JP6826984B2 - アシル−アミノ−ｌｎａオリゴヌクレオチドおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−ｌｎａオリゴヌクレオチド - Google Patents

アシル−アミノ−ｌｎａオリゴヌクレオチドおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−ｌｎａオリゴヌクレオチド Download PDF

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Description

本発明は、2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーまたはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドは、ギャップマーまたはミクスマーであり得る。オリゴヌクレオチドは、RNアーゼH媒介性の遺伝子サイレンシングなどによる標的RNAのダウンレギュレーション、またはRNAの調節のための、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用され得る。オリゴヌクレオチドは、タンパク質もしくはペプチド、または核酸以外の標的分子を標的とするアプタマーであり得る。また、本発明は、オリゴヌクレオチドを使用して細胞または生物における遺伝子サイレンシングを媒介する方法に関する。また、本発明は、オリゴヌクレオチドを使用して細胞または生物における遺伝子の機能を調べる方法に関する。さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子産物に対して薬剤が作用するか否かを評価する、方法に関する。加えて、本発明は、動物またはヒトの治療における使用のためのオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。
アンチセンス技術において、RNAは、相補的アンチセンスオリゴヌクレオチド（AON）のワトソン・クリック型ハイブリダイゼーションの標的である。特異的な方法で遺伝子発現を阻害するという目的は、mRNA成熟の防止、翻訳の妨害または、より一般的には標的RNA分解の誘導によって達成され得る[Crooke,S.T. Biochim.Biophys.Acta 1999、1489、31−44； Zamaratski,E.；Pradeepkumar,P.I.；Chattopadhyaya,J. J.Biochem.Biophys.Methods 2001、48、189−208]。有効となるためにはAONは、細胞内に進入できなければならず、ヌクレアーゼに対して安定でなくてはならず、無毒でなくてはならず、そして標的mRNAに対して高い結合親和性および特異性を示さなくてはならない。化学修飾AONの使用により、安定性および結合性に関してかなりの進歩が成し遂げられた。束縛されたNorth型（N型；C3'エンド型）フラノース環配座を有するヌクレオチド類縁体を導入することは、LNA（ロックド核酸）がその有名な例であるが、RNA標的に対する強固な結合を得ることに関して好結果を生むことが判明した。LNAモノマーは、フラノース環をN型配座でロックするO2'−C4'メチレン結合を含有し、例えばLNAヌクレオチドとDNAヌクレオチドとの混成物からなるAONの場合、相補的RNAに対するかつてない結合親和性をもたらす[Koshkin,A.A.；Singh,S.K.；Nielsen,P.；Rajwanshi,V.K.；Kumar,R.；Meldgaard,M.；Olsen,C.E.；Wengel,J. Tetrahedron 1998、54、3607−3630；Obika,S.；Nanbu,D.；Hari,Y.；Andoh,J.−i.；Morio,K.−i.；Doi,T.；Imanishi,T. Tetrahedron Lett.1998、39、5401−5404；Petersen,M.；Wengel,J.Trends Biotechnol.2003、21、74−81；Vester,B.；Wengel,J.Biochemistry 2004、43、13233−13241]。
AONの中へのLNAヌクレオチドの組み込みは、RNA相補体と共に形成された二本鎖のほぼ規範的なＡ型螺旋構造の形成を誘導し[Petersen,M.；Bondensgaard,K.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P. J.Am.Chem.Soc.2002、124、5974−5982；Nielsen,K.E.；Rasmussen,J.；Kumar,R.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P.；Petersen,M. Bioconjugate Chem.2004、15、449−457；Nielsen,C.B.；Singh,S.K.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P. J.Biomol.Struct.Dyn.1999、17、175−191；Nielsen,K.E.；Singh,S.K.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P. Bioconjugate Chem.2000、11、228−238]、したがってLNAは、RNAヌクレオチドの2'−OH基を欠くものの、RNAの構造模倣物として特徴付けられることができる。
反対に、その立体異性体であるα−L−LNAモノマーは、構造的にDNAを模倣したAONをもたらす配座でロックされており、それにより、DNA/α−L−LNAミクスマーとRNAとの間での二本鎖は中間的A/B二本鎖の幾何学配置を採る[Nielsen,K.；Petersen,M.；Hakansson,A.E.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P. Chem.Eur.J.2002、8、3001−3009；Petersen,M.；Hakansson,A.E.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P. J.Am.Chem.Soc.2001、123、7431−7432。意外なことに、LNAヌクレオチドおよびα−L−LNAヌクレオチドはいずれもAONの非常に高いRNA結合親和性を誘起し、1修飾あたり熱変性温度（Tm値）が約2〜8℃上昇する[Vester,B.；Wengel,J. Biochemistry 2004、43、13233−13241；Sorensen,M.D.；Kvaerno,L.；Bryld,T.；Hakansson,A.E.；Verbeure,B.；Gaubert,G.；Herdewijn,P.；Wengel,J. J.Am.Chem.Soc.2002、124、2164−2176]。LNA修飾オリゴヌクレオチドは、マイクロRNAを標的とすることに関して、つまり、いわゆるアンチミールとして、有望な特性を同様に示し、マイクロRNA122を標的とするあるLNAオリゴヌクレオチドは現在、HCV感染を処置する薬物として第2相試験が行われている[www.santaris.com]。さらに、LNA修飾オリゴヌクレオチドは、スプライシング調節化合物として[B.Bestasら、J.Clin.Investigation、2014、9、4067]、またマイクロRNA結合部位を標的とする一本鎖オリゴヌクレオチドであるいわゆるブロックミールとしても、有望性を示した[www.mirrx.dk]。
その他の数々のロックドヌクレオチド、すなわちLNAの類縁体、例えば、BNA、炭素環式LNA、およびCEtが治療用オリゴヌクレオチドとの関連で研究されてきた[Rahman,S.M.A.ら、Chem.Lett.2009、38、512][Zhou,C.およびChattopadhyaya,J.、Curr.Opin.Drug Disc.Devel.、2009、12、2180][Seth,P.P.およびSwayze,E.E.、Natural Products in Medicinal Chemistry、Hanessian,S編集、Wiley−VCH、Weinheim、第1版、2014、203−439]。
修飾オリゴヌクレオチドを含有するギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率性は、それらが遍在性RNアーゼH酵素による標的mRNAの分解を誘導する能力の欠如によって、制限されることが多い。
具体的には、RNアーゼHは、LNAヌクレオチドまたはO2'−アルキル化RNAヌクレオチドのようなN型ヌクレオチドがAON全体に亘って分散した基質二本鎖とは適合しない[Srensen,M.D.；Kvaerno,L.；Bryld,T.；Hakansson,A.E.；Verbeure,B.；Gaubert,G.；Herdewijn,P.；Wengel,J. J.Am.Chem.Soc.2002、124、2164−2176；Lima,W.F.；Nichols,J.G.；Wu,H.；Prakash,T.P.；Migawa,M.T.；Wyrzykiewicz,T.K.；Bhat,B.；Crooke,S.T. J.Biol.Chem.2004、279、36317−36326]。そのようなO2'−アルキル化RNAヌクレオチドとしては、例えば、2'−O−メチル−RNAヌクレオチドまたは2'−O−メトキシエチル−RNA（2'−MOE−RNA）ヌクレオチドを挙げることができる。
アプタマーは、本明細書において短い一本鎖オリゴヌクレオチドとして定義されるが、創薬のための代替オリゴヌクレオチド構築物である。
アプタマーは、例えばペプチド、タンパク質、小分子、ウイルスおよび生細胞を標的とすることが可能な、十分に定義された三次元形状を採る[Eckstein,F.、Expert Opin.Biol.Ther.2007、7、1021；Famulok,M.ら、Chem.Rev.2007、107、3715；Thiel,K.W.およびGiangrande,P.H.、Oligonucleotides 2009、19、209；Mayer,G. Angew.Chem.Int.Ed.2009、48,2672]。溶液中では、アプタマーの配列を一緒に構成しているヌクレオチドは、複雑な三次元形状への分子の折り畳みを誘起することとなる塩基対形成領域のセグメントを形成する潜在性を有し、それにより、アプタマーがその標的分子の表面に対して緊密に結合することを理想上可能にする。アプタマーが標的との結合性相互作用を形成するのを可能にするのは、アプタマーの配列に応じて多様な分子形状を形成するアプタマーの能力である。アプタマーは通常、SELEX（指数関数的富化によるリガンドの体系的進化）として知られるプロセスを用いるいわゆる試験管内進化によって所与の標的に対する特異的配列を進化させることにより生成される[Ellington,A.D.およびSzostak,J.W.、Nature 1990、346、818；Turk,C.およびGold,L.、Science 1990、249、5059]。SELEXは、核酸成分のプールから、つまり2つのプライマー結合領域を両隣に配した中央の（配列をランダム化した）可変領域を含む通常50〜100ヌクレオチド長の配列の広いライブラリから選択される結合アプタマーの、選択とポリメラーゼ触媒富化（PCR）との反復的な繰り返しを伴う。
アプタマーは、受容体または特定のシグナル伝達分子のような細胞外標的に対する進化を受けることができるため、多目的な薬物候補である。
また、それらは、細胞内成分に対して進化を受けることもでき、それにより、一旦細胞の中へ内在化されれば生体応答を媒介することができる。アプタマーは、前立腺癌細胞に抗癌siRNAを特異的に送達するために生体内での適用がなされた[Dassie,J.P.ら、Nature Biotechnology 2009、27、839]。アプタマーの細胞内適用は、それらが比較的大型であることとそれらのポリアニオン的な特徴とに起因して細胞内送達性が低いため、難問的課題である。もう一つの難問は生体内分布である、というのも、いくらかの非複合オリゴヌクレオチドは、静脈内投与するとすぐに腎臓によって速やかに排泄されるからである。PEG化（ポリ（エチレングリコール）のいわゆる複合化による化学的付着）および脂質ナノ粒子形成は、生体内分布を向上させるために適用された手法の例である[Veronese,F.M.ら、Drug Disc.Today 2005、10、1451]。
1つのアプタマーは薬物（ペガプタニブ；眼内に局所投与されて加齢性黄斑変性を処置するもの）として承認されており、その他のアプタマーは、種々の疾患に対する臨床開発の様々な段階にあるかまたはその段階にあった[Famulok,M.、J.Med.Chem. 2009、52、6951]。これらの治療用候補は一般に、完全なSELEX手順によって進化させたアプタマーのいわゆるSELEX後修飾によって得られた。SELEX後修飾は、典型的には、より短いアプタマー候補への切断、生体内分布向上のための複合化（例えばペグ化）、および／または生体内安定性向上のための化学修飾ヌクレオチドの組み込みを伴う。SELEX後修飾は必要である、というのも、幾分ごくわずかな修飾ヌクレオシド三リン酸、例えば、2'−フルオロ−RNA、2'−アミノ−RNAおよび5'−置換ピリミジンヌクレオシド三リン酸[Mayer,G.、Angew.Chem.Int.Ed. 2009、48、2672]のみが、効率的なSELEX手順に必要なポリメラーゼ触媒反応の基質となるからである。SELEX後修飾は通常、合成と、修飾が所望のアプタマー特性に適合していることを保証するための結合性試験／生物学的評価とを反復的に繰り返して実施される。
AS1411は、Gの豊富な26merのオリゴデオキシヌクレオチドである。大多数のアプタマーと同様に、そのヌクレオシド構成要素は天然型ホスホジエステル（PO）結合で結合し合っている、というのも、これらはSELEX手順との適合性が高いからである。AS1411は、安定な二量体型G四重鎖構造体として折り畳まれることが報告されている[Collie G.W.およびParkinson,G.N. Chem.Soc.Rev.2011、40、5867]。それは、ヒト癌細胞株において細胞死の誘導を引き起こすことができ、正常細胞に対して殆ど影響を与えず、またそれは、進行癌を有する患者での第I相および第II相の臨床試行において試験が行われた[Reyes−Reyes,E.M.ら、Cancer Res. 2010、70、8617]。その標的はヌクレオリンと特定されたが、その作用機序は完全には理解されていない。ヌクレオリン結合が癌細胞内へのAS−1411の選択的取り込みをもたらすと提唱されている。より最近の研究から、AS1411の作用におけるヌクレオリンの関与が確認され、AS1411の取り込みがマクロピノサイトーシスであるかもしれないことが示唆された[Reyes−Reyes,E.M.ら、Cancer Res.2010、70、8617]。
アシル−アミノ−LNAおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAのモノマーおよびオリゴマーのいくつかの誘導体および特性は、刊行された学術論文から既知である。アシル−アミノ−LNAおよびアルキルアミノLNA[I.K.AstakhovaおよびJ.Wengel、Acc.Chem.Res.、2014、47、1768]を含めたアミノLNA誘導体が最近公開された。対応するDNA/RNAオリゴヌクレオチドと比較した場合、アシル−アミノ−LNAオリゴヌクレオチドおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAオリゴヌクレオチドは、対応するLNAオリゴヌクレオチドで認められる向上した親和性と大いに一致して、相補的DNA/RNA鎖に対して概して向上した親和性を呈する。
グリシルアミノLNAモノマーおよびパルミトイルアミノLNAモノマーをLNAモノマーおよびDNAモノマーと混在させることができる[Johannsen,M.W.ら、Org.Biomol.Chem.、2011、9、243]。N2'−リンカーを介してアミノLNAモノマーに結合したピレンからなるヌクレオチドモノマーは、蛍光プローブとして有用であることが報告され、また、アシル基として様々なアミノ酸を含有するアシル−アミノ−LNA誘導体は、DNAヌクレオチドに適合する（同じ鎖またはオリゴヌクレオチドの中で混在できる）ことが示され、また、2'−アミノ−LNAモノマーおよび2'−N−メチル−アミノ−LNAモノマーは、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて有用であることが示された[I.K.AstakhovaおよびJ.Wengel、Acc.Chem.Res.、2014、47、1768、ならびにその中で引用されている参考文献を参照されたい]。
ピペラジノ修飾2'−アミノ−LNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは、高い二本鎖安定性および著しいヌクレアーゼ耐性を発揮することが報告された。
研究されたオリゴヌクレオチド（DNAとのミクスマー、ホスホジエステル（PO）結合）のヌクレアーゼ耐性は、ピペラジノ修飾2'−アミノ−LNAモノマーの代わりに親アミノLNAモノマーを含有する対応するオリゴヌクレオチドに比べて、いっそう有意に向上した[Lou,C.、Vester,B.およびWengel,J. Chem.Comm.2015.19、4024−4027]。そして、誘起された核酸分解安定性は、ピペラジノ修飾2'−アミノ−LNAモノマーから数DNAヌクレオチド離れたオリゴヌクレオチドの3'末端にまで及ぶことが示された。これらの結果は、本発明のオリゴヌクレオチドが全PO型オリゴヌクレオチドとしてさえも核酸分解に対する著しい安定性を呈することを実証している。
生体内でRNAを標的とするためにアシル−アミノ−LNA、例えばグリシル−またはパルミトイル−アミノLNA含有オリゴヌクレオチドを例えばアンチセンス、アンチミールもしくはブロックミールとの関連において、またはスプライシング事象を調節できる化合物として、使用することについて公開している報告はない。
本発明は、2つ以上のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドを治療または診断のためのRNA指向性構築物として使用することを開示する。本発明の構築物の例としては、ギャップマーアンチセンス構築物、ミクスマーアンチセンス構築物、アンチミール構築物、ブロックミール構築物およびアプタマー構築物が挙げられる。
2'−アミノ−LNA（「2'−NH」）モノマーおよび2'−N−メチル−アミノ−LNA（「2'−NCH3」）モノマーを唯一のアミノLNA型モノマーとして含有するギャップマーアンチセンス構築物、ミクスマーアンチセンス構築物、アンチミール構築物、ブロックミール構築物およびアプタマー構築物の使用は、本発明に含まれない。
本発明はさらに、2つ以上のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドを非RNA指向性構築物としての核酸アプタマーとして治療目的または診断目的で使用することを開示する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標準的な一本鎖RNA指向性オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオエートMOEオリゴヌクレオチドによって効果的に到達されない動物またはヒトの器官において、RNAの標的化を媒介するために使用することができる。
そのような効果が媒介されるのは、ヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーおよびアシル−アミノ−LNAモノマーにおいてアミノLNAモノマーのN2'位に広範なヒドロカルビル基およびアシル基を連結させてオリゴヌクレオチドに組み込むことができるからである。それにより、オリゴヌクレオチドの薬理動態特性の調節を実現することができる。例えば、疎水性アシル基またはヒドロカルビル（例えばアルキル）基は、細胞膜を横切る透過を容易にし、さらに、肝組織内での蓄積性の向上をもたらし得る。さらに、パルミトイルまたはミリストイルのような多くの脂肪酸残基は、本発明のオリゴヌクレオチドのアミノLNAモノマーのN2'位で結合している場合、血漿タンパク質、例えばアルブミンに対する結合を引き起こし、次いでそれは、血中での循環時間の向上ならびに組織での分布および取り込みの向上につながり得る。
mRNAまたは非コードRNAの標的化（例えば、miRNA標的化、スプライシング切り替えの調節、miRNA標的部位の封鎖、遺伝子サイレンシング、または遺伝子発現のアップレギュレーション）のために、ホスホジエステル系またはホスホロチオエート系のオリゴヌクレオチド、例えばギャップマーまたはミクスマーの血中での循環時間の向上ならびに組織での分布および取り込みの向上を達成するためには、そのような脂肪酸と複合化したアミノLNA修飾（例えば、パルミトイルアミノLNA残基）が2つ存在することは本発明において特に好ましい1つの構造である。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドのホスホジエステル変異形の場合、核酸分解に対する安定性は、例えばLNA−DNA−LNAギャップマーもしくはBNA−DNA−BNAギャップマーまたはLNA/DNAミクスマー、BNA/DNAミクスマー、LNA/2'−O−Me−RNAミクスマー、BNA/2'−O−Me−RNAミクスマーもしくはLNA/DNA/2'−OMe−RNAミクスマーとして構成される対応するオリゴヌクレオチドに比べて向上し、LNAまたはBNAモノマーのうちの2つを本発明のアシル−またはアミノ−LNAモノマーで交換した場合には特に向上する。
1つ以上の正電荷を有するアシル基またはヒドロカルビル（例えばアルキル）基は、細胞膜透過性および組織標的化に有益となる可能性がある。他の選択肢としては、例えば、ガラクトース単位のような炭水化物またはCPP（細胞貫通性ペプチド）と複合させることが挙げられる。
オリゴヌクレオチド中にアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが少なくとも2つ存在することによって、未修飾であるかまたはLNAを含有する基準オリゴヌクレオチドに比べてヌクレアーゼ安定性が向上する。RNA標的化能を妨げることなく様々な大きさの基を連結させることができるという事実は、所望の生体内安定性の設計、例えばヌクレアーゼによる分解に対する向上した安定性の設計を可能にする。
アンチセンス用途では、いわゆるギャップマーが使用されることが多い。
これらは、親和性増強修飾ヌクレオチド（例えば、LNAヌクレオチド、α−L−LNAヌクレオチドまたはO2'−アルキル化RNAヌクレオチド）を両隣に配して中央に連続的に広がるRNアーゼH採用性ヌクレオチド（典型的にはDNAヌクレオチドまたはホスホロチオエートDNAヌクレオチドであるが、その代替物は例えばホスホロチオエートFANAヌクレオチドである[Lok,C.N.；Viazovkina,E.；Min,K.L.；Nagy,E.；Wilds,C.J.；Damah,MJ.； Parniak,M.A.Biochemistry 2002、41、3457−3467]）を有する、キメラAONである[Jepsen,J.S.；Sorensen,M.D.；Wengel,J.Oligonucleotides 2004、14、130−146；Monia,B.P.；Lesnik,E.A.；Gonzalez,C.；Lima,W.F.；McGee,D.；Guinosso,C.J.；Kawasaki,A.M.；Cook,P.D.；Freier,S.M. J.Biol.Chem.1993、268、14514−14522； Kurreck,J.；Wyszko,E.； Gillen,C.；Erdmann,V.A. Nucleic Acids Res.2002、30、1911−1918；Frieden,M.；Christensen,S.M.；Mikkelsen,N.D.；Rosenbohm,C.；Thrue,C.A.；Westergaard,M.；Hansen,H.F.；Orum,H.；Koch,T. Nucleic Acids Res.2003、31、6365−6372]。ギャップの最適な大きさがモチーフ依存性であること、およびギャップの大きさと親和性との間で正しい均衡が要求されることが見出され[Kurreck,J.；Wyszko,E.；Gillen,C.；Erdmann,V.A. Nucleic Acids Res.2002、30、1911−1918]、また、1つまたは2つのDNA模倣型α−L−LNAモノマーがギャップ内に存在することはRNアーゼH活性に対して少なくとも部分的に適合性であると見出された[Srensen,M.D.；Kvaerno,L.；Bryld,T.；Hakansson,A.E.；Verbeure,B. ；Gaubert,G.；Herdewijn,P.；Wengel,J. J.Am.Chem.Soc.2002、124、2164−2176；Frieden,M.；Christensen,S.M.；Mikkelsen,N.D.；Rosenbohm,C.；Thrue,C.A.；Westergaard,M.；Hansen,H.F.；Orum,H.； Koch,T. Nucleic Acids Res.2003、31、6365−6372]。
