WO2024005156A1 - 核酸医薬の毒性軽減剤 - Google Patents

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WO2024005156A1
WO2024005156A1 PCT/JP2023/024244 JP2023024244W WO2024005156A1 WO 2024005156 A1 WO2024005156 A1 WO 2024005156A1 JP 2023024244 W JP2023024244 W JP 2023024244W WO 2024005156 A1 WO2024005156 A1 WO 2024005156A1
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nucleic acid
nucleosides
nucleoside
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double
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PCT/JP2023/024244
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隆徳 横田
耕太郎 吉岡
泰毅 松林
聡 小比賀
治 中川
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国立大学法人東京医科歯科大学
国立大学法人大阪大学
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to agents for reducing the toxicity of nucleic acid drugs, nucleic acid molecules, double-stranded nucleic acid complexes, pharmaceutical compositions, and uses for reducing the toxicity of nucleic acid drugs.
  • oligonucleotides have attracted attention in the ongoing development of medicines called nucleic acid medicines, and in particular, nucleic acid medicines using antisense methods, in view of their high selectivity and low toxicity for target genes. development is actively underway.
  • the antisense method uses a partial sequence of mRNA or miRNA transcribed from a target gene as the target sense strand, and uses an oligonucleotide (antisense oligonucleotide: often referred to herein as "ASO (Antisense Oligonucleotide)" that is complementary to the target sense strand.
  • ASO Antisense Oligonucleotide
  • This method involves selectively modifying or inhibiting the expression of a protein encoded by a target gene or the activity of miRNA by introducing a target gene into cells.
  • the present inventors have developed a double-stranded nucleic acid complex (heteroduplex oligonucleotide, HDO) in which an antisense oligonucleotide and its complementary strand are annealed.
  • a double-stranded nucleic acid complex (heteroduplex oligonucleotide, HDO) in which an antisense oligonucleotide and its complementary strand are annealed.
  • HDO heteroduplex oligonucleotide
  • Double-stranded nucleic acid complexes are a revolutionary technology with high antisense effects.
  • nucleic acid drugs such as antisense drugs
  • antisense drugs progresses and the results of preclinical tests are accumulated, it has become clear that avoiding toxicity is important.
  • gene suppression effects there is a trade-off relationship between gene suppression effects and toxicity in nucleic acid medicines. That is, the stronger the gene-suppressing effect of a nucleic acid drug, the more likely it is to be toxic.
  • gapmer-type antisense nucleic acids that lead to cleavage of target transcripts and antisense nucleic acids containing cross-linked nucleic acids have a strong gene-suppressing effect, but are highly toxic and may exhibit lethal toxicity.
  • Our objective is to provide a new nucleic acid drug that can simultaneously achieve both high gene regulation effects and low toxicity.
  • the present inventors conducted extensive research to solve the above problems, and found that 9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine (9-(2-aminoethoxy)-1,3 -diaza-2-oxophenoxazine) (often referred to herein as "PAEO”) as a nucleobase (often referred to herein as "D-PAEO”), or PAEO as a nucleobase LNA nucleosides (often referred to herein as "L-PAEO”) have been introduced into nucleic acid medicines. As a result, it was found that the toxicity of nucleic acid medicines can be significantly reduced or eliminated by introducing D-PAEO or L-PAEO.
  • a toxicity reducing agent for nucleic acid medicines consisting of a nucleoside containing an artificial base represented by The toxicity reducing agent is linked to a nucleic acid chain constituting the nucleic acid drug through an internucleoside bond.
  • the toxicity reducing agent according to (1) wherein the nucleoside containing the artificial base contains a bicyclic sugar moiety.
  • the toxicity reducing agent according to (2), wherein the nucleoside containing the artificial base is an LNA nucleoside, a cEt BNA nucleoside, or an ENA nucleoside.
  • the toxicity reducing agent according to (1), wherein the nucleoside containing the artificial base is a deoxyribonucleoside.
  • the nucleic acid chain contains one or more selected from the group consisting of deoxyribonucleosides, ribonucleosides, 2'-modified nucleosides, 5'-modified nucleosides, cross-linked nucleosides, morpholino nucleic acids, tricyclo DNA, and peptide nucleic acids. , (1) to (4). (6) The toxicity reducing agent according to any one of (1) to (5), wherein the toxicity is central nervous system toxicity.
  • nucleic acid molecule capable of hybridizing to at least a portion of the target gene or its transcript, and capable of steric blocking, splicing control, expression reduction, expression increase, and/or base editing for the target gene or its transcription product;
  • a nucleic acid molecule capable of inducing The nucleic acid molecule containing at least one toxicity reducing agent according to any one of (1) to (4).
  • the nucleic acid molecule according to (7), which is a gapmer which is steric blocking, splicing control, expression reduction, expression increase, and/or base editing for the target gene or its transcription product.
  • (10) (i) a central region comprising at least two consecutive deoxyribonucleosides; (ii) a 5' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 5' end of the central region; and (iii) a 3' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 3' end of the central region.
  • (11) The nucleic acid molecule according to (10), wherein in the 5' wing region and/or the 3' wing region, the terminal base adjacent to the central region contains the toxicity reducing agent.
  • (12) Contains one or more selected from the group consisting of deoxyribonucleosides, ribonucleosides, 2'-modified nucleosides, 5'-modified nucleosides, cross-linked nucleosides, morpholino nucleic acids, tricycloDNA, and peptide nucleic acids, (7) The nucleic acid molecule according to any one of (11). (13) The 2'-modified nucleoside is a 2'-O-methyl-modified nucleoside, a 2'-O-methoxyethyl-modified nucleoside, or a 2'-O-[2-(N-methylcarbamoyl)ethyl]-modified nucleoside. , (12).
  • the cross-linked nucleoside is selected from the group consisting of LNA nucleosides, 2',4'-BNA NC nucleosides, cEt BNA nucleosides, ENA nucleosides, AmNA nucleosides, GuNA nucleosides, scpBNA nucleosides, scpBNA2 nucleosides, and BANA3 nucleosides.
  • a double-stranded nucleic acid complex comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand
  • the first nucleic acid strand is capable of hybridizing to at least a portion of the target gene or its transcription product, and performs steric blocking, splicing control, expression reduction, expression increase, and/or Alternatively, base editing can be induced
  • the second nucleic acid strand includes a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, and has the following formula (I):
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand is a group consisting of a deoxyribonucleoside, a ribonucleoside, a 2' modified nucleoside, a 5' modified nucleoside, a crosslinked nucleoside, a morpholino nucleic acid, a tricyclo
  • the second nucleic acid strand includes a non-complementary base and/or an insertion sequence and/or deletion of one or more bases with respect to the first nucleic acid strand, (21) to (23).
  • the second nucleic acid strand includes at least one overhang region located at the 5' end and/or 3' end of a region consisting of a base sequence complementary to the first nucleic acid strand. ) to (27).
  • (31) The double-stranded nucleic acid complex according to (30), wherein the linker is a cleavable or non-cleavable linker.
  • (32) The double-stranded nucleic acid according to any one of (21) to (31), wherein all or part of the internucleoside bonds of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand are modified internucleoside bonds. complex.
  • (33) The double-stranded nucleic acid complex according to (32), wherein the modified internucleoside bond is a phosphorothioate bond.
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid molecule according to any one of (7) to (20) or the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (21) to (34) as an active ingredient.
  • (41) Use of a nucleoside containing an artificial base represented by the following formula (I) for reducing the toxicity of a nucleic acid drug, wherein the nucleoside containing the artificial base is located between a nucleic acid chain constituting the nucleic acid drug and the nucleoside. Said use is connected by a bond.
  • This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2022-104782, which is the basis of the priority of this application.
  • a new nucleic acid drug is provided that can simultaneously achieve both high gene regulation effects and low toxicity.
  • Figure 1 shows the structures of various natural or non-natural nucleotides.
  • Figure 2 shows the structures of various crosslinked nucleic acids.
  • FIG. 3 shows the structures of various antisense nucleic acids used in Example 1.
  • Figure 3A shows the structure of ASO (DNA only).
  • Figure 3B shows the structure of ASO(LNA).
  • Figure 3C shows the structure of ASO (D-PAEO).
  • Figure 3D shows the structure of ASO (L-PAEO).
  • Figure 3E shows the structure of ASO (LNA MOE).
  • Figure 3F shows the structure of ASO (D-PAEO MOE).
  • Figure 3G shows the structure of ASO (L-PAEO MOE).
  • Figure 3H shows the structure of ASO (full MOE).
  • Figure 4 shows the scoring system used to calculate the acute phase tolerability score used in Examples 1-2.
  • Figure 5 shows the results of evaluating central nervous system toxicity based on acute tolerability scores in mice to which various nucleic acid agents were administered intracerebroventricularly.
  • Figure 6 shows the results of evaluating motor function 1 hour after administration in mice to which various nucleic acid agents were administered intracerebroventricularly.
  • Figure 6A shows the total distance traveled.
  • Figure 8 shows the results of measuring the expression levels of Malat1 ncRNA and GFAP mRNA in the left occipital cortex 7 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • Figure 8A shows the expression level of Malat1 ncRNA.
  • FIG. 9 shows the structures of various antisense nucleic acids used in Example 2.
  • Figure 9A shows the structure of ASO (DNA only).
  • Figure 9B shows the structure of ASO(LNA).
  • Figure 9C shows the structure of ASO (D-PAEO).
  • Figure 9D shows the structure of ASO (L-PAEO).
  • Figure 10 shows the results of evaluating central nervous system toxicity based on the acute tolerability score in mice to which various nucleic acid agents were administered intracerebroventricularly.
  • FIG. 9 shows the structures of various antisense nucleic acids used in Example 2.
  • Figure 9A shows the structure of ASO (DNA only).
  • Figure 9B shows the structure of ASO(LNA).
  • Figure 9C shows the structure of ASO (D-PAEO).
  • Figure 9D shows the structure of ASO (L-PAEO).
  • Figure 10 shows the results of evaluating central nervous system toxicity based on the acute tolerability score in mice to which various nucleic acid agents were administered intracerebroventricularly.
  • FIG. 11 shows the results of evaluating motor function 1 hour after administration in mice to which various nucleic acid agents were administered intracerebroventricularly.
  • Figure 11A shows the total distance traveled.
  • Figure 11B shows the maximum movement speed.
  • "*” indicates a significant difference (P ⁇ 0.05) from the PBS administration group based on the t-test.
  • "#” indicates a significant difference (P ⁇ 0.05) between each group based on one-way ANOVA test (post-hoc test: Tukey test).
  • Figure 13 shows the results of measuring the expression levels of Mapt mRNA and GFAP mRNA in the left occipital cortex 7 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • Figure 13A shows the expression level of Mapt mRNA.
  • "*" indicates a significant difference (P ⁇ 0.05) from the PBS administration group based on the t-test.
  • FIG. 14 shows the structures of various antisense nucleic acids used in Example 3.
  • Figure 14A shows the structure of ASO (LNA MOE).
  • Figure 14B shows the structure of ASO (D-PAEO MOE).
  • Figure 14C shows the structure of ASO (L-PAEO MOE).
  • Figure 14D shows the structure of ASO (full MOE).
  • Figure 16 shows the results of measuring the expression levels of IL6 mRNA and p21 mRNA in mouse neuroblastoma-derived cells (Neuro-2a cell line) into which various nucleic acid agents were introduced.
  • Figure 16A shows the expression level of IL6 mRNA.
  • "*" indicates a significant difference (P ⁇ 0.05) from the PBS administration group based on the t-test.
  • Toxicity reducer 1-1 Overview
  • the first aspect of the present invention relates to a toxicity reducing agent for nucleic acid medicines.
  • the toxicity reducing agent of the present invention consists of a nucleoside containing a specific artificial base.
  • the toxicity reducing agent of the present invention can reduce the toxicity of a nucleic acid drug by being linked to a nucleic acid chain constituting the nucleic acid drug through an internucleoside bond.
  • a "transcription product" of a target gene refers to any RNA synthesized by RNA polymerase. Specifically, mRNA transcribed from target genes (including mature mRNA, mRNA precursor, mRNA without base modification, etc.), non-coding RNA (ncRNA) such as miRNA, long non-coding RNA (lncRNA), which may include natural antisense RNA.
  • target genes including mature mRNA, mRNA precursor, mRNA without base modification, etc.
  • ncRNA non-coding RNA
  • miRNA miRNA
  • lncRNA long non-coding RNA
  • target gene refers to a transcription product or translation product whose expression level can be suppressed or enhanced by the antisense effect of a nucleic acid strand, a nucleic acid molecule, or a double-stranded nucleic acid complex.
  • the type of target gene is not particularly limited.
  • Examples include genes derived from organisms into which nucleic acid strands, nucleic acid molecules, or double-stranded nucleic acid complexes are introduced, and genes whose expression is increased in various diseases (e.g., central nervous system diseases) and genes in the central nervous system, etc. Examples include genes expressed in the body.
  • SR-B1 scavenger receptor B1
  • Mapt metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1
  • beta-secretase 1 beta-secretase 1
  • Mapt microtubule-associated protein tau
  • Examples include the gene (often referred to as “BACE1” in the specification), the DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) gene, and the dystrophin gene.
  • target transcript refers to a transcript that is a direct target of a nucleic acid strand, nucleic acid molecule, or double-stranded nucleic acid complex
  • transcript of a target gene is also a target transcript. Applicable. Base sequence information of target transcripts and target genes can be obtained from known databases such as the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database.
  • nucleic acid medicine is a drug containing any nucleic acid molecule.
  • a nucleic acid drug basically means one containing two or more nucleosides, and the nucleosides contained in the nucleic acid drug do not matter whether they are natural nucleosides or non-natural nucleosides.
  • the nucleic acid molecule contained in the nucleic acid medicine may be a single-stranded or double-stranded or more nucleic acid.
  • Specific examples of nucleic acid medicines include, but are not limited to, antisense nucleic acids, heteronucleic acids, siRNA, miRNA, aptamers, decoys, ribozymes, vectors, and the like.
  • antisense nucleic acid refers to a base sequence that can hybridize (i.e., is complementary) to at least a portion of a target transcript (mainly a transcript of a target gene), and refers to a single-stranded nucleic acid molecule that can produce an antisense effect.
  • antisense oligonucleotide means an antisense nucleic acid composed of oligonucleotides.
  • antisense nucleic acid or “antisense oligonucleotide” is often referred to as "ASO.”
  • ASO antisense nucleic acid
  • the first nucleic acid strand of a nucleic acid strand, nucleic acid molecule, or double-stranded nucleic acid complex functions as an ASO, and its target regions are 3'UTR, 5'UTR, exon, intron, coding region, translation initiation region, translation It may include a termination region or any other nucleic acid region.
  • the target region of the target transcript is at least 8 bases long, such as 10-35 bases long, 12-25 bases long, 13-20 bases long, 14-19 bases long, or 15-18 bases long, or 13-22 bases long. The length can be 16 to 22 bases, or 16 to 20 bases.
  • antisense effect refers to any effect produced by hybridization of an ASO to a target transcript (e.g., RNA sense strand), such as an effect that modulates expression or editing brought about on the target transcript.
  • a target transcript e.g., RNA sense strand
  • Regulatory the expression or editing of a target transcript refers to the expression of a target gene or the expression level of a target transcript (herein, “target transcript expression level” is often referred to as “target transcript level”). steric blocking, or degradation of transcription products.
  • RNA oligonucleotide when introduced into a cell as an ASO, the ASO forms a partial double strand by annealing with mRNA, which is the transcription product of the target gene.
  • This partial double strand serves as a cover to prevent translation by ribosomes, thereby inhibiting the expression of the target protein encoded by the target gene at the translational level (steric blocking).
  • a DNA-containing oligonucleotide is introduced into cells as an ASO, a partial DNA-RNA heteroduplex is formed.
  • antisense effects can also be produced by targeting introns in pre-mRNAs.
  • antisense effects can also be produced by targeting miRNAs.
  • inhibition of the function of the miRNA may increase the expression of genes whose expression is normally controlled by the miRNA.
  • modulating the expression of a target transcript may be a reduction in the amount of the target transcript.
  • Measurement of the antisense effect can be carried out, for example, by administering a test nucleic acid compound to a subject (e.g., a mouse) and, for example, after several days (e.g., 2 to 7 days), the expression is regulated by the antisense effect provided by the test nucleic acid compound.
  • a test nucleic acid compound e.g., a mouse
  • several days e.g., 2 to 7 days
  • the expression is regulated by the antisense effect provided by the test nucleic acid compound.
  • This can be carried out by measuring the expression level of the target gene or the level (amount) of the target transcript (for example, the amount of mRNA or RNA such as microRNA, the amount of cDNA, the amount of protein, etc.).
  • the measured target gene expression or target transcript level is at least 10%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, or at least 40% compared to a negative control (e.g., vehicle administration). If so, it is indicated that the test nucleic acid compound is capable of producing an antisense effect (eg, a reduction in the amount of target transcript).
  • the number, type, and position of unnatural nucleotides in a nucleic acid strand can affect the antisense effect, etc. provided by the nucleic acid strand, nucleic acid molecule, or nucleic acid complex.
  • the selection of modifications may vary depending on the sequence of the target gene, etc., but those skilled in the art will be familiar with the explanations in the literature related to antisense methods (for example, WO 2007/143315, WO 2008/043753, and WO 2008/049085). Preferred embodiments can be determined by reference.
  • the antisense effect of the modified nucleic acid complex is measured, if the measured value thus obtained is not significantly lower than the measured value of the unmodified nucleic acid complex (e.g. If the measured value obtained after modification is 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the measured value of the nucleic acid complex before modification), the relevant modification can be evaluated.
  • translation product of a target gene refers to a target transcript that is a direct target of a nucleic acid strand, a nucleic acid molecule, or a double-stranded nucleic acid complex, or is synthesized by translation of a target gene transcript. Refers to any polypeptide or protein.
  • aptamer refers to a nucleic acid molecule that specifically binds to a specific target molecule within a cell, on a cell membrane, or extracellularly, such as on a cell membrane or extracellularly.
  • Aptamers can be produced by methods known in the art, such as in vitro selection using the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • the term "decoy” refers to a nucleic acid having a binding site sequence for a transcription factor (e.g. NF-kB) or a similar sequence, and can be used as a “decoy” to induce transcription factors by introducing them into cells.
  • a transcription factor e.g. NF-kB
  • a substance that suppresses the action suppresses transcription if it is a transcription activator, and promotes transcription if it is a transcription repressor. Decoy nucleic acids can be easily designed based on information about the binding sequence of the target transcription factor.
  • bait refers to a nucleic acid molecule that specifically binds to a specific target molecule within a cell and modifies the function of the target molecule.
  • a target that interacts with bait is also called a "prey.”
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” may refer to a monomeric nucleotide or nucleoside, or may refer to an oligonucleotide consisting of multiple monomers or multiple nucleosides linked by internucleoside bonds. Also, if it is a polymer, it includes a polynucleotide.
  • Natural nucleic acid refers to a nucleic acid that exists in nature. Natural nucleic acids include natural nucleosides and natural nucleotides, which will be described later. “Non-natural nucleic acid” or “artificial nucleic acid” refers to any nucleic acid other than natural nucleic acid. Non-natural nucleic acids or artificial nucleic acids include non-natural nucleosides and non-natural nucleotides, which will be described later.
  • nucleic acid strand refers to two or more nucleosides connected by internucleoside bonds, and may be, for example, an oligonucleotide or a polynucleotide.
  • Nucleic acid chains can be produced as full-length chains or partial chains by chemical synthesis using, for example, an automatic synthesizer, or by enzymatic processes using polymerases, ligases, or restriction reactions.
  • Nucleic acid strands may include natural and/or non-natural nucleotides.
  • Nucleoside generally refers to a molecule consisting of a combination of a base and a sugar.
  • the sugar moiety of the nucleoside is usually, but not limited to, composed of pentofuranosyl sugars, specific examples of which include ribose and deoxyribose.
  • the base portion of a nucleoside is usually a heterocyclic base portion. Examples include, but are not limited to, adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil, and other modified nucleobases (modified bases).
  • Nucleotide refers to a molecule in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the nucleoside.
  • a phosphate group is usually linked to the hydroxyl group at the 2', 3', or 5' position of the sugar.
  • Oligonucleotide refers to a linear oligomer formed by covalently linking several to several dozen hydroxyl groups and phosphate groups of sugar moieties between adjacent nucleotides.
  • polynucleotide refers to a linear polymer formed by several tens or more, preferably several hundred or more, of nucleotides, which are more numerous than oligonucleotides, linked by the covalent bonds.
  • phosphate groups are generally considered to form internucleoside linkages.
  • naturally nucleosides refer to nucleosides that exist in nature. Examples include ribonucleosides consisting of ribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or uracil, and deoxyribonucleosides consisting of deoxyribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or thymine. Note that ribonucleosides found in RNA and deoxyribonucleosides found in DNA are often referred to herein as “RNA nucleosides” and “DNA nucleosides,” respectively.
  • natural nucleotide refers to a nucleotide that exists in nature, and refers to a molecule in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the natural nucleoside.
  • examples include ribonucleotides, which have a phosphate group bound to a ribonucleoside and are known as the structural units of RNA, and deoxyribonucleotides, which have a phosphate group bound to deoxyribonucleosides and are known as the structural units of DNA.
  • non-natural nucleotide refers to any nucleotide other than natural nucleotides, and includes modified nucleotides and nucleotide mimetics.
  • modified nucleotide refers to a nucleotide having one or more of a modified sugar moiety, a modified internucleoside bond, and a modified nucleobase.
  • nucleotide mimetic as used herein includes structures that are used to replace nucleosides and linkages at one or more positions in an oligomeric compound.
  • Peptide Nucleic Acid is a nucleotide mimetic that has a main chain in which N-(2-aminoethyl)glycine is linked via an amide bond instead of sugar.
  • nucleic acid strands comprising non-natural oligonucleotides are often referred to as having, for example, enhanced cellular uptake, enhanced affinity for nucleic acid targets, increased stability in the presence of nucleases, or increased inhibitory activity, etc. It has the desirable properties of Therefore, they are preferred over natural nucleotides.
  • non-natural nucleoside refers to any nucleoside other than natural nucleosides. Examples include modified nucleosides and nucleoside mimetics. As used herein, “modified nucleoside” refers to a nucleoside having a modified sugar moiety and/or a modified nucleobase.
  • mimetics refers to a functional group that replaces a sugar, nucleobase, and/or internucleoside bond. Generally, mimetics are used in place of the sugar or sugar-internucleoside linkage combination, and the nucleobase is maintained for hybridization to the target of choice.
  • nucleoside mimetic refers to the substitution of sugars at one or more positions of an oligomeric compound, or the substitution of a sugar and a base, or the bonding between monomer subunits constituting an oligomeric compound. Contains the structure used for replacement.
  • oligomeric compound is meant a polymer of linked monomer subunits that are at least hybridizable to a region of a nucleic acid molecule.
  • Nucleoside mimetics include, for example, morpholino, cyclohexenyl, cyclohexyl, tetrahydropyranyl, bicyclic or tricyclic sugar mimetics, eg, nucleoside mimetics with non-furanose sugar units.
  • Modified sugar refers to a sugar that has substitutions and/or any changes from the natural sugar moiety (i.e., the sugar moiety found in DNA (2'-H) or RNA (2'-OH));"Sugarmodification” refers to substitutions and/or any changes from the naturally occurring sugar moiety.
  • the nucleic acid strand may optionally include one or more modified nucleosides, including modified sugars.
  • “Sugar-modified nucleoside” refers to a nucleoside that has a modified sugar moiety. Such sugar-modified nucleosides may confer enhanced nuclease stability, increased binding affinity, or some other beneficial biological property to the nucleic acid strand.
  • the nucleoside includes a chemically modified ribofuranose ring moiety.
  • chemically modified ribofuranose rings include, but are not limited to, addition of substituents (including 5' and 2' substituents), bicyclic nucleic acids (bridged nucleic acids, BNA ) formation of S, N(R), or C(R1)(R2) of the ribosyl ring oxygen atom (R, R1 and R2 are each independently H, C 1 -C 12 alkyl, or a protecting group). ), and combinations thereof.
  • sugar-modified nucleosides include, but are not limited to, 5'-vinyl, 5'-methyl (R or S), 5'-allyl (R or S), 4'-S, 2'-F ( 2'-fluoro group), 2'-OCH 3 (2'-O-Me group or 2'-O-methyl group), 2'-O-[2-(N-methylcarbamoyl)ethyl] (2'- O-MCE group), and 2'-O-methoxyethyl (2'-O-MOE or 2- O ( CH2 ) 2OCH3 ) substituents.
