ES2638448T3 - Novedosas formulaciones de lípidos para la administración de ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende: (a) un ácido nucleico; (b) un lípido catiónico que comprende del 50 % en moles al 65 % en moles del lípido total presente en la partícula; (c) un lípido no catiónico que comprende hasta el 49,5 % en moles del lípido total presente en la partícula y que comprende una mezcla de un fosfolípido y colesterol o un derivado del mismo, en el que el colesterol o derivado del mismo comprende del 30 % en moles al 40 % en moles del lípido total presente en la partícula; y (d) un conjugado de lípido que inhibe la agregación de partículas que comprende del 0,5 % en moles al 2 % en moles del lípido total presente en la partícula.

Description

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DESCRIPCION
Novedosas formulaciones de lipidos para la administracion de acidos nucleicos Antecedentes de la invencion
La interferencia por ARN (iARN) es un proceso evolutivamente conservado en el que el reconocimiento de ARN bicatenario (ARNbc) conduce por ultimo lugar a la supresion postranscripcional de la expresion genica. Esta supresion esta mediada por ARNbc corto, tambien llamado ARN interferente pequeno (ARNip), que induce degradacion especffica de ARNm mediante apareamiento de bases complementarias. En varios sistemas modelo, esta respuesta natural se ha desarrollado en una poderosa herramienta para la investigacion de la funcion genica (vease, por ejemplo, Elbashir et al., Genes Dev., 15:188-200 (2001); Hammond et al., Nat. Rev. Genet., 2:110-119 (2001)). Mas recientemente, se descubrio que la introduccion de duplex de ARNbc de 21 nucleotidos sinteticos en celulas de mamffero podrfa silenciar eficientemente la expresion genica.
Aunque el mecanismo preciso no esta todavfa claro, la iARN proporciona un posible nuevo enfoque para regular por disminucion o silenciar la transcripcion y traduccion de un gen de interes. Por ejemplo, se desea modular (por ejemplo, reducir) la expresion de ciertos genes para el tratamiento de trastornos neoplasicos tales como el cancer. Tambien se desea silenciar la expresion de genes asociados a enfermedades y trastornos del hfgado tales como hepatitis. Se desea ademas reducir la expresion de ciertos genes para el tratamiento de aterosclerosis y sus manifestaciones, por ejemplo, hipercolesterolemia, infarto de miocardio y trombosis.
Se requiere un sistema de administracion de acidos nucleicos seguro y eficaz para que la iARN sea terapeuticamente util. Los vectores vfricos son sistemas de administracion genica relativamente eficientes, pero padecen una variedad de limitaciones, tales como potencial de inversion a los problemas de respuesta no mutante, ademas de inmunitaria. Como resultado, los sistemas de administracion genica no vfricos estan recibiendo cada vez mas atencion (Worgall et al., Human Gene Therapy, 8:37 (1997); Peeters et al., Human Gene Therapy, 7:1693 (1996); Yei et al., Gene Therapy, 1:192 (1994); Hope et al., Molecular Membrane Biology, 15:1 (1998)). Ademas, los sistemas vfricos son rapidamente eliminados de la circulacion, limitando la transfeccion a organos de "primer paso" tales como los pulmones, hfgado y bazo. Ademas, estos sistemas inducen respuestas inmunitarias que comprometen la administracion con inyecciones posteriores.
Los complejos de ADN de plasmido-liposoma cationico son actualmente los vehfculos de administracion genica no vfrica mas comunmente empleados (Feigner, Scientific American, 276:102 (1997); Chonn et al., Current Opinion in Biotechnology, 6:698 (1995)). Por ejemplo, los complejos de liposoma cationico hechos de un compuesto anfipatico, un lfpido neutro y un detergente para transfectar celulas de insecto se desvelan en la patente de EE.UU. N.° 6.458.382. Tambien se desvelan complejos de liposoma cationico en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20030073640.
