JP2014530602A - アルデヒドデヒドロゲナーゼをサイレンシングするための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)遺伝子発現を標的とする干渉RNA(例えば、siRNAなどのdsRNA)などの治療用核酸を含む組成物、その治療用核酸の1つまたは複数(例えば、カクテル)を含む脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法ならびに脂質粒子を送達および/または投与する(例えば、ヒトにおけるアルコール症を処置するため)方法を提供する。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)遺伝子発現をサイレンシングする干渉RNAを含む組成物であって、前記干渉RNAがセンス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、前記干渉RNAが約15〜約60個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む組成物が提供される。
Description
関連出願の引用
本願は、2012年2月15日に出願した米国仮特許出願第61/599,238号および2011年10月5日に出願した米国仮特許出願第61/543,700号の米国特許法第119条(e)項の下での利益を主張する。これらの出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本願は、2012年2月15日に出願した米国仮特許出願第61/599,238号および2011年10月5日に出願した米国仮特許出願第61/543,700号の米国特許法第119条(e)項の下での利益を主張する。これらの出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供される。これを参照により本明細書に組み込む。配列表を含むテキストファイルの名称はTEKM_074_02WO_ST25.txt.である。テキストファイルは12KBであり、2012年10月4日に作製したもので、EFS−Webを介して電子的に提出されている。
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供される。これを参照により本明細書に組み込む。配列表を含むテキストファイルの名称はTEKM_074_02WO_ST25.txt.である。テキストファイルは12KBであり、2012年10月4日に作製したもので、EFS−Webを介して電子的に提出されている。
発明の背景
アルコール症は、ビール、ワインおよび蒸留酒などのアルコール飲料を過剰量飲酒することに対する嗜癖または依存である。アルコール症は、アルコール乱用またはアルコール依存症と称されることもある。
アルコール症は、ビール、ワインおよび蒸留酒などのアルコール飲料を過剰量飲酒することに対する嗜癖または依存である。アルコール症は、アルコール乱用またはアルコール依存症と称されることもある。
アルコール症を支える生物学的機序は不確かであるが、危険因子には、ストレス、精神衛生上の問題および遺伝的素因が含まれる。長期のアルコール乱用は脳内での生理学的変化を生み出し、これは、アルコール消費の中断によってアルコール禁断症候群をもたらす。アルコールは体内のほぼすべての臓器に損傷を与え、アルコール依存症患者は、医学的および精神的障害に罹患するリスクに曝される。
アルコール症の処置は解決の難しいものであり、これには、一般にアルコール依存症患者をアルコール飲酒から離脱させるためのアルコール解毒が含まれる。ベンゾジアゼピンなどの神経学的に活性な薬物を用いてアルコール禁断症状に対処することができる。心理療法などの医療後のケアは、通常、アルコール節制を維持するために要求される。
ジスルフィラムは、摂取されたアルコール(エタノール)に対する急性過敏症を引き起こす薬物であり、慢性アルコール症の処置において使用されることがある。アルコールは、肝臓で酵素アルコールデヒドロゲナーゼによってアセトアルデヒドに分解され、次いで、これは酵素アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによって酢酸に転換される。ジスルフィラムは酵素アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを遮断する。したがって、ジスルフィラムは、アルコールを消費したヒトの血液中のアセトアルデヒド濃度が、ジスルフィラムの非存在下で同量のアルコールを消費したヒトの血液中で見られるアセトアルデヒド濃度より、大幅に高くなる(例えば、5〜10倍高くなる)ようにすることができる。アセトアルデヒドは、「二日酔い」の症状の主原因の1つであり、そのため、ジスルフィラムの消費は、アルコールに対する重度の負の反応をもたらす。その症状には、皮膚の紅潮、心拍数の加速、息切れ、吐き気、嘔吐、ズキズキする頭痛、視覚障害、精神的錯乱、姿勢の崩れ(postural fainting)および循環虚脱が含まれる。
しかし、患者による服薬遵守の欠如ならびに眠気、頭痛および、それほど頻繁ではないが、神経毒性などの一連の副作用のため、ジスルフィラムには臨床上の限界がある。ジスルフィラムは、効果的にするために通常毎日投与されるが、そのため、患者がその薬物の使用を中断するのが容易である。
したがって、哺乳動物、特にヒトにおけるアルコールの代謝に関与するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を抑止、低減および/または排除するための組成物および方法に対するニーズが依然としてある。そうした組成物および方法は、例えばアルコール症の処置において用いることができる。特に、ジスルフィラムの有効期間より大幅に長い期間(例えば、数週間または数カ月)、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を抑止、低減および/または排除し、それによってそうした比較的長期間持続するALDHの阻害剤を消費した後、ヒト対象が、アルコール嫌悪療法を中断するのが困難になるようにする組成物および方法に対するニーズがある。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を抑止、低減および/または排除し、ジスルフラム(disulfuram)より少ないまたはより重度ではない副作用しかもたない組成物および方法に対する特別のニーズもある。
発明の簡単な概要
本明細書でより全般的に説明するように、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、より広い部類のアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)酵素のメンバーである。ヒトの肝臓においてアセトアルデヒドを酢酸に転換させるのに主に関与していると考えられるALDHファミリーのメンバーはアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)酵素であるが、ALDH1などのALDHの他のイソ型もヒトにおけるアルコールの代謝に関係している。本発明の目的は、1つまたは複数のALDH酵素、特にALDH2酵素をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供することである。阻害は、RNA干渉の機序によるものである。したがって、本発明の組成物および方法は、例えば、アセトアルデヒドの酢酸への転換を阻害または遮断し、それによってアルコールを消費するヒトの体内におけるアセトアルデヒドの量を増大させ、その結果体内でのアセトアルデヒドの存在に伴う悪影響(例えば、頭痛および吐き気)を増強させることによって、ヒトのアルコール症を処置するのに有用である。
本明細書でより全般的に説明するように、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、より広い部類のアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)酵素のメンバーである。ヒトの肝臓においてアセトアルデヒドを酢酸に転換させるのに主に関与していると考えられるALDHファミリーのメンバーはアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)酵素であるが、ALDH1などのALDHの他のイソ型もヒトにおけるアルコールの代謝に関係している。本発明の目的は、1つまたは複数のALDH酵素、特にALDH2酵素をコードする1つまたは複数の遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供することである。阻害は、RNA干渉の機序によるものである。したがって、本発明の組成物および方法は、例えば、アセトアルデヒドの酢酸への転換を阻害または遮断し、それによってアルコールを消費するヒトの体内におけるアセトアルデヒドの量を増大させ、その結果体内でのアセトアルデヒドの存在に伴う悪影響(例えば、頭痛および吐き気)を増強させることによって、ヒトのアルコール症を処置するのに有用である。
したがって、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)遺伝子発現を標的とする干渉RNA(例えば、siRNAなどのdsRNA)などの治療用核酸を含む組成物、治療用核酸の1つまたは複数(例えば、カクテル)を含む脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法ならびに脂質粒子を送達および/または投与する(例えば、アルコール症を処置するために)方法を提供する。
より特別には、本発明は、ALDH遺伝子発現を阻害またはサイレンシングする非修飾および化学修飾干渉RNA(例えば、siRNA)分子を含む組成物を提供する。本発明は、本明細書で説明する干渉RNA(例えば、siRNA)の1つまたは複数(例えば、カクテル)、カチオン性脂質および非カチオン性脂質を含み、粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含むことができる血清安定性の核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)およびその処方物も提供する。干渉RNA分子の例には、これらに限定されないが、二本鎖のRNA(dsRNA)、例えばsiRNA、ダイサー−基質dsRNA、shRNA、aiRNA、プレmiRNAおよびその組合せが含まれる。
一態様では、本発明は、センス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、約15〜約60個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む、ALDH遺伝子発現を標的とする干渉RNAを提供する。特定の実施形態では、本発明は、ALDHゲノムの同じおよび/または異なる領域を標的とする少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の干渉RNA分子の組合せ(例えば、カクテル)を含む組成物を提供する。本発明の干渉RNAは、in vitroおよびin vivoでALDH遺伝子発現を阻害またはサイレンシングすることができる。
例えばALDH2遺伝子発現を阻害するsiRNA分子の設計において使用できるALDH2転写物配列の非限定的な例は、受託番号NM_000690.3(遺伝子ID217、イソ型1)およびNM001204889.1(遺伝子ID217、イソ型2)としてGenbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)に示されている。
例えば、ALDH1遺伝子発現を阻害するsiRNA分子の設計において使用できるALDH1転写物配列の非限定的な例は、受託番号NM_000689.4(ALDH1A1、遺伝子ID216)およびNM_000692.4(ALDH1B1、遺伝子ID219)としてGenbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)に示されている。
他の態様では、本発明は、センス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、約15〜約60個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)遺伝子発現を標的とする干渉RNAを提供する。特定の実施形態では、本発明は、ALDH遺伝子の同じおよび/または異なる領域を標的とする少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の干渉RNA分子の組合せ(例えば、カクテル)を含む組成物を提供する。本発明の干渉RNAは、in vitroおよびin vivoでALDH遺伝子発現を阻害するまたは完全にサイレンシングすることができる。
本発明の組成物中に存在する干渉RNA配列のそれぞれは、例えば二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖中において、2’OMeヌクレオチドなどの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを独立に含むことができる。ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドは2’OMeヌクレオチドで修飾されていることが好ましい。特定の実施形態では、本発明の組成物中に存在する干渉RNA配列のそれぞれは、センスおよび/またはアンチセンス鎖中に少なくとも1つの2’OMe−ウリジンヌクレオチドおよび少なくとも1つの2’OMe−グアノシンヌクレオチドを含む。
ALDH2遺伝子発現を阻害するための本発明の実施において有用な二本鎖siRNA分子の例には、本明細書の実施例4の表Aに示す化学修飾されたセンスおよびアンチセンス鎖配列を有する二本鎖siRNA分子(1〜6まで番号付けされている)が含まれる。実施例4の表Aに示す二本鎖siRNA分子は、文字「m」で特定されるリボヌクレオチド単位上の2’−O−メチル部分の存在によって化学修飾されている。本発明は、実施例4の表Aに示すセンスおよびアンチセンス配列を有する二本鎖siRNA分子であって、そのセンスおよびアンチセンス鎖が化学修飾されていない分子も含む。本発明は、実施例4の表Aに示すセンス鎖配列(化学修飾されているかまたは化学修飾されていない)のいずれか1つを有する単離された一本鎖の核酸分子も含む。本発明は、実施例4の表Aに示すアンチセンス鎖配列のいずれか1つを有する単離された一本鎖の核酸分子(化学修飾されているかまたは化学修飾されていない)も含む。
本発明は、ALDH遺伝子発現を標的とする干渉RNA(例えば、siRNA)分子の1つまたはカクテルおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
他の態様では、本発明は、ALDH遺伝子発現を標的とする核酸−脂質粒子を提供する。核酸−脂質粒子は典型的には、ALDH遺伝子発現をサイレンシングする1つまたは複数の非修飾および/または修飾干渉RNA、カチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含む。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は、ALDH遺伝子発現をサイレンシングする1つまたは複数の非修飾および/または修飾干渉RNA、カチオン性脂質、非カチオン性脂質ならびに粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を含む。
他の実施形態では、本発明の干渉RNA分子は、核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)中に完全にカプセル化されている。干渉RNAのカクテルを含む処方物に関して、異なる種類の干渉RNA分子を同じ核酸−脂質粒子中に同時カプセル化するか、またはカクテル中に存在する各種の干渉RNA種をそれ自体の粒子中にカプセル化することができる。
本発明は、核酸−脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
本発明の核酸−脂質粒子は、1つまたは複数のALDH遺伝子(例えば、ALDH2遺伝子)の発現をサイレンシングする干渉RNA(例えば、dsRNA)分子の予防的または治療的送達に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する干渉RNA分子の1つまたは複数を核酸−脂質粒子中に処方し、その粒子を、そうした処置を必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)に投与する。特定の例では、治療有効量の核酸−脂質粒子を、哺乳動物に、例えばヒトのアルコール症を防止または処置するために)投与することができる。本発明の核酸−脂質粒子は、大部分のALDH2遺伝子発現部位であるヒトの肝細胞を標的とするのに特に有用である。核酸−脂質粒子の投与は、例えば経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下または皮内などの当業界で公知の任意の経路によってよい。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば腸内経由または非経口経路の投与により全身的に投与される。
いくつかの実施形態では、ALDH遺伝子発現の下方制御は、核酸−脂質粒子投与後の哺乳動物からの生物学的試料中のALDH RNAまたはタンパク質レベルを検出することによって判定される。他の実施形態では、ALDH遺伝子発現の下方制御は、核酸−脂質粒子投与後の哺乳動物からの生物学的試料中のALDH mRNAまたはタンパク質レベルを検出することによって判定される。特定の実施形態では、ALDHまたはALDH遺伝子発現の下方制御は、粒子投与後の哺乳動物におけるアルコール離脱に伴う症状を監視することによって検出される。
他の実施形態では、本発明は、ALDH遺伝子発現をサイレンシングする干渉RNAを細胞中に導入するための方法であって、細胞を本発明の核酸−脂質粒子と接触させるステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、ALDH遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)におけるALDH遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、その方法それぞれが、哺乳動物に本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルコール症に伴う1つまたは複数の症状を処置および/または改善するための方法であって、その方法それぞれが、ヒトに治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、ALDHの発現を阻害することを必要とする哺乳動物(例えば、アルコール症に罹患しているヒト)におけるALDHの発現を阻害するための方法であって、その方法それぞれが、哺乳動物に治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルコール症を防止および/または処置するための方法であって、その方法それぞれが、ヒトに治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかであろう。
発明の詳細な説明
I.はじめに
本明細書で説明する干渉RNA(例えば、siRNA)薬物療法は、有利には、ヒトにおけるアルコール症を処置するための特筆すべき新規の組成物および方法を提供する。本発明の実施形態は、例えば1日に1回、1週間に1回または数週間に1回(例えば、2、3、4、5または6週間に1回)投与することができる。数日または数週間の期間ALDHを阻害するのに有効である本発明の組成物を消費した後、アルコール依存症患者がアルコール嫌悪療法を中断するのはより困難である。
I.はじめに
本明細書で説明する干渉RNA(例えば、siRNA)薬物療法は、有利には、ヒトにおけるアルコール症を処置するための特筆すべき新規の組成物および方法を提供する。本発明の実施形態は、例えば1日に1回、1週間に1回または数週間に1回(例えば、2、3、4、5または6週間に1回)投与することができる。数日または数週間の期間ALDHを阻害するのに有効である本発明の組成物を消費した後、アルコール依存症患者がアルコール嫌悪療法を中断するのはより困難である。
さらに、本明細書で説明する脂質粒子(例えば、SNALP)は、体内の標的とする組織および細胞中への干渉RNAなどの核酸薬物の効果的な送達を可能にする。脂質粒子の存在は、血流中でのヌクレアーゼ分解からの保護をもたらし、標的組織における優先的蓄積を可能にし、そこでsiRNAがRNA干渉のそれらの目的とする機能を果たすことができる、細胞の細胞質中への薬物投入の手段を提供する。
II.定義
本明細書で使用するように、以下の用語は、別段の指定のない限り、それらの帰属する意味を有する。
本明細書で使用するように、以下の用語は、別段の指定のない限り、それらの帰属する意味を有する。
「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」(ALDHと略される)という用語は、アルデヒド(例えば、アセトアルデヒド)のカルボン酸(例えば、酢酸)への酸化(脱水素化)を触媒する酵素を意味する。構造的にかつ機能的に関係するアルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーは、哺乳動物中に存在しており、ヒトにおけるアセトアルデヒドの酢酸への転換に主に関与していると考えられるミトコンドリア的に局在化した酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)を含む。
本明細書で用いる「干渉RNA」、または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、その干渉RNAが標的遺伝子または配列として同じ細胞中にある場合、標的遺伝子または配列の発現を低減させるまたは阻害する(例えば、干渉RNA配列に対して相補的であるmRNAの分解を媒介するまたはその翻訳を阻害することによって)ことができる一本鎖RNA(例えば、成熟miRNA、ssRNAiオリゴヌクレオチド、ssDNAiオリゴヌクレオチド)または二本鎖のRNA(すなわち、二重鎖(duplex)RNA、例えばsiRNA、ダイサー−基質dsRNA、shRNA、aiRNAまたはプレmiRNA)を含む。したがって、干渉RNAは、標的mRNA配列に対して相補的である一本鎖RNAあるいは2つの相補鎖または単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子または配列と実質的な同一性または完全な同一性を有するか、またはミスマッチの領域(すなわち、ミスマッチモチーフ)を含むことができる。干渉RNAの配列は、完全長標的遺伝子またはその部分配列に対応させることができる。干渉RNA分子は化学的に合成されることが好ましい。
干渉RNAは、「低分子干渉RNA」または「siRNA」、例えば約15〜60、15〜50または15〜40個の(二重鎖)ヌクレオチドの長さ、より典型的には約15〜30、15〜25または19〜25個の(二重鎖)ヌクレオチドの長さの干渉RNAを含み、好ましくは、約20〜24、21〜22または21〜23個の(二重鎖)ヌクレオチドの長さ(例えば、二本鎖siRNAの各相補配列は、15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25または19〜25個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約20〜24、21〜22または21〜23個のヌクレオチドの長さであり、その二本鎖siRNAは約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25または19〜25個の塩基対の長さ、好ましくは約18〜22、19〜20または19〜21個の塩基対の長さである)である。siRNA二重鎖は、約1〜約4個のヌクレオチドまたは約2〜約3個のヌクレオチドの3’オーバーハングおよび5’リン酸末端を含むことができる。siRNAの例には、これらに限定されないが、一方の鎖がセンス鎖であり他方の鎖が相補的アンチセンス鎖である2つの別個の鎖分子から構築された二本鎖のポリヌクレオチド分子;センスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーで連結された一本鎖分子から構築されている二本鎖のポリヌクレオチド分子;自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を備えた二本鎖のポリヌクレオチド分子;ならびにその環状ポリヌクレオチドをin vivoまたはin vitroでプロセッシングして活性な二本鎖siRNA分子を生成させることができる、2つ以上のループ構造ならびに自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを備えた環状一本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。
siRNAは化学的に合成することが好ましい。siRNAは、E.coli RNaseIIIまたはダイサーでの、より長いdsRNA(例えば、約25個のヌクレオチドの長さより大きいdsRNA)の切断によって生成させることもできる。これらの酵素は、dsRNAをプロセッシングして生物学的に活性なsiRNAにする(例えば、Yangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99巻:9942〜9947頁(2002年);Calegariら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99巻:14236頁(2002年);Byromら、Ambion TechNotes、10巻(1号):4〜6頁(2003年);Kawasakiら、Nucleic Acids Res.、31巻:981〜987頁(2003年);Knightら、Science、293巻:2269〜2271頁(2001年);およびRobertsonら、J.Biol.Chem.、243巻:82頁(1968年)を参照されたい)。dsRNAは、少なくとも50個のヌクレオチド〜約100、200、300、400または500個のヌクレオチドの長さであることが好ましい。dsRNAは、1000、1500、2000、5000個もの長さまたはそれ以上の長さのヌクレオチドであってよい。dsRNAは、遺伝子転写物全体または遺伝子転写物の一部についてコードすることができる。特定の例では、siRNAはプラスミドによってコードすることができる(例えば、ヘアピンループで自動的に二つ折りされて二重鎖となる配列として転写される)。
本明細書で用いる「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、その標的配列に対して100%の相補性をもたない干渉RNA(例えば、siRNA)配列の部分を指す。干渉RNAは、少なくとも1、2、3、4、5、6個またはそれ以上のミスマッチ領域を有することができる。ミスマッチ領域は連続的であっても、また1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられていてもよい。ミスマッチモチーフまたは領域は、単一のヌクレオチドを含むことも、また2、3、4、5個またはそれ以上のヌクレオチドを含むこともできる。
「標的遺伝子の発現を阻害する」という語句は、本発明の干渉RNA(例えば、siRNA)が標的遺伝子(例えば、ALDH遺伝子)の発現をサイレンシングする、低減させるまたは阻害する能力を指す。遺伝子サイレンシングの程度を試験するために、テスト試料(例えば、標的遺伝子を発現する対象生物体からの生物学的試料または標的遺伝子を発現する培養物中の細胞の試料)を、標的遺伝子の発現をサイレンシングする、低減させるまたは阻害する干渉RNA(例えば、siRNA)と接触させる。テスト試料中での標的遺伝子の発現を、干渉RNA(例えば、siRNA)と接触していない対照試料(例えば、標的遺伝子を発現する対象生物体からの生物学的試料または標的遺伝子を発現する培養物中の細胞の試料)での標的遺伝子の発現と比較する。対照試料(例えば、標的遺伝子を発現する試料)を100%の値と指定することができる。特定の実施形態では、対照試料に対して、テスト試料の値が、約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、10%、5%または0%である場合、標的遺伝子の発現のサイレンシング、阻害または低減は達成されている。適切なアッセイには、これらに限定されないが、当業者に公知の技術を用いたタンパク質またはmRNAレベルの試験、例えばドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュでのハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能ならびに当業者に公知の表現型アッセイなどが含まれる。
干渉RNAなどの治療用核酸の「有効量」または「治療有効量」は、所望の効果、例えば干渉RNAの非存在下で検出された正常な発現レベルと比較して、標的配列の発現の阻害をもたらすのに十分な量である。特定の実施形態では、干渉RNAで得られた値が対照に対して約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%または0%である場合に、標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は達成されている。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための適切なアッセイには、これらに限定されないが、当業者に公知の技術を用いたタンパク質またはmRNAレベルの試験、例えばドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュでのハイブリダイゼーション、ELISA、免疫沈降、酵素機能ならびに当業者に公知の表現型アッセイなどが含まれる。
干渉RNAによる免疫応答の「減少(decrease)」、「減少(する)(decreasing)」、「低減(reduce)」または「低減(する)(reducing)」は、所与の干渉RNA(例えば、修飾干渉RNA)に対する免疫応答の検出可能な減少を意味するものとする。修飾干渉RNAによる免疫応答の減少量は、非修飾干渉RNAの存在下での免疫応答のレベルと比較して判定することができる。検出可能な減少は、非修飾干渉RNAの存在下で検出される免疫応答より約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%またはそれ以上低くてよい。干渉RNAに対する免疫応答の減少は一般に、in vitroでのキラー細胞によるサイトカイン産生(例えば、IFNγ、IFNα、TNFα、IL−6またはIL−12)の減少、または干渉RNAの投与後の哺乳動物対象の血清中でのサイトカイン産生の減少によって測定される。
本明細書で用いる「キラー細胞(responder cell)」という用語は、非修飾siRNAなどの免疫賦活性干渉RNAと接触させた場合、検出可能な免疫応答をもたらす細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。キラー細胞の例には、例えば樹枝状細胞、マクロファージ、末梢血単核球(PBMC)、脾細胞などが含まれる。検出可能な免疫応答には、例えばサイトカインまたは増殖因子、例えばTNF−α、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、IL−13、TGFおよびその組合せの産生が含まれる。検出可能な免疫応答には、例えばテトラトリコペプチド反復配列1(IFIT1)mRNAでのインターフェロン誘発タンパク質の誘発も含まれる。
「実質的な同一性」は、ストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする配列または参照配列の特定領域にわたって特定パーセントの同一性を有する配列を指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、その下で核酸が、一般に核酸の複合混合物中でその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なった環境下では異なってくることになる。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な案内は、Tijssen、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Probes、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993年)に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度pHでの特異的な配列についての熱融点(thermal melting point)(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、そこで、標的に対して相補的であるプローブの50%が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度下で)である(Tmで、標的配列が過剰に存在するので、平衡状態でプローブの50%が占有される)。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで実現することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルは、少なくともバックグラウンドの2倍(two times background)、好ましくはバックグラウンドの10倍のハイブリダイゼーションである。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りであってよい:50%ホルムアミド、5×SSCおよび1%SDS、42℃でインキュベート、または5×SSC、1%SDS、65℃でインキュベート、65℃で0.2×SSCおよび0.1%SDSで洗浄。PCRについて、低ストリンジェンシー増幅のためには約36℃の温度が一般的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約32℃〜48℃で変化してよい。高ストリンジェンシーPCR増幅のためには約62℃の温度が一般的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて約50℃〜約65℃の範囲であってよい。高ストリンジェンシー増幅と低ストリンジェンシー増幅の両方のための典型的なサイクル条件は、90℃〜95℃で30sec〜2minの変性フェーズ、30sec〜2min続くアニーリングフェーズおよび約72℃で1〜2minの拡張フェーズを含む。低および高ストリンジェンシー増幅反応のためのプロトコールおよび指針は、例えばInnisら、PCR Protocols、A Guide to Methods and Applications、Academic Press, Inc.N.Y.(1990年)に提供されている。
それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードによって許容される最大コドン縮重を用いて生み出される場合に起こる。そうした場合、核酸は一般に中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例は、40%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDSの緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーション、45℃、1×SSCでの洗浄を含む。正ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いて同様のストリンジェンシーの条件を提供できることを容易に理解されよう。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するための追加的な指針は、多くの文献、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら、eds.に提供されている。
2つ以上の核酸の関連で「実質的に同一性の」または「実質的な同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるか、またはマニュアルでの整列化および外観検査により測定して、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって比較し最大の一致を目指して整列化した場合に、同一である、または特定のパーセンテージの同一ヌクレオチド(すなわち、指定領域にわたって少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%の同一性)を有する2つ以上の配列または部分配列を指す。その関連で示される場合、この定義は、配列の相補性も同様に指す。実質的な同一性は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60個のヌクレオチドの長さの領域にわたって存在することが好ましい。
配列比較のため、一般に1つの配列が、それとテスト配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テストおよび参照配列がコンピュータに打ち込まれ、必要なら部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを使用するか、または代替のパラメーターを指定することができる。次いで、プログラムパラメーターをもとにして、配列比較アルゴリズムによって、参照配列に対するテスト配列についての配列同一性パーセントが計算される。
本明細書で用いる「比較ウィンドウ」は、そこで、2つの配列が最適に整列化された後、配列を、同数の近接位置の参照配列と比較できる約5〜約60、一般に約10〜約45、より一般的に約15〜約30からなる群から選択されるいくつかの近接位置のいずれか1つのセグメントへの参照を含む。比較のための配列の整列化方法は当業界で周知である。比較のための配列の最適な整列化は、SmithおよびWaterman、Adv.Appl.Math.、2巻:482頁(1981年)の局所ホモロジーアルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol、48巻:443頁(1970年)のホモロジー整列化アルゴリズム、PearsonおよびLipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻:2444頁(1988年)の類似した方法の探求、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施(GAP, BESALDHIT, FASTA, and ALDHASTA in the Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI)またはマニュアルによる整列化および外観検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら、eds.(1995年補足)を参照されたい)によって実行することができる。
配列同一性パーセントおよび配列相似性を判定するのに適したアルゴリズムの非限定的な例は、それぞれAltschulら、Nuc.Acids Res.、25巻:3389〜3402頁(1977年)およびAltschulら、J.Mol.Biol、215巻:403〜410頁(1990年)に記載されているBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムである。本明細書で説明するパラメーターで、BLASTおよびBLAST2.0を用いて、本発明の核酸についての配列同一性パーセントを決定する。BLAST分析を実行するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手することができる。他の例は、タンパク質またはヌクレオチド(例えば、RNA)配列を整列化するためのNeedleman−Wunschアルゴリズムなどの配列同一性パーセントを決定するためのグローバル整列化アルゴリズムである。
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の相似性の統計的分析も実行する(例えば、KarlinおよびAltschul、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90巻:5873〜5787頁(1993年)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される相似性の1つの尺度は最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))である。これは、それによって2つのヌクレオチド配列間の整合が偶然生じる確率の目安を提供する。例えば、参照核酸に対するテスト核酸の比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は参照配列と類似していると見なされる。
本明細書で用いる「核酸」という用語は、一本鎖かまたは二本鎖の形態で少なくとも2つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むポリマーを指し、それにはDNAおよびRNAが含まれる。DNAは、例えばアンチセンス分子、プラスミドDNA、予備縮合(pre-condensed)DNA、PCR産生物、ベクター(PI、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、発現カセット、キメラ配列、染色体DNAまたはこれらの群の誘導体および組合せの形態であってよい。RNAは、低分子干渉RNA(siRNA)、ダイサー−基質dsRNA、小ヘアピンRNA(shRNA)、非対称干渉RNA(aiRNA)、ミクロRNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、ウイルスRNA(vRNA)およびその組合せの形態であってよい。核酸は合成、天然由来および非天然由来であり、参照核酸と類似した結合特性を有する公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を含む。そうした類似体の例には、これらに限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2’−O−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド−核酸(PNA)が含まれる。特に限定されていない限り、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指定のない限り、具体的な核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、SNPおよび相補配列ならびに明確に示されている配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの第3の位置が混合塩基(mixed-base)および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を形成させることによって遂行することができる(Batzerら、Nucleic Acid Res.、19巻:5081頁(1991年);Ohtsukaら、J.Biol.Chem.、260巻:2605〜2608頁(1985年);Rossoliniら、Mol.Cell. Probes、8巻:91〜98頁(1994年))。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース(DNA)またはリボース(RNA)、塩基およびホスフェート基を含む。ヌクレオチドは、ホスフェート基を介して一緒に結合している。「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび天然の類似体ならび、これに限定されないが、新規の反応基、例えばこれらに限定されないがアミン、アルコール、チオール、カルボキシレートおよびアルキルハライドなどを配置する修飾を含む、プリンおよびピリミジンの合成誘導体がさらに含まれる。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長または全長のコード配列を含む核酸(例えば、DNAまたはRNA)配列を指す。