  • "2'-modified sugar” means a furanosyl sugar modified at the 2' position. Nucleosides containing 2'-modified sugars are sometimes referred to as "2'-modified nucleosides" or "2'-sugar-modified nucleosides.”
  • Bicyclic nucleoside refers to a modified nucleoside that includes a bicyclic sugar moiety. Nucleic acids containing bicyclic sugar moieties are commonly referred to as bridged nucleic acids (BNA). Nucleosides containing bicyclic sugar moieties are sometimes referred to as “bridged nucleosides,” “bridged non-natural nucleosides,” or “BNA nucleosides.” Figure 2 shows some examples of crosslinked nucleic acids.
  • a bicyclic sugar may be a sugar in which the carbon atom at the 2' position and the carbon atom at the 4' position are bridged by two or more atoms.
  • bicyclic sugars are known to those skilled in the art.
  • One subgroup of bicyclic sugar-containing nucleic acids (BNAs) or BNA nucleosides are 4'-(CH 2 ) p -O-2', 4'-(CH 2 ) p -CH 2 -2', 4 '-(CH 2 ) p -S-2', 4'-(CH 2 ) p -OCO-2', 4'-(CH 2 ) n -N(R 3 )-O-(CH 2 ) m - 2' [where p, m and n represent an integer of 1 to 4, an integer of 0 to 2, and an integer of 1 to 3, respectively; and R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cyclo Represents an al
  • R 1 and R 2 are typically are hydrogen atoms, which may be the same or different, and may also be hydrogen atoms, protecting groups for hydroxyl groups for nucleic acid synthesis, alkyl groups, alkenyl groups, cycloalkyl groups, aryl groups, aralkyl groups, acyl groups.
  • R 4 and R 5 are the same as each other] a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, a mercapto group, a mercapto group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, an amino group, which may be present or different, respectively; Substituted with an alkoxy group having ⁇ 5 carbon atoms, an alkylthio group having 1 to 5 carbon atoms, a cyanoalkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms [representing an amino group] may also be used.
  • amine BNA also known as 2'-Amino-LNA
  • amine BNA also known as 2'-Amino-LNA
  • scpBNA 2'-O,4'-C-spirocyclopropylene bridged nucleic acids
  • BNA nucleosides include methyleneoxy (4'- CH2 -O-2') BNA nucleosides (LNA nucleosides, also known as 2',4'-BNA nucleosides) (e.g., ⁇ -L-methyleneoxy(4'-CH 2 -O-2')BNA nucleoside, ⁇ -D-methyleneoxy(4'-CH 2 -O-2')BNA nucleoside), ethyleneoxy(4'-(CH 2 ) 2 -O-2')BNA nucleoside (also known as ENA nucleoside), ⁇ -D-thio (4'-CH 2 -S-2') BNA nucleoside, aminooxy (4'-CH 2 -ON(R 3 )-2')BNA nucleoside, also known as oxyamino(4'-CH 2 -N(R 3 )-O-2')BNA nucleoside (2',4'-BNA NC nucleoside)
  • a "cationic nucleoside” refers to a cationic nucleoside that, at a certain pH (e.g., human physiological pH (approximately 7.4), the pH of the delivery site (e.g., organelle, cell, tissue, organ, organism, etc.)), A modified nucleoside that exists as a cationic form as compared to a neutral form (such as the neutral form of a ribonucleoside).
  • a cationic nucleoside may include one or more cationic modifying groups at any position on the nucleoside.
  • Bicyclic nucleosides with methyleneoxy (4'- CH2 -O-2') bridges are sometimes referred to as LNA nucleosides.
  • modified internucleoside linkage refers to an internucleoside linkage that has a substitution or any change from a naturally occurring internucleoside linkage (ie, a phosphodiester linkage).
  • Modified internucleoside bonds include internucleoside bonds that include a phosphorus atom and internucleoside bonds that do not include a phosphorus atom.
  • Typical phosphorus-containing internucleoside bonds include phosphodiester bonds, phosphorothioate bonds, phosphorodithioate bonds, phosphotriester bonds (methylphosphotriester bonds and ethylphosphotriester bonds described in U.S. Patent No.
  • alkyl Phosphonate bonds e.g., methylphosphonate bonds as described in U.S. Patent Registration Nos. 5,264,423 and 5,286,717, methoxypropylphosphonate bonds as described in WO 2015/168172
  • alkylthiophosphonate bonds e.g., methylphosphonate bonds as described in U.S. Patent Registration Nos. 5,264,423 and 5,286,717, methoxypropylphosphonate bonds as described in WO 2015/168172
  • alkylthiophosphonate bonds e.g., methylthiophosphonate bonds as described in U.S. Patent Registration Nos. 5,264,423 and 5,286,717, methoxypropylphosphonate bonds as described in WO 2015/168172
  • alkylthiophosphonate bonds e.g., methylthiophosphonate bonds as described in U.S. Patent Registration Nos. 5,264,423 and 5,286,717, methoxypropylphosphon
  • An internucleoside bond containing e.g., a substructure represented by the following formula (IV):
  • an internucleoside bond containing a guanidine moiety e.g., a tetramethylguanidine (TMG) moiety
  • TMG tetramethylguanidine
  • V formula (V) below
  • a phosphorothioate bond refers to an internucleoside bond in which a sulfur atom replaces the non-bridging oxygen atom of a phosphodiester bond.
  • Methods for preparing phosphorus-containing and non-phosphorus-containing linkages are well known.
  • the modified internucleoside linkage is one that is more resistant to nucleases than naturally occurring internucleoside linkages.
  • the internucleoside bond When the internucleoside bond has a chiral center, the internucleoside bond may be chirally controlled. "Chirally controlled” is intended to exist in a single diastereomer with respect to a chiral center, such as a chiral bonding phosphorus. Chirally controlled internucleoside linkages can be completely chirally pure or have high chiral purity, such as 90% de, 95% de, 98% de, 99% de, 99.5% de, 99.8 % de, 99.9% de, or higher chiral purity.
  • chiral purity refers to the proportion of one diastereomer in a mixture of diastereomers, expressed as diastereomeric excess (% de), (diastereomer of interest - other diastereomers). Stereomers)/(total diastereomers) x 100(%).
  • the internucleoside linkage may include a chirally controlled phosphorothioate linkage in the Rp or Sp configuration, a guanidine moiety substituted with 1 to 4 C 1-6 alkyl groups (e.g., a tetramethylguanidine (TMG) moiety; (see Alexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811) and/or internucleoside linkages containing a cyclic guanidine moiety. .
  • TMG tetramethylguanidine
  • Chirally controlled phosphorothioate linkages in the Rp or Sp configuration are also known, for example Naoki Iwamoto et al., Nat. Biotechnol,. 2017, 35(9), 845-851, Anastasia Khvorova et al., Nat. Biotechnol. , 2017, 35(3), 238-248.
  • a phosphorothioate bond chirally controlled in the Sp configuration is more stable than one in the Rp configuration, and/or a chirally controlled ASO in the Sp configuration facilitates target RNA cleavage by RNase H1. , resulting in a more sustained response in vivo.
  • nucleobase refers to a base component (heterocyclic moiety) that constitutes a nucleic acid, and mainly includes adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil.
  • base includes both modified and unmodified nucleobases (bases), unless otherwise specified. Therefore, unless otherwise specified, the purine base may be either a modified or unmodified purine base. Furthermore, unless otherwise specified, the pyrimidine base may be either a modified or unmodified pyrimidine base.
  • Modified nucleobase or “modified base” means any nucleobase other than adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil.
  • Unmodified nucleobase or “unmodified base” (natural nucleobase) refers to the purine bases adenine (A) and guanine (G), and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C), and It means uracil (U).
  • modified nucleobases include hypoxanthine, 5-methylcytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-iodocytosine or N4-methylcytosine; N6-methyladenine or 8-bromoadenine; 2-thio- Examples include, but are not limited to, thymine; and N2-methylguanine or 8-bromoguanine.
  • modified nucleobase 9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine (9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza- 2-oxophenoxazine) (herein referred to as "PAEO” or "PAEO base”).
  • PAEO 9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine)
  • PAEO base 9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine
  • the term "complementary” refers to the relationship between nucleobases through hydrogen bonding, so-called Watson-Crick base pairs (natural base pairs) or Wobble base pairs (guanine-thymine, or guanine-uracil). ), and a relationship in which similar base pairs can be formed between a natural nucleobase and a modified nucleobase or between modified nucleobases.
  • the natural base pair formed by a guanine base and a cytosine base contains three hydrogen bonds as shown below.
  • the PAEO base represented by the above formula (I) can form four hydrogen bonds with the guanine base as shown below, so it has a higher double-strand formation ability than the natural base pair. can be improved.
  • the nucleic acid strand, the nucleic acid molecule, and the antisense region of the first nucleic acid strand do not necessarily need to be completely complementary to at least a portion of the target transcript (e.g., the transcript of the target gene).
  • the base sequences have a complementarity of at least 70%, preferably at least 80%, and even more preferably at least 90% (e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more). Permissible.
  • Antisense regions in a nucleic acid strand, a nucleic acid molecule, and a first nucleic acid strand can be used when the base sequences are complementary (typically, when the base sequences are complementary to the base sequence of at least a portion of the target transcript). in some cases), can hybridize to the target transcript.
  • the complementary region in the second nucleic acid strand does not necessarily need to be completely complementary to at least a portion of the first nucleic acid strand; Complementarity of preferably at least 80%, and even more preferably at least 90% (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) is acceptable.
  • the complementary region in the second nucleic acid strand can be annealed when the base sequence is complementary to at least a portion of the first nucleic acid strand.
  • Complementarity of base sequences can be determined using a BLAST program or the like. Those skilled in the art can easily determine the conditions (temperature, salt concentration, etc.) under which two strands can anneal or hybridize, taking into account the degree of complementarity between the strands.
  • those skilled in the art can easily design an antisense nucleic acid complementary to a target transcription product, for example, based on information on the base sequence of the target gene.
  • the hybridization conditions may be various stringency conditions, for example, low stringency conditions and high stringency conditions.
  • Low stringency conditions may be relatively low temperature and high salt concentration conditions, for example, 30° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • High stringency conditions may be relatively high temperature and low salt concentration conditions, for example, 65° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • 1x SSC contains 150mM sodium chloride and 15mM sodium citrate.
  • toxicity refers to an effect that causes unfavorable objective or subjective symptoms or functional abnormalities in a subject.
  • Toxicity may be in any organ.
  • Toxicity may be neurotoxic, hepatotoxic, or nephrotoxic.
  • Neurotoxicity refers to effects that cause damage to nervous tissue, including central and peripheral nervous tissue, and interfere with the normal activity of the nervous system. In particular, toxicity to the central nervous system is called central nervous system toxicity.
  • Neurotoxicity can include death, respiratory abnormalities, cardiovascular abnormalities, headache, nausea or vomiting, unresponsiveness or hyporesponsiveness, impaired consciousness, mental disorders, personality changes, hallucinations, delusions, cognitive impairment, postural abnormalities, involuntary movements, and tremors.
  • Neurotoxicity may be acute neurotoxicity.
  • Acute neurotoxicity can be neurotoxicity that occurs within 1, 3, 6, 9, 12, 24 or 48 hours of administration.
  • Toxicity can be evaluated, for example, by acute phase tolerability score, side effect event rate, mortality rate, etc., as described in the Examples below.
  • Hepatotoxicity refers to the property of causing functional abnormality and/or functional decline in the liver.
  • Nephrotoxicity refers to the property of causing functional abnormality and/or functional decline in the kidneys. Evaluation of hepatotoxicity and renal function can be performed by any method known to those skilled in the art, such as serum biochemical tests.
  • the term "subject” refers to a subject to whom the nucleic acid strand, nucleic acid molecule, or double-stranded nucleic acid complex, or pharmaceutical composition of the present invention is applied.
  • Subjects include not only individuals but also organs, tissues, and cells. If the subject is an individual, any animal including humans may be applicable. For example, other than humans, various livestock, poultry, pets, experimental animals, etc. can be mentioned.
  • the subject may be, without limitation, an individual in need of reducing the expression level of a target transcript or an individual in need of treatment or prevention of a disease such as a central nervous system disease.
  • plural means, for example, 2, 2 to 3, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, 2 to 7, 2 to 8, 2 to 10 , 2 to 12 pieces, 2 to 14 pieces, 2 to 16 pieces, 2 to 18 pieces, 2 to 20 pieces, 2 to 25 pieces, 2 to 30 pieces, 2 to 35 pieces, 2 to 40 pieces, or more say.
  • the toxicity reducing agent of the present invention has the following formula (I): It consists of a nucleoside containing an artificial base shown in
  • the sugar moiety of the nucleoside containing the artificial base represented by formula (I) above may be either an unmodified sugar moiety or a modified sugar moiety.
  • modified sugar moieties include 2'-modified sugars and bicyclic sugar moieties.
  • the sugar moiety of the nucleoside containing the artificial base represented by formula (I) above is a bicyclic sugar moiety.
  • Nucleosides containing bicyclic sugar moieties include, but are not limited to, LNA nucleosides, cEt BNA nucleosides, and ENA nucleosides.
  • the LNA nucleoside containing the artificial base represented by the above formula (I) is represented by the following formula (II), and is referred to herein as "L-PAEO". It is disclosed in the literature (Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021, 27(7):2427-2438.) that L-PAEO has excellent duplex formation ability. However, it was completely unexpected that it would show a remarkable toxicity reducing effect as shown in the Examples described below.
  • the sugar moiety of the nucleoside containing the artificial base represented by formula (I) above is an unmodified sugar moiety.
  • Nucleosides containing unmodified sugar moieties are, for example, deoxyribonucleosides or ribonucleosides.
  • the deoxyribonucleoside containing the artificial base represented by the above formula (I) is represented by the following formula (III), and is referred to herein as "D-PAEO".
  • the nucleoside containing the artificial base represented by the above formula (I) is linked to the nucleic acid chain constituting the nucleic acid drug through an internucleoside bond.
  • the toxicity reducing agent of the present invention can reduce the toxicity of a nucleic acid drug by being linked to a nucleic acid chain constituting the nucleic acid drug.
  • the nucleic acid medicine in this embodiment is not particularly limited.
  • antisense nucleic acids heteronucleic acids, siRNAs, vectors, aptamers, etc. may be used.
  • the antisense nucleic acid may be, for example, a mixmer or a gapmer.
  • the linking position of the toxicity reducing agent is not particularly limited.
  • the toxicity reducing agent of the present invention may be linked to the terminal end (5' end and/or 3' end) of a nucleic acid chain constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid, or It can also be linked to the non-terminal portion (inside the nucleic acid chain) of the nucleic acid chain constituting the drug.
  • the toxicity reducing agent may be linked to the central region, 5' wing region, and/or 3' wing region of the gapmer. If the toxicity reducing agent is linked to the central region, the toxicity reducing agent may be included in the terminal base adjacent to the central region in the 5' wing region and/or 3' wing region.
  • nucleic acid strand constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid can also be linked to a nucleic acid strand constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid.
  • the toxicity reducing agent of the present invention may be linked to an antisense nucleic acid by substituting a cytosine base in a nucleic acid chain constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid.
  • the toxicity reducing agent of the present invention is linked at its 5' side to a nucleoside containing a cytosine base via an internucleoside bond, and/or at its 3' side to a nucleoside containing a cytosine base via an internucleoside bond. be done. It is known that when the nucleoside adjacent to the 5' and/or 3' side of L-PAEO contains a cytosine base, the duplex formation ability can be further enhanced (Kishimoto Y., et al., Chem . Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.).
  • the toxicity reducing agent of the present invention is linked on its 5' side to a nucleoside containing a guanine base through an internucleoside bond, and/or on its 3' side to a nucleoside containing a guanine base through an internucleoside bond. be done. It is known that when the nucleoside adjacent to the 5' side and/or 3' side of L-PAEO contains a guanine base, the duplex formation ability can be further enhanced (Kishimoto Y., et al., Chem . Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.).
  • the toxicity reducing agent is replaced with the toxicity reducing agent of the present invention by replacing a crosslinked nucleoside such as an LNA nucleoside and/or a deoxyribonucleoside in a nucleic acid chain constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid with the toxicity reducing agent of the present invention.
  • a crosslinked nucleoside such as an LNA nucleoside and/or a deoxyribonucleoside in a nucleic acid chain constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid
  • the internucleoside bond through which the toxicity reducing agent of the present invention is linked to a nucleic acid chain constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid may be a phosphodiester bond or a modified internucleoside bond.
  • the modified internucleoside linkage may be, for example, a phosphorothioate linkage.
  • Nucleic acid chains constituting a nucleic acid drug such as an antisense nucleic acid to which the toxicity reducing agent of the present invention is linked include deoxyribonucleosides, ribonucleosides, 2' modified nucleosides, 5' modified nucleosides, cross-linked nucleosides, morpholino nucleic acids, tricyclo DNA, and peptide nucleic acids.
  • Examples of 2'-modified nucleosides include 2'-O-methyl-modified nucleosides, 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides, and 2'-O-[2-(N-methylcarbamoyl)ethyl]-modified nucleosides.
  • Examples of 5'-modified nucleosides include 5'-cp-modified nucleosides, 5'-methyl-modified nucleosides, and 5'-dimethyl-modified nucleosides.
  • Examples of bridged nucleosides include LNA nucleosides, 2',4'-BNA NC nucleosides, cEt BNA nucleosides, ENA nucleosides, AmNA nucleosides, GuNA nucleosides, scpBNA nucleosides, scpBNA2 nucleosides, and BANA3 nucleosides.
  • the number of toxicity reducing agents linked to the nucleic acid chain constituting the nucleic acid medicine such as antisense nucleic acid is at least 1, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6. or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, 30 or less, 25 or less, 20 or less, 15 or less, 10 or less, 9 or less, 8 below, the number may be 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less.
  • the number of toxicity reducing agents may be from 1 to 10, preferably from 1 to 6.
  • the number may be 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
  • the base length of the nucleic acid strand constituting the nucleic acid medicine such as the antisense nucleic acid to which the toxicity reducing agent of the present invention is linked is not particularly limited, but is at least 8 bases long, at least 9 bases long, at least 10 bases long, or at least 11 bases long. It may be at least 12 bases long, at least 13 bases long, at least 14 bases long, or at least 15 bases long.
  • the base length of the antisense nucleic acid is 35 bases or less, 30 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, 22 bases or less, 21 bases or less, 20 bases or less, The length may be 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, or 16 bases or less.
  • the toxicity of nucleic acid drugs for example, central nervous (neurotoxicity, hepatotoxicity, and/or nephrotoxicity) can be reduced or eliminated. Furthermore, the induction of inflammation or gliosis, or the abnormal increase in cytokines or chemokines associated with administration of antisense nucleic acids can be reduced.
  • the toxicity reducing agent of the present invention can reduce the toxicity of a nucleic acid drug to which the toxicity reducing agent of the present invention is linked, compared to a nucleic acid drug that does not contain the toxicity reducing agent of the present invention.
  • Steric block type antisense nucleic acids that do not cleave the target transcript have relatively low toxicity, but gapmer type antisense nucleic acids that can cleave the target have a high gene control effect but can be highly toxic.
  • Gapmers containing cross-linked nucleosides may have even greater efficacy, but may exhibit lethal toxicity.
  • the toxicity reducing agent of the present invention can reduce the toxicity of the antisense nucleic acid by being linked to the antisense nucleic acid, and therefore can simultaneously achieve high gene regulation effects and low toxicity or no toxicity.
  • the present invention also provides the use of a nucleoside containing an artificial base represented by the above formula (I) for reducing the toxicity of nucleic acid medicines.
  • the second aspect of the invention is a nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is capable of hybridizing to at least a portion of a target gene or its transcription product, and comprises at least one toxicity reducing agent of the first aspect.
  • the nucleic acid molecules of the present invention can simultaneously achieve high gene regulation effects and low or no toxicity.
  • the nucleic acid molecule of this embodiment comprises the toxicity reducing agent of the first embodiment.
  • the nucleic acid molecule of this embodiment can hybridize to at least a portion of a target gene or its transcription product, and can perform steric blocking, splicing control, expression reduction, expression increase, and/or Alternatively, base editing can be induced.
  • the number of toxicity reducing agents of the first embodiment contained in the nucleic acid molecule of this embodiment is at least 1, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, It may be 8 or more, 9 or more, or 10 or more, but not more than 30, not more than 25, not more than 20, not more than 15, not more than 10, not more than 9, not more than 8, not more than 7,
  • the number may be 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less.
  • the number of toxicity reducing agents in the first embodiment may be 1 to 10, preferably 1 to 6.
  • the number may be 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
  • the position where the toxicity reducing agent of the first embodiment is placed is not particularly limited.
  • the toxicity reducing agent of the first embodiment may be placed at the terminal end (5' end and/or 3' end) of the nucleic acid molecule, or at the non-terminal end (inside the nucleic acid chain) of the nucleic acid molecule. may have been done.
  • the nucleic acid molecule is a gapmer described below, the toxicity reducing agent may be located in the central region, 5' wing region, and/or 3' wing region of the gapmer.
  • the toxicity reducing agent is placed in the 5' wing region and/or 3' wing region, the toxicity reducing agent is placed at the terminal base adjacent to the central region in the 5' wing region and/or 3' wing region. You can leave it there.
  • the toxicity reducing agent of the first embodiment can also be placed at a position complementary to the guanine base of the target gene or its transcription product.
  • the toxicity reducing agent of this aspect is placed at a position where it is linked to a nucleoside containing a cytosine base via an internucleoside bond on its 5' and/or 3' sides.
  • the nucleoside adjacent to the 5' and/or 3' side of L-PAEO contains a cytosine base, the duplex formation ability can be further enhanced (Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.).
  • the toxicity reducing agent of the present invention is placed at a position where it is linked to a nucleoside containing a guanine base through an internucleoside bond on its 5' and/or 3' side.
  • the nucleoside adjacent to the 5' and/or 3' side of L-PAEO contains a guanine base, the duplex formation ability can be further enhanced (Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.).
  • the nucleic acid molecule of this embodiment can hybridize to at least a portion of the target gene or its transcription product. Therefore, the nucleic acid molecule of this embodiment includes a base sequence complementary to at least a portion of the target gene or its transcription product.
  • the nucleosides contained in the nucleic acid molecule of this embodiment other than the toxicity reducing agent of the first embodiment may be natural nucleosides (deoxyribonucleosides, ribonucleosides, or both) and/or non-natural nucleosides.
  • the nucleic acid molecule of this embodiment may be a mixmer.
  • the term "mixmer” refers to a nucleic acid chain that contains alternating natural and non-natural nucleosides with periodic or random segment lengths and does not contain four or more consecutive deoxyribonucleosides and ribonucleosides. .
  • a mixmer in which the unnatural nucleoside is a crosslinked nucleoside and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside is particularly referred to as a "BNA/DNA mixmer.”
  • a mixmer in which the unnatural nucleoside is a peptide nucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside is particularly referred to as a "peptide nucleic acid/DNA mixmer.”
  • a mixmer in which the unnatural nucleoside is a morpholino nucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside is particularly referred to as a "morpholino nucleic acid/DNA mixmer.”
  • Mixmers are not limited to containing only two nucleosides.
  • Mixmers can include any number of types of nucleosides, whether natural or modified nucleosides or nucleoside mimetics. For example, it may have one or two consecutive deoxyribonucleosides separated by a bridging nucleoside (eg, an LNA nucleoside). Bridged nucleosides may further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • a bridging nucleoside eg, an LNA nucleoside
  • Bridged nucleosides may further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • the nucleic acid molecule of this embodiment may be a gapmer.
  • “gapmer” basically refers to a "central region” (DNA gap region) and wing regions located directly at its 5' and 3' ends (respectively, “5' wing region” and “DNA gap region”).
  • the central region in the gapmer may contain at least two (e.g., at least three or at least four) contiguous deoxyribonucleosides (modified nucleobases recognized by RNase H, e.g., 5-methylcytosine). ), the wing region comprising at least one non-natural nucleoside.
  • the non-natural nucleosides contained in the wing region usually have higher binding strength to RNA than natural nucleosides and have high resistance to nucleolytic enzymes (nucleases, etc.).
  • the non-natural nucleosides that make up the 5' wing region and the 3' wing region may be, for example, crosslinked nucleosides and/or 2' modified nucleosides. If the non-natural nucleosides constituting the wing region contain or consist of cross-linked nucleosides, said gapmers are specifically referred to as "BNA/DNA gapmers".
  • the number of crosslinked nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region is at least 1, and may be, for example, 2 or 3.
