JP7043078B2 - 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 - Google Patents
血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7043078B2 JP7043078B2 JP2018540337A JP2018540337A JP7043078B2 JP 7043078 B2 JP7043078 B2 JP 7043078B2 JP 2018540337 A JP2018540337 A JP 2018540337A JP 2018540337 A JP2018540337 A JP 2018540337A JP 7043078 B2 JP7043078 B2 JP 7043078B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- double
- strand
- chain
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Botany (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
[1]第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現量を減少させるための組成物であって、
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロールもしくはコレステロールまたはそれらの類縁体と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物。
[2]被験体の中枢神経系疾患を治療するための、[1]に記載の組成物。
[3]第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系に薬剤を送達するための組成物であって、
該第1核酸鎖および/または該第2核酸鎖は、少なくとも1種の薬剤と結合しており、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロールもしくはコレステロールまたはそれらの類縁体と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物。
[4]前記第1核酸鎖が、少なくとも4個の連続デオキシリボヌクレオシドを含む、[1]~[3]のいずれかに記載の組成物。
[5]前記第1核酸鎖が、ギャップマーである、[4]に記載の組成物。
[6]前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖中の少なくとも4個の連続デオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続リボヌクレオシドを含む、[4]または[5]に記載の組成物。
[7]前記第1核酸鎖が、13~20塩基長である、[1]~[6]のいずれかに記載の組成物。
[8]前記中枢神経系が、大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、小脳、および脊髄からなる群から選択される、[1]~[7]のいずれかに記載の組成物。
[9]前記中枢神経系が、前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、小脳核、頸髄、胸髄および腰髄からなる群から選択される、[1]~[7]のいずれかに記載の組成物。
[10]静脈内投与または皮下投与される、[1]~[9]のいずれかに記載の組成物。
[11]前記核酸複合体の1回の投与量が5mg/kg以上である、[1]~[10]のいずれかに記載の組成物。
[12]前記第2核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、[1]~[11]のいずれかに記載の組成物。
[13]前記第2核酸鎖の核酸部分が修飾もしくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシドおよび/または糖修飾ヌクレオシドから成る、[1]~[12]のいずれかに記載の組成物。
[14]前記第2核酸鎖に非切断性(uncleavable)リンカーを介してリガンドが結合している、[1]~[13]のいずれかに記載の組成物。
[15]前記第1核酸鎖がミックスマーである、[1]~[14]のいずれかに記載の組成物。
[16]前記核酸複合体が血液脳関門(BBB)を通過する、[1]~[15]のいずれかに記載の組成物。
[17]第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体を含む、被験体の網膜において標的RNAの発現または編集を調節するための組成物であって、
該第1核酸鎖は、標的RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的RNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物。
[18]前記核酸複合体が血液網膜関門(BRB)を通過する、[17]に記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-185806号の開示内容を包含する。
本発明は、核酸複合体を含む組成物に関する。この核酸複合体は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む。第2核酸鎖は、第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。一実施形態では、第2核酸鎖は、トコフェロールもしくはコレステロールまたはそれらの類縁体と結合している。核酸複合体において、第1核酸鎖は、第2核酸鎖にアニールしている。
Raは、限定されないが、CH3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-であってもよい。
Rcは、限定されないが、-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(CH2OH)-、または-(CH2)6-であってもよい。
一態様では、上記の核酸複合体を含む、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現量を減少させるための組成物が本発明によって提供される(なお、本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する)。本発明に係る組成物は、被験体の中枢神経系疾患を治療するためのものであってもよい。組成物は、医薬組成物であってもよい。
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。
該第1核酸鎖および/または該第2核酸鎖は、少なくとも1種の薬剤と結合しており、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。
該第1核酸鎖は、標的miRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的miRNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。例えば、標的miRNAの効果を阻害することにより、当該miRNAが通常ダウンレギュレートしている遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。
該第1核酸鎖は、標的RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的RNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。ここで、標的RNAの発現調節とは、例えば、発現量の上方制御および下方制御を含む。標的RNAの編集調節とは、RNA編集によるスプライシングの調節、例えば、エキソン・スキッピングやエキソン・インクルージョンを含む。一部の実施形態においては、標的RNAはウイルスもしくは細菌のRNA、または毒性のRNA(Toxic RNA)であってもよい。
該第1核酸鎖は、標的mRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的mRNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。第1核酸鎖が標的mRNAに結合することにより、ステリックブロックが生じ、mRNAの翻訳が阻害される。
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。
該第1核酸鎖および/または該第2核酸鎖は、少なくとも1種の薬剤と結合しており、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。
該第1核酸鎖は、標的miRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的miRNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。
該第1核酸鎖は、標的RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的RNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。
該第1核酸鎖は、標的mRNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的mRNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしている、組成物にも関する。
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳におけるアンチセンス効果の評価
アンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸剤による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
二本鎖剤を、従来の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)対照と比較した。対照(ASO)は、転位関連肺腺癌転写産物(malat1)ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)とした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのmalat1ノンコーディングRNA(GenBankアクセッション番号NR_002847、配列番号6)の1316~1331位に相補的な塩基配列を有する。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、トコフェロール結合型相補鎖RNA(Toc#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるトコフェロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Tocopherol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Toc-HDO)を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をToc#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Toc#1-cRNA(mMalat1)
5'-Toc#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のα-トコフェロール#1を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=3で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて50 mg/kgの量で静脈内注射した(単回投与)。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
注射の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質を摘出した。続いて、RNAを、ハイスループット全自動核酸抽出装置MagNA Pure 96(ロシュ・ライフサイエンス社)を使用してプロトコルに従って抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・ライフサイエンス社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・ライフサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計および製造された製品であった。増幅条件(温度および時間)は以下のとおりであった:95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、ノンコーディングRNA(malat1)の発現量/mRNA(GAPDH;内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、相対的発現レベルを得た。相対的発現レベルの平均値および標準誤差を算出した。また各群の結果を比較し、さらにt-検定によって結果を評価した。
