CN106794141B

CN106794141B - 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法

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Publication number: CN106794141B
Application number: CN201580049636.8A
Authority: CN
Inventors: K·A·鲍曼; N·加德纳; T·让诺特; C·瓦热塞
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: EP4223285A3; EP3169309B1; EP4223285A2; CN106794141A; US10342761B2; JP2020183411A; WO2016010840A1; JP7091393B2; JP6778175B2; US20190321295A1; EP3169309A1; ES2949172T3; US20170196809A1; JP2017523965A

Abstract

通过使一个或多个核酸流与一个或多个脂质流交汇产生了具有均匀小粒度的包封核酸纳米粒。所述包封核酸纳米粒包括包封在脂质纳米粒主体内的核酸。通过使水性核酸流和在有机溶剂中的脂质流以高的线速度交汇且有机溶剂总浓度小于33％获得了均匀的小粒度。

Description

将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法

发明领域

本发明通常涉及包封核酸纳米粒组合物以及用于制备具有均匀的小粒度的包封核酸纳米粒的方法和系统。

发明背景

向受治疗者递送生物活性剂(包括治疗相关化合物)经常由于化合物到达靶细胞或组织的困难而受到阻碍。具体而言，将许多生物活性剂运输到活细胞中受到细胞的复杂膜系统的高度限制。这些限制可导致需要使用比获得结果所期望的那些高得多的浓度的生物活性剂，这增加了毒性作用和副作用的风险。一种解决该问题的方法是利用特定的载体分子和载体组合物，它们被允许选择性进入细胞内。脂质载体、可生物降解的聚合物和各种缀合系统可用于改善生物活性剂向细胞的递送。

一类特别难于递送到细胞的生物活性剂是生物治疗剂(包括核苷、核苷酸、聚核苷酸、核酸和衍生物，例如mRNA和RNAi剂)。通常，核酸在细胞或血浆中仅能在有限的时间内保持稳定。RNA干扰、RNAi治疗、mRNA治疗、RNA药物、反义治疗和基因治疗等的发展已经增加了将活性核酸试剂引入细胞中的有效方式的需求。为此，对于能够稳定且递送基于核酸的活性剂到细胞中的组合物是特别令人感兴趣的。

用于改善外源核酸向细胞内转运的最充分研究的方法包括使用病毒载体或含阳离子脂质的制剂。病毒载体可用于将基因有效地传递到一些细胞类型中，但是它们通常不能用于将化学合成的分子引入到细胞中。

一种供选的方法是使用引入了阳离子脂质的递送组合物，其在一个部分与生物活性剂相互作用病情在另一个部分与膜系统相互作用。据报道，这类组合物根据组成和制备方法提供了脂质体、胶束、脂质复合物(lipoplexes)或脂质纳米粒(综述参见Felgner,1990,Advanced Drug Delivery Reviews,5,162-187；Felgner,1993,J.Liposome Res.,3,3-16；Gallas,2013,Chem.Soc.Rev.,42,7983-7997；Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；及其中参考文献)。

自从在1965年Bangham首次描述了脂质体(J.Mol.Biol.13,238-252)，对于开发用于递送生物活性剂的基于脂质的载体系统存在持续的兴趣和努力(Allen,2013,AdvancedDrug Delivery Reviews,65,36-48)。Philip Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413-7417(1987)首次描述了通过采用带正电荷的脂质体将功能性核酸引入培养细胞中的方法。K.L.Brigham等人,Am.J.Med.Sci.,298,278-281(1989)随后在体内验证了该方法。近来，已经开发了体外和体内具有验证了的功效的脂质纳米粒制剂(Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；Morrissey,2005,Nat.Biotech.,23,1002-1007；Zimmerman,2006,Nature,441,111-114.；Jayaraman,2012,Angew.Chem.Int.Ed.,51,8529-8533)。

脂质制剂是很有吸引力的载体，因为它们能够保护生物分子不被降解并同时提高它们的细胞摄取。在各种类型的脂质制剂中，含有阳离子脂质的制剂通常被用于递送聚阴离子(例如核酸)。这类制剂可以使用单独的阳离子脂质形成，任选地包括其它脂质和两亲物如磷脂酰乙醇胺。本领域熟知的是，脂质制剂的组成及其制备方法均影响所得聚集物的结构和尺寸(Leung,2012,J.Phys Chem.C,116,18440-18450)。

已经报道了多种技术将核酸包封在脂质纳米粒中，包括洗涤剂透析、挤出、高速混合和逐步稀释。然而，现有的核酸包封方法具有低包封率或不可规模化的问题，产生的纳米粒缺乏高度均匀性，和/或不能获得小于80nm平均粒度。因此，需要将核酸包封在脂质纳米粒中的新方法，其产生了高包封度、可规模化并且产生了具有小于80nm的平均粒度的尺寸均匀的纳米粒。

发明简述

本发明涉及改善的将核酸包封在脂质纳米粒主体(host)中的方法。该方法是可规模化的，并且提供了具有小的平均粒度(例如＜80nm)、改善的粒度均匀性和高的核酸包封度(例如>90％)的包封核酸纳米粒的形成。通过本发明的方法产生的纳米粒具有长期稳定性。

本发明的第一个方面提供了将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，该方法通过将一个或多个脂质流与一个或多个核酸流合并和使所述合并流流动以得到包封核酸纳米粒的第一出口溶液。每个脂质流包含一种或多种脂质在有机溶剂(例如乙醇)中的混合物。每个核酸流包含一种或多种核酸在水性溶液中的混合物。在脂质流和核酸流的交汇点，每种流都表征有线速度。所述一个或多个脂质纳米粒流具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度。同样，所述一个或多个核酸流具有大于或等于约1.5米/秒的复合线速度。在脂质流和核酸流合并和混合后，有机溶剂的最终浓度为使聚集最小的量(例如小于33％)。在一些实施方案中，第一出口溶液中有机溶剂的最终浓度为约20％至约25％。在第一个方面的一些实施方案中，将合并的脂质和核酸流用稀释溶剂稀释，以提供第一出口溶液。在第一个方面的其它实施方案中，合并的核酸流的复合线速度为约3至约14米/秒，脂质流的复合线速度为约1.5至约7米/秒。

在本发明的第二个方面，所述第一出口溶液通过稀释、培养、浓缩和透析进行进一步加工。在第二个方面的一些实施方案中，透析溶液也可以是无菌过滤的。通过第二个方面的方法产生的包封核酸纳米粒具有长期稳定性。

在本发明的第三个方面，通过本发明的方法产生的包封脂质纳米粒具有小于约80nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米粒具有约30至约80nM的平均直径。在优选的实施方案中，纳米粒具有小于约70nm(例如约40-70nm)的平均直径。

本发明的第四个方面提供了包封核酸纳米粒组合物，其包含可药用载体、脂质纳米粒主体和核酸，其中所述包封核酸纳米粒具有约40nm至约70nm的平均直径。

附图简述

图1图解了用于制备和加工包封核酸纳米粒的示例性方法的流程图。

图2图解了用于制备包封核酸纳米粒的代表性系统。

图2a图解了图2的系统中使用的稀释室的供选实施方案。

图3a、3b和3c图解了图2的系统中使用的混合室的供选实施方案。

图4a是低温电子显微镜检查得到的图像，其图解了采用十字形混合室和方法实施例2中所述的方法和物质产生的siRNA包封脂质纳米粒的颗粒均匀性。

图4b是低温电子显微镜检查得到的图像，其图解了采用T-形混合室和方法实施例2中所述的方法和物质产生的siRNA包封脂质纳米粒的颗粒均匀性。

详细说明

1.0概述

本发明提供了制备具有均匀的小粒度的包封核酸纳米粒的方法。图1显示的是概括地描绘本发明的一个实施方案的步骤的代表性流程图。在步骤100中，一个或多个脂质流在第一交汇点与一个或多个核酸流合并，得到第一合并流。然后，使第一合并流流动(步骤110)以允许所述合并流的各个流联合，由此进行脂质纳米粒组装和核酸包封的过程。根据对初始核酸流所选择的具体参数，合并流可以任选地用水性介质进一步稀释(步骤120)，得到第一出口溶液(步骤130)。或者，可以省略任选的稀释步骤120和在步骤100中通过使用适当稀释的核酸流、由流动的合并流直接获得第一出口流。步骤130获得的第一出口溶液含有包封核酸纳米粒。

可以对第一出口溶液进行进一步加工以除去有机溶剂和由此得到包封核酸纳米粒，所述包封核酸纳米粒为具有长期稳定性的制剂。首先，第一出口溶液的培养(步骤140)在室温下进行一段时间(例如60分钟)，然后用水性介质(例如水、柠檬酸盐缓冲液)稀释(步骤150)，浓缩和透析(步骤160)，最后无菌过滤(步骤170)。稀释步骤150可以将有机溶剂浓度稀释两倍。浓缩可以通过切向流过滤进行。

已经令人惊奇地发现，通过使一个或多个脂质流与一个或多个核酸流合并/交汇获得了小的和均匀的颗粒，其中合并的脂质流和合并的核酸流各自保持了大于1.5米/秒的线速度，并且当合并/混合流时有机溶剂的最终浓度小于33％体积。保持有机溶剂小于33％可抑制纳米粒的聚集，而本发明的高流速保持粒度小且均匀。该方法提供了核酸的有效包封。

在一些实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约1.5至约14米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约1.5至约7米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约3至约14米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约1.5至约4.5米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约8至约14米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约1.5至约4.5米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约3至约8米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约1.5至约4.5米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约9至约14米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约3至约4米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约11至约14米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约3至约4米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约9至约11米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约3至约4米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约6至约8米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约3至约4米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约10.2米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约3.4米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约6.8米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约3.4米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约13.6米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约3.4米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约3.4米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约1.7米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约3米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约1.5米/秒。在其它实施方案中，所述一个或多个核酸流的复合线速度为约14米/秒，且所述一个或多个脂质流的复合线速度为约7米/秒。

2.0核酸

适用于本发明的核酸包括：反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA:RNA组合物、等位酶、适体、核酶、诱饵及其类似物、质粒及其它类型的表达载体以及小核酸分子、RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、信使核糖核酸(信使RNA、mRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子、肽核酸(PNA)、锁定核酸核苷酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(小内部节段干扰RNA)、aiRNA(不对称干扰RNA)和在正义链和反义链之间具有1个、2个或更多个错配的siRNA(相关细胞和/或组织的那些，例如在细胞组织、受治疗者或生物体中)。这类化合物可以被纯化或部分纯化，可以是天然存在的或合成的，并且可以是化学修饰的。在一个实施方案中，生物活性剂为RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子。在一个实施方案中，生物活性剂为可用于调节RNA干扰(RNAi)的RNAi剂。

“核糖核酸”(RNA)是通过磷酸二酯键连接的核苷酸聚合物，其中每个核苷酸含有核糖或其修饰形式作为糖组分。核苷酸各自含有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或其修饰形式作为碱。mRNA分子中的遗传信息以mRNA分子的核苷酸碱基序列进行编码，其被安排为各自由三个核苷酸碱基组成的密码子。除了结束翻译(蛋白质合成)的终止密码子，每个密码子编码多肽的特定氨基酸。在活细胞内，mRNA被运输至核糖体(合成蛋白质的位置)，在那里其提供了蛋白质合成(翻译)的遗传信息。对于更完整的描述，参见Alberts B等人(2007)Molecular Biology of Cell,第5版,Garland Science。

在真核生物中，mRNA在染色体中通过细胞酶RNA聚合酶被体内转录。在体内转录期间或之后，将5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)在体内加至mRNA的5'端。5'帽为末端7-甲基鸟苷残基，其通过5'-5'-三磷酸酯键与第一个转录的核苷酸连接。另外，大多数真核生物mRNA分子在mRNA分子的3’端具有聚腺苷酰部分(“聚(A)尾”)。在体内，真核细胞在转录后添加聚(A)尾，通常长度为约250个腺苷残基。因此，典型的成熟真核mRNA具有如下结构：在5’端以mRNA帽核苷酸开始，接着是核苷酸的5’非翻译区(5’UTR)，然后是以起始密码子(其为核苷酸碱基的AUG三联体)开始、编码蛋白质序列并以可以是核苷酸碱基的UAA、UAG或UGA三联体的终止密码子结束的可读框，之后是核苷酸的3’非翻译区(3’UTR)，以聚腺苷尾结束。虽然典型的成熟真核mRNA的特征是在真核细胞中体内天然产生的，但是可以采用分子生物学方法体外产生相同的或结构和功能上等同的特征。因此，任何具有与典型的成熟真核mRNA类似结构的RNA都可以起到mRNA的作用，并且也落入术语“信使核糖核酸”的范围内。

mRNA分子通常具有可被包封在本发明的脂质纳米粒内的尺寸。虽然mRNA分子的尺寸性质上根据编码特定蛋白质的mRNA种类的特性而变化，mRNA分子的平均尺寸是500－10,000个碱基的平均mRNA尺寸。

如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”(DNA)指载有活生物体的细胞和多种病毒中的遗传信息的聚合核酸。在体内，DNA能够自我复制和合成RNA。DNA由缠绕成双螺旋且通过互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)之间的氢键结合的两条核苷酸长链组成。核苷酸的序列决定了个体遗传特征。参见The American

Dictionary of the English Language,第4版(2009年更新).Houghton MifflinCompany。

DNA聚合物的各个核苷酸通过磷酸二酯键以5’至3’方向连接。每个核苷酸含有脱氧核糖或其修饰物作为糖组分。每个核苷酸含有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或其修饰物作为碱基。

体内存在的大多数DNA分子为双链螺旋，所述双链螺旋由反向平行形成的两个长聚合物组成，一个主链是3’，另一个是5’。在该双链形成中，碱基通过氢键键合配对，腺嘌呤与胸腺嘧啶键合，鸟嘌呤与胞嘧啶键合，产生了双螺旋结构。其它DNA分子是单链的，虽然单链DNA分子如果与具有互补核苷酸序列的另一个单链DNA或RNA分子匹配的话有可能变成双链。关于更详细的说明，参见Alberts B等人,(2007)Molecular Biology of the Cell,第5版,Garland Science。

