JP6882735B2 - 構造強化されたmiRNA阻害剤S−TuD - Google Patents
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Description
さらに最近本発明者らの一部は、miRNAを効率的に阻害するためのmiRNA阻害体、該阻害体を細胞内で発現させるためのベクター、該ベクターの構築方法、および該阻害体またはベクターを利用したmiRNAの阻害方法を開発した(特許第4936343号公報=特許文献1)。
(1)RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、該miRNA阻害複合体は、少なくとも1つの二本鎖構造およびmiRNA結合配列を含み、該miRNA結合配列の2つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に一本ずつ結合しており、該miRNA阻害複合体は少なくとも1つの架橋核酸(BNA)を含む、miRNA阻害複合体。
(2)前記BNAは2’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、4’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも1つ原子を介して架橋されたBNAを含む、項目1に記載の複合体。
(3)前記BNAは
(4)前記BNAは、
(5)前記BNAは、
(6)前記BNAはBNANC(NMe)である、項目1〜5のいずれか一項に記載の複合体。
(7)前記BNAは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記miRNA結合配列の相補鎖の少なくとも一つの鎖に含まれる、項目1〜6のいずれか一項に記載の複合体。
(8)前記BNAは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる、項目1〜7のいずれか一項に記載の複合体。
(9)前記BNAは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる、項目1〜8のいずれか一項に記載の複合体。
(10)前記BNAは2つ以上含まれる、項目1〜9のいずれか一項に記載の複合体。
(11)前記BNAは4つ以上含まれる、項目1〜10のいずれか一項に記載の複合体。
(12)前記BNAは6つ以上含まれる、項目1〜11のいずれか一項に記載の複合体。
(13)前記複合体は、前記二本鎖構造を2つ以上含み、該二本鎖構造の第1の二本鎖構造の片端の2つの鎖にmiRNA結合配列を含む鎖がそれぞれ1本ずつ結合しており、該2つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該2つ以上の二本鎖構造の第2の二本鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合している、項目1〜12のいずれか一項に記載の複合体。
(14)前記miRNA結合配列を含む2つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している、項目1〜13のいずれか一項に記載の複合体。
(15)前記リンカーの長さは1〜5塩基長である、項目14に記載の複合体。
(16)前記二本鎖の構造は、少なくとも6塩基長である、項目1〜15のいずれか一項に記載の複合体。
(17)前記二本鎖の構造は、少なくとも8塩基長である、項目1〜16のいずれか一項に記載の複合体。
(18)前記二本鎖の構造は、少なくとも10塩基長である、項目1〜17のいずれか一項に記載の複合体。
(19)前記二本鎖の構造は、少なくとも15塩基長である、項目1〜18のいずれか一項に記載の複合体。
(20)前記二本鎖の構造は、少なくとも18塩基長である、項目1〜19のいずれか一項に記載の複合体。
(21)前記二本鎖の構造は、50塩基長以下である、項目1〜20のいずれか一項に記載の複合体。
(22)2から5つのmiRNA結合配列を含む、項目1〜21のいずれか一項に記載の複合体。
(23)2つのmiRNA結合配列を含む、項目1〜22のいずれか一項に記載の複合体。
(24)項目1〜23のいずれか一項に記載の複合体であって、以下
(24A)前記二本鎖構造は各鎖の端部が互いに結合し一本鎖核酸の形態である、項目1〜24のいずれか一項に記載の複合体。
(24B)直鎖状一本鎖RNAまたはその類縁体から構成される、項目1〜24または24Aのいずれか一項に記載の複合体。
(24C)前記複合体は、前記二本鎖構造の片端の2つの鎖に、miRNA結合配列を含む2つの鎖の末端が、それぞれ1〜5塩基のリンカーを介して1本ずつ結合しており、二本鎖または四本鎖から選択される第2の多重鎖構造を含み、該二本鎖構造と該第2の多重鎖構造とに挟まれるように、該miRNA結合配列を含む2つの鎖のそれぞれの他端が、該第2の多重鎖構造の片端の2つの鎖に、それぞれ1〜5塩基のリンカーを介して結合している、項目1〜24、24Aまたは24Bのいずれか一項に記載の複合体。
miRNA阻害複合体であって、該miRNA結合配列を含む2つの鎖は、それぞれの鎖がmiRNA結合配列を含み、miRNA結合配列を含む鎖が2つあるものである
(24D)前記miRNA結合配列を含む2つの鎖は、それぞれの鎖がmiRNA結合配列を含み、miRNA結合配列を含む鎖が2つある、項目1〜24、24A、24Bまたは24Cのいずれか一項に記載の複合体。
(25)項目1〜24、24A、24B、24Cまたは24Dのいずれか一項に記載の複合体を構成するRNAまたはその類縁体。
(26)項目1〜24、24A、24B、24Cまたは24Dのいずれか一項に記載の複合体または項目25に記載のRNAまたはその類縁体を製造する方法であって、
A)化学合成により、リボ核酸およびBNAを用いて、目的とするRNAまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程;
B)生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程;ならびに
必要に応じてC)脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程
を包含する方法。
(27)項目1〜24、24A、24B、24Cまたは24Dのいずれか一項に記載の複合体を含む医薬。
(27A)医薬として使用するための、項目1〜24、24A、24B、24Cまたは24Dのいずれか一項に記載の複合体。
(27B)項目1〜24、24A、24B、24Cまたは24Dのいずれか一項に記載の複合体をそれを必要とする被験者に投与する工程を包含する、疾患または障害の治療または予防の方法。
本発明は、miRNAを効率的かつ特異的に阻害することができるmiRNA阻害複合体の改良型に関する。本発明のmiRNA阻害複合体は、少なくとも1つの二本鎖構造およびmiRNA結合配列(MBS)を含み、miRNA結合配列の2つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に(通常、それぞれ一本ずつ)結合しており、そのうえで、miRNA阻害複合体は少なくとも1つの架橋核酸(BNA)を含むことを特徴とするものである。本発明の阻害複合体は「S-TuD」と称することもある。なお本発明においては、この二本鎖構造を「第一の」二本鎖構造と呼ぶことで、本発明の複合体に含まれ得るさらなる二本鎖構造と区別できるようにすることがある。本発明の複合体は、一本鎖(すなわち共有結合で結合した1分子)であってもなくてもよく、例えば一本鎖、二本鎖、またはそれ以上の複数の鎖で構成されていてよい。例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、MBSを含むRNA鎖が、それぞれ一本ずつ結合した、二本鎖RNAからなる複合体は、複合体中に少なくとも1つの架橋核酸(BNA、例えば、BNANC(NMe))を含む限り、本発明に含まれる。また、例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、少なくとも1つのMBSを含む一本のRNA鎖が結合していてもよい。この場合、MBSを含むRNA鎖により、二本鎖構造の片端の2つの鎖はつながれることになる。二本鎖構造の2つの鎖をつなぐRNAには、MBSが少なくとも1つ含まれているが、例えば2つ、3つ、またはそれ以上含まれていてもよい。二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンを含む。すなわち、二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンに含まれる二本鎖構造であってもよい。
