JP2023523993A - アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法 - Google Patents

アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023523993A
JP2023523993A JP2022565879A JP2022565879A JP2023523993A JP 2023523993 A JP2023523993 A JP 2023523993A JP 2022565879 A JP2022565879 A JP 2022565879A JP 2022565879 A JP2022565879 A JP 2022565879A JP 2023523993 A JP2023523993 A JP 2023523993A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleotides
strand
dsrna agent
antisense strand
apoe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022565879A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021222065A5 (ja
Inventor
リー ボストウィック，ブレット
ペン，ハイヤン
ディ マキニンチ，ジェイムズ
カストレノ，アダム
ケイ シュリーゲル，マーク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2023523993A publication Critical patent/JP2023523993A/ja
Publication of JPWO2021222065A5 publication Critical patent/JPWO2021222065A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/35—Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen

Abstract

本開示は、ＡＰＯＥ遺伝子を標的化する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡｉ）剤および組成物、ならびにそのようなｄｓＲＮＡｉ剤および組成物を使用して、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害する方法、およびＡＰＯＥ関連神経変性疾患または障害、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病を有する対象を処置する方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０２０年４月２７日に出願された米国特許仮出願第６３／０１５，８６７号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出された配列表を含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年４月２０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１_１１２２０_ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２００，９４４バイトのサイズである。
アポリポタンパク質Ｅ遺伝子は、１８個のアミノ酸シグナルペプチドが切断された後に２９９個のアミノ酸から構成される、糖タンパク質であるアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）タンパク質をコードする。ＡＰＯＥには３つの一般的なアイソフォーム、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、およびＡＰＯＥ４が存在し、対応する対立遺伝子によってコードされる。３つのＡＰＯＥアイソフォーム、ＡｐｏＥ ε２（ＡＰＯＥ２）、ＡｐｏＥ ε３（ＡＰＯＥ３）、ＡｐｏＥ ε４（ＡＰＯＥ４）は、アミノ酸位置１１２および１５８のみで互いと異なり、ＡＰＯＥ２はＣｙｓ１１２およびＣｙｓ１５８を有し、ＡＰＯＥ３はＣｙｓ１１２およびＡｒｇ１５８を有し、ＡＰＯＥ４はＡｒｇ１１２およびＡｒｇ１５８を有する。ＡＰＯＥは広く発現しているが、主に肝臓の肝細胞および中枢神経系（ＣＮＳ）におけるグリア細胞で末梢的に発現する。
末梢において、ＡＰＯＥは、脂質ホメオスタシスにおいて機能する。これらのリポタンパク質粒子は、血液脳関門を通過することができない。研究から、星状細胞および小グリア細胞から放出されるａｐｏＥ含有粒子が脳のａｐｏＥの主な供給源であることが示されている［Bjorkhem I, et al. (1998) J Lipid Research 39(8):1594-1600；Pitas RE, et al. (1987) Biochimica Biophysica Acta. 13;917(1):148-161；Krasemann S, et al. (2017) Immunity. 47(3):566-581.e9. doi:10.1016/j.immuni.2017.08.008］。脳において、ＡＰＯＥは、脂質輸送、シナプスの完全性および可塑性、糖代謝、神経炎症、ならびに脳血管の完全性を含めた複数の経路をモジュレートする。例えば、ＡＰＯＥが細胞から分泌されると、いくつかの輸送体（例えば、ＡＴＰ結合カセット（ｃｓｓｅｓｔｔｅ）輸送体）は、コレステロールおよびリン脂質を新生ＡＰＯＥに移送してリポタンパク質粒子を形成し、ＡＰＯＥは続いてそれを、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）ファミリーメンバーなどのＡＰＯＥ受容体との結合を通して神経細胞に分配する。さらに、肝移植後にレシピエントの血清ＡＰＯＥの表現型はドナーの表現型に完全に変換されるが、脳脊髄液（ＣＳＦ）ＡｐｏＥの表現型はそうではないことが観察されている。加えて、星状細胞は、ＡＰＯＥを高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）様粒子で産生するが、これは他の供給源に由来するＡＰＯＥとは別個の特性を有している［例えば、Morikawa, et al., Neurobiol Dis.. Jun-Jul 2005;19(1-2): 66-76を参照されたい］。したがって、ＣＳＦにおけるＡＰＯＥは、血漿プールから得ることができず、したがって局所的に合成されなければならない［Linton MF, et al. (1991) J Clin Invest. 88(1):270-281. doi:10.1172/JCI115288］。
ＡＰＯＥ遺伝子における多型は、複数のプロテイノパチーに関連してきた。ＡＰＯＥ多型と疾患との間で最も確立されている関連は、ＡＰＯＥ遺伝子型とアルツハイマー病（ＡＤ）との間であり、それは、症状が６５歳後に発症する遅発型アルツハイマー病のリスク決定要因であることが示されている。加えて、Ｈａｌｔｚｍａｎ研究室からの最近の研究は、ε４対立遺伝子を有すると疾患進行が有意に加速され（ｐ＝０．０２）、１つのε４対立遺伝子では非保有者と比較して進行速度が１４％増加し、２つのε４対立遺伝子では２３％増加すると記載した［Holtzman, et al. (2017) Nature 549:523］。ＡＤは、高齢者における認知症の主因であり、その病理学的特徴としては、アミロイド斑としての細胞外アミロイド－β（Ａβ）凝集物の沈着、および神経原線維変化としての細胞内過リン酸化タウ凝集物、それらに加えて神経細胞脱落およびグリアの活性化が挙げられる。遅発型ＡＤを有する個体は、ＡＤ個体群全体の９５％以上を占めることから、ＡＤにおけるＡＰＯＥの役割を解明するための様々な取り組みが進行中である。
より具体的には、ＡＰＯＥ４の１つのコピーを有する対象は３倍超のＡＤ発症のリスクを有し、ＡＰＯＥ４の２つのコピーを有する対象は１２倍超の増大したＡＤ発症のリスクを有するのに対し、ＡＰＯＥ２の２つのコピーは対象においてＡＤ発症から保護的であることが示されている［Reiman EM, et al. (2020) Nature Communications 11 (1); 667］。加えて、報告されているＡＰＯＥノックアウトのヒトの症例が３つあるが、これらの対象のうち誰も通院時に認知症を経験していなかった（４０歳～６０歳）［Ghiselli, et al. (1981) Science 214(4526):1239；Mak, et al. (2014) JAMA Neurol 71:1228；およびLohse, et al. (1992) J Lipid Res. (11):1583］。３つの症例のうち１つ（４０歳男性）では、ＭＲＩおよび脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカー検査から、神経変性の兆候がなく、脳の構造が損なわれておらず、タウおよびｐ－タウのレベルが正常範囲であることが実証された。さらに、最近の研究から、ＡｐｏＥ３中にクライストチャーチ突然変異（Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ）があると、保存された認知機能およびＰＥＴによる限定的なタウオパチーから明らかであるように、ピレセニリン１により駆動される認知症に対して保護的になり得ることが示されている。クライストチャーチ突然変異が存在すると、ＡｐｏＥ３はＨＳＰＧおよびＬＤＬ受容体に結合する機能を喪失し、患者は高リポタンパク血症ＩＩＩ型を有するが、循環器疾患は有さない［Arboleda-Velasquez, et al. (2019) Nature Medicien 25:1680］。
ＡｐｏＥ誘導性アミロイドマウスモデルにおいてＡｐｏＥ４の発現が増大するとアミロイドの蓄積および神経炎性ジストロフィーが加速されること［Liu, et al. (2017) Neuron 96:1024］およびHuynh, et al. ［Neuron (2017) 96:1013］、ならびにＡＰＯＥ４のアンチセンス阻害がアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）／プレセニリン１（ＰＳ１－２１）遺伝子導入マウスにおいて保護的であることも実証されている。加えて、タウオパチーマウスモデルにおいてＡｐｏＥ４を欠失させると神経変性に対して保護的になったこと［Holtzman, et al. (2017) Nature 549:523］、およびＡＰＯＥ４を発現するがＡＰＯＥをヌルにした誘導多能性幹細胞に由来するヒト神経細胞においてＡＰＯＥ４の発現を再導入するとＡＰＯＥ４からの毒性作用が得られたこと［wang, et al. (2018) Nat Medicine 24:647］が示されている。さらに、マウスの肝臓に対してＡＰＯＥ４の発現を制限しても、認知能力に影響を及ぼす場合があること、血液脳関門を損ない、神経炎症を増大させる場合があることが示されている（alzforum.org/news/research-news/apoe-has-hand-Alzheimer'ss-beyond-av-beyond-brain）。
現在のところ、ＡＤなどのＡＰＯＥ関連神経変性疾患を有する対象を治療するための治療法または予防的処置は存在せず、支持療法および対症療法が処置の主力である。したがって、神経変性疾患を有するか、またはそれを発症するリスクのある対象を処置するための組成物および方法へのニーズが当技術分野に存在する。
本開示は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を実行する、ＲＮＡｉ剤組成物を提供する。ＡＰＯＥ遺伝子は、細胞内、例えば、対象、例えばヒト内の細胞にあってもよい。本開示はまた、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための、またはＡＰＯＥ遺伝子、例えば、病原性のＡＰＯＥ対立遺伝子、すなわち、ＡＰＯＥ４の発現の阻害もしくは低減が有益であろう対象、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患、例えば、アミロイド－β媒介性疾患もしくはタウ媒介性疾患を患うもしくは患う傾向にある対象を処置するための、本開示のＲＮＡｉ剤組成物の使用方法も提供する。特に、本明細書におけるＲＮＡｉ剤組成物は、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患を処置するためにＣＮＳ内の星状細胞による特有のＡＰＯＥ発現に影響を及ぼすことが可能である。
したがって、一態様において、本開示は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、ＲＮＡｉ剤を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表７および８のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表９および１０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表７および８のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表９および１０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表７および８のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表９および１０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つの少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。ある特定の実施形態において、アラインされた（比較された）配列間でのチミンからウラシルまたはウラシルからチミンの相違は、アラインされた（比較された）配列間での異なるヌクレオチドとして数えられない。
一部の実施形態において、薬剤は、適宜リンカーまたは担体を介して１つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートしている１つまたは複数の親油性部分を含む。
他の実施形態において、薬剤は、リンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に適宜コンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
さらに他の実施形態において、薬剤は、適宜リンカーまたは担体を介して１つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートしている１つまたは複数の親油性部分、およびリンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に適宜コンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示の別の態様は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、表２～５および７～１０に提示するセンス鎖配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０に提示するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ある特定の実施形態において、センス鎖は、表２～５および７～１０に提示するセンス鎖配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０に提示するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、センス鎖は、表７および８に提示するセンス鎖配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表７および８に提示するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、センス鎖は、表９および１０に提示するセンス鎖配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表９および１０に提示するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、センス鎖は、表２～５および７～１０に提示するセンス鎖配列のいずれか１つの（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０に提示するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）。ある特定の実施形態において、センス鎖は、表７および８に提示するセンス鎖配列のいずれか１つの（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表７および８に提示するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、センス鎖は、表９および１０に提示するセンス鎖配列のいずれか１つの（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表９および１０に提示するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、薬剤は、適宜リンカーまたは担体を介して１つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートしている１つまたは複数の親油性部分を含む。
他の実施形態において、薬剤は、リンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に適宜コンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
さらに他の実施形態において、薬剤は、適宜リンカーまたは担体を介して１つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートしている１つまたは複数の親油性部分、およびリンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に適宜コンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示のさらなる態様は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、もしくは９のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、配列番号１、３、５、７、および９のいずれかのチミンのウラシルへの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号１、３、５、７、および９のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）ことに寄与する相違としては数えられず、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、もしくは１０のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号２、４、６、８、もしくは１０のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性，例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、配列番号２、４、６、８、および１０のいずれかのチミンのウラシルへの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号２、４、６、８、および１０のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号２、４、６、８、もしくは１０のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列、と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）ことに寄与する相違としては数えられず、センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも１つは、適宜リンカーまたは担体を介して１つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートしている１つまたは複数の親油性部分を含む、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表２～５および７～１０に記載の二重鎖のセンス鎖ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表７および８に記載の二重鎖のセンス鎖ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表９および１０に記載の二重鎖のセンス鎖ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表２～５および７～１０の１つに記載の二重鎖のいずれか１つのアンチセンスヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表７および８の１つに記載の二重鎖のアンチセンスヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表９および１０の１つに記載の二重鎖のアンチセンスヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、配列番号１のヌクレオチド５０～１１３、５９～９７、５９～９０、１０７～１７７、１０７～１５３、１２４～１５３、１９８～２４０、２０３～２４０、２０９～２４０、２８３～３７８、２８３～３１２、３０７～３７８、３２２～３６９、３３０～３５７、３９４～４１９、５６８～６００、５６８～５９４、８４１～８７９、９００～９２６、９９７～１０５５、１００２～１０４４、１０１４～１０４４、１０１９～１０４４、１１２０～１１６６、１１３０～１１６６、１１３０～１１５５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖、および配列番号２の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、配列番号１のヌクレオチド５９～９０、３３０～３５７、５６８～５９４、１０１９～１０４４、１１３０～１１５５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖、および配列番号２の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、配列番号１のヌクレオチド５７～７９、６２～８４、７５～９７、８６～１０８、２０７～２２９、２１３～２３５、２１８～２４０、８９８～９２０、１１２８～１１５０、６３７～６５９のヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖、および配列番号２の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、配列番号１のヌクレオチド５７～７９、６２～８４、２０７～２２９、１１２８～１１５０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖、および配列番号２の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０６、ＡＤ－１２０４７０７、ＡＤ－１２０４７０８、ＡＤ－１２０４７０９、ＡＤ－１２０４７１０、ＡＤ－１２０４７１１、ＡＤ－１２０４７１２、およびＡＤ－１２０４７１３からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０８、およびＡＤ－１２０４７１２からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一部の実施形態において、薬剤は、リンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に適宜コンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
本発明のある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。
ある特定の実施形態において、ｌｏｇＫｏｗによって測定された親油性部分の親油性は、０を超える。
一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおいて未結合画分によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、０．２を超える。関連する実施形態において、血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである。
ある特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾されたヌクレオチドである。センス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾されたヌクレオチドであってもよい。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾されたヌクレオチドである。アンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾されたヌクレオチドであってもよい。
センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾されたヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つは、デオキシヌクレオチド、３’末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド、２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、２’－デオキシ修飾されたヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非ロックドヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾されたヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾されたヌクレオチド、２’－ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾されたヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾されたヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾されたヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾されたヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾されたヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣物を含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体を含むヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェートを含むヌクレオチド、またはコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドである。
関連する実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、２’－デオキシ修飾されたヌクレオチド、３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、または非天然塩基を含むヌクレオチドである。
一実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。
別の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’フルオロ、およびＧＮＡ修飾である。
さらなる実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８個（例えば、６、７、または８個）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含んでもよい。
ある特定の実施形態では、相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である。相補性の領域は、１９～２３ヌクレオチド長であってもよい。相補性の領域は、１９ヌクレオチド長であってもよい。
一実施形態において、各鎖は、３０ヌクレオチド長以下である。
別の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでもよい。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の３’端に一価または分岐した二価もしくは三価のリンカーによってコンジュゲートしている親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンドをさらに含む。ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、内部ヌクレオチド位置に例えば、一価または分岐した二価もしくは三価のリンカーによってコンジュゲートしている親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンドをさらに含む。
一実施形態において、リガンドは、
Figure 2023523993000001
 （式中、Ｂは、ヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基類似体であり、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルであってもよい）
である。
他の実施形態において、薬剤は、リンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に適宜コンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
さらに他の実施形態において、薬剤は、内部ヌクレオチド位置に、例えば、一価または分岐した二価もしくは三価のリンカーによってコンジュゲートしている親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンド、およびセンス鎖の３’端に一価または分岐した二価もしくは三価のリンカーによってコンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
別の実施形態において、ＡＰＯＥに対して相補性の領域は、表２～５および７～１０のいずれか１つに記載のアンチセンス配列のいずれか１つを含む。ある特定の実施形態において、ＡＰＯＥに対して相補性の領域は、表７および８のいずれか１つに記載のアンチセンス配列のいずれか１つを含む。ある特定の実施形態において、ＡＰＯＥに対して相補性の領域は、表９および１０のいずれか１つに記載のアンチセンス配列のいずれか１つを含む。
さらなる実施形態において、ＡＰＯＥに対して相補性の領域は、表２～５および７～１０のいずれか１つに記載のアンチセンス配列のいずれか１つのものである。ある特定の実施形態において、ＡＰＯＥに対して相補性の領域は、表７および８のいずれか１つに記載のアンチセンス配列のいずれか１つのものである。一部の実施形態において、内部ヌクレオチド位置は、鎖の各端から末端の２つの位置を除く全ての位置を含む。ある特定の実施形態において、ＡＰＯＥに対して相補性の領域は、表９および１０のいずれか１つに記載のアンチセンス配列のいずれか１つのものである。一部の実施形態において、内部ヌクレオチド位置は、鎖の各端から末端の２つの位置を除く全ての位置を含む。
関連する実施形態において、内部位置は、鎖の各端から末端の３つの位置を除く全ての位置を含む。内部位置は、センス鎖の切断部位領域を除いてもよい。
一部の実施形態において、内部位置は、センス鎖の５’端から数えて位置９～１２を除く。ある特定の実施形態において、センス鎖は２１ヌクレオチド長である。
他の実施形態において、内部位置は、センス鎖の３’端から数えて位置１１～１３を除く。内部位置は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除いてもよい。ある特定の実施形態において、センス鎖は２１ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、内部位置は、アンチセンス鎖の５’端から数えて位置１２～１４を除く。ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
別の実施形態において、内部位置は、センス鎖において３’端から数えて位置１１～１３、およびアンチセンス鎖において５’端から数えて位置１２～１４を除く。ある特定の実施形態において、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
さらなる実施形態において、１つまたは複数の親油性部分は、次の内部位置：各鎖の５’末端から数えて、センス鎖において位置４～８および位置１３～１８、ならびにアンチセンス鎖において位置６～１０および位置１５～１８の１つまたは複数にコンジュゲートしている。１つまたは複数の親油性部分は、次の内部位置：各鎖の５’末端から数えて、センス鎖において位置５、６、７、１５、および１７、ならびにアンチセンス鎖において位置１５および１７の１つまたは複数にコンジュゲートしていてもよい。ある特定の実施形態において、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
ある特定の実施形態において、親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である。親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール（ｈｅｘｙａｎｏｌ）、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンであってもよい。
一部の実施形態において、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、またはアルキンから選択される適宜の官能基とを含有する。
ある特定の実施形態において、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する。親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有してもよい。関連する実施形態において、親油性部分は、内部位置における１つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、担体は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、もしくはデカリニルである環状基であるか、またはセリノール骨格もしくはジエタノールアミン骨格に基づく非環状部分である。
一実施形態において、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、リン酸ジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して、二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートしている。
一実施形態において、親油性部分は、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる。
別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’端におけるホスフェートまたはホスフェート模倣物をさらに含む。ホスフェート模倣物は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）であってもよい。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＣＮＳ組織へのデリバリーを媒介する受容体を標的化する標的化リガンド、例えば、親水性リガンドをさらに含む。ある特定の実施形態において、標的化リガンドはＣ１６リガンドである。
一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、脳組織、例えば、線条体を標的化する標的化リガンドをさらに含む。
一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、肝組織、例えば、肝細胞を標的化する標的化リガンドをさらに含む。
一実施形態において、親油性部分または標的化リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖もしくはオリゴ糖、またはそれらの組合せである生物切断性リンカーを介してコンジュゲートされる。
関連する実施形態において、センス鎖の３’端は、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、またはデカリニルである。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド、２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、またはビニルホスホネートを含むヌクレオチドである、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。ＲＮＡｉ剤は、次の修飾：２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド、２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、およびビニルホスホネートを含むヌクレオチド、の各々のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、下記の表２～５および７～１０に示すような修飾されたヌクレオチドのパターンを含み、ここでは、２’－Ｃ１６、２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡ、ホスホロチオエート、および２’－フルオロ修飾の場所は、表示したＲＮＡｉ剤の個々のヌクレオチド塩基配列に無関係である。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、下記の表７および８に示すような修飾されたヌクレオチドのパターンを含み、ここでは、２’－Ｃ１６、２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡ、ホスホロチオエート、および２’－フルオロ修飾の場所は、表示したＲＮＡｉ剤の個々のヌクレオチド塩基配列に無関係である。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、下記の表９および１０に示すような修飾されたヌクレオチドのパターンを含み、ここでは、２’－Ｃ１６、２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡ、ホスホロチオエート、および２’－フルオロ修飾の場所は、表示したＲＮＡｉ剤の個々のヌクレオチド塩基配列に無関係である。
本開示の別の態様は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＰＯＥをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎｂ－（Ｚ Ｚ Ｚ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０～２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、０～１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、
Ｎｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾とは異なり、Ｎｂ’上の修飾は、Ｙ’上の修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしている、
二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
一実施形態において、ｉは０であるか、ｊは０であるか、ｉは１であるか、ｊは１であるか、ｉおよびｊは両方とも０であるか、またはｉおよびｊは両方とも１である。
別の実施形態において、ｋは０であるか、ｌは０であるか、ｋは１であるか、ｌは１であるか、ｋおよびｌは両方とも０であるか、またはｋおよびｌは両方とも１である。
ある特定の実施形態において、ＸＸＸはＸ’Ｘ’Ｘ’に対して相補的であり、ＹＹＹはＹ’Ｙ’Ｙ’に対して相補的であり、ＺＺＺはＺ’Ｚ’Ｚ’に対して相補的である。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
別の実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。
さらなる実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’端から位置１１、１２、および１３に生じる。Ｙ’は、２’－Ｏ－メチルであってもよい。
一部の実施形態において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩａ）
によって表される。
別の実施形態において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎｂ－Ｚ Ｚ Ｚ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩｂ）
（式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、１～５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
さらなる実施形態において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－Ｘ Ｘ Ｘ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩｃ）
（式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、１～５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
ある特定の実施形態において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－Ｘ Ｘ Ｘ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎｂ－Ｚ Ｚ Ｚ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩｄ）
（式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、１～５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ＮａおよびＮａ’は独立に、２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
別の実施形態において、二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さである。二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対の長さであってもよい。
ある特定の実施形態において、二本鎖領域は、１７～２５ヌクレオチド対の長さである。二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対の長さであってもよい。
一部の実施形態において、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである。二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さであってもよい。
ある特定の実施形態において、各鎖は、１５～３０ヌクレオチドを有する。各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有してもよい。各鎖は、１９～２３ヌクレオチドを有してもよい。
ある特定の実施形態において、二本鎖領域は１９～２１ヌクレオチド対の長さであり、各鎖は１９～２３ヌクレオチドを有する。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、または２’－ヒドロキシル、およびそれらの組合せである。ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、またはＧＮＡ、およびそれらの組合せを含む。関連する実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６部分であるか、またはそれを含むリガンドを含む。
他の実施形態において、薬剤は、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
さらに他の実施形態において、薬剤は、センス鎖の３’端に一価または分岐した二価もしくは三価のリンカーによってコンジュゲートしている親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンド、およびセンス鎖の３’端に一価または分岐した二価もしくは三価のリンカーによってコンジュゲートしている、肝組織を標的化する標的化リガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
ある特定の実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’端に付着される。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む。関連する実施形態において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の３’末端にある。鎖は、アンチセンス鎖であってもよい。別の実施形態において、鎖はセンス鎖である。関連する実施形態において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端にある。鎖は、アンチセンス鎖であってもよい。別の実施形態において、鎖はセンス鎖である。
別の実施形態において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’および３’末端の両方にある。鎖は、アンチセンス鎖であってもよい。別の実施形態において、鎖はセンス鎖である。
さらなる実施形態において、ＲＮＡｉ剤の二重鎖のアンチセンス鎖の５’端の１位における塩基対は、Ａ：Ｕ塩基対である。
ある特定の実施形態において、Ｙヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を含有する。
一部の実施形態において、Ｙ’ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含有する。
ある特定の実施形態において、ｐ’＞０である。ｐ’＝２であってもよい。
一部の実施形態において、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’のオーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して相補的である。
ある特定の実施形態において、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’のオーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して非相補的である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は合計２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は合計２３ヌクレオチドを有する。
別の実施形態において、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結される。全てのｎｐ’が、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結されてもよい。
ある特定の実施形態において、本開示のＡＰＯＥ ＲＮＡｉ剤は、表２～５および７～１０に列挙されるもののうちの１つである。ある特定の実施形態において、本開示のＡＰＯＥ ＲＮＡｉ剤は、表７および８に列挙されるもののうちの１つである。一部の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。ある特定の実施形態において、本開示のＡＰＯＥ ＲＮＡｉ剤は、表９および１０に列挙されるもののうちの１つである。一部の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。
本開示の別の態様は、細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＰＯＥ遺伝子をコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎｂ－（Ｚ Ｚ Ｚ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０～２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、０～１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾とは異なり、Ｎｂ’上の修飾は、Ｙ’上の修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、リガンドは、１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６のリガンド、および／または１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体であってもよい、
二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示のさらなる態様は、細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＰＯＥをコードするｍＲＮＡの一部分に対して相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎｂ－（Ｚ Ｚ Ｚ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩ）
［式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは各々独立に、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ｐ、ｑ、およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結されており、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０～２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、０～１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチル、グリコール核酸（ＧＮＡ）、または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾とは異なり、Ｎｂ’上の修飾は、Ｙ’上の修飾とは異なる］
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、リガンドは、１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６のリガンド、および／または１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体であってもよい、
二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示の別の態様は、細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＰＯＥをコードするｍＲＮＡ（配列番号１、または配列番号１の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列）の一部分に対して相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎｂ－（Ｚ Ｚ Ｚ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは各々独立に、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ｐ、ｑ、およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結されており、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０～２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、０～１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾とは異なり、Ｎｂ’上の修飾は、Ｙ’上の修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、リガンドは、１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６のリガンド、および／または１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体であってもよい、
二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示のさらなる態様は、細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＰＯＥをコードするｍＲＮＡ（配列番号１、または配列番号１の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列）の一部分に対して相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎｂ－（Ｚ Ｚ Ｚ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは各々独立に、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ｐ、ｑ、およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結されており、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０～２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、０～１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾とは異なり、Ｎｂ’上の修飾は、Ｙ’上の修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、リガンドは、１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６のリガンド、および／または１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体であってもよい、
二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示の別の態様は、細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対して相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＰＯＥをコードするｍＲＮＡ（配列番号１、または配列番号１の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列）の一部分に対して相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－Ｙ Ｙ Ｙ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’ （ＩＩＩａ）
（式中、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ｐ、ｑ、およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結されており、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０～２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、それらは修飾されているか、もしくは修飾されていないか、またはそれらの組合せであり、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、リガンドは、１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６のリガンド、および／または１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体であってもよい、
二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示のさらなる態様は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列と、３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号２、４、６、８、および１０のヌクレオチド配列のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列と、３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、配列番号１～１０に示される配列中のいずれかのチミンのウラシルへの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号１～１０に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つとの３個以下のヌクレオチドが異なることに寄与する相違としては数えられず、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、２’－Ｏ－メチル修飾、ＧＮＡ、または２’－フルオロ修飾である修飾を含み、センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結、３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、センス鎖は、１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６のリガンドにコンジュゲートしており、肝臓を標的化するリガンド、例えば、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含むリガンドをさらに含んでもよい、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
本開示の別の態様は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、ＡＰＯＥを標的化する二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列と、３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のヌクレオチド配列のいずれか１つ、または配列番号２、４、６、８、および１０のヌクレオチド配列のいずれか１つの全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列と、３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、配列番号１～１０に示される配列中のいずれかのチミンのウラシルへの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号１～１０に示されるヌクレオチド配列のいずれか１つとの３個以下のヌクレオチドが異なることに寄与する相違としては数えられず、センス鎖は、少なくとも１つの３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）を含み、アンチセンス鎖は、３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）を含む、二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾されたヌクレオチドである。
別の実施形態において、各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有する。
ある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、５’領域の最初の９ヌクレオチド位置内に二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾（またはその前駆体）を含む。二重鎖の熱的不安定化修飾は、以下
Figure 2023523993000002
 （式中、Ｂは核酸塩基である）
のうちの１つまたは複数であってもよい。
本開示の別の態様は、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞を提供する。
本開示のさらなる態様は、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、緩衝化されていない溶液中で投与される。緩衝化されていない溶液は、生理食塩水または水であってもよい。
別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、緩衝溶液と共に投与される。緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩、またはそれらのあらゆる組合せを含んでもよい。別の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
本開示の別の態様は、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物と脂質製剤とを含む医薬組成物を提供する。
一実施形態において、脂質製剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。
本開示のさらなる態様は、細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害する方法であって、（ａ）細胞を、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本開示の医薬組成物と接触させること；および（ｂ）工程（ａ）において産生された細胞を、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに十分な時間維持すること、それによって細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、細胞は、対象内にある。対象は、ヒトであってもよい。
ある特定の実施形態において、対象は、アカゲザル、カニクイザル、マウス、またはラットである。
ある特定の実施形態において、ヒト対象は、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患、例えば、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、またはタウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（Ｃｏｒｄｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（Ｇｌｏｂｕｌａｒ ｇｌｉａｌ ｔａｕｏｐａｔｈｙ）（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、もしくは二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症を患っている。
ある特定の実施形態において、本方法は、コリンエステラーゼ阻害剤および／またはメマンチンなどの追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。
ある特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの用量において投与される。
一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に髄腔内投与される。
一実施形態において、本方法は、脳（例えば、線条体）または脊柱組織でのＡＰＯＥ遺伝子の発現を低減させる。脳または脊柱組織は、線条体、皮質、小脳、頚椎、腰椎、または胸椎であってもよい。
一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に皮下投与される。
一実施形態において、本方法は、肝臓でのＡＰＯＥ遺伝子の発現を低減させる。
他の実施形態において、本方法は、肝臓および脳でのＡＰＯＥ遺伝子の発現を低減させる。
本開示の別の態様は、対象におけるＡＰＯＥの発現を阻害する方法であって、治療有効量の本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本開示の医薬組成物を対象に投与すること、それによって対象におけるＡＰＯＥの発現を阻害することを含む、方法を提供する。
本開示のさらなる態様は、対象におけるＡＰＯＥ関連神経変性疾患または障害を治療または防止するための方法であって、治療有効量の本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本開示の医薬組成物を対象に投与すること、それによって対象におけるＡＰＯＥ関連神経変性疾患または障害を治療または防止することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患はアミロイド－β媒介性疾患であり、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症からなる群から選択されるアミロイド－β媒介性疾患である。
ある特定の実施形態において、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患は、原発性タウオパチーまたは二次性タウオパチーなどのタウ媒介性疾患である。
ある特定の実施形態において、原発性タウオパチーは、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、二次性タウオパチーは、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症からなる群から選択される、
