WO2023080159A1 - リガンド結合核酸複合体 - Google Patents

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WO2023080159A1
WO2023080159A1 PCT/JP2022/040996 JP2022040996W WO2023080159A1 WO 2023080159 A1 WO2023080159 A1 WO 2023080159A1 JP 2022040996 W JP2022040996 W JP 2022040996W WO 2023080159 A1 WO2023080159 A1 WO 2023080159A1
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nucleic acid
ligand
acid complex
strand
nucleotides
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PCT/JP2022/040996
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French (fr)
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鋼 高木
秀樹 木澤
大司 岡本
佳子 兼子
伸之 布施
敬 越智
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レナセラピューティクス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid complex that regulates the expression or editing of a target gene, its transcription product or its translation product, and more specifically, a ligand-binding nucleic acid in which a ligand that can be delivered to a target organ, cell, or the like is bound to the nucleic acid complex.
  • a ligand-binding nucleic acid in which a ligand that can be delivered to a target organ, cell, or the like is bound to the nucleic acid complex.
  • nucleic acid drugs are being developed as next-generation drugs because they act on the sequences of transcription products of disease-causing genes to regulate the expression of transcripts and proteins.
  • Nucleic acids used as nucleic acid medicines include small interfering nucleic acids (siNA), small interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), microRNA (miRNA), and RNA interference against target nucleic acid sequences.
  • siNA small interfering nucleic acids
  • siRNA small interfering RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • miRNA microRNA
  • short hairpin RNA short hairpin RNA (shRNA) molecules that can mediate (RNAi), single stranded Antisense Oligonucleotide (ASO) and antisense double-stranded DNA oligonucleotides using antisense technology, ADO), a hetero-duplex oligonucleotide (HDO) consisting of an antisense strand of DNA and a complementary strand of RNA, a single-stranded heteroduplex oligonucleotide (ss-HDO), etc.
  • RNAi short hairpin RNA
  • ASO Antisense Oligonucleotide
  • ADO antisense double-stranded DNA oligonucleotides using antisense technology
  • HDO hetero-duplex oligonucleotide
  • ss-HDO single-stranded heteroduplex oligonucleotide
  • HDO consists of an antisense strand having a nucleic acid sequence capable of hybridizing to a target gene or target transcript, and a complementary strand (also referred to as a sense strand), which is a nucleic acid strand complementary to the antisense strand.
  • a complementary strand also referred to as a sense strand
  • a structure in which is annealed to a complementary strand is called a hetero-duplex oligonucleotide (HDO) (Patent Document 1).
  • ss-HDO is a single-stranded oligonucleotide as manufactured, comprising an antisense strand consisting of DNA nucleotides or DNA nucleotide analogues, a linker portion consisting of 3-10 nucleotides, and a complementary portion to said antisense strand.
  • a structure comprising a sense strand consisting of RNA nucleotides or RNA nucleotide analogues.
  • This single-stranded oligonucleotide is an oligonucleotide having the structure XLY (Patent Document 2).
  • X is the antisense strand
  • Y is the complementary strand to the antisense strand
  • L consists of nucleotides that act as a linker.
  • this single-stranded oligonucleotide is used as a pharmaceutical composition, it is used in physiological saline, aqueous injections, non-aqueous injections, suspension injections, solid injections, etc., or in blood or plasma.
  • the strand and the strand complementary to the antisense strand are annealed as a single molecule with the linker as a fulcrum to form a double-stranded structure.
  • such a nucleic acid complex acts as a pharmaceutical composition, it undergoes single-molecule annealing to form a double-stranded structure, so this single-stranded oligonucleotide is one of HDOs.
  • a known technique for delivering a nucleic acid complex to a target organ is to add a ligand or the like that can be delivered to the target organ to the nucleic acid complex.
  • Ligands and the like include molecules selected from lipids, peptides and proteins. Lipids may be selected from cholesterol, fatty acids, fat-soluble vitamins, glycolipids and glycerides.
  • ligands for receptors exposed on the surface of target cells can also be selected as ligands (Patent Document 1).
  • cholesterol when used as a ligand, etc., it is taken up into cells via LDL receptors on the cell surface, so it can be delivered particularly to the liver as an organ containing cells with LDL receptors.
  • LDL receptors since many cells with LDL receptors also exist in organs other than the liver, when targeting organs other than the liver, they are also delivered to other organs. Consideration is required.
  • a ligand-bound nucleic acid complex used as a nucleic acid drug is required to be delivered to an organ and to be taken up by the tissue or cells in the organ to exert an antisense effect.
  • the hurdle is high because it is difficult to predict whether the ligand-bound nucleic acid complex will be taken up into cells when a nucleic acid molecule having a molecular weight larger than that of the ligand is bound.
  • bioventures and pharmaceutical companies are continuously researching and developing ligands that can be more specifically delivered to target organs.
  • PTH receptors are widely distributed throughout the body, but are often expressed in the kidney and bone, and types 1 to 3 have been identified to date.
  • the PTH1 receptor is a G protein-coupled receptor.
  • Parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related protein (PTHrP) are known as in vivo ligands for the PTH1 receptor.
  • PTH is a hormone secreted from the parathyroid gland and is a peptide hormone consisting of 84 amino acids. It is involved in the action of regulating the blood calcium level, and most of it is mediated by the PTH1 receptor in the kidney. done in the system.
  • PTHrP is a 139-173 amino acid protein with N-terminal homology with PTH, but the N-terminus of PTHrP has high homology with PTH, and both bind to a common PTH receptor and exert their actions. .
  • PTHrP is secreted from various cells in all organs depending on the time, and physiologically acts mainly in a paracrine/autocrine manner.
  • the biological activity of PTH can be reproduced by an N-terminal fragment of amino acid sequence 1-34, ie hPTH(1-34) (US Pat. PTH(1-34) and PTHrP(1-34) are known to have two amphopic alpha-helical domains.
  • Biological activities of PTH(1-34) and PTHrP(1-34) include promoting the differentiation of osteoblast progenitor cells and preosteoblasts, suppressing apoptosis of osteoblasts, and promoting osteoblasts. It is known to increase the number of cells and promote osteogenesis.
  • PTH1 ligand for the PTH1 receptor
  • PTH1 ligand a ligand for the PTH1 receptor
  • the PTH1 receptor is one of the G protein-coupled receptors (GPCR, G-protein-coupled receptor) and has seven transmembrane helices. PTH1 receptors are widely distributed throughout the body, and tend to be highly expressed in organs and tissues such as kidney, bone and subcutaneous fat, and in cells such as vascular endothelial cells. Among organs of humans and mice, it is highly expressed especially in the kidney.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the problem to be solved by the present invention is to deliver a ligand-binding nucleic acid complex via the PTH1 receptor to an organ of a subject in which the PTH1 receptor is expressed, to obtain a target gene, its transcription product or its translation product. is to modulate the expression or editing of In addition, it can be delivered to the organ of the subject expressing the PTH1 receptor via the PTH1 receptor by intravenous administration or subcutaneous administration, which is an administration method that places less physical burden on the subject, and is targeted. It is to find and perfect a ligand-binding nucleic acid complex capable of regulating the expression or editing of a gene, its transcription product or its translation product.
  • the inventors have found that a nucleic acid complex to which a ligand for the PTH1 receptor expressed in each tissue of the kidney and bone of a subject such as a human or mouse is added is delivered to an organ expressing the PTH1 receptor, The invention was completed by confirming that the expression or editing of the target gene, its transcription product or its translation product is regulated.
  • the inventors have conducted research on ligands for the PTH1 receptor, and as a result, the PTH1 ligand-binding nucleic acid complex of the present invention is delivered to the target organ and regulates the expression or editing of the target gene, its transcription product or its translation product. I found out.
  • the ligand-binding nucleic acid complex of the present invention can be used to treat diseases of organs containing cells expressing PTH1 receptor.
  • a ligand-binding nucleic acid complex in which a nucleic acid molecule that regulates the expression or editing of a target gene, its transcription product or its translation product, and a PTH1 ligand are bound via a linker or not.
  • A5 is Leu, His, Nle, Ile, Cha, ⁇ -Nal, Trp, Pal, Acc, Phe pX-Phe or absent, where X is OH, halogen, or CH3;
  • A6 is Gln;
  • A7 is Leu, Nle, Ile, Cha, ⁇ -Nal, Trp, Pal, Acc, Phep-X-Phe or absent, where X is OH, halogen, or CH3;
  • A8 is Met, Nva, Leu, Val, Ile, Cha, Acc, Nle or missing;
  • A9 is His or missing;
  • A10 is Asp or Asn;
  • A11 is Leu, Lys, Nle, Ile, Cha, ⁇ -Nal, Trp, Pal, Acc, Phe or p
  • a nucleic acid molecule comprising an antisense strand consisting of an oligonucleotide having a nucleobase sequence complementary to a target gene or its transcription product, a nucleobase sequence that specifically binds to a target protein and a decoy consisting of an oligonucleotide having a nucleic acid sequence that is complementary to a target transcription factor.
  • nucleic acid strand of the nucleic acid molecule comprises nucleotides, modified nucleotides and/or nucleotide analogues.
  • the antisense strand is a gapmer, a gap region containing nucleotides and/or modified nucleotides, and one or more nucleotide analogues and/or
  • the ligand-binding nucleic acid complex of [15] comprising wing regions comprising modified nucleotides.
  • the complementary strand comprises a center region containing nucleotides and/or modified nucleotides, and wing regions containing one or more nucleotide analogues and/or modified nucleotides arranged at the 5′ end and/or 3′ end of the center region.
  • the nucleotide analogue is the group consisting of PNA, GNA, TNA, cEt, tcDNA, morpholino nucleic acids and BNA, guanidine bridged nucleic acid (GuNA) and 2′-O,4′-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA)
  • the ligand-binding nucleic acid complex of [13] which is independently selected from [23]
  • the ligand-binding nucleic acid complex of [13] wherein at least one nucleotide or modified nucleotide in the nucleic acid molecule is phosphorothioated or boranophosphated.
  • a ligand binding comprising an antisense strand for reducing the expression level of a target transcript in an organ of a subject expressing the PTH1 receptor, and a PTH1 ligand for delivering the antisense strand to the organ of the subject
  • a ligand-binding nucleic acid complex wherein the antisense strand comprises a base sequence capable of hybridizing to at least a portion of a target transcript and has an antisense effect on the target transcript Complex.
  • the nucleic acid complex is a double-stranded nucleic acid agent consisting of a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand, and the first nucleic acid strand is a base capable of hybridizing to at least part of a target transcript.
  • the second nucleic acid strand comprising a base sequence complementary to said first nucleic acid strand and bound to a PTH1 ligand;
  • the ligand-binding nucleic acid complex of [24] wherein said first nucleic acid strand is annealed to said second nucleic acid strand.
  • the ligand-binding nucleic acid complex of [25] which is a ligand-binding nucleic acid complex for intravenous administration.
  • the ligand-binding nucleic acid complex of the present invention can be used to treat diseases of organs containing cells expressing PTH1 receptors.
  • the ligand-bound nucleic acid complex of the present invention can be delivered organ- or cell-specifically by the PTH1 ligand, and can regulate the expression or editing of the target gene or its transcription product or its translation product by the nucleic acid molecule.
  • Nucleic acid complexes that target disease-causing genes, their transcription products, or their translation products can be used as therapeutic agents for diseases of specific organs.
  • the PTH1 ligand-binding nucleic acid complex can be used as a therapeutic drug for renal diseases because it is easily delivered to the kidney where the PTH1 receptor is most expressed among the organs.
  • FIG. 1 shows changes in body weight of animals before and after administration of L001-HDO6.
  • FIG. 2A shows changes in blood ALT activity three days after administration of L001-HDO6 to mice.
  • FIG. 2B shows changes in blood AST activity 3 days after administration of L001-HDO6 to mice.
  • FIG. 3 shows changes in mMalat1 ncRNA expression levels in the liver of mice after administration of L001-HDO6.
  • FIG. 4 shows changes in mMalat1 ncRNA expression levels in mouse kidneys after administration of L001-HDO6.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of fluorescence-labeled ASO and HDO used in the kidney distribution test.
  • FIG. 6 shows immunostaining images of kidneys 10 minutes, 6 hours, 24 hours and 72 hours after a single intravenous administration of L001-HDO6-Alexa488 to mice.
  • FIG. 7 shows changes in mMalat1 ncRNA expression levels in mouse kidneys after intravenous administration of HDO, L001-HDO6, L003-HDO6, L005-HDO6 and L010-HDO6.
  • FIG. 8 shows changes in mMalat1 ncRNA expression levels in mouse kidneys after subcutaneous administration of L031-HDO6 and L021-HDO6.
  • FIG. 7 shows changes in mMalat1 ncRNA expression levels in mouse kidneys after intravenous administration of HDO, L001-HDO6, L003-HDO6, L005-HDO6 and L010-HDO6.
  • FIG. 8 shows changes in mMalat1 ncRNA expression levels in mouse kidneys after subcutaneous administration of L031-HDO6 and L021-
  • FIG. 9 shows changes in mMalat1 ncRNA expression level by L021-HDO6, L003-HDO6, L005-HDO6 and L010-HDO6 by in vitro assay using mPth1R stable expression cell lines.
  • FIG. 10 shows changes in mMalat1 ncRNA expression level by L021-HDO6 and L011-HDO6 by in vitro assay using mPth1R stably expressing cell lines.
  • FIG. 11 shows changes in mMalat1 ncRNA expression level by L031-HDO6 and L040-HDO6 by in vitro assay using mPth1R stably expressing cell line.
  • FIG. 12 shows changes in mMalat1 ncRNA expression level by L089-HDO6 and L098-HDO6 by in vitro assay using mPth1R stably expressing cell lines.
  • FIG. 13 shows changes in mMalat1 ncRNA expression level by L165-HDO6 and L168-HDO6 by in vitro assay using mPth1R stably expressing cell line.
  • FIG. 14 shows changes in mMalat1 ncRNA expression levels caused by L001-ASO by in vitro assay using mPth1R stably expressing cell lines.
  • FIG. 15 shows changes in Gapdh mRNA expression levels caused by L010-siRNA by in vitro assay using mPth1R stably expressing cell lines.
  • the present invention is a ligand-bound nucleic acid complex in which a ligand is bound to a nucleic acid complex, and the ligand and nucleic acid complex are bound indirectly via a linker or directly without a linker.
  • nucleic acid complex refers to a nucleic acid molecule that regulates the expression or editing of a target gene, its transcription product or its translation product.
  • nucleic acid molecules include nucleic acid molecules having a complementary nucleic acid sequence to a target gene or its transcription product and having antisense activity. More specifically, the nucleic acid molecule is a single stranded antisense strand (ASO), miRNA, anti-miR, RNA interference (RNAi), short interference RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA ), antisense double-stranded DNA oligonucleotide (ADO), hetero-duplex oligonucleotide (HDO).
  • ASO single stranded antisense strand
  • miRNA miRNA
  • anti-miR RNA interference
  • siRNA short interference RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • ADO antisense double-stranded DNA oligonucleotide
  • HDO hetero-duplex oligon
  • nucleic acid molecules include aptamers that have high specificity and high binding affinity for target molecules such as proteins.
  • nucleic acid molecules include decoys.
  • the function of decoys is that transcription factors bind to binding sites of transcription regulatory factors such as specific promoters of genes, and normally the transcription factors activate genes or regulate the on/off of gene functions. , decoy hybridizes to the transcription factor to suppress the original function of the transcription factor.
  • nucleic acid molecules include baits, which are nucleic acid molecules that specifically bind to specific target molecules in cells and that modify the function of the target molecules.
  • a "target gene” is a gene to which the antisense strand of the nucleic acid complex of the present invention can bind.
  • Target genes include, for example, genes derived from organisms into which the nucleic acid complex of the present invention is introduced, such as genes whose expression is increased in various diseases. Examples thereof include Indian hedgehog gene, interferon gene, apolipoprotein B gene, huntingtin gene, dystrophin gene, DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) gene and the like.
  • Indian hedgehog is a secretory protein belonging to the hedgehog family. Located downstream of the transcription factor TAZ, it is known to exacerbate NASH fibrosis.
  • IL-1 cytokine interleukin-1 gene
  • Skipping exon9 which encodes the transmembrane domain of the pre-messenger RNA (mRNA) IL-1RAcP, as a therapeutic strategy has been reported to result in substantial inhibition of IL-1 signaling (Mol Ther. Nucleic Acids.2013 Jan22(1):e66.doi:10.1038/mtna.2012.58.).
  • the apolipoprotein B gene, ApoB-100 is known to cause familial hypercholesterolemia, an inherited metabolic disease. In 2013, the nucleic acid drug mipomersen was launched in the United States.
  • Huntington's disease is a chronic progressive neurodegenerative disease that takes an autosomal dominant inheritance pattern and is characterized by involuntary movements, mainly chorea movements, mental symptoms, and dementia as the main symptoms. It is known that 4p16.3 on the short arm of chromosome 4 of the Huntington gene is the causative gene of Huntington's disease.
  • Duchenne muscular dystrophy is known to occur in boys as a rule, with muscular dystrophy caused by mutations in the dystrophin gene, an X-linked recessive inheritance. Exon skipping, which skips abnormal exons of the dystrophin gene, is an effective treatment.
  • the DMPK gene encodes myotonin protein kinase and is known as the causative gene of myotonic dystrophy, which has the highest incidence among adult muscular dystrophies.
  • the COL4A3, COL4A4, and COL4A5 genes are genes that encode the ⁇ 3, ⁇ 4, and ⁇ 5 chains of type 4 collagen that constitutes the basement membrane. develop a syndrome.
  • Alport syndrome is a syndrome that presents hearing loss and eye complications in addition to renal failure, and is known to often progress to end-stage renal failure.
  • Target transcript refers to any RNA that is directly targeted by the nucleic acid complex of the present invention and synthesized by RNA polymerase.
  • target gene transcript corresponds to the “target transcript”. Specifically, mRNA transcribed from the target gene (including mature mRNA, pre-mRNA, and mRNA that has not undergone base modification), non-coding RNA such as miRNA (non-coding RNA, ncRNA), long non-coding RNA RNA (lncRNA), including natural antisense RNA.
  • target transcripts examples include pre-mRNA that is the transcript of the IL-1RAcP gene, mRNA that is the transcript of the ApoB-100 gene, mRNA that is the transcript of the IHH gene, and pre-mRNA that is the transcript of the dystrophin gene.
  • DMPK mRNA which is a transcription product of the DMPK gene
  • Mealat1 metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (Malat1) non-coding RNA (ncRNA), and the like.
  • Malat1 is a long non-coding RNA (lncRNA) that is highly expressed in malignant tumors such as lung cancer, and is known to reside in the nucleus of muscle cells.
  • lncRNA long non-coding RNA
  • a “target translation product” is a transcription product of mRNA, excluding non-coding RNA, which is used as a template, and the ribosome connects amino acids carried by the messenger RNA (transfer RNA) according to the codon to create a peptide chain.
  • transfer RNA messenger RNA
  • “translation product of target gene” and “translation product of target transcript” correspond to "target translation product”.
  • Aptamer refers to a target translation product, for example, a nucleic acid molecule that specifically binds to a specific target molecule inside, on the cell membrane, or extracellularly, for example, on the cell membrane or extracellularly.
  • Aptamers include DNA-type and RNA-type aptamers, and can be produced by a method known in the art, for example, an in vitro selection method using the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • the length of the nucleobase of the aptamer is not particularly limited, but is 10 to 70 bases long, preferably 20 to 50 bases long.
  • “Decoy” refers to a nucleic acid having a binding site sequence of a transcription factor (for example, NF-kB) or a similar sequence. If it is an activator, it suppresses transcription; if it is a transcription repressor, it promotes transcription).
  • a decoy nucleic acid can be easily designed based on the information of the binding sequence of the target transcription factor.
  • the base length of the decoy nucleic acid is not particularly limited, but is 8 to 30 base lengths, preferably 10 to 25 base lengths.
  • Nucleic acid or “nucleic acid molecule” means a nucleoside or nucleotide if it is a monomer, an oligonucleotide if it is an oligomer, or a polynucleotide if it is a polymer.
  • the term “nucleic acid strand” is also used herein to refer to oligonucleotides. Nucleic acid strands may be prepared in whole or in part by chemical synthesis methods such as the use of automated synthesizers, and may be prepared by enzymatic treatment, including but not limited to polymerase, ligase or restriction enzyme reactions. may
  • Nucleoside generally refers to a molecule consisting of a combination of a base and a sugar.
  • the sugar moiety of a nucleoside is usually, but not limited to, composed of pentofuranosyl sugars, specific examples of which include ribose and deoxyribose.
  • the base portion (nucleobase) of a nucleoside is usually a heterocyclic base portion. Non-limiting examples include adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil, as well as other modified nucleobases (modified bases).
  • Nucleotide refers to a molecule in which a phosphate group is covalently bonded to the sugar moiety of the nucleoside. Nucleotides containing a pentofuranosyl sugar typically have a phosphate group attached to the hydroxyl group at the 2', 3', or 5' positions of the sugar.
  • Oligonucleotide refers to a linear oligomer formed by covalently linking several to several tens of hydroxyl groups and phosphate groups of sugar moieties between adjacent nucleotides.
  • polynucleotide refers to a polymer formed by linking several tens or more, preferably several hundreds or more of nucleotides, which are more numerous than oligonucleotides, by covalent bonds.
  • phosphate groups are commonly considered to form internucleoside linkages.
  • Antisense technology refers to a technology that uses a nucleic acid molecule with an antisense strand to regulate the amount, activity and/or function of a target nucleic acid.
  • the principle of antisense technology using an antisense strand is that a nucleic acid molecule bearing an antisense strand hybridizes to a target nucleic acid to modulate the amount, activity and/or function of the target nucleic acid.
  • a nucleic acid molecule with an antisense strand will alter the transcription or translation of a target. Such modulation of expression can be achieved, for example, by degradation or occupancy-based inhibition of the target mRNA.
  • RNA target function by degradation is ribonuclease (RNase) degradation of target RNA upon hybridization with a nucleic acid molecule bearing a DNA-like antisense strand.
  • RNase ribonuclease
  • An antisense strand (ASO) composed of DNA that is capable of hybridizing with the target RNA hybridizes to the target RNA to form a double strand, and then is degraded by RNase.
  • Inhibition of expression of target RNA, suppression of action of target RNA, and the like are performed by reducing RNA. This antisense effect is called RNase-dependent antisense effect.
  • RNAi RNA interference
  • RNAi is antisense-mediated gene silencing that utilizes the RNA-induced silencing complex (RISC). Examples of RNAi include siRNA, shRNA, miRNA, and the like. This antisense effect is also called RNAi-dependent antisense effect.
  • antisense effect refers to the effect of regulating expression or editing of a target gene or its transcript by hybridizing the antisense strand of a nucleic acid molecule to the target gene or its transcript (RNA sense strand).
