JP2021517826A - Gys2発現を阻害するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年3月2日に出願された米国特許仮出願第62/637574号、発明の名称「COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING GYS2 EXPRESSION」の米国特許法第119条(e)に基づく利益を主張するものである。この文献の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、ファイル名がD0800.70014WO00−SEQ.txtであり、2019年2月15日に作成され、サイズが132キロバイトのファイルとして提供されている。電子形式の配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の一態様は、GYS2の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号193〜384、417〜466、518〜568、575〜580、586〜598、又は620〜627のいずれか1つに示されている配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号193〜384、417〜466、518〜568、575〜580、586〜598、又は620〜627のいずれか1つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号417〜466、575〜580、586〜598、620〜627のいずれか1つに示されている配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号1〜192、385〜416、467〜517、569〜574、581〜585、又は612〜619のいずれか1つに示されている配列を含むセンス鎖を更に含む。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号1〜192、385〜416、467〜517、569〜574、581〜585、又は612〜619のいずれか1つに示されている配列からなる。一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号385〜416、569〜574、581〜585、612〜619のいずれか1つに示されている配列を含むか又はからなる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々が21〜23ヌクレオチド長の範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、19〜21ヌクレオチド長の範囲である二重鎖構造を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1又は複数ヌクレオチド長の3’−突出配列を含み、3’−突出配列は、アンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2ヌクレオチド長のアンチセンス鎖に3’−突出配列を更に含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは2ヌクレオチド長の3’−突出配列を含み、3’−突出配列はアンチセンス鎖に存在し、センス鎖は21ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は23ヌクレオチド長であり、センス鎖及びアンチセンス鎖は、21ヌクレオチド長の二重鎖を形成する。
本開示の別の態様は、GYS2の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、21〜27ヌクレオチド長であり、GYS2との相補性領域を有し、センス鎖は、S1−L−S2として示されるステム−ループをその3’末端に含み、式中S1は、S2に相補的であり、Lは、S1とS2との間に3〜5ヌクレオチド長のループを形成し、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、少なくとも19ヌクレオチド長の二重鎖構造を形成するが、共有結合では連結されていない、オリゴヌクレオチドを提供する(例えば、図3を参照)。一部の実施形態では、相補性領域は、GYS2 mRNAの少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、又は少なくとも21個の連続ヌクレオチドに完全に相補的である。一部の実施形態では、Lは、テトラループである。一部の実施形態では、Lは、4ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、Lは、GAAAとして示される配列を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の5’−ヌクレオチドの糖の4’−炭素は、ホスフェート類似体を含む。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは、1つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む。一部の実施形態では、各標的指向性リガンドは、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分を含む。一部の実施形態では、GalNac部分は、一価GalNAc部分、二価GalNAc部分、三価GalNAc部分、又は四価GalNAc部分である。一部の実施形態では、ステム−ループのLの最大で4個のヌクレオチドが、各々一価GalNAc部分にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、標的指向性リガンドは、アプタマーを含む。
本開示の別の態様は、本開示のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物を提供する。本開示の別の態様は、本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、上記方法は、肝腫大、肝小結節形成、肝毒性(例えば、AST、ALT、及び/又はALPのレベル)、肝線維症、肝細胞増殖、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び/又は肝細胞癌のレベル減少又は予防をもたらす。本開示の別の態様は、糖原病又は糖原病の1つ若しくは複数の症状を治療するための方法を提供する。例示的な糖原病の非限定的セットとしては、GSDI(例えば、GSDIa)、GSDIII、GSDIV、GSDVI、及びGSDIXを挙げることができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表4に示されている表の行から選択される1対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。
I.定義
投与:本明細書で使用される場合、用語「投与する」又は「投与」は、物質(例えば、オリゴヌクレオチド)を、薬理学的に有用な様式で(例えば、対象の状態を治療するために)対象に提供することを意味する。
およそ:本明細書で使用される場合、1つ又は複数の目的の値に適用される用語「およそ」又は「約」は、表記されている参照値と同様である値を指す。ある実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別様の記述がない限り又は別様に状況から明白でない限り(そのような数値が、可能な値の100%を超えてしまう場合を除く)、表記されている参照値のいずれかの方向に(より大きな又は未満)25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、又はそれよりも小さな値内に入る値の範囲を指す。
アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR):本明細書で使用される場合、用語「アシアロ糖タンパク質受容体」又は「ASGPR」は、大きな48kDaサブユニット(ASGPR−1)及び小さな40kDaサブユニット(ASGPR−2)により形成される二分C型レクチン(bipartite C−type lectin)を指す。ASGPRは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はN−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質(アシアロ糖タンパク質)の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有する。
デオキシリボヌクレオチド:本明細書で使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の2’位に水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、ホスフェート基、若しくは塩基に修飾を含むか又は糖、ホスフェート基、若しくは塩基の置換を含む、2’位以外の原子の1つ又は複数の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
賦形剤:本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、例えば、所望の稠度又は安定化効果を提供又は寄与するように組成物に含まれていてもよい非治療剤を指す。
糖原病:本明細書で使用される場合、用語「糖原病」、「GSD」、又は「糖原病(複数)」は、グリコーゲン合成、グリコーゲン分解、及び/又はグルコース分解(解糖)に影響を及ぼす酵素欠損により引き起こされる代謝障害を指す。GSD 0、GSD I(GSD1又はフォンギールケ病としても知られている;例えば、GSDIa)、GSD II(ポンペ病又は酸性マルターゼ欠乏症としても知られている)、GSD III(GSD3、コリ病、又はフォーブズ病としても知られている)、GSD IV(GSD4又はアンダーセン病)、GSD V(マッカードル病としても知られている)、GSD VI(GSD6又はハース病としても知られている)、GSD VII(GSD7又は垂井病としても知られている)、GSD VIII、及びGSD IX(GSD9としても知られている)を含む種々のタイプの糖原病が特徴付けられている。一部の実施形態では、糖原病を有する個体は、これらに限定されないが、肝腫大、肝毒性の増加(例えば、より高いレベルのAST、ALT、及び/又はALP)、肝線維症、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び/又は肝細胞癌を含む、幾つかの症状を呈する。
