementary to bases 1334 to 1348 of SEQ ID NO: 62.
  • Oligonucleotides 0123-16039 have a sequence complementary to bases 1332 to 1347 of SEQ ID NO: 62.
  • Oligonucleotides 0123-16040 have a sequence complementary to bases 1334 to 1349 of SEQ ID NO: 62.
  • Oligonucleotide 0123-16041 has a sequence complementary to bases 1333 to 1348 of SEQ ID NO: 62.
  • the antisense oligonucleotide according to the present invention is from the 1338th base to the 1351st base, the 1334th base to the 1347th base, the 1337th base to the 1351st base, and the 1338th base of SEQ ID NO: 62.
  • Such complementary oligonucleotides can include the modifications described herein.
  • the antisense oligonucleotide according to the present invention is in the form of a pharmaceutically acceptable salt, a prodrug, a pharmaceutically acceptable salt of such a prodrug, and other bioequivalence. May be good.
  • Suitable pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, sodium and potassium salts.
  • the ASO according to the present invention can be produced by a method using known chemical synthesis, an enzymatic transcription method, or the like.
  • methods using known chemical synthesis include a phosphoramidite method, a phosphorothioate method, a phosphotriester method, and the like.
  • ABI3900 high-throughput nucleic acid synthesizer manufactured by Applied Biosystems
  • NTS H-6 nucleic acid synthesis It can be synthesized by a machine (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.) and an Oligoilot10 nucleic acid synthesizer (manufactured by GE Healthcare Co., Ltd.).
  • Examples of the enzymatic transcription method include transcription using an RNA polymerase such as T7, T3, and SP6 RNA polymerase using a plasmid or DNA having the desired base sequence as a template.
  • the ASO produced by the synthetic method or the transcription method is then purified by HPLC or the like.
  • HPLC purification ASO is eluted from the column using triethylammonium acetate (TEAA) or a mixed solution of hexamylammonium acetate (HAA) and acetonitrile. Then, the elution solution is dialyzed against 1000 times the elution volume of distilled water for 10 hours, the dialysis solution is freeze-dried, and then frozen and stored until use. At the time of use, for example, it is dissolved in distilled water so that the final concentration is about 100 ⁇ M.
  • TEAA triethylammonium acetate
  • HAA hexamylammonium acetate
  • the nucleic acid used in the ASO according to the present invention may be any nucleoside or a molecule having a function equivalent to that of the nucleoside, as long as it is a molecule polymerized via an internucleoside bond.
  • Nucleoside is a type of compound in which a base (nucleobase) and a sugar are bound.
  • Bases include purine bases such as adenine and guanine, pyrimidine bases such as thymine, cytosine and uracil, nicotinamide and dimethylisoaroxazine.
  • Typical nucleosides include adenosine, thymidine, guanosine, cytidine, and uridine.
  • Nucleotides are substances in which a phosphate group is bound to a nucleoside.
  • examples of the oligonucleotide include RNA, which is a polymer of ribonucleotide, DNA, which is a polymer of deoxyribonucleotide, a polymer in which RNA and DNA are mixed, and a nucleotide polymer containing a modified nucleoside. Be done. Natural DNA and RNA have a phosphodiester bond as an internucleoside bond.
  • the nucleic acid used for ASO according to the present invention may contain modifications.
  • Nucleic acid modification positions include sugar moieties, backbone (linkage) moieties, nucleobase (base) moieties, and 3'or 5'terminal moieties.
  • the ASO used in the present invention may contain a morpholino nucleic acid and a peptide nucleic acid.
  • Modified nucleosides include, for example, ribo for improving or stabilizing nuclease resistance, increasing affinity with complementary-stranded nucleic acids, increasing cell permeability, or visualizing compared to RNA or DNA.
  • Examples include nucleosides, deoxyribonucleosides, RNA or DNA-modified molecules, and examples thereof include sugar-modified nucleosides such as 2'-MOE, LNA, and ENA.
  • the ASO of the present invention may contain, for example, the modified nucleic acid molecule disclosed in Khvorova & Watts (Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017) doi: 10.1038 / nbt.3765).
  • Modified sugar refers to sugars that have substitutions and / or arbitrary changes from the natural sugar moiety (ie, the sugar moiety found in DNA (2'-H) or RNA (2'-OH)).
  • a modified nucleoside refers to a modified nucleoside containing a modified sugar.
  • the sugar-modified nucleoside may be any one obtained by adding or substituting an arbitrary chemical structural substance to a part or all of the chemical structure of the sugar of the nucleoside, for example, substituting with 2'-O-methylribose.
  • Modified nucleosides substituted with 2'-O-propylribose Modified nucleosides substituted with 2'-methoxyethoxyribose, Modified nucleosides substituted with 2'-O-methoxyethylribose, 2'- Modified nucleoside substituted with O- [2- (guanidium) ethyl] ribose, modified nucleoside substituted with 2'-O-fluororibose, bridge structure having two cyclic structures by introducing a bridge structure into the sugar moiety.
  • Type artificial nucleic acid (Bridged Nucleic Acid) (BNA), more specifically, Locked Nucleic Acid (LNA) in which an oxygen atom at the 2'position and a carbon atom at the 4'position are crosslinked via methylene, ethylene.
  • Cross-linked artificial nucleic acids (Ethylene bridged nucleic acid: ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)], etc., and peptide nucleic acids (PNA) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)) ], Oxypeptide Nucleic Acid (OPNA) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)], and Peptide Ribonucleic Acid (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)] And so on.
  • 2'-O-methyl (2'-OMe) modification (2'-OMe-RNA) of RNA is a naturally occurring modification that improves the binding affinity and nuclease resistance of modified oligonucleotides and immunizes them. Reduces irritation.
  • nuclease resistance is further increased over 2'-OMe modification, and the binding affinity ( ⁇ Tm) of modified nucleotides is also significantly increased.
  • 2'-fluoro (2'-F) modification (2'-F-RNA) of RNA can also be used to increase the affinity of oligonucleotides.
  • Examples of other 2'modified nucleic acids include 2'-F-ANA and 2'-modified derivatives of Sekine et al. (Patent No. 5194256, JP-A-2015-02994).
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • 2'oxygen and 4'carbon of ribose bring about a significant increase in binding affinity.
  • the 2'oxygen and 4'carbon of the ribose sugar of RNA are fixed in the ring structure. This modification increases specificity, affinity, and half-life, allowing effective delivery to the tissue of interest with lower toxicity.
  • oligomers longer than about 8 nucleotides fully modified with LNA are known to tend to aggregate and are commonly used in admixture with DNA and other sugar-modified nucleic acids.
  • CEt which is a methylation analog of LNA, is as useful as LNA.
  • Tricyclo-DNA tkDNA is a restrictive nucleotide based on a tricyclic skeleton.
  • modified nucleosides include atoms (eg, hydrogen atoms, oxygen atoms) or functional groups (eg, hydroxyl groups, amino groups) in the base portion of the nucleic acid, other atoms (eg, hydrogen atoms, sulfur atoms), and functional groups.
  • atoms eg, hydrogen atoms, oxygen atoms
  • functional groups eg, hydroxyl groups, amino groups
  • nucleoside for example, lipid, phospholipid, phenazine, forate , Phenantridin, anthraquinone, aclysine, fluorescein, rhodamine, coumarin, dye, and other molecules to which another chemical substance is added may be used.
  • Modified nucleobases include any nucleobase except adenine, cytosine, guanine, timine, or uracil, including, for example, 5-methylcytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-. Iodocytosine, N4-methylcytosine, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-iodouracil, 2-thiothymine, N6-methyladenine, 8-bromoadenine, N2-methylguanine, 8-bromoguanine, and inosine, etc. Can be mentioned.
  • At least one cytosine may be replaced with 5-methylcytosine, and in some embodiments, all cytosines are replaced with 5-methylcytosine. It may have been.
  • Nucleoside Bonds Natural DNA and RNA have phosphodiester bonds as nucleoside bonds.
  • the internucleoside bond may include modification.
  • a modified nucleoside bond is a nucleoside bond that has a substitution or arbitrary change from a naturally occurring nucleoside bond (that is, a phosphodiester bond), and a modified nucleoside bond is a nucleoside bond containing a phosphorus atom.
  • nucleoside bonds that do not contain phosphorus atoms are included.
  • the modified nucleoside bond may be one in which an arbitrary chemical substance is added or substituted to a part or all of the chemical structure of the phosphate diester bond of the nucleotide.
  • a modified nucleoside bond substituted with a phosphorothioate bond examples thereof include a modified nucleoside bond substituted with an N3'-P5'phosphodiester bond.
  • Other modified nucleoside linkages include ( SC5'R p ) - ⁇ , ⁇ -CNA, PMO and the like.
  • Typical phosphorus-containing nucleoside bonds include, for example, phosphodiester bond, phosphorothioate bond (also referred to as thiophosphate bond), phosphorodithioate bond, phosphotriester bond, and methylphosphonate bond, methylthiophosphonate bond, and borane phosphate. Examples include binding and phosphodiester bonding.
  • PS phosphorothioate
  • Phosphorothioate (PS) modifications were originally incorporated into oligonucleotides to confer nuclease resistance, but these modifications also have a significant impact on oligonucleotide transport and uptake.
  • PS increases the binding of receptor sites and plasma proteins by altering the charge of ASO, increasing the amount of ASO reaching the target tissue.
  • Heparin-binding proteins are one of the most compatible targets for phosphorothioate-modified oligonucleotides. Proper binding by plasma proteins suppresses rapid elimination from the blood by the renal system and promotes optimal delivery.
  • the ASO of the invention comprises at least one modified internucleotide bond, eg, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% of the total number of internucleotide bonds. As described above, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more may be modified internucleotide bonds. In one embodiment of the invention, ASO is used in which all internucleotide bonds are modified internucleotide bonds (eg, phosphorothioate bonds).
  • Phosphorothioate linkages has a stereogenic phosphorus atom part
  • fully modified oligonucleotide is typically a mixture of 2 n-1 diastereomers (e.g., phosphorothioate oligonucleotides 14mer is 2 thirteen It becomes a mixture of diastereomers).
  • Sp and R p diastereomeric bonds are known to exhibit different properties.
  • R p diastereomers are less nuclease resistance than S p diastereomers, it joins with a complementary strand with a higher affinity.
  • chiral control may be performed during the synthesis of the modified nucleoside-linked bond, and the synthesis may be controlled so that the specific phosphorothioate bond becomes a specific diastereomer.