アシル−およびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマーは、以前にDNA鎖の中に組み込まれたことがあり、それゆえ、自動化オリゴヌクレオチド合成のためのそれらのホスホロアミダイト構築ブロックを調製する手順、およびそれらをオリゴヌクレオチド（例えば、DNA、RNA、LNA、UNA（非ロックド核酸）または2'−OMe−RNAオリゴヌクレオチド）の中に組み込む手順については報告がなされている[I.K.AstakhovaおよびJ.Wengel、Acc.Chem.Res.、2014、47、1768ならびにその中で引用されている参考文献、特にJohannsen,M.W.ら、Org.Biomol.Chem.、2011、9、243を参照されたい]。
以下の構造的および機能的特徴はアンチセンス型オリゴヌクレオチド（例えばギャップマーまたはミクスマー）に最適であると、本発明者らは考える：
（a）比較的小型、すなわち合計20ヌクレオチド未満であること；
（b）ホスホジエステル（PO）であるかまたは過半数がPOであるヌクレオシド間結合をPSヌクレオシド間結合の代わりに含有していること；
（c）血清中での長い半減期；
（d）制限された腎臓（尿）による排泄；
（e）核酸分解に対する安定性；
（f）細胞膜を貫通しかつ、導入剤の添加またはナノ粒子製剤の使用なしで遺伝子発現の調節を媒介する能力。
a）の達成は、製造目的において好都合であり、そしてさらに、細胞膜透過および／または生体内分布に役立ち得る。LNA型ヌクレオチド（またはBNA型ヌクレオチド）の組み込みは、LNA（またはBNA）ヌクレオチドによって誘起される高いRNA標的親和性ゆえに、治療用オリゴヌクレオチドの長さを減少させる好ましい方法である[Obad,S.ら、Nature Genetics 2011、43、371−378]。LNA（またはBNA）ヌクレオチドの組み込みはまた、短い治療用アプタマーの開発を可能にし得る、というのも、LNA（またはBNA）ヌクレオチドの優れたハイブリダイゼーション特性は、短いアプタマー配列の場合でさえ分子内構造化を促進し得るからである。
b）の達成は、各PS（ホスホロチオエート）結合において発生するジアステレオ異性体混合物の形成を回避するために好都合である。
一例として、16merの全PS型の標準的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、異なる215（＝32.768）個の分子の混合物として存在し得[Wan,W.B.ら、Nucleic Acids Res.2014、42、13456−13468]、そのうちのいくつかは所望の治療作用に寄与し得るが、その他は例えば望ましくない影響を生じさせ得る。
PS結合を含有するオリゴヌクレオチドのいくつかの的外れな影響は、タンパク質に対する非特異的な結合および免疫関連の副作用に起因し得る[Jastrzebskaら Org.Biomol.Chem.2015、13、10032−10040およびその中で引用されている参考文献]。標準的PSオリゴヌクレオチドのこれらの難問は、Pを立体的に画定したPSオリゴヌクレオチドの合成についての研究を促したが、そのような化合物の調製は、煩雑な合成方法の使用および開発を要し、改良された治療用誘導体を提供しなかった[Wan,W.B.ら、Nucleic Acids Res.2014、42、13456−13468； Jastrzebskaら Org.Biomol.Chem.2015、13、10032−10040]。優先的または排他的にPO結合を含有する治療用オリゴヌクレオチドは、的外れな影響をより少なく示すであろうことから、望ましいものであると考えられる。
c）、d）およびe）の達成は、オリゴヌクレオチド創薬に必要な薬理動態特性を獲得するために望ましい。
これらの3点を達成すべく、PS結合は、血漿タンパク質への結合、それゆえ腎臓による排泄の低減、さらにはヌクレアーゼによる分解に対する保護を達成するために、典型的に使用された。しかしながら、なおも腎臓による著しい量の望まれない急速な排泄が認められる。代わりに、血漿タンパク質への結合を媒介するために脂質誘導体、最も典型的にはコレステリル誘導体が適用された。これは特に、siRNA（二本鎖RNA）構築物に関して研究されてきたが[Wolfrum,C.ら、Nature Biotech.2007、25、1149−1157； Howard,K.A.、Bienk,K.およびKragh−Hansen,U. WO2014/005596]、薬物として承認されたsiRNAまたは一本鎖オリゴヌクレオチドの脂質誘導体は未だに全くなく、難問が多い[Wittrup,A.およびLieberman,J.、Nature Rev.Gen.2015、16、543−552]。興味深いことに、一重または二重にコレステリル修飾されたsiRNAでは、導入剤とアルブミンとを使用して有望な遺伝子サイレンシング活性が報告されたが、注目すべきことに、対応するC12〜C16脂肪酸官能基化siRNAでは報告されなかった[Wolfrum,C.ら、Nature Biotech.2007、25、1149−1157； Howard,K.A.、Bienk,K.およびKragh−Hansen,U. WO2014/005596]。
アプタマーの場合、c）およびd）の達成は、典型的にはPEG（ポリエチレングリコール）単位との複合化によって達成された[Hirota,M.ら、Nucleic Acids Ther.2016、26、10−19]。これはしかし、好ましくない解決策である。第1に、PEGとの複合化は、最終的薬物成分を獲得する上でのさらなる複雑化要因となり、第2に、PEG単位に対する免疫反応およびPEG化された系の急速なクリアランスが報告されている[Yang,Q.およびLai,S.K.、Advanced Review 2015、7、655−677]。
オリゴヌクレオチドの効率的ないわゆる裸状送達（すなわち、導入剤を使用しない非支援型送達）およびそれに付随する遺伝子調節活性は、生体内での活性と特に良好に相関していることが報告されており、それゆえ、細胞内へのそのような効率的な非支援型透過はオリゴヌクレオチド創薬に極めて重要であると現在考えられている。
効率的な非支援型送達は、親和性の高いLNA型アンチセンスギャップマー[Stein,C.A.ら、Nucleic Acids Res.2010、38、e3； Zhang,Y.ら Gene Therapy 2011、18、326−333]および親和性の比較的高い2'−FANAオリゴヌクレオチド[Souleimanian,N.ら、Mol.Ther.Nucleic Acids 2012、1、e43]について実証された。したがって、f）の達成は、高親和性モノマーを含有するオリゴヌクレオチドを使用することによって達成されたが、注目すべきことにそれはPS結合との関連においてのみ達成された。遺伝子発現の阻害に関して得られたIC50値は低マイクロモル範囲であり、導入剤を使用する場合にしばしば得られるナノモル範囲よりも著しく高かったと言わねばならない。さらに、標準的な全PO型オリゴヌクレオチドは非支援型送達条件下では活性または取り込みを呈することに失敗したということに留意すべきである。
これまでに文献で報告されている一本鎖オリゴヌクレオチドに基づくと、上に列挙および記述した6つの所望点a）〜f）全てを達成した構築物は全くない。
報告されているデータに基づくいくつかの要点を以下にまとめる：
1）全PS型オリゴヌクレオチドは、全PO型オリゴヌクレオチドに比べて向上した薬理動態特性を呈するが、それらの治療上の使用は、的外れな望ましくない影響および比較的高速な腎クリアランスによって阻まれる；
2）siRNA構築物の二重コレステリル官能基化は、導入／透過を補助する分子を使用して試験管内での効率的な遺伝子サイレンシングに適合することが示されたが、同様の条件下での同siRNAの二重パルミトイル官能基化は、効率的な遺伝子サイレンシングを実証できなかった；
3）コレステリルおよびパルミトイルで官能基化されたsiRNAについて、向上した循環半減期、すなわち低減された腎クリアランス速度が報告された；
4）エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する一本鎖オリゴヌクレオチドの安定性は通常、鎖内の殆どのヌクレオチド位置において、またはPS結合を使用する場合実質的に全ての結合位置において、化学修飾ヌクレオチドの使用を必要とする。
5）RNAヌクレオチドおよびPO結合を30〜40％より多く含有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、通常は核酸分解に対して不安定である。
6）非支援型送達条件下での効率的な細胞取り込みおよび遺伝子サイレンシング活性は、PS結合を殆どの結合位置において有する一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を必要とする。
本発明の目的は、真核細胞、または生物、例えば動物もしくはヒトの細胞において、たとえ導入剤を使用せずとも高い導入効率を有する、一本鎖オリゴヌクレオチドを提供することである。
本発明の目的は、哺乳動物などの動物の血清中での長い半減期を有するオリゴヌクレオチドを提供することである。
本発明の目的は、RNA標的配列と結合した場合にRNアーゼH型酵素の効率的な基質となる、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
本発明の別の目的は、RNアーゼHの基質となることなく標的RNAと強固に結合してそれによって遺伝子発現の調節をもたらす、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
標的RNAは、mRNAまたは非コードRNAとすることができる。
本発明の別の目的は、細胞培養物中または生体内での酵素的分解に対する安定性に関して向上した特性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、2つ以上のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを含有していない対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて、向上した生物学的利用能、増加した組織内分布、さもなければ向上した特性、例えば生体内での向上した遺伝子サイレンシング効果を呈する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。
驚いたことに、本発明者らは、2つ以上のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有する本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドが、上に列挙した所望点a）〜f）全てを達成することを発見した。本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、下記を呈する：
7）それらは、アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが媒介するLNA型高親和性ハイブリダイゼーションゆえに、比較的短い鎖として効率的である；
8）それらは、全PS型誘導体としてだけでなく、全PO型（つまり、全ての結合または殆どの結合にPOを有する）オリゴヌクレオチドとしてさえ、非支援型送達条件下で効率的に細胞に取り込まれて遺伝子調節活性を呈する：
9）それらは、アシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを有さない対応する全PS型オリゴヌクレオチドと比べた場合でさえ、全PO型誘導体および全PS型誘導体として血清中での向上した半減期を呈する；
10）それらは、アシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを有さない対応する全PS型オリゴヌクレオチドと比べた場合でさえ、全PO型誘導体および全PS型誘導体として腎臓での低い蓄積性を示す；
11）それらは、その相当な血清半減期によっても証明される、核酸分解に対する十分な安定性を示す；
12）それらは、全PO型誘導体および全PS型誘導体のどちらとしても、導入剤の添加またはナノ粒子製剤の使用を必要とせずに細胞膜を貫通して遺伝子発現の調節を媒介する能力を呈する。
本発明は、とりわけ、下記項目1）〜46）を提供する：
1）2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーまたはアルキルアミノLNAヌクレオチドモノマーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、他のヌクレオチドモノマーをDNAヌクレオチドモノマー、RNAヌクレオチドモノマーまたは化学修飾ヌクレオチドモノマーとすることができ、
オリゴヌクレオチドのモノマーが、ホスホジエステル結合および／またはホスホロチオエート結合および／またはホスホトリエステル結合で結合しており、
アシル−アミノ−LNAモノマーおよびアルキルアミノLNAモノマーのアシル基およびアルキル基が場合によって置換されており、したがって場合によって1つ以上のヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、アルキルチオ基、エーテル基および／またはチオール（メルカプト）基を含有し、そして、
アシル−アミノ−LNAモノマーおよびアルキルアミノLNAモノマーのアシル基およびアルキル基が、直鎖もしくは分岐鎖、環状、または両者の組み合わせであり、但し、アシル基およびアルキル基の各々において炭素原子の総数が30未満であることを条件とする、一本鎖オリゴヌクレオチド。
2）2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーまたはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、他のヌクレオチドモノマーをDNAヌクレオチドモノマー、RNAヌクレオチドモノマーまたは化学修飾ヌクレオチドモノマーとすることができ；
オリゴヌクレオチドのモノマーが、ホスホジエステル結合および／またはホスホロチオエート結合および／またはホスホトリエステル結合で結合しており、
アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのアシル基およびヒドロカルビル基が場合によって置換されており、したがって場合によって1つ以上のヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、アルキルチオ基、エーテル基および／またはチオール（メルカプト）基を含有し、そして、
アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのアシル基およびヒドロカルビル基が、直鎖もしくは分岐鎖、環状、または両者の組み合わせであり、但し、アシル基およびヒドロカルビル基の各々において炭素原子の総数が30未満であることを条件とする、一本鎖オリゴヌクレオチド。
3）上記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％がホスホジエステル結合である、上記項目1または2に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
4）上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマー部分のうちの40％以下、好ましくは30％以下、より好ましくは20％以下、最も好ましくは10％以下がリボヌクレオチドモノマー部分である、上記項目1〜3に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
5）上記ヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーが、アルキルアミノLNAヌクレオチドモノマーである、上記項目1〜4のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
6）上記オリゴヌクレオチドが、少なくとも2つのN−アシル−アミノLNAヌクレオチドモノマーまたは、少なくとも2つのN−ヒドロカルビル−アミノLNAヌクレオチドモノマーまたは、少なくとも1つのN−アシル−アミノLNAヌクレオチドモノマーおよび少なくとも1つのN−ヒドロカルビル−アミノLNAヌクレオチドモノマーを含有する、上記項目1〜5のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
7）上記オリゴヌクレオチドが、コレステリル部分と結合した1つまたは2つのヌクレオチドモノマー単位（部分）を含有する、上記項目1〜6のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
8）上記アシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマー単位のアシル部分が、N−アルカノイル部分、N−アルケニオル部分および／またはN−アルキノイル部分であり、各々が、4〜30個の炭素原子、好ましくは7〜22個の炭素原子、より好ましくは10〜22個の炭素原子を有し、上記アシル部分が、非置換であるかまたは、ヒドロキシ基、C1〜C6アルコキシ基、アミノ基、C1〜C6モノもしくはジアルキルアミノ基、オキソ基、チオール基およびC1〜C6アルキルチオ基から選択される1つ以上の基で置換されている、上記項目1〜7のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
9）上記オリゴヌクレオチドが、少なくとも7個のヌクレオチドモノマー単位、好ましくは少なくとも8個のヌクレオチドモノマー単位、より好ましくは少なくとも11個のヌクレオチドモノマー単位、よりいっそう好ましくは少なくとも12個のヌクレオチドモノマー単位を含む、上記項目1、2、3、4、5、6、7または8のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
10）上記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドモノマー単位がホスホジエステル結合で結合している、上記項目1〜9のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
11）ギャップマー、アプタマーまたはミクスマーである、上記項目1〜10のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
12）上記オリゴヌクレオチドが、5'末端から3'末端まで、3つのセグメント：少なくとも2ヌクレオチド単位の5'末端セグメントと、少なくとも6ヌクレオチド単位の長さの中央結合セグメントと、少なくとも2ヌクレオチド単位の長さの3'末端セグメントとを有し、そして、
上記オリゴヌクレオチドが、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーもしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを、5'末端セグメントもしくは3'末端セグメントのどちらかの中には含有するがしかし中央セグメント中には全く含有しないか；または、少なくとも1つのN−アシル−アミノLNAヌクレオチドモノマーもしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを、上記末端セグメントの各々の中には含有するがしかし中央セグメント中には全く含有しない、上記項目1〜11のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
13）上記オリゴヌクレオチドが、下記構成：
NV−MY−NZ
を有するギャップマーである、上記項目1〜11のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、Mは、標的RNAのRNアーゼH分解に適合するヌクレオチドモノマーを表し、Nは、親和性増強ヌクレオチドモノマー、アシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーならびにDNAヌクレオチドモノマーのうちから選択されるモノマーを表し、V、YおよびZはセグメント中のモノマーの数を示し、ハイフンは、2つのウィング配列セグメントNVおよびNZとギャップ配列セグメントMYとの間の分離を示し；V+Z+Yの合計が最大で30であるという条件の下に、数VおよびZを2〜8の間で変化させてもよく、かつ数Yを6〜14の間で変化させてもよく、但し、
少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが、ウィングセグメントすなわちNモノマーからなるセグメントの各々の中に存在すること；または
少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが、ウィングセグメントすなわちNモノマーからなるセグメントのうちの一方の中に存在すること
が条件である。
14）オリゴヌクレオチドが下記構成5'−（L）2〜4−（D）6〜10−（L）2〜4を有する、上記項目13に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、DはDNAヌクレオチドモノマーを表し、Lは、親和性増強ヌクレオチドモノマーまたは、アシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを表し、但し、
少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが、ウィングセグメントすなわちLモノマーからなるセグメントの各々の中に存在すること；または
少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが、ウィングセグメントすなわちLモノマーからなるセグメントのうちの一方の中に存在すること
を条件とする。
15）RNアーゼHを媒介とするアンチセンスRNA標的化によって遺伝子調節を媒介することができる、上記項目1〜14のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
16）オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが2つの半配列セグメントのどちらにも含まれないという条件の下に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが半配列セグメントのうちの一方、すなわちオリゴヌクレオチド配列の5'末端半分またはオリゴヌクレオチド配列の3'末端半分の中に存在するか；または、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数であるならば上記少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのうちの1つを場合によって中心ヌクレオチドモノマーとすることができる、上記項目1〜11のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
17）構成5'−（N）7〜26を有する一本鎖ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチド。
式中、Nは、少なくとも1つの親和性増強モノマーを表し、加えて他のタイプのヌクレオチドモノマーを表してもよく、但し、少なくとも2つのNヌクレオチドがアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーであることを条件とし、かつ、
