CN102119217A - 用于核酸递送的新型制剂 - Google Patents

用于核酸递送的新型制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN102119217A
CN102119217A CN2009801224134A CN200980122413A CN102119217A CN 102119217 A CN102119217 A CN 102119217A CN 2009801224134 A CN2009801224134 A CN 2009801224134A CN 200980122413 A CN200980122413 A CN 200980122413A CN 102119217 A CN102119217 A CN 102119217A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
nucleic acid
granule
peg
sirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801224134A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102119217B (zh
Inventor
伊恩·麦克拉克伦
爱德华·亚沃尔斯基
基尤·拉姆
劳埃德·B·杰夫斯
洛恩·R·帕默尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wild strawberry bio pharmaceutical company
Original Assignee
Protiva Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41198741&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN102119217(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Protiva Biotherapeutics Inc filed Critical Protiva Biotherapeutics Inc
Publication of CN102119217A publication Critical patent/CN102119217A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102119217B publication Critical patent/CN102119217B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07JSTEROIDS
    • C07J9/00Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/32Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供包含一种或多种活性剂或治疗剂的新型稳定的脂质颗粒,制备所述脂质颗粒的方法,和递送和/或施用所述脂质颗粒的方法。更具体地,本发明提供包含核酸(诸如一种或多种干扰RNA)的稳定核酸-脂质颗粒(SNALP),制备SNALP的方法,和递送和/或施用SNALP的方法。