実施例1の結果は、図5のグラフに示される。大脳皮質におけるmalat1ノンコーディングRNA発現の、1本鎖ASOによる抑制は、陰性対照(PBSのみ)の場合と同程度であった。一方、Toc#1HDOは、ASOと比較して、大脳皮質におけるmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体は、脳に効率的に送達され、脳においてmalat1ノンコーディングRNAに対してアンチセンス効果をもたらすことが示された。
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の複数回投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
アンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の複数回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
実施例1と同じ核酸剤、すなわち、一本鎖ASOおよびトコフェロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Toc#1HDO)を使用した。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて1回の投与あたり50 mg/kgの量で静脈内注射した。投与は、週1回行い、4週間にわたり計4回行った。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して脳および脊髄を摘出した。脳から大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。脊髄から、頸髄、胸髄および腰髄を別々に採取した。また、マウスから網膜を採取した。得られた各組織から、実施例1に記載したとおりに、RNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
加えて、核酸剤の大脳皮質における濃度を、TaqMan Small Assay(ロシュ・ライフサイエンス社)を用いてプロトコルに従って定量RT-PCRにより測定した。
実施例2の結果は、図6~8のグラフに示される。Toc#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)および一本鎖ASOと比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、胸髄、腰髄および網膜のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した(図6および7)。さらに、大脳皮質における核酸剤の濃度は、ASOよりもToc#1HDOにおいて顕著に高かった(図8)。
この結果から、トコフェロールが結合した二本鎖核酸複合体は、脳および脊髄の様々な部位および網膜に大量に効率的に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
SR-B1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳におけるアンチセンス効果の評価
実施例1および2とは異なるSR-B1遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸剤による脳内mRNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
二本鎖剤を、従来の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)対照と比較した。対照(ASO)は、スカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1、SR-B1)mRNAを標的とする14merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mSR-B1)、配列番号3)とした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の2個および3'末端の2個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのSR-B1 mRNA(GenBankアクセッション番号NM_016741、配列番号7)の2479~2492位に相補的な塩基配列を有する。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、トコフェロール結合型相補鎖RNA(Toc#1-cRNA(mSR-B1)、配列番号11)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるトコフェロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Tocopherol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Toc-HDO)を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をToc#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mSR-B1)
5'-T * C *a*g*t*c*a*t*g*a*c*t* T * C-3'(配列番号3)
・第2鎖:Toc#1-cRNA(mSR-B1)
5'-Toc#1-g * a *AGUCAUGACU* g * a-3'(配列番号11)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のα-トコフェロール#1を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて50 mg/kgの量で静脈内注射した(単回投与)。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
注射の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄を摘出した。続いて、mRNAを、各組織からハイスループット全自動核酸抽出装置MagNA Pure 96(ロシュ・ライフサイエンス社)を使用してプロトコルに従って抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・ライフサイエンス社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・ライフサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)によって設計および製造された製品であった。増幅条件(温度および時間)は以下のとおりであった:95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、mRNA(SR-B1)の発現量/mRNA(GAPDH;内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、相対的発現レベルを得た。相対的発現レベルの平均値および標準誤差を算出した。また各群の結果を比較し、さらにt-検定によって結果を評価した。
実施例3の結果は、図9および10のグラフに示される。大脳皮質におけるSR-B1 mRNA発現の、1本鎖ASOによる抑制は、陰性対照(PBSのみ)の場合と同程度であった。一方、Toc#1HDOは、ASOと比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄におけるSR-B1 mRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、二本鎖核酸複合体の脳におけるアンチセンス効果はmalat1に特異的ではなく、様々な遺伝子転写産物を標的とし得ることが示された。
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の複数回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、実施例1~3とは異なりコレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の複数回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
対照(ASO)は、実施例1で用いた、malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)とした。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるコレステロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO)を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて1回の投与あたり50 mg/kgの量で静脈内注射した。投与は、週1回行い、4週間にわたり計4回行った。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄を摘出した。得られた各組織から、実施例1に記載したとおりに、RNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例4の結果は、図11および12のグラフに示される。Chol#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)および一本鎖ASOと比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、コレステロールが結合した二本鎖核酸複合体は、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の複数回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、実施例4とは異なり3'末端にコレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の複数回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、3'末端にコレステロールが結合したコレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#3-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#3HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#3-cRNA(mMalat1)
5'-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-Chol#3-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#3は、上記のコレステロール#3を表す。
実施例4に記載したように、マウスに核酸剤を複数回投与した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例5の結果は、図13のグラフに示される。Chol#3HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、3'末端にコレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型DNA相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の複数回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、実施例1~5とは異なりDNA相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の複数回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、トコフェロール結合型相補鎖DNA(Toc#1-cDNA(mMalat1)、配列番号12)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。このトコフェロール結合型相補鎖DNA(第2鎖)は、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をToc#1DNA/DNAと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Toc#1-cDNA(mMalat1)
