WO2022250050A1 - ｓｃｐＢＮＡ又はＡｍＮＡを含むヘテロ核酸 - Google Patents

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哲也 永田
耕太郎 吉岡
聡 小比賀
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国立大学法人東京医科歯科大学
国立大学法人大阪大学
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    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/53—Methods for regulating/modulating their activity reducing unwanted side-effects

Definitions

  • the present invention relates to a double-stranded nucleic acid complex containing scpBNA or AmNA, a pharmaceutical composition containing the same, and the like.
  • oligonucleotides In recent years, in the ongoing development of medicines called nucleic acid medicines, attention has been focused on oligonucleotides. is being actively developed.
  • a partial sequence of mRNA or miRNA transcribed from the target gene is used as the target sense strand, and a complementary oligonucleotide (antisense oligonucleotide: in this specification, often referred to as "ASO (Antisense Oligonucleotide)").
  • ASO Antisense Oligonucleotide
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Documents 1 and 2.
  • the double-stranded nucleic acid complex has a high antisense effect and is an epoch-making technology that crosses the blood-brain barrier and enables control of the central nervous system.
  • treatment of neurological diseases such as Alzheimer's disease requires administration at high doses, and serious side effects such as liver damage may become a problem.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems, and found that 2'-O,4'-C-spirocyclopropylene crosslinked nucleic acid (scpBNA) or amide crosslinked nucleic acid (AmNA) is a double-stranded nucleic acid. introduced into the complex. As a result, they found that introduction of scpBNA or AmNA can dramatically reduce or eliminate the toxicity of double-stranded nucleic acid complexes. This toxicity-suppressing effect is a surprising effect that greatly exceeds conventional expectations. Furthermore, it was found that the introduction of scpBNA or AmNA did not impair the efficacy of the double-stranded nucleic acid complex.
  • the present invention is based on the above findings, and provides the following.
  • a double-stranded nucleic acid complex comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand is capable of hybridizing to at least a portion of a target gene or transcript thereof; having an antisense effect on the target gene or its transcript, the second nucleic acid strand comprising a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, and the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid
  • the chain has the following formula (I) or formula (II): (Wherein, R represents a hydrogen atom or a methyl group.)
  • the double-stranded nucleic acid complex comprising at least one crosslinked non-natural nucleoside represented by (2)
  • the first nucleic acid strand is [1] a central region comprising at least 4 consecutive deoxyribonucleosides; [2] a 5' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 5' end of the central region; and [3] a 3' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 3' end of the central region.
  • the double-stranded nucleic acid complex according to (2) comprising a wing region.
  • said second nucleic acid strand comprises at least 4 contiguous ribonucleosides complementary to at least 4 contiguous deoxyribonucleosides in said central region of said first nucleic acid strand, (3) or (4) ).
  • the region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or the 3' wing region of the first nucleic acid strand is represented by the formula (I) or formula (II).
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand are 2'-O-methyl modified nucleosides, 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides, and 2'-O-[2-(N-methyl
  • a pharmaceutical composition comprising the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (1) to (14) as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to (15) or (16) which is administered intracerebroventricularly or intrathecally.
  • a double-stranded nucleic acid complex with reduced toxicity is provided without impairing efficacy.
  • FIG. 1 shows the structures of various crosslinked nucleic acids.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structures of various natural or non-natural nucleotides.
  • 3 is a schematic diagram of the structure of the nucleic acid used in Example 1.
  • FIG. 3A shows the structure of ASO (LNA) containing 3 LNA nucleosides at the 5′ and 3′ ends and 10 DNA nucleosides between them.
  • FIG. 3B shows the structure of HDO (LNA) comprising ASO (LNA) as the first nucleic acid strand and RNA having a sequence complementary to the first nucleic acid strand as the second nucleic acid strand.
  • LNA ASO
  • LNA HDO
  • FIG. 3C shows the structure of ASO (scpBNA) containing 3 scpBNA nucleosides at each of the 5' and 3' ends and 10 DNA nucleosides between them.
  • FIG. 3D shows the structure of HDO (scpBNA) comprising ASO (scpBNA) as the first nucleic acid strand and RNA having a sequence complementary to the first nucleic acid strand as the second nucleic acid strand.
  • FIG. 4 shows Mapt mRNA expression levels in the hippocampus of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 5 shows the expression levels of TNF ⁇ mRNA and GFAP mRNA in the hippocampus of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • FIG. 5A shows the expression level of TNF ⁇ mRNA.
  • FIG. 5B shows the expression level of GFAP mRNA. Error bars indicate standard error.
  • 6 is a schematic diagram of the structure of the nucleic acid used in Example 2.
  • FIG. Figure 6A shows the structure of Toc-HDO (LNA).
  • Figure 6B shows the structure of Toc-HDO (scpBNA).
  • Figure 6C shows the structure of Toc-HDO (AmNA). Toc indicates tocopherol.
  • FIG. 1 shows the expression levels of TNF ⁇ mRNA and GFAP mRNA in the hippocampus of mice to which various nucleic acid agents were intracerebroventricularly administered.
  • FIG. 5A shows the expression level of TNF ⁇ mRNA.
  • FIG. 5B shows the expression level
  • FIG. 7 shows the expression level of malat1 mRNA in mice to which a single dose of the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered.
  • FIG. 7A shows the expression level of malat1 mRNA in the liver.
  • FIG. 7B shows the expression level of malat1 mRNA in kidney. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 8 shows the expression level of malat1 mRNA in mice to which a single dose of the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered.
  • FIG. 8A shows the expression level of malat1 mRNA in quadriceps muscle.
  • FIG. 8B shows the expression level of malat1 mRNA in myocardium. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 8A shows the expression level of malat1 mRNA in quadriceps muscle.
  • FIG. 8B shows the expression level of malat1 mRNA in myocardium. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 8A shows the expression level of
  • FIG. 9 shows the results of serum analysis and body weight measurement in mice to which a single dose of a double-stranded nucleic acid complex agent targeting malat1 was intravenously administered.
  • FIG. 9A shows the measurement results of AST and ALT in serum.
  • FIG. 9B shows the body weight measurement results. Error bars indicate standard error.
  • 10 is a schematic diagram of the structure of the nucleic acids used in Examples 3 and 4.
  • FIG. 10A shows the structure of Toc-HDO (LNA).
  • Figure 10B shows the structure of Toc-HDO (scpBNA).
  • Figure 10C shows the structure of Toc-HDO (AmNA). Toc indicates tocopherol.
  • FIG. 10A shows the structure of Toc-HDO (LNA).
  • Figure 10B shows the structure of Toc-HDO (scpBNA).
  • Figure 10C shows the structure of Toc-HDO (AmNA).
  • Toc indicates tocopherol.
  • FIG. 10A shows the structure of Toc
  • FIG. 11 shows the expression level of PTEN mRNA in mice to which the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered once.
  • FIG. 11A shows the expression level of PTEN mRNA in the liver.
  • FIG. 11B shows the expression level of PTEN mRNA in kidney. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 12 shows the expression levels of PTEN mRNA in mice to which a single dose of the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered.
  • FIG. 12A shows the expression level of PTEN mRNA in quadriceps muscle.
  • FIG. 12B shows the expression level of PTEN mRNA in myocardium. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 12 shows the expression levels of PTEN mRNA in mice to which the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered once.
  • FIG. 11A shows the expression level of PTEN mRNA in the liver.
  • FIG. 11B shows the expression level of PTEN mRNA in kidney
  • FIG. 13 shows the results of serum analysis and body weight measurement in mice that received a single intravenous administration of a double-stranded nucleic acid complex agent targeting PTEN.
  • FIG. 13A shows the results of measuring AST and ALT in serum.
  • FIG. 13B shows changes in body weight before and after administration of the double-stranded nucleic acid complex agent. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 14 shows the expression level of SR-B1 mRNA in mice to which the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered once.
  • FIG. 14A shows the expression level of SR-B1 mRNA in liver.
  • FIG. 14B shows the expression level of SR-B1 mRNA in kidney. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 14A shows the expression level of SR-B1 mRNA in liver.
  • FIG. 14B shows the expression level of SR-B1 mRNA in kidney. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 14A shows the expression level of
  • FIG. 15 shows the expression level of SR-B1 mRNA in mice to which a double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered once.
  • FIG. 15A shows the expression level of SR-B1 mRNA in quadriceps muscle.
  • FIG. 15B shows the expression level of SR-B1 mRNA in myocardium. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 16 shows the results of serum analysis and body weight measurement in mice that received a single intravenous administration of a double-stranded nucleic acid complex agent targeting SR-B1.
  • FIG. 16A shows the measurement results of AST and ALT in serum.
  • FIG. 16B shows changes in body weight before and after administration of the double-stranded nucleic acid complex agent. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 17 is a schematic diagram of the structure of the nucleic acid used in Example 5.
  • FIG. Figure 17A shows the structure of Chol-HDO (LNA).
  • Figure 17B shows the structure of Chol-HDO (scpBNA). Chol indicates cholesterol.
  • FIG. 18 shows the expression level of SR-B1 mRNA in mice to which double-stranded nucleic acid complex agents were intravenously administered multiple times.
  • Figure 18A shows SR-B1 mRNA in Cortex, Cerebellum, Striatum, Hippocampus, Brain stem, Cervical SC, and Lumbar SC.
  • FIG. 19 shows the measurement results of serum AST and ALT in mice to which double-stranded nucleic acid complex agents were intravenously administered multiple times.
  • LNA Chol-HDO
  • FIG. 20 shows the measurement results of TNF ⁇ in the blood of mice to which the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered once.
  • FIG. 20A shows results for Toc-HDO (PTEN) and Toc-HDO (Malat1).
  • FIG. 20B shows the results for Toc-HDO (SR-B1).
  • FIG. 21 shows the measurement results of IP-10 in the blood of mice to which a double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered once.
  • FIG. 21A shows results for Toc-HDO (PTEN) and Toc-HDO (Malat1).
  • Figure 21B shows the results for Toc-HDO (SR-B1).
  • FIG. 22 shows the measurement results of RANTES in the blood of mice to which a double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously administered once.
  • FIG. 22A shows results for Toc-HDO (PTEN) and Toc-HDO (Malat1).
  • Figure 22B shows the results for Toc-HDO (SR-B1).
  • Double-stranded nucleic acid complex 1-1 A first aspect of the present invention is a double-stranded nucleic acid complex.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention comprises a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand, the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand comprising at least one scpBNA or AmNA.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention has reduced toxicity such as hepatotoxicity, and reduced induction of inflammation or gliosis, or abnormal elevation of cytokines or chemokines.
  • a "transcript" of a target gene refers to any RNA that is directly targeted by the nucleic acid complex of the present invention and synthesized by RNA polymerase. Specifically, mRNA transcribed from target genes (including mature mRNA, pre-mRNA, and mRNA that has not undergone base modification), non-coding RNA such as miRNA (non-coding RNA, ncRNA), long non-coding RNA RNA (lncRNA), which may include natural antisense RNA.
  • target genes including mature mRNA, pre-mRNA, and mRNA that has not undergone base modification
  • non-coding RNA such as miRNA (non-coding RNA, ncRNA), long non-coding RNA RNA (lncRNA), which may include natural antisense RNA.
  • Target gene whose expression is regulated (eg, suppressed, altered, or modified) by the antisense effect is not particularly limited, but includes, for example, genes whose expression is increased in various diseases.
  • Target gene transcripts include, for example, SR-B1 mRNA, which is the transcript of the SR-B1 gene, Malat1 non-coding RNA, which is the transcript of the Malat1 gene, and DMPK mRNA, which is the transcript of the DMPK gene.
  • a “target transcript” is, for example, scavenger receptor B1 (often referred to herein as “SR-B1”), myotonic dystrophy protein kinase (often referred to herein as “DMPK”), transthyretin (often referred to herein as “TTR”), Apolipoprotein B (often referred to herein as “ApoB”), metastasis-associated lung It may also be the gene for adenocarcinoma transcript 1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1; often referred to herein as "Malat1”), such as their non-coding RNA or mRNA.
  • SR-B1 scavenger receptor B1
  • DMPK myotonic dystrophy protein kinase
  • TTR transthyretin
  • Apolipoprotein B often referred to herein as "ApoB”
  • metastasis-associated lung It may also be the gene for aden
  • SEQ ID NO: 19 shows the base sequence of mouse Malat1 non-coding RNA
  • SEQ ID NO: 20 shows the base sequence of human Malat1 non-coding RNA
  • SEQ ID NO: 21 shows the base sequence of mouse SR-B1 mRNA
  • SEQ ID NO: 22 shows the base sequence of human SR-B1 mRNA
  • SEQ ID NO: 23 shows the nucleotide sequence of mouse DMPK mRNA
  • SEQ ID NO: 24 shows the nucleotide sequence of human DMPK mRNA.
  • the base sequence of mRNA is replaced with the base sequence of DNA.
  • the base sequence information of these genes and transcripts can be obtained from known databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information) databases (eg, GenBank, Trace Archive, Sequence Read Archive, BioSample, BioProject).
  • antisense oligonucleotides or “antisense nucleic acids” are capable of hybridizing (i.e., complementary a) refers to a single-stranded oligonucleotide containing a base sequence and capable of producing an antisense effect on a target transcript.
  • the first nucleic acid strand functions as an ASO, and its target region is 3'UTR, 5'UTR, exon, intron, coding region, translation initiation region, translation termination region, or Any other nucleic acid region may be included.
  • the target region of the target transcript is at least 8 bases long, e.g. It can be 16-22 bases long, or 16-20 bases long.
  • Antisense effect refers to the effect of regulating the expression or editing of a target transcript (eg, RNA sense strand) by hybridizing the ASO to the target transcript.
  • “Modulating the expression or editing of a target transcript” refers to the expression of a target gene or the expression level of a target transcript (herein, “target transcript expression level” is often referred to as “target transcript level”). expression), inhibition of translation, RNA editing, splicing function modification effects (eg, splicing switch, exon inclusion, exon skipping, etc.), or degradation of transcripts.
  • RNA oligonucleotide when introduced into a cell as an ASO, the ASO forms a partial duplex by annealing with mRNA, the transcript of the target gene. This partial double strand serves as a cover to prevent translation by the ribosome, thereby inhibiting the expression of the target protein encoded by the target gene at the translational level (steric blocking).
  • oligonucleotides containing DNA as ASO are introduced into cells, partial DNA-RNA heteroduplexes are formed. Recognition of this heteroduplex structure by RNase H results in degradation of target gene mRNA and inhibition of expression of the protein encoded by the target gene at the expression level.
  • antisense effects can also be produced by targeting introns in pre-mRNAs.
  • antisense effects can also be produced by targeting miRNAs.
  • the functional inhibition of the miRNA can increase the expression of genes whose expression is normally controlled by the miRNA.
  • modulating expression of the target transcript may be reduction in target transcript abundance.
  • the antisense effect is measured, for example, by administering a test nucleic acid compound to a subject (eg, a mouse), and, for example, several days later (eg, 2 to 7 days later), the expression is regulated by the antisense effect provided by the test nucleic acid compound. It can be carried out by measuring the expression level of the target gene or the level (amount) of the target transcript (for example, the amount of mRNA or RNA such as microRNA, the amount of cDNA, the amount of protein, etc.).
  • the measured target gene expression level or target transcript level is at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, or at least 40% compared to a negative control (e.g., vehicle administration) If so, it indicates that the test nucleic acid compound is capable of producing an antisense effect (eg, reduction in target transcript abundance).
  • a negative control e.g., vehicle administration
  • the number, type and position of non-natural nucleotides in the nucleic acid chain can affect the antisense effect provided by the nucleic acid complex.
  • the selection of modification may differ depending on the sequence of the target gene, etc., but a person skilled in the art should refer to the literature related to the antisense method (for example, WO 2007/143315, WO 2008/043753, and WO 2008/049085).
  • the preferred embodiment can be determined by reference.
  • the measured value thus obtained is not significantly lower than the measured value of the nucleic acid complex before modification (e.g., When the measured value obtained after modification is 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the measured value of the nucleic acid complex before modification), the relevant modification can be evaluated.
  • target gene translation product refers to any polypeptide or protein synthesized by translation of the target transcript or target gene transcript that is the direct target of the nucleic acid complex of the present invention. Say.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” as used herein may refer to a monomeric nucleotide or nucleoside, or may refer to an oligonucleotide composed of multiple monomers.
  • nucleic acid strand or simply “strand” means an oligonucleotide or polynucleotide. Nucleic acid strands can be produced full length or partial strands by chemical synthetic methods, for example, using automated synthesizers, or by enzymatic processes using polymerases, ligases, or restriction reactions. A nucleic acid strand may comprise naturally occurring and/or non-naturally occurring nucleotides.
  • Nucleoside generally refers to a molecule consisting of a combination of a base and a sugar.
  • the sugar moiety of a nucleoside is usually, but not limited to, composed of pentofuranosyl sugars, specific examples of which include ribose and deoxyribose.
  • the base portion (nucleobase) of a nucleoside is usually a heterocyclic base portion. Non-limiting examples include adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil, as well as other modified nucleobases (modified bases).
  • Nucleotide refers to a molecule in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the nucleoside. Nucleotides containing a pentofuranosyl sugar typically have a phosphate group attached to the hydroxyl group at the 2', 3', or 5' position of the sugar.
  • Oligonucleotide refers to a linear oligomer formed by covalently linking several to several tens of hydroxyl groups and phosphate groups of sugar moieties between adjacent nucleotides.
  • polynucleotide refers to a linear polymer formed by linking several tens or more, preferably several hundred or more nucleotides by covalent bonds, which is larger than that of oligonucleotides.
  • phosphate groups are commonly considered to form internucleoside linkages.
  • Natural nucleoside refers to a nucleoside that exists in nature. Examples thereof include ribonucleosides composed of ribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or uracil, and deoxyribonucleosides composed of deoxyribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or thymine.
  • ribonucleosides found in RNA and deoxyribonucleosides found in DNA are often referred to as "DNA nucleosides" and "RNA nucleosides", respectively.
  • naturally occurring nucleotide refers to a naturally occurring nucleotide in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the natural nucleoside.
  • ribonucleotides known as structural units of RNA, in which a phosphate group is bound to a ribonucleoside
  • deoxyribonucleotides known as a structural unit of DNA, in which a phosphate group is bound to a deoxyribonucleoside.
  • non-natural nucleotide refers to any nucleotide other than natural nucleotides, including modified nucleotides and nucleotide mimetics.
  • modified nucleotide means a nucleotide having any one or more of modified sugar moieties, modified internucleoside linkages, and modified nucleobases.
  • nucleotide mimetics include structures that are used to replace nucleosides and linkages at one or more positions of an oligomeric compound.
  • Peptide Nucleic Acid is a nucleotide mimetic with a backbone of N-(2-aminoethyl)glycine instead of sugar linked by amide bonds.
  • Nucleic acid strands comprising unnatural oligonucleotides, as used herein, are often characterized by, for example, enhanced cellular uptake, enhanced affinity for nucleic acid targets, increased stability in the presence of nucleases, or increased inhibitory activity. has the desired properties of Therefore, it is preferred over natural nucleotides.
  • non-natural nucleoside refers to any nucleoside other than natural nucleosides. Examples include modified nucleosides and nucleoside mimetics. As used herein, “modified nucleoside” means a nucleoside having a modified sugar moiety and/or modified nucleobase.
  • mimetics refers to functional groups that replace sugars, nucleobases, and/or internucleoside linkages. In general, mimetics are used in place of the sugar or sugar-internucleoside linkage combination so that the nucleobase is maintained for hybridization to a target of choice.
  • nucleoside mimetic refers to substitution of a sugar at one or more positions of an oligomeric compound, substitution of a sugar and a base, or binding between monomer subunits constituting an oligomeric compound. Contains the structure used to replace.
  • oligomeric compound is meant a polymer of linked monomeric subunits capable of hybridizing to at least a region of a nucleic acid molecule.
  • Nucleoside mimetics include, for example, morpholino, cyclohexenyl, cyclohexyl, tetrahydropyranyl, bicyclic or tricyclic sugar mimetics, eg, nucleoside mimetics having non-furanose sugar units.
  • Modified sugar refers to a sugar that has a substitution and/or any change from the natural sugar moiety (i.e., sugar moieties found in DNA (2'-H) or RNA (2'-OH));
  • a “sugar modification” refers to a substitution and/or any change from a naturally occurring sugar moiety.
  • Nucleic acid strands may optionally contain one or more modified nucleosides, including modified sugars.
  • a “sugar modified nucleoside” refers to a nucleoside having a modified sugar moiety. Such sugar-modified nucleosides may confer enhanced nuclease stability, increased binding affinity, or some other beneficial biological property to nucleic acid chains.
  • nucleosides include chemically modified ribofuranose ring moieties.
  • chemically modified ribofuranose rings include, but are not limited to, addition of substituents (including 5' and 2' substituents), bridging of non-geminal ring atoms to form bicyclic nucleic acids (bridged nucleic acids, BNA ), S, N(R), or C(R1)(R2) of the ribosyl ring oxygen atom (R, R1 and R2 are each independently H, C1 - C12 alkyl, or a protecting group ), and combinations thereof.
