CN104245935B

CN104245935B - 三环硫代磷酸酯dna

Info

Publication number: CN104245935B
Application number: CN201280057688.6A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂安·卢曼; 路易斯·加西亚; 托马斯·沃伊特
Original assignee: France National Medical Association Of Health And Research; Universitaet Bern; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Association Institut de Myologie
Current assignee: France National Medical Association Of Health And Research; Universitaet Bern; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Association Institut de Myologie
Priority date: 2011-10-13
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2032-10-12
Also published as: EP2766479B1; IN2014DN03463A; EP2581448A1; PL2581448T3; CA2776651C; BR112014009066B8; ES2535654T3; US9738891B2; BR112014009066B1; JP2015501144A; JP6181653B2; EP2581448B1; CA2776651A1; PT2581448E; CN104245935A; ES2651216T3; BR112014009066A8; WO2013053928A1; EP2766479A1; DK2581448T3

Abstract

本发明涉及含有由核苷间硫代磷酸酯键相连的三环核苷序列的核酸分子。本发明还涉及合成的反义寡核苷酸及其使用方法。

Description

三环硫代磷酸酯DNA

发明领域

发明背景

三环DNA(tc-DNA)是一类受限DNA类似物，其中通过引入环丙烷环对每个核苷酸进行修饰，以限制骨架的构象柔性并优化扭转角γ的骨架几何学。同碱基的含有腺嘌呤和含有胸腺嘧啶的tc-DNA与互补的RNA形成格外稳定的A-T碱基对。

最近，本发明人提出将这类核酸的有利性质使用在反义寡核苷酸中，用于大量疾病的治疗。国际申请号PCT/EP2010/054735公开了合成的反义寡核苷酸，以及使用反义寡核苷酸来改变pre-mRNA加工期间发生的剪接事件或下调含有重复序列例如3'或5'CUG、CAG和/或CCUG的突变的mRNA的表达的方法。更具体来说，已显示，三环DNA反义寡核苷酸有效地促进pre-mRNA加工期间的外显子跳跃，掩蔽pre-mRNA中的内含子沉默序列和/或茎-环序列，以及靶向RNase介导的mRNA的破坏。

杜氏肌营养不良(DMD)是最常见的遗传性肌病，3,500名男性中约有1人患有此病，与种族无关。DMD的最主要后果是肌纤维变得特别脆，并且自然的肌肉活动就会激起肌肉组织的普遍损伤。肌萎缩蛋白的缺乏使肌纤维特别容易受到机械应力的攻击，并经历反复发作的坏死循环。结果，患者表现出骨骼肌的渐进性虚弱，所述骨骼肌随着时间被脂肪纤维组织替换，导致在12岁左右丧失行走能力，随后在十几岁至三十几岁之间由呼吸衰竭或心肌病导致过早死亡。此外，约三分之一的DMD患者还表现出认知缺损，表明神经元和脑功能的值得注意的破坏。DMD影响所有随意肌，并在疾病的较晚阶段涉及心肌和呼吸肌。因此，被执行用于治疗或减轻DMD患者的症状的任何疗法应该优选地靶向心脏和CNS。

寻找到一类新的化合物，其在与三环DNA寡核苷酸相比时具有提高的效率。本发明描述了三环硫代磷酸酯核苷酸的合成、性质和用途。

发明概述

本发明人已令人吃惊地显示，包含三环硫代磷酸酯核苷酸的核酸分子除了它们与tc-DNA分子共有的在广范围的肌肉中有活性的能力之外，在穿透心脏组织中也高度有效，并且在心脏细胞中具有高活性。还已显示，这样的三环硫代磷酸酯核苷酸在系统递送后能够在CNS中挽救蛋白质、尤其是肌萎缩蛋白的表达。因此，本发明人显示了包含三环硫代磷酸酯核苷酸的核酸分子跨过血脑屏障的出人意料的性质。

因此，本发明涉及包含通过核苷间硫代磷酸酯键(3'-OPS-O-5'键)相连的三环核苷的核酸分子。本发明的核酸分子在本公开中也被称为“三环硫代磷酸酯DNA”或“tc-DNA-PS”。

本发明还涉及包含tc-DNA-PS和载体的组合物。具体来说，所述组合物可以是药物组合物，其中所述载体是可药用载体。本发明的组合物还可以任选地包含其他活性药剂。

本发明还涉及用于合成tc-DNA-PS分子的方法。

本发明的核酸分子作为反义寡核苷酸(AON)特别有用，尤其是用于在肌肉和心脏细胞中或在CNS中获得反义效果，尤其是在AON的系统递送之后。因此，本发明还提供tc-DNA-PS AON。

由于本发明人已显示在系统递送之后，本发明的tc-DNA-PS AON可以在肌肉、心脏组织和CNS中校正肌萎缩蛋白的表达，因此本发明还涉及利用tc-DNA-PS AON来治疗疾病的方法。代表性的疾病包括例如心脏病如由cMYBP-C突变引起的肥厚型梗阻性心肌病，以及神经肌肉疾病例如杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩和Steinert肌强直性营养不良。更广义来说，本发明涉及在对象的细胞中校正异常基因表达的方法，所述方法包括向所述对象给药tc-DNA-PS反义寡核苷酸，其中所述tc-DNA-PS反义寡核苷酸与所述基因编码的RNA的一部分互补。在优选实施方式中，将所述tc-DNA-PS反义寡核苷酸以足以校正所述异常表达的量外周给药于所述对象。优选的外周给药包括系统性注射例如静脉内、皮下、腹膜内或动脉内注射。

本发明还涉及由对象的组织或细胞中的异常基因表达引起的遗传疾病的治疗方法，所述方法包括向所述对象给药tc-DNA-PS反义寡核苷酸，其中所述tc-DNA-PS反义寡核苷酸与所述基因编码的RNA的一部分互补。优选地将tc-DNA-PS反义寡核苷酸以足以校正所述异常表达的量外周给药于所述对象。具体来说，所述组织或细胞可以选自肌肉、心脏和CNS组织或细胞。

已显示，在皮下或静脉内/腹膜内系统施药后，本发明中的Tc-DNA-PS在血流中被运输到所有骨骼肌、CNS和心肌，并被这些组织摄取。

从下面本发明的详细描述，其他目的和应用将变得显而易见。

附图描述

图1示出了在mdx小鼠中用于肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子23跳跃的PMO吗啉代、2'O-Me-PS-RNA、Tc-DNA和Tc-硫代磷酸酯DNA寡核苷酸的化学结构和序列。

图2是mdx突变和用于肌萎缩蛋白挽救的剪接-切换的基本原理的示意图。mdx突变由肌萎缩蛋白基因的外显子23中的单碱基变化(C至T转变)构成(A)。这样的转变产生废止肌萎缩蛋白合成的提早形成的终止密码子(UAA)(B)。根据外显子23周围的外显子定相，可以在pre-mRNA剪接期间通过使用与参与外显子23定义的关键原动力退火的反义寡核苷酸，来跳过带有所述提早形成的终止密码子的外显子(C)。得到的缺少外显子23的mRNA可以被翻译成截短但仍有功能的肌萎缩蛋白。

图3示出了在tc-DNA-PS(M23D+2-13)的系统递送后，在mdx肌肉中广泛分布的肌萎缩蛋白挽救。

(A)在tc-DNA-PS的系统递送(剂量：200或50mg/kg体重/每周两次；路线：静脉内；持续时间：12周)之后，mdx肌肉中外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA的检测。在治疗结束后2周，通过以前所描述的巢式RT-PCR分析RNA样品。在包括心脏的所有被试验的肌肉中，检测到对应于外显子23被跳过的mRNA的688-bp片段。还用示意图示出了肌萎缩蛋白pre-mRNA(带有或不带有外显子23的跳跃)中存在的不同外显子，以及用于巢式PCR的引物在外显子20和26中的位置。

(B)从来自于被治疗小鼠的不同肌肉提取并用NCL-DYS1染色的总蛋白(50μg)的Western印迹。箭头指示在来自于正常肌肉的样品中检测到的用于比较的全长肌萎缩蛋白。注意，在这种类型的凝胶上，不能分辨野生型与被挽救的蛋白之间预期的8kD差异。

(C)通过Taqman qPCR分析的外显子跳跃的百分率(左图)和通过Western印迹评估的被挽救的肌萎缩蛋白的百分率(右图)。外显子23跳跃被表示成通过外显子4-5的表达水平所计算的总肌萎缩蛋白在使用内源对照归一化之后的百分率。为了对各种肌肉中恢复的肌萎缩蛋白的水平进行定量，通过扫描将膜转变成数值图片，并使用ImageJ1.46r软件分析条带强度。肌萎缩蛋白水平被表示为与野生型组织中的水平相比的百分率。分析包括每组3只动物。

图4是正常(A)、未治疗的mdx(B)肌肉和静脉内注射tc-PS寡核苷酸(+2-13)后12周的mdx小鼠肌肉(C)腓肠肌、(D)胫骨前肌、(E)横膈膜的肌萎缩蛋白免疫染色。(F和G)分别示出了在来自于野生型和被治疗mdx的心脏中的肌萎缩蛋白染色。核用Dapi复染。

图例说明：在用tc-DNA-PS寡聚体M23D(+2-13)系统治疗后，mdx肌肉中肌萎缩蛋白的检测。将Mdx小鼠每周用M23D(+2-13)的静脉内注射进行治疗，共12周，剂量为200mg/kg体重。在最后一次注射后2周，将肌肉剖下并处理，用于涉及使用NCL-DYS2单克隆肌萎缩蛋白抗体的染色的免疫荧光分析。(A和B)示出了正常和mdx肌肉的横切面。(C、D和E)示出了来自于被治疗mdx的肌肉样品的肌萎缩蛋白免疫标记：分别为腓肠肌、胫骨前肌和横膈膜。(F和G)分别示出了在正常心脏和被治疗的mdx中的肌萎缩蛋白染色。

图5示出了关于tc-PS寡核苷酸的静脉内与皮下递送的比较的实验。

将Mdx动物每周两次用100mg/kg通过静脉内(A)或皮下(B)注射递送的tc-DNA-PS(M23D+2-13)治疗8周。两种给药途径产生类似的结果，正如由来自于用NCL-DYS1单克隆抗体染色的肌肉样品的Western印迹分析所示出的(每条道装载有100μg总蛋白)。分析在治疗结束后2周进行。箭头指示在装载有野生型肌肉的道中检测到的全长肌萎缩蛋白。

图6显示了western印迹的照片，其示出了在用tc-DNA-PS寡聚体M23D(+2-13)系统治疗后，在mdx小鼠的心肌中肌萎缩蛋白的表达。

从用M23D(+2-13)tc-DNA寡聚体治疗的3只mdx小鼠(白色星形)(每两周一次以100mg/kg的剂量皮下和静脉内注射，共8周)(A)和在同样条件下用M23D(+2-13)tc-DNA-硫代磷酸酯(-PS)寡聚体治疗的3只mdx小鼠(黑色星形)(B)的心脏分离的总蛋白提取物(100μg载量)的Western印迹分析(使用肌萎缩蛋白NCL-DYS1单克隆抗体)的结果。箭头指示在相应的野生型对照的道中检测到的全长427kD肌萎缩蛋白，用于肌萎缩蛋白信号检测的半定量比较。将野生型心脏提取物在mdx心脏提取物中对于(A)来说稀释30至5％，并且对于(B)来说稀释10至1.25％，以便将蛋白的装载量归一化至每道100μg。