Description

用于核酸递送的新型制剂
相关申请的交叉参考
本申请要求于2008年4月15日递交的的美国临时申请号61/045,228的优先权,为了所有目的将其公开内容通过引用全部结合于此。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是进化保守过程,其中双链RNA(dsRNA)的识别最终导致基因表达的转录后抑制。该抑制由短dsRNA,也称为小干扰RNA(siRNA)介导,其通过互补碱基配对诱导mRNA的特异性降解。在若干模型系统中,这种天然反应已经被开发为用于研究基因功能的有力工具(参见,例如,Elbashir等,Genes Dev.(基因发育),15:188-200(2001);Hammond等,Nat.Rev.Genet.(自然遗传学综述),2:110-119(2001))。更近期,发现将合成的21个核苷酸的dsRNA双链体引入哺乳动物细胞可以有效沉默基因表达。
尽管精确机制尚不清楚,但是RNAi提供潜在的新方法,以下调或沉默目的基因的转录和翻译。例如,需要调节(例如,减小)某些基因的表达,从而治疗肿瘤性疾病诸如癌症。还需要沉默与肝疾病和功能障碍诸如肝炎有关的基因的表达。还需要减小某些基因的表达,从而治疗动脉粥样硬化及其表现,例如,高胆固醇血症,心肌梗塞,和血栓形成。
为了使RNAi在治疗上有效,需要安全有效的核酸递送系统。病毒载体是相对有效的基因递送系统,但是受到多种局限,诸如回复突变至野生型的可能性以及免疫应答问题。结果,非病毒递送系统受到越来越多的关注(Worgall等,Human Gene Therapy,8:37(1997);Peeters等,Human Gene Therapy(人类基因治疗),7:1693(1996);Yei等,Gene Therapy (基因治疗),1:192(1994);Hope等,Molecular Membrane Biology(分子膜生物学),15:1(1998))。此外,病毒系统从循环中迅速清除,从而将转染限制到“首过(first-pass)”器官诸如肺、肝和脾。另外,这些系统诱导危害随后多次注射进行的递送的免疫反应。
质粒DNA-阳离子脂质体复合物目前是最普遍使用的非病毒基因递送载体(Felgner,Scientific American(科学美国),276:102(1997);Chonn等,Current Opinion in Biotechnology (当前生物技术观点),6:698(1995))。例如,由两性化合物、中性液体、和用于转染昆虫细胞的去污剂制成的阳离子脂质体复合物公开在美国专利号6,458,382中。阳离子脂质体复合物还公开在美国专利申请号20030073640中。
阳离子脂质体复合物是大的不好确定的系统,其不适于全身应用并引起相当大的毒性副作用(Harrison等,Biotechniques (生物技术),19:816(1995);Li等,The Gene(基因),4:891(1997);Tam等,Gene Ther.(基因治疗),7:1867(2000))。作为大的带正电聚集物,脂质体DNA复合物(lipoplex)在体内施用时迅速清除,在首过器官,特别是肺中观察到最高表达水平(Huang等,Nature Biotechnology (自然生物技术),15:620(1997);Templeton 等,Nature Biotechnology (自然生物技术),15:647(1997);Hofland等,Pharmaceutical Research (药物研究),14:742(1997))。
其他脂质体递送系统包括,例如,反胶团、阴离子脂质体、和聚合物脂质体的使用。反胶团公开在美国专利号6,429,200中。阴离子脂质体公开在美国专利公开号20030026831中。结合糊精或甘油-磷酸胆碱聚合物的聚合物脂质体分别公开在美国专利公开号20020081736和20030082103中。
包含用于全身递送的包封的核酸的基因递送系统应该很小(即,小于约100nm直径)并应该在循环中在延长的时间段内保持完整,从而完成至受累组织的递送。这要求高度稳定的、含有耐血清核酸的颗粒,所述颗粒不与血管腔隙的细胞或其他组分相互作用。该颗粒还应该容易地与疾病部位处的靶细胞相互作用,从而促进所需核酸的细胞内递送。
近期的工作已经显示核酸可以包封在小的(例如,约70nm直径)“稳定的质粒-脂质颗粒”(SPLP)中,所述“稳定的质粒-脂质颗粒”由包封在双层脂囊泡中的单质粒组成(Wheeler等,Gene Therapy(基因治疗),6:271(1999))。这些SPLP典型地包含“融合”脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE),低水平的阳离子脂质,并且由于存在聚(乙二醇)(PEG)涂层而在水性介质中稳定。SPLP具有全身的应用性,因为它们在静脉内注射后表现出延长的循环寿命,优先积聚在远处肿瘤部位(这归因于在该区域内增强的血管通透性),并可以在这些肿瘤部位处介导转基因的表达。在静脉内注射含有荧光素酶标记物的SPLP后在肿瘤部位处观察到的转基因表达水平优于使用质粒DNA-阳离子脂质体复合物(lipoplexes)或裸DNA可以获得的水平。
因此,仍然存在着对新型且更加有效的将核酸诸如siRNA引入细胞的方法和组合物的强烈需要。另外,本领域中存在对下调目的基因的表达以治疗或预防疾病和功能障碍诸如癌症和动脉粥样硬化的方法的需要。本发明解决这些和其他需要。
发明概述
本发明提供包含一种或多种活性剂或治疗剂的新型血清-稳定的脂质颗粒,制备所述脂质颗粒的方法,和递送和/或施用所述脂质颗粒的方法(例如,为了治疗疾病或功能障碍)。
在优选的实施方案中,所述活性剂或治疗剂完全包封在脂质颗粒的脂质部分中,从而使脂质颗粒中的活性剂或治疗剂在水溶液中对酶降解,例如通过核酸酶或蛋白酶的酶降解具有抗性。在其他优选实施方案中,所述脂质颗粒对哺乳动物诸如人基本无毒。
在一方面,本发明提供脂质颗粒,其包含:(a)一种或多种活性剂或治疗剂;(b)一种或多种阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约50mol%-约85mol%;(c)一种或多种非-阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约13mol%-约49.5mol%;和(d)一种或多种抑制颗粒聚集的缀合脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约0.5mol%-约2mol%。
更特别地,本发明提供血清-稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP),其包含核酸(例如,一种或多种干扰RNA分子诸如siRNA,aiRNA,和/或miRNA),制备SNALP的方法,和递送和/或施用SNALP的方法(例如,为了治疗疾病或功能障碍)。
在某些实施方案中,核酸-脂质颗粒(例如,SNALP)包含:(a)核酸(例如,干扰RNA);(b)阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约50mol%-约85mol%;(c)非-阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约13mol%-约49.5mol%;和(d)抑制颗粒聚集的缀合脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约0.5mol%-约2mol%。
在一个优选的实施方案中,核酸-脂质颗粒(例如,SNALP)包含:(a)siRNA;(b)阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约56.5mol%-约66.5mol%;(c)胆固醇或其衍生物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约31.5mol%-约42.5mol%;和(d)PEG-脂质缀合物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约1mol%-约2mol%。该核酸-脂质颗粒的优选实施方案通常在本文中称为“1∶62”制剂。
在另一个优选实施方案中,核酸-脂质颗粒(例如,SNALP)包含:(a)siRNA;(b)阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约52mol%-约62mol%;(c)磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约36mol%-约47mol%;和(d)PEG-脂质缀合物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约1mol%-约2mol%。该核酸-脂质颗粒的优选实施方案通常在本文中称为“1∶57”制剂。
本发明还提供药物组合物,其包含本文中所述的脂质颗粒(例如,SNALP)和药用载体。
在另一方面,本发明提供用于将活性剂或治疗剂(例如,核酸)引入细胞的方法,所述方法包括使所述细胞与本文中所述的脂质颗粒诸如核酸-脂质颗粒(例如,SNALP)相接触。
在另一方面,本发明提供用于体内递送活性剂或治疗剂(例如,核酸)的方法,所述方法包括对哺乳动物受试者施用本文中所述的脂质颗粒诸如核酸-脂质颗粒(例如,SNALP)。
在另一个方面,本发明提供用于在需要治疗的哺乳动物受试者中治疗疾病或功能障碍的方法,所述方法包括对所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的本文中所述的脂质颗粒诸如核酸-脂质颗粒(例如,SNALP)。
由以下详细描述和附图,本领域中的技术人员应该清楚本发明的其他目的、特性、和优势。
附图简述
图1图示证明含有Eg5 siRNA的1∶57 SNALP在人结肠癌细胞系中的活性的数据。
图2图示证明含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP在小鼠中静脉内施用后的活性的数据。
图3图示证明含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP在小鼠中静脉内施用后的活性的其他数据。每个棒代表5只动物的组平均值。误差棒表示标准差。
图4图示证明含有ApoB siRNA的1∶57和1∶62 SNALP在小鼠中静脉内施用后的活性的数据。
图5图示证明含有ApoB siRNA的1∶62 SNALP在小鼠中静脉内施用后的活性的数据。
图6图示证明由柠檬酸盐缓冲液对比PBS直接稀释法制备的含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP的耐受性在血液临床化学参数方面无显著区别的数据。
图7图示证明由齿轮泵制备的含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP的功效与由注射器按压制备的相同SNALP相似的数据。
图8图示证明在施用含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP后24小时对体重的影响非常小的数据。
图9图示证明在施用含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP后不存在明显血小板计数改变的数据。
图10图示证明在含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP的特定药物剂量下发生的临床上显著的肝酶升高(3xULN)的数据。
图11图示证明在测试药物剂量下含有ApoB siRNA的较低脂质∶药物(L∶D)1∶57 SNALP的功效与较高L∶D SNALP相同的数据。
图12图示证明ApoB蛋白和总胆固醇水平被处于6∶1输入L∶D比率(最终比率为7∶1)的含有ApoB siRNA的1∶57 SNALP和处于9∶1输入L∶D比率(最终比率为10∶1)的1∶57 SNALP降低至相似程度的数据。
图13图示证明具有靶向PLK-1的siRNA的1∶57 SNALP的治疗方案在具有Hep3B肝肿瘤的小鼠中被充分耐受而没有明显的治疗相关毒性的征象的数据。
图14图示证明使用含有PLK-1 siRNA的1∶57 SNALP的治疗导致具有Hep3B肝肿瘤的小鼠存活显著增加的数据。
图15图示证明使用含有PLK-1 siRNA的1∶57 SNALP的治疗在SNALP施用后24小时在小鼠内生长的肝内Hep3B肿瘤中降低PLK-1 mRNA水平50%的数据。
图16图示证明在用含有PLK-1 siRNA的1∶57 SNALP处理的小鼠中可通过5’RACE-PCR检测到PLK-1 mRNA的特异性分裂产物的数据。将10μl PCR产物/孔加样到1.5%琼脂糖凝胶上。泳道号:(1)分子量(MW)标记物;(2)PBS小鼠1;(3)PBS小鼠2;(4)PBS小鼠3;(5)Luc SNALP小鼠1;(6)Luc SNALP小鼠2;(7)PLK SNALP小鼠1;(8)PLK SNALP小鼠2;(9)PLKSNALP小鼠3;和(10)无模板对照。
图17图示证明对照(Luc)1∶57 SNALP-处理的小鼠在Hep3B中表现出正常有丝分裂(上图),而用含有PLK-1 siRNA的1∶57 SNALP处理的小鼠在Hep3B肿瘤中表现出许多异常有丝分裂和肿瘤细胞凋亡(下图)的数据。
图18图示证明多剂量的含有PEG-cDSA的1∶57 PLK-1 SNALP诱导已形成的Hep3B皮下(S.C.)肿瘤的消退的数据。
图19图示证明在单次静脉内SNALP施药后在S.C.Hep3B肿瘤中利用1∶57PLK SNALP引起的PLK-1 mRNA沉默的数据。
图20图示证明PLK-1 PEG-cDSA SNALP抑制大S.C.Hep3B肿瘤生长的数据。
图21图示证明Hep3B肝内肿瘤中的肿瘤来源的PLK-1 mRNA沉默的数据。
图22图示证明含有PEG-cDMA或PEG-cDSA的1∶57 PLK-1 SNALP的血清清除曲线的数据。
发明详述
I.介绍
本发明部分地基于这样的惊人发现,即包含约50mol%-约85mol%阳离子脂质,约13mol%-约49.5mol%非-阳离子脂质,和约0.5mol%-约2mol%脂质缀合物的脂质颗粒在用于体外或体内递送活性剂,诸如治疗性核酸(例如,干扰RNA)时提供一些优势。具体地,如本文中的实施例所举例说明地,本发明提供稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP),其有利地赋予被包封核酸(例如,干扰RNA诸如siRNA)增加的活性和提高该制剂的体内耐受性,由此导致治疗指数与以前所述的核酸-脂质颗粒组合物相比的显著增加。另外,本发明的SNALP在循环中是稳定的,例如,在血清中对由核酸酶引起的降解具有抗性,并且对哺乳动物诸如人基本无毒性。作为非限制性实例,实施例4的图3显示本发明的一个SNALP实施方案(“1∶57SNALP”)与以前所述的核酸-脂质颗粒(“2∶30 SNALP”)相比,在10倍的更低剂量下以10倍的有效性介导靶基因沉默。类似地,实施例3的图2显示“1∶57 SNALP”制剂与以前所述的核酸-脂质颗粒(“2∶40 SNALP”)相比,在沉默靶基因的表达时基本上更为有效。
在某些实施方案中,本发明提供用于递送干扰RNA诸如siRNA分子的改良组合物。具体地,本文中的实施例举例说明本发明的改良脂质颗粒制剂在下调靶基因的mRNA和/或蛋白水平中高度有效。此外,本文中的实施例举例说明一定摩尔比的脂质组分的存在导致本发明的这些脂质颗粒制剂的提高或增强的活性。例如,本文中所述的“1∶57 SNALP”和“1∶62SNALP”制剂是特别有利的本发明的示范性制剂,因为它们在体内提供提高的功效和耐受性是血清-稳定的,是基本无毒的,能够进入血管外部位,且能够到达靶细胞群。
本发明的脂质颗粒和组合物可以用于许多目的,包括体外和体内递送缔合的或包封的治疗剂至细胞。因此,本发明提供用于在需要治疗的受试者中治疗疾病或功能障碍的方法,其通过使所述受试者与本文中所述的包含一种或多种合适治疗剂的脂质颗粒相接触实现。
本发明的脂质颗粒的不同示范性实施方案,以及包含所述脂质颗粒的组合物和制剂,和它们递送治疗和调节靶基因和蛋白表达的应用,在下文中进一步详细描述。
II.定义
用于本文中时,除非另外指明,以下术语具有属于其本身的含义。
术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”指这样的单链RNA (例如,成熟miRNA)或双链RNA(即,双链体RNA诸如siRNA,aiRNA,或前-miRNA),其在当干扰RNA与靶基因或序列处于相同细胞中时,能够降低或抑制该靶基因或序列的表达(例如,通过介导降解和抑制与干扰RNA序列互补的mRNA的翻译)。干扰RNA因此指与靶mRNA序列互补的单链RNA或由两条互补链或由单条自身互补链形成的双链RNA。干扰RNA可以与靶基因或序列具有基本或完全的同一性,或可以包括错配区(即,错配基序)。干扰RNA的序列可以与全长靶基因或其子序列相对应。
干扰RNA包括“小-干扰RNA”或“siRNA,”例如,长度约15-60,15-50,或15-40个(双链体)核苷酸,更典型长度约15-30,15-25,或19-25个(双链体)核苷酸,和优选长度约20-24,21-22,或21-23个(双链体)核苷酸的干扰RNA(例如,双链siRNA的每条互补链序列是长度15-60,15-50,15-40,15-30,15-25,或19-25个核苷酸,优选长度约20-24,21-22,或21-23个核苷酸,且双链siRNA是长度约15-60,15-50,15-40,15-30,15-25,或19-25个碱基对,优选长度约18-22,19-20,或19-21个碱基对)。siRNA双链体可以包括约1-约4个核苷酸或约2-约3个核苷酸的3’突出端和5’磷酸末端。siRNA的实例包括,但不仅限于,由两个单独的链分子装配的双链多核苷酸分子,其中一条链是有义链且另一条是互补的反义链;由单链分子装配的双链多核苷酸分子,其中有义区和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头相连;含有具有自互补有义区和反义区的发夹二级结构的双链多核苷酸分子;和含有有两个以上环结构和具有自互补有义区和反义区的茎部的环形单链多核苷酸分子,其中所述环形多核苷酸可以在体内或体外加工以生成活性双链siRNA分子。
优选地,siRNA是化学合成的。siRNA还可以通过使用大肠杆菌(E.coli)RNA酶III或Dicer裂解较长的dsRNA(例如,长度大于约25个核苷酸的dsRNA)来产生。这些酶将dsRNA加工为生物活性siRNA(参见,例如,Yang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),99:9942-9947(2002);Calegari等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),99:14236(2002);Byrom等,Ambion TechNotes(Ambion技术手册),10(1):4-6(2003);Kawasaki等,Nucleic Acids Res.(核酸研究),31:981-987(2003);Knight等,Science(科学),293:2269-2271(2001);和Robertson等,J.Biol.Chem(生物化学杂志).,243:82(1968))。优选地,dsRNA长度是至少50个核苷酸-约100,200,300,400,或500个核苷酸。dsRNA长度可以长达1000,1500,2000,5000个核苷酸或更长。dsRNA可以编码完整基因转录物或部分基因转录物。在某些实例中,siRNA可以由质粒来编码(例如,转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列)。
用于本文中时,术语“错配基序”或“错配区”指干扰RNA(例如,siRNA,aiRNA,miRNA)序列的一部分,该部分与其靶序列不具有100%的互补性。干扰RNA可以具有至少1、2、3、4、5、6、或更多个错配区。错配区可以是连续的或可以被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸分开。错配基序或错配区可以包括单核苷酸或可以包括2、3、4、5、或更多个核苷酸。
活性剂或治疗剂诸如干扰RNA的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生所需作用,例如,与在缺少干扰RNA条件下检测的正常表达水平相比抑制靶序列表达的量。使用干扰RNA获得的值相对于对照为约90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或0%时实现靶基因或靶序列表达的抑制。用于测量靶基因或靶序列表达的合适测定包括,例如,利用本领域中技术人员已知的技术检验蛋白或RNA水平,诸如点印迹、northern印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能、以及本领域中技术人员已知的表型测定。
通过干扰RNA“减小(decrease),”“减小(decreasing),”“降低(reduce),”或“降低(reducing)”免疫应答意指针对给定干扰RNA(例如,修饰的干扰RNA)的免疫应答的可检测到的减小。由修饰的干扰RNA引起的免疫应答的减小量可以相对于存在未修饰的干扰RNA的条件下的免疫应答水平来确定。可检测到的减小可以是比在存在未修饰的干扰RNA的条件下检测到的免疫应答低约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%,或更多。针对干扰RNA的免疫应答的减小典型地通过在体外由效应器细胞引起的细胞因子产量(例如,IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6或IL-12)减少或施用干扰RNA后哺乳动物受试者血清内细胞因子产量减少来测量。
用于本文中时,术语“效应器细胞”指在与免疫刺激性干扰RNA诸如未修饰的siRNA接触时产生可检测到的免疫应答的细胞,优选哺乳动物细胞。示范性效应器细胞包括,例如,树突细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞(PBMCs)、脾细胞等。可检测到的免疫应答包括,例如,产生细胞因子或生长因子诸如TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TGF及其组合。
“基本同一性”指在严格条件下与参考序列杂交的序列,或在参考序列特定区域范围内具有特定百分比同一性的序列。
短语“严格杂交条件”指这样的条件,在该条件下,核酸会与其靶序列杂交,典型地在核酸的复杂混合物中,但不与其他序列杂交。严格条件是序列依赖性的且在不同环境中应该不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导参见Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes(生物化学和分子生物学技术—使用核探针的杂交),“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(杂交原则和核酸测定策略综述)”(1993)。通常,严格条件被选择为在确定的离子强度pH下,比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm是这样的温度(在确定的离子强度、pH、和核浓度下),在所述温度下,50%与靶标互补的探针在平衡时与靶序列杂交(因为靶序列在Tm下过量存在,50%的探针在平衡时被占用)。严格条件还可以通过加入去稳定剂诸如甲酰胺来获得。为了选择性或特异性杂交,阳性信号是本底的至少2倍,优选是本底杂交的10倍。
示范性严格杂交条件可以如下所示:50%甲酰胺,5x SSC,和1%SDS,在42℃温育,或,5x SSC,1%SDS,在65℃温育,并在0.2x SSC,和0.1%SDS中65℃清洗。关于PCR,约36℃的温度典型地用于低严格性扩增,尽管退火温度可以取决于引物长度在约32℃和48℃之间变化。对于高严格性PCR扩增,约62℃的温度是典型的,尽管高严格性退火温度可以取决于引物长度和特异性在约50℃至65℃的范围内变化。高和低严格性扩增二者的典型循环条件包括90℃-95℃30秒-2分钟的变性阶段,持续30秒-2分钟的退火阶段,和约72℃1-2min的延伸阶段。关于低和高严格性扩增反应的试验技术和指导提供在,例如,Innis等,PCR Protocols(PCR试验技术),A Guide to Methods and Applications(方法和应用指导),Academic Press,Inc.(学术出版社公司)N.Y.(1990)中。
在严格条件下不彼此杂交的核酸仍然基本上相同,条件是它们的编码的多肽基本上相同。这发生在,例如,当利用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时。在这样的情形中,核酸典型地在中等严格杂交条件下杂交。示范性“中等严格杂交条件”包括在40%甲酰胺,1M NaCl,1%SDS的缓冲液中37℃杂交,和在1X SSC中45℃清洗。阳性杂交是本底的至少2倍。普通技术人员应该容易地认识到备选的杂交和清洗条件可以用于提供相似严格性的条件。关于确定杂交参数的其他指导提供在许多参考文献,例如,Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学试验技术),Ausubel等编,中。
术语“基本上相同”或“基本同一性”在两个或更多核酸的上下文中指当通过使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测测量时在比较窗,或指定区域范围内比较和比对最大对应性时,为相同的或具有特定百分比的相同核苷酸(即,在特定区域范围内至少约60%,优选至少约65%、70%、75%、80%、85%、90%,或95%同一性)的两个或更多个序列或子序列。该定义,在上下文指出时,还类似意指序列的互补体。优选地,基本同一性在长度至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55,或60个核苷酸的区域范围内存在。
为了序列比较,典型地,一个序列起参考序列的作用,测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时,将测试和参考序列输入计算机,如果需要,指定子序列坐标,并且指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数,或可以指定备选的参数。序列比较算法然后可以基于程序参数,计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
“比较窗”,用于本文中时,包括对由选自由以下组成的组中的许多连续位置中任意之一的区段的引用:约5-约60,通常约10-约45,更通常约15-约30,其中序列可以在两个序列最佳比对后与具有相同数目的连续位置的参考序列比较。用于进行比较的序列的比对方法是本领域中公知的。用于进行比较的序列的最佳比对可以,例如,通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.(现代应用方法学),2:482(1981)的局部同源算法,通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol(分子生物学杂志).,48:443(1970)的同源比对算法,通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),85:2444(1988)的相似性搜索方法,通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(遗传学计算机小组),575 Science Dr.,Madison,WI),或通过手动比对和目测(参见,例如,Current Protocols in Molecular Biology (当前分子生物学试验技术),Ausubel等,编.(1995增刊))来执行。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法,其分别记述在Altschul等,Nuc.Acids Res.(核酸研究),25:3389-3402(1977)和Altschul等,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志),215:403-410(1990)中。BLAST和BLAST 2.0使用本文中所述的参数用于确定本发明的核酸的百分比序列同一性。执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共地获得。
BLAST算法也进行两序列之间相似性的统计学分析(参见,例如,Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N)),其提供两核苷酸序列之间会偶然发生匹配的概率指示。例如,如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2,更优选小于约0.01,和最优选小于约0.001时,则认为核酸与参考序列相似。
术语“核酸”用于本文中时,指含有处于单链或双链形式的至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物并且包括DNA和RNA。DNA可以采用下列形式:例如,反义分子、质粒DNA、预浓缩DNA、PCR产物、载体(P1,PAC,BAC,YAC,人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或这些组的衍生物和组合。RNA可以采用下列形式:siRNA、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、和其组合。核酸包括包含已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸,其是合成的、天然存在的、和非天然存在的,且其具有与参考核酸类似的结合特性。所述类似物的实例包括,但不仅限于,硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNAs)。除非特别限定,该术语包括包含具有与参考核酸类似的结合特性的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指明,具体的核酸序列还固有地包括其保守修饰变体(例如,简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP、和互补序列以及明确指出的序列。特别地,简并密码子取代可以通过产生这样的序列实现,在所述序列中,一种或多种所选(或全部)密码子的第三个位置被混合的碱性和/或脱氧肌苷残基(Batzer等,Nucleic Acid Res.(核酸研究),19:5081(1991);Ohtsuka等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志),260:2605-2608(1985);Rossolini等,Mol.Cell.Probes(分子细胞探针),8:91-98(1994))取代。“核苷酸”包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA),碱基,和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶,其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然类似物,以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物,其包括但不限于,放置新的反应基团诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物的修饰。
术语“基因”是指包含用于产生多肽或前体多肽所必需的部分长度或全长编码序列的核酸(例如,DNA或RNA)序列。
“基因产物”用于本文中时,指基因的产物诸如RNA转录物或多肽。
术语“脂质”是指一组有机化合物,其包括但不仅限于脂肪酸的酯,并且特征是在水中不溶,但是在许多有机溶剂中是可溶的。通常将它们分成至少三类:(1)“简单脂质”,其包括脂肪和油以及蜡;(2)“化合物脂质”,其包括磷脂和糖脂;和(3)“衍生的脂质”诸如类固醇。
“脂质颗粒”用于本文中时,指可以用于递送活性剂或治疗剂,诸如核酸(例如,干扰RNA),至目标靶部位的脂质制剂。在本发明的典型由阳离子脂质、非-阳离子脂质、和防止颗粒聚集的结合脂质形成的脂质颗粒中,所述活性剂或治疗剂可以包封在脂质中,由此保护试剂免受酶降解。
用于本文中时,术语“SNALP”指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表由脂质(例如,阳离子脂质,非-阳离子脂质,和防止颗粒聚集的结合脂质)制成的颗粒,其中所述核酸(例如,siRNA,aiRNA,miRNA,ssDNA,dsDNA,ssRNA,短发夹RNA(shRNA),dsRNA,或质粒,包括由其转录干扰RNA的质粒)完全包封在脂质中。用于本文中时,术语“SNALP”包括SPLP,其是用于指代包含包封在脂质中的核酸(例如,质粒)的核酸-脂质颗粒的术语。SNALP和SPLP典型地含有阳离子脂质,非-阳离子脂质,和脂质缀合物(例如,PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP非常有效用于全身应用,因为它们可以在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命,它们可以在积聚在远处部位(例如,身体上与施药部位分开的部位),并且它可以在这些远处部位处介导转染基因的表达或靶基因表达的沉默。SPLP包括“pSPLP”,其包括包封的凝聚剂-核酸复合物,如PCT公开号WO 00/03683中所述,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)典型地具有中位直径约40nm-约150nm,约50nm-约150nm,约60nm-约130nm,约70nm-约110nm,或约70-约90nm,且基本无毒。另外,核酸,在存在于本发明的脂质颗粒中时,在水溶液中对核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开在,例如,美国专利公开号20040142025和20070042031,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
用于本文中时,“脂质包封的”可以指提供完全包封、部分包封、或二者的活性剂或治疗剂,诸如核酸(例如,干扰RNA)的脂质颗粒。在优选的实施方案中,核酸完全包封在脂质颗粒中(例如,以形成SPLP,pSPLP,SNALP,或其他核酸-脂质颗粒)。
术语“脂质缀合物”指抑制脂质颗粒聚集的结合脂质。所述脂质缀合物包括,但不仅限于,聚酰胺低聚物(例如,ATTA-脂质缀合物),PEG-脂质缀合物,诸如与二烷氧基丙基偶联的PEG,与二酰甘油偶联的PEG,与胆固醇偶联的PEG,与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG,与神经酰胺偶联的PEG(参见,例如,美国专利号5,885,613,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的),阳离子PEG脂质,及其混合物。PEG可以与脂质直接缀合或可以通过连接体结构部分与脂质相连。可以使用适合于连接PEG和脂质的任何连接体结构部分,例如不含酯的连接体结构部分和含酯的连接体结构部分。在优选的实施方案中,使用不含酯的连接体结构部分。
术语“两亲性脂质”部分地指任何适合的材料,其中脂质材料的疏水部分定向到疏水相中,而亲水部分定向到水相。亲水性质来自极性或带电基团诸如糖类、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团的存在。疏水性可以通过包含非极性基团而赋予,所述基团包括,但不限于,长链饱和和不饱和脂族烃基和由一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。两亲性化合物的实例包括,但不限于,磷脂、氨基脂和鞘脂类。
磷脂的代表性实例包括,但不限于,磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其它化合物,诸如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰甘油和β-酰氧酸也包括在被称为两亲性脂质的组中。另外,上述的两亲性脂质可与其它脂质混和,所述其他脂质包括甘油三酯类和固醇类。
术语“中性脂质”指在选定的pH值下以不带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质物种中的任何一种。在生理pH值下,这样的脂质包括,例如,二酰磷脂酰胆碱、二酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰甘油。
术语“非阳离子脂质”指任何两亲性脂质以及任何其他中性脂质或阴离子脂质。
术语“阴离子脂质”指在生理pH值下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括,但不限于,磷脂酰甘油、心磷脂、二酰磷脂酰丝氨酸、二酰磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG),和其它与中性脂质连接的阴离子修饰基团。
术语“阳离子脂质”指在选定的pH值,诸如生理pH值(例如,pH为约7.0)下携带净正电荷的许多脂质物种中的任何一种。已经意外地发现,包含具有多个不饱和位点,例如,至少2或3个不饱和位点的烷基链的阳离子脂质特别有效用于形成具有增加的膜流动性的脂质颗粒。也有效用于本发明的许多阳离子脂质和相关类似物已经记述在美国专利公开号20060083780和20060240554;美国专利号5,208,036;5,264,618;5,279,833;5,283,185;5,753,613;和5,785,992;和PCT公开号WO 96/10390中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。阳离子脂质的非限制性实例详细记述在本文中。在一些情形中,阳离子脂质包含可质子化叔胺(例如,可pH滴定的)头基,C18烷基链,所述头基和烷基链之间的醚键,和0至3个双键。这样的脂质包括,例如,DSDMA,DLinDMA,DLenDMA,和DODMA。
术语“疏水性脂质”指具有非极性基团的化合物,所述基团包括,但不限于,长链饱和和不饱和脂族烃基团和任选由一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。合适的实例包括,但不仅限于,二酰甘油,二烷基甘油,N-N-二烷基氨基,1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷,和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
术语“融合的”指脂质颗粒,诸如SNALP与细胞膜融合的能力。所述膜可以是质膜或围绕细胞器的膜,所述细胞器例如,内体、细胞核等。
用于本文中时,术语“水溶液”指全部或部分地包含水的组合物。
用于本文中时,术语“有机脂质溶液”指全部或部分地包含具有脂质的有机溶剂的组合物。
“远处部位,”用于本文中时,指身体上分隔的部位,其不局限于邻近的毛细管床,而是包括遍及生物体广泛分布的部位。
关于核酸-脂质颗粒诸如SNALP的“血清-稳定的”意指该颗粒在暴露于显著降解游离DNA或RNA的血清或核酸酶测定后不显著降解。合适的测定包括,例如,标准血清测定、DNA酶测定或RNA酶测定。
“全身递送”,用于本文中时,指导致活性剂或治疗剂诸如干扰RNA在生物体内广泛生物分布的脂质颗粒递送。一些给药技术可以导致某些试剂,但非其他试剂的全身递送。全身递送意指使有效量,优选治疗量,的试剂暴露于身体的大多数部位。为了获得广泛的生物分布,通常需要这样的血液寿命,即使该试剂在到达远离给药部位的疾病部位之前不迅速降解或清除(诸如被首过器官(肝、肺等)或被迅速的非特异性细胞结合降解或清除)。脂质颗粒的全身递送可以提供本领域中已知的任何方式,包括,例如,静脉内、皮下、和腹膜内来进行。在优选的实施方案中,脂质颗粒的全身递送提供静脉内递送来进行。
“局部递送”,用于本文中时,指将活性剂或治疗剂诸如干扰RNA直接递送至生物体内的靶部位。例如,试剂可以通过直接注射到疾病部位诸如肿瘤或其他靶部位诸如炎症部位或靶器官诸如肝、心脏、胰腺、肾等中而被局部递送。
术语“哺乳动物”指任何哺乳动物物种诸如人、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
术语“癌症”指特征为异常细胞不受控生长的疾病类型的任意成员。该术语包括全部已知的癌症和肿瘤性疾病,无论其特征为恶性的、良性的、软组织、或实体,和全部阶段和级别的癌症包括转移前和后的癌症。不同类型癌症的实例包括,但不仅限于,肺癌(lung cancer)、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、肛门癌(anal cancer)、胆管癌(bile duct cancer)、小肠癌(small intestine cancer)、胃癌(stomach(gastric)cancer)、食道癌(esophageal cancer);胆囊癌(gallbladder cancer)、肝癌(liver cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer),阑尾癌(appendix cancer)、乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌(ovarian cancer);宫颈癌(cervical cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肾癌(renal cancer)(例如,肾细胞癌(renal cell carcinoma))、中枢神经系统的癌症、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、皮肤癌(skin cancer)、淋巴瘤(lymphomas)、绒毛膜癌(choriocarcinomas)、头颈癌(head and neck cancers)、骨源性肉瘤(osteogenic sarcomas)、和血癌(blood cancers)。特殊类型的肝癌的非限制性实例包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)(HCC),继发性肝癌(secondary liver cancer)(例如,由一些其他非-肝癌细胞类型的转移引起的),和肝胚细胞瘤(hepatoblastoma)。用于本文中时,“肿瘤”包括一个或多个癌细胞。
III.实施方案描述
本发明提供包含一种或多种活性剂或治疗剂的新型血清-稳定的脂质颗粒,制备所述脂质颗粒的方法,和递送和/或施用所述脂质颗粒的方法(例如,为了治疗疾病或功能障碍)。
在一方面,本发明提供脂质颗粒,其包含:(a)一种或多种活性剂或治疗剂;(b)一种或多种阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约50mol%-约85mol%;(c)一种或多种非-阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约13mol%-约49.5mol%;和(d)一种或多种抑制颗粒聚集的结合脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约0.5mol%-约2mol%。
在某些实施方案中,所述活性剂或治疗剂完全包封在脂质颗粒的脂质部分中,从而使脂质颗粒中的活性剂或治疗剂在水溶液中对酶降解,例如通过核酸酶或蛋白酶的酶降解具有抗性。在某些其他实施方案中,所述脂质颗粒对哺乳动物诸如人基本无毒。
在一些实施方案中,所述活性剂或治疗剂包括核酸。在某些实例中,核酸包括干扰RNA分子诸如,例如,siRNA,aiRNA,miRNA,或其混合物。在某些其他实例中,核酸包括单链或双链DNA,RNA,或DNA/RNA杂合体诸如,例如,反义寡核苷酸,核酶,质粒,免疫刺激性寡核苷酸,或其混合物。
在其他实施方案中,所述活性剂或治疗剂包括肽或多肽。在某些实例中,所肽或多肽包括抗体诸如,例如,多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段;人源化抗体、重组抗体、重组人抗体、PrimatizedTM抗体、或其混合物。在某些其他实例中,肽或多肽包括细胞因子、生长因子、凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体、配体、激素、小分子(例如,小有机分子或化合物)、或其混合物。
在优选的实施方案中,所述活性剂或治疗剂包括siRNA。在一个实施方案中,siRNA分子包括长度约15-约60个核苷酸(例如,长度约15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个核苷酸,或长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸)的双链区。本发明的siRNA能够体外和/或体内沉默靶序列的表达。
在一些实施方案中,siRNA分子包括至少一个修饰的核苷酸。在某些优选的实施方案中,siRNA分子在双链区内包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个修饰的核苷酸。在某些实例中,siRNA在双链区内包括约1%-约100%(例如,约1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)的修饰的核苷酸。在优选的实施方案中,双链区内小于约25%(例如,小于约25%、20%、15%、10%或5%)或约1%-约25%(例如,约1%-25%、5%-25%、10%-25%、15%-25%、20%-25%或10%-20%)的核苷酸包括修饰的核苷酸。
在其他实施方案中,siRNA分子包括修饰核苷酸,其包括但不仅限于,2’-O-甲基(2’OMe)核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’F)核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-O-(2-甲氧乙基)(MOE)核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、及其混合物。在优选的实施方案中,siRNA包括2’OMe核苷酸(例如,2’OMe嘌呤和/或嘧啶核苷酸)诸如,例如,2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、2’OMe-腺苷核苷酸、2’OMe-胞嘧啶核苷酸,及其混合物。在某些实例中,siRNA不包括2’OMe-胞嘧啶核苷酸。在其他实施方案中,siRNA包括发夹环结构。
siRNA可以在siRNA分子双链区的一条链(即有义或反义)中或两条链中包含修饰的核苷酸。优选地,尿苷和/或鸟苷核苷酸在siRNA双链体的双链区内的选择性位置处修饰。关于尿苷核苷酸修饰,有义和/或反义链中的至少1、2、3、4、5、6、或更多个尿苷核苷酸可以是修饰的尿苷核苷酸,诸如2’OMe-尿苷核苷酸。在一些实施方案中,有义和/或反义链中的每个尿苷核苷酸是2’OMe-尿苷核苷酸。关于鸟苷核苷酸修饰,有义和/或反义链中的至少1、2、3、4、5、6、或更多个鸟苷核苷酸可以是修饰的鸟苷核苷酸,诸如2’OMe-鸟苷核苷酸。在一些实施方案中,有义和/或反义链中的每个鸟苷核苷酸是2’OMe-鸟苷核苷酸。
在某些实施方案中,siRNA序列中至少1、2、3、4、5、6、7、或更多个5’-GU-3’基序可以,例如,通过引入错配以消除5’-GU-3’基序和/或通过引入修饰的核苷酸诸如2’OMe核苷酸来修饰。5’-GU-3’基序可以在siRNA序列的有义链、反义链或两条链中。5’-GU-3’基序可以彼此邻近或,备选地,它们可以被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸分开。
在一些优选的实施方案中,修饰的siRNA分子比相应的未修饰siRNA序列免疫刺激性更低。在这样的实施方案中,具有降低的免疫刺激性特性的修饰的siRNA分子有利地保持RNAi针对靶序列的活性。在另一个实施方案中,修饰siRNA分子的免疫刺激性特性及其沉默靶基因表达的能力可以通过在siRNA序列内诸如,例如,在siRNA双链体的双链区内引入最小和选择性2’Ome修饰来平衡或最优化。在某些实例中,修饰的siRNA比相应的未修饰siRNA的免疫刺激性低至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,或100%。本领域中技术人员应该容易清楚的是,修饰siRNA分子和相应未修饰siRNA分子的免疫刺激性可以通过,例如,由利用适当的基于脂质的递送系统(诸如本文中公开的SNALP递送系统)在哺乳动物中全身施药或转染哺乳动物效应器细胞后约2-约12小时测量INF-α和/或IL-6水平来确定。
在某些实施方案中,修饰的siRNA分子具有这样的IC50(即,半最大抑制浓度),其小于或等于相应未修饰siRNA的IC50的10倍(即,修饰siRNA具有这样的IC50,其小于或等于相应的未修饰siRNA的IC50的10倍)。在其他实施方案中,修饰siRNA具有这样的IC50,其小于或等于相应的未修饰siRNA序列的IC50的3倍。在其他实施方案中,修饰siRNA具有这样的IC50,其小于或等于相应的未修饰siRNA的IC50的2倍。本领域中技术人员应该容易清楚的是,利用本领域中技术人员已知的方法可以生成剂量-反应曲线并且可以容易地确定修饰siRNA和相应的未修饰siRNA的IC50值。
在再一个实施方案中,修饰siRNA分子,相对于相应的未修饰siRNA序列,能够沉默至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或100%的靶序列表达。
在一些实施方案中,siRNA分子例如,在双链区的有义和/或反义链中不包括磷酸根主链修饰。在其他实施方案中,siRNA例如,在双链区的有义和/或反义链中包括1、2、3、4、或更多个磷酸根主链修饰。在优选的实施方案中,siRNA不包括磷酸根主链修饰。
在进一步的实施方案中,siRNA例如,在双链区的有义和/或反义链中不包括2’-脱氧核苷酸。在进一步的实施方案中,siRNA例如,在双链区的有义和/或反义链中包括1、2、3、4、或更多个2’-脱氧核苷酸。在优选的实施方案中,siRNA不包括2’-脱氧核苷酸。
在某些实例中,有义和/或反义链的双链区的3’-末端处的核苷酸不是修饰的核苷酸。在某些其他实例中,有义和/或反义链的双链区的3’-末端附近的核苷酸(例如,在3’-末端的1、2、3、或4个核苷酸)不是修饰的核苷酸。
本文中所述的siRNA分子可以在双链区的一侧或两侧具有1、2、3、4、或更多个核苷酸的3’突出端,或可以在双链区的一侧或两侧缺少突出端(即,具有平端)。优选地,siRNA在双链区每侧具有2个核苷酸的3’突出端。在某些实例中,反义链的3’突出端具有与靶序列的互补性,且有义链的3’突出端具有与靶序列的互补链的互补性。备选地,3’突出端不具有与靶序列或其互补链的互补性。在一些实施方案中,3’突出端包括1、2、3、4、或更多个核苷酸诸如2’-脱氧(2’H)核苷酸。在某些优选的实施方案中,3’突出端包括脱氧胸苷(dT)和/或尿苷核苷酸。在其他实施方案中,双链区的一侧或两侧上的3’突出端的一个或多个核苷酸包括修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的非限制性实例如上所述,并且包括2’OMe核苷酸、2’脱氧-2’F核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-O-2-MOE核苷酸、LNA核苷酸及其混合物。在优选的实施方案中,siRNA有义和/或反义链上存在的3’突出端中的1、2、3、4、或更多个核苷酸包括2’OMe核苷酸(例如,2’OMe嘌呤和/或嘧啶核苷酸)诸如,例如,2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、2’OMe-腺苷核苷酸、2’OMe-胞嘧啶核苷酸及其混合物。
siRNA可以包括沉默靶基因表达的至少一种(例如,至少2、3、4、5、6、、7、8、9、10或更多种)未修饰和/或修饰的siRNA序列或其混合物。siRNA的混合物可以包括针对一种或多种靶基因的相同区域或结构域(例如,“热点”)和/或针对一种或多种靶基因的不同区域或结构域的序列。在某些实例中,沉默靶基因表达的一种或多种(例如,至少2、3、4、5、6、、7、8、9、10或更多种)修饰的siRNA存在于混合物中。在某些其他实例中,沉默靶基因表达的一种或多种(例如,至少2、3、4、5、6、、7、8、9、10或更多种)未修饰siRNA序列存在于混合物中。
在一些实施方案中,siRNA分子的反义链包括以下序列或由其组成,所述序列与靶序列或其部分至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%互补。在其他实施方案中,siRNA分子的反义链包括与靶序列或其部分100%互补的序列或由其组成。在其他实施方案中,siRNA分子的反义链包括包括与靶序列或其部分特异性杂交的序列或由其组成。
在其他实施方案中,siRNA分子的有义链包括以下序列或由其组成,所述序列与靶序列或其部分至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%,或99%相同。在另外的实施方案中,siRNA分子的有义链包括与靶序列或其部分100%相同的序列或由其组成。
在本发明的脂质颗粒(例如,含有干扰RNAi诸如siRNA的SNALP)中,阳离子脂质可以包括,例如,以下的一种或多种:1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨乙基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-C2-DMA;“XTC2”)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(4-二甲基氨基丁基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-C4-DMA)、2,2-二亚油基-5-二甲基氨基甲基-[1,3]-二噁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-甲基pepiazino-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-MPZ)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-DMA)、1,2-二亚油基氨甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、氯化1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐(DLin-TMA.Cl)、氯化1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羧乙基溴化铵(DMRIE)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)、双十八基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺,顺式-9,12-十八二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺式-9’,1-2’-十八二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)或其混合物。在某些优选的实施方案中,阳离子脂质是DLinDMA、DLin-K-C2-DMA(“XTC2”)或其混合物。
阳离子脂质诸如DLin-K-C2-DMA(“XTC2”)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLin-K6-DMA、和DLin-K-MPZ,以及另外的阳离子脂质的合成记述在2008年10月9日提交的美国临时申请号61/104,212中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。阳离子脂质诸如DLin-K-DMA、DLin-C-DAP、DLin-DAC、DLin-MA、DLinDAP、DLin-S-DMA、DLin-2-DMAP、DLin-TMA.Cl、DLin-TAP.Cl、DLin-MPZ、DLinAP、DOAP、和DLin-EG-DMA,以及另外的阳离子脂质的合成记述在2008年12月31日提交的PCT申请号PCT/US08/88676中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。阳离子脂质诸如CLinDMA,以及另外的阳离子脂质的合成记述在美国专利公开号20060240554中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
在一些实施方案中,阳离子脂质可以占所述颗粒中存在的总脂质的约50mol%-约90mol%、约50mol%-约85mol%、约50mol%-约80mol%、约50mol%-约75mol%、约50mol%-约70mol%、约50mol%-约65mol%或约50mol%-约60mol%。
在其他实施方案中,阳离子脂质可以占所述颗粒中存在的总脂质的约55mol%-约90mol%、约55mol%-约85mol%、约55mol%-约80mol%、约55mol%-约75mol%、约55mol%-约70mol%或约55mol%-约65mol%。
在其他实施方案中,阳离子脂质可以占所述颗粒中存在的总脂质的约60mol%-约90mol%、约60mol%-约85mol%、约60mol%-约80mol%、约60mol%-约75mol%或约60mol%-约70mol%。
在其他实施方案中,阳离子脂质可以占所述颗粒中存在的总脂质的约65mol%-约90mol%、约65mol%-约85mol%、约65mol%-约80mol%或约65mol%-约75mol%。
在其他实施方案中,阳离子脂质可以包括所述颗粒中存在的总脂质的约70mol%-约90mol%、约70mol%-约85mol%、约70mol%-约80mol%、约75mol%-约90mol%、约75mol%-约85mol%或约80mol%-约90mol。
在另外的实施方案中,阳离子脂质可以包括所述颗粒中存在的总脂质的(至少)约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89,或90mol%(或其任意部分或其中的范围)。
在本发明的脂质颗粒(例如,包含干扰RNA诸如siRNA的SNALP)中,非-阳离子脂质可以包括,例如,一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。在优选的实施方案中,非-阳离子脂质包括以下的中性脂质成分之一:(1)胆固醇或其衍生物;(2)磷脂;或(3)磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物。
胆固醇衍生物的实例包括,但不仅限于,胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆固醇基-2’-羟基乙醚、胆固醇基-4’-羟基丁醚、及其混合物。胆固醇基-2’-羟基乙醚的合成记述在本文中。
磷脂可以是中性脂质,其包括,但不仅限于,二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰基-磷脂酰甘油(POPG)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC),及其混合物。在某些优选的实施方案中,磷脂是DPPC、DSPC,或其混合物。
在一些实施方案中,非-阳离子脂质(例如,一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约60mol%、约15mol%-约60mol%、约20mol%-约60mol%、约25mol%-约60mol%、约30mol%-约60mol%、约10mol%-约55mol%、约15mol%-约55mol%、约20mol%-约55mol%、约25mol%-约55mol%、约30mol%-约55mol%、约13mol%-约50mol%、约15mol%-约50mol%或约20mol%-约50mol%。当非-阳离子脂质是磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物的混合物时,该混合物可以占所述颗粒中存在的总脂质的至多-约40、50或60mol%。
在其他实施方案中,非-阳离子脂质(例如,一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约49.5mol%、约13mol%-约49.5mol%、约15mol%-约49.5mol%、约20mol%-约49.5mol%、约25mol%-约49.5mol%、约30mol%-约49.5mol%、约35mol%-约49.5mol%或约40mol%-约49.5mol%。
在其他实施方案中,非-阳离子脂质(例如,一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约45mol%、约13mol%-约45mol%、约15mol%-约45mol%、约20mol%-约45mol%、约25mol%-约45mol%、约30mol%-约45mol%或约35mol%-约45mol%。
在其他实施方案中,非-阳离子脂质(例如、一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约40mol%、约13mol%-约40mol%、约15mol%-约40mol%、约20mol%-约40mol%、约25mol%-约40mol%或约30mol%-约40mol%。
在其他实施方案中,非-阳离子脂质(例如,一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约35mol%、约13mol%-约35mol%、约15mol%-约35mol%、约20mol%-约35mol%或约25mol%-约35mol%。
在进一步的实施方案中,非-阳离子脂质(例如,一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%、约13mol%-约30mol%、约15mol%-约30mol%、约20mol%-约30mol%、约10mol%-约25mol%、约13mol%-约25mol%或约15mol%-约25mol%。
在另外的实施方案中,非-阳离子脂质(例如,一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占所述颗粒中存在的总脂质(至少)约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60mol%(或其任意部分或其中的范围)。
在某些优选的实施方案中,非-阳离子脂质包括所述颗粒中存在的总脂质的约31.5mol%-约42.5mol%的胆固醇或其衍生物。作为非限制性实例,本发明的磷脂-游离脂质颗粒可以包括所述颗粒中存在的总脂质的约37mol%的胆固醇或其衍生物。在其他优选实施方案中,本发明的磷脂-游离脂质颗粒可以包括所述颗粒中存在的总脂质的约30mol%-约45mol%、约30mol%-约40mol%、约30mol%-约35mol%、约35mol%-约45mol%、约40mol%-约45mol%、约32mol%-约45mol%、约32mol%-约42mol%、约32mol%-约40mol%、约34mol%-约45mol%、约34mol%-约42mol%、约34mol%-约40mol%,或约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44,或45mol%(或其任意部分或其中的范围)的胆固醇或其衍生物。
在某些其他优选实施方案中,非-阳离子脂质包括以下各项的混合物:(i)所述颗粒中存在的总脂质的约4mol%-约10mol%的磷脂;和(ii)所述颗粒中存在的总脂质的约30mol%-约40mol%的胆固醇或其衍生物。作为非限制性实例,包括磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒可以包括所述颗粒中存在的总脂质的约7mol%的DPPC和约34mol%的胆固醇。在其他实施方案中,非-阳离子脂质包括以下的混合物:(i)所述颗粒中存在的总脂质的约3mol%-约15mol%、约4mol%-约15mol%、约4mol%-约12mol%、约4mol%-约10mol%、约4mol%-约8mol%、约5mol%-约12mol%、约5mol%-约9mol%、约6mol%-约12mol%、约6mol%-约10mol%,或约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14,或15mol%(或其任意部分或其中的范围)的磷脂;和(ii)所述颗粒中存在的总脂质的约25mol%-约45mol%、约30mol%-约45mol%、约25mol%-约40mol%、约30mol%-约40mol%、约25mol%-约35mol%、约30mol%-约35mol%、约35mol%-约45mol%、约40mol%-约45mol%、约28mol%-约40mol%、约28mol%-约38mol%、约30mol%-约38mol%、约32mol%-约36mol%,或约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44,或45mol%(或其任意部分或其中的范围)的胆固醇或其衍生物。
在进一步优选的实施方案中,非-阳离子脂质包括以下的混合物:(i)所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%的磷脂;和(ii)所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%的胆固醇或其衍生物。作为非限制性实例,包括磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒可以包括所述颗粒中存在的总脂质的约20mol%的DPPC和约20mol%的胆固醇。在其他实施方案中,非-阳离子脂质包括以下的混合物:(i)所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%、约10mol%-约25mol%、约10mol%-约20mol%、约15mol%-约30mol%、约20mol%-约30mol%、约15mol%-约25mol%、约12mol%-约28mol%、约14mol%-约26mol%,或约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29,或30mol%(或其任意部分或其中的范围)的磷脂;和(ii)所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%、约10mol%-约25mol%、约10mol%-约20mol%、约15mol%-约30mol%、约20mol%-约30mol%、约15mol%-约25mol%、约12mol%-约28mol%、约14mol%-约26mol%,或约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29,或30mol%(或其任意部分或其中的范围)的胆固醇或其衍生物。