沿着脱氧核糖主链的核苷酸碱基序列编码遗传信息。对于蛋白质的合成，当产生mRNA分子时，遗传信息在称为转录的过程中被拷贝到mRNA分子的核苷酸序列中。

DNA能够以至少两种具有不同尺寸的形式存在。DNA的第一种形式是称为染色体的具有非常大尺寸的聚合物。染色体含有细胞中的多种或大多数蛋白质的遗传信息，并且还含有细胞能够藉此控制DNA分子复制的信息。细菌细胞可以含有一种或多种染色体。真核细胞通常含有多于一种的细胞染色体，每种染色体。

DNA的第二种形式是具有较短尺寸的形式。第二种形式的多种DNA分子具有能够包封在本发明的脂质纳米粒中的尺寸。这些较短形式的DNA中的一些可以具有可用于编码蛋白质的尺寸。DNA的这些第二种较短的有用形式的实例包括质粒及其它载体。关于更详细的说明，参见Alberts B等人(2007)Molecular Biology of the Cell,第5版,GarlandScience。

质粒是物理上与细胞内的染色体DNA分离并且可独立于细胞内的染色体DNA进行复制的小DNA分子。质粒通常在体内作为小的圆形双链DNA分子存在。在性质上，质粒载有可转录和翻译为对生物体存活有益的蛋白质的基因(例如抗生素抗性)。在性质上，质粒常常可以通过水平基因转移从一个生物体转移到另一个生物体。人工质粒或重组质粒广泛用于分子生物学中，用来允许宿主生物体内的重组DNA序列的复制和有用蛋白质的表达。质粒尺寸可以为1至超过25千碱基对不等。重组质粒可以被重组制成具有能够包封在本发明的脂质纳米粒中的尺寸。

在分子生物学中，载体为DNA分子，其用作载体以将来自一个细胞或来自体外生化反应的遗传物质人工运载到可以复制和/或表达该DNA的其它细胞中。含有外源DNA的载体称为重组体。有用的载体类型包括质粒和病毒载体。将载体插入到靶细胞中对于细菌细胞通常称为转化，对于真核细胞通常称为转染，但是病毒载体的插入通常称为转导。

病毒载体通常是携带经修饰的病毒DNA或RNA的重组病毒，已经使其成为非传染性的，但是含有病毒启动子以及转基因，由此允许通过病毒启动子来翻译转基因。病毒载体通常被设计成将插入物永久合并入宿主基因组中，因而在合并转基因后在宿主基因组中留下明显的遗传标记。病毒载体可以被重组制成具有能够被包封在本发明的脂质纳米粒中的尺寸。

“RNAi剂”是能够调节RNA干扰的组合物或化合物。术语“RNA干扰”(RNAi)是使用RNAi剂来降低含有与所述RNAi剂相同或非常类似序列的信使RNA(mRNA)的转录后靶基因沉默技术。参见：Zamore和Haley 2005Science 309:1519-1524；Zamore等人,2000Cell 101:25-33；Elbashir等人,2001Nature 411:494-498；和Kreutzer等人,PCT公开WO 00/44895；Fire,PCT公开WO 99/32619；Mello和Fire,PCT公开WO 01/29058；等。

如本文所用的RNAi相当于用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传。例如，含有本发明的脂质的制剂可以与siNA分子组合使用以在转录后水平和/或转录前水平在表观遗传学上使基因沉默。在非限制性实例中，通过siNA分子调节基因表达可以产生于经由RISC或如本领域已知的翻译抑制的siNA介导的RNA(编码或非编码RNA)裂解。在另一个实施方案中，siNA调节基因表达可以产生于转录抑制，例如如在Janowski等人,2005Nature Chemical Biology 1:216-222中报道的那样。

RNAi剂特别包括siRNA或siNA、微RNA(miRNA)、shRNA、短干扰寡核苷酸和化学修饰的短干扰核酸分子。如本文所用的术语“短干扰RNA”(siRNA)或“短干扰核酸”(siNA)等指能够通过以序列特异性方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制的任意分子。siRNA可通过核糖核酸酶III裂解由较长的双链RNA(dsRNA)而天然产生，所述双链RNA(dsRNA)与沉默的基因靶标同源或对其特异。它们还可以通过本领域已知的各种方法来人工产生。

本公开内容的RNAi剂可以靶向任意靶基因，包含任意序列，并且可以具有多种形式、组分、取代和/或修饰中的任一种。

RNAi剂通常包括两条链，反义链(或引导链)和有义链(或过客链)；反义链被整合到RISC(RNA干扰沉默复合物)中并靶向于靶mRNA的相应序列。反义链的序列(或其部分)与靶mRNA相匹配。可存在一些不阻止靶特异性RNAi活性的错配(通常每15nt序列不超过1-3个错配)。反义链和有义链可以是单独的分子，或通过连接基或袢连接(以形成例如shRNA)。反义链通常为49-mer或更短，经常是19-mer至25-mer。有义链可以具有与反义链相同的长度或比其更短或更长。如本文所示，反义链可以短至18-mer，有义链可以短至14-mer。

典型的siRNA为两条链的RNA，各自为21-mer，具有19-bp(碱基对)双链区和两个2-nt(核苷酸)突出物。Elbashir等人,2001Nature 411:494-498；Elbashir等人,2001EMBOJ.20:6877-6888。突出物可以被二核苷酸如dTdT、TT、UU、U(2’-OMe)dT、U(2’-OMe)U(2’-OMe)、T(2’-OMe)T(2’-OMe)、T(2’-OMe)dT等所替代。突出物发挥保护RNAi剂不被核酸酶裂解的作用，同时不干扰RNAi活性或有助于靶识别。Elbashir等人,2001Nature 411:494-498；Elbashir等人,2001EMBO J.20:6877-6888；和Kraynack等人,2006RNA 12:163-176。另外的3'-未端核苷酸突出物包括dT(脱氧胸苷)、2’-O,4’-C-乙烯基胸苷(eT)和2-羟乙基磷酸酯(hp)。也可以进行4-硫尿嘧啶和5-溴尿嘧啶取代。Parrish等人,2000Molecular Cell6:1077-1087。核苷酸突出物可以被非核苷酸3’端帽代替，条件是这类帽能够保护末端不被裂解，并且允许分子的RNAi活性。参见例如U.S.专利号8,097,716；8,084,600；8,404,831；8,404,832；和8,344,128；和U.S.专利申请61/886,739，它们整体引入本文作为参考。

在任一条链中，一个或多个位点可以被间隔基替代。这些包括但不限于糖、烷基、环烷基、核糖醇或其它类型的碱基核苷酸、2’-脱氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)、C_3-6烷基或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇(5300)。在某些分子中，可以向有义链中引入空位，产生两个较短的有义链；这称为sisiRNA。Wengels和Kjems的WO2007/107162。也可以在有义链和反义链之间引入一个或多个错配和凸出。Khvorova的美国专利申请No.2009/0209626。

RNAi剂可以由RNA构建，如在典型siRNA中。然而，在各种RNAi剂中，RNA核苷酸可以被取代或修饰。在一个或多个位点，RNA核苷酸可以被DNA、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、环己烯核酸(CeNA)、失水己糖醇核酸(HNA)或解锁定核酸(UNA)取代或修饰。特别地，在种子区域(反义链的约2-7位和有义链的相应位点)，一条或两条链中的核苷酸可以被DNA替代。整个种子区域可以被DNA替代，形成能够调节RNA干扰的DNA-RNA杂交物。Yamato等人,2011.Cancer Gene Ther.18:587-597。

RNA核苷酸可以被其它组分(如上所述)取代和/或修饰。修饰和/或取代可以在糖、磷酸酯基和/或碱基上进行。在各个方面，RNAi剂包括糖的2'-修饰，例如2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧、2'-脱氧2'-氟(2’-F)、2'-O-甲基(2’-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)；其它RNA修饰是本领域已知的。参见例如Usman and Cedergren 1992TIBS.17:34；Usman等人,1994Nucleic Acids Symp.Ser.31:163；Burgin等人,1996Biochemistry 35:14090。在某些实施方案中，任一条或两条链的3’端上的两个RNA核苷酸被2’-MOE修饰，形成2’-MOE夹。U.S.专利号8,097,716；和8,084,600。

糖-磷酸酯主链的一个或多个磷酸酯基可以被例如经修饰的核苷内连接基替代。这可以包括但不限于硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基、氨基磷酸酯基、硼烷膦酸酯基(boranophosphonoate)、酰胺连接基和式(Ia)的化合物

其中R³选自O^-、S^-、NH₂、BH₃、CH3、C_1-6烷基、C_6-10芳基、C_1-6烷氧基和C_6-10芳基氧基，其中C_1-6烷基和C_6-10芳基是未取代的或任选独立地被1至3个独立地选自卤素、羟基和NH₂的基团取代；和R⁴选自O、S、NH或CH₂。

碱基也可以是经修饰的或取代的，例如被下述基团修饰或取代：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤(xantine)、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(β-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、丁氧核苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶(pseudouracil)、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。在某些方面，RNAi剂可以包含非天然核碱基，其中非天然核碱基为二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。很多其它修饰是本领域已知的。参见例如Usman等人,1992TIBS 17:34；Usman等人,1994Nucl.Acids Symp.Ser.31:163；Burgin等人,1996Biochem.35:14090。

例如，一个或多个位点可以由2'-O-甲基胞苷-5’-磷酸酯基、2'-O-甲基尿苷-5’-磷酸酯基代表。简言之，任何一个或多个位点都可以由本领域已知的任何修饰或取代所代表，所述修饰或取代包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基团的核苷、与胆甾醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团连接的未端核苷、锁定核苷、无碱基核苷、2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷、2'-氨基修饰的核苷、2'-烷基修饰的核苷、吗琳代基核苷、解锁定核糖核苷酸(例如无环核苷酸单体，如WO 2008/147824中所述)、磷酰胺或包含核苷的非天然碱基或其任意组合。

任意这些各种形式、组分、取代和/或修饰可以以不同方式混合和匹配或合并以形成针对任意靶标和包含任意序列的RNAi剂。例如，本公开内容涉及包含两条链的RNAi剂，其中一条或两条链为18-mer，其在3’端以磷酸酯基或经修饰的核苷间连接基终止，并且以5’至3’顺序进一步包含间隔基、第二个磷酸酯基或经修饰的核苷间连接基和3’端帽。在另一个实施方案中，本公开内容涉及包含有义链和反义链的RNAi剂，其中反义链以5-至3-顺序包含18-mer，其在3’端以磷酸酯基或经修饰的核苷间连接基终止，并且以5’至3’顺序进一步包含间隔基、第二个磷酸酯基或经修饰的核苷间连接基和3’端帽；并且其中有义链以5’至3’顺序包含14-mer(或更长)，其在3'端以磷酸酯基或经修饰的核苷间连接基终止，并且以5’至3’顺序进一步包含间隔基、第二个磷酸酯基或经修饰的核苷间连接基和3'端帽。

在本公开内容的多个实施方案中，RNAi剂可以靶向任意靶基因和可以具有任意序列，并且可以具有如本文所述的或本领域已知的任何形式、组分、取代和/或修饰。

术语“RNAi抑制剂”为可以下调(例如降低或抑制)细胞或患者中RNA干扰功能或活性的任何分子。RNAi抑制剂可以通过与RNAi途径的任何组分(包括蛋白质组分如RISC或核酸组分如miRNA或siRNA)的功能相互作用或相互干扰而下调、减少或抑制RNAi(例如RNAi介导的靶聚核苷酸裂解、翻译抑制或转录沉默)。RNAi抑制剂可以是siNA分子、反义分子、适体或影响或干扰RISC、miRNA或siRNA或细胞或患者中RNAi途径的任何其它组分的功能的小分子。通过抑制RNAi(例如RNAi介导的靶聚核苷酸的裂解、翻译抑制或转录沉默)，RNAi抑制剂可用于调节(例如上调或下调)靶基因的表达。在一个实施方案中，RNA抑制剂经由翻译抑制、转录沉默或RISC介导的聚核苷酸(例如mRNA)的裂解、通过干扰(例如减少或阻止)基因表达的内源性下调或抑制而用于上调基因表达。通过干扰基因表达的内源性遏制、沉默或抑制的机制，本发明的RNAi抑制剂因而可用于上调基因表达，从而用于治疗由功能丧失导致的疾病或病症。在本文的各个实施方案中，术语“RNAi抑制剂”与术语“siNA”可互换使用。

如本文所用的术语“酶性核酸”指在底物结合区域与特定基因靶具有互补性并且还具有特异性裂解靶RNA、由此使靶RNA分子失活的酶活性的核酸分子。互补区域允许酶性核酸分子与靶RNA充分杂交，由此允许裂解。100％的互补性是优选的，但是低至50-75％的互补性也可用于本发明(参见例如Werner和Uhlenbeck,1995,Nucleic Acids Research,23,2092-2096；Hammann等人,1999,Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.,9,25-31)。核酸可以在碱基、糖基和/或磷酸酯基进行修饰。术语酶性核酸与诸如核酶、催化RNA、酶性RNA、催化DNA、适体酶(aptazyme)或结合适体的核酶、可调节的核酶、催化寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、DNA酶、RNA酶、核糖核酸内切酶、核酸内切酶、微小酶(minizyme)、leadzyme、低聚酶(oligozyme)或DNA酶。所有这些术语均描述了具有酶活性的核酸分子。酶性核酸分子的关键特征是其具有与靶核酸区域中的一个或多个互补的特异性底物结合位点，并且其具有在底物结合位点内或其周围的给分子赋予核酸裂解和/或结合活性的核苷酸序列(参见例如Cech等人,U.S.专利4,987,071；Cech等人,1988,260JAMA 3030)。本发明的核酶和酶性核酸分子可以是化学修饰的，例如如本领域或本文其它地方所述。

如本文所用的术语“反义核酸”指利用RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(proteinnucleic acid；Egholm等人,1993Nature 365,566)相互作用与靶RNA结合和改变靶RNA活性的非酶性核酸分子(综述参见Stein和Cheng,1993Science 261,1004和Woolf等人,U.S.专利5,849,902)。反义DNA可以是化学合成的或经由利用单链DNA表达载体或其同等物表达的。本发明的反义分子可以是化学修饰的，例如如本领域所述。

如本文所用的术语“RNase H活化区域”指能够结合靶RNA以形成被细胞RNase H酶识别的非共价复合物的核酸分子的区域(长度通常大于或等于4-25个核苷酸，优选长度为5-11个核苷酸)(参见例如Arrow等人,U.S.专利5,849,902；Arrow等人,U.S.专利5,989,912)。RNase H酶结合核酸分子-靶RNA复合物，并且裂解靶RNA序列。

