WO2023080225A1 - 脊髄小脳失調症治療用医薬組成物 - Google Patents

脊髄小脳失調症治療用医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2023080225A1
WO2023080225A1 PCT/JP2022/041282 JP2022041282W WO2023080225A1 WO 2023080225 A1 WO2023080225 A1 WO 2023080225A1 JP 2022041282 W JP2022041282 W JP 2022041282W WO 2023080225 A1 WO2023080225 A1 WO 2023080225A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
nucleotide sequence
region
seq
acid molecule
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/041282
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆徳 横田
欽也 石川
哲也 永田
美和 東
耕太郎 吉岡
誠 小泉
朗之 大西
貴生 小路
Original Assignee
国立大学法人東京医科歯科大学
第一三共株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京医科歯科大学, 第一三共株式会社 filed Critical 国立大学法人東京医科歯科大学
Publication of WO2023080225A1 publication Critical patent/WO2023080225A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule having an antisense effect against a transcript of a mutant gene containing an abnormal repeat region, and a pharmaceutical composition for treating spinocerebellar ataxia.
  • SCA31 Spinocerebellar ataxia type 31
  • SCA31 The age at onset of SCA31 is 45 to 77 years old (average 60 years old). It develops when the patient is unsteady, and gradually becomes unable to walk. Although there are individual differences, it gradually deteriorates to the need for a cane or wheelchair after about 10 years. It is a disease that In addition, SCA31 is one of the most common spinocerebellar degenerations among Japanese, and the estimated number of patients in Japan is 2,000 to 3,000.
  • Non-Patent Document 2 SCA31 was first discovered in 2000 in a family linked to the long arm of chromosome 16 (Non-Patent Document 1). Furthermore, in 2009, 2.5 to 3.8 in the intron shared by two genes, BEAN1 (brain expressed associated with NEDD4; NEDD4-associated brain expression 1) and TK2 (thymidine kinase 2), which are oppositely oriented in the same region. It has been reported that SCA31 is induced by an aberrant repeat region containing a five-nucleotide repeat extended to about kb (Non-Patent Document 2).
  • This five-nucleotide repeat is expressed as a UGGAA repeat in the transcript of the BEAN1 gene, and as a UUCCA repeat in the transcript of the TK2 gene.
  • RNA molecules in which these repeats are transcribed aggregate in the nucleus In patients with SCA31, RNA molecules in which these repeats are transcribed aggregate in the nucleus. Spinocerebellar ataxia is thought to be caused by this RNA aggregate (RNA foci).
  • SCA10 spinocerebellar ataxia type 10
  • ATXN10 mutant ataxin-10 gene in SCA10.
  • Non-Patent Document 3 The AUUCC repeat sequence of SCA10 matches the UUCCA repeat sequence in the TK2 transcript of SCA31 when the repeat unit is shifted by one base.
  • nucleic acid molecule that has an antisense effect against a transcript of a mutant gene containing an abnormal repeat region.
  • the present inventors conducted intensive research and searched for nucleic acid molecules that have an antisense effect against transcripts of mutant genes containing the SCA31 abnormal repeat region. As a result, they have found a group of nucleic acid molecules that can effectively suppress the expression of the transcript.
  • the present invention is based on the above findings, and provides the following.
  • a nucleic acid molecule having an antisense effect against a transcript of a mutant gene containing an abnormal repeat region wherein the abnormal repeat region consists of a 5' region, a core repeat region, and a 3' region, and the core
  • the repeat region consists of a nucleotide sequence that repeats the nucleotide sequence (5'-TGGAA-3') shown in SEQ ID NO: 1 multiple times or a nucleotide sequence complementary thereto, and the nucleic acid molecule comprises the abnormal repeat in the transcript.
  • Said nucleic acid molecule comprising a target binding region comprising a nucleotide sequence complementary to 4 or more consecutive bases in the region and capable of hybridizing to said transcript.
  • the mutant gene is a mutant NEDD4-associated brain expression 1 (BEAN1) gene, and the core repeat region consists of a nucleotide sequence obtained by repeating the nucleotide sequence (5'-TGGAA-3') shown in SEQ ID NO: 1 multiple times;
  • the mutated gene is a mutant NEDD4-associated brain expression 1 (BEAN1) gene
  • the core repeat region is a nucleotide sequence obtained by repeating the nucleotide sequence (5'-TGGAA-3') shown in SEQ ID NO: 1 multiple times;
  • the 3' region comprises a sequence in which the nucleotide sequence (5'-TAGAA-3') shown in SEQ ID NO: 5 is repeated multiple times and a sequence in which the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:
  • nucleic acid molecule according to (4), wherein the 3' region comprises any one of the base sequences selected from the group consisting of (b1) to (b5) below.
  • (b1) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (5'-TAGAA-3') repeated multiple times, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 repeated multiple times A nucleotide sequence concatenated in order from the 5' side
  • nucleic acid molecule according to any one of (2) to (5) wherein the entire length of the target binding region is contained in a nucleotide sequence complementary to either the core repeat region or the 3' region.
  • nucleic acid molecule according to any one of (2) to (5) wherein the entire length of the target binding region is included in the complementary nucleotide sequence to the core repeat region.
  • the nucleic acid molecule according to any one of (2) to (5), comprising: (10) the mutant gene is a mutant thymidine kinase 2 (TK2) gene, and the core repeat region is complementary to a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence (5'-TGGAA-3') shown in SEQ ID NO: 1 is repeated multiple times;
  • the 5' region consists of a sequence in which the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 is repeated multiple times and a sequence in which the nucleotide sequence (5'-TTCTA-3') shown in SEQ ID NO: 17 is repeated multiple times.
  • the nucleic acid molecule of (1) comprising: (11) The nucleic acid molecule according to (10), wherein the 5' region consists of any base sequence selected from the group consisting of (c1) to (c5) below.
  • (c1) a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 is repeated multiple times, a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence (5'-TTCTA-3') shown in SEQ ID NO: 17 is repeated multiple times, and a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 A nucleotide sequence concatenated in order from the 5' side
  • (c2) a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 is repeated multiple times, a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence (5'-TTCTA-3') shown in SEQ ID NO: 17 is repeated multiple times, and a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 A
  • (d1) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27;
  • (d2) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28;
  • (d3) Nucleotide sequence (5'-GTGA-3') represented by SEQ ID NO: 26, and
  • (d4) Nucleotide sequence (5'-TTCTA-3') represented by SEQ ID NO: 17 repeated multiple times and SEQ ID NO Nucleotide sequence formed by connecting the nucleotide sequence (5'-GTGA-3') indicated by 26 in order from the 5' side (14)
  • the target-binding region is complementary to terminal bases of two adjacent regions in the 5′ region, the core repeat region, the 3′ region, and the non-mutated region adjacent to the 3′ side of the 3′ region;
  • the nucleic acid molecule according to any one of (10) to (13), which contains each of
  • nucleic acid molecule according to any one of (10) to (13), wherein the entire length of the target binding region is contained in a nucleotide sequence complementary to either the 5' region or the core repeat region.
  • nucleic acid molecule according to any one of (10) to (13), which consists of any one base sequence selected from the group consisting of: (18) the mutant gene is a mutant ataxin 10 (ATXN10) gene, and the core repeat region is complementary to a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence (5'-TGGAA-3') shown in SEQ ID NO: 1 is repeated multiple times;
  • the nucleic acid molecule according to (1) which consists of a nucleotide sequence, wherein the entire length of the target binding region is included in the nucleotide sequence complementary to the core repeat region.
  • SEQ ID NOS: 33-37, 58-61, 64-67, 70-139, 141-150, 152-155, and 204-206 (provided that u in the sequence may be t, and t is The nucleic acid molecule according to (18), which consists of any one base sequence selected from the group consisting of (may be u).
  • nucleic acid molecule according to any one of (1) to (29), which contains a modified nucleobase (31) The nucleic acid molecule according to any one of (1) to (30), wherein the antisense effect is a decrease in the amount of the transcript (preferably a decrease due to degradation of the transcript). (32) The nucleic acid molecule according to any one of (1) to (30), wherein the antisense effect is steric blocking.
  • a double strand comprising a first nucleic acid strand consisting of the nucleic acid molecule according to any one of (1) to (32) and a second nucleic acid strand comprising a base sequence complementary to the first nucleic acid strand Nucleic acid complex.
  • nucleosides in the region consisting of a base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand are (a) deoxyribonucleosides, (b) deoxyribonucleosides and ribonucleosides, (c) ) deoxyribonucleosides and 2'-modified nucleosides, (d) ribonucleosides and 2'-modified nucleosides, or (e) deoxyribonucleosides, ribonucleosides and 2'-modified nucleosides, according to (33) or (34) double-stranded nucleic acid complex of.
  • a first nucleic acid strand comprising the nucleic acid molecule according to any one of (23) to (26), and a second nucleic acid strand comprising a base sequence complementary to the first nucleic acid strand, wherein the second A double-stranded nucleic acid, wherein the nucleic acid strand comprises a region comprising at least two consecutive ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides complementary to at least two consecutive deoxyribonucleosides in said central region of said first nucleic acid strand.
  • a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or the 3' wing region of the first nucleic acid strand contains a bridging nucleoside and/or a 2' modified nucleoside
  • the 2' modified group of the 2' modified nucleoside is a 2'-O-methyl group or a 2'-O-methoxyethyl group; Double-stranded nucleic acid complex.
  • the second nucleic acid strand has one or more consecutive 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides located at the 5' end and/or one or more consecutive two nucleosides located at the 3' end.
  • the base sequence of the first nucleic acid strand consists of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 65 (where t in the sequence may be u), and the base sequence of the second nucleic acid strand is Consists of any base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, and SEQ ID NO: 203 (where t in the sequences may be u),
  • SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, and SEQ ID NO: 203 (where t in the sequences may be u)
  • the first nucleic acid strand consists of the nucleic acid strand set forth in SEQ ID NO: 65, and the second nucleic acid strand consists of SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, and SEQ ID NO: 203
  • the double-stranded nucleic acid complex according to claim 50 comprising any nucleic acid strand selected from the group consisting of: (52) The nucleic acid molecule according to any one of (2) to (9) and (20) to (32) citing it, or the nucleic acid molecule according to any one of (33) to (49) citing it A double-stranded nucleic acid complex and/or a nucleic acid molecule according to any one of (10) to (19) and (20) to (32) citing it, or (33) to (51) citing it ).
  • nucleic acid molecule according to any one of (20) to (32) citing it, or the nucleic acid molecule according to any one of (33) to (51) citing it A pharmaceutical composition for treating spinocerebellar ataxia type 10 (SCA10), comprising a double-stranded nucleic acid complex.
  • SCA10 spinocerebellar ataxia type 10
  • SCA31 spinocerebellar ataxia type 31
  • nucleic acid molecule according to any one of (2) to (9) and (20) to (32) cited therein, for use in the treatment of spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31), or The double-stranded nucleic acid complex according to any one of (33) to (49) citing it, and/or (10) to (19) and any of (20) to (32) citing it or the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (33) to (51) citing it.
  • SCA31 spinocerebellar ataxia type 31
  • nucleic acid molecule according to any one of (2) to (9) and (20) to (32) citing them for the production of a therapeutic agent for spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31), Or the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (33) to (49) citing it, and/or (10) to (19), and any of (20) to (32) citing it or the double-stranded nucleic acid complex according to any one of (33) to (51) citing it.
  • SCA31 spinocerebellar ataxia type 31
  • a nucleic acid molecule having an antisense effect against a transcript of a mutant gene containing an abnormal repeat region can be provided.
  • FIG. 1 shows the structures of various natural and non-natural nucleotides.
  • FIG. 2 shows the structures of various crosslinked nucleic acids.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing examples of specific embodiments of nucleic acid molecules for use in the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing examples of specific embodiments of nucleic acid complexes used in the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the structure of a mutant TK2 gene containing an abnormal repeat region.
  • FIG. 5A shows the locations of the aberrant repeat regions in the mutant TK2 gene.
  • Non-mutated sequences flanking the SCA31 aberrant repeat region include sequences with polymorphisms (5'-(TAAAA) m -3'; m is an integer greater than or equal to 1, eg, about 8-20).
  • Figure 5B shows the sequences known as the 5' region, the core repeat region, and the 3' region.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the structure of the antisense oligonucleotide (ASO) used in Example 1 and its position in the mutant TK2 gene. In the designation of each ASO, capital letters indicate DNA, underlined capital letters LNA (underlined C is 5-methylcytosine LNA).
  • FIG. 7 is a diagram showing the effect of ASO (2 nM) in suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 2.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • 8 shows the results of FISH for detecting the expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 2.
  • FIG. T-r1 (2 nM) was used as ASO against the SCA31 mutated repeat (TK2).
  • Cells in which expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) was detected are indicated by arrows.
  • 9 is a diagram showing the effect of ASO (0.1 nM, 0.5 nM, or 2 nM) on suppressing expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 4.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 10 is a diagram showing the effect of ASO (0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, or 2 nM) on suppressing expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 5.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • 11 is a diagram showing the effect of ASO (0.1 nM) in suppressing expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 6.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • Figure 12 shows the structures of ASOs targeted within the core repeat region. In the designation of each ASO, uppercase letters indicate DNA, underlined uppercase letters ENA, and italic lowercase letters 2'-OMe RNA.
  • FIG. 13 is a diagram showing the effect of ASO (0.1 nM) targeting the inside of the core repeat region for suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 7.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • Figure 14 shows the structures of ASOs targeted within the core repeat region. In the designation of each ASO, uppercase letters indicate DNA, underlined uppercase letters LNA, and italic lowercase letters 2'-O-MOE RNA.
  • 15 is a diagram showing the effect of ASO (0.5 nM or 2 nM) targeting the inside of the core repeat region for suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 8.
  • FIG. 16 is a diagram showing the effect of ASO (0.5 nM) in suppressing expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 9.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • 17 is a diagram showing the effect of ASO (0.5 nM) in suppressing expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 10.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • 18 is a diagram showing the effect of ASO (0.5 nM) in suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 11.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • 19 is a diagram showing the effect of ASO (0.5 nM) in suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 12.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 20 is a diagram showing the effect of suppressing expression of SCA31 mutated repeat (TK2) by a heteroduplex nucleic acid (0.5 nM) in Example 14.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • 21 is a diagram showing the effect of ASO on suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 15.
  • FIG. LNA/DNA gapmers (LDG), LNA/RNA gapmers (LRG), LNA/DNA mixmers (LDM), and LNA/RNA mixmers (LRM) were used as ASOs. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 22 is a diagram showing the structure of a mutant BEAN1 gene containing an abnormal repeat region.
  • FIG. 22A shows the locations of the aberrant repeat regions in the mutant BEAN1 gene.
  • Non-mutated sequences flanking the SCA31 aberrant repeat region include sequences with polymorphisms (5'-(TAAAA) m -3'; m is an integer greater than or equal to 1, eg, about 8-20).
  • Figure 22B shows the sequences known as the 5' region, the core repeat region, and the 3' region.
  • FIG. 23 is a schematic diagram showing the structure of ASO used in Example 16 and its position in the mutant BEAN1 gene. In the designation of each ASO, capital letters indicate DNA, underlined capital letters LNA (underlined C is 5-methylcytosine LNA). 24 is a diagram showing the effect of ASO (2 nM) in suppressing expression of SCA31 mutated repeat (BEAN1) in Example 16.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 25 is a diagram showing the effect of ASO (0.1 nM) in suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (BEAN1) in Example 18.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • Figure 26 shows the structures of ASOs targeted within the core repeat region. In the designation of each ASO, upper case letters indicate DNA and italic lower case letters indicate 2'-O-MOE RNA.
  • 27 is a diagram showing the effect of ASO (0.1 nM) targeting the inside of the core repeat region to suppress the expression of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) in Example 19.
  • FIG. 28 is a diagram showing the effect of ASO on suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (BEAN1) in Example 20.
  • FIG. 29 shows the structure of the transgene constructs used to generate TK2-Tg mice and BEAN1-BAC-Tg mice.
  • SCA31-1" and “EX2-3” indicate positions detected by qRT-PCR.
  • 30 is a diagram showing injection positions into the mouse brain ventricle in Example 21.
  • FIG. "+” indicates Bregma and " ⁇ ” indicates injection location.
  • 31 is a diagram showing the effect of ASO or HDO on suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in TK2-Tg mice in Example 21.
  • FIG. 31A shows qRT-PCR results showing the effect of T-re10a ASO on suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (TK2).
  • the test was performed with TK2-Tg mice, and the average values are shown.
  • FIG. 31B shows qRT-PCR results showing the effect of T-re10a-HDO on suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2). Error bars indicate standard error.
  • FIG. 31C is the results of Northern blotting showing the effect of T-re10a-HDO on suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2). The position of the band corresponding to the SCA31 mutated repeat (TK2) is indicated by an arrow.
  • FIG. 32 is a diagram showing the effect of ASO on suppressing the expression of SCA31 mutated repeats in Example 21.
  • FIG. 32A shows qRT-PCR results showing the effect of T-r2′_1 ASO on suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in TK2-Tg mice.
  • FIG. 32B is the result of qRT-PCR showing the suppression effect of B-r2 ASO on the expression of SCA31 mutated repeat (BEAN1) in BEAN-BAC-Tg mice. Error bars indicate standard error.
  • 33 is a schematic diagram showing the structure of HDO used in Example 22.
  • FIG. 33A shows the structure of T-re10a HDO (Default).
  • FIG. 33B shows the structure of T-re10a HDO (cMOE/DNA).
  • FIG. 33C shows the structure of T-re10a HDO (Full cMOE).
  • Figure 33D shows the structure of T-re10a HDO (cMOE/DNA_2).
  • Figure 33E shows the structure of T-re10a HDO (cMOE/DNA_3).
  • FIG. 34 is a diagram showing the suppressive effect of HDO on the expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 22.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • 35 is a diagram showing the effect of HDO on suppressing the expression of SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 22.
  • FIG. Error bars indicate standard error.
  • FIG. 36 is a diagram showing the structure of the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction or the BEAN1 direction.
  • Figure 36A shows the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 orientation.
  • Figure 36B shows the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the BEAN1 orientation.
  • "SCA31-0" indicates the position detected by qRT-PCR.
  • FIG. 37 is a diagram showing the suppressive effect of HDO on SCA31 mutated repeat (TK2) expression in Example 22.
  • nucleic acid molecules In one aspect, the invention relates to nucleic acid molecules.
  • the nucleic acid molecules of the present invention have an antisense effect on mutant gene transcripts containing abnormal repeat regions.
  • the nucleic acid molecule of the present invention comprises a target binding region that contains a base sequence complementary to four or more consecutive bases in the aberrant repeat region and that is capable of hybridizing to the transcript of the mutant gene containing the aberrant repeat region.
  • abnormal repeat region refers to a mutant gene (mutant BEAN1 gene, mutant TK2 gene, or mutant ATXN10 gene) of a patient with spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31) or type 10 (SCA10). It is the region consisting of the abnormal nucleotide sequence found. Abnormal repeat region refers to the entire region of abnormal sequence that is not present in the gene of normal individuals and is present only in SCA31 or SCA10, and can include both repetitive sequence portions and non-repetitive sequence portions.
  • the aberrant repeat region consists of an abnormal nucleotide sequence in the intron of the mutant BEAN1 gene from patients with spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31), and the intron of the mutant TK2 gene from patients with spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31). or the region consisting of the abnormal nucleotide sequence in the intron of the mutant ATXN10 gene of patients with allele B of spinocerebellar ataxia type 10 (SCA10).
  • SCA31 abnormal repeat region particularly the abnormal repeat region in SCA31 or SCA10 is referred to as "SCA31 abnormal repeat region" and "SCA10 abnormal repeat region", respectively.
  • the specific position of the SCA31 aberrant repeat region can be identified as between positions 68486 and 68487 in, for example, NCBI Reference Sequence: NG_021403.2.
  • target gene refers to a gene to which the nucleic acid molecule or the first nucleic acid strand of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention can bind. Specifically, any of a mutant BEAN1 gene containing an abnormal repeat region, a mutant TK2 gene containing an abnormal repeat region, or a mutant ATXN10 gene containing an abnormal repeat region is applicable.
  • target transcript refers to RNA that is directly targeted by the nucleic acid molecule or nucleic acid complex of the present invention and synthesized by RNA polymerase. Specifically, it is an RNA that is transcribed from a mutant gene targeted by the present invention and that contains an RNA sequence corresponding to an abnormal repeat region. It may be mature mRNA, pre-mRNA, RNA fragment derived from pre-mRNA (for example, an intron segment spliced out from pre-mRNA), etc. Pre-mRNA is preferred. Examples of target transcripts include RNA that is the transcript of the mutant BEAN1 gene, RNA that is the transcript of the mutant TK2 gene, and RNA that is the transcript of the mutant ATXN10 gene.
  • antisense oligonucleotide (ASO) or “antisense nucleic acid” includes all or part of a target transcript, e.g. It refers to a single-stranded oligonucleotide capable of regulating the expression of the transcript of its target gene or the level of the target transcript through sense effects.
  • the term “antisense effect” refers to the effect of regulating expression or editing of a target transcript by hybridization of ASO to the target transcript.
  • “Modulating the expression or editing of the target transcript” means the expression of the target gene or the expression level of the target transcript (herein, “the expression level of the target transcript” is often referred to as “the level of the target transcript”). ), inhibition of translation, RNA editing, splicing function altering effects (eg, splicing switch, exon inclusion, exon skipping, etc.), or degradation of transcripts.
  • RNA oligonucleotide when introduced into a cell as an ASO, the ASO forms a partial duplex by annealing with mRNA, the transcript of the target gene. This partial double strand serves as a cover to prevent translation by the ribosome, thereby inhibiting the expression of the target protein encoded by the target gene at the translational level (steric blocking).
  • oligonucleotides containing DNA as ASO are introduced into cells, partial DNA-RNA heteroduplexes are formed. Recognition of this heteroduplex structure by RNase H results in degradation of target gene mRNA and inhibition of expression of the protein encoded by the target gene at the expression level.
  • antisense effects can also be produced by targeting introns in pre-mRNAs.
  • antisense effects can also be produced by targeting non-coding RNAs such as miRNAs (steric blocking).
  • functional inhibition of the non-coding RNA can affect the expression and function of the gene targeted by the non-coding RNA.
  • inhibition of miRNA function can increase the expression of genes whose expression is normally controlled by the miRNA.
  • the antisense effect is transcript abundance reduction and/or steric block.
  • the ASO hybridizes to target gene mRNA having a sequence complementary to the ASO to form a DNA-RNA heteroduplex.
  • RNase H recognizes this heteroduplex structure and degrades the target gene mRNA. Therefore, the aforementioned decrease in transcript abundance is preferably brought about by transcript degradation.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” as used herein means a nucleoside or nucleotide if monomeric, an oligonucleotide if oligomeric, or a polynucleotide if polymeric.
  • Nucleoside generally refers to a molecule consisting of a combination of a base and a sugar.
  • the sugar moiety of a nucleoside is usually, but not limited to, composed of pentofuranosyl sugars, specific examples of which include ribose and deoxyribose.
  • the base portion (nucleobase) of a nucleoside is usually a heterocyclic base portion. Non-limiting examples include adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil, as well as other modified nucleobases (modified bases).
  • Nucleotide refers to a molecule in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the nucleoside. Nucleotides containing a pentofuranosyl sugar typically have a phosphate group attached to the hydroxyl group at the 2', 3', or 5' position of the sugar.
  • Oligonucleotide refers to a linear oligomer formed by covalently linking several to several tens of hydroxyl groups and phosphate groups of sugar moieties between adjacent nucleotides.
  • polynucleotide refers to a linear polymer formed by linking several tens or more, preferably several hundred or more nucleotides by covalent bonds, which is larger than that of oligonucleotides. Nucleosides of oligonucleotides or polynucleotides are linked by phosphodiester bonds.
  • nucleic acid strand or simply “strand” means an oligonucleotide or polynucleotide. Nucleic acid strands can be produced full length or partial strands by chemical synthesis methods, for example, using automated synthesizers, or by enzymatic processes using polymerases, ligases, or restriction enzyme reactions. A nucleic acid strand may comprise naturally occurring and/or non-naturally occurring nucleotides.
  • Natural nucleoside refers to a nucleoside that exists in nature. Examples thereof include ribonucleosides composed of ribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or uracil, and deoxyribonucleosides composed of deoxyribose and a base such as adenine, cytosine, guanine, or thymine.
  • ribonucleosides found in RNA and deoxyribonucleosides found in DNA are often referred to as "DNA nucleosides" and "RNA nucleosides", respectively.
  • naturally occurring nucleotide refers to a naturally occurring nucleotide in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the natural nucleoside.
  • ribonucleotides known as structural units of RNA, in which a phosphate group is bound to a ribonucleoside
  • deoxyribonucleotides known as a structural unit of DNA, in which a phosphate group is bound to a deoxyribonucleoside.
  • non-natural nucleoside refers to any nucleoside other than natural nucleosides. Examples include modified nucleosides and nucleoside mimetics.
  • modified nucleoside means a nucleoside having a modified sugar moiety and/or modified nucleobase. Nucleic acid strands comprising unnatural oligonucleotides are often used for desirable properties such as, for example, enhanced cellular uptake, enhanced affinity for nucleic acid targets, increased stability in the presence of nucleases, or increased inhibitory activity. , is preferred over the native form.
  • mimetics refers to functional groups that replace sugars, nucleobases, and/or internucleoside linkages. In general, mimetics are used in place of the sugar or sugar-internucleoside linkage combination so that the nucleobase is maintained for hybridization to a target of choice.
  • nucleoside mimetic refers to substitution of a sugar at one or more positions of an oligomeric compound, substitution of a sugar and a base, or binding between monomer subunits constituting an oligomeric compound. Contains the structure used to replace.
  • oligomeric compound is meant a polymer of linked monomeric subunits capable of hybridizing to at least a region of a nucleic acid molecule.
  • Nucleoside mimetics include, for example, morpholino, cyclohexenyl, cyclohexyl, tetrahydropyranyl, bicyclic or tricyclic sugar mimetics, eg, nucleoside mimetics having non-furanose sugar units.
  • Figure 1 shows the structures of various natural or non-natural nucleotides.
  • bicyclic nucleoside refers to a modified nucleoside containing a bicyclic sugar moiety.
  • Nucleic acids containing bicyclic sugar moieties are commonly referred to as bridged nucleic acid (BNA).
  • BNA bridged nucleic acid
  • Nucleosides containing a bicyclic sugar moiety are sometimes referred to herein as “bridged nucleosides.”
  • a bicyclic sugar may be a sugar in which the 2' and 4' carbon atoms are bridged by two or more atoms. Examples of bicyclic sugars are known to those of skill in the art.
  • One subgroup of bicyclic sugar containing nucleic acids (BNAs) is 4'-( CH2 ) p -O-2', 4'-( CH2 ) p - CH2-2 ', 4'-( CH2 ) p -S-2',4'-( CH2 ) p -OCO-2',4'-( CH2 ) n -N( R3 )-O-( CH2 ) m -2'[ wherein p, m and n each represent an integer of 1 to 4, an integer of 0 to 2 and an integer of 1 to 3 ; aryl group, aralkyl group, acyl group, sulfonyl group, and unit substituent (fluorescent or chemiluminescent labeling molecule, functional group having nu
  • R 1 and R 2 are typically hydrogen atoms
  • they may be the same or different, and furthermore, a hydroxyl group-protecting group, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl group, and a sulfonyl group for nucleic acid synthesis.
  • R 4 and R 5 are 1 to 5 hydroxyl groups, hydroxyl groups protected by protecting groups for nucleic acid synthesis, mercapto groups, mercapto groups protected by protecting groups for nucleic acid synthesis, amino groups, which may be different, respectively an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, an alkylthio group having 1 to 5 carbon atoms, a cyanoalkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. represents an amino group].
  • Non-limiting examples of such BNAs include methyleneoxy (4'- CH2 -O-2') BNA (LNA (Locked Nucleic Acid®, also known as 2',4'-BNA). ), such as ⁇ -L-methyleneoxy(4'- CH2 -O-2')BNA or ⁇ -D-methyleneoxy(4'- CH2 -O-2')BNA, 2 and 4 Ethyleneoxy (4'-(CH 2 ) 2 -O-2') BNA (also known as "2'-O,4'-C-ethylene nucleoside""ENA”) having an ethylene bridge between the See JP-A-2000-297097 and International Publication No.
  • LNA Locked Nucleic Acid®, also known as 2',4'-BNA
  • non-natural nucleotide refers to any nucleotide other than natural nucleotides, including modified nucleotides and nucleotide mimetics.
  • modified nucleotide means a nucleotide having any one or more of modified sugar moieties, modified internucleoside linkages, and modified nucleobases.
  • nucleotide mimetics include structures that are used to replace nucleosides and linkages at one or more positions of an oligomeric compound. Nucleotide mimetics include, for example, peptide nucleic acids or morpholino nucleic acids.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • MNA Morpholino Nucleic Acid
  • Nucleic acid strands comprising non-naturally occurring oligonucleotides, as used herein, are often characterized by, for example, enhanced cellular uptake, enhanced affinity for nucleic acid targets, enhanced stability in the presence of nucleases, or enhanced inhibitory activity. has the desired properties of Therefore, when utilizing nucleotides as ASOs, non-natural nucleotides are preferred over natural nucleotides.
  • modified internucleoside linkage refers to an internucleoside linkage having substitutions or arbitrary changes from naturally occurring internucleoside linkages (ie, phosphodiester linkages). Modified internucleoside linkages include phosphorus-containing internucleoside linkages that contain a phosphorus atom and non-phosphorus-containing internucleoside linkages that do not contain a phosphorus atom.
