ITMI20081249A1 - Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata. - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

?Immunogeni di Escherichia coli con solubilit? migliorata* ;;;RIASSUNTO ;Sono state identificate varianti del ?precursore di AcfD? di E. coli patogeno con solubilit? incrementata se paragonate alla proteina di AcfD nativa, che scatenano in un soggetto una risposta immunitaria sostanzialmente simile a quella scatenata dalla proteina di AcfD nativa. ;DESCRIZIONE ;SETTORE TECNICO ;L?invenzione si riferisce all?immunizzazione contro ceppi di Escher?chia coli patogeni. ;STATO DELL?ARTE DELL?INVENZIONE ;I ceppi di E. coli sono stati classificati tradizionalmente come o commensali o patogeni, ed i ceppi patogeni vengono poi sotto-classificati come ceppi intestinali o extra-intestinali. E. coli patogeni vengono discussi in maggior dettaglio nel riferimento 1 , e ricadono in un numero di differenti patotipi, vale a dire un gruppo di ceppi di E. coli che causano una malattia comune utilizzando un insieme comune di fattori di virulenza. La patotipizzazione di ceppi ? una tecnica ordinaria che pu? essere effettuata genotipicamente o fenotipicamente. Un metodo di patotipizzazione recente basato sul genotipo [2] utilizza un microarray di DNA. ;Tra i ceppi intestinali sono conosciuti almeno sei patotipi ben descritti: enteropatogeno (EPEC), enteroemorragico (EHEC), enteroaggregativo (EAEC), enteroinvasivo (EIEC), enterotossigeno (ETEC) e aderente in maniera diffusa (DAEC). ;I ceppi patogeni extra-intestinali (o ceppi ?ExPEC? [3,4]) di E. coli comprendono ceppi uropatogeni (UPEC), ceppi associati a meningite (MNEC), e ceppi associati a setticemia (SEPEC). ExPEC ? la causa pi? comune di infezioni del tratto urinario ed ima delle principali cause di meningite neonatale e sepsi neonatale negli umani, le quali possono portare a gravi complicazioni e morte. Altri tipi di infezioni extraintestinali comprendono osteomielite, infezioni polmonari, intraaddominali, dei tessuti molli, e associate a dispositivo intra-vascolare. Un altro patotipo ExPEC oltre a quello umano ? il patogeno aviario (APEC), che causa infezioni extra- intestinali nel pollame. ;La maggior parte dei precedenti vaccini per ExPEC sono stati basati su lisati di cellule o su strutture cellulari. SOLCOUROVAC? comprende dieci differenti batteri uccisi al calore comprendenti sei ceppi ExPEC. URO-VAXOM? ? un vaccino in compressa orale contenente lisati batterici liofilizzati di 18 ceppi di E. coli selezionati. Baxter Vaccines ha sviluppato un vaccino per UTI basato su pili da 6 a 10 differenti ceppi. Medlmmune ha sviluppato un prodotto chiamato MEDI 516 basato sul complesso di adesina FimH. Al contrario, i riferimenti 5 e 6 divulgano immunogeni specifici per ceppi ExPEC che possono essere utilizzati come la base di vaccini definiti contro entrambi i ceppi sia MNEC sia UPEC. ;? un obiettivo dell?invenzione fornire ulteriori e migliori antigeni per l'utilizzo nell?immunizzazione contro ceppi di E. coli patogeni, ed in modo pi? particolare contro patotipi intestinali (per esempio ceppi EAEC, EIEC, EPEC e ETEC) come pure patotipi ExPEC. ;DIVULGAZIONE DELL?INVENZIONE ;Uno dei molti antigeni divulgati nel riferimento 5 viene commentato come il precursore del fattore D di colonizzazione accessorio (AcfD) (SEQ ID NO: 7051 & 7052 in esso; SEQ ID NO: 1 & 2 qui). Il riferimento 5 divulga la sequenza dal ceppo IHE3034 di MNEC, e la presente invenzione ? basata su varianti del 'precursore di AcfD' di ExPEC che sono state identificate in ulteriori patotipi, comprendenti ceppi APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC e ETEC. A differenza della divulgazione del riferimento 5, queste varianti possono essere particolarmente utili per trattare patotipi intestinali. Quindi l?invenzione fornisce tali varianti, insieme con il loro utilizzo nell 'immunizzare pazienti contro infezioni da E. coli. In aggiunta, questa divulgazione comprende i frammenti della proteina AcfD di tutti i patotipi di E. coli, dove il frammento ha una solubilit? incrementata se paragonato alla lunghezza intera, pur scatenando in un soggetto una risposta immunitaria sostanzialmente analoga rispetto a quella scatenata dalla proteina a lunghezza intera. ;Polipeptidi utilizzati con l'invenzione ;L'invenzione fornisce un polipeptide comprendente una sequenza amminoacidica che: ;(a) ? identica (vale a dire identica al 100%) ad una qualsiasi di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128; ;(b) ha almeno a% di identit? di sequenza ad una o pi? di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 1 14-128; ;(c) ? un frammento di almeno b amminoacidi consecutivi di una o pi? di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128; ;(d) ha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o pi?) alterazioni di singolo amminoacido (delezioni, inserzioni, sostituzioni), che possono essere in posizioni separate o possono essere contigue, se paragonata alle sequenze di (a) o (b), e/o ;(e) quando allineata con una qualsiasi di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128 utilizzando un algoritmo di allineamento a due a due, ciascuna finestra di movimento di x amminoacidi dal N-terminale al C-terminale (in modo tale che per un allineamento che si estende per p amminoacidi, dove p>x, vi sono p-x+1 di tali finestre), ha almeno x ? y amminoacidi allineati identici, dove: x viene selezionato da 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y viene selezionato da 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99, e se x ? y non ? un numero intero, allora esso viene arrotondato al numero intero pi? vicino. L?algoritmo di allineamento a due a due preferito ? l?algoritmo di allineamento globale di Needleman-Wunsch [7], utilizzando i parametri di default (per esempio, penalit? per apertura di gap = 10,0, e con penalit? per estensione di gap = 0,5, utilizzando la matrice di punteggio EBLOSUM62). Questo algoritmo viene implementato in maniera conveniente nello strumento ago nel pacchetto EMBOSS [8]. ;Questi polipeptidi comprendono varianti di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, e SEQ ID NO 114-128, comprendendo varianti alleliche, forme polimorfiche, omologhi, ortoioghi, paraloghi, mutanti, eccetera. ;Il valore di a pu? essere selezionato dal 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o pi?. ;Il valore di b pu? essere selezionato da 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o pi?. ;Frammenti preferiti comprendono un epitopo o un frammento immunogenico da SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, e SEQ ID NO 114-128. Altri frammenti preferiti mancano di uno o pi? amminoacidi (per esempio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o pi?) dal C-terminale e/o uno o pi? amminoacidi (per esempio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o pi?) dal N-terminale di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128, preferibilmente, pur mantenendo almeno un epitopo o frammento immunogenico di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128. Altri frammenti preferiti omettono uno o pi? domini di proteina, per esempio omissione di un peptide segnale, di un dominio citoplasmatico, di un dominio transmembrana, di un dominio extra-cellulare, eccetera. Una delezione al N-terminale, fino a e comprendente la sequenza GGGSG (vale a dire per SEQ ID NO: 3, la delezione di amminoacidi da 1 a 30), fornisce un frammento utile (vedere, per esempio, SEQ ID NO 99-113). ? anche utile la delezione di circa 90 amminoacidi al N-terminale, per rimuovere la regione ricca in prolina (vedere, per esempio, SEQ ID NO 114-128). Come dimostrato qui, tali delezioni incrementano la solubilit? del polipeptide di AcfD, pur mantenendo sostanzialmente la medesima immunogenicit?. ;Un altro frammento utile dell'invenzione viene formato dal taglio di una di SEQ ID NO: da 3 a 16 attorno alla sua regione ricca in Arg (per esempio residui 770-775 SEQ ID NO: 3). Per esempio, un tale frammento ha, al suo C-terminale o entro 20 amminoacidi da essol, una sequenza avente almeno a% di identit? agli amminoacidi 760-769 di SEQ ID NO: 3; un altro tale frammento ha, al suo N-terminale o entro 20 amminoacidi da essol, una sequenza avente almeno a% di identit? agli amminoacidi 776-785 di SEQ ID NO: 3. I frammenti a valle della regione ricca in Arg sono particolarmente utili. ;Un epitopo aH'intemo di un frammento pu? essere un epitopo di cellula B e/o un epitopo di cellula T. Tali epitopi possono essere identificati empiricamente (per esempio utilizzando PEPSCAN [9, 10] o metodi analoghi), o essi possono essere predetti (per esempio utilizzando l?indice antigenico di Jameson-Wolf [11], approcci basati su matrice [12], MAPITOPE [13], TEPITOPE [14, 15] , reti neurali [16], OptiMer & EpiMer [17, 18], ADEPT [19], Tsites [20], idrofilicit? [21], indice antigenico [22] o i metodi divulgati nei riferimenti 23, 24, 25, 26, 27, eccetera) Gli epitopi sono le parti di un antigene che vengono riconosciute da e legate ai siti di legame all'antigene di anticorpi o recettori di cellula T, ed essi possono anche essere riferiti come ?determinanti antigenici?. ;Frammenti immunogenici di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128 discussi sopra comprendono, senza limitazione, frammenti immunogenici che, quando somministrati ad un soggetto in una composizione adeguata che pu? comprendere un adiuvante (comprendendo, senza limitazione qualsiasi degli adiuvanti elencati o discussi nella sezione "Composizioni e medicamenti immunogenici" qui sotto), o un vettore adeguato accoppiato al polipeptide, inducono una risposta immunitaria mediata da un anticorpo o da cellula T che riconosce il polipeptide a lunghezza intera isolato di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128, rispettivamente, da cui viene derivato il frammento immunogenico. ;Frammenti particolarmente utili comprendono, ma non sono limitati a, SEQ ID NO: da 17 a 95. ;Un polipeptide dell'invenzione pu?, paragonato ad una qualsiasi di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128, comprendere una o pi? (per esempio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, eccetera) sostituzioni amminoacidiche, come sostituzioni conservative (vale a dire sostituzioni di un amminoacido con un altro che ha una catena laterale correlata). Gli amminoacidi geneticamente codificati vengono generalmente suddivisi in quattro famiglie: (1) acido, vale a dire aspartato, glutammato; (2) basico, vale a dire lisina, arginina, istidina; (3) non polare, vale a dire alanina, vaiina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e (4) polare non carico, vale a dire glieina, asparagina, glutammina, cisteina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, e tirosina talvolta vengono classificati congiuntamente come amminoacidi aromatici. In generale, la sostituzione di singoli amminoacidi aH'intemo di queste famiglie non ha un grande effetto sull?attivit? biologica. ;Un polipeptide pu? comprendere una o pi? (per esempio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, eccetera) delezioni di amminoacido singolo relative ad una qualsiasi di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99 -113, o SEQ ID NO 114-128. Analogamente, i polipeptidi possono comprendere una o pi? (per esempio 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, eccetera) inserzioni (per esempio: ciascuna di 1, 2, 3, 4 o 5 amminoacidi), relative ad una qualsiasi di SEQ ID NO da 3 a 16. ;All'interno del gruppo (c), delezioni o sostituzioni possono essere al N-terminale e/o al C-terminale, o possono essere tra i due terminali. Quindi un troncamento ? un esempio di una delezione. I troncamenti possono comportare la delezione di fino a 40 (o pi?) amminoacidi al N-terminale e/o al C-terminale. Come menzionato sopra, per esempio, pu? essere utilizzato un troncamento per rimuovere l?N-terminale fino alla sequenza GGGSG. ;In generale, quando un polipeptide dell' invenzione comprende una sequenza che non ? identica ad una completa di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128 (per esempio quando essa comprende una lista di sequenza con <100% di identit? di sequenza a questa, o quando essa comprende un suo frammento) viene preferito che il polipeptide possa suscitare un anticorpo che riconosce un polipeptide costituito dalla sequenza SEQ ID completa, vale a dire l'anticorpo si lega ad una o pi? di dette SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128. Tali anticorpi possono legarsi in maniera specifica a SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128, rispettivamente, pur non legandosi a proteine non AcfD con affinit? significativamente pi? elevata rispetto all?affinit? non specifica degli anticorpi per l?albumina di siero umano come uno standard di riferimento di legame non specifico. ;In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un polipeptide comprendente una sequenza amminoacidica: (a) avente almeno a % di identit? ad una qualsiasi di SEQ ID NO da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, o SEQ ID NO 114-128; e (b) comprendente un frammento di almeno b amminoacidi consecutivi di detta SEQ ID. ;Un polipeptide dell'invenzione pu? comprendere uno ione di metallo per esempio, uno ione di metallo che viene coordinato da uno o pi? amminoacidi nella catena del polipeptide. Per esempio, il polipeptide pu? comprendere un catione di metallo monovalente, bivalente o trivalente. I cationi bivalenti sono tipici, come Mn<2+>, Fe<2+>, C0<2+>, Ni<2+>, Cu<2+>, eccetera. Il catione bivalente ? preferibilmente Zn<2+>. Lo ione pu? essere coordinato da una sequenza amminoacidica HEAGH o HEVGH. ;I polipeptidi utilizzati con l'invenzione possono assumere svariate forme (per esempio, nativa, fusioni, glicosilata, non glicosilata, lipidata, non lipidata, fosforilata, non fosforilata, miristoilata, non miristoilata, monomerica, multimerica, in particolato, denaturata, eccetera) Per esempio, un polipeptide dell'invenzione pu? avere una cisteina N-terminale lipidata (per esempio cys-24 di SEQ ID NO: da 3 a 16). ;I polipeptidi utilizzati con l'invenzione possono essere preparati mediante svariati mezzi (per esempio, espressione ricombinante, purificazione da coltura di cellula, sintesi chimica, eccetera). Vengono preferite le proteine espresse in maniera ricombinante. ;I polipeptidi utilizzati con l'invenzione vengono preferibilmente fomiti in forma purificata o sostanzialmente purificata, vale a dire sostanzialmente esenti da altri polipeptidi (per esempio, senza polipeptidi presenti naturalmente), in maniera particolare da altri polipeptidi di E. coli o di cellula ospite, e sono generalmente puri almeno al 50% circa (in peso) e, solitamente, almeno puri al 90% circa, vale a dire meno del 50% circa, e pi? preferibilmente meno del 10% circa (per esempio il 5%) di una composizione ? costituito da altri polipeptidi espressi. Quindi gli antigeni nelle composizioni vengono separati dairorganismo intero con il quale viene espressa la molecola. ;I polipeptidi utilizzati con l'invenzione preferibilmente sono polipeptidi di E. coli. Tali polipeptidi possono essere ulteriormente selezionati da polipeptidi di E. coli di MNEC, APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC e ETEC. ;II termine "polipeptide" si riferisce a polimeri amminoacidici di qualsiasi lunghezza. Il polimero pu? essere lineare o ramificato, esso pu? comprendere amminoacidi modificati, ed esso pu? essere interrotto da non amminoacidi. I termini racchiudono anche un polimero amminoacidico che ? stato modificato, naturalmente, o mediante un intervento, per esempio, formazione di legame disolfuro, glicosilazione, lipidazione, acetilazione, fosforilazione, o qualsiasi altra manipolazione o modificazione, come coniugazione con un componente di marcatura. Vengono anche compresi, per esempio, polipeptidi contenenti uno o pi? analoghi di un amminoacido (comprendenti, per esempio, amminoacidi non naturali, eccetera), come pure altre modificazioni conosciute nell?arte. I