5'-Toc#1-G * C * A *ttcagtgaac* T * A * G-3'(配列番号12)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のα-トコフェロール#1を表す。
実施例4に記載したように、マウスに核酸剤を複数回投与した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例6の結果は、図14及び15のグラフに示される。Toc#1DNA/DNAは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、トコフェロールが結合したDNA相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型DNA相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、実施例1~5とは異なりDNA相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖DNA(Chol#1-cDNA(mMalat1)、配列番号12)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。このコレステロール結合型相補鎖DNA(第2鎖)は、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1DNA/DNAと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cDNA(mMalat1)
5'-Chol#1-G * C * A *ttcagtgaac* T * A * G-3'(配列番号12)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例7の結果は、図16及び17のグラフに示される。Chol#1DNA/DNAは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合したDNA相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の複数回投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
実施例1~7とは異なりDMPKを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の複数回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
DMPK(dystrophia myotonica-protein kinase) mRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mDMPK)、配列番号13)を第1鎖とした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのDMPK mRNA(GenBankアクセッション番号NM_032418、配列番号17)の2682~2697位に相補的な塩基配列を有する。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mDMPK)、配列番号14)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mDMPK)
5'-A * C * A *a*t*a*a*a*t*a*c*c*g* A * G * G-3'(配列番号13)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mDMPK)
5'-Chol#1-c * c * u *CGGUAUUUAU* u * g * u-3'(配列番号14)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
投与を週2回、計4回行ったことを除いて実施例4に記載したように、マウスに核酸剤を複数回投与した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、腰髄、および後根神経節を別々に採取した。定量RT-PCRにおいてmalat1の代わりにDMPK mRNAを増幅するプライマーを用い、また、内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、DMPK mRNAの発現レベルを評価した。
実施例8の結果は、図18および19のグラフに示される。Chol#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、腰髄、および後根神経節のいずれにおいてもDMPK mRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、本発明の一実施形態に係る二本鎖核酸複合体は、様々な遺伝子転写産物を標的とし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の霊長類への単回投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、トコフェロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の霊長類(カニクイザル)への単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
カニクイザルのmalat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mfMalat1)、配列番号15)を第1鎖とした。このLNA/DNAギャップマーの塩基配列はHung Gら(Characterization of Target mRNA Reduction Through In Situ RNA Hybridization in Multiple Organ Systems Following Systemic Antisense Treatment in Animal, Nucleic Acid Therapeutics. 23(6): 369-378 (2013))を参考にして設計した。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、トコフェロール結合型相補鎖RNA(Toc#1-cRNA(mfMalat1)、配列番号16)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をToc#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mfMalat1)
5'-A * G * T *a*c*t*a*t*a*g*c*a*t* C * T * G-3'(配列番号15)
・第2鎖:Toc#1-cRNA(mfMalat1)
5'-Toc#1-c * a * g *AUGCUAUAGU* a * c * u-3'(配列番号16)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のα-トコフェロール#1を表す。
カニクイザルは、体重1.8kgの雄であった。実験は全て、n=1で実施した。核酸剤を、カニクイザルにそれぞれ伏在静脈を通じて50 mg/kgの量で静脈内に注射した。また、陰性対照群として、PBSのみまたは第1鎖(ASO)を注射したカニクイザルも作製した。
投与の72時間後、PBSをカニクイザルに灌流させ、その後解剖して大脳皮質、線条体、脳幹、頸髄、および胸髄を別々に採取した。各組織から4箇所のサンプルを得た。定量RT-PCRにおいてマウスmalat1の代わりにカニクイザルmalat1を増幅するプライマーを用い、また、内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各サンプルからのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例9の結果は、図20のグラフに示される。Toc#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、線条体、脳幹、頸髄、および胸髄のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、本発明の一実施形態に係る二本鎖核酸剤は、霊長類の脳および脊髄の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#2-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#2HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#2-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#2-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#2は、上記のコレステロール#2を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例10の結果は、図21及び22のグラフに示される。Chol#2HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳および脊髄の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#4-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#4HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#4-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#4-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#4は、上記のコレステロール#4を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例11の結果は、図23及び24のグラフに示される。Chol#4HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#5-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#5HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#5-cRNA(mMalat1)
5'-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-Chol#5-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#5は、上記のコレステロール#5を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例12の結果は、図25のグラフに示される。Chol#5HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回皮下投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回皮下投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
尾静脈を通じた静脈内注射の代わりに皮下注射を行ったことを除いて実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、腰髄、および後根神経節を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例13の結果は、図26および27のグラフに示される。Chol#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、腰髄、および後根神経節のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、本発明の一実施形態に係る二本鎖核酸剤は、皮下投与により、脳および脊髄の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
二本鎖核酸複合体の長期効果の評価
二本鎖核酸剤の長期間にわたるin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
