JP7262816B2 - ヘテロ核酸のbbb通過脂質リガンド - Google Patents
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Description
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、
(1)トコフェロール若しくはその類縁体、
(2)コレステロール若しくはその類縁体、又は
(3)置換された若しくは置換されていないC1~30のアルキル基、置換された若しくは置換されていないC2~30のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないC1~30のアルコキシ基
と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、核酸複合体又はその塩。
[2](1)トコフェロール若しくはその類縁体、
(2)コレステロール若しくはその類縁体、又は
(3)置換された若しくは置換されていないC1~30のアルキル基、置換された若しくは置換されていないC2~30のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないC1~30のアルコキシ基
と結合している核酸鎖であって、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有する、前記核酸鎖又はその塩。
[3]前記トコフェロール又はその類縁体が、下式(I):
で表される、[1]又は[2]記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[4]前記コレステロール又はその類縁体が、下式(II)、(V)、(VI)、及び(VII):
環Aは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないベンゼンを表し、
環Bは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
環Cは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサンを表し、
R2は、水素原子、置換された若しくは置換されていないC1~30のアルキル基、置換された若しくは置換されていないC2~30のアルケニル基、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル基、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル-オキシ基、又はオキソ基を表し、
R3は、水素原子を表し、
R2及びR3は、一緒になって、置換された若しくは置換されていない1,6-ジオキサスピロ[4.5]デカン環を形成してもよく、
L1は、-O-、-NH-、
から成る群より選択される式で表される、[1]~[3]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[5]前記コレステロール又はその類縁体が、下式(IIa):
環Aは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
R1は、置換された若しくは置換されていないC1~30のアルキル基、置換された若しくは置換されていないC2~30のアルケニル基、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル基、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル-オキシ基、又はオキソ基を表し、
L1は、-O-、-NH-、
で表される、[1]又は[2]記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[6]前記コレステロール又はその類縁体が、下式(IIa-1)、(IIa-2)、(IIa-3)、及び(IIa-4):
(IIa-2)、
(IIa-3)、
(IIa-4)
(式中、
L1は、-O-、-NH-、
から成る群より選択される式で表される、[1]又は[2]記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[7]第2核酸鎖が、下式(VIII):
L2は、置換された若しくは置換されていないC1~12のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないC3~8シクロアルキレン基、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又はCH(CH2-OH)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-を表し、
L3は、-NH-又は結合を表し、
L4は、置換された若しくは置換されていないC1~12のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないC3~8のシクロアルキレン基、-(CH2)2-[O-(CH2)2]m-、又は結合を表し、ここで、mは1~25の整数を表し、
L5は、-NH-(C=O)-、-(C=O)-、又は結合を表す)
で表されるリンカーを介して、
(1)トコフェロール若しくはその類縁体、
(2)コレステロール若しくはその類縁体、又は
(3)置換された若しくは置換されていないC1~30のアルキル基、置換された若しくは置換されていないC2~30のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないC1~30のアルコキシ基
と結合している、[1]~[6]のいずれか記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[8]前記第1核酸鎖が、少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む、[1]~[7]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[9]前記第1核酸鎖が、ギャップマーである、[1]~[8]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[10]前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖中の少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含む、[8]又は[9]に記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[11]前記第1核酸鎖が、ミックスマーである、[1]~[7]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[12]前記第1核酸鎖が、13~20塩基長である、[1]~[11]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[13]前記第2核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、[1]~[12]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[14]前記第2核酸鎖の核酸部分が修飾若しくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド及び/又は糖修飾ヌクレオシドから成る、[1]~[13]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩。
[15][1]~[14]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩を含む、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための組成物。
[16]被験体の中枢神経系疾患治療用である、[15]に記載の組成物。
[17]前記中枢神経系疾患が、免疫性中枢神経系疾患である、[16]に記載の組成物。
[18][1]~[14]のいずれかに記載の核酸複合体、核酸鎖、又はその塩を含む、被験体の中枢神経系に薬剤を送達するための組成物。
[19]前記中枢神経系が、大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、小脳、及び脊髄からなる群から選択される、[15]~[18]のいずれかに記載の組成物。
[20]前記中枢神経系が、前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、小脳核、頸髄、胸髄及び腰髄からなる群から選択される、[15]~[18]のいずれかに記載の組成物。
[21]静脈内投与用又は皮下投与用である、[15]~[20]のいずれかに記載の組成物。
[22]1回の投与量中に5mg/kg以上の前記核酸複合体、核酸鎖、又はその塩を含む、[15]~[21]のいずれかに記載の組成物。
[23]前記核酸複合体、核酸鎖、又はその塩が血液脳関門(BBB)を通過する、[15]~[22]のいずれかに記載の組成物。
[24]前記免疫性中枢神経疾患が、ミクログリア関連疾患である、[17]に記載の組成物。
[25]前記ミクログリア関連疾患が、アルツハイマー病、多発性硬化症、ALS、または神経障害性疼痛である、[24]に記載の組成物。
[26]ミクログリアにおける標的転写産物の発現又は編集を調節するための、[15]~[25]のいずれかに記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-055372号の開示内容を包含する。
本明細書において「標的転写産物」とは、本発明の核酸複合体の標的となり得、かつDNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAをいう。一般的には標的遺伝子の転写産物が該当する。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNA(成熟mRNA、mRNA前駆体、塩基修飾を受けていないmRNA等を含む)、miRNA等のノンコーディングRNA(non-coding RNA、ncRNA)を含み得る。
一態様において、本発明は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体に関する。
環Aは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないベンゼンを表し、環Bは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、環Cは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサンを表し、R2は、水素原子、置換された若しくは置換されていないC1~30のアルキル基(例、エチル、イソプロピル、1-メチルプロピル、1,5-ジメチルヘキシル、4-エチル-1,5-ジメチルヘキシル)、置換された若しくは置換されていないC2~30のアルケニル基(例、1,5-ジメチル-4-ヘキセン-1-イル、1,4,5-トリメチル-2-ヘキセン-1-イル、4-エチル-1,5-ジメチル-2-ヘキセン-1-イル)、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル基(例、1-オキソエチル)、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル-オキシ基(例、(1-オキソヘプチル)オキシ)、又はオキソ基を表し、R3は、水素原子を表し、R2及びR3は、一緒になって、置換された若しくは置換されていない1,6-ジオキサスピロ[4.5]デカン環を形成してもよい)。