polipeptidi possono presentarsi come catene singole o catene associate. ;L'invenzione fornisce polipeptidi comprendenti una sequenza -P-Q- o -Q-P-, in cui: -P- ? una sequenza amminoacidica come definito sopra e -Q- non ? una sequenza come definito sopra, vale a dire l'invenzione fornisce proteine di fusione. Dove il codone N-terminale di -P- non ? ATG, ma questo codone non ? presente al N-terminale di un polipeptide, esso verr? tradotto come l?amminoacido standard per quel codone piuttosto che come una Met. Dove questo codone ? al N-terminale di un polipeptide, tuttavia, esso verr? tradotto come una Met. Esempi di frazioni -Q- comprendono, ma non sono limitati a, tag di istidine (vale a dire Hisn dove n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o pi?), una proteina di legame al maltosio, o glutatione-S-transferasi (GST). ;L'invenzione fornisce inoltre una proteina oligomerica comprendente un polipeptide dell'invenzione. L?oligomero pu? essere un dimero, un trimero, un tetramero, eccetera. L?oligomero pu? essere un omo-oligomero o un etero-oligomero. I polipeptidi nell?oligomero possono essere associati in maniera covalente o in maniera non covalente. ;L'invenzione fornisce anche polipeptidi di E. coli che sono frammenti del AcfD di lunghezza intera (dei quali le SEQ ID N02-16 sono solo esempi rappresentativi) che hanno solubilit? incrementata rispetto alla proteina di lunghezza intera, pur scatenando comunque in un soggetto una risposta immunitaria sostanzialmente analoga a quella scatenata dalla proteina di lunghezza intera. Esempi di tali frammenti di polipeptide immunogenici comprendono qualsiasi di SEQ ID NO 99-128. La solubilit? incrementata pu? essere misurata mediante qualsiasi mezzo a disposizione di un tecnico del ramo. Un metodo semplice comporta la sovra-espressione del frammento in batteri e la corsa di campioni comparativi di lisato batterico totale contro un supematante di lisato batterico dopo centrifugazione o campioni di pellet di lisato batterico dopo centrifugazione contro campioni di supematante di lisato batterico dopo centrifugazione. Un tecnico del ramo farebbe crescere ed esprimere tali frammenti di polipeptide immunogenico utilizzando tecniche standard (per esempio, trasformare batteri BL2 1 (DE3) con un vettore di espressione pET21 che esprime il frammento, far crescere i batteri a 0,6 ????? in LB ed indurre con IPTG 1 mM, e coltivare per 3 ore dopo l'induzione). Tali campioni possono essere fatti correre su SDS PAGE (per esempio, MOPS 4-12%) e quantificati in maniera grossolana scansionando il gel risultante colorato e misurando la dimensione relativa delle bande. La solubilit? incrementata come utilizzata qui ? come determinata a 25?C. Tale solubilit? incrementata pu? essere un incremento del 10% in polipeptide solubile, un incremento del 20% in polipeptide solubile, un incremento del 30% in polipeptide solubile, un incremento del 50% in polipeptide solubile, un incremento del 75% in polipeptide solubile, un incremento del 100% (vale a dire, due volte) in polipeptide solubile, un incremento di tre volte in polipeptide solubile, un incremento di quattro volte in polipeptide solubile, un incremento di cinque volte in polipeptide solubile, un incremento di sette volte in polipeptide solubile, o un incremento di dieci volte in polipeptide solubile. ;Il confronto della risposta immunitaria scatenata in un soggetto da parte del polipeptide con la risposta immunitaria scatenata dalla proteina di lunghezza intera pu? essere effettuato mediante qualsiasi mezzo a disposizione di un tecnico del ramo. Un metodo semplice come utilizzato negli esempi qui di seguito comporta l'immunizzazione di un soggetto modello come un topo e poi la stimolazione con una dose letale di E. coli Per un corretto confronto, un tecnico del ramo dovrebbe selezionare naturalmente il medesimo adiuvante come l?adiuvante di Freund completo. In una tale prova, i frammenti polipeptidici immunogenici della presente invenzione scateneranno in un soggetto una risposta immunitaria sostanzialmente analoga {vale a dire, forniranno sostanzialmente la medesima protezione contro la stimolazione letale) se, per esempio, il polipeptide fornisce almeno il 70% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera, almeno l'80% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera, almeno l'85% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera, almeno il 90% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera, almeno il 95% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera, almeno il 97% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera, almeno il 98% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera, o almeno il 99% della protezione fornita dalla proteina di lunghezza intera. ;La proteina AcfD di lunghezza intera contro la quale il frammento polipeptidico immunogenico dovrebbe essere paragonato (sia per la solubilit? sia per la risposta immunitaria scatenata), pu? essere qualsiasi proteina AcfD di E. coli rappresentativa, comprendendo senza limitazione SEQ ID NO 2-16. In forme di realizzazione preferite, la proteina di AcfD sar? la proteina di lunghezza intera corrispondente dalla quale viene ottenuto il frammento polipeptidico immunogenico. ;In alcune forme di realizzazione, il polipeptide immunogenico conterr? una delezione relativa alla proteina di AcfD di E. coli che ha come risultato la solubilit? incrementata. La delezione pu? comprendere la rimozione di sostanzialmente tutti gli amminoacidi N-terminali fino al linker di gly-ser, la rimozione di tutto o di una parte della ripetizione N-terminale ricca in prolina, o entrambe. Un tecnico del ramo dovrebbe comprendere che gli amminoacidi N-terminali fino al linker di gly-ser corrispondenti alla regione della proteina AcfD di E. coli di interesse sono quella porzione della proteina che si allinea alla regione delle proteine AcfD di E. Coli identificate qui, che vengono denotate con una "G" sotto l'allineamento in Figura 1. Analogamente, un tecnico del ramo dovrebbe comprendere che la ripetizione N-terminale ricca in prolina corrispondente alla regione della proteina di AcfD di E. coli di interesse ? quella porzione della proteina che si allinea alla regione delle proteine AcfD di E. Coli identificate qui, che vengono denotate con una "P" sotto l'allineamento in Figura 1. ;In determinati aspetti, il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 99 o 114 (comprendenti qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID: 114 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 99 e 114) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 2. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 100 o 115 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 115 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 100 e 115) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 3. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 101 o 116 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID: 116 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 101 e 116) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 4. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 102 o 117 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID: 117 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 102 e 117) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 5. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 103 o 118 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 118 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 103 e 118) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 6. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 104 o 119 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 119 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 104 e 119) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 7. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 105 o 120 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 120 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 105 e 120) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 8. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 106 o 121 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID: 121 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 106 e 121) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 9. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 107 o 122 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 122 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 107 e 122) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 10. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 108 o 123 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 123 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 108 e 123) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 11. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 109 o 124 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 124 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 109 e 124) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 12. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID 110 o 125 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 125 con un N-terminale tra il Nterminale di SEQ ID n. 110 e n. 125) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 13. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 111 o 126 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 126 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 111 e 126) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 14. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 112 o l27 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 127 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 112 e 127) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 15. Il frammento polipeptidico immunogenico pu? essere un frammento che comprende SEQ ID NO 113 o 128 (comprendendo qualsiasi frammento che racchiude SEQ ID NO: 128 con un N-terminale tra il N-terminale di SEQ ID NO 113 e 128) a condizione che il frammento polipeptidico immunogenico non abbia la sequenza amminoacidica della SEQ ID NO 16. Qualsiasi dei precedenti frammenti polipeptidici immunogenici pu? anche comprendere variazioni fin tanto che le variazioni non hanno come risultato un polipeptide immunogenico avente la sequenza di qualsiasi proteina AcfD di lunghezza intera, comprendendo, senza limitazione qualsiasi delle variazioni elencate in questa sezione "Polipeptidi utilizzati con l'invenzione". Gli esempi comprendono: da 1 a 10 alterazioni di singolo amminoacido rispetto alle SEQ ID NO applicabili; almeno l'85% di identit? di sequenza alle SEQ ID NO applicabili; un frammento di almeno 10 amminoacidi consecutivi delle SEQ ID NO applicabili; e quando allineati con le SEQ ID NO applicabili utilizzando un algoritmo di allineamento a due a due, ciascuna finestra di movimento di x amminoacidi dal N-terminale al C-terminale ha almeno x ? y amminoacidi identici allineati, dove x ? 30 e y ? 0,75. ;L'invenzione fornisce anche un processo per produrre un polipeptide dell'invenzione, comprendente la fase di coltivare una cellula ospite trasformata con acido nucleico dell'invenzione in condizioni che inducono l?espressione del polipeptide. Il polipeptide pu? allora essere purificato per esempio da supematanti di coltura. ;L'invenzione fornisce una cellula di E. coli contenente un plasmide che codifica per un polipeptide dell'invenzione. Il cromosoma della cellula di E. coli pu? comprendere un omologo di AcfD, o un tale omologo pu? essere assente, ma in entrambi i casi il polipeptide dell'invenzione pu? essere espresso dal plasmide. Il plasmide pu? comprendere un gene che codifica per un marcatore, eccetera. Questi ed altri dettagli di plasmidi adeguati vengono riportati qui di seguito. ;Sebbene l?espressione dei polipeptidi dell'invenzione possa avere luogo in un ceppo di E. coli, l'invenzione solitamente utilizzer? un ospite eterologo per l?espressione. L?ospite eterologo pu? essere procariotico (per esempio un batterio) o eucariotico. Gli ospiti adeguati comprendono, ma non sono limitati a, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi , Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacter?a (per esempio M. tuberculosis), lieviti, eccetera. ;L'invenzione fornisce un processo per produrre un polipeptide dell'invenzione, che comprende la fase di sintetizzare almeno parte del polipeptide mediante mezzi chimici. ;Qualsiasi e tutti i precedenti proteine, polipeptidi, polipeptidi ibridi, epitopi e frammenti immunogenici possono essere in una qualsiasi di un numero di forme comprendenti, senza limitazione, ricombinante, isolata o sostanzialmente purificata (da materiali coesistenti con tali proteine, polipeptidi, polipeptidi ibridi, epitopi e frammenti immunogenici nel loro stato naturale). ;Acidi nucleici ;L'invenzione fornisce anche un acido nucleico che codifica per polipeptidi e polipeptidi ibridi dell'invenzione. Essa fornisce anche un acido nucleico comprendente una sequenza di nucleotide che codifica per uno o pi? polipeptidi o polipeptidi ibridi dell'invenzione. ;L'invenzione fornisce anche un acido nucleico comprendente sequenze di nucleotide avente identit? di sequenza a tali sequenze di nucleotidiche. L?identit? tra sequenze viene preferibilmente determinata mediante l?algo ritmo di ricerca di omologia di Smith Waterman come descritto sopra. Tali acidi nucleici comprendono quelli che utilizzano codoni alternativi per codificare per il medesimo amminoacido. ;L'invenzione fornisce anche un acido nucleico che pu? ibridarsi a questi acidi nucleici. Le reazioni di ibridazione possono essere eseguite in condizioni di "stringenza" differente. Le condizioni che incrementano la stringenza di una reazione di ibridazione sono ampiamente conosciute e pubblicate nell'arte (per esempio pagina 7,52 del riferimento 222). Gli esempi di condizioni rilevanti comprendono (al fine di incrementare la stringenza): temperature di incubazione di 25?C, 37?C, 50?C, 55?C e 68?C; concentrazioni di tampone di SSC 10 x, SSC 6 x, SSC 1 x, SSC 0,1 x (dove SSC ? NaCl 0,15 M e tampone citrato 15 mM) ed i loro equivalenti che utilizzano altri sistemi tampone; concentrazioni di formammide di 0%, 25%, 50% e 75%; tempi di incubazione da 5 minuti a 24 ore; 1, 2, o pi? fasi di lavaggio; tempi di incubazione di lavaggio di 1, 2, o 15 minuti; e soluzioni di lavaggio di SSC 6 x, SSC 1 x, SSC 0,1 x, o acqua de-ionizzata. Le tecniche di ibridazione e la loro ottimizzazione sono ben conosciute nell?arte (per esempio, vedere riferimenti 28, 29, 222, 224, eccetera]. ;In alcune forme di realizzazione, un acido nucleico dell'invenzione si ibrida ad un bersaglio sotto condizioni di stringenza bassa; in altre forme di realizzazione esso si ibrida sotto condizioni di stringenza intermedia; in forme di realizzazione preferite esso si ibrida sotto condizioni di stringenza elevata. Una serie esemplificativa di condizioni di ibridazione a stringenza bassa ? 50?C e SSC 10 x. Una serie esemplificativa di condizioni di ibridazione a stringenza intermedia ? 55?C e SSC 1 x. Una serie esemplificativa di condizioni di ibridazione a stringenza elevata ? 