実施例13に記載した二本鎖核酸剤Chol#1HDOを用いた。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の3日、7日、14日、28日および56日後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例14の結果は、図28~30のグラフに示される。Chol#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を長期間にわたり顕著に抑制した。
二本鎖核酸複合体の用量の検討
様々な用量の二本鎖核酸剤によるin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
実施例13に記載した二本鎖核酸剤Chol#1HDOを用いた。
用量12.5 mg/kg、25.0 mg/kg、50 mg/kgまたは75 mg/kgを用いたことを除き実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例15の結果は、図31および32のグラフに示される。Chol#1HDOは、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄のいずれにおいても、用量依存的にmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制する傾向を示した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の複数回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
DMPKを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、5'末端にトコフェロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の複数回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
DMPK(dystrophia myotonica-protein kinase) mRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mDMPK)、配列番号13)を第1鎖とした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのDMPK mRNA(GenBankアクセッション番号NM_032418、配列番号17)の2682~2697位に相補的な塩基配列を有する。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、トコフェロール結合型相補鎖RNA(Toc#1-cRNA(mDMPK)、配列番号14)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をToc#1HDOと称する
・第1鎖:ASO(mDMPK)
5'-A * C * A *a*t*a*a*a*t*a*c*c*g* A * G * G-3'(配列番号13)
・第2鎖:Toc#1-cRNA(mDMPK)
5'-Toc#1-c * c * u *CGGUAUUUAU* u * g * u-3'(配列番号14)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のトコフェロール#1を表す。
週1回、計4回マウスに核酸剤を静脈内投与した。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみまたは第1鎖(ASO)を注射したマウスも作製した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して全脳を採取した。定量RT-PCRにおいてmalat1の代わりにDMPK mRNAを増幅するプライマーを用い、また、内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、DMPK mRNAの発現レベルを評価した。
実施例16の結果は、図33のグラフに示される。Toc#1HDOは、陰性対照(PBSのみまたはASOのみ)と比較して、全脳のDMPK mRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、本発明の一実施形態に係る二本鎖核酸複合体は、様々な遺伝子転写産物を標的とし得ることが示された。
トコフェロール結合siRNAの投与による、脳および脊髄の様々な部位における遺伝子抑制効果の評価
BACE1(Beta-secretase 1)を標的とした5'末端にトコフェロールが結合したアンチセンス鎖と相補鎖からなる二本鎖(siRNA)核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
BACE1(Beta-secretase 1) mRNAを標的とする29merのRNAおよび2'-O-Me RNAからなる一本鎖オリゴヌクレオチド(Toc#1-AS(mBACE1)、配列番号19)をアンチセンス鎖とした。このアンチセンス鎖は、マウスのBACE1 mRNA(GenBankアクセッション番号NM_011792.6、配列番号23)の2522~2550位に相補的な塩基配列を有する。このアンチセンス鎖は、5'末端にトコフェロールが結合している。このアンチセンス鎖(第1鎖)を、RNAおよび2'-O-Me RNAからなる27merのセンス鎖オリゴヌクレオチド(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をToc#1siRNAと称する。
・第1鎖:Toc#1-AS(mBACE1)
5'-Toc#1-guauaaACAUuCGCAuCGCAUAgGUuC*U*U-3' (配列番号19)
・第2鎖:SS(mBACE1)27mer
5'-GAAcCuAuGCGAuGCGAAuGUUUAU*A*C-3' (配列番号20)
大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のトコフェロール#1を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じてアンチセンス鎖で92 mg/kg(実施例1のヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド50mg/kg投与時のアンチセンス鎖と等モル)の量で静脈内注射した(単回投与)。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、腰髄および後根神経節を別々に採取した。定量RT-PCRにおいてmalat1の代わりにBACE1 mRNAを増幅するプライマーを用い、また、内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、BACE1 mRNAの発現レベルを評価した。
実施例17の結果は、図34および図35のグラフに示される。Toc#1siRNAは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、BACE1発現抑制効果を全く示さなかった。
この結果から、アンチセンス鎖(第1鎖)に脂質リガンドを結合させたsiRNAを末梢投与した場合には、脳内で遺伝子抑制効果を示さないことが示された。
コレステロール結合siRNAの投与による、脳の様々な部位における遺伝子抑制効果の評価
BACE1(Beta-secretase 1)を標的とした5'末端にコレステロールが結合したアンチセンス鎖とセンス鎖からなる二本鎖(siRNA)核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
BACE1(Beta-secretase 1) mRNAを標的とする23merのRNAおよび2'-O-Me RNAからなる一本鎖オリゴヌクレオチド(Chol#1-AS(mBACE1)、配列番号21)をアンチセンス鎖とした。このアンチセンス鎖は、マウスのBACE1 mRNA(GenBankアクセッション番号NM_011792.6、配列番号23)の2522~2544位に相補的な塩基配列を有する。このアンチセンス鎖は、5'末端にコレステロールが結合している。このアンチセンス鎖(第1鎖)を、RNAおよび2'-O-Me RNAからなる21merセンス鎖オリゴヌクレオチド(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1siRNAと称する。
・第1鎖:Chol#1-AS(mBACE1)
5'-Chol#1-a*cAUuCGCAuCGCAUAgGUuC*U*U-3’ (配列番号21)
・第2鎖:SS(mBACE1)21mer
5'-GAAcCuAuGCGAuGCGAAuG*U-3' (配列番号22)
大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じてアンチセンス鎖で73 mg/kg(実施例1のヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド50mg/kg投与時のアンチセンス鎖と等モル)の量で静脈内注射した(単回投与)。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して脳を摘出した。脳から大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRにおいてmalat1の代わりにBACE1 mRNAを増幅するプライマーを用い、また、内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、BACE1 mRNAの発現レベルを評価した。
実施例18の結果は、図36のグラフに示される。Chol#1siRNAは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、BACE1発現抑制効果を全く示さなかった。
この結果から、アンチセンス鎖(第1鎖)に脂質リガンドを結合させたsiRNAを末梢投与した場合には、脳内で遺伝子抑制効果を示さないことが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとドコサヘキサエン酸(DHA)結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、実施例4とは異なり5'末端にDHAが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、5'末端にDHAが結合したDHA結合型相補鎖RNA(DHA-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をDHA-HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:DHA-cRNA(mMalat1)
5'-DHA-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて50 mg/kgの量で静脈内注射した(単回投与)。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例19の結果は、図37および38のグラフに示される。DHA-HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制しなかった。
二本鎖核酸複合体(トコフェロール)の長期効果の評価
二本鎖核酸剤の長期間にわたるin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
実施例1に記載した二本鎖核酸剤Toc#1HDOを用いた。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の3日、7日、14日、および28日後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して全脳を採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHを用いて実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例20の結果は、図39のグラフに示される。Toc#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、全脳においてmalat1ノンコーディングRNAの発現を2週間にわたり抑制した。
SR-B1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳におけるアンチセンス効果の評価
実施例1および2とは異なるSR-B1遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸剤による脳内mRNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