  • sugar modified nucleosides include, but are not limited to, 5'-vinyl, 5'-methyl (R or S), 5'-allyl (R or S), 4'-S, 2'-F ( 2'-fluoro group), 2'- OCH3 (2'-OMe group or 2'-O-methyl group), 2'-O-[2-(N-methylcarbamoyl)ethyl] (2'-O- MCE group), and nucleosides containing 2'-O-methoxyethyl (2'-O- MOE or 2-O( CH2 ) 2OCH3 ) substituents.
  • a "2'-modified sugar” means a furanosyl sugar modified at the 2' position.
  • a nucleoside containing a 2'-modified sugar is sometimes referred to as a "2'-sugar modified nucleoside".
  • Bicyclic nucleoside refers to a modified nucleoside containing a bicyclic sugar moiety. Nucleic acids containing bicyclic sugar moieties are commonly referred to as bridged nucleic acid (BNA). Nucleosides containing a bicyclic sugar moiety are sometimes referred to as “bridged nucleosides,” “bridged non-natural nucleosides,” or “BNA nucleosides.” Some examples of crosslinked nucleic acids are shown in FIG.
  • a bicyclic sugar may be a sugar in which the 2' and 4' carbon atoms are bridged by two or more atoms. Examples of bicyclic sugars are known to those of skill in the art.
  • One subgroup of bicyclic sugar containing nucleic acids (BNA) or BNA nucleosides are 4'-( CH2 ) p -O-2', 4'-( CH2 ) p - CH2-2 ', 4 '-( CH2 ) p -S-2', 4'-( CH2 ) p -OCO-2', 4'-( CH2 ) n -N( R3 )-O-( CH2 ) m- 2' [wherein p, m and n represent an integer of 1 to 4, an integer of 0 to 2, and an integer of 1 to 3, respectively; and R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cyclo Represents an alkyl group, an aryl group,
  • R 1 and R 2 are typically is a hydrogen atom, which may be the same or different, and is also a hydroxyl group-protecting group for nucleic acid synthesis, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl a sulfonyl group, a silyl group, a phosphate group, a phosphate group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, or P(R 4 )R 5 [wherein R 4 and R 5 are a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a mercapto group, a mercapto group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, an amino group, 1
  • BNA nucleosides include methyleneoxy(4'- CH2 -O-2') BNA nucleosides (LNA nucleosides, also known as 2',4'-BNA nucleosides) (e.g., ⁇ -L-methyleneoxy(4'- CH2 -O-2')BNA nucleoside, ⁇ -D-methyleneoxy(4'-CH2 - O-2')BNA nucleoside), ethyleneoxy(4'-(CH 2 ) 2 -O-2')BNA nucleoside (ENA nucleosides), ⁇ -D-thio(4'- CH2 -S-2')BNA nucleosides, aminooxy(4'-CH2 - ON( R3 )-2')BNA nucleosides, Oxyamino (4'-CH2 - N( R3 )-O-2') BNA nucleosides (also known as 2',4'-BNA NC nucle
  • amine BNA nucleosides also known as 2'-Amino-LNA nucleosides
  • 2'-Amino-LNA nucleosides e.g., 3-(Bis(3-amino propyl)amino)propanoyl substituted nucleosides
  • 2'-O,4'-C-spirocyclopropylene bridged nucleosides also known as scpBNA nucleosides
  • other BNA nucleosides known to those skilled in the art.
  • a "cationic nucleoside” refers to, at a certain pH (e.g., human physiological pH (about 7.4), pH of a delivery site (e.g., organelle, cell, tissue, organ, organism, etc.)) A modified nucleoside that exists as a cationic form as compared to a neutral form (such as the neutral form of a ribonucleoside).
  • Cationic nucleosides may contain one or more cationic modifying groups at any position of the nucleoside.
  • the cationic nucleosides are 2'-Amino-LNA nucleosides (e.g.
  • Bicyclic nucleosides with a methyleneoxy (4'- CH2 -O-2') bridge are sometimes referred to as LNA nucleosides.
  • modified internucleoside linkage refers to an internucleoside linkage that has a substitution or any change from a naturally occurring internucleoside linkage (ie, a phosphodiester linkage).
  • Modified internucleoside linkages include internucleoside linkages containing a phosphorus atom and internucleoside linkages without a phosphorus atom.
  • Representative phosphorus-containing internucleoside linkages include phosphodiester linkages, phosphorothioate linkages, phosphorodithioate linkages, phosphotriester linkages (methylphosphotriester and ethylphosphotriester linkages described in US Pat. No.
  • alkyl Phosphonate linkages e.g., methylphosphonate linkages described in U.S. Pat. Nos. 5,264,423 and 5,286,717, methoxypropylphosphonate linkages described in WO 2015/168172
  • alkylthiophosphonate linkages e.g., methylthiophosphonate linkages, boranophosphate linkages, cyclic guanidine moieties
  • An internucleoside bond containing e.g., a substructure represented by the following formula (III):
  • an internucleoside linkage comprising a guanidine moiety substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups e.g., a tetramethylguanidine (TMG) moiety
  • TMG tetramethylguanidine
  • a phosphorothioate linkage refers to an internucleoside linkage in which a sulfur atom replaces the non-bridging oxygen atom of a phosphodiester linkage.
  • Methods for preparing phosphorus-containing and non-phosphorus-containing linkages are well known.
  • Modified internucleoside linkages are preferably linkages that are more resistant to nucleases than naturally occurring internucleoside linkages.
  • the internucleoside linkage When the internucleoside linkage has a chiral center, the internucleoside linkage may be chirally controlled. "Chirally controlled” is intended to exist in a single diastereomer about a chiral center, eg, a chiral bound phosphorus. Chirally controlled internucleoside linkages can be completely chirally pure or highly chiral pure, e.g. It may have a chiral purity of %de, 99.9% de, or higher.
  • chiral purity refers to the proportion of one diastereomer in a mixture of diastereomers, expressed as diastereomeric excess (% de), (diastereomer of interest minus other diastereomer defined as (stereomers)/(total diastereomers) ⁇ 100 (%).
  • internucleoside linkages may be phosphorothioate linkages chiral controlled to the Rp or Sp configuration, guanidine moieties substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups (e.g., tetramethylguanidine (TMG) moieties; e.g. Alexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811), including internucleoside linkages (e.g. substructures represented by formula (IV)), and /or an internucleoside linkage containing a cyclic guanidine moiety (eg, a substructure represented by formula (III)).
  • TMG tetramethylguanidine
  • nucleobase or “base” used herein is a base component (heterocyclic moiety) that constitutes a nucleic acid, and adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil are mainly known.
  • nucleobase or “base” includes both modified and unmodified nucleobases (bases) unless otherwise specified.
  • the purine base can be either modified or unmodified purine base.
  • the pyrimidine base may be a modified or unmodified pyrimidine base.
  • Modified nucleobase or “modified base” means any nucleobase other than adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil.
  • Unmodified nucleobases or “unmodified bases” (natural nucleobases) include the purine bases adenine (A) and guanine (G), and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C), and means uracil (U).
  • modified nucleobases include 5-methylcytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-iodocytosine or N4-methylcytosine; N6-methyladenine or 8-bromoadenine; 2-thio-thymine; Examples include, but are not limited to, N2-methylguanine or 8-bromoguanine.
  • the modified nucleobase is preferably 5-methylcytosine.
  • the term “complementary” means that the nucleobases can form so-called Watson-Crick base pairs (natural base pairs) or non-Watson-Crick base pairs (Hoogsteen bases) through hydrogen bonding. It means a relationship that can form an equality).
  • the antisense oligonucleotide region in the first nucleic acid strand does not necessarily have to be completely complementary to at least part of the target transcript (for example, the transcript of the target gene). Complementarity of at least 70%, preferably at least 80%, even more preferably at least 90% (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) is acceptable.
  • the antisense oligonucleotide region in the first nucleic acid strand is complementary in base sequence (typically when the base sequence is complementary to the base sequence of at least a portion of the target transcript), It can hybridize to a target transcript.
  • the region of complementarity in the second nucleic acid strand need not necessarily be completely complementary to at least a portion of the first nucleic acid strand, but has a base sequence of at least 70%, preferably at least 80%, and even More preferably, at least 90% (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) complementarity is acceptable.
  • the complementary regions in the second nucleic acid strand can anneal when they are complementary in base sequence to at least a portion of the first nucleic acid strand.
  • Complementarity of base sequences can be determined by using the BLAST program or the like.
  • a person skilled in the art can easily determine the conditions (temperature, salt concentration, etc.) under which two strands can anneal or hybridize, taking into consideration the degree of complementarity between the strands.
  • a person skilled in the art can easily design an antisense nucleic acid complementary to the target transcript, for example, based on information on the base sequence of the target gene.
  • Hybridization conditions may be various stringent conditions such as low stringent conditions and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions may be relatively low temperature and high salt conditions, eg, 30° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • Highly stringent conditions may be relatively high temperature and low salt conditions, eg, 65° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • Hybridization stringency can be adjusted by varying conditions such as temperature and salt concentration.
  • 1 ⁇ SSC contains 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
  • the term "subject” refers to a subject to which the double-stranded nucleic acid complex or pharmaceutical composition of the present invention is applied.
  • Subjects include organs, tissues, and cells as well as individuals.
  • any animal including humans can be applicable.
  • various livestock, poultry, pets, experimental animals, and the like can be mentioned.
  • a subject may be an individual in need of decreased expression of a target transcript or an individual in need of treatment or prevention of a disease.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention comprises a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand. Specific configurations of each nucleic acid strand are shown below.
  • the first nucleic acid strand can hybridize to at least a portion of the target gene or its transcript and has an antisense effect on the target gene or its transcript.
  • the second nucleic acid strand comprises a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, and the first nucleic acid strand and/or said second nucleic acid strand has the following formula (I) or formula (II): (Wherein, R represents a hydrogen atom or a methyl group.) contains at least one crosslinked non-natural nucleoside represented by
  • the crosslinked non-natural nucleoside represented by formula (I) above is a 2'-O,4'-C-spirocyclopropylene crosslinked nucleic acid, and is mainly referred to as "scpBNA" in this specification.
  • R may be either a hydrogen atom or a methyl group.
  • R may be either a hydrogen atom or a methyl group.
  • a methyl group can also be written as AmNA[N-Me].
  • the number of crosslinked non-natural nucleosides represented by the above formula (I) or (II) contained in the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand constituting the double-stranded nucleic acid complex is at least one. Yes, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, 30 or less, 25 , 20 or less, 15 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less good too.
  • the number of crosslinked non-natural nucleosides represented by formula (I) or formula (II) may be 1-10, preferably 1-6. For example, it may be 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand that constitutes the double-stranded nucleic acid complex of the present invention has the formula (I ), may include only those represented by formula (II), or may include both of formulas (I) and (II).
  • crosslinked non-natural nucleosides represented by formulas (I) and (II) above may be contained only in the first nucleic acid strand, may be contained only in the second nucleic acid strand, or may be contained only in the second nucleic acid strand. It may be contained in both the nucleic acid strand and the second nucleic acid strand.
  • the base lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are not particularly limited, but are at least 8 bases long, at least 9 bases long, at least 10 bases long, at least 11 bases long, at least 12 bases long, at least 13 bases long, at least It may be 14 bases long, or at least 15 bases long.
  • the base lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are 35 base lengths or less, 30 base lengths or less, 25 base lengths or less, 24 base lengths or less, 23 base lengths or less, 22 base lengths or less, and 21 base lengths or less. , 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, or 16 bases or less.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may have the same length or different lengths (eg, one may be 1 to 3 bases shorter or longer).
  • the double-stranded structure formed by the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may contain a bulge.
  • the choice of length can be determined by the balance between the strength of the antisense effect and the specificity of the nucleic acid strand for its target, among other factors such as cost, synthetic yield, and the like.
  • the first nucleic acid strand can contain at least 4, at least 5, at least 6, or at least 7 contiguous nucleosides that are recognized by RNase H when hybridized to the target transcript. Generally, any region containing consecutive nucleosides of 4 to 20 bases, 5 to 16 bases, or 6 to 12 bases may be used. As a nucleoside recognized by RNase H, for example, natural deoxyribonucleoside can be used. Suitable nucleosides containing modified deoxyribonucleosides and other bases are well known in the art. It is also known that nucleosides having a hydroxy group at the 2'-position, such as ribonucleosides, are unsuitable as the nucleosides.
  • the suitability of nucleosides for use in this region containing "at least 4 contiguous nucleosides" can readily be determined.
  • the first nucleic acid strand may comprise at least 4 contiguous deoxyribonucleosides.
  • the nucleosides of the first nucleic acid strand comprise or consist of deoxyribonucleosides, e.g., 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more of the nucleosides of the first nucleic acid strand are deoxyribonucleosides. be.
  • the first nucleic acid strand may be a gapmer.
  • the term "gapmer” basically refers to a central region (DNA gap region) and wing regions located directly at its 5' and 3' ends (5' wing region and 3' wing region, respectively). It refers to a single-stranded nucleic acid consisting of The length of the DNA gap region is 13 to 22 bases, 16 to 22 bases, or 16 to 20 bases, or 4 to 20 bases, 5 to 18 bases, 6 to 16 bases, or 7 to 14 bases. long, or 8-12 bases long.
  • the central region in the gapmer contains at least 4 contiguous deoxyribonucleosides and the wing regions contain at least one non-natural nucleoside.
  • non-natural nucleosides contained in the wing regions usually have higher binding strength to RNA than natural nucleosides and have high resistance to nucleolytic enzymes (nucleases and the like).
  • the non-naturally occurring nucleosides making up the wing regions comprise or consist of bridging nucleosides
  • said gapmers are specifically referred to as "BNA/DNA gapmers”.
  • the number of bridging nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region is at least 1, and may be, for example, 2 or 3.
  • the bridging nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region may be present continuously or non-contiguously within the 5' wing region and the 3' wing region.
  • Bridging nucleosides can further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • modified nucleobases eg, 5-methylcytosine
  • the bridging nucleosides are LNA nucleosides
  • said gapmers are referred to as "LNA/DNA gapmers”.
  • the non-natural nucleosides making up the 5' and 3' wing regions comprise or consist of peptide nucleic acids
  • said gapmers are specifically referred to as "peptide nucleic acid gapmers”.
  • the unnatural nucleosides making up the 5' and 3' wing regions comprise or consist of morpholino nucleic acids
  • said gapmers are specifically referred to as "morpholino nucleic acid gapmers”.
  • the base lengths of the 5' wing region and the 3' wing region may each independently be at least 2 bases long, for example, 2 to 10 bases long, 2 to 7 bases long, or 3 to 5 bases long.
  • the 5′ wing region and/or the 3′ wing region may contain at least one non-natural nucleoside, and may further contain natural nucleosides.
  • the 5' and 3' wing regions may be, for example, non-natural nucleosides linked by modified internucleoside linkages such as phosphorothioate linkages, eg 2'-O-methyl modified nucleosides.
  • the first nucleic acid strand constituting the gapmer is, in order from the 5′ end, a bridging nucleoside of 2 to 7 bases or 3 to 5 bases (for example, 2 or 3 bases), 4 to 15 bases or 8 to 12 bases. It may be composed of ribonucleosides or deoxyribonucleosides having a base length (eg, 8 or 10 base lengths) and bridging nucleosides having a length of 2 to 7 bases or 3 to 5 bases (eg, 2 or 3 base lengths).
  • a nucleic acid strand having a wing region only on either the 5'-end side or the 3'-end side is called a "hemigapmer" in the art. shall be included.
  • the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand may contain a crosslinked non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above.
  • the number of bridged non-natural nucleosides represented by the above formula (I) or formula (II) contained in each region of the 5' wing region or 3' wing region may be at least 1, for example 2.
  • the number may be greater than or equal to 3, or may be 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less. For example, it may be 1, 2, 3, or 4.
  • the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand may consist of a crosslinked non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above. .
  • the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand comprises a bridged non-natural nucleoside and an LNA nucleoside represented by formula (I) or (II) above.
  • the first nucleic acid strand may be a mixmer.
  • the term "mixmer” refers to a nucleic acid chain that contains alternating natural and unnatural nucleosides of periodic or random segment length and is free of four or more contiguous deoxyribonucleosides and ribonucleosides. .
  • Mixmers in which the unnatural nucleoside is a bridged nucleoside and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "BNA/DNA mixmers".
  • the bridged nucleoside may be a bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above.
  • Mixmers in which the non-natural nucleoside is a peptide nucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "peptide nucleic acid/DNA mixmers".
  • Mixmers in which the unnatural nucleoside is a morpholinonucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "morpholinonucleic acid/DNA mixmers”.
  • Mixmers are not limited to containing only two nucleosides.
  • Mixmers can include any number of types of nucleosides, whether natural or modified nucleosides or nucleoside mimetics.
  • bridging nucleoside e.g., LNA nucleoside or a bridging non-natural nucleoside represented by formula (I) or (II) above.
  • Bridging nucleosides may further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • All nucleosides of the second nucleic acid strand may be composed of ribonucleosides and/or modified nucleosides.
  • all nucleosides of the second nucleic acid strand may consist of ribonucleosides.
  • All nucleosides of the second nucleic acid strand may be composed of deoxyribonucleosides and/or modified nucleosides, or may be free of ribonucleosides.
  • the second nucleic acid strand comprises at least 4 contiguous ribonucleosides complementary to the at least 4 contiguous nucleosides (e.g., deoxyribonucleosides) in the central region of the first nucleic acid strand. good too. This is so that the second nucleic acid strand forms a partial DNA-RNA heteroduplex with the first nucleic acid strand and is recognized and cleaved by RNaseH. At least four consecutive ribonucleosides in the second nucleic acid strand are preferably linked by naturally occurring internucleoside linkages, ie phosphodiester linkages.
  • the second nucleic acid strand may further comprise at least 2 consecutive deoxyribonucleosides in addition to the at least 4 consecutive ribonucleosides described above.
  • the at least two contiguous deoxyribonucleosides are complementary to the first nucleic acid strand and may be included in a region complementary to the central region of the first nucleic acid strand.
  • the at least two consecutive deoxyribonucleosides may be positioned on either the 5' side or the 3' side of the at least four consecutive ribonucleosides, and may be positioned on both the 5' and 3' sides.
  • the at least two consecutive deoxyribonucleosides may be 2, 3, 4, 5, 6 or more consecutive deoxyribonucleosides.
  • Modified nucleosides may include modified sugars and/or modified nucleobases.
  • Modified sugars may be 2'-modified sugars (eg, sugars containing a 2'-O-methyl group).
  • a modified nucleobase can also be 5-methylcytosine.
  • the second nucleic acid strand is, in order from the 5' end, a modified nucleoside (e.g., a modified nucleoside containing a 2'-modified sugar) having a length of 2 to 7 bases or a length of 3 to 5 bases (for example, 2 or 3 bases), 4 to ribonucleosides or deoxyribonucleosides (optionally linked by modified internucleoside linkages) 15 bases long or 8-12 bases long (eg 8 or 10 bases long) and 2-7 bases long or 3-5 bases long ( (eg, 2 or 3 bases long) modified nucleosides (eg, modified nucleosides containing 2'-modified sugars).
  • the first nucleic acid strand may be a gapmer.
  • the second nucleic acid strand is represented by the above formula (I) or formula (II) in a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand It may also contain non-natural nucleosides in cross-linked form.
  • Number of bridged nucleosides other than the bridged non-natural nucleoside represented by the above formula (I) or (II), contained in the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand constituting the double-stranded nucleic acid complex is, but is not limited to, 0-50, 0-40, 0-30, 0-20, 0-15, 0-12, 0-10, 0-8, or 0- 6, preferably 0 to 5, for example 0, 1, 2, 3, 4 or 5.
  • a non-natural nucleoside other than the crosslinked non-natural nucleoside represented by the above formula (I) or (II), contained in the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand constituting the double-stranded nucleic acid complex The number of is not limited, but is, for example, 0 to 30, 0 to 20, 0 to 15, 0 to 12, 0 to 10, 0 to 8, or 0 to 6, preferably 0 There may be ⁇ 5, such as 0, 1, 2, 3, 4, or 5.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand constituting the double-stranded nucleic acid complex in addition to the crosslinked non-natural nucleoside represented by the above formula (I) or (II), It may contain at least one ribose 2'-modified nucleoside.
  • the ribose 2' modified nucleosides are 2'-O-methyl modified nucleosides (2'-O-Me-modified nucleosides), 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides (2'-O-MOE modified nucleosides), and at least one ribose 2'-modified nucleoside selected from the group consisting of 2'-O-[2-(N-methylcarbamoyl)ethyl] modified nucleosides (2'-O-MCE-modified nucleosides) good.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand that constitutes the double-stranded nucleic acid complex contains at least one crosslinked non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above. and at least one 2'-O-methyl modified nucleoside (2'-O-Me-modified nucleoside).
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand that constitutes the double-stranded nucleic acid complex contains at least one crosslinked non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above. and at least one 2'-O-methoxyethyl modified nucleoside (2'-O-MOE modified nucleoside).
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand that constitutes the double-stranded nucleic acid complex contains at least one crosslinked non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above. and at least one 2'-O-[2-(N-methylcarbamoyl)ethyl]-modified nucleoside (2'-O-MCE-modified nucleoside).