本開示の別の態様は、ａ）本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤と、ｂ）使用するための使用説明書と、ｃ）適宜、二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与するためのデバイスとを含む、本開示の方法を実施するためのキットを提供する。
本開示のさらなる態様は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、表２～５および７～１０のアンチセンス鎖核酸塩基配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、例えば、少なくとも１５個のヌクレオチド（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）、少なくとも１９個のヌクレオチド（すなわち、３個、２個、１個、または０個のヌクレオチドが異なる）を含む相補性の領域を含む、ＲＮＡｉ剤を提供する。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、次の修飾：２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド、２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾されたヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、およびビニルホスホネート（ＶＰ）を含むヌクレオチド、のうちの１つまたは複数を含む。ＲＮＡｉ剤は、次の修飾：２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド、２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾されたヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、およびビニルホスホネート（ＶＰ）を含むヌクレオチド、の各々のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、約１０％以下阻害される。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、４個以上のＰＳ修飾を含み、６～１０個のＰＳ修飾を含んでもよく、８個のＰＳ修飾を含んでもよい。
さらなる実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、５’末端および３’末端を有し、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々の３’末端および５’末端それぞれの最後から２番目および最後のヌクレオチド間連結の各々に位置する８個のＰＳ修飾を含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、ＧＮＡを含む唯一のヌクレオチドを含む。ＧＮＡを含むヌクレオチドは、アンチセンス鎖上でアンチセンス鎖の５’末端から７番目の核酸塩基残基に位置してもよい。
さらなる実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、１～４個の２’－Ｃ－アルキル修飾されたヌクレオチドを含む。２’－Ｃ－アルキル修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｃ１６修飾されたヌクレオチドであってもよい。ＲＮＡｉ剤は、単一の２’－Ｃ－アルキル、例えば、Ｃ１６修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。単一の２’－Ｃ－アルキル、例えば、Ｃ１６修飾されたヌクレオチドは、センス鎖上でセンス鎖の５’末端から６番目の位置に置かれてもよい。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、２個以上の２’－フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む。ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、２個以上の２’－フルオロ修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。２’－フルオロ修飾されたヌクレオチドは、センス鎖上でセンス鎖の５’末端から核酸塩基の位置７、９、１０、および１１に、アンチセンス鎖上でアンチセンス鎖の５’末端から核酸塩基の位置２、１４、および１６に置かれてもよい。
さらなる実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、１つまたは複数のＶＰ修飾を含む。ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端に単一のＶＰ修飾を含んでもよい。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、２個以上の２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを含む。ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ、２’－アルキル、またはグリコール核酸（ＧＮＡ）によって修飾されていない全ての核酸塩基の場所に２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。２個以上の２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドは、センス鎖上でセンス鎖の５’末端から位置１、２、３、４、５、８、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１に、アンチセンス鎖上でアンチセンス鎖の５’末端から位置１、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、および２３に置かれてもよい。
一態様において、本発明は、星状細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、星状細胞を本発明のｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物と接触させること；および産生された星状細胞を、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに十分な時間維持すること、それによって星状細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害することを含む。
ある特定の実施形態において、細胞は、対象内、例えば、ヒト対象内にある。
一部の実施形態において、星状細胞に接触させることは、医薬組成物の髄腔内（ｉｎｔｈｒａｔｈｅｃａｌ）投与による。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０８、およびＡＤ－１２０４７１２からなる群から選択される二重鎖アンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。
図１Ａは、脳室内注射（ＩＣＶ）によって、単一の３００μｇ用量の示される二重鎖または人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）対照を投与したホモ接合型ヒト化ＡＰＯＥノックインマウスの脳の右半球（ＢＲＨ）に、投薬後１４日目に残存するＡＰＯＥ ｍＲＮＡのパーセントを示すグラフである。図１Ｂは、脳室内注射（ＩＣＶ）によって、単一の３００μｇ用量の示される二重鎖または人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）対照を投与したホモ接合型ヒト化ＡＰＯＥノックインマウスの肝臓に、投薬後１４日目に残存するＡＰＯＥ ｍＲＮＡのパーセントを示すグラフである。 図１Ａは、脳室内注射（ＩＣＶ）によって、単一の３００μｇ用量の示される二重鎖または人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）対照を投与したホモ接合型ヒト化ＡＰＯＥノックインマウスの脳の右半球（ＢＲＨ）に、投薬後１４日目に残存するＡＰＯＥ ｍＲＮＡのパーセントを示すグラフである。図１Ｂは、脳室内注射（ＩＣＶ）によって、単一の３００μｇ用量の示される二重鎖または人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）対照を投与したホモ接合型ヒト化ＡＰＯＥノックインマウスの肝臓に、投薬後１４日目に残存するＡＰＯＥ ｍＲＮＡのパーセントを示すグラフである。 図２は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での薬剤ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０６、ＡＤ－１２０４７０７、ＡＤ－１２０４７０８、ＡＤ－１２０４７０９、ＡＤ－１２０４７１０、ＡＤ－１２０４７１１、ＡＤ－１２０４７１２およびＡＤ－１２０４７１３の活性の、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での薬剤の活性との相関を示すグラフである。
本発明の開示は、遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を実行する、ＲＮＡｉ組成物を提供する。ＡＰＯＥ遺伝子は、細胞内、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。また、本開示は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するため、またはＡＰＯＥ遺伝子、例えば、病原性ＡＰＯＥ対立遺伝子、すなわち、ＡＰＯＥ４の発現の阻害または低減が有益であろう障害、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患、例えば、アミロイド－β媒介性疾患またはタウ媒介性疾患を有する対象を処置するための、本開示のＲＮＡｉ組成物を使用する方法を提供する。
本開示のＲＮＡｉ剤は、約３０ヌクレオチドまたはそれ未満の長さ、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドの長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部である。ある特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、約２１～２３ヌクレオチド長である領域を有し、領域が、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。
ある特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である、少なくとも１９の連続するヌクレオチドの領域を有する、より長い長さ、例えば、最大でも６６ヌクレオチドまで、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長を含むことができる、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。より長い長さのアンチセンス鎖を有するこれらのＲＮＡｉ剤は、好ましくは、２０～６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み、この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１８～３０の連続するヌクレオチドの二重鎖を形成する。
これらのＲＮＡｉ剤の使用は、哺乳動物におけるＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡの標的化された分解を可能にする。したがって、これらのＲＮＡｉ剤を含む方法および組成物は、ＡＰＯＥタンパク質のレベルまたは活性の低減が有益であろう対象、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患、例えば、アミロイド－β媒介性疾患またはタウ媒介性疾患を有する対象を処置するために有用である。
以下の詳細な説明は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡｉ剤を含有する組成物を作製および使用する方法、ならびに遺伝子の発現の阻害または減少が有益であろう、疾患または障害を有する対象を処置するための組成物または方法を開示する。
Ｉ．定義
本開示がさらに容易に理解され得るために、ある特定の用語が、最初に定義される。加えて、パラメータの値または値の範囲が列記される場合にはいつでも、列記された値の中間の値および範囲も、本開示の一部であることが意図されることが意図される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法上の対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも一つ）を意味するために使用される。例えば、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、語句「を含むが、これらに限定されるわけではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味するために本明細書において使用され、当該語句と相互互換的に使用される。用語「または」は、文脈において明確に示されない限り、用語「および／または」を意味するために本明細書において使用され、当該語句と相互互換的に使用される。
用語「約」は、当技術分野において、典型的な交差の範囲内であることを意味するために、本明細書において使用される。例えば、「約」は、平均から約２標準偏差として理解することができる。ある特定の実施形態において、約は、±１０％を意味する。ある特定の実施形態において、約は、±５％を意味する。約が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「約」は、一連における数または範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
数字または数字の連なりの前の用語「少なくとも」、「以上」または「またはそれより多く」は、用語「少なくとも」に隣接する数字、および文脈から明らかなように、論理的に含まれ得る全ての後続の数字または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子におけるヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドが、示された特性を有することを意味する。少なくとも、なる用語が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連における数および範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
本明細書において使用される場合、「以下」または「未満」は、当該語句に隣接する値およびその値より論理的により小さい値または整数から、文脈から論理的である場合、ゼロまでとして理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」のオーバーハングを有する二重鎖は、２、１、または０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。「以下」が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「以下」は、一連における数または範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
本明細書において使用される場合、検出の方法は、存在する分析物の量が方法の検出レベル未満であることの判定を含むことができる。
示された標的部位と、センス鎖またはアンチセンス鎖に対するヌクレオチド配列とが一致しない場合、示された配列が優先する。
化学構造と化学名称が一致しない場合、化学構造が優先する。
用語「ＡＰＯＥ」、または「アポリポタンパク質Ｅ」、「アルツハイマー病２」、「ＬＰＧ」および「ＬＤＬＣＱ５」としても公知の「ＡＰＯＥ」は、タンパク質ＡＰＯＥをコードする周知の遺伝子を指す。ＡＰＯＥは、身体全体を通して、主に肝臓において合成され、脂質輸送タンパク質として機能し、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体の主要なリガンドである。ＡＰＯＥは、コレステロール代謝および心血管疾患において役割を果たすことが示されており、より最近では、アルツハイマー病の主要なリスク因子であることが明らかになってきており、他の神経変性疾患の病理と関連付けられている。
ＡＰＯＥのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４１．４［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＡＰＯＥ、配列番号１、逆相補物、配列番号２］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２７０６８１．１［ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＡＰＯＥ、配列番号３；逆相補物、配列番号４］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１３０５８４３．１［ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＡＰＯＥ、配列番号５、逆相補物、配列番号６］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿０２８８３９２０２．１［アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＡＰＯＥ、配列番号７、逆相補物、配列番号８］；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００５５８９５５４．２［カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＡＰＯＥ、配列番号９；逆相補物、配列番号１０］において見出すことができる。
ＡＰＯＥ配列のさらなる例は、公共的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＯＭＩＭ、およびＵｎｉＰｒｏｔに見出すことができる。ＡＰＯＥに関する追加の情報は、例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/348において見出すことができる。
用語ＡＰＯＥは、本明細書において使用される場合、ＳＮＰデータベースにおいて、例えば、ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=APOE[gene]において、提供されるヒトＡＰＯＥの変異体を含むＡＰＯＥ遺伝子の変形も指す。
ヒトＡＰＯＥ遺伝子は、２つの一塩基多型を含み、これらは３つの最も一般的な変異体であるＡＰＯＥ２（ＡＰＯＥ＊ε２またはε２とも称される；Ｃｙｓ１１２、Ｃｙｓ１５８）、ＡＰＯＥ３（ＡＰＯＥ＊ε３またはε３とも称される；Ｃｙｓ１１２、Ａｒｇ１５８）およびＡＰＯＥ４（ＡＰＯＥ＊ε４またはε４とも称される；Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１５８）をもたらす。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４１．４（ヒトＡＰＯＥ、配列番号１、逆相補物、配列番号２）は、ＡＰＯＥ＊ε３（ＡＰＯＥ３）変異体のヌクレオチド配列であり；ＡＰＯＥ＊ε２（ＡＰＯＥ２）変異体は、配列番号１のヌクレオチド５９５Ｃ＞Ｔにおいて単一のヌクレオチド変化を有し、ＡＰＯＥ＊ε４（ＡＰＯＥ４）変異体は、配列番号１のヌクレオチド４５７Ｔ＞Ｃにおいて単一のヌクレオチド変化を有する。
本明細書において特定されない限り、用語「ＡＰＯＥ」、「ＡｐｏＥ」などは、３つのＡＰＯＥ変異体または対立遺伝子のうちの任意の１つまたは複数を指すと理解されるべきである。例えば、本明細書において使用される場合、用語「ＡＰＯＥ遺伝子」は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、および／またはＡＰＯＥ４対立遺伝子を指すが、用語「ＡＰＯＥ４対立遺伝子」などは、ＡＰＯＥ４対立遺伝子のみを指す。
本明細書において使用される場合、「標的配列」は、ＡＰＯＥ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子、例えば、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡなどのヌクレオチド配列における連続する一部分を意味する。一実施形態において、配列の標的部分は、ＡＰＯＥ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の一部分またはその付近におけるＲＮＡｉ依存性切断のための基質として機能するのに、少なくとも十分に長いであろう。
標的配列は、約１５～３０個のヌクレオチドの長さである。例えば、標的配列は、約１５～３０ヌクレオチド長、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長であり得る。ある特定の実施形態において、標的配列は、１９～２３ヌクレオチド長であり、適宜、２１～２３ヌクレオチド長であってもよい。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
本明細書において使用される場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的ヌクレオチド用語体系を使用して言及される配列によって説明されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」はそれぞれ、一般的に、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドとの関連において、それぞれ塩基としての、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下においてより詳述されるような修飾ヌクレオチド、または代理の置換部分（例えば、表１を参照されたい）も意味することができることは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変更することなく、他の部分で置き換えることができることを十分に意識している。例えば、これらに限定されるわけではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドで置換することができる。別の例において、オリゴヌクレオチドのいずれかにおけるアデニンおよびシトシンは、標的ｍＲＮＡとＧ－ＵＷｏｂｂｌｅ塩基対合を形成するために、それぞれ、グアニンおよびウラシルで置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示において特徴とされる組成物および方法にとって好適である。
本明細書において相互互換的に使用される、用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」は、本明細書において用語が定義されるＲＮＡを含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、ＲＮＡ転写における標的化された切断を媒介するような、薬剤を意味する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍＲＮＡの配列特異的な分解を指示するプロセスである。ＲＮＡｉは、細胞中で、例えば対象、例えば哺乳類対象内の細胞中で、ＡＰＯＥの発現をモジュレートする、例えば阻害する。
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を指示するために、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＡＰＯＥ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用する一本鎖ＲＮＡｉを含む。理論に束縛されることを望むわけではないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと分解されると考えられる［Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485］。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、これらのｄｓＲＮＡを、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡへとプロセシングする［Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363］。次いで、これらのｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと導入され、この場合、１つまたは複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二重鎖を解き、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする［Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309］。適切な標的ｍＲＮＡへの結合の際に、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、サイレンシングを誘導するために、標的を切断する［Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188］。したがって、一態様では、本開示は、細胞内において生成され、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進し、それとにより標的遺伝子、すなわちＡＰＯＥ遺伝子のサイレンシングを行う、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」は、上記において説明されたＲＮＡｉも意味するために本明細書において使用される。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または有機体に導入された一本鎖ＲＮＡであり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるアルゴノート２に結合し、次いで、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、概して、１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載されており、そのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において説明されるアンチセンスヌクレオチド配列はいずれも、本明細書において説明される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
別の実施形態において、本開示の組成物および方法における使用のための「ＲＮＡｉ剤」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、または「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。用語「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＡＰＯＥ遺伝子に関して「センス」または「アンチセンス」配向を有すると言われる、２本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を意味する。本開示の一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと呼ばれる転写後遺伝子サイレンシングメカニズムによって、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を誘導する。
概して、ｄｓＲＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含むことができるが、本明細書において詳細に説明されるように、それぞれの鎖または両方の鎖は、１つまたは複数のリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、も含むことができる。加えて、本明細書において使用される場合、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間連結、または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。したがって、修飾ヌクレオチドなる用語は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基への、例えば、官能基または原子などの置換、付加、または除去を包含する。本開示の薬剤における使用にとって好適な修飾は、本明細書に開示される修飾または当技術分野で公知の修飾の全てのタイプを包含する。ｓｉＲＮＡタイプの分子において使用される、任意のそのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
本開示のある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤内に存在する場合、ヌクレオチドの天然に存在する形態として認められているデオキシヌクレオチドの包含は、修飾ヌクレオチドを構成するとみなすことができる。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路による所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであり得、ならびに約１５～３６塩基対の長さ、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対の長さ、例えば、約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２の塩基対の長さに及び得る。ある特定の実施形態において、二重鎖領域は、１９～２１塩基対の長さ、例えば、２１塩基対の長さである。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子における異なる一部分であり得るか、またはそれらは、別々のＲＮＡ分子であり得る。２つの鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、１つの鎖の３’端と、二重鎖構造を形成するそれぞれ他の鎖の５’端との間において、割り込まれていないヌクレオチドの鎖によって接続され、その場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの無対のヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の無対のヌクレオチドまたはｄｓＲＮＡの標的部位を対象としないヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、１０以下のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ヘアピンループは、８以下の無対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ヘアピンループは、４～１０の無対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ヘアピンループは、４～８の無対のヌクレオチドであり得る。
ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖は、別々のＲＮＡ分子に含まれ、それらの分子は、必ずしも必要ではないが、共有結合することができる。２つの鎖が、１つの鎖の３’端と、二重鎖構造を形成するそれぞれ他の鎖の５’端との間において、割り込まれないヌクレオチドの鎖以外の手段によって共有結合される、ある特定の実施形態において、接続構造は、「リンカー」と呼ばれる（本明細書の他の箇所において定義されるある特定の他の構造も「リンカー」と呼ばれ得るが）。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖におけるヌクレオチドの数から二重鎖に存在する全てのオーバーハングを引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。ＲＮＡｉ剤の一実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらなる他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤の１つの鎖の３’および５’端の両方は、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、ｄｓＲＮＡであり、その各鎖は、独立して、標的ＲＮＡの切断を誘導するために、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＡＰＯＥ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用する１９～２３ヌクレオチドを含む。
本明細書において使用される場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ＲＮＡｉ剤、例えばｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する少なくとも１つの無対のヌクレオチドを意味する。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’端が、他方の鎖の５’端を越えて延びる場合、その逆の場合も同様に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含むことができ；あるいは、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどのヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含み得、またはそれらからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれらの任意の組合せの上にあり得る。その上、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のどちらかの５’端、３’端、またはその両方に存在し得る。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’端または５’端に１～１０ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’端または５’端に１～１０ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハングにおけるヌクレオチドの１つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’端または５’端に１～１０ヌクレオチドオーバーハング、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’端または５’端に１～１０ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハングにおけるヌクレオチドの１つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。
ある特定の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖におけるオーバーハングは、１０ヌクレオチドより長い、例えば、１～３０ヌクレオチド長、２～３０ヌクレオチド長、１０～３０ヌクレオチド長、または１０～１５ヌクレオチド長の、伸長された長さを含み得る。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖にある。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の３’端に存在する。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の５’端に存在する。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖にある。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の３’端に存在する。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の５’端に存在する。ある特定の実施形態において、オーバーハングにおけるヌクレオチドの１つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。ある特定の実施形態において、オーバーハングは、オーバーハングが、生理学的条件下において安定なヘアピン構造を形成することができるような自己相補性部分を含む。
用語「ブラント（ｂｌｕｎｔ）」または「ブラントエンド（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｅｄ）」は、ｄｓＲＮＡに関して本明細書において使用される場合、ｄｓＲＮＡの所定の末端において無対ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの片端または両端は、ブラントであり得る。ｄｓＲＮＡの両端がブラントである場合、ｄｓＲＮＡは、ブラントエンドであると言われる。明瞭化のため、「ブラントエンド」ｄｓＲＮＡは、両端がブラントであるｄｓＲＮＡ、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、そのような分子は、その全長にわたって二本鎖であろう。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えば、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡに対して実質的に相補的な領域を含む、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を意味する。
本明細書において使用される場合、用語「相補性の領域」は、本明細書において定義されるように、配列、例えば、標的配列、例えば、ＡＰＯＥヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を意味する。相補性の領域が、標的配列に対して完全には相補的でない場合、そのミスマッチは、分子の内部領域または末端領域においてであり得る。一般に、最も許容できるミスマッチは、末端領域、例えば、ＲＮＡｉ剤の５’末端または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド以内においてである。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書において使用される場合、用語が本明細書において定義されるようなアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むＲＮＡｉ剤の鎖を意味する。
本明細書において使用される場合、用語「切断領域」は、切断部位に直接隣接して位置される領域を意味する。切断部位は、切断が生じる標的上の部位である。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位のどちらかの末端において直接隣接している３つの塩基を含む。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位のどちらかの末端において直接隣接している２つの塩基を含む。一部の実施形態において、詳細には、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位において生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、および１３を含む。
本明細書において使用される場合、特に明記されない限り、用語「相補的」は、当業者によって理解されるように、第２のヌクレオチド配列との関連において第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合、ある特定の条件下において、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖を形成する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を意味する。
ＲＮＡｉ剤内、例えば、本明細書において説明されるｄｓＲＮＡ内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたっての、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書において、お互いに関して「完全に相補的」であると呼ぶことができる。しかしながら、本明細書において、第１の配列が、第２の配列に対して「実質的に相補的」であるとみなされる場合、２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらは、３０までの塩基対の二重鎖の場合、ハイブリダイゼーションの際に１つまたは複数、しかし、概して、５、４、３、または２以下のミスマッチの塩基対を形成してもよく、一方で、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の阻害に最も関連する条件下においてハイブリダイズする能力を保持する。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定に関して、ミスマッチとはみなされない。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むようなｄｓＲＮＡは、依然として、本明細書において説明される目的に対して、「完全に相補的」とみなすことができる。
「相補的」配列は、本明細書において使用される場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対、または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、またはそれらから完全に形成され得る。そのような非ワトソン・クリック塩基対としては、これらに限定されるわけではないが、Ｇ：ＵＷｏｂｂｌｅまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合が挙げられる。
用語「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」は、本明細書において、それらが使用される文脈から理解されるように、２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの間、例えば、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間における塩基マッチングに関連して使用することができる。
本明細書において使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＡＰＯＥをコードするｍＲＮＡ）の連続部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＡＰＯＥをコードするｍＲＮＡの割り込みされていない部分に対して実質的に相補的である場合、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＰＯＥ配列に対して完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＰＯＥ配列に対して実質的に相補的であり、ＡＰＯＥの配列番号１、３、５、７もしくは９、またはＡＰＯＥの配列番号１、３、５、７もしくは９の断片のヌクレオチド配列の同等の領域に対してその全長にわたり少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＰＯＥ配列に実質的に相補的であり、ＡＰＯＥの表２～５および７～１０のうちのいずれか１つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つに対してその全長にわたり少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、標的ＡＰＯＥ配列と同じであるアンチセンスポリヌクレオチドに対して実質的に相補的であるセンス鎖を含み、センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８および１０、または配列番号２、４、６、８および１０のいずれか１つの断片の同等の領域に対してその全長にわたって少なくとも約８０％、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、ＡＰＯＥ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡの量の低減によって評価され、このようなｍＲＮＡは、ＡＰＯＥ遺伝子が転写されており、ＡＰＯＥ遺伝子の発現が阻害されるように処置された、または処置されている第１の細胞または細胞群から単離することができる、またはそのような細胞または細胞群において検出され、第１の細胞または細胞群に実質的に同一であるが、そのように処置されたまたは処置されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較される。阻害の程度は、以下の単位で表すことができる：
Figure 2023523993000003
ｄｓＲＮＡなどの「細胞をＲＮＡｉ剤と接触させること」なる語句は、本明細書において使用される場合、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを包含する。細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることは、細胞をインビトロにおいてＲＮＡｉ剤と接触させることまたは細胞をインビボにおいてＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。接触させることは、直接的または間接的に行われ得る。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤は、方法を個別に実施することによって、細胞と物理的に接触させ得るか、あるいはＲＮＡｉ剤は、その後に細胞と接触することを可能にし得るまたは引き起こし得るような状況に置かれ得る。
細胞をインビトロにおいて接触させることは、例えば、細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートすることによって為され得る。細胞をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において接触させることは、例えば、ＲＮＡｉ剤を細胞が位置されている組織中もしくはその付近に注入することによって、または別の領域、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）に、適宜、髄腔内注入、硝子体内注入、もしくは他の注入によってＲＮＡｉ剤を注入することによって、または薬剤がその後に、接触されるべき細胞が位置されている組織に到達するように、血流もしくは皮下腔にＲＮＡｉ剤を注入することによって、為され得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば、ＣＮＳに向かわせるかまたは安定化するリガンド、例えば、下記において説明され、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３１１７０においてさらに詳述されるような親油性部分を含み得るかまたはそれにカップリングされ得る。一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、リガンド、例えば、下記において説明され、目的の部位、例えば、肝臓にＲＮＡｉ剤を方向付けるかまたは別の方法で安定化させる１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含有するかまたはそれにカップリングされ得る。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、親油性部分および１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含有するかまたはそれにカップリングされ得る。接触させるためのインビトロでの方法およびインビボでの方法の組合せも可能である。例えば、細胞をインビトロにおいてＲＮＡｉ剤と接触させ、その後に対象に移してもよい。
一実施形態において、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることは、細胞内への取り込みまたは吸収を促進または実施することによって「導入すること」または「ＲＮＡｉ剤を細胞内にデリバリーすること」を含む。ＲＮＡｉ剤の吸収または取り込みは、自発的拡散性のもしくは活性な細胞プロセスによって、または助剤もしくはデバイスによって生じ得る。ＲＮＡｉ剤を細胞内に導入することは、インビトロまたはインビボにおいてであり得る。例えば、インビボ導入の場合、ＲＮＡｉ剤は、組織部位に注入され得るかまたは全身的に投与され得る。細胞内へのインビトロ導入としては、当技術分野で公知の方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどが挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書の下記において説明されるか、または当技術分野で公知である。
用語「親油性」または「親油性部分」は、脂質に対して親和性を有する任意の化合物または化学部分を広く意味する。親油性部分の親油性を特徴付ける方法の１つは、オクタノール－水分配係数ｌｏｇＫｏｗによってであり、この場合、Ｋｏｗは、平衡状態の２相系における水相の化学物質の濃度に対するオクタノール相の化学物質の濃度の比である。オクタノール－水分配係数は、物質における実験室測定された特性である。しかしながら、それは、第１原理または経験的方法を使用して算出される化学物質の構造成分に起因する係数を使用することによっても予想され得る［例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001)を参照されたい］。それは、水よりもむしろ非水性または油性環境を好む物質の傾向の熱力学的尺度（すなわち、親水性／親油性のバランス）を提供する。原則として、化学物質は、ｌｏｇＫｏｗが０を超える場合、親油性の性質である。典型的には、親油性部分は、１を超える、１．５を超える、２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、または１０を超えるｌｏｇＫｏｗを有する。例えば、６－アミノヘキサノールのｌｏｇＫｏｗは、およそ０．７であることが予想される。同じ方法を使用することにより、コレステリルＮ－（ヘキサン－６－オール）カルバメートのｌｏｇＫｏｗは、１０．７であることが予想される。
分子の親油性は、分子が有する官能基に関して変更することができる。例えば、親油性部分の末端にヒドロキシル基またはアミン基を加えることにより、親油性部分の分配係数（例えば、ｌｏｇＫｏｗ）値を増加または減少させることができる。
あるいは、１つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定することができる。例えば、ある特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイの非結合分率は、二本鎖ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性に正に相関し得る、二本鎖ＲＮＡｉ剤の相対的疎水性に正に相関することを判定することができる。
一実施形態において、判定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。この結合アッセイの例示的プロトコールは、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３１１７０において詳細に説明される。結合アッセイにおける非結合ｄｓＲＮＡのフラクションによって測定される二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、増強されたｄｓＲＮＡのインビボデリバリーの場合、０．１５を超える、０．２を超える、０．２５を超える、０．３を超える、０．３５を超える、０．４を超える、０．４５を超える、または０．５を超える。
したがって、親油性部分を二本鎖ＲＮＡｉ剤の内部位置にコンジュゲートすることにより、ｓｉＲＮＡにおける増強されたインビボデリバリーに対する最適の疎水性が提供される。
用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、薬学的に活性な分子、例えば、核酸分子、例えば、ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤の転写元のプラスミドなどを封入する脂質層を含むベシクルである。ＬＮＰは、例えば、米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２、８，１５８，６０１号、および同第８，０５８，０６９号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「対象」は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サルおよびチンパンジーなど）、または非霊長類（例えば、ラットまたはマウスなど）である。好ましい実施形態において、対象は、ヒトであり、例えば、ＡＰＯＥ発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態のために処置または評価されたヒト；ＡＰＯＥ発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態のリスクがあるヒト；ＡＰＯＥ発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態を有するヒト；または本明細書に記載されるようにＡＰＯＥ発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態のために処置されたヒトである。
本明細書において使用される場合、用語「処置すること」または「処置」は有益なまたは所望の結果を指し、それらとしては、ＡＰＯＥ遺伝子発現またはＡＰＯＥタンパク質産生と関連する１つまたは複数の兆候または症状、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患、例えば、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、またはタウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（Ｃｏｒｄｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、慢性外傷性脳症（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｅｎｃｅｌｏｐａｔｈｙ）（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ、ＦＴＤＰ－１７）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、および球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、もしくは二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、および拳闘家認知症の緩和または改善が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。「処置」は、処置が行われない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することも意味し得る。
対象におけるＡＰＯＥのレベルまたは疾患マーカーまたは症状に関連する用語「低下させる（ｌｏｗｅｒ）」は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態において、減少は、少なくとも２０％である。ある特定の実施形態において、減少は、疾患マーカー、例えば、タンパク質または遺伝子発現レベルにおける少なくとも５０％の減少である。対象におけるＡＰＯＥのレベルの文脈における「低下させる」は、好ましくは、そのような障害のない個体における正常な範囲内として受け入れられるレベルまで下げることである。ある特定の実施形態において、「低下させる」は、疾患を患っている対象におけるマーカーまたは症状のレベルと、個体が正常な範囲内で受け入れられるレベルとの間の差の減少、例えば、肥満な個体と正常な範囲内で受け入れられる体重を有する個体との間での体重の減少のレベルである。本明細書において使用される場合、低下させるとは、ヌクレオチド反復配列伸長（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を有するＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡのレベルを低下させるかまたは優勢に低下させることを指し得る。
本明細書において使用される場合、「予防」または「予防すること」は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現またはＡＰＯＥタンパク質の産生の低減が有益であろう疾患、障害、またはそれらの状態に関して使用される場合、対象が、そのような疾患、障害、または状態に関連する症状、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患の症状を発症する可能性の低減を指す。疾患、障害、または状態を発症しないこと、またはそのような疾患、障害、または状態に関連する症状の発症の減少（例えば、その疾患または障害に対して臨床的に受け入れられる規模の少なくとも約１０％の減少）、または遅延された症状の提示の遅延（例えば、数日、数週間、数か月、または数年の遅延）は、有効な予防とみなされる。
本明細書において使用される場合、用語「ＡＰＯＥ関連神経変性疾患」または「ＡＰＯＥ関連神経変性障害」は、ＡＰＯＥの発現および／または活性における低減が有益であろう任意の疾患または障害として理解される。例示的なＡＰＯＥ関連神経変性疾患としては、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、ならびにタウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、ならびに二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症が挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「アミロイド－β媒介性疾患」は、アミロイド－βの細胞外蓄積から生ずる障害であり、アミロイド－βの細胞外蓄積は、脳組織内のアミロイド斑の形成をもたらす。例示的なアミロイド－β媒介性疾患としては、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）が挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「タウ媒介性疾患」は、タウタンパク質の凝集から生じ、神経原線維変化（タングル）をもたらす障害である。タングルは、タウの過剰リン酸化によって形成され、タンパク質が微小管からおよび凝集体から解離することをもたらす。タウオパチーは、病理が主にタウ凝集によって駆動される「原発性タウオパチー」と、別の因子が疾患を駆動する「二次性タウオパチー」（例えば、アルツハイマー病におけるアミロイド－β斑）とに分けることができ、タウオパチーの存在は、疾患進行を悪化させる。原発性タウオパチーの例としては、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）が挙げられる。二次性タウオパチーの例としては、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症が挙げられる。
ＡＰＯＥ多型は、多数のタウオパチーと関連している。ＡＰＯＥ４対立遺伝子は、ＭＡＰＴ変異を有する患者において神経変性を加速させ、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の開始時の年齢を低下させることが見出された［Koriath, C. et al. (2019) Alzheimers Dement 11:277-280］。加えて、ＡＰＯＥ４の存在は、反復性の頭部衝撃に低頻度で曝されたフットボールプレイヤーの脳解剖において［Verscaj, C. et al. (2017) Neurology 88 (16) Supplement S9.001］、および拳闘家の脳において［Jordan, B.D. et al. (1997) JAMA 278(2): 136-140］より進行した慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）と相関した。ＡＰＯＥ４対立遺伝子の存在は、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）のリスクの増加とも関連し、一方で、ＡＰＯＥ３対立遺伝子の存在は、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）への易罹患性に対する保護と関連している［Wei, Y. et al. (2013) J Clinical Neuroscience 21(3): 390-394］。
さらに、Ｓｈｉらは、ＦＴＤのＰ３０１Ｓマウスモデルにおいて、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥノックアウトが存在する場合と比較して、ＡＰＯＥ４が存在する場合、タウレベル、脳萎縮および神経炎症における顕著な増加があることを説明した［Shi et al., (2017) Nature 549: 523-527］。パーキンソニズムを伴うＦＴＤにおいて見出されるＰ３０１Ｌ突然変異を有するヒトタウを発現するマウスモデルを使用した別の研究において、過剰リン酸化タウ、タウ凝集、行動異常は、ＡＰＯＥ２バックグラウンドに対して悪化した［Zhao, N. et al., (2018) Nat Commun 9:4388］。Ｚｈａｏらは、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）および皮質基底核変性症の確定症例においてＡＰＯＥε２／ε２遺伝子型とタウオパチーのリスクとの関係をさらに特定し、ＡＰＯＥ２はアミロイド病理が存在する場合において保護的である場合があり、ＡＰＯＥ２はアミロイド病理の非存在下においてタウ病理の重症度の増加に関連することを示唆した。
「アルツハイマー病」（「ＡＤ」）は、通常緩徐に開始し、徐々に経時的に悪化する慢性神経変性疾患である。最も一般的な初期症状は、最近の事象を思い出すことの困難である。疾患が進行するにつれて、症状は、言語の問題、見当識障害（容易に道に迷うことを含む）、気分変動、意欲の喪失、自己管理の不能、および行動問題を含み得る。本人の状態が衰えるにつれて、彼らはしばしば家族および社会から遠ざかる。徐々に身体の機能が失われ、最終的に死に至る。
神経病理学的に、ＡＤは、大脳皮質およびある特定の皮質下領域におけるニューロンおよびシナプスの喪失によって特徴付けられる。この喪失は、罹患した領域の著しい萎縮をもたらし、著しい萎縮とは、側頭葉および頭頂葉、ならびに前頭皮質および帯状回の部分における変性を含む。変性は、青斑核のような脳幹の核にも存在する。ＭＲＩおよびＰＥＴを使用した研究は、ＡＤを有する人が軽度の認知障害からアルツハイマー病へ進行するにつれての、かつ健康な高齢者からの同様の画像と比較した、ＡＤを有する人における特定の脳領域の大きさの低減を記録している。
アミロイド斑および神経原線維変化の両方は、ＡＤに罹患した人の脳において顕微鏡によって明らかに視認できる。斑は、ニューロンの外側および周囲の、ベータ－アミロイドペプチドおよび細胞物質の濃く、ほとんど不溶性の沈着物である。タングル（神経原線維変化）は、過剰リン酸化し、それ自体細胞内に蓄積する微小管関連タンパク質タウの凝集体である。多くの高齢者が、加齢の結果として一部の斑およびタングルを発症するが、ＡＤを有する人の脳は、特定の脳領域、例えば、側頭葉においてそれらをより多く有する。レビー小体は、ＡＤを有する人の脳において稀ではない。
国立神経障害・脳卒中研究所（ＮＩＮＣＤＳ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）およびアルツハイマー病・関連障害協会（ＡＤＲＤＡ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、現在はアルツハイマー病協会として公知）は、診断に最も一般的に使用されるＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡアルツハイマー病基準を１９８４年に確立し、２００７年に大規模に更新した。これらの基準は、ＡＤの可能性またはＡＤの確実性の臨床診断のために、認知障害の存在および認知症候群の疑いが神経心理学的検査によって確認されることを必要とする。確定診断には、脳組織の顕微鏡検査を含む組織病理学的確認が必要とされる。診断基準と確定的な組織病理学的確認との間で、優れた統計的信頼性および正当性が示されている。最も一般的には、８つの知的ドメイン、すなわち、記憶、言語、知覚技能、注意力、運動技能、見当識、問題解決、および実行機能が、ＡＤにおいて損なわれている。これらのドメインは、米国精神医学会によって公開された精神障害の診断統計マニュアル（ＤＳＭ－ＩＶ－ＴＲ）において列挙されるＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡアルツハイマー病基準と同等である。
現在、ＡＤ患者を処置するために利用可能な薬物には、コリンエステラーゼ阻害剤およびメマンチンがある。これらの薬物は、例えば、記憶、思考、および言語に関連する症状を処置することによって患者のクオリティ・オブ・ライフを改善することができるが、しかしながら、それらは、疾患の進行または衰える速度を変更しない。
ＡＤの原因は、十分に理解されていないが、上記に議論される通り、ＡＰＯＥ４の存在は、６５歳を超えて症状が発症する晩期発症型アルツハイマー病（ＡＤ）の主要なリスク決定因子であることが示されており、アミロイド－β媒介性疾患（ＡＤ）およびタウ媒介性疾患の非ヒト動物モデルにおける多くの研究は、ＡＰＯＥ、例えば、ＡＰＯＥ４を阻害することは、アミロイド斑の形成および認知機能に対して有益な効果を有することを実証している。