在本发明的脂质颗粒(例如,包含干扰RNA诸如siRNA的SNALP)中,抑制颗粒聚集的结合脂质可以包括,例如,以下的一种或多种:聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物、聚酰胺(ATTA)-脂质缀合物、阳离子-聚合物-脂质缀合物(CPLs),或其混合物。在一个优选的实施方案中,核酸-脂质颗粒包括PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物。在某些实施方案中,PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物与CPL一起使用。抑制颗粒聚集的结合脂质可以包括PEG-脂质,其包括、例如、PEG-二酰甘油(DAG)、PEG二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer),或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是PEG-二月桂基氧基丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)、PEG-二棕榈基氧基丙基(C16)、PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)或其混合物。
适合用于本发明的另外的PEG-脂质缀合物包括,但不仅限于,mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn3-氨甲酰基甘油酯(carbomoylglyceride)(PEG-C-DOMG)。PEG-C-DOMG的合成记述在2008年12月31日提交的PCT申请号PCT/US08/88676中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。适合用于本发明的其他另外的PEG-脂质缀合物包括,但不仅限于,1-[8’-(1,2-二肉豆蔻酰基-3-丙烷氧基)-甲酰胺基-3’,6’-二氧杂辛基]氨甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)(2KPEG-DMG)。2KPEG-DMG的合成记述在美国专利号7,404,969中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
本文中所述的PEG-脂质缀合物的PEG结构部分可以包括范围为约550道尔顿-约10,000道尔顿的平均分子量。在某些实例中,PEG结构部分具有约750道尔顿-约5,000道尔顿(例如,约1,000道尔顿-约5,000道尔顿、约1,500道尔顿-约3,000道尔顿、约750道尔顿-约3,000道尔顿、约750道尔顿-约2,000道尔顿、等)的平均分子量。在优选的实施方案中,PEG结构部分具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。
在一些实施方案中,抑制颗粒聚集的结合脂质是具有以下通式的CPL:A-W-Y,其中A是脂质结构部分,W是亲水聚合物,且Y是聚阳离子结构部分。W可以是选自由以下各项组成的组的聚合物:聚乙二醇(PEG),聚酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物,或其组合,所述聚合物具有约250-约7000道尔顿的分子量。在一些实施方案中,Y在选定pH下具有至少4个正电荷。在一些实施方案中,Y可以是赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、其衍生物或其组合。
在某些实例中,抑制颗粒聚集的结合脂质(例如,PEG-脂质缀合物)可以占所述颗粒中存在的总脂质的约0.1mol%-约2mol%、约0.5mol%-约2mol%、约1mol%-约2mol%、约0.6mol%-约1.9mol%、约0.7mol%-约1.8mol%、约0.8mol%-约1.7mol%、约1mol%-约1.8mol%、约1.2mol%-约1.8mol%、约1.2mol%-约1.7mol%、约1.3mol%-约1.6mol%、约1.4mol%-约1.5mol%,或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9,或2mol%(或其任意部分或其中的范围)。
在本发明的脂质颗粒中,所述活性剂或治疗剂可以完全包封在颗粒的脂质部分内,由此保护所述活性剂或治疗剂免受酶降解。在优选的实施方案中,包含核酸诸如干扰RNA(例如,siRNA)的SNALP完全包封在颗粒的脂质部分内,由此保护所述核酸免受核酸酶降解。在某些实例中,SNALP中的核酸在使该颗粒在37℃暴露于核酸酶至少约20、30、45,或60分钟后基本不降解。在某些其他实例中,SNALP中的核酸在使该颗粒在血清中37℃温育至少约30、45或60分钟或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34,或36小时后基本不降解。在其他实施方案中,所述活性剂或治疗剂(例如,核酸诸如siRNA)与颗粒的脂质部分复合。本发明制剂的益处之一是所述脂质颗粒组合物对哺乳动物诸如人基本无毒。
术语“完全包封的”表示脂质颗粒中的活性剂或治疗剂在暴露于会显著降解游离DNA、RNA、或蛋白的血清或核酸酶或蛋白酶测定后不显著降解。在完全包封的系统中,优选小于约25%的颗粒中的活性剂或治疗剂在通常会降解100%游离活性剂或治疗剂的处理中被降解,更优选小于约10%,且最优选小于约5%的颗粒中的活性剂或治疗剂被降解。在核酸治疗剂的情形中,完全包封可以通过Oligreen
Figure BPA00001277238500291
测定确定。Oligreen
Figure BPA00001277238500292
是用于量化溶液中的寡核苷酸和单链DNA或RNA的超灵敏荧光核酸染色(可获自Invitrogen Corporation(Invitrogen公司);Carlsbad,CA)。“完全包封的”还表示脂质颗粒是血清-稳定的,即,它们在体内施用中不迅速分解为它们的组成部分。
在另一方面,本发明提供包含多种脂质颗粒的脂质颗粒(例如,SNALP)组合物。在优选的实施方案中,所述活性剂或治疗剂(例如,核酸)完全包封在脂质颗粒(例如,SNALP)的脂质部分内,从而使约30%-约100%、约40%-约100%、约50%-约100%、约60%-约100%、约70%-约100%、约80%-约100%、约90%-约100%、约30%-约95%、约40%-约95%、约50%-约95%、约60%-约95%、、约70%-约95%、约80%-约95%、约85%-约95%、约90%-约95%、约30%-约90%、约40%-约90%、约50%-约90%、约60%-约90%、约70%-约90%、约80%-约90%,或至少约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,或99%(或其任意部分或其中的范围)的脂质颗粒(例如,SNALP)具有包封在其中的活性剂或治疗剂。
典型地,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)具有的脂质∶活性剂(例如,脂质∶核酸)比(质量/质量比)为约1-约100。在一些情形中,脂质∶活性剂(例如,脂质∶核酸)比(质量/质量比)范围为约1-约50、约2-约25、约3-约20、约4-约15或约5-约10。在优选的实施方案中,本发明的脂质颗粒具有的脂质∶活性剂(例如,脂质∶核酸)比(质量/质量比)为约5-约15,例如,约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14,或15(或其任意部分或其中的范围)。
典型地,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)具有的平均直径为约40nm-约150nm。在优选的实施方案中,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)具有的平均直径为约40nm-约130nm、约40nm-约120nm、约40nm-约100nm、约50nm-约120nm、约50nm-约100nm、约60nm-约120nm、约60nm-约110nm、约60nm-约100nm、约60nm-约90nm、约60nm-约80nm、约70nm-约120nm、约70nm-约110nm、约70nm-约100nm、约70nm-约90nm、约70nm-约80nm,或小于约120nm、110nm、100nm、90nm,或80nm(或其任意部分或其中的范围)。
在本发明的一个特殊实施方案中,SNALP包括:(a)一种或多种沉默靶基因表达的未修饰和/或修饰的干扰RNA(例如,siRNA、aiRNA、miRNA);(b)占所述颗粒中存在的总脂质的约56.5mol%-约66.5mol%的阳离子脂质;(c)占所述颗粒中存在的总脂质的约31.5mol%-约42.5mol%的非-阳离子脂质;和(d)占所述颗粒中存在的总脂质的约1mol%-约2mol%的抑制颗粒聚集的结合脂质。该SNALP的特殊实施方案通常在本文中称为“1∶62”制剂。在优选的实施方案中,阳离子脂质是DLinDMA或DLin-K-C2-DMA(“XTC2”)、非-阳离子脂质是胆固醇,且结合脂质是PEG-DAA缀合物,尽管这些是1∶62制剂的优选实施方案,但是本领域中技术人员应该理解其他阳离子脂质、非-阳离子脂质(包括其他胆固醇衍生物)和结合脂质可以用在如本文中所述的1∶62制剂中。
在本发明的另一个特殊的实施方案中,SNALP包括:(a)一种或多种沉默靶基因表达的未修饰和/或修饰的干扰RNA(例如,siRNA、aiRNA、miRNA);(b)占所述颗粒中存在的总脂质的约52mol%-约62mol%的阳离子脂质;(c)占所述颗粒中存在的总脂质的约36mol%-约47mol%的非-阳离子脂质;和(d)占所述颗粒中存在的总脂质的约1mol%-约2mol%的抑制颗粒聚集的结合脂质。该SNALP的特殊实施方案通常在本文中称为“1∶57”制剂。在一个优选的实施方案中,阳离子脂质是DLinDMA或DLin-K-C2-DMA(“XTC2”),非-阳离子脂质是磷脂(诸如DPPC)和胆固醇的混合物,其中所述磷脂占所述颗粒中存在的总脂质的约5mol%-约9mol%(例如,约7.1mol%)且所述胆固醇(或胆固醇衍生物)占所述颗粒中存在的总脂质的约32mol%-约37mol%(例如,约34.3mol%),且PEG-脂质是PEG-DAA(例如,PEG-cDMA)。在另一个优选的实施方案中,阳离子脂质是DLinDMA或DLin-K-C2-DMA(“XTC2”),非-阳离子脂质是磷脂(诸如DPPC)和胆固醇的混合物,其中所述磷脂占所述颗粒中存在的总脂质的约15mol%-约25mol%(例如,约20mol%)且所述胆固醇(或胆固醇衍生物)占所述颗粒中存在的总脂质的约15mol%-约25mol%(例如,约20mol%),且PEG-脂质是PEG-DAA(例如,PEG-cDMA)。尽管这些是1∶57制剂的优选实施方案,但是本领域中技术人员应该理解其他阳离子脂质、非-阳离子脂质(包括其他磷脂和其他胆固醇衍生物)和结合脂质可以用在如本文中所述的1∶57制剂中。
在优选的实施方案中,1∶62 SNALP制剂是三组分系统,其无磷脂且包括约1.5mol%PEG-cDMA(或PEG-cDSA)、约61.5mol%DLinDMA(或XTC2)和约36.9mol%胆固醇(或其衍生物)。在其他优选实施方案中,1∶57 SNALP制剂是四组分系统,其包括约1.4mol%PEG-cDMA(或PEG-cDSA)、约57.1mol%DLinDMA(或XTC2)、约7.1mol%DPPC和约34.3mol%胆固醇(或其衍生物)。在其他优选实施方案中,1∶57 SNALP制剂是四组分系统,其包括约1.4mol%PEG-cDMA(或PEG-cDSA)、约57.1mol%DLinDMA(或XTC2)、约20mol%DPPC和或20mol%胆固醇(或其衍生物)。应该理解这些SNALP制剂是靶制剂,且SNALP制剂中存在的脂质(阳离子脂质和非-阳离子脂质二者)和脂质缀合物的量可以变化。
本发明还提供药物组合物,其包含本文中所述脂质颗粒(例如,SNALP)和药用载体。
在另一个方面,本发明提供用于将一种或多种活性剂或治疗剂(例如,核酸)引入至细胞中的方法,包括使所述细胞与本文中所述脂质颗粒(例如,SNALP)相接触。在一个实施方案中,所述细胞是哺乳动物中的细胞且所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中,本发明提供用于体内递送一种或多种活性剂或治疗剂(例如,核酸)的方法,其包括对哺乳动物受试者施用本文中所述脂质颗粒(例如,SNALP)。在优选的实施方案中,给药模式包括,但不仅限于,口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、病灶内、气管内、皮下、和皮内。优选地,所述哺乳动物受试者是人。
在一个实施方案中,至少约5%、10%、15%、20%或25%的脂质颗粒(例如,SNALP)的总注射剂量在注射后约8、12、24、36,或48小时存在于血浆中。在其他实施方案中,超过约20%、30%、40%和多至约60%、70%或80%的脂质颗粒(例如,SNALP)的总注射剂量在注射后约8、12、24、36,或48小时存在于血浆中。在某些实例中,超过约10%的大量颗粒在给药后约1小时存在于哺乳动物的血浆中。在某些其他实例中,脂质颗粒(例如,SNALP)的存在在施用颗粒后至少约1小时可检测到。在某些实施方案中,活性剂或治疗剂诸如干扰RNA(例如,siRNA)的存在在给药后8、12、24、36、48、60、72或96小时,在肺、肝、肿瘤的细胞中,或在炎症部位处可检测到。在其他实施方案中,由活性剂或治疗剂诸如干扰RNA(例如,siRNA)引起的靶序列表达的下调在给药后8、12、24、36、48、60、72或96小时可检测到。在其他实施方案中,由活性剂或治疗剂诸如干扰RNA(例如,siRNA)引起的靶序列表达的下调优先地发生在肿瘤细胞中或在炎症部位处的细胞中。在其他实施方案中,活性剂或治疗剂诸如干扰RNA(例如,siRNA)在接近或远离给药部位的部位处的细胞中或肺、肝、或肿瘤的细胞中的存在或作用在给药后约12、24、48、72或96小时,或约6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26或28天可检测到。在另外的实施方案中,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)经肠胃外或腹膜内施用。
在一些实施方案中,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)特别有效用于治疗性递送一种或多种包含干扰RNA序列(例如,siRNA)的核酸的方法中。具体地,本发明的目的是提供通过下调或沉默一种或多种靶核酸序列或目的基因的转录和/或翻译来治疗哺乳动物(例如,啮齿类动物诸如小鼠或灵长类动物诸如人、黑猩猩、或猴)中的疾病或功能障碍的体外和体内方法。作为非限制性实例,本发明的方法有效用于体内递送干扰RNA(例如,siRNA)至哺乳动物受试者的肝和/或肿瘤。在某些实施方案中,所述疾病或功能障碍与基因的表达和/或过表达有关,且该基因的表达或过表达被干扰RNA(例如,siRNA)减少。在某些其他实施方案中,可以将治疗有效量的脂质颗粒(例如,SNALP)施用于哺乳动物。在一些情形中,将干扰RNA(例如,siRNA)配制为SNALP,并将颗粒施用于需要这种治疗的患者。在其他情形中,从患者中取出细胞,体外递送干扰RNA(例如,siRNA)(例如,利用本文中所述的SNALP),并将细胞再注射到患者中。
在另外的方面,本发明提供包含沉默靶基因的表达的不对称干扰RNA(aiRNA)分子的脂质颗粒(例如,SNALP),和利用所述颗粒沉默靶基因表达的方法。
在一个实施方案中,aiRNA分子包括具有长度为约10-约25个(碱基配对的)核苷酸的双链(双链体)区,其中所述aiR分子包括含有5’和3’突出端的反义链,且其中所述aiRNA分子能够沉默靶基因表达。
在某些实例中,aiRNA分子包括具有长度为约12-20、12-19、12-18、13-17或14-17个(碱基配对的)核苷酸,更典型长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20个(碱基配对的)核苷酸的双链(双链体)区。在某些其他实例中,反义链上的5’和3’突出端包括与靶RNA序列互补的序列,且可以任选地进一步包括非靶序列。在一些实施方案中,反义链上的5’和3’突出端各包括1、2、3、4、5、6、7、或更多个核苷酸或由其组成。
在其他实施方案中,aiRNA分子包括修饰的核苷酸,所述修饰的核苷酸选自由以下各项组成的组:2’OMe核苷酸、2’F核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-O-MOE核苷酸、LNA核苷酸、及其混合物。在优选的实施方案中,aiRNA分子包括2’OMe核苷酸。作为非限制性实例,2’OMe核苷酸可以选自由以下各项组成的组:2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、及其混合物。
在相关方面,本发明提供包含沉默靶基因表达的微小RNA(miRNA)分子的脂质颗粒(例如,SNALP),和利用该组合物沉默靶基因表达的方法。
在一个实施方案中,miRNA分子在长度上包括约15-约60个核苷酸,其中miRNA分子能够沉默靶基因表达。
在某些实例中,miRNA分子在长度上包括约15-50、15-40,或15-30个核苷酸,更典型约15-25或19-25个核苷酸,且优选约20-24、21-22,或21-23个核苷酸。在优选的实施方案中,miRNA分子是靶向目的RNA序列的成熟miRNA分子。
在一些实施方案中,miRNA分子包括修饰的核苷酸,所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组:2’OMe核苷酸、2’F核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-O-MOE核苷酸、LNA核苷酸、及其混合物。在优选的实施方案中,miRNA分子包括2’OMe核苷酸。作为非限制性实例,2’OMe核苷酸可以选自由以下各项组成的组:2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、及其混合物。
同样地,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)是有利的并且适合用于将活性剂或治疗剂诸如核酸(例如,干扰RNA诸如siRNA、aiRNA,和/或miRNA)施用于受试者(例如,哺乳动物诸如人),因为它们在循环中稳定,具有导致进入血管外部位的药效行为所需的尺寸,并能够到达靶细胞群。
IV.活性剂
活性剂(例如,治疗剂)包括能够对细胞、组织、器官或受试者发挥所需作用的任何分子或化合物。所述作用可以是,例如,生物学的、生理学的、和/或美容的。活性剂可以是任何类型的分子或化合物,其包括,但不仅限于,核酸、肽、多肽、小分子、及其混合物。核酸的非限制性实例包括干扰RNA分子(例如,siRNA、aiRNA、miRNA)、反义寡核苷酸、质粒、核酶、免疫刺激性寡核苷酸、及其混合物。肽或多肽的实施例包括,但不仅限于,抗体(例如,多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、人源化抗体、重组抗体、重组人抗体、PrimatizedTM抗体)、细胞因子、生长因子、凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体及其配体、激素、及其混合物。小分子的实例包括,但不仅限于,小有机分子或化合物诸如本领域中技术人员已知的任何常规试剂和药物。
在一些实施方案中,活性剂是治疗剂、或其盐或衍生物。治疗剂衍生物可以本身具有治疗活性或者它们可以是前药,所述前药在进一步改性后变为具有活性。因此,在一个实施方案中,治疗剂衍生物与未改性的试剂相比,保持一些或全部治疗活性,而在另一个实施方案中,治疗剂衍生物是缺乏治疗活性但在进一步改性时变为有活性的前药。
A.核酸
在某些实施方案中,本发明的脂质颗粒与核酸相缔合,由此产生核酸-脂质颗粒(例如,SNALP)。在一些实施方案中,核酸完全包封在脂质颗粒中。用于本文中时,术语“核酸”包括任何寡核苷酸或多核苷酸,其具有通常称为寡核苷酸的包含多至60个核苷酸的片段,和称为多核苷酸的较长片段。在特殊实施方案中,本发明的寡核苷酸长度为约15-约60个核苷酸。核酸可以在本发明的脂质颗粒中单独施用,或与本发明的包含肽、多肽、或小分子诸如常规药物的脂质颗粒组合施用(例如,共施用)。
在本发明的上下文中,术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”指核苷酸或核苷单体的聚合物或低聚物,所述核苷酸或核苷单体由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键组成。术语“多聚苷酸”和“寡核苷酸”还包括包含非天然存在单体的聚合物或低聚物,或其起相似功能的部分。所述修饰的或取代的寡核苷酸通常比天然形式更优选,这归因于这样的性质,诸如,例如,增强的细胞吸收,减小的免疫原性,和增加的在核酸酶存在下的稳定性。
寡核苷酸通常分类为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由5碳糖,称为脱氧核糖组成,无碳糖与该糖的5′和3′碳处的磷酸根共价连接,以形成交替的无支链聚合物。核糖寡核苷酸由相似的重复结构组成,其中所述5碳糖是核糖。
按照本发明的脂质-核酸颗粒中存在的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文中使用的核酸可以是单链DNA或RNA,或双链DNA或RNA,或DNA-RNA杂合体。双链DNA的实例记述在本文中并且包括,例如,结构基因,包括控制区和终止区的基因,和自我复制系统诸如病毒或质粒DNA。双链RNA的实例记述在本文中并且包括,例如,siRNA和其他RNAi试剂诸如aiRNA和前-miRNA。单链核酸包括,例如,反义寡核苷酸、核酶、成熟miRNA、和形成三链体的寡核苷酸。
本发明的核酸可以是不同长度的,其通常取决于核酸的具体形式。例如,在特殊的实施方案中,质粒或基因可以是长度为约1,000-约100,000个核苷酸残基。在特殊的实施方案中,寡核苷酸长度范围可以是约10-约100个核苷酸。在多种相关的实施方案中,寡核苷酸,两条单链、双链和三链,均可以具有长度范围约10-约60个核苷酸、约15-约60个核苷酸、约20-约50个核苷酸、约15-约30个核苷酸,或约20-约30个核苷酸。
在特殊的实施方案中,本发明的寡核苷酸(或其链)与靶多核苷酸序列特异性杂交或互补。术语“特异性杂交”和“互补”用于本文中时,指足以使DNA或RNA靶标和寡核苷酸之间发生稳定的和特异性结合的互补性程度。理解寡核苷酸不需要与其靶核酸序列100%互补来特异性杂交。在优选的实施方案中,当寡核苷酸与靶序列的结合妨碍靶序列的正常功能从而导致其效用或表达丧失时,该寡核苷酸是特异性杂交的,且存在足以在需要特异性结合的条件下,即在体内测定或治疗性处理情形中的生理学条件下或在体外测定情形中,进行测定的条件下,避免寡核苷酸与非靶序列非特异性结合的互补性程度。因此,寡核苷酸与其靶向或特异性杂交的基因或mRNA序列的区域相比,可以包括1、2、3或更多个碱基取代。
1.siRNA
本发明的核酸-脂质颗粒的siRNA组分能够沉默目的靶基因的表达。siRNA双链体的每条链典型地长度约15-约60个核苷酸,优选长度约15-约30个核苷酸。在某些实施方案中,siRNA包括至少一个修饰的核苷酸。所述修饰的siRNA通常具有比相应未修饰siRNA序列更小的免疫刺激性,且保持针对目的靶基因的RNAi活性。在一些实施方案中,修饰的siRNA含有至少一个2’OMe嘌呤或嘧啶核苷酸诸如2’OMe-鸟苷、2’OMe-尿苷、2’OMe-腺苷,和/或2’OMe-胞嘧啶核苷酸。在优选的实施方案中,一种或多种尿苷和/或鸟苷核苷酸是修饰的。修饰的核苷酸可以存在于siRNA的一条链(即,有义或反义)或两条链中。siRNA序列可以具有突出端(例如,3’或5’突出端,如Elbashir等,Genes Dev.(基因发育),15:188(2001)或
Figure BPA00001277238500361
等,Cell(细胞),107:309(2001)中所述),或可以缺少突出端(即,具有平端)。
修饰的siRNA通常包括siRNA双链体的双链区中的约1%-约100%(例如,约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或100%)的修饰的核苷酸。在某些实施方案中,siRNA的双链区中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸包括修饰的核苷酸。
在一些实施方案中,siRNA的双链区中小于约25%(例如、小于约25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%,或1%)的核苷酸包括修饰的核苷酸。
在其他实施方案中,siRNA的双链区中约1%-约25%(例如,约1%-25%、2%-25%、3%-25%、4%-25%、5%-25%、6%-25%、7%-25%、8%-25%、9%-25%、10%-25%、11%-25%、12%-25%、13%-25%、14%-25%、15%-25%、16%-25%、17%-25%、18%-25%、19%-25%、20%-25%、21%-25%、22%-25%、23%-25%、24%-25%,等)或约1%-约20%(例如,约1%-20%、2%-20%、3%-20%、4%-20%、5%-20%、6%-20%、7%-20%、8%-20%、9%-20%、10%-20%、11%-20%、12%-20%、13%-20%、14%-20%、15%-20%、16%-20%、17%-20%、18%-20%、19%-20%、1%-19%、2%-19%、3%-19%、4%-19%、5%-19%、6%-19%、7%-19%、8%-19%、9%-19%、10%-19%、11%-19%、12%-19%、13%-19%、14%-19%、15%-19%、16%-19%、17%-19%、18%-19%、1%-18%、2%-18%、3%-18%、4%-18%、5%-18%、6%-18%、7%-18%、8%-18%、9%-18%、10%-18%、11%-18%、12%-18%、13%-18%、14%-18%、15%-18%、16%-18%、17%-18%、1%-17%、2%-17%、3%-17%、4%-17%、5%-17%、6%-17%、7%-17%、8%-17%、9%-17%、10%-17%、11%-17%、12%-17%、13%-17%、14%-17%、15%-17%、16%-17%、1%-16%、2%-16%、3%-16%、4%-16%、5%-16%、6%-16%、7%-16%、8%-16%、9%-16%、10%-16%、11%-16%、12%-16%、13%-16%、14%-16%、15%-16%、1%-15%、2%-15%、3%-15%、4%-15%、5%-15%、6%-15%、7%-15%、8%-15%、9%-15%、10%-15%、11%-15%、12%-15%、13%-15%、14%-15%,等)的核苷酸包括修饰的核苷酸。
在其他实施方案中,例如,当siRNA的一条或两条链在尿苷和/或鸟苷核苷酸处选择性修饰时,由此产生的修饰的siRNA可以包括小于约30%修饰的核苷酸(例如,小于约30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%,或1%修饰的核苷酸)或约1%-约30%修饰的核苷酸(例如,约1%-30%、2%-30%、3%-30%、4%-30%、5%-30%、6%-30%、7%-30%、8%-30%、9%-30%、10%-30%、11%-30%、12%-30%、13%-30%、14%-30%、15%-30%、16%-30%、17%-30%、18%-30%、19%-30%、20%-30%、21%-30%、22%-30%、23%-30%、24%-30%、25%-30%、26%-30%、27%-30%、28%-30%,或29%-30%修饰的核苷酸)。
a.siRNA序列的选择
合适的siRNA序列可以利用本领域中已知的任何方法来识别。典型的,记述在Elbashir等,Nature(自然),411:494-498(2001)和Elbashir等,EMBOJ.(欧洲分子生物学组织杂志),20:6877-6888(2001)中的方法与Reynolds等,Nature Biotech.(自然生物技术),22(3):326-330(2004)中所述的理性设计规则相结合。
通常,扫描来自目的靶基因的转录物的AUG起始密码子的核苷酸序列3’以获得二核苷酸序列(例如,AA、NA、CC、GG,或UU,其中N=C、G或U)(参见,例如,Elbashir等,EMBO J.(欧洲分子生物学组织杂志),20:6877-6888(2001))。将与该二核苷酸序列直接3’相连的核苷酸识别为潜在的siRNA序列(即,靶序列或有义链序列)。典型地,将与该二核苷酸序列直接3’相连的19、21、23、25、27、29、31、33、35,或更多个核苷酸识别为潜在的siRNA序列。在一些实施方案中,所述二核苷酸序列是AA或NA序列并将与AA或NA二核苷酸直接3’相连的19个核苷酸识别为潜在的siRNA序列。siRNA序列通常沿靶基因的长度以不同位置间隔。为了进一步提高siRNA序列的沉默效率,可以分析潜在的siRNA序列,以识别例如,靶细胞或生物体内不包含与其他编码序列同源的区域的位点。例如,在靶细胞或生物体中,约21对碱基对的合适siRNA序列典型地不具有多于16-17对与编码序列同源的连续碱基对。如果siRNA序列要从RNA Pol III启动子开始表达,则选择缺少超过4个连续A或T的siRNA序列。
一旦已经识别潜在的siRNA序列,可以设计互补序列(即,反义链序列)。潜在的siRNA序列还可以利用多种本领域中已知的标准来分析。例如,为了提高它们的沉默效率,可以通过理性设计算法来分析siRNA序列,从而识别具有一种或多种以下性质的序列:(1)G/C含量为约25%-约60%G/C;(2)在有义链位置15-19处至少3个A/U;(3)无内部重复序列;(4)有义链的位置19处的A;(5)有义链的位置3处的A;(6)有义链的位置10处的U;(7)有义链的位置19处的无G/C;和(8)有义链的位置13处的无G。结合对这些性质中的每种赋予合适数值的算法并有效用于siRNA选择的siRNA设计工具可以参见,例如,http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNA。本领域中技术人员应该理解可以选择具有一种或多种前述特征的序列,以作为潜在siRNA序列来进一步分析和测试。
另外,具有一种或多种以下标准的潜在siRNA序列通常可以作为siRNA来消除:(1)包含一段4个或更多个连续相同碱基的序列;(2)包含Gs的同聚物的序列(即,用于减少由于这些聚合物的结构特征而造成的可能的非特异性作用;(3)包含三碱基基序的序列(例如,GGG、CCC、AAA,或TTT);(4)包含一段7个或更多个连续的G/Cs的序列;和(5)在引起内部折回结构的候选者中包含4个或更多个碱基的直接重复序列的序列。然而,本领域中技术人员应该理解具有一种或多种前述特征的序列仍可以选择作为潜在siRNA序列来进一步分析和测试。
在一些实施方案中,潜在siRNA序列可以进一步基于siRNA双链体不对称性来分析,如记述在,例如,Khvorova等,Cell(细胞),115:209-216(2003);和Schwarz等,Cell(细胞),115:199-208(2003)中。在其他实施方案中,潜在siRNA序列可以进一步基于靶位点处的二级结构来分析,如记述在,例如,Luo等,Biophys.Res.Commun.(生物物理研究通讯),318:303-310(2004)中。例如,靶位点处的二级结构可以利用Mfold算法(可获自http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/forml.cgi)来建模,从而选择偏爱在存在较少的处于碱基配对和茎-环形式的二级结构的靶位点处进入的siRNA序列。
一旦已经识别了潜在的siRNA序列,可以例如,利用体外细胞因子测定或体内动物模型来分析该序列的任何免疫刺激性特性的存在。siRNA序列的有义和/或反义链中的基序诸如富含GU的基序(例如,5’-GU-3’,5’-UGU-3’,5’-GUGU-3’,5’-UGUGU-3’,等)也可以提供该序列是否可以是免疫刺激性的指示。一旦发现siRNA分子是免疫刺激性的,则可以如本文中所述对其进行修饰,从而减小其免疫刺激性。作为非限制性实例,siRNA序列可以与哺乳动物效应器细胞在这样的条件下相接触,以使该细胞产生可检测到的免疫应答,从而确定siRNA是免疫刺激性还是非免疫刺激性siRNA。哺乳动物效应器细胞可以来自原态哺乳动物(即,以前未与siRNA序列的基因产物接触过的哺乳动物)。哺乳动物效应器细胞可以是,例如,外周血单核细胞(PBMC)、巨噬细胞,等。可检测的免疫应答可以包括生成细胞因子或生长因子诸如,例如,TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12或其组合。然后可以修饰被识别具有免疫刺激性的siRNA分子,从而通过用修饰核苷酸替换有义和/或反义链上的至少一个核苷酸来减小其免疫刺激性特性。例如,siRNA双链体的双链区中的小于约30%(例如,小于约30%、25%、20%、15%、10%或5%)核苷酸可以替换为修饰的核苷酸诸如2’OMe核苷酸。修饰的siRNA可以然后与如上所述的哺乳动物效应器细胞相接触,从而验证其免疫刺激性特性已经被减小或消除。
用于测定免疫应答的合适体外测定包括,但不仅限于,David等的双单克隆抗体夹心式免疫测定技术(美国专利号4,376,110);单克隆-多克隆抗体夹心式测定(Wide等,在Kirkham和Hunter,编,Radioimmunoassay Methods(放射免疫测定方法)中,E.and S.Livingstone,Edinburgh(1970));Gordon等的“Western印迹”法(美国专利号4,452,901);标记配体的免疫沉淀(Brown等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志),255:4980-4983(1980));如,例如,Raines等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志),257:5154-5160(1982)所述的酶联免疫吸附测定(ELISA);免疫细胞化学技术,包括荧光染料的使用(Brooks等,Clin.Exp.Immunol.(临床实验免疫学),39:477(1980));和活性中和(Bowen-Pope等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),81:2396-2400(1984))。除如上所述的免疫测定外,可以获得许多其他免疫测定,包括美国专利号3,817,827;3,850,752;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;和4,098,876中描述的那些。这些参考文献的公开内容通过引用整体结合于此用于全部目的。
用于检测免疫应答的体内模型的非限制性实例包括体内小鼠细胞因子诱导测定,如例如,Judge等,Mol.Ther.(分子治疗),13:494-505(2006)中所述。在某些实施方案中,测定可以进行如下:(1)可以通过标准静脉内注射将siRNA施用于侧尾静脉;(2)可以通过在给药后约6小时心脏穿刺收集血液并加工为血浆,以进行细胞因子分析;和(3)根据制造商的说明利用夹心式ELISA试剂盒量化细胞因子(例如,小鼠和人IFN-α(PBL Biomedical(PBL生物医学);Piscataway,NJ);人IL-6和TNF-α(eBioscience;圣地亚哥,CA);和小鼠IL-6,TNF-α,和IFN-γ(BD Biosciences(BD生物科学,圣地亚哥,CA))。
特异性结合细胞因子和生长因子的单克隆抗体可商购自多个来源,且可以利用本领域中的已知方法来生成(参见,例如,Kohler等,Nature(自然),256:495-497(1975)以及Harlow和Lane,ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(抗体,实验手册),Cold Spring Harbor Publication(冷泉港出版社),纽约(1999))。单克隆抗体的生成以前已经描述并且可以通过本领域中任何已知的方式完成(Buhring等,在Hybridoma(杂交瘤),第10卷,第1期,第77-78页(1991))。在一些方法中,(例如,用可通过光谱法、光化学、生物化学、电学、光学、或化学方式检测的任何组合物)标记单克隆抗体,以利于检测。
b.生成siRNA分子
siRNA可以以若干形式提供,所述形式包括,例如,作为一种或多种分离的小干扰RNA(siRNA)双链体、作为较长双链RNA(dsRNA),或作为由DNA质粒中的转录盒转录的siRNA或dsRNA。siRNA序列可以具有突出端(例如,3’或5’突出端,如Elbashir等,Genes Dev.(基因发育),15:188(2001)或等,Cell(细胞),107:309(2001)中所述,或可以缺少突出端(即,具有平端)。
RNA群可以用于提供长前体RNA,或与所选靶序列具有实质的或完全的同一性的长前体RNA,所述长前体RNA可以用于制备siRNA。RNA可以根据本领域中技术人员公知的方法,分离自细胞或组织,合成和/或克隆。RNA可以是混合群(由细胞或组织获得,由cDNA转录、缩减、选择等),或可以代表单靶序列。RNA可以是天然存在的(例如,由组织或细胞样品分离),体外合成的(例如,利用T7或SP6聚合酶和PCR产物或克隆的cDNA),或化学合成的。
为了形成长dsRNA,关于合成的RNA,互补体也在体外转录并杂交以形成dsRNA。如果使用天然存在的RNA群,则例如,通过转录对应于RNA群的cDNAs,或通过使用RNA聚合酶也提供RNA互补体(例如,以形成用于被大肠杆菌(E.coli)RNA酶III或切酶(Dicer)消化的dsRNA)。前体RNA然后杂交以形成用于消化的双链RNA。dsRNA可以直接施用于受试者或可以在施用前在体外消化。
用于分离RNA,合成RNA,杂交核酸,制备和筛选cDNA文库,和执行PCR的方法是本领域中公知的(参见,例如,Gubler和Hoffman,Gene(基因),25:263-269(1983);Sambrook等,见上;Ausubel等,见上),PCR方法也是本领域中公知的(参见,美国专利号4,683,195和4,683,202;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR试验技术:方法和应用指南)(Innis等,编,1990))。表达文库也是本领域中技术人员公知的。公开本发明中使用的一般方法的其他基础教科书包括Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆,实验室手册)(第二版1989);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(基因转移和表达:实验室手册)(1990);和Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学试验技术)(Ausubel等,编,1994)。这些参考文献的公开内容通过引用整体结合于此用于全部目的。
优选地,siRNA是化学合成的。包含本发明siRNA分子的寡核苷酸可以利用任意本领域中已知的许多方法,诸如Usman等,J.Am.Chem.Soc.(美国化学协会杂志),109:7845(1987);Scaringe等,Nucl.Acids Res.(核酸研究),18:5433(1990);Wincott等,Nucl.Acids Res.(核酸研究),23:2677-2684(1995);和Wincott等,Methods Mol.Bio.(分子生物学方法),74:59(1997)中描述的那些来合成。寡核苷酸的合成利用常见核酸保护和偶联基团,诸如5’末端处的二甲氧基三苯甲基和3’末端处的亚磷酰胺。作为非限制性实例,小规模合成可以在应用生物系统合成仪(Applied Biosystems synthesizer)上,利用0.2μmol规模流程来进行。备选地,0.2μmol规模的合成可以在来自Protogene(Palo Alto,CA)的96孔板合成器上进行。然而,更大或更小规模的合成也属于本发明的范围。用于寡核苷酸合成的合适试剂、用于RNA去保护的方法、和用于RNA纯化的方法是本领域中技术人员已知的。
siRNA分子还可以通过串联合成技术来合成,其中两条链均作为被可分裂的接头分开的单个连续寡核苷酸片段或链来合成,所述接头随后分裂以提供分开的片段或链,所述分开的片段或链杂交形成siRNA双链体。所述接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。siRNA的串联合成可以容易地适合于多孔/多板合成平台以及使用间歇反应器、合成柱等的大规模合成平台二者。备选地,siRNA分子可以由两种不同的寡核苷酸组装,其中一种寡核苷酸包括siRNA的有义链,另一种包括siRNA的反义链。例如,每条链可以分别合成并在合成和/或去保护后通过杂交或连接结合在一起。在某些其他实例中,siRNA分子可以作为单个连续寡核苷酸片段合成,其中自互补的有义区和反义区杂交形成具有发夹二级结构的siRNA双链体。
c.修饰siRNA序列
在某些方面,siRNA分子包括双链体,所述双链体具有两条链和双链区内的至少一个修饰的核苷酸,其中每条链长度约15-约60个核苷酸。有利地,修饰的siRNA比相应的未修饰siRNA序列免疫刺激性更低,但是保持沉默靶序列表达的能力。在优选的实施方案中,引入siRNA分子中的化学修饰程度使在减小或消除siRNA免疫刺激性特性和保持RNAi活性之间达到平衡。作为非限制性实例,靶向目的基因的siRNA分子可以在siRNA双链体内的选择性尿苷和/或鸟苷核苷酸处最小程度地修饰(例如,小于约30%、25%、20%、15%、10%或5%的修饰),以消除由siRNA产生的免疫应答,同时保持其沉默靶基因表达的能力。
适合用于本发明的修饰的核苷酸的实例包括,但不仅限于,具有2’-O-甲基(2’OMe)、2’-脱氧-2’-氟(2’F)、2’-脱氧、5-C-甲基、2’-O-(2-甲氧乙基)(MOE)、4’-硫代、2’-氨基或’-C-烯丙基基团的核糖核苷酸。具有Northern构象的修饰的核苷酸,诸如在,例如,Saenger,Principles of NucleicAcid Structure(核酸结构原理),Springer-Verlag编(1984)中描述的那些,也适合用于siRNA分子。这样的修饰的核苷酸包括,但不仅限于,锁核酸(LNA)核苷酸(例如,2’-O、4’-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)、2’-O-(2-甲氧乙基)(MOE)核苷酸、2’-甲基-硫代-乙基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’F)核苷酸、2’-脱氧-2’-氯(2’Cl)核苷酸和2’-叠氮核苷酸。在某些实例中,本文中描述的siRNA分子包括一种或多种G-钳核苷酸。G-钳核苷酸指修饰的胞嘧啶类似物,其中所述修饰赋予双链体内互补鸟嘌呤核苷酸的Watson-Crick和Hoogsteen面两者以氢键的能力。另外,具有核苷酸碱基类似物的核苷酸,诸如,例如,C-苯基、C-萘基、其他芳族衍生物、肌苷、唑类甲酰胺(azole carboxamide)和硝基唑类(nitroazole)衍生物诸如3-硝基吡咯,4-硝基吲哚,5-硝基吲哚,和6-硝基吲哚(参见,例如,Loakes,Nucl.Acids Res.(核酸研究),29:2437-2447(2001))可以引入siRNA分子中。
在某些实施方案中,siRNA分子还可以包括一种或多种化学修饰诸如端帽结构部分,磷酸根主链修饰,等。端帽结构部分的实例包括,但不仅限于,反向脱氧无碱基残基、甘油基修饰、4’,5’-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤型呋喃酰基)核苷酸、4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、苏型-戊呋喃酰核苷酸、无环3’,4’-断裂核苷酸,无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3’-3’-反向核苷酸结构部分、3’-3’-反向无碱基结构部分、3’-2’-反向核苷酸结构部分、3’-2’-反向无碱基结构部分、5’-5’-反向核苷酸结构部分、5’-5’-反向无碱基结构部分、3’-5’-反向脱氧无碱基结构部分、5’-氨基-烷基磷酸酯、1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1,2-氨基十二烷基磷酸酯、羟基丙基磷酸酯、1,4-丁二醇磷酸酯、3’-氨基磷酸酯、5’-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3’-磷酸酯、5’-氨基、3’-硫代磷酸酯、5’-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、和桥连或非-桥连的甲基磷酸酯或5’-巯基结构部分(参见,例如,美国专利号5,998,203;Beaucage等,Tetrahedron(四面体)49:1925(1993))。磷酸根主链修饰的非限制性实例(即,形成修饰的核苷酸间键)包括硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,甲基磷酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化物、氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetal)和烷基甲硅烷基取代(参见,例如,Hunziker等,Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties(核酸类似物:合成和特性),在Modern Synthetic Methods(现代合成方法)中,VCH,331-417(1995);Mesmaeker等,Novel Backbone Replacements for Oligonuceotides(寡核苷酸的新型主链替换),在Carbohydrate Modifications in antisense Research(反义研究中的碳水化合物修饰)中,ACS,24-39(1994))。这样的化学修饰可以发生在siRNA的有义链、反义链或两条链的5’-末端和/或3’-末端处。这些参考文献的公开内容通过引用整体结合于此用于全部目的。
在一些实施方案中,siRNA分子的有义链和/或反义链还可以包括3’-端突出端,所述突出端具有约1-约4(例如,1、2、3或4)个2’-脱氧核糖核苷酸和/或修饰的和未修饰的核苷酸的任意组合。可以引入至siRNA分子中的修饰的核苷酸和化学修饰类型的其他实例记述在,例如,英国专利号GB 2,397,818 B和美国专利公开号20040192626,20050282188,和20070135372中,将其公开内容通过引用整体结合于此用于全部目的。
本文中所述siRNA分子可以在siRNA的一条或两条链中任选地包含一种或多种非-核苷酸。用于本文中时,术语“非-核苷酸”指可以引入至核酸链中代替一种或多种核苷酸单元,包括糖和/或磷酸根取代,并容许剩余碱基表现其活性的任何基团或化合物。所述基团或化合物是无碱基的,因为其不包含公认的核苷酸碱基诸如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶,并因此缺少处于1’位置处的碱基。
在其他实施方案中,siRNA的化学修饰包括使siRNA分子连接缀合物。所述缀合物通过共价连接诸如,例如,可生物降解的接头连接在siRNA的有义链和/或反义链的5’和/或3’-末端处。所述缀合物还可以,例如,通过氨基甲酸酯基团或其他连接基团与siRNA连接(参见,例如,美国专利公开号20050074771,20050043219,和20050158727)。在某些实例中,所述缀合物是促进递送siRNA至细胞中的分子。适合于与siRNA连接的缀合物分子的实例包括,但不仅限于,类固醇如胆固醇、乙二醇诸如聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、脂肪酸、类胡萝卜素、萜类、胆酸、叶酸盐(例如,叶酸,叶酸类似物及其衍生物)、糖(例如,半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、甘露糖、果糖、岩藻糖,等)、磷脂、肽、能够介导细胞摄取的细胞受体的配体,及其组合(参见,例如,美国专利公开号20030130186,20040110296,和20040249178;美国专利号6,753,423)。其他实例包括美国专利公开号20050119470和20050107325中所述的亲脂性结构部分、维生素、聚合物、肽、蛋白、核酸、小分子、寡糖、碳水化合物簇、嵌入剂、小沟结合物、裂解剂和交联剂缀合分子。另外的其他实例包括美国专利公开号20050153337中所述的2’-O-烷基胺、2’-O-烷氧基烷基胺、聚胺、C5-阳离子修饰的嘧啶、阳离子肽、胍基、脒基、阳离子氨基酸缀合分子。另外的实例包括美国专利公开号20040167090中所述的疏水性基团、膜活性化合物、细胞渗透化合物、细胞靶向信号、相互作用改性剂和空间稳定剂缀合分子。其他实例包括美国专利公开号20050239739中所述的缀合分子。对于siRNA的改进的药物动力学分布、生物利用度、和/或稳定性,同时保持RNAi活性,可以评估所用的缀合物类型和与siRNA分子的缀合程度。同样地,本领域中技术人员可以利用许多公知的体外细胞培养或体内动物模型的任一种来筛选具有多种与其连接的缀合物的siRNA分子,从而鉴别具有改进的特性和完全RNAi活性的siRNA分子。上述专利文件的公开内容通过引用整体结合于此用于全部目的。
d.靶基因
本文中所述的核酸-脂质颗粒的siRNA成分可以用于下调或沉默目的基因的翻译(即,表达)。目的基因包括,但不仅限于,与病毒感染和存活有关的基因,与代谢性疾病或功能障碍(例如,肝疾病和功能障碍)有关的基因,与肿瘤发生和细胞转化(例如,癌症)有关的基因,血管发生基因,免疫调节基因诸如与炎性和自身免疫应答有关的那些,配体受体基因,和与神经退行性疾病有关的基因。
与病毒感染和存活有关的基因包括为了在细胞中结合、进入、和复制而由病毒表达的那些。特别感兴趣的是与慢性病毒疾病有关的病毒序列。特别感兴趣的病毒序列包括以下各项的序列:线状病毒诸如依波拉病毒和马尔堡病毒(参见,例如,Geisbert等,J.Infect.Dis.(传染病杂志),193:1650-1657(2006));沙粒病毒诸如拉沙病毒、胡宁病毒(Junin virus)、马丘波病毒(Machupo virus)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)和Sabia病毒(Buchmeier等,Arenaviridae:the viruses and their replication(沙粒病毒科::病毒及其复制),在:FIELDS VIROLOGY(费氏病毒学),Knipe等(编),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia,(2001));流感病毒诸如流感A、B和C型病毒,(参见,例如,Steinhauer等,Annu Rev Genet(遗传学年度综述),36:305-332(2002);和Neumann等,J Gen Virol.(基因病毒学杂志),83:2635-2662(2002));肝炎病毒(参见,例如,Hamasaki等,FEBS Lett.(欧洲生物化学学会联盟通讯),543:51(2003);Yokota等,EMBO Rep.(EMBO 报告),4:602(2003);Schlomai等,Hepatology(肝脏病学),37:764(2003);Wilson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),100:2783(2003);Kapadia等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),100:2014(2003);和FIELDS VIROLOGY(费氏病毒学),Knipe等(编),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(2001));Human Immunodeficiency Virus(人免疫缺陷病毒)(HIV)(Banerjea等,Mol.Ther.(分子治疗),8:62(2003);Song等,J.Virol.(病毒学杂志),77:7174(2003);Stephenson,JAMA,289:1494(2003);Qin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),100:183(2003));疱疹病毒(Jia等,J.Virol.(病毒学杂志),77:3301(2003));和人乳头瘤病毒(HPV)(Hall等,J.Virol.(病毒学杂志),77:6066(2003);Jiang等,Oncogene(癌基因),21:6041(2002))。
能够被沉默的示范性线状病毒核酸序列包括,但不仅限于,编码结构蛋白(例如,VP30、VP35、核蛋白(NP)、聚合酶蛋白(L-pol))和膜相关蛋白(例如,VP40、糖蛋白(GP)、VP24)的核酸序列。依波拉病毒的完整基因组序列记述为,例如,Genbank编号NC_002549;AY769362;NC_006432;NC_004161;AY729654;AY354458;AY142960;AB050936;AF522874;AF499101;AF272001;和AF086833。依波拉病毒VP24序列记述为,例如,Genbank编号U77385和AY058897。依波拉病毒L-pol序列记述为,例如,Genbank编号X67110。依波拉病毒VP40序列记述为,例如,Genbank编号AY058896。依波拉病毒NP序列记述为,例如,Genbank编号AY058895。依波拉病毒GP序列记述为,例如,Genbank编号AY058898;Sanchez等,Virus Res(病毒研究).,29:215-240(1993);Will等,J.Virol.(病毒学杂志),67:1203-1210(1993);Volchkov等,FEBS Lett.(欧洲生物化学学会联盟通讯),305:181-184(1992);和美国专利号6,713,069。另外的依波拉病毒序列记述为,例如,Genbank编号L11365和X61274。马尔堡病毒的完整基因组序列记述为,例如,Genbank编号NC_001608;AY430365;AY430366;和AY358025。马尔堡病毒GP序列记述为,例如,Genbank编号AF005734;AF005733;和AF005732。马尔堡病毒VP35序列记述为,例如,Genbank编号AF005731和AF005730。另外的马尔堡病毒序列记述为,例如,Genbank编号X64406;Z29337;AF005735;和Z12132。靶向依波拉病毒和马尔堡病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括记述在美国专利公开号20070135370中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
能够被沉默的示范性流感病毒核酸序列包括,但不仅限于,编码核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)、非结构蛋白(NS1和NS2)、RNA聚合酶(PAPB1、PB2)、神经氨酸酶(NA)、和血凝素(H)的核酸序列。流感A型NP序列记述为,例如,Genbank编号NC_004522;AY818138;AB166863;AB188817;AB189046;AB189054;AB189062;AY646169;AY646177;AY651486;AY651493;AY651494;AY651495;AY651496;AY651497;AY651498;AY651499;AY651500;AY651501;AY651502;AY651503;AY651504;AY651505;AY651506;AY651507;AY651509;AY651528;AY770996;AY790308;AY818138;和AY818140。流感A型PA序列记述为,例如,Genbank编号AY818132;AY790280;AY646171;AY818132;AY818133;AY646179;AY818134;AY551934;AY651613;AY651610;AY651620;AY651617;AY651600;AY651611;AY651606;AY651618;AY651608;AY651607;AY651605;AY651609;AY651615;AY651616;AY651640;AY651614;AY651612;AY651621;AY651619;AY770995;和AY724786。靶向流感病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括记述在美国专利公开号20070218122中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
能够被沉默的示范性肝炎病毒核酸序列包括,但不仅限于,参与转录和翻译的核酸序列(例如,En1、En2、X、P)和编码结构蛋白(例如,核心蛋白包括C蛋白和C-相关蛋白,衣壳蛋白和包膜蛋白包括S蛋白、M蛋白、和/或L蛋白、或其片段)的核酸序列(参见,例如,Fields Virology(费氏病毒学),见上)。能够被沉默的示范性丙型肝炎病毒(HCV)核酸序列包括,但不仅限于,5’-非翻译区(5’-UTR)、3’-非翻译区(3’-UTR)、多聚蛋白翻译起始密码子区、内部核糖体进入位点(IRES)序列,和/或编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白酶/解旋酶、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和/或NS5B RNA-依赖性RNA聚合酶的核酸序列。HCV基因组序列记述为,例如,Genbank编号NC_004102(HCV基因型1a),AJ238799(HCV基因型1b),NC_009823(HCV基因型2),NC_009824(HCV基因型3),NC_009825(HCV基因型4),NC_009826(HCV基因型5),和NC_009827(HCV基因型6)。甲型肝炎病毒核酸序列记述为,例如,Genbank编号NC_001489;乙型肝炎病毒核酸序列记述为,例如,Genbank编号NC_003977;丁型肝炎病毒核酸序列记述为,例如,Genbank编号NC_001653;戊型肝炎病毒核酸序列记述为,例如,Genbank编号NC_001434;和庚型肝炎病毒核酸序列记述为,例如,Genbank编号NC_001710。编码与病毒感染和存活相关的基因的序列的沉默可以方便地与用于治疗病毒病症的常规药剂的施用联合使用。靶向肝炎病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括记述在美国专利公开号20060281175,20050058982,和20070149470;美国专利号7,348,314;和2009年3月20日提交的美国临时申请号61/162,127中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
与代谢性疾病和功能障碍(例如,其中肝是靶标的功能障碍以及肝疾病和功能障碍)相关的基因包括,例如,在血脂异常(例如,肝X受体诸如LXRα和LXRβ(Genback编号NM_007121),法尼酯X受体(FXR)(Genbank编号NM_005123),固醇调节元件结合蛋白(SREBP),位点-1蛋白酶(S1P),3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶-A还原酶(HMG辅酶-A还原酶),载脂蛋白B(ApoB)(Genbank编号NM_000384),载脂蛋白CIII(ApoC3)(Genbank编号NM_000040和NG_008949 REGION:5001..8164),和载脂蛋白E(ApoE)(Genbank编号NM_000041和NG_007084 REGION:5001..8612));和糖尿病(例如,葡萄糖6-磷酸酶)(参见,例如,Forman等,Cell(细胞),81:687(1995);Seol等,Mol.Endocrinol.(分子内分泌学),9:72(1995),Zavacki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),94:7909(1997);Sakai等,Cell(细胞),85:1037-1046(1996);Duncan等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志),272:12778-12785(1997);Willy等,Genes Dev.(基因发育),9:1033-1045(1995);Lehmann等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志),272:3137-3140(1997);Janowski等,Nature(自然),383:728-731(1996);和Peet等,Cell(细胞),93:693-704(1998))中表达的基因。本领域中技术人员应该理解与代谢性疾病和功能障碍(例如,其中肝是靶标的功能障碍以及肝疾病和功能障碍)相关的基因包括在肝本身中表达的基因以及在其他器官和组织中表达的基因。编码与代谢性疾病和功能障碍相关的基因的序列的沉默可以方便地与用于治疗所述疾病或功能障碍的常规药剂的施用联合使用。靶向ApoB基因的siRNA分子的非限制性实例包括记述在美国专利公开号20060134189中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。靶向ApoC3基因的siRNA分子的非限制性实例包括记述在2009年1月26日提交的美国临时申请号61/147,235中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
与肿瘤发生和细胞转化(例如,癌症或其他瘤形成)相关的基因序列的实例包括有丝分裂驱动蛋白诸如Eg5(KSP,KIF11;Genbank编号NM_004523);丝氨酸/苏氨酸激酶诸如polo样激酶1(PLK-1)(Genbank编号NM_005030;Barr等,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.(自然分子细胞生物学综述),5:429-440(2004));酪氨酸激酶诸如WEE1(Genbank编号NM_003390和NM_001143976);凋亡抑制剂诸如XIAP(Genbank编号NM_001167);COP9信号复合体(signalosome)亚基诸如CSN1,CSN2,CSN3,CSN4,CSN5(JAB1;Genbank编号NM_006837);CSN6,CSN7A,CSN7B,和CSN8;泛素连接酶诸如COP1(RFWD2;Genbank编号NM_022457和NM_001001740);和组蛋白脱乙酰酶诸如HDAC1,HDAC2(Genbank编号NM_001527),HDAC3,HDAC4,HDAC5,HDAC6,HDAC7,HDAC8,HDAC9,等。靶向Eg5和XIAP基因的siRNA分子的非限制性实例包括记述在2007年5月29日提交的美国专利申请号11/807,872中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。靶向PLK-1基因的siRNA分子的非限制性实例包括记述在美国专利公开号20050107316和20070265438;和2008年12月23日提交的美国专利申请号12/343,342中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。靶向CSN5基因的siRNA分子的非限制性实例包括记述在2008年4月15日提交的美国临时申请号61/045,251中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
与肿瘤发生和细胞转化相关的基因序列的其他实例包括易位序列诸如MLL融合基因,BCR-ABL(Wilda等,Oncogene(癌基因),21:5716(2002);Scherr等,Blood(血液),101:1566(2003)),TEL-AML1,EWS-FLI1,TLS-FUS,PAX3-FKHR,BCL-2,AML1-ETO,和AML1-MTG8(Heidenreich 等,Blood(血液),101:3157(2003));过表达序列诸如多重抗药性基因(Nieth等,FEBS Lett.(欧洲生物化学学会联盟通讯),545:144(2003);Wu等,Cancer Res.(癌症研究)63:1515(2003)),细胞周期蛋白(Li等,Cancer Res.(癌症研究),63:3593(2003);Zou等,Genes Dev.(基因发育),16:2923(2002)),β-连环蛋白(Verma等,Clin Cancer Res.(临床癌症研究),9:1291(2003)),端粒酶基因(Kosciolek等,Mol Cancer Ther.(分子癌症治疗),2:209(2003)),c-MYC,N-MYC,BCL-2,生长因子受体(例如,EGFR/ErbB1(Genbank编号NM_005228,NM_201282,NM_201283,和NM_201284;也参见,Nagy等Exp.Cell Res.(实验细胞研究),285:39-49(2003),ErbB2/HER-2(Genbank编号NM_004448和NM_001005862),ErbB3(Genbank编号NM_001982和NM_001005915),和ErbB4(Genbank编号NM_005235和NM_001042599);和突变序列诸如RAS(在Tuschl和Borkhardt,Mol.Interventions(分子干预),2:158(2002)中综述)。靶向EGFR基因的siRNA分子的非限制性实例包括记述在2007年5月29日提交的美国专利申请号11/807,872中的那些,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