  • the 5' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and at least one
  • the 3' wing region of the first nucleic acid strand may contain a ribose 2'-modified nucleoside, and the 3' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and 5' may include at least one ribose 2'-modified nucleoside.
  • the 5' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and at least one
  • the 3' wing region of the first nucleic acid strand may contain a ribose 2'-modified nucleoside, and the 3' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and 5' may include at least one ribose 2'-modified nucleoside.
  • the 5' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and at least one
  • the 3' wing region of the first nucleic acid strand may comprise a ribose 2'-modified nucleoside, and the 3' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and 3' may include at least one ribose 2'-modified nucleoside.
  • the 5' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and at least one
  • the 3' wing region of the first nucleic acid strand may comprise a ribose 2'-modified nucleoside, and the 3' wing region of the first nucleic acid strand comprises at least one bridged non-natural nucleoside represented by formula (I) or formula (II) above, and 3' may include at least one ribose 2'-modified nucleoside.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand may contain nucleoside mimics or nucleotide mimics in whole or in part.
  • Nucleotide mimetics may be peptide nucleic acids and/or morpholino nucleic acids.
  • the internucleoside linkages in the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may be naturally occurring internucleoside linkages and/or modified internucleoside linkages. At least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the end (5′ end, 3′ end, or both ends) of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand are modified internucleoside linkages, but are not limited to A bond is preferred.
  • two internucleoside bonds from the end of a nucleic acid chain mean the internucleoside bond closest to the end of the nucleic acid chain and the internucleoside bond adjacent thereto and located on the opposite side of the end. Modified internucleoside linkages in terminal regions of nucleic acid strands are preferred because they can reduce or inhibit unwanted degradation of the nucleic acid strand.
  • all or part of the internucleoside linkages of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand may be modified internucleoside linkages.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 modified internucleoside linkages. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, It may contain 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 93%, at least 95%, at least 98%, or 100%.
  • the modified internucleoside linkage may be a phosphorothioate linkage.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 chirally controlled internucleoside linkages. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, It may contain 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50% chirally controlled internucleoside linkages. %, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have 1, 2, 3, 4 non-negatively charged internucleoside linkages (preferably neutral internucleoside linkages), 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 or more.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand each have at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50% non-negatively charged internucleoside linkages. , at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or more.
  • At least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the 5' end of the second nucleic acid strand may be modified internucleoside linkages. At least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the 3′ end of the second nucleic acid strand are replaced with modified internucleoside linkages, such as phosphorothioate linkages, 1-4 C 1-6 alkyl groups an internucleoside linkage (e.g., partial structure represented by formula (IV)) containing a guanidine moiety (e.g., TMG moiety) and/or an internucleoside linkage (e.g., a cyclic guanidine moiety) (e.g., represented by formula (III) may be a partial structure). Modified internucleoside linkages may be chirally controlled to the Rp or Sp configuration.
  • At least one (eg, three) internucleoside linkage from the 3' end of the second nucleic acid strand may be a modified internucleoside linkage such as a highly RNase-resistant phosphorothioate linkage.
  • the double-stranded nucleic acid complex has an improved gene suppressing activity, which is preferable.
  • the modified internucleoside linkages of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand are controlled at a pH (e.g., human physiological pH (about 7.4), a delivery site (e.g., an organelle, cell, tissue, organ).
  • a pH e.g., human physiological pH (about 7.4)
  • a delivery site e.g., an organelle, cell, tissue, organ.
  • the modified internucleoside linkage is in an anionic form (e.g., -OP(O)(O - )-O- (anionic form of natural phosphate linkage), -OP(O) (S ⁇ )—O— (anionic form of phosphorothioate linkages, etc.)), including non-negatively charged (neutral or cationic, respectively) internucleoside linkages that exist as neutral or cationic forms.
  • the modified internucleoside linkages of the first and/or second nucleic acid strand comprise neutral internucleoside linkages.
  • the modified internucleoside linkages of the first and/or second nucleic acid strand comprise cationic internucleoside linkages.
  • a non-negatively charged internucleoside linkage e.g., a neutral internucleoside linkage
  • the non-negatively charged internucleoside linkage is, for example, a methylphosphonate linkage as described in U.S. Patent Nos.
  • the non-negatively charged internucleoside linkage comprises a triazole or alkyne moiety.
  • the non-negatively charged internucleoside linkage comprises a cyclic guanidine moiety and/or a guanidine moiety (preferably a TMG moiety) substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups.
  • a modified internucleoside linkage comprising a cyclic guanidine moiety has a substructure represented by Formula (III).
  • the guanidine moiety substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups has a substructure represented by Formula (IV).
  • neutral internucleoside linkages comprising cyclic guanidine moieties and/or guanidine moieties substituted with 1-4 C 1-6 alkyl groups are chirally controlled.
  • the disclosure relates to a composition
  • a composition comprising an oligonucleotide comprising at least one neutral internucleoside linkage and at least one phosphorothioate internucleoside linkage.
  • neutral internucleotide linkages have properties compared to equivalent nucleic acids that do not contain neutral internucleotide linkages. and/or improve activity, e.g., improve delivery, improve resistance to exonucleases and endonucleases, improve cellular uptake, improve endosomal escape, and/or improve nuclear uptake, etc. do.
  • the second nucleic acid strand may be lipid-bound.
  • Lipids include tocopherol, cholesterol, fatty acids, phospholipids and their analogs; folic acid, vitamin C, vitamin B1, vitamin B2; estradiol, androstane and their analogs; steroids and their analogs; LDLR, SRBI or LRP1 /2 ligands; FK-506, and cyclosporin; lipids described in PCT/JP2019/12077, PCT/JP2019/10392 and PCT/JP2020/035117, but are not limited thereto.
  • tocopherol is a methylated derivative of tocorol, a fat-soluble vitamin (vitamin E) with a cyclic structure called chroman. Tocorol has a strong antioxidant action, and therefore, in vivo, as an antioxidant substance, it has the function of quenching free radicals generated by metabolism and protecting cells from injury.
  • tocopherol Several different forms of tocopherol are known, consisting of ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, and ⁇ -tocopherol, based on the position of the methyl group that binds to the chroman.
  • a tocopherol herein can be any tocopherol.
  • Analogues of tocopherol include various unsaturated analogues of tocopherol, such as ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol and ⁇ -tocotrienol.
  • the tocopherol is ⁇ -tocopherol.
  • cholesterol is a type of sterol, also known as steroidal alcohol, and is particularly abundant in animals. Cholesterol plays an important role in metabolic processes in vivo, and in animal cells, it is also a major constituent of the cell membrane system together with phospholipids. Analogs of cholesterol also refer to various cholesterol metabolites and analogs, which are alcohols having a sterol backbone, including, but not limited to, cholestanol, lanosterol, cerebrosterol, dehydrocholesterol, and coprostanol. etc.
  • analog refers to compounds having the same or similar basic skeleton and having similar structures and properties. Analogs include, for example, biosynthetic intermediates, metabolites, compounds with substituents, and the like. A person skilled in the art can determine whether a compound is an analog of another compound based on common general technical knowledge.
  • Cholesterol analogs refer to various cholesterol metabolites and analogs, etc., which are alcohols with a sterol backbone, including, but not limited to, cholestanol, lanosterol, cerebrosterol, dehydrocholesterol, and coprostanol. include.
  • the second nucleic acid strand may be conjugated with tocopherol or cholesterol or analogues thereof.
  • the second nucleic acid strand bound to cholesterol or its analogue may have a group represented by general formula (V) below.
  • R c represents an optionally substituted alkylene group having 4 to 18 carbon atoms, preferably 5 to 16 carbon atoms (wherein the substituent is a halogen atom or a hydroxy an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms which may be substituted with a group such as a hydroxymethyl group, and non-adjacent carbon atoms of the alkylene group may be substituted with oxygen atoms).
  • R c represents an optionally substituted alkylene group having 4 to 18 carbon atoms, preferably 5 to 16 carbon atoms (wherein the substituent is a halogen atom or a hydroxy an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms which may be substituted with a group such as a hydroxymethyl group, and non-
  • Rc is, but is not limited to, -( CH2 ) 3 -O-( CH2 ) 2 -O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- , -( CH2 ) 3 -O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O- CH2 -CH( CH2OH )- or -( CH2 ) 6- may be
  • the group represented by general formula (V) above can be bound to the 5' end or 3' end of the second nucleic acid strand via a phosphate ester bond.
  • a lipid such as cholesterol or an analogue thereof may be bound to either the 5' end, the 3' end, or both ends of the second nucleic acid strand.
  • the cholesterol or analogue lipid may also be attached to an internal nucleotide of the second nucleic acid strand.
  • Cholesterol or analogs thereof attached to the 5' end of the second nucleic acid strand are particularly preferred, but are not limited thereto.
  • the second nucleic acid strand contains multiple cholesterols or analogues thereof, they may be the same or different. For example, this applies to the case where the second nucleic acid strand has one cholesterol bound to the 5′ end and one other cholesterol analogue bound to the 3′ end. With respect to the binding position, the cholesterol or analogue thereof may be bound at multiple positions and/or at one position as a group on the second nucleic acid strand. Cholesterol or analogs thereof may be linked to the 5' end and the 3' end of the second nucleic acid strand, respectively.
  • the binding between the second nucleic acid strand and the lipid may be direct binding or indirect binding mediated by another substance.
  • the second nucleic acid strand and the lipid When the second nucleic acid strand and the lipid are directly bound, they may be bound to the second nucleic acid strand via, for example, covalent bonds, ionic bonds, hydrogen bonds, or the like.
  • a covalent bond is preferred in view of the fact that a more stable bond can be obtained.
  • the second nucleic acid strand is not bound to a ligand.
  • ligand-free means that lipids such as tocopherol and cholesterol are not bound.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the invention is unliganded, ie neither the first nor the second nucleic acid strand is bound with a ligand.
  • linker When the second nucleic acid strand and cholesterol or analogs thereof are indirectly bonded, they may be bonded via a linking group (herein often referred to as "linker").
  • a linker can be either a cleavable linker or an uncleavable linker.
  • “Cleavable linker” means a linker that can be cleaved under physiological conditions, for example, intracellularly or in an animal body (eg, human body). Cleavable linkers are selectively cleaved by endogenous enzymes such as nucleases. Cleavable linkers include, but are not limited to, amides, esters, phosphodiester esters or both, phosphate esters, carbamates, and disulfide bonds, as well as natural DNA linkers. As an example, cholesterol or an analogue thereof may be linked via a disulfide bond.
  • Non-cleavable linker means a linker that is not cleaved under physiological conditions, such as within a cell or within an animal (eg, within a human body).
  • Non-cleavable linkers include, but are not limited to, phosphorothioate linkages, and linkers composed of modified or unmodified deoxyribonucleosides or modified or unmodified ribonucleosides linked by phosphorothioate linkages.
  • the linker is a nucleic acid such as DNA or an oligonucleotide
  • the chain length is not particularly limited, but usually it may be 2 to 20 bases, 3 to 10 bases, or 4 to 6 bases.
  • linker is a linker represented by formula (VI) below.
  • L2 is a substituted or unsubstituted C1 - C12 alkylene group (e.g. propylene, hexylene, dodecylene), a substituted or unsubstituted C3 - C8 cycloalkylene group (e.g.
  • L3 represents -NH- or a bond
  • L4 is a substituted or unsubstituted C1 - C 12 alkylene groups (e.g., ethylene, pentylene, heptylene, anddecylene), substituted or unsubstituted C3-8 cycloalkylene groups (e.g., cyclohexylene), -( CH2 ) 2- [O- ( CH2 ) 2 ] m- , or
  • the linker represented by formula (VI) is such that L 2 is an unsubstituted C 3 -C 6 alkylene group (eg, propylene, hexylene), —(CH 2 ) 2 —O—( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 3- or -( CH2 ) 2- O-(CH2) 2- O-( CH2 ) 2- O- (CH 2 ) 2 -O-( CH2 ) 3- , L3 is -NH-, and L4 and L5 are a bond.
  • C 3 -C 6 alkylene group eg, propylene, hexylene
  • L3 is -NH-
  • L4 and L5 are a bond.
  • linker is a linker represented by general formula (VII) below. [wherein, n represents 0 or 1; ]
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand may further contain at least one functional moiety bound to the polynucleotides constituting the nucleic acid strand.
  • a “functional portion” refers to a portion that imparts a desired function to a double-stranded nucleic acid complex and/or a nucleic acid strand to which the functional portion is bound. Desired functions include, for example, labeling functions, purification functions, and the like. Examples of moieties that provide a labeling function include compounds such as fluorescent proteins and luciferase.
  • moieties that impart a purification function include compounds such as biotin, avidin, His-tag peptides, GST-tag peptides and FLAG-tag peptides.
  • a functional moiety is added to the second nucleic acid strand.
  • a molecule having an activity of delivering a double-stranded nucleic acid complex in certain embodiments to a target site is bound.
  • moieties that provide targeted delivery functions include lipids, antibodies, aptamers, ligands for specific receptors, and the like.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand (preferably the second nucleic acid strand) is associated with a functional moiety.
  • the binding between the second nucleic acid strand and the functional moiety may be direct binding or indirect binding via another substance. It is preferable that the second nucleic acid strand and the functional moiety are directly bonded by, for example, a hydrogen bond, and a covalent bond is more preferable from the viewpoint of obtaining a more stable bond.
  • the second nucleic acid strand may further comprise at least one overhang region located on one or both of the 5' and 3' ends of the complementary region.
  • An example of this embodiment is described in WO2018/062510.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may be linked via a linker.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand can be linked via a linker to form a single strand.
  • the functional region has the same configuration as that of the double-stranded nucleic acid complex even in that case, such a single-stranded nucleic acid is also included in the present specification as an embodiment of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention. do.
  • a linker can be any polymer. Examples include polynucleotides, polypeptides, alkylenes, and the like.
  • the linker can be composed of, for example, natural nucleotides such as DNA and RNA, or non-natural nucleotides such as peptide nucleic acids and morpholino nucleic acids.
  • the linker may have a chain length of at least 1 base, such as 3-10 bases or 4-6 bases. A chain length of 4 bases is preferred.
  • the position of the linker can be either on the 5' side or the 3' side of the first nucleic acid strand. , the 5′ end of the first nucleic acid strand and the 3′ end of the second nucleic acid strand are linked via the linker.
  • Linkers may be either cleavable or non-cleavable.
  • the antisense effect of the first nucleic acid strand on the target transcript can be measured by a method known in the art. For example, after introducing a double-stranded nucleic acid complex into a cell or the like, measurement may be performed using a known technique such as Northern blotting, quantitative PCR, or Western blotting. By measuring the expression level of the target gene or the level of the target transcript (for example, the amount of mRNA or RNA such as microRNA, the amount of cDNA, the amount of protein, etc.), the expression of the target gene is suppressed by the double-stranded nucleic acid complex.
  • Criteria for the determination include, but are not limited to, the target gene expression level or target transcript measured by at least 5%, at least 10%, or at least 15% compared to the measured value of a negative control (e.g. vehicle administration). %, at least 20%, at least 25%, at least 30%, or at least 40%, it may be determined that the double-stranded nucleic acid complex of the present invention has an antisense effect.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention is not limited to the above exemplary embodiments.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention can be produced by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method. Although not limited, it usually starts with designing and manufacturing each of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand that constitute the double-stranded nucleic acid complex.
  • the first nucleic acid strand is designed based on information on the nucleotide sequence of the target transcript (for example, the nucleotide sequence of the target gene), and the second nucleic acid strand is designed as its complementary strand.
  • each nucleic acid chain may be synthesized using, for example, a commercially available automatic nucleic acid synthesizer from GE Healthcare, Thermo Fisher Scientific, Beckman Coulter, and the like. Thereafter, the obtained oligonucleotide can be purified using a reversed-phase column or the like.
  • the first nucleic acid strand may be produced according to the above method.
  • the functional moiety-bound second nucleic acid strand can be produced by performing the above-described synthesis and purification using a nucleic acid species to which a functional moiety has been bound in advance.
  • a nucleic acid species with pre-bound cholesterol or an analog thereof may be used to produce a second nucleic acid strand by performing the synthesis and purification described above.
  • cholesterol or an analogue thereof may be bound to the second nucleic acid strand produced by carrying out the synthesis and purification described above by a known method.
  • the first and second nucleic acid strands are annealed to produce a double-stranded nucleic acid complex to which the desired functional moiety is bound.
  • the nucleic acids are mixed in a suitable buffer solution, denatured at about 90° C.-98° C. for several minutes (eg, 5 minutes), and then the nucleic acids are annealed at about 30° C.-70° C. for about 1-8 hours. to produce one of the double-stranded nucleic acid complexes of the present invention.
  • Methods for linking functional moieties to nucleic acids are well known in the art. Nucleic acid chains can also be obtained by ordering from various manufacturers (eg, Gene Design Co., Ltd.) specifying the nucleotide sequence, modification site and type.
  • the toxicity of the double-stranded nucleic acid complex can be reduced or eliminated without impairing the efficacy of the double-stranded nucleic acid complex. That is, compared with conventional double-stranded nucleic acid complexes, hepatotoxicity and nephrotoxicity are reduced without impairing the antisense effect on the target gene, and inflammation or gliosis is induced, or cytokines or chemokines are abnormally increased. is reduced.
  • a second aspect of the present invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the double-stranded nucleic acid complex of the first aspect as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has low hepatotoxicity and/or low nephrotoxicity. In addition, induction of inflammation or gliosis, or abnormal elevation of cytokines or chemokines is reduced.
  • Each component that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention is specifically described below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes at least the double-stranded nucleic acid complex according to the first aspect as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain two or more types of double-stranded nucleic acid complexes.
  • the amount (content) of the double-stranded nucleic acid complex contained in the pharmaceutical composition depends on the type of the double-stranded nucleic acid complex, the delivery site, the dosage form of the pharmaceutical composition, the dosage of the pharmaceutical composition, and the carrier described later. depends on the type of Therefore, it is sufficient to determine them as appropriate in consideration of each condition.
  • a single dose of the pharmaceutical composition is adjusted to include an effective amount of the double-stranded nucleic acid complex.
  • Effective amount means an amount necessary for the double-stranded nucleic acid complex to exhibit its function as an active ingredient, and an amount that imparts little or no harmful side effects to the living body to which it is applied. Say. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of administration, and frequency of administration. Ultimately, it is determined by the judgment of a doctor, veterinarian, pharmacist, or the like.
  • Subject information is various individual information of a living body to which the pharmaceutical composition is applied. For example, if the subject is a human, the information includes age, weight, sex, dietary habits, health condition, disease progression and severity, drug sensitivity, presence or absence of concomitant drugs, and the like.
  • Carrier A pharmaceutical composition of the present invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to additives commonly used in the field of formulation technology. For example, solvents, vegetable oils, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, pH adjusters, stabilizers, flavorants, fragrances, excipients, vehicles, preservatives, binders, diluents, Tonicity agents, soothing agents, bulking agents, disintegrating agents, buffering agents, coating agents, lubricants, coloring agents, sweetening agents, thickening agents, flavoring agents, solubilizing agents, and other additives.
  • the solvent may be, for example, water or other pharmaceutically acceptable aqueous solution, or a pharmaceutically acceptable organic solvent.
  • Aqueous solutions include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, phosphate buffers, and sodium acetate buffers.
  • auxiliary agents include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low-concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • the carrier is used to avoid or suppress in vivo degradation of the double-stranded nucleic acid complex, which is an active ingredient, by enzymes, etc., facilitate formulation and administration methods, and maintain the dosage form and efficacy. and can be used as needed.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is such that the active ingredient, the double-stranded nucleic acid complex according to the first aspect, is delivered to the target site without being inactivated by degradation or the like, and is effective in vivo.
  • the form can exhibit the pharmacological effect of the component (antisense effect on target gene expression).
  • Specific dosage forms differ depending on the administration method and/or prescription conditions. Since administration methods can be broadly classified into parenteral administration and oral administration, dosage forms suitable for each administration method may be used.
  • the preferred dosage form is a liquid formulation that can be administered directly to the target site or systemically administered via the circulatory system.
  • liquid formulations include injections. Injections are appropriately combined with the aforementioned excipients, elixirs, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, pH adjusters, etc., and mixed in a unit dosage form generally accepted for pharmaceutical practice. It can be formulated by Other formulations include ointments, plasters, cataplasms, transdermal formulations, lotions, inhalants, aerosols, eye drops, and suppositories.
  • preferred dosage forms may be solids or liquids, such as tablets, capsules, drops, lozenges, pills, granules, powders, powders, and liquids for internal use. , emulsions, syrups, pellets, sublingual agents, peptizers, buccal preparations, pastes, suspensions, elixirs, coatings, ointments, plasters, cataplasms, oral Skins, lotions, inhalants, aerosols, eye drops, injections, and suppositories.
  • a solid formulation it is optionally made into a dosage form with a coating known in the art, such as a sugar-coated tablet, a gelatin-coated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, and a multilayer tablet. be able to.
  • a coating known in the art, such as a sugar-coated tablet, a gelatin-coated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, and a multilayer tablet.