本明細書で用いる「遺伝子産生物」は、RNA転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産生物を指す。
「脂質」という用語は、これに限定されないが、脂肪酸のエステルを含み、水に不溶性であるが多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。これらは通常少なくとも3つの部類に分けられる、すなわち:(1)油脂ならびにワックスを含む「単純脂質」;(2)リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質(compound lipid)」;ならびに(3)ステロイドなどの「誘導脂質」である。
「脂質粒子」という用語は、対象の標的部位(例えば、細胞、組織、臓器など)に治療用核酸(例えば、干渉RNA)を送達するために使用できる脂質処方物を含む。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を防ぐ任意選択のコンジュゲートされた脂質から形成された核酸−脂質粒子である。他の好ましい実施形態では、治療用核酸(例えば、干渉RNA)を、その粒子の脂質部分の中にカプセル化し、それによって酵素分解からその核酸を保護することができる。
本明細書で用いる「SNALP」という用語は安定な核酸−脂質粒子を指す。SNALPは、脂質(例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を防ぐ任意選択のコンジュゲートされた脂質)から作製された粒子を表し、ここで核酸(例えば、干渉RNA)は脂質中に完全にカプセル化されている。特定の例では、それらが静脈内(i.v.)注射の後、長い循環寿命を示すことができ、それらが遠位部位(例えば、投与部位から物理的に隔てられた部位)で蓄積することができ、かつ、これらの遠位部位で標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるので、SNALPは、全身的な用途に非常に有用である。PCT公開番号WO00/03683に示されているように、核酸を、縮合剤で複合化し、SNALP中にカプセル化することができる。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は一般に、約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、約70nm〜約100nm、約80nm〜約100nm、約90nm〜約100nm、約70〜約90nm、約80nm〜約90nm、約70nm〜約80nm、または約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nmもしくは150nmの平均径を有し、これらは実質的に非毒性である。さらに、本発明の脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中で、ヌクレアーゼでの分解に対して抵抗性がある。核酸−脂質粒子およびその調製方法は、例えば米国特許公開番号第20040142025号および同第20070042031号に開示されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本明細書で用いる「脂質カプセル化された(lipid encapsulated)」とは、干渉RNA(例えば、siRNA)などの治療用核酸を完全カプセル化、部分カプセル化またはその両方で提供する脂質粒子を指すことができる。好ましい実施形態では、核酸(例えば、干渉RNA)は、(例えば、SNALPまたは他の核酸−脂質粒子を形成させるために)脂質粒子中に完全にカプセル化されている。
「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を指す。そうした脂質コンジュゲートには、これらに限定されないが、PEG−脂質コンジュゲート、例えばジアルキルオキシプロピルと結合したPEG(例えば、PEG−DAAコンジュゲート)、ジアシルグリセロールと結合したPEG(例えば、PEG−DAGコンジュゲート)、コレステロールと結合したPEG、ホスファチジルエタノールアミンと結合したPEGおよびセラミドとコンジュゲートされたPEG(例えば、米国特許第5,885,613号を参照されたい)、カチオン性PEG脂質、ポリオキサゾリン(POZ)−脂質コンジュゲート(例えば、POZ−DAAコンジュゲート;例えば2010年1月13日出願の米国仮出願番号第61/294,828号および2010年1月14日出願の米国仮出願番号第61/295,140号を参照されたい)、ポリアミドオリゴマー(例えば、ATTA−脂質コンジュゲート)およびそれらの混合物が含まれる。POZ−脂質コンジュゲートの追加的な例は、PCT公開番号WO2010/006282に記載されている。PEGまたはPOZは、脂質と直接コンジュゲートさせることが可能であり、またはリンカー部分を介して脂質と結合させることができる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、PEGまたはPOZを脂質と連結させるのに適した任意のリンカー部分を用いることができる。特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記特許文献のそれぞれの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
「両親媒性脂質」という用語は、一部分において、脂質材料の疎水性部分が疎水性相中へ指向し、親水性部分が水相の方へ指向する適切な任意の材料を指す。親水性の特徴は、炭水化物、ホスフェート、カルボン酸、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよび他の同様の基などの極性または荷電基の存在に由来する。疎水性は、これらに限定されないが、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに1つもしくは複数の芳香族、脂環式または複素環式基で置換されたそうした炭化水素基を含む無極性基を含めることによって付与することができる。両親媒性化合物の例には、これらに限定されないが、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が含まれる。
リン脂質の代表的な例には、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロールおよびβ−アシルオキシ酸(acyloxyacid)などのリンを含まない他の化合物も、両親媒性脂質と指定される基の範囲内である。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合することができる。
「中性脂質」という用語は、選択されたpHで荷電されていないかまたは中性の両性イオン形態で存在する多くの脂質種のいずれかを指す。生理学的pHで、そうした脂質は、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールを含む。
「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質ならびに他の任意の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的pHで負の電荷をもつ任意の脂質を指す。これらの脂質には、これらに限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオル(palmitoyloleyol)ホスファチジルグリセロール(POPG)および中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が含まれる。
「疎水性脂質」という用語は、これらに限定されないが、長鎖の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに1つもしくは複数の芳香族、脂環式または複素環式基で任意選択で置換されたそうした炭化水素基を含む無極性基を有する化合物を指す。適切な例には、これらに限定されないが、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N−N−ジアルキルアミノ、1,2−ジアシルオキシ−3−アミノプロパンおよび1,2−ジアルキル−3−アミノプロパンが含まれる。
「カチオン性脂質」および「アミノ脂質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、それらには、1つ、2つ、3つもしくはそれ以上の脂肪酸または脂肪族アルキル鎖およびpH滴定可能なアミノ頭部基(例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基)を有するそれらの脂質およびその塩が含まれる。カチオン性脂質は、一般にカチオン性脂質のpKaより低いpHでプロトン化されており(すなわち、正に荷電している)、pKaを超えるpHで実質的に中性である。本発明のカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と称することもできる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は:プロトン化可能な第三アミン(例えば、pH滴定可能な)頭部基;各アルキル鎖が独立に0〜3個(例えば、0、1、2または3個)の二重結合を有するC18アルキル鎖;頭部基とアルキル鎖の間のエーテル、エステルまたはケタール結合を含む。そうしたカチオン性脂質には、これらに限定されないが、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ−DLenDMA、DLin−K−DMA、DLin−K−C2−DMA(DLin−C2K−DMA、XTC2およびC2Kとしても公知である)、DLin−K−C3−DMA、DLin−K−C4−DMA、DLen−C2K−DMA、γ−DLen−C2K−DMA、DLin−M−C2−DMA(MC2としても公知である)およびDLin−M−C3−DMA(MC3としても公知である)が含まれる。
「塩」という用語は、カチオン性脂質と1つまたは複数のアニオンとの間で形成される複合体などの任意のアニオンおよびカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定的な例には、無機および有機アニオン、例えばヒドリド、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、オキサレート(例えば、ヘミオキサレート)、ホスフェート、ホスホネート、ハイドロジェンホスフェート、ジハイドロジェンホスフェート、オキシド、カーボネート、ビカーボネート、ナイトレート、ナイトライト、ニトリド、ビサルファイト、スルフィド、サルファイト、ビサルフェート、サルフェート、チオサルフェート、ハイドロジェンサルフェート、ボレート、ホーメート、アセテート、ベンゾエート、シトレート、タートレート、ラクテート、アクリレート、ポリアクリレート、フマレート、マレエート、イタコネート、グリコレート、グルコネート、マレート、マンデレート、チグレート、アスコルベート、サリシレート、ポリメタクリレート、パークロレート、クロレート、クロライト、ヒポクロライト、ブロメート、ヒポブロマイト、ヨーデート、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、アーセネート、アーセナイト、クロメート、ジクロメート、シアニド、シアネート、チオシアネート、ヒドロキシド、ペルオキシド、ペルマンガネートおよびそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、本明細書で開示するカチオン性脂質の塩は、結晶塩である。
「アルキル」という用語は、1〜24個の炭素原子を含む直鎖状または分枝状、非環状または環状の飽和脂肪族炭化水素を含む。代表的な飽和直鎖アルキルには、これらに限定されないが、メチル、エチル、n−プロピル、n−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシルなどが含まれ、飽和分枝状アルキルには、これらに限定されないが、イソプロピル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環状アルキルには、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれ、不飽和環状アルキルには、これらに限定されないが、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが含まれる。
「アルケニル」という用語は、隣接炭素原子間に少なくとも1個の二重結合を含む上記に定義したようなアルキルを含む。アルケニルにはcis異性体とtrans異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖状および分枝状アルケニルには、これらに限定されないが、エチレニル、プロピレニル、1−ブテニル、2−ブテニル、イソブチレニル、1−ペンテニル、2−ペンテニル、3−メチル−1−ブテニル、2−メチル−2−ブテニル、2,3−ジメチル−2−ブテニルなどが含まれる。
「アルキニル」という用語は、隣接炭素間に少なくとも1個の三重結合を追加的に含む上記に定義したような任意のアルキルまたはアルケニルを含む。代表的な直鎖状および分枝状アルキニルには、これらに限定されないが、アセチレニル、プロピニル、1−ブチニル、2−ブチニル、1−ペンチニル、2−ペンチニル、3−メチル−1ブチニルなどが含まれる。
「アシル」という用語は、結合点の炭素が以下で定義するようなオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む。以下のもの:−C(=O)アルキル、−C(=O)アルケニルおよび−C(=O)アルキニルはアシル基の非限定的な例である。
「複素環」という用語は、飽和、不飽和または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される1または2個のヘテロ原子を含み、その窒素および硫黄ヘテロ原子が任意選択で酸化されていてよく、その窒素ヘテロ原子が任意選択で四級化されていてよい5〜7員の単環式または7〜10員の二環式、複素環式環であって、上記複素環のいずれかがベンゼン環と縮合している二環式環を含む複素環式環を含む。その複素環は任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合していてよい。複素環には、これらに限定されないが、以下で定義するヘテロアリールならびにモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル(piperidinyl)、ピペリジニル(piperizynyl)、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル(tetrahydroprimidinyl)、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
「任意選択で置換されたアルキル」、「任意選択で置換されたアルケニル」、「任意選択で置換されたアルキニル」、「任意選択で置換されたアシル」および「任意選択で置換された複素環」という用語は、置換されている場合、少なくとも1個の水素原子がある置換基で置き換えられていることを意味する。オキソ置換基(=O)の場合、2個の水素原子が置き換えられる。この関連で、置換基には、これらに限定されないが、オキソ、ハロゲン、複素環、−CN、−ORx、−NRxRy、−NRxC(=O)Ry−NRxSO2Ry、−C(=O)Rx、−C(=O)ORx、−C(=O)NRxRy、−SOnRxおよび−SOnNRxRyが含まれる。ここで、nは0、1または2であり、RxおよびRyは、同じかまたは異なっており、独立に水素、アルキルまたは複素環であり、そのアルキルおよび複素環置換基のそれぞれは、オキソ、ハロゲン、−OH、−CN、アルキル、−ORx、複素環、−NRxRy、−NRxC(=O)Ry−NRxSO2Ry、−C(=O)Rx、−C(=O)ORx、−C(=O)NRxRy、−SOnRxおよび−SOnNRxRyの1つまたは複数でさらに置換されていてよい。「任意選択で置換された」という用語は、置換基のリストの前で用いられる場合、そのリスト中の置換基のそれぞれが本明細書で説明するように任意選択で置換されていてよいことを意味する。
「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。
「融合性」という用語は、SNALPなどの脂質粒子が細胞膜と融合する能力を指す。その膜は、原形質膜であっても細胞小器官、例えばエンドソーム、細胞核等を取り囲む膜であってもよい。
本明細書で用いる「水溶液」という用語は、全体的にまたは部分的に水を含む組成物を指す。
本明細書で用いる「有機脂質溶液」という用語は、全体的にまたは部分的に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
本明細書で用いる「遠位部位」は、近接毛細血管床(adjacent capillary bed)に限定されず、生物体全体にわたって広く分布している部位を含む物理的に隔てられた部位を指す。
SNALPなどの核酸−脂質粒子に関連して「血清安定な」ということは、遊離DNAまたはRNAを著しく劣化させることになる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、その粒子がそれほど劣化しないことを意味する。適切なアッセイには、例えば標準的な血清アッセイ、DNAseアッセイまたはRNAseアッセイが含まれる。
本明細書で用いる「全身的送達」は、生物体内で干渉RNA(例えば、siRNA)などの活性薬剤の広範な生体内分布をもたらす、脂質粒子の送達を指す。いくつかの投与技術は、そのほかのものはできない、特定の薬剤の全身的送達をもたらすことができる。全身的送達は、有用な好ましくは治療量の薬剤が身体の大部分に曝露されることを意味する。広範な生体内分布を得るということは、通常、投与部位より遠位にある疾患部位に到達する前にその薬剤が急速に分解したり一掃されたり(初回通過臓器(肝臓、肺等)によるまたは急速な非特異的細胞結合によるなど)しないような血液寿命を必要とする。脂質粒子の全身的送達は、例えば静脈内、皮下および腹腔内を含む当業界で公知の任意の手段によるものであってよい。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身的送達は静脈内による送達である。
本明細書で用いる「局所送達」は、生物体内の標的部位への干渉RNA(例えば、siRNA)などの活性薬剤の直接的な送達を指す。例えば、薬剤を、疾患部位、他の標的部位または標的臓器、例えば肝臓、心臓、膵臓、腎臓などに直接注射することによって局所的に送達することができる。
「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、テンジクネズミ、ウサギ、家畜などの任意の哺乳動物種を指す。
「細網内皮系」または「RES」という用語は、単球およびマクロファージなどの細網結合組織中に位置する食細胞を含む細網内皮細胞を含む免疫系の部分を指す。これらの細胞は一般にリンパ節および脾臓の中で蓄積する。肝臓のクッパー細胞および組織の組織球もRESの一部である。RESは、一次リンパ器官と二次リンパ器官に分けられる。一次(「中枢」)リンパ器官は、RESの細胞が産生される部位である。RESの細胞は骨髄中で産生される。T細胞成熟のための要求部位であるので、胸腺も含まれる。二次(「末梢」)リンパ器官は、RESの細胞が機能する部位である。これには、リンパ節、へんとう腺、脾臓および「MALT」(粘膜関連リンパ組織)が含まれる。MALTはさらに、「GALT」(腸管関連リンパ組織)と「BALT」(気管支関連リンパ組織)に分けられる。肝臓のクッパー細胞はこの系の一部として役割を果たすが、組織中に組織化はされず;むしろ、これらは、肝臓類洞中全体に分散される。中枢神経系(CNS)のミクログリアはRESの一部と考えることができる。これらは、CNS損傷に応答して増殖するスカベンジャー細胞である。
III.実施形態の説明
本発明は、ALDH遺伝子、特にALDH2遺伝子の発現を標的とする干渉RNA(例えば、siRNAなどのdsRNA)などの治療用核酸、その治療用核酸の1つまたは複数(例えば、カクテル)を含む脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法、および脂質粒子を送達および/または投与する(例えば、ヒトにおけるアルコール症の処置のために)方法を提供する。
本発明は、ALDH遺伝子、特にALDH2遺伝子の発現を標的とする干渉RNA(例えば、siRNAなどのdsRNA)などの治療用核酸、その治療用核酸の1つまたは複数(例えば、カクテル)を含む脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法、および脂質粒子を送達および/または投与する(例えば、ヒトにおけるアルコール症の処置のために)方法を提供する。
一態様では、本発明は、ALDH遺伝子発現を標的とする干渉RNA分子を提供する。干渉RNA分子の非限定的な例には、siRNA、ダイサー−基質dsRNA、shRNA、aiRNA、プレmiRNAおよびそれらの混合物などのRNAiを媒介することができる二本鎖のRNAが含まれる。特定の例では、本発明は、ALDH遺伝子の異なる領域を標的とする干渉RNAの組合せ(例えば、カクテル、プールまたは混合物)を含む組成物を提供する。特定の例では、本発明の干渉RNA(例えば、siRNA)分子は、in vitroまたはin vivoで、ALDH遺伝子発現をサイレンシングし、ALDHを不活性化し、かつ/またはALDHの複製を阻害することができる。
特定の実施形態では、本発明は、ALDH遺伝子発現をサイレンシングする干渉RNA(例えば、siRNA)であって、その干渉RNAがセンス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、その干渉RNAが約15〜約60個のヌクレオチドの長さ(例えば、約15〜60、15〜30、15〜25、19〜30、19〜25、20〜60、20〜55、20〜50、20〜45、20〜40、20〜35、20〜30、20〜25、21〜30、21〜29、22〜30、22〜29、22〜28、23〜30、23〜28、24〜30、24〜28、25〜60、25〜55、25〜50、25〜45、25〜40、25〜35または25〜30個のヌクレオチドの長さまたは約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34もしくは35個のヌクレオチドの長さ)の二本鎖領域を含む干渉RNAを提供する。
特定の実施形態では、本発明の干渉RNA(例えば、siRNA)は、例えば干渉RNAの二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば2’OMeヌクレオチドを含むことができる。干渉RNA中のウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドは、2’OMeヌクレオチドで修飾されていることが好ましい。特定の例では、干渉RNAは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の中で2’OMeヌクレオチドを含み、二本鎖領域中に少なくとも1つの2’OMe−ウリジンヌクレオチドおよび少なくとも1つの2’OMe−グアノシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、干渉RNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖は、例えば干渉RNAの二本鎖領域中に、修飾された(例えば、2’OMe−修飾された)アデノシンおよび/または修飾された(例えば、2’OMe−修飾された)シトシンヌクレオチドをさらに含むことができる。
特定の実施形態では、本発明の干渉RNA(例えば、siRNA)分子は、1つまたは両方の鎖中に1、2、3または4個のヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。特定の例では、干渉RNAは少なくとも1つの平滑末端を含むことができる。特定の実施形態では、干渉RNAの1つまたは両方の鎖中の3’オーバーハングは、標的配列またはその相補鎖に対して相補性を有する、1、2、3もしくは4個の修飾および/または非修飾デオキシチミジン(「t」または「dT」)ヌクレオチド、1、2、3もしくは4個の修飾(例えば、2’OMe)および/または非修飾ウリジン(「U」)リボヌクレオチドあるいは1、2、3もしくは4個の修飾(例えば、2’OMe)および/または非修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ独立に含むことができる。
本発明は、本明細書で説明する干渉RNAの1つまたは複数(例えば、カクテル)および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
他の態様では、本発明は、ALDH遺伝子発現を標的とする核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)を提供する。核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)は、一般に本明細書で説明する干渉RNAの1つまたは複数(例えば、カクテル)、カチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)は、粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含む。核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)は、本明細書で説明する干渉RNAの1つまたは複数(例えば、カクテル)、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を含むことが好ましい。
いくつかの実施形態では、本発明の干渉RNA(例えば、siRNA)は、核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)中に完全にカプセル化されている。干渉RNAカクテルを含む処方物に関して、カクテル(例えば、異なる配列を有する干渉RNA化合物)中に存在する異なる種類の干渉RNA種が同じ粒子中に同時カプセル化されていても、またカクテル中に存在する各種類の干渉RNA種が別個の粒子中にカプセル化されていてもよい。干渉RNAカクテルは、同一の、類似したもしくは異なる濃度またはモル比で、2つ以上の個々の干渉RNA(それぞれ独特の配列を有する)の混合物を用いて本明細書で説明する粒子中に処方することができる。一実施形態では、干渉RNAのカクテル(異なる配列を有する複数の干渉RNAに相当する)を、同一の、類似したもしくは異なる濃度またはモル比の各干渉RNA種を用いて処方し、異なる種類の干渉RNAを同じ粒子中に同時カプセル化する。他の実施形態では、カクテル中に存在する各種の干渉RNA種を、同一の、類似したもしくは異なる干渉RNA濃度またはモル比で異なる粒子中にカプセル化し、こうして形成された粒子(それぞれ異なる干渉RNAペイロードを含む)を別個に(例えば、治療レジメンにしたがって異なる時間で)投与する、または合わせて単一の単位用量として一緒に投与する(例えば、薬学的に許容される担体で)。本明細書で説明する粒子は血清安定性であり、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性があり、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
本発明の核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)中のカチオン性脂質は、例えば本明細書で説明する式I〜IIIの1つもしくは複数のカチオン性脂質または他の任意のカチオン性脂質種を含むことができる。1つの特定の実施形態では、カチオン性脂質は1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、1,2−ジ−γ−リノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(γ−DLenDMA)、2,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−C2−DMA)、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)、ジリノレイルメチル−3−ジメチルアミノプロピオネート(DLin−M−C2−DMA)、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin−M−C3−DMA)、それらの塩およびそれらの混合物からなる群から選択される。
本発明の核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)中の非カチオン性脂質は、例えば1つまたは複数のアニオン性脂質および/または中性脂質を含むことができる。いくつかの実施形態では、その非カチオン性脂質は以下の中性脂質成分:(1)リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物;(2)コレステロールまたはその誘導体;あるいは(3)リン脂質の1つを含む。特定の好ましい実施形態では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)またはそれらの混合物を含む。特に好ましい実施形態では、非カチオン性脂質はDPPCとコレステロールとの混合物である。
本発明の核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)中の脂質コンジュゲートは、粒子の凝集を阻止するものであり、例えば本明細書で説明する脂質コンジュゲートの1つまたは複数を含むことができる。1つの特定の実施形態では、脂質コンジュゲートはPEG−脂質コンジュゲートを含む。PEG−脂質コンジュゲートの例には、これらに限定されないが、PEG−DAGコンジュゲート、PEG−DAAコンジュゲートおよびそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、脂質粒子中のPEG−DAAコンジュゲートは、PEG−ジデシルオキシプロピル(C10)コンジュゲート、PEG−ジラウリルオキシプロピル(C12)コンジュゲート、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(C14)コンジュゲート、PEG−ジパルミチルオキシプロピル(C16)コンジュゲート、PEG−ジステアリルオキシプロピル(C18)コンジュゲートまたはそれらの混合物を含むことができる。他の実施形態では、脂質コンジュゲートはPOZ−DAAコンジュゲートなどのPOZ−脂質コンジュゲートを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約50mol%〜約85mol%を構成する1つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約13mol%〜約49.5mol%を構成する1つまたは複数の非カチオン性脂質;および(d)粒子中に存在する全脂質の約0.5mol%〜約2mol%を構成する、粒子の凝集を阻止する1つまたは複数のコンジュゲートされた脂質を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)を提供する。
この実施形態の1つの態様では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約52mol%〜約62mol%を構成するカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約36mol%〜約47mol%を構成するリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物;および(d)粒子中に存在する全脂質の約1mol%〜約2mol%を構成するPEG−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「1:57」処方物と称する。1つの特定の実施形態では、この1:57処方物は、約1.4mol%PEG−脂質コンジュゲート(例えば、PEG2000−C−DMA)、約57.1mol%カチオン性脂質(例えば、DLin−K−C2−DMA)またはその塩、約7.1mol%DPPC(またはDSPC)および約34.3mol%コレステロール(またはその誘導体)を含む四成分系である。
この実施形態の他の態様では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約56.5mol%〜約66.5mol%を構成するカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約31.5mol%〜約42.5mol%を構成するコレステロールまたはその誘導体;および(d)粒子中に存在する全脂質の約1mol%〜約2mol%を構成するPEG−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「1:62」処方物と称する。1つの特定の実施形態では、この1:62処方物は、リン脂質フリーであり、約1.5mol%PEG−脂質コンジュゲート(例えば、PEG2000−C−DMA)、約61.5mol%カチオン性脂質(例えば、DLin−K−C2−DMA)またはその塩および約36.9mol%コレステロール(またはその誘導体)を含む三成分系である。
1:57および1:62処方物に関する追加の実施形態は、PCT公開番号WO09/127060および公開されている米国特許出願公開番号第2011/0071208A1号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
他の実施形態では、本発明は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約2mol%〜約50mol%を構成する1つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約90mol%を構成する1つまたは複数の非カチオン性脂質;および(d)粒子中に存在する全脂質の約0.5mol%〜約20mol%を構成する粒子の凝集を阻止する1つまたは複数のコンジュゲートされた脂質を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)を提供する。
この実施形態の1つの態様では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約30mol%〜約50mol%を構成するカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約47mol%〜約69mol%を構成するリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物;および(d)粒子中に存在する全脂質の約1mol%〜約3mol%を構成するPEG−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「2:40」処方物と称する。1つの特定の実施形態では、この2:40処方物は、約2mol%PEG−脂質コンジュゲート(例えば、PEG2000−C−DMA)、約40mol%カチオン性脂質(例えば、DLin−K−C2−DMA)またはその塩、約10mol%DPPC(またはDSPC)および約48mol%コレステロール(またはその誘導体)を含む四成分系である。
他の実施形態では、本発明は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約50mol%〜約65mol%を構成する1つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約25mol%〜約45mol%を構成する1つまたは複数の非カチオン性脂質;および(d)粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約10mol%を構成する粒子の凝集を阻止する1つまたは複数のコンジュゲートされた脂質を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)を提供する。
この実施形態の1つの態様では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約50mol%〜約60mol%を構成するカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約35mol%〜約45mol%を構成するリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物;および(d)粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約10mol%を構成するPEG−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「7:54」処方物と称する。特定の例では、7:54処方物中のこの非カチオン性脂質混合物は:(i)粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約10mol%のリン脂質;および(ii)粒子中に存在する全脂質の約25mol%〜約35mol%のコレステロールまたはその誘導体を含む。1つの特定の実施形態では、この7:54処方物は、約7mol%PEG−脂質コンジュゲート(例えば、PEG750−C−DMA)、約54mol%カチオン性脂質(例えば、DLin−K−C2−DMA)またはその塩、約7mol%DPPC(またはDSPC)および約32mol%コレステロール(またはその誘導体)を含む四成分系である。
この実施形態の他の態様では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数(例えば、カクテル)の干渉RNA分子;(b)粒子中に存在する全脂質の約55mol%〜約65mol%を構成するカチオン性脂質またはその塩;(c)粒子中に存在する全脂質の約30mol%〜約40mol%を構成するコレステロールまたはその誘導体;および(d)粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約10mol%を構成するPEG−脂質コンジュゲートを含む。核酸−脂質粒子のこの実施形態を本明細書では一般に「7:58」処方物と称する。1つの特定の実施形態では、この7:58処方物は、リン脂質フリーであり、約7mol%PEG−脂質コンジュゲート(例えば、PEG750−C−DMA)、約58mol%カチオン性脂質(例えば、DLin−K−C2−DMA)またはその塩および約35mol%コレステロール(またはその誘導体)を含む三成分系である。
7:54および7:58処方物に関する追加の実施形態は、公開されている米国特許出願公開番号第2011/0076335A1号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明は、SNALPなどの核酸−脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
本発明の核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)は、1つまたは複数のALDH遺伝子の発現をサイレンシングする干渉RNA(例えば、siRNA)の治療的送達に有用である。いくつかの実施形態では、ALDH遺伝子の異なる領域(例えば、重なった配列および/または重なっていない配列)を標的とする干渉RNAのカクテルを、同じかまたは異なる核酸−脂質粒子に処方し、その粒子をそうした処置を必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)に投与する。特定の例では、治療有効量の核酸−脂質粒子を、哺乳動物に、例えばヒトにおけるアルコール症を処置するために投与することができる。
特定の実施形態では、本発明は、本明細書で説明する1つまたは複数の干渉RNA(例えば、siRNA)分子を、その細胞を本明細書で説明する核酸−脂質粒子(例えば、SNALP処方物)と接触させることによって細胞中に導入するための方法を提供する。1つの特定の実施形態では、その細胞は細網内皮細胞(例えば、単球またはマクロファージ)、線維芽細胞、内皮細胞または血小板細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)は、以下の投与経路:経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下および皮内の1つによって投与される。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は全身的に、例えば腸内経由または非経口投与経路で投与される。
特定の実施形態では、例えば急性または慢性のアルコール症を処置するために、本発明の核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)は、干渉RNA(例えば、dsRNA)などのペイロードを他の組織と比較して肝臓に優先的に送達することができる。
特定の態様では、本発明は、ALDH遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)におけるALDH遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、哺乳動物に、治療有効量の本明細書で説明する1つまたは複数の干渉RNA(例えば、siRNA)(例えば、1つまたは複数のALDH遺伝子を標的とするsiRNA)を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP処方物)を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のALDH干渉RNAを含む核酸−脂質粒子の投与は、ALDH RNAレベルを、干渉RNAの非存在下(例えば、緩衝対照または無関係の非ALDHを標的とする干渉RNA対照)で検出されるALDH RNAレベルと比較して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%(またはその中の任意の範囲)低減させる。他の実施形態では、1つまたは複数のALDH標的干渉RNAを含む核酸−脂質粒子の投与は、ALDH RNAレベルを、例えば緩衝対照または無関係の非ALDHを標的とする干渉RNA対照などの陰性対照に対して、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100日間またはそれ以上(またはその中の任意の範囲)低減させる。
他の態様では、本発明は、ALDH遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)におけるALDH遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、哺乳動物に治療有効量の本明細書で説明する1つまたは複数の干渉RNA(例えば、siRNA)(例えば、ALDH遺伝子の1つまたは複数の領域を標的とするsiRNA)を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP処方物)を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のALDH干渉RNAを含む核酸−脂質粒子の投与は、ALDH mRNAレベルを、干渉RNAの非存在下(例えば、緩衝対照または無関係の非ALDHを標的とする干渉RNA対照)で検出されるALDH mRNAレベルと比較して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%(またはその中の任意の範囲)低減させる。他の実施形態では、1つまたは複数のALDH標的干渉RNAを含む核酸−脂質粒子の投与は、ALDH mRNAレベルを、例えば緩衝対照または無関係の非ALDHを標的とする干渉RNA対照などの陰性対照に対して、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100日間またはそれ以上(またはその中の任意の範囲)低減させる。