发现编码DNA修复酶的序列的沉默在与化疗剂的施用结合的应用(Collis等,Cancer Res.(癌症研究),63:1550(2003))。编码与肿瘤迁移相关的蛋白的基因也是目标靶序列,例如,整联蛋白,选择蛋白,和金属蛋白酶。前述实例是不是排他的。本领域中技术人员应该理解可以包括有助于或促进肿瘤发生或细胞转化、肿瘤生长或肿瘤迁移的任何完整或部分基因序列作为模板序列。
血管发生基因能够促进新血管的形成。特别感兴趣的是血管内皮生长因子(VEGF)(Reich等,Mol.Vis.(分子视野),9:210(2003))或VEGFR。靶向VEGFR的siRNA序列记述在,例如,GB 2396864;美国专利公开号20040142895;和CA 2456444中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
抗-血管发生基因能够抑制新血管形成。这些基因特别有效用于治疗那些癌症,即其中血管发生在该疾病的病理学发展中起作用。抗-血管发生基因的实例包括,但不仅限于,内皮抑素(参见,例如,美国专利号6,174,861),血管抑素(参见,例如,美国专利号5,639,725),和VEGFR2(参见,例如,Decaussin等,J.Pathol.(病理学杂志),188:369-377(1999)),通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
免疫调节剂基因是调节一种或多种免疫应答的基因。免疫调节剂基因的实例包括,但不仅限于,细胞因子诸如生长因子(例如,TGF-α,TGF-β,EGF,FGF,IGF,NGF,PDGF,CGF,GM-CSF,SCF,等),白介素(例如,IL-2,IL-4,IL-12(Hill等,J.Immunol.(免疫学杂志),171:691(2003)),IL-15,IL-18,IL-20,等),干扰素(例如,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,等)和TNF。Fas和Fas配体基因也是目标免疫调节剂靶序列(Song等,Nat.Med.(自然医学),9:347(2003))。在造血细胞和淋巴样细胞中编码二级信号传导分子的基因也包括在本发明中,例如,Tec家族激酶诸如Bruton酪氨酸激酶(Btk)(Heinonen 等,FEBS Lett.(欧洲生物化学学会联盟通讯),527:274(2002))。
细胞受体配体包括能够结合细胞表面受体(例如,胰岛素受体,EPO受体,G-蛋白偶联受体,具有酪氨酸激酶活性的受体,细胞因子受体,生长因子受体,等),调节(例如,抑制,活化,等)受体参与的生理学途径(例如,葡萄糖水平调节,血细胞发育,有丝分裂发生,等)的配体。细胞受体配体的实例包括,但不仅限于,细胞因子,生长因子,白介素,干扰素,红细胞生成素(EPO),胰岛素,胰高血糖素,G-蛋白偶联受体配体,等。编码三核苷酸重复序列(例如,CAG重复序列)的延伸体的模板存在在由三核苷酸重复序列的延伸体引起的神经退行性疾病,诸如骨髓延髓肌肉萎缩(spinobulbular muscular atrophy)和亨廷顿病(Huntington’s Disease)中沉默致病序列的应用(Caplen等,Hum.Mol.Genet.(人类分子遗传学),11:175(2002))。
除其为了治疗目的沉默任何上述基因表达的效用外,本文中所述的siRNA还有效用于研究和开发应用以及诊断、预防、预后、临床、和其他卫生保健应用。作为非限制性实例,siRNA可以用于靶标验证研究,其目标为检测目标基因是否具有作为治疗性靶标的潜力。siRNA还可以用于靶标鉴定研究,其目标为发现作为潜在治疗性靶标的基因。
2.aiRNA
如同siRNA,不对称干扰RNA(aiRNA)可以募集RNA诱导的沉默复合物(RISC)并可以在哺乳动物细胞中通过介导靶序列在相对于反义链5’末端的核苷酸10和11之间的序列-特异性裂解,而导致多种基因的有效沉默(Sun等,Nat.Biotech.(自然生物技术),26:1379-1382(2008))。典型地,aiRNA分子包括具有有义链和反义链的短RNA双链体,其中所述双链体在反义链的3’和5’末端包含突出端。aiRNA通常是不对称的,因为在与互补反义链相比时有义链在两末端均较短。在一些方面中,aiRNA分子可以在与用于siRNA分子的条件相似的条件下进行设计、合成、和退火。作为非限制性实例,aiRNA序列可以利用上述用于选择siRNA序列的方法来选择和生成。
在另一个实施方案中,不同长度(例如,约10-25、12-20、12-19、12-18、13-17或14-17个碱基对,更典型地12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对)的aiRNA双链体可以设计为在反义链的3’和5’末端具有突出端,以靶向目标mRNA。在某些实例中,aiRNA分子的有义链是长度约10-25、12-20、12-19、12-18、13-17或14-17个核苷酸,更典型地长度12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在某些其他实例中,aiRNA分子的反义链是长度约15-60、15-50或15-40个核苷酸,更典型地长度约15-30、15-25或19-25个核苷酸,且优选地长度约20-24、21-22或21-23个核苷酸。
在一些实施方案中,5’反义突出端含有1、2、3、4、或更多个非靶向核苷酸(例如,“AA”、“UU”、“dTdT”,等)。在其他实施方案中,3’反义突出端含有1、2、3、4、或更多个非靶向核苷酸(例如,“AA”、“UU”、“dTdT”,等)。在某些方面,本文中所述的aiRNA分子可以包括一种或多种修饰的核苷酸,例如,在双链(双链体)区和/或在反义突出端中。作为非限制性实例,aiRNA序列可以包括一种或多种以上关于siRNA序列所述的修饰的核苷酸。在优选的实施方案中,aiRNA分子包括2’OMe核苷酸诸如,例如,2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸或其混合物。
在某些实施方案中,aiRNA分子可以包括反义链,所述反义链对应于siRNA分子,例如,本文中所述的siRNA分子之一的反义链。在其他实施方案中,aiRNA分子可以用于沉默如上所述的任一种靶基因的表达,诸如,例如与病毒感染和存活相关的基因,与代谢性疾病和功能障碍相关的基因,与肿瘤发生和细胞转化相关的基因,血管发生基因,免疫调节剂基因诸如与炎性反应和自身免疫应答相关的那些,配体受体基因,和与神经退行性疾病相关的基因。
3.miRNA
通常,微小RNA(miRNA)是长度约21-23个核苷酸的单链RNA分子,其调节基因表达。miRNA由来自转录它们的DNA的基因编码,但是miRNA不翻译为蛋白(非编码RNA);代替地,各初级转录物(pri-miRNA)加工为短茎-环结构,称为前miRNA并最终加工为功能上成熟的miRNA。成熟miRNA分子与一种或多种信使RNA(mRNA)分子部分或完全互补,且它们的重要功能是下调基因表达。miRNA分子的鉴定记述在,例如,Lagos-Quintana等,Science(科学),294:853-858;Lau等,Science(科学),294:858-862;和Lee等,Science(科学),294:862-864中。
编码miRNA的基因比加工的成熟miRNA分子长得多。miRNA迅速转录为具有帽和多聚A尾部的初级转录物或pri-miRNA,并在细胞核中加工为短、~70个核苷酸的茎-环结构,称为前miRNA。该加工过程在动物中通过称为微处理机复合物(Microprocessor complex)的蛋白复合物进行,所述微处理机复合物由核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白Pasha组成(Denli等,Nature(自然),432:231-235(2004))。这些前miRNA随后在细胞质中通过与核酸内切酶Dicer相互作用加工为成熟miRNA,这也启动了RNA诱导的沉默复合物(RISC)的形成(Bernstein等,Nature(自然),409:363-366(2001)。DNA的有义链或反义链均起作为用于产生miRNA的模板的功能。
当Dicer裂解前miRNA茎-环时,形成两个互补的短RNA分子,但仅一个整合到RISC复合物中。该链称为反引导链并且通过argonaute蛋白,即RISC复合物中的催化活性RNA酶,基于5’末端的稳定性来选择(Preall等,Curr.Biol.(现代生物学),16:530-535(2006))。剩余的链,称为反引导链或过客链,降解为RISC复合物底物(Gregory等,Cell(细胞),123:631-640(2005))。整合到活性RISC复合物中后,miRNA碱基与其互补mRNA分子配对并诱导靶mRNA降解和/或翻译沉默。
哺乳动物miRNA分子通常与靶mRNA序列的3’UTR中的位点互补。在,某些实例中,miRNA与靶mRNA的退火通过阻断蛋白翻译机器抑制蛋白翻译。在某些其他实例中,miRNA与靶mRNA的退火通过与RNA干扰(RNAi)类似的过程促进靶mRNA的裂解和降解。miRNA还可以靶向与靶mRNA相对应的基因组位点的甲基化。通常,与蛋白的互补体相关的miRNA功能总称为miRNP。
在某些方面中,本文中所述的miRNP分子长度约15-100、15-90、15-80、15-75、15-70、15-60、15-50或15-40个核苷酸,更典型地长度约15-30、15-25或19-25个核苷酸,且更优选地长度约20-24、21-22或21-23个核苷酸。在某些其他方面,miRNA分子可以包括一种或多种修饰的核苷酸。作为非限制性实例,miRNA序列可以包括一种或多种以上关于siRNA序列所述的修饰核苷酸。在优选的实施方案中,miRNA分子包括2’OMe核苷酸诸如,例如,2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸,或其混合物。
在一些实施方案中,miRNA分子可以用于沉默上述任一种靶基因的表达,诸如,例如,与病毒感染和存活相关的基因,与代谢性疾病和功能障碍相关的基因,与肿瘤发生和细胞转化相关的基因,血管发生基因,免疫调节剂基因诸如与炎性反应和自身免疫应答相关的那些,配体受体基因,和与神经退行性疾病相关的基因。
在其他实施方案中,一种或多种阻断miRNA靶向目标mRNA的活性的试剂利用本发明的脂质颗粒(例如,核酸-脂质颗粒)来施用。阻断剂的实例包括,但不仅限于,空间阻断寡核苷酸,锁核酸寡核苷酸,和吗啉代寡核苷酸。所述阻断剂可以直接与miRNA或与靶mRNA上的miRNA结合位点结合。
4.反义寡核苷酸
在一个实施方案中,核酸是针对靶基因或目标序列的反义寡核苷酸。术语“反义寡核苷酸”或“反义”包括与靶向的多核苷酸序列互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸是与所选序列互补的DNA或RNA的单链。反义RNA寡核苷酸通过与RNA结合阻止互补RNA链的翻译。反义DNA寡核苷酸可以用于靶向特异性、互补(编码或非编码)RNA。如果结合发生,则该DNA/RNA杂合体可以被酶RNA酶H降解。在特殊的实施方案中,反义寡核苷酸包括约10-约60个核苷酸,更优选约15-约30个核苷酸。该术语还包括可以不与所需靶基因精确互补的反义寡核苷酸。因此,本发明可以用在这样的情形中,其中使用反义发现非靶标特异性活性,或其中含有一个或多个与靶序列的错配的反义序列对于特殊应用是最优选的。
反义寡核苷酸已经证明是蛋白合成的有效靶向抑制剂,且因此,可以用于通过靶向的基因而特异性抑制蛋白合成。反义寡核苷酸抑制蛋白合成的功效是充分确定的。例如,多聚半乳糖醛酸酶和毒蝇碱2型乙酰胆碱受体的合成被针对其各自mRNA序列的反义寡核苷酸抑制(参见,美国专利号5,739,119和5,759,829)。此外,反义抑制的实例已经使用核蛋白细胞周期蛋白,多重抗药性基因(MDR1),ICAM-1,E-选择蛋白,STK-1,纹状体GABAA受体,和人EGF证明(参见,Jaskulski等,Science(科学),240:1544-6(1988);Vasanthakumar等,Cancer Commun.(癌症通讯),1:225-32(1989);Peris等,Brain Res Mol Brain Res.(脑研究和分子脑研究),15;57:310-20(1998);和美国专利号5,801,154;5,789,573;5,718,709和5,610,288)。而且,还已经描述了反义构建体,其抑制并可以用于治疗多种异常细胞增殖,例如,癌症(参见,美国专利号5,747,470;5,591,317;和5,783,683)。这些参考文献的公开内容通过引用整体引入本文中用于全部目的。
产生反义寡核苷酸的方法是本领域中已知的且可以容易地适合于产生靶向任何多核苷酸序列的反义寡核苷酸。选择对给定靶序列特异的反义寡核苷酸序列基于所选择的靶序列的分析和二级结构的确定,Tm,结合能,和相对稳定性。反义寡核苷酸可以基于它们形成二聚体、发夹、或其他二级结构的相对无能性来选择,它们形成二聚体、发夹、或其他二级结构会减少或抑制与宿主细胞中靶mRNA的特异性结合。mRNA的高度优选靶区域包括位于或接近AUG翻译起始密码子的那些区域和与mRNA的5’区基本互补的那些序列。这些二级结构分析和靶位点选择考虑可以,例如,利用OLIGO引物分析软件的v.4(Molecular Biology Insights)和/或BLASTN2.0.5算法软件(Altschul等,Nucleic Acids Res.(核酸研究),25:3389-402(1997))来进行。
5.核酶
根据本发明的另一个实施方案,核酸-脂质颗粒与核酶结合。核酶是具有特异性催化结构域的RNA-蛋白复合物,所述特异性催化结构域具有核酸内切酶活性(参见,Kim等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊).,84:8788-92(1987);和Forster等,Cell(细胞),49:211-20(1987))。例如,大量核酶以高特异性程度加速磷酸酯转移反应,这通常仅裂解寡核苷酸底物中若干磷酸酯之一(参见,Cech等,Cell(细胞),27:487-96(1981);Michel等,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志),216:585-610(1990);Reinhold-Hurek等,Nature(自然),357:173-6(1992))。该特异性已经归因于在化学反应前底物经由特异性碱基配对相互作用与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合的要求。
目前已知天然存在的酶性RNA分子的至少6种碱基变化性。每种可以在生理学条件下反向催化RNA磷酸二酯键的水解(并因此可以裂解其他RNA分子)。通常,酶性核酸通过首先与靶RNA结合来起作用。所述结合通过酶性核酸的靶标结合部分发生,所述靶标结合部分保持与起裂解靶RNA作用的分子的酶部分紧密靠近。因此,酶性核酸首先识别并随后通过互补配对结合靶RNA,并且一旦结合至正确位点,发挥酶作用以切断靶RNA。所述靶RNA的策略性裂解会破坏其引导编码蛋白合成的能力。在酶性核酸已经结合并裂解其RNA靶标后,其由该RNA释放,搜寻另一个靶标并能够反复地结合和裂解新靶标。酶性核酸分子可以以例如锤头、发夹、δ型肝炎病毒、I组内含子或RNaseP RNA(与RNA引导序列结合)、或链孢霉(Neurospora)VS RNA基序形成。锤头基序的特殊实例记述在,例如,Rossi等,Nucleic Acids Res.(核酸研究),20:4559-65(1992)中。发夹基序的实例记述在,例如,EP 0360257,Hampel等,Biochemistry(生物化学),28:4929-33(1989);Hampel等,Nucleic Acids Res.(核酸研究),18:299-304(1990);和美国专利号5,631,359中。δ型肝炎病毒基序的实例记述在,例如,Perrotta等,Biochemistry(生物化学),31:11843-52(1992)中。RNaseP基序的实例记述在,例如,Guerrier-Takada等,Cell(细胞),35:849-57(1983)中。链孢霉VS RNA核酶基序的实例记述在,例如,Saville等,Cell(细胞),61:685-96(1990);Saville等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),88:8826-30(1991);Collins等,Biochemistry(生物化学),32:2795-9(1993)中。I组内含子的实例记述在,例如,美国专利号4,987,071中。根据本发明使用的酶性核酸分子的重要特征是它们具有特异性底物结合位点,其位点与一个或多个靶基因DNA或RNA区互补,且它们在该底物结合位点内或周围具有赋予该分子RNA裂解活性的核苷酸序列。因此,核酶构建体不需要局限于本文中提到的特殊基序。这些参考文献的公开内容通过引用整体引入本文中用于全部目的。
生成靶向任何多核苷酸序列的核酶方法是本领域中已知的。核酶可以如例如,PCT公开号WO 93/23569和WO 94/02595中所述设计,并合成,从而如其中所述地体外和/或体内测试。这些PCT公开出版物的公开内容通过引用整体引入本文中用于全部目的。
核酶活性可以如下来优化:通过改变核酶结合臂的长度或化学合成具有阻止其被血清核糖核酸酶降解的修饰的核酶(参见,例如,PCT公开号WO 92/07065,WO 93/15187,WO 91/03162,和WO 94/13688;EP 92110298.4;和美国专利号5,334,711,其描述能够对酶性RNA分子的糖结构部分进行的多种化学修饰,其公开内容通过引用整体引入本文中用于全部目的),增强其在细胞中的功效的修饰,和去除茎II碱基以缩短RNA合成时间和减少化学需求。
6.免疫刺激性寡核苷酸
与本发明的脂质颗粒结合的核酸可以是免疫刺激性的,包括在施用于受试者时能够诱导免疫应答的免疫刺激性寡核苷酸(ISS;单链或双链),所述受试者可以是哺乳动物诸如人。ISS包括,例如,某些导致发夹二级结构的回文序列(参见,Yamamoto等,J.Immunol.(免疫学杂志),148:4072-6(1992)),或CpG基序,以及其他已知ISS特性(诸如多-G结构域;参见;PCT公开号WO 96/11266,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的)。
免疫刺激性核酸在不需要它们特异性结合并减小靶序列表达从而引起免疫应答时,被认为是非序列特异性的。因此,某些免疫刺激性核酸可以包括与天然存在基因或mRNA的区域相对应的序列,但是它们仍可以被认为是非序列特异性免疫刺激性核酸。
在一个实施方案中,免疫刺激性核酸或寡核苷酸包括至少一个CpG二核苷酸。寡核苷酸或CpG二核苷酸可以是未甲基化或甲基化的。在另一个实施方案中,免疫刺激性核酸包括至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。在一个实施方案中,核酸包括单CpG二核苷酸,其中CpG二核苷酸中的胞嘧啶是甲基化的。在备选的实施方案中,核酸包括至少2个CpG二核苷酸,其中CpG二核苷酸中的至少一个胞嘧啶是甲基化的。在另一个实施方案中,序列中存在的CpG二核苷酸中每个胞嘧啶是甲基化的。在另一个实施方案中,核酸包括许多CpG二核苷酸,其中至少一个CpG二核苷酸包括甲基化胞嘧啶。适合用于本发明的组合物和方法中的免疫刺激性寡核苷酸的实例记述在2008年12月31日提交的PCT申请号PCT/US08/88676,PCT公开号WO 02/069369和WO 01/15726,美国专利号6,406,705,和Raney等,J.Pharm.Exper.Ther.(药物实验治疗杂志),298:1185-92(2001)中,通过引用将其公开内容整体分别引入本文中用于全部目的。在某些实施方案中,在本发明的组合物和方法中使用的寡核苷酸在CpG基序中具有磷酸二酯(“PO”)主链或硫代磷酸酯(“PS”)主链,和/或至少一个甲基化胞嘧啶残基。
B.其他活性剂
在某些实施方案中,与本发明脂质颗粒相缔合的活性剂可以包括一种或多种治疗性蛋白、多肽、或小有机分子或化合物。所述治疗有效的试剂或药物的非限制性实例包括肿瘤学药物(例如,化疗药、激素治疗剂、免疫治疗剂、放射性治疗剂等)、降脂剂、抗病毒药、抗炎化合物、抗抑郁药、刺激物、止痛剂、抗生素、节育药、解热药、血管扩张剂、抗-血管发生药、细胞性血管剂(cytovascularagent)、信号转导抑制剂、心血管药诸如抗心律失常药、激素、血管收缩药、和类固醇。这些活性剂可以在本发明的脂质颗粒中单独施用,或与包含核酸诸如干扰RNA的本发明脂质颗粒组合施用(例如,共施用)。
化疗药的非限制性实例包括基于铂的药物(例如,奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、螺铂(spiroplatin)、异丙铂(iproplatin)、沙铂(satraplatin)、等)、烷化剂(例如、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)、氮芥(mechlorethamine)、乌拉莫司汀(uramustine)、塞替派(thiotepa)、亚硝基脲类(nitrosoureas)、等)、抗代谢药(例如、5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、等)、植物碱(例如、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉醇(paclitaxel)(泰素(taxol))、多西他赛(docetaxel)、等)、拓扑异构酶抑制剂(例如、伊立替康(irinotecan)(CPT-11;Camptosar)、托泊替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)(VP16)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、等)、抗肿瘤抗生素(例如、多柔比星(doxorubicin)、阿霉素(adriamycin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普卡霉素(plicamycin)、等)、酪氨酸激酶抑制剂(例如、吉非替尼(gefitinib)(易瑞沙
Figure BPA00001277238500611
(Iressa)),舒尼替尼(sunitinib)(Sutent
Figure BPA00001277238500613
SU11248)、厄洛替尼(erlotinib)(特罗凯
Figure BPA00001277238500614
(Tarceva
Figure BPA00001277238500615
);OSI-1774)、拉帕替尼(lapatinib)(GW572016;GW2016)、卡奈替尼(canertinib)(CI 1033)、司马沙尼(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)、伊马替尼(imatinib)(Gleevec
Figure BPA00001277238500616
STI571)、达沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)、来氟米特(leflunomide)(SU101)、凡德他尼(vandetanib)(ZactimaTM;ZD6474)、等)、其药用盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物、及它们的组合。
常规激素治疗剂的实例包括,但不仅限于,类固醇(例如,地塞米松(dexamethasone))、非那雄胺(finasteride)、芳香酶抑制药(aromatase inhibitors)、他莫昔芬(tamoxifen)、和戈舍瑞林(goserelin)以及其他促性腺素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonists)(GnRH)。
常规免疫治疗剂的实例包括,但不仅限于,免疫刺激剂(例如,卡介菌(Bacillus Calmette-Guérin)(BCG)、左旋咪唑(levamisole)、白介素-2、α-干扰素,等),单克隆抗体(例如,抗-CD20、抗-HER2、抗-CD52、抗-HLA-DR,和抗-VEGF单克隆抗体)、免疫毒素(例如,抗-CD33单克隆抗体-卡奇霉素(calicheamicin)缀合物、抗-CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)缀合物,等)和放射免疫疗法(例如,与111In、90Y、或131I缀合的抗-CD20单克隆抗体,等)。
常规放射性治疗剂的实例包括,但不仅限于,放射性核素诸如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、和212Bi,其任选地与针对肿瘤抗原的抗体缀合。
可以按照本发明使用的其他肿瘤学药物包括,但不仅限于,爱克兰(alkeran)、别嘌醇(allopurinol)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿糖胞苷(araC)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、贝沙罗汀(bexarotene)、卡氮芥(biCNU)、卡莫司汀(carmustine)、CCNU、塞来考昔(celecoxib)、克拉屈滨(cladribine)、环孢素(cyclosporin)A、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、环磷酰胺(cytoxan)、右雷佐生(dexrazoxane)、DTIC、雌莫司汀(estramustine)、依西美坦(exemestane)、FK506、吉妥珠单抗-奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin)、羟基脲(hydrea)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、干扰素、来曲唑(letrozole)、克拉屈滨(leustatin)、亮丙瑞林(leuprolide)、litretinoin、甲羟孕酮(megastrol)、L-PAM、美司钠(mesna)、甲氧沙林(methoxsalen)、光神霉素(mithramycin)、氮芥(nitrogen mustard)、帕米二磷酸(pamidronate)、培加酶(Pegademase)、喷司他丁(pentostatin)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、泼尼松(prednisone)、美罗华(rituxan)、链佐星(streptozocin)、STI-571、泰索帝(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、VM-26、托瑞米芬(toremifene)、维A酸(tretinoin)、ATRA、戊柔比星(valrubicin)、和硫酸长春碱制剂(velban)。可以按照本发明使用的肿瘤学药物的其他实例是玫瑰树碱(ellipticin)和玫瑰树碱类似物或衍生物、埃博霉素(epothilones)、胞内激酶抑制剂、和喜树碱(camptothecins)。
用于治疗与升高的甘油三酸酯、胆固醇,和/或葡萄糖相关的脂质疾病或功能障碍的降脂剂的非限制性实例包括他汀类(statins)、贝特类(fibrates)、依泽替米贝(ezetimibe)、噻唑啉二酮类(thiazolidinediones)、烟酸(niacin)、β-阻滞剂、硝酸甘油(nitroglycerin)、钙拮抗剂、鱼油、及其混合物。
抗病毒药的实例包括,但不仅限于,阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(aciclovir)、无环鸟苷(acyclovir)、阿德福韦(adefovir)、金刚烷胺(amantadine)、氨普那韦(amprenavir)、阿比朵尔(arbidol)、阿扎那韦(atazanavir)、atripla、西多福韦(cidofovir)、双汰芝(combivir)、地瑞那韦(darunavir)、地拉韦定(delavirdine)、去羟肌苷(didanosine)、二十二烷醇(docosanol)、依度尿苷(edoxudine)、依法韦仑(efavirenz)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩夫韦肽(enfuvirtide)、恩替卡韦(entecavir)、进入抑制剂(entry inhibitors)、泛昔洛韦(famciclovir)、固定剂量复合剂(fxed dose combinations)、福米韦生(fomivirsen)、呋山那韦(fosamprenavir)、膦甲酸(foscarnet)、膦乙酸(fosfonet)、融合抑制剂(fusioninhibitors)、更昔洛韦(ganciclovir)、伊巴他滨(ibacitabine)、异丙肌苷(imunovir)、碘苷(idoxuridine)、咪喹莫特(imiquimod)、茚地那韦(indinavir)、肌苷、整合酶抑制剂(integrase inhibitors)、干扰素III型(例如,IFN-λ分子诸如IFN-λ1、IFN-λ2、和IFN-λ3)、干扰素II型(例如,IFN-γ)、干扰素I型(例如,IFN-α诸如PEG化的IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω,和IFN-ζ)、干扰素、拉米夫定(lamivudine)、洛匹那韦(lopinavir)、洛韦胺(loviride)、MK-0518、马拉维诺(maraviroc)、吗啉胍(moroxydine)、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平(nevirapine)、nexavir、核苷类似物、奥塞米韦(oseltamivir)、喷昔洛韦(penciclovir)、帕拉米韦(peramivir)、普来可那立(pleconaril)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、蛋白酶抑制剂、反转录酶抑制剂、利巴韦林(ribavirin)、金刚乙胺(rimantadine)、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、司他夫定(stavudine)、协同增强剂、替诺福韦(tenofovir)、tenofovir disoproxil、替拉那韦(tipranavir)、曲氟尿苷(trifluridine)、三协唯(trizivir)、曲金刚胺(tromantadine)、truvada、伐昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、维立韦罗(vicriviroc)、阿糖腺苷(vidarabine)、利巴韦林类似物(viramidine)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)、齐多夫定(zidovudine),其药用盐、其立体异构体,其衍生物、其类似物、及其混合物。
V.脂质颗粒
本发明的脂质颗粒典型地包含活性剂或治疗剂、阳离子脂质、非-阳离子脂质、和抑制颗粒聚集的结合脂质。在一些实施方案中,所述活性剂或治疗剂完全包封在脂质颗粒的脂质部分内,从而使脂质颗粒内的活性剂或治疗剂在水溶液中对酶降解,例如通过核酸酶或蛋白酶的酶降解具有抗性。在其他实施方案中,本文中所述的脂质颗粒对哺乳动物诸如人基本无毒。本发明的脂质颗粒典型地具有平均直径约40nm-约150nm,约50nm-约150nm,约60nm-约130nm,约70nm-约110nm,或约70-约90nm。
在优选的实施方案中,本发明的脂质颗粒是血清稳定的核酸-脂质颗粒(SNALP),其包含干扰RNA(例如,siRNA,aiRNA,和/或miRNA)、阳离子脂质(例如,式I,II,和/或III的阳离子脂质)、非-阳离子脂质(例如,单独的胆固醇或一种或多种磷脂和胆固醇的混合物)和抑制颗粒聚集的结合脂质(例如,一种或多种PEG-脂质缀合物)。所述SNALP可以包括至少1、2、3\4、5、6、7、8、9、10,或更多未修饰和/或修饰的干扰RNA分子。核酸-脂质颗粒及其制备方法记述在,例如,美国专利号5,753,613;5,785,992;5,705,385;5,976,567;5,981,501;6,110,745;和6,320,017;和PCT公开号WO 96/40964中,通过引用将其公开内容整体分别引入本文中用于全部目的。
A.阳离子脂质
多种阳离子脂质中的任一种可以,单独地或与一种或多种其他阳离子脂质物种或非-阳离子脂质物种组合地用在本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)中。
有效用于本发明中的阳离子脂质可以是许多在生理学pH下带净正电荷的脂质物种中的任一种。这样的脂质包括,但不仅限于,N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羧乙基溴化铵(DMRIE)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、双十八基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺,顺式-9,12-十八二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3.β.-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺式-9’,1-2’-十八二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP),及它们的混合物。许多这些脂质和相关类似物已经记述在美国专利公开号20060083780和20060240554;美国专利号5,208,036;5,264,618;5,279,833;5,283,185;5,753,613;和5,785,992;和PCT公开号WO 96/10390中,通过引用将其公开内容整体分别引入本文中用于全部目的。另外,可获得许多商业阳离子脂质制剂并可以用于本发明。这些包括,例如,LIPOFECTIN
Figure BPA00001277238500651
(可商购的阳离子脂质体,其包含DOTMA和DOPE,来自GIBCO/BRL,Grand Island,纽约,美国);LIPOFECTAMINE
Figure BPA00001277238500652
(可商购的阳离子脂质体,其包含DOSPA和DOPE,来自GIBCO/BRL);和TRANSFECTAM
Figure BPA00001277238500653
(可商购的阳离子脂质体,其包含DOGS,来自Promega Corp.,Madison,威斯康星州,美国)。
另外,具有以下结构的式I阳离子脂质可用于本发明中。
Figure BPA00001277238500654
其中R1和R2独立选择并且是H或C1-C3烷基,R3和R4独立选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基,且R3和R4中至少一个包括至少2个不饱和位点。在某些实例中,R3和R4均相同,即,R3和R4均是亚油基(C18),等。在某些其他实例中,R3和R4不同,即,R3是十四碳三烯基(tetradectrienyl)(C14)且R4是亚油基(C18)。在优选的实施方案中,式I的阳离子脂质是对称的,即,R3和R4均相同。在另一个优选实施方案中,R3和R4均包括至少2个不饱和位点。在一些实施方案中,R3和R4独立选自由十二碳二烯基(dodecadienyl)、十四碳二烯基(tetradecadienyl)、十六碳二烯基(hexadecadienyl)、亚油基、和二十碳二烯基(icosadienyl)组成的组。在优选的实施方案中,R3和R4均是亚油基。在一些实施方案中,R3和R4包括至少3个不饱和位点且独立选自,例如,十二碳三烯基(dodecatrienyl),十四碳三烯基,十六碳三烯基(hexadecatrienyl),亚麻基(linolenyl),和二十碳三烯基(icosatrienyl)。在特别优选的实施方案中,式I的阳离子脂质是1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)或1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。
此外,具有以下结构的式II阳离子脂质有效用于本发明中。
Figure BPA00001277238500661
其中R1和R2独立选择并且是H或C1-C3烷基,R3和R4独立选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基,且R3和R4中至少一个包括至少2个不饱和位点。在某些实例中,R3和R4均相同,即,R3和R4均是亚油基(C18),等。在某些其他实例中,R3和R4不同,即,R3是十四碳三烯基(C14)且R4是亚油基(C18)。在优选的实施方案中,本发明的阳离子脂质是对称的,即,R3和R4均相同。在另一个优选实施方案中,R3和R4均包括至少2个不饱和位点。在一些实施方案中,R3和R4独立选自由十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、亚油基和二十碳二烯基组成的组。在优选的实施方案中,R3和R4均是亚油基。在一些实施方案中,R3和R4包括至少3个不饱和位点且独立选自,例如,十二碳三烯基、十四碳三烯基、十六碳三烯基、亚麻基和二十碳三烯基。
此外,具有以下结构的式III阳离子脂质(或其盐)有效用于本发明中。
Figure BPA00001277238500662
其中R1和R2相同或不同并独立地是任选取代的C12-C24烷基,任选取代的C12-C24烯基,任选取代的C12-C24炔基,或任选取代的C12-C24酰基;R3和R4相同或不同并独立地是任选取代的C1-C6烷基,任选取代的C1-C6烯基,或任选取代的C1-C6炔基或R3和R4可以结合形成任选取代的4-6个碳原子和1或2个选自氮和氧的杂原子的杂环;R5不存在或是氢或C1-C6烷基以提供季胺;m,n,和p相同或不同并独立地是0或1,条件是m,n,和p不同时为0;q是0,1,2,3,或4;且Y和Z相同或不同并独立地是O,S,或NH。
在一些实施方案中,式III的阳离子脂质是2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨乙基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-C2-DMA;“XTC2”)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(4-二甲基氨基丁基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-C4-DMA)、2,2-二亚油基-5-二甲基氨基甲基-[1,3]-二噁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-甲基pepiazino-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-MPZ)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-DMA)、1,2-二亚油基氨甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、氯化1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐(DLin-TMA.Cl)、氯化1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA),或其混合物。在优选的实施方案中,式III的阳离子脂质是DLin-K-C2-DMA(XTC2)。
阳离子脂质典型地占所述颗粒中存在的总脂质的约50mol%-约90mol%、约50mol%-约85mol%、约50mol%-约80mol%、约50mol%-约75mol%、约50mol%-约70mol%、约50mol%-约65mol%,或约55mol%-约65mol%。
本领域中技术人员应该清楚地,取决于该颗粒预期的应用,组分比例可以变化并且具体制剂的递送效率可以利用,例如,内体释放参数(ERP)测定来测量。
B.非-阳离子脂质
用于本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)中的非-阳离子脂质可以是多种能够产生稳定复合物的中性不带电、两性离子、或阴离子脂质中的任一种。
非-阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂诸如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、蛋黄鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、联十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反油酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱、及其混合物。也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选是源自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基、例如、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
非-阳离子脂质的另外的实例包括固醇类诸如胆固醇及其衍生物诸如胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆固醇基-2’-羟基乙醚、胆固醇基-4’-羟基丁醚,及其混合物。
在一些实施方案中,所述脂质颗粒(例如,SNALP)中存在的非-阳离子脂质包括胆固醇或其衍生物或由其组成,例如,无磷脂的脂质颗粒制剂。在其他实施方案中,所述脂质颗粒(例如,SNALP)中存在的非-阳离子脂质包括一种或多种磷脂或由其组成,例如,无胆固醇的脂质颗粒制剂。在其他实施方案中,所述脂质颗粒(例如,SNALP)中存在的非-阳离子脂质(例如,SNALP)包括一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物或由其组成。
适合用于本发明的非-阳离子脂质的其他实例包括不含磷的脂质诸如,例如,十八酰胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、硬脂酸十六烷酯(hexadecyl stereate)、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-硫酸月桂酯、硫酸烷基-芳基酯聚乙氧化脂肪酸酰胺、双十八基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂,等。
在一些实施方案中,非-阳离子脂质占所述颗粒中存在的总脂质的约13mol%-约49.5mol%、约20mol%-约45mol%、约25mol%-约45mol%、约30mol%-约45mol%、约35mol%-约45mol%、约20mol%-约40mol%、约25mol%-约40mol%或约30mol%-约40mol%。
在某些实施方案中,无磷脂脂质颗粒中存在的胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质的约30mol%-约45mol%、约30mol%-约40mol%、约35mol%-约45mol%或约35mol%-约40mol%。作为非限制性实例,无磷脂脂质颗粒可以包括占所述颗粒中存在的总脂质约37mol%的胆固醇。
在某些其他实施方案中,包含磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒中存在的胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质的约30mol%-约40mol%、约30mol%-约35mol%,或约35mol%-约40mol%。作为非限制性实例,包含磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒可以包括占所述颗粒中存在的总脂质约34mol%的胆固醇。
在其他实施方案中,包含磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒中存在的胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%、约15mol%-约25mol%或约17mol%-约23mol%。作为非限制性实例,包含磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒可以包括占所述颗粒中存在的总脂质约20mol%的胆固醇。
在这样的实施方案中,其中脂质颗粒包含磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物的混合物,所述混合物可以占所述颗粒中存在的总脂质的至多约40、45、50、55或60mol%。在某些实例中,所述混合物中的磷脂组分可以占所述颗粒中存在的总脂质的约2mol%-约12mol%、约4mol%-约10mol%、约5mol%-约10mol%、约5mol%-约9mol%或约6mol%-约8mol%。作为非限制性实例,包含磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒可以包括占所述颗粒中存在的总脂质约7mol%的磷脂诸如DPPC或DSPC(例如,在具有约34mol%胆固醇的混合物中)。在某些其他实例中,所述混合物中的磷脂组分可以占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%、约15mol%-约25mol%,或约17mol%-约23mol%。作为另一个非限制性实例,包含磷脂和胆固醇的混合物的脂质颗粒可以包括占所述颗粒中存在的总脂质约20mol%的磷脂诸如DPPC或DSPC(例如,在具有约20mol%胆固醇的混合物中)。
C.脂质缀合物
除阳离子和非阳离子脂质外,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)包括脂质缀合物。结合脂质是有效的,因为它防止颗粒聚集。合适的结合脂质包括,但不仅限于,PEG-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物、阳离子-聚合物-脂质缀合物(CPLs),及其混合物。在某些实施方案中,所述颗粒包括PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物以及CPL。
在优选的实施方案中,所述脂质缀合物是PEG-脂质。PEG-脂质的实例包括,但不仅限于,如,例如,PCT公开号WO 05/026372中所述的与二烷氧基丙基偶联的PEG(PEG-DAA),如记述在,例如,美国专利公开号20030077829和2005008689中的与二酰甘油偶联的PEG(PEG-DAG),与磷脂诸如磷脂酰乙醇胺偶联的PEG(PEG-PE),如记述在例如,美国专利号5,885,613中的与神经酰胺偶联的PEG,与胆固醇或其衍生物缀合的PEG,及其混合物。这些专利文件的公开内容通过引用整体结合与此用于全部目的。另外的PEG-脂质包括,但不仅限于,PEG-C-DOMG,2KPEG-DMG,及其混合物。
PEG是具有两个端羟基的乙烯PEG重复单元的线性、水溶性聚合物。PEG由其分子量分类;例如,PEG 2000具有约2,000道尔顿的平均分子量,且PEG 5000具有约5,000道尔顿的平均分子量。PEG可商购自Sigma Chemical Co.(西格玛化学公司)和其他公司并包括,例如,以下:单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。其他PEG诸如美国专利号6,774,180和7,053,150中记述的那些(例如,mPEG(20KDa)胺)也有效用于制备本发明的PEG-脂质缀合物。这些专利的公开内容通过引用整体结合与此用于全部目的。另外,单甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)特别有效用于制备PEG-脂质缀合物包括,例如,PEG-DAA缀合物。
本文中所述的PEG-脂质缀合物的PEG结构部分可以包括约550道尔顿-约10,000道尔顿范围内的平均分子量。在某些实例中,PEG结构部分具有约750道尔顿-约5,000道尔顿(例如,约1,000道尔顿-约5,000道尔顿、约1,500道尔顿-约3,000道尔顿、约750道尔顿-约3,000道尔顿、约750道尔顿-约2,000道尔顿,等)的平均分子量。在优选的实施方案中,PEG结构部分具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。
在某些实例中,PEG可以任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。PEG可以与脂质直接缀合或可以与脂质通过连接体结构部分相连接。可以使用任何适合于使PEG与脂质偶联的连接体结构部分包括,例如,不含酯的连接体结构部分和含酯的连接体结构部分。在优选的实施方案中,所述连接体结构部分是不含酯的连接体结构部分。用于本文中时,术语“不含酯的连接体结构部分”指不包含羧酸酯键(-OC(O)-)的连接体结构部分。合适的不含酯的连接体结构部分包括,但不仅限于,胺基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)、尿素(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、琥珀酰基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、琥珀酰胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物,及其组合(诸如包含氨基甲酸酯连接体结构部分和胺基连接体结构部分二者的连接体)。在优选的实施方案中,使用氨基甲酸酯连接体来偶联PEG和脂质。
在其他实施方案中,使用含酯的连接体结构部分来偶联PEG和脂质。合适的含酯的连接体结构部分包括,例如,碳酸酯(-OC(O)O-),琥珀酰基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯,及其组合。
具有不同链长度和饱和程度的多种酰基链基团的磷脂酰乙醇胺可以与PEG缀合形成脂质缀合物。这样的磷脂酰乙醇胺可商购,或可以利用本领域中技术人员已知的常规技术分离或合成。优选碳链长度在C10-C20范围内的包含饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酰-乙醇胺。也可以使用具有单-或二不饱和脂肪酸以及饱和和不饱和脂肪酸混合物的磷脂酰乙醇胺。合适的磷脂酰乙醇胺包括,但不仅限于,二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
术语“ATTA”或“聚酰胺”指,不仅限于,美国专利号6,320,017和6,586,559中记述的化合物,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。这些化合物包括具有下式的化合物:
Figure BPA00001277238500721
其中R是选自由氢、烷基和酰基组成的组中的成员;R1是选自由氢和烷基组成的组中的成员;或任选地,R和R1以及它们连接的氮形成叠氮结构部分;R2是选自由氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基和氨基酸侧链组成的组中的成员;R3是选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、巯基、肼基、氨基和NR4R5组成的组中的成员,其中R4和R5独立地是氢或烷基;n是4-80;m是2-6;p是1-4;且q是0或1。本领域中技术人员应该清楚的是其他聚酰胺可以用于本发明的化合物中。
术语“二酰甘油”指具有2个脂肪酰基链,R1和R2的化合物,所述R1和R2二者独立地具有2-30个碳,其通过酯键与甘油的1-和2-位结合。酰基可以是饱和的或具有不同的不饱和程度。合适的酰基包括,但不仅限于,月桂基(C12)、肉豆蔻基(C14)、棕榈基(C16)、硬脂基(C18)和二十烷基(C20)。在优选的实施方案中,R1和R2相同,即,R1和R2均是肉豆蔻基(即,二肉豆蔻基),R1和R2均是硬脂基(即,二硬脂基),等。二酰甘油具有以下通式:
术语“二烷氧基丙基”指具有2个烷基链,R1和R2的化合物,所述R1和R2二者独立地具有2-30个碳。烷基基团可以是饱和的或具有不同的不饱和程度。二烷氧基丙基具有以下通式:
Figure BPA00001277238500723
在优选的实施方案中,PEG-脂质是具有以下通式的PEG-DAA缀合物:
其中R1和R2独立地选择并且是具有约10-约22个碳原子的长链烷基基团;PEG是聚乙二醇;且L是如上所述的不含酯的连接体结构部分或含酯的连接体结构部分。所述长链烷基基团可以是饱和的或不饱和的。合适的烷基基团包括,但不仅限于,月桂基(C12),肉豆蔻基(C14),棕榈基(C16),硬脂基(C18),和二十烷基(C20)。在优选的实施方案中,R1和R2相同,即,R1和R2均是肉豆蔻基(即,二肉豆蔻基),R1和R2均是硬脂基(即,二硬脂基),等。
在上式VII中,PEG具有约550道尔顿-约10,000道尔顿范围内的平均分子量。在某些实例中,PEG具有约750道尔顿-约5,000道尔顿(例如,约1,000道尔顿-约5,000道尔顿,约1,500道尔顿-约3,000道尔顿,约750道尔顿-约3,000道尔顿,约750道尔顿-约2,000道尔顿,等)的平均分子量。在优选的实施方案中,PEG具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。PEG可以任选地用烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中,末端羟基基团用乙氧基或甲基取代。
在优选的实施方案中,“L”是不含酯的连接体结构部分。合适的不含酯的连接体包括,但不仅限于,胺基连接体结构部分、氨基连接体结构部分、羰基连接体结构部分、氨基甲酸酯连接体结构部分、尿素连接体结构部分、醚连接体结构部分、二硫化物连接体结构部分、琥珀酰胺基连接体结构部分,及其组合。在优选的实施方案中,所述不含酯的连接体结构部分是氨基甲酸酯连接体结构部分(即,PEG-C-DAA缀合物)。在另一个优选实施方案中,所述不含酯的连接体结构部分是胺基连接体结构部分(即,PEG-A-DAA缀合物)。在另一个优选实施方案中,所述不含酯的连接体结构部分是琥珀酰胺基连接体结构部分(即,PEG-S-DAA缀合物)。
在特殊的实施方案中,PEG-脂质缀合物选自:
Figure BPA00001277238500741
PEG-DAA缀合物利用本领域中技术人员已知的标准技术和试剂来合成。应该认识到PEG-DAA缀合物会包含多种酰胺、胺、醚、硫代、氨基甲酸酯、和尿素键。本领域中技术人员应该认识到用于形成这些键的方法和试剂是公知的且容易获得。参见,例如,March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY(现代有机化学)(Wiley 1992);Larock,COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(综合有机转化)(VCH 1989);和Furniss,VOGEL’S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY(VOGEL应用有机化学教科书),第5版(Longman 1989)。还应该理解,存在的任何官能团可能在PEG-DAA缀合物合成中的不同点时需要保护和去保护。本领域中技术人员应该认识到这样的技术是公知的。参见,例如,Green和Wuts,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(有机合成中的保护基)(Wiley 1991)。
优选地,PEG-DAA缀合物是二月桂基氧基丙基(C12)-PEG缀合物,二肉豆蔻基氧基丙基(C14)-PEG缀合物,二棕榈基氧基丙基(C16)-PEG缀合物,或二硬脂基氧基丙基(C18)-PEG缀合物。本领域中技术人员应该容易理解其他二烷氧基丙基可以用于本发明的PEG-DAA缀合物。
除前述外,本领域中技术人员应该容易清楚的是,其他亲水聚合物可以代替PEG使用。可以代替PEG使用的合适聚合物实例包括,但不仅限于,聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸,和衍生的纤维素诸如羟基甲基纤维素或羧乙基纤维素。
除前述组分外,本发明的颗粒(例如,SNALP或SPLP)还可以包括阳离子聚(乙二醇)(PEG)脂质或CPL(参见,例如,Chen等,Bioconj.Chem.(生物缀合化学),11:433-437(2000))。用于本发明的合适SPLP和SPLP-CPL,和制备和使用SPLP和SPLP-CPL的方法公开在,例如美国专利号6,852,334和PCT公开号WO 00/62813中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
合适的CPL包括式VIII的化合物:
A-W-Y  (VIII),
其中A,W,和Y如下所述。
关于式VIII,“A”是起脂质锚定作用的脂质结构部分诸如两性脂质,中性脂质,或疏水性脂质。合适的脂质实例包括,但不仅限于,二酰基甘油基,二烷基甘油基,N-N-二烷基氨基,1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷,和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
“W”是聚合物或低聚物诸如亲水聚合物或低聚物。优选地,所述亲水聚合物是非免疫原性或具有低固有免疫原性的生物相容聚合物。备选地,所述亲水聚合物如果与适当的佐剂一起使用可以是弱抗原性的。合适的非免疫原性聚合物包括,但不仅限于,PEG,聚酰胺,聚乳酸,聚乙醇酸,聚乳酸/聚乙醇酸共聚物,及其组合。在优选的实施方案中,所述聚合物具有约250-约7,000道尔顿的分子量。
“Y”是聚阳离子结构部分。术语聚阳离子结构部分指在所选pH,优选生理学pH下带正电荷,优选至少2个正电荷的化合物、衍生物或官能团。合适的聚阳离子结构部分包括碱性氨基酸及其衍生物诸如精氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,赖氨酸,和组氨酸;精胺;亚精胺;阳离子树枝状大分子;聚胺;聚胺糖;和氨基多糖。所述聚阳离子结构部分可以在结构上是线性的,诸如线性四赖氨酸,分支的或树枝状的。聚阳离子结构部分在所选pH值下具有约2-约15个正电荷,优选约2-约12个正电荷,且更优选约2-约8个正电荷。选择使用哪种聚阳离子结构部分可以通过所需的颗粒应用类型来确定。
聚阳离子结构部分上的电荷可以围绕整个颗粒结构部分分布,或备选地,它们可以是在处于颗粒结构部分的一个特殊区域例如电荷峰(spike)中离散浓度的电荷密度。如果电荷密度分布在颗粒上,则电荷密度可以平均分布或不平均分布。聚阳离子结构部分的电荷分布的所有变化包括在本发明中。
脂质“A”和非免疫原性聚合物“W”可以通过不同方法和优选通过共价连接来连接。本领域中技术人员已知的方法可以用于“A”和“W”的共价连接。合适的键包括,但不仅限于,酰胺、胺、羧基、碳酸酯、氨基甲酸酯、酯、和腙键。本领域中技术人员应该清楚“A”和“W”必须具有互补的官能团以完成键合。这两个基团(一个在所述脂质上且另一个在所述聚合物上)的反应将提供所需的键。例如,当脂质是二酰甘油且末端羟基被例如NHS和DCC活化以形成活性酯并然后与包含氨基基团的聚合物,诸如聚酰胺反应时(参见,例如,美国专利号6,320,017和6,586,559,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的),这两个基团之间将形成酰胺键。
在某些实例中,所述聚阳离子结构部分可以具有连接的配体,诸如靶向配体或用于络合钙的螯合结构部分。优选地,当配体连接后,阳离子结构部分保持正电荷。在某些实例中,连接的配体具有正电荷。合适的配体包括,但不仅限于,具有反应性官能团的化合物或装置并且包括脂质、两亲性脂质、载体化合物、生物亲合化合物、生物材料、生物聚合物、生物医学装置、可分析检测的化合物、治疗活性化合物、酶、肽、蛋白、抗体、免疫刺激剂、放射性标记物、荧光团、生物素、药物、半抗原、DNA、RNA、多糖、脂质体、病毒体、微团、免疫球蛋白、官能团、其他靶向结构部分,或毒素。
所述脂质缀合物(例如,PEG-脂质)典型地占所述颗粒中存在的总脂质的约0.1mol%-约2mol%、约0.5mol%-约2mol%、约1mol%-约2mol%、约0.6mol%-约1.9mol%、约0.7mol%-约1.8mol%、约0.8mol%-约1.7mol%、约0.9mol%-约1.6mol%、约0.9mol%-约1.8mol%、约1mol%-约1.8mol%、约1mol%-约1.7mol%、约1.2mol%-约1.8mol%、约1.2mol%-约1.7mol%、约1.3mol%-约1.6mol%,或约1.4mol%-约1.5mol%。
本领域中技术人员应该理解脂质缀合物的浓度可以发生变化,取决于所用脂质缀合物和核酸-脂质颗粒形成融合的速率。
通过控制脂质缀合物的组成和浓度,人们可以控制使脂质缀合物从核酸-脂质颗粒中交换出来的速率,和随即使核酸-脂质颗粒形成融合体的速率。例如,当PEG-磷脂酰乙醇胺缀合物或PEG-神经酰胺缀合物用作脂质缀合物时,使核酸-脂质颗粒形成融合体的速率可以例如通过改变脂质缀合物浓度,通过改变PEG分子量,或通过改变磷脂酰乙醇胺或神经酰胺上酰基链基团的链长度和饱和程度而变化。另外,其他变量包括,例如,pH、温度、离子强度等可以用于改变和/或控制使核酸-脂质颗粒形成融合体的速率。本领域中技术人员在阅读本发明公开内容时应该清楚可以用于控制使核酸-脂质颗粒形成融合体的速率的其他方法。
VI.制备脂质颗粒
本发明的脂质颗粒,例如,SNALP,其中活性剂或治疗剂诸如干扰RNA包封在脂质双分子层中且受到保护免受降解,可以通过任何本领域中已知的任何方法包括,但不仅限于,连续混合法或直接稀释法来形成。
在优选的实施方案中,阳离子脂质是式I、II、和III的脂质,或其组合。在其他优选实施方案中,非-阳离子脂质是蛋黄鞘磷脂(ESM),二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC),二油酰磷脂酰胆碱(DOPC),1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC),二棕榈酰基-磷脂酰胆碱(DPPC),单甲基-磷脂酰乙醇胺,二甲基-磷脂酰乙醇胺,14:0 PE(1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)),16:0 PE(1,2-二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)),18:0 PE(1,2-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)),18:1 PE(1,2-二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)),18:1反式PE(1,2-二反油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)),18:0-18:1PE(1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)),16:0-18:1 PE(1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)),基于聚乙二醇的聚合物(例如,PEG 2000,PEG 5000,PEG-改性的二酰甘油,或PEG-改性的二烷氧基丙基),胆固醇,或其组合。
在某些实施方案中,本发明提供通过连续混合法,例如,包括以下步骤的过程产生的SNALP:在第一储槽中提供包含核酸诸如干扰RNA的水溶液,在第二储槽中提供有机脂质溶液,并混合所述水溶液和有机脂质溶液以使得有机脂质溶液与水溶液混合从而基本立即产生包封该核酸(例如,干扰RNA)的脂质体。该过程和用于执行该过程的装置详细记述在美国专利公开号20040142025中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
将脂质和缓冲溶液连续引入混合环境,诸如混合室中的行为导致用缓冲溶液连续稀释脂质溶液,由此在混合时基本上立即产生脂质体。用于本文中时,短语“用缓冲溶液连续稀释脂质溶液”(和变体)通常意指脂质溶液在水合过程中以充足压力充分迅速地稀释从而完成小泡的产生。通过混合包含核酸的水溶液和有机脂质溶液,有机脂质溶液在缓冲溶液(即,水溶液)的存在下经历连续的逐步稀释,从而产生核酸-脂质颗粒。
利用连续混合法形成的SNALP典型地具有约40nm-约150nm,约50nm-约150nm,约60nm-约130nm,约70nm-约110nm,或约70nm-约90nm的尺寸。由此形成的颗粒不聚集并且任选地调节尺寸以获得统一的颗粒尺寸。
在另一个实施方案中,本发明提供通过直接稀释法产生的SNALP,所述直接稀释法包括形成脂质体溶液和立即并直接将脂质体溶液引入至容纳受控量的稀释缓冲液的收集容器中。在优选的方面,收集容器包括一种或多种配置为搅拌收集容器内容物以促进稀释的部件。在一方面,收集容器中存在的稀释缓冲液的量基本等于向其中引入的脂质体溶液的体积。作为非限制性实例,处于45%乙醇中的脂质体溶液在引入至含有等体积稀释缓冲液的收集容器中时,将有利地产生较小的颗粒。
在另一个实施方案中,本发明提供通过直接稀释法产生的SNALP,其中容纳稀释缓冲液的第三储槽与第二混合区流体相连。在该实施方案中,在第一混合区内形成的脂质体溶液立即并直接与第二混合区中的稀释缓冲液混合。在优选的方面,第二混合区包括T-连接器,所述T-连接器配置成使得脂质体溶液流和稀释缓冲液流作为180°反向流相遇;然而,可以使用提供较浅角度,例如约27°-约180°的连接器。泵机构将可控缓冲液流递送至第二混合区。在一方面,将提供至第二混合区的稀释缓冲液流速控制为基本等于将脂质体溶液由第一混合区引入其中的流速。该实施方案有利地容许更好地控制在第二混合区内与脂质体溶液混合的稀释缓冲液流,并因此还更好地在整个第二混合过程中控制脂质体溶液的浓度。所述稀释缓冲液流速的控制有利地容许在较低的浓度下形成小的粒度。
这些方法和执行这些直接稀释方法的装置详细记述在美国专利公开号20070042031中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