图7是巢式PCR反应的琼脂糖凝胶，其示出了在用tc-DNA M23D(+2-13)寡核苷酸或tc-DNA-PS M23D(+2-13)寡核苷酸治疗的mdx小鼠的CNS中肌萎缩蛋白pre-mRNA的跳跃。注射系统地进行或通过立体定位注射到小脑延髓池中。

图例说明：在用tc-DNA或tc-DNA-PS M23D(+2-13)寡聚体治疗后，mdx中枢神经系统中外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA的检测。将Mdx小鼠每两周一次用M23D(+2-13)(tc-DNA或tc-DNA-PS骨架)的皮下和静脉内注射进行治疗，共8周，剂量为100mg/kg体重。在最后一次注射后一周，将脑解剖出来并进行处理，用于外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA的检测。使用允许特异性识别作为398bp片段的被跳过的信使的引物(分别为与外显子20退火的Fo(out)/Fi(in)以及与外显子26和连接部22-24退火的Ro/Ri)，通过巢式RT-PCR来分析RNA样品。注意，由于Ri引物与外显子22-外显子24边界特异性退火，因此未被跳过的肌萎缩蛋白mRNA不被扩增，并且398-bp的条带只能在含有失去外显子23的肌萎缩蛋白mRNA的样品中被检测到。SM，尺寸标志物；第2道-未治疗的mdx小脑；第3至5道–在小脑延髓池中立体定位注射400μg M23D(+2-13)tc-DNA后一个月时mdx CNS中的皮层、海马和小脑；第6至8道–在用M23D(+2-13)tc-DNA系统性治疗后，3只mdx小鼠中的小脑(白色*)；第9至11道–在用M23D(+2-13)tc-DNA硫代磷酸酯(-PS)系统性治疗后，3只mdx小鼠的小脑(黑色*)。在使用仅仅25mg/kg/周的M23D(+2-13)tc-DNA-PS系统性治疗5周后，在皮层、海马和小脑中检测外显子23跳跃。注意，使用tc-DNA-PS寡聚体M23D(+2-13)的系统性治疗，在系统性给药后在CNS中挽救了肌萎缩蛋白mRNA，而tc-DNA形式需要脑内递送。

图8示出了在以两种不同剂量系统性递送tc-DNA-PS(M23D+2-13)后，mdx小鼠的CNS中的肌萎缩蛋白mRNA挽救。

(A)在系统性递送后，M23D tc-DNA-PS在CNS中的效应(剂量：200和50mg/kg/周；路线：静脉内；持续时间：12周)。使用特异性扩增外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA(398bp扩增子)的特异性引物，通过巢式RT-PCR对来自于全脑或小脑的RNA样品进行分析。使用来自于被治疗的mdx的胫骨前肌的样品作为阳性对照。(B)在被治疗的动物(每组n＝3)的全脑和小脑中通过Taqman qPCR分析的外显子跳跃的百分率。

图9示出的实验显示，tc-DNA-PS(M23D+2-13)的系统性递送改善了mdx表型。(A)与野生型和未治疗的mdx相比，治疗过的动物中的血清肌酸激酶水平(每组n＝3)。对于200mg/kg/wk来说P<0.001，对于50mg/kg/w来说p<0.05。(B)对于两种治疗方式(200或50mg/kg)来说，血清中的ALT和AST水平表明tc-DNA-PS不引发肝毒性。与未治疗的mdx小鼠相比P>0.05。(C)在tc-DNA-PS治疗的小鼠中肌肉功能的改善。分析治疗过的mdx小鼠的胫骨前肌(TA)肌肉的断面比力(对横截面积归一化的最大力)。对于200mg/kg/wk来说p<0.001，并且与未治疗的小鼠相比p<0.05。(D)通过在一系列3次离心收缩后测量力亏损，来评估力下降的百分率。数值证实了与未治疗的mdx相比，在治疗过的mdx动物中肌肉更具恢复力。在治疗过的小鼠(200和50mg/kg/wk)中的力降与野生型没有显著差异。

图10示出的实验显示了在dKO小鼠模型中，在tc-DNA-PS(M23+2-13)的静脉内递送后肌萎缩蛋白的挽救。

(A)用tc-DNA-PS(M23D+2-13)系统性治疗(剂量：200mg/kg/周；路线：静脉内和皮下交替)在dKO小鼠中避免了营养不良疾病的发作。与看起来健康的治疗过的同胎仔畜(右侧)相比，未治疗的12周龄dKO小鼠的照片(左侧)显示出强烈的脊柱后凸和关节挛缩。治疗在3周龄时开始。(B)在系统递送tc-DNA-PS(剂量：200mg/kg/周；路线：静脉内和皮下交替；持续时间：20周)后，在dKO肌肉中外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA的检测。在治疗结束后2周时，通过如前所述的巢式RT-PCR来分析RNA样品。在所有试验的肌肉包括心脏中，检测到对应于外显子23被跳过的mRNA的688-bp片段。(C–F)在来自于治疗过的dKO的肌肉的横断面上的肌萎缩蛋白免疫染色：(C)胫骨前肌；(D)腓肠肌；(E)横膈膜；(F)心脏。来自于未治疗动物的断面没有肌萎缩蛋白染色。将核用Dapi复染(蓝色)。(G)在5、11、18或20次注射后，在不同肌肉和脑中通过Taqman qPCR分析的外显子跳跃的百分率。

图11是示出了在治疗一年后的预期结果的图。根据重复的系统性注射的累积效应，预期治疗的最大效果，对于横膈膜来说将在约20周时获得(在实验过程期间观察)，对于其他骨骼肌来说将在40周时获得。人们还可以预期，外显子跳跃在心肌中将达到60％，在CNS中达到约15％。

图12示出的实验显示tc-DNA-PS(M23D+2-13)的系统性递送改善dKO表型。

(A)与野生型和未治疗的dKO相比，在治疗过的动物中的血清肌酸激酶水平(每个组群n＝5)(p<0.05)。(B和C)在10周龄时，使用旷场行为活动笼子对小鼠进行分析。(B)累积活动时间和(C)在1小时内移动的距离(每个组群n＝5)。(D–F)在tc-DNA-PS治疗的小鼠中肌肉功能的改善。(D)前肢肌肉功能评估显示出在治疗过的dKO中的身体改善，P<0.05。(E)分析治疗过的dKO小鼠的趾长伸肌(EDL)肌肉的断面比力(对横截面积归一化的最大力)。(F)通过在一系列5次离心收缩后测量力亏损，来评估力下降的百分率。与未治疗的dKO小鼠相比p<0.05。数值证实了与在未治疗的dKO中相比，在治疗过的dKO动物中肌肉更具恢复力。误差棒被显示为平均值±SEM(每个组群N＝5)。

图13和14示出的实验显示了tc-DNA-PS(M23D+2-13)的持续效果。图13示出了静脉内注射后tc-DNA-PS(M23D+3-13)的药物动力学(A)。小鼠接受浓度为200mg/kg的单次寡核苷酸注射。在不同时间点收集血清样品并通过HPLC-MS/MS进行分析，以评估血液区划中的tc-DNA-PS水平。(B)通过对在载有相同量的tc-DNA-PS(总量为约15mg)但在治疗结束后2周或13周时进行分析的动物中的跳跃百分率进行比较，来评估治疗的耐久性。重要的是，在最后一次注射后约3个月，跳跃的水平仍然显著地非常高，占在治疗后2周时测量的初始结果的几乎一半。这表明，tc-DNA-PS在细胞中稳定，并且可以随着时间被重新利用，从而限制了对在这些寡聚体被破坏或被它们的mRNA靶滴定的情况下将会需要的频繁填补组织的需求。

图14示出了用于试验治疗效果的持久性的另一种方式。将三组动物用相同量的tc-DNA-PS M23D(+2-13)治疗。第1组以200mg/kg/周的剂量治疗12周，第2组以50mg/kg/周的剂量治疗12周，第3组以200mg/kg/周的剂量治疗4周然后以50mg/kg/周的剂量治疗8周。在治疗结束后2周收集肌肉并通过Taqman RT-qPCR进行分析(每个组群n＝3)。

图15示出了在SMA小鼠模型(FVB.Cg-Tg(SMN2)2Hung Smn1tm1Hung/J)中系统性递送tc-DNA-PS(ISS7)的效果。

SMA III型小鼠(FVB.Cg-Tg(SMN2)2Hung Smn1^tm1Hung/J)被敲除Smn(Smn1-/-)，并含有由人类SMN2基因的两个串联拷贝制成的SMN2转入基因。这些动物在约1月龄时开始表现出典型特点，包括尾部的坏死。这样的坏死逐渐地扩展到耳的外耳壳和足部，并且在生命的晚期，这些动物显示出肌无力。

照片示出了3个III型个体(1月龄)。最上方的个体是未治疗的对照，显示出典型的尾部坏死；另外两个个体用tc-DNA-PS(ISS7)治疗，没有显示出这样的特点，表明通过包含外显子7从而产生SMN，SMN2基因得到挽救：它们在出生时接受单次ICV(脑室内)注射(5μl，含有20μg tc-DNA-PS(ISS7))，并且每周一次以200mg/kg的剂量接受重复的SC(皮下)注射。

图16示出的实验显示了tc-DNA寡核苷酸靶向CUG扩增的体外效率。

图17示出的实验显示了tc-DNA-PS寡核苷酸靶向CUG扩增的体外效率。

图18至20示出的实验显示了tc-DNA-PS寡核苷酸靶向CUG扩增的体内效率。

详细描述

本发明是基于下述发现，即以被命名为M23D(+02-13)的tc-DNA-PS反义寡核苷酸(AON)为例的三环硫代磷酸酯DNA分子，在静脉内给药后可以被递送到心脏细胞中并递送到中枢神经系统(CNS)中，以恢复突变的基因例如突变的肌萎缩蛋白基因。

这一发现是相当令人吃惊的，因为寡核苷酸的三环DNA版本(即在三环核苷之间包含经典的磷酸二酯键的寡核苷酸)在系统性给药后，在改变心脏细胞中或CNS中的基因表达方面不是一样有效的。此外，PMO和2’OMe-PS-RNA在可接受用于人类对象的剂量下都不显示出改变心脏细胞中的基因表达(Yokota,T等，Ann Neurol2009；Mol Ther.2010Jun；18(6):1210-7，2'-O-甲基-硫代磷酸酯RNA反义寡核苷酸在mdx小鼠模型中的临床前PK和PD研究(Preclinical PK and PD studies on2'-O-methyl-phosphorothioate RNA antisenseoligonucleotides in the mdx mouse model.)Heemskerk H,de Winter C,van Kuik P,Heuvelmans N,Sabatelli P,Rimessi P,Braghetta P,van Ommen GJ,de Kimpe S,Ferlini A,Aartsma-Rus A,van Deutekom JC.)。对于这些化学品来说，进入心脏细胞需要格外高的剂量例如3g/kg，即在目前的临床试验中使用的剂量的300倍(GeneTher.2010Jan；17(1):132-40.通过系统性递送吗啉代化合物剂量依赖性地恢复营养不良小鼠的心肌中肌萎缩蛋白的表达(Dose-dependent restoration of dystrophinexpression in cardiac muscle of dystrophic mice by systemically deliveredmorpholino.)Wu B,Lu P,Benrashid E,Malik S,Ashar J,Doran TJ,Lu QL)，或者需要偶联穿透性肽或机械应力例如超声(Mol Ther.2011Jul；19(7):1295-303.Pip5转导肽在mdx小鼠中指导心脏中高效的寡核苷酸介导的肌萎缩蛋白外显子跳跃和表型校正(Pip5transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediateddystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice.)，YinH,Saleh AF,Betts C,Camelliti P,Seow Y,Ashraf S,Arzumanov A,Hammond S,MerrittT,Gait MJ,Wood MJ；Ultrasound Med Biol.2009Jun；35(6):976-84.微泡稳定性是超声和微泡介导的体内基因转移的效率的主要决定因素(Microbubble stability is a majordeterminant of the efficiency of ultrasound and microbubble mediated in vivogene transfer)，Alter J,Sennoga CA,Lopes DM,Eckersley RJ,Wells DJ.)