他の態様では、本発明は、アルコール症に付随する1つまたは複数の症状を処置する、防止する、その発症のリスクまたは可能性を低減させる(例えば、それに対する感受性を低減させる)、その発現を遅延させる、かつ/または改善することを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)におけるアルコール症に付随する1つまたは複数の症状を処置する、防止する、その発症のリスクまたは可能性を低減させる(例えば、それに対する感受性を低減させる)、その発現を遅延させる、かつ/または改善するための方法であって、哺乳動物に治療有効量の、ALDH遺伝子発現を標的とする本明細書で説明する1つまたは複数の干渉RNA分子(例えば、siRNA)を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP処方物)を投与するステップを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、それを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)(例えば、アルコール症に罹患しているヒト)におけるALDHを不活性化するための方法であって、哺乳動物に治療有効量のALDH遺伝子発現を標的とする本明細書で説明する1つまたは複数の干渉RNA(例えば、siRNA)を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP処方物)を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のALDH標的干渉RNAを含む核酸−脂質粒子の投与は、ALDH酵素レベルを、干渉RNAの非存在下(例えば、緩衝対照または無関係の非ALDHを標的とする干渉RNA対照)で検出されるALDH酵素レベルと比較して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%(またはその中の任意の範囲)低下、低減または減少させる。
例を挙げると、ALDH2mRNAは、分岐DNAアッセイ(QuantiGene(登録商標);Affymetrix)を用いて測定することができる。分岐DNAアッセイは、bDNA分子を、捕獲した標的RNAからのシグナルを増幅するために使用するサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション法である。再度例を挙げると、ALDH酵素活性は、NADおよび基質(例えば、アセトアルデヒド)をタンパク質試料に加え、340nmでのNADHの生成を測定することによって、分光光度的に測定することができる(例えば、Sheppard, Albersheim & McClearn、J.Biol.Chem.1970年245巻(11号):2876頁;Arolfoら、Alcoholism: Clinical and Experimental Research 2009年33巻(11号):1935頁;Garverら、Alcohol & Alcoholism 2000年35巻(5号):435頁)を参照されたい)。
IV.治療用核酸
「核酸」という用語は、一般にオリゴヌクレオチドと称される最大で60個のヌクレオチドを含む断片、およびポリヌクレオチドと称されるより長い断片を有する任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド(oligonucletoide)は約15〜約60個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書で説明する脂質粒子などの担体系と一緒になっている(associated with)。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中に完全にカプセル化されている。核酸は、本発明の脂質粒子単独で、またはペプチド、ポリペプチドもしくは慣用的な薬物などの小分子を含む脂質粒子と組み合わせて投与する(例えば、同時投与する)ことができる。
「核酸」という用語は、一般にオリゴヌクレオチドと称される最大で60個のヌクレオチドを含む断片、およびポリヌクレオチドと称されるより長い断片を有する任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド(oligonucletoide)は約15〜約60個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書で説明する脂質粒子などの担体系と一緒になっている(associated with)。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中に完全にカプセル化されている。核酸は、本発明の脂質粒子単独で、またはペプチド、ポリペプチドもしくは慣用的な薬物などの小分子を含む脂質粒子と組み合わせて投与する(例えば、同時投与する)ことができる。
本発明の関連で、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーもしくはオリゴマーまたは天然由来の塩基、糖および糖間(骨格)結合からなるヌクレオシドモノマーのポリマーもしくはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、非天然由来のモノマーもしくは同様に機能するその一部を含むポリマーまたはオリゴマーも含む。そうした修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば高い細胞取り込み、低い免疫原性およびヌクレアーゼの存在下での高い安定性などの特性のため、しばしば天然形態のものより好ましい。
オリゴヌクレオチドは通常、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の5’および3’炭素でホスフェートと共有結合して交互型の非分岐ポリマーを形成しているデオキシリボースと呼ばれる五炭糖からなる。リボオリゴヌクレオチドは、五炭糖がリボースである類似した反復構造からなる。
核酸は、一本鎖DNAもしくはRNAであっても二本鎖のDNAもしくはRNAであっても、またDNA−RNAハイブリッドであってもよい。好ましい実施形態では、核酸は二本鎖のRNAである。二本鎖のRNAの例は本明細書で説明されており、それらには、例えばsiRNAおよび他のRNAi剤、例えばダイサー−基質dsRNA、shRNA、aiRNAおよびプレmiRNAが含まれる。他の実施形態では、核酸は一本鎖である。一本鎖核酸には、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟miRNAおよび三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが含まれる。
本発明の核酸は一般に、核酸の具体的な形態に応じて様々な長さのものであってよい。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約1,000〜約100,000個のヌクレオチド残基の長さであってよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは約10〜約100個のヌクレオチドの長さの範囲であってよい。様々な関連実施形態では、一本鎖と二本鎖および三本鎖の両方のオリゴヌクレオチドは、約10〜約60個のヌクレオチド、約15〜約60個のヌクレオチド、約20〜約50個のヌクレオチド、約15〜約30個のヌクレオチドまたは約20〜約30個のヌクレオチドの長さの範囲であってよい。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド(またはその鎖)は、標的ポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、または標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。本明細書で用いる「特異的にハイブリダイズ可能である」および「相補的である(complementary)」という用語は、DNAまたはRNA標的とオリゴヌクレオチドの間で、安定で特異的な結合が起こるのに十分な程度の相補性を表す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、標的核酸配列に対して100%相補的である必要はないことは理解される。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的配列の結合が標的配列の正常な機能に干渉して有用性またはそれからの発現の喪失を引き起こす場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望ましい条件下、すなわちin vivoアッセイもしくは治療処置の場合の生理学的条件下、またはin vitroアッセイの場合、アッセイが実行される条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。したがって、オリゴヌクレオチドは、標的とするまたはそれに特異的にハイブリダイズする遺伝子またはmRNA配列の領域と比較して、1、2、3個またはそれ以上の塩基置換を含むことができる。
A.siRNA
本発明の非修飾および修飾siRNA分子はALDH遺伝子発現をサイレンシングすることができる。siRNA二重鎖の各鎖は一般に約15〜約60個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約15〜約30個のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、siRNAは少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾siRNAは通常、対応する非修飾siRNA配列より免疫賦活性が低く、対象の標的遺伝子に対するRNAi活性を保持している。いくつかの実施形態では、修飾siRNAは、少なくとも1つの2’OMeプリンまたはピリミジンヌクレオチド、例えば2’OMe−グアノシン、2’OMe−ウリジン、2’OMe−アデノシンおよび/または2’OMe−シトシンヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、siRNAの1つの鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス)中またはその両方の鎖中に存在してよい。いくつかの好ましい実施形態では、ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドの1つまたは複数は、siRNAの1つの鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス)中またはその両方の鎖中で修飾されている(例えば、2’OMe修飾されている)。これらの実施形態では、修飾siRNAは、1つまたは複数の修飾された(例えば、2’OMe修飾された)アデノシンおよび/または修飾された(例えば、2’OMe修飾された)シトシンヌクレオチドをさらに含むことができる。他の好ましい実施形態では、ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドだけが、siRNAの1つの鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス)中またはその両方の鎖中で修飾されている(例えば、2’OMe修飾されている)。siRNA配列はオーバーハング(例えば、Elbashirら、Genes Dev.、15巻:188頁(2001年)またはNykanenら、Cell、107巻:309頁(2001年)に記載されているような3’または5’オーバーハング)を有していても、またオーバーハングが欠けていてもよい(すなわち、平滑末端を有する)。
本発明の非修飾および修飾siRNA分子はALDH遺伝子発現をサイレンシングすることができる。siRNA二重鎖の各鎖は一般に約15〜約60個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約15〜約30個のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、siRNAは少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾siRNAは通常、対応する非修飾siRNA配列より免疫賦活性が低く、対象の標的遺伝子に対するRNAi活性を保持している。いくつかの実施形態では、修飾siRNAは、少なくとも1つの2’OMeプリンまたはピリミジンヌクレオチド、例えば2’OMe−グアノシン、2’OMe−ウリジン、2’OMe−アデノシンおよび/または2’OMe−シトシンヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、siRNAの1つの鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス)中またはその両方の鎖中に存在してよい。いくつかの好ましい実施形態では、ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドの1つまたは複数は、siRNAの1つの鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス)中またはその両方の鎖中で修飾されている(例えば、2’OMe修飾されている)。これらの実施形態では、修飾siRNAは、1つまたは複数の修飾された(例えば、2’OMe修飾された)アデノシンおよび/または修飾された(例えば、2’OMe修飾された)シトシンヌクレオチドをさらに含むことができる。他の好ましい実施形態では、ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドだけが、siRNAの1つの鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス)中またはその両方の鎖中で修飾されている(例えば、2’OMe修飾されている)。siRNA配列はオーバーハング(例えば、Elbashirら、Genes Dev.、15巻:188頁(2001年)またはNykanenら、Cell、107巻:309頁(2001年)に記載されているような3’または5’オーバーハング)を有していても、またオーバーハングが欠けていてもよい(すなわち、平滑末端を有する)。
特定の実施形態では、siRNAの一方または両方の鎖の二本鎖領域中への2’OMeウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの選択的組み込みは、そのsiRNA分子への免疫応答を低減させるまたは完全に妨げる。特定の例では、特異的siRNA配列の免疫賦活特性およびそれらが遺伝子発現をサイレンシングする能力は、siRNA二重鎖の二本鎖領域中への最少で選択的な2’OMe修飾の導入によって、平衡を保つかまたは最適化することができる。これは、治療的に実行可能なsiRNA用量で、サイトカイン導入、毒性および非修飾siRNAの使用に付随する標的外の影響を伴うことなく、実施することができる。
修飾siRNAは一般に、siRNA二重鎖の二本鎖領域に約1%〜約100%(例えば、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%)の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、siRNAの二本鎖領域中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態では、siRNAの二本鎖領域中の修飾ヌクレオチドの一部またはすべては、お互いから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個のヌクレオチドまたはそれ以上で隔てられている。好ましい1つの実施形態では、siRNAの二本鎖領域中のどの修飾ヌクレオチドも互いに隣接していない(例えば、各修飾ヌクレオチド間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の非修飾ヌクレオチドのすき間がある)。
いくつかの実施形態では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満(例えば、約49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%または36%未満、好ましくは約35%、34%、33%、32%、31%または30%未満)は修飾された(例えば、2’OMe)ヌクレオチドを含む。これらの実施形態の1つの態様では、siRNAの1つまたは両方の鎖の二本鎖領域中のウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドの約50%未満は選択的に(例えば、それだけで)修飾されている。これらの実施形態の他の態様では、そのsiRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAはsiRNAの両方の鎖中に2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは少なくとも1つの2’OMe−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1つの2’OMe−ウリジンヌクレオチドを含み、二本鎖領域中に存在する2’OMeヌクレオチドは2’OMe−グアノシンヌクレオチドおよび2’OMe−ウリジンヌクレオチドだけである。これらの実施形態のさらに他の態様では、そのsiRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは修飾siRNAの両方の鎖中で2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチド、2’OMe−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは二本鎖領域中に2’OMe−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAはsiRNAの両方の鎖中で2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは少なくとも1つの2’OMe−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1つの2’OMe−ウリジンヌクレオチドを含み、siRNAは二本鎖領域中に2’OMe−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは修飾siRNAの両方の鎖中に2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチド、2’OMe−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される2’OMeヌクレオチドを含み、二本鎖領域中の2’OMeヌクレオチドは互いに隣接していない。
他の実施形態では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%(例えば、約5%〜50%、10%〜50%、15%〜50%、20%〜50%、25%〜50%、30%〜50%、35%〜50%、40%〜50%、45%〜50%、5%〜45%、10%〜45%、15%〜45%、20%〜45%、25%〜45%、30%〜45%、35%〜45%、40%〜45%、5%〜40%、10%〜40%、15%〜40%、20%〜40%、25%〜40%、25%〜39%、25%〜38%、25%〜37%、25%〜36%、26%〜39%、26%〜38%、26%〜37%、26%〜36%、27%〜39%、27%〜38%、27%〜37%、27%〜36%、28%〜39%、28%〜38%、28%〜37%、28%〜36%、29%〜39%、29%〜38%、29%〜37%、29%〜36%、30%〜40%、30%〜39%、30%〜38%、30%〜37%、30%〜36%、31%〜39%、31%〜38%、31%〜37%、31%〜36%、32%〜39%、32%〜38%、32%〜37%、32%〜36%、33%〜39%、33%〜38%、33%〜37%、33%〜36%、34%〜39%、34%〜38%、34%〜37%、34%〜36%、35%〜40%、5%〜35%、10%〜35%、15%〜35%、20%〜35%、21%〜35%、22%〜35%、23%〜35%、24%〜35%、25%〜35%、26%〜35%、27%〜35%、28%〜35%、29%〜35%、30%〜35%、31%〜35%、32%〜35%、33%〜35%、34%〜35%、30%〜34%、31%〜34%、32%〜34%、33%〜34%、30%〜33%、31%〜33%、32%〜33%、30%〜32%、31%〜32%、25%〜34%、25%〜33%、25%〜32%、25%〜31%、26%〜34%、26%〜33%、26%〜32%、26%〜31%、27%〜34%、27%〜33%、27%〜32%、27%〜31%、28%〜34%、28%〜33%、28%〜32%、28%〜31%、29%〜34%、29%〜33%、29%〜32%、29%〜31%、5%〜30%、10%〜30%、15%〜30%、20%〜34%、20%〜33%、20%〜32%、20%〜31%、20%〜30%、21%〜30%、22%〜30%、23%〜30%、24%〜30%、25%〜30%、25%〜29%、25%〜28%、25%〜27%、25%〜26%、26%〜30%、26%〜29%、26%〜28%、26%〜27%、27%〜30%、27%〜29%、27%〜28%、28%〜30%、28%〜29%、29%〜30%、5%〜25%、10%〜25%、15%〜25%、20%〜29%、20%〜28%、20%〜27%、20%〜26%、20%〜25%、5%〜20%、10%〜20%、15%〜20%、5%〜15%、10%〜15%、または5%〜10%)は修飾ヌクレオチドを含む。これらの実施形態の1つの態様では、siRNAの1つまたは両方の鎖の二本鎖領域中のウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドの約1%〜約50%は選択的に(例えば、それだけで)修飾されている。これらの実施形態の他の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAはsiRNAの両方の鎖中で2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは少なくとも1つの2’OMe−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1つの2’OMe−ウリジンヌクレオチドを含み、二本鎖領域中に存在する2’OMeヌクレオチドは2’OMe−グアノシンヌクレオチドおよび2’OMe−ウリジンヌクレオチドだけである。これらの実施形態のさらに他の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは修飾siRNAの両方の鎖中で2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチド、2’OMe−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは二本鎖領域中に2’OMe−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAはsiRNAの両方の鎖中で2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは少なくとも1つの2’OMe−グアノシンヌクレオチドおよび少なくとも1つの2’OMe−ウリジンヌクレオチドを含み、siRNAは二本鎖領域中に2’OMe−シトシンヌクレオチドを含まない。これらの実施形態の他の態様では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%は2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは修飾siRNAの両方の鎖中で2’OMeヌクレオチドを含み、siRNAは2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチド、2’OMe−アデノシンヌクレオチドおよびそれらの混合物からなる群から選択される2’OMeヌクレオチドを含み、二本鎖領域中の2’OMeヌクレオチドは互いに隣接していない。
siRNA中に導入できる追加的な範囲、パーセンテージおよび修飾のパターンは米国特許公開番号第20070135372号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
1.siRNA配列の選択
適切なsiRNA配列は、当業界で公知の任意の手段を用いて特定することができる。一般に、Elbashirら、Nature、411巻:494〜498頁(2001年)およびElbashirら、EMBO J.、20巻:6877〜6888頁(2001年)に記載されている方法を、Reynoldsら、Nature Biotech.、22巻(3号):326〜330頁(2004年)に示されている合理的な設計ルールと組み合わせる。
適切なsiRNA配列は、当業界で公知の任意の手段を用いて特定することができる。一般に、Elbashirら、Nature、411巻:494〜498頁(2001年)およびElbashirら、EMBO J.、20巻:6877〜6888頁(2001年)に記載されている方法を、Reynoldsら、Nature Biotech.、22巻(3号):326〜330頁(2004年)に示されている合理的な設計ルールと組み合わせる。
非限定的な例として、対象の標的遺伝子からの転写物のAUG出発コドンのヌクレオチド配列3’を、ジヌクレオチド配列(例えば、AA、NA、CC、GGまたはUU、ここでN=C、GまたはUである)について走査することができる(例えば、Elbashirら、EMBO J.、20巻:6877〜6888頁(2001年)を参照されたい)。ジヌクレオチド配列のすぐ3’側のヌクレオチドは、潜在的siRNA配列(すなわち、標的配列またはセンス鎖配列)として特定される。一般に、ジヌクレオチド配列のすぐ3’側の19、21、23、25、27、29、31、33、35個またはそれ以上のヌクレオチドは潜在的siRNA配列として特定される。いくつかの実施形態では、ジヌクレオチド配列はAAまたはNA配列であり、AAまたはNAジヌクレオチドのすぐ3’側の19個のヌクレオチドは潜在的siRNA配列として特定される。siRNA配列は、通常、標的遺伝子の長さに沿って異なる位置で間隔があけられている。siRNA配列のサイレンシング効率をさらに増進させるために、潜在的siRNA配列を分析して、例えば標的細胞または生物体中に、他のコード配列と相同性の領域を含まない部位を特定することができる。例えば、約21個の塩基対の適切なsiRNA配列は一般に、標的細胞または生物体中のコード配列と相同性の16〜17個超の近接塩基対はもたないことになる。siRNA配列がRNA PolIIIプロモーターから発現されることになる場合、4個超の近接A’またはT’が欠けたsiRNA配列が選択される。
潜在的siRNA配列が特定されたら、相補配列(すなわち、アンチセンス鎖配列)を設計することができる。潜在的siRNA配列は当業界で公知の様々な基準を用いて分析することもできる。例えば、それらのサイレンシング効率を増進させるために、合理的設計アルゴリズムによってsiRNA配列を分析して以下の特徴:(1)約25%〜約60%のG/CのG/C含量;(2)センス鎖の15〜19位で少なくとも3つのA/U;(3)内部反復はなし;(4)センス鎖の19位にA;(5)センス鎖の3位にA;(6)センス鎖の10位にU;(7)センス鎖の19位にG/Cはなし;および(8)センス鎖の13位にGはなしの1つまたは複数を有する配列を特定することができる。これらの特徴のそれぞれの適切な値を指定するものであり、siRNAの選択に有用であるアルゴリズムを組み込んでいるsiRNA設計ツールは、例えば、http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.htmlに見ることができる。当業者は、上記特徴の1つまたは複数を有する配列を、さらなる分析および試験のために、潜在的siRNA配列として選択できることを理解されよう。
さらに、以下の基準、すなわち:(1)列の中に4つ以上の同じ塩基のストレッチを含む配列;(2)Gのホモポリマーを含む配列(すなわち、これらのポリマーの構造的特徴に起因する非特異的効果の可能性を低減させるため);(3)三重塩基(triple base)モチーフ(例えば、GGG、CCC、AAAまたはTTT)を含む配列;(4)列の中に7つ以上のG/Cのストレッチを含む配列;および(5)内部折り返し構造をもたらす候補中の4つ以上の塩基の直列反復を含む配列、の1つまたは複数を有する潜在的siRNA配列は、siRNAとしてしばしば排除することができる。しかし、当業者は、上記特徴の1つまたは複数を有する配列も、潜在的siRNA配列としてさらに分析および試験するために選択することができることを理解されよう。
いくつかの実施形態では、潜在的siRNA配列は、例えばKhvorovaら、Cell、115巻:209〜216頁(2003年);およびSchwarzら、Cell、115巻:199〜208頁(2003年)に記載されている、siRNA二重鎖非対称をもとにしてさらに分析することができる。他の実施形態では、潜在的siRNA配列は、例えばLuoら、Biophys.Res.Commun.、318巻:303〜310頁(2004年)に記載されている標的部位での二次構造をもとにしてさらに分析することができる。例えば、標的部位での二次構造を、Mfoldアルゴリズム(http://mfold.burnet.edu.au/rna_formで入手することができる)を用いてモデル化して、塩基対合およびステム−ループの形態の二次構造がより少ない標的部位でのアクセス性に好都合なsiRNA配列を選択することができる。
潜在的siRNA配列が特定されたら、例えばin vitroサイトカインアッセイまたはin vivo動物モデルを用いて、配列を、任意の免疫賦活特性の存在について分析することができる。GU−リッチモチーフ(例えば、5’−GU−3’,5’−UGU−3’,5’−GUGU−3’,5’−UGUGU−3’等)などのsiRNA配列のセンスおよび/またはアンチセンス鎖中のモチーフは、その配列が免疫賦活性であるかどうかの目安も提供することができる。siRNA分子が免疫賦活性であることが分かったら、次いでこれを修飾して、本明細書で説明するようなその免疫賦活特性を減少させることができる。非限定的な例として、細胞が検出可能な免疫応答をもたらすような条件下で、siRNA配列を哺乳動物のキラー細胞と接触させ、siRNAが免疫賦活性であるか非免疫賦活性siRNAであるか判定することができる。哺乳動物のキラー細胞は、無処置の哺乳動物(すなわち、それまでsiRNA配列の遺伝子産生物と接触していない哺乳動物)からのものであってよい。哺乳動物のキラー細胞は、例えば末梢血単核球(PBMC)、マクロファージなどであってよい。検出可能な免疫応答は、サイトカインまたは増殖因子、例えばTNF−α、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、IL−6、IL−12またはその組合せなどの産生を含むことができる。次いで、センスおよび/またはアンチセンス鎖上のヌクレオチドの少なくとも1つを修飾ヌクレオチドで置き換えることによって、免疫賦活性であると特定されたsiRNA分子を修飾してその免疫賦活特性を減少させることができる。例えば、siRNA二重鎖の二本鎖領域中のヌクレオチドの約30%未満(例えば、約30%、25%、20%、15%、10%または5%未満)を、2’OMeヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドで置き換えることができる。次いで修飾siRNAを上述したような哺乳動物のキラー細胞と接触させて、その免疫賦活特性が低減しているまたは妨げられていることを確認することができる。
免疫応答を検出するための適切なin vitroアッセイには、これらに限定されないが、Davidら(米国特許第4,376,110号)の二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫アッセイ手法;モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ(Wideら、KirkhamおよびHunter, eds.、Radioimmunoassay Methods、E.and S.Livingstone、Edinburgh(1970年));Gordonら(米国特許第4,452,901号)の「ウエスタンブロット」法;標識リガンドの免疫沈降(Brownら、J.Biol.Chem.、255巻:4980〜4983頁(1980年));例えばRainesら、J.Biol.Chem.、257巻:5154〜5160頁(1982年)によって記載されているような酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA);蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学的手法(Brooksら、Clin.Exp.Immunol、39巻:477頁(1980年));および活性の中和(Bowen-Popeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻:2396〜2400頁(1984年))が含まれる。上記の免疫アッセイに加えて、米国特許第3,817,827号、同第3,850,752号、同第3,901,654号、同第3,935,074号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号および同第4,098,876号に記載されているものを含むいくつかの他の免疫アッセイを利用することができる。これらの文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
免疫応答を検出するためのin vivoモデルの非限定的な例には、例えばJudgeら、Mol.Ther.、13巻:494〜505頁(2006年)に記載されているようなin vivoマウスサイトカイン誘発アッセイが含まれる。特定の実施形態では、実行することができるアッセイは以下の通りである:(1)siRNAを、側部尾静脈で標準的な静脈内注射によって投与することができ;(2)投与後約6時間で、血液を心穿刺により採取し、サイトカイン分析用の血漿として処理することができ;(3)製造業者の取扱説明書にしたがってサンドイッチELISAキットを用いてサイトカインを定量化することができる(例えば、マウスおよびヒトIFN−α(PBL Biomedical;Piscataway、NJ);ヒトIL−6およびTNF−α(eBioscience;San Diego、CA);ならびにマウスIL−6、TNF−αおよびIFN−γ(BD Biosciences;San Diego、CA))。
サイトカインおよび増殖因子と特異的に結合するモノクローナル抗体は、複数の供給業者から市販されており、これらは当業界で公知の方法を用いて作製することができる(例えば、Kohlerら、Nature、256巻:495〜497頁(1975年)ならびにHarlowおよびLane, ANTIBODIES、A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Publication、New York(1999年)を参照されたい)。モノクローナル抗体の作製はこれまで記載されており、これらは当業界で公知の任意の手段(Buhringら、Hybridoma、10巻、1号、77〜78頁(1991年))で遂行することができる。いくつかの方法では、検出し易くするために、モノクローナル抗体に標識を付ける(例えば、分光的、光化学的、生化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物で)。
2.siRNA分子の作製
siRNAは、例えば、1つまたは複数の単離された低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖として、より長い二本鎖のRNA(dsRNA)として、またはDNAプラスミド中の転写カセットから転写されたsiRNAもしくはdsRNAとしての形態を含むいくつかの形態で提供することができる。いくつかの実施形態では、siRNAは、酵素的に、または部分的/全体的な有機合成によって産生することができ、修飾されたリボヌクレオチドは、in vitroでの酵素的または有機合成によって導入することができる。特定の例では、各鎖は化学的に調製される。RNA分子の合成方法は当業界で公知であり、それらは、例えばVermaおよびEckstein(1998年)に記載されているかまたは本明細書で説明するような化学的合成方法である。
siRNAは、例えば、1つまたは複数の単離された低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖として、より長い二本鎖のRNA(dsRNA)として、またはDNAプラスミド中の転写カセットから転写されたsiRNAもしくはdsRNAとしての形態を含むいくつかの形態で提供することができる。いくつかの実施形態では、siRNAは、酵素的に、または部分的/全体的な有機合成によって産生することができ、修飾されたリボヌクレオチドは、in vitroでの酵素的または有機合成によって導入することができる。特定の例では、各鎖は化学的に調製される。RNA分子の合成方法は当業界で公知であり、それらは、例えばVermaおよびEckstein(1998年)に記載されているかまたは本明細書で説明するような化学的合成方法である。
RNA集団を用いて長い前駆体RNAを提供することができるまたは選択された標的配列との実質的なまたは完全な同一性を有する長い前駆体RNAを用いて、siRNAを作製することができる。RNAは、当業者に周知の方法にしたがって、細胞または組織から単離し、合成しかつ/またはクローン化することができる。RNAは、混合集団(cDNAから転写され、差し引きされ、選択される等により細胞または組織から得られる)であっても、また単一の標的配列を表してもよい。RNAは、天然由来(例えば、組織または細胞試料から単離された)であっても、in vitroで合成されても(例えば、T7もしくはSP6ポリメラーゼおよびPCR産生物またはクローンcDNAを用いて)、また化学的に合成されてもよい。
合成RNA用の長いdsRNAを形成するために、補体もin vitroで転写され、ハイブリダイズされてdsRNAを形成する。天然由来のRNA集団を使用する場合、例えば、RNA集団に対応するcDNAを転写することによって、またはRNAポリメラーゼを使用することによって、RNA補体も提供される(例えば、E.coli RNAseIIIまたはダイサーによる消化のためのdsRNAを形成させるために)。次いで前駆体RNAをハイブリダイズして消化のための二本鎖のRNAを形成させる。dsRNAは対象に直接投与するか、または投与の前に、in vitroで消化させることができる。
RNAを単離し、RNA合成し、核酸をハイブリダイズし、cDNAライブラリーを作製しスクリーニングし、PCRを実施するための方法は当業界で周知であり(例えば、GublerおよびHoffman、Gene、25巻:263〜269頁(1983年);Sambrookら(上記);Ausubelら(上記)を参照されたい)、PCR法(米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号;PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innisら、eds、1990年)を参照されたい)がある。発現ライブラリーも当業者に周知である。本発明における使用の一般的方法を開示している追加的な基礎的教科書には、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(2nd ed.1989年);Kriegler、Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990年);およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら、eds.、1994年)が含まれる。これらの文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
siRNAは化学的に合成することが好ましい。本発明のsiRNA分子を含むオリゴヌクレオチドは、Usmanら、J.Am.Chem.Soc、109巻:7845頁(1987年);Scaringeら、Nucl.Acids Res.、18巻:5433頁(1990年);Wincottら、Nucl.Acids Res.、23巻:2677〜2684頁(1995年);およびWincottら、Methods Mol.Bio.、74巻:59頁(1997年)に記載されているものなどの当業界で公知の様々な技術のいずれかを用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成では、5’末端でのジメトキシトリチルおよび3’末端でのホスホラミダイトなどの一般的な核酸の保護および結合基を使用する。非限定的な例として、小規模な合成は、0.2μmolスケールプロトコールを用いてApplied Biosystems合成装置で実施することができる。あるいは、0.2μmolスケールでの合成をProtogene(Palo Alto、CA)からの96ウェルプレート合成装置で実施することができる。しかし、より大きいまたはより小さいスケールの合成も本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチド合成用の適切な試薬、RNA脱保護法およびRNA精製法は当業者に公知である。
siRNA分子は、タンデム型合成技術によって合成することもできる。ここで両方の鎖は、その後に切断されてハイブリダイズしてsiRNA二重鎖を形成する別個の断片または鎖を提供する、切断可能なリンカーにより分離された単一の連続したオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成される。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。siRNAのタンデム型合成は、マルチウェル/マルチプレート合成plaALDHormsと回分反応器、合成カラムなどを用いる大規模合成plaALDHormsの両方に容易に適合させることができる。あるいは、siRNA分子を、一方のオリゴヌクレオチドがセンス鎖を含み他方がsiRNAのアンチセンス鎖を含む、区別できる2つのオリゴヌクレオチドから構築することができる。例えば、各鎖を別個に合成し、合成および/または脱保護に続く、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションによって一緒に結合させることができる。他の特定の場合、siRNA分子を、単一の連続したオリゴヌクレオチド断片として合成することができる。ここで、その自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域はハイブリダイズしてヘアピン二次構造を有するsiRNA二重鎖を形成する。
3.siRNA配列の修飾
特定の態様では、siRNA分子は二本鎖領域中に2つの鎖および少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを有する二重鎖を含み、各鎖は、約15〜約60個のヌクレオチドの長さである。修飾siRNAは、対応する非修飾siRNA配列より免疫賦活性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持していることが有利である。好ましい実施形態では、siRNA分子中に導入される化学修飾の度合いは、siRNAの免疫賦活特性の低減または妨げと、RNAi活性の保持の間のバランスに影響を及ぼす(strike)。非限定的な例として、対象の遺伝子を標的とするsiRNA分子は、siRNA二重鎖中の選択的ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドで、最小限修飾されて(例えば、約30%、25%、20%、15%、10%または5%未満修飾されて)、標的遺伝子発現をサイレンシングする能力を保持しながら、siRNAによってもたらされる免疫応答を排除することができる。