本発明の特徴の一つに、特定の修飾核酸として安定化型核酸、すなわち、二本鎖形成が促進される修飾核酸が含まれることが特徴であり、例えば広義の架橋核酸(BNA)を含めている点がある。
れる少なくとも1つ原子を介して架橋されたBNAであり得る。
架橋鎖に分岐を持つBNAは、これに限定されるものではないが、たとえばBNA(cEt)
(2)また、BNANC(NMe)修飾DNAオリゴヌクレオチドは二本鎖DNA鎖に対する三重鎖形成能にも卓越している。
<1>ヌクレオシド類縁体の合成
((BNA−1)及び(BNA−2))
一般式(BNA−1)及び(BNA−2)で表される化合物は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。反応条件、保護基導入試薬、反応試薬は、具体的には実施例に記載の方法を参考にすることができるが、これに限定されず、本分野の技術常識に基づき使用可能な反応条件、試薬を適宜採用することができる。例えば、特開2000−297097号公報、特開平10−304889号公報に記載の方法を参考にすることができる。また、一般式(BNA−1)及び(BNA−2)におけるBaseとして種々の天然、非天然の核酸塩基およびその他の芳香族複素環や芳香族炭化水素環を有する場合についても、特開平10−304889号公報に記載の方法を参考にして、本発明化合物の原料を合成することができる。
化合物A−1
(2)化合物A−3の合成
(たとえば窒素気流下、)化合物A−2(たとえば146mg,0.23mmol)の溶液(たとえばピリジン溶液(1.5ml))に適切な温度(たとえば氷冷下)、PG5X(式中、PG5は、本明細書に記載の保護基であり、Xは、Cl、Br、Iであり、たとえば塩化メチルスルホニル(45.1ml,0.59mmol)である)を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば1時間)撹拌する。(たとえば反応溶液に水を加えて)反応をクエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、有機層を(たとえば飽和重曹水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物A−3を得る。化合物A−3は精製せずに次の反応に用いることもできる。
(3)化合物A−4の合成
化合物A−3(たとえば170mg)の溶液(たとえば水−エタノール溶液(1:2,6ml))に、適切な温度(たとえば室温)で適切な試薬(たとえば1M水酸化ナトリウム水溶液(0.70ml,0.70mmol))を加え、適切な時間(たとえば1時間)撹拌することにより、2’位に(CR1R1’)mzOHを導入する(R1およびR1’は、本明細書に記載の置換基である)。(たとえば10%塩酸水溶液で)中和後、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出する。有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=15:1)により)精製し、化合物A−4を得る(たとえば139mg,95%(2段階),白色固体)。
(4)化合物A−5の合成
(たとえば窒素気流下、)化合物A−4(たとえば0.80g,1.28mmol)の溶液(たとえばエタノール溶液(10ml))に、適切な試薬(たとえば20%水酸化パラジウム−炭素粉末(0.60g)、シクロヘキセン(5.2ml,51mmol))を加え、適切な時間(たとえば5時間)、適切な温度条件(たとえば加熱還流)で撹拌することにより、PG2およびPG3を除去する。PG2を除去する工程とPG3を除去する工程は、同一の工程であっても、別々の工程であってもよい。反応溶液を濾過後、溶媒を減圧留去する。得られた粗生成物A−5は、精製せずに次の反応に用いることができる。
(5)化合物A−6の合成
(たとえば窒素気流下、)化合物A−5(たとえば0.46g)の溶液(たとえばN,N−ジメチルホルムアミド溶液(10ml))に、PG6X(式中、PG6は、本明細書に記載の保護基であり、Xは、Cl、Br、Iであり、たとえば1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン(0.45ml,1.41mmol)である)、塩基(たとえばイミダゾール(0.38g,5.63mmol))を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば5時間)撹拌することによりPG6を導入する。反応液を適切な有機溶媒(たとえばエーテル)で抽出し、有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄した後、適切な乾燥剤(たとえば硫酸マグネシウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1→1:1)により)精製し、化合物A−6を得る(たとえば0.60g,68%(2段階),白色固体)。
(6)化合物A−7の合成
(たとえば窒素気流下、)化合物A−6(たとえば200mg,0.29mmol)の溶液(たとえばピリジン溶液(3ml))に適切な温度(たとえば氷冷下)、PG5X(式中、PG5は、本明細書に記載の保護基であり、Xは、Cl、Br、Iであり、たとえば無水トリフルオロメタンスルホン酸(0.15ml,0.88mmol))、塩基(たとえば4−(ジメチルアミノ)ピリジン(7mg,0.06mmol))を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば7.5時間)撹拌する。(たとえば反応溶液に水を加えて)反応をクエンチし、適切な有機溶媒(たとえばジクロロメタン)で抽出する。有機層を(たとえば飽和重曹水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物A−7を得る。得られるA−7は精製せず、次の反応に用いることができる。
(7)化合物A−8の合成
化合物A−7の2’位のヒドロキシ基にアミノ基を導入した化合物A−8を合成する。その合成法は、これに限定されるものではないが、たとえば以下のようなものである。(たとえば窒素気流下、)化合物A−7(たとえば0.29g)の溶液(たとえばアセトニトリル溶液(3ml))に、適切な温度(たとえば室温)で適切な試薬(たとえばN−ヒドロキシフタルイミド(67mg,0.41mmol)、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン(61(1,0.41mmol))を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば12時間)撹拌する。反応溶液を適切な有機溶媒(たとえばジクロロメタン)で抽出し、有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)により)精製し、化合物A−7’を得る。得られた化合物A−7’(1.16g,1.40mmol)の溶液(たとえばエタノール溶液(35ml))に、適切な試薬(たとえばヒドラジン−水和物(0.12ml,2.38mmol))を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば10分間)撹拌する。反応溶液の溶媒を留去後、濾過し、濾液を適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出する。有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥し、溶媒を減圧留去し、得られたA−8は精製せず、次の反応に用いることができる。