SR-B1 mRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mSR-B1)、配列番号3)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mSR-B1)、配列番号11)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mSR-B1)
5'-T * C *a*g*t*c*a*t*g*a*c*t* T * C-3'(配列番号3)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mSR-B1)
5'-Chol#1-g * a *AGUCAUGACU* g * a-3'(配列番号11)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて50 mg/kgの量で静脈内注射した(単回投与)。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
注射の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄を摘出した。続いて、mRNAを、ハイスループット全自動核酸抽出装置MagNA Pure 96(ロシュ・ライフサイエンス社)を使用してプロトコルに従って抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・ライフサイエンス社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・ライフサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific)によって設計および製造された製品であった。増幅条件(温度および時間)は以下のとおりであった:95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、mRNA(SR-B1)の発現量/mRNA(アクチン;内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、相対的発現レベルを得た。相対的発現レベルの平均値および標準誤差を算出した。また各群の結果を比較し、さらにt-検定によって結果を評価した。
実施例21の結果は、図40および41のグラフに示される。Chol#1HDOにより、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄においてSR-B1 mRNAの発現が顕著に抑制されたことが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の少量複数回投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の複数回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて6.25 mg/kgの量で静脈内注射した。投与は週2回、計4回行った。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例22の結果は、図42および43のグラフに示される。Chol#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄、および腰髄のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドと、様々なヌクレオシド間結合の修飾パターンを有するコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、様々なヌクレオシド間結合の修飾パターンを有するコレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、様々なヌクレオシド間結合の修飾パターンを有するコレステロール結合型相補鎖RNA(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。下記のように3種類の第2鎖を用意した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)(PO)
5'-Chol#1-gcaUUCAGUGAACuag-3'(配列番号10)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)(5'PS)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAACuag-3'(配列番号10)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)(3'PS)
5'-Chol#1-gcaUUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて50mg/kgの量で静脈内に単回注射した。また、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例23の結果は、図44および45のグラフに示される。二本鎖剤Chol#1HDO(PO)、Chol#1HDO(5'PS)およびChol#1HDO(3'PS)は、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。特に、3'末端から修飾ヌクレオシド間結合を有する場合に、活性が増加する傾向が示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロールまたはコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の週2回投与による脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、トコフェロールまたはコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の週2回投与での脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、トコフェロール結合型相補鎖RNA(Toc#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)またはコレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Toc#1-cRNA(mMalat1)
5'-Toc#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のα-トコフェロール#1を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
マウスは、体重20gの6~7週齢の雄のC57BL/6マウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=4で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて1回の投与あたり25mg/kgまたは50mg/kgの量で静脈内注射した。投与は、週2回行った。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
最終投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して脳を摘出した。脳から大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。得られた各組織から、実施例1に記載したとおりに、RNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例24の結果は、図46のグラフに示される。Toc#1HDOおよびChol#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回皮下投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回皮下投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA-Chol#3(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDOChol#3と称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA-Chol#3(mMalat1)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-Chol#3-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。Chol#3は、上記のコレステロール#3を表す。
尾静脈を通じた静脈内注射の代わりに皮下注射を行ったことを除いて実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例25の結果は、図47および48のグラフに示される。Chol#1HDOChol#3は、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
この結果から、本発明の一実施形態に係る二本鎖核酸剤は、皮下投与により、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型DNA相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、実施例1~5とは異なりDNA相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖DNA(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。下記のように3種類の第2鎖を用いた。第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3' (配列番号1)
・第2鎖: Chol#1-cDNA(mMalat1) Full DNA
5'-Chol#1-g*c*a*ttcagtgaac*t*a*g-3' (配列番号24)
・第2鎖: Chol#1-cDNA(mMalat1) Full PS
5'-Chol#1-g * c * a *t*t*c*a*g*t*g*a*a*c* u * a * g-3' (配列番号25)
・第2鎖: Chol#1-cDNA(mMalat1) Full PO
5'-Chol#1-gcattcagtgaacuag-3' (配列番号25)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例26の結果は、図49および50のグラフに示される。二本鎖剤Chol#1DNA/DNA full DNA、Chol#1DNA/DNA full PS、およびChol#1DNA/DNA full POは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合したDNA相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳および脊髄の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型DNA相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるmiRNA抑制効果の評価
miRNA-21(miR21)を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内miRNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
miR21を標的とする15merの一本鎖LNA/DNAミックスマー(ASO(anti-miR21)、配列番号26)(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(anti-miR21))、配列番号27)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDO(antimiR21)と称する。
・第1鎖:ASO(anti-miR21)
5'-T *c* A *g*t* C * T *g*a* T *a* A *g* C * T -3' (配列番号26)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(anti-miR21)
5'-Chol#1-a * g * c *UUAUCAGAC* u * g * a-3' (配列番号27)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。RNAをmiRNeasy Mini Kit(Qiagen社)を使用してプロトコルに従って抽出した。cDNAは、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・ライフサイエンス社)により実施した。また定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてU6を使用した。