特定の態様では、siRNA分子は二本鎖領域中に2つの鎖および少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを有する二重鎖を含み、各鎖は、約15〜約60個のヌクレオチドの長さである。修飾siRNAは、対応する非修飾siRNA配列より免疫賦活性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持していることが有利である。好ましい実施形態では、siRNA分子中に導入される化学修飾の度合いは、siRNAの免疫賦活特性の低減または妨げと、RNAi活性の保持の間のバランスに影響を及ぼす(strike)。非限定的な例として、対象の遺伝子を標的とするsiRNA分子は、siRNA二重鎖中の選択的ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドで、最小限修飾されて(例えば、約30%、25%、20%、15%、10%または5%未満修飾されて)、標的遺伝子発現をサイレンシングする能力を保持しながら、siRNAによってもたらされる免疫応答を排除することができる。
本発明で使用するのに適した修飾ヌクレオチドの例には、これらに限定されないが、2’−O−メチル(2’OMe)、2’−デオキシ−2’−フルオロ(2’F)、2’−デオキシ、5−C−メチル、2’−O−(2−メトキシエチル)(MOE)、4’−チオ、2’−アミノまたは2’−C−アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれる。例えばSaenger、Principles of Nucleic Acid Structure、Springer-Verlag Ed.(1984年)に記載されているものなどのノーザン構造(Northern conformation)を有する修飾ヌクレオチドもsiRNA分子での使用に適している。そうした修飾ヌクレオチドには、これらに限定されないが、ロックト核酸(LNA)ヌクレオチド(例えば、2’−O,4’−C−メチレン−(D−リボフラノシル)ヌクレオチド)、2’−O−(2−メトキシエチル)(MOE)ヌクレオチド、2’−メチル−チオ−エチルヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロ(2’F)ヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−クロロ(2’Cl)ヌクレオチドおよび2’−アジドヌクレオチドが含まれる。特定の例では、本明細書で説明するsiRNA分子には、1つまたは複数のG−クランプヌクレオチドが含まれる。G−クランプヌクレオチドは修飾されたシトシン類似体を指し、この修飾は、二重鎖内の相補型グアニンヌクレオチドのワトソン−クリック(Watson-Crick)面とフーグステン(Hoogsteen)面の両方と水素結合する能力を付与する(例えば、Linら、J.Am.Chem.Soc、120巻:8531〜8532頁(1998年)を参照されたい)。さらに、ヌクレオチドベースの類似体、例えばC−フェニル、C−ナフチル、他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミドおよびニトロアゾール誘導体、例えば3−ニトロピロール、4−ニトロインドール、5−ニトロインドールおよび6−ニトロインドールを有するヌクレオチド(例えば、Loakes、Nucl.Acids Res.、29巻:2437〜2447頁(2001年)を参照されたい)を、siRNA分子中に取り込むことができる。
特定の実施形態では、siRNA分子は、1つまたは複数の化学修飾、例えば末端キャップ部分、ホスフェート骨格修飾などをさらに含むことができる。末端キャップ部分の例には、これらに限定されないが、反転デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、4’,5’−メチレンヌクレオチド、1−(β−D−エリトロフラノシル)ヌクレオチド、4’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、1,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3’,4’−セコヌクレオチド、非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3’−3’−反転ヌクレオチド部分、3’−3’−反転脱塩基部分、3’−2’−反転ヌクレオチド部分、3’−2’−反転脱塩基部分、5’−5’−反転ヌクレオチド部分、5’−5’−反転脱塩基部分、3’−5’−反転デオキシ脱塩基部分、5’−アミノ−アルキルホスフェート、1,3−ジアミノ−2−プロピルホスフェート、3−アミノプロピルホスフェート、6−アミノヘキシルホスフェート、1,2−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、1,4−ブタンジオールホスフェート、3’−ホスホルアミデート、5’−ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、3’−ホスフェート、5’−アミノ、3’−ホスホロチオエート、5’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよび架橋型もしくは非架橋型メチルホスホネートまたは5’−メルカプト部分(例えば、米国特許第5,998,203号;Beaucageら、Tetrahedron 49巻:1925頁(1993年)を参照されたい)が含まれる。ホスフェート骨格修飾(すなわち、修飾されたヌクレオチド間結合をもたらす)の非限定的な例には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよびアルキルシリル置換体(例えば、Hunzikerら、Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties、Modern Synthetic Methods、VCH、331〜417頁(1995年);Mesmaekerら、Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS、24〜39頁(1994年)を参照されたい)が含まれる。そうした化学修飾は、siRNAのセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の5’末端および/または3’末端で行うことができる。これらの文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
いくつかの実施形態では、siRNA分子のセンスおよび/またはアンチセンス鎖は、約1〜約4(例えば、1、2、3または4)個の2’−デオキシリボヌクレオチド、修飾(例えば、2’OMe)および/または非修飾ウリジンリボヌクレオチドおよび/または修飾(例えば、2’OMe)および非修飾ヌクレオチドの他の任意の組合せを有する3’末端オーバーハングをさらに含むことができる。
siRNA分子中に導入することができる修飾ヌクレオチドおよび化学修飾の種類の追加的な例は、例えば英国特許第2,397,818B号および米国特許公開番号第20040192626号、同第20050282188号および同第20070135372号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本明細書で説明するsiRNA分子は、siRNAの1つまたは両方の鎖中に1つもしくは複数の非ヌクレオチドを任意選択で含むことができる。本明細書で用いる「非ヌクレオチド」という用語は、糖および/またはホスフェート置換体を含む1つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み込むことができ、残りの塩基がそれらの活性を示すようにする任意の基または化合物を指す。この基または化合物は、一般に認識されるヌクレオチド塩基、例えばアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンを含まず、したがって1’位での塩基を欠いているという点で脱塩基である。
他の実施形態では、siRNAの化学修飾は、siRNA分子にコンジュゲートを結合させることを含む。コンジュゲートは、例えば生分解性リンカーなどの共有結合によってsiRNAのセンスおよび/またはアンチセンス鎖の5’および/または3’末端で結合させることができる。コンジュゲートは、例えばカルバメート基または他の連結基を介してsiRNAと結合させることもできる(例えば、米国特許公開番号第20050074771号、同第20050043219号および同第20050158727号を参照されたい)。特定の例では、コンジュゲートは細胞へのsiRNAの送達を容易にする分子である。siRNAとの結合に適したコンジュゲート分子の例には、これらに限定されないが、ステロイド、例えばコレステロール、グリコール、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸(塩)(例えば、葉酸、葉酸類似体およびその誘導体)、糖類(例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N−アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコース等)、リン脂質、ペプチド、細胞取り込みを媒介することができる細胞受容体のためのリガンドおよびその組合せが含まれる(例えば、米国特許公開番号第20030130186号、同第20040110296号および同第20040249178号;米国特許第6,753,423号を参照されたい)。他の例には、米国特許公開番号第20050119470号および同第20050107325号に記載されている、親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、干渉物質(intercalator)、小溝結合剤(minor groove binder)、開裂剤および架橋剤コンジュゲート分子が含まれる。さらに他の例には、米国特許公開番号第20050153337号に記載されている2’−O−アルキルアミン、2’−O−アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、C5−カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジニウム基、アミジニウム(amidininium)基、カチオン性アミノ酸コンジュゲート分子が含まれる。追加的な例には、米国特許公開番号第20040167090号に記載されている、疎水性基、膜活性化合物、細胞透過性化合物、細胞標的シグナル、相互作用修飾因子および立体安定剤コンジュゲート分子が含まれる。他の例には、米国特許公開番号第20050239739号に記載されているコンジュゲート分子が含まれる。使用されるコンジュゲートの種類およびsiRNA分子とのコンジュゲーションの度合いは、改善された薬物動態的プロファイル、生物学的利用能および/またはRNAi活性を保持しながらのsiRNAの安定性について評価することができる。したがって、当業者は、様々な周知のin vitro細胞培養またはin vivo動物モデルのいずれかを用いて、それと結合している種々のコンジュゲートを有するsiRNA分子をスクリーニングして改善された特性および完全なRNAi活性を有するものを特定することができる。上記特許文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
4.siRNA実施形態の例
いくつかの実施形態では、siRNA分子の各鎖は、約15〜約60個のヌクレオチドの長さ(例えば、約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25もしくは19〜25個のヌクレオチドの長さまたは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25個のヌクレオチドの長さ)を含む。1つの特定の実施形態では、siRNAは化学的に合成される。本発明のsiRNA分子は、標的配列のin vitroおよび/またはin vivoでの発現をサイレンシングすることができる。
いくつかの実施形態では、siRNA分子の各鎖は、約15〜約60個のヌクレオチドの長さ(例えば、約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25もしくは19〜25個のヌクレオチドの長さまたは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25個のヌクレオチドの長さ)を含む。1つの特定の実施形態では、siRNAは化学的に合成される。本発明のsiRNA分子は、標的配列のin vitroおよび/またはin vivoでの発現をサイレンシングすることができる。
他の実施形態では、siRNAは少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、siRNAは二本鎖領域中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約50%未満(例えば、約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%または5%未満)は修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、siRNAの二本鎖領域中のヌクレオチドの約1%〜約50%(例えば、約5%〜50%、10%〜50%、15%〜50%、20%〜50%、25%〜50%、30%〜50%、35%〜50%、40%〜50%、45%〜50%、5%〜45%、10%〜45%、15%〜45%、20%〜45%、25%〜45%、30%〜45%、35%〜45%、40%〜45%、5%〜40%、10%〜40%、15%〜40%、20%〜40%、25%〜40%、30%〜40%、35%〜40%、5%〜35%、10%〜35%、15%〜35%、20%〜35%、25%〜35%、30%〜35%、5%〜30%、10%〜30%、15%〜30%、20%〜30%、25%〜30%、5%〜25%、10%〜25%、15%〜25%、20%〜25%、5%〜20%、10%〜20%、15%〜20%、5%〜15%、10%〜15%、または5%〜10%)は修飾ヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、siRNAは、これらに限定されないが、2’−O−メチル(2’OMe)ヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロ(2’F)ヌクレオチド、2’−デオキシヌクレオチド、2’−O−(2−メトキシエチル)(MOE)ヌクレオチド、ロックト核酸(LNA)ヌクレオチドおよびそれらの混合物を含む修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、siRNAは、2’OMeヌクレオチド(例えば、2’OMeプリンおよび/またはピリミジンヌクレオチド)、例えば2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチド、2’OMe−アデノシンヌクレオチド、2’OMe−シトシンヌクレオチドまたはそれらの混合物などを含む。1つの特定の実施形態では、siRNAは、少なくとも1つの2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチドまたはそれらの混合物を含む。特定の例では、siRNAは2’OMe−シトシンヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、siRNAはヘアピンループ構造を含む。
特定の実施形態では、siRNAは、siRNA分子の二本鎖領域の1つの鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス)または両方の鎖の中に修飾ヌクレオチドを含む。ウリジンおよび/またはグアノシンヌクレオチドは、siRNA二重鎖の二本鎖領域中の選択的位置で修飾されていることが好ましい。ウリジンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび/またはアンチセンス鎖中のウリジンヌクレオチドの少なくとも1、2、3、4、5、6個またはそれ以上は、2’OMe−ウリジンヌクレオチドなどの修飾ウリジンヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、センスおよび/またはアンチセンス鎖中のどのウリジンヌクレオチドも2’OMe−ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチド修飾に関して、センスおよび/またはアンチセンス鎖中のグアノシンヌクレオチドの少なくとも1、2、3、4、5、6個またはそれ以上は、2’OMe−グアノシンヌクレオチドなどの修飾グアノシンヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、センスおよび/またはアンチセンス鎖中のどのグアノシンヌクレオチドも2’OMe−グアノシンヌクレオチドである。
特定の実施形態では、例えば、5’−GU−3’モチーフを排除するためにミスマッチを導入することによって、かつ/または2’OMeヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを導入することによって、siRNA配列中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7個またはそれ以上の5’−GU−3’モチーフを修飾することができる。5’−GU−3’モチーフは、センス鎖中、アンチセンス鎖中またはsiRNA配列の両方の鎖中にあってよい。5’−GU−3’モチーフは互いに隣接していてよく、あるいはそれらは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個またはそれ以上のヌクレオチドによって隔てられていてよい。
いくつかの実施形態では、修飾siRNA分子は対応する非修飾siRNA配列より免疫賦活性が低い。そうした実施形態では、低い免疫賦活特性を有する修飾siRNA分子は、標的配列に対するRNAi活性を有利に保持する。他の実施形態では、修飾siRNA分子の免疫賦活特性および標的遺伝子発現をサイレンシングするその能力は、siRNA配列中、例えばsiRNA二重鎖の二本鎖領域中への最少で選択的な2’OMe修飾の導入によって平衡を保つかまたは最適化することができる。特定の例では、修飾siRNAは、対応する非修飾siRNAより、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%免疫賦活性が低い。修飾siRNA分子および対応する非修飾siRNA分子の免疫賦活特性は、例えば、哺乳動物での全身投与、または適切な脂質ベースの送達系(本明細書で開示するSNALP送達系など)を用いた哺乳動物のキラー細胞のトランスフェクション後、約2〜約12時間、INF−αおよび/またはIL−6レベルを測定することによって判定できることは当業者に容易に明らかであろう。
他の実施形態では、修飾siRNA分子は、対応する非修飾siRNAのIC50の10倍以下のIC50(すなわち、半数阻害濃度)を有する(すなわち、修飾siRNAは対応する非修飾siRNAのIC50の10倍以下のIC50を有する)。他の実施形態では、修飾siRNAは、対応する非修飾siRNA配列の3倍以下のIC50を有する。さらに他の実施形態では、修飾siRNAは対応する非修飾siRNAの2倍以下IC50を有する。用量応答曲線を作製することができ、修飾siRNAおよび対応する非修飾siRNAについてのIC50値を当業者に公知の方法を用いて簡単に決定できることは、当業者に容易に明らかであろう。
他の実施形態では、非修飾または修飾siRNA分子は、陰性対照(例えば、緩衝剤のみ、異なる遺伝子を標的とするsiRNA配列、スクランブルされたsiRNA配列等)に対して標的配列の発現の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%をサイレンシングすることができる。
さらに他の実施形態では、修飾siRNA分子は、対応する非修飾siRNA配列に対して標的配列の発現の少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%をサイレンシングすることができる。
いくつかの実施形態では、siRNA分子は、例えば二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖中にホスフェート骨格修飾を含まない。他の実施形態では、siRNAは、例えば二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖中に1、2、3、4個またはそれ以上のホスフェート骨格修飾を含む。好ましい実施形態では、siRNAはホスフェート骨格修飾を含まない。
他の実施形態では、siRNAは、例えば二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖中に2’−デオキシヌクレオチドを含まない。さらに他の実施形態では、siRNAは、例えば二本鎖領域のセンスおよび/またはアンチセンス鎖中に1、2、3、4個またはそれ以上の2’−デオキシヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、siRNAは2’−デオキシヌクレオチドを含まない。
特定の例では、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の二本鎖領域の3’末端でのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドではない。他の特定の場合、センスおよび/またはアンチセンス鎖中の二本鎖領域の3’末端近傍のヌクレオチド(例えば、3’末端の1、2、3または4個以内のヌクレオチド)は修飾ヌクレオチドではない。
本明細書で説明するsiRNA分子は、二本鎖領域の一方の側または両側に1、2、3、4個またはそれ以上のヌクレオチドの3’オーバーハングを有していても、また二本鎖領域の一方の側または両側にオーバーハングを欠いていてもよい(すなわち、平滑末端を有する)。特定の実施形態では、センスおよび/またはアンチセンス鎖上の3’オーバーハングは、1、2、3、4個またはそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば2’OMeヌクレオチドおよび/または本明細書で説明するかまたは当業界で公知の他の任意の修飾ヌクレオチドを独立に含む。
特定の実施形態では、ALDH RNAまたはALDH mRNAを標的とするsiRNAを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、その核酸−脂質粒子は:(a)ALDHを標的とする1つまたは複数のsiRNA分子;(b)カチオン性脂質(例えば、DLinDMA、DLenDMA、DLin−K−C2−DMAおよび/またはγ−DLenDMA);および(c)非カチオン性脂質(例えば、DPPC、DSPC、DSPEおよび/またはコレステロール)を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質(例えば、PEG−DAAおよび/またはPOZ−DAA)をさらに含むことができる。
治療目的のための、上記ALDH遺伝子のいずれかの発現のサイレンシングにおけるその有用性に加えて、本明細書で説明するsiRNAは、研究および開発用途ならびに診断、予防、予後、臨床および他のヘルスケア用途においても有用である。非限定的な例として、siRNAを、ALDH遺伝子ファミリーの特定のメンバーが治療標的である可能性を有するかどうかのテストを指向した標的妥当性試験において使用することができる。
B.ダイサー−基質dsRNA
本明細書で用いる「ダイサー−基質dsRNA」または「前駆体RNAi分子」という用語は、in vivoでダイサーによってプロセッシングされて、標的遺伝子のRNA干渉のためにRISC複合体中に組み込まれた活性なsiRNAを産生する任意の前駆体分子を含むものとする。
本明細書で用いる「ダイサー−基質dsRNA」または「前駆体RNAi分子」という用語は、in vivoでダイサーによってプロセッシングされて、標的遺伝子のRNA干渉のためにRISC複合体中に組み込まれた活性なsiRNAを産生する任意の前駆体分子を含むものとする。
一実施形態では、ダイサー−基質dsRNAは、ダイサーによってプロセッシングされてsiRNAを産生するのに十分な長さを有する。この実施形態によれば、ダイサー−基質dsRNAは、(i)約25〜約60個のヌクレオチドの長さ(例えば、約25〜60、25〜55、25〜50、25〜45、25〜40、25〜35または25〜30個のヌクレオチドの長さ)、好ましくは約25〜約30個のヌクレオチドの長さ(例えば、25、26、27、28、29または30個のヌクレオチドの長さ)である第1のオリゴヌクレオチド配列(センス鎖とも称される)、および(ii)細胞の細胞質中で見られる条件などの生物学的条件下で第1の配列とアニーリングする第2のオリゴヌクレオチド配列(アンチセンス鎖とも称される)を含む。第2のオリゴヌクレオチド配列は、約25〜約60個のヌクレオチドの長さ(例えば、約25〜60、25〜55、25〜50、25〜45、25〜40、25〜35または25〜30個のヌクレオチドの長さ)、好ましくは約25〜約30個のヌクレオチドの長さ(例えば、25、26、27、28、29または30個のヌクレオチドの長さ)であってよい。さらに、ダイサー−基質dsRNAの配列の1つ、特にアンチセンス鎖の領域は、標的遺伝子から産生されたRNAのヌクレオチド配列に対してRNAi応答の引き金を引くのに十分に相補的である、少なくとも約19個のヌクレオチド、例えば約19〜約60個のヌクレオチド(例えば、約19〜60、19〜55、19〜50、19〜45、19〜40、19〜35、19〜30または19〜25個のヌクレオチド)、好ましくは約19〜約23個のヌクレオチド(例えば、19、20、21、22または23個のヌクレオチド)の長さの配列を有する。
第2の実施形態では、ダイサー−基質dsRNAは、ダイサーによるそのプロセッシングを増進させるいくつかの特性を有する。この実施形態によれば、このdsRNAは、ダイサーによってプロセッシングされてsiRNAを産生するのに十分な長さを有し、かつ以下の特性、すなわち:(i)dsRNAは非対称性である、例えばアンチセンス鎖上に3’−オーバーハングを有する;かつ/または(ii)dsRNAは、dsRNAのダイサー結合およびプロセッシングの活性なsiRNAへの方向性を導くためのセンス鎖上の修飾3’末端をもつことの少なくとも1つを有する。この後者の実施形態によれば、センス鎖は約22〜約28個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は約24〜約30個のヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ダイサー−基質dsRNAはアンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有する。他の実施形態では、センス鎖は、センス鎖の3’末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサー結合およびプロセッシングのために修飾される。適切な修飾因子には、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および立体障害分子、例えば蛍光性分子などが含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、これらは、dsRNAの長さが変化しないようにdsRNA中のリボヌクレオチドを置き換える。他の実施形態では、ダイサー−基質dsRNAはアンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有しており、センス鎖はダイサープロセッシングのために修飾される。他の実施形態では、センス鎖の5’末端はホスフェートを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端はホスフェートを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖またはその両方の鎖は1つもしくは複数の2’−O−メチル(2’OMe)修飾ヌクレオチドを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は2’OMe修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖(stand)は、2’OMe修飾ヌクレオチドを含む3’−オーバーハングを含む。アンチセンス鎖は追加の2’OMe修飾ヌクレオチドも含み得る。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件などの生物学的条件下でアニールする。さらに、ダイサー−基質dsRNAの配列の1つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも約19個のヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端に隣接する21−ヌクレオチド領域中にあり、標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列に対して十分に相補的である。さらに、この実施形態によれば、ダイサー−基質dsRNAは、以下の追加の特性:(a)アンチセンス鎖は典型的な21−merからの右方シフトを有する(すなわち、典型的な21−merと比較した場合、アンチセンス鎖はその分子の右側にヌクレオチドを含む);(b)その鎖は完全には相補的でない可能性がある、すなわち、その鎖は単純なミスマッチ対を含む可能性がある;および(c)ロックト核酸(複数可)などの塩基修飾がセンス鎖の5’末端中に含まれていてよいということの1つまたは複数を有することもできる。
第3の実施形態では、センス鎖は約25〜約28個のヌクレオチド(例えば、25、26、27または28個のヌクレオチド)を含み、センス鎖の3’末端の2個のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は5’末端にホスフェートを含む。アンチセンス鎖は約26〜約30個のヌクレオチド(例えば、26、27、28、29または30個のヌクレオチド)を含み、1〜4個のヌクレオチドの3’−オーバーハングを含む。3’−オーバーハングを含むヌクレオチドは2’OMe修飾リボヌクレオチドで修飾されている。アンチセンス鎖は、3’−オーバーハングに隣接するアンチセンス鎖の第1のモノマーで始まり、その3’−オーバーハングに隣接する第1のモノマーからヌクレオチド15〜19個伸びる交互型の2’OMe修飾ヌクレオチドを含む。例えば、27−ヌクレオチドアンチセンス鎖について、アンチセンス鎖の5’末端の第1の塩基を位置番号1と数えると、2’OMe修飾は塩基9、11、13、15、17、19、21、23、25、26および27に配置されることになる。一実施形態では、ダイサー−基質dsRNAは以下の構造:
を有する。ここで、「X」=RNAであり、「p」=ホスフェート基であり、「X」=2’OMe RNAであり、「Y」は任意選択で2’OMe RNAモノマーである1、2、3または4個のRNAモノマーを含むオーバーハングドメインであり、「D」=DNAである。上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。
第4の実施形態では、ダイサー−基質dsRNAは、ダイサーによるそのプロセッシングを増進させるいくつかの特性を有する。この実施形態によれば、dsRNAは、ダイサーによってプロセッシングされてsiRNAを産生するのに十分な長さを有しており、以下の特性:(i)dsRNAは非対称性である、例えばセンス鎖上に3’−オーバーハングを有する;および(ii)dsRNAは、dsRNAのダイサー結合およびプロセッシングを活性なsiRNAへの方向へ導くためのアンチセンス鎖上の修飾3’末端を有することの少なくとも1つを有する。この実施形態によれば、センス鎖は約24〜約30個のヌクレオチド(例えば、24、25、26、27、28、29または30個のヌクレオチド)を含み、アンチセンス鎖は約22〜約28個のヌクレオチド(例えば、22、23、24、25、26、27または28個のヌクレオチド)を含む。一実施形態では、ダイサー−基質dsRNAはセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3’末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサー結合およびプロセッシングのために修飾される。適切な修飾因子には、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および立体障害分子、例えば蛍光性分子などが含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、これらは、dsRNAの長さが変化しないように、dsRNA中のリボヌクレオチドを置き換える。他の実施形態では、dsRNAはセンス鎖の3’末端にオーバーハングを有し、アンチセンス鎖はダイサープロセッシングのために修飾される。一実施形態では、アンチセンス鎖は5’−ホスフェートを有する。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件などの生物学的条件下でアニールする。さらに、dsRNAの配列の1つ、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19個のヌクレオチドの配列長さを有し、これらのヌクレオチドはアンチセンス鎖の3’末端に隣接しており、標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列に対して十分に相補的である。さらに、この実施形態によれば、ダイサー−基質dsRNAは、以下の追加の特性:(a)アンチセンス鎖は典型的な21−merからの左方シフトを有する(すなわち、典型的な21−merと比較した場合、アンチセンス鎖はその分子の左側にヌクレオチドを含む);および(b)その鎖は完全には相補的でない可能性がある、すなわち、その鎖は単純なミスマッチ対を含む可能性があるということの1つまたは複数を有することもできる。
好ましい実施形態では、ダイサー−基質dsRNAは非対称構造を有しており、センス鎖は25−塩基対長さを有し、アンチセンス鎖は、2個の塩基3’−オーバーハングを含む27−塩基対長さを有する。特定の例では、非対称構造を有するこのdsRNAは、リボヌクレオチドのうちの2つの代わりに、センス鎖の3’末端に2個のデオキシヌクレオチドをさらに含む。他の特定の場合、非対称構造を有するこのdsRNAは、アンチセンス鎖の9、11、13、15、17、19、21、23および25位(ここでアンチセンス鎖の5’末端での第1の塩基は1位である)で2’OMe修飾をさらに含む。特定の追加的な例では、非対称構造を有するこのdsRNAは、1、2、3または4個の2’OMeヌクレオチドを含むアンチセンス鎖上に3’−オーバーハング(例えば、アンチセンス鎖上の26および27位での2’OMeヌクレオチドの3’−オーバーハング)をさらに含む。
他の実施形態では、ダイサー−基質dsRNAは、少なくとも19個のヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖siRNA配列を最初に選択することによって設計することができる。いくつかの例では、アンチセンスsiRNAは、5’末端上に約5〜約11個のリボヌクレオチドを含むように修飾されて約24〜約30個のヌクレオチドの長さを提供する。アンチセンス鎖が21個のヌクレオチドの長さを有する場合、3〜9、好ましくは4〜7、またはより好ましくは6個のヌクレオチドを5’末端上に付加させることができる。付加されたリボヌクレオチドは標的遺伝子配列に対して相補的であってよいが、標的配列とアンチセンスsiRNAの間の完全な相補性は必要としない。すなわち、得られるアンチセンスsiRNAは標的配列と十分に相補的である。次いで約22〜約28個のヌクレオチドを有するセンス鎖が産生される。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールするのにアンチセンス鎖と十分に相補的である。一実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖のダイサープロセッシングを導くための修飾3’末端を含むように合成される。他の実施形態では、dsRNAのアンチセンス鎖は3’−オーバーハングを有する。他の実施形態では、センス鎖は、ダイサー結合およびプロセッシングのための修飾3’末端を含むように合成され、dsRNAのアンチセンス鎖は3’−オーバーハングを有する。
関連する実施形態では、アンチセンスsiRNAを、5’末端上に約1〜約9個のリボヌクレオチドを含むように修飾して約22〜約28個のヌクレオチドの長さを提供することができる。アンチセンス鎖が21個のヌクレオチドの長さを有する場合、1〜7、好ましくは2〜5、またはより好ましくは4個のリボヌクレオチドを3’末端に付加させることができる。付加されたリボヌクレオチドは任意の配列を有してよい。付加されたリボヌクレオチドは標的遺伝子配列に対して相補的であってよいが、標的配列とアンチセンスsiRNAの間の完全な相補性は必要としない。すなわち、得られるアンチセンスsiRNAは標的配列と十分に相補的である。次いで約24〜約30個のヌクレオチドを有するセンス鎖が産生される。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニールするのに、アンチセンス鎖と十分に相補的である。一実施形態では、アンチセンス鎖は、ダイサープロセッシングを導くための修飾3’末端を含むように合成される。他の実施形態では、dsRNAのセンス鎖は3’−オーバーハングを有する。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、ダイサー結合およびプロセッシングのための修飾3’末端を含むように合成され、dsRNAのセンス鎖は3’−オーバーハングを有する。
適切なダイサー−基質dsRNA配列は、siRNA配列を設計し、合成し、修飾するための当業界で公知の任意の手段を用いて、特定し、合成し、修飾することができる。特定の実施形態では、本発明のダイサー−基質dsRNAは、ALDH遺伝子発現をサイレンシングすることができる。特定の実施形態では、ALDH mRNAを標的とするダイサー−基質dsRNAを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数のダイサー−基質dsRNA分子;(b)カチオン性脂質(例えば、DLinDMA、DLenDMA、DLin−K−C2−DMAおよび/またはγ−DLenDMA);および(c)非カチオン性脂質(例えば、DPPC、DSPC、DSPEおよび/またはコレステロール)を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質(例えば、PEG−DAAおよび/またはPOZ−DAA)をさらに含むことができる。
本発明のダイサー−基質dsRNAに関連する追加の実施形態ならびにそうしたdsRNAを設計し合成する方法は、米国特許公開番号第20050244858号、同第20050277610号、および同第20070265220号、同第2011/0071208号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
C.shRNA
「小ヘアピンRNA」、または「短ヘアピンRNA」または「shRNA」は、RNA干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするのに用いることができるタイトヘアピンターンを作る短いRNA配列を含む。本発明のshRNAは、化学的に合成するか、またはDNAプラスミド中の転写カセットから転写することができる。shRNAヘアピン構造は細胞機構によってsiRNAに切断され、次いでこれは、RNA誘発サイレンシング複合体(RISC)と結合する。
「小ヘアピンRNA」、または「短ヘアピンRNA」または「shRNA」は、RNA干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするのに用いることができるタイトヘアピンターンを作る短いRNA配列を含む。本発明のshRNAは、化学的に合成するか、またはDNAプラスミド中の転写カセットから転写することができる。shRNAヘアピン構造は細胞機構によってsiRNAに切断され、次いでこれは、RNA誘発サイレンシング複合体(RISC)と結合する。
本発明のshRNAは、一般に約15〜60、15〜50または15〜40個の(二重鎖)ヌクレオチドの長さ、より典型的には約15〜30、15〜25または19〜25個の(二重鎖)ヌクレオチドの長さ、好ましくは約20〜24、21〜22または21〜23個の(二重鎖)ヌクレオチドの長さである(例えば、二本鎖のshRNAの各相補配列は15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25または19〜25個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約20〜24、21〜22または21〜23個のヌクレオチドの長さであり、二本鎖shRNAは約15〜60、15〜50、15〜40、15〜30、15〜25または19〜25個の塩基対の長さ、好ましくは約18〜22、19〜20または19〜21個の塩基対の長さである)。shRNA二重鎖は、アンチセンス鎖上に約1〜約4個のヌクレオチドまたは約2〜約3個のヌクレオチドの3’オーバーハング、および/またはセンス鎖上に5’−ホスフェート末端を含むことができる。いくつかの実施形態では、shRNAは、約15〜約60個のヌクレオチドの長さ(例えば、約15〜60、15〜55、15〜50、15〜45、15〜40、15〜35、15〜30または15〜25個のヌクレオチドの長さ)、好ましくは約19〜約40個のヌクレオチドの長さ(例えば、約19〜40、19〜35、19〜30または19〜25個のヌクレオチドの長さ)、より好ましくは約19〜約23個のヌクレオチドの長さ(例えば、19、20、21、22または23個のヌクレオチドの長さ)のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖配列を含む。
shRNAの非限定的な例には、そのセンスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結されている、一本鎖分子から構築された二本鎖のポリヌクレオチド分子;および、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖のポリヌクレオチド分子が含まれる。好ましい実施形態では、shRNAのセンスおよびアンチセンス鎖は、約1〜約25個のヌクレオチド、約2〜約20個のヌクレオチド、約4〜約15個のヌクレオチド、約5〜約12個のヌクレオチドまたは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むループ構造によって連結されている。
適切なshRNA配列は、siRNA配列を設計し、合成し、修飾するための当業界で公知の任意の手段を用いて、特定し、合成し、修飾することができる。特定の実施形態では、本発明のshRNAは、ALDH遺伝子発現をサイレンシングすることができる。特定の実施形態では、ALDH mRNAを標的とするshRNAを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数のshRNA分子;(b)カチオン性脂質(例えば、DLinDMA、DLenDMA、DLin−K−C2−DMAおよび/またはγ−DLenDMA);および(c)非カチオン性脂質(例えば、DPPC、DSPC、DSPEおよび/またはコレステロール)を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質(例えば、PEG−DAAおよび/またはPOZ−DAA)をさらに含むことができる。