如本文所用的术语“2-5A反义嵌合体”指含有5’-磷酸化2’-5’-连接的腺苷酸残基的反义寡核苷酸。这些嵌合体以序列特异性的方式结合靶RNA，并且激活细胞2-5A-依赖性核糖核酸酶，其随后裂解靶RNA(Torrence等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,1300；Silverman等人,2000,Methods Enzymol.,313,522-533；Player和Torrence,1998,Pharmacol.Ther.,78,55-113)。2-5A反义嵌合体分子可以是化学修饰的，例如如本领域所述。

如本文所用的术语“三螺旋形成寡核苷酸”指能够以序列特异性方式结合双链DNA以形成三链螺旋的寡核苷酸。这类三螺旋结构的形成已经显示出抑制靶基因的转录(Duval-Valentin等人,1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,504；Fox,2000,Curr.Med.Chem.,7,17-37；Praseuth等人,2000,Biochim.Biophys.Acta,1489,181-206)。本发明的三螺旋形成寡核苷酸可以是化学修饰的，例如如本领域所述。

如本文所用的术语“诱饵RNA”指被设计成与预期配体优先结合的RNA分子或适体。这种结合可导致靶分子的抑制或活化。诱饵RNA或适体可以与天然存在的结合靶竞争性结合特定配体。类似地，诱饵RNA被设计成与受体结合并阻断效应分子的结合，或者可以被设计成结合感兴趣的受体并阻止与受体的相互作用。本发明的诱饵分子可以是化学修饰的，例如如本领域所述。

如本文所用的术语“单链DNA”(ssDNA)指含有线性单链的天然存在的或合成的脱氧核糖核酸分子，例如ssDNA可以是有义或反义基因序列或EST(已表达序列标志)。

如本文所用的术语“等位酶”指变构酶性核酸分子，包括例如美国专利号5,834,186、5,741,679、5,589,332、5,871,914和PCT公开号WO 00/24931、WO 00/26226、WO 98/27104和WO 99/29842。

如本文所用的术语“适体”指与靶分子特异性结合的聚核苷酸组合物，其中所述聚核苷酸具有的序列不同于细胞中靶分子所正常识别的序列。或者，适体可以是与靶分子结合的核酸分子，其中靶分子不天然地结合核酸。靶分子可以为任何感兴趣的分子。本发明的适体分子可以是化学修饰的，例如如本领域所述。

3.0脂质

3.1阳离子脂质

适用于脂质组合物的阳离子脂质包括但不限于N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1,2-二油酰基氨甲酰基-3-二甲基铵丙烷(DOCDAP)、1,2-Dilineoy1-3-二甲基铵丙烷(DLINDAP)、二油酰基氧基-N-[2-精胺甲酰氨基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、DC-Chol、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3～-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',12'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)和/或其混合物。

其它适宜的阳离子脂质公开在美国临时申请序列号61/918,927中，其整体引入本文作为参考。一种适宜的脂质为式(I)化合物或其盐：

其中n和p各自独立地为1或2；R¹为杂环基、杂环基-C_1-8-烷基或杂环基-C_1-8-烷氧基，其各自可以任选被1、2或3个基团取代，所述基团独立地选自C_1-8-烷基、C_3-7-环烷基、C_3-7-环烷基-C_1-8-烷基、杂环基、-[(C₁-C₄)亚烷基]_v-N(R’)R”、-O-[(C₁-C₄)亚烷基]_v-N(R’)R”或N(H)-[(C₁-C₄)亚烷基]_v-N(R’)R”，其中所述(C₁-C₄)亚烷基任选被一个或多个R基团取代；v为0、1、2、3或4；R为氢或-C_1-8-烷基，或当v为0时R不存在；R’和R”各自独立地为氢、-C_1-8-烷基；或R'和R”与它们结合的氮一起且任选包括另一个选自N、O和S的杂原子以形成5-8元杂环或杂芳基，任选被-C_1-8-烷基、羟基或环烷基-C_1-8-取代；R²和R³各自独立地为C_12-22烷基、C_12-22链烯基、

R⁴选自氢、C_1-14烷基、

其它阳离子脂质包括式(II)化合物或其盐：

其它适宜的阳离子脂质包括式(I)和(II)的那些，其中R4为氢或其中R⁴为

其它适宜的阳离子脂质包括前述脂质，其中R¹选自：

其它适宜的阳离子脂质包括前述脂质，其中R²选自：

其它适宜的阳离子脂质包括前述脂质，其中R³选自：

根据前述脂质的其它适宜脂质包括其中R²和R³相同的那些。

具体的阳离子脂质包括选自下述的化合物：

双(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1,3-二甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((4-(吡咯烷-1-基)丁酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((4-(哌啶-1-基)丁酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(二甲基氨基)乙酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-(二乙基氨基)丙酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1-(环丙基甲基)哌啶-4-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-吗琳子基丙酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

双(8-(辛酰氧基)辛酸)2-(((1,3-二甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((1-乙基哌啶-3-基)甲氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；

双(2-庚基十一酸)2-((((2-(二乙基氨基)乙氧基)羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((2-(二乙基氨基)乙氧基)羰基)氧基)-2-(((2-庚基十一酰基)氧基)甲基)丙基酯；

双(2-庚基十一酸)2-((((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((2-庚基十一酰基)氧基)甲基)丙基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)-2-(((3-辛基十一酰基)氧基)甲基)丙基酯；

双(3-辛基十一酸)2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((3-辛基十一酰基)氧基)甲基)丙基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((9-戊基十四酰基)氧基)甲基)丙基酯；

十八碳-9,15-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((5-庚基十二烷酰基)氧基)甲基)丙基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(2,2-双(庚氧基)乙酰氧基)-2-((((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；和

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((6,6-双(辛氧基)己酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯。

其它适宜的阳离子脂质公开在美国临时申请序列号61/918,941中，其全文引入本文作为参考。一种适宜的脂质为式(III)化合物或其盐：

其中n为0、1、2、3或4；p为0、1、2、3、4、5、6、7或8；L₁为-O-或价键；L₂为-OC(O)-或-C(O)O-；R¹选自：

v为0、1、2、3或4；w为0、1、2或3；Cyl为任选被一个或两个烷基取代的5-7元含氮杂环；R和R’各自独立地为氢或C_1-8烷基；和R²选自C_6-20烷基，任选被下述基团取代：羟基、C_15-19链烯基、C_1-12烷基-OC(O)-C_5-20烷基、C_1-12烷基-C(O)O-C_5-20烷基和

R³选自：C_4-22烷基、C_12-22链烯基、

其它适宜的阳离子脂质包括式(IV)的那些或其盐:

其它适宜的阳离子脂质包括式(V)的那些:

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(V)的那些，其中R²选自：

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(V)的那些，其中R²为：

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(V)的那些，其中所述化合物具有式(VI):

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(VI)的那些，其中R³选自：

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(VI)的那些，其中R³为

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(VI)的那些，其中R³为

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(VI)的那些，其中所述化合物具有式(VII):

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(VII)的那些，其中所述化合物具有式(VIII):

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(VIII)的那些，其中所述化合物具有式(IX):

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(IX)的那些，其中R¹选自:

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(IX)的那些，其中R¹为

其它适宜的阳离子脂质包括式(III)至式(IX)的那些，其中R¹为

其它适宜的阳离子脂质选自：

二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2-氮杂十五烷-15-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧杂-2-氮杂十七烷-17-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2-氮杂十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧杂-2-氮杂十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧杂-3-氮杂二十烷-20-基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧杂-2--氮杂十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基酯；

4,4-双(辛氧基)丁酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

4,4-双((2-乙基己基)氧基)丁酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

4,4-双((2-丙基戊基)氧基)丁酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

4,4-双((2-丙基戊基)氧基)丁酸3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

4,4-双((2-丙基戊基)氧基)丁酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

6,6-双(辛氧基)己酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

6,6-双(己氧基)己酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

6,6-双((2-乙基己基)氧基)己酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

8,8-双(己氧基)辛酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

8,8-二丁氧基辛酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

8,8-双((2-丙基戊基)氧基)辛酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

8,8-双((2-丙基戊基)氧基)辛酸3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

8,8-双((2-丙基戊基)氧基)辛酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

3-辛基十一酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

3-辛基十一碳-2-烯酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

7-己基十三碳-6-烯酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

9-戊基十四烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

9-戊基十四碳-8-烯酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十三烷基酯；

5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十一烷基酯；

琥珀酸1,3-双(辛酰氧基)丙-2-基酯(3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯；

琥珀酸1,3-双(辛酰氧基)丙-2-基酯(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯；

癸二酸1-(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-辛基酯；

癸二酸1-(3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-辛基酯；

癸二酸1-(3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-辛基酯；

癸二酸1-(3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-(2-乙基己基)酯；

癸二酸1-(3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-(2-乙基己基)酯；

10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

癸酸8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧杂-2-氮杂十九烷-19-基酯；

10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；

1,4-二甲基哌啶-4-甲酸1-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰基氧基)十五烷-3-基酯；

4,4-双((2-乙基己基)氧基)丁酸2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-(12Z,15Z)-3-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；

3-辛基十一酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；

5-庚基十二烷酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；

7-己基十三烷酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；

9-戊基十四酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；

3-(二甲基氨基)丙酸(12Z,15Z)-1-((((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)羰基)氧基)二十一碳-12,15-二烯-3-基酯；

2,2-双(庚氧基)乙酸(13Z,16Z)-4-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯；

2,2-双(庚氧基)乙酸(13Z,16Z)-4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯；

3-((3-乙基-10-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-8,15-二氧代-7,9,14-三氧杂-3-氮杂十七烷-17-基)二硫基)丙酸2,2-双(庚氧基)乙基酯；

琥珀酸(13Z,16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯十七碳-9-基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-2-(((11Z,14Z)-2-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)二十碳-11,14-二烯-1-基)氧基)乙基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；

3-辛基十一烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；

5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-羟基十三烷基酯；

5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；

7-己基十三烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；

9-戊基十四烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-羟基十三烷基酯；

9-戊基十四烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；

癸二酸1-(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基)酯10-辛基酯；

10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-5-辛基十三烷基酯；

癸酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-5-辛基十三烷基酯；

辛酸5-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-7-辛基十五烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-5-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-7-辛基十五烷基酯；

辛酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-辛基十九烷基酯；

癸酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-辛基十九烷基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九烷基酯；

己酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九烷基酯；

3-辛基十一烷酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九烷基酯；

己酸9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十九烷基酯；

3-辛基十一烷酸9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十九烷基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12,15三烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z,15Z,15'Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

二油酸(Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双十四酸烷2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双十四烷酸2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双十四烷酸2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双十二烷酸2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双十二烷酸2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双十二烷酸2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(癸酸)2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(癸酸)2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

二辛酸2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；

4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酸4,4-双(辛氧基)丁基酯；

2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二烷酸4,4-双(辛氧基)丁基酯；

十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-10-十二烷基-3-乙基-14-(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰氧基)乙基)-8,13-二氧代-7,9-二氧杂-3,14-二氮杂十六烷-16-基酯；

二辛酸2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-(辛酰氧基)十一烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；和

双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(9-十二烷基-2-甲基-7,12-二氧代-6,8,13-三氧杂-2-氮杂十四烷-14-基)丙烷-1,3-二基酯。

如本文所用的术语“烷基”指具有指定碳原子数的完全饱和的支链或非支链烃链。例如，C_1-8烷基指具有1至8个碳原子的烷基。例如，C_4-22烷基指具有4至22个碳原子的烷基。例如，C_6-10烷基指具有6至10个碳原子的烷基。例如，C_12-22烷基指具有12至22个碳原子的烷基。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、9-甲基十七烷基、1-庚基癸基、2-辛基癸基、6-己基十二烷基、4-庚基十一烷基等。

如本文所用的术语“亚烷基”指二价的如上文定义的烷基。亚烷基的代表性实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、正亚丙基、异亚丙基、正亚丁基、仲亚丁基、异亚丁基、叔亚丁基、正亚戊基、异亚戊基、新亚戊基、正亚己基、3-甲基亚己基、2,2-二甲基亚戊基、2,3-二甲基亚戊基、正亚庚基、正亚辛基、正亚壬基、正亚癸基等。

如本文所用的“链烯基”指具有指定碳原子数并且在链中具有一条或多条碳-碳双键的不饱和支链或非支链烃链。例如，C_12-22链烯基指具有12至22个碳原子并且在链中具有一条或多条碳-碳双键的链烯基。在某些实施方案中，链烯基在链中具有一条碳-碳双键。在其它实施方案中，链烯基在链中具有多于一条的碳-碳双键。链烯基可以任选被一个或多个如式(I)或(III)中定义的取代基取代。链烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。链烯基的其它实例包括但不限于：Z-十八碳-9-烯基、Z-十一碳-7-烯基、Z-十七碳-8-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、亚麻基(linolenyl)、2-辛基癸-1-烯基、亚油基(linoleyl)和油基。

如本文所用的术语“亚烯基”指二价的如上文定义的链烯基基团。亚烯基的代表性实例包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基、亚己烯基等。

如本文所用的术语“烷氧基”指通过氧桥连接的任意烷基部分(即-O-C_1-3烷基，其中C_1-3烷基如本文定义)。这类基团的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基和丙氧基。

如本文所用的术语“环烷基”指具有指定碳原子数的饱和单环、二环或三环烃环。例如，C_3-7环烷基指具有3至7个碳原子的环烷基环。环烷基可以任选被一个或多个如式(I)中定义的取代基取代。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、二环[2.1.1]己基、二环[2.2.1]庚基、金刚烷基等。