  • Examples of molecules obtained by adding another chemical substance to an oligonucleotide / terminal-modified oligonucleotide nucleic acid in which a ligand or the like is linked include, for example, a 5'-polyamine-added derivative, a cholesterol-added derivative, a steroid-added derivative, a bile acid-added derivative, and a vitamin-added derivative. , Cy5 Derivatives, Cy3 Derivatives, 6-FAM Derivatives, Biotin Derivatives, etc. and Derivatives of Kitade et al. (PCT / JP2007 / 00877, PCT / JP2016 / 59398).
  • the site to which the ligand or the like is added may be at the end of the oligonucleotide (5'end or 3'end) and / or inside the oligonucleotide.
  • the ligand or the like may be indirectly bound via hybridization with an oligonucleotide complementary to the ASO to which the ligand or the like is added (WO2013 / 089283A1).
  • ASO and cholesterol can be linked via triethylene glycol (TEG), for example, as shown below.
  • TOG triethylene glycol
  • GalNAc-linked oligonucleotides and PUFA-linked oligonucleotides are known as examples of terminal modification.
  • a ligand such as GalNAc may be directly or indirectly linked to the ASO used in the present invention.
  • Short oligonucleotides tend to be delivered more to the kidneys and long oligomers tend to be delivered more to the liver. Short oligonucleotides are less likely to bind to plasma proteins and, as a result, tend to have shorter half-lives in plasma, but multimers can be constructed using cleavable linkers and the like.
  • the ASO used in the present invention may be linked to another ASO using a cleavable linker or the like.
  • the ASO according to the present invention may have a phosphate group added to the 5'end and / or the 3'end.
  • Other terminal modifications include E-VP, methylphosphonate, phosphorothioate, C-methyl analog, etc., which are known to enhance the stability of oligonucleotides.
  • the ASO used in the present invention may include these terminal modifications.
  • Sequence design of ASO The sequence of ASO can be designed based on the base sequence of the target gene.
  • a method for designing an ASO sequence is known to those skilled in the art, and a large number of ASOs have been designed so far and their activities have been evaluated.
  • examples of antisense oligonucleotides targeting the p53 gene include EP1012267B1, EP1889911A2, WO98 / 33904, EP1598420A2, WO95 / 09916, WO20 / 248885, WO98 / 22142, WO1993 / 003770, US Pat. No. 5,654,415, US Pat. No. 5641754, US Pat. No. 5,087,617, Japanese Patent No.
  • ASO may be determined in consideration of the secondary or tertiary structure of the target RNA.
  • the present inventors use a unique algorithm named MobyDick TM for sequencing.
  • nucleic acid structure prediction For nucleic acid structure prediction, the following references may be referred to: --Markham, N.R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; --Markham, NR & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, JM, editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1 , Pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.).
  • the oligonucleotide 0123-14003 shown in the examples can be considered to be the preferred ASO in that it also perfectly matches the p53 genes of mouse, rat and cynomolgus monkeys.
  • the antisense oligonucleotide (ASO) according to the present invention can be substantially identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 59.
  • substantially the same means that the oligonucleotide does not have to be completely (100%) identical to the target sequence, but has 80% or more identity.
  • the oligonucleotides are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% of any one of the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 59. , Or an oligonucleotide having 100% identity.
  • One aspect of the invention is a pharmaceutical composition for inhibiting the expression of the p53 gene in a cell, the oligonucleotide containing a complementary region that is substantially complementary to at least a portion of the mRNA encoding the p53 gene.
  • the oligonucleotide is an antisense oligonucleotide having a sequence substantially identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 59.
  • substantially complementary means that the oligonucleotide does not have to be completely (100%) complementary to the target sequence and is 80% or more, for example 85%, 90%, 95%, 98% or It means having 99% complement.
  • This oligonucleotide contains at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% of any one of the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 59. It can be an oligonucleotide consisting of sequences having the same identity. In certain embodiments, the oligonucleotide consists of a sequence that is 100% identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 59. In certain embodiments, the oligonucleotides may have additional sequences on the 5'and / or 3'sides of the complementarity regions.
  • the antisense oligonucleotide is essentially a single-stranded molecule.
  • being essentially single-stranded means that in the process of delivering or formulating an oligonucleotide, a double-strand may be formed with a separate nucleic acid that is temporarily complementary.
  • oligonucleotide When an oligonucleotide hybridizes to a target RNA and exerts an antisense effect, it acts in the form of a single-stranded oligonucleotide, and finally a double strand is formed by the target RNA and ASO. ..
  • oligonucleotides having the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 125 can also be used as part of siRNA.
  • Hybrid ASO International Publication No. 2013/089283 and Nishina et al., Nature Communications volume 6, Article number: 7969 (2015) contain ASO double-stranded oligonucleotides (also called HDOs) containing RNA oligonucleotides complementary to ASO. It is described that the target gene is efficiently delivered and accumulated in the liver and the expression of the target gene in the liver is suppressed.
  • International Publication No. 2015/105083 describes ASO in which a GalNAc derivative is bound to HDO via a linker, and such antisense oligonucleotides are more efficient than tocopherol (Toc) modified products. It is described that the expression of the target gene is suppressed.
  • single-stranded oligonucleotides in which ASO-complementary oligonucleotides are linked to form double strands in the molecule are equivalent to double-stranded oligonucleotides. It is described that the above antisense effect is exhibited.
  • the ASO may form a double strand with a nucleic acid strand complementary thereto.
  • the ASO may be linked to a nucleic acid strand complementary thereto, and a double-stranded portion may be formed by intramolecular self-annealing.
  • a ligand such as tocopherol (Toc) or GalNAc may be linked to the nucleic acid region complementary to ASO.
  • the oligonucleotides of the present disclosure may be used as part of a siRNA duplex.
  • the pharmaceutical composition antisense nucleic acid can be formulated by itself, but is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and any of the well-known technical fields of pharmaceutics. It is desirable to administer it as a pharmaceutical preparation produced by the above method.
  • the pharmaceutical composition may contain a mixture of multiple ASOs having different sequences.
  • the administration target includes human or non-human animals, for example, non-human mammals. It is desirable to use the most effective route of administration for treatment, and oral administration or parenteral administration such as oral, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, and transdermal administration can be mentioned. It can be done, preferably intravenously.
  • preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sucrose, sorbitol, sugars such as fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, and p-hydroxybenzoic acid. It can be produced by using preservatives such as esters, flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives. Capsules, tablets, powders, granules, etc.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol, hydroxy. It can be produced by using a binder such as propyl cellulose and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plastic agent such as glycerin as additives.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • the injection is prepared using a carrier consisting of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • the suppository is prepared using a carrier such as cocoa butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray agent is prepared using a carrier or the like that does not irritate the oral cavity and airway mucosa of the recipient and disperses the active ingredient as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose, glycerin, liposomes, and nanomicelles.
  • formulations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives in the oral preparation can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the target therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is, for example, 10 ⁇ g / kg to 100 mg / kg per day for adults.
  • One aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising about 14-20 mer oligonucleotides (ASOs) for use in the treatment or prevention of a disease or condition in a patient.
  • the patient can be a human or non-human animal.
  • the term "about 14 mer” is understood to include at least the range of 1 base before and after that, that is, 13 mer, 14 mer, and 15 mer, and the term "about 20 mer” means 19 mer, 20 mer, and It is understood to include 21 mer.
  • a 14 mer ASO is preferably used.
  • the disease or symptom is ischemic-reperfusion injury, hearing loss, hearing impairment, balance impairment, hearing loss, chemotherapy-induced alopecia, radiation therapy-induced alopecia, acute renal failure, acute renal injury.
  • Chronic kidney disease (CKD) side effects associated with anticancer drug therapy, delayed transplant function (DGF) in kidney transplant patients, spinal cord injury, brain injury, seizures, stroke, neurodegenerative disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, tumors, It can be any of burns, wounds, hyperthermia, hypoxia, ischemia, organ transplantation, bone marrow transplantation (BMT), myocardial infarction / heart attack, cardiotoxicity, p53-positive cancer, and acute liver failure.
  • BMT bone marrow transplantation
  • One embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a disease or symptomatology, or a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a disease or symptomatology, any sequence selected from the following.
  • pharmaceutical compositions comprising ASO comprising, or consisting of any of the sequences: 0123-14007, 0123-14003, 0123-15021, 0123-15022, 0123-15038, 0123-16039, 0123-16040, and 0123- 16041.
  • One aspect of the invention relates to the use of oligonucleotides (ASOs) of about 14-20 mer in the manufacture of medicines for use in the treatment or prevention of diseases or disorders in patients.
  • ASOs oligonucleotides
  • a 14 mer ASO is preferably used.
  • one aspect of the present invention is a method for treating or preventing a disease or disorder in a patient, which comprises the step of administering about 14 to 20 mer of oligonucleotide (ASO) to the patient.
  • ASO oligonucleotide
  • a 14 mer ASO is preferably used.
  • one aspect of the present invention is a method for treating or preventing acute renal failure (acute renal injury) in a patient, which comprises or contains any sequence selected from the following. 0123-14007, 0123-14003, 0123-15021, 0123-15022, 0123-15038, 0123-16039, 0123-16040, and 0123-16401.
  • Acute Kidney Insufficiency occurs, for example, in patients undergoing major cardiovascular surgery after reduced local blood flow to the kidney during surgery and recovery of blood flow. Due to reperfusion injury, the onset may occur within hours to days after surgery, and the mortality rate 30 days after onset exceeds 50%.
  • ASOs according to the invention can be administered to patients to prevent, reduce their severity, or treat acute renal failure. Administration of ASO is, for example, from before the start of surgery (eg, 2 hours, 4 hours, or 6 hours) to within 8 hours after surgery (eg, 3 hours, 4 hours, or 5 hours after surgery). It can be done at any time. Administration can be single or multiple doses. Administration can be, for example, by intravenous injection.
  • Example 1 Design of antisense (ASO) for p53, synthesis A sequence targeting p53 was designed for ASO and synthesized.
  • the human transcript NM_000546.5 (SEQ ID NO: 62, FIG. 1) registered in the NCBI Refseq collection was used for the design. The synthesis was outsourced to GeneDesign, Inc.
  • Tables 1 and 2 below show the synthesized nucleotide sequences. Uppercase letters indicate RNA or sugar-modified nucleic acid, and lowercase letters indicate DNA. "5" represents 5-methylcytidine.
  • the parentheses in each nucleotide indicate the modification of the 2'position of ribose, where L indicates LNA, M indicates 2'OMe, and F indicates 2'F.
  • G (L) represents LNA-type guanosine.
  • the acute accent flex " ⁇ " between bases (this symbol is also called a caret or hat) indicates that the nucleoside bond is a thiophosphate bond (phosphorothioate bond).