Los complejos de liposoma cationico son sistemas grandes poco definidos que no son aptos para aplicaciones sistemicas y pueden provocar efectos secundarios toxicos considerables (Harrison et al., Biotechniques, 19:816 (1995); Li et al., The Gene, 4:891 (1997); Tam et al, Gene Ther., 7:1867 (2000)). Como agregados grandes, positivamente cargados, los lipoplejos son rapidamente eliminados cuando se administran in vivo, con los niveles de expresion mas altos observados en los organos de primer paso, particularmente los pulmones (Huang et al., Nature Biotechnology, 15:620 (1997); Templeton et al., Nature Biotechnology, 15:647 (1997); Hofland et al., Pharmaceutical Research, 14:742 (1997)).
Otros sistemas de administracion liposomica incluyen, por ejemplo, el uso de micelas inversas, liposomas anionicos y liposomas de polfmero. Las micelas inversas se desvelan en la patente de EE.UU. N.° 6.429.200. Los liposomas anionicos se desvelan en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20030026831. Los liposomas de polfmero que incorporan dextrina o polfmeros de glicerol-fosfocolina se desvelan en las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20020081736 y 20030082103, respectivamente.
Un sistema de administracion genica que contiene un acido nucleico encapsulado para administracion sistemica debe ser pequeno (es decir, menos de aproximadamente 100 nm de diametro) y debe permanecer intacto en la circulacion durante un periodo de tiempo prolongado con el fin de lograr la administracion a los tejidos afectados. Esto requiere una partfcula que contiene acido nucleico resistente al suero altamente estable que no interaccione con celulas y otros componentes del compartimento vascular. La partfcula debe tambien interaccionar facilmente con celulas diana en un sitio de enfermedad con el fin de facilitar la administracion intracelular de un acido nucleico deseado.
Trabajo reciente ha mostrado que los acidos nucleicos pueden encapsularse en "partfculas de plasmido-lfpido estabilizadas" (SPLP) pequenas (por ejemplo, aproximadamente 70 nm de diametro) que consisten en un unico plasmido encapsulado dentro de una vesfcula de lfpido bicapa (Wheeler et al., Gene Therapy, 6:271 (1999)). Estas SPLP normalmente contienen el lfpido "fusogenico" dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), bajos niveles de lfpido cationico, y se estabilizan en medios acuosos por la presencia de un recubrimiento de poli(etilenglicol) (PEG). Las
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SPLP tienen aplicacion sistemica, ya que presentan vidas en circulacion prolongadas tras la inyeccion intravenosa (i.v.), se acumulan preferencialmente en sitios tumorales distales debido a la potenciada permeabilidad vascular en tales regiones, y pueden mediar en la expresion transgenica en estos sitios tumorales. Los niveles de expresion
transgenica observados en el sitio tumoral tras la inyeccion i.v. de SPLP que contienen el gen marcador de
luciferasa son superiores a los niveles que pueden lograrse empleando ADN de complejos de plasmido-liposoma cationico (lipoplejos) o ADN desnudo.
Asf, sigue existiendo una fuerte necesidad en la materia de metodos y composiciones novedosos y mas eficientes para introducir acidos nucleicos tales como ARNip en celulas. Ademas, existe una necesidad en la materia de metodos de regulacion por disminucion de la expresion de genes de interes para tratar o prevenir enfermedades y trastornos tales como cancer y aterosclerosis. La presente invencion trata estas y otras necesidades.
La publicacion de patente de EE.UU. N.° 2005064595 desvela ARN interferente encapsulado en lfpidos.
La publicacion de patente de EE.UU. N.° 2006008910 desvela ARN interferente encapsulado en lfpidos.
La publicacion de patente WO N.° 2006053430 desvela el silenciamiento de ARNip de apolipoprotefna b. La publicacion de patente WO N.° No 2007056861 desvela el silenciamiento de ARNip de la expresion genica del virus de la gripe.
La publicacion de patente WO N.° 2005035764 desvela acidos nucleicos autogenos que codifican una ARN polimerasa secretable.
La publicacion de patente WO N.° 2006002538 desvela moleculas de ARNip inmunoestimulantes y usos de las mismas.