这一发现将在总的来说遗传疾病的治疗中，更具体来说在神经肌肉或肌肉骨骼疾病例如杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩和Steinert肌强直性营养不良的治疗中以及心脏或CNS疾病的治疗中找到广阔应用。

定义

当在本文中使用时，术语“硫代磷酸酯键”是指核酸分子中两个相邻核苷之间的5'...-O-P(S)-O-...3'组成部分。

当在本文中使用时，术语“三环DNA(tc-DNA)”是指一类受限的DNA类似物，其中通过引入环丙烷环对每个核苷酸进行修饰，以限制骨架的构象柔性并优化骨架扭转角γ的几何学(Ittig等，Nucleic Acids Res.32:346-353(2004)；Ittig等，Prague,Academy ofSciences of the Czech Republic.7:21-26(Coll.Symp.Series,Hocec,M.,2005)；Ivanova等，Oligonucleotides17:54-65(2007)；Renneberg等，Nucleic Acids Res.30:2751-2757(2002)；Renneberg等，Chembiochem.5:1114-1118(2004)；以及Renneberg等，JACS.124:5993-6002(2002))。含有同碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶的tc-DNA与互补RNA形成格外稳定的A-T碱基对。

当在本文中使用时，术语“三环核苷”是指具有下式的核酸分子的亚基：

当在本文中使用时，术语“反义寡核苷酸(AON)”是指能够与具有互补核苷酸序列的pre-mRNA或mRNA相互作用和/或杂交，由此改变基因表达的寡核苷酸。

当在本文中使用时，“碱基”是指典型的DNA和RNA碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶)以及修饰的碱基或碱基类似物(例如5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或肌苷)。碱基类似物是分子结构模拟典型的DNA或RNA碱基的结构的化学物质。

当在本文中使用时，“互补”是指核酸分子能够与另一个核酸分子通过互补的核苷或核苷酸之间的传统的Watson-Crick碱基配对或其他非传统类型的配对(例如Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键形成)而形成氢键。对于本公开的tc-DNA-PS AON来说，tc-DNA-PSAON与其互补序列的结合自由能足以允许tc-DNA-PS AON执行相关功能，并具有足够的互补性程度以避免tc-DNA-PS AON与非靶序列在需要特异性结合的条件下、即离体或体内治疗情形中的生理条件下发生非特异性结合。核酸分子结合自由能的确定在本技术领域中是公知的(参见例如Turner等，CSH Symp.Quant.Biol.LII:123-133(1987)；Freier等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA83:9373-77(1986)；以及Turner等，J.Am.Chem.Soc.109:3783-3785(1987))。因此，“互补”(或“可特异性杂交”)这种术语是表明存在足够程度的互补性或精确配对，使得在tc-DNA-PS AON与pre-mRNA或mRNA靶之间能够发生稳定和特异的结合。

在本技术领域中应该理解，核酸分子不是必需与靶核酸序列100％互补才能特异性杂交。也就是说，两个或更多核酸分子可以低于完全互补。互补性由核酸分子中能够与第二核酸分子形成氢键的毗连残基的百分率表示。例如，如果第一核酸分子具有10个核苷酸并且第二核酸分子具有10个核苷酸，那么第一与第二核酸分子之间5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对分别表示50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补性。“完全”或“全部”互补的核酸分子是指其中第一核酸分子的所有毗连残基都将与第二核酸分子中相同数量的毗连残基形成氢键的核酸分子，其中两个核酸分子具有相同数量的核苷酸(即具有相同长度)，或者两个分子具有不同长度。

当在本文中使用时，术语“前体mRNA”或“pre-mRNA”是指含有一个或多个居间序列(内含子)的信使核糖核酸(mRNA)的未成熟的单链。pre-mRNA由RNA聚合酶从细胞核中的DNA模板转录而来，并由内含子和编码区(外显子)的交替序列构成。一旦pre-mRNA通过内含子的剪接和外显子的联结而被完全加工后，它被称为“信使RNA”或“mRNA”，其是完全由外显子构成的RNA。真核生物的pre-mRNA在被完全加工成mRNA之前只短暂地存在。当pre-mRNA已被正确加工成mRNA序列后，它被输出到核外，并最终被细胞质中的核糖体翻译成蛋白质。

当在本文中使用时，术语“剪接”和“加工”是指pre-mRNA在转录后的修饰，其中内含子被移除，外显子被联结。剪接发生在由5个小核核糖核蛋白(snRNP)构成的被称为剪接体的大的RNA-蛋白质复合体所催化的一系列反应中。在内含子中，3’剪接位点、5’剪接位点和分支位点为剪接所需。snRNP的RNA组分与内含子相互作用，并可能参与催化。

Pre-mRNA剪接包含两个顺序的生物化学反应。两个反应都涉及RNA核苷酸之间的剪接体转酯作用。在第一反应中，内含子中在剪接体装配期间限定的特定分支点核苷酸的2’-OH，对内含子5’剪接位点处的第一个核苷酸执行亲核攻击，形成套索中间体。在第二反应中，释放出的5’外显子的3’-OH在内含子3’剪接位点处的最后一个核苷酸处执行亲核攻击，由此联结外显子并释放出内含子套索。pre-mRNA剪接受到许多因子例如外显子剪接增强或抑制序列的调控，特别是还受到内含子沉默序列(ISS)和末端茎环(TSL)序列的调控。

当在本文中使用时，术语“内含子沉默序列(ISS)”和“末端茎环(TSL)”分别是指内含子和外显子内的序列元件，其通过结合反式作用蛋白因子控制pre-mRNA内的可替选剪接，由此导致剪接位点的不同用法。通常，内含子沉默序列为8至16个核苷酸，并且与外显子-内含子接点处的剪接位点相比保守性较低。末端茎环序列通常为12至24个核苷酸，并由于互补性而在12-24个核苷酸的序列内形成二级环结构并因此结合。

“对象”是指作为外植细胞的供体或受体的生物体或细胞本身。“对象”也指可以给药本公开的核酸分子的生物体。在一种实施方式中，对象是哺乳动物或哺乳动物细胞。在另一种实施方式中，对象是人类或人类细胞。

当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指在其所给药的对象(例如人类)中足以治疗或预防所陈述的疾病、障碍或病症的tc-DNA-PS分子(例如AON)的量。本公开的tc-DNA-PS分子可以单独或组合或与其他药物联合用于治疗疾病或病症，尤其是本文中讨论的疾病或病症。例如，为了治疗特定疾病、障碍或病症，可以将tc-DNA-PS在适合于治疗的情况下，单独或与一种或多种药物组合给药于患者，或可以给药于对于本领域技术人员来说显而易见的其他适合细胞。

当在本文中使用时，短语“可药用”是指分子实体和组合物，当给药于人类时是生理上可耐受的，并且通常不产生过敏或类似的不利反应，例如胃不适、头晕等。优选地，当在本文中使用时，术语“可药用”是指得到联邦或州政府的管理机构批准或被列于《美国药典》(U.S.Pharmacopeia)或其他广泛认可的药典中，以供用于动物、更具体为人类。

当在本文中使用时，术语“分离的”是指所提到的材料从其本源环境例如细胞中被取出。因此，分离的生物材料可以不含一些或所有细胞组分，即天然存在本源材料的细胞的组分(例如细胞质或膜组分)。

当在本文中使用时，术语“纯化的”是指材料已经在减少或消除无关材料的存在的条件下被分离，所述无关材料即污染物，包括从中获得材料的本源材料。例如，纯化的tc-DNA-PS分子优选地基本上不含细胞或培养组分，包括组织培养组分、污染物等。当在本文中使用时，术语“基本上不含”在操作上用于材料分析测试的情形中。优选地，基本上不含污染物的纯化材料至少为50％纯，更优选为至少90％纯，更加优选为至少99％纯。纯度可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定和本领域已知的其他方法来评估。

在本发明的说明书中，除非另有指明，否则任何浓度范围、百分率范围、比率范围或整数范围应被理解为包括所述范围内的任何整数值，以及在适合情况下的其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。此外，除非另有指明，否则本文中所述的与任何物理特性例如聚合物亚基、大小或厚度相关的任何数字范围，应该被理解为包括所述范围内的任何整数。当在本文中使用时，除非另有指明，否则“约”或“基本上由……构成”是指所指范围、值或结构的±20％。

当在本文中使用时，术语“包括”和“包含”同义使用。应该理解，本文中使用的没有数量指示的组分是指“一个或多个”所列举的组分。替换词(例如“或”)的使用应该被理解为是指替换项中的任一项、两者或其任何组合。

术语“约”或“近似于”是指在值的有统计学意义的范围之内。这样的范围可以在给定的值或范围的一定数量级内，优选在50％以内、优选20％以内、更优选10％以内、甚至更优选5％以内。术语“约”或“近似于”所涵盖的容许偏差取决于所研究的具体系统，并可以被本领域的普通技术人员容易地认识到。

在本文中使用的用于命名AON的命名法中，例如在M23D(+02-13)中，M是指小鼠，23是外显子id，D是指在外显子的3’末端处的供体位点，+2表明反义寡核苷酸始于外显子内D位点之前的2个核苷酸处，-13表明反义寡核苷酸终止于下游内含子的第13个核苷酸处。

本发明的三环硫代磷酸酯DNA分子以及含有它们的组合物

本发明的一个目的涉及包含由核苷间硫代磷酸酯键(3'-OPS-O-5'键)相连的三环核苷的核酸分子，其在本公开中也被称为“三环硫代磷酸酯DNA”或“tc-DNA-PS”。

