CN110650742A - 使用经结构强化的S-TuD的新的癌症治疗方法 - Google Patents
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Abstract
提供使用经结构强化的S‑TuD的新的癌症治疗方法。提供一种组合物，其用于预防或处置肿瘤且包含含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，或者提供使用该组合物的用于预防或处置肿瘤的方法。miRNA抑制复合体优选包含至少1个双链结构和miRNA结合序列。优选miRNA结合序列的两条链分别与双链结构的至少一端的两条链中的1条结合。本发明的部分方面还提供用于递送这种miRNA抑制复合体的递送系统。
Description
技术领域
本发明涉及使用经结构强化的合成强诱饵(Tough Decoy)(S-TuD)的新的癌症治疗方法、相关的治疗剂、药物递送介质。
背景技术
微小RNA(miRNA)通过控制多个靶基因而形成基因调控网络，在包括发生在内的多种生命现象中发挥重要的作用，已开发了抑制miRNA的各种抑制剂(WO2010/047216＝专利文献1)。
另外，在实验性miRNA抑制中，使用S-TuD等抑制核酸，本发明的部分发明人一直在进行增强型的抑制核酸的开发。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/047216号
发明内容
用于解决问题的方案
本发明人们发现，通过使包含RNA或其类似物的miRNA抑制复合体中包含至少1个桥接核酸(Bridged Nucleic Acid，BNA)(本说明书中，也将包含BNA的核酸称为BNA修饰型抑制核酸“S-TuD”)，抑制活性得到巩固，生物活性得到强化，可有效地处置疾病(例如癌症等)，从而完成了本发明。在具体实施方式中，本发明人们发现，通过在癌相关miRNA(例如miR-200家族)的抑制中使用包含至少1个桥接核酸(BNA)的复合体可有效地抑制肿瘤。而且发现，在癌相关miRNA的多个不同成员的同时抑制中也观察到该效果。
本发明中发现，BNA修饰型抑制核酸“S-TuD”相较于以往的“S-TuD”小型化、血清稳定性增加、microRNA抑制能力增强，从而实现了基于miRNA抑制的肿瘤治疗方法。与以往的S-TuD相比，本发明的BNA修饰型抑制核酸“S-TuD”可期待有效地改善。
因此，在各种实施方式中，本发明的一实施方式提供一种组合物，其用于肿瘤的预防或处置，包含含有RNA或其类似物且含有至少1个BNA的miRNA抑制复合体；或者提供使用该组合物的用于预防或处置肿瘤的方法。miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列。miRNA结合序列的两条链分别与双链结构的至少一端的两条链中的1条结合。通过采取这种结构，本发明中使用的miRNA抑制复合体的血清稳定性增加、miRNA抑制能力增强，在肿瘤的预防或处置中有利。
例如，本发明的优选实施方式提供以下的项目。
(项目A1)一种组合物，其为用于预防或处置肿瘤的、包含含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体的组合物，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目A2)根据上述项目所述的组合物，其中，上述BNA包含经由2’位侧的选自由氧和碳组成的组中的至少1个原子、经由4’位侧的碳以及选自由碳和氮组成的组中的至少1个原子桥接的BNA。
(项目A3)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA包含下式(BNA-1)所示的2’,4’取代桥接核酸，
[化1]
(式(BNA-1)中，R1、R1’、R2、R2’、和R3分别独立地表示选自由氢原子、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳烷基、取代或非取代的酰基、取代或非取代的磺酰基、取代或非取代的甲硅烷基、和功能性分子单元取代基组成的组中的基团，m为0～2的整数，Base表示选自由腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基、胍基、和甲基胞嘧啶基组成的组中的基团，n为1～3的整数，q为0或1的整数。)。
(项目A4)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA包含下式(BNA-2)所示的2’,4’取代桥接核酸，
[化2]
(式(BNA-2)中，R3表示选自由氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、甲硅烷基、和功能性分子单元取代基组成的组中的基团，Base表示选自由腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基、胍基、和甲基胞嘧啶基组成的组中的基团，m为0～2的整数，n为1～3的整数。)。
(项目A5)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA包含下式所示的化合物或2’,4’亚甲基桥接核酸(LNA)，
[化3]
(项目A6)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA为BNANC(NMe)。
(项目A7)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个以上的上述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而该链被该2个以上的双链结构夹住。
(项目A8)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述双链的结构为至少6碱基长。
(项目A9)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述双链的结构为至少8碱基长。
(项目A10)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述双链的结构为50碱基长以下。
(项目A11)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2至5个miRNA结合序列。
(项目A12)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列。
(项目A13)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含以下所示的结构，
[化4]
该结构的I和II为双链结构，该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列。
(项目A14)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和/或5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目A15)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目A16)一种核酸分子，其包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的序列，所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目A16-2)一种核酸分子，其为包含2个miRNA结合序列的核酸分子，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)或5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)或5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)，所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目A17)一种核酸分子，其为包含2个miRNA结合序列的核酸分子，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)，所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目A18A)一种核酸分子，其包含含有序列号1的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列和含有序列号2的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
(项目A18B)一种核酸分子，其包含含有序列号3的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列和含有序列号4的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
(项目A19A)一种核酸分子，其包含序列号9的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号10的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)，所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目A19B)一种核酸分子，其包含序列号5的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号6的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目AA1)一种核酸分子，其包含5'-AUAAGCU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的序列，所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目AA2)一种核酸分子，其包含有含序列号33的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列，所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目AA3)一种核酸分子，其包含含有序列号34的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
(项目AA4)一种核酸分子，其包含序列号37和/或序列号38的序列。
(项目A20)一种组合物，其包含上述项目中任一项所述的核酸分子。
(项目A21)根据上述项目中任一项所述的组合物，其用于预防或处置肿瘤。
(项目A22)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述肿瘤为癌(carcinoma)。
(项目A23)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述肿瘤为结肠癌(coloncancer)、肺癌(lung cancer)或乳腺癌(breast cancer)。
(项目A24)根据上述项目中任一项所述的组合物，其用于促进上述肿瘤的上皮-间充质转换。
(项目A25)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体或核酸分子以包含在用于核酸递送的载体中的形态存在。
(项目A26)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述载体选自由脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子性脂质体、非阳离子性脂质体、阳离子性聚合物、非阳离子性聚合物、β葡聚糖、去端肽胶原、PLGA纳米颗粒、表面活性剂肽和超级磷灰石组成的组。
(项目A27)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述载体为LNP，该LNP包含阳离子性脂质。
(项目A28)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述LNP包含阳离子性脂质、辅助脂质和PEG修饰脂质。
(项目A29)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述阳离子性脂质在分子内包含叔胺和/或二硫键。
(项目B1)一种组合物，其为包含含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体、和用于核酸递送的载体的组合物，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链各结合1条，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目B1-1)根据上述项目B1所述的组合物，其具有项目A1～A29中任一项所述的特征。
(项目B2)根据上述项目中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
(项目B3)根据上述项目中任一项所述的组合物，其用于将上述miRNA抑制复合体递送到期望的部位。
(项目B4)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA包含经由2’位侧的选自由氧和碳组成的组中的至少1个原子、经由4’位侧的碳以及选自由碳和氮组成的组中的至少1个原子桥接的BNA。
(项目B5)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA包含下式(BNA-1)所示的2’,4’取代桥接核酸，
[化5]
(式(BNA-1)中，R1、R1’、R2、R2’、和R3分别独立地表示选自由氢原子、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳烷基、取代或非取代的酰基、取代或非取代的磺酰基、取代或非取代的甲硅烷基、和功能性分子单元取代基组成的组中的基团，m为0～2的整数，Base表示选自由腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基、胍基、和甲基胞嘧啶基组成的组中的基团，n为1～3的整数，q为0或1的整数。)。
(项目B6)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA包含下式(BNA-2)所示的2’,4’取代桥接核酸，
[化6]
(式(BNA-2)中，R3表示选自由氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、磺酰基、甲硅烷基、和功能性分子单元取代基组成的组中的基团，Base表示选自由腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基、胍基、和甲基胞嘧啶基组成的组中的基团，m为0～2的整数，n为1～3的整数。)。
(项目B7)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA包含下述结构的化合物或2’,4’亚甲基桥接核酸(LNA)，
[化7]
(项目B8)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA为BNANC(NMe)。
(项目B9)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个以上的上述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而被该2个以上的双链结构夹住。
(项目B10)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述双链的结构为至少6碱基长。
(项目B11)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述双链的结构为至少8碱基长。
(项目B12)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述双链的结构为50碱基长以下。
(项目B13)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2至5个miRNA结合序列。
(项目B14)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列。
(项目B15)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含以下所示的结构，
[化8]
该结构的I和II为双链结构，该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列。
(项目B16)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和/或5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目B17)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目B18A)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含含有序列号1(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列和含有序列号2(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
(项目B18B)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含含有序列号3(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列和含有序列号4(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
(项目B19A)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含序列号5的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号6的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目B19B)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含序列号9的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号10的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目B20)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述载体选自由脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子性脂质体、非阳离子性脂质体、阳离子性聚合物、非阳离子性聚合物、β葡聚糖、去端肽胶原、PLGA纳米颗粒、表面活性剂肽和超级磷灰石组成的组。
(项目B21)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述载体为LNP，该LNP包含阳离子性脂质。
(项目B22)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述LNP包含阳离子性脂质、辅助脂质和PEG修饰脂质。
(项目B23)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述阳离子性脂质在分子内包含叔胺和/或二硫键。
(项目C1)一种组合物，其为包含脂质膜结构体和被该脂质膜结构体包封的核酸复合体的组合物，所述脂质膜结构体包含式(1’)所示的化合物作为膜的构成脂质，
[化9]
(式(1’)中，
Xa和Xb分别独立地为包含叔胺的取代基，
s为1或2，
R4表示碳数1～6的烷基，
na和nb分别独立地为0或1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
R3a和R3b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，
甾醇残基为胆甾烯基、胆甾烷基、豆甾烯基、β-谷甾烯基、羊毛甾烯基或麦角甾烯基，
脂溶性维生素为视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚)，
该核酸复合体为含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目C1-1)根据项目C1所述的组合物，其具有项目A1～29或项目B1～23中任一项所述的特征。
(项目C2)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，Xa和Xb分别独立地为X1、X2或X3；
[化10]
(项目C3)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(1’)中，R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基。
(项目C4)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(1’)中，Ya和Yb分别独立地为酯键。
(项目C5)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(1’)中，na和nb为1。
(项目C6)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(1’)中，R3a与R3b、Ya与Yb、和/或Xa与Xb相同。
(项目C7-1)一种组合物，其为包含脂质膜结构体和被该脂质膜结构体包封的核酸复合体的组合物，所述脂质膜结构体包含式(1)所示的化合物作为膜的构成脂质，
[化11]
(式(1)中，Xa和Xb分别独立地为X1、X2或X3；
[化12]
s为1或2，
R4表示碳数1～6的烷基，
na和nb分别独立地为0或1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
R3a和R3b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，
甾醇残基为胆甾烯基、胆甾烷基、豆甾烯基、β-谷甾烯基、羊毛甾烯基或麦角甾烯基，
脂溶性维生素为视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚)，
该核酸复合体为含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目C7-2)根据上述项目中任一项所述的组合物，其为包含脂质膜结构体和被该脂质膜结构体包封的核酸复合体的组合物，所述脂质膜结构体包含式(1)所示的化合物作为膜的构成脂质，
[化13]
(式(1)中，Xa和Xb分别独立地为X1或X2；
[化14]
s为1或2，
R4表示碳数1～6的烷基，
na和nb分别独立地为1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
R3a和R3b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，甾醇残基为胆甾烯基、胆甾烷基、豆甾烯基、β-谷甾烯基、羊毛甾烯基或麦角甾烯基，
脂溶性维生素为视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚)，
该核酸复合体为含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目C8)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式中，Xa和Xb独立地为X2。
(项目C9)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式中，R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基。
(项目C10)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式中，R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基。
(项目C11)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述脂溶性维生素衍生物残基为具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应产物来源的残基。
(项目C12)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，R3a和R3b独立地为碳数12～22的脂肪族烃基。
(项目C13)根据上述项目中任一项所述的组合物，其为包含脂质膜结构体和被该脂质膜结构体包封的核酸复合体的组合物，所述脂质膜结构体包含式(4)所示的化合物作为膜的构成脂质，
[化15]
(式(4)中，R4a和R4b分别独立地为碳数8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
X1a和X1b分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键，
R5a和R5b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素残基或碳数13～23的脂肪族烃基，甾醇残基为胆甾烯基、胆甾烷基、豆甾烯基、β-谷甾烯基、羊毛甾烯基或麦角甾烯基，脂溶性维生素为视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚)，
该核酸复合体为含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目C15)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(4)中，R4a和R4b独立地为碳数8以下的亚烷基。
(项目C16)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(4)中，X1a和X1b为酯键。
(项目C17)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(4)中，R5a和R5b独立地为脂溶性维生素残基或碳数13～23的脂肪族烃基。
(项目C18)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(4)中，R5a和R5b独立地为脂溶性维生素残基。
(项目C19)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，式(4)中，R5a和R5b独立地为碳数13～23的脂肪族烃基。
(项目C20)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述BNA为BNANC(NMe)。
(项目C21)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个以上的上述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而被该2个以上的双链结构夹住。
(项目C22)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列。
(项目C23)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含以下所示的结构，
[化16]
该结构的I和II为双链结构，该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列。