本発明のshRNAに関連する追加の実施形態ならびにそうしたshRNAを設計し合成する方法は、米国特許出願公開番号第2011/0071208号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
D.aiRNA
siRNAと同様に、非対称干渉RNA(aiRNA)は、アンチセンス鎖の5’末端に対してヌクレオチド10とヌクレオチド11の間の標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、RNA誘発サイレンシング複合体(RISC)をリクルートし、哺乳動物の細胞における様々な遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる(Sunら、Nat.Biotech.、26巻:1379〜1382頁(2008年))。一般に、aiRNA分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する短いRNA二重鎖を含み、その二重鎖は、アンチセンス鎖の3’および5’末端にオーバーハングを含む。相補的アンチセンス鎖と比較した場合、両末端上でセンス鎖がより短いので、aiRNAは一般に非対称である。いくつかの態様では、aiRNA分子は、siRNA分子に用いられるものと同様の条件下で設計し、合成し、アニールすることができる。非限定的な例として、aiRNA配列を、siRNA配列を選択するために上述した方法を用いて選択し、形成させることができる。
siRNAと同様に、非対称干渉RNA(aiRNA)は、アンチセンス鎖の5’末端に対してヌクレオチド10とヌクレオチド11の間の標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、RNA誘発サイレンシング複合体(RISC)をリクルートし、哺乳動物の細胞における様々な遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる(Sunら、Nat.Biotech.、26巻:1379〜1382頁(2008年))。一般に、aiRNA分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する短いRNA二重鎖を含み、その二重鎖は、アンチセンス鎖の3’および5’末端にオーバーハングを含む。相補的アンチセンス鎖と比較した場合、両末端上でセンス鎖がより短いので、aiRNAは一般に非対称である。いくつかの態様では、aiRNA分子は、siRNA分子に用いられるものと同様の条件下で設計し、合成し、アニールすることができる。非限定的な例として、aiRNA配列を、siRNA配列を選択するために上述した方法を用いて選択し、形成させることができる。
他の実施形態では、種々の長さ(例えば、約10〜25、12〜20、12〜19、12〜18、13〜17または14〜17個の塩基対、より典型的には12、13、14、15、16、17、18、19または20個の塩基対)のaiRNA二重鎖を、アンチセンス鎖の3’および5’末端でのオーバーハングで、対象のmRNAを標的とするように設計することができる。特定の例では、aiRNA分子のセンス鎖は、約10〜25、12〜20、12〜19、12〜18、13〜17または14〜17個のヌクレオチドの長さ、より典型的には12、13、14、15、16、17、18、19または20個のヌクレオチドの長さである。他の特定の場合、aiRNA分子のアンチセンス鎖は約15〜60、15〜50または15〜40個のヌクレオチドの長さ、より典型的には約15〜30、15〜25または19〜25個のヌクレオチドの長さであり、好ましくは約20〜24、21〜22または21〜23個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、5’アンチセンスオーバーハングは1、2、3、4個またはそれ以上の非標的ヌクレオチド(例えば、「AA」、「UU」、「dTdT」等)を含む。他の実施形態では、3’アンチセンスオーバーハングは1、2、3、4個またはそれ以上の非標的ヌクレオチド(例えば、「AA」、「UU」、「dTdT」等)を含む。特定の態様では、本明細書で説明するaiRNA分子は、例えば二本鎖(二重鎖)の領域中、および/またはアンチセンスオーバーハング中に1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。非限定的な例として、aiRNA配列は、siRNA配列について上記した修飾ヌクレオチドの1つまたは複数を含むことができる。好ましい実施形態では、aiRNA分子は、2’OMeヌクレオチド、例えば2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチドまたはそれらの混合物などを含む。
特定の実施形態では、aiRNA分子は、siRNA分子、例えば本明細書で説明するsiRNA分子の1つのアンチセンス鎖に対応するアンチセンス鎖を含むことができる。特定の実施形態では、本発明のaiRNAはALDH遺伝子発現をサイレンシングすることができる。特定の実施形態では、ALDH mRNAを標的とするaiRNAを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数のaiRNA分子;(b)カチオン性脂質(例えば、DLinDMA、DLenDMA、DLin−K−C2−DMAおよび/またはγ−DLenDMA);および(c)非カチオン性脂質(例えば、DPPC、DSPC、DSPEおよび/またはコレステロール)を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質(例えば、PEG−DAAおよび/またはPOZ−DAA)をさらに含むことができる。
適切なaiRNA配列は、siRNA配列を設計し、合成し、修飾するための当業界で公知の任意の手段を用いて特定し、合成し、修飾することができる。本発明のaiRNA分子に関連する追加の実施形態は、2008年12月23日出願の米国特許出願番号第12/343,342号および2009年4月15日出願の米国特許出願番号第12/424,367号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
E.miRNA
一般に、ミクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現を制御する約21〜23個のヌクレオチドの長さの一本鎖RNA分子である。miRNAは、それらが転写されるそのDNAからの遺伝子によってコードされるが、miRNAはタンパク質中に翻訳されず(ノンコーディングRNA);その代わり、各一次転写物(pri−miRNA)はプレmiRNAと称される短いステム−ループ構造中に、最後に機能的成熟miRNA中にプロセッシングされる。成熟miRNA分子は、1つまたは複数のメッセンジャーRNA(mRNA)分子に対して部分的または完全に相補的であり、それらの主要機能は遺伝子発現を下方制御することである。miRNA分子の特定については、例えばLagos-Quintanaら、Science、294巻:853〜858頁;Lauら、Science、294巻:858〜862頁;およびLeeら、Science、294巻:862〜864頁に記載されている。
一般に、ミクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現を制御する約21〜23個のヌクレオチドの長さの一本鎖RNA分子である。miRNAは、それらが転写されるそのDNAからの遺伝子によってコードされるが、miRNAはタンパク質中に翻訳されず(ノンコーディングRNA);その代わり、各一次転写物(pri−miRNA)はプレmiRNAと称される短いステム−ループ構造中に、最後に機能的成熟miRNA中にプロセッシングされる。成熟miRNA分子は、1つまたは複数のメッセンジャーRNA(mRNA)分子に対して部分的または完全に相補的であり、それらの主要機能は遺伝子発現を下方制御することである。miRNA分子の特定については、例えばLagos-Quintanaら、Science、294巻:853〜858頁;Lauら、Science、294巻:858〜862頁;およびLeeら、Science、294巻:862〜864頁に記載されている。
miRNAをコードする遺伝子は、プロセッシングされた成熟miRNA分子よりずっと長い。miRNAは、一次転写物またはキャップおよびポリAテールを有するpri−miRNAとして最初に転写され、細胞核中で、プレmiRNAとして公知の短い約70−ヌクレオチドステム−ループ構造にプロセッシングされる。このプロセッシングは、動物中で、ヌクレアーゼドローシャおよび二本鎖のRNA結合タンパク質パシャからなるマイクロプロセッサー複合体として公知のタンパク質複合体によって実行される(Denliら、Nature、432巻:231〜235頁(2004年))。次いでこれらのプレmiRNAは、細胞質中で、RNA誘発サイレンシング複合体(RISC)の形成も開始させるエンドヌクレアーゼダイサーとの相互作用によって、プロセッシングされて成熟miRNAとなる(Bernsteinら、Nature、409巻:363〜366頁(2001年)。DNAのセンス鎖かまたはアンチセンス鎖は、鋳型として機能してmiRNAをもたらすことができる。
ダイサーがプレmiRNAステム−ループを切断する場合、2つの相補性の短いRNA分子が形成されるが、1つだけはRISC複合体中に組み込まれる。この鎖はガイド鎖として公知であり、5’末端の安定性をベースにして、RISC複合体中で触媒的に活性なRNaseであるアルゴノートタンパク質によって選択される(Preallら、Curr.Biol、16巻:530〜535頁(2006年))。アンチガイドまたはパッセンジャー鎖として公知の残りの鎖は、RISC複合体基質として分解する(Gregoryら、Cell、123巻:631〜640頁(2005年))。活性なRISC複合体中に組み込まれた後、miRNA塩基はそれらの相補性mRNA分子と対になり、標的mRNAの分解および/または翻訳サイレンシングを誘発する。
哺乳動物のmiRNA分子は、通常、標的mRNA配列の3’UTR中の部位に対して相補的である。特定の例では、miRNAの標的mRNAとのアニーリングは、タンパク質翻訳機構を遮断することによってタンパク質翻訳を阻害する。他の特定の場合、miRNAの標的mRNAとのアニーリングは、RNA干渉(RNAi)と同様のプロセスによって、標的mRNAの切断と分解を容易にする。miRNAは、標的にされたmRNAに対応するゲノム部位のメチル化も標的とすることができる。一般に、タンパク質の補体に関連したmiRNA機能を集合的にmiRNPと称する。
特定の態様では、本明細書で説明するmiRNA分子は、約15〜100、15〜90、15〜80、15〜75、15〜70、15〜60、15〜50または15〜40個のヌクレオチドの長さ、より典型的には約15〜30、15〜25または19〜25個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約20〜24、21〜22または21〜23個のヌクレオチドの長さである。特定の他の態様では、miRNA分子は1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。非限定的な例として、miRNA配列は、siRNA配列について上記した修飾ヌクレオチドの1つまたは複数を含むことができる。好ましい実施形態では、miRNA分子は、2’OMeヌクレオチド、例えば2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチドなどまたはそれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、miRNA分子は、ALDH遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる。特定の実施形態では、ALDH mRNAを標的とするmiRNAを、核酸−脂質粒子などの担体系を用いて投与する。好ましい実施形態では、核酸−脂質粒子は:(a)ALDH遺伝子発現を標的とする1つまたは複数のmiRNA分子;(b)カチオン性脂質(例えば、DLinDMA、DLenDMA、DLin−K−C2−DMAおよび/またはγ−DLenDMA);および(c)非カチオン性脂質(例えば、DPPC、DSPC、DSPEおよび/またはコレステロール)を含む。特定の例では、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を防ぐコンジュゲートされた脂質(例えば、PEG−DAAおよび/またはPOZ−DAA)をさらに含むことができる。
他の実施形態では、ALDH mRNAを標的とするmiRNAの活性を遮断する1つまたは複数の薬剤を、本発明の脂質粒子(例えば、核酸−脂質粒子)を用いて投与する。遮断剤の例には、これらに限定されないが、立体遮断型オリゴヌクレオチド、ロックト核酸オリゴヌクレオチドおよびモルホリノオリゴヌクレオチドが含まれる。そうした遮断剤は、miRNAまたは標的RNA上のmiRNA結合部位と直接結合することができる。
V.治療用核酸を含む担体系
一態様では、本発明は、1つまたは複数の治療用核酸(例えば、dsRNAなどの干渉RNA)を含む担体系を提供する。いくつかの実施形態では、担体系は、脂質粒子(例えば、SNALP)、カチオン性脂質またはリポソーム核酸複合体(すなわち、リポプレックス)、リポソーム、ミセル、ビロソームあるいはそれらの混合物などの脂質ベースの担体系である。他の実施形態では、担体系は、カチオン性ポリマー−核酸複合体(すなわち、ポリプレックス)などのポリマーベースの担体系である。追加の実施形態では、担体系は、シクロデキストリンポリマー−核酸複合体などのシクロデキストリンベースの担体系である。他の実施形態では、担体系は、カチオン性ペプチド−核酸複合体などのタンパク質ベースの担体系である。担体系は、SNALPなどの脂質粒子であることが好ましい。当業者は、本発明の治療用核酸を裸分子(naked molecule)として送達することもできることを理解されよう。
一態様では、本発明は、1つまたは複数の治療用核酸(例えば、dsRNAなどの干渉RNA)を含む担体系を提供する。いくつかの実施形態では、担体系は、脂質粒子(例えば、SNALP)、カチオン性脂質またはリポソーム核酸複合体(すなわち、リポプレックス)、リポソーム、ミセル、ビロソームあるいはそれらの混合物などの脂質ベースの担体系である。他の実施形態では、担体系は、カチオン性ポリマー−核酸複合体(すなわち、ポリプレックス)などのポリマーベースの担体系である。追加の実施形態では、担体系は、シクロデキストリンポリマー−核酸複合体などのシクロデキストリンベースの担体系である。他の実施形態では、担体系は、カチオン性ペプチド−核酸複合体などのタンパク質ベースの担体系である。担体系は、SNALPなどの脂質粒子であることが好ましい。当業者は、本発明の治療用核酸を裸分子(naked molecule)として送達することもできることを理解されよう。
A.脂質粒子
特定の態様では、本発明は、1つまたは複数の治療用核酸(例えば、dsRNAなどの干渉RNA)およびカチオン性(アミノ)脂質またはその塩の1つまたは複数を含む脂質粒子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子は1つまたは複数の非カチオン性脂質をさらに含む。他の実施形態では、脂質粒子は、粒子凝集を低減させるまたは阻止することができる1つまたは複数のコンジュゲートされた脂質をさらに含む。
特定の態様では、本発明は、1つまたは複数の治療用核酸(例えば、dsRNAなどの干渉RNA)およびカチオン性(アミノ)脂質またはその塩の1つまたは複数を含む脂質粒子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子は1つまたは複数の非カチオン性脂質をさらに含む。他の実施形態では、脂質粒子は、粒子凝集を低減させるまたは阻止することができる1つまたは複数のコンジュゲートされた脂質をさらに含む。
本発明の脂質粒子は、治療用核酸、例えば干渉RNA(例えば、siRNA)、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、治療用核酸は、脂質粒子中の治療用核酸が水溶液中でヌクレアーゼ分解に対して抵抗性があるように、脂質粒子の脂質部分中に完全にカプセル化されている。他の実施形態では、本明細書で説明する脂質粒子は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。本発明の脂質粒子は一般に、約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nmまたは約70〜約90nmの平均径を有する。本発明の脂質粒子は一般に、約1:1〜約100:1、約1:1〜約50:1、約2:1〜約25:1、約3:1〜約20:1、約5:1〜約15:1または約5:1〜約10:1の脂質:治療剤(例えば、脂質:核酸)比(質量/質量比)も有する。
好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、干渉RNA(例えば、siRNA、ダイサー−基質dsRNA、shRNA、aiRNAおよび/またはmiRNAなどのdsRNA)、カチオン性脂質(例えば、本明細書で示す式I〜IIIの1つまたは複数のカチオン性脂質またはその塩)、非カチオン性脂質(例えば、1つまたは複数のリン脂質とコレステロールとの混合物)および粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質(例えば、1つまたは複数のPEG−脂質コンジュゲート)を含む血清安定性の核酸−脂質粒子(SNALP)である。SNALPは、本明細書で説明する遺伝子の1つまたは複数を標的とする少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の非修飾および/または修飾干渉RNA(例えば、siRNA)を含むことができる。核酸−脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば米国特許第5,753,613号、同第5,785,992号、同第5,705,385号、同第5,976,567号、同第5,981,501号、同第6,110,745号および同第6,320,017号;ならびにPCT公開番号WO96/40964に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明の核酸−脂質粒子では、核酸を、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化し、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護することができる。好ましい実施形態では、干渉RNAなどの核酸を含むSNALPを、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化し、それによって核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。特定の例では、その粒子を、37℃で少なくとも約20、30、45または60分間ヌクレアーゼに曝露させた後でも、SNALP中の核酸は実質的に分解していない。他の特定の場合、SNALP中の核酸は、粒子を血清中、37℃で少なくとも約30、45もしくは60分間または少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34もしくは36時間インキュベーションした後でも、実質的に分解していない。他の実施形態では、核酸は粒子の脂質部分と複合化されている。本発明の処方物の利益の1つは、核酸−脂質粒子組成物が、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性であるということである。
「完全にカプセル化される」という用語は、核酸−脂質粒子中の核酸が、遊離DNAまたはRNAを著しく分解させることになる血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露の後、実質的に分解されないことを表す。完全にカプセル化された系では通常、遊離核酸の100%が分解する処置において、好ましくは粒子中の核酸の約25%未満が分解し、より好ましくは粒子中の核酸の約10%未満、最も好ましくは約5%未満が分解する。「完全にカプセル化される」ということは、核酸−脂質粒子が血清安定性である、すなわち、in vivoでの投与によってそれらがそれらの成分パーツに急速に分解しないことも表す。
核酸の関連で、完全なカプセル化は、核酸と会合すると高い蛍光をもつ染料を使用する、膜非透過性蛍光染料排除アッセイを実施することによって判定することができる。OliGreen(登録商標)およびRiboGreen(登録商標)(Invitrogen Corp.;Carlsbad、CA)などの特異的な染料は、プラスミドDNA、一本鎖デオキシリボヌクレオチドおよび/または一本鎖または二本鎖のリボヌクレオチドの定量的決定に使用可能である。カプセル化は、その染料をリポソーム処方物に加え、得られる蛍光を測定し、少量の非イオン性洗剤の添加によって観察される蛍光と比較することによって判定される。リポソーム二重層の洗剤媒介による破壊によって、カプセル化された核酸が放出され、膜非透過性染料と相互作用できるようにする。核酸カプセル化はE=(I0−I)/I0として計算することができる。ここでIおよびI0は洗剤の添加前後の蛍光強度を指す(Wheelerら、Gene Ther.、6巻:271〜281頁(1999年)を参照されたい)。
他の実施形態では、本発明は、複数の核酸−脂質粒子を含む核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)組成物を提供する。
いくつかの例では、SNALP組成物は、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化されている核酸を含み、その結果、その粒子の約30%〜約100%、約40%〜約100%、約50%〜約100%、約60%〜約100%、約70%〜約100%、約80%〜約100%、約90%〜約100%、約30%〜約95%、約40%〜約95%、約50%〜約95%、約60%〜約95%、約70%〜約95%、約80%〜約95%、約85%〜約95%、約90%〜約95%、約30%〜約90%、約40%〜約90%、約50%〜約90%、約60%〜約90%、約70%〜約90%、約80%〜約90%または少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)はその中にカプセル化された核酸を有する。
他の例では、SNALP組成物は、粒子の脂質部分中に完全にカプセル化されている核酸を含み、その結果、投入核酸の約30%〜約100%、約40%〜約100%、約50%〜約100%、約60%〜約100%、約70%〜約100%、約80%〜約100%、約90%〜約100%、約30%〜約95%、約40%〜約95%、約50%〜約95%、約60%〜約95%、約70%〜約95%、約80%〜約95%、約85%〜約95%、約90%〜約95%、約30%〜約90%、約40%〜約90%、約50%〜約90%、約60%〜約90%、約70%〜約90%、約80%〜約90%または少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)はその粒子中にカプセル化されている。
本発明の脂質粒子の使用目的に応じて、その成分の割合を変えることができ、特定の処方物の送達効率を、例えばエンドソーム放出パラメーター(ERP)アッセイを用いて測定することができる。
1.カチオン性脂質
様々なカチオン性脂質またはその塩のいずれも、単独か、あるいは1つもしくは複数の他のカチオン性脂質種または非カチオン性脂質種と組み合わせて、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)において使用することができる。カチオン性脂質にはその(R)型および/または(S)型の鏡像異性体が含まれる。
様々なカチオン性脂質またはその塩のいずれも、単独か、あるいは1つもしくは複数の他のカチオン性脂質種または非カチオン性脂質種と組み合わせて、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)において使用することができる。カチオン性脂質にはその(R)型および/または(S)型の鏡像異性体が含まれる。
またはその塩が本発明において有用である:ここで、
R1およびR2は同じであるかまたは異なっており、独立に水素(H)または任意選択で置換されたC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルもしくはC2〜C6アルキニルである、あるいはR1とR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子および窒素(N)、酸素(O)およびそれらの混合物からなる群から選択される1または2個のヘテロ原子の任意選択で置換された複素環式環を形成していてよく;
R3は存在しないかまたは水素(H)もしくはC1〜C6アルキルであって四級アミンを提供しており;
R4およびR5は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたC10〜C24アルキル、C10〜C24アルケニル、C10〜C24アルキニルまたはC10〜C24アシルであり、R4およびR5の少なくとも1つは少なくとも2つの不飽和部位を含み;
nは0、1、2、3または4である。
いくつかの実施形態では、R1およびR2は独立に、任意選択で置換されたC1〜C4アルキル、C2〜C4アルケニルまたはC2〜C4アルキニルである。好ましい1つの実施形態では、R1とR2はどちらもメチル基である。他の好ましい実施形態では、nは1または2である。他の実施形態では、pHがカチオン性脂質のpKaより高い場合、R3は存在せず、pHがカチオン性脂質のpKaより低い場合、R3は水素であり、それによってアミノ頭部基はプロトン化される。代替の実施形態では、R3は任意選択で置換されたC1〜C4アルキルであって四級アミンを提供する。他の実施形態では、R4およびR5は独立に、任意選択で置換されたC12〜C20もしくはC14〜C22アルキル、C12〜C20もしくはC14〜C22アルケニル、C12〜C20もしくはC14〜C22アルキニルまたはC12〜C20もしくはC14〜C22アシルであり、R4およびR5の少なくとも1つは少なくとも2つの不飽和部位を含む。
特定の実施形態では、R4およびR5は、ドデカジエニル部分、テトラデカジエニル部分、ヘキサデカジエニル部分、オクタデカジエニル部分、イコサジエニル部分、ドデカトリエニル部分、テトラデカトリエニル(tetradectrienyl)部分、ヘキサデカトリエニル部分、オクタデカトリエニル部分、イコサトリエニル部分、アラキドニル部分およびドコサヘキサエノイル部分ならびにそのアシル誘導体(例えば、リノレオイル、リノレノイル、γ−リノレノイル等)からなる群から独立に選択される。いくつかの例では、R4およびR5の1つは、分枝状アルキル基(例えば、フィタニル部分)またはそのアシル誘導体(例えば、フィタノイル部分)を含む。特定の例では、オクタデカジエニル部分はリノレイル部分である。他の特定の場合、オクタデカトリエニル部分はリノレニル部分またはγ−リノレニル部分である。特定の実施形態では、R4およびR5はどちらもリノレイル部分、リノレニル部分またはγ−リノレニル部分である。特定の実施形態では、式Iのカチオン性脂質は、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、1,2−ジリノレイルオキシ−(N,N−ジメチル)−ブチル−4−アミン(C2−DLinDMA)、1,2−ジリノレオイルオキシ−(N,N−ジメチル)−ブチル−4−アミン(C2−DLinDAP)またはそれらの混合物である。
いくつかの実施形態では、式Iのカチオン性脂質は1つまたは複数のアニオンと塩(好ましくは結晶塩)を形成する。1つの特定の実施形態では、式Iのカチオン性脂質はそのシュウ酸(例えば、ヘミシュウ酸)塩であり、これは好ましくは結晶塩である。
DLinDMAおよびDLenDMAなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、米国特許公開番号第20060083780号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。C2−DLinDMAおよびC2−DLinDAPなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、国際特許出願番号WO2011/000106に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
ここで、R1およびR2は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたC12〜C24アルキル、C12〜C24アルケニル、C12〜C24アルキニルまたはC12〜C24アシルであり;R3およびR4は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルである、あるいはR3とR4は一緒になって、4〜6個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される1〜2個のヘテロ原子の任意選択で置換された複素環式環を形成していてよく;R5は存在しないかまたは水素(H)もしくはC1〜C6アルキルであって四級アミンを提供しており;m、n,およびpは同じであるかまたは異なっており、独立に0、1または2のいずれかであり、ただしm、nおよびpは同時に0であることはなく;qは0、1、2、3または4であり;YおよびZは同じであるかまたは異なっており、独立にO、SまたはNHである。好ましい実施形態では、qは2である。
いくつかの実施形態では、式IIのカチオン性脂質は2,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−C2−DMA;「XTC2」または「C2K」)、2,2−ジリノレイル−4−(3−ジメチルアミノプロピル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−C3−DMA;「C3K」)、2,2−ジリノレイル−4−(4−ジメチルアミノブチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−C4−DMA;「C4K」)、2,2−ジリノレイル−5−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキサン(DLin−K6−DMA)、2,2−ジリノレイル−4−N−メチルペピアジノ−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−MPZ)、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)、2,2−ジオレオイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DO−K−DMA)、2,2−ジステアロイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DS−K−DMA)、2,2−ジリノレイル−4−N−モルホリノ−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−MA)、2,2−ジリノレイル−4−トリメチルアミノ−[1,3]−塩化ジオキソラン(DLin−K−TMA.Cl)、2,2−ジリノレイル−4,5−ビス(ジメチルアミノメチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K2−DMA)、2,2−ジリノレイル−4−メチルピペリジン−[1,3]−ジオキソラン(D−Lin−K−N−メチルピペリジン)、またはそれらの混合物である。好ましい実施形態では、式IIのカチオン性脂質はDLin−K−C2−DMAである。
いくつかの実施形態では、式IIのカチオン性脂質は1つまたは複数のアニオンと塩(好ましくは結晶塩)を形成する。1つの特定の実施形態では、式IIのカチオン性脂質はそのシュウ酸(例えば、ヘミシュウ酸)塩であり、これは好ましくは結晶塩である。
DLin−K−DMAなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、PCT公開番号WO09/086558に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。DLin−K−C2−DMA、DLin−K−C3−DMA、DLin−K−C4−DMA、DLin−K6−DMA、DLin−K−MPZ、DO−K−DMA、DS−K−DMA、DLin−K−MA、DLin−K−TMA.Cl、DLin−K2−DMAおよびD−Lin−K−N−メチルピペラジン(methylpiperzine)などのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、2009年10月9日出願の「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」という名称のPCT出願番号PCT/US2009/060251に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
またはその塩は本発明において有用である。ここで:R1およびR2は同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルもしくはC2〜C6アルキニルである、またはR1とR2は一緒になって、4〜6個の炭素原子ならびに窒素(N)、酸素(O)およびそれらの混合物からなる群から選択される1または2個のヘテロ原子の任意選択で置換された複素環式環を形成していてよく;R3は存在しないかまたは水素(H)もしくはC1〜C6アルキルであって四級アミンを提供しており;R4およびR5は存在しないかまたは存在しており、存在する場合、同じであるかまたは異なっており、独立に、任意選択で置換されたC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルであり;nは0、1、2、3または4である。
いくつかの実施形態では、R1およびR2は独立に、任意選択で置換されたC1〜C4アルキル、C2〜C4アルケニルまたはC2〜C4アルキニルである。好ましい実施形態では、R1およびR2はどちらもメチル基である。他の好ましい実施形態では、R4およびR5はどちらもブチル基である。さらに他の好ましい実施形態では、nは1である。他の実施形態では、pHがカチオン性脂質のpKaより高い場合、R3は存在せず、pHがカチオン性脂質のpKaより低い場合、R3は水素であり、それによってアミノ頭部基はプロトン化される。代替の実施形態では、R3は任意選択で置換されたC1〜C4アルキルであって四級アミンを提供する。他の実施形態では、R4およびR5は独立に、任意選択で置換されたC2〜C6もしくはC2〜C4アルキルまたはC2〜C6もしくはC2〜C4アルケニルである。
代替の実施形態では、式IIIのカチオン性脂質は、アミノ頭部基とアルキル鎖の1つまたは両方の間にエステル結合を含む。いくつかの実施形態では、式IIIのカチオン性脂質は1つまたは複数のアニオンと塩(好ましくは結晶塩)を形成する。1つの特定の実施形態では、式IIIのカチオン性脂質はそのシュウ酸(例えば、ヘミシュウ酸)塩であり、これは好ましくは結晶塩である。
式IIIのアルキル鎖のそれぞれは、6、9および12位でcis二重結合を含む(すなわち、cis,cis,cis−Δ6,Δ9,Δ12)が、代替の実施形態では、1つもしくは両方のアルキル鎖中のこれらの二重結合の1つ、2つまたは3つはtrans構造であってよい。
γ−DLenDMAなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、2009年7月1日出願の「Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」という名称の米国仮出願番号第61/222,462号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
DLin−M−C3−DMA(「MC3」)などのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質(例えば、MC3の特定の類似体)の合成は、2009年6月10日出願の「Novel Lipids and Compositions for the Delivery of Therapeutics」という名称の米国仮出願番号第61/185,800号および2009年12月18日出願の「Methods and Compositions for Delivery of Nucleic Acids」という名称の米国仮出願番号第61/287,995号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明の脂質粒子中に含めることができる他のカチオン性脂質またはその塩の例には、これらに限定されないが、WO2011/000106(この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む)に記載されているものなどのカチオン性脂質、ならびにN,N−ジオレイル−N,N−塩化ジメチルアンモニウム(DODAC)、1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DODMA)、1,2−ジステアリルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DSDMA)、N−(1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−塩化トリメチルアンモニウム(DOTMA)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)−N,N,N−塩化トリメチルアンモニウム(DOTAP)、3−(N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル)コレステロール(DC−Chol)、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロパ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミン−カルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)、3−ジメチルアミノ−2−(コレスタ−5−エン−3−beta−オキシブタン−4−オキシ)−1−(cis,cis−9、12−オクタデカジエノキシ)プロパン(CLinDMA)、2−[5’−(コレスタ−5−エン−3−β−オキシ)−3’−オキサペントキシ)−3−ジメチ−1−(cis,cis−9’、1−2’−オクタデカジエノキシ)プロパン(CpLinDMA)、N,N−ジメチル−3,4−ジオレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、1,2−N,N’−ジオレイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパン(DOcarbDAP)、1,2−N,N’−ジリノレイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパン(DLincarbDAP)、1,2−ジリノレイルカルバモイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−C−DAP)、1,2−ジリノレヨキシ−3−(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin−DAC)、1,2−ジリノレイオキシ−3−モルホリノプロパン(DLin−MA)、1,2−ジリノレオイル−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2−ジリノレイルチオ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−S−DMA)、1−リノレオイル−2−リノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−2−DMAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin−TMA.Cl)、1,2−ジリノレオイル−3−トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin−TAP.Cl)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−(N−メチルピペラジノ)プロパン(DLin−MPZ)、3−(N,N−ジリノレイルアミノ)−1,2−プロパンジオール(DLinAP)、3−(N,N−ジオレイルアミノ)−1,2−プロパンジオ(DOAP)、1,2−ジリノレイルオキソ−3−(2−N,N−ジメチルアミノ)エトキシプロパン(DLin−EG−DMA)、1,2−ジオエイルカルバモイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DO−C−DAP)、1,2−ジミリストレオイル−3−ジメチルアミノプロパン(DMDAP)、1,2−ジオレオイル−3−塩化トリメチルアミノプロパン(DOTAP.Cl)、ジリノレイルメチル−3−ジメチルアミノプロピオネート(DLin−M−C2−DMA;DLin−M−K−DMAまたはDLin−M−DMAとしても公知である)などのカチオン性脂質およびそれらの混合物が含まれる。本発明の脂質粒子中に含めることができる追加のカチオン性脂質またはその塩は米国特許公開番号第20090023673号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
CLinDMAなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、米国特許公開番号第20060240554号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。DLin−C−DAP、DLinDAC、DLinMA、DLinDAP、DLin−S−DMA、DLin−2−DMAP、DLinTMA.Cl、DLinTAP.Cl、DLinMPZ、DLinAP、DOAPおよびDLin−EG−DMAなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、PCT公開番号WO09/086558に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。DO−C−DAP、DMDAP、DOTAP.Cl、DLin−M−C2−DMAなどのカチオン性脂質ならびに追加のカチオン性脂質の合成は、2009年10月9日出願の「Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids」という名称のPCT出願番号PCT/US2009/060251に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。いくつかの他のカチオン性脂質および関連類似体の合成は、米国特許第5,208,036号、同第5,264,618号、同第5,279,833号、同第5,283,185号、同第5,753,613号および同第5,785,992号;ならびにPCT公開番号WO96/10390に記載されている。これらの開示をそれぞれ、全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。さらに、例えばLIPOFECTIN(登録商標)(Invitrogenから入手できるDOTMAおよびDOPEを含む);LIPOFECTAMINE(登録商標)(Invitrogenから入手できるDOSPAおよびDOPEを含む);ならびにTRANSFECTAM(登録商標)(Promega Corp.から入手できるDOGSを含む)などのカチオン性脂質のいくつかの市販の製剤を使用することができる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約50mol%〜約90mol%、約50mol%〜約85mol%、約50mol%〜約80mol%、約50mol%〜約75mol%、約50mol%〜約70mol%、約50mol%〜約65mol%、約50mol%〜約60mol%、約55mol%〜約65mol%または約55mol%〜約70mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約50mol%、51mol%、52mol%、53mol%、54mol%、55mol%、56mol%、57mol%、58mol%、59mol%、60mol%、61mol%、62mol%、63mol%、64mol%または65mol%(またはその任意の割合)を構成する。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約2mol%〜約60mol%、約5mol%〜約50mol%、約10mol%〜約50mol%、約20mol%〜約50mol%、約20mol%〜約40mol%、約30mol%〜約40mol%または約40mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