  • Representative phosphorus-containing internucleoside linkages include, but are not limited to, phosphorothioate linkages, phosphorodithioate linkages, phosphotriester linkages, alkylphosphonate linkages, alkylthiophosphonate linkages, phosphorodiamidate linkages, and the like.
  • a phosphorothioate bond is an internucleoside bond in which the non-bridging oxygen atom of a phosphodiester bond is replaced by a sulfur atom. Methods for preparing phosphorus-containing and non-phosphorus-containing linkages are well known.
  • Modified internucleoside linkages are preferably linkages that are more resistant to nucleases than naturally occurring internucleoside linkages.
  • the internucleoside linkage When the internucleoside linkage has a chiral center, the internucleoside linkage may be chirally controlled. "Chirally controlled” is intended to exist in single diastereomer form about a chiral center, eg, a chiral phosphorus atom. Chirally-controlled internucleoside linkages may be of completely single stereochemistry or of high isomeric purity, e.g. 90%de, 95%de, 98%de, 99%de, It may have an isomeric purity of 99.5% de, 99.8% de, 99.9% de, or greater.
  • isomeric purity refers to the proportion of one diastereomer in a mixture of diastereomers, expressed as diastereomeric excess (% de), (diastereomer of interest minus other defined as diastereomers)/(total diastereomers) ⁇ 100 (%).
  • the internucleoside linkage may be a phosphorothioate linkage with chiral control in the Rp or Sp configuration.
  • Methods for the preparation of chirally controlled internucleoside linkages are known, for example phosphorothioate linkages chirally controlled to the Rp or Sp configuration are described in Naoki Iwamoto et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48( 3), 496-9, Natsuhisa Oka, et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317, Natsuhisa Oka, J. Am. , Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem.
  • modified nucleobase or “modified base” means any nucleobase other than adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil.
  • modified nucleobases include 5-methylcytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-iodocytosine, N4-methylcytosine, N6-methyladenine, 8-bromoadenine, N2-methylguanine, or 8 - include but are not limited to bromoguanine.
  • a preferred modified nucleobase is 5-methylcytosine. Note that 5-methyluracil and thymine have the same structure, and may be labeled based on uracil (eg, "5meU”) or labeled based on thymine (eg, "T”). good.
  • Unmodified nucleobase or “unmodified base” is synonymous with natural nucleobase and includes the purine bases adenine (A) and guanine (G), and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C ), and uracil (U).
  • a "modified sugar” has a substitution and/or any change from a natural sugar moiety (i.e., a sugar moiety found in DNA (2'-H) or RNA (2'-OH)) points to sugar.
  • Nucleic acid strands herein may include one or more modified nucleosides, optionally including modified sugars.
  • Sugar-modified nucleosides may confer improved nuclease stability, increased binding affinity, or some other beneficial biological property to a nucleic acid strand.
  • Nucleosides may contain chemically modified ribofuranose ring moieties.
  • Examples of chemically modified ribofuranose rings include, but are not limited to, the addition of substituents (including 5' and 2' substituents), bicyclic nucleic acids by forming bridges within the ribofuranose ring (bridged nucleic acids, BNA ), S, N(R), or C(R1)(R2) of the ribosyl ring oxygen atom (R, R1 and R2 are each independently H, C1 - C12 alkyl, or a protecting group ), and combinations thereof.
  • nucleosides with modified sugar moieties include, but are not limited to, 5'-vinyl, 5'-methyl (R or S), 4'-S, 2'-F(2' -fluoro group), 2'- OCH3 (2'-OMe group or 2'-O-methyl group), and 2'-O( CH2 ) 2OCH3 ( 2' -O-MOE group or 2'- nucleosides containing an O-methoxyethyl group).
  • 2′-modified sugar herein is meant a furanosyl sugar modified at the 2' position.
  • a nucleoside containing a 2'-modified sugar is referred to herein as a "2'-modified nucleoside".
  • a 2'-modified nucleoside in which the 2'-modified group is a 2'-O-methoxyethyl group is called a 2'-O-methoxyethyl-modified nucleoside.
  • nucleotides in the same strand can independently undergo different modifications.
  • the same nucleotide may also have modified internucleoside linkages (e.g. phosphorothioate linkages) and modified sugars (e.g. 2'-O-methyl modified sugars or bicyclic sugar).
  • modified nucleobases e.g, 5-methylcytosine
  • modified sugars e.g, 2'-O-methyl modified sugars or bicyclic sugars.
  • the number, type and position of non-natural nucleotides in the nucleic acid chain can affect the antisense effect provided by the nucleic acid complex of the present invention.
  • the selection of modifications may vary depending on the sequence of the target gene, etc., but a person skilled in the art will appreciate the descriptions of this specification and literature related to antisense methods (e.g., WO 2007/143315, WO 2008/043753, and WO 2008/049085) can be selected as appropriate, and the embodiment is not limited to the embodiments.
  • the measured value thus obtained is not significantly lower than the measured value of the nucleic acid complex before modification (e.g., When the measured value obtained after modification is 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the measured value of the nucleic acid complex before modification), the relevant modification can be evaluated.
  • the term “complementary” means that the nucleobases are paired through hydrogen bonding, so-called Watson-Crick base pairs (natural base pairs) or Wobble base pairs (guanine-thymine or guanine-uracil). ) means a relationship that can form
  • the nucleic acid molecule or first nucleic acid strand does not necessarily have to be completely complementary to all or part of the target transcript (e.g., target gene transcript), and the base sequence is at least 70% , preferably at least 80%, even more preferably at least 90% (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) complementarity is acceptable.
  • the second nucleic acid strand does not necessarily have to be completely complementary to all or part of the first nucleic acid strand, and the nucleotide sequence is at least 70%, preferably at least 80%. %, even more preferably at least 90% (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more) of complementarity is acceptable.
  • Sequence complementarity can be determined by using the BLAST program or the like.
  • a first nucleic acid strand "hybridizes" to a target transcript if the sequence is complementary (typically if the sequence is complementary to the sequence of at least a portion of the target transcript). can be done.
  • a first nucleic acid strand can "anneal" to a complementary region of a second nucleic acid strand when the sequences are complementary.
  • a person skilled in the art can easily determine the conditions (temperature, salt concentration, etc.) under which two strands can anneal or hybridize, taking into consideration the degree of complementarity between the strands. Such conditions may typically be physiological conditions.
  • a person skilled in the art can easily design an antisense nucleic acid complementary to the target transcript, for example, based on information on the base sequence of the target gene.
  • Hybridization conditions may be, for example, stringent conditions such as low stringent conditions and high stringent conditions.
  • Low stringency conditions may be, for example, 30° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • Highly stringent conditions may be, for example, 65° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • Hybridization stringency can be adjusted by varying conditions such as temperature and salt concentration.
  • 1 ⁇ SSC contains 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
  • tocopherol is a methylated derivative of tocol, a fat-soluble vitamin (vitamin E) with a cyclic structure called chroman.
  • Tocol has a strong antioxidant action, and therefore, in vivo, as an antioxidant substance, it has the function of quenching free radicals generated by metabolism and protecting cells from injury.
  • tocopherol Several different forms of tocopherol are known, consisting of ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, and ⁇ -tocopherol, based on the position of the methyl group that binds to the chroman.
  • a tocopherol herein can be any tocopherol.
  • Analogues of tocopherol include various unsaturated analogues of tocopherol, such as ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol and ⁇ -tocotrienol.
  • the tocopherol is ⁇ -tocopherol.
  • cholesterol is a type of sterol, also known as steroidal alcohol, and is particularly abundant in animals. Cholesterol plays an important role in metabolic processes in vivo, and in animal cells, it is also a major constituent of the cell membrane system together with phospholipids. Analogs of cholesterol also refer to various cholesterol metabolites and analogs, which are alcohols having a sterol backbone, including, but not limited to, cholestanol, lanosterol, cerebrosterol, dehydrocholesterol, and coprostanol. etc.
  • analog refers to compounds having the same or similar basic skeleton and having similar structures and properties. Analogs include, for example, biosynthetic intermediates, metabolites, compounds with substituents, and the like. A person skilled in the art can determine whether a compound is an analog of another compound based on common general technical knowledge.
  • the term "subject” refers to an object to which the nucleic acid molecule, double-stranded nucleic acid complex, or pharmaceutical composition of the present invention is applied.
  • Subjects include organs, tissues, and cells as well as individuals.
  • any animal including humans can be applicable.
  • various livestock, poultry, pets, experimental animals, and the like can be mentioned.
  • the subject is an individual in need of reduced expression of the target transcript, preferably an individual suffering from or expected to be affected by SCA31 or SCA10 (e.g., SCA31 or SCA10 and/or individuals expected to be affected by SCA31 or SCA10 based on genotype, etc.).
  • nucleotide sequences are described in order from the 5' side to the 3' side unless otherwise specified.
  • the base sequences indicated by the skipped sequence numbers in the sequence listing are shown below. In addition, both show the DNA sequence derived from a human.
  • SEQ ID NO: 1 5'-TGGAA-3' SEQ ID NO: 2: 5'-TCAC-3' SEQ ID NO: 5: 5'-TAGAA-3' SEQ ID NO: 8: 5'-TTCCA-3' SEQ ID NO: 17: 5'-TTCTA-3' SEQ ID NO: 26: 5'-GTGA-3' SEQ ID NO: 191: 5'-TAAAA-3' SEQ ID NO: 194: 5'-TTTTA-3' SEQ ID NO: 196: 5'-TTGAAACAG-3' SEQ ID NO: 198: 5'-CTGTTTCAA-3'
  • the nucleic acid molecule of this embodiment is a nucleic acid molecule that contains a target binding region that can hybridize to a mutant gene transcript containing an abnormal repeat region and that has an antisense effect on the transcript.
  • the target binding region comprises a base sequence complementary to 4 or more contiguous bases in the abnormal repeat region in the transcript.
  • the abnormal repeat region contained in the mutant gene encoding the transcript targeted by the nucleic acid molecule of this embodiment consists of the 5' region, the core repeat region, and the 3' region.
  • the core repeat region refers to a nucleotide sequence (5'-(TGGAA) n -3'; n is 2 Integer above), or a base sequence complementary thereto.
  • the "nucleotide sequence complementary thereto” means a nucleotide sequence (5'-(TTCCA) n -3'; n is integer of 2 or more).
  • “n” varies depending on the case and is not limited to the following range, but an integer of 2-500, 100-400, or 200-400 is exemplified.
  • the "5' region” is a region located on the 5' side of the core repeat region in the abnormal repeat region.
  • the “3′ region” is a region located on the 3′ side of the core repeat region in the abnormal repeat region.
  • the nucleotide sequences of the 5' and 3' regions are not limited as long as they are sequences that can be found in SCA31 or SCA10 spinocerebellar ataxia patients.
  • nucleic acid molecule of the present invention differ depending on the type of target mutated gene, so the following description will be divided according to the type of mutated gene.
  • the mutant gene encoding the transcript targeted by the nucleic acid molecule of the present invention is a mutant BEAN1 gene.
  • the core repeat region consists of a base sequence (5'-(TGGAA) n -3 '; n is an integer of 2 or more, where 'n' varies depending on the case and is not limited to the following range, for example, an integer of 2 to 500, 100 to 400, or 200 to 400 exemplified.
  • nucleotide sequences of the 5' and 3' regions of the abnormal repeat region of the mutant BEAN1 gene are not particularly limited as long as they are sequences that can be found in patients with SCA31 spinocerebellar ataxia.
  • the 5' region in the abnormal repeat region of the mutant BEAN1 gene includes, for example, a region containing the base sequence (5'-TCAC-3') shown in SEQ ID NO:2.
  • the specific base sequences include the following (a1) to (a4): (a1) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (5'-TCACTAAAA(TAGAA) 2 -3'), (a2) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 (5'-TCACTAAAA(TAGAA) 4 -3'), (a3) the nucleotide sequence (5'-TCAC-3') represented by SEQ ID NO: 2, and (a4) the nucleotide sequence (5'-TCAC-3') represented by SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (5 '-TAGAA-3') repeated multiple times (5'-(TAGAA) n -3'; n is an integer of 2 or more) linked sequentially from the 5' side.
  • "n"
  • the 3' region of the abnormal repeat region of the mutant BEAN1 gene includes, for example, a sequence (5'-(TAGAA) n -3') obtained by repeating the nucleotide sequence (5'-TAGAA-3') shown in SEQ ID NO: 5 multiple times. n is an integer of 2 or more), and a region containing multiple repetitions of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 (5'-(TAAAATAGAA) n -3'; n is an integer of 2 or more).
  • the specific base sequences include the following (b1) to (b5): (b1) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 (5'-TGGGAATGGAATGGGAA(TAGAA) 2 (TGGAA) 2 (TAGAA) 2 TGGAA-3') and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 (5'-TAGAA-3') Nucleotide sequence repeated multiple times (5'-(TAGAA) n -3', n is an integer of 2 or more), and a nucleotide sequence (5'-(TAAAATAGAA) n- 3', n is an integer of 2 or more) linked in order from the 5' side, (b2) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 (5'-TGGGAATAGAATGGGAA(TAGAA) 2 (TGGAA) 3 TAGAATGGAA-3', n is an integer of 2 or more), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 (5'-TAGAA
  • the combination of the above 5' and 3' regions in the abnormal repeat region of the mutant BEAN1 gene is not particularly limited, and can be any combination.
  • the sequences of the above 5' and 3' regions are illustrated in FIG.
  • the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the invention comprises three regions: a non-mutated region, a 5' region, a core repeat region, a 3' region, and a 3' region that 5' flanks the 5' region.
  • the non-mutated region flanking the ' side it can be designed to include the boundary position of the two flanking regions. That is, the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the present invention includes a non-mutated region 5' adjacent to the 5' region, a 5' region, a core repeat region, a 3' region, and a Each of the bases complementary to the terminal bases of the two adjacent regions may be included in the adjacent non-mutated region.
  • a "non-mutated region” is a region that is adjacent to an abnormal repeat region and that can also be found in a normal gene in the locus of a mutant gene containing an abnormal repeat region.
  • the non-mutated region may be any gene region that can be found in healthy individuals (for example, individuals not suffering from SCA31 or SCA10), and genetic polymorphisms (for example, single nucleotide polymorphisms found in healthy individuals or repeated sequence repeats). polymorphism in terms of frequency) shall be allowed.
  • the non-mutated region is either the region 5' to the 5' region of the aberrant repeat region or the region 3' to the 3' region of the aberrant repeat region.
  • the entire length of the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the present invention is contained in the base sequence complementary to either the 5' region, core repeat region, or 3' region.
  • the nucleic acid molecule of this aspect is selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 156-189 and 207-209, where u can be t and t can be u. consists of any one of the base sequences
  • the mutant gene encoding the transcript targeted by the nucleic acid molecule of the present invention is a mutant TK2 gene.
  • the core repeat region is a nucleotide sequence (5'-(TGGAA) n- 3', n is an integer of 2 or more), that is, the nucleotide sequence (5'-(TTCCA) n - 3'; n is an integer of 2 or more).
  • n varies depending on the case and is not limited to the following range, but an integer of 2-500, 100-400, or 200-400 is exemplified.
  • nucleotide sequences of the 5' and 3' regions of the abnormal repeat region of the mutant TK2 gene are not particularly limited as long as they are sequences that can be found in patients with SCA31 spinocerebellar ataxia.
  • the 5' region of the abnormal repeat region of the mutant TK2 gene includes, for example, a sequence obtained by repeating the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 multiple times (5'-(TTCTATTTTA) n -3'; n is an integer of 2 or more), and a region containing a sequence (5'-(TTCTA) n -3'; n is an integer of 2 or more) in which the nucleotide sequence (5'-TTCTA-3') shown in SEQ ID NO: 17 is repeated multiple times.
  • the specific base sequences include the following (c1) to (c5): (c1) a nucleotide sequence obtained by repeating the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 multiple times (5'-(TTCTATTTTA) n -3', n is an integer of 2 or more), the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 (5'-TTCTA- 3') repeated multiple times (5'-(TTCTA) n -3', n is an integer of 2 or more), and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 (5'-TTCCA (TTCTA) 2 (TTCCA) 2 (TTCTA) 2 TTCCCATTCCATTCCCA-3') linked in order from the 5' side, (c2) a nucleotide sequence obtained by repeating the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 multiple times (5'-(TTCTATTTTA) n -3', n is an integer of 2 or more), the nucleotide sequence shown in S
  • the 3′ region in the abnormal repeat region of the mutant TK2 gene includes, for example, a region containing the base sequence (5′-GTGA-3′) shown in SEQ ID NO:26.
  • the specific base sequences include the following (d1) to (d4): (d1) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 (5'-(TTCTA) 2 TTTTAGTGA-3'), (d2) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 (5'-(TTCTA) 4 TTTTAGTGA-3'), (d3) the nucleotide sequence (5'-GTGA-3') shown in SEQ ID NO: 26, and (d4) the nucleotide sequence (5'-TTCTA-3') repeated multiple times (5') -(TTCTA) n -3'; n is an integer of 2 or more) and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 (5'-GTGA-3') linked in order from the 5' side.
  • “n” varies depending on the case and
  • the combination of the above 5' and 3' regions in the abnormal repeat region of the mutant TK2 gene is not particularly limited, and can be any combination.
  • the sequences of the above 5' and 3' regions are illustrated in FIG.
  • the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the invention comprises three regions: a non-mutated region, a 5' region, a core repeat region, a 3' region, and a 3' region that 5' flanks the 5' region.
  • the non-mutated region flanking the ' side it can be designed to include the boundary position of the two flanking regions. That is, the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the present invention includes a non-mutated region 5' adjacent to the 5' region, a 5' region, a core repeat region, a 3' region, and a Each of the bases complementary to the terminal bases of the two adjacent regions may be included in the adjacent non-mutated region.
  • the entire length of the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the present invention is contained in the base sequence complementary to either the 5' region, core repeat region, or 3' region.
  • nucleic acid molecules of this aspect are SEQ ID NOs: 33-53, 58-139, 141-150, 152-155, and 204-206, where u can be t, t may be u).
  • the mutant gene encoding the transcript targeted by the nucleic acid molecule of the present invention is a mutant ATXN10 gene.
  • the core repeat region is a nucleotide sequence (5'-(TGGAA) n- 3', n is an integer of 2 or more), that is, the nucleotide sequence (5'-(TTCCA) n - 3'; n is an integer of 2 or more).
  • n varies depending on the case and is not limited to the following range, but an integer of 2-600, 100-500, or 200-400 is exemplified.
  • Nucleotide sequences of the 5′ region and the 3′ region of the abnormal repeat region of the mutant ATXN10 gene are not particularly limited as long as they are sequences that can be found in patients with SCA10 spinocerebellar ataxia.
  • Specific examples of the 5' region in the abnormal repeat region of the mutant ATXN10 gene include, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 (5'-TTCTA-3'), or a nucleotide sequence repeated multiple times (5'- (TTCTA) n -3 ', n is an integer of 2 or more) (n is an integer of 2 or more, varies depending on the case, and is not limited to the following range, for example, 2 to 600, 100-500, or 200-400 integers).
  • 3' region in the abnormal repeat region of the mutant ATXN10 gene include, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 (5'-TTCTA-3'), or a nucleotide sequence obtained by repeating it multiple times (5 '-(TTCTA) n -3', n is an integer of 2 or more) (n is an integer of 2 or more, varies depending on the case, and is not limited to the following ranges, for example is an integer greater than or equal to 100, greater than or equal to 200, or greater than or equal to 400).
  • the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the invention comprises three regions: a non-mutated region, a 5' region, a core repeat region, a 3' region, and a 3' region that 5' flanks the 5' region.
  • the non-mutated region flanking the ' side it can be designed to include the boundary position of the two flanking regions. That is, the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the present invention includes a non-mutated region 5' adjacent to the 5' region, a 5' region, a core repeat region, a 3' region, and a Each of the bases complementary to the terminal bases of the two adjacent regions may be included in the adjacent non-mutated region.
  • the entire length of the target binding region contained in the nucleic acid molecule of the present invention is contained in the base sequence complementary to either the 5' region, core repeat region, or 3' region.
  • the nucleic acid molecule of this aspect comprises SEQ ID NOS: 33-37, 58-61, 64-67, 70-139, 141-150, 152-155, and 204-206, where u in the sequence is may be t, and t may be u).
  • the base length of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited. Or at least 15 bases long.
  • the base length of the nucleic acid molecule is 40 bases or less, 35 bases or less, 30 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, 22 bases or less, 21 bases or less, 20 bases or less. It may have a base length of 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, or 16 bases or less.
  • the base length of the nucleic acid molecule may be, for example, 10-40 bases, 12-30 bases, or 15-25 bases.
  • the choice of length can be determined by the balance between the strength of the antisense effect and the specificity of the nucleic acid strand for its target, among other factors such as cost, synthetic yield, and the like.
  • the base length of the nucleic acid molecule as a whole may be the base length of the bound nucleic acid added to the above base length.
  • Nucleosides contained in the nucleic acid molecules of the present invention may be natural nucleosides (deoxyribonucleosides, ribonucleosides, or both) and/or non-natural nucleosides.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be a mixmer.
  • the term "mixmer” refers to a nucleic acid chain that contains alternating natural and unnatural nucleosides of periodic or random segment length and is free of four or more contiguous deoxyribonucleosides and ribonucleosides. .
  • Mixmers in which the unnatural nucleoside is a bridged nucleoside and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "BNA/DNA mixmers".
  • Mixmers in which the non-natural nucleoside is a peptide nucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "peptide nucleic acid/DNA mixmers".
  • Mixmers in which the unnatural nucleoside is a morpholinonucleic acid and the natural nucleoside is a deoxyribonucleoside are particularly referred to as "morpholinonucleic acid/DNA mixmers”.
  • Mixmers are not limited to containing only two nucleosides.
  • Mixmers can include any number of types of nucleosides, whether natural or modified nucleosides or nucleoside mimetics.
  • one may have one or two contiguous deoxyribonucleosides separated by a bridging nucleoside (eg, LNA nucleosides).
  • Bridging nucleosides may further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be a gapmer.
  • the term “gapmer” basically refers to a "central region” (DNA gap region) and wing regions located directly at its 5' and 3' ends ("5' wing region” and (referred to as the "3' wing region”).
  • the central region in the gapmer may contain at least 2 (e.g., at least 3 or at least 4) contiguous deoxyribonucleosides (modified nucleobases recognized by RNase H, e.g., 5-methylcytosine). may comprise), wherein said wing regions comprise at least one non-natural nucleoside.
  • non-natural nucleosides contained in the wing regions usually have higher binding strength to RNA than natural nucleosides and have high resistance to nucleolytic enzymes (nucleases and the like).
  • the non-natural nucleosides that make up the 5' and 3' wing regions may be, for example, bridged nucleosides and/or 2' modified nucleosides.
  • said gapmers are specifically referred to as "BNA/DNA gapmers".
  • the number of bridging nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region is at least 1, and may be, for example, 2 or 3.
  • the bridging nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region may be present continuously or non-contiguously within the 5' wing region and the 3' wing region.
  • Bridging nucleosides can further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • a bridging nucleoside may be an LNA nucleoside or an ENA nucleoside.
  • LNA/DNA gapmers When the bridging nucleosides are LNA nucleosides, said gapmers are referred to as "LNA/DNA gapmers".
  • the gapmers are called "ENA/DNA gapmers”.
  • the gapmers are specifically referred to as "peptide nucleic acid gapmers".
  • the unnatural nucleosides making up the 5' and 3' wing regions comprise or consist of morpholino nucleic acids
  • said gapmers are specifically referred to as "morpholino nucleic acid gapmers”.
  • the non-natural nucleosides constituting the 5' wing region and 3' wing region comprise or consist of a 2' modified nucleoside
  • the 2' modified group of the 2' modified nucleoside is a 2'-O-methyl group or a 2' It may be an -O-methoxyethyl group.
  • the number of 2' modified nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region is at least 1, and may be, for example, 2 or 3.
  • the 2' modified nucleosides contained in the 5' wing region and the 3' wing region may be present consecutively or non-contiguously within the 5' wing region and the 3' wing region.
  • 2' modified nucleosides can further include modified nucleobases (eg, 5-methylcytosine).
  • non-natural nucleosides constituting the 5' wing region and 3' wing region include or consist of bridged nucleosides and 2' modified nucleosides, two or more types of bridged nucleosides and/or 2' modified nucleosides are combined.
  • LNA nucleoside and ENA nucleoside may have been For example, a combination of the two: LNA nucleoside and ENA nucleoside; LNA nucleoside and 2'-O-methyl nucleoside; LNA nucleoside and 2'-O-methoxyethyl nucleoside; ENA nucleoside and 2'-O-methyl nucleoside; and 2'-O-methoxyethyl nucleosides; or 2'-O-methyl nucleosides and 2'-O-methoxyethyl nucleosides.
  • LNA nucleosides For example, three combinations of LNA nucleosides, ENA nucleosides, and 2'-O-methyl nucleosides; LNA nucleosides, ENA nucleosides, and 2'-O-methoxyethyl nucleosides; or ENA nucleosides, 2'-O-methyl nucleosides. , and 2′-O-methoxyethyl nucleosides.
  • a combination of four types may be LNA nucleoside, ENA nucleoside, 2'-O-methyl nucleoside, and 2'-O-methoxyethyl nucleoside.
  • the DNA gap region is, for example, 4-10 bases long, 5-8 bases long, 5-8 bases long, 6-8 bases long, 7 bases long or 8 bases long. There may be. DNA gap regions are composed of the natural nucleosides of DNA.
  • the base lengths of the 5' wing region and 3' wing region of the gapmer are each independently at least 2 bases long, for example, 2 to 10 bases long, 2 to 7 bases long. It may be 3 bases long, 3-5 bases long, 3-4 bases long, or 3 bases long.
  • Nucleic acid molecules of the invention may comprise at least one LNA or ENA in the 5' and 3' wing regions.
  • the 5' wing region may comprise at least one LNA or ENA, such as 1-4, 2-4, 2-3, such as 2.
  • the 3' wing region may comprise at least one LNA or ENA, such as 1-4, 2-4, 2-3, such as 2.
  • the type, number and position of modifications in the 5' wing region and the 3' wing region may be the same or different.
  • the 5' wing region and 3' wing region may be combined with 2'-O-methylnucleoside, 2'-O-methoxyethyl nucleoside, 2'-LNA or ENA, and the type of modification is 1 to There may be 4 types, 2-3 types, such as 2 types, and the types may be the same or different in the 5' and 3' wing regions.
  • examples of base lengths of the 5' wing region, DNA gap region, and 3' wing region are 2-8-3, 3-8-2, and 3. -7-3, 4-6-3, 3-6-4, 4-5-4, 4-7-3, 3-7-4, 4-6-4, 5-6-3, 3-6 -5, 3-7-5, 5-7-3, 4-7-4, 4-6-5, 5-6-4, 5-5-5, 5-6-5 and the like.
  • A-B-C indicates the base length of the 5' wing region
  • B indicates the base length of the DNA gap region
  • C indicates the base length of the 3' wing region.
  • a nucleic acid strand having a wing region only on either the 5'-end side or the 3'-end side is called a "hemigapmer" in the art. shall be included.
  • the internucleoside linkages in the nucleic acid molecule of the present invention may be naturally occurring internucleoside linkages and/or modified internucleoside linkages. Although not limited, it is preferred that at least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the terminus (5' terminus, 3' terminus, or both ends) of the nucleic acid molecule of the present invention are modified internucleoside linkages. .
  • two internucleoside bonds from the end of a nucleic acid chain mean the internucleoside bond closest to the end of the nucleic acid chain and the internucleoside bond adjacent thereto and located on the opposite side of the end.
  • Modified internucleoside linkages in terminal regions of nucleic acid strands are preferred because they can reduce or inhibit unwanted degradation of the nucleic acid strand.
  • all or part of the internucleoside linkages of the nucleic acid molecule may be modified internucleoside linkages.
  • Modified internucleoside linkages may be phosphorothioate linkages.
  • nucleic acid molecules of the present invention may contain nucleoside mimetics or nucleotide mimetics in whole or in part.
  • Nucleotide mimetics may be peptide nucleic acids and/or morpholino nucleic acids.
  • a nucleic acid molecule of the invention may comprise or consist of a morpholino nucleic acid.
  • natural ribonucleosides of the nucleic acid molecules of the invention are less than half the length, or are absent.
  • the nucleic acid molecules of the invention may contain modified nucleobases.
  • the number of modified nucleobases is not limited and may be, for example, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, or at least 6.
  • the antisense effect of the nucleic acid molecule of the present invention on the target transcript can be measured by a method known in the art. For example, after introducing a nucleic acid molecule into a cell or the like, measurement may be performed using a known technique such as Northern blotting, quantitative PCR, or Western blotting. By measuring the expression level of the target gene or the level of the target transcript (for example, the amount of RNA such as mRNA, the amount of cDNA, etc.) in a specific tissue (e.g. brain), target gene expression by nucleic acid molecules at those sites It can be determined whether or not to be suppressed.
  • a specific tissue e.g. brain
  • Measured target gene expression or target transcript level is at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 40%, or at least 50% compared to a negative control (e.g., vehicle administration or no treatment) A decrease indicates that the test nucleic acid compound is capable of producing an antisense effect.
  • a negative control e.g., vehicle administration or no treatment
  • the invention relates to a double-stranded nucleic acid complex.
  • a double-stranded nucleic acid complex of the present invention comprises a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand.
  • the first nucleic acid strand can function as an ASO. Specific configurations of each nucleic acid strand are shown below.