修飾ヌクレオチド間連結:本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド間連結」は、リン酸ジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間連結と比較して、1つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチド間連結を指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然連結である。典型的には、修飾ヌクレオチド間連結は、修飾ヌクレオチド間連結が存在する核酸に1つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。
修飾ヌクレオチド:本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して、1つ又は複数の化学的修飾を有するヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び/又はホスフェート基に1つ又は複数の化学的修飾を有する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドにコンジュゲートされた1つ又は複数の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に1つ又は複数の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、低免疫原性等を向上させることができる。ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース環の2’位に2’−O−メチル置換又は2’−F置換を含む。
オリゴヌクレオチド:本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、100ヌクレオチド長未満の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び/又は例えば修飾リボヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよく又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していてもよく又は有していなくともよい。1セットの非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、ダイサー基質干渉RNA(dsiRNA、dicer substrate interfering RNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖siRNA、又は一本鎖siRNAであってもよい。一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、RNAiオリゴヌクレオチドである。
ホスフェート類似体:本明細書で使用される場合、用語「ホスフェート類似体」は、ホスフェート基の静電気特性及び/又は立体特性を模倣する化学部分を指す。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、酵素的に除去され易いことが多い5’−ホスフェートの代わりに、オリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオチドに配置されている。一部の実施形態では、5’ホスフェート類似体は、ホスファターゼ耐性連結を含む。ホスフェート類似体の例としては、5’メチレンホスホネート(5’−MP)及び5’−(E)−ビニルホスホネート(5’−VP)等の5’ホスホネートが挙げられる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、5’−末端ヌクレオチドの糖の4’−炭素位置にホスフェート類似体を有する(「4’−ホスフェート類似体」と呼ばれる)。4’−ホスフェート類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分(例えば、その4’−炭素に)又はその類似体に結合されているオキシメチルホスホネートである。例えば、2017年9月1日に出願された国際特許出願第PCT/US2017/049909号、2016年9月2日に出願された米国特許仮出願第62/383,207号明細書、及び2016年9月12日に出願された第62/393,401号明細書を参照されたい。これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの5’末端には、他の修飾が開発されている(例えば、国際公開第2011/133871号;米国特許第8,927,513号明細書;及びPrakashら(2015年)、Nucleic Acids Res.、43巻(6号):2993〜3011頁を参照、これらの文献の各々のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。
RNAiオリゴヌクレオチド:本明細書で使用される場合、用語「RNAiオリゴヌクレオチド」は、(a)センス鎖(パッセンジャー)及びアンチセンス鎖(ガイド)を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部分は、標的mRNAの切断に際してアルゴノート2(Ago2)エンドヌクレアーゼにより使用される、二本鎖オリゴヌクレオチド、又は(b)単一のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖(又はそのアンチセンス鎖の一部分)は、標的mRNAの切断に際してAgo2エンドヌクレアーゼにより使用される、一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
鎖:本明細書で使用される場合、用語「鎖」は、ヌクレオチド間連結(例えば、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結)を介して共に連結されているヌクレオチドの単一の連続配列を指す。一部の実施形態では、鎖は、2つの遊離末端、例えば、5’−末端及び3’−末端を有する。
対象:本明細書で使用される場合、用語「対象」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。用語「個体」又は「患者」は、「対象」と同義的に使用される場合がある。
合成:本明細書で使用される場合、用語「合成」は、人為的に合成されたか(例えば、機械(例えば、固相核酸合成機)を使用して)、又はそうでなければ通常その分子を産生する天然供給源(例えば、細胞又は生物)に由来しない核酸又は他の分子を指す。
i. GYS2標的指向性オリゴヌクレオチド
本明細書では、異なる種(ヒト及びアカゲザル、(例えば、実施例1を参照))のmRNAを含むGYS2 mRNAの調査、並びにin vitro試験及びin vivo試験により、強力なオリゴヌクレオチドが特定された。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、GYS2活性を低減させることにより、及び結果的に肝腫大、肝毒性(例えば、AST、ALT、及び/又はALPのレベルにより示される)、肝線維症、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び/又は肝細胞癌を減少又は予防することにより、糖原病(例えば、GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI、及びGSDIX)又は糖原病の1つ若しくは複数の症状を有する対象の治療利益を達成することができる。例えば、本明細書では、表4に提供されている表にも配置されているような(例えば、配列番号1に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号193に示されている配列を含むアンチセンス鎖)、配列番号1〜192、385〜416、467〜517、569〜574、581〜585、又は612〜619のいずれか1つに示されている配列を含むか又はからなるセンス鎖、及び配列番号193〜384、417〜466、518〜568、575〜580、586〜598、又は620〜627から選択される相補的配列を含むか又はからなるアンチセンス鎖を有する強力なRNAiオリゴヌクレオチドが提供される。
一部の実施形態では、GYS2 mRNAのある領域は、他の領域よりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害を起こし易いため、標的化のホットスポットであることが発見された。一部の実施形態では、GYS2のホットスポット領域は、配列番号599〜608のいずれか1つに示されている配列からなる。GYS2 mRNAのこうした領域は、GYS2 mRNA発現を阻害するための本明細書で考察されているオリゴヌクレオチドを使用して標的とすることができる。
更に、一部の実施形態では、本明細書に提供されている二本鎖オリゴヌクレオチドは、表4に提供されている表に配置されているような(例えば、配列番号1に示されている配列を含むセンス鎖、及び配列番号193に示されている配列を含むアンチセンス鎖)、配列番号1〜192、385〜416、467〜517、569〜574、581〜585、又は612〜619のいずれか1つに示されている配列を有するセンス鎖、並びに配列番号193〜384、417〜466、518〜568、575〜580、586〜598、又は620〜627から選択される相補的配列を有するアンチセンス鎖を含むか又はからなる。
