JP2010519203A - 生物活性分子の活性を強化するための組成物及び方法 - Google Patents

生物活性分子の活性を強化するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、１つ以上の送達ビヒクル及び１つ以上の担体分子と一緒に、生物活性分子の活性を強化するための、新規な組成物及び方法に関する。特に本発明は、担体分子を、送達ビヒクル及び興味のある生物活性分子と組合せて使用して、該生物活性分子の活性を強化することを特徴とする。担体分子は、生物学的に不活性（ｉｎｅｒｔ）、非活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）、又は減弱されているか；或いはまた、興味のある生物活性分子と同じか又は異なる方法で、生物学的に活性であってもよい。特に本発明は、種々の生物活性分子を担体分子と一緒に細胞へ到達するのに有用である、カチオン性脂質、マイクロ粒子、及びナノ粒子を含む、新規な粒子形成送達剤であることを特徴とする。本発明はまた、担体分子と一緒に細胞内に送達される、患者又は生体において、遺伝子発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾患、及び症状を、研究、診断、及び治療するための、組成物及び使用法も特徴とする。種々の実施態様において、本発明は、生物活性分子、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体その他）、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学治療剤、低分子、ビタミン、コファクター、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、アロザイム、アプタマー、デコイ及びその類似体、及び、小核酸分子、例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を、例えば患者又は生体中の、関係する細胞及び／又は組織に対し、１つ以上の担体分子と一緒に、効率的にトランスフェクト又は送達する、新規なカチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、及びトランスフェクション剤に関する。１つ以上の担体分子と一緒に使用される、かかる新規なカチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、及びトランスフェクション剤は、例えば、疾患、症状、又は形質を、細胞、患者、又は生体において予防、阻害、又は治療するための組成物の提供において有用である。

Description

本発明は、１つ以上の送達ビヒクル及び１つ以上の担体分子と一緒に、生物活性分子の活性を強化するための、新規な組成物及び方法に関する。特に本発明は、担体分子を、送達ビヒクル及び興味のある生物活性分子と組合せて使用して、該生物活性分子の活性を強化することを特徴とする。担体分子は、生物学的に不活性（ｉｎｅｒｔ）、非活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）、又は減弱されているか；或いはまた、興味のある生物活性分子と同じか又は異なる方法で、生物学的に活性であってもよい。特に本発明は、種々の生物活性分子を担体分子と一緒に細胞へ送達するのに有用である、カチオン性脂質、マイクロ粒子、及びナノ粒子を含む、新規な粒子形成送達剤であることを特徴とする。本発明はまた、担体分子と一緒に細胞内に送達される、患者又は生体において、遺伝子発現及び／又は活性の調節に応答する形質、疾患、及び症状を、研究、診断、及び治療するための、組成物及び使用法も特徴とする。種々の実施態様において、本発明は、生物活性分子、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体その他）、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、低分子、ビタミン、コファクター、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、アロザイム、アプタマー、デコイ及びその類似体、及び、小核酸分子、例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を、例えば患者又は生体中の、関係する細胞及び／又は組織に対し、１つ以上の担体分子と一緒に、効率的にトランスフェクト又は送達する、新規なカチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、及びトランスフェクション剤に関する。１つ以上の担体分子と一緒に使用される、かかる新規なカチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、及びトランスフェクション剤は、例えば、疾患、症状、又は形質を、細胞、患者、又は生体において予防、阻害、又は治療するための組成物の提供において有用である。
本発明は、生物活性分子の活性を、インビボ及びインビトロにおいて強化するための、新規な組成物及び方法に関する。特に、本発明は、１つ以上の送達ビヒクル及び１つ以上の担体分子の使用により、例えば上皮組織及び内皮組織において、細胞膜を横切る輸送を促進することにより、細胞に対し、核酸、ポリヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、及びその類似体、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ホルモン、及び低分子を送達するための、化合物、組成物、及び方法に関する。本発明の化合物、組成物、及び方法は、細胞、組織、及び臓器への生物活性分子の効果的な輸送に依存する、治療、研究、及び診断上の適用において有用である。この議論は、以下の本発明を理解するためにのみ提供されている。この要旨は、以下に記載されたいずれの研究も、クレームされた本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
種々の治療用化合物、例えば抗ウイルス剤及び化学療法剤の細胞送達は、通常、２つの制約によって脅かされる。第１に、多くの治療剤の選択性はしばしば低く、正常な組織に対し高い毒性を生じる結果となる。第２に、生きた細胞内に多くの化合物を輸送することは、細胞の複雑な膜系により高度に制限される。特定のトランスポーターは、栄養物又は調節分子の選択的な輸送を可能にする一方で、核酸及びタンパク質といった外来性分子の殆どを排除する。細胞内への化合物の輸送を改善するため、脂質担体、生分解性ポリマー、及び種々のコンジュゲート系を含む、様々な戦略を使用することができる。
細胞内への外来核酸の輸送を改善するための最も充分に研究されたアプローチは、ウイルスベクター又は、カチオン性脂質及び関連するサイトフェクチンの使用を包含する。ウイルスベクターは、遺伝子をある細胞タイプ内に効率的に輸送するために使用し得るが、一般にそれらは、化学合成された分子を細胞内に導入するために使用することはできない。別のアプローチは、カチオン性脂質を取り入れている送達製剤の使用であり、これは、一方の端で核酸と、そしてもう一方の端で脂質又は膜系と相互作用する（総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，１９９０，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５，１６２−１８７；Ｆｅｌｇｎｅｒ，１９９３，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，３，３−１６参照）。合成核酸並びにプラスミドは、サイトフェクチンを使用して送達し得るが、かかる化合物の有用性は、細胞タイプ特異性、トランスフェクションの間の低血清の必要性、及び毒性により、しばしば制限される。
生物活性分子を送達するための別のアプローチは、コンジュゲートの使用を包含する。コンジュゲートは、しばしば、ある分子が選択的に特定の細胞内に、例えば、受容体介在性エンドサイトーシスにより、輸送される能力に基づき選択される。興味の化合物を、細胞膜を横切って活発に輸送される分子に結合することにより、その化合物の、細胞又は特定の細胞オルガネラ内への効率的な輸送を実現し得る。別法として、活発な輸送メカニズムなしに細胞膜を貫通し得る分子、例えば、種々の親油性分子を使用して、興味の化合物を送達することができる。コンジュゲートとして利用可能な分子の例は、制限されることなく、ペプチド、ホルモン、脂肪酸、ビタミン、フラボノイド、糖、レポーター分子、レポーター酵素、キレーター、ポルフィリン、インターカレーター、及び、能動輸送又は受動輸送により細胞膜を貫通し得る他の分子を包含する。
特定の細胞タイプ、例えば、癌細胞又は、特定の組織及び臓器に特異的な細胞、に対する化合物の送達は、特定の細胞タイプに関連した受容体を利用することにより達成し得る。高親和性葉酸受容体を含め、特定の受容体が、ある癌性細胞において過剰発現される。例えば、高親和性のフォレート受容体は、腫瘍マーカーであり、これは、乳房、卵巣、子宮頚部、結腸直腸、腎臓、及び鼻咽頭腫瘍を含む、多様な新生物組織において過剰発現されるが、正常組織では、非常に限られた程度に発現される。細胞膜を横切って外来化合物を輸送するための葉酸ベースコンジュゲートの使用は、疾患の治療及び診断のための標的化された送達アプローチをもたらすことができ、かつ治療用化合物の必要用量の低減をもたらすことができる。さらに、治療的バイオアベイラビリティ、薬力学、及び薬物動態学的パラメータは、フォレートバイオコンジュゲートを含む、バイオコンジュゲートの使用により調節し得る。Ｇｏｄｗｉｎ，１９７２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，２２６６−２２７１は、生物活性プテロイルオリゴ−Ｌ−グルタメートの合成を報告している。Ｈａｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，９，２８３−２９１は、あるオリゴヌクレオチド−フォレートコンジュゲートの固相合成のための方法を記載している。Ｃｏｏｋ、米国特許第６，７２１，２０８号は、特異的なコンジュゲート基で修飾された、あるオリゴヌクレオチドを記載している。特異的オリゴヌクレオチドを含む外来分子の、膜を横切る輸送を促進するための、ビオチン及びフォレートコンジュゲートの使用は、Ｌｏｗら、米国特許第５，４１６，０１６、５，１０８，９２１、及び国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１２０９６号により報告されている。Ｍａｎｏｈａｒａｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／６６０６３号は、コンジュゲートの核酸成分に結合したホスホロアミダイト基をもつ、特異的な核酸フォレートコンジュゲートを含むあるフォレートコンジュゲート、及びこれらのフォレートコンジュゲートの合成法を記載している。Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，５０１６−５０２１は、あるタイプのフォレート−ヌクレオシドコンジュゲートの合成において有用な中間体、アルファ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］葉酸の合成を記載している。Ｇｕｚａｅｖら、米国特許第６，３３５，４３４号は、あるフォレートオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成を記載している。Ｖａｒｇｅｅｓｅら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０２／０９４１８５号及び米国特許出願公開第２００３０１３０１８６及び２００４０１１０２９６号は、ある核酸コンジュゲートを記載している。
他の細胞タイプへの送達は、あるタイプの細胞、例えば肝細胞に関連した受容体を利用することにより達成し得る。例えば、受容体介在性エンドサイトーシスを利用する薬剤
送達系は、薬剤標的化並びに薬剤取込み促進を達成するべく使用されてきた。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２参照）は、肝細胞に固有であり、そして分枝したガラクトース末端糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）に結合する。かかる糖タンパク質又は合成グリココンジュゲートの、受容体に対する結合は、オリゴ糖鎖の分枝の程度に強く依存する親和性をもって起こり、例えば、トリアンテナリー型構造は、バイアンテナリー型又はモノアンテナリー型鎖よりも大きい親和性をもって結合される（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ，１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，４，３１７−３２８は、ガラクトースに比較してより高い受容体に対する親和性をもつＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物基として使用することにより、この高い特異性を得た。この「クラスタリング効果」はまた、マンノシル末端をもつ糖タンパク質又はグリココンジュゲートの、結合及び取込みについても記載されてきた（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４，１３８８−１３９５）。細胞膜を横切って外来化合物を輸送するための、ガラクトース及びガラクトサミンベースコンジュゲートの使用は、ＨＢＶ及びＨＣＶ感染、又は肝細胞癌といった肝疾患の治療のための標的化送達アプローチを提供し得る。バイオコンジュゲートの使用はまた、治療に必要な治療用化合物の必要用量の低減を提供することができる。さらに、治療的バイオアベイラビリティ、薬力学、及び薬物動態学的パラメータは、バイオコンジュゲートの使用により調節可能である。
いくつかの研究グループにより、数多くのペプチドベースの細胞トランスポーターが開発されてきた。これらのペプチドは、インビトロ及びインビボにおいて、高い効率で細胞膜を横切ることができる。かかる膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペプチドの例は、ＡＮＴＥＮＮＡＰＥＤＩＡのホメオドメインの１６−アミノ酸フラグメント、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）転写因子（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９２，３３１８−３３２２）；ＮＬＳドメインをもつかもたない、カポジ線維芽細胞成長因子のシグナル配列の疎水領域に相当する１７量体フラグメント（Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，５９８−６０６）；カイマンクロコダイルのＩｇ（５）軽鎖の１７量体シグナルペプチド配列（Ｃｈａｌｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４３，６０１−６０８）；ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１１４の１７アミノ酸融合配列（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，２７３０−２７３６）；ＨＩＶ−１ Ｔａｔ４９−５７フラグメント（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１５６９−１５７２）；トランスポータンＡ−神経ペプチドガラニンのＮ末端フラグメントと、膜相互作用性スズメバチ毒ペプチド、マストパラレとからなるキメラ２７量体（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１１，６１９−６２６）；及びインフルエンザウイルス血球凝集素エンベロープ糖タンパク質由来の２４量体（Ｂｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２２，４６８１−４６８８）を包含する。これらのペプチドは、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートの一部として、細胞培養トランスフェクション用に、脂質なしで首尾よく使用された。多くの場合、かかるコンジュゲートは、脂質送達を使用してトランスフェクトされた親オリゴヌクレオチドより良好な細胞培養効率を示した。加えて、ファージディスプレイ技術の使用は、いくつかの臓器標的化及び腫瘍標的化ペプチドをインビボで同定してきた（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２，６９７−７１５）。ドキソルビシンに対する腫瘍標的化ペプチドのコンジュゲーションは、毒性プロフィールを有意に改善することが示されており、またインビボのネズミ癌モデルＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌において、ドキソルビシンの効果を増強することが示された（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，３７７−３８０）。
生物活性分子の細胞内送達のための別のアプローチは、カチオン性ポリマーの使用を包含する。例えば、Ｒｙｓｅｒら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ７９／００５１５号は、細胞膜を横切る種々の分子の輸送を増大するための、高分子量リジンポリマーの使用を記載している。Ｒｏｔｈｂａｒｄら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／５２６１４号は、生体膜を横切って薬剤及び高分子を輸送するための、ある方法及び組成物を記載しており、これにおいて、薬剤又は高分子は、その少なくとも５０％がグアニジノ又はアミジノ側鎖を含有する６から２５個までのサブユニットからなる輸送ポリマーに対し、共有結合により結合されている。当該輸送ポリマーは、好ましくは、全てＤ−、全てＬ−、又は、Ｄ−及びＬ−アルギニンの混合物からなる、ポリアルギニンペプチドである。Ｒｏｔｈｂａｒｄら、米国特許出願公開第２００３００８２３５６号は、皮膚、胃腸管、肺上皮、及び血液脳関門を含む、上皮組織を横切る薬剤及び他の薬剤の送達用の、あるポリ−リジン及びポリ−アルギニン化合物を記載している。Ｗｅｎｄｅｌら、米国特許出願公開第２００３００３２５９３号は、あるポリアルギニン化合物を記載している。ロスバードら、米国特許出願公開第２００３００２２８３１号は、薬剤の眼内送達用の、あるポリ−リジン及びポリ−アルギニン化合物を記載している。コサク、米国特許出願公開第２００１００３４３３３号は、架橋結合されたカチオン性ポリマー成分を包含する、あるシクロデキストランポリマー組成物を記載している。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第６，３９５，７１３号；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０４８１９号；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０５０９４号；及びＢｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許出願公開第２００３００７３６４０号は、ある脂質ベースの製剤を記載している。
生物活性分子の細胞内送達のための別のアプローチは、リポソーム又は他の粒子形成組成物の使用を包含する。１９９５年の、Ｂａｎｇｈａｍによるリポソームの最初の記載（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３，２３８−２５２）以来、薬学的に活性のある化合物の送達のための、脂質ベースの担体系の開発の領域には、持続した興味及び努力があった。リポソームは、それらが生体分子を分解から保護するとともに、その細胞取込みを改善することから、魅力的な薬剤担体である。ポリアニオン（例えば、ＤＮＡ）を送達するための、最も一般的に使用されるクラスのリポソーム製剤の１つは、カチオン性脂質を含有するものである。脂質集合体は、高分子とともに、カチオン性脂質を単独で、又は他の脂質及び両親媒性物質、例えばホスファチジルエタノールアミンを含めて使用することにより形成し得る。当該技術分野においては、脂質製剤の組成並びにその調製法の双方が、結果として得られるアニオン性高分子−カチオン性脂質集合体の、構造及びサイズに影響を及ぼすことが周知である。これらの因子を調節して、特定の細胞タイプへの、インビトロ及びインビボでのポリアニオンの送達を最適化することができる。生物活性分子の細胞送達のためのカチオン性脂質の使用には、いくつかの利点がある。カチオン性脂質を使用したアニオン性化合物の封入は、静電的相互作用により本質的に定量的である。さらに、カチオン性脂質は、負に帯電した細胞膜と相互作用して、細胞膜輸送を開始させると考えられている（Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，５６１６）。
プラスミドＤＮＡを小粒子内に被包し得て、これが脂質二重層のベシクル内に被包された単一のプラスミドからなることを、実験が示してきた（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，６，２７１−２８１）。これらの粒子は、典型的には、融合性脂質である、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベルのカチオン性脂質を含有し、かつポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）コーティングの存在により、水性媒体中で安定化することができる。これらの粒子は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に循環持続時間の延長を示すこと、種々の組織及び臓器又は腫瘍では、かかる領域内の血管透過性の増大により選択的に蓄積し得ること、及び、エンドソーム膜の破壊による、リソゾーム性のエンドサイトーシス経路を回避するべく設計可能であることから、全身適用に供される。こうした特性は、実験及び治療適用のための、種々の細胞タイプに対する生物活性分子の送達において有用であってよい。例えば、インビトロ及びインビボにおける、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス、リボザイム、デコイ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａ オリゴヌクレオチド、及びアプタマーといった、核酸技術の効果的な使用は、これらの化合物の細胞膜を横切る効果的な送達から恩恵を受けることができる。Ｌｅｗｉｓら、米国特許出願公開第２００３０１２５２８１号は、ｓｉＲＮＡ、ある両親媒性化合物、及びあるポリカチオンの組合せからなる、いくつかの組成物を記載している。ＭａｃＬａｃｈｌａｎ、米国特許出願公開第２００３００７７８２９号は、ある脂質ベースの製剤を記載している。ＭａｃＬａｃｈｌａｎ、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０５／００７１９６号は、脂質に被包された干渉ＲＮＡ製剤を記載している。Ｖａｒｇｅｅｓｅら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５００７８５４号は、ポリヌクレオチドの細胞送達用の、あるポリカチオン性組成物を記載している。ＭｃＳｗｉｇｇｅｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０５／０１９４５３、ＷＯ ０３／７０９１８、ＷＯ ０３／７４６５４号、及び米国特許出願公開第２００５００２０５２５及び２００５００３２７３３号は、低分子干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）及び、ｓｉＮＡ分子及び他のポリヌクレオチドの送達のための様々な技術を記載している。
さらに、カチオン性脂質に関連した最近の研究は、核酸（又は他のポリアニオン性化合物）とカチオン性脂質とを含んでなる、２つの構造的に異なる複合体の生成を示した（Ｓａｆｉｎｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１，７８−８１）。１つの構造は、カチオン性脂質二重層の間にサンドイッチされた核酸の単層をもつ、マルチラメラ構造を含んでなる（「ラメラ構造」）（図１３）。２番目の構造は、二次元ヘキサゴナル柱状相構造（「インバーティッドヘキサゴナル構造」）を含んでなり、これにおいて、核酸分子は、ヘキサゴナル構造の構成物中で、カチオン性脂質によって取り囲まれている（図１３）。Ｓａｆｉｎｙａらは、インバーティッドヘキサゴナル構造が、ラメラ構造よりもより効率的に哺乳類細胞をトランスフェクトすることを示した。さらに、光学顕微鏡研究は、ラメラ構造を含んでなる複合体が、アニオン性ベシクルに対し、該ベシクルに融合することなく安定に結合するのに対し、インバーティッドヘキサゴナル構造を含んでなる複合体は不安定であり、そして迅速にアニオン性ベシクルに融合し、融合時に核酸を放出することを示した。
ラメラ相からインバーティッドヘキサゴナル相複合体への構造トランスフォーメーションは、インバーティッドヘキサゴナル構造の採用において助けとなる適当なヘルパー脂質を取り入れることによるか、又はヘキサノールのようなコサーファクタントを使用することにより達成される。しかしながら、これらのトランスフォーメーション条件はいずれも、生物系における送達には適さない。さらに、インバーティッドヘキサゴナル複合体は、より大きいトランスフェクション効率を示す一方で、ラメラ複合体に比較して非常に低い血清安定性をもつ。したがって、血清安定性があり、すなわち循環において安定であり、かつ、構造トランスフォーメーションを、例えば、ラメラ相からインバースヘキサゴナル相へ、生体条件下で受け得る送達剤を設計する必要がある。
本出願は、生物活性分子を、１つ以上の担体分子と一緒に全身及び局所に送達するための効率を、有意に改善するための、化合物、組成物及び方法を提供する。中でも、本出願は、循環において安定であり、かつ適当な生理的条件（例えば、ｐＨ）下で構造変化を受け、そのことが、１つ以上の担体と一緒の生物活性分子の送達効率を増大させる、新規な送達剤を作成及び使用するための、化合物、組成物、及び方法を提供する。
種々の脂質核酸粒子及びその調製法は、米国特許出願公開第２００３００７７８２９、２００３０１０８８８６、２００６００５１４０５、２００６００８３７８０、２００３０１０４０４４、２００６００５１４０５、２００４０１４２０２５、２００６００８３７８８０、２００５００６４５９５、２００５／０１７５６８２、２００５／０１１８２５３、２００５０２５５１５３、及び２００５０００８６８９号；及び米国特許第５，８８５，６１３；６，５８６，００１；６，８５８，２２５；６，８５８，２２４；６，８１５，４３２；６，５８６，４１０；６，５３４，４８４；及び６，２８７，５９１号に記載されている。
Ｖａｇｌｅら、米国特許出願公開第２００６０２４０５５４号は、生物活性分子の送達用のための、脂質ナノ粒子ベースの組成物及び方法を記載している。
Ｂａｌｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０（１４），４２５９−４２７７は、エタノール沈澱と、それに続く酵母ｔＲＮＡ担体の添加とにより、二本鎖ｃＤＮＡを単離するための一般法を記載している。
Ｓｔｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２２５（２），５２９−５３３は、同調されたＣＶ−１細胞における、高Ｍｒ担体ＤＮＡによるＤＮＡ媒介遺伝子伝達の増強を記載している。
発明の要旨
本発明は、生物活性分子の活性を強化するための、新規な組成物及び方法に関する。特に本発明は、１つ以上の担体分子及び／又は１つ以上の生物活性分子を包含する、送達ビヒクルを含んでなる組成物を特徴とする。本発明の組成物は、生物活性分子の活性及び／又は細胞内送達を強化し、それにより、実質的に低減された生物活性分子の濃度又は用量を用いて、同等の生物活性を提供する。当該担体分子は、生物学的に不活性（ｉｎｅｒｔ）、非活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）、又は減弱されているか；或いはまた、興味のある生物活性分子と同じか又は異なる方法で、生物学的に活性であってもよい。生物活性分子の細胞内送達を強化するための、新規な組成物及び方法は、インビトロ及びインビボ双方の適用において利用可能である。
１つの実施態様においては、本発明は、１つ以上の生物活性分子を包含する第１のビヒクルと、１つ以上の担体分子を包含する第２のビヒクルとを、例えば不均一な集団として、含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、第１のビヒクルと第２のビヒクルとは、生物活性分子及び担体分子を除いて同じである（製剤タイプＡ１と呼ぶ、図１Ａ参照）。さらに別の実施態様においては、第１のビヒクルと第２のビヒクルとは、異なっている（製剤タイプＡ２と呼ぶ、図１Ｂ参照）。１つの実施態様においては、第１のビヒクルは、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、１つ以上の生物活性分子と１つ以上の担体分子とを包含するビヒクルを、例えば均一な集団として、含んでなる組成物を特徴とする（製剤タイプＢと呼ぶ、図２参照）。１つの実施態様においては、当該組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、１つ以上の担体分子と、１つ以上の生物活性分子を包含するビヒクルとを、例えば不均一な集団として、含んでなる組成物を特徴とする（製剤タイプＣと呼ぶ、図３参照）。１つの実施態様においては、当該組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、１つ以上の担体分子を包含する第１の製剤と、１つ以上の生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、他の核酸分子、及び／又は本明細書に記載の他の生物活性分子）を包含する第２の製剤、カチオン性脂質、中性脂質、及びポリエチレングリコールコンジュゲート、例えばＰＥＧ−ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、第１及び／又は第２の製剤は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。別の実施態様においては、第１及び／又は第２の製剤は、さらに、アルコール又は界面活性剤を含んでなる。別の実施態様においては、第１及び／又は第２の製剤は、さらに、リネオイル（ｌｉｎｅｏｙｌ）アルコールを含んでなる。この組成物は、全般的に本明細書において、ＬＮＰ製剤タイプＡと呼ばれる（図４参照）。１つの実施態様においては、第２の製剤は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、１つ以上の担体分子、１つ以上の生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、他の核酸分子、及び／又は本明細書に記載の他の生物活性分子）、カチオン性脂質、中性脂質、及びポリエチレングリコールコンジュゲート、例えばＰＥＧ−ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを包含する製剤を含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、該製剤はさらに、コレステロールまたはコレステロール誘導体を含んでなる。別の実施態様においては、該製剤はさらに、アルコール又は界面活性剤を含んでなる。１つの実施態様においては、該製剤はさらに、リネオイルアルコールを含んでなる。この組成物は、全般的に本明細書において、ＬＮＰ製剤タイプＢと呼ばれる（図５参照）。１つの実施態様においては、該組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、１つ以上の担体分子と、１つ以上の生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、他の核酸分子、及び／又は本明細書に記載の他の生物活性分子）、カチオン性脂質、中性脂質、及びポリエチレングリコールコンジュゲート、例えばＰＥＧ−ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを包含する製剤、とを含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、該製剤はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。別の実施態様においては、該製剤はさらに、アルコール又は界面活性剤を含んでなる。別の実施態様においては、該製剤はさらに、リネオイルアルコールを含んでなる。この組成物は、全般的に本明細書において、ＬＮＰ製剤タイプＣと呼ばれる（図６参照）。１つの実施態様においては、該組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の生物活性分子は、１つ以上のヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、アロザイム、アプタマー、デコイ及、又は小核酸分子（低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＲＮＡｉ阻害剤分子、及び／又はそれらの任意の組合せを包含する）を含んでなる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０６／０３２１６８（その記載全体が参考として本明細書に含まれる）を参照）。
１つの実施態様においては、本発明の生物活性分子は、１つ以上の抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体など）、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、ワクチン、抗生物質、化学療法剤、低分子、ビタミン、及び／又はコファクターを含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の担体分子は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、中性脂質）、ペプチド、タンパク質、ステロイド（例えば、コレステロール、エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココーチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチソール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、及び／又は成長ホルモン）、低分子、ビタミン、コファクター、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド（例えば、単鎖、二本鎖、又は三本鎖）、及び／又は、当該技術分野において一般に認められるポリマー、又はそれらの任意の組合せを含んでなる。１つの実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドベースの担体分子は、例えば、長さ約２ないし約１００，０００塩基の、単鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子；例えば、長さ約２ないし約１００，０００塩基対の、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子、又は、例えば、長さ約２ないし約１００，０００塩基対の、三本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を包含する、１つ以上の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドベースの担体分子は、非ヒト精子ＤＮＡのような、様々な種に由来する非ヒトＤＮＡ、を含んでなる（例えば、サケ精子ＤＮＡを記載しているＪＰ６３１０２６８２を参照）。別の実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドベースの担体分子は、非ヒトｔＲＮＡのような、様々な種に由来する非ヒトＲＮＡを含んでなる。１つの実施態様においては、ポリヌクレオチド担体分子は、本明細書に記載の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子である。別の実施態様においては、ポリヌクレオチド担体分子は、標的核酸分子（これは、同じ組成物中の生物活性分子によって標的とされる）に対し相補的ではない。例えば、本発明の生物活性分子が標的ポリヌクレオチド配列に相補性をもつｓｉＮＡを含んでなる場合には、本発明の組成物において利用される核酸ベースの担体分子は、該標的ポリヌクレオチド配列に対し相補性をもたない配列からなる。１つの実施態様においては、本発明の担体分子は、本発明の製剤の成分である。
１つの実施態様においては、本発明の二本鎖担体分子を設計して、ＲＩＳＣ−ローディング（積み込み）の良好な基質ではないようにする。例えば、二本鎖担体分子を化学的に修飾し、例えば、１つ以上の末端キャップ成分（例えば、二本鎖担体分子の一方又は双方の鎖の、５’末端、３’末端、又は、５’及び３’双方の末端）の取込みによるか、又は、二本鎖担体分子の１つ以上のヌクレオチドの化学修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、又は本明細書の任意の別の修飾を含む、２’−置換ヌクレオチドの取込み）により、ＲＩＳＣの基質ではないようにすることができる。別の実施態様においては、二本鎖担体分子は、例えば、該二本鎖担体分子の一方又は双方の末端において１つ以上の塩基対のＴｍを上げることにより、その配列がＲＩＳＣ−ローディングを受けにくいように設計される。
１つの実施態様においては、本発明のビヒクルは、１つ以上のトランスフェクション剤、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、カプシド、ウイロイド、ビリオン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、タンパク質ケージ、フェリチン、ヒドロゲル、又は、本明細書に記載の、若しくは当該技術分野において一般に認められたポリマーを含んでなる組成物である。
１つの実施態様においては、本発明のビヒクルは、１つ以上の脂質ナノ粒子又はＬＮＰ組成物を含んでなり、例えば、本明細書（例えば表ＩＶ）及び、米国特許出願公開第２００６０２４０５５４号及び２００６年１０月２４日出願のＵＳＳＮ １１／５８６，１０２（これら双方は、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載のＬＮＰ組成物を参照のこと。
１つの実施態様においては、本発明のビヒクルは、１つ以上の安定な核酸粒子またはＳＮＡＬＰ組成物を含んでなり、例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０１２１９１号及び米国特許出願公開第２００６０８３７８０、２００６０５１４０５号、ＵＳ２００５１７５６８２、ＵＳ２００４１４２０２５、ＵＳ２００３０７７８２９、ＵＳ２００６２４００９３（これらは全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）を参照のこと。
１つの実施態様においては、本発明のビヒクルは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５１０５１５２及びＷＯ２００７０１４３９１号、及び米国特許第７，１４８，２０５、７，１４４，８６９、７，１３８，３８２、７，１０１，９９５、７，０９８，０３２、７，０９８，０３０、７，０９４，６０５、７，０９１，０４１、７，０８７，７７０、７，０７１，１６３、７，０４９，１４４、７，０４９，１４２、７，０４５，３５６、７，０３３，６０７、７，０２２，５２５、７，０１９，１１３、７，０１５，０４０、６，９３６，７２９、６，９１９，０９１、６，８９７，０６８、６，８８１，５７６、６，８７２，５１９、６，８６７，１９６、６，８１８，６２６、６，７９４，１８９、６，７４０，６４３、６，７４０，３３６、６，７０６，９２２、６，６７３，６１２、６，６３０，３５１、６，６２７，６１６、６，５９３，４６５、６，４５８，３８２、６，４２９，２００、６，３８３，８１１、６，３７９，９６６、６，３３９，０６７、６，２６５，３８７、６，２６２，２５２、６，１８０，７８４、６，１２６，９６４、６，０９３，７０１、及び５，７４４，３３５号（これらは全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された、１つ以上の送達系を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のビヒクルは、１つ以上のペプチド又はペプチド関連送達系を含んでなり、例えば、米国特許出願公開第２００６００４０８８２、２００５０１３６４３７、２００５００３１５４９、及び２００６００６２７５８号（これらは全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）参照。
１つの実施態様においては、本発明のビヒクルは、タンパク質、例えばアルブミン、コラーゲン、及びゼラチン；多糖類、例えばデキストラン及びデンプン；及び、ポリラクチド（ＰＬＡ），ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ラクチド−グリコリドコポリマー（ＰＬＧ）、ポリ（乳酸−グリコール酸）共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ラクチド−カプロラクトンコポリマー、ポリヒドロキシブチラート、ポリアルキルシアノアクリラート、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、アクリラートポリマー及びコポリマー、例えば、メチルメタクリラート、メタクリル酸、ヒドロキシアルキルアクリラート及びメタクリラート、エチレングリコールジメタクリラート、アクリルアミド及び／又はビスアクリルアミド、セルロースベースポリマー、エチレングリコールポリマー及びコポリマー、オキシエチレン及びオキシプロピレンポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、及び／又はそれらの任意の組合せを含む、マトリックス形成組成物を含んでなる。
種々の実施態様において、本発明は、生物活性分子、例えば抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体など）、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、低分子、ビタミン、コファクター、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、アロザイム、アプタマー、デコイ及びその類似体、及び、小核酸分子、例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を、例えば患者又は生体中の、関係する細胞及び／又は組織に対し、１つ以上の担体分子と一緒に、効率的にトランスフェクト又は送達する、新規なカチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、及びトランスフェクション剤に関する。
１つの実施態様においては、本発明は、種々の生物活性分子の、生体系、例えば細胞内への送達を促進するための、担体化合物、組成物、及び方法であることを特徴とする。本発明により提供される担体化合物、組成物、及び方法は、細胞膜を横切るか、又は上皮若しくは内皮組織の１つ以上の層を横切る、治療用化合物の輸送を強化することにより、治療活性を付与し得る。かかる担体化合物、組成物、及び方法の使用は、生物活性分子の細胞内送達の強化を可能にし、したがって、実質的に低用量の活性化合物の使用を可能にするか、或いはまた、より少ない副作用でより高い用量を可能にする。
１つの実施態様においては、本発明は、制限されることなく、低分子、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗体、毒素、負に帯電したポリマー、及び他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、又はポリアミンを含む生物活性分子の、１つ以上の担体化合物又は組成物と一緒の、細胞膜を横切る送達のための、新規薬剤の設計及び合成を包含する。本発明の化合物及び方法を用いて細胞膜を横切って送達し得るポリヌクレオチドの非限定的な例は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）（これはｓｉＲＮＡを包含する）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、酵素的核酸分子、２’、５’−オリゴアデニレート、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アプタマー、デコイ、及び遺伝子療法適用のためのｃＤＮＡを包含する。一般に、記載されたトランスポーターは、個別に、又は多成分系の一部として、分解可能なリンカーを用いるか又は用いずに使用するべく設計される。本発明化合物は、組成物中に製剤された場合、種々の組織に由来する多くの細胞タイプ内への、血清の存在下又は非存在下での送達を改善することが期待される。
本発明の化合物、組成物、及び方法は、生物活性物質（例えば、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ阻害剤、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、抗体、及び低分子）を、細胞へ、又は、上皮及び内皮組織、例えば、皮膚、粘膜、血管組織、胃腸組織、血液脳関門組織、眼科的組織、肺組織、肝組織、心臓組織、腎組織その他を横切って送達するのに有用である。本発明の化合物、組成物、及び方法は、投与の特定部位への送達用のため及び全身送達のための双方に使用可能である。
本発明の化合物、組成物、及び方法は、細胞又は組織への、生物活性物質（例えば、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ阻害剤、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、抗体、及び低分子）の送達またはアベイラビリティを、本発明の化合物、組成物、及び方法を用いない分子送達に比較して、増大することができる。すなわち、本発明の化合物、及び組成物の存在下では、細胞、組織、又は生体の内側の生物活性分子のレベルは、本発明の化合物、組成物の不在下に比較して、増大される。
１つの態様においては、本発明は、新規なカチオン性脂質、トランスフェクション剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、及びそれらのを１つ以上の担体分子と一緒に生物活性分子を用いた製剤であること特徴とする。別の実施多様においては、本発明は、患者又は生体において、遺伝子発現及び／又は活性の調節に応答する、形質、疾患、及び症状を、研究、診断、及び治療するための、組成物、及び使用法であることも特徴とする。別の実施態様においては、本発明は、新規なカチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子トランスフェクション剤及び、小核酸分子、例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、及びその阻害剤（ＲＮＡｉ阻害剤）を、例えば患者又は生体中の、関係する細胞及び／又は組織に対し、１つ以上の担体分子と一緒に、効率的にトランスフェクト又は送達する製剤であることを特徴とする。かかる新規な製剤は、担体組成物、カチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、トランスフェクション剤を含んでなり、かつ製剤は、例えば、本明細書に記載の、細胞、患者又は生体における疾患、症状、又は形質を、予防、阻害、又は治療するための組成物の提供において有用である。
１つの態様においては、本発明は、種々のカチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、トランスフェクション剤、及び、１つ以上の担体分子と一緒に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、例えば患者又は生体内の、細胞、組織において、標的遺伝子の発現又は活性を調節する、化学修飾された合成低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子及び／又はＲＮＡｉ阻害剤の、送達用の製剤であることを特徴とする。化学修飾されたｓｉＮＡの使用は、インビボのヌクレアーゼ分解に対する増大された抵抗性、改善された細胞取込み、及び改善されたインビボの薬物動態学的性質により、天然ｓｉＲＮＡ分子の種々の特性を改善する。担体分子の使用は、細胞取込み、フソジェニシティ（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、及び／又は、治療用ペイロード（例えばｓｉＮＡ）のエンドソーム放出を改善し、したがって、インビトロ及び／又はインビボでの同じ治療効果を、より少ない活性治療組成物の投与量で可能にする。本発明の担体分子、カチオン性脂質、マイクロ粒子、ナノ粒子、トランスフェクション剤、製剤、及び、ｓｉＮＡ分子及びＲＮＡｉ阻害剤は、様々な治療、獣医学、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、及びファーマコゲノミクスに応用するための、有用な試薬及び方法を提供する。
１つの態様においては、本発明は、タンパク質、例えば、疾患、形質、又は症状、例えば肝臓の疾患、形質、又は症状の、維持及び／又は発生に関連するタンパク質、をコードしている標的遺伝子の発現を、独立して又は組合せて調節する、組成物及び方法であることを特徴とする。これらの遺伝子は、本明細書では全般的に、標的遺伝子と呼ばれる。かかる標的遺伝子は、当該技術分野において一般的に知られており、かかる遺伝子の転写物は、一般に、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号により参照され、例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／７４６５４号、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、及び米国特許出願第１０／９２３，５３６号を参照のこと（これらはともに参考として本明細書に含まれる）。本発明の種々の態様及び実施態様についての以下の記載は、例示的な標的遺伝子及び標的遺伝子転写物について提供されている。しかしながら、種々の態様及び実施態様はまた、他の標的遺伝子、例えば遺伝子ホモローグ、遺伝子転写物バリアント、及び、ある標的遺伝子に関連した遺伝子多形（例えば、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）にも関係している。すなわち、種々の態様及び実施態様はまた、例えば、疾患、形質、又は症状の、維持及び／又は発生に関連している、シグナル伝達又は遺伝子発現の経路に関与する別の遺伝子にも関係している。これらの付加的な遺伝子は、本明細書の標的遺伝子について記載された方法を使用して、標的部位について分析し得る。したがって、他の遺伝子の調節及び、他の遺伝子のかかる調節の効果は、本明細書に記載のように実施、判定、及び測定し得る。
１つの実施態様においては、本発明は、各々が約１０ｎｍないし１０００ｎｍのサイズを有している、第１の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクル、及び第２の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物を特徴とし、これにおいて：第１のビヒクルはさらに、１つ以上の生物活性分子を含んでなり；第２のビヒクルはさらに、１つ以上の担体分子を含んでなり；かつ各々のビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなる。１つの実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルは、同じ組成の脂質成分を含んでなる。別の実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルは、異なる組成の脂質成分を含んでなる。１つの実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルは、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’、６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる。１つの実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルは、さらにリノレイルアルコールを含んでなる。別の実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールは、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有する。別の実施態様においては、脂質ナノ粒子は、５０ないし５００ｎｍ、又は１００ないし２００ｎｍのサイズを有する。
１つの実施態様においては、本発明は、約１０ｎｍないし約１０００ｎｍのサイズを有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物を特徴とし、これにおいて：ビヒクルはさらに、１つ以上の生物活性分子を含んでなり；ビヒクルはさらに、１つ以上の担体分子を含んでなり；かつ該脂質ナノ粒子ビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルは、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’、６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルはさらに、リノレイルアルコールを含んでなる。別の実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールは、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有する。別の実施態様においては、脂質ナノ粒子は、５０ないし５００ｎｍ、又は１００ないし２００ｎｍのサイズを有する。１つの実施態様においては、組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、約１０ｎｍないし約１０００ｎｍのサイズを有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物を特徴とし、これにおいて：ビヒクルはさらに、１つ以上の生物活性分子を含んでなり；組成物はさらに、１つ以上の担体分子を含んでなり；かつ脂質ナノ粒子ビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルは、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’、６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルはさらに、リノレイルアルコールを含んでなる。別の実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールは、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有する。別の実施態様においては、脂質ナノ粒子は、５０ないし５００ｎｍ、又は１００ないし２００ｎｍのサイズを有する。１つの実施態様においては、組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なる生物活性分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、各々が約１０ｎｍないし１０００ｎｍのサイズを有している、第１の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルと、第２の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルとを含んでなる組成物を特徴とし、これにおいて：第１のビヒクルはさらに、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長を有しているセンス鎖及び相補的なアンチセンス鎖を含んでなる１つ以上の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなり、ここで、アンチセンス鎖は、哺乳類のＲＮＡ配列に相補的な１５ないし３０個のヌクレオチドを含んでなり、かつセンス鎖は、前記哺乳類のＲＮＡ配列の１５ないし３０個のヌクレオチドを含んでなり；第２のビヒクルはさらに、前記哺乳類のＲＮＡ配列に相補的ではない、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸配列を含んでなる１つ以上の担体分子を含んでなり；かつ各ビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなる。１つの実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルは、同じ組成の脂質成分を含んでなる。別の実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルは、異なる組成の脂質成分を含んでなる。１つの実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルは、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’、６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる。１つの実施態様においては、各脂質ナノ粒子ビヒクルはさらに、リノレイルアルコールを含んでなる。別の実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールは、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有する。別の実施態様においては、該脂質ナノ粒子は、５０ないし５００ｎｍ、又は１００ないし２００ｎｍのサイズを有する。１つの実施態様においては、組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なるｓｉＮＡ分子を、例えばカクテルとして含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、約１０ｎｍないし約１０００ｎｍのサイズを有している、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物を特徴とし、これにおいて：該ビヒクルはさらに、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長を有している、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖を含んでなる１つ以上の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなり、ここで、アンチセンス鎖は、哺乳類のＲＮＡ配列に相補的な１５ないし３０個のヌクレオチドを含んでなり、かつセンス鎖は、前記哺乳類のＲＮＡ配列の１５ないし３０個のヌクレオチドを含んでなり；該ビヒクルはさらに、前記哺乳類のＲＮＡ配列に相補的ではない、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸配列を含んでなる１つ以上の担体分子を含んでなり；かつ脂質ナノ粒子ビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルは、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’、６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルはさらに、リノレイルアルコールを含んでなる。別の実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールは、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有する。別の実施態様においては、脂質ナノ粒子は、５０ないし５００ｎｍ、又は１００ないし２００ｎｍのサイズを有する。１つの実施態様においては、組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なるｓｉＮＡ分子を、例えばカクテルとして含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、約１０ｎｍないし約１０００ｎｍのサイズを有している、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物を特徴とし、これにおいて：ビヒクルはさらに、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長を有している、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖を含んでなる１つ以上の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなり、ここで、アンチセンス鎖は、哺乳類のＲＮＡ配列に相補的な１５ないし３０個のヌクレオチドを含んでなり、かつ該センス鎖は、前記哺乳類のＲＮＡ配列の１５ないし３０個のヌクレオチドを含んでなり；組成物はさらに、前記哺乳類のＲＮＡ配列に相補的ではない、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸配列を含んでなる１つ以上の担体分子を含んでなり；かつ脂質ナノ粒子ビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルは、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’、６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる。１つの実施態様においては、脂質ナノ粒子ビヒクルはさらに、リノレイルアルコールを含んでなる。別の実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールは、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有する。別の実施態様においては、該脂質ナノ粒子は、５０ないし５００ｎｍ、又は１００ないし２００ｎｍのサイズを有する。１つの実施態様においては、組成物は、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）異なるｓｉＮＡ分子を、例えばカクテルとして含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（例えば、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールであり、この化合物は、本明細書では全般的に、ＣＬｉｎＤＭＡ又は、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンと呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＩＩ：
Figure 2010519203
 ［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＩＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、そしてＲ３及びＲ４は、オレイルであり、この化合物は、本明細書では全般的に、ＤＭＯＢＡ又は、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオエレイルオキシベンジルアミンと呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＶＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＶＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＶＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；そして、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、そしてＲ３及びＲ４は、リノルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＩＸ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバメート カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＩＩａ又はＣＬＸＩＩｂ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ０及び、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＩＶａ及びＣＬＸＩＶｂ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ０及び、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌはリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｌは、リンカーであり、そして各Ｒ３は、独立して、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、コレステロールであり、そしてＬは、ブチルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＶＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；各Ｌは、リンカーであり、その構造は、他のＬとは独立しており、そして各Ｒ３は、独立して、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、Ｒ３は、コレステロールであり、そしてＬは、ブチルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＶＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり、そしてＲ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、そしてＲ３は、リノイルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＶＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、メチルであり、そしてＲ３は、リノイルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＩＸ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、そしてＬはリンカーである］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。である。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＩＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、そしてＬはリンカーである］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。である。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、そしてＬはリンカーである］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。である。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＶＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＶＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、そしてＬはリンカーである］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。である。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又はポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＶＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＩＸ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素であり；Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３又はＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立してリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はない、ポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（例えば、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立してリンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ５は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ５は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＩＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＶＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＶＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＩＸ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＸ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＸＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルであり、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、独立して、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＸＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、各Ｌは、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、各Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＸＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ８−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、エーテル、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、ドデシル（Ｃ１２）である。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＸＩＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ８−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、エーテル、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、ドデシル（Ｃ１２）である。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＸＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ８−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、エーテル、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、ドデシル（Ｃ１２）である。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＣＬＸＸＸＸＶＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ８−Ｃ２４脂肪族炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよく、そして各Ｌは、独立して、リンカーであり、これらは、存在してもしなくてもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ジスルフィド結合があるか又はないポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、エーテル、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、ドデシル（Ｃ１２）である。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、オレイルである。
１つの実施態様においては、ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩの任意の化合物は、生分解性の結合、例えば：
Figure 2010519203
といったジスルフィド結合を、Ｌとして包含する。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＮＬＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、又は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素又若しくはアルコールであり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１はＯＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルか、或いはその対応するアルコールである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（例えば、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１は、ＯＨであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＮＬＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、又は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素又若しくはアルコールであり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルか、或いはその対応するアルコールである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１は、ＯＨであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＮＬＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素又若しくはアルコールであり；そして各Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪族飽炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルか、或いはその対応するアルコールである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ１は、ＯＨであり、そしてＲ３及びＲ４は、オレイルであり、この化合物は、本明細書では全般的に、ＤＯＢＡ又は、ジオレイルオキシベンジルアルコールと呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＮＬＩＶ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素又若しくはアルコールであり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルか、或いはその対応するアルコールである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１は、ＯＨであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＮＬＶ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素又若しくはアルコールであり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌは、リンカーであり、そしてＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルか、或いはその対応するアルコールである。１つの実施態様においては、Ｒ３は、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ４は、コレステロールである。１つの実施態様においては、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、Ｌは、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。１つの実施態様においては、Ｒ１は、ＯＨであり、Ｒ３は、リノイルであり、Ｌは、ブチルであり、そしてＲ４は、コレステロールである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＮＬＶＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素又若しくはアルコールであり；Ｒ３は、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、Ｌは、リンカーである］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルか、或いはその対応するアルコールである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。１つの実施態様においては、各Ｌは、独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ポリエチレングリコールリンカーである。別の実施態様においては、各Ｌは、独立して、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニルリンカーである。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＮＬＶＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキニル、又はアリール炭化水素又若しくはアルコールであり；Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、Ｃ９−Ｃ２４脂肪族飽和又は不飽和炭化水素であり、これらは、同じか又は異なってもよい］を有する化合物を特徴とする。１つの実施態様においては、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はブチルか、或いはその対応するアルコールである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、リノイル、イソステアリル、オレイル、エライジル、ペトロセリニル、リノレニル、エラエオステアリル、アラキジル、ミリストイル、パルミトイル、又はラウロイルである。１つの実施態様においては、Ｒ３及びＲ４は、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロイドホルモン、又は胆汁酸である。
１つの実施態様においては、式ＣＬＩ−ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶＩＩ−ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＶＩ、及びＣＬＸＸＶＩＩＩ−ＣＬＸＸＸＩＸを有する任意の化合物の、各Ｏ−Ｒ３及び／又はＯ−Ｒ４は、さらにリンカーＬを含んでなり（例えば、ここで、上記に示された−Ｏ−Ｒ３及び／又は−Ｏ−Ｒ４は、−Ｏ−Ｌ−Ｒ３及び／又は−Ｏ−Ｌ−Ｒ４である）、これにおいて、Ｌは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、又は、ポリエチレングリコール、アセタール、アミド、スクシニル、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又は、当該技術分野において一般に知られている他のリンカーである。
１つの実施態様においては、本発明の製剤（例えば、本発明の製剤分子組成物（ＦＭＣ）又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））は、式ＮＬＩ−ＮＬＶＩＩのいずれかを有する中性脂質である。
ステロイドホルモンの例は、コレステロール、エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココーチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチソール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、及び／又は成長ホルモンを含んでなるものを包含する。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、他の核酸分子、及び／又は本明細書に記載の他の生物活性分子）、カチオン性脂質、中性脂質、及びポリエチレングリコールコンジュゲート、例えば、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、該組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。本明細書に記載の組成物は、全般的に、製剤分子組成物（ＦＭＣ）、又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と呼ばれる。本発明のある実施例においては、製剤分子組成物（ＦＭＣ）、又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
適当なカチオン性脂質は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨにおいて、正味の負電荷をもつカチオン性脂質を包含する。特に有用なカチオン性脂質は、比較的小さい頭部基、例えば、第三級アミン、第四級アミン、又はグアニジン頭部基、及び立体障害性の非対称脂質鎖を有するものを包含する。本明細書に記載の任意の実施態様においては、カチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＸＶＩ；ＣＬＸＸＸＸＩＩＩ；ＣＬＸＸＸＸＩＶ；ＣＬＸＸＸＸＶ；ＣＬＸＸＸＸＶＩ；Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−スペルミンカルボキサミド）エチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、及び／又はそれらの混合物、並びに、類似の性質を共有する他のカチオン性脂質、を含んでなるものから選択し得る。上記のカチオン性脂質は、当該技術分野において既知の、種々の異なる塩を包含し得る。これらのカチオン性脂質の非限定的な例は、図７ないし１１に示されている。
ある実施態様においては、カチオン性脂質の頭部基は、切断可能又は切断不能のリンカー、例えば、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別のリンカーを介して、脂質に結合し得る。適当なリンカーの非限定的な例は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニル、を含んでなるものを包含する。
適当な中性脂質は、安定な複合体を産生し得る、任意の多様な中性非荷電性、両性イオン性、又はアニオン性脂質を含んでなるものを包含する。それらは、好ましくは中性であるが、択一的に正又は負に帯電し得る。本明細書に記載の任意の実施態様においては、適当な中性脂質は、式ＮＬＩないしＮＩＶＩＩを有する化合物、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、コレステロール、並びに、以下の本明細書に記載の他の中性脂質、及び／又はそれらの混合物、から選択されるものを包含する。
適当なポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール、又はポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）のコンジュゲートは、独立して約Ｃ４ないし約Ｃ４０の飽和又は不飽和炭素原子を含んでなるアルキル鎖長を有する、ジアルキルグリセロール又はジアルキルグリカミド基を含んでなるものを包含する。該ジアルキルグリセロール又はジアルキルグリカミド基は、さらに、１つ以上の置換アルキル基を含んでいてもよい。本明細書に記載の任意の実施態様において、該ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ−１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、及びＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）、及びＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、から選択し得る。
１つの実施態様においては、本発明は、本明細書の、Ｌ０５１、Ｌ０５３、Ｌ０５４、Ｌ０６０、Ｌ０６１、Ｌ０６９、Ｌ０７３、Ｌ０７７、Ｌ０８０、Ｌ０８２、Ｌ０８３、Ｌ０８６、Ｌ０９７、Ｌ０９８、Ｌ０９９、Ｌ１００，Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｌ１１０、Ｌ１１１、Ｌ１１２、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１５、Ｌ１１６、Ｌ１１７、Ｌ１１８、Ｌ１２１、Ｌ１２２、Ｌ１２３、Ｌ１２４、Ｌ１３０、Ｌ１３１、Ｌ１３２、Ｌ１３３、Ｌ１３４、Ｌ１４９、Ｌ１５５、Ｌ１５６、Ｌ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ｌ１６５、Ｌ１６６、Ｌ１６７、Ｌ１７４、Ｌ１７５、Ｌ１７６、Ｌ１８０、Ｌ１８１、及び／又はＬ１８２（表ＩＶ参照）として製剤された、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）を含んでなる組成物を特徴とする。
他の適当なＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−コレステロール又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを包含する。１つの実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、飽和又は不飽和脂質鎖、例えば、オレイル、リノレイル、及び類似の脂質鎖に結合したＰＥＧを包含する。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、任意の式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩを有するカチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−ＤＡＧ（すなわち、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール、又はポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、該組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。別の実施態様においては、該組成物は、本明細書の、Ｌ０５１、Ｌ０５３、Ｌ０５４、Ｌ０６０、Ｌ０６１、Ｌ０６９、Ｌ０７３、Ｌ０７７、Ｌ０８０、Ｌ０８２、Ｌ０８３、Ｌ０８６、Ｌ０９７、Ｌ０９８、Ｌ０９９、Ｌ１００，Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｌ１１０、Ｌ１１１、Ｌ１１２、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１５、Ｌ１１６、Ｌ１１７、Ｌ１１８、Ｌ１２１、Ｌ１２２、Ｌ１２３、Ｌ１２４、Ｌ１３０、Ｌ１３１、Ｌ１３２、Ｌ１３３、Ｌ１３４、Ｌ１４９、Ｌ１５５、Ｌ１５６、Ｌ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ｌ１６５、Ｌ１６６、Ｌ１６７、Ｌ１７４、Ｌ１７５、Ｌ１７６、Ｌ１８０、Ｌ１８１、及び／又はＬ１８２（表ＩＶ参照）として製剤される。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含んでなるカチオン性脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含んでなる中性脂質、ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧ、及びコレステロールを含んでなる組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は、それぞれ４８：４０：１０：２であり、この組成物は、本明細書では全般的に製剤Ｌ０５１と呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）を含んでなるカチオン性脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含んでなる中性脂質、ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧ、及びコレステロールを含んでなる組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ＤＭＯＢＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は、それぞれ３０：２０：４８：２であり、この組成物は、本明細書では全般的に製剤Ｌ０５３と呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）を含んでなるカチオン性脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含んでなる中性脂質、ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧ、及びコレステロールを含んでなる組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ＤＭＯＢＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は、それぞれ５０：２０：２８：２であり、この組成物は、本明細書では全般的に製剤Ｌ０５４と呼ばれる。別の実施態様においては、該組成物はさらに、中性脂質、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含んでなるカチオン性脂質、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）を含んでなるカチオン性脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含んでなる中性脂質、ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧ、及びコレステロールを含んでなる組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ：ＤＭＯＢＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は、それぞれ２５：２５：２０：２８：２であり、この組成物は、本明細書では全般的に製剤Ｌ０７３と呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含んでなるカチオン性脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含んでなる中性脂質、ＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）を含んでなるＰＥＧ、及びコレステロールを含んでなる組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ＣＬｉｎＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−Ｃｈｏｌのモル比は、それぞれ４８：４０：１０：２であり、この組成物は、本明細書では全般的に製剤Ｌ０６９と呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン）（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）を含んでなるカチオン性脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含んでなる中性脂質、ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧ、及びコレステロールを含んでなる組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は、それぞれ３０：２０：４８：２であり、この組成物は、本明細書では全般的に製剤Ｔ０１８．１と呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）を含んでなるカチオン性脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含んでなる中性脂質、ＰＥＧ−ｎ−ジミリスチルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧ、及びコレステロールを含んでなる組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ＤＯＤＭＡ：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比は、それぞれ３０：２０：４８：２であり、この組成物は、本明細書では全般的に製剤Ｔ０１９．１と呼ばれる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）と、任意の