各配列要素、すなわちオリゴヌクレオチド配列の5'末端半分およびオリゴヌクレオチド配列の3'末端半分の各々が、少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを含有すること、または
ヌクレオチドの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが2つの配列要素のどちらにも含まれないという条件の下に、
少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方、すなわちオリゴヌクレオチド配列の5'末端半分もしくはヌクレオチド配列の3'末端半分の中に存在すること、または
該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数であるならば該少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのうちの1つを場合によって中心ヌクレオチドモノマーとしてもよいこと
を条件とし、そして、
オリゴヌクレオチドのモノマーが、ホスホジエステル結合および／またはホスホロチオエート結合および／またはホスホトリエステル結合で結合しており、
アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが、場合によって置換されており、したがって1つ以上のヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、アルキルチオ基、エーテル基またはチオール（メルカプト）基を含有し、そして、
アシル−アミノ−LNAモノマーおよび該ヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのアシル基およびヒドロカルビル基を、直鎖もしくは分岐鎖、環状、または両者の組み合わせとすることができ、但し、アシル基およびヒドロカルビル基の各々において炭素原子の総数が30未満であることを条件とする。
18）上記オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオシド間結合の少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％がホスホジエステル結合である、項目17に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
19）上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマーの40％以下、好ましくは30％以下、より好ましくは20％以下、最も好ましくは10％以下がリボヌクレオチドモノマーである、項目17または18に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
20）構成が5'−（N）7〜12である、上記項目17〜19のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、Nは、上記配列要素の各々が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを含有するように、親和性増強ヌクレオチドならびに、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを表す。
21）構成が5'−（N）12〜22である、上記項目17〜19のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、Nは、上記配列要素の各々が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビルLNAモノマーを含有するように、少なくとも4つのLNA型親和性増強モノマー、数々のDNAモノマーまたは2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを表す。
22）構成が5'−（N）15〜22である、上記項目17〜19のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、Nは、上記配列要素の各々が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビルLNAモノマーを含有するように、少なくとも3つのLNA型親和性増強モノマー、1つ以上の2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを表す。
23）構成が5'−（N）7〜12である、上記項目17〜19のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、Nは、ヌクレオチドの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが2つの配列要素のどちらにも含まれないという条件の下に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方、すなわち配列の5'末端半分もしくは配列の3'末端半分の中に存在するように；または、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数であるならば上記少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのうちの1つが場合によって中心ヌクレオチドモノマーとなり得るように、親和性増強ヌクレオチド、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを構成する。
24）構成が5'−（N）12〜22である、上記項目17〜19のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、Nは、ヌクレオチドの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが2つの配列要素のどちらにも含まれないという条件の下に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方、すなわち配列の5'末端半分もしくは配列の3'末端半分の中に存在するように；または、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数であるならば上記少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのうちの1つが場合によって中心ヌクレオチドモノマーとなり得るように、少なくとも4つのLNA型親和性増強モノマー、数々のDNAモノマーまたは2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを表す。
25）構成が5'−（N）15〜22である、上記項目17〜19のいずれか1項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
式中、Nは、ヌクレオチドの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが2つの配列要素のどちらにも含まれないという条件の下に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方、すなわち配列の5'末端半分もしくは配列の3'末端の中に存在するように；または、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数であるならば上記少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのうちの1つが場合によって中心ヌクレオチドモノマーとなることができるように、少なくとも3つのLNA型親和性増強モノマー、数々の2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを表す。
26）上記細胞または生物を、上記項目1〜25のいずれかに定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、細胞または生物において遺伝子サイレンシングを媒介する方法。
27）上記方法が生体内または単離細胞において実施されるか；または上記方法が、哺乳動物において（例えば完全動物、またはヒトにおいて）生体内で、例えば上記哺乳動物に上記オリゴヌクレオチドを投与することによって実施される、項目26に記載の方法。
28）上記オリゴヌクレオチドが、好ましくはRNアーゼHを媒介として、標的遺伝子または標的RNAのサイレンシングを媒介するために、上記細胞または生物において発現される標的遺伝子または標的RNAに対して相補性を有する、項目26に記載の方法。
29）動物またはヒトの治療における使用のための、上記項目1〜25のいずれか1項に定義されるnオリゴヌクレオチド。
30）上記オリゴヌクレオチドが、好ましくはRNアーゼHを媒介して、標的遺伝子または標的RNAのサイレンシングを媒介するために、標的遺伝子または標的RNAに対する相補性を有する、項目29に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
31）細胞または生物の遺伝子の機能を検査する方法であって、
遺伝子サイレンシングのためにRNAを標的とする上記項目1〜25のいずれかに定義されるオリゴヌクレオチドを細胞または生物の中へ導入し、それによって試験細胞または試験生物を作製することと；
遺伝子サイレンシングが起こる条件下で試験細胞または試験生物を維持し、それによって遺伝子のRNAレベルが低下した試験細胞または試験生物を作製することと；
作製された試験細胞または生物の表現型を観察し、場合により、観察された表現型を適切な対照細胞または対照生物の表現型と比較し、それによって遺伝子の機能に関する情報を提供することと
を含む、方法。
32）遺伝子産物が治療介入のための適切な標的であるか否か、を判定するために用いられる、項目31に記載の方法。
33）上記方法が生体内または単離細胞において実施される、上記項目31または32に記載の方法。
34）上記方法が完全動物またはヒトにおいて生体内で実施される、項目31および32に記載の方法。
35）遺伝子産物に対して薬剤が作用するか否かを評価する方法であって、下記ステップ：
遺伝子サイレンシングを媒介するために、RNAを標的とする上記項目1〜25のいずれかに定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞または生物の中へ導入し、それによって試験細胞または試験生物を作製するステップと、
遺伝子サイレンシングが起こる条件下で試験細胞または試験生物を維持し、それによって遺伝子のRNAレベルが低下した試験細胞または試験生物を作製するステップと、
薬剤を試験細胞または試験生物の中へ導入するステップと、
試験細胞または生物の表現型を観察し、場合により、観察された表現型を対照細胞または対照生物の表現型と比較し、それによって、遺伝子産物に対して薬剤が作用するか否かについての情報を提供するステップと
を含む、方法。
36）上記方法が生体内または単離細胞において実施される、項目35に記載の方法。
37）上記方法が完全動物またはヒトにおいて生体内で実施される、項目35に記載の方法。
38）上記項目1〜25のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは補助薬とを含む医薬組成物。
39）医薬として使用するため、または治療によってヒトまたは動物の体を処置する方法において使用するための、上記項目1〜25のいずれかのオリゴヌクレオチド。
40）ヒトまたは動物の体に対して実践される診断方法において使用するための、上記項目1〜25のいずれかのオリゴヌクレオチド。
41）疾患予測に使用するための、上記項目1〜25のいずれかのオリゴヌクレオチド。
42）研究用途のための、上記項目1〜25のいずれかのオリゴヌクレオチド。
43）2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーが、グリシルアミノLNAモノマー、パルミトイルアミノLNAモノマー、ミリストイルアミノLNAモノマーおよびアセチルアミノLNAモノマーのうちから選択される、上記項目1〜25のいずれか1項のオリゴヌクレオチド。
44）2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーが、（1つ以上の）パルミトイルアミノLNAモノマー、（1つ以上の）ミリストイルアミノLNAモノマーまたは、別の脂肪酸アシル基でN−アシル化されたアミノLNAモノマーであり、上記脂肪酸アシル基が、好ましくは飽和脂肪酸の脂肪酸アシル基でありかつ／または好ましくは10〜18個の炭素原子を含む、上記項目1〜25のいずれか1項のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
45）オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの3'末端および／または5'末端に連結された1つ以上の複合基を含有する、項目1〜44のいずれかのオリゴヌクレオチド。
46）上記項目1〜25のいずれか1項のオリゴヌクレオチドを含有する試薬。
本発明者らは、驚くべきことに、2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマー単位またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドモノマー単位を有する本発明のオリゴヌクレオチドが、たとえ導入剤を全く使用していない場合（細胞内への非支援型送達）であっても真核細胞に対して高い導入効率を呈し、ヌクレアーゼ媒介性の生分解に対する高い安定性を示し、アルブミンに結合し、血清中で長い半減期を示し、生物学的活性を示すことにより、例えば一本鎖オリゴヌクレオチド療法として有用であることを見出した。非経口投与後に血清半減期は高く、生物学的利用能も高い。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば治療および診断、特に生体内での診断のために非常に有用である。
図1は、実施例4においてアルブミン結合性を評価したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）の概略図である。 図2の第2−1部は、パルミトイルアミノLNA修飾を1つ（ON7452；左）および2つ（ODN7453；右）有するODN、またはパルミトイルアミノLNA修飾を有さない対照としてのODN（ON7451）を使用してSYBR金染色によって可視化したアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである（実施例4参考）。ここでのODNは、ホスホジエステルのヌクレオシド間結合を有する。上部の矢印は、アルブミンがゲル中でどこを走行しているかを示しており；可視バンドは、（アルブミンに結合した）染色されたODNに由来するものであり、他方、より弱く染色されたバンドは未結合ODNである。最上部のバンド（アルブミン多量体）は、（またも、染色されたODNによって可視化された）ODNと2つ以上のアルブミンとが会合したものであると考えられる。 図2の第2−2部は、パルミトイルアミノLNA修飾を1つ（ON7455；左）および2つ（ODN7456；右）有するODN、またはパルミトイルアミノLNA修飾を有さない対照としてのODN（ON7454）を使用してSYBR金染色によって可視化したアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）である。ここでのODNは、ホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を有する。上部の矢印は、アルブミンがゲル中でどこを走行しているかを示しており；可視バンドは、（アルブミンに結合した）染色されたODNに由来するものであり、他方、より弱く染色されたバンドは未結合ODNである。 図2の第2−3部は、ホスホジエステル結合を有するODN（ON7451；左）およびホスホロチオエート結合を有するODN（ON7454；右）についてのアルブミン/ODN複合体のアニーリングのSYBR金染色により可視化したPAGEである。 図3は、実施例5で使用した参照番号の振られた修飾ODNの図解である。 図4は、実施例5のアルブミン対ODN比の力価測定によるアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。PO−ODN（NAC7451）についての結果を左側、PS−ODN（NAC7454）についての結果を右側に示す。 図5は、実施例5のアルブミン対ODN比の力価測定によるアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。PO−ODN（NAC7452）についての結果を左側、PS−ODN（NAC7455）についての結果を右側に示す。 図6は、実施例5のアルブミン対ODN比の力価測定によるアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。PO−ODN（NAC7453）についての結果を左側、PS−ODN（NAC7456）についての結果を右側に示す。 図7は、実施例5のアルブミン対ODN比の力価測定によるアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。PO−ODN（NAC7714）についての結果を左側、PS−ODN（NAC7715）についての結果を右側に示す。 図8は、実施例5のアルブミン対ODN比の力価測定によるアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。PO−ODN（NAC7716）についての結果を左側、PS−ODN（NAC7718）についての結果を右側に示す。 図9は、実施例5のアルブミン対ODN比の力価測定によるアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。PO−ODN（NAC7717）についての結果を左側、PS−ODN（NAC7719）についての結果を右側に示す。 図10は、実施例8の（左）PO結合または（右）PS結合を有しかつパルミトイル化アミノLNA修飾を有さないODNを使用したアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。ODNは、SYBR金染色によって可視化される。上：様々な濃度のアルブミンで力価測定した蛍光2xパルミトイルODN。下：様々な濃度のアルブミンで力価測定した非蛍光2xパルミトイルODN（以前のデータ；図4参照）。 図11は、実施例8の（左）PO結合または（右）PS結合を有しかつパルミトイル化アミノLNA修飾を有さない3'二重パルミトイル化ODNを使用したアルブミン/ODN複合体のアニーリングのPAGEである。ODNは、SYBR金染色によって可視化される。上：様々な濃度のアルブミンで力価測定した蛍光2xパルミトイルODN。下：アルブミンで力価測定した非蛍光2xパルミトイルODN（以前のデータ；図7参照）。 図12は、実施例7の所与の時点におけるCy5.5蛍光ODN構築物の血漿中レベルである。Living Image（Perkin Elmer）を使用して蛍光を定量し、その量を1分後のレベルに正規化した。右上隅の挿入図は、最初の4時間の拡大図である。実験の時間表は上部に示されている。 図13は、実施例7で使用した参照番号の振られた修飾ODNの図解である。 図14は、注射から24時間後にIVISスキャナで走査したマウス由来の器官である（実施例7）。器官は上から下に：心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓である。PSに関しては左から2番目のマウスがPBS対照であり、PO、PS 2xpalおよびPO 2xpalに関しては左のマウスがPBS対照である。全ての画像を別々に取得し、グループとして読み込み、Living Scaleソフトウェア（Perkin Elmer）を使用して同じ倍率に正規化した。 図15は、注射から24時間後にIVISスキャナで走査した単離器官からの蛍光の定量である。蛍光強度は、PS腎臓からの信号に対して正規化し、標準偏差（N=5）と共に平均値として表した。 図16は、軟骨細胞における非支援型取り込み後の共焦点顕微鏡写真およびフローサイトメトリー結果である（実施例8）。
本発明は、2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーまたはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、他のヌクレオチドモノマーをDNAヌクレオチドモノマー、RNAヌクレオチドモノマーまたは化学修飾ヌクレオチドモノマーとすることができ；オリゴヌクレオチドのモノマーが、ホスホジエステル結合（本明細書では「PO」とも呼ぶ）および／またはホスホロチオエート結合（本明細書では「PS」とも呼ぶ）および／またはホスホトリエステル結合で結合しており；アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのアシル基およびヒドロカルビル基が場合によって置換されており、したがって場合によって1つ以上のヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、アルキルチオ基、エーテル基および／またはチオール（メルカプト）基を含有し；そして、
アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーのアシル基およびヒドロカルビル（例えばアルキル）基が、直鎖もしくは分岐鎖、環状、または両者の組み合わせであり、但し、アシル基およびヒドロカルビル基の各々において炭素原子の総数が30未満であることを条件とする、一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも10個のヌクレオチドモノマー単位、好ましくは少なくとも11個のヌクレオチドモノマー単位、より好ましくは12個以下のモノマー単位を含む。オリゴヌクレオチドは、10〜30個のモノマー単位、好ましくは11〜30個のモノマー単位、より好ましくは12〜26個のモノマー単位、さらにいっそう好ましくは14〜24個のモノマー単位、さらにいっそう好ましくは14〜20個のモノマー単位で構成され得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、12〜16個のヌクレオチドモノマー単位を有する。ヌクレオチドモノマー単位が結合してオリゴヌクレオチドを形成しているため、「ヌクレオチドモノマー単位」または簡潔には「モノマー単位」という用語は、ヌクレオチドモノマーが、孤立した分子ではなく、オリゴヌクレオチド中で1つまたは2つの他のヌクレオチドモノマー単位と結合した化学物質部分である、ということを指し示す。オリゴヌクレオチドとの関連において用語「モノマー」は、モノマー単位またはモノマー部分を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では「オリゴ」と略記され得る。略語「ODN」および「AON」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。
本発明のオリゴでは、オリゴヌクレオチドのモノマーが、ホスホジエステル結合および／またはホスホロチオエート結合および／またはホスホトリエステル結合で結合している。所与のオリゴヌクレオチドは、これらの結合のうちの1種類のみ、これらのうちの2種類、または3種類全ての結合を有し得る。好ましい実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチド中で、ヌクレオシド間結合の少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％が、ホスホジエステル結合（PO）であり、残りのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合および／またはホスホトリエステル結合であり得る。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は、全PO型（全ホスホジエステル型）である。全PS型（全ホスホロチオエート型）のヌクレオシド間結合、またはPOとPSとが混在するヌクレオシド間結合を有する実施形態もある。これらの種類の結合ならびにこれらの結合を有するオリゴの自動合成方法は、一般知識から当業者に既知である。