  • Modulating the expression or editing of a target gene, its transcript or its translation product means the expression of the target gene or the expression level of the target transcript (herein, “the expression level of the target transcript” is often referred to as “ (referred to as “target transcript level”) suppression or reduction, enhancement, translation inhibition, translation product function inhibition, RNA splicing control (e.g. splicing switch, exon inclusion, exon skipping, etc.), transcript degradation, or targeting It means inhibition of binding of gene to protein.
  • target transcript level suppression or reduction, enhancement, translation inhibition, translation product function inhibition, RNA splicing control (e.g. splicing switch, exon inclusion, exon skipping, etc.), transcript degradation, or targeting It means inhibition of binding of gene to protein.
  • the antisense effect is caused by inhibition of translation or splicing function conversion effects such as exon skipping, which can be caused by covering the transcript by hybridization, and/or recognition of the hybridized portion. It means said repression caused by degradation of said transcript obtained.
  • the antisense effect is obtained by incorporating exons that are excluded from mRNA due to genetic abnormalities in the exon inclusion of a target gene or transcript by the action of antisense, contrary to exon skipping. It refers to the resulting enhancement of normal mRNA expression.
  • RNA oligonucleotide in post-transcriptional inhibition of a target gene, when an RNA oligonucleotide is introduced into a cell as an ASO, the ASO forms a partial double strand by annealing with mRNA, the transcript of the target gene. This partial double strand serves as a cover to prevent translation by the ribosome, thereby inhibiting the expression of the target protein encoded by the target gene at the translational level (steric blocking).
  • oligonucleotides containing DNA as ASO are introduced into cells, partial DNA-RNA heteroduplexes are formed. Recognition of this heteroduplex structure by RNase results in degradation of the mRNA of the target gene and inhibition of expression of the protein encoded by the target gene at the expression level.
  • antisense effects can also be produced by targeting introns in pre-mRNAs.
  • antisense effects can also be produced by targeting miRNAs.
  • functional inhibition of the miRNA can increase the expression of genes whose expression is normally controlled by the miRNA.
  • modulating expression of the target transcript may be reduction in target transcript abundance.
  • the DNA double strand is cleaved by DNA nuclease (DNase) in the cell, and then the DNA antisense strand hybridizes to the target RNA to form a double strand. is formed, the target RNA is then degraded by RNase. By repeating this cycle, the expression of the target RNA is inhibited, the action of the target RNA is suppressed, and the like.
  • DNase DNA nuclease
  • RNA splicing such as, suppresses or enhances the expression of target genes.
  • HDO when used as a nucleic acid molecule having an antisense strand, after the complementary strand of HDO RNA is cleaved by RNase in the cell, the DNA antisense strand hybridizes to the target RNA to form a double strand. After formation, the target RNA is degraded by RNase. By repeating this cycle, the expression of the target RNA is inhibited, the action of the target RNA is suppressed, and the like.
  • the DNA antisense strand hybridizes to the target RNA, and by controlling RNA splicing such as inhibition of transcription or translation of the target RNA and exon skipping, target It suppresses or enhances expression of genes.
  • RNAi RNA interference
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • examples of RNAi include siRNA, shRNA, and the like.
  • regulation of RNA target function is by occupancy-based mechanisms, such as those mechanisms naturally utilized by microRNAs.
  • MicroRNAs are small non-coding RNAs that regulate the expression of protein-coding RNAs. Binding of a nucleic acid molecule with an antisense strand to a microRNA inhibits the binding of the microRNA to its mRNA target, thereby interfering with the function of the microRNA.
  • MicroRNA mimetics can enhance native microRNA function. Nucleic acid molecules with specific antisense strands alter the splicing of pre-mRNA. Regardless of the specific mechanism, sequence specificity makes nucleic acid molecules with antisense strands useful as tools for target validation and gene functionalization, as well as for selective expression of genes involved in disease pathogenesis. used as a therapeutic agent to modulate
  • the length of the antisense strand is not particularly limited, it is at least 8 bases, for example 8 to 40 bases, preferably 12 to 30 bases, more preferably 12 to 25 bases, or 13 to 20 bases. is. In some cases, the length of the strand chosen will generally depend on the strength of the antisense effect of the nucleic acid strand on the target, and other factors such as cost, synthetic yield, and the like. In the case of a double-stranded nucleic acid, the chain length may be selected from a chain length such that the Tm value of the double strand is preferably 50°C or higher, more preferably 60°C or higher.
  • the length of the complementary strand may be the same as that of the antisense strand. In that case, it is at least 8 bases, for example 8 to 40 bases, preferably 12 to 30 bases, more preferably 12 to 25 bases, or 13 to 20 bases. Moreover, it may be longer or shorter than the chain length of the antisense nucleic acid chain by several bases to ten and several bases.
  • “Complementary” or “complementarity” means that through hydrogen bonding, so-called Watson-Crick base pairs (natural base pairs) or non-Watson-Crick base pairs (Hoogsteen base pairs, etc.) can be formed. It means relationship. If a sufficient number of nucleobases of the antisense strand are capable of hydrogen bonding with the corresponding nucleobases of the target gene or target transcript, then the antisense strand and target gene or target transcript are complementary to each other, so the desired An antisense effect occurs. Non-complementary nucleobases between the antisense strand and the target gene or target transcript are permissible provided the antisense strand can specifically hybridize to the target nucleic acid.
  • the antisense strand can hybridize to one or more segments of the target gene or target transcript, whereby intervening or flanking segments are involved in hybridization events (e.g., loop structures, mismatches or hairpin structures). do not.
  • the antisense strand is said to be complementary to the sequence of the target gene or target transcript.
  • Complementary means that the antisense strand is complementary to the extent that it can bind to the target gene or target transcript. Above, 98% or more, or 99% or more complementary. They may be 100% complementary. There may be as many as 0-4 mismatches.
  • the "nucleic acid complex" of the present invention is a single-stranded oligonucleotide when manufactured, comprising an antisense strand consisting of DNA nucleotides or DNA nucleotide analogues and a linker portion consisting of 3 to 10 nucleotides. and a sense strand consisting of RNA nucleotides or RNA nucleotide analogs that are complementary to the antisense strand.
  • a nucleic acid complex with this structure is called a single stranded heteroduplex oligonucleotide (ss-HDO), and is an oligonucleotide consisting of an XLY structure (Patent Document 4).
  • X is the antisense strand
  • Y is the complementary strand to the antisense strand
  • L consists of nucleotides that act as a linker.
  • this single-stranded oligonucleotide is used as a pharmaceutical composition, it is used in physiological saline, aqueous injections, non-aqueous injections, suspension injections, solid injections, etc., or in blood or plasma.
  • the strand and the strand complementary to the antisense strand are annealed as a single molecule with the linker as a fulcrum to form a double-stranded structure.
  • Such a nucleic acid complex is one of the double-stranded nucleic acid complexes, since one molecule is annealed to form a double-stranded structure when acting as a pharmaceutical composition.
  • the nucleic acid complex may be referred to as a nucleic acid molecule.
  • the antisense strand comprises nucleotides, modified nucleotides and/or nucleotide analogs.
  • the antisense strand means that it has DNA nucleotides, RNA nucleotides, and optionally modified nucleotides, nucleotide analogues in the nucleic acid strand.
  • the complementary strand comprises nucleotides, modified nucleotides and/or nucleotide analogs.
  • a complementary strand means that it has DNA nucleotides and RNA nucleotides, and may optionally further have modified nucleotides and nucleotide analogues in the nucleic acid strand.
  • the complementary strand comprises a central region containing nucleotides and/or modified nucleotides, and one or more nucleotide analogues and/or modified nucleotides arranged at the 5′ end and/or the 3′ end thereof. It has a wing area.
  • DNA nucleotide means a naturally occurring DNA nucleotide or a DNA nucleotide whose base, sugar or phosphate binding subunits have been modified.
  • RNA nucleotide means a naturally occurring RNA nucleotide or an RNA nucleotide whose base, sugar or phosphate binding subunits have been modified.
  • a "modified nucleotide” is the addition of one substituent to the base, sugar or phosphate-linked subunit of a nucleotide, or the substitution of one within a subunit, replacing the entire subunit with a different chemical group.
  • DNA may be modified nucleotides from the viewpoint that part or all of the region containing nucleotides is highly resistant to DNase and the like.
  • Such modifications include, for example, cytosine 5-methylation, 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N4-methylation, thymidine 5-demethylation, 5-fluorination, 5- bromination, 5-iodination, N6-methylation of adenine, 8-bromination, N2-methylation of guanine, 8-bromination, phosphorothioation, boranophosphate, methylphosphonate, methylthiophosphonate, chiral- methylphosphonate, phosphorodithioate, phosphoramidate, 2′-O-methylation, 2′-methoxyethyl (MOE), 2′-aminopropyl (AP), and 2′-fluorination Among them, phosphorothioate is preferred from the viewpoint of excellent pharmacokinetics. Furthermore, such modifications may be applied to the same DNA in combination of multiple types. In addition, as described later, RNA nucleotides may be modified in order to achieve similar effects.
  • the number and position of modified nucleotides may affect the antisense effect and the like exhibited by the double-stranded nucleic acid disclosed herein. Since these aspects differ depending on the sequence of the target gene, etc., they cannot be generalized, but a person skilled in the art can determine them by referring to the literature regarding the antisense method described below.
  • the antisense effect of the double-stranded nucleic acid complex after modification is measured, and if the obtained measured value is not significantly lower than that of the double-stranded nucleic acid complex before modification (for example, If the measured value of the double-stranded nucleic acid complex after modification is 30% or more of the measured value of the double-stranded nucleic acid complex before modification), the modification can be evaluated.
  • the antisense effect can be measured, for example, by introducing a test nucleic acid compound into a cell or the like, as shown in the Examples below, and measuring in the cell or the like suppressed by the antisense effect exhibited by the test nucleic acid compound.
  • the expression level of the target gene mRNA level, cDNA level, protein level, etc.
  • Nucleotide analogue means a non-naturally occurring nucleotide, in which two or more substituents have been added to the base, sugar or phosphate binding subunit of the nucleotide, or two or more substituted, or substituted entirely with a different chemical group. Examples of analogs with more than one substitution include crosslinked nucleic acids.
  • a bridging nucleic acid is a nucleotide analogue to which a bridging unit is added based on two substitutions in the sugar ring, typically the 2' and 4' carbons are attached. is mentioned.
  • the first nucleic acid strand further comprises a nucleotide analog from the viewpoint of increasing the affinity for the partial sequence of the transcript of the target gene and/or the resistance to nucleolytic enzymes.
  • Nucleotide analogs may be nucleotides that have been modified (crosslinked, substituted, etc.) to increase the affinity for the partial sequence of the transcript of the target gene and/or the resistance to nucleolytic enzymes.
  • nucleic acids disclosed as being suitable for use in antisense methods are also referred to as "references relating to antisense methods"
  • nucleic acids disclosed in said document hexitol nucleic acid (HNA), cyclohexene nucleic acid (CeNA), peptide nucleic acid (PNA), glycol nucleic acid (GNA), threose nucleic acid (TNA), morpholino nucleic acid, tricyclo-DNA (tcDNA).
  • 2′-O-methylated nucleic acids (2′-OMe), 2′-O-methoxyethylated nucleic acids (2′-MOE), 2′-O-ethylated nucleic acids (cEt), 2′-O-amino Propylated nucleic acid (2'-AP), 2'-fluorinated nucleic acid, 2'F-arabino nucleic acid (2'-F-ANA), bridged nucleic acid (BNA).
  • the BNA may be a ribonucleotide or deoxyribonucleotide in which the 2'- and 4'-carbons are bridged by two or more atoms.
  • Examples of cross-linked nucleic acids are known to those of skill in the art.
  • the 2′ and 4′ carbons are 4′-(CH 2 )p—O-2′, 4′-(CH 2 )p—S -2′,4′-(CH 2 )p-OCO-2′,4′-(CH 2 )nN(R 3 )-O-(CH 2 )m-2′ (where p, m and n are integers of 1 to 4, 0 to 2 and 1 to 3, respectively;
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, Aralkyl groups, acyl groups, sulfonyl groups, and unit substituents (such as fluorescent or chemiluminescent labeled molecules, nucleic acid cleaving functional groups, or intracellular or nuclear localization signal peptides).
  • R 1 and R 2 of the substituent at the 3′ carbon: OR 2 and the substituent at the 5′ carbon: OR 1 are typically hydrogen atoms, which may be the same or different, hydroxyl-protecting groups for nucleic acid synthesis, alkyl groups, alkenyl groups, cycloalkyl groups, aryl groups, aralkyl groups, acyl groups, sulfonyl groups, silyl groups, phosphate groups, and protecting groups for nucleic acid synthesis or —P(R 4 )R 5 (wherein R 4 and R 5 may be the same or different, a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, A mercapto group, a mercapto group protected by a protecting group for nucleic acid synthesis, an amino group, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, an alkylthio group having 1 to 5 carbon atoms, a cyano
  • Such BNAs include, for example, ⁇ -L-methyleneoxy (4'-CH 2 -O- 2′) BNA) or ⁇ -D-methyleneoxy (4′-CH 2 -O-2′) BNA, ethyleneoxy (4′-(CH 2 )2-O-2′) BNA, also called ENA, Also called ⁇ -D-thio(4′-CH 2 -S-2′)BNA, aminooxy(4′-CH 2 -ON(R 3 )-2′)BNA, 2′,4′-BNANC oxyamino(4'- CH2 -N( R3 )-O-2')BNA, 2',4'-BNACOC, 3'amino-2',4'-BNA, 5'-methyl BNA, (4′-CH(CH 3 )-O-2′)BNA, also called cEt-BNA, (4′-CH(CH 2 OCH 3 )-O-2′)BNA, also called cMOE-BNA, Amido BNA (4
  • the base site may be modified.
  • base site modifications include cytosine 5-methylation, 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N4-methylation, thymidine 5-demethylation, 5-fluorination, 5- Bromination, 5-iodination, N6-methylation of adenine, 8-bromination, N2-methylation of guanine, 8-bromination can be mentioned.
  • the modified nucleic acids may have modified phosphodiester binding sites.
  • Modifications of the phosphodiester binding site include, for example, phosphorothioation, boranophosphate, methylphosphonate, methylthiophosphonate, chiral-methylphosphonate, phosphorodithioate, and phosphoramidate, but Phosphorothioate is used from the viewpoint of excellent pharmacokinetics.
  • Phosphorothioate is used from the viewpoint of excellent pharmacokinetics.
  • a plurality of such base site modifications and phosphodiester binding site modifications may be combined for the same nucleic acid.
  • modified nucleotides and nucleotide analogs are not limited to those exemplified here.
  • Numerous modified nucleotides and nucleotide analogs are known in the art, for example, Tachas et al., US Pat. No. 8,299,039, particularly columns 17-22, may also be used as an embodiment of the present application. .
  • nucleotide analogue can be selected and utilized as appropriate, in certain embodiments, the nucleotide analogue is LNA.
  • the antisense strand comprises a region containing multiple DNA nucleotides (hereinafter also referred to as "DNA gap region") and one or more nucleotides located at the 5'-end and/or 3'-end of the region. It includes wing regions that contain analogues.
  • This antisense strand is also called a Gapmer.
  • the chain length of the gapmer is at least 8 bases, such as 8-40 bases, preferably 12-30 bases, more preferably 12-25 bases, or 13-20 bases.
  • the plurality of DNA nucleotides may be modified nucleotides.
  • the plurality of DNA nucleotides may be nucleotide analogs.
  • a region containing nucleotide analogues positioned at the 5′ end of the DNA gap region (hereinafter also referred to as “5′ wing region”) and a region containing nucleotide analogues positioned at the 3′ end of the DNA gap region (hereinafter “ 3' wing region”) are independent of each other, and may contain at least one nucleotide analogue listed in the antisense literature. Nucleic acids (DNA or RNA) or modified nucleotides may be included. In addition, the chain lengths of the 5' wing region and 3' wing region are independently usually 1 to 10 bases, 1 to 7 bases, or 2 to 5 bases.
  • the antisense strand is composed of multiple DNA nucleotides, modified nucleotides or nucleotide analogs, or combinations thereof, rather than gapmers.
  • This antisense strand is also called non-gapmer.
  • the chain length of said non-gapmer is at least 8 bases, such as 8-40 bases, preferably 12-30 bases, more preferably 12-25 bases, or 13-20 bases.
  • the complementary strand in the double-stranded nucleic acid complex comprises a region containing a plurality of DNA nucleotides or RNA nucleotides and one or more modified nucleotides arranged at the 5'-end and/or 3'-end of the region. and/or gapmers containing wing regions containing nucleotide analogues.
  • the complementary strand in the double-stranded nucleic acid complex may be multiple DNA nucleotides and/or modified nucleotides or nucleotide analogues, RNA nucleotides and/or modified nucleotides or nucleotide analogues. Furthermore, the complementary strand in the double-stranded nucleic acid complex has a center region containing nucleotides and/or modified nucleotides, and one or more nucleotide analogues and/or Alternatively, it may have wing regions containing modified nucleotides.
  • the nucleic acid molecule that regulates the expression or editing of the target gene, its transcription product or its translation product consists of an oligonucleotide having a nucleic acid base sequence complementary to the above-mentioned target gene or its transcription product. selected from the group consisting of a nucleic acid molecule comprising an antisense strand, an aptamer having a nucleobase sequence that specifically binds to a target protein, and a decoy consisting of an oligonucleotide having a nucleic acid sequence that is complementary to a target transcription factor. and nucleic acid molecules.
  • nucleic acid molecules that regulate the expression or editing of target genes, transcription products thereof, or translation products thereof include nucleic acid molecules selected from the group consisting of ADO, ASO, HDO, and RNAi. .
  • Ligands By “ligand” is meant a substance that binds to a biomolecule to form a complex and serve a biological purpose. In some cases, the ligand has a delivery function to the target.
  • lipids are preferred ligands from the viewpoint of being able to deliver highly specific and efficient nucleic acid complexes to the liver and the like.
  • lipids include lipids such as cholesterol and fatty acids (e.g., vitamin E (tocopherols, tocotrienols), vitamin A, vitamin D), fat-soluble vitamins such as vitamin K (e.g., acylcarnitine), acyl CoA, and the like.
  • sugars eg, glucose and sucrose
  • preferred ligands are receptor ligands, antibodies, and/or them. and peptides or proteins such as fragments of
  • a "PTH1 ligand” is a ligand that can bind to a PTH1 receptor.
  • Representative examples of ligands that can bind to the PTH1 receptor include human parathyroid hormone (hPTH), human parathyroid hormone-related protein (hPTHrP), and human tuberoinfundibular peptide (hTIP). mentioned.
  • the PTH1 ligand is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by the formula below.
  • [Chemical 2] A 1 -A 2 -A 3 -A 4 -A 5 -A 6 -A 7 -A 8 -A 9 -A 10 -A 11 -A 12 -A 13 -A 14 -A 15 -A 16 -A 17 -A 18 -A 19 -A 20 -A 21 -A 22 -A 23 -A 24 -A 25 -A 26 -A 27 -A 28 -A 29 -A 30 -A 31 -A 32 -A 33 -A 34 [In the formula, the amino acid sequence is written from the N-terminus to the C-terminus.
  • A5 is Leu, His, Nle, Ile, Cha, ⁇ -Nal, Trp, Pal, Acc, Phe pX-Phe or absent, where X is OH, halogen, or CH3;
  • A6 is Gln;
  • A7 is Leu, Nle, Ile, Cha, ⁇ -Nal, Trp, Pal, Acc, Phep-X-Phe or absent, where X is OH, halogen, or CH3;
  • A8 is Met, Nva, Leu, Val, Ile, Cha, Acc, Nle or missing;
  • A9 is His or missing;
  • A10 is Asp or Asn;
  • A11 is Leu, Lys, Nle, Ile, Cha, ⁇ -Nal, Trp, Pal, Acc, Phe or p
  • Gly or G Glycine Ala or A: Alanine Val or V: Valine Leu or L: Leucine Ile or I: Isoleucine Ser or S: Serine Thr or T: Threonine Cys or C: Cysteine Met or M: Methionine Glu or E: Glutamic acid Asp or D: Aspartic acid Lys or K: Lysine Arg or R: Arginine His or H: Histidine Phe or F: Phenylalanine Tyr or Y: Tyrosine Trp or W: Tryptophan Pro or P: Proline Asn or N: Asparagine Gln or Q : Glutamine Aib : Aminoisobutyric acid Nle : Norleucine ⁇ -Ala: ⁇ -alanine hPTH: Human PTH Boc: t-butoxycarbonyl Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl Nva: norvaline Abu: ⁇ -aminobutyric acid Ahc
  • Peptides represented by the above formula include hPTH(1-34), hPTH(1-34) derivatives, e.g. It includes hPTHrP(1-34), hPTHrP(1-34) derivatives, and peptides lacking n amino acid residues from the N-terminus (where n is an integer from 1 to 9).
  • the PTH1 ligand lacks n amino acid residues from the N-terminus of hTIP(1-39), hTIP(1-39) derivatives, and peptides thereof (where n is an integer from 1 to 9). includes things.
  • the PTH1 ligand is a hPTH(1-34) peptide, hPTHrP(1-34) peptide, hTIP(1-39) selected from the group of peptides of SEQ ID NOs: 1-168 contained in Table 2 below.
  • n amino acid residues an integer from 1 to 9 from the N-terminus.
  • PTH1 ligands listed in Table 2 are human PTH1 ligands.
  • the PTH1 ligand is a peptide selected from the hPTHrP(1-34) peptides of SEQ ID NOS: 1-88 included in Table 1 and partial peptides thereof.
  • the PTH1 ligand is a peptide selected from the hPTH(1-34) peptides of SEQ ID NOS: 89-164 contained in Table 1 and partial peptides thereof.
  • the PTH1 ligand is a peptide selected from the hTIP(1-39) peptides of SEQ ID NOS: 165-168 contained in Table 1 and partial peptides thereof.
  • the PTH1 ligand is at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more identical to L001, L011, L021, L031, L041, L051, L072 from hPTHrP(1-34) Or they may be peptides with homologous amino acid sequences.
  • the PTH1 ligand has an amino acid sequence that is at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more identical or homologous to L089, L099, L109 from hPTH(1-34). It may be a peptide.
  • the PTH1 ligand is a peptide having an amino acid sequence that is at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more identical or homologous to L165 from hTIP(1-39) good.
  • the ligand is bound to the antisense strand and/or complementary strand of the nucleic acid molecule.
  • the ligand is attached to the 3' or 5' end of the nucleic acid strand.
  • the ligand is attached to a site other than the end of the nucleic acid strand.
  • a method for binding a ligand to the 2-position of the pentose of a nucleotide is known, and can be performed, for example, by the method described in International Publication No. WO2018/003739.
