WO2022255273A1 - リガンド結合核酸複合体 - Google Patents

リガンド結合核酸複合体 Download PDF

Info

Publication number
WO2022255273A1
WO2022255273A1 PCT/JP2022/021836 JP2022021836W WO2022255273A1 WO 2022255273 A1 WO2022255273 A1 WO 2022255273A1 JP 2022021836 W JP2022021836 W JP 2022021836W WO 2022255273 A1 WO2022255273 A1 WO 2022255273A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
ligand
acid complex
nucleotides
group
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/021836
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
鋼 高木
秀樹 木澤
大司 岡本
佳子 兼子
伸之 布施
敬 越智
Original Assignee
レナセラピューティクス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by レナセラピューティクス株式会社 filed Critical レナセラピューティクス株式会社
Priority to BR112023024384A priority Critical patent/BR112023024384A2/pt
Priority to KR1020237045279A priority patent/KR20240016342A/ko
Priority to CN202280039001.XA priority patent/CN117412773A/zh
Priority to EP22816021.4A priority patent/EP4353266A1/en
Priority to JP2023525798A priority patent/JPWO2022255273A1/ja
Priority to CA3222167A priority patent/CA3222167A1/en
Priority to AU2022285344A priority patent/AU2022285344A1/en
Publication of WO2022255273A1 publication Critical patent/WO2022255273A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/548—Phosphates or phosphonates, e.g. bone-seeking
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/683—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols
    • A61K31/685—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols one of the hydroxy compounds having nitrogen atoms, e.g. phosphatidylserine, lecithin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/683—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols
    • A61K31/688—Diesters of a phosphorus acid with two hydroxy compounds, e.g. phosphatidylinositols both hydroxy compounds having nitrogen atoms, e.g. sphingomyelins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

目的とする臓器にデリバリーされ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節するためのＳ１Ｐリガンド結合核酸複合体の提供。　標的転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有し１２～３０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む核酸と、Ｓ１Ｐリガンドを結合した構造のＳ１Ｐリガンド結合核酸複合体は、臓器にデリバリーされ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節することにより当該遺伝子が原因する疾患の治療に有用である。また、当該リガンド結合核酸複合体は、Ｓ１Ｐ受容体が発現している臓器、組織や細胞、例えば、骨格筋、心筋、肝臓、腎臓、肺、乳腺、脂肪、ポドサイト、リンパ球、血管内皮細胞にデリバリー可能であるからこれらの臓器の疾患の治療に有用である。