  • the first nucleic acid strand can be selected from the embodiments of nucleic acid molecules described above.
  • the first nucleic acid strand consists of the above nucleic acid molecules that are gapmers; or (1) a central region comprising at least two (e.g., at least three or at least four) contiguous deoxyribonucleosides, (2 ) a 5' wing region containing a non-natural nucleoside located on the 5' end of the central region, and (3) a 3' wing region containing a non-natural nucleoside located on the 3' end of the central region.
  • It consists of a nucleic acid molecule as described above, comprising The gapmer and the structures of (1) to (3) above conform to the description of the nucleic acid molecule above.
  • the second nucleic acid strand is a nucleic acid molecule containing a base sequence complementary to the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand is annealed to the first nucleic acid strand through hydrogen bonding of complementary base pairs.
  • International Publication No. 2013/089283 Nishina K, et. al., Nature Communication, 2015, 6:7969, and Asami Y, et al., Drug Discoveries & Therapeutics. 2016; 10( 5):256-262, heteroduplex oligonucleotides (HDOs).
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention comprises a first nucleic acid strand selected from any of the nucleic acid molecule embodiments described above and a second nucleic acid strand comprising a base sequence complementary to the first nucleic acid strand. and nucleic acid strands.
  • the second nucleic acid strand may comprise ribonucleosides, deoxyribonucleosides, and/or modified nucleosides.
  • nucleosides in the region consisting of a base sequence complementary to the central region of the first nucleic acid strand are (a) deoxyribonucleosides; (b) deoxyribonucleosides and ribonucleosides; ) deoxyribonucleosides and 2'-modified nucleosides; (d) ribonucleosides and 2'-modified nucleosides; or (e) deoxyribonucleosides, ribonucleosides and 2'-modified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand comprises a region comprising at least two consecutive ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides complementary to at least two consecutive deoxyribonucleosides in the central region of the first nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid strand contains at least 3 or at least 4 contiguous ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides complementary to at least 3 or at least 4 contiguous deoxyribonucleosides in the central region of the first nucleic acid strand.
  • the number of continuous deoxyribonucleosides in the central region of the first nucleic acid strand and the number of continuous ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides complementary to the continuous deoxyribonucleosides in the second nucleic acid strand are the same. may be different.
  • the number of said consecutive deoxyribonucleosides may be at least 4 and the number of said consecutive ribonucleosides and/or deoxyribonucleosides may be at least 3.
  • the second nucleic acid strand may contain a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or the 3' wing region of the first nucleic acid strand.
  • the region consisting of a nucleotide sequence complementary to the 5' wing region and/or 3' wing region of the first nucleic acid strand may contain at least one non-natural nucleoside, and the non-natural nucleoside is For example, it may be a bridged nucleoside and/or a 2' modified nucleoside.
  • the bridging nucleosides in the second nucleic acid strand may be LNA nucleosides, ENA nucleosides, or BNA NC nucleosides.
  • the 2' modified group of the 2' modified nucleoside in the second nucleic acid strand may be a 2'-O-methyl group or a 2'-O-methoxyethyl group.
  • the internucleoside linkage in the second nucleic acid strand may be a naturally occurring internucleoside linkage and/or a modified internucleoside linkage. Although not limited, at least 1, at least 2, or at least 3 internucleoside linkages from the end (5' end, 3' end, or both ends) of the second nucleic acid strand are preferably modified internucleoside linkages. In one embodiment, all or part of the internucleoside linkages of the second nucleic acid strand may be modified internucleoside linkages.
  • the second nucleic acid strand may contain modified internucleoside linkages in a region consisting of a base sequence complementary to the 5' wing region and/or the 3' wing region of the first nucleic acid strand.
  • Modified internucleoside linkages may be phosphorothioate linkages.
  • the second nucleic acid strand can contain 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides.
  • the number of 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides in the second nucleic acid strand is not limited. For example, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% of the total number of nucleosides in said second nucleic acid strand %, or at least 95%, or 100% may be 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides.
  • all of the nucleosides are 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides.
  • the second nucleic acid strand comprises one or contiguous two or more 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides located at the 5' terminus and/or one or contiguous More than one 2'-O-methoxyethyl modified nucleoside can be included.
  • the number of 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides located at the 5'-terminus and/or the 3'-terminus is not limited.
  • the second nucleic acid strand comprises one or consecutive 2, 3, 4, 5, 6, or 7 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides located at the 5' end, and/ or may contain one or consecutive 2, 3, 4, 5, 6, or 7 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides located at the 3' terminus.
  • the second nucleic acid strand has 1 to 7 at positions other than one or two or more consecutive 2'-O-methoxyethyl-modified nucleosides located at the 5' end and / or 3' end. 2'-O-Methoxyethyl modified nucleosides may also be included.
  • the type of nucleoside other than the 2'-O-methoxyethyl-modified nucleoside in the second nucleic acid strand is not particularly limited.
  • all nucleosides other than 2'-O-methoxyethyl modified nucleosides may be deoxyribonucleosides.
  • the second nucleic acid strand may comprise modified nucleobases.
  • the number of modified nucleobases is not limited and may be, for example, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, or at least 6.
  • the second nucleic acid strand may further comprise at least one overhang region located on one or both of the 5' and 3' ends of the complementary region.
  • the "overhang region” is the region adjacent to the complementary region, and when the first and second nucleic acid strands are annealed to form a double-stranded structure, the 5' end of the second nucleic acid strand.
  • the second nucleic acid extends beyond the 3' end of the nucleic acid strand and/or the 3' end of the second nucleic acid strand extends beyond the 5' end of the first nucleic acid strand, i.e.
  • the overhang region in the second nucleic acid strand may be located on the 5'-terminal side or the 3'-terminal side of the complementary region.
  • the overhang regions in the second nucleic acid strand may be located on the 5'-end side and the 3'-end side of the complementary region.
  • a functional moiety may be bound to the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand, eg, the second nucleic acid strand.
  • the binding between the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand and the functional moiety may be direct binding or indirect binding via another substance.
  • it is preferable that the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand and the functional moiety are directly bound by a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, or the like, from the viewpoint of obtaining a more stable bond. , covalent bonding is more preferred.
  • the structure of the "functional portion” is not particularly limited, and imparts a desired function to the double-stranded nucleic acid complex that binds it. Desired functions include labeling, purification and target delivery functions. Examples of moieties that impart a labeling function include compounds such as fluorescent proteins and luciferase. Examples of moieties that impart a purification function include compounds such as biotin, avidin, His-tag peptides, GST-tag peptides, and FLAG-tag peptides.
  • the first nucleic acid strand and / or the second nucleic acid strand it is preferable that a molecule having an activity to deliver a double-stranded nucleic acid complex in certain embodiments to a target site is bound as the functional moiety.
  • moieties that provide targeted delivery functions include lipids, antibodies, aptamers, ligands for specific receptors, and the like.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand, eg, the second nucleic acid strand is associated with a lipid.
  • Lipids include tocopherol, cholesterol, fatty acids, phospholipids and their analogs; folic acid, vitamin C, vitamin B1, vitamin B2; estradiol, androstane and their analogs; steroids and their analogs; LDLR, SRBI or LRP1 /2 ligands; FK-506, and cyclosporin; lipids described in PCT/JP2019/12077 and PCT/JP2019/10392;
  • the lipid may be tocopherol or analogues thereof and/or cholesterol or analogues thereof, substituted or unsubstituted C 1-30 alkyl groups, substituted or unsubstituted C 2-30 alkenyl groups, or It may be a substituted or unsubstituted C 1-30 alkoxy group.
  • the second nucleic acid strand include to
  • the functional portion may be ligated to the 5' end, 3' end, or both ends of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand.
  • the functional moiety may be linked to nucleotides within the first and/or second nucleic acid strand.
  • the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand contains two or more functional moieties such as lipids, which may be linked to multiple positions of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand, and/or may be linked as a group to one position of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand.
  • One functional moiety may be linked to each of the 5' and 3' ends of the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand.
  • the binding between the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand and the functional moiety may be direct binding or indirect binding mediated by another substance.
  • the functional moiety is preferably directly attached to the first and/or second nucleic acid strand via covalent, ionic, hydrogen bonding, etc., and more A covalent bond is more preferable from the viewpoint that a stable bond can be obtained.
  • the functional portion may also be attached to the first nucleic acid strand and/or the second nucleic acid strand via a cleavable or uncleavable linker.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand can be linked via a linker to form a single strand.
  • a linker can be any polymer. Examples include polynucleotides, polypeptides, alkylenes, and the like.
  • the linker can be composed of, for example, natural nucleotides such as DNA and RNA, or non-natural nucleotides such as peptide nucleic acids and morpholino nucleic acids.
  • the linker may have a chain length of at least 1 base, such as 3-10 bases or 4-6 bases. A chain length of 4 bases is preferred.
  • the linker may take the form of a hinge (hairpin loop). The position of the linker can be either on the 5' side or the 3' side of the first nucleic acid strand. The 5' end of the first nucleic acid strand and the 3' end of the second nucleic acid strand are linked via a linker.
  • “Cleavable linker” means a linking group that is cleaved under physiological conditions, for example, intracellularly or in an animal body (eg, human body).
  • cleavable linkers are selectively cleaved by endogenous enzymes such as nucleases.
  • Cleavable linkers include amides, esters, phosphodiester esters or both, phosphate esters, carbamates, and disulfide bonds, as well as natural DNA linkers.
  • Non-cleavable linker means a linker that is not cleaved under physiological conditions, such as within a cell or within an animal (eg, within a human body).
  • Non-cleavable linkers include, but are not limited to, phosphorothioate linkages, and linkers composed of modified or unmodified deoxyribonucleosides or modified or unmodified ribonucleosides linked by phosphorothioate linkages.
  • the linker is a nucleic acid such as DNA or an oligonucleotide
  • the chain length is not particularly limited, but usually it may be 2 to 20 bases, 3 to 10 bases, or 4 to 6 bases.
  • linker represented by the following formula (I).
  • L2 is a substituted or unsubstituted C1 - C12 alkylene group (e.g. propylene, hexylene, dodecylene), a substituted or unsubstituted C3 - C8 cycloalkylene group (e.g.
  • L3 represents -NH- or a bond
  • L4 is a substituted or unsubstituted C1 - C 12 alkylene groups (e.g.
  • C3 - C8 cycloalkylene groups e.g. cyclohexylene
  • -( CH2 ) 2- [O -( CH2 ) 2 ] m- or represents a bond, where m represents an integer from 1 to 25
  • the linker of formula (I) is such that L 2 is an unsubstituted C 3 -C 6 alkylene group (eg, propylene, hexylene), —(CH 2 ) 2 —O—( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 2- O-( CH2 ) 3- or -( CH2 ) 2- O-(CH2) 2- O-( CH2 ) 2- O- (CH 2 ) 2 -O-( CH2 ) 3- , L3 is -NH-, and L4 and L5 are a bond.
  • C 3 -C 6 alkylene group eg, propylene, hexylene
  • L3 is -NH-
  • L4 and L5 are a bond.
  • the base lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are not particularly limited, but are at least 8 bases long, at least 9 bases long, at least 10 bases long, at least 11 bases long, at least 12 bases long, at least 13 bases long, at least It may be 14 bases long, or at least 15 bases long.
  • the base lengths of the first and second nucleic acid strands are 40 bases or less, 35 bases or less, 30 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, and 22 bases or less. , 21 bases or less, 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, or 16 bases or less.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may have the same length or different lengths (eg, one may be 1 to 3 bases shorter or longer).
  • the double-stranded structure formed by the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may contain a bulge.
  • the choice of length can be determined by the balance between the strength of the antisense effect and the specificity of the nucleic acid strand for its target, among other factors such as cost, synthetic yield, and the like.
  • the base length of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand as a whole is the length of the nucleic acid bound to the above base length.
  • a base length may be added.
  • the base length of the nucleic acid to be bound is not limited, but may be, for example, at least 10 base length, at least 15 base length, or at least 20 base length, and 100 base length or less, 80 base length or less, or 60 base length or less. , 40 bases or less, or 30 bases or less.
  • the mutant gene encoding the target transcript of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention is a mutant TK2 gene, and the base sequence of the first nucleic acid strand is SEQ ID NO: 65 (wherein the sequence may be u), and the base sequence of the second nucleic acid strand is SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, or SEQ ID NO: 203 (provided that , t in the sequence may be u).
  • the base sequence of the first nucleic acid strand in this embodiment consists of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 65 (however, t in the sequence may be u), sugar modifications and internucleoside Modification is not particularly limited.
  • all or part of the internucleoside linkages may be modified internucleoside linkages, and the modified internucleoside linkages may be phosphorothioate linkages. The same applies to the second nucleic acid strand.
  • the mutant gene encoding the target transcript of the double-stranded nucleic acid complex of the present invention is a mutant TK2 gene
  • the first nucleic acid strand consists of the nucleic acid chain set forth in SEQ ID NO: 65
  • the second nucleic acid strand consists of the nucleic acid strand set forth in SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:202, or SEQ ID NO:203.
  • the first nucleic acid strand in this embodiment is specified as the structure shown in SEQ ID NO: 65 in all of its base sequence, sugar modifications, and internucleoside linkages. The same applies to the second nucleic acid strand.
  • the invention relates to pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex described herein as an active ingredient, It can be used for therapy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain two or more types of nucleic acid molecules and/or double-stranded nucleic acid complexes described herein.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a therapeutic drug for spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31) comprising a nucleic acid molecule and/or a double-stranded nucleic acid complex that targets a transcript of a mutant BEAN1 gene.
  • SCA31 spinocerebellar ataxia type 31
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a therapeutic drug for spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31) comprising a nucleic acid molecule and/or a double-stranded nucleic acid complex that targets a transcript of a mutant TK2 gene.
  • SCA31 spinocerebellar ataxia type 31
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a nucleic acid molecule and/or a double-stranded nucleic acid complex that targets the transcript of the mutant BEAN1 gene, and a nucleic acid molecule that targets the transcript of the mutant TK2 gene. and/or a double-stranded nucleic acid complex for treating spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31).
  • SCA31 spinocerebellar ataxia type 31
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a therapeutic drug for spinocerebellar ataxia type 10 (SCA10) comprising a nucleic acid molecule and/or a double-stranded nucleic acid complex that targets a transcript of a mutant ATXN10 gene.
  • SCA10 spinocerebellar ataxia type 10
  • the amount (content) of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex contained in the pharmaceutical composition depends on the type of nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex, the site to be delivered (e.g., brain), and the dosage form of the pharmaceutical composition. , the dose of the pharmaceutical composition, and the type of carrier described below. Therefore, it is sufficient to determine them as appropriate in consideration of each condition.
  • a single dose of the pharmaceutical composition is arranged to contain an effective amount of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex.
  • the term "effective amount” refers to the amount necessary for the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex to function as an active ingredient.
  • an “effective amount” may impart little or no adverse side effects to the organism to which it is applied. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of administration, and frequency of administration. Ultimately, it is determined by the judgment of a doctor, veterinarian, pharmacist, or the like.
  • Subject information is various individual information of a living body to which the pharmaceutical composition is applied. For example, if the subject is a human, the information includes age, weight, sex, diet, health condition, disease progression and severity, drug sensitivity, presence or absence of concomitant drugs, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may consist only of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex described herein.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise ancillary components such as carriers in addition to the nucleic acid molecules or double-stranded nucleic acid complexes described herein.
  • a pharmaceutical composition of the invention can comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to additives commonly used in the field of formulation technology. For example, solvents, vegetable oils, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, pH adjusters, stabilizers, flavorants, fragrances, excipients, vehicles, preservatives, binders, diluents, Tonicity agents, soothing agents, bulking agents, disintegrating agents, buffering agents, coating agents, lubricants, coloring agents, sweetening agents, thickening agents, flavoring agents, solubilizing agents, and other additives.
  • the solvent may be, for example, water or other pharmaceutically acceptable aqueous solution, or a pharmaceutically acceptable organic solvent.
  • Aqueous solutions include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, phosphate buffers, and sodium acetate buffers.
  • auxiliary agents include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low-concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • the above carrier avoids or suppresses in vivo enzymatic degradation of the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex, which is the active ingredient, facilitates formulation and administration, and maintains the dosage form and efficacy. It is used for , and may be used appropriately as necessary.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention does not inactivate the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex described herein, which is an active ingredient, by degradation or the like, and the pharmacological effect of the active ingredient is exhibited in vivo. It is not particularly limited as long as it can be exhibited.
  • Specific dosage forms differ depending on the administration method and/or prescription conditions. Since administration methods can be broadly classified into parenteral administration and oral administration, dosage forms suitable for each administration method may be used.
  • the preferred dosage form is a liquid formulation that can be administered directly to the target site or systemically administered via the circulatory system.
  • liquid formulations include injections. Injections are appropriately combined with the aforementioned excipients, elixirs, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, pH adjusters, etc., and mixed in a unit dosage form generally accepted for pharmaceutical practice. It can be formulated by Other formulations include ointments, plasters, cataplasms, transdermal formulations, lotions, inhalants, aerosols, eye drops, and suppositories.
  • preferred dosage forms include solid formulations (including tablets, capsules, drops, and lozenges), granules, powders, powders, and liquid formulations (internal water, emulsion, and syrup). ). If it is a solid formulation, it is optionally made into a dosage form with a coating known in the art, such as a sugar-coated tablet, a gelatin-coated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, and a multilayer tablet. be able to.
  • each dosage form described above are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art for each dosage form.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention it may be formulated according to a conventional method in the technical field.
  • Administration can be systemic or local.
  • the route of administration may be oral or parenteral.
  • Specific examples of parenteral administration include intravenous administration, intraarterial administration, administration by blood transfusion, intraperitoneal administration, intracerebroventricular administration, intrathecal administration, intraocular administration, intramuscular administration, and subcutaneous administration (implanted continuous subcutaneous administration). including), intradermal, intravesical, intravaginal, rectal, inhalation or nasal, and tracheal/bronchial administration.
  • intracerebroventricular administration or intrathecal administration which is the target site, is suitable.
  • the dosage or ingestion is, for example, from 0.00001 mg/kg/day to 10000 mg/kg/day of the contained nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex, or 0.001 mg/kg/day to 100 mg/kg/day.
  • the pharmaceutical composition may be single-dose or multi-dose. In the case of multiple administrations, it can be administered daily or at appropriate time intervals (eg, at intervals of 1 day, 2 days, 3 days, 1 week, 2 weeks, 1 month), for example, 2 to 20 doses.
  • a single dose of the above nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex is, for example, 0.001 mg/kg or more, 0.005 mg/kg or more, 0.01 mg/kg or more, 0.1 mg/kg or more, 0.25 mg/kg or more , 0.5 mg/kg or more 1 mg/kg or more 2.5 mg/kg or more 0.5 mg/kg or more 1.0 mg/kg or more mg/kg or more, 10 mg/kg or more, 20 mg/kg or more, 30 mg/kg or more, 40 mg/kg or more, 50 mg/kg or more, 75 mg/kg or more, 100 mg/kg or more, 150 mg/kg kg or more, 200 mg/kg or more, 300 mg/kg or more, 400 mg/kg or more, or 500 mg/kg or more, for example, any within the range of 0.001 mg/kg to 500 mg/kg amount of ) can be selected as appropriate.
  • the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex of the present invention may be administered at a dose of 0.01 to 10 mg/kg (eg, about 6.25 mg/kg) twice a week for 4 times.
  • the nucleic acid molecule or double-stranded nucleic acid complex is administered at a dose of 0.05 to 30 mg/kg (eg, about 25 mg/kg) at a frequency of 1 to 2 times a week, 2 to 4 times, for example, twice a week. Two doses may be given.
  • Employing such a dosing regimen can reduce toxicity (eg, avoid platelet depletion) and reduce burden on the subject compared to single administration of higher doses.
  • the pharmaceutical composition has an additive inhibitory effect in cells even after repeated administration.
  • SCA31 Spinocerebellar Ataxia Type 31
  • nucleic acid molecules and/or double-stranded nucleic acid complexes that target transcripts of mutant TK2 genes, and/or mutant TK2 genes are also provided.
  • nucleic acid molecules and/or double-stranded nucleic acids targeting transcripts of the mutant ATXN10 gene described herein for use in the treatment of Spinocerebellar Ataxia Type 10 (SCA10) Composites are also provided.
  • the invention relates to a method of producing an antisense effect on a transcript comprising administering to a subject a nucleic acid molecule, double-stranded nucleic acid complex, or pharmaceutical composition described herein. .
  • the method may be a method of treating or preventing disease in a subject.
  • the invention relates to a method of treatment comprising administering to a patient an effective amount of a nucleic acid molecule, double-stranded nucleic acid complex, or pharmaceutical composition described herein.
  • the disease targeted by the therapeutic method of this embodiment is spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31) or spinocerebellar ataxia type 10 (SCA10).
  • a method for treating spinocerebellar ataxia type 31 (SCA31) comprises administering to a patient an effective amount of a nucleic acid molecule and/or a double-stranded nucleic acid complex that targets a transcript of the mutant BEAN1 gene described herein.
  • a method of treating spinocerebellar ataxia type 10 comprises administering to the patient an effective amount of a nucleic acid molecule and/or a double-stranded nucleic acid complex that targets a transcript of the mutant ATXN10 gene described herein. including administering
  • a nucleic acid molecule, double-stranded nucleic acid complex, or pharmaceutical composition of the present invention can be produced by a person skilled in the art by appropriately selecting known methods. Although not limited, it usually starts with designing and manufacturing each of the first and second nucleic acid strands that constitute the nucleic acid molecule or the double-stranded nucleic acid complex.
  • a nucleic acid molecule or first nucleic acid strand is designed based on information on the base sequence of a target transcript (for example, the base sequence of a target gene), and a second nucleic acid strand is designed as its complementary strand.
  • each nucleic acid strand is synthesized using a phosphoramidite method using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer such as GE Healthcare, Thermo Fisher Scientific, and Beckman Coulter. can be combined. After that, the obtained oligonucleotide can be purified using a reverse phase column, an ion exchange column, or the like.
  • the first nucleic acid strand may be produced according to the above method.
  • the functional moiety-bound second nucleic acid strand can be produced by performing the above-described synthesis and purification using a nucleic acid species to which a functional moiety has been bound in advance.
  • a nucleic acid species with a pre-bound functional moiety may be used to produce the second nucleic acid strand by performing the synthesis and purification described above.
  • functional moieties may be bound by known methods to the second nucleic acid strand produced by carrying out the synthesis and purification described above. After producing each nucleic acid strand, the first and second nucleic acid strands are annealed to produce a double-stranded nucleic acid complex to which the target functional moiety is bound.
  • Nucleic acids prepared by this method are mixed in a suitable buffer solution and denatured at about 90°C to 98°C for several minutes (eg, 5 minutes), after which the nucleic acids are annealed at about 30°C to 70°C for about 1 to 8 hours. to produce one of the double-stranded nucleic acid complexes of the present invention.
  • Nucleic acid chains can also be obtained by ordering from various manufacturers (eg, Gene Design Co., Ltd.) specifying the nucleotide sequence, modification site and type.
  • the annealing step can be performed by allowing the substrate to stand at room temperature (about 10° C. to 35° C.) for about 5 to 60 minutes.
  • Each of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand is dissolved in a buffer (eg, phosphate buffered saline) or water at about 70° C. to 98° C., the resulting two solutions are mixed, and the mixture is It is held at 70° C. to 98° C. for several minutes (for example, 5 minutes), and then the mixture is held at about 30° C. to 70° C. (or about 30° C. to 50° C.) for about 1 to 8 hours.
  • a double-stranded nucleic acid complex of some embodiments may be prepared.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand can each be dissolved in a buffer (eg, phosphate buffered saline) or water at room temperature (about 10°C to 35°C).
  • a buffer eg, phosphate buffered saline
  • the annealing conditions (time and temperature) during preparation of the double-stranded nucleic acid complex are not limited to the above conditions. Also, conditions suitable for promoting annealing of nucleic acid strands are well known in the art.
  • nucleic acid molecules and/or double-stranded nucleic acid complexes targeting transcripts of the mutant BEAN1 gene described herein for use in the treatment of Spinocerebellar Ataxia Type 31 (SCA31) and/or the use of nucleic acid molecules and/or double-stranded nucleic acid complexes that target transcripts of mutant TK2 genes.
  • nucleic acid molecules and/or double-stranded nucleic acid complexes targeting transcripts of the mutant ATXN10 gene described herein for use in the treatment of Spinocerebellar Ataxia Type 10 (SCA10) Body use is provided.
  • Example 1 Synthesis of ASO (LNA/DNA gapmer) targeting SCA31 mutated repeat (TK2)> Antisense oligonucleotides (ASO) targeting the SCA31 abnormal repeat region in the mutant TK2 gene transcript (hereinafter referred to as "SCA31 mutant repeat (TK2)") were obtained from Gene Design Co., Ltd. (Osaka, Japan). ) was commissioned and synthesized.
  • ASO LNA/DNA gapmer
  • SCA31 mutant repeat SCA31 mutant repeat
  • Table 1 and Figure 6 show the synthesized ASOs. All of the ASOs synthesized in this example are LNA/DNA gapmers.
  • Example 2 Verification of the effect of suppressing gene expression by the LNA/DNA gapmer synthesized in Example 1> (the purpose) The effect of suppressing gene expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) by the ASO (LNA/DNA gapmer) synthesized in Example 1 is verified.
  • TK2 SCA31 mutated repeat
  • TK2 For transient expression of the SCA31 mutated repeat (TK2), use the pkSCX-IRES-EGFP vector with the sequence of the SCA31 mutated repeat (TK2) downstream of the chicken ⁇ -actin promoter followed immediately by IRES-EGFP.
  • TK2 sequence of the SCA31 mutated repeat downstream of the chicken ⁇ -actin promoter followed immediately by IRES-EGFP.
  • 0.8 ⁇ g of pkSCX-IRES-EGFP vector was diluted with 50 ⁇ L of Opti-MEM.
  • ASO was prepared as a stock solution at 10 ⁇ M in PBS.
  • a probe primer mixture consisting of SCA31-0_primer FW (SEQ ID NO: 18, 5'-TGGCTGCACATAGCTTTATCTCTT-3') and SCA31-0_primer RV (SEQ ID NO: 20, 5'-AAGCCCAATCTGGAAGCAAA-3'):
  • qRT-PCR was performed using Roche Light Cycler 480II with SCA31-0 (TaqMan). The position detected by qRT-PCR is indicated as "SCA31-0" in Figure 36A.
  • ACTB Hs01060665-g1, ABI
  • individual results were analyzed by the ⁇ Ct method, and significance was analyzed by the t-test.
  • FISH T-r1 (SEQ ID NO: 33) was selected from the ASOs used in (1) above, and the effect of suppressing gene expression on the SCA31 mutated repeat (TK2) was verified by FISH. Other sequences were similarly verified.
  • ASO T-r1 was introduced into HeLa cells together with pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction in the same manner as in (1) above. Twenty-four hours after gene transfer, the cells were washed with 1 ⁇ PBS for 5 minutes and prefixed with 4% PFA for 1 hour. After washing with 1 ⁇ PBS for 5 minutes, the cells were reacted with 0.2N HCl for 20 minutes to destroy cell walls, and permeabilized with 0.1% TritonX-100 for 10 minutes. After washing with 1 ⁇ PBS for 5 minutes and postfixing with 4% PFA for 5 minutes, acetylation was performed with triethanolamine acetic anhydride solution for 20 minutes.
  • DIG-labeled LNA-(TGGAA) 5 probe was hybridized (60° C., 2 hours). Washed at 60° C. for 5 minutes with 4 ⁇ SSC, 3 times with 2 ⁇ SSC/Formamide for 20 minutes, and 3 times with 0.1 ⁇ SSC for 40 minutes. After blocking for 30 minutes, 1/2000 anti-DIG-AP antibody was allowed to react overnight at 4°C. After washing with TBS-t for 15 minutes ⁇ 4 times, reaction was performed with a detection solution (0.1M Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 0.1M NaCl) for 10 minutes, followed by color development with HNPP/FastRed for 30 minutes. Finally, nuclear staining was performed with Hoechst for 10 minutes and embedded with VECTASHEILD.
  • Fig. 8 shows the results of FISH.
  • arrows indicate cells in which expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) was detected.
  • ASO T-r1 was shown to repress the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2).
  • TK2 ENA/DNA gapmer targeting SCA31 mutated repeat
  • the synthesis method of ASO targeting the SCA31 mutated repeat (TK2) in this example is T-re10: HO-T e2s -G e2s -G s -A s -A s -T s -Gs -G s -A s -T e2s -G e2s -G 2t -H (SEQ ID NO: 59) (The meaning of each symbol in the formula is as described above.) will be described as an example.
  • synthesis was performed using the phosphoramidite method (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984).
  • activator solution-3 (0.25 mol/L 5-benzylthio-1H-tetrazole/acetonitrile solution, Wako Pure Chemical Industries, product No. 013-20011)
  • CAP A for AKTA (1-methylimidazole/acetonitrile solution, Sigma-Aldrich, product No. L040050
  • Cap B1 for AKTA acetic anhydride/acetonitrile solution, manufactured by Sigma-Aldrich, product No.
  • Cap B2 for AKTA pyridine/acetonitrile solution, manufactured by Sigma-Aldrich, product No. L050150
  • DCA Deblock diichloroacetic acid/toluene solution , Sigma-Aldrich, product No. L023050
  • DNA phosphoramidites (adenosine product No. ANP-5551, guanosine product No. ANP-5553, thymidine product No. ANP-5554) and 2'-OMe nucleoside phosphoramidites (adenosine product No. ANP-5751, cytidine product No. ANP-5752, guanosine product No. ANP-5753, uridine product No. ANP-5754) were manufactured by ChemGenes, and 5-methyldeoxycytidine phosphoramidite was quoted.