環Aは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセン、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサン又は置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、
R1は、置換された若しくは置換されていないC1~30のアルキル基(例えば、C2~20、C4~16、C6~12又はC8~10のアルキル基)、置換された若しくは置換されていないC2~30のアルケニル基(例えば、C2~20、C4~16、C6~12又はC8~10のアルケニル基))、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル基、置換された若しくは置換されていないC1~6アルキル-カルボニル-オキシ基、又はオキソ基を表し、
L1は、-O-、-NH-、
(IIa-2)
(IIa-3)
(IIa-4)
(式中、
L1は、-O-、-NH-、
から成る群より選択される。
L2は、置換された若しくは置換されていないC1~12のアルキレン基(例、プロピレン、ヘキシレン、ドデシレン)、置換された若しくは置換されていないC3~8シクロアルキレン基(例、シクロヘキシレン)、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又はCH(CH2-OH)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-を表し、L3は、-NH-又は結合を表し、L4は、置換された若しくは置換されていないC1~12のアルキレン基(例、エチレン、ペンチレン、へプチレン、アンデシレン)、置換された若しくは置換されていないC3~8のシクロアルキレン基(例、シクロヘキシレン)、-(CH2)2-[O-(CH2)2]m-、又は結合を表し、ここで、mは1~25の整数を表し、L5は、-NH-(C=O)-、-(C=O)-、又は結合を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる)。
本発明の核酸複合体は、被験体の中枢神経系において標的miRNAの効果を阻害することができる。例えば、具体的には、第1核酸鎖は、標的miRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、その標的miRNAに対してアンチセンス効果を有し、第2核酸鎖は、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と結合しており、第1核酸鎖と第2核酸鎖に互いにアニールしている核酸複合体が挙げられる。この核酸複合体によって標的miRNAの効果を阻害することにより、当該標的miRNAが通常ダウンレギュレートしている遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。
本発明の第2態様は組成物である。本発明の組成物は、前記第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖を有効成分として、及び/又は薬剤送達分子として包含する。前記第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖は、BBBを通過し、中枢神経系にて標的転写産物の発現量をアンチセンス効果によって調節する(例えば、発現量を減少させる)ことができる。したがって、本発明の組成物は、被験体に投与することで、核酸複合体を送達し、被験体を治療する組成物であってもよく、また医薬組成物であってもよい。なお、本発明の組成物は、それに限定されるものではないが、中枢神経系のミクログリア(小膠細胞)における標的転写産物の発現又は編集の調節において有効に使用することができる。
本明細書において、組成物は自体公知の方法により製剤化することができる。例えば、本組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、微粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、解膠剤(peptizer)、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、コーティング剤、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、注射剤及び坐剤の形態で、経口的に又は非経口的に使用することができる。
本明細書において、組成物の好ましい投与形態には特定の限定はない。例えば、経口投与又は非経口投与であればよい。非経口投与の具体例として、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気管/気管支投与、直腸投与、及び筋肉内投与、並びに輸血による投与が挙げられる。筋肉内注射投与、静脈内点滴投与、又は埋め込み型持続皮下投与で投与することもできる。皮下投与は、患者自身による自己注射が可能であるので好適である。また、静脈内投与の場合、組成物1回の投与量中に含まれる核酸複合体の量、すなわち核酸複合体の単回投与量は、例えば、0.001mg/kg以上、0.005mg/kg以上、0.01mg/kg以上、00.25mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2.5mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、20mg/kg以上、30mg/kg以上、40mg/kg以上、50mg/kg以上、75mg/kg以上、100mg/kg以上、150mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、若しくは500mg/kg以上とすることができる。例えば、0.001mg/kg~500mg/kgの範囲に含まれる任意の量(例えば、0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、若しくは200mg/kg)を適宜選択することができる。
本明細書で「被検体」とは、本発明の組成物を適用する対象をいう。被検体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被検体が個体の場合、本発明の組成物は、ヒトを含むあらゆる動物に適用することができる。ヒト以外の対象としては、例えば、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が適用対象となり得る。被験体は、中枢神経系で標的転写産物の発現量を減少させることが必要な個体や、中枢神経系疾患の治療が必要な個体であってもよい。
本発明の組成物は、有効成分として含有する第1態様の核酸複合体又は一本鎖核酸鎖がBBBを通過し、中枢神経系に効率的に送達され得ることを利用して、特定の薬剤を第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖に結合させることによって、その薬剤を神経系、特に中枢神経系に送達することができる。神経系に送達される薬剤は、特に限定されないが、ペプチド、タンパク質又は核酸薬剤、あるいはその他の有機化合物等、例えば抗腫瘍薬、ホルモン薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症薬等が挙げられる。薬剤は、好ましくは、小分子薬剤である。「小分子薬剤」とは、当該技術分野において十分に理解されている。小分子薬剤は、典型的には、1,000ダルトン未満の分子量を有する薬剤を指す。薬剤は、親油性薬剤であってもよい。核酸薬剤としては、特に限定されないが、ASO、アンタゴmiR、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、アプタマー、一本鎖siRNA、マイクロRNA、プレ-マイクロRNA等が挙げられる。薬剤の第2核酸鎖における結合位置及び結合の種類は、トコフェロール若しくはコレステロール又はその類縁体等と第2核酸鎖との結合について上に記載される通りである。
1H NMRの解析にはACD/SpecManager(商品名)ソフトウエアなどを用いた。水酸基やアミノ基などのプロトンピークが非常に緩やかなピークについては記載していないことがある。
M:モル濃度
N:規定度
CDCl3:重クロロホルム
DMSO-d6:重ジメチルスルホキシド
1H NMR:プロトン核磁気共鳴
LC/MS:液体クロマトグラフ質量分析計
DIPEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMAP:4-ジメチルアミノピリジン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
HATU:O―(7―アザベンゾトリアゾール―1―イル)―N,N,N’,N’―テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩
NMP:N-メチル-2-ピロリドン
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
TEA:トリエチルアミン
TEAA:トリエチルアミンアセタート
THF:テトラヒドロフラン
IY1の合成
6-アミノヘキサン酸(146 mg)のピリジン溶液(5567 μL)にトリメチルシリルクロリド(569 μL)を0℃で加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、30分室温で攪拌した。クロロぎ酸 コレステロール(500 mg)を0 ℃で加え、反応混合物を窒素雰囲気下、30分室温で攪拌した。反応混合物に1規定塩酸水溶液を0 ℃で加えて中和し、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水、続いて飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮乾固した。得られた固体をジイソプロピルエーテルで洗浄し、表題化合物を200 mg得た。
IY9の合成
エストラジオールエナンタート(200 mg)とピリジン(535 μL)のTHF溶液(5 mL)にニトロフェニルカルボノクロリダート(210 mg)を0 ℃で加えた。反応混合物を室温で3時間反応させた。沈殿物をセライトろ過で除去し、ろ過物をジイソプロピルエーテルで洗浄した。ろ液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/ヘキサン) で精製して標題化合物を80 mg得た。
以下の表3に、参考例9、10、36、39及び40の化合物の化学構造式及びNMRデータを示す。
IY11の合成
A)IY11-1の合成
クロロぎ酸コレステロール(300 mg)と3-(2-アミノエトキシ)プロパン酸(89 mg)を用いて参考例1と同様の方法により表題化合物を得た。この化合物は精製せずに次工程で用いた。
工程Aで得られたIY11-1のテトラヒドロフラン溶液 (6700 μL)にビス(ペンタフルオロフェニル) カルボナート(528 mg) を加え、反応混合物を窒素雰囲気下室温で1時間攪拌した。反応混合物を室温で水に加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を127 mg得た。
IY18の合成
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.68 (3H, s), 0.80-1.69 (37H, m), 1.73-2.07 (6H, m), 2.18-2.71 (11H, m), 3.27-3.46 (3H, m), 3.47-3.73 (80H, m), 3.78 (2H, t, J = 6.1 Hz), 4.39-4.66 (1H, m), 5.24 (1H, brs), 5.37 (1H, d, J = 5.4 Hz), 6.98 (1H, s).