Description

リガンド結合核酸複合体
　本発明は、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸複合体に関し、より詳しくは、標的臓器や細胞等にデリバリー可能なリガンドを核酸複合体に結合したリガンド結合核酸複合体に関する。
　核酸医薬は従来の低分子医薬と異なり疾患の原因となる遺伝子の転写産物の配列自体に作用して転写産物やタンパク質の発現を調節することから、次世代医薬として開発が進められている。
　核酸医薬として使用されている核酸としては、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介できる短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、アンチセンス技術を用いる一本鎖アンチセンス核酸（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）やアンチセンス二本鎖核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＤＯ）やＤＮＡのアンチセンス鎖とＲＮＡの相補鎖とからなるヘテロ二本鎖核酸（ｈｅｔｅｒｏ－ｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＨＤＯ）、一本鎖ヘテロ二本鎖核酸（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｓｓ－ＨＤＯ）等の化学修飾した低分子核酸等が従来から知られている。
　ＨＤＯは、標的遺伝子又は標的転写産物にハイブリダイズ可能な核酸配列を有するアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖である相補鎖（センス鎖ともいう）からなり、アンチセンス鎖が相補鎖にアニーリングしている構造体はヘテロ二本鎖核酸（ｈｅｔｅｒｏ－ｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＨＤＯ）と言われている（特許文献１）。
　ｓｓ－ＨＤＯは、製造時は一本鎖のオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡヌクレオチド若しくはＤＮＡヌクレオチドアナログからなるアンチセンス鎖と、３～１０ヌクレオチドからなるリンカー部分と、前記アンチセンス鎖に相補的であるＲＮＡヌクレオチド若しくはＲＮＡヌクレオチドアナログからなるセンス鎖を含む構造である。この一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｘ－Ｌ－Ｙの構造からなるオリゴヌクレオチドである（特許文献２）。Ｘはアンチセンス鎖で、Ｙはアンチセンス鎖に対する相補鎖で、Ｌがリンカーの役割をするヌクレオチドからなる。この一本鎖オリゴヌクレオチドを医薬組成物として用いる際は、生理食塩水や水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、固形注射剤等に用いられる溶媒若しくは血液または血漿中でアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に対する相補鎖がリンカーを支点として一分子アニーリングして２重鎖構造をとる。このような核酸複合体は、医薬組成物として作用するときは一分子アニーリングして２重鎖構造をとるため、この一本鎖オリゴヌクレオチドはＨＤＯの一つである。
　一方、核酸複合体を目的の臓器にデリバリーする技術は、核酸複合体に目的の臓器にデリバリー可能なリガンド等を付加するものが知られている。リガンド等としては、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子がある。脂質は、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択することができる。また、リガンド等として標的細胞の表面に表出している受容体に対するリガンドも選択可能である（特許文献３）。
　例えばリガンド等としてコレステロールを用いる場合、細胞表面のＬＤＬ受容体を介して細胞内に取り込まれるから、ＬＤＬ受容体を持つ細胞を含む臓器として特に肝臓にデリバリー可能である。しかしながら、ＬＤＬ受容体を持つ細胞は肝臓以外の臓器にも多数存在するため、肝臓以外の臓器を標的とする場合、他の臓器にもデリバリーされてしまうため、他の臓器における安全性や副作用の検討が必要である。
　核酸医薬として用いるリガンド結合核酸複合体は、臓器へのデリバリーに加えて、臓器組織若しくは臓器中の細胞にリガンド結合核酸複合体が取り込まれてアンチセンス効果を奏することが求められる。リガンドよりも分子量の大きな核酸分子を結合した場合、リガンド結合核酸複合体が細胞内に取り込まれるかどうか予測することは困難であることからそのハードルは高い。未だに各臓器へデリバリー可能なリガンド結合核酸複合体が十分に提供されている状況にない。現在、バイオベンチャーや製薬企業によりより特異的に目的臓器へデリバリー可能なリガンドの研究開発は継続的に行われている。
　Ｓ１Ｐ受容体は、血管内皮細胞分化遺伝子（Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅ：ＥＤＧ）によってコードされるＧタンパク共役型受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）である（非特許文献１）。このＧＰＣＲは当初はＥＤＧ受容体（Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれ、その後新たにＳ１Ｐ受容体（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼称されるようになり、現在までにＳ１Ｐ１（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）からＳ１Ｐ５（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５）まで５種類のサブタイプが見出されている（非特許文献２）。
　リゾリン脂質の一種として体内に存在するスフィンゴシン　１　リン酸（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ　１　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：Ｓ１Ｐ）は、Ｓ１Ｐ受容体（ＥＤＧ受容体ともいう）に結合するとリン酸化酵素であるスフィンゴシンキナーゼ（ＳｐｈＫ）の働きによりスフィンゴシンから生成するＳ１Ｐが生体内で様々な生理活性を持つ重要な脂質メディエーターとしての役割を有する。
　Ｓ１Ｐ受容体に対する生体内リガンドとしては、スフィンゴシンアナログ等（Ｓ１Ｐ　ａｎａｌｏｇｓ）が知られており、例えばマイリオシン、スフィンゴシン、スフィンゴシン１－リン酸、フィンゴリモド（ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ，ＦＴＹ７２０）、ＦＴＹ７２０リン酸の（Ｓ）エナンチオマー（（Ｓ）－ＦＴＹ７２０－Ｐ）（非特許文献３）が挙げられる。また、スフィンゴシンアナログとして、ＶＰＣ２２０４１，ＶＰＣ２２０５１，ＶＰＣ２２０５３，ＶＰＣ２２０６１，ＶＰＣ２２１５７，ＶＰＣ２２１７３，ＶＰＣ２２１９９，ＶＰＣ２２２１１，ＶＰＣ２２１７９，ＶＰＣ２２１８１，ＶＰＣ２３０３１，ＶＰＣ２３０１９，ＶＰＣ２３０６５，ＶＰＣ２３０７５，ＶＰＣ２３０６９，ＶＰＣ２３０７９等（非特許文献４，５）が公知である。
　スフィンゴシンアナログは、Ｓ１Ｐ受容体に結合すると、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）に立体配座の変化が誘導され、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）は関連Ｇタンパク質のαサブユニットのグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）によって置換され、その後Ｇタンパク質は細胞質に放出される。αサブユニットはその後βγサブユニットから解離され、それにより、各サブユニットはエフェクタータンパク質と結合できるようになる。エフェクタータンパク質は、細胞応答をもたらす二次メッセンジャーを活性化する。最終的に、Ｇタンパク質のＧＴＰはＧＤＰに加水分解され、Ｇタンパク質のサブユニットは相互に再結合し、その後受容体と再結合する。増幅は一般的なＧＰＣＲ経路において重要な役割を果たす。一つのリガンドの一つの受容体への結合は、多くのＧタンパク質の活性化につながり、そのＧタンパク質の各々は、増幅された細胞応答をもたらす多くのエフェクタータンパク質と結合することができる。個々の受容体は組織特異性と応答特異性の両方を兼ね備えるので、Ｓ１Ｐ受容体は良い薬剤標的となると考えられている。これらのスフィンゴシンアナログは、免疫抑制作用があることが知られており、免疫抑制剤や多発性硬化症治療薬の研究開発が行われてきた。中でも低分子化合物であるフィンゴリモドは多発性硬化症治療薬として米国で２０１０年９月、日本で２０１１年１１月に上市されたＳ１Ｐ受容体アゴニストである（特許文献５）。
　しかしながら、これらのスフィンゴシンアナログをＳ１Ｐ受容体に対するリガンド（以下、Ｓ１Ｐリガンドという）を標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子に結合させ、臓器や組織、細胞にデリバリーさせる目的でＳ１Ｐリガンドを用いて組織中や細胞内に標的遺伝子又はその転写産物に対するアンチセンス鎖を含む核酸分子を取り込ませ、核酸分子で標的遺伝子又はその転写産物若しくはその翻訳産物の発現又は編集を調節する試みは行われていなかった。
国際公開第ＷＯ２０１３／０８９２８３号 国際公開第ＷＯ２０１７／１３１１２４号 国際公開第ＷＯ２０１３／０８９２８３号 米国特許第ＵＳ７０６４２１７号明細書 米国特許第ＵＳ７６３８６３７号明細書
Ｍ　Ｊ　Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９８　Ｖｏｌ２７９　ｐ１５５２－１５５５ （ａ）Ｋｏｎ，Ｊ．；Ｓａｔｏ，Ｋ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．；Ｔｏｍｕｒａ，Ｈ．；Ｋｕｗａｂａｒａ，Ａ．；Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．；Ｔａｍａｍａ，Ｋ．；Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｔ．；Ｍｕｒａｔａ，Ｎ．；Ｋａｎｄａ，Ｔ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．；Ｏｈｔａ，Ｈ．；Ｕｉ，Ｍ．；Ｏｋａｊｉｍａ，Ｆ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４，２３９４０－２３９４７． 山梨医科学誌３０（１），１－６，２０１５ Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．２０１３　Ｊａｎ　２２（１）：ｅ６６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１２．５８． Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２（２），９２～１０１，２００９
　Ｓ１Ｐ受容体は、血管内皮細胞分化遺伝子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ：ＥＤＧ）であるＳ１Ｐ遺伝子よってコードされる膜タンパク質であって、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ、Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の一つであり、７本の膜貫通ヘリックスを持っている。Ｓ１Ｐ受容体は特にポドサイト、肺、リンパ球、腎臓、血管内皮細胞において高発現している傾向がある。他の臓器では骨格筋、心筋、肝臓、脂肪、乳腺等に発現している。
　発明者らは、ヒトやマウスの腎臓、ポドサイト、肺、リンパ球、骨格筋、心筋、肝臓の各組織に発現しているＳ１Ｐ受容体に対するリガンド（以下、Ｓ１Ｐリガンドという）を付加した核酸複合体であれば、Ｓ１Ｐリガンドを結合した核酸複合体がＳ１Ｐ受容体を発現している臓器にデリバリーされ、標的遺伝子の発現を抑制することを確認し発明を完成させた。
　発明者らは、Ｓ１Ｐ受容体に対するリガンドについて研究を進めた結果、本発明のリガンド結合核酸複合体が標的臓器にデリバリーされ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節することを見出した。本発明のリガンド結合核酸複合体は、Ｓ１Ｐ受容体が発現している細胞を含む臓器の疾患の治療に用いることが可能である。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、次の式で特定される化合物若しくは製薬上許容される塩が、リンカーを介して、又は介さず結合するリガンド結合核酸複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 式１中、
Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
ｍは、０－４の整数であり；
Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－Ｐ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨからなる群から選択され；
Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、スルホン酸誘導体、アジド、チオールからなる群から選択され；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖はシクロアルキルアルキル、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、当該炭素鎖の鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、スルホニルおよび／またはカルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ６０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい。
［２］　式１中、
Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
ｍは、０－４の整数であり；
Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓからなる群から選択され；
Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、アジド、チオールからなる群から選択され；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖はアリールアルキル、ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、当該炭素鎖の鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、スルホニルおよび／またはカルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ６０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
で表される、［１］の化合物及び製薬上許容される塩。
［３］　式１中、
Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
ｍは、０－４の整数であり；
Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓからなる群から選択され；
Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、アジドからなる群から選択され；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０のアリールアルキルであって、当該アリールアルキルの鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、カルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ５の直鎖または分岐のアルキル、アシル、アルコキシからなる群から選択され；
で表される、［１］の化合物及び製薬上許容される塩。
［４］　（Ｒ）－１－アジド－１７－（（４－デシルフェニル）カルバモイル）－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザオクタデカ－１８－ニルリン酸、又は（Ｒ）－２－アミノ－３－（（４－デシルフェニル）アミノ）－３－オキソプロピル（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）リン酸である、［１］の化合物及び製薬上許容される塩。
［５］　１－アジド－１７－（ヒドロキシメチル）－１７－（４－オクチルフェニチル）－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザオクタデカ－１８－ニルリン酸、又は２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－４－（４－オクチルフェニル）ブチル（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）リン酸である、［１］の化合物及び製薬上許容される塩。
［６］　式１で特定される化合物が、以下の構造を有する化合物群から選択された化合物である、［１］の化合物及び製薬上許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
［７］　核酸と、式１で特定される化合物若しくは製薬上許容される塩が、リンカーを介して結合している、［１］～［６］のいずれかのリガンド結合核酸複合体。
［８］　リンカーが、切断可能な構造を有する切断性リンカーである、［７］のリガンド結合核酸複合体。
［９］　リンカーが、以下の構造を有するリンカーである、［８］のリガンド結合核酸複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
。
［１０］　核酸分子が、標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸分子と、標的タンパク質に対して特異的に結合する核酸塩基配列を有するアプタマーと、標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなるデコイから選択される核酸分子である、［１］のリガンド結合核酸複合体。
［１１］　核酸分子がＡＤＯ、ＡＳＯ、ＨＤＯ、ＲＮＡｉから選択される核酸分子である、［１］のリガンド結合核酸複合体。
［１２］　核酸分子のアンチセンス鎖が連続する１２～３０のヌクレオチドからなる、［１１］のリガンド結合核酸複合体。
［１３］　核酸分子が標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有し８～３０のヌクレオチドからなるデコイである、［９］のリガンド結合核酸複合体。
［１４］　前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡからなるアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるｓｉＲＮＡである、［１０］のリガンド結合核酸複合体。
［１５］　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、Ｓ１Ｐ受容体に対するリガンドとが結合している、リガンド結合核酸複合体。
［１６］　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、Ｓ１Ｐ受容体に対するリガンドとが、リンカーを介して結合している、［１５］のリガンド結合核酸複合体。
［１７］　リンカーが、切断可能な構造を有する切断性リンカーである、［１６］のリガンド結合核酸複合体。
［１８］　核酸分子が、標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸分子と、標的タンパク質に対して特異的に結合する核酸塩基配列を有するアプタマーと、標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなるデコイから選択される核酸分子である、［１５］のリガンド結合核酸複合体。
［１９］　核酸分子がＡＳＯ、ＨＤＯ、ＲＮＡｉから選択される核酸分子である、［１８］のリガンド結合核酸複合体。
［２０］　核酸分子の核酸鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、［１５］のリガンド結合核酸複合体。
［２１］　核酸分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、１２～３０ヌクレオチドからなる、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［２２］　核酸分子がＨＤＯであり、ＨＤＯのアンチセンス鎖及び相補鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、それぞれ１２～３０ヌクレオチドからなる、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［２３］核酸分子が標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖と、当該アンチセンス鎖に相補的な核酸塩基配列を有する相補鎖を持つＨＤＯであり、ＨＤＯの相補鎖にＳ１Ｐ受容体に対するリガンドが結合している、［１５］～［１６］のいずれかのリガンド結合核酸複合体。
［２４］　核酸分子が標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有し８～３０ヌクレオチドからなるデコイである、［１５］のリガンド結合核酸複合体。
［２５］　アンチセンス鎖は、ギャップマーであり、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むギャップ領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域からなる、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［２６］　アンチセンス鎖は、非ギャップマーであり、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［２７］　相補鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、［２２］のリガンド結合核酸複合体。
［２８］　相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域からなる、［２７］のリガンド結合核酸複合体。
［２９］　修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－ＣＨ３基又は２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）基を含むヌクレオチドである、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［３０］　ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ－ＢＮＡから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［３１］　ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ－ＢＮＡから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［３２］　ヌクレオチドアナログは、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ｔｃＤＮＡ、モルホリノ核酸、ＢＮＡから独立して選択される、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
［３３］　核酸分子における少なくとも１つのヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチドがホスホロチオエート化若しくはボラノホスフェート化されている、［２０］のリガンド結合核酸複合体。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２１－０９１５８９号の開示内容を包含する。
　本発明のリガンド結合核酸複合体は、Ｓ１Ｐ受容体が発現している細胞を含む臓器の疾患の治療に用いることが可能である。
　本発明のリガンド結合核酸複合体は、Ｓ１Ｐリガンドにより臓器若しくは細胞特異的なデリバリーができ、核酸分子により標的遺伝子又はその転写産物若しくはその翻訳産物の発現又は編集を調節することができる。疾患の原因となる遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物を標的とする核酸複合体を用いることで特定の臓器の疾患の治療薬として用いることが可能である。
図１Ａは、Ｓ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ（ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６）による標的転写産物Ｍａｌａｔ－１の発現抑制を示し、図１Ｂは、Ｓ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ（ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６）による標的転写産物Ｍａｌａｔ－１の発現抑制を示す図である。 図２はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与前後の動物の体重変化を示す図である。 図３Ａ及びＢは、マウスにＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯを投与３日後、血中ＡＬＴおよびＡＳＴ活性の変化を示す図である。 図４はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの肝臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図５はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの肺のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図６はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図７はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与前後の動物の体重変化を示す図である。 図８Ａは、マウスにＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯを投与３日後、血中ＡＬＴの変化を示す図である。 図８Ｂは、マウスにＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯを投与３日後、血中ＡＳＴ活性の変化を示す図である。 図９はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの肝臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１０はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１１はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの肺のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１２Ａは、Ｓ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１２Ｂは、Ｓ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの肝臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１２Ｃは、Ｓ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの肺のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１２Ｄは、Ｓ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１３はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１４はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１５はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１６はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１７はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１８はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１９はＳ１Ｐリガンド結合ＨＤＯ投与後のマウスの骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。
　本発明は、リガンドを核酸複合体に結合したリガンド結合核酸複合体であり、リガンドと核酸複合体はリンカーを介して間接的に、又はリンカーを介さず直接結合している。
１．核酸複合体
　本発明において「核酸複合体」とは、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子のことである。当該核酸分子の例としては、標的遺伝子又はその転写産物に相補的な核酸配列を有しアンチセンス活性を有する核酸分子が挙げられる。当該核酸分子は、より具体的には、一本鎖アンチセンス鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）、ｍｉＲＮＡ，ａｎｔｉ－ｍｉＲ，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス二本鎖核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＤＯ）、ヘテロ二本鎖核酸（Ｈｅｔｅｒｏ－ｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＨＤＯ）が挙げられる。
　さらに当該核酸分子の例としては、タンパク質などの標的分子に対して高い特異性と高い結合親和性を有するアプタマーが挙げられる。さらに当該核酸分子の例としてはデコイが挙げられる。デコイの作用は、遺伝子の特定のプロモーターなど転写調節因子の結合部位に転写因子が結合して本来であれば転写調節因子によって遺伝子が活性化されたり、遺伝子機能のオン、オフが調節されるところ、デコイが当該転写因子にハイブリダイズすることで本来の転写因子の機能を抑制することである。さらに当該核酸分子の例としては、細胞内で特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子であって標的分子の機能を修飾するものであるベイト（ｂａｉｔ）が挙げられる。
　「標的遺伝子」とは、本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖が結合しうる遺伝子である。
　標的遺伝子の種類は、生体内で発現する限り特に限定されない。標的遺伝子は、例えば、本発明に係る核酸複合体を導入する生物由来の遺伝子、例えば、様々な疾患において、その発現が増加する遺伝子が挙げられる。例えば、インディアンヘッジホッグ遺伝子、インターフェロン遺伝子、アポリポプロテインＢ遺伝子、ハンチントン遺伝子、ジストロフィン遺伝子、ＤＭＰＫ（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ　ｍｙｏｔｏｎｉｃａ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）遺伝子、及び転移関連肺腺癌転写産物１（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　１：Ｍａｌａｔ１）遺伝子等が挙げられる。
　インディアンヘッジホッグ（Ｉｎｄｉａｎ　Ｈｅａｄｇｅｈｏｇ：ＩＨＨ）は、ヘッジホッグファミリーに属する分泌タンパクである。転写因子ＴＡＺの下流に位置し、ＮＡＳＨ線維化を増悪させることが知られている。
　サイトカインのインターロイキン１遺伝子（ＩＬ―１）は、慢性炎症疾患の原因となることが知られている。治療戦略としてｐｒｅ－ｍＲＮＡであるＩＬ－１ＲＡｃＰの膜貫通ドメインをコードするｅｘｏｎ９をスキップすることによって、ＩＬ－１シグナル伝達の実質的な阻害をもたらすことが報告されている（Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．２０１３Ｊａｎ２２（１）：ｅ６６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１２．５８．）。
　アポリポプロテインＢ遺伝子は、ＡｐｏＢ－１００が遺伝性代謝性疾患である家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｌ　ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）は知られており、２０１３年に米国で核酸医薬ミポメルセン（ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎ）が上市された。
　ハンチントン病は、常染色体優性遺伝様式をとり、舞踏病運動を主体とする不随意運動と精神症状、認知症を主症状とする慢性進行性神経変性疾患である。ハンチントン遺伝子の第４染色体短腕４ｐ１６．３がハンチントン病の病因遺伝子であることが知られている。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異による筋ジストロフィー、Ｘ連鎖劣性遺伝形式をとり原則男児に発症することが知られている。ジストロフィン遺伝子の異常のあるエクソンを読み飛ばすエクソンスキッピングが、その治療に有効である。
　ＤＭＰＫ遺伝子は、ミオトニンプロテインキナーゼをコードし、筋ジストロフィーの中でも成人で発症頻度が最も高い筋緊張性ジストロフィーの原因遺伝子として知られている。
　Ｍａｌａｔ１は、肺癌をはじめとする悪性腫瘍で高発現している長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）で、筋細胞の核内に滞留することが知られている。
　「標的転写産物」とは、本発明の核酸複合体の直接的な標的となり、かつＲＮＡポリメラーゼによって合成される任意のＲＮＡをいう。また、「標的遺伝子の転写産物」は「標的転写産物」に該当する。具体的には、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、塩基修飾を受けていないｍＲＮＡ等を含む）、ｍｉＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ）、ロングノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ナチュラルアンチセンスＲＮＡを含む。標的転写産物として、例えば、ＩＬ－１ＲＡｃＰ遺伝子の転写産物であるｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ＡｐｏＢ－１００遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ、ＩＨＨ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ、ジストロフィン遺伝子の転写産物であるｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ＤＭＰＫ遺伝子の転写産物であるＤＭＰＫ　ｍＲＮＡ、Ｍａｌａｔ１遺伝子の転写産物であるＭａｌａｔ１　ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）等が挙げられる。
　「標的翻訳産物」とは、転写産物であるｍＲＮＡのうち、ノンコーディングＲＮＡを除くｍＲＮＡを鋳型として、リボソームがコドンに応じて伝令ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＲＮＡ）が運んでくるアミノ酸を連結させペプチド鎖を作る反応を触媒することにより合成されるタンパク質をいう。また、「標的遺伝子の翻訳産物」及び「標的転写産物の翻訳産物」は「標的翻訳産物」に該当する。
　「アプタマー」とは、標的翻訳産物、例えば細胞内、細胞膜上、又は細胞外、例えば細胞膜上又は細胞外の特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子をいう。アプタマーは、ＤＮＡ型とＲＮＡ型のアプタマーがあり、当該分野で公知の方法、例えば、ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いた試験管内選別法により作製することができる。アプタマーの核酸塩基長は、特に制限は無いが、１０～７０塩基長、好ましくは２０～５０塩基長である。
　「デコイ」とは、転写因子（例えばＮＦ－ｋＢ）の結合部位の配列又は類似の配列を有する核酸を指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制（転写活性化因子であれば転写を抑制、転写抑制因子であれば転写を促進）するものをいう。デコイ核酸は、標的となる転写因子の結合配列の情報に基づいて容易に設計することができる。デコイ核酸の塩基長は、特に制限は無いが、８～３０塩基長、好ましくは１０～２５塩基長である。
　「核酸」又は「核酸分子」とは、モノマーであればヌクレオシド又はヌクレオチドを、オリゴマーであればオリゴヌクレオチドを、またポリマーであればポリヌクレオチドを意味する。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラ―ゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。
　「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
　「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の２’位、３’位、又は５’位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
　「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成されるポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般にヌクレオシド間結合を形成するとみなされる。
　「アンチセンス技術」とは、アンチセンス鎖を利用したアンチセンス技術の原理は、アンチセンス鎖を持つ核酸分子が標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の量、活性及び／または機能を調節することである。例えば、ある場合には、アンチセンス鎖を持つ核酸分子は、標的の転写または翻訳に変化をもたらす。このような発現の調節は、例えば、標的ｍＲＮＡの分解または占有に基づく（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ－ｂａｓｅｄ）阻害によって達成することができる。分解によるＲＮＡ標的機能の調節の一例は、ＤＮＡ様アンチセンス鎖を持つ核酸分子とのハイブリダイゼーションの際における標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ　Ｈによる分解である。標的ＲＮＡとハイブリダイズ可能に構成したＤＮＡからなるアンチセンス鎖（ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、ＲＮａｓｅ　Ｈにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより細胞内で標的ＲＮＡを減少することにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。このアンチセンス効果は、ＲＮａｓｅＨ依存的アンチセンス効果という。また、アンチセンス鎖を持つ核酸分子は、ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果としては、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果を用いる場合がある。この場合、ＡＳＯが標的ＲＮＡにハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。また、ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果の別の態様としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が挙げられる。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ；ＲＩＳＣ）を利用するアンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングである。ＲＮＡｉの例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。このアンチセンス効果は、ＲＮＡｉ依存的アンチセンス効果ともいう。
　「アンチセンス効果」とは、核酸分子のアンチセンス鎖が、標的遺伝子又はその転写産物（ＲＮＡセンス鎖）にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子又はその転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。
　「標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する」とは、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、亢進、翻訳の阻害、翻訳産物の機能阻害、ＲＮＡスプライシング制御（例えばスプライシングスイッチ、エクソンインクルージョン、エクソンスキッピング等）、転写産物の分解、又は標的遺伝子のタンパク質への結合の阻害を意味する。
　ある実施態様では、アンチセンス効果はハイブリダイゼーションにより前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、及び／又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解によって生じる、前記抑制を意味する。また別の実施態様では、アンチセンス効果は、標的遺伝子又は転写産物のエクソンインクルージョンにおいて、エクソンスキッピングとは逆に遺伝子の異常によりｍＲＮＡから排除されてしまうエクソンをアンチセンスの作用によりｍＲＮＡに組み込むことによって生じる、正常なｍＲＮＡの発現の亢進を意味する。
　例えば、標的遺伝子の転写後阻害では、ＡＳＯとしてＲＮＡオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、ＡＳＯは標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡとアニーリングによって部分的二本鎖を形成する。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされた標的タンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（ステリックブロッキング）。一方、ＡＳＯとしてＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、部分的ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がＲＮａｓｅ　Ｈによって認識される結果、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される。さらに、アンチセンス効果は、ｍＲＮＡ前駆体におけるイントロンを標的としてももたらされ得る。さらに、アンチセンス効果は、ｍｉＲＮＡを標的としてももたらされ得る。この場合、そのｍｉＲＮＡの機能阻害により、当該ｍｉＲＮＡが通常発現を制御している遺伝子の発現が増加し得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
　例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＡＤＯを使用する場合、細胞内でＤＮＡ二本鎖は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖は標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、標的ＲＮＡはＲＮａｓｅ　Ｈにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。また、別の実施態様では、ＡＤＯのＤＮＡ二本鎖がＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖が標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のＲＮＡスプライシングの制御により標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。
　例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＨＤＯを使用する場合、細胞内でＨＤＯのＲＮＡからなる相補鎖がＲＮａｓｅ　Ｈによって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、標的ＲＮＡがＲＮａｓｅ　Ｈにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。また、細胞内でＨＤＯのＲＮＡ相補鎖がＲＮａｓｅ　Ｈによって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖が標的ＲＮＡにハイブリダイズし、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のＲＮＡスプライシングの制御によって、標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。
　例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用する場合、ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を利用する機序を介した、アンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを指す。ＲＮＡｉの例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。また、別の例では、ＲＮＡ標的機能の調節は、占有に基づく機序によるものであり、ｍｉｃｒｏＲＮＡによって自然に利用されている機序などである。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、タンパク質をコードしているＲＮＡの発現を調節する、小さな非コードＲＮＡである。アンチセンス鎖を持つ核酸分子がｍｉｃｒｏＲＮＡに結合すると、当該ｍｉｃｒｏＲＮＡのそのメッセンジャーＲＮＡ標的への結合が阻害され、それによりｍｉｃｒｏＲＮＡの機能が妨げられる。ｍｉｃｒｏＲＮＡ模倣体は、生来のｍｉｃｒｏＲＮＡ機能を高めることができる。特定のアンチセンス鎖を持つ核酸分子は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更する。特定の機序にかかわらず、配列特異性は、アンチセンス鎖を持つ核酸分子を、標的の検証及び遺伝子の機能化のためのツールとして、また、疾患の病因に関与する遺伝子の発現を選択的に調節する治療薬として使用される。