(项目C24)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和/或5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目C25)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目C26A)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含含有序列号1的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列、和含有序列号2的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
(项目C26B)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含含有序列号3的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列、和含有序列号4的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
(项目C27A)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含序列号5的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号6的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目C27B)根据上述项目中任一项所述的组合物，其中，上述miRNA抑制复合体包含序列号9的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号10的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
(项目D1)一种miRNA抑制复合体，其为用于肿瘤的处置或预防的应用的、含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目D2)
一种用于上述项目所述的应用的miRNA抑制复合体，其还具有上述项目中的任一项或多项所述的特征。
(项目E1)一种用于在受试体中预防或处置肿瘤的方法，其包含将有效量的上述项目中任一项所述的组合物、miRNA抑制复合体或核酸分子给药于该受试体的工序。
(项目E2)根据上述项目所述的方法，其还具有上述项目中的任一项或多项所述的特征。
(项目F1)一种用于肿瘤的处置或预防的、含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体的应用，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
(项目F2)
根据上述项目所述的应用，其还具有上述项目中的任一项或多项所述的特征。
需要说明的是，对于上述每一项，意图使将引用相同项的各项所记载的两个或2个以上发明任意组合而成的发明也包括在它们所引用的上位的项中所记载的发明中。另外，意图使本说明书所记载的任意的发明要素及其的任意组合包括在本说明书中。另外，意图使从上述发明中排除了本说明书所记载的染衣的要素或其的任意的组合的发明包括在本发明中。另外，当本说明书在说明书中记载某特定方案作为例如优选方案时，不仅公开了该方案本身，而且还公开了从包括该方案在内的更上位的本说明书所公开的发明中的除该方案外的发明。
发明的效果
本发明的改良型S-TuD的miRNA抑制活性相较于以往的S-TuD得到强化，通过使用所述改良型S-TuD抑制miR-200家族等miRNA，能够实现肿瘤的预防或处置。
附图说明
图1示意性示出以往的S-TuD和本发明的部分置换型S-TuD的示意图。
图2示出本说明书所用的miRNA抑制复合体的典型结构，在此示出包含MBS的2条RNA链与2个双链结构的各链分别结合、从而被2个双链结构夹住的形态。
图3也示出本说明书所用的miRNA抑制复合体的典型结构，在此示出#12～#16作为典型例子。这里，包含MBS的2条RNA链与双链结构的已配对的各条链结合，因此RNA链的方向变为彼此反向。
图4示出(1)S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(具有针对miR-141和miR-200c的MBS)和(2)S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1-s(MBS相对于miR不具有互补性)的结构。序列中的小写字母表示取代为BNANC(NMe)的位置。
图5是示出将(1)S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(S-TuD-141/200c)或(2)S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1-s(S-TuDNCs)给药于尾部静脉内或肿瘤内的肿瘤移植小鼠的体重(g)的经时变化的图。箭头表示进行给药的时点。
图6是示出将(1)S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(S-TuD-141/200c)或(2)S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1-s(S-TuDNCs)给药于尾部静脉内或肿瘤内的肿瘤移植小鼠中的肿瘤体积(mm3)的经时变化的图。箭头表示进行给药的时点。
图7是示意性示出实施例2中使用的脂质纳米颗粒的组成的图。
图8是示出将包封于脂质纳米颗粒的S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD 141/200c)或PBS注入尾部静脉内的肿瘤移植小鼠的体重(g)的经时变化的图。箭头表示进行给药的时点。
图9是示出将包封于脂质纳米颗粒的S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD 141/200c)或PBS注入尾部静脉内的肿瘤移植小鼠的肿瘤体积(mm3)的经时变化的图。箭头表示进行给药的时点。
图10示出各种miR-200c的S-TuD结构。从上方起分别表示(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(对种子区域的互补序列进行BNANC(NMe)化)、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(对非种子区域的互补序列进行BNANC(NMe)化)、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(对非种子区域的互补序列进行BNANC(NMe)化)。
图11是示出将包封于脂质纳米颗粒的S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD-141/200c)或S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD阴性对照)注入尾部静脉内的肿瘤移植小鼠的体重(g)的经时变化的图。箭头表示进行给药的时点。
图12是示出将包封于脂质纳米颗粒的S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD-141/200c)或S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD阴性对照)注入尾部静脉内的肿瘤移植小鼠的肿瘤体积(mm3)的经时变化的图。箭头表示进行给药的时点。
图13示出psiCHECK2-UT(上)和psiCHECK2-miRT(下)的结构。
图14示出实施例中使用的萤光素酶报告载体的示意图。
图15示出萤光素酶报告载体的制作中使用的psiCHECK2-T21-5p-s、psiCHECK2-T21-5p-a、psiCHECK2-T200c-3p-s、psiCHECK2-T200c-3p-a的序列信息。这些序列均为无修饰的DNA。
图16-1示出所使用的寡聚物的结构。
图16-2示出图16-1的寡聚物的关于miR-21进行报告基因测试的结果。左侧表示300pM的结果，右侧表示1000pM的结果。误差棒表示对照报告基因活性与miR-21报告基因抑制活性之比。miR-21的抑制效果越高，则误差棒变得越高。
图17-1示出所使用的寡聚物的结构。
图17-2示出图17-1的寡聚物的关于miR-200c进行报告基因测试的结果。左侧表示10pM的结果，右侧表示100pM的结果。误差棒表示对照报告基因活性与miR-200c报告基因抑制活性之比。miR-200c的抑制效果越高，则误差棒变得越高。
图17-3示出关于miR-200c进行报告基因测试的结果。示出导入了表达TuD-141/200c的慢病毒载体的H358细胞中的结果。误差棒表示对照报告基因活性与miR-200c报告基因抑制活性之比。miR-200c的抑制效果越高，则误差棒变得越高。
具体实施方式
以下对本发明进行说明。在整个说明书中，单数形式的表示在没有特别声明时，应理解为还包含其复数形式的概念。因此，单数形式的冠词(例如，英语时的“a”、“an”、“the”等)在没有特别声明时，应理解为还包含其复数形式的概念。另外，在没有特别声明时，本说明书所用的术语应理解为以在该领域中通常使用的意思来使用。因此，只要没有定义为其它意思，则本说明书所用的全部专业术语和科学技术术语具有与本发明所属的领域的本领域技术人员的通常理解相同的意思。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)优先。
＜miRNA抑制复合体＞
本发明中发现，可以将以下详述的miRNA抑制复合体作为药物用于各种疾病的预防或治疗，特别是可以进行肿瘤的处置或预防。本发明的部分实施方式中，提供用于肿瘤的处置或预防的、包含以下详述的miRNA抑制复合体的组合物。
本发明另外提供包含以下详述的miRNA抑制复合体和用于核酸递送的载体的组合物。通过与这种用于核酸递送的载体组合，本说明书中记载的miRNA抑制复合体可以被更好地递送至靶。
本说明书中，使用的miRNA抑制复合体的改良型可以高效地且特异地抑制miRNA，其详细情况可以参照PCT/JP2016/004252，在本说明书中以参考形式援引该内容。本说明书所用的miRNA抑制复合体的特征在于，包含至少1个双链结构，包含miRNA结合序列(MBS)的至少1条链与该双链结构的至少一端的两条链结合，包含至少1个桥接核酸(BNA)。本发明中使用的抑制复合体有时也称为“S-TuD”。需要说明的是，本发明中也将该双链结构称为“第一”双链结构，以便能够与本说明书所使用的复合体中可能包含的其它双链结构区分。本说明书所用的复合体可以是单链(即，以共价键键合的1分子)，也可以由例如单链、双链或两条以上的多条链构成。例如，只要包含双链RNA的复合体在复合体中包含至少1个桥接核酸(BNA，例如BNANC(NMe))则包含在本发明中使用的复合体的范围内，其中，所述双链RNA是在双链结构的一端的两条链上分别结合各1条包含MBS的RNA链的RNA。另外，例如在双链结构的一端的两条链上可以结合包含至少1个MBS的一条RNA链。这种情况下，双链结构的一端的两条链通过包含MBS的RNA链而被连接。连接双链结构的两条链的RNA包含至少1个MBS，可以包含例如2个、3个或3个以上。双链结构包含茎环结构或发夹。即，双链结构可以是包含在茎环结构或发夹中的双链结构。改良型的miRNA抑制复合体由于抑制效率高、血清稳定性高而可以期待体内的肿瘤抑制效果的提高。
另外，本发明中，“非种子”区域是指：miRNA序列中的、miRNA活性所必需的miRNA的5’端起第2～8位的碱基以外的碱基，具体是指miRNA的5’端起的第9～21位的碱基。本发明所使用的复合体中，“非种子结合区域”是指：MBS内的与miRNA的非种子区域具有高互补性而与其结合的序列，“茎区域”是指双链结构。所含的BNA可以包含或不包含在非种子结合区域，也可以包含或不包含在茎区域(参照图1)。对于在非种子结合区域和茎区域包含BNA者，确认到本发明中发现的生物活性增强效果等，可理解的是，在BNA仅包含在非种子结合区域或BNA仅包含在茎区域的情况下，该活性也根据所含的BNA而同样地得到增强。
本发明中使用的miRNA抑制复合体可以是具有双链结构的、包含至少1条RNA或其类似物的结构体。该复合体优选包含一分子或两分子的含有RNA或其类似物的分子。
本说明书中，“miRNA结合序列(MBS)”是指：与miRNA结合的序列。MBS至少包含与miRNA互补的部分，以便可以与miRNA结合。如日本专利第4936343号公报所示，MBS可以是或不是与miRNA完全互补的序列。例如，MBS可以是靶向miRNA的天然的RNA序列。MBS例如相对于miRNA连续或非连续地包含至少10碱基、例如11碱基以上、12碱基以上、13碱基以上、14碱基以上、15碱基以上、16碱基以上、17碱基以上、18碱基以上、19碱基以上、20碱基以上、21碱基以上、22碱基以上、23碱基以上或24碱基以上的互补的碱基。该互补的碱基连续或可具有3处以下、2处以下、优选为1处缺口。缺口可以是MBS侧和/或miRNA侧的不配对的(凸起(bulges))，对于1处缺口而言，可以仅在一条链上有凸起碱基，也可以在两条链上有不配对的碱基。例如，可以按照至少在MBS侧包含不配对的碱基的方式来设计。关于凸起和错配的碱基数，每1处的凸起和错配，每条链中为例如6碱基以下、优选为5碱基以下、4碱基以下、3碱基以下、2碱基以下或1碱基。可形成凸起的MBS有时显示出高于由完全互补的序列形成的MBS的miRNA抑制效果。因此，为了得到更高的miRNA抑制效果，可以按照形成凸起的方式来设计MBS。例如，MBS的3’末端起的第10位和/或第11位的碱基与miRNA不互补或在第10位与第11位之间包含多余的碱基的MBS(或者，miRNA中的靶序列(与MBS发生杂交的序列)的5’末端起第10位和/或第11位的碱基为与MBS不互补的碱基或在第10位与第11位的核苷酸之间包含不配对的碱基的MBS)不易被分解，可以期待高活性。但是，在使用耐受分解性高的修饰碱基时，不需要包含凸起。这种情况下，例如可以按照使包含miRNA的5’末端起第10位和第11位的碱基不配对的方式设计MBS，例如可以按照使第9～11位、第10～12位或第9～12位不配对的方式设计MBS。另外，在miRNA侧没有不配对的碱基、但在MBS侧在3’末端起的第10位与第11位之间(或者，在与miRNA中的靶序列(与MBS杂交的序列)的5’末端起第10位和第11位相当的部位之间)具有不配对的碱基的方式也允许。不配对的碱基可以存在于miRNA侧和/或MBS侧，优选至少在MBS侧存在。各链中不配对的核苷酸的数量可以适当调整，例如为1～6核苷酸，优选为1～5核苷酸，更优选为3～5、例如3、4或5核苷酸。另外，已知对于识别miRNA靶而言，miRNA的5’端起第2～8位的碱基(种子区域)匹配这一点很重要(Jackson ALet al.,RNA12(7):1179-1187,2006；Lewis BP et al.,Cell 120:15-20,2005；Brenneckeet al.PLoS BIOLOGY3,0404-0418,2005；Lewis et al.Cell 115,787-798,2003；Kiriakidou et al.Genes&Development 18,1165-1178,2004)。实际上，本说明书所用的miRNA抑制RNA即使是具有仅种子区域匹配、与其它区域仅具有低互补性的MBS的RNA，也可以有效地抑制miRNA。作为本发明中的MBS，优选为与miRNA的种子区域(miRNA的5’端起第2～8位的碱基)完全互补的MBS。这种情况下，G:U对(U:G对)也可视为互补，优选仅将G:C(C:G)和A:U(U:A)视为互补。另外，作为本发明中的MBS，优选与miRNA的种子区域(miRNA的5’端起第2～8位的碱基)完全互补、并且相对于miRNA连续包含至少8碱基、更优选为9碱基、更优选为10碱基的互补碱基。进一步地，本发明中的MBS优选相对于miRNA包含合计11碱基以上、更优选为12碱基以上、更优选为13碱基以上的互补碱基。
MBS优选为与miRNA序列在生理条件下杂交的序列。生理条件下是指：例如150mMNaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0、37℃。更优选地，MBS为与miRNA序列在严谨条件下杂交的序列。严谨条件是指：例如1×SSC(1×SSC为150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0)或0.5×SSC、42℃的条件，更优选为1×SSC或0.5×SSC、45℃的条件，更优选为1×SSC或0.5×SSC、50℃的条件。杂交中，例如对包含miRNA序列的RNA或包含MBS的RNA中的任一者进行标记，将另一者固定在膜上而使两者杂交。关于杂交的条件，例如可以在包含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA、5xDenhardt’s液(1xDenhardt’s溶液包含0.2％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白、和0.2％聚糖体(Ficoll))的溶液中且在例如37℃或45℃或50℃下进行。在孵育充分的时间(例如3、4、5或6小时以上)后，以上述的条件进行洗涤，检测已标记的核酸是否发生杂交，从而可以确定核酸在该条件下是否杂交。
或者，MBS优选与miRNA序列的互补序列显示高同源性。高同源性是指：例如具有70％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的同一性的碱基序列。碱基序列的同一性例如可以使用BLAST程序(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)来确定。例如，可以在NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)的BLAST网页中使用默认的参数进行检索(Altschul S.F.etal.,Nature Genet.3:266-272,1993；Madden,T.L.et al.,Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul S.F.et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Zhang J.&MaddenT.L.,Genome Res.7:649-656,1997)。例如，可以利用在2个序列间进行比较的blast2sequences程序(Tatiana A et al.,FEMS Microbiol Lett.174:247-250,1999)建立两个序列的比对，从而确定序列的同一性。miRNA序列的碱基序列的外侧的缺口可忽略，内侧的缺口例如与错配同样地处理，计算相对于比对中的miRNA序列的碱基序列整体(加上进入序列内侧的缺口而得的总碱基长度)的同一性的值。但是如日本专利第4936343号公报所示，MBS与miRNA的错配可能提高miRNA的抑制活性。因此，例如优选忽略位于比对的内侧中的插入miRNA序列中的缺口来计算同一性。
或者，MBS可以由相对于miRNA序列的互补序列插入、置换、和/或缺失1或数个碱基而成的序列构成。MBS可由具有相对于miRNA序列的互补序列插入、置换、和/或缺失8碱基以内、7碱基以内、6碱基以内、5碱基以内、4碱基以内、3碱基以内、2碱基以内或1碱基的序列构成。或者，MBS可由具有相对于miRNA序列的互补序列插入8碱基以内、7碱基以内、6碱基以内、5碱基以内、4碱基以内、3碱基以内、2碱基以内或1碱基的序列构成。相较于与miRNA序列完全互补的序列，MBS为具有错配的序列时，有时miRNA的抑制活性更高。我们认为，这是由于当MBS为完全互补的序列时，被包含miRNA的RISC切割而导致miRNA抑制RNA的表达水平降低。但是，在使用耐受分解性高的修饰碱基时，则不需要包含凸起。特别地，对于按照当MBS与miRNA杂交时MBS的3’末端起第10位和/或第11位的碱基不配对(或者，与MBS杂交的miRNA侧的靶序列的5’末端起的第10位和/或第11位的碱基在与MBS杂交时不配对)或者在第10位与第11位的核苷酸之间包含不配对的碱基的方式设计的MBS，可以期待高活性。这种不配对例如可以是MBS侧的凸起，形成凸起的碱基为1～6碱基、优选为1～5碱基、更优选为3～5碱基(例如3、4或5碱基)。MBS可以由RNA构成，或者可以包含核酸类似物或由核酸类似物构成。特别地，通过将MBS的切割位点(MBS的3’末端起的第10位和/或第11位的碱基等)设为核酸类似物来避免发生切割，可期待miRNA抑制效果的提高。另外，使用具有硫代磷酸酯、2"-O-甲基等骨架或糖的核酸也是适宜的(Krutzfeldt,J.et al.,Nucleic Acids Res.35:2885-2892；Davis,S.et al.,2006,Nucleic Acids Res.34:2294-2304)。
本说明书中，使用的miRNA抑制复合体所靶向的miRNA没有特别限制。只要具有miRNA结构，则也可应用于植物、线虫、脊椎动物等任意种属来源的miRNA。已知在以人、小鼠、鸡、斑马鱼、拟南芥为代表的数量繁多的生物中miRNA的序列非常多(参照miRBase::Sequences的网页：microrna.sanger.ac.uk/sequences/)。例如，可以以包括小鼠、大鼠、山羊等在内的哺乳动物、包括猴在内的灵长类、和人的miRNA为靶。可列举例如miR-200家族的miRNA(例如miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)，优选列举miR-200c和miR-141等。进而，就可作为靶的miRNA而言，可列举例如miR-21、miR-17-92簇的miRNA(例如miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、miR-92a-1)、miR-155、miR-133a、miR-196b、miR-197、miR-205、miR-125b、miR-135b、miR-106a、miR-10a/10b、miR-146a、miR-182、miR-96等。
一实施方式中，本说明书所用的miRNA抑制复合体除了包含第一双链结构以外还包含第二双链结构，形成在位于第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含MBS的RNA链的结构，该RNA链的各另一端分别与位于该第二双链结构的一端的两条链结合，从而该RNA链被夹在第一双链结构与第二双链结构之间。例如，miRNA抑制复合体包含多个miRNA结合序列，例如包含2至5个miRNA结合序列。miRNA抑制复合体包含多个miRNA结合序列的方式在同时抑制多个miRNA方面有利，在通过抑制多个miRNA而有效地处置或预防的肿瘤的处置或预防方面有用。一实施方式中，miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列。双链结构可以是两条链，或者，可以是G-四联体(G-quadruplex)之类的4条链。例如，在本发明的一个实施方式中，除了包含第一双链结构以外还包含第二双链结构，并且形成第一双链结构中的、MBS所结合的末端的两条链上分别结合有各一条包含MBS的RNA链的结构，该RNA链的各另一端分别与该第二双链结构的两条链结合，从而该RNA链被夹在第一双链结构与第二双链结构之间。该RNA复合体例如具有下述结构：具有至少2个双链结构，并且构成该2个双链结构的4条RNA链分别不是介由其余3条链中的任一条链、而是直接结合于包含MBS的RNA。若更清楚地说明这种miRNA抑制复合体，则其是包含MBS的2条RNA链以被2个双链结构夹住的方式分别结合于2个双链结构的各链的miRNA抑制复合体(图2)。即，本发明中包含作为具有图2的结构的RNA复合体的、RNA链a和b被双链结构I和II夹住并且该a和b中分别包含1个以上的MBS的RNA。包含MBS的2条RNA链结合于双链结构的已配对的各条链，因此RNA链的方向变为彼此反向(图3、#12～#16)。通过像这样地在双链的各链中分别添加MBS，从而能够发挥更高的miRNA抑制活性。
在按照被2个双链结构夹住的方式存在的、包含MBS的2条RNA链中，分别包含1个以上的MBS。这些MBS的序列可以相同或不同。另外，可以是靶向相同的miRNA的序列，也可以是与不同的靶miRNA结合的序列。例如，在1条链中可以包含2个以上、例如2、3、4或5个MBS(图3、#12～#16)。例如，在被2个双链结构夹住的各链中可以包含1个或2个MBS。例如，本说明书所用的miRNA抑制复合体可以包含总计2个MBS，这2个MBS可以是相同的序列或与相同的miRNA结合的序列，也可以是不同的序列或与不同的miRNA结合的序列。
本说明书中，使用的miRNA抑制复合体所含的、双链的已配对的各条链通常如上所述为各RNA分子，双链的一或两个末端可以连接而形成直链状或环状。需要说明的是，直链状仅仅是相对于环状的词语、是指具有末端，当然不是意味着不形成二级结构。由直链状单链RNA构成的miRNA抑制复合体例如可以通过一次RNA合成来制作。例如，在包含2个双链结构的情况下，可以将第二双链结构的一端(不结合MBS的一侧)的两条链用环连接，从而使整体形成单链。在用于连接双链的序列中，可以包含1个或1个以上的MBS(例如图3、#13、#14、#16)。为了使序列尽量紧凑，可以将双链用短的环连接。例如，可以用1～10碱基、优选为1～8碱基、2～6碱基、3～5碱基、例如4碱基的序列来连接双链。序列没有特别限制。可列举例如5’-GUCA-3’。例如，本发明包含下述RNA，所述RNA具有图3的#13的结构，RNA链a和b被双链结构I和II夹住，双链结构II形成发夹(或茎·环)，在该a和b中分别包含1个以上的MBS。
本说明书中，使用的miRNA抑制复合体所含的双链结构的序列没有特别限制，可以是任意的碱基长。关于优选实施方式，以下将另外进行详细说明。
形成双链结构的碱基对的序列可按照能够在miRNA抑制复合体中特异地且稳定地形成双链的方式来适当设计。例如，优选避免同一碱基长长地(例如8碱基以上、优选为7碱基以上、更优选为5碱基以上、更优选为4碱基以上、更优选为3碱基以上)连续的均聚序列。另外，优选还避免两碱基重复序列、3～4碱基重复序列等数个碱基的序列串联重复的序列。双链部分的GC含量可适当进行调整，例如为12％～85％、优选为15％～80％、20％～75％、25％～73％、32％～72％、35％～70％、37％～68％或40％～65％。若列举一例，可列举日本专利第4936343号公报中示出的茎I和茎II的序列，但不限于这些。作为4条链，可列举G-四联体，具体可设为GGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGG这一序列。这里，loop的序列可适宜选择，例如可以将3个环均设为1碱基(例如M(A或C))或均设为3碱基。
MBS与双链结构可以直接连接，也可以借助其它序列连接。例如，可以借助适当的接头或间隔序列将MBS结合在双链结构的端部。即使将MBS直接连接在双链部分，也可以得到显著的抑制活性，但是，添加接头(或者也称为间隔序列)则对miRNA的抑制效果将进一步上升。MBS序列与双链结构之间的接头或间隔序列有可能增加MBS对存在于RISC中的miRNA的趋近性。接头或间隔序列的长度可以适当进行调整，例如为1～10碱基、优选为1～9碱基、1～8碱基、1～7碱基、1～6碱基、1～5碱基、1～4碱基或1～3碱基。例如，在将2个以上的MBS连接的情况下，也可以借助接头或间隔序列来连接。接头或间隔序列的序列没有特别限制，可以设为例如由A和/或C构成的序列或者相较于其它的碱基包含更多的A和/或C的序列。另外，优选注意避免使接头或间隔序列与相面对的接头或间隔序列或MBS之间形成稳定的碱基对。若列举一例，可例示AGA、AAC、CAA、ACC、CCA或包含这些中的任一者的序列等。添加在MBS两侧的一对接头或间隔序列可以设为反向序列(镜像序列)。例如，可以在MBS的5’侧添加AAC、在3’侧添加CAA。