実施例27の結果は、図51のグラフに示される。Chol#1HDO(anti-miR21)は、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬および脳幹のいずれにおいてもmiR21の発現を顕著に抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、コレステロールが結合したDNA相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳の様々な部位に送達され、anti-miR効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとトコフェロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
malat1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、トコフェロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤の単回投与による脳内RNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。実施例1とは異なり投与7日後での効果を評価した。
malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)(第1鎖)を、トコフェロール結合型相補鎖RNA(Toc#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤を調製した。第1鎖と第2鎖とを等モル量で混合し、溶液を95℃で5分間加熱し、その後37℃に冷却して1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をToc#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Toc#1-cRNA(mMalat1)
5'-Toc#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Toc#1は、上記のトコフェロール#1を表す。
実施例1に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の7日後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例28の結果は、図52または53のグラフに示される。Toc#1HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、7日後においても大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹のいずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を顕著に抑制した。
この結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、トコフェロールが結合した相補鎖とからなる二本鎖核酸剤は、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果を長期間もたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
相補鎖(第2鎖)の構造を変更した二本鎖核酸剤のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
対照(ASO)は、実施例1で用いた、malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)とした。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(LNA)(mMalat1)、配列番号28)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるコレステロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO)を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDO(LNA/LNA)と称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(LNA)(mMalat1)
5'-Chol#1-G * C * A *UUCAGUGAAC* T * A * G-3'(配列番号28)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹および頸髄を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例29の結果は、図54または55のグラフに示される。Chol#1HDO(LNA/LNA)は、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、および頸髄いずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
この結果から、LNAが両端に配置した相補鎖(第2鎖)を用いた二本鎖核酸剤は、脳および脊髄の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳および脊髄の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
相補鎖(第2鎖)のオリゴヌクレオチドとコレステロール間の結合を変更した二本鎖核酸剤のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
対照(ASO)は、実施例1で用いた、malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)とした。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるコレステロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO)を調製した。以下のように2種類の第2鎖を用いた。第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。
第2鎖としてChol#1-cRNA(DNA)(mMalat1)を用いて調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDO(DNA)と称する。Chol#1-cRNA(DNA)(mMalat1)では、コレステロールと5'末端のgは、4塩基長のDNAで連結されている。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(PS)(mMalat1)
5'-Chol#1* g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(DNA)(mMalat1)
5'-Chol#1-cttcg * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号29)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例30の結果は、図56または57のグラフに示される。Chol#1HDO(PS)またはChol#1HDO(DNA)は、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、脳幹、頸髄および腰髄いずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
この結果から、Chol#1HDO(PS)またはChol#1HDO(DNA)は、脳および脊髄の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。またChol#1HDO(PS)は、Chol#1HDO(DNA)と比較して効果が強い傾向があることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドと先端にOH基がついたアルキル基結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
トコフェロールおよびコレステロールの代わりに、先端にOH基がついたアルキル基が結合した二本鎖核酸剤のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
対照(ASO)は、実施例1で用いた、malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)とした。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、アルキル基結合型相補鎖RNA(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるアルキル基結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチドを調製した。以下のように3種類の第2鎖を用いた。第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。
第2鎖としてC9(OH)-cRNA(mMalat1)を用いて調製した二本鎖核酸剤をC9(OH)HDOと称する。
第2鎖としてC12(OH)-cRNA(mMalat1)を用いて調製した二本鎖核酸剤をC12(OH)HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:C6(OH)-cRNA(mMalat1)
5'-C6(OH)-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:C9(OH)-cRNA(mMalat1)
5'-C9(OH)-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:C12(OH)-cRNA(mMalat1)
5'-C12(OH)-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。C6(OH)、C9(OH)およびC12(OH)の構造は上に記載されている。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例31の結果は、図58または59のグラフに示される。C6(OH)HDO、C9(OH)HDOおよびC12(OH)HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹いずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
この結果から、C6(OH)HDO、C9(OH)HDOまたはC12(OH)HDOは、脳の様々な部位に送達され、アンチセンス効果をもたらし得ることが示された。またC12(OH)HDOは、C6(OH)HDOおよびC9(OH)HDOと比較して効果が強い傾向があることが示された。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
アンチセンスオリゴヌクレオチド(第1鎖)の構造を、LNAを両側に配置したRNAに変更した二本鎖核酸剤のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
対照(ASO)は、malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/RNAギャップマー(ASO(RNA)(mMalat1)、配列番号30)とした。このLNA/RNAギャップマー(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるコレステロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO)を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDO(RNA/RNA)と称する。
・第1鎖:ASO(RNA)(mMalat1)
5'-C * T * A *G*U*U*C*A*C*U*G*A*A* T * G * C-3'(配列番号30)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例32の結果は、図60のグラフに示される。Chol#1HDO(RNA/RNA)は、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬および脳幹いずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとアルキル基結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の単回投与による、脳の様々な部位におけるアンチセンス効果の評価