如本文所用的术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。

如本文所用的术语“杂环”指含有1至4个杂原子的4至12元饱和或不饱和单环或双环。杂环环系不是芳香性的。含有一个以上杂原子的杂环基团可含有不同的杂原子。杂环基团是单环、螺环或者稠合或桥连的双环环系。单环杂环基团的实例包括四氢呋喃基、二氢呋喃基、1,4-二噁烷基、吗啉基、1,4-二噻烷基、氮杂环丁烷基、哌嗪基、哌啶基、1,3-二氧戊环基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、1,2,3,6-四氢吡啶基、氧硫杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基、1,3-二噁烷基、1,3-二噻烷基、氧硫杂环己烷基、硫吗啉基、1,4,7-三氧杂-10-氮杂环十二烷基、氮杂环庚基等。螺杂环的实例包括但不限于1,5-二氧杂-9-氮杂螺[5.5]十一烷基、1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸基、2-氮杂-7-氮杂螺[3.5]壬基等。稠合杂环环系具有8至11个环原子，并且包括其中杂环与苯基环稠合的基团。稠合杂环的实例包括但不限于十氢喹啉基(decahydroqunilinyl)、(4aS,8aR)-十氢异喹啉基、(4aS,8aS)-十氢异喹啉基、八氢环戊二烯并[c]吡咯基、异喹啉基(isoinolinyl)、(3aR,7aS)-六氢-[1,3]二氧杂环戊烯并[4.5-c]吡啶基、八氢-1H-吡咯并[3,4-b]吡啶基、四氢异喹啉基等。

如本文所用的术语“杂环基C_1-8烷基”指通过单键或通过如上定义的C_1-8烷基基团连接至分子的其余部分的如上定义的杂环。

如本文所用的术语“杂芳基”指包含1、2、3或4个单独地选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6-元芳族单环基团。杂芳基基团可以经由碳原子或杂原子键合。杂芳基的实例包括但不限于呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基或吡啶基。

如本文所用的术语“杂芳基C_1-8烷基”指通过单键或通过如上定义的C_1-8烷基基团连接至分子的其余部分的如上定义的杂芳基环。

3.2中性脂质

适用于本发明的脂质组合物的中性脂质包括例如多种中性的不带电荷或两性离子性的脂质。适用于本发明的中性磷脂的实例包括但不限于:5-十七烷基苯-1,3-二醇(间二苯酚)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、l,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、l-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、l-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、l-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、l,2-二花生酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、l-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、l,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在一个实施方案中，中性磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。

3.3阴离子脂质

适用于本发明的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-丁二酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)和赖氨酰基磷脂酰甘油。

3.4辅助脂质(Helper lipids)

辅助脂质是以某种程度增强转染(例如，包括生物活性剂的纳米粒的转染)的脂质。辅助脂质增强转染的机制可包括例如增强颗粒稳定性和/或增强膜融合性(fusogenicity)。辅助脂质包括类固醇和烷基间苯二酚。适用于本发明的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。

3.4隐形脂质(Stealth lipids)

隐形脂质是增加纳米粒可以体内(例如在血液中)存在的持续时间的脂质。适用于本发明的脂质组合物的隐形脂质包括但不限于具有与脂质部分连接的亲水性头基的隐形脂质。这类隐形脂质的实例包括式(XI)化合物，如WO2011/076807中所述，

或其盐或可药用衍生物，其中：

Z为选自PEG和基于下述的聚合物的亲水性头基组分：聚(噁唑啉)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、多糖和聚(氨基酸)，其中所述聚合物可以是直链或支链的，并且其中所述聚合物可以任选被取代；其中Z为n个亚基聚合的；

n为在10至200个Z单元之间的数均聚合度，其中n对于不同的聚合物类型是优化的；

L₁为任选取代的C_1-10亚烷基或C_1-10杂亚烷基连接基，其包括醚(例如-O-)、酯(例如-C(O)O-)、琥珀酸酯基(例如-O(O)C-CH₂-CH₂-C(O)O-))、氨甲酸酯基(例如-OC(O)-NR’-)、碳酸酯基(例如-OC(O)O-)、酮(例如-C-C(O)-C-)、羰基(例如-C(O)-)、脲(例如-NRC(O)NR’-)、胺(例如-NR’-)、酰胺(例如-C(O)NR’-)、亚胺(例如-C(NR’)-)、硫醚(例如-S-)、黄原酸酯基(例如-OC(S)S-)和磷酸二酯(例如-OP(O)₂O-)中的零个、一个、两个或更多个；其任意一者可以被零、一个或多个Z基团取代；其中R’独立地选自-H、NH-、-NH₂、-O-、-S-、磷酸酯基或任选取代的C_1-10亚烷基；

X₁和X₂独立地选自碳或杂原子，所述杂原子选自-NH-、-O-、-S-或磷酸酯基；

A₁和A₂独立地选自C_6-30烷基、C_6-30链烯基和C_6-30炔基，其中A₁和A₂可以相同或不同，或其中A₁和A₂与它们连接的碳原子一起形成任选取代的类固醇。

具体的隐形脂质包括但不限于表1中列举的那些。

表1.隐形脂质

适用于本发明的脂质组合物的其它隐形脂质和关于这类脂质的生物化学的信息可以在Romberg等人,Pharmaceutical Research,第25卷,第1期,2008,第55-71页和Hoekstra等人,Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52中找到。

在一个实施方案中，适宜的隐形脂质包括选自PEG(有时称为聚(环氧乙烷))和基于下述的聚合物的集合：聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。其它适宜的PEG脂质公开在例如WO2006/007712中。

特别适宜的隐形脂质包括聚乙二醇-二酰甘油或聚乙二醇-二酰甘氨酸酰胺(glycamide)(PEG-DAG)共轭物，包括包含二烷基甘油或二烷基甘氨酸酰胺基团、具有独立地包含约C₄至约C₄₀饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的那些。二烷基甘油或二烷基甘氨酸酰胺基团可以进一步包含一个或多个取代的烷基。在本文描述的任一项实施方案中，PEG共轭物可以选自PEG-二月桂基甘油、PEG-二肉豆蔻基甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，来自NOF,日本东京)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基(disteryl)甘油、PEG-二月桂基甘氨酸酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘氨酸酰胺、PEG-二棕榈酰基甘氨酸酰胺和PEG-二硬脂基甘氨酸酰胺、PEG-胆固醇(1-[8’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3’,6’-二氧杂辛烷基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](目录号880150P，来自Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA)。

在一个实施方案中，隐形脂质为S010、S024、S027、S031或S033。

在另一个实施方案中，隐形脂质为S024。

除非另有说明，否则如本文所用的术语“PEG”指任何聚乙二醇或其它聚亚烷基醚聚合物。在一个实施方案中，PEG为乙二醇或环氧乙烷的任选取代的直链或支链聚合物。在一个实施方案中，PEG为未取代的。在一个实施方案中，PEG为取代的，例如被一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基基团取代。在一个实施方案中，该术语包括PEG共聚物，例如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992))；在另一个实施方案中，该术语不包括PEG共聚物。在一个实施方案中，PEG具有的分子量为约130至约50,000；在一个亚实施方案中，分子量为约150至约30,000；在一个亚实施方案中，分子量为约150至约20,000；在一个亚实施方案中，分子量为约150至约15,000；在一个亚实施方案中，分子量为约150至约10,000；在一个亚实施方案中，分子量为约150至约6000；在一个亚实施方案中，分子量为约150至约5000；在一个亚实施方案中，分子量为150至约4000；在一个亚实施方案中，分子量为150至约3000；在一个亚实施方案中，分子量为300至约3000；在一个亚实施方案中，分子量为约1000至约3000；和在一个亚实施方案中，分子量为约1500至约2500。

在一些实施方案中，PEG为“PEG-2K”，也称为“PEG 2000”，其具有约2000道尔顿的平均分子量。PEG-2K在本文中由下式(XIIa)表示，其中n为45，表示数均聚合度包括约45个亚基。然而，可以使用本领域已知的其它PEG实施方案，包括例如其中数均聚合度包括约23个亚基(n＝23)和/或68个亚基(n＝68)的那些。

用于本发明的方法的优选的式(I)-(IX)化合物为下述实施例1-36。

4.0包封核酸纳米粒

“脂质纳米粒”指包括多个(即多于一个)彼此通过分子间力物理结合的脂质分子的颗粒。脂质纳米粒可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)、乳剂中的分散相、胶束或混悬液中的内相。

术语“脂质纳米粒主体”指多个彼此通过分子间力/静电相互作用物理结合以包封一个或多个核酸分子如siRNA的脂质分子。

某些实施方案提供了包封核酸纳米粒组合物，其包含可药用载体和包封核酸纳米粒。所述包封核酸纳米粒包括脂质纳米粒主体和被包封在脂质纳米粒主体中的核酸。如本文所用的术语“可药用载体”指无毒的惰性稀释剂。可以充当可药用载体的物质包括但不限于无热原水、去离子水、等渗盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲液。在优选的实施方案中，包封核酸纳米粒具有约40至约70nm的平均尺寸和小于约0.1的多分散指数(如通过动态光散射、例如采用Malvern Zetasizer Nano ZS测定)。脂质纳米粒主体包含可降解的阳离子脂质、脂质化聚乙二醇、胆固醇和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱组分，如本文在别处所述的。

本发明的实施方案提供了制备包含阳离子脂质和其它脂质组分的包封核酸纳米粒组合物的方法。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质和辅助脂质如胆固醇的方法。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法。本发明的另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法。本发明的另一个实施方案提供了将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中所述纳米粒包含阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC、隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033，并且核酸为例如RNA或DNA。本发明的另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中所述核酸为例如mRNA、siRNA或DNA。

在本发明的某些实施方案中，脂质溶液/流含有阳离子脂质化合物、辅助脂质(胆固醇)、任选的中性脂质(DSPC)和隐形脂质(例如S010、S024、S027或S031)。当制剂含有四种脂质组分时，脂质的摩尔比范围对于阳离子脂质而言可以是20至70摩尔百分比(目标是40-60)，辅助脂质的摩尔百分比范围为20至70(目标是30至50)，中性脂质的摩尔百分比范围为0-30，PEG脂质的摩尔百分比范围为1至6(目标是2至5)。

在某些实施方案中，脂质溶液/流含有30-60％的式(III)化合物、30-60％的胆固醇/5-10％的DSPC和1-5％的PEG-DMG、S010、S011或S024。

本发明的另一个实施方案提供了采用阳离子脂质和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约40-55的阳离子脂质/约40-55的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约40-55的阳离子脂质/约40-55的辅助脂质/约5-15的中性脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约40-55的阳离子脂质/约40-55的辅助脂质/约5-15的中性脂质/约1-10的隐形脂质。

本发明的另一个实施方案提供了采用阳离子脂质和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约40-50的阳离子脂质/约40-50的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约40-50的阳离子脂质/约40-50的辅助脂质/约5-15的中性脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约40-50的阳离子脂质/约40-50的辅助脂质/约5-15的中性脂质/约1-5的隐形脂质。

本发明的另一个实施方案提供了使用阳离子脂质和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约43-47的阳离子脂质/约43-47的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约43-47的阳离子脂质/约43-47的辅助脂质/约7-12的中性脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约43-47的阳离子脂质/约43-47的辅助脂质/约7-12的中性脂质/约1-4的隐形脂质。

本发明的另一个实施方案提供了使用阳离子脂质和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约45％的阳离子脂质和约44％的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约45％的阳离子脂质、约44％的辅助脂质和约9％的中性脂质。另一个实施方案提供了使用阳离子脂质、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约45％的阳离子脂质、约44％的辅助脂质、约9％的中性脂质和约2％的隐形脂质。

本发明的一个实施方案提供了制备包含式(I)化合物和其它一种或多种脂质组分的包封核酸纳米粒组合物的方法。另一个实施方案提供了使用式(I)化合物和辅助脂质如胆固醇的方法。另一个实施方案提供了使用式(I)化合物、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法。本发明的另一个实施方案提供了使用式(I)化合物、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法。本发明的另一个实施方案提供了将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中所述纳米粒包含式(I)化合物、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC、隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033，并且核酸为例如RNA或DNA。本发明的另一个实施方案提供了使用式(I)化合物、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中所述核酸为例如mRNA、siRNA或DNA。

本发明的另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约40-55的式(I)化合物/约40-55的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约40-55的式(I)-(IX)任一者的化合物/约40-55的辅助脂质/约5-15的中性脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约40-55的式(I)化合物/约40-55的辅助脂质/约5-15的中性脂质/约1-10的隐形脂质。

本发明的另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约40-50的式(I)-(IX)任一者的化合物/约40-50的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约40-50的式(I)-(IX)任一者的化合物/约40-50的辅助脂质/约5-15的中性脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约40-50的式(I)-(IX)任一者的化合物/约40-50的辅助脂质/约5-15的中性脂质/约1-5的隐形脂质。

本发明的另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约43-47的式(I)-(IX)任一者的化合物/约43-47的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约43-47的式(I)-(IX)任一者的化合物/约43-47的辅助脂质/约7-12的中性脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约43-47的式(I)-(IX)任一者的化合物/约43-47的辅助脂质/约7-12的中性脂质/约1-4的隐形脂质。

本发明的另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和辅助脂质如胆固醇将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法，其中脂质摩尔比为约45％的式(I)-(IX)任一者的化合物和约44％的辅助脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC的方法，其中脂质摩尔比为约45％的式(I)-(IX)任一者的化合物、约44％的辅助脂质和约9％的中性脂质。另一个实施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、辅助脂质如胆固醇、中性脂质如DSPC和隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂质摩尔比为约45％的式(I)-(IX)任一者的化合物、约44％的辅助脂质、约9％的中性脂质和约2％的隐形脂质。

在本发明的方法中的脂质:核酸(例如siRNA)的比例可以为约15-20:1(wt/wt)。在某些实施方案中，脂质:核酸的比例为约17-19:1。在其它实施方案中，脂质:核酸的比例为约18.5:1。

通过本发明的方法制备的纳米粒具有平均直径和在平均值周围的粒度分布。较窄范围的粒度对应于更均匀的粒度分布。粒度可以在收集纳米粒时、培养时间之后或在整个处理(例如稀释、过滤、透析等)纳米粒制剂之后测定。例如，粒度测定通常在60分钟培养期之后和/或在整个样品处理之后进行。平均粒度报道为Z-均值或数均值。Z-均值通过动态光散射在Malvern Zetasizer上测量。将纳米粒样品稀释在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，使得计数速率为约200-400kcts。数据表示为强度测量值的加权平均值。动态光散射还提供了多分散指数(PDI)，其对粒度分布的宽度进行了定量。较大的PDI与较大的粒度分布相关，反之亦然。在另一方面，数均值可以通过在显微镜下测量来确定。