本说明书中，构成使用的miRNA抑制复合体的核酸的特征在于，用本发明的特定的修饰核酸进行了修饰，但是也可以包含特定的修饰核酸以外的修饰核酸。例如，构成核酸的核苷酸除了包含本发明的特定的修饰核酸以外还可以包含天然的核苷酸、修饰的核苷酸、人工核苷酸或它们的组合。另外，本说明书所用的miRNA抑制复合体所含的核酸只要包含本说明书中言及的特定的修饰核酸，则该特定的修饰核酸以外可以由RNA构成，或者可以是RNA·DNA嵌合体，或者可以是其它的核酸类似物，可以包含它们的任意的组合。核酸中只要包含本发明的特定的修饰核酸，则不仅包含通过磷酸二酯键结合的核酸，还包括具有酰胺键、其它的骨架的核酸(肽核酸(PNA)等)。核酸类似物中包含例如天然和人工的核酸，可以是核酸衍生物、核酸类似物、核酸派生物等。这类核酸类似物在该领域中是周知的，包含例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2"-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)，但不限于这些。作为PNA骨架，可包含含有氨基乙基甘氨酸、聚酰胺、聚乙基、聚硫代酰胺、聚亚磺酰按、聚磺酰胺或它们的组合的骨架(Krutzfeldt,J.et al.,Nucleic AcidsRes.35:2885-2892；Davis,S.et al.,2006,NucleicAcids Res.34:2294-2304；Boutla,A.et al.,2003),Nucleic Acids Res.31:4973-4980；Hutvagner,G.et al.,2004,PLoSBiol.2:E98；Chan,J.A.et al.,2005,Cancer Res.65:6029-6033；Esau,C.et al.,2004,J.Biol.Chem.279:52361-52365；Esau,C.et al.,2006,Cell Metab.3:87-98)。
(本发明中使用的桥接核酸(BNA))
本发明中使用的miRNA抑制复合体的特征在于，包含稳定化型核酸、即促进双链形成的修饰核酸作为特定的修饰核酸，特征在于例如包含广义上的桥接核酸(BNA)这一点。
本说明书中，“桥接核酸(BNA)”(BNA是指Bicyclic Nucleic Acid和BridgedNucleic Acid两者。也称为“桥核酸”、“二环式核酸”或“桥/二环式核酸”。)是指：核酸的2’位与4’位之间相连接(成桥)、从而环结构成为2个(二环式)的任意的修饰型核酸。
1个例示性实施方式中，作为本发明中使用的稳定化型核酸(即，促进双链形成的修饰核酸)，可以使用桥接核酸。例如，可以使用日本专利4731324号、Pradeep S.Pallan etal.,Chem Commun(Camb).2012August 25；48(66):8195-8197.doi:10.1039/c2cc32286b中记载的桥接核酸，作为这些，可列举锁核酸(LNA)、2"-O,4"-C-亚乙基桥接核酸(2"-O,4"-C-ethylene bridged nucleic acid(ENA))等亚乙基核酸、其它桥接核酸(BNA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid；HNA)、吗啉代核酸、三环-DNA(tcDNA)、聚醚核酸(例如，参照美国专利第5,908,845号)、环己烯核酸(CeNA)、和它们的组合。
本说明书中，“取代”是指：将桥接核酸(BNA)等有机化合物中的某特定氢原子用其它原子或原子团取代。
本说明书中，“取代基”是指：在桥接核酸(BNA)等的化学结构中取代了其它原子或官能团的原子或官能团。
本说明书中，作为使用的miRNA抑制复合体中可使用的取代基，可列举烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、烷氧基、碳环基、杂环基、卤素、羟基、硫醇基、氰基、硝基、氨基、羧基、氨甲酰基、酰基、酰基氨基、硫代羧基、酰胺、取代的羰基、取代的硫代羰基、取代的磺酰基或取代的亚磺酰基，但不限于这些。取代基均可以具有氢以外的取代基。
本说明书中，只要没有特别声明，则取代是指：将某一有机化合物或取代基中的1或2个以上的氢原子用其它的原子或原子团取代或形成双键或三键。也可以除去1个氢原子并取代为1价的取代基或与单键一起形成双键，并且还可以将2个氢原子除去并取代为2价的取代基或与单键一起形成三键。
本说明书中，“烷基”是指：从甲烷、乙烷、丙烷之类的脂肪族烃(烷烃)中失去一个氢原子而生成的1价的基团，通常用CnH2n+1-表示(在此，n为正整数)。烷基可以是直链或支链。这些的具体例可以是C1～C2烷基、C1～C3烷基、C1～C4烷基、C1～C5烷基、C1～C6烷基、C1～C7烷基、C1～C8烷基、C1～C9烷基、C1～C10烷基、C1～C11烷基或C1～C20烷基、C1～C2取代的烷基、C1～C3取代的烷基、C1～C4取代的烷基、C1～C5取代的烷基、C1～C6取代的烷基、C1～C7取代的烷基、C1～C8取代的烷基、C1～C9取代的烷基、C1～C10取代的烷基、C1～C11取代的烷基或C1～C20取代的烷基。在此，例如C1～C10烷基是指：具有1～10个碳原子的直链或支链状的烷基。本说明书中，“取代烷基”是指：烷基的H被本说明书中规定的取代基取代而成的烷基。具体而言，虽然不限于这些，但可列举CH3OCH2-、CH3OCH2CH2-、CH3OCH2CH2CH2-、HOCH2-、HOCH2CH2-、HOCH2CH2CH2-、NCCH2-、NCCH2CH2-、NCCH2CH2CH2-、FCH2-、FCH2CH2-、FCH2CH2CH2-、H2NCH2-、H2NCH2CH2-、H2NCH2CH2CH2-、HOOCCH2-、HOOCCH2CH2-、HOOCCH2CH2CH2-。
本说明书中，“亚烷基”是指：从甲烷、乙烷、丙烷之类的脂肪族烃(烷烃)失去了两个氢原子而生成的2价基团，通常用-CnH2n-表示(在此，n为正整数)。亚烷基可以是直链或支链。本说明书中，“取代亚烷基”是指：亚烷基的H被上述的取代基取代而成的亚烷基。这些的具体例可以是C1亚烷基、C1～C2亚烷基、C1～C3亚烷基、C1～C4亚烷基、C1～C5亚烷基、C1～C6亚烷基、C1～C7亚烷基、C1～C8亚烷基、C1～C9亚烷基、C1～C10亚烷基、C1～C11亚烷基或C1～C20亚烷基、C1～C2取代亚烷基、C1～C3取代亚烷基、C1～C4取代亚烷基、C1～C5取代亚烷基、C1～C6取代亚烷基、C1～C7取代亚烷基、C1～C8取代亚烷基、C1～C9取代亚烷基、C1～C10取代亚烷基、C1～C11取代亚烷基或C1～C20取代亚烷基。在此，例如C1～C10亚烷基是指：具有1～10个碳原子的直链或支链状的亚烷基。另外，例如，C1～C10取代亚烷基是指：其中的1或多个氢原子被取代基取代的C1～C10亚烷基。本说明书中，“亚烷基”可以包含1个以上的选自氧原子和硫原子的原子。
本说明书中，“环烷基”是指：具有环式结构的烷基。“取代环烷基”是指：环烷基的H被上述的取代基取代的环烷基。作为具体例，可以是C3～C4环烷基、C3～C5环烷基、C3～C6环烷基、C3～C7环烷基、C3～C8环烷基、C3～C9环烷基、C3～C10环烷基、C3～C11环烷基、C3～C20环烷基、C3～C4取代环烷基、C3～C5取代环烷基、C3～C6取代环烷基、C3～C7取代环烷基、C3～C8取代环烷基、C3～C9取代环烷基、C3～C10取代环烷基、C3～C11取代环烷基或C3～C20取代环烷基。
本说明书中，“烯基”是指：分子内具有一个双键的脂肪族烃失去一个氢原子而成的1价基团，通常用CnH2n-1-表示(在此，n为2以上的正整数)。“取代烯基”是指：烯基的H被上述的取代基取代而成的烯基。作为具体例，可以是C2～C3烯基、C2～C4烯基、C2～C5烯基、C2～C6烯基、C2～C7烯基、C2～C8烯基、C2～C9烯基、C2～C10烯基、C2～C11烯基或C2～C20烯基、C2～C3取代烯基、C2～C4取代烯基、C2～C5取代烯基、C2～C6取代烯基、C2～C7取代烯基、C2～C8取代烯基、C2～C9取代烯基、C2～C10取代烯基、C2～C11取代烯基或C2～C20取代烯基。在此，例如C2～C10烷基是指包含2～10个碳原子的直链或支链状的烯基。另外，例如，C2～C10取代烯基是指其中的1或多个氢原子被取代基取代的C2～C10烯基。
本说明书中，“芳基”是指：1个键合在芳香族烃的环上的氢原子离去而产生的基团，本说明书中，芳基包含在碳环基中。从苯衍生的是苯基(C6H5-)，从甲苯衍生的是甲苯基(CH3C6H4-)，从二甲苯衍生的是二甲苯基((CH3)2C6H3-)，从萘衍生的是萘基(C10H8-)。
本说明书中，“芳烷基”是指：烷基的1个氢原子被芳基取代而成的烷基。芳烷基的具体例可以是苄基、苯乙基(苯基乙基)、1-萘乙基等。
本说明书中，“酰基”是指：从羧酸除去OH而形成的1价基团。作为酰基的代表例，可列举乙酰基(CH3CO-)、苯甲酰基(C6H5CO-)等。“取代酰基”是指：将酰基的氢用上述的取代基取代而成的基团。
本说明书中，“磺酰基”是对包含特征性基团-SO2-的基团的总称。“取代磺酰基”是指：被上述的取代基取代的磺酰基。
本说明书中，“甲硅烷基”是指通常用SiR1R2R3-表示的基团(在此，R1、R2、R3分别独立地从由氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、烷氧基、碳环基、杂环基组成的组中选择)。这些的具体例可以是三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基。
本说明书中，“功能性分子单元取代基”是指：包含标记分子(包括例如萤光分子、化学发光分子、放射性同位素在内的分子种类等)、DNA或RNA切割活性分子、细胞内或核内迁移信号肽等的基团。
一实施方式中，上述BNA可以是经由2’位侧的选自由氧和碳组成的组中的至少1个原子、经由4’位侧的选自碳和由碳和氮组成的组中的至少1个原子桥接的BNA。
代表性实施方式中，本发明中使用的BNA为以下的BNA-1所示的2’,4’取代桥接核酸，
[化17]
(式(BNA-1)中，R1、R1’、R2、R2’、和R3分别独立地表示选自由氢原子、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳烷基、取代或非取代的酰基、取代或非取代的磺酰基、取代或非取代的甲硅烷基、和功能性分子单元取代基组成的组中的基团，例如，虽然不限于这些但可列举取代或非取代的苯氧基乙酰基、碳数1～5的烷基、碳数1～5的烯基、碳数6～14的芳基、被1～3个芳基取代的甲基、甲磺酰基或对甲苯磺酰基等低级脂肪族或芳香族磺酰基或者乙酰基等碳数1～5的脂肪族酰基、苯甲酰基等芳香族酰基，n为1～3的整数，q为0或1的整数。)。
Base为嘌呤-9-基、2-氧代-嘧啶-1-基或其衍生物，例如，虽然不限于这些但可列举日本专利4731324号所例示的、本发明中有代表性的6-氨基嘌呤-9-基(即，腺嘌呤基)、2-氨基-6-氯嘌呤-9-基、2-氨基-6-氟嘌呤-9-基、2-氨基-6-溴嘌呤-9-基、2-氨基-6-羟基嘌呤-9-基(即，胍基)、6-氨基-2-氯嘌呤-9-基、6-氨基-2-氟嘌呤-9-基、2,6-二甲氧基嘌呤-9-基、2,6-二氯嘌呤-9-基、6-巯基嘌呤-9-基、2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，胞嘧啶基)、2-氧代-4-氨基-5-氟-1,2-二氢嘧啶-1-基、4-氨基-2-氧代-5-氯-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-甲氧基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-巯基-1,2-二氢嘧啶-1-基、2-氧代-4-羟基-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，尿嘧啶基)、2-氧代-4-羟基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，胸腺嘧啶基)、4-氨基-5-甲基-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，5-甲基胞嘧啶基)、9-β-D-呋喃核糖基次黄嘌呤基(即，肌苷基)和它们的衍生物，可以优选列举腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、胍基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基和5-甲基胞嘧啶基以及这些的衍生物。
另一代表性实施方式中，本发明中使用的BNA包含以下的BNA-2所示的2’,4’取代桥接核酸，
[化18]
(式(BNA-2)中，R3表示选自由氢原子、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳烷基、取代或非取代的酰基、取代或非取代的磺酰基、取代或非取代的甲硅烷基、和功能性分子单元取代基组成的组中的基团，例如，虽然不限于这些但可列举苯氧基乙酰基、碳数1～5的烷基、碳数1～5的烯基、碳数6～14的芳基、被1～3个芳基取代的甲基、甲磺酰基或对甲苯磺酰基等低级脂肪族或芳香族磺酰基或者乙酰基等碳数1～5的脂肪族酰基、苯甲酰基等芳香族酰基，m为0～2的整数，n为1～3的整数。)。Base与BNA-1中所说明的相同，可优选为腺嘌呤基、胍基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基和5-甲基胞嘧啶基、以及它们的衍生物。
另一代表性实施方式中，本发明中使用的BNA为以下的BNA-3：
[化19]
(式(BNA-3)中，R2和R2’分别独立地表示选自由氢原子、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳烷基、取代或非取代的酰基、取代或非取代的磺酰基、取代或非取代的甲硅烷基、和功能性分子单元取代基组成的组中的基团，例如，虽然不限于这些但可列举甲基、O-甲氧基乙基，Base与BNA-1中所说明的相同，可优选为腺嘌呤基、胍基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基和它们的衍生物。在此，n为1～3的整数，R2或R2’均不为氢。)
关于桥接链上具有支链的BNA，虽然不限于此，但可列举例如BNA(cEt)，
[化20]
(cEt：2’,4’-受限的乙基)。已知BNA(cEt)具有与以往的LNA同样的热稳定性和错配识别，但对于核酸酶的稳定性提高。
代表性实施方式中，本发明中使用的BNA可以是：
[化21]
(本说明书中，只要没有特别声明则表示为“BNANC(NMe)”，有时也表示为“(2’,4’-)BNANC”。)，这里，Base定义与上述相同，优选选自由腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、胍基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基和5-甲基胞嘧啶基组成的组。
本说明书中，“保护基”是指：为了在特定的化学反应中保护官能团而使用的基团。本说明书中，保护基有时也记作“PG”。
优选地，使用BNANC(NMe)或LNA作为BNA，更优选使用BNANC(NMe)作为BNA。
优选实施方式中，m为0，n为1。
因此，在用于miRNA时，可以是含有1或2个以上的下述通式(II)所示的核苷的单元结构中的1种以上的、作为DNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸的寡核苷酸或其药理学上可接受的盐。在此，其中，寡核苷酸中的各核苷间的结合方式除了与天然核酸相同的磷酸二酯键[-OP(O2-)O-]以外，可以含有1或2个以上的硫代磷酸酯键[-OP(O)(S-)O-]，另外在含有2个以上的上述结构中的1种以上时，Base在该结构间可以相同或不同。
作为本发明的一种的、含有人工核酸BNANC(NMe)[通式(I)中，R1和R2为氢，R3为氢或甲基]的DNA或RNA寡核苷酸类似物(II)具有下述的优异特性。这是由于，相对于互补的RNA链的双链形成能力非常高。
在DNA寡核苷酸中，每导入1个BNANC(NMe)单元(相当于1个修饰)则Tm值上升3～6℃。并且，对互补的DNA链的双链形成能力几乎不上升(提高)。在相对于互补的RNA链的结合亲和性方面，该特性与BNA修饰DNA寡核苷酸时同样地使Tm值跨越性上升(双链形成能力大幅提高)，另一方面，在相对于互补的DNA链方面，BNA修饰DNA寡核苷酸相较于未修饰DNA寡核苷酸可观察到双链形成能力的提高(每1个修饰使Tm值上升2～4℃)，与此相对地，对于BNANC(NMe)修饰DNA寡核苷酸则几乎观察不到结合亲和性的提高。因此，BNANC(NMe)修饰DNA寡核苷酸对RNA链的选择性结合亲和性极优异。
(2)另外，BNANC(NMe)修饰DNA寡核苷酸相对于双链DNA链的三链形成能力也出色。
在DNA寡核苷酸中导入1个BNANC(NMe)单元则在相对于双链DNA链的三链形成方面Tm值上升7～12℃。另外，在三链形成时，严格识别碱基序列、仅与靶序列结合的序列选择性是必不可少的，BNANC(NMe)修饰DNA寡核苷酸相对于匹配序列和错配序列的Tm值相差25℃以上，具有超过天然型DNA寡核苷酸的优异的序列选择性。BNANC(NMe)的的情况下，核酸酶抗性也是超群的。
BNANC(NMe)修饰寡核苷酸的核酸酶抗性虽然高于天然DNA寡核苷酸，但是远低于S-寡聚物(硫代磷酸酯型寡核苷酸)。本发明的BNANC(NMe)修饰寡核苷酸的核酸酶抗性优异当然高于BNA修饰寡核苷酸，甚至高于由于核酸酶抗性优异而受到好评的S-寡聚物，具有强烈对抗生体内的分解的特性。
(3)本发明的人工核酸BNANC(NMe)分子中所含的N-O键可以在温和条件下被还原试剂选择性断裂，并游离出NH基和OH基。通过以该NH基、OH基团为基础而结合其它功能性分子，从而不论在寡核苷酸类似物制备前还是制备后，均可以容易地得到各种复合体(缀合体)。作为其它功能性分子，可以是包括萤光分子、化学发光分子、放射性同位素原子在内的分子种类等标记用分子、各种DNA(RNA)切割活性分子、细胞内或核内迁移信号肽类等。
所使用的、用各种方式修饰有BNANC(NMe)的DNA、RNA寡核苷酸类似物不仅作为基于反义法、抗原法、诱饵法、基因同源重组法、RNA干扰法等的基因药品的研发的高性能材料有用，而且作为分子信标、DNA芯片等基因诊断法的基材、以及作为基因功能分析阐释等的研究用试剂的开发材料也极为有用。
作为本发明的化合物(BNA-1)和其盐中的优选的化合物，可列举：(5)R3为氢原子、碳数1～5的烷基、碳数1～5的烯基、碳数6～14的芳基、被1～3个芳基取代的甲基、甲磺酰基或对甲苯磺酰基等低级脂肪族或者芳香族磺酰基或乙酰基等碳数1～5的脂肪族酰基、苯氧基乙酰基和苯甲酰基等芳香族酰基的化合物和其盐、另外，R3的功能性分子单元取代基为萤光或化学发光标记分子、核酸切割活性官能团或者细胞内或核内迁移信号肽的物质，(6)Base如上所述，优选为腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、肌苷基、胞嘧啶基、胍基、甲基胞嘧啶基或它们的衍生物。
本发明的核苷类似物和寡核苷酸类似物可以基于实施例中记载的方法和本领域的现有技术合成。
(1)核苷类似物的合成
((BNA-1)和(BNA-2))
通式(BNA-1)和(BNA-2)所示的化合物可以基于实施例中记载的方法和本领域的现有技术来合成。反应条件、保护基导入试剂、反应试剂具体可以参考实施例中记载的方法，但不受其限定，可以基于本领域的技术常识适当采用可使用的反应条件、试剂。例如，可以参考日本特开2000-297097号公报、日本特开平10-304889号公报中记载的方法。另外，在具有各种天然、非天然的核酸碱基和其它的芳香族杂环、芳香族烃环来作为通式(I)或(II)中的Base时，也可以参考日本特开平10-304889号公报中记载的方法来合成本发明化合物的原料。
(核苷类似物的一般合成例)
[化22]
(1)化合物A-2的合成
向化合物A-1
[化23]
(式(A-1)中，PG1～PG4独立地为本说明书中记载的保护基，Base为本说明书中记载的核酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)的溶液(例如THF溶液3.5ml)中，在合适的温度(例如冰冷却下)加入合适的试剂(例如40％甲基胺水溶液(0.11ml，1.50mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如3小时)。将反应溶液的溶剂馏去后，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层。将有机层用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥，馏去溶剂后，(例如用硅胶柱色谱(正己烷：乙酸乙酯＝1：1))纯化，得到化合物A-2(例如45mg，99％，白色固体)。
(2)化合物A-3的合成
(例如在氮气流下)向化合物A-2(例如146mg，0.23mmol)的溶液(例如吡啶溶液(1.5ml))中，在合适的温度下(例如冰冷却下)加入PG5X(式中，PG5为本说明书中记载的保护基，X为Cl、Br、I，例如甲磺酰氯(45.1ml，0.59mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如1小时)。(例如向反应溶液中加入水)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，得到化合物A-3。化合物A-3也可以不经纯化而直接用于以下反应。
(3)化合物A-4的合成
向化合物A-3(例如170mg)的溶液(例如水-乙醇溶液(1：2,6ml))中，在合适的温度(例如室温)下加入合适的试剂(例如1M氢氧化钠水溶液(0.70ml，0.70mmol))，搅拌合适的时间(例如1小时)，从而向2’位导入(CR1R1’)mOH(R1和R1’为本说明书中记载的取代基)。(例如用10％盐酸水溶液)中和后，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取。(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇＝15：1))纯化，得到化合物A-4(例如139mg，95％(2阶段)，白色固体)。
(4)化合物A-5的合成
(例如在氮气流下)向化合物A-4(例如0.80g，1.28mmol)的溶液(例如乙醇溶液(10ml))中加入合适的试剂(例如20％氢氧化钯-碳粉末(0.60g)、环己烯(5.2ml，51mmol))，在合适的温度条件(例如加热回流)下搅拌合适的时间(例如5小时)，从而除去PG2和PG3。除去PG2的工序和除去PG3的工序可以是相同的工序，也可以是不同的工序。将反应溶液过滤后，减压馏去溶剂。得到的粗产物A-5可以不经纯化而直接用于以下反应。
(5)化合物A-6的合成
(例如在氮气流下)向化合物A-5(例如0.46g)的溶液(例如N,N-二甲基甲酰胺溶液(10ml))中，向PG6X(式中，PG6为本说明书中记载的保护基，X为Cl、Br、I，例如1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(0.45ml，1.41mmol))、碱(例如咪唑(0.38g，5.63mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如5小时)而导入PG6。将反应液用合适的有机溶剂(例如醚)萃取，(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如硫酸镁)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(正己烷：乙酸乙酯＝2：1→1：1))纯化，得到化合物A-6(例如0.60g，68％(2阶段)，白色固体)。
(6)化合物A-7的合成
(例如在氮气流下)向化合物A-6(例如200mg，0.29mmol)的溶液(例如吡啶溶液(3ml))中，在合适的温度(例如冰冷却下)加入PG5X(式中，PG5为本说明书中记载的保护基，X为Cl、Br、I，例如三氟甲磺酸酐(0.15ml，0.88mmol))、碱(例如4-(二甲基氨基)吡啶(7mg，0.06mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如7.5小时)。(例如向反应溶液中加入水)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如二氯甲烷)萃取。(例如用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，得到化合物A-7。得到的A-7可以不经纯化而直接用于以下反应。
(7)化合物A-8的合成
合成向化合物A-7的2’位的羟基导入氨基的化合物A-8。其合成方法例如为以下方法，但不限于此。(例如在氮气流下)向化合物A-7(例如0.29g)的溶液(例如乙腈溶液(3ml))中，在合适的温度(例如室温)下加入合适的试剂(例如N-羟基邻苯二甲酰亚胺(67mg，0.41mmol)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(61(1，0.41mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如12小时)。用合适的有机溶剂(例如二氯甲烷)对反应溶液进行萃取，(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(氯仿))纯化，得到化合物A-7’。向得到的化合物A-7’(1.16g，1.40mmol)的溶液(例如乙醇溶液(35ml))中加入合适的试剂(例如肼水合物(0.12ml，2.38mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如10分钟)。将反应溶液的馏去溶剂后，过滤，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)对滤液进行萃取。(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥，将溶剂减压馏去，得到的A-8可以不经纯化而直接用于以下反应。
(8)化合物A-9的合成
(例如在氮气流下)向化合物A-8(0.93g)的溶液(例如二氯甲烷溶液(15ml))中，在合适的温度下(例如冰冷却下)加入合适的试剂(例如饱和碳酸氢钠水溶液(4.0ml，4.2mmol))、PG7X(式中，PG7为本说明书中记载的保护基，X为Cl、Br、I，例如氯甲酸苄酯(0.30ml，2.1mmol))，搅拌合适的时间(例如1小时)。(例如加入饱和碳酸氢钠水溶液)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取。(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层，用合适的干燥剂(例如硫酸镁)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(正己烷：乙酸乙酯＝4：1))纯化，得到化合物A-9(例如0.92g，94％(2阶段)，白色固体)。
(9)化合物A-10的合成
(例如在氮气流下)向碱(例如氢化钠(60％in oil，0.55g，13.7mmol)的四氢呋喃悬浮液(25ml))中，在合适的温度下(例如冰冷却下)滴加化合物A-9(例如3.81g，4.57mmol)的溶液(例如四氢呋喃溶液(15ml))，搅拌合适的时间(例如1小时)后，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如5小时)，从而除去OPG4且经2’位与4’位桥接。除去OPG4的工序和将2’位与4’位桥接的工序可以是相同的工序，也可以是不同的工序。(例如用饱和草酸水溶液)中和后，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取。(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(氯仿→氯仿：甲醇＝100：1))纯化，得到化合物A-10(例如2.87g，95％，白色固体)。
(10)化合物A-11的合成
(例如在氮气流下)向化合物A-10(例如0.35mg，0.53mmol)的溶液(例如二氯甲烷溶液(10ml))中，在合适的温度下(例如冰冷却下)加入合适的试剂(例如1M三氯化硼己烷溶液(5.29ml，5.29mmol))，搅拌合适的时间(例如1小时)。(例如通过向反应溶液中加入饱和碳酸氢钠水溶液而)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇＝50：1))纯化，得到化合物A-11(例如0.27g，96％，白色固体)。
(11)化合物A-12的合成
向化合物A-11(0.19g，0.36mmol)的溶液(例如1M对甲苯磺酸吡啶鎓-甲醇溶液(3.6ml))中，在合适的温度(例如室温)下加入合适的试剂(例如20％甲醛水溶液(0.06ml，0.40mmol))，搅拌合适的时间(例如10分钟)。进一步在合适的温度下(例如冰冷却下)加入合适的试剂(例如氰基硼氢化钠(45mg，0.72mmol))，用取代基R3(R3为本说明书中记载的取代基)对氨基进行取代。搅拌合适的时间(例如1小时)。将反应溶液用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和盐水)洗涤，将有机层用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(正己烷：乙酸乙酯＝2：1))纯化，得到化合物A-12(例如0.19g，100％，白色固体)。