  • the cross-linked nucleosides contained in the 5' wing region and 3' wing region may exist continuously or discontinuously within the 5' wing region and 3' wing region.
  • Bridged nucleosides can further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • the bridged nucleoside may be an LNA nucleoside or an ENA nucleoside.
  • the gapmer When the bridged nucleoside is an LNA nucleoside, the gapmer is referred to as an "LNA/DNA gapmer.” When the bridged nucleoside is an ENA nucleoside, the gapmer is referred to as an "ENA/DNA gapmer.” When the non-natural nucleosides constituting the 5'wing region and the 3'wing region contain or consist of a peptide nucleic acid, the gapmer is specifically referred to as a "peptide nucleic acid gapmer”.
  • the gapmer is specifically referred to as a "morpholino nucleic acid gapmer."
  • the 2' modifying group of the 2' modified nucleosides is a 2'-O-methyl group or a 2' -O-methoxyethyl group may also be used.
  • the number of 2' modified nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region is at least 1, and may be, for example, 2 or 3.
  • the 2' modified nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region may be present continuously or discontinuously within the 5' wing region and the 3' wing region.
  • 2' modified nucleosides can further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • modified nucleobases eg, 5-methylcytosine.
  • the non-natural nucleosides constituting the 5' wing region and 3' wing region include or consist of cross-linked nucleosides and 2'-modified nucleosides, they are composed of a combination of two or more types of cross-linked nucleosides and/or 2'-modified nucleosides. may have been done.
  • the DNA gap region is, for example, 2 to 12 bases long, 3 to 11 bases long, 4 to 10 bases long, 5 to 9 bases long, 6 to 8 bases long, or 7 bases long. or 8 bases in length.
  • DNA gap regions are composed of natural nucleosides made of DNA.
  • the base length of the 5' wing region and the 3' wing region of the gapmer is independently at least 2 bases long, for example, 2 to 10 bases long, 2 to 7 bases long. It may be base length, 3 to 5 bases, 3 to 4 bases, or 3 bases long.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can contain a 2' modified nucleoside and/or a bridged nucleoside in the 5' wing region and the 3' wing region.
  • the 5' wing region and 3' wing region contain bridged nucleosides containing PAEO bases (e.g., L-PAEO), 2'-O-methyl nucleosides, 2'-O-methoxyethyl nucleosides, 2'-LNA or ENA. They may be combined, and the types of modifications may include 1 to 4 types, 2 to 3 types, for example, 2 types, and these types may be the same in the 5' wing region and the 3' wing region. or may be different.
  • PAEO bases e.g., L-PAEO
  • 2'-O-methyl nucleosides e.g., 2'-O-methoxyethyl nucleosides
  • 2'-LNA or ENA e.g., ENA
  • examples of base lengths of the 5' wing region, DNA gap region, and 3' wing region include 2-8-3, 3-8-2, 3 -7-3, 4-6-3, 3-6-4, 4-5-4, 4-7-3, 3-7-4, 4-6-4, 5-6-3, 3-6 -5, 3-7-5, 5-7-3, 4-7-4, 4-6-5, 5-6-4, 5-5-5, 5-6-5, etc.
  • A-B-C indicates the base length of the 5' wing region
  • B indicates the base length of the DNA gap region
  • C indicates the base length of the 3' wing region.
  • nucleic acid strand that has a wing region only on either the 5' end or the 3' end is called a "hemigapmer" in the field; however, in this specification, a hemi gapmer is also referred to as a gapmer. shall be included.
  • the nucleic acid molecule of this aspect is a gapmer
  • the 5' wing region comprises one or more (eg, 1-6, 1-5, or 2-4) modified nucleosides and a central
  • the region contains one or more (1-3, 1-2, or 1) toxicity reducing agents located at the ends adjacent to the region, and the central region contains 2 or more (e.g., 2-30, 2-25) toxicity reducing agents. , 2 to 20, 2 to 15, 2 to 8, 2 to 7, or 3 to 5) DNA nucleosides, and the 3' wing region consists of 1 or a plurality (1-3, 1-2, or 1), and one or more (eg, 1-6, 1-5, or 2-4) modified nucleosides.
  • the internucleoside linkages in the nucleic acid molecules of this embodiment may be naturally occurring internucleoside linkages and/or modified internucleoside linkages.
  • at least one, at least two, or at least three internucleoside bonds from the ends (5' end, 3' end, or both ends) of the nucleic acid molecule of this embodiment are preferably modified internucleoside bonds.
  • the two internucleoside bonds from the end of the nucleic acid chain mean the internucleoside bond closest to the end of the nucleic acid chain and the internucleoside bond adjacent thereto and located on the opposite side from the end.
  • Modified internucleoside linkages in the terminal regions of the nucleic acid strand are preferred because they can suppress or inhibit undesired degradation of the nucleic acid strand.
  • all or some of the internucleoside linkages of the nucleic acid molecule may be modified internucleoside linkages.
  • the modified internucleoside linkage may be a phosphorothioate linkage.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain a nucleoside mimetic or a nucleotide mimetic in whole or in part. Nucleotide mimetics may be peptide and/or morpholino nucleic acids. In one embodiment, a nucleic acid molecule of the invention may comprise or consist of a morpholino nucleic acid.
  • the nucleic acid molecule of this aspect may contain a modified nucleobase in addition to the toxicity reducing agent of the first aspect.
  • the number of modified nucleobases other than the toxicity reducing agent is not limited, and may be, for example, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, or at least 6.
  • the base length of the nucleic acid molecule of this embodiment is not particularly limited, but may include at least 8 bases, at least 9 bases, at least 10 bases, at least 11 bases, at least 12 bases, at least 13 bases, at least 14 bases, Alternatively, it may be at least 15 bases long.
  • the base length of the nucleic acid molecule is 40 bases or less, 35 bases or less, 30 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, 22 bases or less, 21 bases or less, 20 bases or less, The length may be less than 1 base, 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, or 16 bases or less.
  • the base length of the nucleic acid molecule may be, for example, 10 to 40 bases, 12 to 30 bases, or 15 to 25 bases.
  • the choice of length can be determined by the balance between the strength of the antisense effect and the specificity of the nucleic acid strand for the target, among other factors such as cost, synthetic yield, etc.
  • the base length of the entire nucleic acid molecule may be the base length of the bound nucleic acid added to the above base length.
  • the antisense effect of the nucleic acid molecule of this embodiment on a target transcription product can be measured by a method known in the art. For example, after introducing a nucleic acid molecule into a cell or the like, measurement may be performed using a known technique such as Northern blotting, quantitative PCR, or Western blotting. By measuring the expression level of target genes or the level of target transcripts (e.g., amount of RNA such as mRNA amount, amount of cDNA, etc.) in specific tissues, it is possible to determine whether target gene expression is suppressed by nucleic acid molecules at those sites. You can determine whether or not.
  • a known technique such as Northern blotting, quantitative PCR, or Western blotting.
  • the measured target gene expression or target transcript level is at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 40%, or at least 50% compared to a negative control (e.g., vehicle administered or no treatment). If it is decreased, it is indicated that the test nucleic acid compound is capable of producing an antisense effect.
  • a negative control e.g., vehicle administered or no treatment
  • the nucleic acid molecules of the present invention can achieve high efficacy (eg, steric blocking, splicing control, reduced expression, increased expression, and/or base editing) while simultaneously having low or no toxicity.
  • gapmer-type antisense nucleic acids that can cleave targets, particularly gapmers containing cross-linked nucleosides have high efficacy, their increased toxicity has been a major obstacle to their practical application.
  • the nucleic acid molecules of the present invention are based on the surprising effect that toxicity is significantly reduced while efficacy is maintained.
  • Double-stranded nucleic acid complex 3-1 The third aspect of the invention is a double-stranded nucleic acid complex.
  • the double-stranded nucleic acid complex of this embodiment includes a first nucleic acid strand that can function as an antisense nucleic acid, and a second nucleic acid strand that includes a base sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the double-stranded nucleic acid complex of this embodiment can simultaneously achieve high gene regulation effects and low or no toxicity.
  • the double-stranded nucleic acid complex of this embodiment includes a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand.
  • the first nucleic acid strand is capable of hybridizing to at least a portion of the target gene or its transcript, and provides steric blocking, splicing control, decreased expression, increased expression, and/or Base editing can be induced.
  • either or both of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand contains at least one nucleoside containing the above-mentioned PAEO.
  • the first nucleic acid strand comprises PAEO, ie, the toxicity reducing agent of the first aspect.
  • the first nucleic acid strand may be selected from the embodiments of the nucleic acid molecule of the second aspect.
  • the first nucleic acid strand does not contain PAEO, ie, the toxicity reducing agent of the first aspect, while only the second nucleic acid strand comprises PAEO.
  • the first nucleic acid strand can be selected from the embodiments of the nucleic acid molecule of the second aspect except for including the toxicity reducing agent of the first aspect.
  • the first nucleic acid strand consists of a nucleic acid molecule as described above that is a gapmer; or (1) a central region comprising at least 2 (e.g., at least 3 or at least 4) contiguous deoxyribonucleosides; ) a 5' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 5' end of the central region; and (3) a 3' wing region containing a non-natural nucleoside located at the 3' end of the central region. comprising the above nucleic acid molecule.
  • the configurations of the gapmer and the above (1) to (3) are similar to the description regarding the nucleic acid molecule in the second embodiment.
  • the second nucleic acid strand contains PAEO.
  • the sugar moiety of the nucleoside containing PAEO may be either an unmodified sugar moiety or a modified sugar moiety.
  • modified sugar moieties include 2'-modified sugars and bicyclic sugar moieties.
  • nucleosides containing bicyclic sugar moieties include, for example, LNA nucleosides, cEt BNA nucleosides, and ENA nucleosides.
  • the PAEO-containing nucleoside may be L-PAEO or D-PAEO as described above.
  • the second nucleic acid strand is a nucleic acid molecule containing a base sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand is annealed to the first nucleic acid strand via hydrogen bonding of complementary base pairs.
  • the second nucleic acid strand has all nucleosides in a region consisting of a base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand (a) deoxyribonucleosides; (b) deoxyribonucleosides and ribonucleosides; (c) ) deoxyribonucleosides and 2'-modified nucleosides; (d) ribonucleosides and 2'-modified nucleosides; or (e) deoxyribonucleosides, ribonucleosides, and 2'-modified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand comprises a region comprising at least two contiguous ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides that is complementary to at least two contiguous deoxyribonucleosides in the central region of the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand comprises at least 3 or at least 4 contiguous ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides that are complementary to at least 3 or at least 4 contiguous deoxyribonucleosides in the central region of the first nucleic acid strand. It may also include an area containing.
  • the number of consecutive deoxyribonucleosides in the central region of the first nucleic acid strand and the number of consecutive ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides complementary to these consecutive deoxyribonucleosides in the second nucleic acid strand are the same. may also be different.
  • the number of consecutive deoxyribonucleosides may be at least four, and the number of consecutive ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides may be at least three.
  • the second nucleic acid strand may include a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand.
  • the region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand may contain at least one non-natural nucleoside, and the non-natural nucleoside is For example, it may be a nucleoside containing PAEO (eg L-PAEO or D-PAEO), a bridged nucleoside and/or a 2' modified nucleoside.
  • PAEO eg L-PAEO or D-PAEO
  • the bridged nucleoside may be a bridged nucleoside comprising PAEO (eg, L-PAEO), LNA nucleoside, ENA nucleoside, or BNA NC nucleoside.
  • PAEO eg, L-PAEO
  • LNA nucleoside LNA nucleoside
  • ENA nucleoside ENA nucleoside
  • BNA NC nucleoside BNA NC nucleoside.
  • the 2' modification group of the 2' modified nucleoside in the second nucleic acid strand may be a 2'-O-methyl group or a 2'-O-methoxyethyl group.
  • the crosslinked nucleosides and/or 2' modified nucleosides in the first and second nucleic acid strands are not the same. may also be different.
  • the internucleoside linkages in the second nucleic acid strand may be naturally occurring internucleoside linkages and/or modified internucleoside linkages. Although not limited, it is preferred that at least one, at least two, or at least three internucleoside bonds from the end (5' end, 3' end, or both ends) of the second nucleic acid strand are modified internucleoside bonds. In one embodiment, all or some of the internucleoside linkages of the second nucleic acid strand may be modified internucleoside linkages.
  • the second nucleic acid strand may include a modified internucleoside bond in a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand.
  • the modified internucleoside linkage may be a phosphorothioate linkage.
  • the second nucleic acid strand can include a 2' modified nucleoside (eg, a 2'-O-methoxyethyl modified nucleoside).
  • the number of 2'-modified nucleosides is not limited. For example, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90 of the total number of nucleosides in said second nucleic acid strand.
  • %, or at least 95%, or 100% may be 2' modified nucleosides (eg, 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides).
  • all of the nucleosides in the second nucleic acid strand are 2' modified nucleosides (eg, 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides).
  • the second nucleic acid strand comprises one or more consecutive 2'-modified nucleosides (e.g., 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides) located at the 5' end, and/or at the 3' end. It can include one or more consecutive 2' modified nucleosides (eg, 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides).
  • the number of 2'-modified nucleosides (eg, 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides) located at the 5' and/or 3' ends is not limited.
  • the second nucleic acid strand may include one or consecutive 2, 3, 4, 5, 6, or 7 2' modified nucleosides (e.g., 2'-O-methoxy) located at the 5' end. ethyl-modified nucleosides), and/or one or consecutive 2, 3, 4, 5, 6, or 7 2'-modified nucleosides (e.g., 2'-O-methoxy ethyl-modified nucleosides).
  • the second nucleic acid strand may include a modified nucleobase other than PAEO.
  • the number of modified nucleobases is not limited and may be, for example, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, or at least 6.
  • the second nucleic acid strand may include a non-complementary base and/or an insertion sequence and/or deletion of one or more bases with respect to the first nucleic acid strand.
  • the number of non-complementary bases in the second nucleic acid strand is not limited, but for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to It may be 4 pieces, 1 to 3 pieces, 1 to 2 pieces, or 1 or 2 pieces.
  • the number of bases of the inserted sequence in the second nucleic acid strand is not limited, but for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to It may be 4 pieces, 1 to 3 pieces, 1 to 2 pieces, or 1 or 2 pieces.
  • the length of consecutive bases of the deletion in the second nucleic acid strand is not limited, but for example, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 It may be ⁇ 4 pieces, 1 ⁇ 3 pieces, 1 ⁇ 2 pieces, or 1 piece or 2 pieces. A region composed of non-complementary bases or inserted sequences may form a bulge.
  • the second nucleic acid strand may further include at least one overhang region located at one or both of the 5' and 3' ends of the complementary region.
  • overhang region is a region adjacent to a complementary region, in which when the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand anneal to form a double-stranded structure, the 5' end of the second nucleic acid strand A second nucleic acid that extends beyond the 3' end of the nucleic acid strand and/or that the 3' end of the second nucleic acid strand extends beyond the 5' end of the first nucleic acid strand, i.e.
  • the overhang region in the second nucleic acid strand may be located at the 5' end or at the 3' end of the complementary region.
  • the overhang region in the second nucleic acid strand may be located at the 5' and 3' ends of the complementary region.
  • a functional moiety may be bound to the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand, for example, the second nucleic acid strand.
  • the binding between the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand and the functional portion may be a direct binding or an indirect binding via another substance, but in certain embodiments In this case, it is preferable that the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand and the functional part are directly bonded by covalent bond, ionic bond, hydrogen bond, etc., from the viewpoint of obtaining a more stable bond. , a covalent bond is more preferred.
  • the structure of the "functional part” is not particularly limited, and it imparts a desired function to the double-stranded nucleic acid complex that binds it. Desired functions include labeling, purification, and target delivery functions. Examples of moieties that provide a labeling function include compounds such as fluorescent proteins and luciferase. Examples of moieties that impart a purification function include compounds such as biotin, avidin, His tag peptide, GST tag peptide, and FLAG tag peptide.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand Preferably, a molecule having the activity of delivering the double-stranded nucleic acid complex to a target site in certain embodiments is bound as a functional moiety to the double-stranded nucleic acid complex.
  • moieties that provide a target delivery function include lipids, antibodies, aptamers, and ligands for specific receptors.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand, eg, the second nucleic acid strand are associated with a lipid.
  • Lipids include tocopherol, cholesterol, fatty acids, phospholipids and their analogs; folic acid, vitamin C, vitamin B1, vitamin B2; estradiol, androstane and their analogs; steroids and their analogs; LDLR, SRBI or LRP1 /2 ligand; FK-506, and cyclosporine; lipids described in PCT/JP2019/12077 and PCT/JP2019/10392, and the like, but are not limited to these.
  • the lipid may be tocopherol or an analog thereof and/or cholesterol or an analog thereof, a substituted or unsubstituted C 1-30 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 2-30 alkenyl group, or It may be a substituted or unsubstituted C 1-30 alkoxy group.
  • the second nucleic acid strand may be conjugated to tocopherol or cholesterol or analogs thereof.
  • tocopherol is a methylated derivative of tocolor, a fat-soluble vitamin (vitamin E) with a cyclic structure called chroman. Tocorol has a strong antioxidant effect, and therefore, in vivo, has the function of scavenging free radicals generated by metabolism and protecting cells from damage as an antioxidant.
  • tocopherol Several different types are known, based on the position of the methyl group bonded to chroman, including ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, and ⁇ -tocopherol.
  • Tocopherol herein may be any tocopherol.
  • analogs of tocopherol include various unsaturated analogs of tocopherol, such as ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, and the like.
  • the tocopherol is ⁇ -tocopherol.
  • cholesterol is a type of sterol, also called steroid alcohol, and is particularly abundant in animals. Cholesterol plays an important function in metabolic processes in living organisms, and in animal cells, it is also a major component of the cell membrane system together with phospholipids. Cholesterol analogs refer to various cholesterol metabolites and analogs, which are alcohols having a sterol skeleton, including but not limited to cholestanol, lanosterol, cerebrosterol, dehydrocholesterol, and coprostanol. Including etc.
  • analog refers to compounds having the same or similar basic skeletons and similar structures and properties. Analogs include, for example, biosynthetic intermediates, metabolites, compounds with substituents, and the like. Whether a certain compound is an analog of another compound can be determined by those skilled in the art based on common technical knowledge.
  • the functional moiety may be linked to the 5' end, 3' end, or both ends of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand.
  • the functional moiety may be linked to an internal nucleotide of the first and/or second nucleic acid strand.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand contains two or more functional moieties such as lipids, and these may be linked to multiple positions of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand, and/or may be linked as a group at one position of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand.
  • One functional moiety may be linked to the 5' end and 3' end of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand, respectively.
  • the bond between the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand and the functional portion may be a direct bond or an indirect bond mediated by another substance.
  • the functional moiety is preferably and even more directly attached to the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand via a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, etc.
  • a covalent bond is more preferable from the viewpoint of being able to obtain a stable bond.
  • the functional moiety may also be linked to the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand via a cleavable or non-cleavable linker.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand can be linked via a linker to form a single strand.
  • the functional region has the same structure as the double-stranded nucleic acid complex, and therefore, in this specification, such single-stranded nucleic acids are also included as an embodiment of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention.
  • the linker can be any polymer. Examples include polynucleotides, polypeptides, alkylenes, and the like.
  • the linker may be composed of natural nucleotides such as DNA and RNA, or non-natural nucleotides such as peptide nucleic acids and morpholino nucleic acids.
  • the linker consists of a nucleic acid
  • the chain length of the linker can be at least 1 base, for example, 3 to 10 bases or 4 to 6 bases. Preferably, the chain length is 4 bases.
  • the linker may take the form of a hinge (hairpin loop).
  • the linker can be positioned on either the 5' side or the 3' side of the first nucleic acid strand, but for example, in the case of a configuration in which the second nucleic acid strand is bound to the 5' side of the first nucleic acid strand, The 5' end of the first nucleic acid strand and the 3' end of the second nucleic acid strand are linked via a linker.
  • “Cleavable linker” means a linking group that is cleaved under physiological conditions, for example within a cell or an animal body (eg, within a human body).
  • the cleavable linker is selectively cleaved by an endogenous enzyme, such as a nuclease.
  • Cleavable linkers include amides, esters, one or both phosphodiesters, phosphate esters, carbamates, and disulfide bonds, as well as natural DNA linkers.
  • Non-cleavable linker means a linker that is not cleaved under physiological conditions, for example, within a cell or an animal body (eg, a human body).
  • Non-cleavable linkers include, but are not limited to, linkers consisting of a phosphorothioate bond, a modified or unmodified deoxyribonucleoside, or a modified or unmodified ribonucleoside linked by a phosphorothioate bond, and the like.
  • the linker is a nucleic acid such as DNA or an oligonucleotide
  • the chain length is not particularly limited, but it may generally be 2 to 20 bases, 3 to 10 bases, or 4 to 6 bases long.
  • linker is a linker represented by the following formula (VI).
  • L 2 is a substituted or unsubstituted C 1 to C 12 alkylene group (e.g., propylene, hexylene, dodecylene), a substituted or unsubstituted C 3 to C 8 cycloalkylene group (e.g., cyclohexylene); Silene), -(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 3 -, -(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 - O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 3 -, or CH(CH 2 -OH)-CH 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 3 -, L 3 represents -NH- or a bond, and L 4 is substituted
  • C 3 -C 8 cycloalkylene groups e.g. cyclohexylene
  • -(CH 2 ) 2 -[O -(CH 2 ) 2 ] m - or a bond
  • m represents an integer from 1 to 25
  • the linker of formula (VI) is such that L 2 is an unsubstituted C 3 -C 6 alkylene group (e.g., propylene, hexylene), -(CH 2 ) 2 -O-( CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 3 - or -(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 2 -O-(CH 2 ) 3 -, L 3 is -NH-, and L 4 and L 5 are a bond.
  • C 3 -C 6 alkylene group e.g., propylene, hexylene
  • L 3 is -NH-
  • L 4 and L 5 are a bond.
  • the base lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are not particularly limited, but are at least 8 bases long, at least 9 bases long, at least 10 bases long, at least 11 bases long, at least 12 bases long, at least 13 bases long, at least It may be 14 bases long, or at least 15 bases long.
  • the base length of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand is 40 bases or less, 35 bases or less, 30 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, 22 bases or less , 21 bases or less, 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, or 16 bases or less.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may have the same length or different lengths (for example, either one is 1 to 3 bases shorter or longer).
  • the double-stranded structure formed by the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may include a bulge.
  • the choice of length can be determined by the balance between the strength of the antisense effect and the specificity of the nucleic acid strand for the target, among other factors such as cost, synthetic yield, etc.
  • the base length of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand as a whole is equal to the base length of the nucleic acid bound to the above base length.
  • the base length may be added.
  • the base length of the nucleic acid to be bound is not limited, but may be, for example, at least 10 bases, at least 15 bases, or at least 20 bases, and may be 100 bases or less, 80 bases or less, or 60 bases or less. , 40 bases or less, or 30 bases or less in length.
  • the double-stranded nucleic acid complexes of the present invention can achieve high efficacy (eg, steric blocking, splicing control, decreased expression, increased expression, and/or base editing) while at the same time having low or no toxicity.
  • high efficacy eg, steric blocking, splicing control, decreased expression, increased expression, and/or base editing
  • the fourth aspect of the invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains at least one nucleic acid molecule of the second embodiment or the double-stranded nucleic acid complex of the third embodiment, and can be used for the treatment of diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can simultaneously achieve high gene regulation effects and low or no toxicity.
  • compositions of the present invention includes at least the nucleic acid molecule according to the second aspect or the double-stranded nucleic acid complex according to the third aspect as an active ingredient.
  • compositions of the invention may include one or more nucleic acid molecules or double-stranded nucleic acid complexes.
  • the amount (content) of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex contained in the composition of the present invention is determined by the type of nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex, the delivery site, the dosage form of the composition, and the administration of the composition. It varies depending on the amount and the type of carrier described below. Therefore, it may be determined as appropriate in consideration of each condition. Typically, a single dose of the composition will contain an effective amount of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex.
  • Effective amount is the amount necessary for the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex to perform its function as an active ingredient, and which causes little or no harmful side effects to the living organism to which it is applied. Refers to the amount not granted. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of administration, and number of administrations. The final decision is made by the judgment of a doctor, veterinarian, pharmacist, etc.
  • Subject information refers to various individual information about the living body to which the composition is applied. For example, if the subject is a human, the information includes age, weight, sex, diet, health condition, degree of progression and severity of disease, drug sensitivity, presence or absence of concomitant drugs, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients commonly used in the pharmaceutical art. For example, solvents, vegetable oils, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, pH adjusters, stabilizers, excipients, vehicles, preservatives, binders, diluents, tonicity agents, Included are sedatives, fillers, disintegrants, buffers, coatings, lubricants, thickeners, solubilizers, and other additives.