在某些实施方案中，通过本发明的方法制备的包封核酸纳米粒具有约30至约150nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约30至约40nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约40至约70nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约65至约80nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约50至约80nm的Z-均值和/或约40至约80nm的数均值。在其它实施方案中，颗粒具有约50至约70nm的Z-均值和/或约40至约65nm的数均值。在其它实施方案中，颗粒具有约70至约80nm的Z-均值和/或约60至约80nm的数均值。所获得的颗粒的具体尺寸可取决于核酸和脂质流的线速度、任选稀释步骤的使用和所用的具体核酸或脂质。较大的线速度和保持第一出口溶液中的有机溶剂浓度＜33％倾向于产生较小的粒度。

在某些实施方案中，通过本发明的方法制备的包封siRNA纳米粒具有约30至约150nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约30至约40nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约40至约70nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约65至约80nm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有约50至约80nm的Z-均值和/或约40至约80nm的数均值。在其它实施方案中，颗粒具有约50至约70nm的Z-均值和/或约40至约65nm的数均值。在其它实施方案中，颗粒具有约70至约80nm的Z-均值和/或约60至约80nm的数均值。在其它实施方案中，通过本发明的方法制备的包封siRNA纳米粒可以具有约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75或约80nm的平均直径。

使用动态光散射(例如Malvern Zetasizer NanoZS)，多分散指数(PDI)的范围可以为0至1.0。在某些优选的实施方案中，PDI为小于约0.2。在其它优选的实施方案中，PDI为小于约0.1。

本发明的方法可以由本领域技术人员通过将具有预期pKa范围的阳离子脂质、隐形脂质、辅助脂质和中性脂质合并成制剂而进一步优化，所述制剂包括例如脂质体制剂、脂质纳米粒(LNP)制剂等，用于递送至体内特定的细胞和组织。在一个实施方案中，进一步优化可以通过调节这些各种类型的脂质之间的脂质摩尔比而获得。在一个实施方案中，进一步优化可以通过调节预期粒度、N/P比例和/或加工参数中的一者或多者而获得。本领域技术人员已知的有关上述实施方案的各种优化技术被视为是本发明的一部分。

5.0将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法

下述方法可用于制备本发明的脂质纳米粒。为了获得粒度减小和/或增加颗粒中的尺寸均匀性，本领域技术人员可以使用下文给出的方法步骤，采用不同组合进行试验。另外，技术人员可以采用超声处理、过滤或脂质体制剂中使用的其它改变尺寸的技术。

用于制备本发明的组合物的方法通常包括：提供在第一个储器中的包含核酸的水性溶液如柠檬酸盐缓冲液，提供包含脂质的有机溶液、例如有机醇如乙醇的第二个储器，然后将水性溶液与有机脂质溶液混合。第一个储器任选地是与第二个储器流体连通的。混合步骤任选地继之以培养步骤、过滤或透析步骤以及稀释和/或浓缩步骤。培养步骤包括使来自混合步骤的溶液在大约室温下在容器中静置约0至约24小时(优选约1小时)，并任选避光保护。在一个实施方案中，稀释步骤在培养步骤之后。稀释步骤可以包括用水性缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液或纯净水)稀释，例如使用泵装置(例如蠕动泵)。过滤步骤可以是超滤或透析。超滤包括浓缩稀释液，随后是透滤，例如使用适宜的泵系统(例如泵装置，如蠕动泵或其等同物)连同适宜的超滤膜(例如GE Hollow纤维滤芯或其等同物)。透析包括经由适宜膜(例如10,000mwc蛇皮膜)的溶剂(缓冲液)交换。

在一个实施方案中，混合步骤提供了澄清的单相。

在一个实施方案中，在混合步骤之后，将有机溶剂除去以提供颗粒的混悬液，其中核酸被脂质包封。

有机溶剂的选择通常将包括考虑溶剂极性以及在颗粒形成后期溶剂除去的容易性。有机溶剂(也可以用作增溶剂)的量优选足以提供核酸和脂质的澄清单相混合物。适宜的有机溶剂包括Strickley,Pharmaceutical Res.(2004),21,201-230所述的用作可注射制剂的助溶剂的那些。例如，有机溶剂可以选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲亚砜(DMSO)中的一或多种(例如两种)。优选地，有机溶剂为乙醇。

本文公开了用于制备本发明的组合物的仪器。所述仪器通常包括至少一个容纳包含核酸的水性溶液的储器和另外一个或多个容纳有机脂质溶液的储器。所述仪器通常还包括装配用于将水性溶液和有机脂质溶液泵送到混合区或混合室中的泵装置。在某些实施方案中，所述混合区或混合室包括交叉连接或其等同物，其使得水性流体流和有机流体流当进入交叉连接器时合并和使得所得的合并的水性溶液和有机溶液排出交叉连接器进入收集储器或其等同物中。在某些实施方案中，混合区或混合室包括T形连接或其等同物，其使得水性流体流和有机流体流当进入T形连接器时合并和使得所得的合并的水性溶液和有机溶液排出T形连接器进入收集储器或其等同物中。

可以通过参照图2更好地理解本发明的方法，图2图解了在形成包封核酸纳米粒的示例性方法中使用的系统。仪器1含有交叉器16，交叉器16具有通道12、22和32，用于分别接收第一核酸流10、第二核酸流20和脂质流30。通过从一个或多个含有核酸溶液的储器和一个或多个含有脂质溶液的储器经由适宜的管道泵送各个流，可以将流10、20和30递送至通道12、22和32(管道和储器未显示)。图2中的通道12、22和32具有近似相等的内径。流10、20和30在交汇点14交汇，形成合并流40。由于交叉器16的几何形状，脂质流30沿着与核酸流10和20垂直的方向流动，所述核酸流10和20以对着交汇点14彼此相对约180°的相反方向流动。合并流40流过通道42进入加工室70，其本体(72)可以具有比通道42大的直径。加工室70也可以具有不同长度。例如，加工室70的长度可以是通道12、22和32的直径的约100-2000倍，直径可以是通道12、22和32的直径的约4倍。

在图2的实施方案中，合并流40与通过通道52进入的稀释流50相交。稀释流50可以通过管道从含有稀释溶液的稀释储器递送。在图2中，通道52具有与通道12、22和32相比约2倍大的直径。合并流40和稀释流50在T形室54中交汇。合并流40和稀释流50交汇得到的流是含有包封核酸纳米粒的第一出口溶液60。

在一些实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.1至约1.5mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约10至约25mg/mL。在其它实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.2至约0.9mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约15至约20mg/mL。在其它实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.225、0.3、0.33或0.45至约0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约16-18mg/mL。在其它实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.225、0.3、0.33、0.45或0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约16.7mg/mL。

脂质流包含一种或多种脂质在有机溶剂中的混合物。一种或多种脂质可以是阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质的混合物，其各自可以以大约与上文对最终包封核酸纳米粒所述相同的相对量存在。脂质流中所用的有机溶剂是能够增溶脂质并且与水性介质可溶混的有机溶剂。适宜的有机溶剂包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲亚砜(DMSO)。优选地，有机溶剂包含约80％或更多的乙醇。优选地，有机溶剂包含约90％或更多的乙醇。更优选地，有机溶剂为乙醇。在一些实施方案中，脂质流包含任选的缓冲溶液，例如柠檬酸钠缓冲溶液(例如25mm)。

核酸流包含适宜核酸在第一水性溶液中的混合物。第一水性溶液可以不包括盐或可以包括至少一种盐。例如，第一水性溶液可以包括在没有添加盐的去离子水或蒸馏水中的适宜核酸。在一些实施方案中，第一水性溶液是包括至少一种盐如氯化钠和/或柠檬酸钠的第一缓冲溶液。在第一水性溶液中，氯化钠存在的浓度范围可以为约0至约300mm。在某些实施方案中，氯化钠的浓度为约50、66、75、100或150mm。第一水性溶液可以包括浓度为约0mM至约100mm的柠檬酸钠。第一缓冲溶液优选具有约4至约6.5、更优选约4.5-5.5的pH。在某些实施方案中，第一缓冲溶液的pH为约5，并且柠檬酸钠的浓度为约25mm。在其它实施方案中，第一缓冲溶液的pH为约6，并且柠檬酸钠的浓度为约100mm。优选地，第一缓冲溶液具有小于阳离子脂质的pKa的pH。对于在水性溶液中不包括盐的本发明的实施方案，脂质流包括任选的缓冲溶液。在核酸流或脂质流中不存在盐(例如柠檬酸钠)的情况下，不会出现包封。

其它可能的缓冲液包括但不限于乙酸钠/乙酸、Na₂HPO₄/柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾/氢氧化钠、邻苯二甲酸氢二钠/正磷酸二氢钠、邻苯二甲酸氢二钾/正磷酸二氢钾、正磷酸二氢钾/氢氧化钠。

在一些实施方案中，有机溶剂包含乙醇，并且第一出口溶液包含约20-25％乙醇、约0.15-0.25mg/mL核酸和约3-4.5mg/mL脂质。在其它实施方案中，有机溶剂包含乙醇，并且第一出口溶液包含约20％乙醇、约0.15-0.2mg/mL核酸和约3-3.5mg/mL脂质。在其它实施方案中，有机溶剂包含乙醇，并且第一出口溶液包含约20％乙醇、约0.18mg/mL核酸和约3.3mg/mL脂质。在其它实施方案中，有机溶剂包含乙醇，并且第一出口溶液包含约25％乙醇、约0.2-0.25mg/mL核酸和约4-4.5mg/mL脂质。在其它实施方案中，有机溶剂包含乙醇，并且第一出口溶液包含约25％乙醇、约0.23mg/mL核酸和约4.2mg/mL脂质。

在图2的一些实施方案中，核酸流10和20具有约3至约8米/秒的复合线速度，脂质流30具有约1.5至约4.5米/秒的线速度，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液60中的有机溶剂浓度小于33％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约15-20:1或约17-19:1，出口溶液60中的有机溶剂浓度为约20-25％。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1，出口溶液60中的有机溶剂浓度为约25％。应当理解，从上述范围中选择核酸流和脂质流的线速度受限于保持如本文定义的脂质与核酸比例的要求。因此，为了获得脂质与核酸的目标比例，可能有必要调节其它参数(例如核酸浓度(mg/mL))、流速((mL/min)。

在图2的一些实施方案中，核酸流10和20具有约6至约8米/秒的复合线速度，脂质流30具有约3至约4米/秒的线速度，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液60中的有机溶剂浓度小于33％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约15-20:1或约17-19:1，出口溶液60中的有机溶剂浓度为约20-25％。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1，出口溶液60中的有机溶剂浓度为约25％。

在图2的一些实施方案中，核酸流10和20具有约6.8米/秒的复合线速度，脂质流30具有约3.4米/秒的线速度，流10/20/30/50各自具有大约相同的流速(mL/min)，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液60中的有机溶剂浓度为约25％。通过提供大约相同体积的两个核酸流、一个脂质流和一个稀释流，第一出口溶液中来自脂质流(脂质在100％有机溶剂中)的有机溶剂的总浓度为约25％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约17-19:1。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1。

在本发明的典型实施方案中，核酸流10/20各自可以具有约0.45mg/mL的核酸浓度和3.4米/秒的线速度，脂质流30可以具有约16.7mg/mL的总脂质浓度和约3.4米/秒的线速度，各个流的流速大约相等。例如，通道12、22和32可以具有0.5mm的内径，流10、20和30各自具有约40mL/min的流速和约3.4米/秒的相应线速度。或者，通道12、22和32可以具有1.0mm的内径，流10、20和30各自具有约160mL/min的流速，同时相应的线速度保持为约3.4米/秒。在进一步的供选方案中，通道12、22和32可以具有约2.0mm的内径，流10、20和30各自具有约640mL/min的流速，同时线速度保持为约3.4米/秒。如前述实例中显而易见的，为了保持恒定的线速度，通路和流的直径增加两倍要求流速增加4倍。在这些实例中，稀释流50具有与物流10、20和30相同的流速，虽然通道52的2倍大的直径导致在每个加工规模下稀释流的线速度下降50％。已经出人意料地发现，本发明的方法可以如上所述规模化，同时保持了相同的高的核酸包封度和小且均匀的粒度。

合并的核酸流10/20相对于脂质流30的线速度与各个流中核酸和脂质的浓度以及各个流、包括稀释流50的流速(mL/min)有关。然而，核酸和脂质的浓度不限于上述给出的特定值，并且可以上调或下调，条件是酌情相应地调节流速以通常保持脂质:核酸的比例为约15-20:1。例如，为了保持核酸的总递送恒定，核酸浓度从0.45mg/mL至0.405mg/mL的10％降低将需要流速(mL/min)增加约1.11倍。在保持核酸流的直径恒定的情况下，流速(mL/min)增加1.11倍也导致线速度(米/秒)增加1.11倍。同样在保持稀释流的流速恒定的情况下，出口溶液60中的来自脂质流的有机溶剂总浓度将降低约23.5％。当然，稀释流50的流速同样可以降低，以保持有机溶剂浓度为约25％，如果期望如此的话。最后，核酸浓度足够地降低且核酸流流速相应地增加可以避免需要稀释流50以保持第一出口溶液60中的有机溶剂浓度为约25％。相反，可以增加核酸浓度(例如增加至0.9mg/mL)。然而，为了保持有机溶剂浓度为约25％和脂质:核酸比例为约15-20:1，这种两倍增加将需要相应地降低核酸流的流速和增加稀释流的流速。流10、20、30和50的核酸或脂质浓度、流速或线速度的进一步变化可以根据前述原理进行。

在本发明的其它实施方案中，核酸流10/20和脂质流30的流速和/或线速度可以均降低或升高。因此，在保持每个流的直径和浓度恒定的情况下，合并的核酸流的线速度可以降低至3.4米/秒且脂质流的线速度可以降低至1.7米/秒。在其它实施方案中，合并的核酸流的速度可以降低至约3米/秒，脂质流的速度可以降低至约1.5米/秒。同样，合并的核酸流的速度可以升高至约14米/秒，且脂质流的速度可以升高至约7米/秒。通常，速度范围的上限仅受到用于泵送流的装置的机械限制。非常高的流速/速度可导致引起装置故障的回压。通常，图2的合并的核酸流的速度范围可以为约3米/秒至约14米/秒，对于脂质流可以为1.5至约4.5米/秒。优选地，合并的核酸流的速度为约6-8米/秒，对于脂质流为约3-4米/秒。在一些实施方案中，合并的核酸流的复合速度为约6.8米/秒，对于脂质流为约3.4米/秒。