ヌクレオチドモノマー単位の核酸塩基（簡潔には「塩基」）は、本発明のオリゴにおいて特に限定されない。それらは、標準的な核酸塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルであってもよく、またはそれらの任意の誘導体もしくは任意の化学修飾核酸塩基であってもよく、特に好ましい例は5−メチルシトシンおよび5−置換ウラシルである。
本発明のオリゴは、2つ以上のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーまたはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを有する。アシル−アミノ−LNAまたはヒドロカルビル−アミノ−LNAは、2'−アミノ−LNA部分を有する、つまり、LNAの2'−酸素原子を、アシル化またはヒドロカルビル化（例えばアルキル化）された2'−窒素原子で置き換えた、ヌクレオチドモノマー単位である。アミノLNAは、先行技術において既知であり、例えば、I.K.AstakhovaおよびJ.Wengel、Acc.Chem.Res.、2014、47、1768の総説を参照されたい。したがって、アシル−アミノ−LNAは2'−N−アシル−2'−アミノ−LNAであり、ヒドロカルビル−アミノ−LNAは2'−N−ヒドロカルビル−2'−アミノ−LNAである。アシル−アミノ−LNAまたはヒドロカルビル−アミノ−LNAの核酸塩基は、特に限定されず、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルであってもよく、またはそれらの任意の誘導体もしくは任意の化学修飾核酸塩基であってもよい。2'−アミノ−LNAヌクレオシドの調製を簡単にするために、2'−アミノ−LNA部分の塩基は、チミンまたは5−メチルシトシンであり得る。
本発明のオリゴ中のその他のヌクレオチドモノマー単位は、それらのリボース部分またはその誘導体に関して、特に制約されない。それらはDNAもしくはRNAであってもよく、または化学修飾リボース誘導体を有してもよい。したがって、それらは、DNA、RNA、LNA、BNA、UNA、2'−アミノ−LNA、α−L−LNA、2'−F−RNA、2'−O−アルキル−RNAおよび／または2'−O−アルコキシアルキル−RNAのモノマー単位、またはそれらの混合物であり得る。2'−O−アルキル−RNAモノマーは、2'−O−C1〜C26−アルキル−RNAモノマー単位であり得る。2'−O−アルキルオキシアルキル−RNAモノマー単位は、2'−O−C1〜C6−アルキルオキシ−C1〜C26−アルキル−RNAモノマー単位、例えば2'−O−メトキシエチル−RNA単位であり得る。BNAは、炭素環式LNAおよびCEt[Rahman,S.M.Aら、Chem.Lett.2009、38、512] [Zhou,C.およびChattopadhyaya,J.、Curr.Opin.Drug Disc.Devel.、2009、12、2180]を含めて、C2'原子とC4'原子との間にリンカーを有する数々のロックドヌクレオチドを包含し、UNAは、リボース単位を非環式単位、好ましくは2',3'−seco−RNA単位で置き換えたヌクレオチドの部類である[Langkjaer,N.、Pasternak,A.およびWengel,J.、Bioorg.Med.Chem.2009、17、5420−5]。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドでは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマーの30％以下がリボヌクレオチドモノマー（RNA）であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマーの20％以下、より好ましくは10％以下、さらにいっそう好ましくは5％以下が、リボヌクレオチドモノマーである。重要な実施形態では、オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドモノマー単位を有さない。一実施形態では、その他のヌクレオチドモノマー単位は全てデオキシリボヌクレオチドモノマー単位（DNA）であり、さらに別の実施形態では、それらは全て2'−O−メチル−RNAモノマー単位である。さらなる実施形態では、その他のモノマー単位はDNA単位およびRNA単位であるが、但しRNA単位の総数はオリゴ中のヌクレオチドモノマー単位の総数の30％以下である。一般的な理解およびIUPACの定義と一致して、リボヌクレオチドという用語は、1'位の核酸塩基および5'位のリン酸部分を除けばリボース部分に置換を有さない、ヌクレオチドを指す。したがって、リボヌクレオチドモノマー（単位）という用語は、1'位の核酸塩基と5'位および場合により3'位にあり得るヌクレオシド間結合とを除けばリボース部分に置換を有さない、ヌクレオチドモノマー（単位）を指す。より詳しくは、リボヌクレオチドは、2'−位および2'−OH基において非置換である。
本発明のオリゴ中の他のヌクレオチドモノマー単位の一例は、好ましくはリボース部分で化学修飾され、例えばアンテナ様の、単量体、二量体または三量体のガラクトシル部分またはN−アセチルアミノガラクトシル部分を有する、ヌクレオチドモノマー単位である。本発明は、好ましい実施形態として、そのような単量体、二量体または三量体のガラクトシル部分またはN−アセチルアミノガラクトシル部分とのオリゴヌクレオチドの3'末端複合体または5'末端複合体を含む。（例えばアンテナ様の）単量体、二量体または三量体のガラクトシル部分またはN−アセチルアミノガラクトシル部分は、オリゴヌクレオチド中でアミノLNAヌクレオチドモノマー単位の2'−アミノ基と結合していてもよい。近年、数々の報告において、肝臓、例えば肝細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的指向型送達を達成する方法が、アンチセンスオリゴヌクレオチドと（例えばアンテナ様の）単量体、二量体または三量体のガラクトシル部分またはN−アセチルアミノガラクトシル部分との複合体を使用して例証された。これらは、種々様々な結合（安定な結合または生体内で切断される結合の両方とも）を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させたものであり、それらを調製する一般的方法は下記の2つの文献に記載されている：[Prakash,T.Pら、Nucleic Acids Res.2014、42、8796−8807； Albaek,N.ら、US20150368642]。これらの方法を用いて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、アンテナ様の単量体、二量体または三量体のガラクトシル部分またはN−アセチルアミノガラクトシル部分との同様の複合体を設計および合成することができる。
本発明のオリゴ中のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーの個数は、少なくとも2個である。通常は、オリゴ中のモノマー単位の総数の40％以下、好ましくは30％以下、より好ましくは20％以下が、アシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーである。オリゴ中のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーの個数は、2〜8個、好ましくは2〜6個、より好ましくは2〜4個、例えば2個または3個であり得る。これらの数は、オリゴ中のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーとヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーとの合計を指す。本発明のオリゴは、少なくとも2つのN−アシル−アミノLNAヌクレオチドモノマー、または少なくとも2つのN−ヒドロカルビル−アミノLNAヌクレオチドモノマー、または少なくとも1つのN−アシル−アミノLNAヌクレオチドモノマーおよび少なくとも1つのN−ヒドロカルビル−アミノLNAヌクレオチドモノマーを含有し得る。一実施形態では、本発明のオリゴは、このすぐ上で定義した含有量でアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマー単位を含有するが、ヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチド単位を有していなくてもよい。別の実施形態では、本発明のオリゴは、このすぐ上で定義した含有量でヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマー単位を含有するが、アシル−アミノ−LNAヌクレオチド単位を有していなくてもよい。
オリゴの少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーは、オリゴの5'末端および／または3'末端の近くに配置されてもよく、オリゴの中央領域には存在しなくてもよい。一実施形態では、それらは全て、5'末端モノマー単位を位置1としてオリゴの5'末端からヌクレオチド位置1〜4、好ましくはヌクレオチド位置1〜3のところに存在し；かつ/または、それらは、3'末端モノマー単位を位置tとしてオリゴの3'末端からヌクレオチド位置t〜（t−3）、好ましくはヌクレオチド位置t〜（t−2）のところに存在する。
一実施形態では、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーは全て、オリゴの半配列セグメントのうちの一方、すなわち配列の5'末端半分または配列の3'末端半分の中に存在する。代替となる一実施形態では、少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーがオリゴの半配列セグメントの各々の中に存在する、つまり、少なくとも1つが配列の5'末端半分の中に存在しかつ少なくとも1つが配列の3'末端半分の中に存在する。オリゴ中のオリゴヌクレオチド単位の総数が奇数であるならば、中心ヌクレオチドモノマーは2つの半配列セグメントのどちらにも含まれない。一実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数である場合に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのうちの1つが中心ヌクレオチドモノマーである。この段落および上記段落の実施形態を、上記のオリゴの長さの定義、上記の好ましいヌクレオシド間結合、上記のオリゴ中のRNAヌクレオチドモノマーの最大数、および／または上記のオリゴ中のアシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーの数と組み合わせてもよい。
次に、ヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチド単位のヒドロカルビル部分について説明する。ヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチド単位のヒドロカルビル（例えばアルキル）基は、直鎖もしくは分岐鎖であるか、環状（例えばシクロアルキル基）であるか、または環状基と線状または分岐鎖との組み合わせである。ヒドロカルビル（例えばアルキル）基中の炭素原子の総数は30未満である。好ましくは、ヒドロカルビル（例えばアルキル）基中の炭素原子の最小個数は、2個、好ましくは6個、好ましくは7個、より好ましくは10個である。一実施形態では、ヒドロカルビル基またはアルキル基は、6〜30個、好ましくは7〜22個、より好ましくは10〜22個の炭素原子、よりいっそう好ましくは12〜20個の炭素原子、最も好ましくは14〜18個の炭素原子を有する。好ましくは、ヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチド単位のヒドロカルビル基は、直鎖または分岐鎖、例えば、直鎖状または分岐状のヒドロカルビル基である。ヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチド単位のヒドロカルビル基は、以下にさらに定義するように非置換であっても置換されていてもよい。
ヒドロカルビル基またはヒドロカルビル部分は、炭化水素から水素原子を除去することによって形成される一価の基である。ヒドロカルビル基は、飽和であっても不飽和であってもよく、それは、直鎖状、分岐状もしくは環状の基、またはこれらのいずれかの組み合わせであってもよい。直鎖状または分岐状のヒドロカルビル基が好ましい。好ましい直鎖状または分岐状のヒドロカルビル基の例は、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基である。好ましいアルキル基の具体例は、N−エチル基、N−テトラデシル基およびN−ヘキサデシル基であり、そのうちN−ヘキサデシル基が最も好ましい。最も好ましいヒドロカルビル基は、アルキル基、とりわけ直鎖状または分岐状のアルキル基である。その炭素数は上記のとおりである。
環状ヒドロカルビル基の例は、（C4〜C8−シクロアルキル）基および（C4〜C8−シクロアルケニル）基、好ましくは（C5〜C7シクロアルキル）基である。具体例は、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基およびシクロヘプチル基である。ヒドロカルビル部分は、以下に定義するように非置換であっても置換されていてもよい。環状アルキル基は、シクロアルキル基であってもよい。環状アルキル基の例は、C4〜C8シクロアルキル基、好ましくはC5〜C7シクロアルキル基である。具体例は、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基およびシクロヘプチル基である。
一方での直鎖または分岐鎖と、他方でのヒドロカルビル基またはアルキル基との組み合わせは、下記基であってもよい：シクロアルキル−アルキル基、アルキル−シクロアルキル基、ジアルキル−シクロアルキル基、アルキル−シクロアルキル−アルキル基、およびシクロアルキル−アルキル基。これらの組み合わせにおいてシクロアルキル部分に連結された一価のアルキル部分は、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、また、1〜24個の炭素原子、好ましくは2〜20個の炭素原子、より好ましくは3〜16個の炭素原子、最も好ましくは4〜12個の炭素原子を有し得る。これらの組み合わせにおいて炭素原子の総数は、ヒドロカルビル基の炭素原子数に関して上述したとおりであり得る。
ヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーのヒドロカルビル基（例えばアルキル基）は、非置換であってもよく、または1つ以上のヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、アルキルチオ基、エーテル基および／もしくはチオール（メルカプト）基で置換されていてもよい。アルキルチオ基は、C1〜C6アルキルチオ基、好ましくはC1〜C3アルキルチオ基であり得る。エーテル基は、C1〜C10アルキルオキシ基、好ましくはC1〜C6アルキルオキシ基、より好ましくはC1〜C3アルキルオキシ基である。さらに可能な置換基は、C1〜C3アルキルアミノ基およびジ（C1〜C3アルキル）アミノ基である。したがって、ヒドロカルビル（例えばアルキル）基は、ヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、C1〜C6アルキルチオ基、C1〜C6アルキルチオ基、好ましくはC1〜C3アルキルチオ基、C1〜C6アルキルオキシ基、好ましくはC1〜C3アルキルオキシ基、C1〜C3アルキルアミノ基、およびジ（C1〜C3アルキル）アミノ基から構成される群から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい、上記炭素原子数を有するヒドロカルビル基（例えばC7〜C22アルキル基）であり得る。
本発明のオリゴ中の多数のヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチド単位のヒドロカルビル基は、同じであっても異なっていてもよい。ヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレチドモノマーの代替物として、ヒドロカルビル基を以下に定義されるヘテロヒドロカルビル基で置き換えてもよい。
次に、アシル−アミノ−LNAヌクレオチド単位のアシル部分について説明する。アシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマー単位のアシル基は、アミノLNA部分の2'−N原子に結合してアミド基を形成する−C（=O）R基であり、ここでRは有機基である。本発明のオリゴのアシル−アミノ−LNAモノマー単位のアシル基は、直鎖もしくは分岐鎖、環状、または両者の組み合わせであり、但し、各アシル基の炭素原子の総数が30未満であることを条件とする。
アシル基中の炭素原子の総数は、少なくとも2、好ましくは少なくとも6、より好ましくは少なくとも7、よりいっそう好ましくは少なくとも10である。一実施形態では、アシル基は、4〜30個の炭素原子、好ましくは6〜30個、好ましくは7〜22個、より好ましくは10〜22個の炭素原子、よりいっそう好ましくは12〜20個の炭素原子、最も好ましくは14〜18個の炭素原子を有する。好ましくは、アシル−アミノ−LNAヌクレオチド単位のアシル基は、直鎖状または分岐状のアシル基である。
アシル基は、ヒドロカルビルカルボニル基またはヘテロヒドロカルビル−カルボニルであってもよく、前者が好ましい。ヘテロヒドロカルビル部分は、炭素原子および水素原子は別として、O、SまたはN（好ましくはO）から選択される1〜3個のヘテロ原子、好ましくは1または2個のヘテロ原子を含有する。したがって、アシル基は、1〜3個の酸素ヘテロ原子を有するヘテロヒドロカルビルカルボニル基であってもよい。ヒドロカルビル部分およびヘテロヒドロカルビル部分は、飽和であっても不飽和であってもよく、好ましくは飽和である。ヒドロカルビル基およびヘテロヒドロカルビル基は、以下に定義するように非置換であっても置換されていてもよい。
環状アシル基は、環状のヒドロカルビルカルボニル基またはヘテロヒドロカルビル−カルボニル基であってもよい。環状基の例は、（C4〜C8−シクロアルキル）カルボニル基、好ましくは（C5〜C7シクロアルキル）カルボニル基である。具体例は、シクロブチルカルボニル基、シクロペンチルカルボニル基、シクロヘキシルカルボニル基およびシクロヘプチルカルボニル基である。対応するヘテロヒドロカルビルカルボニル基は、このすぐ上で述べたいずれかの基において1〜3個のC1単位をO、S、NまたはNH単位、好ましくはOで置き換えた基であり得る。ヒドロカルビル部分およびヘテロヒドロカルビル部分は、以下に定義するように非置換であっても置換されていてもよい。
アシル基としての直鎖または分岐鎖は、直鎖状または分岐状のヒドロカルビルカルボニル基またはヘテロヒドロカルビルカルボニル基であってもよい。直鎖または分岐鎖（およびヒドロカルビルカルボニル基）は、アルカノイル基、アルケノイル基またはアルキノイル基であってもよい。対応するヘテロヒドロカルビルカルボニルは、このすぐ上で述べたいずれかの基において1〜3個のC1単位をO、S、NまたはNH単位、好ましくはOで置き換えた基であり得る。これらは、2〜30個の炭素原子、好ましくは7〜22個の炭素原子、より好ましくは10〜22個の炭素原子、最も好ましくは14〜18個の炭素原子を有し得る。好ましい直鎖または分岐鎖（または直鎖状または分岐状のヒドロカルビルカルボニル基）は、アルカノイル基、例えば飽和脂肪酸から誘導されるものである。好ましいアルカノイル基の具体例は、N−アセチル基、N−ミリストイル基およびN−パルミトイル基であり、そのうちN−パルミトイル基が最も好ましい。ヒドロカルビル部分およびヘテロヒドロカルビル部分は、以下に定義するように非置換であっても置換されていてもよい。
アシル基において、一方の直鎖または分岐鎖と、他方の環状基との組み合わせは、下記のヒドロカルビルカルボニル基であってもよい：シクロアルキル−アルキルカルボニル基、アルキル−シクロアルキルカルボニル基、ジアルキル−シクロアルキルカルボニル基、アルキル−シクロアルキル−アルキルカルボニル基、およびシクロアルキル−アルキルカルボニル基。対応するヘテロヒドロカルビルカルボニルは、このすぐ上で述べたいずれかの基において1〜3個のC1単位をO、S、NまたはNH単位、好ましくはOで置き換えた基であり得る。これらの組み合わせにおいてシクロアルキル部分に連結された一価のアルキル部分は、直鎖状であっても分岐状であってもよく、また、1〜24個の炭素原子、好ましくは2〜20個の炭素原子、より好ましくは3〜16個の炭素原子、最も好ましくは4〜12個の炭素原子を有し得る。これらの組み合わせにおいて炭素原子の総数は、アシル基の炭素原子数に関して上述したとおりであり得る。ヒドロカルビル部分およびヘテロヒドロカルビル部分は、以下に定義するように非置換であっても置換されていてもよい。
アシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーのアシル基、例えば、ヒドロカルビルカルボニル基またはヘテロヒドロカルビルカルボニル基は、非置換であってもよく、または1つ以上のヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、アルキルチオ基、エーテル基および／またはチオール（メルカプト）基で置換されていても（または含んでいても）よい。アルキルチオ基は、C1〜C6アルキルチオ基、好ましくはC1〜C3アルキルチオ基であり得る。エーテル基は、C1〜C12アルキルオキシ基、好ましくはC1〜C6アルキルオキシ基、好ましくはC1〜C3アルキルオキシ基である。さらに可能な置換基は、C1〜C3アルキルアミノ基およびジ（C1〜C3アルキル）アミノ基である。ヒドロカルビルカルボニル基および（またはヘテロヒドロカルビルカルボニル基は、
ヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、C1〜C6アルキルチオ基、好ましくはC1〜C3アルキルチオ基、C1〜C6アルキルオキシ基、好ましくはC1〜C3アルキルオキシ基、C1〜C3アルキルアミノ基、およびジ（C1〜C3アルキル）アミノ基から構成される群から選択される1つ以上、好ましくは1つまたは2つの置換基で置換されていてもよい、上記炭素原子数を有するアシル基であり得る。1つの実施形態において、ヒドロカルビルカルボニル基および／またはヘテロヒドロカルビルカルボニル基は上記炭素原子数を有し、ヒドロキシル基、オキソ基、C1〜C3アルキルチオ基、C1〜C3アルキルオキシ基から構成される群から選択される1つ以上、好ましくは1つまたは2つの置換基で置換されていてもよい。
好ましい実施形態では、アシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーのアシル部分（例えばヒドロカルビルカルボニル基）は、2〜30個の炭素原子、好ましくは7〜22個の炭素原子、より好ましくは10〜22個の炭素原子、最も好ましくは14〜18個の炭素原子を有する、非置換であるかまたは置換されているN−アルカノイル部分、N−アルケノイル部分またはN−アルキノイル部分である。これらの中でも、N−アルカノイル基、例えば、飽和脂肪酸から誘導されるものが好ましい。好ましいN−アルカノイル基の具体例は、N−アセチル基、N−ミリストイル基およびN−パルミトイル基であり、その中でもN−パルミトイル基が最も好ましい。
別の実施形態において、アシル基としての（ヘテロ）ヒドロカルビルカルボニル基の炭素原子の個数は、2〜22個、好ましくは2〜16個、より好ましくは2〜10個、よりいっそう好ましくは2〜6個の炭素原子であり、ヒドロカルビルカルボニル基は、非置換であるかまたは、ヒドロキシル基、アミノ基、チオ基、オキソ基、C1〜C6アルキルチオ基、好ましくはC1〜C3アルキルチオ基、C1〜C6アルキルオキシ基、好ましくはC1〜C3アルキルオキシ基、C1〜C3アルキルアミノ基およびジ（C1〜C3アルキル）アミノ基から構成される群から選択される1つの置換基で置換されている。1つの下位実施形態において、置換基はアミノ基である。そのようなアシル基は、20種の標準アミノ酸などのα−アミノ酸から誘導されるアシル基であってもよい。具体例は、グリシンまたはN−メチルグリシンから誘導されるアシル基であり、その場合、アシル−アミノ−LNAはそれぞれグリシルアミノLNAまたはN−メチルグリシル−アミノLNAである。