トコフェロールおよびコレステロールの代わりにアルキル基が結合した二本鎖核酸剤のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。
対照(ASO)は、実施例1で用いた、malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)とした。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、アルキル基結合型相補鎖RNA(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるアルキル基結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチドを調製した。以下のように5種類の第2鎖を用いた。第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。
第2鎖としてC4-cRNA(mMalat1)を用いて調製した二本鎖核酸剤をC4HDOと称する。
第2鎖としてC8-cRNA(mMalat1)を用いて調製した二本鎖核酸剤をC8HDOと称する。
第2鎖としてC10-cRNA(mMalat1)を用いて調製した二本鎖核酸剤をC10HDOと称する。
第2鎖としてC12-cRNA(mMalat1)を用いて調製した二本鎖核酸剤をC12HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:C3-cRNA(mMalat1)
5'-C3-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:C4-cRNA(mMalat1)
5'-C4-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:C8-cRNA(mMalat1)
5'-C8-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:C10-cRNA(mMalat1)
5'-C10-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
・第2鎖:C12-cRNA(mMalat1)
5'-C12-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。C3、C4、C8、C10およびC12の構造は上に記載されている。
実施例3に記載したように、マウスに核酸剤を単回投与した。
投与の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹を別々に採取した。定量RT-PCRの内部標準遺伝子としてGAPDHの代わりにアクチンを用いたことを除き実施例1に記載したように、得られた各組織からのRNA抽出、cDNA合成、および定量RT-PCRを行い、malat1ノンコーディングRNAの発現レベルを評価した。
実施例33の結果は、図61または62のグラフに示される。C3HDO、C4HDO、C8HDO、C10HDOおよびC12HDOは、陰性対照(PBSのみ)と比較して、大脳皮質、小脳、線条体、海馬、および脳幹いずれにおいてもmalat1ノンコーディングRNAの発現を抑制した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとコレステロール結合型相補鎖とからなる二本鎖核酸複合体の投与による、血小板数への影響の評価
二本鎖核酸剤の血小板数への影響を評価する実験を行った。
対照(ASO)は、実施例1で用いた、malat1ノンコーディングRNAを標的とする16merの一本鎖LNA/DNAギャップマー(ASO(mMalat1)、配列番号1)とした。このLNA/DNAギャップマー(第1鎖)を、コレステロール結合型相補鎖RNA(Chol#1-cRNA(mMalat1)、配列番号10)(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖核酸剤であるコレステロール結合型ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(Cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotide、Chol-HDO)を調製した。具体的には、第2鎖(粉末)を、95℃に加熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れ、ボルテックスにかけて溶解し、95℃に加熱した第1鎖の溶液と混合し、得られた混合液を95℃で5分間保持し、その後、混合液を37℃で1時間保持し、これにより核酸鎖をアニールして上記の二本鎖核酸剤を調製した。アニールした核酸を4℃または氷上で保存した。調製した二本鎖核酸剤をChol#1HDOと称する。
・第1鎖:ASO(mMalat1)
5'-C * T * A *g*t*t*c*a*c*t*g*a*a* T * G * C-3'(配列番号1)
・第2鎖:Chol#1-cRNA(mMalat1)
5'-Chol#1-g * c * a *UUCAGUGAAC* u * a * g-3'(配列番号10)
下線付の大文字はLNAを表し(Cは5-メチルシトシンLNAを表す)、小文字はDNAを表し、大文字はRNAを表し、下線付きの小文字は2'-O-メチル化RNAを表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。Chol#1は、上記のコレステロール#1を表す。
マウスに核酸剤を25mg/kgの用量で2回(3日間隔)静脈投与するか、または50mg/kgの用量で1回静脈投与して、血小板数を評価した。また同様にマウスに核酸剤を50mg/kgの用量で1回静脈投与するか、または50mg/kgの用量で1回皮下投与をして、血小板数を評価した。
投与の72時間後または7日後、採血を行い、LSIメディエンス社により血小板数を測定した。
実施例34の結果は、図63のグラフに示される。25mg/kgの用量で2回静脈投与した場合、50mg/kgの用量で1回静脈投与した場合と比較して、血小板数の低下は見られなかった。また50mg/kgの用量で1回皮下投与した場合、50mg/kgの用量で1回静脈投与した場合と比較して、血小板数の低下は見られなかった。
この結果から、本発明に係る二本鎖核酸剤は、1回あたりの投与量を減少させるか、または皮下投与することにより、血小板減少を回避できることが示された。
Claims (15)
- 第1核酸鎖と第2核酸鎖とからなる、被験体の中枢神経系において標的転写産物の発現量を減少させるための静脈内投与用または皮下投与用二本鎖核酸剤であって、
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール、コレスタノール、ラノステロール、セレブロステロール、デヒドロコレステロールおよびコプロスタノールからなる群から選択されるいずれか一の脂質と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしており、
該第1核酸鎖がギャップマーまたはミックスマーである、二本鎖核酸剤。 - 被験体の中枢神経系疾患を治療するための、請求項1に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記第1核酸鎖が、少なくとも4個の連続デオキシリボヌクレオシドを含む、請求項1または2に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記第2核酸鎖が、前記第1核酸鎖中の少なくとも4個の連続デオキシリボヌクレオシドに相補的な、少なくとも4個の連続リボヌクレオシドを含む、請求項3に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記第1核酸鎖が、13~20塩基長である、請求項1~4のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記中枢神経系が、大脳皮質、大脳基底核、大脳白質、間脳、脳幹、小脳、および脊髄からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記中枢神経系が、前頭葉、側頭葉、海馬、海馬傍回、頭頂葉、後頭葉、線条体、淡蒼球、前障、視床、視床下核、中脳、黒質、橋、延髄、小脳皮質、小脳核、頸髄、胸髄および腰髄からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記二本鎖核酸剤の1回の投与量が5mg/kg以上である、請求項1~7のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記第2核酸鎖が天然リボヌクレオシドを含まない、請求項1~8のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記第2核酸鎖の核酸部分が修飾もしくは非修飾のヌクレオシド間結合により連結されたデオキシリボヌクレオシドおよび/または糖修飾ヌクレオシドから成る、請求項1~9のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記第2核酸鎖に非切断性(uncleavable)リンカーを介してリガンドが結合している、請求項1~10のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記二本鎖核酸剤が血液脳関門(BBB)を通過する、請求項1~11のいずれか一項に記載の二本鎖核酸剤。
- 第1核酸鎖と第2核酸鎖とからなり、被験体の網膜において標的RNAの発現または編集を調節するための静脈内投与用または皮下投与用二本鎖核酸剤であって、
該第1核酸鎖は、標的RNAの少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的RNAに対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、トコフェロール、コレステロール、もしくは置換基を有していてもよいアルキル基と結合しており、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖にアニールしており、
該第1核酸鎖がギャップマーまたはミックスマーであり、
該置換基を有していてもよいアルキル基は、以下の一般式(III)
で示される基、または
以下の一般式(IV)
で示される基である、
二本鎖核酸剤。 - 前記二本鎖核酸剤が血液網膜関門(BRB)を通過する、請求項13に記載の二本鎖核酸剤。
- 前記第2核酸がトコフェロールと結合している、請求項1または13に記載の二本鎖核酸剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022036122A JP2022069529A (ja) | 2016-09-23 | 2022-03-09 | 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016185806 | 2016-09-23 | ||
JP2016185806 | 2016-09-23 | ||
PCT/JP2017/034561 WO2018056442A1 (ja) | 2016-09-23 | 2017-09-25 | 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022036122A Division JP2022069529A (ja) | 2016-09-23 | 2022-03-09 | 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018056442A1 JPWO2018056442A1 (ja) | 2019-07-18 |
JP7043078B2 true JP7043078B2 (ja) | 2022-03-29 |
Family
ID=61689625
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018540337A Active JP7043078B2 (ja) | 2016-09-23 | 2017-09-25 | 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 |
JP2022036122A Pending JP2022069529A (ja) | 2016-09-23 | 2022-03-09 | 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022036122A Pending JP2022069529A (ja) | 2016-09-23 | 2022-03-09 | 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11433089B2 (ja) |