(8)化合物A−9の合成
(たとえば窒素気流下)化合物A−8(0.93g)の溶液(たとえば塩化メチレン溶液(15ml))に適切な温度(たとえば氷冷下)、適切な試薬(たとえば飽和重曹水(4.0ml,4.2mmol))、PG7X(式中、PG7は、本明細書に記載の保護基であり、Xは、Cl、Br、Iであり、たとえばクロロギ酸ベンジル(0.30ml,2.1mmol)である)を加え、適切な時間(たとえば1時間)撹拌する。反応を(たとえば飽和重曹水を加えて)クエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出する。有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄し、適切な乾燥剤(たとえば硫酸マグネシウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=4:1)により)精製し、化合物A−9を得る(たとえば0.92g,94%(2段階),白色固体)。
(9)化合物A−10の合成
(たとえば窒素気流下、)塩基(たとえば水素化ナトリウム(60% in oil,0.55g,13.7mmol)のテトラヒドロフラン懸濁液(25ml))に適切な温度(たとえば氷冷下)、化合物A−9(たとえば3.81g,4.57mmol)の溶液(たとえばテトラヒドロフラン溶液(15ml))を滴下し、適切な時間(たとえば1時間)撹拌後、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば5時間)撹拌することによりOPG4を除去するとともに2’位と4’位を架橋する。OPG4を除去する工程と2’位と4’位を架橋する工程は同一の工程であっても、異なる工程であってもよい。(たとえば飽和シュウ酸水溶液で)中和後、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出する。有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム→クロロホルム:メタノール=100:1)により)精製し、化合物A−10を得る(たとえば2.87g,95%,白色固体)。
(10)化合物A−11の合成
(たとえば窒素気流下、)化合物A−10(たとえば0.35mg,0.53mmol)の溶液(たとえば塩化メチレン溶液(10ml))に適切な温度(たとえば氷冷下)、適切な試薬(たとえば1M三塩化ホウ素ヘキサン溶液(5.29ml,5.29mmol))を加え、適切な時間(たとえば1時間)撹拌する。(たとえば反応溶液に飽和重曹水を加えることにより)反応をクエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄した後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=50:1)により)精製し、化合物A−11を得る(たとえば0.27g,96%,白色固体)。
(11)化合物A−12の合成
化合物A−11(0.19g,0.36mmol)の溶液(たとえば1M p−トルエンスルホン酸ピリジニウム−メタノール溶液(3.6ml))に、適切な温度(たとえば室温)にて適切な試薬(たとえば20%ホルムアルデヒド水溶液(0.06ml,0.40mmol))を加え、適切な時間(たとえば10分間)撹拌する。さらに、適切な温度(たとえば氷冷下)において適切な試薬(たとえばシアン化水素化ホウ素ナトリウム(45mg,0.72mmol))を加えて置換基R3(R3は、本明細書に記載の置換基である)によりアミノ基を置換する。適切な時間(たとえば1時間)撹拌する。反応溶液を適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、(たとえば水、飽和重曹水、飽和食塩水)で洗浄し、有機層を適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1)にて)精製し、化合物A−12を得る(たとえば0.19g,100%,白色固体)。
(12)化合物A−13の合成
化合物A−12(46mg,0.085mmol)の溶液(たとえばテトラヒドロフラン溶液(2ml))に適切な試薬(たとえばフッ化テトラ−n−ブチルアンモニウム(1M テトラヒドロフラン中,0.17ml,0.17mmol))を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば5分間)撹拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール=15:1により)精製し、化合物A−13を得る(たとえば25mg,100%,白色固体)。
(13)化合物A−14の合成
化合物A−13(たとえば0.16g,0.54mmol)の溶液(たとえばピリジン溶液(10ml))に適切な試薬(たとえば塩化4,4’−ジメトキシトリチル(たとえば0.22g,0.64mmol))を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば12時間)撹拌する。反応液に(たとえば飽和重曹水を加え、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、有機層を(たとえば水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%トリエチルアミン含有n−ヘキサン:酢酸エチル=1:2→酢酸エチル:メタノール=30:1)にて)精製し、化合物A−14を得る(たとえば0.30g,93%,白色固体)。
(14)化合物A−15の合成
化合物A−14(たとえば0.17g,0.28mmol)及び適切な試薬(たとえば4,5−ジシアノイミダゾール(40mg,0.34mmol))の溶液(たとえばアセトニトリル溶液(6ml))に、適切な試薬(たとえば2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト(0.13ml,0.42mmol))を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば4時間)撹拌することにより3’位のヒドロキシ基をP(O)(OPG9)(OPG10)(PG9およびPG10は、それぞれ独立して本明細書に記載の保護基である)により修飾する。(たとえば反応液に飽和重曹水を加えて)クエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出する。有機層を(たとえば飽和重曹水、水、飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)で乾燥し、溶媒を減圧留去する。得られた粗生成物を(たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%トリエチルアミン含有n−ヘキサン:酢酸エチル=1:1)、ついで再沈澱(酢酸エチル−ヘキサン)により)精製し、化合物A−15を得る(たとえば0.20g,88%,白色固体)。
一般式BNA−3で表される化合物は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。反応条件、保護基導入試薬、反応試薬は、具体的には実施例に記載の方法を参考にすることができるが、これに限定されず、本分野の技術常識に基づき使用可能な反応条件、試薬を適宜採用することができる。例えば、J.Org.Chem.2010,75,1569-1581に記載の方法を参考にすることができる。また、一般式(BNA−3)におけるBaseとして種々の天然、非天然の核酸塩基およびその他の芳香族複素環や芳香族炭化水素環を有する場合についても、J.Org.Chem.2010,75,1569-1581に記載の方法を参考にして、本発明化合物の原料を合成することができる。
BNA−3の一般合成例
化合物B−1