IY19の合成
ジオスゲニン(445 mg)、ビス(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) カルボナート(1650 mg)、トリエチルアミン(2.244 mL)およびアセトニトリル(10 mL)の混合物を超音波条件下3時間反応させた。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で希釈下後、酢酸エチルとジエチルエーテルの混合溶媒で抽出した。抽出液を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を55 mg得た。
IY-23の合成
IY23-1(300 mg)のジクロロメタン溶液(10 mL)にイミダゾール(152 mg)、DMAP(91 mg)を室温で加え、15分撹拌した。tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート(0.34 mL)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を150 mg得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ -0.01 (6H, s), 0.67 (3H, s), 0.66 - 0.96 (15H, m), 0.91 - 1.14 (9H, m), 1.11 - 1.40 (8H, m), 1.42 (2H, dd, J = 8.0, 4.6 Hz), 1.44 - 1.53 (6H, m), 1.77 - 1.89 (3H, m), 1.91 - 2.05 (2H, m), 2.17 - 2.33 (2H, m), 3.34 (1H, dd, J = 9.7, 6.8 Hz), 3.42 (1H, dd, J = 9.6, 6.0 Hz), 3.47 - 3.57 (1H, m), 5.34 (1H, d, J = 4.8 Hz).
工程Aで得られたIY23-1を用いて参考例19と同様の方法により、標題化合物を得た。
得られた化合物のNMRの結果は以下の通りである。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.04 (s, 6 H) 0.68 (s, 3 H) 0.77 - 1.63 (m, 38 H) 1.67 - 2.18 (m, 6 H) 2.48 (d, J = 7.54 Hz, 2 H) 2.83 (s, 4 H) 3.28 - 3.51 (m, 2 H) 4.51 - 4.70 (m, 1 H) 5.42 (d, J = 4.14 Hz, 1 H)
IY27の合成
ラウリン酸(148 mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)にジシクロヘキシルカルボジイミド(226 mg)、IY27-1(250 mg)、DMAP(26.7 mg)を加え、室温で16時間撹拌した。ジクロロメタン(50 mL)で反応溶液を希釈し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を230 mg得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ0.68 (3H, s), 0.87 (3H, t, J = 5.5 Hz), 0.95 (3H, d, J = 6.1 Hz), 1.01(3H, s), 1.05 - 1.18 (3H, m), 1.25 (16H, s), 1.36-1.65 (14H, m), 1.80 - 1.89 (4H, m), 1.91 - 2.04 (2H, m), 2.21 - 2.33 (4H, m), 2.34 - 2.45 (1H, m), 2.46 - 2.59 (1H, m), 4.55 - 4.65 (1H, m), 5.27 (2H, s), 5.36 (1H, d, J = 2.8 Hz), 7.62 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.77 (2H, d, J = 8.5 Hz).
工程Aで得られたIY27-2(180 mg)のジクロロメタン溶液(10 mL)に酢酸(10 mL)、亜鉛粉末(113 mg)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物をセライトでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を100 mg得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.67 (3H, s), 0.86 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.93 (3H, d, J = 6.3 Hz), 1.01(3H, s), 1.06 - 1.19 (3H, m), 1.24 (14H, s), 1.36 - 1.65 (14H, m), 1.80 - 1.88 (5H, m), 1.91 - 2.02 (2H, m),2.27 (7H, dt, J = 15.1, 7.3 Hz), 4.53 - 4.67 (1H, m), 5.36 (1H, d, J = 5.8 Hz).
IY37の合成
IY37-1(1.0 g)のDMF溶液(10 mL)にイミダゾール(460 mg)とDMAP(275 mg)を室温で加え、15分間撹拌した。tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート(1.03 mL)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を1 g得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.04 (6H, d, J = 4.6 Hz), δ 0.66 (3H, s), 0.81 - 0.93 (17H, m), 0.95 - 1.17 (12H, m), 1.22 - 1.39 (6H, m), 1.39 - 1.54 (4H, m), 1.71 - 1.91 (5H, m), 1.94 - 2.06 (4H, m), 2.31 (2H, q, J = 7.5 Hz), 3.93 (1H, d, J = 7.9 Hz), 4.54 - 4.66 (1H, m), 5.29 (1H, s).
工程Aで得られたIY37-2(1 g)のエタノール(4 mL)、ジクロロメタン(2 mL)溶液に水酸化ナトリウム水溶液(10%、2.86 mL)を加え、室温で3時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加え、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、標題化合物を800 mg得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ -0.04 - 0.09 (6H, m), 0.66 (3H, s), 0.82 - 0.93 (18H, m), 0.94 - 1.16 (12H, m), 1.24 (1H, d, J = 7.3 Hz), 1.28 - 1.41 (4H, m), 1.52 (6H, d, J = 32.7 Hz), 1.73 - 1.86 (4H, m), 1.95 - 2.05 (1H, m), 2.24 (2H, d, J = 10.9 Hz), 3.47 - 3.58 (1H, m), 3.93 (1H, d, J = 7.6 Hz), 5.26 (1H, s).
工程Bで得られたIY37-3(800 mg)のアセトニトリル(4 mL)、ジクロロメタン(4 mL)溶液にトリエチルアミン(3.26 mL)とビス(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) カルボナート(2.38 g)を加え、45 ℃で16時間撹拌した。反応混合物をセライトでろ過し、5%クエン酸溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を800 mg得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.05 (6H, d, J = 4.6 Hz), 0.66 (3H, s), 0.84 - 0.92 (17H, m), 0.95 - 1.16 (12H, m), 1.21 - 1.37 (6H, m), 1.40 - 1.55 (3H, m), 1.70 - 1.82 (3H, m), 1.89 (1H, d, J = 13.8 Hz), 1.95 - 2.06 (3H, m), 2.47 (2H, d, J = 7.8 Hz), 2.82 (4H, s), 3.92 (1H, d, J = 7.5 Hz), 4.53 - 4.67 (1H, m), 5.31 (1H, d, J = 15.7 Hz).