  • an ASO having 0123-14001 as the ID shown below is a 14 base long 3-8-3 gapmer having a 5'wing region of 3 bases and a 3'wing region, respectively. No phosphate group was added to the 5'end and 3'end of these ASOs. "-Cho" indicates that cholesterol is added to the end.
  • Example 2 Evaluation of antisense against p53
  • the ASOs shown in Table 3 below were synthesized and transfected into HeLa cells at a final concentration of 20 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIG. 2 and Table 4. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • QPI-1002 (CAS Registry Number: 1231737-88-4) is the siRNA used for comparison (see, eg, US Pat. No. 9,868,953).
  • NTS1 is a negative control.
  • 0123-14001, 0123-14003, 0123-14004, 0123-14005, 0123-14006, 0123-14007, 0123-14028, 0123-14029, 0123-14031 are 80% or more. It showed the inhibitory effect of. 0123-14002, 0123-14008, 0123-14012, 0123-14013, 0123-14016, 0123-14017, 0123-14018, 0123-14030 showed an inhibitory effect of 50% or more.
  • Example 3 Evaluation of antisense against p53
  • the ASOs shown in Table 5 below were synthesized and transfected into HeLa cells at a final concentration of 20 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIG. 3 and Table 6. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • the 2-10-2, 3-8-3, 4-6-4 LNA gapmers (0123-14064, 0123-14007, 0123-14509, respectively) have an inhibitory effect. Although it was about the same, the inhibitory effect of 0123-14060, which is a 5-4-5 LNA gapmer, was significantly weakened. When the LNAs located at both ends of ASO were changed to other modified nucleic acids, the inhibitory effect was significantly reduced.
  • Example 4 Assessment of antisense concentration dependence on p53 0123-14007 was transfected into HeLa cells at a final concentration of 0.3-100 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIG. 4 and Table 7. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • 0123-14007 showed an inhibitory effect from 1 nM and a concentration-dependent inhibitory effect up to 100 nM.
  • the maximum inhibitory effect was 97%.
  • the IC 50 was 2.3 nM on Day 1 and 3.0 nM on Day 2.
  • Example 5 Evaluation of antisense against p53
  • the ASOs shown in Table 8 below were synthesized and some of them were transfected into HeLa cells at a final concentration of 20 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIG. 5 and Table 9. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • 0123-12032,033,034 which is a 2-nt shortened version of 0123-14003, had almost the same or attenuated inhibitory effect.
  • the inhibitory effect of 0123-1335,036, which was shortened by 1-nt was almost unchanged or attenuated.
  • 037 and 038 extended to 15-mer had almost the same inhibitory effect as 003, but 038-40 extended to 16-mer had a slightly stronger inhibitory effect.
  • 0123-120033 was shortened to 12-mer, it showed the same inhibitory effect as 003.
  • Example 6 Evaluation of antisense against p53
  • the ASOs shown in Table 8 above were synthesized and some of them were transfected into HeLa cells at a final concentration of 20 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIG. 6 and Table 9 above. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • 042 which introduced a mismatch in the gap portion of 0123-14003, lost the suppressing effect.
  • 043 which introduced a mismatch at the 3'-end, showed the same inhibitory effect as 003.
  • 044 a mismatch of 2 bases was introduced, but the inhibitory effect was remarkably attenuated probably because the mismatch was introduced in the gap portion.
  • 0123-14045 to 049 changed the number of LNA modifications at both ends, but when the number of LNAs was 0 (045), the inhibitory effect was significantly attenuated.
  • 046 in which 1-nt LNA was introduced at both ends, also significantly attenuated the inhibitory effect.
  • the inhibitory effect of 050 to which cholesterol was added was significantly attenuated.
  • Example 7 Evaluation of antisense against p53
  • the ASOs shown in Table 8 above were synthesized and some of them were transfected into HeLa cells at a final concentration of 20 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIG. 7 and Table 9 above. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • Example 8 Evaluation of HDO for p53 synthesizing and annealing sense strand RNAs for 0123-14003 and 0123-14007 (0123-14003ssRNA: UCCCGCCAUAAAAA (SEQ ID NO: 60) and 0123-14007sRNA: GCCAUAAAAAACUC (SEQ ID NO: 61)). It was converted to HDO.
  • HDO-ized ASO was transfected into HeLa cells at a final concentration of 20 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIGS. 8, 9 and 10. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • the HDO-ized ASO showed an inhibitory effect almost the same as that of the single-stranded ASO.
  • Example 9 Assessment of antisense concentration dependence on p53 0123-14003 was transfected into HeLa cells at a final concentration of 0.3-100 nM. Lipofectamine® 3000 was used for transfection and was performed according to the attached protocol. Cells were harvested 24 and 48 hours after transfection and total RNA was extracted. The p53 mRNA level contained in the extracted total RNA was measured using real-time PCR. The results are shown in FIGS. 10 and 11. The measurement results are shown at a relative level with Mock as 1.
  • 0123-14003 showed an inhibitory effect from 3 nM and a concentration-dependent inhibitory effect up to 100 nM.
  • the maximum inhibitory effect was 94%.
  • the IC 50 was 8.0 nM on Day 1 and 11.3 nM on Day 2.
  • ASOs antisense oligonucleotides that act on transcripts of the p53 gene. By using these relatively short oligonucleotides, the amount of p53 mRNA can be reduced and protein expression can be suppressed. These ASOs may be useful in the treatment or prevention of acute renal failure, alopecia and the like.

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Abstract

【課題】ｐ５３遺伝子の発現に関連する疾患または症状を治療または予防するための核酸医薬を提供すること。 【解決手段】本発明者らは，ｐ５３遺伝子の転写産物に対して作用するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を同定した。これらの比較的短いオリゴヌクレオチドを用いることで，ｐ５３　ｍＲＮＡの量を低下させ，タンパク質の発現を抑制することができる。これらのＡＳＯは急性腎不全や脱毛症などの治療または予防に有用となりうる。

Description

核酸医薬とその使用 関連出願の相互参照
　本願は、特願2020-018405号（出願日：2020年2月6日）の優先権の利益を享受する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
　本発明は，オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現の調節に関する。より詳細には，遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の処置に関する。さらに詳細には，ｐ５３遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の予防または治療方法に関する。
　従来的な医薬品開発における創薬技術では，タンパク質を創薬標的とする取組みが多く推進され，低分子医薬や抗体とはじめとするタンパク質やペプチドと作用する医薬による創薬が中心であった。近年，ゲノム科学や個別化医療など疾患の原因が遺伝子レベルで解明されてきたため，創薬標的を核酸とする取組みが進められており，低分子医薬品や抗体医薬品では狙いにくい治療標的にも対応できると考えられるため，核酸医薬が新しいモダリティ（創薬手法）として期待されつつある。
　基礎研究としては，アンチセンス核酸やＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）などの研究が行われ（非特許文献１），その技術に基づく医薬品開発が行われ，上市される製品も出始めている。さらに，タンパク質をコードしない核酸の機能も明らかとされつつあり，ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）として遺伝子発現調節技術として創薬への応用が進められている（非特許文献２）。