本開示の方法でGYS2 mRNAを標的とするのに有用なオリゴヌクレオチドには、RNAi、miRNA等を含む様々な構造が存在する。本明細書又は他所に記載の構造はいずれも、本明細書に記載の配列(例えば、配列番号599〜608に示されているもの等のGYS2のホットスポット配列、或いはそれぞれ、配列番号1〜192、385〜416、467〜517、569〜574、581〜585、若しくは612〜619に示されているか又は配列番号193〜384、417〜466、518〜568、575〜580、586〜598、若しくは620〜627に示されている配列を含むか又はからなるセンス鎖又はアンチセンス鎖)を組み込むか又は標的とするためのフレームワークとして使用することができる。GYS2発現を標的とするための二本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、RNAi経路により)は、一般に、互いに二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されていない。しかしながら、一部の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合で連結されている。
一部の実施形態では、GYS2発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドは、RNA干渉(RNAi)を引き起こす。例えば、各鎖が、1〜5個ヌクレオチドの少なくとも1つの3’突出を有する19〜25個ヌクレオチドのサイズを有するRNAiオリゴヌクレオチドが開発されている(例えば、米国特許第8,372,968号明細書を参照)。ダイサーによりプロセシングされて活性RNAi産物を生成するより長いオリゴヌクレオチドも開発されている(例えば、米国特許第8,883,996号明細書を参照)。更なる研究により、鎖の一方が熱力学的に安定なテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の末端が二重鎖標的指向性領域を越えて伸長している伸長二本鎖オリゴヌクレオチドがもたらされた(例えば、米国特許第8,513,207号明細書及び第8,927,705号明細書並びに国際公開第2010033225号を参照。これらの文献は、それらのオリゴヌクレオチドの開示について参照により本明細書に組み込まれる)。そのような構造としては、一本鎖伸長(分子の一方又は両方の側の)並びに二本鎖伸長を挙げることができる。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス−センス二重鎖を越えて伸長する領域を含む36個ヌクレオチドのセンス鎖を有し、伸長領域は、ステムが6塩基対の二重鎖であり、テトラループが4個のヌクレオチドを有するステム−テトラループ構造を有する。一部の実施形態では、ステム−テトラループは、S1−L−S2として示され、式中、S1は二重鎖を形成するようにS2と相補的であり、Lは、S1とS2との間にテトラループを形成する。
こうした実施形態にあるものでは、テトラループヌクレオチドの3個又は4個は各々、一価GalNacリガンドにコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、25個ヌクレオチドのセンス鎖、及びダイサー酵素による作用を受けると、成熟RISCに組み込まれるアンチセンス鎖がもたらされる27個ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。
一部の実施形態では、GYS2を標的とするための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号193〜384、417〜466、518〜568、575〜580、586〜598、又は620〜627のいずれか1つに示されている配列を含むか又はからなるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号193〜384、417〜466、518〜568、575〜580、586〜598、又は620〜627のいずれか1つに示されている配列の少なくとも12個(例えば、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、又は少なくとも23個)の連続ヌクレオチドを含むか又はからなるアンチセンス鎖を含む。
一部の実施形態では、GYS2を標的とするための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜192、385〜416、467〜517、569〜574、581〜585、又は612〜619のいずれか1つに示されているセンス鎖配列を含むか又はからなる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号1〜192、385〜416、467〜517、569〜574、581〜585、又は612〜619のいずれか1つに示されている配列の少なくとも12個(例えば、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、又は少なくとも23個)の連続ヌクレオチドを含むか又はからなるセンス鎖を有する。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、最大で40ヌクレオチド長(例えば、最大で40、最大で36、最大で30、最大で27、最大で25、最大で21、最大で19、最大で17、又は最大で12ヌクレオチド長)のセンス鎖(又はパッセンジャー鎖)を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも12ヌクレオチド長(例えば、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも19、少なくとも21、少なくとも25、少なくとも27、少なくとも30、少なくとも36、又は少なくとも38ヌクレオチド長)のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、12〜40(例えば、12〜40、12〜36、12〜32、12〜28、15〜40、15〜36、15〜32、15〜28、17〜21、17〜25、19〜27、19〜30、20〜40、22〜40、25〜40、又は32〜40)ヌクレオチド長の範囲のセンス鎖を有してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40ヌクレオチド長のセンス鎖を有してもよい。
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、少なくとも12(例えば、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、又は少なくとも21)ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、12〜30ヌクレオチド長(例えば、12〜30、12〜27、12〜22、15〜25、18〜30、18〜22、18〜25、18〜27、18〜30、19〜30、又は21〜30ヌクレオチド長)の範囲である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の長さ全体にはわたっていない。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの長さ全体にわたる。ある実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の長さ全体にわたる。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかに、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に、3’−突出が存在する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、一方の5’末端が、他方の5’末端と比較して熱力学的により不安定である。一部の実施形態では、センス鎖の3’末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の3’末端に突出を含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の3’突出は、1〜8ヌクレオチド長(例えば、1、2、3、4、5、6、7、又は8ヌクレオチド長)である。
典型的には、RNAiのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス(ガイド)鎖の3’末端に2個ヌクレオチドの突出を有する。しかしながら、他の突出が可能である。一部の実施形態では、突出は、1〜6個ヌクレオチド、任意選択で1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜6、3〜5、3〜4、4〜6、4〜5、5〜6個ヌクレオチド、又は1、2、3、4、5、若しくは6個ヌクレオチドの長さを含む3’突出である。しかしながら、一部の実施形態では、突出は、1〜6個ヌクレオチド、任意選択で1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜6、3〜5、3〜4、4〜6、4〜5、5〜6個ヌクレオチド、又は1、2、3、4、5、若しくは6個ヌクレオチドの長さを含む5’突出である。