工程Cで得られたIY37-4(800 mg)のTHF(8 mL)溶液にトリエチルアミン・3フッ化水素塩 (2.64 mL)を0℃で加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を110 mg得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.68 (3H, s), 0.86 (6H, d, J = 5.0 Hz), 0.91 (3H, d, J = 6.2 Hz), 0.98 - 1.17 (11H, m), 1.22 - 1.43 (8H, m), 1.41 - 1.53 (3H, m), 1.70 - 1.83 (2H, m), 1.84 - 1.96 (2H, m), 2.04 (2H, s), 2.51 (2H, t, J = 9.1 Hz), 2.83 (4H, s), 3.85 (1H, s), 4.55 - 4.69 (1H, m), 5.35 (1H, s).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.63 (3H, s), 0.86 (8H, dd, J = 16.0, 5.6 Hz), 0.94 - 1.38 (21H, m), 1.44 - 1.69 (6H, m), 1.71 - 1.81 (1H, m), 1.82 - 1.97 (2H, m), 2.15 (1H, t, J = 12.0 Hz), 2.80 (4H, s), 3.38 (1H, s), 4.13 (1H, s), 4.64 (1H, d, J = 4.0 Hz), 5.03 - 5.14 (1H, m)
8規定水酸化ナトリウム水溶液 (2.92 mL)と過酸化水素水 (14.3 mL)をIY41-1 (1.8 g)のメタノール溶液(3.12 mL)-ヘキサン(6.24 mL)混合溶液に加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。過酸化水素水 (1.43 mL) を加えた。尿素・過酸化水素(1.32 g)を加え1時間撹拌した。反応混合物を6規定塩酸水溶液で中和し、チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、1規定塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、続いて飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を立体異性体混合物(4α,5αエポキシ体及び4β,5βエポキシ体)として700 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.64-0.73 (3H, m), 0.80-0.93 (9H, m), 0.94-2.47 (31H, m), 2.98 (1H, s, 4-H beta), 3.03 (1H, 2, 4-H alpha).
工程Aで得られたIY41-2 (700 mg)の酢酸(10 mL)とTHF(10 mL)の混合溶液にp-トルエンスルホニル ヒドラジド(342 mg)を小分けにして加えた反応混合物を室温で4時間撹拌した。反応混合物に飽和食塩水(30 mL)を加え、有機層を分離した。水層を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を560 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.73 (3H, s), 0.82-0.95 (9H, m), 0.96-1.08 (3H, m), 1.09 (3H, s), 1.10-2.39 (25H, m), 2.44-2.62 (1H, m).
工程Bで得られたIY41-3(560 mg)のメタノール溶液(10 mL)に水素化ホウ素ナトリウム(110 mg)を室温で加えた。反応混合物を室温で30分撹拌した後、酢酸エチルで希釈した。有機層を分離し、水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物)を立体異性体混合物(5α及び5βヒドロシキ体)として560 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.65 (9H, d, J = 3.4 Hz), 0.74-2.36 (35H, m), 3.43-3.56 (1H, m, 5-H alpha), (1H, d, J = 2.4 Hz, 5-H alpha).
工程Cで得られたIY41-4(540 mg)のエタノール溶液(7 mL)にパラジウム/炭素(7.4 mg)を加え、水素雰囲気下終夜撹拌した。反応混合物をアミノシリカパッドでろ取し、溶媒を留去し、標題化合物を立体異性体混合物(5α及び5βヒドロキシ体)として540 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.61-0.69 (3H, m), 0.80 (3H, s), 0.81-1.91 (42H, m), 1.92-2.03 (1H, m), 3.43-3.55 (1H, m, 5-H alpha), 3.63 (1H, brs, 5-H beta).
工程Dで得られたIY41-5を用いて参考例9と同様の方法により、標題化合物を単一異性体として得た。本反応条件下未反応であったIY41-5のαヒドロキシ体は精製の過程において取り除かれた。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.66 (4H, s), 0.73-2.07 (47H, m), 4.72 (1H, dd, J = 11.2, 4.2 Hz), 7.36 (2H, d, J = 8.9 Hz), 8.28 (2H, d, J = 8.3 Hz).
IY42の合成
IY42-1 (3.03 g)のピリジン溶液(30 mL)にp-トルエンスルホニルクロリド(2.40 g)を室温で加えた。反応混合物を3時間撹拌した後、p-トルエンスルホニルクロリド(2.40 g)を加え、終夜撹拌した。反応混合物に1規定塩酸水溶液を室温で加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し標題化合物を1.45g得た。粗生成物は精製せずに次の工程に用いた。
工程Aで得られたIY42-2 (377 mg)のDMF (3 mL)にアジ化ナトリウム(238 mg)を室温で加え、70度で4時間撹拌した。反応混合物を水に室温で加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄し標題化合物を310 mg得た。粗生成物は精製せずに次の工程に用いた。
工程Bで得られたIY42-3 (493 mg)のTHF (10 mL)と水 (1 mL)の混合溶媒にポリマー担持トリフェニルホスフィン (3 mmol/g) (1.32 g)を加え、70℃で3時間撹拌した。不溶固体をろ過し、さらに酢酸エチルで洗浄した。ろ液に飽和食塩水を加え、有機層を分離、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をピリジン(10 mL)に溶解させ、3,5-ビス(トリフルオロメチル)-ベンゾイル クロリド(0.241 mL)を室温で加えた。反応混合物を終夜撹拌後、1規定塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を370 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.81 (3H, s), 0.94-1.74 (22H, m), 1.74-2.12 (5H, m), 2.33 (2H, d, J = 7.3 Hz), 4.20-4.38 (1H, m), 4.62 (1H, brs), 5.39 (1H, brs), 5.96 (1H, d, J = 8.9 Hz), 8.00 (1H, s), 8.16 (2H, s).
工程Cで得られたIY49-5 (370 mg)をメタノール(3 mL)-THF (3 mL)に溶解後、炭酸カリウム(256 mg)を加え、室温で2時間撹拌した。反応混合物の溶媒を留去して得られた残渣に1規定塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を0℃で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて中和し、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)で精製して標題化合物を183 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.80 (3H, s), 0.90-2.12 (25H, m), 2.16-2.65 (2H, m), 3.53 (1H, brs), 4.25 (1H, d, J = 6.8 Hz), 5.36 (1H, brs), 6.08 (1H, d, J =8.7 Hz), 7.99 (1H, s), 8.16 (2H, s).