  • each dosage form described above are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art for each dosage form.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention it may be formulated according to a conventional method in the technical field.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention has excellent solubility in water, Japanese Pharmacopoeia Dissolution Test 2nd Fluid, or Japanese Pharmacopoeia Disintegration Test 2nd Fluid, drug half-life, brain penetration, metabolic stability, CYP inhibition) and low toxicity (e.g., acute toxicity, chronic toxicity, genotoxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, drug interaction, carcinogenicity, phototoxicity) It is superior as a drug in terms of, etc.) and has excellent properties as a drug, such as less side effects (for example, suppression of sedation and avoidance of lamellar necrosis).
  • Dosage Forms and Dosages There is no particular limitation herein on the preferred dosage form of the pharmaceutical composition.
  • oral administration or parenteral administration may be used.
  • Specific examples of parenteral administration include intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration (including continuous subcutaneous implanted administration), intradermal administration, tracheal/bronchial administration, rectal administration, and by blood transfusion.
  • the dosage or ingestion is, for example, 0.00001 mg/kg/day to 10000 mg/kg/day, or 0.001 mg/kg/day of the included double-stranded nucleic acid complex. It should be between 100mg/kg/day.
  • the pharmaceutical composition may be single-dose or multi-dose. In the case of multiple administrations, it can be administered daily or at appropriate time intervals (eg, at intervals of 1 day, 2 days, 3 days, 1 week, 2 weeks, 1 month), for example, 2 to 20 doses.
  • a single dose of the above double-stranded nucleic acid complex is, for example, 0.001 mg/kg or more, 0.005 mg/kg or more, 0.01 mg/kg or more, 0.25 mg/kg or more, 0.5 mg/kg or more, 1.0 mg /kg or more, 2.0mg/kg or more, 2.5mg/kg or more, 3.0mg/kg or more, 4.0mg/kg or more, 5mg/kg or more, 10mg/kg or more, 20mg/kg or more, 30mg/kg or more, 40mg/kg or more kg or more, 50 mg/kg or more, 75 mg/kg or more, 100 mg/kg or more, 150 mg/kg or more, 200 mg/kg or more, 300 mg/kg or more, 400 mg/kg or more, or 500 mg/kg or more, such as , any amount within the range of 0.001 mg/kg to 500 mg/kg (e.g., 0.001 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention may be administered at a dose of 0.01 to 10 mg/kg (eg, about 6.25 mg/kg) twice a week for 4 times.
  • the double-stranded nucleic acid complex is administered at a dose of 0.05 to 30 mg/kg (eg, about 25 mg/kg) at a frequency of 1 to 2 times a week, 2 to 4 times, for example, twice a week. good too.
  • Employment of such a dosing regimen can reduce toxicity (eg, avoid platelet depletion) and reduce burden on the subject compared to single administration of higher doses.
  • the pharmaceutical composition has an additive inhibitory effect in cells even after repeated administration.
  • the pharmaceutical composition of this aspect is administered intracerebroventricularly or intrathecally.
  • 0.01 mg or more, 0.1 mg or more, or 1 mg or more, for example, 2 mg or more, 3 mg or more, 4 mg or more, or 5 mg or more is administered to monkeys or humans.
  • 1 mg to 20 mg may be administered, and in the case of mice, 1 ⁇ g or more may be administered.
  • the pharmaceutical composition of this aspect is administered intravenously or subcutaneously.
  • the diseases to which the pharmaceutical composition is applied are not limited, and can be diseases associated with increased expression of target genes, such as neurological diseases, central nervous system diseases, metabolic diseases, tumors, and infectious diseases. .
  • pharmaceutical compositions of this aspect can be used to treat central nervous system disease in a subject.
  • the central nervous system disease to which the pharmaceutical composition of this aspect is applied is not particularly limited, but examples thereof include brain tumor, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, Huntington's disease, and the like. be done.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has low hepatotoxicity and/or low nephrotoxicity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has a reduced induction of inflammation or gliosis, or an abnormal increase in cytokines or chemokines due to intracerebroventricular, intrathecal, intravenous, or subcutaneous administration.
  • diseases can be treated or prevented by suppressing or inhibiting the expression of specific genes substantially without hepatotoxicity and/or nephrotoxicity.
  • diseases can be treated or prevented while reducing abnormal increases in cytokines or chemokines without substantially inducing inflammation or gliosis.
  • the treatment of neurological diseases requires the administration of high doses of nucleic acid agents, which poses a problem of serious side effects such as liver damage. It is possible to significantly reduce it.
  • a method for treating and/or preventing a disease such as a central nervous system disease comprises administering the double-stranded nucleic acid complex or pharmaceutical composition described above to a subject.
  • Example 1 Gene suppression effect and toxicity reduction effect by intracerebroventricular administration of HDO (scpBNA)> (Purpose)
  • a heteroduplex oligonucleotide containing hereinafter referred to as "HDO(scpBNA)
  • the first nucleic acid strand of HDO contains 5' and 3' wing regions composed of 3 scpBNA nucleosides at the 5' and 3' ends, respectively, with 10 DNA nucleosides between them.
  • a scpBNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid containing The base sequence of the first nucleic acid strand is complementary to a portion of mouse microtubule-associated protein tau (Mapt) mRNA.
  • the second nucleic acid strand of HDO is composed of RNA having a sequence complementary to the first nucleic acid strand. Neither the first nucleic acid strand nor the second nucleic acid of HDO(scpBNA) is bound to the ligand.
  • the scpBNA used in the examples of this specification has the following formula (I): is a non-natural nucleoside represented by
  • HDO(LNA) heteroduplex oligonucleotide
  • ASO(LNA) LNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid
  • Table 2 and FIG. 3B show the structures and base sequences of the first and second nucleic acid strands that constitute the HDO (LNA) used in this example. Neither the first nucleic acid strand nor the second nucleic acid strand of HDO (LNA) is bound to a ligand.
  • the first and second nucleic acid strands are mixed in equimolar amounts, the solution is heated at 95°C for 5 minutes, then cooled to 37°C for 1
  • a double-stranded nucleic acid complex was prepared by holding for a period of time, thereby annealing the nucleic acid strands. Annealed nucleic acids were stored at 4°C or on ice. All oligonucleotides were custom synthesized by Gene Design Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • Quantitative RT-PCR was performed using the resulting cDNA as a template in order to evaluate the gene-suppressing effect and toxicity of various nucleic acid agents.
  • Quantitative RT-PCR was performed by TaqMan (Roche Applied Science). Primers used in quantitative RT-PCR were products designed and manufactured by Thermo Fisher Scientific (formerly Life Technologies Corp) based on different gene numbers. there were.
  • Amplification conditions were as follows: 95° C. for 15 seconds, 60° C. for 30 seconds, and 72° C. for 1 second (1 cycle) repeated for 40 cycles.
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • FIG. 4 shows Mapt mRNA expression levels in the left hippocampus of mice to which various nucleic acid agents were administered into the left ventricle. Intraventricular administration of ASO (LNA), HDO (LNA), ASO (scpBNA), and HDO (scpBNA) did not show any significant difference in Mapt gene suppression effect.
  • LNA ASO
  • LNA HDO
  • scpBNA ASO
  • scpBNA HDO
  • Figure 5 shows the expression levels of TNF ⁇ mRNA and GFAP mRNA in the left hippocampus of mice to which various nucleic acid agents were administered into the left ventricle.
  • ASO (LNA) and HDO (LNA) significantly increased the expression levels of TNF ⁇ mRNA and GFAP mRNA compared to PBS administration.
  • ASO (scpBNA) and HDO (scpBNA) did not significantly increase the expression levels of TNF ⁇ mRNA and GFAP mRNA compared to PBS administration, and induced inflammatory cytokine gliosis attenuated. .
  • Example 2 Gene suppression effect and hepatotoxicity reduction effect by single intravenous administration of Toc-HDO (scpBNA) targeting mMalat1>
  • scpBNA Toc-HDO
  • mMalat1> Purpose
  • a double-stranded nucleic acid complex consisting of a scpBNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a tocopherol-binding complementary strand, and a duplex consisting of an AmNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a tocopherol-binding complementary strand, targeting mMalat1 Regarding the stranded nucleic acid complex, the effect of suppressing target gene expression by single intravenous administration and the effect of reducing toxicity will be verified.
  • Method 1 (1) Preparation of Nucleic Acid
  • the target gene was metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (mMalat1).
  • Table 3 and FIG. 6 show the base sequences of the first and second nucleic acid strands that constitute the three types of double-stranded nucleic acid complexes used in this example.
  • the first nucleic acid strand targets the mMalat1 gene and is composed of a 13-mer gapmer having a nucleotide sequence complementary to a part of the non-coding RNA of malat1, which is its transcription product.
  • the first nucleic acid chain of Toc-HDO (LNA) includes a 5' wing region composed of three LNA nucleosides at the 5' end, a 3' wing region composed of two LNA nucleosides at the 3' end, and Eight between them consist of DNA nucleosides.
  • Toc-HDO scpBNA
  • Toc-HDO AmNA
  • some of the LNA nucleosides in the 5' and 3' wing regions are replaced with scpBNA or AmNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand has a complementary sequence to the first nucleic acid strand and is composed of a tocopherol-binding complementary strand RNA with tocopherol bound to its 5' end.
  • the AmNA used in the examples of the present specification has the following formula (II): (In the formula, R represents a methyl group.) is a non-natural nucleoside represented by
  • a double-stranded nucleic acid complex was prepared in the same manner as in Example 1 (1).
  • a single dose of the double-stranded nucleic acid complex agent was injected intravenously into mice at 50 mg/kg through the tail vein.
  • a single injection of PBS alone was also prepared as a negative control group. Mice were perfused with PBS after blood collection at 72 hours post-dose. Mice were then dissected and the liver, kidney, heart muscle, and quadriceps muscle were removed.
  • the resulting amplified product was quantified by quantitative RT-PCR, the expression levels of malat1 mRNA and GAPDH mRNA (internal standard gene) were calculated, the relative expression level was obtained from the ratio of the two, and the average relative expression level was obtained. and standard errors were calculated. And the difference between each group was analyzed by t-test.
  • Fig. 9A The results of serum analysis are shown in Fig. 9A.
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • Toc-HDO(LNA)-administered group showed a decrease in body weight, while the Toc-HDO(scpBNA)-administered group and the Toc-HDO(AmNA)-administered group showed no significant change in body weight (Fig. 9B).
  • Example 3 Gene suppression effect and hepatotoxicity reduction effect by single intravenous administration of Toc-HDO (scpBNA) targeting PTEN> (Purpose) A double-stranded nucleic acid complex consisting of a scpBNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a tocopherol-binding complementary strand, and a duplex consisting of an AmNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a tocopherol-binding complementary strand, targeting PTEN Regarding the stranded nucleic acid complex, the effect of suppressing target gene expression by single intravenous administration and the effect of reducing toxicity will be verified.
  • the target gene was PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10).
  • Table 4 and FIG. 10 show the base sequences and chemical modifications of the first and second nucleic acid strands that constitute the three types of double-stranded nucleic acid complexes used in this example.
  • the first nucleic acid strand targets the PTEN gene and is composed of a 14-mer gapmer having a base sequence complementary to part of the PTEN mRNA.
  • the first nucleic acid strand of Toc-HDO includes a 5' wing region composed of two LNA nucleosides at the 5' end, a 3' wing region composed of two LNA nucleosides at the 3' end, and Consists of 10 DNA nucleosides between them.
  • Toc-HDO scpBNA
  • Toc-HDO Toc-HDO
  • AmNA Toc-HDO
  • all of the LNA nucleosides in the 5' and 3' wing regions are replaced with scpBNA or AmNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand has a complementary sequence to the first nucleic acid strand and is composed of a tocopherol-binding complementary strand RNA with tocopherol bound to its 5' end.
  • a double-stranded nucleic acid complex was prepared in the same manner as in Example 1 (1).
  • Example 2 The in vivo experiment was performed in the same manner as in Example 2, except that the double-stranded nucleic acid complex agent was intravenously injected into mice at 35 mg/kg. Expression analysis and serum analysis were performed in the same manner as in Example 2.
  • Example 4 Gene suppression effect and hepatotoxicity reduction effect by single intravenous administration of Toc-HDO (scpBNA) targeting SR-B1>
  • scpBNA Toc-HDO
  • SR-B1 A double-stranded nucleic acid complex consisting of a scpBNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a tocopherol-binding complementary strand, and an AmNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a tocopherol-binding complementary strand, targeting SR-B1
  • the target gene was the scavenger receptor B1 (SR-B1) gene.
  • Table 5 and FIG. 10 show the base sequences of the first and second nucleic acid strands that constitute the three types of double-stranded nucleic acid complexes used in this example.
  • the first nucleic acid strand targets the SR-B1 gene and is composed of a 14-mer gapmer having a nucleotide sequence complementary to part of the SR-B1 mRNA.
  • the first nucleic acid strand of Toc-HDO (LNA) includes a 5' wing region composed of two LNA nucleosides at the 5' end, a 3' wing region composed of two LNA nucleosides at the 3' end, and Ten among them consist of DNA nucleosides.
  • Toc-HDO scpBNA
  • Toc-HDO Toc-HDO
  • AmNA Toc-HDO
  • all of the LNA nucleosides in the 5' and 3' wing regions are replaced with scpBNA or AmNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand has a complementary sequence to the first nucleic acid strand and is composed of a tocopherol-binding complementary strand RNA with tocopherol bound to its 5' end.
  • a double-stranded nucleic acid complex was prepared in the same manner as in Example 1 (1).
  • Toc-HDO(LNA)-administered group showed a decrease in body weight
  • Toc-HDO(scpBNA)-administered group and the Toc-HDO(AmNA)-administered group showed no significant change in body weight (Fig. 16B).
  • Example 5 Gene-suppressing effect and hepatotoxicity-reducing effect by multiple intravenous administrations of Chol-HDO (scpBNA)> (Purpose)
  • scpBNA Chol-HDO
  • a double-stranded nucleic acid complex consisting of a scpBNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a cholesterol-bound complementary strand targeting SR-B1 was examined for its effect of suppressing target gene expression by multiple intravenous administrations. Verify the mitigation effect.
  • the first nucleic acid strand targets the SR-B1 gene and is composed of a 14-mer gapmer having a nucleotide sequence complementary to part of the SR-B1 mRNA.
  • the first nucleic acid strand of Chol-HDO includes a 5' wing region composed of two LNA nucleosides at the 5' end, a 3' wing region composed of two LNA nucleosides at the 3' end, and Consists of 10 DNA nucleosides between them.
  • scpBNA Chol-HDO
  • all of the LNA nucleosides in the 5' and 3' wing regions are replaced with scpBNA nucleosides.
  • the second nucleic acid strand has a complementary sequence to the first nucleic acid strand and is composed of a cholesterol-binding complementary strand RNA with cholesterol bound to its 5' end.
  • a double-stranded nucleic acid complex was prepared in the same manner as in Example 1 (1).
  • the resulting amplified product was quantified by quantitative RT-PCR, and based on the results, the expression levels of SR-B1 mRNA and Actin mRNA (internal standard gene) were calculated, and the relative expression level was obtained from the ratio of the two. rice field. Mean values and standard errors of relative expression levels were calculated. And the difference between each group was analyzed by t-test.
  • Example 6 Effect of single intravenous administration of Toc-HDO (scpBNA) to reduce the expression of blood inflammatory cytokines/chemokines> (Purpose) To verify the expression of inflammatory cytokines/chemokines in the blood when a double-stranded nucleic acid complex consisting of an scpBNA/DNA gapmer-type antisense nucleic acid and a tocopherol-binding complementary strand is intravenously administered.
  • scpBNA Toc-HDO
  • Method 1 Preparation of nucleic acids
  • Toc-HDO (LNA), Toc-HDO (scpBNA), and Toc-HDO (AmNA) targeting mMalat1 listed in Table 3 and PTEN listed in Table 4 were used.
  • Targeting Toc-HDO (LNA), Toc-HDO (scpBNA), and Toc-HDO (AmNA) and Toc-HDO (LNA), Toc-HDO (scpBNA) targeting SR-B1 listed in Table 5 ), and Toc-HDO (AmNA).
  • a double-stranded nucleic acid complex was prepared in the same manner as in Example 1 (1).
  • the following protein groups G-CSF, GM-CSF, IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, KC, LIF , LIX, MCP-1, M-CSF, MIG, MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ , MIP-2, RANTES, TNF ⁇ , VEGF, and Eotaxin/CCL11.
  • TNF ⁇ , IP-10, and RANTES which were elevated by Toc-HDO (LNA) administration, were measured as indices of inflammation.
  • FIGS. 20 to 22 The results of measuring the amount of inflammatory cytokines in blood are shown in FIGS. 20 to 22.
  • FIG. 20 to 22 compared with the Toc-HDO (LNA) administration group, the Toc-HDO (scpBNA) administration group and the Toc-HDO (AmNA) administration group showed TNF ⁇ (FIG. 20), IP-10 It was shown that the expression levels of both (Fig. 21) and RANTES (Fig. 22) were low. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

有効性が損なわれることなく、毒性が軽減した二本鎖核酸複合体を提供することである。　第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、前記標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖は、式（I）又は式（II）（式中、Ｒは水素原子又はメチル基を示す。）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを少なくとも１個含む、前記二本鎖核酸複合体を提供する。

Description

ｓｃｐＢＮＡ又はＡｍＮＡを含むヘテロ核酸
　本発明は、scpBNA又はAmNAを含む二本鎖核酸複合体、及びそれを含む医薬組成物等に関する。
　近年、核酸医薬と呼ばれる医薬品の現在進行中の開発において、オリゴヌクレオチドが関心を集めており、また特に、標的遺伝子の高い選択性及び低毒性の点から考えて、アンチセンス法を利用する核酸医薬の開発が積極的に進められている。アンチセンス法とは、標的遺伝子より転写されたmRNAやmiRNAの部分配列を標的センス鎖として、それに相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド：本明細書ではしばしば「ASO（Antisense Oligonucleotide）」と表記する）を細胞に導入することによって、標的遺伝子によってコードされたタンパク質の発現やmiRNAの活性を選択的に改変又は阻害することを含む方法である。
　アンチセンス法を利用した核酸として、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれに対する相補鎖とをアニーリングさせた二本鎖核酸複合体(ヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド(heteroduplex oligonucleotide、HDO))を開発した(特許文献１、非特許文献１及び２)。
　二本鎖核酸複合体は高いアンチセンス効果を有し、血液脳関門を越えて中枢神経系の制御を可能とした画期的な技術である。しかしながら、アルツハイマー病等の神経疾患の治療には高用量での投与が必要となり、重篤な肝障害の副作用が問題になる場合がある。
　よって、二本鎖核酸複合体の有効性を損なわずにその毒性を軽減する技術が必要とされている。
国際公開第2013/089283号 国際公開第2014/192310号
Nishina K, et. al., "DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing", Nature Communication, 2015, 6:7969. Asami Y, et al., "Drug delivery system of therapeutic oligonucleotides", Drug Discoveries & Therapeutics. 2016; 10(5):256-262.