本発明の脂質粒子で使用するのに適したカチオン性脂質の追加的なパーセンテージおよび範囲は、PCT公開番号WO09/127060、米国特許公開出願番号第2011/0071208号、PCT公開番号WO2011/000106および米国特許公開出願番号第2011/0076335号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明の脂質粒子中に存在するカチオン性脂質のパーセンテージは目標量であり、処方物中に存在するカチオン性脂質の実際量は、例えば±5mol%変動する可能性があることを理解すべきである。例えば1:57脂質粒子(例えば、SNALP)処方物において、カチオン性脂質の目標量は57.1mol%であるが、カチオン性脂質の実際量は、その目標量の±5mol%、±4mol%、±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%または±0.1mol%であってよく、処方物の残りは他の脂質成分で構成される(合計すると粒子中に存在する全脂質が100mol%となる)。
2.非カチオン性脂質
本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)中で使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体をつくることができる様々な中性の非荷電性、両性イオンまたはアニオン性脂質のいずれかであってよい。
本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)中で使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体をつくることができる様々な中性の非荷電性、両性イオンまたはアニオン性脂質のいずれかであってよい。
非カチオン性脂質の非限定的な例には、リン脂質、例えばレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン(ESM)、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、パルミトイルオレイオル−ホスファチジルグリセロール(POPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(DOPE−mal)、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン(DEPE)、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンおよびそれらの混合物が含まれる。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、好ましくはC10〜C24個の炭素鎖を有する脂肪酸、例えばラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルから誘導されるアシル基である。
非カチオン性脂質の追加の例には、コレステロールおよびその誘導体などのステロールが含まれる。コレステロール誘導体の非限定的な例には、5α−コレスタノール、5β−コプロスタノール、コレステリル−(2’−ヒドロキシ)−エチルエーテル、コレステリル−(4’−ヒドロキシ)−ブチルエーテルおよび6−ケトコレスタノールなどの極性類似体;5α−コレスタン、コレステノン、5α−コレスタノン、5β−コレスタノンおよびコレステリルデカノエートなどの非極性類似体ならびにそれらの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体はコレステリル−(4’−ヒドロキシ)−ブチルエーテルなどの極性類似体である。コレステリル−(2’−ヒドロキシ)−エチルエーテルの合成は、PCT公開番号WO09/127060に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
いくつかの実施形態では、脂質粒子(例えば、SNALP)中に存在する非カチオン性脂質は、1つまたは複数のリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、脂質粒子(例えば、SNALP)中に存在する非カチオン性脂質は、1つまたは複数のリン脂質、例えばコレステロールフリー脂質粒子処方物を含むかまたはそれからなる。さらに他の実施形態では、脂質粒子(例えば、SNALP)中に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えばリン脂質フリー脂質粒子処方物を含むかまたはそれからなる。
本発明で使用するのに適した非カチオン性脂質の他の例には、非リン含有脂質、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル(hexadecyl stereate)、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン−ラウリルサルフェート、アルキル−アリールサルフェートポリエチルオキシル化(polyethyloxylated)脂肪酸アミド、ジオクデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどが含まれる。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約10mol%〜約60mol%、約20mol%〜約55mol%、約20mol%〜約45mol%、約20mol%〜約40mol%、約25mol%〜約50mol%、約25mol%〜約45mol%、約30mol%〜約50mol%、約30mol%〜約45mol%、約30mol%〜約40mol%、約35mol%〜約45mol%、約37mol%〜約42mol%または約35mol%、36mol%、37mol%、38mol%、39mol%、40mol%、41mol%、42mol%、43mol%、44mol%または45mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
脂質粒子がリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含む実施形態では、その混合物は、粒子中に存在する全脂質の最大で約40mol%、45mol%、50mol%、55mol%または60mol%を構成することができる。
いくつかの実施形態では、その混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する全脂質の約2mol%〜約20mol%、約2mol%〜約15mol%、約2mol%〜約12mol%、約4mol%〜約15mol%または約4mol%〜約10mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成することができる。特定の好ましい実施形態では、混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約10mol%、約5mol%〜約9mol%、約5mol%〜約8mol%、約6mol%〜約9mol%、約6mol%〜約8mol%または約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%または10mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む1:57脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約34mol%(またはその任意の割合)でのコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物中、DPPCまたはDSPCなどのリン脂質を約7mol%(またはその任意の割合)で含むことができる。他の非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む7:54脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約32mol%(またはその任意の割合)でのコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物中、DPPCまたはDSPCなどのリン脂質を約7mol%(またはその任意の割合)で含むことができる。
他の実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する全脂質の約25mol%〜約45mol%、約25mol%〜約40mol%、約30mol%〜約45mol%、約30mol%〜約40mol%、約27mol%〜約37mol%、約25mol%〜約30mol%または約35mol%〜約40mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成することができる。特定の好ましい実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する全脂質の約25mol%〜約35mol%、約27mol%〜約35mol%、約29mol%〜約35mol%、約30mol%〜約35mol%、約30mol%〜約34mol%、約31mol%〜約33mol%または約30mol%、31mol%、32mol%、33mol%、34mol%または35mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。一般に、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む1:57脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約7mol%(またはその任意の割合)でのDPPCまたはDSPCなどのリン脂質との混合物中、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約34mol%(またはその任意の割合)で含むことができる。一般に、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む7:54脂質粒子処方物は、例えば粒子中に存在する全脂質の約7mol%(またはその任意の割合)でのDPPCまたはDSPCなどのリン脂質との混合物中、コレステロールまたはコレステロール誘導体を約32mol%(またはその任意の割合)で含むことができる。
脂質粒子がリン脂質フリーである実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する全脂質の最大で約25mol%、30mol%、35mol%、40mol%、45mol%、50mol%、55mol%または60mol%を構成することができる。
いくつかの実施形態では、リン脂質フリー脂質粒子処方物中のコレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する全脂質の約25mol%〜約45mol%、約25mol%〜約40mol%、約30mol%〜約45mol%、約30mol%〜約40mol%、約31mol%〜約39mol%、約32mol%〜約38mol%、約33mol%〜約37mol%、約35mol%〜約45mol%、約30mol%〜約35mol%、約35mol%〜約40mol%または約30mol%、31mol%、32mol%、33mol%、34mol%、35mol%、36mol%、37mol%、38mol%、39mol%または40mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成することができる。非限定的な例として、1:62脂質粒子処方物は、粒子中に存在する全脂質の約37mol%(またはその任意の割合)でコレステロールを含むことができる。他の非限定的な例として、7:58脂質粒子処方物は粒子中に存在する全脂質の約35mol%(またはその任意の割合)でコレステロールを含むことができる。
他の実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約90mol%、約10mol%〜約85mol%、約20mol%〜約80mol%、約10mol%(例えば、リン脂質のみ)または約60mol%(例えば、リン脂質およびコレステロールまたはその誘導体)(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
本発明の脂質粒子で使用するのに適した非カチオン性脂質の追加的なパーセンテージおよび範囲は、PCT公開番号WO09/127060、米国特許公開出願番号第2011/0071208号、PCT公開番号WO2011/000106および米国特許公開出願番号第2011/0076335号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明の脂質粒子中に存在する非カチオン性脂質のパーセンテージは目標量であり、処方物中に存在する非カチオン性脂質の実際量は、例えば±5mol%変動する可能性があることを理解すべきである。例えば1:57脂質粒子(例えば、SNALP)処方物において、リン脂質の目標量は7.1mol%であり、コレステロールの目標量は34.3mol%であるが、リン脂質の実際量は、その目標量の±2mol%、±1.5mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%または±0.1mol%であってよく、コレステロールの実際量は、その目標量の±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%または±0.1mol%であってよく、処方物の残りは他の脂質成分で構成される(合計すると粒子中に存在する全脂質が100mol%となる)。同様に、7:54脂質粒子(例えば、SNALP)処方物において、リン脂質の目標量は6.75mol%であり、コレステロールの目標量は32.43mol%であるが、リン脂質の実際量は、その目標量の±2mol%、±1.5mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%または±0.1mol%であってよく、コレステロールの実際量は、その目標量の±3mol%、±2mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%または±0.1mol%であってよく、処方物の残りは他の脂質成分で構成される(合計すると粒子中に存在する全脂質が100mol%となる)。
3.脂質コンジュゲート
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は脂質コンジュゲートをさらに含むことができる。コンジュゲートされた脂質は、それが粒子の凝集を防ぐという点で有用である。適切なコンジュゲートされた脂質には、これらに限定されないが、PEG−脂質コンジュゲート、POZ−脂質コンジュゲート、ATTA−脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー−脂質コンジュゲート(CPL)およびそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、その粒子はPEG−脂質コンジュゲートかまたはATTA−脂質コンジュゲートをCPLと一緒に含む。
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は脂質コンジュゲートをさらに含むことができる。コンジュゲートされた脂質は、それが粒子の凝集を防ぐという点で有用である。適切なコンジュゲートされた脂質には、これらに限定されないが、PEG−脂質コンジュゲート、POZ−脂質コンジュゲート、ATTA−脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー−脂質コンジュゲート(CPL)およびそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、その粒子はPEG−脂質コンジュゲートかまたはATTA−脂質コンジュゲートをCPLと一緒に含む。
好ましい実施形態では、脂質コンジュゲートはPEG−脂質である。PEG−脂質の例には、これらに限定されないが、例えばPCT公開番号WO05/026372に記載されているようなジアルキルオキシプロピルと結合したPEG(PEG−DAA)、例えば米国特許公開番号第20030077829号および同第2005008689号に記載されているようなジアシルグリセロールと結合したPEG(PEG−DAG)、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質と結合したPEG(PEG−PE)、例えば米国特許第5,885,613号に記載されているようなセラミドとコンジュゲートされたPEG、コレステロールとコンジュゲートされたPEGまたはそれらの誘導体およびそれらの混合物が含まれる。これらの特許文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。[0001]本発明で使用するのに適した追加のPEG−脂質には、これに限定されないが、mPEG2000−1,2−ジ−O−アルキル−sn3−カルバモイルグリセリド(carbomoylglyceride)(PEG−C−DOMG)が含まれる。PEG−C−DOMGの合成はPCT公開番号WO09/086558に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。さらに追加の適切なPEG−脂質コンジュゲートには、これらに限定されないが、1−[8’−(1,2−ジミリストイル−3−プロパノキシ)−カルボキシアミド−3’,6’−ジオキサオクタニル]カルバモイル−ω−メチル−ポリ(エチレングリコール)(2KPEG−DMG)が含まれる。2KPEG−DMGの合成は米国特許第7,404,969号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
PEGは、2個の末端ヒドロキシル基を有するエチレンPEG反復単位の直鎖状水溶性ポリマーである。PEGはその分子量によって分類される;例えば、PEG2000は約2,000ダルトンの平均分子量を有し、PEG5000は約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGはSigma Chemical Co.および他の会社から市販されており、それらには、これらに限定されないが以下の:モノメトキシポリエチレングリコール(MePEG−OH)、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート(MePEG−S)、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート(MePEG−S−NHS)、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン(MePEG−NH2)、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート(tresylate)(MePEG−TRES)、モノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル(MePEG−IM)ならびに末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含むそうした化合物(例えば、HO−PEG−S、HO−PEG−S−NHS、HO−PEG−NH2等)が含まれる。米国特許第6,774,180号および同第7,053,150号に記載されているもの(例えば、mPEG(20KDa)アミン)などの他のPEGも、本発明のPEG−脂質コンジュゲートを調製するのに有用である。これらの特許の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸(MePEG−CH2COOH)は、例えばPEG−DAAコンジュゲートを含むPEG−脂質コンジュゲートを調製するのに特に有用である。
本明細書で説明するPEG−脂質コンジュゲートのPEG部分は、約550ダルトン〜約10,000ダルトンの範囲の平均分子量を備えることができる。特定の例では、そのPEG部分は、約750ダルトン〜約5,000ダルトン(例えば、約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約2,000ダルトン等)の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、PEG部分は約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。
特定の例では、PEGはアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基で任意選択で置換されていてよい。PEGは、脂質に直接コンジュゲートされていても、またリンカー部分を介して脂質と連結されていてもよい。例えば非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含むPEGを脂質と連結させるのに適した任意のリンカー部分を用いることができる。好ましい実施形態では、そのリンカー部分は非エステル含有リンカー部分である。本明細書で用いる「非エステル含有リンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合(−OC(O)−)を含まないリンカー部分を指す。適切な非エステル含有リンカー部分には、これらに限定されないが、アミド(−C(O)NH−)、アミノ(−NR−)、カルボニル(−C(O)−)、カルバメート(−NHC(O)O−)、尿素(−NHC(O)NH−)、ジスルフィド(−S−S−)、エーテル(−O−)、スクシニル(−(O)CCH2CH2C(O)−)、スクシンアミジル(−NHC(O)CH2CH2C(O)NH−)、エーテル、ジスルフィドならびにその組合せ(カルバメートリンカー部分とアミドリンカー部分の両方を含むリンカーなど)が含まれる。好ましい実施形態では、カルバメートリンカーが、PEGを脂質と連結させるために使用される。
他の実施形態では、エステル含有リンカー部分が、PEGを脂質と連結させるために使用される。適切なエステル含有リンカー部分には、例えば炭酸(−OC(O)O−)、スクシノイル、リン酸エステル(−O−(O)POH−O−)、スルホン酸エステルおよびその組合せが含まれる。
様々な鎖長および飽和度の様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンは、PEGにコンジュゲートされて脂質コンジュゲートを形成することができる。そうしたホスファチジルエタノールアミンは市場で入手するか、または当業者に公知の慣用的技術を用いて単離または合成することができる。C10〜C20の範囲の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含むホスファチジル−エタノールアミンが好ましい。モノ−またはジ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルエタノールアミンも使用することができる。適切なホスファチジルエタノールアミンには、これらに限定されないが、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)およびジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)が含まれる。
「ATTA」または「ポリアミド」という用語は、これらに限定されないが、米国特許第6,320,017号および同第6,586,559号に記載されている化合物を含む。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。これらの化合物は式:
を有する化合物を含む。
ここで、Rは水素、アルキルおよびアシルからなる群から選択されるメンバーであり;R1は水素およびアルキルからなる群から選択されるメンバーである;または、任意選択で、RおよびR1とそれらが結合している窒素はアジド部分を形成しており;R2は水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリールおよびアミノ酸の側鎖から選択される群のメンバーであり;R3は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびNR4R5からなる群から選択されるメンバーであり、R4およびR5は独立に水素またはアルキルであり;nは4〜80であり;mは2〜6であり;pは1〜4であり;qは0または1である。他のポリアミドを本発明の化合物中で使用できることは当業者に明らかであろう。
「ジアシルグリセロール」または「DAG」という用語は、その両方がエステル結合によってグリセロールの1位および2位に結合した2〜30個の炭素を独立に有する、2つの脂肪酸アシル鎖、R1およびR2を有する化合物が含まれる。アシル基は飽和していても、また様々な不飽和度を有していてもよい。適切なアシル基には、これらに限定されないが、ラウロイル(C12)、ミリストイル(C14)、パルミトイル(C16)、ステアロイル(C18)およびイコソイル(C20)が含まれる。好ましい実施形態では、R1とR2は同じである、すなわちR1とR2はどちらもミリストイル(すなわち、ジミリストイル)であり、R1とR2はどちらもステアロイル(すなわち、ジステアロイル)等である。ジアシルグリセロールは以下の一般式:
を有する。
「ジアルキルオキシプロピル」または「DAA」という用語は、その両方が独立に2〜30個の炭素を有する2つのアルキル鎖、R1およびR2を有する化合物を含む。アルキル基は飽和していても、また様々な不飽和度を有していてもよい。ジアルキルオキシプロピルは以下の一般式:
を有する。
ここで、R1およびR2は独立に選択され、約10〜約22個の炭素原子を有する長鎖のアルキル基であり;PEGはポリエチレングリコールであり;Lは、上述したような非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。長鎖のアルキル基は飽和であっても不飽和であってもよい。適切なアルキル基には、これらに限定されないが、デシル(C10)、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)およびイコシル(C20)が含まれる。好ましい実施形態では、R1とR2は同じである、すなわちR1とR2はどちらもミリスチル(すなわち、ジミリスチル)であり、R1とR2はどちらもステアリル(すなわち、ジステアリル)等である。
上記式VIIにおいて、PEGは約550ダルトン〜約10,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する。特定の例では、PEGは約750ダルトン〜約5,000ダルトン(例えば、約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約3,000ダルトン、約750ダルトン〜約2,000ダルトン等)の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、PEGは約2,000ダルトンまたは約750ダルトンの平均分子量を有する。PEGはアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基で任意選択で置換されていてよい。特定の実施形態では、末端ヒドロキシル基はメトキシまたはメチル基で置換されている。
好ましい実施形態では、「L」は非エステル含有リンカー部分である。適切な非エステル含有リンカーには、これらに限定されないが、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分およびその組合せが含まれる。好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分はカルバメートリンカー部分(すなわち、PEG−C−DAAコンジュゲート)である。他の好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分はアミドリンカー部分(すなわち、PEG−A−DAAコンジュゲート)である。さらに他の好ましい実施形態では、非エステル含有リンカー部分はスクシンアミジルリンカー部分(すなわち、PEG−S−DAAコンジュゲート)である。
PEG−DAAコンジュゲートは、当業者に公知の標準的な技術および試薬を用いて合成される。PEG−DAAコンジュゲートは種々のアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメートおよび尿素結合を含むことを理解されよう。当業者は、これらの結合を形成させるための方法および試薬が周知のものであり、容易に入手できることを理解されよう。例えば、March、ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY(Wiley 1992年);Larock、COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH 1989年);およびFurniss、VOGEL’S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY、5th ed.(Longman 1989年)を参照されたい。存在する任意の官能基は、PEG−DAAコンジュゲートの合成の異なるポイントで保護および脱保護が必要となる可能性があることも理解されよう。当業者はそうした技術が周知であることを理解されよう。例えば、GreenおよびWuts、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(Wiley 1991年)を参照されたい。
PEG−DAAコンジュゲートは、PEG−ジデシルオキシプロピル(C10)コンジュゲート、PEG−ジラウリルオキシプロピル(C12)コンジュゲート、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(C14)コンジュゲート、PEG−ジパルミチルオキシプロピル(C16)コンジュゲートまたはPEG−ジステアリルオキシプロピル(C18)コンジュゲートであることが好ましい。これらの実施形態では、PEGは約750または約2,000ダルトンの平均分子量を有することが好ましい。1つの特に好ましい実施形態では、PEG−脂質コンジュゲートはPEG2000−C−DMAを含み、その「2000」はPEGの平均分子量を表し、「C」はカルバメートリンカー部分を表し、「DMA」はジミリスチルオキシプロピルを表す。他の特に好ましい実施形態では、PEG−脂質コンジュゲートはPEG750−C−DMAを含み、その「750」はPEGの平均分子量を表し、「C」はカルバメートリンカー部分を表し、「DMA」はジミリスチルオキシプロピルを表す。特定の実施形態では、PEGの末端ヒドロキシル基はメチル基で置換されている。当業者は、他のジアルキルオキシプロピルを、本発明のPEG−DAAコンジュゲートにおいて使用できることを容易に理解されよう。
上記に加えて、当業者には、PEGの代わりに他の親水性ポリマーを使用できることは容易に明らかであろう。PEGの代わりに使用できる適切なポリマーの例には、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および誘導化されたセルロース、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが含まれる。
上記成分に加えて、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、カチオン性ポリ(エチレングリコール)(PEG)脂質またはCPLをさらに含むことができる(例えば、Chenら、Bioconj.Chem.、11巻:433〜437頁(2000年);米国特許第6,852,334号;PCT公開番号WO00/62813を参照されたい。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む)。
適切なCPLには式VIIIの化合物:
A−W−Y(VIII)
が含まれる。
A−W−Y(VIII)
が含まれる。
ここで、A、WおよびYは以下で記載する通りである。
式VIIIを参照して、「A」は、脂質アンカーとして役割を果たす、両親媒性脂質、中性脂質または疎水性脂質などの脂質部分である。適切な脂質の例には、これらに限定されないが、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、N−N−ジアルキルアミノ、1,2−ジアシルオキシ−3−アミノプロパンおよび1,2−ジアルキル−3−アミノプロパンが含まれる。
「W」は親水性ポリマーまたはオリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。親水性ポリマーは、非免疫原性である、または低い固有免疫原性を有する生体適合ポリマーであることが好ましい。あるいは、親水性ポリマーは、適切なアジュバントと使用される場合、弱い抗原性であってよい。適切な非免疫原性ポリマーには、これらに限定されないが、PEG、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸/ポリグリコール酸コポリマーおよびその組合せが含まれる。好ましい実施形態では、そのポリマーは約250〜約7,000ダルトンの分子量を有する。
「Y」はポリカチオン性部分である。ポリカチオン性部分という用語は、選択されたpH、好ましくは生理学的pHで正電荷、好ましくは少なくとも2個の正電荷を有する化合物、誘導体または官能基を指す。適切なポリカチオン性部分には、塩基性アミノ酸およびその誘導体、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシンおよびヒスチジン;スペルミン;スペルミジン;カチオン性デンドリマー;ポリアミン;ポリアミン糖(polyamine sugar);およびアミノ多糖が含まれる。ポリカチオン性部分は直鎖状、例えば直鎖状テトラリシン、分枝状またはデンドリマー状の構造であってよい。ポリカチオン性部分は、選択されたpH値で約2〜約15個の正電荷、好ましくは約2〜約12個の正電荷、より好ましくは約2〜約8個の正電荷を有する。どのポリカチオン性部分を用いるかという選択は、所望される粒子施用(application)のタイプによって決定することができる。
ポリカチオン性部分での電荷は粒子部分周り全体に分布していても、あるいは、それらは粒子部分の1つの特定の領域での電荷密度の離散的な濃度、例えば電荷スパイクであってもよい。電荷密度が粒子上に分布している場合、その電荷密度は均等に分布していても、不均等に分布していてもよい。ポリカチオン性部分のすべての電荷分布の変動は本発明に包含される。
脂質「A」と非免疫原性ポリマー「W」は種々の方法によって、好ましくは共有結合によって結合させることができる。当業者に公知の方法を「A」と「W」の共有結合のために用いることができる。適切な結合には、これらに限定されないが、アミド、アミン、カルボキシル、カーボネート、カルバメート、エステルおよびヒドラゾン結合が含まれる。「A」および「W」は、結合を達成させるために相補性官能基を有していなければならないことは当業者に明らかであろう。一方の脂質上と他方のポリマー上のこれらの2つの基の反応は所望の結合を提供することになる。例えば、脂質がジアシルグリセロールである場合、末端ヒドロキシルは、例えばNHSおよびDCCで活性化されて活性エステルを形成し、次いでアミノ基を含むポリマー、例えばポリアミドと反応し(例えば、米国特許第6,320,017号および同第6,586,559号を参照されたい。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む)、アミド結合が2つの基の間で形成することになる。
特定の例では、ポリカチオン性部分は、標的リガンドまたはカルシウムを錯化させるためのキレート部分などの結合したリガンドを有することができる。好ましくは、リガンドが結合した後、カチオン性部分は正電荷を保持する。特定の例では、結合したリガンドは正電荷を有する。適切なリガンドには、これらに限定されないが、反応性官能基を有する化合物またはデバイスが含まれ、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生物親和性化合物、生体材料、バイオポリマー、生物医学デバイス、分析的に検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫促進剤、放射性標識、発蛍光団(fluorogen)、ビオチン、薬物、ハプテン、DNA、RNA、多糖、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的部分または毒素が含まれる。
いくつかの実施形態では、脂質コンジュゲート(例えば、PEG−脂質)は、粒子中に存在する全脂質の約0.1mol%〜約2mol%、約0.5mol%〜約2mol%、約1mol%〜約2mol%、約0.6mol%〜約1.9mol%、約0.7mol%〜約1.8mol%、約0.8mol%〜約1.7mol%、約0.9mol%〜約1.6mol%、約0.9mol%〜約1.8mol%、約1mol%〜約1.8mol%、約1mol%〜約1.7mol%、約1.2mol%〜約1.8mol%、約1.2mol%〜約1.7mol%、約1.3mol%〜約1.6mol%または約1.4mol%〜約1.5mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
他の実施形態では、脂質コンジュゲート(例えば、PEG−脂質)は、粒子中に存在する全脂質の約0mol%〜約20mol%、約0.5mol%〜約20mol%、約2mol%〜約20mol%、約1.5mol%〜約18mol%、約2mol%〜約15mol%、約4mol%〜約15mol%、約2mol%〜約12mol%、約5mol%〜約12mol%または約2mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
他の実施形態では、脂質コンジュゲート(例えば、PEG−脂質)は粒子中に存在する全脂質の約4mol%〜約10mol%、約5mol%〜約10mol%、約5mol%〜約9mol%、約5mol%〜約8mol%、約6mol%〜約9mol%、約6mol%〜約8mol%または約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%または10mol%(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)を構成する。
本発明の脂質粒子で使用するのに適した脂質コンジュゲートの追加的なパーセンテージおよび範囲は、PCT公開番号WO09/127060、米国特許公開出願番号第2011/0071208号、PCT公開番号WO2011/000106および米国特許公開出願番号第2011/0076335号に記載されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明の脂質粒子中に存在する脂質コンジュゲート(例えば、PEG−脂質)のパーセンテージは目標量であり、処方物中に存在する脂質コンジュゲートの実際量は、例えば±2mol%で変動する可能性があることを理解すべきである。例えば、1:57脂質粒子(例えば、SNALP)処方物において、脂質コンジュゲートの目標量は1.4mol%であるが、脂質コンジュゲートの実際量は目標量の±0.5mol%、±0.4mol%、±0.3mol%、±0.2mol%、±0.1mol%または±0.05mol%である可能性があり、処方物の残りは他の脂質成分で構成される(合計すると粒子中に存在する全脂質が100mol%となる)。同様に、7:54脂質粒子(例えば、SNALP)処方物において、脂質コンジュゲートの目標量は6.76mol%であるが、脂質コンジュゲートの実際量は目標量の±2mol%、±1.5mol%、±1mol%、±0.75mol%、±0.5mol%、±0.25mol%または±0.1mol%である可能性があり、処方物の残りは他の脂質成分で構成される(合計すると粒子中に存在する全脂質が100mol%となる)。
当業者は、脂質コンジュゲートの濃度は、使用する脂質コンジュゲートおよび脂質粒子が融合性となるその割合(rate)に応じて変動する可能性があることを理解されよう。
脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子から引き出す割合、次いで脂質粒子が融合性となるその割合を制御することができる。例えば、PEG−DAAコンジュゲートを脂質コンジュゲートとして使用する場合、脂質粒子が融合性となるその割合は、例えば、脂質コンジュゲートの濃度を変える、PEGの分子量を変える、またはPEG−DAAコンジュゲート上のアルキル基の鎖長および飽和度を変えることによって変えることができる。さらに、例えばpH、温度、イオン強度等を含む他の変数を用いて、脂質粒子が融合性となるその割合を変えかつ/または制御することができる。脂質粒子が融合性となるその割合を制御するために用いることができる他の方法は、本開示を読むことによって当業者には明らかになるであろう。また、脂質コンジュゲートの組成および濃度を制御することによって、脂質粒子(例えば、SNALP)のサイズも制御することができる。
B.追加的な担体系
本発明で使用するのに適した追加的な脂質ベースの担体系の非限定的な例には、リポプレックス(例えば、米国特許公開番号第20030203865号;およびZhangら、J.Control Release、100巻:165〜180頁(2004年)を参照されたい)、pH感受性リポプレックス(例えば、米国特許公開番号第20020192275号を参照されたい)、可逆的にマスキングされたリポプレックス(例えば、米国特許公開番号第20030180950号を参照されたい)、カチオン性脂質ベースの組成物(例えば、米国特許第6,756,054号;および米国特許公開番号第20050234232号を参照されたい)、カチオン性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030229040号、同第20020160038号および同第20020012998号;米国特許第5,908,635号;およびPCT公開番号WO01/72283を参照されたい)、アニオン性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030026831号を参照されたい)、pH感受性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20020192274号;およびオーストラリア特許出願公開番号第2003210303号を参照されたい)、抗体コーティングされたリポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030108597号;およびPCT公開番号WO00/50008を参照されたい)、細胞型特異性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030198664号を参照されたい)、核酸およびペプチドを含むリポソーム(例えば、米国特許第6,207,456号を参照されたい)、放出可能な親水性ポリマーで誘導化された脂質を含有するリポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030031704号を参照されたい)、脂質捕捉された核酸(例えば、PCT公開番号WO03/057190およびWO03/059322を参照されたい)、脂質カプセル化された核酸(例えば、米国特許公開番号第20030129221号;および米国特許第5,756,122号を参照されたい)、他のリポソーム組成物(例えば、米国特許公開番号第20030035829号および同第20030072794号;ならびに米国特許第6,200,599号を参照されたい)、リポソームとエマルジョンの安定化された混合物(例えば、欧州特許第1304160号を参照されたい)、エマルジョン組成物(例えば、米国特許第6,747,014号を参照されたい)ならびに核酸マイクロエマルジョン(例えば、米国特許公開番号第20050037086号を参照されたい)が含まれる。