本发明的核酸分子源自于含三环核苷的DNA的化学物质的改进，在所述DNA中磷酸二酯键被硫代磷酸酯键代替。

根据本公开，本发明的核酸包含由硫代磷酸酯键相连的至少两个相邻的三环核苷。这种组成部分的序列在本研究之前从未公开过。应该理解，本发明的核酸分子还可以包含具有不同化学的核苷，例如经典的含有核糖或脱氧核糖的核苷、LNA核苷等。除了硫代磷酸酯键之外，本发明的核酸分子还可以含有其他类型的核苷间键，例如经典的磷酸二酯键。然而，本发明优选地涉及其中三环核苷的比例占核酸分子中总核苷的至少50％，优选地至少60％、70％、80％、90％或95％的核酸分子。此外，本发明优选地涉及其中核苷间硫代磷酸酯键的比例占核酸分子中总核苷间键的至少50％，优选地至少60％、70％、80％、90％或95％的核酸分子。在特定实施方式中，本发明的核酸分子中的所有核苷是三环核苷。在另一种实施方式中，所有亚基间键是硫代磷酸酯键。

在特别优选的实施方式中，本发明的核酸分子是包含由亚基间键相连的核苷亚基的三环硫代磷酸酯核酸分子，其中所有核苷是三环核苷，并且所有亚基间键是硫代磷酸酯键。

本发明的核酸中包含的核苷亚基可以被选择成处于确定序列中，例如能够与单链核酸靶序列特异性杂交的碱基序列，或允许在本发明的核酸与靶核酸双链体之间形成三链体结构的序列。靶核酸序列可以是RNA和DNA序列。当需要时，可以将本发明的核酸用报告基团例如放射活性标记物、生物素标记物、荧光标记物等标记，以便于检测核酸自身及其在例如杂交复合体中的存在的。

本发明的核酸分子的尺寸取决于制备它所用于的特定用途。例如，本发明的tc-DNA-PS分子可以为至少3个核苷酸长，尤其是至少5、10、20、30、40或50个核苷酸长。在特定实施方式中，本发明的tc-DNA-PS分子包含3至50个核苷酸，尤其是5至21的核苷酸，特别是6至18个核苷酸。有趣的是，tc-PS DNA寡核苷酸可以被缩短至15mer，而PMO吗啉代和2’O-Me-PS-RNA通常分别由24和20mer构成。因此，具体来说，本发明涉及包含15个核苷酸或由15个核苷酸构成的tc-DNA-PS分子。在其他特定实施方式中，本发明的核酸分子包含3至20个核苷酸，尤其是10至15个核苷酸。

三环核苷的合成在本领域中是已知的，例如在下面的文献中所描述：Steffens,R.和Leumann,C.(1997)在糖-磷酸骨架中具有受限的构象灵活性的核酸类似物“三环DNA”。部分I：[(5'R,6'R)-2-脱氧-3',5'-乙醇基-5',6'-甲醇基-β-D-呋喃核糖基]胸腺嘧啶和-腺嘌呤的制备以及用于寡核苷酸合成的相应的亚磷酰胺(Nucleic-acid analogs withconstraint conformational flexibility in the sugar-phosphate backbone "Tricyclo-DNA".Part1.Preparation of[(5'R,6'R)-2-deoxy-3',5'-ethano-5',6'-methano-β-D-ribofuranosyl]thymine and-adenine,and the correspondingphosphoramidites for oligonucleotide synthesis)，Helv.Chim.Acta,80,2426-2439，以及Renneberg,D.和Leumann,C.J.(2002)三环DNA的Watson-Crick碱基配对性质(Watson-Crick base-pairing properties of tricyclo-DNA)，J.Am.Chem.Soc.,124,5993-6002。

硫代磷酸酯tc-DNA的合成按照亚磷酰胺方法，遵照固相寡核苷酸合成中的经典程序(《寡核苷酸合成-实用方法》(Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach)，Oxford University Press,Oxford,1984)。在本发明的合成方法中，将第一个三环核苷连接到固相支持物(例如通过琥珀酰基连接物连接到长链烷基胺可控孔径玻璃(LCAA-CPG))。第一核苷酸另外具有受保护的5'-OH基团(例如二甲氧基三苯甲基–DMT基团)。然后将受保护的5'基团去保护以形成游离的5'-OH基团，将第二个核苷酸添加到其上。第一核苷酸的游离的5'-OH基团与5'-受保护的三环核苷-3'-O-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺反应。然后将核苷间亚磷酰胺基团硫化以在第一和第二三环核苷之间形成硫代磷酸酯核苷间键。将第一核苷酸的未反应的5’-OH基团酯化(封端)，以防止故障序列的合成。然后根据需要将这一顺序重复多次以添加其他tc-PS核苷酸，形成完整的所需核酸序列。

下面参考反应图式1描述本发明的核酸合成方法的特定实施方式。

反应图式1：用于合成三环硫代磷酸酯-DNA(tc-DNA-PS)的通用流程

向生长中的链附连一个附加单元的合成循环由四个顺序步骤(a-d)构成。在链组装后，以通常方式(浓NH₃，55℃，16h)将寡核苷酸从固相支持物上拆下并去保护。使用长链烷基胺可控孔径玻璃(LCAA-CPG)作为固相支持物，第一个三环核苷通过琥珀酰基连接物连接到其上。合成一般以1.3或10μmol的规模在Pharmacia gene assembler plus DNA合成仪上进行。三环硫代磷酸酯-寡核苷酸被合成为具有5’末端磷酸酯或硫代磷酸酯基团，以确保5’-末端的化学稳定性(R.Steffens和C.J.Leumann，J.Am.Chem.Soc.,1999,121,3249-3255)。每个步骤a)-d)的条件在下面给出，并且为10μmol的合成进行优化。

a)脱三苯甲基化：

用1,2-二氯乙醇(DCE)中的3％二氯乙酸冲洗1.5min。然后用DCE和CH₃CN清洗。

b)偶联：

将亚磷酰胺溶液(0.1μM，在CH₃CN^*中，400μL)和活化剂5-乙基硫代四唑(ETT，0.25M，在CH₃CN中，600μL)施加到固相。偶联时间：9min。然后用CH₃CN清洗。

*将CH₃CN用于构件tc-T、tc-G和tc-C。出于溶解性原因，构件tc-A在作为溶剂的无水DCE中使用。

c)硫化：

将1/1的无水吡啶/CH₃CN中的双(苯基乙酰基)二硫化物(PADS)(0.2M)在固相支持物上冲洗3min。然后用CH₃CN清洗。

d)封端：

将未反应的5’-羟基用CapA(CH₃CN中的4-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.5M))和CapB溶液(乙酸酐(AC₂O)、可力丁在CH₃CN中(2:3:5))各封端20s。然后用CH₃CN洗涤。

用于合成本发明的核酸分子的tc-DNA亚磷酰胺构件可以如Steffens和Leumann,C.Helv.Chim.Acta80:2426-2439(1997)中所述进行合成。链延伸循环可以基本上与用于天然寡脱氧核苷酸合成的循环基本上一致。参见Pharmacia LKB用户手册(56-1111-56)(GeneAssembler Special/4Primers)。

本发明的tc-DNA-PS分子可以是与基因、尤其是人类基因编码的RNA的一部分互补的反义寡核苷酸。因此，本发明还涉及三环硫代磷酸酯DNA反义寡核苷酸。

具体来说，本发明的tc-DNA-PS分子(或反义寡核苷酸)可以被设计成：

-用于执行外显子跳跃，尤其是用于肌萎缩蛋白基因中一个或多个外显子的跳跃；

-用于在靶pre-mRNA的加工期间便于包含外显子，尤其是用于在SMN2pre-mRNA的加工期间便于包含外显子7；

-用于靶向包含过多CUG扩增的突变的mRNA以防止将核蛋白隔绝到扩增的CUG重复序列，例如用于靶向包含过多CUG扩增的突变的DM1mRNA；

-用于便于包含过多CUG扩增的突变的mRNA的破坏，例如便于包含过多CUG扩增的突变的DM1mRNA的破坏。

可以用载体将本发明的Tc-DNA-PS分子配制成组合物。所述组合物可以是药物组合物，其中所述配体是可药用载体。

因此，本发明还涉及包含本发明的核酸的药物组合物，所述核酸尤其是与基因、尤其是人类基因编码的RNA的一部分互补的反义寡核苷酸，并且其中所述组合物还包含可药用载体。此外，本发明还涉及本发明的核酸分子与另一种治疗剂的组合。可以将本发明的核酸分子和其他治疗剂配制成药物组合物或作为组合制剂(套装制剂)的一部分，用于同时、分开或顺序使用。本领域技术人员将改造其他治疗剂和本发明的核酸的序列以适应于试图治疗的特定疾病。

本文描述的Tc-DNA-PS分子可以与适用于制造水性悬液的赋形剂混合。这样的赋形剂是悬浮剂例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧化乙烯硬脂酸酯，或氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物例如十七氧化乙烯鲸蜡醇，或氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧化乙烯山梨糖醇单油酸酯，或氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚氧化乙烯失水山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬液也可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯。适合通过添加水来制备水性悬液的可分散粉末和颗粒，提供了活性成分与分散或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合。

根据特定实施方式，本发明涉及包含如上所述的tc-DNA-PS分子和可药用载体的组合物，所述组合物是可注射组合物。Tc-DNA-PS组合物可以采取无菌可注射水性或油性悬液的形式。悬液可以按照已知技术，使用上面提到的适合的分散或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的可肠胃外使用的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的介质和溶剂是水、林格氏(Ringer's)溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油被常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何品牌的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，发现脂肪酸例如油酸可用于制备注射剂。

本公开还包括被制备用于储存或给药的组合物，其在可药用载体或稀释剂中包含药物有效量的本发明的所需tc-DNA-PS分子。治疗用的可接受载体或稀释剂在制药技术领域中是公知的，并描述在例如《Remington制药学》(Remington's PharmaceuticalSciences)(Mack Publishing Co.,A.R.Gennaro主编，1985)中。例如，可以提供防腐剂和稳定剂。它们包括苯甲酸钠、山梨酸以及对羟基苯甲酸的酯。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

本公开还提供了用于促进pre-mRNA中的外显子跳跃或掩蔽内含子沉默或末端茎环或者用于靶向破坏细胞或生物体中的mRNA的组合物和方法。在相关实施方式中，本公开提供了用于治疗患有疾病或具有发生所述疾病的风险的对象，包括人类细胞、组织或个体的方法和包含本发明的tc-DNA-PS分子的组合物，所述疾病尤其是本文中所描述的具体疾病之一。在一种实施方式中，方法包括向细胞或生物体例如哺乳动物给药本发明的tc-DNA-PS分子或含有所述tc-DNA-PS分子的药物组合物，以便改变pre-mRNA的加工或定向破坏mRNA。适合使用本发明的组合物和方法治疗的哺乳动物对象，包括患有适合接受这样的治疗的一种或多种障碍例如杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩或Steinert肌强直性营养不良的对象。

本公开的tc-DNA-PS组合物可以有效地用作可药用配方。可药用配方对于患者中的疾病状态或其他不利状况起到预防、改变其发生或严重性或治疗(以可检测或可测量的程度减轻一种或多种症状)的作用。可药用配方包括上述化合物的盐，例如酸加成盐例如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。药物组合物或配方是指适合于给药、例如系统性给药到细胞或患者例如人类中的形式的组合物或配方。适合的形式部分取决于用法或进入途径，例如透皮或通过注射。这样的形式应该不阻止所述组合物或配方到达靶细胞(即希望将tc-DNA-PS分子递送给它的细胞)。例如，注射到血流中的药物组合物应该是可溶的。其他因素在本技术领域中是已知的，包括诸如毒性和阻止组合物或配方行使其效应的形式的考虑。