利用直接稀释法形成的SNALP典型地具有约40nm-约150nm,约50nm-约150nm,约60nm-约130nm,约70nm-约110nm,或约70nm-约90nm的尺寸。由此形成的颗粒不聚集并且任选地调节尺寸以获得统一的颗粒尺寸。
如果需要,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)可以通过任何可用于调节脂质体尺寸的方法来调节尺寸。可以进行尺寸调节,以获得所需的尺寸范围和相对窄的粒度分布。
存在若干用于将颗粒调节至所需尺寸的技术。一种尺寸调节方法,其用于脂质体并同样适用于本发明颗粒,记述在美国专利号4,737,323中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。通过浴槽(bath)或探头超声波降解法来超声波处理颗粒混悬液产生尺寸渐进地缩小至尺寸小于约50nm的颗粒。均质化是另一种依赖剪切能使较大颗粒碎裂为较小颗粒的方法。在典型的均质化步骤中,颗粒通过标准乳化均质器再循环直至观察到所选的粒度,典型地在约60-约80nm之间。在这两种方法中,粒度分布可以通过常规激光束粒度判定,或QELS来监测。
颗粒通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶膜挤出也是一种将粒度减小至相对明确的粒度分布的有效方法。典型地,混悬液经过膜循环一次或多次直至获得所需的粒度分布。颗粒可以连续地通过小孔膜挤出,以获得尺寸的逐渐减小。
在一些实施方案中,预先浓缩SNALP中的核酸,如,例如,美国专利申请号09/744,103中所述,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
在其他实施方案中,该方法应该还包括加入非脂质聚阳离子,其利用本发明的组合物用于实现细胞的脂质转染。合适的非脂质聚阳离子的实例包括,海美溴铵(hexadimethrine bromide)(以商品名POLYBRENE
Figure BPA00001277238500791
销售,来自Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,威斯康星州,美国)或其他己二甲铵盐。其他合适的聚阳离子包括,例如,聚-L-鸟氨酸,聚-L-精氨酸,聚-L-赖氨酸,聚-D-赖氨酸,聚烯丙胺,和聚乙烯亚胺的盐。这些盐的添加优选在颗粒已经形成后。
在一些实施方案中,形成的SNALP中的核酸与脂质的比(质量/质量比)应该在约0.01-约0.2,约0.02-约0.1,约0.03-约0.1,或约0.01-约0.08的范围内。起始物质的比也属于该范围。在其他实施方案中,SNALP制备使用约400μg核酸/10mg总脂质或核酸与脂质的质量比为约0.01-约0.08且,更优选地,约0.04,这对应于1.25mg总脂质/50μg核酸。在其他优选实施方案中,颗粒具有约0.08的核酸∶脂质质量比。
在其他实施方案中,形成的SNALP中的脂质与核酸的比(质量/质量比)应该在约1(1∶1)-约100(100∶1),约5(5∶1)-约100(100∶1),约1(1∶1)-约50(50∶1),约2(2∶1)-约50(50∶1),约3(3∶1)-约50(50∶1),约4(4∶1)-约50(50∶1),约5(5∶1)-约50(50∶1),约1(1∶1)-约25(25∶1),约2(2∶1)-约25(25∶1),约3(3∶1)-约25(25∶1),约4(4∶1)-约25(25∶1),约5(5∶1)-约25(25∶1),约5(5∶1)-约20(20∶1),约5(5∶1)-约15(15∶1),约5(5∶1)-约10(10∶1),约5(5∶1),6(6∶1),7(7∶1),8(8∶1),9(9∶1),10(10∶1),11(11∶1),12(12∶1),13(13∶1),14(14∶1),或15(15∶1)的范围内。起始物质的比也属于该范围。
如前所述,结合脂质还可以包括CPL。在本文中讨论许多制备SNALP-CPLs(含CPL的SNALP)的一般方法。两种一般技术包括“插入后”技术,即将CPL插入至,例如,预先形成的SNALP中,和“标准”技术,其中CPL在例如,SNALP形成步骤过程中包括在脂质混合物中。插入后技术产生具有主要位于SNALP双分子层膜的外侧面中的CPL的SNALP,而标准技术提供具有处于内侧面和外侧面上的CPL的SNALP。该方法特别有效用于由磷脂制备的小泡(其可以包含胆固醇)并还特别有效用于包含PEG-脂质(诸如PEG-DAA和PEG-DAG)的小泡。制备SNALP-CPL的方法,在例如美国专利号5,705,385;6,586,410;5,981,501;6,534,484;和6,852,334;美国专利公开号20020072121;和PCT公开号WO 00/62813中教导,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。
VII.试剂盒
本发明还提供采用试剂盒形式的脂质颗粒(例如,SNALP)。所述试剂盒可以包括划分为容纳脂质颗粒的各种成分(例如,活性剂或治疗剂诸如核酸和颗粒的各种脂质成分)的容器。在一些实施方案中,所述试剂盒还包括内体膜去稳定剂(例如,钙离子)。所述试剂盒典型地包含优选采用脱水形式的本发明的脂质颗粒组合物和它们再水合和施用的说明书。
如本文中所述,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)可以定制为优先地靶向特殊的目标组织、器官、或肿瘤。在某些实例中,脂质颗粒诸如SNALP的优先靶向可以通过控制颗粒组分本身来进行。例如,如实施例11中所述,已经发现1∶57 PEG-cDSA SNALP制剂可以用于优先地靶向肝外的肿瘤,而1∶57 PEG-cDMA SNALP制剂可以用于优先地靶向肝(包括肝肿瘤)。
在某些其他实例中,可能需要使靶向结构部分与脂质颗粒表面连接,从而进一步增强颗粒的靶向性。使靶向结构部分(例如,抗体、蛋白等)与脂质(诸如本发明颗粒中使用的那些)相连接的方法是本领域中技术人员已知的。
VII.脂质颗粒的施用
一旦形成,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)有效用于将活性剂或治疗剂(例如,核酸诸如干扰RNA)引入至细胞。因此,本发明还提供用于将活性剂或治疗剂诸如核酸(例如,干扰RNA)引入至细胞中的方法。该方法通过以下步骤体外或体内进行:首先形成如上所述的颗粒,然后使该颗粒与细胞相接触以足以发生活性剂或治疗剂至细胞的递送的一段时间。
本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)可以吸附于几乎任何与其相混合或相接触的细胞类型。一旦吸附,该颗粒可以被细胞的一部分内吞,与细胞膜交换脂质,或与细胞融合。颗粒的活性剂或治疗剂(例如,核酸)部分的转移或结合可以通过这些途径的任意一种发生。具体地,当融合发生时,颗粒膜整合到细胞膜中并且颗粒的内容物与胞内流体结合。
本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)可以单独地或以与药用载体(例如生理盐水或磷酸盐缓冲液)的混合物施用,所述药用载体根据给药途径和标准药物实践来选择。通常,标准缓冲盐水(例如,135-150mM NaCl)应该作为药用载体来使用。其他合适的载体包括,例如,水、缓冲水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等,包括用于增加稳定性的糖蛋白,诸如白蛋白,脂蛋白,球蛋白等。另外的合适载体记述在,例如,REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿制药科学),Mack Publishing Company(马克出版公司),费城,PA,第17版(1985)中。用于本文中时,“载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬液、胶体等。短语“药用的”指在施用于人时不产生变态反应或类似不利反应的分子实体和组合物。
药用载体一般在颗粒形成后加入。因此,在颗粒形成后,可以将颗粒稀释至药用载体诸如标准缓冲盐水中。
药物制剂中颗粒的浓度可以广泛变化,即,由小于约0.05重量%,通常处于或至少约2-5重量%,到至多约10-90重量%,并且主要根据所选择的具体给药模式通过流体体积、粘度等来选择。例如,可以增加浓度以降低与治疗相关的流体负荷。这在具有与动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压的患者中可能特别理想。备选地,可以将由刺激性脂质制成的颗粒稀释至低浓度,从而减轻给药部位处的炎症。
本发明的药物组合物可以通过常规、公知灭菌技术来灭菌。水溶液可以包装备用或在无菌条件下过滤并冻干,冻干的制剂在施用前与无菌水溶液结合。所述组合物可以根据需要包含药用助剂物质,以接近生理条件,诸如pH调节和缓冲剂,张力调节剂等,例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、和氯化钙。另外,颗粒混悬液可以包括脂质-保护剂,其在存储中保护脂质免受自由基和脂质-过氧化破坏。亲脂性自由基猝灭剂,诸如α生育酚和水溶性离子特异性螯合剂,诸如铁草胺(ferrioxamine)是适合的。
A.体内施用
用于体内治疗的全身递送,例如,通过身体系统诸如循环将治疗性核酸递送至远隔靶细胞,已经利用核酸-脂质颗粒诸如PCT公开号WO 05/007196,WO 05/121348,WO 05/120152,和WO 04/002453中记述的那些实现了,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。本发明还提供完全包封的脂质颗粒,其保护核酸免于在血清中被核酸酶降解,是非免疫原性的,尺寸很小,并且适合于反复给药。
为了体内施用,给药可以采用本领域中已知的任何方式,例如,通过注射、口服给药、吸入(例如,鼻内或气管内)、经皮施用、或直肠给药。给药可以通过单次或分次剂量来实现。所述药物组合物可以经肠胃外,即关节内、静脉内、腹膜内、皮下、或肌内施用。在一些实施方案中,所述药物组合物通过推注注射静脉内或腹膜内施用(参见,例如,美国专利号5,286,634)。胞内核酸递送也已经在Straubringer等,Methods Enzymol.(酶学方法),101:512(1983);Mannino等,Biotechniques(生物技术),6:682(1988);Nicolau等,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.(治疗药物载体系统评述),6:239(1989);和Behr,Acc.Chem.Res.(化学研究报告),26:274(1993)中讨论。施用基于脂质的治疗剂的其他方法记述在,例如,例如,美国专利号3,993,754;4,145,410;4,235,871;4,224,179;4,522,803;和4,588,578中。脂质颗粒可以通过在疾病部位处直接注射或通过在远离疾病部位的部位处注射来施用(参见,例如,Culver,HUMAN GENE THERAPY(人类基因治疗),MaryAnn Liebert,Inc.,Publishers,纽约.第70-71页(1994))。上述参考文献的公开内容通过引用整体引入本文中用于全部目的。
本发明的组合物,可以单独地或与其他合适成分组合地制成气雾制剂(即,它们可以被“雾化”),从而通过吸入(例如,鼻内或气管内)施用(参见,Brigham等,Am.J.Sci.(美国科学杂志),298:278(1989))。气雾制剂可以置于容许加压的推进剂,诸如二氯二氟甲烷,丙烷,氮等中。
在某些实施方案中,所述药物组合物可以通过鼻内喷雾、吸入、和/或其他气雾剂递送媒介物来递送。用于将核酸组合物通过鼻腔气雾剂喷雾直接递送至肺的方法已经记述在,例如,美国专利号5,756,353和5,804,212中。同样地,利用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利5,725,871)的药物递送也是制药领域中公知的。类似地,采用聚四氟乙烯载体基质的形式透粘膜药物递送记述在美国专利号5,780,045中。上述专利的公开内容通过引用整体引入本文中用于全部目的。
适合于肠胃外给药,诸如,例如,通过关节内(关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内、和皮下途径的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液,其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使该制剂与目的接受者的血液等渗的溶质,和可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂的水性和非水性无菌混悬液。在本发明的实践中,组合物优选,例如通过静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内、或鞘内施用。
一般地,当静脉内施用时,脂质颗粒制剂使用合适的药物载体配制。许多药用载体可以用于本发明的组合物和方法中。用于本发明的合适制剂参见,例如,REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿制药科学),Mack Publishing Company(马克出版公司),费城,PA,第17版(1985)中。可以使用多种水性载体,例如,水、缓冲水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等,并且可以包括用于增强稳定性的糖蛋白,诸如白蛋白,脂蛋白,球蛋白等。通常,标准缓冲盐水(例如,135-150mM NaCl)应该作为药用载体来使用,但其他合适的载体应该能够胜任。这些组合物可以通过常规脂质体灭菌技术诸如过滤来灭菌。所述组合物可以如所需地包含药用助剂物质,以接近生理条件,诸如pH调节和缓冲剂,张力调节剂,润湿剂等,例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。这些组合物可以利用上面提到的技术灭菌或,备选地,它们可以在无菌条件下产生。由此生成的水溶液可以包装备用或在无菌条件下过滤并冻干,冻干的制剂在施用前与无菌水溶液结合。
在某些应用中,本文中公开的脂质颗粒可以经由口服给药递送至个体。颗粒可以与赋形剂结合并以可摄取的片剂、口含片剂、含片(troche)、胶囊剂、丸剂、锭剂(lozenge)、酏剂、漱口药、混悬液、口腔喷雾剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等(参见,例如,美国专利号5,641,515,5,580,579,和5,792,451,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的)。这些口服剂型还可以包含以下:粘合剂,明胶;赋形剂,润滑剂,和/或调味剂。当单位剂型是胶囊剂时,其除上述物质外,可以含有脂质载体。多种其他物质可以作为包衣存在或另外对剂量单位的外形进行改性。当然,制备任何单位剂量中使用的任何物质应该是药物纯的且在使用量中是基本无毒的。
典型地,这些口服制剂可以含有至少约0.1%脂质颗粒或更多,尽管颗粒的百分比当然可以不同,并可以方便地为总制剂重量或体积约1%或2%-约60%或70%或更多之间。自然地,在可以制备的每种治疗有效的组合物中颗粒的量是这样的方式,即应该在任意给定单位剂量的化合物中获得合适剂量。制备所述药物制剂的领域中的技术人员应该考虑一些因素诸如溶解性、生物利用度、生物半衰期、给药途径、产品保存期、以及其他药理学考虑因素,并且同样地,许多剂量和治疗方案可以是合乎需要的。
适合于口服给药的制剂可以由以下组成:(a)脂质溶液,诸如悬浮在稀释剂诸如水、盐水、或PEG 400中的有效量的包装的治疗剂诸如核酸(例如,干扰RNA);(b)胶囊剂,囊剂,或片剂,各自包含预定量的治疗剂诸如核酸(例如,干扰RNA),如液体、固体、颗粒、或明胶;(c)处于适当液体中的混悬液;和(d)合适的乳剂。片剂形式可以包括乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸、和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂、和药物相容载体中的一种或多种。锭剂形式可以包括在调味剂,例如蔗糖中的治疗剂诸如核酸(例如,干扰RNA),以及包含处于惰性基质中的治疗剂的软锭剂(pastille),所述惰性基质诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶乳剂,凝胶,以及除了治疗剂以外含有本领域中已知的载体的类似锭剂。
在其应用的另一个实例中,脂质颗粒可以结合到广泛范围的局部剂型中。例如,可以配制含有核酸-脂质颗粒诸如SNALP的混悬液并作为凝胶、油、乳剂、局部霜剂、糊剂、膏剂、洗剂、泡沫剂、摩丝剂等施用。
当制备本发明的脂质颗粒的药物制剂时,优选使用大量已经纯化以减少或消除空颗粒或具有与外表面缔合的治疗剂诸如核酸的颗粒。
本发明的方法可以在多种宿主中实施。优选的宿主包括哺乳动物物种,诸如灵长类动物(例如,人和黑猩猩以及其他非人灵长类动物)、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、绵羊、山羊、啮齿动物(例如,大鼠和小鼠)、兔形目动物、和猪。
施用的颗粒量应该取决于治疗剂(例如,核酸)与脂质的比,所用的具体治疗剂(例如,核酸),待治疗的疾病或功能障碍,患者的年龄、体重和状况,和临床医生的判断,但是通常应该在约0.01-约50mg/千克体重,优选约0.1-约5mg/千克体重,或约108-1010个颗粒/施用(例如,注射)。
B.体外施药
为了体外应用,治疗剂诸如核酸(例如,干扰RNA)可以递送至培养中生长的任何细胞,无论植物或动物来源,脊椎动物或无脊椎动物,和任何组织或类型。在优选的实施方案中,所述细胞是动物细胞,更优选哺乳动物细胞,且最优选人细胞。
细胞和脂质颗粒之间的接触,在体外进行时,在生物相容培养基中发生。颗粒浓度广泛地变化,取决于具体应用,但是通常在约1μmol-约10mmol。用脂质颗粒治疗细胞通常以生理学温度(约37℃)进行约1-48小时,优选约2-4小时的时期。
在一组优选的实施方案中,将脂质颗粒混悬液加入至细胞密度为约103-约105细胞/ml,更优选约2x104细胞/ml的60-80%汇合的接种细胞。加入至细胞的混悬液的浓度是优选约0.01-0.2μg/ml,更优选约0.1μg/ml。
利用内体释放参数(ERP)测定,可以优化本发明SNALP或其他脂质颗粒的递送效率。ERP测定记述在美国专利公开号20030077829中,通过引用将其公开内容整体引入本文中用于全部目的。更具体地,ERP测定的目的是基于它们对内体膜的结合/摄取或与内体膜融合/使内体膜不稳定的相对作用,区分SNALP的多种阳离子脂质和辅助脂质组分的作用。该测定容许人们定量确定SNALP或其他脂质颗粒的各种成分如何影响递送效率,由此优化SNALP或其他脂质颗粒。通常,ERP测定测量报告蛋白(例如,荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)等)的表达,并且在一些实例中,对于表达质粒优化的SNALP制剂也应该适合于包封干扰RNA。在其他实例中,ERP测定可以适合于测量靶序列在存在或缺乏干扰RNA(例如,siRNA)的条件下转录或翻译的下调。通过比较各种SNALP或其他脂质颗粒每一种的ERP,人们可以容易地确定优化的系统,例如在细胞中具有最大摄取量的SNALP或其他脂质颗粒。
C.用于递送脂质颗粒的细胞
本发明的组合物和方法用于体内和体外处理广泛多样的细胞类型。合适的细胞包括,例如,造血前体(干)细胞、成纤维细胞、角化细胞、肝细胞、内皮细胞、骨骼肌和平滑肌细胞、造骨细胞、神经元、静止淋巴细胞、终末分化细胞、缓慢或非循环的原发细胞、实质细胞、淋巴样细胞、上皮细胞、骨细胞等。在优选的实施方案中,活性剂或治疗剂诸如干扰RNA(例如,siRNA)递送至癌症细胞诸如,例如肺癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肛门癌细胞、胆管癌细胞、小肠癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞、胆囊癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、阑尾癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞、中枢神经系统癌细胞、胶质母细胞瘤肿瘤细胞、皮肤癌细胞、淋巴瘤细胞、绒毛膜癌肿瘤细胞、头颈癌细胞、骨源性肉瘤肿瘤细胞、和血癌细胞。
体内递送脂质颗粒诸如包封干扰RNA(例如,siRNA)的SNALP适合于靶向任何细胞类型的细胞。所述方法和组合物可以与广泛多样的脊椎动物,包括哺乳动物,诸如例如,犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、绵羊、山羊、啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、兔形目动物、猪、和灵长类动物(例如,猴、黑猩猩和人)的细胞一起使用。
就可能需要细胞的组织培养而言,是本领域中公知的。例如,Freshney,Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique(动物细胞培养,基础技术手册),第3版,Wiley-Liss,纽约(1994),Kuchler等,Biochemical Methods in Cell Culture and Virology(细胞培养和病毒学中的生物化学方法),Dowden,Hutchinson and Ross,Inc.(1977),和其中引用的参考文献对细胞培养提供一般性指导。培养的细胞系统经常采用细胞单层形式,尽管也使用细胞混悬液。
D.检测脂质颗粒
在一些实施方案中,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)可以在约1、2、3、4、5、6、7、8或更多小时时在受试者中检测到。在其他实施方案中,本发明的脂质颗粒(例如,SNALP)可以在施用颗粒后约8、12、24、48、60、72或96小时,或约6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25或28天时在受试者中检测到。颗粒的存在可以在来自受试者的细胞、组织或其他生物样品中检测到。颗粒可以,例如,通过直接检测颗粒、检测治疗性核酸诸如干扰RNA(例如,siRNA)序列,检测目的靶序列(即,通过检测目的序列的表达或减少的表达),或其组合来检测。
1.颗粒的检测
本发明的脂质颗粒诸如SNALP可以利用本领域中任何已知方法来检测。例如,标记物可以利用本领域中公知的方法与脂质颗粒的组分直接或间接偶联。可以使用广泛多样的标记物,标记物的选择取决于所需的灵敏度、与脂质颗粒组分缀合的容易度、稳定性要求、和可用的仪器和处理规定。合适的标记物包括,但不仅限于,光谱标记物诸如荧光染料(例如,荧光素及衍生物,诸如异硫氰酸荧光素(FITC)和Oregon GreenTM;若丹明及衍生物如德克萨斯红,异硫氰酸四甲基若丹明(TRITC),等,地高辛配基,生物素,藻红蛋白,AMCA,CyDyesTM,等;放射性标记物诸如3H,125I,35S,14C,32P,33P,等;酶诸如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,等;光谱比色标记物诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠诸如聚苯乙烯,聚丙烯,胶乳,等。所述标记物可以利用本领域中任何已知方式来检测。
2.核酸的检测
本文中通过许多本领域中技术人员公知的方式的任一种来检测并量化核酸(例如,干扰RNA)。核酸的检测可以通过公知的方法诸如Southern分析,Northern分析,凝胶电泳,PCR,放射性标记,闪烁计数,和亲合层析来进行。也可以使用另外的分析性生物化学方法诸如分光光度法、X射线照相法、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、和高扩散色谱法。
核酸杂交形式的选择不是关键的。本领域中技术人员已知许多核酸杂交形式。例如,普遍形式包括夹心式测定和竞争或置换测定。杂交技术通常记述在,例如,“Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach(核酸杂交,实践方法),”Hames和Higgins编,IRL Press(1985)中。
杂交测定的灵敏性可以通过使用核酸扩增系统来提供,所述核酸扩增系统倍增被检测的靶核酸。适合于扩增用作分子探针或用于生成核酸片段以进行随后的亚克隆的序列的体外扩增技术是已知的。足以指导技术人员完成该体外扩增方法的技术实例,包括聚合酶链反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),Qβ-复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(例如,NASBATM)参见Sambrook等,在Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册)中,Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)(2000);和Ausubel等,SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(分子生物学中的简短试验技术),编,Current Protocols(当前试验技术),Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.(2002);以及美国专利号4,683,202;PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications(PCR试验技术,方法和应用指南)(Innis等编)Academic Press Inc.(学术出版社)圣地亚哥,CA(1990);Arnheim & Levinson(1990年10月1日),C&EN 36;The Journal Of NIH Research(NIH研究杂志),3:81(1991);Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),86:1173(1989);Guatelli等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊),87:1874(1990);Lomell等,J.Clin.Chem.(临床化学杂志),35:1826(1989);Landegren等,Science(科学),241:1077(1988);Van Brunt,Biotechnology(生物技术),8:291(1990);Wu和Wallace,Gene (基因),4:560(1989);Barringer等,Gene (基因),89:117(1990);和Sooknanan和Malek,Biotechnology (生物技术),13:563(1995)。克隆体外扩增的核酸的改良方法记述在美国专利号5,426,039中。本领域中记述的其他方法是基于核酸序列的扩增(NASBATM,Cangene,Mississauga,安大略)和Qβ-复制酶系统。这些系统可以用于直接识别突变体,其中PCR或LCR引物设计为仅在选择序列存在时延伸或连接。备选地,选择序列可以通过利用,例如,非特异性PCR引物来扩增,且随后探测扩增的靶区域中指示突变的特异性序列。上述参考文献的公开内容通过引用整体引入本文用于全部目的。
用作探针的核酸,例如,在体外扩增方法中用作基因探针,或用作抑制剂成分的核酸典型地根据Beaucage等,Tetrahedron Letts.(四面体通讯),22:1859 1862(1981)中记述的固相亚磷酰胺三酯法,利用如Needham VanDevanter等,Nucleic Acids Res.(核酸研究),12:6159(1984)所述的自动合成器来化学合成。多核苷酸的纯化,在需要时,典型地通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC进行,如Pearson等,J.Chrom.(染色体杂志),255:137 149(1983)中所述。合成的多核苷酸序列可以利用Grossman和Moldave(编)学术出版社,纽约,Methods in Enzymology(酶学方法),65:499中的Maxam和Gilbert(1980)的化学降解法来验证。
用于确定转录水平的备选方式是原位杂交。原位杂交测定是公知的且通常记述在Angerer等,Methods Enzymol.(酶学方法),152:649(1987)中。在原位杂交测定中,将细胞固定于固体载体上,典型地玻璃载玻片上。如果要探测DNA,则用加热或碱变性细胞。然后使细胞与杂交溶液在适当的温度下接触,以允许标记的特异性探针退火。该探针优选用放射性同位素或荧光报告分子来标记。
VIII.实施例
本发明将通过具体实施例更详细描述。以下实施例为了举例说明的目的提供,其不意欲以任何方式限制本发明。本领域中技术人员应该容易地认识到多种可以被改变或修改以产生基本上相同的结果的非关键参数。
实施例1.材料和方法
siRNA:这些研究中使用的全部siRNA分子是由University of Calgary(卡尔加里大学)(卡尔加里,AB)或Dharmacon Inc.(Lafayette,CO)化学合成的。利用标准程序对siRNA进行脱盐和退火。
siRNA的脂质包封:在一些实施方案中,siRNA分子包封在包括以下脂质的核酸-脂质颗粒中:脂质缀合物PEG-cDMA(3-N-[(-M乙氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙胺);阳离子脂质DLinDMA(1,2-二亚油基氧基-3-(N,N-二甲基)氨基丙烷);磷脂DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱;Avanti Polar Lipids;Alabaster,AL);和合成胆固醇(Sigma-Aldrich Corp.(西格玛-奥德里奇公司);St.Louis,MO),其摩尔比分别为1.4∶57.1∶7.1∶34.3。换言之,siRNA包封在以下“1∶57”制剂的SNALP中:1.4%PEG-cDMA;57.1%DLinDMA;7.1%DPPC;和34.3%胆固醇。在其他实施方案中,siRNA分子包封在包括以下脂质的无磷脂SNALP中:脂质缀合物PEG-cDMA;阳离子脂质DLinDMA;和合成胆固醇,其摩尔比分别为1.5∶61.5∶36.9。换言之,siRNA包封在以下“1∶62”制剂的无磷脂SNALP中:1.5%PEG-cDMA;61.5%DLinDMA;和36.9%胆固醇。对于媒介物对照,具有相同脂质成分的空颗粒在缺乏siRNA的条件下形成。应该理解1∶57制剂和1∶62制剂是靶制剂,且该制剂中存在的脂质(阳离子和非阳离子二者)的量和存在的脂质缀合物的量可以变化。典型地,在1∶57制剂中,阳离子脂质的量将是57mol%±5mol%,且脂质缀合物的量将是1.5mol%±0.5mol%,1∶57制剂的余量由非-阳离子脂质(例如,磷脂,胆固醇,或二者的混合物)组成。类似地,在1∶62制剂中,阳离子脂质的量将是62mol%±5mol%,且脂质缀合物的量将是1.5mol%±0.5mol%,1∶62制剂的余量由非-阳离子脂质(例如,胆固醇)组成。
实施例2.配制为1∶57 SNALP的Eg5 siRNA是有效的体外细胞生长抑制剂。
SNALP制剂利用靶向Eg5的siRNA作为核酸组分来制备。Eg5是驱动蛋白相关蛋白的成员,所述驱动蛋白相关蛋白参与与细胞器、微管、或染色体沿微管的运动有关的功能。这些功能包括轴突运输、细胞核融合或分裂过程中的微管滑动、和减数分裂和早期有丝分裂过程中的染色体分离。Eg5在哺乳动物的有丝分裂中起关键作用。本研究中使用的Eg5 siRNA在表1中提供。修饰包括在Eg5 2263 siRNA序列的有义链和反义链中选定位置处引入2’OMe-尿苷,其中所述siRNA双链体包含小于约20%的2’OMe-修饰的核苷酸。
表1.包含有义和反义Eg5 RNA多核苷酸的siRNA双链体。
Figure BPA00001277238500911
栏1:“U/U”=2’OMe-尿苷修饰的siRNA双链体;栏2:2’OMe-修饰的核苷酸以粗体和下划线表示。siRNA双链体可以备选地或另外地包括2’-脱氧-2’-氟(2’F)核苷酸,2’-脱氧核苷酸,2’-O-(2-甲氧乙基)(MOE)核苷酸,和/或锁核酸(LNA)核苷酸。“dT”=脱氧胸苷。栏3:提供siRNA双链体中的2’OMe-修饰的核苷酸的数量和百分比。栏4:提供siRNA双链体中双链(DS)区中的修饰的核苷酸的数量和百分比。
SNALP制剂的脂质组分和物理特性总结在表2中。脂质∶药物比以mg总脂质/mg核酸作为单位来描述。平均粒度和多分散性在MalvernInstruments Zetasizer上测量。核酸的包封利用Ribogreen测定来测量,所述Ribogreen测定基本上如Heyes等,Journal of Controlled Release(可控释放杂志),107:276-287(2005)中所述。
表2.本研究中使用的SNALP制剂的特性。
Figure BPA00001277238500931
由siRNA转染沉默Eg5在哺乳动物细胞中引起有丝分裂停滞和凋亡。使用包含靶向Eg5的siRNA的SNALP转染后的细胞活力因此提供了简单的体外转染效率的生物学读数。体外细胞培养的细胞活力利用商业试剂CellTiter-Blue
Figure BPA00001277238500932
(Promega Corp.;Madison,WI),即一种由代谢活性细胞还原为荧光产物试卤灵的刃天青染料来评估。利用标准组织培养技术培养人结肠癌细胞系HT29。SNALP施用后72小时,将CellTiter-Blue
Figure BPA00001277238500933
试剂加入培养物中,从而量化细胞代谢活性,这是细胞活力的量度。数据表示为细胞活力相对于仅接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物的(“未处理”)对照细胞的百分比。
图1显示含有Eg5 2263U/U siRNA的1∶57 SNALP制剂在所有测试的siRNA浓度下,是最有效的肿瘤细胞生长抑制剂之一(参见,图1B,样品9)。
实施例3.配制为1∶57 SNALP的ApoB siRNA具有有效的体内沉默活性。
SNALP制剂利用靶向载脂蛋白B(ApoB)的siRNA作为核酸组分来制备。ApoB是乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)的主要载脂蛋白。ApoB中的突变与高胆固醇血症相关。ApoB以2种主要形式出现在血浆中,所述2种主要形式为ApoB48和ApoB100,其由于器官特异性终止密码子而分别在肠和肝中合成。本研究中使用的ApoB siRNA提供在表3中。修饰包括在ApoB siRNA序列的有义链和反义链中选定位置处引入2’OMe-尿苷或2’OMe-鸟苷,其中所述siRNA双链体包含小于约20%的2’OMe-修饰的核苷酸。
表3.包含有义和反义ApoB RNA多核苷酸的siRNA双链体。
栏1:数字指有义链的5’碱基相对于小鼠ApoB mRNA序列XM_137955的核苷酸位置。栏2:数字指2’OMe化学修饰在各条链中的分布。栏3:2’OMe-修饰的核苷酸以粗体和下划线表示。siRNA双链体可以备选地或另外地包括2’-脱氧-2’-氟(2’F)核苷酸,2’-脱氧核苷酸,2’-O-(2-甲氧乙基)(MOE)核苷酸,和/或锁核酸(LNA)核苷酸。栏4:提供siRNA双链体中的2’OMe-修饰的核苷酸的数量和百分比。栏5:提供siRNA双链体中双链(DS)区中的修饰的核苷酸的数量和百分比。
所述制剂的脂质组分和物理特性总结在表4中。脂质∶药物比以mg总脂质/mg核酸作为单位来描述。平均粒度和多分散性在MalvernInstruments Zetasizer上测量。核酸的包封利用Ribogreen测定来测量,所述Ribogreen测定基本上如Heyes等,Journal of Controlled Release(可控释放杂志),107:276-287(2005)中所述。
表4.本研究中使用的SNALP制剂的特征。
Figure BPA00001277238500942
Figure BPA00001277238500951
BALB/c小鼠(雌性,至少4周龄)获自Harlan Labs。在驯化周期(至少7天)后,在研究第0天,通过在侧尾静脉中静脉内(IV)注射对动物施用SNALP,每日一次(总共1剂量/动物)。剂量为1mg包封的siRNA/kg体重,这对应于10ml/kg(约至最接近10μl)。作为阴性对照,对一组动物给予IV注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物。在研究第2天,将动物安乐死并将肝组织收集在RNAlater中。
利用QuantiGene测定(Panomics;Fremont,CA)分析肝组织的ApoBmRNA水平,该水平针对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA水平来标准化,所述QuantiGene测定基本如Judge等,Molecular Therapy(分子治疗),13:494(2006)中所述。
图2显示包含ApoB 10048 U2/2 G1/2 siRNA的1∶57 SNALP制剂在减少体内ApoB表达中最有效(参见,组11)。
实施例4.配制为1∶57 SNALP的ApoB siRNA具有有效的体内沉默活性。
SNALP制剂使用表3中所述的ApoB siRNA来制备。所述制剂的脂质组分和物理特性总结在表5中。脂质∶药物比以mg总脂质/mg核酸作为单位来描述。平均粒度和多分散性在Malvern Instruments Zetasizer上测量。核酸的包封利用Ribogreen测定来测量,所述Ribogreen测定基本上如Heyes等,Journal of Controlled Release(可控释放杂志),107:276-287(2005)中所述。
表5.本研究中使用的SNALP制剂的特性。
Figure BPA00001277238500961
本研究中使用的2∶30 SNALP制剂是PEG-C-DMA、DLinDMA、DSPC、和胆固醇的脂质组合物,其摩尔百分比为2∶30∶20∶48(以该顺序)。该制剂以13∶1的输入脂质与药物(L∶D)比(mg∶mg),通过注射器挤压来制备。
本研究中使用的1∶57 SNALP制剂是PEG-C-DMA、DLinDMA、DPPC、和胆固醇的脂质组合物,其摩尔百分比为1.5∶57.1∶7∶34.3(以该顺序)。该制剂以9∶1的输入脂质与药物(L∶D)比(mg∶mg),通过注射器挤压来制备。
BALB/c小鼠(雌性,4周龄)获自Harlan Labs。在驯化周期(至少7天)后,在研究第0、1、2、3和4天,通过在侧尾静脉中静脉内(IV)注射对动物施用SNALP,每日一次,总共5剂量/动物。每日剂量为1.0(对于2∶30 SNALP)或0.1(对于1∶57 SNALP)mg包封的siRNA/kg体重,这对应于10ml/kg(约至最接近10μl)。作为阴性对照,对一组动物给予IV注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物。在研究第7天,最后处理后72h,将动物安乐死并将肝组织收集在RNAlater中。
利用QuantiGene测定(Panomics;Fremont,CA)分析肝组织的ApoBmRNA水平,该水平针对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA水平来标准化,所述QuantiGene测定基本如Judge等,Molecular Therapy(分子治疗),13:494(2006)中所述。
图3显示包含ApoB 10048 U2/2 G1/2siRNA的1∶57 SNALP制剂在10倍的更低剂量下在介导小鼠肝中的ApoB基因沉默中的效力是2∶30SNALP的10倍以上。
实施例5.配制为1∶57或1∶62 SNALP的ApoB siRNA具有有效的体内沉默活性。
SNALP制剂使用表3中所述的ApoB siRNA来制备。所述制剂的脂质组分和物理特性总结在表6中。脂质∶药物比以mg总脂质/mg核酸作为单位来描述。平均粒度和多分散性在Malvern Instruments Zetasizer上测量。核酸的包封利用Ribogreen测定来测量,所述Ribogreen测定基本上如Heyes等,Journal of Controlled Release(可控释放杂志),107:276-287(2005)中所述。
表6.本研究中使用的SNALP制剂的特性。
Figure BPA00001277238500971
Figure BPA00001277238500981
BALB/c小鼠(雌性,至少4周龄)获自HarlanLabs。在驯化周期(至少7天)后,在研究第0天,通过在侧尾静脉中静脉内(IV)注射对动物施用SNALP,每日一次(总共1剂量/动物)。剂量为0.75mg包封的siRNA/kg体重,这对应于10ml/kg(约至最接近10μl)。作为阴性对照,对一组动物给予IV注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物。在研究第2天,将动物安乐死并将肝组织收集在RNAlater中。
利用QuantiGene测定(Panomics;Fremont,CA)分析肝组织的ApoBmRNA水平,该水平针对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA水平来标准化,所述QuantiGene测定基本如Judge等,Molecular Therapy(分子治疗),13:494(2006)中所述。
图4显示1∶57和1∶62 SNALP制剂具有可比的体内ApoB沉默活性(参见,例如,组2&3)。
实施例6.配制为1∶62 SNALP的ApoB siRNA具有有效的体内沉默活性。
SNALP制剂使用表3中所述的ApoB siRNA来制备。所述制剂的脂质成分和物理特性总结在表7中。脂质∶药物比以mg总脂质/mg核酸作为单位来描述。平均粒度和多分散性在Malvern Instruments Zetasizer上测量。核酸的包封利用Ribogreen测定来测量,所述Ribogreen测定基本上如Heyes等,Journal of Controlled Release(可控释放杂志),107:276-287(2005)中所述。
表7.本研究中使用的SNALP制剂的特性。
Figure BPA00001277238500991
BALB/c小鼠(雌性,至少4周龄)获自Harlan Labs。在驯化周期(至少7天)后,在研究第0天,通过在侧尾静脉中静脉内(IV)注射对动物施用SNALP,每日一次(总共1剂量/动物)。剂量为0.1mg包封的siRNA/kg体重,这对应于10ml/kg(约至最接近10μl)。作为阴性对照,对一组动物给予IV注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物。在研究第2天,将动物安乐死并将肝组织收集在RNAlater中。
利用QuantiGene测定(Panomics;Fremont,CA)分析肝组织的ApoB mRNA水平,该水平针对3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA水平来标准化,所述QuantiGene测定基本如Judge等,Molecular Therapy(分子治疗),13:494(2006)中所述。
图5显示1∶62 SNALP制剂是测试的无磷脂SNALP制剂中,在两种不同脂质∶药物比(即,6.1和10.1)时最有效的ApoB表达抑制剂之一(参见,组2和15)。
实施例7.利用经由注射器挤压或齿轮泵过程制备的1∶57 SNALP对ApoB表达的体内沉默。
本研究举例说明通过不同制造方法制备的具有靶向ApoB的siRNA的1∶57 SNALP制剂的耐受性和功效的比较。具体地,1∶57 SNALP利用PBS或柠檬酸盐缓冲液(混合后稀释液)通过注射器挤压或齿轮泵过程制备并在小鼠中静脉内施用。
实验设计
动物模型:雌性BALB/c小鼠,5周龄,n=4/组/笼。
siRNA有效负荷:ApoB10048 U2/2 G1/2 siRNA.
耐受性:
Figure BPA00001277238501001
功效:
制剂:
制剂以钳口瓶(crimp top vials)中的0.22μm滤器灭菌的0.005-0.9mgsiRNA/mL提供。
制剂详细信息:
1.本研究中使用的脂质组合物“1|57柠檬酸盐混合物”是以PEG-C-DMA,DLinDMA,DPPC,和胆固醇(以该顺序)的摩尔百分比描述的1.4∶57.1∶7.1∶34.3。该制剂的输入脂质与药物比为8.9。
2.齿轮泵设置包括0.8mm T-连接器和400mL/min速度。
3.本研究中使用的siRNA是apoB-10048 U2/2 G1/2 siRNA。
制剂总结:
Figure BPA00001277238501011
程序
处理:即将第一次处理前,称重动物并基于每只动物的重量计算剂量(与10mL/kg相当,约至最接近10μl)。测试物在第0天,经由尾静脉通过IV注射施用一次(总共1剂量/动物)。在整个研究期间内每日测量体重(每24h)。每日与体重测量相一致地进行笼侧观察,并另外作为保证。
组1-7终点:动物在第1天,即测试物给药后24h处死。在处死时通过心脏穿刺收集血液。总量收集到SST microtainer中以获得血清。室温下凝结30(至60)min,在16,000xg & 16℃离心5min,翻转以验证离心是充分的,并在4℃保存。分析全部的小动物临床化学检验项目加AST和SDH。最先考虑的列表为:ALT,AST,SDH,胆红素,碱性磷酸酶,GGT,BUN,CPK,葡萄糖。其次考虑的列表为:肌酸酐,白蛋白,球蛋白,总蛋白。
组8-12终点:动物在第2天,即测试物给药后48h处死。通过心脏穿刺收集血液并加工以获得血浆。立即在16,000xg(在16℃)离心5min。记录任何不寻常血浆外观的观察结果。将清澈血浆上清吸移至干净的微型离心管中并以-80℃保存。以下组织被摘除并分别称重:肝和脾。将左肝叶的下半部(不相连的)分开并浸没在≥5体积的RNAlater中(在1.5mLRNAlater中<0.3g,处于2.0mL管中),在分析前在4℃保存至少16小时并为了存档目的在-20℃或-80℃长期保存。制剂被预期是充分耐受的。表现出与处理有关的痛苦征象的小鼠由动物饲养所工作人员判断定而终止生命。
终止:用致命剂量的氯胺酮(ketamine)/赛拉嗪(xylazine)麻醉小鼠;然后进行心脏穿刺,随后进行颈椎脱位。
数据分析:处理方案的耐受性通过动物外观和行为以及体重来监测。血液临床化学通过自动化分析仪来测量。肝中的ApoB和GAPDH mRNA水平通过QG测定来测量。血浆中的ApoB蛋白通过ELISA来测量。血浆中的总胆固醇通过标准酶/比色测定来测量。
结果
当施用1∶57 SNALP制剂时,在动物外观/行为中没有体重损失或改变。图6显示由柠檬酸盐缓冲液对比PBS直接稀释制备的SNALP的耐受性就血液临床化学参数而言无显著差别。在恒定siRNA剂量下,在注射器柠檬酸盐和注射器PBS之间存在耐受性差别,但是这可能是根据这两种制剂的不同最终脂质∶药物(L∶D)比造成的人为假象。
图7显示通过齿轮泵制备的1∶57 SNALP的功效与通过注射器挤压制备的相同SNALP的功效类似。使用齿轮泵过程改善了耐受性特性,这可以归因于增加的初始包封率和减小的最终L∶D比。
实施例8.利用通过直接稀释或In-Line稀释过程制备的1∶57 SNALP对ApoB表达的体内沉默。
本研究举例说明通过提供直接稀释或In-Line稀释过程,以6∶1或9∶1的输入脂质与药物比制备的具有靶向ApoB的siRNA的1∶57 SNALP制剂的耐受性和功效的比较。
实验设计
动物模型:雌性BALB/c小鼠,7周龄。
siRNA有效负荷:ApoB10048 U2/2 G1/2 siRNA.
CBC/Diff:
Figure BPA00001277238501031
临床化学:
活性:
Figure BPA00001277238501033
制剂:
制剂以钳口瓶(crimp top vials)中的0.22μm滤器灭菌的0.005-1.7mgsiRNA/mL提供。
制剂详细信息:
1.本研究中使用的“1|57 SNALP”是以PEG-C-DMA,DLinDMA,DPPC,和胆固醇(以该顺序)的摩尔百分比描述的1.4∶57.1∶7.1∶34.3脂质组合物。该制剂以9∶1(28mM脂质)或6∶1(14mM脂质)的输入脂质与药物比通过齿轮泵制备。
2.本研究中使用的siRNA是apoB-10048 U2/2 G1/2 siRNA。
制剂总结:
Figure BPA00001277238501041
程序
处理:即将第一次处理前,称重动物并基于每只动物的重量计算剂量(与10mL/kg相当,约至最接近10μl)。测试物在第0天,经由尾静脉通过IV注射施用一次(总共1剂量/动物)。在整个研究期间内每日测量体重(每24h)。每日与体重测量相一致地进行笼侧观察,并另外作为保证。
终点:动物在第1天,即测试物给药后24h(组1-10)或在第2天,即测试物给药后48h(组11-19)处死。
组1-3:在处死时通过心脏穿刺收集血液。总量收集到EDTA microtainer中,立即混合以免凝结,并送去进行CBC/Diff特征分析。进行简单尸检。
组4-11:血液通过心脏穿刺收集至SST microtainer中,以获得血清。室温下凝结30(至60)min,在16,000xg & 16℃离心5min,翻转以验证离心是充分的,并在4℃保存。分析全部的小动物临床化学检验项目加AST和SDH。最先考虑的列表为:ALT,AST,SDH,胆红素,碱性磷酸酶,GGT,BUN,CPK,葡萄糖。其次考虑的列表为:肌酐,白蛋白,球蛋白,总蛋白。进行简单尸检。
组12-19:通过心脏穿刺收集血液并加工以获得血浆:立即在16,000xg(在16℃)离心5min。记录任何不寻常血浆外观的观察结果。将清澈血浆上清吸移至干净的微型离心管中并以-80℃保存。摘除以下组织:肝。不称重肝;将左肝叶的下半部(不相连的)分开并浸没在≥5体积的RNAlater中(在1.5mL RNAlater中<0.3g,处于2.0mL管中),在分析前在4℃保存至少16小时并在-80℃长期保存。制剂被预期是充分耐受的。表现出与处理有关的痛苦征象的小鼠由动物饲养所工作人员判定而终止生命。
终止:用致命剂量的氯胺酮(ketamine)/赛拉嗪(xylazine)麻醉小鼠;然后进行心脏穿刺,随后进行颈椎脱位。
数据分析:处理方案的耐受性通过动物外观和行为以及体重来监测。血液临床化学和CBC/Diff特征通过自动化分析仪来测量。肝ApoB mRNA通过QuantiGene测定来测量。血浆ApoB-100通过ELISA来测量。血浆总胆固醇通过标准酶测定来测量。
结果
耐受性:
图8显示1∶57 SNALP施用后24小时对体重非常小的影响。在最高药物剂量17mg/kg下观察到最大体重减少3.6±0.7%。在任何测试剂量下也不存在动物外观/行为的明显变化。
图9显示不存在血小板计数的明显变化。血小板的减少可以导致平均血小板体积增加,因为身体为了代偿与处理相关的减少而生成新的血小板。在此研究的条件下,平均血小板体积在SNALP处理组中没有改变。
图10显示对于1∶57 SNALP在药物剂量11mg/kg下脂质∶药物(L∶D)比为10,和在13mg/kg下L∶D为7时发生临床显著的肝酶上升(3xULN)。也观察到血浆总蛋白和球蛋白的轻微剂量反应上升趋势。
功效:
图11显示基于肝mRNA QuantiGene分析,在测试药物剂量下,较低L∶D SNALP的效力与较高L∶D SNALP一样好。实际上,ApoB沉默活性在0.05和0.1mg/kg剂量下相同。同样地,在减少ApoB表达方面,处于6∶1输入L∶D比(最终比7∶1)的1∶57 SNALP的效力与处于9∶1输入L∶D比(最终比10∶1)的1∶57 SNALP类似。
图12显示ApoB蛋白和总胆固醇水平被处于6∶1输入L∶D比(最终比7∶1)的1∶57 SNALP和处于9∶1输入L∶D比(最终比10∶1)的1∶57 SNALP减少至相似程度。
治疗指数:
该研究证明处于6∶1输入L∶D比(最终比7∶1)的1∶57 SNALP和处于9∶1输入L∶D比(最终比10∶1)的1∶57 SNALP在0.1mg/kg的药物剂量下引起约60%ApoB肝mRNA沉默。从图10中的可用数据点插入,在10mg/kg下的10∶1最终L∶D比可以导致与在13mg/kg下的7∶1最终L∶D类似的酶升高程度。利用这些活性和毒性点,处于10∶1最终L∶D比的1∶57 SNALP的治疗指数是(10mg/kg)/(0.1mg/kg)=100且处于7∶1最终L∶D比的1∶57SNALP的治疗指数是(13mg/kg)/(0.1mg/kg)=130。利用该数据集,处于7∶1最终L∶D比的1∶57 SNALP的治疗指数比处于10∶1最终L∶D比的1∶57SNALP的治疗指数高30%。
实施例9.利用1∶57 SNALP体内沉默PLK-1表达增加具有Hep3B肿瘤的小鼠的存活。
测试含有polo-样激酶1(PLK-1)siRNA的SNALP(1∶57 SNALP制剂:1.4%PEG-cDMA;57.1%DLinDMA;7.1%DPPC;和34.3%胆固醇),以获得它们对具有Hep3B肝肿瘤的CD1 nu/nu小鼠存活的影响。PLK-1是含有两个功能结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶:(1)激酶结构域;和(2)polo-盒结构域(参见,例如,Barr等,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.(自然分子细胞生物学综述),5:429-440(2004))。PLK-1的活性和细胞浓度对于精确调节细胞分离很关键。PLK-1在许多癌症类型包括肝细胞瘤和结肠癌中过表达,且PLK-1表达通常与较差的患者预后相关。PLK-1(野生型或激酶无活性)的过表达导致多核化(遗传不稳定性)。高活性PLK-1使DNA损伤检查点无效。组成型PLK-1表达导致NIH 3T3细胞转化。PLK-1使p53肿瘤抑制剂磷酸化,由此抑制p53的促凋亡作用。本研究使用的PLK-1 siRNA提供在表8中。修饰包括在PLK-1 siRNA序列的有义链和反义链中选定位置处引入2’OMe-尿苷或2’OMe-鸟苷,其中所述siRNA双链体包含小于约20%的2’OMe-修饰的核苷酸。
表8.包含有义和反义PLK-1 RNA多核苷酸的siRNA双链体。
Figure BPA00001277238501071
栏1:“PLK”后的数字指有义链的5’碱基相对于人PLK-1 mRNA序列NM_005030起始密码子(ATG)的核苷酸位置。栏2:2’-O-甲基(2’OMe)核苷酸以粗体和下划线表示。siRNA双链体可以备选地或另外地包括2’-脱氧-2’-氟(2’F)核苷酸,2’-脱氧核苷酸,2’-O-(2-甲氧乙基)(MOE)核苷酸,和/或锁核酸(LNA)核苷酸。。N=脱氧胸苷(dT)核苷酸,尿苷(U)核糖核苷酸,或与靶序列或其互补链具有互补性的核糖核苷酸。栏3:提供siRNA双链体的双链(DS)区中的修饰的核苷酸的数量和百分比。
实验组
20只CD1 nu/nu小鼠如下接种:
Figure BPA00001277238501072
测试物
全部样品在稀释到工作浓度前过滤灭菌。所有管用配制日期、脂质组成、和核酸浓度来标记。SNALP样品以0.2mg/ml核酸提供。需要最少20ml各种SNALP进行本研究。用于本研究的制剂包含:
Figure BPA00001277238501081
程序
第0天    小鼠将在即将手术前,通过SC注射接受Anafen(100μg
处于20μl盐水中)。每只小鼠通过异氟烷(isoflourane)
气体吸入麻醉并施用眼润滑油以避免过度眼干燥。在保
持在来自鼻锥的气体麻醉下,在胸骨下方横跨中线做一
个1.5cm切口。然后利用高压灭菌的棉棒将左侧肝叶
从腹中取出。利用leur尖Hamilton注射器(50μl)和30G
(3/8”)针头,将25μl悬浮在PBS中的肿瘤细胞以浅的
角度注射到该肝叶中。细胞将缓慢(~30s)注射并在拔出
针头后立即将药签按压在针孔伤口处。在停止出血后
(~1min),在肌肉壁中用5-6根缝合线和3-4个皮肤夹
闭合切口。细胞混悬液在即将进行每次注射前充分混
合。小鼠将在衬有纸巾的干净笼子中从麻醉中复苏并密
切监测2-4小时。然后将动物返回至正常饲养。
第1天    所有小鼠将通过异氟烷气体浅麻醉并检查缝合线。动物
随后将通过SC注射接受Anafen(100μg处于20μl盐
水中)。
第10天   使小鼠随机化到合适的处理组中。
第11天     组A,B——第11天:所有动物经由侧尾静脉通过IV
注射以2mg/kg施用SNALP。小鼠将根据体重给药(10
ml/kg)。给药基于初始体重重复连续5天。
第14-35天  组A,B——第14,17,21,25,28,32,35天:所有动物经
由侧尾静脉通过IV注射以2mg/kg再施用SNALP。小
鼠将根据体重给药(10ml/kg)。
体重组:小鼠在给药5周那天进行称重,然后每周二次
直至研究结束。
终点:肿瘤负荷和制剂被预期是充分耐受的。表现出与
处理或肿瘤负荷有关的痛苦征象的小鼠由动物饲养所
工作人员判定而终止生命。
终止:     小鼠用致命剂量的氯胺酮/赛拉嗪来麻醉;然后进行颈
椎脱位。
数据分析: 测定存活和体重。
结果
图13显示在Hep3B肝内(I.H.)肿瘤模型中治疗性给药PLK1424 SNALP过程中小鼠的平均体重。处理方案是充分耐受的,其不存在与处理相关的毒性的明显征象。
图14显示使用1∶57 SNALP-配制的PLK1424的处理导致具有Hep3B肿瘤的小鼠的存活的显著增加。在缺乏任何明显毒性或免疫刺激的条件下观察到该体内抗肿瘤作用。
实施例10.利用1∶57 SNALP体内沉默PLK-1表达在具有Hep3B肿瘤的小鼠中诱导肿瘤细胞凋亡。
本研究的目的如下:
1.为了确定在单次IV施用PLK1424 SNALP后,形成的Hep3B肝肿瘤中的mRNA沉默水平。
2.为了通过利用RACE-PCR检测特异性RNA裂解产物验证mRNA沉默机制。
3.为了通过组织病理学验证肿瘤细胞凋亡的诱导。
为了本研究使用1∶57 SNALP制剂(1.4%PEG-cDMA;57.1% DLinDMA;7.1%DPPC;和34.3%胆固醇)。
实验组
20只SCID/beige小鼠如下接种:
Figure BPA00001277238501101
测试物
全部样品在稀释到工作浓度前过滤灭菌。所有管用配制日期、脂质组成、和核酸浓度来标记。SNALP样品以0.2mg/ml核酸提供。需要最少2mlSNALP进行本研究。用于本研究的制剂包含:
  组   测试物说明
  A   PBS
  B   Luc U/U 1∶57 SNALP
  C   PLK1424 U4/GU 1∶57 SNALP
程序
第0天    小鼠将在即将手术前,通过SC注射接受Anafen(100μg
处于20μl盐水中)。每只小鼠通过异氟烷(isoflourane)
气体吸入麻醉并施用眼润滑油以避免过度眼干燥。在保
持在来自鼻锥的气体麻醉下,在胸骨下方横跨中线做一
个1.5cm切口。然后利用高压灭菌的棉棒将左侧肝叶
从腹中取出。利用leur尖Hamilton注射器(50μl)和30G
(3/8”)针头,将25μl悬浮在PBS中的肿瘤细胞以浅的
角度注射到该肝叶中。细胞将缓慢(~30s)注射并在拔出
针头后立即将药签按压在针孔伤口处。在停止出血后
(~1min),肌肉壁切口用5-6根缝合线闭合。然后皮肤
切口用3-4个金属皮肤夹闭合。细胞混悬液在即将进行
每次注射前充分混合。小鼠将在衬有纸巾的干净笼子中
从麻醉中复苏并密切监测2-4小时。然后将动物返回至
正常饲养。
第1天       所有小鼠将通过异氟烷气体浅麻醉并检查缝合线。动
物随后将通过SC注射接受Anafen(100μg处于20μl
盐水中)。
第7天       使小鼠随机化到合适的处理组中。
第20天      组A-C:小鼠称重并然后经由侧尾静脉通过IV注射
施用PBS,Luc,或PLK1424 SNALP。SNALP根据体重,
以2mg/kg或等价体积(10ml/kg)给药。
第21天      组A-C:对全部小鼠称重并然后通过致命麻醉进行安
乐死。
对来自每组所有小鼠的带有肿瘤的肝叶称重并收集
到RNALater中以进行RNA分析。
终点:肿瘤负荷和制剂被预期是充分耐受的。表现出
与处理或肿瘤负荷有关的痛苦征象的小鼠由动物饲
养所工作人员判定而终止生命。
终止:      小鼠用致命剂量的氯胺酮/赛拉嗪来麻醉;然后进行颈
椎脱位。
数据分析:  通过bDNA(QG)测定和RACE-PCR进行肝肿瘤的
mRNA分析。
通过组织病理学进行肿瘤细胞凋亡分析。
结果
从第14天开始监测体重,从而评估肿瘤进展。在第20天,将6只表现出最大体重减轻的小鼠随机至3组中的每一组中并进行处理。全部6只小鼠在处死时(第21天)具有实质性大的I.H.肿瘤。剩余14只小鼠的处理因此在第21天开始(第22天处死)。10/14只小鼠具有实质性肿瘤;2/14只小鼠具有小/可能的肿瘤;且2/14只小鼠不具有可看到的肿瘤负荷。
图15显示来自用于测量人(肿瘤)-特异性PLK-1 mRNA水平的Quantigene测定的数据。单次2mg/kg剂量的1∶57 SNALP降低在小鼠中生长的肝内Hep3B肿瘤中的PLK-1 mRNA水平约50%。
图16显示通过5’RACE-PCR在用PLK1424 SNALP处理的小鼠中可检测到PLK-1 mRNA的特异性裂解产物。在用PBS或对照(Luc)SNALP处理的小鼠中没有检测到特异性PCR产物。PCR产物的核苷酸测序通过PLK-1 mRNA中PLK1424 siRNA-介导的RNA干扰证实预测的裂解位点。
图17显示用Luc SNALP(上)或PLK1424 SNALP(下)处理的小鼠中的Hep3B肿瘤组织学。Luc SNALP-处理的小鼠表现出Hep3B肿瘤中的正常有丝分裂,而PLK1424 SNALP-处理的小鼠表现出Hep3B肿瘤中的许多异常有丝分裂和肿瘤细胞凋亡。
结论
该实施例举例说明对具有Hep3B肿瘤的小鼠进行单次PLK1424 1∶57SNALP给药诱导显著的PLK-1 mRNA体内沉默。这种PLK-1 mRNA的减少被利用5’RACE-PCR分析验证是由RNA干扰介导的。重要的是,由1∶57SNALP制剂引起的PLK-1 mRNA沉默完全破坏肿瘤细胞增殖(有丝分裂),从而导致肿瘤细胞随后凋亡。如在前实施例中证明地,该抗肿瘤作用转化为延长荷瘤小鼠的存活时间。
实施例11.在皮下Hep3B肿瘤模型中比较含有PEG-cDMA或PEG-cDSA的1∶57 PLK-1 SNALP。
该实施例证明1∶57制剂中的PEG-脂质PEG-cDSA(3-N-[(-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二硬脂酰氧基丙胺)用于全身靶向远隔(例如,皮下)肿瘤的功效。具体地,该实施例比较含有PEG-cDMA(C14)或PEG-cDSA(C18)的1∶57 PLK-1 SNALP的肿瘤靶向能力。读数是肿瘤生长抑制和PLK1mRNA沉默。使用的PLK1 mRNA是PLK1424 U4/GU,其序列提供在表8中。
皮下(S.C.)Hep3B肿瘤在scid/beige小鼠中形成。对于以下各组(每组n=5)评价1∶57 PLK-1 SNALP的多剂量抗肿瘤功效:(1)“Luc-cDMA”-PEG-cDMA Luc SNALP;(2)“PLK-cDMA”-PEG-cDMA PLK-1 SNALP;和(3)“PLK-cDSA”-PEG-cDSA PLK-1 SNALP。肿瘤一旦达到直径约5mm(第10天),开始施用6x2mg/kg siRNA。给药在第10、12、14、17、19和21天进行。通过测径器测量肿瘤,每周2次。
图18显示多次剂量的包含PEG-cDSA的1∶57 PLK-1 SNALP诱导形成的Hep3B S.C.肿瘤的消退。具体地,在PLK1-cDSA处理的小鼠中5/5肿瘤出现扁平,这仅可通过肿瘤部位处的褪色测量到。
图19显示在单次静脉内SNALP给药后,在S.C.Hep3B肿瘤中1∶57PLK SNALP的mRNA沉默。在图18中所示的多剂量研究中,关于PLK1-cDSA SNALP观察到的沉默程度与抗肿瘤活性相关。
Luc-cDMA SNALP-处理组,其在第24天已经形成了大的S.C.肿瘤,然后在第24、26、28、31、33和35天施用PLK-cDSA SNALP。对最初PLK-1 SNALP-处理组没有另外的给药。使用大的已形成肿瘤的此交叉给药研究的结果提供在图20中,其显示PLK1-cDSA SNALP抑制大的S.C.Hep3B肿瘤的生长。
在scid/beige小鼠中,利用形成的肝内Hep3B肿瘤进行PEG-cDMA和PEG-cDSA 1∶57 SNALP对PLK-1mRNA沉默的作用的比较。静脉内施用单次2mg/kg剂量的含有PEG-cDMA或PEG-cDSA的1∶57 PLK-1SNALP。在SNALP处理后24和96小时收集肝/肿瘤样品。对照=2mg/kgLuc-cDMA SNALP,在24小时时。
图21显示PLK-cDMA SNALP和PLK-cDSA SNALP在24小时后具有类似的沉默活性,但是PLK-cDSA SNALP可以增加肝内肿瘤中mRNA沉默的持续时间。
图22显示含有PEG-cDMA或PEG-cDSA的1∶57 PLK-1 SNALP的血液清除曲线。对PLK-cDSA SNALP观察到的延长的血液循环时间可以能够增加在远隔(例如,皮下)肿瘤部位处的累积和活性。
因此,本研究显示1∶57 PEG-cDSA SNALP制剂可以用于优先地靶向肝外的肿瘤,而1∶57 PEG-cDMA SNALP可以用于优先地靶向肝。
实施例12.胆固醇基-2’-羟基乙醚的合成。
步骤1:装有胆固醇(5.0g,12.9mmol)和搅拌棒的250ml圆底烧瓶密封并用氮注满。将甲苯磺酰氯(5.0g,26.2mmol)称重到单独的100-mL圆底烧瓶中,也密封并用氮注满。将无水吡啶(2x50ml)递送至每个烧瓶中。然后,通过套管将甲苯磺酰氯溶液转移至该250ml烧瓶中,并搅拌反应物过夜。吡啶通过旋转蒸发去除,并向残渣中加入甲醇(80ml)。这随后搅拌1小时,直至获得均匀混悬液。混悬液过滤,用乙腈(50ml)清洗,并在真空下干燥以产生为松散的白色固体的甲苯磺酸胆固醇酯(6.0g,86%)。
步骤2:将甲苯磺酸胆固醇酯(2.0g,3.7mmol),1,4-二噁烷(50mL),和乙二醇(4.6g,74mmol)加入至装有搅拌棒的100ml烧瓶。对烧瓶装配冷凝器,并回流过夜。然后通过旋转蒸发去除二噁烷,并将反应混合物悬浮在水(100ml)中。将溶液转移至分液漏斗并用氯仿(3x100ml)萃取。合并有机相,用水清洗(2x150ml),在硫酸镁上干燥,并去除溶剂。粗产物通过柱层析(5%丙酮/己烷)纯化,以生成为白色固体的产物(1.1g,69%)。
胆固醇衍生物胆固醇基-2’-羟基乙醚和胆固醇基-4’-羟基丁醚的结构如下:
Figure BPA00001277238501141
胆固醇基-2’-羟基乙醚
Figure BPA00001277238501151
胆固醇基-4’-羟基丁醚
要理解的是以上说明意欲举例说明而非限制。在阅读以上说明后,许多实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本发明的范围,因此不应该参考以上说明来确定,而应该替代地通过参照附带的权利要求,以及权利要求有权保护的等价物的全部范围来确定。全部文章和参考文献,包括专利申请、专利、PCT出版物、和Genbank编号的公开内容均通过引用引入本文用于全部目的。