　急性腎不全（ＡＲＦ）（急性腎障害（ＡＫＩ）とも呼ばれる）は，急激な腎機能の低下に伴い，体液の恒常性が維持できなくなった状態をいう。ＡＲＦは，腎機能の急速な悪化が数日以内に起こることを特徴とする臨床症候群であり，一般的には，血清クレアチニン値の急速な上昇，または血清クレアチニン値とＢＵＮの急速な上昇に基づき，急性腎不全（急性腎障害）の診断が行われる。一般に，人口１００万人あたり１７０～２００の重度ＡＲＦ症例が毎年発生している。手術，造影検査，抗癌剤投与など医療行為に関連して，ショックなどによる虚血，シスプラチン，アミノグリコシド，造影剤などの腎毒性物質に起因する尿細管壊死による急性腎不全が発症する場合があり，例えば，急性腎障害は心臓手術などの大手術を受けた患者に起こる腎虚血再灌流障害（ＩＲＥ）の結果として発症する例も多い。手術，造影検査，抗悪性腫瘍薬や抗生物質の投与などによる急性腎不全は，細胞外液量が減少している状態において発症しやすく，前もって十分な補液を行っておくことにより，その発症の頻度が減少し，腎不全の程度を軽減し得ることが知られている。しかしながら現状，ＡＲＦに対する特異的な治療法は存在しておらず，急性腎不全の予防，治療方法には，さらなる改善が求められている。
　米国特許第９，３３４，４９９号には，急性腎不全を発症する危険性のある患者，または急性腎不全を発症した患者を治療するための方法であって，ｐ５３遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに有効な量のｐ５３遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を患者に投与することを含む方法が開示されている。また，同文献には，ｐ５３遺伝子発現のダウンレギュレーションが，癌の化学療法や放射線療法に起因する脱毛症に対しても有効となり得ることも開示されている。
　米国特許第７，９１０，５６６号には，ｐ５３遺伝子を標的とした特定の塩基配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を特定の時期に用いることを特徴とする，腎虚血再灌流後における急性腎不全の危険のある患者の処置方法が開示されている。この文献は，ラットの虚血再灌流誘導性ＡＲＦモデルにおいて，ｐ５３を標的としたｓｉＲＮＡが虚血再灌流障害の影響から腎組織を保護し，ＡＲＦの重症度を抑え得ることを示している。
米国特許第９，３３４，４９９号 米国特許第７，９１０，５６６号
Chery,J.（2016)ＲＮＡtherapeutics: RNAi and antisense mechanisms and clinical applications. Postdoc J. 4(7): 35-50 Rupaimoole,R. & Slack,F.J.（2017）MicroRNA therapeutics: towards a new era for the managemeｎｔof cancer and other diseases. Nature Review Drug Discovery，16，203-221
　本発明は，ｐ５３遺伝子の発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド；以下，ＡＳＯとも言う）を含有する医薬組成物と，それを用いた疾患または状態の予防または治療方法を提供することを目的の一つとする。また本発明は，ｐ５３遺伝子の発現に対するノックダウン効率が高く，かつ細胞内への取り込み効率の高いＡＳＯを提供することも目的の一つとしている。
　本発明者らは，ｐ５３遺伝子の発現を調節することを目的として，ｐ５３遺伝子の転写産物に対して作用するＡＳＯを同定した。これらのＡＳＯを用いて，ｐ５３遺伝子の転写産物からの翻訳を抑制することにより，急性腎不全等のｐ５３関連疾病を治療，予防し得ると考えられる。本発明は，本発明者らが開発したこれら核酸医薬に基づくものであり，以下の態様を包含する：
［態様１］細胞においてｐ５３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する，医薬組成物。
［態様２］前記ｐ５３遺伝子がヒトｐ５３遺伝子である，態様１記載の医薬組成物。
［態様３］前記ｐ５３遺伝子が配列番号６２の配列を有する，態様１または２記載の医薬組成物。
［態様４］前記オリゴヌクレオチドが本質的に一本鎖の分子である，態様１～３のいずれか記載の医薬組成物。
［態様５］前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である，態様１～４のいずれか記載の医薬組成物。
［態様６］前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）がギャップマーである，態様５記載の医薬組成物。
［態様７］前記オリゴヌクレオチドが１２～１８塩基長である，態様１～６のいずれか記載の医薬組成物。
［態様８］前記オリゴヌクレオチドが１４塩基長である，態様７記載の医薬組成物。
［態様９］前記オリゴヌクレオチドが３－８－３ギャップマーである，態様８記載の医薬組成物。
［態様１０］前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記ｐ５３遺伝子に対して８０％以上相補的である，態様１～９のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１１］前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記ｐ５３遺伝子に対して１００％相補的である，態様１～１０のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１２］前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含む，態様１～１１のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１３］修飾ヌクレオシドが架橋型核酸である，態様１２記載の医薬組成物。
［態様１４］架橋型核酸がＬＮＡである，態様１３記載の医薬組成物。
［態様１５］修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，態様１２～１４のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１６］すべての修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，態様１２～１５のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１７］すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，態様１～１６のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１８］修飾ヌクレオシド間結合がキラル制御されている，態様１２～１７のいずれか記載の医薬組成物。
［態様１９］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されている，態様１～１８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２０］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている，態様１～１９のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２１］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されていない，態様１～１８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２２］前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されていない，態様１～１８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２３］前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチドである，態様１～２２のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２４］前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列からなるオリゴヌクレオチドである，態様１～２２のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２５］前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，または１００％の同一性を有する配列からなるオリゴヌクレオチドである，態様１～２２のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２６］対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物である，態様１～２５のいずれか記載の医薬組成物。
［態様２７］前記疾患または症状が，ｐ５３遺伝子の発現に関連するものである，態様２６記載の医薬組成物。
［態様２８］前記疾患または症状が，虚血-再灌流障害，難聴，聴覚障害，バランス障害，失聴，化学療法誘発性脱毛症，放射線療法誘発性脱毛症，急性腎不全，急性腎障害，慢性腎臓病（ＣＫＤ），抗癌剤療法に関連する副作用，腎移植患者における遅発性移植機能（ＤＧＦ），脊髄損傷，脳損傷，発作，脳卒中，神経変性疾患，パーキンソン病，アルツハイマー病，腫瘍，熱傷，創傷，高熱症，低酸素，虚血，臓器移植，骨髄移植（ＢＭＴ），心筋梗塞／心臓発作，心臓毒性，ｐ５３陽性の癌，および急性肝不全から成る群より選択される，態様２６または２７記載の医薬組成物。
［態様２９］薬学的に許容される賦形剤，緩衝剤，および／または添加物を含有する，態様１～２８のいずれか記載の医薬組成物。
［態様３０］対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含む，本質的に一本鎖のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有し，該オリゴヌクレオチドが１４塩基長のギャップマーであり，該ギャップマーの５’側および３’側のウイング領域がそれぞれ２塩基のＬＮＡからなり，該ギャップマーの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，医薬組成物。
［態様３１］対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって，０１２３－１４００７，０１２３－１４００３，０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２，０１２３－１５０３８，０１２３－１６０３９，０１２３－１６０４０，および０１２３－１６０４１から成る群より選択されるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する，医薬組成物。
［態様３２］０１２３－１４００７，０１２３－１４００３，０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２，０１２３－１５０３８，０１２３－１６０３９，０１２３－１６０４０，および０１２３－１６０４１から成る群より選択されるオリゴヌクレオチド，またはその塩。
［態様３３］以下の式Ｉ－ａまたは式Ｉ－ｂにより表されるオリゴヌクレオチド，またはその塩。
　T(L)^T(L)^T(L)^t^t^a^t^g^g^c^g^G(L)^G(L)^A(L)　　式Ｉ－ａ
　G(L)^A(L)^G(L)^t^t^t^t^t^t^a^t^G(L)^G(L)^5(L)　　式Ｉ－ｂ
（式中，大文字はＲＮＡまたは糖修飾核酸を示し，小文字はＤＮＡを示し，５は５－メチルシチジンを示し，括弧を伴う塩基はリボースの２’位の修飾を示し，ＬはＬＮＡを示し，各塩基間の記号＾はヌクレオシド間結合がチオリン酸結合であることを示す。）
図１は，ヒトｐ５３遺伝子の塩基配列（NM_000546.5）を示している（配列番号６２）。 図２は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでのＡＳＯ（１４ｍｅｒ）の添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図３は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでのＡＳＯ（１３～１５ｍｅｒ）の添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図４は，０１２３－１４００７と名付けられたＡＳＯを様々な濃度で添加した場合におけるｐ５３　ｍＲＮＡレベルの低下を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図５は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでのＡＳＯ（１２～１６ｍｅｒ）の添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図６は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでのＡＳＯ（１４ｍｅｒ）の添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図７は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでのＡＳＯ（１４ｍｅｒ）の添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図８は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでの０１２３－１４００３のＡＳＯおよびＨＤＯの添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図９は，ＨｅＬａ細胞を用いた，トランスフェクション試薬ありでの０１２３－１４００７のＡＳＯおよびＨＤＯの添加により，ｐ５３のｍＲＮＡレベルが低下することを示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。 図１０は，０１２３－１４００３と名付けられたＡＳＯを様々な濃度で添加した場合におけるｐ５３　ｍＲＮＡレベルの低下を示すグラフである。縦軸は，ｐ５３のｍＲＮＡレベルの相対値を示している。Ｄａｙ１（左側）およびＤａｙ２（右側）は，それぞれトランスフェクションから２４時間後および４８時間後におけるデータを示す。
　本発明者らは，比較的短いオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて，効率よく細胞内におけるｐ５３遺伝子の発現を調節する手法を開発した。以下に，本発明を詳細に説明する。
ｐ５３遺伝子