工程Dで得られたIY42-6を用いて参考例19と同様の方法により標題化合物を合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.81 (3H, s), 0.90-1.24 (7H, m), 1.32 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.41-2.16 (14H, m), 2.49 (2H, d, J = 7.0 Hz), 2.84 (4H, s), 4.27 (1H, s),4.62 (1H, s), 5.42 (1H, d, J = 4.7 Hz), 5.92 (1H, d, J = 9.4 Hz), 8.00 (1H, s), 8.15 (2H, s).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.67 (3H, s), 0.78-2.12 (38H, m), 2.35 (2H, d, J = 8.3 Hz), 3.24 (1H, d, J = 9.0 Hz), 5.37 (1H, d, J = 5.1 Hz).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.69 (3H, s), 0.79-2.19 (43H, m), 2.27-2.89 (6H, m), 4.34 (1H, brs), 5.45 (1H, brs), 7.32 (1H, s).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) - 0.70 (3H, s), 0.80-1.66 (36H, m), 1.70-2.12 (6H, m), 2.17-2.51 (4H, m), 2.68 (1H, ddt, J = 16.0, 10.0, 3.2 Hz), 2.85 (4H, s),2.89-3.27 (4H, m), 4.01 (1H, tt, J = 12.2, 3.9 Hz), 4.29-4.44 (1H, m), 4.47-4.61 (1H, m), 5.42 (1H, d, J = 1.9 Hz).
IY50-1(1.02 g)を出発原料として、参考例42の工程Aと同様の方法により標題化合物を825 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.64 (3H, s), 0.81-2.39 (33H, m), 2.45 (3H, s), 3.50 (2H, brs), 3.67-4.06 (3H, m), 4.71 (1H, brs), 5.33 (1H, brs), 7.34 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.78 (2H, d, J = 7.9 Hz).
工程Aで得られたIY50-2(411 mg)を出発原料として、参考例42の工程Bと同様の方法により標題化合物を258 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 0.69 (3H, s), 0.82-2.43 (33H, m), 3.04 (1H, dd, J = 11.8, 7.4 Hz), 3.28-3.68 (3H, m), 3.81-4.03 (1H, m), 4.72 (1H, brs), 5.35(1H, brs).
工程Bで得られたIY50-3 (258 mg)を出発原料として、参考例42の工程Cと同様の方法により標題化合物を190 mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.73 (3H, s), 0.87-1.43 (22H, m), 1.63-2.14 (8H, m), 2.37 (1H, s), 3.03-4.03 (7H, m), 4.72 (1H, brs), 5.36 (1H, s), 6.13 (1H, s), 8.01 (1H, s), 8.20 (2H, s).
工程Cで得られたIY50-5 (190 mg)、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム(101 mg)とメタノール(5 mL)の混合物を加熱還流下1時間撹拌した。減圧条件下溶媒を留去し、残渣を水に加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去し、標題化合物を170 mgを得た。粗生成物は精製せずに次の工程に用いた。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.74 (3H, s), 0.86-2.45 (28H, m), 3.10-3.33 (1H, m), 3.41-3.69 (2H, m), 5.35 (1H, brs), 6.15 (1H, brs), 8.01 (1H, s), 8.20 (2H, s).
工程Dで得られたIY53-6を用いて参考例19と同様にして標題化合物を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.74 (3H, s), 0.88-2.21 (25H, m), 2.49 (2H, d, J = 7.9 Hz), 2.84 (4H, s), 3.09-3.32 (1H, m), 3.59 (1H, d, J = 12.8 Hz), 4.60 (1H,
brs), 5.43 (1H, brs), 6.15 (1H, brs), 8.01 (1H, s), 8.20 (2H, s).
A)5' 末端にY1-を結合させたcRNA(Y1-cRNA(Malat1))の合成
IY1の50 mM NMP溶液(800 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(800 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(800 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(2000 nmol)、NMP(2100 μL)、蒸留水 (153 μL)、DIPEA (63 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を690 nmol得た。B)二本鎖核酸剤Y1-HDOの合成
転移関連肺腺癌転写産物(Malat1)ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(Malat1))は、5'末端の3個及び3'末端の3個のLNAヌクレオシド、並びにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのMalat1ノンコーディングRNA(GenBankアクセッション番号NR_002847、配列番号3)の1316~1331に相補的な塩基配列を有する。 ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY1-cRNA(Malat1)(第2鎖)とを等モル量で混合し、混合液を70℃で5分加熱した。その後室温に徐冷し、上記の二本鎖核酸剤であるY1結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y1-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y1-HDO)を調製した。
A)5' 末端にY3-を結合させたcRNA(Y3-cRNA(Malat1))の合成
IY3の50 mM DMSO溶液(240 μL)、HATUの75 mM NMP溶液 (240 μL)、DIPEA (240 μL) の150 mM NMP溶液(240 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で15分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(253 μL, 1200 nmol)、DMSO(1980 μL)、蒸留水 (47.4 μL)、DIPEA (38 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、酢酸エチルで抽出し、水層を限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により精製した。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を定量的に得た。
B) 二本鎖核酸剤Y3-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY3-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY3結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y3-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y3-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY4-を結合させたcRNA(Y4-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(2000 nmol)及びIY4を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を590 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y4-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY4-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY4結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y4-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y4-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY5-を結合させたcRNA(Y5-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(1000 nmol)及びIY5を用いて実施例3の工程Aと同様にして標題化合物を776 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y5-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY5-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY5結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y5-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y5-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY6-を結合させたcRNA(Y6-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(1000 nmol)及びIY6を用いて実施例3の工程Aと同様にして標題化合物を880 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y6-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY6-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY6結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y6-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y6-HDO)を調製した。
A)5' 末端にY7-を結合させたcRNA(Y7-cRNA(Malat1))の合成
IY7の50 mM NMP溶液(1200 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(1200 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(1200 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(548 μL, 3000 nmol)、NMP(3150 μL)、蒸留水 (202 μL)、DIPEA (94 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液を凍結乾燥した後、蒸留水で溶解することにより、標題化合物を780 nmol得た。
B)二本鎖核酸剤Y7-HDOの合成
転移関連肺腺癌転写産物(Malat1)ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(Malat1))は、5'末端の3個及び3'末端の3個のLNAヌクレオシド、並びにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのMalat1ノンコーディングRNA(GenBankアクセッション番号NR_002847、配列番号3)の1316~1331に相補的な塩基配列を有する。ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY1-cRNA(Malat1)(第2鎖)とを等モル量で混合し、混合液を70℃で5分加熱した。その後、混合液を室温に徐冷した。さらにBT AG 50W-X8 Resinを用いてナトリウム塩へとイオン交換した後、凍結乾燥し蒸留水を加えることで二本鎖核酸剤であるY7結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y1-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y7-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY8-を結合させたcRNA(Y8-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(3000 nmol)及びIY8を用いて実施例7の工程Aと同様にして標題化合物を630 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y8-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY8-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY8結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y8-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y8-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY9-を結合させたcRNA(Y9-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(260 μL, 1500 nmol)にIY9の50 mM NMP溶液(900 μL)、蒸留水(190 μL)、NMP(2100 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (375 μL)、の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、2時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液を凍結乾燥し、標題化合物を578 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y9-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY9-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY9結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y9-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y9-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY10-を結合させたcRNA(Y10-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(421 μL, 2000 nmol)にIY10の50 mM NMP溶液(800 μL)、蒸留水(79 μL)、NMP(3200 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (500 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により濃縮及びNMP等の低分子試薬の除去を行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1185 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y10-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY10-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY10結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y10-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y10-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY11-を結合させたcRNA(Y11-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(173.5 μL, 1000 nmol)にIY11の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(76.5 μL)、NMP(1600 μL)、×10 PBS (250 μL)、DIPEA (31 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を592 nmol得た。