　アンチセンス鎖の鎖長としては特に制限はないが、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。ある場合においては、通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、鎖長は選択される。二本鎖核酸の場合においては、鎖長は、好ましくは二本鎖のＴｍ値が５０℃以上、さらに好ましくは６０℃以上となる鎖長から選択してもよい。
　二本鎖核酸の場合、相補鎖の鎖長は、アンチセンス鎖と同じであってもよい。その場合、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。また、アンチセンス核酸鎖の鎖長に対して数塩基から十数塩基長くても短くてもよい。
　「相補的」又は「相補性」とは、水素結合を介して、いわゆるワトソン－クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン－クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。アンチセンス鎖の十分な数の核酸塩基が、標的遺伝子又は標的転写産物の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、アンチセンス鎖及び標的遺伝子又は標的転写産物は互いに相補的であるので、所望のアンチセンス効果が生じる。アンチセンス鎖と標的遺伝子又は標的転写産物との間の非相補的核酸塩基は、アンチセンス鎖が標的核酸に特異的にハイブリダイズできるという条件で許容され得る。さらに、アンチセンス鎖は標的遺伝子又は標的転写産物の１つ以上のセグメントに対してハイブリダイズでき、それにより介入する又は隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造、ミスマッチ又はヘアピン構造）に関与しない。当該アンチセンス鎖は、標的遺伝子又は標的転写産物の配列に対して相補的であると言える。相補的であるとは、アンチセンス鎖が標的遺伝子又は標的転写産物に結合できる程度に相補的であればよく、例えば、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上相補的であればよい。１００％相補的であってもよい。０～４個程度のミスマッチがあってもよい。
　本発明の「核酸複合体」は、特定の実施態様では、製造時は一本鎖のオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡヌクレオチド若しくはＤＮＡヌクレオチドアナログからなるアンチセンス鎖と、３～１０ヌクレオチドからなるリンカー部分と、前記アンチセンス鎖に相補的であるＲＮＡヌクレオチド若しくはＲＮＡヌクレオチドアナログからなるセンス鎖を含む構造であってもよい。この構造の核酸複合体は一本鎖ヘテロ二本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｓｓ－ＨＤＯ）と言われるものであり、Ｘ－Ｌ－Ｙの構造からなるオリゴヌクレオチドである（特許文献４）。Ｘはアンチセンス鎖で、Ｙはアンチセンス鎖に対する相補鎖で、Ｌがリンカーの役割をするヌクレオチドからなる。この一本鎖オリゴヌクレオチドを医薬組成物として用いる際は、生理食塩水や水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、固形注射剤等に用いられる溶媒若しくは血液または血漿中でアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に対する相補鎖がリンカーを支点として一分子アニーリングして２重鎖構造をとる。このような核酸複合体は、医薬組成物として作用するときは一分子アニーリングして２重鎖構造をとるため、２重鎖核酸複合体の一つである。
　以上、いくつかの実施態様において、一本鎖ＡＳＯ及び二重鎖核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施態様における一本鎖ＡＳＯ及び二重鎖核酸複合体は上記典型例に限定されるものではない。
　ある実施形態において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む。アンチセンス鎖は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドを有し、また当該核酸鎖において任意に修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。
　ある実施形態において、相補鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む。
　相補鎖は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドを有し、また当該核酸鎖において任意に修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。
　ある実施形態において、相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を有している。
　ここで「ＤＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＤＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＤＮＡヌクレオチドを意味する。
　同様に、「ＲＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＲＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＲＮＡヌクレオチドを意味する。
　「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオチドの塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットに対する１の置換基の付加、又は、サブユニット内における１の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。ヌクレオチドを含む領域の一部又は全部は、ＤＮＡ分解酵素等に対する耐性が高いという観点から、ＤＮＡは修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化、ホスホロチオエート化、ボラノホスフェート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’－Ｏ－メチル化、２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’－アミノプロピル（ＡＰ）化、２’－フルオロ化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が好ましい。さらに、かかる修飾は同一のＤＮＡに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。また、後述の通り、同様の効果を奏するために、ＲＮＡヌクレオチドに修飾を施してもよい。
　ある場合において、修飾されたヌクレオチドの数や位置によっては、ここで開示する二重鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、後記のアンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、決定することができる。また、修飾後の二重鎖核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二重鎖核酸複合体のそれよりも有意に低下していなければ（例えば、修飾後の二重鎖核酸複合体の測定値が修飾前の二重鎖核酸複合体の測定値の３０％以上であれば）、当該修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているような、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、タンパク質量等）を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。
　「ヌクレオチドアナログ」は、天然には存在しないヌクレオチドを意味し、ヌクレオチドの塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットにおいて、２以上の置換基が付加されており、若しくは、サブユニット内が２以上置換されており、又はサブユニット全体を異なる化学基に置換されていることを意味する。２以上の置換を伴うアナログの例としては、架橋化核酸が挙げられる。架橋化核酸は、糖環における２箇所の置換に基づいて架橋ユニットが付加されるヌクレオチドアナログであり、典型的には、２’位の炭素と４’位の炭素とが結合しているヌクレオチドアナログが挙げられる。ある実施形態における第１の核酸鎖においては、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大させるという観点から、第１の核酸鎖はヌクレオチドアナログをさらに含む。ヌクレオチドアナログとしては、修飾（架橋、置換等）により、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大されているヌクレオチドであればよく、例えば、特開平１０－３０４８８９号公報、国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０－１９５０９８号公報、特表２００２－５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号（以下、これら文献を「アンチセンス法に関する文献」とも称する）において、アンチセンス法に好適に用いられるとして開示されている核酸が挙げられる。すなわち、前記文献に開示されている核酸：ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル化核酸（２’－ＯＭｅ）、２’－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）化核酸、２’－ＡＰ（２’－Ｏ－アミノプロピル）化核酸、２’－フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２’－Ｆ－ＡＮＡ）、ＢＮＡ（架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ））が挙げられる。
　ある実施態様におけるＢＮＡとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、２以上の原子によって架橋されているリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであればよい。架橋化核酸の例は当業者に知られている。このようなＢＮＡの一のサブグループとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、４’－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－２’、４’－（ＣＨ２）ｐ－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）ｐ－ＯＣＯ－２’、４’－（ＣＨ２）ｎ－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－２’によって架橋されているＢＮＡを挙げられる（ここで、ｐ、ｍ及びｎは、各々１～４、０～２及び１～３の整数である。Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基（蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチド等）を示す）。さらに、ある実施態様におけるＢＮＡにおいて、３’位の炭素における置換基：ＯＲ２及び５’位の炭素における置換基：ＯＲ１のＲ１及びＲ２は、典型的には水素原子であるが、同一又は異なっていてもよく、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５（式中、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のアルキルチオ基、炭素数１～６のシアノアルコキシ基、又は、炭素数１～５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）であってもよい。このようなＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’－ＢＮＡ）とも称される、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）又はβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ３）－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ－２’，４’－ＢＮＡ，５’－メチルＢＮＡ，ｃＥｔ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ，ｃＭＯＥ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ，ＡｍＮＡとも称されるアミドＢＮＡ（４’－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒ＝Ｈ，Ｍｅ），当業者に知られた他のＢＮＡが挙げられる。
　さらに、ある実施態様における修飾核酸においては、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における修飾核酸においては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、ボラノホスフェート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、このような塩基部位の修飾やリン酸ジエステル結合部位の修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
　全体として、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログは、ここで例示したものに限定されるわけではない。多数の修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログが当該分野では知られており、例えば、Ｔａｃｈａｓらの米国特許第８２９９０３９号明細書の記載、特に１７～２２欄の記載を、本願の実施態様として利用することもできる。
　当業者であれば、このような修飾核酸の中から、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、核酸分解酵素に対する耐性等の観点を考慮し、核酸複合体を構成する核酸として適宜ヌクレオチドアナログを選択して利用することができるが、ある実施形態において、ヌクレオチドアナログはＬＮＡである。
　ある実施形態では、アンチセンス鎖は、複数のＤＮＡヌクレオチドを含む領域（以下「ＤＮＡギャップ領域」とも称する）と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログを含むウィング領域からなるものである。このアンチセンス鎖をＧａｐｍｅｒとも称する。該Ｇａｐｍｅｒの鎖長は少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。
　また、ある実施形態では、複数のＤＮＡヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであってもよい。
　また、ある実施形態では、複数のＤＮＡヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログであってもよい。
　該ＤＮＡギャップ領域の５’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「５’ウィング領域」とも称する）、及び該ＤＮＡギャップ領域の３’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「３’ウィング領域」とも称する）は、それぞれ独立したものであり、前記アンチセンス法に関する文献に挙げられているヌクレオチドアナログを少なくとも１種含んでいればよく、さらに、かかるヌクレオチドアナログ以外に天然型の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）若しくは修飾ヌクレオチドが含まれていてもよい。また、５’ウィング領域及び３’ウィング領域の鎖長は独立的に、通常１～１０塩基であり、１～７塩基、又は２～５塩基である。
　ある実施形態では、アンチセンス鎖は、Ｇａｐｍｅｒではなく、複数のＤＮＡヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ若しくはこれらの組み合わせからなるものである。このアンチセンス鎖を非Ｇａｐｍｅｒとも称する。該非Ｇａｐｍｅｒの鎖長は、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。　ある実施形態では、二本鎖核酸複合体における相補鎖は、複数のＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドを含む領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数の修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含むウィング領域からなるＧａｐｍｅｒであってもよい。５‘ウィング領域若しくは３’ウィング領域を修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログとすることによりアンチセンス鎖との結合をより強化することができる。
　ある実施形態では、二本鎖核酸複合体における相補鎖は、複数のＤＮＡヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログや、ＲＮＡヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログであってもよい。さらには、二本鎖核酸複合体における相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を有していてもよい。
２．リガンド
　「リガンド」とは、生体分子に結合して複合体を形成して生物学的な目的を果たす物質を意味する。ある場合、リガンドは標的への送達機能を有する。例えば、肝臓等に特異性高く効率的にある核酸複合体を送達できるという観点から、好ましいリガンドとして脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ，ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができるが、これらの中では、より安全性が高いという観点から、好ましいリガンドとしてコレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）が挙げられる。また、脳に特異性高く効率的に核酸分子を送達できるという観点から、好ましいリガンドとして糖（例えば、グルコース、スクロース）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的に核酸複合体を送達できるという観点から、好ましいリガンドとして受容体のリガンドや抗体、及び／又はそれらの断片等のペプチド又はタンパク質が挙げられる。
　「Ｓ１Ｐリガンド」とは、Ｓ１Ｐ受容体に結合可能なリガンドである。
ある実施態様では、Ｓ１Ｐリガンドは、次の式１で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 式１中、
Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
ｍは、０－４の整数であり；
Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－Ｐ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨからなる群から選択され；
Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、スルホン酸誘導体、アジド、チオールからなる群から選択され；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖はシクロアルキルアルキル、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、当該炭素鎖の鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、スルホニルおよび／またはカルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ６０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよく、Ｎに結合した２つのＷは同じであっても、異なっていてもよい；
で表される化合物及び製薬上許容される塩。
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、好ましくは、式１中、
Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
ｍは、０－４の整数であり；
Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓからなる群から選択され；
Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、アジド、チオールからなる群から選択され；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖はアリールアルキル、ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、当該炭素鎖の鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、スルホニルおよび／またはカルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ６０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよく、Ｎに結合した２つのＷは同じであっても、異なっていてもよい；
で表される化合物及び製薬上許容される塩。
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、より好ましくは、式１中、
Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
ｍは、０－４の整数であり；
Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
Ｘは、Ｏ、Ｓからなる群から選択され；
Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、アジドからなる群から選択され；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０のアリールアルキルであって、当該アリールアルキルの鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、カルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ５の直鎖または分岐のアルキル、アシル、アルコキシからなる群から選択され、Ｎに結合した２つのＷは同じであっても、異なっていてもよい；
で表される化合物及び製薬上許容される塩。
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、Ｒ１は表１に示す化合物から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、Ｒ２及びＲ４は表２に示す化合物から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、Ｒ３及びＲ５は表３に示す化合物から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、Ｙは表４に示す化合物から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、Ｚは表５に示す化合物から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　ある実施態様では、本発明のＳ１Ｐリガンドは、式１で表される化合物の中で、Ｗは表６に示す化合物から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　本発明の核酸複合体では、リガンドは核酸分子のアンチセンス鎖に結合される。二本鎖核酸分子の場合、リガンドは核酸分子のアンチセンス鎖及び／又は相補鎖に結合される。核酸分子がＨＤＯのある実施態様では、リガンドは核酸分子の相補鎖に結合される。その場合、ＨＤＯが標的組織若しくは細胞に入りリボヌクレアーゼ等の酵素（主にＲＮａｓｅＨ）によって相補鎖が切断されるとリガンドも切断された相補鎖と一緒にアンチセンス鎖から離れる。そうすると標的組織若しくは細胞中でアンチセンス鎖はリガンドによる影響なく標的転写因子との結合が可能となるため好ましい。ある実施態様では、リガンドは核酸鎖の３‘末端若しくは５’末端に結合される。また、ある実施態様では、リガンドは核酸鎖の末端以外の部位に結合される。ヌクレオチドの五炭糖の２位にリガンドを結合する方法は公知であり、例えば国際公開第ＷＯ２０１８／００３７３９号に記載の方法で行うことができる。
　上記化合物の塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、臭化水素酸塩等が挙げられる。
３．リガンドと核酸分子の結合
　リガンドと核酸の結合の仕方としては、リガンドの結合可能な基と核酸分子の結合可能な基を共有結合、非共有結合、例えば水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用等により結合することができる。リガンドの結合可能な基とは例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボン酸、チオール基、ジスルフィド、アジド基等があげられるが、これに限定されるものではない。核酸の結合可能な基としては、ヌクレオシドの糖の２位の炭素、３位のヒドロキシ基または５位のヒドロキシ基、ヌクレオチドの５位のリン酸基、またはヌクレオシドの塩基部分が挙げられる。また、核酸分子の結合可能な基としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸基も挙げられる。
４．リンカー
　ある実施態様では、リガンドは、リンカーを介して核酸分子に結合される。リンカーはスペーサーと称されることもある。核酸分子がＨＤＯの場合、リガンドはＨＤＯのアンチセンス鎖及び／又は相補鎖にリンカーを介して結合されていてもよい。リンカーは、切断性（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）又は非切断性（ｕｎｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを用いることが可能である。
　「切断性リンカー」とは、生理学的条件下で、例えば細胞内又は動物体内（例えば、ヒト体内）で、切断される連結基を意味する。特定の実施形態では、切断性リンカーは、ヌクレアーゼなどの内在性酵素によって選択的に切断される。切断性リンカーとしては、アミド、エステル、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、及びジスルフィド結合、ならびに天然ＤＮＡリンカーが挙げられる。「非切断性リンカー」は、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内（例えば、ヒト体内）で切断されないリンカーを意味する。非切断性リンカーは、限定はしないが、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾若しくは非修飾のデオキシリボヌクレオシド又は修飾若しくは非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。リンカーがＤＮＡ等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、鎖長は、特に限定はされないが、通常は２～２０塩基長、好ましくは３～１０塩基長であればよい。
　ある実施態様では、本発明で用いられるリンカーとしては、ヒドロカルビル鎖等の鎖構造、またはエチレングリコール、ヌクレオシドもしくはアミノ酸単位等の反復単位のオリゴマーを含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、およびヒドロキシルアミノから選択される１つ以上の基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミドおよびエーテル基から選択される基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキルおよびアミド基から選択される基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、少なくとも１つのリン部分を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、少なくとも１つのホスフェート基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、少なくとも１つの中性結合基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、１－１０００Åの長さを有する。特定のリンカーは、３―５００Åの長さを有する。好ましくは、１０－２００Åの長さを有する。（Ｓ１Ｐ１レセプターとＷ１４６が結合した結晶構造（ＰＤＢ３Ｖ２Ｙ；Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１２，３３５，８５１－８５５）を基に長さを推定した。）。
　ある実施態様では、リンカーとオリゴヌクレオチドの結合は二官能性結合を用いることができる。一般に、二官能性結合は、少なくとも２つの官能基を用いる結合である。リンカーの官能基のあるものは、オリゴヌクレオチドの特定の部位に結合するように選択され、他方は、リガンド部分に結合するように選択される。リンカーの二官能性結合に使用される官能基の例としては、限定されるものではないが、求核基と反応するための求電子剤および求電子基と反応するための求核剤が挙げられる。特定の実施形態において、二官能性結合は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニル、およびアルキニルから選択される１つ以上の基が利用可能である。
　リンカーの例としては、これら限定されるものではないが、６－アミノヘキサン酸（ＡＨＡまたはＡＨＥＭ）や（２，５－ジオキシピロリジ－１－ニル）４－（２－アザトリシクロ［１０．４．０．０４，９］ヘキサデカ－１（１６），４，６，８，１２，１４－ヘキセ－１０－ニン－２－イル－４－オキソブタノエート（ＤＢＣＯ－ＮＨＳ）、３－メルカプトプロピオン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－メレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレートが挙げられる。他のリンカーとしては、これらに限定されるものではないが、置換もしくは非置換Ｃ１―Ｃ１０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２―Ｃ１０アルケニルまたは置換もしくは非置換Ｃ２―Ｃ１０アルキニルが挙げられ、好ましい置換基の非限定的列記としては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。
　特定の実施形態において、リンカーは次の構造を有する化合物及びその誘導体から選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　特定の実施形態において、リンカーは、２～２０個のリンカー－ヌクレオシドで構成されていてもよい。特定の実施形態において、そのようなリンカー－ヌクレオシドは、連続する修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、そのようなリンカー－ヌクレオシドは、修飾糖部分を含んでもよい。特定の実施形態において、リンカー－ヌクレオシドは、非修飾である。特定の実施形態において、リンカー－ヌクレオシドは、場合により、プリン、置換プリン、ピリミジンまたは置換ピリミジンから選択される保護された複素環式塩基を含む。
　特定の実施形態において、リンカーは、次の構造を有する化合物及びその誘導体から選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である。
　特定の実施形態において、以下の化４の式で示す活性エステルを有する化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中Ｘは、リガンド結合部位である）を、以下の化５の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）を含む、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中Ｘはリガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位である。核酸分子は天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログから選択されるか、又はそれらを用いるオリゴヌクレオチドである。）
　上の化６の式で示すリンカーを得ることができる。
　特定の実施形態において、ホスフェート／トリエチレングリコールを含むリンカーを使用することができる。
　特定の実施形態において、以下の化７の式で示すリンカーを使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位、Ｂｘは、修飾または非修飾核酸塩基である。
　特定の実施形態において、上の化７の式で示すアミダイトを有する化合物と、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中Ｘは、リガンドである）
化８の式で示す化合物とを、固相担体上のオリゴヌクレオチド部位Ｙと反応させて、固相担体から開裂することで
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （式中Ｙは、核酸分子である）
　上の化９の式で示すリンカーを得ることができる。
　特定の実施形態において、リンカーは、以下の化１０の式で示す構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式中Ｘはリガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位、Ｗはホスホジエステルまたはアミノ基であり、Ｚは、以下の化１１の式で表されるピロリジニル基であり；ｊは０または１であり；ｎは約１－約１０であり；ｍは約１－約１０であり；ｌは０または１－４であり；およびＸがアミノ基の場合、ｌは１である）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　特定の実施形態において、リンカークリックケミストリーを用いて調製される。いくつかの実施形態で使用するのに好適なさらなるリンカーは、“Ｃｌｉｃｋ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ”Ｅｄ．Ｊｏｅｒｇ　Ｌａｈａｍ，Ｗｉｌｅｙ　２００９（これは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されているクリックケミストリーによって調製することができる。
　特定の実施形態において、以下の化１２の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 を、以下の化１３の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）
と、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 化１４の式で示す化合物を得た。これを、アジドを有するリガンドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位を表す）
　上の化１５の式で表すリンカーを得た。
　特定の実施形態において、リンカーはマレイミドリンカーを使用することができる。当該リンカーは、以下の化１６の式で示す構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 を含み、
　Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である。
　特定の実施形態において、
以下の化１７の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 を、以下の化１８の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）
を、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 化１９の式で示す化合物を得た。これを、マレイミドを有するリガンドコンジュゲート部分と反応させることで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 （式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である。）
　上の化２０の式で示すリンカーを得た。
　特定の実施形態において、以下の化２１の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 と、以下の化２２の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）
を、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 上の化２３の式で示す化合物を得た。これを、チオールを有するリガンドコンジュゲート部分と反応させることで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 （式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である）
　上の化２４の式で示すリンカーを得た。
ジスルフィドリンカーの具体例及びつけ方
　特定の実施形態において、リンカーはジスルフィド結合を含むリンカーを使用することができる。特定の実施形態において、リンカーは、リガンド結合部分とジスルフィド結合を形成する活性化ジスルフィドを含む。
　特定の実施形態において、以下の化２５の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 と、以下の化２６の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 （式中Ｙは、核酸分子の結合部位である）
とを、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 上の化２７の式で示す化合物を得た。これを、ジスルフィド結合を切断することで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 上の化２８の式で示す化合物を得た。これを、チオールを有するリガンドコンジュゲート部分と反応させることで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 （式中Ｘはリガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である）
　上の化２９の式で示すリンカーを得た。
　特定の実施形態において、Ｓ１Ｐリガンドにリンカーが化学的に結合している。リンカーを介して、Ｓ１Ｐリガンドはオリゴヌクレオチドに付着させるための官能基と結合している。
　特定の実施形態において、限定されるものではないが、リガンド結合部分のアミノ基（Ｘ―ＮＨ２；Ｘはアミノ基を除いたリガンドコンジュゲート部分）に対して、以下の化３０の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 （式中Ｙは、直接または間接的にオリゴに付着させるための官能基であり、アジド、マレイミド等）を反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 （式中、Ｘはリガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位である）
上の化３１の式で示すリガンド結合部分にリンカーを導入したリンカーを得た。
　特定の実施形態において、限定されるものではないが、リガンド結合部分のヒドロキシ基（ＰＸ―ＯＨ；ＰＸはヒドロキシ基を除いたリガンドコンジュゲート部分の前駆体）に対して、以下の化３２の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 （式中ＰＹは、直接または間接的にオリゴヌクレオチドに付着させるための官能基の前駆体であり、トシル、トリフルオロメタンスルホニル基等）を反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　上の化３３の式で示す化合物を得て、最終的に
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 （式中Ｘは、ヒドロキシ基を除いたリガンド結合部位；直接または間接的にオリゴに付着させるための官能基であり、アジド、マレイミド等）
　上の化３４の式で示すリンカーを得た。
５．医薬組成物
　本発明のリガンド結合核酸複合体が標的とする疾患としては、標的とする臓器及び臓器中の組織、細胞が関連する疾患であればよい。例えば、そのような疾患として、糖尿病、メタボリックシンドローム、心臓病、心筋症、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、腎線維症、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、原発性糸球体疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、間質性肺炎、肺線維症、心疾患、筋疾患、肝臓疾患、急性ウイルス性肝炎、薬剤性肝障害などの急性肝疾患、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、肝硬変、肝がん、アルコール性肝障害、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）などの慢性肝疾患等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。
　これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
　製剤化等に際し、経腸投与の実施形態におけるリガンド結合核酸複合体においては、さらに経腸投与の効率を高めるという観点から、大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する物質（例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体（塩、エステル体又はエーテル体））及び界面活性剤（非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤）との複合体（混合ミセル、エマルジョン）であってもよい。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、髄腔内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
　［実施例１］
　Ｓ１ＰリガンドとしてＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ１－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ９－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－Ｃ１０－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、及びＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰを合成した。
合成プロセス１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 ＜ｔ－ブチル（Ｒ）－（１－（（４―デシルフェニル）アミノ）－３－ヒドロキシ－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（化合物２）の合成＞
　４－デシルアニリン（１．１６ｇ）を乾燥ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解させ、（ｔ－ブトキシカルボニル）－Ｄ－セリン（化合物１，１．０２ｇ）、トリエチルアミン（７５０μＬ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（２．１４ｇ）を順次加えて、窒素雰囲気下室温で２時間攪拌したのち、反応溶液に水（０．２ｍＬ）を加えて１時間攪拌した。反応溶液を溶媒留去後、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、残渣を白色固体（２．８４ｇ）として得た。残渣をクロロホルムに溶解させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ＨＩ－ＦＬＡＳＨ　ＰＲＥＭＩＵＭ　ｓｉｌｉｃａ；φ４６×１３０ｍｍ；メタノール／クロロホルム（メタノール０％→１０％））により精製し、２を白色固体（１．８４ｇ）として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１９．２［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．６８（ｂｒ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），５．６８（ｂｒ，１Ｈ），４．２９－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．７５－３．６８（ｍ，１Ｈ），３．０９（ｂｒ，１Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），１．５７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．２７（ｍ，１４Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
 