Breve sumario de la invencion
En el presente documento se describen novedosas partfculas de lfpido estables en suero que comprenden uno o mas agentes activos o agentes terapeuticos, metodos de preparacion de las partfculas de lfpido, y metodos de suministro y/o administracion de las partfculas de lfpido (por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno).
La presente invencion proporciona una partfcula de acido nucleico-lfpido que comprende:
(a) un acido nucleico;
(b) un lfpido cationico que comprende del 50 % en moles al 65 % en moles del lfpido total presente en la partfcula;
(c) un lfpido no cationico que comprende hasta el 49,5 % en moles del lfpido total presente en la partfcula y que comprende una mezcla de un fosfolfpido y colesterol o un derivado del mismo, en la que el colesterol o derivado del mismo comprende del 30 % en moles al 40 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; y
(d) un lfpido conjugado que inhibe la agregacion de partfculas que comprende del 0,5 % en moles al 2 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En realizaciones preferidas, el agente activo o agente terapeutico esta completamente encapsulado dentro de la porcion de lfpido de la partfcula de lfpido de forma que el agente activo o agente terapeutico en la partfcula de lfpido sea resistente en solucion acuosa a la degradacion enzimatica, por ejemplo, por una nucleasa o proteasa. En otras realizaciones preferidas, las partfculas de lfpido son sustancialmente no toxicas para los mamfferos tales como los seres humanos.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona partfculas de lfpido que comprenden: (a) uno o mas agentes activos o agentes terapeuticos; (b) uno o mas lfpidos cationicos que comprenden de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; (c) uno o mas lfpidos no cationicos que comprenden de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; y (d) uno o mas lfpidos conjugados que inhiben la agregacion de partfculas que comprenden de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
Mas particularmente, la presente divulgacion proporciona partfculas de acido nucleico-lfpido estables en suero (SNALP) que comprenden un acido nucleico (por ejemplo, una o mas moleculas de ARN interferente tales como ARNip, ARNia y/o miARN), metodos de preparacion de SNALP, y metodos de suministro y/o de administracion de SNALp (por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno).
En ciertos aspectos, la partfcula de acido nucleico-lfpido (por ejemplo, SNALP) comprende: (a) un acido nucleico (por ejemplo, un ARN interferente); (b) un lfpido cationico que comprende de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; (c) un lfpido no cationico que comprende de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles del lfpido total presente en la
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partfcula; y (d) un lipido conjugado que inhibe la agregacion de partfculas que comprende de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En un aspecto preferido, la partfcula de acido nucleico-lfpido (por ejemplo, SNALP) comprende: (a) un ARNip; (b) un lipido cationico que comprende de aproximadamente el 56,5 % en moles a aproximadamente el 66,5 % en moles del lipido total presente en la partfcula; (c) colesterol o un derivado del mismo que comprende de aproximadamente el 31,5 % en moles a aproximadamente el 42,5 % en moles del lipido total presente en la partfcula; y (d) un conjugado de PEG-lfpido que comprende de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Esta partfcula de acido nucleico-lfpido se denomina generalmente en el presente documento la formulacion "1:62".
En una realizacion preferida, la partfcula de acido nucleico-lfpido (por ejemplo, SNALP) comprende: (a) un ARNip; (b) un lipido cationico que comprende de aproximadamente el 52 % en moles a aproximadamente el 62 % en moles del lipido total presente en la partfcula; (c) una mezcla de un fosfolfpido y colesterol o un derivado del mismo que comprende de aproximadamente el 36 % en moles a aproximadamente el 47 % en moles del lipido total presente en la partfcula; y (d) un conjugado de PEG-lfpido que comprende de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Esta realizacion preferida de la partfcula de acido nucleico-lfpido se denomina generalmente en el presente documento la formulacion "1:57".