式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＸＶ、又はＣＬＸＸＸＸＶＩを有する化合物を含んでなるカチオン性脂質と、を含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、該組成物はさらに、中性脂質、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでなる。別の実施態様においては、該組成物はさらに、ＰＥＧコンジュゲートを含んでなる。なお別の実施態様においては、該組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）と、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）を含んでなるカチオン性脂質と、を含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、該組成物はさらに、中性脂質、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでなる。別の実施態様においては、該組成物はさらに、ＰＥＧ−コンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）を含んでなる。なお別の実施態様においては、該組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）と、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）とを含んでなるカチオン性脂質と、を含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、該組成物はさらに、中性脂質、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでなる。なお別の実施態様においては、該組成物はさらに、カチオン性脂質ＣＬｉｎＤＭＡを含んでなる。別の実施態様においては、該組成物はさらに、ＰＥＧコンジュゲートを含んでなる。なお別の実施態様においては、該組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のカチオン性脂質は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨでは正味の負電荷をもつカチオン性脂質を包含する。特に有用なカチオン性脂質は、比較的小さい頭部基、例えば、第三級アミン、第四級アミン、又はグアニジン頭部基、及び立体障害性の非対称脂質鎖を有するものを包含する。本明細書に記載の任意の実施態様においては、該カチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＸＶＩ（ＵＳＳＮ １１／５８６，１０２参照）；Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−スペルミンカルボキサミド）エチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、及び／又はそれらの混合物、並びに、類似の性質を共有する他のカチオン性脂質、を含んでなるものから選択し得る。
上記のカチオン性脂質は、当該技術分野において既知の、種々の異なる塩を包含し得る。これらのカチオン性脂質の制限されない例は、ＵＳＳＮ １１／５８６，１０２に示されている。
ある実施態様においては、カチオン性脂質の頭部基は、切断可能又は切断不能のリンカー、例えば、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別のリンカーを介して、脂質に結合し得る。適当なリンカーの非限定的な例は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキルエーテル、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、アセタール、アミド、カルボニル、カルバミド、カルバメート、カルボナート、エステル（すなわち、モノエステル、ジエステル）、又はスクシニル、を含んでなるものを包含する。
１つの実施態様においては、本発明の中性脂質は、安定な複合体を産生し得る、多様な中性非荷電性、両性イオン性、又はアニオン性脂質のいずれかを含んでなるものを包含する。それらは、好ましくは中性であるが、択一的に正又は負に帯電し得る。本明細書に記載の任意の実施態様においては、適当な中性脂質は、式ＮＬＩないしＮＩＶＩＩを有する化合物、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、コレステロール、並びに以下の本明細書に記載の他の中性脂質、及び／又はそれらの混合物、から選択されるものを包含する。
１つの実施態様においては、本発明のポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール、又はポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）のコンジュゲートは、独立して約Ｃ４ないし約Ｃ４０の飽和又は不飽和炭素原子を含んでなるアルキル鎖長を有する、ジアルキルグリセロール又はジアルキルグリカミド基を含んでなるものを包含する。該ジアルキルグリセロール又はジアルキルグリカミド基は、さらに、１つ以上の置換アルキル基を含んでいてもよい。本明細書に記載の任意の実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、及びＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）、及びＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、から選択し得る。
１つの実施態様においては、本発明の製剤又はビヒクルは、本明細書の、Ｌ０５１、Ｌ０５３、Ｌ０５４、Ｌ０６０、Ｌ０６１、Ｌ０６９、Ｌ０７３、Ｌ０７７、Ｌ０８０、Ｌ０８２、Ｌ０８３、Ｌ０８６、Ｌ０９７、Ｌ０９８、Ｌ０９９、Ｌ１００，Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７、Ｌ１０８、Ｌ１０９、Ｌ１１０、Ｌ１１１、Ｌ１１２、Ｌ１１３、Ｌ１１４、Ｌ１１５、Ｌ１１６、Ｌ１１７、Ｌ１１８、Ｌ１２１、Ｌ１２２、Ｌ１２３、Ｌ１２４、Ｌ１３０、Ｌ１３１、Ｌ１３２、Ｌ１３３、Ｌ１３４、Ｌ１４９、Ｌ１５５、Ｌ１５６、Ｌ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ｌ１６５、Ｌ１６６、Ｌ１６７、Ｌ１７４、Ｌ１７５、Ｌ１７６、Ｌ１８０、Ｌ１８１、及び／又はＬ１８２（表ＩＶ参照）として製剤された、組成物（例えば、１つ以上の生物活性分子及び／又は１つ以上の担体分子）を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の組成物はさらに、特定の組織タイプの細胞のための標的化リガンドを含んでなる。かかるリガンドの非限定的な例は、糖及び炭水化物、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、及びＮ−アセチルガラクトサミン；ホルモン、例えば、エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココーチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチソール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、及び成長ホルモン；成長因子、例えばＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、及びＰＤＧＦ；コレステロール；胆汁酸；神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ、グルタメート、アセチルコリン；ＮＯＧＯ；イノシトール三リン酸；ジアシルグリセロール；エピネフリン；ノルエピネフリン；酸化窒素、ペプチド、ビタミン、例えば葉酸塩及びピリドキシン、薬剤、抗体、及び、インビボ又はインビトロで受容体と相互作用し得る任意の他の分子を包含する。リガンドは、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｓｉＮＡ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の任意の成分（例えば、カチオン性脂質成分、中性脂質成分、ＰＥＧ−ＤＡＧ成分、又はｓｉＮＡ成分その他）に対し、リンカー分子、例えばアミド（ａｍｉｄｅ）、アミド（ａｍｉｄｏ）、カルボニル、エステル、ペプチド、ジスルフィド、シラン、ヌクレオシド、脱塩基性ヌクレオシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリハイドロカーボン、リン酸エステル、ホスホルアミダート、チオホスフェイト、アルキルホスフェイト、又は感光性リンカー、を使用して結合し得る。１つの実施態様においては、該リンカーは生分解性リンカーである。
１つの実施態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子及び／又は担体分子、任意の式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩを有するカチオン性脂質、中性脂質、及び、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール、又はポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）のコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）を含んでなる組成物を特徴とする。これらの組成物は、本明細書では全般的に、ＬＮＰ組成物の製剤ｓｉＮＡ組成物と呼ばれる。別の実施態様においては、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物のｓｉＮＡ成分は、哺乳類の細胞、患者、又は生体においてインターフェロン応答を刺激しないように化学修飾されている。かかるｓｉＮＡ分子は、改善された毒素性のプロフィールをもつと言ってよく、例えば、免疫刺激性が弱められているか又はないか、オフターゲット効果が弱められているか又はないか、或いは、他に本明細書に記載の通りである（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０６／０３２１６８参照）。
１つの実施態様においては、本発明は、ｍｉＲＮＡ分子又は担体分子、任意の式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩを有するカチオン性脂質、中性脂質、及び、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール、又はポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）のコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）を含んでなる組成物を特徴とする。これらの組成物は、本明細書では全般的に、製剤ｍｉＲＮＡ組成物と呼ばれる。別の実施態様においては、本発明の製剤ｍｉＲＮＡ組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の製剤ｍｉＲＮＡ組成物のｍｉＲＮＡ成分は、哺乳類の細胞、患者、又は生体においてインターフェロン応答を刺激しないよう、化学修飾されている。かかるｍｉＲＮＡ分子は、改善された毒素性のプロフィールをもつと言ってよく、例えば、免疫刺激性が弱められているか又はない、オフターゲット効果が弱められているか又はない、或いは他に本明細書に記載の通りである。
１つの実施態様においては、本発明は、ＲＮＡｉ阻害剤分子及び／又は担体分子、任意の式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩを有するカチオン性脂質、中性脂質、及び、ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール、又はポリエチレングリコール−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）の、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）を含んでなる組成物を特徴とする。これらの組成物は、本明細書では全般的に、製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物と呼ばれる。別の実施態様においては、本発明の製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物のＲＮＡｉ阻害剤成分は、哺乳類の細胞、患者、又は生体においてインターフェロン応答を刺激しないよう化学修飾されている。かかるＲＮＡｉ阻害剤分子は、改善された毒素性のプロフィールをもつと言ってよく、例えば、免疫刺激性が弱められているか又はない、オフターゲット効果が弱められているか又はない、或いは他に本明細書に記載の通りである。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、標的遺伝子のＲＮＡに対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該標的遺伝子ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該標的遺伝子ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、標的ＲＮＡは、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号により、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／７４６５４号、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、及び米国特許出願第１０／９２３，５３６（ともに参考として本明細書に含まれる）において参照されるＲＮＡ配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、標的遺伝子のＲＮＡに対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するｍｉＲＮＡ分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｍｉＲＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約４０ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｍｉＲＮＡ分子の一方の鎖は、該ｍｉＲＮＡ分子が該標的遺伝子ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該標的遺伝子ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、標的ＲＮＡは、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号により、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／７４６５４号、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、及び米国特許出願第１０／９２３，５３６（ともに参考として本明細書に含まれる）において参照されるＲＮＡ配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ標的のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性を調節する、ＲＮＡｉ阻害剤分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ＲＮＡｉ阻害剤分子は、約１５ないし約４０ヌクレオチド長であり；かつ、前記ＲＮＡｉ阻害剤分子は、該ＲＮＡｉ阻害剤分子が該標的ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を調節するために充分な相補性を、標的ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ標的は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号により、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／７４６５４号、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、及び米国特許出願第１０／９２３，５３６（ともに参考として本明細書に含まれる）において参照されるＲＮＡ配列の一部を含んでなるＲＮＡ配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、肝炎ウイルスＲＮＡに対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該肝炎ウイルスＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該肝炎ウイルスＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、肝炎ウイルスＲＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。１つの実施態様においては、肝炎ウイルスＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡは、米国特許出願第６０／４０１１０４、１０／６７７，２７１、及び１０／９４２，５６０号（これらは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該ＰＴＰ１Ｂ ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＰＴＰ１Ｂ ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡは、米国特許出願第２００４００１９００１、及び２００５００７０４９７８号（これらは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）及び／又は形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦ−ベータＲ）ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該ＴＧＦ−ベータ及び／又はＴＧＦ−ベータＲ ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＴＧＦ−ベータ及び／又はＴＧＦ−ベータＲ ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １１／０５４，０４７（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、コレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該ＣＥＴＰ ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＣＥＴＰ ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １０／９２１，５５４（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該ＧＩＰ ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＧＩＰ ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １０／９１６，０３０（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該ＳＣＤ ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＳＣＤ ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １０／９２３，４５１（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコール−ジアシルグリセロールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＡＣＢ）ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該ＡＣＡＣＢ ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＡＣＡＣＢ ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １０／８８８，２２６（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、アポリポタンパク質ＲＮＡ（例えば、アポＡＩ、アポＡ−ＩＶ、アポＢ、アポＣ−ＩＩＩ、及び／又はアポＥ ＲＮＡ）に対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該アポリポタンパク質ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該アポリポタンパク質ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １１／０５４，０４７（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦ受容体ＲＮＡ（例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及び／又はＶＥＧＦＲ３ ＲＮＡ）に対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が該ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦ受容体ＲＮＡ対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦ受容体ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １０／９６２，８９８（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、ＩＬ−４受容体ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＩＬ−４受容体ＲＮＡ対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ＩＬ−４受容体ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １１／００１，３４７（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、ヘアレス（Ｈａｉｒｌｅｓｓ）ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子がヘアレスＲＮＡ対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該ヘアレスＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡは、ＵＳＳＮ １０／９１９，９６４（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、（ａ）式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するカチオン性脂質；（ｂ）中性脂質；（ｃ）ポリエチレングリコールコンジュゲート（すなわち、ポリエチレングリコール ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ ＤＭＢ）；及び（ｄ）担体分子、及び／又は、標的ＲＮＡに対し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、
を含んでなる組成物であり、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ、前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子が標的ＲＮＡに対しＲＮＡ干渉を媒介するために充分な相補性を、該標的ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該標的ＲＮＡは、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号により、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／７４６５４号、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、及び米国特許出願第１０／９２３，５３６（ともに参考として本明細書に含まれる）において参照されるＲＮＡ配列を含んでなる。別の実施態様においては、組成物はさらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の組成物の、カチオン性脂質成分（例えば、式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有するか、又は別に本明細書に記載の化合物）は、製剤中に存在する全脂質の、約２％ないし約６０％、約５％ないし約４５％、約５％ないし約１５％、又は、約４０％ないし約５０％を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の組成物の中性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約５％ないし約９０％、又は約２０％ないし約８５％を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の組成物のＰＥＧコンジュゲート（すなわち、ＰＥＧ ＤＡＧ、ＰＥＧ−コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＢ）は、製剤中に存在する全脂質の、約１％ないし約２０％、又は約４％ないし約１５％を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の組成物のコレステロール成分は、製剤中に存在する全脂質の、約１０％ないし約６０％、又は約２０％ないし約４５％を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の製剤ｓｉＮＡ成分は、製剤中に存在する全脂質の約３０ないし約５０％を含んでなるカチオン性脂質、製剤中に存在する全脂質の約３０ないし約５０％を含んでなる中性脂質、及び製剤中に存在する全脂質の約０ないし約１０％を含んでなるＰＥＧコンジュゲート（すなわち、ＰＥＧ ＤＡＧ、ＰＥＧ−コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＢ）を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の製剤分子組成物は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有する化合物、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧコンジュゲート（すなわち、ＰＥＧ−ＤＡＧ、ＰＥＧ−コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＢ）を含んでなる。１つの実施態様においては、該ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、及びＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、該ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢである。別の実施態様においては、製剤分子組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の製剤分子組成物は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、式ＣＬＩを有する化合物、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、及びＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢである。別の実施態様においては、製剤分子組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の製剤分子組成物は、生物活性分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）、式ＣＬＶを有する化合物、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、及びＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢである。別の実施態様においては、製剤分子組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の組成物（例えば、製剤分子組成物）はさらに、特定の組織タイプの細胞のための標的化リガンドを含んでなる。かかるリガンドの非限定的な例は、糖及び炭水化物、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、及びＮ−アセチルガラクトサミン；ホルモン、例えば、エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココーチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチソール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、及び成長ホルモン；成長因子、例えばＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、及びＰＤＧＦ；コレステロール；胆汁酸；神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ、グルタメート、アセチルコリン；ＮＯＧＯ；イノシトール三リン酸；ジアシルグリセロール；エピネフリン；ノルエピネフリン；酸化窒素、ペプチド、ビタミン、例えば葉酸塩及びピリドキシン、薬剤、抗体、及び、インビボ又はインビトロで受容体と相互作用し得る任意の他の分子を包含する。リガンドは、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物の任意の成分（例えば、カチオン性脂質成分、中性脂質成分、ＰＥＧ−ＤＡＧ成分、又はｓｉＮＡ成分その他）に対し、リンカー分子、例えばアミド（ａｍｉｄｅ）、アミド（ａｍｉｄｏ）、カルボニル、エステル、ペプチド、ジスルフィド、シラン、ヌクレオシド、脱塩基性ヌクレオシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリハイドロカーボン、リン酸エステル、ホスホルアミダート、チオホスフェイト、アルキルホスフェイト、又は感光性リンカー、を使用して結合し得る。１つの実施態様においては、リンカーは生分解性リンカーである。
１つの実施態様においては、本発明のＰＥＧコンジュゲート、例えばＰＥＧ−ＤＡＧ、ＰＥＧ−コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＢは、２００ないし１０，０００原子のＰＥＧ分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明の組成物、例えば、製剤分子組成物は、ジアシルグリセロール−ポリエチレングリコールコンジュゲート、すなわち、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含んでなる。用語「ジアシルグリセロール」は、その双方が、エステル結合により該グリセロールの１−及び２−位に結合した、独立して２ないし３０個の炭素を有する２つの脂肪酸アシル鎖、Ｒ１及びＲ２を有する化合物を指す。アシル基は、飽和しているか、又は種々の不飽和度を有してもよい。ジアシルグリセロールは、以下の一般式ＶＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、脂質、又はリガンドである］を有する。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ２ないしＣ３０アルキル基である。１つの実施態様においては、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートは、ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）−ＰＥＧコンジュゲート、ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）−ＰＥＧコンジュゲート、ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）−ＰＥＧコンジュゲート、ジステリルグリセロール（Ｃ１８）−ＰＥＧコンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。当業者は、他のジアシルグリセロールが本発明のＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートにおいて使用可能であることを容易に認識するであろう。
１つの実施態様においては、本発明の組成物、例えば、製剤分子組成物は、ポリエチレングリコール−コレステロールコンジュゲート、すなわち、ＰＥＧ−ｃｈｏｌコンジュゲートを含んでなる。ＰＥＧ−ｃｈｏｌコンジュゲートは、コレステロール又はコレステロール誘導体に結合した、２００ないし１０，０００原子のＰＥＧ分子を含んでいてもよい。例示的なＰＥＧ−ｃｈｏｌ及びその合成は、図３０に示されている。
１つの実施態様においては、本発明の組成物、例えば、製剤分子組成物は、ポリエチレングリコール−ＤＭＢコンジュゲートを含んでなる。用語「ＤＭＢ」は、化合物 ３，
４−ジテトラデコキシベンジル−β−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテルを指す。ＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートは、ＤＭＢに結合した、２００ないし１０，０００原子のＰＥＧ分子を含んでいてもよい。例示的なＰＥＧ−ＤＭＢ及びその合成は、図３０Ａに示されている。
１つの実施態様においては、本発明の組成物、例えば、製剤分子組成物は、ＰＥＧ−脂質、例えば、ポリエチレングリコール−ＤＭＧ（ＰＥＧ−ＤＭＧ）コンジュゲートを含んでなる。用語「ＰＥＧ−ＤＭＧ」は、化合物 １−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）を指すことができる。ＰＥＧ−ＤＭＧコンジュゲートは、ＤＭＧ基に結合した、２００ないし１０，０００原子のＰＥＧ分子を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、ＰＥＧは、式ＰＥＧｎ［式中、１５００Ｄａないし３０００ＤａのＰＥＧについては、ｎ＝３３ないし６７であり、２ＫＰＥＧ／ＰＥＧ２０００については、平均＝４５である］によって表わされる多分散物である。例示的なＰＥＧ−ＤＭＧ及びその合成は、図３０Ｂに示されている。
用語「リガンド」は、受容体のような別の化合物と、直接又は間接的に相互作用し得る、任意の化合物又は分子、例えば、薬剤、ペプチド、ホルモン、又は神経伝達物質を指す。リガンドと相互作用し得る受容体は、細胞の表面上に存在してよく、或いはまた、細胞内受容体であってもよい。受容体とリガンドの相互作用は、結果として生化学反応を生じてよく、或いは、単純に物理的相互作用又は結合であってもよい。リガンドの非限定的な例は、糖及び炭水化物、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、及びＮ−アセチルガラクトサミン；ホルモン、例えば、エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココーチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチソール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、及び成長ホルモン；成長因子、例えばＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、及びＰＤＧＦ；コレステロール；胆汁酸；神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ、グルタメート、アセチルコリン；ＮＯＧＯ；イノシトール三リン酸；ジアシルグリセロール；エピネフリン；ノルエピネフリン；酸化窒素、ペプチド、ビタミン、例えば葉酸塩及びピリドキシン、薬剤、抗体、及び、インビボ又はインビトロで受容体と相互作用し得る任意の他の分子を包含する。リガンドは、本発明の化合物に対し、リンカー分子、例えばアミド（ａｍｉｄｅ）、アミド（ａｍｉｄｏ）、カルボニル、エステル、ペプチド、ジスルフィド、シラン、ヌクレオシド、脱塩基性ヌクレオシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリハイドロカーボン、リン酸エステル、ホスホルアミダート、チオホスフェイト、アルキルホスフェイト、又は感光性リンカー、を使用して結合し得る。１つの実施態様においては、該リンカーは生分解性リンカーである。
本明細書で使用される用語「生分解性リンカー」は、種々の条件下に切断可能なリンカー基を指す。切断に適した条件は、制限なく、ｐＨ、ＵＶ照射、酵素活性、温度、加水分解、脱離、及び置換反応、及び、結合の熱力学的性質を包含し得る。
本明細書で使用される用語「感光性リンカー」は、特定のＵＶ波長下に選択的に切断される、当該技術分野において既知のリンカー基を指す。感光性リンカーを含有する本発明の化合物は、興味の標的細胞又は組織に対し化合物を送達するために使用可能であり、その後に、ＵＶ源の存在下に放出し得る。
本明細書で使用される用語「脂質」は、任意の親油性化合物を指す。脂質化合物の非限定的な例は、直鎖、分枝鎖、飽和、及び不飽和脂肪酸を含む、脂肪酸及びその誘導体、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、及び、コレステロール及びその誘導体又は類似体を含むステロイドを包含する。
本明細書で使用される用語「ＰＥＧ−脂質」は、ＰＥＧ基に対し共有結合により結合している、任意の親油性化合物を指す。本発明のＰＥＧ−脂質の非限定的な例は、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知である別の、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート、及びＰＥＧ−コレステロールコンジュゲートを包含する。１つの実施態様においては、ＰＥＧは、式ＰＥＧｎ［式中、１５００Ｄａないし３０００ＤａのＰＥＧについては、ｎ＝３３ないし６７であり、２ＫＰＥＧ／ＰＥＧ２０００については、平均＝４５である］によって表わされる多分散物である。例示的なＰＥＧ−ＤＭＧ及びその合成は、図３０Ｂに示されている。
本明細書で使用される用語「製剤」は、１つ以上の生物活性分子、１つ以上の担体分子、又は生物活性分子及び担体分子の双方を、該生物活性分子及び／又は担体分子の細胞内送達を可能にする任意の他の成分と一緒に包含する、任意の製剤組成物を指す。１つの実施態様においては、製剤は、本明細書に記載の（表ＩＶ参照）、又は当該技術分野において既知である別の、脂質ナノ粒子製剤である。
本発明における使用に適した製剤、及びかかる製剤を作成及び使用する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４０５５４号及び、２００６年１０月２４日出願の、ＵＳＳＮ １１／５８６，１０２；国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０１２１９１号、及び特許出願公開第２００６０８３７８０、２００６０５１４０５号、ＵＳ２００５１７５６８２、ＵＳ２００４１４２０２５、ＵＳ２００３０７７８２９、ＵＳ２００６２４００９３（これらは全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）において開示されている。
本発明は、さらに、製剤又は組成物が、生物活性分子の生体系内への送達に有効であるかどうかを判定するための方法を提供する。１つの実施態様においては、製剤又は組成物が、生物活性分子の生体系内への送達に有効であるかどうかを判定するための該方法は、（１）製剤又は組成物の血清安定性を測定すること、及び（２）製剤又は組成物の、ｐＨ依存性の相転移を測定することを含んでなり、これにおいて、製剤又は組成物が血清中で安定であることの判定、及び、該製剤又は組成物が約ｐＨ４ないし約７において、例えば、５．５から６．５へ相転移を受けることの判定は、該製剤又は組成物が生物活性分子の生体内への送達に有効となることを示す。別の実施態様においては、方法はさらに、製剤又は組成物の、インビトロの細胞におけるトランスフェクション効率を測定することを含んでなる。
製剤又は組成物の血清安定性は、製剤又は組成物の血清中での安定性を測定する、本明細書に記載の、及び当該技術分野において既知である別のアッセイを含む、任意のアッセイを用いて測定可能である。血清安定性を測定するために使用可能な１つの例示的なアッセイは、ある時間にわたり、血清中の該組成物の相対濁度を測定するアッセイである。例えば、製剤又は組成物の相対濁度は、血清（すなわち、５０％）の存在又は不在下に、該製剤又は組成物の吸光度を、いくつかの時点において２４時間にわたり、分光光度計を使用して測定することにより判定し得る。吸光度によって測定されるとき、ある時間にわたり相対濁度が常に約１．０付近であれば、製剤又は組成物は血清中で安定である。
製剤又は組成物のｐＨ依存性の相転移は、本明細書に記載の、及び当該技術分野において既知である別のアッセイを含め、製剤又は組成物の相転移を約ｐＨ５．５−６．５において測定する任意のアッセイを使用して測定し得る。ｐＨ依存性の相転移を測定するために使用可能な１つの例示的なアッセイは、組成物の相対濁度を、ある時間にわたり異なるｐＨにおいて測定するアッセイである。例えば、製剤又は組成物の相対濁度は、ある範囲の異なるｐＨ値をもつ緩衝液中で、製剤又は組成物の吸光度をある時間にわたり測定することにより判定し得る。吸光度によって測定されるとき、ｐＨが７．０より下に低下すると相対濁度が減少する場合、該製剤又は組成物はｐＨ依存性の相転移を受ける。
さらに、迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける製剤又は組成物の、送達剤としての効率は、該製剤又は組成物のトランスフェクション効率を測定することにより判定し得る。トランスフェクションアッセイを行うための方法は、本明細書に記載されており、かつ当該技術分野において既知の別の方法である。
１つの実施態様においては、本発明の方法により製される粒子は、約５０ないし約６００ｎｍのサイズを有する。該粒子は、界面活性剤透析法によるか、又は、有機溶媒を利用して成分の混合の間に単一層を得る逆相法の変法により形成し得る。何ら特定の形成メカニズムに束縛されることを意図することなく、分子（例えば、ポリヌクレオチドのような生物活性分子）を、カチオン性脂質の界面活性剤溶液と接触させ、コートされた分子複合体を形成する。これらのコートされた分子は、凝集しかつ沈澱し得る。しかしながら、界面活性剤の存在が、この凝集を低減し、かつコート分子を過剰の脂質（典型的には、非カチオン性脂質）と反応させて粒子を形成し、これにおいて興味の分子は脂質二重層の中に被包される。有機溶媒を使用して製剤又は組成物を形成するための、以下に記載の方法は、同様のスキームに従う。
１つの実施態様においては、粒子は、界面活性剤透析を使用して形成される。したがって、本発明は、ｐＨ依存性の相転移を受けるものを含む、血清安定性の製剤又は組成物の調製のための方法であって：（ａ）分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含む、ポリヌクレオチドのような生物活性分子）を、界面活性剤溶液中で、カチオン性脂質と混ぜ合せて、コートされた分子−脂質複合体を形成すること；（ｂ）非カチオン性脂質を、コートされた分子−脂質複合体と接触させて、ｓｉＮＡ−脂質複合体と非カチオン性脂質とを含んでなる界面活性剤溶液を形成すること；及び（ｃ）工程（ｂ）の界面活性剤溶液を透析して、血清安定性の分子−脂質粒子の溶液を得ること、を含んでなる該方法を提供し、これにおいて、該分子は脂質二重層内に被包され、かつ該粒子は血清安定性であり、かつ約５０から約６００ｎｍまでのサイズを有している。
１つの実施態様においては、コートされた分子−脂質（例えば、ポリヌクレオチド−脂質）複合体の最初の溶液は、例えば、該分子を界面活性剤溶液中でカチオン性脂質と混ぜ合せることにより形成される。
これらの実施態様においては、界面活性剤溶液は、好ましくは、１５ないし３００ｍＭ、さらに好ましくは２０ないし５０ｍＭの臨界ミセル濃度を有する中性界面活性剤の水溶液である。適当な界面活性剤の例は、例えば、Ｎ，Ｎ’−（（オクタノイルイミノ）−ビス−（トリメチレン））−ビス−（Ｄ−グルコナミド）（ＢＩＧＣＨＡＰ）；ＢＲＩＪ３５；デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ；ドデシルポリ（エチレングリコール）エーテル；ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０；ツイーン４０；ツイーン６０；ツイーン８０；ツイーン８５；メガ（Ｍｅｇａ）８；メガ９；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−０８；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０；トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−４０５；ヘキシル−、ヘプチル−、オクチル−、及びノニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；及びヘプチルチオグルコピラノシド、を包含し、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド及びツイーン２０が最も好適である。界面活性剤溶液中の界面活性剤濃度は、典型的には約１００ｍＭないし約２Ｍ、好ましくは約２００ｍＭないし約１．５Ｍである。
１つの実施態様においては、該カチオン性脂質及び興味の分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含む、ポリヌクレオチドのような生物活性分子）は、典型的には、約１：１ないし約２０：１の電荷比（＋／−）を生成するべく、好ましくは約１：１ないし約１２：１の割合で、さらに好ましくは、約２：１ないし約６：１の割合で混ぜ合されるであろう。さらに、溶液中のｓｉＮＡの全濃度は、典型的には、約２５μｇ／ｍＬないし約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２５μｇ／ｍＬないし約５００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約１００μｇ／ｍＬないし約２５０μｇ／ｍＬであろう。興味の分子及びカチオン性脂質の、界面活性剤溶液中での混ぜ合せは、典型的には室温において、コートされた複合体を形成するのに充分な時間にわたり維持される。別法として、興味の分子及びカチオン性脂質を、界面活性剤溶液中で混ぜ合せ、そして約３７℃の温度に温めてもよい。温度に対し特に感受性である分子（例えば、本明細書のポリヌクレオチド）については、コートされた覆複合体を、より低い温度で、典型的には約４℃に下げて形成し得る。
１つの実施態様においては、形成した製剤または組成物中の、生物活性分子対脂質比（質量／質量比）は、約０．０１ないし約０．０８の範囲である。精製の工程は、典型的には、未被覆の生物活性分子ならびに空のリポソームを除去することから、出発物質の比もまたこの範囲内に入る。別の実施態様においては、製剤化した生物活性分子組成物製剤は、全脂質１０ｍｇ当たりｓｉＮＡ約４００μｇ、又は、約０．０１ないし約０．０８、さらに好ましくは、約０．０４の生物活性分子対脂質比を使用し、これは、生物活性分子５０μｇ当たり、全脂質１．２５ｍｇに相当する。本発明の製剤又は組成物は、特定の臓器、組織、又は細胞タイプを標的とするべく開発されている。１つの実施態様においては、本発明の製剤又は組成物は、肝臓又は肝実質細胞を標的とするべく開発されている。該製剤又は組成物の種々の成分の割合は、特定の臓器、組織、又は細胞タイプを標的とするべく調整される。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の細胞又は複数の細胞に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の細胞又は複数の細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、経肺投与により該患者又は生体の細胞又は複数の細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の肝臓又は肝細胞（例えば、肝実質細胞）に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の肝臓又は肝細胞（例えば、肝実質細胞）に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、直接注入、門脈注入、カテーテル法、ステント留置法など）により、患者又は生体の肝臓又は肝細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の腎臓又は腎細胞に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の腎臓又は腎細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、直接注入、カテーテル法、ステント留置法など）により、患者又は生体の腎臓又は腎細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の腫瘍又は腫瘍細胞に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の腫瘍又は腫瘍細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、直接注入、カテーテル法、ステント留置法など）により、患者又は生体の腫瘍又は腫瘍細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体のＣＮＳ又はＣＮＳ細胞（例えば、脳、脊髄）に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体のＣＮＳ又はＣＮＳ細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、直接注入、カテーテル法、ステント留置法など）により、患者又は生体のＣＮＳ又はＣＮＳ細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の肺又は肺細胞に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の肺又は肺細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、肺組織及び細胞への直接的な肺投与）により、患者又は生体の肺又は肺細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の血管又は血管細胞に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の血管又は血管細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、クランピング、カテーテル法、ステント留置法など）により、患者又は生体の血管又は血管細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の皮膚又は皮膚細胞（例えば、真皮、真皮細胞、胞、又は胞細胞）に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の皮膚又は皮膚細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、該製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、直接的な皮膚投与又はイオン導入法その他）により、患者又は生体の皮膚又は皮膚細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の眼又は眼細胞（例えば、黄班、窩、角膜、網膜その他）に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の眼又は眼細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物を、投与を促進するための賦形剤とともに、または賦形剤なしに、当該技術分野において一般に知られるように、例えば、製剤又は組成物の非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下投与）又は、局所投与（例えば、直接注入、眼内注射、眼周囲注射、イオン導入法、点眼剤の使用、移植その他）により、患者又は生体の眼又は眼細胞と接触させる。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を、患者又は生体の耳又は耳の細胞（例えば、内耳、中耳、外耳）に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該生物活性分子成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の耳又は耳の細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、投与は、米国特許第５，４２１，８１８、５，４７６，４４６、５，４７４，５２９、６，０４５，５２８、６，４４０，１０２、６，６８５，６９７、６，１２０，４８４；及び５，５７２，５９４号（これらは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）、及び、Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，１９９９，Ｅａｒ Ｎｏｓｅ Ｔｈｒｏａｔ Ｊ．，７８，５９５−８，６００；及び、Ｊａｃｋｓｏｎ，ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，２００２，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，３５，６３９−５３の教示に記載され、かつ、本発明の組成物の使用に適合された方法及び装置を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする
低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物であって、これにおいて、前記ｓｉＮＡ分子が、約１５ないし約２８塩基対を含んでなる、該組成物を特徴とする。
１つの実施態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物であって、これにおいて、該二本鎖ｓｉＮＡ分子は第１及び第２の鎖を含んでなり、該ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり、該ｓｉＮＡの該第１の鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって該標的ＲＮＡの切断を指示するために充分な相補性を、該標的ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなり、かつ
前記ｓｉＮＡ分子の該第２の鎖が、該第１の鎖に対し相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。
１つの実施態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物であって、これにおいて、該二本鎖ｓｉＮＡ分子は第１及び第２の鎖を含んでなり、該ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２３ヌクレオチド長であり、該ｓｉＮＡ分子の該第１の鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって該標的ＲＮＡの切断を指示するために充分な相補性を、該標的ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなり、かつ前記ｓｉＮＡ分子の該第２の鎖が、該第１の鎖に対し相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。
１つの実施態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する化学合成された二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物であって、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２８ヌクレオチド長であり；かつ該ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって該標的ＲＮＡの切断を指示するために充分な相補性を、該標的ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。
１つの実施態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的ＲＮＡの切断を指示する化学合成された二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物であって、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１８ないし約２３ヌクレオチド長であり；かつ該ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によって該標的ＲＮＡの切断を指示するために充分な相補性を、該標的ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。
１つの実施態様においては、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする
低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、例えば、これにおいて該標的遺伝子は、標的エンコーディング配列を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、例えば、これにおいて該標的遺伝子は、標的非コーディング配列又は標的遺伝子発現に関与する調節エレメントを含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡは、標的遺伝子又は標的遺伝子ファミリーの発現を阻害するために使用され、これにおいて、該遺伝子又は遺伝子ファミリー配列は、配列相同性を共有する。かかる相同配列は、当該技術分野において知られるように、例えば配列アライメントを使用して同定し得る。ｓｉＮＡ分子は、完全に相補的な配列を用いるか、又は非正規塩基対、例えば、付加的な標的配列を提供し得るミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対を取り入れることにより、かかる相同配列を標的化するべく設計し得る。ミスマッチが同定される場合、非正規塩基対（例えば、ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対）を使用して、１つ以上の遺伝子配列を標的化するｓｉＮＡ分子を生成し得る。非限定的な例では、ＵＵ及びＣＣ塩基対といった非正規塩基対を使用して、配列相同性を共有する異なる標的について配列を標的とし得るｓｉＮＡ分子を生成する。すなわち、本発明のｓｉＮＡを使用することの１つの利点は、単一のｓｉＮＡを設計して、相同遺伝子の間で保存されているヌクレオチド配列に対し相補的である核酸配列を含むようにし得ることである。このアプローチでは、種々の遺伝子を標的化するために１つ以上のｓｉＮＡ分子を使用する代わりに、単一のｓｉＮＡを使用して、１つ以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
１つの実施態様においては、本発明は、標的ＲＮＡに対しＲＮＡｉ活性をもつｓｉＮＡ分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物であって、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子が、標的コーディング配列を有する任意のＲＮＡに対し相補的な配列を含んでなる、該組成物を特徴とする。本明細書に記載の製剤に適したｓｉＮＡ分子の例は、国際出願番号ＵＳ０４／１０６３９０（ＷＯ ０５／１９４５３）（これは、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に提供されている。ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ ０５／１９４５３）、２００３年５月２３日出願の、ＵＳＳＮ１０／４４４，８５３、２００４年８月２０日出願の、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６、２００５年９月２３日出願の、ＵＳＳＮ１１／２３４，７３０、２００５年１２月８日出願の、ＵＳＳＮ１１／２９９，２５４（全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載されたか、又は本明細書に記載された別の化学修飾を、本発明の任意のｓｉＮＡコンストラクトに適用し得る。別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用し得て、それにより標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介するヌクレオチド配列を包含しており、例えば、これにおいてｓｉＮＡは、クロマチン構造又は標的遺伝子のメチル化パターンを調節する細胞プロセスにより、標的遺伝子発現の調節を媒介し、該標的遺伝子の発現を防止する。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、疾患又は症状（例えば、脱毛症、脱毛、及び／又は無毛症）に関連した標的ハプロタイプ多形から生じる標的タンパク質の発現を、ダウンレギュレートするか、又は阻害するべく使用される。標的遺伝子、又は標的タンパク質若しくはＲＮＡレベルの分析を使用して、かかる多形をもつ患者、又は、本明細書に記載の、形質、症状、又は疾患を発生するリスクにある患者を同定することができる。こうした患者は、治療、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子と、標的遺伝子発現に関連した疾患の治療に有用な任意の他の組成物とを用いた治療、に適用可能である。例えば、標的タンパク質又はＲＮＡレベルの分析を使用して、患者の治療における治療タイプ及び治療のコースを決定することができる。標的タンパク質又はＲＮＡレベルのモニタリングを使用して、治療の成果を予測し、かつ、形質、症状、又は疾患に関連したある標的タンパク質のレベル及び／又は活性を調節する、化合物及び組成物の有効性を判定することができる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的タンパク質をコードしているヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、アンチセンス鎖を含んでいる。該ｓｉＮＡは、さらにセンス鎖を含んでなり、これにおいて、前記センス鎖は、標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的タンパク質をコードしているヌクレオチド配列又はその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる、アンチセンス領域を含んでいる。該ｓｉＮＡは、さらにセンス領域を含んでなり、これにおいて、前記センス領域は、標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡは、標的遺伝子のヌクレオチド配列又は配列の一部に対し相補的であるｓｉＮＡ分子の、アンチセンス領域のヌクレオチド配列を含んでなる。別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡは、１つの領域、例えば、標的遺伝子配列又はその一部を含んでなる配列に相補的である該ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域、を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含んでなり、これにおいて、該アンチセンス鎖は、標的タンパク質をコードしているＲＮＡ配列又はその一部に対し相補的であり、かつこれにおいて、前記ｓｉＮＡはさらに、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを有するセンス鎖を含んでなり、かつこれにおいて、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、各鎖の少なくとも約１５ヌクレオチドが他方の鎖に対し相補的である、別個のヌクレオチド配列である。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを有するアンチセンス領域を含んでなり、これにおいて、該アンチセンス領域は、標的タンパク質をコードしているＲＮＡ配列に対し相補的であり、かつこれにおいて、前記ｓｉＮＡはさらに、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを有するセンス領域を含んでなり、かつこれにおいて、前記センス領域及び前記アンチセンス領域は、１つの直鎖状の分子に含まれてなり、ここで、該センス領域は、該アンチセンス領域に対し相補的である少なくとも約１５ヌクレオチドを含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。標的遺伝子は、ある程度の配列相同性を互いに共有し得ることから、異なる標的間で共有されているか、又はそれに代えて、特定の標的に固有である配列を選択することにより、一クラスの標的遺伝子か、又は代わりに、特定の標的遺伝子（例えば、多形性の変異体）を標的とするべく、ｓｉＮＡ分子を設計することができる。それ故、１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡ分子を設計して、いくつかの標的遺伝子変異体間で相同性を有する保存された標的ＲＮＡ配列を標的化し、１つのｓｉＮＡ分子を用いて一クラスの標的遺伝子を標的化するようにすることができる。したがって、１つの実施態様においては、本発明の該ｓｉＮＡ分子は、一方又は双方の標的化された対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｓ）の発現を、患者において調節する。別の実施態様においては、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を媒介するのに必要とする高度の特異性の故に、該ｓｉＮＡ分子を設計して、特定の標的ＲＮＡ配列に固有である配列（例えば、単一標的対立遺伝子又は、標的単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ））を標的とすることができる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、二本鎖である。別の実施態様においては、本発明の該ｓｉＮＡ分子は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの間に、約１５ないし約３０塩基対を含有する二重鎖核酸分子からなる。なお別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１ないし約３（例えば、約１、２、又は３）個のヌクレオチドの突出末端（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ ｅｎｄ）をもつ二重鎖核酸分子、例えば、約１９塩基対と、３’末端のモノヌクレオチド、ジヌクレオチド、又はトリヌクレオチドの突出とをもつ、約２１−ヌクレオチドの二重鎖、を含んでなる。なお別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端をもつ二重鎖核酸分子を含んでなり、これにおいて、双方の末端は平滑であるか、或いはまた一方の末端が平滑である。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的タンパク質を発現する核酸分子、例えば、標的タンパク質をコードしているＲＮＡ、に対し特異性を有する。１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡベース（例えば、２’−ＯＨヌクレオチドを含んでなるｓｉＮＡ）であり、かつ、１つ以上の化学修飾、例えば、本明細書に記載のもの、を包含する。かかる化学修飾の非限定的な例は、制限なく、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、２’−デオキシロボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び末端グリセリル及び／又は逆転デオキシ脱塩基残基の組込みを包含する。これらの化学修飾は、種々のｓｉＮＡコンストラクト（例えば、ＲＮＡベースのｓｉＮＡコンストラクト）において使用される場合、細胞においてＲＮＡｉ活性を保持しながら、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増大することが示されている。さらに、Ｐａｒｒｉｓｈら、上記、に公開されたデータに反して、本出願人は、多数（１つより多い）ホスホロチオエート置換が充分に耐性であり、かつ修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの血清安定性に実質的な増加を与えることを示している。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持ながらも、修飾されたヌクレオチドを含んでなる。修飾ヌクレオチドを用いて、安定性、活性、及び／又はバイオアベイラビリティといった、インビボ又はインビトロの特性を改善することができる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、該ｓｉＮＡ分子中に存在する全ヌクレオチド数の、あるパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含んでなることができすなわち、本発明のｓｉＮＡ分子は、一般に、約５％ないし１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の修飾ヌクレオチド）を含んでいてもよい。所与のｓｉＮＡ分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセントは、該ｓｉＮＡ分子に存在する全ヌクレオチド数に依存するであろう。もし該ｓｉＮＡ分子が単鎖であれば、修飾のパーセントは、該単鎖ｓｉＮＡ分子中に存在する全ヌクレオチド数に基づいてよい。同様に、もし該ｓｉＮＡ分子が二本鎖であれば、修飾のパーセントは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は、センス鎖及びアンチセンス鎖の双方に存在する全ヌクレオチド数に基づいてよい。
本発明の１つの態様は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該二本鎖ｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学修飾を含んでなり、かつ該二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は、約２１ヌクレオチド長である。１つの実施態様においては、該二本鎖ｓｉＮＡ分子は、何らリボヌクレオチドを含有しない。別の実施態様においては、該二本鎖ｓｉＮＡ分子は、１つ以上のリボヌクレオチドを含んでなる。１つの実施態様においては、該二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、独立して、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを含んでなり、これにおいて、各鎖は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個の、他方の鎖のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んでなる。１つの実施態様においては、該二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に対し相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、そして該二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に実質的に類似したヌクレオチド配列を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、アンチセンス領域（ここで、該アンチセンス領域は、標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる）、及びセンス領域（ここで、該センス領域は、標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配列を含んでなる）を含んでなる、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とする。１つの実施態様においては、該アンチセンス領域及びセンス領域は、独立して、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを含んでなり、これにおいて、該アンチセンス領域は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個の、該センス領域のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を含んでなる、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該アンチセンス領域は、該標的遺伝子又はその一部によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該センス領域は、該アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端、すなわち、何ら突出ヌクレオチドを含まない末端、を含んでなる。例えば、２００３年５月２３日出願の、ＵＳＳＮ１０／４４４，８５３、２００４年８月２０日出願の、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６、又は２００５年９月２３日出願の、ＵＳＳＮ１１／２３４，７３０（全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された修飾か、又はそれらの任意の組合せを含んでなり、及び／又は、本明細書に記載された任意の長さのｓｉＮＡ分子は、何ら突出ヌクレオチドのない平滑末端、又は複数の平滑末端を含んでなっていてもよい。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の平滑末端を含んでいてもよく、すなわち、ここで、平滑末端は何ら突出ヌクレオチドをもたない。１つの実施態様においては、平滑末端化されたｓｉＮＡ分子は、該ｓｉＮＡ分子の各鎖に存在するヌクレオチド数に等しい数の塩基対を有する。別の実施態様においては、該ｓｉＮＡ分子は、１つの平滑末端を有しており、例えばこれにおいて、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端は、何ら突出ヌクレオチドをもたない。別の例では、該ｓｉＮＡ分子は、１つの平滑末端を有しており、例えばこれにおいて、アンチセンス鎖の３’末端及びセンス鎖の５’末端は、何ら突出ヌクレオチドをもたない。別の例では、ｓｉＮＡ分子は２つの平滑末端を有しており、例えばこれにおいて、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端、並びにアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端とは、何ら突出ヌクレオチドをもたない。平滑末端化したｓｉＮＡ分子は、例えば、約約１５ないし約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）を含んでいてもよい。平滑末端化したｓｉＮＡ分子に存在する他のヌクレオチドは、例えば、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を媒介する活性を調節するための、ミスマッチ、バルジ、ループ、又はゆらぎ塩基対を含んでいてもよい。
「平滑末端」により、対称性の末端、又は、何ら突出ヌクレオチドをもたない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端が意味される。二本鎖ｓｉＮＡ分子の２つの鎖は、その末端において、突出ヌクレオチドなしに互いに配列する。例えば、平滑末端化したｓｉＮＡコンストラクトは、該ｓｉＮＡ分子のセンス及びアンチセンス領域の間で相補的である末端ヌクレオチドを含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、２つの別個のオリゴヌクレオチドフラグメントから組立てられ、ここで、１つのフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のセンス領域を含んでなり、そして第２のフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖を含んでなる。該センス領域は、リンカー分子、例えばポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーを介して、該アンチセンス領域に結合し得る。
１つの実施態様においては、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個の塩基対を含んでなり、かつここで、該ｓｉＮＡ分子の各鎖は、１つ以上の化学修飾を含んでなる。別の実施態様においては、該二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、該標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に実質的に類似したヌクレオチド配列を含んでなる。別の実施態様においては、該二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、該標的遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に実質的に類似したヌクレオチド配列を含んでなる。別の実施態様においては、該ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを含んでなり、かつ各鎖は、少なくとも約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個の、他方の鎖のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含んでなる。
本明細書に記載の任意の実施態様において、本発明のｓｉＮＡ分子は、何らリボヌクレオチドを含まなくてもよい。或いはまた、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上のリボヌクレオチドを含んでなってもよい。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンス領域を含んでなり、かつ該ｓｉＮＡはさらに、該標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配列を含んでなるセンス領域を含んでなる。別の実施態様においては、該アンチセンス領域及び該センス領域は、それぞれ、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを含んでなり、かつ該アンチセンス領域は、少なくとも約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個の、該センス領域のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含んでなる。該標的遺伝子は、例えば、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセッション番号により、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／７４６５４号、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、又はＵＳＳＮ１０／９２３，５３６において参照される配列を含んでいてもよい。別の実施態様においては、該ｓｉＮＡは、二本鎖核酸分子であり、ここで、該ｓｉＮＡ分子の２つの鎖の各々は、独立して、約１５ないし約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０）個のヌクレオチドを含んでなり、かつここで、該ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、少なくとも約１５個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個以上）の、該標的遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドを含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を含んでなり、ここで、該アンチセンス領域は、該標的遺伝子又はその一部によってコードされたＲＮＡヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該センス領域は、該アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡ分子は、２つの別個のオリゴヌクレオチドフラグメントから組立てられ、ここで、１つのフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のセンス領域を含んでなり、そして第２のフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含んでなる。別の実施態様においては、該センス領域は、リンカー分子を介して、該アンチセンス領域に結合される。別の実施態様においては、該センス領域は、リンカー分子、例えば、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー、を介して該アンチセンス領域に結合される。該標的遺伝子は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／７４６５４号、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８、又はＵＳＳＮ１０／９２３，５３６において参照される配列か、又は当該技術分野において知られる別の配列を含んでいてもよい。
１つの実施態様においては、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を含んでなる、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該アンチセンス領域は、該標的遺伝子又はその一部によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該センス領域は、該アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡ分子は１つ以上の修飾されたピリミジン及び／又はプリンヌクレオチドを有する。１つの実施態様においては、該センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド、又は２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、そして該センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドである。別の実施態様においては、該センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、そして該センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の実施態様においては、該センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、そして該センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、該アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、そして該アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、又は２’−デオキシプリンヌクレオチドである。任意の上記記載のｓｉＮＡ分子の別の実施態様においては、該センス鎖の非相補領域（例えば、突出領域）に存在する任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの実施態様においては、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、２つの別個のオリゴヌクレオチドフラグメントから組立てられ、ここで、１つのフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のセンス領域を含んでなり、そして第２のフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖を含んでなり、かつここで、該センス領域を含んでなる該フラグメントは、該フラグメントの５’末端、３’末端、又は５及び３’双方の末端において、末端キャップ成分を包含する。１つの実施態様においては、該末端キャップ成分は、反転デオキシ脱塩基成分（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ａｂａｓｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、又はグリセリル基である。１つの実施態様においては、該ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントの各々は、独立して約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを含んでなる。別の実施態様においては、該ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントの各々は、独立して、約１５ないし約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０）個のヌクレオチドを含んでなる。非限定的な例においては、該ｓｉＮＡ分子の２つのフラグメントの各々は、約２１個のヌクレオチドを含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなるｓｉＮＡ分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。該ｓｉＮＡは、例えば、約１５ないし約４０ヌクレオチド長であることができる。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全ピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡの修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン、又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを包含する。別の実施態様においては、ｓｉＮＡの修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−フルオロシチジン、及び少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを包含する。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのシチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのアデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのグアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは、さらに、少なくとも１つの修飾インターヌクレオチド結合、例えば、ホスホロチオエート結合を含んでなっていてもよい。１つの実施態様においては、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、リボヌクレアーゼによる切断に対し感受性である、ｓｉＮＡ中の特に選ばれた部位、例えば、ピリミジンヌクレオチドをもつ部位に存在する。