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間には1つ又は複数の(例えば、1、2、3、又は4つの)ミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に1つよりも多くのミスマッチが存在する場合、それらは、連続的に配置されていてもよく(例えば、2つ、3つ、又はそれより多くが連続して)、又は相補性領域の全体にわたって点在していてもよい。一部の実施形態では、センス鎖の3’−末端は、1つ又は複数のミスマッチを含む。一実施形態では、2つのミスマッチが、センス鎖の3’末端に組み込まれている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の3’−末端のセグメントの塩基ミスマッチ又は不安定化は、恐らくはダイサーによるプロセシングを促進することにより、RNAiにおける合成二重鎖の効力を向上させた。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている、GYS2発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造としては、これらに限定されないが、一本鎖RNAiオリゴヌクレオチドを挙げることができる。最近の努力により、一本鎖RNAiオリゴヌクレオチドの活性が実証されている(例えば、Matsuiら(2016年5月)、Molecular Therapy、24巻(5号)、946〜955頁を参照)。しかしながら、一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’から3’方向に記載して、特定の核酸の標的とされているセグメントの逆相補体を含み、(例えば、ギャップマー(gapmer)として)細胞でのその標的RNAのRNaseH媒介性切断を誘導するように、又は(例えば、ミックスマー(mixmer)として)細胞での標的mRNAの翻訳を阻害するように好適に修飾されている核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。本開示で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関するその開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9,567,587号明細書に示されているものを含む、当該技術で公知の任意の好適な様式で修飾することができる(例えば、長さ、核酸塩基(ピリミジン、プリン)の糖部分、及び核酸塩基のヘテロ環部分の変更を含む)。更に、アンチセンス分子は、特定の標的遺伝子の発現を低減させるために、数十年にわたって使用されている(例えば、Bennettら、Pharmacology of Antisense Drugs,Annual Review of Pharmacology and Toxicology、57巻:81〜105頁を参照)。
オリゴヌクレオチドは、種々の方法で修飾して、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解からの耐性、免疫原性、塩基対合特性、RNA分布、及び細胞取り込み、及び治療使用又は研究使用に関連する他の特徴を向上又は制御することができる。例えば、Bramsenら、Nucleic Acids Res.、2009年、37巻、2867〜2881頁;Bramsen及びKjems(Frontiers in Genetics、3巻(2012年):1〜22頁)を参照されたい。従って、一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の好適な修飾を含んでいてもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基(又は核酸塩基)、糖(例えば、リボース、デオキシリボース)、又はホスフェート基に修飾を有する。
一部の実施形態では、修飾糖(本明細書では糖類似体とも呼ばれる)としては、例えば、糖の2’、3’、4’、及び/又は5’炭素位置に1つ又は複数の修飾が生じる修飾デオキシリボース又はリボース部分が挙げられる。また、一部の実施形態では、修飾糖は、ロックド核酸(「LNA」)(例えば、Koshkinら(1998年)、Tetrahedron 54巻、3607〜3630頁を参照)、アンロックド核酸(「UNA」)(例えば、Sneadら(2013年)、Molecular Therapy−Nucleic Acids、2巻、e103頁を参照)、及びブリッジ核酸(「BNA」)(例えば、Imanishi及びObika(2002年)、The Royal Society of Chemistry,Chem.Commun.、1653〜1659頁を参照)に提示されているもの等の非天然代替炭素構造を含んでいてもよい。Koshkinら、Sneadら、Imanishi、及びObikaは、糖修飾に関するそれらの開示について参照により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドの5’−末端ホスフェート基は、アルゴノート2との相互作用を増強してもよく又は一部の場合では増強する。しかしながら、5’−ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素による分解に感受性であってもよく、それによりin vivoでのそれらの生物学的利用能を制限することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドとしては、そのような分解に耐性である5’ホスフェートの類似体が挙げられる。一部の実施形態では、ホスフェート類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の5’末端は、天然5’−ホスフェート基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分(「ホスフェート模倣体」)に付着されている(例えば、Prakashら(2015年)、Nucleic Acids Res.、Nucleic Acids Res.2015年3月31日;43巻(6号):2993〜3011頁を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。5’末端に付着させることができるホスフェート模倣体が数多く開発されている(例えば、米国特許第8,927,513号明細書を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。オリゴヌクレオチドの5’末端のための他の修飾が開発されている(例えば、国際公開第2011/133871号を参照。この文献のホスフェート類似体に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。ある実施形態では、ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチドの5’末端に付着されている。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ホスフェート修飾又は置換は、少なくとも1つの(例えば、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つの)修飾ヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドをもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか1つは、1〜10個の(例えば、1〜10、2〜8、4〜6、3〜10、5〜10、1〜5、1〜3、又は1〜2個の)修飾ヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか1つは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の修飾ヌクレオチド間連結を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の修飾核酸塩基を有する。一部の実施形態では、修飾核酸塩基(本明細書では塩基類似体とも呼ばれる)は、ヌクレオチド糖部分の1’位に連結されている。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含んでいない。例えば、米国特許出願公開第20080274462号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、ある実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含んでいない(脱塩基)。
一部の実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の1’位に、又は二重鎖に存在する場合、二重鎖の構造を実質的に変更することなく1つよりも多くのタイプの塩基の反対側に配置することができるヌクレオチド糖部分置換の等価位置に位置するヘテロ環式部分である。一部の実施形態では、標的核酸と完全に相補的な参照一本鎖核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸と形成される二重鎖よりも低いTmを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。しかしながら、一部の実施形態では、ユニバーサル塩基が、単一のミスマッチを生成するように塩基と置き換えられている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される二重鎖よりも高いTmを有する、標的核酸との二重鎖を形成する。
ある修飾をなして、標的細胞に到達する前のin vivo環境からオリゴヌクレオチドを保護することができるが、それらは、標的細胞のサイトゾルに到達するとオリゴヌクレオチドの効力又は活性を低減させる場合がある。分子が細胞の外部で望ましい特性を維持するように可逆的修飾をなすことができ、その後可逆的修飾は、細胞のサイトゾル環境に進入すると除去される。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用により、又は細胞内部の化学条件により(例えば、細胞内グルタチオンによる還元により)除去することができる。
一部の実施形態では、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート連結により創出される負電荷を遮蔽し、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を向上させるように、環式ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。元々はTraversa Therapeutics,Inc.社に帰属する米国特許出願公開第2011/0294869号明細書(「Traversa」)、Solstice Biologics,Ltd.社の国際公開第2015/188197号(「Solstice」)、Meadeら、Nature Biotechnology、2014年、32巻:1256〜1263頁(「Meade」)、Merck Sharp & Dohme Corp社の国際公開第2014/088920号を参照されたい。これらの文献の各々は、そのような修飾の開示について参照により組み込まれる。ヌクレオチド間ジホスフェート連結のこの可逆的修飾は、サイトゾルの還元環境(例えば、グルタチオン)により細胞内で切断されるように設計されている。より初期の例としては、細胞内部で切断可能であることが報告された中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる(Dellingerら、J.Am.Chem.Soc.2003年、125巻:940〜950頁)。