  • Example 14 The 6f compound from the literature (Organic Process Research & Development, 2000, 4, 175-181) was used.
  • a non-natural phosphoramidite is Example 14 (5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylene-6-N-benzoyladenosine-3'-O- (2-cyanoethyl N,N-diisopropyl) phosphoramidite),
  • Example 27 (5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylene-2-N-isobutyrylguanosine-3' -O-(2-cyanoethyl N,N-diisopropyl) phosphoramidite),
  • Example 22 (5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylene-4-N-benzoyl-5- methylcytidine-3'-O-(2-cyanoethyl N,N-diisopropyl) phosphoram
  • T-re10 SEQ ID NO: 59
  • the above T-re10 was synthesized using 0.2 ⁇ mol of Glen Unysupport FC 96-well format (manufactured by GlenResearch) as a solid phase carrier.
  • the time required for the condensation of the amidite was about 9 minutes.
  • the oligomer was cleaved from the support, and the cyanoethyl group on the phosphorus atom and the protective group on the nucleobase were removed.
  • the oligomer mixture solution was mixed with 300 ⁇ L of Clarity QSP DNA Loading Buffer (manufactured by Phenomenex) and charged onto a Clarity SPE 96 well plate (manufactured by Phenomenex).
  • DCA dichloroacetic acid
  • This compound is a reverse-phase HPLC (column (Phenomenex, Clarity 2.6 ⁇ m Oligo-MS 100A (2.1 ⁇ 50 mm)), A solution: 100 mM hexafluoroisopropanol (HFIP), 8 mM triethylamine aqueous solution, B solution: methanol, B%: 10% ⁇ 25% (4 min, linear gradient); 60°C; 0.5 mL/min; 260 nm) eluted at 2.12 min. Compounds were identified by negative ion ESI mass spectrometry.
  • Table 3 shows the synthesized ASOs. All of the ASOs synthesized in this example are ENA/DNA gapmers.
  • Example 4 Verification of gene expression inhibitory effect by ASO (ENA/DNA gapmer) synthesized in Example 3> (the purpose) The gene expression-suppressing effect of the SCA31 mutated repeat (TK2) by the ASO (ENA/DNA gapmer) synthesized in Example 3 is verified.
  • Fig. 9 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). From this result, it was found that the ENA/DNA gapmer has the same expression-suppressing effect as the LNA/DNA gapmer.
  • TK2 ASO targeting SCA31 mutated repeat (TK2): ENA-2'-OMe RNA-GAPMER with ENA wing region> (the purpose)
  • TK2 ENA-2'-OMe RNA-GAPMER with ENA wing region>
  • ASO was synthesized in the same manner as in Example 3.
  • Table 4 shows the synthesized ASOs. All of the ASOs synthesized in this example are ENA/DNA gapmers having ENA-2'-OMe RNA-ENA wing regions.
  • ASO was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was quantified by qRT-PCR.
  • ASO was used at 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, or 2 nM.
  • Fig. 10 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). From this result, it was found that the ENA/DNA gapmer having the ENA-2'-OMe RNA-ENA wing region has the same expression-suppressing effect as the LNA/DNA gapmer.
  • Example 6 ASO targeting SCA31 mutated repeat (TK2): Peripheral sequence of T-re10a> (the purpose) An ASO consisting of a peripheral sequence of T-re10a, which showed a strong effect of suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) in Example 5, is synthesized and its effect is verified.
  • ASO 0.1 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 11 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2).
  • T-re10e exhibited an expression-suppressing effect equivalent to that of T-re10a.
  • T-re10f to T-re10p also exhibited an expression-suppressing effect.
  • T-re10a and T-re10e were found to have the strongest expression-suppressing effect.
  • ASO 0.1 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 13 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). All of T-r1a, T-r2a, T-r2b, T-r2c, and T-r2d exhibited strong gene expression suppression effects. In particular, it was found that T-r1a has a strong effect of suppressing expression.
  • Example 8 ASO targeting within the core repeat region of the SCA31 mutated repeat (TK2): MOE/DNA gapmer> (the purpose) We will synthesize ASOs (MOE/DNA gapmers) targeting the core repeat region of the SCA31 mutated repeat (TK2) and verify the gene silencing effect of the SCA31 mutated repeat (TK2).
  • ASO 0.5 nM or 2 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) was performed by qRT-PCR. Amount was quantified.
  • Fig. 15 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). All of the ASOs shown in Table 7 exhibited a gene expression-suppressing effect, and T-r2'-1 in particular exhibited a strong expression-suppressing effect.
  • TK2 ASO targeting SCA31 mutated repeat
  • MOE/ENA/DNA gapmer> (the purpose) By synthesizing MOE/ENA/DNA gapmers with modified positions and numbers of MOE and ENA in the wing region, the effect of suppressing gene expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) is verified.
  • ASO 0.5 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 16 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). All of the ASOs shown in Table 8 exhibit a strong gene expression-suppressing effect. and T-r2'#25 showed a strong inhibitory effect. T-r2'#23 and T-r2'#25, which contain two ENAs each in the 5' wing region and the 3' wing region, exhibited a particularly strong effect of suppressing expression.
  • TK2 ASO targeting SCA31 mutated repeat
  • MOE/ENA/DNA gapmer> (the purpose) By synthesizing MOE/ENA/DNA gapmers with modified positions and numbers of MOE and ENA in the wing region, the effect of suppressing gene expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) is verified.
  • ASO 0.5 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 17 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). All of the ASOs shown in Table 9 exhibited a strong gene expression-suppressing effect, and among them, T-r2'#30, T-r2'#32, and T-r2'#33 exhibited a particularly strong expression-suppressing effect. Indicated.
  • TK2 ASO targeting SCA31 mutated repeat
  • MOE/ENA/DNA gapmer> (the purpose) By synthesizing MOE/ENA/DNA gapmers with modified positions and numbers of MOE and ENA in the wing region, the effect of suppressing gene expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) is verified.
  • ASO 0.5 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 18 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). All of the ASOs shown in Table 10 exhibited a strong effect of suppressing expression.
  • TK2 ASO targeting SCA31 mutated repeat
  • 2'-OMe RNA/ENA/DNA gapmer> (the purpose) Synthesize 2'-OMe RNA and 2'-OMe RNA/ENA/DNA gapmers containing ENA in the wing region to verify the gene expression suppression effect of the SCA31 mutated repeat (TK2).
  • ASO 0.5 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 19 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). All of the ASOs shown in Table 11 exhibited a strong gene expression-suppressing effect, and among them, T-r2'#13wOme and T-r2'#23wOme exhibited a strong expression-suppressing effect.
  • HDO heteroduplex nucleic acid
  • TK2 mutated repeat
  • HDO Heteroduplex nucleic acid consisting of ASO targeting SCA31 mutated repeat (TK2) and its complementary strand ) is synthesized.
  • PS bonds phosphorothioate bonds
  • TK2-r2 TK2-r2 shown below: HO- Cm1s - Cm1s - Am1s -Urp-Urp- Crp - Crp - Arp -Urp - Urp - Crs - Cm1s - Am1t -H (SEQ ID NO: 140) (The meaning of each symbol in the formula is as described in [Formula 1] above.) to synthesize.
  • Cap B2 for AKTA pyridine/acetonitrile solution, manufactured by Sigma-Aldrich, product No. L050150
  • DCA Deblock diichloroacetic acid -Toluene solution, Sigma-Aldrich product No. L023050
  • phenyl acetyl disulfide CARBOSYNTH, product No.
  • ANP-5752 are produced by ChemGenes
  • the compound of this example was synthesized using Primer Support 5G Unylinker 350 (manufactured by GE Healthcare) as a solid phase carrier. However, the time required for the condensation of the amidite was about 10 minutes.
  • the carrier was removed from the resulting deprotected solution by filtration and concentrated to dryness under reduced pressure.
  • the resulting residue was treated with 5 mL of 1.0 M TBAF THF solution (manufactured by Tokyo Kasei) to remove the TBDMS group on the 2'-OH of RNA.
  • the resulting solution was concentrated under reduced pressure, 0.01 M hydrochloric acid was added, and the mixture was stirred at pH 2.0 for 1 hour to remove the 5'-OH protecting group. Concentrated ammonium water was added to the obtained reaction solution to neutralize it.
  • the obtained mixed solution of oligomers was mixed with 30 mL of 0.1 M TEAB solution prepared from 1.0 M TEAB solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and charged onto a Clarity QSP 5 g/6 mL Cartridge (manufactured by Phenomenex).
  • This compound is a reverse-phase HPLC (column (Phenomenex, Clarity 2.6 ⁇ m Oligo-MS 100A (2.1 ⁇ 50 mm)), A solution: 100 mM hexafluoroisopropanol (HFIP), 8 mM triethylamine aqueous solution, B solution: methanol, B%: 10% ⁇ 25% (4 min) ⁇ 40% (2 min) ⁇ 65% (2 min) ⁇ 100% (2 min); 60°C; 0.5 mL/min; 260 nm), eluted at 1.44 minutes was done. The compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (negative ion ESI mass spectrometry observed value 4129.52).
  • T-re10a HDO Preparation of T-re10a HDO in which T-re10a (SEQ ID NO: 65) and TK2-r2 (SEQ ID NO: 140) form a double strand T-re10a (2.0 ⁇ mol, SEQ ID NO: 65) and TK2-r2 (2.0) ⁇ mol, SEQ ID NO: 140) were each dissolved in Milli-Q water (1000 ⁇ L), mixed in equimolar amounts (1.8 ⁇ mol), heated at 70° C. for 5 minutes, then cooled on ice for 5 minutes, and the two compounds were mixed. A solution was obtained.
  • the resulting mixed solution was subjected to electrophoresis using a 20% polyacrylamide gel (Tris-bolate EDTA (TBE) buffer, 200 V constant voltage, 1 hour), and stained and visualized using methylene blue. Bands corresponding to the chains T-re10a and TK2-r2 disappeared, and new bands with lower mobility than T-re10a and TK2-r2 were generated. The compound corresponding to the newly generated band was identified as T-re10a HDO in which T-re10a and TK2-r2 formed a duplex. T-re10a HDO was obtained by lyophilizing the mixed solution of the two compounds.
  • TBE Tris-bolate EDTA
  • Table 12 shows the nucleic acids constituting HDO synthesized by the same method as above.
  • Table 13 shows the structure of the nucleic acid chain that constitutes HDO.
  • Example 14 Verification of gene expression inhibitory effect by HDO synthesized in Example 13> (the purpose) The effect of HDO synthesized in Example 13 on suppressing gene expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) is verified.
  • Fig. 20 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2). All of the HDOs shown in Table 13 exhibited a strong effect of suppressing expression.
  • Example 15 Mixmer targeting SCA31 mutated repeat (TK2)> (the purpose) Synthesize mixmers targeting SCA31 mutated repeat (TK2) to verify the gene suppression effect of SCA31 mutated repeat (TK2).
  • ASO (2 nM) was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2) was quantified by qRT-PCR. bottom.
  • Fig. 21 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (TK2).
  • the mixmers shown in Table 14 the T-r1-LNA/DNA mixmer (T-LDM) gave a good effect of suppressing expression.
  • Example 16 ASO (LNA/DNA gapmer) targeting SCA31 mutated repeat (BEAN1)>
  • An ASO (LNA/DNA gapmer) targeting the SCA31 abnormal repeat region in the mutant BEAN1 gene transcript (hereinafter referred to as "SCA31 mutant repeat (BEAN1)”) was synthesized in the same manner as in Example 1.
  • the synthesized nucleic acids are shown in Table 15 below and Figure 23.
  • BEAN1 Transiently express the SCA31 mutated repeat (BEAN1) and introduce ASO into HeLa cells to verify the gene expression suppression effect on the SCA31 mutated repeat (BEAN1).
  • BEAN1 the sequence of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) is placed downstream of the chicken ⁇ -actin promoter in the same manner as in Example 2, followed immediately by the pkSCX- An IRES-EGFP vector was used (Fig. 36B).
  • ASO (2 nM) was introduced into HeLa cells together with a pkSCX-IRES-EGFP vector containing a BEAN1-oriented SCA31 insertion sequence, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) was quantified by qRT-PCR.
  • a probe primer mixture consisting of SCA31-0_primer FW (SEQ ID NO: 18, 5'-TGGCTGCACATAGCTTTATTCTCTT-3') and SCA31-0_primer RV (SEQ ID NO: 20, 5'-AAGCCCAATCTGGAAGCAAA-3'): SCA31-0 ( TaqMan) was used. .
  • Fig. 24 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1). All of the compounds used for evaluation showed a strong gene expression-suppressing effect. Especially B-r11, B-r12, B-r13, B-r14, B-r15, B-r16, B-r9, B-r10, B-r6, B-r8, B-r5, B-r4, B -r3, B-r2, B-r1, B-r7, B-j1, B-j2, B-j3, B-j4, and B-j5 have a strong suppressive effect on the SCA31 mutated repeat (BEAN1). was taken.
  • Example 18 ASO targeting SCA31 mutated repeat (BEAN1): Peripheral sequence of B-r2> (the purpose) An ASO consisting of the peripheral sequence of B-r2, which showed a strong expression-suppressing effect on the SCA31 mutated repeat (BEAN1) in Example 16, is synthesized and its effect is verified.
  • BEAN1 ASO targeting SCA31 mutated repeat
  • ASO 0.1 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the BEAN1 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 25 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1). Both B-r2a and B-r2b exhibited strong gene expression suppression effects. The effect of suppressing expression by B-r2 was higher than that of B-r2a and B-r2b.
  • Example 19 ASO targeting within the core repeat region of SCA31 mutated repeat (BEAN1): MOE/DNA gapmer> (the purpose) We will synthesize ASOs (MOE/DNA gapmers) targeting the core repeat region of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) and verify the gene silencing effect of the SCA31 mutated repeat (BEAN1).
  • ASO was synthesized in the same manner as in Example 3.
  • Table 17 shows the synthesized ASOs.
  • FIG. 26 shows the position of each ASO in the SCA31 mutated repeat (BEAN1).
  • ASO 0.1 nM was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the BEAN1 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) was measured by qRT-PCR. quantified.
  • Fig. 27 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1). All of the ASOs shown in Table 17 exhibited a favorable effect of suppressing expression.
  • Example 20 Mixmer targeting SCA31 mutated repeat (BEAN1)> (the purpose) We will synthesize mixmers targeting the SCA31 mutated repeat (BEAN1) and verify the effect of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) on gene expression suppression.
  • ASO (2 nM) was introduced into HeLa cells together with the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the BEAN1 direction, and the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) was quantified by qRT-PCR. bottom.
  • Fig. 28 shows the results of quantifying the expression level of the SCA31 mutated repeat (BEAN1).
  • BEAN1 SCA31 mutated repeat
  • Example 21 Verification of expression suppression effect on SCA31 mutated repeat in vivo> (the purpose) The effect of ASO/HDO on SCA31 mutated repeat (TK2) and SCA31 mutated repeat (BEAN1) is verified in vivo.
  • TK2-Tg mice and BEAN1-BAC-Tg mice were produced.
  • TK2-Tg mice were generated by introducing into C57BL/6J mice the same construct as the pkSCX-IRES-EGFP vector containing the SCA31 insertion sequence in the TK2 orientation used in the above example (FIG. 29A).
  • BEAN1-BAC Tg used line D generated by introducing a BAC encompassing the patient genomic region (FIG. 29B) into C57BL/6N mice. All Tg mice have expression of the same mutant sequences as SCA31 patient brains and cause gait abnormalities.
  • Table 19 below shows an overview of the TK2-Tg mice and BEAN-BAC-Tg mice used in this example.
  • ASO used 50 ⁇ g/ ⁇ L PBS as a stock solution and was used after denaturation at 85°C for 3 minutes.
  • For HDO the same amount of cRNA as the backbone was prepared at 95°C for 5 minutes and at 37°C for 60 minutes.
  • ASO was diluted with PBS, and 10 ⁇ L was used as a drug solution.
  • HDO was diluted with PBS, and 10 ⁇ L was used as a drug solution.
  • PBS 10 ⁇ L was administered as a control.
  • Injection into the mouse ventricle was performed into the left ventricle.
  • the injection position was 1 mm lateral to Bregma and 3 mm intracranially from the site 0.2 mm caudal (indicated by “ ⁇ ” in FIG. 30).
  • 10 ⁇ L of the drug was injected over 3 minutes, and the needle was removed after standing for 5 minutes.
  • the ASO and HDO used in this example are shown in Tables 20 to 23, respectively.
  • Fig. 31A shows the results of suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) by T-re10a ASO (100 ⁇ g). It was found that T-re10a ASO exerted a strong suppressive effect on SCA31 mutated repeats in vivo.
  • Fig. 31B shows the results of suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) by T-re10a HDO (0.3 ⁇ g to 300 ⁇ g). It was found that T-re10a HDO exerted a good concentration-dependent suppressive effect on SCA31 mutated repeats in vivo. The effect was particularly strong at doses of 10 ⁇ g or more.
  • Fig. 32A shows the results of suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) by T-r2'_1 ASO (100 ⁇ g).
  • T-r2'_1 ASO also exerts a silencing effect on the SCA31 mutated repeat in vivo, although it is weaker than the T-re10a ASO.
  • Fig. 32B shows the results of suppressing the expression of the SCA31 mutated repeat (BEAN1) by B-r2 ASO (10 ⁇ g or 50 ⁇ g).
  • BEAN1 SCA31 mutated repeat
  • RNA samples obtained from the left cerebellum were treated with DNase in the same manner as in (3), and then PolyA was purified using Oligotex (trademark)-dt30 ⁇ super> mRNA Purification Kit Takara.
  • Northern blots were performed on the samples. Electrophoresis was performed at 50 V for 3.5 hours, transcription was performed for 20 hours, and then RNA was immobilized on the membrane by UV cross-linking. Hybridization was performed O/N at 45°C using DIG-labeled LNA-(TTCCA) 5 probe (SEQ ID NO: 31) and LNA-(TGGAA) 5 probe (SEQ ID NO: 32), followed by anti-DIG-AP. detected with an antibody. DIG Wash and Block Buffer Set was used and developed with CDP Star.
  • FIG. 31C The results of Northern blotting are shown in Fig. 31C.
  • the first to third lanes from the left show the results of loading 1 ⁇ g, 0.5 ⁇ g, and 0.25 ⁇ g RNA samples obtained from PBS-injected negative control mice and detecting SCA31 repeats.
  • the fourth lane from the left shows the results of loading 1 ⁇ g RNA sample obtained from mice injected with 300 ⁇ g T-re10a HDO and detecting SCA31 repeats.
  • the results showed that the administration of T-re10a HDO reduced the expression of the SCA31 mutated repeat (TK2) by more than four-fold.
  • TK2 SCA31 mutated repeat
  • Example 22 HDO containing 2'-O-MOE-RNA nucleoside> (the purpose) An HDO containing T-re10a as the first nucleic acid strand and 2'-O-MOE-RNA nucleoside as the second nucleic acid strand is prepared, and its effect of suppressing gene expression on the SCA31 mutated repeat (TK2) is verified.
  • TK2 SCA31 mutated repeat
  • HDO was injected into the brain ventricles of TK2-Tg mice, and one week later, the expression of SCA31 mutated repeats (TK2) was analyzed in both hippocampus and cerebellum by qRT-PCR.
  • FIG. 34 shows the results of expression suppression for repeat (TK2). It was found that each HDO exerted a strong silencing effect on SCA31 mutated repeats in vivo.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子を提供することである。　異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子であって、前記異常反復領域は、5'領域、コア反復領域、及び3'領域からなり、前記コア反復領域は、塩基配列TGGAAを複数回反復した塩基配列、又はそれに相補的な塩基配列からなり、前記核酸分子は、前記転写産物における前記異常反復領域において連続する4以上の塩基に相補的な塩基配列を含み、かつ前記転写産物にハイブリダイズすることができる標的結合領域を含む、前記核酸分子を提供する。

Description

脊髄小脳失調症治療用医薬組成物
　本発明は、異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子、及び脊髄小脳失調症治療用医薬組成物に関する。
　脊髄小脳失調症31型（Spinocerebellar ataxia type 31；SCA31）は優性遺伝性の脊髄小脳変性症である。SCA31では、小脳虫部上面が障害され、小脳プルキンエ細胞が特に変性し脱落することが知られている。
　SCA31の発症年齢は45～77歳（平均60歳）であり、ふらつくことで発病し、徐々に歩けなくなり、個人差はあるが10年程度で杖使用や車いすが必要になる等、緩徐に悪化する疾患である。また、SCA31は日本人の中で最も多い脊髄小脳変性症の一つであり、推定患者数は日本国内で2,000～3,000人である。
　SCA31は、2000年に16番染色体長腕に連鎖する家系で初めて発見された（非特許文献１）。さらに、2009年には、同領域内で互いに逆向きに存在する2つの遺伝子BEAN1（brain expressed associated with NEDD4；NEDD4関連脳発現1）とTK2（チミジンキナーゼ2）が共有するイントロンにおける、2.5～3.8 kb程度に伸長した5塩基リピートを含む異常反復領域によってSCA31が発症することが報告された（非特許文献２）。この5塩基リピートは、BEAN1遺伝子の転写産物ではUGGAA反復配列として、TK2遺伝子の転写産物ではUUCCA反復配列として発現する。SCA31の患者では、これらの繰り返し配列が転写されたRNA分子が核内に凝集する。このRNA凝集体（RNA foci）によって、脊髄小脳失調症が発症すると考えられている。
　類似した分子病態を有する脊髄小脳失調症には脊髄小脳失調症10型（SCA10）がある。SCA10における変異型アタクシン10（ataxin-10; ATXN10）遺伝子には4種類のアレルが知られており、そのうちアレルBではAUUCC反復配列を含む異常反復領域が転写され、RNA凝集体（RNA foci）が形成される（非特許文献３）。SCA10のAUUCC反復配列は、反復単位を1塩基ずらした場合にSCA31におけるTK2転写産物中のUUCCA反復配列と一致する。
　しかしながら、上記のSCA31及びSCA10には、これまでに有効な治療法が知られていない。
Nagaoka U., Takashima M., Ishikawa K., et al., Neurology, 2000, 54:1971-1975. Sato N., Amino T., Kobayashi K., et al., Am J Hum Genet, 2009, 85:544-557. McFarland K.N., et al., PLoS One, 2015, 10(8):e0135906.