B) 二本鎖核酸剤Y11-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY11-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY11結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y11-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y11-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY12-を結合させたcRNA(Y12-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(3000 nmol)及びIY12を用いて実施例7の工程Aと同様にして標題化合物を1770 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y12-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY12-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY12結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y12-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y12-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY13-を結合させたcRNA(Y13-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(3000 nmol)及びIY13を用いて実施例7工程Aと同様にして標題化合物を1230 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y13-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY13-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY13結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y13-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y13-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY14-を結合させたcRNA(Y14-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(3000 nmol)及びIY14を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を1650 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y14-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY14-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY14結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y14-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y14-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY15-を結合させたcRNA(Y15-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(210 μl nmol, 1000 nmol)及びIY15を用いて実施例3の工程Aと同様にして標題化合物を900 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y15-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY15-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY15結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y15-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y15-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY16-を結合させたcRNA(Y16-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(176 μL, 1000 nmol)及びIY16を用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を532 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y16-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY16-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY16結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y16-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y16-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY17-を結合させたcRNA(Y17-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(176 μL, 1000 nmol)及びIY17を用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を686 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y17-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY17-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY17結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y17-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y17-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY18-を結合させたcRNA(Y18-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(274 μL, 1500 nmol)及びIY18を用いて実施例3の工程Aと同様にして標題化合物を1398 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y18-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY18-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY18結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y18-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y18-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY19-を結合させたcRNA(Y19-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(210.5 μL, 1000 nmol)にIY19の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(39.5 μL)、NMP(1600 μL)、×10 PBS (250 μL)、DIPEA (31 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により濃縮及びNMP等の低分子試薬の除去を行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を927 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y19-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY19-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY19結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y19-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y19-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY20-を結合させたcRNA(Y20-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(260 μL, 1500 nmol)及びIY19を用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を686 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y20-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY20-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY20結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y20-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y20-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY21-を結合させたcRNA(Y21-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(260 μL, 1500 nmol)にIY21の50 mM NMP溶液(300 μL)、蒸留水(115 μL)、NMP(2400 μL)、×10 PBS (375 μL)、50 mM DMAP (300 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を917 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y21-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY21-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY21結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y21-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y21-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY22-を結合させたcRNA(Y22-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(365 μL, 2000 nmol)及びIY22を用いて実施例21の工程Aと同様にして標題化合物を1253 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y22-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY22-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY22結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y22-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y22-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY23-を結合させたcRNA(Y23-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(382 μL, 2200 nmol)にIY23の50 mM NMP溶液(440 μL)、蒸留水(168 μL)、NMP(3520 μL)、×10 PBS (550 μL)、50 mM DMAP (440 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液を1000 μLに蒸留水で希釈し、蒸留水(200 μL)、NMP(400 μL)、メタノール(4400 μL)、50 mM フッ化水素のDMSO溶液(2000 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応液に300 mMトリメチルエトキシシランのDMSO溶液 (2000 μL)を加えた。反応混合物をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1114 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y23-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY23-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY23結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y23-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y23-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY24-を結合させたcRNA(Y24-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(174 μL, 1000 nmol)及びIY24を用いて実施例21の工程Aと同様にして標題化合物を870 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y24-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY24-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY24結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y24-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y24-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY25-を結合させたcRNA(Y25-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(274 μL, 1500 nmol)及びIY25を用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を760 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y25-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY25-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY25結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y25-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y25-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY26-を結合させたcRNA(Y26-cRNA(Malat1))の合成
IY26の50 mM THF溶液(400 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(400 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(400 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(315 μL, 2000 nmol)、NMP(1450 μL)、THF(1850 μL)、蒸留水 (184 μL)、DIPEA (63 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。さらに、IY26の50 mM THF溶液(400 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(400 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(400 μL)をファルコンチューブ中で混合し15分静置した後に、反応液に合わせ、DIPEA (125 μL) を加え室温で2時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を237 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y26-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY26-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY26結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y26-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y26-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY27-を結合させたcRNA(Y27-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(312 μL, 2000 nmol)及びIY27を用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を705 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y27-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY27-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY27結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y27-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y27-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY28-を結合させたcRNA(Y28-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(346 μL, 2530 nmol)及びIY28を用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を1046 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y28-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY28-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY28結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y28-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y28-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY29-を結合させたcRNA(Y29-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y62-cRNA(Malat1))の水溶液(369 μL, 1500 nmol)及びIY29を用いて実施例21の工程Aと同様にして標題化合物を903nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y29-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY29-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY29結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y29-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y29-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY30-を結合させたcRNA(Y30-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y63-cRNA(Malat1))の水溶液(358 μL, 1500 nmol)及びクロロギ酸コレステロールを用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を1228 