EP (1) | EP3517610A4 (ja) |
JP (2) | JP7043078B2 (ja) |
WO (1) | WO2018056442A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3760209B1 (en) | 2018-02-28 | 2023-11-22 | National University Corporation Tokyo Medical and Dental University | Ischemic-lesion-site-specific gene therapy |
EP3766972A4 (en) * | 2018-03-14 | 2022-03-02 | National University Corporation Tokyo Medical and Dental University | NUCLEIC ACID COMPLEX |
WO2019182294A1 (ko) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 주식회사 케이티 | 비디오 신호 처리 방법 및 장치 |
EP3769769A4 (en) * | 2018-03-19 | 2022-05-04 | National University Corporation Tokyo Medical and Dental University | NUCLEIC ACID WITH REDUCED TOXICITY |
JP7262816B2 (ja) * | 2018-03-22 | 2023-04-24 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | ヘテロ核酸のbbb通過脂質リガンド |
US20220175817A1 (en) * | 2019-04-08 | 2022-06-09 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Pharmaceutical Composition for Treating Muscle Disease |
WO2021054370A1 (ja) * | 2019-09-18 | 2021-03-25 | 国立大学法人東京医科歯科大学 | 核酸複合体 |
JPWO2021070959A1 (ja) | 2019-10-11 | 2021-04-15 | ||
WO2022106695A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | Alpha Anomeric Sas | Nucleic acid duplexes |
WO2022250050A1 (ja) * | 2021-05-25 | 2022-12-01 | 国立大学法人東京医科歯科大学 | scpBNA又はAmNAを含むヘテロ核酸 |
GB202215614D0 (en) * | 2022-10-21 | 2022-12-07 | Proqr Therapeutics Ii Bv | Heteroduplex rna editing oligonucleotide complexes |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015502134A (ja) | 2011-12-16 | 2015-01-22 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | キメラ2重鎖核酸 |
WO2015075942A1 (ja) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 国立大学法人 東京大学 | 薬剤送達用のキャリア、コンジュゲートおよびこれらを含んでなる組成物並びにこれらの投与方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2792291A1 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Kumamoto University | Sirna therapy for transthyretin (ttr) related ocular amyloidosis |
RU2018108405A (ru) | 2013-01-30 | 2019-02-26 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Конъюгаты углевода и lna-олигонуклеотида |
US20160108395A1 (en) | 2013-03-01 | 2016-04-21 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Chimeric single-stranded antisense polynucleotides and double-stranded antisense agent |
ES2700277T3 (es) | 2013-05-30 | 2019-02-14 | Univ Nat Corp Tokyo Medical & Dental | Agentes de doble cadena para el suministro de oligonucleótidos terapéuticos |
US10190117B2 (en) | 2013-06-16 | 2019-01-29 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Double-stranded antisense nucleic acid with exon-skipping effect |
US11116843B2 (en) | 2015-09-25 | 2021-09-14 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated antisense compounds and their use |
-
2017
- 2017-09-25 US US16/335,017 patent/US11433089B2/en active Active
- 2017-09-25 JP JP2018540337A patent/JP7043078B2/ja active Active
- 2017-09-25 WO PCT/JP2017/034561 patent/WO2018056442A1/ja unknown
- 2017-09-25 EP EP17853209.9A patent/EP3517610A4/en active Pending
-
2022
- 2022-03-09 JP JP2022036122A patent/JP2022069529A/ja active Pending
- 2022-07-27 US US17/815,473 patent/US20230024153A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015502134A (ja) | 2011-12-16 | 2015-01-22 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | キメラ2重鎖核酸 |
WO2015075942A1 (ja) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 国立大学法人 東京大学 | 薬剤送達用のキャリア、コンジュゲートおよびこれらを含んでなる組成物並びにこれらの投与方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
NISHINA,K. et al.,Novel oligonucleotide based on DNA/RNA heteroduplex structures.,第57 回日本神経学会学術大会 プログ ラム・抄録集,2016年,p.194 |
UNO,Y. et al.,Efficient In Vivo Delivery of siRNA to the Brain by Conjugation of Alpha-Tocopherol.,Molecular Therapy,2009年,Vol.17, Supplement 1,p.S197, 515 |
UNO,Y. et al.,Efficient In Vivo delivery of siRNA to the Brain by Conjugation of alpha-Tocopherol.,第32 回日本分子生物学会年 会プログラム・講演要旨集,2009年,p.248,1P-0816 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3517610A4 (en) | 2020-05-27 |
US20230024153A1 (en) | 2023-01-26 |
JPWO2018056442A1 (ja) | 2019-07-18 |
WO2018056442A1 (ja) | 2018-03-29 |
US11433089B2 (en) | 2022-09-06 |
EP3517610A1 (en) | 2019-07-31 |
JP2022069529A (ja) | 2022-05-11 |
US20190247414A1 (en) | 2019-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7043078B2 (ja) | 血液脳関門通過型ヘテロ2本鎖核酸 | |
JP7129702B2 (ja) | オーバーハングを有する二本鎖核酸複合体 | |
WO2020196662A1 (ja) | 二本鎖核酸複合体及びその使用 | |
JP2021011501A (ja) | キメラ2重鎖核酸 | |
EP2961841B1 (en) | Chimeric single-stranded antisense polynucleotides and double-stranded antisense agent | |
WO2020209285A1 (ja) | 筋疾患治療用医薬組成物 | |
JP7333079B2 (ja) | 毒性が軽減した核酸 | |
WO2021054370A1 (ja) | 核酸複合体 | |
WO2021187392A1 (ja) | モルホリノ核酸を含むヘテロ核酸 | |
JP6974872B2 (ja) | ヘテロ二本鎖型antimiR | |
JP7394392B2 (ja) | 核酸複合体 | |
JP6934695B2 (ja) | 核酸医薬とその使用 | |
WO2021157730A1 (ja) | 核酸医薬とその使用 | |
WO2024005156A1 (ja) | 核酸医薬の毒性軽減剤 | |
WO2024071099A1 (ja) | 5'-シクロプロピレン修飾を含む核酸分子 | |
WO2021070959A1 (ja) | 修飾ヘテロ核酸 | |
WO2022250050A1 (ja) | scpBNA又はAmNAを含むヘテロ核酸 | |
WO2023022229A1 (ja) | モルホリノ核酸を含む修飾ヘテロ核酸 | |
WO2023042876A1 (ja) | 2'-修飾ヌクレオシドを含むヘテロ核酸 | |
WO2023127848A1 (ja) | Ebv関連疾患を標的とする核酸医薬 | |
WO2023080225A1 (ja) | 脊髄小脳失調症治療用医薬組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211 Effective date: 20190319 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200907 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200907 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210817 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211008 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220208 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220309 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7043078 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R157 | Certificate of patent or utility model (correction) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R157 |