  • the solvent may be, for example, water or another pharmaceutically acceptable aqueous solution, or a pharmaceutically acceptable organic solvent.
  • aqueous solutions include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, phosphate buffers, and sodium acetate buffers.
  • the adjuvant include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • the above-mentioned carrier is used to avoid or suppress the decomposition of the double-stranded nucleic acid complex, which is the active ingredient, in vivo by enzymes, etc., as well as to facilitate formulation and administration methods, and to maintain the dosage form and drug efficacy. It can be used as needed.
  • Dosage form The dosage form of the composition of the present invention is such that the active ingredient, the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex, is delivered to the target site without being inactivated by degradation, etc., and the pharmacological effect of the active ingredient is achieved in vivo.
  • the form can exhibit an antisense effect (for example, antisense effect on target gene expression).
  • the specific dosage form varies depending on the administration method and/or prescription conditions. Administration methods can be broadly classified into parenteral administration and oral administration, and the dosage form suitable for each administration method may be used.
  • the preferred dosage form is a liquid.
  • liquid preparations include injections. Injectables are mixed with the above-mentioned excipients, elixirs, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, pH regulators, etc., as appropriate, in the unit dosage form required by generally accepted pharmaceutical practice. It can be formulated by In addition, ointments, plasters, cataplasms, transdermal preparations, lotions, inhalants, aerosols, eye drops, and suppositories may also be used.
  • preferred dosage forms include solids (including tablets, capsules, drops, and lozenges), granules, powders, powders, and liquids (including oral solutions, emulsions, and syrups). ). If it is a solid drug, it may be made into a dosage form with a coating known in the art, such as sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, double tablets, or multilayer tablets, if necessary. be able to.
  • each of the above dosage forms are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention it may be formulated according to conventional methods in the technical field.
  • Dosage Form and Dosage There are no particular limitations herein on the preferred dosage form of the pharmaceutical composition.
  • Administration may be systemic or local.
  • the route of administration may be oral or parenteral.
  • Specific examples of parenteral administration include intravenous administration, intraarterial administration, administration by blood transfusion, intraperitoneal administration, intraventricular administration, intrathecal administration, intraocular administration, intramuscular administration, and subcutaneous administration (implanted continuous subcutaneous administration). ), intradermal administration, intravesical administration, intravaginal administration, rectal administration, inhalation or nasal administration, and tracheal/bronchial administration.
  • intrathecal administration is suitable.
  • Intrathecal administration may be intraventricular administration, posterior fossa puncture, or lumbar puncture, and may be administered using a shunt, indwelling catheter, or subcutaneous port.
  • the amount administered or ingested is, for example, between 0.00001 mg/kg/day and 10000 mg/kg/day of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex contained, or 0.001 mg/kg/day. mg/kg/day to 100 mg/kg/day.
  • Pharmaceutical compositions may be administered in a single dose or in multiple doses. In the case of multiple administrations, it can be administered daily or at appropriate time intervals (for example, at intervals of 1 day, 2 days, 3 days, 1 week, 2 weeks, or 1 month), for example, 2 to 20 times.
  • a single dose of the above nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex is, for example, 0.001 mg/kg or more, 0.005 mg/kg or more, 0.01 mg/kg or more, 0.1 mg/kg or more, 0.25 mg/kg or more , 0.5 mg/kg or more, 1 mg/kg or more, 2.5 mg/kg or more, 0.5 mg/kg or more, 1.0 mg/kg or more, 2.0 mg/kg or more, 3.0 mg/kg or more, 4.0 mg/kg or more, 5 mg/kg or more, 10 mg/kg or more, 20 mg/kg or more, 30 mg/kg or more, 40 mg/kg or more, 50 mg/kg or more, 75 mg/kg or more, 100 mg/kg or more, 150 mg/kg kg or more, 200 mg/kg or more, 300 mg/kg or more, 400 mg/kg or more, or 500 mg/kg or more, for example, any amount within the range of 0.001 mg/kg to 500 mg/kg amount (for example, 0.001 mg
  • the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex of the invention may be administered at a dose of 0.01 to 10 mg/kg (eg, about 6.25 mg/kg) four times twice a week.
  • the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex may also be administered at a dose of 0.05 to 30 mg/kg (e.g., about 25 mg/kg) once or twice a week to 2 to 4 times, e.g., twice a week. May be administered twice.
  • Adoption of such a dosing regimen may further reduce toxicity (e.g. avoid platelet reduction) and reduce burden on the subject compared to single administration of higher doses. .
  • the pharmaceutical composition exerts an additive inhibitory effect within cells.
  • effectiveness can be improved by leaving a certain interval between administrations (for example, half a day or more).
  • Target disease The disease to which the pharmaceutical composition is applicable is not limited. By steric blocking, splicing control, expression reduction, expression increase, and/or base editing of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex of the present invention, the expression level of the transcription product or translation product can be suppressed or enhanced.
  • the pharmaceutical composition can be used in animals, including humans, as subjects. However, there are no particular limitations on animals other than humans, and various livestock, poultry, pets, laboratory animals, etc. can be the subjects of some embodiments.
  • the subject may be a subject in need of decreasing the expression level of a target transcript in the central nervous system.
  • the subject may also be in need of treatment for a central nervous system disease.
  • the disease to be treated can be a central nervous system disease associated with increased or decreased gene expression, particularly a disease associated with increased expression of a target transcript or target gene (such as a tumor).
  • Central nervous system diseases include, but are not particularly limited to, brain tumors, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, Huntington's disease, and the like.
  • the nervous system is divided into the central nervous system and the peripheral nervous system.
  • the central nervous system consists of the brain and spinal cord.
  • the brain includes the cerebrum (cerebral cortex, cerebral white matter, basal ganglia), diencephalon (thalamus, subthalamic nucleus), cerebellum (cerebellar cortex, cerebellar nuclei), and brainstem (midbrain, substantia nigra, pons, medulla oblongata).
  • the spinal cord includes the cervical, thoracic, lumbar, sacral, and caudal spinal cords.
  • the central nervous system in this specification may refer to any of these areas, but in particular, it includes the cerebral cortex (frontal lobe, temporal lobe, parietal lobe, occipital lobe), cerebellum, striatum, globus pallidus, anterior It may be the spinal cord, hippocampus, parahippocampal gyrus, brainstem, cervical spinal cord, thoracic spinal cord, or lumbar spinal cord. Peripheral nerves consist of cranial nerves and spinal nerves.
  • cerebral cortex frontal lobe, temporal lobe, parietal lobe, occipital lobe
  • cerebellum cerebellum
  • striatum striatum
  • globus pallidus anterior It may be the spinal cord, hippocampus, parahippocampal gyrus, brainstem, cervical spinal cord, thoracic spinal cord, or lumbar spinal cord.
  • Peripheral nerves consist of cranial nerves and spinal nerve
  • FTD frontotemporal dementia
  • SD semantic dementia
  • PNFA progressive nonfluent aphasia
  • the frontal lobe, temporal Drug delivery to the leaves and/or substantia nigra may be effective.
  • Parkinson's disease dementia drug delivery to the occipital lobe, substantia nigra, and/or striatum may be effective.
  • Drug delivery to the substantia nigra and/or striatum may be effective in treating Parkinson's disease.
  • CBD corticobasal degeneration
  • PSP progressive supranuclear palsy
  • amyotrophic lateral sclerosis drug delivery to the frontal lobe, parietal lobe, basal ganglia, and/or substantia nigra may be effective.
  • SCD spinocerebellar degeneration
  • Drug delivery to the brainstem and/or cerebellum can be effective.
  • Drug delivery to the basal ganglia, brainstem, and/or cerebellum may be effective in the treatment of dentate nucleus pallidum-Luysian degeneration (DRPLA).
  • DPLA dentate nucleus pallidum-Luysian degeneration
  • SBMA spinal and bulbar atrophy
  • FA Friedreich's ataxia
  • FA Friedreich's ataxia
  • striatum In the treatment of Huntington's disease, drug delivery to the striatum, frontal lobe, parietal lobe, and/or basal ganglia may be effective.
  • prion diseases mad cow disease, GSS
  • drug delivery to the cerebral cortex, cerebral white matter, basal ganglia, and/or substantia nigra In the treatment of cerebral leukoencephalopathy, drug delivery to the cerebral white matter may be effective.
  • Whole-brain drug delivery can be effective in treating encephalitis (viral, bacterial, fungal, tuberculous) and meningitis (viral, bacterial, fungal, tuberculous).
  • drug delivery to the whole brain can be effective.
  • drug delivery to the cerebral white matter may be effective.
  • Drug delivery to the entire brain can be effective in treating cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, moyamoya disease, and anoxic encephalopathy.
  • drug delivery to the cerebral white matter may be effective.
  • Drug delivery to cerebral white matter can be effective in treating diffuse axonal injury.
  • drug delivery to the entire brain can be effective.
  • MM multiple sclerosis
  • NMO neuromyelitis optica
  • drug delivery to the cerebral white matter, cerebral cortex, optic nerve and/or spinal cord can be effective.
  • myotonic dystrophy DM1, DM2
  • drug delivery to skeletal muscle, cardiac muscle, cerebral cortex, and/or cerebral white matter may be effective.
  • familial spastic paraplegia HSP
  • drug delivery to the parietal lobe and/or spinal cord can be effective.
  • Fukuyama muscular dystrophy drug delivery to skeletal muscle, cerebral cortex, and/or cerebral white matter may be effective.
  • ⁇ nigra In the treatment of dementia with Lewy bodies (DLB), drug delivery to the substantia nigra, striatum, occipital lobe, frontal lobe, and/or parietal lobe may be effective.
  • MSA multiple system atrophy
  • drug delivery to the striatum, basal ganglia, cerebellum, substantia nigra, frontal and/or temporal lobes may be effective.
  • Drug delivery to the cerebral white matter may be effective in treating Alexander disease.
  • CADASIL and CARASIL drug delivery to the cerebral white matter may be effective.
  • a disease e.g., central nervous system disease
  • a subject such as a human (e.g., intrathecally).
  • a disease e.g., central nervous system disease
  • toxicity reducing agent of the first aspect the nucleic acid molecule of the second aspect, or the double-stranded nucleic acid complex of the third aspect in the manufacture of a medicament.
  • Example 1 Efficacy and toxicity of Malat1-targeting antisense nucleic acids containing D-PAEO/L-PAEO (in vivo experiment)> (the purpose)
  • PAEO 9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine
  • D-PAEO 9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine
  • LNA nucleoside containing PAEO herein often referred to as "L-PAEO”
  • the gene expression suppressing effect and central nervous system toxicity of a single intracerebroventricular administration of this antisense nucleic acid will be verified through in vivo experiments.
  • the antisense nucleic acids (ASO) used in this example are antisense nucleic acids that target mouse metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript-1 (Malat1) mRNA, and have a base complementary to a part of Malat1 mRNA. It has a structure in which 20 nucleosides are linked by phosphorothioate bonds.
  • ASO DNA only
  • ASO LNA
  • ASO is composed of, in order from the 5' end, 4 DNA nucleosides, 1 LNA nucleoside, 11 DNA nucleosides, 1 LNA nucleoside, and 3 DNA nucleosides.
  • ASO (D-PAEO) consists of 4 DNA nucleosides, 1 D-PAEO, 11 DNA nucleosides, 1 D-PAEO nucleoside, and 3 DNA nucleosides in order from the 5' end. be done.
  • ASO (L-PAEO) consists of 4 DNA nucleosides, 1 L-PAEO, 11 DNA nucleosides, 1 L-PAEO nucleoside, and 3 DNA nucleosides in order from the 5' end. be done.
  • ASO (LNA MOE) consists of, in order from the 5' end, 4 2'-O-MOE-RNA nucleosides, 1 LNA nucleoside, 11 DNA nucleosides, 1 LNA nucleoside, and 3 2'-O-MOE-RNA nucleosides. Composed of '-O-MOE-RNA nucleosides.
  • ASO (D-PAEO MOE) consists of, in order from the 5' end, 4 2'-O-MOE-RNA nucleosides, 1 D-PAEO nucleoside, 11 DNA nucleosides, and 1 D-PAEO nucleoside. , and three 2'-O-MOE-RNA nucleosides.
  • ASO (L-PAEO MOE) consists of, in order from the 5' end, 4 2'-O-MOE-RNA nucleosides, 1 L-PAEO nucleoside, 11 DNA nucleosides, and 1 L-PAEO nucleoside. , and three 2'-O-MOE-RNA nucleosides.
  • ASO (full MOE) is composed of 5 2'-O-MOE-RNA nucleosides, 11 DNA nucleosides, and 4 2'-O-MOE-RNA nucleosides in order from the 5' end. .
  • L-PAEO is the following formula (I): It is an LNA nucleoside containing an artificial base (PAEO: 9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine) represented by the following formula (II).
  • D-PAEO is a DNA nucleoside containing an artificial base (PAEO) represented by the above formula (I), and is represented by the following formula (III).
  • Each powdered nucleic acid agent was added to phosphate buffered saline (PBS) and dissolved. All nucleic acid strands were custom synthesized by Gene Design Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • mice to which only PBS was administered were also created as a negative control group.
  • Each category includes two behavioral evaluation items. Each behavioral evaluation item is evaluated on a 5-point scale from 0 to 4 points ( Figure 4, scores 1 to 4), with 0 points being normal and higher scores as the toxicity becomes higher. For each category, the higher score of the two behavioral evaluation items is adopted as the score for that category.
  • the sum of the scores in the five categories is the acute tolerability score (0 to 20 points).
  • an open field test was performed at each time point after administration of various nucleic acid agents. Specifically, a mouse was placed in the center of a cage (width 50 cm x diameter 50 cm x height 40 cm), and the trajectory of the mouse was recorded for 5 minutes. Based on the recorded data, the total moving distance (m), maximum moving speed (m/s), and moving time (s) were measured using video tracking software (ANY-maze). Statistically significant differences between each administration group were evaluated by t-test and one-way ANOVA test (post-hoc test: Tukey test).
  • ncRNA Malat1 non-coding RNA
  • GFAP mRNA GFAP mRNA
  • Actb mRNA internal standard gene
  • the ratio of the expression levels of Malat1 ncRNA and GFAP mRNA to the expression level of Actb mRNA was calculated, and the values normalized to the values of the PBS administration group were defined as relative Malat1 ncRNA levels and GFAP mRNA levels.
  • Gene suppression effects were evaluated from Malat1 mRNA levels, and chronic neurotoxicity was evaluated from GFAP mRNA levels.
  • Figure 5 shows the results of calculating acute tolerability scores and evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were administered intracerebroventricularly.
  • the ASO (D-PAEO) and ASO (L-PAEO) administration groups the acute tolerability score was significantly decreased compared to the ASO (DNA only) administration group and the ASO (LNA) administration group, respectively.
  • the acute tolerability score was significantly decreased compared to the ASO (LNA MOE) administration group, and the score was 0 at any time point. Met.
  • Figures 6 and 7 show the results of evaluating motor function in mice administered intracerebroventricularly with various nucleic acid agents one hour after administration.
  • the total movement distance ( Figure 6A) and maximum movement speed were significantly lower than in the ASO (DNA only) administration group and the ASO (LNA) administration group, respectively.
  • FIG. 6B mobilization time (FIG. 7) were significantly improved.
  • the total distance traveled, maximum movement speed, and movement time were significantly improved compared to the ASO (LNA MOE) administration group, all of which were equivalent to the PBS administration group. Demonstrated motor function.
  • antisense nucleic acids containing L-PAEO or D-PAEO have an extremely small effect on suppressing motor function and have extremely low toxicity compared to 2'-O-MOE modification.
  • antisense nucleic acids containing D-PAEO and 2'-O-MOE modified nucleosides, as well as antisense nucleic acids containing L-PAEO and 2'-O-MOE modified nucleosides are substantially free from acute central nervous system toxicity. It was shown that
  • Figure 8 shows the expression levels of Malat1 ncRNA (Figure 8A) and GFAP mRNA ( Figure 8B) in the occipital cortex 7 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • the gene suppression effect on Malat1 ncRNA was increased in the ASO (D-PAEO) and ASO (L-PAEO) treated groups compared to the ASO (DNA only) and ASO (LNA) treated groups, respectively.
  • the increase in GFAP gene expression level was suppressed in the ASO(L-PAEO)-administered group compared to the ASO(LNA)-administered group.
  • the GFAP gene expression level was increased in the ASO (D-PAEO) administration group compared to the AS (DNA only) administration group.
  • antisense nucleic acids containing D-PAEO or L-PAEO can achieve a high gene suppression effect and at the same time can significantly reduce acute central nervous system toxicity. Furthermore, it was shown that the effect of reducing chronic neurotoxicity could not be obtained by replacing DNA nucleosides with D-PAEO, but could be obtained by replacing LNA nucleosides with L-PAEO.
  • Example 2 Efficacy and toxicity of Mapt target antisense nucleic acids containing D-PAEO/L-PAEO (in vivo experiment)> (the purpose) D-PAEO or L-PAEO is introduced into the antisense nucleic acid targeting the Mapt gene. The gene expression suppressing effect and central nervous system toxicity of a single intracerebroventricular administration of this antisense nucleic acid will be verified through in vivo experiments.
  • the antisense nucleic acids (ASO) used in this example are all antisense nucleic acids that target microtubule-associated protein tau (Mapt) mRNA, and have a base sequence complementary to a portion of Mapt mRNA. It has a structure in which 16 nucleosides are linked by phosphorothioate bonds.
  • ASO DNA only
  • ASO LNA
  • ASO is composed of, in order from the 5' end, 4 DNA nucleosides, 1 LNA nucleoside, 8 DNA nucleosides, 1 LNA nucleoside, and 2 DNA nucleosides.
  • ASO (D-PAEO) consists of 4 DNA nucleosides, 1 D-PAEO, 8 DNA nucleosides, 1 D-PAEO nucleoside, and 2 DNA nucleosides in order from the 5' end. be done.
  • ASO (L-PAEO) consists of 4 DNA nucleosides, 1 L-PAEO, 8 DNA nucleosides, 1 L-PAEO nucleoside, and 2 DNA nucleosides in order from the 5' end. be done.
  • ASO DNA only
  • ASO LNA
  • ASO D-PAEO
  • ASO L-PAEO
  • nucleic acid preparation in vivo experiments, and central Neurotoxicity evaluation and motor function evaluation were performed.
  • the left occipital lobe cortex was removed from mice 7 days after administration of various nucleic acid agents, and the gene suppression effect and chronic central nervous system toxicity were evaluated.
  • the amount of nucleic acid agent administered per mouse was 19.0 nmol/mouse.
  • Figure 10 shows the results of evaluating central nervous system toxicity in mice to which various nucleic acid agents were administered intracerebroventricularly. At 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 4 hours after administration of the nucleic acid agent, the ASO (D-PAEO) and ASO (L-PAEO) administration groups , the acute tolerability score was significantly decreased compared to the ASO (DNA only) administration group and the ASO (LNA) administration group, respectively. These results showed that antisense nucleic acids containing D-PAEO or L-PAEO significantly reduced central nervous system toxicity.
  • Figures 11 and 12 show the results of evaluating motor function in mice 1 hour after administration of various nucleic acid agents intracerebroventricularly.
  • the total movement distance (Figure 11A) and maximum movement speed were significantly lower than in the ASO (DNA only) administration group and the ASO (LNA) administration group, respectively.
  • FIG. 11B mobilization time (FIG. 12) were significantly improved.
  • Figure 13 shows Malat1 mRNA (Figure 13A) and GFAP mRNA expression levels (Figure 13B) in the occipital cortex 7 days after intracerebroventricular administration of various nucleic acid agents.
  • the gene suppression effect in the ASO (D-PAEO) administration group was increased compared to the ASO (DNA only) administration group, and the gene suppression effect in the ASO (L-PAEO) administration group was equivalent to that in the ASO (LNA) administration group. Met.
  • the increase in GFAP gene expression level was suppressed in the ASO(L-PAEO)-administered group compared to the ASO(LNA)-administered group.
  • the GFAP gene expression level was increased in the ASO (D-PAEO) administration group compared to the ASO (DNA only) administration group.
  • Example 3 Efficacy and toxicity of Malat1 target antisense nucleic acid containing D-PAEO/L-PAEO (in vitro experiment)> (the purpose) The effectiveness and toxicity of Malat1-targeting antisense nucleic acids containing D-PAEO or L-PAEO will be verified by in vitro experiments.
  • nucleic acids were prepared in the same manner as in Example 1.
  • nucleic acid agents were introduced into mouse neuroblastoma-derived cells (Neuro-2a cell line) at 0.4 nM, 2 nM, or 50 nM using the lipofection method (lipofectamine 2000).
  • the ratios of Mapt mRNA, IL6 mRNA, and p21 mRNA amounts to Actb mRNA (internal standard gene) expression levels were calculated, and the values normalized to those of the PBS administration group were calculated as relative Mapt mRNA level, relative IL6 mRNA level, and relative p21 mRNA levels.
  • the nucleic acid agent was introduced into the Neuro-2a cell line using the same method as in (2) above. 48 hours after introduction, dehydrogenase activity, which is an indicator of the number of viable cells, was measured using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories). The color reagent WST-8 is reduced to formazan by dehydrogenase. The more living cells there are, the higher the dehydrogenase activity and the greater the amount of formazan produced. Since formazan has maximum absorption around 450 nm, its production amount can be measured based on absorbance. Therefore, the higher the absorbance based on formazan, the lower the toxicity to nerve cells.
  • FIG. 15 and FIG. 16 show the measurement results of the expression suppression effect on target genes and neurotoxicity in mouse neuroblastoma-derived cells (Neuro-2a cell line).
  • ASO L-PAEO MOE
  • a strong gene suppression effect equivalent to that of ASO (LNA MOE) and ASO (full MOE) was obtained ( Figure 15).
  • the IL6 gene expression level was significantly suppressed in the ASO (L-PAEO MOE) administration group compared to the ASO (LNA MOE) administration group, and was suppressed to the same level or lower when compared to ASO (full MOE) ( Figure 16A).
  • the p21 gene expression level was significantly suppressed in the ASO(L-PAEO MOE) administration group compared to the ASO(L-PAEO) administration group and the ASO(full MOE) administration group (FIG. 16B).
  • Figure 17 shows the results of evaluating the number of viable cells based on dehydrogenase activity after introducing various nucleic acid agents into cells.
  • the ASO (L-PAEO MOE) administration group had a higher number of viable cells and lower cytotoxicity than the ASO (L-PAEO) administration group and the ASO (full MOE) administration group.

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Abstract

高い遺伝子制御効果と低毒性の両方を同時に達成できる新たな核酸医薬を提供することを課題とする。　式（I）で示される人工塩基を含むヌクレオシドからなる、核酸医薬の毒性軽減剤であって、前記核酸医薬を構成する核酸鎖とヌクレオシド間結合で連結される、前記毒性軽減剤を提供する。

Description

核酸医薬の毒性軽減剤
　本発明は、核酸医薬の毒性軽減剤、核酸分子、二本鎖核酸複合体、医薬組成物、及び核酸医薬の毒性を軽減するための使用等に関する。
　近年、核酸医薬と呼ばれる医薬品の現在進行中の開発において、オリゴヌクレオチドが関心を集めており、また特に、標的遺伝子の高い選択性及び低毒性の点から考えて、アンチセンス法を利用する核酸医薬の開発が積極的に進められている。アンチセンス法とは、標的遺伝子より転写されたmRNAやmiRNAの部分配列を標的センス鎖として、それに相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド：本明細書ではしばしば「ASO（Antisense Oligonucleotide）」と表記する）を細胞に導入することによって、標的遺伝子によってコードされたタンパク質の発現やmiRNAの活性を選択的に改変又は阻害することを含む方法である。
　アンチセンス法を利用した核酸として、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとそれに対する相補鎖とをアニーリングさせた二本鎖核酸複合体(ヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド(heteroduplex oligonucleotide、HDO))を開発した(特許文献１及び２、非特許文献１及び２)。二本鎖核酸複合体は高いアンチセンス効果を有する画期的な技術である。
　アンチセンス法等の核酸医薬では、臨床開発が進み、前臨床試験の結果が蓄積されるにつれ、毒性回避が重要であることが明らかになってきた。核酸医薬では、遺伝子抑制効果と毒性はトレードオフの関係にあることが知られている。すなわち、核酸医薬の遺伝子抑制効果が強いほど、一般的に毒性が高い傾向を示す。特に標的転写産物の切断を導くギャップマー型のアンチセンス核酸や、架橋型核酸を含むアンチセンス核酸は、強い遺伝子抑制効果を有する一方で、毒性が高く、致死的な毒性を示す場合がある。
　したがって、毒性を低減しながら高い遺伝子制御効果を得るための新たな技術が必要とされている。
国際公開第2013/089283号 国際公開第2014/192310号
Nishina K, et. al., "DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing", Nature Communications, 2015, 6:7969. Asami Y, et al., "Drug delivery system of therapeutic oligonucleotides", Drug Discoveries & Therapeutics. 2016; 10(5):256-262.