  • the "PTH1 ligand” may be a salt of the above peptide, and examples of the salt of the above peptide include sodium salt, potassium salt, calcium salt, hydrochloride, sulfate, nitrate, acetate, methanesulfonate, and toluenesulfonate. , citrate, fumarate, maleate, hydrobromide and the like.
  • the above peptides can be produced by known methods such as solid-phase synthesis.
  • Binding of ligands and nucleic acid molecules Binding methods of ligands and nucleic acids include covalent bonds, non-covalent bonds such as hydrogen bonds, electrostatic interactions, and hydrophobic interactions. They can be combined by action or the like.
  • Examples of the ligand-binding group include, but are not limited to, amino groups, hydroxy groups, carboxylic acid groups, thiol groups, disulfide groups, and azide groups possessed by peptides that are PTH1 ligands.
  • Nucleic acid binding groups include the 2-carbon of a nucleoside sugar, the 3- or 5-hydroxy group, the 5-phosphate group of a nucleotide, or the base portion of a nucleoside. Groups to which nucleic acid molecules can be attached also include phosphate groups in oligonucleotides. The nucleic acid molecule and ligand are attached with or without a linker.
  • the ligand is attached to the nucleic acid molecule via a linker.
  • the ligand may be attached to the antisense strand and/or complementary strand of HDO via a linker.
  • Linkers can be cleavable or uncleavable linkers.
  • “Cleavable linker” means a linking group that is cleaved under physiological conditions, for example, intracellularly or in an animal body (eg, human body).
  • cleavable linkers are selectively cleaved by endogenous enzymes such as nucleases.
  • Cleavable linkers include amide, ester, phosphodiester or both esters, phosphate, carbamate, and disulfide bonds, as well as natural DNA linkers.
  • a “non-cleavable linker” means a linker that is not cleaved under physiological conditions, eg, in cells or in animals (eg, in humans).
  • Non-cleavable linkers include, but are not limited to, phosphorothioate linkages, and linkers composed of modified or unmodified deoxyribonucleosides or modified or unmodified ribonucleosides linked by phosphorothioate linkages.
  • the linker is a nucleic acid such as DNA or an oligonucleotide
  • the chain length is not particularly limited, but is usually 2 to 20 bases long, preferably 3 to 10 bases long.
  • linkers used in the present invention include chain structures such as hydrocarbyl chains or oligomers of repeating units such as ethylene glycol, nucleoside or amino acid units.
  • the linker comprises one or more groups selected from alkyl, amino, oxo, amido, disulfide, polyethylene glycol, ether, thioether, and hydroxylamino.
  • the linker comprises groups selected from alkyl, amino, oxo, amido and ether groups.
  • the linker comprises groups selected from alkyl and amido groups.
  • the linker comprises groups selected from alkyl and ether groups.
  • the linker comprises at least one phosphorus moiety.
  • the linker comprises at least one phosphate group.
  • the linker includes at least one neutral linking group.
  • the linker has a length of 1-1000 ⁇ .
  • Certain linkers have a length of 3-500 ⁇ .
  • it has a length of 3-200 ⁇ (the length was estimated based on the crystal structure (PDB 6F3J) in which the PTH1R receptor and the PTH analog bind).
  • a bifunctional bond can be used to bond the linker to the oligonucleotide.
  • bifunctional linkages are linkages using at least two functional groups. Some of the linker's functional groups are selected to bind to specific sites on the oligonucleotide and others are selected to bind to the ligand portion. Examples of functional groups used for bifunctional attachment of linkers include, but are not limited to, electrophiles to react with nucleophiles and nucleophiles to react with electrophiles. be done.
  • bifunctional linkages are available with one or more groups selected from amino, hydroxyl, carboxylic acid, thiol, alkyl, alkenyl, and alkynyl.
  • linkers include, but are not limited to, 6-aminohexanoic acid (AHA or AHEM) and (2,5-dioxypyrrolidi-1-yl)4-(2-azatricyclo[10.4.0. 04,9]hexadeca-1(16),4,6,8,12,14-hexe-10-nin-2-yl-4-oxobutanoate (DBCO-NHS), 3-mercaptopropionic acid, succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate
  • linkers include, but are not limited to, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 - C10 alkenyl or substituted or unsubstituted C2 - C10 alkynyl, a non-limiting list of preferred substituents include hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol
  • the linker can be selected from compounds having the following structures in Table 3 and derivatives thereof.
  • the n of the polyethylene glycol group in Table 3 is 1-200, preferably 1-100, more preferably 1-50.
  • the linker may consist of 2-20 linker-nucleosides. In certain embodiments, such linker-nucleosides are consecutive modified nucleosides. In certain embodiments, such linker-nucleosides may contain modified sugar moieties. In certain embodiments, linker-nucleosides are unmodified. In certain embodiments, the linker-nucleoside optionally comprises a protected heterocyclic base selected from purines, substituted purines, pyrimidines or substituted pyrimidines.
  • the linker can be selected from compounds having the following structures and derivatives thereof.
  • X is the ligand binding site and Y is the nucleic acid molecule binding site.
  • a compound having an active ester of formula 4 below (Where X is a ligand binding site), a compound represented by the following formula: (where Y is a nucleic acid molecule binding site), reacting with an oligonucleotide having a terminal amine, (wherein X is the ligand binding site and Y is the nucleic acid molecule binding site.
  • the nucleic acid molecule is an oligonucleotide selected from or using natural nucleotides, modified nucleotides, nucleotide analogues).
  • a linker represented by Formula 6 above can be obtained.
  • linkers containing phosphate/triethylene glycol can be used.
  • a linker represented by the following formula 7 can be used.
  • X is a ligand
  • a linker represented by the formula of Chemical Formula 9 above can be obtained.
  • the linker is a structure represented by Formula 10 below.
  • X is a ligand-binding site, Y is a nucleic acid molecule-binding site, W is a phosphodiester or amino group, Z is a pyrrolidinyl group represented by the following formula 11; j is 0 or 1; yes; n is about 1 to about 10; m is about 1 to about 10; l is 0 or 1-4; and l is 1 when X is an amino group
  • linker-click chemistry is prepared using linker-click chemistry. Additional linkers suitable for use in some embodiments are described in "Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science” Ed. It can be prepared by click chemistry as described in Joerg Laham, Wiley 2009, which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • a compound represented by the following formula: (wherein Y is a nucleic acid molecule binding site) with an oligonucleotide having a terminal amine, A compound represented by the formula of Formula 14 was obtained. This is reacted with an azide-bearing ligand to (wherein X represents the ligand binding site and Y represents the nucleic acid molecule binding site) A linker represented by the above formula 15 was obtained.
  • a maleimide linker can be used as the linker.
  • the linker has a structure represented by Formula 16 below.
  • X is the ligand binding site and Y is the nucleic acid molecule binding site.
  • a compound represented by the following formula: (wherein Y is a nucleic acid molecule binding site) is reacted with an oligonucleotide having a terminal amine, A compound represented by the formula of Chemical Formula 19 was obtained. By reacting this with a ligand conjugate moiety having a maleimide, (In the formula, X is a ligand binding site and Y is a nucleic acid molecule binding site.) A linker represented by the above formula 20 was obtained.
  • a compound represented by the following formula: and a compound represented by the following formula: (wherein Y is a nucleic acid molecule binding site) is reacted with an oligonucleotide having a terminal amine, A compound represented by the formula of Chemical Formula 23 above was obtained. By reacting this with a thiol-bearing ligand conjugate moiety, (wherein X is the ligand binding site and Y is the nucleic acid molecule binding site) A linker represented by the above formula 24 was obtained.
  • linkers that contain disulfide bonds can be used.
  • the linker comprises an activated disulfide that forms a disulfide bond with the ligand binding moiety.
  • a compound represented by the following formula: and a compound represented by the following formula: (wherein Y is a nucleic acid molecule binding site) is reacted with an oligonucleotide having a terminal amine, A compound represented by the above formula 27 was obtained. By breaking the disulfide bond, A compound represented by the above formula 28 was obtained. By reacting this with a thiol-bearing ligand conjugate moiety, (wherein X is the ligand binding site and Y is the nucleic acid molecule binding site) A linker represented by the above formula 29 was obtained.
  • a linker is chemically attached to the PTH1 ligand. Via the linker, the PTH1 ligand is attached to a functional group for attachment to the oligonucleotide.
  • a compound represented by the following formula: (In the formula, Y is a functional group for direct or indirect attachment to oligos, such as azide, maleimide, etc.), (Wherein, X is the ligand binding site and Y is the nucleic acid molecule binding site)
  • a linker was obtained by introducing a linker into the ligand-binding portion represented by the formula of Chemical Formula 31 above.
  • the disease targeted by the ligand-binding nucleic acid complex of the present invention may be any disease associated with the target organ and the tissues and cells in the organ.
  • diseases include diabetes, metabolic syndrome, heart disease, muscular dystrophy, myotonic dystrophy, Becker muscular dystrophy, congenital muscular dystrophy, Duchenne muscular dystrophy, distal muscular dystrophy, Emery-Dreyfus muscular dystrophy, facioscapulohumeral.
  • muscular dystrophy muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, oculopharyngeal muscular dystrophy, chronic kidney disease (CKD), renal fibrosis, diabetic nephropathy, chronic glomerulonephritis, IgA nephropathy, lupus nephritis, primary glomerular disease, chronic obstructive
  • COPD lung disease
  • emphysema interstitial pneumonia
  • pulmonary fibrosis heart disease
  • muscle disease and the like.
  • a composition containing a ligand-binding nucleic acid complex in some embodiments can be formulated by known pharmaceutical methods. For example, capsules, tablets, pills, liquids, powders, granules, fine granules, film coating agents, pellets, lozenges, sublingual agents, chewing agents, buccal agents, pastes, syrups, suspensions, Enteral (oral, etc.) or It can be used enterally.
  • pharmacologically acceptable carriers specifically sterile water, physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, pH adjusters , stabilizers, flavoring agents, fragrances, excipients, vehicles, preservatives, binders, diluents, tonicity agents, soothing agents, bulking agents, disintegrants, buffers, coating agents, lubricants, Coloring agents, sweetening agents, thickening agents, flavoring agents, solubilizing agents, other additives, and the like can be appropriately combined.
  • the ligand-bound nucleic acid complex in the embodiment of enteral administration should be formulated with a substance that enhances the permeability of the colonic mucosal epithelium (e.g., medium-chain fatty acids, long Complexes (mixed micelles, emulsions) of chain unsaturated fatty acids or their derivatives (salts, esters or ethers)) and surfactants (nonionic surfactants, anionic surfactants) good too.
  • a substance that enhances the permeability of the colonic mucosal epithelium e.g., medium-chain fatty acids, long Complexes (mixed micelles, emulsions) of chain unsaturated fatty acids or their derivatives (salts, esters or ethers)
  • surfactants nonionic surfactants, anionic surfactants
  • Preferred modes of administration of a composition containing a ligand-binding nucleic acid complex in some embodiments are not particularly limited, and are enteral (oral, etc.) or parenteral, more specifically intravenous administration, Intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intrathecal administration, intratracheal administration, rectal administration and intramuscular administration, and administration by infusion.
  • a composition containing a ligand-binding nucleic acid complex in some embodiments can be used for animals including humans, but non-human animals are not particularly limited, and various livestock, poultry, pets, Experimental animals and the like can be used as subjects.
  • the dosage or intake depends on the subject's age, body weight, symptoms, health condition, type of composition (medicine, food and drink etc.), etc., but the effective intake of the composition according to an embodiment is preferably 0.001 mg/kg/day to 50 mg/kg/day in terms of nucleotides.
  • Example 1 Synthesis and purification of PTH1 ligand
  • the polypeptides listed in Table 1, which are PTH1 ligands of the present invention, are introduced into oligonucleic acids in the synthesis pattern shown in Table 4.
  • modification pattern A is, for example, L001-L009, L031-L040, L080-L098, etc. from the C-terminus of polypeptides such as the second amino acid Lysine side chain amino group substituted with PEG3-Azide group (K -PEG3-Azide), with the azide group of K-PEG3-Azide and a 5′-dibenzocyclooctyne-succinyl-hexylamino oligonucleic acid modified with a dibenzocyclooctyne-succinyl-hexylamino group at the 5′ end of the oligonucleotide Modification patterns by binding and attaching polypeptides such as L001-L009, L031-L040, L080-L098 to oligonucleotides.
  • polypeptides such as the second amino acid Lysine side chain amino group substituted with PEG3-Azide group (K -
  • modification pattern C is, for example, L021-L030, L051-L088, L109-L168, etc.
  • the side chain amino group of Lysine at the C-terminus of a polypeptide is substituted with a PEG3-Azide group (K-PEG3-Azide ), and the azide group of K-PEG3-Azide and a 5′-dibenzocyclooctyne-succinyl-hexylamino oligonucleic acid modified with a dibenzocyclooctyne-succinyl-hexylamino group at the 5′ end of the oligonucleotide are combined to form an oligo Modification patterns by binding polypeptides such as L021-L030, L051-L088, L109-L168 to nucleotides.
  • the linker structure when L001 and an oligonucleotide are bound is K-PEG3-Unit.
  • Unit refers to the linker portion on the oligo side of the linker structure.
  • the binding site the structure in which the azide and the DBCO structure react
  • the phosphate group located at the 5' end of the oligo side are the Units.
  • modification pattern B is, for example, L011-L020, L041-L050, L099-L108, etc. from the C-terminus of the cysteine thiol at the 2nd amino acid and 3 pyridyldithiopropionyl groups at the 5' end modified 5 '-3 Pyridyldithiopropionyl-hexylaminooligonucleotide is a modification pattern by binding with an SS bond and introducing it into an oligonucleotide.
  • the linker structure when L099 and an oligonucleotide are bound is CS-Unit).
  • Unit refers to the linker portion on the oligo side of the linker structure.
  • the binding site (SS bond) and the phosphate group located at the 5' end of the oligo are Units.
  • the solid-phase peptide synthesis method developed by Merrifield et al. can be used as a method for synthesizing the ligand linker LG001 for introducing the oligonucleic acid of L001.
  • the solid-phase peptide synthesis method developed by Merrifield et al. can be used.
  • Commonly available automated peptide synthesizers may be used.
  • synthesis of polypeptide L001 can be performed using an automated peptide synthesizer 430A (Applied Biosystems).
  • the purified polypeptide is obtained by subjecting the resulting peptide-containing resin to gel filtration.
  • PTH1 ligands used in the present invention can be prepared by a person skilled in the art by a similar method.
  • the peptides listed in Table 1 can be synthesized according to the following method.
  • suitable protecting groups such as Boc, Fmoc, benzyl, t-butyl groups
  • a reagent capable of selectively deprotecting the protecting group of the amino group of the main chain portion of the amino acid to the amino acid corresponding to the C-terminus, only the amino group of the main chain portion is selectively removed.
  • HATU (1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate is added in advance to the deprotected amino group of the main moiety.
  • L001 the polypeptide of SEQ ID NO: 1 in Table 1
  • Ligand linker LG001 for introducing L001 (polypeptide of SEQ ID NO: 1) described in Table 1 was obtained from Peptide Institute Inc. Purity was approximately 99% by HPLC. The molecular weight by mass spectrometry (ESI-MS) was 4188.8 (which was consistent with the calculated molecular weight of 4188.8). L002-L168 can also be synthesized by a similar method.
  • the nucleic acid complex of the present invention may have an antisense strand capable of hybridizing to a target gene or target transcript and exhibits an antisense effect.
  • Any possible complementary strand combination can be used. For example, it is possible to select from ASO, HDO, and siRNA consisting of the following sequences, and when targeting different diseases, since the target transcripts are different, an antisense strand having a nucleic acid sequence corresponding to each target can be used.
  • nucleic acid complex in which a PTH1 ligand is bound to ASO having an antisense strand and/or HDO and/or siRNA having a strand complementary to the antisense strand consisting of the following nucleic acid sequences in Table 5 can be used. .
  • lowercase letters represent DNA
  • underlined uppercase type represents LNA (C means LNA methylcytosine)
  • uppercase letters represent RNA
  • uppercase italic letters represent 2′-O-methyl sugar modifications
  • Lowercase italics represent morpholino nucleic acids
  • underlined lowercase italics represent 2'-fluoro-sugar modifications
  • asterisks represent phosphorothioate linkages.
  • Example 2 L001-HDO6 targeting mouse Malat1 (mMalat1) ncRNA was produced using the antisense strand (SEQ ID NO: 179), the complementary strand (SEQ ID NO: 180), and the PTH1 ligand L001.
  • Lower case letters represent DNA
  • underlined upper case type represents LNA (C stands for LNA methylcytosine)
  • upper case letters represent RNA
  • double underlined upper case letters represent 2′-O-methyl sugar modifications
  • asterisks Marks represent phosphorothioate linkages.
  • SEQ ID NO: 179 is an antisense strand consisting of 16 nucleic acids (16mer) targeting mMalat1 ncRNA, targeting mMalat1 ncRNA and composed of a sequence capable of hybridizing to the target site of mouse Malat1 ncRNA.
  • SEQ ID NO: 180 is a complementary strand consisting of 16 nucleic acids (16mer) having a sequence complementary to the antisense strand of SEQ ID NO: 179, and is composed of a sequence that can hybridize to the antisense strand of SEQ ID NO: 179. .
  • a ligand molecule can be bound to the 5' end of the complementary strand of SEQ ID NO: 180 by performing a conjugation reaction as follows.
  • each L002-L010, L021-L040, L051-L098, L0109-L168 ligand-conjugated ASOs, HDOs and siRNAs can be generated.
  • the antisense strand of SEQ ID NO: 179 (0.2 mM, 750 ⁇ L) and the complementary strand of SEQ ID NO: 180 (0.20 mM, 750 ⁇ L) bound to L001 were mixed, and L001-HDO6 (0. 1 mM, 1.5 mL).
  • L001-HDO6 is added to normal saline (Otsuka Saline Injection (Otsuka Pharmaceutical)), the solution is heated at 95° C. for 5 minutes, and the solution is slowly cooled to room temperature to form an annealed double-stranded complex. A double-stranded complex, L001-HDO6, was thereby generated.
  • a PTH1 ligand-binding HDO is prepared by the same method. is possible.
  • the Tm of HDO6 introduced with L001, L003, L005, L010, L021, L040, L089, L098, L098, L165 and L168 was as shown in Table 7 below.
  • the nucleic acid complex used in this example is L001-HDO6, a 16-mer HDO targeting mouse Malat1 ncRNA generated in Example 2 conjugated with L001 as a ligand.
  • the inventors prepared these oligos in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to 100 ⁇ M, and double-stranded HDO was denatured in a block bath (CDB-105, AS ONE) at 90° C. for 5 minutes, followed by natural cooling. Annealing operation was performed by returning to room temperature in (about 2 hours).
  • mice Since PTH1 receptor, PTH, and PTHrP have little species difference between humans and mice, c57BL/6J mice (25 mice, Charles River Japan, female, 4 weeks old upon arrival) were used as test subjects. The animals were housed in plastic cages in groups of 5 under an environment of room temperature (24 ⁇ 2°C), humidity (55 ⁇ 5%) and 12-hour lighting (8:00-20:00). (MF, Oriental Yeast Co., Ltd.) and acclimatized for one week.
  • room temperature 24 ⁇ 2°C
  • humidity 55 ⁇ 5%
  • 12-hour lighting 8:00-20:00
  • vehicle Saline, Otsuka Pharmaceutical
  • L001 complementary chain (1 ⁇ mol/kg) administration group
  • the L001 complementary strand (1 ⁇ mol/kg) administration group was used as a negative control.
  • hemostasis at the administration site was confirmed, and the animals were returned to their breeding cages. Necropsy was performed 3 days after administration (Day 3).
  • mice On the day of necropsy, the mice were weighed, and under anesthesia with isoflurane (3-5% induction, 1-3% maintenance), intracardiac blood collection (Thermosyringe SS-01P2525, containing anticoagulant heparin) was performed, and exsanguination. were euthanized by The abdomen was opened, and the liver and kidney were removed. The excised organs were immediately immersed in ISOGEN and subjected to mRNA extraction.
  • the blood sample was placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, centrifuged at 10,000 rpm/5 minutes, and the supernatant was frozen (-30°C) and stored for measurement of blood liver deviating enzymes Alanine aminotransferase (ALT) and Aspartate aminotransferase (AST). Using.
  • RNA disruption was performed using a biomasher, GentleMACS Dissociators (Miltenyi Biotec) or FastPrep-24 5G (MP Biomedicals).
  • Total RNA was extracted from the tissue homogenate using ReliaPrep TM RNA Tissue Miniprep System (Z6112, Promega).
  • cDNA was prepared from Total RNA by reverse transcription using PrimeScript TM RT Master Mix (TaKaRa, RR036A). The mRNA expression of each gene was measured with a real-time PCR system Step One Plus (Applied Biosystems).
  • TaqMan probe sets for mouse Malat1 Mm 01227912-s1, Thermo Fisher Scientific
  • 18S rRNA Mm 03928990-g1, Thermo Fisher Scientific
  • Blood ALT/AST activity was measured using a Test Wako ALT/AST measurement kit (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 431-3090) and an enzyme calibrator (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 416-57191). .
  • mice were administered through the tail vein at a dose of 10 ml/kg, but no behavioral changes were observed immediately after administration.
  • FIG. 2A shows changes in blood ALT activity three days after administration of mMalat1 oligo to mice.
  • FIG. 2B shows changes in blood AST activity 3 days after administration of mMalat1 oligo to mice.
  • ALT and AST activities of the mMalat1 oligo-administered group showed no significant change compared to the Vehicle-administered group.
  • Kidney Renal mMalat1 ncRNA expression was significantly decreased in the L001-HDO6 administration group compared to the vehicle administration group and the L001 complementary chain administration group (Fig. 4).
  • L001-HDO6 was administered intravenously to a subject, whereby L001-HDO6 was delivered to an organ in which the PTH1 receptor was expressed, such as the liver, resulting in the expression of the target transcript, mMalat1 ncRNA.
  • FIG. 5 shows fluorescence-labeled HDO used for histological examination by immunostaining image.
  • Annealing was performed by the method described in Example 2 for the fluorescence-labeled ASO in which Alexa488 was bound to the 5′ end of the antisense strand (SEQ ID NO: 179) prepared in Example 2 and the L001 complementary strand (SEQ ID NO: 180). , produced a fluorescently labeled HDO (L001-HDO6-Alexa488) by forming a double-stranded complex.
  • kidney glomeruli were treated with Nephrin (primary antibody Mouse Nephrin Affinity Purified Polyclonal Antibody, Goat IgG (R&D Systems: AF3459)), secondary antibody Alexa Flour 594 chicken anti-goat I gG(H+L) (A-21468, Invitrogen), and cell nuclei containing DNA were stained with DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) solution. Fluorescent images of pathological sections were taken with an Olympus VS120 Slide Scanning System.