本発明のオリゴ中の多数のアシル−アミノ−LNAヌクレオチド単位のアシル基は、同じであっても異なっていてもよい。
本発明のオリゴは、例えばオリゴの血清半減期を向上させるために、PEG化されていてもよい。ポリ（エチレングリコール）（PEG）によるオリゴヌクレオチドの修飾は、当該分野において既知であり、IkedaおよびNagasaki、Journal of Applied Polymer Sciences 2014、40293に概説されている。本発明のオリゴは、オリゴ中の1つまたは2つのヌクレオチド単位、例えば、5'の1つもしくは2つのヌクレオチド単位、または3'末端の1つもしくは2つのヌクレオチド単位、または5'末端単位もしくは3'末端単位において、PEG化されていてもよい。PEGをオリゴヌクレオチドに結合させる化学は既知である（概説されている例えば上記に引用したIkedaおよびNagasaki、ならびにその中で引用されている参考文献）。PEGは直鎖状PEGであっても分岐状PEGであってもよく、5〜50000個、好ましくは20〜20000個、より好ましくは100〜10000個、よりいっそう好ましくは500〜5000個の−CH2CH2O−単位を有し得る。本発明のオリゴがオリゴの一端にアシル−アミノ−LNAヌクレオチド単位またはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチド単位を含む場合、PEG化はオリゴの他端に存在し得る。好ましい実施形態では、本発明のオリゴはPEG化されていない、というのも、本発明のオリゴの有益な特性は、PEG化されていない場合でさえ高い導入効率のために十分な血清半減期を達成することを可能にするからである。
塩基部分、アミノLNA部分および骨格結合、ならびに本発明のオリゴ中のアシル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーの含有量に関して上に示した好ましい実施形態は、組み合わされてもよい。
本発明のオリゴは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用され得る。本発明のオリゴは、ギャップマーまたはミクスマーであり得る。本発明はまた、RNAを標的とすることにおいて共通する、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド、ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチミールオリゴヌクレオチドおよびブロックミールオリゴヌクレオチドの構造および使用を提供する。
ギャップマーは、親和性増強（修飾）ヌクレオチド（例えば、LNAヌクレオチド、α−L−LNAヌクレオチド、BNAヌクレオチド、CEtヌクレオチドまたはO2'−アルキル化RNAヌクレオチド）を含有するウィングを両隣に配して中央に連続的に広がるRNアーゼH採用性ヌクレオチドを有する、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ギャップマーは、RNアーゼHを媒介とするアンチセンスRNA標的化および後者のサイレンシングのために使用され得る。本発明のギャップマーの通常の構成は、5'−ウィング−ギャップ−ウィングである。
RNアーゼH採用性のヌクレオチドまたはヌクレオチドモノマー単位は、本明細書ではRNアーゼH分解に適合するヌクレオチド（またはヌクレオチドモノマー単位）とも呼ばれるが、DNAヌクレオチドまたはFANAヌクレオチドであり得る。ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合であり得る。好ましくは、RNアーゼH採用性ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合、好ましくは上記のような高いホスホジエステル含有量、より好ましくはホスホジエステル結合を有する、DNAヌクレオチドである。別の実施形態において、RNアーゼH採用性ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合を有するFANAヌクレオチドである。FANAヌクレオチドは、2'−デオキシ−2'−フルオロアラビノヌクレオチドを意味する[Kalota,A.ら、Nucleic Acids Res.2006、34、451−461]。
親和性増強モノマーは、LNAヌクレオチド、α−L−LNAヌクレオチド、BNAヌクレオチド、CEtヌクレオチドまたはO2'−アルキル化（例えば、2'−O−C1〜C6−アルキル）RNAヌクレオチドであり得る。ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合、好ましくはホスホジエステル結合である。本発明のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーは、親和性増強モノマーの部類に属する。但し、ある種のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはアルキルアミノLNAモノマーがそれ自体ではRNAに対する親和性増大を誘起しないということを無視することはできず、しかしそれは、ギャップマーのウィング中または概してオリゴヌクレオチド中に他の上記親和性増強モノマーを組み込むことによって調節することができる。したがって、親和性増強モノマーは、LNAヌクレオチド、α−L−LNAヌクレオチド、BNAヌクレオチド、CEtヌクレオチドもしくは2'O−アルキル化RNAヌクレオチド、ならびに／または本発明のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーであり得る。親和性増強モノマーのセグメント中にはDNAヌクレオチドモノマーも存在していてもよいが、それらは本明細書において親和性増強性であるとはみなされない。
ギャップマーは、5'末端から3'末端まで、3つのセグメント：少なくとも2ヌクレオチド単位の5'末端セグメントと、少なくとも6ヌクレオチド単位の長さの中央結合セグメントと、少なくとも2ヌクレオチド単位の長さの3'末端セグメントとを含むかまたはそれらから構成されるオリゴヌクレオチドであり得、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも2つの2'−N−アシル−2'−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーもしくは2'−N−ヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを5'末端セグメントもしくは3'末端セグメントのどちらかの中に含有するかまたは、少なくとも1つの2'−N−アシル−2'−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーもしくは2'−N−ヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドモノマーを上記末端セグメントの各々の中に含有し、但し、より具体的な実施形態では、中央セグメント中にはそれらを全く含有しない。オリゴは、5'末端セグメントまたは3'末端セグメントのどちらかの中のヌクレオチド単位、例えば上記でより一般的に定義した末端単位においてPEG化されていてもよいが、好ましい一実施形態においてオリゴは、5'末端セグメントまたは3'末端セグメントのどちらの中のヌクレオチド単位においてもPEG化されていない。5'末端セグメントおよび／もしくは3'末端セグメントは、少なくとも3つもしくは少なくとも4つのヌクレオチド単位を有し得；かつ／または中央結合セグメントは長さが少なくとも8ヌクレオチド単位または少なくとも10ヌクレオチド単位であり得る。本明細書において、用語「セグメント」は、オリゴヌクレオチド中の複数の連続したヌクレオチドモノマー単位を指す。オリゴヌクレオチドの一部に言及する場合、「要素」という用語が時には同じ意味で使用される。
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、構成：NV−MY−NZのギャップマーであり、式中、Mは、標的RNAのRNアーゼH分解に適合するヌクレオチドモノマーを表し、Nは、親和性増強ヌクレオチドモノマー、本明細書において定義されるアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマー、ならびに／またはDNAヌクレオチドモノマーのうちから選択されるモノマーを表し、V、YおよびZはセグメント中の連続するモノマーの数を示す。ハイフンは、2つのウィング配列セグメント（要素）NVおよびNZとギャップ配列セグメントMYとの間の結合を示し（または分離を示し）；数VおよびZは、2〜8、好ましくは2〜5の整数であり、数Yは、6〜14、好ましくは8〜13の整数であり、但し、V+Z+Yの合計が10〜30、好ましくは12〜26であることを条件とする。
一実施形態（a）では、少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーが、2つのウィングセグメント（要素）すなわちNモノマー単位からなるセグメントの各々の中に存在する。別の実施形態（b）では、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーは、ウィングセグメント（要素）のうちの一方の中に存在するものの、他方のウィングセグメントの中には全く存在しなくてもよい。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、下記構成：5'−（L）2〜4−（D）6〜10−（L）2〜4を有してもよく、式中、DはDNAヌクレオチドモノマーを表し、Lは、親和性増強ヌクレオチドモノマーまたは、本明細書において定義されるアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマー、またはDNAモノマー、または2'−O−アルキル−RNAモノマー、または2'−O−アルコキシアルキル−RNAモノマーを表す。少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーは、2つのウィングセグメントすなわちLモノマー単位からなるセグメントの各々の中に存在し得る。あるいは、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマー単位および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマー単位は、ウィングセグメントのうちの一方の中に存在し；他方のウィングセグメントには、アシル−アミノ−LNAモノマー単位および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマー単位が欠けていてもよく、またはそれが1つ以上含まれていてもよい。
本発明のミクスマーは、上記で定義した親和性増強修飾ヌクレオチド（例えば、LNAヌクレオチド、α−L−LNAヌクレオチド、BNAヌクレオチド、CEtヌクレオチドまたはO2'−アルキル化RNAヌクレオチド）を含有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド分子であり得る。加えて、それらはDNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドを含有していてもよい。ミクスマーという用語は、ギャップマーとして構成されていない、つまり一般構造5'−ウィング−ギャップ−ウィングに制約されない、RNAを標的とするオリゴヌクレオチドを意味する。したがってそれらは、例えば、交互になったDNAヌクレオチドとLNA型ヌクレオチドとからなることができ、この場合、LNA型ヌクレオチドのうちの少なくとも2つがアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーのうちから選択されるものであり、または別の例として、それらは、約60〜70％の2'−O−Me−RNAおよび約30〜40％のLNA型ヌクレオチドからなることができ、この場合、LNA型ヌクレオチドのうちの少なくとも2つがアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーのうちから選択されるものである。修飾または置換されたRNA、例えば2'−O−Me−RNAは、本明細書において（非置換）RNAとはみなされない。ミクスマーという用語は、本明細書で使用する場合、アンチミール、ブロックミール、スプライス切替剤、エクソンスキップ剤および立体ブロックアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含することを意味する。
本発明は、構成5'−（N）7〜26、好ましくは5'−（N）8〜26を有する一本鎖（ミクスマーアンチセンス）オリゴヌクレオチドを提供する。式中、Nは、任意のヌクレオチドモノマー単位を表し、好ましくは、少なくとも1つのNが親和性増強モノマーであり得、かつ他のNが他の任意の種類のヌクレオチドモノマーであり得、但し、少なくとも2つのNヌクレオチドモノマー単位が上記のようなアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーであることを条件とする。当該構成の配列は、ヌクレオチド単位の数が等しい2つの配列セグメント（要素）、すなわち5'セグメントと3'セグメントとに分割され得る。一実施形態（a）において、各配列セグメント（要素）、すなわち5'セグメントおよび3'セグメントの各々は、少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有する。別の実施形態（b）では、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが、2つのセグメント（要素）のうちの一方、すなわち5'セグメントまたは3セグメントセグメントの中に存在し、他方のセグメントの中には全く存在しなくてもよい。その場合、ヌクレオチド単位の総数が奇数であるならば、つまり5'セグメントと3'セグメントとを決定するために、中心ヌクレオチドモノマー単位は2つの半配列セグメントのどちらにも含まれない。
しかしながらこれは、中心モノマー単位が、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーのうちの1つであり得るアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーであってもよいという可能性を排除するものではない。1つの代替策では、ヌクレオチドの総数が奇数である場合、1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方の中に存在し、第2のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが中心モノマーとして存在する。オリゴヌクレオチドのモノマーは、ホスホジエステル結合および／またはホスホロチオエート結合および／またはホスホトリエステル結合で結合しており、好ましいこととして上に記載したホスホジエステル結合の割合は、ミクスマーオリゴヌクレオチドについても好ましい。
一実施形態では、一本鎖ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成が5'−（N）7〜12であり、式中、Nは、上記配列セグメント（要素）の各々が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーを含有するように、親和性増強ヌクレオチド、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表す。別の実施形態では、一本鎖ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）12〜22を有し、式中、Nは、上記配列要素の各々が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有するように、少なくとも4つのLNA型親和性増強モノマー、数々のDNAモノマーまたは2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表す。他のさらなる実施形態では、一本鎖ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）15〜22を有し、式中、Nは、上記配列要素の各々が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有するように、少なくとも3つのLNA型親和性増強モノマー、数々の2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表す。
別の実施形態では、一本鎖ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）7〜12を有し、式中、Nは、ヌクレオチドの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが2つの配列要素のどちらにも含まれないという条件の下に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方、すなわち配列の5'末端半分または配列の3'末端半分の中に存在するように、親和性増強ヌクレオチド、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを構成する。あるいは、ヌクレオチドの総数が奇数である場合、1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方の中に存在し、第2のアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが中心モノマーとして存在する。別の実施形態では、一本鎖ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）12〜22を有し、式中、Nは、ヌクレオチドの総数が奇数であるならば、つまり5'セグメントと3'セグメントとを決定するために、中心ヌクレオチドモノマーが2つの配列要素のどちらにも含まれない、という条件の下に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方、すなわち配列の5'末端半分または配列の3'末端半分の中に存在するように、少なくとも4つのLNA型親和性増強モノマー、数々のDNAモノマーまたは2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表す。しかしながらこれは、中心ヌクレオチドモノマー単位が、アシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーである実施形態を排除するものではない。別の実施形態では、一本鎖ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）15〜22を有し、式中、Nは、ヌクレオチドの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが2つの配列要素のどちらにも含まれないという条件の下に、少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーが半配列要素のうちの一方、すなわち配列の5'末端半分または配列の3'末端の中に存在するように、少なくとも3つのLNA型親和性増強モノマー、数々の2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表す。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの一般構造は、5'−（N）7〜30であり、このことは、それらが7〜30個のヌクレオチドから構成されることを意味する。これらのヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）は、少なくとも2つがアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーであるということを条件として、文献から公知の任意のヌクレオチド構造とすることができ、上記の好ましい実施形態のいずれかをこの一般構造と組み合わせてもよい。
以下の節では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい実施形態を記載する。本発明のギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの一実施形態において、アシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーのうちの少なくとも1つは、5'末端の方のウィング配列要素の中に位置し、アシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーのうちの少なくとも1つは、3'末端の方のウィング配列要素の中に位置する。これは、オリゴの配列をヌクレオチド単位の数の等しい2つの配列セグメント（要素）、すなわち5'セグメントと3'セグメントとに分割して考え得るミクスマーのシナリオ（分割において奇数の場合は中心ヌクレオチド単位を無視する）を模倣するものである。これらの構成を有することにより、2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーの効果は、互いに補い合い、それゆえに特性の向上、例えば、核酸分解に対する耐性の向上、生体内安定性の向上、生体内分布の増加、組織内分布の増加、細胞透過性の向上、生体内での遺伝子発現を調節する能力の向上、および／または毒性の低下を提供する。
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、上記のような配列セグメント（要素）（配列要素はここでは、ギャップマーの2つのウィングまたはミクスマーの各配列要素（配列の5'−末端半分および3'末端半分）を意味する）の各々の中に1つのパルミトイル−2'−アミノ−LNAモノマーを含有するならば、それは本発明に含まれる。同様に、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドが上記のような配列要素の各々の中に1つのグリシルアミノLNAモノマーを含有するならば、それもまた本発明に含まれる。同様に、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドが1つのグリシルアミノLNAモノマーおよび1つのパルミトイルアミノLNAモノマーを含有するならば、それらは2つの異なる配列要素の中に位置し得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが3つのグリシルアミノLNAモノマーを含有するならば、それらは両方の配列要素の中に分散していてもよい。同様に、2つ以上、例えば、3つ、4つ、5つまたは6つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーがギャップマーまたはミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの中に含まれているならば、それらは両方の配列要素の中に分散していてもよい。これは、各配列要素がアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーのうちの少なくとも1つを含有し得ることを意味する。
上記の実施形態のいずれか1つと組み合わされ得る一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、リンカーを介してコレステリル部分と結合している1つまたは2つのヌクレオチドモノマーを有する。コレステリル部分は、例えば国際公開第2014/005596号パンフレットに記載されているように、そのヒドロキシ基を介してホスホジエステルのヌクレオシド間結合に結合させてもよい。あるいは、コレステリル部分を、オリゴヌクレオチド中のさらなる2'−アミノ−LNAヌクレオチド単位の2'−アミノ基に結合させてもよい。後者の例は以下のとおりである：