　ｐ５３遺伝子は，細胞内でのＤＮＡ修復や細胞増殖の停止，細胞増殖サイクルの抑制などに関与しており，細胞が癌化したときにはアポトーシスを起こすとされる遺伝子である。ｐ５３はいわゆる癌抑制遺伝子の一つとされ，この遺伝子の機能が障害すると癌が起こると考えられている。細胞が癌化するためには複数の癌遺伝子と癌抑制遺伝子の変化が必要と考えられているが，ｐ５３は悪性腫瘍において最も高頻度に異常が認められている遺伝子である。ｐ５３ポリペプチドは，例えば，ガンマ線照射などのＤＮＡ損傷条件，転写または複製の調節異常，および癌遺伝子による形質転換といった，種々の異なる刺激を細胞増殖の停止やアポトーシスに変換することにより，細胞ストレス応答メカニズムにおいて重要な役割を果たしている。ｐ５３ポリペプチドは，そのような刺激に対する応答としてアポトーシス，つまり，プログラムされた細胞死を誘導する。このように，ｐ５３は細胞の恒常性の維持やアポトーシス誘導といった重要な役割を有している。ほとんどの抗癌療法は，ｐ５３を有する正常な細胞にも傷害を与え，健康な細胞の損傷または死に関連する重篤な副作用を引き起こす。そのような副作用は，ｐ５３が誘導する正常細胞の細胞死に多く起因しており，抗癌療法の急性期における一時的なｐ５３の抑制が，こういった重篤な毒性を回避するための治療戦略として提案されている。つまり，当業者には，ｐ５３遺伝子の転写産物にＡＳＯなどの薬剤を作用させて，ｐ５３タンパク質の発現を制御することにより，アポトーシス誘導に関係する疾患または症状を治療または予防できることが理解される。ｐ５３遺伝子の発現抑制は，ｐ５３遺伝子から転写，翻訳を経て合成されるタンパク質量を，薬剤を作用させていない場合に比べて，７５％以下，５０％以下，４０％以下，３０％以下，２５％以下，２０％以下，１５％以下，１０％以下，５％以下，または３％以下に低減させることにより行われ得る。本発明の態様の一つは，対象におけるｐ５３遺伝子の発現に関連する疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物に関する。特定の実施態様においては，標的となる疾患または症状は，虚血－再灌流障害，難聴，聴覚障害，バランス障害，失聴，化学療法誘発性脱毛症，放射線療法誘発性脱毛症，急性腎不全，急性腎障害，慢性腎臓病（ＣＫＤ），抗癌剤療法に関連する副作用，腎移植患者における遅発性移植機能（ＤＧＦ），脊髄損傷，脳損傷，発作，脳卒中，神経変性疾患，パーキンソン病，アルツハイマー病，腫瘍，熱傷，創傷，高熱症，低酸素，虚血，臓器移植，骨髄移植（ＢＭＴ），心筋梗塞／心臓発作，心臓毒性，ｐ５３陽性の癌，または急性肝不全であるが，標的はこれらに限定はされない。
　ｐ５３遺伝子およびそのｍＲＮＡの塩基配列は公知であり，ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから容易に入手することができる。例えば，ヒトｐ５３遺伝子のｍＲＮＡ配列としては，ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００５４６．５の配列（図１；配列番号６２）を利用することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
　アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯとも呼ばれる）は，標的核酸の少なくとも一部に対して実質的に相補的な配列を有し，対応する核酸塩基間のワトソン－クリック型，フーグスティーン型，または逆フーグスティーン型の水素結合によりハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，その標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する検出可能または測定可能なアンチセンス活性を示すことができる。アンチセンス効果が奏されるメカニズムは，アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションに起因する任意のメカニズムを含み，例えば，そのハイブリダイゼーションの結果または効果は，標的の分解または標的の占拠のいずれかであり得る。特定の実施形態において，アンチセンス活性は，標的核酸の量または発現の減少，またはそのような標的核酸によってコードされるタンパク質の量または発現の減少である。例えば，アンチセンス活性は，特定の実施形態においては，標的の分解（切断）によるアンチセンス阻害であり，これは，標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下における標的核酸レベルの低下を意味する。特に，４塩基以上の連続したＤＮＡを少なくとも一部に含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡとハイブリダイズして細胞内のRNase Hの基質となり，標的ＲＮＡの特異的な分解（切断）を誘導することができる。また，特定の実施形態において，アンチセンス活性は，標的の占拠による立体障害に起因するタンパク質結合阻害であり，その結果，翻訳の抑制やスプライシングの調節（例えば，エキソンスキッピング）が生じる。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは，主にデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ），リボヌクレオシド（ＲＮＡ），修飾ヌクレオシド，ヌクレオシド模倣物（モルホリノ核酸，ペプチド核酸など）から構成される一本鎖オリゴマーである。RNase H切断を誘導する複数のヌクレオシド（例えば，連続４塩基以上のデオキシリボヌクレオシド）を有する内部領域の両側，または片側に１以上のヌクレオシド（例えば，ＬＮＡなどの糖修飾ヌクレオシド）を有する外部領域を有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは，ギャップマーと呼ばれる。特に，外部領域がすべてＬＮＡから成るものはＬＮＡギャップマーと呼ばれる。外部領域を片側のみに有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは，特にヘミギャップマーとも呼ばれる。内部領域に含まれるヌクレオシドは，外部領域に含まれるヌクレオシドとは化学的に性質が異なる。内部領域は「ギャップ」と呼ばれ，外部領域は「ウイング」と呼ばれることがある。例えば，５’側と３’側にそれぞれ３塩基のウイング領域を有し，８塩基のギャップ領域を有する１４塩基長のギャップマーは，３－８－３ギャップマーと呼ばれることがある。特定の実施形態においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドは２－１０－２ギャップマー，２－９－３ギャップマー，３－９－２ギャップマー，３－８－３ギャップマー，３－７－４ギャップマー，４－７－３ギャップマー，４－６－４ギャップマーのいずれかであり得る。特定の実施形態においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドは２－１０－２ＬＮＡギャップマー，２－９－３ＬＮＡギャップマー，３－９－２ＬＮＡギャップマー，３－８－３ＬＮＡギャップマー，３－７－４ＬＮＡギャップマー，４－７－３ＬＮＡギャップマー，４－６－４ＬＮＡギャップマーのいずれかであり得る。内部領域（ギャップ領域）の塩基数は，１塩基以上，例えば，２，３，４，５，６，７，８，９，または１０塩基であり得るが，これらに限定はされない。外部領域（ウイング領域）の塩基数は，５’側，３’側それぞれ独立に，０塩基以上，例えば，１，２，３，４，５，または６塩基であり得るが，これらに限定はされない。５’側および３’側のウイング領域は，それぞれ異なる塩基数を有していてもよい。特定の実施形態においては，ウイング領域は同一または異なる糖修飾ヌクレオシドにより構成されていてもよく，ウイング領域の糖修飾ヌクレオシドは例えばＬＮＡであり得るが，これに限定はされない。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは，特定の実施形態においては，修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。また，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，特定の実施形態においては，オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されていてもよく，例えば，オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されていてもよい。特定の実施形態において，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，例えば，少なくとも８塩基長以上，例えば，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，または２１塩基長であり得るが，これらに限定はされない。一部の実施態様では，約１４塩基のＡＳＯが好適に使用される。
　本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは，特定の実施形態においては，実施例に開示される０１２３－１４００７，０１２３－１４００３，０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２，０１２３－１５０３８，０１２３－１６０３９，０１２３－１６０４０，および０１２３－１６０４１のいずれかであり得る。オリゴヌクレオチド０１２３－１４００７は，配列番号６２の１３３８番目の塩基から１３５１番目の塩基に相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチド０１２３－１４００３は，配列番号６２の１３３４番目の塩基から１３４７番目の塩基に相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチド０１２３－１５０２１は，配列番号６２の１３３７番目の塩基から１３５１番目の塩基に相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチド０１２３－１５０２２は，配列番号６２の１３３８番目の塩基から１３５２番目の塩基に相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチド０１２３－１５０３８は，配列番号６２の１３３４番目の塩基から１３４８番目の塩基に相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチド０１２３－１６０３９は，配列番号６２の１３３２番目の塩基から１３４７番目の塩基に相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチド０１２３－１６０４０は，配列番号６２の１３３４番目の塩基から１３４９番目の塩基に相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチド０１２３－１６０４１は，配列番号６２の１３３３番目の塩基から１３４８番目の塩基に相補的な配列を有している。本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは，配列番号６２の１３３８番目の塩基から１３５１番目の塩基，１３３４番目の塩基から１３４７番目の塩基，１３３７番目の塩基から１３５１番目の塩基，，１３３８番目の塩基から１３５２番目の塩基，１３３４番目の塩基から１３４８番目の塩基，１３３２番目の塩基から１３４７番目の塩基，１３３４番目の塩基から１３４９番目の塩基，および１３３３番目の塩基から１３４８番目の塩基に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。そのような相補的オリゴヌクレオチドは，本明細書中に述べる修飾を含むことができる。また，本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは，薬学的に許容される塩，プロドラッグ，そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩，および他の生物学的同等物の形態であってもよい。適切な薬学的に許容される塩は，ナトリウム塩およびカリウム塩を含むが，これらに限定はされない。
本発明に係るＡＳＯは，公知の化学合成を用いる方法，あるいは酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として，ホスホロアミダイト法，ホスホロチオエート法，ホスホトリエステル法等を挙げることができ，例えば，ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）やＮＴＳ　Ｈ－６核酸合成機（日本テクノサービス社製），Ｏｌｉｇｏｉｌｏｔ１０核酸合成機（ＧＥヘルスケア社製）により合成することができる。酵素的転写法としては，目的の塩基配列を有するプラスミドまたはＤＮＡを鋳型として，Ｔ７，Ｔ３，ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼを用いた転写を挙げることができる。合成法または転写法により製造したＡＳＯは，次いでＨＰＬＣ等にて精製する。例えばＨＰＬＣ精製時には，triethylammonium acetate（ＴＥＡＡ）またはhexylammonium acetate（ＨＡＡ）とアセトニトリルの混合溶液を用いて，ＡＳＯをカラムから溶出する。その後，溶出体積の１０００倍量の蒸留水で溶出溶液を１０時間透析し，透析溶液を凍結乾燥した後，使用時まで冷凍保存する。使用時には，例えば，蒸留水で最終濃度が１００μＭ程度になるように溶解する。
　本発明に係るＡＳＯに用いられる核酸としては，ヌクレオシドまたはそのヌクレオシドと同等の機能を有する分子がヌクレオシド間結合を介して重合した分子であればいかなるものでもよい。ヌクレオシドは，塩基（核酸塩基）と糖が結合した化合物の一種である。塩基としては，アデニン，グアニンなどのプリン塩基，チミン，シトシン，ウラシルなどのピリミジン塩基，ニコチンアミド，ジメチルイソアロキサジンなどを含む。アデノシン，チミジン，グアノシン，シチジン，ウリジンなどが代表的なヌクレオシドである。ヌクレオチドとは，ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質である。オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチドとも言う）としては，例えばリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ，デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ，ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体，修飾ヌクレオシドを含むヌクレオチド重合体が，それぞれ挙げられる。天然のＤＮＡ，ＲＮＡはヌクレオシド間結合として，ホスホジエステル結合を有している。本発明に係るＡＳＯに用いられる核酸は，修飾を含むものであってもよい。核酸修飾の位置には，糖部分，骨格（連結）部分，核酸塩基（塩基）部分，３’または５’末端部分が含まれる。また，本発明において用いられるＡＳＯには，モルホリノ核酸，ペプチド核酸が含まれていてもよい。
修飾ヌクレオシド
　修飾ヌクレオシドとしては，例えばＲＮＡまたはＤＮＡと比較して，ヌクレアーゼ耐性を向上または安定化させるため，相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため，細胞透過性をあげるため，あるいは可視化させるために，リボヌクレオシド，デオキシリボヌクレオシド，ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子を挙げることができ，例えば，２’－ＭＯＥ，ＬＮＡ，ＥＮＡなどの糖部修飾ヌクレオシドが例示される。本発明のＡＳＯは，例えば，Khvorova & Watts（Nature Biotechnology 35，238-248（2017）doi:10.1038/nbt.3765）に開示の修飾核酸分子を含んでいてもよい。