　有効性が損なわれることなく、毒性が軽減した二本鎖核酸複合体を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸（scpBNA）又はアミド架橋型核酸（AmNA）を二本鎖核酸複合体に導入した。その結果、scpBNA又はAmNAの導入により、二本鎖核酸複合体の毒性を劇的に軽減又は消失させることができることを見出した。この毒性抑制効果は、従来の予想を大きく超える、驚くべき効果である。さらに、scpBNA又はAmNAの導入により二本鎖核酸複合体の有効性が損なわれないことが判明した。本発明は上記知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、前記標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖は、以下の式（I）又は式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒは水素原子又はメチル基を示す。）
で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを少なくとも１個含む、前記二本鎖核酸複合体。
（２）前記第1核酸鎖がギャップマーである、（１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３）前記第1核酸鎖が、
　[1]少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、
　[2]前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び
　[3]前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、（２）に記載の二本鎖核酸複合体。
（４）前記5’ウイング領域及び／又は前記3’ウイング領域が前記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを含む、（３）に記載の二本鎖核酸複合体。
（５）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の前記中央領域における少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含む、（３）又は（４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（６）前記第2核酸鎖が、少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドをさらに含む、（５）に記載の二本鎖核酸複合体。
（７）前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に前記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを含む、（３）～（６）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（８）前記第1核酸鎖がミックスマーである、（１）に記載の二本鎖核酸複合体。
（９）前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖が、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及び2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]修飾ヌクレオシドからなる群から選択される少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含む、（１）～（８）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１０）前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、（１）～（９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１１）前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、（１０）に記載の二本鎖核酸複合体。
（１２）前記第2核酸鎖が、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合している、（１）～（１１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１３）リガンドと結合していない、（１）～（１１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１４）前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖とが切断性又は非切断性リンカーを介して結合している、（１）～（１３）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（１５）（１）～（１４）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む医薬組成物。
（１６）被検体の中枢神経系疾患を治療するための、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）脳室内投与又は髄腔内投与される、（１５）又は（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）前記二本鎖核酸複合体が0.1mg～200mg投与される、（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）静脈内投与又は皮下投与される、（１５）又は（１６）に記載の医薬組成物。
（２０）前記二本鎖核酸複合体が0.1mg/kg～100mg/kg投与される、（１９）に記載の医薬組成物。
（２１）炎症若しくはグリオーシスの惹起、又はサイトカイン若しくはケモカインの異常上昇が低減されている、（１５）～（２０）のいずれかに記載の医薬組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-087941号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、有効性が損なわれることなく、毒性が軽減した二本鎖核酸複合体が提供される。
図1は、様々な架橋核酸の構造を示す図である。 図2は、様々な天然ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの構造を示す図である。 図3は、実施例1で用いた核酸の構造の模式図である。図3Aは、5'末端及び3'末端に3個のLNAヌクレオシドを含み、それらの間に10個のDNAヌクレオシドを含むASO(LNA)の構造を示す。図3Bは、第1核酸鎖としてASO(LNA)、第2核酸鎖として第1核酸鎖に相補的な配列を有するRNAを含む、HDO(LNA)の構造を示す。図3Cは、5'末端及び3'末端の各々に3個のscpBNAヌクレオシドを含み、それらの間に10個のDNAヌクレオシドを含むASO(scpBNA)の構造を示す。図3Dは、第1核酸鎖としてASO(scpBNA)、第2核酸鎖として第1核酸鎖に相補的な配列を有するRNAを含む、HDO(scpBNA)の構造を示す。 図4は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの海馬におけるMapt mRNA発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図5は、各種核酸剤を脳室内に投与したマウスの海馬におけるTNFα mRNA及びGFAP mRNAの発現量を示す。図5Aは、TNFα mRNAの発現量を示す。図5Bは、GFAP mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図6は、実施例2で用いた核酸の構造の模式図である。図6AはToc-HDO(LNA)の構造を示す。図6BはToc-HDO(scpBNA)の構造を示す。図6CはToc-HDO(AmNA)の構造を示す。Tocはトコフェロールを示す。 図7は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおけるmalat1 mRNAの発現量を示す。図7Aは、肝臓におけるmalat1 mRNAの発現量を示す。図7Bは、腎臓におけるmalat1 mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図8は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおけるmalat1 mRNAの発現量を示す。図8Aは、大腿四頭筋におけるmalat1 mRNAの発現量を示す。図8Bは、心筋におけるmalat1 mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図9は、malat1を標的とする二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおける血清解析と体重測定の結果を示す。図9Aは血清中のAST及びALTの測定結果を示す。図9Bは体重測定結果を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図10は、実施例3及び4で用いた核酸の構造の模式図である。図10AはToc-HDO(LNA)の構造を示す。図10BはToc-HDO(scpBNA)の構造を示す。図10CはToc-HDO(AmNA)の構造を示す。Tocはトコフェロールを示す。 図11は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおけるPTEN mRNAの発現量を示す。図11Aは、肝臓におけるPTEN mRNAの発現量を示す。図11Bは、腎臓におけるPTEN mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図12は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおけるPTEN mRNAの発現量を示す。図12Aは、大腿四頭筋におけるPTEN mRNAの発現量を示す。図12Bは、心筋におけるPTEN mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図13は、PTENを標的とする二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおける血清解析と体重測定の結果を示す。図13Aは血清中のAST及びALTの測定結果を示す。図13Bは二本鎖核酸複合体剤の投与前後における体重変化を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図14は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。図14Aは、肝臓におけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。図14Bは、腎臓におけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図15は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。図15Aは、大腿四頭筋におけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。図15Bは、心筋におけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図16は、SR-B1を標的とする二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスにおける血清解析と体重測定の結果を示す。図16Aは血清中のAST及びALTの測定結果を示す。図16Bは二本鎖核酸複合体剤の投与前後における体重変化を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図17は、実施例5で用いた核酸の構造の模式図である。図17AはChol-HDO(LNA)の構造を示す。図17BはChol-HDO(scpBNA)の構造を示す。Cholはコレステロールを示す。 図18は、二本鎖核酸複合体剤を複数回静脈投与したマウスにおけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。図18Aは、皮質（Cortex）、小脳（Cerebellum）、線条体（Striatum）、海馬（Hippocampus）、脳幹（Brain stem）、頚髄（Cervical SC）、及び腰髄（Lumbar SC）におけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。図18Bは、肝臓（Liver）、腎臓（Kidney）、脾臓（Spleen）、心臓（Heart）、四頭筋（Quadriceps）、固有背筋（Back）、横隔膜（Diaphragm）、副腎（Adrenal gland）、肺（Lung）、結腸（Colon）、小腸（Small intestine）、及び脂肪組織（Adipose tissue）におけるSR-B1 mRNAの発現量を示す。エラーバーは標準誤差を示す。 図19は、二本鎖核酸複合体剤を複数回静脈投与したマウスの血清中のAST及びALTの測定結果を示す。Chol-HDO(LNA)については、投与したマウスが1回投与後に死亡したため、1回投与後のAST/ALT測定結果を示す。 図20は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスの血中におけるTNFαの測定結果を示す。図20AはToc-HDO(PTEN)及びToc-HDO(Malat1)の結果を示す。図20BはToc-HDO(SR-B1)の結果を示す。 図21は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスの血中におけるIP-10の測定結果を示す。図21AはToc-HDO(PTEN)及びToc-HDO(Malat1)の結果を示す。図21BはToc-HDO(SR-B1)の結果を示す。 図22は、二本鎖核酸複合体剤を単回静脈投与したマウスの血中におけるRANTESの測定結果を示す。図22AはToc-HDO(PTEN)及びToc-HDO(Malat1)の結果を示す。図22BはToc-HDO(SR-B1)の結果を示す。
１．二本鎖核酸複合体
１－１．概要
　本発明の第１態様は二本鎖核酸複合体である。本発明の二本鎖核酸複合体は第1核酸鎖及び第2核酸鎖を含み、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖はscpBNA又はAmNAを少なくとも１個含む。本発明の二本鎖核酸複合体は、肝毒性等の毒性が低減されており、炎症若しくはグリオーシスの惹起、又はサイトカイン若しくはケモカインの異常上昇が低減されている。
１－２．用語の定義
　本明細書において、標的遺伝子の「転写産物」とは、本発明の核酸複合体の直接的な標的となり、かつRNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAをいう。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNA（成熟mRNA、mRNA前駆体、塩基修飾を受けていないmRNA等を含む）、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)、ロングノンコーディングRNA（lncRNA）、ナチュラルアンチセンスRNAを含み得る。
　アンチセンス効果によってその発現が調節(例えば、抑制、変更、又は改変)される「標的遺伝子」としては特に限定されないが、例えば、様々な疾患において、その発現が増加する遺伝子が挙げられる。標的遺伝子の転写産物として、例えば、SR-B1遺伝子の転写産物であるSR-B1 mRNA、Malat1遺伝子の転写産物であるMalat1 ノンコーディングRNA、及びDMPK遺伝子の転写産物であるDMPK mRNAが挙げられる。「標的転写産物」は、例えば、スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1：本明細書ではしばしば「SR-B1」と表記する)、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ(myotonic dystrophy protein kinase、本明細書ではしばしば「DMPK」と表記する)、トランスサイレチン(transthyretin：本明細書ではしばしば「TTR」と表記する)、アポリポ蛋白Ｂ(Apolipoprotein B：本明細書ではしばしば「ApoB」と表記する)、転移関連肺腺癌転写産物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1：本明細書ではしばしば「Malat1」と表記する）の遺伝子、例えばこれらのノンコーディングRNA又はmRNAであってもよい。配列番号19にマウスMalat1ノンコーディングRNAの塩基配列を、配列番号20にヒトMalat1ノンコーディングRNAの塩基配列を示す。また、配列番号21にマウスSR-B1 mRNAの塩基配列を、配列番号22にヒトSR-B1 mRNAの塩基配列を示す。そして、配列番号23にマウスDMPK mRNAの塩基配列を、配列番号24にヒトDMPK mRNAの塩基配列を示す。なお、配列番号19～24は、いずれもmRNAの塩基配列をDNAの塩基配列に置き換えている。これらの遺伝子及び転写産物の塩基配列情報は、例えばNCBI(米国国立生物工学情報センター)データベース(例、GenBank、Trace Archive、Sequence Read Archive、BioSample、BioProject)等の公知のデータベースから入手できる。
　本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）」又は「アンチセンス核酸」とは、標的転写産物(主として標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な(すなわち、相補的な)塩基配列を含み、標的転写産物にアンチセンス効果をもたらすことができる、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。本発明の二本鎖核酸複合体では、第1核酸鎖がASOとして機能し、その標的領域は、3'UTR、5'UTR、エクソン、イントロン、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、又は他のいずれの核酸領域を含んでいてもよい。標的転写産物の標的領域は、少なくとも8塩基長、例えば、10～35塩基長、12～25塩基長、13～20塩基長、14～19塩基長、若しくは15～18塩基長、又は13～22塩基長、16～22塩基長、若しくは16～20塩基長とすることができる。
　「アンチセンス効果」とは、ASOが標的転写産物（例えばRNAセンス鎖）にハイブリダイズすることによって、その標的転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。「標的転写産物の発現又は編集を調節する」とは、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、翻訳の阻害、RNA編集、スプライシング機能改変効果（例えばスプライシングスイッチ、エクソンインクルージョン、エクソンスキッピング等）、又は転写産物の分解をいう。例えば、標的遺伝子の転写後阻害では、ASOとしてRNAオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、ASOは標的遺伝子の転写産物であるmRNAとアニーリングによって部分的二本鎖を形成する。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされた標的タンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（ステリックブロッキング）。一方、ASOとしてDNAを含むオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がRNase Hによって認識される結果、標的遺伝子のmRNAが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される。さらに、アンチセンス効果は、mRNA前駆体におけるイントロンを標的としてももたらされ得る。さらに、アンチセンス効果は、miRNAを標的としてももたらされ得る。この場合、そのmiRNAの機能阻害により、当該miRNAが通常発現を制御している遺伝子の発現が増加し得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
　アンチセンス効果の測定は、例えば、被験核酸化合物を被検体(例えばマウス)に投与し、例えば数日後(例えば2～7日後)に、被験核酸化合物によって提供されるアンチセンス効果により発現が調節される標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(量)(例えば、mRNA量若しくはマイクロRNA等のRNA量、cDNA量、タンパク質量等)を測定することによって、実施することができる。
　例えば、測定された標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベルが、陰性対照(例えばビヒクル投与)と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、又は少なくとも40％減少している場合に、被験核酸化合物がアンチセンス効果(例えば、標的転写産物量の低下)をもたらし得ることが示される。
　核酸鎖における非天然ヌクレオチドの数、種類及び位置は、核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果等に影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子等の配列によって異なり得るが、当業者であれば、アンチセンス法に関連する文献(例えば、WO 2007/143315、WO 2008/043753、及びWO 2008/049085)の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前の核酸複合体の測定値と比較して有意に低くない場合(例えば、修飾後に得られた測定値が、修飾前の核酸複合体の測定値の70％以上、80％以上又は90％以上である場合)、関連修飾を評価することができる。
　本明細書において「標的遺伝子の翻訳産物」とは、本発明の核酸複合体の直接的な標的となる前記標的転写産物又は標的遺伝子の転写産物の翻訳によって合成される任意のポリペプチド又はタンパク質をいう。
　本明細書中で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」は、モノマーのヌクレオチド又はヌクレオシドを指してもよいし、複数のモノマーからなるオリゴヌクレオチドを意味してもよい。
　本明細書において「核酸鎖」又は単なる「鎖」とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。核酸鎖は、例えば自動合成装置を使用した化学的合成法により、又はポリメラーゼ、リガーゼ、又は制限反応による酵素的工程により全長鎖又は部分鎖を作製することができる。核酸鎖は、天然ヌクレオチド及び／又は非天然ヌクレオチドを含み得る。
　「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
　「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の2'位、3'位、又は5'位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
　「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成される直鎖状のポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般にヌクレオシド間結合を形成するとみなされる。
　本明細書において「天然ヌクレオシド」とは、自然界に存在するヌクレオシドをいう。例えば、リボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はウラシル等の塩基からなるリボヌクレオシドや、デオキシリボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はチミン等の塩基からなるデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。なお、RNA中に見られるリボヌクレオシド、及びDNA中に見られるデオキシリボヌクレオシドを、本明細書では、しばしば、それぞれ「DNAヌクレオシド」及び「RNAヌクレオシド」と称する。
　本明細書において「天然ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドで、前記天然ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。例えば、リボヌクレオシドにリン酸基が結合した、RNAの構成単位として知られるリボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合した、DNAの構成単位として知られるデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
　本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、及び修飾核酸塩基のいずれか1つ以上を有するヌクレオチドを意味する。ここでいう「ヌクレオチド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオチド模倣体としては、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ核酸(-N(H)-C(=O)-O-又は他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ)が挙げられる。ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid、PNA）は、糖の代わりにN-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。本明細書において非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性を有する。したがって、天然ヌクレオチドよりも好ましい。
　本明細書において「非天然ヌクレオシド」とは、天然ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドをいう。例えば、修飾ヌクレオシド及びヌクレオシド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
　本明細書において「模倣体」とは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を置換する官能基を指す。一般に、模倣体は、糖又は糖－ヌクレオシド間結合の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選択される標的に対するハイブリダイゼーションのために維持される。ここでいう「ヌクレオシド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において糖を置換するために、又は糖及び塩基を置換するために、又はオリゴマー化合物を構成するモノマーサブユニット間の結合等を置換するために使用される構造体を含む。「オリゴマー化合物」とは、核酸分子のある領域に少なくともハイブリダイズ可能な連結したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。ヌクレオシド模倣体としては、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環式又は三環式糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣体が挙げられる。
　「修飾糖」とは、天然糖部分(すなわち、DNA(2'-H)又はRNA(2'-OH)中に認められる糖部分)からの置換及び／又は任意の変化を有する糖を指し、「糖修飾」とは、天然糖部分からの置換及び／又は任意の変化をいう。核酸鎖は、場合により、修飾糖を含む1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。「糖修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分を有するヌクレオシドをいう。かかる糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性を核酸鎖に付与し得る。特定の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定するものではないが、置換基(5'及び2'置換基を含む)の付加、非ジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸(架橋核酸、BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、又はC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基を表す)での置換、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
　糖修飾ヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、5'-ビニル、5'-メチル(R又はS)、5'-アリル(R又はS)、4'-S、2'-F(2'-フルオロ基)、2'-OCH3(2'-OMe基若しくは2'-O-メチル基)、2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]（2'-O-MCE基）、及び2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE若しくは2-O(CH2)2OCH3）置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。2'位の置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、-O-アリル、-O-C1-C10アルキル、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、及びO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)から選択することができ、各Rm及びRnは、独立して、H又は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。「2'-修飾糖」は、2'位で修飾されたフラノシル糖を意味する。2'-修飾糖を含むヌクレオシドを「2'-糖修飾ヌクレオシド」と称することもある。
　「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)と称される。二環式糖部分を含むヌクレオシドは、「架橋ヌクレオシド」、「架橋型の非天然ヌクレオシド」、又は「BNAヌクレオシド」と称することもある。図1に架橋核酸を一部例示する。
　二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例は当業者に公知である。二環式糖を含む核酸(BNA)又はBNAヌクレオシドの1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-CH2-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-OCO-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'[式中、p、m及びnは、それぞれ1～4の整数、0～2の整数、及び1～3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基(蛍光若しくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内又は核内局在化シグナルペプチド等)を表す]により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有すると説明することができる。さらに、特定の実施形態によるBNA又はBNAヌクレオシドに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基及び5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1及びR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、又はP(R4)R5[ここで、R4及びR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1～5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1～5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1～6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、又は1～5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す]であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2',4'-BNAとしても知られている)（例えば、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA若しくはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA）、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNA(ENAとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA(2',4'-BNANCとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me])、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミドBNA（アミド架橋型核酸）若しくは(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)(AmNAとしても知られている；図1のR=HはAmNA[N-H]、R=MeはAmNA[N-Me])、グアニジンBNA(GuNA（例、図1のR=HはGuNA[N-H]、R=MeはGuNA[N-Me]）としても知られる)、アミンBNA(2'-Amino-LNAとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換体)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸(scpBNAとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAが挙げられる。このようなBNAヌクレオシドの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド(LNAヌクレオシド、2',4'-BNAヌクレオシドとしても知られている)（例、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド、β-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド)、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNAヌクレオシド(ENAヌクレオシドとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNAヌクレオシド、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNAヌクレオシド、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNAヌクレオシド(2',4'-BNANCヌクレオシドとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]ヌクレオシド、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me]ヌクレオシド)、2',4'-BNAcocヌクレオシド、3'-アミノ-2',4'-BNAヌクレオシド、5'-メチルBNAヌクレオシド、(4'-CH(CH3)-O-2')BNAヌクレオシド(cEtヌクレオシドとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNAヌクレオシド(cMOEヌクレオシドとしても知られている)、アミドBNAヌクレオシド若しくは(4'-C(O)-N(R)-2')BNAヌクレオシド(R=H、Me)(AmNAヌクレオシドとしても知られている；図1のR=HはAmNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはAmNA[N-Me]ヌクレオシド)、グアニジンBNAヌクレオシド(GuNAヌクレオシド（例、図1のR=HはGuNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはGuNA[N-Me]ヌクレオシド）としても知られる)、アミンBNAヌクレオシド(2'-Amino-LNAヌクレオシドとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換ヌクレオシド)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋ヌクレオシド(scpBNAヌクレオシドとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAヌクレオシドが挙げられる。