68?C e SSC 0, 1 x. ;L'invenzione comprende un acido nucleico comprendente le sequenze complementari a queste sequenze (per esempio, per antisenso o sonda, o per utilizzo come primer). ;Gli acidi nucleici dell'invenzione possono essere utilizzati in reazioni di ibridazione (per esempio, Northern o Southern blot, o in microarray di acido nucleico o 'gene chip') e reazioni di amplificazione (per esempio, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, eccetera) ed altre tecniche di acido nucleico. ;L?acido nucleico secondo l'invenzione pu? assumere svariate forme (per esempio a singolo filamento, a doppio filamento, vettori, primer, sonde, marcate, eccetera). Gli acidi nucleici dell'invenzione possono essere circolari o ramificati, ma saranno generalmente lineari. Se non diversamente specificato o richiesto, qualsiasi forma di realizzazione dell?invenzione che utilizza un acido nucleico pu? utilizzare siala forma a doppio filamento sia ciascuna delle due forme a filamento singolo complementari che compongono la forma a doppio filamento. Primer e sonde sono generalmente a singolo filamento, come lo sono gli acidi nucleici antisenso. ;Gli acidi nucleici dell'invenzione preferibilmente vengono fomiti in forma purificata o sostanzialmente purificata, vale a dire sostanzialmente esenti da altri acidi nucleici (per esempio, esenti da acidi nucleici presenti in natura), in maniera particolare da altri acidi nucleici di E. coli o di cellula ospite, generalmente essendo puri almeno al 50% circa (in peso) e, solitamente, puri almeno al 90% circa. Gli acidi nucleici dell'invenzione sono preferibilmente acidi nucleici di E. coli Gli acidi nucleici dell'invenzione possono essere preparati in molte maniere, per esempio mediante sintesi chimica (per esempio sintesi di fosforamidite del DNA) in tutto o in parte, digerendo acidi nucleici pi? lunghi utilizzando nucleasi (per esempio enzimi di restrizione), unendo acidi nucleici pi? brevi o nucleotidi (per esempio utilizzando ligasi o polimerasi), da librerie genomiche o di cDNA, eccetera. ;L?acido nucleico dell'invenzione pu? essere attaccato ad un supporto solido (per esempio, una biglia, una piastra, un filtro, una pellicola, un vetrino, un supporto di microarray, una resina, eccetera). L?acido nucleico dell'invenzione pu? essere marcato per esempio, con un tracciante radioattivo o fluorescente, o un tracciante di biotina. Questo ? particolarmente utile dove l?acido nucleico deve essere utilizzato in tecniche di rilevamento per esempio, dove l'acido nucleico ? un primer o usato come sonda. ;Il termine "acido nucleico" comprende, in generale una forma polimerica di nucleotidi di qualsiasi lunghezza, che contiene deossiribonucleotidi, ribonucleotidi, e/o loro analoghi. Esso comprende DNA, RNA, ibridi di DNA/RNA. Esso comprende anche analoghi di DNA o RNA, come quelli contenenti scheletri modificati (per esempio, acidi nucleici peptidici (PNA) o fosforotioati) o basi modificate. Quindi l?invenzione comprende mRNA, tRNA, rRNA, ribozimi, DNA, cDNA, acidi nucleici ricombinanti, acidi nucleici ramificati, plasmidi, vettori, sonde, primer, eccetera. Dove l?acido nucleico dell'invenzione assume la forma di RNA, esso pu? o pu? non avere un cappuccio 5?. ;Gli acidi nucleici dell'invenzione possono essere parte di un vettore, vale a dire parte di un costrutto di acido nucleico progettato per la traduzione/ trasfezione di uno o pi? tipi di cellule. I vettori possono essere, per esempio, "vettori di clonaggio", che vengono progettati per l'isolamento, la propagazione e la replicazione di nucleotidi inseriti, "vettori di espressione", che vengono progettati per l?espressione di una sequenza di nucleotide in una cellula ospite, "vettori virali" che vengono progettati per avere come risultato la produzione di un virus ricombinante o di particelle simili a virus, o "vettori navetta", che comprendono gli attributi di pi? di un tipo di vettore. I vettori preferiti sono plasmidi, come menzionato sopra. Una "cellula ospite" comprende una cellula individuale o una coltura cellulare che pu? essere o ? stata un ricevente di acido nucleico esogeno. Le cellule ospiti comprendono la progenie di una singola cellula ospite, e la progenie pu? non necessariamente essere completamente identica (in morfologia o nel complemento di DNA totale) alla cellula parentale originale a causa di mutazione e/o cambiamento naturale, accidentale o deliberata. Le cellule ospiti comprendono cellule transfettate o infettate o in vivo o in vitro con un acido nucleico dell'invenzione. ;Dove un acido nucleico ? DNA, verr? apprezzato che una "U" in una sequenza di RNA verr? sostituita da una "T" nel DNA. Analogamente, dove un acido nucleico ? RNA, verr? apprezzato che una "T" in una sequenza di DNA, verr? sostituita da una "U" nel RNA. ;Il termine "complemento" o "complementare" quando utilizzato in relazione ad acidi nucleici si riferisce ad accoppiamento di base di Watson-Crick. Quindi il complemento di C ? G, il complemento di G ? C, il complemento di A ? T (o U), e il complemento di T (o U) ? A. ? anche possibile utilizzare basi come I (la purina inosina) per esempio per complementare le pirimidine (C o T). ;Gli acidi nucleici dell'invenzione possono essere utilizzati, per esempio: per produrre polipeptidi; come sonde di ibridazione per il rilevamento di acido nucleico in campioni biologici; per generare copie addizionali degli acidi nucleici; per generare ribozimi o oligonucleotidi antisenso; come primer o sonde di DNA a singolo filamento, o come oligonucleotidi che formano un triplo filamento. ;L'invenzione fornisce un processo per produrre un acido nucleico dell'invenzione, in cui l'acido nucleico viene sintetizzato in parte o tutto utilizzando mezzi chimici. ;L'invenzione fornisce vettori che comprendono le sequenze di nucleotide dell'invenzione (per esempio vettori di clonaggio o di espressione) e cellule ospiti trasformate con tali vettori. ;L?amplificazione degli acidi nucleici secondo l'invenzione pu? essere quantitativa e/o in tempo reale. ;Per determinate forme di realizzazione dell'invenzione, gli acidi nucleici sono preferibilmente almeno 7 nucleotidi in lunghezza (per esempio, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 , 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleotidi o pi? lunghi). ;Per determinate forme di realizzazione dell'invenzione, gli acidi nucleici sono preferibilmente al massimo 500 nucleotidi in lunghezza (per esempio 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70 , 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleotidi o pi? corti). ;Primer e sonde dell?invenzione, ed altri acidi nucleici utilizzati per l'ibridazione, sono preferibilmente tra 10 e 30 nucleotidi in lunghezza (per esempio 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleotidi). ;Composizioni e medicamenti immunogenici ;I polipeptidi dell'invenzione sono utili come principi attivi (immunogeni) in composizioni immunogeniche, e tali composizioni possono essere utili come vaccini. I vaccini secondo l'invenzione possono essere o profilattici (vale a dire per prevenire l'infezione) o terapeutici (vale a dire per trattare l?infezione), ma tipicamente saranno profilattici. ;Le composizioni immunogeniche saranno accettabili dal punto di vista farmaceutico. Esse solitamente comprenderanno componenti in aggiunta agli antigeni, per esempio esse tipicamente comprendono uno o pi? trasportatore(i), eccipiente(i) e/o adiuvante(i) farmaceutici. Una discussione approfondita di trasportatori ed eccipienti ? disponibile nel riferimento 2 19. Discussioni approfondite di adiuvanti di vaccino sono disponibili nei riferimenti 30 e 31 . ;Le composizioni generalmente verranno somministrate ad un mammifero in forma acquosa. Prima della somministrazione, tuttavia, la composizione pu? essere stata in una forma non acquosa. Per esempio, sebbene alcuni vaccini vengano fabbricati in forma acquosa, quindi riempiti e distribuiti e somministrati anche in forma acquosa, altri vaccini vengono liofilizzati nel corso della fabbricazione e vengono ricostituiti in ima forma acquosa al momento dell 'utilizzo. Quindi una composizione deirinvenzione pu? essere essiccata, come una formulazione liofilizzata. ;La composizione pu? comprendere conservanti come tiomersale o 2-fenossietanolo. Viene preferito, tuttavia, che il vaccino sia sostanzialmente esente da (vale a dire inferiore a 5 pg/ mi) materiale mercuriale per esempio, senza tiomersale. I vaccini non contenenti mercurio sono maggiormentepreferiti. I vaccini senza conservanti vengono preferiti in maniera particolare. ;Per migliorare la stabilit? termica, una composizione pu? comprendere un agente di protezione dalla temperatura. ;Per controllare la tonicit?, si preferisce includere un sale fisiologico, come un sale di sodio. Viene preferito il cloruro di sodio (NaCl), che pu? essere presente a tra 1 e 20 mg/ mi, per esempio, circa 10?2 mg/ mi di NaCl. Altri sali che possono essere presenti comprendono cloruro di potassio, diidrogeno fosfato di potassio, fosfato disodico disidratato, cloruro di magnesio, cloruro di calcio, eccetera. ;Le composizioni generalmente avranno una osmolalit? tra 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferibilmente tra 240-360 mOsm/kg, e pi? preferibilmente cadranno airintemo deirintervallo di 290-310 mOsm/kg. ;Le composizioni possono comprendere uno o pi? tamponi. I tamponi tipici comprendono: un tampone di fosfato, un tampone di Tris, un tampone di borato, un tampone di succinato, un tampone di istidina (in maniera particolare con un adiuvante di idrossido di alluminio); o un tampone di citrato. I tamponi tipicamente verranno compresi neirintervallo di 5-20 mM. ;Il pH di una composizione sar? generalmente tra 5,0 e 8,1, e pi? tipicamente tra 6,0 e 8,0, per esempio 6,5 e 7,5, o tra 7,0 e 7,8. ;La composizione ? preferibilmente sterile. La composizione ? preferibilmente apirogena, per esempio contenente <1 EU (unit? di endotossina, una misura standard) per dose, e preferibilmente <0, 1 UE per dose. La composizione ? preferibilmente senza glutine. ;La composizione pu? comprendere materiale per una singola immunizzazione, o pu? comprendere materiale per immunizzazioni multiple (vale a dire un kit 'multidose'). L'inclusione di un conservante viene preferita in disposizioni multidose. Come alternativa (o in aggiunta) all?inclusione di un conservante in composizioni multidose, le composizioni possono essere contenute in un contenitore avente un adattatore asettico per la rimozione del materiale. ;I vaccini umani vengono tipicamente somministrati in un volume di dosaggio di circa 0,5 mi, anche se ai bambini pu? essere somministrata una mezza dose (vale a dire circa 0,25 mi). ;Le composizioni immunogeniche dell'invenzione possono anche comprendere uno o pi? agenti immunoregolatori. Preferibilmente, uno o pi? degli agenti immunoregolatori comprendono uno o pi? adiuvanti. Gli adiuvanti possono comprendere un adiuvante TH1 e/o un adiuvante TH2, discussi ulteriormente pi? avanti. ;Gli adiuvanti che possono essere utilizzati in composizioni dell'invenzione comprendono, ma non sono limitati a: ;A. Composizioni contenenti minerali ;Le composizioni contenenti minerali adatte per l'utilizzo come adiuvanti nell?invenzione comprendono sali minerali, come sali di alluminio e sali di calcio (o loro miscele). I sali di calcio comprendono fosfato di calcio (per esempio le particelle "PAC" divulgate nel riferimento 32). I sali di alluminio comprendono idrossidi, fosfati, solfati, eccetera, con i sali che assumono qualsiasi forma adeguata (per esempio gel, cristallina, amorfa, eccetera). L?adsorbimento su questi sali viene preferito. Le composizioni contenenti minerale possono essere formulate anche come una particella di sale di metallo [33]. ;Possono essere utilizzati gli adiuvanti conosciuti come idrossido di alluminio e fosfato di alluminio. Questi nomi sono convenzionali, ma vengono utilizzati solamente per convenienza, siccome non ? neppure una descrizione precisa del composto chimico effettivo che ? presente (per esempio, vedere il capitolo 9 del riferimento 30). L'invenzione pu? utilizzare uno qualsiasi degli adiuvanti di "idrossido" o "fosfato" che vengono in generale utilizzati come adiuvanti. Gli adiuvanti conosciuti come "idrossido di alluminio" sono tipicamente sali di ossiidrossido di alluminio, che sono solitamente almeno parzialmente cristallini. Gli adiuvanti conosciuti come "fosfato di alluminio" sono tipicamente idrossifosfati di alluminio, spesso contenenti anche una piccola quantit? di solfato (vale a dire solfato di idrossifosfato di alluminio). Essi possono essere ottenuti mediante precipitazione, e le condizioni e le concentrazioni della reazione durante la precipitazione influenzano il grado di sostituzione di fosfato per ossidrile nel sale. ;Una morfologia fibrosa (per esempio, come visto nelle microfotografie elettroniche a trasmissione) ? tipica per adiuvanti di idrossido di alluminio. Il pi di adiuvanti di idrossido di alluminio ? in genere circa 11 vale a dire l?adiuvante stesso ha una carica di superficie positiva a pH fisiologico. Per gli adiuvanti di idrossido di alluminio sono state riportate capacit? di adsorbimento tra 1,8-2, 6 mg di proteina per mg di Al<+++ >a pH 7,4. ;Gli adiuvanti di fosfato di alluminio hanno generalmente un rapporto molare di PO4/AI tra 0,3 e 1,2, preferibilmente tra 0,8 e 1,2, e pi? preferibilmente 0,95?0,1. Il fosfato di alluminio sar? generalmente amorfo, in maniera particolare per sali di idrossifosfato. Un adiuvante tipico ? idrossifosfato di alluminio amorfo con rapporto molare di PO4/AI tra 0,84 e 0,92, compreso a 0,6 mg di AL<3+>/ml. Il fosfato di alluminio sar? generalmente in particolato (per esempio, morfologia simile a piastre come visto nelle microfotografie elettroniche a trasmissione). I tipici diametri delle particelle sono nell?intervallo di 0,5-20 pm (per esempio, circa 5-10 pm) dopo l?adsorbimento di qualsiasi antigene. Per gli adiuvanti di fosfato di alluminio sono state riportate capacit? di adsorbimento di 0,7- 1,5 mg di proteina per mg di Al<+++ >a pH 7,4. ;Il punto di carica zero (PZC) del fosfato di alluminio ? inversamente correlato al grado di sostituzione di fosfato per ossidrile, e questo grado di sostituzione pu? variare a seconda delle condizioni di reazione e della concentrazione dei reagenti utilizzati per preparare il sale mediante precipitazione. Il PZC viene anche alterato cambiando la concentrazione di ioni di fosfato liberi in soluzione (pi? fosfato = PZC pi? acido) o aggiungendo un tampone come un tampone di istidina (rende PZC pi? basico). I fosfati di alluminio utilizzati secondo l'invenzione avranno generalmente un PZC di tra 4,0 e 7,0, pi? preferibilmente tra 5,0 e 6,5, per esempio circa 5,7. ;Le sospensioni di sali di alluminio utilizzate per preparare le composizioni deirinvenzione possono contenere un tampone (per esempio un tampone di fosfato o di istidina o di Tris), ma questo non ? sempre necessario. Le sospensioni sono preferibilmente sterili ed esenti da pirogeni. Una sospensione pu? comprendere ioni fosfato acquosi liberi per esempio presenti ad ima concentrazione tra 1,0 e 20 mM, preferibilmente tra 5 e 15 mM, e pi? preferibilmente circa 10 mM. Le sospensioni possono anche comprendere cloruro di sodio. ;L'invenzione pu? utilizzare una miscela comprendente sia un idrossido di alluminio sia un fosfato di alluminio. In questo caso vi pu? essere pi? fosfato di alluminio che idrossido per esempio, un rapporto in peso di almeno 2:1 per esempio >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, eccetera La concentrazione di Al<+++ >in una composizione per la somministrazione ad un paziente ? preferibilmente inferiore a 10 mg/ mi per esempio, <5 mg/ mi, <4 mg/ mi, <3 mg/ mi, <2 mg/ mi, <1 mg/ mi, eccetera. Un intervallo preferito ? tra 0,3 e 1 mg/ml. Viene preferito un massimo di 0,85 mg/ dose. ;B. Emulsioni oleose ;Le composizioni di emulsione oleose adeguate per l'utilizzo come adiuvanti nell?invenzione comprendono emulsioni di squaleneacqua, come MF59 [capitolo 10 del riferimento 30; vedere anche il riferimento 34] (squalene 5%, Tween 80 0,5%, e Span 85 0,5%, formulata in particelle sottomicrometriche utilizzando un microfluidif?catore). Possono anche essere utilizzati l?adiuvante di Freund completo (CFA) e l?adiuvante di Freund incompleto (IFA). ;Sono conosciuti svariati adiuvanti di emulsione di olio in acqua, ed essi tipicamente comprendono almeno un olio ed almeno un tensioattivo, l'olio(i) ed il tensioattivo (i) essendo biodegradabili (metabolizzabili) e biocompatibili. La goccioline di olio nell?emulsione sono generalmente inferiori a 5 pm in diametro, e idealmente hanno un diametro al di sotto del micron, queste piccole dimensioni essendo ottenute con un microfluidificatore per fornire emulsioni stabili. Le goccioline con una dimensione inferiore