Claims (46)

1.一种核酸-脂质颗粒,包含:
(a)核酸;
(b)阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约50mol%-约85mol%;
(c)非-阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约13mol%-约49.5mol%;和
(d)抑制颗粒聚集的缀合脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约0.5mol%-约2mol%。
2.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸包括小干扰RNA(siRNA)。
3.权利要求2所述的核酸-脂质颗粒,其中所述siRNA包含约15-约60个核苷酸。
4.权利要求2所述的核酸-脂质颗粒,其中所述siRNA包含至少一个修饰的核苷酸。
5.权利要求2所述的核酸-脂质颗粒,其中所述siRNA包含至少一个2’-O-甲基(2’OMe)核苷酸。
6.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质包括1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)或其混合物。
7.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质包括2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨乙基)-[1,3]-二氧环戊烷(DLin-K-C2-DMA)。
8.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质占所述颗粒中存在的总脂质的约56.5mol%-约66.5mol%。
9.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质占所述颗粒中存在的总脂质的约52mol%-约62mol%。
10.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述非-阳离子脂质包括胆固醇或其衍生物。
11.权利要求10所述的核酸-脂质颗粒,其中所述胆固醇或其衍生物占约所述颗粒中存在的总脂质的约31.5mol%-约42.5mol%。
12.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述非-阳离子脂质包括磷脂。
13.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述非-阳离子脂质包括磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物。
14.权利要求13所述的核酸-脂质颗粒,其中所述磷脂包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或其混合物。
15.权利要求13所述的核酸-脂质颗粒,其中所述磷脂占所述颗粒中存在的总脂质的约4mol%-约10mol%且所述胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质的约30mol%-约40mol%。
16.权利要求13所述的核酸-脂质颗粒,其中所述磷脂占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%且所述胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol%-约30mol%。
17.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中抑制颗粒聚集的所述缀合脂质包括聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
18.权利要求17所述的核酸-脂质颗粒,其中所述PEG-脂质缀合物包括PEG-二酰甘油(PEG-DAG)缀合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物或其混合物。
19.权利要求18所述的核酸-脂质颗粒,其中所述PEG-DAA缀合物包括PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(PEG-DMA)缀合物、PEG-二硬脂基氧基丙基(PEG-DSA)缀合物或其混合物。
20.权利要求19所述的核酸-脂质颗粒,其中所述PEG的平均分子量为约2,000道尔顿。
21.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中抑制颗粒聚集的所述缀合脂质占所述颗粒中存在的总脂质的约1mol%-约2mol%。
22.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸-脂质颗粒中的核酸在所述颗粒在血清中37℃温育30分钟后基本不降解。
23.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸完全包封在所述核酸-脂质颗粒中。
24.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸-脂质颗粒的脂质∶核酸质量比为约5-约15。
25.权利要求1所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸-脂质颗粒的中位直径为约40nm-约150nm。
26.一种药物组合物,其包含权利要求1所述的核酸-脂质颗粒和药用载体。
27.一种核酸-脂质颗粒,包含:
(a)siRNA;
(b)阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约56.5mol%-约66.5mol%;
(c)胆固醇或其衍生物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约31.5mol%-约42.5mol%;和
(d)PEG-脂质缀合物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约1mol%-约2mol%。
28.权利要求27所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质包括DLinDMA。
29.权利要求27所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质包括DLin-K-C2-DMA。
30.权利要求27所述的核酸-脂质颗粒,其中所述PEG-脂质缀合物包括PEG-DAA缀合物。
31.权利要求27所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸-脂质颗粒包含约61.5mol%阳离子脂质、约36.9%胆固醇或其衍生物和约1.5mol%PEG-脂质缀合物。
32.一种药物组合物,其包含权利要求27所述的核酸-脂质颗粒和药用载体。
33.一种核酸-脂质颗粒,包含:
(a)siRNA;
(b)阳离子脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的约52mol%-约62mol%;
(c)磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约36mol%-约47mol%;和
(d)PEG-脂质缀合物,其占所述颗粒中存在的总脂质的约1mol%-约2mol%。
34.权利要求33所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质包括DLinDMA。
35.权利要求33所述的核酸-脂质颗粒,其中所述阳离子脂质包括DLin-K-C2-DMA。
36.权利要求33所述的核酸-脂质颗粒,其中所述磷脂包括DPPC。
37.权利要求33所述的核酸-脂质颗粒,其中所述PEG-脂质缀合物包括PEG-DAA缀合物。
38.权利要求33所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸-脂质颗粒包含约57.1mol%阳离子脂质、约7.1mol%磷脂、约34.3mol%胆固醇或其衍生物和约1.4mol%PEG-脂质缀合物。
39.权利要求33所述的核酸-脂质颗粒,其中所述核酸-脂质颗粒包含约57.1mol%阳离子脂质、约20mol%磷脂、约20mol%胆固醇或其衍生物和约1.4mol%PEG-脂质缀合物。
40.一种药物组合物,其包含权利要求33所述的核酸-脂质颗粒和药用载体。
41.一种将核酸引入细胞的方法,所述方法包括:
使所述细胞与权利要求1、27、或33所述的核酸-脂质颗粒相接触。
42.权利要求41所述的方法,其中所述细胞是哺乳动物的细胞。
43.一种用于体内递送核酸的方法,所述方法包括:
对哺乳动物受试者施用权利要求1、27、或33所述的核酸-脂质颗粒。
44.权利要求43所述的方法,其中所述施用选自由以下各项组成的组:口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、病灶内、气管内、皮下、和皮内。
45.一种用于在需要治疗的哺乳动物受试者中治疗疾病或功能障碍的方法,所述方法包括:
对所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求1、27、或33所述的核酸-脂质颗粒。
46.权利要求45所述的方法,其中所述疾病或病症选自由病毒感染、肝疾病或功能障碍、和癌症组成的组。
CN200980122413.4A 2008-04-15 2009-04-15 用于核酸递送的新型制剂 Active CN102119217B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4522808P 2008-04-15 2008-04-15
US61/045,228 2008-04-15
PCT/CA2009/000496 WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-04-15 Novel lipid formulations for nucleic acid delivery