本公开的药物组合物也可以采取水包油乳液的形式。油性相可以是植物油或矿物油或它们的混合物。适合的乳化剂可以是天然存在的树胶例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶、天然存在的磷脂类例如大豆、卵磷脂以及源自于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯例如失水山梨糖醇单油酸酯，以及所述偏酯与氧化乙烯的缩合产物例如聚氧化乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。

本公开的tc-DNA-PS分子可以使用或不使用稳定剂、缓冲剂等形成适合用于治疗的组合物，通过任何标准方式给药于患者。当希望使用脂质体递送机制时，可以遵照形成脂质体的标准流程。因此，本公开的核酸分子可以任何方式给药，例如透皮或通过局部、全身、直肠、肌肉内、心内、腹膜内、局部区域、系统(例如静脉内或动脉内)或鞘内注射。

本公开还描述了包含表面改性的脂质体的组合物的使用，所述脂质体含有聚乙二醇脂类(PEG改性或长循环脂质体或隐形脂质体)。这些配方提供了用于增加本发明的tc-DNA-PS分子在靶组织中的积累的方法。这类药物载体抵抗调理作用以及单核细胞吞噬系统(MPS或RES)的消除，从而能够获得囊化的tc-DNA-PS分子的更长血液循环时间并增加组织对其的暴露(Lasic等，Chem.Rev.95:2601-2627(1995)，以及Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.43:1005-1011(1995))。长循环脂质体改进了核酸分子的药物动力学和药效学，特别是与已知在MPS组织中积累的常规阳离子型脂质体相比(Liu等，J.Biol.Chem.42:24864-24870(1995)；Choi等，PCT公布号WO96/10391；Ansell等，PCT公布号WO96/10390；Holland等，PCT公布号WO96/10392)。在其避免在代谢上具有攻击性的MPS组织例如肝脏和脾脏中积累的基础上，长循环脂质体与阳离子型脂质体相比，还可能更大程度地保护本发明的tc-DNA-PS分子免于核酸酶降解。

药物有效剂量是预防疾病状态、抑制其发生或对其进行治疗(在一定程度上减轻症状、优选地所有症状)所需的剂量。药物有效剂量取决于疾病类型、所使用的组合物、给药途径和所治疗的哺乳动物类型、所考虑的具体哺乳动物的身体特征、同时使用的药物以及医学领域的技术人员将会意识到的其他因素。例如，取决于本公开的tc-DNA-PS分子的效能，活性成分的给药量介于0.1mg/kg至100mg/kg体重/天之间。

每周每千克体重约0.1mg至约140mg量级的剂量水平可用于治疗上面指出的病症(每位患者每周约0.5mg至约7g)。可以与载体材料合并以生产单剂量形式的活性成分的量，随着所治疗的宿主和具体的给药方式而变。剂量单位形式一般含有约1mg至约500mg活性成分。

应该理解，任何特定患者的具体剂量水平取决于各种因素，包括所使用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合以及正在治疗的具体疾病的严重性。在根据本公开的配方和方法给药组合物后，测试对象与安慰剂治疗的或其他适合的对照对象相比，与被治疗疾病或病症相关的一种或多种症状将表现出约10％直至约99％的减轻。

本发明的tc-DNA-PS分子可以通过本领域技术人员已知的各种方法给药到细胞，包括在只包含tc-DNA-PS分子的配方中或在还包含一种或多种其他组分例如可药用载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等的制剂中给药。在某些实施方式中，本发明的tc-DNA-PS分子可以被囊封在脂质体中、通过离子电渗给药、或掺入到其他介质例如水凝胶、环糊精、生物可降解纳囊、生物黏附性微球或蛋白质载体中(参见例如PCT公布号WO00/53722)。

本公开的tc-DNA-PS分子的直接注射，不论是静脉内、皮下、肌肉内还是真皮内，都可以使用标准的针头和注射器方法来进行，或者可以通过无针技术，例如在Conry等，Clin.Cancer Res.5:2330-2337(1999)和PCT公布号WO99/31262中所描述的技术。

用于递送核酸分子的其他方法，描述在例如下列文献中：Boado等，J.Pharm.Sci.87:1308-1315(1998)；Tyler等，FEBS Lett.421:280-284(1999)；Pardridge等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA92:5592-5596(1995)；Boado,Adv.Drug Delivery Rev.15:73-107(1995)；Aldrian-Herrada等，Nucleic Acids Res.26:4910-4916(1998)；Tyler等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA96:7053-7058(1999)；Akhtar等，Trends Cell Bio.2:139(1992)；《用于反义寡核苷酸治疗的递送策略》(Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics)(Akhtar主编，1995)；Maurer等，Mol.Membr.Biol.16:129-140(1999)；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol137:165-192(1999)；以及Lee等，ACS Symp.Ser.752:184-192(2000)。这些流程可用于增补或补充本公开中实际考虑的事实上任何tc-DNA-PS分子的递送。

治疗方法

如上所述，本发明的核酸分子可以是被设计以便与特定mRNA或pre-mRNA互补的反义寡核苷酸(AON)。本发明的反义寡核苷酸可用于大量疾病的治疗，所述疾病的几种在下文中描述。当然，下面提出的说明性疾病不限制本发明，并且本文中提供的新的化学品可用于治疗专业技术人员设想的可以通过AON的给药治疗的任何疾病。

用于治疗杜氏肌营养不良的三环硫代磷酸酯反义寡核苷酸

在某些实施方式中，本公开提供了可以适用于治疗杜氏肌营养不良(DMD)的AON，所述杜氏肌营养不良是一种严重的隐性X染色体连锁的肌营养不良形式，其特征为肌肉退化的快速发展，最终导致丧失步行能力、瘫痪和死亡。DMD由位于人类X染色体上的肌萎缩蛋白基因内的突变例如无义或移码突变引起。肌萎缩蛋白基因编码肌萎缩蛋白，其是肌肉组织中的重要结构组分，为肌纤维肌膜以及位于细胞膜处的肌萎缩蛋白聚糖复合体(DGC)提供结构稳定性。无义或移码突变可能引起翻译的过早终止，因此产生C-端截短的无功能的肌萎缩蛋白。

由一个或多个终止突变或移码突变引起的DMD，可以通过切除一个或几个外显子以便恢复翻译阅读框并由此恢复突变下游的mRNA序列来缓解。为了实现这一点，作为本公开的一部分，开发了本发明的核酸分子作为靶向pre-mRNA内能够掩蔽一个或多个外显子的剪接体识别的区域的翻译AON。通过用tc-DNA-PS AON靶向这些区域，可以通过可替选剪接来移除外显子，以获得成熟的、内部部分缺失但是有功能的肌萎缩蛋白mRNA。

因此，本文描述的tc-DNA-PS AON有效地促进肌萎缩蛋白pre-mRNA加工期间肌萎缩蛋白基因中的一个或多个突变外显子的跳过，从而恢复所得到的肌萎缩蛋白mRNA的正确阅读框，其在翻译时产生部分功能性肌萎缩蛋白。因此，本文公开的tc-DNA-PS AON可治疗性用于患有DMD的患者。

当在本文中使用时，术语“外显子跳跃”是指通过用一种或多种互补的反义寡核苷酸(AON)靶向pre-mRNA内的剪接供体和/或受体位点来修改pre-mRNA剪接。通过阻断剪接体与一个或多个剪接供体或受体位点或事实上在剪接的定义中包含的外显子或内含子内的任何其他位点的接近，AON能够阻止剪接反应，由此引起一个或多个外显子从完全加工的mRNA中缺失。外显子跳跃在pre-mRNA成熟加工期间在核中实现。它包括使用例如与pre-mRNA内的剪接供体序列互补的反义寡核苷酸(AON)来掩蔽参与被靶外显子剪接的关键序列。本文提供的tc-DNA-PS AON，通过掩蔽肌萎缩蛋白pre-mRNA中内含子/外显子接点处的剪接位点，由此促进pre-mRNA向成熟mRNA的加工过程中突变外显子的缺失，可以适用于外显子跳跃。

例如，肌萎缩蛋白基因的外显子23或外显子50内的无义或移码突变产生羧基端截短的无功能的肌萎缩蛋白。通过与分别包含内含子23或内含子51中的肌萎缩蛋白pre-mRNA剪接供体位点的核苷酸、以及外显子23或外显子51的相邻5’核苷酸杂交，本文公开的tc-DNA-PSAON能够阻止突变的外显子23或外显子51包含在成熟mRNA转录本中。该成熟mRNA转录本的表达产生有部分功能的肌萎缩蛋白，其缺失了由外显子23或外显子50和51编码的氨基酸，但是包括那些缺失氨基酸的N-端和C-端两侧的肌萎缩蛋白氨基酸。

本文公开的用于在肌萎缩蛋白pre-mRNA加工期间跳过外显子的tc-DNA-PS AON，通常含有6-22个毗连的三环PS核苷酸、特别是8-20个三环PS核苷酸、更特别是10至18个毗连的三环PS核苷酸，其中tc-DNA-PS AON的6-16个核苷酸、特别是8-16个核苷酸与肌萎缩蛋白pre-mRNA的内含子剪接供体位点互补，其中tc-DNA-PS AON的2-8个核苷酸与肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子区互补，并且其中内含子剪接供体位点与外显子区毗连并位于其5’端。取决于所设想的具体应用，tc-DNA-PS AON可以具有12至16个核苷酸或13至15个核苷酸，并可以包含与内含子剪接供体位点互补的6至14个核苷酸和与外显子区互补的2至5个核苷酸。

本文中示例了被设计用于跳过肌萎缩蛋白pre-mRNA内突变的外显子23的tc-DNA-PS AON。所述tc-DNA-PS AON包含核苷酸序列5’-AACCTCGGCTTACCT-3’(M23D(+02-13)，SEQID NO:1)，并与位于肌萎缩蛋白pre-mRNA的内含子23的3’末端的核苷酸和位于肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子23的毗连5’末端的核苷酸特异性杂交。可以使用的可替选的AON是序列5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCT-3'(M23D(+2-18)，SEQ ID NO:2)。

还提供了被设计用于跳过肌萎缩蛋白pre-mRNA内突变的外显子51的tc-DNA-PSAON。所述tc-DNA AON包含选自5’-AGAAATGCCATCTTC-3’(H51(+68+82)，SEQ ID NO:3)、5’-AAATGCCATCTTCCT-3’(H51(+70+84)，SEQ ID NO:4)、5’-TGCCATCTTCCTTGA-3’(H51(+73+87)，SEQ ID NO:5)和5’-GCAGTTTCCTTAGTAA-3’(H51(+40+55)，SEQ ID NO:6)的核苷酸序列，并与位于肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子51的3’末端的核苷酸和位于肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子51的5’末端的核苷酸特异性杂交。