　異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、SCA31異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子を探索した。その結果、当該転写産物の発現を有効に抑制することができる一群の核酸分子を見出した。本発明は上記知見に基づくものであって、以下を提供する。
(１）異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子であって、前記異常反復領域は、5’領域、コア反復領域、及び3’領域からなり、前記コア反復領域は、配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列、又はそれに相補的な塩基配列からなり、前記核酸分子は、前記転写産物における前記異常反復領域において連続する4以上の塩基に相補的な塩基配列を含み、かつ前記転写産物にハイブリダイズすることができる標的結合領域を含む、前記核酸分子。
(２）前記変異遺伝子が変異型NEDD4関連脳発現1（BEAN1）遺伝子であり、前記コア反復領域は配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列からなり、前記5'領域が配列番号2で示す塩基配列（5'-TCAC-3'）を含む、（１）に記載の核酸分子。
(３）前記5'領域が、以下の(a1)～(a4)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、（２）に記載の核酸分子。
　(a1)配列番号3で示す塩基配列、
　(a2)配列番号4で示す塩基配列、
　(a3)配列番号2で示す塩基配列（5'-TCAC-3'）、並びに
　(a4)配列番号2で示す塩基配列（5'-TCAC-3'）と配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列とを5'側から順に連結してなる塩基配列
(４）前記変異遺伝子が変異型NEDD4関連脳発現1（BEAN1）遺伝子であり、前記コア反復領域は配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列からなり、前記3'領域が、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した配列を含む、（１）～（３）のいずれかに記載の核酸分子。
(５）前記3'領域が、以下の(b1)～(b5)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、（４）に記載の核酸分子。
　(b1)配列番号7で示す塩基配列、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
　(b2)配列番号9で示す塩基配列、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
　(b3)配列番号11で示す塩基配列、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
　(b4)配列番号12で示す塩基配列、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列、配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、及び配列番号13で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、並びに
　(b5)配列番号14で示す塩基配列、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列
(６）前記標的結合領域が、前記5’領域の5'側に隣接する非変異領域、前記5’領域、前記コア反復領域、前記3’領域、及び前記3’領域の3'側に隣接する非変異領域において隣接する2つの領域の末端塩基に相補的な塩基の各々を含む、（２）～（５）のいずれかに記載の核酸分子。
(７）前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域又は前記3’領域のいずれかに相補的な塩基配列に含まれる、（２）～（５）のいずれかに記載の核酸分子。
(８）前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域に相補的な塩基配列に含まれる、（２）～（５）のいずれかに記載の核酸分子。
(９）配列番号156～189及び207～209（ただし、配列中のuはｔであってもよく、ｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる、（２）～（５）のいずれかに記載の核酸分子。
(１０）前記変異遺伝子が変異型チミジンキナーゼ2（TK2）遺伝子であり、前記コア反復領域は配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記5'領域が、配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した配列、及び配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した配列を含む、（１）に記載の核酸分子。
(１１）前記5'領域が、以下の(c1)～(c5)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、（１０）に記載の核酸分子。
　(c1)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号19で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
　(c2)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号21で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
　(c3)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号22で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
　(c4)配列番号23で示す塩基配列、配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号24で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、並びに
　(c5)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列、及び配列番号29で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列
(１２）前記変異遺伝子が変異型チミジンキナーゼ2（TK2）遺伝子であり、前記コア反復領域は配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記3'領域が配列番号26で示す塩基配列（5'-GTGA-3'）を含む、（１）、（１０）、及び（１１）のいずれかに記載の核酸分子。
(１３）前記3'領域が、以下の(d1)～(d4)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、（１２）に記載の核酸分子。
　(d1)配列番号27で示す塩基配列、
　(d2)配列番号28で示す塩基配列、
　(d3)配列番号26で示す塩基配列（5'-GTGA-3'）、並びに
　(d4)配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列と配列番号26で示す塩基配列（5'-GTGA-3'）とを5'側から順に連結してなる塩基配列
(１４）前記標的結合領域が、前記5’領域、前記コア反復領域、前記3’領域、及び前記3’領域の3'側に隣接する非変異領域において隣接する2つの領域の末端塩基に相補的な塩基の各々を含む、（１０）～（１３）のいずれかに記載の核酸分子。
(１５）前記標的結合領域の全長が、前記5’領域又は前記コア反復領域のいずれかに相補的な塩基配列に含まれる、（１０）～（１３）のいずれかに記載の核酸分子。
(１６）前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域に相補的な塩基配列に含まれる、（１０）～（１３）のいずれかに記載の核酸分子。
(１７）配列番号33～53、58～139、141～150、152～155、及び204～206（ただし、配列中のuはｔであってもよく、ｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる、（１０）～（１３）のいずれかに記載の核酸分子。
(１８）前記変異遺伝子が変異型アタクシン10（ATXN10）遺伝子であり、前記コア反復領域は配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域に相補的な塩基配列に含まれる、（１）に記載の核酸分子。
(１９）配列番号33～37、58～61、64～67、70～139、141～150、152～155、及び204～206（ただし、配列中のuはｔであってもよく、ｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる、（１８）に記載の核酸分子。
(２０）12～30塩基長である、（１）～（１９）のいずれかに記載の核酸分子。
(２１）ミックスマーである、（１）～（２０）のいずれかに記載の核酸分子。
(２２）ギャップマーである、（１）～（２０）のいずれかに記載の核酸分子。
(２３）[1]少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、[2]前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び[3]前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、（２２）に記載の核酸分子。
(２４）前記5’ウイング領域及び前記3’ウイング領域が架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドを含む、（２３）に記載の核酸分子。
(２５）前記架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシド又はENAヌクレオシドである、（２４）に記載の核酸分子。
(２６）前記2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基が2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基である、（２４）又は（２５）に記載の核酸分子。
(２７）モルホリノ核酸を含む、又はモルホリノ核酸からなる、（１）～（２０）のいずれかに記載の核酸分子。
(２８）前記核酸分子のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、（１）～（２７）のいずれかに記載の核酸分子。
(２９）前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、（２８）に記載の核酸分子。
(３０）修飾核酸塩基を含む、（１）～（２９）のいずれかに記載の核酸分子。
(３１）前記アンチセンス効果が前記転写産物量の減少（好ましくは転写産物の分解による減少）である、（１）～（３０）のいずれかに記載の核酸分子。
(３２）前記アンチセンス効果がステリックブロックである、（１）～（３０）のいずれかに記載の核酸分子。
(３３）（１）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子からなる第1核酸鎖と、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含む、二本鎖核酸複合体。
(３４）前記第2核酸鎖が、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、及び／又は修飾ヌクレオシドを含む、（３３）に記載の二本鎖核酸複合体。
(３５）前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが、(a)デオキシリボヌクレオシド、(b)デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド、(c)デオキシリボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、(d)リボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、又は(e)デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び2'-修飾ヌクレオシドである、（３３）又は（３４）に記載の二本鎖核酸複合体。
(３６）（２３）～（２６）のいずれかに記載の核酸分子からなる第1核酸鎖と、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含み、前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の前記中央領域における少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも2個の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドを含む領域を含む、二本鎖核酸複合体。
(３７）前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に修飾ヌクレオシド間結合を含む、（３６）に記載の二本鎖核酸複合体。
(３８）前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、（３７）に記載の二本鎖核酸複合体。
(３９）前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドを含む、（３６）～（３８）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
(４０）前記第2核酸鎖において、前記架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、又はBNANCヌクレオシドである、（３９）に記載の二本鎖核酸複合体。
(４１）前記第2核酸鎖において、前記2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基が2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基である、（３９）又は（４０）に記載の二本鎖核酸複合体。
(４２）前記第2核酸鎖が、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを１個以上含む、（３３）～（４１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
(４３）前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドの総数の少なくとも20％が、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである、（４２）に記載の二本鎖核酸複合体。
(４４）前記第2核酸鎖が、5’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含む、（３３）～（４３）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
(４５）前記第2核酸鎖が、5’末端及び3’末端以外の位置に、1～7個の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含む、（３３）～（４４）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
(４６）前記第2核酸鎖において、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド以外の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、（３３）～（４５）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
(４７）前記第2核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである、（３３）～（４５）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
(４８）前記第2核酸鎖が、修飾核酸塩基を含む、（３３）～（４７）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
(４９）前記第2核酸鎖が、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合している、（３３）～（４８）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（５０）前記第1核酸鎖の塩基配列が、配列番号65（ただし、配列中のｔはuであってもよい）に記載の塩基配列からなり、かつ前記第2核酸鎖の塩基配列が、配列番号140、配列番号200、配列番号201、配列番号202、及び配列番号203（ただし、配列中のｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、請求項３３～４９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
（５１）前記第1核酸鎖が、配列番号65に記載の核酸鎖からなり、かつ前記第2核酸鎖が、配列番号140、配列番号200、配列番号201、配列番号202、及び配列番号203からなる群から選択されるいずれかの核酸鎖からなる、請求項５０に記載の二本鎖核酸複合体。
(５２）（２）～（９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（４９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は（１０）～（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体を含む、脊髄小脳失調症31型（SCA31）治療用医薬組成物。
(５３）（１８）又は（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、又はそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体を含む、脊髄小脳失調症10型（SCA10）治療用医薬組成物。
(５４）脳室内投与又は髄腔内投与される、（５２）又は（５３）に記載の医薬組成物。
(５５）前記核酸分子の1回の投与量が0.1mg/kg以上である、（５２）～（５４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５６）患者に対して有効量の、（２）～（９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（４９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は（１０）～（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体を投与することを含む、脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療方法。
（５７）患者に対して有効量の、（１８）又は（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、又はそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体を投与することを含む、脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療方法。
（５８）脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療に使用するための、（２）～（９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（４９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は（１０）～（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（５９）脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療に使用するための、（１８）又は（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、又はそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体。
（６０）脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療薬の製造のための、（２）～（９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（４９）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は（１０）～（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、若しくはそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体、の使用。
（６１）脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療薬の製造のための、（１８）又は（１９）、及びそれを引用する（２０）～（３２）のいずれかに記載の核酸分子、又はそれを引用する（３３）～（５１）のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体の使用。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-181571号の開示内容を包含する。
　異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子を提供することができる。
図1は、様々な天然ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドの構造を示す図である。 図2は、様々な架橋核酸の構造を示す図である。 図3は、本発明で用いる核酸分子の特定の実施形態の例を示す模式図である。 図4は、本発明で用いる核酸複合体の特定の実施形態の例を示す模式図である。 図5は、異常反復領域を含む変異型TK2遺伝子の構造を示す図である。図5Aは、変異型TK2遺伝子における異常反復領域の位置を示す。SCA31異常反復領域に隣接する非変異配列には、多型性を有する配列（5'-(TAAAA)m-3'；mは1以上の整数、例えば約8～20）が含まれる。図5Bは、5’領域、コア反復領域、及び3’領域として公知の配列を示す。 図6は、実施例1で用いたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の構造と、変異型TK2遺伝子におけるその位置を示す模式図である。各ASOの表示において、大文字はDNA、下線付き大文字はLNA（下線付きCは5-メチルシトシンLNA)を示す。 図7は、実施例2においてASO（2nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図8は、実施例2においてSCA31変異リピート（TK2）の発現を検出するFISHの結果を示す図である。SCA31変異リピート（TK2）に対するASOとしてT-r1（2nM）を用いた。SCA31変異リピート（TK2）の発現が検出された細胞を矢印で示す。 図9は、実施例4においてASO（0.1nM、0.5nM、又は2nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図10は、実施例5においてASO（0.1nM、0.5nM、1nM、又は2nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図11は、実施例6においてASO（0.1nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図12は、コア反復領域内部を標的とするASOの構造を示す図である。各ASOの表示において、大文字はDNA、下線付き大文字はENA、斜体小文字は2'-OMe RNAを示す。 図13は、実施例7においてコア反復領域内部を標的とするASO（0.1nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図14は、コア反復領域内部を標的とするASOの構造を示す図である。各ASOの表示において、大文字はDNA、下線付き大文字はLNA、斜体小文字は2'-O-MOE RNAを示す。 図15は、実施例8においてコア反復領域内部を標的とするASO（0.5nM又は2nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。 図16は、実施例9においてASO（0.5nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図17は、実施例10においてASO（0.5nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図18は、実施例11においてASO（0.5nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図19は、実施例12においてASO（0.5nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図20は、実施例14においてヘテロ2本鎖核酸（0.5nM）によるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図21は、実施例15においてASOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。ASOとして、LNA/DNAギャップマー（LDG）、LNA/RNAギャップマー（LRG）、LNA/DNAミックスマー（LDM）、及びLNA/RNAミックスマー（LRM）を使用した。エラーバーは標準誤差を示す。 図22は、異常反復領域を含む変異型BEAN1遺伝子の構造を示す図である。図22Aは、変異型BEAN1遺伝子における異常反復領域の位置を示す。SCA31異常反復領域に隣接する非変異配列には、多型性を有する配列（5'-(TAAAA)m-3'；mは1以上の整数、例えば約8～20）が含まれる。図22Bは、5’領域、コア反復領域、及び3’領域として公知の配列を示す。 図23は、実施例16で用いたASOの構造と、変異型BEAN1遺伝子におけるその位置を示す模式図である。各ASOの表示において、大文字はDNA、下線付き大文字はLNA（下線付きCは5-メチルシトシンLNA）を示す。 図24は、実施例16においてASO（2nM）によるSCA31変異リピート（BEAN1）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図25は、実施例18においてASO（0.1nM）によるSCA31変異リピート（BEAN1）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図26は、コア反復領域内部を標的とするASOの構造を示す図である。各ASOの表示において、大文字はDNA、斜体小文字は2'-O-MOE RNAを示す。 図27は、実施例19においてコア反復領域内部を標的とするASO（0.1nM）によるSCA31変異リピート（BEAN1）の発現抑制効果を示す図である。 図28は、実施例20においてASOによるSCA31変異リピート（BEAN1）の発現抑制効果を示す図である。ASOとしてLNA/DNAギャップマー（LDG）、LNA/RNAギャップマー（LRG）、LNA/DNAミックスマー（LDM）、及びLNA/RNAミックスマー（LRM）を使用した。エラーバーは標準誤差を示す。 図29は、TK2-Tgマウス及びBEAN1-BAC-Tgマウスの作製に使用した導入遺伝子構築物の構造を示す図である。「SCA31-1」及び「EX2-3」は、qRT-PCRにより検出した位置を示す。 図30は、実施例21においてマウス脳室への注入位置を示す図である。「＋」はBregmaを示し、「○」は注入位置を示す。 図31は、実施例21においてTK2-TgマウスにおけるASO又はHDOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。図31Aは、T-re10a ASOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示すqRT-PCRの結果である。TK2-Tgマウスで試験を行い、その平均値を示した。図31Bは、T-re10a-HDOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示すqRT-PCRの結果である。エラーバーは標準誤差を示す。図31Cは、T-re10a-HDOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示すノザンブロットの結果である。SCA31変異リピート（TK2）に対応するバンドの位置を矢印で示す。 図32は、実施例21においてASOによるSCA31変異リピートの発現抑制効果を示す図である。図32Aは、TK2-TgマウスにおいてT-r2'_1 ASOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示すqRT-PCRの結果である。図32Bは、BEAN-BAC-TgマウスにおいてB-r2 ASOによるSCA31変異リピート（BEAN1）の発現抑制効果を示すqRT-PCRの結果である。エラーバーは標準誤差を示す。 図33は、実施例22で用いたHDOの構造を示す模式図である。図33Aは、T-re10a HDO (Default)の構造を示す。図33Bは、T-re10a HDO (cMOE/DNA)の構造を示す。図33Cは、T-re10a HDO (Full cMOE)の構造を示す。図33Dは、T-re10a HDO (cMOE/DNA_2)の構造を示す。図33Eは、T-re10a HDO (cMOE/DNA_3)の構造を示す。 図34は、実施例22においてHDOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図35は、実施例22においてHDOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。エラーバーは標準誤差を示す。 図36は、TK2方向又はBEAN1方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorの構造を示す図である。図36Aは、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorを示す。図36Bは、BEAN1方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorを示す。「SCA31-0」は、qRT-PCRにより検出した位置を示す。 図37は、実施例22においてHDOによるSCA31変異リピート（TK2）の発現抑制効果を示す図である。図は、左小脳における結果の平均値（n=3～9）を示し、エラーバーは標準誤差を示す。
＜核酸分子＞
　一態様において、本発明は核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する。本発明の核酸分子は、異常反復領域において連続する4以上の塩基に相補的な塩基配列を含み、かつ異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物にハイブリダイズすることができる標的結合領域を含む。
　本明細書において「異常反復領域」とは、脊髄小脳失調症31型（SCA31）又は10型（SCA10）の患者の変異遺伝子（変異型BEAN1遺伝子、変異型TK2遺伝子、又は変異型ATXN10遺伝子）において見出される異常な塩基配列からなる領域である。異常反復領域は、正常な個体の遺伝子には存在せず、SCA31又はSCA10にのみ存在する異常な配列の領域全体を意味し、反復配列の部分と非反復配列の部分の両方を包含し得る用語として本明細書では使用される。異常反復領域は、脊髄小脳失調症31型（SCA31）患者の変異型BEAN1遺伝子のイントロンに含まれる異常な塩基配列からなる領域、脊髄小脳失調症31型（SCA31）患者の変異型TK2遺伝子のイントロンに含まれる異常な塩基配列からなる領域、又は脊髄小脳失調症10型（SCA10）のアレルBを有する患者の変異型ATXN10遺伝子のイントロンに含まれる異常な塩基配列からなる領域のいずれかである。本明細書では、特にSCA31又はSCA10における異常反復領域をそれぞれ「SCA31異常反復領域」、「SCA10異常反復領域」と表記する。なお、SCA31異常反復領域の具体的な位置は、例えばNCBI Reference Sequence: NG_021403.2において、68486位と68487位の間として特定することができる。
　本明細書において「標的遺伝子」とは、本発明の核酸分子又は二本鎖核酸複合体の第1核酸鎖が結合し得る遺伝子である。具体的には、異常反復領域を含む変異型BEAN1遺伝子、異常反復領域を含む変異型TK2遺伝子、又は異常反復領域を含む変異型ATXN10遺伝子のいずれかが該当する。
　本明細書において「標的転写産物」とは、本発明の核酸分子又は核酸複合体の直接的な標的となり、かつRNAポリメラーゼによって合成されるRNAをいう。具体的には、本発明の標的となる変異遺伝子から転写され、異常反復領域に対応するRNA配列を含むRNAである。成熟mRNA、mRNA前駆体、mRNA前駆体に由来するRNA断片（例えばmRNA前駆体からスプライスアウトされたイントロン部分）等を問わないが、好ましくはmRNA前駆体である。標的転写産物としては、例えば、変異型BEAN1遺伝子の転写産物であるRNA、変異型TK2遺伝子の転写産物であるRNA、変異型ATXN10遺伝子の転写産物であるRNAが挙げられる。
　本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）」又は「アンチセンス核酸」とは、標的転写産物の全部又は一部、例えば、任意の標的領域にハイブリダイズ可能な相補的塩基配列を含み、アンチセンス効果によってその標的遺伝子の転写産物の発現又は標的転写産物のレベルを制御し得る一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
　本明細書において「アンチセンス効果」とは、ASOが標的転写産物にハイブリダイズすることによって、その標的転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。「標的転写物の発現又は編集を調節する」とは標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、翻訳の阻害、RNA編集、スプライシング機能改変効果（例えばスプライシングスイッチ、エクソンインクルージョン、エクソンスキッピング等）、又は転写産物の分解である。例えば、標的遺伝子の転写後阻害では、ASOとしてRNAオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、ASOは標的遺伝子の転写産物であるmRNAとアニーリングによって部分的二本鎖を形成する。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされた標的タンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される(ステリックブロッキング)。一方、ASOとしてDNAを含むオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がRNase Hによって認識される結果、標的遺伝子のmRNAが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される。さらに、アンチセンス効果は、mRNA前駆体におけるイントロンを標的としてももたらされ得る。さらに、アンチセンス効果は、miRNA等のnon-coding RNAを標的としてももたらされ得る(ステリックブロッキング)。この場合、そのnon-coding RNAの機能阻害により、当該non-coding RNAが標的とする遺伝子の発現や機能が影響されうる。例えばmiRNAの機能阻害であれば、当該miRNAが通常発現を制御している遺伝子の発現が増加し得る。一実施形態では、アンチセンス効果は転写産物量の減少及び／又はステリックブロックである。一般に、DNAを含むASOが細胞に導入されると、ASOは、ASOに相補的な配列を持つ標的遺伝子mRNAにハイブリダイズし、DNA-RNAヘテロ二本鎖を形成する。RNase Hがこのヘテロ二本鎖構造を認識し、標的遺伝子mRNAを分解する。したがって、上述の転写産物量の減少は、好ましくは転写産物の分解によってもたらされる。
　本明細書中で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」とは、モノマーであればヌクレオシド又はヌクレオチドを、オリゴマーであればオリゴヌクレオチドを、またポリマーであればポリヌクレオチドを意味する。
　「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
　「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の2'位、3'位、又は5'位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
　「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成される直鎖状のポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのヌクレオシド間は、リン酸ジエステル結合で連結されている。
　本明細書において「核酸鎖」又は単なる「鎖」とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。核酸鎖は、例えば自動合成装置を使用した化学的合成法により、又はポリメラーゼ、リガーゼ、又は制限酵素反応による酵素的工程により全長鎖又は部分鎖を作製することができる。核酸鎖は、天然ヌクレオチド及び／又は非天然ヌクレオチドを含み得る。
　本明細書において「天然ヌクレオシド」とは、自然界に存在するヌクレオシドをいう。例えば、リボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はウラシル等の塩基からなるリボヌクレオシドや、デオキシリボースと前記アデニン、シトシン、グアニン、又はチミン等の塩基からなるデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。なお、RNA中に見られるリボヌクレオシド、及びDNA中に見られるデオキシリボヌクレオシドを、本明細書では、しばしば、それぞれ「DNAヌクレオシド」及び「RNAヌクレオシド」と称する。
　本明細書において「天然ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドで、前記天然ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。例えば、リボヌクレオシドにリン酸基が結合した、RNAの構成単位として知られるリボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合した、DNAの構成単位として知られるデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
　本明細書において「非天然ヌクレオシド」とは、天然ヌクレオシド以外の任意のヌクレオシドをいう。例えば、修飾ヌクレオシド及びヌクレオシド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの強化、核酸標的への親和性の強化、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加等の望ましい特性により、天然型よりも好ましい。
　本明細書において「模倣体」とは、糖、核酸塩基、及び／又はヌクレオシド間結合を置換する官能基を指す。一般に、模倣体は、糖又は糖－ヌクレオシド間結合の組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選択される標的に対するハイブリダイゼーションのために維持される。ここでいう「ヌクレオシド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において糖を置換するために、又は糖及び塩基を置換するために、又はオリゴマー化合物を構成するモノマーサブユニット間の結合等を置換するために使用される構造体を含む。「オリゴマー化合物」とは、核酸分子のある領域に少なくともハイブリダイズ可能な連結したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。ヌクレオシド模倣体としては、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環式又は三環式糖模倣体、例えば、非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣体が挙げられる。図1に様々な天然ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドの構造を示す。
　本明細書において「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドをいう。二環式糖部分を含む核酸は、一般に架橋核酸(bridged nucleic acid、BNA)と称される。本明細書において、二環式糖部分を含むヌクレオシドは、「架橋ヌクレオシド」と称することもある。図2に架橋核酸を一部例示する。
　二環式糖は、2'位の炭素原子及び4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている糖であってよい。二環式糖の例は当業者に公知である。二環式糖を含む核酸(BNA)の1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2'、4'-(CH2)p-CH2-2'、4'-(CH2)p-S-2'、4'-(CH2)p-OCO-2'、4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'[式中、p、m及びnは、それぞれ1～4の整数、0～2の整数、及び1～3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基(蛍光若しくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内又は核内局在化シグナルペプチド等)を表す]により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有すると説明することができる。さらに、特定の実施形態によるBNAに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基及び5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1及びR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、又はP(R4)R5[ここで、R4及びR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1～5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1～5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1～6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、又は1～5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す]であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2',4'-BNAとしても知られている)、例えば、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA若しくはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA、2位と4位との間でエチレン架橋を有するエチレンオキシ(4'-(CH2)2-O-2')BNA(「2'-O,4'-C-エチレンヌクレオシド」「ENA」としても知られている；特開2000-297097及び国際公開第WO2019/009299A1号参照)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA(2',4'-BNANCとしても知られている；R=Hは2',4'-BNANC[N-H]、R=Meは2',4'-BNANC[N-Me])、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミドBNA(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)(AmNAとしても知られている；R=HはAmNA[N-H]、R=MeはAmNA[N-Me]))、グアニジンBNA(GuNA（例、図5のR=HはGuNA[N-H]、R=MeはGuNA[N-Me]）としても知られる)、アミンBNA(2'-Amino-LNAとしても知られている)、2'-O,4'-C-スピロシクロプロピレン架橋型核酸(scpBNAとしても知られている)及び当業者に公知の他のBNAが挙げられる。メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')架橋を有する二環式ヌクレオシドを、LNAヌクレオシドと称することもある。
　本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドを指し、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド模倣体を含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、及び修飾核酸塩基のいずれか1つ以上を有するヌクレオチドを意味する。ここでいう「ヌクレオチド模倣体」とは、オリゴマー化合物の一以上の位置において、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造体を含む。ヌクレオチド模倣体としては、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ核酸が挙げられる。ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid、PNA）は、糖の代わりにN-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。モルホリノ核酸(Morpholino Nucleic Acid、MNA)は、モルホリン環がホスホロジアミデート結合で結合した主鎖を有するヌクレオチド模倣体である。本明細書において非天然オリゴヌクレオチドを含む核酸鎖は、多くの場合、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的への親和性の増強、ヌクレアーゼ存在下での安定性の向上、又は阻害活性の向上等の望ましい特性を有する。したがって、ASOとしてヌクレオチドを利用する場合、非天然ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドよりも好ましい。
　本明細書において「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステル結合）からの置換又は任意の変化を有するヌクレオシド間結合をいう。修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むリン含有ヌクレオシド間結合とリン原子を含まない非リン含有ヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アルキルチオホスホネート結合、及びホスホロジアミデート等が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子を硫黄原子に置換したヌクレオシド間結合である。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は周知である。修飾ヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性が天然に存在するヌクレオシド間結合よりも高い結合であることが好ましい。
　ヌクレオシド間結合がキラル中心を有する場合、ヌクレオシド間結合はキラル制御されたものであってもよい。「キラル制御された」とは、キラル中心、例えばキラルリン原子に関して単一のジアステレオマーで存在することを意図する。キラル制御されたヌクレオシド間結合は、完全に単一の立体化学を有するものであってもよいし、異性体純度が高いもの、例えば90%de、95%de、98%de、99%de、99.5%de、99.8%de、99.9%de、又はそれ以上の異性体純度を有するものであってよい。本明細書において「異性体純度」は、ジアステレオマーの混合物中の1つのジアステレオマーの割合を指し、ジアステレオマー過剰率(%de)として表され、(対象のジアステレオマー－その他のジアステレオマー)／(総ジアステレオマー)×100(%)として定義される。
　例えば、ヌクレオシド間結合は、Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合であってよい。キラル制御されたヌクレオシド間結合の調製方法は公知であり、例えばRp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Naoki Iwamoto et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48(3), 496-9、Natsuhisa Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317、Natsuhisa Oka et al.,J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2016, 81, 2753-2762、Yohei Nukaga et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 7913-7922に記載の方法に従って合成することができる。Rp配置又はSp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合も公知であり、例えばNaoki Iwamoto et al., Nat. Biotechnol., 2017, 35(9), 845-851、Anastasia Khvorova et al., Nat. Biotechnol., 2017, 35(3), 238-248に記載されるような効果を奏することが知られている。例えば、一実施形態において、Sp配置にキラル制御されたホスホロチオエート結合は、Rp配置のものよりも安定であり、及び／又はSp配置にキラル制御されたASOは、RNase H1による標的RNA切断を促進し、生体内でより持続的な応答をもたらす。