  • Nephrin primary antibody Mouse Nephrin Affinity Purified Polyclonal Antibody, Goat IgG (R&D Systems: AF3459)
  • secondary antibody Alexa Flour 594 chicken anti-goat I gG(H+L) A-21468, Invitrogen
  • DAPI 4′,6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 6 shows that 1 ⁇ mol/kg of fluorescence-labeled HDO (L001-HDO6-Alexa488) was administered to c57BL/6J mice i.v. v. 10 minutes, 6 hours, 24 hours and 72 hours after administration of a single dose, immunohistochemical staining images of kidneys are shown.
  • Each post-dose time photograph consists of four photographs.
  • the upper left photograph is an ultraviolet (UV) fluorescence image showing the results of DAPI staining.
  • the lower left photograph is a red fluorescence image (red-Alexa594) showing the results of staining with an anti-Nephrin antibody.
  • the upper right photograph is a green fluorescence image showing the result of staining with L001-HDO6-Alexa488 (green-Alexa488).
  • the lower right photo is a merged image of the above three photos.
  • L001-HDO6 by intravenous administration of L001-HDO6 to a subject, L001-HDO6 was delivered to organs expressing PTH1 receptors, such as the liver, and remained in the renal tubules in the liver for 72 hours. The results showed that the
  • the nucleic acid complex used in this example is a 16-mer HDO or ASO targeting the mouse Malat1 ncRNA prepared in the example, to which a PTH1 ligand is attached.
  • the inventors prepared these oligos in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory), oligos for animal evaluation in block bath (CDB-105, AS ONE), and double-stranded HDO for cell evaluation. Denaturation was performed at 95° C. for 10 minutes in a T100 thermal cycler (Bio-Rad), followed by cooling (about 2 hours) and annealing to room temperature. Oligos for animal evaluation were final adjusted to 100 nmol/mL in physiological saline, and oligos for cell evaluation were prepared at various concentrations in DMEM (Invitrogen) with 0.1% FCS.
  • DMEM Invitrogen
  • mice C57BL/6J mice (Japan SLC, female, 4 weeks old at the time of arrival) were used. The animals were housed in plastic cages in groups of 5 under an environment of room temperature (24 ⁇ 2°C), humidity (55 ⁇ 5%), and 12-hour lighting (7:00-19:00). (MF, Oriental Yeast Co., Ltd.) and acclimatized for one week.
  • vehicle Saline, Otsuka Pharmaceutical Factory
  • PTH1 ligand-HDO 1 ⁇ mol/kg
  • the mice were restrained in a restraint device while awake, and the reagent was slowly administered (10 mL/kg, Day 0) through the tail vein or subcutaneously on the back of the neck. After administration, hemostasis at the administration site was confirmed, and the animals were returned to their breeding cages. Necropsy was performed 3 days after administration (Day 3).
  • ReliaPrep TM RNA Tissue Miniprep System (Promega) was used for extraction of total RNA from the tissue homogenate.
  • cDNA was prepared from Total RNA by reverse transcription using PrimeScript TM RT Master Mix (TaKaRa).
  • the mRNA expression of each gene was measured with a real-time PCR system Step One Plus (Applied Biosystems).
  • TaqMan probe sets for mouse Malat1 (Mm 01227912-s1, Applied Biosystems), mouse Gapdh (Mm99999915_g1, Applied Biosystems) mRNA were used.
  • L001 is a peptide consisting of 34 amino acid residues
  • L003 is a peptide consisting of 32 amino acid residues lacking 2 amino acid residues from the N-terminus of L001
  • L005 lacks 4 amino acid residues from the N-terminus of L001. It is a peptide consisting of 30 amino acid residues
  • L010 is a peptide consisting of 25 amino acid residues lacking 9 amino acid residues from the N-terminus of L001.
  • HDO bound with a peptide consisting of 34 amino acid residues of L001 inhibited the expression of the target gene. Furthermore, HDO bound to peptides consisting of 32, 30, and 25 amino acid residues in which 2, 4, and 9 amino acid residues were deleted from the N-terminal side of the peptide consisting of 34 amino acid residues, respectively, also inhibited the expression of target genes. The results showed that peptides lacking at least 9 amino acid residues from the N-terminal side of the peptide had an antisense effect.
  • L031 is a peptide consisting of 35 amino acid residues
  • L021 is a peptide consisting of 34 amino acid residues. The difference in the amino acid sequences of these peptides was the presence or absence of T on the C-terminal side or the difference in the position of K (Lys), but both peptides significantly inhibited the expression of the target gene.
  • mPth1R mouse Pth1R
  • the clone cell line stably expressing mPth1R used to evaluate the action of the PTH1 ligand is a cell line that has a cAMP-inducing ability with an IC50 of approximately 100 pM at 33K agonist activity.
  • mPth1R stably expressing cell line was seeded in a 96-well plate at 1.5 ⁇ 10 4 cells/well. Twenty-four hours after seeding, the medium in each well was removed by aspiration, and 100 ⁇ L of PTH1 ligand-HDO prepared in DMEM containing 0.1% FBS at various concentrations was added to each well. Total RNA was extracted from the cells according to the protocol of RNA purification kit of SV 96 Total RNA Isolation System (Promega). That is, 24 hours after the addition of PTH1 ligand-HDO, the medium in each well was removed by aspiration, and then each well was washed with PBS.
  • RNA Lysis Buffer attached to the RNA Purification Kit was added to each well to lyse the cells.
  • total RNA was obtained according to the SV 96 Total RNA Isolation System (Promega).
  • PrimeScript TM RT Master Mix (TaKaRa) was used for reverse transcription from Total RNA to cDNA.
  • the mRNA expression of each gene was measured using the real-time PCR system Step One Plus (Applied Biosystems). Malat1 (Mm 01227912-s1, Applied Biosystems) was used for target gene analysis, and a TaqMan probe of Gapdh (Mm99999915_g1, Applied Biosystems) was used as an internal standard gene.
  • L001-ASO L001-ASO which is an ASO bound to the PTH1 ligand L001, decreased Malat1 ncRNA expression in a concentration-dependent manner, with an IC50 of 1.25 nM (FIG. 14).
  • the results showed that ASO bound to the PTH1 ligand consisting of the peptide of SEQ ID NO: 1 had a concentration-dependent antisense effect on the target gene.
  • the PTH1 ligands of the present invention bound to single-stranded nucleic acid molecules and exhibited concentration-dependent antisense effects on target genes.
  • the nucleic acid complex of the present invention may have an antisense strand capable of hybridizing to a target gene or target transcript and exhibits an antisense effect.
  • Any possible complementary strand combination can be used.
  • siRNA consisting of the following sequences, and when targeting different diseases, since the target transcripts are different, a nucleic acid molecule having an antisense strand with a nucleic acid sequence corresponding to each target can be used.
  • the nucleic acid complex can use siRNA consisting of the following antisense strand (SEQ ID NO: 181) and guide strand (SEQ ID NO: 182).
  • uppercase italics represent 2'-O-methyl sugar modifications
  • underlined lowercase italics represent 2'-fluoro-sugar modifications
  • asterisks represent phosphorothioate linkages.
  • SEQ ID NO: 181 is an antisense strand consisting of 23 nucleic acids (23mer) targeting mGapdh mRNA, which is composed of a sequence capable of hybridizing to the target site of mouse Gapdh mRNA.
  • SEQ ID NO: 182 is a complementary strand consisting of 23 nucleic acids (21mer) having a sequence complementary to the antisense strand of SEQ ID NO: 181, and is composed of a sequence that can hybridize to the antisense strand of SEQ ID NO: 181. .
  • a ligand molecule can be bound to the 5' end of the complementary strand of SEQ ID NO: 182 by performing a conjugation reaction in the same manner as HDO.
  • the PTH1 ligand-binding nucleic acid complex used in this example is L010-siRNA obtained by binding the PTH1 ligand L010 according to the method of Example 2 to the 23-mer siRNA targeting mouse Gapdh mRNA described above.
  • the inventors prepared these oligos in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), and denatured the siRNAs for cell evaluation in a T100 thermal cycler (Bio-Rad) at 95°C for 10 minutes, followed by cooling ( about 2 hours), and an annealing operation was performed to return to room temperature. Oligos for animal evaluation were finally adjusted to 100 nmol/mL in physiological saline, and oligos for cell evaluation were prepared at various concentrations using Opti-MEM (Invitrogen).
  • a cell line was used in which mouse Pth1R (mPth1R) was stably expressed in the NIH/3T3 cell line by the PiggyBac transposon method.
  • mPth1R stably expressing cell line was seeded in a 96-well plate at 3.75 ⁇ 10 3 cells/well. Four hours after seeding, the medium in each well was removed by aspiration, and 100 ⁇ L of L010-siRNA of various concentrations prepared in Opti-MEM was added to each well. Total RNA was extracted from the cells according to the protocol of RNA purification kit of SV96 Total RNA Isolation System (Promega). That is, 72 hours after addition of L010-siRNA, the medium in each well was removed by aspiration, and then each well was washed with PBS.
  • RNA Lysis Buffer attached to the RNA Purification Kit was added to each well to lyse the cells.
  • total RNA was obtained according to the SV96 Total RNA Isolation System.
  • PrimeScript RT Mster Mix (TaKaRa) was used for reverse transcription from Total RNA to cDNA.
  • Fig. 15 shows the test results. 10 ⁇ M of siRNA bound to PTH1 ligand L010 reduced mGapdh mRNA expression by 14% compared to the control (0 ⁇ M) administration group.
  • the PTH1 ligand of the present invention exhibited an antisense effect against the target gene even when bound to siRNA.
  • the ligand-binding nucleic acid complex of the present invention can be used for nucleic acid drugs that are delivered to organs having PTH1 receptors and regulate the expression or editing of target genes or their transcripts.

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Abstract

目的とする臓器にデリバリーされ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節するためのＰＴＨ１リガンド結合核酸複合体の提供。　標的転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有し１２～３０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む核酸と、ＰＴＨ１リガンドを結合した構造のＰＴＨ１リガンド結合核酸複合体は、臓器にデリバリーされ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節することにより当該遺伝子が原因する疾患の治療に有用である。また、当該リガンド結合核酸複合体は、ＰＴＨ１受容体が発現している臓器、組織や細胞、例えば、腎臓、骨、皮下脂肪などの組織、及び血管内皮細胞などの細胞にデリバリー可能であるからこれらの臓器の疾患の治療に有用である。

Description

リガンド結合核酸複合体
　本発明は、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸複合体に関し、より詳しくは、標的臓器や細胞等にデリバリー可能なリガンドを核酸複合体に結合したリガンド結合核酸複合体に関する。
　核酸医薬は従来の低分子医薬と異なり疾患の原因となる遺伝子の転写産物の配列自体に作用して転写産物やタンパク質の発現を調節することから、次世代医薬として開発が進められている。
　核酸医薬として使用されている核酸としては、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介できる短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、アンチセンス技術を用いる一本鎖アンチセンス核酸（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）やアンチセンス二本鎖核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＤＯ）やＤＮＡのアンチセンス鎖とＲＮＡの相補鎖とからなるヘテロ二本鎖核酸（ｈｅｔｅｒｏ－ｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＨＤＯ）、一本鎖ヘテロ二本鎖核酸（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｓｓ－ＨＤＯ）等の化学修飾した低分子核酸等が従来から知られている。
　ＨＤＯは、標的遺伝子又は標的転写産物にハイブリダイズ可能な核酸配列を有するアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖である相補鎖（センス鎖ともいう）からなり、アンチセンス鎖が相補鎖にアニーリングしている構造体はヘテロ二本鎖核酸（ｈｅｔｅｒｏ－ｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＨＤＯ）と言われている（特許文献１）。
　ｓｓ－ＨＤＯは、製造時は一本鎖のオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡヌクレオチド若しくはＤＮＡヌクレオチドアナログからなるアンチセンス鎖と、３～１０ヌクレオチドからなるリンカー部分と、前記アンチセンス鎖に相補的であるＲＮＡヌクレオチド若しくはＲＮＡヌクレオチドアナログからなるセンス鎖を含む構造である。この一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｘ－Ｌ－Ｙの構造からなるオリゴヌクレオチドである（特許文献２）。Ｘはアンチセンス鎖で、Ｙはアンチセンス鎖に対する相補鎖で、Ｌがリンカーの役割をするヌクレオチドからなる。この一本鎖オリゴヌクレオチドを医薬組成物として用いる際は、生理食塩水や水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、固形注射剤等に用いられる溶媒若しくは血液または血漿中でアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に対する相補鎖がリンカーを支点として一分子アニーリングして２重鎖構造をとる。このような核酸複合体は、医薬組成物として作用するときは一分子アニーリングして２重鎖構造をとるため、この一本鎖オリゴヌクレオチドはＨＤＯの一つである。
　一方、核酸複合体を目的の臓器にデリバリーする技術は、核酸複合体に目的の臓器にデリバリー可能なリガンド等を付加するものが知られている。リガンド等としては、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子がある。脂質は、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択することができる。また、リガンド等として標的細胞の表面に表出している受容体に対するリガンドも選択可能である（特許文献１）。
　例えばリガンド等としてコレステロールを用いる場合、細胞表面のＬＤＬ受容体を介して細胞内に取り込まれるから、ＬＤＬ受容体を持つ細胞を含む臓器として特に肝臓にデリバリー可能である。しかしながら、ＬＤＬ受容体を持つ細胞は肝臓以外の臓器にも多数存在するため、肝臓以外の臓器を標的とする場合、他の臓器にもデリバリーされてしまうため、他の臓器における安全性や副作用の検討が必要である。
　核酸医薬として用いるリガンド結合核酸複合体は、臓器へのデリバリーに加えて、臓器組織若しくは臓器中の細胞にリガンド結合核酸複合体が取り込まれてアンチセンス効果を奏することが求められる。リガンドよりも分子量の大きな核酸分子を結合した場合、リガンド結合核酸複合体が細胞内に取り込まれるかどうか予測することは困難であることからそのハードルは高い。未だに各臓器へデリバリー可能なリガンド結合核酸複合体が十分に提供されている状況にない。現在、バイオベンチャーや製薬企業によりより特異的に目的臓器へデリバリー可能なリガンドの研究開発は継続的に行われている。
　ＰＴＨ受容体は、全身に幅広く分布しているが、腎臓と骨に多く発現しており、現在までに１～３型が同定されている。ＰＴＨ１受容体はＧ蛋白共役型受容体である。ＰＴＨ１受容体に対する生体内リガンドとしては、副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ，ＰＴＨ）と、副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）が知られている。
　ＰＴＨは、副甲状腺より分泌されるホルモンであり、８４個のアミノ酸からなるペプチドホルモンであるが、血中カルシウムレベルを調節する作用に関与していて、その大部分は腎臓のＰＴＨ１受容体を介する系で行われている。ＰＴＨｒＰは、ＰＴＨとＮ―末端相同性のある１３９～１７３アミノ酸タンパク質であるが、ＰＴＨｒＰのＮ端はＰＴＨと高い相同性を有し、いずれも共通のＰＴＨ受容体に結合し、作用を発揮する。ＰＴＨｒＰはあらゆる臓器の様々な細胞より、時に応じて分泌され、生理的には主にパラクライン・オートクライン的に作用している。ＰＴＨの生物学的活性は、アミノ酸順序１－３４のＮ末端フラグメント、即ちｈＰＴＨ（１－３４）によって再現されうる（特許文献３）。ＰＴＨ（１―３４）及びＰＴＨｒＰ（１－３４）は２個の親和性の（ａｍｐｈｏｐｉｌｉｃ）アルファ螺旋ドメインを有することが知られている。ＰＴＨ（１－３４）及びＰＴＨｒＰ（１－３４）の生物学的活性としては、骨芽細胞前駆細胞や前骨芽細胞の分化を促進し、骨芽細胞のアポトーシスを抑制することにより、骨芽細胞の数を増加させ、骨形成を促進する作用が知られている。
　しかしながら、ＰＴＨ１受容体に対するリガンド（以下、ＰＴＨ１リガンドという）を標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子に結合させ、臓器や組織、細胞にデリバリーさせる目的でＰＴＨ１リガンドを用いて組織中や細胞内に標的遺伝子又はその転写産物に対するアンチセンス鎖を含む核酸分子を取り込ませ、核酸分子で標的遺伝子又はその転写産物若しくはその翻訳産物の発現又は編集を調節する試みは行われていなかった。
国際公開第ＷＯ２０１３／０８９２８３号 国際公開第ＷＯ２０１７／１３１１２４号 特公昭６２－２８７９９号公報
　ＰＴＨ１受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ、Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の一つであり、７本の膜貫通ヘリックスを持っている。ＰＴＨ１受容体は、全身に幅広く分布しているが、臓器・組織では、腎臓、骨、皮下脂肪など及び細胞では血管内皮細胞などに高発現している傾向がある。ヒトやマウスの臓器の中では、特に腎臓で高発現している。
　本発明が解決しようとする課題は、ＰＴＨ１受容体を介して、ＰＴＨ１受容体が発現している被験体の臓器に、リガンド結合核酸複合体をデリバリーして標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節することである。また、被験体への身体的な負担が少ない投与方法である静脈投与若しくは皮下投与でＰＴＨ１受容体を介して、ＰＴＨ１受容体が発現している被験体の臓器にデリバリー可能であり、かつ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節することが可能なリガンド結合核酸複合体を見出し完成させることである。
　発明者らは、ヒトやマウスなどの被験体の腎臓、骨の各組織に発現しているＰＴＨ１受容体に対するリガンドを付加した核酸複合体が、ＰＴＨ１受容体を発現している臓器にデリバリーされ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節することを確認し発明を完成させた。
　発明者らは、ＰＴＨ１受容体に対するリガンドについて研究を進めた結果、本発明のＰＴＨ１リガンド結合核酸複合体が標的臓器にデリバリーされ、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節することを見出した。本発明のリガンド結合核酸複合体は、ＰＴＨ１受容体が発現している細胞を含む臓器の疾患の治療に用いることが可能である。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、ＰＴＨ１リガンドが、リンカーを介して、又は介さず結合するリガンド結合核酸複合体。
［２］　ＰＴＨ１リガンドが、下記式で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］のリガンド結合核酸複合体:
［化１］
Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－Ａ１９－Ａ２０－Ａ２１－Ａ２２－Ａ２３－Ａ２４－Ａ２５－Ａ２６－Ａ２７－Ａ２８－Ａ２９－Ａ３０－Ａ３１－Ａ３２－Ａ３３－Ａ３４
[式中、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向かって記述したものである。
式中、
Ａ１はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｄａｐまたは欠損しており；
Ａ２はＶａｌまたは欠損しており；
Ａ３はＳｅｒ，Ｔｈｒ、Ａｉｂまたは欠損しており；
Ａ４はＧｌｕまたは欠損しており；
Ａ５はＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
ｐ－Ｘ－Ｐｈｅまたは欠損しており、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ６はＧｌｎ；
Ａ７はＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅｐ－Ｘ－Ｐｈｅまたは欠損しており、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ８はＭｅｔ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ａｃｃ、Ｎｌｅまたは欠損しており；
Ａ９はＨｉｓまたは欠損しており；
Ａ１０はＡｓｐまたはＡｓｎであり；