　修飾糖とは，天然糖部分（すなわち，ＤＮＡ（２’－Ｈ）またはＲＮＡ（２’－ＯＨ）中に認められる糖部分）からの置換および／または任意の変化を有する糖を指し，糖部修飾ヌクレオシドとは，修飾糖を含む修飾ヌクレオシドを指す。糖部修飾ヌクレオシドは，ヌクレオシドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し，任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく，例えば，２’－Ｏ－メチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’－Ｏ－プロピルリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’－メトキシエトキシリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’－Ｏ－メトキシエチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’－Ｏ－［２－（グアニジウム）エチル］リボースで置換された修飾ヌクレオシド，２’－Ｏ－フルオロリボースで置換された修飾ヌクレオシド，糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ），より具体的には，２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Locked Nucleic Acid：ＬＮＡ），エチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid：ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research，32，e175（2004)］等があげられ，さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res.，32，624（1999)］，オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am. Chem. Soc.，123，4653（2001)］，およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J. Am. Chem. Soc.，122，6900（2000)］等を挙げることができる。
　ＲＮＡの２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾（２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ）は，天然にも存在する修飾であり，修飾オリゴヌクレオチドの結合親和性とヌクレアーゼ耐性を向上させると共に，免疫刺激性を低下させる。２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）は，ヌクレアーゼ耐性が２’－ＯＭｅ修飾よりもさらに増加しており，修飾ヌクレオチドの結合親和性（ΔＴｍ）も大幅に上昇している。ＲＮＡの２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾（２’－Ｆ－ＲＮＡ）を用いてオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることもできる。他の２’修飾核酸としては，２’－Ｆ－ＡＮＡや，関根らの２’ －修飾誘導体（特許第５１９４２５６号，特開２０１５－０２０９９４）を挙げることができる。
　リボースの２’酸素と４’炭素を連結したＬＮＡ（Locked nucleic acid）は，結合親和性に大幅な増加をもたらす。ＬＮＡでは，ＲＮＡのリボース糖の２’酸素と４’炭素が環構造において固定されている。この修飾は，特異性，親和性，および半減期を増加させ，目的の組織への効果的な送達を，より低い毒性で可能とする。しかし，ＬＮＡで完全に修飾された約８ヌクレオチドよりも長いオリゴマーは凝集する傾向があることが知られており，一般的には，ＤＮＡや他の糖部修飾核酸との混合で用いられる。
　ＬＮＡのメチル化類似体であるｃＥｔもＬＮＡと同様に有用である。トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）は，３環骨格に基づく拘束型ヌクレオチドである。
　修飾ヌクレオシドとしては，その他に，核酸の塩基部分の原子（例えば，水素原子，酸素原子）もしくは官能基（例えば，水酸基，アミノ基）が他の原子（例えば，水素原子，硫黄原子），官能基（例えば，アミノ基），もしくは炭素数１～６のアルキル基で置換されたものまたは保護基（例えばメチル基またはアシル基）で保護されたもの，ヌクレオシドに，例えば脂質，リン脂質，フェナジン，フォレート，フェナントリジン，アントラキノン，アクリジン，フルオレセイン，ローダミン，クマリン，色素など，別の化学物質を付加した分子等を用いてもよい。
　修飾核酸塩基（または修飾塩基）には，アデニン，シトシン，グアニン，チミン，またはウラシル以外のあらゆる核酸塩基が含まれるが，例えば，５－メチルシトシン，５－フルオロシトシン，５－ブロモシトシン，５－ヨードシトシン，Ｎ４－メチルシトシン，５－フルオロウラシル，５－ブロモウラシル，５－ヨードウラシル，２－チオチミン，Ｎ６－メチルアデニン，８－ブロモアデニン，Ｎ２－メチルグアニン，８－ブロモグアニン，およびイノシンなどが挙げられる。例えば，配列番号１～５９の配列を有するオリゴヌクレオチドは，少なくとも１つのシトシンが５－メチルシトシンにより置換されていてもよく，一部の実施形態においては，全てのシトシンが５－メチルシトシンにより置換されていてもよい。
ヌクレオシド間結合
　天然のＤＮＡ，ＲＮＡはヌクレオシド間結合として，ホスホジエステル結合を有している。本発明の一つの態様においては，ヌクレオシド間結合は，修飾を含んでいてもよい。修飾ヌクレオシド間結合とは，天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち，ホスホジエステル結合）からの置換または任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指し，修飾ヌクレオシド間結合には，リン原子を含むヌクレオシド間結合，およびリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合としては，ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し，任意の化学物質を付加あるいは置換したものでもよく，例えば，ホスホロチオエート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合，Ｎ３’－Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合等を挙げることができる。他の修飾ヌクレオシド間結合としては（ＳＣ５’Ｒｐ）－α，β－ＣＮＡ，ＰＭＯなどが挙げられる。
　代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては，例えば，ホスホジエステル結合，ホスホロチオエート結合（チオリン酸結合ともいう），ホスホロジチオエート結合，ホスホトリエステル結合，およびメチルホスホネート結合，メチルチオホスホネート結合，ボラノホスフェート結合，ホスホロアミデート結合を挙げることができる。
　主要な修飾ヌクレオシド間結合の一つであるホスホロチオエート（ＰＳ）結合は，ヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護するのに役立つ。ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は，もともとはヌクレアーゼ耐性を付与するためにオリゴヌクレオチドに組み込まれたものであるが，この修飾は，オリゴヌクレオチドの輸送と取り込みにも大きな影響を与える。ＰＳは，ＡＳＯの電荷を変えることによって，受容体部位および血漿タンパク質への結合を増加させ，標的組織に到達するＡＳＯの量を増加させる。ヘパリン結合タンパク質は，ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの最も親和性の高い標的の一つである。血漿タンパク質による適切な結合は，腎臓系による血液からの迅速な排除を抑制し，最適な送達を促進する。
　一部の実施態様において，本発明のＡＳＯは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含み，例えば，ヌクレオチド間結合の総数のうちの２０％以上，３０％以上，４０％以上，５０％以上，６０％以上，７０％以上，８０％以上，９０％以上，または９５％以上が修飾ヌクレオチド間結合であってもよい。本発明の一実施態様においては，全てのヌクレオチド間結合が修飾ヌクレオチド間結合（例えばホスホロチオエート結合）であるＡＳＯが用いられる。
　ホスホロチオエート結合は，リン原子部分に立体中心を有しており，完全修飾オリゴヌクレオチドは通常，２ｎ－１種のジアステレオマーの混合物となる（例えば，１４ｍｅｒのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは，２１３種のジアステレオマーの混合物となる）。ＳｐおよびＲｐジアステレオマー結合は，異なる特性を示すことが知られている。Ｒｐジアステレオマーは，Ｓｐジアステレオマーよりもヌクレアーゼ耐性が低いが，より高い親和性で相補鎖と結合する。本発明のＡＳＯにおいては，修飾ヌクレオシド間結合の合成時にキラル制御を行い，特定のホスホロチオエート結合が特定のジアステレオマーとなるように合成を制御してもよい。
リガンド等を連結したオリゴヌクレオチド／末端修飾オリゴヌクレオチド
　核酸に別の化学物質を付加した分子としては，例えば，５’－ポリアミン付加誘導体，コレステロール付加誘導体，ステロイド付加誘導体，胆汁酸付加誘導体，ビタミン付加誘導体，Ｃｙ５付加誘導体，Ｃｙ３付加誘導体，６－ＦＡＭ付加誘導体，ビオチン付加誘導体等および北出らの誘導体（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００００８７，ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／５９３９８）を挙げることができる。リガンド等を付加する部位は，オリゴヌクレオチドの末端（５’末端または３’末端）および／またはオリゴヌクレオチドの内部であり得る。リガンド等は，リガンド等を付加したＡＳＯに相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して間接的に結合していてもよい（ＷＯ２０１３／０８９２８３Ａ１）。
　ＡＳＯとコレステロールとは，例えば以下に示すように，トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を介して連結されることができる。
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　末端修飾の例として，ＧａｌＮＡｃ連結オリゴヌクレオチドやＰＵＦＡ連結オリゴヌクレオチドが知られている。ＧａｌＮＡｃを末端に連結することにより，オリゴヌクレオチドの肝臓への送達効率を高めることができる。本発明において用いられるＡＳＯには，ＧａｌＮＡｃなどのリガンドが直接または間接的に連結されていてもよい。
　短いオリゴヌクレオチドは，腎臓に多く送達され，長いオリゴマーは肝臓に多く送達される傾向がある。短いオリゴヌクレオチドは，血漿タンパク質に結合しにくく，結果として血漿中の半減期が短くなる傾向があるが，切断可能なリンカーなどを用いて多量体を構築することが可能である。本発明において用いられるＡＳＯは，切断可能なリンカーなどを用いて，他のＡＳＯに連結されていてもよい。
　本発明に係るＡＳＯは，５’末端および／または３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。他の末端修飾としては，Ｅ－ＶＰ，メチルホスホネート，ホスホロチオエート，Ｃ－メチルアナログなどがあり，オリゴヌクレオチドの安定性を高めることが知られている。本発明において用いられるＡＳＯは，これらの末端修飾を含んでいてもよい。
ＡＳＯの配列設計
　ＡＳＯの配列は，標的とする遺伝子の塩基配列に基づき設計することができる。ＡＳＯ配列の設計方法は，当業者には公知であり，これまでに多数のＡＳＯが設計され，その活性が評価されている。例えば，ｐ５３遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は，ＥＰ１０１２２６７Ｂ１，ＥＰ１８８９９１１Ａ２，ＷＯ９８／３３９０４，ＥＰ１５９８４２０Ａ２，ＷＯ９５／０９９１６，ＷＯ２０／２４８８５，ＷＯ９８／２２１４２，ＷＯ１９９３／００３７７０，米国特許第５６５４４１５号，米国特許第５６４１７５４号，米国特許第５０８７６１７号，日本国特許第５６７１７９１号，Hata et al.Biochemical and Biophysical Research Communications 1991，179，528-534，Bayever et al. Leukemia & Lymphoma 1994，12，223-231，Mahdi et al. Journal of Cell Science 1995，108，1287-1293，Hirota et al. Jpn. J. Cancer Res. 1996，87，735-742，Dai et al. Acta Pharmacologica Sinica 2006，27，1453-1458，Robu et al. Pros Genetics 2007，3，e78，Alachkar et al.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2012,71，228-232，Gorska et al. 2013，PLoS ONE 8(11): e78863，Swiatkowska et al. PLOS ONE，2015，10，e0141676，Swaitkowska et al. Acta Biochimica Polonica，2016，63，645-651.に開示されている。ＡＳＯの配列は，標的とするＲＮＡの二次構造あるいは三次構造を考慮して決定してもよい。本発明者らは，ＭｏｂｙＤｉｃｋ（商標）と名付けた独自のアルゴリズムを配列決定の際に利用している。
　なお，核酸の構造予測に関しては，以下の参考文献を参照してもよい：
- Markham，N. R. & Zuker，M.（2005）DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res.，33，W577-W581; 
- Markham，N. R. & Zuker，M.（2008）UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith，J. M.，editor，Bioinformatics，Volume II. Structure，Function and Applications，number 453 in Methods in Molecular Biology，chapter 1，pages 3-31. Humana Press，Totowa，NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.）。
　また，配列決定の際には，標的遺伝子のノックダウン効率だけでなく，毒性，オフターゲット効果，生物種間での共通性，安定性，細胞内への取り込み効率や，その他の因子も考慮に含めることができる。例えば，実施例において示されるオリゴヌクレオチド０１２３－１４００３は，マウス，ラット，カニクイザルのｐ５３遺伝子ともパーフェクトマッチする点で好ましいＡＳＯであるとみなされうる。
標的配列との相補性