「ダウン症候群」（「ＤＳ」）は、２１トリソミーとしても公知であり、第２１染色体の第３のコピーの全てまたは部分の存在によって引き起こされる遺伝性障害（ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒｄｅｒ）である。ＤＳは、生涯にわたる状態であり、知的障害、特徴的な顔つき、幼少期における筋緊張の薄弱を伴い、ＤＳを有する人は多くの場合、認知機能の漸進的な衰えを経験する。第３の第２１染色体は、余分のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子を有し、過剰なアミロイド産生は、アミロイド－β斑の蓄積、および結果として早期発症型アルツハイマー病（ＡＤ）のリスクの５０％超の増加をもたらす。ＤＳにおいて三重になっている別の遺伝子は、ＤＹＲＫ１Ａであり、これは、タウの選択的スプライシングに影響を及ぼし、タウを刺激して異常な過剰リン酸化をもたらし、神経原線維変性を促進する［Hartley D. et al. (2016) Alzheimers Dement 11(6): 700-709］。ＡＤを有するＤＳ個体は、一般的なＡＤ患者と同様の神経病理学的変化を有し、これはアミロイド斑、タウ神経原線維変化、酸化的損傷、およびニューロン喪失を含む。ＤＳ個体の脳脊髄液において、高レベルのアミロイドおよびタウの両方が見出される［Lee, N.C. et al. (2017) Neurology and Therapy 6: 69-81］。
「脳アミロイド血管症」（「ＣＡＡ」）は、脳の小血管～中血管の壁およびある特定の領域において、アミロイド斑が沈着する形態の血管症である。アミロイド斑は、脳細胞を損傷し、脳の様々な部分を損なう。加えて、血管内のアミロイド沈着物は、血管に柔軟性を与える筋肉および弾性線維と置き換わり、血管が破損しやすくなることをもたらす。ＣＡＡは、認知症、頭蓋内出血、および一過性神経学的事象を引き起こし得る。ＣＡＡは、アルツハイマー病の形態学的特徴のうちの１つとして認識されている。アミロイド－β前駆タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子における突然変異は、遺伝性ＣＡＡの最も一般的な原因である［Desimone C.V. et al. (2017) J Am Coll Cardiol 70(9): 1173-1182］。
「前頭側頭型認知症」（「ＦＴＤ」）は、ピック病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、および皮質基底核変性症（ＣＢＤ）などの疾患を包含する。ＦＴＤは、６５歳未満の患者における認知症の一般的な型であり、行動、実行機能、または言語における進行性の衰えによって特徴付けられる一群の神経変性疾患を包含する。ＦＴＤにおいては、脳の前頭葉および側頭葉の神経細胞が失われ、それゆえ、ＦＴＤは、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）とも称される。微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の突然変異およびタウの蓄積は、ピック病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、および皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含むＦＴＤのいくつかのサブタイプにおいて見出される。
「ピック病」は、前頭、側頭、および帯状回の際立つ、境界のはっきりした萎縮によって特徴付けられ、頭頂葉はよりよく保存されている。
「皮質基底核変性症」（「ＣＢＤ」）は、背側前頭前皮質、補足運動野、ローランド周囲皮質、および皮質下核の細胞の優勢な喪失によって特徴付けられる。
「進行性核上性麻痺」（「ＰＳＰ」）は、前頭弓隆部の萎縮と関連し；皮質下萎縮は、淡蒼球、視床下核、および脳幹核のレベルにおいて重度である［Olney, N.T. et al. (2017) Neurol Clin 35(2): 339-374］。
「球状グリアタウオパチー」（「ＧＧＴ」）は、４反復タウアイソフォームを含有する星状膠細胞および乏突起膠細胞において広範囲にわたる球状含有物を有する型の、稀な前頭側頭葉変性症（ＦＬＤ）である。これらの症例は、根底にあるタウ病理および神経変性の重症度および分布と相関する、ある範囲の臨床像と関連する［Ahmed, Z. et al. (2013) Acta Neuropathol 126(4): 537-544］。
「パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症」（「ＦＴＤＰ」）は、運動にも影響を及ぼす、より一般的でない型のＦＴＤである。第１７染色体は、ＦＴＤＰ（ＦＴＤＰ－１７）と連結していることが見出され、第１７染色体上の微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）の突然変異は、家族性ＦＴＤＰ－１７を有する多くの家系において見出された。ＭＡＰＴにおける突然変異のためのＦＴＤＰ－１７は、２５～６５歳の間に開始し、浸透度は１００％に近い。症状は、多くの個体において発症する失語症およびパーキンソニズムを伴う、実行機能障害ならびに人格および行動の変化を含む［Boeve, B.F. et al. (2008) Arch Neurol 65(4): 460-464］。
「慢性外傷性脳症」（「ＣＴＥ」）は、多くのアスリート、とりわけフットボールプレイヤーにおいて見出される反復性の軽度の外傷性脳損傷から生ずる衰弱させる神経変性疾患である。ＣＴＥの神経病理学的シグネチャは、溝および血管周囲領域におけるリン酸化タウの蓄積、小膠細胞症、および星状細胞増多症を含み；初期段階の一部のタウ沈着物から、疾患は、後期段階の脳全体の萎縮に進行し得る。ＣＴＥは、軽度の症状、例えば、短期記憶欠陥および軽度の攻撃性から、何年もかけて、進行した言語欠陥、ならびに妄想症およびパーキンソニズムを含む精神病症状へと進行し得る［Fesharaki-Zadeh, A.(2019) Front Neurol 10:713］。
「拳闘家認知症」は、ボクシングによる頭部への反復性の強打のための認知および運動機能の甚だしい機能障害を含む形態のＣＴＥである［Castellani. R.J et al. (2017) J Alzheimers Dis 60(4): 1209-1221］。
「嗜銀顆粒病」（「ＡＧＤ」）は、非常に頻繁に起こる散発性タウオパチーであり、いくつかの研究においてアルツハイマー病の次に最も一般的な神経変性疾患である。ＡＧＤは、嗜銀顆粒（ＡＧ）と称される、神経プロセスにおける小紡錘形または巴形の銀染色陽性病変によって特徴付けられる晩期発症型神経変性疾患である。リン酸化タウは、ＡＧの主要な構成成分である。最も一般的なＡＧＤ所見は、緩徐進行性の健忘および軽度の認知機能障害、ならびに付随する高有病率の神経精神医学症状である。突出した臨床特色がないために、ＡＧＤは、３つの病理特色である、ＡＧ、乏突起膠細胞コイル小体および神経タングルに基づいて、多くの場合死後にのみ診断される［Rodriguez, R.D. et al.(2015) Dement Neuropsychol 9(1): 2-8］。
「原発性年齢関連タウオパチー」（「ＰＡＲＴ」）は、認知機能が正常であるかまたは軽度にのみ損なわれている高齢の個体の脳において一般的に死後に観察される病理である。ＰＡＲＴの脳は、アルツハイマー病の変化と区別できないタウ神経原線維変化を有するが、アミロイド－β斑を有しない［Crary, J.F. et al. (2014) Acta Neuropathol 128(6): 755-66］。
「クロイツフェルト・ヤコブ病」（「ＣＪＤ」）は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病として公知のヒトおよび動物疾患のファミリーに属する。「タンパク質」および「感染性」に由来する語であるプリオンは、人においてＣＪＤ、および動物においてＴＳＥを引き起こす。海綿状とは、感染した脳を顕微鏡下で観察すると、スポンジのようになるまで穴で満たされた状態になる、脳の特徴的な外観を指す。ＣＪＤは、稀な変性かつ致命的な脳障害であり、通常、晩期に出現し、迅速な過程をとる。典型的な症状開始は、約６０歳において起こり、個体の約７０パーセントは１年以内に死亡する。疾患の初期段階において、人々は、物忘れ、行動変化、協調の欠落、および視覚障害を有し得る。病気が進行するにつれて、精神機能低下が明白になり、不随意運動、失明、四肢衰弱、および昏睡が起こり得る。プリオンプラークに加えて、タウ病理もまた、ＣＪＤ患者のいくつかの脳領域において観察され、広範囲なタウ病理を有する患者の脳脊髄液は、また、高い全タウタンパク質を有する［Kovacs, G.G et al. (2017) Brain Pathol 3: 332-344］。
「家族性英国型認知症」（「ＦＢＤ」）は、認知症、痙攣性四肢不全麻痺（ｓｐａｓｔｉｃ ｔｅｔｒｅｐａｒｅｓｉｓ）、および小脳性運動失調を含む臨床像を有する、大きな英国家系の罹患したメンバーにおいて最初に報告された型の、脳アミロイド血管症である。ＦＢＤは、ＢＲＩ２遺伝子における突然変異によって引き起こされる。ＦＢＤにおけるアミロイド斑は、アミロイド－Ｂｒｉからなり、タウ陽性神経原線維変化が、アミロイド－Ｂｒｉ病変に罹患した領域において見出される。ＦＢＤにおけるタウのイムノブロッティングは、アルツハイマー病におけるタウのパターンと類似している［Holton J.L. et al. (2001) Am J Patho 2: 515-526］。
「治療有効量」は、本明細書において使用される場合、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患を有する対象に投与されたときに、疾患の処置（例えば、既存の疾患または疾患の１つもしくは複数の症状を減少、改善、または維持することによる）を実施するのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤がどのように投与されるか、疾患およびその重症度、ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、先行または並行する処置のタイプ、存在するのであれば、処置される対象の他の個別の特性に応じて変わり得る。
「予防有効量」は、本明細書において使用される場合、ＡＰＯＥ関連神経変性障害を有する対象に投与されたときに、疾患または疾患の１つまたは複数の症状を予防または改善するのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾患の改善は、疾患の経過を鈍化させること、または後で発症する疾患の重症度を減少させることを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤がどのように投与されるか、疾患のリスクの程度、ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、先行または並行する処置のタイプ、存在するのであれば、処置される患者の他の個別の特性に応じて変わり得る。
「治療有効量」または「予防有効量」は、任意の処置に適用可能な合理的な恩恵／リスク比においていくつかの所望の局所的または全身的効果を生じるＲＮＡｉ剤の量も包含する。本開示の方法において用いられるＲＮＡｉ剤は、そのような処置に適用可能な合理的な恩恵／リスク比を生じるのに十分な量において投与され得る。
語句「薬学的に許容される」は、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、合理的な恩恵／リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内でのヒト対象および動物対象の組織との接触における使用にとって好適な、化合物、材料、組成物、または剤形を意味するために本明細書において用いられる。
語句「薬学的に許容される担体」は、本明細書において使用される場合、１つの臓器、または身体の一部分から、他の臓器、例えば、身体の一部分への対象化合物の搬送または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤など、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の原材料に対して適合性であるという意味において「許容され」なければならず、ならびに処置される対象に対して有害であってはならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびショ糖など；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど；（４）トラガント末；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなど；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび座剤ワックスなど；（９）オイル、例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油など；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコールなど；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、またはポリ無水物；（２２）充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸など；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬなど；ならびに（２２）医薬製剤に用いられるその他の無毒の親和性物質が挙げられる。
用語「試料」は、本明細書において使用される場合、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織、ならびに対象内に存在する体液、細胞、または組織のコレクションを包含する。生体液の例としては、血液、血清、および漿膜液、血漿、髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液、などが挙げられる。組織試料は、組織、臓器、または局所領域からの試料を含み得る。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の一部、またはそれらの臓器内の体液または細胞から得られ得る。ある特定の実施形態において、試料は、脳（例えば、脳全体または脳におけるあるセグメント、例えば、線状体、または脳におけるあるタイプの細胞、例えば、ニューロンおよびグリア細胞（星状細胞、オリゴデンドロサイト、小グリア細胞））から得られ得る。他の実施形態において、「対象から得られた試料」は、対象から得られた肝臓組織（またはその副成分）を意味する。一部の実施形態において、「対象から得られた試料」は、対象から得られた血液またはそれらから得られた血漿もしくは血清を意味する。さらなる実施形態において、「対象から得られた試料」は、対象から得られた脳組織（またはその副成分）または網膜組織（またはその副成分）を意味する。
ＩＩ．本開示のＲＮＡｉ剤
ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤が、本明細書において説明される。一部の実施形態において、本明細書において提供されるＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子、ＡＰＯＥ３対立遺伝子、およびＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害する。他の実施形態において、本明細書において提供されるＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ４対立遺伝子の発現を阻害し、例えば、ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ２対立遺伝子またはＡＰＯＥ３対立遺伝子の発現を実質的に阻害せず、例えば、ＡＰＯＥ２および／またはＡＰＯＥ３発現の阻害は、約１０％以下である。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、細胞、例えば対象［例えば、哺乳動物、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患、例えば、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、ならびにタウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、または二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症を有するヒト］内の細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＡＰＯＥ遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約１５～３０ヌクレオチド長またはそれ以下である。ＡＰＯＥ遺伝子を発現する細胞と接触すると、ＲＮＡｉ剤は、ＡＰＯＥ遺伝子（例えば、ヒト遺伝子、霊長類遺伝子、非霊長類遺伝子）の発現を、例えば、ＰＣＲまたは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によって、またはタンパク質ベースの方法によって、例えば、ウェスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などによってアッセイされるように、少なくとも５０％阻害する。一実施形態において、ノックダウンのレベルは、以下の実施例１に提供されるデュアル・ルシフェラーゼアッセイ方法を使用して、ヒト神経芽細胞腫ＢＥ（２）－Ｃ細胞において１０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡにてアッセイされる。
ｄｓＲＮＡは、２つのＲＮＡ鎖を含み、それらは、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下においてハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、実質的に相補的で、概して標的配列に対して完全に相補的である、相補性の領域を含む。標的配列は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現の際に形成されたｍＲＮＡの配列から得ることができる。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的な領域を含み、それにより、２つの鎖は、好適な条件下で組み合わされた場合、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書の他の箇所で説明され、当技術分野で公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補配列は、別々のオリゴヌクレオチド上において相対するように、単一の核酸分子の自己相補領域として含ませることもできる。
概して、二重鎖構造は、１５から３０塩基対の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さである。ある特定の好ましい実施形態において、二重鎖構造は、１８から２５塩基対の長さ、例えば、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～２５、２３～２４、または２４～２５塩基対の長さ、例えば、１９～２１塩基対の長さである。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１５から３０ヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長、例えば、１９～２３ヌクレオチド長または２１～２３ヌクレオチド長である。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１５から２３ヌクレオチド長、または２５から３０ヌクレオチド長である。概して、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として機能するのに十分に長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒのための基質として機能することができることは、当技術分野において周知である。当業者も認識するであろうように、切断のために標的化されるＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より長いＲＮＡ分子、多くの場合、ｍＲＮＡ分子の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ依存性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路による切断）のための基質であることを可能にするのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者は、二重鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、１５から３６塩基対、例えば、１５～３６、１５～３５、１５～３４、１５～３３、１５～３２、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対、例えば、１９～２１塩基対の二重鎖領域であることも認識するであろう。したがって、一実施形態において、切断のために所望のＲＮＡを標的化する、例えば、１５～３０塩基対の、機能的二重鎖へとプロセシングされる限り、３０超の塩基対の二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＡＰＯＥ発現を標的化するために有用なＲＮＡｉ剤は、より大きなｄｓＮＲＡの切断によって標的細胞において生成されない。
本明細書において説明されるｄｓＲＮＡは、例えば、１、２、３、または４ヌクレオチドの、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどのヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含み得るかまたはそれらからなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらの任意の組合せであり得る。その上、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のどちらかの５’端上、３’端上、またはその両方に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、当技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。
一態様では、本開示のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＡＰＯＥに対するセンス鎖配列は、表２～５、および７～１０のいずれか１つにおいて提供される配列の群から選択され得、ならびにセンス鎖の、アンチセンス鎖の対応するヌクレオチドは、表２～５、および７～１０のいずれか１つの配列の群から選択され得る。この態様では、２つの配列の一方は、２つの配列の他方に対して相補的であり、この場合、配列の一方は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現の際に生じたｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的である。そのため、この態様では、ｄｓＲＮＡは、一方のオリゴヌクレオチドが、ＡＰＯＥについての表２～５および７～１０のいずれか１つにおけるセンス鎖（パッセンジャー鎖）として説明され、第２のオリゴヌクレオチドが、表２～５および７～１０のいずれか１つにおけるセンス鎖に対する対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として説明される、２つのオリゴヌクレオチドを含むであろう。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡに対する実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡに対する実質的に相補的な配列は、単一のオリゴヌクレオチドに含まれる。
表３、５、８および１０における配列は、修飾配列またはコンジュゲートされた配列として説明され、表２、４、７および９における配列は、修飾されていない配列として説明されるが、本開示のＲＮＡｉ剤のＲＮＡ、例えば、本開示のｄｓＲＮＡは、修飾されていない、コンジュゲートされていない、またはそこで説明されるものとは異なって修飾もしくはコンジュゲートされている、表２～５および７～１０のいずれか１つにおいて説明される配列のいずれか１つを含み得ることは理解されよう。１つまたは複数の親油性リガンドおよび／または１つまたは複数のＧａｌＮＡｃリガンドは、本出願において提供されるＲＮＡｉ剤の位置のいずれかに含まれ得る。
当業者は、約２０から２３塩基対、例えば、２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の導入において特に有効であるとして歓迎されていることを十分に意識している［Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888］。しかしながら、他のものは、より短いまたはより長いＲＮＡ二重鎖構造も有効であり得ることをわかっている［Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226］。上記において説明した実施形態において、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書において説明されるｄｓＲＮＡは、最小２１ヌクレオチド長さの少なくとも１つの鎖を含むことができる。片端または両端のいくつかのヌクレオチドを差し引いたより短い二重鎖は、上記において説明されるｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることは、合理的に予想することができる。したがって、本明細書に提供される配列の１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡであって、本明細書の実施例に提供されるような、Ｃｏｓ７および１０ｎＭの濃度のＲＮＡ剤を用いたインビトロアッセイならびにＰＣＲアッセイを使用したときに、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が、１０、１５、２０、２５または３０％以下の阻害だけ全長配列を含むｄｓＲＮＡとは異なるｄｓＲＮＡは、本開示の範囲内であることが企図される。
加えて、本明細書において説明されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断を受けやすいＡＰＯＥ転写物の部位を特定する。そのため、本開示は、この部位内を標的化するＲＮＡｉ剤をさらに特徴とする。本明細書において使用される場合、ＲＮＡｉ剤は、特定の部位内のいずれかにおける転写物の切断を促進する場合、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的化すると言われる。そのようなＲＮＡｉ剤は、概して、ＡＰＯＥ遺伝子における選択された配列に隣接する領域から取られた追加のヌクレオチド配列にカップリングした本明細書において提供される配列の１つから、少なくとも約１５のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１９のヌクレオチドを含むであろう。
したがって、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤は、標的配列に対する１つまたは複数のミスマッチを含むことができる。一実施形態において、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤は、３つ以下のミスマッチ（すなわち、３つ、２つ、１つ、または０のミスマッチ）を含む。一実施形態において、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤は、２つ以下のミスマッチを含む。一実施形態において、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤は、１つ以下のミスマッチを含む。一実施形態において、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤は、０のミスマッチを含む。ある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含む場合、ミスマッチは、適宜、相補性の領域の５’端または３’端から最後の５ヌクレオチド以内に制限することもできる。例えば、そのような実施形態において、２３ヌクレオチドのＲＮＡｉ剤の場合、ＡＰＯＥ遺伝子の領域に対して相補的な鎖は、概して、中央の１３ヌクレオチド以内にいかなるミスマッチも含まない。本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の方法を使用することにより、標的配列に対するミスマッチを含有するＲＮＡｉ剤が、ＡＰＯＥ遺伝子の発現の阻害において有効であるか否かを判定することができる。とりわけ、ＡＰＯＥ遺伝子における相補性の特定の領域が、集団内での多形配列バリエーションを有することが知られている場合、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害することにおける、ミスマッチを有するＲＮＡｉ剤の有効性を考慮することは重要である。
ＩＩＩ．本開示の修飾されたＲＮＡｉ剤
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤のＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、未修飾であり、例えば、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。好ましい実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤のＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するように化学修飾される。本開示のある特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本開示の他の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤のヌクレオチドの全てが修飾されている。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本開示のＲＮＡｉ剤は、全体的にではないが大部分が修飾され、５、４、３、２、１または未修飾ヌクレオチドを含み得る。本開示のさらに他の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、５、４、３、２または１つの修飾されたヌクレオチドを含み得る。
本開示において特徴とされる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されるものによって合成または修飾できる。修飾には、例えば、末端修飾、例えば、５’端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆連結）または３’端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対形成する塩基との置き換え、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）またはコンジュゲートされた塩基、糖修飾（例えば、２’位置または４’位置での）もしくは糖の置き換え、またはホスホジエステル結合の修飾もしくは置き換えを含む骨格修飾が含まれる。本明細書に記載される実施形態において有用なＲＮＡｉ剤の具体例として、それだけには限らないが、修飾された骨格を含有する、または天然ヌクレオシド間連結を含有しないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとして、中でも、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的上、時には、当技術分野で言及されるように、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾されたＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。一部の実施形態において、修飾されたＲＮＡｉ剤は、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
修飾されたＲＮＡ骨格として、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、２’－５’連結されたこれらの類似体およびヌクレオシド単位の隣接する対が、３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結される逆極性を有するものが挙げられる。種々の塩、例えば、ナトリウム塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第３，６８７，８０８号、同４，４６９，８６３号、同４，４７６，３０１号、同５，０２３，２４３号、同５，１７７，１９５号、同５，１８８，８９７号、同５，２６４，４２３号、同５，２７６，０１９号、同５，２７８，３０２号、同５，２８６，７１７号、同５，３２１，１３１号、同５，３９９，６７６号、同５，４０５，９３９号、同５，４５３，４９６号、同５，４５５，２３３号、同５，４６６，６７７号、同５，４７６，９２５号、同５，５１９，１２６号、同５，５３６，８２１号、同５，５４１，３１６号、同５，５５０，１１１号、同５，５６３，２５３号、同５，５７１，７９９号、同５，５８７，３６１号、同５，６２５，０５０号、同６，０２８，１８８号、同６，１２４，４４５号、同６，１６０，１０９号、同６，１６９，１７０号、同６，１７２，２０９号、同６，２３９，２６５号、同６，２７７，６０３号、同６，３２６，１９９号、同６，３４６，６１４号、同６，４４４，４２３号、同６，５３１，５９０号、同６，５３４，６３９号、同６，６０８，０３５号、同６，６８３，１６７号、同６，８５８，７１５号、同６，８６７，２９４号、同６，８７８，８０５号、同７，０１５，３１５号、同７，０４１，８１６号、同７，２７３，９３３号、同７，３２１，０２９号およびＲＥ３９４６４号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
中にリン原子を含まない修飾されたＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとして、モルホリノ連結（幾分かはヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するものならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第５，０３４，５０６号、同５，１６６，３１５号、同５，１８５，４４４号、同５，２１４，１３４号、同５，２１６，１４１号、同５，２３５，０３３号、同５，６４，５６２号、同５，２６４，５６４号、同５，４０５，９３８号、同５，４３４，２５７号、同５，４６６，６７７号、同５，４７０，９６７号、同５，４８９，６７７号、同５，５４１，３０７号、同５，５６１，２２５号、同５，５９６，０８６号、同５，６０２，２４０号、同５，６０８，０４６号、同５，６１０，２８９号、同５，６１８，７０４号、同５，６２３，０７０号、同５，６６３，３１２号、同５，６３３，３６０号、同５，６７７，４３７号および同５，６７７，４３９号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤での使用に適したＲＮＡミメティックが企図され、このＲＮＡミメティックでは、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結の両方、すなわち骨格が新規の基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有するとわかっているＲＮＡミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は、保持され、直接的または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第５，５３９，０８２号、同５，７１４，３３１号および同５，７１９，２６２号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のＲＮＡｉ剤において使用するために適したさらなるＰＮＡ化合物は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載されている。
本開示において特徴とされるいくつかの実施形態には、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡおよびヘテロ原子骨格、特に、上記で参照された米国特許第５，４８９，６７７号の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－および上記で参照された米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドが含まれる。一部の実施形態において、本明細書において特徴とされるＲＮＡは、上記で参照されたＵＳ５，０３４，５０６のモルホリノ骨格構造を有する。天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－ＯＣＨ２－として表され得る。
修飾されたＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換された糖部分を含有し得る。本明細書において特徴とされるＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位置に以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニルまたはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうち１つを含む場合があり、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適した修飾として、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中、ｎおよびｍは、１～約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位置に以下：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、ＲＮＡｉ剤の薬物動態特性を改善するための基またはＲＮＡｉ剤の薬動力学特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基のうち１つを含む。一部の実施形態において、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的修飾として、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下に実施例において記載されるような２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当技術分野で公知の）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２がある。さらなる例示的修飾として、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド（これら３つのファミリー中のＲおよびＳ異性体の両方）、２’－アルコキシアルキルおよび２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。
他の修飾として、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－Ｏ－ヘキサデシルおよび２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、ＲＮＡｉ剤のＲＮＡ上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’－５’連結ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位置および５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行うことができる。ＲＮＡｉ剤はまた、糖ミメティック、例えば、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第４，９８１，９５７号、同５，１１８，８００号、同５，３１９，０８０号、同５，３５９，０４４号、同５，３９３，８７８号、同５，４４６，１３７号、同５，４６６，７８６号、同５，５１４，７８５号、同５，５１９，１３４号、同５，５６７，８１１号、同５，５７６，４２７号、同５，５９１，７２２号、同５，５９７，９０９号、同５，６１０，３００号、同５，６２７，０５３号、同５，６３９，８７３号、同５，６４６，２６５号、同５，６５８，８７３号、同５，６７０，６３３号および同５，７００，９２０号が挙げられ、それらのうちある特定のものは、本出願と共同所有されている。前記のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のＲＮＡｉ剤はまた、核酸塩基（当技術分野では簡単に「塩基」と呼ばれることも多い）修飾または置換を含み得る。本明細書において使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008において開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990において開示されるもの、Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613によって開示されるものおよびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちある特定のものは、本開示において特徴とされるオリゴマー化合物の結合親和性を増大するために特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含むＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃だけ増大するとわかっており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらにより詳しくは、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に例示的塩基置換である。
上記の修飾された核酸塩基ならびに他の修飾された核酸塩基のある特定のものの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、同４，８４５，２０５号、同５，１３０，３０２号、同５，１３４，０６６号、同５，１７５，２７３号、同５，３６７，０６６号、同５，４３２，２７２号、同５，４５７，１８７号、同５，４５９，２５５号、同５，４８４，９０８号、同５，５０２，１７７号、同５，５２５，７１１号、同５，５５２，５４０号、同５，５８７，４６９号、同５，５９４，１２１号、同５，５９６，０９１号、同５，６１４，６１７号、同５，６８１，９４１号、同５，７５０，６９２号、同６，０１５，８８６号、同６，１４７，２００号、同６，１６６，１９７号、同６，２２２，０２５号、同６，２３５，８８７号、同６，３８０，３６８号、同６，５２８，６４０号、同６，６３９，０６２号、同６，６１７，４３８号、同７，０４５，６１０号、同７，４２７，６７２号および同７，４９５，０８８号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤をまた、１つまたは複数の二環式糖部分を含むように修飾できる。「二環式糖」は、隣接しているか否かにかかわらず、２つの炭素を架橋することによって形成された環によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、隣接しているか否かにかかわらず、糖環の２つの炭素を架橋することによって形成された環を含み、それによって二環式環構造を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、架橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素を、適宜、２’－非環式酸素原子を介して接続する。したがって、一部の実施形態において、本発明の薬剤は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する追加の架橋を含む、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’－エンド構造立体配座に効率的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清におけるｓｉＲＮＡ安定性を増大し、オフターゲット効果を低減するとわかっている［Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447、Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843、Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193］。本発明のポリヌクレオチドにおいて使用するための二環式ヌクレオシドの例として、制限するものではないが、４’と２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤として、４’から２’への架橋を含む１つまたは複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。
ロックドヌクレオシドは、以下の構造（立体化学は省略する）：
Figure 2023523993000004
 によって表され得る（式中、Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、Ｌは、２’－炭素をリボース環の４’－炭素に接続する連結基である）。このような４’から２’へ架橋された二環式ヌクレオシドの例として、それだけには限らないが、４’－（ＣＨ２）－－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ２）－－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）２－－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許公開第２００４／０１７１５７０号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－－Ｏ－２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは窒素保護基である）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照されたい）および４’－ＣＨ２－－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照されたい）が挙げられる。前記の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許公開として、それだけには限らないが、以下：米国特許第６，２６８，４９０号、同６，５２５，１９１号、同６，６７０，４６１号、同６，７７０，７４８号、同６，７９４，４９９号、同６，９９８，４８４号、同７，０５３，２０７号、同７，０３４，１３３号、同７，０８４，１２５号、同７，３９９，８４５号、同７，４２７，６７２号、同７，５６９，６８６号、同７，７４１，４５７号、同８，０２２，１９３号、同８，０３０，４６７号、同８，２７８，４２５号、同８，２７８，４２６号、同８，２７８，２８３号、ＵＳ２００８／００３９６１８およびＵＳ２００９／００１２２８１が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む１つまたは複数の立体化学的糖立体配置を有する前記の二環式ヌクレオシドのいずれも、調製できる（ＷＯ９９／１４２２６を参照されたい）。
本開示のＲＮＡｉ剤をまた、１または複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾できる。本明細書において使用される場合、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０～２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、Ｓ立体配座にあり、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれる。
本開示のＲＮＡｉ剤はまた、１つまたは複数の「立体配座制限ヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’とＣ４’炭素を、またはリボースのＣ３と－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配座にロックし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増大する。リンカーは、酸素を安定性および親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さのものであり、その結果、リボース環パッカリングが少なくなる。
上記のＣＲＮのある特定のものの調製を教示する代表的な刊行物として、それだけには限らないが、ＵＳ２０１３／０１９０３８３およびＷＯ２０１３／０３６８６８が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＵＮＡ（非ロックド核酸）ヌクレオチドである１つまたは複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、非ロックド非環式核酸であり、糖の結合のいずれも除去されており、非ロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’の間の結合（すなわち、Ｃ１’とＣ４’炭素の間の共有結合の炭素－酸素－炭素結合）が除去されているモノマーも包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’とＣ３’炭素の間の共有結合の炭素－炭素結合）が除去されている［参照により本明細書に組み込まれる、Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたい］。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国の刊行物として、それだけには限らないが、ＵＳ８，３１４，２２７および米国特許公開第２０１３／００９６２８９号、同２０１３／００１１９２２号および同２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ分子の末端への潜在的に安定化する修飾として、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆塩基ｄＴ（ｉｄＴ）および他のものを挙げることができる。この修飾の開示内容は、ＷＯ２０１１／００５８６１に見出すことができる。
本開示のＲＮＡｉ剤の他の修飾として、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣物、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣物が挙げられる。適したホスフェート模倣物は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０１５７５１１に開示されている。
Ａ．本開示のモチーフを含む修飾されたＲＮＡｉ剤
本開示のある特定の態様では、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０７５０３５において開示されるような化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書に、およびＷＯ２０１３／０７５０３５において示されるように、３連続ヌクレオチド上の３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフを、切断部位でまたはその付近でＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖中に導入することによって優れた結果を得ることができる。一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、そうでなければ完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入は、存在する場合にはセンスまたはアンチセンス鎖の修飾パターンを妨げる。ＲＮＡｉ剤を、親油性リガンド、例えば、センス鎖上の例えば、Ｃ１６リガンドとコンジュゲートしてもよい。ＲＮＡｉ剤を、例えば、アンチセンス鎖の１つまたは複数の残基で（Ｓ）－グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾で修飾してもよい。得られたＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
したがって、本開示は、インビボで標的遺伝子（すなわち、ＡＰＯＥ遺伝子）の発現を阻害可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１５～３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、各鎖は、１６～３０ヌクレオチド長、１７～３０ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長または２１～２３ヌクレオチド長であり得る。ある特定の実施形態において、各鎖は、１９～２３ヌクレオチド長である。
センス鎖およびアンチセンス鎖は通常、「ＲＮＡｉ剤」とも本明細書において呼ばれる二重鎖の二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二重鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、二重鎖領域は、１６～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～３０ヌクレオチド対の長さ、２７～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～２３ヌクレオチド対の長さ、１７～２１ヌクレオチド対の長さ、１７～１９ヌクレオチド対の長さ、１９～２５ヌクレオチド対の長さ、１９～２３ヌクレオチド対の長さ、１９～２１ヌクレオチド対の長さ、２１～２５ヌクレオチド対の長さまたは２１～２３ヌクレオチド対の長さであり得る。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７ヌクレオチド長から選択される。好ましい実施形態において、二重鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、一方または両方の鎖の３’端、５’端または両端に１つまたは複数のオーバーハング領域またはキャッピング基を含有し得る。オーバーハングは、１～６ヌクレオチド長、例えば、２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長または１～２ヌクレオチド長であり得る。好ましい実施形態において、ヌクレオチドオーバーハング領域は、２ヌクレオチド長である。オーバーハングは、一方の鎖が他方よりも長い結果または同一の長さの２つの鎖がねじれ形である結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化される遺伝子配列と相補的であり得る、または別の配列であり得る。また、第１のおよび第２の鎖を、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによってつなぐこともできる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドは各々独立に、２’－糖修飾された、例えば、２－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）およびそれらの任意の組合せを含むがそれに限定されるわけではない、修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドであり得る。
例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化される遺伝子配列と相補的であり得る、または別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の５’－または３’－オーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態において、オーバーハング領域（複数可）は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含有し、２つのヌクレオチドは、同一である場合も、異なる場合もある。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の３’端に存在する。一実施形態において、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において、この３’－オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、その安定性全体に影響を及ぼすことなくＲＮＡｉの干渉活性を強化できる単一のオーバーハングのみを含有し得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端に、あるいは、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’端（またはセンス鎖の３’端）に位置する平滑末端を有し得る、または逆も同じである。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’端は平滑である。理論に捉われようとは思わないが、非対称のアンチセンス鎖の５’端の平滑末端およびアンチセンス鎖の３’端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖積み込みに好都合である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の両側ブラントマー（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、ここでは、センス鎖が、５’末端から位置７、８、９の３つの連続ヌクレオチド上に、３つの２’－Ｆ修飾のうちの少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’端から位置１１、１２、１３の３連続ヌクレオチド上に３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、両端が平滑末端化され、２０ヌクレオチドの長さであり、センス鎖は、５’端から位置８、９、１０の３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’端から位置１１、１２、１３の３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含有する。
さらに別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、両端が平滑末端化され、２１ヌクレオチドの長さであり、センス鎖は、５’端から位置９、１０、１１の３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’端から位置１１、１２、１３の３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含有する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’端から位置９、１０、１１の３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含有し、アンチセンス鎖は、５’端から位置１１、１２、１３の３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含有し、ＲＮＡｉ剤の一方の末端は、平滑であり、もう一方の末端は、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’端にある。２ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’端にある場合には、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結がある場合があり、３つのヌクレオチドのうち２つは、オーバーハングヌクレオチドであり、３番目のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の対形成されたヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’端およびアンチセンス鎖の５’端の両方で末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに有する。一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中のどのヌクレオチドも、修飾されたヌクレオチドである。一実施形態において、各残基は独立に、例えば、交互モチーフ中で２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾されている。ＲＮＡｉ剤は、リガンド（例えば、親油性リガンド、適宜、Ｃ１６リガンド）をさらに含んでもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基の長さであり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖の位置１～２３は、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基の長さであり、３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の位置１～２３と対形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、最大６つの連続３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、それによって、１～６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対形成しない１０～３０の連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０～３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のためにアラインされる場合に、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対形成される塩基であり、それによって、センスおよびアンチセンス鎖の間に実質的に二本鎖の領域を形成し、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、センス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含有し、モチーフのうち少なくとも１つは、切断部位でまたはその付近で生じる。アンチセンス鎖は、切断部位にまたはその付近に３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含有する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５かつ多くとも２９ヌクレオチドである長さを有する第１の鎖と、多くとも３０ヌクレオチドである長さを有し、５’端から位置１１、１２、１３の３連続ヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを有する第２の鎖とを含み、第１の鎖の３’端と、第２の鎖の５’端は平滑末端を形成し、第２の鎖は、第１の鎖よりもその３’端で１～４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの第２の鎖の長さに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断は、第２の鎖の３’端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それによって、哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減する。適宜、ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含んでもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含有し、モチーフのうち１つは、センス鎖中の切断部位に生じる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖もまた、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含有することができ、モチーフのうち１つは、アンチセンス鎖中の切断部位にまたはその付近に生じる。