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102119217A true CN102119217A (zh) 2011-07-06
CN102119217B CN102119217B (zh) 2015-06-03

Family

ID=41198741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980122413.4A Active CN102119217B (zh) 2008-04-15 2009-04-15 用于核酸递送的新型制剂

Country Status (14)

Country Link
US (11) US8058069B2 (zh)
EP (1) EP2279254B1 (zh)
JP (1) JP5475753B2 (zh)
CN (1) CN102119217B (zh)
AU (1) AU2009238175C1 (zh)
CA (1) CA2721333C (zh)
DK (1) DK2279254T3 (zh)
ES (1) ES2638448T3 (zh)
HU (1) HUE034483T2 (zh)
IL (1) IL208744A (zh)
NZ (1) NZ588583A (zh)
PL (1) PL2279254T3 (zh)
PT (1) PT2279254T (zh)
WO (1) WO2009127060A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104114571A (zh) * 2011-10-05 2014-10-22 普洛体维生物治疗公司 用于沉默醛脱氢酶的组合物和方法
CN104321304A (zh) * 2012-02-24 2015-01-28 普洛体维生物治疗公司 三烷基阳离子脂质及其使用方法
CN104997801A (zh) * 2015-05-28 2015-10-28 厦门成坤生物技术有限公司 包含季铵盐类化合物和siRNA的组合物及其制备方法
CN106794141A (zh) * 2014-07-16 2017-05-31 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
CN111542338A (zh) * 2017-12-27 2020-08-14 武田药品工业株式会社 含核酸脂质纳米粒子及其用途
CN113164379A (zh) * 2018-10-01 2021-07-23 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的可生物降解脂质
CN114681402A (zh) * 2020-12-28 2022-07-01 财团法人工业技术研究院 免疫刺激性脂质复合体、包含免疫刺激性脂质复合体的药物组合物以及其用途

Families Citing this family (592)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10214983A1 (de) 2002-04-04 2004-04-08 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen
DE60334618D1 (de) 2002-06-28 2010-12-02 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
ES2423060T3 (es) 2004-03-12 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF
AU2005306533B2 (en) * 2004-11-17 2012-05-31 Arbutus Biopharma Corporation siRNA silencing of apolipoprotein B
US9393315B2 (en) 2011-06-08 2016-07-19 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing siRNA activity
EP3611266B1 (en) 2005-08-23 2022-11-09 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
AU2006308765B2 (en) * 2005-11-02 2013-09-05 Arbutus Biopharma Corporation Modified siRNA molecules and uses thereof
EP3578656B1 (en) 2006-05-11 2021-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
US8598333B2 (en) * 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
JP5697988B2 (ja) * 2007-12-27 2015-04-08 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 干渉rnaを使用したポロ様キナーゼ発現のサイレンシング方法
JP2011511004A (ja) * 2008-01-31 2011-04-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド PCSK9遺伝子を標的とするdsRNAを送達するための最適化された方法
JP2011518117A (ja) 2008-03-05 2011-06-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド Eg5およびVEGF遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
JP5681626B2 (ja) 2008-07-14 2015-03-11 ポリーペイド リミテッドPolypid Ltd. 徐放性薬剤キャリア組成物
CA2739170A1 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of serum amyloid a gene
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP2344639B1 (en) 2008-10-20 2015-04-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
NZ593618A (en) 2008-12-10 2013-02-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
JP5793423B2 (ja) * 2008-12-31 2015-10-14 ロシュ・イノベーション・センター・コペンハーゲン・アクティーゼルスカブRoche Innovation Center Copenhagen A/S 急性冠症候群の治療のためのLNAApoBアンチセンスオリゴマーの使用
JP6032724B2 (ja) * 2009-03-12 2016-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法
KR101184928B1 (ko) * 2009-05-14 2012-09-20 한국과학기술연구원 작은 올리고뉴클레오티드의 중합 방법 및 상기 중합 방법에 의하여 제조된 고분자 올리고뉴클레오티드의 용도
EP2442792A4 (en) 2009-06-15 2015-12-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc DOUBLE STRANDED RNA IN LIPID FORMULATION TARGETING THE PCSK9 GENE
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
DE102009031274A1 (de) 2009-06-30 2011-01-13 Justus-Liebig-Universität Giessen Liposomen zur pulmonalen Applikation
IL292615B2 (en) * 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
US8236943B2 (en) 2009-07-01 2012-08-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
WO2011007353A1 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Polypid Ltd. Sustained-release drug carrier composition
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
AP2015008874A0 (en) 2009-08-14 2015-11-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
WO2011022460A1 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
CN107519133A (zh) 2009-09-15 2017-12-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 脂质配制的组合物及抑制Eg5和VEGF基因的表达的方法
US9187746B2 (en) 2009-09-22 2015-11-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dual targeting siRNA agents
EP2480668A2 (en) 2009-09-23 2012-08-01 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing genes expressed in cancer
JP5723378B2 (ja) 2009-11-03 2015-05-27 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. トランスサイレチン(ttr)を阻害する脂質製剤化組成物及び方法
RU2573409C2 (ru) * 2009-11-04 2016-01-20 Дзе Юниверсити Оф Бритиш Коламбиа Содержащие нуклеиновые кислоты липидные частицы и относящиеся к ним способы
ES2713852T3 (es) 2009-12-01 2019-05-24 Translate Bio Inc Derivado de esteroides para la administración de ARNm en enfermedades genéticas humanas
EP2525778B1 (en) 2010-01-19 2018-08-01 Polypid Ltd. Sustained-release nucleic acid matrix compositions
US20130037977A1 (en) 2010-04-08 2013-02-14 Paul A. Burke Preparation of Lipid Nanoparticles
WO2011139911A2 (en) * 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
US8865675B2 (en) 2010-05-12 2014-10-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
US8802863B2 (en) 2010-05-24 2014-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. Amino alcohol cationic lipids for oligonucleotide delivery
AU2011261434B2 (en) 2010-06-02 2015-11-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods directed to treating liver fibrosis
US9006417B2 (en) * 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
PT2591114T (pt) 2010-07-06 2016-08-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Imunização de mamíferos de grande porte com doses baixas de arn
LT2590676T (lt) 2010-07-06 2016-10-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Viriono tipo išnešiojančios dalelės, skirtos besireplikuojančioms rnr molekulėms
RS54489B1 (en) 2010-07-06 2016-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa LIPOSOMS WITH LIPIDS THAT HAVE IMPROVED PKA VALUE FOR RNA RELEASE
EP2590670B1 (en) 2010-07-06 2017-08-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods of raising an immune response by delivery of rna
EP2590625B1 (en) * 2010-07-06 2017-09-20 GlaxoSmithKline Biologicals SA Cationic oil-in-water emulsions
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
DK2606134T3 (da) 2010-08-17 2019-07-22 Sirna Therapeutics Inc RNA-Interferens-formidlet inhibering af hepatitis-B-virus (HBV)-genekspression ved hjælp af kort interfererende nukleinsyre (siNA)
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP3406730B1 (en) 2010-08-31 2022-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides
ES2935542T3 (es) 2010-08-31 2023-03-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas pequeños para la administración de ARN que codifica para inmunógeno
PL3970742T3 (pl) 2010-08-31 2022-09-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pegylowane liposomy do dostarczania rna kodującego immunogen
KR101223483B1 (ko) * 2010-09-10 2013-01-17 한국과학기술연구원 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 동시에 연결된 고분자―siRNA 나노입자 전달체
ES2888231T3 (es) 2010-09-20 2022-01-03 Sirna Therapeutics Inc Lípidos catiónicos de bajo peso molecular para el suministro de oligonucleótidos
WO2012044638A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
CN104531671A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
US20140030292A1 (en) 2010-10-11 2014-01-30 Novartis Ag Antigen delivery platforms
EP3485913A1 (en) 2010-10-21 2019-05-22 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
DK2632472T3 (en) 2010-10-29 2018-03-19 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA)
DK2635265T3 (en) 2010-11-05 2018-07-16 Sirna Therapeutics Inc New low molecular weight cyclic amine-containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
EP2648763A4 (en) 2010-12-10 2014-05-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR EXPRESSION INHIBITION OF GENES KLF-1 AND BCL11A
WO2012078967A2 (en) 2010-12-10 2012-06-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing erythropoietin (epo) production
SG193923A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for inhibiting expression of tmprss6 gene
CA2831613A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US8592572B2 (en) * 2011-05-23 2013-11-26 Delta-Fly Pharma, Inc. Liposome containing shRNA molecule targeting a thymidylate synthase and use thereof
US20120301537A1 (en) * 2011-05-23 2012-11-29 Delta-Fly Pharma, Inc. LIPOSOME CONTAINING shRNA MOLECULE TARGETING A THYMIDYLATE SYNTHASE AND USE THEREOF
IL280771B2 (en) * 2011-06-08 2024-03-01 Shire Human Genetic Therapies Preparations of lipid nanoparticles and methods for administration of mRNA
US9011903B2 (en) 2011-06-08 2015-04-21 Nitto Denko Corporation Cationic lipids for therapeutic agent delivery formulations
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
US9068184B2 (en) 2011-06-21 2015-06-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of expression of protein C (PROC) genes
AU2012272908A1 (en) 2011-06-21 2013-12-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
MX344807B (es) 2011-06-21 2017-01-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibicion de genes para alipoproteina c-iii (apoc3).
MX360782B (es) 2011-06-21 2018-11-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni similares a angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para su uso.
EP3366312A1 (en) 2011-06-23 2018-08-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina 1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment
US11896636B2 (en) 2011-07-06 2024-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combination compositions and uses thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP3069785A1 (en) 2011-10-25 2016-09-21 The University Of British Columbia Limit size lipid nanoparticles and related methods
US9320814B2 (en) * 2011-11-01 2016-04-26 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Polyplexes of hydrophobically-modified siRNA for delivery of siRNA
PL3301177T3 (pl) 2011-11-18 2020-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ŚRODKI RNAi, KOMPOZYCJE I SPOSOBY ICH ZASTOSOWANIA DO LECZENIA CHORÓB ZWIĄZANYCH Z TRANSTYRETYNĄ (TTR)
WO2013086373A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
AU2012347637B2 (en) 2011-12-07 2017-09-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
WO2013151666A2 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243953A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9402816B2 (en) 2012-04-19 2016-08-02 Sima Therapeutics, Inc. Diester and triester based low molecular weight, biodegradeable cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9127274B2 (en) 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
EP2858679B2 (en) 2012-06-08 2024-06-05 Translate Bio, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
WO2014008334A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Stable non-aggregating nucleic acid lipid particle formulations
CN102719437A (zh) * 2012-07-11 2012-10-10 潍坊医学院 利用慢病毒载体介导PLK1 RNAi在治疗食管鳞癌转移中的应用
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
DK2922554T3 (en) 2012-11-26 2022-05-23 Modernatx Inc Terminalt modificeret rna
RS56783B9 (sr) 2012-12-05 2021-12-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Sastavi pcsk9 irnk i postupci njihovih primena
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
EA201591293A1 (ru) 2013-03-14 2016-02-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки антител, кодируемых мрнк
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
AU2014244116B9 (en) 2013-03-14 2020-08-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component C5 iRNA compositions and methods of use thereof
KR20210122917A (ko) 2013-03-14 2021-10-12 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Cftr mrna 조성물 및 관련 방법 및 사용
DK2970955T3 (en) 2013-03-14 2019-02-11 Translate Bio Inc METHODS FOR CLEANING MESSENGER RNA
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US20140288149A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Graham Lord Mir-142 and antagonists thereof for treating disease
LT2972360T (lt) 2013-03-15 2018-09-10 Translate Bio, Inc. Sinergistinis nukleorūgščių pristatymo padidinimas sumaišytų kompozicijų pagalba
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014172045A1 (en) 2013-03-15 2014-10-23 The University Of British Columbia Lipid nanoparticles for transfection and related methods
AP2015008862A0 (en) 2013-05-22 2015-11-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
TWI664187B (zh) 2013-05-22 2019-07-01 阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子A1 iRNA組成物及其使用方法
SG11201510286QA (en) 2013-06-17 2016-01-28 Broad Inst Inc Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
DK3011031T3 (da) 2013-06-17 2020-12-21 Broad Inst Inc Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi
DK3011032T3 (da) 2013-06-17 2020-01-20 Broad Inst Inc Fremføring, modificering og optimering af systemer, fremgangsmåder og sammensætninger til målretning mod og modellering af sygdomme og forstyrrelser i postmitotiske celler
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
CA2919226C (en) 2013-07-23 2024-05-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
TW202003849A (zh) 2013-10-02 2020-01-16 美商艾爾妮蘭製藥公司 抑制lect2基因表現之組合物及方法
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051214A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
MY197646A (en) 2013-10-04 2023-06-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene
US11224642B2 (en) 2013-10-22 2022-01-18 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
US20150110857A1 (en) 2013-10-22 2015-04-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
EA034103B1 (ru) 2013-10-22 2019-12-27 Транслейт Био, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
PE20161242A1 (es) 2013-10-22 2016-12-11 Massachusetts Inst Technology Formulaciones de lipidos para la administracion de arn mensajero
DK3071696T3 (da) 2013-11-22 2019-10-07 Mina Therapeutics Ltd C/ebp alfa kort aktiverings-rna-sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse
EP4219699A1 (en) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
AU2014362262B2 (en) 2013-12-12 2021-05-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component iRNA compositions and methods of use thereof
CN111269902A (zh) 2013-12-12 2020-06-12 布罗德研究所有限公司 Crispr-cas系统和组合物的递送及用途
DK3079725T3 (da) 2013-12-12 2020-01-20 Broad Inst Inc Administration, brug og terapeutiske anvendelser af crispr-cas-systemerne og sammensætninger til genomredigering
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
JP6625055B2 (ja) 2013-12-12 2020-01-08 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるcrispr−cas系の使用方法
KR20160089526A (ko) 2013-12-12 2016-07-27 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 입자 전달 성분을 이용한 표적 장애 및 질병에 대한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 이용 및 치료 적용
KR102592370B1 (ko) 2014-02-11 2023-10-25 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 케토헥소키나제(KHK) iRNA 조성물 및 그의 사용 방법
US10821175B2 (en) 2014-02-25 2020-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
EP4023249A1 (en) * 2014-04-23 2022-07-06 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
EP3134506B1 (en) 2014-04-25 2019-08-07 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
KR102410687B1 (ko) 2014-05-22 2022-06-22 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오텐시노겐 (agt) irna 조성물 및 이의 사용 방법
BR112016027705A2 (pt) 2014-05-30 2018-01-30 Shire Human Genetic Therapies lipídios biodegradáveis para distribuição de ácidos nucleicos
EP3154694A1 (en) 2014-06-13 2017-04-19 Children's Medical Center Corporation Products and methods to isolate mitochondria
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
UA121863C2 (uk) 2014-06-24 2020-08-10 Транслейт Байо, Інк. Стереохімічно збагачені композиції для доставки нуклеїнових кислот
RS63848B1 (sr) 2014-06-25 2023-01-31 Acuitas Therapeutics Inc Novi lipidi i formulacije lipidnih nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
BR112016030852A2 (pt) 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
EP3169693B1 (en) 2014-07-16 2022-03-09 ModernaTX, Inc. Chimeric polynucleotides
AU2015289656A1 (en) 2014-07-16 2017-02-16 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3686279B1 (en) 2014-08-17 2023-01-04 The Broad Institute, Inc. Genome editing using cas9 nickases
US9765333B2 (en) 2014-08-21 2017-09-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing marburg virus gene expression
HUE059857T2 (hu) 2014-08-29 2023-01-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Patizirán transztiretin által közvetített amiloidózis kezelésében történõ alkalmazásra
EP3191591A1 (en) 2014-09-12 2017-07-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016054421A1 (en) 2014-10-02 2016-04-07 Protiva Biotherapeutics, Inc Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
JOP20200115A1 (ar) 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
WO2016061487A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting aminolevulinic acid synthase-1 (alas1) and uses thereof
EP3904519A1 (en) 2014-10-30 2021-11-03 Genzyme Corporation Polynucleotide agents targeting serpinc1 (at3) and methods of use thereof
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
WO2016081444A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
MA56412A (fr) 2014-12-05 2022-05-04 Translate Bio Inc Thérapie par l'arn messager pour le traitement des maladies articulaires
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3230452A1 (en) 2014-12-12 2017-10-18 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir(商標)化合物
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
AU2016209295B2 (en) 2015-01-21 2021-08-12 Genevant Sciences Gmbh Methods, compositions, and systems for delivering therapeutic and diagnostic agents into cells
CA2976445A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
EP3270894B1 (en) 2015-03-19 2021-02-24 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for pompe disease
MX2017012610A (es) 2015-04-08 2018-03-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion del gen lect2.
US10653768B2 (en) 2015-04-13 2020-05-19 Curevac Real Estate Gmbh Method for producing RNA compositions
WO2016197132A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2016201301A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
WO2016205323A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
FI3430134T3 (fi) 2015-06-18 2023-01-13 Uusia CRISPR-entsyymejä ja järjestelmiä
WO2016205745A2 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2016205613A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Crispr enzyme mutations reducing off-target effects
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
CN107922364B (zh) 2015-06-29 2021-12-31 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的脂质和脂质纳米颗粒制剂
WO2017011286A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (igfals) and insulin-like growth factor 1 (igf-1) irna compositions and methods of use thereof
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
US11007260B2 (en) 2015-07-21 2021-05-18 Modernatx, Inc. Infectious disease vaccines
EP3329003A2 (en) 2015-07-29 2018-06-06 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
DK3329002T3 (da) 2015-07-31 2021-01-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc Transthyretin (ttr)-irna-sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling eller forebyggelse af ttr-forbundne sygdomme
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
EP3337908A4 (en) 2015-08-18 2019-01-23 The Broad Institute, Inc. METHOD AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN GRINDING AND / OR DOMAINS
BR112018003784A2 (pt) 2015-08-24 2018-09-25 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. nanopartículas de polinucleotídeo para a modulação da expressão gênica e sua utilização
EA201890619A1 (ru) 2015-09-02 2018-09-28 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ iRNA ЛИГАНДА 1 БЕЛКА ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК 1 (PD-L1) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP3350328A1 (en) 2015-09-14 2018-07-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) and methods of use thereof
LT3350157T (lt) 2015-09-17 2022-02-25 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
WO2017062513A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
US20190255107A1 (en) 2015-10-09 2019-08-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
AU2016338559B2 (en) 2015-10-14 2022-11-24 Translate Bio, Inc. Modification of RNA-related enzymes for enhanced production
EP3362049A1 (en) 2015-10-16 2018-08-22 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing camptothecin pharmaceutical compositions
EA201891001A1 (ru) 2015-10-22 2018-11-30 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот против вируса ветряной оспы (vzv)
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
CN109153980B (zh) 2015-10-22 2023-04-14 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
JP2018531290A (ja) 2015-10-22 2018-10-25 モデルナティーエックス, インコーポレイテッド 性感染症ワクチン
WO2017070613A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US11492670B2 (en) 2015-10-27 2022-11-08 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific sequence variations
JP7030690B2 (ja) 2015-10-28 2022-03-07 アキィタス・セラピューティクス・インコーポレイテッド 核酸のデリバリーのための新規脂質および脂質ナノ粒子製剤
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017075478A2 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by use of immune cell gene signatures
US11903974B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from cultured cells
AU2016366978B2 (en) 2015-12-10 2022-07-28 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP4036079A3 (en) 2015-12-22 2022-09-28 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
SI3394093T1 (sl) 2015-12-23 2022-05-31 Modernatx, Inc. Metode uporabe liganda OX40, ki kodira polinukleotid
WO2017120612A1 (en) 2016-01-10 2017-07-13 Modernatx, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies
DK3440206T3 (da) 2016-04-08 2020-11-23 Translate Bio Inc Multimer-kodende nukleinsyre og anvendelser deraf
US20200263190A1 (en) 2016-04-19 2020-08-20 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
CA3026112A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
MA45295A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser
SG10202010311SA (en) 2016-04-19 2020-11-27 Broad Inst Inc Novel Crispr Enzymes and Systems
KR102533456B1 (ko) 2016-05-18 2023-05-17 모더나티엑스, 인크. 릴랙신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
ES2941411T3 (es) 2016-05-18 2023-05-22 Modernatx Inc Polinucleótidos que codifican interleucina-12 (IL12) y usos de los mismos
AU2017266929B2 (en) 2016-05-18 2023-05-11 Modernatx, Inc. Combinations of mRNAs encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
EP3469083A1 (en) 2016-06-10 2019-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
US10835583B2 (en) 2016-06-13 2020-11-17 Translate Bio, Inc. Messenger RNA therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
JP2019525901A (ja) * 2016-06-14 2019-09-12 モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX,Inc. 脂質ナノ粒子の安定化製剤
US11788083B2 (en) 2016-06-17 2023-10-17 The Broad Institute, Inc. Type VI CRISPR orthologs and systems
US20210222164A1 (en) 2016-06-29 2021-07-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
EP3478838A1 (en) 2016-06-30 2019-05-08 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for delivering messenger rna
KR20190026819A (ko) 2016-07-07 2019-03-13 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 외인성 rna를 발현하는 치료용 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법
US11352647B2 (en) 2016-08-17 2022-06-07 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
US20200283743A1 (en) 2016-08-17 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2018033254A2 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Curevac Ag Rna for cancer therapy
US20190262399A1 (en) 2016-09-07 2019-08-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
WO2018064755A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
WO2018119514A1 (en) * 2016-12-28 2018-07-05 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
US20200016202A1 (en) 2016-10-07 2020-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
JP6980780B2 (ja) 2016-10-21 2021-12-15 モデルナティーエックス, インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
EP3532103A1 (en) 2016-10-26 2019-09-04 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
EP3538067A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
CN110167587A (zh) 2016-11-11 2019-08-23 摩登纳特斯有限公司 流感疫苗
TW202313978A (zh) 2016-11-23 2023-04-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子A1 iRNA組成物及其使用方法
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
JP2020501545A (ja) 2016-12-08 2020-01-23 キュアバック アーゲー 肝疾患の処置または予防のためのrna
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
AU2017376950B2 (en) 2016-12-16 2024-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing TTR-associated diseases using transthyretin (TTR) iRNA compositions
WO2018115507A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Henipavirus vaccine
US11141476B2 (en) 2016-12-23 2021-10-12 Curevac Ag MERS coronavirus vaccine
US11464847B2 (en) 2016-12-23 2022-10-11 Curevac Ag Lassa virus vaccine
AU2018224326B2 (en) 2017-02-27 2024-01-04 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized CFTR mRNA
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE
US11752206B2 (en) * 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP3595727A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 ModernaTX, Inc. Lipid nanoparticle formulation
DK3596042T3 (da) 2017-03-15 2022-04-11 Modernatx Inc Krystalformer af aminolipider
US11739308B2 (en) 2017-03-15 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Cas13b orthologues CRISPR enzymes and systems
CN110520409A (zh) 2017-03-15 2019-11-29 摩登纳特斯有限公司 用于细胞内递送治疗剂的化合物和组合物
US11045540B2 (en) * 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
EP3609534A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. BROAD SPECTRUM VACCINE AGAINST THE INFLUENZA VIRUS
EP3595715A1 (en) 2017-03-17 2020-01-22 CureVac AG Rna vaccine and immune checkpoint inhibitors for combined anticancer therapy
WO2018170347A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
CN110914433A (zh) 2017-03-24 2020-03-24 库尔维科公司 编码crispr相关蛋白质的核酸及其用途
MA48047A (fr) 2017-04-05 2020-02-12 Modernatx Inc Réduction ou élimination de réponses immunitaires à des protéines thérapeutiques administrées par voie non intraveineuse, par exemple par voie sous-cutanée
KR20200006054A (ko) 2017-04-12 2020-01-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규 타입 vi crispr 오르소로그 및 시스템
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
WO2018191719A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid delivery of therapeutic agents to adipose tissue
WO2018191750A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute Inc. Novel delivery of large payloads
MA50278A (fr) 2017-04-18 2020-02-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Méthodes pour le traitement de sujets atteints d'une infection par le virus de l'hépatite b (vhb)
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
KR20200034668A (ko) 2017-05-08 2020-03-31 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 막 융합을 촉진시키기 위한 조성물 및 그의 용도
EP3624824A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
AU2018278315B2 (en) 2017-05-31 2024-01-18 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Therapeutics for glycogen storage disease type III
WO2018222890A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Synthesis and structure of high potency rna therapeutics
EP3630200A4 (en) 2017-05-31 2021-02-24 Arcturus Therapeutics, Inc. THERAPEUTICS FOR PHENYLKETONURIA
AU2018285860A1 (en) 2017-06-13 2020-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions comprising curons and uses thereof
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. RNA FORMULATIONS
CN111328287A (zh) 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子
JP7277432B2 (ja) 2017-07-13 2023-05-19 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド 乳酸脱水素酵素A(LDHA)iRNA組成物及びその使用方法
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
EP4328314A3 (en) 2017-08-22 2024-03-20 Tessera Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle methods and compositions for producing engineered erythroid cells
WO2019038332A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Curevac Ag VACCINE AGAINST BUNYAVIRUS
MX2020002348A (es) * 2017-08-31 2020-10-08 Modernatx Inc Métodos de elaboración de nanopartículas lipídicas.
AU2018330495A1 (en) 2017-09-08 2020-03-26 Mina Therapeutics Limited Stabilized hnf4a sarna compositions and methods of use
EP3679140B1 (en) 2017-09-08 2022-11-16 MiNA Therapeutics Limited Stabilized cebpa sarna compositions and methods of use
US10653767B2 (en) 2017-09-14 2020-05-19 Modernatx, Inc. Zika virus MRNA vaccines
EP3684931A1 (en) 2017-09-19 2020-07-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
CN111511388A (zh) 2017-09-21 2020-08-07 博德研究所 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物
WO2019071054A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF BUCKLES AND / OR CHROMATIN DOMAINS
RU2020115287A (ru) 2017-10-19 2021-11-19 Куревак Аг Новые молекулы искусственных нуклеиновых кислот
US11547614B2 (en) 2017-10-31 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for studying cell evolution
WO2019089828A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lamellar lipid nanoparticles
WO2019092153A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Curevac Ag Rna sequence adaptation
WO2019094983A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for treating cancer by targeting the clec2d-klrb1 pathway
EP3710587A1 (en) 2017-11-16 2020-09-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Kisspeptin 1 (kiss1) irna compositions and methods of use thereof
WO2019100039A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
US11931406B2 (en) 2017-12-13 2024-03-19 CureVac SE Flavivirus vaccine
TW201936201A (zh) 2017-12-14 2019-09-16 美商堅固生物科技公司 基因之非病毒生產及遞送
CA3086343A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. High mobility group box-1 (hmgb1) irna compositions and methods of use thereof
EP3727428A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
TW201930591A (zh) 2018-01-08 2019-08-01 瑞士商諾華公司 用於與嵌合抗原受體療法併用之免疫增強rna
WO2019140116A2 (en) 2018-01-10 2019-07-18 Rubius Therapeutics, Inc. Amplifiable rnas for therapeutic cell systems
US11911453B2 (en) 2018-01-29 2024-02-27 Modernatx, Inc. RSV RNA vaccines
US10982210B2 (en) 2018-03-02 2021-04-20 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions for delivery of cargo to cells
EP3773702A2 (en) 2018-04-05 2021-02-17 CureVac AG Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination
EP3775211B1 (en) 2018-04-12 2023-04-05 MiNA Therapeutics Limited Sirt1-sarna compositions and methods of use
WO2019202035A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Curevac Ag Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination
TW202016304A (zh) 2018-05-14 2020-05-01 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原(AGT)iRNA組成物及其使用方法
WO2020002525A1 (en) 2018-06-27 2020-01-02 Curevac Ag Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination
EP3833761A1 (en) 2018-08-07 2021-06-16 The Broad Institute, Inc. Novel cas12b enzymes and systems
US11987792B2 (en) 2018-08-16 2024-05-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the LECT2 gene
US20210317429A1 (en) 2018-08-20 2021-10-14 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
CA3108544A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
GB2617429B (en) 2018-09-04 2023-12-27 Univ Texas Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
GB2606038B (en) 2018-09-04 2023-05-03 Univ Texas Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
EP3853364A1 (en) 2018-09-18 2021-07-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
EP3852732A1 (en) 2018-09-19 2021-07-28 ModernaTX, Inc. Peg lipids and uses thereof
EP3852911A2 (en) 2018-09-21 2021-07-28 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
CA3111476A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Nutcracker Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations comprising lipidated cationic peptide compounds for nucleic acid delivery
CA3114699A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 The University Of British Columbia Compositions and systems comprising transfection-competent vesicles free of organic-solvents and detergents and methods related thereto
US10913951B2 (en) 2018-10-31 2021-02-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure
CA3122080A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating ornithine transcarbamylase deficiency
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
TW202039534A (zh) 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
CN113631709A (zh) 2018-12-20 2021-11-09 普拉克西斯精密药物股份有限公司 用于治疗kcnt1相关病症的组合物和方法
CA3118034A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Curevac Ag Rna for malaria vaccines
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020146805A1 (en) 2019-01-11 2020-07-16 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3125511A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Curevac Ag Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophthalmic diseases
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US20220177863A1 (en) 2019-03-18 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
WO2020208361A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Mina Therapeutics Limited Sirt1-sarna compositions and methods of use
US20220220469A1 (en) 2019-05-20 2022-07-14 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
WO2020246581A1 (ja) 2019-06-07 2020-12-10 富士フイルム株式会社 脂質組成物
WO2020254535A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Curevac Ag Rotavirus mrna vaccine
CA3147875A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Recombinase compositions and methods of use
WO2021020412A1 (ja) 2019-07-30 2021-02-04 塩野義製薬株式会社 Murf1を標的とする核酸医薬
WO2021022109A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SERPIN FAMILY F MEMBER 2 (SERPINF2) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP4007811A2 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carboxypeptidase b2 (cpb2) irna compositions and methods of use thereof
WO2021030522A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SMALL RIBOSOMAL PROTEIN SUBUNIT 25 (RPS25) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CR20220108A (es) 2019-08-14 2022-05-27 Acuitas Therapeutics Inc Nanopartículas lipídicas mejoradas para el suministro de ácidos nucleicos
JP2022544412A (ja) 2019-08-14 2022-10-18 キュアバック アーゲー 免疫賦活特性が減少したrna組み合わせおよび組成物
JOP20220030A1 (ar) 2019-08-16 2023-01-30 Regeneron Pharma صيغ مضادة لـ c5 عالية التركيز
EP4022058A2 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Sixfold Bioscience Ltd. Compositions for transfer of cargo to cells
BR112022003860A2 (pt) 2019-09-03 2022-08-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para inibir a expressão do gene lect2
US20220280427A1 (en) 2019-09-06 2022-09-08 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof
CN114728887A (zh) 2019-09-19 2022-07-08 摩登纳特斯有限公司 用于治疗剂的细胞内递送的支链尾端脂质化合物和组合物
US20220389429A1 (en) 2019-10-04 2022-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing ugt1a1 gene expression
WO2021076828A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Solute carrier family member irna compositions and methods of use thereof
CN115176004A (zh) 2019-10-22 2022-10-11 阿尔尼拉姆医药品有限公司 补体成分C3 iRNA组合物及其使用方法
AU2020369581A1 (en) 2019-10-25 2022-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing regimens for treating or preventing C5-associated diseases
AR120341A1 (es) 2019-11-01 2022-02-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSICIONES DE AGENTES DE ARNi CONTRA LA HUNTINGTINA (HTT) Y SUS MÉTODOS DE USO
WO2021087325A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing dnajb1-prkaca fusion gene expression
PE20230179A1 (es) 2019-11-13 2023-02-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de un trastorno asociado con angiotensinogeno (agt)
CN117417265A (zh) 2019-11-15 2024-01-19 富士胶片株式会社 脂质组合物
BR112022007481A2 (pt) 2019-11-22 2022-07-12 Generation Bio Co Lipídios ionizáveis e composições de nanopartículas dos mesmos
EP4061945A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ataxin3 (atxn3) rnai agent compositions and methods of use thereof
EP4073251A1 (en) 2019-12-13 2022-10-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Human chromosome 9 open reading frame 72 (c9orf72) irna agent compositions and methods of use thereof
WO2021126734A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
IL293890A (en) 2019-12-20 2022-08-01 Curevac Ag Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
WO2021154941A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11576966B2 (en) 2020-02-04 2023-02-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
JP2023513502A (ja) 2020-02-04 2023-03-31 キュアバック エスイー コロナウイルスワクチン
JP2023514190A (ja) 2020-02-10 2023-04-05 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド Vegf-a発現をサイレンシングするための組成物および方法
CN115397989A (zh) 2020-02-18 2022-11-25 阿尔尼拉姆医药品有限公司 载脂蛋白C3(APOC3)iRNA组合物及其使用方法
EP4114947A1 (en) 2020-03-05 2023-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
CN115485383A (zh) 2020-03-06 2022-12-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 己酮糖激酶(KHK)iRNA组合物及其使用方法
US11759515B2 (en) 2020-03-09 2023-09-19 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
KR20230003478A (ko) 2020-03-24 2023-01-06 제너레이션 바이오 컴퍼니 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도
CN115667530A (zh) 2020-03-24 2023-01-31 世代生物公司 非病毒dna载体和其用于表达因子ix治疗剂的用途
CN116209759A (zh) 2020-03-26 2023-06-02 阿尔尼拉姆医药品有限公司 冠状病毒iRNA组合物及其使用方法
US20230190785A1 (en) 2020-03-30 2023-06-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing dnajc15 gene expression
EP4126947A1 (en) 2020-03-30 2023-02-08 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
US11773391B2 (en) 2020-04-01 2023-10-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19
CN117377763A (zh) 2020-04-06 2024-01-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于沉默myoc表达的组合物和方法
EP4133076A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensin-converting enzyme 2 (ace2) irna compositions and methods of use thereof
WO2021206922A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
CA3179678A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing scn9a expression
AU2021252164A1 (en) 2020-04-09 2022-12-15 Finncure Oy Mimetic nanoparticles for preventing the spreading and lowering the infection rate of novel coronaviruses
GB2594365B (en) 2020-04-22 2023-07-05 BioNTech SE Coronavirus vaccine
JP2023523993A (ja) 2020-04-27 2023-06-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド アポリポタンパク質E(ApoE)iRNA剤組成物およびその使用方法
JP2023523345A (ja) 2020-04-27 2023-06-02 シックスフォールド バイオサイエンス リミテッド モジュール官能基を有する核酸ナノ粒子を含有する組成物
BR112022021136A2 (pt) 2020-04-30 2022-11-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de fator b de complemento (cfb) e métodos de uso das mesmas
EP4150086A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2)
WO2021231692A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of otoferlin (otof)
WO2021231698A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate lyase (asl)
EP4150088A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate synthetase (ass1)
WO2021231685A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of transmembrane channel-like protein 1 (tmc1)
WO2021231691A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of retinoschisin 1 (rsi)
WO2021231680A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2021231679A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of gap junction protein beta 2 (gjb2)
WO2021236980A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus antigen compositions and their uses
US20230193311A1 (en) 2020-05-20 2023-06-22 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
WO2021237097A1 (en) 2020-05-21 2021-11-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting marc1 gene expression
US20230203510A1 (en) 2020-05-29 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
CA3170740A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Curevac Ag Nucleic acid based combination vaccines
AU2021281453A1 (en) 2020-05-29 2022-11-17 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
AR122534A1 (es) 2020-06-03 2022-09-21 Triplet Therapeutics Inc Métodos para el tratamiento de los trastornos de expansión por repetición de nucleótidos asociados con la actividad de msh3
EP4162050A1 (en) 2020-06-09 2023-04-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
IL299094A (en) 2020-06-15 2023-02-01 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration of an adeno-associated virus vector for muscular dystrophies
IL299063A (en) 2020-06-18 2023-02-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Xanthine dehydrogenase (xdh) RNA compositions and methods of using them
CA3188801A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rna replicon vaccines against hbv
IL299750A (en) * 2020-07-10 2023-03-01 Genevant Sciences Gmbh Lipid nanoparticles for the delivery of therapeutic agents to the lungs
EP4182297A1 (en) 2020-07-16 2023-05-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
CN116234917A (zh) 2020-07-27 2023-06-06 安杰瑞姆生物科学公司 Dna分子组合物及其制备方法和使用方法
EP4172194A1 (en) 2020-07-31 2023-05-03 CureVac SE Nucleic acid encoded antibody mixtures
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2022043551A2 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Curevac Ag Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
WO2022051629A1 (en) 2020-09-03 2022-03-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
CN116056728A (zh) 2020-09-14 2023-05-02 富士胶片株式会社 脂质组合物
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗peg抗體的化合物
WO2022066847A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) irna compositions and methods of use thereof
TW202229552A (zh) 2020-10-05 2022-08-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 G蛋白-偶合受體75(GPR75)iRNA組成物及其使用方法
EP4232581A1 (en) 2020-10-21 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria
EP4232582A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin 5b (muc5b) irna compositions and methods of use thereof
WO2022099003A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Sanofi Lipid nanoparticles for delivering mrna vaccines
TW202237841A (zh) 2020-11-13 2022-10-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 凝血因子V(F5)iRNA組成物及其使用方法
AU2021385572A1 (en) 2020-11-25 2023-06-22 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
CA3201452A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
EP4259795A1 (en) 2020-12-08 2023-10-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coagulation factor x (f10) irna compositions and methods of use thereof
GB2603454A (en) 2020-12-09 2022-08-10 Ucl Business Ltd Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants
KR20230124980A (ko) * 2020-12-22 2023-08-28 코넬 유니버시티 쯔비터이온성 지질 나노입자 조성물 및 사용 방법
CA3171051A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
CA3205569A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 CureVac SE Rna vaccine against sars-cov-2 variants
US20240175020A1 (en) 2020-12-23 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
EP4267740A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Arcturus Therapeutics, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
EP4274896A1 (en) 2021-01-05 2023-11-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component 9 (c9) irna compositions and methods of use thereof
EP4281034A1 (en) 2021-01-24 2023-11-29 Forrest, Michael, David Inhibitors of atp synthase - cosmetic and therapeutic uses
US20240102065A1 (en) 2021-01-27 2024-03-28 CureVac SE Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
AU2022220704A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Superoxide dismutase 1 (sod1) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1- (sod1-) associated neurodegenerative diseases
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
EP4298220A1 (en) 2021-02-25 2024-01-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Prion protein (prnp) irna compositions and methods of use thereof
CA3209032A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Ethris Gmbh Formulations for aerosol formation and aerosols for the delivery of nucleic acid
BR112023016645A2 (pt) 2021-02-26 2023-11-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de ceto-hexoquinase (khk) e métodos de uso das mesmas
MX2023010249A (es) 2021-03-04 2023-09-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni de proteina similar a la angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para usarlas.
EP4305169A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
AU2022246144A1 (en) 2021-03-26 2023-09-21 Mina Therapeutics Limited Tmem173 sarna compositions and methods of use
WO2022200575A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
TW202305134A (zh) 2021-03-29 2023-02-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 杭丁頓蛋白(HTT)iRNA劑組成物及其使用方法
CA3171429A1 (en) 2021-03-31 2022-09-30 Alexander SCHWENGER Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna
KR20230165276A (ko) 2021-03-31 2023-12-05 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션 폴리펩티드 및 암의 치료에서의 이의 용도
EP4314293A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
EP4319803A1 (en) 2021-04-08 2024-02-14 Vaxthera SAS Coronavirus vaccine comprising a mosaic protein
KR20240012370A (ko) 2021-04-20 2024-01-29 안자리움 바이오사이언시스 아게 아밀로-알파-1, 6-글루코시다제, 4-알파-글루카노트랜스퍼라제를 인코딩하는 dna 분자의 조성물, 이를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법
JP2024515080A (ja) 2021-04-22 2024-04-04 インベンテージ ラボ インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子の製造方法およびその製造装置
AU2022264478A1 (en) 2021-04-26 2023-10-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane protease, serine 6 (tmprss6) irna compositions and methods of use thereof
WO2022232286A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
KR20240011714A (ko) 2021-04-27 2024-01-26 제너레이션 바이오 컴퍼니 치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 dna 벡터 및 이의 용도
JP2024519293A (ja) 2021-04-29 2024-05-10 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド シグナル伝達兼転写活性化因子6(STAT6)iRNA組成物およびその使用方法
EP4334446A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 CureVac SE Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
WO2022245583A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
EP4341405A1 (en) 2021-05-20 2024-03-27 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
WO2022244831A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Okinawa Institute Of Science And Technology School Corporation Coronavirus vaccine suitable for elderly individuals
WO2022256283A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
TW202317762A (zh) 2021-06-02 2023-05-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 含有類PATATIN磷脂酶結構域3(PNPLA3)的iRNA組成物及其使用方法
IL308743A (en) 2021-06-04 2024-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions of human chromosome 9 open reading frame 72 iRNA factor (C9ORF72) and methods of using them
WO2022260939A2 (en) 2021-06-08 2022-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing stargardt's disease and/or retinal binding protein 4 (rbp4)-associated disorders
CA3173953A1 (en) 2021-06-11 2023-12-10 Tyson D. BOWEN Rna polymerase iii promoters and methods of use
KR20220167770A (ko) 2021-06-11 2022-12-21 주식회사 나이벡 타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20240023420A (ko) 2021-06-14 2024-02-21 제너레이션 바이오 컴퍼니 양이온성 지질 및 이의 조성물
EP4358936A1 (en) 2021-06-22 2024-05-01 Bio-TRIP B.V. Nucleic acid containing nanoparticles
US20230194709A9 (en) 2021-06-29 2023-06-22 Seagate Technology Llc Range information detection using coherent pulse sets with selected waveform characteristics
EP4363574A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
WO2023278576A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating an angiotensinogen- (agt-) associated disorder
WO2023283403A2 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bis-rnai compounds for cns delivery
WO2023288285A1 (en) 2021-07-15 2023-01-19 Turn Biotechnologies, Inc. Polycistronic expression vectors
US20230046606A1 (en) 2021-07-15 2023-02-16 Turn Biotechnologies, Inc. Synthetic, persistent rna constructs with on/off mechanism for controlled expression and methods of use
US20230044997A1 (en) 2021-07-15 2023-02-09 Turn Biotechnologies, Inc. Synthetic, persistent rna constructs and methods of use for cell rejuvenation and for treatment
WO2023003922A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Metabolic disorder-associated target gene irna compositions and methods of use thereof
AU2022316139A1 (en) 2021-07-23 2024-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Beta-catenin (ctnnb1) irna compositions and methods of use thereof
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
JPWO2023008415A1 (zh) 2021-07-27 2023-02-02
WO2023009687A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa reductase (hmgcr) irna compositions and methods of use thereof
CA3171750A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tim SONNTAG Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases
WO2023014677A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof
AU2022324003A1 (en) 2021-08-04 2024-02-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA COMPOSITIONS AND METHODS FOR SILENCING ANGIOTENSINOGEN (AGT)
IL310407A (en) 2021-08-13 2024-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Factor XII (F12) IRNA compositions and methods of using them
WO2023023055A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Compositions and methods for optimizing tropism of delivery systems for rna
IL309505A (en) 2021-09-03 2024-02-01 CureVac SE Lipid nanoparticles for nucleic acid delivery
WO2023031392A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine
TW202325263A (zh) 2021-09-14 2023-07-01 美商雷納嘉德醫療管理公司 非環狀脂質及其使用方法
WO2023044333A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and methods of use thereof
WO2023044370A2 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing complement component 3 (c3)
AU2022346861A1 (en) 2021-09-17 2024-03-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
AU2022345881A1 (en) 2021-09-20 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Inhibin subunit beta e (inhbe) modulator compositions and methods of use thereof
PE20240728A1 (es) 2021-09-21 2024-04-15 Scribe Therapeutics Inc Sistemas de represores de casx disenados por ingenieria genetica
WO2023064530A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extra-hepatic delivery irna compositions and methods of use thereof
AU2022370530A1 (en) 2021-10-18 2024-05-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2023069603A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for disrupting nrf2-keap1 protein interaction by adar mediated rna editing
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
TW202334418A (zh) 2021-10-29 2023-09-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 杭丁頓(HTT)iRNA劑組成物及其使用方法
WO2023076451A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b (cfb) irna compositions and methods of use thereof
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
KR20230068047A (ko) 2021-11-10 2023-05-17 주식회사 에스엠엘바이오팜 트레할로즈 유도체 및 신규 구조 유지 화합물을 포함하는 핵산 의약품 전달용 지질나노입자의 약학 조성물
WO2023091490A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023091787A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023097003A2 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and their uses
CA3238370A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
WO2023096990A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovation Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
WO2023099884A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Mina Therapeutics Limited Pax6 sarna compositions and methods of use
GB202117758D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Ucl Business Ltd Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
WO2023115013A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods for enrichment of circular rna under denaturing conditions
WO2023121964A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Beam Therapeutics Inc. Nanomaterials comprising disulfides
WO2023121975A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Beam Therapeutics Inc. Ionizable amine lipids and lipid nanoparticles
WO2023121965A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Beam Therapeutics Inc. Nanomaterial comprising diamines
WO2023121971A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Beam Therapeutics Inc. Nanomaterials comprising tetravalent lipid compounds
WO2023121970A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Beam Therapeutics Inc. Ionizable amine and ester lipids and lipid nanoparticles
WO2023122745A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2023122752A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Constrained lipids and methods of use thereof
US20230201817A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Biontech Delivery Technologies Gmbh Modular drug production system
TW202342064A (zh) 2021-12-23 2023-11-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
WO2023147090A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2023170435A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Mina Therapeutics Limited Il10 sarna compositions and methods of use
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
US11951177B2 (en) 2022-03-23 2024-04-09 Nanovation Therapeutics Inc. High sterol-containing lipid nanoparticles
WO2023183616A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods
WO2023196931A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
US20230346977A1 (en) 2022-04-13 2023-11-02 Universitat Autònoma De Barcelona Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023218431A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2023230098A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Logicbio Therapeutics, Inc. Gene therapy compositions and methods of use thereof
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2023230295A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 BioNTech SE Rna compositions for delivery of monkeypox antigens and related methods
WO2023232747A1 (en) 2022-05-30 2023-12-07 BioNTech SE Complexes for delivery of nucleic acids
WO2023235818A2 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Scribe Therapeutics Inc. Engineered class 2 type v crispr systems
WO2023233042A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Bio-Trip B.V. Polyvalent molecule based lipid nanoparticles for nucleic acid delivery
WO2023240074A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of pcsk9
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
EP4314267A1 (en) 2022-06-07 2024-02-07 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of pcsk9
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024033901A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
WO2024039776A2 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Universal non-targeting sirna compositions and methods of use thereof
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024042236A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Ethris Gmbh Stable lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
EP4327829A1 (en) 2022-08-26 2024-02-28 Ethris GmbH Stabilization of lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024049979A2 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2024059165A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (hsd17b13) irna compositions and methods of use thereof
EP4342460A1 (en) 2022-09-21 2024-03-27 NovoArc GmbH Lipid nanoparticle with nucleic acid cargo
WO2024064931A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of liver stage antigens and related methods
WO2024064934A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium csp antigens and related methods
WO2024063789A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024063788A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024064910A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024068545A1 (en) 2022-09-26 2024-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024074376A1 (en) 2022-09-27 2024-04-11 Resolution Therapeutics Limited Therapeutic macrophages
WO2024073588A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Respiratory dry powder delivery
WO2024071319A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Okinawa Institute Of Science And Technology School Corporation Composition comprising isolated or enriched phosphoenolpyruvate or a salt thereof
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024074211A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024074634A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024083345A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 BioNTech SE Methods and uses associated with liquid compositions
WO2024089638A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024102799A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)