１つの実施態様においては、本発明は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入することを含んでなる、リボヌクレアーゼによる切断に対し本発明のｓｉＮＡ分子の安定性を増大する方法を特徴とし、これにおいて、該修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン、又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを包含する。別の実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−フルオロシチジン、及び少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを包含する。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのシチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのアデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する全てのグアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは、さらに、少なくとも１つの修飾されたインターヌクレオチド結合、例えば、ホスホロチオエート結合を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、リボヌクレアーゼによる切断に対し感受性である、ｓｉＮＡ中の特に選ばれた位置、例えば、ピリミジンヌクレオチドをもつ位置に存在する。
１つの実施態様においては、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を含んでなる、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該アンチセンス領域は、該標的遺伝子又はその一部によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該センス領域は、該アンチセンス領域に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつこれにおいて、該アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含んでなる。別の実施態様においては、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含んでなる。上記実施例のいずれにおいても、該アンチセンス領域は、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、該アンチセンス領域の３’末端に含んでなっていてもよい。別法として、上記実施例のいずれにおいても、該アンチセンス領域は、グリセリル修飾を、該アンチセンス領域の３’末端に含んでなっていてもよい。上記記載の任意のｓｉＮＡ分子の別の実施態様においては、該アンチセンス鎖の非相補領域（例えば、突出領域（ｏｖｅｒｈａｎｇ ｒｅｇｉｏｎ））に存在する任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の該アンチセンス領域は、特定の標的疾患に関連した対立遺伝子に固有の配列、例えば、疾患特異的対立遺伝子に関連した単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を含んでなる配列、を有する標的転写物の一部に相補的な配列を含んでなる。すなわち、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、特定の対立遺伝子に固有である配列に相補的な配列を含んでなってよく、疾患、症状、又は形質に関連した対立遺伝子に対する選択的ＲＮＡｉの媒介において特異性を提供することができる。
１つの実施態様においては、本発明は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて該ｓｉＮＡ分子は、２つの別々のオリゴヌクレオチドフラグメントから組立てられ、ここで、一方のフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のセンス領域を含んでなり、かつ第２のフラグメントは、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含んでなる。別の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子は、二本鎖核酸分子であり、ここで、各鎖は、約２１ヌクレオチド長であり、かつここで、該ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの約１９個のヌクレオチドは、該ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドに対し塩基対を作っており（ｂａｓｅ−ｐａｉｒｅｄ）、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドは、該ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントのヌクレオチドに対し塩基対を作っていない。別の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子は、二本鎖核酸分子であり、ここで、各鎖は、約１９ヌクレオチド長であり、かつここで、該ｓｉＮＡ分子の各フラグメントのヌクレオチドは、該ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドに対し塩基対を作っており、少なくとも約１５（例えば、１５、１６、１７、１８、又は１９）個の塩基対を形成しており、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子の一方又は双方の末端は、平滑末端である。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの二つの３’末端ヌクレオチドの各々は、２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ−チミジンである。別の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子の各フラグメントの全ヌクレオチドは、該ｓｉＮＡ分子の他方のフラグメントの相補的ヌクレオチドに対し塩基対を作っている。別の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有する、約１９ないし２５個の塩基対の二本鎖核酸分子であり、ここで、該アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドは、標的遺伝子によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に対し、塩基対を作っている。別の実施態様においては、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、該標的遺伝子によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に対し、塩基対を作っている。上記の任意の実施態様においては、前記アンチセンス領域を含んでなる該フラグメントの５’末端は、リン酸基を包含してもよい。
本明細書に記載の任意の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、表Ｉに示された、又は、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ ０５／１９４５３）、２００３年５月２３日出願の、ＵＳＳＮ１０／４４４，８５３、２００４年８月２０日出願の、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６、２００５年９月２３日出願の、ＵＳＳＮ１１／２３４，７３０、又は２００５年１２月８日出願の、ＵＳＳＮ１１／２９９，２５４（全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された、１つ以上の安定化化学を使用し得る。
１つの実施態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列（例えば、前記標的ＲＮＡ配列は、標的経路に関与する標的遺伝子によってコードされている）の発現を阻害する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、何らリボヌクレオチドを含有せず、かつこれにおいて、該二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５ないし３０ヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子は、２１ヌクレオチド長である。非リボヌクレオチド含有ｓｉＮＡコンストラクトの例は、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ ０５／１９４５３）、２００３年５月２３日出願の、ＵＳＳＮ１０／４４４，８５３、２００４年８月２０日出願の、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６、２００５年９月２３日出願の、ＵＳＳＮ１１／２３４，７３０、又は２００５年１２月８日出願の、ＵＳＳＮ１１／２９９，２５４（全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された、安定化化学の組合せである。
１つの実施態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉を介して標的ＲＮＡの切断を指示する、化学合成された二本鎖ＲＮＡ分子を含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を特徴とし、これにおいて、前記ＲＮＡ分子の各鎖は、約１５ないし約３０ヌクレオチド長であり；該ＲＮＡ分子の一方の鎖は、該ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して該標的ＲＮＡの切断を指示するのに充分な相補性を、該標的ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなり；かつこれにおいて、該ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、任意で、本明細書に記載の１つ以上の化学修飾されたヌクレオチド、例えば、制限なく、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、その他を含んでなってもよい。
１つの実施態様においては、本発明は、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に含んでなる組成物を特徴とする。
１つの実施態様においては、本発明は、標的ＲＮＡ配列の発現を阻害する、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は何らリボヌクレオチドを含有せず、かつこれにおいて、該二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５ないし約３０ヌクレオチドである。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子は、２１ヌクレオチド長である。非リボヌクレオチド含有ｓｉＮＡコンストラクトの例は、表Ｉにおいて、センス／アンチセンス化学の任意の組合せ、例えば、Ｓｔａｂ ７／８、Ｓｔａｂ ７／１１、Ｓｔａｂ ８／８、Ｓｔａｂ １８／８、Ｓｔａｂ １８／１１、Ｓｔａｂ １２／１３、Ｓｔａｂ ７／１３、Ｓｔａｂ １８／１３、Ｓｔａｂ ７／１９、Ｓｔａｂ ８／１９、Ｓｔａｂ １８／１９、Ｓｔａｂ ７／２０、Ｓｔａｂ ８／２０、Ｓｔａｂ １８／２０、Ｓｔａｂ ７／３２、Ｓｔａｂ ８／３２、Ｓｔａｂ １８／３２（例えば、Ｓｔａｂ ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、又は３２を有している、任意のｓｉＮＡセンス鎖又はアンチセンス鎖、或いはそれらの任意の組合せ）、において示された安定化化学の組合せである。本明細書では、数字で示したＳｔａｂ化学（ｓｔａｂ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、表Ｉに示された化学の、２’−フルオロ及び２’−ＯＣＦ３バージョンの双方を包含し得る。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８及びＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの双方、その他を指す。１つの実施態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉を介して標的ＲＮＡの切断を指示する、化学合成された二本鎖ＲＮＡ分子を特徴とし、これにおいて、前記ＲＮＡ分子の各鎖は、約１５ないし約３０ヌクレオチド長であり；該ＲＮＡ分子の一方の鎖は、該ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介して該標的ＲＮＡの切断を指示するのに充分な相補性を、該標的ＲＮＡに対し有しているヌクレオチド配列を含んでなり；かつこれにおいて、該ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、任意で、本明細書に記載の１つ以上の化学修飾されたヌクレオチド、例えば、制限なく、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、その他を含んでなってもよい。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該化学修飾は、式Ｉ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、任意のヌクレオチド、非ヌクレオチド、又はポリヌクレオチドであり、これは、天然であるか、又は化学修飾されていてもよく、各Ｘ及びＹは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、アルキル、又は置換アルキルであり、各Ｚ及びＷは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリール、アラルキル、又はアセチルであり、かつこれにおいて、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺは、任意で、全てがＯでなくてもよい］
を有する骨格修飾インターヌクレオチド結合を含んでなる、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０個、又はそれ以上）のヌクレオチドを含んでなる。別の実施態様においては、本発明の骨格修飾は、ホスホノアセテート及び／又はチオホスホノアセテートインターヌクレオチド結合（例えば、Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，４１０９−４１８８参照）を含んでなる。
例えば、任意のＺ、Ｗ、Ｘ、及び／又はＹが、独立して、硫黄原子を含んでなる、式Ｉを有する化学修飾されたインターヌクレオチド結合は、ｓｉＮＡの二重鎖の一方又は双方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｉをもつ、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０個、又はそれ以上）の化学修飾されたインターヌクレオチド結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉをもつ、約１ないし約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の化学修飾されたインターヌクレオチド結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、５’末端において含んでいてもよい。別の非限定的な例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉをもつ化学修飾されたインターヌクレオチド結合を用いて、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０個、又はそれ以上）のピリミジンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖において含んでいてもよい。なお別の非限定的な例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉをもつ化学修飾されたインターヌクレオチド結合とともに、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０個、又はそれ以上）のプリンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は双方において含んでいてもよい。別の実施態様においては、式Ｉのインターヌクレオチド結合をもつ本発明のｓｉＮＡ分子はまた、式ＩないしＶＩＩのいずれかをもつ、化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該化学修飾は、式ＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は、式Ｉ若しくはＩＩを有する基であり；Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２であり、そしてＢは、ヌクレオチド塩基、例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、又は、標的ＲＮＡに相補的又は非相補的であってよい任意の他の非天然塩基、或いは、非ヌクレオシド塩基、例えば、フェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、又は、標的ＲＮＡに相補的又は非相補的であってよい任意の他の非天然ユニバーサル塩基である］
を有する１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０個、又はそれ以上）のヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでなる。１つの実施態様においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、コンジュゲート基、及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は他の当該技術分野において既知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含んでなる。制限しないコンジュゲート基の例は、細胞受容体用のリガンド、例えば、天然タンパク質リガンドに由来するペプチド；細胞ＺＩＰコード配列を含む、タンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミン及び他のコファクター、例えば、葉酸塩及びＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド、及びポリアミン、例えば、ＰＥＩ、スペルミン、又はスペルミジンを包含する。
式ＩＩの、化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二重鎖の一方又は双方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の、式ＩＩの化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１ないし約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の、式ＩＩの化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、５’末端において含んでいてもよい。別の制限しない例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１ないし約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の、式ＩＩの化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、３’末端において含んでいてもよい。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該化学修飾は、式ＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は、式Ｉ若しくはＩＩを有する基であり；Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２であり、そしてＢは、ヌクレオチド塩基、例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、又は、標的ＲＮＡに相補的又は非相補的であるように用い得る任意の他の非天然塩基、或いは、非ヌクレオシド塩基、例えば、フェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、又は、標的ＲＮＡに相補的又は非相補的であってよい任意の他の非天然ユニバーサル塩基である］
を有する１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０個、又はそれ以上）のヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでなる。１つの実施態様においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、コンジュゲート基、及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は他の当該技術分野において既知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含んでなる。制限しないコンジュゲート基の例は、細胞受容体用のリガンド、例えば、天然タンパク質リガンドに由来するペプチド；細胞ＺＩＰコード配列を含む、タンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミン及び他のコファクター、例えば、葉酸塩及びＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド、及びポリアミン、例えば、ＰＥＩ、スペルミン、又はスペルミジンを包含する。
式ＩＩＩの、化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二重鎖の一方又は双方のオリゴヌクレオチド鎖中に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖中に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の、式ＩＩＩの化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１ないし約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の、式ＩＩＩの、化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、５’末端において含んでいてもよい。別の制限しない例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１ないし約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の、式ＩＩＩの化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、３’末端において含んでいてもよい。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、式ＩＩ又はＩＩＩを有するヌクレオチドを含んでなり、これにおいて、式ＩＩ又はＩＩＩを有する該ヌクレオチドは、反転した立体配置にある。例えば、式ＩＩ又はＩＩＩを有する該ヌクレオチドは、ｓｉＮＡコンストラクトに対し、３’−３’、３’−２’、２’−３’、又は５’−５’の立体配置において、例えば、一方又は双方のｓｉＮＡ鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において結合する。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該化学修飾は、式ＩＶ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｘ及びＹは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、又はアルキルハロであり；これにおいて、各Ｚ及びＷは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、アラルキル、アルキルハロ、又はアセチルであり；かつこれにおいて、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺは、全てＯというのではない］
を有する５’末端リン酸基を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、式ＩＶを有する５’末端リン酸基を、標的−相補鎖上、例えば、標的ＲＮＡに相補的な鎖上に有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、全てＲＮＡｓｉＮＡ分子を含んでなる。別の実施態様においては、本発明は、式ＩＶを有する５’末端リン酸基を、標的−相補鎖上に有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子はまた、約１ないし約４個（例えば、約１、２、３、又は４個）のデオキシリボヌクレオチドを有する約１ないし約３個（例えば、約１、２、又は３個）のヌクレオチド３’末端ヌクレオチド突出を、一方又は両鎖の３’末端上に含んでなる。別の実施態様においては、式ＩＶを有する５’末端リン酸基は、本発明のｓｉＮＡ分子、例えば、式ＩないしＶＩＩのいずれかを有する化学修飾をもつｓｉＮＡ分子、の標的−相補鎖上に存在する。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該化学修飾は、１つ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を含んでなる。例えば、非限定的な例においては、本発明は、約１、２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、１つのｓｉＮＡ鎖に有している、化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。なお別の実施態様においては、本発明は、約１、２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、双方のｓｉＮＡ鎖に個々に有している、化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合は、該ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は双方のオリゴヌクレオチド鎖に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、約１ないし約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の連続したホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の、５’末端において含んでいてもよい。別の非限定的な例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖に含んでいてもよい。なお別の非限定的な例においては、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のプリンホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖に含んでいてもよい。
１つの実施態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子であって、これにおいて、センス鎖は、１個以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、任意で、該センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、末端キャップ分子を含んでいてもよく；かつこれにおいて、アンチセンス鎖は、約１ないし約１０個、又はそれ以上の、特に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、任意で、該アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、任意で末端キャップ分子を含んでいてもよい、該ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施態様においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、同じか、又は異なる鎖に存在する、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方における末端キャップ分子を用いるか用いずに、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
別の実施態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子であって、これにおいて、センス鎖が、約１ないし５個、特に約１、２、３、４、又は５個のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、任意で、該センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、末端キャップ分子を含んでいてもよく；かつこれにおいて、アンチセンス鎖は、約１ないし約５個、又はそれ以上の、特に約１、２、３、４、５個、又はそれ以上の、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、任意で、該アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、任意で末端キャップ分子を含んでいてもよい、該ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施態様においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のピリジンヌクレオチドは、同じか、又は異なる鎖に存在する、約１ないし約５個、又はそれ以上の、例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において、末端キャップ分子を用いるか用いずに、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
１つの実施態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子であって、これにおいて、アンチセンス鎖は、１個以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、該センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、末端キャップ分子を含んでなってもよく；かつこれにおいて、アンチセンス鎖は、約１ないし約１０個、又はそれ以上の、特に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、任意で、該アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、末端キャップ分子を含んでなってもよい、該ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施態様においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、同じか、又は異なる鎖に存在する、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において、末端キャップ分子を用いるか用いずに、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
別の実施態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子であって、これにおいて、アンチセンス鎖が、約１ないし５個、又はそれ以上の、特に約１、２、３、４、又は５個のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、任意で、該センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、末端キャップ分子を含んでなってもよく；かつこれにおいて、アンチセンス鎖は、約１ないし約５個、又はそれ以上の、特に約１、２、３、４、５個、又はそれ以上の、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は１個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、及び、任意で、該アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に、任意で末端キャップ分子を含んでいてもよい、該ｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施態様においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の、１個以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、同じか、又は異なる鎖に存在する、約１ないし約５個、又はそれ以上の、例えば、約１、２、３、４、５個、又はそれ以上のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において、末端キャップ分子を用いるか用いずに、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、４’−チオ、及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
１つの実施態様においては、本発明は、約１ないし約５個、又はそれ以上（特に約１、２、３、４、５個、又はそれ以上）のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を、ｓｉＮＡ分子の各鎖に有している、化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
別の実施態様においては、本発明は、２’−５’インターヌクレオチド結合を含んでなるｓｉＮＡ分子を特徴とする。該２’−５’インターヌクレオチド結合は、一方又は双方のｓｉＮＡ配列鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において存在することができる。さらに、該２’−５’インターヌクレオチド結合は、一方又は双方のｓｉＮＡ配列鎖の他の様々な位置において存在することができ、例えば、該ｓｉＮＡ分子の一方又は双方の鎖における約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又は、全てを含めてそれ以上の、ピリミジンヌクレオチドのインターヌクレオチド結合は、２’−５’インターヌクレオチド結合を含んでなることができ、或いは、該ｓｉＮＡ分子の一方又は双方の鎖における約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又は、全てを含めてそれ以上の、プリンヌクレオチドのインターヌクレオチド結合は、２’−５’インターヌクレオチド結合を含んでいてもよい。
別の実施態様においては、本発明の化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、２つの鎖を有する二重鎖を含んでなり、その一方又は双方は、化学修飾可能であり、これにおいて、各鎖は、独立して、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）ヌクレオチド長であり、これにおいて、該二重鎖は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）塩基対を有しており、かつこれにおいて、該化学修飾は、式ＩないしＶＩＩのいずれかを有する構造を含んでなる。例えば、本発明の化学修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は、２つの鎖を有する二重鎖を含んでなり、その一方又は双方が、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せを有する化学修飾を用いて化学修飾することができ、これにおいて、各鎖は、約２１ヌクレオチドからなり、各々が２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド突出を有しており、かつこれにおいて、該二重鎖は、約１９塩基対を有する。別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、短鎖ヘアピン構造を含んでなり、これにおいて、該ｓｉＮＡは、約３６ないし約７０（例えば、約３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）ヌクレオチド長であって、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個の塩基対を有しており、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡは、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せをもつ構造を含んでなる化学修飾を包含することができる。例えば、本発明の化学修飾された例示的ｓｉＮＡ分子は、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せを有する化学修飾を用いて化学修飾されている、約４２ないし約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）個のヌクレオチドを有する直鎖オリゴヌクレオチドを含んでなり、これにおいて、該直鎖オリゴヌクレオチドは、約１９ないし約２１（例えば、１９、２０、又は２１）個の塩基対と、２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド突出とを有する、ヘアピン構造を形成する。別の実施態様においては、本発明の直鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフ（ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｍｏｔｉｆ）を含有し、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子のループ部分は、生分解性である。例えば、本発明の直鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子は、インビボでのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解が、３’末端突出、例えば、約２ヌクレオチドを含んでなる３’末端ヌクレオチド突出をもつ、二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成し得るよう設計される。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ヘアピン構造を含んでなり、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、約２５ないし約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチド長であって、約３ないし約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）個の塩基対を有しており、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡは、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せをもつ構造を含んでなる、１つ以上の化学修飾を含み得る。例えば、本発明の化学修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は、約２５ないし約３５（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５）個のヌクレオチドを有する直鎖状のオリゴヌクレオチドを含んでなり、これは、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せを有する１つ以上の化学修飾を用いて化学修飾されており、これにおいて、該直鎖状のオリゴヌクレオチドは、約３ないし約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）個の塩基対を有するヘアピン構造と、本明細書に記載のように化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶを有する５’末端リン酸基）とを形成する。別の実施態様においては、本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含有し、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。１つの実施態様においては、本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含んでなる、ループ部分を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、非対称性のヘアピン構造を含んでなり、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、約２５ないし約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチド長であって、約３ないし約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）個の塩基対を有しており、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡは、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せをもつ構造を含んでなる、１つ以上の化学修飾を含み得る。例えば、本発明の化学修飾された例示的ｓｉＮＡ分子は、約２５ないし約３５（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５）個のヌクレオチドを有する直鎖状のオリゴヌクレオチドを含んでなり、これは、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せをもつ１つ以上の化学修飾によって化学修飾されており、これにおいて、該直鎖状のオリゴヌクレオチドは、約３ないし約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）個の塩基対を有する非対称性ヘアピン構造と、本明細書に記載のように化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶを有する５’末端リン酸基）とを形成する。１つの実施態様においては、本発明の非対称性ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループモチーフを含有し、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子のループ部分は生分解性である。別の実施態様においては、本発明の非対称性ヘアピンｓｉＮＡ分子は、非ヌクレオチドリンカーを含んでなる、ループ部分を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス及びアンチセンス領域を含んでなる別個のポリヌクレオチド鎖を有している、非対称性の二本鎖構造を含んでなり、これにおいて、該アンチセンス領域は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）ヌクレオチド長であり、これにおいて、該センス領域は、約３ないし約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチド長であり、これにおいて、該センス領域及び該アンチセンス領域は、少なくとも３つの相補的ヌクレオチドを有しており、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡは、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せをもつ構造を含んでなる、１つ以上の化学修飾を含み得る。例えば、本発明の化学修飾された例示的ｓｉＮＡ分子は、センス及びアンチセンス領域を含んでなる別個のポリヌクレオチド鎖を有している、非対称性二本鎖構造を含んでなり、これにおいて、該アンチセンス領域は、約１８ないし約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）ヌクレオチド長であり、かつこれにおいて、該センス領域は、約３ないし約１５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）ヌクレオチド長であり、これにおいて、該センス領域及び該アンチセンス領域は、少なくとも３つの相補的ヌクレオチドを有しており、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡは、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せをもつ構造を含んでなる、１つ以上の化学修飾を含み得る。別の実施態様においては、非対称性の二本鎖ｓｉＮＡ分子はまた、本明細書に記載のように化学修飾され得る５’末端リン酸基（例えば、式ＩＶを有する５’末端リン酸基）を有し得る。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、環状核酸分子を含んでなり、これにおいて、該ｓｉＮＡは、約３８ないし約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）ヌクレオチド長であって、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個の塩基対を有しており、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡ分子は、式ＩないしＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せをもつ構造を含んでなる、化学修飾を含み得る。例えば、本発明の化学修飾された例示的ｓｉＮＡ分子は、式Ｉないし式ＶＩＩのいずれか、又はそれらの任意の組合せを有する化学修飾によって化学修飾されている、約４２ないし約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）個のヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含んでなり、これにおいて、該環状オリゴヌクレオチドは、約１９塩基対と２つのループとを有するダンベル型の構造を形成する。
別の実施態様においては、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、２つのループモチーフを含有し、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子の一方又は双方のループ部分は、生分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、インビボでのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解が、３’末端突出、例えば、約２ヌクレオチドを含んでなる３’末端ヌクレオチド突出をもつ、二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成し得るよう設計される。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の脱塩基（ａｂａｓｉｃ）成分、例えば、式Ｖ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は、式Ｉ若しくはＩＩを有する基であり；Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２である］
を有する化合物を含んでなる。１つの実施態様においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、コンジュゲート基、及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は他の当該技術分野において既知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含んでなる。制限しないコンジュゲート基の例は、細胞受容体用のリガンド、例えば、天然タンパク質リガンドに由来するペプチド；細胞ＺＩＰコード配列を含む、タンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミン及び他のコファクター、例えば、葉酸塩及びＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド、及びポリアミン、例えば、ＰＥＩ、スペルミン、又はスペルミジンを包含する。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の反転脱塩基成分、例えば、式ＶＩ：
Figure 2010519203
［式中、各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は、式Ｉ若しくはＩＩを有する基であり；Ｒ９は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ２であり、かつ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８、又はＲ１３のいずれかが、本発明のｓｉＮＡ分子への結合点として役割を果たす］
を有する化合物を含んでなる。１つの実施態様においては、Ｒ３及び／又はＲ７は、コンジュゲート基、及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は他の当該技術分野において既知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含んでなる。制限しないコンジュゲート基の例は、細胞受容体用のリガンド、例えば、天然タンパク質リガンドに由来するペプチド；細胞ＺＩＰコード配列を含む、タンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミン及び他のコファクター、例えば、葉酸塩及びＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド、及びポリアミン、例えば、ＰＥＩ、スペルミン、又はスペルミジンを包含する。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の置換ポリアルキル基、例えば、式ＶＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、各ｎは、独立して、１から１２までの整数であり、各Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリール又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は、式Ｉを有する基であり、かつＲ１、Ｒ１、又はＲ３は、本発明のｓｉＮＡ分子への結合点として役割を果たす］
を有する化合物を含んでなる。１つの実施態様においては、Ｒ３及び／又はＲ１は、コンジュゲート基、及びリンカー（例えば、本明細書に記載の、又は他の当該技術分野において既知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー）を含んでなる。制限しないコンジュゲート基の例は、細胞受容体用のリガンド、例えば、天然タンパク質リガンドに由来するペプチド；細胞ＺＩＰコード配列を含む、タンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミン及び他のコファクター、例えば、葉酸塩及びＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド、及びポリアミン、例えば、ＰＥＩ、スペルミン、又はスペルミジンを包含する。
「ＺＩＰコード」配列により、細胞のトポジェニックなシグナリング媒介輸送に関与する任意のペプチド、又はタンパク質配列が意味される（例えば、Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６（１５０１）：１５０５参照）。
別の実施態様においては、本発明は、式ＶＩＩを有する化合物を特徴とし、これにおいて、Ｒ１及びＲ２は、ヒドロキシル（ＯＨ）基であり、ｎ＝１であり、そしてＲ３は、Ｏを含んでなり、かつ本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方又は双方の鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方への、或いは本発明の単鎖ｓｉＮＡ分子への結合点である。この修飾を、本発明においては「グリセリル」と呼ぶ。
別の実施態様においては、本発明の化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩのいずれかを有する成分）は、本発明のｓｉＮＡ分子の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において存在する。例えば、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩを有する成分）は、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス及びセンス両鎖の、３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において存在し得る。１つの実施態様においては、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩを有する成分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の、センス鎖の５’末端及び３’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端に存在する。１つの実施態様においては、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩを有する成分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の、センス鎖の５’末端及び３’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端の、末端位に存在する。１つの実施態様においては、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩを有する成分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の、センス鎖の５’末端及び３’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端の、末端位の２つに存在する。１つの実施態様においては、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩを有する成分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の、センス鎖の５’末端及び３’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端の、端から２番目の位置に存在する。さらに、式ＶＩＩを有する成分は、本明細書に記載のヘアピンｓｉＮＡ分子の、３’末端又は５’末端に存在し得る。
別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｖ又はＶＩを有する脱塩基残基を含んでなり、これにおいて、式Ｖ又はＶＩを有する該脱塩基残基は、ｓｉＮＡコンストラクトに対し、３’−３’、３’−２’、２’−３’、又は５’−５’の立体配置において、例えば、一方又は双方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において結合される。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）のロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド分子を、例えば、該ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’及び３’末端の双方、又はそれらの任意の組合せにおいて含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の４’−チオヌクレオチドを、例えば、該ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’及び３’末端の双方、又はそれらの任意の組合せにおいて含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）非環式ヌクレオチドを、例えば、該ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’及び３’末端の双方、又はそれらの任意の組合せにおいて含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、センス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの実施態様においては、本発明は、センス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであり）、これにおいて、前記センス領域に存在する３’末端ヌクレオチド突出を含んでなる任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの実施態様においては、本発明は、センス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの実施態様においては、本発明は、センス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該センス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、前記センス領域に存在する３’末端ヌクレオチド突出を含んでなる任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの実施態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの実施態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、前記アンチセンス領域に存在する３’末端ヌクレオチド突出を含んでなる任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
１つの実施態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
１つの実施態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含んでなる本発明の化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個以上又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これは、センス領域： これにおいて、該センス領域に存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該センス領域に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである）；及びアンチセンス領域： これにおいて、該アンチセンス領域に存在する任意の１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、該アンチセンス領域に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）、を含んでなる。センス領域及び／又はアンチセンス領域は、末端キャップ修飾を有しても良く、これは任意で、該センス領域及び／又はアンチセンス領域の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に存在してもよい。該センス領域及び／又はアンチセンス領域は、任意でさらに、約１ないし約４個（例えば、約１、２、３、又は４個）の２’−デオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド突出を含んでいてもよい。突出ヌクレオチドは、さらに、１個以上（例えば、約１、２、３、４個、又はそれ以上）のホスホロチオエート、ホスホノアセテート、及び／又はトリホスホノアセテートインターヌクレオチド結合を含んでいてもよい。記述されたこれらの任意の実施態様において、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、択一的に２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり）、かつ、アンチセンス領域に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。また、これらの任意の実施態様においては、センス領域に存在する１個以上のプリンヌクレオチドは、択一的にプリンリボヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか、或いはまた、複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであり）、かつ、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドである）。さらに、これらの任意の実施態様においては、センス領域に存在する、及び／又はアンチセンス領域に存在する、１個以上のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される（例えば、全てのプリンヌクレオチドが、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される）。
別の実施態様においては、任意の修飾されたヌクレオチドは、本発明のｓｉＮＡ分子において、好ましくは、本発明の該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが、また任意で、センス鎖、及び／又は、アンチセンス及びセンス両鎖において存在してもよく、天然リボヌクレオチドに類似した性質又は特徴を有する修飾されたヌクレオチドを含んでなる。例えば、本発明は、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）コンフォメーション（例えば、ノーザンシュードローテーションサイクル、例えば、サンガー（Ｓａｅｎｇｅｒ）著、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（核酸構造）」、スプリンガー・バーラグ版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ、１９８４年を参照）を有する修飾されたヌクレオチドを包含するｓｉＮＡ分子を特徴とする。すなわち、化学修飾されたヌクレオチドは、本発明のｓｉＮＡ分子において、好ましくは、本発明の該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが、また任意で、センス鎖、及び／又は、アンチセンス及びセンス両鎖において存在してもよく、ヌクレアーゼ分解に対し抵抗性であると同時に、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持している。ノーザンコンフィギュレーションを有するヌクレオチドの非限定的な例は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを包含する。
１つの実施態様においては、本発明の二本鎖低分子干渉核酸心分子のセンス鎖は、末端キャップ成分、例えば反転デオキシ脱塩基成分を、該センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方において含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、化学修飾された低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて該化学修飾は、化学修飾されたｓｉＮＡ分子に対し共有結合により結合されたコンジュゲートを含んでなる。本発明に係るコンジュゲートの非限定的な例は、２００３年４月３０日出願の、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、ＵＳＳＮ１０／４２７，１６０（その記載全体が、図面とともに、参考として本明細書に含まれる）に記載されたコンジュゲート及びリガンドを包含する。別の実施態様においては、コンジュゲートは、化学修飾されたｓｉＮＡ分子に対し、生分解性リガンドを介して共有結合されている。１つの実施態様においては、コンジュゲート分子は、化学修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、又は両鎖の、３’末端に結合する。別の実施態様においては、コンジュゲート分子は、化学修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、又は両鎖の、５’末端に結合する。なお別の実施態様においては、コンジュゲート分子は、化学修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか、又は両鎖の、３’末端及び５’末端の双方か、又はそれらの任意の組合せに結合する。１つの実施態様においては、本発明のコンジュゲート分子は、化学修飾されたｓｉＮＡ分子の、生物系、例えば細胞、の内部への送達を促進する分子を含んでなる。別の実施態様においては、化学修飾されたｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲート分子は、細胞受容体用のリガンド、例えば、天然タンパク質リガンドに由来するペプチド；細胞ＺＩＰコード配列を含む、タンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミン及び他のコファクター、例えば、葉酸塩及びＮ−アセチルガラクトサミン；ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；リン脂質；コレステロール；ステロイド、及びポリアミン、例えば、ＰＥＩ、スペルミン、又はスペルミジンである。化学修飾されたｓｉＮＡ分子に結合し得る、本発明に係る具体的なコンジュゲート分子の例は、２００２年７月２２日出願の、Ｖａｒｇｅｅｓｅら、ＵＳＳＮ１０／２０１，３９４（その記載全体が、参考として本明細書に含まれる）に記載されている。使用したコンジュゲートのタイプ、及び本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの程度は、ＲＮＡｉ活性を媒介するｓｉＮＡの能力を同時に維持しながら、ｓｉＮＡコンストラクトの改善された薬物動態学プロフィール、バイオアベイラビリティ、及び／又は安定性について評価し得る。すなわち、当業者は、当該技術分野において一般に知られているような動物モデルにおいて、種々のコンジュゲートで修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングして、該ｓｉＮＡコンジュゲート複合体が、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら、改善された特性をもつかどうかを判定することができる。
１つの実施態様においては、本発明は、本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、該ｓｉＮＡ分子はさらに、該ｓｉＮＡ分子のセンス領域を該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に結合する、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含んでなる。１つの実施態様においては、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーは、例えば、コンジュゲート成分をｓｉＮＡに結合するために使用する。１つの実施態様においては、本発明のヌクレオチドリンカーは、２ヌクレオチド長以上、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長であってよい。別の実施態様においては、ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであってよい。
なお別の実施態様においては、本発明の非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他のポリマー化合物（例えば、ポリエチレングリコール、例えば、２ないし１００個のエチレングリコール単位を有するもの）を含んでなる。具体的な例は、Ｓｅｅｌａ ａｎｄ Ｋａｉｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３、及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７，１５：３１１３；Ｃｌｏａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５、及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄら、国際公開第ＷＯ８９／０２４３９、Ｕｓｍａｎら、国際公開ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚら、国際公開ＷＯ９５／１１９１０、及び、Ｆｅｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３巻：４０００（ここに、全て参考として本明細書に含まれる）により記載されたものを包含する。「非ヌクレオチド」はさらに、１個以上のヌクレオチド単位の代わりに、糖及び／又はリン酸置換のいずれかを含めて、核酸鎖中に取込まれ得て、残りの塩基がその酵素活性を示すことができるようにする、任意の基又は化合物を意味する。該基又は化合物は、一般に認識されているヌクレオチド塩基、例えばアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミンを、糖のＣ１位において含有しない場合、脱塩基であり得る。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞又は再構築されたインビトロ系の中で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、これにおいて、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組立てられた、該ｓｉＮＡ分子の一方又は双方の鎖は、何らリボヌクレオチドを含まない。例えば、ｓｉＮＡ分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組立てられてもよく、ここで、該ｓｉＮＡのセンス及びアンチセンス領域は、オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）をもたない別個のオリゴヌクレオチドを含んでなる。別の例では、ｓｉＮＡ分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組立てられてもよく、ここで、該ｓｉＮＡのセンス及びアンチセンス領域は、本明細書に記載のヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーにより、結合されるか又は環化されており、これにおいて、該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中に存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）をもたない。本出願人は、驚くべきことに、ｓｉＮＡ分子中のリボヌクレオチド（例えば、２’−ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）の存在が、ＲＮＡｉ活性を支持しるために必要又は必須ではないことを見出した。例えば、１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ中の全ての位置は、化学修飾されたヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチド、例えば、式Ｉ、ＩＩ，ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩを有するヌクレオチド及び又は非ヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを、細胞内でＲＮＡｉ活性を支持する該ｓｉＮＡ分子の能力が維持される程度に包含し得る。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞又は再構築されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する単鎖ｓｉＮＡ分子であって、標的核酸配列に相補性を有する単鎖ポリヌクレオチドを含んでなる。別の実施態様においては、本発明の単鎖ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基を含んでなる。別の実施態様においては、本発明の単鎖ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基及び３’末端リン酸基（例えば、２’、３’−環状ホスフェイト）を含んでなる。別の実施態様においては、本発明の単鎖ｓｉＮＡ分子は、約１５ないし約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを含んでなる。なお別の実施態様においては、本発明の単鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の、１個以上の化学修飾されたヌクレオチド、又は非ヌクレオチドを含んでなる。例えば、ｓｉＮＡ分子中の全ての位置は、化学修飾されたヌクレオチド、例えば、式ＩないしＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを、細胞内でＲＮＡｉ活性を支持する該ｓｉＮＡ分子の能力が維持される程度に包含し得る。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞又は再構築されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する単鎖ｓｉＮＡ分子であって、標的核酸配列に相補性を有する単鎖ポリヌクレオチド； これにおいて、該ｓｉＮＡに存在する１個以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリミジンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシピリジンヌクレオチドであり）、かつこれにおいて、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、又は２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシプリンヌクレオチドであり）；及び、任意で該アンチセンス配列の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の双方に存在してもよい、末端キャップ修飾を含んでなる。該ｓｉＮＡは、任意でさらに、約１ないし約４個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４個又はそれ以上）の末端２’−デオキシヌクレオチドを、該ｓｉＮＡ分子の３’末端に有してもよく、これにおいて、該末端ヌクレオチドは、さらに１個以上（例えば、１、２、３、４個又はそれ以上）のホスホロチオエート、ホスホノアセテート、及び／又はチオホスホノアセテートインターヌクレオチド結合を含んでなることができ、かつこれにおいて、該ｓｉＮＡは、任意でさらに、末端リン酸基、例えば５’末端リン酸基を含んでなってもよい。これらの任意の実施態様においては、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは、択一的に２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであり）る。また、これらの任意の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子に存在する任意のプリンヌクレオチド（すなわち、センス及び／又はアンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド）は、択一的に、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであってよい（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであるか、或いは又複数のプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである）。また、これらの任意の実施態様においては、ｓｉＮＡに存在する任意のプリンヌクレオチドは、択一的に２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである（例えば、これにおいて、全てのプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであるか、或いはまた複数のプリンヌクレオチドが、２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである）。別の実施態様においては、本発明の単鎖ｓｉＮＡ分子に存在する任意の修飾されたヌクレオチドは、天然リボヌクレオチドに類似した性質又は特徴を有する修飾されたヌクレオチドを含んでなる。例えば、本発明は、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）コンフォメーション（例えば、ノーザンシュードローテーションサイクル、例えば、サンガー（Ｓａｅｎｇｅｒ）著、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（核酸構造）」、スプリンガー・バーラグ版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ｅｄ、１９８４年を参照）を有する修飾されたヌクレオチドを包含するｓｉＮＡ分子を特徴とする。すなわち、本発明の単鎖ｓｉＮＡ分子に存在する化学修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレアーゼ分解に対し抵抗性であると同時に、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持している。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドといった、式ＩないしＶＩＩのいずれかを有している）を、該ｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖又は領域内の交互の位置において含んでなる。例えば、かかる化学修飾は、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子の１つおきの位置に導入可能であり、該ｓｉＮＡの３’末端又は５’末端から、１番目又は２番目のヌクレオチドのいずれかで始まる。非限定的な例においては、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、これにおいて、各鎖の位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１が化学修飾されていることを特徴とする（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドといった、式ＩないしＶＩＩのいずれかを有している化合物で）。別の非限定的な例において、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、これにおいて、各鎖の位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０が化学修飾されていることを特徴とする（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドといった、式ＩないしＶＩＩのいずれかを有している化合物で）。かかるｓｉＮＡ分子は、さらに、本明細書に記載の末端キャップ成分及び／又は骨格修飾を含んでいてもよい。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）を、患者又は生体の細胞又は複数の細胞に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該ポリヌクレオチド成分の送達に適した条件下に、該患者又は生体の細胞又は複数の細胞に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。別の実施態様においては、該細胞は、例えば、肺細胞、肝細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腫瘍細胞、腎細胞、血管細胞、皮膚細胞、眼細胞、又は耳の細胞である。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）を、患者又は生体の肝臓又は肝細胞（例えば、肝実質細胞）に、送達又は投与するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該製剤又は組成物の該ポリヌクレオチド成分の送達に適した条件下に、患者又は生体の肝臓又は肝細胞（例えば、肝実質細胞）に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。