　本明細書において「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル以外のあらゆる核酸塩基を意味する。修飾核酸塩基の例としては、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン、N4-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、8-ブロモアデニン、N2-メチルグアニン、又は8-ブロモグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンである。なお、5-メチルウラシルとチミンは同一の構造であり、ウラシルをベースとした表示（例えば「5meＵ」）がされても良く、チミンをベースとした表示（例えば、「Ｔ」）がされても良い。
　「非修飾核酸塩基」又は「非修飾塩基」とは、天然核酸塩基と同義であり、プリン塩基であるアデニン（A）及びグアニン（G）、並びにピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）、及びウラシル（U）を意味する。
　本明細書において「修飾糖」とは、天然糖部分（すなわち、DNA(2'-H)又はRNA(2'-OH)中に認められる糖部分）からの置換及び／又は任意の変化を有する糖を指す。本明細書において核酸鎖は、場合により修飾糖を含む1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の向上、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性を核酸鎖に付与し得る。ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含んでいてもよい。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定するものではないが、置換基(5'及び2'置換基を含む)の付加、リボフラノース環内における架橋形成による二環式核酸(架橋核酸、BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、又はC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基を表す)での置換、及びそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書において、修飾糖部分を有するヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、5'-ビニル、5'-メチル(R又はS)、4'-S、2'-F(2'-フルオロ基)、2'-OCH3(2'-OMe基若しくは2'-O-メチル基)、及び2'-O(CH2)2OCH3(2'-O-MOE基若しくは2'-O-メトキシエチル基)を含むヌクレオシドが挙げられる。
　本明細書において「2'-修飾糖」は、2'位で修飾されたフラノシル糖を意味する。2'-水酸基の置換として、C1-C10アルキル、アリル、アミノ、アジド、チオ、-O-アリル、-O-C1-C10アルキル、-OCF3、-O(CH2)2SCH3、-O(CH2)2OCH3、-O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)、及び-O-(CH2)2-C(=O)-N(Rm)(Rn)等から選択することができ、各Rm及びRnは、独立して、H又は置換若しくは非置換C1-C10アルキルである。本明細書において2'-修飾糖を含むヌクレオシドを「2'修飾ヌクレオシド」という。例えば、2'修飾基が2'-O-メトキシエチル基である2'修飾ヌクレオシドを2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドという。
　一般的には、修飾は、同一鎖中のヌクレオチドが独立して異なる修飾を受けることができるように実施することができる。また、酵素的切断に対する抵抗性を与えるため、同一のヌクレオチドが、修飾ヌクレオシド間結合(例えば、ホスホロチオエート結合)を有し、さらに、修飾糖(例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖)を有することができる。同一のヌクレオチドはまた、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)を有し、さらに、修飾糖(例えば、2'-O-メチル修飾糖又は二環式糖)を有することができる。
　核酸鎖における非天然ヌクレオチドの数、種類及び位置は、本発明の核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果等に影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子等の配列によって異なり得るが、当業者であれば、本明細書の記載、及びアンチセンス法に関連する文献(例えば、WO 2007/143315、WO 2008/043753、及びWO 2008/049085)の説明を参照することによって適宜選択することができ、実施例の態様に限定されるものではない。さらに、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前の核酸複合体の測定値と比較して有意に低くない場合(例えば、修飾後に得られた測定値が、修飾前の核酸複合体の測定値の70%以上、80%以上又は90%以上である場合)、関連修飾を評価することができる。
　本明細書において、Ａt、Ｇt、５ｍｅＣt、Ｃt、Ｔt、Ｕt、Ａp、Ｇp、５ｍｅＣp、Ｃp、Ｔp、Ｕp、Ａs、Ｇs、５ｍｅＣs、Ｃs、Ｔs、Ｕs、Ａrt、Ｇrt、Ｃrt、Ｕrt、Ａrp、Ｇrp、Ｃrp、Ｕrp、Ａrs、Ｇrs、Ｃrs、Ｕrs、Ａm1t、Ｇm1t、Ｃm1t、５ｍｅＣm1t、Ｕm1t、Ａm1p、Ｇm1p、Ｃm1p、５ｍｅＣm1p、Ｕm1p、Ａm1s、Ｇm1s、Ｃm1s、５ｍｅＣm1s、Ｕm1s、Ａ2t、Ｇ2t、Ｃ2t、Ｔ2t、Ａe2p、Ｇe2p、Ｃe2p、Ｔe2p、Ａe2s、Ｇe2s、Ｃe2s、Ｔe2sは、下記に示す構造を有する基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　本明細書中で使用される用語「相補的」とは、核酸塩基が水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対（天然型塩基対）又はWobble塩基対（グアニン-チミン、又はグアニン-ウラシル）を形成し得る関係を意味する。本発明において、核酸分子又は第1核酸鎖は、標的転写産物(例えば、標的遺伝子の転写産物)の全部又は一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%(例えば、95%、96%、97%、98%、又は99%以上)の相補性を有していれば許容される。同様に、二本鎖核酸複合体において第2核酸鎖は、第1核酸鎖の全部又は一部と完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%(例えば、95%、96%、97%、98%、又は99%以上)の相補性を有していれば許容される。配列の相補性は、BLASTプログラム等を使用することによって決定することができる。第1核酸鎖は、配列が相補的である場合に(典型的には、配列が標的転写産物の少なくとも一部の配列に相補的である場合に)、標的転写産物に「ハイブリダイズする」ことができる。第1核酸鎖は、配列が相補的である場合に、第2核酸鎖の相補的領域に「アニールする」ことができる。当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、2本の鎖がアニール又はハイブリダイズし得る条件(温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。このような条件は、典型的には、生理的条件であってよい。またさらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
　ハイブリダイゼーション条件は、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等のストリンジェントな条件であってもよい。低ストリンジェントな条件は、例えば、30℃、2×SSC、0.1% SDSであってよい。高ストリンジェントな条件は、例えば、65℃、0.1×SSC、0.1% SDSであってよい。温度及び塩濃度等の条件を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整できる。ここで、1×SSCは、150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含む。
　本明細書において「トコフェロール」は、トコールのメチル化誘導体で、クロマンと呼ばれる環状構造を有する脂溶性ビタミン（ビタミンE）である。トコールは、強い抗酸化作用を有しており、それ故に、生体内では、抗酸化物質として、代謝によって生じるフリーラジカルを消失させ、細胞を傷害から保護する機能を有する。
　トコフェロールは、クロマンに結合するメチル基の位置に基づき、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロール、及びδ-トコフェロールからなる複数の異なる型が知られている。本明細書におけるトコフェロールは、いずれのトコフェロールであってもよい。また、トコフェロールの類縁体としては、トコフェロールの種々の不飽和類縁体、例えば、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール等が挙げられる。好ましくは、トコフェロールは、α-トコフェロールである。
　本明細書において「コレステロール」とは、ステロイドアルコールとも呼ばれるステロールの1種であり、特に動物において多く存在する。コレステロールは、生体内における代謝過程で重要な機能を果たしている他、動物細胞では、リン脂質と共に細胞の膜系を構成する主要な構成成分でもある。また、コレステロールの類縁体は、ステロール骨格を有するアルコールである、種々のコレステロール代謝産物及び類縁体等を指し、限定されるものではないが、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロール、及びコプロスタノール等を含む。
　本明細書において「類縁体(analog)」とは、同一又は類似の基本骨格を有する類似した構造及び性質を有する化合物を指す。類縁体は、例えば、生合成中間体、代謝産物、置換基を有する化合物等を含む。ある化合物が他の化合物の類縁体であるか否かは、当業者であれば技術常識に基づき判定できる。
　本明細書で「被験体」とは、本発明の核酸分子、二本鎖核酸複合体、又は医薬組成物を適用する対象をいう。被験体は、個体の他、器官、組織、及び細胞を含む。被験体が個体の場合、ヒトを含むあらゆる動物が該当し得る。例えば、ヒト以外では、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等が挙げられる。限定はしないが、被験体は、標的転写産物の発現量の減少の必要がある個体、好ましくはSCA31又はSCA10に罹患している個体、又は罹患することが予想される個体（例えば、SCA31又はSCA10の家系に属する個体、及び／又は遺伝子型等からSCA31又はSCA10に罹患することが予想される個体）であってもよい。
　本明細書において塩基配列は、特に断りのない限り5'側から3'側に向かう順序で記載するものとする。配列表中でスキップされた配列番号が示す塩基配列を以下に示す。なお、いずれもヒトに由来するDNA配列を示す。
　配列番号1：5'-TGGAA-3'
　配列番号2：5'-TCAC-3'
　配列番号5：5'-TAGAA-3'
　配列番号8：5'-TTCCA-3'
　配列番号17：5'-TTCTA-3'
　配列番号26：5'-GTGA-3'
　配列番号191：5'-TAAAA-3'
　配列番号194：5'-TTTTA-3'
　配列番号196：5'-TTGAAACAG-3'
　配列番号198：5'-CTGTTTCAA-3'
　本態様の核酸分子は、異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物にハイブリダイズすることができる標的結合領域を含み、当該転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子である。標的結合領域は、転写産物における前記異常反復領域において連続する4以上の塩基に相補的な塩基配列を含む。
　本態様の核酸分子の標的となる転写産物をコードする変異遺伝子に含まれる異常反復領域は、5’領域、コア反復領域、及び3’領域からなる。
　本明細書において、「コア反復領域」は、配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TGGAA)n-3'；nは2以上の整数）、又はそれに相補的な塩基配列のいずれかである。ここで「それに相補的な塩基配列」とは、配列番号8で示す塩基配列（5'-TTCCA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCCA)n-3'；nは2以上の整数）である。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～500、100～400、又は200～400の整数が例示される。
　本明細書において、「5’領域」とは、異常反復領域においてコア反復領域の5'側に位置する領域である。また、「3’領域」とは、異常反復領域においてコア反復領域の3'側に位置する領域である。5’領域及び3'領域の塩基配列は、SCA31又はSCA10の脊髄小脳失調症患者に見出され得る配列である限り限定しない。
　本発明の核酸分子のさらなる構成は、標的とする変異遺伝子の種類によって異なるため、以下では変異遺伝子の種類に分けて説明する。
　一実施形態では、本発明の核酸分子の標的となる転写産物をコードする変異遺伝子は、変異型BEAN1遺伝子である。
　変異型BEAN1遺伝子に含まれ得る異常反復領域では、コア反復領域は配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TGGAA)n-3'；nは2以上の整数である。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～500、100～400、又は200～400の整数が例示される。
　変異型BEAN1遺伝子の異常反復領域における5'領域及び3'領域の塩基配列は、SCA31の脊髄小脳失調症患者に見出され得る配列である限り、特に限定しない。
　変異型BEAN1遺伝子の異常反復領域における5'領域には、例えば配列番号2で示す塩基配列（5'-TCAC-3'）を含む領域が挙げられる。その具体的な塩基配列には、以下の(a1)～(a4）：
　(a1)配列番号3で示す塩基配列（5'-TCACTAAAA(TAGAA)2-3'）、
　(a2)配列番号4で示す塩基配列（5'-TCACTAAAA(TAGAA)4-3'）、
　(a3)配列番号2で示す塩基配列（5'-TCAC-3'）、並びに
　(a4)配列番号2で示す塩基配列（5'-TCAC-3'）と配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TAGAA)n-3'；nは2以上の整数）とを5'側から順に連結してなる塩基配列が挙げられる。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～500、100～400、又は200～400の整数が例示される。
　変異型BEAN1遺伝子の異常反復領域における3'領域には、例えば、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した配列（5'-(TAGAA)n-3'；nは2以上の整数）、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した配列（5'-(TAAAATAGAA)n-3'；nは2以上の整数）を含む領域が挙げられる。その具体的な塩基配列には、以下の(b1)～(b5）：
　(b1)配列番号7で示す塩基配列（5'-TGGGAATGGAATGGGAA(TAGAA)2(TGGAA)2(TAGAA)2TGGAA-3'）、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TAGAA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TAAAATAGAA)n-3'、nは2以上の整数）を5'側から順に連結した塩基配列、
　(b2)配列番号9で示す塩基配列（5'-TGGGAATAGAATGGGAA(TAGAA)2(TGGAA)3TAGAATGGAA-3'、nは2以上の整数）、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TAGAA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TAAAATAGAA)n-3'、nは2以上の整数）を5'側から順に連結した塩基配列、
　(b3)配列番号11で示す塩基配列（5'-TGGGAATAGAATGGGAA(TGGAA)3(TAGAATGGAA)4(TAGAA)6TGGAATAGAATGGAA-3'）、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TAGAA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TAAAATAGAA)n-3'、nは2以上の整数）を5'側から順に連結した塩基配列、
　(b4)配列番号12で示す塩基配列（5'-(TAGAA)2TGGAA(TAGAA)2TGGAA-3'）、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TAGAA)n-3'、nは2以上の整数）、配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TAAAATAGAA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号13で示す塩基配列（5'-(TAAAA)3TAGAA-3'）を5'側から順に連結した塩基配列、並びに
　(b5)配列番号14で示す塩基配列（5'-TGGGAATAGAATGGGAA(TAGAA)2(TGGAA)3TAGAATGGAA-3'）、配列番号5で示す塩基配列（5'-TAGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TAGAA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TAAAATAGAA)n-3'、nは2以上の整数）を5'側から順に連結した塩基配列
が挙げられる。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、2～500、100～400、又は200～400の整数が例示される。
　変異型BEAN1遺伝子の異常反復領域における上記の5'領域と3'領域の組合せは特に限定せず、任意の組合せであり得る。上記の5'領域と3'領域の配列は、図22に図示される。
　一実施形態において、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域は、5’領域の5'側に隣接する非変異領域、5’領域、コア反復領域、3’領域、及び3’領域の3'側に隣接する非変異領域において、隣接する2つの領域の境界位置を含むように設計され得る。すなわち、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域は、5’領域の5'側に隣接する非変異領域、5’領域、コア反復領域、3’領域、及び3’領域の3'側に隣接する非変異領域において隣接する2つの領域の末端塩基に相補的な塩基の各々を含んでもよい。
　本明細書において「非変異領域」とは、異常反復領域を含む変異型遺伝子の遺伝子座において、異常反復領域に隣接し、正常な遺伝子にも見出され得る領域である。非変異領域は、健常個体（例えばSCA31又はSCA10を罹患していない個体）に見出され得る遺伝子領域であればよく、遺伝子多型（例えば健常個体に見られる一塩基多型や繰り返し配列の繰り返し回数に関する多型）は許容されるものとする。非変異領域は、異常反復領域の5'領域の5'側に隣接する領域、又は異常反復領域の3'領域の3'側に隣接する領域のいずれかである。
　別の実施形態において、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域の全長は、5'領域、コア反復領域、又は3’領域のいずれかに相補的な塩基配列に含まれる。
　一実施形態では、本態様の核酸分子は、配列番号156～189及び207～209（ただし、配列中のuはｔであってもよく、ｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる。
　一実施形態では、本発明の核酸分子の標的となる転写産物をコードする変異遺伝子は、変異型TK2遺伝子である。
　変異型TK2遺伝子に含まれ得る異常反復領域では、コア反復領域は、配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TGGAA)n-3'、nは2以上の整数）に相補的な塩基配列、すなわち配列番号8で示す塩基配列（5'-TTCCA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCCA)n-3'；nは2以上の整数）である。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～500、100～400、又は200～400の整数が例示される。
　変異型TK2遺伝子の異常反復領域における5'領域及び3'領域の塩基配列は、SCA31の脊髄小脳失調症患者に見出され得る配列である限り、特に限定しない。
　変異型TK2遺伝子の異常反復領域における5'領域には、例えば、配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した配列（5'-(TTCTATTTTA)n-3'；nは2以上の整数）、及び配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した配列（5'-(TTCTA)n-3'；nは2以上の整数）を含む領域が挙げられる。その具体的な塩基配列には、以下の(c1)～(c5）：
　(c1)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTATTTTA)n-3'、nは2以上の整数）、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号19で示す塩基配列（5'-TTCCA(TTCTA)2(TTCCA)2(TTCTA)2TTCCCATTCCATTCCCA-3'）を5'側から順に連結した塩基配列、
　(c2)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTATTTTA)n-3'、nは2以上の整数）、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号21で示す塩基配列（5'-TTCCATTCTA(TTCCA)3(TTCTA)2TTCCCATTCTATTCCCA-3'）を5'側から順に連結した塩基配列、
　(c3)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTATTTTA)n-3'、nは2以上の整数）、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号22で示す塩基配列（5'-TTCCATTCTATTCCA(TTCTA)6(TTCCATTCTA)4(TTCCA)3TTCCCATTCTATTCCCA-3'）を5'側から順に連結した塩基配列、
　(c4)配列番号23で示す塩基配列（5'-TTCTA(TTTTA)3-3'）、配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTATTTTA)n-3'、nは2以上の整数）、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号24で示す塩基配列（5'-TTCCA(TTCTA)2TTCCA(TTCTA)2-3'）を5'側から順に連結した塩基配列、並びに
　(c5)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTATTTTA)n-3'、nは2以上の整数）、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'、nは2以上の整数）、及び配列番号29で示す塩基配列（5'-TTCCATTCTA(TTCCA)3(TTCTA)2TTCCCATTCTATTCCCA-3'）を5'側から順に連結した塩基配列
が挙げられる。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～500、100～400、又は200～400の整数が例示される。
　変異型TK2遺伝子の異常反復領域における3'領域には、例えば、配列番号26で示す塩基配列（5'-GTGA-3'）を含む領域が挙げられる。その具体的な塩基配列には、以下の(d1)～(d4）：
　(d1)配列番号27で示す塩基配列（5'-(TTCTA)2TTTTAGTGA-3'）、
　(d2)配列番号28で示す塩基配列（5'-(TTCTA)4TTTTAGTGA-3'）、
　(d3)配列番号26で示す塩基配列（5'-GTGA-3'）、並びに
　(d4)配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'；nは2以上の整数）と配列番号26で示す塩基配列（5'-GTGA-3'）とを5'側から順に連結してなる塩基配列
が挙げられる。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～500、100～400、又は200～400の整数が例示される。
　変異型TK2遺伝子の異常反復領域における上記の5'領域と3'領域の組合せは特に限定せず、任意の組合せであり得る。上記の5'領域と3'領域の配列は、図5に図示される。
　一実施形態において、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域は、5’領域の5'側に隣接する非変異領域、5’領域、コア反復領域、3’領域、及び3’領域の3'側に隣接する非変異領域において、隣接する2つの領域の境界位置を含むように設計され得る。すなわち、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域は、5’領域の5'側に隣接する非変異領域、5’領域、コア反復領域、3’領域、及び3’領域の3'側に隣接する非変異領域において隣接する2つの領域の末端塩基に相補的な塩基の各々を含んでもよい。
　別の実施形態において、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域の全長は、5'領域、コア反復領域、又は3’領域のいずれかに相補的な塩基配列に含まれる。
　一実施形態では、本態様の核酸分子は、配列番号33～53、58～139、141～150、152～155、及び204～206（ただし、配列中のuはｔであってもよく、ｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる。
　一実施形態では、本発明の核酸分子の標的となる転写産物をコードする変異遺伝子は、変異型ATXN10遺伝子である。
　変異型ATXN10遺伝子に含まれ得る異常反復領域では、コア反復領域は、配列番号1で示す塩基配列（5'-TGGAA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TGGAA)n-3'、nは2以上の整数）に相補的な塩基配列、すなわち配列番号8で示す塩基配列（5'-TTCCA-3'）を複数回反復した塩基配列（5'-(TTCCA)n-3'；nは2以上の整数）である。ここで「n」は、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～600、100～500、又は200～400の整数が例示される。
　変異型ATXN10遺伝子の異常反復領域における5'領域及び3'領域の塩基配列は、SCA10の脊髄小脳失調症患者に見出され得る配列である限り、特に限定しない。変異型ATXN10遺伝子の異常反復領域における5'領域の具体例としては、例えば、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）、又はそれを複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'、nは2以上の整数）を含む領域が挙げられる（nは2以上の整数であり、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば2～600、100～500、又は200～400の整数である）。また、変異型ATXN10遺伝子の異常反復領域における3'領域の具体例としては、例えば、配列番号17で示す塩基配列（5'-TTCTA-3'）、又はそれを複数回反復した塩基配列（5'-(TTCTA)n-3'、nは2以上の整数）を含む領域が挙げられる（nは2以上の整数であり、症例によって異なり、以下の範囲に限定されるものではないが、例えば100以上、200以上、又は400以上の整数である）。
　一実施形態において、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域は、5’領域の5'側に隣接する非変異領域、5’領域、コア反復領域、3’領域、及び3’領域の3'側に隣接する非変異領域において、隣接する2つの領域の境界位置を含むように設計され得る。すなわち、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域は、5’領域の5'側に隣接する非変異領域、5’領域、コア反復領域、3’領域、及び3’領域の3'側に隣接する非変異領域において隣接する2つの領域の末端塩基に相補的な塩基の各々を含んでもよい。
　別の実施形態において、本発明の核酸分子に含まれる標的結合領域の全長は、5'領域、コア反復領域、又は3’領域のいずれかに相補的な塩基配列に含まれる。
　一実施形態では、本態様の核酸分子は、配列番号33～37、58～61、64～67、70～139、141～150、152～155、及び204～206（ただし、配列中のuはｔであってもよく、ｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる。
　本発明の核酸分子の塩基長は、特に限定されないが、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であればよい。また、核酸分子の塩基長は、40塩基長以下、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であればよい。核酸分子の塩基長は、例えば、10～40塩基長、12～30塩基長、又は15～25塩基長であってもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率等の他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。なお、核酸分子にアプタマー等の核酸が結合している場合、核酸分子の全体としての塩基長は、上記塩基長に結合した核酸の塩基長を加えたものであってよい。
　本発明の核酸分子に含まれるヌクレオシドは、天然ヌクレオシド(デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、若しくは両者)及び／又は非天然ヌクレオシドであってよい。
　本発明の核酸分子は、ミックスマー（mixmer）であってもよい。本明細書において「ミックスマー」とは、周期的又は無作為セグメント長の交互型の天然ヌクレオシド及び非天然ヌクレオシドを含み、かつ4個以上の連続するデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドを含まない核酸鎖をいう。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドであり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「BNA／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがペプチド核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「ペプチド核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーにおいて、前記非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸であり、かつ天然ヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであるミックスマーを特に「モルホリノ核酸／DNAミックスマー」と称する。ミックスマーは、2種のヌクレオシドのみを含むようには制限されない。ミックスマーは、天然若しくは修飾のヌクレオシド又はヌクレオシド模倣体であるか否かに関わらず、任意の数の種類のヌクレオシドを含むことができる。例えば、架橋ヌクレオシド(例えば、LNAヌクレオシド)により分離された1又は2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを有してもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン)をさらに含んでもよい。
　本発明の核酸分子は、ギャップマー（gapmer）であってもよい。本明細書において「ギャップマー」とは、原則として、「中央領域」（DNAギャップ領域）と、その5'末端及び3'末端に直接配置されたウイング領域（それぞれ、「5'ウイング領域」及び「3'ウイング領域」と称する）からなる一本鎖核酸をいう。ギャップマーにおける前記中央領域は少なくとも2個（例えば、少なくとも3個又は少なくとも4個）の連続するデオキシリボヌクレオシド（RNase Hに認識される修飾核酸塩基を含んでいてもよく、例えば、5-メチルシトシンを含んでもよい）を含み、前記ウイング領域は少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含む。限定はしないが、ウイング領域に含まれる非天然ヌクレオシドは、通常、天然ヌクレオシドよりもRNAとの結合力が高く、核酸分解酵素(ヌクレアーゼ等)に対する耐性の高い性質を有する。5’ウイング領域及び3’ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドは、例えば、架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドであってもよい。ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが架橋ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「BNA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドの数は、少なくとも1個であり、例えば、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる架橋ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。架橋ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。架橋ヌクレオシドはLNAヌクレオシド又はENAヌクレオシドであってもよい。架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「LNA／DNAギャップマー」と称する。架橋ヌクレオシドがENAヌクレオシドである場合、前記ギャップマーを「ENA／DNAギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがペプチド核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「ペプチド核酸ギャップマー」と称する。5'ウイング領域及び3'ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドがモルホリノ核酸を含む、又はそれからなる場合、前記ギャップマーを特に「モルホリノ核酸ギャップマー」と称する。また、5’ウイング領域及び3’ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドが2'修飾ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基は2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる2'修飾ヌクレオシドの数は、少なくとも1個であり、例えば、2又は3個であってもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域に含まれる2'修飾ヌクレオシドは、5'ウイング領域及び3'ウイング領域内に連続又は非連続に存在していてもよい。2'修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン）をさらに含むことができる。5’ウイング領域及び3’ウイング領域を構成する非天然ヌクレオシドは、架橋ヌクレオシド、2'修飾ヌクレオシドを含む、又はそれからなる場合、2種類以上の架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドが組み合わされて構成されていてもよい。例えば、2種類の組み合わせとして、LNAヌクレオシド及びENAヌクレオシド；LNAヌクレオシド及び2'-O-メチルヌクレオシド；LNAヌクレオシド及び2'-O-メトキシエチルヌクレオシド；ENAヌクレオシド及び2'-O-メチルヌクレオシド；ENAヌクレオシド及び2'-O-メトキシエチルヌクレオシド；又は2'-O-メチルヌクレオシド及び2'-O-メトキシエチルヌクレオシドであってもよい。例えば、3種類の組み合わせとして、LNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、及び2'-O-メチルヌクレオシド；LNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、及び2'-O-メトキシエチルヌクレオシド；又はENAヌクレオシド、2'-O-メチルヌクレオシド、及び2'-O-メトキシエチルヌクレオシドであってもよい。例えば、4種類の組み合わせとして、LNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、2'-O-メチルヌクレオシド、及び2'-O-メトキシエチルヌクレオシドであってもよい。
　本発明の核酸分子がギャップマーである場合、DNAギャップ領域は、例えば4～10塩基長、5～8塩基長、5～8塩基長、6～8塩基長、7塩基長又は8塩基長であってもよい。DNAギャップ領域は、DNAからなる天然ヌクレオシドから構成される。
　本発明の核酸分子がギャップマーである場合、ギャップマーの5'ウイング領域及び3'ウイング領域の塩基長は、それぞれ独立して、少なくとも2塩基長、例えば、2～10塩基長、2～7塩基長、3～5塩基長、3～4塩基長、又は3塩基長であってもよい。本発明の核酸分子は、5'ウイング領域及び3'ウイング領域にLNA又はENAを少なくとも１個含んでもよい。例えば、5'ウイング領域は、LNA又はENAを少なくとも1個、例えば1～4個、2～4個、2～3個、例えば2個含んでもよい。3'ウイング領域はLNA又はENAを少なくとも1個、例えば1～4個、2～4個、2～3個、例えば2個含んでもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域の修飾の種類、数、位置は、同じであっても又は異なっていてもよい。5'ウイング領域及び3'ウイング領域には、2’-O-メチルヌクレオシド、2’-O-メトキシエチルヌクレオシド、2’-LNA又はENAを組みあわせてもよく、その修飾の種類は、1～４種類、２～３種類、例えば２種類を含んでもよく、それらの種類は、5'ウイング領域及び3'ウイング領域で同じであっても又は異なっていてもよい。
　本発明の核酸分子がギャップマーである場合、5'ウイング領域、DNAギャップ領域、及び3'ウイング領域の各領域の塩基長の例としては、2-8-3、3-8-2、3-7-3、4-6-3、3-6-4、4-5-4、4-7-3、3-7-4、4-6-4、5-6-3、3-6-5、3-7-5、5-7-3、4-7-4、4-6-5、5-6-4、5-5-5、5-6-5等が挙げられる。ここで、「A-B-C」の表記において、「A」は5'ウイング領域の塩基長を示し、「B」はDNAギャップ領域の塩基長を示し、「C」は3'ウイング領域の塩基長を示す。
　なお、ウイング領域を5'末端側又は3'末端側のいずれか一方にのみ有する核酸鎖は、当該分野では「ヘミギャップマー」と呼ばれるが、本明細書においては、ヘミギャップマーもギャップマーに包含されるものとする。
　本発明の核酸分子におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、本発明の核酸分子の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。ここで、例えば核酸鎖の末端から2つのヌクレオシド間結合とは、核酸鎖の末端に最も近接するヌクレオシド間結合と、それに隣接し、かつ末端とは反対側に位置するヌクレオシド間結合を意味する。核酸鎖の末端領域における修飾ヌクレオシド間結合は、核酸鎖の望ましくない分解を抑制又は阻害できるために好ましい。一実施形態では、核酸分子のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
　本発明の核酸分子は、全部又は一部にヌクレオシド模倣体又はヌクレオチド模倣体を含んでもよい。ヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸及び／又はモルホリノ核酸であってもよい。一実施形態において、本発明の核酸分子は、モルホリノ核酸を含んでもよく、又はモルホリノ核酸からなるものであってもよい。
　一実施形態では、本発明の核酸分子の天然リボヌクレオシドは、全長の半数以下であるか、又は含まれない。
　一実施形態において、本発明の核酸分子は、修飾核酸塩基を含んでもよい。修飾核酸塩基の数は限定せず、例えば少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、又は少なくとも6個であってもよい。
　本発明の核酸分子が有する標的転写産物に対するアンチセンス効果は、当該分野で公知の方法で測定できる。例えば、核酸分子を細胞等に導入した後、ノザンブロッティング、定量PCR、又はウェスタンブロッティング等の公知技術を使用することにより測定すればよい。特定の組織(例えば脳)における標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベル(例えば、mRNA量等のRNA量、cDNA量等)を測定することで、それらの部位において核酸分子によって標的遺伝子発現が抑制されるか否かを判定できる。測定された標的遺伝子の発現量又は標的転写産物のレベルが、陰性対照(例えばビヒクル投与又は無処置)と比較して、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%又は少なくとも50%減少している場合に、被験核酸化合物がアンチセンス効果をもたらし得ることが示される。
＜二本鎖核酸複合体＞
　一態様では、本発明は二本鎖核酸複合体に関する。本発明の二本鎖核酸複合体は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む。本発明の二本鎖核酸複合体では、第1核酸鎖がASOとして機能し得る。各核酸鎖の具体的な構成を以下に示す。
　第1核酸鎖は、上述の核酸分子の実施形態から選択することができる。例えば、第1核酸鎖は、ギャップマーである上記の核酸分子からなるか；又は(1)少なくとも2個（例えば、少なくとも3個又は少なくとも4個）の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、(2)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び(3)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、上記の核酸分子からなる。ギャップマー及び上記(1)～(3)の構成については、上述の核酸分子に関する記載に準じる。
　第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む核酸分子である。本発明の二本鎖核酸複合体において、第2核酸鎖は、相補的塩基対の水素結合を介して第1核酸鎖にアニールしている。本実施形態の一例としては、国際公開第2013/089283号、Nishina K, et. al., Nature Communication, 2015, 6:7969、及びAsami Y, et al., Drug Discoveries & Therapeutics. 2016; 10(5):256-262に開示されるヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド(heteroduplex oligonucleotide、HDO)がある。
　一実施形態では、本発明の二本鎖核酸複合体は、上述の核酸分子の実施形態から選択されるいずれかの第1核酸鎖と、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含む。さらなる実施形態において、第2核酸鎖は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、及び／又は修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが、(a)デオキシリボヌクレオシド；(b)デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド；(c)デオキシリボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド；(d)リボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド；又は(e)デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び2'-修飾ヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域における少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも2個の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドを含む領域を含む。例えば、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の中央領域における少なくとも3個又は少なくとも4個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも3個又は少なくとも4個の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドを含む領域を含んでもよい。ここで、第1核酸鎖の中央領域において連続するデオキシリボヌクレオシドの数、及び第2核酸鎖において、この連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドの数は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、上記の連続するデオキシリボヌクレオシドの数は少なくとも4個であり、上記の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドの数は少なくとも3個であってもよい。
　さらなる実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域を含んでもよい。第2核酸鎖において、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域は、少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含んでもよく、当該非天然ヌクレオシドは、例えば、架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドであってもよい。さらなる実施形態において、第2核酸鎖における架橋ヌクレオシドはLNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、又はBNANCヌクレオシドであってもよい。また、第2核酸鎖における2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基は、2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基であってもよい。なお、第1核酸鎖と第2核酸鎖が共に架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドを含む場合、第1核酸鎖及び第2核酸鎖における架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドは、同一であっても異なっていてもよい。
　第2核酸鎖におけるヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシド間結合であってよい。限定はしないが、第2核酸鎖の末端（5'末端、3'末端若しくは両端）から少なくとも1個、少なくとも2個、又は少なくとも3個のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが好ましい。一実施形態では、第2核酸鎖のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合であってもよい。一実施形態では、第2核酸鎖は、第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に修飾ヌクレオシド間結合を含んでもよい。修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であってよい。
　さらなる実施形態において、第2核酸鎖は、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むことができる。第2核酸鎖において、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドの数は限定しない。例えば、前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドの総数の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、若しくは少なくとも95％、又は100％が、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであってもよい。一実施形態では、第2核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである。