Ａ１１はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
またはｐ－Ｘ－Ｐｈｅであり、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ１２はＧｌｙ、Ａｃｃ、またはＡｉｂであり；
Ａ１３はＬｙｓ；
Ａ１４はＳｅｒまたはＨｉｓであり；
Ａ１５はＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
またはＰ－Ｘ－Ｐｈｅであり、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ１６はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡｉｂであり；
Ａ１７はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、またはＡｉｂであり；
Ａ１８はＭｅｔ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ａｃｃ、Ｃｈａ、またはＡｉｂであり；
Ａ１９はＡｒｇ、ＧｌｕまたはＡｉｂであり；
Ａ２０はＡｒｇ；
Ａ２１はＡｒｇ、Ｖａｌ、Ａｃｃ、Ｃｈａ、またはＭｅｔであり；
Ａ２２はＰｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２３はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２４はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２５はＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＧｌｕであり；
Ａ２６はＨｉｓ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＬｙｓであり；
Ａ２７はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、ｈＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２８はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２９はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｃｃ、またはＡｉｂであり；
Ａ３０はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｃｈａ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＬｙｓであり；
Ａ３１はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｃｈａ、Ｌｙｓ若しくはＡｃｃであり；
Ａ３２はＨｉｓであり；
Ａ３３はＴｈｒ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＣｙｓであり；
Ａ３４はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、ＡｍｐまたはＡｉｂである]。
［３］　ＰＴＨ１リガンドが、配列番号１～配列番号１６８からなる群から選択されるいずれか一つの配列からなるペプチドである、［１］のリガンド結合核酸複合体。
［４］　ＰＴＨ１リガンドが、配列番号１～配列番号１６４からなる群から選択されるいずれか一つの配列からなるペプチドである、［２］のリガンド結合核酸複合体。
［５］　核酸分子と、ＰＴＨ１リガンドが、リンカーを介して結合している、［４］のリガンド結合核酸複合体。
［６］　リンカーが、切断可能な構造を有する切断性リンカーである、［５］のリガンド結合核酸複合体。
［７］　リンカーが、以下の構造を有するリンカーのいずれかである、［５］のリガンド結合核酸複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［８］　核酸分子が、標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸分子、標的タンパク質に対して特異的に結合する核酸塩基配列を有するアプタマー及び標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなるデコイからなる群から選択される核酸分子である、［１］のリガンド結合核酸複合体。
［９］　核酸分子がＡＤＯ、ＡＳＯ、ＨＤＯ、ＲＮＡｉから選択される核酸分子である、［１］のリガンド結合核酸複合体。
［１０］　核酸分子のアンチセンス鎖が連続する１２～３０のヌクレオチドからなる、［９］のリガンド結合核酸複合体。
［１１］　核酸分子が標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有し８～３０のヌクレオチドからなるデコイである、［８］のリガンド結合核酸複合体。
［１２］　前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡからなるアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるｓｉＲＮＡである、［９］のリガンド結合核酸複合体。
［１３］　核酸分子の核酸鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、［９］のリガンド結合核酸複合体。
［１４］　核酸分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、１２～３０ヌクレオチドからなる、［１３］のリガンド結合核酸複合体。
［１５］　核酸分子がＨＤＯであり、ＨＤＯのアンチセンス鎖及び相補鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、それぞれ１２～３０ヌクレオチドからなる、［１３］のリガンド結合核酸複合体。
［１６］　アンチセンス鎖は、ギャップマーであり、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むギャップ領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を含む、［１５］のリガンド結合核酸複合体。
［１７］　アンチセンス鎖は、非ギャップマーであり、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、［１５］のリガンド結合核酸複合体。
［１８］　相補鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、［１７］のリガンド結合核酸複合体。
［１９］　相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を含む、［１６］のリガンド結合核酸複合体。
［２０］　修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－ＣＨ３基又は２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）基を含むヌクレオチドである、［１３］のリガンド結合核酸複合体。
［２１］　ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ－ＢＮＡからなる群から独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む、［１３］のリガンド結合核酸複合体。
［２２］　ヌクレオチドアナログは、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ｃＥｔ、ｔｃＤＮＡ、モルホリノ核酸及びＢＮＡ、Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　（ＧｕＮＡ）及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ｓｃｐＢＮＡ）からなる群から独立して選択される、［１３］に記載のリガンド結合核酸複合体。
［２３］　核酸分子における少なくとも１つのヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチドがホスホロチオエート化若しくはボラノホスフェート化されている、［１３］のリガンド結合核酸複合体。
［２４］ＰＴＨ１受容体を発現する被験体の臓器において標的転写産物の発現量を減少させるためのアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖を被験体の臓器にデリバリーするためのＰＴＨ１リガンドを有するリガンド結合核酸複合体であって、該アンチセンス鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有する、リガンド結合核酸複合体。
［２５］核酸複合体が第１核酸鎖と第２核酸鎖とからなる二本鎖核酸剤であり、該第１核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、該第２核酸鎖は、該第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、ＰＴＨ１リガンドと結合しており、該第１核酸鎖は、該第２核酸鎖にアニールしている、［２４］のリガンド結合核酸複合体。
［２６］静脈内投与用のリガンド結合核酸複合体である、［２５］のリガンド結合核酸複合体。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-179771号の開示内容を包含する。
　本発明のリガンド結合核酸複合体は、ＰＴＨ１受容体が発現している細胞を含む臓器の疾患の治療に用いることが可能である。
　本発明のリガンド結合核酸複合体は、ＰＴＨ１リガンドにより臓器若しくは細胞特異的なデリバリーができ、核酸分子により標的遺伝子又はその転写産物若しくはその翻訳産物の発現又は編集を調節することができる。疾患の原因となる遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物を標的とする核酸複合体を用いることで特定の臓器の疾患の治療薬として用いることが可能である。臓器の中で最もＰＴＨ１受容体が発現している腎臓にデリバリーされ易いため、ＰＴＨ１リガンド結合核酸複合体は、腎臓疾患の治療薬として用いることが可能である。
図１は、Ｌ００１－ＨＤＯ６投与前後の動物の体重変化を示す図である。 図２Ａは、マウスにＬ００１－ＨＤＯ６を投与３日後、血中ＡＬＴ活性の変化を示す図である。 図２Ｂは、マウスにＬ００１－ＨＤＯ６を投与３日後、血中ＡＳＴ活性の変化を示す図である。 図３はＬ００１－ＨＤＯ６を投与後のマウスの肝臓のｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図４はＬ００１－ＨＤＯ６を投与後のマウスの腎臓のｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図５は腎臓分布試験に使用した蛍光標識ＡＳＯ、ＨＤＯの模式図である。 図６はＬ００１－ＨＤＯ６－Ａｌｅｘａ４８８をマウスに静脈単回投与し、１０分、６時間、２４時間および７２時間経過後の腎臓の免疫染色像である。 図７はＨＤＯ、Ｌ００１－ＨＤＯ６、Ｌ００３－ＨＤＯ６、Ｌ００５－ＨＤＯ６及びＬ０１０－ＨＤＯ６を静脈投与後のマウスの腎臓のｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図８はＬ０３１－ＨＤＯ６及びＬ０２１－ＨＤＯ６を皮下投与後のマウスの腎臓のｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図９はｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによりＬ０２１－ＨＤＯ６、Ｌ００３－ＨＤＯ６、Ｌ００５－ＨＤＯ６及びＬ０１０－ＨＤＯ６によるｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１０はｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによりＬ０２１－ＨＤＯ６及びＬ０１１－ＨＤＯ６によるｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１１はｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによりＬ０３１－ＨＤＯ６及びＬ０４０－ＨＤＯ６によるｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１２はｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによりＬ０８９－ＨＤＯ６及びＬ０９８－ＨＤＯ６によるｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１３はｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによりＬ１６５－ＨＤＯ６及びＬ１６８－ＨＤＯ６によるｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１４はｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによりＬ００１－ＡＳＯによるｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現量の変化を示す図である。 図１５はｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによりＬ０１０－ｓｉＲＮＡによるＧａｐｄｈ　ｍＲＮＡ発現量の変化を示す図である。
　本発明は、リガンドを核酸複合体に結合したリガンド結合核酸複合体であり、リガンドと核酸複合体はリンカーを介して間接的に、又はリンカーを介さず直接結合している。
１．核酸複合体
　本発明において「核酸複合体」とは、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子のことである。当該核酸分子の例としては、標的遺伝子又はその転写産物に相補的な核酸配列を有しアンチセンス活性を有する核酸分子が挙げられる。当該核酸分子は、より具体的には、一本鎖アンチセンス鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）、ｍｉＲＮＡ，ａｎｔｉ－ｍｉＲ，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス二本鎖核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＤＯ）、ヘテロ二本鎖核酸（Ｈｅｔｅｒｏ－ｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＨＤＯ）が挙げられる。
　さらに当該核酸分子の例としては、タンパク質などの標的分子に対して高い特異性と高い結合親和性を有するアプタマーが挙げられる。さらに当該核酸分子の例としてはデコイが挙げられる。デコイの作用は、遺伝子の特定のプロモーターなど転写調節因子の結合部位に転写因子が結合して本来であれば転写調節因子によって遺伝子が活性化されたり、遺伝子機能のオン、オフが調節されるところ、デコイが当該転写因子にハイブリダイズすることで本来の転写因子の機能を抑制することである。さらに当該核酸分子の例としては、細胞内で特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子であって標的分子の機能を修飾するものであるベイト（ｂａｉｔ）が挙げられる。
　「標的遺伝子」とは、本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖が結合しうる遺伝子である。
　標的遺伝子の種類は、生体内で発現する限り特に限定されない。標的遺伝子は、例えば、本発明に係る核酸複合体を導入する生物由来の遺伝子、例えば、様々な疾患において、その発現が増加する遺伝子が挙げられる。例えば、インディアンヘッジホッグ遺伝子、インターフェロン遺伝子、アポリポプロテインＢ遺伝子、ハンチントン遺伝子、ジストロフィン遺伝子、ＤＭＰＫ（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ　ｍｙｏｔｏｎｉｃａ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）遺伝子等が挙げられる。
　インディアンヘッジホッグ（Ｉｎｄｉａｎ　Ｈｅｄｇｅｈｏｇ：ＩＨＨ）は、ヘッジホッグファミリーに属する分泌タンパクである。転写因子ＴＡＺの下流に位置し、ＮＡＳＨ線維化を増悪させることが知られている。
　サイトカインのインターロイキン１遺伝子（ＩＬ―１）は、慢性炎症疾患の原因となることが知られている。治療戦略としてｐｒｅ－メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるＩＬ－１ＲＡｃＰの膜貫通ドメインをコードするｅｘｏｎ９をスキップすることによって、ＩＬ－１シグナル伝達の実質的な阻害をもたらすことが報告されている（Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．２０１３　Ｊａｎ２２（１）：ｅ６６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１２．５８．）。
　アポリポプロテインＢ遺伝子は、ＡｐｏＢ－１００が遺伝性代謝性疾患である家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｌ　ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）は知られており、２０１３年に米国で核酸医薬ミポメルセン（ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎ）が上市された。
　ハンチントン病は、常染色体優性遺伝様式をとり、舞踏病運動を主体とする不随意運動と精神症状、認知症を主症状とする慢性進行性神経変性疾患である。ハンチントン遺伝子の第４染色体短腕４ｐ１６．３がハンチントン病の病因遺伝子であることが知られている。
　デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異による筋ジストロフィー、Ｘ連鎖劣性遺伝形式をとり原則男児に発症することが知られている。ジストロフィン遺伝子の異常のあるエクソンを読み飛ばすエクソンスキッピングが、その治療に有効である。
　ＤＭＰＫ遺伝子は、ミオトニンプロテインキナーゼをコードし、筋ジストロフィーの中でも成人で発症頻度が最も高い筋緊張性ジストロフィーの原因遺伝子として知られている。
　ＣＯＬ４Ａ３，ＣＯＬ４Ａ４，ＣＯＬ４Ａ５遺伝子は、基底膜を構成する４型コラーゲンのα３鎖，α４鎖またはα５鎖をコードしている遺伝子であり、ＣＯＬ４Ａ３，ＣＯＬ４Ａ４，ＣＯＬ４Ａ５遺伝子のいずれかに異常がある場合、アルポート症候群を発症する。アルポート症候群は、腎障害に加えて、難聴、眼合併症を呈する症候群であり、しばしば末期腎不全へと進行することが知られている。
　「標的転写産物」とは、本発明の核酸複合体の直接的な標的となり、かつＲＮＡポリメラーゼによって合成される任意のＲＮＡをいう。また、「標的遺伝子の転写産物」は「標的転写産物」に該当する。具体的には、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、塩基修飾を受けていないｍＲＮＡ等を含む）、ｍｉＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ）、ロングノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ナチュラルアンチセンスＲＮＡを含む。標的転写産物として、例えば、ＩＬ－１ＲＡｃＰ遺伝子の転写産物であるｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ＡｐｏＢ－１００遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ、ＩＨＨ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ、ジストロフィン遺伝子の転写産物であるｐｒｅ－ｍＲＮＡ、ＤＭＰＫ遺伝子の転写産物であるＤＭＰＫ　ｍＲＮＡ、転移関連肺腺癌転写産物１（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｕｎｇ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　１：Ｍａｌａｔ１）ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）等が挙げられる。
　Ｍａｌａｔ１は、肺癌をはじめとする悪性腫瘍で高発現している長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）で、筋細胞の核内に滞留することが知られている。
　「標的翻訳産物」とは、転写産物であるｍＲＮＡのうち、ノンコーディングＲＮＡを除くｍＲＮＡを鋳型として、リボソームがコドンに応じて伝令ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＲＮＡ）が運んでくるアミノ酸を連結させペプチド鎖を作る反応を触媒することにより合成されるタンパク質をいう。また、「標的遺伝子の翻訳産物」及び「標的転写産物の翻訳産物」は「標的翻訳産物」に該当する。
　「アプタマー」とは、標的翻訳産物、例えば細胞内、細胞膜上、又は細胞外、例えば細胞膜上又は細胞外の特定の標的分子と特異的に結合する核酸分子をいう。アプタマーは、ＤＮＡ型とＲＮＡ型のアプタマーがあり、当該分野で公知の方法、例えば、ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いた試験管内選別法により作製することができる。アプタマーの核酸塩基長は、特に制限は無いが、１０～７０塩基長、好ましくは２０～５０塩基長である。
　「デコイ」とは、転写因子（例えばＮＦ－ｋＢ）の結合部位の配列又は類似の配列を有する核酸を指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制（転写活性化因子であれば転写を抑制、転写抑制因子であれば転写を促進）するものをいう。デコイ核酸は、標的となる転写因子の結合配列の情報に基づいて容易に設計することができる。デコイ核酸の塩基長は、特に制限は無いが、８～３０塩基長、好ましくは１０～２５塩基長である。
　「核酸」又は「核酸分子」とは、モノマーであればヌクレオシド又はヌクレオチドを、オリゴマーであればオリゴヌクレオチドを、またポリマーであればポリヌクレオチドを意味する。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラ―ゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。
　「ヌクレオシド」とは、一般に塩基及び糖の組み合わせからなる分子をいう。ヌクレオシドの糖部分は、限定はしないが、通常、ペントフラノシル糖で構成され、その具体例としてリボースやデオキシリボースが挙げられる。ヌクレオシドの塩基部分（核酸塩基）は、通常は、複素環式塩基部分である。限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシルや、それ以外の修飾核酸塩基（修飾塩基）が挙げられる。
　「ヌクレオチド」とは、前記ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合した分子をいう。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドの場合、通常、糖の２’位、３’位、又は５’位のヒドロキシル基にリン酸基が連結されている。
　「オリゴヌクレオチド」とは、隣接するヌクレオチド間で糖部分のヒドロキシル基とリン酸基が共有結合によって数個～数十個連結することによって形成される直鎖状のオリゴマーをいう。また「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドよりも多数のヌクレオチドが前記共有結合によって数十個以上、好ましくは数百個以上連結することによって形成されるポリマーをいう。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般にヌクレオシド間結合を形成するとみなされる。
　「アンチセンス技術」とは、アンチセンス鎖を持つ核酸分子を用いて標的核酸の量、活性及び／または機能を調節する技術をいう。アンチセンス鎖を利用したアンチセンス技術の原理は、アンチセンス鎖を持つ核酸分子が標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の量、活性及び／または機能を調節することである。例えば、ある場合には、アンチセンス鎖を持つ核酸分子は、標的の転写または翻訳に変化をもたらす。このような発現の調節は、例えば、標的ｍＲＮＡの分解または占有に基づく（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ－ｂａｓｅｄ）阻害によって達成することができる。分解によるＲＮＡ標的機能の調節の一例は、ＤＮＡ様アンチセンス鎖を持つ核酸分子とのハイブリダイゼーションの際における標的ＲＮＡのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解である。標的ＲＮＡとハイブリダイズ可能に構成したＤＮＡからなるアンチセンス鎖（ＡＳＯ）は、標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、ＲＮａｓｅにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより細胞内で標的ＲＮＡを減少することにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。このアンチセンス効果は、ＲＮａｓｅ依存的アンチセンス効果という。また、アンチセンス鎖を持つ核酸分子は、ＲＮａｓｅ非依存的アンチセンス効果としては、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果を用いる場合がある。この場合、ＡＳＯが標的ＲＮＡにハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。また、ＲＮａｓｅ非依存的アンチセンス効果の別の態様としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が挙げられる。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ；ＲＩＳＣ）を利用するアンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングである。ＲＮＡｉの例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。このアンチセンス効果は、ＲＮＡｉ依存的アンチセンス効果ともいう。
　「アンチセンス効果」とは、核酸分子のアンチセンス鎖が、標的遺伝子又はその転写産物（ＲＮＡセンス鎖）にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子又はその転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。
　「標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する」とは、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、亢進、翻訳の阻害、翻訳産物の機能阻害、ＲＮＡスプライシング制御（例えばスプライシングスイッチ、エクソンインクルージョン、エクソンスキッピング等）、転写産物の分解、又は標的遺伝子のタンパク質への結合の阻害を意味する。
　ある実施態様では、アンチセンス効果はハイブリダイゼーションにより前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、及び／又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解によって生じる、前記抑制を意味する。また別の実施態様では、アンチセンス効果は、標的遺伝子又は転写産物のエクソンインクルージョンにおいて、エクソンスキッピングとは逆に遺伝子の異常によりｍＲＮＡから排除されてしまうエクソンをアンチセンスの作用によりｍＲＮＡに組み込むことによって生じる、正常なｍＲＮＡの発現の亢進を意味する。
　例えば、標的遺伝子の転写後阻害では、ＡＳＯとしてＲＮＡオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、ＡＳＯは標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡとアニーリングによって部分的二本鎖を形成する。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされた標的タンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（ステリックブロッキング）。一方、ＡＳＯとしてＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、部分的ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がＲＮａｓｅによって認識される結果、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される。さらに、アンチセンス効果は、ｍＲＮＡ前駆体におけるイントロンを標的としてももたらされ得る。さらに、アンチセンス効果は、ｍｉＲＮＡを標的としてももたらされ得る。この場合、そのｍｉＲＮＡの機能阻害により、当該ｍｉＲＮＡが通常発現を制御している遺伝子の発現が増加し得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
　例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＡＤＯを使用する場合、細胞内でＤＮＡ二本鎖は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖は標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、標的ＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。また、別の実施態様では、ＡＤＯのＤＮＡ二本鎖がＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖が標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のＲＮＡスプライシングの制御により標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。
　例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＨＤＯを使用する場合、細胞内でＨＤＯのＲＮＡからなる相補鎖がＲＮａｓｅによって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、標的ＲＮＡがＲＮａｓｅにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。また、細胞内でＨＤＯのＲＮＡ相補鎖がＲＮａｓｅによって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖が標的ＲＮＡにハイブリダイズし、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のＲＮＡスプライシングの制御によって、標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。
　例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用する場合、ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を利用する機序を介した、アンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを指す。ＲＮＡｉの例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。また、別の例では、ＲＮＡ標的機能の調節は、占有に基づく機序によるものであり、ｍｉｃｒｏＲＮＡによって自然に利用されている機序などである。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、タンパク質をコードしているＲＮＡの発現を調節する、小さな非コードＲＮＡである。アンチセンス鎖を持つ核酸分子がｍｉｃｒｏＲＮＡに結合すると、当該ｍｉｃｒｏＲＮＡのそのｍＲＮＡ標的への結合が阻害され、それによりｍｉｃｒｏＲＮＡの機能が妨げられる。ｍｉｃｒｏＲＮＡ模倣体は、生来のｍｉｃｒｏＲＮＡ機能を高めることができる。特定のアンチセンス鎖を持つ核酸分子は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更する。特定の機序にかかわらず、配列特異性は、アンチセンス鎖を持つ核酸分子を、標的の検証及び遺伝子の機能化のためのツールとして、また、疾患の病因に関与する遺伝子の発現を選択的に調節する治療薬として使用される。
　アンチセンス鎖の鎖長としては特に制限はないが、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。ある場合においては、通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、鎖長は選択される。二本鎖核酸の場合においては、鎖長は、好ましくは二本鎖のＴｍ値が５０℃以上、さらに好ましくは６０℃以上となる鎖長から選択してもよい。
　二本鎖核酸の場合、相補鎖の鎖長は、アンチセンス鎖と同じであってもよい。その場合、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。また、アンチセンス核酸鎖の鎖長に対して数塩基から十数塩基長くても短くてもよい。