(12)化合物A-13的合成
向化合物A-12(46mg，0.085mmol)的溶液(例如四氢呋喃溶液(2ml))中，加入合适的试剂(例如四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃中，0.17ml，0.17mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如5分钟)。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(乙酸乙酯：甲醇＝15：1)纯化，得到化合物A-13(例如25mg，100％，白色固体)。
(13)化合物A-14的合成
向化合物A-13(例如0.16g，0.54mmol)的溶液(例如吡啶溶液(10ml))中加入合适的试剂(例如4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(例如0.22g，0.64mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如12小时)。对反应液(例如加入饱和碳酸氢钠水溶液，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)进行萃取，(例如用水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(含有1％三乙胺的正己烷：乙酸乙酯＝1：2→乙酸乙酯：甲醇＝30：1))纯化，得到化合物A-14(例如0.30g，93％，白色固体)。
(14)化合物A-15的合成
向化合物A-14(例如0.17g，0.28mmol)和合适的试剂(例如4,5-二氰基咪唑(40mg，0.34mmol))的溶液(例如乙腈溶液(6ml))中，加入合适的试剂(例如2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(0.13ml，0.42mmol))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如4小时)，从而用P(O)(OPG9)(OPG10)(PG9和PG10分别独立地为本说明书中记载的保护基)修饰3’位的羟基。(例如向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液而)淬灭，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取。(例如用饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥，将溶剂减压馏去。将得到的粗产物(例如用硅胶柱色谱(含有1％三乙胺的正己烷：乙酸乙酯＝1：1)，然后重沉淀(乙酸乙酯-己烷))纯化，得到化合物A-15(例如0.20g，88％，白色固体)。
(BNA-3)
通式BNA-3所示的化合物可基于实施例中记载的方法和本领域的现有技术来合成。反应条件、保护基导入试剂、反应试剂具体可以参考实施例中记载的方法，但不受其限定，可以基于本领域的技术常识适当采用可使用的反应条件、试剂。例如，可以参考J.Org.Chem.2010,75,1569-1581中记载的方法。另外，在具有各种天然、非天然的核酸碱基和其它的芳香族杂环、芳香族烃环作为通式(I)或(II)中的Base时，也可以参考J.Org.Chem.2010,75,1569-1581中记载的方法来合成本发明化合物的原料。
BNA-3的一般合成例
[化24]
(1)化合物B-2的合成
向化合物B-1
[化25]
(式(B-1)中，PG1～PG4为独立地本说明书中记载的保护基，R2和R2’为本说明书中记载的取代基，Base为本说明书中记载的核酸碱基，例如腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、胍基或甲基胞嘧啶基)的溶液中，(例如在氮气流下)在合适的温度下加入合适的试剂(例如碳酸钾)，在合适的温度下搅拌合适的时间。(例如向反应溶液中加入水)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用饱和盐水)洗涤有机层。将有机层用合适的干燥剂(例如硫酸钠)干燥，馏去溶剂后，(例如用硅胶柱色谱)纯化，得到化合物B-2。
(2)化合物B-3的合成
(例如在氮气流下)向化合物B-2的溶液中，在合适的温度(例如室温)下加入合适的试剂(例如2,3-二氯-5,6-二氰基-对苯醌(DDQ))，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如12小时)。(例如向反应溶液中加入水)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，得到化合物B-3。
(3)化合物B-4的合成
(例如在氮气流下)向化合物B-3的溶液中，在合适的温度(例如冰冷却下)加入合适的试剂(例如三乙胺三氢氟酸盐)，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如12小时)。(例如向反应溶液中加入水)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，得到化合物B-4。
(3)化合物B-5的合成
(例如在氮气流下)向化合物B-4的溶液中，在合适的温度(例如室温)下加入PG5X(式中，PG5为本说明书中记载的保护基，X为Cl、Br、I，例如二甲氧基三苯甲基氯)，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如12小时)。(例如向反应溶液中加入水)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，得到化合物B-5。
(3)化合物B-6的合成
(例如在氮气流下)向化合物B-5的溶液中，在合适的温度(例如室温)下加入合适的试剂(例如2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺)，在合适的温度(例如室温)下搅拌合适的时间(例如4小时)，从而用P(O)(OPG6)(OPG7)(PG6和PG7分别独立地为本说明书中记载的保护基)修饰3’位的羟基。(例如向反应溶液中加入水)淬灭反应，用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)萃取，(例如用饱和盐水)洗涤有机层后，用合适的干燥剂(例如无水硫酸钠)干燥。将溶剂减压馏去，得到化合物B-6。
(2)寡核苷酸类似物的合成
可以使用公知的DNA合成仪来合成各种在本发明中使用的包含核苷类似物的寡核苷酸类似物。然后将得到的寡核苷酸类似物用反相柱纯化，用反相HPLC、MALDI-TOF-MS分析产物的纯度，从而可以确认纯化寡核苷酸类似物的生成。在寡核苷酸类似物中，可以存在1个以上的本发明的核苷类似物。另外，可以以被1或2个以上的天然核苷酸隔离的状态存在于寡核苷酸类似物的2个以上的位置。根据本发明，可以合成在必要的位置导入了必要数量(长度)的本发明的核苷类似物的寡核苷酸类似物。作为寡核苷酸类似物整体的长度，核苷酸单位为2～50，优选为8～30个。
本发明中使用的寡核苷酸类似物不易被核酸酶分解，对生物体给药后可以长久地存在于生物体内。并且，例如与有义RNA形成双链而抑制对成为疾病原因的生物体内成分(蛋白质)向mRNA的转录。认为另外可抑制所感染的病毒的增殖。
因此，可期待本发明的寡核苷酸类似物作为以抗肿瘤剂、抗病毒剂为代表的、抑制基因的活动从而治疗疾病的药品的有用性。即，根据本发明，提供寡核苷酸类似物和作为其制造中间体的核苷类似物，其具有稳定且优异的反义或抗原活性或者作为特定基因的检测药或用于引起扩增的引物而具有优异的活性。
本发明中使用的、用各种方式修饰有作为核苷类似物之一的2’,4’-BNANC单体的DNA、RNA寡核苷酸类似物(寡核苷酸类似物)作为各种生理·生物活性物质类、药品类的材料、用于RNA干扰法或诱饵法等的双链寡核苷酸的功能性材料、靶向cDNA等单链核酸的DNA芯片、分子信标(molecular beacon)等的功能性材料、各种反义法(包含酶、DNA酶)、抗原法或基因同源重组法用途中的功能性材料、与萤光或发光物质组合而成的生物体微量成分的高灵敏度分析用材料、基因功能分析阐释等的研究用试剂的开发材料有用。
本发明的核苷类似物、寡核苷酸类似物可以配合例如缓冲剂和/或稳定剂等惯用的助剂而制成非经口给药用制剂。另外，作为局部用的制剂，可以配合惯用的药用载体而制剂成软膏、乳霜、液剂或膏药等。
(构成S-TuD的寡核苷酸的一般合成例)
本发明中使用的构成S-TuD的寡核苷酸用合成仪(例如nS-8II合成仪或AKTAoligopilot合成仪)来合成。在寡核苷酸合成中，使用细孔玻璃质固相载体(例如2’-O-甲基-RNA CPG Link Technologies公司制)和具有标准的保护基的2’-O-甲基-RNA亚磷酰胺、(例如，虽然不限定于此，但可列举5’-O-二甲氧基三苯甲基N6-苯甲酰基腺苷-2’-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-乙酰基胞苷-2’-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-异丁酰基鸟苷-2’-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺、和5’-O-二甲氧基三苯甲基尿苷-2’-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺(以上为Sigma-Aldrich公司制)以及2’,4’-BNANC(2’-O，4’-C-aminomethylenebridged nucleic acid)胸苷亚磷酰胺、即2’-O，4’-C-氨基亚甲基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-N,N’-二异丙基亚磷酰胺、2’,4’-BNANC腺苷亚磷酰胺、即2’-O，4’-C-氨基亚甲基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基腺苷-N,N’-二异丙基亚磷酰胺(以上为BNA公司制)、以及LNA(Locked nucleic acid)(2’-O，4’-C-methylene ribonucleic acid)胸苷亚磷酰胺、即，2’-O，4’-C-亚甲基-5’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-N,N’-二异丙基亚磷酰胺(Exiqon公司制))。亚磷酰胺均以合适的溶剂(例如乙腈(CH3CN))中的合适的浓度(例如0.1M)来使用。关于2’-O-甲基RNA、BNA和LNA，使用合适的连接/再利用时间(例如15分钟)。活性剂为例如5-苄基巯基-四唑(0.25M、和光纯药公司制)，但不限于此，PO-氧化例如使用碘/水/吡啶，但不限于此。
(脱保护的一般例(核碱基脱保护的一般例))
合成结束后，将合成载体转移到合适的容器(例如玻璃瓶)中。对于寡核苷酸，相对于载体1g使用15mL的40％甲基胺水溶液与33％甲基胺乙醇溶液的等量混合物，在合适的温度(例如45℃)下以合适的时间(例如13小时)对碱基和磷酸基进行脱保护并从载体上切割下来。对碱基进行脱保护的工序和对磷酸基进行脱保护的工序可以相同也可以不同。然后，对乙醇氨混合物进行过滤，加入合适的容器(例如新的250mL的瓶)中。(例如用2×40mL的乙醇/水(1：1v/v))洗涤载体。然后(例如使用旋转蒸发器(roto-vap))馏去溶剂而干固。
(HPLC纯化的一般例)
将寡核苷酸用HPLC(例如利用Source 15 RPC凝胶柱的反相离子对HPLC)纯化。缓冲液例如为5％CH3CN、0.1M三乙胺乙酸缓冲液(pH7.0)(缓冲液A)和90％CH3CN、0.1M三乙胺乙酸缓冲液(pH7.0)(缓冲液B)，但不限于此。在于5’末端保持有保护基(例如二甲氧基三苯甲基)的状态下，将包含全长的寡核苷酸的级分合并，供于此后的纯化。然后将寡核苷酸合并物用HPLC(例如Source 30Q的阴离子对HPLC)纯化。溶液和缓冲液为例如0.6％的三氟乙酸(溶液A)、20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)(缓冲液C)和20mM磷酸钠缓冲液中的2M氯化钠(缓冲液D)，但不限于此。去除5’末端的保护基后，将包含全长的寡核苷酸的级分合并，脱盐后冷冻干燥。最后使用例如MALDI-TOF/MS和反相HPLC(例如X-Bridge的离子对反相HPLC)分析化合物。
(双链化的一般例)
将纯化后的单链寡核苷酸溶解于合适的溶剂(例如蒸馏水)后，(例如使用紫外分光光度计测定吸光度而)确定寡核苷酸浓度。使用所确定的浓度，按照彼此达到等摩尔浓度的方式混合互补链，在合适的温度(例如95℃)下加热合适的时间(例如10分钟)后缓慢冷却而使其形成双链。例如，利用非变性凝胶电泳来确认形成了双链。
另外，核酸的末端可以包含结合体。作为结合体，可列举例如亲油性物质、萜烯、蛋白质结合物质、维生素、碳水化物、维生素A类和肽等。
(RNA的单链等特殊形态)
可以按照由直链状的单链核酸构成的方式来设计本说明书所用的miRNA抑制复合体(图3)。本发明特别涉及：所有的MBS集中在某一双链结构(图2的茎I)的一侧(图3中为右侧)、该双链结构的各链在该侧形成闭合结构(即，通过包含MBS的序列而连接)、单链RNA的两端存在于该双链结构的相反侧的复合体(图3)。包含MBS的序列中可以包含其它的双链结构(图3的茎II、III等)。单链RNA的长度可适宜地确定，例如在500碱基以内，优选为450碱基以内、420碱基以内、400碱基以内、380碱基以内、360碱基以内、340碱基以内、320碱基以内、300碱基以内、280碱基以内、260碱基以内、240碱基以内、220碱基以内、200碱基以内、180碱基以内、160碱基以内、140碱基以内、120碱基以内、100碱基以内或80碱基以内。例如，形成具有2个双链结构和2个MBS的复合体的单链RNA的长度为例如60～300碱基、优选为70～250碱基、80～200碱基、90～180碱基或100～150碱基。第一双链结构(靠近单链RNA的两端的双链结构)可以设为例如15～30bp，优选为16～28bp、优选为17～25bp、优选为17～24bp，例如17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp或24bp，第二双链结构(包含MBS的序列所含的其它的双链结构)可以比第一双链结构的长度短，以使整体紧凑，例如为4bp～20bp，可以设为例如5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp或7bp～8bp。
另外，本发明涉及构成本说明书所用的miRNA抑制复合体的、包含BNA的RNA(这里，RNA包括天然的RNA和核酸类似物)。在miRNA抑制RNA复合体由1分子的RNA构成时，可以通过该RNA的分子内退火而构建本发明的复合体，另外在由2条以上的RNA分子构成时，可以通过使这些RNA退火而构建本发明的复合体。可以适宜地合成这些RNA。例如，可以通过RNA的化学合成来制造期望的RNA。
编码至少1个MBS的核酸可以包含2个以上的MBS，另外可以在连续的序列中包含可形成双链结构的1对或1对以上的互补序列组。例如，作为该核酸，可例示包含形成至少1个双链结构的1对互补序列、和位于该一对互补序列的两端的各至少1个MBS的核酸。这种核酸具体为在2个MBS之间包含可形成茎的一对互补序列的核酸。该茎相当于上述第二双链结构。或者，作为第二双链结构的替代，可以包含形成G-四联体的序列。
另外，该核酸可以包含2个以上的、在2个MBS之间包含可形成双链结构的1对互补序列的结构单元。可以以多个嵌套的形态包含该结构单元，可以在位于1对MBS之间的可形成双链结构的1对互补序列之间，进一步包含含有1对MBS和位于其间的可形成双链结构的1对互补序列的序列(图3的#15、#16等)。所含的多个MBS序列可以相同也可以不同。
当将这种核酸插入上述的1对互补序列之间时，得到具有如下结构的核酸，所述结构为：在第一形成双链结构的一对互补序列之间，插入有具有MBS-第二形成双链结构的序列-MBS的结构的序列。具体为例如具有下述结构的核酸，所述结构为插入了具有MBS-第二形成双链结构的一对互补序列-MBS的结构的序列的结构。由2个双链结构和位于其间的一对对向的单链(分别包含MBS)构成的核酸紧凑且显示充分的miRNA抑制活性。
可以适当地借助接头、间隔序列来连接可形成双链结构的1对互补序列和MBS。接头、间隔序列的长度如说明书中所记载。另外，可以借助接头、间隔序列来连接互补序列，在形成双链时，该接头、间隔序列形成环，与双链一起形成茎环结构。环的长度也可以适当进行调整，详细如说明书中所记载。或者，作为双链的替代，也可以适当使用形成G-四联体的序列。
本发明的一方面中提供包含5'-CAGUGUU-3'和5'-CAGUAUU-3'的序列、且包含至少1个桥接核酸(BNA)的核酸分子。本发明的一方面提供一种核酸分子，其包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'或5'-CAGUAUU-3'、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'或5'-CAGUAUU-3'，并且包含至少1个桥接核酸(BNA)。本发明的一实施方式提供一种核酸分子，其包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'，并且包含至少1个桥接核酸(BNA)。
本发明的一实施方式提供一种核酸分子，其包含含有序列号1的序列的miRNA结合序列、和含有序列号2的序列的miRNA结合序列。本发明的进一步的实施方式为包含序列号9的序列、和序列号10的序列的核酸分子。
本发明的核酸分子或miRNA抑制复合体中，可以在任意的位置包含任意数量的本发明中使用的BNA。例如，在1个核酸分子或miRNA抑制复合体中，可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多的BNA。如上所述，即使仅包含1个BNA也可发挥效果。BNA可包含于MBS和/或双链结构中，仅在MBS或双链结构中的任一者中包含时也可以期待血清稳定性和miRNA抑制能力的提高。在特别优选实施方式中，BNA包含在MBS和双链结构两方中。例如，利用对图10所示的位置(图中的小写字母处)实施BNA化的核酸分子，可以成功地抑制miR-200C，对于miR21等miR-200C以外的miRNA，也可以观察到同样的抑制效果。
(miRNA的抑制)
本发明中，提供包含包括上述在内的本说明书中记载的核酸分子的组合物或使用其的方法。优选实施方式中，组合物用于预防或处置肿瘤，还提供使用所述组合物的用于预防或处置肿瘤的方法。
一实施方式中，本发明的对象肿瘤为癌。另一实施方式中，本发明的对象肿瘤为结肠癌、肺癌或乳腺癌。本发明的组合物还可以用于促进肿瘤的上皮-间充质转换，本公开还提供用于这种用途的组合物和这种应用的方法。本发明的1个方面涉及一种组合物，其为包含miRNA抑制复合体的组合物，miRNA抑制复合体以包含在用于核酸递送的载体中的形态存在。合适的载体的使用对于miRNA抑制复合体的血清稳定性、促进向靶组织的递送、用于处置或预防而言是特别有用的。
本发明人们发现，对于作为靶miRNA的特异性的强抑制剂的TuD(Tough Decoy)RNA组合四环素诱导性表达系统，并且应用该系统通过TuD的表达同时地抑制人结肠癌细胞株中的miR-200c和miR-141的表达，结果诱导了包括上皮-间充质转换(EMT)的诱导在内的癌细胞亚群的显著变化。
为了了解miR-200家族的抑制对肿瘤细胞造成的影响，基于细胞表面标志物鉴定三阴性乳腺癌细胞的细胞团中所含的特定的亚群，并且观察这些细胞在亚群间相互转变的模式，结果意外地发现，具有上皮性状的亚群显示显著高的致瘤活性。
还获知，当在这些肿瘤细胞中同时抑制miR-200家族的多个成员时，致瘤活性显著降低。另外，在ESA(-)肿瘤细胞亚群中同时抑制多个miR-200家族成员时，本来就低的致瘤活性变得完全观察不到。
这些结果表明：miR-200家族成员与致瘤活性、特别是原发性病灶中的原发肿瘤的增殖密切相关，通过有效地抑制miR-200家族成员能够极高效地降低致瘤活性。以往一直认为，在肿瘤细胞中，具有更接近未分化状态的间充质(mesenchymal)的表型的细胞的致瘤活性高。但是，本发明人们确认具有上皮样(epithelial)表型的细胞对致瘤活性有巨大贡献，另外证实，对促进肿瘤的EMT的miR-200家族成员进行抑制而使肿瘤细胞群的平衡从上皮样向间充质倾斜，从而可以抑制肿瘤增殖。即，本发明的部分方面证实，通过抑制miR-200家族成员可有效地抑制原发性肿瘤的肿瘤增殖，另外还可以实现使已形成的肿瘤萎缩。特别地，通过本发明，不仅以癌干细胞为靶来抑制肿瘤，而且能够同时地防止由非癌干细胞产生癌干细胞的情况。
另外，本发明除了miR-200家族成员以外还以以下记载的miRNA为靶而对其进行抑制。我们认为，通过抑制所述miRNA，可以根据靶miRNA而实现期望的处置，所述期望的处置包括抑制肿瘤增殖、使肿瘤萎缩、防止由非癌干细胞产生癌干细胞等。本发明的抑制复合体可按照与本说明书中例示的任意的miRNA结合的方式来设计。
miR-205与miR-200家族同样地通过抑制Zeb1和Zeb2来抑制EMT(Nature CellBiology volume 10,pages 593-601(2008))。另外，据报道miR-205在肺癌中表达上调、可成为诊断标志物(Biomed Pharmacother.2017Jul；91:823-830.)。因此，认为miR-205与miR-200家族成员同样地可以作为靶。
miR-21在结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、成胶质细胞瘤、皮肤癌、甲状腺癌、子宫颈癌、血细胞系统癌之类的各种癌种类中的表达异常亢进(DOI:10.1111/j.1582-4934.2008.00556.x)。在肝癌细胞中抑制miR-21则可抑制细胞增殖·迁移能力·浸润能力。在成胶质细胞瘤细胞中抑制miR-21则诱导细胞凋亡。在乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、子宫癌、神经胶质瘤、头颈部癌、胃癌、膀胱癌中，miR-21会加剧化学疗法抗药性(Biomed Rep.2016 Oct；5(4):395-402.)。
作为miR-17-92簇的miRNA，可列举miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1，miR-92a-1，这些成簇存在于第13号染色体。miR-17-92簇的miRNA在肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、白血病中可见表达亢进(Front Med(Lausanne).2015；2:64)。
miR-155在神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、口腔鳞状上皮癌、淋巴瘤中加剧癌的恶性性状。另外，miR-155会加剧肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等对抗癌化学疗法、放射线治疗的抗性(Bayraktar,R.&Van Roosbroeck,K.Cancer Metastasis Rev(2018)37:33.)。此外还报道，miR-155在结肠癌、肺癌、乳腺癌中的表达异常亢进(ProcNatl Acad Sci USA 2006；103:2257-61.)，对乳腺癌细胞株MDA-MB-231给药anti-miR-155时，在向小鼠进行移植时可见肿瘤形成的抑制(DOI:10.1158/0008-5472.CAN-09-4250)，当移植用抑制剂抑制了miR-155的肺癌细胞时，肿瘤生长得到抑制，进而当同时抑制miR-21时抑制效果得到增强(Oncotarget.2016 Dec 20；7(51):84508-84519.)。
关于miR-133a，报道了骨肉瘤如果高表达miR-133a则预后差，另外在骨肉瘤荷瘤小鼠中联用miR-133a抑制和化学疗法时肺转移得到抑制，总存活期延长(Stem Cells.2014Apr；32(4):959-73.)。
关于miR-196b，报道了胰腺癌中miR-196b高表达组的预后差(Carcinogenesis.2017 Apr 1；38(4):425-431.)。
关于miR-197，报道了将抑制了miR-197的肺癌细胞株移植到小鼠后，肿瘤生长得到抑制(Cell Death and Differentiation(2014)21,774-782)。
据报道，miR-125b在胃癌中加剧分子靶向治疗药的抗药性，高表达组的预后差(Exp Ther Med.2017 Jul；14(1):657-663.)。
据报道，miR-135b在结肠癌中高表达，高表达组的预后差(Cancer Cell.2014 Apr14；25(4):469-483.)，另外，肺癌中miR-135b高表达组的预后差，在对肺癌细胞株移植小鼠给药抑制剂时，肿瘤生长得到抑制(Nat Commun.2013；4:1877.doi:10.1038/ncomms2876.)。
据报道，miR-106a在肺癌中高表达，高表达组的预后差，另外，在肺癌细胞中抑制miR-106a则细胞增殖得到抑制(Int J Clin Exp Pathol.2015 Apr 1；8(4):3827-34.)，另外，结肠癌中miR-106a高表达组的预后差(Med Mol Morphol.2017 Jun；50(2):76-85.)。
关于miR-10a/10b，报道了抑制肺癌细胞株的miR-10a则细胞增殖得到抑制(Oncotarget.2015 Oct 6；6(30):30239-50.)，以及肺癌中miR-10b高表达组的预后差(Clin Transl Oncol(2015)17:209-214)。
据报道，miR-146a在骨肉瘤中表达上调，高表达组的预后差，在小鼠中，抑制了miR-146a的骨肉瘤的肿瘤生长得到抑制(Oncotarget.2017；8:74276-74286.)。
关于miR-182，报道了在结肠癌细胞中抑制miR-182时，细胞增殖、集落形成能力得到抑制(Oncol Rep.2015 May；33(5):2592-8.)。
关于miR-96，报道了在前列腺癌细胞中抑制miR-96则细胞增殖得到抑制(Oncogene.2015 Sep 3；34(36):4767-76.)。
本发明的优选实施方式的特征在于，抑制包含5'-AACACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA和包含5'-AAUACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA这两者，从而抑制肿瘤。这里，肿瘤的抑制可以是抑制肿瘤细胞的致瘤活性(tumorigenicity)、抑制肿瘤的形成或增殖或者使肿瘤萎缩中的任意者。这些例如可以以将肿瘤细胞注入个体时的体内肿块形成(例如其频度)和其大小或生长速度等为指标来测定。miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'和/或5'-CAGUAUU-3'。从而可以抑制包含5'-AACACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA或包含5'-AAUACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA。miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'，且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'。从而在抑制包含5'-AACACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA和包含5'-AAUACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA这两者方面有利。