＜ｔ－ブチル（Ｒ）－（１－（４－デシルフェニル）アミノ）－３－（（ジ－ｔ－ブトキシホスホリル）オキシ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメイト（化合物３）の合成＞
　化合物２（２１０ｍｇ）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、テトラゾール（７３ｍｇ）、ジ－ｔ－ブチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（３１０μＬ）を順次加えて、窒素雰囲気下室温で１８時間攪拌した。氷冷下で反応溶液にテトラヒドロフラン（５ｍＬ）と３５％過酸化水素水（０．３ｍＬ）を加え、室温で６時間攪拌した。その後１５％チオ硫酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加え室温で１７時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４０ｍＬ×２）と飽和食塩水（４０ｍＬ）で有機層を洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、粗精製物を無色透明オイル（３２６ｍｇ）として得た。得られたオイルは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｌｉｃａ；φ３０×１６５ｍｍ；メタノール／クロロホルム（メタノール０％→３％））により精製し、化合物３を無色透明オイル（２４４ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６１１．２［Ｍ－Ｈ］。
 
＜（Ｒ）－２－アミノ－３－（（４－デシルフェニル）アミノ）－３－オキソプロピルリン酸（化合物４）の合成＞
　化合物３（２４４ｍｇ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加えて室温で３時間攪拌しした。反応溶液にトルエン（５ｍＬ）加えて溶媒留去した。残渣をジエチルエーテル（３ｍＬ）で５回洗い、化合物４を白色固体（１１１ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３９９．１［Ｍ－Ｈ］。
 
＜（Ｒ）－１－アジド－１７－（（４－デシルフェニル）カルバモイル）－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザオクタデカ－１８－ニルリン酸（ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ａｚｉｄｅ）の合成＞
　２，５－ジオキシピロリジンー１－イル１－アジドー３，６，９，１２―テトラオキサペンタデカー１５―ノエート（ＰＥＧ４－ａｚｉｄｅ－ＮＨＳエステル、２４ｍｇ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解させ、化合物４（２４ｍｇ）とトリエチルアミン（２４μＬ）を加えて室温で２時間攪拌した。溶媒減圧下留去した後得られた残渣をメタノール／重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（０．１Ｍ）＝１：１に溶解させ、逆祖カラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ；φ２３×１２３ｍｍ；メタノール／重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（０．１Ｍ）（メタノール４４％→１００％））により精製し、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ａｚｉｄｅ・トリエチルアンモニウム塩を無色透明オイル（２８ｍｇ）として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６７２．１［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．４７（ｄ，８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．６７（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２３－４．１５（ｍ，２Ｈ），３．８４－３．７５（ｍ，２Ｈ），３．６８－３．５９（ｍ，１４Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．１４（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），２．６７－２．５１（ｍ，４Ｈ），１．５９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３１－１．２５（ｍ，２３Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：０．７９。
 
　上述した合成プロセス１と同じ方法を使用し、ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅ－ＮＨＳエステルに代えて、ＰＥＧ１－Ａｚｉｄｅ－ＮＨＳエステル、ＰＥＧ９－Ａｚｉｄｅ－ＮＨＳエステルＣ１０－Ａｚｉｄｅ－ＮＨＳエステル、ＰＥＧ４－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＮＨＳエステル、ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ－ＮＨＳエステルをそれぞれ使用する事で、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ１－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ９－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－Ｃ１０－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰをそれぞれ得た。
 