１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するＲＮＡｉ剤について、アンチセンス鎖の切断部位は通常、５’端からおよそ位置１０、１１および１２である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の位置９、１０、１１、位置１０、１１、１２、位置１１、１２、１３、位置１２、１３、１４または位置１３、１４、１５に生じる場合がある、数はアンチセンス鎖の５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または数はアンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドから開始する。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’端からのＲＮＡｉの二重鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含有し得る、アンチセンス鎖は、鎖の切断部位にまたはその付近に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖を、センス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチド重複を有するように、すなわち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つと塩基対を形成するように配列できる。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複する場合がある、または３つのヌクレオチド全てが重複する場合がある。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含有し得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位にまたはその付近に生じる場合があり、他のモチーフは、ウイング修飾であり得る。本明細書において「ウイング修飾」という用語は、同一の鎖の切断部位のまたはその付近のモチーフから離れている鎖の別の部分に生じるモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接しているか、または少なくとも１つもしくはより多くのヌクレオチドだけ離れている。モチーフが互いにすぐ隣接する場合には、モチーフの化学は、互いに別個であり、モチーフが１つまたは複数のヌクレオチドだけ離れている場合には、化学は、同一である場合も異なっている場合もある。２以上のウイング修飾が存在する場合もある。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合には、各ウイング修飾は、切断部位にもしくはその付近にある第１のモチーフに対して１つの末端に、またはリードモチーフのいずれかの側に生じ得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含有する場合があり、モチーフの少なくとも１つは鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つまたは複数のウイング修飾を含有し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は通常、鎖の３’端、５’端または両端に最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は通常、鎖の３’端、５’端または両端に二重鎖領域内の最初の１つまたは２つの対形成されるヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも１つのウイング修飾を含有する場合には、ウイング修飾は、二重鎖領域の同一末端に入る場合があり、１、２または３つのヌクレオチドの重複を有する。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖が各々、少なくとも２つのウイング修飾を含有する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖を、１つの鎖に由来する２つの修飾が各々、二重鎖領域の１つの末端に入り、１、２または３つのヌクレオチドの重複を有し、１つの鎖に由来する２つの修飾が各々、二重鎖領域のもう一方の末端に入り、１、２または３つのヌクレオチドの重複を有し、２つの修飾１つの鎖がリードモチーフの各側に入り、二重鎖領域中に１、２または３つのヌクレオチドの重複を有するように配列できる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的との、二本鎖内のミスマッチ（複数可）またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域中に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいてランク付けできる（例えば、特定の対形成の会合または解離の自由エネルギーで、最も簡単なアプローチは、個々の対に基づいて対を調べることであるが、次の隣接分析または同様の分析も使用できる）。解離の促進の点では：Ａ：ＵはＧ：Ｃを上回って好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃを上回って好ましく、Ｉ：ＣはＧ：Ｃを上回って好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のもの（本明細書において別の場所で記載されるような）は、正準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対形成を上回って好ましく、ユニバーサル塩基を含む対形成は正準対形成を上回って好ましい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、二本鎖の５’端でのアンチセンス鎖の解離を促進するために、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃおよびミスマッチ対、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のものまたはユニバーサル塩基を含む対形成の群から独立に選択される、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４または５つの塩基対のうち少なくとも１つを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖中の５’端から二重鎖領域内の１位置のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の１、２または３つの塩基対のうち少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
別の実施形態において、センス鎖の３’－末端におけるヌクレオチドは、デオキシ－チミジン（ｄＴ）である。別の実施形態において、アンチセンス鎖の３’－末端におけるヌクレオチドは、デオキシ－チミジン（ｄＴ）である。一実施形態において、デオキシ－チミンヌクレオチドの短い配列、例えば、センスまたはアンチセンス鎖の３’端の２つのｄＴヌクレオチドがある。
一実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ－Ｎｂ－Ｙ Ｙ －Ｎｂ－（Ｚ Ｚ ）Ｚｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉ）
［式中、
ｉおよびｊは各々独立に、０または１であり、
ｐおよびｑは各々独立に、０～６であり、
各Ｎａは独立に、０～２５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂは独立に、０～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐおよびｎｑは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ＮｂおよびＹは、同一修飾を有さず、ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］
によって表すことができる。好ましくは、ＹＹＹは、全て２’－Ｆ修飾されたヌクレオチドである。
一実施形態において、ＮａまたはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合には、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその近傍に生じ得る（例えば、位置６、７、８、７、８、９、８、９、１０、９、１０、１１、１０、１１、１２または１１、１２、１３に生じ得る）、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよい。
一実施形態において、ｉは１であり、ｊは０である、またはｉは０であり、ｊは１である、またはｉおよびｊは両方とも１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｂ）、
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｃ）、または
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｄ）
によって表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｂ）によって表される場合は、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｃ）として表される場合は、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合もある。
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合には、各Ｎｂは独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合もある。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同一である場合も、異なっている場合もある。
他の実施形態において、ｉは０であり、ｊは０であり、センス鎖は、次式：
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合には、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’ ３’ （ＩＩ）
［式中、
ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ’およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各Ｎａ’は独立に、０～２５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂ’独立に、０～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
Ｎｂ’およびＹ’は、同一修飾を有さず、
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］
によって表すことができる。
一実施形態において、Ｎａ’またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合には、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の位置９、１０、１１、位置１０、１１、１２、位置１１、１２、１３、位置１２、１３、１４または一１３、１４、１５で生じる場合があり、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよい。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、位置１１、１２、１３で生じる。
一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾されたヌクレオチドである。
一実施形態において、ｋは１であり、ｌは０であるか、またはｋは０であり、ｌは１であるか、またはｋおよびｌは両方とも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、次式：
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｂ）、
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｃ）、または
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－ Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－ Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｄ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）によって表される場合には、Ｎｂ ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｃ）として表される場合には、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）として表される場合には、各Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態において、ｋは０であり、ｌは０であり、アンチセンス鎖は、次式：
５’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－ Ｎａ’－ｎｑ’ ３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合には、各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同一である場合も、異なっている場合もある。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシルまたは２’－フルオロで独立に修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表す場合がある。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１ｎｔである場合に、鎖の位置９、１０および１１で生じるＹＹＹモチーフを含有し得る、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよく、Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二重鎖領域の対向端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有する場合があり、ＸＸＸおよびＺＺＺは各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、鎖の位置１１、１２、１３で生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有し得る、数は５’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は５’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよく、Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の対向端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有する場合があり、Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本開示の方法において使用するためのＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができ、各鎖は、１４～３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ －Ｎａ－（Ｘ Ｘ Ｘ）ｉ －Ｎｂ－ Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎｂ －（Ｚ Ｚ Ｚ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ ’－ｎｑ ’ ５’ （ＩＩＩ）
［式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ ’は独立に、０～２５の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ ’は独立に、０～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’およびｎｑは、それらの各々は存在する場合も存在しない場合もあるが、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］
によって表される。
一実施形態において、ｉは０であり、ｊは０であるか、またはｉは１であり、ｊは０であるか、またはｉは０であり、ｊは１であるか、またはｉおよびｊは両方とも０であるか、またはｉおよびｊは両方とも１である。別の実施形態において、ｋは０であり、ｌは０であるか、またはｋは１であり、ｌは０であり、ｋは０であり、ｌは１であるか、またはｋおよびｌは両方とも０であるか、またはｋおよびｌは両方とも１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的組合せは、以下の式：
５’ ｎｐ － Ｎａ －Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’ －Ｎａ ’ｎｑ ’ ５’ （ＩＩＩａ）
５’ ｎｐ －Ｎａ －Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎｂ －Ｚ Ｚ Ｚ －Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ ｎｐ－Ｎａ－ Ｘ Ｘ Ｘ －Ｎｂ －Ｙ Ｙ Ｙ － Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’ ５’ （ＩＩＩｃ）
５’ ｎｐ －Ｎａ －Ｘ Ｘ Ｘ －Ｎｂ－Ｙ Ｙ Ｙ －Ｎｂ－ Ｚ Ｚ Ｚ －Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ ’ ５’
（ＩＩＩｄ）
を含む。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合には、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）によって表される場合には、各Ｎｂは独立に、１～１０、１～７、１～５または１～４の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）として表される場合には、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）として表される場合には、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ ’の各々は独立に、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結される。さらに別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、二価または三価の分岐リンカー（以下に記載される）によって付着された１つまたは複数のＣ１６（または関連）部分にコンジュゲートされる。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分岐リンカーによって付着されてもよい、１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６（または関連）部分にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つまたは複数の親油性の、例えば、Ｃ１６（または関連）部分にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二重鎖を含有する多量体であり、二重鎖は、リンカーによって接続される。リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、２つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される、３、４、５、６またはそれより多い二重鎖を含有する多量体であり、二重鎖は、リンカーによって接続される。リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、２つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’端で互いに連結され、３’端の一方または両方は、リガンドにコンジュゲートされてもよい。薬剤の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、２つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または薬剤の各々は、２つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
種々の刊行物には、本開示の方法において使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。このような刊行物には、ＷＯ２００７／０９１２６９、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０ならびにＵＳ７８５８７６９が含まれ、それらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、本明細書に記載されるようなＲＮＡｉ剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾を含む。例示的実施形態において、本開示の５’－ビニルホスホネートは、構造：
Figure 2023523993000005
 ［式中、
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｒは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、またはＣ１～２０アルコキシ（例えば、メトキシまたはｎ－ヘキサデシルオキシ）であり；
Ｒ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、Ｃ５’炭素とＲ５’との間の二重結合は、ＥまたはＺ配置（例えば、Ｅ配置）であり；
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、ここでは、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルであってもよい］
本開示のビニルホスホネートは、本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに付着させることができる。ある特定の実施形態において、本開示のビニルホスホネートを、適宜、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’端でｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に付着させる。
本開示の組成物および方法のためにビニルホスフェート修飾も企図される。例示的ビニルホスフェート構造として上記の構造があり、ここでは、Ｒ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、Ｃ５’炭素とＲ５’との間の二重結合は、ＥまたはＺ配置（例えば、Ｅ配置）である。
Ｅ．熱的不安定化修飾
ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９）中に熱的不安定化修飾を組み込んで、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害することによって、ｄｓＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉のために最適化できる。アンチセンス鎖の５’端から数えて最初の９ヌクレオチド位置内に二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことが発見されている。したがって、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチド位置内に少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５またはそれより多い）二重鎖の熱的不安定化修飾を含む。一部の実施形態において、１つまたは複数の二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’端から位置２～９、または好ましくは、位置４～８中に位置する。一部のさらなる実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾（複数可）は、アンチセンス鎖の５’端から位置６、７または８に位置する。さらに一部のさらなる実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’端から位置７に位置する。「熱的不安定化修飾（複数可）」という用語は、より低い全体の融解温度（Ｔｍ）を有するｄｓＲＮＡをもたらすであろう修飾（複数可）を含む（好ましくは、このような修飾（複数可）を有さないｄｓＲＮＡのＴｍよりも１、２、３または４度低い。一部の実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’端から位置２、３、４、５または９に位置する。
熱的不安定化修飾として、それだけには限らないが、脱塩基修飾、対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および糖修飾、例えば、２’－デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えば、非ロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）を挙げることができる。
例示される脱塩基修飾として、それだけには限らないが、以下：
Figure 2023523993000006
 ［式中、Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ”＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ］
Figure 2023523993000007
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基である］
が挙げられる。
例示される糖修飾として、それだけには限らないが、以下：
Figure 2023523993000008
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基である］
が挙げられる。
一部の実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、以下：
Figure 2023523993000009
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す］
からなる群から選択される。
「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えば、リボース炭素間の結合のいずれか（例えば、Ｃ１’－Ｃ２’、Ｃ２’－Ｃ３’、Ｃ３’－Ｃ４’、Ｃ４’－Ｏ４’またはＣ１’－Ｏ４’）が存在しないか、またはリボース炭素もしくは酸素のうち少なくとも１つ（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’またはＯ４’）が独立に、もしくは組み合わせてヌクレオチドに存在しない、非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態において、非環式ヌクレオチドは、
Figure 2023523993000010
 ［式中、Ｂは、修飾されたまたは未修飾の核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３またはアルキルであり；ならびにＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である］。用語「ＵＮＡ」は、非ロックド非環式核酸を指し、糖の結合のいずれも除去されており、非ロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’の間の結合（すなわち、Ｃ１’とＣ４’炭素の間の共有結合の炭素－酸素－炭素結合）が除去されているモノマーも包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’とＣ３’炭素の間の共有結合の炭素－炭素結合）が除去されている［参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985)；およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009)を参照されたい］。非環式誘導体は、ワトソン－クリック対形成に影響を及ぼすことなく、より大きな骨格柔軟性を提供する。非環式ヌクレオチドは、２’－５’または３’－５’連結を介して連結され得る。
「ＧＮＡ」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡと類似のポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復するグリセロール単位から構成される点でその「骨格」の組成が異なっているグリコール核酸を指す：
Figure 2023523993000011
二重鎖の熱的不安定化修飾は、熱的不安定化ヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ二本鎖内の対向鎖中の対向するヌクレオチドの間のミスマッチ（すなわち、非相補的塩基対）であり得る。例示的ミスマッチ塩基対として、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔまたはそれらの組合せが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対形成も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの間に生じ得る、すなわち、ミスマッチ塩基対形成は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは独立してそれぞれのヌクレオチドに由来する核酸塩基間で生じ得る。ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、２’－デオキシ核酸塩基である、ミスマッチ対形成中の少なくとも１つの核酸塩基を含有する、例えば、２’－デオキシ核酸塩基は、センス鎖中にある。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖のシード領域中の二重鎖の熱的不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基とのＷ－Ｃ Ｈ結合が損なわれたヌクレオチド、例えば：
Figure 2023523993000012
 を含む。
脱塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）およびミスマッチ修飾のより多くの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１３３８７６に詳細に記載されている。
熱的不安定化修飾はまた、対向する塩基と水素結合を形成する能力が低減または消失したユニバーサル塩基およびリン酸修飾を含み得る。
一部の実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾には、非正準塩基を有するヌクレオチド、例えば、それだけには限らないが、対向鎖中の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれた、または完全に消失した核酸塩基修飾が含まれる。これらの核酸塩基修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／００１１８９５に記載されるように、ｄｓＲＮＡ二重鎖の中心領域の不安定化について評価されている。例示的核酸塩基修飾として、以下：
Figure 2023523993000013
一部の実施形態において、アンチセンス鎖のシード領域における二重鎖の熱的不安定化修飾には、標的ｍＲＮＡ上の塩基と相補的である１つまたは複数のα－ヌクレオチド、例えば、以下：
Figure 2023523993000014
 ［式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ－アルキルである］
が含まれる。
天然のホスホジエステル結合と比較して、ｄｓＲＮＡ二重鎖の熱的安定性を低下させると知られている例示的リン酸修飾として：
Figure 2023523993000015
Ｒ基のアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり得る。Ｒ基の具体的なアルキルとして、それだけには限らないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
当業者は認識するであろうが、核酸塩基の機能的役割が本開示のＲＮＡｉ剤の特異性を定義していることを考慮して、核酸塩基修飾は、例えば、オフターゲット効果に対してオンターゲット効果を増強する目的のために、例えば、本開示のＲＮＡｉ剤中に不安定化修飾を導入するために、本明細書に記載されるような種々の方法で実施できるが、利用可能な、一般に、本開示のＲＮＡｉ剤上に存在する修飾の範囲は、非核酸塩基修飾、例えば、ポリリボヌクレオチドの糖基またはリン酸骨格への修飾についてより大きいものとなる傾向がある。このような修飾は、本開示の他の節においてより詳細に記載されており、上記または本明細書において他の場所で記載されるような、天然の核酸塩基または修飾された核酸塩基のいずれかを有する本開示のＲＮＡｉ剤のために明確に企図される。
熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、ｄｓＲＮＡはまた、１または複数の安定化修飾を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）安定化修飾を含み得る。制限するものではないが、安定化修飾は全て、一方の鎖中に存在する場合がある。一部の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖両方が、少なくとも２つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる場合があり、各安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じる場合があり、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンで安定化修飾を含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンと比較してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の安定化修飾を含む。制限するものではないが、アンチセンス鎖中の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、アンチセンスは、５’端から位置２、６、８、９、１４および１６に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態において、アンチセンスは、５’端から位置２、６、１４および１６に安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態において、アンチセンスは、５’端から位置２、１４および１６に安定化修飾を含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも１つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’端または３’端の、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１または＋１のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’端および３’端の各々、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１および＋１に安定化修飾を含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’端に、すなわち、不安定化修飾の位置から位置＋１および＋２に少なくとも２つの安定化修飾を含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の安定化修飾を含む。制限するものではないが、センス鎖中の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、センス鎖は、５’端から位置７、１０および１１に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、５’端から位置７、９、１０および１１に安定化修飾を含む。一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２および１５に対して対向するまたは相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２、１３および１５に対して対向するまたは相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の実施形態において、センス鎖は、２、３または４つの安定化修飾のブロックを含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖中の二重鎖の熱的不安定化修飾に対抗するまたは相補的な位置に安定化修飾を含まない。
例示的な熱的安定化修飾として、それだけには限らないが、２’－フルオロ修飾が挙げられる。他の熱的安定化修飾として、それだけには限らないが、ＬＮＡが挙げられる。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの（例えば、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）２’－フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、２’－フルオロヌクレオチドは全て、一方の鎖中に存在する場合がある。一部の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖両方が、少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。２’－フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる場合があり、各２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じる場合があり、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンで２’－フルオロ修飾を含む。センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンと比較してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、アンチセンス鎖中の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、アンチセンスは、５’端から位置２、６、８、９、１４および１６に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態において、アンチセンスは、５’端から位置２、６、１４および１６に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態において、アンチセンスは、５’端から位置２、１４および１６に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも１つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’－フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’端または３’端の、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１または＋１のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’端および３’端の各々、すなわち、不安定化修飾の位置から位置－１および＋１に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’端に、すなわち、不安定化修飾の位置から位置＋１および＋２に少なくとも２つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、センス鎖中の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、アンチセンスは、５’端から位置７、１０および１１に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、５’端から位置７、９、１０および１１に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２および１５に対して対向するまたは相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の位置１１、１２、１３および１５に対して対向するまたは相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、センス鎖は、２、３または４つの２’－フルオロヌクレオチドのブロックを含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖中の二重鎖の熱的不安定化修飾に対向するまたは相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域中に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９に）生じ、ｄｓＲＮＡの一方の末端は平滑であり、もう一方の末端は２ｎｔのオーバーハングを含み、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’端に平滑末端を含む。好ましくは、２ｎｔのオーバーハングは、アンチセンスの３’端にある。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基の長さであり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、前記センス鎖の位置１～２３は、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基の長さであり、３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の位置１～２３と対形成される位置中の少なくとも８のリボヌクレオチドは、二本鎖を形成し、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、最大６つの連続３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、それによって、１～６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対形成しない１０～３０の連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０～３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のためにアラインされる場合に、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対形成される塩基であり、それによって、センスおよびアンチセンス鎖の間に実質的に二本鎖の領域を形成し、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域中（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９に）にある。例えば、熱的不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’端の位置１４～１７に対向するまたは相補的な位置の間に生じ、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～３０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５かつ多くとも２９ヌクレオチドである長さを有するセンス鎖と、多くとも３０ヌクレオチドである長さを有するアンチセンス鎖を含み、センス鎖は５’端から位置１１に酵素分解に対して感受性である修飾されたヌクレオチドを含み、前記センス鎖の３’端と前記アンチセンス鎖の５’端は平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、センス鎖よりもその３’端で１～４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は少なくとも２５ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの前記アンチセンス鎖の長さに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断は、前記アンチセンス鎖の３’端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それによって、哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減し、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも１つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域中（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９）にあり、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～２９ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を有する。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖中のどのヌクレオチドも修飾され得る。各ヌクレオチドは、非連結性リン酸酸素の、または連結性リン酸酸素の１つもしくは複数の一方または両方の１つまたは複数の変更、リボース糖の構成成分の、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、リン酸部分の「デホスホ」リンカーとの大規模な置き換え、天然に存在する塩基の修飾または置き換え、およびリボース－リン酸骨格の置き換えまたは修飾を含み得る同一または異なる修飾で修飾され得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じる、例えば、塩基またはリン酸部分またはリン酸部分の非連結性Ｏの修飾。一部の場合には、修飾は、核酸中の対象位置の全てで生じるが、多くの場合、生じない。例として、修飾は、３’または５’末端位置でのみ生じる場合があり、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置で、または最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じる場合がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じる場合がある。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域においてのみ生じる場合があり、またはＲＮＡの一本鎖領域においてのみ生じる場合がある。例えば、非連結性Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ生じる場合があり、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置で、または最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じる場合があり、または二本鎖および一本鎖領域において、特に、末端で生じる場合がある。５’端または両端がリン酸化され得る。
例えば、安定性を増強すること、オーバーハング中に特定の塩基を含めること、または一本鎖オーバーハング中、例えば、５’もしくは３’オーバーハング中、または両方中に修飾されたヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。一部の実施形態において、３’または５’オーバーハング中の塩基の全てまたは一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の２’位置での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチル修飾された、デオキシリボヌクレオチドの使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、または２’－フルオロで独立に修飾される。鎖は、２以上の修飾を含有し得る。一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。これらの修飾は、アンチセンス鎖中に存在する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾に追加されるということは理解されるべきである。
少なくとも２つの異なる修飾は通常、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それらの２つの修飾は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、非環式ヌクレオチドなどであり得る。一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々、２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシから選択される２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチドまたは２’－アラ－Ｆヌクレオチドで独立に修飾される。やはり、これらの修飾は、アンチセンス鎖中に存在する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾に追加されるということは理解されるべきである。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、特に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域における交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」または「交互パターン」という用語は、本明細書において使用される場合、１つまたは複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾は、１つの鎖の交互ヌクレオチドで生じる。交互ヌクレオチドとは、１つおきのヌクレオチド毎に１つまたは３ヌクレオチド毎に１つまたは同様のパターンを指す場合がある。例えば、Ａ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドへの修飾の１つのタイプを表す場合には、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。
交互モチーフ中に含有される修飾のタイプは、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチド上の修飾の１つのタイプを表す場合には、交互パターン、すなわち、１つおきのヌクレオチド上の修飾は、同一である場合があるが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」または「ＣＤＣＤＣＤ…」などといった交互モチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対してシフトされているセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。シフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾された基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なって修飾された基に対応するようなものであり得る、逆もまた同様。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖中のアンチセンス鎖と対形成される場合には、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始する場合があり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始する場合がある。別の例として、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始する場合があり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’に「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始する場合があり、その結果、センス鎖とアンチセンス鎖の間で修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトがある。
本開示のｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置においてセンス鎖またはアンチセンス鎖または両方の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる可能性があり、各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じ得る、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンで両方のヌクレオチド間連結修飾を含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も、異なっている場合もあり、センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング領域中にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の対形成されるヌクレオチドと連結するように行われ得る。例えば、少なくとも２、３、４または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結でき、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対形成されるヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結があってもよい。例えば、３ヌクレオチドのうち２つがオーバーハングヌクレオチドであり、３番目は、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対形成されるヌクレオチドである、末端の３ヌクレオチドの間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結があり得る。好ましくは、これらの末端の３ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端であり得る。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、２～１０のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の１～１０のブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むアンチセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、３つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、４つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、６つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７または８つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、７つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５または６つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、８つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３または４つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、９つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち１つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の１～１０の末端位置内に１つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、センスまたはアンチセンス鎖の一方の末端または両端でホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結され得る。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の各々の二重鎖の内部領域の１～１０内に１つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、センス鎖の５’端から数えて二重鎖領域の位置８～１６でホスホロチオエートメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結され得る。ｄｓＲＮＡ分子は、１～１０の末端位置内に１つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含んでもよい。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１～５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１～５つ（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つ（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つ（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１～５内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置１８～２３内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２０および２１に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つ（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２０および２１に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１および２２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１および２２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２２および２３に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の位置１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２１に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）ならびにアンチセンス鎖の位置１および２に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置２３および２３に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾（５’端から数えて）をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、骨格キラル中心のパターンを含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも５つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも６つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも７つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも８つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも９つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１０のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１１のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１２のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１３のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１４のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１５のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１６のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１７のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１８のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１９のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において８つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において７つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において６つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において５つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において４つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において３つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において２つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｒｐ立体配置において１つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、８つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む（限定されるわけではない例として、ホスホジエステル）。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、７つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、６つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、５つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、４つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、３つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、２つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、１つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１０のヌクレオチド間連結および８つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１１のヌクレオチド間連結および７つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１２のヌクレオチド間連結および６つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１３のヌクレオチド間連結および６つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１４のヌクレオチド間連結および５つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１５のヌクレオチド間連結および４つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、Ｓｐ立体配置におけるヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。一部の実施形態において、Ｒｐ立体配置におけるヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。一部の実施形態において、キラルではないヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。一部の実施形態において、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＲｐである点でＲｐブロックである。一部の実施形態において、５’－ブロックは、Ｒｐブロックである。一部の実施形態において、３’－ブロックは、Ｒｐブロックである。一部の実施形態において、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＳｐである点でＳｐブロックである。一部の実施形態において、５’－ブロックは、Ｓｐブロックである。一部の実施形態において、３’－ブロックは、Ｓｐブロックである。一部の実施形態において、提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲｐおよびＳｐブロックの両方を含む。一部の実施形態において、提供されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＲｐを含むが、Ｓｐブロックを含まない。一部の実施形態において、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＳｐを含むが、Ｒｐブロックを含まない。一部の実施形態において、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の、各ヌクレオチド間連結が天然リン酸連結であるＰＯブロックを含む。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである５’－ブロックを含む。一部の実施形態において、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、修飾されたヌクレオチド間連結であり、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態において、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、ホスホロチオエート連結であり、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態において、５’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、５’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、５’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、５’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、３’－ブロックは、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態において、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、修飾されたヌクレオチド間連結であり、各糖部分が、２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態において、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、ホスホロチオエート連結であり、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである。一部の実施形態において、３’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、３’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、３’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、３’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、領域中にあるタイプのヌクレオシドを含み、またはオリゴヌクレオチドに、特定のタイプのヌクレオチド間連結、例えば、天然のリン酸連結、修飾されたヌクレオチド間連結、Ｒｐキラルヌクレオチド間連結、Ｓｐキラルヌクレオチド間連結などが続く。一部の実施形態において、Ａに、Ｓｐが続く。一部の実施形態において、Ａに、Ｒｐが続く。一部の実施形態において、Ａに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態において、Ｕに、Ｓｐが続く。一部の実施形態において、Ｕに、Ｒｐが続く。一部の実施形態において、Ｕに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態において、Ｃに、Ｓｐが続く。一部の実施形態において、Ｃに、Ｒｐが続く。一部の実施形態において、Ｃに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態において、Ｇに、Ｓｐが続く。一部の実施形態において、Ｇに、Ｒｐが続く。一部の実施形態において、Ｇに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態において、ＣおよびＵに、Ｓｐが続く。一部の実施形態において、ＣおよびＵに、Ｒｐが続く。一部の実施形態において、ＣおよびＵに、天然のリン酸連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態において、ＡおよびＧに、Ｓｐが続く。一部の実施形態において、ＡおよびＧに、Ｒｐが続く。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２１と２２の間およびヌクレオチド位置２２と２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾を含有し、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１と２の間、ヌクレオチド位置２と３の間、ヌクレオチド位置２１と２２の間およびヌクレオチド位置２２と２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾を含有し、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド位置１と２の間、ヌクレオチド位置２と３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾を含有し、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド位置１と２の間およびヌクレオチド位置２と３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１と２の間、ヌクレオチド位置２と３の間、ヌクレオチド位置２１と２２の間およびヌクレオチド位置２２と２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の位置２～９に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱的不安定化修飾を含有し、ｄｓＲＮＡは、以下の特徴のうち少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７つ全て）をさらに有してもよい：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｖ）センス鎖は、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、標的との、二本鎖内のミスマッチ（複数可）またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域中に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいてランク付けできる（例えば、特定の対形成の会合または解離の自由エネルギーで、最も簡単なアプローチは、個々の対に基づいて対を調べることであるが、次の隣接分析または同様の分析も使用できる）。解離の促進の点では：Ａ：ＵはＧ：Ｃを上回って好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃを上回って好ましく、Ｉ：ＣはＧ：Ｃを上回って好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のもの（本明細書において別の場所で記載されるような）は、正準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対形成を上回って好ましく、ユニバーサル塩基を含む対形成は正準対形成を上回って好ましい。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、二本鎖の５’端でのアンチセンス鎖の解離を促進するために、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃおよびミスマッチ対、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のものまたはユニバーサル塩基を含む対形成の群から独立に選択され得る、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４または５つの塩基対のうち少なくとも１つを含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖中の５’端から二重鎖領域内の１位置のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の１、２または３つの塩基対のうち少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置で、ジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）連結の３’端に、４’－修飾されたまたは５’－修飾されたヌクレオチドを導入することは、ヌクレオチド間連結に対して立体的効果を発揮し、ひいては、それをヌクレアーゼから保護し、安定化できるということが見出された。