１つの実施態様においては、細胞内で標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、細胞において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に、該細胞内に導入することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該細胞は肝細胞（例えば、肝実質細胞）である。別の実施態様においては、該細胞は、例えば、肺細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腫瘍細胞、腎細胞、血管細胞、皮膚細胞、眼細胞、又は耳の細胞である。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、細胞内で１つ以上の標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を、該細胞において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に、該細胞内に導入することを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該細胞は肝細胞（例えば、肝実質細胞）である。別の実施態様においては、該細胞は、例えば、肺細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腫瘍細胞、腎細胞、血管細胞、皮膚細胞、眼細胞、又は耳の細胞である。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体における遺伝子発現に関連した疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、該患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に、該患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを含んでなる、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、遺伝子発現の低減、及びしたがってそれぞれのタンパク質／ＲＮＡレベルの低減が、疾患、障害、形質、又は症状の徴候をある程度緩和する。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において癌を治療又は予防するための方法であって、該患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に、該患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを含んでなり、それにより癌の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば癌性細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における癌の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、該製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体における適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において増殖性の疾患又は症状を治療又は予防するための方法であって、該患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に、該患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを含んでなり、それにより増殖性の疾患又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば増殖性疾患に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における増殖性の疾患又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、該製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体における適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、移植片及び／又は組織拒絶（同種移植片拒絶）を治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより移植片及び／又は組織拒絶（同種移植片拒絶）の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば移植片及び／又は組織拒絶（同種移植片拒絶）に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における移植片及び／又は組織拒絶（同種移植片拒絶）の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、該製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、自己免疫疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより自己免疫疾患、障害、形質、又は症状の治療または予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば自己免疫疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における自己免疫疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、該製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、感染性疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより感染性疾患、障害、形質、又は症状の治療または予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば感染性疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における感染性疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、該製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、年齢関連疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより年齢関連疾患、障害、形質、又は症状の治療または予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば年齢関連疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における年齢関連疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、該製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、神経又は神経変性疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより神経又は神経変性疾患、障害、形質、又は症状の治療または予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば神経又は神経変性疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における神経又は神経変性疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、該製剤又は組成物の、カテーテル法、浸透圧ポンプ投与（例えば、髄腔内又は脳室）静脈内、又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。１つの実施態様においては、神経疾患はハンチントン病である。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、代謝疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより代謝疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば代謝疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における代謝疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、心臓血管疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより心臓血管疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば心臓血管疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における心臓血管疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、呼吸器疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより呼吸器疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば呼吸器疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における呼吸器疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、眼性疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより眼性疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば眼性疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における眼性疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、皮膚の疾患、障害、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより皮膚の疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば皮膚の疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における皮膚の疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、肝臓の疾患、障害、形質、又は症状（例えば、肝炎、ＨＣＶ、ＨＢＶ、糖尿病、肝硬変、肝細胞癌など）を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより肝臓の疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば肝臓の疾患、障害、形質、又は症状に関与する細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における肝臓の疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、腎臓／腎性の疾患、障害、形質、又は症状（例えば、多発性嚢胞腎）を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより腎臓／腎性の疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、腎臓／腎性の疾患、障害、形質、又は症状に関係している、腎臓／腎性細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における腎臓／腎性の疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、聴覚の疾患、障害、形質、又は症状（例えば、聴力損失、難聴）を、治療又は予防するための方法であって、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と、患者又は生体において標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下に接触させ、それにより聴覚の疾患、障害、形質、又は症状の治療又は予防を達成し得る、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、ポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、聴覚の疾患、障害、形質、又は症状に関係している、耳、内耳、又は中耳の細胞及び組織、への局所投与により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。１つの実施態様においては、本発明は、関連する組織又は細胞、例えば、患者又は生体における聴覚の疾患、障害、形質、又は症状の維持又は発生に関与する組織又は細胞、への全身投与（例えば、製剤又は組成物の、静脈内又は皮下投与）により、患者又は生体を、本発明の製剤又は組成物と接触させることを特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、患者又は生体において適当な組織又は細胞を標的とするべく、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で製剤又はコンジュゲートし得る。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、本明細書に記載の疾患又は症状を治療又は予防するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を該患者又は生体に投与することを含んでなり；これにおいて、該製剤又は組成物は、患者における標的遺伝子発現のレベルを、該製剤又は組成物で処理されていない患者に比較して低減又は阻害するのに適した条件下に投与される、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、脂質ナノ粒子及び本発明のｓｉＮＡ分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、本明細書に記載の疾患又は症状を治療又は予防するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を該患者に投与することを含んでなり；これにおいて、（ａ）製剤分子組成物は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸分子を含んでなり；（ｂ）該二本鎖核酸分子の各鎖は、１５ないし２８ヌクレオチド長であり；（ｃ）該センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドが、該アンチセンス鎖に相補的であり；（ｄ）該二本鎖核酸分子の該アンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対し相補性を有しており；かつこれにおいて、該製剤又は組成物は、該患者における標的ＲＮＡを、該製剤又は組成物で処理されていない患者に比較して低減又は阻害するのに適した条件下に投与される、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、製剤又は組成物は、脂質ナノ粒子及び本発明のｓｉＮＡ分子を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、患者又は生体において、本明細書に記載の疾患又は症状を治療又は予防するための方法であって、本発明の製剤又は組成物を該患者又は生体に投与することを含んでなり；これにおいて、（ａ）製剤分子組成物は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸分子を含んでなり；（ｂ）該二本鎖核酸分子の各鎖は、１５ないし２８ヌクレオチド長であり；（ｃ）該センス鎖の少なくとも１５ヌクレオチドが、該アンチセンス鎖に相補的であり；（ｄ）該二本鎖核酸分子の該アンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対し相補性を有しており；（ｅ）該二本鎖核酸分子の各鎖の内部ヌクレオチドの少なくともとも２０％が、化学修飾を有する修飾されたヌクレオチドであり；かつ（ｆ）少なくとも２つの該化学修飾は、互いに異なっており、かつこれにおいて、該製剤又は組成物は、該患者における標的ＲＮＡのレベルを、該製剤又は組成物で処理されていない患者に比較して低減又は阻害するのに適した条件下に投与される、該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、該製剤又は組成物は、脂質ナノ粒子及び本発明のｓｉＮＡ分子を含んでなる。
本発明の治療法のいずれにおいても、該製剤又は組成物は、患者に対し、治療コースとして、例えば、１日１回を治療コースにわたり、２日毎に１回を治療コースにわたり、３日毎に１回を治療コースにわたり、４日毎に１回を治療コースにわたり、５日毎に１回を治療コースにわたり、６日毎に１回を治療コースにわたり、１週間に１回を治療コースにわたり、１週間おきに１回を治療コースにわたり、１か月に１回を治療コースにわたり、などといった、様々な時間間隔での投与として投与可能である。１つの実施態様においては、治療のコースは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週間毎に１回である。１つの実施態様においては、治療のコースは、約１ないし約５２週間又はそれ以上（例えば、無期限）である。１つの実施態様においては、治療のコースは、約１から約４８か月まで又はそれ以上（例えば、無期限）である。
１つの実施態様においては、治療のコースは、最初の治療コース、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間、又はそれより多い週毎に１回を、固定された期間に（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれ以上）にわたり、及びそれに続く維持用の治療コース、例えば、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０週間、又はそれより多い週毎に１回を、追加の固定された期間（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれ以上）にわたるものを包含する。
本発明の任意の治療法において、該製剤又は組成物は、本明細書に記載の通り、又は当該技術において既知の他の方法で、患者に対し全身投与することができる。全身投与は、当該技術分野において一般に知られているような、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、カテーテル法、鼻咽頭、経皮、又は消化管投与を包含し得る。
１つの実施態様においては、本発明の任意の治療又は予防法において、該製剤又は組成物は、本明細書に記載の通り、又は当該技術において既知の他の方法で、患者に局所又は局所細胞に投与することができる。局所投与は、例えば、カテーチル法、移植、浸透圧ポンプ、直接注射、皮膚／経皮適用、ステント留置術、点耳／点眼、又は、関連組織への門脈投与か、或いは、当該技術分野において一般に知られている任意の他の局所投与技術、方法、又は手順を包含する。
１つの実施態様においては、本発明は、本発明の製剤又は組成物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、本発明は、１つ以上の遺伝子を標的化する本発明の製剤又は組成物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に含んでなる組成物を特徴とする。別の実施態様においては、本発明は、患者における疾患又は症状を診断するための方法であって、該患者に対し、本発明の製剤又は組成物を、該患者における疾患又は症状の診断に適した条件下に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。別の実施態様においては、本発明は、患者における疾患、形質、又は症状を、治療又は予防するための方法であって、該患者に対し、本発明の製剤又は組成物を、単独で、又は１つ以上の他の治療用化合物と一緒に、該患者における疾患、形質、又は症状の治療又は予防に適した条件下に投与することを含んでなる、該方法を特徴とする。
１つの実施態様においては、制限しないが、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子を含む、本発明のポリヌクレオチド分子の合成法は、Ｓｃａｒｉｎｇｅら、米国特許第５，８８９，１３６；６，００８，４００；及び６，１１１，０８６号（その記載全体が、参考として本明細書に含まれる）の教示を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、増大されたヌクレアーゼ抵抗性をもつ製剤ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）組成物を生成するための方法であって、（ａ）修飾されたヌクレオチドを、本発明の製剤又は組成物のポリヌクレオチド成分に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）の製剤又は組成物を、増大されたヌクレアーゼ抵抗性を有する製剤ポリヌクレオチド組成物を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。
別の実施態様においては、本発明は、改善された毒性プロフィールをもつ（例えば、免疫刺激性が弱められているか、又はない）ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）分子を生成するための方法であって、（ａ）式ＩないしＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば、表Ｉにおいて参照されたｓｉＮＡモチーフ）又はそれらの任意の組合せを、ポリヌクレオチド分子に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のポリヌクレオチド分子を、改善された毒性プロフィールを有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。
別の実施態様においては、本発明は、改善された毒性プロフィールをもつ（例えば、免疫刺激性が弱められているか、又はない）製剤ｓｉＮＡ組成物を生成するための方法であって、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の他の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を生成すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を、改善された毒性プロフィールを有する製剤ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。
別の実施態様においては、本発明は、細胞、患者、又は生体において、インターフェロン応答を刺激しない（例えば、インターフェロン応答がないか、又はインターフェロン応答が弱められている）ｓｉＮＡ分子を生成するための方法であって、（ａ）式ＩないしＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば、表Ｉにおいて参照されたｓｉＮＡモチーフ）又はそれらの任意の組合せを、ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。
別の実施態様においては、本発明は、細胞、患者、又は生体において、インターフェロン応答を刺激しない（例えば、インターフェロン応答がないか、又はインターフェロン応答が弱められている）製剤ｓｉＮＡ組成物を生成するための方法であって、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の他の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を生成すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を、インターフェロン応答を刺激しない製剤ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、インターフェロンはインターフェロンアルファを含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、細胞、患者、又は生体において、炎症性又は前炎症性サイトカイン応答を刺激しない（例えば、サイトカイン応答がないか、又はサイトカイン応答が弱められている）ｓｉＮＡ分子を生成するための方法であって、（ａ）式ＩないしＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば、表Ｉにおいて参照されたｓｉＮＡモチーフ）又はそれらの任意の組合せを、ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、サイトカイン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、サイトカインは、インターロイキン、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）、及び／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を含んでなる。
１つの実施態様においては、本発明は、細胞、患者、又は生体において、炎症性又は前炎症性サイトカイン応答を刺激しない（例えば、サイトカイン応答がないか、又はサイトカイン応答が弱められている）製剤ｓｉＮＡ組成物を生成するための方法であって、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の他の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を生成すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を、サイトカイン応答を刺激しない製剤ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、サイトカインは、インターロイキン、例えばインターロイキン−６（ＩＬ−６）、及び／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、細胞、患者、又は生体において、トール様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体（ＴＬＲ）応答を刺激しない（例えば、ＴＬＲ応答がないか、又はＴＬＲ応答が弱められている）ｓｉＮＡ分子を生成するための方法であって、（ａ）式ＩないしＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド（例えば、表Ｉにおいて参照されたｓｉＮＡモチーフ）又はそれらの任意の組合せを、ｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、ＴＬＲ応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、細胞、患者、又は生体において、トール様受容体（ＴＬＲ）応答を刺激しない（例えば、ＴＬＲ応答がないか、又はＴＬＲ応答が弱められている）製剤ｓｉＮＡ組成物を生成するための方法であって、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子と、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の他の、送達ビヒクル又は送達粒子とを含んでなる、製剤ｓｉＮＡ組成物を生成すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ製剤を、ＴＬＲ応答を刺激しない製剤ｓｉＮＡ組成物を単離するのに適した条件下にアッセイすること、を含んでなる該方法を特徴とする。１つの実施態様においては、ＴＬＲは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９を含んでなる。
「改善された毒性プロフィール」により、未修飾のポリヌクレオチド、製剤又は組成物、ｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物、或いは、ほとんど修飾がないか、又は改善された毒性を付与する上で有効性の少ない修飾を有しているｓｉＮＡ分子に比較して、ポリヌクレオチド、製剤又は組成物、ｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物が、細胞、患者、又は生体において、低減された毒性を示すことを意味する。非限定的な例においては、改善された毒性プロフォールをもつポリヌクレオチド、製剤又は組成物、ｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、未修飾のポリヌクレオチド、製剤又は組成物、ｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物、或いは、ほとんど修飾がないか、又は改善された毒性を付与する上で有効性の少ない修飾を有しているポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ）に比較して、低減された免疫刺激性、例えば、細胞、患者、又は生体において低減されたか、又は弱められた免疫刺激性の応答に関連づけられる。かかる改善された毒性プロフィールは、阻害又は低減された免疫刺激、例えば、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ）、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６のようなインターロイキン、及び／又はＴＮＦ−アルファ）、及び／又はトール様受容体（例えば、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、及び／又はＴＬＲ−９）の誘導の低減又は阻害、によって特徴づけられる。１つの実施態様においては、改善された毒性プロフィールをもつポリヌクレオチド、製剤又は組成物、ｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、何らリボヌクレオチドを含まない。１つの実施態様においては、改善された毒性プロフィールをもつポリヌクレオチド、製剤又は組成物、ｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、５個未満のリボヌクレオチド（例えば、１、２、３、又は４個のヌクレオチド）を含んでなる。１つの実施態様においては、改善された毒性プロフィールをもつｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、Ｓｔａｂ ７、Ｓｔａｂ ８、Ｓｔａｂ １１、Ｓｔａｂ １２、Ｓｔａｂ １３、Ｓｔａｂ １６、Ｓｔａｂ １７、Ｓｔａｂ １８、Ｓｔａｂ １９、Ｓｔａｂ ２０、Ｓｔａｂ ２３、Ｓｔａｂ ２４、Ｓｔａｂ ２５、Ｓｔａｂ ２６、Ｓｔａｂ ２７、Ｓｔａｂ ２８、Ｓｔａｂ ２９、Ｓｔａｂ ３０、Ｓｔａｂ ３１、Ｓｔａｂ ３２、Ｓｔａｂ ３３、Ｓｔａｂ ３４、又はそれらの任意の組合せを含んでなる（表Ｉ参照）。本明細書では、数字で示したＳｔａｂ化学は、表Ｉに示された化学の、２’−フルオロ及び２’−ＯＣＦ３バージョンの双方を包含し得る。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８及びＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの双方、その他を指す。１つの実施態様においては、改善された毒性プロフィールをもつｓｉＮＡ又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、米国特許出願公開第２００３００７７８２９号（図面を含め、その記載全体が、参考として本明細書に含まれる）に記述されている。
１つの実施態様においては、所与のポリヌクレオチド、製剤又は組成物、ｓｉＮＡ分子又は製剤ｓｉＮＡ組成物に関連する免疫刺激性応答のレベルは、本明細書に記載の、又は当該技術分野において既知の別の方法で、例えば、ＰＫＲ／インターフェロン応答、増殖、Ｂ細胞活性化、及び／又はサイトカイン産生のレベルを、特定のポリヌクレオチド分子の免疫刺激応答を定量化するためのアッセイにおいて判定することにより、測定可能である（例えば、Ｌｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２６，３１３−９；及び米国特許第５，９６８，９０９号（その記載全体が参考として含まれる）を参照）。１つの実施態様においては、低減された免疫刺激性応答は、未修飾又は最小限に修飾されたｓｉＲＮＡ分子に比較して、約１０％ないし約１００％、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低減された免疫刺激性応答である。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子に関連する免疫刺激性応答は、化学修飾の程度により調節可能である。例えば、修飾されたｓｉＮＡ分子中、約１０％ないし１００％、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のヌクレオチド位置を有する該ｓｉＮＡ分子が、本明細書に記載の、対応する程度の免疫刺激性をもつべく選択可能である。
１つの実施態様においては、低減された免疫刺激性応答の程度は、最適化されたＲＮＡｉ活性について選択される。例えば、ある一定の度合の免疫刺激を保持することが、ウイルス感染を治療するために好適であり得て、この場合、免疫刺激の１００％未満の低減（例えば、免疫刺激における約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の低減）が、最大抗ウイルス活性のために好適であってよく、一方、最小限の免疫刺激性をもつｓｉＮＡ分子については、非特異的毒性又はオフターゲット効果を防止するために、内在遺伝子標的の発現制御（例えば、免疫刺激の約９０％ないし１００％の低減）が好適であってもよい。
１つの実施態様においては、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物は、該組成物が細胞に対し非毒性であるか、又は最小化された毒性プロフィールを有するように設計して、該組成物が、製剤ｓｉＮＡ組成物のｓｉＮＡ成分により媒介されるＲＮＡｉの効果に干渉しないか、又は結果として細胞に対し毒性を生じないようにする。
本明細書で使用される、用語「生物活性分子」は、系において生物学的応答を誘発するか又は修飾することが可能な、化合物又は分子を指す。生物活性分子の非限定的な例は、抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、その他）、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、抗生物質、低分子、ビタミン、コファクター、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ、及びそれらの類似体を包含する。本発明の生物活性分子はまた、他の生物活性分子、例えば、脂質及びポリマー、例えばポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、及び他のポリエーテルの薬物動態学及び／又は薬力学を調節し得る分子も包含する。ある実施態様においては、用語「生物活性分子」は、本明細書では、用語「分子」又は「興味の分子」と互換的に使用される。
本明細書で使用される、用語「担体」又は「担体分子」は、送達ビヒクル又は系と共同して、生物活性分子の活性及び／又は細胞内送達を強化し得る、任意の化合物又は組成物を指す。何らのメカニズム又は理論に束縛されることを望むものではないが、担体分子は、生物活性分子の強力な細胞内送達を可能にする、送達ビヒクル又は系の最大化された効率のための手だてであり、担体分子なしの送達ビヒクル又は系の使用に比較して、低減された量又は濃度の生物活性物質が、細胞、組織、又は生体において生物活性を与えることができるようにする。別法として、担体分子は、生物活性分子の生物活性を与える１つ以上の因子との相互作用を介する、生物活性分子の最大化された活性のための手だてであり、これにより生物活性分子の活性を強化する。１つの実施態様においては、担体分子は、特定の量の生物活性分子を、送達ビヒクル又は系と共同して置換え又は交換するべく使用される。１つの実施態様においては、約１ないし約９９パーセント（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント）のモル質量、分子量、又は生物活性分子の濃度を、担体分子で、又は送達ビヒクル又は系と共同して、置換え又は交換し得る。担体分子の非限定的な例は、脂質（例えば、カチオン性脂質、中性脂質）、ペプチド、タンパク質、ステロイド（例えば、コレステロール、エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココーチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチソール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、及び／又は成長ホルモン）、低分子、ビタミン、コファクター、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド（例えば、単鎖、二本鎖、又は三本鎖）、ポリマー、アルブミン、コラーゲン、及びゼラチン、多糖類、例えばデキストラン及びデンプン、及び、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ラクチド−グリコリドコポリマー（ＰＬＧ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ラクチド−カプロラクトンコポリマー、ポリヒドロキシブチラート、ポリアルキルシアノアクリラート、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、アクリラートポリマー及びコポリマー、例えばメチルメタクリラート、メタクリル酸、ヒドロキシアルキルアクリラート及びメタクリラート、エチレングリコールジメタクリラート、アクリルアミド、及び／又はビスアクリルアミド、セルロースベースポリマー、エチレングリコールポリマー及びコポリマー、オキシエチレン及びオキシプロピレンポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、及び／又はそれらの任意の組合せを包含するマトリックス形成組成物、を包含する。１つの実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドベースの担体分子は、例えば、約２ないし約１００，０００塩基長の、単鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子；例えば、約２ないし約１００，０００塩基対長の、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子；例えば、約２ないし約１００，０００塩基対長の、三本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を含む、１つ以上の核酸分子を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドベースの担体分子は、非常に異なる種に由来する非ヒトＤＮＡ、例えば、非ヒト精子ＤＮＡを含んでなる（例えば、サケ精子ＤＮＡを記載している、ＪＰ６３１０２６８２を参照）。別の実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドベースの担体分子は、非常に異なる種に由来する非ヒトＤＮＡ、例えば、非ヒトｔＲＮＡを含んでなる。１つの実施態様においては、ポリヌクレオチド担体分子は、本明細書に記載の、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子である。別の実施態様においては、ポリヌクレオチド担体分子は、標的核酸分子に相補的ではなく、これは、同じ組成物中の生物活性分子により標的化される。例えば、本発明の生物活性分子が、標的ポリヌクレオチド配列に相補性を有するｓｉＮＡ分子を含んでなる場合、本発明の組成物中に利用される核酸ベースの担体分子は、該標的ポリヌクレオチド配列に対し相補性をもたない配列からなる。１つの実施態様においては、本発明の担体分子は、本発明の製剤の成分である、１つの実施態様においては、本発明の担体分子は、ポリヌクレオチドを欠いている。
本明細書で使用される、用語「ビヒクル」は、生物活性分子を輸送することができる任意の送達系又は組成物を指す。ビヒクルの非限定的な例は、トランスフェクション剤、リポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、カプシド、ウイロイド、ビリオン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、タンパク質ケージ、フェリチン、ヒドロゲル、及びポリマー；脂質ナノ粒子又はＬＮＰ組成物（例えば、表ＩＶ、及び米国特許出願公開第２００６０２４０５５４号、及び２００６年１０月２４日出願のＵＳＳＮ １１／５８６，１０２を参照）；安定な核酸粒子又はＳＮＡＬＰ組成物（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０１２１９１号、及び米国特許第出願公開第２００６０８３７８０、２００６０５１４０５、ＵＳ２００５１７５６８２、ＵＳ２００４１４２０２５、ＵＳ２００３０７７８２９、ＵＳ２００６２４００９３を参照）；国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５１０５１５２号及びＷＯ２００７０１４３９１号、及び米国特許第７，１４８，２０５、７，１４４，８６９、７，１３８，３８２、７，１０１，９９５、７，０９８，０３２、７，０９８，０３０、７，０９４，６０５、７，０９１，０４１、７，０８７，７７０、７，０７１，１６３、７，０４９，１４４、７，０４９，１４２、７，０４５，３５６、７，０３３，６０７、７，０２２，５２５、７，０１９，１１３、７，０１５，０４０、６，９３６，７２９、６，９１９，０９１、６，８９７，０６８、６，８８１，５７６、６，８７２，５１９、６，８６７，１９６、６，８１８，６２６、６，７９４，１８９、６，７４０，６４３、６，７４０，３３６、６，７０６，９２２、６，６７３，６１２、６，６３０，３５１、６，６２７，６１６、６，５９３，４６５、６，４５８，３８２、６，４２９，２００、６，３８３，８１１、６，７３９，９６６、６，３３９，０６７、６，２６５，３８７、６，２６２，２５２、６，１８０，７８４、６，１２６，９６４、６，０９３，７０１、及び５，７４４，３３５号に記載された送達系；ペプチド又はペプチド関連送達系（例えば、米国特許出願公開第２００６００４０８８２、２００５０１３６４３７、２００５００３１５４９、及び２００６００６２７５８号を参照）；タンパク質、例えば、アルブミン、コラーゲン、及びゼラチン；多糖類、例えば、デキストラン及びデンプン、及び、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ラクチド−グリコリドコポリマー（ＰＬＧ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ラクチド−カプロラクトンコポリマー、ポリヒドロキシブチラート、ポリアルキルシアノアクリラート、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、アクリラートポリマー及びコポリマー、例えばメチルメタクリラート、メタクリル酸、ヒドロキシアルキルアクリラート及びメタクリラート、エチレングリコールジメタクリラート、アクリルアミド、及び／又はビスアクリルアミド、セルロースベースポリマー、エチレングリコールポリマー及びコポリマー、オキシエチレン及びオキシプロピレンポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、及び／又はそれらの任意の組合せを包含するマトリックス形成組成物を包含する。本発明のある実施態様においては、用語ビヒクルは、用語製剤と互換的に使用される。
本発明において使用される、用語「脂質ナノ粒子」、又は「脂質ナノ粒子組成物」、又は「ＬＮＰ」は、１つ以上の担体分子及び／又は１つ以上の生物活性分子を、独立して、又はカチオン性脂質、中性脂質、及び／又はポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（すなわち、ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）コンジュゲートと組合せて、含んでなる組成物を指す。製剤又は組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでいてもよい（図１２参照）。本発明のカチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩのいずれかを有する化合物、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ），Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ］）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。中性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢを含んでいてもよい。カチオン性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約２％ないし約６０％、約５％ないし約４５％、約５％ないし約１５％、又は約４０％ないし約５０％を含んでいてもよい。中性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約５％ないし約９０％、又は約２０％ないし約８５％を含んでいてもよい。ＰＥＧ−ＤＡＣコンジュゲート（例えば、ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＣ）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢ）は、製剤中に存在する全脂質の、約１％ないし約２０％、又は約４％ないし約１５％を含んでいてもよい。コレステロール成分は、製剤中に存在する全脂質の、約１０％ないし約６０％、又は約２０％ないし約４５％を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、本発明の製剤又は組成物は、製剤中に存在する全脂質の約７．５％を含んでなるカチオン性脂質成分、製剤中に存在する全脂質の約８２．５％を含んでなる中性脂質、及び製剤中に存在する全脂質の約１０％を含んでなるＰＥＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、本発明の製剤又は組成物は、生物活性分子、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、製剤又は組成物はまた、コレステロール又はコレステロール誘導体も含んでなる。１つの実施態様においては、製剤又は組成物は、表ＩＶに示された脂質ナノ粒子製剤を含んでなる。１つの実施態様においては、ＬＮＰは、製剤ｓｉＮＡ組成物を含んでなる。別の実施態様においては、ＬＮＰは、製剤ｍｉＲＮＡ組成物を含んでなる。別の実施態様においては、ＬＮＰは、製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物を含んでなる。
本明細書で用いられる、用語「製剤ｓｉＮＡ組成物」は、１つ以上のｓｉＮＡ分子、又は１つ以上のｓｉＮＡ分子をコードしているベクターを、独立して、或いは、カチオン性脂質、中性脂質、及び／又はポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）又はＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）コンジュゲートと組合せて含んでなる組成物を指す。製剤ｓｉＮＡ組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでいてもよい。本発明のカチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩのいずれかを有する化合物、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ），Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ］）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。中性脂質は、式ＮＬＩないしＮＬＶＩＩのいずれかを有する化合物、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢを含んでいてもよい。カチオン性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約２％ないし約６０％、約５％ないし約４５％、約５％ないし約１５％、又は約４０％ないし約５０％を含んでいてもよい。中性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約５％ないし約９０％、又は約２０％ないし約８５％を含んでいてもよい。ＰＥＧ−ＤＡＣコンジュゲートは、製剤中に存在する全脂質の、約１％ないし約２０％、又は約４％ないし約１５％を含んでいてもよい。コレステロール成分は、製剤中に存在する全脂質の、約１０％ないし約６０％、又は約２０％ないし約４５％を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物は、製剤中に存在する全脂質の約７．５％を含んでなるカチオン性脂質成分、製剤中に存在する全脂質の約８２．５％を含んでなる中性脂質、及び製剤中に存在する全脂質の約１０％を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物は、ｓｉＮＡ分子、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、製剤ｓｉＮＡ組成物はまた、コレステロール又はコレステロール誘導体も含んでなる。
本明細書で用いられる、用語「製剤ｍｉＲＮＡ組成物」は、１つ以上のｍｉＲＮＡ分子、又は１つ以上のｍｉＲＮＡ分子をコードしているベクターを、独立して、或いは、カチオン性脂質、中性脂質、及び／又はポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）又はＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）コンジュゲートと組合せて含んでなる組成物を指す。製剤ｍｉＲＮＡ組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでいてもよい。本発明のカチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩのいずれかを有する化合物、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ），Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ］）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。中性脂質は、式ＮＬＩないしＮＬＶＩＩのいずれかを有する化合物、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢを含んでいてもよい。カチオン性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約２％ないし約６０％、約５％ないし約４５％、約５％ないし約１５％、又は約４０％ないし約５０％を含んでいてもよい。中性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約５％ないし約９０％、又は約２０％ないし約８５％を含んでいてもよい。ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは、製剤中に存在する全脂質の、約１％ないし約２０％、又は約４％ないし約１５％を含んでいてもよい。コレステロール成分は、製剤中に存在する全脂質の、約１０％ないし約６０％、又は約２０％ないし約４５％を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、本発明の製剤ｍｉＲＮＡ組成物は、製剤中に存在する全脂質の約７．５％を含んでなるカチオン性脂質成分、製剤中に存在する全脂質の約８２．５％を含んでなる中性脂質、及び製剤中に存在する全脂質の約１０％を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、本発明の製剤ｍｉＲＮＡ組成物は、ｍｉＲＮＡ分子、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、製剤ｍｉＲＮＡ組成物はまた、コレステロール又はコレステロール誘導体も含んでなる。
本明細書で用いられる、用語「製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物」は、１つ以上のＲＮＡｉ阻害剤分子、又は１つ以上のＲＮＡｉ阻害剤分子をコードしているベクターを、独立して、或いは、カチオン性脂質、中性脂質、及び／又はポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）又はＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）コンジュゲートと組合せて含んでなる組成物を指す。製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでいてもよい。本発明のカチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩのいずれかを有する化合物、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ），Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ］）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９’，１２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。中性脂質は、式ＮＬＩないしＮＬＶＩＩのいずれかを有する化合物、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び／又はそれらの混合物を含んでいてもよい。ＰＥＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢを含んでいてもよい。カチオン性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約２％ないし約６０％、約５％ないし約４５％、約５％ないし約１５％、又は約４０％ないし約５０％を含んでいてもよい。中性脂質成分は、製剤中に存在する全脂質の、約５％ないし約９０％、又は約２０％ないし約８５％を含んでいてもよい。ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは、製剤中に存在する全脂質の、約１％ないし約２０％、又は約４％ないし約１５％を含んでいてもよい。コレステロール成分は、製剤中に存在する全脂質の、約１０％ないし約６０％、又は約２０％ないし約４５％を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、本発明の製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物は、製剤中に存在する全脂質の約７．５％を含んでなるカチオン性脂質成分、製剤中に存在する全脂質の約８２．５％を含んでなる中性脂質、及び製剤中に存在する全脂質の約１０％を含んでなるＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、本発明の製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物は、ＲＮＡｉ阻害剤分子、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートを含んでなる。１つの実施態様においては、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施態様においては、製剤ＲＮＡｉ阻害剤組成物はまた、コレステロール又はコレステロール誘導体も含んでなる。
本明細書で使用される「カチオン性脂質」により、特定のｐＨにおいてカチオン性変化を有する任意の親油性化合物、例えば、式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有する化合物、が意味される。
本明細書で使用される「中性脂質」により、特定のｐＨにおいて非カチオン性変化（例えば、アニオン性又は中性変化）を有する任意の親油性化合物が意味される。
「ＰＥＧ」により、任意のポリエチレングリコール又は他のポリアルキレンエーテル、又は同等のポリマーが意味される。１つの実施態様においては、ＰＥＧは、例えば、本発明の脂質成分に結合した、２００ないし１０，０００原子のＰＥＧ分子を含んでいてもよいＰＥＧコンジュゲートである。１つの実施態様においては、ＰＥＧは、式ＰＥＧｎ［式中、１５００Ｄａないし３０００ＤａのＰＥＧでは、ｎ＝約３３ないし６７であり、２ＫＰＥＧ／ＰＥＧ２０００では、平均＝４５］によって表わされる多分散物である。
「ナノ粒子」により、そのサイズがナノメートルで測定される、顕微鏡的粒子が意味される。本発明のナノ粒子は、典型的には、直径約１ないし約９９９ｎｍの範囲にあり、被包又は封入された生物活性分子を包含し得る。
「マイクロ粒子」は、そのサイズがマイクロメートルで測定される、顕微鏡的粒子が意味される。本発明のマイクロ粒子は、典型的には、直径約１ないし約１００マイクロメートルの範囲にあり、被包又は封入された生物活性分子を包含し得る。
用語「低分子干渉核酸（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」、及び「化学修飾された低分子干渉核酸分子」は、本明細書で使用されるとき、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを配列に特異的な方法で媒介することにより、遺伝子発現又はウイルス複製を阻害又はダウンレギュレートし得る任意の核酸分子を指す（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１０６３９０（ＷＯ ０５／１９４５３）、２００３年５月２３日出願の、ＵＳＳＮ１０／４４４，８５３、２００４年８月２０日出願の、ＵＳＳＮ１０／９２３，５３６、２００５年９月２３日出願の、ＵＳＳＮ１１／２３４，７３０、２００５年１２月８日出願の、ＵＳＳＮ１１／２９９，２５４、２００６年８月１７日出願の、ＰＣＴ／ＵＳ０６／３２１６８（全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）を参照）。これらの用語は、個々の核酸分子の双方、複数のかかる核酸分子、又はかかる核酸分子のプールを指すこともできる。ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含んでなる二本鎖核酸分子であってよく、これにおいて、該アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、該センス領域は、該標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２つの別々のオリゴヌクレオチドから組立てることができ、ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、これにおいて、該アンチセンス及び該センス鎖は、自己相補的である（すなわち、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる；例えば、アンチセンス鎖及びセンス鎖が二重鎖又は二本鎖構造を形成する場合、例えば、二本鎖領域は約１５ないし約３０、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０塩基対であり；該アンチセンス鎖は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、該センス鎖は、該標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有する（例えば、ｓｉＮＡ分子の約１５ないし約２５個、又はそれ以上のヌクレオチドが、標的核酸又はその一部に相補的である）。別法として、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組立てられ、ここで、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス及びアンチセンス領域は、核酸ベース又は非核酸ベースのリンカーによって結合されている。ｓｉＮＡは、二重鎖、非対称性の二重鎖、ヘアピン、又は非対称性のヘアピン二次構造であってよく、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を備えたポリヌクレオチドであり、これにおいて、該アンチセンス領域は、別の標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該センス領域は、該標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２個以上のループ構造と、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含んでなるステムとを有する、環状単鎖ポリヌクレオチドであってよく、これにおいて、該アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ該センス領域は、該標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有しており、かつこれにおいて、該環状ポリヌクレオチドは、インビボ又はインビトロのいずれかにおいてプロセスされて、ＲＮＡｉを媒介し得る活性ｓｉＮＡ分子を生じ得る。ｓｉＮＡはまた、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する単鎖ポリヌクレオチドを含んでなることができ（例えば、これにおいて、かかるｓｉＮＡ分子は、該標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列が該ｓｉＮＡ分子中に存在することを必要としない）、これにおいて、該単鎖ポリヌクレオチドは、さらに、末端リン酸基、例えば、５’−ホスフェイト（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４、及びＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８参照）、又は５’，３’−ジホスフェイトを含んでいてもよい。ある実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、別のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含んでなり、これにおいて、該センス及びアンチセンス領域は、当該技術分野において既知の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合により結合されているか、或いはまた、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、及び／又はスタッキング相互作用によって、非共有結合的に結合されている。ある実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と、該標的遺伝子の発現阻害を引き起こすように相互作用する。本明細書で用いる場合、ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有するような分子に限定される必要はないが、化学的修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに包含する。ある実施態様においては、本発明の低分子干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。出願人は、いくつかの実施態様において、ＲＮＡｉを媒介するのに２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない低分子干渉核酸を記述しており、例えば、本発明の低分子干渉核酸分子は、任意で、何らリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を包含しなくてもよい。ＲＮＡｉを支援するためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としない、かかるｓｉＮＡ分子は、しかしながら、２’−ＯＨ基をもつ１個以上のヌクレオチドを含有する、結合したリンカー又は複数のリンカー、或いは他の結合又は会合された基、成分、又は鎖を有し得る。任意で、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％において、リボヌクレオチドを含んでいてもよい。本発明の修飾された低分子干渉核酸分子はまた、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」とも呼ぶことができる。本明細書において使用される場合、用語ｓｉＮＡは、配列特異的ＲＮＡｉを媒介し得る核酸分子を記載するために使用される他の用語、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロ−ＲＮＡ、（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、その他と同等であることを意味する。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例は、２００５年９月２３日出願の、ＵＳＳＮ１１／２３４，７３０（その記載全体が、参考として本明細書に含まれる）に示されている。かかるｓｉＮＡ分子は、遺伝子発現の阻害を媒介する当該技術分野において既知の他の核酸技術、例えば、リボザイム、アンチセンス、三重鎖形成、アプタマー、２，５−Ａキメラ、又はデコイオリゴヌクレオチドとは別個である。
「ＲＮＡ干渉」又は「ＲＮＡｉ」により、細胞において、当該技術分野において一般に知られているように、遺伝子の発現を阻害するか又はダウンレギュレートする生物学的プロセスが意味され、かつこれは低分子干渉核酸分子により媒介される（例えば、Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；
Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；及びＫｒｅｕｔｚｅｒら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｋら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／０１８４６号；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅ、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／２９０５８号；Ｄｅｓｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９９／０７４０９号；及びＬｉら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；及びＲｅｉｎｈａｒｔ ＆ Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１参照）。さらに、本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡｉ」は、配列特異的ＲＮＡ干渉を記載するために使用される他の用語、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、又はエピジェネティクス（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、と同等であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、遺伝子を、転写後レベル又は転写前レベルの双方において、エピジェネティックにサイレンス化するべく使用し得る。非限定的な例においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、遺伝子発現を変えるための、クロマチン構造又はメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介性の修飾からの結果として生じ得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。制限しない別の例においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣによるｓｉＮＡ媒介性のＲＮＡ切断（コーディング又は非コーディングＲＮＡのいずれか）、或いはまた、当該技術分野において既知の翻訳阻害からの結果として生じ得る。別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、転写阻害からの結果として生じ得る（例えば、Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２１６−２２２参照）。
本明細書で用いられる「非対称ヘアピン」により、アンチセンス領域、ループ部分（これは、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよい）、及びセンス領域（これは、該センス領域がアンチセンス領域と塩基対合してループをもつ二重鎖を形成するために充分な相補的ヌクレオチドを有する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含んでなる）を含んでなる。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに充分な長さを有するアンチセンス領域（例えば、約１５ないし約３０、又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）、及び約４なし約１２（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２）ヌクレオチドを含んでなるループ領域、及び、該アンチセンス領域に相補的である、約３ないし約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチドを有するセンス領域、を含んでいてもよい。該非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた、化学修飾可能な５’末端リン酸基を含んでいてもよい。該非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載の、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、又は、コンジュゲート分子を含んでいてもよい。
本明細書で使用される「非対称二重鎖」により、センス領域及びアンチセンス領域を含んでなる、別の２つの鎖を有するｓｉＮＡ分子が意味され、これにおいて、センス領域は、該センス領域がアンチセンス領域と塩基対合してループをもつ二重鎖を形成するために充分な相補的ヌクレオチドを有する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含んでなる。例えば、本発明の非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は、細胞又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに充分な長さ（例えば、約１５ないし約３０、又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、該アンチセンス領域に相補的である約３ないし約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチドを有するセンス領域と、を含んでいてもよい。
用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、本明細書で用いる場合、ヌクレオチドを有する分子を指す。該核酸は、単鎖、二本鎖、又は多重鎖であってよく、かつ修飾又は未修飾の、ヌクレオチド又は非ヌクレオチド、或いはそれらの種々の混合物及び組合せを含んでいてもよい。
「ＲＮＡｉ阻害剤」により、細胞又は生体におけるＲＮＡ干渉機能又は活性を、ダウンレギュレートするか、低減するか、又は阻害し得る任意の分子が意味される。ＲＮＡｉ阻害剤は、タンパク質成分、例えばＲＩＳＣ、又は核酸成分、例えばｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含む、ＲＮＡｉ経路の任意の成分の機能との相互作用又は干渉により、ＲＮＡｉ（例えば、ＲＮＡｉ媒介性の、標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング）をダウンレギュレートするか、低減するか、又は阻害することができる。ＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＩＳＣ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡの機能か、或いは細胞又は生体におけるＲＮＡｉ経路の任意の他の成分と、相互作用するか又は干渉する、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー、又は低分子核酸であってよい。ＲＮＡｉ（例えば、ＲＮＡｉ媒介性の、標的ポリヌクレオチドの切断、翻訳阻害、又は転写サイレンシング））を阻害することにより、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、標的遺伝子の発現を調節（例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレート）するべく使用し得る。１つの実施態様においては、本発明のＲＮＡ阻害剤は、翻訳阻害、転写サイレンシング、又はＲＩＳＣ介在性のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の切断による、遺伝子発現の内在性のダウンレギュレーション又は阻害を、干渉すること（例えば、低減又は防止すること）によって遺伝子発現をアップレギュレートするべく使用される。遺伝子発現の、内在性の抑制、サイレンシング、又は阻害のメカニズムと干渉することにより、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、それ故、機能の損失からの結果として生じる疾患、形質、又は症状の治療のために、遺伝子発現をアップレギュレートするべく使用し得る。１つの実施態様においては、用語「ＲＮＡｉ阻害剤」は、本明細書の種々の態様において、例えば、機能損失疾患、形質、及び／又は症状の治療のための遺伝子発現の増大効果をもって、用語「ｓｉＮＡ」の代わりに使用される。
本明細書で使用される、用語「酵素的核酸分子」は、特定の遺伝子標的に対する基質結合領域に相補性を有しており、かつまた標的ＲＮＡを特異的に切断にするのに有効である酵素活性も有している核酸分子を指す。すなわち、該酵素的核酸分子は、ＲＮＡを分子間切断することができ、それにより標的ＲＮＡ分子を不活性化する。これらの相補的領域は、標的ＲＮＡに対する酵素核酸分子の充分なハイブリッド形成を可能にし、それ故切断を可能にする、１００パーセントの相補性が好ましいが、５０ないし７５％のような低い相補性もまた、本発明においては有用である（例えば、Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２０９２−２０９６；Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｄ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，２５−３１参照）。該核酸は、塩基、糖、及び／又はリン酸基において修飾し得る。用語「酵素的核酸」は、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的ＤＮＡ、アプタザイム（ａｐｔａｚｙｍｅ）又はアプタマー結合リボザイム、調節可能なリボザイム、触媒的オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム、又はＤＮＡ酵素といった用語と、互換的に使用される。これらの専門用語は全て、酵素活性をもつ核酸分子を記載している。本出願において記載された特別の酵素核酸分子は、本発明において制限するものではなく、当業者は、本発明の酵素的核酸分子において重要であるものは全て、１つ以上の標的核酸領域に相補的である特異的基質結合部位を有するものであり、かつ、該基質結合部位の中又は周辺に、核酸切断及び／又は結合活性を分子に付与するヌクレオチド配列を有するものであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＪＡＭＡ，２６０，３０３０参照）。本発明のリボザイム及び酵素的核酸分子は、当該技術分野において一般に知られているか、又は本明細書に記載のように化学修飾可能である。
本明細書で使用される、用語「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡ−ＲＮＡ、又はＲＮＡ−ＤＮＡ、又はＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡに結合し、かつ、該標的ＲＮＡの活性を変える非酵素的核酸分子を指す（総説については、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，１００４、及びＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号を参照）。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一な連続した配列に沿って、標的配列に相補的である。しかしながら、ある実施態様においては、アンチセンス分子は、基質に結合して、該基質分子がループを形成するようにすることができ、及び／又は、アンチセンス分子は、アンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。したがって、該アンチセンス分子は、２つ（又はさらにそれ以上）の非連続的な基質配列に対し相補的であってよく、或いは、アンチセンス分子の２つ（又はさらにそれ以上）の非連続的な配列部分が、標的配列に対し相補的であるか、或いは両方であってもよい。現在のアンチセンス戦略の総説については、Ｓｃｈｍａｊｕｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２１７８３−２１７８９、Ｄｅｌｉｈａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，１５，７５１−７５３、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，７，１５１、Ｃｒｏｏｋｅ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，３−４５；Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１５，１２１−１５７、Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，１−４９参照。さらに、アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡを標的とするべく使用可能であり、それにより、標的二重鎖中の標的ＲＮＡを消化する、ＲＮアーゼＨを活性化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨ切断を活性化し得る、１つ以上のＲＮアーゼＨ活性化領域を含んでいてもよい。アンチセンスＤＮＡは、化学的に合成されるか、又は単鎖ＤＮＡ発現ベクター若しくはその同等物の使用により発現可能である。本発明のアンチセンス分子は、当該技術分野において一般に知られているか、又は本明細書に記載のように、化学修飾可能である。
用語「ＲＮアーゼＨ活性化領域」は、本明細書で用いる場合、標的ＲＮＡに結合して、細胞ＲＮアーゼＨ酵素により認識される非共有結合型の複合体を形成し得る、核酸分子の領域（一般に、４ないし２５ヌクレオチド長以上、好ましくは５ないし１１ヌクレオチド長）を指す（例えば、Ａｒｒｏｗら、ＵＳ ５，８４９，９０２；Ａｒｒｏｗら、ＵＳ ５，９８９，９１２；参照）。ＲＮアーゼＨ酵素は、核酸分子−標的ＲＮＡ複合体に結合し、そして標的ＲＮＡ配列切断する。ＲＮアーゼＨ活性化領域は、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート（好ましくは、少なくとも４つのヌクレオチドがホスホロチオアート置換；さらに具体的には、４ないし１１個のヌクレオチドがホスホロチオアート置換である）；ホスホロジチオアート、５’−チオホスフェイト、又はメチルホスホナート骨格化学、又はそれらの組合せを含んでなる。上記の１つ以上の骨格化学に加えて、ＲＮアーゼＨ活性化領域はまた、多様な糖化学も含んでいてもよい。例えば、ＲＮアーゼＨ活性化領域は、デオキシリボース、アラビノ、フルオロアラビノ、又はそれらの組合せ、ヌクレオチド糖化学、を含んでいてもよい。当業者は、上記のものが非限定的な例であること、及び、ＲＮアーゼＨ酵素の活性を支持する核酸の、ホスフェイト、糖、及び塩基化学の任意の組合せが、ＲＮアーゼＨ活性化領域の定義及び本発明の範囲内に入ることを認識するであろう。
用語「２−５Ａアンチセンスキメラ」は、本明細書で用いるとき、５’−ホスホリル化された２’−５’−結合アデニレート残基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのキメラは、配列特異的方法で標的ＲＮＡに結合し、そして細胞の２−５Ａ−依存性のリボヌクレアーゼを活性化し、これが次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１３００；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１３，５２２−５３３；Ｐｌａｙｅｒ ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７８，５５−１１３）。本発明の２−５Ａアンチセンスキメラ分子は、当該技術分野において一般に知られているか、又は本明細書に記載のように、化学修飾可能である。
用語「三重鎖形成オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いるとき、配列特異的方法で二本鎖ＤＮＡに結合して、三本鎖ヘリックスを形成し得るオリゴヌクレオチドを指す。かかる三重鎖ヘリックス構造の形成は、標的遺伝子の転写を阻害することが示されてきた（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９，５０４；Ｆｏｘ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７，１７−３７；Ｐｒａｓｅｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９，１８１−２０６）。本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において一般に知られているか、又は本明細書に記載のように、化学修飾可能である。
本明細書で使用される、用語「デコイＲＮＡ」は、予め決められたリガンドに選択的に結合するべく設計された、ＲＮＡ分子又はアプタマーを指す。かかる結合は、結果として、標的分子の阻害又は活性化を生じ得る。デコイＲＮＡ又はアプタマーは、特定のリガンドの結合について、天然の結合標的と競合することができる。例えば、ＨＩＶのトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現が「デコイ」として作用し得て、ＨＩＶｔａｔタンパク質を結合し、それにより、ＨＩＶ ＲＮＡにコードされているＴＡＲ配列にそれが結合するのを妨げることが示されてきた（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６３，６０１−６０８）。これは、１つの具体例にすぎず、当業者は、当該技術分野において一般に知られている技術を用いて、他の実施態様が容易に生成され得ることを認識するであろう（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；及びＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８参照）。同様に、デコイＲＮＡは、受容体に結合してエフェクター分子の結合をブロックするべく設計可能であり、或いは、デコイＲＮＡは、興味の受容体に結合して、該受容体との相互作用を妨げるべく設計可能である。本発明のデコイ分子は、当該技術分野において一般に知られているか、又は本明細書に記載のように、化学修飾可能である。
用語「単鎖ＲＮＡ」（ｓｓＲＮＡ）は、本明細書で用いる場合、直鎖状の一本鎖を含んでなる、天然又は合成されたリボ核酸分子を指し、例えば、ｓｓＲＮＡは、１つの遺伝子の、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）その他であってよい。
用語「単鎖ＤＮＡ」（ｓｓＤＮＡ）は、本明細書で用いる場合、直鎖状の一本鎖を含んでなる、天然又は合成されたデオキシリボ核酸分子を指し、例えば、ｓｓＤＮＡは、センス又はアンチセンス遺伝子配列、又はＥＳＴ（発現配列タグ）であってよい。
用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、本明細書で用いるとき、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＮＡ）を含め、ＲＮＡ干渉が可能な二本鎖ＲＮＡ分子を指す。
本明細書で用いられる、用語「アロザイム」は、アロステリック酵素的な核酸分子を指す（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら、米国特許第５，８３４，１８６及び５，７４１，６７９号、Ｓｈｉｈら、米国特許第５，５８９，３３２号、Ｎａｔｈａｎ、米国特許第５，８７１，９１４号、Ｎａｔｈａｎ及びＥｌｌｉｎｇｔｏｎ、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／２４９３１号、Ｂｒｅａｋｅｒら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／２６２２６及び９８／２７１０４号、及びＳｕｌｌｅｎｇｅｒら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９９／２９８４２号を参照）。
本明細書において使用される、「アプタマー」又は「核酸アプタマー」により、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドが意味され、これにおいて、該核酸分子は、その天然の状況において該標的分子によって認識される配列とは異なる配列を有する。或いはまた、アプタマーは、標的分子に特異的に結合する核酸分子であってよく、ここで、該標的分子は、天然には核酸に結合しない。標的分子は、興味の任意の分子でよい。例えば、アプタマーは、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するべく使用でき、それにより、天然リガンドの、該タンパク質との相互作用を妨げる。これは、非限定的な例であり、当業者は、当該技術分野において一般に知られている技術を用いて、他の実施態様が容易に生成され得ることを認識するであろう（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｎｃｅ，）２８７，８２０；Ｊａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８参照）。本発明のアプタマー分子は、当該技術分野において一般に知られているか、又は本明細書に記載のように、化学修飾可能である。
「調節する」により、遺伝子の発現、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードしている、ＲＮＡ分子若しくは同等のＲＮＡ分子のレベル、又は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、アップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ、発現、レベル、又は活性が、モジュレーターの不在時に観察されるものよりも大きいか又は小さくなるようにすることが意味される。例えば、用語「調節する」は、「阻害する」を意味することができるが、用語「調節する」の使用は、この定義に限定されない。
「阻害する」、「ダウンレギュレートする」、又は「低減する」により、遺伝子の発現、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードしている、ＲＮＡ分子若しくは同等のＲＮＡ分子のレベル、又は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の不在下に観察されるものよりも低く低減されることが意味される。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子による阻害、ダウンレギュレーション、又は低減は、不活性な又は弱められた分子の存在下に観察されるレベルよりも低い。別の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子による阻害、ダウンレギュレーション、又は低減は、例えば、スクランブル配列をもつか、又はミスマッチをもつｓｉＮＡ分子の存在下に観察されるレベルよりも低い。別の実施態様においては、本発明の核酸による遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、又は低減は、該核酸の存在下では、その不在下よりも大きい。１つの実施態様においては、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、又は低減は、転写後のサイレンシング、例えば、標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ）のＲＮＡｉ媒介性の切断、又は翻訳の阻害に関連する。１つの実施態様においては、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、又は低減は、転写前のスライシングに関連する。
「アップレギュレートする」又は「促進する」により、遺伝子の発現、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードしている、ＲＮＡ分子若しくは同等のＲＮＡ分子のレベル、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性化が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の不在下に観察されるものよりも高く増大されることが意味される。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のアップレギュレーション又は促進は、不活性な又は弱められた分子の存在下に観察されるレベルよりも高い。別の実施態様においては、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のアップレギュレーション又は促進は、例えば、スクランブル配列をもつか、又はミスマッチをもつｓｉＮＡ分子の存在下に観察されるレベルよりも高い。別の実施態様においては、本発明の核酸による遺伝子発現のアップレギュレーション又は促進は、該核酸の存在下では、その不在下よりも大きい。１つの実施態様においては、遺伝子発現のアップレギュレーション又は促進は、ＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシング、例えば、アップレギュレートされるべき興味の遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、阻害するか、又はサイレンスする、コーディング又は非コーディングＲＮＡ標的の、ＲＮＡ媒介性の切断又はサイレンシングに関連する。遺伝子発現のダウンレギュレーションは、例えば、コーディングＲＮＡ、又はそのコードされたタンパク質により、例えば、ネガティブフィードバック、又は拮抗作用によって誘導可能である。遺伝子発現のダウンレギュレーションは、例えば、興味の遺伝子を、例えば翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣ媒介ＲＮＡ切断、又は翻訳阻害を介して該遺伝子の発現をサイレンシングすることにより調節支配する、非コーディングＲＮＡによって誘導し得る。例えば、興味の遺伝子をダウンレギュレートするか、抑制するか、又はサイレンスする標的の、阻害又はダウンレギュレーションは、治療的使用に向けて、該遺伝子の発現をアップレギュレートするか又は促進するべく使用し得る。
１つの実施態様においては、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、ＲＮＡｉ又は遺伝子サイレンシングを阻害することにより、遺伝子発現をアップレギュレートするべく使用し得る。例えば、本発明のＲＮＡｉ阻害剤は、遺伝子発現をアップレギュレートすることにより、機能損失型の疾患及び症状を治療するべく、例えば、特定の遺伝子の一方の対立遺伝子が突然変異（例えば、フレームシフト、ミスセンス、又はナンセンス突然変異）を隠しており、結果として、該突然変異対立遺伝子によってコードされたタンパク質の機能の損失を生じる、ハプロ不全の例において使用可能である。かかる例においては、ＲＮＡｉ阻害剤は、野生型又は機能性の対立遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を、アップレギュレートするべく使用可能であり、このようにして、突然変異体又はヌル対立遺伝子を補償することにより、ハプロ不全を修正する。別の実施態様においては、例えば、本明細書の、又は当該技術分野において既知の他の疾患、形質、又は症状の治療において、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して、機能対立遺伝子の毒性増加の発現をダウンレギュレートする一方で、本発明のＲＮＡｉ阻害剤を併用して、野生型又は機能性対立遺伝子の発現をアップレギュレートする（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，１１１４７−１１１５２、及びＭｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１５，２０１０−２０１７参照）。
「遺伝子」、又は「標的遺伝子」により、ＲＮＡをコードする核酸、例えば、制限なく、ポリペプチドをコードしている構造遺伝子を含む核酸配列が意味される。遺伝子又は標的遺伝子はまた、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）、又は非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えばスモールテンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ）核酸（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及びそれらの前駆体ＲＮＡもコードし得る。かかる非コーディングＲＮＡは、機能性又は調節性の細胞プロセスに関与する、ｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡの活性の調節における、ｓｉＮＡ媒介性のＲＮＡ干渉のための標的核酸分子として役立ち得る。疾患をもたらす異常なｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性は、それ故、本発明のｓｉＮＡ分子によって調節し得る。ｆＲＮＡ及びｎｃＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子はまた、細胞プロセス、例えば遺伝的刷り込み、転写、翻訳、又は核酸プロセシング（例えば、アミノ基転移、メチル化、その他）に介入することにより、患者、生体、又は細胞の遺伝子型又は表現型を操作又は改変するべく使用し得る。標的遺伝子は、細胞由来の遺伝子、内在性遺伝子、トランスジーン、病原体、例えばウイルス、の遺伝子のような外来遺伝子（これは、その感染後に細胞内に存在する）であってよい。標的遺伝子を含有する細胞は、任意の生体、例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、又は真菌に、由来するか、又は含有されていてもよい。制限しない植物の例は、単子葉類、双子葉類、又は裸子植物を包含する。制限しない動物の例は、脊椎動物又は無脊椎動物を包含する。制限しない真菌の例は、糸状菌又は酵母を包含する。総説としては、例えば、Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照。
本明細書で使用される「標的」により、標的遺伝子によってコードされた任意の標的タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドが意味される。用語「標的」はまた、例えば標的ＲＮＡによってコードされた、標的活性を有している任意の標的タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドをコードしている核酸配列も指す。用語「標的」はまた、他の標的コーディング配列、例えば、他の標的アイソフォーム、突然変異体標的遺伝子、標的遺伝子のスプライスバリアント、及び標的遺伝子多型を包含することも意味する。「標的核酸」により、その発現又は活性が調節されるべき任意の核酸配列が意味される。標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。