另外，基于本发明的肿瘤抑制的特征还在于，不仅靶向癌干细胞，而且可以同时防止由非癌干细胞产生癌干细胞。即，作为本发明中的肿瘤抑制，包含(i)抑制癌干细胞形成肿瘤、(ii)抑制由非癌干细胞产生癌干细胞这两者的实现。具体而言，基于本发明的肿瘤抑制不仅在肿瘤细胞团中抑制由致瘤活性相对上升的亚群(亚集团)形成肿瘤，而且还发挥将属于致瘤活性相对上升的亚群的细胞转变为致瘤活性相对低的亚群的细胞的作用，另外抑制属于致瘤活性相对低的亚群的细胞转变为致瘤活性相对上升的细胞。从而，本发明的肿瘤抑制不仅对已产生的致瘤活性高的癌细胞(例如癌干细胞)抑制其致瘤活性，而且将这些癌细胞转变为致瘤活性更低的癌细胞(非癌干细胞)，还可以抑制致瘤活性低的癌细胞向致瘤活性高的癌细胞的转变。从而，不仅靶向癌干细胞、而且能够同时防止由非癌干细胞产生癌干细胞的本发明的肿瘤抑制，其在临床应用中具有极高的有用性。另外，还可以期待通过本发明的肿瘤抑制在癌症发病前后的早期阶段预防性地抑制肿瘤形成。即，本发明中，“肿瘤的抑制”的优选方式为下述抑制：该肿瘤的抑制实现在肿瘤的细胞团中抑制致瘤活性上升的肿瘤细胞亚群形成肿瘤、和抑制该致瘤活性上升的肿瘤细胞亚群的生成两者。
可以使用期望的标志物等进行将肿瘤细胞团分级为亚群。例如，可以以上皮标志物为指标而分级为亚群。作为上皮标志物，例如可以从ESA(epithelial specificantigen，上皮特异性抗原)、CDH1(Cadherin-1，钙黏蛋白-1)、CDH3(Cadherin-3，钙黏蛋白-3)、和ESRP1(epithelial splicing regulatory protein 1，上皮剪接调节蛋白1)等中任意选择，更优选列举ESA，但不限于这些。另外，可以将这些标志物组合使用。在上皮标志物阳性的亚群与阴性的亚群相比致瘤活性相对高的情况下，该阳性的亚群为致瘤活性相对上升的亚群(致瘤活性高的细胞群)，该阴性的亚群为致瘤活性相对低的亚群(致瘤活性低的细胞群)。
另外，种子序列是指从miRNA的5'末端数起第2位至第8位的碱基序列。就包含5'-AACACUG-3'作为种子序列的miRNA而言，包括miR-200a(5'-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3'、序列号13)和miR-141(5'-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3'、序列号14)。另外，就包含5'-AAUACUG-3'作为种子序列的miRNA而言，包括miR-200b(5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3'、序列号15)、miR-200c(5'-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA-3'、序列号16)、和miR-429(5'-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3'、序列号17)。
在仅用针对包含5'-AAUACUG-3'作为种子序列的miR-200c的抑制剂的抑制中，包含5'-AACACUG-3'作为种子序列的miR-141的活性几乎不受抑制。这表明，两者的种子序列中所存在的1碱基差异导致针对一miRNA的抑制剂不能有效地抑制另一miRNA。通过将抑制各miRNA的2种miRNA组合，则能够发挥本发明中所示的显著的抗肿瘤活性。
本发明的另一实施方式的特别在于，抑制包含5'-AGCUUAU-3'作为种子序列的至少1个miRNA，从而抑制肿瘤。作为所述miRNA，可列举miR-21(5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'、序列号41)。
上述的本发明方法优选至少抑制miR-200c和miR-141。被抑制的细胞中的各miRNA的活性相较于非抑制时的各miRNA的活性为例如1/3以下，优选为例如1/4以下、1/5以下、1/6以下、1/7以下、1/8以下或1/9以下。更优选为例如10％以下、8％以下、5％以下或3％以下。更优选本发明的方法抑制miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429中的每一个。各miRNA的活性相较于非抑制时的各miRNA的活性为例如1/3以下，优选为例如1/4以下、1/5以下、1/6以下、1/7以下、1/8以下或1/9以下。更优选为例如10％以下、8％以下、5％以下或3％以下。优选本发明的方法抑制miR-200家族的所有成员。关于活性测定，例如可以通过使用萤光素酶的报告基因测试(例如使用Dual-萤光素酶(注册商标)Reporter Assay System(Promega)的测试)等本领域技术人员公知的测试来实施。
在本说明书的其它位置公开了对于抑制miRNA特别有用的miRNA抑制复合体。在本发明中，作为miRNA抑制剂，可以特别优选使用S-TuD。本发明中，S-TuD是指具有下述结构的的miRNA抑制剂，所述结构是：具有分别包含至少1个miRNA结合序列的一对链，该包含miRNA结合序列的一对链的两端结合在一对多重链的各自的一端，从而被一对多重链(例如双链和/或四条链)夹住。该miRNA抑制剂可以由RNA构成，另外也可以由其它的核酸、核酸类似物或它们的组合构成。
另外，包含5'-AACACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA的抑制、和包含5'-AAUACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA的抑制可以是被彼此不同的抑制剂抑制或用1种抑制剂抑制两者的情况，优选的是，分别具有抑制包含5'-AACACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA的部位、和抑制包含5'-AAUACUG-3'作为种子序列的至少1个miRNA的部位，并且通过这两个不同的抑制部位来进行抑制。在本发明中，将这种miRNA抑制剂称为使用不同的抑制部位抑制包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA(第一miRNA)、和包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA(第二miRNA)这两者。这种情况下，miRNA抑制剂的抑制第一miRNA的抑制部分与miRNA抑制剂的抑制第二miRNA的抑制部分不同。具体而言，例如miRNA抑制剂的抑制第一miRNA的抑制部分包含与第一miRNA的种子序列互补的序列，miRNA抑制剂的抑制第二miRNA的抑制部分包含与第二miRNA的种子序列互补的序列。作为这种抑制的例子，可列举例如：使用含有与第一miRNA的种子序列互补的序列的miRNA抑制剂分子、和含有与第二miRNA的种子序列互补的序列的miRNA抑制剂分子进行miRNA抑制。另外，作为另一例，可列举：使用在同一分子内包含含有与第一miRNA的种子序列互补的序列的miRNA抑制部分、和含有与第二miRNA的种子序列互补的序列的miRNA抑制部分的miRNA抑制剂来进行miRNA抑制。
本发明中，将按照具有2种以上的miRNA抑制部位、且各部位以miRNA的不同部分为靶(从而例如以不同的miRNA为靶)的方式设计的miRNA抑制剂称为杂化miRNA抑制剂。本发明的miRNA抑制剂优选为具有针对包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的抑制部位、和针对包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的抑制部位的杂化miRNA抑制剂。
成为本发明抑制对象的癌症没有特别限制，优选为例如癌等上皮源或至少部分性具有上皮性状的癌症。成为本发明抑制对象的癌症优选为至少包含表达上皮标志物的细胞群的癌症，更优选为包含表达上皮标志物的细胞群作为主要细胞群的癌症(即，不表达任一上皮标志物的细胞群少于一半的癌症)。作为上皮标志物，可以从例如ESA(epithelialspecific antigen，上皮特异性抗原)、CDH1(Cadherin-1，钙黏蛋白-1)、CDH3(Cadherin-3，钙黏蛋白-3)、和ESRP1(epithelial splicing regulatory protein 1，上皮剪接调节蛋白1)等中任意选择，更优选列举ESA，但不限于这些。另外，可以将这些标志物组合使用。这种癌症包含0.3％以上、优选为0.5％以上、1％以上、2％以上、3％以上、5％以上、7％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上的表达任一上皮标志物(例如ESA)的细胞(例如ESA+细胞)。本发明提供一种癌症的检查方法，其包含确认肿瘤细胞中包含上皮标志物阳性细胞的工序。另外，成为本发明抑制对象的癌症优选可通过抑制包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA、和包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA这两者而促进上皮-间充质转换和/或抑制间质-上皮转化。另外，成为本发明抑制对象的癌症优选可通过表达包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA、和包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA这两者而促进间质-上皮转化和/或抑制上皮-间充质转换。另外，优选成为本发明抑制对象的癌症可通过抑制miR-200c和miR-141而促进上皮-间充质转换和/或抑制间质-上皮转化。另外，成为本发明抑制对象的癌症优选可通过表达miR-200c和miR-141这两者而促进间质-上皮转化和/或抑制上皮-间充质转换。
另外，虽然并非必需，但是可以在肿瘤抑制之前对肿瘤细胞至少包含表达上皮标志物的细胞群这一点进行确认。即，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含下述工序：在肿瘤抑制之前，对肿瘤细胞至少包含表达上皮标志物的细胞群这一点进行确认。例如，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含：在肿瘤抑制之前，对肿瘤细胞至少包含表达上皮标志物的细胞群这一点进行确认的工序；和，对该已确认被促进的肿瘤进行抑制。另外，虽然并非必需，但是可以在肿瘤抑制之前对通过在肿瘤细胞中抑制该miRNA而促进上皮-间充质转换这一点进行确认。即，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含下述工序：在肿瘤抑制之前对通过在肿瘤细胞中抑制该miRNA而促进上皮-间充质转换这一点进行确认。例如，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含：在肿瘤抑制之前对通过在肿瘤细胞中抑制该miRNA而促进上皮-间充质转换这一点进行确认的工序；和，对该已确认促进的肿瘤进行抑制。但是，本发明不限于这样的方法。另外，本发明提供一种癌症检查方法，其包含下述工序：对通过在肿瘤细胞中抑制该miRNA而促进上皮-间充质转换这一点进行确认。
另外，成为本发明抑制对象的癌症例如可以是包含具有上皮性状的亚群(spE)和具有间质性状的亚群(spM)的癌症。这种癌症例如包含上皮标志物阳性的细胞亚群和上皮标志物阴性(或低表达)或间质标志物阳性的细胞亚群。优选成为本发明抑制对象的癌症分别包含0.3％以上、优选为0.5％以上、1％以上、2％以上、3％以上、5％以上、7％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上或30％以上的表达上皮标志物的细胞亚群和上皮标志物阴性或低表达(或间质标志物阳性)细胞亚群两者。亚群的比例可以对所采集的癌细胞直接进行确定或在期望的培养基中培养癌细胞而确定，例如可以使用DMEM培养基、Ham's F-12培养基等。可以适当加入5-10％胎牛血清(FBS)等进行测试。另外，可以在肿瘤抑制之前对肿瘤细胞中表达上皮标志物的细胞亚群和上皮标志物阴性或低表达(或间质标志物阳性)细胞亚群的比例进行确认，但本发明不限于这样的发明。
另外，成为本发明抑制对象的癌症优选在具有上皮性状的亚群(spE)中包含癌干细胞。癌干细胞是指在肿瘤样块形成测试中具有肿瘤样块形成能力的细胞或在使用动物的肿瘤形成实验中具有形成肿瘤的能力的细胞。将属于具有上皮性状的亚群(spE)的癌干细胞称为上皮性状性癌干细胞或上皮性癌干细胞。关于包含癌干细胞这一点，只要确认该细胞团具有致瘤性即可，例如可以通过按照本领域技术人员公知的步骤来测试肿瘤样块的形成或者将细胞移植到小鼠等中进行肿瘤形成试验来确认。
可以在肿瘤抑制之前对对象肿瘤是否包含上皮性状性癌干细胞这一点进行确认。即，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含下述工序：在肿瘤抑制之前，对对象癌症包含上皮性状性癌干细胞这一点进行确认。例如，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含：在肿瘤抑制之前，对对象癌症包含上皮性状性癌干细胞这一点进行确认的工序；和，按照本发明的上述方法对该已确认的癌症进行抑制的方法。
另外，成为本发明抑制对象的癌症优选为具有上皮性状的亚群(spE)的致瘤性高于其余群(例如具有间质性状的亚群；spM)、癌细胞整体的致瘤性高的癌症。本说明书中，将这种癌症称为上皮性状亚群致瘤性肿瘤(spE致瘤性肿瘤)或上皮性状致瘤性肿瘤。肿瘤形成性可以如下测定：例如，按照本领域技术人员公知的步骤测试肿瘤样块的形成或者将细胞移植到小鼠等中并测量有无肿瘤形成或肿瘤尺寸。例如，从肿瘤细胞中分离出具有上皮性状的亚群(spE)。以其余群(例如具有间质性状的亚群；spM)、癌细胞整体为对照组，用相同数量的细胞测试致瘤性。在spE的致瘤性高时，将该癌症判断为具有上皮性状的亚群(spE)的致瘤性高于其余群和癌细胞整体的致瘤性的上皮性状致瘤性肿瘤。具有上皮性状的亚群可以使用上皮标志物适当地分离·鉴定，作为上皮标志物，如上所述例如可以从ESA、CDH1、CDH3、和ESRP1等中任意选择。另外，本发明还涉及一种癌症的检查方法和分类方法，其包含下述工序：在肿瘤中，对具有上皮性状的亚群(spE)的致瘤性高于不具有上皮性状的亚群或癌细胞整体这一点进行确认。
另外，本发明中，可以在肿瘤抑制之前在对象肿瘤中对具有上皮性状的亚群(spE)的致瘤性高于其余群(例如具有间质性状的亚群；spM)、癌细胞整体的致瘤性这一点进行确认。即，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含下述工序：在肿瘤抑制之前，在对象肿瘤中，对具有上皮性状的亚群(spE)的致瘤性高于其余群(例如具有间质性状的亚群；spM)、癌细胞整体的致瘤性这一点进行确认。例如，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含：在肿瘤抑制之前，对于对象肿瘤，对具有上皮性状的亚群(spE)的致瘤性高于其余群(例如具有间质性状的亚群；spM)、癌细胞整体的致瘤性这一点进行确认的工序；和，按照本发明的上述方法对该已确认高的肿瘤进行抑制。
另外，成为本发明抑制对象的癌症优选为包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA或包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的表达为阳性的癌症。对象癌症可以是包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA、和包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA这两者的表达均为阳性的癌症(miR-200的二亚集团阳性肿瘤)。具体而言，这种癌症可以是miR-200a、miR-141、miR-200b、miR-200c和miR-429中的至少任1者至少为阳性的癌症。进而，癌症可以是miR-200a和miR-141中的至少任1者(更优选为miR-141)、以及miR-200b、miR-200c和miR-429中的至少任一者(更优选为miR-200c)至少为阳性的癌症。另外，本发明中，可以在肿瘤抑制之前对对象肿瘤为miR-200的亚集团阳性肿瘤、更优选为miR-200的二亚集团阳性肿瘤这一点进行确认。即，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含下述工序：在肿瘤抑制之前，对对象肿瘤的、包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA和/或包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的表达为阳性这一点进行确认。例如，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含：在肿瘤抑制之前对对象肿瘤的、包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA和/或包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的表达为阳性这一点进行确认的工序；和，按照本发明的上述方法对该已确认的肿瘤进行抑制的方法。
另外，成为本发明抑制对象的癌症可以优选为包含5’-AGCUUAU-3’作为种子序列的至少1个miRNA的表达为阳性的癌症。具体而言，这种癌症可以是至少miR-21为阳性的癌症。另外，本发明中，可以在肿瘤抑制之前对对象肿瘤为miR-21的亚集团阳性肿瘤这一点进行确认。即，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含下述工序：在肿瘤抑制之前，对对象肿瘤为包含5’-AGCUUAU-3’作为种子序列的至少1个miRNA的表达为阳性这一点进行确认。例如，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含：在肿瘤抑制之前，对对象肿瘤的、包含5’-AGCUUAU-3’作为种子序列的至少1个miRNA的表达为阳性这一点进行确认的工序；和，按照本发明的上述方法对该已确认的肿瘤进行抑制。
另外，成为本发明抑制对象的癌症优选为：由miR-200家族的2个染色体座(chromosomal loci)、优选由miR-200家族的2个染色体座分别表达至少1个miR-200家族成员的癌症(miR-200的基因座阳性肿瘤、更优选为miR-200的二基因座阳性肿瘤)。具体而言，这种癌症为miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c和miR-141中的至少任一者的表达为阳性的癌症，这种癌症可以是miR-200a、miR-200b和miR-429中的至少任一者的表达以及miR-200c和miR-141中的至少任一者的表达为阳性的癌症。另外，本发明中，可以在肿瘤抑制之前对对象肿瘤为miR-200的亚集团阳性肿瘤、更优选为miR-200的二基因座阳性肿瘤这一点进行确认。即，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含下述工序：在肿瘤抑制之前，对对象肿瘤的miR-200a、miR-200b和miR-429中的至少任一者、和/或miR-200c和miR-141中的至少任一者为阳性这一点进行确认。例如，本发明的方法的一方式包含一种方法，其包含：在肿瘤抑制之前，对对象肿瘤的miR-200a、miR-200b和miR-429中的至少任一者的表达、和/或miR-200c和miR-141中的至少任一者的表达为阳性这一点进行确认的工序；和，按照本发明的上述方法对该已确认的肿瘤进行抑制。
成为本发明抑制对象的癌症具体包括结肠癌、肺癌、和乳腺癌。成为本发明抑制对象的癌症尤其可列举：孕酮受体(PR)、雌激素受体(ER)、和HER2中的任一者为阴性的肿瘤(例如乳腺癌等)，更优选为至少孕酮受体(PR)为阴性的肿瘤(例如乳腺癌)，最优选为雌激素受体、孕酮受体、和HER2均为阴性的三阴性乳腺癌。另外，成为本发明抑制对象的癌症包括前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、和肾癌，但不限于这些。另外，成为本发明抑制对象的癌症优选为人的癌症。
本发明的肿瘤抑制例如在抑制肿瘤的产生和增大等方面特别有用，尤其是抑制原发性肿瘤方面发挥较高的效果。这里，原发性肿瘤是指：肿瘤所来自的器官或组织与该肿瘤所存在的器官或组织一致。例如，如果是乳腺癌则本发明对于乳房中的乳腺癌的增殖的抑制特别有用，如果是结肠癌则本发明对大肠中的结肠癌的增殖的抑制特别有用，如果是前列腺癌和非小细胞肺癌和肾癌则本发明分别对前列腺、肺、和肾脏中的各癌的增殖的抑制特别有用。
另外，例如已知原发性肿瘤的增殖·发展与肿瘤转移的机制不同。转移时，癌细胞从原发性病灶的脱离和向脉管(血管、淋巴管)浸润、在脉管内移动、与转移脏器的血管内皮粘附、和对转移脏器的浸润等过程是必要的。另外，为了成功地转移，癌细胞需要在上述过程的全程中能够逃避免疫消除机制而存活。因此，如果能够抑制上述任一过程则可实现抑制转移，另一方面，对于抑制原发性肿瘤而言，必须抑制原发性肿瘤的增殖性、存活性、抗细胞凋亡活性等才能实现。
另外，本发明涉及本发明的miRNA抑制剂的、用于抑制肿瘤的应用和在制造用于抑制肿瘤的药剂中的应用。即，本发明涉及：单独或组合抑制包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA和包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的1或多种抑制剂的、用于抑制肿瘤的应用和在制造用于抑制肿瘤的药剂中的应用。另外，本发明涉及用于抑制肿瘤的该miRNA抑制剂。
更具体而言，本发明涉及：miRNA抑制剂的、在制造用于抑制肿瘤的药剂中的应用，所述药剂为通过给予单独或组合抑制包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA和包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的1个或多个miRNA抑制剂、从而抑制肿瘤的药剂。另外，本发明涉及：miRNA抑制剂的、在制造用于促进肿瘤细胞的上皮-间充质转换和/或抑制间质-上皮转化的药剂中的应用，所述药剂为通过给予单独或组合抑制包含5’-AACACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA和包含5’-AAUACUG-3’作为种子序列的至少1个miRNA的1个或多个miRNA抑制剂、从而促进肿瘤细胞的上皮-间充质转换和/或抑制间质-上皮转化的药剂。在该单独或组合中，优选至少抑制miR-200c和miR-141，更优选抑制包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429在内的miR-200家族成员中的每一个。这里，miRNA的抑制优选是指：抑制剂与靶miRNA结合(相互作用)、从而直接进行抑制。即，本发明中，miRNA抑制剂优选通过与miR-200c和miR-141结合(相互作用)而进行直接抑制，更优选miRNA抑制剂与包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429在内的miR-200家族成员的每一个发生相互作用、从而直接进行抑制。
(药物)
另一方面，本发明提供一种包含本发明的复合体的药物。
一实施方式中，本说明书所用的miRNA抑制复合体或构成该复合体的RNA(这里，作为RNA，包含天然RNA和类似物)可以制成用于抑制miRNA的组合物。本发明的组合物可以特异地且高效地抑制靶miRNA，因此在通过抑制miRNA而进行基因功能控制方面有用。本发明的组合物可以根据需要与药理学上可接受的期望的载体或介质组合。它们可列举通常用于悬浮核酸的期望溶液，可例例示如蒸馏水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、氯化钠溶液、林格氏溶液、培养液等。另外，可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、杀生物剂等。另外，可以添加保存剂或其它的添加剂。另外，本发明的组合物还可以组合生物聚合物等有机物、羟基磷灰石等无机物、具体为胶原基质、聚乳酸聚合物或低聚物、聚乙二醇聚合物或低聚物及其化学衍生物等作为载体。本发明的组合物可以以期望的试剂或药物组合物形式使用。另外，本发明提供本发明的组合物、本说明书所用的miRNA抑制复合体或构成该复合体的RNA或其类似物的、用于抑制miRNA的应用。另外，本发明提供包含它们中的任一者的miRNA抑制剂。
另一方面，本发明提供对疾病或障碍进行处置的方法，其包含下述工序：将有效量的本发明的复合体或包含其的药物给药于由此需求的受试体。虽然不限于此，但本发明例如可以用于作为已进入临床开发的HCV治疗药、肾纤维化治疗剂的用途等。
本发明的药物可以给药其本身或以适当的药物组合物形式给药。作为用于给药的药物组合物，可以是包含本发明的药物和药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。这种药物组合物可以以适合于经口或非经口给药的剂形来提供。
作为用于非经口给药的组合物，使用例如注射剂、栓剂等，注射剂可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂形。这种注射剂可以按照公知的方法制备。作为注射剂的制备方法，例如可以将上述本发明的核酸溶解、悬浮或乳化于通常用于注射剂的无菌的水性液或油性液而制备。作为注射用的水性液，使用例如生理盐水、包含葡萄糖或其它辅助药剂的等渗液等，可以组合使用适当的助溶剂，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂〔例如聚山梨酯80、HCO-50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castoroil)〕等。作为油性液，使用例如芝麻油、大豆油等，可以组合使用作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇等。所制备的注射液优选填充到适当的安瓿中。用于直肠给药的栓剂可以通过将上述核酸混合到通常的栓剂用基剂中而制备。
作为用于经口给药的组合物，可列举固体或液体的剂形，具体可列举片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这种组合物可通过公知的方法制造，可含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，例如使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。
上述的非经口用或经口用药物组合物适合制成适合于活性成分的给药量的单剂量给药剂形。作为这种单剂量给药剂型，可列举例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂。
本发明的药物为低毒性，可以直接以液剂形式或以适当剂型的药物组合物形式经口或非经口(例如血管内给药、皮下给药等)给药于人或哺乳动物(例如大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。
向细胞的导入可以通过体外、离体或体内方式进行。在借助细胞来给药时，导入到适当的培养细胞或从接种对象动物采集的细胞等中。作为核酸的导入，可列举通过磷酸钙共沉淀法、脂质转染、DEAE葡聚糖法、注射针等直接将DNA溶液注入组织的方法、利用基因枪的导入等。给药量根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形态、给药方法、导入基因等而不同，可根据给药对象动物、给药部位、给药次数等适当调整，可由本领域技术人员适当决定。可以适宜地选择给药途径。给药对象优选为哺乳动物(包括人和非人哺乳类)。具体包括：人、猴等非人灵长类；小鼠、大鼠等啮齿类；兔子、山羊、绵羊、猪、牛、狗、猫和其它哺乳动物。
(DDS)
本发明的一方面提供一种组合物，其包含本说明书所用的miRNA抑制复合体、或者组合包含构成该复合体的RNA和用于核酸递送的载体。用于核酸递送的载体也称为用于核酸递送的药物递送系统(DDS)。使用合适的载体对于miRNA抑制复合体的血清稳定性、促进向靶组织的递送、用于处置或预防特别有用。
一实施方式提供一种组合物，其包含含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体、和用于核酸递送的载体。所述组合物可以是药物组合物。另外，这种组合物适合于将miRNA抑制复合体递送至期望部位，可用于所述用途。
作为合适的载体的例子，可列举脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子性脂质体、非阳离子性脂质体、阳离子性聚合物、非阳离子性聚合物、β葡聚糖、去端肽胶原、PLGA纳米颗粒、表面活性剂肽和超级磷灰石等。