一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の2’炭素に付着されている。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの5’−末端ヌクレオチドである場合、糖の5’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの3’−末端ヌクレオチドである場合、糖の3’−炭素に位置する。一部の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、2016年8月23日に出願され、国際公開第2018/039364号として2018年3月1日に公開された、Compositions Comprising Reversibly Modified Oligonucleotides and Uses Thereofと題する国際特許出願第PCT/US2017/048239号を参照されたい。これらの文献の内容は、その関連開示について参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを、1つ若しくは複数の細胞又は1つ若しくは複数の臓器に標的化することが望ましい場合がある。そのような戦略は、他の臓器における望ましくない効果の回避を支援することができるか、又はオリゴヌクレオチドにとって利益とならない可能性がある細胞、組織、若しくは臓器へのオリゴヌクレオチドの過度の喪失を回避することができる。従って、一部の実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞、又は臓器の標的化を容易にするように、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝実質細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾されていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされているヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、GYS2の発現を低減するオリゴヌクレオチドを、対象の肝臓の肝実質細胞へと標的化することが望ましい。任意の好適な肝実質細胞指向性部分をこの目的に使用することができる。
GalNAcは、主に肝実質細胞の洞様表面に発現され、末端ガラクトース又はN−アセチルガラクトサミン残基を含む循環性糖タンパク質(アシアロ糖タンパク質)の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を有するアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に対する高親和性リガンドである。GalNAc部分を本開示のオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションすることにより(間接的又は直接的のいずれかで)、そうしたオリゴヌクレオチドを、そうした肝実質細胞上に発現されるASGPRへと標的化することができる。
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするための種々の製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑えるか、送達及び/若しくは取り込みを容易にするか、又は製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象又は細胞環境に送達することができる。一部の実施形態では、本明細書には、GYS2の発現を低減させるオリゴヌクレオチド(例えば、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド)を含む組成物が提供される。そのような組成物は、標的細胞の直近環境に又は全身性のいずれかで対象に投与されると、十分な割合のオリゴヌクレオチドが細胞に進入して、GYS2発現を低減するように好適に製剤化することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを使用して、本明細書で開示されているGYS2を低減するためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩溶液等の緩衝溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドで製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートは、水又は水溶液(例えば、pH調整剤を有する水)で製剤化される。一部の実施形態では、ネイキッドオリゴヌクレオチド又はそれらのコンジュゲートは、塩基性緩衝水溶液(例えば、PBS)で製剤化される。
従って、一部の実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、若しくはナノ粒子を含むか、又はそうでなければそれを必要とする対象の細胞、組織、臓器、若しくは体内に投与するために製剤化することができる(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第22版、Pharmaceutical Press、2013年を参照)。
一部の実施形態では、医薬組成物は、その意図されている投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、径粘膜、及び直腸内投与が挙げられる。典型的には、投与経路は、静脈内又は皮下である。
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約0.1%又はそれよりも多くの治療剤(例えば、GYS2発現を低減するためのオリゴヌクレオチド)を含んでいてもよいが、活性成分のパーセンテージは、全組成物の質量又は容積の約1%〜約80%又はそれよりも大きくてもよい。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品保管寿命等の要因、並びに他の薬学的考慮要因が、そのような医薬製剤を調製する当業者により企図されることになり、従って様々な投薬量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
幾つかの実施形態は、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達に関するが、他の組織標的化も企図される。
i.細胞におけるGYS2発現の低減
一部の実施形態では、細胞でのGYS2の発現を低減させるための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか1つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、任意の適切な細胞タイプに有用である。一部の実施形態では、細胞は、GYS2(例えば、肝実質細胞又は脂肪細胞等の肝臓細胞)を発現する任意の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、対象から得られたものであり、細胞が実質的にその天然表現型特性を維持するように、継代の回数が限定的であってもよい初代細胞である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、ex vivoであってもよく又はin vitroであってもよい(つまり、培養中の細胞に、又は細胞が存在する生物に送達することができる)。具体的な実施形態では、肝実質細胞においてのみ又は主に肝実質細胞においてGYS2の発現を低減させるための本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか1つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。
阻害の結果は、細胞又は対象の1つ又は複数の特性を評価するための適切なアッセイにより、又はGYS2発現(例えば、RNA、タンパク質)を示す分子を評価する生化学的技法により確認することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドが、GYS2の発現レベルを低減する程度は、発現レベル(例えば、GYS2のmRNAレベル又はタンパク質レベル)を適切な対照(例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていないか又は陰性対照が送達されている細胞又は細胞集団でのGYS2発現のレベル)と比較することにより評価される。一部の実施形態では、GYS2発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定しなくともよいように、所定のレベル又は値であってもよい。所定のレベル又は値は、様々な形態をとることができる。一部の実施形態では、所定のレベル又は値は、中央値又は平均値等の、単一のカットオフ値であってもよい。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞でオリゴヌクレオチド(例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖)を発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子の形態で送達される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示されている任意のオリゴヌクレオチドを発現するように遺伝子操作されている導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス)又は非ウイルスベクター(例えば、プラスミド又は合成mRNA)を使用して送達してもよい。一部の実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接注射してもよい。