「非正規塩基」により、任意の非ワトソンクリック塩基対、例えば、反転性ミスマッチ、単一水素結合性ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、三重塩基相互作用、及び四重塩基相互作用を含む、ミスマッチ及び／又は揺らぎ型塩基対を意味する。かかる非正規塩基対の非限定的な例は、制限されることなく、ＡＣ リバースフーグスティーン、ＡＣ 揺らぎ型、ＡＵ リバースフーグスティーン、ＧＵ 揺らぎ型、ＡＡ Ｎ７アミノ、ＣＣ ２−カルボニル−アミノ（Ｈ１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡ 剪断型、ＵＣ ４−カルボニルアミノ、ＵＵ イミノ−カルボニル、ＡＣ リバーズ揺らぎ型、ＡＵ フーグスティーン、ＡＵ リバーズワトソンクリック、ＣＧ リバーズワトソンクリック、ＧＣ Ｎ３−アミノ−アミノＮ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ対称型、ＡＡ Ｎ７−アミノ対称型、ＧＡ Ｎ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１、ＧＧ Ｎ１−カルボニル対称型、ＧＧ Ｎ３−アミノ対称型、ＣＣ カルボニル−アミノ対称型、ＣＣ Ｎ３−アミノ対称型、ＵＵ ２−カルボニル−イミノ対称型、ＵＵ ４−カルボニル−イミノ対称型、ＡＡ アミノ−Ｎ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ、ＡＣ アミノ２−カルボニル、ＡＣ Ｎ３−アミノ、ＡＣ Ｎ７−アミノ、ＡＵ アミノ−４−カルボニル、ＡＵ Ｎ１−イミノ、ＡＵ Ｎ３−イミノ、ＡＵ Ｎ７−イミノ、ＣＣ カルボニル−アミノ、ＧＡ アミノ−Ｎ１、ＧＡ アミノ−Ｎ７、ＧＡ カルボニル−アミノ、ＧＡ Ｎ３−アミノ、ＧＣ アミノ−Ｎ３、ＧＣ カルボニル−アミノ、ＧＣ Ｎ３−アミノ、ＧＣ Ｎ７−アミノ、ＧＧ アミノ−Ｎ７、ＧＧ カルボニル−イミノ、ＧＧ Ｎ７−アミノ、ＧＵ アミノ−２−カルボニル、ＧＵ カルボニル−イミノ、ＧＵ イミノ−２−カルボニル、ＧＵ Ｎ７−イミノ、ｐｓｉＵ イミノ−２−カルボニル、ＵＣ ４−カルボニル−アミノ、ＵＣ イミノ−カルボニル、ＵＵ イミノ−４−カルボニル、ＡＣ Ｃ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡ カルボニル−Ｃ２−Ｈ、ＵＵ イミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣ アミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル、ＧＣ イミノアミノ−カルボニル、Ｇｓｐｉ イミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル、及びＧＵ イミノアミノ−２−カルボニル塩基対を包含する。
本明細書で使用される「標的」により、例えば、ＵＳＳＮ １０／９２３，５３６及びＵＳＳＮ １０／９２３５３６（ともに参考として本明細書に含まれる）に示された、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によってコードされた、任意の標的タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドが意味される。用語「標的」はまた、ＵＳＳＮ １０／９２３，５３６及びＵＳＳＮ １０／９２３５３６に示された、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する配列によってコードされた、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドのような、任意の標的タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドをコードしている、核酸配列又は標的ポリヌクレオチド配列も指す。興味のある「標的」は、標的ＤＮＡ又は標的ＲＮＡといった、標的ポリヌクレオチド配列を包含し得る。用語「標的」はまた、他の配列、例えば、異なるアイソフォーム、突然変異体標的遺伝子、標的ポリヌクレオチドのスプライスバリアント、標的多型、及び非コーディング（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓＲＮＡ）、又は本明細書に記載の他の調節ポリヌクレオチド配列を包含することも意味する。それ故、本発明の種々の実施態様においては、標的ＲＮＡに相補性を有する本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）を、ｍｉＲＮＡ又は他のｎｃＲＮＡ活性を阻害又はダウンレギュレートするべく使用し得る。１つの実施態様においては、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性の阻害を使用して、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ活性に依存する遺伝子発現（例えば、本明細書に記載の、又は他当該技術分野において既知の他の遺伝子標的）又はウイルス複製（例えば、本明細書に記載の、又は他当該技術分野において既知の他のウイルス標的）をダウンレギュレート又は阻害することができる。別の実施態様においては、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡに相補性を有している本発明の二本鎖核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）による、ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡの阻害は、かかる遺伝子の発現が該ｍｉＲＮＡ又はｎｃＲＮＡによってダウンレギュレートされるか、抑制されるか、又はサイレンスされている場合に、標的遺伝子発現（例えば、本明細書に記載の、又は他当該技術分野において既知の他の遺伝子標的）をアップレギュレート又は促進するべく使用し得る。遺伝子発現のかかるアップレギュレーションは、当該技術分野において一般に知られている、機能の損失又はハプロ不全に関連した疾患及び症状を治療するべく使用し得る（例えば、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、又は、本明細書に記載の神経疾患及び症状、例えば、幼児重症ミオクロニー性てんかん又はドラヴェ（Ｄｒａｖｅｔ）症候群を含むてんかん）。
「相同配列」により、１つ以上のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、遺伝子転写物、及び／又は非コーディングポリヌクレオチド、によって共有されているヌクレオチド配列が意味される。例えば、相同配列は、関連するがしかし異なるタンパク質、例えば、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、又は完全に異なっている遺伝子、例えば、サイトカイン及びその対応する受容体、をコードしている２つ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であってよい。相同配列は、２つ以上の非コーディングポリヌクレオチド、例えば、非コーディングＤＮＡ又はＲＮＡ、調節配列、イントロン、及び転写調節又は制御の部位、によって共有されるヌクレオチド配列であってよい。相同配列はまた、１つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有された、保存配列領域も含んでいてもよい。相同性は、部分的に相同な配列（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％その他）もまた本発明によって意図されていることから、完全な相同性（例えば、１００％）である必要はない。
「保存配列領域」は、１つのポリヌクレオチド中の１つ以上の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、又は１つの生物系、患者、又は生体から、別の生物系、患者、又は生体まで、有意に異ならないことが意味される。該ポリヌクレオチドは、コーディング及び非コーディング双方のＤＮＡ及びＲＮＡを包含し得る。
「センス領域」により、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対し相補性をもつ、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列が意味される。さらに、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性をもつ核酸配列を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、センス鎖又はパッセンジャー鎖と呼ばれる。
「アンチセンス領域」により、標的核酸配列に対し相補性をもつ、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列が意味される。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、任意で、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対し相補性を有する核酸配列を含んでいてもよい。１つの実施態様においては、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、アンチセンス鎖又はガイド鎖と呼ばれる。
「標的核酸」又は「標的ポリヌクレオチド」により、その発現又は活性が調節されるべき、任意の核酸配列が意味される。該標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。１つの実施態様においては、本発明の標的核酸は、標的ＲＮＡ又はＤＮＡである。
「相補的」及び「相補性」（及びその変形）により、別の核酸配列と、伝統的なワトソンクリック又は本明細書に記載された他の非伝統的なタイプのいずれかにより、水素結合を形成し得る核酸を記載することが意味される。好ましくは、相補性の程度は、相補的である核酸が、生理的条件下に二本鎖複合体又は二重鎖を形成するようにする程度である。かかる核酸は、必ずしもそうではないが、好ましくは相補的であってよい。相補的核酸は、該核酸が生理的条件下に二重鎖を形成し得る限り、１、２、３個、又はそれ以上のミスマッチを包含し得る。１つの実施態様においては、本発明の２本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、これにおいて、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖核酸分子の２つの鎖の間で、約１０％ないし１００％（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％）の相補性を含んでなる。別の実施態様においては、本発明の２本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、これにおいて、一方の鎖がセンス鎖であり、かつ他方の鎖がアンチセンス鎖であり、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列と、その対応する標的核酸分子、例えば標的ＲＮＡ、又は標的ｍＲＮＡ、又はウイルスＲＮＡ、のヌクレオチド配列との間で、約１０％ないし１００％（例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％）の相補性を含んでなる。１つの実施態様においては、本発明の２本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、これにおいて、一方の鎖がセンス領域と呼ばれるヌクレオチド配列を含んでなり、かつ他方の鎖がアンチセンス領域と呼ばれるヌクレオチド配列を含んでなり、これにおいて、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖核酸分子の該センス領域と該アンチセンス領域との間で、約１０％ないし１００％（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％）の相補性を含んでなる。本発明の核酸分子について、その相補的配列をもつ核酸分子の結合自由エネルギーは、該核酸に関連した機能の進行、例えばＲＮＡｉ活性、を行なわせるのに充分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５）。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合）を形成し得る核酸分子中の隣接した残基のパーセンテージを示す（例えば、１０ヌクレオチドを有する第２の核酸配列に対して塩基対合している、第１のオリゴヌクレオチド中の全１０ヌクレオチドのうちの、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性を表わす）。１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間に、完全な相補性を有する。１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、対応する標的核酸分子に対し完全に相補的である。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての隣接残基が、第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することを意味する。１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子又はその一部に対し相補的である、約１５ないし約３０個、又はそれ以上（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個、又はそれ以上）のヌクレオチドを含んでなる。１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、該ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間か、或いは、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間に、部分的な相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的な相補性は、ｓｉＮＡ構造内に、種々のミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれ以上の、ミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド）を包含でき、その結果として、該ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間か、或いは、該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間に結果として生じる、バルジ（ｂｕｌｇｅ）、ループ、又は突出を生じ得る。
１つの実施態様においては、本発明の二本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、該核酸分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間に、完全な相補性を有する。１つの実施態様においては、本発明の二本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、対応する標的核酸分子に対し、完全に相補的である。
１つの実施態様においては、本発明の二本鎖核酸分子、例えばｓｉＮＡ分子は、該二本鎖核酸分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間か、或いは、該核酸分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間に、部分的な相補性（すなわち、１００未満の相補性）を有する。例えば、部分的な相補性は、該二本鎖核酸分子構造内に、種々のミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれ以上の、ミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド、例えばヌクレオチドバルジ）を包含でき、その結果として、該二本鎖核酸分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間か、或いは、該二本鎖核酸分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間に結果として生じる、バルジ、ループ、又は突出を生じ得る。
１つの実施態様においては、本発明の二本鎖核酸分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」により、標的メッセンジャーＲＮＡの発現を、ｍＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害、又はヘテロクロマチンサイレンシングにより調節する、低分子二本鎖ＲＮＡが意味される（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４、Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０２，３−９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；及びＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８参照）。１つの実施態様においては、本発明のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間か、或いは、該ｍｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間に、部分的な相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。例えば、部分的な相補性は、該二本鎖核酸分子構造内に、種々のミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれ以上の、ミスマッチ又は非塩基対合ヌクレオチド、例えばヌクレオチドバルジ）を包含でき、その結果として、該ｍｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域と、アンチセンス鎖又はアンチセンス領域との間か、或いは、該ｍｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖又はアンチセンス領域と、対応する標的核酸分子との間に結果として生じる、バルジ、ループ、又は突出を生じ得る。
１つの実施態様においては、本発明の組成物、例えば、標的遺伝子発現をダウンレギュレート又は低減する、本発明の製剤又は組成物、及び製剤ｓｉＮＡ組成物は、患者又は生体において、疾患、障害、症状、又は形質を、本明細書に記載のように、又は当該技術分野において周知のように、予防又は治療するために使用される。
本明細書で用いられる、「増殖性疾患」又は「癌」により、当該技術分野において既知の、制御されない細胞増殖又は複製によって特徴づけられる、任意の疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型が意味され；白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及び慢性リンパ性白血病、ＡＩＤＳ関連癌、例えばカポジ肉腫；乳癌；骨癌、例えば骨肉腫、骨軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、アダマンチノーマ、及び脊索腫；脳癌、例えば髄膜腫、神経膠芽細胞腫、グレードの低い星状細胞腫、乏突起細胞腫、下垂体腫瘍、神経鞘腫、及び転移性脳癌；種々のリンパ腫を含む、頭頸部の癌、例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、腺腫、扁平上皮細胞癌、咽頭癌、胆嚢及び胆管癌、網膜の癌、例えば網膜芽細胞腫、食道癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、黒色腫、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌；及び増殖性疾患及び症状、例えば、腫瘍血管形成に付随した血管新生、黄班変性（例えば、滲出型／委縮型ＡＭＤ）、角膜血管新生、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、近視性変性、及び他の増殖性疾患及び症状、例えば、再狭窄及び腎嚢胞、及び、単独で又は他の療法と組合せて、細胞又は組織において、疾患関連遺伝子発現の調節に対し応答し得る、任意の他の癌又は増殖性疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型、を包含する。
本明細書で用いる場合、「炎症性疾患」又は「炎症性症状」により、当該技術分野において既知の、炎症性又はアレルギー性プロセスによって特徴づけられる、任意の疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型、例えば、炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、皮膚炎、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、リウマチ様関節炎、炎症性大腸炎、骨盤炎症性疾患、疼痛、眼の炎症性疾患、セリアック病、ライ症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症（ＦＥ）、常染色体劣性痙攣性失調、咽頭炎症性疾患；結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症及び他の塵肺症、及び、単独で又は他の療法と組合せて、細胞又は組織において、疾患関連遺伝子発現の調節に対し応答し得る、任意の他の炎症性疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型、が意味される。
本明細書で用いられる、「自己免疫疾患」又は「自己免疫症状」により、当該技術分野において既知の、自己免疫性によって特徴づけられる、任意の疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型、例えば、多発性硬化症、糖尿病、狼瘡、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、硬皮、グッドバスチャー症候群、ウェグナー肉芽腫瘍、自己免疫性てんかん、ラスムッセン脳炎、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、アジソン病、橋本甲状腺炎、線維筋痛症、メニエール症候群；移植拒絶（例えば、同種移植拒絶の防止）、悪性貧血、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、狼瘡エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、及び、単独で又は他の療法と組合せて、細胞又は組織において、疾患関連遺伝子発現の調節に対し応答し得る、任意の他の自己免疫性疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型、が意味される。
「感染症」により、感染因子、例えばウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は寄生生物に関連した、任意の疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型が意味される。本発明のｓｉＮＡ分子を使用して標的化され得る、種々のウイルス遺伝子の非限定的な例は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｄ１１１６８、Ｄ５０４８３．１、Ｌ３８３１８及びＳ８２２２７）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１００３０８．１）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｕ５１１８８）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｘ６０６６７）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＣ ００１５６３）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＣ ００１３４７）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＣ ００１７８１）、インフルエンザウイルス（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０３７４１２）、ライノウイルス（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｄ００２３９、Ｘ０２３１６、Ｘ０１０８７、Ｌ２４９１７、Ｍ１６２４８、Ｋ０２１２１、Ｘ０１０８７）、乳頭腫ウイルス（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＣ ００１３５３）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＣ ００１３４５）、及び他のウイルス、例えばＨＴＬＶ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＪ４３０４５８）を包含する。多くのウイルスゲノムの高い配列変異性のため、幅広い治療適用のためのｓｉＮＡ分子の選択は、ウイルスゲノムの保存領域を含むことが予想されよう。ウイルスゲノムの保存領域の非制限的な例は、制限なく、５’非コーディング領域（ＮＣＲ）、３’非コーディング領域（ＮＣＲ）、及び／又は、リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）を包含する。種々のウイルスゲノムの保存領域に対して設計されたｓｉＮＡ分子は、多種多様な患者集団におけるウイルス複製の効率的な阻害を可能にし、そして、ウイルスゲノムの非保存領域の突然変異に起因して発生するウイルスの類似種に対するｓｉＮＡ分子の有効性を保証するであろう。細菌感染症の非制限的な例は、放線菌症、炭疽病、アスペルギルス症、菌血症、細菌感染症及び真菌症、バルトネラ感染症、ボツリヌス中毒症、ブルセラ症、ブルクホルデリア感染症、カンピロバクター感染症、カンジダ症、猫引っ掻き病、クラミジア感染症、コレラ、クロストリジウム感染症、コクシジオイデス症、交差感染、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、（皮膚真菌症）、ジフテリア、エーリキア症、大腸菌感染症、筋膜炎、壊死、フゾバクテリウム感染症、ガス壊疽、グラム陰性菌感染症、グラム陽性菌感染症、ヒストプラスマ症、膿痂疹、クレブシエラ感染症、レジオネラ症、らい病、レプトスピラ症、リステリア感染症、ライム病、マズラ足、類鼻疽、マイコバクテリウム感染症、マイコプラズマ感染症、真菌症、ノカルジア感染症、爪甲心筋症、鳥類病、ペスト、肺炎双球菌感染症、緑膿菌感染症、Ｑ熱、鼠咬熱、回帰熱、リウマチ熱、リケッチア感染症、ロッキー山紅斑熱、サルモネラ感染症、猩紅熱、恙虫病、敗血症、性交渉感染症、細菌性皮膚疾患−細菌性、細菌性皮膚疾患、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、破傷風、ダニ媒介疾患、結核、野兎病、腸チフス、チフス、発疹チフス、ビブリオ感染症、イチゴ腫、エルシニア感染症、人畜共通伝染病、及び接合菌症を包含する。真菌感染症の非制限的例は、アスペルギルス症、分芽菌症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、手足の爪真菌症、真菌性副鼻腔炎、ヒストプラスマ症、（ヒストプラスマ症）、ムコール菌症、爪真菌感染、パラコクシジオイデス症、スポロトリクス症、渓谷熱（コクシジオイデス症）、及びカビアレルギーを包含する。
「神経疾患」又は「神経性疾患」により、中枢又は末梢神経系に影響を及ぼす任意の疾患、障害、又は症状が意味され、ＡＤＨＤ、ＡＩＤＳ−神経合併症、透明中隔の欠如、後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパーズ病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、委縮性側索硬化症、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、クモ膜嚢胞、クモ膜炎、アーノルドキアリ奇形、脊髄動静脈奇形、アスパルテーム病、アスペルガー症候群、血管拡張性失調症、失調、注意欠陥多動性障害、自閉症、自律神経機能異常、背痛、バース症候群、バッテン病、ベーチェット病、顔面神経麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性焦点性筋委縮症、良性頭蓋内圧亢進、ベルンハルト・ロート症候群、ビンスワンゲル病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルズバーガー症候群、腕神経叢分娩時損傷、腕神経叢損傷、ブラッドベリ・エグルストン症候群、脳動脈瘤、脳損傷、脳脊髄腫瘍、ブラウン・セカール症候群、延髄脊髄筋委縮症、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、海綿腫、海綿状血管腫、海綿状血管奇形、中心性頸髄症候群、頸髄症候群、中心性疼痛症候群、頭部障害、小脳変性症、小脳低形成、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳委縮、脳性脚気、脳性巨人症、脳低酸素症、脳性麻痺、脳・眼・顔・骨格症候群、シャルコー・マリー・ツース病、キアリー奇形、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性起立耐性失調、慢性痛、コケーン症候群２型、コフィン・ローリー症候群、昏睡、遷延性植物状態を含む、複合性局所疼痛症候群、先天性顔面両側麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパシー、先天性海綿状血管腫、大脳皮質基底変性症、頭蓋内血管炎、頭蓋骨癒合症、クロイツフェルト・ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞性封入体症（ＣＩＢＣ）、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイズ−ダンシングフィート（Ｄａｎｃｉｎｇ ｅｙｅｓ−Ｄａｎｓｉｎｇ Ｆｅｅｔ）症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、ドモーシエ（Ｄｅ Ｍｏｒｓｉｅｒ’ｓ）症候群、デジェリーヌ・クルンプケ麻痺、多発塞栓性痴呆、皮質下痴呆、レビー小体性痴呆、皮膚筋炎、発達性統合運動障害、デビック症候群、糖尿病性腎症、広汎性硬化症、乳児重症ミオクロニーてんかん（Ｄｒａｖｅｔ症候群）、自律神経障害、書字障害、失読症、嚥下困難、ジストニア、早期乳児てんかん脳症、エンプティセラ症候群、嗜眠性脳炎、脳炎及び髄膜炎、脳ヘルニア、脳症、脳３叉神経領域血管腫、てんかん、エルブ麻痺、エルブ・デュシェンヌ及びデジェリーヌ・クルンプケ麻痺、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性自律神経障害、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化、家族性痙性麻痺、熱性痙攣（例えば、ＧＥＦＳ及びＧＥＦＳプラス）、フィッシャー症候群、筋緊張低下児症候群、フリードライヒ失調症、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨細胞性動脈炎、巨細胞性封入体病、グロボイド細胞性ロイコジストロフィー、舌咽神経痛、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連ミエロパシー、ハレルフォルデン・スパッツ病、頭部外傷、頭痛、持続性片頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺、遺伝性ニューロパシー、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調、耳ヘルペス、帯状ヘルペス、平山症候群、全前脳症、ハンチントン病、水頭無脳症、正常圧水頭症、水頭症、水脊髄症、高コルチゾール症、睡眠過剰、高血圧症、低血圧症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、幼児低血圧症、幼児型フィタン酸蓄積症、幼児型レフサム病、幼児性痙攣、炎症性、炎症性ミオパシー、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進、アイザック症候群、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤ症候群、ケネディ病、キンスボーン（Ｋｉｎｓｂｏｕｒｎｅ）症候群、クライン・レヴィン症候群、クリッペル・フィル症候群、クリッペル・トレノーネイ症候群（ＫＴＳ）、クリューヴァー・ビューシー症候群、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルバーグ・ヴェランダー病、ランバート・イートン筋無力症候群、ランダウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経エントラップメント、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス・ゲシュタウト症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レバイン・クリッチュリー症候群、レビー小体型認知症、脳回欠損、かぎしめ症候群、ルー・ゲーリング病、狼瘡−神経学的後遺症、ライム病−神経学的合併症、マシャド・ジョセフ病、巨大頭蓋症、巨脳、メルカーソン・ローゼンタール症候群、髄膜炎、メンケス症候群、間隔異常性大腿神経痛、異染色性脳白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、小発作、ミトコンドリアミオパシー、メービウス症候群、単肢筋委縮症、運動ニューロン疾患、モヤモヤ病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発塞栓性痴呆、多巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症、起立性低血圧を伴う多系統委縮症、多系統委縮症、筋ジストロフィー、先天性筋無力症、重症筋無力症、ミエリン破壊性広汎性硬化症、乳児ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、先天性ミオパシー、甲状腺中毒性ミオパシー、ミオパシー、先天性ミオトニー、ミオトニー、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、脳内鉄蓄積を伴う神経変性症、神経線維腫症、神経遮断薬誘発性悪性症候群、ＡＩＤＳの神経合併症、ポンペ病の神経学的症状発現、視神経脊髄炎、神経ミオトニー、神経性セロイドリポフスチン沈着症、ニューロン移動障害、遺伝性ニューロパシー、神経サルコイドーシス、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクロード症候群、後頭神経痛、続発性潜在性脊髄癒合不全、太田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮、眼球クローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧症、濫用症候群、慢性疼痛、パラネオプラスチック症候群、感覚異常症、パーキンソン病、先天性パラミオトニア、発作性舞踏病アテトーゼ、発作性片頭痛、ペイリー・ロンベルグ病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ペナ・ショッカー症候群ＩＩ型、神経周囲嚢胞、周期性四肢麻痺、末梢性ニューロパシー、脳質周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、ヘルペス後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧症、体位性起立性頻脈症候群、体位性頻脈症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性片側顔面委縮、進行性脊髄癆、進行性多病巣性白質脳症、進行性硬化性灰白質委縮症、進行性核上麻痺、偽脳腫瘍、ピリドキシン依存性及びピリドキシン応答性の発作障害、ラムゼー・ハント症候群１型、ラムゼー・ハント症候群２型、ラスムッセン脳炎及び他の自己免疫性てんかん、反射交感神経ジストロフィー症候、乳児型レフサム病、レフサム病、反復運動障害、反復性ストレス損傷、不穏下肢症候群、レトロウイルス関連ミエロパシー、レット症候群、ライ症候群、ライリー・デイ症候群、ＳＵＮＣＴ頭痛、仙骨神経根嚢腫、舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、脳裂、発作障害、視神経異形成症、幼児重症ミオクロニー性てんかん（ＳＭＥＩ）、揺さぶられっ子症候群、帯状ヘルペス、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙性、二分脊椎、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄筋委縮症、脊髄小脳、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー症候群、スティッフ・パーソン症候群、線条体黒質変性症、卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、嚥下障害、シドナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、脊髄水空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄癆、遅発性ジスキネジー、ターロヴ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄終糸症候群、トムゼン病、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパシー、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥーレット症状群、一過性虚血性発作、伝染性海綿状脳症、横断脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性対不全麻痺、結節硬化症、血管拡張性腫瘍、側頭動脈炎を含む血管炎、フォン・エコーノモ病、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、フォンレックリングハウゼン病、ワレンベルグ・ホフマン症候群、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウェスト症候群、ウィッペル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、Ｘ染色体性球脊髄性筋萎縮症、及びツェルヴェーガー症候群を包含する。
「呼吸器疾患」により、気道に影響を及ぼす任意の疾患又は症状、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患又は「ＣＯＰＤ」、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管狭窄、炎症、アレルギー、呼吸妨害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性繊維症、肺高血圧症、肺血管狭窄、肺気腫、及び、単独で又は他の療法と組合せて、細胞又は組織において、疾患関連遺伝子発現の調節に対し応答し得る、任意の他の呼吸器疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型、が意味される。
「心臓血管疾患」により、制限なく、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、大動脈弁狭窄症、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、心筋梗塞（心臓発作）、脳血管疾患（卒中）、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、アンギナ（安定及び不安定）、心房性細動、不整脈、Ｖａｖｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ、鬱血性心不全、高コレステロール血症、Ｉ型高リポタンパク血症、ＩＩ型高リポタンパク血症、ＩＩＩ型高リポタンパク血症、ＩＶ型高リポタンパク血症、Ｖ型高リポタンパク血症、二次性高トリグリセリド血症、及び家族性レシチンコレステロールアシル転移酵素欠損症を含む、心臓及び血管に影響を及ぼす任意の疾患又は症状が意味される。
本明細書で使用される「眼性疾患」により、当該技術分野において既知の、眼及び関連構造の任意の疾患、症状、形質、遺伝子型、又は表現型、例えば、類嚢胞黄斑浮腫、星状硝子体症、病的近視及び後部ブドウ腫、トキソカラ症（眼幼虫移行症）、網膜静脈閉塞症、後部硝子体剥離、牽引性網膜裂孔、網膜上膜、糖尿病性網膜症、格子様変性、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、黄斑変性（例えば、滲出型ＡＭＤ又は委縮型ＡＭＤといった、年齢関連性の黄班変性）、トキソプラスマ症、脈絡膜黒色腫、後天性網膜分離症、ホレンホースト斑、特発性中心性漿液性網脈絡膜症、黄斑円孔、推定眼ヒストプラスマ症候群、網膜動脈瘤（Ｒｅｔｉｎａｌ Ｍａｃｒｏａｎｅｕｒｓｙｍ）、色素性網膜炎、網膜剥離、高血圧性網膜症、網膜色素上皮（ＲＰＥ）剥離、乳頭静脈炎、眼虚血症候群、コート病、レーバー粟粒動脈瘤、結膜新生物、アレルギー性結膜炎、春季結膜炎、急性細菌性結膜炎、アレルギー性結膜炎及び春季角結膜炎、ウイルス性結膜炎、細菌性結膜炎、クラミジア及び淋菌性結膜炎、結膜裂傷、上強膜炎、強膜炎、瞼裂斑炎、翼状片、上方輪部角結膜炎（テオドール（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ）のＳＬＫ）、中毒性結膜炎、偽膜性結膜炎、巨大乳頭結膜炎、テリエン辺縁変性、アカントアメーバ角膜炎、真菌性角膜炎、糸状角膜炎、細菌性角膜炎、乾燥性角膜炎／ドライアイ症候群、細菌性角膜炎、単純ヘルペス性角膜炎、無菌性角膜浸潤、フリクテン症、角膜剥離及び再発性角膜びらん、角膜異物、化学火傷、上皮基底膜ジストロフィー（ＥＭＢＤ）、タイゲソン表層性点状角膜症、角膜裂傷、ザルツマン結節状角膜変性、フックス内皮ジストロフィー、水晶体亜脱臼、毛様体ブロック緑内障、原発性開放隅角緑内障、色素分散症候群及び色素性緑内障、偽落屑症候群及び偽落屑緑内障、原発性開放隅角緑内障、ブドウ膜炎緑内障及び緑内障毛様体炎発症、色素分散症候群及び色素性緑内障、急性閉塞隅角緑内障、前部ブドウ膜炎、前房出血、隅角後退緑内障、水晶体原性緑内障、偽落屑症候群及び偽落屑緑内障、アクセンフェルト・リーガー症候群、血管新生緑内症、扁平部炎、脈絡膜破裂、デュエーン眼球後退症候群、中毒性／栄養性視神経症、第ＩＩＩ脳神経の迷走性再生、頭蓋内腫瘤状病巣、頚動脈海綿静脈洞瘻、前部乏血性視神経症、視神経乳頭浮腫及び乳頭水腫、第ＩＩＩ脳神経麻痺、第ＩＶ脳神経麻痺、第ＶＩ脳神経麻痺、第ＶＩＩ脳神経（顔面神経）麻痺、ホルネル症候群、核間性眼筋麻痺、視神経乳頭形成不全、眼陥凹、緊張性瞳孔、視神経乳頭ドルーゼ、脱髄性視神経症（視神経炎、球後視神経炎）、一過性黒内障及び一過性虚血性発作、偽脳腫瘍、下垂体腺腫、伝染性軟属腫、小管炎、揖保、疣贅及び乳頭腫、シラミ寄生症及び毛ジラミ症、眼瞼炎、麦粒腫、眼窩隔膜前蜂巣炎、霰粒腫、基底細胞癌、眼部帯状ヘルペス、シラミ寄生症及び毛ジラミ症、眼窩骨折、慢性流涙症、涙嚢炎、単純ヘルペス眼瞼炎、眼窩蜂巣炎、老人性内反、及び扁平上皮細胞癌が意味される。
「代謝疾患」により、当該技術分野において既知の、代謝経路に影響を及ぼす任意の疾患又は症状が意味される。代謝疾患は、結果として、遺伝性の酵素異常（代謝の先天異常）による先天性の、又は内分泌器官の疾患、若しくは肝臓のような代謝上重要な臓器の障害による後天性の、いずれかの異常な代謝プロセスを生じ得る。１つの実施態様においては、代謝疾患は、肥満、インスリン抵抗性、及び糖尿病（例えば、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病）を包含する。
「皮膚疾患」により、皮膚、真皮、又は、その任意の下部構造、例えば毛、胞等、任意の疾患又は症状が意味される。皮膚疾患、障害、症状、及び形質は、乾癬、異所性皮膚炎、皮膚癌、例えば黒色腫及び基底細胞癌、脱毛症、抜け毛、色素沈着の変化、及び、皮膚、真皮、又はその下部構造に関連した任意の他の疾患、症状、又は形質を包含し得る。
「聴覚疾患」により、耳、例えば内耳、中耳、外耳、聴神経、及びそれらの任意の下部構造を含む、聴覚系の任意の疾患又は症状が意味される。聴覚疾患、障害、症状、及び形質は、聴力損失、難聴、耳鳴り、メニエール病、眩暈、平衡及び運動障害、及び、耳又はその構造に関連した任意の他の疾患、症状、又は形質を包含し得る。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は、独立して、約１５ないし約３０ヌクレオチド長、具体的な実施態様においては、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の二重鎖は、独立して約１５ないし約３０塩基対（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）を含んでなる。別の実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖は、独立して、標的核酸分子に対し相補的である約１５ないし約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）を含んでなる。なお別の実施態様においては、ヘアピン又は環状構造を含んでなる本発明のｓｉＮＡ分子は、約３５ないし約５５（例えば、約３５、４０、４５、５０、又は５５）ヌクレオチド長であるか、又は約３８ないし約４４（例えば、約３８、３９、４０、４１、４２、４３、又は４４）ヌクレオチド長であり、かつ約１５ないし約２５（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）塩基対を含んでなる。
本明細書で用いる場合、「細胞」は、その通常の生物学的意味において使用され、かつ、完全な多細胞生物を指さず、例えば、特にヒトを指さない。細胞は、生体、例えば、鳥類、植物、哺乳類、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコに存在してよい。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）か、又は真核細胞（例えば、哺乳類又は植物の細胞）でよい。細胞は、体細胞又は生殖細胞系起源、全能又は多能性、分裂又は非分裂性であってよい。細胞はまた、配偶子又は胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来するか、又はこれらを含んでなってもよい。
１つの実施態様においては、本発明の製剤又は組成物、又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、直接注入、カテーテル法、又はステント留置法（例えば、門脈カテーテル法／ステント留置法）により、関連する組織に対し、エクソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）又はインビボにおいて局所投与される。
１つの実施態様においては、本発明の製剤又は組成物、又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、当該技術分野において既知の非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下注射により、患者又は生体に対し全身投与される。
別の実施態様においては、本発明は、本発明の１つ以上の製剤又は組成物、又は製剤ｓｉＮＡ組成物を含有している哺乳類細胞を提供する。１つ以上の製剤又は組成物、又は製剤ｓｉＮＡ組成物は、独立して、同じか又は異なる部位に対し標的化可能である。
「ＲＮＡ」により、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含んでなる分子が意味される。「リボヌクレオチド」により、β−Ｄ−リボフラノース成分の２’位にヒドロキシルキをもつヌクレオチドが意味される。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、単鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、部分精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより生成されたＲＮＡ、並びに、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変により天然ＲＮＡとは異なった、改変されたＲＮＡを包含する。かかる改変は、非ヌクレオチド物質の、例えば、ｓｉＮＡの末端へ、又は内部へ、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドへの付加を包含し得る。本発明のＲＮＡ分子におけるヌクレオチドはまた、非標準的なヌクレオチド、例えば、非天然ヌクレオチド、又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドを含んでなってもよい。これらの改変されたＲＮＡは、類似体、又は天然ＲＮＡの類似体と呼ばれ得る。
「患者」により、移植細胞のドナー又はレシピエントである生体、又は細胞自体が意味される。「患者」はまた、本発明の核酸分子がそれに対し投与され得る生体も指す。患者は、ヒト又はヒト細胞を含む、哺乳類又は哺乳類細胞であってよい。
用語「ホスホロチオアート」は、本明細書で用いる場合、式Ｉ［式中、Ｚ及び／又はＷは、硫黄原子を含んでなる］を有するインターヌクレオチド結合を指す。したがって、用語ホスホロチオアートは、ホスホロチオアート及びホスホロチオアートインターヌクレオチド結合の双方を指す。
用語「ホスホノアセテート」は、本明細書で用いる場合、式Ｉ［式中、Ｚ及び／又はＷは、アセチル又は保護されたアセチル基を含んでなる］を有するインターヌクレオチド結合をさす。
用語「チオホスホノアセテート」は、本明細書で用いる場合、式Ｉ［式中、Ｚは、アセチル又は保護されたアセチル基を含んでなり、かつＷは、硫黄原子を含んでなるか、或いはまた、Ｗが、アセチル又は保護されたアセチル基を含んでなり、かつＺが、硫黄原子を含んでなる］を有するインターヌクレオチド結合をさす。
用語「ユニバーサル」塩基は、本明細書で用いる場合、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と、それらの間に殆ど区別なく塩基対を形成する、ヌクレオチド塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基の非限定的な例は、当該技術分野において既知の、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル、及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、及びニトロアゾール誘導体、例えば、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールを包含する（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７参照）。
用語「非環状ヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指し、例えば、これにおいて、任意のリボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５）は、独立して又は組合せて、該ヌクレオチドから欠けている。
さらなる実施態様においては、製剤又は組成物、及び製剤ｓｉＮＡ組成物は、他の既知の治療と組合せて、患者又は生体において、本明細書に記載の、又は他の当該技術分野において既知の、疾患、形質、及び症状を、阻害、低減、又は予防するべく使用可能である。例えば、記載された分子は、１つ以上の既知の化合物、治療、又は方法と組合せて使用して、患者又は生体において、本明細書に記載の、又は他の当該技術分野において既知の、疾患、形質、及び症状を、阻害、低減、又は予防することも可能である。非限定的な例では、ＨＣＶ感染及びＨＢＶ感染に付随している併発症状を治療するべく使用される、製剤又は組成物、及び製剤ｓｉＮＡ組成物は、他のＨＣＶ治療、例えば、ＨＣＶワクチン；抗ＨＣＶ抗体、例えば、ＨｅｐｅＸ−Ｃ及びＣｉｖａｃｉｒ；プロテアーゼ阻害剤、例えばＶＸ−９５０；ペグ・インターフェロン、例えばＰＥＧ−イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）、及び／又は他の抗ウイルス剤、例えばリバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）及び／又はバロピシタビン（Ｖａｌｏｐｉｃｉｔａｂｉｎｅ）と組合せて使用される。
１つの実施態様においては、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチド分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）をコードしている核酸配列を、該ｓｉＮＡ分子の発現を可能にする方法で含んでなる、発現ベクターを含んでなる。例えば、該ベクターは、二重鎖を含んでなるｓｉＮＡ分子の、両鎖をコードしている配列を含有し得る。該ベクターはまた、自己相補性があり、それ故ｓｉＮＡ分子を形成する、単鎖核酸分子をコードしている配列も含有し得る。かかる発現ベクターの非限定的な例は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；及びＮｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。１つの実施態様においては、本発明の発現ベクターは、同じか又は異なってもよい２つ以上のｓｉＮＡ分子をコードしている核酸配列を含んでなる。
別の態様においては、本発明のポリヌクレオチド、例えば、標的ＲＮＡ分子と相互作用し、かつ標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって参照される標的ＲＮＡ分子）をコードしている遺伝子をダウンレギュレートするｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中にインサートされた転写単位から発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターでよい。ポリヌクレオチド発現性のウイルスベクターは、制限なく、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスをベースとして構築し得る。ポリヌクレオチド分子を発現し得る組換えベクターは、本明細書に記載のように送達可能であり、標的細胞中に残続する。別法として、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチド分子の一過性の発現に備えたものを使用し得る。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与可能である。例えば、ひとたび発現されれば、ｓｉＮＡ分子が結合し、そしてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、遺伝子機能又は発現をダウンレギュレートする。製剤又は組成物発現性ベクターの送達は、全身性、例えば、静脈内又は筋肉内投与によるか、患者からの外植標的細胞への投与及びそれに続く該患者への再導入によるか、又は、所望の標的細胞内への導入を可能にするであろう、任意の他の手段によることができる。
「ベクター」により、所望の核酸を送達するべく使用される、任意の核酸ベース及び／又はウイルスベースの技術が意味される。
本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい実施態様についての以下の記載から、及びクレームから明らかであろう。
１つ以上の生物活性分子（Ｂ）を包含する第１のビヒクルと、１つ以上の担体分子（Ｘ）を包含する第２のビヒクルとを、例えば不均一な集団として含んでなる組成物の、非限定的な例を示す図である。第１のビヒクル及び第２のビヒクルは、生物活性分子及び担体分子を除いて、同じであってよい（製剤タイプＡ１と呼ばれる、図１Ａ参照）。第１のビヒクル及び第２のビヒクルはまた、異なってもよい（製剤タイプＡ２と呼ばれる、図１Ｂ参照）。第１のビヒクル及び第２のビヒクルは、同じ比率（例えば１：１）で、又は異なる比率で存在し得る。 １つ以上の生物活性分子（Ｂ）と１つ以上の担体分子（Ｘ）とを包含するビヒクルを、例えば均一な集団として含んでなる組成物の、非限定的な例を示す図である（製剤タイプＢと呼ばれる）。生物活性分子（Ｂ）及び担体分子（Ｘ）は、同じ比率（例えば１：１）で、又は異なる比率で存在し得る。 １つ以上の担体分子（Ｘ）と、１つ以上の生物活性分子（Ｂ）を含んでなるビヒクルとを、例えば不均一な集団として含んでなる組成物の、非限定的な例を示す図である（製剤タイプＣと呼ばれる）。ビヒクル及び担体分子（Ｘ）は、同じ比率（例えば１：１）で、又は異なる比率で存在し得る。 １つ以上の担体分子（Ｘ）を包含する第１の製剤、１つ以上の生物活性分子（Ｂ）（例えば、ポリヌクレオチド、例えばｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、本明細書に記載の、他の核酸分子及び／又は他の生物活性分子）、カチオン性脂質、中性脂質、及びポリエチレングリコールコンジュゲート、例えばＰＥＧ−ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを包含する第２の製剤、を含んでなる組成物の、非限定的な例を示す図である。第１及び／又は第２の製剤は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでいてもよい。第１及び／又は第２の製剤は、さらに、アルコール又は界面活性剤を含んでいてもよい。第１及び／又は第２の製剤は、さらに、リネオイル（ｌｉｎｅｏｙｌ）アルコールを含んでいてもよい。この組成物は、本明細書において全般的に、ＬＮＰ製剤タイプＡと呼ばれる。第１の製剤及び第２の製剤は、同じ比率（例えば１：１）で、又は異なる比率で存在し得る。 １つ以上の担体分子（Ｘ）、１つ以上の生物活性分子（Ｂ）（例えば、ポリヌクレオチド、例えばｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、本明細書に記載の、他の核酸分子及び／又は他の生物活性分子）、カチオン性脂質、中性脂質、及びポリエチレングリコールコンジュゲート、例えばＰＥＧ−ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲート、を包含する製剤を含んでなる組成物の、非限定的な例を示す図である。製剤は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでいてもよい。製剤は、さらに、アルコール又は界面活性剤を含んでいてもよい。製剤は、さらに、リネオイルアルコールを含んでいてもよい。この組成物は、本明細書において全般的に、ＬＮＰ製剤タイプＢと呼ばれる。生物活性分子（Ｂ）及び担体分子（Ｘ）は、同じ比率（例えば１：１）で、又は異なる比率で存在し得る。 １つ以上の担体分子（Ｘ）と、１つ以上の生物活性分子（Ｂ）（例えば、ポリヌクレオチド、例えばｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、本明細書に記載の、他の核酸分子及び／又は他の生物活性分子）、カチオン性脂質、中性脂質、及びポリエチレングリコールコンジュゲート、例えばＰＥＧ−ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール、又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲート、を包含する製剤と、を含んでなる組成物の、非限定的な例を示す図である。製剤は、さらに、コレステロール又はコレステロール誘導体を含んでいてもよい。製剤は、さらに、アルコール又は界面活性剤を含んでいてもよい。製剤は、さらに、リネオイルアルコールを含んでいてもよい。この組成物は、本明細書において全般的に、ＬＮＰ製剤タイプＣと呼ばれる。ビヒクル及び担体分子（Ｘ）は、同じ比率（例えば１：１）で、又は異なる比率で存在し得る。 本発明のカチオン性脂質化合物の非限定的な例を示す図である。 本発明のアセタール結合カチオン性脂質化合物の非限定的な例を示す図である。 本発明のスクシニル／アシル結合カチオン性脂質化合物の非限定的な例を示す図である。 本発明の芳香族カチオン性脂質化合物の非限定的な例を示す図である。 本発明の追加のカチオン性脂質化合物の非限定的な例を示す図である。 製剤又は組成物の成分の構成図を示す図である。 製剤又は組成物により採用可能な、ラメラ構造及び逆ヘキサゴナル構造の概略説明図を示す図である。 迅速なｐＨ依存性相転移を受ける、血清安定性の製剤又は組成物、Ｌ０５１の成分を示す図である。 迅速なｐＨ依存性相転移を受ける、血清安定性の製剤又は組成物、Ｌ０７３の成分を示す図である。 迅速なｐＨ依存性相転移を受ける、血清安定性の製剤又は組成物、Ｌ０６９の成分を示す図である。 ５００ｎｍでの吸収により測定された、５０％血清中の製剤又は組成物の相対濁度によって判定された、製剤又は組成物Ｌ０６５、Ｆ２、Ｌ０５１、Ｌ０７３の、血清安定性を描いているグラフを示す図である。 ３５０ｎｍでの吸収により測定された、ｐＨ３．５からｐＨ９．０までの範囲の緩衝溶液中の、製剤又は組成物の相対濁度によって判定された、製剤又は組成物Ｌ０６５、Ｆ２、Ｌ０５１、Ｌ０７３の、ｐＨ依存性の相転移を描いているグラフを示す図である。製剤又は組成物、Ｌ０５１及びＬ０７３は、各々、ｐＨ５．５ないしｐＨ６．５において、迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける。 ３５０ｎｍでの吸収により測定された、ｐＨ３．５からｐＨ９．０までの範囲の緩衝溶液中の、製剤又は組成物の相対濁度によって判定された、製剤又は組成物Ｌ０６９の、ｐＨ依存性の相転移を描いているグラフを示す図である。製剤又は組成物、Ｌ０６９は、ｐＨ５．５ないしｐＨ６．５において、迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける。 本発明のｓｉＮＡ分子の化学修飾の非限定的な例を示す図である。 ＨｅｐＧ２細胞での、ＨＢｓＡｇレベルの低減におけるｓｉＮＡナノ粒子のインビトロの有効性の、非限定的な例を示す図である。活性のある化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、ＨＢＶ部位２６３ＲＮＡを標的化するべく設計された（ｓｉＮＡ配列は、図２０に示されている）。この図は、製剤された活性ｓｉＮＡ Ｌ０５１ナノ粒子（表ＩＶ参照）で処理された細胞におけるＨＢｓＡｇのレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示している。活性ｓｉＮＡで処理した細胞では、用量依存性のＨＢｓＡｇレベルの減少が観察されたが、ネガティブコントロール処理細胞では何ら減少は見られない。 ＨｅｐＧ２細胞での、ＨＢｓＡｇレベルの低減におけるｓｉＮＡナノ粒子のインビトロの有効性の、非限定的な例を示す図である。活性のある化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、ＨＢＶ部位２６３ＲＮＡを標的化するべく設計された（ｓｉＮＡ配列は、図２０に示されている）。この図は、製剤された活性ｓｉＮＡ Ｌ０５３及びＬ０５４ナノ粒子（表ＩＶ参照）で処理された細胞におけるＨＢｓＡｇのレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示している。活性ｓｉＮＡで処理した細胞では、用量依存性のＨＢｓＡｇレベルの減少が観察されたが、ネガティブコントロール処理細胞では何ら減少は見られない。 ＨｅｐＧ２細胞での、ＨＢｓＡｇレベルの低減におけるｓｉＮＡナノ粒子のインビトロの有効性の、非限定的な例を示す図である。活性のある化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、ＨＢＶ部位２６３ＲＮＡを標的化するべく設計された（ｓｉＮＡ配列は、図２０に示されている）。この図は、活性ｓｉＮＡを含んでなる製剤分子組成物、Ｌ０６９（表ＩＶ参照）で処理された細胞におけるＨＢｓＡｇのレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示している。活性ｓｉＮＡで処理した細胞では、用量依存性のＨＢｓＡｇレベルの減少が観察されたが、ネガティブコントロール処理細胞では何ら減少は見られない。 ＨＢＶマウスモデルにおける、全身投与されたｓｉＮＡ Ｌ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の、非限定的な例を示す図である。流体力学的な尾静脈注射を、０．３μｇのｐＷＴＤ ＨＢＶベクターの含有によって行なった。ナノ粒子被包活性ｓｉＮＡ分子を、ＨＤＩ後６日に始まる標準的なＩＶ（静脈内）注射により、３ｍｇ／ｋｇ／日において３日間投与した。グループ（Ｎ＝５）の動物を、最終回投与の３及び７日後に犠牲にし、そして血清ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを測定した。ＨＢＶ ＤＮＡの力価を、リアルタイム定量ＰＣＲにより判定し、平均ｌｏｇ１０ コピー／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。 ＨＢＶマウスモデルにおける、全身投与されたｓｉＮＡ Ｌ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の、非限定的な例を示す図である。流体力学的な微静脈注射を、０．３μｇのｐＷＴＤ ＨＢＶベクターを含有して行なった。ナノ粒子被包活性ｓｉＮＡ分子を、ＨＤＩ後６日に始まる標準的なＩＶ（静脈内）注射により、３ｍｇ／ｋｇ／日において３日間投与した。グループ（Ｎ＝５）の動物を、最終回投与の３及び７日後に犠牲にし、そして血清ＨＢＶＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢＶＡｇレベルを、ＥＬＩＳＡによりアッセイし、平均ｌｏｇ１０ ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。 Ｈｕｈ７ ＨＣＶレプリコン系におけるウイルス複製を用量依存性の方法で標的化している、製剤ｓｉＮＡ Ｌ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子コンストラクトの、非限定的な例を示す図である。活性ｓｉＮＡ製剤を、１、５、１０、及び２５ｎＭにおいて、未処理細胞（「未処理」）、及び、同じ濃度における製剤された不活性なｓｉＮＡスクランブルコントロールコンストラクトに比較して評価した。 Ｈｕｈ７ ＨＣＶレプリコン系におけるウイルス複製を用量依存性の方法で標的化している、製剤ｓｉＮＡ Ｌ０５３及びＬ０５４（表ＩＶ）ナノ粒子コンストラクトの、非限定的な例を示す図である。活性ｓｉＮＡ製剤を、１、５、１０、及び２５ｎＭにおいて、未処理細胞（「未処理」）、及び、同じ濃度における製剤された不活性なｓｉＮＡスクランブルコントロールコンストラクトに比較して評価した。 未製剤のｓｉＮＡ、コレステロール−コンジュゲートｓｉＮＡ、及び製剤ｓｉＮＡ（製剤分子組成物１８．１及び１９．１）の気管内投与後の、マウスの肺組織におけるｓｉＮＡの分布を示す図である。示した通り、肺組織における暴露の最長半減期は、分子組成物Ｔ０１８．１又はＴ０１９．１中に製剤化されたｓｉＮＡについて観察された。 ３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）の合成に使用した合成スキームの、非限定的な例を示す図である。 ３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）の合成に使用した、別の合成スキームの、非限定的な例を示す図である。 Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジリノレイルオキシベンジルアミン、及びＮ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンの合成に使用した合成スキームの、非限定的な例を示す図である。 １−［８’−（コレスタ−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−コレステロール）、及び３，４−ジテトラデコキシイルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ−ＤＭＢ）の合成に使用した合成スキームの、非限定的な例を示す図である。図中、ＰＥＧはＰＥＧ２０００、多分散物であり、これは典型的には、式ＰＥＧｎ（すなわち、ここで、ｎは約３３ないし約６７、又は平均して〜４５である）によって表わされた〜１５００から〜３０００Ｄａまで変動し得る。 １−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）の合成に使用した合成スキームの、非限定的な例を示す図である。図中、ＰＥＧはＰＥＧ２０００、多分散物であり、これは典型的には、式ＰＥＧｎ（すなわち、ここで、ｎは約３３ないし約６７、又は平均して〜４５である）によって表わされた〜１５００から〜３０００Ｄａまで変動し得る。 迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける、血清安定性製剤又は組成物、Ｌ０８３の成分を示す図である。 迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける、血清安定性製剤又は組成物、Ｌ０７７の成分を示す図である。 迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける、血清安定性製剤又は組成物、Ｌ０８０の成分を示す図である。 迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける、血清安定性製剤又は組成物、Ｌ０８２の成分を示す図である。 ＨＢＶマウスモデルにおける、全身投与されたｓｉＮＡ Ｌ０７７、Ｌ０６９、Ｌ０８０、Ｌ０８２、Ｌ０８３、Ｌ０６０、Ｌ０６１、Ｌ０５１（表ＩＶ）ナノ粒子の活性の、非限定的な例を示す図である。流体力学的な尾静脈注射を、０．３μｇのｐＷＴＤ ＨＢＶベクターの含有によって行なった。ナノ粒子被包活性ｓｉＮＡ分子を、ＨＤＩ後６日に始まる標準的なＩＶ（静脈内）注射により、３ｍｇ／ｋｇ／日において３日間投与した。グループ（Ｎ＝５）の動物を、最終回投与の３及び７日後に犠牲にし、そして血清ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを測定した。ＨＢＶ ＤＮＡの力価を、リアルタイム定量ＰＣＲにより判定し、平均ｌｏｇ１０ コピー／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。 ＨＢＶマウスモデルにおける、全身投与されたｓｉＮＡ Ｌ０８３及びＬ０８４（表ＩＶ）ナノ粒子の、用量依存性の活性の、非限定的な例を示す図である。流体力学的な尾静脈注射を、０．３μｇのｐＷＴＤ ＨＢＶベクターの含有によって行なった。ナノ粒子被包活性ｓｉＮＡ分子を、ＨＤＩ後６日に始まる標準的なＩＶ（静脈内）注射により、３ｍｇ／ｋｇ／日において３日間投与した。グループ（Ｎ＝５）の動物を、最終回投与の３及び７日後に犠牲にし、そして血清ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢｓＡｇレベルを、ＥＬＩＳＡによりアッセイし、平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。 ＨＢＶマウスモデルにおける、全身投与されたｓｉＮＡ Ｌ０７７（表ＩＶ）ナノ粒子の、用量依存性の活性の、非限定的な例を示す図である。流体力学的な尾静脈注射を、０．３μｇのｐＷＴＤ ＨＢＶベクターの含有によって行なった。ナノ粒子被包活性ｓｉＮＡ分子を、ＨＤＩ後６日に始まる標準的なＩＶ（静脈内）注射により、３ｍｇ／ｋｇ／日において３日間投与した。グループ（Ｎ＝５）の動物を、最終回投与の３及び７日後に犠牲にし、そして血清ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢｓＡｇレベルを、ＥＬＩＳＡによりアッセイし、平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。 ＨＢＶマウスモデルにおける、全身投与されたｓｉＮＡ Ｌ０８０（表ＩＶ）ナノ粒子の、用量依存性の活性の、非限定的な例を示す図である。流体力学的な尾静脈注射を、０．３μｇのｐＷＴＤ ＨＢＶベクターの含有によって行なった。ナノ粒子被包活性ｓｉＮＡ分子を、ＨＤＩ後６日に始まる標準的なＩＶ（静脈内）注射により、３ｍｇ／ｋｇ／日において３日間投与した。グループ（Ｎ＝５）の動物を、最終回投与の３及び７日後に犠牲にし、そして血清ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。血清ＨＢｓＡｇレベルを、ＥＬＩＳＡによりアッセイし、平均ｌｏｇ１０ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。 ｓｉＮＡ Ｌ０７７、Ｌ０８０、Ｌ０８２、及びＬ０８３（表ＩＶ）ナノ粒子製剤の、血清安定性の非限定的な例を示す図である。 ３５０ｎｍでの吸収により測定された、ｐＨ３．５からｐＨ９．０までの範囲の緩衝溶液中の、製剤分子組成物の相対濁度によって判定された、ｓｉＮＡ Ｌ０７７、Ｌ０８０、Ｌ０８２、及びＬ０８３（表ＩＶ）ナノ粒子製剤の、ｐＨ依存性の相転移を描いているグラフを示す図である。製剤分子組成物、Ｌ０６９は、ｐＨ５．５ないしｐＨ６．５において、迅速なｐＨ依存性の相転移を受ける。 ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞におけるＭａｐＫ１４部位１０３３を標的化する、ＬＮＰ５８及びＬＮＰ５９製剤についての有効性のデータを、ＬＦＫ２０００及び製剤された無関係なｓｉＮＡコントロールに比較して示す図である。 ＭＭ１４．Ｌｕ正常マウス肺細胞におけるＭａｐＫ１４部位１０３３を標的化する、ＬＮＰ９８製剤についての有効性のデータを、ＬＦＫ２０００及び製剤された無関係なｓｉＮＡコントロールに比較して示す図である。 ６．１２Ｂリンパ球細胞におけるＭａｐＫ１４部位１０３３を標的化する、ＬＮＰ５４、ＬＮＰ９７、及びＬＮＰ９８製剤についての有効性のデータを、ＬＦＫ２０００及び製剤された無関係なｓｉＮＡコントロールに比較して示す図である。 ＮＩＨ ３Ｔ３細胞におけるＭａｐＫ１４部位１０３３を標的化する、ＬＮＰ９８製剤についての有効性のデータを、ＬＦＫ２０００及び製剤された無関係なｓｉＮＡコントロールに比較して示す図である。 ＲＡＷ２６４．７細胞における、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ５４及びＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存性の低減を示す図である。 ＭＭ１４．Ｌｕ細胞における、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存性の低減を示す図である。 ６．１２Ｂ細胞における、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９７及びＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存性の低減を示す図である。 ＮＩＨ ３Ｔ３細胞における、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの用量依存性の低減を示す図である。 ＯＶＡ誘発に媒介される気道過敏症のマウスモデルにおける、ＩＬ−４Ｒを標的化するＬＮＰ−５１製剤ｓｉＮＡによる処理からの、低減された気道過敏症の非限定的な例を示す図である。活性のある製剤ｓｉＮＡを、０．０１、０．１、及び１．０ｍｇ／ｋｇにおいて試験し、ＬＮＰビヒクル単独及び未処理（ナイーブ）の動物と比較した。 インビボのハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子発現の、ＬＮＰ製剤ｓｉＮＡ媒介性の阻害の、非限定的な例を示す図である。アルゼット（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプを用いて、ＬＮＰ中に被包されたｓｉＮＡを、０．１ないし１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（全用量は、８．４ないし８４μｇの範囲）で、マウス側側脳室又は線条内に、それぞれ７又は１４日間注入した。ＬＮＰ−０９８又はＬＮＰ−０６１で製剤した活性ｓｉＮＡで処理された動物を、ＬＮＰ−０６１で製剤されたミスマッチコントロールｓｉＮＡ、及び未処理動物コントロールと比較した。ハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子発現のレベルは、ＱＰＣＲにより判定した。 不活性ｓｉＮＡの担体ＬＮＰ製剤の在・不在下での、活性のあるＬＮＰ製剤ＨＢＶ２６３ｓｉＮＡの、未処理コントロールに比較した用量依存性の抗ＨＢＶ活性の、非限定的な例を示す図である。 不活性ｓｉＮＡの担体ＬＮＰ製剤の在・不在下での、活性のあるＬＮＰ製剤ＳＳＢ２９１ｓｉＮＡによる、マウス肝臓におけるＳＳＢ標的ＲＮＡの、未処理コントロールに比較した用量依存性のノックダウンの、非限定的な例を示す図である。 活性のあるＬＮＰ製剤ＳＳＢ２９１ｓｉＮＡのＲＮＡｉ活性に対する、ＬＮＰ製剤単鎖又は二重鎖ポリヌクレオチド担体分子の、未処理コントロールに比較しての作用の、非限定的な例を示す図である。 担体作用の活性についての、非限定的な例を示す図である。担体作用が、有効なＲＮＡｉを、多数のｓｉＲＮＡについて混合物中で可能にするかどうかを調べるため、３つの異なる遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡを使用した。ＳＳＢ２９１、ＣＲＴＣ２：２８３、及びＩＫＫ２ ２３８９ｓｉＲＮＡを、３ｍｇ／ｋｇで単独に、又は全３種の、２．１ｍｇ／ｋｇの担体ＨＣＶ３１６との混合物として、全用量３ｍｇ／ｋｇで投与した。ｓｉＲＮＡを、０．３ｍｇ／ｋｇで個別に投与した場合、それらはその意図した標的に対し、中程度のノックダウンを示すか、又は何らノックダウンを示さなかった。一方、混合物として与えた場合、ノックダウン作用は有意に改善された。ＳＳＢ２９１では、標的ノックダウンは、単独で与えた場合の３１％から、混合物において与えた場合の７７％に改善した。ＣＲＴＣ２：２８３では、標的ノックダウンは、単独で与えた場合の１７％から、混合物において与えた場合の４１％に改善した。ＩＫＫ２：２３８９では、標的ノックダウンは、単独で与えた場合何らノックダウンは観察されなかったが、混合物において与えた場合、それは４８％に改善した。したがって、各々のｓｉＲＮＡの濃度が０．３ｍｇ／ｋｇであっても、単独又は混合物において与えた場合、活性の有意な改善が、それらを混合物として投与することにより達成された。このことは、多数の標的を低い用量で標的化して、相加効果又は相乗効果を達成できるようにする。 有利な担体作用のための、空のＬＮＰの使用についての、非限定的な例を示す図である。担体カーゴの性質をさらに理解するため、空のＬ２０１を調製した。ＳＳＢ２９１ Ｌ２０１を、１ｍｇ／ｋｇで単独に、又は担体としての空のＬ２０１の存在下に、全用量３ｍｇ／ｋｇで注射した。全肝臓ＲＮＡを単離し、ＳＳＢ ＲＮＡについて分析した。ＳＳＢ２９１は、単独で投与した場合、５４％の標的ＲＮＡのノックダウンを示したが、空のＬＮＰ担体と共に与えた場合、ノックダウン効率は７９％に改善した。空のＬＮＰ担体それ自体では、ＳＳＢ標的の有意なノックダウンを示さなかった。この結果は、ＲＮＡｉ活性の強化が、空のＬＮＰ、「空の担体」によって達成可能であることを示している。
発明の詳細な記載
本発明の核酸分子の作用メカニズム
アプタマー：核酸アプタマーは、興味のある特定のリガンドに特異的に結合させるべく選択し得る（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５６７，５８８号及び米国特許第５，４７５，０９６号、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；及びＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８参照）。例えば、インビトロ選択法の使用を適用して、ＣｙｌＡに結合特異性をもつ核酸アプタマーを進化させることができる。核酸アプタマーは、本明細書に記載の、化学修飾及びリンカーを包含し得る。本発明の核酸は、二本鎖又は単鎖でよく、かつ互いに複合体形成する１つの別個の核酸配列、又は１つ以上の核酸配列を含んでいてもよい。ＣｙｌＡに結合する本発明のアプタマー分子は、ＣｙｌＡのプロテアーゼ活性と、それに続く細胞溶解素の活性化とを調節し、かつそれ故に、腸球菌感染に関連した急性毒性を調節し得る。
アンチセンス：アンチセンス分子は、修飾又は未修飾のＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合ポリマーオリゴヌクレオチドであってよく、そして主に、適合性配列に対し特異的に結合し、その結果としてペプチド合成の調節を生じることにより機能する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ １９９４，ＢｉｏＰｈａｒｍ，２０−３３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソンクリック塩基対合により標的ＲＮＡに結合し、結合した配列のリボソームでの翻訳を、立体阻害又はＲＮアーゼＨ酵素の活性化のいずれかによって妨げることにより、遺伝子発現を阻止する。アンチセンス分子はまた、ＲＮＡプロセシング又は、核から細胞質への輸送に干渉することにより、タンパク質合成を改変させる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ＆ Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ７，１５１−１９０）。
さらに、ＲＮＡに対する単鎖ＤＮＡの結合は、結果として、ヘテロ二重鎖のヌクレアーゼ分解を生じてもよい（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ、上記；Ｃｒｏｏｋｅ，上記）。現在までのところ、ＲＮアーゼＨの基質として作用することができる骨格修飾ＤＮＡ化学は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、及び三フッ化ホウ素塩のみである。最近、２’−アラビノ及び２’−フルオロアラビノ−を含有するオリゴもまた、ＲＮアーゼＨ活性を活性化し得ることが報告された。
化学修飾されたヌクレオチド、二次構造、及び／又はＲＮアーゼＨ基質ドメインの、新規なコンフィギュレーションを利用するいくつかのアンチセンス分子が記載されてきた（Ｗｏｏｌｆら、米国特許第５，９８９，９１２号；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９８年４月２０日出願のＵＳＳＮ６０／０８２，４０４；Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９８年９月２１日出願のＵＳＳＮ６０／１０１，１７４）（これらは全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）。
アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡを標的化し、それにより、二重鎖中の標的ＲＮＡを消化するＲＮアーゼＨを活性化するべく使用し得る。アンチセンスＤＮＡは、化学合成可能であり、或いは、単鎖ＤＮＡ細胞内発現ベクター又はその同等物の使用によって発現可能である。
三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）：単鎖オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに対し配列特異的な方法で結合するべく設計可能である。ＴＦＯは、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）塩基対合を介してＤＮＡヘリックスに結合する、ピリミジンリッチなオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ、上記）。さらに、ＴＦＯは、標的ＤＮＡ配列に対する結合親和性を増大するべく化学修飾可能である。結果として得られた、ＤＮＡセンス、ＤＮＡアンチセンス、及びＴＦＯから構成される、得られた三本鎖ヘリックスは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を破壊する。ＴＦＯメカニズムは、結合が不可逆的であってもよいことから、遺伝子発現又は細胞死を生じる結果となる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ＆ Ｒｏｔｈ、上記）。
２’−５’オリゴアデニレート：２−５Ａシステムは、高等脊椎動物において発見された、ＲＮＡ分解のためのインターフェロン媒介性のメカニズムである（Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６７８０−６７８５）。２つのタイプの酵素、２−５Ａシンセターゼ及びＲＮアーゼＬ、がＲＮＡ切断に必要である。２−５Ａシンセターゼは、２’−５’オリゴアデニレート（２−５Ａ）を形成するのに二本鎖ＲＮＡを必要とする。２−５Ａは次に、単鎖ＲＮＡ切断能をもつＲＮアーゼＬを利用するためのアロステリックエフェクターとして作用する。二本鎖ＲＮＡと２−５Ａ構造を形成するこの能力は、このシステムを、ウイルス複製の調節のために特に有用なものにする。
（２’−５’）オリゴアデニレート構造は、アンチセンス分子に対し共有結合により結合し得て、ＲＮＡ切断が可能なキメラオリゴヌクレオチドを形成する（Ｔｐｒｒｅｎｃｅ、上記）。これらの分子は、推定上、２−５Ａ依存性のＲＮアーゼに結合して活性化し、次にオリゴヌクレオチド／酵素複合体が、標的ＲＮＡ分子に結合して、これを次に該ＲＮアーゼ酵素により切断され得るようにする。２’−５’オリゴアデニレート構造の共有結合は、アンチセンスへの応用に限定されず、本発明の核酸分子への結合を包含するべくさらに合成し得る。
酵素的核酸：現在、いくつかの多様な天然の酵素ＲＮＡが知られている（Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３０，４５７−４７５；Ｓｙｍｏｎｓ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．，４，３２２−３０）。さらに、いくつかのインビトロでの選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ ２０５，４３５）が、ホスホジエステル結合の切断及び結合を触媒し得る新規な核酸触媒を進化させるべく使用されてきた（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４，４２６２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ３，９１４；Ｎａｋａｍａｙｅ ＆ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，上記；Ｌｏｎｇ ＆ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９４，上記；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５、上記；Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，６４９５）。各々は、生理的条件下に、トランスでのホスホジエルテル結合の加水分解を包含する一連の反応を触媒し得る（したがって、他のＲＮＡ分子の切断が可能である）。
酵素的核酸の酵素的性質は、治療的処置に影響を及ぼすために必要な核酸の濃度が低いといった、有意な利点をもつ。この利点は、酵素的核酸分子が酵素的に作用する能力を反映している。例えば、単一の酵素的核酸分子が、多くの標的ＲＮＡ分子を切断し得る。さらに、酵素的核酸分子は、高度に特異的なモジュレーターであり、調節の特異性は、標的ＲＮＡに対する結合の塩基対合メカニズムだけでなく、標的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断部位付近の単一のミスマッチ又は塩基置換を選択して、酵素的核酸分子の触媒活性を完全に除去することが可能である。
エンドヌクレアーゼ酵素的活性を有する核酸分子は、ヌクレオチド塩基配列に特異的な方法で、他の別のＲＮＡ分子を反復的に切断することができる。適切な設計及び構築により、かかる酵素的核酸分子を任意のＲＮＡ転写物に対し標的化して、有効な切断をインビトロで達成することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２４、Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｕｈｌｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔｕｒｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；及びＪｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１，１９８９；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３，４０９２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ９４，４２６２）。
その配列特異性の故に、トランス切断性の酵素的核酸分子は、ヒト疾患用の治療剤として期待される（Ｕｓｍａｎ ＆ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。酵素的核酸分子を設計して、細胞ＲＮＡのバックグラウンド内の特異的なＲＮＡ標的を切断することができる。かかる切断事象は、ＲＮＡを非機能性化し、かつそのＲＮＡからのタンパク質発現を阻止する。この方法で、疾患状態に関連したタンパク質の合成を選択的に調節し得る（Ｗａｒａｓｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，２３７−２５０）。
本発明はまた、本発明の核酸デコイ及び／又はアプタマーを含んでなるセンサードメインを有する、核酸センサー分子又はアロザイムも特徴とする。核酸センサー分子のセンサードメインの、分子標的との相互作用は、核酸センサー分子の酵素的核酸ドメインを活性化又は不活性化して、該核酸センサー分子の活性が、標的シグナリング分子の存在下に調節されるようにすることができる。核酸センサー分子は、標的分子の存在下に活性化されるべく設計可能であり、或いはまた、標的分子の存在下に不活性化されるべく設計可能である。例えば、リガンドに対する結合特異性をもつアプタマーを含んでなるセンサードメインをもつ、核酸センサー分子が設計される。非限定的な例では、リガンドと、核酸センサー分子のセンサードメインとの相互作用は、該核酸センサー分子の酵素的核酸ドメインを活性化して、該センサー分子が反応、例えばリガンドをコードしているＲＮＡの切断、を触媒するようにすることができる。この例では、核酸センサー分子は、リガンドの存在下に活性化され、そして該リガンドに関連した疾患又は症状を治療するための治療剤として使用可能である。別法として、この反応は、標識された核酸レポーター分子の切断又は結合を含んでいてもよく、系におけるリガンドの存在を検出するための有用な診断薬を提供する。