一部の実施形態において、５’－修飾されたヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入される。例えば、５’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入できる。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとして、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、４’－修飾されたヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入される。例えば、４’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入できる。リボース糖の４’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。あるいは、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’端に導入できる。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドがある。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、５’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改良する。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的５’－アルキル化ヌクレオシドとして、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、４’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改良する。４’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的４’－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改良する。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとして、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドがある。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２’－５’連結（２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有し、Ｐ＝ＯまたはＰ＝Ｓである）を含み得る。例えば、２’－５’連結修飾を、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用できる、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’端で使用できる。
別の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、Ｌ糖（例えば、２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ－アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾を、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用できる、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’端で使用できる。
種々の刊行物に多量体ｓｉＲＮＡが記載されており、これらは全て、本開示のｄｓＲＮＡとともに使用できる。このような刊行物には、その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０９１２６９、ＵＳ７８５８７６９、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０が含まれる。
以下により詳細に記載されるように、ＲＮＡｉ剤への１つまたは複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含有するＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数の特性を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分を、ＲＮＡｉ剤の修飾されたサブユニットに付着させる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を別の部分、例えば、炭水化物リガンドが付着される非炭水化物（好ましくは、環式）担体と置き換えることができる。サブユニットのリボース糖がそのように置き換えられているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置き換え修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環式担体は、炭素環系であり得る、すなわち、全ての環原子は、炭素原子であるか、または複素環式環構造、すなわち、１つまたは複数の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環式担体は、単環式環構造であり得る、または２つ以上の環、例えば、縮合環を含有し得る。環式担体は、完全飽和環構造であり得る、または１つもしくは複数の二重結合を含有し得る。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに付着させることができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点」、好ましくは、２つの「骨格付着点」ならびに（ｉｉ）少なくとも１つの「繋留付着点」を含む。「骨格付着点」とは、本明細書において使用される場合、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または、一般的に、骨格、例えば、リボ核酸のリン酸または修飾されたリン酸、例えば、硫黄含有骨格への担体の組み込みのために利用可能な、およびそれに適している結合を指す。「繋留付着点」（ＴＡＰ）とは、一部の実施形態において、選択された部分を接続する環式担体の構成物環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは別個）を指す。部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。選択された部分は、介在するテザーによって環式担体に接続されてもよい。したがって、環式担体は、官能基、例えば、アミノ基を含む、または一般的に、構成物環への、別の化学実体、例えば、リガンドの組み込みもしくは繋留に適している結合を提供することが多いであろう。
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされる場合があり、担体は、環式基または非環式基であり得る、好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され、好ましくは、非環式群は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
ある特定の具体的実施形態において、本開示の方法において使用するためのＲＮＡｉ剤は、表２～５、および７～１０のいずれか１つにおいて列挙される薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンド、例えば、１つもしくは複数の親油性部分、１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体、または１つもしくは複数の親油性部分および１つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体の両方をさらに含み得る。
ＩＶ．リガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡを１つまたは複数のリガンド、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または例えば、細胞への細胞取り込みを増強する部分またはコンジュゲートと化学的に連結することを含む。このような部分として、それだけには限らないが、コレステロール部分などの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330、Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654、Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変更する。一部の実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較されるように、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞種、コンパートメント、例えば、細胞のまたは臓器のコンパートメント、組織、器官または身体の領域に対する親和性の増強を提供する。通常のリガンドは、二本鎖核酸において二重鎖対形成に関与しない。
リガンドとして、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸であるポリアミノ酸、スチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸（ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ））、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドにはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、特定の細胞種、例えば、膠細胞に結合する抗体が含まれ得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロールステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンまたはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチドミメティックであり得る。ある特定の実施形態において、リガンドは、多価ガラクトース、例えば、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンである。
リガンドの他の例として、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的親和性を有する分子または抗体、例えば、脳細胞または膠細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースが含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーターまたはＮＦ－κＢのアクチベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小線維または中間径線維を破壊することによってｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増大し得る物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるようなｉＲＮＡに付着されるリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターには、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが含まれる。例示的ＰＫモジュレーターとして、それだけには限らないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合すると知られており、従って、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドはまた、リガンドとして（例えば、ＰＫモジュレーティングリガンドとして）本発明に適している。さらに、血清構成成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫモジュレーティングリガンドとして使用するのに適している。
本発明のリガンドがコンジュゲートされたｉＲＮＡは、ペンダント反応性官能性を有する、例えば、オリゴヌクレオチド上への連結分子の付着に由来する（以下に記載される）オリゴヌクレオチドの使用によって合成できる。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されているリガンドまたはそれに付着された連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。
本発明のコンジュゲートにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の公知の技術によって好都合に、日常的に作製できる。このような合成のための機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（カリフォルニア州、フォスターシティ）を含むいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知のこのような合成のための任意の他の手段をさらに、または代わりに使用してもよい。他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を調製するために同様の技術を使用することも公知である。
本発明のリガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドおよびリガンド－配列特異的な連結されたヌクレオシドを有する分子では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準ヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体または連結部分をすでに有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに有するリガンド－ヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体またはビルディングブロックを有する非ヌクレオシドリガンドを利用して適したＤＮＡシンセサイザーで組み立てることができる。
連結部分をすでに有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合には、配列特異的な連結されたヌクレオシドの合成が通常完了され、次いで、リガンド分子が連結部分と反応されて、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドが形成される。一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結されたヌクレオシドは、市販されており、オリゴヌクレオチド合成において日常的に使用される標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホラミダイトを使用して自動化シンセサイザーによって合成される。
Ａ．脂質コンジュゲート
ある特定の実施形態において、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、通常、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合できる。ＨＳＡ結合性リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合できる他の分子も、リガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大できる、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜中への標的化もしくは輸送を増大できる、または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整できる。
脂質ベースのリガンドを使用して、コンジュゲートの標的組織への結合をモジュレート、例えば、管理（例えば、阻害）できる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓へ標的化される可能性が低く、したがって、身体から排除される可能性が低くなる。あまり強力にＨＳＡに結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化するために使用できる。
ある特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。例えば、リガンドは、十分な親和性でＨＳＡに結合でき、その結果、非腎臓組織へのコンジュゲートの分布が増強される。しかし、親和性は、通常、ＨＳＡ－リガンド結合を元に戻すことができないほど強力ではない。
ある特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、全く結合せず、その結果、腎臓へのコンジュゲートの分布が増強される。脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的化する他の部分も使用できる。
ある特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、全く結合せず、その結果、腎臓へのコンジュゲートの分布が増強される。脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的化する他の部分も使用できる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖している細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性種、例えば、がん細胞の望まれない細胞増殖を特徴とする障害の処置にとって特に有用である。例示的ビタミンとして、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。他の例示的ビタミンとして、Ｂビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたはがん細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＳＡおよび低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えば、ヘリックス細胞透過剤である。ある特定の実施形態において、これらの細胞透過剤は、両親媒性である。例示的細胞透過剤として、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）がある。薬剤がペプチドである場合は、修飾される場合があり、ぺプチジルミメティック、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド連結およびＤ－アミノ酸の使用を含む。ヘリックス剤は、通常、α－ヘリックス剤であり、親油性および疎油性相を有し得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチドミメティックであり得る。ペプチドミメティック（本明細書においてオリゴペプチドミメティックとも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似する規定の三次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチドミメティックのｉＲＮＡ剤への付着は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチドミメティック部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチドミメティックは、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代替法では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドとして、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１１）を有するＲＦＧＦがある。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体［例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１２）］も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を横切ってペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶことができる、「デリバリー」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列［ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１３）］およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質に由来する配列［ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１４）］は、デリバリーペプチドとして機能化能であると見出されている。ペプチドまたはペプチドミメティックは、ファージディスプレイライブラリーまたは１－ビーズ－１－化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991）から同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。通常、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に繋留されるペプチドまたはペプチドミメティックとして、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣物がある。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体配座特性を増大する構造修飾を有し得る。以下に記載される構造修飾のいずれも利用できる。
本発明の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、線状である場合も、環状である場合もあり、特定の組織（複数可）への標的化を促進するように修飾される、例えば、グリコシル化またはメチル化される場合もある。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）は、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣物を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的化する他の部分を使用できる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的化する。
ＲＧＤペプチド部分を、特定の細胞種、例えば、腫瘍細胞、例えば、内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞を標的化するために使用できる（Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002）。ＲＧＤペプチドは、ｄｓＲＮＡ剤の肺、腎臓、脾臓または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍への標的化を促進できる（Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001）。通常、ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤の腎臓への標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、線状である場合も、環状である場合もあり、特定の組織（複数可）への標的化を促進するように修飾される、例えば、グリコシル化またはメチル化される場合もある。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤をαＶβ３を発現する腫瘍細胞にデリバリーできる（Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001）。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌もしくは真菌細胞または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に透過可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－ヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）または１つもしくは２つの優性アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドはまた、核局在性シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法の一部の実施形態において、ｉＲＮＡは、炭水化物をさらに含む。炭水化物がコンジュゲートされたｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびにインビボ治療的使用に適した組成物のインビボデリバリーにとって有利である。本明細書において使用される場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも６個の炭素原子（線状、分岐または環状であり得る）を有する１つもしくは複数の単糖単位で構成されている炭水化物自体またはその一部として、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々少なくとも６個の炭素原子（線状、分岐または環状であり得る）を有する１または複数の単糖単位で構成されている炭水化物部分を有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物として、糖（単糖、二糖、三糖および約４、５、６、７、８または９つの単糖単位を含有するオリゴ糖）ならびに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムが挙げられる。特定の単糖として、Ｃ５が挙げられ、上記の（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）糖、二糖および三糖は、２つまたは３つの単糖単位有する糖（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）を含む。
ある特定の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、単糖を含む。
ある特定の実施形態において、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，１０６，０２２に記載されている。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡを特定の細胞に標的化するリガンドとして働く。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝臓細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして働くことによってｉＲＮＡを肝臓細胞に標的化する。
一部の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカー、例えば、二価または三価分岐リンカーを介して付着させることができる。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’端にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書に記載されるようなリンカーを介してｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の３’端に）コンジュゲートされる。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の５’端にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書に記載されるようなリンカーを介してｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の５’端に）コンジュゲートされる。
本発明のある特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。本発明のさらに他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。本発明の他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、四価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。
ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に付着された１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに各々独立に付着された、複数の（例えば、２、３、４、５または６つの）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
一部の実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、複数の対形成されないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’端と、それぞれのもう一方の鎖の５’端の間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続された１つの大きな分子の一部である場合には、ヘアピンループ内の対形成されないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して付着されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。ヘアピンループはまた、二本鎖のうち１つの鎖における延長されたオーバーハングによって形成される場合もある。
一部の実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、複数の対形成されないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’端と、それぞれのもう一方の鎖の５’端の間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続された１つの大きな分子の一部である場合には、ヘアピンループ内の対形成されないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して付着されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。ヘアピンループはまた、二本鎖のうち１つの鎖における延長されたオーバーハングによって形成される場合もある。
一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、
Figure 2023523993000016
 である。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の模式図で示されるようにリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに付着され、式中、Ｘは、ＯまたはＳである。
Figure 2023523993000017
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、表１において定義され、以下に示されるようにＬ９６にコンジュゲートされる：
Figure 2023523993000018
ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される：
Figure 2023523993000019
Figure 2023523993000020
Figure 2023523993000021
Figure 2023523993000022
Figure 2023523993000023
Figure 2023523993000024
Figure 2023523993000025
Figure 2023523993000026
ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。ある特定の実施形態において、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、
Figure 2023523993000027
 である。
本明細書に記載される実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとして、それだけには限らないが、
Figure 2023523993000028
 ［式中、ＸまたはＹのうち一方は、オリゴヌクレオチドであり、もう一方は、水素である］
が挙げられる。
一部の実施形態において、適したリガンドは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／０５５６３３において開示されるリガンドである。一実施形態において、リガンドは、以下の構造：
Figure 2023523993000029
 を含む。
ある特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＧａｌＮＡｃリガンドを、このようなＧａｌＮＡｃリガンドが現在、本開示の好ましい髄腔内／ＣＮＳデリバリー経路（複数可）にとって限定された価値のものであると予測されている場合であっても含み得る。
本発明のある特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。本発明のさらに他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。本発明の他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を、四価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に付着させる。
ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’端、または本明細書に説明される二重標的化ＲＮＡｉ剤の１つもしくは両方のセンス鎖の５’端に付着された１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数のリンカー、例えば、一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチド各々独立に付着された、複数の（例えば、２、３、４、５または６つの）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
一部の実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、複数の対形成されないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’端と、それぞれのもう一方の鎖の５’端の間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続された１つの大きな分子の一部である場合には、ヘアピンループ内の対形成されないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して付着されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。
一部の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、それだけには限らないが、ＰＫモジュレーターまたは細胞透過ペプチドなどの、上記のような１または複数のさらなるリガンドをさらに含む。
本発明において使用するのに適したさらなる炭水化物コンジュゲートおよびリンカーとして、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１７９６２０およびＷＯ２０１４／１７９６２７に記載されるものが挙げられる。
Ｄ．リンカー
一部の実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着させることができる。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の２つの部分を接続する、例えば、化合物の２つの部分を共有結合によって付着させる有機部分を意味する。リンカーは、通常、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位またはそれだけには限らないが、１つもしくは複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）によって中断または終結され得る、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、へテロアリールアルケニル、へテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）、Ｒ８が、水素、アシル、脂肪族もしくは置換脂肪族である、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環式などの原子の鎖を含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、約１～２４個原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８個の原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６または８～１６個の原子である。
切断可能な連結基とは、細胞の外側で十分に安定であるが、標的細胞中に入ると、切断されて、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態において、切断可能な連結基は、対象の血液において、または第２の参照条件下（血液または血清において見出される条件を模倣または表すように選択され得る）よりも、標的細胞において、または第１の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る）で、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍またはそれより多く、または少なくとも約１００倍速く切断される。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液においてよりも細胞の内側で、より一般的であるか、またはより高いレベルもしくは活性で見出される。このような分解剤の例として、特定の基質のために選択される、または基質特異性を有さない酸化還元剤が挙げられ、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素または還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解できる、細胞中に存在する、メルカプタンなどの還元剤、エステラーゼ、エンドソームまたは酸性環境を作出できる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの、一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびホスファターゼとして作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解もしくは分解できる酵素を含む。
切断可能な連結基、例えば、ジスルフィド結合は、ｐＨの影響を受けやすい場合がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それによって、細胞の内側でリガンドからカチオン性脂質を細胞の所望のコンパートメント中に放出する切断可能な連結基を有するであろう。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的化されるべき細胞に応じて変わり得る。例えば、肝臓標的化リガンドを、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結できる。肝臓細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、肝臓細胞において、エステラーゼが豊富ではない細胞種よりも効率的に切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞種として、肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。
肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞種を標的化する場合には、ペプチド結合を含有するリンカーを使用できる。
一般に、候補の切断可能な連結基の適合性は、分解剤（または条件）の、候補連結基を切断する能力を試験することによって評価できる。また、血液中で、または他の非標的組織と接触する場合に、切断に抵抗する能力について候補の切断可能な連結基を試験することも望ましいであろう。したがって、第１および第２の条件の間の切断に対する相対的感受性を決定でき、第１のものは、標的細胞において切断を示すように選択され、第２のものは、他の組織または生物学的流体、例えば、血液もしくは血清において切断を示すように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養物において、臓器においてまたは組織培養物において、または動物全体において実施できる。細胞不含または培養条件において最初の評価を行うことおよび動物全体におけるさらなる評価によって確認することは、有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞において（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く切断される。
ｉ．酸化還元切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例として、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）がある。候補の切断可能な連結基が適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または、例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書に記載される方法に目を向けることができる。例えば、細胞、例えば、標的細胞において観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオトレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価できる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価できる。あるものでは、候補化合物は、血液において最大で約１０％切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞において（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態学アッセイを使用して決定できる。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な連結基を含む。リン酸ベースの切断可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞中のリン酸基を切断する薬剤の例として、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。リン酸ベースの連結基の例として、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓがある。例示的な実施形態として、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－があり、ここで、Ｒｋは、各出現について独立に、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ１～Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、またはＣ７～Ｃ１２アラルキルであり得る。ある特定の好ましい実施形態において、リン酸ベースの連結基は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ｉｉｉ．酸切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸切断可能な連結基は、約６．５以下の（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０またはそれより低い）ｐＨを有する酸性環境において、または一般酸として作用できる酵素などの薬剤によって切断される。細胞では、特定の低ｐＨオルガネラ、例えば、エンドソームおよびリソソームは、酸切断可能な連結基のための切断環境を提供できる。酸切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏまたは－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素と結合している炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基または第三級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである場合である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ｉｖ．エステルベースの切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な連結基を含む。エステルベースの切断可能な連結基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ｖ．ペプチドベースの切断可能な連結基
さらに別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な連結基を含む。ペプチドベースの切断可能な連結基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成され、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドをもたらすペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらすアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらす、ペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－、（式中、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である）を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
一部の実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの限定されるわけではない例として、それだけには限らないが、
Figure 2023523993000030
Figure 2023523993000031
 ［ＸまたはＹのうち一方が、オリゴヌクレオチドである場合は、もう一方は、水素である］
が挙げられる。
本発明の組成物および方法のある特定の実施形態において、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して付着された１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＬＶ）～（ＸＬＶＩ）のいずれかで示される構造の群から選択される二価または三価分岐リンカーにコンジュゲートされる：
Figure 2023523993000032
 ［式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、各出現について独立に、０～２０を表し、反復単位は、同一である場合も、異なる場合もあり、
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現について各々独立に、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり、
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現について独立に、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうち１つまたは複数によって中断または終結され得る、
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現について各々独立に、存在しない、
Figure 2023523993000033
 であり、
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、リガンド、すなわち、各出現について各々独立に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖を表し、Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である]。三価コンジュゲート性ＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子、例えば、式（ＸＬＩＸ）のもの：
Figure 2023523993000034
 ［式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、単糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ誘導体を表す］
の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤とともに使用するために特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする適した二価および三価分岐リンカー基の例として、それだけには限らないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸおよびＸＩＩＩのような上記で列挙された構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第４，８２８，９７９号、同４，９４８，８８２号、同５，２１８，１０５号、同５，５２５，４６５号、同５，５４１，３１３号、同５，５４５，７３０号、同５，５５２，５３８号、同５，５７８，７１７号、同５，５８０，７３１号、同５，５９１，５８４号、同５，１０９，１２４号、同５，１１８，８０２号、同５，１３８，０４５号、同５，４１４，０７７号、同５，４８６，６０３号、同５，５１２，４３９号、同５，５７８，７１８号、同５，６０８，０４６号、同４，５８７，０４４号、同４，６０５，７３５号、同４，６６７，０２５号、同４，７６２，７７９号、同４，７８９，７３７号、同４，８２４，９４１号、同４，８３５，２６３号、同４，８７６，３３５号、同４，９０４，５８２号、同４，９５８，０１３号、同５，０８２，８３０号、同５，１１２，９６３号、同５，２１４，１３６号、同５，０８２，８３０号、同５，１１２，９６３号、同５，２１４，１３６号、同５，２４５，０２２号、同５，２５４，４６９号、同５，２５８，５０６号、同５，２６２，５３６号、同５，２７２，２５０号、同５，２９２，８７３号、同５，３１７，０９８号、同５，３７１，２４１号、同５，３９１，７２３号、同５，４１６，２０３号、同５，４５１，４６３号、同５，５１０，４７５号、同５，５１２，６６７号、同５，５１４，７８５号、同５，５６５，５５２号、同５，５６７，８１０号、同５，５７４，１４２号、同５，５８５，４８１号、同５，５８７，３７１号、同５，５９５，７２６号、同５，５９７，６９６号、同５，５９９，９２３号、同５，５９９，９２８号、同５，６８８，９４１号、同６，２９４，６６４号、同６，３２０，０１７号、同６，５７６，７５２号、同６，７８３，９３１号、同６，９００，２９７号、同７，０３７，６４６号および同８，１０６，０２２号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物において全ての位置について均一に修飾される必要はなく、実際、前記修飾のうち２つ以上を単一化合物中に、またはさらにｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物を含む。
本発明との関連で「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」とは、各々、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合にはヌクレオチドで構成されている、２つ以上の化学的に別個の領域を含有する、ｉＲＮＡ化合物、好ましくは、ｄｓＲＮＡ剤である。これらのｉＲＮＡは通常、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するようにＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質として働くことができる。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果的に、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合により短いｉＲＮＡで比較できる結果を得ることができることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出できる。
ある特定の例では、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾できる。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。このような非リガンド部分には、コレステロールなどの脂質部分［Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553］、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306、Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651、Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969）またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）が含まれていた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記で列挙されている。通常のコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次いで、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基が、コンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、ＲＮＡがまだ固体支持体に結合している状態で、または溶液相でＲＮＡが切断された後に実施できる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製によって、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。
Ｖ．ＡＰＯＥノックダウンのインビボ試験
１つまたは複数のヒトＡＰＯＥアイソフォーム（ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、およびＡＰＯＥ４）を発現するトランスジェニックマウスを含むヒトＡＰＯＥノックインマウスモデルを生み出し［例えば、Trommer, et al. (2005) Neuroreport 15:2655-2658を参照されたい］、これは、本明細書で提供されるＲＮＡｉ剤のインビボ有効性を実証するために使用することができる。
ＡＰＯＥ関連神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）のマウスモデルも生み出し、これは本明細書で提供されるＲＮＡｉ剤のインビボ有効性を実証するためにさらに使用することができる。そのようなモデルは、ヒトＡＰＯＥの１つまたは複数のアイソフォームのトランスジェニック発現を、例えば、一部の場合には病原性突然変異［例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）］を含むヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｉｔｉｖｅ）発現もしくは誘導性発現、例えば、過剰発現、一部の場合には病原性突然変異（例えば、Ｌ１６６Ｐ）突然変異［例えば、Huynh, et al. (2017) Neuron 96: 1013-1023を参照されたい］を含むヒトプレセニリン１（ＰＳ１）の構成的発現もしくは誘導性発現、例えば、過剰発現、および／または一部の場合には病原性突然変異（例えば、Ｐ３０１Ｓ突然変異）［Shi, et al. (2017) Nature 549: 523-527］を含む１Ｎ４Ｒヒトタウタンパク質の構成的発現もしくは誘導性発現、例えば、過剰発現と組み合わせることができる。
ＶＩ．本開示のＲＮＡｉ剤のデリバリー
細胞、例えば、対象［例えば、ヒト対象、例えば、それを必要とする対象、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性障害、例えば、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、またはタウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、もしくは二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症を有する対象］内の細胞への本開示のＲＮＡｉ剤のデリバリーは、いくつかの異なる方法において達成することができる。例えば、デリバリーは、細胞をインビトロまたはインビボのどちらかにおいて本開示のＲＮＡｉ剤と接触させることによって実施され得る。インビボデリバリーは、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施してもよい。あるいは、インビボデリバリーは、ＲＮＡｉ剤をコードしその発現を誘導する１つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施してもよい。これらの代替策は、下記においてさらに説明される。