在本发明的的某些实施方案中，核酸和脂质的浓度可以均降低或升高。例如，虽然为了更有效的方法通常期望保持浓度尽可能高，但是降低核酸浓度至约0.045mg/mL和降低脂质浓度至约1.67mg/mL是可能的。然而，在更低的浓度下，颗粒聚集往往增加。

在图2的一些实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.1至约1.5mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约10至约25mg/mL。在其它实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.2至约0.9mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约15至约20mg/mL。在其它实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.225、0.3、0.33或0.45至约0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约16-18mg/mL。在其它实施方案中，一个或多个核酸流中的核酸浓度为约0.225、0.3、0.33、0.45或0.675mg/mL，并且一个或多个脂质流中的脂质浓度为约16.7mg/mL。通常，较高的核酸浓度需要相应地增加来自稀释流50的稀释水平以保持第一出口流60中的核酸浓度处于优选范围(例如，约0.15-0.25mg/mL)。

在其它实施方案中，图2中的T形连接器可以被交叉器54a(图2a)替代，从而两个稀释流50a和50b可以与合并流(例如流40)交汇。稀释流50a和50b通过交叉器54a的通道52a和52b进入。使用两个稀释流而不是单一稀释流使得合并流40的稀释因数更大。所得到的第一出口流60的更大稀释可以提供稍微更小的粒度。例如，使用上文关于图2所述的核酸流/脂质流的流速和速度，但是替换以图2a的交叉器54a，可以使稀释溶剂的体积加倍。所得到的第一合并流40的更大稀释产生了具有较低浓度的来自脂质流的有机溶剂(例如乙醇)的第一出口流60。例如，使用交叉器54a，第一出口溶液中的有机溶剂浓度可以降低至约20％。在其它方面，采用交叉器54a，与有关图2中所述相同，可以改变核酸浓度、脂质浓度、流速、速度等。

或者，来自前述实施方案任一个的合并流可以在含有与稀释流50、50a或50b所提供相等的体积的稀释溶剂的稀释池中简单稀释。

在供选实施方案中，图2中的交叉器16可以被如图3a所示的T-形室86代替。使用室86的方法具有两个进入通道82和92，用于一个核酸流80和一个脂质流90。在使用混合室86的方法中，核酸流和脂质流具有彼此相对约180°的相反流向。采用室86，单个核酸流的流速和速度可以是脂质流的两倍，以保持采用交叉器16(利用两个核酸流)可以获得的相同的脂质:核酸比例。例如，在采用T形室86(例如0.5mm直径的通道82和92)的一个实施方案中，具有约0.45mg/mL核酸的核酸流可以具有约80mL/min的流速和6.8米/秒的线速度，脂质流可以具有约16.7mg/mL的浓度和3.4米/秒的线速度。在采用室86的方法中如图2所示采用流速为40mL/min的稀释流50导致第一出口溶液中的有机溶剂浓度为约25％。令人惊奇地，采用T形室86可以获得与采用交叉器16相同的小粒度和均匀性的有益性质。与图2中单个核酸流的流速相比，采用T形室86的区别是核酸流的流速加倍。对于两种方法而言，整体的核酸流流速保持相同，因此产生了具有基本等同性质的纳米粒。

在使用T形室86和稀释流50的一些实施方案中，核酸流80具有约3至约8米/秒的线速度，脂质流90具有约1.5至约4.5米/秒的线速度，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约15-20:1或约17-19:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20-25％。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约25％。

在使用T形室86和稀释流50的其它实施方案中，核酸流80具有约6至约8米/秒的线速度，脂质流90具有约3至约4米/秒的线速度，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约15-20:1或约17-19:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20-25％。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约25％。

在使用T形室86和稀释流50的一个实施方案中，核酸流80具有约6.8米/秒的线速度，脂质流90具有约3.4米/秒的线速度，流80的流速(mL/min)是流90和稀释流50的两倍，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约25％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约17-19:1。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1。

在使用T形室86而没有稀释流50的一些实施方案中，核酸流80具有约8至约14米/秒的线速度，脂质流90具有约1.5至约4.5米/秒的线速度，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约15-20:1或约17-19:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20-25％。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20或25％。

在使用T形室86没有稀释流50的其它实施方案中，核酸流80具有约9至约11米/秒的线速度，脂质流90具有约3至约4米/秒的线速度，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约15-20:1或约17-19:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20-25％。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约25％。

在使用T形室86而没有稀释流50的一个实施方案中，核酸流80具有约10.2米/秒的线速度，脂质流90具有约3.4米/秒的线速度，流80的流速(mL/min)为流90的三倍，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约25％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约17-19:1。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1。

在使用T形室86而没有稀释流50的其它实施方案中，核酸流80具有约11至约14米/秒的线速度，脂质流90具有约3至约4米/秒的线速度，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约15-20:1或约17-19:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20-20％。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20％。

在使用T形室86而没有稀释流50的一个实施方案中，核酸流80具有约13.6米/秒的线速度，脂质流90具有约3.4米/秒的线速度，流80的流速(mL/min)是流90的四倍，脂质:核酸的质量比为约15-20:1，出口溶液中的有机溶剂浓度为约20％。在特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约17-19:1。在其它特定实施方案中，脂质:核酸的质量比为约18.5:1。

如上文关于图2所述，采用T形室86，核酸流80和脂质物流90的比例、浓度、流速和线速度可以类似地变化。特别地，上文关于图2所述的核酸浓度、脂质浓度和乙醇浓度也可用于采用T形室86的本发明的实施方案。在一个示例性的实施方案中，核酸浓度可以减小三分之一(例如从0.45减小至0.3mg/mL)，并且核酸流的流速增加50％(例如从80mL/min增加至120mL/min)，以保持相同的核酸总递送(约36mg/min)。线速度将类似地增加至约10.2米/秒。由于核酸流的更大稀释，在没有使用补充性稀释流的情况下可以获得出口溶液中约25％的有机溶剂浓度。通过进一步增加核酸流流速至160mL/min(对于0.5mm流，速度为13.6米/秒)，出口溶液中的有机溶剂浓度减小至约20％。在后一方法中，核酸流的速度可以减小至约6.8米/秒，并且脂质流的速度减小至约1.7米/秒，粒度和均匀性没有显著变化。

虽然图2和3以及上文概述的各种核酸、脂质和稀释流以直角或正面交汇，但是这些角度不是重要的。例如，图3中的T形室86可以被Y-形室84(图3b)替代。或者，T形室的方向可以如室94(图3c)所示进行旋转。虽然图3c显示核酸流80与脂质流90的顺流交汇，但是在图3c中核酸和脂质流的位置可以反过来。

在其它实施方案中，核酸和脂质流的数量可以进一步改变，同时适当地调节浓度和流速。例如，采用适宜的装置，2、3或4个脂质流可以与1、2、3或4个核酸流合并。

本文所述的本发明的方法提供了高的核酸包封率。通常，包封率>70％。在本发明的某些实施方案中，75％或更多的核酸被包封。在其它实施方案中，80％或85％的核酸被包封。在其它的实施方案中，90％或更多的核酸被包封。在其它实施方案中，约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99或约100的核酸被包封。

在如本文所述形成包封核酸纳米粒之后，可以在室温下培养第一出口溶液约60分钟。在培养后，可以将该溶液与第二稀释溶剂混合，以将第一出口溶液稀释约2倍，得到第二出口溶液。第二稀释溶剂可以是第三种缓冲溶液或水。稀释步骤可以通过在T连接器如图3a中的T形室86中将经培养的第一出口溶液与第二稀释溶剂(水)混合来进行。经培养的第一出口溶液和第二稀释溶剂可以以任何适宜的流速或速度、例如约0.5至1米/秒供应给T连接器。在稀释步骤之后，相对于第一出口溶液，第二出口溶液中的有机溶剂浓度降低了一半。因此，在某些实施方案中，第二出口溶液的有机溶剂(例如乙醇)浓度小于16.5％。在其它实施方案中，第二出口溶液中的有机溶剂(例如乙醇)浓度为约10-15％、约10-12.5％、约12.5％或约10％。第二出口溶液可以通过切向流过滤进行浓缩，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行15X透滤以除去起始缓冲液和乙醇，它们被PBS所替换。在切向流过滤之后，可以收集浓缩的在PBS中的包封核酸纳米粒池，如下述实施例中更详细描述的那样进行无菌过滤。通过前述的额外方法步骤制备的制剂中存在的包封核酸纳米粒可以于4℃稳定存储6个月以上。

根据本文公开的每个实施方案，进一步的实施方案是其中核酸为siRNA的实施方案。例如，根据本文描述的实施方案，进一步的实施方案是其中核酸流为包含在缓冲溶液中的一种或多种siRNA分子的混合物且具有本文所公开的线速度的siRNA流。

6.0方法实施例

6.1siRNA脂质制剂

通过图2-3b概括显示和上文概述的系统和仪器，通过将溶于乙醇中的脂质溶液与溶于柠檬酸盐缓冲液中的siRNA混合形成了包封siRNA脂质纳米粒。使用具有内径为0.5、1.0或2.0mm的通道的混合室。加工室具有50mm至1000mm的长度。稀释室的通道的内径等于或至少是约0.5或1.0或2.0或4.0mm的混合室的内径的两倍。脂质溶液含有阳离子脂质、辅助脂质(胆固醇)、中性脂质(DSPC)和隐形脂质。

总脂质浓度为16.7mg/mL或25mg/mL。对于这些实验，总脂质:siRNA的比例为约18.3:1。siRNA溶液的浓度为在柠檬酸钠:氯化钠缓冲液(pH5)中0.225、0.3、0.3375或0.45mg/mL。NaCl的浓度为50mm、66mm、75mm或100mm。流速和线速度如下所述变化。

对于siRNA包封实验，所用的阳离子脂质和隐形脂质(即PEG脂质)显示在下表中。

表2

这些实验使用的siRNA具有如下表所示的序列和SEQ ID NO.。

表3

6.2方法实施例1 siRNA的包封

6.2.1在乙醇中的脂质混合物的制备

下述是以4.5:1的阳离子脂质胺比siRNA磷酸盐(N:P)的摩尔比包封siRNA的实例。将表4所示量的脂质(阳离子脂质、DSPC、胆固醇和脂质化PEG)溶于150mL乙醇中。脂质的摩尔比分别为45:9:44:2。将混合物简单超声，然后轻轻振荡5分钟，随后于37℃保持备用。

表4脂质混合物组分

试剂	量(mg)	MW	最终浓度(mM)
				阳离子脂质A1	1315.9	732.15	12
DSPC	284	790.16	2.4
				胆固醇	679.5	386.67	11.7
PEG脂质B1	226.6	2837	0.53

6.2.2 siRNA SEQ ID NO.1在柠檬酸盐缓冲液中的制备

用于siRNA流的缓冲液为pH 5的100mm氯化钠和25mm柠檬酸钠。柠檬酸盐缓冲液的pH最初证实为pH 5.00。如果不是，则在进行操作之前调节pH。将足量的用于包封的在水中的siRNA从-80℃贮存下解冻。将siRNA SEQ ID NO.1加入到柠檬酸盐缓冲溶液中，通过在UV分光光度计中以260nm的光密度测量溶解的siRNA的浓度。在无菌PETG瓶中在150ml柠檬酸盐缓冲液中将siRNA的终浓度调节为0.45mg/mL，于室温储存备用。

6.2.3 siRNA在脂质纳米粒中的包封

使用如图2概括显示的系统进行siRNA包封。向无菌注射器中装载相同体积(25ml)的在乙醇中的脂质(注射器(a))、在柠檬酸盐缓冲液中的siRNA(注射器(b1)和(b2))和单独的水(注射器(c))。将从在含有16.7mg/mL脂质的注射器(a)上的Luer装置引出的管道连接至具有0.5mm内径的交叉连接器的中心输入口。将从在含有0.45mg/mL siRNA的注射器(b1)和(b2)上的Luer装置引出的管道连接至交叉连接器的侧面输入口。管道是具有1.55mm内径的氟化乙烯丙烯(FEP)管道。注射器(a)、(b1)和(b2)安装在注射器泵A上。从脂质输入对面的交叉器中心输入引出的管道与具有1mm内径的T形连接器(参见例如图2，T形连接器54)连接。从在含有单独的水的注射器(c)上的Luer装置引出的管道与T形连接器连接，以能够在线稀释siRNA脂质纳米粒，注射器(c)安装在注射器泵B上。将来自T形连接器的输出线放置在无菌PETG瓶上用于收集稀释的siRNA脂质纳米粒。重要的是确保所有装置都紧紧地在注射器上。将注射器泵设置为适当的注射器制造商和尺寸及40ml/分钟的流速。同时启动两个泵，在约0.5秒后开始收集材料。收集约90ml的包封siRNA脂质纳米粒，其含有按体积计25％的乙醇、0.23mg/mL的siRNA、4.2mg/mL的脂质和50mm的NaCl。在60分钟的混合后培养期之后，使用Malvern Zetasizer测定粒度。

6.2.4 siRNA脂质纳米粒的稀释

设置1.0mm内径的T形连接器用于进一步稀释siRNA脂质纳米粒混悬液。该稀释步骤采用在一个注射器泵上的两个注射器进行。一个140mL注射器含有siRNA脂质纳米粒，第二个140mL注射器含有水。流速设置为25ml/分钟。siRNA流和水流以彼此180度的方向进入T形连接器。将稀释的siRNA脂质纳米粒混悬液收集到无菌PETG瓶中。最终体积将为约280ml，乙醇浓度为12.5％。

6.2.5通过切向流过滤对siRNA脂质纳米粒进行透析和浓缩

对于每50mg的包封运行中的siRNA，使用Vivaflow 50柱。对于100mg siRNA包封运行，使用串联连接的2个Vivaflow 50柱。再生纤维素柱必须进行冲洗以除去来自制造商的任何贮存溶液。这通过用500ml DI水填充空的TFF储器和用蠕动泵以115ml/min的流速再循环来进行。渗透线不应当受限制，冲洗过程在全部500ml水冲过膜后完成。

将siRNA脂质纳米粒混悬液上样到Minimate TFF储器中。将混合物浓缩，同时保持总压力为20-25psi。在整个浓缩步骤中，滤液应当以约4ml/分钟洗脱。该速率是采用夹管阀限制渗透线直到获得适当的流速来获得的。进行浓缩直至储器中的液面处于15ml刻度。将浓缩的siRNA脂质纳米粒混悬液对225ml无热原、无核酸酶的1x PBS进行透滤。增加流速至80ml/min。透滤后，重新开始浓缩该物质直至TFF系统的滞留体积。从储器收集siRNA脂质纳米粒混悬液。能够用另外2ml 1x PBS冲洗TFF系统和收集含有稀释的siRNA脂质纳米粒混悬液的该清洗液，但是该清洗液应当与浓缩的siRNA脂质纳米粒混悬液分别收集。将物质于4℃储存待分析。