（Ｒ）―２―（３―（２－アジドエトキシ）プロパナミド）－３－（（４―デシルフェニル）アミノ）―３―オキソプロピルリン酸（ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ１－Ａｚｉｄｅ）
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５４０．１［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．４７－７．４４（ｍ，２Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２２－４．１２（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６７－３．６３（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），３．１５（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），２．６７－２．５４（ｍ，４Ｈ），１．５９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３１－１．２６（ｍ，２３Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．２３。
（Ｒ）―１―アジド―３２―（（（４―デシルフェニル）カルバモイル）―３０―オキソ―３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７―ノナオキサ―３１―アザトリトリアコンタニ―３３―ルリン酸（ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ９－Ａｚｉｄｅ）
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８９４．４［Ｍ＋Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．４７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２１－４．１４（ｍ，２Ｈ），３．８３－３．５２（ｍ，３６Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），２．６５－２．５２（ｍ，４Ｈ），１．５９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３１－１．２３（ｍ，２３Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．４３。
（Ｒ）―２―（１１―ウンデカナミド）―３―（（４―デシルフェニル）アミノ）―３―オキソプロピルリン酸（ＲＮ０１－Ｎ－Ｃ１０－Ａｚｉｄｅ）
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６１０．３［Ｍ＋Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．３７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．５４（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１０－４．０５（ｍ，２Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．５８－１．４６（ｍ，６Ｈ），１．２４－１．１９（ｍ，２６Ｈ），０．８１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．４３。
（Ｒ）―１７―（（４―デシルフェニル）カルバモイル）―１―（２，５―ジオキソ―２，５―ジヒドロ―１Ｈ―ピローリ―１―ル）―１５―オキソ―３，６，９，１２―テトラオキサ―１６―アザオクタデカニ―１８―ルリン酸（ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８４５．３［Ｍ＋Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．４６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｓ，２Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２１－４．１４（ｍ，２Ｈ），３．８３－３．５２（ｍ，１８Ｈ），３．１８（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），２．６７－２．５２（ｍ，４Ｈ），１．５９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３２－１．２７（ｍ，２３Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．１１。
　（Ｒ）―２―（（４―デシルフェニル）カルバモイル）―４，２０―ジオキサ―２２―（ピリジニ―２―ルジスルフェネル）―７，１０，１３，１６―テトラオキサ―３，１９―ジアザドコシルリン酸（ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４ＳＰＤＰ）
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８４５．３［Ｍ＋Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：８．４１－８．３９（ｍ，１Ｈ），７．８５－７．８０（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｄｄ，Ｊ＝７．８，６．１Ｈｚ，２Ｈ），７．２４－７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．２１－４．１０（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｍ，２Ｈ），３．６６－３．５８（ｍ，１２Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），３．０６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６５－２．５４（ｍ，６Ｈ），１．６１－１．５８（ｍ，２Ｈ），１．３１－１．２６（ｍ，２３Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．１１。
　表８は、実施例１で合成したＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ１－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ９－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－Ｃ１０－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、及びＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰの構造式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
 合成スキーム２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 ＜１４－ヒドロキシ－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル４－メチルベンゼンスルホネート（化合物６）の合成＞
　化合物５（１．２２ｇ）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（７００μＬ）を加えた。トシルクロリド（９５９ｍｇ）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させた後、氷冷下で先ほどの化合物５を含む溶液に滴下した。窒素雰囲気下氷浴下で１５分攪拌後、室温で４０分攪拌した。反応溶液にメタノール（０．１ｍＬ）を加えて室温で１時間攪拌後溶媒を留去し、残渣を白色ゲル（２．９０ｇ）として得た。残渣をクロロホルムに溶解させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｌｉｃａ；φ３０×１６５ｍｍ；メタノール／クロロホルム（メタノール１％→８％））により精製し、化合物６を無色透明オイル（９９４ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３９３．０［Ｍ＋Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．７１－３．５９（ｍ，１８Ｈ），２．５７（ｂｒ，１Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ）。
合成スキーム３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 ＜１４－（（ｔ－ブトキシ（（Ｒ）－３－（（４－デシルフェニル）アミノ－３－オキソ－２－ピバルアミドプロピオキシ）ホスホリル）オキシ）３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル４－メチルベンゼンスルホネート（化合物７）の合成＞
　化合物２（４２０ｍｇ）とｔ－ブトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトライソプロピルホスフィンジアミン（６０５ｍｇ）を乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、ジイソプロアンモニウムテトラゾライド（３４６ｍｇ）を加えて、反応溶液を窒素雰囲気下室温で１時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて、ジクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、残渣を無色透明オイル（６９５ｍｇ）として得た。得られた残渣は、化合物６（４７６ｍｇ）と共に乾燥テトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解させて、テトラゾール（３４４ｍｇ）の乾燥テトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）を滴下し窒素雰囲気下１日攪拌した。反応溶液に３５％過酸化水素水（０．５ｍＬ）を加えて室温で１．５時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶解させた後、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、残渣を無色透明オイル（８８０ｍｇ）として得た。残渣をクロロホルムに溶解させて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｌｉｃａ；φ３０×１６５ｍｍ；酢酸エチル／ヘキサン（酢酸エチル８０％→１００％））により精製し、化合物７を無色透明オイル（１３９ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９２９．２［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．５６（ｂｒ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），５．９４（ｍ，１Ｈ），４．４９－４．４４（ｍ，２Ｈ），４．２５－４．０７（ｍ，５Ｈ），３．６９－３．５０（ｍ，１６Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），１．５５（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．３０－１．２０（ｍ，１４Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：－５．４４。
＜１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル－ｔ－ブチル（（Ｒ）－３－（（４－デシルフェニル）アミノ）－３－ｏｘｏ－２－ピバルアミドプロピルホスフェート（化合物８）の合成＞
　化合物７（１３９ｍｇ）を乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解させて、アジ化ナトリウム（５１ｍｇ）を加えて、反応溶液を窒素雰囲気下６０℃で２．５時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、化合物８を無色透明オイル（８７ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８０１．２［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．６３（ｂｒ，１Ｈ），７．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．１Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．０３－５．９０（ｍ，１Ｈ），４，５９－４．４９（ｍ，２Ｈ），４．２７－４．０９（ｍ，３Ｈ），３．６９－３．５０（ｍ，１６Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），１．５７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．３０－１．２０（ｍ，１４Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
＜３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：－５．４８。
（Ｒ）－２－アミノ－３－（（４－デシルフェニル）アミノ）－３－オキソプロピル（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）リン酸（ＲＮ０１－Ｐ－ＰＥＧ４－ａｚｉｄｅ）の合成＞
　化合物８（８７ｍｇ）のジクロロメタン（２ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えて室温で１時間攪拌した。さらに反応溶液にトリフルオロ（０．２ｍＬ）を加えて、室温で２時間攪拌した。反応溶液にトルエン（２ｍＬ）を加えて溶媒を留去し、残渣を無色透明オイル（７９ｍｇ）として得た。残渣をメタノールに溶解させて、逆相クロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ；φ１８×１１４ｍｍ；メタノール）により精製し、ＲＮ０１－Ｐ－ＰＥＧ４－ａｚｉｄｅを無色透明オイル（４２ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６４４．１［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．４９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３６－４．２１（ｍ，３Ｈ），４．０４－３．９８（ｍ，２Ｈ），３．６９－３．６１（ｍ，１６Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），２．５８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．５９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３２－１．２３（ｍ，１４Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：－０．３５。
合成スキーム４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 ＜（Ｒ）―Ｎ―（４―デシルフェニル）―３―ヒドロキシ―２―（２，２，２―トリフルオロアセタミド）プロパナミド（化合物９）の合成＞
　化合物２（８４６ｍｇ）をジクロロメタン（８ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えて室温で３時間半攪拌した。トルエン（５ｍＬ）を加えて溶媒留去した。得られた残渣をメタノール（２０ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（１．４ｍＬ）とトリフルオロ酢酸エチルエステル（０．８ｍＬ）を加えて室温で１時間半攪拌した。溶媒留去後残渣をジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（８０ｍＬ×２）と飽和食塩水（８０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去し化合物９を白色固体（７７１ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４１５．１［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．３７（ｂｒ，１Ｈ），７．６０（ｂｒ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．５９（ｔｄ，Ｊ＝６．４，３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．０８（ｂｒ，１Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），１．５８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．３９－１．２０（ｍ，１４Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）。
 
＜１９Ｆ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：―７５．５５。
２―シアノエチル　（Ｒ）―３―（（４―デシルフェニル）アミノ―３―オキソ―２―（２，２，２―トリフルオロアセタミド）プロピルホスホロアミダイト（ＲＮ０１－Ｐ－Ａｍｉｄｉｔｅ）の合成＞
　化合物９を乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ―ジイソプロピルエチルアミン（５２０μＬ）と２―シアノエチル―Ｎ，Ｎ―ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（３３０μＬ）を加えて、反応溶液を窒素雰囲気下室温で１時間攪拌した。反応溶液にジクロロメタン（４０ｍＬ）を加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）と飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去し、残渣を黄色タール（６６６ｍｇ）として得た。残渣をヘキサンと酢酸エチルに溶解させて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｍｉｎｏ　ｓｉｌｉｃａ；φ２３×１２３ｍｍ；酢酸エチル／ヘキサン（酢酸エチル１５％→５０％、トリエチルアミン１％含有））により精製し、ＲＮ０１－Ｐ－Ａｍｉｄｉｔｅを無色透明オイル（３２９ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６１５．２［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．２２（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５７－７．４０（ｍ，３Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．７３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２１－３．５５（ｍ，６Ｈ），２．７２－２．５４（ｍ，４Ｈ），１．５８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．２９－１．１０（ｍ，２６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）
　１９Ｆ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：―７５．７２。
　３１ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５１．１１，１４９．２３（ジアステレオマーのため）。
合成スキーム５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
  
＜（２－メチル－４－（４－オクチルフェニチル）－４，５－ジヒドロオキサゾリ－４－ル）メタノール（化合物１１）の合成＞
　２－アミノ－２－（４－オクチルフェニチル）プロパン－１，３－ジオール塩酸塩（化合物１０，１７４ｍｇ）を乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解させて、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２６０μＬ）、オルト酢酸トリメチル（７５μＬ）を加えて、反応溶液を窒素雰囲気下１２０℃で３時間攪拌した。反応溶液を室温に戻し、酢酸エチル（４０ｍＬ）を加えて、水（４０ｍＬ）と飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒留去することで化合物１１を褐色オイル（２３２ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３３２．２［Ｍ＋Ｈ］。
＜ジ－ｔ－ブチル（２－メチル－４－（４－オクチルフェニチル））－４，５－ジヒドロオキサゾリ－４－ル）メチル）ホスフェート（化合物１２）の合成＞
　化合物１１（２３２ｍｇ）にテトラゾール（３４４ｍｇ）の乾燥テトラヒドロフラン溶液（８ｍＬ）、ジ－ｔ－ブチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（３１０μＬ）を順次加えて、窒素雰囲気下室温で１６時間攪拌した。反応溶液に３５％過酸化水素水（０．３ｍＬ）を加え、室温で３日間攪拌した。反応溶液に酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）で有機層を洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、粗精製物を黄色オイル（３０２ｍｇ）として得た。得られた粗精製物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｌｉｃａ；φ３０×１６５ｍｍ×２本；酢酸エチル／ヘキサン（酢酸エチル７２％→１００％））により精製し、化合物１２を黄色オイル（７１ｍｇ）として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５２４．２［Ｍ＋Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．０８（ｓ，４Ｈ），４．３３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９６－３．８５（ｍ，２Ｈ），２．６４－２．５３（ｍ，４Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），１．９８－１．７７（ｍ，２Ｈ），１．５７－１．５３（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）１．２７（ｍ，１０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
 
＜３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：－９．７７。
１－アジド－１７－（ヒドロキシメチル）－１７－（４－オクチルフェニチル）－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザオクタデカ－１８－ニルリン酸（ＲＮ０２－Ｎ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅ）の合成＞
　化合物１２（７１ｍｇ）をエタノール（５ｍＬ）に溶解させ、濃塩酸（１ｍＬ）を加えて反応溶液を５０℃で４時間攪拌した。反応溶液にトルエン（２ｍＬ）を加えて溶媒留去し、残渣を白色フォームとして得た。残渣にジクロロメタン（１ｍＬ）とトリエチルアミン（４００μＬ）、２，５－ジオキシピロリジ－１－ニル１－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカ－１５－ノエート（５７ｍｇ）のジクロロメタン溶液（２ｍＬ）を加えて室温で２４時間攪拌した。反応溶液を溶媒留去し、アセトニトリル／重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（０．１Ｍ）＝１：１に溶解させ、カラムクロマトグラフィー（Ｌｕｎａ　Ｏｍｅｇａ　Ｐｏｌａｒ　Ｃ１８；Φ２１．２×２５０ｍｍ；アセトニトリル／重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（０．１Ｍ）　（アセトニトリル５０％））により精製し、ＲＮ０２－Ｎ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅのトリエチルアミン塩を無色透明オイル（１７ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６６１．１［Ｍ＋Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．１２－７．０３（ｍ，４Ｈ），４．１４－３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８５－３．５６（ｍ，１６Ｈ），３．３９－３．３３（ｍ，２Ｈ），３．１８（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，４Ｈ），２．６３－２．５２（ｍ，４Ｈ），２．４８（ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．１３－２．００（ｍ，２Ｈ），１．５８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．３７－１．１８（ｍ，１７Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．４５。
 
合成スキーム６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
  
＜１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル－ｔ－ブチルジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物１３）の合成＞
　化合物３（４３８ｍｇ）を乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾライド（２５９ｍｇ）とｔ－ブトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトライソプロピルホスフィンジアミン（６１２ｍｇ）を加えて窒素雰囲気下室温で反応溶液を３時間攪拌した。反応溶液にジクロロメタン（４０ｍＬ）を加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で有機層を洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し粗精製物を無色透明オイル（１．１５ｇ）として得た。得られた粗精製物は、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｍｉｎｏ；φ２３×１２３ｍｍ×２本；酢酸エチル／１％トリエチルアミン含有ヘキサン（酢酸エチル４％→２５％））により精製し、化合物１３を無色透明オイル（４３８ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５４０．２［Ｍ－Ｂｕ＋２Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：　７．８２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），４．１８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．７８－３．５５（ｍ，２０Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｓ，９Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１２Ｈ）。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１３７．４３
 
合成スキーム７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
  
＜ｔ－ブチル（１－ヒドロキシ－２－（（メトキシメトキシ）メチル）－４－（オクチルフェニル）ブタ－２－ニル）カルバメート（１４）の合成＞
　化合物１０（３４９ｍｇ）を乾燥メタノール（７ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５２０μＬ）とジ－ｔ－ブチルジカルボネート４６０μＬ）を加えて、窒素雰囲気下室温で３時間攪拌し、再びジ－ｔ－ブチルジカルボネート（２３０μＬ）を加えて窒素雰囲気下室温で１９時間攪拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（６０ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、無色透明オイルを得た。無色透明オイルに乾燥ジクロロメタン（６ｍＬ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２５０μＬ）を溶解し０°Ｃに冷却しクロロメチルメチルエーテル（９０μＬ）を加えた後に窒素雰囲気下室温で３時間攪拌した。反応溶液にメタノール（１ｍＬ）を加えて室温で１４時間攪拌後、反応溶液をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、粗精製物を無色透明オイル（５０５ｍｇ）として得た。得られた粗精製物を酢酸エチル／ヘキサン＝１：１溶液（３ｍＬ）に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｌｉｃａ；φ２３×１２３ｍｍ×２本；酢酸エチル／ヘキサン（酢酸エチル１５％→４０％））により精製し、化合物１４を無色透明オイル（１７０ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３５２．０［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．０８（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，４Ｈ），５．１４（ｂｒ，１Ｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ），４．０５（ｂｒ，１Ｈ），３．８０－３．５０（ｍ，４Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），２．６８－２．４８（ｍ，４Ｈ），２．１１－１．８６（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．５６（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），１．２７（ｍ，１０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
 
＜１４－（（ｔ－ブトキシ（２－（（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－２－（（メトキシメトキシ）メチル）－４－（４－オクチルフェニル）ブトキシ）ホスホリル）－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル－４－メチルベンゼンスルホネート（化合物１５）の合成＞
　化合物１３（４３８ｍｇ）と化合物１４（１７０ｍｇ）を乾燥ジクロロメタン（６ｍＬ）に溶解し、テトラゾール（８６ｍｇ）の乾燥アセトニトリル溶液（２ｍＬ）を加えて、反応溶液を窒素雰囲気下室温で２２時間攪拌した。その後、ｔ－ブチルヒドロぺルオキサイド／ｎ－デカン溶液（～５．５Ｍ；２７０μＬ）を加えて窒素雰囲気下室温で２６時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて、有機層を１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、粗精製物を薄黄色オイル（５７２ｍｇ）として得た。粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｙａｍａｚｅｎ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃｏｌｕｍｎ　ｓｉｌｉｃａ；φ２３×１２３ｍｍ；メタノール／酢酸エチル（メタノール０％→１７％））により精製し、化合物１５（ジアステレオ混合物）を無色透明オイル（２６９ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９７９．３［Ｍ＋ＮＨ４］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１１－７．０５（ｍ，４Ｈ），５．００（ｂｒ，１Ｈ），４．６２（ｓ，２Ｈ），４．１８－４．１０（ｍ，６Ｈ），３．７５－３．５８（ｍ，１８Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），２．６２－２．５２（ｍ，４Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．１３－２．１０（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．５３（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．３２－１．２３（ｍ，１０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：－５．３２，－５．４３
 
＜ｔ－ブチル（１－（（（（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－２－（（メトキシメトキシ）メチル）－４－（４－オクチルフェニル）ブタ－２－ニル）カルバメート（化合物１６）の合成＞
　化合物１５（２６９ｍｇ）を乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、アジ化ナトリウム（９６ｍｇ）を加えて窒素雰囲気下８０℃で１．５時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒留去し、化合物１６を淡黄色オイル（２２８ｍｇ）として得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８５０．３［Ｍ＋ＮＨ４］。
 