概して、核酸分子をデリバリーする任意の方法（インビトロまたはインビボ）は、本開示のＲＮＡｉ剤の使用に適合させることができる［例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Akhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144およびＷＯ９４／０２５９５を参照されたい］。インビボデリバリーの場合、ＲＮＡｉ剤をデリバリーするために考慮する要因としては、例えば、デリバリーされた薬剤の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織におけるデリバリーされた薬剤の蓄積が挙げられる。ＲＮＡｉ剤の非特異的効果は、局所投与、例えば、組織への直接注入もしくは移植または調製物の局所投与によって最小限に抑えることができる。処置部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化し、薬剤によって害され得るかまたは薬剤を分解することができる全身組織への薬剤の曝露を制限し、投与されるＲＮＡｉ剤のより少ない合計用量を可能にする。いくつかの研究は、ＲＮＡｉ剤が局所的に投与された場合での遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルでの硝子体注入によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内デリバリー［Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138］およびマウスでの網膜下注入［Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216］は、両方とも、加齢黄斑変性症の実験モデルにおいて、新生血管形成を予防することが示された。加えて、マウスへのｄｓＲＮＡの直接的腫瘍内注入は、腫瘍体積を減少させ［Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther. 11:267-274］、ならびに腫瘍を有するマウスの生存を長引かせることができる［Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S. et al., (2007) Mol. Ther. 15:515-523］。ＲＮＡ干渉は、直接注入によるＣＮＳへの［Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93 :594-602］、および鼻腔内投与による肺への［Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med. 11:50-55］、局所デリバリーによる成功も示している。疾患の処置のためにＲＮＡｉ剤を全身投与する場合、ＲＮＡを修飾することができ、またはその代わりに、薬物デリバリーシステムを使用してデリバリーすることができ；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐように機能する。ＲＮＡまたは医薬担体の修飾も、標的組織へのＲＮＡｉ剤の標的化を可能にすることができ、望ましくないオフターゲット効果を避けることができる（例えば、理論に束縛されることを望むわけではないが、本明細書において説明されるＧＮＡの使用は、ｄｓＲＮＡのシード領域を不安定化することが特定されており、そのようなオフターゲット効果は、そのようなシード領域の不安定化によって著しく弱められるため、結果として、オフターゲット効果と比較したときのオンターゲットの有効性に対する、そのようなｄｓＲＮＡの優先性を高める）。ＲＮＡｉ剤は、細胞取り込みを増強し、分解を防ぐように、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによって修飾することができる。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートさせたＡｐｏＢへと誘導されたＲＮＡｉ剤を、マウスに全身的に注入したところ、結果として、肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを生じた［Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432:173-178］。アプタマーへのＲＮＡｉ剤のコンジュゲーションは、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害し、腫瘍縮小を媒介することが分かっている［McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015］。代替の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、薬物デリバリーシステム、例えば、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性デリバリーシステムなどを使用してデリバリーすることができる。正に帯電したカチオン性デリバリーシステムは、分子ＲＮＡｉ剤（負に帯電した）の結合を促進し、負に帯電した細胞膜での相互作用も高め、それにより、細胞によるＲＮＡｉ剤の効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ＲＮＡｉ剤に結合することができるか、またはＲＮＡｉ剤を封入するベシクルまたはミセルを形成するように誘導することができる［例えば、Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照されたい］。ベシクルまたはミセルの形成はさらに、全身投与したときのＲＮＡｉ剤の分解を防ぐ。カチオン性ＲＮＡｉ剤複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である［例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照されたい］。ＲＮＡｉ剤の全身デリバリーにとって有用な薬物デリバリーシステムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ［Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra］、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、「固体核酸脂質粒子」［Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441:111-114］、カルジオリピン［Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091］、ポリエチレンミン［Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659］、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド［Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487］、およびポリアミドアミン［Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804］が挙げられる。一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。投与の方法およびＲＮＡｉ剤とシクロデキストリンとによる医薬組成物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２７，６０５号に見出すことができる。
本開示のある特定の態様は、細胞においてＡＰＯＥ標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、細胞を本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることを含む方法に関する。一実施形態において、細胞は、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ）、適宜、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）である。一実施形態において、細胞は、肝外細胞、適宜、ＣＮＳ細胞である。
本開示の別の態様は、対象においてＡＰＯＥ標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、対象に本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を投与することを含む方法に関する。
本開示の別の態様は、ＡＰＯＥ関連神経変性障害を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与すること、それによって対象を処置することを含む方法に関する。本開示の方法によって処置することができる例示的なＣＮＳ障害としては、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、ならびにタウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、ならびに二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症が挙げられる。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下投与される。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、髄腔内投与される。二本鎖ＲＮＡｉ剤の髄腔内投与によって、方法は、脳（例えば、線条体）または脊柱組織、例えば、皮質、小脳、頚椎、腰椎、および胸椎でのＡＰＯＥ標的遺伝子の発現を低減させることができる。
解説の容易さのために、このセクションにおける製剤、組成物、および方法は、主に、修飾されたｓｉＲＮＡ化合物に関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、未修飾ｓｉＲＮＡ化合物によって実践することができ、そのような実践は、本開示内であることは理解され得る。ＲＮＡｉ剤を含む組成物は、様々な経路によって対象にデリバリーすることができる。例示的経路としては、髄腔内、静脈内、局所、経直腸、経肛門、経膣、経鼻、経肺、および経眼が挙げられる。
本開示のＲＮＡｉ剤は、投与にとって好適な医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、通常、１種または複数種のＲＮＡｉ剤と薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において使用される場合、語句「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合性の、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗真菌剤および防かび剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来的な媒質または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除き、組成物におけるそれらの使用は想到される。補足の有効成分もまた組成物に組み込まれ得る。
本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、ならびに処置されるエリアに応じて、いくつかの方法において投与され得る。投与は、局所（例えば、点眼、経膣、経直腸、鼻腔内、経皮など）、経口、または非経口投与であり得る。非経口投与は、点滴、皮下、腹腔内、もしくは筋肉注射、または髄腔内または脳室内投与を含む。
投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択され得る。例えば、筋肉細胞を標的化するためには、目的の筋肉への筋肉内注射が論理的な選択であろう。肺細胞は、エアゾール形態でのＲＮＡｉ剤の投与によって標的化され得る。血管内皮細胞は、ＲＮＡｉ剤によるバルーンカテーテルのコーティングおよびＲＮＡの機械的導入によって標的化され得る。
局所投与用製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、溶液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬用担体、水性、粉末、または油状基剤、増粘剤なども必要であり得、または望ましくあり得る。被覆したコンドーム、手袋なども有用であり得る。
経口投与用組成物は、散剤または顆粒剤、水中における懸濁剤または溶液剤、シロップ剤、エキシル剤または非水性媒体、タブレット剤、カプセル剤、ドロップ剤、またはトローチ剤を含む。錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩が挙げられる。様々な崩壊剤、例えば、デンプンなど、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどが、錠剤において一般的に使用される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。経口投与に水性懸濁液が必要な場合、核酸組成物は、乳化剤および懸濁剤と組み合わせることができる。所望の場合、ある特定の甘味剤または風味剤を加えることができる。
髄腔内または脳室内投与用の組成物は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌水溶液を含み得る。
非経口投与用の製剤は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えばリザーバーに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進され得る。静脈内使用の場合、溶質の総濃度は、調製物を等張にするように制御され得る。
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして、または拡散性注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、心室内、脳内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡下、経直腸、経口、経膣、局所、経肺、鼻腔内、経尿道、または経眼である。投与は、本人によって、または他の人、例えば、医療提供者などによって提供され得る。医薬品は、測定された用量において、または秤量された用量をデリバリーするディスペンサーにおいて提供することができる。選択されたデリバリーのモードは、下記においてより詳細に説明される。
髄腔内投与
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、髄腔内注入（すなわち、脳および脊髄組織を浸す髄液への注入）によってデリバリーされる。髄液へのＲＮＡｉ剤の髄腔内注入は、ボーラス注入として、または、皮下に注入することができるミニポンプによって、実施することができ、それにより、髄液中へのｓｉＲＮＡの規則正しい一定のデリバリーを提供することができる。髄液が産生される脈絡叢からの髄液の循環は、脊髄および後根神経節の周りを下り、その後、小脳を通過して、クモ膜顆粒へと皮質を越え、そこで、体液はＣＮＳを出ることができ、注入された化合物のサイズ、安定性、および溶解性に応じて、髄腔内によりデリバリーされる分子は、ＣＮＳ全体を通して標的を攻撃することができる。
一部の実施形態において、髄腔内投与は、ポンプを介して行われる。ポンプは、外科手術によって移植された浸透圧ポンプであり得る。一実施形態において、浸透圧ポンプは、髄腔内投与を容易にするために、脊柱管の髄腔内に移植される。
一部の実施形態において、髄腔内投与は、ある量の医薬品を収容するリザーバーおよびリザーバーに収容された医薬品の一部をデリバリーするように構成されたポンプを含む、製薬品の髄腔内デリバリーシステムを介して行われる。この髄腔内デリバリーシステムについてのさらなる詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／１１６６５８に見出され得る。
髄腔内注入されたＲＮＡｉ剤の量は、一方の標的遺伝子から別の標的遺伝子へと変わり得、ならびに適用されるべき適切な量は、各標的遺伝子に対して個別に決定しなければならない場合がある。典型的には、この量は、１０μｇから２ｍｇ、好ましくは５０μｇから１５００μｇ、より好ましくは１００μｇから１０００μｇの範囲である。
本開示のベクターコードＲＮＡｉ剤
ＡＰＯＥ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写物ユニットから発現され得る［例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; WO 00/22113、WO 00/22114、およびUS 6,054,299を参照されたい］。発現は、好ましくは、使用される特定のコンストラクトならびに標的組織または細胞タイプに応じて継続される（数か月またはそれ以上）。これらの導入遺伝子は、直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、それらは、統合ベクターまたは非統合ベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継代されることを可能にするように構築することもできる［Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292］。
ＲＮＡｉ剤の個々の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写させることができる。２つの別々の鎖が、例えば、ｄｓＲＮＡを産生するように発現される場合、２つの別々の発現ベクターを、標的細胞中に共導入することができる（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個別の鎖を、両方が同じ発現プラスミド上に位置されたプロモーターによって転写させることができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステム－アンド－ループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ＲＮＡｉ剤発現ベクターは、一般的に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞に対して適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に対して適合性の発現ベクターを使用することにより、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤の発現のための組換えコンストラクトを生成することができる。ＲＮＡｉ剤発現ベクターのデリバリーは、例えば、静脈内または筋肉内投与によって、患者から外植された標的細胞への投与とその後の患者への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって、全身性であり得る。
本明細書において説明される方法および組成物と共に用いることができるウイルスベクターシステムとしては、これらに限定されるわけではないが、（ａ）アデノウィルスベクター；（ｂ）レトロウイルスベクター、例えば、これらに限定されるわけではないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオームウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）水泡ウイルスベクター、例えば、オルソポックス、例えば、種痘疹ウイルスベクターなど、または鳥ポックス（ａｖｉｐｏｘ）、例えば、カナリア痘または家禽ジフテリアなど；ならびに（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウィルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムの中に組み込まれるかまたは組み込まれないであろう。コンストラクトは、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含ませることができる。あるいは、コンストラクトは、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどに組み込むことができる。ＲＮＡｉ剤の組換え発現のためのコンストラクトは、概して、標的細胞におけるＲＮＡｉ剤の発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、などを必要とするであろう。ベクターおよびコンストラクトを考慮する他の態様は、当技術分野で公知である。
ＶＩＩ．本発明の医薬組成物
本開示は、本開示のＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態において、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書において提供される。ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、ＡＰＯＥの発現または活性に関連する疾患または障害、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患、例えば、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、タウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、または二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症の処置にとって有用である。
そのような医薬組成物は、デリバリーのモードに基づいて製剤化される。一例は、非経口デリバリー、例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、または皮下（ｓｕｂＱ）デリバリーによる全身投与のために製剤化される組成物である。別の例は、例えば、注入の髄腔内または硝子体内経路、適宜、脳（例えば、線状体）内への注入、例えば、連続ポンプ注入などによる、ＣＮＳ内への直接デリバリーのために製剤化された組成物である。
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、パイロジェンフリーまたは非発熱性である。
本開示の医薬組成物は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量において投与され得る。概して、本開示のＲＮＡｉ剤の好適な用量は、１日あたりレシピエントの体重１キログラムあたり約０．００１ミリグラムから約２００．０ミリグラムの範囲、概して、１日あたり体重１キログラムあたり約１ｍｇから５０ｍｇの範囲であろう。
反復投薬計画は、定期的な、例えば、月１回から６か月毎に１回などのＲＮＡｉ剤の治療量の投与を含み得る。ある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、四半期に約１回（すなわち、３か月毎に約１回）から１年に約２回、投与される。
初期処置計画（例えば、初回負荷量）の後、処置は、低頻度において投与することができる。
他の実施形態において、医薬組成物の単回投与は、継続することができ、それにより、その後の用量は、１か月以下、２か月以下、３か月以下、もしくは４か月以下、またはそれ以上の間隔において投与される。本開示の一部の実施形態において、本開示の医薬組成物の単回投与は、月１回投与される。本開示の他の実施形態において、本開示の医薬組成物の単回投与は、四半期に１回から年に２回において投与される。
当業者は、ある特定の要因、例えば、これらに限定されるわけではないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の健康全般または年齢、および他の存在する疾患など、は、対象を効果的に処置するために必要な投薬量および投薬のタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するだろう。その上、治療有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置または一連の処置を含み得る。
マウス遺伝学における進歩は、ＡＰＯＥの発現の低減が有益であろう様々なＡＰＯＥ関連神経変性疾患の研究のためのいくつかのマウスモデルを生み出した。そのようなモデルは、ＲＮＡｉ剤のインビボ試験のため、および治療有効用量を決定するために使用することができる。適したマウスモデルは、当技術分野で公知であり、例えば、本明細書の他の箇所において説明されるマウスモデルが挙げられる。
本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、および処置されるエリアに応じて、いくつかの方法において投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮貼布による）、経肺、（例えば、ネブライザーなどによる散剤またはエアゾール剤の吸入または吹送による）；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入；皮下（例えば、移植されたデバイスによる）、または脳内（例えば、実質内、髄腔内、または心室内投与による）を含む。
ＲＮＡｉ剤は、特定の組織、例えば、肝臓、ＣＮＳ（例えば、脳のニューロン、膠細胞、または維管束組織）、または肝臓およびＣＮＳの両方を標的化する方式においてデリバリーすることができる。
局所投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤を含み得る。従来の、医薬担体、水性、粉末状、または油性基剤、増粘剤などは、必要であり得るか、または望ましくあり得る。被覆されたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所用製剤としては、本開示において特徴とされるＲＮＡｉ剤が、局所デリバリー剤、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性物質との混合物であるような製剤が挙げられる。好適な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本開示において特徴とされるＲＮＡｉ剤は、リポソーム内においてカプセル化することができ、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームに対して複合体を形成することができる。あるいは、ＲＮＡｉ剤は、脂質、特にカチオン性脂質に対して複合体化することができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、これらに限定されるわけではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプロエート、１－ドデシルアザシクロヘプタナ－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセライド、ディグリセライド、またはそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。局所用製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，７４７，０１４において詳細に説明されている。
Ａ．膜分子アセンブリを含むＲＮＡｉ剤製剤
本開示の組成物および方法における使用のためのＲＮＡｉ剤は、膜分子アセンブリ、例えば、リポソームまたはミセルでのデリバリー用に製剤化することができる。本明細書において使用される場合、用語「リポソーム」は、少なくとも１つの二層、例えば、１つの二層または複数の二層において整列された両親媒性脂質で構成されたベシクルを意味する。リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性内部とを有する単層および多層ラメラベシクルを含む。水性部分は、ＲＮＡｉ剤組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を、典型的にはＲＮＡｉ剤組成物を含まない（いくつかの例では、含む場合もある）水性外部から隔離する。リポソームは、作用部位への活性成分の移送およびデリバリーにとって有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に似ているため、リポソームが組織に適用される場合、リポソーム二層は、細胞膜の二層と融合する。リポソームと細胞の併合が進行するため、ＲＮＡｉ剤を含む内部水性内容物は、細胞内へとデリバリーされ、そこで、ＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを媒介することができる。場合によって、リポソームはまた、例えば、ＲＮＡｉ剤を特定の細胞タイプに誘導するために、特異的に標的化される。
ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製することができる。一例において、リポソームの脂質成分が界面活性剤に溶解され、それにより、脂質成分によってミセルが形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的界面活性剤としては、コレート、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコレート、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ＲＮＡｉ剤が、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質上のカチオン性基は、ＲＮＡｉ剤と相互作用し、ＲＮＡｉ剤の周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、界面活性剤は、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物を得るために、例えば、透析などによって除去される。
必要であれば、凝集反応の際に、例えば、制御された添加によって、凝集を補助する担体化合物を加えることもできる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマーであり得る（例えば、スペルミン、またはスペルミジン）。凝縮を支持するために、ｐＨも調整することができる。
デリバリービヒクルの構造要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定なポリヌクレオチドデリバリービヒクルを生成する方法は、例えば、ＷＯ９６／３７１９４においてより詳細に説明されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。リポソームの形成は、Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417；米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第５，１７１，６７８号；Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol. 23:238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339; and Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115:757において説明される例示的方法の１つまたは複数の態様も含むことができる。デリバリービヒクルとしての使用のために適切なサイズの脂質集合体を調製するために一般的に使用される方法としては、超音波処理ならびに凍結融解および押出加工が挙げられる［例えば、Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161を参照されたい］。一貫して小さくて（５０ｎｍから２００ｎｍ）比較的均一な集合体が所望される場合、顕微溶液化を使用することができる［Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169］。これらの方法は、ＲＮＡｉ剤調製物をリポソーム内にパッキングすることに容易に適合される。
リポソームは、２つの広いクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正に帯電したリポソームであり、負に帯電した核酸分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中へと放出する［Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985］。
リポソームは、ｐＨ感応性（ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であるかまたは負に帯電しており、それらとの複合体ではなく核酸を捕捉する。核酸および脂質の両方が、同じように荷電されるため、複合体形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、いくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部へと捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養中の細胞単層にデリバリーするために、ｐＨ感応性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的遺伝子において検出された［Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274］。
リポソーム組成物の主要なタイプの１つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方で、アニオン性融合リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなど、から形成される。別のタイプは、リン脂質またはホスファチジルコリンまたはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロおよびインビボにおいてリポソームを細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；米国特許第５，１７１，６７８号；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４；Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649; Gershon, (1993) Biochem. 32:7143; and Strauss, (1992) EMBO J. 11:417が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤とコレステロールとを含む系も、皮膚への薬物のデリバリーにおけるそれらの有用性を判定するために調べられている。ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）（商標） Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびノバソーム（商標） ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮中にシクロスポリン－Ａをデリバリーするために使用された。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリン－Ａの蓄積を促進することにおいて有効であることを示した［Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466］。
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、当該用語は、本明細書において使用される場合、リポソームに組み込まれた場合に、結果としてそのような特化された脂質を欠くリポソームと比較して増強された循環寿命を生じるような１つまたは複数の特化された脂質を含むリポソームを意味する。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、（Ａ）１つまたは複数の糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１を含むもの、または（Ｂ）：１つまたは複数の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などによって誘導体化されるものである。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームの場合、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への減少した取り込みに由来すると、当技術分野において考えられる［Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765］。
１つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら［Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64］は、リポソームの血液半減期を改善する、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドサルフェート、およびホスファチジルイノシトールの能力について報告している。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85,:6949］によって解説されている。米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４（両方ともＡｌｌｅｎらによる）では、（１）スフィンゴミエリン、および（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）では、スフィンゴミエリンを含むリポソームについて開示されている。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）において開示されている。
一実施形態において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的には融合することができないが、インビボにおいてマクロファージによって取り込まれるため、ＲＮＡｉ剤をマクロファージにデリバリーするために使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性および生分解性であること；リポソームは、様々な水および脂質溶解性薬物を組み込むことができること；リポソームは、それらの内部コンパートメント内のカプセル化されたＲＮＡｉ剤を、代謝および劣化から保護することができることが挙げられる［Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245］。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事柄は、脂質表面の電荷、ベシクルのサイズ、およびリポソームの水の量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）は、小さいリポソームを形成するために使用することができ、リポソームは、自然に核酸と相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合することができる脂質－核酸複合体を形成し、それにより、結果としてＲＮＡｉ剤のデリバリーをもたらす［例えば、ＤＯＴＭＡおよびＤＮＡによるその使用の説明は、Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417、および米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい］。
ＤＯＴＭＡアナログである１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用することにより、ＤＮＡ複合体化ベシクルを形成することができる。リポフェクチン（商標）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ゲイザースバーグ、メリーランド州）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む、生きた組織培養細胞内への高いアニオン性の核酸のデリバリーのための有効な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、結果として得られる複合体上の正味電荷も正である。この方法において調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然に付着し、原形質膜と融合して、機能的核酸を、例えば、組織培養細胞内へと効率的にデリバリーする。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、インディアナ）は、オレオイル部分が、エーテル連結ではなくエステルによって連結されている点においてＤＯＴＭＡとは異なっている。
他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、様々な部分にコンジュゲートしているもの、例えば、２つのタイプの脂質の一方にコンジュゲートしているカルボキシスペルミンなど、ならびに５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（トランスフェクタム（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号を参照されたい）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム中へと製剤化されているコレステロールによる脂質の誘導体化（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）を含む［Gao, X. and Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280を参照されたい］。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって作製されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションにとって効果的であることが報告されている［Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8］。ある特定の細胞系にとって、コンジュゲートしたカチオン性脂質を含むこれらのリポソームは、低い毒性を示すと言われており、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりもより効率的なトランスフェクションを提供する。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、ゲイザースバーグ、メリーランド州）が挙げられる。オリゴヌクレオチドのデリバリーにとって好適な他のカチオン性脂質は、ＷＯ９８／３９３５９およびＷＯ９６／３７１９４に記載されている。
リポソーム製剤は、局所性投与に対して特に適しており、リポソームは、他の製剤に勝るいくつかの利点を提示する。そのような利点としては、投与された薬物の高い体内吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の累積の増加、およびＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。いくつかの実践形態において、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を上皮細胞にデリバリーするため、および皮膚組織内、例えば、皮膚内へのＲＮＡｉ剤の浸透を増強するためにも、使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所デリバリーは、文献に報告されている［例えば、Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682-690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56:267-276; Nicolau, C. et al. (1987) Meth. Enzymol. 149:157-176; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527; Wang, C. Y. and Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855を参照されたい］。
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系、も、皮膚への薬物のデリバリーにおけるそれらの有用性を判定するためにも調べられている。マウスの皮膚の真皮内に薬物をデリバリーするために、ノバソームＩ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびノバソームＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。ＲＮＡｉ剤を伴うそのような製剤は、皮膚科障害を処置するために有用である。
ＲＮＡｉ剤を含むリポソームは、非常に変形可能に作製することができる。そのような変形能は、リポソームがリポソームの平均半径より小さい孔を通って浸透することを可能にする。例えば、トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なタイプのリポソームである。トランスファーソームは、表面エッジ活性化剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常は界面活性剤を標準的リポソーム組成物に加えることによって作製することができる。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、ＲＮＡｉ剤を皮膚のケラチン生成細胞にデリバリーするために、感染によって、例えば皮下に、デリバリーすることができる。無傷の哺乳動物の皮膚を横断するために、脂質ベシクルは、好適な経皮勾配の影響下において、それぞれが５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細な孔を通過しなければならない。加えて、脂質特性に起因して、これらのトランスファーソームは、自己最適性（例えば皮膚などにおける孔の形状に適応性のある）、自己修復性であり得、ならびに断片化することなく頻繁にそれらの標的に達することができ、多くの場合、自己装填することができる。
本開示に適した他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国特許仮出願第６１／０１８，６１６号；２００８年１月２日に出願された米国特許仮出願第６１／０１８，６１１号；２００８年３月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／０３９，７４８号；２００８年４月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／０４７，０８７号；および２００８年５月８日に出願された米国特許仮出願第６１／０５１，５２８号に記載される。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号にも、本開示に適した製剤について記載されている。
トランスファーソームは、別のタイプのリポソームであり、薬物デリバリービヒクルの魅力的な候補である、非常に変形可能な脂質集合体である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、脂質滴より小さい孔を通って容易に浸透することができる、脂質滴として説明することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応し、例えば、それらは、自己最適性（皮膚における孔の形状に適応性のある）であり、自己修復性であり、断片化することなく頻繁にそれらの標的に達し、多くの場合、自動装填性である。トランスファーソームを作製するために、表面エッジ活性化剤、通常は界面活性剤を標準的リポソーム組成物に加えることができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンをデリバリーするために使用されてきた。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介デリバリーは、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同じくらい有効であることが分かっている。
界面活性剤は、本明細書において説明されるような製剤において、特にエマルション（マイクロエマルションを含む）において、広い応用を見い出す。天然および合成の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および格付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による方法である。親水性基（「ヘッド」としても知られる）の性質は、製剤に使用される様々な界面活性剤をカテゴライズするための最も有用な手段を提供する（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それらは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧製品において広い応用を見い出し、広い範囲のｐＨ値において使用可能である。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなど、も、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も一般的なメンバーである。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が負電荷を保持する場合、界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート、例えば、石鹸など、アシルラクチレ－ト、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、アルキル硫酸エステルおよびエトキシ化アルキル硫酸エステルなど、スルホネート、例えば、アキルベンゼンスルホネート、など、アシルイセチオネート、アシルタウレート、ならびにスルホスクシネートおよびホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤のクラスの最も一般的なメンバーは、アルキル硫酸エステルおよび石鹸である。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が正電荷を保持する場合、界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のどちらかを保持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
薬品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用は、概説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
本開示の方法での使用のためのＲＮＡｉ剤は、ミセル製剤としても提供することができる。「ミセル」は、本明細書において、分子の全ての疎水性基が内側を向くように両親媒性分子が球状構造において整列され、それにより、親水性部分を周囲の水相に接触させたままにする、特定のタイプの分子アセンブリとして定義される。環境が疎水性の場合、逆の配置も存在する。
経皮的な膜によるデリバリーにとって好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液と、アルカリ金属のＣ８からＣ２２アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物とを混合することによって調製され得る。例示的ミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリチシャ油、月見草油、メンソール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容される塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびそのアナログ、ポリドカノールアルキルエーテルおよびそのアナログ、ケノデオキシコレート（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、デオキシコレート、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属のアルキル硫酸塩と同時に加えてもよく、またはそれらを加えた後に加えてもよい。混合ミセルは、原材料の、実質的に任意の種類の混合によって形成されるであろうが、より小さいサイズのミセルを提供するために、激しい混合によって形成されるであろう。
一方法において、第１のミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物と少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含むように調製される。第１のミセル組成物は、次いで、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合され、混合ミセル組成物を形成する。別の方法において、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物のうちの少なくとも１つとを混合し、その後に、激しく混合しながら、残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。
製剤を安定化させるため、および細菌増殖から保護するために、フェノールまたはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に加えてもよい。あるいは、フェノールまたはｍ－クレゾールを、ミセル形成原材料と共に加えてもよい。グリセリンなどの等張剤を、混合ミセル組成物の形成後に加えてもよい。
噴霧剤としてのミセル製剤のデリバリーのために、製剤を、エアゾールディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーは、発射薬を装填される。加圧下の発射薬は、ディスペンサー内において液体状態である。原材料の比率は、水相および発射薬相が１つになるように、すなわち、１つの相が存在するように調整される。２つの相が存在する場合、例えば、計量式バルブなどによって、内容物の一部を分配する前に、ディスペンサーを振盪する必要がある。医薬品の分配用量が、微細な噴霧において計量式バルブから射出される。
発射薬は、含水素クロロフルオロカーボン、含水素フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを含み得る。ある特定の実施形態において、ＨＦＡ１３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用され得る。
必須の原材料の特定の濃度は、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔による吸収のために、射出のためまたは胃腸管を通る投与のために、投薬量を、例えば、少なくとも二倍または三倍に増加させることは、多くの場合、望ましい。
脂質粒子
ＲＮＡｉ剤、例えば、本開示のｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えば、ＬＮＰなど、または他の核酸－脂質粒子において、完全にカプセル化され得る。
本明細書において使用される場合、用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸－脂質粒子を意味する。ＬＮＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む。ＬＮＰは、静脈内注射（ｉ．ｖ．）後に、延長された循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）において蓄積するため、全身投与にとって非常に有用である。ＬＮＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含み、それは、ＷＯ００／０３６８３において詳しく説明されるようなカプセル化された縮合剤－核酸複合体を含む。本開示の粒子は、典型的には、約５０ｎｍから約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍから約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍから約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸は、本開示の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を有する。核酸－脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号、およびＷＯ９６／４０９６４において開示されている。
一実施形態において、脂質と薬物の比率（質量／質量比）（例えば、脂質とｄｓＲＮＡの比率）は、約１：１から約５０：１、約１：１から約２５：１、約３：１から約１５：１、約４：１から約１０：１、約５：１から約９：１、または約６：１から約９：１の範囲であるだろう。上記に列記した範囲の中間的な範囲も、本開示の一部であることが想到される。
ＲＮＡｉ剤のデリバリーのためのある特定のＬＮＰ製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０４２９７３などにおいて説明されるような「ＬＮＰ０１」製剤など、当技術分野において説明されている。
追加の例示的脂質－ｄｓＲＮＡ製剤は、下記の表において特定される。
Figure 2023523993000035
Figure 2023523993000036
 ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン；ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン；ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＰＥＧ－ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１４）（ＰＥＧは２０００の平均分子量を有する）；ＰＥＧ－ＤＳＧ：ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール（Ｃ１８－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１８）（ＰＥＧは２０００の平均分子量を有する）；ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１，２－ジミリスチルオキシプロピルアミン（ＰＥＧは２０００の平均分子量を有する）およびＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／１２７０６０に記載されている。
ＸＴＣを含む製剤は、ＷＯ２０１０／０８８５３７に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、ＷＯ２０１０／０５４４０６に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃ１２－２００を含む製剤は、ＷＯ２０１０／１２９７０９に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末剤または粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体における懸濁剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サッシェ、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は、望ましくあり得る。一部の実施形態において、経口製剤は、本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併せて投与される、製剤である。好適な界面活性剤としては、脂肪酸またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸またはそれらの塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプロエート、１－ドデシルアザシクロヘプタナ－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセライド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態において、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などが使用される。例示的組合せの１つは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらに、浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示において特徴とされるｄｓＲＮＡは、噴霧された乾燥粒子などの粒状において、経口によりデリバリーすることができ、またはマイクロ粒子またはナノ粒子を形成するために複合体化することができる。ｄｓＲＮＡ複合剤としては、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化されたゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロース、およびデンプンが挙げられる。好適な複合剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリーＬリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミン、およびＤＥＡＥデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびその調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３／００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号において詳細に説明されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳内へ）、髄腔内、脳室内、または肝内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤、例えば、これらに限定されるわけではないが、浸透促進剤、担体化合物、他の薬学的に許容される担体または賦形剤などを含むことができる滅菌水溶液を含むことができる。
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルション、およびリポソームを含有する製剤を含む。これらの組成物は、これらに限定されるわけではないが、予め形成された液体、自己乳化性固体、および自己乳化性半固体を含む様々な成分から生成することができる。特に好ましいのは、ＡＰＰ関連疾患または障害を処置する場合において脳を標的化する製剤である。
本開示の医薬製剤は、単位剤形において簡便に提示することができ、製薬産業において周知の従来技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤と混合する工程を含む。概して、製剤は、活性成分を液体担体または微粉化された固体担体またはその両方と均一にかつ密接に混合し、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
本開示の組成物は、例えば、これらに限定されるわけではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ、軟質ゲル、坐剤、および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化することができる。本開示の組成物は、水性媒質、非水性媒質、または混合媒質における懸濁液としても製剤化することができる。水懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどをさらに含有することができる。懸濁液は、安定化剤も含有することができる。
さらなる製剤
ｉ．エマルション
本開示の組成物は、エマルションとして調製および製剤化することができる。エマルションは、典型的には、一方の液体が通常は直径０．１μｍを超える液滴の形態において別の液体に分散された不均質系である［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照されたい］。エマルションは、多くの場合、お互いに十分に混合され分散された２つの不混和性液相を含む二相系である。一般的に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）種または水中油（ｏ／ｗ）種のどちらかであり得る。水相が、微細化されて微細な液滴として大量の油相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が、微細化されて微細な液滴として大量の水相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相および、水相中また油相中のどちらかの溶液としてまたはそれ自体別々の相として存在し得る活性薬物に加えて、追加の成分を含有することができる。乳化剤、安定化剤、染料、および抗酸化剤などの医薬品賦形剤も、必要であれば、エマルション中に存在していてもよい。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３相以上で構成される多相エマルションでもあってもよい。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二相エマルションでは提供することができないある特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さい水滴を封入する多相エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、連続油相中において安定化された水の小滴中に封入された油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことによって特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相中によく分散されており、乳化剤または製剤の粘度によってこの形態に維持される。エマルション様式の軟膏基剤およびクリーム剤の場合と同様に、エマルションの相のいずれかは、半固体または固体であってもよい。エマルションを安定化するその他の手段は、乳化剤の使用を伴い、それらは、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る。乳化剤は、以下の４つのカテゴリ：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体に大きく分類することができる［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの製剤化において広い適用可能性を見出しており、文献において概説されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199を参照されたい］。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性性質に対する親水性性質の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と命名されており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて以下の異なるクラス：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類することができる［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285を参照されたい］。