ＲＮＡ干渉：以下の議論は、現在知られている低分子干渉ＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉についての提唱されたメカニズムを議論しており、限定されることを意味するものではなく、また先行技術と認めるものではない。本出願人は、本明細書において、化学修飾された低分子干渉核酸が、ｓｉＲＮＡ分子と類似か又は改善されたＲＮＡｉ媒介能を有し、かつインビボでの改善された安定性及び活性を有することが予想されることを示しており；したがって、この議論は、ｓｉＲＮＡのみに限定されることを意味するものではなく、全体としてｓｉＮＡに適用可能である。「ＲＮＡｉを媒介する改善された能力」又は「改善されたＲＮＡｉ活性」により、インビトロ及び／又はインビボで測定されたＲＮＡｉ活性を含むことが意味され、ここで、ＲＮＡｉ活性は、ＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡの能力と、本発明のｓｉＮＡの安定性の、双方を反映する。本発明では、これらの活性の産物を、全ＲＮＡ ｓｉＲＮＡ又は複数のリボヌクレオチドを含有するｓｉＮＡに比較して、インビトロ及び／又はインビボにおいて増大させることができる。ある場合には、ｓｉＮＡ分子の活性又は安定性は、低減され得るが（すなわち、１０分の１より低く）、ｓｉＮＡ分子の全体としての活性は、インビボ及び／又はインビトロで増大される。
ＲＮＡ干渉は、動物において低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは、一般に、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと呼ばれており、また真菌では、クエリングとも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するべく使用される、進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられ、これは様々な叢又は門によって共有されている（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。外来遺伝子発現からのかかる防御は、相同単鎖ＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答により、ウイルス感染又は宿主ゲノム内へのトランスポゾンエレメントのランダムインテグレーションに由来する、二本鎖ＲＮＡの産生に応答して、進化してきたのかもしれない。細胞内のｄｓＲＮＡの存在は、まだ完全には特性決定されていないメカニズム介して、ＲＮＡｉ応答を誘発する。このメカニズムは、プロテインキナーゼＰＫＲと、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断を生じる結果となる２’、５’−オリゴアデニレートシンセターゼとの、ｄｓＲＮＡ媒介性の活性化からの結果であるインターフェロン応答とは異なるようである。
細胞内の長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い断片のｄｓＲＮＡへのプロセシングに関与する（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１ないし約２３ヌクレオチド長であり、かつ約１９個の塩基対の二重鎖を含んでなる。ダイサーはまた、翻訳制御に関与する保存構造をもつ前駆体ＲＮＡからの、２１及び２２ヌクレオチドの小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しに関係づけられてきた（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた、一般にはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、ｓｉＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、これは、ｓｉＲＮＡと相同な配列を有する単鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド配列に対し相補的な領域の、中央で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。さらに、ＲＮＡ干渉はまた、小さいＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）に媒介される遺伝子サイレンシングに関与し得て、これはおそらく、クロマチン構造を制御し、それにより標的遺伝子の転写を妨害する細胞メカニズムによる（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７参照）。すなわち、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ転写物との相互作用を介して、或いはまた特定の遺伝子配列との相互作用により、遺伝子サイレングを媒介するべく使用可能であり、この場合、かかる相互作用の結果として、転写レベル又は転写後レベルのいずれかにおいて、遺伝子サイレンシングを生じる。
ＲＮＡｉは、様々な系において研究されてきた。Ｆｉｒｅら（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓｅ）において最初にＲＮＡｉを観察した。Ｗｉｎｎａｙ及びＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０）は、マウス胚において、ｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載している。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡでトランスフェクトされたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞において、ＲＮＡｉを記載している。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は、ヒト胚性腎細胞及びＨｅＬａ細胞を包含する培養哺乳類細胞において、合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖を導入することにより誘導された、ＲＮＡｉを記載している。ショウジョウバエ胚の溶解物における最近の研究は、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために不可欠である、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成物、及び配列について、いくつかの必要条件を明らかにしてきた。これらの研究は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖が、２つの２−ヌクレオチド３’末端の突出を含有する場合、最も活性があることを示した。さらに、一方又は双方のｓｉＲＮＡ鎖を、２’−デオキシ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換することは、ＲＮＡｉ活性を消失するのに対し、３’−末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二重鎖の中央におけるミスマッチ配列もまた、ＲＮＡｉ活性を消失させることが示された。さらに、これらの研究はまた、標的ＲＮＡにおける切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡガイド配列の３’端よりもむしろ５’末端によって規定されることを示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。別の研究は、ｓｉＮＡ二重鎖の標的相補鎖上の５’ホスフェイトが、ｓｉＲＮＡ活性に必要であること、及び、ｓｉＲＮＡ分子上の５’−リン酸基を維持するためにＡＴＰが利用されていることを示している（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）；しかしながら、５’ホスフェイトを欠いているｓｉＲＮＡ分子は、外来性に導入された場合は活性があり、ｓｉＲＮＡコンストラクトの５’−リン酸化が、インビボで生じてもよいことを示唆している。
核酸分子の合成
１００ヌクレオチド長を超える核酸の合成は、自動化された方法を用いては困難であり、かつ、かかる分子の治療コストは法外に高い。本発明においては、小さな核酸モチーフ（「小さな」は、１００ヌクレオチド長を超えない、好ましくは８０ヌクレオチド長を超えない、そして最も好ましくは５０ヌクレオチド長を超えない核酸モチーフを指し；例えば、個々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列か、又はタンデムに合成されたｓｉＮＡ配列を指す）が、好ましくは外来性の送達に使用される。これらの分子の単純な構造は、標的領域のタンパク質及び／又はＲＮＡ構造への、核酸の侵入能力を増大する。本発明の例示的な分子は、化学的に合成されているが、他のものも同様に合成し得る。
オリゴヌクレオチド（例えば、ある修飾されたオリゴヌクレオチド、又はリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチド部分）は、当該技術分野において既知のプロトコルを用いて、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４４５９号、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，及びＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載のように合成される。これらの参考文献は、参考として本明細書に含まれる。オリゴヌクレオチドの合成は、一般的な核酸保護基及びカップリング基、例えばジメトキシトリチルを５’末端において、かつホスホルアミダイトを３’末端において利用する。非限定的な例においては、小スケールの合成を、３９４ アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｄｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）合成装置において、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドには２．５分間のカップリング工程を、また２’−デオキシヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドには４５秒間のカップリング工程を用いて
行なう。表ＩＩは、合成サイクルにおいて使用される試薬の量及び接触時間の概要を示している。別法として、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、９６ウエルプレートの合成装置、例えば、プロトジーン（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ，Ｐａｌｏ ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造された装置において、サイクルに最少の修正を加えて行ない得る。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに比較して、３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト、及び１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を使用し得る。デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに比較して、約２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイト、及び７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を使用し得る。トリチル分画の比色定量により判定された、３９４アプライド・バイオシステムズ・インク合成装置での平均カップリング収率は、典型的には９７．５ないし９９％である。３９４アプライド・バイオシステムズ・インク合成装置用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬は、以下を包含する：脱トリチル化溶液は、塩化メチレン中の３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは、ＴＨＦ中の１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）、及びＴＨＦ中の１０％無水酢酸／１０％ ２，６−ルチジン（ＡＢＩ）を用いて行ない；かつ酸化溶液は、ＴＨＦ中の１６．９ｍＭ Ｉ２、４９ｍＭ ピリジン、９％ 水（パーセプティブ・バイオシステムズ・インク（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．））である。バーディック＆ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）合成等級のアセトニトリルは、試薬瓶から直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、アメリカン・インタナショナル・ケミカル・インク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．）から入手した固体から作成する。或いはまた、ホスホロチオアート結合の導入用には、ボウケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を使用する。
ＤＮＡベースのオリゴヌクレオチドの脱保護は、以下のように行なう：ポリマー結合トリチル−オン オリゴリボヌクレオチドを、４ｍＬのガラススクリュートップバイアルに移し、４０％メチルアミン水溶液（１ｍＬ）中に、６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後、上清をポリマー支持体から移す。支持体を、１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、そして次に、上清を最初の上清に添加する。オリゴリボヌクレオチドを含有している合わせた上清を、乾燥させて白色粉末を得る。
本発明のいくつかのｓｉＮＡ分子を包含するＲＮＡのために使用される合成法は、Ｕｓｍａｎｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；及び Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４ Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９、に記載された方法に従い、一般的な核酸保護基及びカップリング基、例えば、ジメトキシトリチルを５’末端において、かつホスホルアミダイトを３’末端において利用する。非限定的な例においては、小スケールの合成を、３９４ アプライド・バイオシステムズ・インク合成装置において、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで、アルキルシリル保護されたヌクレオチドには７．５分間のカップリング工程を、及び２’−Ｏ−メチル化されたヌクレオチドには２．５分間のカップリング工程を用いて行なう。表ＩＩは、合成サイクルにおいて使用される試薬の量及び接触時間の概要を示している。別法として、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、９６ウエルプレートの合成装置、例えば、プロトジーン（Ｐａｌｏ ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造された装置において、サイクルに最少の修正を加えて行ない得る。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに比較して、３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト、及び７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を使用し得る。リボ残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに比較して、６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護されたホスホロアミダイト、及び１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を使用し得る。トリチル分画の比色定量により判定された、３９４アプライド・バイオシステムズ・インク合成装置での平均カップリング収率は、典型的には９７．５ないし９９％である。３９４アプライド・バイオシステムズ・インク合成装置用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬は、以下を包含する：脱トリチル化溶液は、塩化メチレン中の３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは、ＴＨＦ中の１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）、及びＴＨＦ中の１０％無水酢酸／１０％ ２，６−ルチジン（ＡＢＩ）を用いて行ない；酸化溶液は、ＴＨＦ中の１６．９ｍＭ Ｉ２、４９ｍＭ ピリジン、９％ 水（パーセプティブ・バイオシステムズ・インク（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．））である。バーディック＆ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）合成等級のアセトニトリルは、試薬瓶から直接使用する。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、アメリカン・インタナショナル・ケミカル・インク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．）から入手した固体から作成する。或いはまた、ホスホロチオアート結合の導入用には、ボウケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を使用する。
ＲＮＡの脱保護は、２ポットプロトコル又は１ポットプロトコルのいずれかを用いて行なう。２ポットプロトコルでは、ポリマー結合トリチル−オン オリゴリボヌクレオチドを、４ｍＬのガラススクリュートップバイアルに移し、そして４０％メチルアミン水溶液（１ｍＬ）中で、６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後、上清をポリマー支持体から移す。支持体を、１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、そして次に、上清を最初の上清に添加する。オリゴリボヌクレオチドを含有している合わせた上清を、乾燥させて白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを、無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン、７５０μＬ ＴＥＡ、及び１ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ、ＨＦ濃度１．４Ｍとする）中に再懸濁し、６５℃で加熱する。１．５時間後、１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３でオリゴマーをクエンチする。
別法として、１ポットプロトコル用には、ポリマー結合トリチル−オン オリゴリボヌクレオチドを、４ｍＬのガラススクリュートップバイアルに移し、３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中に、６５℃で１５分間懸濁する。バイアルを室温にし、ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を添加し、バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し、次いで、１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３でクエンチする。
トリチル−オン オリゴマー精製用には、クエンチしたＮＨ４ＨＣＯ３溶液を、アセトニトリルで、続いて５０ｍＭ ＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリッジに負荷する。負荷されたカートリッジを水で洗浄した後、ＲＮＡを、０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次いで、カートリッジを水で再度洗浄し、１Ｍ ＮａＣｌで塩交換し、そして再度水で洗浄する。次に、オリゴヌクレオチドを３０％アセトニトリルで溶出する。
平均段階カップリング収率は、典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３，２６７７−２６８４）。当業者は、合成のスケールを、例えば、制限なく９６ウエルフォーマットを含めて、上記記載の例よりも大きく又は小さく適合し得ることを認識するであろう。
別法として、本発明の核酸分子は、個別に合成し、そして合成後に、例えば、ライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．；１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４）、又は、合成及び／又は脱保護に続くハイブリダイゼーションにより、つなぎ合わせてもよい。
本発明のｓｉＮＡ分子はまた、本明細書の実施例１で記載したタンデム合成法により合成可能であり、これにおいて、双方のｓｉＮＡ鎖を、切断可能なリンカーによって隔てられた単一の連続したオリゴヌクレオチドフラグメント又は鎖として合成し、続いてこれを切断して、ハイブリダイズしかつｓｉＮＡ二重鎖の精製を可能にする、個別のｓｉＮＡフラグメント又は鎖を得る。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカー、又は非ヌクレオチドリンカーでよい。本明細書に記載のｓｉＮＡのタンデム合成は、マルチウエル／マルチプレート合成プラットフォームの双方、例えば９６ウエル又は類似のより大きいマルチウエルプラットフォームに容易に適合し得る。本明細書に記載のｓｉＮＡのタンデム合成はまた、バッチリアクター合成カラムなどを用いた大規模の合成プラットフォームにも容易に適合可能である。
ｓｉＮＡ分子はまた、２つの別個の核酸鎖又はフラグメントから組立て可能であり、これにおいて、一方のフラグメントはＲＮＡ分子のセンス領域を包含し、第２のフラグメントがＲＮＡ分子のアンチセンス領域を包含する。
本発明の核酸分子は、広範囲に修飾して、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈを用いた修飾により、安定性を増強し得る（総説としては、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。ｓｉＮＡコンストラクトは、ゲル電気泳動により、一般法を用いて精製可能であり、或いは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；例えば、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａ．，上記（その記載全体が参考として本明細書に含まれる）を参照）により精製可能であり、水中に再懸濁する。
本発明の別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター内にインサートされた、転写ユニットから発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターでよい。ｓｉＮＡ発現ウイルスベクターは、制限なく、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスをベースに構築し得る。ｓｉＮＡ分子の発現が可能な組換えベクターは、本明細書に記載のように送達可能であり、標的細胞内で存続する。別法として、ｓｉＮＡ分子の一過性の発現に備えたウイルスベクターを使用し得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の調製
１つの実施態様においては、本発明は、本発明の脂質ナノ粒子組成物を製造するためのプロセスを特徴とする。このプロセスは、典型的には、本発明の生物活性分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はＲＮＡｉ阻害剤）、及び／又は本発明の担体を含んでなる水溶液を、第１のリザーバーであって、第２のリザーバー内の有機脂質溶液と液体連絡がある該第１のリザーバーにおいて提供すること、及び、該水溶液を該有機脂質溶液と混合すること、これに続くインキュベーション工程、透析濾過工程、及び最終濃縮工程を含んでなる。１つの実施態様においては、該水溶液、例えば緩衝液は、生物活性分子及び／又は担体分子を含んでなり、この工程の結果として該生物活性分子が脂質ナノ粒子中に被包されるようにする。ある実施態様においては、担体分子は、第２のリザーバー内の有機脂質溶液中に溶解される。
別の実施態様においては、本発明は、生物活性分子を包含する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を製造するための装置を特徴とする。該装置は、典型的には、水溶液を保持するための第１のリザーバーと、有機脂質溶液を保持するための第２のリザーバーとを包含し、これにおいて、該水溶液が生物活性分子を包含する。該装置はまた、典型的には、該水溶液及び有機脂質溶液を、実質的に等しい流速で、混合領域又は混合チャンバー内に注入するべく設定された、ポンプメカニズムも包含する。１つの実施態様においては、該混合領域又は混合チャンバーは、Ｔ型カップリング又はその同等物を含んでなり、これは、Ｔコネクター内に投入されるとき、水性及び有機液体流を合わせるようにし、得られた混ぜられた水性及び有機溶液が、Ｔコネクターからコレクションリザーバー又はその同等物内に出るようにする。稼働中、有機脂質溶液を混合領域において水溶液と混合して、インキュベーション、透析濾過、及び濃縮の後に、所望の脂質ナノ粒子組成物を形成する。
１つの実施態様においては、本発明は、本発明の脂質ナノ粒子組成物を合成するための工程であって：（ａ）本発明の生物活性分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はＲＮＡｉ阻害剤）及び／又は本発明の担体分子を含んでなる水溶液を提供すること；（ｂ）本発明のＬＮＰ成分（例えば、表ＩＶに示されたＬＮＰ成分）を含んでなる有機溶液を提供すること；（ｃ）該水溶液を該有機溶液と混合すること；（ｄ）得られた混合された水溶液及び有機溶液を、インキュベートした後に（ｅ）希釈すること；（ｆ）限外濾過；及び（ｇ）脂質ナノ粒子組成物を製造するのに適した条件下に最終濃縮すること、を含んでなる該プロセスを特徴とする。１つの実施態様においては、生物活性分子は、工程の結果として脂質ナノ粒子内に被包される。
１つの実施態様においては、本発明は、生物活性分子を含んでなる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を調製するための方法であって：（ａ）興味のある生物活性分子及び／又は担体分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ組成物）の溶液を、適当な緩衝液中に調製すること；（ｂ）脂質成分（例えば、ＣｌｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ）、及び／又はリノレイルアルコール）の溶液を、適当な緩衝液中に調製すること；（ｃ）該脂質成分溶液と、該生物活性分子溶液とを、粒子形成に適した条件下に混ぜ合わせること；（ｄ）得られた混合物をインキュベートした後に、（ｅ）適当な緩衝液で希釈すること；（ｆ）限外濾過；及び（ｇ）ＬＮＰ組成物を最終濃縮すること、を含んでなる該方法を提供する（例えば、表ＶＩ参照）。
１つの実施態様においては、（ａ）の緩衝液は、水性緩衝液、例えばクエン酸緩衝液である。別の実施態様においては、（ｂ）の緩衝液は、有機アルコール、例えばエタノールを含んでなる。１つの実施態様においては、（ｃ）の、混合することは、（ａ）の溶液の第１の液体流と、（ｂ）の溶液の第２の液体流とを、実質的に等しい流速で混合領域内に混ぜ入れて、脂質ナノ粒子組成物を形成する、ポンプ装置を利用することを含んでなる。別の実施態様においては、（ｄ）のインキュベーションは、得られた（ｃ）のインプロセス溶液を、約１２ないし約１００時間（好ましくは約１２ないし約２４時間）、ほぼ室温において、かつ任意で光を防御して、容器内に静置させることを含んでなる。１つの実施態様においては、希釈（ｅ）は、ポンプ系（例えば、横隔膜ポンプ）を使用した、水性緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液）による希釈を包含する。１つの実施態様においては、限外濾過（ｆ）は、希釈されたＬＮＰ溶液の濃縮と、それに続く透析濾過、例えば、適当なポンプ系（例えば、クワトロフロー（Ｑｕａｔｒｏｆｌｏｗ）ポンプ系又はその同等物等のポンプ装置）を、適当な限外濾過膜（例えば、ＧＥ ＮＰ ＵＦＰ−１００−Ｃ−３５Ａ又はその同等物）と組合せて使用することを含んでなる。
別の実施態様においては、本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を調製するための方法であって：（ａ）カチオン性脂質及び非カチオン性脂質を含んでなる混合物を、有機溶媒中に調製すること；（ｂ）興味の分子（例えば、生物活性分子及び／又は担体分子）の水溶液を、工程（ａ）の混合物と接触させて、透明な単相を提供すること；及び（ｃ）該有機溶媒を除去して、分子−脂質粒子の懸濁液を提供することを含んでなる該方法を提供し、これにおいて、興味の分子は、脂質二重層内に被包されており、該粒子は血清中で安定であって、約５０ないし約１５０ｎｍか、或いはまた５０ないし約６００ｎｍのサイズを有する。
有機溶媒の選択は、典型的には、溶媒の極性と、粒子形成のもっと遅い段階での溶媒除去の容易さとを考慮することを含む。可溶化剤としても使用されている有機溶媒は、生物活性分子及び脂質の、透明な単相混合物を提供するのに充分な量である。適当な溶媒は、制限されないが、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、又は他の脂肪族アルコール、例えば、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、イソブタノール、ペンタノール、及びヘキサノールを包含する。２種以上の溶媒の組合せもまた、本発明において使用可能である。
興味の分子を、カチオン性及び中性脂質の有機溶液と接触させることは、典型的には水溶液である、興味の分子の第１の溶液と、第２の、脂質の有機溶液とを混ぜ合わせることによって達成される。当業者は、この混合が、任意の多くの方法により、例えば、ボルテックスミキサーの使用によるような機械的手段により、行ない得ることを理解するであろう。
興味の分子を脂質の有機溶液と接触させた後、有機溶媒を除去し、このようにして血清安定性の分子−脂質粒子の水性懸濁物を形成する。有機溶媒を除去するために使用した方法は、典型的には、減圧下での蒸発か、又は不活性ガス（例えば、窒素又はアルゴン）の流れを、混合物を横切ってブローすることを包含するであろう。
このように形成された製剤又は組成物は、典型的には、約５０ｎｍないし１５０ｎｍ、或いはまた約５０ないし６００ｎｍか、又は約５ないし１０００ｎｍのサイズであろう。粒子の、さらなるサイズの減少、又はサイズの均一性を達成するためには、上記記載のようにサイジングを行ない得る。
別の実施態様においては、この方法はさらに、本発明の組成物を用いた細胞のトランスフォーメーションを引き起こすのに有用である、非脂質性ポリカチオンの添加を含んでいてもよい。適当な非脂質性ポリカチオンの例は、制限されないが、臭化ヘキサジメトリン（アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）から、商品名ポリブレン（ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ）（登録商標）で市販）、又は他のヘキサジメトリンの塩を包含する。他の適当なポリカチオンは、例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリアリルアミン、及びポリエチレンイミンの塩を包含する。
ある実施態様においては、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の形成は、単相系（例えば、ブライ及びダイヤー単相系（Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ ｍｏｎｏｐｈａｓｅ）、又は類似の水性溶媒及び有機溶媒の混合物）か、又は適当な混合による二相系のいずれかにおいて行ない得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形成を単相系で行なう場合、カチオン性脂質及び興味の分子は、それぞれある量の単相混合物中に溶解される。２つの溶液を混ぜ合わせることで、その中で複合体が形成されている単一の混合物を得る。別法として、複合体は、二相系において形成可能であり、これにおいて、カチオン性脂質が、該分子（これは、水性相に存在する）に結合し、そして有機相内にそれを「引っ張る」。
別の実施態様においては、本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を調製するための方法であって：（ａ）興味の分子（例えば、生物活性分子及び／又は担体分子）を、非カチオン性脂質及び界面活性剤を含んでなる溶液と接触させて、分子−脂質混合物を形成すること；（ｂ）カチオン性脂質を、該分子−脂質混合物と接触させて、興味の分子の負電荷部分を中和し、かつ、分子及び脂質の、電荷中和混合物を形成すること；及び（ｃ）該電荷中和混合物から界面活性剤を除去して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を得ることを含んでなる、該方法を提供する。
一群の実施態様においては、中性脂質及び界面活性剤の溶液は、水溶液である。興味の分子（例えば、生物活性分子及び／又は担体分子）を中性脂質及び界面活性剤の溶液と接触させることは、典型的には、興味の分子の第１の溶液と、脂質及び界面活性剤の第２の溶液とを、混ぜ合わせることによって達成される。当業者は、この混合が任意の多くの方法により、例えば、ボルテックスミキサーの使用によるような機械的手段により、行ない得ることを理解するであろう。好ましくは、該分子溶液もまた、界面活性剤溶液である。本方法において使用される中性脂質の量は、典型的には、使用されるカチオン性脂質の量に基づき決定され、典型的には、カチオン性脂質の量の約０．２ないし５倍、好ましくは、用いたカチオン性脂質の量の約０．５ないし約２倍である。
このように形成された分子−脂質混合物は、カチオン性脂質と接触され、存在している興味の分子（例えば、生物活性分子及び／又は担体分子、又は他のポリアニオン性物質）に付随した負電荷部分を中和する。使用されるカチオン性脂質の量は、典型的には、興味の分子の負電荷の少なくとも５０％を中和するのに充分な量である。好ましくは、負電荷は、少なくとも７０％が中和され、さらに好ましくは少なくとも９０％が中和される。本発明において有用なカチオン性脂質は、例えば、式ＣＬＩないしＣＬＸＸＩＸのいずれかを有する化合物、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＭＯＢＡ、ＣＬｉｎＤＭＡ、及びＤＭＲＩＥを含んでなる。これらの脂質及び関連類似体は、米国特許出願第０８／３１６，３９９号；米国特許第５，２０８，０３６、５，２６４，６１８、５，２７９，８３３、及び５，２８３，１８５号（これらの開示は、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載されてきた。さらに、いくつかの市販のカチオン性脂質標品が入手可能であり、本発明において使用し得る。これらは、例えば、リポフェクチン（ＬＩＰＯＰＨＥＣＴＩＮ）（登録商標）（ギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）から市販の、ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含んでなるカチオン性リポソーム）；リポフェクタミン（ＬＩＰＯＰＨＥＣＴＡＭＩＮＥ）（登録商標）（ギブコ／ＢＲＬから市販の、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含んでなるカチオン性リポソーム）；及びトランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標）（プロメガ・コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から市販の、エタノール中にＤＯＧＳを含んでなるカチオン性脂質）を包含する。
カチオン性脂質を分子−脂質混合物と接触させることは、任意のいくつかの技術により、好ましくは、該カチオン性脂質の溶液と、該分子−脂質混合物を含有する溶液とを、混ぜ合わせることによって達成される。二つの溶液を混合する（又は任意の他の方法において接触させる）と、興味の分子に付随した負電荷の一部が中和される。
カチオン性脂質を分子−脂質混合物と接触させた後、界面活性剤（又は、界面活性剤と有機溶媒の組合せ）を除去し、このようにして製剤又は組成物を形成する。界面活性剤を除去するのに使用した方法は、典型的には透析を包含する。有機溶媒が存在する場合、除去は、典型的には減圧下での蒸発か、又は不活性ガス（例えば、窒素又はアルゴン）の流れを、混合物を横切ってブローすることによる。
このように形成された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物粒子は、典型的には、約５０ｎｍないし数ミクロンのサイズである。粒子の、さらなるサイズの減少、又はサイズの均一性を達成するためには、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物粒子を超音波処理するか、濾過するか、又は、リポソーム製剤において使用され、かつ当業者に既知の、他のサイジング技術によることができる。
別の実施態様においては、この方法はさらに、本発明の組成物を用いた細胞のリポフェクションに影響を及ぼすのに有用である、非脂質性ポリカチオンを添加することを含んでいてもよい。適当な非脂質性ポリカチオンの例は、制限されないが、臭化ヘキサジメトリン（アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）から、商品名ポリブレン（ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ）（登録商標）で市販）、又は他のヘキサジメトリンの塩を包含する。他の適当なポリカチオンは、例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリアリルアミン、及びポリエチレンイミンの塩を包含する。これらの塩の添加は、粒子が形成された後が好ましい。
別の態様においては、本発明は、製剤ｓｉＮＡ組成物の調製法であって：（ａ）ある量のカチオン性脂質をｓｉＮＡと、溶液中で接触させること（ここで該溶液は約１５ないし３５％の水、及び約６５ないし８５％の有機溶媒を含んでなり、該カチオン性脂質の量は、約０．８５ないし約２．０の＋／−電荷比を生成して、疎水性の、脂質−ｓｉＮＡ複合体を提供するのに充分である）；（ｂ）溶液中の、該疎水性の、脂質−ｓｉＮＡ複合体を、中性脂質と接触させて、ｓｉＮＡ−脂質混合物を得ること；及び（ｃ）該脂質−ｓｉＮＡ混合物から有機溶媒を除去して、製剤ｓｉＮＡ組成物粒子を得ること、を含んでなる該方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、製剤ｓｉＮＡ／担体組成物の調製法であって：（ａ）ある量のカチオン性脂質をｓｉＮＡ／担体と、溶液中で接触させること（ここで該溶液は約１５ないし３５％の水、及び約６５ないし８５％の有機溶媒を含んでなり、該カチオン性脂質の量は、約０．８５ないし約２．０の＋／−電荷比を生成して、疎水性の、脂質−ｓｉＮＡ／担体複合体を提供するのに充分である）；（ｂ）溶液中の、該疎水性の、脂質−ｓｉＮＡ／担体複合体を、中性脂質と接触させて、ｓｉＮＡ／担体−脂質混合物を得ること；及び（ｃ）該脂質−ｓｉＮＡ／担体混合物から有機溶媒を除去して、製剤ｓｉＮＡ／担体組成物粒子を得ること、を含んでなる該方法を提供する。
別の態様においては、本発明は、製剤担体分子組成物の調製法であって；（ａ）ある量のカチオン性脂質を担体分子と、溶液中で接触させること（ここで該溶液は約１５ないし３５％の水、及び約６５ないし８５％の有機溶媒を含んでなり、該カチオン性脂質の量は、約０．８５ないし約２．０の＋／−電荷比を生成して、疎水性の、脂質−担体複合体を提供するのに充分である）；（ｂ）溶液中の、該疎水性の、脂質−担体複合体を、中性脂質と接触させて、ｓｉＮＡ−担体混合物を得ること；及び（ｃ）該脂質−担体混合物から有機溶媒を除去し、製剤担体組成物粒子を得ること、を含んでなる該方法を提供する。
本発明のこの態様において有用であるｓｉＮＡ、担体分子、中性脂質、カチオン性脂質、及び有機溶媒は、界面活性剤を使用した上記の方法について記載されたものと同様である。一群の実施態様においては、工程（ａ）の溶液は、単相である。別の群の実施態様においては、工程（ａ）の溶液は、二相である。
１つの実施態様においては、本発明の製剤において使用されるカチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＸＩＩを有する化合物、及びＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＣＤＡＰ、ＤＬＩＮＤＡＰ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＧＳ、ＤＭＯＢＡ、ＣＬｉｎＤＭＡ、及びそれらの組合せから選択される。１つの実施態様においては、非カチオン性質は、ＥＳＭ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコールベースポリマー（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、又はＰＥＧ−修飾ジアシルグリセロール）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びそれらの組合せから選択される。１つの実施態様においては、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、及びそれらの組合せから選択される。
１つの実施態様においては、カチオン性脂質は、式ＣＬＩ、ＣＬＩＩ、ＣＬＩＩＩ、ＣＬＩＶ、ＣＬＶ、ＣＬＶＩ、ＣＬＶＩＩ、ＣＬＶＩＩＩ、ＣＬＩＸ、ＣＬＸ、ＣＬＸＩ、ＣＬＸＩＩ、ＣＬＸＩＩＩ、ＣＬＸＩＶ、ＣＬＸＶ、ＣＬＸＶＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＶＩＩ、ＣＬＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＩＸ、ＣＬＸＸ、ＣＬＸＸＩ、ＣＬＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＶ、ＣＬＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＩＸ、ＣＬＸＸＸ、ＣＬＸＸＸＩ、ＣＬＸＸＸＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＶ、ＣＬＸＸＸＶ、ＣＬＸＸＸＶＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩ、ＣＬＸＸＸＶＩＩＩ、ＣＬＸＸＸＩＸを有する化合物、又はＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＣＤＡＰ、ＤＬＩＮＤＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＧＳ、又はそれらの組合せから選択され；非カチオン性脂質は、ＥＳＭ、ＤＯＰＥ、ＤＡＧ−ＰＥＧ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、又はそれらの組合せ（例えば、ＤＳＰＣ及びＤＡＧ−ＰＥＧ）であり；そして有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、及びそれらの組合せである。
上記のように、ｓｉＮＡ及び／又は担体を、カチオン性脂質と接触させることは、典型的には、ｓｉＮＡ及び／又は担体の第１の溶液と、脂質の第２の溶液とを混ぜ合わせることにより、好ましくは、ボルテックスミキサーの使用によるような機械的手段により行なわれる。得られた混合物は、上記記載のような複合体を含有する。これらの複合体は、次に、中性脂質の添加及び有機溶媒の除去により、粒子に変換される。中性脂質の添加は、典型的には、中性脂質の溶液を、複合体を含有する混合物に対し、単純に添加することにより達成される。逆の添加もまた使用し得る。続く有機溶媒の除去は、当業者に既知の、及び上記記載の方法によって達成可能である。
本発明のこの態様において使用される中性脂質の量は、典型的には、電荷中和された脂質−核酸複合体を得るべく使用されたカチオン性脂質の、約０．２ないし約１５倍の量（モルベースで）である。好ましくは、この量は、使用されたカチオン性脂質の約０．５ないし約９倍である。
なお別の態様においては、本発明は、上記記載の方法により調製される、製剤ｓｉＮＡ及び／又は担体組成物を提供する。これらの実施態様においては、製剤ｓｉＮＡ及び／又は担体組成物は、中性の正味電荷をもつか、又は、製剤ｓｉＮＡ及び／又は担体組成物により大きいリポフェクション活性を与える全電荷をもち続けるか、のいずれかである。１つの実施態様においては、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリンであり、カチオン性脂質はＤＯＤＡＣである。１つの実施態様においては、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ及びコレステロールの混合物であり、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。別の実施態様においては、非カチオン性脂質は、さらに、コレステロールを含んでいてもよい。
核酸製剤を調製するための非限定的な例は、米国特許第５，９７６，５６７号、米国特許第５，９８１，５０１号、及びＰＣＴ特許公開第ＷＯ９６／４０９６４号（に開示されており、これらの全ての開示は、その記載全体が参考として本明細書に含まれる。本発明において有用であるカチオン性脂質は、選択されたｐＨ、例えば生理的ｐＨにおいて、正味の正の電荷をもつ、任意の数の脂質種でよい。適当なカチオン性脂質は、制限なく、式ＣＬＩないしＣＬＸＸＸＸＶＩのいずれかを有する化合物、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＣＤＡＰ、ＤＬＩＮＤＡＰ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、及びＤＭＲＩＥ、並びに本明細書に記載の他のカチオン性脂質、又はそれらの混合物を包含する。これらのいくつかのカチオン性脂質及び、本発明においてもまた有用である関連類似体は、米国特許出願第０８／３１６，３９９号；米国特許第５，２０８，０３６、５，２６４，６１８、５，２７９，８３３、及び５，２８３，１８５号に記載されおり、これらの開示は、その記載が参考として本明細書に含まれる。さらに、いくつかの市販のカチオン性脂質標品が入手可能であり、本発明において使用し得る。これらは、例えば、リポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）（ギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）から市販の、ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含んでなるカチオン性リポソーム）；リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（登録商標）（ギブコ／ＢＲＬから市販の、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含んでなるカチオン性リポソーム）；及びトランスフェクタム（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ）（登録商標）（プロメガ・コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から市販の、ＤＯＧＳを含んでなるカチオン性リポソーム）を包含する。
本発明において使用される非カチオン性脂質は、安定な複合体を生成し得る、任意の多様な中性非荷電性、両性イオン性、又はアニオン性脂質でよい。それらは、好ましくは中性であるが、択一的に正又は負に帯電し得る。本発明において有用な非カチオン性脂質は、リン脂質関連物質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェイト、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）を包含する。非カチオン性脂質又はステロイド、例えばコレステロールが存在してもよい。追加の非リン含有脂質は、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミタート、グリセロールリシノレアート、ヘキサデシルステアラート、イソプロピルミリスタート、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル−アリール硫酸ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムなど、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドである。他の脂質、例えば、リソフォスファチジルコリン、及びリソフォスファチジルエタノールアミンが存在してもよい。非カチオン性脂質はまた、米国同時係属出願第０８／３１６，４２９号（参考として本明細書に含まれる）に記載のような、ポリエチレングリコールベースポリマー、例えばＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、及び、リン脂質又はセラミドに対しコンジュゲートされたポリエチレングリコール（ＰＥＧ−Ｃｅｒと呼ばれる）を包含する。
１つの実施態様においては、非カチオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、又はジリノレオイルホスファチジルコリン）、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及びパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、セラミド、又はスフィンゴミエリンである。これらの脂質におけるアシル基は、好ましくは、約Ｃ１０ないしＣ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。１つの実施態様においては、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。追加の実施態様においては、非カチオン性脂質は、コレステロール、１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、又は卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）を含んでなる。
カチオン性脂質及び中性脂質に加えて、本発明の製剤又は組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートを含んでなる。ＰＥＧコンジュゲートは、ジアシルグリセロール−ポリエチレングリコールコンジュゲート、すなわち、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含んでなってもよい。用語「ジアシルグリセロール」は、２つの脂肪酸、Ｒ１及びＲ２を有しており、その双方が独立して、エステル結合によってグリセロールの１−及び２−位に結合した２ないし３０個の炭素を有している化合物を指す。アシル基は、飽和されているか、又は種々の度合の不飽和があってもよい。ジアシルグリセロールは、以下の一般式ＶＩＩＩ：
Figure 2010519203
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、脂質、又はリガンドである］を有する。１つの実施態様においては、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ２ないしＣ３０アルキル基である。
１つの実施態様においては、該ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートは、ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）−ＰＥＧコンジュゲート、ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）−ＰＥＧコンジュゲート、ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）−ＰＥＧコンジュゲート、ジステリルグリセロール（Ｃ１８）−ＰＥＧコンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミドコンジュゲート（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミドコンジュゲート（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミドコンジュゲート（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｂ１８）である。当業者は、他のジアシルグリセロールが本発明のＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートにおいて使用可能であることを容易に認識するであろう。
ＰＥＧコンジュゲートは、択一的に、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲート以外のコンジュゲート、例えば、ＰＥＧ−コレステロールコンジュゲート又はＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含んでいてもよい。
上記の成分に加えて、本発明の製剤又は組成物、又はＬＮＰは、さらに、正の電荷を与えるべく脂質二重層内へのインサート用に設計された、カチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質、又はＣＰＬを含んでいてもよい（例えば、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１１，４３３−４３７参照）。本発明における使用に適した製剤、及びかかる製剤の作成法及び使用法は、例えば、２０００年４月２０日出願の、米国特許出願第０９／５５３，６３９号、及び、２０００年４月２０日に出願され、かつ２０００年１０月２６日にＷＯ ００／６２８１３として公開された、ＰＣＴ出願第ＣＡ００／００４５１号（これらの各々の教示は、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に開示されている。
本発明の製剤又は組成物、すなわち、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含有する、製剤又は組成物、又はＬＰＳは、任意のいくつかの異なる方法を使用して製造し得る。例えば、脂質−核酸粒子は、粗水性のｓｉＮＡ−脂質中間複合体を介して生成し得る。該複合体は、好ましくは電荷中和されている。界面活性剤ベース又は有機溶媒ベースのいずれかの系におけるこれらの複合体の操作は、その中で核酸が保護される粒子形成をもたらし得る。
本発明は、ｐＨ依存性の相変化を受ける製剤を含む、血清安定性の製剤又は組成物（又は脂質ナノ粒子、ＬＮＰ）を調製する方法であって、これにおいて、生物活性分子が脂質二重層内に被包され、かつ分解から保護される、該方法を提供する。さらに、本発明において形成された製剤粒子は、好ましくは、生理的ｐＨにおいて中性か又は負に帯電する。インビボ適用には、中性の粒子が有利であるのに対し、インビトロ適用には、粒子はより好ましくは負に帯電している。このことは、生物活性分子がカチオン性脂質内に被包され得る、正に帯電したリポソーム製剤に対し、凝集の低減というさらなる利点を提供する。
本発明の方法により製剤粒子及びＬＮＰは、約５０ないし約６００ｎｍ又はそれ以上のサイズを有しており、ある粒子は約６５ないし８５ｎｍである。粒子は、界面活性剤透析法によるか、又は、成分の混合の間に単相を得るべく有機溶媒を利用する、逆相法の変法によって形成し得る。何ら特定の製剤メカニズムに束縛されることを意図するものではないが、生物活性分子は、カチオン性脂質の界面活性剤溶液と接触して、コートされた分子複合体を形成する。これらのコートされた分子は、凝集しかつ沈澱し得る。しかしながら、界面活性剤の存在がこの凝集を低減し、コートされた分子が過剰の脂質（典型的には、非カチオン性脂質）と反応して、その中で生物活性分子が脂質二重層内に被包されている粒子を形成する。有機溶媒を使用した製剤又は組成物の形成のための、下記に記載の方法は、同様のスキ―ムに従う。
ある実施態様においては、粒子は、界面活性剤透析を用いて形成される。すなわち、本発明は、血清安定性の製剤又は組成物（ｐＨ依存性の相転移を受ける製剤を含む）の調製のための方法であって：（ａ）興味の分子を、カチオン性脂質と、界面活性剤溶液中で混ぜ合わせて、コートされた分子−脂質複合体を形成すること；（ｂ）非カチオン性脂質を、該コートされた分子−脂質複合体と接触させて、分子−脂質複合体と、非カチオン性脂質とを含んでなる界面活性剤溶液を形成すること；及び（ｃ）工程（ｂ）の界面活性剤溶液を透析して、血清安定性の分子−脂質粒子の溶液を得ることを含んでなり、これにおいて、興味の分子は、脂質二重層内に被包され、かつ該粒子は約５０ないし約６００ｎｍのサイズを有している、該方法を提供する。１つの実施態様においては、粒子は、約５０ないし約１５０ｎｍのサイズを有する。
コートされた分子−脂質複合体の最初の溶液は、例えば、興味の分子をカチオン性脂質と、界面活性剤溶液中で混ぜ合わせることにより形成される。
これらの実施態様においては、界面活性剤溶液は、好ましくは１５ないし３００ｍＭ、さらに好ましくは２０ないし５０ｍＭの臨界ミセル濃度を有する中性洗剤の水溶液である。適当な界面活性剤の例は、例えば、Ｎ，Ｎ’−（（オクタノイルイミノ）−ビス−（トリメチレン）−ビス−（Ｄ−グルコンアミド）（ＢＩＧＣＨＡＰ）；ＢＲＩＪ ３５；デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ；ドデシルポリ（エチレングリコール）エーテル；ツイーン２０；ツイーン４０；ツイーン６０；ツイーン８０；ツイーン８５；Ｍｅｇａ８；Ｍｅｇａ９；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−８；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０；トリトンＸ−４０５；ヘキシル−、ヘプチル−、オクチル−、及びノニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；及びヘプチルチオグルコピラノシドを包含する。１つの実施態様においては、界面活性剤は、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド又はツイーン２０である。界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は、典型的には、約１００ｍＭないし約２Ｍ、好ましくは約２００ｍＭないし約１．５Ｍである。
カチオン性脂質及び被包されるべき分子は、典型的には、約１：１ないし約２０：１、の電荷比（＋／−）、好ましくは約１：１ないし１２：１の比、及びさらに好ましくは約２：１ないし６：１の比を生成するべく混ぜ合わされるであろう。さらに、溶液中の興味の分子の全体濃度は、典型的には、約２５μｇ／ｍＬないし約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２５μｇ／ｍＬないし約５００μｇ／ｍＬ、及びさらに好ましくは約１００μｇ／ｍＬないし約２５０μｇ／ｍＬであろう。界面活性剤溶液中での分子及びカチオン性脂質の混ぜ合わせは、典型的には、室温において、コートされた複合体を形成するのに充分な時間にわたり保持される。別法として、分子及びカチオン性脂質を、界面活性剤溶液中で混ぜ合わせ、かつ約３７℃の温度に温めてもよい。温度に対し特に感受性のある分子については、コートされた複合体を、より低い温度において、典型的には約４℃に下げて形成することができる。
１つの実施態様においては、形成された製剤又は組成物中の、分子対脂質比（質量／質量比）は、約０．０１から約０．０８までの範囲であろう。精製の工程は、典型的には、未被包の分子並びに空のリポソームを除去することから、出発物質の比もまたこの範囲内に入る。別の実施態様においては、製剤又は組成物標品は、全脂質１０ｍｇ当たり約４００μｇのｓｉＮＡ、又は約０．０１ないし０．０８の分子対脂質比、さらに好ましくは約０．０４（これは、５０μｇのｓｉＮＡ当たり、１．２５ｍｇの全脂質に相当する）を使用する。
コートされた分子−脂質複合体の界面活性剤溶液を、次に、中性脂質と接触させて、分子−脂質複合体及び中性脂質の界面活性剤溶液を得る。この工程において有用である中性脂質は、なかんずく、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、及びセレブロシドを包含する。好ましい実施態様においては、中性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、又はスフィンゴミエリンである。これらの脂質におけるアシル基は、好ましくは、Ｃ１０ないしＣ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。さらに好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。好ましい実施態様においては、中性脂質は、１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、又はそれらの混合物である。最も好ましい実施態様においては、ｓｉＮＡ−脂質粒子は、インビボでの増強された特性をもつ膜融合性の粒子であり、中性脂質は、ＤＳＰＣ又はＤＯＰＥである。上記に説明されたように、本発明のｓｉＮＡ−脂質粒子は、さらに、ＰＥＧコンジュゲート、例えば、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲート、ＰＥＧ−コレステロールコンジュゲート、及びＰＥＧ−ＤＭＢコンジュゲートを含んでいてもよい。さらに、本発明のｓｉＮＡ−脂質粒子は、さらに、コレステロールを含んでいてもよい。
本方法において使用される中性脂質の量は、典型的には、５０μｇの興味の分子に対し、約０．５ないし約１０ｍｇの全脂質である。好ましくは、全脂質の量は、５０μｇの興味の分子当たり、約１ないし約５ｍｇである。
分子−脂質複合体及び中性脂質の界面活性剤溶液の形成に続いて、好ましくは透析により、界面活性剤を除去する。界面活性剤の除去は、結果として興味の分子を取り囲む脂質二重層を形成して、約５０ｎｍないし約１５０ｎｍ、又は約５０ｎｍないし約６００ｎｍのサイズを有する血清安定性の分子−脂質粒子が得られる。このようにして形成した粒子は、凝集せず、また均一の粒子サイズを達成するべく任意にサイジングしてもよい。
血清安定性の分子−脂質粒子は、当該技術分野において既知の、リポソームのサイジングに利用可能な任意の方法によりサイジングし得る。サイジングは、所望のサイズ範囲及び比較的狭い粒子サイズ分布を達成するべく行い得る。
所望のサイズに粒子をサイジングするためには、いくつかの技術が利用可能である。リポソーム用に使用され、かつ本発明の粒子にも同様に適用可能な１つのサイジング法は、米国特許第４，７３７，３２３号（参考として本明細書に含まれる）に記載されている。バス型又はプローブ型の超音波処理のいずれかにより、粒子懸濁液を超音波処理すると、サイズ約５０ｎｍ未満の粒子までの、徐々に進行するサイズダウンを生じる。ホモジナイゼーションは、剪断エネルギーに依存して大きい粒子をより小さいものへ断片化する、もう１つの方法である。典型的なホモジナイゼーション法では、粒子は、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して、選択された粒子サイズ、典型的には約６０ないし８０ｎｍが観察されるまで再循環される。双方の方法においては、粒子サイズの分布を、通常のレーザービーム粒子サイズ識別法、又はＱＥＬＳによりモニターし得る。
本明細書において粒子の「サイズ」が記載される場合、例えば、通常のレーザービーム粒子サイズ識別法、又はＱＥＬＳにより測定された、粒子の分布の平均サイズを記載している。したがって、５０ｎｍないし１５０ｎｍのサイズを有する粒子は、例えば、通常のレーザービーム粒子サイズ識別法、又はＱＥＬＳにより測定された、平均サイズ５０ｍｍないし１５０ｎｍを有するタイプの粒子の集合体を指す。好ましくは、分布の標準偏差は、分布の平均サイズの５０％未満、さらに好ましくは３０％未満、及び、なおさらに好ましくは１０％未満である。
細孔をもつポリカーボネート膜、又は非対称セラミック膜を通した粒子の押出しもまた、比較的充分に規定されたサイズ分布まで粒子サイズを低減するのに有効である。典型的には、懸濁液を、所望の粒子サイズ分布を達成するまで１回以上、膜を通して循環する。粒子を、より孔の小さい膜を連続的に通して押出して、段階的なサイズ減少を実現してもよい。
製剤ｓｉＮＡ組成物−ＣＰＬ（ＣＰＬ−含有性の製剤ｓｉＮＡ組成物）を作成するための多様な一般法が、本明細書に議論されている。２つの一般的な技術は、「ポスト・インサーション」技術、すなわち、例えば、予め製剤ｓｉＮＡ組成物内へのＣＰＬのインサーションと、ＣＰＬが例えば、製剤ｓｉＮＡ組成物形成の工程の間に脂質混合物中に包含される、「標準的」技術とを包含する。ポスト・インサーション技術は、結果として、製剤ｓｉＮＡ組成物二重膜の主として外表面にＣＰＬを有している、製剤ｓｉＮＡ組成物を生ずるのに対し、標準的技術は、内外両表面にＣＰＬを有している、製剤ｓｉＮＡ組成物を得る。
特に、「ポスト・インサーション」は、製剤ｓｉＮＡ組成物（任意の方法による）を形成すること、及び予め形成された、製剤ｓｉＮＡ組成物を、ＣＰＬの存在下に適当な条件下で（好ましくは、６０℃で２ないし３時間）インキュベートすることを包含する。ＣＰＬの６０ないし８０％を、レシピエントベシクルの外側のリーフレット中にインサートして、約５ないし１０ｍｏｌ％（全脂質に比較して）までの最終濃度を得ることができる。この方法は、リン脂質（これは、コレステロールを含有し得る）から製造されたベシクルに、またＰＥＧ−脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＧ）を含有するベシクルにも特に有用である。
「標準的」技術の一例においては、本発明のＣＰＬ−製剤ｓｉＮＡ組成物は、押出しにより形成し得る。この実施態様においては、ＣＰＬを含む全ての脂質を、クロロホルム中に同時溶解し、次にクロロホルムを、窒素下に、続いて高真空下に除去する。脂質混合物を適当な緩衝液中で水和し、孔サイズ１００ｎｍの２つのポリカーボネートフィルターを通して押出す。得られた製剤ｓｉＮＡ組成物は、内外両表面にＣＰＬを含有する。なお別の標準的技術においては、ＣＰＬ−製剤ｓｉＮＡ組成物の形成は、界面活性剤透析法、又はエタノール透析法を用いて、例えば、米国特許第５，９７６，５６７及び５，９８１，５０１号（これらの双方は、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に議論されたように達成し得る。
本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物は、単独で、又は、投与の経路及び標準的薬学のプラクティスに従って選択された生理学的に許容される担体（例えば、生理食塩水又はリン酸緩衝液）と混合して投与し得る。一般には、通常の食塩水が、薬学的に許容される担体として用いられるであろう。他の適当な担体は、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、及びその他、安定性を増強するための糖タンパク質を含め、例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンその他を包含する。
薬学的担体は、一般に、製剤ｓｉＮＡ組成物形成に続いて添加される。したがって、製剤ｓｉＮＡ組成物が形成した後、製剤ＳｉＮＡ組成物を薬学的に許容される担体、例えば通常の食塩水中に希釈してよい。
医薬製剤中の製剤ｓｉＮＡ組成物の濃度は、幅広く、すなわち、重量で約０．０５％未満、又は少なくとも約２ないし５％から、１０ないし３０％までも変動可能であり、選択された特定の投与様式に従って、主として液体体積、粘性、その他により選択できる。例えば、濃度を増して、治療に伴う液体負荷を低減することができる。このことは、アテローム性動脈硬化症に随伴する鬱血性心不全、又は重症高血圧症をもつ患者において特に望ましい。別法として、刺激性の脂質からなる製剤ｓｉＮＡ組成物を低濃度に希釈して、投与部位における炎症を和らげることができる。
上記記載のように、本発明の製剤ｓｉＮＡ組成物は、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートを含んでなる。しばしば他の、ＤＡＧ−ＰＥＧコンジュゲートと類似の様式で作用するもの、及び、粒子凝集を防止して、循環中の存続時間を増すため、及び標的組織への製剤ｓｉＮＡ組成物の送達を増すための手段を提供するのに役立つ成分を包含することが望ましい。かかる成分は、制限されないが、粒子に対する、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ−セラミド又はＰＥＧ−リン脂質（例えば、ＰＥＧ−ＰＥ）、ガングリオシドＧＭ１−修飾脂質、又は，ＡＴＴＡ−脂質である。典型的には、粒子中の該成分の濃度は、約１ないし２０％、好ましくは約３ないし１０％であろう。
本発明の医薬組成物は、通常の、周知の滅菌技術により滅菌し得る。水溶液は、無菌条件下に、使用に向けてパッケージされるか又は濾過され、凍結乾燥され、凍結乾燥標品は、投与に先立ち、無菌の水溶液と混ぜ合わされる。該組成物は、必要であれば、生理的条件に近づけるべく、薬学的に許容される助剤、例えば、ｐＨ調整及び緩衝剤、張度調整剤、及びその他、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウムを含有し得る。さらに、粒子懸濁液は、貯蔵時のフリーラジカル及び脂質−過酸化性の破壊に対し、脂質を保護する脂質保護剤を包含し得る。親油性のフリーラジカルクエンチ剤、例えば、アルファトコフェロール及び水溶性の鉄特異キレーター、例えばフェリオキサミンが適する。
その使用についての別の実施態様では、製剤又は組成物は、制限されないが、ゲル、オイル、エマルジョンなどを包含する、広範囲の局所剤形に取り入れ得る。例えば、製剤又は組成物を含有する懸濁液は、局所用クリーム、ペースト、軟膏、ゲル、ローションなどとして製剤及び投与し得る。
ひとたび形成されれば、本発明の製剤又は組成物は、細胞内への生物活性分子の導入に有用である。したがって、本発明はまた、生物活性分子を細胞内へ導入するための方法も提供する。この方法は、まず、製剤又は組成物を上記記載のように形成すること、及び次に、該製剤又は組成物を、トランスフェクションが起こるのに充分な時間、細胞と接触させることにより、インビトロ又はインビボにおいて行なわれる。
本発明の製剤又は組成物は、それらと共に混合又は接触された、殆どの任意の細胞タイプに吸着され得る。ひとたび吸着されれば、製剤は、細胞の一部によりエンドサイトーシスされるか、細胞膜と脂質交換するか、又は細胞と融合することのいずれかが可能である。製剤の生物活性分子部分の輸送又は取込みは、これらの経路のうちの任意の１つによって起こりうる。特に、融合が起こる場合には、粒子の膜は細胞膜にインテグレートされ、そして該粒子の内容物、すなわち、生物活性分子は細胞内流体、例えば細胞質と混ざり合う。ｐＨ依存性の相転移を受ける血清安定性の製剤又は組成物は、初期エンドソームｐＨ（すなわち、約ｐＨ５．５ないし６．５）において細胞融合を増加させ、粒子の内容物、すなわち、生物活性分子の、細胞への効率的な送達を生じる結果となる。
本発明のエンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを使用して、製剤又は組成物、又は他の脂質ベース担体系の、トランスフェクション効率を最適化し得る。さらに詳細には、ＥＲＰアッセイの目的は、製剤又は組成物の種々のカチオン性脂質及びヘルパー脂質成分の効果を、エンドソーム膜の結合／取込み、又は融合／不安定化に対するそれらの相対効果に基づき識別することである。これらのアッセイは、製剤又は組成物又は他の脂質ベース担体系の各成分が、いかにトランスフェクション効率をもたらすかを、定量的に判定させ、それにより製剤又は組成物又は他の脂質ベース担体系を最適化できるようにする。本明細書に説明したように、エンドソーム放出パラメータ、別名ＥＲＰは、製剤又は組成物の取込み／細胞 で割った、レポーター遺伝子発現／細胞 として定義される。
当業者には、任意のレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、その他）が、このアッセイに使用可能であることが容易に分かるであろう。さらに、脂質成分（又は、別法として、製剤又は組成物の任意の成分）を任意の検出可能な標識物で標識し、細胞内への取込みを阻害又は干渉する。本発明のＥＲＰアッセイを使用して、当業者は、種々の脂質成分（例えば、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ−脂質誘導体、ＰＥＧ−ＤＡＧコンジュゲート、ＡＴＴＡ−脂質誘導体、カルシウム、ＣＰＬ、コレステロール、その他）の、細胞取込み及びトランスフェクション効率に対する強い影響を評価し、それにより製剤ｓｉＮＡ組成物を最適化することができる。ＥＲＰを、種々の製剤又は組成物の各成分について比較することにより、最適化された系、例えば、最大のトランスフェクション効率と対になった、最大の細胞取込みを有する製剤又は組成物を容易に判定し得る。
本発明のＥＲＰアッセイを行うために適当な標識は、制限されないが、スペクトル標識、例えば、蛍光色素（例えば、フルオレセイン及び誘導体、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）及びオレゴン・グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）９；ローダミン及び誘導体、例えばテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）、イソチオシアン酸テトラローダミン（ＴＲＩＴＣ）、その他、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓ、など；放射性標識、例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、その他；酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、その他；スペクトル比色標識、例えば、金コロイド、又は着色ガラス又はプラスチックビーズ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、その他を包含する。標識は、当該技術分野において周知の方法を用いて、製剤又は組成物の成分に対し、直接又は間接的に結合し得る。上記に示したように、必要な感度、製剤ｓｉＮＡ組成物とのコンジュゲートの容易さ、安定性の要求条件、及び利用可能な機械装備及び廃棄設備に依存して標識を選択することにより、広く多様な標識を使用できる。
さらに、製剤又は組成物、又は他の脂質ベース担体系のトランスフェクション効率は、血清中の組成物の安定性を測定することにより、及び／又は、製剤又は組成物のｐＨ依存性の相転移を測定することにより判定可能であり、これにおいて、製剤又は組成物が血清中で安定であることの判定、及び製剤又は組成物が約ｐＨ５．５ないし６．５における相転移を受けることの判定が、製剤又は組成物が増大されたトランスフェクション効率をもつこととなると示している。製剤又は組成物の血清安定性は、例えば、血清中で組成物の相対濁度を測定するアッセイを用いて、血清中の組成物の濁度が、ある時間にわたり一定のままであることを判定することにより測定し得る。製剤又は組成物のｐＨ依存性相転移は、組成物の相対濁度を、一定時間にわたり種々のｐＨにおいて測定するアッセイを用いて、ｐＨが生理的ｐＨからずれた場合に濁度が変化することを判定することにより、測定可能である。
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基、糖、及び／又はホスフェイト）を有する化学修飾された核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）は、血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ、そのことがその効力を増大し得る（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｅｎ，１９９２， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎら、国際公開第ＷＯ９３／１５１８７号；及びＲｏｓｓｉら、国際公開第ＷＯ９１／０３１６２号；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄら、米国特許第６，３００，０７４号；及びＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，上記、（これらの全ては、参考として本明細書に含まれる）を参照）。上記の参考文献は全て、本明細書に記載された核酸分子の塩基、ホスフェイト、及び／又は糖成分に対し行ない得る種々の化学修飾を記載している。細胞におけるその効力を増強する修飾、及び、オリゴヌクレオチドの合成時間を短縮しかつ必要な化学物質を低減するための、核酸成分からの塩基の除去が望ましい。
当該技術分野においては、核酸分子中に導入されてそのヌクレアーゼ安定性及び効力を有意に増強し得る、糖、塩基、及びホスフェイト修飾を記載しているいくつかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈによる修飾、ヌクレオチド塩基修飾により、安定性を増強し、及び／又は生物活性を増強するべく修飾される（総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ．１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は、当該技術分野において幅広く記載されてきた（Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９３／１５１８７号；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号、及びＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２６２７０号、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第５，７１６，８２４号、Ｕｓｍａｎら、米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／１３５２６号、Ｔｈｏｍｏｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８年４月２０日出願の、ＵＳＳＮ６０／０８２，４０４；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；及びＢｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０、（これらの参考文献は全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）を参照）。これらの刊行物は、触媒作用を調製することなく、糖、塩基、及び／又はホスフェイト修飾などを核酸分子中に取込む位置を決定するための、一般的な方法及び戦略を記載しており、参考として本明細書に含まれる。かかる教示を考慮すれば、ｓｉＮＡが細胞内のＲＮＡｉを促進する能力が有意に阻害されない限り、本明細書に記載のように同様の修飾を用いて、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、及び／又は５’−メチルホスホナート結合による、オリゴヌクレオチドのインターヌクレオチド結合の化学的修飾は、安定性を改善する一方、過剰な修飾は、多少の毒性又は活性の低下を引き起こし得る。それ故、核酸分子の設計においては、これらのインターヌクレオチド結合の量を最小にするべきである。これらの結合の濃度の低減は、毒性を低下させ、結果としてこられの分子の効力を高め、かつ特異性を高くするはずである。
活性を維持又は増強する化学修飾を有するポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）が提供される。かかる核酸はまた、一般に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼに対する耐性が高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボの活性は、有意に低下しないはずである。調節が目標である場合、外来的に送達された治療用核酸分子は、最適には、望ましくないタンパク質のレベルを低減するべく充分長く標的ＲＮＡの翻訳を調節するまで、細胞内に安定しているべきである。この時間は、疾患の状態に依存して、数時間から数日間まで様々である。ＲＮＡ及びＤＮＡの化学合成における改善（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９（参考として本明細書に含まれる））により、上記記載のように、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強することにより、核酸分子を修飾する能力が拡大された。
１つの実施態様においては、本発明の核酸分子は、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）のＧ−クランプヌクレオチドを包含する。Ｇ−クランプヌクレオチドは、修飾されたシトシン類似体であり、これにおいて、修飾は、二重鎖内の相補的グアニンのワトソン・クリック及びフーグスティーン面の双方に水素結合能を与える（例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照）。オリゴヌクレオチド中の単一のＧ−クランプ類似体置換は、相補的オリゴヌクレオチドに対しハイブリダイズした場合、結果として、らせんの、熱安定性及びミスマッチ識別性の実質的な増強を生じ得る。本発明の核酸分子中にかかるヌクレオチドを包含することにより、核酸標的、相補的配列、又は鋳型鎖に対し、親和性及び特異性の双方の増強を生じる結果となる。別の実施態様においては、本発明の核酸分子は、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）のＬＮＡ「ロック核酸」ヌクレオチド、例えば、２’、４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを包含する（例えば、Ｗｅｎｇｅｌら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ００／６６６０４及びＷＯ ９９／１４２２６号を参照）。
別の実施態様においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲート及び／又は複合体を特徴とする。かかるコンジュゲート及び／又は複合体を用いて、生体系、例えば細胞内へのｓｉＮＡ分子の送達を促進することができる。本発明により提供されるコンジュゲート及び複合体は、細胞膜を横切って治療用化合物を輸送し、薬物動態を変更し、及び／又は本発明の核酸分子の局在化を調節することにより、治療的活性を与えることができる。本発明は、制限なく、低分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負に帯電したポリマー、及び他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、又はポリアミンを含め、分子を、細胞の膜を横切って送達するための、新規なコンジュゲート及び複合体の、設計及び合成を包含する。一般に、記載されたトランスポーターは、個別に、又は多成分系の一部として、分解可能なリンカーを用いるか用いずに使用されるべく設計される。これらの化合物は、血清の存在下又は非存在下での、種々の組織に由来する多くの細胞タイプへの、本発明の核酸分子の送達及び／又は局在化を、改善することが予想される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ａｎｄ Ｃｅｃｈ、米国特許第５，８５４，０３８号参照）。本明細書に記載の分子のコンジュゲートは、生物分解性であるリンカー、例えば、生物分解性核酸リンカー分子を介して、生物活性分子に対し結合し得る。
用語「生分解性リンカー」は、本明細書で用いる場合、１つの分子を別の分子に、例えば、生物活性分子を本発明のｓｉＮＡ分子に、又は、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス及びアンチセンス鎖を結合するための生分解性リンカーとして設計されている核酸又は非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、特定の目的、例えば、特定の組織又は細胞タイプへの送達用にその安定性を調節することができるよう設計される。核酸ベースの生分解性リンカー分子の安定性は、種々の化学、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び化学修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、及び、他の２’−修飾又は塩基修飾されたヌクレオチドの組合せ、を用いることにより調節可能である。生分解性核酸リンカー分子は、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はより長い核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであってよく、或いはリンをベースとする結合、例えば、ホスホルアミダート、又はホスホジエステル結合をもつ単一のヌクレオチドを含んでなってもよい。生分解性核酸リンカー分子はまた、核酸骨格、核酸糖、又は核酸塩基修飾を含んでなることも可能である。
用語「生分解性」は、本明細書で用いる場合、生体系における分解、例えば、酵素的分解又は化学的分解を指す。
用語「リン脂質」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つの含リン基を含んでなる疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基と飽和又は不飽和アルキル基とを含んでなり、任意で、ＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、又は置換又は未置換のアリール基で置換されていてもよい。
外来的に送達された治療用核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）は、最適には、ＲＮＡの逆転写が該ＲＮＡの転写物のレベルを低減するべく充分に長く調節されるまで、細胞内に安定している。核酸分子は、有効な細胞内治療剤として機能するためには、ヌクレアーゼに耐性である。本発明において、及び当該技術分野において記載された核酸分子の化学合成における改善は、上記記載のように、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強することにより、核酸分子を修飾する能力を拡大させてきた。
さらに別の実施態様においては、ＲＮＡｉに関与するタンパク質の酵素活性を維持又は増強する化学修飾を有するｓｉＮＡ分子が提供される。かかる核酸はまた、一般に、未修飾の核酸よりもヌクレアーゼに対しより抵抗性である。したがって、インビトロ及び／又はインビボにおいて、活性は有意に低下されないはずである。
本発明の核酸ベースの分子の使用は、併用療法の可能性を提供することにより、よりよい治療をもたらすであろう（例えば、異なる遺伝子に対し標的化した多数のｓｉＮＡ分子；既知の低分子モジュレーターに結合した核酸分子；又は、異なるモチーフ及び／又は他の化学的又は生物学的分子を含む、分子の組合せによる間欠的治療）。
別の態様においては、本発明のポリヌクレオチド分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）は、１つ以上の５’及び／又は３’キャップ構造を、例えば、センスｓｉＮＡ鎖のみに、アンチセンスｓｉＮＡ鎖のみ、又は双方のｓｉＮＡ鎖に含んでなる。
「キャップ構造」により、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端において組込まれている化学修飾が意味される（例えば、Ａｄａｍｉｃら、米国特許第５，９９８，２０３号（参考として本明細書に含まれる））。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、かつ、送達及び／又は細胞内局在化を助けてもよい。キャップは、５’末端（５’−キャップ）又は３’末端（３’−キャップ）に存在してもよく、或いは双方の末端に存在してもよい。非限定的例では、５’−キャップは、制限なく、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（成分）；４’、５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’、４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；３’−３’−反転ヌクレオチド成分；３’−３’−反転脱塩基成分；３’−２’−反転ヌクレオチド成分；３’−２’−反転脱塩基成分；１，４−ブタンジオールホスフェイト；３’−ホスホルアミダート；ヘキシルホスフェイト；アミノヘキシルホスフェイト；３’−ホスフェイト；３’−ホスホロチオアート；ホスホロジチオアート、又は架橋又は非架橋メチルホスホナート成分を包含する。
非限定的例では、３’−キャップは、制限なく、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（成分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェイト；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェイト；３−アミノプロピルホスフェイト；６−アミノヘキシルホスフェイト；１，２−アミノドデシルホスフェイト；ヒドロキシプロピルホスフェイト；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド：修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転脱塩基成分；５’−ホスホルアミダート；５’−ホスホロチオアート；１，４−ブタンジオールホスフェイト；５’−アミノ；架橋又は非架橋５’−ホスホルアミダート、ホスホロチオアート及び／又はホスホロジチオアート、架橋又は非架橋メチルホスホナート、及び５’−メルカプト成分を包含する（さらに詳細には、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５；（参考として本明細書に含まれる）を参照）。