＜２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－４－（４－オクチルフェニル）ブチル（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）リン酸（ＲＮ０２－Ｐ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅ）の合成＞
　化合物１６（９７ｍｇ）をＴＨＦ（４ｍＬ）、水（０．５ｍＬ）、塩酸（６Ｍ；０．５ｍＬ）に溶解し、反応溶液を５０℃で２日間攪拌した。反応溶液にトリエチルアミン（０．６ｍＬ）を加え溶媒留去し、粗精製物を白色固体（４６４ｍｇ）として得た。粗精製物をアセトニトリル／重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（０．１Ｍ）＝１：１に溶解させ、カラムクロマトグラフィー（Ｌｕｎａ　Ｏｍｅｇａ　Ｐｏｌａｒ　Ｃ１８　ＡＸＩＡ　５ｍｍ；Φ２１．２×２５０ｍｍ；アセトニトリル／重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（０．１Ｍ）　（アセトニトリル５０％→９０％））により精製し、ＲＮ０２－Ｐ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅを無色透明オイル（２５ｍｇ）で得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６３１．２［Ｍ－Ｈ］。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：７．１２（ｄｄ，Ｊ＝１８．３，８．１Ｈｚ，４Ｈ），４．１０－３．９９（ｍ，４Ｈ），３．７６－３．５９（ｍ，１８Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６６（ｔｄ，Ｊ＝８．７，６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．０１－１．９５（ｍ，２Ｈ），１．５８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１０Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）
　３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：０．０４。
 
［実施例２］
　本発明の核酸複合体は、標的遺伝子又は標的転写産物に対しハイブリダイズ可能なアンチセンス鎖を有しアンチセンス効果を奏するものであればよく、二本鎖の場合はさらにアンチセンス鎖とハイブリダイズ可能な相補鎖の組み合わせを用いることができる。例えば次の配列からなるＡＳＯ、ＨＤＯ、ｓｉＲＮＡから選択することが可能であるし、異なる疾患を標的とする場合、標的転写産物が異なることから、それぞれの標的に応じた核酸配列を持つアンチセンス鎖を有する核酸分子を用いることができる。
　ある実施態様では、次の核酸配列からなるアンチセンス鎖を持つＡＳＯ及び／又はアンチセンス鎖と相補鎖を持つＨＤＯに表９に示すＳ１Ｐリガンド若しくはＳ１Ｐリガンドとリンカーとの結合体を結合した核酸複合体を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　ある実施態様では、表９に示すＳ１Ｐリガンドを結合した核酸複合体を用いることができる。表１０は、表９に示すＳ１Ｐリガンドを次の核酸配列からなるアンチセンス鎖を持つＡＳＯ及び／又はアンチセンス鎖と相補鎖を持つＨＤＯに結合した核酸複合体を示す。表９中のＨＤＯでは、Ｓ１Ｐリガンドは全てＨＤＯの相補鎖に結合したものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　表１０中、小文字はＤＮＡを表し、下線付きの大文字タイプはＬＮＡを表し（ＣはＬＮＡメチルシトシンを意味する）、大文字はＲＮＡを表し、大文字イタリックは２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、小文字イタリックはモルホリノ核酸を表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
　実施例２では、マウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡを標的とするＳ１リガンド結合ＨＤＯを、アンチセンス鎖ＡＳＯ０６（配列番号１１）と相補鎖ＳＯ０６（配列番号１２）と、ＲＮ００１、ＲＮ０２のリガンドを用いて作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　小文字はＤＮＡを表し、下線付きの大文字タイプはＬＮＡを表し（ＣはＬＮＡメチルシトシンを意味する）、大文字はＲＮＡを表し、二重下線付き大文字は２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、星印（アスタリスク）はホスホロチオエート結合を表す。
　ＡＳＯ０６（配列番号１１）はマウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡを標的とする１６個の核酸（１６ｍｅｒ）からなるアンチセンス鎖であり、マウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡを標的とし、マウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡの標的部位にハイブリダイズ可能な配列で構成されている。
　ＳＯ０６（配列番号１２）はアンチセンス鎖ＡＳＯ０６（配列番号１１）に相補的な配列を有する１６個の核酸（１６ｍｅｒ）からなる相補鎖であり、ＡＳＯ０６にハイブリダイズ可能な配列で構成されている。
　まず、ＳＯ０６の５‘端にジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノ基を修飾した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
（Ｘはジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノ基、＊はホスホロチオエート結合、大文字斜体は２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、大文字はＲＮＡを表す）の製造は次の方法で行った。
１．０ｍＭ３．０ｍＬのＳＯ０６に対し、実施例１で作製したＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅ溶液（０．５ｍＭ、１２ｍＬ）を加え攪拌後５分から～３６時間静置した。８ｍＭトリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液で希釈し、ＨＰＬＣにて精製（カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０Ｘ１０．０ｍｍＩＤ　Ｓ－５μｍ；溶離液：Ａ　８ｍＭ　トリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液、Ｂ　８０％メタノール水溶液；溶出条件：４．７ｍＬ／分、０－６０％Ｂ）を行った。溶媒を減圧下除去した後に、水（１ｍＬ）に再度溶解し、塩化ナトリウム水溶液を（５．０Ｍ、３０μＬ）添加・攪拌した後、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）を加え遠心した。得られた沈殿は８０％ＥｔＯＨで洗浄したのち減圧下乾燥させ、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＳＯ０６を得た。
　上記と同様の方法で、核酸鎖ＳＯ０６に代えて別の核酸配列からなるアンチセンス鎖や相補鎖を用いることにより、Ｓ１Ｐリガンドを結合した核酸鎖を製造することができる。
　ある実施態様では、上記と同様の方法で配列ＳＯ０６をＡＳＯ０６とすることでＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＡＳＯ０６を製造することができた。
　別の実施態様では、配列ＳＯ０６をＡＳＯ０６に代え、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ＡｚｉｄｅをＲＮ０２－Ｎ－ＰＥＧ４Ａｚｉｄｅに代えて用いることでＲＮ０２－Ｎ－ＳＰ０１－ＡＳＯ０６を得た。
　Ｓ１Ｐリガンドを結合したＨＤＯの製造は次の方法で行った。ＡＳＯ０６（０．２ｍＭ、７５０μＬ）と、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＳＯ０６（０．２０ｍＭ、７５０μＬ）を混合させ溶媒を除去することでリガンドを結合させたＨＤＯであるＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６（０．１ｍＭ、１．５ｍＬ）を得た。ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６を整理食塩液（大塚生食注（大塚製薬））に添加し、この溶液を９５℃で５分加熱し、溶液をゆっくりと室温に冷却してアニールを実施した。
　別の実施態様では、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅに代えてＲＮ０１－Ｐ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ１－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ９－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０１－Ｎ－Ｃ１０－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０２－Ｎ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅ、ＲＮ０２－Ｐ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｅをそれぞれ用いることで、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０２－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０３－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０４－ＨＤＯ０６、ＲＮ０２－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６、ＲＮ０２－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６をそれぞれ得た。
　別の実施態様では、５′ジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノオリゴ核酸に変えて、５′ビシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノオリゴ核酸を用いることで、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０５－ＨＤＯを得た。
　各ＨＤＯのＴｍ値を測定した。値を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
 　別の実施態様では、配列番号１２の相補鎖ＳＯ０６の５‘端に３―（２―ピリジルジチオプロピオニル－ヘキシルアミノ基を修飾した５′３―（２―ピリジルジチオプロピオニル－ヘキシルアミノ－ＳＯ００６（１．０ｍＭ１．０ｍＬ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
Ｘは３―（２―ピリジルジチオプロピオニル－ヘキシルアミノ基、＊はホスホロチオエート結合、大文字斜体は２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、大文字はＲＮＡを表す）に対し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（０．１Ｍ０．１ｍＬ）を加え攪拌した。８ｍＭトリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液で希釈し、ＨＰＬＣにて精製（カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０Ｘ１０．０ｍｍＩＤ　Ｓ－５μｍ；溶離液：Ａ　８ｍＭ　トリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液、Ｂ　８０％メタノール水溶液；溶出条件：４．７ｍＬ／分、０－６０％Ｂ）を行った。得られた溶液に対して、ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰを加え攪拌後５分から～３６時間静置した。８ｍＭトリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液で希釈し、ＨＰＬＣにて精製（カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０Ｘ１０．０ｍｍＩＤ　Ｓ－５μｍ；溶離液：Ａ　８ｍＭ　トリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液、Ｂ　８０％メタノール水溶液；溶出条件：４．７ｍＬ／分、０－６０％Ｂ）を行った。溶媒を留去後、水（１ｍＬ）に再度溶解し、塩化ナトリウム水溶液を（５．０Ｍ、３０μＬ）添加・攪拌した後、エタノール（４ｍＬ）を加え遠心した。得られた沈殿は８０％ＥｔＯＨで洗浄したのち減圧下乾燥させ、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０６－ＳＯ０６を得た。
　ＡＳＯ０６（０．２ｍＭ、７５０μＬ）と、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＳＯ０６（０．２０ｍＭ、７５０μＬ）を混合させ溶媒を除去することでリガンドを結合させたＨＤＯであるＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＨＤＯ０６（０．１ｍＭ、１．５ｍＬ）を得た。ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０６－ＨＤＯ０６に整理食塩液（大塚生食注（大塚製薬））を添加し、この溶液を９５℃で５分加熱し、溶液をゆっくりと室温に冷却してアニールを実施した。
　ＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰに変えてＲＮ０１－Ｎ－ＰＥＧ４－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを用いることでＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０７－ＨＤＯ０６を得た。
　各ＨＤＯのＴｍ値を測定した。値を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068
 　６．３ｍＬリアクターにＰｒｉｍｅｒＳｕｐｐｏｒｔＴＭ５ＧＵｎｙｌｉｎｋｅｒ３５０を０．５ｇ（１７５μｍｏｌ）充填し、核酸自動合成装置（ＡＫＴＡＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１００）に設置し、下記の条件で伸長反応の合成サイクルを設定し、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＳＯ０６が担持されたオリゴマーを合成した。
　デブロッキング工程は３％（ｖ／ｖ）ジクロロ酢酸トルエン溶液をデブロック溶液として用いた。ＲＮＡ、２ＯＭｅヌクレオチドのカップリングはＲＮＡ、２ＯＭｅアミダイトを０．１５Ｍに溶かした溶液と０．２５ｍｏｌ／Ｌ５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール・アセトニトリル溶液を２：３の割合になるように送液した。ＲＮ０１－ＰのカップリングはＲＮ０１－Ｐ－Ａｍｉｄｉｔｅを０．１Ｍに溶かした溶液と０．２５ｍｏｌ／Ｌ５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール・アセトニトリル溶液を１：４の割合になるように送液した。硫黄化工程はフェニルアセチルジスルフィドをアセトニトリルと３－ピコリン１：１の溶液を硫黄化溶液として使用した。酸化工程は５０ｍＭヨウ素・水：ピリジン９：１の溶液酸化溶液として使用した。キャッピング工程はＡ液として２メチルイミダゾールとアセトニトリル２：８の混合溶液、Ｂ液として無水酢酸－２，６－ルチジン－アセトニトリル２：３：５の混合溶液を１：１の比率で送液して用いた。
　上記で合成したＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＳＯ０６が担持された樹脂をリアクターから回収し１５分以上通風乾燥した。乾燥した樹脂のうち３００ｍｇに対し２０％メチルアミン－イソプロパノール１：１、３ｍＬを加え４０℃で２時間撹拌した。樹脂を濾別し、ＤＭＳＯ１０ｍＬで洗浄した。得られた濾液に三フッ化水素・３トリエチルアミンを５ｍＬ加え６０℃で２時間攪拌した。攪拌後３０ｍＬエタノールを加えＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＳＯ０６させ上清を除去した。得られた沈殿を８ｍＭトリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液に溶解し、ＨＰＬＣにて精製（カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０Ｘ１０．０ｍｍＩＤ　Ｓ－５μｍ；溶離液：Ａ　８ｍＭ　トリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％メタノール水溶液、Ｂ　８０％メタノール水溶液；溶出条件：４．７ｍＬ／分、０－６０％Ｂ）を行った。溶媒を留去後、水（１ｍＬ）に再度溶解し、塩化ナトリウム水溶液を（５．０Ｍ、３０μＬ）添加・攪拌した後、エタノール（４ｍＬ）を加え遠心した。得られた沈殿は８０％ＥｔＯＨで洗浄したのち減圧下乾燥させ、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＨＤＯ０６を得た。
　ＡＳＯ０６（０．２ｍＭ、７５０μＬ）と、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＳＯ０６（０．２０ｍＭ、７５０μＬ）を混合させ溶媒を除去することでリガンドを結合させたＨＤＯであるＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＨＤＯ０６（０．１ｍＭ、１．５ｍＬ）を得た。ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＨＤＯ０６に整理食塩液（大塚生食注（大塚製薬））を添加し、この溶液を９５℃で５分加熱し、溶液をゆっくりと室温に冷却してアニールした。
　ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＨＤＯ０６のＴｍ値を測定した。値を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000069
 ［実施例３］
　実施例２で作製した二本鎖アンチセンス核酸複合体であるＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６の、培養細胞における標的遺伝子ノックダウン効果を試験した。この実験では、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６及びＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６の標的受容体であるＳ１Ｐ受容体を発現するマウス繊維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３を用いた。ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６が細胞膜上の受容体を介して細胞内に取り込まれると、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６の標的転写産物であるＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡの発現量の低下がみられる。
細胞培養
　マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３は、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所より購入した。３７℃にて５％ＣＯ２中、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で維持した。
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ遺伝子ノックダウン効果試験
　マウス線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３を市販の２４－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１Ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ／０．５　ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種し、２４時間ＣＯ２インキュベータ中で培養した。その翌日、１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは３０ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／ＬのＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６又はＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６（以下、各ＨＤＯという）を培地に添加し、細胞に取り込ませた。陰性対照として、ＰＢＳ添加群を実施した。各ＨＤＯ添加２４時間後に細胞を回収した。ＳＶ９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを精製し、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ、ＲＲ０３６Ａ）を用いて実施した。内在遺伝子Ｍａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡの発現量を比較解析するために、ｑＰＣＲ解析をＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施し、マウスＭａｌａｔ１とマウス１８ＳｒＲＮＡのプライマー／プローブはＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でデザインされた試薬を使用し、ｍＲＮＡ発現量はマウスＭａｌａｔ１とマウス１８Ｓ　ｒＲＮＡの各Ｃｔ値を測定した後、ΔΔＣｔ法に基づく相対定量法により算出した。
　上記の方法で、各ＨＤＯについて内在遺伝子Ｍａｌａｔ１のノックダウン効果試験を実施した。結果を図１Ａ及びＢに示す。図１に於いて横軸は、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、３０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ　のＰＢＳとＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０１（図１Ａ）又はＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０２（図１Ｂ）を表す。縦軸は、相対発現レベル（Ｍａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量／１８ＳｒＲＮＡ発現量）を表す。
　図１Ａに示すように、１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは３０ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌ　のＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６添加で１４、１０．２、６１．１％のＭａｌａｔ１発現量のノックダウン効果が確認された。また、図１Ｂに示すように、１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは３０ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌ　のＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６添加で３３．４、４１．８、７２．９％のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量のノックダウン効果が確認された。
［実施例４］
試薬
　この実施例で使用する核酸複合体は、実施例２で作製したマウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡをターゲットとする１６ｍｅｒのＨＤＯにＳ１ＰリガンドをコンジュゲートしたＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６とＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６である。発明者らは、これらのオリゴを生理食塩水（大塚製薬）にて１００μＭに調製し、２本鎖のＨＤＯはブロックバス（ＣＤＢ－１０５、アズワン）にて９０℃５分間変性させ、その後自然冷却（約２時間）で室温に戻すことでアニーリング操作を行った。
動物
　ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２５匹、日本チャールズリバー、雌性、入荷時４週齢）を用いた。動物は室温（２４±２℃）、湿度（５５±５％）および１２時間照明（８：００－２０：００）の環境下でプラスチックの飼育ゲージに５匹ずつ飼育し、自由飲水と固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業）を与え、１週間を馴化した。
方法
　マウスの体重によりＶｅｈｉｃｌｅ（Ｓａｌｉｎｅ、大塚製薬）投与群、ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群およびＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６（ＶＮ－Ｈ、１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群に分けた（各群動物ｎ＝５）。試薬投与当日、マウスを覚醒下で保定器にて保定し、尾静脈より試薬をゆっくり投与（１０ｍｌ／ｋｇ、Ｄａｙ　０）した。投与後、投与部位の止血を確認し、飼育ケージに戻した。投与３日後（Ｄａｙ　３）に剖検を実施した。剖検当日、マウスの体重を測定し、イソフルラン（３－５％で導入、１－３％で維持）麻酔下にて心内採血（テルモシリンジＳＳ－０１Ｐ２５２５、抗凝固剤ヘパリン含有）を行い、放血により安楽死させた。開腹し、肝臓、腎臓、脾臓を摘出した。引き続き開胸し、肺、心臓および胸腺を摘出した。摘出した臓器は速やかにＩＳＯＧＥＮに浸し、ｍＲＮＡ抽出に供した。また、肝臓、腎臓、肺の一部分のドライアイスにて冷凍保存し、ＡＳＯのＥＬＯＳＡ測定に用いる。血液サンプルは１．５ｍｌエッペンチューブに入れ、１００００ｒｐｍ／５分遠心し、上清を冷凍（－３０℃）保存し、血中肝臓逸脱酵素Ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）とＡｓｐａｒａｔｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）の測定に用いた。
　組織の破砕はバイオマッシャー、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）またはＦａｓｔＰｒｅｐ－２４　５Ｇ（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いた。組織破砕液からＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出はＲｅｌｉａＰｒｅｐＴＭ　ＲＮＡ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚ６１１２、プロメガ）を用いた。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの調製はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ、ＲＲ０３６Ａ）を用いて逆転写した。各遺伝子の　ｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて計測した。マウスＭａｌａｔ１（Ｍｍ　０１２２７９１２－ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１８Ｓ　ｒＲＮＡ（Ｍｍ　０３９２８９９０－ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｍＲＮＡのＴａｑＭａｎプローブセットを用いた。
　血中ＡＬＴ／ＡＳＴ活性の測定はテストワコーＡＬＴ／ＡＳＴ測定キット（富士フィルム和光純薬工業株式会社、４３１－３０９０）と酵素キャリブレーター（富士フィルム和光純薬工業株式会社、４１６－５７１９１）を用いて（ｉｎ　ｖｉｖｏプロトコール／テストワコーＡＬＴＡＳＴ測定）計測した。
　すべての測定値は平均値±標準偏差で表した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　７．０４を用いて一元配置ＡＮＯＶＡ検定を行い、群間の比較はＤｕｎｎｅｔｔ多重比較を用いた。また、危険率５％未満を有意とする。
結果
１．一般状況
　マウスの毛並み、行動、糞便など投与前後に明確な変化は観察されなかった。試薬は尾静脈より１０ｍｌ／ｋｇの用量で投与したが、投与直後に行動異変は観察されなかった。
２．体重
　投与前各群動物の平均体重１７ｇで、投与前後で大きく変化は認められなかった。また、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べ、オリゴ投与群の平均体重は有意な変化は認められなかった（図２）。
３．血中ＡＬＴ／ＡＳＴ活性
　図３ＡはマウスにＭａｌａｔ１オリゴを投与３日後、血中ＡＬＴ活性の変化を示す。
　図３ＢはマウスにＭａｌａｔ１オリゴを投与３日後、血中ＡＳＴ活性の変化を示す。
　Ｍａｌａｔ１オリゴ投与群のＡＬＴおよびＡＳＴ活性は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ、有意な変化は認められなかった。
４組織中Ｍａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現変化
４．１肝臓
　肝臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６またはＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６投与はＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べいずれも低下したが、有意差は認められなかった。しかし、それぞれのキャリア鎖投与群に比べ、有意にノックダウンされた（図４）。
４．２肺
　肺のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６またはＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６投与はＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べいずれも低下した（図５）。
４．３腎
　腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６またはＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６投与はＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べいずれも低下した（図６）。
 