(たとえば窒素気流下、)化合物B−2の溶液に適切な温度(たとえば室温)、適切な試薬(たとえば2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノ−p−ベンゾキノン(DDQ)である)を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば12時間)撹拌する。(たとえば反応溶液に水を加えて)反応をクエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、有機層を(たとえば飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物B−3を得る。
(たとえば窒素気流下、)化合物B−3の溶液に適切な温度(たとえば氷冷下)、適切な試薬(たとえばトリエチルアミン三フッ化水素酸塩)を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば12時間)撹拌する。(たとえば反応溶液に水を加えて)反応をクエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、有機層を(たとえば飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物B−4を得る。
(たとえば窒素気流下、)化合物B−4の溶液に適切な温度(たとえば室温)、PG5X(式中、PG5は、本明細書に記載の保護基であり、Xは、Cl、Br、Iであり、たとえば塩化ジメトキシトリチルである)を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば12時間)撹拌する。(たとえば反応溶液に水を加えて)反応をクエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、有機層を(たとえば飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物B−5を得る。
(たとえば窒素気流下、)化合物B−5の溶液に適切な温度(たとえば室温)、適切な試薬(たとえば2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト)を加え、適切な温度(たとえば室温)で適切な時間(たとえば4時間)撹拌することにより3’位のヒドロキシ基をP(O)(OPG6)(OPG7)(PG6およびPG7は、それぞれ独立して本明細書に記載の保護基である)により修飾する。(たとえば反応溶液に水を加えて)反応をクエンチし、適切な有機溶媒(たとえば酢酸エチル)で抽出し、有機層を(たとえば飽和食塩水で)洗浄後、適切な乾燥剤(たとえば無水硫酸ナトリウム)にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物B−6を得る。
本発明のヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチド類縁体は、公知のDNAシンセサイザーを用いて種々合成することができる。次いで、得られるオリゴヌクレオチド類縁体を、逆相カラムを用いて精製し、生成物の純度を逆相HPLCやMALDI−TOF−MSで分析することにより、精製オリゴヌクレオチド類縁体の生成を確認できる。本発明のヌクレオシド類縁体は、オリゴヌクレオチド類縁体の中に1個以上存在させることができる。また、オリゴヌクレオチド類縁体の2カ所以上の位置に、1又は2以上の天然ヌクレオチドを介して隔離された状態で存在させてもよい。本発明によれば、本発明のヌクレオシド類縁体を必要な位置に必要な数(長さ)で導入したオリゴヌクレオチド類縁体を合成することができる。オリゴヌクレオチド類縁体全体の長さとしてヌクレオチド単位が2〜50、好ましくは8〜30個である。
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、ヌクレアーゼに対して分解されにくく、生体への投与後、長く生体内に存在することができる。そして、例えば、センスRNAと二重鎖を形成して病因となる生体内成分(タンパク質)のmRNAへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を阻害すると考えられる。
本発明で使用されるS−TuDを構成するオリゴヌクレオチドは、合成機(たとえばnS−8II 合成機もしくは、AKTA oligopilot合成機)で合成する。細孔ガラス質固相担体(たとえば2’−O−メチル−RNA CPG Link Technologies社製)と、標準的な保護基を有する2’−O−メチル−RNAホスホロアミダイト、(たとえば、これに限定するものではないが、5’−O−ジメトキシトリチルN6−ベンゾイルアデノシン−2’−O−メチル−3’−O−N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチルシチジン−2’−O−メチル−3’−O−N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチリルグアノシン−2’−O−メチル−3’−O−N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、および5’−O−ジメトキシトリチルウリジン−2’−O−メチル−3’−O−N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト(以上シグマアルドリッチ社製)、並びに、2’,4’−BNANC(2’−O,4’−C−アミノメチレン架橋核酸)チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’−O,4’−C−アミノメチレン−5’−O−ジメトキシトリチル−チミジン−N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、2’,4’−BNANCアデノシンホスホロアミダイト、すなわち2’−O,4’−C−アミノメチレン−5’−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイルアデノシン−N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト(以上BNA社製)、並びに、LNA(Locked nucleic acid)(2’−O,4’−C−メチレンリボ核酸)チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’−O,4’−C−メチレン−5’−O−ジメトキシトリチルチミジン−N,N’−ジイソプロピルホスホロアミダイト(エキシコン社製)が挙げられる)をオリゴヌクレオチド合成に使用する。ホスホロアミダイトは全て、適切な溶媒(たとえばアセトニトリル(CH3CN))中、適切な濃度(たとえば0.1M)で使用する。2’−O−メチルRNA、BNA及びLNAについては適切な連結/再利用時間(たとえば15分)を使用する。活性剤は、たとえば、これに限定されるものではないが、5−ベンジルメルカプト−テトラゾール(0.25M、和光純薬社製)であり、PO−酸化については、たとえば、これに限定されるものではないが、ヨウ素/水/ピリジンを使用する。PS−チオエート化については、たとえば、これに限定されるものではないが、市販のオリゴヌクレオチド自動合成機用硫化試薬(すなわちEIDTH、DDTT、PADS、Beucage試薬など)を適切な試薬(たとえばピリジン)とともに使用する。
合成が完了した後、合成担体を適切な容器(たとえばガラスボトル)に移す。オリゴヌクレオチドを、担体1gに対して15mLの、40%メチルアミン水溶液と33%メチルアミンエタノール溶液の等量混合物を用いて、適切な温度(たとえば45℃)で適切な時間(たとえば13時間)、塩基とリン酸基を脱保護して担体から切断する。塩基を脱保護する工程とリン酸基を脱保護する工程は、同一であっても、異なっていてもよい。その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、適切な容器(たとえば新しい250mLのボトル)に入れる。担体を(たとえば2×40mLのエタノール/水(1:1 v/v)で)洗浄する。その後、(たとえばロータリーエバポレーター(roto−vap)を用いて)溶媒を留去し乾固する。