　本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は，配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列に対して実質的に同一であり得る。ここで，実質的に同一とは，オリゴヌクレオチドが標的配列に対して完全（１００％）に同一である必要はなく，８０％以上の同一性を有することを意味する。特定の実施形態においては，オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，または１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。同一性の値は，ＷＯ２０１６／０２７７４７の記載に従って算出することができる（その内容は参照により本明細書に取り込まれる）。ＡＳＯによる発現または活性の阻害は，発現または活性の減少または阻止を指し，必ずしも発現または活性が完全に排除される必要はない。
　本発明の一つの態様は，細胞においてｐ５３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを有効成分として含有し，該オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列に対して実質的に同一な配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする，医薬組成物に関する。ここで，実質的に相補的とは，オリゴヌクレオチドが標的配列に対して完全（１００％）に相補的である必要はなく，８０％以上，例えば８５％，９０％，９５％，９８％または９９％の相補的を有することを意味する。このオリゴヌクレオチドは，配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，または１００％の同一性を有する配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。特定の実施形態において，オリゴヌクレオチドは，配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列に対して１００％同一な配列からなる。特定の実施態様では，オリゴヌクレオチドは，相補性領域の５’側および／または３’側に付加的な配列を有していてもよい。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計，調製および使用のための手法は，当業者にとり周知であるが，例えば，ＷＯ２０１６／０２７７４７を参照することができる（その内容は参照により本明細書に取り込まれる）。
オリゴヌクレオチドの送達
　オリゴヌクレオチドの細胞への送達には，トランスフェクション試薬，リポソーム，ベクター，ナノミセル，相補的核酸などのＤＤＳツールが利用されうる。なお，本発明の一部の態様において，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，本質的に一本鎖の分子である。ここで，本質的に一本鎖であるとは，オリゴヌクレオチドの送達や製剤化の過程において，一時的に相補的な別個の核酸と二本鎖を形成しても良いことを意味する。オリゴヌクレオチドが，標的ＲＮＡにハイブリダイズしてアンチセンス効果を発揮する際には，一本鎖のオリゴヌクレオチドの形で作用し，最終的には標的ＲＮＡとＡＳＯとにより二本鎖が形成される。なお，本発明の一部の態様において，配列番号１から１２５の配列を有するオリゴヌクレオチドは，ｓｉＲＮＡの一部としても用いられうる。
ハイブリッド型ＡＳＯ
　国際公開第２０１３／０８９２８３号およびNishina et al.，Nature Communications volume 6，Article number: 7969（2015)には，ＡＳＯと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド（ＨＤＯとも呼ばれる）がＡＳＯと比較して，効率よく肝臓に送達，集積され，肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されることが記載されている。国際公開第２０１５／１０５０８３号には，ＨＤＯにＧａｌＮＡｃ誘導体がリンカーを介して結合しているＡＳＯが記載されており，そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると，トコフェロール（Ｔｏｃ）修飾体より効率的に標的遺伝子の発現が抑制されることが記載されている。さらに，国際公開第２０１７／１３１１２号には，ＡＳＯに相補的なオリゴヌクレオチドを連結させて，分子内で二本鎖を形成するようにした一本鎖オリゴヌクレオチドが，二本鎖オリゴヌクレオチドと同等以上のアンチセンス効果を示すことが記載されている。よって，本発明の一部の態様では，ＡＳＯは，それに相補的な核酸鎖と二本鎖を形成していてもよい。また，本発明の一部の態様では，ＡＳＯは，それに相補的な核酸鎖と連結されており，分子内のセルフアニーリングにより，二本鎖部分を形成していてもよい。さらに，本発明の一部の態様では，ＡＳＯに相補的な核酸領域にトコフェロール（Ｔｏｃ）やＧａｌＮＡｃなどのリガンドが連結されていてもよい。さらに，一部の態様では，本開示のオリゴヌクレオチドは，ｓｉＲＮＡ二重鎖の一部として用いられてもよい。
医薬組成物
　アンチセンス核酸はそれ単独で製剤化することもできるが，通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し，製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。医薬組成物には，異なる配列を有する複数のＡＳＯの混合物が含まれていてもよい。
　投与対象には，ヒトまたは非ヒト動物，例えば，非ヒト哺乳動物が含まれる。投与経路は，治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく，経口投与，または口腔内，気道内，直腸内，皮下，筋肉内，静脈内および経皮などの非経口投与を挙げることができ，望ましくは静脈内投与を挙げることができる。
　経口投与に適当な製剤としては，乳剤，シロップ剤，カプセル剤，錠剤，散剤，顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は，水，ショ糖，ソルビトール，果糖などの糖類，ポリエチレングリコール，プロピレングリコールなどのグリコール類，ゴマ油，オリーブ油，大豆油などの油類，ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤，ストロベリーフレーバー，ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤，錠剤，散剤，顆粒剤などは，乳糖，ブドウ糖，ショ糖，マンニトールなどの賦形剤，デンプン，アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤，ステアリン酸マグネシウム，タルクなどの滑沢剤，ポリビニルアルコール，ヒドロキシプロピルセルロース，ゼラチンなどの結合剤，脂肪酸エステルなどの界面活性剤，グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
　非経口投与に適当な製剤としては，注射剤，座剤，噴霧剤などがあげられる。注射剤は，塩溶液，ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂，水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また，噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず，かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
　担体として具体的には乳糖，グリセリン，リポソーム，ナノミセルなどが例示される。本発明で用いる核酸，さらには用いる担体の性質により，エアロゾル，ドライパウダーなどの製剤が可能である。また，これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
　投与量または投与回数は，目的とする治療効果，投与方法，治療期間，年齢，体重などにより異なるが，例えば，成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。
　本発明の一つの態様は，約１４～２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む，患者における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物に関する。患者は，ヒトもしくは非ヒト動物であり得る。なお，本明細書において，約１４ｍｅｒと言った場合は，少なくともその前後１塩基の範囲，すなわち１３ｍｅｒ，１４ｍｅｒ，および１５ｍｅｒを含むものと解され，約２０ｍｅｒと言った場合は，１９ｍｅｒ，２０ｍｅｒ，および２１ｍｅｒを含むものと解される。一部の態様においては，１４ｍｅｒのＡＳＯが好適に用いられる。
　特定の実施態様において，疾患または症状は，虚血－再灌流障害，難聴，聴覚障害，バランス障害，失聴，化学療法誘発性脱毛症，放射線療法誘発性脱毛症，急性腎不全，急性腎障害，慢性腎臓病（ＣＫＤ），抗癌剤療法に関連する副作用，腎移植患者における遅発性移植機能（ＤＧＦ），脊髄損傷，脳損傷，発作，脳卒中，神経変性疾患，パーキンソン病，アルツハイマー病，腫瘍，熱傷，創傷，高熱症，低酸素，虚血，臓器移植，骨髄移植（ＢＭＴ），心筋梗塞／心臓発作，心臓毒性，ｐ５３陽性の癌，および急性肝不全のうちのいずれかであり得る。
　本発明の一つの態様は，疾患または症状の治療もしくは予防のための医薬組成物，または疾患または症状の治療もしくは予防に用いるための医薬組成物であって，以下から選択されるいずれかの配列を含むか，いずれかの配列から成るＡＳＯを含む，医薬組成物に関する：０１２３－１４００７，０１２３－１４００３，０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２，０１２３－１５０３８，０１２３－１６０３９，０１２３－１６０４０，および０１２３－１６０４１。
医薬の製造における使用および治療方法
　本発明の一つの態様は，患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬の製造における，約1４～２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用に関する。一部の態様においては，１４ｍｅｒのＡＳＯが好適に用いられる。
　また，本発明の一つの態様は，患者における疾患または障害の治療または予防のための方法であって，該患者に約1４～２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を投与する工程を含むことを特徴とする，方法に関する。一部の態様においては，１４ｍｅｒのＡＳＯが好適に用いられる。
　また，本発明の一つの態様は，患者における急性腎不全（急性腎障害）の治療もしくは予防のための方法であって，以下から選択されるいずれかの配列を含むか，いずれかの配列から成るオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程を含む方法に関する：０１２３－１４００７，０１２３－１４００３，０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２，０１２３－１５０３８，０１２３－１６０３９，０１２３－１６０４０，および０１２３－１６０４１。
手術に関連する急性腎不全の予防および治療
　急性腎不全（ＡＲＦ）は，例えば，心血管系の大手術を受けた患者においては，手術中の腎臓への局所血流の減少および血流回復後の再灌流障害に起因して，術後数時間から数日以内に発症するおそれがあり，発症後３０日の死亡率は５０％を超える。急性腎不全の予防，重症度の軽減，または治療を行うために，本発明に係るＡＳＯを患者に投与することができる。ＡＳＯの投与は，例えば，手術の開始前（例えば，２時間前，４時間前，または６時間前）から手術後８時間以内（例えば術後３時間後，４時間後，または５時間後）のいずれかの時点で行うことができる。投与は，単回または複数回のいずれでも行われ得る。投与は，例えば静脈注射により行われ得る。
　以下に，実施例を示して本発明を具体的に説明するが，これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
例１：ｐ５３に対するアンチセンス（ＡＳＯ）の設計，合成
　ｐ５３を標的とした配列をＡＳＯについて設計し，合成した。設計にはNCBI Refseqコレクションに登録されているヒト転写物NM_000546.5（配列番号６２，図１）を利用した。合成は株式会社ジーンデザイン（GeneDesign）に委託した。
　以下の表１および表２に合成した各ヌクレオチド配列を示す。大文字はＲＮＡまたは糖修飾核酸，小文字はＤＮＡを示す。「５」は５－メチルシチジンを表す。なお，各ヌクレオチドにおける括弧は，リボースの２’位の修飾を示し，ＬはＬＮＡを，Ｍは２’ＯＭｅを，Ｆは２’Ｆをそれぞれ示す。例えば，Ｇ（Ｌ）はＬＮＡ型のグアノシンを表す。また，塩基間のアクサンシルコンフレックス「＾」（この記号はキャレット，ハットとも呼ばれる）はヌクレオシド間結合がチオリン酸結合（ホスホロチオエート結合）であることを示す。例えば，以下に示されるＩＤとして０１２３－１４００１を有するＡＳＯは，それぞれ３塩基の５’ウイング領域と３’ウイング領域を有する１４塩基長の３－８－３ギャップマーである。なお，これらのＡＳＯの５’末端および３’末端にはリン酸基は付加されていない。「－ｃｈｏ」は末端にコレステロールが付加されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
例２：ｐ５３に対するアンチセンスの評価
　以下の表３に示されるＡＳＯを合成し，ＨｅＬａ細胞に終濃度２０ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後，２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図２および表４に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。ＱＰＩ－１００２（ＣＡＳ番号：１２３１７３７－８８－４）は，比較のために用いたｓｉＲＮＡである（例えば，米国特許第９，８６８，９５３号を参照）。ＮＴＳ１は，ネガティブコントロールである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　図２および表４に示されるように，０１２３－１４００１，０１２３－１４００３，０１２３－１４００４，０１２３－１４００５，０１２３－１４００６，０１２３－１４００７，０１２３－１４０２８，０１２３－１４０２９，０１２３－１４０３１は８０％以上の抑制効果を示した。０１２３－１４００２，０１２３－１４００８，０１２３－１４０１２，０１２３－１４０１３，０１２３－１４０１６，０１２３－１４０１７, ０１２３－１４０１８, ０１２３－１４０３０は５０％以上の抑制効果を示した。
例３：ｐ５３に対するアンチセンスの評価