a 220 nm sono preferite in quanto esse possono essere sottoposte a sterilizzazione su filtro. ;L'emulsione pu? comprendere oli come quelli derivati da una sorgente animale (come pesci) o vegetale. Le sorgenti per oli vegetali comprendono noci, semi e grani. L?olio di arachide, olio di soia, olio di cocco, e olio d'oliva, i pi? comunemente disponibili, esemplificano gli oli di noci Pu? essere utilizzato olio di jojoba per esempio ottenuto dal fagiolo di jojoba. Gli oli di semi comprendono olio di girasole, olio di cotone, olio di semi di girasole, olio di semi di sesamo e simili. Nel gruppo di grano, l?olio di mais ? il pi? facilmente disponibile, ma pu? anche essere utilizzato l?olio di altri grani di cereale come grano, avena, segale, riso, tef, triticale e simili. Esteri di acidi grassi a 6-10 atomi di carbonio di glicerolo e 1,2-propandiolo, mentre non sono naturalmente presenti in oli di semi, possono essere preparati mediante idrolisi, separazione ed esterificazione dei materiali appropriati a partire dagli oli di noci e di semi. I grassi ed oli da latte di mammiferi sono metabolizzabili e possono di conseguenza essere utilizzati nella pratica di questa invenzione. Le procedure per la separazione, purificazione, saponificazione e altri mezzi necessari per ottenere oli puri di origine animale sono ben conosciute nell?arte. La maggior parte dei pesci contengono oli metabolizzabili che possono essere facilmente recuperati. Per esempio, olio di fegato di merluzzo, olio di fegato di squalo, e olio di balena come spermaceti esemplificano svariati degli oli di pesce che possono essere utilizzati qui. Un certo numero di oli a catena ramificata vengono sintetizzati biochimicamente in unit? di isoprene di 5 carboni e sono generalmente riferiti come terpenoidi. L?olio di fegato di squalo contiene un terpenoide ramificato, insaturo conosciuto come squalene, 2,6,10,15,19,23-esametil-2,6,10,14,18,22-tetracosaesaene, che viene qui preferito in maniera particolare. Anche lo squalano, l?analogo saturo dello squalene, ? un olio preferito. Gli oli di pesce, comprendendo squalene e squalano, sono facilmente disponibili da fonti commerciali o possono essere ottenuti mediante metodi conosciuti nell?arte. Altri oli preferiti sono i tocoferoli (vedere sotto). Si possono utilizzare miscele di oli. ;I tensioattivi possono essere classificati mediante il loro 'HLB' (equilibrio idrofilo / lipofilo) . I tensioattivi preferiti dell'invenzione hanno un HLB di almeno 10, preferibilmente almeno 15, e pi? preferibilmente almeno 16. L'invenzione pu? essere utilizzata con tensioattivi comprendenti, ma non limitati a: i tensioattivi di esteri di sorbitano di poliossietilene (comunemente riferiti come i Tweens), soprattutto polisorbato 20 e polisorbato 80; copolimeri di ossido di etilene (EO), ossido di propilene (PO), e/o di ossido di butilene (BO), venduti sotto il nome commerciale di DOWFAX?, come copolimeri di blocco EO/PO lineare; octoxynol, che possono variare nel numero di ripetizioni di gruppi etossi (ossi-l,2-etanodiolo), l?octoxynol-9 (Triton X-100, o tottilfenossipolietossietanolo) essendo di particolare interesse; (ottilfenossi)polietossietanolo (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipidi come fosfatidilcolina (lecitina); etossilati di nonilfenolo, come le serie di Tergitol? NP; eteri di grassi di poliossietilene derivati da alcoli laurilico, cetilico, stearilico e oleilico (conosciuti come tensioattivi Brij), come etere di monolaurile di trietileneglicol (Brij 30); ed esteri di sorbitano (comunemente conosciuti come gli SPAN), come trioleato di sorbitano (Span 85) e monolaurato di sorbitano. Vengono preferiti tensioattivi non ionici. I tensioattivi preferiti per essere compresi nell?emulsione sono Tween 80 (monooleato di sorbitano di poliossietilene), Span 85 (trioleato di sorbitano), lecitina e Triton X-100. ;Possono essere utilizzate miscele di tensioattivi per esempio miscele di Tween 80/ Span 85. ? anche adeguata una combinazione di un estere di sorbitano di poliossietilene come monooleato di sorbitano di poliossietilene (Tween 80) ed un octoxynol come tottilfenossipolietossietanolo (Triton X-100). Un?altra combinazione utile comprende laureth 9 pi? un estere di sorbitano di poliossietilene e/o un octoxynol. ;Quantit? di tensioattivi preferite (% in peso) sono: esteri di sorbitano di poliossietilene (come Tween 80) 0,01 a 1%, in particolare circa 0,1%; ottil- o nonil-fenossipoliossietanoli (come Triton X 100, o altri detergenti nella serie Triton ) 0,001 a 0,1%, in particolare da 0,005 a 0,02%; eteri di poliossietilene (per esempio, laureth 9) da 0,1 a 20%, preferibilmente da 0,1 a 10% ed in particolare da 0,1 a 1% o circa 0,5%. ;Gli adiuvanti di emulsione preferiti hanno una dimensione media di goccioline di <1 pm, per esempio, <750 nm, <500 nm, <400 nm, <300 nm, <250 nm, <220 nm, <200 nm, o pi? piccola. Queste dimensioni di gocciolina possono convenientemente essere realizzate mediante tecniche come microfluidificazione. ;Gli adiuvanti specifici di emulsione di olio in acqua utili per l'invenzione comprendono, ma non sono limitati a: ;? Una emulsione sottomicrometrica di squalene, Tween 80, e Span 85. La composizione dell?emulsione in volume pu? essere il 5% circa di squalene, lo 0,5% circa di polisorbato 80 e lo 0,5% circa di Span 85. In termini di peso, questi rapporti diventano 4,3% di squalene, 0,5% di polisorbato 80 e 0,48% di Span 85. Questo adiuvante ? conosciuto come 'MF59' [35, 36, 37], come descritto in maggior dettaglio nel capitolo 10 del riferimento 38 e nel capitolo 12 del riferimento 39. L?emulsione di MF59 comprende in maniera vantaggiosa ioni citrato, per esempio tampone di citrato di sodio lOmM. ;? Una emulsione di squalene, un tocoferolo, e Tween 80. L'emulsione pu? comprendere soluzione salina di fosfato tamponata. Essa pu? anche comprendere Span 85 (per esempio, al 1%) e/o lecitina. ;Queste emulsioni possono avere dal 2 al 10% di squalene, dal 2 al 10% di tocoferolo e dallo 0,3 al 3% di Tween 80, e il rapporto in peso di squalene: tocoferolo ? preferibilmente <1 siccome esso fornisce una emulsione pi? stabile. Squalene e Tween 80 possono essere presenti in un rapporto di volume di circa 5:2. Una tale emulsione pu? essere fatta dissolvendo Tween 80 in PBS per dare una soluzione al 2%, quindi miscelando 90 mi di questa soluzione con una miscela di (5g di DL-atocoferolo e 5ml di squalene), poi microfluidificando la miscela. L?emulsione risultante pu? avere goccioline di olio sottomicrometriche, per esempio con un diametro medio tra 100 e 250 nm, preferibilmente circa 180 nm. ;? Una emulsione di squalene, un tocoferolo, ed un detergente Triton (per esempio Triton X-100). L'emulsione pu? anche comprendere un 3d-MPL (vedere sotto). L'emulsione pu? contenere un tampone fosfato. ;? Una emulsione comprendente un polisorbato (per esempio, polisorbato 80), un detergente Triton (per esempio Triton X-100) e un tocoferolo (per esempio, un succinato di a-tocoferolo). L'emulsione pu? comprendere queste tre componenti in un rapporto di massa di circa 75:11:10 (per esempio 750 pg/ml di polisorbato 80, 110 pg/ml Triton X-100 e 100 pg/ml succinato di ?-tocoferolo), e queste concentrazioni dovrebbe comprendere qualsiasi contributo di questi componenti da antigeni. L'emulsione pu? anche comprendere squalene. L'emulsione pu? anche comprendere un 3d-MPL (vedere sotto). La fase acquosa pu? contenere un tampone fosfato. ;? Una emulsione di squalano, polisorbato 80 e polossamero 401 ("Pluronic? L121"). L'emulsione pu? essere formulata in soluzione salina di fosfato tamponata, pH 7,4. Questa emulsione ? un veicolo di distribuzione utile per dipeptidi di muramile, ed ? stata utilizzata con treonil-MDP nell?adiuvante "SAF-1" [40] (Thr-MDP 0.05-1%, squalano 5%, Pluronic L121 2,5% e polisorbato 80 0,2%). Essa pu? anche essere utilizzata senza il Thr-MDP, come nell?adiuvante "AF" [41] (squalano 5%, Pluronic L121 1,25% e polisorbato 80 0,2%). Viene preferita la microfluidificazione. ;? Una emulsione che comprende squalene, un solvente acquoso, un tensioattivo non ionico idrofilo di poliossietilene alchiletere (per esempio, cetosteariletere di poliossietilene (12)) e un tensioattivo non ionico idrofobico (per esempio un estere di sorbitano o un estere di mannide, come monoleato di sorbitano o 'Span 80') . L'emulsione ? preferibilmente termoreversibile e/o ha almeno il 90% delle goccioline di olio (in volume) di una dimensione inferiore a 200 nm [42]. L'emulsione pu? anche comprendere uno o pi? di: alditolo; un agente crioprotettivo (per esempio, zucchero, come dodecilmaltoside e/o saccarosio) e/o di un alchilpoliglicoside. Tali emulsioni possono essere liofilizzate. ;? Una emulsione di squalene, Polossamero 105 e Abil-Care [43]. La concentrazione finale (peso) di questi componenti in vaccini adiuvati sono squalene 5%, Polossamero 105 (poliolo pluronico) 4% e Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/ 16 PEG/PPG-16/ 16 dimeticone; trigliceride di caprifico/ caprico) 2%. ;? Una emulsione avente da 0,5-50% di un olio, 0,1-10% di un fosfolipide, e 0,05-5% di un tensioattivo non ionico. Come descritto nel riferimento 44, i componenti fosfolipidici preferiti sono fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina, fosfatidilserina, fosfatidilinositolo, fosfatidilglicerolo, acido fosfatidico, sfingomielina e cardiolipina. Le dimensioni di goccioline sottomicrometriche sono vantaggiose. ;? Una emulsione sottomicrometrica di olio in acqua di un olio non metabolizzabile (per esempio olio minerale leggero) ed almeno un tensioattivo (per esempio, lecitina, Tween 80 o Span 80). Possono essere compresi additivi, come saponina QuilA, colesterolo, un coniugato di saponina lipofilo (come GPI-0100, descritto nel riferimento 45, prodotto mediante l?aggiunta di ammina alifatica a desacilsaponina attraverso il gruppo carbossilico dell?acido glucuronico), bromuro di dimetildiottadecilammonio e/o N,N-diottadecil-N,N-bis(2-idrossietiljpropandiammina. ;? Una emulsione in cui una saponina (per esempio QuilA o QS21) ed uno sterolo (per esempio un colesterolo) vengono associati come micelle elicoidali [46]. ;? Una emulsione comprendente un olio minerale, un alcol grasso etossilato lipofilo non ionico, ed un tensioattivo idrofilo non ionico (per esempio, un alcol grasso etossilato e/o copolimero a blocchi poliossietilene-poliossipropilene) [47] . ;? Una emulsione comprendente un olio minerale, un alcol grasso etossilato idrofilo non ionico, ed un tensioattivo lipofilo non ionico (per esempio, un alcol grasso etossilato e/o un copolimero a blocchi poliossietilene-poliossipropilene) [47]. ;In alcune forme di realizzazione una emulsione pu? essere mescolata con l'antigene estemporaneamente, al momento dell?erogazione e, quindi, l?adiuvante e l?antigene possono essere tenuti separati in un vaccino confezionato o distribuito, pronto per la formulazione finale al momento dell?utilizzo. In altre forme di realizzazione una emulsione viene mescolata con l?antigene nel corso della fabbricazione e, di conseguenza, la composizione viene confezionata in una forma di liquido adiuvato. L'antigene sar? generalmente in una forma acquosa, in modo tale che il vaccino viene preparato alla fine mescolando due liquidi. Il rapporto di volume tra i due liquidi per la miscelazione pu? variare (per esempio tra 5:1 e 1:5), ma ? generalmente di circa 1:1. Dove le concentrazioni di componenti vengono riportate nelle precedenti descrizioni di emulsioni specifiche, queste concentrazioni sono tipicamente per una composizione non diluita, e la concentrazione dopo la miscelazione con una soluzione di antigene quindi diminuir?. ;Quando una composizione comprende un tocoferolo, pu? essere utilizzato uno qualsiasi degli ?, ?, ?, ?, ? ? ? tocoferoli, ma vengono preferiti gli a tocoferoli. Il tocoferolo pu? assumere svariate forme, per esempio differenti sali e/o isomeri. I sali comprendono sali organici, come succinato, acetato, nicotinato, eccetera. Il D-a-tocoferolo ed il DL-a-tocoferolo possono essere utilizzati entrambi. I tocoferoli vengono compresi vantaggiosamente nei vaccini per l'utilizzo nei pazienti anziani (per esempio, di et? compresa tra 60 anni o pi?), dal momento che la vitamina E ? stata riportata avere un effetto positivo sulla risposta immunitaria in questo gruppo di pazienti [48]. Essi hanno anche propriet? antiossidanti che possono aiutare a stabilizzare le emulsioni [49]. Un ?-tocoferolo preferito ? il DL-a-tocoferolo, ed il sale preferito di questo tocoferolo ? il succinato. Il sale di succinato ? stato riscontrato cooperare con ligandi correlati con TNF in vivo. ;C. Formulazioni di saponine [capitolo 22 del riferimento 30] Anche le formulazioni di saponine possono essere utilizzate come adiuvanti nell?invenzione. Le saponine sono un gruppo eterogeneo di glicosidi di sterolo e glicosidi di triterpenoide che vengono riscontrati in corteccia, foglie, fusti, radici e persino fiori di una vasta gamma di specie di piante. La saponina dalla corteccia dell?albero Quillaia saponaria Molina ? stata ampiamente studiata come adiuvante. La saponina pu? anche essere ottenuta commercialmente da Smilax ornata (salsapariglia), Gypsophilla paniculata (velo da sposa), e saponaria officinalis (radice di sapone). Le formulazioni di adiuvante di saponina comprendono formulazioni purificate, come QS21, cos? come formulazioni lipidiche, come ISCOM. QS21 viene commercializzato come Stimulon?. ;Le composizioni di saponina sono state purificate utilizzando HPLC e RP-HPLC. Utilizzando queste tecniche sono state identificate frazioni specifiche purificate, comprendenti QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferibilmente, la saponina ? QS21. Un metodo di produzione di QS21 viene divulgato nel riferimento 50. Le formulazioni di saponina possono anche comprendere uno sterolo, come il colesterolo ;[51]. ;Le combinazioni di saponine e colesteroli possono essere utilizzate per formare particelle uniche chiamate complessi immunostimolanti (ISCOM) [capitolo 23 del riferimento 30]. Gli ISCOM tipicamente comprendono anche un fosfolipide come fosfatidiletanolammina o fosfatidilcolina. Qualsiasi saponina conosciuta pu? essere utilizzata in ISCOM. Preferibilmente, 11SCOM comprende uno o pi? di QuilA, QHA & QHC. Gli ISCOM vengono ulteriormente descritti nei riferimenti 51-52-53. Facoltativamente, gli ISCOM possono essere privi di detergente addizionale [54]. ;Una recensione dello sviluppo di adiuvanti basati su saponina pu? essere trovata nei riferimenti 55 & 56. ;D. Virosomi e particelle simili a virus ;Anche i virosomi e le particelle simili a virus (VLP) possono essere utilizzati come adiuvanti nell?invenzione. Queste strutture generalmente contengono una o pi? proteine da un virus facoltativamente combinate o formulate con un fosfolipide. Esse sono generalmente non patogene, non replicanti e, generalmente, non contengono genoma virale nativo. La proteine virali possono essere prodotte in maniera ricombinante o isolate da virus completi. Queste proteine virali adeguate per l'utilizzo in virosomi o VLP comprendono proteine derivate da virus (come HA o NA), virus dell'epatite B (per esempio proteine del nucleo o del capside), virus dell'epatite E, virus del morbillo, virus Sindbis, Rotavirus, virus della malattia epizootica, Retrovirus, virus Norwalk, virus del papilloma umano, HIV, fagi a RNA, fago Qfi (come proteine di rivestimento), fago GA, fago fr, fago AP205, e Ty (come la proteina pi del retrotrasposone Ty). Le VLP vengono discusse ulteriormente nei riferimenti 57, 58, 59, 60, 61, 62. I Virosomi vengono discussi ulteriormente, per esempio, nel riferimento 63. ;E. Derivati batterici o microbici ;Adiuvanti adeguati per l'utilizzo nell'invenzione comprendono derivati batterici o microbici come derivati non tossici di lipopolisaccaride enterobatterico (LPS), derivati di lipide A, oligonucleotidi immunostimolatori e tossine ADP-ribosilanti e loro derivati detossificati. ;I derivati di LPS non tossici comprendono lipide A monofosforile (MPL) e MPL 3-O-deacilato (3dMPL). 