［実施例５］
試薬
　この実施例で使用する核酸複合体は、実施例２で作製したマウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡをターゲットとするＲＮ０２－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６及びＲＮ０２－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６である。発明者らは、これらのオリゴを生理食塩水（大塚製薬）にて１００μＭに調製し、２本鎖のＨＤＯはブロックバス（ＣＤＢ－１０５、アズワン）にて９０℃５分間変性させ、その後自然冷却（約２時間）で室温に戻すことでアニーリング操作を行った。
 
動物
　ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２５匹、日本チャールズリバー、雌性、入荷時４週齢）を用いた。動物は室温（２４±２℃）、湿度（５５±５　％）および１２時間照明（８：００－２０：００）の環境下でプラスチックの飼育ゲージに５匹ずつ飼育し、自由飲水と固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業）を与え、１週間を馴化した。
方法
　マウスの体重によりＶｅｈｉｃｌｅ（Ｓａｌｉｎｅ、大塚製薬）投与群、ＲＮ０２－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群及びＲＮ０２－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６　（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群に分けた（各群動物ｎ＝５）。試薬投与当日、マウスを覚醒下で保定器にて保定し、尾静脈より試薬をゆっくり投与（１０ｍｌ／ｋｇ、Ｄａｙ　０）した。Ｌ００１相補鎖（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群は、ネガティブコントロールとして使用した。投与後、投与部位の止血を確認し、飼育ケージに戻した。投与３日後（Ｄａｙ　３）に剖検を実施した。剖検当日、マウスの体重を測定し、イソフルラン（３－５％で導入、１－３％で維持）麻酔下にて心内採血（テルモシリンジＳＳ－０１Ｐ２５２５、抗凝固剤ヘパリン含有）を行い、放血により安楽死させた。開腹し、肝臓、腎臓を摘出した。摘出した臓器は速やかにＩＳＯＧＥＮに浸し、ｍＲＮＡ抽出に供した。血液サンプルは１．５　ｍｌエッペンチューブに入れ、１００００　ｒｐｍ／５分遠心し、上清を冷凍（－３０℃）保存し、血中肝臓逸脱酵素Ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）とＡｓｐａｒａｔｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）の測定に用いた。
　組織の破砕はバイオマッシャー、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）またはＦａｓｔＰｒｅｐ－２４　５Ｇ　（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いた。組織破砕液からＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出はＲｅｌｉａＰｒｅｐＴＭ　ＲＮＡ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚ６１１２、プロメガ）を用いた。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの調製はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ、ＲＲ０３６Ａ）を用いて逆転写した。各遺伝子の　ｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて計測した。マウスＭａｌａｔ１（Ｍｍ　０１２２７９１２－ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１８Ｓ　ｒＲＮＡ（Ｍｍ　０３９２８９９０－ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｍＲＮＡのＴａｑＭａｎプローブセットを用いた。
　血中ＡＬＴ／ＡＳＴ活性の測定はテストワコーＡＬＴ／ＡＳＴ測定キット（富士フィルム和光純薬工業株式会社、４３１－３０９０）と酵素キャリブレーター（富士フィルム和光純薬工業株式会社、４１６－５７１９１））を用いて計測した。
　すべての測定値は平均値±標準偏差で表した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　７．０４を用いて一元配置ＡＮＯＶＡ検定を行い、群間の比較はＤｕｎｎｅｔｔ多重比較を用いた。また、危険率５％未満を有意とする。
 
結果
１一般状況
　マウスの毛並み、行動、糞便など投与前後に明確な変化は観察されなかった。試薬は尾静脈より１０ｍｌ／ｋｇの用量で投与したが、投与直後に行動異変は観察されなかった。
 
２体重
　投与前各群動物の平均体重１７ｇで、投与前後で大きく変化は認められなかった。また、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べ、オリゴ投与群の平均体重は有意な変化は認められなかった（図７）。
 
３血中ＡＬＴ／ＡＳＴ活性
　図８ＡはマウスにＭａｌａｔ１オリゴを投与３日後、血中ＡＬＴ活性の変化を示す。
　図８ＢはマウスにＭａｌａｔ１オリゴを投与３日後、血中ＡＳＴ活性の変化を示す。
　Ｍａｌａｔ１オリゴ投与群のＡＬＴおよびＡＳＴ活性は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ、有意な上昇は認められなかった（図８Ａ、Ｂ）。
 
４組織中Ｍａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現変化
４．１肝臓
　肝臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＲＮ０２－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６投与群およびＲＮ０２－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６
はＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ有意に低下した（図９）。
図９では、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ、　＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１　を示す。
 
４．２腎
　腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＲＮ０２－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６投与群はＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ低下傾向を示した（図１０）。
 
４．３肺
　肺組織のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＲＮ０２－Ｐ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６とＲＮ０２－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６投与群はＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ、いずれも低下傾向を示した（図１１）。
 
［実施例６］
試薬
　ある実施態様では、表１４に記載した核酸複合体を使用することができる。表１４は核酸複合体のオリゴ名（Ｎａｍｅ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）と、核酸分子に結合する化合物の構造式を示す表である。
この実施例で使用する核酸複合体は、上述した実施例で作製したマウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡをターゲットとする１６ｍｅｒのＨＤＯ０６或いはＡＳＯ０６にＳ１Ｐリガンドをコンジュゲートした種々の核酸複合体を使用して次の実験を行った。発明者らは、これらのオリゴを生理食塩水（大塚製薬）にて３０或いは１００μｍｏｌ／ｍＬに調製し、２本鎖のＨＤＯはブロックバス（ＣＤＢ－１０５、アズワン）にて９５℃１０分間変性させ、その後自然冷却（約２時間）で室温に戻すことでアニーリング操作を行った。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000070
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000072
動物
　ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ、雌性、入荷時４週齢）を用いた。動物は室温（２４±２℃）、湿度（５５±５　％）および１２時間照明（７：００－１９：００）の環境下でプラスチックの飼育ゲージに５匹ずつ飼育し、自由飲水と固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業）を与え、１週間を馴化した。
方法
　マウスの体重によりＶｅｈｉｃｌｅ（Ｓａｌｉｎｅ、大塚製薬）投与群及び表１４に記載する種々のＨＤＯ（以下、「試薬」という）（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群に分けた（各群動物ｎ＝５）。試薬投与当日、マウスを覚醒下で保定器にて保定し、尾静脈より試薬をゆっくり投与（１０ｍｌ／ｋｇ、Ｄａｙ　０）した。投与後、投与部位の止血を確認し、飼育ケージに戻した。投与３日後（Ｄａｙ　３）に剖検を実施した。剖検当日、イソフルラン（３－５％で導入、１－３％で維持）麻酔下にて放血により安楽死させた。開腹し、肝臓、腎臓、肺、心臓、及び大腿筋を摘出した。摘出した臓器は速やかにＩＳＯＧＥＮに浸漬し、ｍＲＮＡ抽出に供した。
　ｍＲＮＡ抽出のため組織の破砕はＦａｓｔＰｒｅｐ－２４　５Ｇ　（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いた。組織破砕液からＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出はＲｅｌｉａＰｒｅｐＴＭ　ＲＮＡ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚ６１１２、プロメガ）を用いた。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの調製はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ、ＲＲ０３６Ａ）を用いて逆転写した。各遺伝子の　ｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて計測した。マウスＭａｌａｔ１（Ｍｍ　０１２２７９１２－ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１８Ｓ　ｒＲＮＡ（Ｍｍ　０３９２８９９０－ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｍＲＮＡのＴａｑＭａｎプローブセットを用いた。
　すべての測定値は平均値±標準偏差で表した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　７．０４を用いて一元配置ＡＮＯＶＡ検定を行い、群間の比較はＤｕｎｎｅｔｔ多重比較を用いた。また、危険率５％未満を有意とする。
 
結果
１．　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｕｎｉｔが標的転写因子の発現に対する影響の検討
１．１．Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と、表１４中の試薬名ＤＢＣＯ－ＨＤＯ０６投与群と、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６投与群による骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現への影響を比較した。
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、Ｓ１ＰリガンドであるＶＰＣ２２１９９を付与しないＨＤＯ投与群（ＤＢＣＯ－ＨＤＯ０６）では統計学的有意な抑制を示さなかったが、ＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群（ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６）投与群ではＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ有意に低下した。またリガンドの有無の比較においてＶＰＣ２２１９９を付与しないＨＤＯ投与群（ＤＢＣＯ－ＨＤＯ０６）投与群に比べＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群（ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６）ではＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現が有意に低かった。（図１２Ａ）。またＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群は骨格筋のみならず、肝臓、肺及び腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を統計学有意に抑制した（図１２Ｂ、Ｃ及びＤ）。
１．２．ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０５－ＨＤＯ０６
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群（ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０５－ＨＤＯ０６）投与群ではＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ有意に低下した（図１３）。
 
１．３．ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０７－ＨＤＯ０６
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群（ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０７－ＨＤＯ０６）投与群ではＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ低下傾向であった（図１４）。
 
１．４．ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０６－ＨＤＯ０６
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群（ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０６－ＨＤＯ０６）投与群ではＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現が有意に低かった（図１５）。
 
１．５．ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＨＤＯ０６
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群（ＲＮ０１－Ｐ－ＳＰ０８－ＨＤＯ０６）投与群ではＶｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ低下傾向であった（図１６）。
 
２．　Ｓｐａｃｅｒ
２．１．ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０２－ＨＤＯ０６、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０３－ＨＤＯ０６
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群でＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０２－ＨＤＯ０６投与群は統計学有意に低下した。ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０１－ＨＤＯ０６は低下傾向を示したが、ＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０３－ＨＤＯ０６では低下は認められなかった（図１７）。
 
２．２．ＡｌｋｙｌＣ１０
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べＶＰＣ２２１９９を付与したＨＤＯ投与群でＲＮ０１－Ｎ－ＳＰ０４－ＨＤＯ０６は低下傾向を示した（図１８）。
 
３．　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
　骨格筋のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べＡＳＯ及びＤＢＣＯ－ＡＳＯ０６投与では統計学的有意な抑制を示さなかった。一方、Ｓ１ＰリガンドであるＶＰＣ或いはＦＴＹをコンジュゲートしたＡＳＯ及びＨＤＯ投与群では統計学有意に低下した（図１９）。
　本発明のリガンド結合核酸複合体は、臓器にデリバリーされて標的遺伝子又はその転写産物の発現又は編集を調節する核酸医薬に用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (33)