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y30-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY30-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY30結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y30-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y30-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY31-を結合させたcRNA(Y31-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y64-cRNA(Malat1))の水溶液(355 μL, 1400 nmol)及びIY29を用いて実施例21の工程Aと同様にして標題化合物を657 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y31-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY31-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例7の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY31結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y31-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y31-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY32-を結合させたcRNA(Y32-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(315 μL, 2000 nmol)及びIY32を用いて実施例11の工程Aと同様にして標題化合物を864 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y32-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY32-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY32結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y32-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y32-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY33-を結合させたcRNA(Y33-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(365 μL, 2000 nmol)にIY33の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(135 μL)、NMP(3200 μL)、×10 PBS (500 μL)、50 mM DMAP (400 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70℃で、1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を963 nmol得た。B) 二本鎖核酸剤Y33-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY33-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY33結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y33-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y33-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY34-を結合させたcRNA(Y34-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(365 μL, 2000 nmol)及びIY34を用いて実施例33の工程Aと同様にして標題化合物を1083 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y34-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY34-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY34結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y34-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y34-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY35-を結合させたcRNA(Y35-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(315 μL, 2000 nmol)を用いて実施例33の工程Aと同様にして標題化合物を830 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y35-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY35-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY35結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y35-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y35-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY36-を結合させたcRNA(Y36-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)及びIY36を用いて実施例33の工程Aと同様にして標題化合物を830 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y36-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY36-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY36結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y36-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y36-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY37-を結合させたcRNA(Y37-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(400 μL, 2000 nmol)及びIY37を用いて実施例33の工程Aと同様にして標題化合物を1189 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y37-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY37-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY37結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y37-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y37-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY38-を結合させたcRNA(Y38-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)及びIY38を用いて実施例33の工程Aと同様にして標題化合物を1032 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y38-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY38-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY38結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y38-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y38-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY39-を結合させたcRNA(Y39-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)にIY39の50 mM NMP溶液(800 μL)、蒸留水(270 μL)、NMP(2800 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (500 μL)、の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。さらに、IY39の50 mM NMP溶液(400 μL)を追加して室温で1時間反応させた。さらに、IY39の50 mM NMP溶液(400 μL)、Borate Buffer, pH 8.5+/-0.2, 5X Concentrate (100 μL)を追加して室温で終夜反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1554 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y39-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY39-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY39結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y39-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y39-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY40-を結合させたcRNA(Y40-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(364 μL, 2000 nmol)及びIY40を用いて実施例39の工程Aと同様にして標題化合物を607 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y40-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY40-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY40結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y40-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y40-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY41-を結合させたcRNA(Y41-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)及びIY41を用いて実施例39の工程Aと同様にして標題化合物を1400 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y41-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY41-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY41結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y41-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y41-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY42-を結合させたcRNA(Y42-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(365 μL, 2000 nmol)及びIY42を用いて実施例39の工程Aと同様にして標題化合物を1061 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y42-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY42-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY42結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y42-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y42-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY43-を結合させたcRNA(Y43-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)及びIY43を用いて実施例39の工程Aと同様にして標題化合物を820 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y43-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY43-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY43結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y43-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y43-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY44-を結合させたcRNA(Y44-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)及びIY44を用いて実施例39の工程Aと同様にして標題化合物を969 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y44-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY44-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY44結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y44-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y44-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY45-を結合させたcRNA(Y45-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(164 μL, 1000 nmol)及びIY45を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を653 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y45-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY45-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY45結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y45-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y45-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY46-を結合させたcRNA(Y46-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA (Malat1))の水溶液(312 μL, 2000 nmol)にIY46の50 mM NMP溶液(400 μL)、蒸留水(188 μL)、NMP(3200 μL)、×10 PBS (500 μL)、50 mM DMAP (400 μL)の順にエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、70 ℃で、1時間反応させた。さらに、IY46の50 mM NMP溶液(400 μL)及び50 mM DMAP (400 μL)を加え、70℃で1時間、室温で終夜反応させた。さらに、IY46の50 mM NMP溶液(400 μL)及び150 mM DIPEA (400 μL)を加えて70 ℃で1時間反応させた。反応液をODSカラム(カラム: Purif-Pack(登録商標)-EX ODS-50 size 60、昭光サイエンス製、移動相: TEAA/アセトニトリル)にて精製し、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。得られた溶液に1 M メグルミンアセテートを10倍量加えてよく攪拌し、5分放置することでイオン交換を行った。その後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により脱塩処理行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を980 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y46-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY46-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY46結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y46-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y46-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY47-を結合させたcRNA(Y47-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(315 μL, 2000 nmol)及びIY47を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を569nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y47-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY47-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY47結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y47-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y47-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY48-を結合させたcRNA(Y48-cRNA(Malat1))の合成