本発明で使用するのに適した追加的な脂質ベースの担体系の非限定的な例には、リポプレックス(例えば、米国特許公開番号第20030203865号;およびZhangら、J.Control Release、100巻:165〜180頁(2004年)を参照されたい)、pH感受性リポプレックス(例えば、米国特許公開番号第20020192275号を参照されたい)、可逆的にマスキングされたリポプレックス(例えば、米国特許公開番号第20030180950号を参照されたい)、カチオン性脂質ベースの組成物(例えば、米国特許第6,756,054号;および米国特許公開番号第20050234232号を参照されたい)、カチオン性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030229040号、同第20020160038号および同第20020012998号;米国特許第5,908,635号;およびPCT公開番号WO01/72283を参照されたい)、アニオン性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030026831号を参照されたい)、pH感受性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20020192274号;およびオーストラリア特許出願公開番号第2003210303号を参照されたい)、抗体コーティングされたリポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030108597号;およびPCT公開番号WO00/50008を参照されたい)、細胞型特異性リポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030198664号を参照されたい)、核酸およびペプチドを含むリポソーム(例えば、米国特許第6,207,456号を参照されたい)、放出可能な親水性ポリマーで誘導化された脂質を含有するリポソーム(例えば、米国特許公開番号第20030031704号を参照されたい)、脂質捕捉された核酸(例えば、PCT公開番号WO03/057190およびWO03/059322を参照されたい)、脂質カプセル化された核酸(例えば、米国特許公開番号第20030129221号;および米国特許第5,756,122号を参照されたい)、他のリポソーム組成物(例えば、米国特許公開番号第20030035829号および同第20030072794号;ならびに米国特許第6,200,599号を参照されたい)、リポソームとエマルジョンの安定化された混合物(例えば、欧州特許第1304160号を参照されたい)、エマルジョン組成物(例えば、米国特許第6,747,014号を参照されたい)ならびに核酸マイクロエマルジョン(例えば、米国特許公開番号第20050037086号を参照されたい)が含まれる。
本発明で使用するのに適したポリマーベースの担体系の例には、これらに限定されないが、カチオン性ポリマー−核酸複合体(すなわち、ポリプレックス)が含まれる。ポリプレックスを形成させるために、核酸(例えば、干渉RNA)は一般に、細胞表面でアニオン性プロテオグリカンと相互作用し、エンドサイトーシスによって細胞中に入ることができる正電荷を帯びた粒子中に核酸を縮合させる、直鎖状、分枝状、星型もしくは樹枝状のポリマー構造を有するカチオン性ポリマーで複合化させる。いくつかの実施形態では、このポリプレックスは、ポリエチレンイミン(PEI)などのカチオン性ポリマーで複合化された核酸(例えば、干渉RNA)(例えば、米国特許第6,013,240号を参照されたい;Qbiogene,Inc.(Carlsbad、CA)から、In vivo jetPEI(商標)(直鎖状の形態のPEI)として市販されている)、ポリプロピレンイミン(PPI)、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリ−L−リシン(PLL)、ジエチルアミノエチル(DEAE)−デキストラン、ポリ(β−アミノエステル)(PAE)ポリマー(例えば、Lynnら、J.Am.Chem.Soc、123巻:8155〜8156頁(2001年)を参照されたい)、キトサン、ポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマー(例えば、Kukowska-Latalloら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93巻:4897〜4902頁(1996年)を参照されたい)、ポルフィリン(例えば、米国特許第6,620,805号を参照されたい)、ポリビニルエーテル(例えば、米国特許公開番号第20040156909号を参照されたい)、多環式アミジニウム(例えば、米国特許公開番号第20030220289号を参照されたい)、第一アミン、イミン、グアニジンおよび/またはイミダゾール基を含む他のポリマー(例えば、米国特許第6,013,240号;PCT公開番号WO/9602655;PCT公開番号WO95/21931;Zhangら、J.Control Release、100巻:165〜180頁(2004年);およびTieraら、Curr.Gene Ther.、6巻:59〜71頁(2006年)を参照されたい)およびそれらの混合物を含む。他の実施形態では、ポリプレックスは、米国特許公開番号第20060211643号、同第20050222064号、同第20030125281号および同第20030185890号ならびにPCT公開番号WO03/066069に記載されているようなカチオン性ポリマー−核酸複合体;米国特許公開番号第20040071654号に記載されているような生分解性ポリ(β−アミノエステル)ポリマー−核酸複合体;米国特許公開番号第20040142475号に記載されているようなポリマーマトリックスを含む微小粒子;米国特許公開番号第20030157030号に記載されているような他の微小粒子組成物;米国特許公開番号第20050123600号に記載されているような縮合核酸複合体;ならびにオーストラリア特許出願公開番号第2002358514号およびPCT公開番号WO02/096551に記載されているようなナノカプセルおよびマイクロカプセル組成物を含む。
特定の例では、干渉RNAは、シクロデキストリンまたはそのポリマーと複合化させることができる。シクロデキストリンベースの担体系の非限定的な例には、米国特許公開番号第20040087024号に記載されているシクロデキストリン修飾ポリマー−核酸複合体;米国特許第6,509,323号、同第6,884,789号および同第7,091,192号に記載されている直鎖状シクロデキストリンコポリマー−核酸複合体;ならびに米国特許第7,018,609号に記載されているシクロデキストリンポリマー−複合化物質−核酸複合体が含まれる。他の特定の場合、干渉RNAは、ペプチドまたはポリペプチドと複合化させることができる。タンパク質ベースの担体系の一例には、これに限定されないが、PCT公開番号WO95/21931に記載されているカチオン性オリゴペプチド−核酸複合体が含まれる。
VI.脂質粒子の調製
その中で干渉RNA(例えば、siRNA)などの核酸が粒子の脂質部分中に捕捉され、分解から保護される本発明の脂質粒子、例えばSNALPは、これらに限定されないが、連続混合法、直接希釈法およびインライン希釈法を含む当業界で公知の任意の方法で形成させることができる。
その中で干渉RNA(例えば、siRNA)などの核酸が粒子の脂質部分中に捕捉され、分解から保護される本発明の脂質粒子、例えばSNALPは、これらに限定されないが、連続混合法、直接希釈法およびインライン希釈法を含む当業界で公知の任意の方法で形成させることができる。
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、式I〜IIIの脂質またはその塩を単独か、または他のカチオン性脂質と組み合わせて含むことができる。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン(ESM)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、1−パルミトイル−2−オレオイル−ホスファチジルコリン(POPC)、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン(DPPC)、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、14:0 PE(1,2−ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン(DMPE))、16:0 PE(1,2−ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン(DPPE))、18:0 PE(1,2−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE))、18:1 PE(1,2−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE))、18:1 trans PE(1,2−ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン(DEPE))、18:0−18:1 PE(1−ステアロイル−2−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(SOPE))、16:0−18:1 PE(1−パルミトイル−2−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(POPE))、ポリエチレングリコールベースのポリマー(例えば、PEG2000、PEG5000、PEG修飾ジアシルグリセロールまたはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル)、コレステロール、その誘導体またはその組合せである。
特定の実施形態では、本発明は、連続混合法、例えば第1のリザーバーに核酸(例えば、干渉RNA)を含む水溶液を提供するステップと、第2のリザーバーに有機脂質溶液(有機脂質溶液中に存在する脂質は有機溶媒、例えばエタノールなどの低級アルカノール中に溶解している)を提供するステップと、水溶液と有機脂質溶液を混合し、それによって、その脂質小胞内に核酸をカプセル化する脂質小胞(例えば、リポソーム)がほぼ瞬間的に形成されるように、有機脂質溶液を水溶液と混合させるステップとを含む方法によって作製される核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)を提供する。この方法およびこの方法を実施するための装置は米国特許公開番号第20040142025号に詳細に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
脂質および緩衝溶液を混合チャンバーなどの混合環境中に連続的に導入する処理は、脂質溶液の緩衝溶液での連続希釈を引き起こし、それによって、混合により脂質小胞をほぼ瞬間的に生成させる。本明細書で用いる「脂質溶液を緩衝溶液で連続的に希釈する」という語句(およびその変形)は一般に、小胞の生成をもたらすのに十分な力での水和プロセスで、脂質溶液を十分迅速に希釈することを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することによって、有機脂質溶液は、緩衝溶液(すなわち、水溶液)の存在下で連続した段階的な希釈を施されて核酸−脂質粒子を形成する。
連続混合法を用いて形成された核酸−脂質粒子は一般に、約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、約70nm〜約100nm、約80nm〜約100nm、約90nm〜約100nm、約70〜約90nm、約80nm〜約90nm、約70nm〜約80nm、約120nm、110nm、100nm、90nmもしくは80nmまたは約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nmまたは150nm未満(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)のサイズを有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、任意選択で、均一な粒子サイズが達成されるようにサイズ調節される(sized)。
他の実施形態では、本発明は、脂質小胞(例えば、リポソーム)溶液を形成させるステップと、その脂質小胞溶液を制御量の希釈緩衝液を含む収集容器に直ちに直接導入するステップを含む、直接希釈法によって作製された核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)を提供する。好ましい態様では、収集容器は、収集容器の内容物を撹拌して希釈を容易にするように構成された1つまたは複数のエレメントを含む。一態様では、収集容器中に存在する希釈緩衝液の量は、それに導入される脂質小胞溶液の容積と実質的に等しい。非限定的な例として、等しい容積の希釈緩衝液を含む収集容器に導入すると、45%エタノール中の脂質小胞溶液はより小さい粒子を有利にもたらすことになる。
さらに他の実施形態では、本発明は、希釈緩衝液を含む第3のリザーバーが第2の混合領域と流体的に連結されているインライン希釈法によって作製された核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)を提供する。この実施形態では、第1の混合領域で形成された脂質小胞(例えば、リポソーム)溶液は、第2の混合領域で希釈緩衝液と直ちに直接混合される。好ましい態様では、第2の混合領域は、脂質小胞溶液および希釈緩衝液の流れが対向する180°の流れで出会うように配置されたT型コネクターを含むが;より小さい角度、例えば約27°〜約180°(例えば、約90°)を提供するコネクターを使用することができる。ポンピング機構は制御可能な緩衝液の流れを第2の混合領域へ送り出す。一態様では、第2の混合領域に提供される希釈緩衝液の流量は、第1の混合領域からそれに導入される脂質小胞溶液の流量と実質的に等しくなるように制御される。この実施形態は、有利なことに、第2の混合領域中で脂質小胞溶液と混合する希釈緩衝液の流れをより制御できるようにし、したがって第2の混合プロセスを通した緩衝液中の脂質小胞溶液の濃度を制御できるようにする。そうした希釈緩衝液流量の制御は、有利には、低い濃度での小粒子サイズの形成を可能にする。
これらの直接希釈およびインライン希釈法を実施するためのこれらの方法および装置は米国特許公開番号第20070042031号に詳細に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
直接希釈法およびインライン希釈法を用いて形成される核酸−脂質粒子は一般に、約30nm〜約150nm、約40nm〜約150nm、約50nm〜約150nm、約60nm〜約130nm、約70nm〜約110nm、約70nm〜約100nm、約80nm〜約100nm、約90nm〜約100nm、約70〜約90nm、約80nm〜約90nm、約70nm〜約80nm、約120nm、110nm、100nm、90nm、もしくは80nmまたは約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nmまたは150nm未満(またはその任意の割合もしくはその中の範囲)のサイズを有する。このようにして形成された粒子は凝集せず、任意選択で、均一な粒子サイズが達成されるようにサイズ調節される。
必要なら、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、リポソームをサイズ調節するために利用できる方法のいずれかでサイズ調節することができる。このサイズ調節は、所望のサイズ範囲および比較的狭い粒子サイズ分布を達成するために実施することができる。
いくつかの技術が、粒子を所望の大きさにサイズ調節するために利用可能である。リポソームのために使用され、本発明の粒子に同等に適用可能な1つのサイズ調節法は米国特許第4,737,323号に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。浴かまたはプローブ超音波処理による粒子懸濁液の超音波処理によって、約50nm未満のサイズの粒子への漸進的なサイズリダクションがもたらされる。均質化は、大きい粒子にせん断エネルギーをかけてより小さく粉砕する別の方法である。典型的な均質化手順では、選択された粒子サイズ、通常約60〜約80nmが認められるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーで粒子を再循環させる。両方の方法において、粒子サイズ分布を慣用的なレーザービーム粒子サイズ識別またはQELSによって監視することができる。
細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通した粒子の押し出しも、粒子サイズを比較的明確なサイズ分布に低下させるための効果的な方法である。一般に、所望の粒子サイズ分布が達成されるまで、懸濁液を、膜を通して1回または複数回循環させる。粒子を、順により小さい孔の膜を通して押し出して、サイズを徐々に低下させることができる。
いくつかの実施形態では、粒子中に存在する核酸を、例えば米国特許出願番号第09/744,103号に記載されているように予備縮合させる。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
他の実施形態では、本方法は、本発明の組成物を用いた細胞のリポフェクションをもたらすのに有用な非脂質ポリカチオンを加えるステップをさらに含むことができる。適切な非脂質ポリカチオンの例には、臭化ヘキサジメトリン(Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、Wisconsin、USAから、POLYBRENE(登録商標)の商標名のもとで販売されている)またはヘキサジメトリンの他の塩が含まれる。他の適切なポリカチオンには、例えばポリ−L−オルニチン、ポリ−L−アルギニン、ポリ−L−リシン、ポリ−D−リシン、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩の添加は、粒子が形成された後であることが好ましい。
いくつかの実施形態では、形成された核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)における核酸と脂質の比(質量/質量比)は約0.01〜約0.2、約0.05〜約0.2、約0.02〜約0.1、約0.03〜約0.1または約0.01〜約0.08の範囲となる。出発原料(投入)の比もこの範囲内となる。他の実施形態では、粒子の調製には、10mgの全脂質当たり約400μgの核酸、または約0.01〜約0.08、より好ましくは約0.04(これは50μgの核酸当たり1.25mgの全脂質に相当する)の核酸と脂質の質量比が用いられる。他の好ましい実施形態では、粒子は約0.08の核酸:脂質質量比を有する。
他の実施形態では、形成される核酸−脂質粒子(例えば、SNALP)における脂質と核酸の比(質量/質量比)は、約1(1:1)〜約100(100:1)、約5(5:1)〜約100(100:1)、約1(1:1)〜約50(50:1)、約2(2:1)〜約50(50:1)、約3(3:1)〜約50(50:1)、約4(4:1)〜約50(50:1)、約5(5:1)〜約50(50:1)、約1(1:1)〜約25(25:1)、約2(2:1)〜約25(25:1)、約3(3:1)〜約25(25:1)、約4(4:1)〜約25(25:1)、約5(5:1)〜約25(25:1)、約5(5:1)〜約20(20:1)、約5(5:1)〜約15(15:1)、約5(5:1)〜約10(10:1)の範囲、または約5(5:1)、6(6:1)、7(7:1)、8(8:1)、9(9:1)、10(10:1)、11(11:1)、12(12:1)、13(13:1)、14(14:1)、15(15:1)、16(16:1)、17(17:1)、18(18:1)、19(19:1)、20(20:1)、21(21:1)、22(22:1)、23(23:1)、24(24:1)もしくは25(25:1)またはその任意の割合もしくはその中の範囲となる。出発原料(投入)の比もこの範囲内となる。
上記で論じたように、コンジュゲートされた脂質はCPLをさらに含むことができる。SNALP−CPL(CPL含有SNALP)を作製するための様々な一般的方法を本明細書で論じる。2つの一般的手法は、「ポスト挿入(post-insertion)」法、すなわち、例えば事前形成されたSNALP中へのCPLの挿入と、例えばSNALPの形成ステップの間にCPLを脂質混合物中に含める「標準」法を含む。ポスト挿入法は、CPLを主にSNALP二重層膜の外面に有するSNALPをもたらし、標準技法は、CPLをその内面と外面の両方に有するSNALPを提供する。この方法は、リン脂質(コレステロールを含むことができる)から作製された小胞に特に有用であり、またPEG−脂質(PEG−DAAおよびPEG−DAGなど)を含む小胞にも有用である。SNALP−CPLを作製する方法は、例えば米国特許第5,705,385号、同第6,586,410号、同第5,981,501号、同第6,534,484号および同第6,852,334号;米国特許公開番号第20020072121号;ならびにPCT公開番号WO00/62813に教示されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
VII.キット
本発明は、キットの形態の脂質粒子(例えば、SNALP)も提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、脂質粒子の種々のエレメント(例えば、活性薬剤または治療剤、例えば核酸およびその粒子の個々の脂質成分)を保持するために区分化された容器を含む。キットは、その粒子が本明細書で示すプロセスの1つで作製される、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)を保持する容器(例えば、バイアルまたはアンプル)を含むことが好ましい。特定の実施形態では、キットは、エンドソーム膜不安定化因子(例えば、カルシウムイオン)をさらに含むことができる。キットは一般に、本発明の粒子組成物を、薬学的に許容される担体中の懸濁液として、または脱水形態で、その再水和(凍結乾燥されている場合)および投与のための取扱説明書と一緒に含む。
本発明は、キットの形態の脂質粒子(例えば、SNALP)も提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、脂質粒子の種々のエレメント(例えば、活性薬剤または治療剤、例えば核酸およびその粒子の個々の脂質成分)を保持するために区分化された容器を含む。キットは、その粒子が本明細書で示すプロセスの1つで作製される、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)を保持する容器(例えば、バイアルまたはアンプル)を含むことが好ましい。特定の実施形態では、キットは、エンドソーム膜不安定化因子(例えば、カルシウムイオン)をさらに含むことができる。キットは一般に、本発明の粒子組成物を、薬学的に許容される担体中の懸濁液として、または脱水形態で、その再水和(凍結乾燥されている場合)および投与のための取扱説明書と一緒に含む。
本発明のSNALP処方物は、対象の特定の細胞、組織または臓器を優先的に標的とするように調整することができる。SNALPの優先的な標的化は、SNALP自体の組成物を制御することによって実施することができる。特定の実施形態では、本発明のキットは、その粒子が懸濁液として、または脱水形態で容器中に存在するこれらの脂質粒子を含む。
特定の例では、粒子の標的化をさらに増進させるために、脂質粒子の表面と結合した標的部分を有することが望ましいことがある。標的部分(例えば、抗体、タンパク質等)を脂質(本発明の粒子で用いられるものなど)と結合させる方法は当業者に公知である。
VIII.脂質粒子の投与
形成されたら、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は細胞中への核酸(例えば、dsRNAなどの干渉RNA)の導入に特に有用である。したがって、本発明は、核酸(例えば、干渉RNA)を細胞中へ導入するための方法も提供する。特定の実施形態では、核酸(例えば、干渉RNA)は、感染細胞、例えば細網内皮細胞(例えば、マクロファージ、単球等)ならびに線維芽細胞、内皮細胞(血管の内部表面を裏打ちするものなど)および/または血小板細胞を含む他の細胞タイプ中に導入される。本方法は、上述したような粒子を最初に形成させ、次いでその粒子を、干渉RNAの細胞への送達が行われるのに十分な時間細胞と接触させることによって、in vitroまたはin vivoで実施することができる。
形成されたら、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は細胞中への核酸(例えば、dsRNAなどの干渉RNA)の導入に特に有用である。したがって、本発明は、核酸(例えば、干渉RNA)を細胞中へ導入するための方法も提供する。特定の実施形態では、核酸(例えば、干渉RNA)は、感染細胞、例えば細網内皮細胞(例えば、マクロファージ、単球等)ならびに線維芽細胞、内皮細胞(血管の内部表面を裏打ちするものなど)および/または血小板細胞を含む他の細胞タイプ中に導入される。本方法は、上述したような粒子を最初に形成させ、次いでその粒子を、干渉RNAの細胞への送達が行われるのに十分な時間細胞と接触させることによって、in vitroまたはin vivoで実施することができる。
本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、粒子がそれと混合されるまたは接触するほとんどすべての細胞タイプにも吸着させることができる。吸着したら、粒子を細胞の一部で形質膜陥入させ、粒子は脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合させることができる。粒子の核酸(例えば、干渉RNA)部分の移動または組み込みは、これらの経路のいずれか1つにより行うことができる。特に、融合が起こる場合、粒子膜は細胞膜と一体化され、粒子の内容物は細胞内液と一緒になる。
本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、単独か、または投与経路および標準的な薬剤実務にしたがって選択された薬学的に許容される担体(例えば、生理学的生理食塩水またはリン酸緩衝液)との混合物で投与することができる。一般に、標準的な緩衝食塩水(例えば、135〜150mM NaCl)が薬学的に許容される担体として使用されることになる。他の適切な担体には、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性を高めるための糖タンパク質を含む、水、緩衝用水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシンなどが含まれる。適切な追加的な担体は、例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES、Mack Publishing Company、Philadelphia、PA、17th ed.(1985年)に記載されている。本明細書で用いる「担体」には、あらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、賦形剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体液剤、懸濁剤、コロイドなどが含まれる。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与した場合、アレルギー性または同様の有害反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。
薬学的に許容される担体は通常、脂質粒子形成に続いて添加される。したがって、脂質粒子(例えば、SNALP)が形成された後、粒子を、標準緩衝食塩水などの薬学的に許容される担体中に希釈することができる。
薬剤処方物中の粒子の濃度は、幅広く、すなわち約0.05%未満、通常約2〜5%または少なくとも約2〜5%から、約10〜90重量%までも変化してよく、選択された具体的な投与方式にしたがって、主に流体の容積、粘度等によって選択されることになる。例えば、処置に伴う流体ロードを低下させるために、その濃度を増大させることができる。これは、アテローム性動脈硬化症に付随するうっ血性心不全または重度の高血圧症を有する患者において特に望ましい可能性がある。あるいは、刺激性脂質を含む粒子は、投与部位での炎症を抑えるために希釈して低濃度にすることができる。
本発明の医薬組成物は、慣用的な周知の殺菌技術で殺菌することができる。使用のために水溶液をパッケージ化することができる、または、無菌状態下で濾過し、凍結乾燥し、その凍結乾燥された調製物を投与前に滅菌水溶液と混合することができる。この組成物は、生理学的条件近傍下で要求される薬学的に許容される補助剤、例えばpH調整剤および緩衝剤、等張性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムを含むことができる。さらに、粒子懸濁液は、貯蔵時の際の遊離基および脂質過酸化損傷に対して脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。親油性遊離基クエンチャー、例えばアルファトコフェロールおよび水溶性鉄特異性キレート剤、例えばフェリオキサミンが適している。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、干渉RNA配列(例えば、siRNA)を含む1つまたは複数の核酸の治療的送達のための方法において特に有用である。特に、1つまたは複数のALDHアイソザイムの転写および/または翻訳を下方制御またはサイレンシングすることによって、ヒトにおけるアルコール症の処置のためのin vivoでの方法を提供することが本発明の目的である。
A.In vivoでの投与
in vivoでの処置のための全身的送達、例えば、循環などの身体系を介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達が、PCT公開番号WO05/007196、WO05/121348、WO05/120152およびWO04/002453に記載されているものなどの核酸−脂質粒子を用いて遂行されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。本発明は、血清中で核酸をヌクレアーゼ分解から保護するものであり、非免疫原性でありサイズが小さく、反復投与に適している、完全にカプセル化された脂質粒子も提供する。
in vivoでの処置のための全身的送達、例えば、循環などの身体系を介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達が、PCT公開番号WO05/007196、WO05/121348、WO05/120152およびWO04/002453に記載されているものなどの核酸−脂質粒子を用いて遂行されている。これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。本発明は、血清中で核酸をヌクレアーゼ分解から保護するものであり、非免疫原性でありサイズが小さく、反復投与に適している、完全にカプセル化された脂質粒子も提供する。
in vivoでの投与のためには、投与は、例えば注射、経口投与、吸入(例えば、鼻腔内または気管内)、経皮投与または経直腸投与による当業界で公知の任意の仕方であってよい。投与は、単一用量または分割用量で実施することができる。医薬組成物は非経口、すなわち関節内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内で投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物はボーラス注射によって静脈内または腹腔内で投与される(例えば、米国特許第5,286,634号を参照されたい)。細胞内核酸送達は、Straubringerら、Methods Enzymol.、101巻:512頁(1983年);Manninoら、Biotechniques、6巻:682頁(1988年);Nicolauら、Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.、6巻:239頁(1989年);およびBehr、Acc.Chem.Res.、26巻:274頁(1993年)においても論じられている。脂質ベースの治療剤を投与するさらに他の方法は、例えば米国特許第3,993,754号、同第4,145,410号、同第4,235,871号、同第4,224,179号、同第4,522,803号および同第4,588,578号に記載されている。脂質粒子は、疾患部位での直接注射または疾患部位から遠位にある部位での注射によって投与することができる(例えば、Culver、HUMAN GENE THERAPY、MaryAnn Liebert, Inc.、Publishers、New York.70〜71頁(1994年)を参照されたい)。上記文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)が静脈内で投与される実施形態では、粒子の全注射用量の少なくとも約5%、10%、15%、20%または25%が、注射後約8、12、24、36または48時間血漿中に存在する。他の実施形態では、脂質粒子の全注射用量の約20%、30%、40%超、さらに約60%、70%または80%までも、注射後約8、12、24、36または48時間血漿中に存在する。特定の例では、約10%超の複数の粒子が、投与後約1時間、哺乳動物の血漿中に存在する。他の特定の場合、脂質粒子の存在は、粒子の投与後少なくとも約1時間検出可能である。いくつかの実施形態では、干渉RNA分子などの治療用核酸の存在は、細胞中で投与後約8、12、24、36、48、60、72または96時間検出可能である。他の実施形態では、干渉RNA(例えば、siRNA)による、ウイルスまたは宿主配列などの標的配列の発現の下方制御は、投与後約8、12、24、36、48、60、72または96時間検出可能である。さらに他の実施形態では、干渉RNA(例えば、siRNA)による、ウイルスまたは宿主配列などの標的配列の発現の下方制御は、感染細胞および/または感染され得る細胞中で優先的に起こる。他の実施形態では、投与部位に対して近位または遠位の部位での細胞中における干渉RNA(例えば、siRNA)の存在または効果は、投与後約12、24、48、72もしくは96時間または約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26もしくは28日間検出可能である。追加の実施形態では、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は非経口または腹腔内で投与される。
本発明の組成物は、単独かまたは他の適切な成分と組み合わせて、エアゾール処方物(すなわち、これらを「噴霧する(nebulize)」ことができる)にして吸入(例えば、鼻腔内または気管内)により投与することができる(Brighamら、Am.J.Sci.、298巻:278頁(1989年)を参照されたい)。エアゾール処方物を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴射剤中に入れることができる。
特定の実施形態では、医薬組成物を、鼻腔内での噴霧、吸入および/または他のエアゾール送達ビヒクルにより送達することができる。経鼻エアゾール噴霧剤により核酸組成物を肺へ直接送達するための方法は、例えば米国特許第5,756,353号および同第5,804,212号に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物を用いた薬物の送達(米国特許第5,725,871号)も薬剤技術分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン(polytetrafluoroetheylene)支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は米国特許第5,780,045号に記載されている。上記特許の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
例えば関節内(関節の中)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路などによる非経口投与に適した処方物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および対象レシピエントの血液との等張性を処方物に付与する溶質を含むことができる水性および非水性の等張性滅菌注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。本発明の実施に際して、組成物を、例えば静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内または髄腔内で投与することが好ましい。
一般に、静脈内で投与する場合、脂質粒子処方物を適切な薬剤用担体で処方する。多くの薬学的に許容される担体を、本発明の組成物および方法において使用することができる。本発明で使用するのに適した処方物は、例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES、Mack Publishing Company、Philadelphia、PA、17th ed.(1985年)に見られる。様々な水性担体、例えば水、緩衝用水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシンなどを使用することができ、それらは、安定性を高めるためにアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の糖タンパク質を含むことができる。一般に、標準的な緩衝食塩水(135〜150mM NaCl)を薬学的に許容される担体として使用するが、他の適切な担体でも十分である。これらの組成物は、濾過などの慣用的なリポソーム殺菌技術により殺菌することができる。この組成物は、生理学的条件近傍下で要求される薬学的に許容される補助剤、例えばpH調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等を含むことができる。これらの組成物は、上記で参照した技術を用いて殺菌することができる、あるいは、それらを無菌状態下で作製することができる。得られる水性液剤を使用のためにパッケージ化する、または無菌状態下で濾過し、凍結乾燥し、凍結乾燥された調製物を投与前に滅菌水溶液と混合することができる。
特定の用途では、本明細書で開示する脂質粒子を経口投与によって個体に送達することができる。粒子を添加剤と合体させ、摂取可能な錠剤、頬側用錠剤、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ロゼンジ剤、エリキシル剤、うがい薬、懸濁剤、経口噴霧剤、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用することができる(例えば、米国特許第5,641,515号、同第5,580,579号および同第5,792,451号を参照されたい、これらの開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む)。これらの経口剤形は以下の:結合剤、ゼラチン;添加剤、滑沢剤および/または香味剤を含むこともできる。単位剤形がカプセル剤である場合、これは上述した材料に加えて、液体担体を含むことができる。種々の他の材料がコーティングとして存在することができ、あるいは投薬単位の物理的形態を改変することができる。もちろん、任意の単位剤形を調製するのに使用されるどの材料も薬学的に純粋で、かつ使用される量で実質的に非毒性でなければならない。
一般に、これらの経口処方物は少なくとも約0.1%の脂質粒子またはそれ以上を含むことができるが、もちろん、粒子のパーセンテージは変えることができ、好都合には全処方物の重量もしくは容積の約1%もしくは2%から約60%もしくは70%またはそれ以上であってよい。当然、調製できるそれぞれ治療上有用な組成物中の粒子の量は、化合物の任意の所与の単位用量で適切な投薬量が得られるようにする。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命などの因子ならびに他の薬理学的考慮事項は、そうした薬剤処方物を調製する技術分野の技術者によって考慮されることになる。したがって、様々な投薬量および処置レジメンを望み得る。
経口投与に適した処方物は:(a)水、生理食塩水またはPEG400などの賦形剤に懸濁された有効量のパッケージ化治療用核酸(例えば、干渉RNA)などの液体製剤;(b)それぞれが所定量の治療用核酸(例えば、干渉RNA)を液体、固体、顆粒またはゼラチンとして含むカプセル剤、サシェイ剤または錠剤;(c)適切な液体中の懸濁剤;および(d)適切な乳剤を含むことができる。錠剤形態物は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の添加剤、着色剤、充てん剤、結合剤、賦形剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、染料、崩壊剤および薬剤として適合する担体の1つまたは複数を含むことができる。ロゼンジ剤形態物は、香味剤、例えばスクロース中の治療用核酸(例えば、干渉RNA)、ならびに、ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性なベースまたはスクロースおよびアカシアエマルジョン、ゲル中に治療用核酸を含むトローチ、および治療用核酸に加えて当業界で公知の担体を含む同様のものを含むことができる。
それらの他の使用例では、脂質粒子を様々な局所剤形中に混ぜ込むことができる。例えばSNALPなどの核酸−脂質粒子を含む懸濁液をゲル剤、油剤、乳剤、局所クリーム剤、ペースト剤、軟膏剤、ローション剤、泡状剤、ムース剤などとして、処方し投与することができる。
本発明の脂質粒子の医薬品を調製する場合、中身のない粒子または外部表面と会合した核酸などの治療剤を有する粒子を低減または排除するように精製された多量の粒子を使用することが好ましい。
本発明の方法は様々な宿主において実施することができる。好ましい宿主には哺乳動物種、例えば霊長類(例えば、ヒトおよびチンパンジーならびにヒト以外の霊長類)、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯動物(例えば、ラットおよびマウス)、ウサギおよびブタが含まれる。
投与される粒子の量は、治療用核酸(例えば、干渉RNA)と脂質の比、使用される具体的な治療用核酸、処置を受ける疾患または障害、患者の年齢、体重および状態ならびに臨床医の判断によることになるが、一般にkg体重当たり約0.01〜約50mg、好ましくは約0.1〜約5mg/kg体重または投与(例えば、注射)当たり約108〜1010個の粒子である。
B.In vitroでの投与
in vitroでの投与のため、治療用核酸(例えば、干渉RNA)の送達は、植物由来もしくは動物由来、脊椎動物または無脊椎動物、および任意の組織またはタイプにかかわらず、培養液内で成長した任意の細胞に対してであってよい。好ましい実施形態では、その細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
in vitroでの投与のため、治療用核酸(例えば、干渉RNA)の送達は、植物由来もしくは動物由来、脊椎動物または無脊椎動物、および任意の組織またはタイプにかかわらず、培養液内で成長した任意の細胞に対してであってよい。好ましい実施形態では、その細胞は動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