オリゴヌクレオチドを、HPLC(たとえばSource 15 RPCゲルカラムでの逆相イオンペアHPLC)で精製する。緩衝液は、たとえば、これに限定されるものではないが、5% CH3CN、0.1M トリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0)(緩衝液A)と90% CH3CN、0.1M トリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0)(緩衝液B)である。5’末端に保護基(たとえばジメトキシトリチル基)が保持された状態で全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし次の精製に供する。その後オリゴヌクレオチドプールを、HPLC(たとえばSource 30Qの陰イオンペアHPLC)で精製する。溶液及び緩衝液は、たとえばこれに限定されるものではないが、0.6%のトリフルオロ酢酸(溶液A)、20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)(緩衝液C)と20mMリン酸ナトリウム緩衝液中の2M塩化ナトリウム(緩衝液D)である。5’末端の保護基を脱離させた後、完全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩後凍結乾燥する。化合物を、最終的に、たとえばMALDI−TOF/MSと変性ポリアクリルアミドゲルで分析する。
精製の完了した1本鎖オリゴヌクレオチドを適切な溶媒(たとえば蒸留水)にて溶解後、(たとえば紫外分光光度計を用い吸光度測定することにより)オリゴヌクレオチド濃度を決定する。決定された濃度を用い相補鎖をそれぞれ等モル濃度になるように混合し適切な温度(たとえば95℃)で適切な時間(たとえば10分)加熱後徐冷し2本鎖形成させる。2本鎖形成はたとえば非変性ゲル電気泳動にて確認する。
本発明のmiRNA阻害複合体は直鎖状の一本鎖核酸により構成されるように設計することができる(図31)。本発明は特に、MBSの全てがある二本鎖構造(図31のステムI)の片側(図31においては右側)に集中しており、該二本鎖構造の各鎖は、その側で閉じた構造となっており(すなわちMBSを含む配列によりつながっており)、該二本鎖構造の反対側に一本鎖RNAの両端があるような複合体に関する(図31)。MBSを含む配列中には、さらなる二本鎖構造(図31のステムIIやIIIなど)を含んでもよい。一本鎖RNAの長さは適宜決めてよいが、例えば500塩基内、好ましくは450塩基以内、420塩基以内、400塩基以内、380塩基以内、360塩基以内、340塩基以内、320塩基以内、300塩基以内、280塩基以内、260塩基以内、240塩基以内、220塩基以内、200塩基以内、180塩基以内、160塩基以内、140塩基以内、120塩基以内、100塩基以内、または80塩基以内である。例えば2つの二本鎖構造と2つのMBSを持つ複合体を形成する一本鎖RNAの長さは、例えば60〜300塩基、好ましくは70〜250塩基、80〜200塩基、90〜180塩基、または100〜150塩基である。第一の二本鎖構造(一本鎖RNAの両端に近い二本鎖構造)は、例えば15〜30bp、好ましくは16〜28bp、好ましくは17〜25bp、好ましくは17〜24bp、例えば17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、または24bpとすることができ、第二の二本鎖構造(MBSを含む配列中に含まれるさらなる二本鎖構造)は、全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよく、例えば4bp〜20bpであり、例えば5bp〜15bp、5bp〜12bp、5bp〜10bp、6bp〜9bp、または7bp〜8bpとしてよい。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
別の局面において、本発明は、本発明の複合体を含む医薬を提供する。
さらなる局面において、本発明は、有効量の本発明の複合体またはそれを含む医薬をそれを必要とする被験体に投与する工程を包含する、疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。本発明は、限定されないが、例えば、すでに臨床開発が進んでいるHCV治療薬や腎臓の線維化治療剤としての利用等に応用することができる。
(オリゴヌクレオチドの合成)
オリゴヌクレオチドは、nS-8II合成機もしくはAKTAoligopilot合成機で合成した。市販の細孔ガラス質固相担体(2’-O-メチル-RNA CPG Link Technologies社製)と、標準的な保護基を有する2’-O-メチル-RNAホスホロアミダイト、すなわち、5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイルアデノシン-2'-O-メチル-3’-O-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチルシチジン-2'-O-メチル-3’-O-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリルグアノシン-2'-O-メチル-3’-O-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチルウリジン-2'-O-メチル-3’-O-N,N’-ジイソプロピルホスホロアミダイト(以上シグマアルドリッチ社製)、並びに、2’,4’-BNANC(2’-O,4’-C-アミノメチレン架橋核酸)チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-アミノメチレン-5’-O-ジメトキシトリチル-チミジン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト、2’,4’-BNANCアデノシンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-アミノメチレン-5’-O-ジメトキシトリチル-N6-ベンゾイルアデノシン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト(以上BNA社製)、並びに、LNA(Locked nucleic acid)(2’-O,4’-C-メチレンリボ核酸)チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-メチレン-5’-O-ジメトキシトリチルチミジン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト(エキシコン社製)をオリゴヌクレオチド合成に使用した。ホスホロアミダイトは全て、アセトニトリル(CH3CN)中、0.1Mの濃度で使用した。2’-O-メチルRNA、BNA及びLNAについては15分の連結/再利用時間を使用した。活性剤は、5-ベンジルメルカプト-テトラゾール(0.25M、和光純薬社製)であり、PO-酸化については、ヨウ素/水/ピリジンを使用した。PS-ホスホロチオエート化については、市販のオリゴヌクレオチド自動合成機用硫化試薬(すなわちEIDTH、DDTT、PADS、Beucage試薬など)をピリジンとともに使用した。
合成が完了した後、合成担体をガラスボトルに移した。オリゴヌクレオチドを、担体1gに対して15mLの、40%メチルアミン水溶液と33%メチルアミンエタノール溶液の等量混合物を用いて、45℃で13時間、塩基とリン酸基を同時に脱保護しながら担体から切断した。その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい250mLのボトルに入れた。担体を2×40mLのエタノール/水(1:1v/v)で洗浄した。その後、ロータリーエバポレーター(roto-vap)で溶媒留去し乾固した。