エマルション製剤において使用される天然の乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが挙げられる。脱水ラノリンおよび親水性ワセリンなどの吸収基剤は、親水特性を有し、そのため、それらは、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し、それでもなお、それらの半固体の稠度を維持することができる。微粒子固体も、とりわけ界面活性剤との組合せにおいて、および粘性調製物において、良好な乳化剤として使用されている。これらは、極性無機固体、例えば、重金属水酸化物など、膨潤クレー、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなど、顔料、および非極性固体、例えば、炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどを含む。
非常に多様な非乳化材料も、エマルション製剤に含まれ、エマルションの特性に貢献する。そのようなものとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる［Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199］。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然ゴムおよび合成ポリマー、例えば、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーゴム、カラヤゴム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などが挙げられる。これらは、水に分散または膨潤して、コロイド状溶液を形成し、それは、分散相液滴の周囲に強力な界面フィルムを形成すること、および外部相の粘度を増加することによって、エマルションを安定化する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支援することができる多くの成分、例えば、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどを含有するため、これらの製剤は、多くの場合、保存料が組み込まれている。エマルション製剤に含まれる一般的に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を防ぐために、抗酸化剤も、一般的に、エマルション製剤に加えられる。使用される抗酸化剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなど、ならびに酸化防止相乗剤、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンなどであり得る。
皮膚、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において概説されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。経口デリバリー用のエマルション製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの見地からの有効性により、非常に広く使用されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。鉱油系緩下剤、脂溶性ビタミン、および高脂肪栄養製剤は、ｏ／ｗエマルションとして一般的に経口投与されている材料の１つである。
ｉｉ．マイクロエマルション
本開示の一実施形態において、ＲＮＡｉ剤および核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として定義することができる［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照されたい］。典型的には、マイクロエマルションは、油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで、十分な量の第４の成分、概して中鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される、２つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に澄明な分散液として説明されている（Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。マイクロエマルションは、一般的に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解質を含む３つから５つの成分を組み合わせることによって調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプまたは水中油（ｏ／ｗ）タイプのどちらであるかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの構造および幾何学的パッキングに依存する（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271）。
状態図を利用する現象論的アプローチが、広く研究されており、それは、マイクロエマルションをどのようにして製剤化するかの包括的な知識を当業者にもたらした［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335を参照されたい］。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬物を、自然発生的に形成された熱力学的に安定な液滴の製剤に可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製において使用される界面活性剤としては、これらに限定されるわけではないが、単独での、または補助界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプロエート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。補助界面活性剤は、通常はエタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールであり、界面活性剤フィルムに浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生じるボイドスペースにより、乱れたフィルムを作り出すことによって、界面の流動性を増加させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を用いずに調製することもでき、アルコール不含自己乳化性マイクロエマルション系は、当技術分野で公知である。水相は、典型的には、これらに限定されるわけではないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相は、これらに限定されるわけではないが、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料を含むことができる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物の吸収増強の見地から、特に興味深い。脂質系マイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドなどの薬物の経口バイオアベイラビリティを増強すると提唱されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物の可溶化の向上、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤によって誘導される膜流動性および浸透性の変化に起因する、薬物吸収における可能な増強、調製の容易さ、固体剤形よりも経口投与の容易さ、臨床効力の向上、および毒性の減少の利点を提供する（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度において一緒にされたとき、自然発生的に形成され得る。これは、昜熱分解性の薬物であるペプチドまたはＲＮＡｉ剤を製剤化する場合に、特に有利であり得る。さらに、マイクロエマルションは、美容および医薬的適用の両方における、活性成分の経皮デリバリーにとっても効果的であった。本開示のマイクロエマルション組成物および製剤は、胃腸管からのＲＮＡｉ剤および核酸の全身吸収の増加、ならびにＲＮＡｉ剤および核酸の局所細胞取り込みの向上を促進するであろうことが予想される。
本開示のマイクロエマルションは、製剤の性質を向上させるため、および本開示のＲＮＡｉ剤および核酸の吸収を高めるために、追加の成分および添加剤、例えば、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、および浸透促進剤など、も含有することができる。本開示のマイクロエマルションにおいて使用される浸透促進剤は、５つのカテゴリ：界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属するとして分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。これらのクラスのそれぞれは、上記において説明されている。
ｉｉｉ．マイクロ粒子
本開示のＲＮＡｉ剤は、粒子、例えば、マイクロ粒子などに組み込まれ得る。マイクロ粒子は、噴霧乾燥によって生成することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組合せなどの他の方法によっても生成され得る。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本開示は、動物の皮膚への、核酸、特にＲＮＡｉ剤の効率的なデリバリーを実施するために、様々な浸透促進剤を採用する。ほとんどの薬物は、イオン化状態および非イオン化状態の両方において存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性薬物のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が、浸透促進剤で処置されている場合、非親油性薬物も、細胞膜を横断することができることが分かっている。非親油性薬物が細胞膜を横断して拡散するのを支援することに加えて、浸透促進剤も、親油性薬物の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広いカテゴリ、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属するとして分類することができる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照されたい）。浸透促進剤の上記において言及されたクラスのそれぞれについては、以下においてより詳細に説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」」は、水溶液中に溶解されたとき、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、結果として、粘膜を通過するＲＮＡｉ剤の吸収を高める化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); and perfluorochemical emulsions, such as FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252を参照されたい）。
浸透促進剤としての役割を果たす様々な脂肪酸およびその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプロエート、１－ドデシルアザシクロヘプタナ－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１～２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、ならびにそれらのモノ－およびジ－グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプロエート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654を参照されたい）。
胆汁の生理的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935を参照されたい）。様々な天然の胆汁塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤としての役割を果たす。したがって、用語「胆汁塩」は、胆汁の天然に存在する成分の全て、ならびにそれらの合成誘導体の全てを包含する。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583を参照されたい）。
キレート化剤は、本開示に関連して使用される場合、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、結果として、粘膜を通るＲＮＡｉ剤の吸収を高める化合物として定義することができる。本開示における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴的なＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、結果として、キレート化剤によって阻害されるため、キレート化剤は、ＤＮａｓｅ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339）。好適なキレート化剤としては、これらに限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチレート、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトンのＮ－アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、非キレート化非界面活性剤である浸透促進化合物は、キレート化剤または界面活性剤としてはわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜を通してのＲＮＡｉ剤の吸収を高める化合物として定義することができる（例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；ならびに非ステロイド性抗炎症剤、例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなどが挙げられる（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）。
細胞レベルでのＲＮＡｉ剤の取り込みを増強する薬剤も、本開示の医薬組成物および他の組成物に加えることができる。例えば、カチオン性脂質、例えば、リポフェクチンなど（Junichi et al, U.S. Pat. No. 5,705,188）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えば、ポリリジンなど（ＷＯ９７／３０７３１）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを増強することが知られている。
投与された核酸の浸透を高めるために、他の薬剤、例えば、グリコール、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなど、ピロール、例えば、２－ピロールなど、アゾン、ならびにテルペン、例えば、リモネンおよびメントンなどを用いることができる。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物にデリバリーするための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、ならびに、核酸および所定の医薬組成物お他の成分を組み合わせたときに、所望の体積、稠度などを提供するように計画された投与の様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体としては、これらに限定されるわけではないが、結着剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、非経静脈投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤も、本開示の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるわけではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒における非水溶液、または液体もしくは固体油基剤における核酸の溶液を含むことができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有することができる。核酸と有害に反応しない、非経静脈投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を、使用することができる。
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の成分
本開示の組成物は、さらに、医薬組成物中に従来的に見出される他の補助成分を、確立されたそれらの使用レベルにおいて含有することができる。したがって、例えば、組成物は、追加の適合性の、薬学的に活性な材料、例えば、止痒剤、収斂剤、局部麻酔薬、もしくは抗炎症剤などを含有することができ、または、本開示の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の材料、例えば、染料、矯臭剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤などを含有することができる。ただし、そのような材料は、添加したときに、本開示の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌することができ、所望の場合は、製剤の核酸と有害に相互作用しない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、風味剤、または芳香族物質などと混合することができる。
水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含有することができる。懸濁液は、安定化剤も含有することができる。
一部の実施形態において、本開示において特徴とされる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のＲＮＡｉ剤、および（ｂ）非ＲＮＡｉメカニズムによって機能し、ＡＰＯＥ関連神経変性障害を処置する際に有用である、１つまたは複数の薬剤を含む。そのような薬剤の例としては、ＳＳＲＩ、ベンラファキシン、ブプロピオン、および非定型抗精神病薬が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、５０％致死量（集団の５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的有効な用量）を判定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法によって判定することができる。毒性と治療有効性との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として示すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトにおける使用のために様々な投薬量を製剤化する際に使用することができる。本開示における本明細書において特徴とされる組成物の投薬量は、概して、わずかな毒性かまたは毒性が全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更することができる。本開示において特徴とされる方法で使用される任意の化合物に対して、最初に、細胞培養アッセイから治療有効用量を見積もることができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の１／２最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または、適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する）ように、用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
本開示において特徴とされるＲＮＡｉ剤は、上記において説明されるようなそれらの投与以外に、ヌクレオチドリピートの発現によって媒介される病理学的プロセスの処置において有効な他の既知の薬物と併用して投与することもできる。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書において説明された、有効性の標準的尺度を使用して観察された結果に基づいて、ＲＮＡｉ剤投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＶＩＩＩ．キット
ある特定の態様では、本開示は、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、もしくはｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、またはその前駆体）の医薬製剤を収容する好適な容器を含むキットを提供する。
ある特定の実施形態において、医薬製剤の個々の成分は、１つの容器において提供され得る。あるいは、医薬製剤の成分を別々に２つ以上の容器において、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物調製物のための１つの容器と、担体化合物のための少なくとも別の容器において提供することは、望ましくあり得る。キットは、単一の箱における１つまたは複数の容器など、多数の異なる構成においてパッケージしてもよい。異なる成分は、例えば、キットと共に提供される使用説明書に従って、組み合わせることができる。成分は、医薬組成物を調製および投与するために、本明細書において説明される方法に従って組み合わせることができる。キットは、デリバリーデバイスも含むことができる。
ＩＸ．ＡＰＯＥＴ発現を阻害する方法
本開示はまた、細胞においてＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、細胞におけるＡＰＯＥの発現および／または活性を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させること、それによって、細胞におけるＡＰＯＥの発現および／または活性を阻害することを含む。本開示のある特定の実施形態において、ＡＰＯＥは、ＣＮＳ（例えば、脳）細胞において優先的に阻害される。本開示の他の実施形態において、ＡＰＯＥは、肝臓（例えば、肝細胞）において優先的に阻害される。本開示のある特定の実施形態において、ＡＰＯＥは、ＣＮＳ（例えば、脳）細胞において、および肝臓細胞（例えば、肝細胞）において阻害される。
一部の実施形態において、ＡＰＯＥ２の発現は、阻害される。一部の実施形態において、ＡＰＯＥ３の発現は、阻害される。一部の実施形態において、ＡＰＯＥ４の発現は、阻害される。一部の実施形態において、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、阻害される。一部の実施形態において、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４の発現は、阻害される。一部の実施形態において、ＡＰＯＥ４の発現は阻害され、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、実質的に阻害されず、例えば、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３の発現は、１０％以下だけ阻害される。
細胞の、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤との接触は、インビトロまたはインビボで行うことができる。インビボで細胞を、ＲＮＡｉ剤と接触させることは、対象、例えば、ヒト対象内の細胞または細胞の群を、ＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。細胞を接触させるインビトロおよびインビボ法の組合せも可能である。
細胞を接触させることは、上記で論じたように直接的である場合も間接的である場合もある。さらに、細胞を接触させることは、本明細書に記載される、または当技術分野で公知の任意のリガンドを含む標的化リガンドを介して達成できる。一部の実施形態において、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃリガンドまたはＲＮＡｉ剤を目的の部位に向ける任意の他のリガンドである。
「阻害すること」という用語は、本明細書において使用される場合、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」および他の同様の用語と同義的に使用され、阻害の任意のレベルを含む。ある特定の実施形態において、例えば、本開示のＲＮＡｉ剤の阻害のレベルは、例えば、細胞培養物中の細胞が、リポフェクタミン（商標）媒介性トランスフェクションによってトランスフェクトされる細胞培養条件において、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下などの細胞の近傍における濃度で評価できる。所与のＲＮＡｉ剤のノックダウンは、細胞培養物において前処置されたレベル対細胞培養物において後処置されたレベルの比較によって決定でき、また、スクランブルされたまたは他の形態の対照ＲＮＡｉ剤を用いて並行して処置された細胞に対して比較してもよい。例えば、好ましくは５０％またはそれより多くの、細胞培養物におけるノックダウンは、それによって、「阻害すること」または「低減すること」、「下方制御すること」または「抑制すること」などが生じたことを示すと同定され得る。標的化されたｍＲＮＡまたはコードされるタンパク質レベル（および従って、本開示のＲＮＡｉ剤によって引き起こされる「阻害すること」などの程度）の評価も、当技術分野において記載されるような適切に制御された条件下で本開示のＲＮＡｉ剤のインビボ系において評価できるということは明確に企図される。
語句「ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害すること」または「ＡＰＯＥの発現を阻害すること」は、本明細書において使用される場合、任意のＡＰＯＥ遺伝子（例えば、マウスＡＰＯＥ遺伝子、ラットＡＰＯＥ遺伝子、サルＡＰＯＥ遺伝子、またはヒトＡＰＯＥ遺伝子など）、ならびにＡＰＯＥタンパク質をコードするＡＰＯＥ遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を含む。したがって、ＡＰＯＥ遺伝子は、遺伝子操作された細胞、細胞の群または生物の状況において、野生型ＡＰＯＥ遺伝子、突然変異体ＡＰＯＥ遺伝子またはトランスジェニックＡＰＯＥ遺伝子であり得る。
「ＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害すること」は、任意のレベルのＡＰＯＥ遺伝子の阻害、例えば、ＡＰＯＥ遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制、例えば、少なくとも２０％までの阻害を含む。ある特定の実施形態において、阻害は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％；またはアッセイ法の検出レベル未満までである。
ＡＰＯＥ遺伝子の発現は、ＡＰＯＥ遺伝子発現に付随する任意の変数のレベル、例えばＡＰＯＥ ｍＲＮＡのレベルまたはＡＰＯＥタンパク質のレベル、または例えばアミロイドもしくはタウ沈着のレベルに基づいて評価してよい。
阻害は、対照レベルと比較した、これらの変数のうち１つまたは複数の絶対または相対レベルの低下によって評価できる。対照レベルは、当技術分野で利用される任意の種類の対照レベル、例えば、投与前ベースラインレベルまたは未処置であるか、もしくは対照（例えば、バッファーのみの対照または不活性の薬剤対照など）を用いて処置された同様の対象、細胞もしくは試料から決定されるレベルであり得る。
本開示の方法の一部の実施形態において、ＡＰＯＥ遺伝子の発現は、少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはアッセイの検出レベル未満まで阻害される。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、ＡＰＯＥの発現を低減する薬剤を用いる対象の処置後の臨床的に関連するアウトカムによって実証されるような、ＡＰＯＥの発現の臨床的に関連する阻害を含む。
ＡＰＯＥ遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞または細胞の群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第２の細胞または細胞の群（ＲＮＡｉ剤で処置されていない、または目的の遺伝子に標的化されるＲＮＡｉ剤を用いて処置されていない対照細胞（複数可））と比較して、ＡＰＯＥ遺伝子の発現が阻害されるように、ＡＰＯＥ遺伝子が転写され、処置（例えば、細胞（単数または複数）を本開示のＲＮＡｉ剤と接触させることによって、または本開示のＲＮＡｉ剤を、細胞が存在しているもしくは存在していた対象に投与することによって）されている第１の細胞または細胞の群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の低減によって示される場合もある。阻害の程度は、以下の点で表すことができる：
Figure 2023523993000037
他の実施形態において、ＡＰＯＥ遺伝子の発現の阻害は、ＡＰＯＥ遺伝子の発現に機能的に関連するパラメータ、例えばＡＰＯＥタンパク質の発現、の低減の観点で評価してよい。ＭＡＰＴ遺伝子のサイレンシングは、発現コンストラクトから内因性または異種性のＡＰＯＥを発現する任意の細胞において、当技術で既知の任意のアッセイによって決定してよい。
ＡＰＯＥタンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞の群によって発現されるＡＰＯＥタンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中に発現されるタンパク質のレベル）の低減によって明らかにすることができる。上記で説明されたように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処置された細胞または細胞の群におけるタンパク質発現レベルの阻害を、対照細胞または細胞の群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表すことができる。
ＡＰＯＥ遺伝子の発現の阻害を評価するために使用できる対照細胞または細胞の群には、本開示のＲＮＡｉ剤とまだ接触していない細胞または細胞の群が含まれる。例えば、対照細胞または細胞の群は、ＲＮＡｉ剤を用いる対照の処置の前の個々の対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に由来し得る。
細胞または細胞の群によって発現されたＡＰＯＥ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定できる。一実施形態において、試料中のＡＰＯＥの発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部、例えば、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ； Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することを含む、ＲＮＡ抽出技術を使用して細胞から抽出できる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する通常のアッセイ形式には、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析が含まれる。循環するＡＰＯＥ ｍＲＮＡは、ＷＯ２０１２／１７７９０６に記載されている方法を使用して検出してよく、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、ＡＰＯＥの発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。「プローブ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定のＡＰＯＥ核酸またはタンパク質もしくはその断片に選択的に結合可能である任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成できる、または適切な生物学的調製物から誘導できる。プローブは、標識されるように具体的に設計できる。プローブとして利用できる分子の例として、それだけには限らないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡは、それだけには限らないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用できる。ｍＲＮＡレベルを決定する１つの方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態において、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上に流すことおよびｍＲＮＡをゲルからメンブレン、例えば、ニトロセルロースにトランスファーすることによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替実施形態において、プローブ（複数可）を固体表面上に固定化し、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいてｍＲＮＡをプローブ（複数可）と接触させる。当業者ならば、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡのレベルの決定において使用するために容易に適応させることができる。
試料中のＡＰＯＥの発現のレベルを決定するための代替方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７年、米国特許第４，６８３，２０２号に示された実験の実施形態）、リガーゼ連鎖反応［Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193］、自家持続配列複製法［Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878］、転写増幅システム［Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177］、Ｑ－ベータレプリカーゼ［Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197］、ローリングサークル複製（Lizardi et al.、米国特許第５，８５４，０３３号）または任意のその他の核酸増幅法による、例えば、試料中のｍＲＮＡの核酸増幅または逆転写酵素（ｃＤＮＡを調製するための）のプロセスと、それに続く、当業者に公知の技術を使用する増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子が、極めて少数で存在する場合には、核酸分子の検出のために特に有用である。本開示の特定の態様では、ＡＰＯＥの発現のレベルは、定量的蛍光発生的ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム）によって、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイによって、またはＡＰＯＥ発現もしくはｍＲＮＡレベルの測定のための他の技術分野によって認識された方法によって決定される。
ＡＰＯＥ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどといったハイブリダイゼーション分析において使用される）またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズまたはファイバー（または結合している核酸を含む任意の固相支持体）を使用してモニタリングできる。参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号、同５，８７４，２１９号、同５，７４４，３０５号、同５，６７７，１９５号および同５，４４５，９３４号を参照されたい。ＡＰＯＥ発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。
一部の実施形態において、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価される。このＰＣＲ方法の使用は、本明細書において示される実施例において記載され、例示されている。このような方法はまた、ＡＰＯＥ核酸の検出のために使用できる。
ＡＰＯＥ発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定できる。このような方法には、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降素反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度的アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元または二元）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが含まれる。このようなアッセイはまた、ＡＰＯＥタンパク質存在または複製を示すタンパク質の検出のために使用できる。
一部の実施形態において、ＡＰＯＥ関連疾患の処置における本開示の方法の有効性は、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡレベルの低下によって（例えば、ＡＰＯＥレベルについてのＣＳＦ試料の評価によって、脳生検または別の方法によって）評価される。
一部の実施形態において、ＡＰＯＥ関連疾患の処置における本開示の方法の有効性は、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡレベルの低下によって（例えば、ＡＰＯＥレベルについての肝臓試料の評価によって、生検または別の方法によって）評価される。
本開示の方法の一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤が、対象内の特定の部位にデリバリーされるように対象に投与される。ＡＰＯＥの発現の阻害は、ＡＰＯＥ ｍＲＮＡ、対象の中の特定の部位、例えばＣＮＳ細胞から誘導された試料中のＡＰＯＥタンパク質のレベルまたはレベルの変化の測定を使用して評価してよい。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、ＡＰＯＥの発現を低減する薬剤を用いる対象の処置後の臨床的に関連するアウトカムなどによって実証されるような、ＡＰＯＥの発現の臨床的に関連する阻害を含む。
本明細書において使用される場合、分析物のレベルを検出することまたは決定することという用語は、材料、例えば、タンパク質、ＲＮＡが存在するか否かを決定する工程を実施することを意味すると理解される。本明細書において使用される場合、検出するまたは決定する方法は、使用される方法の検出のレベルを下回る分析物レベルの検出または決定を含む。
Ｘ．ＡＰＯＥ関連神経変性疾患を処置または予防する方法
本開示はまた、細胞においてＡＰＯＥ発現を低減または阻害するために本開示のＲＮＡｉ剤または本開示のＲＮＡｉ剤を含有する組成物を使用する方法を提供する。方法は、細胞を本開示のｄｓＲＮＡと接触させることおよび細胞をＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって、細胞においてＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、ＡＰＯＥの発現の低減は、当業者に常用される方法、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してＡＰＯＥのｍＲＮＡ発現レベルを決定することによって；当業者に常用される方法、例えば、ウェスタンブロッティング、免疫学的技術を使用してＡＰＯＥのタンパク質レベルを決定することによって、決定してもよい。
本開示の方法では、細胞をインビトロまたはインビボで接触させることができる、すなわち、細胞は、対象内であり得る。
本開示の方法を使用する処置のために好適な細胞は、ＡＰＯＥ遺伝子を発現する任意の細胞であってよい。本開示の方法における使用にとって適した細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（ラット細胞またはマウス細胞など）であり得る。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒトＣＮＳ細胞である。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝臓細胞である。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒトＣＮＳ細胞およびヒト肝臓細胞である。
ＡＰＯＥの発現は、細胞において少なくとも約３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または約１００％、すなわち、検出レベル未満まで阻害される。好ましい実施形態において、ＡＰＯＥの発現は、少なくとも５０％阻害される。
本開示のインビボ法は、対象に、ＲＮＡｉ剤を含有する組成物を投与することを含むことができ、ＲＮＡｉ剤は、処置されるべき哺乳動物のＡＰＯＥ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。処置されるべき生物が哺乳動物、例えば、ヒトである場合には、組成物は、それだけには限らないが、経口、腹腔内または頭蓋内（例えば、脳室内、実質内および髄腔内）、静脈内の、筋肉内の、硝子体内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸および局所（頬側および舌下を含む）投与を含む非経口経路を含む、当技術分野で公知の任意の手段によって投与され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、皮下注射によって投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、髄腔内注射によって投与される。
一部の実施形態において、投与は、デポー注射によってである。デポー注射は、長時間にわたって一貫した方法でＲＮＡｉ剤を放出し得る。したがって、デポー注射は、所望の効果、例えば、所望のＡＰＯＥの阻害または治療的もしくは予防的効果を得るために必要とされる投薬の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供し得る。デポー注射は、皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態において、デポー注射は、皮下注射である。
一部の実施形態において、投与は、ポンプによってである。ポンプは、外部ポンプまたは外科的に埋め込まれたポンプであり得る。ある特定の実施形態において、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、頭蓋内、静脈内、皮下、動脈性または硬膜外注入のために使用され得る。好ましい実施形態において、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、ＲＮＡｉ剤をＣＮＳにデリバリーする外科的に埋め込まれたポンプである。
投与様式は、局所処置が望まれるか、または全身処置が望まれるかに基づいて、また処置されるべき領域に基づいて選択できる。投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択できる。
一態様では、本開示はまた、哺乳動物においてＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞においてＡＰＯＥ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを含む組成物を投与し、哺乳動物を、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって、細胞においてＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また本明細書に記載される方法、例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価できる。タンパク質産生の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また本明細書に記載される方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって評価できる。一実施形態において、ＣＮＳ生検試料または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料は、ＭＡＰＴ遺伝子またはタンパク質発現の（またはしたがって、プロキシの）低減をモニタリングするための組織材料として働く。
本開示は、それを必要とする対象の処置の方法をさらに提供する。本開示の処置方法は、対象、例えば、ＡＰＯＥの発現の阻害が有益であろう対象、例えば、ＭＡＰＴ遺伝子にミスセンスおよび／または欠失突然変異を有する対象に、ＭＡＰＴ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ剤またはＡＰＯＥ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の治療有効量で、本開示のＲＮＡｉ剤を投与することを含む。
さらに、本開示は、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患または障害、例えば、アミロイド－β媒介性疾患、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症、またはタウ媒介性疾患、例えば、原発性タウオパチー、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、もしくは二次性タウオパチー、例えば、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症を防止する、処置する、またはその進行を阻害する方法を提供する。
本方法は、対象に、治療有効量の本明細書に提供されるＲＮＡｉ剤のいずれか、例えば、ｄｓＲＮＡ剤、または医薬組成物を投与すること、それによって対象におけるＡＰＯＥ関連神経変性疾患または障害を防止する、処置する、またはその進行を阻害することを含む。
本開示のＲＮＡｉ剤は、「遊離ＲＮＡｉ剤」として投与される場合がある。遊離ＲＮＡｉ剤は、医薬組成物の不在下で投与される。裸のＲＮＡｉ剤は、適したバッファー溶液中にある場合がある。バッファー溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩またはリン鎖塩またはそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態において、バッファー溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉ剤を含有するバッファー溶液のｐＨおよび浸透圧は、対象へ投与することに適しているように調整できる。
あるいは、本開示のＲＮＡｉ剤は、医薬組成物、例えば、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤として投与され得る。
ＡＰＯＥ遺伝子の発現の低減または阻害が有益であろう対象は、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患を有する対象である。
本開示は、例えば、ＡＰＯＥ発現の低減もしくは阻害が有益であろう対象、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性障害を有する対象を処置するための、他の医薬または他の治療方法と、例えば、公知の医薬または公知の治療方法、例えば、これらの障害を処置するために現在使用されているものなどと組み合わせた、ＲＮＡｉ剤またはその医薬組成物の使用のための方法をさらに提供する。例えば、ある特定の実施形態において、ＡＰＯＥを標的化するＲＮＡｉ剤は、例えば、本明細書において別の場所に記載されるような、またはそうではなく当技術分野で公知のような、ＡＰＯＥ関連神経変性障害の処置において有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＡＰＯＥ発現の低減が有益であろう対象、例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性障害を有する対象を処置するのに適した追加の薬剤は、ＡＰＯＥの症状を処置するために現在使用されている薬剤を含み得る。ＲＮＡｉ剤および追加の治療薬は、同時にまたは同一組合せで、例えば、髄腔内に投与してもよく、または追加の治療薬は、別個の組成物の一部として、または別個の時間で、または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される別の方法によって投与できる。
一実施形態において、方法は、標的ＡＰＯＥ遺伝子の発現が少なくとも１か月間低下されるように本明細書において特徴とされる組成物を投与することを含む。好ましい実施形態において、発現は、少なくとも２か月、３か月または６か月間低下される。
好ましくは、本明細書において特徴とされる方法および組成物にとって有用なＲＮＡｉ剤は、標的ＡＰＯＥ遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的化する。ＲＮＡｉ剤を使用してこれらの遺伝子の発現を阻害する組成物および方法は、本明細書に記載されるように調製および実施できる。
本開示の方法によるｄｓＲＮＡの投与は、ＡＰＯＥ関連神経変性障害を有する患者においてこのような疾患または障害の重症度、徴候、症状またはマーカーの低減をもたらし得る。これに関連して「低減」とは、このようなレベルの統計的に有意なまたは臨床的に有意な低下を意味する。低減は、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または約１００％であり得る。
疾患の処置または予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患緩解、症状の重症度、疼痛の低減、生活の質、処置効果を持続するために必要とされる投薬の用量、疾患マーカーまたは処置されているまたは予防のために標的化される所与の疾患にとって適切な任意の他の測定可能なパラメータのレベルを測定することによって評価できる。このようなパラメータのうち任意の１つまたはパラメータの任意の組合せを測定することによって、処置または予防の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＡＰＯＥ関連神経変性障害の処置の有効性は、例えば、対象の認知、学習、および／または記憶の定期的なモニタリングによって評価できる。後の読み取り値を、最初の読み取り値と比較することによって、処置が有効であるか否かの指標が医師に提供される。このようなパラメータのうち任意の１つまたはパラメータの任意の組合せを測定することによって、処置または予防の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＡＰＯＥを標的化するＲＮＡｉ剤またはその医薬組成物の投与に関連して、ＡＰＯＥ関連神経変性障害「に対して有効な」は、臨床的に適切な方法での投与が、少なくとも統計的に有意な割合の患者にとって有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、疾患の低減、寿命の延長、生活の質の改善またはＡＰＯＥ関連神経変性障害および関連原因の処置に精通している医師によって肯定的であると一般的に認識される他の効果をもたらすことを示す。
処置または予防的効果は、疾患状態の１つまたは複数のパラメータにおいて統計的に有意な改善がある場合に、または悪化しなかったこともしくはそうでなければ予測される症状を発症しなかったことによって明らかである。例として、疾患の測定可能なパラメータにおける少なくとも１０％の好都合な変化、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多くが、有効な処置を示し得る。所与のＲＮＡｉ剤薬物またはその薬物の製剤の有効性はまた、当技術分野で公知のように、所与の疾患の実験動物モデルを使用して判断できる。実験動物モデルを使用する場合には、処置の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。
あるいは、有効性は、臨床的に許容された疾患重症度類別スケールに基づいて、診断の当業者によって決定されるような疾患の重症度の低減によって測定できる。例えば、適切なスケールを使用して測定される疾患の重症度の減少をもたらす任意の肯定的な変化は、本明細書に記載されるようなＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤製剤を使用する妥当な処置を表す。
対象には、ｄｓＲＮＡの治療量、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを投与することができる。
ＲＮＡｉ剤は、一定期間にわたって定期的に、髄腔内に、硝子体内注射を介して、または静脈内注入によって投与できる。ある特定の実施形態において、最初の処置レジメン後に、より少ない頻度で処置を投与できる。ＲＮＡｉ剤の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、ＣＳＦ試料または他のコンパートメントにおいてＡＰＯＥレベルを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは少なくとも約９９％またはそれより多く低減できる。好ましい実施形態において、ＲＮＡｉ剤の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、ＣＳＦ試料または他のコンパートメントにおいてＡＰＯＥレベルを少なくとも５０％低減できる。
ＲＮＡｉ剤の全用量の投与の前に、患者により少ない用量、例えば、５％の注入反応を投与し、有害作用、例えば、アレルギー反応についてモニタリングできる。別の例では、患者を、望まれない免疫賦活性効果、例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファまたはＩＮＦ－アルファ）レベルの増大についてモニタリングできる。
あるいは、ＲＮＡｉ剤を、皮下に、すなわち、皮下注射によって投与できる。ＲＮＡｉ剤の所望の、例えば、毎月の用量を対象にデリバリーするために、１回または複数回の注射を使用できる。一定期間にわたって、注射を反復できる。投与を定期的に反復できる。ある特定の実施形態において、最初の処置レジメン後に、より少ない頻度で処置を投与できる。反復用量レジメンは、定期的な、例えば、毎月の、または四半期に１回、年に２回、年に１回に延長する、ＲＮＡｉ剤の治療量の投与を含み得る。ある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、月に約１回～四半期に約１回（すなわち、３か月毎に約１回）投与される。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を、本発明において特徴とされるＲＮＡｉ剤および方法の実施または試験に使用できるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単に例示的なものであり、制限であるように意図されない。
非公式な配列表が本明細書と共に提出され、出願される明細書の一部を形成する。
［実施例１］
ＲＮＡｉ剤設計、合成、選択およびインビトロ評価
この実施例は、ＡＰＯＥ ＲＮＡｉ剤の設計、合成、選択およびインビトロ評価のための方法を記載する。
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に与えられない場合には、このような試薬は、分子生物学において適用するための品質／純度基準で分子生物学のための試薬の任意の供給者から得ることができる。
生物情報科学
ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ；ヒトＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿００００４１．４；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：３４８）を標的化する１組のｓｉＲＮＡを、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＮＭ＿００００４１ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、バージョン４は、１１６６ヌクレオチドの長さを有する。
ＡＰＯＥ一本鎖および二重鎖は、当技術分野において公知のルーチン法を使用して作製した。未修飾のＡＰＯＥセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは、表２および４に示され、修飾されたＡＰＯＥセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは、表３および５に示されている。
表７は、病原性ＡＰＯＥ４対立遺伝子を標的化する、表２における薬剤の未修飾のＡＰＯＥセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを提供し、表８は、病原性ＡＰＯＥ４対立遺伝子を標的化する、表３における薬剤の修飾されたＡＰＯＥセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを提供する。
ｓｉＲＮＡ合成
ｓｉＲＮＡを、当技術分野において公知のルーチン法を使用して合成およびアニールした。簡潔に説明すると、ｓｉＲＮＡ配列を、Ｍｅｒｍａｄｅ １９２合成機（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して固体支持体上でのホスホルアミダイト化学により１μｍｏｌスケールにて合成した。固体支持体は、特注ＧａｌＮＡｃリガンド（３’－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）をロードした調整細孔ガラス（５００～１０００Å）、ユニバーサル固体支持体（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、または目的の第１のヌクレオチドであった。補助的な合成試薬および標準の２－シアノエチルホスホルアミダイトモノマー（２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｈｏｎｇｅｎｅ（Ｃｈｉｎａ）、またはＣｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）から取得した。追加のホスホルアミダイトモノマーは、販売業者から調達するか、組織内で調製するか、または種々のＣＭＯからの特注合成を使用して調達した。ホスホルアミダイトは、アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦのいずれかに１００ｍＭの濃度にて調製し、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中の０．２５Ｍ）を使用して４００秒間の反応時間によりカップリングした。ホスホロチオエート連結を、無水アセトニトリル／ピリジン（９：１ ｖ／ｖ）中の３－［（ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン［ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）から取得した］の１００ｍＭ溶液を使用して生成した。酸化時間は５分間であった。ＤＭＴ基の最終的な除去（「ＤＭＴオフ」）により、すべての配列を合成した。
固相合成の完了の際に、固体支持オリゴリボヌクレオチドを、３００μＬのメチルアミン（４０％水性）により室温において９６ウェルプレートにておよそ２時間処理して、固体支持体から切断し、続いてすべてのさらなる塩基不安定性保護基を除去した。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基により保護された任意の天然リボヌクレオチド連結（２’－ＯＨ）を含む配列については、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミントリヒドロフルオリド）を使用して第２の脱保護工程を行った。水性メチルアミン中の各オリゴヌクレオチド溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦを添加し、溶液を６０℃においておよそ３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを室温にし、粗オリゴヌクレオチドを、１ｍＬの９：１のアセトニトリル：エタノールまたは１：１のエタノール：イソプロパノールの添加によって沈殿させた。その後、プレートを４℃において４５分間遠心分離し、マルチチャンネルピペットにより補助しながら上清を慎重に注ぎ出した。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ ＮａＯＡｃ中に再懸濁し、続いて、オートサンプラー、ＵＶ検出器、導電率計、およびフラクションコレクターを装備したＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣシステム上のＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩した。脱塩した試料を、９６ウェルプレートに収集し、その後、ＬＣ－ＭＳおよびＵＶ分光法によって分析して、それぞれ、材料の同一性を確認し、その量を定量した。
Ｔｅｃａｎリキッドハンドリングロボットにおいて一本鎖の二本鎖化を行った。センスおよびアンチセンス一本鎖を、等モル比において、９６ウェルプレートにおける１ｘＰＢＳ中にて１０μＭの最終濃度になるように混合し、プレートを密閉し、１００℃において１０分間インキュベートし、続いてゆっくりと室温まで２～３時間にわたって戻した。各二重鎖の濃度および同一性を確認し、その後、続いて、インビトロスクリーニングアッセイに利用した。
細胞培養およびトランスフェクション
９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり４．９μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭおよび０．１μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ． カタログ番号１３７７８－１５０）を、１ウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖に、各ｓｉＲＮＡ二重鎖を４反復にて、添加することによって、細胞にトランスフェクトし、室温において１５分間インキュベートした。その後、約１．５×１０４個の細胞を含有する４０μＬのＭＥＤＩＡを、ｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を２４時間インキュベートし、その後、ＲＮＡ精製を行った。実験を１０ｎＭにおいて行った。ヒト肝細胞腫Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６４）においてＥＭＥＭ（ＡＴＣＣカタログ番号３０－２００３）によりトランスフェクション実験を行う。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用する総ＲＮＡ単離
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用するＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームで自動化プロトコールを使用してＲＮＡを単離した。手短には、細胞を有するプレートに、７０μＬの溶解／結合バッファーおよび３μＬの磁性ビーズを含有する１０μＬの溶解バッファーを添加した。プレートを、電磁シェーカー上で室温で１０分間インキュベートし、次いで、磁性ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズが結合しているＲＮＡを、１５０μＬの洗浄バッファーＡを用いて２回および洗浄バッファーＢを用いて１回洗浄した。次いで、１５０μＬの溶出バッファーを用いてビーズを洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
ＡＢＩ大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、フォスターシティ、カタログ番号４３６８８１３）を使用するｃＤＮＡ合成
上記で単離されたＲＮＡに、反応あたり１μＬの１０×バッファー、０．４μＬの２５× ｄＮＴＰ、１μＬの１０×ランダムプライマー、０．５μＬの逆転写酵素、０．５μＬのＲＮアーゼ阻害剤および６．６μＬのＨ２Ｏを含有する１０μＬのマスターミックスを添加した。プレートを密閉し、混合し、電磁振動機上において室温にて１０分間インキュベートし、続いて３７℃において２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ
２μＬのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）中の１ウェル当たり０．５μＬのヒトまたはマウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ４３５２９３４Ｅまたは４３５１３０９）および０．５μＬの適切なＡＰＯＥプローブ（市販されている、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから）ならびに５μＬのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）において行った。各二重鎖を、Ｎ＝４により試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に対して正規化した。相対変化倍数を算出するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を用いて実施されたアッセイに対して正規化した。
表５中の薬剤による、Ｈｅｐ３Ｂ細胞における単一用量スクリーニングの結果を、表６に提供する。
Figure 2023523993000038
Figure 2023523993000039
Figure 2023523993000040
Figure 2023523993000041
Figure 2023523993000042
Figure 2023523993000043
Figure 2023523993000044
Figure 2023523993000045
Figure 2023523993000046
Figure 2023523993000047
Figure 2023523993000048
Figure 2023523993000049
Figure 2023523993000050
Figure 2023523993000051
Figure 2023523993000052
Figure 2023523993000053
Figure 2023523993000054
Figure 2023523993000055
Figure 2023523993000056
Figure 2023523993000057