  1. 　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、次の式で特定される化合物若しくは製薬上許容される塩が、リンカーを介して、又は介さず結合するリガンド結合核酸複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    式１中、
    Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
    Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
    ｍは、０－４の整数であり；
    Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－Ｐ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
    Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨからなる群から選択され；
    Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、スルホン酸誘導体、アジド、チオールからなる群から選択され；
    Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖はシクロアルキルアルキル、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、当該炭素鎖の鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、スルホニルおよび／またはカルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
    Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ６０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい。
  2. 　式１中、
    Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
    Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
    ｍは、０－４の整数であり；
    Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
    Ｘは、Ｏ、Ｓからなる群から選択され；
    Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホン酸、アジド、チオールからなる群から選択され；
    Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖はアリールアルキル、ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、当該炭素鎖の鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、スルホニルおよび／またはカルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
    Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ６０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓ、Ｎおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
    で表される、請求項１記載の化合物及び製薬上許容される塩。
  3. 　式１中、
    Ｒ１は、Ｃ６－Ｃ５０の直鎖または分岐の炭素鎖であって、当該炭素鎖は鎖中に二重結合、三重結合、炭素環Ｚ、Ｏ、Ｓおよび／またはカルボニルから選ばれる部分構造、結合またはヘテロ原子を一つ以上有してもよいし、置換基としてＹを一つ以上有してもよい；
    Ｒ２及びＲ４は、（ＣＨ２）ｍであり；
    ｍは、０－４の整数であり；
    Ｒ３及びＲ５は、－Ｈ、－Ｘ－、－ＸＷ、－ＸＰ（＝Ｘ）（－ＸＷ）２からなる群から選択され；
    Ｘは、Ｏ、Ｓからなる群から選択され；
    Ｙは、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アラルキルオキシ、アシル、アルキルアミノ、アルキルチオ、アシルアミノ、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキルカルバモイル、ニトロ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、アジドからなる群から選択され；
    Ｚは、Ｃ１－Ｃ３０のアリールアルキルであって、当該アリールアルキルの鎖中に二重結合、三重結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ、スルフィニル、カルボニルから選ばれる結合またはヘテロ原子を一つ有してもよいし、置換基にＹを一つ以上有してもよい；及び
    Ｗは、独立して、Ｈ又はＣ１－Ｃ５の直鎖または分岐のアルキル、アシル、アルコキシからなる群から選択され；
    で表される、請求項１記載の化合物及び製薬上許容される塩。
  4. 　（Ｒ）－１－アジド－１７－（（４－デシルフェニル）カルバモイル）－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザオクタデカ－１８－ニルリン酸、又は（Ｒ）－２－アミノ－３－（（４－デシルフェニル）アミノ）－３－オキソプロピル（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）リン酸である、請求項１記載の化合物及び製薬上許容される塩。
  5. 　１－アジド－１７－（ヒドロキシメチル）－１７－（４－オクチルフェニチル）－１５－オキソ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１６－アザオクタデカ－１８－ニルリン酸、又は２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－４－（４－オクチルフェニル）ブチル（１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデシル）リン酸である、請求項１記載の化合物及び製薬上許容される塩。
  6. 　式１で特定される化合物若しくは式１で特定される化合物とリンカーとの結合体が、以下の構造を有する化合物群から選択された化合物である、請求項１記載の化合物及び製薬上許容される塩。
    　
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
  7. 　核酸分子と、式１で特定される化合物若しくは製薬上許容される塩が、リンカーを介して結合している、請求項１～６のいずれか１項に記載のリガンド結合核酸複合体。
  8. 　リンカーが、切断可能な構造を有する切断性リンカーである、請求項７に記載のリガンド結合核酸複合体。
  9. 　リンカーが、以下の構造を有するリンカーである、請求項８に記載のリガンド結合核酸複合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004

    。
  10. 　核酸分子が、標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸分子と、標的タンパク質に対して特異的に結合する核酸塩基配列を有するアプタマーと、標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなるデコイから選択される核酸分子である、請求項１に記載のリガンド結合核酸複合体。
  11. 　核酸分子がＡＤＯ、ＡＳＯ、ＨＤＯ、ＲＮＡｉから選択される核酸分子である、請求項１に記載のリガンド結合核酸複合体。
  12. 　核酸分子のアンチセンス鎖が連続する１２～３０のヌクレオチドからなる、請求項１１に記載のリガンド結合核酸複合体。
  13. 　核酸分子が標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有し８～３０のヌクレオチドからなるデコイである、請求項９に記載のリガンド結合核酸複合体。
  14. 　前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡからなるアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるｓｉＲＮＡである、請求項１０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  15. 　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、Ｓ１Ｐ受容体に対するリガンドとが結合している、リガンド結合核酸複合体。
  16. 　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、Ｓ１Ｐ受容体に対するリガンドとが、リンカーを介して結合している、請求項１５に記載のリガンド結合核酸複合体。
  17. 　リンカーが、切断可能な構造を有する切断性リンカーである、請求項１６に記載のリガンド結合核酸複合体。
  18. 　核酸分子が、標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸分子と、標的タンパク質に対して特異的に結合する核酸塩基配列を有するアプタマーと、標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなるデコイから選択される核酸分子である、請求項１５に記載のリガンド結合核酸複合体。
  19. 　核酸分子がＡＳＯ、ＨＤＯ、ＲＮＡｉから選択される核酸分子である、請求項１８に記載のリガンド結合核酸複合体。
  20. 　核酸分子の核酸鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、請求項１５に記載のリガンド結合核酸複合体。
  21. 　核酸分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、１２～３０ヌクレオチドからなる、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  22. 　核酸分子がＨＤＯであり、ＨＤＯのアンチセンス鎖及び相補鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、それぞれ１２～３０ヌクレオチドからなる、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  23. 核酸分子が標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖と、当該アンチセンス鎖に相補的な核酸塩基配列を有する相補鎖を持つＨＤＯであり、ＨＤＯの相補鎖にＳ１Ｐ受容体に対するリガンドが結合している、請求項１５～１６のいずれか１項に記載のリガンド結合核酸複合体。
  24. 　核酸分子が標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有し８～３０ヌクレオチドからなるデコイである、請求項１５に記載のリガンド結合核酸複合体。
  25. 　アンチセンス鎖は、ギャップマーであり、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むギャップ領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域からなる、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  26. 　アンチセンス鎖は、非ギャップマーであり、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  27. 　相補鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、請求項２２に記載のリガンド結合核酸複合体。
  28. 　相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域からなる、請求項２７に記載のリガンド結合核酸複合体。
  29. 　修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－ＣＨ３基又は２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）基を含むヌクレオチドである、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  30. 　ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ－ＢＮＡから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  31. 　ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ－ＢＮＡから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  32. 　ヌクレオチドアナログは、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ｔｃＤＮＡ、モルホリノ核酸、ＢＮＡから独立して選択される、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
  33. 　核酸分子における少なくとも１つのヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチドがホスホロチオエート化若しくはボラノホスフェート化されている、請求項２０に記載のリガンド結合核酸複合体。
PCT/JP2022/021836 2021-05-31 2022-05-27 リガンド結合核酸複合体 WO2022255273A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112023024384A BR112023024384A2 (pt) 2021-05-31 2022-05-27 Complexo de ácido nucleico ligado ao ligante
KR1020237045279A KR20240016342A (ko) 2021-05-31 2022-05-27 리간드-결합 핵산 복합체
CN202280039001.XA CN117412773A (zh) 2021-05-31 2022-05-27 配体结合核酸复合物
EP22816021.4A EP4353266A1 (en) 2021-05-31 2022-05-27 Ligand-bound nucleic acid complex
JP2023525798A JPWO2022255273A1 (ja) 2021-05-31 2022-05-27
CA3222167A CA3222167A1 (en) 2021-05-31 2022-05-27 Ligand-binding nucleic acid complex
AU2022285344A AU2022285344A1 (en) 2021-05-31 2022-05-27 Ligand-bound nucleic acid complex

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-091589 2021-05-31
JP2021091589 2021-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022255273A1 true WO2022255273A1 (ja) 2022-12-08

Family

ID=84324203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/021836 WO2022255273A1 (ja) 2021-05-31 2022-05-27 リガンド結合核酸複合体

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4353266A1 (ja)
JP (1) JPWO2022255273A1 (ja)
KR (1) KR20240016342A (ja)
CN (1) CN117412773A (ja)
AU (1) AU2022285344A1 (ja)
BR (1) BR112023024384A2 (ja)
CA (1) CA3222167A1 (ja)
WO (1) WO2022255273A1 (ja)

Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10195098A (ja) 1996-11-18 1998-07-28 Takeshi Imanishi 新規ヌクレオチド類縁体
JPH10304889A (ja) 1997-03-07 1998-11-17 Takeshi Imanishi 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002521310A (ja) 1997-09-12 2002-07-16 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
WO2005021570A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Gene Design, Inc. Ｎ−０結合性架橋構造型新規人工核酸
US7064217B2 (en) 2001-01-30 2006-06-20 University Of Virginia Patent Foundation Agonists and antagonists of sphingosine-1-phosphate receptors
WO2007143315A2 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceutical, Inc. Compounds and methods for modulating expression of pcsk9
WO2008029619A1 (fr) 2006-09-07 2008-03-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Oligonucléotide antisens ena ayant une action spécifique de la séquence
WO2008043753A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
WO2008049085A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
US7638637B2 (en) 2003-11-03 2009-12-29 University Of Virginia Patent Foundation Orally available sphingosine 1-phosphate receptor agonists and antagonists
US20120142765A1 (en) * 2009-06-22 2012-06-07 Sylentis S.A.U. Sphingosine-bound siRNA
US20120225064A1 (en) * 2008-02-25 2012-09-06 Expression Drug Designs, Llc Sphingosine 1-Phosphate Antagonism
US8299039B2 (en) 2003-02-28 2012-10-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
WO2013089283A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Chimeric double-stranded nucleic acid
WO2017131124A1 (ja) 2016-01-26 2017-08-03 日産化学工業株式会社 一本鎖オリゴヌクレオチド
WO2018003739A1 (ja) 2016-06-30 2018-01-04 レナセラピューティクス株式会社 機能的リガンドを含む核酸複合体
WO2019200293A1 (en) * 2018-04-12 2019-10-17 Children's Medical Center Corporation Ceramide-like lipid-based delivery vehicles and uses thereof
JP2021091589A (ja) 2019-11-29 2021-06-17 Ｊｘ金属株式会社 リン化インジウム基板、半導体エピタキシャルウエハ、及びリン化インジウム基板の製造方法

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10195098A (ja) 1996-11-18 1998-07-28 Takeshi Imanishi 新規ヌクレオチド類縁体
JPH10304889A (ja) 1997-03-07 1998-11-17 Takeshi Imanishi 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002521310A (ja) 1997-09-12 2002-07-16 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US7064217B2 (en) 2001-01-30 2006-06-20 University Of Virginia Patent Foundation Agonists and antagonists of sphingosine-1-phosphate receptors
US8299039B2 (en) 2003-02-28 2012-10-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
WO2005021570A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Gene Design, Inc. Ｎ−０結合性架橋構造型新規人工核酸
US7638637B2 (en) 2003-11-03 2009-12-29 University Of Virginia Patent Foundation Orally available sphingosine 1-phosphate receptor agonists and antagonists
WO2007143315A2 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceutical, Inc. Compounds and methods for modulating expression of pcsk9
WO2008029619A1 (fr) 2006-09-07 2008-03-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Oligonucléotide antisens ena ayant une action spécifique de la séquence
WO2008043753A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
WO2008049085A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
US20120225064A1 (en) * 2008-02-25 2012-09-06 Expression Drug Designs, Llc Sphingosine 1-Phosphate Antagonism
US20120142765A1 (en) * 2009-06-22 2012-06-07 Sylentis S.A.U. Sphingosine-bound siRNA
WO2013089283A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Chimeric double-stranded nucleic acid
WO2017131124A1 (ja) 2016-01-26 2017-08-03 日産化学工業株式会社 一本鎖オリゴヌクレオチド
WO2018003739A1 (ja) 2016-06-30 2018-01-04 レナセラピューティクス株式会社 機能的リガンドを含む核酸複合体
WO2019200293A1 (en) * 2018-04-12 2019-10-17 Children's Medical Center Corporation Ceramide-like lipid-based delivery vehicles and uses thereof
JP2021091589A (ja) 2019-11-29 2021-06-17 Ｊｘ金属株式会社 リン化インジウム基板、半導体エピタキシャルウエハ、及びリン化インジウム基板の製造方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science", 2009, WILEY
JPN. J. CLIN. IMMUNOL., vol. 32, no. 2, 2009, pages 92 - 101
KIZAWA, HIDEKI; IWAMOTO, SHOICHI: "3rd nucleic acid medicine platform: heteroduplex nucleic acid technology", PHARMACIA = FARUMASHIA, vol. 54, no. 11, 1 January 2018 (2018-01-01), JP , pages 1076 - 1078, XP009541652, ISSN: 0014-8601, DOI: 10.14894/faruawpsj.54.11_1076 *
KON, J.SATO, K.WATANABE, T.TOMURA, H.KUWABARA, A.KIMURA, T.TAMAMA, K.ISHIZUKA, T.MURATA, N.KANDA, T., J. BIOL. CHEM., vol. 274, 1999, pages 23940 - 23947
M. J. LEE ET AL., SCIENCE, vol. 279, 1998, pages 1552 - 1555
MOL. THER. NUCLEIC ACIDS, vol. 22, no. 1, January 2013 (2013-01-01), pages e66
MOL. THER., NUCLEIC ACIDS, no. 1, 22 January 2013 (2013-01-22), pages e66
OBIKA SATOSHI, KASAHARA YUUYA: "Design of antisense oligonucleotides", JOURNAL OF JAPANESE PHARMACOLOGY, vol. 148, no. 2, 1 January 2016 (2016-01-01), JP , pages 100 - 104, XP009530197, ISSN: 0015-5691, DOI: 10.1254/fpj.148.100 *
SCIENCE, vol. 335, 2012, pages 851 - 855
YAMANASHI MEDICAL JOURNAL, vol. 30, no. 1, 2015, pages 1 - 6

Also Published As

Publication number Publication date
EP4353266A1 (en) 2024-04-17
AU2022285344A1 (en) 2023-12-14
CN117412773A (zh) 2024-01-16
KR20240016342A (ko) 2024-02-06
BR112023024384A2 (pt) 2024-02-15
CA3222167A1 (en) 2022-12-08
JPWO2022255273A1 (ja) 2022-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10844374B2 (en) Chimeric single-stranded antisense polynucleotides and double-stranded antisense agent
US11260134B2 (en) Double-stranded nucleic acid complex having overhang
EP2427472B1 (en) Lipophilic polynucleotide conjugates
US20230024153A1 (en) Blood-brain barrier permeable heteroduplex nucleic acid
KR20190044653A (ko) 4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드
KR20180056766A (ko) 뉴클레오티드 조성물 및 이의 방법
JP2019526555A (ja) 可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む組成物及びその使用
US20180223280A1 (en) Nucleic acid complex
JP7188087B2 (ja) 一本鎖オリゴヌクレオチド
JP7262816B2 (ja) ヘテロ核酸のｂｂｂ通過脂質リガンド
JP7384033B2 (ja) 一本鎖オリゴヌクレオチド
US20230295628A1 (en) Nucleic acid complex
WO2022255273A1 (ja) リガンド結合核酸複合体
US20230174981A1 (en) Heteronucleic acid containing morpholino nucleic acid
JP7306653B2 (ja) 構造強化されたＳ－ＴｕＤを用いた新規がん治療法
JPWO2019044974A1 (ja) スモールガイドアンチセンス核酸とその使用
WO2023080225A1 (ja) 脊髄小脳失調症治療用医薬組成物
WO2024005156A1 (ja) 核酸医薬の毒性軽減剤
WO2023042876A1 (ja) ２'－修飾ヌクレオシドを含むヘテロ核酸
US20240117346A1 (en) Modified hetero nucleic acids
WO2023022229A1 (ja) モルホリノ核酸を含む修飾ヘテロ核酸
JP2017176074A (ja) アンチセンスオリゴ核酸化合物およびその配列決定法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22816021

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023525798

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022285344

Country of ref document: AU

Ref document number: AU2022285344

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18564299

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3222167

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112023024384

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022285344

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20220527

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20237045279

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022816021

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022816021

Country of ref document: EP

Effective date: 20240102

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112023024384

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20231122