オリゴヌクレオチドを、Source 15 RPCゲルカラムでの逆相イオンペアHPLCで精製した。緩衝液は、5% CH3CN、0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0)(緩衝液A)と90% CH3CN、0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0)(緩衝液B)であった。5’末端にジメトキシトリチル基が保持された状態で全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし次の精製に供した。その後オリゴヌクレオチドプールを、Source30Qの陰イオンペアHPLCで精製した。溶液及び緩衝液は、0.6%のトリフルオロ酢酸(溶液A)、20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)(緩衝液C)と20mMリン酸ナトリウム緩衝液中の2M塩化ナトリウム(緩衝液D)であった。溶液Aを用い、ジメトキシトリチル基を脱離させた後、完全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩後凍結乾燥した。化合物は、最終的に、MALDI-TOF/MSと変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。
精製の完了した1本鎖オリゴヌクレオチドを蒸留水にて溶解後、紫外吸光光度分析計を用い吸光度測定しオリゴヌクレオチド濃度を決定した。決定された濃度を用い相補鎖をそれぞれ等モル濃度になるように混合し、95℃で10分加熱後徐冷し2本鎖形成させた。2本鎖形成は非変性ゲル電気泳動にて確認した。
(HeLaS3-miR199a細胞の作製および培養)
HeLaS3細胞は10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM中、37℃で培養した。HeLaS3細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり1x105細胞(1x105 cells per well)でまき、24時間後にpLSP-miR199aウイルスベクター(<1x104 TU)を、8μg/mlのポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後からピューロマイシン(Puromycin)(1ug/ml)で選択した。1週間の選択の後、培地からピューロマイシン(Puromycin)を除去し、miR-199aレポーターを保持するHeLaS3細胞としてHeLaS3-miR199a細胞を得た。
HeLaS3-miR199a細胞およびHCT-116細胞を、10%ウシ胎児血清(foetal bovine serum)(FBS)を含むDMEM中、それぞれ1ウェルあたり1x105細胞(1.0x105 cells per well)で導入の前日に24ウェルプレートにまき、Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies)および100ngのレポータープラスミド(psiCHECKTM-2,psiCHECK2-T199a-3px3,psiCHECK2-T200c-3pまたはpsiCHECK2-T21-5p)(図16および図17を参照)および各種S-TuDをトリプリケートでトランスフェクトした。全てのアッセイはトランスフェクションの48時間後にdual luciferase assay(Promega)によりGLOMAXTM(Promega)で実施した。
本発明者らが開発したmiRNA阻害剤(合成Tough Decoy,S-TuD)は低濃度でmiRNAの活性を阻害する核酸として注目されているが、その構造の特性上2本鎖化した後の物性が安定しない。そこで、本実施例では、S-TuDの安定的な大量生産及び物性試験法の確立を容易にするために、2本鎖を強固にする方法として2本鎖領域をハイブリダイゼーション能力が向上する修飾核酸に部分置換したものを使用し、miRNA阻害活性を従来型のS-TuDと比較した(図1A)。
STEM領域の一部塩基を2本鎖形成能が上昇するタイプのヌクレオチド種(BNANC(NMe))に変更し、物性評価を実施した。結果を図38に示す。その結果、図1BのピークAが減少し、2本鎖の逆相HPLC純度分析精度が向上した。
miR199a_3p及び5pを内在性に僅かにしか発現しないHeLaS3細胞(Landgraf, P. et al. (2007) Cell, 129, 1401-1414)を10%ウシ胎児血清(foetal bovine serum)(FBS)を含むDMEM中、37℃で培養した。HeLaS3細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり1x105細胞(1x105 cells per well)でまき、24時間後にpLSP-miR199aウイルスベクター(<1x104 TU)を、8μg/mlのポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後からピューロマイシン(Puromycin)(1ug/ml)で選択した。1週間の選択の後、培地からピューロマイシン(Puromycin)を除去し、miR-199aレポーターを保持するHeLaS3細胞としてHeLaS3-miR199a細胞を得た。
psiCHECK2-miRT(プロメガ社、XhoI-NotIサイトに、例えば、miR-199a-3pのような標的miRNAと相補な配列を挿入して作成;全体構造は図3に示す。)、図2に示された、合成S-TuD修飾体を用いて細胞(HeLaS3-miR199a)をトランスフェクションした。
本実施例ではMBS領域等種々の位置においてBNANC(NMe)に置換した場合の影響を確認した。実施例1と同じレポーターアッセイ系を用いた。使用した配列は、図10、12および13に示す。
本実施例では、まず、挿入部位の最適化のために、種々の構造の物を用いてBNANC(NMe)に置換した場合の影響を確認した、使用したS-TuDの構造は図6〜7に示す。オリジナルのS-TuD199a-3p、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(22)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB1(seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(24)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-3-MBSB2 (非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)を示す。修飾核酸(BNANC(NMe))、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化及びMBS領域をホスホロチオエート化)、(23)-(2) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化及びSTEM領域をホスホロチオエート化)、(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化及び全配列ホスホロチオエート化)が使用された。
実施例1と同じレポーターアッセイを用いた。
本実施例で得られた構造体について、MBS領域の一部BNANC(NMe)に置換した結果を図8−1および図8−2に示す。図8−1および図8−2に示されるように、オリジナルのS-TuDに比較し最大10倍程度の阻害活性向上が見られる構造体を得ることができた。MBS領域の非シード領域にBNAを一部挿入することが重要であった。
次に本実施例では、実施例1〜2の結果を受け、STEM領域短鎖化+MBS領域へのBNA挿入効果確認を行った。
本実施例において使用したS-TuDの構造を図10に示す。S-TuD199a-3pのオリジナル配列、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)を使用した。
実験方法は、実施例1〜2に記載されているレポーターアッセイの方法と同様の手法で発現を確認した。