用于治疗脊髓性肌萎缩的三环硫代磷酸酯DNA反义寡核苷酸

在其他实施方式中，本公开提供了可以适用于治疗脊髓性肌萎缩(SMA)的tc-DNA-PS AON。SMA由SMN1基因的两个拷贝中的突变引起，所述基因在正常细胞中以在完全加工的mRNA中存在外显子7和8为特征。在人类中以可变的拷贝数存在的第二个基因SMN2，在外显子7中存在沉默突变，其改变外显子剪接增强序列。因此，与SMN1相比，SMN2的剪接被改变，并且从该仅仅转录出仅仅10％的正常的全长SMN蛋白，而其他无功能的SMN2转录本缺失外显子7。SMN2的正常的全长转录本的低丰度不能完全补偿SMN1转录本的缺少，由此引起疾病。通过掩蔽SMN2pre-mRNA内的内含子沉默序列(ISS)和/或末端茎环(TSL)，本文描述的tc-DNA-PS AON能够促进在加工后的SMN2pre-mRNA中包含外显子7，所述pre-mRNA被翻译成功能完整的SMN2蛋白，其与SMN1蛋白一致，并因此能够补偿有功能SMN1蛋白的丧失。当在体内表达时，SMN2蛋白的量的增加能够至少部分逆转由SMN1基因中的突变引起的脊髓性肌萎缩。

因此，本公开提供了用于在SMN2pre-mRNA加工期间促进外显子7的包含的tc-DNA-PS AON，其中所述tc-DNA-PS AON长度为6-22个三环核苷酸、特别是8-20个三环核苷酸、更特别长度为10-18个三环核苷酸，并且其中tc-DNA-PS AON与SMN2pre-mRNA的内含子沉默序列(ISS)或末端茎-环(TSL)互补。这样的tc-DNA-PS AON可以具有13至17个核苷酸、12至16个核苷酸或13至15个核苷酸。

本文中示例了包含15个核苷酸的序列5’-CUUUCAUAAUGCUGG-3’(SMN2i7(10；25)，SEQ ID NO:7)的tc-DNA AON，所述tc-DNA AON与SMN2pre-mRNA的ISS互补，并且可用于促进将外显子7包含在加工过的SMN2mRNA中。本文中还示例了包含13个核苷酸的序列5’-TTAATTTAAGGAA-3’(SMN2e7(39；51)，SEQ ID NO:8)的tc-DNA-PS AON，所述tc-DNA-PS AON与SMN2pre-mRNA的TSL2互补，并且也可用于促进将外显子7包含在加工过的SMN2mRNA中。

用于治疗Steinert肌强直性营养不良的三环硫代磷酸酯DNA反义寡核苷酸

在其他实施方案中，本公开提供了可以适用于治疗由编码DM1的mRNA的3’末端处的CUG扩增所引起的Steinert肌强直性营养不良的tc-DNA-PS AON。据信，含有过多CUG扩增的突变DM1mRNA被隔绝在核中并积累以形成核灶点(nuclear foci)。这些灶点是稳定的，并被认为与参与剪接机制的因子结合，从而广泛地影响转录组。作为本公开的一部分，预期可以使用tc-DNA-PS AON来靶向CUG序列并促进突变的DM1mRNA的破坏和/或防止核蛋白被隔绝到扩增的CUG重复序列，从而引起剪接因子的释放和核灶点的移除。不受具体机制理论的束缚，还相信本文公开的tc-DNA-PS AON能够促进含有过量CUG扩增的mRNA的破坏。

因此，描述了可以适用于促进包含过量CUG扩增的突变的DM1mRNA的破坏的tc-DNA-PS AON。这样的tc-DNA-PS AON包含9-27个三环核苷酸，其中所述tc-DNA AON与包含一个或多个3’CUG扩增的突变的DM1mRNA互补，并且其中所述tc-DNA-PS AON能够促进DM1mRNA的破坏。取决于所设想的具体应用，tc-DNA-PS AON可以包含3至9个、4至8个或5、6或7个连续重复的核苷酸序列5’-CAG-3’(SEQ ID NO:9)。预期促进突变的DM1的破坏的示例性tc-DNA-PS AON包含15个核苷酸的序列5’-CAGCAGCAGCAGCAG-3’(DM1(CAG5)，SEQ ID NO:10)。预期促进突变的DM1的破坏的另一个示例性tc-DNA-PS AON包含15个核苷酸的序列：

5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’(DM1(CAG7)，SEQ ID NO:11)。

用于治疗心脏病的三环硫代磷酸酯反义寡核苷酸

肥厚型心肌病(HCM)的最常见的遗传病因是心脏的肌球蛋白结合蛋白C(对于综述来说，参见：Schlossarek,S等，J Mol Cell Cardiol50(2011)613-620)。最近，已在体外应用外显子跳跃来修改cMyBP-C ki小鼠的肌细胞中突变的cMyBP-C分子(Gedicke,C,Behrens-Gawlik,V,Dreyfus,PA,Eschenhagen,T,Carrier,L.使用反义寡核糖核苷酸进行的外显子的特异性跳跃在cMyBP-C敲入小鼠的肌细胞中产生新的分子(Specific skippingof exons using antisense oligoribonucleotides results in novel molecule incMyBP-C knock-in mouse myocytes)，Circ201；122(Suppl):A19079)。由于在系统递送后摄入到心脏组织中，tc-DNA-PS可以适合地用于校正心脏组织中突变的cMyBP。当然，还预期本发明的tc-DNA-PS可用于心脏组织中其他蛋白的校正。

用于治疗CNS疾病的三环硫代磷酸酯反义寡核苷酸

出人意料的是，已显示本发明的tc-DNA-PS分子跨越血脑屏障。因此，本发明涉及用于提供将寡核苷酸定向到CNS的方法，所述方法包括向需要的对象给药tc-DNA-PS寡核苷酸。此外，本发明还涉及用于在需要的对象中治疗影响CNS的疾病的方法，所述方法包括向所述对象、尤其是人类对象给药本发明的tc-DNA-PS分子。所述tc-DNA-PS与限定的靶序列互补，使得所给药的tc-DNA-PS与靶序列之间的相互作用提供所述疾病的有效治疗。在特定实施方式中，本发明的核酸分子可用于治疗影响肌肉和CNS两者的疾病。正如上面提到的，尽管杜氏肌营养不良主要以观察到的肌肉机能障碍为特征，但约三分之一的DMD患者还表现出认知缺损，表明神经元和脑功能的值得注意的破坏。因此，本发明的核酸分子可用于恢复由异常的肌萎缩蛋白引起的被破坏的神经元和脑功能。

此外，本发明的核酸分子可用于治疗以CNS障碍为主要特点或主要特点之一的疾病。例如，上面描述的用于恢复有功能蛋白(通过外显子跳跃或外显子包含)或用于破坏特定pre-mRNA的原理，可以被调换到诸如脊髓性肌萎缩、肌强直性营养不良或亨廷顿病的疾病的治疗。

实施例

上面的公开内容对本公开进行了一般性描述，其将通过下面的实施例进行进一步示例说明。描述这些具体实施例仅仅是出于说明的目的，而不打算限制本公开的范围。尽管在本文中使用了具体的靶、项和值，但这些靶、项和值同样应该被理解为是示例性的，而不对本公开的范围构成限制。

杜氏肌营养不良(DMD)是一种X-染色体连锁的阴性障碍，在每3500个活的男性新生儿中影响1人(Emery.Neuromuscul.Disord.1991)。它由编码肌萎缩蛋白的基因中的突变引起，所述肌萎缩蛋白是存在于各种组织中，特别是横纹肌和尤其是中枢神经系统的区域中的神经元中的一种大蛋白(427kDa)(Kunkel等，PNAS.1985；Muntoni F等，LancetNeurol.2003)。肌萎缩蛋白的位置接近于细胞质膜的内表面，通过膜肌萎缩蛋白结合性糖蛋白复合体将肌动蛋白细胞骨架连接到细胞外基质(Culligan等，1988)。肌萎缩蛋白的缺乏使肌纤维特别易受机械应力的伤害，并经历反复出现的坏死循环。结果，患者表现出骨骼肌的渐进性虚弱，所述骨骼肌随着时间被脂肪组织代替，导致到12岁左右丧失行走能力，随后在十几岁到三十几岁之间由呼吸衰竭或心肌病引起过早死亡。此外，约三分之一的DMD患者还表现出认知缺损，表明值得注意的神经元和脑功能的破坏(Bresolin等，Neuromuscul.Disord.1994)。

从由79个外显子构成的主要的14-kb mRNA转录本翻译的全长肌萎缩蛋白是一种模块化蛋白，只要开放阅读框得以保留，其能够幸运地支持多个外显子的缺失(Koenig等，Cell.1987)。这种现象发生在临床上较温和的疾病贝克肌营养不良(BMD)中，其中维持开放阅读框的缺失导致合成截短的、部分有功能形式的肌萎缩蛋白(Monaco等，Genomics.1988)。因此，在15年前提出，使用反义寡核苷酸(AON)干扰所选外显子的剪接过程可能是DMD的适合的治疗方法(Matsuo M.Brain Dev.1996)。

已经深入试验了两种类型的化合物用于反义寡核苷酸诱导的外显子跳跃，具有全长硫代磷酸酯骨架的2’-O-甲基-修饰的核糖寡聚体(2OMe-PS)和二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)。已显示，在DMD的动物模型中和更近的临床试验中，两种类型的反义分子在系统递送后挽救骨骼肌中的肌萎缩蛋白。就目前情况看，使用靶向肌萎缩蛋白pre-mRNA的外显子51的2’OMe-PS和PMO的系统给药的临床试验被良好地耐受，没有药物相关的严重不利事件(van Deutekom等，New.Engl.J；Med.2007；Kinali等，Lancet Neurol.2009；Goemans等，New.Engl.J.Med.2011；Cirak等，Lancet2011)。然而，这些化合物具有重要限制，即它们不有效靶向心肌，并且不跨过血脑屏障。

在这里，我们显示由三环DNA(tc-DNA)核苷酸类似物制造的反义寡聚体的系统递送同样地允许在mdx小鼠模型中挽救骨骼肌中的肌萎缩蛋白。此外，用硫代替磷酸酯骨架中的氧，为tc-DNA反义核酸赋予了对于它们在系统给药后的生物分布来说关键的新的性质。事实上，含有硫代磷酸酯(PS)的tc-DNA寡聚体现在可以有效地靶向心肌并且还跨过血脑屏障，以挽救心脏和中枢神经系统中突变的肌萎缩蛋白。

材料和方法：

三环DNA

硫代磷酸酯tc-DNA的合成按照亚磷酰胺方法，遵照固相寡核苷酸合成中的经典程序。向生长中的链附连一个附加单元的合成循环由四个顺序步骤(a-d)构成。在链组装后，以通常方式(浓NH₃，55℃，16h)将寡核苷酸从固相支持物上拆下并去保护。使用长链烷基胺可控孔径玻璃(LCAA-CPG)作为固相支持物，第一个tc-核苷通过琥珀酰基连接物连接到其上。合成一般以1.3或10μmol的规模在Pharmacia gene assembler plus DNA合成仪上进行。Tc-PS-寡核苷酸被合成为具有5’末端磷酸酯或硫代磷酸酯基团，以确保5’-末端的化学稳定性。每个步骤a)-d)的条件在下面给出，并且为10μmol的合成进行优化。

a)脱三苯甲基化：用1,2-二氯乙醇(DCE)中的3％二氯乙酸冲洗1.5min。然后用DCE和CH₃CN清洗。

b)偶联：将亚磷酰胺溶液(0.1μM，在CH₃CN中，400μL)和活化剂5-乙基硫代四唑(ETT，0.25M，在CH₃CN中，600μL)施加到固相。偶联时间：9min。然后用CH₃CN清洗。

c)硫化：将1/1的无水吡啶/CH₃CN中的双(苯基乙酰基)二硫化物(PADS)(0.2M)在固相支持物上冲洗3min。然后用CH₃CN清洗。

d)封端：将未反应的5’-羟基用CapA(CH₃CN中的4-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.5M))和CapB溶液(乙酸酐(AC₂O)、可力丁在CH₃CN中(2:3:5))各封端20s。然后用CH₃CN洗涤。