　本明細書において、「カチオン性ヌクレオシド」は、あるpH（例えば、ヒトの生理学的pH（約7.4）、送達部位（例えば、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物体等）のpH等）において、中性形態（リボヌクレオシドの中性形態等）と比較して、カチオン形態として存在する修飾ヌクレオシドである。カチオン性ヌクレオシドはヌクレオシドの任意の位置に１つ以上のカチオン性修飾基を含んでもよい。一実施形態では、カチオン性ヌクレオシドは、2'-Amino-LNAヌクレオシド(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換ヌクレオシド)、アミノアルキル修飾ヌクレオシド（例、2'-O-メチル及び4'-CH2CH2CH2NH2置換ヌクレオシド)、GuNAヌクレオシド(例、図3のR=HはGuNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはGuNA[N-Me]ヌクレオシド)等である。メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する二環式ヌクレオシドを、LNAヌクレオシドと称することもある。
　本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステル結合)からの置換又は任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むヌクレオシド間結合、及びリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合(米国特許登録番号5,955,599記載のメチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合)、アルキルホスホネート結合(例、米国特許登録番号5,264,423及び5,286,717記載のメチルホスホネート結合、国際公開第2015/168172号記載のメトキシプロピルホスホネート結合)、アルキルチオホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合（例、以下の式(III)で表される部分構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ）、１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、テトラメチルグアニジン（TMG）部分）を含むヌクレオシド間結合（例、以下の式(IV)で表される部分構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ）、国際公開第2016/081600号記載の自己中和核酸(ZON)に用いられるヌクレオシド間結合及びホスホロアミデート結合が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合を指す。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は周知である。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
　ヌクレオシド間結合がキラル中心を有する場合、ヌクレオシド間結合はキラル制御されたものであってもよい。「キラル制御された」とは、キラル中心、例えばキラル結合リンに関して単一のジアステレオマーで存在することを意図する。キラル制御されたヌクレオシド間結合は、完全にキラル純粋なものであってもよいし、キラル純度が高いもの、例えば90％de、95％de、98％de、99％de、99.5％de、99.8％de、99.9％de、又はそれ以上のキラル純度を有するものであってよい。本明細書において「キラル純度」は、ジアステレオマーの混合物中の1つのジアステレオマーの割合を指し、ジアステレオマー過剰率(％de)として表され、(対象のジアステレオマー－その他のジアステレオマー)／(総ジアステレオマー)×100(％)として定義される。
　例えば、ヌクレオシド間結合は、Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合、１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、テトラメチルグアニジン（TMG）部分；例えばAlexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811を参照のこと）を含むヌクレオシド間結合（例、式(IV)で表される部分構造）、及び／又は環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合（例、式(III)で表される部分構造）であってよい。キラル制御されたヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばRp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Naoki Iwamoto et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48(3), 496-9、Natsuhisa Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317、Natsuhisa Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2016, 81, 2753-2762、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 7913-7922に記載の方法に従って合成することができる。Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合も公知であり、例えばNaoki Iwamoto et al., Nat. Biotechnol., 2017, 35(9), 845-851、Anastasia Khvorova et al., Nat. Biotechnol., 2017, 35(3), 238-248に記載されるような効果を奏することが知られている。例えば、一実施形態において、Sp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Rp配置のものよりも安定であり、及び／又はSp配置にキラル制御されたASOは、RNase H1による標的RNA切断を促進し、生体内でより持続的な応答をもたらす。１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、TMG部分）を含むヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばAlexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811に記載の方法に従って合成することができる。
　本明細書中で使用される用語「核酸塩基」又は「塩基」とは、核酸を構成する塩基成分(複素環部分)であって、主としてアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルが知られる。本明細書において「核酸塩基」又は「塩基」は、特に断りのない場合、修飾又は非修飾の核酸塩基（塩基）のいずれをも包含する。したがって、特に断りのない場合、プリン塩基は修飾又は非修飾のプリン塩基のいずれであってもよい。また、特に断りのない場合、ピリミジン塩基は修飾又は非修飾のピリミジン塩基のいずれであってもよい。
　「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外のあらゆる核酸塩基を意味する。「非修飾核酸塩基」又は「非修飾塩基」(天然核酸塩基)とは、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を意味する。修飾核酸塩基の例としては、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン又はN4-メチルシトシン； N6-メチルアデニン又は8-ブロモアデニン；2-チオ-チミン；並びにN2-メチルグアニン又は8-ブロモグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾核酸塩基は、好ましくは、5-メチルシトシンである。
　本明細書中で使用される用語「相補的」とは、核酸塩基が水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対(天然型塩基対)又は非ワトソン-クリック塩基対(フーグスティーン型塩基対等)を形成し得る関係を意味する。本発明において、第1核酸鎖中のアンチセンスオリゴヌクレオチド領域は、標的転写産物(例えば、標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。第1核酸鎖中のアンチセンスオリゴヌクレオチド領域は、塩基配列が相補的である場合に(典型的には、塩基配列が標的転写産物の少なくとも一部の塩基配列に相補的である場合に)、標的転写産物にハイブリダイズすることができる。同様に、第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と塩基配列が相補的である場合に、アニールすることができる。塩基配列の相補性は、BLASTプログラム等を使用することによって決定することができる。当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、2本の鎖がアニール又はハイブリダイズし得る条件(温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。またさらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
　ハイブリダイゼーション条件は、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等の様々なストリンジェントな条件であってもよい。低ストリンジェントな条件は、比較的低温で、かつ高塩濃度の条件、例えば、30℃、2×SSC、0.1％SDSであってよい。高ストリンジェントな条件は、比較的高温で、かつ低塩濃度の条件、例えば、65℃、0.1×SSC、0.1％SDSであってよい。温度及び塩濃度等の条件を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整できる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む。
　本明細書で「被検体」とは、本発明の二本鎖核酸複合体又は医薬組成物を適用する対象をいう。被検体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被検体が個体の場合、ヒトを含むあらゆる動物が該当し得る。例えば、ヒト以外では、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が挙げられる。限定はしないが、被検体は、標的転写産物の発現量を減少させる必要がある個体や、疾患の治療又は予防が必要な個体であってもよい。
１－３．構成
　本発明の二本鎖核酸複合体は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む。各核酸鎖の具体的な構成を以下に示す。
　本発明の二本鎖核酸複合体において、第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖は、以下の式（I）又は式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒは水素原子又はメチル基を示す。）
で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを少なくとも１個含む。
　上記式（I）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドは、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸であり、本明細書では主として「scpBNA」と表記する。
　上記式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドは、アミドBNA（アミド架橋型核酸）であり、(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)と表記することもできるが、本明細書では主として「AmNA」と表記する。上記式（II）中、Ｒは水素原子又はメチル基のいずれであってもよい。本明細書において、特に断りのない場合、Ｒは水素原子又はメチル基のいずれであってもよいが、両者を区別する場合には、Ｒが水素原子の場合にはAmNA[N-H]、Ｒがメチル基の場合にはAmNA[N-Me]と表記することもできる。
　二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖に含まれる、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドの数は少なくとも1個であり、例えば2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、又は10個以上であってもよく、30個以下、25個以下、20個以下、15個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、又は2個以下であってもよい。例えば、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドの数は、1～10個であってもよく、好ましくは1～6個である。例えば、1個、2個、3個、4個、5個、又は6個であってもよい。
　本発明の二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、上記式（I）及び式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドのうち、式（I）で示されるもののみを含んでもよく、式（II）で示されるものだけを含んでもよく、又は式（I）及び式（II）で示されるものの両方を含んでもよい。
　また、上記式（I）及び式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドは、第1核酸鎖のみに含まれてもよく、第2核酸鎖のみに含まれてもよく、又は第1核酸鎖及び第2核酸鎖の両方に含まれてもよい。
　第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、特に限定されないが、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であってもよい。また、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、同じ長さであっても、異なる長さ（例えば、いずれか一方が1～3塩基短い又は長い長さ）であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖が形成する二本鎖構造は、バルジを含んでいてもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率等の他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。
　第1核酸鎖は、標的転写産物にハイブリダイズしている場合に、RNase Hによって認識される少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、又は少なくとも7個の連続するヌクレオシドを含むことができる。通常、4～20塩基、5～16塩基、又は6～12塩基の連続するヌクレオシドを含む領域であればよい。RNase Hによって認識されるヌクレオシドとして、例えば天然型デオキシリボヌクレオシドを用いることができる。修飾されたデオキシリボヌクレオシド、及び他の塩基を含む好適なヌクレオシドは、当該分野において周知である。また、リボヌクレオシド等の、2'位にヒドロキシ基を有するヌクレオシドが、前記ヌクレオシドとして不適当であることも知られている。「少なくとも4個の連続するヌクレオシド」を含むこの領域への利用に関し、ヌクレオシドの適合性を容易に決定することができる。一実施形態で、第1核酸鎖は、少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み得る。
　一実施形態において、第1核酸鎖のヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含むか又はこれからなり、例えば第1核酸鎖のヌクレオシドの70%以上、80%以上、90%以上、又は95%以上がデオキシリボヌクレオシドである。
　一実施形態において、第1核酸鎖はギャップマー（gapmer)であってもよい。本明細書において「ギャップマー」とは、原則として、中央領域（DNAギャップ領域）と、その5'末端及び3'末端に直接配置されたウイング領域（それぞれ、5'ウイング領域及び3'ウイング領域と称する）からなる一本鎖核酸をいう。DNAギャップ領域の長さは、13～22塩基長、16～22塩基長、若しくは16～20塩基長、又は4～20塩基長、5～18塩基長、6～16塩基長、7～14塩基長、若しくは8～12塩基長であってもよい。ギャップマーにおける前記中央領域は少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含み、前記ウイング領域は少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含む。限定はしないが、ウイング領域に含まれる非天然ヌクレオシドは、通常、天然ヌクレオシドよりもRNAとの結合力が高く、核酸分解酵素(ヌクレアーゼ等)に対する耐性の高い性質を有する。ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「BNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドの数は、少なくとも1個であり、例えば、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「LNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「ペプチド核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「モルホリノ核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域の塩基長は、それぞれ独立して、少なくとも2塩基長、例えば、2～10塩基長、2～7塩基長、又は3～5塩基長であればよい。一実施形態において、5'ウイング領域及び／又は3'ウイング領域は、非天然ヌクレオシドを少なくとも1種含んでいればよく、天然ヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域は、例えば、ホスホロチオエート結合等の修飾ヌクレオシド間結合で連結された非天然ヌクレオシド、例えば2'-O-メチル修飾ヌクレオシドであってもよい。
　前記ギャップマーを構成する第1核酸鎖は、5'末端から順に、2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の架橋ヌクレオシド、4～15塩基長若しくは8～12塩基長（例えば8又は10塩基長）のリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の架橋ヌクレオシドから構成されていてもよい。
　なお、ウイング領域を5'末端側又は3'末端側のいずれか一方にのみ有する核酸鎖は、当該分野では「ヘミギャップマー」と呼ばれるが、本明細書においては、ヘミギャップマーもギャップマーに包含されるものとする。
　第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域は、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを含んでもよい。5’ウイング領域又は3’ウイング領域の各領域に含まれる上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドの数は、少なくとも1個であってもよく、例えば2個以上、又は3個以上であってもよく、5個以下、4個以下、3個以下、又は2個以下であってもよい。例えば、1個、2個、3個、又は4個であってもよい。一実施形態では、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域は、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドからなるものであってもよい。
　一実施形態では、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域は、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド並びにLNAヌクレオシドを含む。
　本発明の二本鎖核酸複合体において第1核酸鎖は、ミックスマー（mixmer）であってもよい。本明細書において「ミックスマー」とは、周期的又は無作為セグメント長の交互型の天然ヌクレオシド及び非天然ヌクレオシドを含み、かつ4個以上の連続するデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドを含まない核酸鎖をいう。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドであり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「BNA／DNAミックスマー」と称する。前記架橋ヌクレオシドは、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドであってもよい。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがペプチド核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「ペプチド核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「モルホリノ核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーは、2種のヌクレオシドのみを含むようには制限されない。ミックスマーは、天然若しくは修飾のヌクレオシド又はヌクレオシド模倣体であるか否かに関わらず、任意の数の種類のヌクレオシドを含むことができる。例えば、架橋ヌクレオシド(例えば、LNAヌクレオシドや上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド)により分離された1又は2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを有してもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)をさらに含んでもよい。
　第2核酸鎖は、全てのヌクレオシドがリボヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシドから構成されていてもよい。例えば、第2核酸鎖の全てのヌクレオシドがリボヌクレオシドから構成されていてもよい。第2核酸鎖の全てのヌクレオシドが、デオキシリボヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシドから構成されていてもよく、リボヌクレオシドを含まなくてもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域における上記の少なくとも4個の連続するヌクレオシド(例えばデオキシリボヌクレオシド）に相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含んでいてもよい。第2核酸鎖が、第1核酸鎖と部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖を形成し、RNaseHによって認識され切断されるようにするためである。第2核酸鎖中の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドは、好ましくは、天然に存在するヌクレオシド間結合、すなわちホスホジエステル結合によって連結される。
　さらなる実施形態では、第2核酸鎖は、上記の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドに加えて、少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドをさらに含んでもよい。当該少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドは、第1核酸鎖に相補的であり、第1核酸鎖の中央領域に相補的な領域に含まれてもよい。当該少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドは、上記の少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドの5'側又は3'側のいずれに位置してもよく、5'側及び3'側の両方に位置してもよい。また、当該少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドは、2個、3個、4個、5個、又は6個以上の連続するデオキシリボヌクレオシドであってもよい。
　第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端、又は両末端）から少なくとも1個、少なくとも2個（例えば2個）、少なくとも3個、又は少なくとも4個のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドであってもよい。修飾ヌクレオシドは、修飾糖及び／又は修飾核酸塩基を含んでいてもよい。修飾糖は、2'-修飾糖（例えば、2'-O-メチル基を含む糖）であってよい。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンとすることもできる。
　第2核酸鎖は、5'末端から順に、2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド）、4～15塩基長若しくは8～12塩基長（例えば8又は10塩基長）の(場合により、修飾ヌクレオシド間結合で連結された)リボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシド、及び2～7塩基長若しくは3～5塩基長（例えば2又は3塩基長）の修飾ヌクレオシド（例えば、2'-修飾糖を含む修飾ヌクレオシド)から構成されていてもよい。この場合、第1核酸鎖は、ギャップマーであってもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを含んでもよい。
　二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖に含まれる、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド以外の架橋型ヌクレオシドの数は、限定しないが、例えば0～50個、0～40個、0～30個、0～20個、0～15個、0～12個、0～10個、0～8個、又は0～6個であり、好ましくは0～5個、例えば0個、1個、2個、3個、4個、又は5個であってもよい。
　また、二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖に含まれる、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド以外の非天然ヌクレオシドの数は、限定しないが、例えば0～30個、0～20個、0～15個、0～12個、0～10個、0～8個、又は0～6個であり、好ましくは0～5個、例えば0個、1個、2個、3個、4個、又は5個であってもよい。
　一実施形態において、二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドに加えて、少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよい。このリボース2'位修飾ヌクレオシドは、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド（2'-O-Me-修飾ヌクレオシド）、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド（2'-O-MOE修飾ヌクレオシド）、及び2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]修飾ヌクレオシド（2'-O-MCE-修飾ヌクレオシド）からなる群から選択される少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態において、二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを少なくとも1個含み、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド（2'-O-Me-修飾ヌクレオシド）を少なくとも1個含む。
　一実施形態において、二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを少なくとも1個含み、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド（2'-O-MOE修飾ヌクレオシド）を少なくとも1個含む。
　一実施形態において、二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを少なくとも1個含み、2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]修飾ヌクレオシド（2'-O-MCE-修飾ヌクレオシド）を少なくとも1個含む。
　一実施形態において、第1核酸鎖の5’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその3'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよく、第1核酸鎖の3’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその5'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　一実施形態において、第1核酸鎖の5’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその5'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよく、第1核酸鎖の3’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその5'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　一実施形態において、第1核酸鎖の5’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその3'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよく、第1核酸鎖の3’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその3'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　好ましい実施形態では、第1核酸鎖の5’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその5'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよく、第1核酸鎖の3’ウイング領域は、少なくとも1個の上記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシド、及びその3'側の少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、全部又は一部にヌクレオシド模倣体又はヌクレオチド模倣体を含んでもよい。ヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸及び／又はモルホリノ核酸であってもよい。
　第1核酸鎖及び第2核酸鎖におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。ここで、例えば核酸鎖の末端から2つのヌクレオシド間結合とは、核酸鎖の末端に最も近接するヌクレオシド間結合と、それに隣接し、かつ末端とは反対側に位置するヌクレオシド間結合を意味する。核酸鎖の末端領域における修飾ヌクレオシド間結合は、核酸鎖の望ましくない分解を抑制又は阻害できるために好ましい。
　一実施形態で、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の全部又は一部のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、修飾ヌクレオシド間結合を1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、修飾ヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも93％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は100％含んでいてもよい。一実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
　一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、キラル制御されたヌクレオシド間結合を1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、キラル制御されたヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又はそれ以上含んでいてもよい。
　一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、非負荷電ヌクレオシド間結合（好ましくは、中性のヌクレオシド間結合）を1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれ以上含んでいてもよい。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、それぞれ、非負荷電ヌクレオシド間結合を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又はそれ以上含んでいてもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖の5'末端から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合は、修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート結合、1～4個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、TMG部分）を含むヌクレオシド間結合（例、式(IV)で表される部分構造）及び／又は環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合（例、式(III)で表される部分構造）であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、Rp配置又はSp配置にキラル制御されていてもよい。
　第2核酸鎖の3'末端から少なくとも1個（例えば3個）のヌクレオシド間結合は、RNase耐性の高いホスホロチオエート結合のような修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。第2核酸鎖の3'末端にホスホロチオエート修飾等の修飾ヌクレオシド間結合を含む場合、二本鎖核酸複合体の遺伝子抑制活性が向上するので好ましい。