　高い遺伝子制御効果と低毒性の両方を同時に達成できる新たな核酸医薬を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、9-(2-アミノエトキシ)-1,3-ジアザ-2-オキソフェノキサジン（9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine）（本明細書ではしばしば「PAEO」と表記する）を核酸塩基として含むデオキシリボヌクレオシド（本明細書ではしばしば「D-PAEO」と表記する）、又はPAEOを核酸塩基として含むLNAヌクレオシド（本明細書ではしばしば「L-PAEO」と表記する）を核酸医薬に導入した。その結果、D-PAEO又はL-PAEOの導入により、核酸医薬の毒性を大幅に軽減又は消失させることができることを見出した。この毒性抑制効果は、従来の予想を大きく超える、驚くべき効果である。一方、核酸医薬の有効性は損なわれず、毒性軽減と高い有効性の両方が達成されることが明らかになった。本発明は上記知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）下記式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で示される人工塩基を含むヌクレオシドからなる、核酸医薬の毒性軽減剤であって、
　前記核酸医薬を構成する核酸鎖とヌクレオシド間結合で連結される、前記毒性軽減剤。
（２）前記人工塩基を含むヌクレオシドが、二環式糖部分を含む、（１）に記載の毒性軽減剤。
（３）前記人工塩基を含むヌクレオシドが、LNAヌクレオシド、cEt BNAヌクレオシド、又はENAヌクレオシドである、（２）に記載の毒性軽減剤。
（４）前記人工塩基を含むヌクレオシドが、デオキシリボヌクレオシドである、（１）に記載の毒性軽減剤。
（５）前記核酸鎖が、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシド、5'修飾ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、モルホリノ核酸、トリシクロDNA、及びペプチド核酸からなる群から選択されるいずれか1以上を含む、（１）～（４）のいずれかに記載の毒性軽減剤。
（６）前記毒性が、中枢神経毒性である、（１）～（５）のいずれかに記載の毒性軽減剤。
（７）標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、かつ前記標的遺伝子又はその転写産物に対してステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集を誘導することができる核酸分子であって、
　（１）～（４）のいずれかに記載の毒性軽減剤を少なくとも１個含む、前記核酸分子。
（８）ミックスマーである、（７）に記載の核酸分子。
（９）ギャップマーである、（７）に記載の核酸分子。
（１０）(i)少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、
　(ii)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び
　(iii)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域
を含む、（９）に記載の核酸分子。
（１１）前記5’ウイング領域及び／又は前記3’ウイング領域において、前記中央領域と隣接する末端塩基に前記毒性軽減剤を含む、（１０）に記載の核酸分子。
（１２）デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシド、5'修飾ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、モルホリノ核酸、トリシクロDNA、及びペプチド核酸からなる群から選択されるいずれか1以上を含む、（７）～（１１）のいずれかに記載の核酸分子。
（１３）前記2'修飾ヌクレオシドが、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、又は2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]修飾ヌクレオシドである、（１２）に記載の核酸分子。
（１４）前記5'修飾ヌクレオシドが、5'-cp修飾ヌクレオシド、5'-メチル修飾ヌクレオシド、又は5'-ジメチル修飾ヌクレオシドである、（１２）に記載の核酸分子。
（１５）前記架橋型ヌクレオシドが、LNAヌクレオシド、2',4'-BNANCヌクレオシド、cEt BNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、AmNAヌクレオシド、GuNAヌクレオシド、scpBNAヌクレオシド、scpBNA2ヌクレオシド、及びBANA3ヌクレオシドからなる群から選択される、（１２）に記載の核酸分子。
（１６）前記核酸分子が、前記標的遺伝子又はその転写産物のグアニン塩基に対して相補的な位置に前記毒性軽減剤を含む、（７）～（１５）のいずれかに記載の核酸分子。
（１７）前記毒性軽減剤を前記核酸分子の内部及び／又は末端部に含む、（７）～（１６）のいずれかに記載の核酸分子。
（１８）前記核酸分子のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、（７）～（１７）のいずれかに記載の核酸分子。
（１９）前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、（１８）に記載の核酸分子。
（２０）8～30塩基長である、（７）～（１９）のいずれかに記載の核酸分子。
（２１）（７）～（２０）のいずれかに記載の核酸分子からなる第1核酸鎖と、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含む、二本鎖核酸複合体。
（２２）第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、
　前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、かつ前記標的遺伝子又はその転写産物に対してステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集を誘導することができ、　前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、下記式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で示される人工塩基を含むヌクレオシドを少なくとも1個含む、前記二本鎖核酸複合体。
（２３）前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖が、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシド、5'修飾ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、モルホリノ核酸、トリシクロDNA、及びペプチド核酸からなる群から選択されるいずれか1以上を含む、（２１）又は（２２）に記載の二本鎖核酸複合体。
（２４）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に対して、非相補的塩基、及び／又は1塩基以上の、挿入配列及び／又は欠失を含む、（２１）～（２３）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２５）前記第2核酸鎖が、前記非相補的塩基を1～3個含む、（２４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（２６）前記挿入配列が1～8塩基からなる、（２４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（２７）前記欠失が連続する1～4塩基からなる、（２４）に記載の二本鎖核酸複合体。
（２８）前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域の5'末端側及び／又は3'末端側に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域を含む、（２１）～（２７）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（２９）前記オーバーハング領域が1～20塩基長である、（２８）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３０）前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖とがリンカーを介して結合している、（２１）～（２９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３１）前記リンカーが、切断性（cleavable）又は非切断性（uncleavable）のリンカーである、（３０）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３２）前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、（２１）～（３１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３３）前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、（３２）に記載の二本鎖核酸複合体。
（３４）前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖が、8～30塩基長である、（２１）～（３３）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（３５）（７）～（２０）のいずれかに記載の核酸分子、又は（２１）～（３４）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む、医薬組成物。
（３６）髄腔内投与のための、（３５）に記載の医薬組成物。
（３７）前記髄腔内投与が脳室内投与、後頭窩穿刺、又は腰椎穿刺である、（３６）に記載の医薬組成物。
（３８）シャント、留置カテーテル、又は皮下ポートを用いて投与される、（３６）又は（３７）に記載の医薬組成物。
（３９）被験体の中枢神経系疾患を治療するための、（３５）～（３８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（４０）前記核酸分子又は前記二本鎖核酸複合体が0.1mg～200mg投与される、（３５）～（３９）のいずれかに記載の医薬組成物。
（４１）核酸医薬の毒性を軽減するための、下記式（I）で示される人工塩基を含むヌクレオシドの使用であって、前記人工塩基を含むヌクレオシドは前記核酸医薬を構成する核酸鎖とヌクレオシド間結合で連結される、前記使用。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-104782号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、高い遺伝子制御効果と低毒性の両方を同時に達成できる新たな核酸医薬が提供される。
図1は、様々な天然ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの構造を示す。 図2は、様々な架橋核酸の構造を示す。 図3は、実施例1で用いた様々なアンチセンス核酸の構造を示す。図3Aは、ASO(DNA only)の構造を示す。図3Bは、ASO(LNA)の構造を示す。図3Cは、ASO(D-PAEO)の構造を示す。図3Dは、ASO(L-PAEO)の構造を示す。図3Eは、ASO(LNA MOE)の構造を示す。図3Fは、ASO(D-PAEO MOE)の構造を示す。図3Gは、ASO(L-PAEO MOE)の構造を示す。図3Hは、ASO(full MOE)の構造を示す。 図4は、実施例1～2で用いた急性期忍容性スコアの算出に用いたスコアリングシステムを示す。 図5は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として急性期忍容性スコア（acute tolerability score）に基づいて中枢神経毒性を評価した結果を示す。 図6は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。図6Aは総移動距離を示す。図6Bは最大移動速度を示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。「#」は、One-way ANOVA検定(事後検定:Tukey検定)に基づく各群間の有意差（P<0.05）を示す。 図7は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に可動時間を評価した結果を示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。「#」は、One-way ANOVA検定(事後検定:tukey検定)に基づく各群間の有意差（P<0.05）を示す。 図8は、各種核酸剤の脳室内投与から7日後に左後頭葉皮質におけるMalat1 ncRNA及びGFAP mRNAの発現レベルを測定した結果を示す。図8Aは、Malat1 ncRNAの発現レベルを示す。図8Bは、GFAP mRNAの発現レベルを示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。 図9は、実施例2で用いた様々なアンチセンス核酸の構造を示す。図9Aは、ASO(DNA only)の構造を示す。図9Bは、ASO(LNA)の構造を示す。図9Cは、ASO(D-PAEO)の構造を示す。図9Dは、ASO(L-PAEO)の構造を示す。 図10は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として急性期忍容性スコア（acute tolerability score）に基づいて中枢神経毒性を評価した結果を示す。 図11は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。図11Aは総移動距離を示す。図11Bは最大移動速度を示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。「#」は、One-way ANOVA検定(事後検定:tukey検定)に基づく各群間の有意差（P<0.05）を示す。 図12は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に可動時間を評価した結果を示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。「#」は、One-way ANOVA検定(事後検定:tukey検定)に基づく各群間の有意差（P<0.05）を示す。 図13は、各種核酸剤の脳室内投与から7日後に左後頭葉皮質におけるMapt mRNA及びGFAP mRNAの発現レベルを測定した結果を示す。図13Aは、Mapt mRNAの発現レベルを示す。図13Bは、GFAP mRNAの発現レベルを示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。「#」は、One-way ANOVA検定(事後検定:tukey検定)に基づく各群間の有意差（P<0.05）を示す。 図14は、実施例3で用いた様々なアンチセンス核酸の構造を示す。図14Aは、ASO(LNA MOE)の構造を示す。図14Bは、ASO(D-PAEO MOE)の構造を示す。図14Cは、ASO(L-PAEO MOE)の構造を示す。図14Dは、ASO(full MOE)の構造を示す。 図15は、各種核酸剤を導入したマウス神経芽細胞腫由来細胞（Neuro-2a細胞株）においてMalat1 ncRNAの発現レベルを測定した結果を示す。結果はn=3～4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。 図16は、各種核酸剤を導入したマウス神経芽細胞腫由来細胞（Neuro-2a細胞株）においてIL6 mRNA及びp21 mRNAの発現レベルを測定した結果を示す。図16Aは、IL6 mRNAの発現レベルを示す。図16Bは、p21 mRNAの発現レベルを示す。結果はn=3～4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。「#」は、One-way ANOVA検定(事後検定:tukey検定)に基づく各群間の有意差（P<0.05）を示す。 図17は、各種核酸剤を導入したマウス神経芽細胞腫由来細胞（Neuro-2a細胞株）において生細胞内の脱水素酵素活性を測定した結果を示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。「*」は、t検定に基づくPBS投与群に対する有意差（P<0.05）を示す。「#」は、One-way ANOVA検定(事後検定:tukey検定)に基づく各群間の有意差（P<0.05）を示す。
１．毒性軽減剤
１－１．概要
　本発明の第1の態様は、核酸医薬の毒性軽減剤に関する。本発明の毒性軽減剤は、特定の人工塩基を含むヌクレオシドからなる。本発明の毒性軽減剤は、核酸医薬を構成する核酸鎖とヌクレオシド間結合で連結されることにより、核酸医薬の毒性を軽減することができる。
１－２．用語の定義
　本明細書において、標的遺伝子の「転写産物」とは、RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAをいう。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNA（成熟mRNA、mRNA前駆体、塩基修飾を受けていないmRNA等を含む）、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)、ロングノンコーディングRNA（lncRNA）、ナチュラルアンチセンスRNAを含み得る。
　本明細書において「標的遺伝子」とは、核酸鎖、核酸分子、又は二本鎖核酸複合体のアンチセンス効果により、その転写産物又は翻訳産物の発現量が抑制若しくは亢進され得る、その転写産物又は翻訳産物の機能が阻害され得る、又はステリックブロッキング、スプライシング制御（例えばスプライシングスイッチ、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン）、塩基編集、若しくはRNA編集が誘導され得る遺伝子である。標的遺伝子の種類は、特に限定しない。例えば、核酸鎖、核酸分子、又は二本鎖核酸複合体を導入する生物由来の遺伝子が挙げられ、様々な疾患（例えば中枢神経系疾患）においてその発現が増加する遺伝子や中枢神経系等の生体内で発現する遺伝子が挙げられる。具体例としては、スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1：本明細書では、しばしば「SR-B1」と表記する）遺伝子、転移関連肺腺癌転写産物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1：本明細書では、しばしば「Malat1」と表記する）遺伝子、微小管結合タンパク質タウ（microtubule-associated protein tau：本明細書では、しばしば「Mapt」と表記する）遺伝子、β-セクレターゼ1(beta-secretase 1：本明細書では、しばしば「BACE1」と表記する)遺伝子、DMPK(dystrophia myotonica-protein kinase)遺伝子、及びジストロフィン遺伝子等が挙げられる。
　本明細書において「標的転写産物」とは、核酸鎖、核酸分子、又は二本鎖核酸複合体の直接的な標的となる転写産物を意味し、「標的遺伝子の転写産物」も標的転写産物に該当する。標的転写産物や標的遺伝子の塩基配列情報は、例えばNCBI(米国国立生物工学情報センター)データベース等の公知のデータベースから入手できる。
　本明細書において「核酸医薬（nucleic acid medicine）」は、任意の核酸分子を含む薬物である。本明細書において、核酸医薬は原則として2以上のヌクレオシドを含むものを意味し、核酸医薬に含まれるヌクレオシドは天然ヌクレオシド又は非天然ヌクレオシドを問わない。また、核酸医薬に含まれる核酸分子は、一本鎖又は二本鎖以上の核酸であってもよい。核酸医薬の具体例としては、限定するものではないが、アンチセンス核酸、ヘテロ核酸、siRNA、miRNA、アプタマー、デコイ、リボザイム、ベクター等を挙げることできる。
　本明細書において「アンチセンス核酸」とは、標的転写産物(主として標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な(すなわち、相補的な)塩基配列を含み、標的転写産物にアンチセンス効果をもたらすことができる、一本鎖の核酸分子を指す。また、本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドで構成されるアンチセンス核酸を意味する。本明細書では、「アンチセンス核酸」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」をしばしば「ASO」と表記する。核酸鎖、核酸分子、又は二本鎖核酸複合体の第1核酸鎖は、ASOとして機能し、その標的領域は、3'UTR、5'UTR、エクソン、イントロン、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、又は他のいずれの核酸領域を含んでいてもよい。標的転写産物の標的領域は、少なくとも8塩基長、例えば、10～35塩基長、12～25塩基長、13～20塩基長、14～19塩基長、若しくは15～18塩基長、又は13～22塩基長、16～22塩基長、若しくは16～20塩基長とすることができる。
　本明細書において「アンチセンス効果」とは、ASOが標的転写産物（例えばRNAセンス鎖）にハイブリダイズすることによって生じる任意の効果、例えば標的転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。「標的転写産物の発現又は編集を調節する」とは、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、翻訳の阻害、RNA編集、塩基編集、スプライシング制御若しくはスプライシング機能改変効果（例えばスプライシングスイッチ、エクソンインクルージョン、エクソンスキッピング等）、ステリックブロッキング、又は転写産物の分解をいう。例えば、標的遺伝子の転写後阻害では、ASOとしてRNAオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、ASOは標的遺伝子の転写産物であるmRNAとアニーリングによって部分的二本鎖を形成する。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされた標的タンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（ステリックブロッキング）。一方、ASOとしてDNAを含むオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がRNase Hによって認識される結果、標的遺伝子のmRNAが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される。さらに、アンチセンス効果は、mRNA前駆体におけるイントロンを標的としてももたらされ得る。さらに、アンチセンス効果は、miRNAを標的としてももたらされ得る。この場合、そのmiRNAの機能阻害により、当該miRNAが通常発現を制御している遺伝子の発現が増加し得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
　アンチセンス効果の測定は、例えば、被験核酸化合物を被験体(例えばマウス)に投与し、例えば数日後(例えば2～7日後)に、被験核酸化合物によって提供されるアンチセンス効果により発現が調節される標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(量)(例えば、mRNA量若しくはマイクロRNA等のRNA量、cDNA量、タンパク質量等)を測定することによって、実施することができる。
　例えば、測定された標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベルが、陰性対照(例えばビヒクル投与)と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、又は少なくとも40％減少している場合に、被験核酸化合物がアンチセンス効果(例えば、標的転写産物量の低下)をもたらし得ることが示される。
　核酸鎖における非天然ヌクレオチドの数、種類及び位置は、核酸鎖、核酸分子、又は核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果等に影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子等の配列によって異なり得るが、当業者であれば、アンチセンス法に関連する文献(例えば、WO 2007/143315、WO 2008/043753、及びWO 2008/049085)の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前の核酸複合体の測定値と比較して有意に低くない場合(例えば、修飾後に得られた測定値が、修飾前の核酸複合体の測定値の70％以上、80％以上又は90％以上である場合)、関連修飾を評価することができる。
　本明細書において「標的遺伝子の翻訳産物」とは、核酸鎖、核酸分子、又は二本鎖核酸複合体の直接的な標的となる前記標的転写産物又は標的遺伝子の転写産物の翻訳によって合成される任意のポリペプチド又はタンパク質をいう。
　本明細書において、「アプタマー」（「核酸アプタマー」とも表記する）とは、細胞内、細胞膜上、又は細胞外、例えば細胞膜上又は細胞外の特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子をいう。アプタマーは、当該分野で公知の方法、例えば、SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いた試験管内選別法により作製することができる。
　本明細書において、「デコイ」とは、転写因子（例えばNF-kB）の結合部位の配列又は類似の配列を有する核酸を指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制（転写活性化因子であれば転写を抑制、転写抑制因子であれば転写を促進）するものをいう。デコイ核酸は、標的となる転写因子の結合配列の情報に基づいて容易に設計することができる。
　本明細書において、「bait(ベイト)」とは、細胞内で特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子であって、標的分子の機能を修飾するものをいう。baitと相互作用する標的を、「prey(プレイ)」ともいう。
　本明細書中で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」は、モノマーのヌクレオチド又はヌクレオシドを指してもよいし、複数のモノマーからなるオリゴヌクレオチドやヌクレオシド間結合によって連結された複数のヌクレオシドを意味してもよく、またポリマーであればポリヌクレオチドが含まれる。「天然核酸」とは、自然界に存在する核酸をいう。天然核酸には後述の天然ヌクレオシドや天然ヌクレオチド等が含まれる。「非天然核酸」又は「人工核酸」とは、天然核酸以外の任意の核酸を指す。非天然核酸又は人工核酸には、後述の非天然ヌクレオシドや非天然ヌクレオチド等が含まれる。
　本明細書において「核酸鎖」又は単なる「鎖」とは、ヌクレオシド間結合によって連結された2以上のヌクレオシドを意味し、例えばオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであってもよい。核酸鎖は、例えば自動合成装置を使用した化学的合成法により、又はポリメラーゼ、リガーゼ、又は制限反応による酵素的工程により全長鎖又は部分鎖を作製することができる。核酸鎖は、天然ヌクレオチド及び／又は非天然ヌクレオチドを含み得る。
　「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
　「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の2'位、3'位、又は5'位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
　「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成される直鎖状のポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般にヌクレオシド間結合を形成するとみなされる。
　本明細書において「天然ヌクレオシド」とは、自然界に存在するヌクレオシドをいう。例えば、リボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はウラシル等の塩基からなるリボヌクレオシドや、デオキシリボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はチミン等の塩基からなるデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。なお、RNA中に見られるリボヌクレオシド、及びDNA中に見られるデオキシリボヌクレオシドを、本明細書では、しばしば、それぞれ「RNAヌクレオシド」及び「DNAヌクレオシド」と称する。
　本明細書において「天然ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドで、前記天然ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。例えば、リボヌクレオシドにリン酸基が結合した、RNAの構成単位として知られるリボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合した、DNAの構成単位として知られるデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
　本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、及び修飾核酸塩基のいずれか1つ以上を有するヌクレオチドを意味する。ここでいう「ヌクレオチド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオチド模倣体としては、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ核酸(-N(H)-C(=O)-O-又は他の非ホスホジエステル結合によって結合されるモルホリノ)が挙げられる。ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid、PNA）は、糖の代わりにN-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。本明細書において非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性を有する。したがって、天然ヌクレオチドよりも好ましい。
　本明細書において「非天然ヌクレオシド」とは、天然ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドをいう。例えば、修飾ヌクレオシド及びヌクレオシド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
　本明細書において「模倣体」とは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を置換する官能基を指す。一般に、模倣体は、糖又は糖－ヌクレオシド間結合の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選択される標的に対するハイブリダイゼーションのために維持される。ここでいう「ヌクレオシド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において糖を置換するために、又は糖及び塩基を置換するために、又はオリゴマー化合物を構成するモノマーサブユニット間の結合等を置換するために使用される構造体を含む。「オリゴマー化合物」とは、核酸分子のある領域に少なくともハイブリダイズ可能な連結したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。ヌクレオシド模倣体としては、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環式又は三環式糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣体が挙げられる。
　「修飾糖」とは、天然糖部分(すなわち、DNA(2'-H)又はRNA(2'-OH)中に認められる糖部分)からの置換及び／又は任意の変化を有する糖を指し、「糖修飾」とは、天然糖部分からの置換及び／又は任意の変化をいう。核酸鎖は、場合により、修飾糖を含む1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。「糖修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分を有するヌクレオシドをいう。かかる糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性を核酸鎖に付与し得る。特定の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定するものではないが、置換基(5'及び2'置換基を含む)の付加、非ジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸(架橋核酸、BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、又はC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基を表す)での置換、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
　糖修飾ヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、5'-ビニル、5'-メチル(R又はS)、5'-アリル(R又はS)、4'-S、2'-F(2'-フルオロ基)、2'-OCH3(2'-O-Me基若しくは2'-O-メチル基)、2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]（2'-O-MCE基）、及び2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE若しくは2-O(CH2)2OCH3）置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。2'位の置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、-O-アリル、-O-C1-C10アルキル、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、及びO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)から選択することができ、各Rm及びRnは、独立して、H又は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。「2'-修飾糖」は、2'位で修飾されたフラノシル糖を意味する。2'-修飾糖を含むヌクレオシドを「2'-修飾ヌクレオシド」又は「2'-糖修飾ヌクレオシド」と称することもある。
　「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)と称される。二環式糖部分を含むヌクレオシドは、「架橋ヌクレオシド」、「架橋型の非天然ヌクレオシド」、又は「BNAヌクレオシド」と称することもある。図2に架橋核酸を一部例示する。