用于挽救mdx肌萎缩蛋白pre-mRNA的反义序列长为15mer，并靶向外显子23的供体剪接位点(M23D(+2-13))。

5’–AACCTCGGCTTACCT–3’(SEQ ID NO:1)

也已按照这种方法合成了本文中描述的其他反义序列。

动物实验

在使用异氟醚的全身麻醉下，如结果部分中所指示的，将成年mdx小鼠(6至8周龄)用tc-DNA或tc-DNA-PS进行肌肉内、静脉内或皮下注射。

DKO小鼠通过对(utr+/-，dys-/-)小鼠进行杂交来产生，后者通过utr-/-小鼠与mdx小鼠的杂交来获得(Deconinck,A.E.,Rafael,J.A.,Skinner,J.A.,Brown,S.C.,Potter,A.C.,Metzinger,L.,Watt,D.J.,Dickson,J.G.,Tinsley,J.M.and Davies,K.E.(1997)作为杜氏肌营养不良的模型的Utrophin-肌萎缩蛋白缺陷的小鼠(Utrophin-dystrophin-deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy)，Cell,90,717–727)。将TcDNA每周以200mg/kg/wk的剂量交替地通过尾静脉中的静脉内(IV)和皮下(Sc)注射递送到dKO小鼠，其中小鼠处于全身麻醉之下。在结果部分中指示的各个时间点，通过CO₂吸入将治疗过的小鼠处死。将肌肉在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻，并在进一步分析之前储存在-80℃下。所有dKO实验在牛津大学生物医学大厦(Biomedical ScienceBuilding,University of Oxford,Oxford,UK)执行，并按照由英国内政部(Home Office)批准的指导方针和流程来进行。

肌肉功能分析

在12周龄时，使用商品化握力监测仪(Chatillon,UK)对治疗和对照小鼠进行功能性握力分析。在距尾巴根部2cm处抓住每只小鼠，使小鼠用其前爪握住附连到装置的杆，并轻柔拉扯直至它们松开抓握。从平均间隔为1min的4次顺序试验记录施加的力。从治疗和对照小鼠的后退剖下的趾长伸肌(EDL)测量断面比力和力降。在解剖和实验期间，将肌肉浸泡在充氧的(95％O₂–5％CO₂)Krebs–Hensley溶液中，所述溶液由下述物质构成(mM)：NaCl，118；NaHCO₃，24.8；KCl，4.75；KH₂PO₄，1.18；MgSO₄，1.18；CaCl₂，2.54；葡萄糖，10。收缩性能如前所述进行测量(Goyenvalle,A.,Babbs,A.,Powell,D.,Kole,R.,Fletcher,S.,Wilton,S.D.和Davies,K.E.(2010)在受到严重影响的肌萎缩蛋白/utrophin缺陷的小鼠中通过吗啉代寡聚物介导的外显子跳跃防止营养不良病(Prevention of dystrophic pathologyin severely affected dystrophin/utrophin-deficient mice by morpholino-oligomer-mediated exon-skipping)，Mol.Ther.,18,198–205.)。

开场活动监测

使用Linton AM1053X,Y,Z IR活动监测仪进行dKO小鼠的开场活动监测。在开始真正的数据收集的前一天，将小鼠在空笼子中适应环境90分钟。连续三天，在90分钟的时间段内每10分钟收集数据。在分析后，将每天的9个记录中的前3个记录忽略。对每只小鼠测量22个不同的活动参数，其中总行走距离、总活动、耸立时间和总运动计数被认为是监测行为活动的最佳参数。

免疫组织化学和组织学

以100μm的间隔，从胫骨前肌、腓肠肌、股四头肌、臀肌、二头肌、三头肌、横膈膜和心肌的至少三分之二的肌肉长度切下8μm的切片。收集居间的肌肉切片用于随后的RT-PCR分析。使用常规苏木精和曙红染色来检查总体肌肉形态。然后使用兔多克隆抗体DYS(Novocastra,UK)检查冷冻切片的肌萎缩蛋白表达，所述抗体随后通过山羊抗兔IgGAlexa488来检测。

RNA分离和RT-PCR分析

按照制造商的说明书(Invitrogen,UK)，使用TRIzol试剂，从在冷冻切片期间收集的居间肌肉切片分离总RNA。将200ng总RNA的等分试样用于RT–PCR分析，所述分析使用Access RT-PCR系统(Promega)在50μl反应中进行，使用了外部引物Ex20Fo(5’–CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG–3’；SEQ ID NO:12)和Ex26Ro(5’–TTCTTCAGCTTGTGTCATCC–3’；SEQ ID NO:13)。cDNA合成在45℃下执行45min，然后直接进行30个循环的94℃(30s)、58℃(1min)和72℃(2min)的主要PCR。然后将2微升的这些反应在巢式PCR中，通过22个循环的94℃(30s)、58℃(1min)和72℃(2min)进行重新扩增，其中使用了内部引物Ex20Fi(5’–CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC–3’；SEQ ID NO:14)和Ex26Ri(5’–CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT–3’；SEQ ID NO:15)。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行分析。

在mdx中枢神经系统中检测外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA

将Mdx小鼠每两周用皮下和静脉内注射的M23D(+2-13)(tc-DNA或tc-DNA-PS骨架)进行治疗，共8周，剂量为100mg/kg体重。在最后一次注射后的一周，将脑解剖出来并进行处理，以检测外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA。使用允许特异性识别作为398bp的片段的被跳过的信使的引物(分别为退火于外显子20的Ex20Fo(out)/Ex20Fi(in)和退火于外显子26和接头22-24的Ex26Ro/Ri22-24)(Ri22-245’-TTATGTGATTCTGTAAATTC-3’SEQ ID NO:16)，通过巢式RT-PCR分析RNA样品。注意，由于Ri引物特异性退火于外显子22-外显子24边界，因此未被跳过的肌萎缩蛋白mRNA没有被扩增，并且398-bp的条带只能在含有失去外显子23的肌萎缩蛋白mRNA的样品中被检测到。

通过定量PCR定量外显子23跳跃

如上所述从小鼠组织分离RNA。使用Turbo无DNA系统(Ambion)从RNA制备物除去污染的DNA。然后使用第一链合成系统(Invitrogen)和随机六聚物，按照制造商的说明书对1μg DNase处理过的RNA的等分试样进行反转录。使用针对外显子4-5或外显子22-24模板设计的Taqman测定法，使用Custom Assay Design Tool(Applied Biosystems)，如Goyenvalle等，通过scAAV-U7snRNA介导的外显子跳跃挽救受到严重影响的肌萎缩蛋白/utrophin缺陷的小鼠(Rescue of severely affected dystrophin/utrophin deficient mice throughscAAV-U7snRNA-mediated exon skipping)，Human Molecular Genetics,2012,Vol.21,No.112559–2571中所述，进行定量PCR。使用本发明人的18S测定法作为内源对照(AppliedBiosystems,4310893E)。每个反应使用50ng cDNA作为输入，并且所有测定以单路进行。测定在快速循环条件下，在Applied Biosystems StepOne Plus热循环仪上进行，所有数据使用伴随的StepOne分析软件，使用比较Ct方法进行分析。对于给定样品来说，分别使用外显子4-5和外显子22-24测定的ΔCt值来计算总肌萎缩蛋白和外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA的相对丰度。然后将外显子23跳跃表示成针对由外显子4-5的表达水平所指示的总肌萎缩蛋白的百分率。

Western印迹分析

使用含有250mM蔗糖、10mM Tris-HCl pH6.7、20％十二烷基硫酸钠、20％甘油、10％β-巯基乙醇、12.5％运行缓冲液(Life Technologies)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的缓冲液，从肌肉样品提取总蛋白。将样品在95℃变性5min并离心。然后将等分试样使用Compat-Able Protein Assay Preparation Reagent Set进行沉淀，用BCA Protein Assaykit(Pierce)定量，并将50μg或100μg蛋白质上样到聚丙烯酰胺凝胶中(NuPage4-12％Bis-Tris，Life Technologies)。将凝胶在130V下电泳4-5hr，并在100mM下过夜转移到硝酸纤维素膜。将印迹用PBS–Tween(PBST)缓冲液中的10％脱脂奶阻断1hr。通过分别用1:50稀释的NCL-DYS1第一抗体(针对肌萎缩蛋白R8重复序列的单克隆抗体；NovoCastra)和1:5000稀释的α-辅肌动蛋白第一抗体(Santa Cruz Biotechnology)探测膜，然后与小鼠辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(1:15000)温育，来检测肌萎缩蛋白和α-辅肌动蛋白。使用增强化学发光(Thermo Scientific)和ECL分析系统(ECL-Plus；GE Healthcare)来揭示Western印迹。使用肌动蛋白的条带来检查蛋白上样的正确性。通过扫描将膜转变成数字图片，并使用ImageJ1.46r软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)分析条带强度。

从血清定量生物标志物水平

在全身麻醉下，从尾部放血收集血样。血清肌酸激酶(CK)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平的分析由病理实验室(Mary Lyon Centre,MedicalResearch Council,Harwell,Oxfordshire,UK)进行。