　一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、あるpH（例えば、ヒトの生理学的pH（約7.4）、送達部位（例えば、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物体等）のpH等）において、当該修飾ヌクレオシド間結合が、アニオン形態（例えば、-O-P(O)(O-)-O-（天然リン酸結合のアニオン形態）、-O-P(O)(S-)-O-（ホスホロチオエート結合のアニオン形態）等）と比較して、中性形態又はカチオン形態として存在する非負荷電（それぞれ中性又はカチオン性の）ヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、中性のヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の修飾ヌクレオシド間結合は、カチオン性のヌクレオシド間結合を含む。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合（例えば、中性のヌクレオシド間結合）は、その中性形態をとるとき、pKaが8未満、9未満、10未満、11未満、12未満、13未満、又は14未満の部分を有さない。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、例えば、米国特許登録番号5,264,423及び5,286,717記載のメチルホスホネート結合、米国特許登録番号5,955,599記載のメチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合、国際公開第2015/168172号記載のメトキシプロピルホスホネート結合、国際公開第2016/081600号記載の自己中和核酸(ZON)に用いられるヌクレオシド間結合等である。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、トリアゾール部分又はアルキン部分を含む。一実施形態では、非負荷電ヌクレオシド間結合は、環状グアニジン部分及び/又は１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（好ましくは、TMG部分）を含む。一実施形態では、環状グアニジン部分を含む修飾ヌクレオシド間結合は、式(III)で表される部分構造を有する。一実施形態では、1～4個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分は、式(IV)で表される部分構造を有する。一実施形態では、環状グアニジン部分及び/又は1～4個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分を含む中性のヌクレオシド間結合は、キラル制御される。一実施形態では、本開示は、少なくとも１つの中性のヌクレオシド間結合及び少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、少なくともいくつかの場合では、中性のヌクレオチド間結合は、中性のヌクレオチド間結合を含まない同等の核酸と比較して特性及び／又は活性を改善することができ、例えば、送達を改善し、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対する耐性を改善し、細胞取り込みを改善し、エンドソーム脱出を改善し、及び／又は核取り込みを改善する等する。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、脂質と結合していてもよい。脂質としては、トコフェロール、コレステロール、脂肪酸、リン脂質及びそれらの類縁体；葉酸、ビタミンC、ビタミンB1、ビタミンB2；エストラジオール、アンドロスタン及びそれらの類縁体；ステロイド及びその類縁体；LDLR、SRBI又はLRP1/2のリガンド；FK-506、及びシクロスポリン；PCT/JP2019/12077、PCT/JP2019/10392及びPCT/JP2020/035117記載の脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「トコフェロール」は、トコロールのメチル化誘導体で、クロマンと呼ばれる環状構造を有する脂溶性ビタミン（ビタミンE）である。トコロールは、強い抗酸化作用を有しており、それ故に、生体内では、抗酸化物質として、代謝によって生じるフリーラジカルを消失させ、細胞を傷害から保護する機能を有する。
　トコフェロールは、クロマンに結合するメチル基の位置に基づき、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、及びδ-トコフェロールからなる複数の異なる型が知られている。本明細書におけるトコフェロールは、いずれのトコフェロールであってもよい。また、トコフェロールの類縁体としては、トコフェロールの種々の不飽和類縁体、例えば、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール等が挙げられる。好ましくは、トコフェロールは、α-トコフェロールである。
　本明細書において「コレステロール」とは、ステロイドアルコールとも呼ばれるステロールの1種であり、特に動物において多く存在する。コレステロールは、生体内における代謝過程で重要な機能を果たしている他、動物細胞では、リン脂質と共に細胞の膜系を構成する主要な構成成分でもある。また、コレステロールの類縁体は、ステロール骨格を有するアルコールである、種々のコレステロール代謝産物及び類縁体等を指し、限定されるものではないが、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロール、及びコプロスタノール等を含む。
　本明細書において「類縁体(analog)」とは、同一又は類似の基本骨格を有する類似した構造及び性質を有する化合物を指す。類縁体は、例えば、生合成中間体、代謝産物、置換基を有する化合物等を含む。ある化合物が他の化合物の類縁体であるか否かは、当業者であれば技術常識に基づき判定できる。
　コレステロールの類縁体は、ステロール骨格を有するアルコールである、種々のコレステロール代謝産物及び類縁体等を指し、限定されるものではないが、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロール、及びコプロスタノール等を含む。
　一実施形態において、第2核酸鎖はトコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合していてもよい。コレステロール又はその類縁体と結合した第2核酸鎖は、以下の一般式(V)で示される基を有してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 [式中、Rcは、置換基を有していてもよい炭素数4～18個、好ましくは炭素数5～16個のアルキレン基を表す(ここで、該置換基はハロゲン原子、又はヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数1～3個のアルキル基、例えばヒドロキシメチル基であり、該アルキレン基は相隣接しない炭素原子が酸素原子で置換されていてもよい)。]
　Rcは、限定されないが、-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(CH2OH)-、又は-(CH2)6-であってもよい。
　上記一般式(V)で示される基は、第2核酸鎖の5'末端又は3'末端にリン酸エステル結合を介して結合することができる。
　コレステロール又はその類縁体等の脂質は、第2核酸鎖の5'末端、又は3'末端、或いは両端のいずれに結合していてもよい。また、コレステロール又はその類縁体の脂質は、第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに結合していてもよい。限定はしないが、第2核酸鎖の5'末端に結合したコレステロール又はその類縁体は、特に好適である。
　第2核酸鎖が、コレステロール又はその類縁体を複数含む場合、それらは同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、第2核酸鎖の5'末端にコレステロールが、3'末端に他のコレステロール類縁体がそれぞれ1つずつ結合している場合が該当する。結合位置に関して、コレステロール又はその類縁体は、第2核酸鎖の複数の位置に結合していてもよく、及び/又は1つの位置に一群として結合していてもよい。コレステロール又はその類縁体が、第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。
　第2核酸鎖と脂質との結合は、直接結合であってもよいし、他の物質によって介在される間接結合であってもよい。
　第2核酸鎖と脂質が直接結合をする場合、例えば、共有結合、イオン性結合、水素結合等を介して第2核酸鎖に結合されていればよい。より安定した結合を得ることができるという点を鑑みれば、共有結合が好ましい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、リガンドと結合していない。本明細書において「リガンドと結合していない」とは、トコフェロールやコレステロール等の脂質が結合していないことをいう。さらなる実施形態では、本発明の二本鎖核酸複合体はリガンドと結合していない、すなわち第1核酸鎖及び第2核酸鎖のいずれもリガンドと結合していない。
　第2核酸鎖とコレステロール又はその類縁体が間接結合をする場合、連結基（本明細書では、しばしば「リンカー」と表記する）を介して結合していてもよい。リンカーは切断可能な（cleavable）リンカー又は非切断(uncleavable)リンカーにいずれであってもよい。
　「切断可能なリンカー」とは、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で切断され得るリンカーを意味する。切断可能なリンカーは、ヌクレアーゼ等の内在性酵素によって選択的に切断される。切断可能なリンカーは、限定はしないが、アミド、エステル、ホスホジエステルの一方若しくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、及びジスルフィド結合、並びに天然DNAリンカーが挙げられる。一例として、コレステロール又はその類縁体がジスルフィド結合を介して連結されていてもよい。
　「非切断性リンカー」とは、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で切断されないリンカーを意味する。非切断性リンカーは、限定はしないが、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾若しくは非修飾のデオキシリボヌクレオシド又は修飾若しくは非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。リンカーがDNA等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、鎖長は、特に限定はされないが、通常は2～20塩基長、3～10塩基長又は4～6塩基長であればよい。
　リンカーの一具体例として、以下の式(VI)で表されるリンカーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、
L2は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン、ドデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～C8シクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又はCH(CH2-OH)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-を表し、L3は、-NH-又は結合を表し、L4は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、エチレン、ペンチレン、へプチレン、アンデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～8のシクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-[O-(CH2)2]m-、又は結合を表し、ここで、mは1～25の整数を表し、L5は、-NH-(C=O)-、-(C=O)-、又は結合を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる）。
　一実施形態において、式(VI)で表されるリンカーは、L2が、置換されていないC3～C6のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又は-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-であり、L3が、-NH-であり、L4及びL5が、結合である。
　また、リンカーの別の具体例として、以下の一般式(VII)で表わされるリンカーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　［式中、ｎは０又は１を表す。］
　第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖（好ましくは第2核酸鎖）は、核酸鎖を構成するポリヌクレオチドに結合した少なくとも1つの機能性部分をさらに含んでいてもよい。「機能性部分」とは、二本鎖核酸複合体及び/又は当該機能性部分が結合している核酸鎖に所望の機能を付与する部分をいう。所望の機能には、例えば、標識機能、又は精製機能等が挙げられる。標識機能を与える部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。また、精製機能を与える部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチド等の化合物が挙げられる。一実施形態において、第1核酸鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第2核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二重鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。標的への送達機能を与える部分の例としては、脂質、抗体、アプタマー、特定のレセプターに対するリガンド等が挙げられる。一実施形態において、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖（好ましくは第2核酸鎖）は、機能性部分と結合している。第2核酸鎖と機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第2核酸鎖と機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。
　さらなる実施形態では、第2核酸鎖は、相補的領域の5'末端側及び3'末端側の一方又は両方に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域をさらに含み得る。本実施形態の一例は、国際公開第2018/062510に記載される。
　第1核酸鎖と第2核酸鎖は、リンカーを介して結合していてもよい。この場合、第1核酸鎖と第2核酸鎖は、リンカーを介して連結され、一本鎖を形成しうる。しかし、その場合も機能領域は二本鎖核酸複合体と同じ構成であることから、本明細書では、このような一本鎖核酸も本発明の二本鎖核酸複合体の一実施形態として包含する。リンカーは、任意のポリマーでありうる。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アルキレン等が挙げられる。具体的には、例えば、DNA、RNAといった天然のヌクレオチド又はペプチド核酸、モルホリノ核酸といった非天然のヌクレオチドから構成されうる。リンカーが核酸からなる場合、リンカーの鎖長は少なくとも1塩基、例えば、3～10塩基又は4～6塩基の鎖長をとりうる。好ましくは4塩基の鎖長である。リンカーの位置は、第1核酸鎖の5’側でも3’側のいずれでも可能であるが、例えば、第2核酸鎖の5’側にコレステロール又はその類縁体を結合させた構成の場合には、第1核酸鎖の5’末端と第2核酸鎖の3’末端とがリンカーを介して連結されることになる。リンカーは切断性又は非切断性のいずれであってもよい。
　本発明の二本鎖核酸複合体において、第1核酸鎖が有する標的転写産物に対するアンチセンス効果は、当該分野で公知の方法で測定できる。例えば、二本鎖核酸複合体を細胞等に導入した後、ノーザンブロッティング、定量PCR、又はウェスタンブロッティング等の公知技術を使用することにより測定すればよい。標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(例えば、mRNA量若しくはマイクロRNA等のRNA量、cDNA量、タンパク質量等)を測定することで、二本鎖核酸複合体によって標的遺伝子発現が抑制されるか否かを判定できる。前記判定の基準は、限定はしないが、標的遺伝子の発現量又は標的転写産物の測定値が、陰性対照(例えばビヒクル投与)の測定値と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、又は少なくとも40％減少している場合に、本発明の二本鎖核酸複合体がアンチセンス効果をもたらしたと判定すればよい。
　上記のように、本発明の二本鎖核酸複合体の例示的実施形態について説明したが、本発明の二本鎖核酸複合体は上記の例示的実施形態に限定されない。
１－４．二本鎖核酸複合体の製造方法
　本発明の二本鎖核酸複合体は、当業者であれば、公知の方法を適切に選択することによって製造することができる。限定はしないが、通常は、まず二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖のそれぞれを設計し、製造するところから始まる。例えば、標的転写産物の塩基配列（例えば、標的遺伝子の塩基配列）情報に基づいて第1核酸鎖を設計し、その相補鎖として第2核酸鎖を設計する。続いて、設計した塩基配列情報に基づいて、それぞれの核酸鎖を、例えば、GE Healthcare社、Thermo Fisher Scientific社、Beckman Coulter社等の市販の自動核酸合成装置を使用して合成すればよい。その後は、得られたオリゴヌクレオチドに逆相カラム等を使用して精製することもできる。
　また、機能性部分が結合した二本鎖核酸複合体の場合には、第1核酸鎖は上記方法に準じて製造すればよい。一方、機能性部分が結合した第2核酸鎖は、機能性部分が予め結合した核酸種を用いて、上記の合成、及び精製を行い、製造することができる。例えば、コレステロール又はその類縁体が予め結合された核酸種を用いて、上記の合成及び精製を実施することによって第2核酸鎖を製造してもよい。或いは、上記の合成及び精製を実施することによって製造された第2核酸鎖に、公知の方法によりコレステロール又はその類縁体を結合させてもよい。各核酸鎖を製造後、第1核酸鎖と第2核酸鎖に対して、アニーリングを実施することによって目的とする機能性部分が結合した二本鎖核酸複合体製造することができる。具体的には、核酸を適切な緩衝溶液中で混合し、約90℃～98℃で数分間（例えば5分間）変性させ、その後核酸を約30℃～70℃で約1～8時間アニールして、本発明の二本鎖核酸複合体の1つを製造することができる。機能性部分を核酸に連結する方法は当該技術分野において周知である。また、核酸鎖は、塩基配列並びに修飾部位及び種類を指定して、各種メーカー(例えば、株式会社ジーンデザイン)に注文し、入手することもできる。
１－５．効果
　本発明の二本鎖核酸複合体によれば、二本鎖核酸複合体の有効性が損なうことなく、二本鎖核酸複合体の毒性を軽減又は消失することができる。すなわち、従来の二本鎖核酸複合体と比較して、標的遺伝子に対するアンチセンス効果を損なうことなく、肝毒性や腎毒性が低減されており、炎症若しくはグリオーシスの惹起、又はサイトカイン若しくはケモカインの異常上昇が低減されている。
２．医薬組成物
２－１．概要
　本発明の第２態様は医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、前記第１態様の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む。本発明の医薬組成物は、低肝毒性及び／又は低腎毒性である。また、炎症若しくはグリオーシスの惹起、又はサイトカイン若しくはケモカインの異常上昇が低減されている。
　以下、本発明の医薬組成物が包含し得る各成分について具体的に説明をする。
２－２．構成
２－２－１．有効成分
　本発明の医薬組成物は、有効成分として少なくとも第１態様に記載の二本鎖核酸複合体を包含する。本発明の医薬組成物は、二本鎖核酸複合体を二種以上含んでもよい。
　医薬組成物に含まれる二本鎖核酸複合体の量（含有量）は、二本鎖核酸複合体の種類、送達部位、医薬組成物の剤形、医薬組成物の投与量、並びに後述する担体の種類によって異なる。したがって、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。通常は、単回投与量の医薬組成物に有効量の二本鎖核酸複合体が包含されるように調整する。「有効量」とは、二本鎖核酸複合体が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被検体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。最終的には医師、獣医師又は薬剤師等の判断によって決定される。「被検体の情報」とは、医薬組成物を適用する生体の様々な個体情報である。例えば、被検体がヒトであれば、年齢、体重、性別、食生活、健康状態、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。
２－２－２．担体
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、植物性油、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香味料、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、溶解助剤、及び他の添加剤が挙げられる。
　溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　上記担体は、有効成分である二本鎖核酸複合体の生体内での酵素等による分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
２－２－３．剤形
　本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分である第１態様に記載の二本鎖核酸複合体を分解等により不活化させることなく、標的部位まで送達し、生体内でその有効成分の薬理効果（標的遺伝子の発現に対するアンチセンス効果）を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
　具体的な剤形は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。投与方法は、非経口投与と経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
　投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、対象部位への直接投与又は循環系を介した全身投与が可能な液剤である。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、エリキシル剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。その他、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、及び坐剤であってもよい。
　投与方法が経口投与であれば、好ましい剤形は、固形剤や液剤であってもよく、例えば、錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤、丸剤、顆粒剤、粉剤、散剤、内用水剤、乳剤、シロップ剤、ペレット剤、舌下剤、解膠剤(peptizer)、バッカル剤、ペースト剤、懸濁剤、エリキシル剤、コーティング剤、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、注射剤、及び坐剤が挙げられる。固形剤であれば、必要に応じて、当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明の医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。
　特定の実施形態において、本発明の二本鎖核酸複合体は、水、日本薬局方溶出試験第２液、又は日本薬局方崩壊試験第２液に対する溶解性に優れ、体内動態（例、血中薬物半減期、脳内移行性、代謝安定性、CYP阻害）に優れ、毒性が低く（例えば、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、薬物相互作用、癌原性、光毒性等の点から医薬として、より優れている）、かつ副作用も少ない（例えば、過沈静（sedation）の抑制、層状壊死の回避）等の医薬品として優れた性質も有する。
２－３．投与形態及び投与量
　本明細書において、医薬組成物の好ましい投与形態には特定の限定はない。例えば、経口投与又は非経口投与であればよい。非経口投与の具体例として、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与（埋め込み型持続皮下投与を含む）、皮内投与、気管／気管支投与、直腸投与、輸血による投与、脳室内投与、髄腔内投与、経鼻投与、及び筋肉内投与が挙げられる。
　医薬組成物が投与又は摂取により適用される場合、投与量又は摂取量は、例えば、包含する二本鎖核酸複合体が0.00001mg/kg/日～10000mg/kg/日、又は0.001mg/kg/日～100mg/kg/日となるようにすればよい。医薬組成物は、単回投与でも、複数回投与であってもよい。複数回投与の場合、毎日若しくは適当な時間間隔で（例えば1日、2日、3日、1週間、2週間、1ヶ月の間隔で）、例えば2～20回等投与することもできる。上記の二本鎖核酸複合体の1回の投与量は、例えば、0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、0.25mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1.0mg/kg以上、2.0mg/kg以上、2.5mg/kg以上、3.0mg/kg以上、4.0mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、若しくは500mg/kg以上とすることができ、例えば、0.001mg/kg～500mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、若しくは200mg/kg）を適宜選択することができる。
　本発明の二本鎖核酸複合体は、0.01～10mg/kg（例えば約6.25mg/kg）の用量で週2回の頻度で4回投与してもよい。また、二本鎖核酸複合体は、0.05～30mg/kg（例えば約25mg/kg）の用量で週1～2回の頻度で2～4回、例えば週2回の頻度で2回投与してもよい。このような投与レジメン（分割投与）の採用により、より高用量の単回投与に比べて、毒性（例えば血小板の減少を回避する）を下げ、被検体への負荷を低減することができる。
　医薬組成物は反復投与でも細胞内において抑制効果が相加的に働く。また、反復投与する場合、ある程度の投与間隔（例えば、半日以上）をおいた方が有効性を向上させることができる。
　一実施形態において、本態様の医薬組成物は脳室内投与又は髄腔内投与される。本態様の医薬組成物を脳室内投与又は髄腔内投与する場合、サルやヒトの場合には0.01mg以上、0.1mg以上、又は1mg以上、例えば、2mg以上、3mg以上、4mg以上、5mg以上、10mg以上、20mg以上、30mg以上、40mg以上、50mg以上、75mg以上、100mg以上、200mg以上、300mg以上、400mg以上、又は500mg以上投与してもよく、0.01mg～1000mg、0.1mg～200mg、又は1mg～20mg投与してもよく、マウスの場合には1μg以上投与してもよい。
　一実施形態において、本態様の医薬組成物は静脈内投与又は皮下投与される。本態様の医薬組成物を静脈内投与又は皮下投与する場合、0.01mg/kg以上、0.1mg/kg以上、又は1mg/kg以上、例えば、2mg/kg以上、3mg/kg以上、4mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、又は500mg/kg以上投与してもよく、0.01mg/kg～1000mg/kg、0.1mg/kg～100mg/kg、又は1mg/kg～10mg/kg投与してもよい。
２－４．適用対象疾患
　医薬組成物の適用対象となる疾患は、限定せず、神経疾患、中枢神経系疾患、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を対象とすることができる。　一実施形態において、本態様の医薬組成物は被検体の中枢神経系疾患を治療するために用いることができる。本態様の医薬組成物の適用対象となる中枢神経系疾患として、特に限定されないが、例えば、脳腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病等が挙げられる。
２－５．効果
　本発明の医薬組成物は、低肝毒性及び／又は低腎毒性である。また、本発明の医薬組成物は、脳室内投与、髄腔内投与、静脈内投与、皮下投与等による炎症若しくはグリオーシスの惹起、又はサイトカイン若しくはケモカインの異常上昇が低減されている。
　本発明の医薬組成物によれば、実質的に肝毒性及び／又は腎毒性を伴うことなく、特定の遺伝子の発現を抑制又は阻害することによって、疾患を治療又は予防することができる。また、炎症若しくはグリオーシスが実質的に惹起されることなく、サイトカイン若しくはケモカインの異常上昇を低減しながら、疾患を治療又は予防することができる。
　特に、アルツハイマー病等の神経疾患の治療には高用量の核酸剤の投与が必要となり、重篤な肝障害の副作用が問題になるが、本発明の医薬組成物によればそのような副作用を大幅に低減することが可能となる。
　上記の二本鎖核酸複合体又は医薬組成物を被検体に投与することを含む、中枢神経系疾患等の疾患の治療及び／又は予防方法もまた提供される。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：HDO(scpBNA)の脳室内投与による遺伝子抑制効果及び毒性軽減効果＞
（目的）
　scpBNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸（以下、「ASO(scpBNA)」と称する）からなる第1核酸鎖、及び第1核酸鎖に相補的な塩基配列を有するRNAで構成される第2核酸鎖を含むヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（以下、「HDO(scpBNA)」と称する）について、脳室内投与による遺伝子抑制効果及び毒性軽減効果をin vivo実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたHDO(scpBNA)を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表1及び図3Dに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　HDO(scpBNA)の第1核酸鎖は、5'末端及び3'末端にそれぞれ3個のscpBNAヌクレオシドから構成される5'ウイング領域及び3'ウイング領域を含み、それらの間に10個のDNAヌクレオシドを含む、scpBNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸である。第1核酸鎖の塩基配列は、マウスのmicrotubule-associated protein tau (Mapt) mRNAの一部に相補的である。HDO(scpBNA)の第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な配列を有するRNAで構成されている。なお、HDO(scpBNA)の第1核酸鎖及び第2核酸はいずれもリガンドと結合していない。
　なお、本明細書の実施例で使用したscpBNAは、以下の式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で示される非天然ヌクレオシドである。
　HDO(scpBNA)の比較対照として、LNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸（以下、「ASO(LNA)」と称する）を含むヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド（以下、「HDO(LNA)」と称する）を用いた。本実施例で用いたHDO(LNA)を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の構造と塩基配列を表2及び図3Bに示す。HDO(LNA)の第1核酸鎖及び第2核酸はいずれもリガンドと結合していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記の二本鎖核酸複合体を調製するために、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして二本鎖核酸複合体を調製した。アニールした核酸を4℃又は氷上で保存した。全てのオリゴヌクレオチドは株式会社ジーンデザイン(Gene Design)(大阪、日本)によって委託合成された。
　また、本実施例では一本鎖のギャップマー型アンチセンス核酸として、表1に示す第1核酸鎖のみからなるASO(scpBNA)、及び表2に示す第1核酸鎖のみからなるASO(LNA)についても以下の実験を行った。
（２）in vivo実験
　7週齢雌のICRマウスを、2.5～4％イソフルレン麻酔下にて脳定位固定装置に固定した。その後、耳間に前後2～3cmで皮膚を切開し、ブレグマ(bregma)の1mm左方かつ0.2mm後方に1mm径ドリルで穿孔した。ハミルトン(Hamilton)シリンジ内に核酸剤を充填した。穿孔部より針を3mm程度刺入し、2～3μl/分の速度で、マウス1匹あたり24μmol/匹の用量の核酸剤を左側脳室内投与し(n=2)、ナイロン糸で皮膚縫合した。注射の7日後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して左海馬を摘出した。
（３）発現解析
　IsogenIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用して、摘出した左海馬からRNAを抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master, DNase (ロシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics))を使用してプロトコルに従って合成した。
　次に、各種核酸剤について遺伝子抑制効果及び毒性を評価するために、得られたcDNAを鋳型として定量RT-PCRを行った。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドサイエンス社(Roche Applied Science))により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Sceientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計及び製造された製品であった。増幅条件(温度及び時間)は以下の通りであった：95℃で15秒、60℃で30秒、及び72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。
　核酸剤による遺伝子抑制効果を評価するために、Mapt mRNA及びActb mRNA (内部標準遺伝子)の発現量を測定し、両者の比率を計算した。また、核酸剤による毒性を評価するために、炎症性サイトカインの指標としてTumor Necrosis Factor-α(TNFα) mRNAの発現量を、アストロサイトの活性化・グリオーシスの指標としてGlial fibrillary acidic protein(GFAP) mRNAの発現量を同様に測定した。
（結果）
　図4は、各種核酸剤を左側脳室内に投与したマウスの左海馬におけるMapt mRNA発現量を示す。ASO(LNA)、HDO(LNA)、ASO(scpBNA)、及びHDO(scpBNA)の脳室内投与では、Mapt遺伝子抑制効果に有意な差は認められなかった。
　図5は、各種核酸剤を左側脳室内に投与したマウスの左海馬におけるTNFα mRNA及びGFAP mRNAの発現量を示す。ASO(LNA)及びHDO(LNA)では、PBS投与と比較してTNFα mRNA及びGFAP mRNAの発現量に有意な上昇が認められた。これに対して、ASO(scpBNA)及びHDO(scpBNA)では、PBS投与と比較してTNFα mRNA及びGFAP mRNAの発現量に有意な上昇が認められず、炎症性サイトカイン・グリオーシスの惹起が軽減された。
　これらの結果から、scpBNAが従来のLNAが有する遺伝子制御効果を減弱せずに中枢神経の副作用を軽減する効果を有することが示され、その軽減効果は、一本鎖のASOのみならずHDO構造においても同様に認められた。
＜実施例２：mMalat1を標的とするToc-HDO(scpBNA)の単回静脈内投与による遺伝子抑制効果と肝毒性軽減効果＞
（目的）