左側には、コレステリル基がカルバメート結合を介してアミノLNAモノマー（ここではホスホジエステル誘導体として示されている）に連結されている例が示されている。右側には、コレステリル基が、1,6−ヘキサンジイル単位またはヘキサノイル−6−イルリンカー（すなわちN 2'−アシル化誘導体）であり得る可変リンカーXを介してアミノLNAモノマー（ここではホスホジエステル誘導体として示されている）に連結されている例が示されており；Xは、代わりに、種々の構成のより短いまたはより長いリンカー、好ましくは2〜20個の炭素原子を有し得る直鎖のアルカンジイル系またはアルカノイル系のリンカーとすることができる。
一般的に好ましい実施形態A、代替物（i）において、ギャップマーオリゴは、上記で定義した構成NV−MY−NZを有するギャップマーオリゴである。別の好ましい実施形態Bにおいて、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの構成は下記：5'−LLL−DDDDDDDDD−LLLであり、式中、DはDNAヌクレオチドモノマーを表し、Lは親和性増強ヌクレオチドモノマーまたはアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはアルキルアミノLNAモノマーを表し、ハイフンは、2つのウィング配列要素とギャップ配列要素との間の分離（結合）を示す。別の好ましい実施形態Cにおいて、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの構成は下記：5'−LL−DDDDDDDD−LLであり、式中、DはDNAヌクレオチドモノマーを表し、Lは親和性増強ヌクレオチドモノマーまたはアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表し、ハイフンは、2つの（Lヌクレオチド単位からなる）ウィング配列要素と（Dヌクレオチド単位からなる）ギャップ配列要素との間の分離（結合）を示す。別の好ましい実施形態Dにおいて、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの構成は下記：5'−LLLL−DDDDDDDD−LLLLであり、式中、DはDNAヌクレオチドモノマーを表し、Lは親和性増強ヌクレオチドモノマーまたはアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／もしくはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表し、ハイフンは、2つの（Lヌクレオチド単位からなる）ウィング配列要素と（Dヌクレオチド単位からなる）ギャップ配列要素との間の分離（結合）を示す。別の好ましい実施形態Eにおいて、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの構成は、上記で定義した式5'−（L）2〜4−（D）6〜10−（L）2〜4を有する構成である。明確にするために記すが、2つのウィング配列要素とギャップ配列要素との間の分離（結合）を示すハイフンは各々、（LモノマーとDモノマーとの間の）ホスホチオエート結合、（LモノマーとDモノマーとの間の）ホスホジエステル結合、または（LモノマーとDモノマーとの間の）ホスホトリエステル結合とすることができ；オリゴヌクレオチドの全てのモノマー単位を同じ結合で結合させてもよいことに留意されたい。
前段落の実施形態（実施形態A〜E）において、1つの下位実施形態では、各ウィングセグメント中の1つのモノマーLは、アシル基が脂肪酸残基（例えばパルミトイル基）となったアシル−アミノ−LNAモノマーであってもよい。別の下位実施形態では、各ウィング中の1つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するパルミトイルアミノLNAモノマーである。別の下位実施形態では、各ウィング中の1つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するミリストイルアミノLNAモノマーである。さらなる下位実施形態では、少なくとも1つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するパルミトイルアミノLNAモノマーである。さらなる下位実施形態では、少なくとも1つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するミリストイルアミノLNAモノマーである。さらなる下位実施形態では、一方のウィング中の1つのモノマーLはミリストイルアミノLNAモノマーであり、他方のウィングセグメント中の別のモノマーLはグリシルアミノLNAモノマーである。さらなる下位実施形態では、少なくとも1つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するグリシルアミノLNAモノマーである。さらなる下位実施形態では、少なくとも1つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するリシルアミノLNAモノマーである。
実施形態A〜Eの好ましい下位実施形態では、一方のウィング要素中の2つのモノマーLは、アシル基が脂肪酸残基（例えばパルミトイル基）となったアシル−アミノ−LNAモノマーである。実施形態A〜Eの別の好ましい下位実施形態では、一方のウィング要素中の2つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するパルミトイルアミノLNAモノマーである。実施形態A〜Eの別の好ましい下位実施形態では、一方のウィング要素中の2つのモノマーLは、ピリミジン核酸塩基を含有するミリストイルアミノLNAモノマーである。
好ましい実施形態Fにおいて、本発明のミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）7〜26を有し、式中、Nは、少なくとも1つの親和性増強モノマーを表し、加えて他のタイプの既知のヌクレオチドモノマーを表してもよく、但し、少なくとも2つのNヌクレオチドがアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーであることと、各配列要素（上記参照）が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有することを条件とする。
1つの好ましい実施形態Gにおいて、ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）7〜12を有し、式中、Nは、各配列要素（上記参照）が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有するように、親和性増強ヌクレオチド、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを構成している。
好ましい実施形態Hにおいて、本発明のミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）12〜22を有し、式中、Nは、配列要素（上記参照）の各々が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有するように、少なくとも4つのLNA型親和性増強モノマー、数々のDNAモノマーまたは2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表す。
別の好ましい実施形態Iでは、本発明のミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）15〜22を有し、式中、Nは、各配列要素（上記参照）が少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有するように、少なくとも3つのLNA型親和性増強モノマー、数々の2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表す。
実施形態F〜Iの1つの好ましい下位実施形態において、各配列要素中の1つのモノマーNは、アシル基が脂肪酸残基（例えばパルミトイル基）となったアシル−アミノ−LNAモノマーである。
実施形態F〜Iの別の好ましい下位実施形態では、各配列要素中の1つのモノマーNは、ピリミジン核酸塩基を含有するパルミトイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F〜Iの別の好ましい下位実施形態では、各配列要素中の1つのモノマーNは、ピリミジン核酸塩基を含有するミリストイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F〜Iの1つの好ましい下位実施形態において、少なくとも1つのモノマーNは、アシル基が脂肪酸残基（例えばパルミトイル基）となったアシル−アミノ−LNAモノマーである。
実施形態F〜Iの別の好ましい下位実施形態において、少なくとも1つのモノマーNは、ピリミジン核酸塩基を含有するパルミトイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F〜Iの別の好ましい下位実施形態において、少なくとも1つのモノマーNは、ピリミジン核酸塩基を含有するミリストイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F〜Iの別の好ましい下位実施形態において、各配列要素中の1つのモノマーNはミリストイルアミノLNAモノマーであり、別のモノマーNはグリシルアミノLNAモノマーである。
実施形態F〜Iの別の好ましい下位実施形態において、少なくとも1つのモノマーNは、ピリミジン核酸塩基を含有するグリシルアミノLNAモノマーである。
実施形態F〜Iの別の好ましい下位実施形態において、少なくとも1つのモノマーNは、ピリミジン核酸塩基を含有するリシルアミノLNAモノマーである。
実施形態A〜Iの1つの下位実施形態では、アダマンチル基をアシル基の一部として含有する少なくとも1つのアシル−アミノ−LNAモノマーが存在する。
実施形態A〜Iの別の下位実施形態では、少なくとも1つのアセチルアミノLNAモノマーが存在する。
実施形態A〜Iの好ましい下位実施形態では、プロトン化によるエンドソーム脱出を媒介するために、1〜3個のアミノLNAモノマー（すなわち、非官能基化2'−NH−LNA）が存在する（公開されているプロトン化N−2'誘導体のpKa値は約6.1である。
好ましい実施形態F'では、本発明のミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）7〜26を有し、式中、Nは、少なくとも1つの親和性増強モノマーを表し、加えて他のタイプの既知のヌクレオチドモノマーを表してもよく、但し、少なくとも2つのNヌクレオチドがアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーであることと、一方の配列要素（上記参照）が少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有することを条件とする。
1つの好ましい実施形態G'では、ミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）7〜12を有し、式中、Nは、親和性増強ヌクレオチド、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを構成しており、但し、少なくとも2つのNヌクレオチドがアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーであることと、一方の配列要素（上記参照）が少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有することを条件とする。
好ましい実施形態H'では、本発明のミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）12〜22を有し、式中、Nは、少なくとも4つのLNA型親和性増強モノマー、数々のDNAモノマーまたは2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表し、但し、一方の配列要素（上記参照）が少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有することを条件とする。
別の好ましい実施形態I'では、本発明のミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、構成5'−（N）15〜22を有し、式中、Nは、少なくとも3つのLNA型親和性増強モノマー、数々の2'−OMe−RNAモノマー、ならびに少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを表し、但し、一方の配列要素（上記参照）が少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAモノマーおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを含有することを条件とする。
実施形態F'〜I'の1つの好ましい下位実施形態において、一方の配列要素中の2つのNモノマーは、アシル基が脂肪酸残基（例えばパルミトイル基）となったアシル−アミノ−LNAモノマーである。
実施形態F'〜I'の別の好ましい下位実施形態において、一方のウィング要素中の2つのNモノマーは、ピリミジン核酸塩基を含有するパルミトイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F'〜I'の別の好ましい下位実施形態において、一方のウィング要素中の2つのNモノマーは、ピリミジン核酸塩基を含有するミリストイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F'〜I'の1つの好ましい下位実施形態において、一方の配列要素中の2つのNモノマーは、アシル基が脂肪酸残基（例えばパルミトイル基）となったアシル−アミノ−LNAモノマーである。
実施形態F'〜I'の別の好ましい下位実施形態において、一方のウィング要素中の2つのNモノマーは、ピリミジン核酸塩基を含有するパルミトイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F'〜I'の別の好ましい下位実施形態において、一方のウィング要素中の2つのNモノマーは、ピリミジン核酸塩基を含有するミリストイルアミノLNAモノマーである。
実施形態F'〜I'の別の好ましい下位実施形態において、1つのモノマーNはミリストイルアミノLNAモノマーであり、別のモノマーNはグリシルアミノLNAモノマーである。
好ましい実施形態では、全てのヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合である。
一実施形態では、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
本発明は、ギャップマーまたはミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるかまたはそれらを含んだ、脂質ナノ粒子、その他のナノ粒子製剤およびデンドリマー（樹状）製剤、ならびにその他のナノ材料を含む。
本発明は、一実施形態として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの複合物、例えば、アンテナ様オリゴガラクトース誘導体を含む。
本発明は、好ましい態様として、アンテナ様の単量体、二量体または三量体のガラクトシル部分またはN−アセチルアミノガラクトシル部分と、アンチセンスオリゴヌクレオチドとの、3'末端複合物または5'末端複合物を含む。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、試験管内または生体内での遺伝子発現の調節、例えば疾患の診断または疾患の処置に有用である。
1つの好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、人体におけるRNA複合体の保持を向上させる血漿タンパク質に結合することができる。
好ましい実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、向上した生体内分布、細胞膜透過性、組織内分布などを媒介することが知られている基と複合化する。当業者に知られているそのような基の例は、細胞透過性ペプチド、コレステロール、ガラクトースまたはアルファ−トコフェロールの部分である。
本発明の別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを有さない対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて低減された免疫応答を生じさせる。
本発明の別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを有さない対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて低減された毒性を呈する。
本発明の別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAモノマーを有さない対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて延長された効果を有する。
さらに別の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトまたは動物の特定の器官または組織に効率的に輸送される。
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞膜を効率的に貫通することができる。
本発明のアンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドは、その配列の一方の半セグメント中に少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAヌクレオチドおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドを含有し得る。驚くべきことにこの構造は、総括的に、非常に魅力的な特性、すなわち腎排泄を制限するヒト血清アルブミンに対する高い結合性をもたらし、向上した生体内分布および生物学的効果をもたらす。本発明のアンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドは、2つのアシル−アミノ−LNAヌクレオチドおよび／またはアルキルアミノLNAヌクレオチドが、最後から一つ手前にある4つのヌクレオチドのうちの1つに位置するように、その配列の一方の半セグメント中に少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAヌクレオチドおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドを含有し得る。本発明のアンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドは、2つのアシル−アミノ−LNAヌクレオチドおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAヌクレオチドが2つの最外（末端に位置する）ヌクレオチドとして位置するように、その配列の一方の半セグメント中に少なくとも2つのアシル−アミノ−LNAヌクレオチドおよび／またはアルキルアミノLNAヌクレオチドを含有し得る。
本発明は、生体内分布および生物学的利用能を向上させるためにアプタマーを改変する方法を開示する。これは、本発明による少なくとも2つのアシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマー単位を含むオリゴヌクレオチドをアプタマーとして使用することによって達成される。これは、ヒト血清アルブミンのような血漿タンパク質への結合性の向上につながり、それによって循環時間を増加させ、つまり迅速なクリアランスを妨げ、それによってPEGまたはナノ粒子製剤のようなより大きい分子実体と複合させる必要性が低減されることになる。
本発明は、アプタマーとしてのアシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマー含有オリゴヌクレオチドを提供する。これらのアプタマーは、例えば、抗増殖剤および抗癌薬として、または薬物送達装置として有用である。アシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNA修飾アプタマーは、その他の疾患に対しても有用となる。
一実施形態では、本発明のアプタマーの全てのアシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマー単位は、開存アプタマーの一方の末端に連続して連結される。
別の実施形態では、本発明のアプタマーの各末端は、少なくとも1つのアシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマーを含有する。
さらに別の実施形態では、親アプタマーに含まれるヌクレオチドのうちの2つ以上の各々が、アシル−またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマーで置き換わっている。
他の実施形態では、結果として得られるアプタマーが少なくとも2つのアシルおよび／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマーを含有するように、上記3つの実施形態の組み合わせが生成される。
一実施形態は、合計で2〜4個のアシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAヌクレオチドを含有するアプタマーを含む。
別の実施形態では、本発明のアプタマーは、合計2つのアシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAヌクレオチドを含有する。
好ましい実施形態では、本発明のアプタマーは、2つのパルミトイルアミノLNAヌクレオチドを含有する。
本発明のアプタマーは、本発明の他の構築物についても例示されているように、自動核酸合成の標準的な方法を用いて合成することができる。このようにして、本発明のアプタマーを製造するために、様々な修飾ヌクレオチドおよび未修飾ヌクレオチドをアシル−および／またはヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノLNAモノマーと混在させることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、生体内での疾患介入または処置に関連する生物学的応答の調節に有用である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に知られているような自動オリゴヌクレオチド合成によって調製され得る。本発明のオリゴヌクレオチド中への本発明のアシル−アミノ−LNAモノマーおよびアルキルアミノLNAモノマーの組み込みは、公開 [Johannsen,M.W.ら、Org.Biomol.Chem.、2011、9、243] されているような改変を伴ってオリゴヌクレオチドの合成、後処理、精製および単離のための標準的な方法[F.Eckstein、Oligonucleotides and Analogues、IRL Press 、Oxford University Press、1991]に従う。本発明のオリゴヌクレオチドを作るために使用され得るいくつかのアシル−アミノ−LNAおよびアルキルアミノLNAモノマーは以前に合成されたことがあり、自動オリゴヌクレオチド合成のためのそれらのホスホロアミダイト構築ブロックを調製する手順は報告がなされている[Johannsen,M.W.ら、Org.Biomol.Chem.、2011、9、243] [I.K.AstakhovaおよびJ.Wengel、Acc.Chem.Res.、2014、47、1768およびその中で引用されている参考文献]。
本発明のオリゴは、動物、例えば哺乳動物、好ましくはヒトの治療に使用され得る。治療は癌の治療であり得る。本発明はまた、医薬として使用するための本発明のオリゴを提供する。本発明はまた、分子診断などの診断に使用するための本発明のオリゴを提供する。本発明はまた、疾患予測に使用するための本発明のオリゴを提供する。当業者には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアプタマーオリゴヌクレオチドを、特定の遺伝子および遺伝子産物を標的とするように設計することができることは明らかであろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してRNA配列を標的とすることができることは理解されるべきである。但し、タンパク質などの遺伝子産物のレベルは、その関連するmRNAまたは非コードRNAが修飾されている場合、RNA分解または翻訳阻害によって間接的に影響を受ける場合がある。また、タンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えばDNAメチル化に起因して影響を受ける場合がある。
本発明のアンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドは、医薬として使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性はもっぱらアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列および構成にあるため、治療標的が検証されれば当業者は標的のレベルおよび活性に影響を及ぼすオリゴヌクレオチドを設計することができる。
本発明はまた、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、希釈剤、キャリアまたは補助薬とを含む医薬組成物を提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、当該技術分野において既知であるように、生理学的に許容可能な媒体（例えば、脱イオン水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、生理食塩水、水性エタノールまたはその他のアルコール、血漿、タンパク質溶液、マンニトール、水性グルコース、植物油など）の中に存在させて投与され得る。したがって、本発明のさらなる実施形態は、適切な賦形剤を含む、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。また、緩衝剤を含んでもよく、特にこの場合、媒体は概して約5〜10の範囲のpHで緩衝されるものであり、この場合、緩衝剤は、塩の濃度が概して約5〜500mMとなる塩、生理学的に許容可能な安定剤、およびそれに類似するものの濃度が約50〜250mMの範囲となる。オリゴヌクレオチドまたは組成物は、貯蔵および輸送を簡便にするために凍結乾燥されてもよい。したがって、本発明のさらなる実施形態では、組成物は、1つ以上の賦形剤、希釈剤および／またはキャリアを含む。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混和した活性材料を含有し得る。そのような賦形剤には、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムおよびアラビアガムが含まれ；分散剤または湿潤剤は、天然ホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステル、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートとすることができる。別の可能な賦形剤は、アルブミン、例えばヒト血清アルブミンである。
水性懸濁液はまた、1つ以上の保存料、例えばp−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはn−プロピル、1つ以上の着色剤、1つ以上の香味剤、および1つ以上甘味剤、例えば蔗糖またはサッカリンを含有することができる。しかしながら、医薬組成物は、保存料を含まないが無菌であり単回投与単位で包装されることが好ましい。
活性成分を、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油、または鉱油、例えば流動パラフィンの中に懸濁させることによって、油性懸濁液を調合することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。口当たりの良い経口製剤を提供するために、甘味剤および香味剤を添加することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって保存することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および1つ以上の保存料と混和した活性成分を提供する。適する分散剤もしくは湿潤剤または懸濁化剤は、上で既に言及したものによって例示されている。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤および着色剤もまた存在することができる。本発明の組成物は、水中油型エマルジョンの形態とすることもできる。油性相は、植物油もしくは鉱油またはこれらの混合物とすることができる。
適する乳化剤は、天然ガム、例えばアラビアガムまたはトラガントガム、天然ホスファチド、例えば、大豆、レシチン、ならびに脂肪酸とヘキシトール、無水物とに由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、および上記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとすることができる。エマルジョンはまた、甘味剤および香味剤を含有することができる。本発明の化合物は、滅菌媒体中に存在させて非経口投与することができる。
使用されるビヒクルおよび濃度に応じて、オリゴヌクレオチドを単独または賦形剤との組み合わせのいずれかでビヒクル中に懸濁または溶解させることができる。好都合なことに、補助薬、例えば、局所麻酔剤、保存料および緩衝剤をビヒクル中に溶解させることができる。
当技術分野でも既知であるように、オリゴヌクレオチドおよび医薬組成物は、概して、非経口的に、例えば、静脈内（IV）、動脈内（LA）、筋肉内（LM）、皮下（SC）、粘膜、経口などで投与される。投与はまた、輸液によって行ってもよく、または複合物の性質が血管系への移行を可能にする場合には粘膜、経口、鼻、直腸、経皮もしくはエアロゾルでの投与であってもよい。通常は単回注射を採用することになるが、所望によっては2回以上の注射を用いてもよい。投与は、シリンジ、トロカール、カテーテルなどを含めていかなる簡便な手段によって行ってもよい。投与の特定様式は、投与される濃度、単回投与であるか連続投与であるかなどに依存して変化するであろう。投与は血管内に行うことができ、導入部位は本発明では重要ではないが、好ましくは迅速な血流のある部位である（例えば末梢静脈または中心静脈の静脈内）。好ましくは、投与経路は粘膜または経口である。他の投与経路は、例えば投与を徐放技法または保護マトリックスと組み合わせる場合に、有用となり得る。
活性成分としてのオリゴヌクレオチドの用量レベルは、1日あたり体重1kgあたりで約0.1mg〜約140mgの程度であり、記載されている症状の処置に有用である（1日あたり患者1人あたりで約0.5mg〜約7g）。単回用の剤形を製造するためにキャリア材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に依存して変化し得る。投与のためのオリゴヌクレオチドの濃度は、投与前に約1pg/ml〜100mg/mlの範囲であり得る。血管内投与される総量は、一般に、約0.1mg〜約500mg、好ましくは約1mg〜約250mgの範囲であろう。
本発明の組成物は、意図された用途のために調合され得る。。したがって、本発明の一実施形態は、経口投与または粘膜投与のために調合された組成物に関する。
医学的用途および処置
オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、特定の遺伝子の遺伝子発現の阻害が有益である哺乳動物の疾患を処置するために使用され得る。処置のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物、例えば、ヒト、家畜用および畜産用動物、動物園用または娯楽用動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。処置され得る疾患は、国際公開第2014/005596号パンフレットに記載されているような、遺伝子またはその産物をダウンレギュレーションまたはサイレンシングすることによって処置することができる疾患である。そのような疾患としては、限定はされないが、例えば、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症および細菌感染症、内分泌系疾患、神経障害、例えば中枢および末梢神経系障害を、心血管障害、肺障害、ならびに生殖器系障害が挙げられる。
本発明の一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドおよび組成物は、癌およびその他の過剰増殖性障害の改善および／または治療に有用である。癌細胞は、大抵、異常な遺伝子発現によって特徴付けられる。本発明によって治療が提供される癌およびその他の過剰増殖性障害としては、限定はされないが、結合組織および筋骨格系組織に関連する新生物、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫および脂肪肉腫、ならびに骨、脳、乳房、結腸、消化器系、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、肝臓、リンパ系、神経系（中枢および末梢）、膵臓、腎盂、腹膜、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭および尿生殖路の中に位置する新生物、ならびに白血病（急性前骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球、単球、赤白血病を含む）、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含む）、多発性骨髄腫、結腸癌腫、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、気管支原性癌、精巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、血管肉腫、リンパ管肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液膜種、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、膵臓癌、腎細胞癌、ウィルムス腫瘍、肝癌、胆管癌、腺癌、上皮癌、メラノーマ、汗腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血液芽腫（emangioblastoma）、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（menangioma）、神経芽腫、網膜芽腫、膀胱癌、胎児性癌、嚢胞腺癌、髄様癌、絨毛癌および精上皮腫が挙げられる。
したがって、本発明の一態様は、腸内送達による恩恵を受ける疾患、例えば上記の癌、炎症性疾患の処置のための、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
本発明の別の態様は、薬物の腸内送達のための本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明のさらに別の用途は、疾患に関連する転写物またはタンパク質の遺伝子発現を調節することに関する。本発明のさらなる用途は、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、疾患を処置する方法に関する。
本発明はさらに、細胞または生物における標的核酸の核酸改変を媒介する方法であって、a.標的核酸の改変を起こすことのできる条件下で細胞または生物を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるステップ；およびb.それにより標的核酸の改変を媒介するステップを含む、方法を提供する。
標的核酸の核酸改変を媒介する方法は、試験管内または生体内で、すなわち哺乳動物などの動物またはヒトにおいて実施され得る。あるいは、標的核酸の核酸改変を媒介する方法は、細胞培養物中または単離細胞内で実施され得る。好ましい実施形態では、本方法の核酸改変は、遺伝子サイレンシング（＝遺伝子発現のダウンレギュレーション）、好ましくは、標的mRNAの分解または、標的mRNAの翻訳阻害または、その他の種類のRNA、例えば非コードRNAの阻害である。したがって、本発明は、細胞または生物を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、上記細胞または生物における遺伝子サイレンシングを媒介する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、機能不全のRNAスプライシングを原因として有する疾患を緩和することのできる遺伝子産物を提供するために細胞またはヒトのような生物におけるスプライシング事象を調節する方法を提供する。
本発明の別の態様は、細胞または生物における遺伝子の機能を検査する方法であって、a.上記遺伝子に対応する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞または生物の中へ導入し、それによって試験細胞または試験生物を作製することと；標的遺伝子の改変を起こすことのできる条件下で試験細胞または試験生物を維持することと；c.ステップbで作製された試験細胞または生物の表現型を観察し、場合により、観察された表現型を適切な対照細胞または対照生物の表現型と比較し、それによって遺伝子の機能に関する情報を提供することとを含む、方法である。
細胞は、好ましくは動物の細胞、例えば哺乳動物またはヒトの細胞である。細胞または生物における遺伝子の機能を検査する方法の好ましい実施形態において、方法は、細胞培養物中、試験管内、または生体内で実施される。さらに別の実施形態において、方法は、単離細胞に対して実施される。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば当業者に既知であるトランスフェクションまたは裸状送達を用いて、細胞内へ導入することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、当業者に既知である静脈内もしくは皮下への注射によって、または当業者に既知であるその他の導入方法によって、生物の中へ導入され得る。
遺伝子の機能に関して得られた情報は、特定の疾患に関して遺伝子産物が治療介入に適した標的であるか否かを判定するために、用いられ得る。したがって、ある種の遺伝子産物が、例えば癌の固有の亜型において影響を受けることが知られているある種の生化学経路に作用することが実証されるのであれば、当該遺伝子産物は、上記癌の亜型を処置するための治療介入に適した標的である可能性がある。
細胞または生物における遺伝子の機能を検査する方法の好ましい実施形態において、本方法の核酸改変は、遺伝子サイレンシング（＝遺伝子発現のダウンレギュレーション）、好ましくは、標的mRNAの分解または、標的RNAの翻訳阻害である。
本発明の別の態様は、遺伝子産物に薬剤が作用するか否かを評価する方法であって、
a.上記遺伝子に対応する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞または生物の中へ導入し、それによって試験細胞または試験生物を作製するステップと；標的遺伝子の改変が起こる条件下で試験細胞または試験生物を維持するステップと；c.薬剤を試験細胞または試験生物の中へ導入するステップと；d.ステップcで作製された試験細胞または生物の表現型を観察し、場合により、観察された表現型を適切な対照細胞または対照生物の表現型と比較し、それによって、遺伝子産物に対して薬剤が作用するか否かについての情報を提供するステップとを含む、方法である。
遺伝子または遺伝子産物に対して薬剤が作用するか否かを評価する方法の好ましい実施形態において、本方法の核酸改変は、遺伝子サイレンシング（＝遺伝子発現のダウンレギュレーション）、好ましくは、標的RNAの分解または、標的RNAの翻訳阻害である。遺伝子産物に対して薬剤が作用するか否かを評価する方法の好ましい実施形態では、方法は、細胞培養物中、試験管内、または生体内で実施される。さらに別の実施形態において、方法は、単離細胞に対して実施される。
本発明のオリゴヌクレオチドは研究目的にも有用である。例えば、化学修飾オリゴヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチドを使用して遺伝子の機能を研究することができる方法は、周知である。これは、細胞膜透過が可能な条件下で細胞培養物にオリゴヌクレオチドを添加することを含む。標的遺伝子または標的核酸に相補的となるように配列を設計することにより、そのようなRNA/核酸標的化の効果を評価することができる。これは、例えば、その所与の遺伝子の発現の重要性および効果の評価を可能にする。したがって、この研究は、所定の遺伝子の発現の関連性を評価するために重要であり得る。所与の疾患の発症のために、このような遺伝子によってコードされるタンパク質。したがって、本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドを含有する試薬を提供する。試薬は、賦形剤、例えば上に記載した任意の1つ以上をさらに含有してもよい。
実施例1.アシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーの合成
本発明のいくつかのアシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーは、以前に合成されたことがあり、自動オリゴヌクレオチド合成のためのそれらのホスホロアミダイト構築ブロックを調製する手順は報告がなされている[Madsen,A.S.ら、J.Org.Chem. 2012、77、10718] [Johannsen,M.W.ら、Org.Biomol.Chem.、2011、9、243][I.K.AstakhovaおよびJ.Wengel、Acc.Chem.Res.、2014、47、1768およびその中で引用されている参考文献]。これらの方法は、当業者に周知となろうものであり、他のアシル−アミノ−LNAモノマーおよびヒドロカルビル−アミノ−LNAモノマーのホスホロアミダイト構築ブロックの合成に用いることができる。
実施例2.本発明のオリゴヌクレオチドの合成
本発明のオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の自動オリゴヌクレオチド合成によって調製される。本発明のオリゴヌクレオチド中への本発明のアシル−アミノ−LNAモノマーおよびアルキルアミノLNAモノマーの組み込みは、公開 [Johannsen,M.W.ら、Org.Biomol.Chem.、2011、9、243] [I.K.AstakhovaおよびJ.Wengel、Acc.Chem.Res.、2014、47、1768およびその中で引用されている参考文献]されているようなわずかな改変を伴ってオリゴヌクレオチドの合成、後処理、精製および単離のための標準的な方法[F.Eckstein、Oligonucleotides and Analogues、IRL Press 、Oxford University Press、1991]に従う。
本発明のアシル−アミノ−LNAおよびヒドロカルビル（例えばアルキル）−アミノ−LNAの構造を以下に例示する（MeCは5−メチルシトシン−1−イルを表す）。
比較用のLNAヌクレオチドモノマーの構造：
ピリミジンアセチルアミノLNAモノマーの構造：
ピリミジンパルミトイルアミノLNAモノマーの構造：
ピリミジングリシルアミノLNAモノマーの構造[注：アシル置換基のアミノ基は生理学的pHでプロトン化されることになる]：
実施例3.ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性
非支援型送達を用いる、つまり導入剤を全く加えない細胞培養での比較研究において、過半数が標準的LNA−DNA−LNA（3−9−3）型である一連のギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの中でも下記アンチセンスオリゴヌクレオチド：
配列番号27： 5'−lG XX− dC dT dC dG dA dG dC dG dT−XX lC [全てPSのヌクレオシド間結合]
は最も良好であり、式中、IGおよびlCは、LNAヌクレオチドであり、dC、dA、dGおよびdTはDNAヌクレオチドであり、Xは、ピリミジングリシルアミノLNAモノマー（上記構造を参照）を表す。
同様の研究において、例えば下記の構成：
配列番号28： 5'−IG P L−dC dT dC dG dA dG dC dG dT−L P IC [全てPSのヌクレオシド間結合]、
配列番号29： 5'−IG P X−dC dT dC dG dA dG dC dG dT−X P IC [全てPSのヌクレオシド間結合]
の配列もまた効率的であり、式中、PはチミジンパルミトイルアミノLNAモノマー（上記構造を参照）であり、dC、dA、dGおよびdTはDNAヌクレオチドであり、1Tおよび1GはLNAヌクレオチドであり、LはピリミジンLNAモノマーであり、XはグリシルアミノLNAモノマー（上記構造を参照）である。
この実験に基づいて、下記のことが結論付けられる：
a）本発明のアンチセンス構築物が、非支援型送達（「裸状送達」）条件下において標的遺伝子のサイレンシング（すなわちダウンレギュレーション）に有効であること、および
b）パルミトイルアミノLNAモノマーを2つのウィングの各々の中に有する状態で、本発明のヌクレオチド構築物のアミノLNAモノマーがLNA（アミノLNA）−DNA−LNA（アミノLNA）ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方の「ウィング」の中に同時に位置することができ、そのような構築物が生物学的に活性であること。
実施例4.本発明のギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのアルブミン結合性
アルブミン結合性について評価したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）の概略図を図1に示す。以下の表は、パルミトイル化アミノLNAモノマーの数、およびONNがホスホロチオエート（「+」）ヌクレオシド間結合を有するか否かをまとめたものである。その欠如（「−」）は、ヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であることを意味する。

6つのオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：

ON7451 5'−TAGcctgtcacttCTC（全PO型） 配列番号1
ON7452 5'−PAGcctgtcacttCTC（全PO型） 配列番号2
ON7453 5'−PAGcctgtcacttP*TC（全PO型） 配列番号3
ON7454 5'−TAGcctgtcacttCTC（全PS型） 配列番号4
ON7455 5'−PAGcctgtcacttCTC（全PS型） 配列番号5
ON7456 5'−PAGcctgtcacttP*TC（全PS型） 配列番号6

PおよびP*はそれぞれパルミトイル−アミノ−LNAチミンモノマーおよびパルミトイル−アミノ−LNA 5−メチル−シトシンモノマーを表す。A、C、GおよびTはLNAモノマーを表し、a、c、gおよびtはDNAモノマーを表す。
アルブミン対ODN比の力価測定を行ってアルブミンに対する脂肪酸複合化アミノLNA修飾ODN（ここでは例としてパルミトイルアミノLNA修飾ODN）の結合性を視覚化した。これは、6つのODN全てについて行った（図2−1、図2−2および図2−3）。ゲル実験は、XCell SureLock（商標）Mine−Cell電気泳動システムを使用するか、Novex（商標） 8％ポリアクリルアミドゲル1X TBE緩衝液、12ウェル（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用するか、または市販でないチャンバにおいてProtoGel 30％（National Diagnostics、ソマーヴィル、ニュージャージー州）を使用して行った。試料は、Novex（商標）TBE泳動用緩衝液（5X）（Invitrogen）を使用して装填した。ゲルに1×TBE緩衝液（10×原液からのもの、Gibco、Live Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州）を流した。ODNの染色は、標準プロトコルに従ってSYBR−Gold核酸染色剤（Invitrogen）を使用して行った。
図2−1中の2つのゲルは、アルブミンと共に4時間保温した後での、ODN（特にホスホジエステルヌクレオシド間結合を含むODN）中の1つ（ON7452；左側）または2つ（ON7453；右側）のパルミトイルアミノLNA修飾との複合体形成を示す。1つのパルミトイルアミノLNA修飾を有するODNとアルブミンとの間での明確な相互作用は、40：1のアルブミン：ODN比においてさえ、観察されない。対照的に、2つのパルミトイルアミノLNA修飾を有するODN（ON7453）は、低いアルブミン：ODN比においてさえ、アルブミンと結合し、40：1のアルブミン：ODN比では遊離ODNが全く観察されない（図2−1、右）。パルミトイルアミノLNA修飾を全く有さない対照ODN（ON7451）は、40：1のアルブミン：ODN比においてアルブミンとの結合を全く示さなかった（図2−1中の2つのゲルの左側のレーン）。
ホスホロチオエート結合を有するODNで同様の実験を行った（図2−2）。パルミトイルアミノLNA修飾を有さないODN（ON7454）の場合（40：1のアルブミン：ODN比）、アルブミンが位置するところに小さいバンドが現れるが、アルブミン単独の場合に同じバンドが現れるので、それはアルブミンに対するSYBR金の非特異的結合に起因して出現している可能性が最も高い（図2−2中の2つのゲルの左側のレーン）。主ODNバンドのすぐ上の小さいバンドも観察されるが、アルブミンとは関連せず、ODN凝集物の存在を反映している可能性が最も高い。1つのパルミトイルアミノLNA修飾を有するODN（ON7455）の場合、アルブミンとのいくらかの相互作用が観察されたが、アルブミンに結合した有意な量のODNを得るにはかなり余剰な量のアルブミン（40：1）が必要であった（図2−2、左）。2つのパルミトイルアミノLNA修飾を有するODN（ON7456）は、最も小さいアルブミン：ODN比（0.625：1）において既にアルブミンと結合し始め、10：1のアルブミン：ODN比では既に全てのODNがアルブミンと結合している（図2−2、右）。
アルブミン結合のために脂肪酸単位が重要であることをさらに強調するために、パルミトイルアミノLNA修飾を有さない2つのODNを使用した研究に着手した（図2−3）。以下から分かるように、ホスホジエステル結合を有するODN（ON7451）についてもホスホロチオエート結合を有するODN（ON7454）についてもアルブミンに対する有意な結合性は観察されなかった。
これらの結果に基づいて、本発明者らは以下の結論を下す：
（a）2つの脂肪酸アミノLNA単位に連結したODNは、アルブミンに対して高い結合性を示す。
（b）2つのパルミトイルアミノLNA修飾を有するODNは、アルブミンに対して高い結合性を示す。
（c）2つのパルミトイルアミノLNA修飾を（LNA−DNA−LNAギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの各末端に1つずつ）有するODNは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
（d）2つのパルミトイルアミノLNA修飾を（LNA/DNAまたはLNA/2'−OMe−RNAミクスマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの各末端に1つずつ）有するODNは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
（e）ホスホジエステル結合を含有し、ホスホロチオエート結合を全く含有しないが2つのパルミトイルアミノLNA修飾を有するODNは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
ホスホロチオエート結合は、アルブミンに対するパルミトイルアミノNA修飾ODNの結合性を増加させ得る。
（1つ以上の）脂肪酸残基は、アルブミンに対するODNの効率的な結合に重要な構成要素であると考えられる。
実施例5.ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのアルブミン結合性
この実施例の背景にあるのは、以下の一般的知識である：
− アルブミンは、薬物キャリアとしての大きな潜在性を有する
− アンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）は、それらのホスホロチオエート形態において、腎臓によるそれらの迅速な排泄を防止するアルブミンおよびその他の血清タンパク質と結合し得る
− 脂肪酸残基は、アルブミンならびに、修飾/設計アルブミン誘導体および変異形と結合し得る。
アルブミン結合性について評価したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）の概略図を図3に示すとともに下記表に一覧で示す。

上に一覧で示したODNは、以下の配列を有する。

NAC7451 5'−TAGcctgtcacttCTC（全PO型） 配列番号1
NAC7452 5'−PAGcctgtcacttCTC（全PO型） 配列番号2
NAC7453 5'−PAGcctgtcacttP*TC（全PO型） 配列番号3
NAC7454 5'−TAGcctgtcacttCTC（全PS型） 配列番号4
NAC7455 5'−PAGcctgtcacttCTC（全PS型） 配列番号5
NAC7456 5'−PAGcctgtcacttP*TC（全PS型） 配列番号6

NAC7714 5'−TAGcctgtcacttCPP*（全PO型） 配列番号7
NAC7715 5'−TAGcctgtcacttCPP*（全PS型） 配列番号8
NAC7716 5'−MAGcctgtcacttCTC（全PO型） 配列番号9
NAC7717 5'−MAGcctgtcacttM*TC（全PO型） 配列番号10
NAC7718 5'−MAGcctgtcacttCTC（全PS型） 配列番号11
NAC7719 5'−MAGcctgtcacttM*TC（全PS型） 配列番号12