　「相補的」又は「相補性」とは、水素結合を介して、いわゆるワトソン－クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン－クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。アンチセンス鎖の十分な数の核酸塩基が、標的遺伝子又は標的転写産物の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、アンチセンス鎖及び標的遺伝子又は標的転写産物は互いに相補的であるので、所望のアンチセンス効果が生じる。アンチセンス鎖と標的遺伝子又は標的転写産物との間の非相補的核酸塩基は、アンチセンス鎖が標的核酸に特異的にハイブリダイズできるという条件で許容され得る。さらに、アンチセンス鎖は標的遺伝子又は標的転写産物の１つ以上のセグメントに対してハイブリダイズでき、それにより介入する又は隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造、ミスマッチ又はヘアピン構造）に関与しない。当該アンチセンス鎖は、標的遺伝子又は標的転写産物の配列に対して相補的であると言える。相補的であるとは、アンチセンス鎖が標的遺伝子又は標的転写産物に結合できる程度に相補的であればよく、例えば、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上相補的であればよい。１００％相補的であってもよい。０～４個程度のミスマッチがあってもよい。
　本発明の「核酸複合体」は、特定の実施態様では、製造時は一本鎖のオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡヌクレオチド若しくはＤＮＡヌクレオチドアナログからなるアンチセンス鎖と、３～１０ヌクレオチドからなるリンカー部分と、前記アンチセンス鎖に相補的であるＲＮＡヌクレオチド若しくはＲＮＡヌクレオチドアナログからなるセンス鎖を含む構造であってもよい。この構造の核酸複合体は一本鎖ヘテロ二本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｓｓ－ＨＤＯ）と言われるものであり、Ｘ－Ｌ－Ｙの構造からなるオリゴヌクレオチドである（特許文献４）。Ｘはアンチセンス鎖で、Ｙはアンチセンス鎖に対する相補鎖で、Ｌがリンカーの役割をするヌクレオチドからなる。この一本鎖オリゴヌクレオチドを医薬組成物として用いる際は、生理食塩水や水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、固形注射剤等に用いられる溶媒若しくは血液または血漿中でアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に対する相補鎖がリンカーを支点として一分子アニーリングして２重鎖構造をとる。このような核酸複合体は、医薬組成物として作用するときは一分子アニーリングして２重鎖構造をとるため、２重鎖核酸複合体の一つである。
　なお、本発明において、上記の核酸複合体を核酸分子と呼ぶことがある。
　以上、いくつかの実施態様において、一本鎖ＡＳＯ及び二重鎖核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施態様における一本鎖ＡＳＯ及び二重鎖核酸複合体は上記典型例に限定されるものではない。
　ある実施形態において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む。アンチセンス鎖は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドを有し、また当該核酸鎖において任意に修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。
　ある実施形態において、相補鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む。
　相補鎖は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドを有し、また当該核酸鎖において任意に修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。
　ある実施形態において、相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を有している。
　ここで「ＤＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＤＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＤＮＡヌクレオチドを意味する。
　同様に、「ＲＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＲＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＲＮＡヌクレオチドを意味する。
　「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオチドの塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットに対する１の置換基の付加、又は、サブユニット内における１の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。ヌクレオチドを含む領域の一部又は全部は、ＤＮＡ分解酵素等に対する耐性が高いという観点から、ＤＮＡは修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化、ホスホロチオエート化、ボラノホスフェート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’－Ｏ－メチル化、２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’－アミノプロピル（ＡＰ）化、２’－フルオロ化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が好ましい。さらに、かかる修飾は同一のＤＮＡに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。また、後述の通り、同様の効果を奏するために、ＲＮＡヌクレオチドに修飾を施してもよい。
　ある場合において、修飾されたヌクレオチドの数や位置によっては、ここで開示する二重鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、後記のアンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、決定することができる。また、修飾後の二重鎖核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二重鎖核酸複合体のそれよりも有意に低下していなければ（例えば、修飾後の二重鎖核酸複合体の測定値が修飾前の二重鎖核酸複合体の測定値の３０％以上であれば）、当該修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているような、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、タンパク質量等）を、ノーザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。
　「ヌクレオチドアナログ」は、天然には存在しないヌクレオチドを意味し、ヌクレオチドの塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットにおいて、２以上の置換基が付加されており、若しくは、サブユニット内が２以上置換されており、又はサブユニット全体を異なる化学基に置換されていることを意味する。２以上の置換を伴うアナログの例としては、架橋化核酸が挙げられる。架橋化核酸は、糖環における２箇所の置換に基づいて架橋ユニットが付加されるヌクレオチドアナログであり、典型的には、２’位の炭素と４’位の炭素とが結合しているヌクレオチドアナログが挙げられる。ある実施形態における第１の核酸鎖においては、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大させるという観点から、第１の核酸鎖はヌクレオチドアナログをさらに含む。ヌクレオチドアナログとしては、修飾（架橋、置換等）により、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大されているヌクレオチドであればよく、例えば、特開平１０－３０４８８９号公報、国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０－１９５０９８号公報、特表２００２－５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号（以下、これら文献を「アンチセンス法に関する文献」とも称する）において、アンチセンス法に好適に用いられるとして開示されている核酸が挙げられる。すなわち、前記文献に開示されている核酸：ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル化核酸（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル化核酸（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－エチル化核酸（ｃＥｔ）、２’－Ｏ－アミノプロピル化核酸（２’－ＡＰ）、２’－フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２’－Ｆ－ＡＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ、ＢＮＡ）が挙げられる。
　ある実施態様におけるＢＮＡとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、２以上の原子によって架橋されているリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであればよい。架橋化核酸の例は当業者に知られている。このようなＢＮＡの一のサブグループとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、４’－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－２’、４’－（ＣＨ２）ｐ－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）ｐ－ＯＣＯ－２’、４’－（ＣＨ２）ｎ－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－２’によって架橋されているＢＮＡを挙げられる（ここで、ｐ、ｍ及びｎは、各々１～４、０～２及び１～３の整数である。Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基（蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチド等）を示す）。さらに、ある実施態様におけるＢＮＡにおいて、３’位の炭素における置換基：ＯＲ２及び５’位の炭素における置換基：ＯＲ１のＲ１及びＲ２は、典型的には水素原子であるが、同一又は異なっていてもよく、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５（式中、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のアルキルチオ基、炭素数１～６のシアノアルコキシ基、又は、炭素数１～５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）であってもよい。このようなＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’－ＢＮＡ）とも称される、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）又はβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ３）－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ－２’，４’－ＢＮＡ、５’－メチルＢＮＡ，ｃＥｔ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ｃＭＯＥ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＡｍＮＡとも称されるアミドＢＮＡ（４’－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒ＝Ｈ，Ｍｅ）、Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＧｕＮＡ）、４’－Ｃ－Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ｓｃｐＢＮＡ）、当業者に知られた他のＢＮＡが挙げられる。
　さらに、ある実施態様における修飾核酸においては、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における修飾核酸においては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、ボラノホスフェート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、このような塩基部位の修飾やリン酸ジエステル結合部位の修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
　全体として、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログは、ここで例示したものに限定されるわけではない。多数の修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログが当該分野では知られており、例えば、Ｔａｃｈａｓらの米国特許第８２９９０３９号明細書の記載、特に１７～２２欄の記載を、本願の実施態様として利用することもできる。
　当業者であれば、このような修飾核酸の中から、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、核酸分解酵素に対する耐性等の観点を考慮し、核酸複合体を構成する核酸として適宜ヌクレオチドアナログを選択して利用することができるが、ある実施形態において、ヌクレオチドアナログはＬＮＡである。
　ある実施形態では、アンチセンス鎖は、複数のＤＮＡヌクレオチドを含む領域（以下「ＤＮＡギャップ領域」とも称する）と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログを含むウィング領域を含むものである。このアンチセンス鎖をＧａｐｍｅｒ（ギャップマー）とも称する。該Ｇａｐｍｅｒの鎖長は少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。
　また、ある実施形態では、複数のＤＮＡヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであってもよい。
　また、ある実施形態では、複数のＤＮＡヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログであってもよい。
　該ＤＮＡギャップ領域の５’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「５’ウィング領域」とも称する）、及び該ＤＮＡギャップ領域の３’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「３’ウィング領域」とも称する）は、それぞれ独立したものであり、前記アンチセンス法に関する文献に挙げられているヌクレオチドアナログを少なくとも１種含んでいればよく、さらに、かかるヌクレオチドアナログ以外に天然型の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）若しくは修飾ヌクレオチドが含まれていてもよい。また、５’ウィング領域及び３’ウィング領域の鎖長は独立的に、通常１～１０塩基であり、１～７塩基、又は２～５塩基である。
　ある実施形態では、アンチセンス鎖は、Ｇａｐｍｅｒではなく、複数のＤＮＡヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ若しくはこれらの組み合わせからなるものである。このアンチセンス鎖を非Ｇａｐｍｅｒとも称する。該非Ｇａｐｍｅｒの鎖長は、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。
　ある実施形態では、二本鎖核酸複合体における相補鎖は、複数のＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドを含む領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数の修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含むウィング領域を含むＧａｐｍｅｒであってもよい。５’ウィング領域若しくは３’ウィング領域を修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログとすることによりアンチセンス鎖との結合をより強化することができる。
　ある実施形態では、二本鎖核酸複合体における相補鎖は、複数のＤＮＡヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログや、ＲＮＡヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログであってもよい。さらには、二本鎖核酸複合体における相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を有していてもよい。
　本発明において、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子として、上記の、標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸分子、標的タンパク質に対して特異的に結合する核酸塩基配列を有するアプタマー、及び標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなるデコイからなる群から選択される核酸分子が挙げられる。
　また、本発明において、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子として、上記の、ＡＤＯ、ＡＳＯ、ＨＤＯ、及びＲＮＡｉからなる群から選択される核酸分子が挙げられる。
２．リガンド
　「リガンド」とは、生体分子に結合して複合体を形成して生物学的な目的を果たす物質を意味する。ある場合、リガンドは標的への送達機能を有する。例えば、肝臓等に特異性高く効率的にある核酸複合体を送達できるという観点から、好ましいリガンドとして脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ，ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができるが、これらの中では、より安全性が高いという観点から、好ましいリガンドとしてコレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）が挙げられる。また、脳に特異性高く効率的に核酸分子を送達できるという観点から、好ましいリガンドとして糖（例えば、グルコース、スクロース）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的に核酸複合体を送達できるという観点から、好ましいリガンドとして受容体のリガンドや抗体、及び／又はそれらの断片等のペプチド又はタンパク質が挙げられる。
　「ＰＴＨ１リガンド」とは、ＰＴＨ１受容体に結合可能なリガンドである。ＰＴＨ１受容体に結合可能なリガンドは、代表的なものとしてヒト副甲状腺ホルモン（ｈｕｍａｎ　ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ，ｈＰＴＨ）と、ヒト副甲状腺ホルモン関連蛋白（ｈＰＴＨｒＰ）と、ヒトＴＩＰ（ｈｕｍａｎ　ｔｕｂｅｒｏｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌａｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ，ｈＴＩＰ）などが挙げられる。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、下記式で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
［化２］
Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－Ａ１９－Ａ２０－Ａ２１－Ａ２２－Ａ２３－Ａ２４－Ａ２５－Ａ２６－Ａ２７－Ａ２８－Ａ２９－Ａ３０－Ａ３１－Ａ３２－Ａ３３－Ａ３４
[式中、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向かって記述したものである。
式中、
Ａ１はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｄａｐまたは欠損しており；
Ａ２はＶａｌまたは欠損しており；
Ａ３はＳｅｒ，Ｔｈｒ、Ａｉｂまたは欠損しており；
Ａ４はＧｌｕまたは欠損しており；
Ａ５はＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
ｐ－Ｘ－Ｐｈｅまたは欠損しており、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ６はＧｌｎ；
Ａ７はＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅｐ－Ｘ－Ｐｈｅまたは欠損しており、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ８はＭｅｔ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ａｃｃ、Ｎｌｅまたは欠損しており；
Ａ９はＨｉｓまたは欠損しており；
Ａ１０はＡｓｐまたはＡｓｎであり；
Ａ１１はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
またはｐ－Ｘ－Ｐｈｅであり、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ１２はＧｌｙ、Ａｃｃ、またはＡｉｂであり；
Ａ１３はＬｙｓ；
Ａ１４はＳｅｒまたはＨｉｓであり；
Ａ１５はＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
またはＰ－Ｘ－Ｐｈｅであり、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
Ａ１６はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡｉｂであり；
Ａ１７はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、またはＡｉｂであり；
Ａ１８はＭｅｔ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ａｃｃ、Ｃｈａ、またはＡｉｂであり；
Ａ１９はＡｒｇ、ＧｌｕまたはＡｉｂであり；
Ａ２０はＡｒｇ；
Ａ２１はＡｒｇ、Ｖａｌ、Ａｃｃ、Ｃｈａ、またはＭｅｔであり；
Ａ２２はＰｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２３はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２４はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２５はＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＧｌｕであり；
Ａ２６はＨｉｓ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＬｙｓであり；
Ａ２７はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、ｈＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２８はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
Ａ２９はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｃｃ、またはＡｉｂであり；
Ａ３０はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｃｈａ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＬｙｓであり；
Ａ３１はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｃｈａ、Ｌｙｓ若しくはＡｃｃであり；
Ａ３２はＨｉｓであり；
Ａ３３はＴｈｒ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＣｙｓであり；
Ａ３４はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、ＡｍｐまたはＡｉｂである]。
　本発明明細書において、アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ－体を示すものとする。
ＧｌｙまたはＧ　：グリシン
ＡｌａまたはＡ　：アラニン
ＶａｌまたはＶ　：バリン
ＬｅｕまたはＬ　：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ　：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ　：セリン
ＴｈｒまたはＴ　：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ　：システイン
ＭｅｔまたはＭ　：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ　：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ　：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ　：リジン
ＡｒｇまたはＲ　：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ　：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ　：フェニールアラニン
ＴｙｒまたはＹ　：チロシン
ＴｒｐまたはＷ　：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ　：プロリン
ＡｓｎまたはＮ　：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ　：グルタミン
Ａｉｂ　：アミノイソブチル酸
Ｎｌｅ　：ノルロイシン
β－Ａｌａ：β－アラニン
ｈＰＴＨ：ヒトＰＴＨ
Ｂｏｃ　：ｔ－ブトキシカルボニル
Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメトキシカルボニル
Ｎｖａ　：ノルバリン
Ａｂｕ　：α－アミノブチリル酸
Ａｈｃ　：１－アミノシクロヘキシルカルボン酸
ｈＡｒｇ：ホモアルギニン
Ｃｈａ：２－アミノ－３－シクロヘキシルプロピオン酸
Ｎｐａ：３－（２－ナフチル）－アラニン
Ｄａｐ：２，３－アミノプロピオン酸
Ｄ－Ｓｅｒ：（Ｄ）－Ｓｅｒ
Ｄ－Ｌｅｕ：（Ｄ）－Ｌｅｕ
Ｄ－Ｔｒｐ：（Ｄ）－Ｔｒｐ
　上記式で表されるペプチドは、ｈＰＴＨ（１－３４）、ｈＰＴＨ（１－３４）誘導体、例えばｈＰＴＨ（１－３４）の特定の位置のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換したもの、ｈＰＴＨｒＰ（１－３４）、ｈＰＴＨｒＰ（１－３４）誘導体、及びそれらのペプチドのＮ末端からｎ個（ｎ＝１乃至９の整数）のアミノ酸残基を欠損したものを含むものである。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、ｈＴＩＰ（１－３９）、ｈＴＩＰ（１－３９）誘導体、及びそれらのペプチドのＮ末端からｎ個（ｎ＝１乃至９の整数）のアミノ酸残基を欠損したものを含むものである。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、次の表２に含まれる配列番号１～１６８のペプチド群から選択されるｈＰＴＨ（１－３４）ペプチド、ｈＰＴＨｒＰ（１－３４）ペプチド、ｈＴＩＰ（１－３９）ペプチド及びそれらの誘導体並びにそれらの部分ペプチド：それらのペプチドのＮ末端からｎ個（ｎ＝１乃至９の整数）のアミノ酸残基を欠損したものを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　表２において、相同性のスコアは、第１列のリガンド番号を付されたペプチドのアミノ酸配列と、比較対象のペプチドのアミノ酸配列との相同性（ホモロジー）を示す。つまり、第１列のペプチドがＬ０１１であり、比較対象のペプチドがＬ００１である場合、３４アミノ酸残基のうちＣ末端から２番目のＫとＣが不一致であるが、残りの３３アミノ酸残基は同一配列であるから、相同性スコアは、３３／３４＝０．９７１（９７．１％）と計算される。また、ペプチドがｈＰＴＨｒＰ（１－３４）、ｈＰＴＨ（１－３４）またはｈＴＩＰ（１－３９）由来のフルレングスのペプチドのＮ末端からｎ個（ｎ＝１乃至９の整数）のアミノ酸残基を欠損したアミノ酸配列を有するペプチドである場合、例えば第１列のペプチドがＬ０１２（ｎ＝１欠損）であり、比較対象のペプチドがＬ００１である場合、Ｌ０１２と、Ｌ００１のうちＬ０１２に対応する部分である３３アミノ酸残基のうちＣ末から２番目のＫとＣが不一致であるが、残りの３２アミノ酸残基は同一配列であるから、相同性スコアは、３２／３３＝０．９７０（９７．０％）と計算される。
　表２に記載したＰＴＨ１リガンドは全てヒトＰＴＨ１リガンドである。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、表１に含まれる配列番号１～８８のｈＰＴＨｒＰ（１－３４）ペプチド及びその部分ペプチド群から選択されるペプチドである。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、表１に含まれる配列番号８９～１６４のｈＰＴＨ（１－３４）ペプチド及びそれらの部分ペプチド群から選択されるペプチドである。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、表１に含まれる配列番号１６５～１６８のｈＴＩＰ（１－３９）ペプチド及びそれらの部分ペプチド群から選択されるペプチドである。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、ｈＰＴＨｒＰ（１－３４）由来のＬ００１、Ｌ０１１、Ｌ０２１、Ｌ０３１、Ｌ０４１、Ｌ０５１、Ｌ０７２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、ｈＰＴＨ（１－３４）由来のＬ０８９、Ｌ０９９、Ｌ１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
　ある実施態様では、ＰＴＨ１リガンドは、ｈＴＩＰ（１－３９）由来のＬ１６５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
　本発明の核酸複合体では、リガンドは核酸分子のアンチセンス鎖及び／又は相補鎖に結合される。ある実施態様では、リガンドは核酸鎖の３’末端若しくは５’末端に結合される。また、ある実施態様では、リガンドは核酸鎖の末端以外の部位に結合される。ヌクレオチドの五炭糖の２位にリガンドを結合する方法は公知であり、例えば国際公開第ＷＯ２０１８／００３７３９号に記載の方法で行うことができる。
　「ＰＴＨ１リガンド」として、上記ペプチドの塩でもよく、上記ペプチドの塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、臭化水素酸塩等が挙げられる。
　上記ペプチドは、固相合成法等の公知の方法で作製することができる。
３．リガンドと核酸分子の結合
　リガンドと核酸の結合の仕方としては、リガンドの結合可能な基と核酸分子の結合可能な基を共有結合、非共有結合、例えば水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用等により結合することができる。リガンドの結合可能な基とは例えば、ＰＴＨ１リガンドであるペプチドが有するアミノ基、ヒドロキシ基、カルボン酸、チオール基、ジスルフィド、アジド基等があげられるが、これに限定されるものではない。核酸の結合可能な基としては、ヌクレオシドの糖の２位の炭素、３位のヒドロキシ基または５位のヒドロキシ基、ヌクレオチドの５位のリン酸基、またはヌクレオシドの塩基部分が挙げられる。また、核酸分子の結合可能な基としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸基も挙げられる。
　核酸分子とリガンドは、リンカーを介して、又は介さず結合させる。
４．リンカー
　ある実施態様では、リガンドは、リンカーを介して核酸分子に結合される。核酸分子がＨＤＯの場合、リガンドはＨＤＯのアンチセンス鎖及び／又は相補鎖にリンカーを介して結合されていてもよい。リンカーは、切断性（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）又は非切断性（ｕｎｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを用いることが可能である。
　「切断性リンカー」とは、生理学的条件下で、例えば細胞内又は動物体内（例えば、ヒト体内）で、切断される連結基を意味する。特定の実施形態では、切断性リンカーは、ヌクレアーゼなどの内在性酵素によって選択的に切断される。切断性リンカーとしては、アミド、エステル、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、及びジスルフィド結合、ならびに天然ＤＮＡリンカーが挙げられる。「非切断性リンカー」は、生理学的条件下、例えば、細胞内又は動物体内（例えば、ヒト体内）で切断されないリンカーを意味する。非切断性リンカーは、限定はしないが、ホスホロチオエート結合、及びホスホロチオエート結合で連結された修飾若しくは非修飾のデオキシリボヌクレオシド又は修飾若しくは非修飾のリボヌクレオシドからなるリンカー等が挙げられる。リンカーがＤＮＡ等の核酸又はオリゴヌクレオチドの場合、鎖長は、特に限定はされないが、通常は２～２０塩基長、好ましくは３～１０塩基長であればよい。