　mMalat1を標的とする、scpBNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とトコフェロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体、及びAmNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とトコフェロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体について、単回静脈内投与による標的遺伝子発現抑制効果を検証すると共に、毒性軽減効果について検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　標的遺伝子は転移関連肺腺癌転写産物1(mMalat1)とした。本実施例で用いた3種類の二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列を表3及び図6に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　上記第1核酸鎖は、mMalat1遺伝子を標的とし、その転写産物であるmalat1ノンコーディングRNAの一部に相補的な塩基配列を有する13merのギャップマーで構成される。Toc-HDO(LNA)の第1核酸鎖は、5’末端の3個のLNAヌクレオシドで構成される5'ウイング領域、3’末端の2個のLNAヌクレオシドで構成される3'ウイング領域、及びそれらの間の8個がDNAヌクレオシドからなる。Toc-HDO(scpBNA)及びToc-HDO(AmNA)では、5'及び3'ウイング領域におけるLNAヌクレオシドの一部がscpBNA又はAmNAヌクレオシドで置換されている。
　一方、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な配列を有し、かつその5’末端にトコフェロールを結合したトコフェロール結合型相補鎖RNAで構成されている。
　なお、本明細書の実施例で使用したAmNAは、以下の式（II）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、Ｒはメチル基を示す。）
で示される非天然ヌクレオシドである。
　二本鎖核酸複合体は、実施例１の（１）と同様の方法で調製した。
（２）in vivo実験
　二本鎖核酸複合体剤を投与するマウスは、体重20gの6～7週齢の雄のC57BL/6マウスを用いた。各条件についてn=4で実験を行った。
　二本鎖核酸複合体剤を単回投与で、尾静脈を通じて50mg/kgでマウスに静脈内注射した。さらに、陰性対照群としてPBSのみを単回投与で注射したマウスも作製した。
　投与後72時間の時点で採血後、PBSをマウスに灌流させた。その後マウスを解剖して肝臓、腎臓、心筋、及び大腿四頭筋を摘出した。
（３）発現解析
　ハイスループット全自動核酸抽出装置MagNA Pure 96(ロシュ・ライフサイエンス社)を使用して、各組織からmRNAをプロトコルに従って抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・ライフサイエンス社)のプロトコルに従って合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・ライフサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)によって設計及び製造された製品を用いた。PCR条件(温度及び時間)は、95℃で15秒、60℃で30秒、及び72℃で1秒を1サイクルとして、40サイクルの繰り返しとした。得られた増幅産物を定量RT-PCRによって定量し、malat1 mRNA及びGAPDH mRNA（内部標準遺伝子)の発現量を計算し、両者の比率から相対的発現レベルを得て、相対的発現レベルの平均値及び標準誤差を算出した。また各群の間の差をt-検定によって解析した。
（４）血清の解析
　採血して得られた血清は、株式会社エスアールエル八王子ラボへの委託により解析した。
（結果）
　発現解析の結果を図7～8に示す。Toc-HDO(scpBNA)及びToc-HDO(AmNA)は、肝臓（図7A）、腎臓（図7B）、大腿四頭筋（図8A）、及び心筋（図8B）のいずれにおいても、Toc-HDO(LNA)と同等な遺伝子抑制効果を示した。
　血清解析の結果を図9Aに示す。Toc-HDO(LNA)投与群では、AST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の測定値が大幅に上昇し、肝機能低下を示した。一方、Toc-HDO(scpBNA)投与群及びToc-HDO(AmNA)投与群では、AST及びALTの大幅な増大は検出されず、肝毒性が軽減することが示された。
　さらに、Toc-HDO(LNA)投与群は体重の減少が認められた一方、Toc-HDO(scpBNA)投与群及びToc-HDO(AmNA)投与群では体重に有意な変化が認められなかった（図9B）。
　以上の結果から、第1核酸鎖のウイング領域においてLNAの一部をscpBNA又はAmNAで置換することにより、HDOによる遺伝子抑制効果を減弱することなく、その毒性を軽減できることが示された。
＜実施例３：PTENを標的とするToc-HDO(scpBNA)の単回静脈内投与による遺伝子抑制効果と肝毒性軽減効果＞
（目的）
　PTENを標的とする、scpBNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とトコフェロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体、及びAmNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とトコフェロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体について、単回静脈内投与による標的遺伝子発現抑制効果を検証すると共に、毒性軽減効果について検証する。
（方法）
　標的遺伝子はPTEN(Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10)とした。本実施例で用いた3種類の二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列と化学修飾を表4及び図10に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　上記第1核酸鎖は、PTEN遺伝子を標的とし、PTEN mRNAの一部に相補的な塩基配列を有する14merのギャップマーで構成される。Toc-HDO(LNA)の第1核酸鎖は、5’末端の2個のLNAヌクレオシドで構成される5'ウイング領域、3’末端の2個のLNAヌクレオシドで構成される3'ウイング領域、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドからなる。Toc-HDO(scpBNA)及びToc-HDO(AmNA)では、5'及び3'ウイング領域におけるLNAヌクレオシドの全部がscpBNA又はAmNAヌクレオシドで置換されている。
　一方、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な配列を有し、かつその5’末端にトコフェロールを結合したトコフェロール結合型相補鎖RNAで構成されている。
　二本鎖核酸複合体は、実施例１の（１）と同様の方法で調製した。
　in vivo実験は、二本鎖核酸複合体剤を35mg/kgでマウスに静脈内注射した点を除いて、実施例２と同様に行った。発現解析及び血清の解析は、実施例２と同様の方法で行った。
（結果）
　発現解析の結果を図11～12に示す。Toc-HDO(scpBNA)及びToc-HDO(AmNA)は、肝臓（図11A）、腎臓（図11B）、大腿四頭筋（図12A）、及び心筋（図12B）において、Toc-HDO(LNA)と概ね同等以上の遺伝子抑制効果を示した。
　血清解析の結果を図13Aに示す。Toc-HDO(LNA)投与群では、AST及びALTが大幅に上昇し、肝機能低下を示した。一方、Toc-HDO(scpBNA)投与群及びToc-HDO(AmNA)投与群では、AST及びALTの大幅な増大は検出されず、肝毒性が軽減することが示された。
　さらに、Toc-HDO(LNA)投与群は体重の大幅な減少が認められた一方、Toc-HDO(scpBNA)投与群及びToc-HDO(AmNA)投与群では大きな変化は認められなかった（図13B）。
　以上の結果から、第1核酸鎖のウイング領域を構成するヌクレオシドの全部又は一部をscpBNA又はAmNAで置換することにより、HDOによる遺伝子抑制効果を減弱することなく、その毒性を軽減できることが示された。
＜実施例４：SR-B1を標的とするToc-HDO(scpBNA)の単回静脈内投与による遺伝子抑制効果と肝毒性軽減効果＞
（目的）
　SR-B1を標的とする、scpBNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とトコフェロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体、及びAmNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とトコフェロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体について、単回静脈内投与による標的遺伝子発現抑制効果を検証すると共に、毒性軽減効果について検証する。
（方法）
　標的遺伝子はスカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1; SR-B1）遺伝子とした。本実施例で用いた3種類の二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列を表5及び図10に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　上記第1核酸鎖は、SR-B1遺伝子を標的とし、SR-B1 mRNAの一部に相補的な塩基配列を有する14merのギャップマーで構成される。Toc-HDO(LNA)の第1核酸鎖は、5’末端の2個のLNAヌクレオシドで構成される5'ウイング領域、3’末端の2個のLNAヌクレオシドで構成される3'ウイング領域、及びそれらの間の10個がDNAヌクレオシドからなる。Toc-HDO(scpBNA)及びToc-HDO(AmNA)では、5'及び3'ウイング領域におけるLNAヌクレオシドの全部がscpBNA又はAmNAヌクレオシドで置換されている。
　一方、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な配列を有し、かつその5’末端にトコフェロールを結合したトコフェロール結合型相補鎖RNAで構成されている。
　二本鎖核酸複合体は、実施例１の（１）と同様の方法で調製した。
　in vivo実験、発現解析、及び血清の解析は、実施例２と同様の方法で行った。
（結果）
　発現解析の結果を図14～15に示す。Toc-HDO(scpBNA)及びToc-HDO(AmNA)は、肝臓（図14A）、腎臓（図14B）、大腿四頭筋（図15A）、及び心筋（図15B）のいずれにおいても、Toc-HDO(LNA)と同等な遺伝子抑制効果を示した。
　血清解析の結果を図16Aに示す。Toc-HDO(LNA)投与群では、AST及びALTが大幅に上昇し、肝機能低下を示した。一方、Toc-HDO(scpBNA)投与群及びToc-HDO(AmNA)投与群では、AST及びALTが増大せず、肝毒性が検出されなかった。
　さらに、Toc-HDO(LNA)投与群は体重の減少が認められた一方、Toc-HDO(scpBNA)投与群及びToc-HDO(AmNA)投与群では体重に有意な変化が認められなかった（図16B）。
　以上の結果から、第1核酸鎖のウイング領域を構成するヌクレオシドの全部又は一部をscpBNA又はAmNAで置換することにより、HDOによる遺伝子抑制効果を減弱することなく、その毒性を軽減できることが示された。
＜実施例５：Chol-HDO(scpBNA)の複数回静脈内投与による遺伝子抑制効果と肝毒性軽減効果＞
（目的）
　SR-B1を標的とする、scpBNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とコレステロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体について、複数回静脈内投与による標的遺伝子発現抑制効果を検証すると共に、毒性軽減効果について検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　標的遺伝子はSR-B1遺伝子とした。本実施例で用いた2種類の二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基配列を表6及び図17に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　上記第1核酸鎖は、SR-B1遺伝子を標的とし、SR-B1 mRNAの一部に相補的な塩基配列を有する14merのギャップマーで構成される。Chol-HDO(LNA)の第1核酸鎖は、5’末端の2個のLNAヌクレオシドで構成される5'ウイング領域、3’末端の2個のLNAヌクレオシドで構成される3'ウイング領域、及びそれらの間の10個のDNAヌクレオシドからなる。Chol-HDO(scpBNA)では、5'及び3'ウイング領域におけるLNAヌクレオシドの全部がscpBNAヌクレオシドで置換されている。
　一方、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な配列を有し、かつその5’末端にコレステロールを結合したコレステロール結合型相補鎖RNAで構成されている。
　二本鎖核酸複合体は、実施例１の（１）と同様の方法で調製した。
（２）in vivo実験
　二本鎖核酸複合体剤を投与するマウスは、体重20gの6～7週齢の雄のC57BL/6マウスを用いた。各条件についてn=4で実験を行った。
　二本鎖核酸複合体剤を複数回投与（週1回、計4回投与）で、尾静脈を通じて50mg/kgでマウスに静脈内注射した。さらに、陰性対照群としてPBSのみを単回投与で注射したマウスも作製した。
　投与後72時間の時点で採血後、PBSをマウスに灌流させた。その後マウスを解剖して脳の各部位及び全身を摘出した。
（３）発現解析
　ハイスループット全自動核酸抽出装置MagNA Pure 96(ロシュ・ライフサイエンス社)を使用して、各組織からmRNAをプロトコルに従って抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・ライフサイエンス社)のプロトコルに従って合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・ライフサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)によって設計及び製造された製品を用いた。PCR条件(温度及び時間)は、95℃で15秒、60℃で30秒、及び72℃で1秒を1サイクルとして、40サイクルの繰り返しとした。得られた増幅産物を定量RT-PCRによって定量し、その結果に基づいて、SR-B1 mRNA及びActin mRNA(内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、両者の比率から相対的発現レベルを得た。相対的発現レベルの平均値及び標準誤差を算出した。また各群の間の差をt-検定によって解析した。
（４）血清の解析
　採血して得られた血清は、株式会社エスアールエル八王子ラボへの委託により解析した。
（結果）
　発現解析の結果を図18に示す。Chol-HDO(scpBNA)は、脳内（図18A）及び全身臓器（図18B）で強い遺伝子抑制効果を示した。
　血清解析の結果を図19に示す。Chol-HDO(LNA)投与群では、初回投与後、3日後にAST/ALTが高度に上昇し、5～6日後に死亡した。これに対して、Chol-HDO(scpBNA)投与群では4回投与後も生存して、AST/ALTの上昇は軽度であった。
　以上の結果から、複数回投与においても、第1核酸鎖のウイング領域にscpBNAを配置することによりHDOの毒性が軽減されることが示された。
＜実施例６：Toc-HDO(scpBNA)の単回静脈内投与による血中炎症性サイトカイン／ケモカイン発現軽減効果＞
（目的）
　scpBNA/DNAギャップマー型アンチセンス核酸とトコフェロール結合型相補鎖からなる二本鎖核酸複合体を静脈内投与した場合の血中炎症性サイトカイン／ケモカイン発現について検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例では、表3に記載のmMalat1を標的とするToc-HDO(LNA)、Toc-HDO(scpBNA)、及びToc-HDO(AmNA)、表4に記載のPTENを標的とするToc-HDO(LNA)、Toc-HDO(scpBNA)、及びToc-HDO(AmNA)、並びに表5に記載のSR-B1を標的とするToc-HDO(LNA)、Toc-HDO(scpBNA)、及びToc-HDO(AmNA)を用いた。二本鎖核酸複合体は、実施例１の（１）と同様の方法で調製した。
（２）in vivo実験
　in vivo実験は、mMalat1を標的とするHDOの投与量を50mg/kgとし、PTENを標的とするHDOの投与量を35mg/kgとした点を除き、実施例２と同様に行った。すなわち、二本鎖核酸複合体剤を単回投与で、尾静脈を通じて静脈内投与した。
　投与後72時間の時点で採血を行った。
（３）血中の炎症性サイトカイン／ケモカインの定量
　採血して得られた血液の解析は、MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex（Millipore）を用いて、説明書に記載の方法に従って行った。核酸剤による毒性を評価するために、以下のタンパク質群：G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12 (p40)、IL-12 (p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、KC、LIF、LIX、MCP-1、M-CSF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、RANTES、TNFα、VEGF、及びEotaxin/CCL11を対象としてタンパク質量を測定した。その結果、Toc-HDO(LNA)投与で上昇がみられた、TNFα、IP-10、及びRANTESを炎症の指標として測定した。
（結果）
　血中の炎症性サイトカイン量を測定した結果を図20～図22に示す。
　図20～図22に示す通り、Toc-HDO(LNA)投与群と比較して、Toc-HDO(scpBNA)投与群及びToc-HDO(AmNA)投与群では、TNFα（図20）、IP-10（図21）、及びRANTES（図22）のいずれの発現量も低いことが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (21)

  1. 　第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、
    　前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、前記標的遺伝子又はその転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
    　前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、
    　前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖は、以下の式（I）又は式（II）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒは水素原子又はメチル基を示す。）
    で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを少なくとも１個含む、前記二本鎖核酸複合体。
  2. 　前記第1核酸鎖がギャップマーである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  3. 　前記第1核酸鎖が、
    　(1)少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、
    　(2)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び
    　(3)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、請求項２に記載の二本鎖核酸複合体。
  4. 　前記5’ウイング領域及び／又は前記3’ウイング領域が前記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを含む、請求項３に記載の二本鎖核酸複合体。
  5. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の前記中央領域における少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含む、請求項３又は４に記載の二本鎖核酸複合体。
  6. 　前記第2核酸鎖が、少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドをさらに含む、請求項５に記載の二本鎖核酸複合体。
  7. 　前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に前記式（I）又は式（II）で示される架橋型の非天然ヌクレオシドを含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  8. 　前記第1核酸鎖がミックスマーである、請求項１に記載の二本鎖核酸複合体。
  9. 　前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖が、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及び2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]修飾ヌクレオシドからなる群から選択される少なくとも1個のリボース2'位修飾ヌクレオシドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  10. 　前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１～９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  11. 　前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１０に記載の二本鎖核酸複合体。
  12. 　前記第2核酸鎖が、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合している、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  13. 　リガンドと結合していない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  14. 　前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖とが切断性又は非切断性リンカーを介して結合している、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  15. 　請求項１～１４のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む医薬組成物。
  16. 　被検体の中枢神経系疾患を治療するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　脳室内投与又は髄腔内投与される、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
  18. 　前記二本鎖核酸複合体が0.1mg～200mg投与される、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 　静脈内投与又は皮下投与される、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
  20. 　前記二本鎖核酸複合体が0.1mg/kg～100mg/kg投与される、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 　炎症若しくはグリオーシスの惹起、又はサイトカイン若しくはケモカインの異常上昇が低減されている、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5286717A (en) 1987-03-25 1994-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5955599A (en) 1995-06-01 1999-09-21 Hybridon, Inc. Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages
WO2007143315A2 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceutical, Inc. Compounds and methods for modulating expression of pcsk9
WO2008043753A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
WO2008049085A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
WO2013089283A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Chimeric double-stranded nucleic acid
WO2014192310A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Double-stranded agents for delivering therapeutic oligonucleotides
WO2015168172A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
WO2016081600A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Zata Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidite synthones for the synthesis of self-neutralizing oligonucleotide compounds
WO2018056442A1 (ja) * 2016-09-23 2018-03-29 国立大学法人東京医科歯科大学 血液脳関門通過型ヘテロ２本鎖核酸
WO2018062510A1 (ja) 2016-09-29 2018-04-05 国立大学法人東京医科歯科大学 オーバーハングを有する二本鎖核酸複合体
WO2020209285A1 (ja) * 2019-04-08 2020-10-15 国立大学法人東京医科歯科大学 筋疾患治療用医薬組成物
JP2021087941A (ja) 2019-11-21 2021-06-10 日本無機株式会社 エアフィルタ

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5286717A (en) 1987-03-25 1994-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5955599A (en) 1995-06-01 1999-09-21 Hybridon, Inc. Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages
WO2007143315A2 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceutical, Inc. Compounds and methods for modulating expression of pcsk9
WO2008043753A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
WO2008049085A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
WO2013089283A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Chimeric double-stranded nucleic acid
JP2015502134A (ja) * 2011-12-16 2015-01-22 国立大学法人 東京医科歯科大学 キメラ２重鎖核酸
WO2014192310A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Double-stranded agents for delivering therapeutic oligonucleotides
WO2015168172A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
WO2016081600A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Zata Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidite synthones for the synthesis of self-neutralizing oligonucleotide compounds
WO2018056442A1 (ja) * 2016-09-23 2018-03-29 国立大学法人東京医科歯科大学 血液脳関門通過型ヘテロ２本鎖核酸
WO2018062510A1 (ja) 2016-09-29 2018-04-05 国立大学法人東京医科歯科大学 オーバーハングを有する二本鎖核酸複合体
WO2020209285A1 (ja) * 2019-04-08 2020-10-15 国立大学法人東京医科歯科大学 筋疾患治療用医薬組成物
JP2021087941A (ja) 2019-11-21 2021-06-10 日本無機株式会社 エアフィルタ

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDER A. LOMZOV ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN., vol. 513, no. 4, 2019, pages 807 - 811
ANASTASIA KHVOROVA ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 35, no. 3, 2017, pages 238 - 248
ASAMI Y ET AL.: "Drug delivery system of therapeutic oligonucleotides", DRUG DISCOVERIES & THERAPEUTICS, vol. 10, no. 5, 2016, pages 256 - 262, XP055634473, DOI: 10.5582/ddt.2016.01065
ASAMI YUTARO, NAGATA TETSUYA, YOSHIOKA KOTARO, KUNIEDA TAIKI, YOSHIDA-TANAKA KIE, BENNETT C. FRANK, SETH PUNIT P., YOKOTA TAKANORI: "Efficient Gene Suppression by DNA/DNA Double-Stranded Oligonucleotide In Vivo", MOLECULAR THERAPY, ELSEVIER INC., US, vol. 29, no. 2, 1 February 2021 (2021-02-01), US , pages 838 - 847, XP055834158, ISSN: 1525-0016, DOI: 10.1016/j.ymthe.2020.10.017 *
MASAHIKO HORIBA, TAKAO YAMAGUCHI, SATOSHI OBIKA: "Synthesis of scpBNA- m C, -A, and -G Monomers and Evaluation of the Binding Affinities of scpBNA-Modified Oligonucleotides toward Complementary ssRNA and ssDNA", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 81, no. 22, 18 November 2016 (2016-11-18), pages 11000 - 11008, XP055376695, ISSN: 0022-3263, DOI: 10.1021/acs.joc.6b02036 *
NAOKI IWAMOTO ET AL., ANGEW. CHEM. INT. ED. ENGL., vol. 48, no. 3, 2009, pages 496 - 9
NAOKI IWAMOTO ET AL., NAT. BIOTECHNOL, vol. 35, no. 9, 2017, pages 845 - 851
NATSUHISA OKA ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 125, 2003, pages 8307 - 8317
NATSUHISA OKA ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 130, 2008, pages 16031 - 16037
NISHIKAWA MAKIYA, YUKITAKE YOSHIOKA, MAKOTO NAGAOKA, KOSUKE KUSAMORI: "Development of Oligonucleotide Therapeutics: Tissue Distribution and Drug Delivery System", DDS. DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 36, no. 1, 25 January 2021 (2021-01-25), pages 40 - 50, XP093006747, DOI: 10.2745/dds.36.40 *
NISHINA K: "DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing", NATURE COMMUNICATION, vol. 6, 2015, pages 7969, XP055834307, DOI: 10.1038/ncomms8969
OKIBA SATOSHI: "Building a platform for innovative non-toxic oligonucleotide therapeutics -Synthesis, screening, and evaluation of dual-modified artificial nucleic acids-", BASIC SCIENCE AND PLATFORM TECHNOLOGY PROGRAM FOR INNOVATIVE BIOLOGICAL MEDICINE; FY2015 GENERAL RESEARCH AND DEVELOPMENT REPORT, 1 January 2015 (2015-01-01), XP093006748 *
SETOGUCHI KIYOKO, CUI LIN, HACHISUKA NOBUTAKA, OBCHOEI SUMALEE, SHINKAI KENTARO, HYODO FUMINORI, KATO KIYOKO, WADA FUMITO, YAMAMOT: "Antisense Oligonucleotides Targeting Y-Box Binding Protein-1 Inhibit Tumor Angiogenesis by Downregulating Bcl-xL-VEGFR2/-Tie Axes", MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS, CELL PRESS, US, vol. 9, 1 December 2017 (2017-12-01), US , pages 170 - 181, XP055941192, ISSN: 2162-2531, DOI: 10.1016/j.omtn.2017.09.004 *
TAKAO INOUE, KIYOMI SASAKI, TOKUYUKI YOSHIDA: "Current status of development of oligonucleotide therapeutics", DRUG DELIVERY SYSTEM., NIHON D D S GAKKAI, JAPAN, vol. 34, no. 2, 25 March 2019 (2019-03-25), Japan , pages 86 - 98, XP009539425, ISSN: 0913-5006, DOI: 10.2745/dds.34.86 *
YOHEI NUKAGA ET AL., J. ORG. CHEM., vol. 77, 2012, pages 7913 - 7922
YOHEI NUKAGA ET AL., J. ORG. CHEM., vol. 81, 2016, pages 2753 - 2762

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