　二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例は当業者に公知である。二環式糖を含む核酸(BNA)又はBNAヌクレオシドの1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-CH2-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-OCO-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'[式中、p、m及びnは、それぞれ1～4の整数、0～2の整数、及び1～3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基(蛍光若しくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内又は核内局在化シグナルペプチド等)を表す]により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有すると説明することができる。さらに、特定の実施形態によるBNA又はBNAヌクレオシドに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基及び5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1及びR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、又はP(R4)R5[ここで、R4及びR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1～5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1～5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1～6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、又は1～5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す]であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2',4'-BNAとしても知られている)（例えば、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA若しくはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA）、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNA(ENAとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA(2',4'-BNANCとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me])、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミドBNA（アミド架橋型核酸）若しくは(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)(AmNAとしても知られている；図2のR=HはAmNA[N-H]、R=MeはAmNA[N-Me])、グアニジンBNA(GuNA（例、図2のR=HはGuNA[N-H]、R=MeはGuNA[N-Me]）としても知られる)、アミンBNA(2'-Amino-LNAとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換体)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸(scpBNAとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAが挙げられる。このようなBNAヌクレオシドの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド(LNAヌクレオシド、2',4'-BNAヌクレオシドとしても知られている)（例、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド、β-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAヌクレオシド)、エチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNAヌクレオシド(ENAヌクレオシドとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNAヌクレオシド、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNAヌクレオシド、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNAヌクレオシド(2',4'-BNANCヌクレオシドとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]ヌクレオシド、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me]ヌクレオシド)、2',4'-BNAcocヌクレオシド、3'-アミノ-2',4'-BNAヌクレオシド、5'-メチルBNAヌクレオシド、(4'-CH(CH3)-O-2')BNAヌクレオシド(cEtヌクレオシドとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNAヌクレオシド(cMOEヌクレオシドとしても知られている)、アミドBNAヌクレオシド若しくは(4'-C(O)-N(R)-2')BNAヌクレオシド(R=H、Me)(AmNAヌクレオシドとしても知られている；図2のR=HはAmNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはAmNA[N-Me]ヌクレオシド)、グアニジンBNAヌクレオシド(GuNAヌクレオシド（例、図2のR=HはGuNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはGuNA[N-Me]ヌクレオシド）としても知られる)、アミンBNAヌクレオシド(2'-Amino-LNAヌクレオシドとしても知られている)(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換ヌクレオシド)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋ヌクレオシド(scpBNAヌクレオシドとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAヌクレオシドが挙げられる。
　本明細書において、「カチオン性ヌクレオシド」は、あるpH（例えば、ヒトの生理学的pH（約7.4）、送達部位（例えば、オルガネラ、細胞、組織、臓器、生物体等）のpH等）において、中性形態（リボヌクレオシドの中性形態等）と比較して、カチオン形態として存在する修飾ヌクレオシドである。カチオン性ヌクレオシドはヌクレオシドの任意の位置に１つ以上のカチオン性修飾基を含んでもよい。一実施形態では、カチオン性ヌクレオシドは、2'-Amino-LNAヌクレオシド(例、3-(Bis(3-アミノプロピル)アミノ)プロパノイル置換ヌクレオシド)、アミノアルキル修飾ヌクレオシド（例、2'-O-メチル及び4'-CH2CH2CH2NH2置換ヌクレオシド)、GuNAヌクレオシド(例、図2のR=HはGuNA[N-H]ヌクレオシド、R=MeはGuNA[N-Me]ヌクレオシド)等である。メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する二環式ヌクレオシドを、LNAヌクレオシドと称することもある。
　本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステル結合)からの置換又は任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むヌクレオシド間結合、及びリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合(米国特許登録番号5,955,599記載のメチルホスホトリエステル結合、エチルホスホトリエステル結合)、アルキルホスホネート結合(例、米国特許登録番号5,264,423及び5,286,717記載のメチルホスホネート結合、国際公開第2015/168172号記載のメトキシプロピルホスホネート結合)、アルキルチオホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合（例、以下の式(IV)で表される部分構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ）、１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、テトラメチルグアニジン（TMG）部分）を含むヌクレオシド間結合（例、以下の式(V)で表される部分構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ）、国際公開第2016/081600号記載の自己中和核酸(ZON)に用いられるヌクレオシド間結合及びホスホロアミデート結合が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合を指す。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は周知である。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
　ヌクレオシド間結合がキラル中心を有する場合、ヌクレオシド間結合はキラル制御されたものであってもよい。「キラル制御された」とは、キラル中心、例えばキラル結合リンに関して単一のジアステレオマーで存在することを意図する。キラル制御されたヌクレオシド間結合は、完全にキラル純粋なものであってもよいし、キラル純度が高いもの、例えば90％de、95％de、98％de、99％de、99.5％de、99.8％de、99.9％de、又はそれ以上のキラル純度を有するものであってよい。本明細書において「キラル純度」は、ジアステレオマーの混合物中の1つのジアステレオマーの割合を指し、ジアステレオマー過剰率(％de)として表され、(対象のジアステレオマー－その他のジアステレオマー)／(総ジアステレオマー)×100(％)として定義される。
　例えば、ヌクレオシド間結合は、Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合、１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、テトラメチルグアニジン（TMG）部分；例えばAlexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811を参照のこと）を含むヌクレオシド間結合、及び／又は環状グアニジン部分を含むヌクレオシド間結合であってよい。キラル制御されたヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばRp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Naoki Iwamoto et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48(3), 496-9、Natsuhisa Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317、Natsuhisa Oka et al.,J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2016, 81, 2753-2762、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 7913-7922に記載の方法に従って合成することができる。Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合も公知であり、例えばNaoki Iwamoto et al., Nat. Biotechnol,. 2017, 35(9), 845-851、Anastasia Khvorova et al., Nat. Biotechnol., 2017, 35(3), 238-248に記載されるような効果を奏することが知られている。例えば、一実施形態において、Sp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Rp配置のものよりも安定であり、及び／又はSp配置にキラル制御されたASOは、RNase H1による標的RNA切断を促進し、生体内でより持続的な応答をもたらす。１～４個のＣ１～６のアルキル基で置換されたグアニジン部分（例えば、TMG部分）を含むヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばAlexander A. Lomzov et al., Biochem Biophys Res Commun., 2019, 513(4), 807-811に記載の方法に従って合成することができる。
　本明細書中で使用される用語「核酸塩基」又は「塩基」とは、核酸を構成する塩基成分(複素環部分)であって、主としてアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルが知られる。本明細書において「核酸塩基」又は「塩基」は、特に断りのない場合、修飾又は非修飾の核酸塩基（塩基）のいずれをも包含する。したがって、特に断りのない場合、プリン塩基は修飾又は非修飾のプリン塩基のいずれであってもよい。また、特に断りのない場合、ピリミジン塩基は修飾又は非修飾のピリミジン塩基のいずれであってもよい。
　「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外のあらゆる核酸塩基を意味する。「非修飾核酸塩基」又は「非修飾塩基」(天然核酸塩基)とは、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を意味する。修飾核酸塩基の例としては、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン又はN4-メチルシトシン；N6-メチルアデニン又は8-ブロモアデニン；2-チオ-チミン；並びにN2-メチルグアニン又は8-ブロモグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾核酸塩基のさらなる例として、下記式（I）で示す9-(2-アミノエトキシ)-1,3-ジアザ-2-オキソフェノキサジン（9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine）（本明細書において「PAEO」又は「PAEO塩基」と表記する）が挙げられる。なお、下記式（I）で示す修飾核酸塩基はリボースやデオキシリボース等の糖部分の1’位に結合することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　本明細書中で使用される用語「相補的」とは、核酸塩基が水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対（天然型塩基対）又はWobble塩基対（グアニン-チミン、又はグアニン-ウラシル）を形成し得る関係や、天然核酸塩基と修飾核酸塩基との間又は修飾核酸塩基同士で類似する塩基対を形成し得る関係が挙げられる。例えば、グアニン塩基とシトシン塩基が形成する天然型塩基対は、以下のように3つの水素結合を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　これに対して、上記式(I)で示すPAEO塩基であれば、以下に示すようにグアニン塩基と4つの水素結合を形成することができるため、天然型塩基対よりも二重鎖形成能を向上させることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　本発明において、核酸鎖、核酸分子、及び第1核酸鎖のアンチセンス領域は、標的転写産物(例えば、標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。核酸鎖、核酸分子、及び第1核酸鎖中のアンチセンス領域は、塩基配列が相補的である場合に(典型的には、塩基配列が標的転写産物の少なくとも一部の塩基配列に相補的である場合に)、標的転写産物にハイブリダイズすることができる。同様に、二本鎖核酸複合体において第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％(例えば、95％、96％、97％、98％、又は99％以上)の相補性を有していれば許容される。第2核酸鎖中の相補的領域は、第1核酸鎖の少なくとも一部と塩基配列が相補的である場合に、アニールすることができる。塩基配列の相補性は、BLASTプログラム等を使用することによって決定することができる。当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、2本の鎖がアニール又はハイブリダイズし得る条件(温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。またさらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
　ハイブリダイゼーション条件は、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等の様々なストリンジェントな条件であってもよい。低ストリンジェントな条件は、比較的低温で、かつ高塩濃度の条件、例えば、30℃、2×SSC、0.1％SDSであってよい。高ストリンジェントな条件は、比較的高温で、かつ低塩濃度の条件、例えば、65℃、0.1×SSC、0.1％SDSであってよい。温度及び塩濃度等の条件を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整できる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む。
　本明細書において「毒性」とは、被験体に好ましくない他覚的若しくは自覚的症状又は機能異常を引き起こす作用をいう。毒性は、いずれの臓器での毒性であってもよい。毒性は、神経毒性、肝毒性、又は腎毒性であってもよい。神経毒性は、中枢神経組織及び末梢神経組織を含む神経組織に損傷を引き起こし、神経系の正常な活動を妨げる作用を指す。特に中枢神経系に対する毒性を中枢神経毒性という。神経毒性は、死亡、呼吸異常、心血管異常、頭痛、嘔気もしくは嘔吐、無反応もしくは低反応、意識障害、精神障害、性格変化、幻覚、妄想、認知機能障害、姿勢異常、不随意運動、震え、けいれん、活動過剰運動機能障害、麻痺、感覚障害又は自律神経機能障害から選択される症状を引き起こし得る。神経毒性は、急性神経毒性であってもよい。急性神経毒性は、投与から1、3、6、9、12、24又は48時間以内に生じる神経毒性であり得る。毒性は、例えば、後述の実施例に記載するように、急性期忍容性スコア、副作用イベント率又は死亡率などによって評価することができる。肝毒性は、肝臓に機能異常及び／又は機能低下を生じさせる性質をいう。腎毒性は、腎臓に機能異常及び／又は機能低下を生じさせる性質をいう。肝毒性及び腎機能の評価は、当業者に公知の任意の手法、例えば血清生化学的検査などにより行うことができる。
　本明細書で「被験体」とは、本発明の核酸鎖、核酸分子、若しくは二本鎖核酸複合体、又は医薬組成物を適用する対象をいう。被験体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被験体が個体の場合、ヒトを含むあらゆる動物が該当し得る。例えば、ヒト以外では、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が挙げられる。限定はしないが、被験体は、標的転写産物の発現量を減少させる必要がある個体や、中枢神経系疾患等の疾患の治療又は予防が必要な個体であってもよい。
　本明細書において「複数個」とは、例えば、2個、2～3個、2～4個、2～5個、2～6個、2～7個、2～8個、2～10個、2～12個、2～14個、2～16個、2～18個、2～20個、2～25個、2～30個、2～35個、2～40個、若しくはそれ以上をいう。
１－３．構成
　本発明の毒性軽減剤は、下記式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 で示される人工塩基を含むヌクレオシドからなる。
　上記式(I)で示す人工塩基を含むヌクレオシドの糖部分は、非修飾糖部分又は修飾糖部分のいずれであってもよい。修飾糖部分の例としては、2'-修飾糖及び二環式糖部分が挙げられる。
　一実施形態において、上記式(I)で示す人工塩基を含むヌクレオシドの糖部分は、二環式糖部分である。二環式糖部分を含むヌクレオシドとしては、限定するものではないが、例えばLNAヌクレオシド、cEt BNAヌクレオシド、及びENAヌクレオシドが挙げられる。上記式(I)で示す人工塩基を含むLNAヌクレオシドは下記式（II）で示され、本明細書において「L-PAEO」と称する。L-PAEOは、優れた二重鎖形成能を有することが文献（Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.）に開示されているが、後述の実施例のように顕著な毒性軽減効果を示すことは全く予想外であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　一実施形態において、上記式(I)で示す人工塩基を含むヌクレオシドの糖部分は、非修飾糖部分である。非修飾糖部分を含むヌクレオシドは、例えばデオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドである。上記式(I)で示す人工塩基を含むデオキシリボヌクレオシドは、下記式（III）で示され、本明細書において「D-PAEO」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　本発明の毒性軽減剤では、上記式(I)で示す人工塩基を含むヌクレオシドは、核酸医薬を構成する核酸鎖とヌクレオシド間結合で連結される。本発明の毒性軽減剤は、核酸医薬を構成する核酸鎖に連結されることによって、核酸医薬の毒性を軽減することができる。
　本態様における核酸医薬は、特に限定しない。例えば、アンチセンス核酸、ヘテロ核酸、siRNA、ベクター、アプタマー等であってもよい。また、アンチセンス核酸は、例えばミックスマー又はギャップマーであってもよい。
　本発明の毒性軽減剤が連結されるアンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖において、毒性軽減剤の連結位置は、特に限定しない。例えば、本発明の毒性軽減剤は、アンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖の末端部（5'末端及び／又は3'末端）に連結してもよく、或いはアンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖の非末端部（核酸鎖の内部）に連結することもできる。アンチセンス核酸がギャップマーである場合には、毒性軽減剤はギャップマーにおいて中央領域、5’ウイング領域、及び／又は3’ウイング領域に連結してもよい。毒性軽減剤が中央領域に連結される場合であれば、5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域において中央領域と隣接する末端塩基に毒性軽減剤が含まれてもよい。
　また、アンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖における１又は複数のヌクレオシドを本発明の毒性軽減剤で置換することにより、アンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖と連結することもできる。例えば、アンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖におけるシトシン塩基と置換することにより、本発明の毒性軽減剤をアンチセンス核酸に連結してもよい。
　一実施形態において、本発明の毒性軽減剤は、その5'側でシトシン塩基を含むヌクレオシドとヌクレオシド間結合で連結され、かつ／又はその3'側でシトシン塩基を含むヌクレオシドとヌクレオシド間結合で連結される。L-PAEOの5'側及び／又は3'側に隣接するヌクレオシドがシトシン塩基を含む場合、二重鎖形成能がさらに増強され得ることが知られている（Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.）。
　一実施形態において、本発明の毒性軽減剤は、その5'側でグアニン塩基を含むヌクレオシドとヌクレオシド間結合で連結され、かつ／又はその3'側でグアニン塩基を含むヌクレオシドとヌクレオシド間結合で連結される。L-PAEOの5'側及び／又は3'側に隣接するヌクレオシドがグアニン塩基を含む場合、二重鎖形成能がさらに増強され得ることが知られている（Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.）。
　一実施形態において、アンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖におけるLNAヌクレオシド等の架橋ヌクレオシド、及び／又はデオキシリボヌクレオシドを本発明の毒性軽減剤で置換することにより、毒性軽減剤をアンチセンス核酸に連結することができる。
　また、本発明の毒性軽減剤がアンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖に連結されるヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合又は修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、例えばホスホロチオエート結合であってもよい。
　本発明の毒性軽減剤が連結されるアンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシド、5'修飾ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、モルホリノ核酸、トリシクロDNA、及びペプチド核酸からなる群から選択されるいずれか1以上を含んでいてもよい。2'修飾ヌクレオシドの例として、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及び2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]修飾ヌクレオシドが挙げられる。また、5'修飾ヌクレオシドの例としては、5'-cp修飾ヌクレオシド、5'-メチル修飾ヌクレオシド、及び5'-ジメチル修飾ヌクレオシドが挙げられる。架橋型ヌクレオシドの例として、LNAヌクレオシド、2',4'-BNANCヌクレオシド、cEt BNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、AmNAヌクレオシド、GuNAヌクレオシド、scpBNAヌクレオシド、scpBNA2ヌクレオシド、及びBANA3ヌクレオシドが挙げられる。
　アンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖に対して連結される毒性軽減剤の数は、少なくとも1個であり、例えば2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、又は10個以上であってもよく、30個以下、25個以下、20個以下、15個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、又は2個以下であってもよい。例えば、毒性軽減剤の数は、1～10個であってもよく、好ましくは1～6個である。例えば、1個、2個、3個、4個、5個、又は6個であってもよい。
　本発明の毒性軽減剤が連結されるアンチセンス核酸等の核酸医薬を構成する核酸鎖の塩基長は、特に限定されないが、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であってもよい。また、アンチセンス核酸の塩基長は、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であってもよい。
１－４．効果
　本発明の毒性軽減剤によれば、核酸医薬の有効性（ステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集）を損なうことなく、核酸医薬の毒性（例えば、中枢神経毒性等の神経毒性、肝毒性、及び／又は腎毒性）を軽減又は消失させることができる。また、アンチセンス核酸の投与に伴う炎症若しくはグリオーシスの惹起、又はサイトカイン若しくはケモカインの異常上昇を軽減することができる。
　本発明の毒性軽減剤は、本発明の毒性軽減剤を含まない核酸医薬と比較して、本発明の毒性軽減剤が連結された核酸医薬の毒性を低下させることができる。
　標的転写産物を切断しないステリックブロック型のアンチセンス核酸は、毒性が比較的低いが、標的を切断することができるギャップマー型のアンチセンス核酸は、遺伝子制御効果が高い反面、毒性が強いことが知られている。架橋型ヌクレオシドを含むギャップマーでは、有効性がさらに増強され得るものの、致死的な毒性を示す場合がある。本発明の毒性軽減剤は、アンチセンス核酸に連結されることによって、アンチセンス核酸の毒性を軽減することができるため、高い遺伝子制御効果と低毒性又は無毒性を同時に達成することができる。
　また、本発明によれば、核酸医薬の毒性を軽減するための、上記式（I）で示される人工塩基を含むヌクレオシドの使用も提供される。
２．核酸分子
２－１．概要
　本発明の第2態様は核酸分子である。本発明の核酸分子は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、第1態様の毒性軽減剤を少なくとも１個含む。本発明の核酸分子は、高い遺伝子制御効果と低毒性又は無毒性を同時に達成することができる。
２－２．構成
　本態様の核酸分子は、第1態様の毒性軽減剤を含む。本態様の核酸分子は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、かつ前記標的遺伝子又はその転写産物に対してステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集を誘導することができる。
　本態様の核酸分子に含まれる、第1態様の毒性軽減剤の数は少なくとも1個であり、例えば2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、又は10個以上であってもよく、30個以下、25個以下、20個以下、15個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、又は2個以下であってもよい。例えば、第1態様の毒性軽減剤の数は、1～10個であってもよく、好ましくは1～6個である。例えば、1個、2個、3個、4個、5個、又は6個であってもよい。
　本態様の核酸分子において、第1態様の毒性軽減剤が配置される位置は、特に限定しない。例えば、第1態様の毒性軽減剤は、核酸分子の末端部（5'末端及び／又は3'末端）に配置されていてもよく、或いは核酸分子の非末端部（核酸鎖の内部）に配置されていてもよい。核酸分子が後述するギャップマーである場合には、毒性軽減剤はギャップマーにおいて中央領域、5’ウイング領域、及び／又は3’ウイング領域に配置されていてもよい。毒性軽減剤が5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に配置される場合であれば、5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域において中央領域と隣接する末端塩基に毒性軽減剤が配置されていてもよい。
　また、本態様の核酸分子において第1態様の毒性軽減剤は、標的遺伝子又はその転写産物のグアニン塩基に対して相補的な位置に配置することもできる。
　一実施形態において、本態様の毒性軽減剤は、その5'側及び／又は3'側でシトシン塩基を含むヌクレオシドとヌクレオシド間結合で連結された位置に配置される。L-PAEOの5'側及び／又は3'側に隣接するヌクレオシドがシトシン塩基を含む場合、二重鎖形成能がさらに増強され得る（Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.）。
　一実施形態において、本発明の毒性軽減剤は、その5'側及び／又は3'側でグアニン塩基を含むヌクレオシドとヌクレオシド間結合で連結された位置に配置される。L-PAEOの5'側及び／又は3'側に隣接するヌクレオシドがグアニン塩基を含む場合、二重鎖形成能がさらに増強され得る（Kishimoto Y., et al., Chem. Eur. J., 2021,27(7):2427-2438.）。
　本態様の核酸分子は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる。したがって、本態様の核酸分子は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部に相補的な塩基配列を含む。
　本態様の核酸分子において第1態様の毒性軽減剤以外に含まれるヌクレオシドは、天然ヌクレオシド(デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、若しくは両者)及び／又は非天然ヌクレオシドであってよい。
　本態様の核酸分子は、ミックスマー（mixmer）であってもよい。本明細書において「ミックスマー」とは、周期的又は無作為セグメント長の交互型の天然ヌクレオシド及び非天然ヌクレオシドを含み、かつ4個以上の連続するデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドを含まない核酸鎖をいう。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドであり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「BNA／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがペプチド核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「ペプチド核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「モルホリノ核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーは、2種のヌクレオシドのみを含むようには制限されない。ミックスマーは、天然若しくは修飾のヌクレオシド又はヌクレオシド模倣体であるか否かに関わらず、任意の数の種類のヌクレオシドを含むことができる。例えば、架橋ヌクレオシド(例えば、LNAヌクレオシド)により分離された1又は2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを有してもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)をさらに含んでもよい。
　本態様の核酸分子は、ギャップマー（gapmer）であってもよい。本明細書において「ギャップマー」とは、原則として、「中央領域」（DNAギャップ領域）と、その5'末端及び3'末端に直接配置されたウイング領域（それぞれ、「5'ウイング領域」及び「3'ウイング領域」と称する）からなる一本鎖核酸をいう。ギャップマーにおける前記中央領域は少なくとも2個（例えば、少なくとも3個又は少なくとも4個）の連続するデオキシリボヌクレオシド（RNase Hに認識される修飾核酸塩基を含んでいてもよく、例えば、5-メチルシトシンを含んでもよい）を含み、前記ウイング領域は少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含む。限定はしないが、ウイング領域に含まれる非天然ヌクレオシドは、通常、天然ヌクレオシドよりもRNAとの結合力が高く、核酸分解酵素(ヌクレアーゼ等)に対する耐性の高い性質を有する。5’ウイング領域及び3’ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドは、例えば、架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドであってもよい。ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「BNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドの数は、少なくとも1個であり、例えば、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。架橋ヌクレオシドはLNAヌクレオシド又はENAヌクレオシドであってもよい。架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「LNA／DNAギャップマー」と称する。架橋ヌクレオシドがENAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「ENA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「ペプチド核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「モルホリノ核酸ギャップマー」と称する。また、5’ウイング領域及び3’ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが2'修飾ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基は2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる2'修飾ヌクレオシドの数は、少なくとも1個であり、例えば、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる2'修飾ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。2'修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。5’ウイング領域及び3’ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドは、架橋ヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、2種類以上の架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドが組み合わされて構成されていてもよい。