　ある実施態様では、本発明で用いられるリンカーとしては、ヒドロカルビル鎖等の鎖構造、またはエチレングリコール、ヌクレオシドもしくはアミノ酸単位等の反復単位のオリゴマーを含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル、およびヒドロキシルアミノから選択される１つ以上の基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミドおよびエーテル基から選択される基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキルおよびアミド基から選択される基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、少なくとも１つのリン部分を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、少なくとも１つのホスフェート基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、少なくとも１つの中性結合基を含む。
　ある実施態様では、リンカーは、１－１０００Åの長さを有する。特定のリンカーは、３―５００Åの長さを有する。好ましくは、３－２００Åの長さを有する（ＰＴＨ１ＲレセプターとＰＴＨ類縁体が結合した結晶構造（ＰＤＢ　６Ｆ３Ｊ）を基に長さを推定した。）。
　ある実施態様では、リンカーとオリゴヌクレオチドの結合は二官能性結合を用いることができる。一般に、二官能性結合は、少なくとも２つの官能基を用いる結合である。リンカーの官能基のあるものは、オリゴヌクレオチドの特定の部位に結合するように選択され、他方は、リガンド部分に結合するように選択される。リンカーの二官能性結合に使用される官能基の例としては、限定されるものではないが、求核基と反応するための求電子剤および求電子基と反応するための求核剤が挙げられる。特定の実施形態において、二官能性結合は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、アルキル、アルケニル、およびアルキニルから選択される１つ以上の基が利用可能である。
　リンカーの例としては、これら限定されるものではないが、６－アミノヘキサン酸（ＡＨＡまたはＡＨＥＭ）や（２，５－ジオキシピロリジ－１－ニル）４－（２－アザトリシクロ［１０．４．０．０４，９］ヘキサデカ－１（１６），４，６，８，１２，１４－ヘキセ－１０－ニン－２－イル－４－オキソブタノエート（ＤＢＣＯ－ＮＨＳ）、３－メルカプトプロピオン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレートが挙げられる。他のリンカーとしては、これらに限定されるものではないが、置換もしくは非置換Ｃ１―Ｃ１０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２―Ｃ１０アルケニルまたは置換もしくは非置換Ｃ２―Ｃ１０アルキニルが挙げられ、好ましい置換基の非限定的列記としては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。
　特定の実施形態において、リンカーは表３の次の構造を有する化合物及びその誘導体から選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表３中のポリエチレングリコール基のｎは１～２００であり、好ましくは１～１００であり、より好ましくは１～５０である。
　特定の実施形態において、リンカーは、２～２０個のリンカー－ヌクレオシドで構成されていてもよい。特定の実施形態において、そのようなリンカー－ヌクレオシドは、連続する修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、そのようなリンカー－ヌクレオシドは、修飾糖部分を含んでもよい。特定の実施形態において、リンカー－ヌクレオシドは、非修飾である。特定の実施形態において、リンカー－ヌクレオシドは、場合により、プリン、置換プリン、ピリミジンまたは置換ピリミジンから選択される保護された複素環式塩基を含む。
　特定の実施形態において、リンカーは、次の構造を有する化合物及びその誘導体から選択することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である。
　特定の実施形態において、以下の化４の式で示す活性エステルを有する化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中Ｘは、リガンド結合部位である）を、以下の化５の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）を含む、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中Ｘはリガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位である。核酸分子は天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログから選択されるか、又はそれらを用いるオリゴヌクレオチドである。）
　上の化６の式で示すリンカーを得ることができる。
　特定の実施形態において、ホスフェート／トリエチレングリコールを含むリンカーを使用することができる。
　特定の実施形態において、以下の化７の式で示すリンカーを使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位、Ｂｘは、修飾または非修飾核酸塩基である）
　特定の実施形態において、上の化７の式で示すアミダイトを有する化合物と、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中Ｘは、リガンドである）
化８の式で示す化合物を、固相担体上のオリゴヌクレオチド部位Ｙと反応させて、固相担体から開裂することで
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （式中Ｘは、リガンドであり、Ｙは、核酸分子である）
　上の化９の式で示すリンカーを得ることができる。
　特定の実施形態において、リンカーは、以下の化１０の式で示す構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中Ｘはリガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位、Ｗはホスホジエステルまたはアミノ基であり、Ｚは、以下の化１１の式で表されるピロリジニル基であり；ｊは０または１であり；ｎは約１－約１０であり；ｍは約１－約１０であり；ｌは０または１－４であり；およびＸがアミノ基の場合、ｌは１である）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　特定の実施形態において、リンカークリックケミストリーを用いて調製される。いくつかの実施形態で使用するのに好適なさらなるリンカーは、“Ｃｌｉｃｋ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ”Ｅｄ．Ｊｏｅｒｇ　Ｌａｈａｍ，Ｗｉｌｅｙ　２００９（これは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されているクリックケミストリーによって調製することができる。
　特定の実施形態において、以下の化１２の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 を、以下の化１３の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）
と、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 化１４の式で示す化合物を得た。これを、アジドを有するリガンドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （式中Ｘはリガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位を表す）
　上の化１５の式で表すリンカーを得た。
　特定の実施形態において、リンカーはマレイミドリンカーを使用することができる。当該リンカーは、以下の化１６の式で示す構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 を含み、
　Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である。
　特定の実施形態において、以下の化１７の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 を、以下の化１８の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）
を、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 化１９の式で示す化合物を得た。これを、マレイミドを有するリガンドコンジュゲート部分と反応させることで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 （式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である。）
　上の化２０の式で示すリンカーを得た。
　特定の実施形態において、以下の化２１の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 と、以下の化２２の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）
を、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 上の化２３の式で示す化合物を得た。これを、チオールを有するリガンドコンジュゲート部分と反応させることで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　（式中Ｘは、リガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である）
　上の化２４の式で示すリンカーを得た。
ジスルフィドリンカーの具体例及びつけ方
　特定の実施形態において、リンカーはジスルフィド結合を含むリンカーを使用することができる。特定の実施形態において、リンカーは、リガンド結合部分とジスルフィド結合を形成する活性化ジスルフィドを含む。
　特定の実施形態において、以下の化２５の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 と、以下の化２６の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 （式中Ｙは、核酸分子結合部位である）
とを、末端アミンを有するオリゴヌクレオチドと反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 上の化２７の式で示す化合物を得た。これを、ジスルフィド結合を切断することで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 上の化２８の式で示す化合物を得た。これを、チオールを有するリガンドコンジュゲート部分と反応させることで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 （式中Ｘはリガンド結合部位、Ｙは、核酸分子結合部位である）
　上の化２９の式で示すリンカーを得た。
　特定の実施形態において、ＰＴＨ１リガンドにリンカーが化学的に結合している。リンカーを介して、ＰＴＨ１リガンドはオリゴヌクレオチドに付着させるための官能基と結合している。
　特定の実施形態において、限定されるものではないが、リガンド結合部分のアミノ基（Ｘ―ＮＨ２；Ｘはアミノ基を除いたリガンドコンジュゲート部分）に対して、以下の化３０の式で示す化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 （式中Ｙは、直接または間接的にオリゴに付着させるための官能基であり、アジド、マレイミド等）を反応させて、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 （式中、Ｘはリガンド結合部位、Ｙは核酸分子結合部位である）
上の化３１の式で示すリガンド結合部分にリンカーを導入したリンカーを得た。
５．医薬組成物
　本発明のリガンド結合核酸複合体が標的とする疾患としては、標的とする臓器及び臓器中の組織、細胞が関連する疾患であればよい。例えば、そのような疾患として、糖尿病、メタボリックシンドローム、心臓病、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、腎線維症、糖尿病性腎症、慢性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、原発性糸球体疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、間質性肺炎、肺線維症、心疾患、筋疾患等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。
　これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
　製剤化等に際し、経腸投与の実施形態におけるリガンド結合核酸複合体においては、さらに経腸投与の効率を高めるという観点から、大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する物質（例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体（塩、エステル体又はエーテル体））及び界面活性剤（非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤）との複合体（混合ミセル、エマルジョン）であってもよい。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、髄腔内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
　いくつかの実施形態におけるリガンド結合核酸複合体を含む組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
［実施例１］ＰＴＨ１リガンドの合成と精製
　本発明のＰＴＨ１リガンドである表１に記載のポリペプチドは表４に示す合成パターンでオリゴ核酸に導入する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
　表４中、修飾パターンＡは、例えばＬ００１－Ｌ００９、Ｌ０３１－Ｌ０４０、Ｌ０８０－Ｌ０９８等のポリペプチドのＣ末端から２アミノ酸目のＬｙｓｉｎｅの側鎖のアミノ基にＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅ基を置換し（Ｋ－ＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅ）とし、Ｋ－ＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅのアジド基と、オリゴヌクレオチドの５’端にジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノ基を修飾した５’－ジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノオリゴ核酸と結合してオリゴヌクレオチドにＬ００１－Ｌ００９、Ｌ０３１－Ｌ０４０、Ｌ０８０－Ｌ０９８等のポリペプチドを結合することによる修飾パターンである。
　表４中、修飾パターンＣは、例えばＬ０２１－Ｌ０３０、Ｌ０５１－Ｌ０８８、Ｌ１０９－Ｌ１６８等のポリペプチドのＣ末端のＬｙｓｉｎｅの側鎖のアミノ基にＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅ基を置換し（Ｋ－ＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅ）とし、Ｋ－ＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅのアジド基と、オリゴヌクレオチドの５’端にジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノ基を修飾した５’－ジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノオリゴ核酸と結合してオリゴヌクレオチドにＬ０２１－Ｌ０３０、Ｌ０５１－Ｌ０８８、Ｌ１０９－Ｌ１６８等のポリペプチドを結合することによる修飾パターンである。
（Ｋ－ＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　この方法で、例えばＬ００１とオリゴヌクレオチドを結合したときのリンカー構造はＫ－ＰＥＧ３－Ｕｎｉｔである。ここで、Ｕｎｉｔとは、リンカー構造のうちオリゴ側のリンカー部分をいう。下の化３３の構造式中、結合部位（azideとＤＢＣＯ構造が反応した構造）及びオリゴ側の５‘末端に位置するリン酸基までがＵｎｉｔである。
（Ｋ－ＰＥＧ３－Ｕｎｉｔ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　表４中、修飾パターンＢは、例えばＬ０１１－Ｌ０２０、Ｌ０４１－Ｌ０５０、Ｌ０９９－Ｌ１０８等のポリペプチドのＣ末端から２アミノ酸目のＣｙｓｔｅｉｎｅのチオールと５’端に３ピリジルジチオプロピオニル基を修飾した５’－３ピリジルジチオプロピオニル－ヘキシルアミノオリゴクレオチドとＳＳ結合で結合してオリゴヌクレオチドへ導入することによる修飾パターンである。
　この方法で、例えばＬ０９９とオリゴヌクレオチドを結合したときのリンカー構造はＣ－Ｓ－Ｕｎｉｔ）である。ここで、Ｕｎｉｔとは、リンカー構造のうちオリゴ側のリンカー部分をいう。下の化３4の構造式中の、結合部位（SS結合）及びオリゴ側の５’末端に位置するリン酸基までがＵｎｉｔである。
（Ｃ－Ｓ－Ｕｎｉｔ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　Ｌ００１のオリゴ核酸導入用のリガンド・リンカーＬＧ００１を合成する方法としては、メリフィールドらにより開発されたペプチドの固相合成法を用いることができる。一般的に入手可能な自動ペプチド合成機を使用してもよい。例えば、自動ペプチド合成機４３０Ａ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてポリペプチドＬ００１の合成を実施することができる。得られたペプチド含有樹脂をゲル濾過することで精製されたポリペプチドを得る。
　本発明に用いるＰＴＨ１リガンドである他のペプチドは、当該分野における通常の知識を有する者によって同様の方法により調製できる。
　表１に記載されているペプチドは次の方法に従って合成することが可能である。
　切断可能なスペーサーを介して固相担体上に固定化され、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、ベンジル基、ｔ－ブチル基等の適切な保護基が主鎖および側鎖に事前に導入された合成ペプチドのＣ末端に該当するアミノ酸に対して、アミノ酸の主鎖部分のアミノ基の保護基を選択的に脱保護できる試薬を導入することにより、主鎖部分のアミノ基のみを選択的に脱離する。脱保護された主査部分のアミノ基に対して、あらかじめＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート）などの縮合剤とＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）などの塩基の添加により活性化されたカルボン酸を有する適切な保護基で保護された、伸長予定のアミノ酸を反応させることで、アミド結合を形成し、主鎖のＮ末端側への伸長を行う。この工程を繰り返し、目標とするアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成する。Ｌ－００１の場合、Ｎ末端から３３残基目のリジン側鎖のアミノ基に対して、アミン側鎖の保護基を選択的に脱保護した後、２，５－ジオキシピロリジ－１－ニル２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）アセテートなどの、アジド基を含む活性化されたカルボン酸を反応させることでアジド基を導入する。その後、残りの保護基及び固相担体とペプチドを結合するスペーサー部分を切断する。得られた粗精製ペプチドを逆相カラムにより精製し、凍結乾燥などで溶媒を留去し、目的のペプチド鎖を得る。
　ＰＴＨ１リガンドとして、ある実施態様では表１の配列番号１のポリペプチドであるＬ００１を用いた。表１に記載されているＬ００１（配列番号１のポリペプチド）を導入するためのリガンド・リンカーＬＧ００１は株式会社ペプチド研究所から入手した。純度はＨＰＬＣよりおよそ９９％であった。質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）による分子量は４１８８．８であった（これは算出した４１８８．８の分子量と一致した）。Ｌ００２－Ｌ１６８においても同様の方法により合成することができる。
［実施例２］
　本発明の核酸複合体は、標的遺伝子又は標的転写産物に対しハイブリダイズ可能なアンチセンス鎖を有しアンチセンス効果を奏するものであればよく、二本鎖の場合はさらにアンチセンス鎖とハイブリダイズ可能な相補鎖の組み合わせを用いることができる。例えば次の配列からなるＡＳＯ、ＨＤＯ、ｓｉＲＮＡから選択することが可能であるし、異なる疾患を標的とする場合、標的転写産物が異なることから、それぞれの標的に応じた核酸配列を持つアンチセンス鎖を有する核酸分子を用いることができる。
　ある実施態様では、表５の次の核酸配列からなるアンチセンス鎖を持つＡＳＯ及び／又はアンチセンス鎖と相補鎖を持つＨＤＯ及び／又はｓｉＲＮＡにＰＴＨ１リガンドを結合した核酸複合体を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　表５中、小文字はＤＮＡを表し、下線付きの大文字タイプはＬＮＡを表し（ＣはＬＮＡメチルシトシンを意味する）、大文字はＲＮＡを表し、大文字イタリックは２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、小文字イタリックはモルホリノ核酸を表し、下線付きの小文字イタリックは２’－フルオロ－糖修飾を表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
　実施例２では、マウスＭａｌａｔ１（ｍＭａｌａｔ１）ｎｃＲＮＡを標的とするＬ００１－ＨＤＯ６を、アンチセンス鎖（配列番号１７９）と相補鎖（配列番号１８０）と、ＰＴＨ１リガンドＬ００１を用いて作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　小文字はＤＮＡを表し、下線付きの大文字タイプはＬＮＡを表し（ＣはＬＮＡメチルシトシンを意味する）、大文字はＲＮＡを表し、二重下線付き大文字は２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
　配列番号１７９はｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡを標的とする１６個の核酸（１６ｍｅｒ）からなるアンチセンス鎖であり、ｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡを標的とし、マウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡの標的部位にハイブリダイズ可能な配列で構成されている。
　配列番号１８０は配列番号１７９のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する１６個の核酸（１６ｍｅｒ）からなる相補鎖であり、配列番号１７９のアンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列で構成されている。
　下記の通りコンジュゲーション反応を行い、配列番号１８０の相補鎖の５’端にリガンド分子を結合することができる。
　配列番号１８０の相補鎖の５’端にジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノ基を修飾した５′ジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノオリゴ核酸（１．０ｍＭ３．０ｍＬ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 　Ｘはジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノ基、＊はホスホロチオエート結合、二重下線付き大文字は２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、大文字はＲＮＡを表す）に対し、実施例１で入手したＬ００１溶液を加え攪拌後静置する。塩化ナトリウム水溶液を添加・攪拌した後、２－イソプロパノールのようなアルコールやアセトニトリル溶媒を加え攪拌し、－２０℃で静置する。一定時間遠心し固体を沈殿させ上澄みを除去した後、ＨＰＬＣにて精製を行う。溶媒を留去後、水に再度溶解し、塩化ナトリウム水溶液を添加・攪拌した後、アルコールを加え遠心し沈殿物としてＬ００１結合相補鎖を得ることができる。次に、配列番号１７９のアンチセンス鎖と、配列番号１８０のＬ００１結合相補鎖を等モル濃度で等量ずつマイクロチューブに加えて攪拌し、マイクロチューブを９５℃で５分間インキュベートする。その後、マイクロチューブを室温迄徐冷させると、Ｌ００１－ＨＤＯ６を作製することができる。
　表４において、修飾パターンＡ、Ｃで導入するＰＴＨ１リガンドの場合、上記の方法において、Ｌ００１に代えてそれぞれＬ００２－Ｌ０１０、Ｌ０２１－Ｌ０４０、Ｌ０５１－Ｌ０９８、Ｌ０１０９－Ｌ１６８のリガンドを用いることで、各Ｌ００２－Ｌ０１０、Ｌ０２１－Ｌ０４０、Ｌ０５１－Ｌ０９８、Ｌ０１０９－Ｌ１６８のリガンドを結合したＡＳＯ、ＨＤＯ並びにｓｉＲＮＡを作製することができる。
　修飾パターンＢで導入するＰＴＨ１リガンドの場合、上記の方法において、)化３６の式中、Ｘを３ピリジルジチオプロピオニル基に変更し、さらに、Ｌ００１に代えてそれぞれＬＧ０１２－ＬＧ０２０、ＬＧ０４１－ＬＧ０５０、ＬＧ０９９－ＬＧ１０８のリガンドを用いることで、ＬＧ０１２－ＬＧ０２０、ＬＧ０４１－ＬＧ０５０、ＬＧ０９９－ＬＧ１０８のリガンドを結合したＡＳＯ、ＨＤＯ並びにｓｉＲＮＡを作製することができる。
　上記手法を用いてＬ００１、Ｌ００３、Ｌ００５、Ｌ０１０、Ｌ０２１、Ｌ０４０、Ｌ０８９、Ｌ０９８、Ｌ０９８、Ｌ１６５、Ｌ１６８を導入した相補鎖のＨＰＬＣ純度、理論分子量と検出値は下記の表６に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
　配列番号１７９のアンチセンス鎖（０．２ｍＭ、７５０μＬ）と、Ｌ００１を結合した配列番号１８０の相補鎖（０．２０ｍＭ、７５０μＬ）を混合させリガンドを結合させたＨＤＯであるＬ００１－ＨＤＯ６（０．１ｍＭ、１．５ｍＬ）を得た。
　Ｌ００１－ＨＤＯ６を整理食塩液（大塚生食注（大塚製薬））に添加し、この溶液を９５℃で５分加熱し、溶液をゆっくりと室温に冷却してアニールした二本鎖複合体を形成することにより、二本鎖複合体であるＬ００１－ＨＤＯ６を作製した。
　Ｌ００１に変えて、Ｌ００２－Ｌ１６８が導入されたオリゴ核酸においても、また配列をＨＤＯ、ＨＤＯ２、ＨＤＯ３、ＨＤＯ４、ＨＤＯ５に変えたオリゴ核酸を用いても同様の方法によりＰＴＨ１リガンド結合ＨＤＯを作製することが可能である。
　Ｌ００１、Ｌ００３、Ｌ００５、Ｌ０１０、Ｌ０２１、Ｌ０４０、Ｌ０８９、Ｌ０９８、Ｌ０９８、Ｌ１６５、Ｌ１６８を導入したＨＤＯ６のＴｍは下記の表７に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
［実施例３］
試薬
　この実施例で使用する核酸複合体は、実施例２で作製したマウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡをターゲットとする１６ｍｅｒのＨＤＯにリガンドとしてＬ００１をコンジュゲートしたＬ００１－ＨＤＯ６である。発明者らは、これらのオリゴを生理食塩水（大塚製薬）にて１００μＭに調製し、２本鎖のＨＤＯはブロックバス（ＣＤＢ－１０５、アズワン）にて９０℃５分間変性させ、その後自然冷却（約２時間）で室温に戻すことでアニーリング操作を行った。
動物
　ＰＴＨ１受容体及びＰＴＨ、ＰＴＨｒＰは、ヒトとマウス間で種差が少ないため、被験体としてｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２５匹、日本チャールズリバー、雌性、入荷時４週齢）を用いた。動物は室温（２４±２℃）、湿度（５５±５％）および１２時間照明（８：００－２０：００）の環境下でプラスチックの飼育ゲージに５匹ずつ飼育し、自由飲水と固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業）を与え、１週間を馴化した。
方法
　マウスの体重によりＶｅｈｉｃｌｅ（Ｓａｌｉｎｅ、大塚製薬）投与群、Ｌ００１相補鎖（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群及びＬ００１－ＨＤＯ６（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群に分けた（各群動物ｎ＝５）。試薬投与当日、マウスを覚醒下で保定器にて保定し、尾静脈より試剤をゆっくり投与（１０ｍｌ／ｋｇ、Ｄａｙ　０）した。Ｌ００１相補鎖（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群は、ネガティブコントロールとして使用した。投与後、投与部位の止血を確認し、飼育ケージに戻した。投与３日後（Ｄａｙ　３）に剖検を実施した。剖検当日、マウスの体重を測定し、イソフルラン（３－５％で導入、１－３％で維持）麻酔下にて心内採血（テルモシリンジＳＳ－０１Ｐ２５２５、抗凝固剤ヘパリン含有）を行い、放血により安楽死させた。開腹し、肝臓、腎臓を摘出した。摘出した臓器は速やかにＩＳＯＧＥＮに浸し、ｍＲＮＡ抽出に供した。血液サンプルは１．５　ｍｌエッペンチューブに入れ、１００００ｒｐｍ／５分遠心し、上清を冷凍（－３０℃）保存し、血中肝臓逸脱酵素Ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）とＡｓｐａｒｔａｔｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）の測定に用いた。
　組織の破砕はバイオマッシャー、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）またはＦａｓｔＰｒｅｐ－２４　５Ｇ（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いた。組織破砕液からＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出はＲｅｌｉａＰｒｅｐＴＭ　ＲＮＡ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｚ６１１２、プロメガ）を用いた。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの調製はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ、ＲＲ０３６Ａ）を用いて逆転写した。各遺伝子の　ｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて計測した。マウスＭａｌａｔ１（Ｍｍ　０１２２７９１２－ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１８Ｓ　ｒＲＮＡ（Ｍｍ　０３９２８９９０－ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｍＲＮＡのＴａｑＭａｎプローブセットを用いた。
　血中ＡＬＴ／ＡＳＴ活性の測定はテストワコーＡＬＴ／ＡＳＴ測定キット（富士フィルム和光純薬株式会社、４３１－３０９０）と酵素キャリブレーター（富士フィルム和光純薬株式会社、４１６－５７１９１）を用いて計測した。
　すべての測定値は平均値±標準偏差で表した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　７．０４を用いて一元配置ＡＮＯＶＡ検定を行い、群間の比較はＤｕｎｎｅｔｔ多重比較を用いた。また、危険率５％未満を有意とする。
結果
１　一般状況
　マウスの毛並み、行動、糞便など投与前後に明確な変化は観察されなかった。試薬は尾静脈より１０ｍｌ／ｋｇの用量で投与したが、投与直後に行動異変は観察されなかった。
２　体重
　投与前各群動物の平均体重１７ｇで、投与前後で大きく変化は認められなかった。また、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べ、オリゴ投与群の平均体重は有意な変化は認められなかった（図１）。
３　血中ＡＬＴ／ＡＳＴ活性
　図２ＡはマウスにｍＭａｌａｔ１オリゴを投与３日後、血中ＡＬＴ活性の変化を示す。　図２ＢはマウスにｍＭａｌａｔ１オリゴを投与３日後、血中ＡＳＴ活性の変化を示す。　ｍＭａｌａｔ１オリゴ投与群のＡＬＴおよびＡＳＴ活性は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比べ、有意な変化は認められなかった。
４　組織中ｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現変化
４．１　肝臓
　肝臓のｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、Ｌ００１－ＨＤＯ６投与群はＶｅｈｉｃｌｅ投与群及びＬ００１相補鎖投与群に比べ有意に低下した（図３）。
４．２　腎
　腎臓のｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、Ｌ００１－ＨＤＯ６投与群はＶｅｈｉｃｌｅ投与群及びＬ００１相補鎖投与群に比べ有意に低下した（図４）。