统计分析

除非另有陈述，否则所有结果被表示为平均值±SEM。治疗和对照组群之间的差异使用不成对student’s t-检验来确定。

实施例1–tc-DNA-PS反义寡核苷酸用于治疗肌萎缩蛋白介导的肌营养不良的体内评估

通过以每周200或50mg/kg体重的剂量使用tc-DNA-PS M23D(+2-13)寡聚体的皮下和/或静脉内注射，对成年mdx小鼠进行12周的系统性治疗。在最后一次注射后2周，收获肌肉，并使用肌萎缩蛋白基因的外显子20和26中的引物，通过巢式RT-PCR分析RNA样品。图3A示出了在来自于治疗过的动物的大量骨骼肌中外显子23被跳过的肌萎缩蛋白mRNA的检测。903-bp的条带对应于包围mdx无义突变的未被跳过的肌萎缩蛋白mRNA，而更短的688-bp片段对应于外显子23被跳过的mRNA。显然，使用含硫代磷酸酯的寡聚体的系统治疗在各种骨骼肌(即胫骨前肌、腓肠肌、股四头肌、臀肌、三头肌、二头肌、横膈膜)包括呼吸肌以及心肌中诱导肌萎缩蛋白mRNA的显著挽救。与被跳过的转录本的产生相一致，通过Western印迹分析(图3B)和组织切片上的免疫荧光(图4)两者，容易地检测到肌萎缩蛋白。肌萎缩蛋白的水平反映了被挽救的mRNA的水平，并且跳跃程序产生迁移性在427kDa左右的免疫反应性蛋白物质。野生型与挽救的蛋白之间预期的8kD的差异，在本研究中使用的凝胶类型上不能被分辨。重要的是，如图5中所示，静脉内和皮下两种递送方式在mdx中产生相似的广泛的肌萎缩蛋白挽救。无论何种系统递送方式，使用正常的tc-DNA骨架(即具有正常的磷酸二酯核苷间键)制造的寡核苷酸都不能显著靶向心肌。如图6中所示，这只能使用硫代磷酸酯(-PS)骨架来实现。硫代磷酸酯修饰提供显著的药物动力学益处，我们调查了这样的修改是否允许寡核苷酸跨过血脑屏障。事实上，已显示使用正常tc-DNA骨架的寡核苷酸当在立体定位注射到小脑延髓池中之后被递送到脑脊液中时，挽救肌萎缩蛋白mRNA，表明它们可以跨过室管膜上皮。然而，这样的化合物在静脉内和/或皮下递送时是无效的，证实了它们不能跨过血脑屏障(图7)。事实上，这只有在使用硫代磷酸酯化(-PS)形式的tc-DNA时才成功地实现(图8)，因此证实了它们接近理想情况下肌萎缩蛋白必须被恢复的所有主要组织即骨骼肌、心脏和CNS的能力。

tc-DNA-PS(M23D+2-13)的系统递送的治疗效果，被治疗的动物的血清中肌酸激酶水平的显著降低所证实，表明被挽救的肌萎缩蛋白的量适合于保护纤维免于运动诱导的损伤且没有明显毒性，正如由血液中ALT和AST的水平在无论何种寡聚体浓度下也不增加所证明的(图9A和B)。还通过试验治疗过的肌肉的明显提高的断面比力来评估肌肉改善(图9C)。更重要的是，通过测量在一系列离心收缩后的力缺失所评估的营养不良肌肉的特征性特点，即力降的百分率，在治疗的动物中减少，证实了在治疗的动物中肌纤维具有高得多的抗性(图9D)。

在dKO转基因小鼠、一种更严重的DMD模型中评估临床相关性，所述小鼠缺少肌萎缩蛋白和utrophin两者，导致渐进性的肌肉萎缩、运动受损和过早死亡。对于mdx而言，用tc-DNA-PS系统性治疗dKO允许在所有组织区室中显著挽救肌萎缩蛋白(图10)。在开始治疗后的不同时间点通过定量RT-PCR评估外显子跳跃的百分率，显示出在治疗的持续时间内存在着累计效应。在20周后横膈膜中的mRNA挽救几乎完成，人们可以预期其他骨骼肌将在40周内达到这种水平，并且对于寡聚体的摄取显得更低的心脏和脑来说将会晚一些(图11)。然而，在12周的治疗后，dKO中的肌萎缩蛋白挽救水平提供了显著的临床益处。治疗过的小鼠不显示出特征性的脊柱后凸，CK水平降低，同时小鼠身体活动性更强并表现出改善的生理参数(图12)。尽管药物动力学研究显示在静脉内注射后几分钟内寡核苷酸从血清消失(图13A)，但似乎一旦进入到靶组织内部之后他们具有长期持续的效果。在治疗结束后13周发现跳跃水平约为它们的最大值的一半这一事实(图13B)，表明了这一点。这种长期持续的效果在图14中显示的结果中得到证实。可能tc-DNA-PS在细胞中是稳定的，并且可以随时间重新被利用，因此限制了对频繁填充组织的需求，而这种组织的频繁填充在这些寡核苷酸被破坏或被它们的mRNA靶滴定的情况下是需要的。实施例2：递送靶向SMN2的外显子7的tc-DNA-PS(ISS7)的效果

使用SMA小鼠模型(FVB.Cg-Tg(SMN2)2Hung Smn1tm1Hung/J)。SMA III型小鼠(FVB.Cg-Tg(SMN2)2Hung Smn1^tm1Hung/J)被敲除掉Smn(Smn1-/-)，并含有由人类SMN2基因的两个串联拷贝构成的SMN2转入基因。这些动物表现出典型的特点，包括在约1月龄时开始尾巴坏死。这样的坏死逐渐扩展到耳的外耳壳和足部，并且在生命的晚期，这些动物显示出肌肉萎缩。图15的照片示出了3个III型个体(1月龄)。上方的是未治疗的对照；其他两个用tc-DNA-PS(ISS7)治疗：它们在出生时接受单次ICV(脑室内)注射(5μl，含有20μg tc-DNA-PS(ISS7))并每周一次以200mg/kg的剂量接受重复的SC(皮下)注射。

我们得出结论，tc-DNA-PS寡聚体代表了用于SMA疗法的可能的药物候选物。此外，由于这种类型的寡核苷酸可以自发地跨过血脑屏障(参见mdx部分)，因此可能tc-DNA-PS不必定要求脑内给药才能有效地重新指导CNS中的SMN2剪接。

实施例3：tc-DNA和tc-DNA-PS用于DM1的评估

将具有800个CTG重复序列的DM1成肌细胞用增加浓度的tc-DNA-CAG7(SEQ ID NO:11)转染。在培养3天后，通过Northern印迹分析正常和突变的CUGexp-DMPK(强直性肌营养不良蛋白激酶)mRNA两者的表达。对突变体CUGexp-DMPK与正常DMPK mRNA的比率进行定量。突变体CUGexp-DMPK mRNA的剂量依赖性降低而正常DMPK mRNA没有变化，表明使用寡核苷酸的治疗引起突变体CUGexp-DMPK的特异性破坏(参见图16)。

在另一个实验中，将具有扩增的CTG(>800个CTG)的DM1成肌细胞用10μg tc-DNA-PS-CAG7转染。在培养3天后，通过Northern印迹分析正常和突变的CUGexp-DMPK mRNA的表达。对突变体CUGexp-DMPK与正常DMPK mRNA的比率进行定量(图17的上方的道)。通过FISH检测CUG扩增的RNA的核聚集体(灶点)，并对没有CUGexp-RNA核聚集体的细胞数量进行定量(图17的下方的道)。结果显示，用寡核苷酸转染的DM1成肌细胞具有i)降低水平的突变体CUGexp-DMPK mRNA，且正常DMPK mRNA没有任何变化；ii)增加数量的不具有核聚集体的细胞。

然后在体内评估tc-DNA-PS-CAG7寡核苷酸的效果。由于所述寡核苷酸靶向DMPK转录本的CUG扩增的RNA而不影响DM1肌肉细胞中的正常DMPK转录本，因此我们决定评估寡核苷酸在DM1小鼠模型中的效果，所述小鼠模型在人类骨骼肌肌动蛋白(HSA)基因的3’非编码区中表达CUG扩增的RNA。这种DM1小鼠模型已被用于评估CAG8吗啉代和CAG82’-O-Me ASO两者，因为它显示出几种RNA转录本的可替选剪接误调控以及由ClC-1pre-mRNA的错误剪接引起的肌强直。

将在人类骨骼肌肌动蛋白(HSA)基因的3’UTR中表达250CTG的HSA-LR小鼠的胫骨前肌TA，用增加浓度的tc-DNA-PS-CAG7注射。将对侧TA肌肉用盐水注射并用作对照。2周后，通过Northern印迹分析HSA和MSA(小鼠骨骼肌肌动蛋白)mRNA的表达。对HSA与MSA mRNA的比率进行定量。图18示出了寡核苷酸的肌肉内注射引起CUGexp-RNA的显著减少。

将在人类骨骼肌肌动蛋白(HSA)基因的3’UTR中表达250CTG的HSA-LR小鼠的TA肌肉也用30μg tc-DNA-PS-CAG7注射。将对侧TA肌肉用盐水注射并用作对照。在1和2周后，通过Northern印迹分析HSA和MSA(小鼠骨骼肌肌动蛋白)mRNA的表达。对HSA与MSA mRNA的比率进行定量。图19显示，在1周后已经观察到寡核苷酸的肌肉内注射后CUGexp-RNA水平的降低。

最后，将在人类骨骼肌肌动蛋白(HSA)基因的3’UTR中表达250CTG的HSA-LR小鼠的腓肠肌GA用90μg tc-DNA-PS-CAG7注射。将对侧GA肌肉用盐水注射并用作对照。在2、4和8周后，通过Northern印迹分析HSA和MSA(小鼠骨骼肌肌动蛋白)mRNA的表达。对HSA与MSA mRNA的比率进行定量。图20显示，寡核苷酸的肌肉内给药引起CUGexp-RNA的有效破坏，并且效果在治疗后的4至8个月之间得以维持。

Claims

1.一种核酸分子，其包含由核苷间硫代磷酸酯键(3'-OPS-O-5'键)相连的三环核苷。

2.权利要求1的核酸分子，其包含3至50个之间的核苷酸。

3.权利要求1的核酸分子，其与靶序列互补。

4.权利要求3的核酸分子，所述核酸分子是与由基因编码的RNA的一部分互补的反义寡核苷酸。

5.权利要求1的核酸分子，其由在SEQ ID NO：1至11中选择的序列构成。

6.一种用于合成三环硫代磷酸酯DNA分子的方法，所述方法包括：

a)提供结合于固相支持物的第一三环核苷，所述第一三环核苷具有受保护的5'-OH基团；

b)将所述5'基团去保护以形成游离的5'-OH基团；

c)将所述游离的5'-OH基团与5'-受保护的三环核苷-3'-O-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺单体反应，以在所述第一三环核苷与第二三环核苷之间形成核苷间亚磷酰胺键；以及

d)将所述核苷间亚磷酰胺基团硫化，以在所述第一三环核苷与所述第二三环核苷之间形成硫代磷酸酯核苷间键。

7.一种药物组合物，其在可药用载体中包含权利要求1至4任一项的核酸分子。

8.权利要求7的药物组合物，所述组合物是可注射组合物。

9.权利要求8的药物组合物，所述组合物是用于静脉内注射的组合物。

10.权利要求1至4任一项的核酸分子在制备用于心脏病的治疗的药物中的应用。

11.权利要求1至5任一项的核酸分子在制备用于神经肌肉或肌肉骨骼疾病的治疗的药物中的应用。

12.权利要求1至4任一项的核酸分子在制备用于中枢神经系统疾病的治疗的药物中的应用。

13.权利要求10的应用，其中所述心脏病由基因的改变产生，其中所述改变是

1)外显子的整码突变；

2)破坏所述基因的翻译阅读框的突变，并且所述核酸分子促进外显子的跳跃以便恢复所述阅读框；

3)通过将非典型外显子包含在由所述基因编码的mRNA中来补偿的有害突变，并且所述核酸分子与所述基因编码的pre-mRNA中存在的内含子沉默序列或末端茎环互补并促进非典型外显子包含在由所述基因编码的mRNA中；或

4)导致在由所述基因编码的mRNA中出现有害的3'CUG扩增的突变。

14.权利要求11的应用，其中所述神经肌肉或肌肉骨骼疾病由基因的改变产生，其中所述改变是

1)外显子的整码突变；

15.权利要求12的应用，其中所述中枢神经系统疾病由基因的改变产生，其中所述改变是

1)外显子的整码突变；

16.权利要求1至5任一项的核酸分子在制备用于杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩或Steinert肌强直性营养不良的治疗的药物中的应用。