個々のS-TuD 100pMおよび300pMでの結果を図11−1および図11−2に示す。図11−1および図11−2に示されるように、Short typeについてBNA修飾の影響を検討した。オリジナルタイプとLong typeのStem-BNA修飾(16)を比較に加えた。Short type-BNA修飾無(1)’と比べて、stem部分にBNA修飾を入れた(6)’は大きく効果が増強した。さらにSeed相当部位にBNA修飾をいれた(17)は効果を増強しなかった。しかし非seed相当部位にBNA修飾を入れた(18)はさらに効果が増強し、(16)と同等以上になった。Short typeにおいてはMBS内のBNA修飾部位によっては増強効果があることが分かった。
次に、本実施例では、マウス血清を用いて血清中の安定性を確認した。
オリジナルのS-TuDと比較して、血清安定性が向上することを血清安定性試験により確認した。以下にプロトコールを示す。実験は、2μg S-TuD/100% 20μlマウス血清の条件で、37℃中で0h、48h、72h、96h処理した。
使用した修飾S-TuDの構造は、図12〜13及び図19に示す。すなわち、オリジナル構造、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)および(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)および(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)である。
結果を図14〜図15及び図20に示す。図14〜15及び図20で示されるように、MBS領域の一部BNANC(NMe)に置換した結果血清安定性の向上が見られた。
本実施例では、普遍性を確認するために2種類のmiRNAを標的として同種の実験を行った。
実施例1におけるmiR-199aに代えて、miR-200c、miR-21に置換したものを用いて同様にレポーターアッセイ実験を行った。具体的には以下のとおりである。
miR-200cのための構造は、図19に示す。miR-21のための構造は図23に示す。miR-200cには(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をBNANC(NMe)化)を使用した。miR-21には、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(52)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1、(54)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6、(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を使用した。
次に、普遍性の確認を確認した。普遍性は、miR-199a以外にmiR-200c、miR-21についても実施例1と同様の実験を行った。図20には血清耐性を示す電気泳動の結果を示す。miR-200cでの結果をグラフ化したものを図21−1および図21−2(miR-200c)に示す。レポーターアッセイの結果を示す図21−1および図21−2に示されるように、Long type(Stem1=18,Stem2=10)のStemをBNA化した場合(42)、そのMBSの非seed領域の相補配列にさらにBNANC(NMe)修飾を入れても抑制効果は増強しなかった(44)。この42MBSのseed領域の相補配列にさらにBNANC(NMe)修飾を入れると抑制効果は減弱した(43)。Short type(Stem1=10,Stem2=10)のStemをBNANC(NMe)化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNANC(NMe)修飾した場合(45)、そのlong type(44)とほぼ同程度にまで効果が増強された。また、図22に示されるように、Short type(Stem1=10,Stem2=10)のStemをBNANC(NMe)化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合(45)はBNANC(NMe)修飾の全くないoriginal(41)の2倍弱程度効果が高かった。0.1-10pMの投与では、S-TuDがチューブに非特異的に吸着する可能性も考え、担体としてS-TuD NC2を30pM添加したものも解析したが、添加の効果は見られなかった。
199a、200c、21全てにおいてlong typeかつBNA修飾をStem部分とMBSの非seed相当部位の両方にいれたもの(Aと略す)が最も効果が高かった。Short typeのStem,MBS-BNA修飾型はAよりは効果が下がるが、originalよりは阻害効果が大きく高くなっていた。BNANC(NMe)修飾long typeの増強程度は199a、21では従来型の10倍弱程度活性が高くなっていた。BNANC(NMe)修飾short typeの増強程度は199a、21では従来型の3-8倍程度活性が高くなっていた。200cで増強程度が低いのはmiR-200cの発現量・活性が低いためか、すでにpMレベルで阻害効果が出ているので、差が出にくいのではないかと考えられる。
次に、本実施例では、本発明のS-TuDが臨床応用できるかを確認した。
使用した構造を図27に示す。(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1および(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1が使用された。
マウス(C57BL/6 6週齢 オス )へ各S-TuDを1mg/kgで眼窩静脈に単回投与して(n=3)、24hr後にサクリファイスして腎臓を採取し、RT-PCR法で(S-TuDと結合していないと考えられるフリーの)miR-21量を定量した。
結果を図28〜29に示す。
次に本実施例では、実施例1〜7の結果を受け、STEM領域へ2本鎖化形成能が高い修飾塩基置換を行うことがmiRNA阻害の活性を向上させることを確認するため、BNANC(NMe)と同位置に架橋構造が異なるLocked核酸(LNA;2’−O,4’−C−メチレンリボ核酸)置換を行い、活性を比較した。
配列構造は図32に示す。
アッセイ方法としては、実施例1等で使用したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同じ手法を用いた。
結果を図33−1および図33−2に示す。BNANC(NMe)とLNAは同等の効果があり、構造普遍性を確認した。また10bpのSTEM領域に6カ所のBNANC(NMe)置換を実施しても活性は4ヵ所の置換と同等であった。
次に本実施例では、STEM領域の短鎖化を行い、活性を比較した。
結果を図35−1および図35−2に示す。STEM領域を8bp以下にすると活性が5分の1以下に減少した。ただし6bpでも濃度依存的に活性上昇がみられることから、STEM領域は10bp以上あった方が望ましく、また図32の結果と合わせて考えるとSTEM長10bp以下の場合はBNA置換が望ましいことが確認された。
本実施例では、STEM領域短鎖化と架橋型核酸置換の組み合わせを、オリジナルのS-TuD(STEM I18bp STEM II 10bp)とオリジナルのS-TuDにSTEM I及びIIそれぞれにBNA置換したS-TuDを比較して総合的に評価した。
使用した配列の構造は図36に示す。アッセイ方法としては実施例1等において示したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同様の手法を用いた。
結果を図37−1および図37−2に示す。S-TuDのmiRNA阻害活性は、オリジナルを1とすると、オリジナルのS-TuDにSTEM I及びIIそれぞれにBNA置換したS-TuDが3倍以上、STEM Iを10bpに短鎖化してBNANC(NMe)置換したS-TuDが約3倍の活性向上となった。このことによりSTEMの2本鎖形成を強固にすることがS-TuDのmiRNA阻害活性に大きな役割を果たすことが示された。
配列番号2:図2Aのオリジナルアンチセンス配列
配列番号3:図2A(1)のセンス配列
配列番号4:図2A(1)のアンチセンス配列
配列番号5:図2A(2)のセンス配列
配列番号6:図2A(2)のアンチセンス配列
配列番号7:図2A(3)のセンス配列
配列番号8:図2A(3)のアンチセンス配列