　さらなる実施形態において、第2核酸鎖は、5’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むことができる。5’末端及び／又は3’末端に位置する2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドの数は限定しない。例えば、第2核酸鎖は、5’末端に位置する1個又は連続する2個、3個、4個、5個、6個、若しくは7個の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2個、3個、4個、5個、6個、若しくは7個の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　また、第2核酸鎖は、上述の5’末端及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド以外の位置に、1～7個の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
　上記のいずれかの実施形態では、第2核酸鎖において、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド以外のヌクレオシドの種類は特に限定しない。例えば、第2核酸鎖において、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド以外の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドであってもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は修飾核酸塩基を含んでもよい。修飾核酸塩基の数は限定せず、例えば少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、又は少なくとも6個であってもよい。
　一実施形態において、第2核酸鎖は、相補的領域の5'末端側及び3'末端側の一方又は両方に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域をさらに含み得る。本実施形態の一例は、国際公開第2018/062510に記載される。「オーバーハング領域」とは、相補的領域に隣接する領域で、第1核酸鎖と第2核酸鎖がアニールして二本鎖構造を形成した場合、第2核酸鎖の5'末端が第1核酸鎖の3'末端を越えて伸長する、及び／又は第2核酸鎖の3'末端が第1核酸鎖の5'末端を越えて伸長する、つまり、二本鎖構造から突出した第2核酸鎖中のヌクレオチド領域を指す。第2核酸鎖中のオーバーハング領域は、相補的領域の5'末端側に位置してもよく、3'末端側に位置してもよい。第2核酸鎖中のオーバーハング領域は、相補的領域の5'末端側及び3'末端側に位置してもよい。
　一実施形態において、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖、例えば第2核酸鎖に、機能性部分が結合していてもよい。第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖と機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖と機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。
　ある実施形態において、「機能性部分」の構造は、特に制限はなく、それを結合する二本鎖核酸複合体に所望の機能を付与する。所望の機能としては、標識機能、精製機能及び標的への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチド等の化合物が挙げられる。また、第1核酸鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二本鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。標的への送達機能を与える部分の例としては、脂質、抗体、アプタマー、特定のレセプターに対するリガンド等が挙げられる。
　一実施形態において、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖、例えば第2核酸鎖は、脂質と結合している。脂質としては、トコフェロール、コレステロール、脂肪酸、リン脂質及びそれらの類縁体；葉酸、ビタミンC、ビタミンB1、ビタミンB2；エストラジオール、アンドロスタン及びそれらの類縁体；ステロイド及びその類縁体；LDLR、SRBI又はLRP1/2のリガンド；FK-506、及びシクロスポリン；PCT/JP2019/12077及びPCT/JP2019/10392記載の脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、トコフェロール又はその類縁体及び/又はコレステロール又はその類縁体、置換された若しくは置換されていないＣ１～３０のアルキル基、置換された若しくは置換されていないＣ２～３０のアルケニル基、若しくは置換された若しくは置換されていないＣ１～３０のアルコキシ基であってもよい。一実施形態では、第2核酸鎖はトコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合していてもよい。
　機能性部分は、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の5'末端、又は3'末端、あるいは両端に連結されていてもよい。あるいは、機能性部分は、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の内部のヌクレオチドに連結されていてもよい。第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖は、脂質等の機能性部分を2つ以上含み、これらは第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の複数の位置に連結されていてもよく、及び／又は第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の1つの位置に一群として連結されていてもよい。機能性部分は、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖の5'末端と3'末端にそれぞれ1つずつ連結されていてもよい。
　第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖と機能性部分との間の結合は、直接結合であってもよいし、別の物質によって介在される間接結合であってもよい。しかし、特定の実施形態においては、機能性部分は、共有結合、イオン性結合、水素結合等を介して第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖に直接結合されていることが好ましく、またより安定した結合を得ることができるという点から考えると、共有結合がより好ましい。
　機能性部分はまた、切断性(cleavable)又は非切断性(uncleavable)リンカーを介して第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖に結合されていてもよい。この場合、第1核酸鎖と第2核酸鎖は、リンカーを介して連結され、一本鎖を形成し得る。しかし、その場合も機能領域は二本鎖核酸複合体と同じ構成であることから、本明細書では、このような一本鎖核酸も本発明の二本鎖核酸複合体の一実施形態として包含する。リンカーは、任意のポリマーでありうる。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アルキレン等が挙げられる。具体的には、例えば、DNA、RNAといった天然のヌクレオチド又はペプチド核酸、モルホリノ核酸といった非天然のヌクレオチドから構成されうる。リンカーが核酸からなる場合、リンカーの鎖長は少なくとも1塩基、例えば、3～10塩基又は4～6塩基の鎖長をとりうる。好ましくは4塩基の鎖長である。この場合、リンカーはヒンジ(ヘアピンループ)の形態をとり得る。リンカーの位置は、第1核酸鎖の5’側でも3’側のいずれでも可能であるが、例えば、第1核酸鎖の5’側に第2核酸鎖を結合させた構成の場合には、第1核酸鎖の5’末端と第2核酸鎖の3’末端とがリンカーを介して連結されることになる。
　「切断性リンカー」とは、生理学的条件下で、例えば細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で、切断される連結基を意味する。特定の実施形態では、切断性リンカーは、ヌクレアーゼ等の内在性酵素によって選択的に切断される。切断性リンカーとしては、アミド、エステル、ホスホジエステルの一方若しくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、及びジスルフィド結合、並びに天然DNAリンカーが挙げられる。
　「非切断性リンカー」とは、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内(例えば、ヒト体内)で切断されないリンカーを意味する。非切断性リンカーは、限定はしないが、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾若しくは非修飾のデオキシリボヌクレオシド又は修飾若しくは非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。リンカーがDNA等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、鎖長は、特に限定はされないが、通常は2～20塩基長、3～10塩基長又は4～6塩基長であればよい。
　リンカーの一具体例として、以下の式(I)で表されるリンカーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、
L2は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン、ドデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～C8シクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又はCH(CH2-OH)-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-を表し、L3は、-NH-又は結合を表し、L4は、置換された若しくは置換されていないC1～C12のアルキレン基（例、エチレン、ペンチレン、へプチレン、アンデシレン）、置換された若しくは置換されていないC3～C8のシクロアルキレン基（例、シクロヘキシレン）、-(CH2)2-[O-(CH2)2]m-、又は結合を表し、ここで、mは1～25の整数を表し、L5は、-NH-(C=O)-、-(C=O)-、又は結合を表す(ここで、該置換は、好ましくはハロゲン原子によりなされる）。
　一実施形態において、式(I)で表されるリンカーは、L2が、置換されていないC3～C6のアルキレン基（例、プロピレン、ヘキシレン）、-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-、又は-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-であり、L3が、-NH-であり、L4及びL5が、結合である。
　第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、特に限定されないが、少なくとも8塩基長、少なくとも9塩基長、少なくとも10塩基長、少なくとも11塩基長、少なくとも12塩基長、少なくとも13塩基長、少なくとも14塩基長、又は少なくとも15塩基長であればよい。また、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の塩基長は、40塩基長以下、35塩基長以下、30塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、又は16塩基長以下であればよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖は、同じ長さであっても、異なる長さ（例えば、いずれか一方が1～3塩基短い又は長い長さ）であってもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖が形成する二本鎖構造は、バルジを含んでいてもよい。長さの選択は、例えば費用、合成収率等の他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決定することができる。なお、第1核酸鎖及び/又は第2核酸鎖にアプタマー等の核酸が結合している場合、第1核酸鎖及び第2核酸鎖の全体としての塩基長は、上記塩基長に結合した核酸の塩基長を加えたものであってよい。この場合、結合する核酸の塩基長は限定しないが、例えば少なくとも10塩基長、少なくとも15塩基長、又は少なくとも20塩基長であってよく、また100塩基長以下、80塩基長以下、60塩基長以下、40塩基長以下、又は30塩基長以下であってよい。
　一実施形態では、本発明の二本鎖核酸複合体の標的となる転写産物をコードする変異遺伝子は変異型TK2遺伝子であり、第1核酸鎖の塩基配列は、配列番号65（ただし、配列中のｔはuであってもよい）に記載の塩基配列からなり、かつ第2核酸鎖の塩基配列は、配列番号140、配列番号200、配列番号201、配列番号202、又は配列番号203（ただし、配列中のｔはuであってもよい）に記載の塩基配列からなる。本実施形態における第1核酸鎖は、その塩基配列が配列番号65（ただし、配列中のｔはuであってもよい）に記載の塩基配列からなる限り、当該核酸鎖における糖修飾やヌクレオシド間修飾は特に制限されない。例えば、ヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合であってもよく、修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であってもよい。第2核酸鎖も同様である。
　さらなる実施形態では、本発明の二本鎖核酸複合体の標的となる転写産物をコードする変異遺伝子は変異型TK2遺伝子であり、第1核酸鎖は配列番号65に記載の核酸鎖からなり、かつ第2核酸鎖は配列番号140、配列番号200、配列番号201、配列番号202、又は配列番号203に記載の核酸鎖からなる。本実施形態における第1核酸鎖は、その塩基配列、糖修飾、及びヌクレオシド間結合の全てが配列番号65に記載の構造として特定される。第2核酸鎖も同様である。
＜医薬組成物＞
　一態様において、本発明は医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の核酸分子、又は二本鎖核酸複合体を有効成分として含み、脊髄小脳失調症31型（SCA31）又は脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療に用いることができる。
（有効成分）
　本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体を二種以上含んでもよい。
　一実施形態において、本発明の医薬組成物として、変異型BEAN1遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体を含む、脊髄小脳失調症31型（SCA31）治療用医薬組成物が提供される。
　一実施形態において、本発明の医薬組成物として、変異型TK2遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体を含む、脊髄小脳失調症31型（SCA31）治療用医薬組成物が提供される。
　一実施形態において、本発明の医薬組成物として、変異型BEAN1遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体、並びに変異型TK2遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体を含む、脊髄小脳失調症31型（SCA31）治療用医薬組成物が提供される。
　一実施形態において、本発明の医薬組成物として、変異型ATXN10遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体を含む、脊髄小脳失調症10型（SCA10）治療用医薬組成物が提供される。
　医薬組成物に含まれる核酸分子又は二本鎖核酸複合体の量（含有量）は、核酸分子又は二本鎖核酸複合体の種類、送達すべき部位（例えば脳）、医薬組成物の剤形、医薬組成物の投与量、並びに後述する担体の種類によって異なる。したがって、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。通常は、単回投与量の医薬組成物に有効量の核酸分子又は二本鎖核酸複合体が含まれるように調整する。「有効量」とは、核酸分子又は二本鎖核酸複合体が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量をいう。「有効量」は、それを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しないものであってよい。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。最終的には医師、獣医師又は薬剤師等の判断によって決定される。「被験体の情報」とは、医薬組成物を適用する生体の様々な個体情報である。例えば、被験体がヒトであれば、年齢、体重、性別、食生活、健康状態、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。
　本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の核酸分子又は二本鎖核酸複合体のみからなるものであってもよい。あるいは、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の核酸分子又は二本鎖核酸複合体に加えて、担体等の補助的な成分をさらに含んでいてもよい。
（担体）
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、植物性油、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香味料、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、溶解助剤、及び他の添加剤が挙げられる。
　溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　上記担体は、有効成分である核酸分子又は二本鎖核酸複合体の生体内での酵素等による分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
（剤形）
　本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分である本明細書に記載の核酸分子又は二本鎖核酸複合体を分解等により不活化させることなく、生体内でその有効成分の薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
　具体的な剤形は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。投与方法は、非経口投与と経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
　投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、対象部位への直接投与又は循環系を介した全身投与が可能な液剤である。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、エリキシル剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。その他、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、点眼剤、及び坐剤であってもよい。
　投与方法が経口投与であれば、好ましい剤形は、固形剤（錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、乳剤、シロップ剤を含む）が挙げられる。固形剤であれば、必要に応じて、当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明の医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。
（投与形態及び投与量）
　本明細書において、医薬組成物の好ましい投与形態には特定の限定はない。投与は全身投与であっても局所投与であってもよい。投与経路は、経口投与又は非経口投与であってよい。非経口投与の具体例として、静脈内投与、動脈内投与、輸血による投与、腹腔内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼内投与、筋肉内投与、皮下投与（埋め込み型持続皮下投与を含む）、皮内投与、膀胱内投与、経膣内投与、直腸投与、吸入又は点鼻投与、並びに気管／気管支投与が挙げられる。本発明の適用対象部位が脳である場合、対象部位である脳室内投与又は髄腔内投与は好適である。
　医薬組成物が投与又は摂取により適用される場合、投与量又は摂取量は、例えば、含まれる核酸分子又は二本鎖核酸複合体が0.00001 mg/kg/日～10000 mg/kg/日、又は0.001 mg/kg/日～100 mg/kg/日となるようにすればよい。医薬組成物は、単回投与でも、複数回投与であってもよい。複数回投与の場合、毎日若しくは適当な時間間隔で（例えば1日、2日、3日、1週間、2週間、1ヶ月の間隔で）、例えば2～20回等投与することもできる。上記の核酸分子又は二本鎖核酸複合体の1回の投与量は、例えば、0.001 mg/kg以上、0.005 mg/kg以上、0.01 mg/kg以上、0.1 mg/kg以上、0.25 mg/kg以上、0.5 mg/kg以上、1 mg/kg以上、2.5 mg/kg以上、0.5 mg/kg以上、1.0 mg/kg以上、2.0 mg/kg以上、3.0 mg/kg以上、4.0 mg/kg以上、5 mg/kg以上、10 mg/kg以上、20 mg/kg以上、30 mg/kg以上、40 mg/kg以上、50 mg/kg以上、75 mg/kg以上、100 mg/kg以上、150 mg/kg以上、200 mg/kg以上、300 mg/kg以上、400 mg/kg以上、若しくは500 mg/kg以上とすることができ、例えば、0.001 mg/kg～500 mg/kgの範囲に含まれる任意の量（例えば、0.001 mg/kg、0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、若しくは200 mg/kg）を適宜選択することができる。
　本発明の核酸分子又は二本鎖核酸複合体は、0.01～10 mg/kg（例えば約6.25 mg/kg）の用量で週2回の頻度で4回投与してもよい。また、核酸分子又は二本鎖核酸複合体は、0.05～30 mg/kg（例えば約25 mg/kg）の用量で週1～2回の頻度で2～4回、例えば週2回の頻度で2回投与してもよい。このような投与レジメン（分割投与）の採用により、より高用量の単回投与に比べて、毒性（例えば血小板の減少を回避する）を下げ、被験体への負荷を低減することができる。
　医薬組成物は反復投与でも細胞内において抑制効果が相加的に働く。また、反復投与する場合、ある程度の投与間隔（例えば、半日以上）をおいた方が有効性を向上させることができる。
　本発明によれば、脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療に使用するための、本明細書に記載の変異型BEAN1遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体、並びに／又は変異型TK2遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体もまた提供される。
　また本発明によれば、脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療に使用するための、本明細書に記載の変異型ATXN10遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体もまた提供される。
＜方法＞
　一態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子、二本鎖核酸複合体、又は医薬組成物を被験体に投与することを含む、転写産物に対してアンチセンス効果をもたらす方法に関する。当該方法は、被験体の疾患を治療又は予防する方法であってもよい。
＜治療方法＞
　一態様において、本発明は、有効量の、本明細書に記載の核酸分子、二本鎖核酸複合体、又は医薬組成物を患者に投与することを含む、治療方法に関する。本態様の治療方法が対象とする疾患は、脊髄小脳失調症31型（SCA31）又は脊髄小脳失調症10型（SCA10）である。脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療方法は、患者に対して有効量の、本明細書に記載の変異型BEAN1遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体、並びに／又は変異型TK2遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体を投与することを含む。脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療方法は、患者に対して有効量の、本明細書に記載の変異型ATXN10遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体を投与することを含む。
＜製造方法＞
　本発明の核酸分子、二本鎖核酸複合体、又は医薬組成物は、当業者であれば、公知の方法を適切に選択することによって製造することができる。限定はしないが、通常は、まず核酸分子、又は二本鎖核酸複合体を構成する第1核酸鎖及び第2核酸鎖のそれぞれを設計し、製造するところから始まる。例えば、標的転写産物の塩基配列（例えば、標的遺伝子の塩基配列）情報に基づいて核酸分子又は第1核酸鎖を設計し、その相補鎖として第2核酸鎖を設計する。続いて、設計した塩基配列情報に基づいて、それぞれの核酸鎖を、例えば、GE Healthcare社、Thermo Fisher Scientific社、Beckman Coulter社等の市販の自動核酸合成装置を使用してホスホロアミダイト法を用いて合成すればよい。その後は、得られたオリゴヌクレオチドに逆相カラム、イオン交換カラム等を使用して精製するもできる。
　また、機能性部分が結合した二本鎖核酸複合体の場合には、第1核酸鎖は上記方法に準じて製造すればよい。一方、機能性部分が結合した第2核酸鎖は、機能性部分が予め結合した核酸種を用いて、上記の合成、及び精製を行い、製造することができる。例えば、機能性部分が予め結合された核酸種を用いて、上記の合成及び精製を実施することによって第2核酸鎖を製造してもよい。あるいは、上記の合成及び精製を実施することによって製造された第2核酸鎖に、公知の方法により機能性部分を結合させてもよい。各核酸鎖を製造後、第1核酸鎖と第2核酸鎖に対して、後述するアニーリングを実施することによって目的とする機能性部分が結合した二本鎖核酸複合体を製造することができる。
　機能性部分を核酸に連結する方法は当該技術分野において周知である。この方法で製造した核酸を適切な緩衝溶液中で混合し、約90℃～98℃で数分間（例えば5分間）変性させ、その後核酸を約30℃～70℃で約1～8時間アニールして、本発明の二本鎖核酸複合体の一つを製造することができる。また、核酸鎖は、塩基配列並びに修飾部位及び種類を指定して、各種メーカー(例えば、株式会社ジーンデザイン)に注文し、入手することもできる。上記アニール工程は、室温（約10℃～35℃）に約5～60分間静置することで、行うことができる。第1核酸鎖及び第2核酸鎖をそれぞれ、約70℃～98℃の緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）又は水中で溶解し、得られた2つの溶液を混合し、混合液を約70℃～98℃で数分間（例えば5分間)保持し、その後、混合液を約30℃～70℃（又は約30℃～50℃）で約1～8時間保持して、本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体を調製してもよい。第1核酸鎖及び第2核酸鎖はそれぞれ、室温（約10℃～35℃）で緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）又は水中で溶解することもできる。二本鎖核酸複合体の作製時におけるアニーリングの条件（時間及び温度）は、上記条件に限定されない。また、核酸鎖のアニーリングを促進するのに適した条件は、当該技術分野において周知である。
　一実施形態において、脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療に使用するための、本明細書に記載の変異型BEAN1遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体、並びに／又は変異型TK2遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体の使用が提供される。
　別の実施形態において、脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療に使用するための、本明細書に記載の変異型ATXN10遺伝子の転写産物を標的とする核酸分子及び／又は二本鎖核酸複合体の使用が提供される。
　以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
＜実施例１：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASO（LNA/DNAギャップマー）の合成＞
　変異型TK2遺伝子転写産物におけるSCA31異常反復領域（以下、「SCA31変異リピート（TK2）」と表記する）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）を株式会社ジーンデザイン(Gene Design)(大阪、日本)に依頼して合成した。
　合成したASOを表1及び図6に示す。本実施例で合成したASOはいずれもLNA/DNAギャップマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜実施例２：実施例１で合成したLNA/DNAギャップマーによる遺伝子発現抑制効果の検証＞
（目的）
　実施例１で合成したASO（LNA/DNAギャップマー）によるSCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
（１）qRT-PCR
　SCA31変異リピート（TK2）を一過性発現すると共に実施例１で作製したASOをHeLa細胞に導入し、SCA31変異リピート（TK2）に対する遺伝子発現抑制効果を検証する。
　SCA31変異リピート（TK2）の一過性発現には、chicken β-actinプロモーターの下流にSCA31変異リピート（TK2）の配列を配置し、その直後にIRES-EGFPを有するpkSCX-IRES-EGFP vectorを用いた（図36A）。pkSCX-IRES-EGFP vector 0.8 μgをOpti-MEM 50 μLで希釈した。ASOは、10μM in PBSにてストック溶液を作製した。
　なお、本明細書の実施例では、特に断りのない限り、陰性対照としてPBSを使用し（図中、「Control」として示す）、導入するASOと同じ量のPBSを遺伝子導入時に加えた。
　また、標的配列と関連しない塩基配列からなるASOをさらなる対照として使用し（図中、「Unrelated」として示す）、以下の表2に示すいずれかの配列を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　Lipofectamin2000 2 μLを含むOpti-MEM 50 μLを用いて、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vector（図36A）と共にASO（0.1～2nM）をHeLa細胞1.2×105個/μLに共形質導入した。形質導入から24時間後、ISOGENによる抽出とイソプロパノール沈降法により、HeLa細胞からRNAを回収した。次いで、PrimeScript RT Reagent（Takara Bio）を用いて、回収したRNA 250 ngをcDNAに変換した。この原液を鋳型として使用して、SCA31-0_primer FW（配列番号18、5'-TGGCTGCACATAGCTTTATCTCTT-3'）及びSCA31-0_primer RV（配列番号20、5'-AAGCCCAATCTGGAAGCAAA-3'）からなるProbe primer mixture：SCA31-0（TaqMan）を用いて、Roche Light Cycler 480IIを使用してqRT-PCRを行った。qRT-PCRにより検出した位置を図36Aにおいて「SCA31-0」として示す。リファレンスにはACTB（Hs01060665-g1、ABI）を用いて、ΔΔCt法で個々の結果を解析し、t検定により有意性を解析した。
　形質導入効率を確認するために、pkScx-IRES-EGFP vectorの1/40量のds-Redを共形質導入し、24時間後に蛍光強度に差がないことを確認した。
　qRT-PCRの結果を図7に示す。特にT-j1、T-j2、T-r2、T-r1、T-r3、T-r4、T-r5、T-r8、T-r7、T-r12、T-r13、T-r16、及びT-r10により、SCA31変異リピート（TK2）に対する強い発現抑制効果が得られた。この結果から、ASOの標的配列が5’領域とコア反復領域との境界を含む場合、及びコア反復領域と3’領域との境界を含む場合、並びにASOの標的配列がコア反復領域の内側に位置する場合に強い発現抑制効果が得られる傾向が見出された。
（２）FISH
　上記（１）に用いたASOからT-r1（配列番号33）を選択し、SCA31変異リピート（TK2）に対する遺伝子発現抑制効果をFISHによって検証した。その他の配列においても同様に検証した。
　上記（１）と同様の方法でTK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（T-r1）をHeLa細胞に導入した。遺伝子導入から24時間後に1×PBSで5分間洗浄し、4% PFAで1時間前固定を行った。1×PBSで5分間洗浄後、0.2N HClで20分反応させ細胞壁を破壊し、0.1% TritonX-100で10分間透過処理を行った。1×PBSで5分間洗浄及び4% PFAで5分間後固定後に、無水酢酸トリエタノールアミン溶液で20分アセチル化を行った。4×SSCで5分間×2回洗浄、30分間のプレハイブリダイゼーション後に、DIGでラベルしたLNA-(TGGAA)5 probeをハイブリダイゼーションした（60℃、2時間）。4×SSCで5分、2×SSC/Formamideで20分×3回、0.1×SSCで40分×3回、60℃で洗浄した。30分間ブロッキングを行った後、1/2000の抗DIG-AP抗体を4℃で一晩反応させた。TBS-tで15分間×4回洗浄後、ディテクション溶液（0.1M Tris-HCl, 10mM MgCl2,0.1M NaCl）で10分間反応後、HNPP/FastRedで30分間発色した。最後にHoechstで10分間核染色を行い、VECTASHEILDで包埋した。
　FISHの結果を図8に示す。図8では、SCA31変異リピート（TK2）の発現が検出された細胞を矢印で示す。ASO（T-r1）によって、SCA31変異リピート（TK2）の発現が抑制されることが示された。
＜実施例３：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするENA/DNAギャップマーの合成＞
　本実施例におけるSCA31変異リピート（TK2）を標的とするASOの合成方法をT-re10：
　HO-Te2s-Ge2s-Gs-As-As-Ts-Gs-Gs-As-As-Te2s-Ge2s-G2t-H（配列番号59）
　（式中の各記号の意味は上述の通りである。）
を例に説明する。
　核酸自動合成機（BioAutomation製MerMade 192X）を用い、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)を用いて合成を行った。試薬としては、アクチベーター溶液-3 (0.25 mol/L 5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール・アセトニトリル溶液、和光純薬工業製、product No. 013-20011)、CAP A for AKTA (1-メチルイミダゾール・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L040050)、Cap B1 for AKTA (無水酢酸・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050050)、Cap B2 for AKTA (ピリジン・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050150)、DCA Deblock (ジクロロ酢酸・トルエン溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L023050)を用いた。ホスホロチオエート結合を形成するためのチオ化試薬として、0.2Mになるようにフェニルアセチルジスルフィド（CARBOSYNTH製、product No. FP07495）を、アセトニトリル (脱水、関東化学製、product No. 01837-05)、ピリジン (脱水、関東化学製、product No. 11339-05)1:1(v/v)溶液を用いて溶解して用いた。アミダイト試薬としては、DNAのホスホロアミダイト(アデノシン体product No. ANP-5551, グアノシン体product No. ANP-5553, チミジン体product No. ANP-5554)及び2'-OMeヌクレオシドのホスホロアミダイト(アデノシン体product No. ANP-5751, シチジン体product No. ANP-5752,グアノシン体product No. ANP-5753, ウリジン体product No. ANP-5754)はChemGenes製のものを用いた。5-メチルデオキシシチジンホスホロアミダイトは引用文献（Organic Process Research & Development, 2000, 4, 175-181）の6fの化合物を用いた。非天然型のホスホロアミダイトは特開2000-297097の実施例14(5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例27（5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例22（5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例9（5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-5-メチルウリジン-3'-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用いた。固相担体として、Glen Unysupport FC 96ウェルフォーマット0.2 μmol（GlenResearch製）を用い、上記T-re10（配列番号59）を合成した。ただし、アミダイト体の縮合に要する時間は、約9分とした。
　目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を600 μLの濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。オリゴマーの混合溶液を、Clarity QSP DNA Loading Buffer（Phenomenex製）300 μLを混合し、Clarity SPE 96 well plate（Phenomenex製）上にチャージした。Clarity QSP DNA Loading Buffer:水 = 1:1溶液1 mL、水3 mL、3%ジクロロ酢酸(DCA)水溶液3 mL、水6 mLの順に添加した後、20mM Tris水溶液:アセトニトリル= 9:1溶液にて抽出される成分を集めた。溶媒留去後、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Phenomenex, Clarity 2.6 μm Oligo-MS 100A (2.1×50 mm)）、A溶液：100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：10% → 25%（4 min, linear gradient）；60℃；0.5 mL/min；260 nm）で分析すると、2.12分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した。
　合成したASOを表3に示す。本実施例で合成したASOはいずれもENA/DNAギャップマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜実施例４：実施例３で合成したASO（ENA/DNAギャップマー）による遺伝子発現抑制効果の検証＞
（目的）
　実施例３で合成したASO（ENA/DNAギャップマー）によるSCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASOをHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。ASOとして実施例１で合成したLNA/DNAギャップマー及び実施例３で合成したENA/DNAギャップマーを0.1nM、0.5nM、又は2nMにて使用した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図9に示す。この結果から、ENA/DNAギャップマーによってLNA/DNAギャップマーと同等の発現抑制効果が得られることが見出された。
＜実施例５：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASO：ENA-2’-OMe RNA-ENAウイング領域を有するギャップマー＞
（目的）
　ウイング領域にENA-2'-OMe RNA-ENA構造を有するENA/DNAギャップマーを合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表4に示す。本実施例で合成したASOはいずれもENA-2’-OMe RNA-ENAウイング領域を有するENA/DNAギャップマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASOをHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。ASOは、0.1nM、0.5nM、1nM、又は2nMで使用した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図10に示す。この結果から、ENA-2’-OMe RNA-ENAウイング領域を有するENA/DNAギャップマーによって、LNA/DNAギャップマーと同等の発現抑制効果が得られることが見出された。
＜実施例６：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASO：T-re10aの周辺配列＞
（目的）
　実施例５でSCA31変異リピート（TK2）に対して強い発現抑制効果を示したT-re10aの周辺配列からなるASOを合成し、その効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.1nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図11に示す。表5に示すASOの中では、T-re10eがT-re10aと同等の発現抑制効果を示した。また、T-re10f～T-re10pも発現抑制効果を示した。これらの化合物の中で、T-re10a、及びT-re10eが最も発現抑制効果が強いことが明らかとなった。
＜実施例７：SCA31変異リピート（TK2）のコア反復領域内部を標的とするENA/DNAギャップマー＞
（目的）
　SCA31変異リピート（TK2）のコア反復領域内部を標的とし、ウイング領域にENA-2’-OMe RNA-ENA構造を有するENA/DNAギャップマーを合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表6に示す。また、SCA31変異リピート（TK2）における各ASOの位置を図12に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.1nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図13に示す。T-r1a、T-r2a、T-r2b、T-r2c、及びT-r2dのいずれも強い遺伝子発現抑制効果を示した。特にT-r1aによる発現抑制効果が強いことが見出された。
＜実施例８：SCA31変異リピート（TK2）のコア反復領域内部を標的とするASO：MOE/DNAギャップマー＞
（目的）
　SCA31変異リピート（TK2）のコア反復領域内部を標的とするASO（MOE/DNAギャップマー）を合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表7に示す。また、SCA31変異リピート（TK2）における各ASOの位置を図14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.5nM又は2nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図15に示す。表7に示すASOは、いずれも遺伝子発現抑制効果を示し、特にT-r2'-1が強い発現抑制効果を示した。
＜実施例９：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASO：MOE/ENA/DNAギャップマー＞
（目的）
　ウイング領域内のMOE及びENAの位置及び個数を改変したMOE/ENA/DNAギャップマーを合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表8に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.5nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図16に示す。表8に示すASOは、いずれも強い遺伝子発現抑制効果を示し、それらの中では、T-r2'#4、T-r2'#15、T-r2'#23、T-r2'#24、及びT-r2'#25が強い発現抑制効果を示した。5'ウイング領域と3’ウイング領域にENAを2個ずつ含むT-r2'#23及びT-r2'#25が特に強い発現抑制効果を示した。
＜実施例１０：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASO：MOE/ENA/DNAギャップマー＞
（目的）
　ウイング領域内のMOE及びENAの位置及び個数を改変したMOE/ENA/DNAギャップマーを合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表9に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.5nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図17に示す。表9に示すASOは、いずれも強い遺伝子発現抑制効果を示し、それらの中では、T-r2'#30、T-r2'#32、及びT-r2'#33が特に強い発現抑制効果を示した。
＜実施例１１：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASO：MOE/ENA/DNAギャップマー＞
（目的）
　ウイング領域内のMOE及びENAの位置及び個数を改変したMOE/ENA/DNAギャップマーを合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表10に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.5nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図18に示す。表10に示すASOはいずれも強い発現抑制効果を示した。
＜実施例１２：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASO：2’-OMe RNA/ENA/DNAギャップマー＞
（目的）
　ウイング領域内に2’-OMe RNA及びENAを含む2’-OMe RNA/ENA/DNAギャップマーを合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表11に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.5nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図19に示す。表11に示すASOは、いずれも強い遺伝子発現抑制効果を示し、それらの中では、T-r2'#13wOme、及びT-r2'#23wOmeが強い発現抑制効果を示した。
＜実施例１３：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするヘテロ2本鎖核酸（HDO）の合成＞　SCA31変異リピート（TK2）を標的とするASOとその相補鎖からなるヘテロ2本鎖核酸（HDO）を合成する。HDOを構成するASOではホスホロチオエート結合（PS結合）の数を減らし、ホスホジエステル結合とする。
　HDOの合成方法をT-re10a HDOを例に説明する。
（１）TK2-r2の合成
　以下に示すTK2-r2：
　HO-Cm1s-Cm1s-Am1s-Urp -Urp -Crp -Crp -Arp -Urp -Urp -Crs-Cm1s-Am1t-H （配列番号140）
　（式中の各記号の意味は上述の［化１］に記載の通りである。）
を合成する。