脂质纳米颗粒(LNP)一般由离子化氨基脂质、辅助脂质、PEG脂质构成，可以通过将含脂质的乙醇溶液和含核酸分子的酸性缓冲液混合来形成。在脂质纳米颗粒内部的脂质核中，可以填充siRNA等核酸分子。
脂质体具有脂质双层膜，内部保持有水相。内部的水相中可以填充siRNA等核酸分子。阳离子性脂质体由于与核酸分子的磷酸基的负电荷发生静电相互作用，在核酸分子的稳定化方面是优选的。另一方面，非阳离子性脂质体在生物体内的药代动力学中可以防止非特异性吸附方面可能是有利的。
阳离子性聚合物有例如：具有季铵碱的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺等聚合物或低聚物；二烯丙基二甲基氯化铵的聚合物或低聚物、聚(乙烯基苄基三甲基氯化铵)、聚酰胺多胺·表氯醇缩合物、胺类与表氯醇的缩合物、聚烯丙基胺盐酸盐、聚乙烯亚胺、聚脒、淀粉、纤维素的阳离子化物等，可以使用生物体顺应性的物质形成纳米颗粒或囊泡而用于核酸分子的递送。
可以将β葡聚糖的三螺旋结构作为用于递送核酸分子的载体来使用。对于β-1,3-葡聚糖的三螺旋而言，溶解于DMSO等极性有机溶剂时螺旋解开而成为随机缠绕的单链。将该溶剂恢复为水则重新形成三螺旋结构。如果该“复原”过程中存在核酸，则核酸会置换三螺旋中的一条高分子链。经复合的核酸可以受到保护而避免酶的水解、被血清中的蛋白质非特异性吸附(M.Mizu,K.Koumoto,T.Kimura,K.Sakurai,and S.Shinkai,Biomaterials,25,3109(2004))。
去端肽胶原是将胶原蛋白的主要抗原部位即端肽除去而降低了胶原蛋白的抗原性的物质，可以与siRNA等核酸分子形成复合体而使其稳定(Drug Delivery System 25-6,2010 607-614)。
PLGA(聚乳酸)可以通过各种方法制备成基质型的微粒(纳米球)，能包封核酸之类的水溶性药物后使用。
表面活性剂肽是由6-10残基左右的氨基酸构成的自组织肽、在水溶液中形成粒径为约50-100nm的纳米胶束、纳米管。表面活性剂样肽能够序列依赖性地控制物质的表面电荷、粒径，因此正在作为siRNA等的基因传递载体进行开发。
超级磷灰石(Wu X,Yamamoto H,Nakanishi H,Yamamoto Y,Inoue A,Tei M,etal.(2015)Innovative Delivery of siRNA to Solid Tumors by Super CarbonateApatite.PLoS ONE 10(3):e0116022.doi:10.1371/journal.pone.0116022)也正在作为用于siRNA等核酸的递送的优选载体加以研究。将用于基因导入的化合物“碳酸磷灰石”用超声波微细粉碎至直径10nm程度而成的超微粒被称为“超级磷灰石”，据报道：将结合有药剂的超级磷灰石注射到患有癌症的小鼠的静脉中，结果与以往的微粒相比显示出高抗癌效果。癌组织的血管脆弱，因此认为微粒透过其血管壁的间隙而仅进入癌细胞中。超级磷灰石等微粒在癌细胞内分解，因此认为副作用少。
作为其它的载体，可列举树状高分子(树状聚合物)(例如，作为以赖氨酸为构成单元的树状聚合物的树枝状聚赖氨酸(KG6))、作为阳离子性的聚氨基酸衍生物的PEG-P[Asp(DET)]。
本发明的一个优选实施方式中，载体为LNP，优选该LNP包含阳离子性脂质。例如，LNP可包含阳离子性脂质、辅助脂质和/或PEG修饰脂质。
作为本发明的核酸递送中特别优选的载体，可列举使用包含以下所说明的阳离子性脂质的脂质膜复合体的载体。
一个优选实施方式中，载体中使用的阳离子性脂质在分子内包含叔胺和/或二硫键。通过采用所述结构，从而在二硫键被切断后，具有2个脂质部位的结构被破坏，脂质膜结构体在细胞中崩解，所包封的核酸等化合物被高效地释放到细胞质中。另外，在用于核酸导入时，核酸在不与胺部位相互作用的状态下被释放到细胞中，因此转录因子与核酸的接近和结合不受妨碍。当二硫键在细胞内被切断时，所生成的残基不会分离为作为极性基团的胺部位和作为非极性基团的脂质部位，因此残基保持了表面活性剂性能。从而可以期待内体膜的不稳定化、和伴随于此的内体脱出促进效果。
作为优选的阳离子性脂质，可列举式(1’)所示的化合物，
[化26]
(式(1’)中，
Xa和Xb分别独立地为包含叔胺的取代基，
s为1或2，
R4表示碳数1～6的烷基，
na和nb分别独立地为0或1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
R3a和R3b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，
甾醇残基为胆甾烯基、胆甾烷基、豆甾烯基、β-谷甾烯基、羊毛甾烯基或麦角甾烯基，
脂溶性维生素为视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚)。
式(1’)中，优选Xa和Xb分别独立地为X1、X2或X3。
[化27]
优选在式(1’)中R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基。优选在式(1’)中Ya和Yb分别独立地为酯键。优选在式(1’)中na和nb为1。
优选在式(1’)中R3a与R3b、Ya与Yb、以及Xa与Xb相同。
作为优选的阳离子性脂质，可列举式(1)所示的化合物。
[化28]
式(1)中，Xa和Xb分别独立地为以下所示的X1、X2或X3。
[化29]
式(1)中，Xa和Xb分别独立地为以下所示的X1或X2。
[化30]
X1中的R4表示碳数1～6的烷基，可以是直链状、支链状或环状。该烷基的碳数优选为1～3。作为碳数1～6的烷基，具体可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等。R4优选为甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选为甲基。
X2中的s为1或2。s为1时，X2优选为吡咯烷鎓基，s为2时，X2优选为哌啶鎓基。
Xa可以与Xb相同也可以不同，优选Xa为与Xb相同的基团。
na和nb分别独立地为0～2的整数。na为1时，R3a借助Ya和R2a而与Xa结合，na为0时，形成R3a-Xa―R1a―S-的结构。同样地，nb为1时，R3b借助Yb和R2b与Xb结合，nb为0时，形成R3b-Xb―R1b―S-的结构。
na可以与nb相同也可以不同，优选na与nb相同。
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，可以是直链状，也可以具有支链，优选为直链状。作为碳数1～6的亚烷基，具体可列举亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基、四亚甲基、亚异丁基、五亚甲基、亚新戊基等。R1a和R1b优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基，最优选为亚乙基。
R1a可以与R1b相同也可以不同，优选R1a为与R1b相同的基团。
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，可以是直链状，也可以具有支链，优选为直链状。作为碳数1～6的亚烷基，可列举作为R1a和R1b的碳数1～6的亚烷基的例子而列举的例子。R2a和R2b优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚异丙基或四亚甲基，最优选为三亚甲基。
R2a可以与R2b相同也可以不同，优选R2a为与R2b相同的基团。
Ya和Yb分别独立地为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键、脲键，优选为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键，最优选为酯键。Ya和Yb的键合方向没有限制，在Ya为酯键时，优选形成R3a-CO-O-R2a-的结构，在Yb为酯键时，优选形成R3b-CO-O-R2b-的结构。
Ya可以与Yb相同也可以不同，优选Ya为与Yb相同的基团。
R3a和R3b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，优选为脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，最优选为脂溶性维生素衍生物残基。
作为甾醇残基，可列举例如胆甾烯基(胆甾醇残基)、胆甾烷基(胆甾烷醇残基)、豆甾烯基(豆甾醇残基)、β-谷甾烯基(β-谷甾醇残基)、羊毛甾烯基(羊毛甾醇残基)、和麦角甾烯基(麦角甾醇残基)等。甾醇残基优选为胆甾烯基或胆甾烷基。
脂溶性维生素衍生物残基除了为脂溶性维生素来源的残基以外，还为使脂溶性维生素中的作为官能团的羟基、醛基、羧基通过与其它的二官能性化合物的羧基、氨基或羟基反应而适当地转变为其它的反应性官能团而成的衍生物来源的残基。例如，对于具有羟基的脂溶性维生素而言，可以通过与琥珀酸酐、戊二酸酐等二羧酸反应而将羟基转变为羧酸。作为脂溶性维生素，可列举视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚、生育三烯酚等。脂溶性维生素优选为视黄酸或生育酚。作为二官能性的化合物，虽然没有限定，但可列举多元羧酸、二羧酸、氨基酸、羟基酸、氨基醇、多元醇、二元醇等。
碳数12～22的脂肪族烃基可以是直链状也可以具有支链，优选为直链状。该脂肪族烃基可以是饱和的也可以是不饱和的。在不饱和脂肪族烃基的情况下，该脂肪族烃基中所含的不饱和键的数量通常为1～6个、优选为1～3个、更优选为1～2个。不饱和键包括碳-碳双键和碳-碳三键，优选为碳-碳双键。该脂肪族烃基中所含的碳数优选为12～18，最优选为13～17。脂肪族烃基中包括烷基、烯基、炔基等，优选为烷基或烯基。作为碳数12～22的脂肪族烃基，具体可列举十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、癸二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、异十八烷基等。碳数12～22的脂肪族烃基优选为十三烷基、十四烷基、十七烷基、十八烷基、十七碳二烯基或十八碳二烯基，特别优选为十三烷基、十七烷基、十七碳二烯基。
一方式中，碳数12～22的脂肪族烃基使用来自脂肪酸、脂肪族醇或脂肪族胺的脂肪族烃基。在R3a(或R3b)为脂肪酸来源时，Ya(或Yb)为酯键或酰胺键，脂肪酸来源的羰基碳包含在Ya(或Yb)中。例如，在使用亚油酸时，R3a(或R3b)为十七碳二烯基。
R3a可以与R3b相同也可以不同，优选R3a为与R3b相同的基团。
一方式中，Xa与Xb相同，na与nb相同，R1a与R1b相同，R2a与R2b相同，R3a与R3b相同，Ya与Yb相同。
一方式中，
Xa和Xb分别独立地为X1，
R4表示碳数1～3的烷基，na和nb为1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb表示酯键，
R3a和R3b分别独立地表示碳数12～22的脂肪族烃基。
一方式中，
Xa和Xb为X1，
R4表示碳数1～3的烷基，na和nb为1，
R1a和R1b表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb表示酯键，
R3a和R3b表示碳数12～22的脂肪族烃基，
Xa与Xb相同，
R1a与R1b相同，
R2a与R2b相同，
R3a与R3b相同。
一方式中，
Xa和Xb为X1，
R4表示甲基，na和nb为1，
R1a和R1b表示亚乙基，
R2a和R2b表示三亚甲基，
Ya和Yb表示-CO-O-，
R3a和R3b分别独立地表示碳数13～17的烷基或烯基。
一方式中，
Xa和Xb为X1，
R4表示甲基，na和nb为1，
R1a和R1b表示亚乙基，
R2a和R2b表示三亚甲基，
Ya和Yb表示-CO-O-，
R3a和R3b表示碳数13～17的烷基或烯基，
R3a与R3b相同。
一方式中，
Xa和Xb分别独立地为X1，
R4表示碳数1～3的烷基，na和nb为1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb表示酯键，
R3a和R3b分别独立地表示脂溶性维生素衍生物残基(例如视黄酸残基、生育酚残基)。
一方式中，Xa和Xb为X1，
R4表示碳数1～3的烷基，na和nb为1，
R1a和R1b表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb表示酯键，
R3a和R3b表示脂溶性维生素衍生物残基(例如视黄酸残基、生育酚残基)，
Xa与Xb相同，
R1a与R1b相同，
R2a与R2b相同，
R3a与R3b相同。
一方式中，
Xa和Xb为X1，
R4表示甲基，na和nb为1，
R1a和R1b表示亚乙基，
R2a和R2b表示三亚甲基，
Ya和Yb表示-CO-O-，
R3a和R3b分别独立地表示脂溶性维生素衍生物残基(例如视黄酸残基、生育酚残基)。
一方式中，
Xa和Xb为X1，
R4表示甲基，na和nb为1，
R1a和R1b表示亚乙基，
R2a和R2b表示三亚甲基，
Ya和Yb表示-CO-O-，
R3a和R3b表示脂溶性维生素衍生物残基(例如视黄酸残基、生育酚残基)，
R3a为R3b相同。
一方式中，
Xa和Xb为X2，
S为2，
na和nb为1，
R1a和R1b表示亚乙基，
R2a和R2b表示亚乙基，
Ya和Yb表示-CO-O-，
R3a和R3b表示由生育酚与琥珀酸的反应得到、脂溶性维生素衍生物残基团，
R3a与R3b相同。
作为本发明的阳离子性脂质的具体例，可列举以下的B-2、B-2-2、B-2-3、B-2-4和B-2-5的化合物。
[表1]
作为特别优选的阳离子脂质的例子，可列举：
[化31]
所述阳离子脂质在作为例如COATSOME SS-33/4PE-15(注册商标)(日油株式会社)销售。
作为优选的阳离子性脂质，可列举式(4)所示的化合物。
[化32]
R4a和R4b分别独立地表示碳数8以下的亚烷基或氧二亚烷基，优选为碳数8以下的亚烷基。
碳数8以下的亚烷基可以是直链状，也可以具有支链，优选为直链状。该亚烷基中所含的碳数优选为6以下，最优选为4以下。作为碳数8以下的亚烷基，具体可列举亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、四亚甲基、亚异丁基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基等，优选为亚甲基、亚乙基、亚丙基、四亚甲基，最优选为亚乙基。
碳数8以下的氧二亚烷基表示夹着醚键的亚烷基(亚烷基-O-亚烷基)且所存在的2个亚烷基的碳数合计为8以下的基团。在此，所存在的2个亚烷基可以相同也可以不同，优选相同。作为碳数8以下的氧二亚烷基，具体可列举氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基、氧二亚丁基等。优选为氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二亚丙基，最优选为氧二亚乙基。
R4a可以与R4b相同，也可以不同，优选R4a为与R4b相同的基团。
X1a和X1b分别独立地为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键，优选为酯键、酰胺键，最优选为酯键。X1a和X1b的键合方向没有限制，X1a和X1b为酯键时，优选形成R5a-CO-O-R4a-和R5b-CO-O-R4b-结构。
X1a可以与X1b相同，也可以不同，优选X1a为与X1b相同的基团。
R5a和R5b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素残基或碳数13～23的脂肪族烃基，优选为脂溶性维生素残基或碳数13～23的脂肪族烃基。最优选为脂肪族烃基。另外，从脏器(特别是肝脏)特异性的观点出发，还优选R5a和R5b为脂溶性维生素残基。
作为“甾醇残基”，可列举除参与与Xa或Xb的键合的反应性官能团(例如羟基)以外的甾醇或来自甾醇衍生物的残基，优选为来自甾醇衍生物的残基。作为甾醇衍生物，可列举例如使甾醇的羟基与二羧酸中的一个羧酸反应而成的甾醇半酯(这种情况下，另一羧酸成为反应性官能团)。作为甾醇，可列举例如胆甾醇、胆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇、和麦角甾醇等，优选为胆甾醇或胆甾烷醇。作为二羧酸，可列举例如丙二酸、琥珀酸、戊二酸或己二酸等，优选为琥珀酸或戊二酸。作为甾醇衍生物的具体例，可列举胆甾醇半琥珀酸酯、胆甾醇半戊二酸酯等。
作为“脂溶性维生素残基”，可列举除参与与X1a或X1b的键合的反应性官能团(例如羟基)以外的脂溶性维生素或来自脂溶性维生素衍生物的残基，优选为来自脂溶性维生素衍生物的残基。脂溶性维生素衍生物可列举：使反应性官能团为羟基的脂溶性维生素的羟基与二羧酸中的一个羧酸反应而成的脂溶性维生素半酯(这种情况下，另一羧酸成为反应性官能团)。作为脂溶性维生素，可列举例如视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚等，优选为视黄酸或生育酚，最优选为生育酚。作为二羧酸，可列举丙二酸、琥珀酸、戊二酸和己二酸等，优选为琥珀酸和戊二酸。作为脂溶性维生素衍生物的具体例，可列举生育酚半琥珀酸酯、生育酚半戊二酸酯等。
碳数13～23的脂肪族烃基可以是直链，也可以具有支链，优选为直链。该脂肪族烃基可以是饱和的也可以是不饱和的。在不饱和烃基的情况下，该脂肪族烃基中所含的不饱和键的数量为1～6个、优选为1～3个、最优选为1～2个。不饱和键包括碳-碳双键和三键，优选为双键。关于该脂肪族烃基中所含的碳数，在直链时优选为13～21，最优选为13～17。作为碳数13～23的脂肪族烃基，可列举例如十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十五烯基、二十二碳六烯基、甲基十二烷基、甲基十三烷基、甲基十四烷基、甲基十五烷基、甲基十七烷基、甲基十八烷基、甲基十九烷基、甲基二十烷基、甲基二十一烷基、甲基二十二烷基、乙基十一烷基、乙基十二烷基、乙基十三烷基、乙基十四烷基、乙基十五烷基、乙基十七烷基、乙基十八烷基、乙基十九烷基、乙基二十烷基、乙基二十一烷基、己基庚基、己基壬基、庚基辛基、庚基癸基、辛基壬基、辛基十一烷基、壬基癸基、癸基十一烷基、十一烷基十二烷基、六甲基十一烷基等。作为直链脂肪族烃基，优选为十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、二十一烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基，特别优选为十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基。作为支链脂肪族烃基，优选甲基十五烷基、己基壬基、庚基癸基、辛基十一烷基、六甲基十一烷基，特别优选为甲基十五烷基、己基壬基、庚基癸基。
一方式中，碳数13～23的脂肪族烃基使用来自脂肪酸、脂肪族醇或脂肪族胺的脂肪族烃基。R5a来自脂肪酸时，X1a为酯键或酰胺键，来自脂肪族的羰基碳包含在X1a中。R5b来自脂肪酸时，X1b为酯键或酰胺键，来自脂肪族的羰基碳包含在X1b中。作为脂肪族烃基的具体例，在使用亚油酸作为脂肪酸时为十七碳二烯基，在使用油酸作为脂肪酸时为十七碳烯基。
R5a可以与R5b相同，也可以不同，优选R5a为与R5b相同的基团。
一方式中，R4a与R4b相同，X1a与X1b相同，R5a与R5b相同。
一方式中，
R4a和R4b分别独立地表示碳数8以下(碳数1～8)的亚烷基，
X1a和X1b表示酯键，
R5a和R5b分别独立地表示脂溶性维生素残基(例如来自生育酚半琥珀酸酯的基团)。
一方式中，
R4a和R4b分别独立地表示碳数8以下(碳数1～8)的亚烷基，
X1a和X1b表示酯键，
R5a和R5b分别独立地表示碳数13～23的脂肪族烃基(例如十七碳二烯基、十七碳烯基)。
一方式中，
R4a和R4b表示碳数8以下(碳数1～8)的亚烷基，
X1a和X1b表示酯键，
R5a和R5b表示脂溶性维生素残基(例如来自生育酚半琥珀酸酯的基团)，
R4a与R4b相同，
R5a与R5b相同。
一方式中，
R4a和R4b表示碳数8以下(碳数1～8)的亚烷基，
X1a和X1b表示酯键，
R5a和R5b表示碳数13～23的脂肪族烃基(例如十七碳二烯基、十七碳烯基)，
R4a与R4b相同，
R5a与R5b相同。
一方式中，
R4a和R4b表示亚乙基，
X1a和X1b表示-CO-O-，
R5a和R5b分别独立地表示脂溶性维生素残基(例如来自生育酚半琥珀酸酯的基团)。
一方式中，
R4a和R4b表示亚乙基，
X1a和X1b表示-CO-O-，
R5a和R5b分别独立地表示碳数13～23的脂肪族烃基(例如十七碳二烯基、十七碳烯基)。
一方式中，
R4a和R4b表示亚乙基，
X1a和X1b表示-CO-O-，
R5a和R5b表示脂溶性维生素残基(例如来自生育酚半琥珀酸酯的基团)，
R5a与R5b相同。
一方式中，
R4a和R4b表示亚乙基，
X1a和X1b表示-CO-O-，
R5a和R5b表示碳数13～23的脂肪族烃基(例如十七碳二烯基、十七碳烯基)，
R5a与R5b相同。
作为本发明的阳离子性脂质的具体例，可列举以下的TS-PZ4C2、L-PZ4C2、O-PZ4C2。
[表2]
作为特别优选的阳离子脂质的例子，可列举：
[化33]
所述阳离子脂质例如在作为COATSOME SS-33/1PZ-21(注册商标)(日油株式会社)销售。
作为载体，可以使用包含所述化合物作为膜的构成脂质的脂质膜结构体。本发明的一实施方式提供一种组合物，其包含脂质膜结构体和被脂质膜结构体包封的核酸复合体。
脂质纳米颗粒有时优选被PEG修饰。这是由于，这样可以增加血中的存在。另外，所述脂质纳米颗粒由于EPR效应(Enhanced permeation and retention effect，被增强的渗透和保留效应)而能够在肿瘤组织中累积。
作为脂质纳米颗粒的直径，可以是例如约110nm～约130nm，例如为约120nm。一实施方式中，脂质纳米颗粒的直径为约125nm。合适的纳米颗粒的直径可促进本说明书所用的miRNA抑制复合体的适当递送。
(优选实施方式)
以下说明本发明的优选实施方式。以下提供的实施方式是为了更容易理解本发明而提供的，可理解的是，本发明的范围不应限定于以下记载。因此可知，本领域技术人员可参酌本说明书中的记载在本发明的范围内适当进行改变。另外可理解的是，本发明的以下的实施方式可单独使用或将它们组合使用。
(miRNA抑制复合体)
一个方面中，本发明提供一种miRNA抑制复合体，其为含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。这种改良型S-TuD或修饰S-TuD(miRNA抑制复合体)包含至少1个桥接核酸(BNA)，从而使本说明书所用的miRNA抑制复合体的稳定性提高，还抑制纯化过程中产生杂质，进而令人惊讶的是生物学活性也提高，因此可理解可作为理想的核酸药物原料或药物本身。
一个优选实施方式中，上述BNA包含经由2’位侧的选自由氧和碳组成的组中的至少1个原子、经由4’位侧碳和选自由碳和氮组成的组中的至少1个原子而桥接的BNA。期望不受理论束缚，但可以容易地进行寡核苷酸的合成，并且可促进RNA双链的形成，因此可作为优选的BNA使用。
一个优选实施方式中，本发明中使用的BNA可以使用在(本发明中使用的桥接核酸(BNA))部分所说明的任意的BNA。例如，BNA-1为代表例。优选实施方式中，本发明中使用的BNA可以是BNA-2。进一步可优选为BNA-3。进而，作为可使用的实施方式，可以是例如cEt、BNANC(NMe)或2’,4’亚甲基桥接核酸(LNA)等。特别优选BNANC(NMe)。其原因在于，期望不受理论束缚，但通过使用该特定的核酸，稳定性增加，促进双链的形成，进而还观察到生物学活性的提高。
另一实施方式中，可以使用cEt。其原因在于，期望不受理论束缚，但BNA(cEt)具有与以往的LNA同样的热稳定性和错配识别，但相对于核酸酶的稳定性提高。
一实施方式中，本发明中使用的BNA包含在上述双链结构部分的至少一条链和上述miRNA结合序列的至少一条链中。
另一实施方式中，本发明中使用的BNA包含在上述双链结构部分的至少一条链中。另一实施方式中，本发明中使用的BNA包含在上述双链结构部分的两条链中。
一实施方式中，本发明的复合体可包含1个以上或多个“双链结构”，可以是与日本专利第4936343号公报或实施例同样的S-TuD结构。例如如果是串联，可连续包含3个、4个双链结构，应可理解，这种实施方式也包含在本发明中。
一实施方式中，本发明的复合体包含2个以上的上述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而该链被该2个以上的双链结构夹住。
另一实施方式中，本发明的包含miRNA结合序列的两条链的末端借助接头而结合。优选实施方式中，本发明的上述接头的长度为1～10碱基长，更优选为1～9碱基长，进一步优选为1～8碱基长，进一步优选为1～7碱基长，进一步优选为1～5碱基长，可以是4碱基长、3碱基长、2碱基长、1碱基长。
本说明书中，使用的miRNA抑制复合体中的双链结构的长度如上所述可以是任意的长度，优选具有4碱基对以上的长度。特别地，本发明的RNA复合体所含的双链结构的至少1个(即，第一双链结构)对于RNA复合体的核外输送具有重要的作用。该双链的链长可以是例如10～50、15～50碱基对，优选为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45碱基或它们中的任一者以上，为50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18碱基或它们中的任一者以下。更优选的方式中，双链结构的碱基对的长度为例如10～30、15～30，优选为16～28、优选为17～25、优选为17～24，例如为17、18、19、20、21、22、23或24。虽然超过20bp也可以发挥高活性，但超过20bp的dsRNA在细胞质中可能成为Dicer切断的的潜在目标，因此为了避免该切断，本发明的复合体所含的双链结构可以设为20bp以下，例如19bp以下或18bp以下。关于miRNA抑制复合体所含的双链结构，将在以下的优选实施方式中进一步说明。例如，可设为5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp、7bp～8bp、10bp～12bp。
本发明所使用的复合体中，双链结构的下限长度没有特别限定，只要保持活性即可，为至少4碱基长、至少5碱基长、至少6碱基长、至少7碱基长、至少8碱基长，优选为至少9碱基长，进一步优选为至少10碱基长。有2个以上的双链时，它们的碱基长可以相同也可以不同。另外，为10碱基长时可确认双链的充分形成、显示有充分的效果，但根据场合可以是例如至少11碱基长、至少12碱基长、至少13碱基长、至少14碱基长、至少15碱基长、至少16碱基长、至少17碱基长、至少18碱基长。
本发明的复合体中，双链结构的上限长度没有特别限制，只要保持活性即可，可以是例如100碱基长以下、90碱基长以下、80碱基长以下、70碱基长以下、60碱基长以下、50碱基长以下等。
本说明书中，在所使用的miRNA抑制复合体中包含第二或更多的双链结构时，这些双链结构的序列、其长度没有特别限制。这些双链结构例如可以比第一双链结构的长度短，以使miRNA抑制复合体整体紧凑。各双链的链长可以适当进行调整，为例如4bp～20bp，可以设为例如5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp或7bp～8bp。
本发明所使用的复合体中，BNA为1个即可期待其效果，可优选设为包含2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上。其中，6个左右即可发挥充分的效果，有时即使包含更多效果也不再增加，因此包含6个左右(例如4～8个、4～6个等)可能是充分的。
另外，本发明中使用的复合体具有比以往的复合体更强的活性(低浓度下起作用)。并非进行限定，但例如本发明的复合体相较于以往复合体可发挥约2倍以上、约3倍以上、约4倍以上、约5倍以上、约6倍以上、约7倍以上、约8倍以上、9倍以上、约10倍以上、约15倍以上、约20倍以上、约25倍以上、约30倍以上、约40倍以上、约50倍以上、约75倍以上、约100倍以上的效果。因此，例如本发明的复合体发挥以下显著效果：在10nM以下起作用，在5nM以下起作用，在3nM以下起作用，在1nM以下起作用，在500pM以下起作用，在300pM以下起作用，在100pM以下起作用，在50pM以下起作用，在30pM以下起作用，在10pM以下起作用，在5pM以下起作用，在3pM以下起作用，在1pM以下起作用。