本開示の態様は、対象の糖原病を治療するためにGYS2発現を低減するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象に本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドのいずれか1つの有効量を投与することを含んでいてもよい。そのような治療は、例えば、肝腫大、肝毒性(例えば、より低いか又は減少されたレベルのAST、ALT、及び/又はALP)、肝線維症、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び/又は肝細胞癌を減少又は予防するために使用することができる。また、そのような治療、例えば、以下のもの:GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI、及びGSDIXからなるリストから選択される糖原病と関連する1つ又は複数の症状を治療又は予防するために、又はそのような糖原病の1つ又は複数の症状を治療又は予防するために使用することができる。本開示は、糖原病(例えば、GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI、及びGSDIX)並びに/又は糖原病(例えば、GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI、及びGSDIX)に関連する症状若しくは状態のリスクのある(又は罹りやすい)対象を治療するための予防的及び治療的方法を両方とも提供する。
本明細書に記載の方法は、典型的には、有効量の、すなわち望ましい治療結果をもたらすことが可能な量のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。治療的に許容される量は、疾患又は障害を治療することが可能な量であってもよい。任意の1つの対象にとって適切な投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間及び経路、全体的な健康、並びに同時に投与されている他の薬物を含むある要因に依存することになる。
一部の実施形態では、対象には、本明細書で開示されている組成物のいずれか1つが、経腸的に(例えば、経口的に、経胃栄養チューブにより、十二指腸栄養チューブにより、胃瘻により、又は直腸的に)、非経口的に(例えば、皮下注射、静脈内注射又は注入、動脈内注射又は注入、筋肉内注射)、局所的に(例えば、上皮に、吸入により、目薬により、又は粘膜を介して)、又は標的臓器(例えば、対象の肝臓)への直接注射により投与される。典型的には、本明細書で開示されているオリゴヌクレオチドは、静脈内に又は皮下に投与される。
非限定的なセットの例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、典型的には、1年に1回、1年に2回、四半期毎に(3か月毎に1回)、2か月に1回(2か月毎に1回)、毎月、又は毎週投与されるだろう。
一部の実施形態では、治療しようとする対象は、ヒト(例えば、ヒト対象)又は非ヒト霊長類又は他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコ等の飼育動物;ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリ等の家畜;並びにマウス、ラット、モルモット、及びハムスター等の動物が挙げられる。
ヒト及びマウスに基づくアッセイを使用して、GYS2発現を阻害するための候補オリゴヌクレオチドを開発した。まず、コンピューターに基づくアルゴリズムを使用して、GYS2を阻害するための候補オリゴヌクレオチド配列(25〜27量体)を生成した。その後、細胞に基づくアッセイ及びPCRアッセイを使用して、候補オリゴヌクレオチドを、GYS2発現を低減させるそれらの能力について評価した。
コンピューターに基づくアルゴリズムにより、ヒトGYS2 mRNA(配列番号609、表1)に相補的だったオリゴヌクレオチドがもたらされた。それらのある配列は、アカゲザルGYS2 mRNA(配列番号610、表1)にも相補的だった。
ホットスポットの配列は表2に概説されている。
初期のHEK−293細胞に基づくアッセイで評価した264個のオリゴヌクレオチドのうち、71個の特に活性だったオリゴヌクレオチドを、GYS2レベルをノックダウンするそれらの能力に基づいてヒットとして選択し、二次スクリーニングに供した。
この二次スクリーニングでは、候補オリゴヌクレオチドを、一次スクリーニングと同じだが、2つ又は3つの異なる濃度(1nM、0.1nM、及び0.03nM)でのアッセイを使用して試験した(図2A及び2B)。標的mRNAレベルを、一般に、試料にわたって安定的発現参照を提供するハウスキーピング遺伝子であるスプライシング因子アルギニン/セリンリッチ9(SFRS9)に基づいて正規化して、図2A及び2Bに示されているmRNAパーセントを生成した。図2A及び2Bの各々における試験したオリゴヌクレオチドは、陰性対照配列(NC1)及び擬似トランスフェクションと比較して示されている。71個のオリゴヌクレオチドは全て、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び2’−O−メチル修飾ヌクレオチドの組合せを含む、M1と表記されている同じ修飾パターンを有していた。試験した71個のオリゴヌクレオチドの配列は、表3に提供されている。
この段階で、試験に由来する最も強力な配列の36個を、更なる分析のために選択した。選択した配列を、ニック付きテトラループ構造形式(22量体ガイド鎖を有する36量体パッセンジャー鎖)に変換した。基本的なテトラループ構造は、図3を参照されたい。その後、こうしたオリゴヌクレオチドを以前と同様に試験し、HepG2細胞においてGYS2 mRNA発現を低減するその能力について3つの濃度にて各オリゴヌクレオチドを評価した。
上記のin vitro実験のデータを評価して、マウス肝実質細胞でのGYS2発現低減活性を維持しつつ、送達特性を向上させることになるテトラループ及び修飾パターンを特定した。その後、この分析に基づいて、選択したオリゴヌクレオチドをGalNAc部分にコンジュゲートした。4つのGalNAc部分を、センス鎖のテトラループのヌクレオチドにコンジュゲートした。クリックリンカーを使用してコンジュゲーションを実施した。使用したGalNAcは、下記に示されている通りだった。
65個の試験したコンジュゲートから、8つの最も強力な塩基配列を特定し、ヒトGYS2 mRNAを一過性に発現するCD−1マウスに0.5mg/kgで皮下注射することにより、各々を同じ修飾パターンで試験した。マウスを、投与後4日目に安楽死させた。肝臓試料を得、RNAを抽出して、RT−qPCRによりGYS2 mRNAレベルを評価した。こうした測定に基づいて、PBS対照mRNAと比較したGYS2 mRNAパーセントを決定した。それらは図7に示されている。
トランスフェクション
最初のスクリーニングのため、リポフェクタミンRNAiMAX(商標)を使用して、効率的なトランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合体化した。オリゴヌクレオチド、RNAiMAX、及びOpti−MEMを、室温で20分間一緒にインキュベートし、その後このミックスの50μLを、トランスフェクション前にプレートの各ウェルに添加した。活性継代細胞のフラスコから培地を吸引し、トリプシンの存在下で3〜5分間37℃で細胞をインキュベートした。細胞がフラスコにもはや接着しなくなった後、細胞増殖培地(ペニシリン及びストレプトマイシンを欠如する)を添加してトリプシンを中和し、細胞を懸濁した。10μLのアリコートを取り出し、血球計算器で計数して、1ミリリットル当たりを基準にして細胞を定量化した。細胞を、10,000又は25,000細胞/ウェルで、各ウェルの培地(例えば、100μLの培地)に接種した。希釈した細胞懸濁物を、Opti−MEM中にオリゴヌクレオチドを既に含んでいた96ウェルトランスフェクションプレートに添加した。その後、トランスフェクションプレートを37℃で24時間インキュベートした。24時間のインキュベーション後、各ウェルから培地を吸引した。細胞を、Promega RNA単離キットの溶解緩衝液を使用して溶解した。溶解緩衝液を、各ウェルに添加した。その後、溶解した細胞を、RNA単離のためにCorbett XtractorGENE(QIAxtractor社)に移したか、又は−80℃で保管した。
後のスクリーニング及び実験、例えば二次スクリーニングのために、リポフェクタミンRNAiMAxを使用して、オリゴヌクレオチドをリバーストランスフェクションのために複合体化した。複合体は、OptiMEM培地中でRNAiMAX及びsiRNAを15分間混合することにより製作した。トランスフェクション混合物を、多ウェルプレートに移し、細胞懸濁物をウェルに添加した。24時間のインキュベーション後、細胞を、PBSで1回洗浄し、その後Promega SV96キットの溶解緩衝液を使用して溶解した。真空マニホールドにてSV96プレートを使用してRNAを精製した。その後、4マイクロリットルの精製RNAを、65℃で5分間加熱し、4℃に冷却した。その後、High Capacity逆転写キット(Life Technologies社)を使用した10マイクロリットル反応中での逆転写のためにRNAを使用した。その後、cDNAを無ヌクレアーゼ水で50μLに希釈し、多重化5’−エンドヌクレアーゼアッセイ及びSSoFast qPCRマスターミックス(Bio−Rad laboratories社)による定量PCRに使用した。
Corbett X−tractor Gene(商標)(QIAxtractor社)を使用して、組織培養中の哺乳動物細胞からRNAを単離した。改変SuperScript IIプロトコールを使用して、単離したRNAからcDNAを合成した。単離したRNA(およそ5ng/μL)を65℃に5分間加熱し、dNP、ランダム六量体、オリゴdT、及び水と共にインキュベートした。混合物を15秒間冷却した。水、5×第一鎖緩衝液、DTT、SUPERase・In(商標)(RNA阻害剤)、及びSuperScript II RTaseからなる「酵素ミックス」を混合物に添加した。内容物を、サーモサイクラーを使用して42℃に1時間、その後70℃に15分間加熱し、その後4℃に冷却した。その後、得られたcDNAを、SYBR(登録商標)に基づくqPCRに供した。1反応当たり2つの5’エンドヌクレアーゼアッセイを含むように、qPCR反応を多重化した。