Family Cites Families (229)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US534484A (en) * 1895-02-19 Price and weighing scale
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3817827A (en) 1972-03-30 1974-06-18 Scott Paper Co Soft absorbent fibrous webs containing elastomeric bonding material and formed by creping and embossing
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3993754A (en) 1974-10-09 1976-11-23 The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4086257A (en) 1976-10-12 1978-04-25 Sears Barry D Phosphatidyl quaternary ammonium compounds
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
CH624011A5 (zh) 1977-08-05 1981-07-15 Battelle Memorial Institute
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4394448A (en) * 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
ATE8584T1 (de) * 1980-01-16 1984-08-15 Hans Georg Prof. Dr. Weder Verfahren und dialysiereinrichtung zur herstellung von bilayer-vesikeln und verwendung der bilayer-vesikel.
US4598051A (en) * 1980-03-12 1986-07-01 The Regents Of The University Of California Liposome conjugates and diagnostic methods therewith
US4452901A (en) 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4522808A (en) 1980-08-15 1985-06-11 Societe Anonyme Dite: L'oreal Anti-sunburn compositions containing 2-phenyl-indole derivatives
US4522803A (en) 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US4588578A (en) 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
US4515736A (en) * 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US5545412A (en) * 1985-01-07 1996-08-13 Syntex (U.S.A.) Inc. N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) * 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5320906A (en) * 1986-12-15 1994-06-14 Vestar, Inc. Delivery vehicles with amphiphile-associated active ingredient
JP2539665B2 (ja) * 1988-06-20 1996-10-02 日本臓器製薬株式会社 神経疾患治療剤
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
GB8822492D0 (en) 1988-09-24 1988-10-26 Considine J Apparatus for removing tumours from hollow organs of body
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5725871A (en) 1989-08-18 1998-03-10 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid
WO1991003162A1 (en) 1989-08-31 1991-03-21 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
JPH03126211A (ja) 1989-10-12 1991-05-29 Nippon Chemicon Corp 電解コンデンサ用電解液
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5225212A (en) * 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5707644A (en) 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
US6753423B1 (en) 1990-01-11 2004-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
JPH06171Y2 (ja) 1990-03-30 1994-01-05 日新製鋼株式会社 圧延機のパスライン切換装置
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6365730B1 (en) 1990-06-19 2002-04-02 Gene Shears Pty. Limited DNA-Armed ribozymes and minizymes
US5789573A (en) 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
FR2674257B1 (fr) * 1991-03-20 1993-05-28 Armines Alliages a base de niobium et de titane resistant a l'oxydation a hautes temperatures.
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
JP2774417B2 (ja) 1991-08-07 1998-07-09 株式会社ディ・ディ・エス研究所 ペプチド骨格を有する分枝鎖型糖複合体及び微粒子キャリヤー
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US6831166B2 (en) 1992-10-23 2004-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5756353A (en) 1991-12-17 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery
US5858784A (en) 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
EP0625207A1 (en) 1991-12-17 1994-11-23 The Regents Of The University Of California Gene therapy for cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activity (cftr)
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
JP2731630B2 (ja) * 1992-02-19 1998-03-25 ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン 細胞増殖のオリゴヌクレオチドの変調
EP0642589A4 (en) 1992-05-11 1997-05-21 Ribozyme Pharm Inc METHOD AND REAGENT TO INHIBIT VIRAL REPLICATION.
ES2105262T3 (es) 1992-05-18 1997-10-16 Minnesota Mining & Mfg Dispositivo de suministro de farmaco a traves de las mucosas.
AU4528493A (en) 1992-06-04 1994-01-04 Regents Of The University Of California, The In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
US5792451A (en) 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
JP2854203B2 (ja) 1992-09-03 1999-02-03 株式会社ディ・ディ・エス研究所 リポソームの製造法
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
WO1995002698A1 (en) 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5674908A (en) 1993-12-20 1997-10-07 Life Technologies, Inc. Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
US6075012A (en) 1994-02-11 2000-06-13 Life Technologies, Inc. Reagents for intracellular delivery of macromolecules
US6989434B1 (en) 1994-02-11 2006-01-24 Invitrogen Corporation Reagents for intracellular delivery of macromolecules
US5591317A (en) 1994-02-16 1997-01-07 Pitts, Jr.; M. Michael Electrostatic device for water treatment
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
CA2194221C (en) 1994-06-22 2001-01-02 Timothy D. Heath Cationic amphiphiles
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5820873A (en) * 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
ATE219660T1 (de) 1994-09-30 2002-07-15 Inex Pharmaceuticals Corp Mittel zum einbringen polyanionischer materialien in zellen
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
WO1996011266A2 (en) 1994-10-05 1996-04-18 Amgen Inc. Method for inhibiting smooth muscle cell proliferation and oligonucleotides for use therein
US5627159A (en) 1994-10-27 1997-05-06 Life Technologies, Inc. Enhancement of lipid cationic transfections in the presence of serum
US5783683A (en) 1995-01-10 1998-07-21 Genta Inc. Antisense oligonucleotides which reduce expression of the FGFRI gene
US5580579A (en) 1995-02-15 1996-12-03 Nano Systems L.L.C. Site-specific adhesion within the GI tract using nanoparticles stabilized by high molecular weight, linear poly (ethylene oxide) polymers
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
AU5979296A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5958901A (en) 1995-06-07 1999-09-28 Genta Incorporated Phosphonic acid-based cationic lipids
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) * 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5811406A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Regents Of The University Of California Dry powder formulations of polynucleotide complexes
EP0830368A1 (en) 1995-06-07 1998-03-25 Genta Incorporated Novel carbamate-based cationic lipids
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US5705385A (en) * 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5747470A (en) 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to gp130 mRNA
US6339173B1 (en) 1996-07-22 2002-01-15 Promega Biosciences, Inc. Amide-based cationic lipids
EP0869937A4 (en) 1995-07-21 2004-07-21 Promega Biosciences Inc AMID BASED CATIONIC LIPIDS
US20030216335A1 (en) 2001-11-30 2003-11-20 Jennifer Lockridge Method and reagent for the modulation of female reproductive diseases and conditions
US20040142895A1 (en) 1995-10-26 2004-07-22 Sirna Therapeutics, Inc. Nucleic acid-based modulation of gene expression in the vascular endothelial growth factor pathway
US6330349B1 (en) 1995-11-30 2001-12-11 Chromavision Medical Systems, Inc. Automated method for image analysis of residual protein
US5817856A (en) 1995-12-11 1998-10-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Radiation-protective phospholipid and method
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US6713069B1 (en) 1996-04-16 2004-03-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for detecting, preventing, and treating African Hemorrhagic Fever
US20050119470A1 (en) 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5841662A (en) * 1996-07-31 1998-11-24 Coburn Optical Industries, Inc. Method and apparatus for chucked work piece recognition
US6284267B1 (en) 1996-08-14 2001-09-04 Nutrimed Biotech Amphiphilic materials and liposome formulations thereof
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6174861B1 (en) 1996-10-22 2001-01-16 The Children's Medical Center Corporation Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of endostatin protein
US6210707B1 (en) 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US5877220A (en) 1997-03-06 1999-03-02 Genta, Incorporated Amide-based oligomeric cationic lipids
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
AU7490098A (en) 1997-05-15 1998-12-08 Genzyme Corporation Cationic amphiphile formulations
US20030073640A1 (en) 1997-07-23 2003-04-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Novel compositions for the delivery of negatively charged molecules
WO1999005303A1 (en) 1997-07-24 1999-02-04 Inex Pharmaceuticals Corporation Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method
DE69837274T2 (de) 1997-10-10 2007-11-08 Inex Pharmaceuticals Corp., Burnaby Verfahren zur verkapselung von nukleinsäuren in lipiddoppelschichten
JP2993489B2 (ja) * 1997-12-15 1999-12-20 日本電気株式会社 疑似多チャンネルステレオ再生装置
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6410328B1 (en) * 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
CA2271582A1 (en) 1998-05-14 1999-11-14 Sean C. Semple Method for administration of therapeutic agents, including antisense, with repeat dosing
US6429200B1 (en) 1998-07-17 2002-08-06 Mirus Corporation Reverse micelles for delivery of nucleic acids
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
US6900049B2 (en) 1998-09-10 2005-05-31 Cell Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof
US7166745B1 (en) 1998-11-12 2007-01-23 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US6649780B1 (en) * 1998-12-22 2003-11-18 Valentis, Inc. Cationic lipids
BR0008711A (pt) 1999-03-02 2002-10-01 Liposome Co Inc Encapsulação de complexos bioativos em lipossomas
US6852334B1 (en) 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
CA2370690A1 (en) 1999-04-20 2000-10-26 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
US6696424B1 (en) 1999-05-28 2004-02-24 Vical Incorporated Cytofectin dimers and methods of use thereof
US20010048940A1 (en) 1999-06-18 2001-12-06 Jennifer D. Tousignant Cationic amphiphile micellar complexes
HUP0202177A3 (en) 1999-07-14 2004-05-28 Alza Corp Mountain View Neutral lipopolymer and liposomal compositions containing same
IL147089A0 (en) 1999-07-15 2002-08-14 Inex Pharmaceuticals Corp Methods of preparing lipid-encapsulated therapeutic agents
BR0013834A (pt) 1999-08-27 2002-04-23 Inex Pharmaceuticals Corp Composições e métodos para estimular a secreção de citoquinas e induzir uma resposta imunológica
US6458382B1 (en) 1999-11-12 2002-10-01 Mirus Corporation Nucleic acid transfer complexes
AU785017B2 (en) 2000-01-10 2006-08-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of disease
US20010048040A1 (en) * 2000-02-04 2001-12-06 Sheldon Paul C. Back-pressure responsive, self-reversing, control valve
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20070026394A1 (en) * 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
IL151928A0 (en) 2000-03-30 2003-04-10 Whitehead Biomedical Inst Rna sequence-specific mediators of rna interference
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
US20030072794A1 (en) 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
WO2001093836A2 (en) 2000-06-09 2001-12-13 Teni Boulikas Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes
US20030082103A1 (en) 2000-10-11 2003-05-01 Targesome, Inc. Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets
EP1328254B1 (en) 2000-10-25 2007-02-21 The University Of British Columbia Lipid formulations for target delivery
US20020086849A1 (en) 2000-10-27 2002-07-04 Gulilat Gebeyehu Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells
US20020081736A1 (en) 2000-11-03 2002-06-27 Conroy Susan E. Nucleic acid delivery
ES2215494T5 (es) 2000-12-01 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Moléculas de RNA pequeñas que median la interferencia de RNA
AU2001297693A1 (en) 2000-12-08 2002-09-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
US20030026831A1 (en) 2001-04-20 2003-02-06 Aparna Lakkaraju Anionic liposomes for delivery of bioactive agents
US20040142892A1 (en) * 2001-04-30 2004-07-22 The University Of British Columbia Autogene nucleic acids encoding a secretable RNA polymerase
US20030077829A1 (en) * 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20030130186A1 (en) 2001-07-20 2003-07-10 Chandra Vargeese Conjugates and compositions for cellular delivery
US20050282188A1 (en) 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US20040063654A1 (en) * 2001-11-02 2004-04-01 Davis Mark E. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
US20050107316A1 (en) 2002-02-22 2005-05-19 Klaus Strebhardt Agent for inhibiting development or progress of proliferative diseases and especially cancer diseases and pharmaceutical composition containing said agent
US7248889B2 (en) * 2002-03-08 2007-07-24 Nokia Corporation Method and device for controlling the power in an asymmetric soft handover condition
AU2003237864B2 (en) 2002-05-15 2008-12-18 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
DE60334618D1 (de) 2002-06-28 2010-12-02 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
EP1532248B1 (en) 2002-07-26 2009-04-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Modified small interfering rna molecules and methods of use
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
ATE477337T1 (de) 2003-01-16 2010-08-15 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur sirna-hemmung von icam-1
US20040167090A1 (en) 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
JP2006522158A (ja) 2003-04-03 2006-09-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド iRNA複合体
EP2664672A1 (en) 2003-04-17 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
BRPI0411505A (pt) 2003-06-18 2006-07-25 Yissum Res Dev Co uso de um composto, método para modular a resposta imune de um indivìduo, composição farmacêutica, vacina, complexo, e, kit para a captura de uma molécula biologicamente ativa
KR100961267B1 (ko) * 2003-06-26 2010-06-03 엘지디스플레이 주식회사 콜레스테릭 액정 컬러필터를 가지는 투과형 액정표시장치및 그 제조 방법
ES2559828T3 (es) 2003-07-16 2016-02-16 Protiva Biotherapeutics Inc. ARN de interferencia encapsulado en lípidos
NZ581166A (en) 2003-09-15 2011-06-30 Protiva Biotherapeutics Inc Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
US7745651B2 (en) 2004-06-07 2010-06-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
AU2005252273B2 (en) * 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
EP1773857A4 (en) * 2004-07-02 2009-05-13 Protiva Biotherapeutics Inc THE IMMUNE SYSTEM STIMULATING SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
WO2006031901A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Somagenics, Inc. SMALL INTERFERING RNAs THAT EFFICIENTLY INHIBIT VIRAL GENE EXPRESSION AND METHODS OF USE THEREOF
AU2005306533B2 (en) 2004-11-17 2012-05-31 Arbutus Biopharma Corporation siRNA silencing of apolipoprotein B
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
WO2007086881A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
US20060228406A1 (en) 2005-03-17 2006-10-12 Invitrogen Corporation Transfection reagent for non-adherent suspension cells
US9005654B2 (en) 2005-07-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
US7838658B2 (en) 2005-10-20 2010-11-23 Ian Maclachlan siRNA silencing of filovirus gene expression
AU2006308765B2 (en) * 2005-11-02 2013-09-05 Arbutus Biopharma Corporation Modified siRNA molecules and uses thereof
WO2007056861A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of influenza virus gene expression
JP2009523823A (ja) * 2006-01-23 2009-06-25 アボット・ラボラトリーズ siRNA送達のための化学的に修飾されたポリカチオンポリマー
US8598333B2 (en) * 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
DK2494993T3 (en) 2007-05-04 2018-11-12 Marina Biotech Inc Amino acid lipids and uses thereof
JP5697988B2 (ja) * 2007-12-27 2015-04-08 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 干渉rnaを使用したポロ様キナーゼ発現のサイレンシング方法
US20110117125A1 (en) 2008-01-02 2011-05-19 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP2011518117A (ja) 2008-03-05 2011-06-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド Eg5およびVEGF遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
WO2009129319A2 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of csn5 gene expression using interfering rna
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP2344639B1 (en) 2008-10-20 2015-04-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
EP3243504A1 (en) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
JP6032724B2 (ja) 2009-03-12 2016-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. 脂質製剤組成物およびEg5遺伝子とVEGF遺伝子の発現を阻害する方法
AU2010259984B2 (en) 2009-06-10 2017-03-09 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
US9051567B2 (en) * 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
US8569256B2 (en) * 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
US9018187B2 (en) * 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8236943B2 (en) * 2009-07-01 2012-08-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
US8455455B1 (en) * 2010-03-31 2013-06-04 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing genes involved in hemorrhagic fever
US8865675B2 (en) * 2010-05-12 2014-10-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
WO2011141704A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US8466122B2 (en) * 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
CN108358812B (zh) 2010-11-15 2021-05-11 生命技术公司 含胺的转染试剂及其制备和使用方法
US9126966B2 (en) * 2011-08-31 2015-09-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use thereof
CA2850792A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing aldehyde dehydrogenase
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
US10421208B2 (en) 2013-03-12 2019-09-24 Sunpower Corporation Method and device for cleaving wafers
HUE059857T2 (hu) 2014-08-29 2023-01-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Patizirán transztiretin által közvetített amiloidózis kezelésében történõ alkalmazásra
WO2016054421A1 (en) * 2014-10-02 2016-04-07 Protiva Biotherapeutics, Inc Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
US20200315967A1 (en) 2016-06-24 2020-10-08 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. RNA FORMULATIONS

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104114571A (zh) * 2011-10-05 2014-10-22 普洛体维生物治疗公司 用于沉默醛脱氢酶的组合物和方法
CN104321304A (zh) * 2012-02-24 2015-01-28 普洛体维生物治疗公司 三烷基阳离子脂质及其使用方法
CN110003030A (zh) * 2012-02-24 2019-07-12 野草莓树生物制药公司 三烷基阳离子脂质及其使用方法
CN106794141A (zh) * 2014-07-16 2017-05-31 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
CN106794141B (zh) * 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
CN104997801A (zh) * 2015-05-28 2015-10-28 厦门成坤生物技术有限公司 包含季铵盐类化合物和siRNA的组合物及其制备方法
CN111542338A (zh) * 2017-12-27 2020-08-14 武田药品工业株式会社 含核酸脂质纳米粒子及其用途
CN113164379A (zh) * 2018-10-01 2021-07-23 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的可生物降解脂质
CN113164379B (zh) * 2018-10-01 2024-04-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的可生物降解脂质
CN114681402A (zh) * 2020-12-28 2022-07-01 财团法人工业技术研究院 免疫刺激性脂质复合体、包含免疫刺激性脂质复合体的药物组合物以及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
IL208744A (en) 2016-12-29
US20140065228A1 (en) 2014-03-06
CA2721333A1 (en) 2009-10-22
US8058069B2 (en) 2011-11-15
AU2009238175B2 (en) 2013-12-12
US20100130588A1 (en) 2010-05-27
PT2279254T (pt) 2017-09-04
AU2009238175C1 (en) 2023-11-30
US20170042814A1 (en) 2017-02-16
US8822668B2 (en) 2014-09-02
JP2011516586A (ja) 2011-05-26
US20180092848A1 (en) 2018-04-05
US9364435B2 (en) 2016-06-14
US20120183581A1 (en) 2012-07-19
PL2279254T3 (pl) 2017-11-30
US20200113832A1 (en) 2020-04-16
JP5475753B2 (ja) 2014-04-16
US20230372245A1 (en) 2023-11-23
CN102119217B (zh) 2015-06-03
CA2721333C (en) 2020-12-01
HUE034483T2 (en) 2018-02-28
IL208744A0 (en) 2010-12-30
US20180085312A1 (en) 2018-03-29
DK2279254T3 (en) 2017-09-18
US11141378B2 (en) 2021-10-12
NZ588583A (en) 2012-08-31
US20210267895A1 (en) 2021-09-02
US8492359B2 (en) 2013-07-23
AU2009238175A1 (en) 2009-10-22
EP2279254B1 (en) 2017-07-05
ES2638448T3 (es) 2017-10-20
US20210220274A1 (en) 2021-07-22
WO2009127060A1 (en) 2009-10-22
US20150164799A1 (en) 2015-06-18
EP2279254A4 (en) 2012-11-14
EP2279254A1 (en) 2011-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102119217B (zh) 用于核酸递送的新型制剂
US20210207140A1 (en) Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
CN104321304A (zh) 三烷基阳离子脂质及其使用方法
US20110313017A1 (en) Snalp formulations containing polyoxazoline-dialkyloxypropyl conjugates
US20220133636A1 (en) Cationic lipids containing silicon
US20230150926A1 (en) Cationic lipids for lipid nanoparticle delivery of therapeutics to hepatic stellate cells
US20230139594A1 (en) Cationic lipids for lipid nanoparticle delivery of therapeutics to hepatic stellate cells
US20240065982A1 (en) Lipid nanoparticles for delivering therapeutics to lungs
AU2013202932A1 (en) Novel lipid formulations for nucleic acid delivery

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180807

Address after: Vancouver, Canada

Patentee after: Wild strawberry bio pharmaceutical company

Address before: British Columbia

Patentee before: Protiva Biotherapeutics Inc.