in vitroで実施する場合、細胞と脂質粒子の接触は、生物学的に適合する媒体中で行われる。粒子の濃度は、具体的な用途に応じて広範に変動するが、一般に約1μmol〜約10mmolである。脂質粒子での細胞の処置は通常、生理学的温度(約37℃)で約1〜48時間、好ましくは約2〜4時間の期間実施される。
好ましい実施形態の1つの群では、脂質粒子懸濁液を、約103〜約105個の細胞/ml、より好ましくは約2×104個の細胞/mlの細胞密度を有する60〜80%コンフルエントで播種された細胞に加える。細胞に加えられる懸濁液の濃度は、好ましくは約0.01〜0.2μg/ml、より好ましくは約0.1μg/mlである。
細胞の組織培養が要求され得る程度は、当業界で周知である。例えば、Freshney、Culture of Animal Cells、a Manual of Basic Technique、3rd Ed.、Wiley-Liss、New York(1994年)、Kuchlerら、Biochemical Methods in Cell Culture and Virology、Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.(1977年)およびそこで参照されている文献は細胞の培養への一般的指針を提供している。培養された細胞系はしばしば細胞の単層の形態となるが、細胞懸濁液も使用される。
エンドソーム放出パラメーター(ERP)アッセイを用いて、本発明のSNALPまたは他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ERPアッセイは、米国特許公開番号第20030077829号に詳細に記載されている。この開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。より具体的には、ERPアッセイの目的は、エンドソーム膜の結合/取り込みまたはそれとの融合/その不安定化へのそれらの相対的効果に対する、SNALPまたは他の脂質粒子の様々なカチオン性脂質およびヘルパー脂質成分の効果を確認することである。このアッセイは、SNALPまたは他の脂質粒子の各成分がいかに送達効率に影響を及ぼすかを定量的に判定し、それによって、SNALPまたは他の脂質粒子を最適化できるようにする。通常、ERPアッセイは、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光性タンパク質(GFP)等)の発現を測定するものであり、いくつかの例では、発現プラスミドについて最適化されたSNALP処方物も干渉RNAをカプセル化するのに適している。他の例では、ERPアッセイを、干渉RNA(例えば、siRNA)の存在下または非存在下での標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するように適合させることができる。種々のSNALPまたは他の脂質粒子のそれぞれについてERPを比較することによって、最適な系、例えば細胞中での最も高い取り込みを有するSNALPまたは他の脂質粒子を容易に決定することができる。
C.脂質粒子の送達のための細胞
本発明の組成物および方法は、in vivoでALDH遺伝子発現を標的とすることによってアルコール症を処置するのに特に適している。本発明は哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯動物(例えば、マウス、ラットおよびテンジクネズミ)、ウサギ、ブタおよび霊長類(例えば、サル、チンパンジーおよびヒト)などを含む任意の脊椎動物種からの様々な細胞タイプについて実施することができる。
本発明の組成物および方法は、in vivoでALDH遺伝子発現を標的とすることによってアルコール症を処置するのに特に適している。本発明は哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯動物(例えば、マウス、ラットおよびテンジクネズミ)、ウサギ、ブタおよび霊長類(例えば、サル、チンパンジーおよびヒト)などを含む任意の脊椎動物種からの様々な細胞タイプについて実施することができる。
D.脂質粒子の検出
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、約1、2、3、4、5、6、7、8時間またはそれ以上の時間、対象において検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、粒子の投与後、約8、12、24、48、60、72もしくは96時間または約6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25もしくは28日間、対象において検出可能である。粒子の存在は、その対象からの細胞、組織または他の生物学的試料中で検出することができる。粒子は、例えば粒子の直接的な検出、干渉RNA(例えば、siRNA)配列などの治療用核酸の検出、対象とする標的配列の検出(すなわち対象とする配列の発現または減少した発現を検出することによって)、EBOVタンパク質(例えば、インターフェロン)によって調節された化合物の検出、対象中のウイルス量の検出あるいはその組合せによって検出することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、約1、2、3、4、5、6、7、8時間またはそれ以上の時間、対象において検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子(例えば、SNALP)は、粒子の投与後、約8、12、24、48、60、72もしくは96時間または約6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25もしくは28日間、対象において検出可能である。粒子の存在は、その対象からの細胞、組織または他の生物学的試料中で検出することができる。粒子は、例えば粒子の直接的な検出、干渉RNA(例えば、siRNA)配列などの治療用核酸の検出、対象とする標的配列の検出(すなわち対象とする配列の発現または減少した発現を検出することによって)、EBOVタンパク質(例えば、インターフェロン)によって調節された化合物の検出、対象中のウイルス量の検出あるいはその組合せによって検出することができる。
1.粒子の検出
SNALPなどの本発明の脂質粒子は、当業界で公知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、当業界で周知の方法を用いて、標識を、脂質粒子のある成分に直接的または間接的に取り付けることができる。様々な標識を、必要とされる感度、脂質粒子成分とのコンジュゲート化のし易さ、安定性の要件ならびに利用可能な器具類および廃棄条項に応じて、標識を選択して使用することができる。適切な標識には、これらに限定されないが、スペクトル標識、例えば蛍光染料(例えば、フルオレセインおよび誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびOregon Green(商標);ローダミンおよび誘導体、例えばテキサスレッド、テトラロージミンイソチオシアネート(TRITC)等、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes(商標)など;放射性標識、例えば3H、125I、35S、14C、32P、33P等;酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等;スペクトル比色分析標識、例えばコロイド状金もしくは着色ガラスまたはプラスチックビーズ、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等が含まれる。標識は、当業界で公知の任意の手段を用いて検出することができる。
SNALPなどの本発明の脂質粒子は、当業界で公知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、当業界で周知の方法を用いて、標識を、脂質粒子のある成分に直接的または間接的に取り付けることができる。様々な標識を、必要とされる感度、脂質粒子成分とのコンジュゲート化のし易さ、安定性の要件ならびに利用可能な器具類および廃棄条項に応じて、標識を選択して使用することができる。適切な標識には、これらに限定されないが、スペクトル標識、例えば蛍光染料(例えば、フルオレセインおよび誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびOregon Green(商標);ローダミンおよび誘導体、例えばテキサスレッド、テトラロージミンイソチオシアネート(TRITC)等、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes(商標)など;放射性標識、例えば3H、125I、35S、14C、32P、33P等;酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等;スペクトル比色分析標識、例えばコロイド状金もしくは着色ガラスまたはプラスチックビーズ、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等が含まれる。標識は、当業界で公知の任意の手段を用いて検出することができる。
2.核酸の検出
核酸(例えば、干渉RNA)は本明細書では、当業者に周知のいくつかの手段のいずれかによって検出し、定量化される。核酸の検出はサザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動法、PCR、放射性同位元素標識法、シンチレーション計数法および親和性クロマトグラフィーなどの周知の方法によって進めることができる。追加的な生化学的分析方法、例えば分光光度法、X線検査、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)および高拡散クロマトグラフィーも使用することができる。
核酸(例えば、干渉RNA)は本明細書では、当業者に周知のいくつかの手段のいずれかによって検出し、定量化される。核酸の検出はサザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動法、PCR、放射性同位元素標識法、シンチレーション計数法および親和性クロマトグラフィーなどの周知の方法によって進めることができる。追加的な生化学的分析方法、例えば分光光度法、X線検査、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)および高拡散クロマトグラフィーも使用することができる。
核酸ハイブリダイゼーションフォーマットの選択は重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーションフォーマットが当業者に公知である。例えば、一般的なフォーマットには、サンドイッチアッセイおよび競合または置換アッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、例えば「Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach」、Eds.HamesおよびHiggins、IRL Press(1985年)に概略的に記載されている。
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増幅させる、核酸増幅システムの使用によって高めることができる。分子プローブとして使用するためまたは後続のサブクローニング用に核酸断片を形成させるために配列を増幅させるのに適したin vitroでの増幅技術は公知である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ−レプリカーゼ増幅および他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA(商標))を含むin vitroでのそうした増幅法によって当業者を導くのに十分な技術の例は、Sambrookら、In Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2000年);およびAusubelら、SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds.、Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.(2002年);ならびに米国特許第4,683,202号;PCR Protocols、A Guide to Methods and Applications(Innisら eds.)Academic Press Inc. San Diego、CA(1990年);Arnheim & Levinson(1990年10月1日)、C & EN 36;The Journal Of NIH Research、3巻:81頁(1991年);Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻:1173頁(1989年);Guatelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻:1874頁(1990年);Lomellら、J.Clin.Chem.、35巻:1826頁(1989年);Landegrenら、Science、241巻:1077頁(1988年);Van Brunt、Biotechnology、8巻:291頁(1990年);WuおよびWallace、Gene、4巻:560頁(1989年);Barringerら、Gene、89巻:117頁(1990年);およびSooknananおよびMalek、Biotechnology、13巻:563頁(1995年)に見られる。in vitroで増幅された核酸をクローニングする改善された方法は、米国特許第5,426,039号に記載されている。当業界で記載されている他の方法は、核酸配列ベースの増幅(NASBA(商標)、Cangene、Mississauga、Ontario)およびQβ−レプリカーゼ系である。これらの系を、選択配列が存在する場合だけPCRまたはLCRプライマーが伸長するまたは連結するように設計されている変異体を直接特定するのに使用することができる。あるいは、選択配列を一般に、例えば非特異的PCRプライマーを用いて増幅させ、その増幅された標的領域を、変異を示す特異的な配列について後でプローブすることができる。上記文献の開示を全体としてすべての目的のために参照により本明細書に組み込む。
例えばin vitroでの増幅法におけるプローブとして使用するため、遺伝子プローブまたは阻害剤成分として使用するための核酸は一般に、例えばNeedham VanDevanterら、Nucleic Acids Res.、12巻:6159頁(1984年)に記載されているような自動合成装置を用いて、Beaucageら、Tetrahedron Letts.、22巻:1859 1862頁(1981年)によって記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法にしたがって化学的に合成される。ポリヌクレオチドの精製は、必要な場合、一般にPearsonら、J.Chrom.、255巻:137 149頁(1983年)に記載されているような未変性アクリルアミドゲル電気泳動かまたは陰イオン交換HPLCによって実施される。合成ポリヌクレオチドの配列は、GrossmanおよびMoldave(eds.)Academic Press、New York、Methods in Enzymology、65巻:499頁におけるMaxamおよびGilbert(1980年)の化学的分解法を用いて立証することができる。
転写のレベルを判定するための代替の手段は、インサイチュでのハイブリダイゼーションである。インサイチュでのハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、Angererら、Methods Enzymol、152巻:649頁(1987年)に概略が記載されている。インサイチュでのハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を固体支持体、一般にスライドグラスに固定する。DNAをプローブしようとする場合、その細胞を熱かまたはアルカリで変性させる。次いで細胞を適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させて標識された特異的プローブのアニーリングができるようにする。プローブは、放射性同位体または蛍光性レポーターで標識することが好ましい。
IX.実施例
本発明を、具体的な実施例でより詳細に説明することとする。以下の実施例は例示のためであり、本発明を限定しようとするものでは全くない。当業者は、変更または改変しても本質的に同じ結果が得られる重要ではない様々なパラメーターを容易に理解されよう。
本発明を、具体的な実施例でより詳細に説明することとする。以下の実施例は例示のためであり、本発明を限定しようとするものでは全くない。当業者は、変更または改変しても本質的に同じ結果が得られる重要ではない様々なパラメーターを容易に理解されよう。
(実施例1)
この実施例は、ALDH2を標的とするsiRNAを含む血清安定な核酸−脂質粒子(SNALP)が、in vitroでマウス肝細胞系内でのアルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子発現を低減することを実証する。
この実施例は、ALDH2を標的とするsiRNAを含む血清安定な核酸−脂質粒子(SNALP)が、in vitroでマウス肝細胞系内でのアルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子発現を低減することを実証する。
材料:
これらの試験で使用するすべてのsiRNA分子は、標準的な手順を用いて化学的に合成し、アニールした。
これらの試験で使用するすべてのsiRNA分子は、標準的な手順を用いて化学的に合成し、アニールした。
ここで「r」はリボヌクレオチドを表し、「m」は2’−O−メチル化リボヌクレオチドを表し、いずれかの接頭辞を欠いているものはデオキシヌクレオチドを表す。
さらに、対照として非標的siRNAを試験に含めた。このsiRNAは蛍ルシフェラーゼ遺伝子を標的とし、哺乳動物細胞において特異的な遺伝子サイレンシング活性をまったくもたないものとする。
方法:
核酸−脂質粒子は以下の「1:57」処方物:1.4%PEG2000−C−DMA;57.1%DLinDMA;7.1%DPPC;および34.3%コレステロールからなるものであった。典型的には、1:57処方物では、DLinDMAの量は57.1mol%±5mol%であり、脂質コンジュゲートの量は1.4mol%±0.5mol%であり、1:57処方物の残りは非カチオン性脂質(例えば、リン脂質、コレステロールまたはこの2つの混合物)で構成されており、最終的なsiRNA/脂質比は約0.11〜0.15(wt/wt)であった。siRNAをロードした粒子が形成されると、平均粒子サイズは直径で85〜100nmであった。
核酸−脂質粒子は以下の「1:57」処方物:1.4%PEG2000−C−DMA;57.1%DLinDMA;7.1%DPPC;および34.3%コレステロールからなるものであった。典型的には、1:57処方物では、DLinDMAの量は57.1mol%±5mol%であり、脂質コンジュゲートの量は1.4mol%±0.5mol%であり、1:57処方物の残りは非カチオン性脂質(例えば、リン脂質、コレステロールまたはこの2つの混合物)で構成されており、最終的なsiRNA/脂質比は約0.11〜0.15(wt/wt)であった。siRNAをロードした粒子が形成されると、平均粒子サイズは直径で85〜100nmであった。
哺乳動物の細胞処理およびmRNA分析:
初代培養肝細胞をマウスから単離し、96ウェルプレート中で付着培養物(adherent culture)として保持した。ALDH−2標的または非標的対照SNALPを0.03125〜0.5μg/mLのsiRNA濃度で培地に加え;各処理条件を3連のウェル中で実施した。SNALPの存在下で約24hインキュベーションした後、細胞を収集し、mRNA分析用に溶解した。細胞溶解物中のマウスALDH2 mRNAを、分岐DNAアッセイ(QuantiGene(登録商標)、Affymetrix)を用いて測定し、マウスグリセルアルデヒド3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して正規化した。
初代培養肝細胞をマウスから単離し、96ウェルプレート中で付着培養物(adherent culture)として保持した。ALDH−2標的または非標的対照SNALPを0.03125〜0.5μg/mLのsiRNA濃度で培地に加え;各処理条件を3連のウェル中で実施した。SNALPの存在下で約24hインキュベーションした後、細胞を収集し、mRNA分析用に溶解した。細胞溶解物中のマウスALDH2 mRNAを、分岐DNAアッセイ(QuantiGene(登録商標)、Affymetrix)を用いて測定し、マウスグリセルアルデヒド3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して正規化した。
結果:
表Aは、任意に「100.0%」と設定した未処理培養ウェル中で測定されたGAPDH正規化ALDH2 mRNAの量(9連ウェルの平均、±6.9%標準偏差)に対する脂質−核酸処理の遺伝子サイレンシング活性(3連ウェルの平均、±標準偏差)を示す。
表Aは、任意に「100.0%」と設定した未処理培養ウェル中で測定されたGAPDH正規化ALDH2 mRNAの量(9連ウェルの平均、±6.9%標準偏差)に対する脂質−核酸処理の遺伝子サイレンシング活性(3連ウェルの平均、±標準偏差)を示す。
結論:
マウスALDH2を標的とする4つのsiRNA処方物は、単離された初代培養マウス肝細胞において、すべて用量応答的な形で遺伝子サイレンシング活性を示した。試験した4つのうち、二重鎖1は最も活性が高く、二重鎖4が最も活性が低かった。
マウスALDH2を標的とする4つのsiRNA処方物は、単離された初代培養マウス肝細胞において、すべて用量応答的な形で遺伝子サイレンシング活性を示した。試験した4つのうち、二重鎖1は最も活性が高く、二重鎖4が最も活性が低かった。
(実施例2)
この実施例は、ALDH2を標的とするsiRNAを含むSNALPは、静脈内経路の投与により、全動物系においてアルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子発現を低減させることを示している。
この実施例は、ALDH2を標的とするsiRNAを含むSNALPは、静脈内経路の投与により、全動物系においてアルデヒドデヒドロゲナーゼ2遺伝子発現を低減させることを示している。
材料:
この試験で使用したマウスALDH−2 siRNA二重鎖1および非標的対照siRNAは実施例1で説明されている。
この試験で使用したマウスALDH−2 siRNA二重鎖1および非標的対照siRNAは実施例1で説明されている。
方法:
SNALP処方物を実施例1に記載されているようにして調製した。
SNALP処方物を実施例1に記載されているようにして調製した。
動物処置:
雌性のBALB/cマウスをHarlan Labsから入手した。この動物に、単一用量のSNALP処方siRNAまたはリン酸緩衝生理食塩水を側部尾静脈で10mL/kg静脈内注射により投与した。投与されたsiRNA用量は体重kg当たり0.025、0.050または0.25mgであった。SNALP注射の約48h後、動物を安楽死させ、肝臓組織をRNAlater(登録商標)RNA安定化溶液中に採取した。
雌性のBALB/cマウスをHarlan Labsから入手した。この動物に、単一用量のSNALP処方siRNAまたはリン酸緩衝生理食塩水を側部尾静脈で10mL/kg静脈内注射により投与した。投与されたsiRNA用量は体重kg当たり0.025、0.050または0.25mgであった。SNALP注射の約48h後、動物を安楽死させ、肝臓組織をRNAlater(登録商標)RNA安定化溶液中に採取した。
組織分析:
肝臓組織を、基本的にJudgeら、2006年、Molecular Therapy 13巻:494頁に記載されているようにして、QuantiGene(登録商標)分岐DNAアッセイ(Panomics、Freemont、CA;現在はAffymetrixの一部)を用いて、GAPDH mRNAレベルに対して正規化されたマウスALDH2 mRNAレベルについて分析した。
肝臓組織を、基本的にJudgeら、2006年、Molecular Therapy 13巻:494頁に記載されているようにして、QuantiGene(登録商標)分岐DNAアッセイ(Panomics、Freemont、CA;現在はAffymetrixの一部)を用いて、GAPDH mRNAレベルに対して正規化されたマウスALDH2 mRNAレベルについて分析した。
結果:
表Bは、任意に「100.0%」と設定した対照PBS処置動物で測定されたGAPDH正規化肝臓ALDH2 mRNAの量(6匹の動物の平均、±6.3%標準偏差)に対するSNALP処置の遺伝子サイレンシング活性(3匹の動物の平均、±標準偏差)を示す。
表Bは、任意に「100.0%」と設定した対照PBS処置動物で測定されたGAPDH正規化肝臓ALDH2 mRNAの量(6匹の動物の平均、±6.3%標準偏差)に対するSNALP処置の遺伝子サイレンシング活性(3匹の動物の平均、±標準偏差)を示す。
結論:
マウスALDH2を標的とするSNALP処方siRNA1の単一の静脈内投与はマウスにおいて、用量応答的な形で、ALDH2遺伝子サイレンシング活性をもたらした。
マウスALDH2を標的とするSNALP処方siRNA1の単一の静脈内投与はマウスにおいて、用量応答的な形で、ALDH2遺伝子サイレンシング活性をもたらした。
(実施例3)
この実施例は、本発明の血清安定性の核酸−脂質粒子の作製方法を説明する。
この実施例は、本発明の血清安定性の核酸−脂質粒子の作製方法を説明する。
siRNA分子を、標準的な手順を用いて化学的に合成しアニールする。
いくつかの実施形態では、siRNA分子を以下の脂質:(1)脂質コンジュゲートPEG2000−C−DMA(3−N−[(−メトキシポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル]−1,2−ジミリスチルオキシプロピルアミン);(2)カチオン性脂質、例えばDLinDMA;(3)リン脂質DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)(Avanti Polar Lipids;Alabaster、AL);および(4)それぞれ1.4:57.1:7.1:34.3のモル比の合成コレステロール(Sigma−Aldrich Corp.;St.Louis、MO)を含む血清安定性の核酸−脂質粒子中にカプセル化する。すなわち、siRNA分子を、以下の「1:57」処方物の核酸−脂質粒子:1.4%PEG2000−C−DMA;57.1%カチオン性脂質;7.1%DPPC;および34.3%コレステロール中にカプセル化する。この1:57処方物は目標処方物であり、存在する脂質(カチオン性と非カチオン性の両方)の量と、処方物中に存在する脂質コンジュゲートの量は変わり得ることを理解すべきである。典型的には、1:57処方物において、カチオン性脂質の量は57.1mol%±5mol%であり、脂質コンジュゲートの量は1.4mol%±0.5mol%であり、1:57処方物の残りは非カチオン性脂質(例えば、リン脂質、コレステロールまたは2つの混合物)で構成される。処方物を、米国特許出願番号第2007/0042031号に記載されている方法を用いて作製する。これを全体として参照により本明細書に組み込む。形成されたら、核酸−脂質粒子をPBSに対して透析し、使用前に0.2μmフィルターでフィルター滅菌する。平均粒子サイズは75〜90nmの範囲であってよく、最終siRNA/脂質比は0.15(wt/wt)であってよい。
(実施例4)
この実施例は、in vitroでのヒト細胞における、ALDH2遺伝子発現のsiRNA媒介による低減を説明する。
この実施例は、in vitroでのヒト細胞における、ALDH2遺伝子発現のsiRNA媒介による低減を説明する。
材料:
これらの試験で使用したすべてのsiRNA分子を、標準的な手順を用いて化学的に合成しアニールした。
これらの試験で使用したすべてのsiRNA分子を、標準的な手順を用いて化学的に合成しアニールした。
方法:
核酸−脂質粒子は以下の「1:57」処方物:1.4%PEG2000−C−DMA;57.1%DLinDMA;7.1%DPPC;および34.3%コレステロールを含んだ。典型的には、1:57処方物において、DLinDMAの量は57.1mol%±5mol%であり、脂質コンジュゲートの量は1.4mol%±0.5mol%であり、1:57処方物の残りは非カチオン性脂質(例えば、リン脂質、コレステロールまたは2つの混合物)で構成され、最終siRNA/脂質比は約0.11〜0.15(wt/wt)であった。siRNA−ロードした粒子が形成されると、平均粒子サイズは直径で85〜100nmであった。
核酸−脂質粒子は以下の「1:57」処方物:1.4%PEG2000−C−DMA;57.1%DLinDMA;7.1%DPPC;および34.3%コレステロールを含んだ。典型的には、1:57処方物において、DLinDMAの量は57.1mol%±5mol%であり、脂質コンジュゲートの量は1.4mol%±0.5mol%であり、1:57処方物の残りは非カチオン性脂質(例えば、リン脂質、コレステロールまたは2つの混合物)で構成され、最終siRNA/脂質比は約0.11〜0.15(wt/wt)であった。siRNA−ロードした粒子が形成されると、平均粒子サイズは直径で85〜100nmであった。
哺乳動物の細胞処理およびmRNA分析:HepG2(ヒト肝細胞癌腫)細胞を、96ウェルプレート中で付着培養物として保持した。ALDH2標的または非標的対照核酸−脂質粒子を3.91および15.63ng/mLのsiRNA濃度で培地に加え;各処理条件を2連のウェル中で実施した。約48時間核酸−脂質粒子インキュベーションした後、細胞を収集し、mRNA分析用に溶解した。細胞溶解物中のヒトALDH2 mRNAを、分岐DNAアッセイ(Panomics、Freemont、CA;現在Affymetrixの一部)を用いて測定し、ヒトグリセルアルデヒド3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して正規化した。
結果:
この実施例の表Bは、核酸−脂質粒子処理の遺伝子サイレンシング活性(2連ウェルの平均、±標準偏差)が、任意に「100.0%」と設定した未処理培養ウェル中で測定されたGAPDH正規化ALDH2 mRNAの量(2連のウェルの平均、±7.4%標準偏差)に対するGAPDH正規化ALDH2 mRNAパーセンテージとして説明されていることを示している。
この実施例の表Bは、核酸−脂質粒子処理の遺伝子サイレンシング活性(2連ウェルの平均、±標準偏差)が、任意に「100.0%」と設定した未処理培養ウェル中で測定されたGAPDH正規化ALDH2 mRNAの量(2連のウェルの平均、±7.4%標準偏差)に対するGAPDH正規化ALDH2 mRNAパーセンテージとして説明されていることを示している。
結論:
脂質粒子中に処方された6つのsiRNAはすべて、用量応答的な形で、ヒトHepG2細胞中のALDH2活性をサイレンシングした。試験した6つのsiRNAのうち、siRNA2は最も活性が高く、siRNA3は最も活性が低かった。
脂質粒子中に処方された6つのsiRNAはすべて、用量応答的な形で、ヒトHepG2細胞中のALDH2活性をサイレンシングした。試験した6つのsiRNAのうち、siRNA2は最も活性が高く、siRNA3は最も活性が低かった。
本明細書において参照した米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物のすべてを、本発明の説明と矛盾しない程度に、全体として参照により本明細書に組み込む。
上記より、例示のために本発明の特定の実施形態が本明細書で説明されているが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な改変を加えることができることを理解されよう。
Claims (66)
- アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)遺伝子発現をサイレンシングする干渉RNAを含む組成物であって、前記干渉RNAがセンス鎖および相補的アンチセンス鎖を含み、前記干渉RNAが約15〜約60個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む組成物。
- 前記干渉RNAが、siRNA、ダイサー−基質dsRNA、shRNA、aiRNA、プレmiRNAおよびその組合せからなる群から選択される二本鎖のRNA(dsRNA)である、請求項1に記載の組成物。
- 前記干渉RNAが約19〜約25個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記干渉RNAが化学的に合成される、請求項1に記載の組成物。
- 前記干渉RNAが、前記干渉RNAの1つまたは両方の鎖中に3’オーバーハングを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記干渉RNAが、前記二本鎖領域中に少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記二本鎖領域中のヌクレオチドの約30%未満が修飾ヌクレオチドを含む、請求項6に記載の組成物。
- 前記修飾ヌクレオチドが2’−O−メチル(2’OMe)ヌクレオチドである、請求項6に記載の組成物。
- 前記2’OMeヌクレオチドが、2’OMe−グアノシンヌクレオチド、2’OMe−ウリジンヌクレオチドまたはそれらの混合物を含む、請求項8に記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記干渉RNAが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)遺伝子発現をサイレンシングする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- (a)請求項1に記載の干渉RNA、
(b)カチオン性脂質および
(c)非カチオン性脂質
を含む核酸−脂質粒子。 - 前記カチオン性脂質が、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、1,2−ジ−γ−リノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(γ−DLenDMA)、それらの塩またはそれらの混合物を含む、請求項11に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記カチオン性脂質が、2,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−C2−DMA)、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)、それらの塩またはそれらの混合物を含む、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記カチオン性脂質が、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin−M−C3−DMA)、ジリノレイルメチル−3−ジメチルアミノプロピオネート(DLin−M−C2−DMA)、それらの塩またはそれらの混合物を含む、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記非カチオン性脂質がリン脂質である、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記非カチオン性脂質がコレステロールまたはその誘導体である、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物である、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)またはそれらの混合物を含む、請求項16または請求項18に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記非カチオン性脂質が、DPPCとコレステロールとの混合物である、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 粒子の凝集を阻止するコンジュゲートされた脂質をさらに含む、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 粒子の凝集を阻止する前記コンジュゲートされた脂質がポリエチレングリコール(PEG)−脂質コンジュゲートである、請求項21に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記PEG−脂質コンジュゲートが、PEG−ジアシルグリセロール(PEG−DAG)コンジュゲート、PEG−ジアルキルオキシプロピル(PEG−DAA)コンジュゲート、PEG−リン脂質コンジュゲート、PEG−セラミド(PEG−Cer)コンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項22に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記PEG−脂質コンジュゲートがPEG−DAAコンジュゲートである、請求項22に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記PEG−DAAコンジュゲートが、PEG−ジデシルオキシプロピル(C10)コンジュゲート、PEG−ジラウリルオキシプロピル(C12)コンジュゲート、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(C14)コンジュゲート、PEG−ジパルミチルオキシプロピル(C16)コンジュゲート、PEG−ジステアリルオキシプロピル(C18)コンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項24に記載の核酸−脂質粒子。
- 粒子の凝集を阻止する前記コンジュゲートされた脂質が、ポリオキサゾリン(POZ)−脂質コンジュゲートである、請求項21に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記POZ−脂質コンジュゲートがPOZ−DAAコンジュゲートである、請求項26に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記干渉RNAが前記粒子中に完全にカプセル化されている、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 約5:1〜約15:1の脂質:干渉RNA質量比を有する、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 約30nm〜約150nmのメジアン直径を有する、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記カチオン性脂質が、前記粒子中に存在する全脂質の約50mol%〜約65mol%を構成する、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、前記リン脂質が前記粒子中に存在する全脂質の約4mol%〜約10mol%を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記粒子中に存在する全脂質の約30mol%〜約40mol%を構成する、請求項12に記載の核酸−脂質粒子。
- 前記リン脂質が前記粒子中に存在する全脂質の約5mol%〜約9mol%を構成し、前記コレステロールまたはその誘導体が前記粒子中に存在する全脂質の約32mol%〜約37mol%を構成する、請求項32に記載の核酸−脂質粒子。
- 粒子の凝集を阻止する前記コンジュゲートされた脂質が前記粒子中に存在する全脂質の約0.5mol%〜約2mol%を構成する、請求項21に記載の核酸−脂質粒子。
- 請求項12に記載の核酸−脂質粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- ALDH遺伝子発現をサイレンシングする干渉RNAを細胞中に導入するための方法であって、前記細胞を請求項12に記載の核酸−脂質粒子と接触させるステップを含む方法。
- 前記細胞が哺乳動物中にある、請求項36に記載の方法。
- 全身的経路で前記哺乳動物に前記粒子を投与することによって、前記細胞を接触させる、請求項36に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項36に記載の方法。
- 前記哺乳動物がアルコール症と診断されている、請求項36に記載の方法。
- 前記干渉RNAが、前記細胞においてALDH2遺伝子発現をサイレンシングする、請求項36に記載の方法。
- ALDH遺伝子発現をサイレンシングすることを必要とする哺乳動物におけるALDH遺伝子発現をサイレンシングするための方法であって、請求項12に記載の核酸−脂質粒子を前記哺乳動物に投与するステップを含む方法。
- 前記粒子を全身的経路で投与する、請求項42に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項42に記載の方法。
- 前記ヒトがアルコール症に罹患している、請求項44に記載の方法。
- 前記粒子の投与が、前記哺乳動物中のALDH RNAレベルを、前記粒子の非存在下のALDH RNAレベルと比較して少なくとも約50%低減させる、請求項42に記載の方法。
- 前記核酸−脂質粒子がALDH2遺伝子発現をサイレンシングする、請求項42に記載の方法。
- ヒトにおけるアルコール症に伴う1つまたは複数の症状を処置および/または改善するための方法であって、前記ヒトに治療有効量の請求項12に記載の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法。
- 前記粒子を全身的経路で投与する、請求項48に記載の方法。
- 前記ヒトがアルコール症を有する、請求項48に記載の方法。
- 前記核酸−脂質粒子の干渉RNAが前記ヒトにおけるALDH2遺伝子の発現を阻害する、請求項48に記載の方法。
- ALDHの発現を阻害することを必要とする哺乳動物におけるALDHの発現を阻害するための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量の請求項12に記載の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法。
- 前記粒子を全身的経路で投与する、請求項52に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項52に記載の方法。
- 前記ヒトがアルコール症を有する、請求項54に記載の方法。
- 前記粒子の投与が、前記哺乳動物におけるALDH遺伝子発現を、前記粒子の非存在下の前記ALDH遺伝子発現と比較して少なくとも約50%低減させる、請求項52に記載の方法。
- ALDH2の発現が前記哺乳動物において阻害される、請求項52に記載の方法。
- ヒトにおけるアルコール症を防止および/または処置するための方法であって、前記ヒトに治療有効量の請求項12に記載の核酸−脂質粒子を投与するステップを含む方法。
- 前記粒子を全身的経路で投与する、請求項58に記載の方法。
- 前記ヒトがアルコール症に罹患している、請求項58に記載の方法。
- 前記核酸−脂質粒子の干渉RNAが前記ヒトにおけるALDH2遺伝子の発現を阻害する、請求項58に記載の方法。
- 本明細書の実施例4の表Aに示す識別番号1、識別番号2、識別番号3、識別番号4、識別番号5および識別番号6からなる群から選択される二本鎖siRNA分子。
- 本明細書の実施例4の表Aに示す一本鎖センス鎖分子から選択される一本鎖RNA分子。
- 本明細書の実施例4の表Aに示す一本鎖アンチセンス鎖分子から選択される一本鎖RNA分子。
- 生細胞中でのALDH遺伝子発現を阻害するための本発明のsiRNA分子の使用。
- 生細胞中でのALDH遺伝子発現を阻害するための本発明の医薬組成物の使用。
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