IY48の50 mM NMP溶液(800 μL)、HATUの75 mM NMP溶液(800 μL)、DIPEA の150 mM NMP溶液(800 μL)をエッペン中で混合し、撹拌、沈降した後、室温で30分反応させた。そこに、表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(2000 nmol)、NMP(2100 μL)、蒸留水 (153 μL)、DIPEA (63 μL) を加え、撹拌、沈降した後、室温で、1時間反応させた。反応用液をNMP濃度が10v/v%になるように蒸留水で希釈した後、限外ろ過(Amicon ultra 3kDa、メルクミリポア社製、蒸留水)により濃縮及びNMP等の低分子試薬の除去を行った。最終物を0.20 μmのメンブレンフィルターでfiltrationし、凍結乾燥後、標題化合物を1085 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y48-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY48-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY48結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y48-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y48-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY49-を結合させたcRNA(Y49-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(329 μL, 2000 nmol)及びIY49を用いて実施例39の工程Aと同様にして標題化合物を1176 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y49-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY49-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY49結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y49-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y49-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY50-を結合させたcRNA(Y50-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(315 μL, 2000 nmol)及びIY50を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を674 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y50-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY50-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY50結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y50-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y50-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY51-を結合させたcRNA(Y51-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(315 μL, 2000 nmol)及びIY51を用いて実施例39の工程Aと同様にして標題化合物を827 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y51-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY51-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY51結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y51-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y51-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY52-を結合させたcRNA(Y52-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(164 μL, 1000 nmol)及びIY52を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を653 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y52-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY52-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY52結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y52-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y52-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY53-を結合させたcRNA(Y53-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(313 μL, 2000 nmol)及びIY53を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を865 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y53-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY53-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY53結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y53-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y53-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY54-を結合させたcRNA(Y54-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(313 μL, 2000 nmol)及びIY54を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を1165 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y54-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY54-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY54結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y54-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y54-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY55-を結合させたcRNA(Y55-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(313 μL, 2000 nmol)及びIY55を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を1401 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y55-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY55-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY55結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y55-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y55-HDO)を調製した。
A) 5' 末端にY57-を結合させたcRNA(Y57-cRNA(Malat1))の合成
表1に示すRNA鎖(Y61-cRNA(Malat1))の水溶液(394 μL, 2500 nmol)及びIY57を用いて実施例1の工程Aと同様にして標題化合物を641 nmol得た。
B) 二本鎖核酸剤Y57-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と前工程Aで得られたY57-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY57結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y57-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y57-HDO)を調製した。
二本鎖核酸剤Y59-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と表1に示すY59-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY59結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y59-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y59-HDO)を調製した。
二本鎖核酸剤Y60-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と表1に示すY60-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるY60結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Y60-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Y60-HDO)を調製した。
二本鎖核酸剤Chol-HDOの合成
ASO(Malat1)(第1鎖)と表1に示すChol-cRNA(Malat1)(第2鎖)を用いて、実施例1の工程Bと同様にして、二本鎖核酸剤であるChol結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Chol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO)を調製した。
(A)in vivo実験
実験動物には、7週齢の雄性C57BL/6Jマウス(日本チャールズリバー)を使用し、一群あたり2-4匹を実験に供した。実験群では、核酸を含む溶液をマウスの尾静脈から5mL/kgの投与量で静脈内に単回投与した。また、比較対象群では、核酸溶液の調製に用いた溶媒(5%ブドウ糖液)を実験群と同様の手順でマウスに静脈内投与した。
核酸溶液投与して72時間後に、ペントバルビタールを50mg/kgで前記マウスに腹腔内投与によって麻酔して、採血及び屠殺し、脳(大脳皮質)を摘出した。脳組織からの全RNA抽出は、RNA抽出用試薬ISOGEN(ニッポン・ジーン社)を用いた。ISOGEN溶液中で摘出した脳組織を破砕した後、クロロホルムでRNA画分として分離した。その後に、核酸分離システムQuickGene RNA tissue kit SII(倉敷紡績社)で実施した。全RNAからのcDNA合成は、ReverTra Ace qPCR RT Kit(東洋紡社)を用い、THUNDERBIRD qPCR Mix(東洋紡社)による定量PCRを実施した。定量PCRには蛍光プローブ法を採用し、蛍光プローブにはマウスMalat1(Integrated DNA Technologies社)及びマウスGapdh(Thermo Fisher Scientific社)を用いた。定量PCRの遺伝子断片増幅反応条件は、上記THUNDERBIRD qPCR Mix(東洋紡社)のプロトコルに従った。マウスMalat1及びGapdh(内部標準遺伝子)の発現量を相対検量線によって算出し、相対発現レベルをMalat1/Gapdhとして計算した。一群あたり2-4匹のマウスの結果から、相対発現レベルの平均値を算出した。比較対象群の相対発現レベルの平均値を100%とした場合の実験群の相対発現レベルの平均値の割合を、相対的Malat1 ncRNA発現レベルとして算出した。
実施例61の結果を表7に示す。表中、投与量はASO(Malat1)の量を示す。
(A)in vivo実験
実験動物には、10週齢の雄性C57BL/6Jマウス(日本チャールズリバー)を使用し、一群あたり3匹を実験に供した。実験群では、核酸を含む溶液をマウスの尾静脈から5mL/kgの投与量で静脈内に単回投与した。また、比較対象群では、核酸溶液の調製に用いた溶媒(生理食塩水)を実験群と同様の手順でマウスに静脈内投与した。
核酸溶液を投与して72時間後に、イソフルラン麻酔下でマウスを開腹し横隔膜を切開して心臓を露出させ、左心室より生理食塩水を注射針にて注入し、右心房を切開して放血させた後、脳を摘出した。脳をNeural Tissue Dissociation Kits (Miltenyi Biotec社)を用いて、プロトコルに従い酵素処理を行い、Debris Removal Solution (Miltenyi Biotec社)を用いてDebris除去を行い、脳細胞液を調製した。ミクログリアの単離にはCD11b (Microglia) Microbeads (Miltenyi Biotec社)を用いて、プロトコルに従い、脳細胞液からミクログリアを単離した。
単離したミクログリアからの全RNA抽出は、RNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いた。全RNAからのcDNA合成は、High Capacity cDNA RT Kit(Thermo Fisher Scientific社)を用い、TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific社)による定量PCRを実施した。定量PCRには蛍光プローブ法を採用し、蛍光プローブにはマウスMalat1(Thermo Fisher Scientific社)及びマウスGapdh(Thermo Fisher Scientific社)を用いた。定量PCRの遺伝子断片増幅反応条件は、上記TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific社)のプロトコルに従った。マウスMalat1及びGapdh(内部標準遺伝子)の発現量を比較Ct法にて算出し、相対発現レベルをMalat1/Gapdhとして計算した。一群あたり3匹のマウスの結果から、相対発現レベルの平均値を算出した。比較対象群の相対発現レベルの平均値を100%とした場合の実験群の相対発現レベルの平均値の割合を、相対的Malat1 ncRNA発現レベルとして算出した。
実施例62の結果を表8に示す。表中、投与量はASO(Malat1)の量を示す。
二本鎖番号58は、ミクログリアにおけるMalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。この結果から、本発明の核酸複合体は、脳に送達され、ミクログリアにおいてもアンチセンス効果をもたらし得ることが立証された。
Claims (22)
- 第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体であって、
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、コレステロールの類縁体と結合しており、
前記コレステロールの類縁体が、下式(IIa):
環Aは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキセンを表し、R1は、置換された若しくは置換されていないC8~10のアルケニル基を表すか、あるいは、
環Aは、置換された若しくは置換されていないシクロヘキサジエンを表し、R1は、置換された若しくは置換されていないC8~10のアルキル基、又は置換された若しくは置換されていないC8~10のアルケニル基を表し、
L1は、-O-、-NH-、
で表され、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、核酸複合体。 - 第2核酸鎖が、下式(VIII):
L2は、置換された若しくは置換されていないC1~12のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないC3~8シクロアルキレン基、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又はCH(CH2-OH)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-を表し、
L3は、-NH-又は結合を表し、
L4は、置換された若しくは置換されていないC1~12のアルキレン基、置換された若しくは置換されていないC3~8のシクロアルキレン基、-(CH2)2-[O-(CH2)2]m-、又は結合を表し、ここで、mは1~25の整数を表し、
L5は、-NH-(C=O)-、-(C=O)-、又は結合を表す)
で表されるリンカーを介して、コレステロールの類縁体と結合している、請求項1又は2に記載の核酸複合体。 - 前記第1核酸鎖が、少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第1核酸鎖が、ギャップマーである、請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖中の少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドを含む、請求項4又は5に記載の核酸複合体。
- 前記第1核酸鎖が、ミックスマーである、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第1核酸鎖が、13~20塩基長である、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、請求項1~8のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖の核酸部分が修飾若しくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシド及び/又は糖修飾ヌクレオシドから成る、請求項1~9のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現又は編集を調節するための組成物。
- 被験体の中枢神経系疾患治療用である、請求項11に記載の組成物。
- 前記中枢神経系疾患が、免疫性中枢神経系疾患である、請求項12に記載の組成物。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系に薬剤を送達するための組成物。
- 前記中枢神経系が、大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、及び小脳からなる群から選択される、請求項11~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記中枢神経系が、前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、及び小脳核からなる群から選択される、請求項11~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 静脈内投与用又は皮下投与用である、請求項11~16のいずれか一項に記載の組成物。
- 1回の投与量中に5mg/kg以上の前記核酸複合体を含む、請求項11~17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸複合体が血液脳関門(BBB)を通過する、請求項11~18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫性中枢神経疾患が、ミクログリア関連疾患である、請求項13に記載の組成物。
- 前記ミクログリア関連疾患が、アルツハイマー病、多発性硬化症、ALS、または神経障害性痛である、請求項20に記載の組成物。
- ミクログリアにおける標的転写産物の発現又は編集を調節するための、請求項11~21のいずれか一項に記載の組成物。
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