用語「非ヌクレオチド」により、１個以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖中に導入可能であって、糖又はホスフェイト置換のいずれかを包含しており、かつ残りの塩基がその酵素活性を示すことができるようにする、任意の基又は化合物が意味される。該基又は化合物は、一般に認識されたヌクレオチド塩基、例えば、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミンを含有せず、それ故１’−位に塩基を欠くという点で脱塩基である。
「アルキル基」は、直鎖、分枝鎖、及び環状アルキル基を包含する、飽和脂肪族炭化水素を指す。好ましくは、及び特に反対に述べられない限り、アルキル基は、１ないし１２個の炭素を有する。さらに好ましくは、これは、１ないし７個の炭素、より好ましくは１ないし４個の炭素をからなる低級アルキルである。アルキル基は、置換されているか、又は未置換でもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２又はＮ（ＣＨ３）２、アミノ、又はＳＨである。この用語はまた、直鎖、分枝鎖、及び環式基を含め、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する不飽和炭化水素基であるアルケニル基も包含する。好ましくは、アルケニル基は、１ないし１２個の炭素を含有する。さらに好ましくは、これは、１ないし７個の炭素、より好ましくは１ないし４個の炭素をからなる低級アルキルである。アルケニル基は、置換されているか、又は未置換でもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ３）２、アミノ、又はＳＨである。用語「アルキル」はまた、直鎖、分枝鎖、及び環式基を含め、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する不飽和炭化水素基であるアルキニル基も包含する。好ましくは、アルキニル基は、１ないし１２個の炭素を含有する。さらに好ましくは、これは、１ないし７個の炭素、より好ましくは１ないし４個の炭素をからなる低級アルキルである。アルキニル基は、置換されているか、又は未置換でもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２又はＮ（ＣＨ３）２、アミノ、又はＳＨである。
かかるアルキル基はまた、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド、及びエステル基を包含し得る。「アリール」基は、共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有している芳香族基を指し、炭素環式アリール、複素環式アリール、及びビアリール基を包含し、これらは全て、任意で置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアミノ基である。「アルキルアリール」基は、アリール基（上記記載）に共有結合したアルキル基（上記記載）を指す。炭素環式アリール基は、芳香族環の環原子が全て炭素原子である基である。炭素原子は、任意で置換されていてもよい。複素環式アリール基は、１ないし３個のヘテロ原子を芳香族環中の環原子として有し、残りの環原子が炭素原子である基である。適当な複素原子は、酸素、硫黄、及び窒素を包含し、かつ、フラニル、チエニル、ビリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルなどを包含し、全てが任意で置換されていてもよい。「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ−ＮＨ−Ｒ［式中、Ｒは、アルキル、アリール、アルキルアリール、又は水素のいずれかである］を指す。「エステル」は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’［式中、Ｒは、アルキル、アリール、アルキルアリール、又は水素のいずれかである］を指す。
本明細書において使用される「ヌクレオチド」により、当該技術分野においては、天然塩基（標準的な）、及び、当該技術分野において周知の修飾塩基を包含することが認識される。かかる塩基は、一般に、ヌクレオチド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に、塩基、糖、及びリン酸基を含んでなる。ヌクレオチドは、糖、ホスフェイト、及び／又は塩基成分において、未修飾か、又は修飾されていてもよい（区別なく、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準的ヌクレオチドなどとも呼ばれる；例えば、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上記；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ、上記（これらは全て、参考として本明細書に含まれる）を参照）。Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３により要約されたような、当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例がある。核酸分子中に導入し得る塩基修飾のいくつかの非限定的例は、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、及びその他を包含する（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ，上記）。この観点において、「修飾塩基」により、１’位における、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシル以外のヌクレオチド塩基、又はそれらの同等物が意味される。
１つの実施態様においては、本発明は、１つ以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミダートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホナート、スルホンアミド、スルファマート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及び／又はアルキルシリル置換を含んでなる、リン酸骨格修飾をもつ、修飾されたポリヌクレオチド分子（例えば、ｓｉＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ阻害剤、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、２−５Ａ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、又は他の核酸分子）を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の総説については、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７、及びＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照。
「脱塩基」により、塩基を欠くか、又は、１’位において塩基の代わりに他の化学基を有している糖成分が意味される（例えば、Ａｄａｍｉｃら、米国特許第５，９９８，２０３号参照）。
「未修飾ヌクレオシド」により、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した、塩基、アデニン、シトシン、グアニン、チミンン、又はウラシルうちの１つが意味される。
「修飾ヌクレオシド」により、未修飾のヌクレオチドの塩基、糖、及び／又はホスフェイトの化学構造中に修飾を含有する任意のヌクレオチド塩基が意味される。修飾ヌクレオチドの非限定的例は、式ＩないしＶＩＩ、及び／又は本明細書に記載の他の修飾によって示される。
本発明に記載された２’−修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」により、２’−ＮＨ２又は２’−Ｏ−ＮＨ２が意味され、これは修飾又は未修飾でよい。かかる修飾塩基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、米国特許第５，６７２，６９５号、及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら、米国特許第６，２４８，８７８号（これら双方は、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載されている。
核酸ｓｉＮＡ構造に対する種々の修飾を、これらの分子の有用性を高めるべく作成し得る。かかる修飾は、保存寿命、インビトロでの半減期、安定性、及び標的部位に対するかかるオリゴヌクレオチドの導入の容易さを向上させて、例えば、細胞膜の透過を高め、標的細胞を認識及び結合する能力を与えることができる。
「コレステロール誘導体」により、その付加、置換、及び／又は欠失を含む、本質的にコレステロール構造からなる任意の化合物が意味される。本明細書の用語、コレステロール誘導体はまた、当該技術分野において一般に認められている、ステロイドホルモン及び胆汁酸も包含する。
製剤ｓｉＮＡ組成物の投与
本発明の製剤又は組成物は、単独で、又は他の療法と組合せて、細胞又は組織における標的遺伝子発現のレベルに関連づけられるか又は応答するであろう、任意の形質、疾患、又は症状を、防止するか、阻害するか、又は低減するべく適合可能である。
１つの実施態様においては、製剤又は組成物は、当業者に既知の多様な方法により、細胞に投与可能であり、制限なく、注射によるか、イオン導入法によるか、又は、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリンといった、他のビヒクル中への取込みによる方法を包含する（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ０３／４７５１８及び、ＷＯ ０３／４６１８５号を参照）。１つの実施態様においては、本発明の製剤又は組成物は、膜破壊剤、例えば、米国特許出願公開第２００１０００７６６６号（図面を含め、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載されたものと複合体形成される。別の実施態様においては、膜破壊剤（単数又は複数）及び生物活性分子はまた、カチオン性脂質又はヘルパー脂質分子、例えば、米国特許第６，２３５，３１０号（図面を含め、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載された脂質と複合体形成される。
１つの実施態様においては、本発明の送達系は、例えば、水性及び非水性ゲル、クリーム、マルチプルエマルジョン、マイクロエマルジョン、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、ハイドロカーボンベース、及び粉末を包含し、かつ、賦形剤、例えば、可溶化剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、及びアミノ酸）、及び疎水性ポリマー（例えば、ポリカーボフィル、及びポリビニルピロリドン）を含有し得る。１つの実施態様においては、薬学的に許容される担体は、経皮増強剤である。
１つの実施態様においては、本発明の送達系は、パッチ、タブレット、坐剤、ペッサリー、ゲル、及びクリームを包含し、かつ、賦形剤、例えば、可溶化剤及び増強剤（例えば、ポリエチレングリコール、胆汁酸塩、及びアミノ酸）、及び他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及び誘導体、及び疎水性ポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒアルロン酸）を含有し得る。
１つの実施態様においては、本発明は、本発明の１つ以上の製剤されたｓｉＮＡ組成物を、許容される担体、例えば、安定剤、緩衝剤などの中に含んでなる、医薬組成物を特徴とする。本発明の製剤又は組成物は、任意の標準的な手段により、医薬組成物を形成するための、安定剤、緩衝剤などを用いるか用いずに、患者に投与及び導入することができる。本発明の組成物はまた、クリーム、ゲル、スプレー、オイル、及び他の、当該技術分野において既知の、局所、皮膚、又は経皮投与に適した組成物として、製剤及び使用可能である。
１つの実施態様においては、本発明はまた、記載された化合物の薬学的に許容される製剤も包含する。これらの製剤は、上記化合物の塩、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸、及びベンゼンスルホン酸の塩を包含する。
医薬組成物又は製剤は、投与、例えば、細胞又は患者（例えばヒトを含む）内への、全身又は局所投与に適した形態の組成物又は製剤を指す。適当な形態は、部分的に、用途又は、例えば、経口、経皮、又は注射による侵入経路に依存する。かかる形態は、製剤又は組成物が標的細胞（すなわち、そこへのｓｉＮＡの送達が望まれる細胞）に到達するのを妨げるべきではない。例えば、血流中に注射された医薬組成物は、可溶性であるべきである。他の因子は、当該技術分野において既知であり、製剤又は組成物がその作用を及ぼすのを妨げる毒性及び形態といった考慮すべき事項を包含する。
１つの実施態様においては、本発明の製剤又は組成物は、薬学的に許容される組成物又は製剤において、全身投与により患者に投与される。「全身投与」により、インビボの全身的吸収、又は血流中への薬物の蓄積とそれに続く全身にわたる分布が意味される。全身的吸収をもたらす投与経路は、制限なく：静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、及び筋肉内を包含する。これらの投与経路の各々は、本発明のｓｉＮＡ分子を、アクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に侵入する速度は、分子量又はサイズの関数であることが示されてきた。
「薬学的に許容される製剤」又は「薬学的に許容される組成物」により、本発明の製剤分子Ａ組成物を、その所望の活性に最も適した物理学的位置において有効に分布させることができる組成物又は製剤が意味される。本発明の製剤又は組成物を用いた製剤に適する薬剤の非限定的例は：Ｐ−糖タンパク質阻害剤（例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｐ８５）、生分解性ポリマー、例えば、徐放送達用のポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）；及び負荷されたナノ粒子、例えばポリブチルシアノアクリラートから製されたものを包含する。本発明の核酸分子の送達戦略の、他の非限定的例は、Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；及びＴｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載されている物質を包含する。
本発明はまた、薬学的に有効な量の所望の化合物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に包含する、貯蔵又は投与用に調製された組成物も包含する。治療的使用のための許容される担体又は希釈剤は、医薬の技術分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）（参考として本明細書に含まれる）に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、染料、及び着香剤を提供することができる。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを包含する。さらに、酸化防止剤及び懸濁化剤が使用可能である。
薬学的に有効な用量は、疾患状態を予防、阻害、又は治療（病状をある程度、好ましくは全ての病状を緩和する）ために必要な用量である。薬学的に有効な用量は、疾患のタイプ、用いる組成物、投与経路、治療される哺乳類の種類、検討されている特定の哺乳類の物理的特性、及び、医学分野の当業者が認識するであろう、他の因子に依存する。一般に、製剤ｓｉＮＡ組成物の効力に依存して、０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量が投与される。
本発明の製剤又は組成物は、通常の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、及び／又はビヒクルを含有する用量単位剤形において、経口的、局所的、非経口的、吸入又はスプレーにより、又は経直腸的に投与可能である。本明細書で用いる用語「非経口的」は、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、又は髄腔内注射、又は輸液技術などを包含する。さらに、本発明の製剤又は組成物と、薬学的に許容される担体とを含んでなる、医薬製剤が提供される。本発明の１つ以上の製剤又は組成物は、１つ以上の非毒性の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバントと、また所望であれば、他の活性成分と一緒に存在することができる。本発明の製剤又は組成物を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形態、例えば、タブレット、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、エマルジョン、硬又は軟カプセル、又は、シロップ又はエリキシルでよい。
経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野において既知の任意の方法により調製可能であり、かかる組成物は、薬学的にエレガントで美味な製品を提供する目的で、１つ以上のかかる甘味剤、着香剤、着色剤、又は保存剤を含有し得る。タブレットは、活性成分を、タブレットの製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム；造粒剤又は崩壊剤、例えば、コーンスターチ、又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、又はアラビアゴム；及び潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクであってよい。タブレットは、コートされていなくてもよく、又は、既知の技術によりコートされていてもよい。ある場合には、既知の技術により、かかるコーティングを調製して、胃腸管内での崩壊及び吸収を遅延させ、それにより、より長時間の持続作用を提供することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリル、又はジステアリン酸グリセリルといった、時間遅延物質が使用可能である。
経口使用のための製剤はまた、活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリンと混合されている、硬ゼラチンカプセルとして、或いは、活性成分が、水又は油状媒体、例えば、ラッカセイ油、流動パラフィン、又はオリーブ油と混合されている、軟カプセルとして提供可能である。
水性懸濁液は、活性成分を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に含有する。かかる賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、及びアラビアゴムであり；分散又は湿潤剤は、天然ホスファチド、例えばレシチン、又は、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又は、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合産物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合産物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンでよい。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤、例えば、エチル、又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート、１つ以上の着色剤、１つ以上の着香剤、及び１つ以上の甘味剤、例えばスクロース、又はサッカリンも含有してよい。
油性懸濁液は、活性成分を、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油又はヤシ油か、又は鉱物油、例えば流動パラフィン中に懸濁することにより製剤してもよい。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコールを含有してもよい。甘味剤、及び着香剤は、美味な経口用製剤を提供するために添加し得る。これらの組成物を、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸の添加により保存してもよい。
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、活性成分を、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤、及び１つ以上の保存剤との混合物中に提供する。適当な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁化剤は、上記のすでに列挙されたものに例示される。付加的な賦形剤、例えば、甘味剤、着香剤、及び着色剤もまた存在してよい。
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形状であってもよい。油性相は、
植物油、鉱物油、又はこれらの混合物でよい。適当な乳化剤は、天然ゴム、例えば、アラビアゴム、又はトラガカントゴム、天然ホスファチド、例えばダイズ、レシチン、及び、脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導されるエステル又は部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、及び、前記部分エステルと、エチレンオキシドとの縮合産物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンでよい。エマルジョンはまた、甘味、及び着香剤を含有してもよい。
シロップ及びエリキシルは、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はスクロースを用いて製剤してもよい。かかる製剤はまた、粘滑剤、保存剤、着香剤及び着色剤を含有してもよい。医薬組成物はまた、無菌の注射用の水性又は油性の懸濁液であってもよい。この懸濁液は、上述の適当な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁化剤を用いて、当該技術分野において知られるように製剤し得る。無菌の注射用製品はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の、無菌の注射用溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒は、なかんずく、水、リンガー液、及び等張の塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定油が、溶媒又は懸濁媒体として便利に使用される。この目的のためには、合成モノ−又はジグリセリドを含め、任意の無刺激性の固定油を使用し得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を、注射用の製品において使用する。
本発明の製剤又は組成物はまた、例えば、薬剤の直腸投与用に、坐剤の形態で投与し得る。これらの組成物は、薬剤を、常温では固定であるが直腸温度では液体であり、それ故直腸内では融解して薬物を放出することができる、適当な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製し得る。かかる物質は、カカオバター、及びポリエチレングリコールを包含する。
本発明の製剤又は組成物は、無菌の媒体中で、非経口的に投与し得る。薬剤は、用いるビヒクル及び濃度に依存して、ビヒクル中に懸濁されるか、又は溶解されていてもよい。有利なことに、局所麻酔剤、保存剤、及び緩衝剤といったアジュバントを、ビヒクル中に溶解することができる。
上記に示した症状の治療においては、キログラム体重当たり、１日当たり、約０．１ｍｇないし約１４０ｍｇのオーダーの投与量レベルが有用である（患者当たり、１日当たり、約０．５ｍｇないし約７ｇ）。担体物質と組合せて単一の剤形を生成しうる活性成分の量は、治療される宿主及び特定の投与様式に依存して異なる。単位剤形は、一般に、約１ｍｇないし約５００ｍｇの活性成分を含有する。
任意の特定の患者のための特定の用量レベルは、用いた特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、及び排出速度、薬剤の併用、及び治療を受けている特定の疾患の重さを含む、種々の因子に依存することが理解される。
非ヒト動物に投与するためには、組成物はまた、動物飼料又は飲料水に添加してもよい。動物が治療上適切な量の組成物を飼料と一緒に摂取するよう、動物飼料及び飲料水組成物を配合することが便利であってよい。組成物を、飼料又は飲料水に添加するためのプレミックスとして提供することもまた便利であってよい。
本発明の製剤又は組成物はまた、他の治療用化合物と組合せて、患者に投与して、全体的な治療効果を高めることもできる。１つの適応症を治療するために、多数の化合物を用いて、副作用の存在を低減しながら、薬効を増大することができる。
実施例１：任意のＲＮＡ配列中の潜在的なｓｉＮＡ標的部位の同定
興味のあるＲＮＡ標的、例えば、ウイルス又はヒトのｍＲＮＡ転写物（例えば、本明細書においてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって言及した任意の配列）を、例えば、コンピュータフォールディングアルゴリズムを使用することにより、標的部位についてスクリーンする。非限定的例では、データベース、例えばＧｅｎｂａｎｋ由来の遺伝子又はＲＮＡ遺伝子転写物の配列を使用して、標的に対し相補性を有するｓｉＮＡ標的を生成する。かかる配列は、データベースから入手可能であるか、又は当該技術分野において知られるように実験的に判定し得る。既知の標的部位、例えば、リボザイム又はアンチセンスといった他の核酸分子を用いた研究に基づき有効な標的部位と判定された標的部位、又は、突然変異又は欠失を含有する部位のような、疾患、形質、又は症状に関連することが知られている標的を用いて、これらの部位を標的化するｓｉＮＡ分子を設計することができる。種々のパラメータを使用して、標的ＲＮＡ配列中のどの部位が最適の標的部位であるかを判定することができる。これらのパラメータは、制限なく、二次又は三次のＲＮＡ構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の種々の領域間の相同性の程度、又はＲＮＡ転写物内の標的配列の相対的位置を包含する。これらの判定に基づき、ＲＮＡ転写物内の任意の数の標的部位を選んで、効力について、例えば、インビトロのＲＮＡ切断アッセイ、細胞培養、又は動物モデルを用いることにより、ｓｉＮＡ分子をスクリーンすることができる。非限定的例では、使用されるべきｓｉＮＡコンストラクトのサイズに基づき、１ないし１０００個の標的部位が、転写物内のどこからでも選ばれる。当該技術分野において既知の方法、例えば、標的遺伝子発現の効率的な低減を判定するためのマルチウエル又はマルチプレートアッセイを用いて、ｓｉＮＡ分子をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。
実施例２：ＲＮＡにおけるｓｉＮＡ分子標的部位の選択
以下の非限定的工程を用いて、所与の遺伝子配列又は転写物を標的化するｓｉＮＡの選択を行うことができる。
１．標的配列を、インシリコで解析して、標的配列内に含有される特定の長さ、例えば２３ヌクレオチドフラグメントの、全フラグメントまたはサブ配列のリストとする。この工程は、典型的には、特注のＰｅｒｌスクリプトを用いて行うが、Ｏｌｉｇｏ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、又はＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅといった、市販の配列分析プログラムも同様に使用し得る。
２．ある場合には、ｓｉＮＡは２つ以上の標的配列に対応する；これらは、例えば、同じ遺伝子内の異なる転写物を標的化するか、２つ以上の遺伝子の異なる転写物を標的化するか、又はヒト遺伝子及び動物ホモログの双方を標的化する場合であろう。この場合、特定の長さのサブ配列リストを各標的について生成し、次いで、リストを比較してマッチング配列を各リスト中に検出する。サブ配列を次に、所与の配列を含有する標的配列の数に従ってランク付けする；この目的は、標的配列の殆ど又は全てに存在するサブ配列を検出することである。或いはまた、ランク付けにより、標的配列に固有のサブ配列、例えば突然変異標的配列を同定し得る。かかるアプローチは、突然変異配列を特異的に標的化し、かつ正常配列の発現には影響を及ぼさないｓｉＮＡの使用を可能にするであろう。
３．ある場合には、ｓｉＮＡサブ配列は、所望の標的配列中に存在しながら、１つ以上の配列中には不在である；これらは、ｓｉＮＡが、標的化されずに残るべきパラロガス（ｐａｒａｌｏｇｏｕｓ）ファミリーメンバーをもつ遺伝子を標的化している場合であろう。上記２の場合のように、各標的について特定の長さのサブ配列リストを生成し、次にリストを比較して、標的遺伝子には存在するが、標的化されないパラログには存在しない配列を検出する。
４．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列を、さらに分析し、ＧＣ含有量に従ってランク付けする。３０ないし７０％ＧＣ含有部位を優先することができ、４０ないし６０％ＧＣ含有部位をさらに優先することができる。
５．ランク付けされたｓｉＮＡ配列は、自己フォールディング及び内部ヘアピンに従って、さらに分析及びランク付けが可能である。弱い内部フォールディングが好ましい；強いヘアピン構造は、避けるべきである。
６．ランク付けされたｓｉＮＡ配列は、それらが配列中にＧＧＧ又はＣＣＣの連続をもつかどうかに従って、さらに分析及びランク付けが可能である。いずれかの鎖中のＧＧＧ（又はさらに多いＧ）は、オリゴヌクレオチド合成を問題が多いものとし、かつＲＮＡｉ活性を潜在的に妨害し得るため、よりよい配列が利用可能である場合は常に、これを避けるようにする。ＣＣＣは、ＧＧＧをアンチセンス鎖に置くことになるため、標的鎖中で検索する。
７．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列は、それらがジヌクレオチドＵＵ（ウリジジヌクレオチド）を配列の３’末端に、及び／又はＡＡを配列の５’末端にもつかどうか（アンチセンス鎖上に３’ＵＵを生じる）に従って、さらに分析及びランク付けが可能である。これらの配列は、末端ＴＴチミジンジヌクレオチドをもつｓｉＮＡ分子の設計を可能にする。
８．上記記載のサブ配列のランク付けされたリストから、５ないし４個の標的部位を選択する。例えば、２３ヌクレオチドを有するサブ配列においては、選択された各２３−ｍｅｒサブ配列の右側の２１ヌクレオチドを、それ故、ｓｉＮＡ二重鎖の上（センス）鎖用に設計及び合成し、一方、選択された各２３−ｍｅｒサブ配列の左側の２１ヌクレオチドの逆補完物を、それ故、ｓｉＮＡ二重鎖の下（アンチセンス）鎖用に設計及び合成する。末端ＴＴ残基が配列（例えば、パラグラフ７で記載したような）に求められる場合には、それ故、オリゴヌクレオチドの合成に先立ち、センス及びアンチセンス両鎖の２つの３’末端ヌクレオチドをＴＴによって置き換える。
９．ｓｉＮＡ分子を、インビトロ、細胞培養、又は動物モデル系においてスクリーンし、最も活性のあるｓｉＮＡ分子、又は、標的ＲＮＡ配列中の最も好適な標的部位を同定する。
１０．標的核酸配列を選択する場合、他の設計上考慮すべき事項を使用することができる（例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２００４年２月１日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６、及びＵｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７参照）。
別のアプローチにおいては、標的配列に特異的なｓｉＮＡコンストラクトのプールを使用して、標的ＲＮＡを発現する細胞、例えば、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、ヒーラ（ＨｅＬａ）、Ａ５４９、又は２９３Ｔ細胞において、標的部位についてスクリーンする。標的ＲＮＡを発現している細胞を、ｓｉＮＡコンストラクトのプールでトランスフェクトし、標的阻害に関連した表現型を示す細胞を分類する。ｓｉＮＡコンストラクトのプールは、適当なベクター中にインサートされた転写カセットから発現可能である。ポジティブな表現型変化（例えば、増殖の低下、標的ｍＲＮＡレベルの低下、又は標的タンパク質発現の低下）を示している細胞からのｓｉＮＡを、シーケンスして、標的ＲＮＡ配列内の最適の標的部位を判定する。
１つの実施態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を、以下の方法論を用いて選択する。以下のガイドラインに準拠して、本明細書に記載の化学修飾を含有する高活性ｓｉＮＡを予測した。これらのルールは、高活性（標的ｍＲＮＡレベルの＞７５％のノックダウン）及び不活性（標的ｍＲＮＡレベルの＜７５％のノックダウン）ｓｉＮＡの、いくつかの異なる標的に対する比較分析から生じた。全２４２個のｓｉＮＡ配列を分析した。２４２ｓｉＮＡのうちの３５個のｓｉＮＡは、高活性群に、そして残りのｓｉＮＡは、不活性群に分類された。高活性ｓｉＮＡは、ｓｉＮＡ配列内の特定のヌクレオチド位置において、ある塩基について明らかに嗜好性を示した。例えば、Ａ又はＵ核塩基は、高活性ｓｉＮＡのセンス鎖の位置１９において圧倒的に存在し、不活性ｓｉＮＡについはその反対であった。高活性ｓｉＮＡのセンス鎖の、位置１５−１９の間のＡ／Ｕリッチ（５塩基のうち３つをＡ又はＵとする）領域、及び位置１−５の間のＧ／Ｃリッチ領域（５塩基のうち３つをＧ又はＣとする）というパターンもあった。表Ｖに示したように、そのような１２のパターンが同定され、これは高活性ｓｉＮＡに特徴的であった。全てのパターンが高活性ｓｉＮＡの各々に存在するのではないことに注目されるべきである。したがって、高活性ｓｉＮＡを予想するためのアルゴリズムを設計するため、各パターンについて異なるスコアが割り当てられた。高活性ｓｉＮＡ対不活性ｓｉＮＡにおいて、かかるパターンがどの程度頻繁に生じる下に依存して、設計パラメータに最高が１０であるスコアを割り当てた。ある核塩基が１つの位置において好適でない場合、負のスコアを割り当てられる。例えば、センス鎖の位置９及び１３において、Ｇヌクレオチドは高活性ｓｉＮＡにおいて好適ではなかったため、それには−３（マイナス３）のスコアが与えられた。各パターンについてのディファレンシャルスコアが表Ｖに示されている。パターン＃４は、最大スコア−１００が与えられた。これは主として、４Ｇ又は４Ｃの連なりを含有する任意の配列を取り除くためであり、その理由は、それらが合成には極めて不適合であり得て、かつ配列を自己集合させることができ、したがってｓｉＮＡを不活性にするからである。このアルゴリズムを用いると、任意のｓｉＮＡの最大可能スコアは、６６である。妥当なサイズ（〜１０００ヌクレオチド）の、任意の所与の標的に対し、多数の可能なｓｉＮＡ配列があることから、このアルゴリズムは高活性ｓｉＮＡを生成するために有用である。
１つの実施態様においては、表Ｖに示したルール１ないし１１を用いて、本発明の活性ｓｉＮＡ分子を生成する。別の実施態様においては、表Ｖに示したルール１ないし１２を用いて、本発明の活性ｓｉＮＡ分子を生成する。
実施例３：ｓｉＮＡ設計
ｓｉＮＡ標的部位は、上記実施例３に記載されたパラメータを用いて標的ＲＮＡ配列の配列を分析すること、及び任意で、上記実施例３において提示されたルールに基づき、及び代わりに、フォールディング（標的に対するｓｉＮＡのアクセシビリティを判定するために分析された任意の所与の配列の構造）に基づき、標的部位に優先順位を付けることによるか、或いは、実施例３に記載したｓｉＮＡ分子のライブラリを用いることによるか、又は本明細書の実施例６に記載のインビトロｓｉＮＡ系を用いることにより選択した。ｓｉＮＡ分子は、それぞれの標的に結合し得るように設計し、かつ上記のアルゴリズムを用いて選択し、かつ任意で、コンピュータフォールディングにより個別に分析して、ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用できるかどうかを評価した。化学修飾の基準を、本明細書に記載の安定化化学のモチーフに基づき（例えば、表Ｉ参照）、化学修飾されたｓｉＮＡ分子の設計に応用した。種々の長さのｓｉＮＡ分子を選択して、活性を最適化することができる。一般に、標的ＲＮＡに結合するか、又はさもなければそれと相互作用するべく、充分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選択されるが、相補性の程度は、種々の長さ又は塩基組成物のｓｉＮＡ二重鎖に適応するべく調節可能である。かかる方法論を用いることにより、ｓｉＮＡ分子は任意の既知のＲＮＡ配列、例えば、任意の遺伝子転写物に対応するＲＮＡ配列内の部位を標的とするべく設計し得る。
標的ＲＮＡ配列を分析して標的を生成し、そこから二本鎖ｓｉＮＡ及び多機能性分子を設計した。合成ｓｉＮＡコンストラクトを生成するため、実施例３に記載のアルゴリズムを利用して、活性二本鎖コンストラクト及びその化学修飾バージョンを選択した。多機能性ｓｉＮＡは、異なる標的配列間の相同部位（例えば、標的間の、約５ないし約１５ヌクレオチド領域の共有されたホモロジー）を検索すること、及び非標準塩基対（例えば、３個までのゆらぎ塩基対合（Ｇ：Ｕ）又はミスマッチ塩基対（例えば、２個までのミスマッチ）を可能にすることにより、設計される。
化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを、本発明に記載のように設計して、ＲＮＡｉ活性の媒介能を保持しながら、インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性及び／又は改善された薬物動態、局在化、及び送達特性を提供する。本明細書に記載の化学修飾は、本明細書に記載の合成法及び当該技術分野において一般に知られている合成法を用いることにより、合成的に導入される。合成ｓｉＮＡコンストラクトは、次に、血清及び／又は細胞／組織抽出物（例えば、肝臓抽出物）中で、ヌクレアーゼ安定性についてアッセイされる。合成ｓｉＮＡコンストラクトはまた、適当なアッセイ、例えば、本明細書に記載のルシフェラーゼレポーターアッセイ、又はＲＮＡｉ活性を定量化し得る他の適当なアッセイを用いて、ＲＮＡｉ活性についても並行して試験される。ヌクレアーゼ安定性及びＲＮＡｉ活性の双方をもつ合成ｓｉＮＡコンストラクトを、さらに修飾して、安定性及び活性のアッセイにおいて再評価することができる。安定化された活性ｓｉＮＡコンストラクトの化学修飾を、次に、任意の選択されたＲＮＡを標的とする任意のｓｉＮＡ配列に適用して、例えば、標的スクリーニングアッセイにおいて用いて、治療薬開発用のリードｓｉＮＡ組成物を選ぶことができる。
実施例４：ｓｉＮＡの化学合成及び精製
ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば、本明細書に記載のＲＮＡ配列内の標的配列と相互作用するべく設計可能である。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は、上述の標的部位の配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載の方法を用いて、化学合成することができる。コントロール配列として使用される不活性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の配列をスクランブルすることにより合成して、標的配列に相補的でないようにすることができる。一般に、ｓｉＮＡコンストラクトは、本明細書に記載の固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成可能である（例えば、Ｕｓｅｍａｎら、米国特許第５，８０４，６８３；５，８３１，０７１；５，９９８，２０３；６，１１７，６５７；６，３５３，０９８；６，３６２，３２３；６，４３７，１１７；６，４６９，１５８号；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、米国特許第６，１１１，０８６；６，００８，４００；６，１１１，０８６号（これらは全て、その記載全体が参考として本明細書に含まれる）を参照）。
非限定的例においては、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において既知のホスホルアミダイト化学を用いて、段階的な様式で合成される。標準的なホスホルアミダイト化学は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基、及び環外アミン保護基（例えば、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４−アセチルシチジン、及びＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含んでなるヌクレオシドの使用を包含する。或いはまた、Ｓｃａｒｉｎｇｅ（上記）によって記載されたように、２’−Ｏ−シリルエーテルを、酸不安定性２’−Ｏ−オルトエステル保護基と一緒に、ＲＮＡの合成において使用し得る。異なる２’化学は、異なる保護基を必要とし、例えば、Ｕｓｅｍａｎら米国特許第５，６３１，３６０号（参考としてその記載全体が本明細書に含まれる）によって記載されたように、２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドは、Ｎ−フタロイル保護を利用し得る。
固相合成の間に、各ヌクレオチドを順番に（３’−から５’−方向に）、固体支持体結合オリゴヌクレオチドに対し付加する。鎖の３’末端の最初のヌクレオシドを、固体支持体（例えば、調整した多孔質ガラス又はポリスチレン）に対し、種々のリンカーを用いて共有結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイト、及び活性化剤を混ぜ合せ、結果として、第２のヌクレオシドホスホルアミダイトを、第１のヌクレオシドの５’末端上にカップリングさせる。次いで、支持体を洗浄し、そして未反応の５’−ヒドロキシル基を無水酢酸のようなキャッピング試薬でキャップして、不活性の５’−アセチル基を生じる。次いで、３価のリン結合を酸化して、より安定なリン酸結合とする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、適当な条件（例えば、トリチルベース基用には酸性条件、シリルベース基用にはフッ化物）下に、５’−Ｏ−保護基を切断する。このサイクルを、後続の各ヌクレオチドについて繰り返す。
合成条件を修正することにより、例えば、合成されるべきｓｉＮＡの特定の化学組成に依存して、異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度、異なる接触時間、異なる固体支持体及び固体支持体リンカー化学を用いることにより、カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護及び精製は、一般に、Ｕｓｍａｎら、米国特許第５，８３１，０７１号；米国特許第６，３５３，０９８号；米国特許第６，４３７，１１７号；及びＢｅｌｌｏｎら、米国特許第６，０５４，５７６号；米国特許第６，１６２，９０９号；米国特許第６，３０３，７７３号、又はＳｃａｒｉｎｇｅ（上記）（その記載全体が参考として本明細書に含まれる）に記載されたように行ない得る。さらに、脱保護条件を修正して、最大可能な収率及び純度のｓｉＮＡコンストラクトを得ることができる。例えば、本出願人は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドが、不適切な脱保護条件下に分解し得ることを観察した。かかるオリゴヌクレオチドは、水性メチルアミンを用いて、約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチドも含んでなる場合には、水性メチルアミンによる約３５℃において３０分間の脱保護の後、ＴＥＡ−ＨＦを添加して、反応を約６５℃においてさらに１５分間維持する、脱保護されたｓｉＮＡの単鎖を、陰イオン交換により精製して、高い収率を維持しながら、高純度を達成する。ｓｉＮＡ二重鎖分子を形成するためには、単鎖を、食塩水において等しいモル比で混ぜ合わせ、二重鎖を形成する。二重鎖ｓｉＮＡが構築され、凍結乾燥に先立ち、タンジェンシャル濾過により脱塩される。
ｓｉＮＡ組成物の製造
非限定的例では、それぞれのｓｉＮＡ組成物について、２つの個々のｓｉＮＡの相補鎖を、固相合成を用いて別々に合成し、次いで、イオン交換クロマトグラフィーにより個別に精製する。相補鎖をアニールして、二本鎖（二重鎖）を形成する。二重鎖を次に、限外濾過し、そして凍結乾燥して、固体ｓｉＮＡ組成物（例えば、医薬組成物）を形成する。製造プロセスの非限定的例を、表ＶＩの工程系統図に示す。
固相合成
単鎖オリゴヌクレオチドを、自動固相合成装置、例えば、アマーシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ（例えば、Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ又はＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １００ｐｌｕｓ）において、ホスホルアミダイト化学を用いて合成する。調節可能な合成カラムに、第１のヌクレオチド残基で誘導体化した固体支持体を詰める。合成を、酸不安定性の５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基の脱トリチル化によって開始し、５’−ヒドロキシルを放出する。ホスホルアミダイト及び適当な活性化剤をアセトニトリル中で、同時に合成カラムに与え、結果として５’−ヒドロキシルに対するアミダイトのカップリングを生じる。次に、カラムをアセトニトリルで洗浄する。ヨウ素をポンプによりカラムに通して、亜リン酸トリエステル結合Ｐ（ＩＩＩ）を酸化してそのリン酸トリエステルＰ（Ｖ）類似体とする。未反応の５’−ヒドロキシル基を、無水酢酸のような試薬を用いて、２，６−ルチジン及びＮ−メチルイミダゾールの存在下にキャップする。伸長サイクルを、次のホスホルアミダイト取込みのための脱トリチル化によって再開する。このプロセスを、所望の配列が合成されるまで繰返す。合成は、末端ジメトキシトリチル基の除去によって終結する。
切断及び脱保護
合成の完了時に、固体支持体及び結合したオリゴヌクレオチドを濾過用漏斗に移し、真空下に乾燥させ、反応容器に移す。水性塩基を添加し、混合物を加熱して、スクシニル結合の切断、シアノエチルリン酸保護基の除去、及び環外アミン保護の脱保護を成し遂げる。
以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含有しない単鎖に対して行なう：固体支持体を水性塩基で処理した後、混合物を減圧下に濾過して、脱保護された粗合成物質から固体支持体を分離する。次に、固体支持体を水ですすぎ、これを濾液と混ぜ合わせる。得られた塩基性溶液を酸で中和して、粗単鎖の溶液を得る。
以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含有する単鎖に対して行なう：固体支持体を水性塩基で処理した後、混合物を減圧下に濾過して、脱保護された粗合成物質から固体支持体を分離する。次に、固体支持体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ですすぎ、これを濾液と混ぜ合わせる。混合物を冷却し、フッ化物試薬、例えば、トリエチルアミントリヒドロフルオリドを添加し、そして溶液を加熱する。反応を、適当な緩衝液でクエンチして、粗単鎖の溶液を得る。
陰イオン交換精製
それぞれの粗単鎖の溶液を、クロマトグラフィー精製を用いて精製する。生成物を、適当な緩衝液勾配を用いて溶出する。分画を密閉無菌容器に収集し、ＨＰＬＣにより分析し、適当な分画を合わせて生成物のプールを得て、これを、純度（ＨＰＬＣ）、同定（ＨＰＬＣ）、及び濃度（ＵＶ Ａ２６０）について分析する。
アニーリング
生成物のプールの分析に基づき、等モル量（理論的な吸光係数を用いて算定）のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を、反応容器に移す。溶液を混合し、クロマトグラフィー法により二重鎖の純度について分析する。もし分析によってどちらかの鎖の過剰が示されれば、追加の非過剰の鎖を二重鎖形成が完了するまで滴定する。分析によって標的生成物の純度が達成されたとき、濃縮及び脱塩のため、材料をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムに移す。
限外濾過
アニールされた生成物の溶液を、適当な分子量カットオフ膜を含有するＴＦＦシステムを用いて濃縮する。濃縮に続き、生成物溶液を、ＷＦＩ品質ウォーターを用いた透析濾過により、濾液の伝導率が水の伝導率になるまで脱塩する。
凍結乾燥
濃縮した溶液を、棚式凍結乾燥器の無菌トレーに移す。生成物を次に、凍結乾燥して粉末とする。凍結乾燥器からトレーを移し、パッケージング用にクラス１００ラミナーエアフロー（Ｌａｍｉｎａｒ Ａｉｒ Ｆｌｏｗ：ＬＡＦ）フードに移す。
薬剤物質のパッケージング
凍結乾燥された生成物を含有する凍結乾燥トレーを、クラス１００ＬＡＦフード内で開ける。生成物を、適当なサイズの無菌容器に移し、これを次に密閉してラベル付けする。
薬剤物質容器密閉システム
凍結乾燥された薬剤物質を、無菌キャップ付きの無菌ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）容器内にバルクパッケージする。使用されるボトルサイズは、それに入れる物質の量に依存する。充填後、各ボトルをさらに、クロージャーにおいてポリエチレンテープで密封する。
分析法及び明細
原料及びインプロセス法
原料は、薬剤物質製造プロセスへの投入に先立ち、同定のため試験する。薬剤物質分子中に取込まれる、重要な原料は、さらに、純度試験又は適当なアッセイテストを用いて試験する。インプロセスサンプルを、製造プロセスにおけるキーコントロールポイントにおいて試験して、最終薬剤物質の品質を監視及び保証する。
薬剤物質分析法及び明細
コントロールを取り入れた、オリゴヌクレオチド用の分析法及び許容基準を、バルクｓｉＮＡ組成物の臨床試験に先立ち確立した。以下の試験法及び許容基準は、これらのコントロールの例を示している。表ＶＩＩは、ｓｉＮＡ医薬組成物用の材料明細の例を要約している。
分析法の要約
同定（ＩＤ）試験
ＩＤ オリゴヌクレオチド主ピーク：薬剤物質の同定は、クロマトグラフィー法を用いて確立される。この判定に用いたデータは、ＨＰＬＣ試験法（純度試験を参照）の１つによって生成される。薬剤物質サンプル及び標準注入物のピーク保持時間を比較する。薬剤物質同定は、主ピーク保持時間の好適な比較により支持される。
分子量：薬剤物質の同定は、分光法を用いて確立される。薬剤物質のサンプルは、酢酸アンモニウム水溶液を用いた沈澱により、分析用に調製する。薬剤物質の分子量は、質量分析法により判定する。この試験は、理論分子量からの原子質量単位の設定数内に制御される。
融解温度：この方法は、二本鎖薬剤物質の融解温度（Ｔｍ）の測定により、薬剤物質の同定を支持する。溶液中のサンプルを、溶液の紫外線（ＵＶ）吸収をモニターしながら加熱する。Ｔｍは、二重鎖が単鎖に解離することにより吸収が増大したときの、吸収曲線の変曲点によって表示する。
アッセイ試験
オリゴヌクレオチド含有量：このアッセイは、薬剤物質中の全オリゴヌクレオチド含有量を判定する。オリゴヌクレオチドは、２６０ｎｍに極大値をもってＵＶ光を吸収する。存在するオリゴヌクレオチド種は、二本鎖ｓｉＮＡ生成物と、残留性の単鎖を含む、製造プロセスからの、他の少量のオリゴヌクレオチド物質とからなる。薬剤物質のサンプルを正確に秤量し、溶解し、かつ容積測定により水に希釈する。吸収は、石英セル内で、ＵＶ分光光度計を使用して測定する。全オリゴヌクレオチドアッセイ値は、実験的に判定された、常用標準器のモル吸光係数を用いて計算し、固体薬剤物質１ミリグラム当たりのナトリウムオリゴヌクレオチドのミリグラムとして記録する。
純度試験：純度は、１つ以上のクロマトグラフィー法を用いて測定されるであろう。存在する薬剤物質の分離及び核酸類似体の数に依存して、オルソゴナル分離法を用いてＡＰＩの純度をモニターしてもよい。分離は、以下の手段により実現する：
ＳＡＸ−ＨＰＬＣ：オリゴヌクレオチドホスホジエステルと強アニオン交換ＨＰＬＣカラムとの間の、緩衝塩勾配を用いた、分離を行なうためのイオン交換相互作用。
ＲＰ−ＨＰＬＣ：オリゴヌクレオチドと疎水性逆相ＨＰＬＣカラムとの間の、水性緩衝液対有機溶媒を用いた、分離を行なうための分配相互作用。
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）：ゲルを充填したキャピラリー内での、緩衝溶液中の分子ふるいによる電気泳動的分離。分離は、電場を適用したときに起こり、アニオン性オリゴヌクレオチドに、それらがゲルマトリックスを通って移動する際に分子サイズによって分離させるようにする。全ての分離法において、ピークは一般にオリゴヌクレオチドの長さの順に溶出し、２６０ｎｍにおいてＵＶにより検出される。
他の試験
物理的外観：薬剤物質サンプルを、視覚的に検査した。この試験は、物質が、凍結乾燥された固体の特徴をもつことを判定し、固体の色を同定し、かつ任意の可視的な汚染物質が存在しないかを判定する。
細菌内毒素試験：細菌内毒素試験を、リムルス変形細胞溶解産物（ＬＡＬ）アッセイにより、９６ウエルプレートにおけるカイネティック比濁法を用いて行なう。薬剤物質に関する内毒素許容限度は、賦形剤と混ぜ合わせたとき、投与された薬剤製品中のエンドトキシンの毎日の許容濃度限界を超えないよう、適切に設定されるであろう。
好気性汚染微生物数：好気性汚染微生物数は、委託研究所により、ＵＳＰ第６１章に基づく方法を用いて実施する。
アセトニトリル含有量：残留アセトニトリル分析は、委託研究所により、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて実施する。アセトニトリルは、上流の合成工程において使用される主要な有機溶媒であるが、他のいくつかの有機試薬も合成において使用される。後続の精製プロセスの工程は、典型的には薬剤物質中の溶媒を除去する。他の溶媒は、プロセス開発作業の結果に依存してモニターしてもよい。溶媒は、ＩＣＨ規制値以内に制限されるであろう。
水分含有量：水分含有量は、容積測定カールフィッシャー（ＫＦ）滴定法により、固体エバポレーターユニット（オーブン）を用いて判定する。水は、典型的には、核酸薬剤物質中に、組成物の数重量パーセントとして存在しており、それ故モニターされる。
ｐＨ：再構成された薬剤物質のｐＨをモニターして、ヒトへの注射に対する適合性を確実にする。
イオン含有量：ナトリウム、塩化物、及びリン酸塩についての試験は、委託研究所により、標準的な原子吸光及びイオンクロマトグラフィー法を用いて行なわれるであろう。一般的なイオンモニタリングを実行して、薬剤物質を取り込んでいる薬剤製品のモル浸透圧が確実に生理学的許容範囲内になるようにする。
金属含有量：関連する金属についての試験は、委託研究所により、標準的な分析法、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）分光法を用いて行なう。
実施例５：ｓｉＮＡ活性を評価するためのＲＮＡｉインビトロアッセイ
無細胞系においてＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを用いて、ＲＮＡ標的を標的とするｓｉＮＡコンストラクトを評価する。アッセイは、標的ＲＮＡを用いた使用に適合され、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７、及びＺａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３により記載された系を含んでなる。多核性胞胚に由来するショウジョウバエ抽出物を用いて、インビトロでＲＮＡｉ活性を再構成する。標的ＲＮＡは、適当な標的発現プラスミドからの、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によるか、又は本明細書に記載の化学合成により生成する。センス及びアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば、各々２０ｕＭ）を、緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で、９０℃で１分間、続いて３７℃で１時間インキュベートすることによりアニールし、次に、溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中に希釈する。アニーリングは、ゲル電気泳動により、アガロースゲル上で、ＴＢＥ緩衝液中でモニターして、エチジウムブロミドで染色することができる。ショウジョウバエ溶解物は，ＯｒｅｇｏｎＲハエからのゼロないし２時間齢の胚を用いて、酵母糖密寒天上に収集して調製し、これを、漿膜を除いて溶解する。溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイは、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０ないし５０ｐＭの終濃度）、及び１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］ｓｉＮＡを含む溶解緩衝液（１０ｎＭ最終濃度）を含有する反応混合物を含んでなる。反応混合物はまた、１０ｍＭ クレアチンリン酸、１０ｕｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕＭ ＧＴＰ、１００ｕＭ ＵＴＰ、１００ｕＭ ＣＴＰ、５００ｕＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｉｎ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、及び１００ｕＭの各アミノ酸を含有する。酢酸カリウムの終濃度を、１００ｍＭに調整する。反応は、氷上で予め組立て、２５℃で１０分間プレインキュベートした後、ＲＮＡを添加し、次いで２５℃でさらに６０分間インキュベートする。反応を、４量の１．２５ｘＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ）でクエンチする。標的ＲＮＡの切断は、ＲＴ−ＰＣＲ分析、又は当該技術分野において既知の他の方法によりアッセイし、反応からｓｉＮＡを省いたコントロール反応と比較する。
別法として、アッセイ用に内部標識した標的ＲＮＡを、［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でのインビトロ転写により調製し、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し、さらなる精製なしに標的ＲＮＡとして使用する。任意で、標的ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−３２Ｐ末端標識してもよい。アッセイは、上述のように行ない、標的ＲＮＡ及びＲＮＡｉにより生成される特異的ＲＮＡ切断産物を、ゲルのオートラジオグラフィーで可視化する。切断のパーセントは、インタクトなコントロールＲＮＡ、又はｓｉＮＡなしのコントロール反応からのＲＮＡ、及びアッセイにより生成された切断産物を表わすバンドの、ＰＨＯＳＰＨＯＲ ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量により判定する。
１つの実施態様においては、このアッセイを用いて、ｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉ切断のための、標的ＲＮＡ標的の標的部位を判定し、これにおいては、例えば、標識された標的ＲＮＡの電気泳動によるか、又はノーザンブロッティングにより、並びに当該技術分野において周知の他の方法論により、複数のｓｉＮＡコンストラクトを、標的ＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介性の切断についてスクリーンする。
実施例６：標的ＲＮＡの核酸阻害
ヒト標的ＲＮＡを標的としたｓｉＮＡ分子を、上述のように設計及び合成する。これらの核酸を、インビボの切断活性について、例えば、以下の方法を用いて試験することができる。
２つのフォーマットを用いて、標的を標的とするｓｉＮＡの効力を試験した。第１に、試薬を、細胞培養において試験して、ＲＮＡ及びタンパク質阻害の程度を判定する。ｓｉＮＡ試薬を、本明細書に記載のように、標的に対し選択する。ＲＮＡ阻害は、これらの試薬を適当なトランスフェクション剤によって細胞に送達した後に測定する。増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ７７００ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を用いて、アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量を測定する。比較は、無関係の標的に対し作成されたオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して、又は、全体の長さ及び化学は同じであるが各位置にランダムに置換されているランダム化ｓｉＮＡコントロールに対して行なう。標的に対し、一次及び二次のリード試薬を選択し、最適化を行なう。最適のトランスフェクション試薬濃度を選択した後、リードｓｉＮＡ分子を用いて、ＲＮＡ阻害のタイムコ−スを実施する。さらに、細胞播種フォーマットを用いて、ＲＮＡ阻害を判定することができる。
細胞に対するｓｉＮＡの送達
細胞は、トランスフェクションの前日に、例えば、ＥＧＭ−２（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、６ウエルディッシュのウエル当たり１ｘ１０５細胞で播種する。製剤ｓｉＮＡ組成物を、ポリスチレン管において、ＥＧＭ基本培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、３７℃で３０分間複合体化する。ボルテックスした後、複合体化した製剤ｓｉＮＡ組成物を各ウエルに添加し、示された時間インキュベートする。最初の最適化実験では、細胞は、例えば１ｘ１０３で９６ウエルプレートに播種し、記載されたようにｓｉＮＡ複合体を添加する。細胞に対するｓｉＮＡ送達の効率は、脂質と複合体化した蛍光ｓｉＮＡを使用して判定する。６ウエルディッシュ中の細胞を、ｓｉＮＡとともに２４時間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ、２％パラホルムアルデヒド中で、室温で１５分間固定する。ｓｉＮＡの取込みは、蛍光顕微鏡を用いて可視化する。
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）及び光サイクラーによるｍＲＮＡの定量
ｓｉＮＡ送達の後、例えば、６−ウエル用にはキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮＡ精製キットを、又は９６ウエルアッセイ用にはＲｎｅａｓｙ抽出キットを用いて、細胞から全ＲＮＡを調製する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）用には、二重標識されたプローブを、５’末端に共有結合されたレポーター色素、ＦＡＭ又はＪＯＥ、及び３’末端にコンジュゲートされたクエンチャー色素、ＴＡＭＲＡを用いて合成した。ワンステップＲＴ−ＰＣＲ増幅を、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ シーケンス・ディテクター（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で、１０μｌ 全ＲＮＡ、１００ｎＭ 前向きプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）、９００ｎＭ 逆向きプライマー（ｒｅｖｅｒｓ ｐｒｉｍｅｒ）、１００ｎＭ プローブ、１Ｘ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００μＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１０Ｕ ＲＮアーセ阻害剤（プロメガ）、１．２５Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ）（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ）、及び１０Ｕ Ｍ−ＭＬＶ リバース・トランスクリプターゼ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（プロメガ）からなる、５０μｌの反応を用いて行なう。熱サイクリング条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、次に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル、からなってもよい。ｍＲＮＡレベルの定量は、連続的に希釈した全細胞ＲＮＡ（３００、１００、３３、１１ｎｇ／ｒｘｎ）から生成した標準に比較して判定し、平行したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）におけるβ−アクチン又はＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対し標準化する。興味の各遺伝子について、アッパー及びロウワープライマー（ｕｐｐｅｒ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、及び蛍光標識したプローブを設計する。特定のＰＣＲ産物中へのＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ色素のリアルタイムの取込みは、ラクトサイクラーを用いてガラスキャピラリー管内で測定し得る。標準曲線は、各プライマー対について、コントロールｃＲＮＡを使用して生成する。値は、各サンプル中のＧＡＰＤＨに対する相対的発現として表わされる。
ウエスタンブロッティング
核抽出物を、標準的なマイクロ調製技術（例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｆａｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９を参照）を用いて調製することができる。上清からのタンパク質抽出物は、例えば、ＴＣＡ沈澱を用いて調製される。同体積の２０％ＴＣＡを、細胞上清に添加し、氷上で１時間インキュベートし、５分間の遠心分離によりペレット化する。ペレットをアセトン中で洗浄し、乾燥させ、水中に再懸濁する。細胞タンパク質抽出物を、１０％ビス−トリス ＮｕＰａｇｅ（核抽出物）、又は４ないし１２％トリス−グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲルに流し、そしてニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は、例えば、５％脱脂乳と１時間、その後一次抗体と４℃で１６時間インキュベートすることにより阻止し得る。洗浄の後、二次抗体、例えば（１：１０，０００希釈）を、室温で１時間適用し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））でシグナル検出する。
実施例７：製剤ｓｉＮＡ組成物の血清安定性の評価
本明細書に議論されたように、製剤された脂質組成物のトランスフェクション又は送達効率を判定するための１つの方法は、インビトロで、製剤組成物の血清中の安定性を判定することである。比濁度測定を用いて、製剤ｓｉＮＡ組成物のインビトロの血清安定性を判定することができる。
濁度測定を用いて、脂質粒子製剤、Ｌ０６５、Ｆ２、Ｌ０５１、及びＬ０７３の血清安定性をモニターした（Ｌ０５１及びＬ０７３の脂質製剤については、図１４及び１５を参照）。Ｌ０６５の脂質製剤は、カチオン性脂質ＣｐＬｉｎＤＭＡ、中性脂質ＤＳＰＣ、コレステロール、及び２ｋＰＥＧ−ＤＭＧを含んでなる。脂質製剤Ｆ２は、ＤＯＤＡＰを含んでなる。５０％血清の存在及び非存在下に、製剤ｓｉＮＡ組成物（０．１ｍｇ／ｍｌ）の吸収を、対応する量の血清のみをリファレンスとして、モレキュラー・ディバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレート分光光度計の使用により、５００ｎｍにおいて測定した。製剤を、３７℃でインキュベートし、そして２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、７時間、及び２７時間で分析した。比濁度は、サンプルの濁度を、５０％血清中で２分間インキュベートされた製剤ｓｉＮＡ組成物の濁度で割ることにより判定した。時間が経過しても比濁度が１．０付近に一定したままであれば、製剤又は組成物は血清中で安定である。図１７に示したように、製剤ｓｉＮＡ組成物、Ｌ０６５、Ｌ０５１、及びＬ０７３は、血清安定性の脂質ナノ粒子組成物である。図３９に示したように、製剤ｓｉＮＡ組成物、Ｌ０７７、Ｌ０８０、Ｌ０８２、及びＬ０８３は、血清安定性の脂質ナノ粒子組成物である。
実施例８：製剤ｓｉＮＡ組成物のｐＨ依存性相転移の評価
さらに、製剤ｓｉＮＡ組成物のトランスフェクション又は送達効率は、製剤組成物のｐＨ依存性相転位をインビトロで測定することにより判定し得る。比濁度を用いて、製剤ｓｉＮＡ組成物のｐＨ依存性相転位をインビトロで判定することができる。
濁度測定を用いて、製剤ｓｉＮＡ組成物、Ｌ０６５、Ｌ０５１、Ｆ２、Ｌ０７３、及びＬ０６９の相転移をモニターした。ｐＨ３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、及び９．０の０．１Ｍリン酸緩衝液中での脂質粒子製剤（０．１ｍｇ／ｍｌ）の吸収を、対応する量の緩衝液のみをリファレンスとして、モレキュラー・ディバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレート分光光度計の使用により、３５０ｎｍにおいて測定した。このアッセイは、種々のｐＨにおける製剤の相対的光散乱を測定する。比較的大きい粒子サイズをもつラメラ構造（すなわち、血清安定性構造）は、対応するインバーティッドヘキサゴナル構造よりも、より光を散乱すると期待される。サンプルを３７℃でインキュベートし、２分間、５分間、１０分間、３０分間、及び２時間で分析した。比濁度は、サンプルの濁度を、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中で２分間インキュベートされた製剤ｓｉＮＡ組成物の濁度で割ることにより判定した。ｐＨ７．５ないし５．０の間で測定したとき、比濁度に変化があれば、製剤又は組成物はｐＨ依存性相転移を受ける。図１８に示したように、製剤ｓｉＮＡ組成物、Ｌ０５１及びＬ０７３は、ｐＨ６．５ないしｐＨ５．０において、ｐＨ依存性相転移を受ける。図１９に示したように、製剤ｓｉＮＡ組成物、Ｌ０６９は、ｐＨ６．５ないしｐＨ５．０において、ｐＨ依存性相転移を受ける。図４０に示したように、製剤ｓｉＮＡ組成物、Ｌ０７７、Ｌ０８０、Ｌ０８２、及びＬ０８３、は、ｐＨ６．５ないしｐＨ５．０において、ｐＨ依存性相転移を受ける。
実施例９：慢性ＨＢＶ感染モデルにおける製剤ｓｉＮＡ組成物の評価
ｓｉＮＡナノ粒子活性のインビトロ分析
ＨｅｐＧ２細胞を、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム（９０％）、及び１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）を加えたＥＭＥＭ（セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、カタログ番号１０−０１０−ＣＶ）において増殖させた。複製コンピテントｃＤＮＡを、ｐｓＨＢＶ−１ベクターからのＨＢＶゲノム配列の切り出し再連結によって生成した。ＨｅｐＧ２細胞（３ｘ１０４細胞／ウエル）を、９６ウエルマイクロタイタープレートに播種し、一晩インキュベートした。形成されたカチオン性脂質／ＤＮＡ複合体は（終濃度で）、カチオン性脂質（１１ないし１５μｇ／ｍＬ）、及び再連結したｐｓＨＢＶ−１（４．５μｇ／ｍＬ）を、増殖培地中に含有していた。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、２０μＬの複合体を、抗生物質なしの培地８０μＬ中に播種されたＨｅｐＧ２細胞に添加した。３７℃で７．５時間後、次に培地を除去し、細胞を培地で１回すすぎ、１００μＬの新鮮な培地を各ウエルに添加した。ウエルあたり５０μＬのｓｉＮＡナノ粒子製剤（製剤の詳細については実施例９を参照）（培地中に３Ｘ濃度に希釈）を添加し、濃度ごとに３つのレプリケートウエルを用いた。細胞を４日間インキュベートし、次いで培地を除去し、ＨＢｓＡｇレベルについてアッセイした。図２１は、製剤された（製剤Ｌ０５１、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からのＨＢｓＡｇレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示す。図２２は、製剤された（製剤Ｌ０５３及びＬ０５４、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からのＨＢｓＡｇレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示す。図２３は、製剤された（製剤Ｌ０５１、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からのＨＢｓＡｇレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示す。図３６は、製剤された（製剤Ｌ０８３及びＬ０８４、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からのＨＢｓＡｇレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示す。図３７は、製剤された（製剤Ｌ０７７、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からのＨＢｓＡｇレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示す。図３８は、製剤された（製剤Ｌ０８０、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からのＨＢｓＡｇレベルを、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較して示す。これらの研究において、ナノ粒子製剤、Ｌ０５１、Ｌ０５３、及びＬ０５４を用いた、活性製剤ｓｉＮＡで処理された細胞では、ＨＢｓＡｇレベルに用量依存性の低減が見られたのに対し、ネガティブコントロール処理細胞では何ら低減は見られなかった。この結果は、製剤ｓｉＮＡ組成物が細胞に侵入し、細胞のＲＮＡｉマシーナリに有効にかかわって、ウイルス遺伝子発現を阻害することを示している。
ＨＢＶ複製のマウスモデルにおける製剤ｓｉＮＡ活性の分析
化学的に安定化したｓｉＮＡナノ粒子（製剤の詳細については実施例９参照）組成物の、ＨＢＶに対する活性を評価するため、製剤ｓｉＮＡ組成物（製剤Ｌ０５１、表ＩＶ）の全身投与を、マウス系統ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ（ジャクソン・ラボラトリ（Ｊａｃｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ））において、ＨＢＶベクターのハイドロダイナミック注入（ＨＤＩ）に従って行なった。雌マウスは、５ないし６週齢であり、実験の時点で約２０グラムであった。用いたＨＢＶベクター、ｐＷＴＤは、完全ＨＢＶゲノムのヘッドツーテイルダイマーである。２０グラムのマウスには、食塩水中にｐＷＴＤを含有する全注入液１．６ｍｌを、５秒以内で尾静脈内に注入した。マウス当たり、全０．３μｇのＨＢＶベクターを注入した。ＨＤＩにより引き起こされる破壊から肝臓を回復させるため、製剤ｓｉＮＡ組成物の投与は、ＨＤＩの６日後に開始した。被包された活性のある、又はネガティブコントロールｓｉＮＡを、標準的なＩＶ注射により、３ｍｇ／ｋｇ／日にて３日間投与した。群（Ｎ＝５）の動物は、最終回投与の３及び７日後に犠牲にし、血清ＨＢＶ ＤＮＡ及びＨＢｓＡｇのレベルを測定した。ＨＢＶ ＤＮＡタイターを、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定し、平均ｌｏｇ１０ コピー／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。血清ＨＢｓＡｇレベルは、ＥＬＩＳＡによりアッセイし、平均ｌｏｇ１０ ｐｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）として表わした。ＰＢＳ及びネガティブコントロール群に比較して、活性製剤ｓｉＮＡ組成物処理群では、３及び７日の双方の時点において、血清ＨＢＶ ＤＮＡ（図２４及び４１）及びＨＢｓＡｇ（図２５、３６、３７、及び３８）に、有意な低減が観察された。
材料及び方法
オリゴヌクレオチド合成及びキャラクタリゼーション
全てのＲＮＡは、本明細書に記載されたように合成した。相補鎖は、ＰＢＳ中でアニールし、脱塩し、そして凍結乾燥した。活性部位２６３ＨＢＶｓｉＮＡの配列を、図２０に示す。インビボで使用した修飾されたｓｉＮＡを、ＨＢＶ２６３Ｍ及びＨＢＶ１５８３Ｍと呼び、一方、未修飾リボヌクレオチド及び反転脱塩基末端キャップを含有するバージョンを、ＨＢＶ２６３Ｒ及びＨＢＶ１５８３Ｒと呼ぶ。ある薬物動態研究は、別の２つの部位を標的とするｓｉＮＡ、ＨＢＶ１５８０Ｍ及びＨＢＶ１５８０Ｒで行なった。
ＨＣＶ無関係コントロール用のｓｉＮＡ配列は：
センス鎖：５’Ｂ−ｃｕＧＡｕＡＧＧＧｕＧｃｕｕＧｃＧＡＧＴＴ−Ｂ ３’（配列番号：１）
アンチセンス鎖：５’ＣＵＣＧｃＡＡＧｃＡｃｃｃｕＡｕｃＡＧＴｓＴ ３’（配列番号：２）
（式中、小文字＝２’−デオキシ−２’−フルオロ；大文字、イタリック＝２’−デオキシ；大文字、下線＝２’−Ｏ−メチル；大文字、太字＝リボヌクレオチド；Ｔ＝チミジン；Ｂ＝反転デオキシ脱塩基；及びｓ＝ホスホロチオアート）
反転コントロール配列は、５’から３’への反転である。
ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡアッセイ
ＨＢｓＡｇのレベルを、ジェネティック・システムス（Ｇｅｎｔｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）／バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡキットを用いて、製造業者の指示に従って測定した。ＨＢＶベクターでトランスフェクトされていない細胞の吸収を、アッセイ用のバックグラウンドとして使用し、したがって、サンプルの実験値から差し引いた。
ＨＢＶ ＤＮＡ分析
ウイルスＤＮＡは、５０μＬのマウス血清から、ＱＩＡｍｐ ９６ＤＮＡＢｌｏｏｄキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従って抽出した。ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００配列検出装置（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を用いて分析した。定量リアルタイムＰＣＲは、以下のプライマー及びプローブ配列を使用して行なった：
前向きプライマー ５’−ＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＧＴ（配列番号３：ＨＢＶヌクレオチド２００６−２０２６）、逆向きプライマー ５’−ＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧ（配列番号４：ＨＢＶヌクレオチド２０６３−２０８３）、及びプローブＦＡＭ ５’−ＴＴＣＧＣＡ ＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣ（配列番号５、ＨＢＶヌクレオチド２０３５−２０６２）。完全長ＨＢＶゲノムを含有するｐｓＨＢＶ−１ベクターを、血清１ｍＬ当たりのＨＢＶコピーを計算するための標準曲線として使用した。
実施例１０：ＨＣＶ感染のインビトロＨＣＶレプリコンモデルにおける製剤ｓｉＮＡ組成物の評価
ＨＣＶレプリコン系を使用して、ＨＣＶ ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡの効力を調べた。試薬は、Ｈｕｈ７細胞を用いた細胞培養（例えば、Ｒａｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１００，２３５−２４０を参照）において試験し、ＲＮＡ阻害の程度を判定した。ｓｉＮＡは、本明細書に記載されたように、ＨＶＣ標的に対して選択した。ＨＣＶ位置３０４用の、活性ｓｉＮＡ配列は、以下の通りである：センス鎖（配列番号１）、アンチセンス鎖（配列番号２）（これらは上記実施例８において不活性配列として用いた）。この研究に用いたｓｉＮＡ不活性コントロール配列は、ＨＢＶ位置２６３を標的とし、以下の通りである：センス鎖（配列番号６）；アンチセンス鎖（配列番号７）（これらは上記実施例８において活性配列として用いた）。活性及び不活性ｓｉＮＡを、上記実施例９に記載したように、製剤Ｌ０５１、Ｌ０５３、又はＬ０５４として製剤した。安定にトランスフェクトされたクローンＡ ＨＣＶサブゲノムレプリコン（Ａｐａｔｈ，ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＨｕｈ７細胞は、５ｍｌの１００Ｘ（１０ｍＭ）非必須アミノ酸（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１１１４０−０５０）、５μＬの２００ｍＭ グルタミン（Ｃｅｌｌｕｇｒｏ、カタログ番号２５−００５−Ｃ１）、５０μＬの熱不活化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２６１４０−０７９）、及び１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１８１１−０２３）を加えたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１９６５−１１８）中で増殖させた。ｓｉＮＡ製剤によるトランスフェクションでは、細胞は、ウエル当たり９，８００個の細胞を、９６ウエル コスター（ＣｏＳｔａｒ）組織培養プレートに、ＮＥＡＡ及び１０％ＦＢＳ（抗生物質なし）を加えたＤＭＥＭを用いて播種する。２０ないし２４時間後、終濃度１ないし２５ｎＭ用の、製剤されたｓｉＮＡで細胞をトランスフェクトした。３日間のインキュベートした後、細胞を溶解し、ＲＮａｑｕｅｏｕｓ−９６キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、カタログ番号１９２０）を使用し、製造業者の指示に従ってＲＮＡを抽出した。図２６は、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較した、製剤された（製剤Ｌ０５１、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からの、ＨＣＶ ＲＮＡレベルを示す。図２７は、未処理又はネガティブコントロール処理細胞に比較した、製剤された（製剤Ｌ０５３及びＬ０５４、表ＩＶ）活性ｓｉＮＡ処理細胞からの、ＨＣＶ ＲＮＡレベルを示す。これらの研究においては、製剤Ｌ０５１、Ｌ０５３、及びＬ０５４を用いて、活性製剤ｓｉＮＡ処理した細胞では、ＨＣＶ ＲＮＡレベルに用量依存性の低減が見られたのに対し、ネガティブコントロール処理細胞では何ら低減は見られない。この結果は、製剤ｓｉＮＡ組成物が細胞に侵入し、ウイルス遺伝子発現を効率的に阻害し得ることを示している。
実施例１１：気管内投与後の未製剤及び製剤ｓｉＮＡの肺分布
肺に対するｓｉＮＡ分子の送達効率を判定するため、未製剤ｓｉＲＮＡ（裸の）、コレステロールコンジュゲートｓｉＮＡ、又は、製剤された分子組成物中のｓｉＲＮＡ（Ｔ０１８．１及びＴ０１９．１）を、気管からマウスの肺へ投与した。未製剤ｓｉＮＡは、裸の核酸を含んでなる。コレステロールコンジュゲートｓｉＮＡは、コレステロールに結合されたｓｉＮＡを含んでなる。製剤された分子組成物、Ｔ０１８．１及びＴ０１９．１は、各々、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＭＧ；及びＤＯＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＭＧを用いて製剤されたｓｉＮＡを含んでなる。３匹の雌のＣ５７Ｂ１／６マウスからなる群を、ケタミン及びキシラジンによる麻酔下に置いた。濾過した投与溶液を、１．０ｍｇ／ｋｇの二重鎖ｓｉＲＮＡにて、ｓｉＲＮＡ（ＴＧＦβ位置１２６４ 安定化化学７／８）をエアロゾル化するための、ペンセンチュリー（Ｐｅｎｎｃｅｎｔｕｒｙ）モデル＃１Ａ−１Ｃマイクロスプレー及びＰｅｎｎｃｅｎｔｕｒｙモデル＃ＦＭＪ２５０シリンジとを用いて、気管から直接肺へ投与した。動物に、未製剤ｓｉＮＡ、コレステロールコンジュゲートｓｉＮＡ、又は、製剤された分子組成物中のｓｉＮＡを投与した。投与の１、２４、又は７２時間後、動物を安楽死させ、放血し、無菌の獣医学用グレードの食塩水で心臓を通して灌流した。肺を除去し、予め秤量したホモジナイズ用チューブに入れ、ドライアイス上で凍結させた。肺重量は、チューブプラス肺を秤量した後に引き算することにより測定した。肺組織中のｓｉＮＡのレベルは、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて測定した。図２８は、（ｉ）未製剤ｓｉＮＡ、（ｉｉ）コレステロールコンジュゲートｓｉＮＡ、又は（ｉｉｉ）製剤された分子組成物、Ｔ０１８．１及びＴ０１９．１中のｓｉＮＡの直接投与の後の、肺組織中のｓｉＮＡのレベルを示す。肺組織における暴露の半減期は、未製剤ｓｉＮＡでは３ないし４時間、コレステロールコンジュゲートｓｉＮＡでは９時間、及び、製剤された分子組成物、Ｔ０１８．１及びＴ０１９．１中のｓｉＮＡでは３７ないし３９時間であった。
実施例１２：本発明のｓｉＮＡ ＬＮＰ製剤を用いた種々の細胞系のトランスフェクション効率
本発明のＬＮＰ製剤のトランスフェクション効率を、６．１２脾臓、Ｒａｗ２６４．７腫瘍、ＭＭ１４Ｌｕ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｄ１０．Ｇ４．１、Ｔｈ２ヘルパー、及び肺初代マクロファージ細胞を含む、種々の細胞系において、内在ＭＡＰキナーゼ１４（ｐ３８）遺伝子発現を標的とすることにより測定した。ＭａｐＫ１４（ｐ３８ａ）に対する有力なリードｓｉＮＡを、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（ＬＦ２Ｋ）を送達剤として用いたインビトロスクリーニングにより選択した。このｓｉＮＡのセンス鎖配列は、５’− Ｂ ｃｕＧＧｕＡｃＡＧＡｃｃＡｕＡｕｕＧＡＴＴ Ｂ −３’（配列番号６）を、そしてアンチセンス鎖配列は、５’− ＵＣＡＡｕＡｕＧＧｕｃｕＧｕＡｃｃＡＧＴｓＴ −３’（配列番号７）を含んでいた（式中、小文字＝２’−デオキシ−２’−フルオロ；大文字、イタリック＝２’−デオキシ；大文字、下線＝２’−Ｏ−メチル；大文字、太字＝リボヌクレオチド；Ｔ＝チミジン；Ｂ＝反転デオキシ脱塩基；及びｓ＝ホスホロチオアート）。
所有のＭａｐＫ１４標的化ＬＮＰをスクリーンし、培養細胞において、ＬＦ２Ｋ及び、不活性ｓｉＮＡを含有するＬＮＰコントロールと比較した。さらに、リードＬＮＰを、用量依存法で試験して、ＩＣ５０値を判定した。結果を表Ｖに要約する。図４１は、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞における、ＭａｐＫ１４位置１０３３を標的とするＬＮＰ５８及びＬＮＰ９８製剤についての効力データを示す。図４２は、ＭＭ１４．Ｌｕ正常マウス肺細胞における、ＭａｐＫ１４位置１０３３を標的とするＬＮＰ９８製剤についての効力データを示す。図４３は、６．１２Ｂリンパ球細胞における、ＭａｐＫ１４位置１０３３を標的とするＬＮＰ５４、ＬＮＰ９７、及びＬＮＰ９８製剤についての効力データを示す。図４４は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞における、ＭａｐＫ１４位置１０３３を標的とするＬＮＰ９８製剤についての効力データを示す。図４５は、ＲＡＷ２６４．７細胞における、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ５４、及びＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる用量依存性の低減を示す。図４６は、ＭＭ１４．Ｌｕ細胞における、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる用量依存性の低減を示す。図４７は、６．１２Ｂ細胞における、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９７及びＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる用量依存性の低減を示す。図４８は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞における、ＭａｐＫ１４ＲＮＡの、ＭａｐＫ１４ＬＮＰ９８製剤ｓｉＮＡによる用量依存性の低減を示す。
ＬＦ２Ｋトランスフェクション法：
以下の方法を、ＬＦ２Ｋトランスフェクションに使用した。２０ないし２４時間後、細胞を、０．２５又は０．３５ｕＬのリポフェクタミン２０００／ウエル、及び０．１５又は０．２５ｕＬの／ウエルの、２５ｎＭｓｉＮＡとの複合物を用いてトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００を、ＯｐｔｉＭＥＭと混合し、少なくとも５分間静置した。０．２５ｕＬのトランスフェクションでは、各複合体用に、１ｕＬのＬＦ２Ｋを、９９ｕＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。０．３５ｕＬのトランスフェクションでは、各複合体用に、１．４ｕＬのＬＦ２Ｋを、９８．６ｕＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。０．１５ｕＬのトランスフェクションでは、各複合体用に、０．６０ｕＬのＳｉｌｅｎｔＦｅｃｔを、９９．４ｕＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。０．３０ｕＬのトランスフェクションでは、各複合体用に、１．２ｕＬのＳｉｌｅｎｔＦｅｃｔを、９８．２ｕＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。ｓｉＮＡを、マイクロタイターチューブ（ＢｉｏＲａｄ＃２２３−９３９５）に加え、次にＯｐｔｉＭＥＭを添加して、４つのウエルに使用するべき全体積１００ｕＬを作成した。１００ｕＬの、リポフェクタミン２０００／ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を添加し、チューブを、中程度の速度で１０秒間ボルテックスし、そして室温で２０分間静置した。チューブを急速にボルテックスし、ウエル当たり５０ｕＬを添加し、これは１００のｕＬ培地を含有した。処理細胞からのＲＮＡは、２４、４８、７２、及び９６時間で単離した。
ＬＮＰトランスフェクション法：
以下の方法を、ＬＮＰトランスフェクションに使用した。細胞は、９６ウエルプレートにおいて、１００ｕＬの完全増殖培地中で、５，０００ないし３０，０００細胞／ウエルの範囲で所望の濃度に播種した。２４時間後、完全増殖培地中の５Ｘ濃度のＬＮＰを細胞上に希釈することによって細胞をトランスフェクトした（２５ｕＬの５Ｘは、結果として１Ｘの終濃度を生じる）。処理細胞からのＲＮＡは、２４、４８、７２、及び９６時間で単離した。
実施例１３：喘息のマウスモデルにおける気道過敏の低減