另一实施方式中，本发明的复合体包含2至5个miRNA结合序列，优选包含2个miRNA结合序列。
一实施方式中，本发明中使用的复合体包含下式所示的结构，[化34]
该结构的I和II为双链结构，可以采取在该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列的结构。
另一方面中，本发明提供构成包含BNA的复合体的各RNA或其类似物(即，各单链)，这些各RNA或其类似物也在本发明的范围内。单链情况下的优选实施方式与双链结构中的单链实质上相同，可以采用相同的优选实施方式。
另一方面中，本发明提供制造本发明中使用的复合体或包含该复合体的药物的方法，其包含下述工序：A)通过化学合成使用核糖核酸和BNA合成目标RNA或其类似物的单链的保护体和其互补体的保护体的工序；B)对生成的该单链的保护体和其互补体分别脱保护的工序；C)使脱保护的该单链分别在双链形成条件下而形成双链的工序；以及，根据需要用得到的复合体制备药物的工序。
另一方面中，本发明提供制造本发明的RNA或其类似物的方法，其包含下述工序：A)通过化学合成使用核糖核酸和BNA合成目标RNA或其类似物的单链的保护体和其互补体的保护体的工序；B)对生成的该单链的保护体和其互补体分别脱保护的工序；和，根据需要用得到的复合体制备药物的工序。
关于这种方法，本说明书中已经在其它部分进行了详述，实施例中也记载有实证例，可理解的是本领域技术人员参考这些则可以制造各种复合体、RNA或其类似物。
(核酸分子)
另一方面中，本发明提供核酸分子，其包含5'-CAGUGUU-3'和/或5'-CAGUAUU-3'的序列且包含至少1个桥接核酸(BNA)。这种核酸分子可作为可形成miRNA抑制复合体的核酸来利用，可有助于高效实现miRNA抑制，利用其可以提供抗癌剂等或其原料。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
另一方面，本发明提供核酸分子，其为包含2个miRNA结合序列的核酸分子，一方的miRNA结合序列包含5’-CAGUGUU-3’、且另一方的miRNA结合序列包含5’-CAGUAUU-3’，包含至少1个桥接核酸(BNA)。这种核酸分子可作为miRNA抑制复合体来利用，可以有助于高效实现miRNA抑制，利用其可以提供抗癌剂等或其原料。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
另一方面中，本发明提供核酸分子，其包含含有序列号1的序列的miRNA结合序列和含有序列号2的序列的miRNA结合序列。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
该核酸分子包含BNA。优选包含：含有序列号3的序列的miRNA结合序列、和序列号4的序列。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
一实施方式中，本发明提供核酸分子，其包含序列号5的序列和序列号6的序列且包含至少1个桥接核酸(BNA)。优选的是，本发明提供包含序列号9的序列和序列号10的序列的核酸分子。
序列例如作为RNA分子序列而记载，但是尿嘧啶碱基和胸腺嘧啶碱基均是与腺嘌呤碱基互补结合的，因此本领域技术人员可理解，可以将序列中作为尿嘧啶碱基而示出的碱基变更为胸腺嘧啶碱基。因此，本说明书中记载的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
一个方面中，本发明提供包含本发明的核酸分子的组合物。该组合物可以用于预防或处置肿瘤，例如，在此肿瘤可以是癌。
具体的实施方式中，对象肿瘤可以是结肠癌、肺癌或乳腺癌，或者可以是用于促进肿瘤的上皮-间充质转换的肿瘤。
一实施方式中，在本发明的组合物中，miRNA抑制复合体或核酸分子以包含在用于核酸递送的载体中的形态存在。
这种载体选自由脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子性脂质体、非阳离子性脂质体、阳离子性聚合物、非阳离子性聚合物、β葡聚糖、去端肽胶原、PLGA纳米颗粒、表面活性剂肽和超级磷灰石组成的组。期望不受理论束缚，但通过包含这种载体，可以减少核酸分子的分解，有利于靶向成为对象的靶，可以提高作为核酸药物的有用性。
一实施方式中，使用的载体为LNP，该LNP包含阳离子性脂质。
这种LNP可包含阳离子性脂质、辅助脂质和PEG修饰脂质，优选阳离子性脂质在分子内包含叔胺和/或二硫键。
(包含miRNA抑制复合体和用于核酸递送的载体的组合物)
一个方面中，本发明提供组合物，其包含含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体、和用于核酸递送的载体。在此，所包含的miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。这里使用的BNA可以利用本说明书中作为(本发明中使用的桥接核酸(BNA))而说明的任意的BNA。作为本发明的组合物所含的miRNA抑制复合体，可以利用在(miRNA抑制复合体)、(miRNA的抑制)、(核酸分子)、(药物)、(DDS)部分所说明的任意的实施方式和在本说明书的其它位置所说明的任意方式。
一方面中，本发明提供药物组合物，其包含组合物，所述组合物含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体、和用于核酸递送的载体。这里所使用的BNA可以利用在本说明书中作为(本发明中使用的桥接核酸(BNA))而说明的任意的BNA。作为本发明的组合物所含的miRNA抑制复合体，可以利用在(miRNA抑制复合体)、(miRNA的抑制)、(核酸分子)、(药物)、(DDS)部分所说明的任意的实施方式和在本说明书的其它位置所说明的任意方式。
另一方面，本发明提供组合物，其包含：含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体、以及用于核酸递送的载体，所述组合物用于将miRNA抑制复合体递送至期望的位点。这里所使用的BNA可以利用在本说明书中作为(本发明中使用的桥接核酸(BNA))而说明的任意的BNA。作为本发明的组合物所含的miRNA抑制复合体，可利用在(miRNA抑制复合体)、(miRNA的抑制)、(核酸分子)、(药物)、(DDS)部分所说明的任意的实施方式和在本说明书的其它位置所说明的任意方式。
一实施方式中，在包含本发明的miRNA抑制复合体和用于核酸递送的载体的组合物中，BNA包含经由2’位侧的选自由氧和碳组成的组中的至少1个原子、经由4’位侧的碳以及选自由碳和氮组成的组中的至少1个原子而桥接的BNA。
一个优选实施方式中，本发明中使用的BNA可以使用在(本发明中使用的桥接核酸(BNA))部分所说明的任意的BNA。例如，BNA-1为代表例。优选实施方式中，本发明中使用的BNA可以是BNA-2。可进一步优选为BNA-3。进而，作为可使用的实施方式，可以是例如cEt、BNANC(NMe)或2’,4’亚甲基桥接核酸(LNA)等。特别优选BNANC(NMe)。其原因在于，期望不受理论束缚，但通过使用该特定的核酸，稳定性增加，促进双链的形成，进而还观察到生物学活性的提高。另一实施方式中，可以使用cEt。其原因在于，期望不受理论束缚，但是BNA(cEt)具有与以往的LNA同样的热稳定性和错配识别，但相对于核酸酶的稳定性提高。
一实施方式中，本发明的复合体包含2个以上的上述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而该链被该2个以上的双链结构夹住。
本发明所使用的复合体中，双链结构的下限长度没有特别限定，只要保持活性即可，为至少4碱基长、至少5碱基长、至少6碱基长、至少7碱基长、至少8碱基长，优选为至少9碱基长，进一步优选为至少10碱基长。有2个以上双链时，它们的碱基长可以相同也可以不同。另外，为10碱基长时可确认双链的充分形成、显示有充分的效果，但根据场合可以是例如至少11碱基长、至少12碱基长、至少13碱基长、至少14碱基长、至少15碱基长、至少16碱基长、至少17碱基长、至少18碱基长。
本发明的复合体中，双链结构的上限长度没有特别限定，只要保持活性即可，可以是例如100碱基长以下、90碱基长以下、80碱基长以下、70碱基长以下、60碱基长以下、50碱基长以下等。
另一实施方式中，本发明的复合体包含2至5个miRNA结合序列，优选包含2个miRNA结合序列。
一实施方式中，本发明中使用的复合体包含下式所示的结构，
[化35]
该结构的I和II为双链结构，可以采取在该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列的结构。
一个优选实施方式中，miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'和/或5'-CAGUAUU-3'，优选miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5’-CAGUGUU-3’、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
一个具体的实施方式中，包含本发明的miRNA抑制复合体和用于核酸递送的载体的组合物包含含有序列号1的序列的miRNA结合序列、和含有序列号2的序列的miRNA结合序列，并且包含BNA。优选包含：含有序列号3的序列的miRNA结合序列、和序列号4的序列。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
一实施方式提供核酸分子，其中，在包含本发明的miRNA抑制复合体和用于核酸递送的载体的组合物中，复合体包含序列号5的序列和序列号6的序列且包含至少1个桥接核酸(BNA)。优选的是，在包含本发明的miRNA抑制复合体和用于核酸递送的载体的组合物中，复合体包含序列号9的序列和序列号10的序列。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
一实施方式中，包含本发明的miRNA抑制复合体和用于核酸递送的载体的组合物所含的载体选自由脂质纳米颗粒(LNP)、阳离子性脂质体、非阳离子性脂质体、阳离子性聚合物、非阳离子性聚合物、β葡聚糖、去端肽胶原、PLGA纳米颗粒、表面活性剂肽和超级磷灰石组成的组。此外，可以利用在(DDS)部分所说明的任意的实施方式和在本说明书的其它位置所说明的任意方式。
优选实施方式中，本发明中使用的载体为LNP，该LNP包含阳离子性脂质，进一步优选LNP包含阳离子性脂质、辅助脂质和PEG修饰脂质，具体而言，阳离子性脂质可在分子内包含叔胺和/或二硫键。
(复合阳离子脂质)
一实施方式中，关注本发明中使用的载体，本发明提供组合物，其为包含脂质膜结构体和被该脂质膜结构体包封的核酸复合体的组合物，所述脂质膜结构体包含式(1)或式(4)所示的化合物作为膜的构成脂质，
[化36]
(式(1)中，Xa和Xb分别独立地为X1或X2；
[化37]
s为1或2，
R4表示碳数1～6的烷基，
na和nb分别独立地为1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
R3a和R3b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，
甾醇残基为胆甾烯基、胆甾烷基、豆甾烯基、β-谷甾烯基、羊毛甾烯基或麦角甾烯基，
脂溶性维生素为视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚)
[化38]
(式(4)中，R4a和R4b分别独立地为碳数8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
X1a和X1b分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键或醚键，
R5a和R5b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素残基或碳数13～23的脂肪族烃基)
该核酸复合体为含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。这里使用的BNA可以利用本说明书中作为(本发明中使用的桥接核酸(BNA))而说明的任意的BNA。作为本发明的组合物所含的miRNA抑制复合体，可以利用在(miRNA抑制复合体)、(miRNA的抑制)、(核酸分子)、(药物)、(DDS)部分所说明的任意的实施方式和在本说明书的其它位置所说明的任意方式。
在此，优选实施方式中，式中，Xa和Xb独立地为X2。
一个优选实施方式中，式中，R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基。
一个优选实施方式中，R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基。
进一步优选的实施方式中，上述脂溶性维生素衍生物残基为具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应产物来源的残基。
一个优选实施方式中，R3a和R3b独立地为碳数12～22的脂肪族烃基。
在此，优选实施方式中，式(4)中，R4a和R4b独立地为碳数8以下的亚烷基。
一个优选实施方式中，式(4)中，X1a和X1b为酯键。
一个优选实施方式中，式(4)中，R5a和R5b独立地为脂溶性维生素残基或碳数13～23的脂肪族烃基。
进一步优选的实施方式中，式(4)中，R5a和R5b独立地为脂溶性维生素残基。
一个优选实施方式中，式(4)中，R5a和R5b独立地为碳数13～23的脂肪族烃基。
作为本发明中使用的特别优选的阳离子脂质的例子，可列举：
[化39]
或
[化40]
分别作为COATSOME SS-33/4PE-15(注册商标)(日油株式会社)和COATSOME SS-33/1PZ-21(注册商标)(日油株式会社)销售。
一个优选实施方式中，上述BNA为BNANC(NMe)。
另一优选实施方式中，本发明中使用的miRNA抑制复合体包含2个以上的上述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而该链被该2个以上的双链结构夹住。
一实施方式中，miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列。在此，优选上述miRNA抑制复合体包含图2所示的结构，该结构的I和II为双链结构，在该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列。
一个优选实施方式中，本发明中使用的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'和/或5'-CAGUAUU-3'，优选miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5’-CAGUGUU-3’、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'。
一个优选实施方式中，本发明中使用的miRNA抑制复合体包含含有序列号1的序列的miRNA结合序列和含有序列号2的序列的miRNA结合序列，包含BNA。优选包含：含有序列号3的序列的miRNA结合序列、和序列号4的序列。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
一实施方式中，本发明提供核酸分子，其中，复合体包含序列号5的序列和序列号6的序列且包含至少1个桥接核酸(BNA)。优选本发明复合体包含序列号9的序列和序列号10的序列。所示的序列中，尿嘧啶碱基根据需要可以是胸腺嘧啶碱基。
本说明书中，在可以采用文章中列举的事项中的“至少1个以上”时，使用“或”。“或者”也同样。本说明书中明确记载“在2个值的范围内”时，该范围也包含2个值本身。
本说明书引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献，其整体与分别且具体记载时同程度地援引到本说明书中作为参考。
以上为了容易理解本发明而示出并说明了优选的实施方式。以下基于实施例对本发明进行说明，但上述的说明和以下的实施例仅用于例示而提供，不是出于限定本发明的目的而提供的。因此，本发明的范围既不限定于本说明书中具体记载的实施方式也不限定于实施例，仅通过权利要求书而限定。需要说明的是，本说明书中所引用的文献均作为本说明书的一部分而包含。
实施例
以下记载本发明的实施例。首先示出合成例，然后示出显示其生物活性的动物模型实验等实施例。动物实验等遵守千叶大学规定的伦理规定和动物保护法及相关规定、以及关于实验动物而制定的政府规定等来进行。
本发明的核苷类似物和寡核苷酸类似物按照下述的合成方案来合成。
(制造例)
(寡核苷酸的合成)
用nS-8II合成仪或AKTAoligopilot合成仪合成寡核苷酸。在寡核苷酸合成中，使用市售的细孔玻璃质固相载体(2’-O-甲基-RNA CPGLink Technologies公司制)和具有标准的保护基的2’-O-甲基-RNA亚磷酰胺、即5’-O-二甲氧基三苯甲基N6-苯甲酰基腺苷-2'-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-乙酰基胞苷-2'-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-异丁酰基鸟苷-2'-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺、和5’-O-二甲氧基三苯甲基尿苷-2'-O-甲基-3’-O-N,N’-二异丙基亚磷酰胺(以上Sigma-Aldrich公司制)、以及2’,4’-BNANC(2’-O,4’-C-氨基亚甲基桥接核酸)胸苷亚磷酰胺、即2’-O,4’-C-氨基亚甲基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-N,N'-二异丙基亚磷酰胺、2’,4’-BNANC腺苷亚磷酰胺、即2’-O,4’-C-氨基亚甲基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基腺苷-N,N'-二异丙基亚磷酰胺(以上BNA公司制)、以及LNA(Locked nucleic acid)(2’-O,4’-C-亚甲基核糖核酸)胸苷亚磷酰胺、即2’-O,4’-C-亚甲基-5’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-N,N'-二异丙基亚磷酰胺(Exiqon公司制)。亚磷酰胺均以乙腈(CH3CN)中的0.1M的浓度使用。关于2’-O-甲基RNA、BNA和LNA，使用15分钟的连接/再利用时间。活性剂为5-苄基巯基-四唑(0.25M、和光纯药公司制)，关于PO-氧化，使用碘/水/吡啶。关于PS-硫代磷酸酯化，与吡啶一起使用市售的寡核苷酸自动合成仪用硫化试剂(即，EIDTH、DDTT、PADS、Beucage试剂等)。
脱保护I(核碱基脱保护)
合成结束后，将合成载体转移到玻璃瓶中。对于寡核苷酸，相对于载体1g使用15mL的40％甲基胺水溶液与33％甲基胺乙醇溶液的等量混合物，边在45℃下对碱基和磷酸基同时脱保护13小时，边从载体切割下来。然后，对乙醇氨混合物进行过滤，加入到新的250mL瓶中。将载体用2×40mL的乙醇/水(1：1v/v)洗涤。然后用旋转蒸发器(roto-vap)馏去溶剂，干固。
(HPLC纯化)
将寡核苷酸使用利用Source 15RPC凝胶柱的反相离子对HPLC纯化。缓冲液为5％CH3CN、0.1M三乙胺乙酸缓冲液(pH7.0)(缓冲液A)和90％CH3CN、0.1M三乙胺乙酸缓冲液(pH7.0)(缓冲液B)。在于5’末端保持有二甲氧基三苯甲基的状态下，将包含全长的寡核苷酸的级分合并，供于此后的纯化。然后将寡核苷酸合并物用Source30Q的阴离子对HPLC纯化。溶液和缓冲液为0.6％的三氟乙酸(溶液A)、20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)(缓冲液C)和20mM磷酸钠缓冲液中的2M氯化钠(缓冲液D)。使用溶液A使二甲氧基三苯甲基脱离之后，将包含全长的寡核苷酸的级分合并，脱盐后冷冻干燥。最后使用MALDI-TOF/MS和反相HPLC分析化合物。
(双链化)
将纯化后的单链寡核苷酸溶解于蒸馏水后，使用紫外吸光光度分析计测定吸光度，从而确定寡核苷酸浓度。使用所确定的浓度，按照使互补链彼此达到等摩尔浓度的方式混合，在95℃加热10分钟后，缓慢冷却而使其形成双链。利用非变性凝胶电泳确认形成了双链。
(实施例1：利用改良型S-TuD的体内的肿瘤抑制)
＜材料和方法＞
细胞培养
从Asterand获得三阴性乳腺癌细胞株SUM149PT(也称为SUM149)，在包含5％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES、5μg/ml胰岛素、1μg/ml氢化可的松和5μg/ml庆大霉素的Ham's F-12培养基(SUM149PT培养基)中在37℃下培养。
动物实验
从日本SLC购入雌BALB/c裸小鼠，所有实验均使用6周龄的小鼠。将细胞悬浮于SUM149PT培养基，混合等量的基质胶(BD)，注入乳腺脂肪体中。用数字式卡尺测量肿瘤体积。
miRNA抑制复合体
按照上述的规程制备miRNA抑制复合体。本实施例中使用的(1)S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(具有针对miR-141和miR-200c的MBS)和(2)S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1-s(MBS相对于miR不具有互补序列)的结构如图4所示。序列中的小写字母表示被BNANC(NMe)置换的位置。
将使5×105SUM149PT细胞注入到小鼠乳腺脂肪体的时点设为第0天，在第69、76、83、90、97、104和111天，向尾静脉内和肿瘤内给药(1)S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1和(2)S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1-s(Naked、3mg/kg)。
给药后经时测定小鼠体重和肿瘤体积。
＜结果＞
结果如图5和图6所示。
如图5所示，通过各途径给药了各S-TuD的小鼠体重没有变化，未确认到由S-TuD带来的副作用，表明可安全使用。
如图6所示，S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(S-TuD-141/200c)与S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1(S-TuDNCs)相比，使肿瘤的生长减少。这表明，本发明的杂化miRNA抑制复合体成功地抑制了2个miRNA(miR-141和miR-200c)，从而可以抑制肿瘤生长。
静脉给药也可以减少肿瘤生长，但是给药于肿瘤内时特别显著地抑制肿瘤生长，这表明，将S-TuD-141/200c使用合适的递送系统递送到肿瘤内对肿瘤的处置或预防非常有效。
TuD是由载体表达的系统，因此如果不是将病毒载体预先导入细胞的离体方式则不能成功地抑制miRNA。本发明的改良型S-TuD与以往的S-TuD相比，miRNA抑制能力高，另外血清稳定性优异，因此体内的miRNA抑制得到大幅改善。因此表明，使用本发明的改良型S-TuD时，通过肿瘤内给药或静脉给药。即体内方式可以实现miRNA的抑制。
(实施例2：使用了DDS的、由改良型S-TuD带来的体内的肿瘤抑制)
本实施例中，对适合于本发明的改良型S-TuD的递送的药物递送系统(DDS)进行研究。
＜材料和方法＞
除了使用药物递送系统这一点以外，与实施例1同样地进行动物的肿瘤模型和miRNA抑制复合体的制备等。
脂质纳米颗粒(LNP)
作为DDS，使用图7所示的脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒包含以下的成分：
COATSOME SS-33/4PE-15
[化41]
胆甾醇
[化42]
DSG-PEG5k
[化43]
(式中，R1和R2为C18:0酰基)。
LNP的组成
制作了脂质纳米颗粒中的成分比为以下比例的LNP。
制剂1：
脂质 6000nmol
S-TuD 6.72nmol
脂质/S-TuD比 1000
回收率(％) 81
包封率(％) 35
直径(d.nm) 125
制剂2：
脂质 3000nmol
S-TuD 6.72nmol
脂质/S-TuD比 250
回收率(％) 56
包封率(％) 33
直径(d.nm) 122.2
制剂3：
脂质 3000nmol
S-TuD 3.36nmol
脂质/S-TuD比 1000
回收率(％) 55
包封率(％) 40
直径(d.nm) 114.6
制剂4：
脂质 6000nmol
S-TuD 13.4nmol
脂质/S-TuD比 500
回收率(％) 94
包封率(％) 28
直径(d.nm) 116.8
其中，将制剂1的组成的LNP用于体内的进一步研究中。针对小鼠的各成分的比率为：
S-TuD 1mg/kg
COATSOME SS-33/4PE-15 430nmol/小鼠
胆甾醇 185nmol/小鼠
DSG-PEG5k 18nmol/小鼠。
与实施例1同样地，对于将5×105SUM149PT细胞注入乳腺脂肪体的小鼠，将肿瘤细胞的移植时点设为第0天，在第29、36、43、50和57天从尾部静脉注入包封于上述LNP的S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD-141/200c)(1mg/kg)或PBS。第29天还进行LNP-S-TuD-141/200c(3mg/kg)的给药，但是有1例死亡，因此没有以该用量进行此后的给药。
＜结果＞
结果示于图8和图9。如图8所示，分别给药了LNP-S-TuD-141/200c(1mg/kg)和PBS的小鼠体重没有显著变化，未确认到副作用，表明可安全使用。
如图9所示，从尾部静脉给药LNP-S-TuD-141/200c(1mg/kg)使肿瘤的生长减少。这表明，使用本实施例所用的脂质纳米颗粒能够将本说明书所用的miRNA抑制复合体有利地递送到肿瘤的靶标部位而进行肿瘤的处置或预防。
(实施例3：针对非小细胞肺癌的、由改良型S-TuD带来的肿瘤抑制)
为了确认在其它脏器来源的癌细胞中也能诱导通过抑制在乳腺癌细胞株中可见的miR-200家族而实现的、体内的肿瘤抑制，移植肺癌细胞并进行分析。
＜材料和方法＞
细胞培养
从ATCC获得非小细胞肺癌细胞株H596、A-427、HCC827。H596细胞在包含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中在37℃下进行培养。A-427细胞在包含10％胎牛血清(FBS)的EMEM中在37℃下培养。HCC827细胞在包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中在37℃下培养。
动物实验
从日本SLC购入雌BALB/c裸小鼠，所有实验中均使用6周龄的小鼠。将导入了病毒的H596细胞悬浮于DMEM培养基，混合等量的基质胶(BD)并注入到右腹侧部。用数字式卡尺测量肿瘤体积。
miRNA抑制复合体
与实施例1同样地制备miRNA抑制复合体(S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1)。
将制备的miRNA抑制复合体给药于移植有肿瘤的小鼠的尾部静脉内或肿瘤内，对肿瘤的减少进行确认。
(实施例4：使用了DDS的、由改良型S-TuD带来的体内的肿瘤抑制)
本实施例中，对于适合于本发明的改良型S-TuD的递送的药物递送系统(DDS)进行研究。
＜材料和方法＞
除了使用药物递送系统这一点以外，与实施例1同样地进行动物的肿瘤模型和miRNA抑制复合体的制备等。
作为DDS，使用成分如下的脂质纳米颗粒。
其包含COATSOME SS-33/1PZ-21
[化44]
胆甾醇、
[化45]
DSG-PEG5k、
[化46]
(式中，R1和R2为C18:0酰基)。
LNP的组成
制作了脂质纳米颗粒中的成分比为以下比例的LNP，用于体内的研究中。
制剂：
脂质 3240nmol
S-TuD 1.67nmol
脂质/S-TuD比 1940
回收率(％) 91
包封率(％) 81
直径(d.nm) 108
针对小鼠的各成分的比率为：
S-TuD 3mg/kg
COATSOMESS-33/1PZ-21 2585nmol/小鼠
胆甾醇 1108nmol/小鼠
DSG-PEG5k 295nmol/小鼠。