配列番号9:図2A(4)のセンス配列
配列番号10:図2A(4)のアンチセンス配列
配列番号11:図2A(5)のセンス配列
配列番号12:図2A(5)のアンチセンス配列
配列番号13:図6(16)のセンス配列
配列番号14:図6(16)のアンチセンス配列
配列番号15:図6(22)のセンス配列
配列番号16:図6(22)のアンチセンス配列
配列番号17:図6(23)のセンス配列
配列番号18:図6(23)のアンチセンス配列
配列番号19:図6(24)のセンス配列
配列番号20:図6(24)のアンチセンス配列
配列番号21:図7(17)のセンス配列
配列番号22:図7(17)のアンチセンス配列
配列番号23:図7(18)のセンス配列
配列番号24:図7(18)のアンチセンス配列
配列番号25:図7(23)-(1)のセンス配列
配列番号26:図7(23)-(1)のアンチセンス配列
配列番号27:図7(23)-(2)のセンス配列
配列番号28:図7(23)-(2)のアンチセンス配列
配列番号29:図7(23)-(3)のセンス配列
配列番号30:図7(23)-(3)のアンチセンス配列
配列番号31:図10(1)’のセンス配列
配列番号32:図10(1)’のアンチセンス配列
配列番号33:図10(6)’のセンス配列
配列番号34:図10(6)’のアンチセンス配列
配列番号35:図12(23)のセンス配列
配列番号36:図12(23)のアンチセンス配列
配列番号37:図19(41)のセンス配列
配列番号38:図19(41)のアンチセンス配列
配列番号39:図19(42)のセンス配列
配列番号40:図19(42)のアンチセンス配列
配列番号41:図19(43)のセンス配列
配列番号42:図19(43)のアンチセンス配列
配列番号43:図19(44)のセンス配列
配列番号44:図19(44)のアンチセンス配列
配列番号45:図19(45)のセンス配列
配列番号46:図19(45)のアンチセンス配列
配列番号47:図23(51)のセンス配列
配列番号48:図23(51)のアンチセンス配列
配列番号49:図23(52)のセンス配列
配列番号50:図23(52)のアンチセンス配列
配列番号51:図23(53)のセンス配列
配列番号52:図23(53)のアンチセンス配列
配列番号53:図23(54)のセンス配列
配列番号54:図23(54)のアンチセンス配列
配列番号55:図23(55)のセンス配列
配列番号56:図23(55)のアンチセンス配列
配列番号57:S-TuD NC2(図18、図22)のセンス配列
配列番号58:S-TuD NC2(図18、図22)のアンチセンス配列
配列番号59:図32(2)’のセンス配列
配列番号60:図32(2)’のアンチセンス配列
配列番号61:図32(7)’のセンス配列
配列番号62:図32(7)’のアンチセンス配列
配列番号63:図32(8)’のセンス配列
配列番号64:図32(8)’のアンチセンス配列
配列番号65:図34(1)”のセンス配列
配列番号66:図34(1)”のアンチセンス配列
配列番号67:図34(2)”のセンス配列
配列番号68:図34(2)”のアンチセンス配列
配列番号69:図34(3)”のセンス配列
配列番号70:図34(3)”のアンチセンス配列
配列番号71:図34(4)”のセンス配列
配列番号72:図34(4)”のアンチセンス配列
配列番号73:図34(5)”のセンス配列
配列番号74:図34(5)”のアンチセンス配列
配列番号75:図17のpsiCHECK2-T200c-3p-s(センス配列)
配列番号76:図17のpsiCHECK2-T200c-3p-a(アンチセンス配列)
配列番号77:図17のpsiCHECK2-T199a-3px3-s(センス配列)
配列番号78:図17のpsiCHECK2-T199a-3px3-a(アンチセンス配列)
配列番号79:図17のpsiCHECK2-T21-5p-s(センス配列)
配列番号80:図17のpsiCHECK2-T21-5p-a(アンチセンス配列)
Claims (20)
- RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、該miRNA阻害複合体は、少なくとも1つの二本鎖構造およびmiRNA結合配列を含み、該miRNA結合配列の2つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に一本ずつ結合しており、該miRNA阻害複合体は少なくとも1つの架橋核酸(BNA)を、該miRNA阻害複合体のstem領域に含み、該複合体は、該二本鎖構造を2つ以上含み、該二本鎖構造の第1の二本鎖構造の片端の2つの鎖にmiRNA結合配列を含む鎖がそれぞれ1本ずつ結合しており、該2つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該2つ以上の二本鎖構造の第2の二本鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合しており、該BNAは4つ以上含まれ、該BNAは該2つ以上の二本鎖構造部分のそれぞれに含まれ、該二本鎖構造は少なくとも10塩基長である、miRNA阻害複合体。
- 前記BNAは2’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子
を介し、4’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも1つ原子を介して架橋されたBNAを含む、請求項1に記載の複合体。 - 前記BNAは
- 前記BNAはBNANC(NMe)である、請求項1に記載の複合体。
- 前記BNAは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記miRNA結合配列の少なくとも一つの鎖に含まれる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記BNAは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記BNAは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる、請求項8に記載の複合体。
- 前記BNAは6つ以上含まれる、請求項1に記載の複合体。
- 前記miRNA結合配列を含む2つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している、請求項1〜10のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記リンカーの長さは1〜5塩基長である、請求項11に記載の複合体。
- 前記二本鎖の構造は、少なくとも15塩基長である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記二本鎖の構造は、少なくとも18塩基長である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記二本鎖の構造は、50塩基長以下である、請求項13または14に記載の複合体。
- 2から5つのmiRNA結合配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の複合体。
- 2つのmiRNA結合配列を含む、請求項16に記載の複合体。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の複合体を製造する方法であって、
A)化学合成により、リボ核酸およびBNAを用いて、目的とするRNAまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程;
B)生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程;ならびに
必要に応じてC)脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程
を包含する方法。 - 請求項1〜18のいずれか一項に記載の複合体を含む医薬。
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