ＯＶＡ誘発性気道過敏モデルを用いて、インターロイキン４Ｒ（ＩＬ−４Ｒアルファ）を標的とするＬＮＰ製剤ｓｉＮＡ分子を、気道過敏を低減する効力について評価した。本研究において使用した、ＩＬ−４Ｒアルファを標的とする活性ｓｉＮＡの、センス鎖配列は、５’− Ｂ ｕｃＡＧｃＡｕｕＡｃｃＡＡＧＡｕｕＡＡＴＴ Ｂ−３’ （配列番号８）を含んでなり、かつアンチセンス鎖配列は、５’−ＵＵＡＡｕｃｕｕＧＧｕＡＡｕＧｃｕＧＡＴｓＴ−３’ （配列番号９）を含んでいた（式中、小文字＝２’−デオキシ−２’−フルオロ；大文字、イタリック＝２’−デオキシ；大文字、下線＝２’−Ｏ−メチル；大文字、太字＝リボヌクレオチド；Ｔ＝チミジン；Ｂ＝反転デオキシ脱塩基；及びｓ＝ホスホロチオアート）。０日及び７日目に、動物を、等量のＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ中に混合した０．４ｍｇ／ｍＬのＯＶＡ／食塩水溶液（最終注入液０．２ｍｇ／ｍＬ）の、腹腔内注射により免疫化した（１００ｕＬ／マウス）。ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋）中に調製した、ＬＮＰ−５１製剤ＩＬ−４Ｒ−アルファ位置１１１１ｓｉＮＡ（ＵＳＳＮ １１／００１，３４７（参考として本明細書に含まれる）を参照）、又は無関係なコントロールを、１７日目に開始して２６日目に終了する全１０回の気管内投与ｑｄ（１日１回）により送達した。２４、２５、及び２６日目に、マウスを、ＯＶＡ（食塩水中１．５％）で、パリ（Ｐａｒｉ）ＬＣエアロゾルネブライザーを用いて３０分間エアロゾルチャレンジした。動物は、気道機能分析に先立ち、２４時間休息させた。２８日目に、気道応答性を、エアロゾル化したメタコリンによるチャレンジの後、バクスコ（Ｂｕｘｃｏ）全身型プレチスモグラフを用いて評価した。メタコリンチャレンジの後、動物を安楽死させた。気管切開を行ない、肺を０．５ｍＬの食塩水で２回洗浄した。肺の洗浄は、動物の胸部をマッサージしながら行ない、全ての洗浄液を収集して氷上に置いた。サイトスピン調製を行って、白血球分画用に、ＢＡＬ液から細胞を集めた。結果は図４９に示されており、これは、ＬＮＰビヒクル単独及び未処理（ｎａｉｖｅ）動物に比較して、用量応答性（０．０１、０．１、及び１ｍｇ／ｋｇ）の製剤ｓｉＮＡの活性を明らかに示している。
実施例１４：ＬＮＰ製剤ｓｉＮＡを用いたインビボのヒトハンチントン（ｈｔｔ）遺伝子発現における有効な低減
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチントン（ｈｔｔ）タンパク質のポリグルタミン（ポリＱ）トラクトの延長によって引き起こされる、優性の神経変性疾患である。ｈｔｔにおけるポリＱ延長は、皮質及び線状体のニューロン細胞の損失と、脳細胞内にｈｔｔ含有凝集体の形成を誘導する。ＨＤ患者には、進行性の、精神医学的、認知的、及び運動の機能障害、及び若年死がある。マウスモデルにおける初期の研究は、疾患表現型の開始後の突然変異体タンパク質の低減が運動機能障害を改善し、かつｈｔｔ凝集体の負荷を低減し得ることを示した。したがって、患者の脳内の突然変異体ｈｔｔの低減は、疾患を改善するかもしれない。
最近の研究は、ＨＤマウスモデルにおいて、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＮＡ）を発現するウイルスベクターを用いて、突然変異体ｈｔｔの低減が、この疾患の行動的及び神経病理学的特徴の開始から動物を防御したことを示している（Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１０２：５８２０−５参照）。この研究を利用して、非ウイルス的方法により、合成されたｓｉＮＡを直接脳に送達することが同様に有効であり得るかどうかを判定した。このアプローチは、用量用法を変更できることを含め、多くの利点をもつ。化学修飾されたｓｉＮＡ、配列５’−Ｂ ＡｃｃＧｕＧｕＧＡＡｕｃＡｕｕＧｕｃｕＴＴ Ｂ−３’（配列番号１０）を有するセンス鎖、及びアンチセンス鎖５’− ＡＧＡｃＡＡｕＧＡｕｕｃＡｃＡｃＧＧｕＴｓＴ−３’（配列番号１１）を、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中に被包した製剤、ＬＮＰ−０６１、ＬＮＰ−０９８、及びＬＮＰ−１０１（表ＩＶ参照）を、この研究において利用した。これらの配列においては、小文字は、２’−デオキシ−２’−フルオロを表わし、大文字はリボヌクレオチドを表わし、下線付き大文字は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを表わし、Ｔはチミジン、ｓはホスホロチオアート、そしてＢは反転デオキシ脱塩基である。種々のＬＮＰ製剤中に被包されたｓｉＮＡ二重鎖を、その完全長ｈｔｔのサイレンシング能について、インビトロでスクリーンし、続いてインビボで試験した。アルゼット（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプを用いて、ＬＮＰ中に被包されたｓｉＮＡを、０．１ないし１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で（８．４ないし８４μｇの範囲の全用量）、側脳質又は線状内に、それぞれ７日又は１４日間注入した。スクランブルコントロール配列、又は未処理の脳に比較して、ＱＰＣＲによって測定されたとき、ＬＮＰ−０６１及びＬＮＰ−０９８製剤ｓｉＮＡで処理された動物において、ｈｔｔｍＲＮＡレベルに印象的な８０％の低減が観察された。結果を図５０に示す。
実施例１５：非標的化核酸を含有する担体ＬＮＰの添加による、ＬＮＰ製剤ｓｉＮＡの強化されたＲＮＡｉ活性
本明細書の種々の実施態様及び実施例に示したように、本出願人は、生物活性分子、例えば低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を効率的に被包する、いくつかの脂質ナノ粒子（ｌＮＰ）製剤を開発してきた。これらのＬＮＰ製剤されたｓｉＮＡの、マウスにおける静脈内経路による注入は、結果として肝臓のような標的臓器への効率的な送達を生じ、かつ、意図した標的の強力かつ特異的なノックダウンを生じる（上記実施例９を参照）。ＬＮＰ製剤されたｓｉＮＡの局所送達もまた、結果として標的臓器、例えば肺及びＣＮＳへの効率的な送達を生じ、かつ、意図した標的の強力かつ特異的なノックダウンを生じる（上記実施例１３及び１４を参照）。これらの製剤ｓｉＮＡはまた、組織培養細胞を効率的にトランスフェクトし、かつ特異的なＲＮＡｉ活性を示す（実施例１２参照）。本出願人は、本明細書において、製剤ｓｉＮＡ組成物を、本発明の非標的化ポリヌクレオチド担体分子と一緒に利用することにより、脂質ベースの送達ビヒクルを用いた生物活性分子の送達を強化するための、一般的な方法論を記載する。
ＬＮＰ製剤された不活性担体分子と一緒にＬＮＰ製剤された、活性ｓｉＮＡ組成物の、強化されたインビトロ活性
ＬＮＰ製剤されたＨＢＶ２６３ｓｉＮＡのＩＣ５０を算定するため、用量応答性研究を、本明細書の実施例９に記載したように、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を安定に発現するＨｅｐＧ２細胞において行なった。Ｌ１２４（表ＩＶ）ＬＮＰ製剤されたＨＢＶ２６３ｓｉＮＡの濃度シリーズを、２つの異なる方法で調製した。最初のシリーズでは、活性ｓｉＮＡを、組織培養培地中に直接希釈して、所望の濃度を達成する。第２のシリーズでは、活性製剤ｓｉＮＡを、担体ＬＮＰ被包コントロールｓｉＮＡ（ＨＢＶ２６３反転配列）で希釈して、全ｓｉＮＡ濃度の終濃度を、各サンプルで同じに保つようにする（詳細は実験のセクションを参照）。図５１に示したように、製剤された担体コントロールｓｉＮＡの存在下に調製された、活性製剤ｓｉＮＡシリーズは、製剤された担体コントロールｓｉＮＡを含有しない活性製剤ｓｉＮＡシリーズに比較して、強化されたＲＮＡｉ活性を示した。この実験は、担体ＬＮＰ製剤コントロールｓｉＮＡの存在が、例えば、活性ｓｉＮＡ分子種の増大された細胞内送達のメカニズムを介して、ＬＮＰ製剤された活性ｓｉＮＡのＲＮＡｉ活性を改善することを示唆した。
ＬＮＰ製剤された不活性担体分子と一緒にＬＮＰ製剤された、活性ｓｉＮＡ組成物の、強化されたインビボ活性
本出願人は、同様の実験を、シェーグレン症候群抗原Ｂ（ＳＳＢ）ＲＮＡを標的とする、ＬＮＰ製剤された活性ｓｉＮＡを注入することにより、インビボ設定において行なった。雄のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．１、０．３、及び３ｍｇ／ｋｇのＬ１２４（表ＩＶ）製剤ＳＳＢ２９１ｓｉＮＡ（対応する全脂質用量は、約９、３０、及び９０ｍｇ／ｋｇである）を、１日１回、３日間にわたり、静脈内に投与した。ＳＳＢ２９１ｓｉＮＡは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみで希釈するか、又は担体ＬＮＰ（Ｌ１２４製剤されたＨＣＶ３１６非標的化ｓｉＮＡ）を用いて希釈して、全ｓｉＮＡ用量が３ｍｇ／ｋｇ（又は、９０ｍｇ／全脂質用量）に等しくなるようにした。最終回投与の３日後、動物を犠牲にし、ＲＮＡ単離用に肝臓を収集した。約１００ｍｇの肝臓組織から、Ｔｒｉ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して、製造業者の指示に従って全ＲＮＡを単離した。リアルタイム逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを使用して、ＳＳＢ ＲＮＡレベルを定量し、マウスＧＡＰＤＨ ＲＮＡに対し標準化した。ＳＳＢ及びＧＡＰＤＨ ＲＮＡ双方の相対量を、ＰＢＳコントロール動物から収集した全肝臓ＲＮＡの標準曲線から計算した（反応当たり、３００ｎｇないし１ｎｇのＲＮＡから三倍連続希釈）。データはＳＳＢ対ＧＡＰＤＨ ＲＮＡの比で表わされる。図５２に示したように、担体ＬＮＰの存在は、ＳＳＢ２９１ｓｉＮＡの活性を有意に改善した。活性ＳＳＢ２９１ｓｉＮＡが０．３ｍｇ／ｋｇで投与された場合、標的ノックダウンは、担体ＬＮＰなしの４５％から、担体ＬＮＰありの７５％に増加した。これらの実験から、担体ＬＮＰが、活性ｓｉＮＡのＲＮＡｉ活性を、例えば、細胞内に送達されるべき全脂質製剤の臨界量を確立するか、又は維持することにより、強化することは明らかである。
不活性二重鎖ｓｉＮＡ（ＲＮＡ標的に対し何ら相補性をもたない二重鎖ｓｉＮＡ）の、担体としての役割を探るべく、不活性単鎖（ＳＳ）ポリヌクレオチド（ＲＮＡ標的に対し何ら相補性をもたない単鎖）との比較を行った。ＨＢＶ２６３ｓｉＮＡ二重鎖の修飾されたセンス鎖を、Ｌ１２４で製剤し、製剤されたＨＣＶ３１６ｓｉＮＡ二重鎖と一緒にアッセイした。ＳＳＢ２９１ｓｉＮＡ二重鎖は、０．３ｍｇ／ｋｇ単独で、又は、全用量３ｍｇ／ｋｇでの担体ＬＮＰの存在下に、上述のように投与した。全肝臓ＲＮＡを単離し、ＳＳＢ ＲＮＡについて上述のように分析した。図５３に示したように、ＳＳＢ２９１は、〜３７％の標的ＲＮＡのノックダウンを示したが、不活性二重鎖又は単鎖ポリヌクレオチドを含有する担体ＬＮＰを与えた場合、ノックダウン効率は、各々、〜７９％及び〜７０％に改善された。担体ＬＮＰそれ自体は、何ら有意なＳＳＢ標的のノックダウンを示さなかった。したがって、担体ＬＮＰは、単鎖又は二本鎖のいずれかを用いて作成することができ、活性ｓｉＮＡのＲＮＡｉ活性をさらに有意に改善する。
何ら特定の理論に束縛されることを望むことなく、１つ以上の担体分子（例えば、不活性のＬＮＰ製剤されたポリヌクレオチド）の存在下に見られる送達ビヒクル結合生物活性分子（例えば、活性のあるＬＮＰ製剤されたｓｉＮＡ）の、生物活性（例えば、ＲＮＡｉ活性）における強化は、１つ以上の理論によって説明が可能である。例えば、生物活性分子（例えば、ＬＮＰ被包された活性ｓｉＮＡ）に結合している送達ビヒクルの臨界量が、生物活性が行われる細胞コンパートメント（例えば、ｓｉＮＡについては、ｓｉＮＡがＲＩＳＣ複合体を形成し得る場所）における、生物活性分子（例えば、活性ｓｉＮＡ）の効果的な送達に必要である可能性がある。１つの仮説は、一定量の又は一定濃度の、送達ビヒクル及び生物活性分子（例えば、ＬＮＰ製剤された活性ｓｉＮＡ）が、エンドソームからの生物活性分子（例えば、活性ｓｉＮＡ）の効率的放出に必要だというものである。また、送達ビヒクル及びそのカーゴ（例えば、ＬＮＰ製剤された活性ｓｉＮＡ）を効率的に取り上げるが、しかしその生物活性（例えば、ｓｉＮＡの場合、ＲＩＳＣ負荷及び、Ａｇｏ１／Ａｇｏ２活性）が起こるようにさせることはない、細胞又は細胞性コンパートメントがあることも可能である。かかる場合、製剤された生物活性分子（例えば、ＬＮＰ製剤されたｓｉＮＡ）が低濃度では、生物活性分子が、生物活性の行われ得る細胞又は細胞コンパートメント（例えば、ＲＮＡｉマシーナリがある場所）に到達することは難しいであろう。例えば、担体ＬＮＰを用いてＬＮＰ製剤の臨界量を増すことにより、少量の活性ＬＮＰであっても、それらがＲＮＡｉ経路において利用される細胞コンパートメントに到達できるようになるであろう。担体現象には、いくつかの利点がある。ＲＮＡｉ活性を誘導するために必要な生物活性分子（例えば、活性ｓｉＮＡ）の有効量を、担体分子（例えば、不活性ポリヌクレオチド）により、劇的に低減し得る。担体分子の使用はまた、同じか又は異なる細胞内標的に対し、生物活性分子の混合物を使用する機会を与えて、かかる生物活性に必要な個々の生物活性分子の濃度を低減しながら、効果的な生物活性のための生物活性分子の臨界量が達成されるようにする。
材料及び方法
（配列は、表ＩＸに示されている）
細胞培養におけるｓｉＮＡのインビトロ活性
ＨｅｐＧ２ｓｉＮＡ研究のためのトランスフェクションプロトコル：
細胞は、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン（９０％）、及び１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）を加えたＥＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ カタログ番号１０−０１０−ＣＶ）において増殖させる。
細胞の播種：
トランスフェクション用には、細胞は、ウエル当たり８０ｕＬの増殖培地中の４２，０００個の細胞（５２５，０００／ｍＬ）を、９６ウエル組織培養プレート（ＣｏＳｔａｒ、カタログ番号３５９６）に播種する。細胞は、１６ないし２４時間後にトランスフェクトする。
ＨＢＶ製剤の試験：
ベクターのみのトランスフェクション用：
６０ウエルの１プレート用のトランスフェクション複合体
８０ｕＬ プラスミド（ｐＳＶ−ＨＢＶ−１）
１，４３０ｕＬ 培地
８０ｕＬ １６８（１ｍｇ／ｍＬ）
４．５において５秒間ボルテックス、インキュベーター内に１５ないし２０分間静置、ボルテックス
アリコートをＢｉｏｒａｄマイクロタイターチューブへ、ウエル当たりこの２０ｕＬを添加
インキュベーター内で６ないし７時間トランスフェクションを起こさせる
製剤トランスフェクション用：
培地を吸引、１００ｕＬの培地で１回洗浄、次いで１００ｕＬの新鮮培地を添加
各ウエルに、５０ｕＬの、培地中に希釈された３Ｘの製剤Ｌ１２４．１．２．７Ａｕ、又は３０ｎＭ 不活性又反転ＨＢＶｉＬ１２．１．２．３．Ｃｕを添加
３日間インキュベート
上清について、指示にしたがってＥＬＩＳＡを実施する（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＨＢｓＡｇ ＥＩＡ ３．０）
実施例１６：本発明のカチオン性脂質の調製（合成スキームについては、図２９Ａ及び２９Ｂを参照）
コレスタ−５−エン−３β−トシラート（２）
コレステロール（１、２５．０ｇ、６４．７ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた１Ｌの丸底フラスコに秤量した。フラスコにピリジン（２５０ｍＬ）を装填し、隔膜（ｓｅｐｔｕｍ）を閉め、アルゴンでフラッシュした。トルエンスルホニルクロリド（２５．０ｇ、１３１ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、これを次に密閉し、ピリジンを装填した。次にトルエンスルホニルクロリド溶液を、シリンジにより、攪拌中のコレステロール溶液に移し、これを一晩攪拌した。ピリジンの殆どを真空中で除去し、得られた固体をメタノール（３００ｍＬ）中に懸濁し、固体が壊れて均一な懸濁液になるまで３時間攪拌した。得られた懸濁液を濾過し、固体をアセトニトリルで洗浄し、高真空下に乾燥させて、３１．８ｇ（９１％）の白色粉末を得た（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９８，９，７８３を参照）。
コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オール（３ａ）
コレスタ−５−エン−３β−トシラート（２０．０ｇ、３７．０ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた５００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコに、ジオキサン（３００ｍＬ）及び１，４−ブタンジオール（６５．７ｍＬ、２０当量）を装填した。フラスコに還流コンデンサーを取り付け、混合物を一晩還流させた。反応を冷却し、真空中で濃縮した。反応混合物を、水（４００ｍＬ）中に懸濁した。溶液を塩化メチレン（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、水（２ｘ２００）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で脱水し、濾過し、そして溶媒を除去した。得られた油／ワックスを、カラムクロマトグラフィー（１５％ アセトン／ヘキサン）でさらに精製して、１３．４１ｇ（７９％）の無色のワックスを得た。
コレスタ−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オール（３ｂ）
この化合物は、コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オールと同様に調製した。コレスタ−５−エン−３β−トシラート（５．０ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた５００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコに、ジオキサン（１５０ｍＬ）及びジエチレングリコール（２２ｍＬ、２５当量）を装填した。フラスコに還流コンデンサーを取り付け、混合物を一晩還流させた。反応を冷却し、濃縮した。反応混合物を、水（５００ｍＬ）中に懸濁した。溶液を塩化メチレン（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、水（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で脱水し、濾過し、そして溶媒を除去した。得られた油／ワックスを、カラムクロマトグラフィー（２５％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）でさらに精製して、３．６０ｇ（８２％）の無色の油を得た（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９８，９，７８３を参照）。
コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−メシラート（４ａ）
コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オール（１２．４５ｇ、２７．１４ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた５００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコを密封し、アルゴンでフラッシュし、塩化メチレン（１００ｍＬ）及びトリエチルアミン（５．６７ｍＬ、１．５当量）を装填し、０℃に冷却した。メタンスルホニルクロリド（３．１５ｍＬ、１．５当量）をＰＰシリンジに計量し、攪拌中の反応溶液に徐々に添加した。反応を０℃で１時間攪拌し、この時点でＴＬＣ分析（７．５％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は、反応が完了したことを示した。反応混合物を塩化メチレン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）及び食塩水（１ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して、１４．４５ｇ（９９％）の無色のワックスを得て、これをさらなる精製なしに用いた。
コレスタ−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−メシラート（４ｂ）
この化合物は、コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−メシラートと同様に調製した。コレスタ−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オール（３．６０ｇ、７．５８ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた５００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコを密封し、アルゴンでフラッシュし、塩化メチレン（３０ｍＬ）及びトリエチルアミン（１．６０ｍＬ、１．５当量）を装填し、０℃に冷却した。メタンスルホニルクロリド（０．８９ｍＬ、１．５当量）をＰＰシリンジに計量し、攪拌中の反応溶液に徐々に添加した。反応を０℃で１時間攪拌し、この時点でＴＬＣ分析（１０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は、反応が完了したことを示した。反応混合物を塩化メチレン（１５０ｍＬ）で希釈し、飽和重炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）及び食塩水（１ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して、４．１５ｇ（９９％）の無色のワックスを得て、これをさらなる精製なしに用いた。
１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（５）
３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール（６．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた１Ｌの丸底フラスコに秤量した。フラスコを密閉し、アルゴンでフラッシュし、ピリジンを装填し、０℃に冷却した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１７．９ｇ、１．０５当量）を、１００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、密閉し、次にピリジン（８０ｍＬ）中に溶解した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド溶液を、攪拌中の反応混合物に対し徐々に添加し、追加の新鮮なピリジン（２０ｍＬ）を用いて、残留する４，４’−ジメトキシトリチルクロリドの移動を成し遂げた。反応を、一晩攪拌しながら、室温にさせた。反応を真空中で濃縮し、ジクロロメタン（３００ｍＬ）中に再溶解した。有機相を飽和重炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）及び食塩水（１ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して、高真空下に乾燥させ、２２．１９ｇの黄色のゴムを得て、これをさらなる精製なしに用いた。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノール（６ａ）
１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（７．５０ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）を、２００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、無水トルエン（２ｘ５０ｍＬ）で共蒸発させた。撹拌子をフラスコに添加し、セプタムを閉じ、アルゴンでフラッシュし、そしてトルエン（６０ｍＬ）を装填した。水素化ナトリウム（１．７１ｇ、４当量）を一度に加え、混合物を室温で２０分間攪拌した。コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−メシラートを、無水トルエン（２０ｍＬ）中に溶解し、シリンジにより反応溶液に添加した。フラスコに、連続的なアルゴン流を用いた還流コンデンサーを取り付け、反応を一晩加熱還流した。反応混合物を、水浴中で室温に冷却し、ガスの発生が止まるまでエタノールを滴下添加した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ３００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ、酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、５００ｍＬの丸底フラスコ内に濃縮して油とした。
フラスコに攪拌子を装着し、密閉し、アルゴンでパージし、ジクロロ酢酸溶液（ＤＣＭ中３％、２００ｍＬ）を装填した。トリエチルシラン（１４．２ｍＬ、８９ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、反応を一晩攪拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ、ＤＣＭ（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して油とし、これをエタノール（１５０ｍＬ）中に再溶解した。溶液に、フッ化カリウム（１０．３ｇ、１７８ｍｍｏｌ）を添加し、これを次に１時間還流させた。混合物を冷却し、真空中で濃縮し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）に再溶解し、濾過し、濃縮して油／結晶混合物とした。混合物を最少量のＤＣＭ中に再溶解し、予め平衡化したシリカゲルカラムに負荷し、２５％ＥｔＯＡｃ／３％ＴＥＡ入りのヘキサンで溶出して、４．８９ｇ（４９％）の無色のワックスを得た。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オキシ）−１−プロパノール（６ｂ）
この化合物は、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノールと同様に調製した。１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（２．６５ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）を、２００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、無水トルエン（２ｘ２０ｍＬ）で共蒸発させた。撹拌子をフラスコに添加し、セプタムを閉じ、アルゴンでフラッシュし、そしてトルエン（５０ｍＬ）を装填した。水素化ナトリウム（０．６１ｇ、４当量）を一度に加え、混合物を室温で２０分間攪拌した。コレスタ−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−メシラート（４．１５ｇ、７．６ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（１０ｍＬ）中に溶解し、シリンジにより反応溶液に添加した。フラスコに、連続的なアルゴン流を用いた還流コンデンサーを取り付け、反応を一晩加熱還流した。反応混合物を、水浴中で室温に冷却し、ガスの発生が止まるまでエタノールを滴下添加した。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ、酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、５００ｍＬの丸底フラスコ内に濃縮して油とした。
フラスコに攪拌子を装着し、密閉し、アルゴンでパージし、ジクロロ酢酸溶液（ＤＣＭ中３％、１５０ｍＬ）を装填した。トリエチルシラン（４．０３ｍＬ、２５．２ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、反応を４時間攪拌した。反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ、ＤＣＭ（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濃縮して油とし、これをエタノール（１００ｍＬ）中に再溶解した。溶液に、フッ化カリウム（３．６ｇ、６３ｍｍｏｌ）を添加し、これを次に１時間還流させた。混合物を冷却し、真空中で濃縮し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）に再溶解し、濾過し、濾過して油／結晶混合物とした。混合物を最少量のＤＣＭ中に再溶解し、予め平衡化したシリカゲルカラムに負荷し、２５％アセトン／３％ＴＥＡ入りのヘキサンで溶出して、２．７０ｇ（７４％）の無色のワックスを得た。
リノレイルメシラート（７）
リノレイルアルコール（１０．０ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた５００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコを密閉し、アルゴンでフラッシュし、ＤＣＭ（１００ｍＬ）及びトリエチルアミン（７．８４ｍＬ、１．５当量）を装填し、０℃に冷却した。メタンスルホニルクロリド（４．３５ｍＬ、１．５当量）をＰＰシリンジに計量し、攪拌中の反応溶液に徐々に添加した。ＴＬＣ分析（７．５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は、反応が１時間以内に完了したことを示した。反応をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して、１２．５３ｇ（９７％）の無色の油とし、これをさらなる精製なしに使用した。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（８ａ）（ＣＬｉｎＤＭＡ）
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノール（２．６ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を、２００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、無水トルエン（２ｘ２０ｍＬ）で共蒸発させた。撹拌子をフラスコに添加し、これを次に密閉し、アルゴンでフラッシュし、そして無水トルエン（１００ｍＬ）を装填した。水素化ナトリウム（０．７ｇ、６当量）を一度に加え、混合物をアルゴン下に２０分間攪拌した。リノレイルメシラート（４．６ｇ、２．３当量）をＰＰシリンジに計量し、反応溶液に徐々に添加した。フラスコに還流コンデンサーを取り付け、装置をアルゴンでフラッシュした。反応混合物を油浴中で加熱し、還流下に一晩攪拌した。反応混合物を次に、水浴中で室温に冷却し、ガスの発生が止まるまでエタノールを滴下添加した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ、酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮した。得られた油を、カラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３％ＴＥＡ）で精製し、３．０ｇ（８１％）の無色の油を得た。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＤＥＧＣＬｉｎＤＭＡ）（８ｂ）
この化合物は、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンと同様に調製した。３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシペント−３−オキサ−アン−５−オキシ）−１−プロパノール（０．７３ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、無水トルエンで共蒸発させた。撹拌子をフラスコに添加し、これを次に密閉し、アルゴンでフラッシュし、そして無水トルエンを装填した。水素化ナトリウム（１２１ｍｇ、４当量）を一度に加え、混合物をアルゴン下に２０分間攪拌した。リノレイルメシラート（０．８７３ｇ、２３当量）をＰＰシリンジに計量し、反応溶液に徐々に添加した。フラスコに還流コンデンサーを取り付け、装置をアルゴンでフラッシュした。反応混合物を油浴中で加熱し、還流下に一晩攪拌した。反応混合物を次に、水浴中で室温に冷却し、ガスの発生が止まるまでエタノールを滴下添加した。反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈し、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ、酢酸エチル（２ｘ５０ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮した。得られた油を、カラムクロマトグラフィー（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３％ＴＥＡ）で精製し、０．７０ｇ（６７％）の無色の油を得た。
ＣＬｉｎＤＭＡの合成のための別の経路（図２９Ｂ）
１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（６）
３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール（５）（５０．１ｇ、４２０．４ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた２Ｌの丸底フラスコに秤量した。フラスコを密閉し、アルゴンでフラッシュし、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１１ｍＬ、６３０．７ｍｍｏｌ）を装填し、０℃に冷却した。ｔ−ブチルジメチルクロロシラン（６７．０ｇ、１．０５当量）を５００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、密閉し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）中に溶解した。ｔ−ブチルジメチルクロロシラン溶液を均圧滴下漏斗に移し、攪拌中の反応混合物に対し、２０分間にわたり徐々に添加した。反応を、３時間にわたり攪拌しながら、室温にさせた。反応を真空中で濃縮した。飽和炭酸塩溶液（１５００ｍＬ）を残渣に添加し、混合物を４Ｌの分液漏斗に移した。水性相を酢酸エチル（３ｘ５００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して、高真空下に乾燥させ、９７．８１ｇ（９９．７％）の透明な無色の油を得て、これをさらなる精製なしに用いた。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノール（７）
１−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−ジメチルアミノ−２−プロパノール（６）（２５．５２ｇ、１０９．３ｍｍｏｌ）を、攪拌子を含有する１Ｌの二口丸底フラスコに秤量した。フラスコに還流コンデンサー及びすり合わせ栓を取り付け、アルゴンでフラッシュし、トルエン（２５０ｍＬ）を装填した。水素化ナトリウム（１０．５０ｇ、４当量）を一度に添加し、混合物を室温で２０分間攪拌した。コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−メシラート（４、上述のように調製）を、無水トルエン（１００ｍＬ）中に溶解し、反応混合物に一度に添加した。追加のトルエン（３０ｍＬ）の洗浄を用いて、残留するメシラート全部を容易に反応混合物に移すようにした。フラスコを、連続的なアルゴン流下に置き、反応を８時間加熱還流した。反応混合物を水浴中で０℃に冷却し、酢酸エチル（３５０ｍＬ）で希釈し、ガスの発生が止まるまでエタノールを滴下添加した。反応混合物を酢酸エチル（３５０ｍＬ）で希釈し、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ１Ｌ）で洗浄した。水性相を合わせ、酢酸エチル（２ｘ５００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、２Ｌの丸底フラスコ内に濃縮して油とした。
フラスコに攪拌子を装着し、残渣を、ジオキサン（３００ｍＬ）、エタノール（２００ｍＬ）、及び水（６ｍＬ）の混合物中に溶解した。濃塩酸（１１．３ｍＬ、１３９．２ｍｍｏＬ）を溶液に添加し、これを次に、室温で２時間攪拌した。１０％炭酸ナトリウム水溶液（２Ｌ）を、４Ｌの分液漏斗において、反応混合物に添加した。水性相を酢酸エチル（３ｘ７５０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して油とした。油の精製は、ヘキサン中３％ＴＥＡで予め平衡化した４．５”シリカゲルカラムで行なった。溶出は、１Ｌのヘキサン、続いて３Ｌの２５％ＥｔＯＡｃ／３％ＴＥＡ入りのヘキサンを用いて行ない、２８．０１ｇ（５０．０％）の無色のワックスを得た。
リノレイルメシラート（８）
リノレイルアルコール（１０．０ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた５００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコを密閉し、アルゴンでフラッシュし、ＤＣＭ（１００ｍＬ）及びトリエチルアミン（７．８４ｍＬ、１．５当量）を装填し、０℃に冷却した。メタンスルホニルクロリド（４．３５ｍＬ）、１．５当量）をＰＰシリンジに計量し、攪拌中の反応混合物に徐々に添加した。ＴＬＣ分析（７．５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は、反応が１時間以内に完了したことを示した。反応をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸塩溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮して、１２．５３ｇ（９７％）の無色の油を得て、これをさらなる精製なしに使用した。
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）（９）
３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−プロパノール（７）（２．６ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を、２００ｍＬの丸底フラスコに秤量し、無水トルエン ２ｘ２０ｍＬ）で共蒸発させた。撹拌子をフラスコに添加し、これを次に密閉し、アルゴンでフラッシュし、そして無水トルエン（１００ｍＬ）を装填した。水素化ナトリウム（０．７ｇ、６当量）を一度に加え、混合物をアルゴン下に２０分間攪拌した。リノレイルメシラート（４．６ｇ、２．３当量）をＰＰシリンジに計量し、反応溶液に徐々に添加した。フラスコに還流コンデンサーを取り付け、装置をアルゴンでフラッシュした。反応混合物を油浴中で加熱し、還流下に一晩攪拌した。反応混合物を次に、水浴中で室温に冷却し、ガスの発生が止まるまでエタノールを滴下添加した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、１０％炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄した。水性相を合わせ、酢酸エチル（２ｘ１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で脱水し、濾過し、濃縮した。得られた油を、カラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３％ＴＥＡ）で精製し、３．０ｇ（８１％）の無色の油を得た。
実施例１７：本発明の芳香族系脂質の調製（図２９Ｃ参照）
ジオレイルオキシベンズアルデヒド、３ａ
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２．７６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた２００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコにジグリム（１００ｍＬ）を装填し、セプタムを閉め、アルゴンでフラッシュした。炭酸セシウム（１９．５ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）を、溶液に対し徐々に分割添加した。オレイルメシラート（１５．２ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）を、シリンジにより添加した。反応混合物を、わずかに高圧のアルゴン下に、１００℃に加熱した。反応混合物を室温に冷却し、濾過した。固体を１，２−ジクロロエタンで洗浄した。合わせた濾液及び洗浄液を濃縮し、次に高真空下に６５℃で乾燥させて、残留するジグリムを除去した。得られた黄色の油を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中、５％酢酸エチル）により精製し、１１．４ｇ（８９％）の黄色の油を得、これは室温に静置すると黄色のワックスに変化した。
ジリノレイルベンズアルデヒド、３ｂ
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２．７６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を、攪拌子を入れた２００ｍＬの丸底フラスコに秤量した。フラスコにジグリム（１００ｍＬ）を装填し、セプタムを閉め、アルゴンでフラッシュした。炭酸セシウム（１９．５ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）を、溶液に対し徐々に分割添加した。リノレイルメシラート（１５．２ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）を、シリンジにより添加した。反応混合物を、わずかに高圧のアルゴン下に、１００℃に加熱した。反応混合物を室温に冷却し、濾過した。固体を１，２−ジクロロエタンで洗浄した。合わせた濾液及び洗浄液を濃縮し、次に高真空下に６５℃で乾燥させて、残留するジグリムを除去した。得られた黄色の油を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中、５％酢酸エチル）により精製し、１１．９ｇ（９４％）の褐色の油を得た。
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン、４ａ
エタノール（２０ｍＬ）中のトリエチルアミンアミン（２．０ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）に対し、塩酸ジメチルアミン（１．６３ｇ、２０ｍｍｏｌ）、チタニウムテトライソプロポキシド（５．９６ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）、及び３，４−ジオレイルオキシベンズアルデヒド（６．３９ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、アルゴン下に室温で１０時間攪拌した。水素化ホウ素ナトリウム（０．５７ｇ、１５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、これを次に室温で一晩攪拌した。濃アンモニア水（４ｍＬ）を、反応混合物に徐々に添加した。反応混合物を濾過し、固体をジクロロメタンで洗浄した。濾液をＫ２ＣＯ３上で脱水し、濾過し、濃縮した。得られた油を、フラッシュクロマトグラフィー（２−１０％アセトン（ジクロロエタン、０．５％ＴＥＡ中）勾配）で精製し、５．８１ｇ（８７−＋％）の黄色の油を得た。
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジリノレイルオキシベンジルアミン、４ｂ
エタノール（２０ｍＬ）中のトリエチルアミンアミン（２．０ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）に対し、塩酸ジメチルアミン（１．６３ｇ、２０ｍｍｏｌ）、チタニウムテトライソプロポキシド（５．９６ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）、及び３，４−ジリノレイルオキシベンズアルデヒド（６．３５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、アルゴン下に室温で１０時間攪拌した。水素化ホウ素ナトリウム（０．５７ｇ、１５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、これを次に室温で一晩攪拌した。６Ｎ アンモニア水（３０ｍＬ）を、反応混合物に徐々に添加し、続いてジクロロメタンを添加した。反応混合物を濾過した。濾液をＫ２ＣＯ３上で脱水し、濾過し、濃縮した。得られた油を、フラッシュクロマトグラフィー（２−１０％アセトン（ジクロロエタン、０．５％ＴＥＡ中）勾配）で精製し、４．９４ｇ（７４％）の黄色の油を得た。
実施例１８：本発明のＰＥＧ−コンジュゲートの調製（図３０Ａ及び３０Ｂ参照）
ＰＥＧ−ＤＭＢ（図３０Ａ）
１−［８’−（コレスタ−５−エン−３β−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−コレステロール）
２０ｍＬの無水ＴＨＦ中の、２．０ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）の１−［８’−アンモニオ−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）、２２ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジン、及び０．９３ｍＬ（５．３ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンの溶液を装填した、２００ｍＬの丸底フラスコに対し、２０ｍＬの無水ＴＨＦ中の、１．２０ｇ（２．６７ｍｍｏｌ）のコレステロールクロロホルマートの溶液を、攪拌しながら添加した。得られた反応混合物を、一晩穏やかに加熱還流した。冷却後、ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去し、得られた残渣を、精製のためシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた（メタノール／ジクロロメタン ５：９５−１０：９０）。クロマトグラフィーは、２．４３ｇ（９１％）の白色固体生成物を生じた。
３，４−ジテトラデコキシルベンジル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル（ＰＥＧ−ＤＭＢ）
２０ｍＬの１，４−ジオキサン中の、２．６７ｇ（５．００ｍｍｏｌ）のジテトラデコキシベンジルアルコールの溶液を装填した、１００ｍＬの丸底フラスコに対し、１，４−ジオキサン中の、２０ｍＬの４．０Ｍ ＨＣ溶液を添加した。次に、フラスコに還流コンデンサーを取り付け、これを炭酸水素ナトリウム溶液に接続して、発生した任意の塩化水素ガスを吸収した。反応混合物を８０℃で６時間加熱した後、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン）は、反応の完了を示した。溶媒及び過剰の試薬を、ロータリーエバポレーションにより、真空下で完全に除去して、２．６９ｇ（９７％）の灰色の固体、３，４−ジテトラデコキシルベンジルクロリドを得た。この粗物質を、さらなる精製なしに次の工程に直接用いた。
ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（２．００ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、真空下にトルエン（２ｘ２０ｍＬ）で共蒸発させることによって乾燥した。用いたＰＥＧは、ＰＥＧ２０００であり、これは典型的には、〜１５００から〜３０００Ｄａまで変動し得る多分散物である（すなわち、ここでＰＥＧ（ｎ）は、約３３ないし約６７、又は平均して〜４５である）。３０ｍＬの無水トルエン中の、乾燥ポリ（エチレングリコール）の溶液に対し、０．１７ｇ（７．２ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウムを、攪拌しながら分割添加した。即座にガス発生が起きた。得られた混合物を６０℃で２時間攪拌し続け、オキシドの完全な形成を確保した。次に、１０ｍＬの無水トルエン中の、０．６６８ｇ（１．２０ｍｍｏｌ）の３，４−ジテトラデコキシルベンジルクロリドの溶液を、上記の混合物に滴下投入した。反応混合物を、８０℃で一晩静置した。冷却後、１０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液の添加により、反応をクエンチした。得られた混合物を、次に、３００ｍＬのジクロロメタン中に取り、飽和塩化アンモニウム（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水し、蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン ２：９８−５：９５）により精製して、１．２４ｇ（４９％）の所望の生成物の灰色の固体を得た。
ＰＥＧ−ＤＭＧ（図３０Ｂ）
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＭＧ−ＯＨ）（１）（１０．０ｇ）及び１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（２）（３．３２ｇ、１．０５当量）を、磁気攪拌子及びゴムセプタを具備した２５０ｍＬの乾いた丸底フラスコに、アルゴン下で添加した。フラスコに５０ｍＬの無水ＴＨＦを装填し、得られた混合物を室温で６時間攪拌した。攪拌子を除去し、反応混合物を、１Ｌの分液漏斗に、３５０ｍＬの酢酸エチルとともに移した。反応混合物を２００ｍＬの脱イオン水で洗浄した。水性相を除去し、洗浄を繰り返し（２ｘ）、有機相を収集し、１０ｇの硫酸マグネシウム上で攪拌しながら脱水した。焼結ガラスでの濾過及びそれに続く真空中での蒸発により、１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ−カルボキシイミダゾール（ＤＭＧ−ＣＤＩ）（３）；１１．６８ｇ、９９％を得た。攪拌子及びゴムセプタムを具備した２００ｍＬの丸底フラスコ内の、メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨ２ ２Ｋ（ＰＥＧ−アミン）（４）（２．３６ｇ）；１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ−カルボキシイミダゾール（ＤＭＧ−ＣＤＩ）（３）（１．９１ｇ、３．０当量）；及び４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０２５ｇ，０．２当量）の混合物に対し、アルゴンン下に、ＴＨＦ（２０ｍＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＰＥＡ）（１．１０ｍＬ、６．０当量）を添加した。用いたＰＥＧは、ＰＥＧ２０００であり、これは典型的には、〜１５００から〜３０００Ｄａまで変動し得る多分散物である（すなわち、ここでＰＥＧ（ｎ）は、約３３ないし約６７、又は平均して〜４５である）。溶液を、１７時間還流及び攪拌させ、その後、反応混合物を室温に冷却し、攪拌子を除去し、反応を真空中で濃縮して、粗１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（５）４．３１ｇを得た。
実施例１９：ナノ粒子被包ｓｉＮＡ／担体製剤の調製
全般的なＬＮＰ調製
ｓｉＮＡナノ粒子溶液は、ｓｉＮＡ及び／又は担体分子を、２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中に、０．９ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解することにより調製した。脂質溶液は、カチオン性脂質（例えば、ＣｌｉｎＤＭＡ又はＤＯＢＭＡ、構造及び比率は表ＩＶの製剤を参照）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＭＧ（比率は表ＩＶに示した）の混合物を、無水エタノール中に、約１５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解することにより調製した。窒素対ホスフェイトの比は、約３：１であった。
同体積の、ｓｉＮＡ／担体及び脂質溶液を、２つのＦＰＬＣポンプにより、同じ流速で、ミキシングＴコネクターに送達した。背圧バルブを用いて所望の粒子サイズに調整した。得られた乳状の混合物を、無菌のガラス瓶に収集した。この混合物を、次に、同体積のクエン酸緩衝液で希釈し、イオン交換膜を通して濾過し、混合物中の任意の遊離のｓｉＮＡ／担体を除去した。限外濾過を、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に対し用いてエタノールを除去し（アルコ（ＡＬＣＯ）スクリーンからのテストスティック）、かつＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対し用いて緩衝液を交換した。最終的なＬＰＮを、所望の体積に濃縮し、かつ０．２μｍのフィルターを通し滅菌濾過することによって得た。得られたＬＮＰは、粒子サイズ、ゼータ電位、アルコール含有量、全脂質含有量、核酸被包、及び全核酸濃度についてキャラクタライズした。
ＬＮＰ製造プロセス
非限定的例においては、ＬＮＰ−０８６ｓｉＮＡ／担体製剤を、以下のようにバルクで調製する。プロセスに関するプロセス工程系統図は、表ＶＩＩＩに示されており、これは、ｓｉＮＡ／担体カクテル（２つのｓｉＮＡ／担体二重鎖が示されている）に、又は単一のｓｉＮＡ／担体二重鎖に適用し得る。プロセスは、（１）脂質溶液を調製すること；（２）ｓｉＮＡ／担体溶液を調製すること；（３）混合／粒子形成；（４）インキュベーション；（５）希釈；（６）限外濾過及び濃縮、からなる。
１．脂質溶液の調製
要約：コンデンサーを備えた３口丸底フラスコに、ＣｌｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールの混合物を添加した。次にエタノールを添加した。懸濁液を、アルゴン下に攪拌子で攪拌し、プロセスコントローラで制御された加熱用マントルを用いて３０℃に加熱した。懸濁液が透明化した後、溶液を室温に冷却した。
８ＬバッチのＬＮＰの製剤のための詳細な手順
１．２Ｌの３口丸底フラスコ、コンデンサー、メスシリンダー、及び２つの１０Ｌの円錐形ガラス容器をピロゲン除去する。
２．脂質を室温に温める。丸底フラスコの風袋を差し引く。ＣｌｉｎＤＭＡ（５０．４４ｇ）を、ピペットエイドを用いてピペットにより３口丸底フラスコに移す。
３．ＤＳＰＣ（４３．３２ｇ）、コレステロール（５．３２ｇ）、及びＰＥＧ−ＤＭＧ（６．９６ｇ）を、秤量紙を用いて、連続的に丸底フラスコに秤量する。
４．リノレイルアルコール（２．６４ｇ）を、別のガラスバイアル（ピロゲン除去された）に秤量する。最初にバイアルの風袋を差し引き、次に化合物をピペットによりバイアル内へ移す。
５．脂質を中に入れた丸底フラスコの全重量を測り、風袋を差し引く。誤差は、通常±１．０％未満であった。
６．脂質溶液に必要な、八分の一のエタノール（１Ｌ）を、丸底フラスコに移す。
７．加熱用マントル内に置かれた丸底フラスコを、Ｊ−ＣＨＥＭプロセスコントローラに接続した。脂質懸濁液を、攪拌子及び上部のコンデンサーを用いて、アルゴン下に攪拌した。熱電対プローブを、密閉アダプター付きの丸底フラスコの１口から、懸濁液内に入れた。
８。懸濁液を３０℃で、透明になるまで加熱した。溶液を室温に冷却し、円錐形ガラス容器に移し、キャップを密閉した。
２．ｓｉＮＡ／担体溶液の調製
要約：ｓｉＮＡ／担体溶液は、単一のｓｉＮＡ二重鎖及び／又は担体を含んでなることができ、或いはまた、２種以上のｓｉＮＡ二重鎖のカクテル及び／又は担体を含んでなってもよい。単一のｓｉＮＡ／担体二重鎖の場合、ｓｉＮＡ／担体は、２５ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解し、終濃度を０．９ｍｇ／ｍＬとする。二種のｓｉＮＡのカクテル／担体分子の場合、ｓｉＮＡ／担体溶液は、それぞれのｓｉＮＡ／担体分子を、全予想体積の５０％の２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解することにより調製し、終濃度を０．９ｍｇ／ｍＬとする。この方法を、他のｓｉＮＡ／担体分子について繰り返す。２つの０．９ｍｇ／ｍＬのｓｉＮＡ／担体溶液を合わせ、０．９ｍｇ／ｍＬの溶液を、２つのｓｉＮＡ分子を含有する全体積において生じる。
８ＬバッチのＬＮＰをｓｉＮＡカクテルと共に製剤するための詳細な手順
１．３．６ｇ掛ける水分補正係数（約１．２）のｓｉＮＡ−１粉末を、無菌容器、例えばコーニング（Ｃｏｒｎｉｇ）保存瓶に秤量する。
２．ｓｉＮＡを、ピロゲン除去した５Ｌのガラス容器に移す。秤量容器を３ｘのクエン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ４．０、及び１００ｍＭ ＮａＣｌ）ですすぎ、すすぎ液を５Ｌ溶液に入れ、適量のクエン酸緩衝液で４Ｌとする。
３．ｓｉＮＡ溶液の濃度を、ＵＶ分光計で測定する。一般的には、溶液から２０μＬを取り、５０倍希釈して１０００μＬとし、クエン酸緩衝液でブランキングした後に、Ａ２６０においてＵＶ測定値を記録する。平行したサンプルを作成し、測定する。もし２つのサンプルの測定値が一致すれば、平均をとり、ｓｉＮＡの吸光係数に基づき濃度を計算する。終濃度が０．９０±０．０１ｍｇ／ｍＬの範囲外であれば、さらなるｓｉＮＡ／担体粉末の添加によって、又は、さらなるクエン酸緩衝液を添加して濃度を調整する。
４．ｓｉＮＡ−２について繰り返す。
５．１０１ ピロゲン除去した１０Ｌのガラス容器に、４Ｌの、それぞれ０．９ｍｇ／ｍＬのｓｉＮＡ溶液を移す。
滅菌濾過
このプロセスは、脂質／エタノール溶液を滅菌濾過するための手順を記載する。この目的は、被包プロセス用に無菌の出発物質を提供することである。濾過プロセスは、８０ｍＬスケールで２０ｃｍ２の膜面積で行なった。流速は、２８０ｍＬ／分である。このプロセスは、チュービングの直径及び濾過面積を増大することによりスケーラブルである。
１．材料
ａ．ナルゲン５０シリコン・チュービング（Ｎａｌｇｅｎ ５０ Ｓｃｉｌｉｃｏｎｅ Ｔｕｂｉｎｇ）ＰＮ８０６０−００４０、オートクレーブ済み
ｂ．マスター・フレックス・ペリスタルティック・ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ） モデル７５２０−４０
ｉ．マスター・フレックス・ポンプ・ヘッド モデル７５１８−００
ｃ．ポール・アクロパック（Ｐａｌｌ Ａｃｒｏｐａｋ）２０ ０．８／０．２μｍ 無菌フィルター ＰＮ １２２０３
ｄ．ピロゲン除去した１０Ｌのガラス容器
ｅ．オートクレーブした、ガラス容器用のリッド
２．手順
ａ．チュービングをポンプヘッドに入れる。ポンプを、全スピードの５０％にセットし、１分間にわたり流速をメスシリンダーで測定する。
ｂ．ポンプ設定を、２８０ｍＬ／分の流速を測定するまで調整する。
ｃ．チュービングにフィルターをセットアップし、クランプで確実に取り付ける。
ｄ．ポンプをセットアップし、チュービングをポンプヘッドに入れる。
ｅ．チュービングのフィード（供給）端を濾過されるべき物質の中に入れる。
ｆ．フィリングベル付きのフィルターの濾液側を、ピロゲン除去したガラス容器内に入れる。
ｇ．材料を、フィルターを通してポンプし、全ての材料が濾過されるまで注入する。
ＡＫＴＡポンプセットアップ
１．材料
ａ．ＡＫＴＡ Ｐ９００ポンプ
ｂ．テフロン（登録商標）チュービング 内径２ｍｍｘ外径３ｍｍ 各２の２０．５ｃｍアップチャーチ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ）ＰＮ１６７７
ｃ．テフロン（登録商標）チュービング 内径１ｍｍｘ外径３ｍｍ ６．５ｃｍ Ｕｐｃｈｕｒｃｈ ＰＮ１６７５
ｄ．ピーク・ティー（Ｐｅｅｋ Ｔｅｅ）内径１ｍｍ 各１ Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｐ
Ｎ Ｐ−７１４
ｅ．１／４−２８Ｆないし１０−３２Ｍ 各２ Ｕｐｃｈｕｒｃｈ ＰＮ Ｐ−６５
２
ｆ．３ｍｍ外径チュービング用のＥＴＦＥフェルール 各６ Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｐ
Ｎ Ｐ−３４３ｘ
ｇ．フランジレスナット 各６ Ｕｐｃｈｕｒｃｈ ＰＮ Ｐ−３４５ｘ
ｈ．１／４−２８フラッボトムフィッティング用ＥＴＦＥキャップ 各１ Ｕｐｃｈ
ｕｒｃｈ ＰＮ Ｐ−７５５
ｉ．アルゴン圧縮ガス
ｊ．レギュレータ ０−６０ｐｓｉ
ｋ．テフロン（登録商標）チュービング
ｌ．ピーク（Ｐｅｅｋ）Ｙフィッティング
ｍ．ピロゲン除去したガラス器具コニカルベース、２個／ポンプ
ｎ．オートクレーブ化したリッド
ｏ．プレッシャーリッド
２．ポンプセットアップ
ａ．ポンプのスイッチを入れる
ｂ．ポンプにセルフテストを実行させる
ｃ．キャップ又はプレッシャーレギュレータがチュービングに取り付けられていないことを確認する（このことは、ポンプに過圧を引き起こすことがある）
ｄ．「ＯＫ］を押して、ポンプを同時進行させる
ｅ．ノブ４を時計回りにクリックして「Ｓｅｔｕｐ」とし、「ＯＫ」を押す
ｆ．ノブ５を時計回りにクリックして「Ｓｅｔｕｐ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｏｄｅ」とし、「ＯＫ」を押す
ｇ．ノブ１を時計回りにクリックして「Ｄ」とし、「ＯＫ」を押す
ｈ．「Ｅｓｃ」を２回押す
３．ポンプの浄化
ａ．１０００ｍＬの、１Ｎ ＮａＯＨを、１Ｌのガラス容器に入れる
ｂ．プレッシャーリッドでポンプに取り付ける
ｃ．１０００ｍＬの、７０％エタノールを、１Ｌのガラス容器に入れる
ｄ．プレッシャーリッドでポンプに取り付ける
ｅ．２０００ｍＬのガラス容器を下のポンプ出口に置く
ｆ．ノブ１を時計回りにクリックして「ＳＥＴ Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ」とし、「ＯＫ」を押す
ｇ．ノブを時計回りに回して流速を４０ｍＬ／分まで上げる；反時計回りで下げる；所望の流速がセットされたら「ＯＫ」を押す。
ｈ．時間を４０分間にセットする
ｉ．アルゴンガスを１０ｐｓｉでオンにする
ｊ．ノブ２を反時計回りにクリックして「Ｒｕｎ」にし「ＯＫ］を押し、タイマーをスタートする
ｋ．ノブ１を反時計回りにクリックして「Ｅｎｄ Ｈｏｌｄ Ｐａｕｓｅ」とする
ｌ．タイマーが鳴ったら、ポンプの「ＯＫ」を押す
ｍ．ガスをオフにする
ｎ．使用の準備ができるまでポンプを浄化溶液中に保存する（一晩？）
４．ポンプ流速チェック
ａ．２００ｍＬのエタノールを、５００ｍＬのピロゲン除去したガラス容器に入れる
ｂ．プレッシャーキャップでポンプに取り付ける
ｃ．２００ｍＬの、無菌のクエン酸緩衝液を、５００ｍＬのピロゲン除去したガラスガラス瓶に入れる
ｄ．プレッシャーキャップでポンプに取り付ける
ｅ．１００ｍＬのメスシリンダーを下のポンプ出口に置く
ｆ．ノブ１を時計回りにクリックして「ＳＥＴ Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ」とし、「ＯＫ」を押す
ｇ．ノブを時計回りに回して流速を４０ｍＬ／分まで上げる；反時計回りで下げる；所望の流速がセットされたら「ＯＫ」を押す。
ｈ．時間を１分間にセットする
ｉ．アルゴンガスを１０ｐｓｉでオンにする
ｊ．ノブ２を反時計回りにクリックして「Ｒｕｎ」にし「ＯＫ］を押し、タイマーをスタートする
ｋ．ノブ１を反時計回りにクリックして「Ｅｎｄ Ｈｏｌｄ Ｐａｕｓｅ」とする
ｌ．タイマーが鳴ったら、ポンプの「ＯＫ」を押す
ｍ．ガスをオフにする
ｎ．４０ｍＬのエタノール／クエン酸溶液が送達されたことを確認する。
３．粒子形成−混合工程
ｏ．無菌の脂質／エタノール溶液をＡＫＴＡポンプに取り付ける
ｐ．無菌のｓｉＮＡ／担体又はｓｉＮＡ／担体カクテル／クエン酸緩衝溶液を、ＡＫＴＡポンプに取り付ける
ｑ．リッド付きのピロゲン除去した受容容器（２ｘバッチサイズ）を取り付ける
ｒ．計算された混合時間用の時間をセットする
ｓ．アルゴンガスをオンにして、圧力を５ないし１０ｐｓｉに維持する
ｔ．ノブ２を反時計回りにクリックして「Ｒｕｎ」にし「ＯＫ］を押し、タイマーをスタートする
ｕ．ノブ１を反時計回りにクリックして「Ｅｎｄ Ｈｏｌｄ Ｐａｕｓｅ」とする
ｖ．タイマーが鳴ったら、ポンプの「ＯＫ」を押す
ｗ．ガスをオフにする
４．インキュベーション
混合後、溶液を２２±２時間インキュベーションに保持する。インキュベーションは、室温（２０ないし２５℃）において行ない、加工中の溶液は遮光する。
５．希釈
脂質ｓｉＮＡ溶液を、同体積のクエン酸緩衝液で希釈する。溶液を、等長のチュービング及びＴｅｅコネクションを具備したデュアルヘッドペリスタルティックポンプで希釈する。流速は３６０ｍＬ／分である。
１．材料
ｈ．ナルゲン５０シリコン・チュービング（Ｎａｌｇｅｎｅ ５０ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｔｕｂｉｎｇ）ＰＮ８０６０−００４０、オートクレーブ済み
ｉ．Ｔｅｅ １／４‘ＩＤ
ｊ．マスター・フレックス・ペリスタルティック・ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ） モデル７５２０−４０
ｉ．マスター・フレックス・ポンプ・ヘッド モデル７５１８−００
ｉｉ．マスター・フレックス・ポンプ・ヘッド モデル７５１８−００
ｋ．ピロゲン除去した２ｘ２０Ｌのガラス容器
ｌ．オートクレーブした、ガラス容器用のリッド
２．手順
ａ．２つの等長のチュービングを、Ｔｅｅコネクターに取り付ける。チュービングは、長さ約１メートルとすべきである。約５０ｃｍの第３のチュービング片を、Ｔｅｅコネクターの出口端に取り付ける。
ｂ．チュービング装置を、デュアルポンプヘッドに入れる。
ｃ．チュービング装置のフィード端をエタノール溶液中に入れる。他方のフィード端を同体積のクエン酸緩衝液中に入れる。
ｄ．ポンプ速度コントロールを５０％にセットする。時間を１分間にセットする。
ｅ．チュービング装置の出口端を、５００ｍＬのメスシリンダーに入れる。
ｆ．ポンプをオンにし、タイマーをスタートする。
ｇ．タイマーが鳴ったらポンプを止め、送達された体積を測定する。
ｈ．ポンプ流速を３６０ｍＬ／分に調整する。
ｉ．流速をセットする際、チュービングを排水する。
ｊ．チュービング装置の一方のフィード端を、脂質／ｓｉＮＡ溶液に入れる。チュービング装置の他方のフィード端を、同体積のクエン酸緩衝液（１６Ｌ）に入れる。
ｋ．チュービング装置の出口端を、２ｘ２０Ｌのピロゲン除去したガラス容器の１番目に入れる。
ｌ．タイマーを９０分間にセットし、ポンプをスタートする、流速が等しいことを確認するため、希釈の進行を視覚的にモニターする。
ｍ．受容容器が１６Ｌになれば、次の容器に交換して、１６Ｌを収集する。
ｎ．全ての材料が移された時点でポンプを停止する。
６．限外濾過及び濃縮
要約：限外濾過プロセスは、時限性のプロセスであり、流速を注意深くモニターするべきである。膜面積は、バッチの体積に基づき判定されてきた。これは、二段階のプロセスである；第１は、希釈された材料を３２リットルから３６００ｍＬへ、及び約２ｍｇ／ｍＬの濃度とする、濃縮工程である。濃縮工程は、約４時間±１５分間である。第２の工程
は、エタノールクエン酸緩衝液をリン酸緩衝食塩水へ交換する、透析濾過工程である。透析濾過工程は、３時間であり、再度、流速を注意深くモニターするべきである。この工程を通じて、エタノール濃度を、ヘッドスペースＧＣによりモニターする。３時間後（２０透析濾過体積）、第二の濃度は、溶液を、約６ｍｇ／ｍＬ又は体積１．２リットルに濃縮するべく保証される。この物質を、ピロゲン除去したガラス容器に収集する。このシステムを、４００ｍＬのＰＢＳで、高流速ですすぎ、透過物ラインを閉じる。この物質を収集して、第１のコレクションに加える。この時点で期待される濃度は、４．５ｍｇ／ｍＬである。濃度及び体積を測定する。
１．材料
ｘ．クアトロフロー（Ｑｕａｔｒｏｆｌｏｗ）ポンプ
ｙ．フレックススタンド（Ｆｌｅｘｓｔａｎｄ）システム、オートクレーブ済みの５Ｌの容器付き
ｚ．限外濾過膜 ＧＥ ＰＮ ＵＦＰ−１００−Ｃ−３５Ａ
ａａ．ＰＢＳ ０．０５μｍで濾過 １００Ｌ
ｂｂ．０．５Ｎ 水酸化ナトリウム
ｃｃ．ＷＦＩ
ｄｄ．ナルゲン５０シリコン・チュービング（Ｎａｌｇｅｎｅ ５０ Ｓｃｉｌｉｃｏｎｅ Ｔｕｂｉｎｇ）ＰＮ８０６０−００４０、オートクレーブ済み
ｅｅ．マスター・フレックス・ペリスタルティック・ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ） モデル７５２０−４０
ｉ．マスター・フレックス・ポンプ・ヘッド モデル７５１８−００
ｆｆ．透過物収集容器 １００Ｌ容量
ｇｇ．ピロゲン除去したメスシリンダー ２Ｌ、１ｌ、５００ｍＬ
２．手順
ａ．システム調製
ｉ．Ｆｌｅｘｓｔａｎｄホルダーに、適当なサイズの膜用のサニタリーフィッティングを用いて、膜をインストールする。ＦｌｅｘｓｔａｎｄをＱｕａｔｒｏｆｌｏｗポンプに取り付ける。チュービングをリテンテート（循環液、ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）及びパーメエート（透過液、ｐｅｒｍａｔｅ）コネクションに取り付け、これらを適当な空き容器に入れる。
ｉｉ．システムのホールドアップ体積を決める。
１．１リットルのＷＦＩをリザーバーに入れる。
２．パーメエートラインをクランプする。
３．Ｑｕａｎｔｒｏｆｌｏｗポンプをスタートし、リテンテートラインに気泡が存在しなくなるまで再循環する。ポンプを停止する。
４．リザーバーにマークを付し、１リットルの示度を記録する。
５．２００ｍＬのＷＦＩをリザーバーに添加し、１２００ｍＬレベルにマークを付す。
ｉｉｉ．３リットルの０．５Ｎ 水酸化ナトリウムをリザーバーに添加し、リテンテートからフラッシュして廃棄する。３Ｌの０．５Ｎ 水酸化ナトリウムをリザーバーに添加し、リテンテートを再循環させ、パーメエートからへフラッシュして廃棄する。３回目の３Ｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムをリザーバーに添加し、パーメエートラインを通してリザーバーに３０分間再循環させる。使用に先立ち、システムを０．５Ｎ 水酸化ナトリウム中に一晩保存する。
ｖｉ．水酸化ナトリウムをフラッシュして廃棄する。
ｖ．３ＬのＷＦＩをリザーバーに添加し、ｐＨが中性になるまでリテンテートをフラッシュして廃棄し、必要に応じてＷＦＩを交換する。リテンテートラインをリザーバーに戻す。
ｖｉ．３ＬのＷＦＩを添加し、ｐＨが中性になるまでパーメエートラインをフラッシュして廃棄し、必要に応じてＷＦＩを交換する。システムを排水する。
ｖｉｉ．３Ｌのクエン酸緩衝液をリザーバーに添加する。ｐＨが＜５になるまでパーメエートラインを通してフラッシュする。必要に応じて、クエン酸緩衝液を添加する。
ｖｉｉｉ．システムを排水する。
ｂ．ＬＮＰ濃縮
ｉ．適当な長さのチュービングを、ペリスタルティックポンプヘッドに入れる。
ｉｉ．フィード端を、希釈ＬＮＰ溶液に入れる；他方の端をリザーバーに入れる。
ｉｉｉ．希釈ＬＮＰ溶液をリザーバー内に、４リットルのマークまでポンプする。
ｉｖ．パーメエートラインを清浄な空き容器に入れる。
ｖ．Ｑｕａｎｔｒｏｆｌｏｗポンプをスタートし、ポンプ速度を調整し、透過流速を３００ｍＬ／分とする。
ｖｉ．ペリスタルティックポンプを３００ｍＬ／分に調整して、リザーバー内の液体レベルが一定して４Ｌであるようにする
ｖｉｉ．全ての希釈ＬＮＰ溶液がリザーバーに移された時点で、ペリスタルティックポンプを停止する。
ｖｉｉｉ．希釈ＬＮＰ溶液を、必要に応じてポンプ速度を調整することにより、２４０分間で３６００ｍＬに濃縮する。
ｉｘ．パーメエート流速、ポンプセッティング、及び、フィード及びリテンテート圧をモニターする。
ｃ．ＬＮＰ透析濾過
ｉ．ペリスタルティックポンプのフィードチュービングを、７２ＬのＰＢＳ（０．０５μｍで濾過した）を含有する容器に入れた。
ｉｉ．ペリスタルティックポンプをスタートし、リザーバー内で３６００ｍＬの一定体積を維持するように流速を調整する。
ｉｉｉ．Ｑｕａｎｔｒｏｆｌｏｗポンプの流速を、４００ｍＬ／分に上げる。
ｉｖ．パーメエート流速、ポンプセッティング、及び、フィード及びリテンテート圧をモニターする。
ｖ．エタノール濃度を、ＧＣによりモニターする。
ｖｉ．ＬＮＰ溶液を、ＰＢＳ（２０体積）により１８０分間透析濾過する。
ｖｉｉ．ペリスタルティックポンプを停止する。チュービングをリザーバーから除去する。
ｄ．終濃度
ｉ．ＬＮＰ溶液を、１．２リットルのマークまで濃縮する。
ｉｉ．ＬＮＰ溶液を、ピロゲン除去した２Ｌのメスシリンダーに収集する。
ｉｉｉ．４００ｍＬのＰＢＳ溶液を、リザーバーに添加する。
ｉｖ．ポンプをスタートし、２分間再循環させる。
ｖ．リンスを収集し、メスシリンダー中の収集したＬＮＰ溶液に添加する。
ｖｉ．ＬＮＰ溶液の体積を記録する。
ｖｉｉ．２Ｌのピロゲン除去したガラス容器に移す。
ｖｉｉｉ．ラベルを付し、冷蔵する。
ｅ．システム浄化
ｉ．１ＬのＷＦＩをリザーバーに添加する
ｉｉ．パーメエートを閉じて５分間再循環させる。
ｉｉｉ．システムを排水する
ｉｖ．２Ｌの０．５Ｎ 水酸化ナトリウムをリザーバーに添加する
ｖ．５分間再循環させる。
ｖｉ．システムを排水する
ｖｉｉ．２Ｌの０．５Ｎ 水酸化ナトリウムをリザーバーに添加する。
ｖｉｉｉ．５分間再循環させ、ポンプを停止する。
ｉｘ．ＷＦＩでシステムを中和する。
ｘ．システムを排水し、膜を廃棄する。
得られたＬＮＰを、粒子サイズ、ゼータ電位、アルコール含有量、全脂質含有量、核酸被包、及び全核酸濃度についてキャラクタライズした。
実施例２０：混合物としての活性の改善
担体効果が、多数のｓｉＲＮＡについて、混合物中で、効率的なＲＮＡｉを可能にするかどうかを探るため、３つの異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを用いた（図５４参照）。ＳＳＢ２９１、ＣＲＴＣ２：２８３、及びＩＫＫ２ ２３８９ｓｉＲＮＡを、３ｍｇ／ｋｇで、単独に、又は全三種を、２．１ｍｇ／ｋｇの担体ＨＣＶ３１６と共に、全用量３ｍｇ／ｋｇで投与した。ｓｉＲＮＡを、０．３ｍｇ／ｋｇで個別に投与した場合、それらは意図した標的に対し、中程度ないしは全く無しのノックダウンを示した。一方、混合物として与えた場合、ノックダウン効率は有意に改善された。ＳＳＢ２９１では、標的ノックダウンは、単独で与えたときの３１％から、混合物として与えたときの７７％に改善された。
ＣＴＣ２：２８３では、標的ノックダウンは、単独で与えたときの１７％から、混合物として与えたときの４１％に改善された。ＩＫＫ２：２３８９では、単独で与えた場合何ら標的ノックダウンは見られなかったが、混合物として与えると４８％に改善された。したがって、各ｓｉＲＮＡの濃度が０．３ｍｇ／ｋｇであっても、単独で又は混合物において与えた場合、それらを混合物として投与することにより、活性において有意な改善を達成した。このことは、低い用量で多数の標的を標的化して、相加又は相乗効果を達成することを可能にする。
実施例２１：有益な担体効果のための空のＬＮＰの使用
担体カーゴの性質をさらに理解するため、空のＬ２０１を調製した。ＳＳＢ２９１ Ｌ２０１を、１ｍｇ／ｋｇで単独に、又は、担体としての空のＫ２０１の存在下に全用量３ｍｇ／ｋｇで注射した。全肝臓ＲＮＡを単離し、ＳＳＢＲＮＡについて分析した。図５５に示したように、ＳＳＢ２９１は、単独で投与した場合、標的ＲＮＡの５４％のノックダウンを示したが、空のＬＮＰ担体と共に与えた場合、ノックダウン効率は７９％に改善した。空のＬＮＰ、担体自体は、ＳＳＢ標的の有意なノックダウンは示さなかった。この結果は、ＲＮＡｉ活性の強化が空のＬＮＰ、「空の担体」によって達成され得ることを示している。
本明細書において記載された全ての特許及び刊行物は、本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本開示において引用された全ての参考文献は、各々の参考文献が個別にその記載全体が参考として含まれたのと同じ程度に、参考として本明細書に含まれる。
当業者は、本発明が、その目的を実施し、記載された結果及び利点、並びに本明細書に固有のものを得るために、充分に適合していることを容易に理解するであろう。現在の好ましい実施態様の代表的なものとして、本明細書に記載された方法及び組成物は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。当業者には、クレームの範囲において定義される、本発明の精神の範囲内に包含される変更及び他の用途が、見出されるであろう。
当業者は、本発明の範囲及び精神から離れることなく、本明細書に開示された本発明に対し、種々の置換及び改変をなし得ることを容易に理解するであろう。すなわち、かかる付加的な実施態様は、本発明及び以下のクレームの範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介する改善された活性を有する核酸コンストラクトの生成に向けて、本明細書に記載の化学修飾の、種々の組合せ及び／又は置換を試験することを、当業者に教示している。かかる改善された活性は、改善された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、及び／又は、ＲＮＡｉ活性を媒介する細胞応答の改善された活性化を含み得る。それ故、本明細書に記載された特定の実施態様は、限定するものではなく、当業者は、改善されたＲＮＡｉ活性をもつｓｉＮＡ分子の同定に向けて、不必要な実験をすることなく、本明細書に記載された修飾の特定の組合せを試験し得ることを、容易に理解することができる。
本明細書において例示的に記載された発明は、本発明に具体的に開示されていない任意の要素、又は限定なしに、適切に実施することができる。用いてきた用語及び表現は、記載のための用語として使用されたものであり、制限するものではなく、かかる用語及び表現の使用においては、示されかつ記載された特徴、又はその一部の、任意の同等物を排除することを意図したものではなく、クレームされた本発明の範囲内で種々の修飾が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施態様及び任意の特徴により本発明を具体的に開示してきたが、本明細書に開示された概念の、任意の特徴、修飾、及び変動が、当業者により修復されてよいこと、及びかかる修飾及び変動が、記載及び添付のクレームにより定義された本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
さらに、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュグループ又は他の代替えグループの概念で記載されている場合、当業者は、本発明もまたそれにより、マーカッシュグループ又は他のグループの、任意の個々のメンバー又はサブグループのメンバーの概念において記載されることを認識するであろう。
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ＣＬｉｎＤＭＡ構造式
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ｐＣＬｉｎＤＭＡ 構造式
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ｅＣＬｉｎＤＭＡ構造式
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ＤＥＧＣＬｉｎＤＭＡ構造式
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ＰＥＧ−ｎ−ＤＭＧ構造式
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ＤＭＯＢＡ構造式
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ＤＭＬＢＡ構造式
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ＤＯＢＡ構造式
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ＤＳＰＣ構造式
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コレステロール構造式
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２ＫＰＥＧ−コレステロール構造式
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２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ構造式
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ＣＯＩＭ構造式
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５−ＣＬＩＭ 及び ２−ＣＬＩＭ構造式
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Claims (33)

  1. 各々が約５０ｎｍないし約５００ｎｍのサイズを有している、第１の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクル及び第２の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物であって、
    ａ）各ビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなり；
    ｂ）前記第１のＬＮＰビヒクルはさらに、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長である、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖を含んでなる、１つ以上の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなり、ここで、前記アンチセンス鎖は、哺乳類ＲＮＡ配列に相補的である１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなり、かつ前記センス鎖は、前記哺乳類ＲＮＡ配列の１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなり；かつ
    ｃ）前記第２のＬＮＰビヒクルはさらに、前記哺乳類ＲＮＡ配列に相補的ではない少なくとも１５ヌクレオチドの核酸配列を含んでなる、１つ以上の担体分子を含んでなり；
    これにおいて、前記第１のＬＮＰビヒクルの脂質は、前記第２のＬＮＰビヒクルと同じか又は異なっている、前記組成物。
  2. 前記各脂質ナノ粒子ビヒクルの脂質成分が同じである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記各脂質ナノ粒子ビヒクルが、脂質成分からなる異なる組成物を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記第１及び第２の脂質ナノ粒子ビヒクルが、それぞれ、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９、１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
  5. 各ＬＮＰビヒクルがさらに、リノレイルアルコールを含んでなる、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールが、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有している、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ｓｉＮＡ分子が、１つ以上のリボヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記センス鎖に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記アンチセンス鎖に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記センス鎖に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記アンチセンス鎖に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
  12. 請求項１に記載の組成物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に含んでなる組成物。
  13. 約５０ｎｍないし約５００ｎｍのサイズを有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物であって、
    ａ）前記脂質ナノ粒子ビヒクルが、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなり；
    ｂ）前記ビヒクルがさらに、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長である、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖を含んでなる、１つ以上の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなり、ここで、前記アンチセンス鎖は、哺乳類ＲＮＡ配列に相補的である１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなり、かつ前記センス鎖は、前記哺乳類ＲＮＡ配列の１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなり；
    ｃ）前記ビヒクルがさらに、前記哺乳類ＲＮＡ配列に相補的ではない少なくとも１５ヌクレオチドの核酸配列を含んでなる、１つ以上の担体分子を含んでなる、
    前記組成物。
  14. 前記脂質ナノ粒子ビヒクルが、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記ＬＮＰビヒクルがさらに、リノレイルアルコールを含んでなる、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールが、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有している、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記ｓｉＮＡ分子が、１つ以上のリボヌクレオチドを含んでなる、請求項１３に記載の組成物。
  18. 前記センス鎖に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである、請求項１３に記載の組成物。
  19. 前記アンチセンス鎖に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである、請求項１３に記載の組成物。
  20. 前記センス鎖に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、請求項１３に記載の組成物。
  21. 前記アンチセンス鎖に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、請求項１３に記載の組成物。
  22. 請求項１３に記載の組成物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に含んでなる組成物。
  23. １つ以上の担体分子と、約５０ｎｍないし約５００ｎｍのサイズを有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルとを含んでなる組成物であって、
    ａ）前記脂質ナノ粒子ビヒクルが、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなり；かつ
    ｂ）前記ビヒクルがさらに、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長である、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖を含んでなる、１つ以上の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなり、ここで、前記アンチセンス鎖は、哺乳類ＲＮＡ配列に相補的である１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなり、かつ前記センス鎖は、前記哺乳類ＲＮＡ配列の１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなる、
    前記組成物。
  24. 前記脂質ナノ粒子ビヒクルが、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３β−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び１−［８’−（１，２−ジミリストイル−３−プロパンオキシ）−カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含んでなる、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記ＬＮＰビヒクルがさらに、リノレイルアルコールを含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びリノレイルアルコールが、約４３／３６／１０／４／７のモル比を有している、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ｓｉＮＡ分子が、１つ以上のリボヌクレオチドを含んでなる、請求項２３に記載の組成物。
  28. 前記センス鎖に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである、請求項２３に記載の組成物。
  29. 前記アンチセンス鎖に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである、請求項２３に記載の組成物。
  30. 前記センス鎖に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、請求項２３に記載の組成物。
  31. 前記アンチセンス鎖に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、請求項２３に記載の組成物。
  32. 請求項２３に記載の組成物を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に含んでなる組成物。
  33. 各々が約５０ｎｍないし約５００ｎｍのサイズを有している、第１の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクル及び第２の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ビヒクルを含んでなる組成物であって、
    ａ）各ビヒクルは、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ−脂質を含んでなり；
    ｂ）前記第１のＬＮＰビヒクルはさらに、各鎖が１５ないし３０ヌクレオチド長である、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖を含んでなる、１つ以上の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含んでなり、ここで、前記アンチセンス鎖は、哺乳類ＲＮＡ配列に相補的である１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなり、かつ前記センス鎖は、前記哺乳類ＲＮＡ配列の１５ないし３０ヌクレオチドを含んでなり；かつ
    ｃ）前記第２のＬＮＰビヒクルはさらに、１つ以上の空の担体分子を含んでなり；
    これにおいて、前記第１のＬＮＰビヒクルの脂質は、前記第２のＬＮＰビヒクルと同じか又は異なっている、前記組成物。
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