　核酸自動合成機（Gene Design製nS-8 II）を用い、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)を用いて合成を行った。試薬としては、アクチベーター溶液-3 (0.25 mol/L 5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール・アセトニトリル溶液、和光純薬工業製、product No. 013-20011)、CAP A for AKTA (1-メチルイミダゾール・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L040050)、Cap B1 for AKTA (無水酢酸・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050050)、Cap B2 for AKTA (ピリジン・アセトニトリル溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L050150)、DCA Deblock (ジクロロ酢酸・トルエン溶液、Sigma-Aldrich製、product No. L023050)、Oxidizer 0.05M Iodine for AKTA (ピリジン／水／ヨウ素 = 9/1/12.7(v/v/w)、Sigma-Aldrich製)を用いた。ホスホロチオエート結合を形成するためのチオ化試薬として、0.2Mになるようにフェニルアセチルジスルフィド（CARBOSYNTH製、product No. FP07495）を、アセトニトリル (脱水、関東化学製、product No. 01837-05)、ピリジン (脱水、関東化学製、product No. 11339-05)1:1(v/v)溶液を用いて溶解して用いた。アミダイト試薬としては、RNAのホスホロアミダイト(アデノシン体product No. ANP-5671, シチジン体product No. ANP-6676, ウリジン体product No. ANP-5674)及び2'-OMeヌクレオシドのホスホロアミダイト(アデノシン体product No. ANP-5751, シチジン体product No. ANP-5752)はChemGenes製のものを用いた。固相担体として、Primer Support 5G Unylinker 350（GE Healthcare製）を用い、本実施例の化合物を合成した。ただし、アミダイト体の縮合に要する時間は、約10分とした。
　目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を6 mLの濃アンモニア水／エタノール＝3/1(v/v)で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。得られた脱保護溶液から担体をろ過により除去し、減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣を5 mLの1.0M TBAF THF溶液（東京化成製）で処理することによってRNAの2'-OH上のTBDMS基をはずした。得られたオリゴマーの混合溶液に1.0M TEAB溶液（和光純薬製）から調製した0.1M TEAB溶液30 mL反応液を添加し逆相オープンカラムクロマトグラフィーで精製（Cosmosil ODS silicagel、A溶液：0.1 M TEAB溶液、B溶液：アセトニトリル、B%：0% → 100%（16 min, linear gradient）；20 mL/min）した。目的物を含むフラクションを回収し減圧濃縮し、得られた残渣をDOWEX 50（和光純薬製）で処理した。得られた溶液を減圧濃縮し、0.01M塩酸を加えpH 2.0で1時間撹拌することで5'-OHの保護基をはずした。得られた反応溶液に濃アンモニ水を加え中和した。得られたオリゴマーの混合溶液と1.0M TEAB溶液（和光純薬製）から調製した0.1M TEAB溶液30 mLを混合し、Clarity QSP 5 g/6 mL Cartridge（Phenomenex製）上にチャージした。0.1M TEAB溶液30 mLを添加した後、30 mLの5.0, 6.6, 10%アセトニトリル／20mM Tris水溶液にて抽出される成分を集めた。得られたオリゴマー溶液をアミコンウルトラ 3K（Merck製）を用いた限外ろ過により濃縮した。PBS（Thermo Fisher製)を加え塩交換し、その後脱塩を行うことで目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Phenomenex, Clarity 2.6 μm Oligo-MS 100A (2.1×50 mm)）、A溶液：100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液：メタノール、B%：10% → 25%（4 min）→ 40%（2 min）→ 65%（2 min）→ 100%（2 min）；60℃；0.5 mL/min；260 nm）で分析すると、1.44分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定（負イオンESI質量分析実測値4129.52）した。
（２）T-re10a（配列番号65）とTK2-r2（配列番号140）が2本鎖を形成したT-re10a HDOの調製
　T-re10a（2.0 μmol、配列番号65）とTK2-r2（2.0 μmol、配列番号140）をそれぞれミリQ水（1000 μL）に溶解し、等モル量（1.8 μmol）で混合し、5分間70℃で加熱し、その後5分間氷冷し、２つの化合物の混合溶液を得た。得られた混合溶液を20%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動（Tris-bolate EDTA （TBE）buffer、200 V定電圧、 1時間）を行い、メチレンブル-を用いて染色・可視化した結果、1本鎖であるT-re10aとTK2-r2のそれぞれに該当するバンドが消失し、T-re10aとTK2-r2よりも移動度の低い新たなバンドの生成が確認された。新たに生成したバンドに該当する化合物は、T-re10aとTK2-r2が2本鎖を形成したT-re10a HDOと同定した。2つの化合物の混合溶液を凍結乾燥することにより、T-re10a HDOを得た。
　上記と同様の方法により合成したHDOを構成する核酸を表12に示す。また、HDOを構成する核酸鎖の構成を表13に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
＜実施例１４：実施例１３で合成したHDOによる遺伝子発現抑制効果の検証＞
（目的）
　実施例１３で合成したHDOによるSCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にHDO（0.5nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図20に示す。表13に示すHDOはいずれも強い発現抑制効果を示した。
＜実施例１５：SCA31変異リピート（TK2）を標的とするミックスマー＞
（目的）
　SCA31変異リピート（TK2）を標的とするミックスマーを合成して、SCA31変異リピート（TK2）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　実施例２と同様の方法で、TK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（2nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（TK2）の発現量を定量した結果を図21に示す。表14に示すミックスマーの中では、T-r1-LNA/DNA mixmer (T-LDM)により良好な発現抑制効果が得られた。
＜実施例１６：SCA31変異リピート（BEAN1）を標的とするASO（LNA/DNAギャップマー）＞
　変異型BEAN1遺伝子転写産物におけるSCA31異常反復領域（以下、「SCA31変異リピート（BEAN1）」と表記する）を標的とするASO（LNA/DNAギャップマー）を実施例1と同様の方法で合成した。合成した核酸を以下の表15及び図23に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　SCA31変異リピート（BEAN1）を一過性発現すると共に作製したASOをHeLa細胞に導入し、SCA31変異リピート（BEAN1）に対する遺伝子発現抑制効果を検証する。SCA31変異リピート（BEAN1）の一過性発現には、実施例2と同様にchicken β-actinプロモーターの下流にSCA31変異リピート（BEAN1）の配列を配置し、その直後にIRES-EGFPを有するpkSCX-IRES-EGFP vectorを用いた（図36B）。実施例2と同様に、BEAN1方向SCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（2nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した。qRT-PCRでは、SCA31-0_primer FW（配列番号18、5'-TGGCTGCACATAGCTTTATCTCTT-3'）及びSCA31-0_primer RV（配列番号20、5'-AAGCCCAATCTGGAAGCAAA-3'）からなるProbe primer mixture：SCA31-0（TaqMan）を用いた。。
　SCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した結果を図24に示す。評価に用いた化合物は、いずれも強い遺伝子発現抑制効果を示した。特にB-r11、B-r12、B-r13、B-r14、B-r15、B-r16、B-r9、B-r10、B-r6、B-r8、B-r5、B-r4、B-r3、B-r2、B-r1、B-r7、B-j1、B-j2、B-j3、B-j4、及びB-j5により、SCA31変異リピート（BEAN1）に対する強い発現抑制効果が得られた。この結果から、ASOの標的配列が5’領域とコア反復領域との境界を含む場合、及びコア反復領域と3’領域との境界を含む場合、並びにASOの標的配列がコア反復領域の内側に位置する場合に強い発現抑制効果が得られる傾向が見出された。
　LNA-(TTCCA)5 probeを用いた実施例2と同様のFISHにより、SCA31変異リピート（BEAN1）を標的とするASOによってSCA31変異リピート（BEAN1）の発現抑制が確認された。
＜実施例１８：SCA31変異リピート（BEAN1）を標的とするASO：B-r2の周辺配列＞
（目的）
　実施例１６でSCA31変異リピート（BEAN1）に対して強い発現抑制効果を示したB-r2の周辺配列からなるASOを合成し、その効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表16に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　実施例１６と同様の方法で、BEAN1方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.1nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した結果を図25に示す。B-r2a及びB-r2bは、いずれも強い遺伝子発現抑制効果を示した。B-r2による発現抑制効果は、B-r2a及びB-r2b の効果よりも高いものであった。
＜実施例１９：SCA31変異リピート（BEAN1）のコア反復領域内部を標的とするASO：MOE/DNAギャップマー＞
（目的）
　SCA31変異リピート（BEAN1）のコア反復領域内部を標的とするASO（MOE/DNAギャップマー）を合成して、SCA31変異リピート（BEAN1）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表17に示す。また、SCA31変異リピート（BEAN1）における各ASOの位置を図26に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　実施例１６と同様の方法で、BEAN1方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（0.1nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した結果を図27に示す。表17に示すASOはいずれも良好な発現抑制効果を示した。
＜実施例２０：SCA31変異リピート（BEAN1）を標的とするミックスマー＞
（目的）
　SCA31変異リピート（BEAN1）を標的とするミックスマーを合成して、SCA31変異リピート（BEAN1）の遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例３と同様の方法によりASOを合成した。合成したASOを表18に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　実施例１６と同様の方法で、BEAN1方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと共にASO（2nM）をHeLa細胞に導入し、qRT-PCRによってSCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した。
　SCA31変異リピート（BEAN1）の発現量を定量した結果を図28に示す。表18に示すミックスマーでは、B-r1-LNA/DNA mixmer(B-LDM)が比較的良好な発現抑制効果を示した。
＜実施例２１：in vivoでのSCA31変異リピートに対する発現抑制効果の検証＞
（目的）
　ASO/HDOによるSCA31変異リピート（TK2）及びSCA31変異リピート（BEAN1）に対する遺伝子発現抑制効果をin vivoで検証する。
（方法と結果）
（１）SCA31病態モデルマウスの作製
　ASOのin vivoでの効果を検討するために、TK2-Tgマウス及びBEAN1-BAC-Tgマウスを作製した。TK2-Tgマウスは、上述の実施例で使用したTK2方向のSCA31挿入配列を含むpkSCX-IRES-EGFP vectorと同じ構築物（図29A）をC57BL/6Jマウスに導入することによって作製した。BEAN1-BAC Tgは、患者ゲノム領域を包含するBAC（図29B）をC57BL/6Nマウスに導入することによって作製したラインDを使用した。TgマウスはいずれもSCA31患者脳と同様の変異配列の発現があり、歩行異常をきたす。
　本実施例で使用したTK2-Tgマウス及びBEAN-BAC-Tgマウスの概要を以下の表19に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
（２）マウス脳室への注入
　（１）で作製したTK2-Tgマウス（継代数F5、13週齢、体重20～30g）、及びBEAN1-BAC Tgマウス（継代数F9、25週齢、体重20～30 g）の脳室にASO/HDOを注入した。
　ASOは50 μg/μL PBSをストック溶液として使用し、85℃3分で変性後に使用した。HDOは主鎖と同一量のcRNAを95℃5分、37℃60分で調製した。ASOはPBSで希釈し、10 μLを薬剤液とした。HDOはPBSで希釈し、10 μLを薬剤液とした。ControlとしてPBS 10 μLを投与した。
　マウスへの麻酔は2%イソフルランで導入し、術中は1.5～2.5%で維持した。術中及び術後は38℃にて保温した。
　マウス脳室への注入は、左側脳室に対して行った。注入位置は、Bregmaより外側に1 mm、尾側に0.2 mmの部位より頭蓋内に3 mmの位置とした（図30において「○」で示す）。穿刺し2分静置後、薬剤10 μLを3分かけて注入し、5分静置後に抜針した。
　本実施例で使用したASO及びHDOを表20～23にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
（３）qRT-PCRによる発現解析
　脳室注入から1週間で両側海馬、小脳を摘出した。Trizolを用いて抽出し、イソプロパノール沈降法でRNAを回収した。回収したRNA 1 μgからPrimeScript Takaraを用いてcDNAを調製した。EASY DilusionでTK2-Tgマウスから得られた産物は10分の1希釈したもの、BEAN1-BAC-Tgマウスから得られた産物は5分の1希釈したものを鋳型として使用した。Roche Light Cycler 480IIでq-PCRを行った。q-PCRのプライマーは、TK2-TgマウスについてはSCA31-1_primer FW（配列番号10、5'-TGGATAGAAACCCCAGCTTCCT-3'）及びSCA31-1_primer RV（配列番号15、5'-CTGCCTCCGACACTTTTCAATT-3'）からなるSCA31-1（TaqMan）を使用し、BEAN1 BAC-TgマウスについてはEx2-3_primer FW（配列番号25、5'-CAGCCACTGCCCAGGACTAA-3'）及びEx2-3_primer RV（配列番号30、5'-GCCACTTCTCTGCCTCAGAGA-3'）からなるAB472391-1（Ex2-3）を使用した。q-PCRにより検出した位置を図29において「SCA31-1」及び「EX2-3」として示す。リファレンスとしてACTB（Mm00607939_s1）を使用した。
　T-re10a ASO（100 μg）によるSCA31変異リピート（TK2）に対する発現抑制の結果を図31Aに示す。T-re10a ASOにより、SCA31変異リピートに対する強い発現抑制効果がin vivoで得られることが見出された。
　T-re10a HDO（0.3 μg～300 μg）によるSCA31変異リピート（TK2）に対する発現抑制の結果を図31Bに示す。T-re10a HDOにより、SCA31変異リピートに対し濃度依存的に良好な発現抑制効果がin vivoで得られることが見出された。特に10 μg以上の投与で効果が強かった。
　T-r2'_1 ASO（100 μg）によるSCA31変異リピート（TK2）に対する発現抑制の結果を図32Aに示す。T-re10a ASOと比較すると弱いが、T-r2'_1 ASOによってもSCA31変異リピートに対する発現抑制効果がin vivoで得られることが見出された。
　B-r2 ASO（10 μg又は50 μg）によるSCA31変異リピート（BEAN1）に対する発現抑制の結果を図32Bに示す。B-r2 ASOの50 μg投与により、SCA31変異リピート（BEAN1）に対する強い発現抑制効果が得られた。
（４）ノザンブロットによる発現解析
　（３）と同様の方法により左小脳から得られたRNAサンプルにDNase処理を行った後に、Oligotex（商標）-dt30 <super> mRNA Purification Kit Takaraを用いてPolyA精製をしたサンプルでノザンブロットを行った。50 V、3.5時間で泳動を行い、20時間で転写を行った後、UVクロスリンクによりメンブレン上にRNAを固定した。DIGラベルしたLNA-(TTCCA)5プローブ（配列番号31）及びLNA-(TGGAA)5プローブ（配列番号32）を用いてハイブリダイゼーションを45℃にてO/Nで行った後、抗DIG-AP抗体で検出した。DIG Wash and Block Buffer Setを使用し、CDP Starで発色した。
　ノザンブロットの結果を図31Cに示す。図31Cにおいて、左から1～3番目のレーンは、PBSを注入した陰性対照マウスから得られたそれぞれ1 μg、0.5 μg、0.25 μgのRNAサンプルをロードしてSCA31リピートを検出した結果を示す。左から4番目のレーンは、300 μgのT-re10a HDOを注入したマウスから得られた1 μgのRNAサンプルをロードしてSCA31リピートを検出した結果を示す。この結果から、T-re10a HDOの投与により、SCA31変異リピート（TK2）の発現が4分の1以下に低下したことが示された。
＜実施例２２：2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDO＞
（目的）
　第1核酸鎖がT-re10aからなり、第2核酸鎖が2'-O-MOE-RNAヌクレオシドを含むHDOを作製し、SCA31変異リピート（TK2）に対する遺伝子発現抑制効果を検証する。
（方法と結果）
　実施例21と同様の方法によりHDOを作製した。作製したHDOを以下の表24に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　実施例21と同様の方法により、HDOをTK2-Tgマウスの脳室に注入し、1週間後に両側の海馬と小脳においてSCA31変異リピート（TK2）の発現をqRT-PCRにより解析した。
　T-re10a HDO (Default)、T-re10a HDO (cMOE/DNA)、T-re10a HDO (Full cMOE)、T-re10a HDO (cMOE/DNA_2)、及びT-re10a HDO (cMOE/DNA_3)によるSCA31変異リピート（TK2）に対する発現抑制の結果を図34に示す。各HDOにより、SCA31変異リピートに対する強い発現抑制効果がin vivoで得られることが見出された。
　100 μgのT-re10a HDO (Default)投与、及び100 μg、10 μg、又は1 μgのT-re10a HDO (cMOE/DNA)投与、及び100 μg、10 μg、又は1 μgのT-re10a HDO (Full cMOE)投与によるSCA31変異リピート（TK2）に対する発現抑制の結果を図35及び図37に示す。T-re10a HDO (cMOE/DNA)及びT-re10a HDO (Full cMOE)の投与量を増加させるとSCA31変異リピート（TK2）に対する発現抑制効果が増大することが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (61)

  1. 　異常反復領域を含む変異遺伝子の転写産物に対してアンチセンス効果を有する核酸分子であって、
    　前記異常反復領域は、5’領域、コア反復領域、及び3’領域からなり、
    　前記コア反復領域は、塩基配列TGGAAを複数回反復した塩基配列、又はそれに相補的な塩基配列からなり、
    　前記核酸分子は、前記転写産物における前記異常反復領域において連続する4以上の塩基に相補的な塩基配列を含み、かつ前記転写産物にハイブリダイズすることができる標的結合領域を含む、前記核酸分子。
  2. 　前記変異遺伝子が変異型NEDD4関連脳発現1（BEAN1）遺伝子であり、前記コア反復領域は塩基配列TGGAAを複数回反復した塩基配列からなり、前記5'領域が塩基配列TCACを含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 　前記5'領域が、以下の(a1)～(a4)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、請求項２に記載の核酸分子。
    　(a1)配列番号3で示す塩基配列、
    　(a2)配列番号4で示す塩基配列、
    　(a3)塩基配列TCAC、並びに
    　(a4)塩基配列TCACと塩基配列TAGAAを複数回反復した塩基配列とを5'側から順に連結してなる塩基配列
  4. 　前記変異遺伝子が変異型NEDD4関連脳発現1（BEAN1）遺伝子であり、前記コア反復領域は塩基配列TGGAAを複数回反復した塩基配列からなり、前記3'領域が、塩基配列TAGAAを複数回反復した配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 　前記3'領域が、以下の(b1)～(b5)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、請求項４に記載の核酸分子。
    　(b1)配列番号7で示す塩基配列、塩基配列TAGAAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
    　(b2)配列番号9で示す塩基配列、塩基配列TAGAAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
    　(b3)配列番号11で示す塩基配列、塩基配列TAGAAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
    　(b4)配列番号12で示す塩基配列、塩基配列TAGAAを複数回反復した塩基配列、配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、及び配列番号13で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、並びに
    　(b5)配列番号14で示す塩基配列、塩基配列TAGAAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号6で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列
  6. 　前記標的結合領域が、前記5’領域の5'側に隣接する非変異領域、前記5’領域、前記コア反復領域、前記3’領域、及び前記3’領域の3'側に隣接する非変異領域において隣接する2つの領域の末端塩基に相補的な塩基の各々を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 　前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域又は前記3’領域のいずれかに相補的な塩基配列に含まれる、請求項２～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 　前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域に相補的な塩基配列に含まれる、請求項２～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 　配列番号156～189及び207～209（ただし、配列中のｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる、請求項２～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 　前記変異遺伝子が変異型チミジンキナーゼ2（TK2）遺伝子であり、前記コア反復領域は塩基配列TGGAAを複数回反復した塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記5'領域が、配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した配列、及び塩基配列TTCTAを複数回反復した配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  11. 　前記5'領域が、以下の(c1)～(c5)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、請求項１０に記載の核酸分子。
    　(c1)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、塩基配列TTCTAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号19で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
    　(c2)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、塩基配列TTCTAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号21で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
    　(c3)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、塩基配列TTCTAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号22で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、
    　(c4)配列番号23で示す塩基配列、配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、塩基配列TTCTAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号24で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列、並びに
    　(c5)配列番号16で示す塩基配列を複数回反復した塩基配列、塩基配列TTCTAを複数回反復した塩基配列、及び配列番号29で示す塩基配列を5'側から順に連結した塩基配列
  12. 　前記変異遺伝子が変異型チミジンキナーゼ2（TK2）遺伝子であり、前記コア反復領域は塩基配列TGGAAを複数回反復した塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記3'領域が塩基配列GTGAを含む、請求項１、１０、及び１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 　前記3'領域が、以下の(d1)～(d4)からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、請求項１２に記載の核酸分子。
    　(d1)配列番号27で示す塩基配列、
    　(d2)配列番号28で示す塩基配列、
    　(d3)塩基配列GTGA、並びに
    　(d4)塩基配列TTCTAを複数回反復した塩基配列と塩基配列GTGAとを5'側から順に連結してなる塩基配列
  14. 　前記標的結合領域が、前記5’領域、前記コア反復領域、前記3’領域、及び前記3’領域の3'側に隣接する非変異領域において隣接する2つの領域の末端塩基に相補的な塩基の各々を含む、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  15. 　前記標的結合領域の全長が、前記5’領域又は前記コア反復領域のいずれかに相補的な塩基配列に含まれる、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  16. 　前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域に相補的な塩基配列に含まれる、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  17. 　配列番号33～53、58～139、141～150、152～155、及び204～206（ただし、配列中のｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  18. 　前記変異遺伝子が変異型アタクシン10（ATXN10）遺伝子であり、前記コア反復領域は塩基配列TGGAAを複数回反復した塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記標的結合領域の全長が、前記コア反復領域に相補的な塩基配列に含まれる、請求項１に記載の核酸分子。
  19. 　配列番号33～37、58～61、64～67、70～139、141～150、152～155、及び204～206（ただし、配列中のｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれか一の塩基配列からなる、請求項１８に記載の核酸分子。
  20. 　12～30塩基長である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  21. 　ミックスマーである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  22. 　ギャップマーである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  23. 　(1)少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドを含む中央領域、
    　(2)前記中央領域の5'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む5’ウイング領域、及び
    　(3)前記中央領域の3'末端側に配置された、非天然ヌクレオシドを含む3’ウイング領域を含む、請求項２２に記載の核酸分子。
  24. 　前記5’ウイング領域及び前記3’ウイング領域が架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドを含む、請求項２３に記載の核酸分子。
  25. 　前記架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシド又はENAヌクレオシドである、請求項２４に記載の核酸分子。
  26. 　前記2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基が2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基である、請求項２４又は２５に記載の核酸分子。
  27. 　モルホリノ核酸を含む、又はモルホリノ核酸からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  28. 　前記核酸分子のヌクレオシド間結合の全部又は一部が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  29. 　前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項２８に記載の核酸分子。
  30. 　修飾核酸塩基を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  31. 　前記アンチセンス効果が前記転写産物量の減少である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  32. 　前記アンチセンス効果がステリックブロックである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  33. 　請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸分子からなる第1核酸鎖と、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含む、二本鎖核酸複合体。
  34. 　前記第2核酸鎖が、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、及び／又は修飾ヌクレオシドを含む、請求項３３に記載の二本鎖核酸複合体。
  35. 　前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の中央領域に相補的な塩基配列からなる領域の全てのヌクレオシドが、
    　(a)デオキシリボヌクレオシド、
    　(b)デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド、
    　(c)デオキシリボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、
    　(d)リボヌクレオシド及び2'-修飾ヌクレオシド、又は
    　(e)デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び2'-修飾ヌクレオシド
    である、請求項３３又は請求項３４に記載の二本鎖核酸複合体。
  36. 　請求項２３～２６のいずれか一項に記載の核酸分子からなる第1核酸鎖と、前記第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む第2核酸鎖とを含み、
    　前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖の前記中央領域における少なくとも2個の連続するデオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも2個の連続するリボヌクレオシド及び／又はデオキシリボヌクレオシドを含む領域を含む、二本鎖核酸複合体。
  37. 　前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項３６に記載の二本鎖核酸複合体。
  38. 　前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項３７に記載の二本鎖核酸複合体。
  39. 　前記第2核酸鎖において、前記第1核酸鎖の5’ウイング領域及び／又は3’ウイング領域に相補的な塩基配列からなる領域に架橋ヌクレオシド及び／又は2'修飾ヌクレオシドを含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  40. 　前記第2核酸鎖において、前記架橋ヌクレオシドがLNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、又はBNANCヌクレオシドである、請求項３９に記載の二本鎖核酸複合体。
  41. 　前記第2核酸鎖において、前記2'修飾ヌクレオシドの2'修飾基が2'-O-メチル基又は2'-O-メトキシエチル基である、請求項３９又は４０に記載の二本鎖核酸複合体。
  42. 　前記第2核酸鎖が、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを１個以上含む、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  43. 　前記第2核酸鎖におけるヌクレオシドの総数の少なくとも20％が、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである、請求項４２に記載の二本鎖核酸複合体。
  44. 　前記第2核酸鎖が、5’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、及び／又は3’末端に位置する1個又は連続する2個以上の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含む、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  45. 　前記第2核酸鎖が、5’末端及び3’末端以外の位置に、1～7個の2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含む、請求項３３～４４のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  46. 　前記第2核酸鎖において、2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド以外の全てのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドである、請求項３３～４５のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  47. 　前記第2核酸鎖において、ヌクレオシドの全てが2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドである、請求項３３～４５のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  48. 　前記第2核酸鎖が、修飾核酸塩基を含む、請求項３３～４７のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  49. 　前記第2核酸鎖が、トコフェロール若しくはコレステロール又はそれらの類縁体と結合している、請求項３３～４８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  50. 　前記第1核酸鎖の塩基配列が、配列番号65（ただし、配列中のｔはuであってもよい）に記載の塩基配列からなり、かつ
    　前記第2核酸鎖の塩基配列が、配列番号140、配列番号200、配列番号201、配列番号202、及び配列番号203（ただし、配列中のｔはuであってもよい）からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる、請求項３３～４９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  51. 　前記第1核酸鎖が、配列番号65に記載の核酸鎖からなり、かつ
    　前記第2核酸鎖が、配列番号140、配列番号200、配列番号201、配列番号202、及び配列番号203からなる群から選択されるいずれかの核酸鎖からなる、請求項５０に記載の二本鎖核酸複合体。
  52. 　請求項２～９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～４９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は
    　請求項１０～１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体
    を含む、脊髄小脳失調症31型（SCA31）治療用医薬組成物。
  53. 　請求項１８又は１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、又はそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体を含む、脊髄小脳失調症10型（SCA10）治療用医薬組成物。
  54. 　脳室内投与又は髄腔内投与される、請求項５２又は５３に記載の医薬組成物。
  55. 　前記核酸分子の1回の投与量が0.1mg/kg以上である、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  56. 　患者に対して有効量の、
    　請求項２～９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～４９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は
    　請求項１０～１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体
    を投与することを含む、脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療方法。
  57. 　患者に対して有効量の、
    　請求項１８又は１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、又はそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体
    を投与することを含む、脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療方法。
  58. 　脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療に使用するための、
    　請求項２～９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～４９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は
    　請求項１０～１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  59. 　脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療に使用するための、
    　請求項１８又は１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、又はそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体。
  60. 　脊髄小脳失調症31型（SCA31）の治療薬の製造のための、
    　請求項２～９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～４９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体、並びに／又は
    　請求項１０～１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、若しくはそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体、の使用。
  61. 　脊髄小脳失調症10型（SCA10）の治療薬の製造のための、
    　請求項１８又は１９、及びそれを引用する請求項２０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、又はそれを引用する請求項３３～５１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸複合体の使用。
PCT/JP2022/041282 2021-11-08 2022-11-07 脊髄小脳失調症治療用医薬組成物 WO2023080225A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021181571 2021-11-08
JP2021-181571 2021-11-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023080225A1 true WO2023080225A1 (ja) 2023-05-11

Family

ID=86241588

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/041282 WO2023080225A1 (ja) 2021-11-08 2022-11-07 脊髄小脳失調症治療用医薬組成物

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023080225A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018062510A1 (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 国立大学法人東京医科歯科大学 オーバーハングを有する二本鎖核酸複合体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018062510A1 (ja) * 2016-09-29 2018-04-05 国立大学法人東京医科歯科大学 オーバーハングを有する二本鎖核酸複合体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOSUKE MATSUZONO, IMAMURA KEIKO, MURAKAMI NAGAHISA, TSUKITA KAYOKO, YAMAMOTO TAKUYA, IZUMI YUISHIN, KAJI RYUJI, OHTA YASUYUKI, YAM: "Antisense Oligonucleotides Reduce RNA Foci in Spinocerebellar Ataxia 36 Patient iPSCs", MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS, vol. 8, 1 September 2017 (2017-09-01), US , pages 211 - 219, XP055560207, ISSN: 2162-2531, DOI: 10.1016/j.omtn.2017.06.017 *
MCFARLAND KAREN N., LIU JILIN, LANDRIAN IVETTE, GODISKA RONALD, SHANKER SAVITA, YU FAHONG, FARMERIE WILLIAM G., ASHIZAWA TETSUO: "SMRT Sequencing of Long Tandem Nucleotide Repeats in SCA10 Reveals Unique Insight of Repeat Expansion Structure", PLOS ONE, vol. 10, no. 8, pages e0135906, XP093063037, DOI: 10.1371/journal.pone.0135906 *
SATO NOZOMU, TAKESHI AMINO, KAZUHIRO KOBAYASHI, SHUICHI ASAKAWA, TARO ISHIGURO, TAIJI TSUNEMI, MAKOTO TAKAHASHI, TOHRU MATSUURA, K: "Spinocerebellar Ataxia Type 31 Is Associated with "Inserted" Penta-Nucleotide Repeats Containing (TGGAA)n", THE AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 85, no. 5, 13 November 2009 (2009-11-13), pages 544 - 557, XP093063032 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7041879B2 (ja) アンチセンス核酸
US20210340540A1 (en) Chimeric double-stranded nucleic acid
US11260134B2 (en) Double-stranded nucleic acid complex having overhang
JP7043078B2 (ja) 血液脳関門通過型ヘテロ２本鎖核酸
EP2961841B1 (en) Chimeric single-stranded antisense polynucleotides and double-stranded antisense agent
KR102473431B1 (ko) 안티센스 핵산
EP3389671A1 (en) Antisense oligomers for treatment of alagille syndrome
WO2020209285A1 (ja) 筋疾患治療用医薬組成物
JP7333079B2 (ja) 毒性が軽減した核酸
CN105121452A (zh) 三环核苷和由其制备的寡聚化合物
WO2021054370A1 (ja) 核酸複合体
JP6882735B2 (ja) 構造強化されたｍｉＲＮＡ阻害剤Ｓ−ＴｕＤ
WO2023080225A1 (ja) 脊髄小脳失調症治療用医薬組成物
WO2021187392A1 (ja) モルホリノ核酸を含むヘテロ核酸
JP6934695B2 (ja) 核酸医薬とその使用
CN107709561B (zh) 修饰的siRNA及含有该修饰的siRNA的药物组合物
WO2023127848A1 (ja) Ｅｂｖ関連疾患を標的とする核酸医薬
WO2023042876A1 (ja) ２&#39;－修飾ヌクレオシドを含むヘテロ核酸
WO2023022229A1 (ja) モルホリノ核酸を含む修飾ヘテロ核酸
WO2021070959A1 (ja) 修飾ヘテロ核酸
WO2021157730A1 (ja) 核酸医薬とその使用
WO2022250050A1 (ja) ｓｃｐＢＮＡ又はＡｍＮＡを含むヘテロ核酸
WO2023080159A1 (ja) リガンド結合核酸複合体
WO2023105898A1 (ja) アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体
WO2022255273A1 (ja) リガンド結合核酸複合体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22890045

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1