　本態様の核酸分子がギャップマーである場合、DNAギャップ領域は、例えば2～12塩基長、3～11塩基長、4～10塩基長、5～9塩基長、6～8塩基長、7塩基長又は8塩基長であってもよい。DNAギャップ領域は、DNAからなる天然ヌクレオシドから構成される。
　本態様の核酸分子がギャップマーである場合、ギャップマーの5'ウイング領域及び3'ウイング領域の塩基長は、それぞれ独立して、少なくとも2塩基長、例えば、2～10塩基長、2～7塩基長、3～5塩基長、3～4塩基長、又は3塩基長であってもよい。本発明の核酸分子は、5'ウイング領域及び3'ウイング領域に2'修飾ヌクレオシド及び／又は架橋型ヌクレオシドを含むことができる。5'ウイング領域及び3'ウイング領域には、PAEO塩基を含む架橋ヌクレオシド（例えば、L-PAEO）、2’-O-メチルヌクレオシド、2’-O-メトキシエチルヌクレオシド、2’-LNA又はENAを組みあわせてもよく、その修飾の種類は、1～4種類、2～3種類、例えば2種類を含んでもよく、それらの種類は、5'ウイング領域及び3'ウイング領域で同じであっても又は異なっていてもよい。
　本態様の核酸分子がギャップマーである場合、5'ウイング領域、DNAギャップ領域、及び3'ウイング領域の各領域の塩基長の例としては、2-8-3、3-8-2、3-7-3、4-6-3、3-6-4、4-5-4、4-7-3、3-7-4、4-6-4、5-6-3、3-6-5、3-7-5、5-7-3、4-7-4、4-6-5、5-6-4、5-5-5、5-6-5等が挙げられる。ここで、「A-B-C」の表記において、「A」は5'ウイング領域の塩基長を示し、「B」はDNAギャップ領域の塩基長を示し、「C」は3'ウイング領域の塩基長を示す。
　なお、ウイング領域を5'末端側又は3'末端側のいずれか一方にのみ有する核酸鎖は、当該分野では「ヘミギャップマー」と呼ばれるが、本明細書においては、ヘミギャップマーもギャップマーに包含されるものとする。
　一実施形態において、本態様の核酸分子がギャップマーであり、5’ウイング領域は、1又は複数個（例えば1～6個、1～5個、又は2～4個）の修飾ヌクレオシド、及び中央領域と隣接する末端に位置する1又は複数個（1～3個、1～2個、又は1個）の毒性軽減剤を含み、中央領域は2以上（例えば2～30個、2～25個、2～20個、2～15個、2～8個、2～7個、又は3～5個）のDNAヌクレオシドで構成され、3’ウイング領域は、中央領域と隣接する末端に位置する1又は複数個（1～3個、1～2個、又は1個）、及び1又は複数個（例えば1～6個、1～5個、又は2～4個）の修飾ヌクレオシドを含む。
　本態様の核酸分子におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、本態様の核酸分子の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。ここで、例えば核酸鎖の末端から2つのヌクレオシド間結合とは、核酸鎖の末端に最も近接するヌクレオシド間結合と、それに隣接し、かつ末端とは反対側に位置するヌクレオシド間結合を意味する。核酸鎖の末端領域における修飾ヌクレオシド間結合は、核酸鎖の望ましくない分解を抑制又は阻害できるために好ましい。一実施形態では、核酸分子のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
　本発明の核酸分子は、全部又は一部にヌクレオシド模倣体又はヌクレオチド模倣体を含んでもよい。ヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸及び／又はモルホリノ核酸であってもよい。一実施形態において、本発明の核酸分子は、モルホリノ核酸を含んでもよく、又はモルホリノ核酸からなるものであってもよい。
　一実施形態において、本態様の核酸分子は、第1態様の毒性軽減剤以外に修飾核酸塩基を含んでもよい。毒性軽減剤以外の修飾核酸塩基の数は限定せず、例えば少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、又は少なくとも6個であってもよい。
　本態様の核酸分子の塩基長は、特に限定されないが、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であればよい。また、核酸分子の塩基長は、40塩基長以下、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であればよい。核酸分子の塩基長は、例えば、10～40塩基長、12～30塩基長、又は15～25塩基長であってもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率等の他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。なお、核酸分子にアプタマー等の核酸が結合している場合、核酸分子の全体としての塩基長は、上記塩基長に結合した核酸の塩基長を加えたものであってよい。
　本態様の核酸分子が有する標的転写産物に対するアンチセンス効果は、当該分野で公知の方法で測定できる。例えば、核酸分子を細胞等に導入した後、ノザンブロッティング、定量PCR、又はウェスタンブロッティング等の公知技術を使用することにより測定すればよい。特定の組織における標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(例えば、mRNA量等のRNA量、cDNA量等)を測定することで、それらの部位において核酸分子によって標的遺伝子発現が抑制されるか否かを判定できる。測定された標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベルが、陰性対照(例えばビヒクル投与又は無処置)と比較して、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%又は少なくとも50%減少している場合に、被験核酸化合物がアンチセンス効果をもたらし得ることが示される。
２－３．効果
　本発明の核酸分子は、高い有効性（例えばステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集）と同時に、低毒性又は無毒性を達成することができる。標的を切断することができるギャップマー型のアンチセンス核酸、特に架橋型ヌクレオシドを含むギャップマーは、有効性が高い反面、毒性が増強されていることが、実用化の大きな傷害となっていた。本発明の核酸分子は、有効性が維持される反面、毒性を大幅に軽減されるという驚くべき効果に基づく。
３．二本鎖核酸複合体
３－１．概要
　本発明の第3態様は二本鎖核酸複合体である。本態様の二本鎖核酸複合体は、アンチセンス核酸として機能し得る第1核酸鎖と、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含む。本態様の二本鎖核酸複合体は、高い遺伝子制御効果と低毒性又は無毒性を同時に達成することができる。
３－２．構成
　本態様の二本鎖核酸複合体は、第1核酸鎖及び第2核酸鎖を含む。第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、かつ前記標的遺伝子又はその転写産物に対してステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集を誘導することができる。
　本態様の二本鎖核酸複合体では、第1核酸鎖及び第2核酸鎖のいずれか一方又は両方が、上述のPAEOを含むヌクレオシドを少なくとも1個含む。
　本態様の二本鎖核酸複合体の一実施形態において、第1核酸鎖はPAEO、すなわち第1態様の毒性軽減剤を含む。この場合、第1核酸鎖は、第2態様の核酸分子の実施形態から選択することができる。
　本態様の二本鎖核酸複合体の一実施形態において、第1核酸鎖はPAEO、すなわち第1態様の毒性軽減剤を含まない一方、第2核酸鎖のみがPAEOを含む。この場合、第1核酸鎖は、第2態様の核酸分子の実施形態において、第1態様の毒性軽減剤を含むことを除いた実施形態から選択することができる。
　例えば、第1核酸鎖は、ギャップマーである上記の核酸分子からなるか；又は(1)少なくとも2個（例えば、少なくとも3個又は少なくとも4個）の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、(2)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び(3)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、上記の核酸分子からなる。ギャップマー及び上記(1)～(3)の構成については、第2態様の核酸分子に関する記載に準じる。
　本態様の二本鎖核酸複合体の一実施形態において、第2核酸鎖はPAEOを含む。この場合、PAEOを含むヌクレオシドの糖部分は、非修飾糖部分又は修飾糖部分のいずれであってもよい。修飾糖部分の例としては、2'-修飾糖及び二環式糖部分が挙げられる。二環式糖部分を含むヌクレオシドの例としては、例えばLNAヌクレオシド、cEt BNAヌクレオシド、及びENAヌクレオシドが挙げられる。PAEOを含むヌクレオシドは、上述のL-PAEO又はD-PAEOであってもよい。
　本態様の二本鎖核酸複合体において、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む核酸分子である。本態様の二本鎖核酸複合体において、第2核酸鎖は、相補的塩基対の水素結合を介して第1核酸鎖にアニールしている。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが、(a)デオキシリボヌクレオシド；(b)デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド；(c)デオキシリボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド；(d)リボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド；又は(e)デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域における少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも2個の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドを含む領域を含む。例えば、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域における少なくとも3個又は少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも3個又は少なくとも4個の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドを含む領域を含んでもよい。ここで、第1核酸鎖の中央領域において連続するデオキシリボヌクレオシドの数、及び第2核酸鎖において、この連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドの数は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、上記の連続するデオキシリボヌクレオシドの数は少なくとも4個であり、上記の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドの数は少なくとも3個であってもよい。
　さらなる実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域を含んでもよい。第2核酸鎖において、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域は、少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含んでもよく、当該非天然ヌクレオシドは、例えば、PAEOを含むヌクレオシド（例えばL-PAEO又はD-PAEO）、架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドであってもよい。さらなる実施形態において、この架橋ヌクレオシドは、PAEOを含む架橋ヌクレオシド（例えばL-PAEO）、LNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、又はBNANCヌクレオシドであってもよい。また、第2核酸鎖における2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基は、2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基であってもよい。なお、第1核酸鎖と第2核酸鎖が共に架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドを含む場合、第1核酸鎖及び第2核酸鎖における架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドは、同一であっても異なっていてもよい。
　第2核酸鎖におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。一実施形態では、第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に修飾ヌクレオシド間結合を含んでもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
　さらなる実施形態において、第2核酸鎖は、2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）を含むことができる。第2核酸鎖において、2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）の数は限定しない。例えば、前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドの総数の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、若しくは少なくとも95％、又は100％が、2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）であってもよい。一実施形態では、第2核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）である。
　さらなる実施形態において、第2核酸鎖は、5’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）を含むことができる。5’末端及び／又は3’末端に位置する2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）の数は限定しない。例えば、第2核酸鎖は、5’末端に位置する1個又は連続する2個、3個、4個、5個、6個、若しくは7個の2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2個、3個、4個、5個、6個、若しくは7個の2'修飾ヌクレオシド（例えば2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド）を含んでもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖はPAEO以外の修飾核酸塩基を含んでもよい。修飾核酸塩基の数は限定せず、例えば少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、又は少なくとも6個であってもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、第1核酸鎖に対して、非相補的塩基、及び／又は1塩基以上の、挿入配列及び／又は欠失を含み得る。第2核酸鎖における非相補的塩基の数は、限定しないが、例えば1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、又は1個又は2個であってもよい。第2核酸鎖における挿入配列の塩基長数は、限定しないが、例えば1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、又は1個又は2個であってもよい。第2核酸鎖における欠失の連続する塩基長は、限定しないが、例えば1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、又は1個又は2個であってもよい。非相補塩基又は挿入配列から構成される領域はバルジを形成していてもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、相補的領域の5'末端側及び3'末端側の一方又は両方に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域をさらに含み得る。本実施形態の一例は、国際公開第2018/062510に記載される。「オーバーハング領域」とは、相補的領域に隣接する領域で、第1核酸鎖と第2核酸鎖がアニールして二本鎖構造を形成した場合、第2核酸鎖の5'末端が第1核酸鎖の3'末端を超えて伸長する、及び／又は第2核酸鎖の3'末端が第1核酸鎖の5'末端を超えて伸長する、つまり、二本鎖構造から突出した第2核酸鎖中のヌクレオチド領域を指す。第2核酸鎖中のオーバーハング領域は、相補的領域の5'末端側に位置してもよく、3'末端側に位置してもよい。第2核酸鎖中のオーバーハング領域は、相補的領域の5'末端側及び3'末端側に位置してもよい。
　一実施形態において、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖、例えば第2核酸鎖に、機能性部分が結合していてもよい。第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖と機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖と機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。
　一実施形態において、「機能性部分」の構造は、特に制限はなく、それを結合する二本鎖核酸複合体に所望の機能を付与する。所望の機能としては、標識機能、精製機能及び標的への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチド等の化合物が挙げられる。また、第1核酸鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二本鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。標的への送達機能を与える部分の例としては、脂質、抗体、アプタマー、特定のレセプターに対するリガンド等が挙げられる。
　一実施形態において、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖、例えば第2核酸鎖は、脂質と結合している。脂質としては、トコフェロール、コレステロール、脂肪酸、リン脂質及びそれらの類縁体；葉酸、ビタミンC、ビタミンB1、ビタミンB2；エストラジオール、アンドロスタン及びそれらの類縁体；ステロイド及びその類縁体；LDLR、SRBI又はLRP1/2のリガンド；FK-506、及びシクロスポリン；PCT/JP2019/12077及びPCT/JP2019/10392記載の脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、トコフェロール又はその類縁体及び／又はコレステロール又はその類縁体、置換された若しくは置換されていないＣ１～３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２～３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１～３０のアルコキシ基であってもよい。一実施形態では、第2核酸鎖はトコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合していてもよい。
　本明細書において「トコフェロール」は、トコロールのメチル化誘導体で、クロマンと呼ばれる環状構造を有する脂溶性ビタミン（ビタミンE）である。トコロールは、強い抗酸化作用を有しており、それ故に、生体内では、抗酸化物質として、代謝によって生じるフリーラジカルを消失させ、細胞を傷害から保護する機能を有する。
　トコフェロールは、クロマンに結合するメチル基の位置に基づき、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、及びδ-トコフェロールからなる複数の異なる型が知られている。本明細書におけるトコフェロールは、いずれのトコフェロールであってもよい。また、トコフェロールの類縁体としては、トコフェロールの種々の不飽和類縁体、例えば、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール等が挙げられる。好ましくは、トコフェロールは、α-トコフェロールである。
　本明細書において「コレステロール」とは、ステロイドアルコールとも呼ばれるステロールの1種であり、特に動物において多く存在する。コレステロールは、生体内における代謝過程で重要な機能を果たしている他、動物細胞では、リン脂質と共に細胞の膜系を構成する主要な構成成分でもある。また、コレステロールの類縁体は、ステロール骨格を有するアルコールである、種々のコレステロール代謝産物及び類縁体等を指し、限定されるものではないが、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロール、及びコプロスタノール等を含む。
　本明細書において「類縁体(analog)」とは、同一又は類似の基本骨格を有する類似した構造及び性質を有する化合物を指す。類縁体は、例えば、生合成中間体、代謝産物、置換基を有する化合物等を含む。ある化合物が他の化合物の類縁体であるか否かは、当業者であれば技術常識に基づき判定できる。
　機能性部分は、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の5'末端、又は3'末端、或いは両端に連結されていてもよい。或いは、機能性部分は、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに連結されていてもよい。第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖は、脂質等の機能性部分を2つ以上含み、これらは第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の複数の位置に連結されていてもよく、及び／又は第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の1つの位置に一群として連結されていてもよい。機能性部分は、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。
　第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖と機能性部分との間の結合は、直接結合であってもよいし、別の物質によって介在される間接結合であってもよい。しかし、特定の実施形態においては、機能性部分は、共有結合、イオン性結合、水素結合等を介して第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖に直接結合されていることが好ましく、またより安定した結合を得ることができるという点から考えると、共有結合がより好ましい。
　機能性部分はまた、切断性(cleavable)又は非切断性(uncleavable)リンカーを介して第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖に結合されていてもよい。この場合、第1核酸鎖と第2核酸鎖は、リンカーを介して連結され、一本鎖を形成し得る。しかし、その場合も機能領域は二本鎖核酸複合体と同じ構成であることから、本明細書では、このような一本鎖核酸も本発明の二本鎖核酸複合体の一実施形態として包含する。リンカーは、任意のポリマーでありうる。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アルキレン等が挙げられる。具体的には、例えば、DNA、RNAといった天然のヌクレオチド又はペプチド核酸、モルホリノ核酸といった非天然のヌクレオチドから構成されうる。リンカーが核酸からなる場合、リンカーの鎖長は少なくとも1塩基、例えば、3～10塩基又は4～6塩基の鎖長をとりうる。好ましくは4塩基の鎖長である。この場合、リンカーはヒンジ(ヘアピンループ)の形態をとり得る。リンカーの位置は、第1核酸鎖の5’側でも3’側のいずれでも可能であるが、例えば、第1核酸鎖の5’側に第2核酸鎖を結合させた構成の場合には、第1核酸鎖の5’末端と第2核酸鎖の3’末端とがリンカーを介して連結されることになる。
　「切断性リンカー」とは、生理学的条件下で、例えば細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で、切断される連結基を意味する。特定の実施形態では、切断性リンカーは、ヌクレアーゼ等の内在性酵素によって選択的に切断される。切断性リンカーとしては、アミド、エステル、ホスホジエステルの一方若しくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、及びジスルフィド結合、並びに天然DNAリンカーが挙げられる。
　「非切断性リンカー」とは、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で切断されないリンカーを意味する。非切断性リンカーは、限定はしないが、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾若しくは非修飾のデオキシリボヌクレオシド又は修飾若しくは非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。リンカーがDNA等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、鎖長は、特に限定はされないが、通常は2～20塩基長、3～10塩基長又は4～6塩基長であればよい。
　リンカーの一具体例として、以下の式(VI)で表されるリンカーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、
L2は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン、ドデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～C8シクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又はCH(CH2-OH)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-を表し、L3は、-NH-又は結合を表し、L4は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、エチレン、ペンチレン、へプチレン、アンデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～C8のシクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-[O-(CH2)2]m-、又は結合を表し、ここで、mは1～25の整数を表し、L5は、-NH-(C=O)-、-(C=O)-、又は結合を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる）。
　一実施形態において、式(VI)で表されるリンカーは、L2が、置換されていないC3～C6のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又は-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-であり、L3が、-NH-であり、L4及びL5が、結合である。
　第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、特に限定されないが、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であればよい。また、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、40塩基長以下、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であればよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、同じ長さであっても、異なる長さ（例えば、いずれか一方が1～3塩基短い又は長い長さ）であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖が形成する二本鎖構造は、バルジを含んでいてもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率等の他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。なお、第1核酸鎖及び／又は第2核酸鎖にアプタマー等の核酸が結合している場合、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の全体としての塩基長は、上記塩基長に結合した核酸の塩基長を加えたものであってよい。この場合、結合する核酸の塩基長は限定しないが、例えば少なくとも10塩基長、少なくとも15塩基長、又は少なくとも20塩基長であってよく、また100塩基長以下、80塩基長以下、60塩基長以下、40塩基長以下、又は30塩基長以下であってよい。
３－３．効果
　本発明の二本鎖核酸複合体は、高い有効性（例えばステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集）と同時に、低毒性又は無毒性を達成することができる。
４．医薬組成物
４－１．概要
　本発明の第4態様は医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、第2態様の核酸分子又は第3態様の二本鎖核酸複合体を少なくとも１個含み、疾患の治療に用いることができる。本発明の医薬組成物は、高い遺伝子制御効果と低毒性又は無毒性を同時に達成することができる。
４－２．構成
４－２－１．有効成分
　本発明の医薬組成物は、有効成分として少なくとも第2態様に記載の核酸分子又は第3態様に記載の二本鎖核酸複合体を包含する。本発明の組成物は、核酸分子又は二本鎖核酸複合体を1つ又は2つ以上含んでもよい。
　本発明の組成物に含まれる核酸分子又は二本鎖核酸複合体の量（含有量）は、核酸分子又は二本鎖核酸複合体の種類、送達部位、組成物の剤形、組成物の投与量、並びに後述する担体の種類によって異なる。したがって、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。通常は、単回投与量の組成物に有効量の核酸分子又は二本鎖核酸複合体が包含されるように調整する。「有効量」とは、核酸分子又は二本鎖核酸複合体が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。最終的には医師、獣医師又は薬剤師等の判断によって決定される。「被験体の情報」とは、組成物を適用する生体の様々な個体情報である。例えば、被験体がヒトであれば、年齢、体重、性別、食生活、健康状態、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。
４－２－２．担体
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、植物性油、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、増粘剤、溶解助剤、及び他の添加剤が挙げられる。
　溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　上記担体は、有効成分である二本鎖核酸複合体の生体内での酵素等による分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
４－２－３．剤形
　本発明の組成物の剤形は、有効成分である核酸分子又は二本鎖核酸複合体を分解等により不活化させることなく、標的部位まで送達し、生体内でその有効成分の薬理効果（例えば、標的遺伝子の発現に対するアンチセンス効果）を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
　具体的な剤形は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。投与方法は、非経口投与と経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
　投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、液剤である。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、エリキシル剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。その他、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、及び坐剤であってもよい。
　投与方法が経口投与であれば、好ましい剤形は、固形剤（錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、乳剤、シロップ剤を含む）が挙げられる。固形剤であれば、必要に応じて、当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明の医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。
４－３．投与形態及び投与量
　本明細書において、医薬組成物の好ましい投与形態には特定の限定はない。投与は全身投与であっても局所投与であってもよい。投与経路は、経口投与又は非経口投与であってよい。非経口投与の具体例として、静脈内投与、動脈内投与、輸血による投与、腹腔内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼内投与、筋肉内投与、皮下投与（埋め込み型持続皮下投与を含む）、皮内投与、膀胱内投与、経膣内投与、直腸投与、吸入又は点鼻投与、並びに気管／気管支投与が挙げられる。本発明の適用対象部位が脳等の中枢神経である場合、髄腔内投与は好適である。髄腔内投与は、脳室内投与、後頭窩穿刺、又は腰椎穿刺であってもよく、シャント、留置カテーテル、又は皮下ポートを用いて投与してもよい。
　医薬組成物が投与又は摂取により適用される場合、投与量又は摂取量は、例えば、含まれる核酸分子又は二本鎖核酸複合体が0.00001 mg/kg/日～10000 mg/kg/日、又は0.001 mg/kg/日～100 mg/kg/日となるようにすればよい。医薬組成物は、単回投与でも、複数回投与であってもよい。複数回投与の場合、毎日若しくは適当な時間間隔で（例えば1日、2日、3日、1週間、2週間、1ヶ月の間隔で）、例えば2～20回等投与することもできる。上記の核酸分子又は二本鎖核酸複合体の1回の投与量は、例えば、0.001 mg/kg以上、0.005 mg/kg以上、0.01 mg/kg以上、0.1 mg/kg以上、0.25 mg/kg以上、0.5 mg/kg以上、1 mg/kg以上、2.5 mg/kg以上、0.5 mg/kg以上、1.0 mg/kg以上、2.0 mg/kg以上、3.0 mg/kg以上、4.0 mg/kg以上、5 mg/kg以上、10 mg/kg以上、20 mg/kg以上、30 mg/kg以上、40 mg/kg以上、50 mg/kg以上、75 mg/kg以上、100 mg/kg以上、150 mg/kg以上、200 mg/kg以上、300 mg/kg以上、400 mg/kg以上、若しくは500 mg/kg以上とすることができ、例えば、0.001 mg/kg～500 mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001 mg/kg、0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、若しくは200 mg/kg、又は0.1mg～200mg/kg）を適宜選択することができる。
　本発明の核酸分子又は二本鎖核酸複合体は、0.01～10 mg/kg（例えば約6.25 mg/kg）の用量で週2回の頻度で4回投与してもよい。また、核酸分子又は二本鎖核酸複合体は、0.05～30 mg/kg（例えば約25 mg/kg）の用量で週1～2回の頻度で2～4回、例えば週2回の頻度で2回投与してもよい。このような投与レジメン（分割投与）の採用により、より高用量の単回投与に比べて、毒性（例えば血小板の減少を回避する）をさらに軽減し、被験体への負荷を低減することができる。
　医薬組成物は反復投与でも細胞内において抑制効果が相加的に働く。また、反復投与する場合、ある程度の投与間隔（例えば、半日以上）をおいた方が有効性を向上させることができる。