6.2.6无菌过滤步骤

通过在被置于预热至50℃的铝块加热器中10min的玻璃小瓶中加热约10ml混悬液将siRNA脂质纳米粒进行过滤。然后，移开小瓶，用注射器移出溶液，经0.22μm PES针筒式过滤器直接过滤入无菌小瓶中。将最终产品于4℃贮存。

6.2.7包封百分比的测定(SYBR GOLD)

为了测定siRNA配制成脂质纳米粒的效率，可以通过测量sybr gold荧光来测定siRNA的包封百分比。当与siRNA结合时，sybr gold发出荧光。sybr gold的荧光强度与siRNA的量是成比例的。

在PBS中制备约0.9mg/mL的siRNA储备液的标准溶液。通过UV测量检验siRNA储备液的浓度。用PBS将siRNA储备液稀释至8μg/mL。进行系列稀释以制备4、2、1、0.5和0.25μg/mL的siRNA溶液。通过将等体积的8μg/mL和4μg/mL溶液混合制备6μg/mL的siRNA。

为了制备试验样品，将10μL siRNA脂质纳米粒混悬液用990μL PBS稀释(现在，这是溶液A)。注意：该第一稀释步骤用于具有～3.6mg/mL或更小的预期siRNA浓度的制剂。如果该浓度高于～3.6mg/mL，则稀释应当更大。将40uL溶液A用160μL PBS稀释(现在，这是溶液1)。

为了测量制剂中的游离siRNA，制备sybr gold在PBS中的0.02％溶液(例如3μLsybr gold在15ml PBS中)(溶液2)。在96孔黑色透明底板中，将10μL溶液1与190μL溶液2混合，得到样品混合物1。在该混合物中，sybr gold仅仅结合未包封的(即游离的)siRNA。它将不能接近脂质体中包封的siRNA。

为了测量制剂中的总siRNA，制备了0.02％sybr gold和0.2％triton-x在PBS中的溶液(例如，3μL sybr gold在15mL 0.2％triton在PBS中)(溶液3)。在96孔黑色透明底板中，将10μL溶液1与190μL溶液3混合，得到样品混合物2。在该混合物中，triton-x破坏了脂质体，并使之前被包封的siRNA暴露于sybr gold结合。因此，sybr gold将结合未包封的(即游离的)siRNA和所有新暴露出的siRNA。游离的siRNA+新暴露的siRNA＝总siRNA。

将上述标准溶液(各10μL)与190μL溶液2混合以得到标准混合物1，或者与190μL溶液3混合以得到标准混合物2。

在SpectraMax M5分光光度计上、使用软件SoftMax pro 5.2及下述参数测量了所有混合物的荧光：

λ_ex＝485nm λ_ex＝530nm

读数模式: 荧光，顶读

波长: Ex 485nm，Em 530nm,自动切断开启530nm

灵敏度: 6个读数,PMT:自动

自动混合: 之前:关

自动校准：开

分析板类型： 96孔costarblk/clrbtm

读取孔：读取全部板

稳定时间: 关

列波长优先：列优先

运输速度: 正常

自动读数: 关

使用从标准混合物1得到的荧光强度值建立游离siRNA的校正曲线。然后，将样品1混合物的荧光强度代入通过游离siRNA的校正曲线提供的方程式中。然后，将样品的实测浓度乘以稀释值，得到脂质纳米粒制剂中的游离siRNA。

使用从标准混合物2得到的荧光强度值建立总siRNA的校正曲线。然后，将样品2混合物的荧光强度代入通过总siRNA的校正曲线提供的方程式。然后，将样品的实测浓度乘以稀释值，得到脂质纳米粒制剂中的总siRNA。

通过下式计算包封的siRNA：[(总siRNA-游离siRNA)/(总siRNA)]x 100％。

6.2.8使用尺寸排阻色谱法(SEC)测定包封百分比

由于游离siRNA的尺寸(5nm)与脂质体的尺寸(50-200nm)不同，因此它们在尺寸排阻柱中将在不同时间洗脱。游离siRNA在脂质体之后洗脱出。siRNA的保留时间为～17分钟，而脂质体的保留时间为～10分钟。经UV检测器，在设定为260nm的吸收波长进行洗脱的siRNA的检测。

在PBS中制备约0.9mg/mL的siRNA储备液。向200μL等分试样的的储备液中加入10μL TRITON X-100。通过UV测量检验siRNA储备液的浓度。进行系列稀释以制备siRNA储备液的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32浓度的标准溶液。将10μL TRITON X-100加入到200μL的各标准溶液中。通过UV测量验证各标准溶液的浓度。

在HPLC小瓶中，将25μL纳米粒制剂加入到185μL 1X PBS(10X PBS(FISHER,BP399)用去离子水稀释至1X)中。将该分散液轻轻涡旋至均匀(分散液1)。在另一个HPLC小瓶中，将25μL脂质纳米粒制剂加入到185μL 20％TRITON X中。将分散液轻轻涡旋至澄清且均匀(分散液2)。

在AGILENT 1200HPLC上，使用EMPOWER PRO软件进行尺寸排阻色谱法。参数为：

柱温: 30℃

流动相流速：: 1ml/min，30分钟

UV检测器波长: 260nm

进样体积:: 20uL

进样数： 2

将20μL标准溶液和分散液进样到尺寸排阻柱上，流动相1x PBS，pH调节为7.7，以1mL/min流动30分钟。采用UV检测器，用260nm吸收波长检测洗脱的物质。

对于siRNA标准溶液，～17分钟的峰代表siRNA。对于分散液1，～10分钟的峰代表含有包封的siRNA的脂质纳米粒，～17分钟的峰代表未包封的(即游离的)siRNA。

在分散液2中，TRITON-X破坏了脂质纳米粒，使得之前包封的siRNA在17分钟与已经游离的siRNA一起洗脱出。～10分钟的峰消失，色谱图中仅保留了一个峰，即～17分钟的峰，其代表未包封的(即游离的)siRNA和新游离的siRNA。游离的siRNA+新游离的siRNA＝总siRNA。

使用从siRNA标准溶液获得的峰面积值建立siRNA浓度校准曲线。将分散液1的～17分钟峰的积分面积代入通过游离siRNA的校正曲线提供的方程式中，得到分散液中的游离siRNA的浓度。然后，将样品的实测浓度乘以稀释值，得到脂质纳米粒制剂中的游离siRNA。

将分散液2的～17分钟峰的积分面积代入通过游离siRNA的校正曲线提供的方程式中，得到分散液中的总siRNA的浓度。然后，将样品的实测浓度乘以稀释值，得到脂质纳米粒制剂中的总siRNA。

6.2.9颗粒分析

使用来自Malvern Instruments的Zetasizer Nano ZS分析siRNA脂质纳米粒的尺寸和多分散性。对于包封siRNA浓度＞1mg/mL的配制的siRNA，用115μl 1x PBS稀释5μl样品。加入到小体积的一次性微量比色杯中。将比色杯插入Zetasizer Nano ZS中。对于机器设置，将材料设置为聚苯乙烯胶乳，分散剂设置为水，池设置为ZEN040。在没有等待时间的情况下于25℃测量样品。记录Z-均值(设置为直径，纳米单位)和多分散指数(PDI)。

表5显示了使用上述方法对于siRNA和脂质纳米粒组合获得的结果。使用SEC方法测定包封百分比。

表5.siRNA脂质纳米粒包封结果

6.3方法实施例2稀释的影响

使用基本上如图2所示的系统，将具有浓度0.45mg/mL的siRNA SEQ ID NO:1、pH 5的100mM NaCl和25mM柠檬酸钠的两个核酸水性流从相对方向引入具有内径0.5mm通道的十字形混合室中，各自流速为40mL/min。同时，将脂质流从与两个核酸流垂直的方向引入十字形混合室中，流速为40mL/min。脂质流由45％阳离子脂质A1、44％胆固醇、9％DSPC和2％PEG-脂质B1在乙醇中制成。脂质的总浓度为16.7mg/mL。在一个运行中，使用类似于图2中的室54的T-形室(内径1.0mm)使来自十字形混合室的合并流进行水稀释步骤。以40mL/min的速度将水引入到T-形室中。收集得到的溶液，分析包封核酸纳米粒的尺寸和均匀性，结果显示在表6的项目1中。从项目1获得的溶液包括按体积计25％的乙醇、0.23mg/mL的siRNA、4.2mg/mL的脂质和50mm的NaCl。在使用相同浓度、流速和初始十字形混合室的单独试验中，将来自混合室的合并流稀释在与项目1中所用相同的稀释体积的水中。这些结果显示在表6的项目2中。所收集溶液的浓度与项目1中相同。为了对比，在相同操作条件下进行另一次试验，但是没有任何稀释步骤。这些结果显示在表6的项目3中。在没有任何稀释步骤下，项目3中的所收集溶液包括33％的乙醇、0.3mg/mL的siRNA、5.6mg/mL的脂质和66mM的NaCl。项目1和2的Z-均值、#-均值和PDI小于没有进行稀释步骤的项目3。表中的Z-均值、#-均值和PDI是在混合后60分钟时测定的。

表6

使用如表6项目1所述相同的方法和脂质混合物，但是采用siRNA SEQ ID NO.3，制备了均匀尺寸的脂质纳米粒，显示在图4a中。用图3a的T-形混合室(内径0.5mm)代替十字形混合室，同时在流速40mg/mL下升高siRNA ID.NO.3的浓度至0.9mg/mL(在一半体积中的相同总量的siRNA)，得到了尺寸较不均匀的脂质纳米粒，显示在图4b中。使用T-形混合室和0.9mg/mL的siRNA的类似方法描述在方法实施例4中。

6.4方法实施例3流速、速度和溶液浓度的影响

在使用类似于图3a所示且具有0.5mm内径的T-形混合室的一系列实验中，将单个核酸流和单个脂质流以各种流速/速度和浓度混合。核酸和脂质流包括如上文方法实施例2中所述的相同组分。在这些实施例中没有使用任何稀释步骤，因为调节了初始siRNA浓度以获得与表6项目1相同的最终溶液浓度。在这些实验中，脂质在乙醇中的浓度为16.7mg/mL(1x)或25mg/mL(1.5x)。结果显示在下表7中，Z-均值、#-均值和PDI在混合60分钟后测定。

表7

6.5方法实施例4流速和速度的影响

在使用类似于图3a(内径0.5mm)中所示和方法实施例3中使用的T-形混合室的一系列实验中，将单个核酸流和单个脂质流以各种流速/线速度从相对方向混合，然后用水以1mm内径稀释T形器(如图2中概述)稀释。在方法实施例4中使用上述量的siRNA SEQ IDNO.4、阳离子脂质A1、PEG脂质B1、胆固醇和DSPC。乙醇流中的脂质总浓度为16.7mg/mL。核酸流中的siRNA浓度为0.9mg/mL。表8中的结果表明，线速度增加减小了粒度和PDI。

表8

6.6方法实施例5T-形混合室方向的影响

表9显示了使用类似于图3c所示的供选混合室(内径0.5mm)的两个实验的结果。项目1显示了其中siRNA从支路进入获得的结果，项目2显示了其中脂质从支路进入获得的结果。对于两个实验，siRNA和脂质与上文方法实施例2中所述的那些相同。siRNA流的流速为120mL/min，脂质流的流速为40mL/min。在含有66mM NaCl的缓冲溶液中，siRNA浓度为0.3mg/mL。脂质浓度为16.7mg/mL。Z-均值、#-均值和PDI在混合后60分钟时测定。

表9

6.7方法实施例6混合室配置的影响

使用具有不同的核酸和脂质流配置的混合室进行一系列实验，流的总数为3至6个。在每种情况下，混合室具有1mm内径的室，调节流速以保持siRNA流的复合流速为240mL/min和脂质流的复合流速为80mL/min。在这些实验中，siRNA的浓度为0.3mg/mL，脂质的浓度为16.7mg/mL。合并的siRNA流的线速度为5.1米/秒。合并的脂质流的线速度为1.7米/秒。当流的数量允许一种以上的流排列时，表10指出了脂质或siRNA流之间的角度。例如，在三个脂质流和三个siRNA流的情况下，每个脂质流与下一个脂质流间隔60度(即3个相邻的脂质流)或120度(即脂质流间隔120度，介于其间的siRNA流也间隔120度)。对于表10中概括的试验结果，使用了siRNA SEQ ID NO.5与比例为45:9:44:2的阳离子脂质A4、DSPC、胆固醇和PEG脂质B1。表10中显示的结果表明，当总流速/速度保持恒定时，不同的混合配置得到了基本相同的结果。

表10.

6.8方法实施例7mRNA的包封

6.8.1材料和试剂

表11用于瘦蛋白mRNA在脂质纳米粒中包封的通用材料和试剂

TEV-h瘦蛋白-GAopt-2xhBG-120A(SEQ ID NO:6)

序列特征:

烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus,TEV)5’UTR:14-154

最佳Kozak序列：155-163

蛋白质登记号#_NP_000221的编码人瘦蛋白的氨基酸1-167，由GeneArt优化的序列密码子：164-664

2个终止密码子：665-670

人β-珠蛋白3’UTR的2个拷贝：689-954

120个核苷酸聚A尾：961-1080

GGGAGACGCGUGUUAAAUAACAAAUCUCAACACAACAUAUACAAAACAAACGAAUCUCAAGCAAUCAAGCAUUCUACUUCUAUUGCAGCAAUUUAAAUCAUUUCUUUUAAAGCAAAAGCAAUUUUCUGAAAAUUUUCACCAUUUACGAACGAUAGCCGCCACCAUGCACUGGGGAACCCUGUGCGGAUUCCUGUGGCUGUGGCCCUACCUGUUCUAUGUGCAAGCCGUGCCCAUCCAGAAGGUGCAGGACGACACCAAGACCCUGAUCAAGACCAUCGUGACCCGGAUCAACGACAUCAGCCACACCCAGAGCGUGUCCAGCAAGCAGAAAGUGACCGGCCUGGACUUCAUCCCCGGCCUGCACCCUAUCCUGACCCUGUCCAAGAUGGACCAGACCCUGGCCGUGUACCAGCAGAUCCUGACCAGCAUGCCCAGCCGGAACGUGAUCCAGAUCAGCAACGACCUGGAAAACCUGCGGGACCUGCUGCACGUGCUGGCCUUCAGCAAGAGCUGCCAUCUGCCUUGGGCCAGCGGCCUGGAAACCCUGGAUUCUCUGGGCGGAGUGCUGGAAGCCAGCGGCUACUCUACAGAGGUGGUGGCCCUGAGCAGACUGCAGGGCAGCCUGCAGGAUAUGCUGUGGCAGCUGGAUCUGAGCCCCGGCUGCUAAUAGCGGACCGGCGAUAGAUGAAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA.