与实施例1同样地，对于将5×105SUM149PT细胞注入到乳腺脂肪体的小鼠，将肿瘤细胞的移植时点设为第0天，在第57、64、71、76、85、92、99和104天从尾部静脉注入包封于上述LNP的S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD-141/200c)(3mg/kg)或包封于上述LNP的S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1(LNP-S-TuD阴性对照)(3mg/kg)。
＜结果＞
结果示于图11和图12。如图11所示，分别给药了LNP-S-TuD-141/200c(3mg/kg)和LNP-S-TuD阴性对照(3mg/kg)(3mg/kg)的小鼠体重没有显著变化，未确认到副作用，表明可安全使用。
如图12所示，从尾部静脉给药LNP-S-TuD-141/200c(3mg/kg)与从尾部静脉给药LNP-S-TuD阴性对照(3mg/kg)相比，使肿瘤的生长减少。因此，这表明使用本实施例中所用的脂质纳米颗粒的使用能够将本说明书所用的miRNA抑制复合体有利地递送到肿瘤的靶部位而进行肿瘤的处置或预防。
(实施例5：由改良型S-TuD带来的肺癌细胞株H358中的miR-21抑制)
(萤光素酶测试)
在导入的前一天，将包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中的H358细胞以1.0x105细胞/孔接种到24孔板中，用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)和100ng的报告质粒(psiCHECK2-UT或psiCHECK2-T21-5p)(参照图13、14和图15)和各种S-TuD进行转染，设置三个重复。全部测试均在转染48小时后用GLOMAXTM(Promega)通过dual luciferase assay(Promega)来实施。
由改良型S-TuD带来的miR-21抑制测试的规程如下。
通过用以下的实验1和实验2取得海肾萤光素酶(RL)与萤火虫萤光素酶(FL)之比来测定靶miRNA活性。
(实验1)
在包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中在37℃下培养内源性表达miR-21的肺癌细胞株H358细胞。
(实验2)
使用psiCHECK2-T21-5p(Promega公司，在XhoI-NotI位点插入例如与miR-21之类的靶miRNA互补的序列而制作；整体结构如图13所示。)、图16-1所示的合成S-TuD修饰体转染H358细胞。
然后，用发光计测定化学发光信号、并且对于所测定的信号取得海肾萤光素酶(RL)与萤火虫萤光素酶(FL)之比，所述化学发光信号是经转染的细胞所表达的海肾萤光素酶(RL)与萤火虫萤光素酶(FL)与各自的特异性底物反应而产生的。将结果示于图16-2。根据图16-2的结果表明，改良型S-TuD-21以1000pM这一低浓度完全抑制了H358细胞的miR-21活性，比以往的S-TuD的抑制活性高。
(实施例6：由改良型S-TuD带来的、肺癌细胞株H358中的miR-200c抑制)
(萤光素酶测试)
在导入的前一天，将包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中的H358细胞以1.0x105细胞/孔接种于24孔板，用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)和100ng的报告质粒(psiCHECK2-UT或psiCHECK2-T200c-3p)(参照图13、14和图15)和各种S-TuD进行转染，设置三个重复。全部测试均在转染48小时后用GLOMAXTM(Promega)通过dual luciferase assay(Promega)实施。
利用改良型S-TuD(有义序列：序列号26和反义序列：序列号27)的miR-200c抑制测试的规程如下。
通过用以下的实验5和实验6取得海肾萤光素酶(RL)与萤火虫萤光素酶(FL)之比来测定靶miRNA活性。
(实验5)
在包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中在37℃下培养内源性表达miR-200c的肺癌细胞株H358细胞。
(实验6)
用psiCHECK2-T200c-3p、图17-1所示的合成S-TuD修饰体转染H358细胞。然后用发光计测定化学发光信号、并且对于所测定的信号取得海肾萤光素酶(RL)与萤火虫萤光素酶(FL)之比，所述化学发光信号是经转染的细胞所表达的海肾萤光素酶(RL)和萤火虫萤光素酶(FL)与各自的特异性底物反应而产生的。将结果示于图17-2。图17-2的结果显示，改良型S-TuD-141/200c以100pM这一低浓度完全抑制了H358细胞的miR-200c活性。
利用TuD表达慢病毒载体的miR-200c抑制测试的规程如下。
通过用以下的实验7和实验8取得海肾萤光素酶(RL)与萤火虫萤光素酶(FL)之比来测定靶miRNA活性。
(实验7)
在包含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中在37℃下培养内源性表达miR-200c的肺癌细胞株H358细胞。将H358细胞以1x105细胞/孔接种在6孔板中，24小时后在8μg/ml的海美溴铵(polybrene)的存在下导入pLSP-TuD-141/200c病毒载体(3x105 TU)，转导24小时后用嘌呤霉素(1ug/ml)进行选择。进行1周的选择后，从培养基中除去嘌呤霉素，得到保持有TuD-141/200c的表达盒的H358-TuD-141/200c细胞。
(实验8)
使用psiCHECK2-T200c-3转染H358-TuD-141/200c细胞。然后用发光计测定化学发光信号、并且对于所测定的信号取得海肾萤光素酶(RL)与萤火虫萤光素酶(FL)之比，所述化学发光信号是经转染的细胞所表达的海肾萤光素酶(RL)和萤火虫萤光素酶(FL)与各自的特异性底物反应而产生的。将结果示于图17-3。图17-3的结果显示，导入的慢病毒载体所表达的TuD-141/200c完全抑制了H358细胞的miR-200c活性。
以上基于实施例说明了本发明。本领域技术人员可理解，该实施例终究是例示，能够形成各种变形例，另外这样的变形例也包含在本发明的范围内。
如上所述，使用本发明的优选实施方式例示了本发明，但可理解，本发明仅基于权利要求书来解释其范围。还可理解，本说明书中引用的专利、专利申请和文献其内容本身以与具体记载于本说明书时同样地，其内容作为本说明书的参考援引到本发明中。本说明书中，特别是可参照PCT/JP2016/078345、PCT/JP2016/004252和日本特愿2013-544251，其内容整体作为参考援引到本说明书中。进一步地，本申请要求日本特愿2017-53124的优先权，其内容整体作为参考援引到本说明书中。
产业上的可利用性
本发明在使用核酸药物等的制药产业和试剂产业中有用。
序列表自由文本
序列号1：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1的针对miR-141的结合序列
序列号2：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1的针对miR-200c的结合序列
序列号3：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1的针对miR-141的结合序列(在特定位置包含BNA)
序列号4：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1的针对miR-200c的结合序列(在特定位置包含BNA)
序列号5：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10有义序列
序列号6：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10反义序列
序列号7：S-TuD-NCs-S10有义序列
序列号8：S-TuD-NCs-S10反义序列
序列号9：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1有义序列(在特定位置包含BNA)
序列号10：S-TuD-141/200c-1_17-pf-S10-BT6-MBSB1反义序列(在特定位置包含BNA)
序列号11：S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1有义序列(在特定位置包含BNA)
序列号12：S-TuD-NCs-S10-BT6-MBSB1反义序列(在特定位置包含BNA)
序列号13：miR-200a
序列号14：miR-141
序列号15：miR-200b
序列号16：miR-200c
序列号17：miR-429
序列号18：图10(41)的有义序列
序列号19：图10(41)的反义序列
序列号20：图10(42)的有义序列
序列号21：图10(42)的反义序列
序列号22：图10(43)的有义序列
序列号23：图10(43)的反义序列
序列号24：图10(44)的有义序列
序列号25：图10(44)的反义序列
序列号26：图10(45)的有义序列
序列号27：图10(45)的反义序列
序列号28：图15的psiCHECK2-T21-5p-s
序列号29：图15的psiCHECK2-T21-5p-a
序列号30：图15的psiCHECK2-T200c-3p-s
序列号31：图15的psiCHECK2-T200c-3p-a
序列号32：以往的S-TuD-21的针对miR-21的结合序列
序列号33：改良型S-TuD-21的针对miR-21的结合序列
序列号34：改良型S-TuD-21的针对miR-21的结合序列(在特定位置包含BNA)
序列号35：以往的S-TuD-21有义序列
序列号36：以往的S-TuD-21反义序列
序列号37：改良型S-TuD-21有义序列
序列号38：改良型S-TuD-21反义序列
序列号39：改良型S-TuD-21有义序列(在特定位置包含BNA)
序列号40：改良型S-TuD-21反义序列(在特定位置包含BNA)
序列号41：miR-21
序列表
<110> 国立大学法人千叶大学（NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION CHIBAUNIVERSITY）
基因设计有限公司（GENE DESIGN INC.）
日油株式会社（NOF CORPORATION）
<120> 使用经结构强化的S-TuD的新的癌症治疗方法
<130> F517PCT273
<150> JP 2017-53124
<151> 2017-03-17
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
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uaacacuguc ugguaaagau gg 22
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<212> DNA
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tacggcgcua ggaucaucaa cccaucauua cccggcagta utacaagtau uctgga 56
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<222> (2)..(2)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (9)..(19)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (20)..(20)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (21)..(22)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (23)..(23)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (24)..(40)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (41)..(41)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (42)..(43)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (44)..(44)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (45)..(48)
<400> 27
accagaatac aacccaucat uacccggcag uauuacaaga tgatccua 48
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> psiCHECK2-T21-5p-s
<400> 28
tcgagtcaac atcagtctga taagctagc 29
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> psiCHECK2-T21-5p-a
<400> 29
ggccgctagc ttatcagact gatgttgac 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> psiCHECK2-T200c-3p-s
<400> 30
tcgagtccat cattacccgg cagtattagc 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> psiCHECK2-T200c-3p-a
<400> 31
ggccgctaat actgccgggt aatgatggac 30
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 通常的 S-TuD-21 MBS miR-21
<400> 32
aucagucgga uaagcua 17
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 改良的 S-TuD-21 MBS miR-21
<400> 33
atcagucgga uaagcua 17
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 通常的 S-TuD-21 MBS miR-21 (BNA)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (1)..(1)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (2)..(2)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (3)..(4)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (5)..(5)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (6)..(17)
<400> 34
atcagucgga uaagcua 17
<210> 35
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 通常的 S-TuD-21 有义序列
<400> 35
uacggcgcua ggaucaucaa caucagucgg auaagcuaca aguauucugg a 51
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 通常的 S-TuD-21 反义序列
<400> 36
uccagaauac aacaucaguc ggauaagcua caagaugauc cuagcgccgu a 51
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 改良的 S-TuD-21 有义序列
<400> 37
taggaucauc aacatcaguc ggauaagcua caaguautcu ggt 43
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 改良的 S-TuD-21 反义序列
<400> 38
accagaatac aacatcaguc ggauaagcua caagatgatc cua 43
<210> 39
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 改良的 S-TuD-21 有义序列 (BNA)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (2)..(14)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (15)..(15)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (16)..(17)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (18)..(18)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (19)..(37)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (38)..(38)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (39)..(42)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (43)..(43)
<400> 39
taggaucauc aacatcaguc ggauaagcua caaguautcu ggt 43
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 改良的 S-TuD-21 反义序列 (BNA)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (1)..(7)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (8)..(8)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (9)..(14)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (15)..(15)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (16)..(17)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (18)..(18)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (19)..(35)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (36)..(36)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (37)..(38)
<220>
<221> BNANC(NMe)
<222> (39)..(39)
<220>
<221> 2'-OMe
<222> (40)..(43)
<400> 40
accagaatac aacatcaguc ggauaagcua caagatgatc cua 43
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
uagcuuauca gacugauguu ga 22
Claims (32)
1.一种组合物，其为用于预防或处置肿瘤的、包含含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体的组合物，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述BNA包含下述结构的化合物或2’,4’亚甲基桥接核酸(LNA)，
[化47]
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述BNA为BNANC(NMe)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含2个以上的所述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而该链被该2个以上的双链结构夹住。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含以下所示的结构，
[化48]
(C)
该结构的I和II为双链结构，该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5’-CAGUGUU-3’、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'。
8.一种核酸分子，其为包含2个miRNA结合序列的核酸分子，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)，并且所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
9.一种核酸分子，其包含含有序列号1的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列、和含有序列号2的序列的miRNA结合序列，并且所述核酸分子包含至少1个桥接核酸(BNA)。
10.一种核酸分子，其包含序列号9的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号10的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
11.一种核酸分子，其包含5'-AUAAGCU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的序列且包含至少1个桥接核酸(BNA)。
12.一种组合物，其包含权利要求8～11中任一项所述的核酸分子。
13.根据权利要求12所述的组合物，其用于预防或处置肿瘤。
14.根据权利要求1～7或13中任一项所述的组合物，其中，所述肿瘤为癌。
15.根据权利要求1～7或13中任一项所述的组合物，其中，所述肿瘤为结肠癌、肺癌或乳腺癌。
16.根据权利要求1～7或13～15中任一项所述的组合物，其用于促进所述肿瘤的上皮-间充质转换。
17.根据权利要求1～7或12～16中任一项所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体或核酸分子以包含在用于核酸递送的载体中的形态存在。
18.一种组合物，其为包含含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体、和用于核酸递送的载体的组合物，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
19.一种组合物，其为包含脂质膜结构体和被该脂质膜结构体包封的核酸复合体的组合物，所述脂质膜结构体包含式(1)所示的化合物作为膜的构成脂质，
[化49]
式(1)中，Xa和Xb分别独立地为X1、X2或X3；
[化50]
s为1或2，
R4表示碳数1～6的烷基，
na和nb分别独立地为0或1，
R1a和R1b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
R2a和R2b分别独立地表示碳数1～6的亚烷基，
Ya和Yb分别独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
R3a和R3b分别独立地表示甾醇残基、脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基，
甾醇残基为胆甾烯基、胆甾烷基、豆甾烯基、β-谷甾烯基、羊毛甾烯基或麦角甾烯基，
脂溶性维生素为视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆甾醇、维生素D2、胆骨化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚或生育三烯酚，
该核酸复合体为含有RNA或其类似物的miRNA抑制复合体，该miRNA抑制复合体包含至少1个双链结构和miRNA结合序列，该miRNA结合序列的两条链分别与该双链结构的至少一端的两条链中的1条结合，该miRNA抑制复合体包含至少1个桥接核酸(BNA)。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，式(1)中，Xa和Xb独立地为X2。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中，式(1)中，Xa和Xb独立地为X3。
22.根据权利要求19～21中任一项所述的组合物，其中，式(1)中，R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基或碳数12～22的脂肪族烃基。
23.根据权利要求19～22中任一项所述的组合物，其中，式中，R3a和R3b独立地为脂溶性维生素衍生物残基。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述脂溶性维生素衍生物残基为具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应产物来源的残基。
25.根据权利要求19～24中任一项所述的组合物，其中，R3a和R3b独立地为碳数12～22的脂肪族烃基。
26.根据权利要求19～25中任一项所述的组合物，其中，所述BNA为BNANC(NMe)。
27.根据权利要求19～26中任一项所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含2个以上的所述双链结构，在该双链结构中的第一双链结构的一端的两条链上分别结合有各一条包含miRNA结合序列的链，该链的各另一端分别与该2个以上的双链结构中的第二双链结构的两条链结合，从而该链被该2个以上的双链结构夹住。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列。
29.根据权利要求27所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含以下所示的结构，
[化51]
(C)
该结构的I和II为双链结构，该结构的a和b中分别包含1个miRNA结合序列。
30.根据权利要求19～29中任一项所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含2个miRNA结合序列，一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUGUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)、且另一方的miRNA结合序列包含5'-CAGUAUU-3'(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
31.根据权利要求19～30中任一项所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含含有序列号1的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列和含有序列号2的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)的miRNA结合序列。
32.根据权利要求19～31中任一项所述的组合物，其中，所述miRNA抑制复合体包含序列号9的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)和序列号10的序列(序列中，尿嘧啶碱基根据需要为胸腺嘧啶碱基)。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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