４－４．適用対象疾患
　医薬組成物の適用対象となる疾患は、限定しない。本発明の核酸分子又は二本鎖核酸複合体のステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集により、その転写産物又は翻訳産物の発現量が抑制若しくは亢進され得る、その転写産物又は翻訳産物の機能が阻害され得る、又はステリックブロッキング、スプライシング制御（例えばスプライシングスイッチ、エクソンスキッピング若しくはエクソンインクルージョン）、塩基編集、若しくはRNA編集が誘導され得る遺伝子が関係し得る疾患を対象とすることができる。例えば、中枢神経系疾患が挙げられる。
　医薬組成物は、被験体としてヒトを含む動物に使用することができる。しかし、ヒトを除く動物には特定の限定はなく、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物などが一部の実施形態の被験体となり得る。被験体は、中枢神経系において標的転写産物の発現量を減少させることが必要な被験体であってもよい。また被験体は、中枢神経系疾患の治療が必要な被験体であってもよい。
　治療対象の疾患は、遺伝子発現の増加又は減少に関連する中枢神経系疾患、特に標的転写産物又は標的遺伝子の発現の増加に関連する疾患(腫瘍等)であり得る。中枢神経系疾患としては、特に限定されないが、例えば、脳腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病などが挙げられる。
　神経系は、中枢神経系及び末梢神経系に分けられる。中枢神経系は、脳及び脊髄からなる。脳は大脳(大脳皮質、大脳白質、大脳基底核)、間脳(視床、視床下核)、小脳(小脳皮質、小脳核) 及び脳幹(中脳、黒質、橋、延髄)を含む。脊髄は、頸髄、胸髄、腰髄、仙髄及び尾髄を含む。本明細書における中枢神経系は、これらのいずれの領域であってもよいが、特に、大脳皮質(前頭葉、側頭葉、頭頂葉、後頭葉)、小脳、線条体、淡蒼球、前障、海馬、海馬傍回、脳幹、頸髄、胸髄又は腰髄であり得る。末梢神経は、脳神経及び脊髄神経からなる。
　例えば、アルツハイマー病の治療においては、海馬及び／又は頭頂葉への薬剤送達が有効となり得る。前頭側頭型認知症(FTD)(前頭側頭葉変性症(FTLD)、意味性認知症(SD)、進行性非流暢性失語(PNFA))、ピック病の治療においては、前頭葉、側頭葉及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。パーキンソン病認知症の治療においては、後頭葉、黒質及び／又は線条体への薬剤送達が有効となり得る。パーキンソン病の治療においては、黒質及び／又は線条体への薬剤送達が有効となり得る。皮質基底核変性症(CBD)の治療においては、前頭葉、頭頂葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。進行性核上性麻痺(PSP)の治療においては、前頭葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。筋萎縮性側索硬化症の治療においては、前頭葉、頭頂葉、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。脊髄小脳変性症(SCD)SCA1型～SCA34型までの治療においては、脳幹及び／又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。歯状核赤核淡蒼球ルイ体変性症(DRPLA)の治療においては、大脳基底核、脳幹及び／又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。球脊髄性萎縮症(SBMA)の治療においては、脳幹及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。フリードライヒ失調症(FA)の治療においては、脳幹及び／又は小脳への薬剤送達が有効となり得る。ハンチントン病の治療においては、線条体、前頭葉、頭頂葉及び／又は大脳基底核への薬剤送達が有効となり得る。プリオン病(狂牛病、GSS)の治療においては、大脳皮質、大脳白質、大脳基底核及び／又は黒質への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。脳炎(ウイルス性、細菌性、真菌性、結核性)、髄膜炎(ウイルス性、細菌性、真菌性、結核性)の治療においては、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。代謝性脳症、中毒性脳症、栄養障害性脳症の治療においては、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、もやもや病、無酸素脳症の治療においては、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。大脳白質性脳症の治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。びまん性軸索損傷(Diffuse axonal injury)の治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。頭部外傷の治療においては、脳全体への薬剤送達が有効となり得る。多発性硬化症(MS)、視神経脊髄炎(NMO)の治療においては、大脳白質、大脳皮質、視神経及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。筋緊張型ジストロフィー症(DM1, DM2)の治療においては、骨格筋、心筋、大脳皮質及び／又は大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。家族性痙性対麻痺(HSP)の治療においては、頭頂葉及び／又は脊髄への薬剤送達が有効となり得る。福山型筋ジストロフィーの治療においては、骨格筋、大脳皮質及び／又は大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。レビー小体型認知症(DLB)の治療においては、黒質、線条体、後頭葉、前頭葉及び／又は頭頂葉への薬剤送達が有効となり得る。多系統萎縮症(MSA)の治療においては、線条体、大脳基底核、小脳、黒質、前頭葉及び／又は側頭葉への薬剤送達が有効となり得る。アレキサンダー病の治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。CADASIL、CARASILの治療においては、大脳白質への薬剤送達が有効となり得る。
４－５．効果
　本発明によれば、上記の医薬組成物をヒト等の被験体に投与（例えば、髄腔内投与）することを含む、疾患（例えば、中枢神経系疾患）の治療及び／又は予防方法もまた提供される。
　医薬の製造における、第1態様の毒性軽減剤、第2態様の核酸分子、又は第3態様の二本鎖核酸複合体の使用もまた提供される。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例1：D-PAEO/L-PAEOを含むMalat1標的アンチセンス核酸の有効性と毒性（in vivo実験）＞
（目的）
　Malat1遺伝子を標的とするアンチセンス核酸において、9-(2-アミノエトキシ)-1,3-ジアザ-2-オキソフェノキサジン（9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine）（以下、「PAEO」と表記する）を核酸塩基として含むデオキシリボヌクレオシド（以下、「D-PAEO」と表記する）、又はPAEOを核酸塩基として含むLNAヌクレオシド（本明細書ではしばしば「L-PAEO」と表記する）を導入する。このアンチセンス核酸を脳室内に単回投与した際の遺伝子発現抑制効果と中枢神経毒性をin vivo実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたアンチセンス核酸を構成する塩基配列、化学修飾、及び融解温度(Tm)を表1及び図3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　本実施例で用いたアンチセンス核酸（ASO）は、いずれもマウスのmetastasis associated in lung adenocarcinoma transcript-1(Malat1) mRNAを標的とするアンチセンス核酸であり、Malat1 mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、20個のヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。ASO(DNA only)はDNAヌクレオシドのみで構成される。ASO(LNA)は、5’末端側から順に、4個のDNAヌクレオシド、1個のLNAヌクレオシド、11個のDNAヌクレオシド、1個のLNAヌクレオシド、及び3個のDNAヌクレオシドで構成される。ASO(D-PAEO)は、5’末端側から順に、4個のDNAヌクレオシド、1個のD-PAEO、11個のDNAヌクレオシド、1個のD-PAEOヌクレオシド、及び3個のDNAヌクレオシドで構成される。ASO(L-PAEO)は、5’末端側から順に、4個のDNAヌクレオシド、1個のL-PAEO、11個のDNAヌクレオシド、1個のL-PAEOヌクレオシド、及び3個のDNAヌクレオシドで構成される。ASO(LNA MOE)は、5’末端側から順に、4個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、1個のLNAヌクレオシド、11個のDNAヌクレオシド、1個のLNAヌクレオシド、及び3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成される。ASO(D-PAEO MOE)は、5’末端側から順に、4個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、1個のD-PAEOヌクレオシド、11個のDNAヌクレオシド、1個のD-PAEOヌクレオシド、及び3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成される。ASO(L-PAEO MOE)は、5’末端側から順に、4個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、1個のL-PAEOヌクレオシド、11個のDNAヌクレオシド、1個のL-PAEOヌクレオシド、及び3個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成される。ASO(full MOE)は、5’末端側から順に、5個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシド、11個のDNAヌクレオシド、及び4個の2'-O-MOE-RNAヌクレオシドで構成される。
　なお、L-PAEOは、下記式（I）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 で示される人工塩基（PAEO：9-(2-aminoethoxy)-1,3-diaza-2-oxophenoxazine）を含むLNAヌクレオシドであり、下記式(II)で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　また、D-PAEOは、上記式（I）で示される人工塩基（PAEO）を含むDNAヌクレオシドであり、下記式（III）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　粉末状の各核酸剤をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に添加して溶解させた。全ての核酸鎖は株式会社ジーンデザイン(Gene Design)(大阪、日本)によって委託合成された。
（２）in vivo実験
　7週齢雌のICRマウスを、2.5～4％イソフルレン麻酔下にて脳定位固定装置に固定した。その後、耳間に前後2～3cmで皮膚を切開し、ブレグマ(bregma)の1mm左方かつ0.2mm後方に1mm径ドリルで穿孔した。ハミルトン(Hamilton)シリンジ内に核酸剤を充填した。穿孔部より針を3mm程度刺入し、2～3μl/分の速度で、マウス1匹当たり7.63nmol/匹の用量で核酸剤を左側脳室内投与し(n=4)、ナイロン糸で皮膚縫合した。また、陰性対照群としてPBSのみを投与したマウスも作製した。
（３）核酸剤投与後の急性中枢神経毒性評価及び運動機能評価
　各種核酸剤投与後のマウスにおいて、中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。
　中枢神経毒性評価として、核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後に、図4に示すスコアリングシステムを用いて行動評価を行った。
　図4に示すスコアリングシステムでは、5つのカテゴリーに属する行動が評価対象となる（図4、カテゴリー1～5）。各カテゴリーには各々2つの行動評価項目が含まれている。各行動評価項目は0～4点（図4、スコア1～4）の5段階で評価され、正常であれば0点となり、高毒性になるほどスコアが高くなる。各カテゴリーでは、2つの行動評価項目のうち高い方のスコアをそのカテゴリーのスコアとして採用する。5つのカテゴリーのスコアを合計した値を急性期忍容性スコア（0～20点）とする。
　また、運動機能評価として、各種核酸剤投与後の各時点でオープンフィールドテストを行った。具体的には、マウスをケージ（幅50cm×直径50cm×高さ40cm）の中央に配置し、マウスの軌跡を5分間記録した。記録データに基づく総移動距離(m)、最大移動速度(m/s)、可動時間(s)をビデオトラッキングソフト（ANY-maze）により計測した。各投与群の間の統計学的有意差はt検定、及びOne-way ANOVA検定(事後検定:tukey検定)によって評価した。
（４）遺伝子抑制効果及び慢性中枢神経毒性の評価
　各種核酸剤投与から7日後のマウスから左後頭葉皮質を摘出した。IsogenIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用して、摘出した左後頭葉皮質からRNAを抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master, DNase (ロシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics))を使用してプロトコルに従って合成した。
　次に、得られたcDNAを鋳型として定量RT-PCRを行うことにより、Malat1ノンコーディングRNA（ncRNA）、GFAP mRNA、及びActb mRNA (内部標準遺伝子)の発現量を測定した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドサイエンス社(Roche Applied Science))により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計及び製造された製品であった。増幅条件(温度及び時間)は以下の通りであった：95℃で15秒、60℃で30秒、及び72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。
　Actb mRNA(内部標準遺伝子)の発現量に対するMalat1 ncRNA及びGFAP mRNAの発現量の比率を計算し、PBS投与群の値に対して標準化した値を相対的Malat1 ncRNAレベル及びGFAP mRNAレベルとした。Malat1 mRNAレベルから遺伝子抑制効果を、GFAP mRNAレベルから慢性神経毒性の評価を行った。
（結果）
　図5は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として急性期忍容性スコア（acute tolerability score）を算出し、中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、ASO(D-PAEO)投与群及びASO(L-PAEO)投与群では、それぞれASO(DNA only)投与群及びASO(LNA）投与群と比較して、急性期忍容性スコア（acute tolerability score）が著しく減少した。同様に、ASO(L-PAEO MOE)投与群では、ASO(LNA MOE)投与群と比較して、急性期忍容性スコア（acute tolerability score）が著しく減少し、いずれの時点においてもスコアが0であった。また、ASO(D-PAEO MOE)投与群及びASO(L-PAEO MOE)投与群では、ASO(full MOE)投与群と比較して、急性期忍容性スコア（acute tolerability score）が著しく減少した。この結果から、L-PAEO又はD-PAEOを含むアンチセンス核酸では急性中枢神経毒性が顕著に低下し、2'-O-MOE修飾と比較しても毒性が極めて低いことが示された。
　図6及び図7は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。ASO(D-PAEO)投与群及びASO(L-PAEO)投与群では、それぞれASO(DNA only) 投与群及びASO(LNA)投与群と比較して、総移動距離（図6A）、最大移動速度（図6B）、及び可動時間(図7)が著しく改善した。同様に、ASO(L-PAEO MOE)投与群では、ASO(LNA MOE)投与群と比較して、総移動距離、最大移動速度、及び可動時間が著しく改善し、いずれもPBS投与群と同等の運動機能を示した。さらに、ASO(D-PAEO MOE)投与群及びASO(L-PAEO MOE)投与群では、ASO(full MOE)投与群と比較して、総移動距離、最大移動速度、及び可動時間が著しく改善した。これらの結果から、L-PAEO又はD-PAEOを含むアンチセンス核酸は、運動機能を抑制する効果が極めて小さく、2'-O-MOE修飾と比較しても毒性が極めて低いことが示された。また、D-PAEO及び2'-O-MOE修飾ヌクレオシドを含むアンチセンス核酸、並びにL-PAEO及び2'-O-MOE修飾ヌクレオシドを含むアンチセンス核酸では、実質的に急性中枢神経毒性を伴わないことが示された。
　図8は、各種核酸剤の脳室内投与から7日後において後頭葉皮質におけるMalat1 ncRNA(図8A)及びGFAP mRNAの発現レベル(図8B)を示す。ASO(D-PAEO)投与群及びASO(L-PAEO)投与群では、それぞれASO(DNA only)投与群及びASO(LNA)投与群と比較して、Malat1 ncRNAに対する遺伝子抑制効果が上昇していた。一方、ASO(L-PAEO)投与群は、ASO(LNA)投与群と比較してGFAP遺伝子発現レベルの上昇が抑制されていた。しかし、ASO(D-PAEO)投与群は、AS(DNA only)投与群と比較してGFAP遺伝子発現レベルが上昇していた。
　以上の結果から、D-PAEO又はL-PAEOを含むアンチセンス核酸では、高い遺伝子抑制効果が得られると同時に、急性中枢神経毒性を顕著に低下させることができることが示された。さらに、慢性神経毒性軽減効果については、DNAヌクレオシドのD-PAEOによる置換では得られない一方、LNAヌクレオシドのL-PAEOによる置換では得られることが示された。
＜実施例2：D-PAEO/L-PAEOを含むMapt標的アンチセンス核酸の有効性と毒性（in vivo実験）＞
（目的）
　Mapt遺伝子を標的とするアンチセンス核酸において、D-PAEO又はL-PAEOを導入する。このアンチセンス核酸を脳室内に単回投与した際の遺伝子発現抑制効果と中枢神経毒性をin vivo実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いたアンチセンス核酸を構成する塩基配列、化学修飾、及び融解温度(Tm)を表2及び図9に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　本実施例で用いたアンチセンス核酸（ASO）は、いずれもmicrotubule-associated protein tau (Mapt) mRNAを標的とするアンチセンス核酸であり、Mapt mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、16個のヌクレオシドがホスホロチオエート結合で連結された構造を有する。ASO(DNA only)はDNAヌクレオシドのみで構成される。ASO(LNA)は5’末端側から順に、4個のDNAヌクレオシド、1個のLNAヌクレオシド、8個のDNAヌクレオシド、1個のLNAヌクレオシド、及び2個のDNAヌクレオシドで構成される。ASO(D-PAEO)は、5’末端側から順に、4個のDNAヌクレオシド、1個のD-PAEO、8個のDNAヌクレオシド、1個のD-PAEOヌクレオシド、及び2個のDNAヌクレオシドで構成される。ASO(L-PAEO)は、5’末端側から順に、4個のDNAヌクレオシド、1個のL-PAEO、8個のDNAヌクレオシド、1個のL-PAEOヌクレオシド、及び2個のDNAヌクレオシドで構成される。
　表2に記載されるASO(DNA only)、ASO(LNA)、ASO(D-PAEO)、及びASO(L-PAEO)について、実施例1と同様の方法により核酸の調製、in vivo実験、中枢神経毒性評価及び運動機能評価を行った。さらに、実施例1と同様の方法により、各種核酸剤投与から7日後のマウスから左後頭葉皮質を摘出して、遺伝子抑制効果及び慢性中枢神経毒性を評価した。但し、本実施例ではマウス1匹当たりの核酸剤投与量は、19.0nmol/匹とした。
（結果）
　図10は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスを対象として中枢神経毒性を評価した結果を示す。核酸剤の投与から30分後、1時間後、2時間後、3時間後、及び4時間後のいずれの時点においても、ASO(D-PAEO)投与群及びASO(L-PAEO)投与群では、それぞれASO(DNA only)投与群及びASO(LNA)投与群と比較して、急性期忍容性スコア（acute tolerability score）が著しく減少した。この結果から、D-PAEO又はL-PAEOを含むアンチセンス核酸では中枢神経毒性が顕著に低下することが示された。
　図11及び図12は、各種核酸剤を脳室内投与したマウスにおいて投与から1時間後に運動機能を評価した結果を示す。ASO(D-PAEO)投与群及びASO(L-PAEO)投与群では、それぞれASO(DNA only)投与群及びASO(LNA)投与群と比較して、総移動距離（図11A）、最大移動速度（図11B）、及び可動時間(図12)が著しく改善した。この結果から、D-PAEO又はL-PAEOを含むアンチセンス核酸では、運動機能を抑制する効果が極めて小さく、毒性が極めて低いことが示された。
　図13は、各種核酸剤の脳室内投与から7日後において後頭葉皮質におけるMalat1 mRNA(図13A)、及びGFAP mRNA発現レベル(図13B)を示す。ASO(D-PAEO)投与群はASO(DNA only)投与群と比較して遺伝子抑制効果が上昇しており、ASO(L-PAEO)投与群ではASO(LNA)投与群と同等の遺伝子抑制効果であった。一方、ASO(L-PAEO)投与群は、ASO(LNA)投与群と比較してGFAP遺伝子発現レベルの上昇が抑制されていた。しかし、ASO(D-PAEO)投与群は、ASO(DNA only)投与群と比較してGFAP遺伝子発現レベルが上昇していた。
　以上の結果から、D-PAEO又はL-PAEOを含むアンチセンス核酸は、高い遺伝子抑制効果が得られ、急性中枢神経毒性を顕著に低下させることが示された。さらに、慢性神経毒性軽減効果については、DNAヌクレオシドのD-PAEOによる置換では得られない一方、LNAヌクレオシドのL-PAEOによる置換では得られることが示された。
＜実施例3：D-PAEO/L-PAEOを含むMalat1標的アンチセンス核酸の有効性と毒性(in vitro実験)＞
（目的）
　D-PAEO又はL-PAEOを含むMalat1標的アンチセンス核酸の有効性及び毒性をin vitro実験により検証する。
（方法）
（１）核酸の調製
　本実施例で用いるアンチセンス核酸を構成する塩基配列、化学修飾、及び融解温度(Tm)を表3及び図14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表3に記載される各種核酸剤について、実施例1と同様の方法により核酸の調製を行った。
（２）遺伝子抑制効果及び神経毒性の評価
　各種核酸剤を0.4nM、2nM、又は50nMにてマウス神経芽細胞腫由来細胞（Neuro-2a細胞株）にリポフェクション法(lipofectamine2000)を用いて導入した。
　核酸剤の導入から48時間後にIsogenIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用して、細胞からRNAを抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master, DNase（ロシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics)）を使用してプロトコルに従って合成した。次に、得られたcDNAを鋳型として定量RT-PCRを行うことにより、Mapt mRNA、IL6 mRNA、p21 mRNA、及びActb mRNA (内部標準遺伝子)の発現量を測定した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドサイエンス社(Roche Applied Science))により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーとして、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計及び製造された製品を用いた。増幅は、95℃15秒、60℃30秒、及び72℃1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返すことにより行った。
　Actb mRNA(内部標準遺伝子)発現量に対するMapt mRNA、IL6 mRNA、及びp21 mRNA量の比率を計算し、PBS投与群の値に対して標準化した値を相対的Mapt mRNAレベル、相対的IL6 mRNAレベル、及び相対的p21 mRNAレベルとした。
（３）細胞毒性の評価
　上記（２）と同様の方法により核酸剤をNeuro-2a細胞株に導入した。導入から48時間後、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所）を使用して、生細胞数の指標となる脱水素酵素活性を測定した。発色試薬WST-8は、脱水素酵素によりホルマザンへと還元される。生細胞が多いほど脱水素酵素活性は高く、ホルマザン産生量が多い。ホルマザンは450nm付近に極大吸収を有するため、吸光度に基づいてその産生量を測定することができる。したがって、ホルマザンに基づく吸光度が高いほど、神経細胞に対する毒性が低いことが示される。
（結果）
　図15及び図16は、マウス神経芽細胞腫由来細胞（Neuro-2a細胞株）における標的遺伝子に対する発現抑制効果及び神経毒性の測定結果を示す。ASO(L-PAEO MOE)投与群ではASO(LNA MOE)及びASO(full MOE)と同等の強い遺伝子抑制効果が得られた(図15)。IL6遺伝子発現レベルは、ASO(L-PAEO MOE)投与群では、ASO(LNA MOE)投与群と比較して有意に抑制され、ASO(full MOE)と比較しても同等以下に抑制された(図16A)。p21遺伝子発現レベルは、ASO(L-PAEO MOE)投与群では、ASO(L-PAEO)投与群及びASO(full MOE)投与群と比較して有意に抑制された(図16B)。
　図17は、各種核酸剤を細胞内に導入した後、脱水素酵素活性に基づいて生細胞数を評価した結果を示す。ASO(L-PAEO MOE)投与群では、ASO(L-PAEO)投与群及びASO(full MOE)投与群と比較して生細胞数が多く、細胞毒性が低いことが示された。
　以上の結果から、L-PAEO及び2'-O-MOE修飾ヌクレオシドを含むアンチセンス核酸によって、高い遺伝子抑制効果と同時に神経細胞毒性の抑制が達成されることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (41)

  1. 　下記式（I）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で示される人工塩基を含むヌクレオシドからなる、核酸医薬の毒性軽減剤であって、
    　前記核酸医薬を構成する核酸鎖とヌクレオシド間結合で連結される、前記毒性軽減剤。
  2. 　前記人工塩基を含むヌクレオシドが、二環式糖部分を含む、請求項１に記載の毒性軽減剤。
  3. 　前記人工塩基を含むヌクレオシドが、LNAヌクレオシド、cEt BNAヌクレオシド、又はENAヌクレオシドである、請求項２に記載の毒性軽減剤。
  4. 　前記人工塩基を含むヌクレオシドが、デオキシリボヌクレオシドである、請求項１に記載の毒性軽減剤。
  5. 　前記核酸鎖が、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシド、5'修飾ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、モルホリノ核酸、トリシクロDNA、及びペプチド核酸からなる群から選択されるいずれか1以上を含む、請求項１に記載の毒性軽減剤。
  6. 　前記毒性が、中枢神経毒性である、請求項１に記載の毒性軽減剤。
  7. 　標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、かつ前記標的遺伝子又はその転写産物に対してステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集を誘導することができる核酸分子であって、
    　請求項１に記載の毒性軽減剤を少なくとも１個含む、前記核酸分子。
  8. 　ミックスマーである、請求項７に記載の核酸分子。
  9. 　ギャップマーである、請求項７に記載の核酸分子。
  10. 　(1)少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、
    　(2)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び
    　(3)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、請求項９に記載の核酸分子。
  11. 　前記5’ウイング領域及び／又は前記3’ウイング領域において、前記中央領域と隣接する末端塩基に前記毒性軽減剤を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
  12. 　デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシド、5'修飾ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、モルホリノ核酸、トリシクロDNA、及びペプチド核酸からなる群から選択されるいずれか1以上を含む、請求項７に記載の核酸分子。
  13. 　前記2'修飾ヌクレオシドが、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、又は2'-O-[2-(N-メチルカルバモイル)エチル]修飾ヌクレオシドである、請求項１２に記載の核酸分子。
  14. 　前記5'修飾ヌクレオシドが、5'-cp修飾ヌクレオシド、5'-メチル修飾ヌクレオシド、又は5'-ジメチル修飾ヌクレオシドである、請求項１２に記載の核酸分子。
  15. 　前記架橋型ヌクレオシドが、LNAヌクレオシド、2',4'-BNANCヌクレオシド、cEt BNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、AmNAヌクレオシド、GuNAヌクレオシド、scpBNAヌクレオシド、scpBNA2ヌクレオシド、及びBANA3ヌクレオシドからなる群から選択される、請求項１２に記載の核酸分子。
  16. 　前記核酸分子が、前記標的遺伝子又はその転写産物のグアニン塩基に対して相補的な位置に前記毒性軽減剤を含む、請求項７に記載の核酸分子。
  17. 　前記毒性軽減剤を前記核酸分子の内部及び／又は末端部に含む、請求項７に記載の核酸分子。
  18. 　前記核酸分子のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項７に記載の核酸分子。
  19. 　前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１８に記載の核酸分子。
  20. 　8～30塩基長である、請求項７に記載の核酸分子。
  21. 　請求項７に記載の核酸分子からなる第1核酸鎖と、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含む、二本鎖核酸複合体。
  22. 　第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む二本鎖核酸複合体であって、
    　前記第1核酸鎖は、標的遺伝子又はその転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることができ、かつ前記標的遺伝子又はその転写産物に対してステリックブロッキング、スプライシング制御、発現低下、発現上昇、及び／又は塩基編集を誘導することができ、
    　前記第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、下記式（I）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で示される人工塩基を含むヌクレオシドを少なくとも1個含む、前記二本鎖核酸複合体。
  23. 　前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖が、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシド、5'修飾ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、モルホリノ核酸、トリシクロDNA、及びペプチド核酸からなる群から選択されるいずれか1以上を含む、請求項２１に記載の二本鎖核酸複合体。
  24. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に対して、非相補的塩基、及び／又は1塩基以上の、挿入配列及び／又は欠失を含む、請求項２１に記載の二本鎖核酸複合体。
  25. 　前記第2核酸鎖が、前記非相補的塩基を1～3個含む、請求項２４に記載の二本鎖核酸複合体。
  26. 　前記挿入配列が1～8塩基からなる、請求項２４に記載の二本鎖核酸複合体。
  27. 　前記欠失が連続する1～4塩基からなる、請求項２４に記載の二本鎖核酸複合体。
  28. 　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列からなる領域の5'末端側及び／又は3'末端側に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域を含む、請求項２１に記載の二本鎖核酸複合体。
  29. 　前記オーバーハング領域が1～20塩基長である、請求項２８に記載の二本鎖核酸複合体。
  30. 　前記第1核酸鎖と前記第2核酸鎖とがリンカーを介して結合している、請求項２１に記載の二本鎖核酸複合体。
  31. 　前記リンカーが、切断性（cleavable）又は非切断性（uncleavable）のリンカーである、請求項３０に記載の二本鎖核酸複合体。
  32. 　前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項２１に記載の二本鎖核酸複合体。
  33. 　前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３２に記載の二本鎖核酸複合体。
  34. 　前記第1核酸鎖及び／又は前記第2核酸鎖が、8～30塩基長である、請求項２１に記載の二本鎖核酸複合体。
  35. 　請求項７～２０のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項２１～３４のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体を有効成分として含む、医薬組成物。
  36. 　髄腔内投与のための、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 　前記髄腔内投与が脳室内投与、後頭窩穿刺、又は腰椎穿刺である、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 　シャント、留置カテーテル、又は皮下ポートを用いて投与される、請求項３６に記載の医薬組成物。
  39. 　被験体の中枢神経系疾患を治療するための、請求項３５に記載の医薬組成物。
  40. 　前記核酸分子又は前記二本鎖核酸複合体が0.1mg～200mg投与される、請求項３５に記載の医薬組成物。
  41. 　核酸医薬の毒性を軽減するための、下記式（I）で示される人工塩基を含むヌクレオシドの使用であって、前記人工塩基を含むヌクレオシドは前記核酸医薬を構成する核酸鎖とヌクレオシド間結合で連結される、前記使用。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
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