3dMPL ? una miscela di lipide A monofosforile 3-O-deacilato con 4, 5 o 6 catene acilate. Una forma di "piccole particelle" preferite di lipide A monofosforile 3-0-deacilato viene divulgata nel riferimento 64. Tali "piccole particelle" di 3dMPL sono abbastanza piccole per essere filtrate sterili, attraverso una membrana di 0,22 pm [64]. Altri derivati di LPS non tossici comprendono mimetici di lipide A monofosforile, come derivati di amminoalchilglucosamminide fosfato e, per esempio RC 529 [65, 66]. ;Derivati di lipide A comprendono derivati di lipide A da Escherichia coli come OM-174. OM-174 viene descritto per esempio nei riferimenti 67 & 68. ;Oligonucleotidi immunostimolatori adatti per l'utilizzo come adiuvanti nell?invenzione comprendono sequenze nucleotidiche contenenti un motivo CpG (una sequenza di dinucleotide contenente una citosina non metilata collegata da un legame fosfato ad una guanosina). RNA ed oligonucleotidi a doppio filamento contenenti sequenze palindromiche o poli(dG) sono stati anche dimostrati essere immunostimolatori. ;Le CpG possono comprendere modificazioni/ analoghi di nucleotide come modificazioni di fosforotioato e possono essere a doppio filamento o a singolo filamento. I riferimenti 69, 70 e71 divulgano possibili sostituzioni di analogo, per esempio sostituzione di guanosina con 2'-deossi-7-deazaguanosina. L?effetto di adiuvante di oligonucleotidi di CpG viene ulteriormente discusso nei riferimenti72, 73, 74, 75, 76, 77. ;La sequenza CpG pu? essere diretta verso TLR9, come il motivo GTCGTT o TTCGTT [78]. La sequenza CpG pu? essere specifica per indurre una risposta immunitaria di Thl, come un ODN CpG-A, o essa pu? essere pi? specifica per indurre una risposta di cellula B, come un ODN CpG-B. ODN CpG-A e CpG-B vengono discussi nei riferimenti 79, 80, 81. Preferibilmente, il CpG ? un ODN CpG-A. ;Preferibilmente, l?oligonucleotide CpG viene costruito in modo tale che l?estremit? 5? ? accessibile per il riconoscimento di recettore. Facoltativamente, due sequenze di oligonucleotide CpG possono essere attaccate alle loro estremit? 3? per formare "immunomeri". Vedere, per esempio, i riferimenti 78 & 82, 83, 84. ;Un adiuvante CpG utile ? CpG7909, conosciuto anche come ProMune? (Coley Pharmaceutical Group, Ine). Un altro ? CpG 1826. Come una alternativa, o in aggiunta, per utilizzare le sequenze CpG, possono essere utilizzate le sequenze TpG [85], e questi oligonucleotidi possono essere senza motivi CpG non metilati. L?oligonucleotide immunostimolatorio pu? essere ricco in pirimidina. Per esempio, esso pu? comprendere pi? di un nucleotide di timidina consecutivo (per esempio TTTT, come divulgato nel riferimento 85), e/o esso pu? avere una composizione di nucleotide con >25% di timidina (per esempio, >35%, >40%, >50%, >60%, > 80%, eccetera) Per esempio, esso pu? comprendere pi? di un nucleotide di citosina consecutivo (per esempio CCCC, divulgato nel riferimento 85), e/o pu? avere una composizione di nucleotide con >25% di citosina (per esempio, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, eccetera) Questi oligonucleotidi possono essere senza motivi CpG non metilati. Oligonucleotidi immuno stimolatori tipicamente comprenderanno almeno 20 nucleotidi. Essi possono comprendere meno di 100 nucleotidi. ;Un adiuvante particolarmente utile basato su oligonucleotidi immunostimolatori ? conosciuto come IC-31? [86]. Quindi un adiuvante utilizzato con l'invenzione pu? comprendere una miscela di (i) un oligonucleotide (per esempio tra 15-40 nucleotidi), comprendente almeno un (e preferibilmente molteplici) motivi Cpl (vale a dire una citosina collegata ad una inosina per formare un dinucleotide), e (ii) un polimero policationico, come un oligopeptide (per esempio tra 5-20 amminoacidi), comprendente almeno una (e preferibilmente molteplici) sequenza(e) di tripeptide Lys-Arg-Lys. L?oligonucleotide pu? essere un deossinucleotide comprendente una sequenza di 26-mero 5'-(IC) 13-3' (SEQ ID NO: 96). Il polimero policationico pu? essere un peptide comprendente una sequenza amminoacidica di 11 -mero KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 97). ;Le tossine batteriche ADP-ribosilanti ed i loro derivati detossificati possono essere utilizzati come adiuvanti nell?invenzione. Preferibilmente, la proteina viene derivata da E. coli (enterotossina "LT" di E. coli instabile al calore), colera ("CT"), o pertosse ("PT"). L'utilizzo di tossine ADP-ribosilanti detossificate come adiuvanti mucosali viene descritto nel riferimento 87 e come adiuvanti parenterali nel riferimento 88. La tossina o il toxoide ? preferibilmente sotto forma di una olotossina, che comprende entrambe le subunit? A e B. Preferibilmente, la subunit? A contiene una mutazione detossificante; preferibilmente la subunit? B non ? mutata. Preferibilmente, l?adiuvante ? un mutante di LT detossificato, come LT-K63, LT-R72, e LT-G192. L'utilizzo di tossine ADP-ribosilanti e di loro derivati detossificati, in maniera particolare, LT-K63 e LT-R72, come adiuvanti pu? essere trovato nei riferimenti 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 e 96. Un mutante di CT utile ? o CT-E29H [97], Il riferimento numerico per sostituzioni di amminoacidi ? preferibilmente basato su allineamenti delle subunit? A e B di tossine ADP-ribosilanti esposte nel riferimento 98, specificatamente incorporato qui a titolo di riferimento in tutta la sua interezza solamente per il fine dell' allineamento e della numerazione di amminoacidi. ;F. Immunomodulatori umani ;Immunomodulatori umani adatti per l'utilizzo come adiuvanti nell?invenzione comprendono citochine, come interleuchine (per esempio, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 12 [99], eccetera ) [100], interferoni (per esempio, l'interferone ?), fattore stimolante la colonia di macrofagi, e fattore di necrosi tumorale. Un immunomodulatore preferito ? IL- 12. ;G. Bioadesivi e Mucoadesivi ;Bioadesivi e mucoadesivi possono essere utilizzati come adiuvanti nell?invenzione. Bioadesivi adatti comprendono microsfere di acido ialuronico esterificato [101] o mucoadesivi come derivati reticolati incrociati di poli(acido acrilico), alcol polivinilico, polivinilpirollidone, polisaccaridi e carbossimetilcellulosa. Anche il chitosano ed i suoi derivati possono essere utilizzati come adiuvanti nell?invenzione [102]. ;H. Microparticelle ;Le microparticelle possono anche essere utilizzate come adiuvanti nell?invenzione. Vengono preferite microparticelle (vale a dire una particella di ~ 100 nm a ~ 150 pm di diametro, pi? preferibilmente di ~ 200 nm a ~ 30 pm di diametro, e il pi? preferibilmente di ~ 500 nm a ~ 10 pm di diametro) formate da materiali che sono biodegradabili e non tossici (per esempio, un poli(a-idrossiacido), un acido poliidrossibutirrico, un poliortoestere, una polianidride, un policaprolattone, eccetera), con poli(lattide-co-glicolide), facoltativamente trattate per avere una superficie caricata negativamente (per esempio con SDS) o una superficie caricata positivamente (per esempio con un detergente cationico, come CTAB). ;I. Liposomi (capitoli 13 e 14 del riferimento 30) ;Esempi di formulazioni di liposomi adatte per l'utilizzo come adiuvanti vengono descritti nei riferimenti 103, 104, 105. ;J. Formulazioni di etere di poliossietilene e estere di poliossietilene ;Gli adiuvanti adatti per l?utilizzo nell'invenzione comprendono eteri di poliossietilene ed esteri di poliossietilene [106]. Tali formulazioni inoltre comprendono tensioattivi di estere di sorbitano di poliossietilene in combinazione con un octoxynol [107] come pure tensioattivi di eteri o esteri alchilici di poliossietilene in combinazione con almeno un tensioattivo non ionico addizionale come un octoxynol [108]. Esteri di poliossietilene preferiti vengono selezionati dal seguente gruppo: etere di poliossietilene-9-laurile (laureth 9), etere di poliossietilene-9-stearile, etere di poliossietilene-8-stearile, etere di poliossietilene-4-laurile, etere di poliossietilene-35-laurile, e etere di poliossietilene-23-laurile. ;K. Fosfazeni ;Pu? essere utilizzato un fosfazene, come poli[di(carbossilatofenossi) fosfazene] ("PCPP"), come descritto, per esempio, nei riferimenti 109 e 110. ;L. Peptidi di muramile ;Esempi di peptidi di muramile adatti per l?utilizzo come adiuvanti nell?invenzione comprendono N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutammina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutammina (nor-MDP), e N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamminil-L-alanina-2-( r-2'-dipalmitoile-sn-glicero-3-idrossifosforilossi)-etilammina MTP-PE). ;M. Composti di imidazochinolone ;Esempi di composti imidazochinolonici adatti per l?utilizzo come adiuvanti nell'invenzione comprendono Imiquimod ("R-837") [111, 112], Resiquimod ("R-848") [113], e i loro analoghi, ed i loro sali (per esempio i sali di cloridrato). Ulteriori informazioni su imidazochinoloni immuno stimolatori possono essere trovate nei riferimenti 114 al 15, 116, 117, 118. ;N. Uree sostituite ;Uree sostituite utili come adiuvanti comprendono composti di Formula I II o III o loro salii: ;; ;; come definiti nei riferimenti 119, come ?ER 803058', ?ER ;803732', ?ER 804053', ?ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', ?ER ;804680', 'ER 804764', 'ER 803022' o ' ER 804057', per esempio: ; ;; O. Ulteriori adiuvanti ;Ulteriori adiuvanti che possono essere utilizzati con l'invenzione comprendono: ;? Un derivato di amminoalchilglucosamminide fosfato, come RC-529 [120, 121]. ;? Un composto di tiosemicarbazone, come quelli divulgati nel riferimento 122. Metodi per formulare, fabbricare, e vagliare composti attivi vengono anche descritti nel riferimento 122. I tiosemicarbazoni sono particolarmente efficaci nella stimolazione di cellule mononucleate del sangue periferico umane per la produzione di citochine, come TNF-a. ;? Un composto di triptantrina, come quelli divulgati nel riferimento 123. Metodi per formulare, fabbricare, e vagliare composti attivi vengono anche descritti nel riferimento 123. I tiosemicarbazoni sono particolarmente efficaci nella stimolazione di cellule mononucleate del sangue periferico umane per la produzione di citochine, come TNF-a ;; ;; ? Loxoribina (7-allil-8-ossoguanosina) [127]. ;? Composti divulgati nel riferimento 128, comprendenti: composti di acilpiperazina, composti di indoldione, composti di tetraidraisochinolina (THIQ), composti di benzociclodione, composti di amminoazavinile, composti di amminobenzimidazolchinolinone (ABIQ) [129, 130], composti di idraftalammide, composti di benzofenone, composti di isossazolo, composti di sterolo, composti di chinazilinone , composti di pirrolo [131], composti di antrachinone, composti di chinossalina, composti di triazina, composti di pirazalopirimidina e composti di benzazolo [132]. ;? Composti contenenti lipidi collegati ad uno scheletro aciclico contenente fosfato, come l?antagonista di TLR4 E5564 [133, 134]; ;? Un polimero di poliossidonio [135, 136] o altro derivato di polietilene-piperazina N-ossidato. ;? Inosina 5' -monofosfato di metile ("MIMP") [137]. ;? Un composto di pirrolizidina poliidrossilata [138], come una avente la formula: ;; ;; dove R viene selezionato dal gruppo comprendente idrogeno, gruppi acile, alchile (per esempio cicloalchile), alchenile, alchimie e arile lineari o ramificati, non sostituiti o sostituiti, saturi o insaturi, o un loro sale o derivato accettabile dal punto di vista farmaceutico. Esempi comprendono, ma non sono limitati a: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosio, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3 , 7 -diepi-casuarina, eccetera. ;? Un ligando di CDld, come una a-glicosilcerammide [139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146] (per esempio agalattosilcerammide), ?-glicosilcerammidi contenenti fitosfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-l-0-(a-D-galattopiranosile)-2-(N-esacosanoilammino)-l,3,4-ottadecantriolo], CRONY-101, 3"-0-solfogalattosilcerammide, eccetera. ;? Una gamma inulina [147] o suoi derivati, come algammulin. ; ;; Combinazioni di adiuvante ;L'invenzione pu? anche comprendere combinazioni di aspetti di uno o pi? degli adiuvanti identificati sopra. Per esempio, le seguenti composizioni di adiuvante possono essere utilizzate nell'invenzione: (1) una saponina ed una emulsione di olio in acqua [148]; (2) una saponina (per esempio QS21) un derivato di LPS non tossico (per esempio 3dMPL) [149]; (3) una saponina (per esempio QS21) un derivato di LPS non tossico (per esempio 3dMPL) un colesterolo; (4) una saponina (per esempio QS21) 3dMPL IL- 12 (facoltativamente uno sterolo) [150]; (5) combinazioni di 3dMPL con, per esempio, QS21 e/o emulsioni di olio in acqua [151]; (6) SAF, contenente squalano 10%, Tween 80? 0,4%, polimero pluronico a blocchi L121 5%, e thr-MDP, o microfluificate in una emulsione sottomicrometrica o agitate con vortex per generare una emulsione di particelle di dimensione maggiore. (7) Sistema di adiuvante Ribi? (RAS), (Ribi Immunochem) contenente squalene 2%, Tween 80 0,2%, ed uno o pi? componenti della parete cellulare batterica dal gruppo consistente di monofosforilipide A (MPL), dimicolato di trealosio (TDM), e scheletro della parete cellulare (CWS), preferibilmente MPL CWS (Detox?), e (8) uno o pi? sali minerali (come un sale di alluminio) un derivato non tossico di LPS (come 3dMPL). Altre sostanze che agiscono come agenti immunostimolanti vengono divulgate nel capitolo 7 del riferimento 30. ;L'utilizzo di un adiuvante di idrossido di alluminio e/o di fosfato di alluminio ? particolarmente preferito, e gli antigeni vengono generalmente adsorbiti su questi sali. Il fosfato di calcio ? un altro adiuvante preferito. Altre combinazioni di adiuvante preferite comprendono combinazioni di adiuvanti Thl e Th2 come CpG & allume o resiquimod & allume. Pu? essere utilizzata una combinazione di fosfato di alluminio e 3dMPL. ;Le composizioni dell?invenzione possono suscitare entrambe una risposta immunitaria mediata da cellule come pure una risposta immunitaria umorale. Questa risposta immunitaria preferibilmente indurr? anticorpi duraturi (per esempio neutralizzanti) ed una immunit? mediata da cellule che pu? rispondere rapidamente dopo esposizione a pneumococcus. ;Due tipi di cellule T, cellule CD4 e CD8, vengono generalmente ritenuti necessari per avviare e/o intensificare l'immunit? mediata da cellule e l?immunit? umorale. Le cellule T CD8 possono esprimere un co-recettore CD8 e vengono comunemente riferite come linfociti T citotossici (CTL). Le cellule T CD8 sono in grado di riconoscere o di interagire con antigeni esposti su molecole MHC di classe I. ;Le cellule T CD4 possono esprimere un co-recettore CD4 e vengono comunemente riferite come cellule T helper. Le cellule T CD4 sono in grado di riconoscere peptidi antigenici legati a molecole MHC di classe II. Dopo interazione con una molecola MHC di classe II, le cellule CD4 possono secernere fattori come citochine. Queste citochine secrete possono attivare cellule B, cellule T citotossiche, macrofagi e altre cellule che partecipano ad una risposta immunitaria. Le cellule T Helper o cellule CD4+ possono essere inoltre divise in due sottoinsiemi funzionalmente distinti: fenotipo TH1 e fenotipo TH2 che differiscono nella loro funzione di citochina e di effettore. ;Le cellule TH1 attivate intensificano l'immunit? cellulare (comprendendo un incremento di produzione di CTL specifico per antigene) e sono di conseguenza di valore particolare nella risposta ad infezioni intra-cellulari. Le cellule TH 1 attivate possono secernere una o pi? di IL-2, IFN-?, e TNF-?. Una risposta immunitaria di TH1 pu? avere come risultato reazioni infiammatorie locali attivando macrofagi, cellule NK (killer naturali), e cellule T citotossiche CD8 (CTL). Una risposta immunitaria di TH1 pu? anche agire per espandere la risposta immunitaria stimolando la crescita di cellule B e T con IL- 12. Le cellule B stimolate da THlpossono