SYBR(登録商標)に基づくqPCRを使用して、プライマーセットをまずスクリーニングした。融解曲線並びに「マイナスRT」対照を評価することにより、アッセイ特異性を検証した。HeLa細胞及びHepa1−6細胞に由来するcDNA鋳型の希釈物(1反応当たり20ngから0.02ngまでの10倍系列希釈)を使用して、それぞれヒト(Hs)アッセイ及びマウス(Mm)アッセイを試験した。qPCRアッセイを384ウェルプレートにセットアップし、MicroAmpフィルムで覆い、Applied Biosystems社の7900HTで実施した。試薬濃度及びサイクル条件は、以下のものを含んでいた:2×SYBRミックス、10μMフォワードプライマー、10μMリバースプライマー、DD H2O、及びcDNA鋳型。これらで総容積を10μLにした。
単一融解曲線を示したPCRアンプリコンを、製造業者の使用説明書に従って、Promega社のpGEM(登録商標)−T Easyベクターキットにライゲーションした。製造業者のプロトコールに従って、JM109高効率細胞を、新たにライゲーションしたベクターで形質転換した。その後、アンピシリンを含むLBプレートに細胞をプレーティングし、コロニー増殖のために37℃で一晩インキュベートした。
PCRを使用して、ライゲーションされた目的のアンプリコンを含むベクターで形質転換された大腸菌(E.coli)のコロニーを特定した。インサートをフランキングするベクター特異的プライマーをPCR反応に使用した。その後、PCR産物を全て1%アガロースゲルに流し、染色後にトランスイルミネーターで画像化した。ゲルを質的に評価して、どのプラスミドが、予想サイズのライゲーションされたアンプリコンを含むと考えられるかを決定した(およそ300bp。アンプリコン、及び使用されたプライマーに特異的なフランキングベクター配列を含む)。
その後、PCRスクリーニングにより形質転換体であることが確認されたコロニーを、アンピシリンを有する2mLのLB培地からなる培養中で、37℃にて振盪しながら一晩インキュベートした。その後、大腸菌細胞を溶解し、Promega社のミニプレップキットを使用して目的のプラスミドを単離した。260nmのUV吸光度によりプラスミド濃度を決定した。
精製したプラスミドを、BigDye(登録商標)ターミネーター配列決定キットを使用して配列決定した。ベクター特異的プライマーであるT7を使用して、インサート全体にわたるリード長を得た。以下の試薬を配列決定反応に使用した:水、5×配列決定緩衝液、BigDyeターミネーターミックス、T7プライマー、及びプラスミド(100ng/μL)。これらで10μLの容積にした。混合物を96℃で1分間保持し、その後96℃で10秒間、50℃で5秒間、60℃で1分15秒間の15サイクル;96℃で10秒間、50℃で5秒間、60℃で1分30秒間の5サイクル;及び96℃で10秒間、50℃で5秒間、60℃で2分間の5サイクルに供した。その後、Applied Biosystems社のキャピラリー電気泳動シーケンサーを使用して、ダイターミネーション反応物を配列決定した。
その後、配列が検証されたプラスミドを定量化した。プラスミドを、単一の切断制限エンドヌクレアーゼを使用して線形化した。線形性は、アガロースゲル電気泳動法を使用して確認した。プラスミド希釈物は全て、ポリプロピレンバイアルに対するプラスミドの非特異的結合を低減させるために、1mL緩衝液当たり100μgのtRNAを有するTE緩衝液(pH7.5)で製作した。
その後、線形化されたプラスミドを、1μL当たり1,000,000から01コピーまで系列希釈し、qPCRに供した。アッセイ効率を算出し、効率が90〜110%の範囲だった場合、アッセイを許容可能とみなした。
各標的について、mRNAレベルを、2つの5’ヌクレアーゼアッセイで定量化した。基本的に、幾つかのアッセイを各標的についてスクリーニングする。選択された2つのアッセイは、良好な効率、低検出限界、及び目的の遺伝子(GOI)の幅広い5’−>3’網羅範囲の組合せを示した。異なるフルオロフォアをそれぞれのプローブに使用した場合は、1つのGOIに対する両アッセイを1つの反応に組み合わせることができた。従って、それらが同じqPCR中に混合されていたか又は「多重化」されていた場合、アッセイ検証の最終工程は、選択されたアッセイの効率を決定することだった。
10倍希釈物で両アッセイを行うための線形化プラスミドを一緒にして、qPCRを実施した。各アッセイの効率を、上記に記載のように決定した。許容される効率割合は、90〜110%だった。線形化プラスミド標準物質を使用して多重化反応を検証する間に、cDNAを鋳型として使用して、目的の標的のCq値も評価した。ヒト標的又はマウス標的には、それぞれ、HeLa cDNA及びHepa1−6 cDNAを使用した。この場合、cDNAは、未トランスフェクト細胞からCorbett(水中約5ng/μl)で単離したRNAに由来した。このように、この試料cDNAの観察されたCq値は、96ウェルプレートトランスフェクションの予想Cq値を代表するものだった。Cq値が30よりも大きかった場合、目的の遺伝子がより高い発現レベルを示す他の細胞株を探した。各ヒト株及びマウス株からCorbettでのハイスループット法により単離された全RNAのライブラリーを生成し、それを使用して、標的発現の許容可能なレベルについてスクリーニングした。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは全て、SN1−ASN2−MN3のいずれかとして表記される。以下の表記法が適用される:
・N1:センス鎖配列の配列識別子番号
・N2:アンチセンス鎖配列の配列識別子番号
・N3:修飾パターンの参照番号であり、各番号は、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオチドのパターンを表わす。
例えば、S27−AS219−M1は、配列番号27により示されるセンス配列、配列番号219により示されるアンチセンス配列を有し、M1として特定されている修飾パターンを有するように構成されているオリゴヌクレオチドを表す。
加えて、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群又は選択肢の他のグループ化として記載されている場合、当業者であれば、本発明はそれにより、マーカッシュ群又は他の群の任意の個々のメンバー又はメンバーの部分群としても記載されていることを認識するだろう。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を説明する際に、配列表に示されている配列を参照することができることを認識されるべきである。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、指定の配列と比較して、1つ若しくは複数の代替ヌクレオチド(例えば、DNAヌクレオチドのRNA相当物又はRNAヌクレオチドのDNA相当物)、及び/又は1つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド、及び/又は1つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド間連結、及び/又は1つ若しくは複数の他の修飾を有していてもよいが、指定の配列と本質的に同じ又は同様の相補性特性を維持する。
Claims (54)
- GYS2の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号417〜466、575〜580、586〜598、及び620〜627のいずれか1つに示される配列を含むアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
- 配列番号385〜416、569〜574、581〜585、及び612〜619のいずれか1つに示される配列を含むセンス鎖を更に含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、配列番号417〜466、575〜580、586〜598、及び620〜627のいずれか1つに示される配列からなる、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、配列番号385〜416、569〜574、581〜585、及び612〜619のいずれか1つに示される配列からなる、請求項2又は3に記載のオリゴヌクレオチド。
- GYS2の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、15〜30ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号599〜608のいずれか1つに示されるGYS2の標的配列との相補性領域を有し、前記相補性領域が、少なくとも15連続ヌクレオチド長である、オリゴヌクレオチド。