PおよびMはそれぞれパルミトイルアミノLNAチミンモノマーおよびミリストイルアミノLNAチミンモノマーを表し、P*およびM*はそれぞれパルミトイルアミノLNA 5−メチル−シトシンモノマーおよびミリストイルアミノLNA 5−メチル−シトシンモノマーを表す。A、C、GおよびTはLNAモノマーを表し、a、c、gおよびtはDNAモノマーを表す。
実施例4および一般的開示において、遠位に位置する2つのそのような脂肪酸複合化アミノLNA修飾（例えば、パルミトイルアミノLNA残基）を含有するオリゴヌクレオチドが開示され、そのような「分離構造」は、ホスホジエステル系またはホスホロチオエート系のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する高いアルブミン結合性を達成するためには特に好ましい構造であることが示された。実施例4において、NAC7451、NAC7452、NAC7453、NAC7454、NAC7455およびNAC7456のODNは、本発明を支持するためにデータが報告されており、この実施例において比較のために用いられ得る。
NAC7716、NAC7717、NAC7718およびNAC7719について以下に報告されるデータは、遠位に位置する2つのミリストイルアミノLNAモノマー（NAC7717およびNAC7719）が、遠位に位置する2つのパルミトイルアミノLNAモノマー（NAC7453およびNAC7456）の場合と類似したアルブミン結合性を誘起することを示す。しかしながら、この実施例でオリゴヌクレオチドNAC7714およびNAC7715について報告されたデータは、驚くべきことに、2つのアシル−アミノ−LNAモノマー（ここではパルミトイルアミノLNAモノマー）が近接して位置することが同様にヒト血清アルブミンに対する強固な結合を誘起することを示す。このタンパク質は脂肪酸残基に対する結合部位を有することが知られているが、NAC7714およびNAC7715の場合のように、オリゴヌクレオチドの同じ半セグメントの中に非常に近接して位置する2つのアシル鎖が、そのような高いアルブミン結合性を促進できると分かるのは大いに驚きである（図4〜図9および以下の説明を参照）。
アルブミン／オリゴヌクレオチド複合体形成についてのデータ
アルブミン対ODN比の力価測定を行ってアルブミンに対するODNの結合を視覚化した。結果は、図4〜図9にPO−ODNの結果を左側、PS−ODNの結果を右側に示してゲルで表現する。アシル−アミノ−LNAモノマーが存在しないPO−およびPS−オリゴヌクレオチドでは、有意なアルブミン結合は観察されない。パルミトイルアミノLNAモノマーを1つ有するPO−ODNの場合、アルブミンの量がかなり余剰（40：1）であるときでさえ、アルブミンとの非常に弱い相互作用しか観察されない。PS−ODNの場合には、5：1のアルブミン：ODN比から始まってアルブミンに対する弱い結合が見られる。遠位に位置する2つのパルミトイルアミノLNAモノマーを有するPO−ODNの場合、5：1のアルブミン：ODN比から始まってアルブミンとの相互作用が観察される。PS−ODNの場合には、アルブミンに対するいっそう強固な結合が観察される。3'末端に2つのパルミトイルアミノLNAモノマーを有するPO−ODNの場合、アルブミン対ODNの割当てが最も低いときでさえ、アルブミンに対する強固な結合が観察される。対応するPS−ODNの場合には、わずかにより強固な結合が観察される。ミリストイルアミノLNAモノマーを1つ有するPO−ODNの場合、アルブミンとの有意な相互作用は観察されない。対応するPS−ODNの場合には、5：1のアルブミン：ODN比から結合の兆候が見られる。
遠位に位置する2つのミリストイルアミノLNAモノマーを有するPO−ODNの場合には、5：1のアルブミン：ODN比からいくらかの結合が観察されるが、他方、対応するPS−ODNは、最も低いアルブミン：ODN比において既に結合性を示す。
この例に基づいて、本発明者らは以下の結論を下す：
a）2つの脂肪酸官能基化アミノLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
b）2つのパルミトイルアミノLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
c）2つのミリストイルアミノLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
d）近接して位置する2つのパルミトイルアミノLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
e）近接して位置する2つのパルミトイルアミノLNAモノマーを含有するギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
f）ホスホジエステル（PO）結合を有し2つの脂肪酸アミノLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは、アルブミンに対する高い結合性を示す。
g）ホスホロチオエート結合（PS）結合を有し2つの脂肪酸アミノLNAモノマーを含有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（PO）結合を有する対応するオリゴヌクレオチドの場合に比べてアルブミンに対するより高い結合性を示す。
h）アシル−アミノ−LNAモノマー中に存在する（1つ以上の）脂肪酸残基は、アルブミンに対するODNの非常に効率的な結合を誘起する重要な構成要素であると考えられる。
実施例6：アプタマーAS1411および11−merアプタマーのCD−133に対する誘導体化。
以下に示す実施例では、アプタマー配列中に含有しているヌクレオチドモノマーに対して以下の記号表示を用いる。
小文字：DNAヌクレオチド
大文字：LNAヌクレオチド
P：パルミトイルアミノLNA−Tヌクレオチド
P*：パルミトイルアミノLNA−5−メチル−Cヌクレオチド
uC：UNA−Cヌクレオチド
fC、fU：2'−フルオロ−2'−デオキシヌクレオチド
rA：RNA−Aヌクレオチド
mG：2'−O−メチル−RNAヌクレオチド
Cy5 蛍光シアニン色素標識（構築ブロックは市販されている）
AS1411は、26−merの全DNA配列である（全てのヌクレオシド間結合はPOである）。親AS1411の配列を以下に示す：
5'−ggt ggt ggt ggt tgt ggt ggt ggt gg 配列番号13
一例において、2つのパルミトイルアミノLNAモノマーをAS1411の3'末端に直接連結した：
5'−ggt ggt ggt ggt tgt ggt ggt ggt ggpP（全PO結合） 配列番号14
別の例では、2つのパルミトイルアミノLNAモノマーを、三量体ヌクレオチドリンカー（ttt）を介してAS1411の3'末端に連結した：
5'−ggt ggt ggt ggt tgt ggt ggt ggt ttP P（全PO結合） 配列番号15
以下は、例えば結腸癌細胞上およびその他の固形腫瘍上に過剰発現されることが既知でありかつ癌幹細胞マーカーと考えられているCD133エピトープと結合することが示されたアプタマーの配列を示している。
5'−Cy5−CtfCuCfUrAfCrAfUAmG 配列番号16
一例では、5'末端の方の2つのLNAを2つのパルミトイルアミノLNAモノマーで置き換えることにより、このアプタマーに2つのパルミトイルアミノLNAモノマーを導入した：
5'−Cy5−P*PfCuCfUrAfCrAfUAmG 配列番号17
この実施例は以下のことを実証する：
− 本発明のアプタマーは、様々な構築物として設計および合成することができる。
− アシル−および／またはアルキル−アミノLNAモノマーは、親アプタマーに比べて余分なヌクレオチドとして、、かつ／または親アプタマーのヌクレオチドの1つ以上を置き換えることによって、かつ／または追加のリンカー単位によって、一方の末端に組み込まれることができる。
− 本発明のアプタマーは、天然のヌクレオチドならびに様々な修飾ヌクレオチドならびにアシル−および／またはアルキル−アミノLNAモノマーを含有し得る。
− 本発明のアプタマーは、蛍光基のような複合部分を含有してもよく、またはその他の基、例えばレポーター基と複合化されてもよい。
実施例7：脂肪酸修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、増大した循環半減期、および変化した生体内分布を示す。
この実験は、2つのアシル−またはアルキル−アミノLNAモノマーで修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）がアルブミンに結合するという先の観察（上記参照）を探求するために設けた。目的は、2つのアシル−またはアルキル−アミノLNAモノマーで修飾されたODNが治療上関連性のある特性を示すか否かについて研究することであった。
先の実施例は、本発明のパルミトイル化ODNがヒト血清アルブミンと結合することを示した。5'末端に連結した蛍光標識Cy5.5を各々有する下記のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）が含まれた。

NAC7834 5'−Cy5.5−TAGcctgtcacttCTC（全PO型） 配列番号18
NAC7833 5'−Cy5.5−TAGcctgtcacttCTC（全PS型） 配列番号19
NAC7836 5'−Cy5.5−TAGcctgtcacttCPP*（全PO型） 配列番号20
NAC7835 5'−Cy5.5−TAGcctgtcacttCPP*（全PS型） 配列番号21

PおよびP*はそれぞれパルミトイルアミノLNAチミンモノマー単位およびパルミトイルアミノLNA 5−メチル−シトシンモノマー単位を表す。A、C、GおよびTはLNAモノマーを表し、a、c、gおよびtはDNAモノマーを表す。Cy5.5は蛍光シアニン色素標識である（オリゴヌクレオチドに組み込むための構築ブロックは市販されている）。これらのオリゴヌクレオチドは、以前に研究された配列NAC7451、NAC7454、NAC7714およびNAC7715の誘導体である。
アルブミン/ODN複合体形成
先に試験した非蛍光ODNで観察された結合を発蛍光団が妨害しないことを確認するために、最初に、生体内での半減期研究のためのCy5.5蛍光標識ODNを様々な濃度のアルブミンと共に4時間保温した。図10および図11はPAGEゲルを示し、左側では、PO結合を有するODNを研究し、右側では、PS結合を有する右側ODNを研究した。
パルミトイル基を有さないODNの場合、PS結合を有さないODNに対しては結合が全く観察されない。パルミトイルを有さないがPS結合を有するODNの場合には、（非常に）わずかな結合が観察される。
ODNの3'末端に2×パルミトイルを有するODNの場合、PS結合を有するODNについても、PS結合を有さないODNについても、アルブミン対ODNの最も低い比率で結合が観察される。全体的に、5'−Cy5.5発蛍光団を有するODNでは、標識を有さないODNの場合と同じ傾向が観察される。
生体内での循環半減期
Cy5.5蛍光標識ODNを、8〜9週齢の雌のC57BL/6マウスの尾静脈に静脈注射した。マウスに3.5mg/kgのODNが総体積200μlで投与された。1分後に舌から血液を採取し、30分後、2時間後、4時間後および24時間後に尾から血液を採取した。血漿を単離し、IVISスキャナで走査した。24時間後、動物を屠殺し、器官および主要部分をIVISスキャナで走査した。実験の時間表は図12中の上部に示されている。
裸状のODNと比較して、パルミトイル化ODNであるNAC7835およびNAC7836については、増大した半減期が観察される（図12参考（研究したオリゴヌクレオチドの図13の概略図も参照））。さらに、PO結合を有するODNと比較して、PS結合を有するODNについては、増大した半減期が観察されるが、NAC7836（全てPOの結合）ではNAC7834（全てPOの結合を有する参照）およびNAC7833（全てPSの結合を有する参照）のいずれと比較しても増大がなおいっそう顕著である。指数関数的減衰曲線に近似すると、以下の半減期が得られた：23分、28分、49分および66分（それぞれPO [NAC7834]、PS [NAC7833]、PO 2xpal [NAC7836]およびPS 2xpal [NAC7835]）。注目すべきことに、全PO型 ODN [NAC7834]をパルミトイルで修飾[NAC7836]すると、循環半減期が2倍超に増大した。
器官内分布
器官を走査することによって、非パルミトイル化ODN [NAC7834およびNAC7833]の場合には腎臓内での蓄積が明らかとなり、PO ODN [NAC7834]の場合には蓄積がより高かった（図14参考）。しかし、2xpal ODNの場合には器官全体に亘ってよりいっそう均一な分布が観察され（図14および図15）、NAC7836およびNAC7835の中に存在する2つのパルミトイルアミノLNAモノマーが全て、対応する非パルミトイル化ODNであるNAC7834およびNAC7833に比べて腎臓でより少なく蓄積しかつ肝臓および脾臓でより多く蓄積することで生体内分布に影響を与えるということを意味している。得られたデータは、本発明の構築物を適用することによって数々の器官への生体内分布に影響を与えることができることを指し示している。パルミトイルアミノLNAモノマーを2つの含有するODNについて観察された、生体内での循環半減期の増大および生体内分布様式の変化は、先の実施例で実証されたようにアルブミンに対する結合の増加によって説明される可能性がある。
実施例8.共焦点顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって研究した軟骨細胞での非支援型取り込み
以下に列挙するギャップマーをこの研究に含めた：

NAC7771 5'−Cy3−GTCctcgagcgtCTC（全PS型） 配列番号22
NAC7772 5'−Cy3−GPCctcgagcgtCPC（全PO型） 配列番号23
NAC7773 5'−Cy3−GPCctcgagcgtCPC（全PS型） 配列番号24
NAC7774 5'−Cy3−GT*C*ctcgagcgtC*T*C（全PS型） 配列番号25
NAC7775 5'−Cy3−GT**CctcgagcgtCT**C（全PS型） 配列番号26

PはパルミトイルアミノLNAチミンモノマーを表す。T*およびC*はそれぞれグリシルアミノLNAチミンモノマーおよび5−メチルシトシンモノマーを表す。T**は、ベータ配置のガラクトシル単位のN2'原子とO1原子との間に−C（=O）CH2−リンカーを有する（つまり、N2'−C（=O）CH2−O−O1リンカー）、ガラクトシル官能基化アミノLNAチミンモノマーを表す。A、C、GおよびTはLNAモノマーを表し、a、c、gおよびtはDNAモノマーを表す。
ヒト軟骨細胞と共に保温したときの50nMでのギャップマー取り込みの共焦点顕微鏡分析を24時間後に行った。核をHoechstで染色し、ギャップマーをCy3（赤色）で標識した。元の倍率は40x。結果を図16（上部）に示す。対照は、Cy3標識オリゴヌクレオチドを全く加えないものである。取り込みはまた、ヒト軟骨細胞と共に保温したときの50nMでのギャップマー取り込みのフローサイトメトリー分析を用いて24時間後に評価した（図16、下）。
LNA−DNA−LNAギャップマー対照（NAC7771；全てPS結合）は、予想されるとおり、導入剤を全く添加しない非支援型取り込み条件を用いて効率的に軟骨細胞内に取り込まれる、と結論付けることができる。パルミトイルアミノLNAモノマーを2つ有するオリゴヌクレオチドもまた、全PO型（NAC7772）誘導体および全PS型（NAC7773）誘導体のいずれとしても、導入剤を全く添加しない非支援型取り込み条件を用いて効率的に軟骨細胞内に取り込まれる。全PO型変異形NAC7772の取り込みは、全PS型変異形NAC773の取り込みよりも効率的であることに留意すべきである。さらに、4つのグリシルアミノLNAモノマー（NAC7774；全PS型）を有するオリゴヌクレオチド、および2つのガラクトシル官能基化アルキルアミノLNAモノマー（NAC7775；全PS型）を有するオリゴヌクレオチドは、導入剤を全く添加しない非支援型条件を用いて効率的に軟骨細胞内に取り込まれる。
以下の4つのデンマーク優先権出願の内容は参照によってそれらの全体が本明細書に含まれる：2015年2月15日に出願されたPA 2015 00090、2015年8月8日に出願されたPA 2015 00440、2015年11月10日に出願されたPA 2015 00711、およびPA 2015 00712。

Claims (16)

  1. 動物またはヒトの治療における使用のための一本鎖オリゴヌクレオチドであって、該一本鎖オリゴヌクレオチドが２つ以上のアシル−アミノ−ＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有し、他のヌクレオチドモノマーをＤＮＡヌクレオチドモノマー、ＲＮＡヌクレオチドモノマーまたは化学修飾ヌクレオチドモノマーとすることができ；
    該オリゴヌクレオチドのモノマーが、ホスホジエステル結合および／またはホスホロチオエート結合および／またはホスホトリエステル結合で結合しており、
    該各アシル−アミノ−ＬＮＡモノマーのアシル基が、独立して、非置換であるか、または、ヒドロキシル、アミノ、チオ、オキソ、アルキルチオ、エーテルおよびチオールから選択される１つ以上の置換基で置換されており、
    該各アシル−アミノ−ＬＮＡモノマーのアシル基が、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｒであり、Ｒが、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ６−Ｃ１５アルキルである、
    一本鎖オリゴヌクレオチド。
  2. 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも５０％がホスホジエステル結合である、および／または
    前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドモノマーのうちの４０％以下がリボヌクレオチドモノマーである、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  3. 前記オリゴヌクレオチドが、コレステリル部分と結合した１つまたは２つのヌクレオチドモノマーを含有する、請求項１または２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  4. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも７個のヌクレオチドモノマー単位を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  5. ギャップマー、アプタマーまたはミクスマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  6. 前記オリゴヌクレオチドが、５’末端から３’末端に、３つのセグメント：少なくとも２ヌクレオチド単位の５’末端セグメントと、少なくとも６ヌクレオチド単位の長さの中央結合セグメントと、少なくとも２ヌクレオチド単位の長さの３’末端セグメントとを有し、そして、
    該オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの２’−Ｎ−アシル−２’−アミノ−ＬＮＡヌクレオチドモノマーを、５’末端セグメントもしくは３’末端セグメントのどちらかの中には含有するがしかし中央セグメント中には全く含有しないか；または、少なくとも１つの２’−Ｎ−アシル−２’−アミノＬＮＡヌクレオチドモノマーを、前記末端セグメントの各々の中には含有するがしかし中央セグメント中には全く含有しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  7. 遺伝子サイレンシングが起こる条件下で、細胞を、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、該細胞において遺伝子サイレンシングを媒介するイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での方法。
  8. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを媒介として、標的遺伝子または標的ＲＮＡのサイレンシングを媒介するために、前記細胞において発現される該標的遺伝子または標的ＲＮＡに対して相補性を有する、請求項７に記載の方法。
  9. ２つ以上のアシル−アミノ−ＬＮＡヌクレオチドモノマーが、グリシルアミノＬＮＡモノマー、パルミトイルアミノＬＮＡモノマー、およびミリストイルアミノＬＮＡモノマーから選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 前記オリゴヌクレオチドが、細胞透過性ペプチド、コレステロール、ガラクトースまたはアルファ−トコフェロールから選択される１つ以上の複合基を含有し、該複合基が該オリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端に連結されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 請求項１〜６および９〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは補助薬とを含む、医薬組成物。
  12. 該アシル−アミノ−ＬＮＡヌクレオチドモノマーのアシル部分が、Ｎ−アルカノイル、Ｎ−アルケノイルおよび／またはＮ−アルキノイル部分であり、各アシル部分が、非置換であるか、または、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ６−ＮＨ−、（Ｃ１−Ｃ６）２−Ｎ−、オキソ、チオールおよびＣ１−Ｃ６アルキルチオから選択される１つ以上の基で置換されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを媒介とするアンチセンスＲＮＡ標的化によって遺伝子調節を媒介するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. 少なくとも２つのアシル−アミノ−ＬＮＡモノマーがオリゴヌクレオチドの５’末端半分またはオリゴヌクレオチドの３’末端半分のいずれか中に存在し、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドモノマーの総数が奇数であるならば中心ヌクレオチドモノマーが５’末端半分の部分である、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
  15. 前記オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子または標的ＲＮＡに対する相補性を有し、相補性が、ＲＮアーゼＨを媒介して、標的遺伝子または標的ＲＮＡのサイレンシングを媒介する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  16. 請求項１〜６、９〜１０および１２〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含有する試薬。
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