secernere IgG2a. ;Le cellule TH2 attivate intensificano la produzione di anticorpi e sono di conseguenza di valore nella risposta alle infezioni extracellulari. Le cellule TH2 attivate possono secernere una o pi? di IL-4, IL-5, IL-6 e IL- 10. Una risposta immunitaria di TH2 pu? avere come risultato la produzione di IgGl, e di IgE, IgA e cellule B della memoria per una protezione futura. ;Una risposta immunitaria intensificata pu? comprendere una o pi? di una maggiore risposta immunitaria di TH1 ed una risposta immunitaria di TH2 intensificate. ;Una risposta immunitaria di TH 1 pu? comprendere uno o pi? di un incremento in CTL, un incremento in una o pi? delle citochine associate con una risposta immunitaria diTHl (come, IL-2, IFN-?, e TNF-?), un incremento in macrofagi attivati, un incremento nella attivit? di NK, o un incremento nella produzione di IgG2a. Preferibilmente, la risposta immunitaria intensificata di TH1 comprender? un incremento nella produzione di IgG2a. ;Una risposta immunitaria di TH1 pu? essere suscitata utilizzando un adiuvante di TH1. Un adiuvante di TH1 generalmente susciter? livelli incrementati di produzione di IgG2a rispetto alla immunizzazione dell' antigene senza adiuvante. Adiu vanti di TH1 adatti per l?utilizzo nell'invenzione possono comprendere per esempio formulazioni di saponina, virosomi e particelle simili a virus, derivati non tossici di lipopolisaccaride enterobatterico (LPS), oligonucleotidi immunostimolatori. Oligonucleotidi immunostimolatori, come oligonucleotidi contenenti un motivo CpG, sono adiuvanti di TH1 preferiti per l?utilizzo nell?invenzione. ;Una risposta immunitaria di TH2 pu? comprendere uno o pi? di un incremento in una o pi? delle citochine associate con una risposta immunitaria di TH2 (per esempio, IL-4, IL-5, IL-6 e IL- 10), o un incremento nella produzione di IgGl, di IgE, IgA e di cellule B della memoria. Preferibilmente, la risposta immunitaria di TH2 intensificata comprender? un incremento nella produzione di IgG 1. ;Una risposta immunitaria di TH2 pu? essere suscitata utilizzando un adiuvante di TH2. Un adiuvante di TH2 generalmente susciter? livelli incrementati della produzione di IgGl rispetto alla immunizzazione dell'antigene senza adiuvante. Adiuvanti di TH2 idonei per l?utilizzo nell?invenzione comprendono, per esempio, composizioni contenenti minerali, emulsioni di olio e tossine ADP-ribosilanti e loro derivati detossif?cati. Composizioni contenenti minerali, come sali di alluminio sono adiuvanti di TH2 preferiti per l?utilizzo nell?invenzione. ;Preferibilmente, l'invenzione comprende una composizione che comprende una combinazione di un adiuvante di TH1 ed un adiuvante di TH2. Preferibilmente, una tale composizione suscita una risposta di TH1 intensificata ed una risposta di TH2 intensificata, vale a dire, un incremento nella produzione di entrambe le IgGl e IgG2a rispetto alla immunizzazione senza un adiuvante. Ancora pi? preferibilmente, la composizione comprendente una combinazione di un adiuvante di TH1 e di un adiuvante di TH2 suscita una risposta di TH1 intensificata e/o una risposta di TH2 intensificata rispetto alla immunizzazione con un adiuvante singolo (vale a dire, rispetto alla immunizzazione con un adiuvante di TH1 da solo o una immunizzazione con un adiuvante di TH2 da solo). ;La risposta immunitaria pu? essere una o entrambe di una risposta immunitaria di TH1 e di una risposta immunitaria di TH2. Preferibilmente, la risposta immunitaria fornisce una o entrambe di una risposta immunitaria di TH 1 intensificata e di una risposta immunitaria di TH2 intensificata. ;La risposta immunitaria intensificata pu? essere una o entrambe di una risposta immunitaria sistemica e di una muco sale. Preferibilmente, la risposta immunitaria fornisce una o entrambe di una risposta immunitaria sistemica intensificata e di una mucosale intensificata. Preferibilmente la risposta immunitaria mucosale ? una risposta immunitaria di TH2. Preferibilmente, la risposta immunitaria mucosale comprende un incremento nella produzione di IgA. ;E. coli pu? causare una malattia in un numero di posizioni anatomiche [4] e cos? le composizioni dell' invenzione possono essere preparate in svariate forme. Per esempio, le composizioni possono essere preparate come sostanze iniettabili, o come soluzioni liquide o sospensioni. Possono anche essere preparate forme solide adatte per soluzione in, o sospensione in, veicoli liquidi prima dell?iniezione (per esempio una composizione liofilizzata o una composizione liofilizzata per atomizzazione). La composizione pu? essere preparata per somministrazione topica per esempio, come un unguento, una crema o una polvere. La composizione pu? essere preparata per somministrazione orale, per esempio, come una compressa o capsula, come uno spray, o come uno sciroppo (facoltativamente aromatizzato). La composizione pu? essere preparata per somministrazione polmonare per esempio, come un inalatore, utilizzando una polvere finissima o imo spray. La composizione pu? essere preparata come una supposta o pessario. La composizione pu? essere preparata per somministrazione nasale, auricolare od oculare, per esempio come gocce. La composizione pu? essere in forma di kit, concepito in modo tale che una composizione combinata viene ricostituita appena prima della somministrazione ad un paziente. Tali kit possono comprendere uno o pi? antigeni in forma liquida e uno o pi? antigeni liofilizzati. ;Quando una composizione deve essere preparata estemporaneamente prima dell'utilizzo (per esempio, dove un componente ? presente in forma liofilizzata) e viene presentata come un kit, il kit pu? comprendere due flaconcini, o esso pu? comprendere una siringa pronta-riempita ed un flaconcino, il contenuto della siringa essendo utilizzato per riattivare il contenuto del flaconcino prima deiriniezione. ;Le composizioni immunogeniche utilizzate come vaccini comprendono una quantit? di antigene(i) immunologicamente efficace, come pure qualsiasi altro componente, come necessario. Per ?quantit? immunologicamente efficace?, viene inteso che la somministrazione di tale quantit? ad un individuo, o in una singola dose o come parte di una serie, ? efficace per il trattamento o la prevenzione. Questa quantit? varia a seconda della salute e delle condizioni fisiche dell?individuo che deve essere trattato, l'et?, il gruppo tassonomico dell?individuo che deve essere trattato (per esempio, primate non umano, primate, eccetera), la capacit? del sistema immunitario dell?individuo di sintetizzare anticorpi , Il grado di protezione desiderato, la formulazione del vaccino, la valutazione della situazione medica da parte del medico curante, ed altri fattori rilevanti. ? atteso che la quantit? ricadr? in un intervallo relativamente ampio che pu? essere determinato attraverso prove ordinarie. ;Metodi di trattamento e di sommin?stmzione del vaccino L'invenzione fornisce anche un metodo per scatenare una risposta immunitaria in un mammifero comprendente la fase di somministrare una quantit? efficace di una composizione dell?invenzione. La risposta immunitaria ? preferibilmente protettiva e, preferibilmente comporta anticorpi e/o immunit? mediata da cellule. Il metodo pu? scatenare una risposta di richiamo. ;L'invenzione fornisce anche un polipeptide dell'invenzione per l?utilizzo come un medicamento per esempio per l?utilizzo nello scatenare una risposta immunitaria in un mammifero. ;L'invenzione fornisce anche l'utilizzo di un polipeptide dell'invenzione nella fabbricazione di un medicamento per scatenare una risposta immunitaria in un mammifero. ;L'invenzione fornisce anche un dispositivo di rilascio preriempito con una composizione immunogenica dell'invenzione. ;Scatenando una risposta immunitaria nel mammifero mediante questi utilizzi e metodi, il mammifero pu? essere protetto contro infezione da E. coli , comprendesi ceppi ExPEC e non ExPEC. L'invenzione ? particolarmente utile per fornire un'ampia protezione contro E. coli patogeni, compresi patotipi intestinali come patotipi EPEC, EAEC, EIEC, ETEC e DAEC. Quindi il mammifero pu? essere protetto contro malattie comprendenti, ma non limitate a, peritonite, pielonefrite, cistite, endocardite, prostatite, infezioni del tratto urinario (UTI), meningite (in maniera particolare meningite neonatale), sepsi (o SIRS), disidratazione, polmonite, diarrea (infantile, del viaggiatore, acuta, persistente, eccetera), dissenteria bacillare, sindrome uremica emolitica (HUS), pericardite, batteriuria, eccetera. ;SEQ ID NO: 3, 12, 199, 109, 115, e 124 e loro varianti sono particolarmente utili per l?immunizzazione contro il patotipo EAEC e, quindi, per prevenire la diarrea (sia acuta sia cronica). ;SEQ ID NO: 4, 10, 101, 107, 116, e 126 e loro varianti sono particolarmente utili per l?immunizzazione contro il patotipo UPEC e, quindi, per prevenire UTI comprendenti ma non limitate a, pielonefrite, cistite (sia acuta sia ricorrente), peritonite, UTI associate a catetere, prostatite, e batteriuria (compresa la batteriuria asintomatica). ;SEQ ID NO: 5, 102 e 117 e loro varianti sono particolarmente utili per l?immunizzazione contro il patotipo EIEC e, quindi, per prevenire la dissenteria (in particolare la dissenteria bacillare) e HUS (per esempio nei bambini). ;SEQ ID NO: 6, 9, 11, 103, 106, 108, 118, 121, e 123 e loro varianti sono particolarmente utili per l?immunizzazione contro il patotipo ETEC e, quindi, per prevenire la diarrea (comprese la diarrea del viaggiatore ed infantile). ;SEQ ID n.: 7, 8, 16, 104, 105, 113, 119, 120 e 128 e loro varianti sono particolarmente utili per l?immunizzazione contro il patotipo EPEC e, quindi, per prevenire la diarrea (compresa la diarrea infantile). ;Il mammifero ? preferibilmente un umano, ma pu? essere per esempio una mucca, un maiale, un pollo, un gatto o un cane, siccome la malattia da E. coli ? problematica anche in queste specie [4]. Dove il vaccino ? per utilizzo profilattico, l'uomo ? preferibilmente un bambino (per esempio, un bambino che fa i primi passi o un infante) o un adolescente, dove il vaccino ? per utilizzo terapeutico, l'uomo ? preferibilmente un adolescente o un adulto. Un vaccino destinato a bambini pu? anche essere somministrato ad adulti per esempio, per valutare la sicurezza, il dosaggio, l'immunogenicit?, eccetera. ;Una maniera per verificare l'efficacia del trattamento terapeutico comporta il monitorare l?infezione da E. coli dopo la somministrazione delle composizioni dell'invenzione. Una maniera per verificare l'efficacia del trattamento profilattico comporta il monitorare le risposte immunitarie, sistemicamente (ad es. monitorando il livello di produzione di IgGl e IgG2a) e/o a livello mucoso (ad es. monitorando il livello di produzione di IgA), contro gli antigeni delle composizioni dell'invenzione dopo la somministrazione della composizione. Tipicamente, le risposte di anticorpo sierico antigene-specifico vengono determinate dopo l?immunizzazione, ma prima della stimolazione mentre le risposte di anticorpo mucosale antigene-specifico vengono determinate dopo l?immunizzazione, e dopo la stimolazione. ;Un?altra maniera per valutare l'immunogenicit? delle composizioni della presente invenzione ? di esprimere le proteine in maniera ricombinante per vagliare sieri o secrezioni mucosali di pazienti mediante immunoblot e/o microarray. Una reazione positiva tra la proteina ed il campione del paziente indica che il paziente ha approntato una risposta immunitaria verso la proteina in questione. Questo metodo pu? anche essere utilizzato per identificare antigeni e/o epitopi all' interno di antigeni immunodominanti. ;L'efficacia delle composizioni di vaccino pu? essere determinata anche in vivo stimolando modelli animali di infezione da E. coli, per esempio, cavie o topi, con le composizioni di vaccino. Un modello murino di ExPEC e di sepsi letale viene descritto nel riferimento 152. Un modello di ratto del cotone viene divulgato nel riferimento 153. ;Le composizioni dell'invenzione generalmente verranno somministrate direttamente al paziente. La distribuzione diretta pu? essere realizzata mediante iniezione parenterale (per esempio per via sottocutanea, per via intraperitoneale, per via endovenosa, per via intramuscolare, o nello spazio interstiziale di un tessuto), o per via mucosale, come mediante somministrazione rettale, orale (per esempio, compressa, spray), vaginale, topica, transdermica o transcutanea, intranasale, oculare, auricolare, polmonare o di altra mucosa. ;L'invenzione pu? essere utilizzata per suscitare una immunit? sistemica e/o mucosale, preferibilmente per suscitare una immunit? sistemica e/o mucosale intensificata. ;Preferibilmente l?immunit? sistemica e/o mucosale intensificata si riflette in una risposta immunitaria di TH1 e/o TH2 intensificata. Preferibilmente, la risposta immunitaria intensificata comprende un incremento nella produzione di IgGl e/o IgG2a e/o IgA. ;Il dosaggio pu? essere per un programma di singola dose o un programma a multiple dosi. Le dosi multiple possono essere utilizzate in un programma di immunizzazione primaria e/o in un programma di immunizzazione di richiamo. In un programma a dose multipla le varie dosi possono essere date mediante le medesime vie o differenti, per esempio, una prima parenterale ed un richiamo muco sale, una prima mucosale ed un richiamo parenterale, eccetera. Dosi multiple tipicamente verranno somministrate almeno 1 settimana di distanza (per esempio, circa 2 settimane, circa 3 settimane, circa 4 settimane, circa 6 settimane, circa 8 settimane, circa 10 settimane, circa 12 settimane, circa 16 settimane, eccetera). ;I vaccini dell'invenzione possono essere utilizzati per trattare sia bambini sia adulti. Quindi un paziente umano pu? essere di et? inferiore ad 1 anno, di 1-5 anni, di 5-15 anni, di 15-55 anni, o almeno di 55 anni. I pazienti preferiti per ricevere i vaccini sono gli anziani (per esempio, > 50 anni, > 60 anni, e preferibilmente > 65 anni), i giovani (per esempio < 5 anni), i pazienti ricoverati, gli operatori sanitari, il personale delle forze armate e militare, le donne incinte, i malati cronici, o i pazienti immunodeficienti. I vaccini non sono adatti esclusivamente per tali gruppi, tuttavia, e possono essere utilizzati, pi? generalmente in una popolazione. ;I vaccini dell'invenzione sono particolarmente utili per i pazienti che sono in attesa di un intervento chirurgico, o altri pazienti degenti in ospedale. Essi sono utili anche in pazienti che verranno cateterizzati. Essi sono anche utili in donne adolescenti (per esempio, di et? compresa tra 11-18) ed in pazienti con infezioni croniche del tratto urinario. ;I vaccini l'invenzione possono essere somministrati a pazienti sostanzialmente nel medesimo momento (per esempio, durante la medesima visita medica o visita in un centro di assistenza sanitaria professionale o di vaccinazione) di altri vaccini, per esempio, sostanzialmente nel medesimo momento di un vaccino per il morbillo, vaccino per la parotite, un vaccino per la rosolia, un vaccino per MMR, un vaccino per la varicella, un vaccino per MMRV, un vaccino per la difterite, un vaccino per il tetano, un vaccino per la pertosse, un vaccino per DTP, un vaccino per un li. influenzae di tipo b coniugato, un vaccino per Poliovirus inattivato, un vaccino per il virus dell'epatite B, un vaccino coniugato meningococcico (per esempio un vaccino A-C-W135-Y tetravalente), un vaccino per il virus respiratorio sinciziale, eccetera. ;Immunizzazione di acido nucleico ;Le composizioni immunogeniche descritte sopra comprendono antigeni polipeptidici. In tutti i casi, tuttavia, gli antigeni polipeptidici possono essere sostituiti da acidi nucleici (DNA in genere) che codificano per tali polipeptidi, per dare composizioni, metodi ed utilizzi basati su immunizzazione con acido nucleico. L?immunizzazione con acido nucleico ? ora un settore sviluppato (per esempio, vedere i riferimenti 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 eccetera). ;L?acido nucleico che