　本実施例では、Ｌ００１－ＨＤＯ６を被験体に静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）することにより、ＰＴＨ１受容体が発現する臓器、例えば肝臓にＬ００１－ＨＤＯ６がデリバリーされ、標的転写産物であるｍＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡの発現を抑制する結果となった。
［実施例４］
Ｌ００１－ＨＤＯ６－Ａｌｅｘａ４８８投与後腎臓の免疫染色像による組織学的検査
　免疫染色像による組織学的検査に用いる蛍光標識ＨＤＯを図５に示す。
　実施例２で調製したアンチセンス鎖（配列番号１７９）の５’端にＡｌｅｘａ４８８を結合した蛍光標識ＡＳＯと、Ｌ００１相補鎖（配列番号１８０）を実施例２に記載されている方法によりアニーリングを行い、二本鎖複合体を形成することにより、蛍光標識ＨＤＯ（Ｌ００１－ＨＤＯ６－Ａｌｅｘａ４８８）を作製した。
　免疫組織化学検討はｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１２匹）を用いて行った。蛍光標識ＨＤＯ（Ｌ００１－ＨＤＯ６－Ａｌｅｘａ４８８）１μｍｏｌ／ｋｇをマウスに静脈単回投与し、１０分後、６時間後、２４時間後及び７２時間後、イソフルラン麻酔下にて心内採血し、左心室内挿管により、１０ｍｌのＳａｌｉｎｅを潅流した後、１０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド液にて潅流し、マウスから腎臓を摘出した。さらに４％パラホルムアルデヒドに浸漬、凍結切片を作成した。各凍結切片に対し、腎臓糸球体はＮｅｐｈｒｉｎ（一次抗体Ｍｏｕｓｅ　Ｎｅｐｈｒｉｎ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ：ＡＦ３４５９））、二次抗体Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　５９４　ｃｈｉｃｋｅｎ　ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａ－２１４６８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、ＤＮＡを含む細胞核はＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて染色した。病理切片の蛍光画像はＯｌｙｍｐｕｓ　ＶＳ１２０　Ｓｌｉｄｅ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍにて取り込んだ。
　図６は蛍光標識ＨＤＯ（Ｌ００１－ＨＤＯ６－Ａｌｅｘａ４８８）１μｍｏｌ／ｋｇをｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにｉ．ｖ．単回投与し、投与後１０分、６時間、２４時間および７２時間後の腎臓の免疫組織染色像を示す。投与後の各時間の写真は、それぞれ４枚の写真で構成されている。左上写真はＤＡＰＩ染色の結果を示す紫外線（ＵＶ）蛍光像である。左下写真は、抗Ｎｅｐｈｒｉｎ抗体で染色した結果を示す赤色蛍光像（ｒｅｄ－Ａｌｅｘａ５９４）である。右上写真はＬ００１－ＨＤＯ６－Ａｌｅｘａ４８８（ｇｒｅｅｎ－Ａｌｅｘａ４８８）の染色の結果を示す緑色蛍光像である。右下写真は上記３枚の写真を重ね合わせ画像（マージ）である。
結果
１　糸球体
　糸球体内からはＡｌｅｘａ－４８８の蛍光がＬ００１－ＨＤＯ６試薬投与１０分後で薄く観察されるが、６、２４及び７２時間のいずれの観察時点で観察されなかった。
２　尿細管
　尿細管細胞ではＡｌｅｘａ－４８８の蛍光がＬ００１－ＨＤＯ６試薬投与１０分後から観察され、６時間で強くなり、２４時間では最も強く、７２時間においても多くの尿細管から蛍光が観察された。
　本実施例では、Ｌ００１－ＨＤＯ６を被験体に静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）することにより、Ｌ００１－ＨＤＯ６はＰＴＨ１受容体が発現する臓器、例えば肝臓にデリバリーされ、肝臓中の尿細管内に７２時間に亘って蓄積されたことを示す結果となった。
［実施例５］
　この実施例で使用する核酸複合体は、実施例で作製したマウスＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡをターゲットとする１６ｍｅｒのＨＤＯ或いはＡＳＯにＰＴＨ１リガンドを付与したものである。発明者らは、これらのオリゴを生理食塩液（大塚製薬工場）にて調製し、動物評価用のオリゴはブロックバス（ＣＤＢ－１０５、アズワン）にて、細胞評価用の２本鎖のＨＤＯはＴ１００　サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にて、９５℃で１０分間変性させ、その後、冷却（約２時間）し室温に戻すアニーリング操作を行った。動物評価用のオリゴは生理食塩液で１００　ｎｍｏｌ／ｍＬに最終調製し、細胞評価用のオリゴは０．１％　ＦＣＳのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて種々の濃度に調製した。
動物
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本ＳＬＣ、雌性、入荷時４週齢）を用いた。動物は室温（２４±２℃）、湿度（５５±５　％）および１２時間照明（７：００－１９：００）の環境下でプラスチックの飼育ゲージに５匹ずつ飼育し、自由飲水と固形飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母工業）を与え、１週間を馴化した。
ｉｎ　ｖｉｖｏ評価方法
　マウスの体重によりＶｅｈｉｃｌｅ（Ｓａｌｉｎｅ、大塚製薬工場）投与群及び種々のＰＴＨ１リガンド－ＨＤＯ（１μｍｏｌ／ｋｇ）投与群に分けた（各群動物ｎ＝５）。試薬投与当日、マウスを覚醒下で保定器にて保定し、尾静脈或いは頚背部皮下より試剤をゆっくり投与（１０ｍＬ／ｋｇ、Ｄａｙ　０）した。投与後、投与部位の止血を確認し、飼育ケージに戻した。投与３日後（Ｄａｙ　３）に剖検を実施した。剖検当日、イソフルラン（３－５％で導入、１－３％で維持）麻酔下にて放血により安楽死させた。開腹し、肝臓、腎臓、肺、心臓、及び大腿筋を摘出した。摘出した臓器は速やかにＩＳＯＧＥＮに浸漬し、ｍＲＮＡ抽出に供した。
　ｍＲＮＡ抽出のため組織の破砕はＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ　ＩＩ　（ＱＩＡＧＥＮ）を用いたビーズ破砕法にて行った。組織破砕液からＴｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出はＲｅｌｉａＰｒｅｐＴＭ　ＲＮＡ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡの調製はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて逆転写した。各遺伝子の　ｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて計測した。マウスＭａｌａｔ１（Ｍｍ　０１２２７９１２－ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｍＲＮＡのＴａｑＭａｎプローブセットを用いた。
　すべての測定値は平均値±標準偏差で表した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　９．４．０を用いて行い、群間の比較は一元配置分散分析の後にＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定にて、また独立２標本間の比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔで行った。なお危険率はいずれも５％未満を統計学的有意とした。
結果
１．　ＰＨＴ１リガンドのペプチドのアミノ酸配列の長さを変更したリガンドの検討
　腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、ＰＴＨ１リガンドを付与しないＨＤＯ静脈内投与群（ＨＤＯ）では統計学的有意な抑制を示さなかったが、ＰＴＨ１リガンドを付与したＨＤＯ静脈内投与群（Ｌ００１－ＨＤＯ６、Ｌ００３－ＨＤＯ６、Ｌ００５－ＨＤＯ６及びＬ０１０－ＨＤＯ６）では、いずれもＳａｌｉｎｅ投与群に比べ統計学的有意に低下した。またＨＤＯとの比較においてもＰＴＨ１リガンドを付与したＨＤＯ静脈内投与群（Ｌ００１－ＨＤＯ６、Ｌ００３－ＨＤＯ６、Ｌ００５－ＨＤＯ６及びＬ０１０－ＨＤＯ６）はいずれも統計学的有意に腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を低下した。結果を図７に示す。
　Ｌ００１は３４アミノ酸残基からなるペプチドであり、Ｌ００３はＬ００１のＮ末端から２アミノ酸残基を欠いた３２アミノ酸残基からなるペプチドであり、Ｌ００５はＬ００１のＮ末端から４アミノ酸残基を欠いた３０アミノ酸残基からなるペプチドであり、Ｌ０１０は、Ｌ００１のＮ末端から９アミノ酸残基を欠いた２５アミノ酸残基からなるペプチドである。
　Ｌ００１の３４アミノ酸残基からなるペプチドを結合したＨＤＯは、標的遺伝子の発現を阻害した結果となった。さらに、３４アミノ酸残基からなるペプチドのＮ末端側からそれぞれ２、４、９アミノ酸残基を欠損した３２、３０及び２５アミノ酸残基からなるペプチドを結合したＨＤＯもそれぞれ標的遺伝子の発現を阻害した結果となり、ペプチドのＮ末端側から少なくとも９個のアミノ酸残基を欠損したペプチドはアンチセンス効果を有することを示した。
　図７及びその他の図中、記号　＊，　＊＊＊　：　ｖｓ　Ｓａｌｉｎｅ　ａｔ　Ｐ＜０．０５　ｏｒ　０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔ）を表し、記号　＃，　＃＃，　＃＃＃　：　ｖｓ　ＨＤＯ　ａｔ　Ｐ＜０．０５，０．０１　ｏｒ　０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔ）を表す。
２．皮下投与
　腎臓のＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現は、リガンドを付与しないＨＤＯ皮下投与群（ＨＤＯ）では統計学的有意な抑制を示さなかった。一方、リガンドを付与したＨＤＯ皮下投与群（Ｌ０３１－ＨＤＯ６及びＬ０２１－ＨＤＯ６）では、いずれもＳａｌｉｎｅ投与群に比べ統計学的有意に低下した（図８）。また、Ｌ０２１－ＨＤＯ６は、皮下投与群も静脈内投与群も同程度に有意に標的遺伝子の阻害活性を示した。
　Ｌ０３１は３５アミノ酸残基からなるペプチドであり、Ｌ０２１は３４アミノ酸残基からなるペプチドである。これらのペプチドのアミノ酸配列の違いは、Ｃ末端側のＴがあるかないかＫ（Ｌｙｓ）の位置の違いであるが、どちらのペプチドも標的遺伝子の発現を有意に阻害した。
３．　ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ
細胞
　ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法によりＮＩＨ／３Ｔ３細胞株にｍｏｕｓｅ　Ｐｔｈ１Ｒ（ｍＰｔｈ１Ｒ）を安定発現させた細胞株を用いた。ＰＴＨ１リガンドの作用評価に用いたｍＰｔｈ１Ｒの安定発現クローン細胞株は、３３Ｋのアゴニスト活性でＩＣ５０がおおよそ１００ｐＭのｃＡＭＰ誘導能を有する細胞株である。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価方法
　ｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を９６穴プレートに１．５ｘ１０４個／ｗｅｌｌで播種した。播種２４時間後に各穴のｍｅｄｉｕｍを吸引除去し、０．１％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭで調製された種々の濃度のＰＴＨ１リガンド－ＨＤＯを１００　μＬずつ各穴に添加した。細胞からのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出はＳＶ　９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＲＮＡ精製キットのプロトコールに則り行った。すなわちＰＴＨ１リガンド－ＨＤＯ添加から２４時間後に各穴のｍｅｄｉｕｍを吸引除去し、次いでＰＢＳにて各穴の洗浄を行った。ＰＢＳを吸引除去し、次いでＲＮＡ精製キット付属のＲＮＡ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒを各穴に１００　μＬずつ加え、細胞の溶解を行った。これ以降の操作についてはＳＶ　９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従いｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（ＴａＫａＲａ）を用いた。各遺伝子のｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて計測した。標的遺伝子の解析にはＭａｌａｔ１（Ｍｍ　０１２２７９１２－ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、内部標準遺伝子としてＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＴａｑＭａｎプローブを用いた。
　すべての測定値はＮ＝３の平均値±標準偏差で表した。ＩＣ５０はＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　９．４．０を用い算出した。
３．１．Ｌ０２１－ＨＤＯ６、Ｌ００３－ＨＤＯ６、Ｌ００５－ＨＤＯ６、Ｌ０１０－ＨＤＯ６
　Ｌ０２１－ＨＤＯ６、Ｌ００３－ＨＤＯ６、Ｌ００５－ＨＤＯ６、Ｌ０１０－ＨＤＯ６は、いずれも濃度依存的にＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を低下させ、それぞれのＩＣ５０は、４６．８ｎＭ、８８．９ｎＭ、１２１．３ｎＭ及び１６６．７ｎＭであった（図９）。配列番号２１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号１０のペプチドからなるＰＴＨ１リガンドを結合したＨＤＯは、標的遺伝子に対し濃度依存的なアンチセンス効果を有することを示す結果となった。
３．２．Ｌ０２１－ＨＤＯ６及びＬ０１１－ＨＤＯ６
　Ｌ０２１－ＨＤＯ６及びＬ０１１－ＨＤＯ６は、いずれも濃度依存的にＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を低下させ、それぞれのＩＣ５０は、６．９４－１０．２ｎＭ及び１１．８－１４．１ｎＭであった（図１０）。配列番号２１、配列番号１１のペプチドからなるＰＴＨ１リガンドを結合したＨＤＯは、標的遺伝子に対し濃度依存的なアンチセンス効果を有することを示す結果となった。
３．３．Ｌ０３１－ＨＤＯ６及びＬ０４０－ＨＤＯ６
　Ｌ０３１－ＨＤＯ６及びＬ０４０－ＨＤＯ６は、いずれも濃度依存的にＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を低下させ、それぞれのＩＣ５０は、４１．５－７１　ｎＭ及び９２．２－１１１ｎＭであった（図１１）。配列番号３１、配列番号４０のペプチドからなるＰＴＨ１リガンドを結合したＨＤＯは、標的遺伝子に対し濃度依存的なアンチセンス効果を有することを示す結果となった。
３．４．Ｌ０８９－ＨＤＯ６及びＬ０９８－ＨＤＯ６
　Ｌ０８９－ＨＤＯ６及びＬ０９８－ＨＤＯ６は、いずれも濃度依存的にＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を低下させ、それぞれのＩＣ５０は、１．１４－１．６１ｎＭ及び４７．７－８２．７ｎＭであった（図１２）。配列番号８９、配列番号９８のペプチドからなるＰＴＨ１リガンドを結合したＨＤＯは、標的遺伝子に対し濃度依存的なアンチセンス効果を有することを示す結果となった。
３．５．Ｌ１６５－ＨＤＯ６及びＬ１６８－ＨＤＯ６
　Ｌ１６５－ＨＤＯ６及びＬ１６８－ＨＤＯ６は、いずれも濃度依存的にＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を低下させ、それぞれのＩＣ５０は、２７．８－１８５　ｎＭ及び１１．４－９６．５ｎＭであった（図１３）。配列番号１６５、配列番号１６８のペプチドからなるＰＴＨ１リガンドを結合したＨＤＯは、標的遺伝子に対し濃度依存的なアンチセンス効果を有することを示す結果となった。
３．６．　Ｌ００１－ＡＳＯ
　ＰＴＨ１リガンドＬ００１を結合したＡＳＯであるＬ００１－ＡＳＯは、いずれも濃度依存的にＭａｌａｔ１　ｎｃＲＮＡ発現を低下させ、ＩＣ５０は１．２５　ｎＭであった（図１４）。配列番号１のペプチドからなるＰＴＨ１リガンドを結合したＡＳＯは、標的遺伝子に対し濃度依存的なアンチセンス効果を有することを示す結果となった。本発明のＰＴＨ１リガンドは一本鎖核酸分子に結合して、標的遺伝子に対し濃度依存的なアンチセンス効果を示した。
［実施例６］
　本発明の核酸複合体は、標的遺伝子又は標的転写産物に対しハイブリダイズ可能なアンチセンス鎖を有しアンチセンス効果を奏するものであればよく、二本鎖の場合はさらにアンチセンス鎖とハイブリダイズ可能な相補鎖の組み合わせを用いることができる。例えば次の配列からなるｓｉＲＮＡから選択することが可能であるし、異なる疾患を標的とする場合、標的転写産物が異なることから、それぞれの標的に応じた核酸配列を持つアンチセンス鎖を有する核酸分子を用いることができる。
　ある実施態様では、核酸複合体は、次のアンチセンス鎖（配列番号１８１）とガイド鎖（配列番号１８２）とからなるｓｉＲＮＡを用いることができる。
配列番号１８１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
配列番号１８２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　上記配列番号１８１、１８２において、大文字イタリックは２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、下線小文字イタリックは２’－フルオロ－糖修飾を表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
　配列番号１８１はｍＧａｐｄｈ　ｍＲＮＡを標的とする２３個の核酸（２３ｍｅｒ）からなるアンチセンス鎖であり、ｍＧａｐｄｈ　ｍＲＮＡを標的とし、マウスＧａｐｄｈ　ｍＲＮＡの標的部位にハイブリダイズ可能な配列で構成されている。
　配列番号１８２は配列番号１８１のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する２３個の核酸（２１ｍｅｒ）からなる相補鎖であり、配列番号１８１のアンチセンス鎖にハイブリダイズ可能な配列で構成されている。
　ＨＤＯと同様にコンジュゲーション反応を行い、配列番号１８２の相補鎖の５‘端にリガンド分子を結合することができる。
　この実施例で使用するＰＴＨ１リガンド結合核酸複合体は、上述したマウスＧａｐｄｈ　ｍＲＮＡをターゲットとする２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡに、実施例２の方法に従ってＰＴＨ１リガンドＬ０１０を結合したＬ０１０－ｓｉＲＮＡである。発明者らは、これらのオリゴを生理食塩液（大塚製薬）にて調製し、細胞評価用のｓｉＲＮＡはＴ１００　サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にて、９５℃で１０分間変性させ、その後、冷却（約２時間）し室温に戻すアニーリング操作を行った。動物評価用のオリゴは生理食塩液で１００　ｎｍｏｌ／ｍＬに最終調製し、細胞評価用のオリゴはＯｐｔｉ―ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて種々の濃度に調製した。
細胞
　ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法によりＮＩＨ／３Ｔ３細胞株にｍｏｕｓｅ　Ｐｔｈ１Ｒ　（ｍＰｔｈ１Ｒ）を安定発現させた細胞株を用いた。
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価方法
　ｍＰｔｈ１Ｒ安定発現細胞株を９６穴プレートに３．７５ｘ１０３個／ｗｅｌｌで播種した。播種４時間後に各穴のｍｅｄｉｕｍを吸引除去し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで調製された種々の濃度のＬ０１０－ｓｉＲＮＡを１００μＬずつ各穴に添加した。細胞からのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出はＳＶ９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＲＮＡ精製キットのプロトコールに則り行った。すなわちＬ０１０－ｓｉＲＮＡ添加から７２時間後に各穴のｍｅｄｉｕｍを吸引除去し、次いでＰＢＳにて各穴の洗浄を行った。ＰＢＳを吸引除去し、次いでＲＮＡ精製キット付属のＲＮＡ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒを各穴に１００　μＬずつ加え、細胞の溶解を行った。これ以降の操作についてはＳＶ９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍに従いｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）を用いた。各遺伝子のｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて計測した。標的遺伝子の解析にはＧａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、内部標準遺伝子としてＡｃｔｂ（Ｍｍ０１２０５６４７＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＴａｑＭａｎプローブを用いた。すべての測定値はＮ＝４の平均値±標準偏差で表した。
　試験結果を図１５に示す。ＰＴＨ１リガンドであるＬ０１０を結合したｓｉＲＮＡ１０μＭは、コントロール（0 μＭ）投与群に比べｍＧａｐｄｈ　ｍＲＮＡ発現を１４％低下させた。本発明のＰＴＨ１リガンドはｓｉＲＮＡに結合した場合においても、標的遺伝子に対しアンチセンス効果を示した。
　本発明のリガンド結合核酸複合体は、ＰＴＨ１受容体を持つ臓器にデリバリーされて標的遺伝子又はその転写産物の発現又は編集を調節する核酸医薬に用いることができる。
１～１８２　合成
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (26)

  1. 　標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子と、ＰＴＨ１リガンドが、リンカーを介して、又は介さず結合するリガンド結合核酸複合体。
  2. 　ＰＴＨ１リガンドが、下記式で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載のリガンド結合核酸複合体：
    ［化１］
    Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９－Ａ１０－Ａ１１－Ａ１２－Ａ１３－Ａ１４－Ａ１５－Ａ１６－Ａ１７－Ａ１８－Ａ１９－Ａ２０－Ａ２１－Ａ２２－Ａ２３－Ａ２４－Ａ２５－Ａ２６－Ａ２７－Ａ２８－Ａ２９－Ａ３０－Ａ３１－Ａ３２－Ａ３３－Ａ３４
    [式中、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向かって記述したものである。
    式中、
    Ａ１はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｄａｐまたは欠損しており；
    Ａ２はＶａｌまたは欠損しており；
    Ａ３はＳｅｒ，Ｔｈｒ、Ａｉｂまたは欠損しており；
    Ａ４はＧｌｕまたは欠損しており；
    Ａ５はＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
    ｐ－Ｘ－Ｐｈｅまたは欠損しており、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
    Ａ６はＧｌｎ；
    Ａ７はＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅｐ－Ｘ－Ｐｈｅまたは欠損しており、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
    Ａ８はＭｅｔ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ａｃｃ、Ｎｌｅまたは欠損しており；
    Ａ９はＨｉｓまたは欠損しており；
    Ａ１０はＡｓｐまたはＡｓｎであり；
    Ａ１１はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
    またはｐ－Ｘ－Ｐｈｅであり、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
    Ａ１２はＧｌｙ、Ａｃｃ、またはＡｉｂであり；
    Ａ１３はＬｙｓ；
    Ａ１４はＳｅｒまたはＨｉｓであり；
    Ａ１５はＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、β－Ｎａｌ、Ｔｒｐ、Ｐａｌ、Ａｃｃ、Ｐｈｅ
    またはＰ－Ｘ－Ｐｈｅであり、この際、ＸはＯＨ、ハロゲン、またはＣＨ３であり；
    Ａ１６はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＡｉｂであり；
    Ａ１７はＳｅｒ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、またはＡｉｂであり；
    Ａ１８はＭｅｔ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ａｃｃ、Ｃｈａ、またはＡｉｂであり；
    Ａ１９はＡｒｇ、ＧｌｕまたはＡｉｂであり；
    Ａ２０はＡｒｇ；
    Ａ２１はＡｒｇ、Ｖａｌ、Ａｃｃ、Ｃｈａ、またはＭｅｔであり；
    Ａ２２はＰｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
    Ａ２３はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
    Ａ２４はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
    Ａ２５はＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＧｌｕであり；
    Ａ２６はＨｉｓ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＬｙｓであり；
    Ａ２７はＬｙｓ、Ａｉｂ、Ｌｅｕ、ｈＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
    Ａ２８はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｃｃ、またはＣｈａであり；
    Ａ２９はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｃｃ、またはＡｉｂであり；
    Ａ３０はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｃｈａ、Ａｉｂ、Ａｃｃ、またはＬｙｓであり；
    Ａ３１はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｃｈａ、Ｌｙｓ若しくはＡｃｃであり；
    Ａ３２はＨｉｓであり；
    Ａ３３はＴｈｒ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＣｙｓであり；
    Ａ３４はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、ＡｍｐまたはＡｉｂである]。
  3. 　ＰＴＨ１リガンドが、配列番号１～配列番号１６８からなる群から選択されるいずれか一つの配列からなるペプチドである、請求項１に記載のリガンド結合核酸複合体。
  4. 　ＰＴＨ１リガンドが、配列番号１～配列番号１６４からなる群から選択されるいずれか一つの配列からなるペプチドである、請求項２に記載のリガンド結合核酸複合体。
  5. 　核酸分子と、ＰＴＨ１リガンドが、リンカーを介して結合している、請求項４に記載のリガンド結合核酸複合体。
  6. 　リンカーが、切断可能な構造を有する切断性リンカーである、請求項５に記載のリガンド結合核酸複合体。
  7. 　リンカーが、以下の構造を有するリンカーのいずれかである、請求項６に記載のリガンド結合核酸複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  8. 　核酸分子が、標的遺伝子又はその転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸分子、標的タンパク質に対して特異的に結合する核酸塩基配列を有するアプタマー及び標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドからなるデコイからなる群から選択される核酸分子である、請求項１に記載のリガンド結合核酸複合体。
  9. 　核酸分子がＡＤＯ、ＡＳＯ、ＨＤＯ及びＲＮＡｉからなる群から選択される核酸分子である、請求項１に記載のリガンド結合核酸複合体。
  10. 　核酸分子のアンチセンス鎖が連続する１２～３０のヌクレオチドからなる、請求項９に記載のリガンド結合核酸複合体。
  11. 　核酸分子が標的転写因子に対して相補的である核酸配列を有し８～３０のヌクレオチドからなるデコイである、請求項８に記載のリガンド結合核酸複合体。
  12. 　前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡからなるアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるｓｉＲＮＡである、請求項９に記載のリガンド結合核酸複合体。
  13. 　核酸分子の核酸鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、請求項９に記載のリガンド結合核酸複合体。
  14. 　核酸分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、１２～３０ヌクレオチドからなる、請求項１３に記載のリガンド結合核酸複合体。
  15. 　核酸分子がＨＤＯであり、ＨＤＯのアンチセンス鎖及び相補鎖のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、それぞれ１２～３０ヌクレオチドからなる、請求項１３に記載のリガンド結合核酸複合体。
  16. 　アンチセンス鎖は、ギャップマーであり、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むギャップ領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を含む、請求項１５に記載のリガンド結合核酸複合体。
  17. 　アンチセンス鎖は、非ギャップマーであり、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、請求項１５に記載のリガンド結合核酸複合体。
  18. 　相補鎖は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む、請求項１７に記載のリガンド結合核酸複合体。
  19. 　相補鎖は、ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含むセンター領域と、その５’末側及び／又は３’末側に配置される１又は複数のヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含むウィング領域を含む、請求項１６に記載のリガンド結合核酸複合体。
  20. 　修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－ＣＨ３基又は２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）基を含むヌクレオチドである、請求項１３に記載のリガンド結合核酸複合体。
  21. 　ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ－ＢＮＡからなる群から独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のリガンド結合核酸複合体。
  22. 　ヌクレオチドアナログは、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ｃＥｔ、ｔｃＤＮＡ、モルホリノ核酸、ＢＮＡ、ＧｕＮＡ及びｓｃｐＢＮＡからなる群から独立して選択される、請求項１３に記載のリガンド結合核酸複合体。
  23. 　核酸分子における少なくとも１つのヌクレオチド若しくは修飾ヌクレオチドがホスホロチオエート化若しくはボラノホスフェート化されている、請求項１３に記載のリガンド結合核酸複合体。
  24. 　ＰＴＨ１受容体を発現する被験体の臓器において標的転写産物の発現量を減少させるためのアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖を被験体の臓器にデリバリーするためのＰＴＨ１リガンドを有するリガンド結合核酸複合体であって、該アンチセンス鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有する、リガンド結合核酸複合体。
  25. 　核酸複合体が第１核酸鎖と第２核酸鎖とからなる二本鎖核酸剤であり、該第１核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、かつ、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、該第２核酸鎖は、該第１核酸鎖に相補的な塩基配列を含み、かつ、ＰＴＨ１リガンドと結合しており、該第１核酸鎖は、該第２核酸鎖にアニールしている、請求項２４に記載のリガンド結合核酸複合体。
  26. 　静脈内投与用のリガンド結合核酸複合体である、請求項２５に記載のリガンド結合核酸複合体。
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