6.8.2在乙醇中的脂质混合物的制备

下述为以阳离子脂质胺比mRNA磷酸盐(N∶P)摩尔比为4∶1包封mRNA的实例。将脂质(阳离子脂质、DSPC、胆固醇和脂质化PEG)溶于乙醇中。脂质的摩尔比各自为40:10:48:2。例如，表12是所有组分在脂质在乙醇中的63ml体积溶液中的量和最终浓度。63ml体积代表所需提及的1.05x以确保可获得目标体积用于装载到注射器中。将混合物称重，放入聚乙烯对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate glycol,PETG)改性的无菌125ml瓶中，加入乙醇。将混合物简单超声，然后轻微振荡5分钟，随后保持在37℃备用。

表12脂质混合物组分

6.8.3 mRNA在柠檬酸盐缓冲液中的制剂

首先证实柠檬酸盐缓冲液的pH为pH 6.00。如果不是，则在进行操作之前调节pH。将足量的用于包封的在水中的mRNA从-80℃贮存下解冻，通过使用Amicon Ultra-15离心浓缩器从水中交换到柠檬酸盐缓冲液pH6.0中。每个浓缩器可以装入10-12mg的mRNA，将其于4℃以4,000rpm离心5分钟。通过加入柠檬酸盐缓冲液pH 6.0使体积增加。为了获得期望的缓冲条件，推荐用≥10体积的柠檬酸盐缓冲液pH6.0交换。通过UV分光光度计在260nm的光密度测量mRNA的浓度。在无菌250ml PETG瓶中，在126ml柠檬酸盐缓冲液中将mRNA的最终浓度调节为0.25mg/mL，于室温保持备用。126ml体积代表1.05x的所需体积以确保可获得目标体积用于装入注射器中。

6.8.4 mRNA在脂质纳米粒中的包封

使用如图2概括显示的系统进行mRNA包封。向60ml无菌注射器中装载相同体积(60ml)的在乙醇中的脂质(注射器(a))、在柠檬酸盐缓冲液中的mRNA(注射器(b1)和(b2))和单独的柠檬酸盐缓冲液(注射器(c))。将从在含有脂质的注射器(a)上的Luer装置引出的管道连接至具有0.5mm内径的交叉连接器的中心输入口。将从在含有0.25mg/ml mRNA的注射器(b1)和(b2)上的Luer装置引出的管道连接至交叉连接器的侧面输入口。管道是具有0.8mm内径的PTFE管道。注射器(a)、(b1)和(b2)安装在注射器泵A上。从脂质输入对面的交叉器中心输入引出的管道与T形连接器(参见例如图2，T形连接器54)连接。从在含有单独的柠檬酸盐缓冲液的注射器(c)上的Luer装置引出的管道与T形连接器连接，以能够在线稀释mRNA脂质纳米粒，注射器(c)安装在注射器泵B上。将来自T形连接器的输出线放置在500ml无菌PETG瓶上用于收集稀释的mRNA脂质纳米粒。重要的是确保所有装置都紧紧地在注射器上。在该尚未优化的中间试验中，将注射器泵设置为适当的注射器制造商和尺寸(BD,Plastipak,60ml)及至多16ml/分钟的流速。同时启动两个泵，在约0.5秒后开始收集材料。将收集约220-230ml的包封mRNA脂质纳米粒。

6.8.5 mRNA脂质纳米粒的稀释

使用140ml注射器抽出135ml的mRNA脂质纳米粒混悬液。将剩余的85-95ml转移到第二个140ml注射器中。准备含有相同体积的柠檬酸盐缓冲液的140ml注射器。将另一个T形连接器设置用于mRNA脂质纳米粒混悬液的另一次稀释。该稀释步骤采用在仅一个注射器泵上的两个注射器进行。首先运行具有135ml体积的140ml注射器(一个含有脂质纳米粒，另一个含有柠檬酸盐缓冲液)，其次运行具有较小体积的140ml注射器。重要的是确认所有装置都紧紧地在注射器上。对于第一个运行，改变注射器泵的设置以校正尺寸和制造商(140ml,Sherwood-Monoject)。流速设置为25ml/分钟。将稀释的mRNA脂质纳米粒混悬液收集到500ml无菌PETG瓶中。最终体积将为约440-460ml。

6.8.6通过切向流过滤对mRNA脂质纳米粒进行透析和浓缩

对于每15mg的包封运行中的mRNA，使用Vivaflow 50柱。对于30mg mRNA包封运行，使用串联连接的2个Vivaflow 50柱。再生纤维素柱必须首先使之无热原。该操作应当在包封前一天开始。使用Minimate TFF系统，建立两个串联的Vivaflow 50柱，连接管。将500ml无热原、无核酸酶的水装入储器中，以20psi压力使其通过柱。将100ml 0.1M NaOH/1.0MNaCl装入储器，使50ml通过柱。使其余50ml在柱中静置过夜。第二天早晨使剩余的50ml以20psi通过柱。再将无热原、无核酸酶的水装入储器中，使50ml通过柱。再重复水洗涤两次。测试最后一次水冲洗液等分试样的内毒素，以确保内毒素低于可检测量。

将mRNA脂质纳米粒混悬液上样到Minimate TFF储器中。将混合物浓缩，同时保持总压力为20-25psi。滤液应当以约4ml/分钟开始洗脱，但是将会减慢。进行浓缩直至储器中的液面处于40ml刻度。将浓缩的mRNA脂质纳米粒混悬液对300ml无热原、无核酸酶的1x PBS进行透滤。保持压力为20-25psi。透滤后，重新开始浓缩该物质直至恰好低于储器上的10ml刻度标记。从储器收集mRNA脂质纳米粒混悬液。能够用另外5ml 1x PBS冲洗TFF系统和收集含有稀释的mRNA脂质纳米粒混悬液的该清洗液，但是该清洗液应当与浓缩的mRNA脂质纳米粒混悬液分别收集。将物质于4℃储存待分析。

6.8.7以384孔板分析测定包封百分比

为了测定mRNA配制成脂质纳米粒的效率，使用来自Life Technologies的Quant-IT ribogreen RNA分析试剂盒测量mRNA的包封百分比。将mRNA脂质纳米粒混悬液在无核酸酶的TE缓冲液中分析以测定脂质纳米粒外的mRNA的浓度，以及在TE缓冲液+0.75％TritonX-100洗涤剂中分析以分裂脂质纳米粒和测定整个脂质纳米粒混悬液中的mRNA浓度。使用两个浓度的关系计算包封百分比。

在TE缓冲液和TE缓冲液+0.75％Triton X-100洗涤剂中，由试剂盒中提供的100μg/mL储备液标准RNA制备了RNA的1000ng/mL溶液。根据表13，采用该储备液产生了在TE缓冲液和TE缓冲液+0.75％Triton X-100洗涤剂中的标准曲线。

表13用于Quant-IT ribogreen分析试剂盒的标准曲线

使用400-2,000倍范围的稀释度，小心地制备在TE缓冲液和TE缓冲液+0.75％Triton X-100洗涤剂中的mRNA脂质纳米粒样品。对于两步稀释，确保在PBS中、而不是在TE或TE+Triton中进行第一步。对于每种缓冲条件下的每种样品，制备两组稀释系列，一式三份测定每组稀释系列，对于每个缓冲条件每种mRNA脂质纳米粒样品总共6个孔。在96-孔深孔板中制备标准曲线和稀释的mRNA脂质纳米粒样品，确保样品如它们被制备时那样充分混合。可以制备较大体积的标准曲线，并于4℃在密封96-孔深孔板中贮存至多3天备用。

向黑色384孔测定板(Costar,未经处理，#_3573)加入40μl标准溶液和样品。使用250μl自动化多道移液管以抽出85μl标准曲线，将40μl分配到分析板的两个孔中。抽出125μl各个稀释的mRNA脂质纳米粒样品，将40μl分配到分析板的三个孔中。

将试剂盒中的ribogreen试剂以240倍稀释在TE缓冲液中，向分析板的各孔中加入60μl。使用125μl自动化多道移液管以抽出125μl稀释的ribogreen试剂，将60μl分配在标准曲线的各孔中，使得你改变你在TE和TE+洗涤剂标准曲线样品之间的tips。改变每个稀释的mRNA脂质纳米粒样品之间的tips。

通过上下抽吸混合各孔中的样品。这可以例如通过将黑色384-孔分析板放在Biomek FX机器人上并使用30μl XL tips来进行。在混合后，使用激发波长480nm和发射波长520nm的荧光微板读数器测量荧光。

从每个RNA样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，得到TE和TE+Triton X-100条件的荧光相对于RNA浓度的标准曲线。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，然后由适当的标准曲线确定每个样品的RNA浓度。通过在TE+TritonX-100中的样品和在单独的TE缓冲液中的样品之间的浓度差除以在TE+Triton X-100洗涤剂中样品的浓度，确定了样品的包封百分比。

6.8.8颗粒分析

使用来自Malvern Instruments的Zetasizer Nano ZS分析mRNA脂质纳米粒的尺寸和多分散性。对于包封mRNA浓度＞1mg/mL的配制的mRNA，用115μl 1x PBS稀释5μl样品。加入到小体积的一次性微量比色杯(Brand，#759200)中。将比色杯插入Zetasizer Nano ZS中。对于机器设置，将材料设置为聚苯乙烯胶乳，分散剂设置为水，池设置为ZEN040。在没有等待时间的情况下于25℃测量样品。记录Z-均值(设置为直径，纳米单位)和多分散指数(PDI)。

表14瘦蛋白mRNA在双(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1,3-二甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯中包封的结果

本发明的实施例和实施方案的上述描述在性质上仅仅是示例性的，因此，其变化不被认为是背离本发明的宗旨和范围。

Claims

1.将核酸包封在脂质纳米粒主体中以提供包封核酸纳米粒的方法，该方法包括：

提供两个核酸流，所述两个核酸流各自包含核酸在第一水性溶液中的混合物，并且一起具有大于或等于3至14米/秒的复合线速度；

提供一个脂质流，所述一个脂质流包含一种或多种脂质在有机溶剂中的混合物，并且具有1.5至4.5米/秒的线速度；

将所述的一个脂质流与所述的两个核酸流在装配为交叉连接器的第一交汇点混合，其中所述两个核酸流从相反方向以彼此180°进入所述交叉连接器，并且所述一个脂质流以相对于所述两个核酸流90°进入所述交叉连接器，得到第一混合流；

使第一混合流以与所述一个脂质流相同的方向和以相对于所述两个核酸流90°以第一个方向流出所述交叉连接器；和

混合所述第一混合流的组分，得到包含包封核酸纳米粒的第一出口溶液；

其中所述第一水性溶液和所述有机溶剂是可溶混的，所述第一水性溶液或所述有机溶剂中的一个含有缓冲液，并且所述第一出口溶液中的有机溶剂浓度小于33％。

2.权利要求1的方法，其中:

所述第一水性溶液为包含碱金属盐水性溶液的第一缓冲溶液；和

所述有机溶剂包含醇性溶剂。

3.权利要求1的方法，还包括：

用选自第二种缓冲溶液和水的稀释溶剂稀释所述第一混合流，其中所述第二种缓冲溶液含有至少一种碱金属盐，得到第一出口流；

其中所述碱金属盐选自NaCl和柠檬酸钠中的一种或多种。

4.权利要求1的方法，其中：

所述一个脂质流的线速度在3至4米/秒之间；和

所述两个核酸流的复合线速度在9至14米/秒之间。

5.权利要求3的方法，其中用稀释溶剂稀释所述第一混合流包括：

提供稀释流，所述稀释流包含选自第二种缓冲溶液和水的水性溶剂；和

将所述第一混合流与所述稀释流合并，得到第一出口流；

其中所述一个脂质流的线速度在3至4米/秒之间；和所述两个核酸流的复合线速度在6至8米/秒之间。

6.权利要求1的方法，还包括：

培养所述第一出口溶液，得到经培养的第一出口溶液；

用选自第三种缓冲溶液和水的第二稀释溶剂稀释经培养的第一出口溶液，得到第二出口溶液；和

将所述第二出口溶液进行浓缩和透析，得到经浓缩的、经透析的溶液。

7.权利要求6的方法，其中所述浓缩包括通过切向流过滤进行浓缩。

8.权利要求7的方法，还包括将经浓缩的、经透析的溶液进行无菌过滤。

9.权利要求1的方法，其中所述核酸为siRNA。

10.权利要求1的方法，其中所述核酸为mRNA。

11.权利要求1的方法，其中所述脂质纳米粒主体包含一种或多种选自下表的脂质：

12.权利要求1的方法，其中所述包封核酸纳米粒具有30nm至80nm的平均粒度直径。

13.权利要求1的方法，其中所述包封核酸纳米粒具有40nm至70nm的平均粒度直径和小于0.1的多分散指数，其通过动态光散射测定。

14.权利要求1的方法，该方法还包括：

培养所述第一出口溶液，得到经培养的第一出口溶液；和

用选自第三种缓冲溶液和水的第二稀释溶剂稀释经培养的第一出口溶液，得到第二出口溶液；

其中脂质:核酸的质量比为15-20:1；所述两个核酸流中的核酸浓度为0.1至1.5mg/mL，并且所述一个脂质流中的脂质浓度为10至25mg/mL；和所述第二出口溶液中的乙醇浓度为10-15％。

15.权利要求5的方法，其中将所述第一混合流与所述稀释流合并包括将所述第一混合流与来自相对于所述第一混合流的方向90°的所述稀释流交汇。

16.权利要求1的方法，其中在第一出口溶液中，大于90％的来自所述核酸流的核酸被包封。