codifica per l?immunogeno viene espresso in vivo, dopo la distribuzione ad un paziente e l?immunogeno allora stimola il sistema immunitario. Il principio attivo tipicamente assumer? la forma di un vettore di acido nucleico che comprende: (i) un promotore, (ii) una sequenza che codifica per l?immunogeno, operativamente collegata al promotore; e facoltativamente (iii) un marcatore selezionabile. I vettori preferiti possono inoltre comprendere (iv) una origine di replicazione, e (v) un terminatore di trascrizione a valle di e operativamente collegato a (ii). In generale, (i) 8? (v) saranno eucariotici e (iii) 8? (iv) saranno procariotici. ;I promotori preferiti sono promotori virali per esempio da citomegalovirus (CMV). Il vettore pu? anche comprendere le sequenze regolatorie trascrizionali (per esempio enhancer (intensificatore)) in aggiunta al promotore e che interagiscono funzionalmente con il promotore. I vettori preferiti comprendono rintensificatore/ promotore del CMV immediato-precoce, ed i vettori pi? preferiti comprendono anche l?introne A del CMV. Il promotore ? operativamente collegato ad una sequenza a valle che codifica per un immunogeno, in modo tale che l?espressione della sequenza codificante per un immunogeno sia sotto il controllo del promotore. ;Dove viene utilizzato un marcatore, preferibilmente esso funziona in un ospite microbico (per esempio in un procariote, in un batterio, in un lievito). Il marcatore ? preferibilmente un marcatore procariotico selezionabile (per esempio, trascritto sotto il controllo di un promotore procariotico). Per convenienza, marcatori tipici sono geni di resistenza ad antibiotico. ;11 vettore dell'invenzione ? preferibilmente un vettore episomiale o extra-cromosomico che si replica autonomamente, come un plasmide. ;II vettore dell'invenzione preferibilmente comprende una origine di replicazione. Viene preferito che l'origine di replicazione sia attiva in procarioti ma non in eucarioti. ;I vettori preferiti quindi comprendono un marcatore procariotico per la selezione del vettore, una origine di replicazione procariotica, ma un promotore eucariotico per guidare la trascrizione della sequenza codificante per un immunogeno. I vettori, pertanto (a) saranno amplificati e selezionati in ospiti procariotici senza espressione polipeptidica, ma (b) verranno espressi in ospiti eucariotici senza essere amplificati. Questa disposizione ? l'ideale per vettori di immunizzazione con acido nucleico. ;II vettore dell?invenzione pu? comprendere una sequenza di terminatore trascrizionale eucariotica a valle della sequenza codificante. Questo pu? intensificare i livelli di trascrizione. Dove la sequenza codificante non dispone della propria, il vettore dell'invenzione preferibilmente comprende una sequenza di poliadenilazione. Una sequenza di poliadenilazione preferita proviene dall?ormone della crescita bovino. ;Il vettore dell?invenzione pu? comprendere un sito di clonaggio multiplo. ;In aggiunta alle sequenze codificanti per l?immunogeno ed un marcatore, il vettore pu? comprendere una seconda sequenza eucariotica codificante. Il vettore pu? anche comprendere una IRES a monte di detta seconda sequenza, al fine di permettere la traduzione di un secondo polipeptide eucariotico dal medesimo trascritto dell?immunogeno. In alternativa, la sequenza codificante per l?immunogeno pu? essere a valle di una IRES. ;II vettore dell?invenzione pu? comprendere motivi CpG non metilati, per esempio sequenze di DNA non mediate che hanno in comune una citosina che precede una guanosina, fiancheggiate da due purine al 5' e due pirimidine al 3'. Nella loro forma non mediata questi motivi di DNA sono stati dimostrati essere potenti stimolatori di svariati tipi di cellule immunitarie. ;I vettori possono essere trasferiti in una maniera mirata. Tecniche di trasferimento di DNA mediato da recettore vengono descritte, per esempio, nei riferimenti 162, 163, 164, 165, 166, 167. Composizioni terapeutiche contenenti un acido nucleico vengono somministrate in un intervallo di circa 100 ng a circa 200 mg di DNA per somministrazione locale in un protocollo di terapia genica. Gli intervalli di concentrazione di circa 500 ng a circa 50 mg, di circa 1 pg a circa 2 mg, di circa 5 pg a circa 500 pg, e di circa 20 pg a circa 100 ?g di DNA possono anche essere utilizzati durante un protocollo di terapia genica. Fattori come metodo di azione (per esempio per intensificare o inibire livelli del prodotto genico codificato) ed efficacia di trasformazione e di espressione sono considerazioni che influiranno sul dosaggio richiesto per una efficacia massima. Dove viene desiderata una maggiore espressione su una area di tessuto pi? vasta, possono essere richieste quantit? di vettore pi? grandi o le medesime quantit? risomministrate in un protocollo di somministrazioni successive, o svariate somministrazioni a differenti porzioni di tessuto adiacenti o vicine per avere come effetto un esito terapeutico positivo. In tutti i casi, la sperimentazione ordinaria in trial clinici determiner? intervalli specifici per un effetto terapeutico ottimale. ;I vettori possono essere trasferiti utilizzando veicoli di trasferimento genico. Il veicolo di trasferimento genico pu? essere di origine virale o non virale (vedere in generale i riferimenti 168, 169, 170, 171). ;I vettori basati su virus per il trasferimento di un acido nucleico desiderato e l?espressione in una cellula desiderata sono ben conosciuti neH?arte. Veicoli basati su virus esemplificativi comprendono, ma non sono limitati a, retrovirus ricombinanti (per esempio riferimenti 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182), vettori basati su alfavirus (per esempio vettori di virus Sindbis, virus Semliki forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus Ross River (possono anche essere utilizzati ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e virus dell?encefalite equina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532); possono anche essere utilizzati ibridi o chimere di questi virus, vettori di poxvirus (per esempio, vaiolo vaccino, vaiolo aviario, vaiolo del canarino, vaiolo vaccino Ankara modificato, eccetera), vettori di adenovirus, e vettori di virus adeno-associati (AAV) (per esempio, vedere riferimenti 183, 184, 185, 186, 187, 188). Pu? anche essere impiegata una somministrazione di DNA collegato ad adenovirus ucciso [189]. ;Possono anche essere impiegati veicoli e metodi di distribuzione non virali, comprendenti, ma non limitati a, DNA condensato policationico collegato o non collegato ad adenovirus ucciso da solo [per esempio, 189], DNA collegato a ligando [190], cellule veicoli di distribuzione di cellula eucariotica [per esempio, riferimenti 191, 192, 193, 194, 195] e neutralizzazione di carica nucleica o fusione con membrane cellulari. Pu? anche essere impiegato DNA nudo. Metodi di introduzione di DNA nudo esemplificativi vengono descritti nei riferimenti 196 e 197. Liposomi (per esempio immunoliposomi) che possono agire come veicoli di trasferimento genico vengono descritti nei riferimenti 198, 199, 200, 201, 202. Ulteriori approcci vengono descritti nei riferimenti 203 Ss 204. ;Ulteriori trasferimenti non virali adatti per l?utilizzo comprendono sistemi di trasferimento meccanici come l'approccio descritto nel riferimento 204. In aggiunta, la sequenza codificante ed il prodotto di espressione di tale sequenza possono essere fomiti attraverso il deposito di materiali di idrogel fotopolimerizzato o l'utilizzo di radiazioni ionizzanti [per esempio, riferimenti 205 & 206]. Altri metodi convenzionali per il trasferimento genico che possono essere utilizzati per il trasferimento della sequenza codificante comprendono, per esempio, l'utilizzo di una pistola a particelle manuale per il trasferimento genico [207] o l'utilizzo di radiazioni ionizzanti per attivare geni trasferiti [205 e 206]. ;Il trasferimento di DNA utilizzando micro-particelle di PLG (poli(lattide-co-glicolide)) ? un metodo preferito in maniera particolare, per esempio mediante adsorbimento sulle micro-particelle, che vengono facoltativamente trattate per avere una superficie caricata negativamente (per esempio, trattate con SDS) o una superficie caricata positivamente (per esempio, trattate con un detergente cationico, come CTAB). ;Riferimento 5 e clausole di rinuncia (?disc laimers?) In alcune forme di realizzazione, l'invenzione pu? non comprendere l'utilizzo di un polipeptide codificato dalla SEQ ID NO: 1 per esempio essa non contempla l?utilizzo di un polipeptide comprendente la sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 2, o essa non contempla l?utilizzo di un polipeptide avente la sequenza N-terminale SEQ ID NO: 98. Tali polipeptidi, e le loro sequenze codificanti, vengono divulgati nel riferimento 5 per l?utilizzo nell?immunizzazione contro infezioni da MNEC. ;In altre forme di realizzazione, tuttavia, vengono contemplati i polipeptidi del riferimento 5, ma per esempio per nuovi scopi medici. Secondo quanto divulgato qui, la stretta omologia tra differenti patotipi di E. coli significa che una risposta immunitaria contro un polipeptide derivato da MNEC pu? fornire una protezione incrociata contro ceppi non-MNEC. Quindi, quando l'invenzione si riferisce al trattamento o alla profilassi di malattie causate da ceppi di E. coli che non sono nel patotipo MNEC (per esempio contro ceppi APEC, UPEC o SEPEC di ExPEC; o contro patotipi intestinali di E. coli, come ceppi EPEC, EAEC, EIEC, ETEC o DAEC), allora possono essere ricompresi i polipeptidi del riferimento 5. ;Anticorpi ;Anticorpi contro antigeni di E. coli possono essere utilizzati per l'immunizzazione passiva [208]. Quindi l'invenzione fornisce un anticorpo che si lega ad almeno 2 (per esempio a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o tutte 13) delle 13 proteine che consistono ciascuna di SEQ ID NO: da 3 a 16, SEQ ID NO 99-113, e SEQ ID NO 114-128. Anticorpi che si legano solamente ad una di detto gruppo di 13 proteine non vengono compresi dalla presente invenzione. ;L'invenzione fornisce anche l?utilizzo di tali anticorpi in terapia. L'invenzione fornisce anche l?utilizzo di tali anticorpi nella fabbricazione di un medicamento. L'invenzione fornisce anche un metodo per trattare un mammifero che comprende la fase di somministrare una quantit? efficace di un anticorpo dell'invenzione. Come descritto sopra per composizioni immunogeniche, questi metodi ed utilizzi consentono ad un mammifero di essere protetti contro l'infezione da E. coll ;Il termine "anticorpo" comprende molecole di immunoglobuline intatte, come pure loro frammenti che sono in grado di legare un antigene. Questi comprendono molecole di anticorpo ibride (chimeriche) [209, 210]; frammenti F(ab')2 e F(ab) e molecole Fv; eterodimeri non covalenti [211, 212]; molecole Fv a singola catena (sFv) [213]; costrutti di frammento di anticorpo dimerico e trimerico; minianticorpi [214, 215]; molecole di anticorpo umanizzato [216, 217, 218]; e qualsiasi frammento funzionale ottenuto da tali molecole, come pure anticorpi ottenuti attraverso processi non convenzionali come esposizione fagica. Preferibilmente, gli anticorpi sono anticorpi monoclonali. I metodi per ottenere anticorpi monoclonali sono ben conosciuti nell?arte. Vengono preferiti anticorpi umanizzati o pienamente umani. ;Genera le ;La pratica della presente invenzione impiegher?, salvo diversa indicazione, metodi convenzionali di chimica, biochimica, biologia molecolare, immunologia e farmacologia, all?interno della competenza dell'arte. Tali tecniche vengono spiegate pienamente nella letteratura. Vedere, per esempio, i riferimenti 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, eccetera. ;Il termine "comprendente" racchiude sia "includente" sia "costituito" per esempio, una composizione "comprendente" X pu? essere costituita esclusivamente da X o pu? includere qualcosa di aggiuntivo per esempio, X Y. ;II termine "circa" in relazione ad un valore numerico x significa, per esempio, x?\0%. ;Viene utilizzata qui la numerazione "Gl". Un numero Gl, o "Genlnfo Identifier", ? una serie di cifre assegnate consecutivamente a ciascuna registrazione di sequenza processata da NCBI quando le sequenze vengono aggiunte alle sue banche dati. Il numero Gl non ha alcuna somiglianza con il numero di accesso della registrazione di sequenza. Quando una sequenza viene aggiornata (per esempio per correzione, o per aggiungere pi? annotazioni o informazioni) allora essa riceve un nuovo numero di Gl. Quindi la sequenza associata con un determinato numero Gl non viene mai cambiata. ;I riferimenti ad una identit? di sequenza percentuale tra due sequenze di amminoacidi significa che, quando allineate, quella percentuale di amminoacidi sono gli stessi nel confronto delle due sequenze. Questo allineamento e l?omologia o l?identit? di sequenza percentuale possono essere determinati utilizzando programmi software conosciuti nell?arte, per esempio quelli descritti nella sezione 7.7.18 del riferimento 227. Un allineamento preferito viene determinato mediante l?algo ritmo di ricerca di omologia di Smith-Waterman con una ricerca di gap affine con una penalit? per apertura di gap di 12 ed una penalit? per estensione di gap di 2, matrice BLOSUM di 62. L?algoritmo di ricerca di omologia di Smith-Waterman viene divulgato nel riferimento 228. ;Un tecnico del ramo dovrebbe comprendere che "isolato" significa alterato "dalla mano dell?uomo" dal suo stato naturale, vale a dire, se esso ? presente in natura, esso ? stato cambiato o rimosso dal suo ambiente originale, o entrambi. Per esempio, un polinucleotide o un polipeptide presente in natura in un organismo vivente ? non "isolato", quando si trova in tale organismo vivente, ma il medesimo polinucleotide o polipeptide separato dai materiali coesistenti del suo stato naturale ? "isolato", nel senso in cui il termine viene utilizzato in questa divulgazione. Inoltre, si dovrebbe comprendere che un polinucleotide o polipeptide che viene introdotto in un organismo mediante trasformazione, manipolazione genetica o mediante qualsiasi altro metodo ricombinante ? "isolato" anche se ? ancora presente in detto organismo, il quale organismo pu? essere vivente o non vivente, salvo il caso in cui tale trasformazione, manipolazione genetica o altro metodo ricombinante produce un organismo che ? altrimenti indistinguibile dall?organismo presente in natura. ;BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI ;La figura 1 mostra un allineamento CLUSTALW di SEQ ID NO: da 2 a 16. Le regioni N-terminali che possono essere rimosse per incrementare la solubilit?, pur mantenendo sostanzialmente la medesima immunogenicit? vengono mostrate in fondo all'allineamento. La regione N-terminale fino al linker di ser-gly viene denotata con "G" e la regione ricca in prolina viene denotata con "P". ;La figura 2 mostra l?identit? amminoacidica tra coppie di sequenze. ;La figura 3 mostra l'analisi su gel di proteina purificata, con bande di peso molecolare (MW) alto visibili in assenza di DTT. ;Le figure 4 e 5 mostrano western blot di lisati (figura 4) e sumatante (figura 5) utilizzando un siero anti-AcfD. Le 8 corsie contengono lisati o supematanti da BL21, DH5a, IHE3034, 536, CFT073, un ceppo IHE3034 con un knockout di un gene non AcfD, un ceppo IHE3034 con un knockout di un altro gene non AcfD, ed un ceppo IHE3034 con un knockout del suo gene AcfD. ;La figura 6 mostra un confronto di solubilit? della proteina AcfD e di svariati frammenti della proteina. Il pannello (A) ? un gel in gradiente SDS-PAGE (tampone MOPS 4-12%) di campioni a 37?C che confronta il pellet (corsia di sinistra per ciascuna proteina o frammento) al sumatante (corsia di destra per ciascuna proteina o frammento). Le corsie da sinistra a destra sono: marcatori di peso molecolare (le bande da 191 kDa, 97 kDa e 64 kDa sono marcate), batteri di controllo trasformati con il vettore di espressione pET con nessun inserto, espressione batterica di 3526 (tag di istidine peptide leader