　以下の表５に示されるＡＳＯを合成し，ＨｅＬａ細胞に終濃度２０ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後，２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図３および表６に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　図３および表６に示されるように，塩基長が１３－ｍｅｒの場合（０１２３－１３０１９，０１２３－１３０２０），抑制効果は弱くなった。塩基長が１５－ｍｅｒのＡＳＯ（０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２）は１４－ｍｅｒのＡＳＯと（０１２３－１４００７）と抑制効果はほとんど変わらなかった。ＡＳＯの配列にミスマッチを導入した場合（０１２３－１４０２３，０１２３－１４０２４，０１２３－１４０２５，０１２３－１４０２６），は抑制効果が弱くなった。特に，２塩基のミスマッチを導入した０１２３－１４０２６は抑制効果が顕著に失われた。３’－末端にコレステロールを付加した０１２３－１４０２７は抑制効果は付加していないものと同程度であった。両末端に位置するＬＮＡ数を変化させた場合，２－１０－２，３－８－３，４－６－４ＬＮＡギャップマー（それぞれ０１２３－１４０６４，０１２３－１４００７，０１２３－１４０５９）は抑制効果は同程度であったが，５－４－５ＬＮＡギャップマーである０１２３－１４０６０は抑制効果が顕著に弱くなった。ＡＳＯの両末端に位置するＬＮＡをほかの修飾核酸に変更した場合，抑制効果は顕著に減少した。
例４：ｐ５３に対するアンチセンスの濃度依存性の評価
　０１２３－１４００７をＨｅＬａ細胞に終濃度０．３～１００ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図４および表７に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　図４および表６に示されるように，０１２３－１４００７は１ｎＭから抑制効果を示し，１００ｎＭまで濃度依存的に抑制効果を示した。抑制効果は最大で９７％であった。ＩＣ５０はＤａｙ１で２．３ｎＭ，Ｄａｙ２で３．０ｎＭであった。
例５：ｐ５３に対するアンチセンスの評価
　以下の表８に示されるＡＳＯを合成し，その一部をＨｅＬａ細胞に終濃度２０ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後，２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図５および表９に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
　図５および表９に示されるように，０１２３－１４００３を２－ｎｔ短鎖化した０１２３－１２０３２，０３３，０３４は抑制効果がほとんど変わらないか減弱した。また，１－ｎｔ短鎖化した０１２３－１３０３５，０３６も同様に，抑制効果はほとんど変わらないか減弱した。１５－ｍｅｒに伸長した０３７，０３８は００３とほとんど抑制効果は変わらなかったが，１６－ｍｅｒに伸長した０３８～４０は若干抑制効果が強くなった。０１２３－１２０３３は１２－ｍｅｒと短鎖化されているが，００３と同程度の抑制効果を示した。
例６：ｐ５３に対するアンチセンスの評価
　上記の表８に示されるＡＳＯを合成し，その一部をＨｅＬａ細胞に終濃度２０ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後，２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図６および上記の表９に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。
　図６および表９に示されるように，０１２３－１４００３のギャップ部分にミスマッチを導入した０４２は抑制効果は失われた。３’－末端にミスマッチを導入した０４３は００３と同程度の抑制効果を示した。０４４は２塩基のミスマッチが導入されているが，ギャップ部分にミスマッチが導入されているためか抑制効果は顕著に減弱した。
　０１２３－１４０４５～０４９は両端のＬＮＡ修飾の数を変更しているが，ＬＮＡ数が０（０４５）の場合は抑制効果が顕著に減弱した。同様に，両端に１－ｎｔずつＬＮＡを導入した０４６も抑制効果が顕著に減弱した。両端に２－ｎｔずつＬＮＡを導入した０４７は００３よりは弱いが，抑制効果を示した。００３よりも更にＬＮＡ数を増やした０４８，０４９は抑制効果が減弱していった。コレステロールを付加した０５０は抑制効果が顕著に減弱した。
例７：ｐ５３に対するアンチセンスの評価
　上記の表８に示されるＡＳＯを合成し，その一部をＨｅＬａ細胞に終濃度２０ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後，２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図７および上記の表９に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。
　図７および表９に示されるように，ＡＳＯの両末端に位置するＬＮＡをほかの修飾核酸に変更した場合，抑制効果は顕著に減少した。
例８：ｐ５３に対するＨＤＯの評価
　０１２３－１４００３，及び０１２３－１４００７に対するセンス鎖ＲＮＡ（０１２３－１４００３ｓｓＲＮＡ：ＵＣＣＣＧＣＣＡＵＡＡＡＡＡ（配列番号６０）および０１２３－１４００７ｓｓＲＮＡ：ＧＣＣＡＵＡＡＡＡＡＡＣＵＣ（配列番号６１））を合成し，アニーリングさせることでＨＤＯ化した。ＨＤＯ化したＡＳＯをＨｅＬａ細胞に終濃度２０ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後，２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図８，図９および表１０に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
　図８，図９および表１０に示されるように，ＨＤＯ化したＡＳＯは一本鎖のＡＳＯとほとんど変わらない程度の抑制効果を示した。
例９：ｐ５３に対するアンチセンスの濃度依存性の評価
　０１２３－１４００３をＨｅＬａ細胞に終濃度０．３～１００ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を用い，付属のプロトコルに従って実行した。トランスフェクション後，２４および４８時間で細胞を回収し，トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ中に含まれるｐ５３　ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。結果を図１０および表１１に示す。測定結果はＭｏｃｋを１とした相対レベルで示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　図１０および表１１に示されるように，０１２３－１４００３は３ｎＭから抑制効果を示し，１００ｎＭまで濃度依存的に抑制効果を示した。抑制効果は最大で９４％であった。ＩＣ５０はＤａｙ１で８．０ｎＭ，Ｄａｙ２で１１．３ｎＭであった。
　本明細書には，本発明の好ましい実施態様を示してあるが，そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは，当業者には明らかであり，当業者であれば，本発明から逸脱することなく，様々な変形，変更，置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が，本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また，本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む，全ての刊行物に記載の内容は，その引用によって，本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
　本発明者らは，ｐ５３遺伝子の転写産物に対して作用するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を同定した。これらの比較的短いオリゴヌクレオチドを用いることで，ｐ５３　ｍＲＮＡの量を低下させ，タンパク質の発現を抑制することができる。これらのＡＳＯは急性腎不全や脱毛症などの治療または予防に有用となりうる。
 

Claims (33)

  1. 　細胞においてｐ５３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する，医薬組成物。
  2. 　前記ｐ５３遺伝子がヒトｐ５３遺伝子である，請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　前記ｐ５３遺伝子が配列番号６２の配列を有する，請求項１または２記載の医薬組成物。
  4. 　前記オリゴヌクレオチドが本質的に一本鎖の分子である，請求項１～３のいずれか一項記載の医薬組成物。
  5. 　前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である，請求項１～４のいずれか一項記載の医薬組成物。
  6. 　前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）がギャップマーである，請求項５記載の医薬組成物。
  7. 　前記オリゴヌクレオチドが１２～１８塩基長である，請求項１～６のいずれか一項記載の医薬組成物。
  8. 　前記オリゴヌクレオチドが１４塩基長である，請求項７記載の医薬組成物。
  9. 　前記オリゴヌクレオチドが３－８－３ギャップマーである，請求項８記載の医薬組成物。
  10. 　前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記ｐ５３遺伝子に対して８０％以上相補的である，請求項１～９のいずれか一項記載の医薬組成物。
  11. 　前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記ｐ５３遺伝子に対して１００％相補的である，請求項１～１０のいずれか一項記載の医薬組成物。
  12. 　前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含む，請求項１～１１のいずれか一項記載の医薬組成物。
  13. 　修飾ヌクレオシドが架橋型核酸である，請求項１２記載の医薬組成物。
  14. 　架橋型核酸がＬＮＡである，請求項１３記載の医薬組成物。
  15. 　修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，請求項１２～１４のいずれか一項記載の医薬組成物。
  16. 　すべての修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，請求項１２～１５のいずれか一項記載の医薬組成物。
  17. 　すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，請求項１～１６のいずれか一項記載の医薬組成物。
  18. 　修飾ヌクレオシド間結合がキラル制御されている，請求項１２～１７のいずれか一項記載の医薬組成物。
  19. 　前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されている，請求項１～１８のいずれか一項記載の医薬組成物。
  20. 　前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている，請求項１～１９のいずれか一項記載の医薬組成物。
  21. 　前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されていない，請求項１～１８のいずれか一項記載の医薬組成物。
  22. 　前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されていない，請求項１～１８のいずれか一項記載の医薬組成物。
  23. 　前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列を含むオリゴヌクレオチドである，請求項１～２２のいずれか一項記載の医薬組成物。
  24. 　前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列からなるオリゴヌクレオチドである，請求項１～２２のいずれか一項記載の医薬組成物。
  25. 　前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から配列番号５９のいずれか１つの配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，または１００％の同一性を有する配列からなるオリゴヌクレオチドである，請求項１～２２のいずれか一項記載の医薬組成物。
  26. 　対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物である，請求項１～２５のいずれか一項記載の医薬組成物。
  27. 　前記疾患または症状が，ｐ５３遺伝子の発現に関連するものである，請求項２６記載の医薬組成物。
  28. 　前記疾患または症状が，虚血-再灌流障害，難聴，聴覚障害，バランス障害，失聴，化学療法誘発性脱毛症，放射線療法誘発性脱毛症，急性腎不全，急性腎障害，慢性腎臓病（ＣＫＤ），抗癌剤療法に関連する副作用，腎移植患者における遅発性移植機能（ＤＧＦ），脊髄損傷，脳損傷，発作，脳卒中，神経変性疾患，パーキンソン病，アルツハイマー病，腫瘍，熱傷，創傷，高熱症，低酸素，虚血，臓器移植，骨髄移植（ＢＭＴ），心筋梗塞／心臓発作，心臓毒性，ｐ５３陽性の癌，および急性肝不全から成る群より選択される，請求項２６または２７記載の医薬組成物。
  29. 　薬学的に許容される賦形剤，緩衝剤，および／または添加物を含有する，請求項１～２８のいずれか一項記載の医薬組成物。
  30. 　対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって，ｐ５３遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含む，本質的に一本鎖のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有し，該オリゴヌクレオチドが１４塩基長のギャップマーであり，該ギャップマーの５’側および３’側のウイング領域がそれぞれ３塩基のＬＮＡからなり，該ギャップマーの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である，医薬組成物。
  31. 　対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって，０１２３－１４００７，０１２３－１４００３，０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２，０１２３－１５０３８，０１２３－１６０３９，０１２３－１６０４０，および０１２３－１６０４１から成る群より選択されるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する，医薬組成物。
  32. 　０１２３－１４００７，０１２３－１４００３，０１２３－１５０２１，０１２３－１５０２２，０１２３－１６０５８，０１２３－１６０３９，０１２３－１６０４０，および０１２３－１６０４１から成る群より選択されるオリゴヌクレオチド，またはその塩。
  33. 　以下の式Ｉ－ａまたは式Ｉ－ｂにより表されるオリゴヌクレオチド，またはその塩。
    　T(L)^T(L)^T(L)^t^t^a^t^g^g^c^g^G(L)^G(L)^A(L)　　式Ｉ－ａ
    　G(L)^A(L)^G(L)^t^t^t^t^t^t^a^t^G(L)^G(L)^5(L)　　式Ｉ－ｂ
    （式中，大文字はＲＮＡまたは糖修飾核酸を示し，小文字はＤＮＡを示し，５は５－メチルシチジンを示し，括弧を伴う塩基はリボースの２’位の修飾を示し，ＬはＬＮＡを示し，各塩基間の記号＾はヌクレオシド間結合がチオリン酸結合であることを示す。）
     
     
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