- 前記相補性領域が、前記GYS2の標的配列と完全に相補的である、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、19〜27ヌクレオチド長である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、21〜27ヌクレオチド長である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、15〜40ヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項2〜8のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、19〜40ヌクレオチド長である、請求項9に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記二重鎖領域が、少なくとも19ヌクレオチド長である、請求項9又は10に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記二重鎖領域が、少なくとも21ヌクレオチド長である、請求項9〜11のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- GYS2との前記相補性領域が、少なくとも19連続ヌクレオチド長である、請求項5〜12のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- GYS2との前記相補性領域が、少なくとも21連続ヌクレオチド長である、請求項5〜13のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、配列番号385〜416、569〜574、581〜585、及び612〜619のいずれか1つに示される配列を含む、請求項9〜14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、配列番号417〜466、575〜580、586〜598、及び620〜627のいずれか1つに示される配列を含む、請求項5〜15のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、配列番号385〜416、569〜574、581〜585、及び612〜619のいずれか1つに示される配列からなる、請求項9〜16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、配列番号417〜466、575〜580、586〜598、及び620〜627のいずれか1つに示される配列からなる、請求項5〜17のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、その3’−末端に、S1−L−S2として示されるステム−ループを含み、式中、S1が、S2と相補的であり、Lが、S1とS2との間に3〜5ヌクレオチド長のループを形成する、請求項9〜18のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- GYS2の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖が、21〜27ヌクレオチド長であり、GYS2との相補性領域を有し、
前記センス鎖が、その3’末端に、S1−L−S2として示されるステム−ループを含み、式中、S1がS2と相補的であり、Lが、S1とS2との間に3〜5ヌクレオチド長のループを形成し、
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、少なくとも19ヌクレオチド長の二重鎖構造を形成するが、共有結合で連結されていない、オリゴヌクレオチド。 - 前記相補性領域が、GYS2 mRNAの少なくとも19個の連続ヌクレオチドと完全に相補的である、請求項20に記載のオリゴヌクレオチド。
- Lが、テトラループである、請求項19〜21のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- Lが、4ヌクレオチド長である、請求項19〜22のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- Lが、GAAAとして示される配列を含む、請求項19〜23のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、27ヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、25ヌクレオチド長である、請求項9〜18のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、25ヌクレオチド長の二重鎖領域を形成する、請求項25に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖に2ヌクレオチド長の3’−突出配列を更に含む、請求項20〜24のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 各々が21〜23ヌクレオチド長の範囲であるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、請求項9〜18のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 19〜21ヌクレオチド長の範囲の二重鎖構造を含む、請求項28に記載のオリゴヌクレオチド。
- 1又は複数ヌクレオチド長の3’−突出配列を含み、前記3’−突出配列が、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、又は前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖に存在する、請求項28又は29に記載のオリゴヌクレオチド。
- 2ヌクレオチド長の3’−突出配列を含み、前記3’−突出配列が、前記アンチセンス鎖に存在し、前記センス鎖が、21ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、23ヌクレオチド長であり、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、21ヌクレオチド長の二重鎖を形成する、請求項28又は29に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記修飾ヌクレオチドが、2’−修飾を含む、請求項32に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記2’−修飾が、2’−アミノエチル、2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−O−メトキシエチル、及び2’−デオキシ−2’−フルオロ−β−d−アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項33に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、全て修飾されている、請求項32〜34のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、請求項36に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖の5’−ヌクレオチドの糖の4’−炭素が、ホスフェート類似体を含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ホスフェート類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項38に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドが、1つ又は複数の標的指向性リガンドにコンジュゲートされている、請求項1〜39のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 各標的指向性リガンドが、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質を含む、請求項40に記載のオリゴヌクレオチド。
- 各標的指向性リガンドが、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分を含む、請求項41に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記GalNac部分が、一価GalNAc部分、二価GalNAc部分、三価GalNAc部分、又は四価GalNAc部分である、請求項42に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ステム−ループのLの最大で4個のヌクレオチドが、各々一価GalNAc部分にコンジュゲートされている、請求項19〜24のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記標的指向性リガンドが、アプタマーを含む、請求項40に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1〜45のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む、組成物。
- オリゴヌクレオチドを対象に送達するための方法であって、請求項46に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 対象における糖原病の1つ又は複数の症状を減少させるための方法であって、請求項46に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 肝腫大、肝小結節形成、肝毒性、肝線維症、肝細胞増殖、肝臓の脂肪酸沈着、肝臓過形成、肝細胞腺腫、及び/又は肝細胞癌を減少又は予防するための方法であって、請求項46に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- AST、ALT、及びALPからなる群から選択される1つ又は複数の酵素のレベルが減少する、請求項49に記載の方法。
- 前記対象が、糖原病に罹患している、請求項49又は請求項50に記載の方法。
- 前記糖原病が、GSDIa、GSDIII、GSDIV、GSDVI、及びGSDIXからなる群から選択される、請求項48〜51のいずれか一項に記載の方法。
- GYS2の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、15〜50ヌクレオチド長のセンス鎖及び15〜30ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記センス鎖が、配列番号385〜416、569〜574、581〜585、及び612〜619のいずれか1つに示される配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号417〜466、575〜580、586〜598、及び620〜627から選択される相補的配列を含む、オリゴヌクレオチド。
- GYS2の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、表4に示される表の行から選択される1対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
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