rimosso) espressione batterica di L3526 (tag di istidine lunghezza intera), espressione batterica di L3526-2stop (lunghezza intera), espressione batterica di 3526-DG (tag di istidine rimozione del N-terminale di AcfD fino al linker flessibile glieina- serina), ed espressione batterica di DP-3526 (tag di istidine rimozione del N-terminale di AcfD fino alla regione ricca in prolina). Il pannello (B) ? un gel in gradiente SDS-PAGE (tampone MOPS 4-12%) di campioni a 25?C che seguono il medesimo ordine per le corsie del pannello (A). ;; ; ;;; MODALIT? PER L'ESECUZIONE DELL'INVENZIONE ;Uno degli ant?geni divulgati nel riferimento 5 viene annotato come precursore del fattore D di colonizzazione accessorio (AcfD) (SEQ ID NO: 2 amminoacidica nel presente documento) da ceppo MNEC IHE3034. Questa proteina ? stata espressa e purificata, ed essa conferisce una protezione contro ceppi ExPEC in un modello animale di sepsi. ;Sono state ottenute le sequenze per gli ortoioghi in vari altri ceppi di E. coli. La sequenza amminoacidica vista in IHE3034 ? stata vista anche in ceppi APECOl e UTI89, ma sono state trovate 14 sequenze supplementari (SEQ ID NO: da 3 a 16). La figura 1 mostra un allineamento delle SEQ ID NO: da 2 a 16. Ci sono diversi tratti di conservazione tra le sequenze (SEQ ID NO: da 17 a 95). I 30 amminoacidi al N-terminale sono conservati al 100%, e questi comprendono il peptide segnale (aa 1-23) e la cisteina N-terminale della lipoproteina nativa. ;Alcuni ceppi hanno avuto una mutazione trame shift (spostamento della sequenza di lettura (?reading trame?)) nel gene AcfD, che ha come risultato nessuna espressione del polipeptide. Il gene AcfD era del tutto assente da ceppi CFT073, EDL933, Sakai e B171. ;La figura 2 mostra la % di identit? tra le sequenze di amminoacidi. Le etichette sono SEQ ID NO, fatta eccezione per MG1655, RS218, DH10B, APECOl e UTI89 dove viene utilizzato il nome del ceppo. Il pi? basso livello di identit? (nel riquadro in Figura 2) ? stato 85,9%, tra SEQ ID NO: 2 e 4 (entrambe ceppi ExPEC). ;La sequenza di AcfD dal ceppo IHE3034 ? stata clonata e poi espressa da un plasmide come una proteina ricombinante con tag di His senza un peptide leader, in un E. coli ospite. La proteina ? stata purificata ed analizzata. La filtrazione su gel ha mostrato un peso molecolare molto pi? elevato di quello predetto unicamente in base alla sequenza amminoacidica. L?analisi su gel in assenza di DTT, ma non in sua presenza, mostra forme della proteina di peso molecolare pi? elevato (Figura 3). Quindi la proteina ? in grado di formare oligomeri. ;Sieri scatenati contro AcfD sono stati utilizzati in western blot contro lisati totali di cellule (Figura 4) o sumatanti di coltura precipitati con TCA 60% (Figura 5). I sieri hanno riconosciuto una proteina di ~ 150 kDa nel lisato da entrambi i ceppi patogeni e commensali. Essi non hanno reagito con questa banda in lisati da CFT073 o da un mutante di IHE3034 knockout per AcfD. La reattivit? con proteine nei supematanti indica che la proteina pu? essere secreta. ;La proteina purificata ? stata utilizzata nel seguente esperimento di immunizzazione. Topi CD1 (di 5 settimane) sono stati immunizzati per via sottocutanea utilizzando 20 pg dell?antigene pi? adiuvante di Freund (o altro adiuvante come indicato qui di seguito). I topi sono stati inoculati a 0, 21, e 35 giorni. Quattordici giorni dopo la terza inoculazione, i topi sono stati stimolati con una dose letale (LD80) di un ceppo patogeno di E. coli. Il sangue ? stato raccolto dalla coda 24 ore dopo la stimolazione per valutare la batteriemia. La mortalit? ? stata monitorata per quattro giorni dopo la stimolazione. Il tasso di protezione, calcolato come (% di morte nel gruppo di controllo (nessuna immunizzazione) -% di morte nel gruppo sperimentale (immunizzato)) / % di morte nel gruppo di controllo x 100, ? stato del 100%. ;In ulteriori esperimenti utilizzando un adiuvante di sale di alluminio, su cui la proteina ? adsorbita completamente, il 75% dei topi sono stati protetti contro lo 0 % nei gruppi di controllo. Le morti in entrambi i gruppi si sono verificate entro 1 giorno dalla stimolazione letale. ;In ulteriori esperimenti, l'ospite ricombinante ? stato cresciuto in due differenti condizioni di ??2 durante l?espressione. In entrambe le condizioni la proteina ? stata visibile in due raggruppamenti con una carica differente. Non sono state viste differenze significative nell?efficacia protettiva dei quattro differenti raggruppamenti di proteina. ;Solubilit? incrementata ;Inaspettatamente, la proteina di AcfD ha mostrato una solubilit? bassa, persino se la proteina ? una proteina secreta. Come mostrato in Figura 6 (B), la rimozione del N-terminale di AcfD fino al linker di ser-gly ha incrementato significativamente la solubilit?, quando espressa a 25?C (vedere pKl-3526-DG Figura 6 (B)). Analogamente la rimozione del N-terminale di AcfD fino alla regione ricca in prolina ha incrementato significativamente la solubilit?, quando espressa a 25?C (vedere pKl-3526-DP Figura 6 (B)). ;Per confermare che entrambi i frammenti hanno avuto sostanzialmente la medesima immunogenicit? del AcfD di lunghezza intera, sono stati purificati i frammenti. I frammenti purificati sono stati utilizzati in un esperimento di immunizzazione nei topi, adiuvati con adiuvante di Freund completo, seguendo il medesimo protocollo come descritto sopra. L?immunizzazione con AcfD con il N-terminale fino al linker ser-gly rimosso ha protetto il 100% dei topi dalla morte, mentre la morte si ? verificata nel 90% degli animali nel gruppo di controllo non immunizzato. L?immunizzazione con AcfD con il N-terminale fino alla regione ricca in prolina rimossa ha protetto il 90% dei topi dalla morte, mentre la morte si ? verificata nel 90% degli animali nel gruppo di controllo non immunizzato. ;Sar? compreso che l'invenzione ? stata descritta solamente a titolo di esempio e possono essere apportate modificazioni, pur restando all?interno dell?ambito e dello spirito dell?invenzione. ;SEQ ID NO: 1 TTGTCACTTGCGTTATTAATGAATAAGAAATTTAAATATAAGAAA TCGCTTTTAGCGGCTATTTTAAGCGCAACCCTGTTAGCCGGTTGTGATGG TGGTGGTTCAGGATCGTCCTCCGATACGCCGTCTGTAGATTCTGGATCA GGGACTTTGCCGGAAGTGAAACCCGATCCAACACCAACCCCGGAGCCG ACACCTGAGCCGACGCCGGACCCAGAACCTACGCCGGATCCAACACCT GATCCTGAGCCGACACCAGAACCGGAGCCAGAACCTGTTCCTACGAAAA CGGGTTATCTGACCCTGGGCGGAAGCCAGCGGGTAACTGGTGCTACCT GTAATGGTGAATCCAGCGATGGCTTTACCTTTACGCCAGGCAATACCGT GAGTTGTGTGGTGGGCAGTACGACCATTGCAACATTCAACACCCAGTC A GAAGCTGCGCGTAGCCTGCGTGCGGTTGACAAAGTGTCGTTTAGCCTGG AGGACGCGCAGGAGCTGGCGAATTCTGAAAATAAGAAAACCAACGCCAT CTCTCTGGTGACGTCCAGCGACAGTTGCCCCGCAGATGCAGAACAGCTT TGTCTTACTTTCTCGTCAGTGGTTGATCGCGCGCGATTTGAAAAACTGTA TAAGCAAATTGATCTGGCAACAGACAATTTCAGCAAGCTGGTCAATGAAG AGGTGGAAAACAATGCTGCGACTGATAAAGCGCCGTCCACCCATACCTC AACGGTAGTGCCAGTCACGACAGAGGGAACAAAACCGGATCTGAACGC GTCCTTCGTGTCGGCTAACGCGGAACAGTTTTATCAGTATCAACCCACTG AAATCATTCTTTCCGAAGGCCAACTGGTGGATAGCCTGGGGAACGGTGT TGCTGGCGTTGACTACTACACCAATTCAGGCCGTGGCGTAACTGACGAA AACGGTAAATTTTCCTTTAGCTGGGGCGAAACCATCTCCTTTGGTATCGA TACCTTTGAACTGGGCTCAGTACGTGGCAATAAGTCGACCATTGCGCTG ACTGAATTGGGTGATGAAGTTCGCGGGGCAAATATCGATCAGCTCATTC ATCGTTATTCGACGACTGGTCAAAATAATACTCGTGTTGTTCCGGACGAT GTACGCAAGGTCTTTGCCGAATATCCCAACGTGATCAACGAGATAATCAA TCTTTCGTTATCCAACGGTGCGACGCTGGATGAAGGCGATCAAAACGTT GTGCTGCCTAACGAATTTATCGAGCAGTTTAAGACGGGTCAGGCCAAAG AGATCGATACCGCGATTTGTGCGAAAACCGACGGTTGTAACGAGGCTCG CTGGTTCTCGCTGACAACGCGCAATGTTAATGACGGCCAGATTCAGGGC GTTATTAACAAGCTGTGGGGCGTGGATACGAACTATCAGTCTGTCAGCA AGTTCCACGTCTTCCATGACTCTACCAACTTCTATGGCAGCACCGGTAAC GCGCGCGGTCAGGCGGTGGTAAATATCTCCAACTCGGCATTCCCGATTC TGATGGCGCGTAATGATAAAAACTACTGGCTGGCGTTTGGCGAAAAACG CGCCTGGGATAAAAATGAGCTGGCGTACATTACGGAAGCGCCTTCCATT GTGC AGCCAGAGAACGTTACGCGCGATACTGCGACTTTCAACCTGCCGT TTATTTCGCTGGGGCAAGTCGGTGAAGGCAAACTGATGGTTATCGGTAA CCCGCACTACAACAGCATCCTGCGTTGCCCGAACGGTTACAGTTGGGGC GGTGGTGTTAATAGTAAAGGTGAGTGTACGCTCAGCGGTGATTCTGATG ACATGAAGCACTTTATGCAGAACGTACTGCGCTACTTGTCAAATGACATC TGGCAGCCAAATACCAAGAGCATCATGACTGTCGGCACCAACCTGGAGA ACGTTTATTTCAAAAAAGCGGGCCAGGTATTGGGAAATAGTGCACCATTT GCTTTCCATGAGGATTTCACTGGTATCACGGTTAAACAGTTGACCAGCTA TGGCGATCTGAATCCGGAAGAGATTCCGTTGCTGATCCTCAACGGCTTT GAATATGTGACTCAGTGGTCTGGCGATCCCTATGCTGTGCCTCTGCGTG CAGATACCAGCAAACCGAAGCTGACTCAGCAGGATGTGACCGATCTGAT CGCTTATCTGAACAAAGGTGGCTCGGTGCTGATCATGGAAAACGTGATG AGCAATCTTAAGGAAGAGAGCGCGTCCAGTTTTGTGCGTCTGCTGGATG CCGCGGGTCTGTCAATGGCTCTGAACAAATCGGTGGTGAACAACGATCC GCAAGGGTATCCGGATCGCGTTCGTCAGCGTCGCGCGACTGGCATTTG GGTTTATGAACGTTATCCTGCTGCAGACGGCGCGCAACCGCCGTACACC ATCGACCCAAATACAGGGGAAGTGACCTGGAAATACCAGCAAGACAACA AGCCTGATGACAAGCCGAAACTGGAAGTTGCGAGCTGGCAGGAGGAAG TTGAGGGCAAACAGGTAACGCGTTATGCCTTTATTGATGAAGCGGAATAC ACAACAGAAGAATCTCTGGAAGCGGCAAAGGCAAAAATCTTTGAGAAGTT TCCTGGGTTACAGGAGTGTAAGGACTCGACTTACCATTACGAGATTAACT GTTTGGAGCGCCGCCCAGGCACGGATGTTCCGGTAACAGGTGGCATGT ATGTTCCGCGCTATACGCAACTGAATCTTGACGCCGACACCGCGAAAGC GATGGTGCAGGCGGCGGATTTAGGCACCAACATTCAGCGCCTGTATCAG CATGAGCTTTATTTCCGTACCAAAGGCAGTAAAGGTGAGCGTCTGAACA GTGTTGATCTGGAACGTCTGTACCAGAACATGTCGGTCTGGCTGTGGAA CGATACGAAATATCGTTACGAAGAGGGCAAGGAAGATGAGCTGGGCTTT AAAACGTTCACCGAGTTCCTGAACTGCTACGCCAATGATGCCTATGCAG GCGGCACCAAGTGCTCCGCAGATCTGAAAAAATCGCTGGTCGATAACAA CATGATCTACGGTGACGGTAGCAGCAAAGCGGGCATGATGAACCCAAGC TATCCGCTCAACTATATGGAAAAACCGCTGACGCGTCTGATGCTGGGCC GTTCCTGGTGGGATCTGAACATTAAGGTTGATGTGGAGAAGTACCCAGG ATCCGTATCGGCAAAGGGTGAGAGCGTTACGGAAAACATCAGCCTGTAC TCGAATCCGACCAAATGGTTTGCGGGTAACATGCAGTCAACCGGCCTGT GGGCACCGGCCCAGCAGGACGTCACCATTAAGTCTTCGGCGTCAGTCC CAGTGACTGTTACCGTGGCGCTGGCTGACGACCTGACTGGACGTGAGA AGCATGAAGTTGCGCTGAACCGTCCGCCAAGAGTGACTAAAACGTATAC TCTGGAGGCTAACGGTGAAGTGACCTTCAAGGTGCCTTATGGTGGTCTG ATTTATATCAAGGGCGACAGTAAGGATGATGTTTCTGCTAACTTCACCTTT ACCGGTGTAGTAAAAGCGCCGTTCTATAAAGACGGCGAATGGAAAAACG ATCTGGACTCACCGGCGCCGCTGGGCGAGCTGGAGTCTGCGTCGTTCG TCTATACCACGCCGAAGAAGAACCTTGAGGCCAGCAATTTCACTGGTGG TGTAGCAGAATTCGCTAAAGATCTGGATACCTTTGCCAGCTCGATGAATG ACTTCTACGGTCGTAATGATGAAGACGGTAAGCACCGGATGTTTACCTAT AAAAACTTGACGGGGCACAAGCATCGTTTCACCAACGATGTGCAGATCT CCATCGGTGATGCGCACTCGGGTTATCCGGTAATGAACAGCAGCTTCTC GACGAACAGCACCACGCTGCCGACGACGCCGCTGAACGACTGGCTGAT TTGGCACGAAGTCGGTCATAACGCTGCAGAAACACCGCTGAACGTACCG GGTGCAACTGAAGTGGCGAACAACGTGCTGGCGCTGTACATGCAGGAT CGCTATCTCGGTAAGATGAACCGTGTCGCTGACGACATTACCGTCGCGC CGGAATATCTGGACGAGAGCAACGGTCAGGCCTGGGCGCGCGGCGGT GCGGGTGACCGTCTGCTGATGTACGCACAGTTGAAGGAGTGGGCAGAG GAAAACTTTGATATCAAACAGTGGTATCCAGATGGTGAGCTGCCTAAGTT CTACAGCGATCGTAAAGGGATGAAGGGCTGGAACCTGTTCCAGTTGATG CACCGTAAAGCGCGCGGCGATGATGTTGGTAACAGCACCTTTGGTGGCA AGAATTACTGTGCTGAATCCAATGGTAACGCTGCCGACACGCTGATGCT GTGTGCATCCTGGGTCGCTCAGGCGGATCTTTCGGAATTCTTTAAGAAAT GGAATCCGGGTGCAAGTGCTTACCAGTTGCCGGGAGCAACGGAGATGA GTTTCCAGGGCGGTGTGAGCTCTTCGGCTTACAGCACGCTGGCGTCACT CAAGCTGCCGAAACCGGAAAAAGGGCCGGAAACCATTAACAAGGTTACC GAGCATAAGATGTCTGCCGAGTAA SEQ ID NO: 2 MSLALLMNKKFKYKKSLLAAILSATLLAGCDGGGSGSSSDTPSV DSGSGTLPEVKPDPTPTPEPTPEPTPDPEPTPDPTPDPEPTPEPEPEPVPTKT GYLTLGGSQRVTGATCNGESSDGFTFTPGNTVSCWGSTTIATFNTQSEAA RSLRAVDKVSFSLEDAQELANSENKKTNAISLVTSSDSCPADAEQLCLTFS SWDRARFEKLYKQIDLATDNFSKLVNEEVENNAATDKAPSTHTSTWPVT TEGTKPDLNASFVSANAEQFYQYQPTEIILSEGQLVDSLGNGVAGVDYYTN SGRGVTDENGKFSFSWGETISFGIDTFELGSVRGNKSTIALTELGDEVRGA NIDQLIHRYSTTGQNNTRWPDDVRKVFAEYPNVINEIINLSLSNGATLDEG DQNWLPNEFIEQFKTGQAKEIDTAICAKTDGCNEARWFSLTTRNVNDGQI QGVINKLWGVDTNYQSVSKFHVFHDSTNFYGSTGNARGQAWNISNSAFPI LMARNDKNYWLAFGEKRAWDKNELAYITEAPSIVQPENVTRDTATFNLPFI SLGQVGEGKLMVIGNPHYNSILRCPNGYSWGGGVNSKGECTLSGDSDDM KHFMQNVLRYLSNDIWQPNTKSIMTVGTNLENVYFKKAGQVLGNSAPFAF HEDFTGITVKQLTSYGDLNPEEIPLLILNGFEYVTQWSGDPYAVPLRADTSK PKLTQQDVTDLIAYLNKGGSVLIMENVMSNLKEESASSFVRLLDAAGLSMA LNKSWNNDPQGYPDRVRQRRATGIWVYERYPAADGAQPPYTIDPNTGEVT WKYQQDNKPDDKPKLEVASWQEEVEGKQVTRYAFIDEAEYTTEESLEAAK AKIFEKFPGLQECKDSTYHYEINCLERRPGTDVPVTGGMYVPRYTQLNLDA DTAKAMVQAADLGTNIQRLYQHELYFRTKGSKGERLNSVDLERLYQNMSV WLWNDTKYRYEEGKEDELGFKTFTEFLNCYANDAYAGGTKCSADLKKSLV DNNMIYGDGSSKAGMMNPSYPLNYMEKPLTRLMLGRSWWDLNIKVDVEK YPGSVSAKGESVTENISLYSNPTKWFAGNMQSTGLWAPAQQDVTIKSSASV PVTVTVALADDLTGREKHEVALNRPPRVTKTYTLEANGEVTFKVPYGGLIYI KGDSKDDVSANFTFTGWKAPFYKDGEWKNDLDSPAPLGELESASFVYTT PKKNLEASNFTGGVAEFAKDLDTFASSMNDFYGRNDEDGKHRMFTYKNL TGHKHRFTNDVQISIGDAHSGYPVMNSSFSTNSTTLPTTPLNDWLIWHEVG HNAAETPLNVPGATEVANNVLALYMQDRYLGKMNRVADDITVAPEYLDES NGQAWARGGAGDRLLMYAQLKEWAEENFDIKQWYPDGELPKFYSDRKG MKGWNLFQLMHRKARGDDVGNSTFGGKNYCAESNGNAADTLMLCASWV AQ AD LS EFFKKWN PGAS AY Q LPG ATEM SFQGG VS S S AY STLAS LKLPKPE KGPETINKVTEHKMSAE SEQ ID NO: 3 MNKKFKYKKSLLAAILSATLLAGCDGGGSGSSSDTPPVDSGTGS LPEVKPDPTPNPEPTPEPTPDPEPTPEPTPDPEPTPEPEPEPVPTKTGYLTLG 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LPTTPLNDWLIWHEVGHNAAETPLNVPGATEVANNVLALYMQDRYLGKMN RVADDITVAPEYLDESNGQAWARGGAGDRLLMYAQLKEWAEENFDIKQW YPDGELPKFYSDRKGMKGWNLFQLMHRKARGDDVSNDKFGGRNYCAES NGNAADTLMLCASWVAQADLSEFFKKWNPGANAYQLPGASEMSFEGGVS QSAYNTLAAMHLSKPEKGPETINKVTEYSMPAE *

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Polipeptide immunogenico comprendente un frammento di una proteina AcfD di E. coli in cui il frammento contiene una delezione relativa alla proteina AcfD di E. coli che incrementa la solubilit? del frammento se paragonato alla proteina di lunghezza intera ed in cui il frammento scatena in un soggetto una risposta immunitaria sostanzialmente analoga a quella scatenata dalla proteina di AcfD di E. coli.
2. 2. Polipeptide immunogenico secondo la rivendicazione 1, in cui la proteina AcfD di E. Coli ha una sequenza amminoacidica selezionata dal gruppo costituito da SEQ ID NO:2-16.
3. 3. Polipeptide immunogenico secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui la delezione ? la rimozione di sostanzialmente tutti gli amminoacidi N-terminali fino al linker di gly-ser, la rimozione di tutta o di una parte della ripetizione ricca in prolina N-terminale, o entrambe.
4. 4. Polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui il frammento polipeptidico immunogenico comprende una sequenza amminoacidica che comprende: (a) la sequenza amminoacidica selezionata dal gruppo consistente di SEQ ID NO 99 a 128; (b) da 1 a 10 alterazioni di singolo amminoacido rispetto a SEQ ID NO: 99 a 128; (c) almeno un?identit? di sequenza del 85% ad una qualsiasi delle SEQ ID NO: 99 a 128; (d) un frammento di almeno 10 amminoacidi consecutivi di una qualsiasi delle SEQ ID NO: 99 a 128; e/o (e) quando allineato con una qualsiasi di SEQ ID NO: da 99 a 128 utilizzando un algoritmo di allineamento a due a due, ciascuna finestra di movimento di x aminoacidi dal N-terminale al C-terminale ha almeno x ? y amminoacidi allineati identici, dove x ? 30 ed y ? 0,75.
5. 5. Polipeptide immunogenico comprendente una sequenza amminoacidica che comprende: (a) la sequenza amminoacidica selezionata dal gruppo costituito da SEQ ID NO da 99 a 128; (b) da 1 a 10 alterazioni di singolo amminoacido in confronto a SEQ ID NO: da 3 a 16; (c) almeno un?identit? di sequenza del 85% ad una qualsiasi delle SEQ ID NO: da 3 a 16; (d) un frammento di almeno 10 amminoacidi consecutivi di una qualsiasi delle SEQ ID NO: da 3 a 16; e/o (e) quando allineato con una qualsiasi di SEQ ID NO: da 3 a 16 utilizzando un algoritmo di allineamento a due a due, ciascuna finestra di movimento di x aminoacidi dal N-terminale al C-terminale ha almeno x ? y amminoacidi allineati identici, dove x ? 30 ed y ? 0,75. in cui il frammento ha una solubilit? incrementata se paragonato alla proteina di lunghezza completa e scatena una risposta immunitaria sostanzialmente simile a quella scatenata dalla proteina di lunghezza intera nativa.
6. 6. Polipeptide immunogenico secondo la rivendicazione 5, in cui la proteina nativa di lunghezza intera ? stata selezionata dal gruppo costituito dalla sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:2-16.
7. 7. Polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 in cui il frammento polipeptidico immunogenico ? isolato, purificato, o ricombinante.
8. 8. Polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7 comprendente inoltre un adiuvante.
9. 9. Polinucleotide codificante per il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6.
10. 10. Cellula di E. coli contenente un plasmide che codifica per il polipeptide immunogenico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6.