Figure 2023523993000058
Figure 2023523993000059
Figure 2023523993000060
Figure 2023523993000061
Figure 2023523993000062
Figure 2023523993000063
Figure 2023523993000064
Figure 2023523993000065
Figure 2023523993000066
Figure 2023523993000067
Figure 2023523993000068
Figure 2023523993000069
Figure 2023523993000070
Figure 2023523993000071
Figure 2023523993000072
Figure 2023523993000073
Figure 2023523993000074
Figure 2023523993000075
Figure 2023523993000076
［実施例２］
トランスジェニックマウスにおけるインビボ評価
この実施例は、アルツハイマー病のＡＰＰＰＳ１－２１トランスジェニックマウスモデルにおけるＡＰＯＥ ＲＮＡｉ剤のインビボ評価の方法を記載する。これらのマウスは、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）を有するヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）ｃＤＮＡ、およびＬ１６６Ｐ突然変異を有する突然変異体ＰＳ１を過剰発現する。これらのマウスにおける内因性ＡｐｏＥ遺伝子は、ヒトＡＰＯＥ３対立遺伝子またはヒトＡＰＯＥ４対立遺伝子のいずれかにより置換した［Huynh, et al. (2017) Neuron 96: 1013-1023］。
実施例１において設計およびアッセイされる選択されたｄｓＲＮＡ剤の能力を、これらの動物の脳および肝臓において、ＡＰＯＥ発現、例えば、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、およびＡＰＯＥ４発現のレベルを低減するそれらの能力について評価する。
簡潔に説明すると、同腹仔に単一用量の目的のｄｓＲＮＡ剤またはプラセボを、クモ膜下腔内投与または皮下投与する。投与の２週間後、動物を殺し、血液、ならびに大脳皮質、脊髄、肝臓、脾臓および頸部リンパ節を含む組織試料を収集する。
ＡＰＯＥ ｍＲＮＡレベルに対する、ＡＰＯＥを標的化するｄｓＲＮＡ剤の投与の効果を決定するために、ｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって皮質および肝臓試料において決定する。
また、このマウスモデルにおけるアルツハイマー病の病理に対する、ＡＰＯＥを標的化する薬剤の投与の効果を、Ｈｕｙｎｈら（上記）で説明される通りに評価する。
同腹仔に、出生時および８週齢において、２用量の目的のｄｓＲＮＡ剤またはプラセボをクモ膜下腔内投与または皮下投与する。１６週齢において、動物を殺し、血液、ならびに大脳皮質、脊髄、肝臓、脾臓および頸部リンパ節を含む組織試料を収集し、適切に加工する。
Ａβ斑の沈着、Ａβの蓄積、神経炎性ジストロフィー全体、プラークサイズ、およびプラーク分布に対する、ｄｓＲＮＡ剤の効果を評価する。簡潔に説明すると、組織試料の免疫蛍光分析のために、固定および次なるスクロース中への少なくとも２４時間の浸漬後、ミクロトームを使用して前頭皮質から海馬尾部（右半球）まで連続冠状切片を収集する。各脳の右半球からの海馬を含む３つの切片を、線維性プラークを可視化するためにＸ３４染料により染色するか、またはアミロイド－β（例えば、８２Ｅ１）に対する市販の抗体および対応する蛍光標識二次抗体により染色する。分析のために、染色した切片を、共焦点顕微鏡により２０倍の倍率（ｍａｇｉｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）においてスキャンする。プラークのクラスターを含むランダムウィンドウをキャプチャーし、このウィンドウはすべての切片についてｚ面において同じ厚さに及ぶ。適したソフトウェアを使用して、マーカーの体積を同じ閾値下において定量する。各データ点は、１つの単一の動物からの３つの別々の組織切片からの平均値を表す。
［実施例３］
ヒト化ＡＰＯＥマウスにおけるインビボ評価
標準の技術を使用して、マウスＡｐｏｅ遺伝子のエクソン２、３、およびエクソン４のほとんどを、エクソン２、３、および４（ならびに一部の３’ＵＴＲ配列）を含むヒトＡＰＯＥ４遺伝子配列により置換することによって、この研究のためのヒト化ＡｐｏＥ４ノックインマウス（Ｊａｘから購入した；ストック番号０２７８９４）を生み出した。
目的の二重鎖のインビボ有効性を評価するために、９～１２週齢の雄および雌のケタミン／キシラジン麻酔したホモ接合ヒト化ＡＰＯＥノックインマウスに、０日目において、２５μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび特注角度付き３．５ｍｍ針を使用して、単一の３００μｇ用量のＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０６、ＡＤ－１２０４７０７、ＡＤ－１２０４７０８、ＡＤ－１２０４７０９、ＡＤ－１２０４７１０、ＡＤ－１２０４７１１、ＡＤ－１２０４７１２、もしくはＡＤ－１２０４７１３、または人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）対照を右脳室へ側脳室内注射（ＩＣＶ）により投与した。
表９は、この実施例において使用される薬剤の未修飾ＡＰＯＥセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを提供し、表１０は、この実施例において使用される薬剤の修飾ＡＰＯＥセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを提供する。
投薬後１４日目に、動物を殺し、脳の両方の半球および肝臓を収集し、液体窒素中において急速冷凍した。組織からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法によって分析した。
この分析の結果は、表１Ａおよび１Ｂに提供され、単一の３００μｇ用量のＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０８、またはＡＤ－１２０４７１２は、脳においてＡＰＯＥ発現を強力にノックダウンすること（図１Ａ）、および末梢ＡＰＯＥ発現に対してより少ない効果を有すること（図１Ｂ）を実証する。
図２は、インビトロでの薬剤の活性の、インビボでの薬剤の活性との相関を示す。特に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において８０％を超えるノックダウンを呈した（１０ｎＭにおいて）４５の二重鎖のうち、そのインビトロスクリーニングにおいて特定された上位４つの二重鎖は、インビボにおける最も優れた活性を示した（丸で囲んだ薬剤、すなわち、ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０８、またはＡＤ－１２０４７１２）。
Figure 2023523993000077
Figure 2023523993000078
Figure 2023523993000079

Claims (123)

  1. ＡＰＯＥの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の一部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖がアンチセンス鎖における少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに対して相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の対応する部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  2. ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の一部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、センス鎖がアンチセンス鎖における少なくとも１７個の連続するヌクレオチドに対して相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の対応する部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  3. ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の一部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、センス鎖がアンチセンス鎖における少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに対して相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の対応する部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  4. ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の一部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、センス鎖がアンチセンス鎖における少なくとも２１個の連続するヌクレオチドに対して相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２の全ヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド、の対応する部分の、０または１つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  5. センス鎖および／またはアンチセンス鎖が、表２～５および７～１０のいずれか１つに記載のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかからなる群から選択されるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖である、請求項１～４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  6. センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド５７～７９、６２～８４、７５～９７、８６～１０８、２０７～２２９、２１３～２３５、２１８～２４０、８９８～９２０、１１２８～１１５０、６３７～６５９のヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  7. センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド５７～７９、６２～８４、２０７～２２９、１１２８～１１５０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  8. アンチセンス鎖が、ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０６、ＡＤ－１２０４７０７、ＡＤ－１２０４７０８、ＡＤ－１２０４７０９、ＡＤ－１２０４７１０、ＡＤ－１２０４７１１、ＡＤ－１２０４７１２、およびＡＤ－１２０４７１３からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  9. アンチセンス鎖が、ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０８、およびＡＤ－１２０４７１２からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  10. ＡＰＯＥ４の発現を阻害するが、ＡＰＯＥ２の発現およびＡＰＯＥ３の発現を実質的に阻害しない、請求項１～９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  11. センス鎖および／またはアンチセンス鎖が、表７および８のいずれか１つに記載のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかからなる群から選択されるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖である、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  12. センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が、１つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートしている、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  13. 親油性部分が、ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域中の１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートしている、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  14. 親油性部分が、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートしている、請求項１２または１３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  15. ｌｏｇＫｏｗによって測定された親油性部分の親油性が、０を超える、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  16. 二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおいて未結合画分によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性が、０．２を超える、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 血漿タンパク質結合アッセイが、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. センス鎖ヌクレオチドの５個以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの５個以下が、修飾されていないヌクレオチドである、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  21. 修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシヌクレオチド、３’末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチド、２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、２’－デオキシ修飾されたヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非ロックドヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ変性ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾されたヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾されたヌクレオチド、２’－ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾されたヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾されたヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾されたヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾されたヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾されたヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’リン酸または５’リン酸模倣物を含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体を含むヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェートを含むヌクレオチド、ならびにコレステリル誘導体およびドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド；ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. 修飾されたヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾されたヌクレオチド、２’－デオキシ修飾されたヌクレオチド、３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ変性ヌクレオチド、２’－アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 修飾されたヌクレオチドが、３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. ヌクレオチドへの修飾が、２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡおよび２’フルオロ修飾である、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 少なくとも１つのホスホロチオエートインターヌクレオチド連結をさらに含む、請求項２１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. ６～８個のホスホロチオエートインターヌクレオチド連結を含む、請求項２５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  27. 各鎖が、３０個以下のヌクレオチドの長さである、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  28. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  29. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  30. 二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項１～２９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  31. 二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  32. 二本鎖領域が、１７～２５ヌクレオチド対の長さである、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  33. 二本鎖領域が、２３～２７ヌクレオチド対の長さである、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  34. 二本鎖領域が、１９～２１ヌクレオチド対の長さである、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  35. 二本鎖領域が、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  36. 各鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  37. 各鎖が、１９～２３ヌクレオチドを有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  38. 各鎖が、２１～２３ヌクレオチドを有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  39. １つまたは複数の親油性部分が、少なくとも１つの鎖における１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートしている、請求項１２～３８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  40. １つまたは複数の親油性部分が、リンカーまたは担体を介して少なくとも１つの鎖における１つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされる、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  41. 内部位置が、少なくとも１つの鎖の各端から末端の２つの位置を除く全ての位置を含む、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  42. 内部位置が、少なくとも１つの鎖の各端から末端の３つの位置を除く全ての位置を含む、請求項４０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  43. 内部位置が、センス鎖の切断部位領域を除く、請求項４０～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  44. 内部位置が、センス鎖の５’端から数えて位置９～１２を除く全ての位置を含む、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  45. 内部位置が、センス鎖の３’端から数えて位置１１～１３を除く全ての位置を含む、請求項４３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  46. 内部位置が、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、請求項４０～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  47. 内部位置が、アンチセンス鎖の５’端から数えて位置１２～１４を除く全ての位置を含む、請求項４６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  48. 内部位置が、センス鎖における３’端から数えて位置１１～１３および５’端から数えて位置１２～１４を除く全ての位置を含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  49. １つまたは複数の親油性部分が、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖における４～８位および１３～１８位、ならびにアンチセンス鎖における６～１０位および１５～１８位からなる群から選択される内部位置の１つまたは複数にコンジュゲートしている、請求項１２～４８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  50. １つまたは複数の親油性部分が、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖における５、６、７、１５、および１７位、ならびにアンチセンス鎖における１５および１７位からなる群から選択される内部位置の１つまたは複数にコンジュゲートしている、請求項４９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  51. 二本鎖領域中の位置が、センス鎖の切断部位領域を排除している、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  52. センス鎖が、２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチド長であり、親油性部分が、センス鎖の位置２１、位置２０、位置１５、位置１、位置７、位置６、もしくは位置２またはアンチセンス鎖の位置１６にコンジュゲートされる、請求項１２～５１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  53. 親油性部分が、センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、または７位にコンジュゲートしている、請求項５２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  54. 親油性部分が、センス鎖の２１位、２０位、または１５位にコンジュゲートしている、請求項５２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  55. 親油性部分が、センス鎖の２０位または１５位にコンジュゲートしている、請求項５２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  56. 親油性部分が、アンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートしている、請求項５２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  57. 親油性部分が、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である、請求項１２～５６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  58. 親油性部分が、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される、請求項５７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  59. 親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される適宜の官能基とを含有する、請求項５８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  60. 親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する、請求項５９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  61. 親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、請求項５９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  62. 飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖が、鎖の５’端から数えて位置６にコンジュゲートされる、請求項６１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  63. 親油性部分が、内部位置または二本鎖領域における１つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる、請求項１２～６０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  64. 担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環状基であるか、あるいはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格に基づく非環状部分である、請求項６３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  65. 親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる、請求項１２～６０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  66. 親油性部分が、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる、請求項１２～６５のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  67. 親油性部分または標的化リガンドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、およびそれらの組合せからなる群から選択される生物切断性リンカーを介してコンジュゲートされる、請求項１２～６６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  68. センス鎖の３’端が、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、前記環状基が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される、請求項１２～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  69. 肝臓組織を標的化する標的化リガンドをさらに含む、請求項１２～６８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  70. 標的化リガンドが、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートである、請求項６９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  71. Ｓｐ立体配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第１のインターヌクレオチド連結に存在する末端のキラル修飾、Ｒｐ立体配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第１のインターヌクレオチド連結に存在する末端のキラル修飾、およびＲｐ立体配置またはＳｐ立体配置のいずれかで連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第１のインターヌクレオチド連結に存在する末端のキラル修飾をさらに含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  72. Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
    ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    をさらに含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  73. Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１、第２、および第３のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
    ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる、末端キラル修飾
    をさらに含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  74. Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第３のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
    ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    をさらに含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  75. Ｓｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    Ｒｐ立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’端における第１および第２のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
    ＲｐまたはＳｐ立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の５’端における第１のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
    をさらに含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  76. アンチセンス鎖の５’端におけるホスフェートまたはホスフェート模倣物をさらに含む、請求項１～７５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  77. ホスフェート模倣物が、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項７６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  78. 二重鎖のアンチセンス鎖の５’端の１つの位置における塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項１～７７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  79. センス鎖が、合計２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が、合計２３ヌクレオチドを有する、請求項１～７８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  80. 請求項１～７９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞。
  81. 請求項１～７９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、ＡＰＯＥをコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  82. 請求項１～７９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤と脂質製剤とを含む医薬組成物。
  83. 細胞におけるＡＰＯＥの発現を阻害する方法であって、
    （ａ）細胞を、請求項１～７９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項８１または８２に記載の医薬組成物と接触させること；および
    （ｂ）工程（ａ）において産生された細胞を、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに十分な時間維持すること、それによって細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害すること
    を含む、方法。
  84. 細胞が、対象内にある、請求項８３に記載の方法。
  85. 対象がヒトである、請求項８４に記載の方法。
  86. ＡＰＯＥの発現が少なくとも５０％阻害される、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 対象が、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患の少なくとも１つの診断基準を満たす、請求項８５に記載の方法。
  88. 対象が、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患と診断されている、請求項８５に記載の方法。
  89. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患が、アミロイド－β媒介性疾患である、請求項８８に記載の方法。
  90. アミロイド－β媒介性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
  91. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患が、タウ媒介性疾患である、請求項８９に記載の方法。
  92. タウ媒介性疾患が、原発性タウオパチーまたは二次性タウオパチーである、請求項９１に記載の方法。
  93. 原発性タウオパチーが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（Ｃｏｒｄｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（Ｇｌｏｂｕｌａｒ ｇｌｉａｌ ｔａｕｏｐａｔｈｙ）（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
  94. 二次性タウオパチーが、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
  95. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患と診断された対象を処置する方法であって、治療有効量の請求項１～７９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項８１もしくは８２に記載の医薬組成物を対象に投与すること、それによって対象を処置することを含む、方法。
  96. 対象がヒトである、請求項９５に記載の方法。
  97. 処置することが、疾患の少なくとも１つの兆候または症状の改善を含む、請求項９５に記載の方法。
  98. 処置することが、疾患の進行の防止を含む、請求項９６に記載の方法。
  99. 対象が、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患と診断されている、請求項９５に記載の方法。
  100. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患が、アミロイド－β媒介性疾患である、請求項９８に記載の方法。
  101. アミロイド－β媒介性疾患が、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
  102. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患が、タウ媒介性疾患である、請求項９８に記載の方法。
  103. タウ媒介性疾患が、原発性タウオパチーまたは二次性タウオパチーである、請求項１０２に記載の方法。
  104. 原発性タウオパチーが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）からなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
  105. 二次性タウオパチーが、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症からなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
  106. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患の少なくとも１つの診断基準を満たす対象におけるＡＰＯＥ関連神経変性疾患の発症を防止する方法であって、治療有効量の請求項１～７９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項８１もしくは８２に記載の医薬組成物を対象に投与すること、それによってＡＰＯＥ関連神経変性疾患の少なくとも１つの診断基準を満たす対象におけるＡＰＯＥ関連神経変性疾患の発症を防止することを含む、方法。
  107. 対象がヒトである、請求項１０６に記載の方法。
  108. 対象が、ＡＰＯＥ関連神経変性疾患と診断されている、請求項１０６に記載の方法。
  109. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患が、アミロイド－β媒介性疾患である、請求項１０６に記載の方法。
  110. アミロイド－β媒介性疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症からなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
  111. ＡＰＯＥ関連神経変性疾患が、タウ媒介性疾患である、請求項１０６に記載の方法。
  112. タウ媒介性疾患が、原発性タウオパチーまたは二次性タウオパチーである、請求項１１１に記載の方法。
  113. 原発性タウオパチーが、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、球状グリアタウオパチー（ＧＧＴ）、パーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ、ＦＴＤＰ－１７）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、拳闘家認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、および原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
  114. 二次性タウオパチーが、ＡＤ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ダウン症候群、および家族性英国型認知症からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
  115. ｄｓＲＮＡ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの用量において対象に投与される、請求項９５～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. ｄｓＲＮＡ剤が、対象に髄腔内投与される、請求項９５～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、およびＡＰＯＥ４タンパク質の１つまたは複数のレベルを測定することをさらに含む、請求項９５～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. ＡＰＯＥ関連神経変性障害の処置または防止に適した追加の薬剤を対象に投与することをさらに含む、請求項９５～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 星状細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害する方法であって、
    （ａ）星状細胞を、請求項１～７９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項８１もしくは８２に記載の医薬組成物と接触させること；および
    （ｂ）工程（ａ）において産生された星状細胞を、ＡＰＯＥ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに十分な時間維持すること、それによって星状細胞におけるＡＰＯＥ遺伝子の発現を阻害すること
    を含む、方法。
  120. 星状細胞が対象内にある、請求項１１９に記載の方法。
  121. 対象がヒトである、請求項１２０に記載の方法。
  122. 星状細胞を接触させることが、医薬組成物の髄腔内（ｉｎｔｈｒａｔｈｅｃａｌ）投与による、請求項１１９～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖が、ＡＤ－１２０４７０４、ＡＤ－１２０４７０５、ＡＤ－１２０４７０８、およびＡＤ－１２０４７１２からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１１９～１２２のいずれか一項に記載の方法。
JP2022565879A 2020-04-27 2021-04-26 アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法 Pending JP2023523993A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063015867P 2020-04-27 2020-04-27
US63/015,867 2020-04-27
PCT/US2021/029081 WO2021222065A1 (en) 2020-04-27 2021-04-26 Apolipoprotein e (apoe) irna agent compositions and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023523993A true JP2023523993A (ja) 2023-06-08
JPWO2021222065A5 JPWO2021222065A5 (ja) 2024-05-09

Family

ID=75919437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022565879A Pending JP2023523993A (ja) 2020-04-27 2021-04-26 アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230193268A1 (ja)
EP (1) EP4143319A1 (ja)
JP (1) JP2023523993A (ja)
KR (1) KR20230018377A (ja)
CN (1) CN115955972A (ja)
AU (1) AU2021263554A1 (ja)
BR (1) BR112022021813A2 (ja)
CA (1) CA3181400A1 (ja)
IL (1) IL297702A (ja)
MX (1) MX2022013525A (ja)
WO (1) WO2021222065A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023078883A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating apolipoprotein e4 expression
US20230242988A1 (en) * 2022-01-23 2023-08-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods Of Improving Health With Apolipoprotein E (APOE) Inhibitors

Family Cites Families (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
ATE113059T1 (de) 1987-06-24 1994-11-15 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DK0942000T3 (da) 1989-10-24 2004-11-01 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modificerede oligonukleotider
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
CA2088258C (en) 1990-07-27 2004-09-14 Phillip Dan Cook Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
NZ239247A (en) 1990-08-03 1993-11-25 Sterling Drug Inc Oligonucleosides containing a non-phosphate inter nucleoside linkage
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
US5596086A (en) 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE69132510T2 (de) 1990-11-08 2001-05-03 Hybridon Inc Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
WO1993009668A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 Affymax Technology N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
ATE317848T1 (de) 1991-12-24 2006-03-15 Isis Pharmaceuticals Inc Unterbrochene 2'-modifizierte oligonukleotide
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
EP0648265A4 (en) 1992-06-18 1996-12-04 Genpharm Int PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS HAVING AN ARTIFICIAL YEAST CHROMOSOME.
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP0654077A4 (en) 1992-07-17 1996-03-13 Ribozyme Pharm Inc PROCESS AND REAGENT FOR THE TREATMENT OF DISEASES IN ANIMALS.
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
RU2143903C1 (ru) 1993-02-19 2000-01-10 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Фармацевтическая композиция, содержащая сополимер нуклеиновой кислоты
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
EP0691968B1 (en) 1993-03-30 1997-07-16 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
EP0691977B1 (en) 1993-03-31 1997-11-26 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
IL111659A0 (en) 1993-11-16 1995-01-24 Genta Inc Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
WO2000022114A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
US6222025B1 (en) 1995-03-06 2001-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of 2′-O-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
CA2220950A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
EP0832271B8 (en) 1995-06-07 2005-03-02 INEX Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
CA2303299C (en) 1997-09-12 2016-02-23 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
DE69906977T2 (de) 1998-07-20 2004-05-19 Protiva Biotherapeutics Inc., Burnaby In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
KR20010099682A (ko) 1998-10-09 2001-11-09 추후보충 단일가닥 ｄｎａ의 효소 합성
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
JP2002537343A (ja) 1999-02-23 2002-11-05 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 多重粒子製剤
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
CA2372085C (en) 1999-05-04 2009-10-27 Exiqon A/S L-ribo-lna analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
AU2001227965A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
ATE325806T1 (de) 2000-10-04 2006-06-15 Santaris Pharma As Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
AU2002323151A1 (en) 2001-08-13 2003-03-03 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
US8101348B2 (en) 2002-07-10 2012-01-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
US7696345B2 (en) 2002-11-05 2010-04-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004044139A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
AU2005212433B2 (en) 2003-05-23 2010-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sINA)
JP4731324B2 (ja) 2003-08-28 2011-07-20 武 今西 Ｎ−ｏ結合性架橋構造型新規人工核酸
TWI335352B (en) 2005-03-31 2011-01-01 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
WO2007091269A2 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
AU2007235231B2 (en) 2006-04-07 2012-04-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds for TLR7 and TLR8
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
MX363224B (es) 2006-10-03 2019-03-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Formulaciones que contienen lipidos.
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
CA2687850C (en) 2007-05-22 2017-11-21 Mdrna, Inc. Oligomers for therapeutics
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
AU2008272918B2 (en) 2007-07-05 2012-09-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
EP2178567A4 (en) 2007-07-09 2010-11-03 Idera Pharmaceuticals Inc STABILIZED IMMUNOMODULATOR RNA COMPOUNDS (SIMRA)
AU2008333811B2 (en) 2007-12-04 2014-05-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
ES2638448T3 (es) 2008-04-15 2017-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Novedosas formulaciones de lípidos para la administración de ácidos nucleicos
EP2321414B1 (en) 2008-07-25 2018-01-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Enhancement of sirna silencing activity using universal bases or mismatches in the sense strand
KR20210158864A (ko) 2008-11-10 2021-12-31 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
CN104673798B (zh) 2008-12-03 2018-03-20 阿克丘勒斯治疗公司 UsiRNA复合物
AU2010208035B2 (en) 2009-01-29 2016-06-23 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
EP3097908A1 (en) 2009-05-05 2016-11-30 Arbutus Biopharma Corporation Lipid compositions
JP5875976B2 (ja) 2009-06-01 2016-03-02 ヘイロー−バイオ アールエヌエーアイ セラピューティクス， インコーポレイテッド 多価ｒｎａ干渉のためのポリヌクレオチド、組成物およびそれらの使用方法
PT3431076T (pt) 2009-06-10 2021-10-26 Arbutus Biopharma Corp Formulação lipídica melhorada
WO2011005860A2 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5' phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
ES2646097T3 (es) 2009-08-27 2017-12-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composición para inhibir la expresión de genes y sus usos
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011139710A1 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof
EP2723865B1 (en) 2011-06-21 2019-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. METHODS FOR DETERMINING ACTIVITY OF RNAi IN A SUBJECT
EP2753631A1 (en) 2011-09-07 2014-07-16 Marina Biotech, Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
US9399775B2 (en) 2011-11-18 2016-07-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (TTR) associated diseases
WO2013181618A2 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods to treat alzheimer's disease using apoe inhibitors
CA2921514C (en) 2013-05-01 2023-10-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein c-iii expression
EP3102253A1 (en) 2014-01-31 2016-12-14 University Hospitals Systems and methods for intrathecal delivery of a pharmaceutical agent
CA3074320A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents and compositions for inhibiting expression of angiopoietin-like 3 (angptl3), and methods of use
WO2019100039A1 (en) * 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
WO2020060987A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use
CN113811311A (zh) * 2019-03-15 2021-12-17 马萨诸塞大学 用于组织特异性apoe调节的寡核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022021813A2 (pt) 2023-01-17
CN115955972A (zh) 2023-04-11
MX2022013525A (es) 2023-01-24
WO2021222065A1 (en) 2021-11-04
CA3181400A1 (en) 2021-11-04
WO2021222065A8 (en) 2021-12-09
AU2021263554A1 (en) 2022-12-08
KR20230018377A (ko) 2023-02-07
US20230193268A1 (en) 2023-06-22
EP4143319A1 (en) 2023-03-08
IL297702A (en) 2022-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11034957B2 (en) Amyloid precursor protein (APP) RNAi agent compositions and methods of use thereof
US20230203486A1 (en) MICROTUBULE ASSOCIATED PROTEIN TAU (MAPT) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US20230193268A1 (en) APOLIPOPROTEIN E (APOE) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
JP2023506181A (ja) ヒト第９染色体オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法
JP2023500661A (ja) ハンチンチン（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法
US11649459B2 (en) Superoxide dismutase 1 (SOD1) iRNA compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1-(SOD1-) associated neurodegenerative diseases
WO2023039503A2 (en) App irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing diseases characterized by enlarged endosomes
EP4221838A1 (en) Snca irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing snca-associated neurodegenerative diseases
EP4188390A1 (en) Atxn2 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing atxn2-associated neurodegenerative diseases
US20240124882A1 (en) Prion protein (prnp) irna compositions and methods of use thereof
US20240150767A1 (en) SUPEROXIDE DISMUTASE 1 (SOD1) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR PREVENTING SUPEROXIDE DISMUTASE 1- (SOD1-) ASSOCIATED NEURODEGENERATIVE DISEASES
US20240132895A1 (en) GLYCOGEN SYNTHASE KINASE 3 ALPHA (GSK3 ALPHA) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
JP2023511434A (ja) ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法
WO2023192977A2 (en) Snca-targeting sirna compositions for treating snca-associated disease
EP4359522A1 (en) Irna compositions and methods for silencing filamin a (flna)
WO2023154900A2 (en) Microtubule associated protein tau (mapt) irna agent compositions and methods of use thereof
WO2022192519A1 (en) Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
EP4127134A1 (en) Alpha-2a adrenergic receptor (adra2a) irna agent compositions and methods of use thereof
JP2024512635A (ja) ハンチンチン（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法
CN117120610A (zh) 用于治疗或预防超氧化物歧化酶1（SOD1）相关神经退行性疾病的超氧化物歧化酶1（SOD1）iRNA组合物以及其使用方法