La presente invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una partfcula de acido nucleico-lfpido de la invencion y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. La presente invencion tambien proporciona un metodo de introduccion de un acido nucleico en una celula, comprendiendo el metodo: poner en contacto la celula in vitro con una partfcula de acido nucleico-lfpido de la invencion, opcionalmente en el que la celula es una celula de mamffero.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos de introduccion de un agente activo o agente terapeutico (por ejemplo, acido nucleico) en una celula, comprendiendo el metodo poner en contacto la celula con una partfcula de lipido descrita en el presente documento tal como una partfcula de acido nucleico-lfpido (por ejemplo, SNALP).
La presente invencion tambien proporciona la partfcula de acido nucleico-lfpido de la invencion para su uso en un metodo para la administracion in vivo de un acido nucleico, comprendiendo el metodo administrar dicha partfcula de acido nucleico-lfpido a un sujeto mamffero.
En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona metodos para la administracion in vivo de un agente activo o agente terapeutico (por ejemplo, acido nucleico), comprendiendo el metodo administrar a un sujeto mamffero una partfcula de lipido descrita en el presente documento tal como una partfcula de acido nucleico-lfpido (por ejemplo, SNALP).
La presente invencion tambien proporciona una partfcula de acido nucleico-lfpido de la invencion para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto mamffero que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha partfcula de acido nucleico-lfpido al sujeto mamffero, en la que la enfermedad o trastorno se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en una infeccion vfrica, un enfermedad o trastorno del hfgado, y cancer.
En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona metodos de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto mamffero que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar al sujeto mamffero una cantidad terapeuticamente eficaz de una partfcula de lipido descrita en el presente documento tal como una partfcula de acido nucleico-lfpido (por ejemplo, SNALP).
Otros objetos, caracterfsticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes para un experto en la materia a partir de la siguiente descripcion detallada y figuras.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra datos que demuestran la actividad de SNALP 1:57 que contiene ARNip de Eg5 en una lfnea de celulas de cancer de colon humano.
La Figura 2 ilustra datos que demuestran la actividad de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB tras la administracion intravenosa en ratones.
La Figura 3 ilustra datos adicionales que demuestran la actividad de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB tras la administracion intravenosa en ratones. Cada barra representa la media por grupo de cinco animales. Las barras de error indican la desviacion estandar.
La Figura 4 ilustra datos que demuestran la actividad de SNALP 1:57 y 1:62 que contiene ARNip de ApoB tras la administracion intravenosa en ratones.
La Figura 5 ilustra datos que demuestran la actividad de SNALP 1:62 que contiene ARNip de ApoB tras la administracion intravenosa en ratones.
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La Figura 6 ilustra datos que demuestran que la tolerabilidad de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB preparado por dilucion directa en tampon citrato frente a PBS no se diferencio significativamente en terminos de parametros de bioqufmica clfnica de la sangre.
La Figura 7 ilustra datos que demuestran que la eficacia de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB preparado por bomba de engranajes fue similar a la misma SNALP preparada por prensa de jeringa.
La Figura 8 ilustra datos que demuestran que hubo muy poco efecto sobre el peso corporal 24 horas despues de la administracion de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB.
La Figura 9 ilustra datos que demuestran que no hubo cambios obvios en la cifra de plaquetas despues de la administracion de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB.
La Figura 10 ilustra datos que demuestran que ocurrieron elevaciones de enzima hepatica clfnicamente significativas (3xULN) a dosificaciones de farmaco particulares de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB.
La Figura 11 ilustra datos que demuestran que la potencia de SNALP 1:57 de lfpido:farmaco (L:D) mas baja que contiene ARNip de ApoB fue tan buena como la de SNALP de L:D mas alta a todas las dosificaciones de farmaco probadas.
La Figura 12 ilustra datos que demuestran que se redujeron los niveles de protefna ApoB y de colesterol total a un grado similar por SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB a una relacion L:D de entrada de 6:1 (relacion final de 7:1) y SNALP 1:57 a una relacion L:D de entrada de 9:1 (relacion final de 10:1).
La Figura 13 ilustra datos que demuestran que una pauta de tratamiento de SNALP 1:57 con ARNip que se dirige a PLK-1 es bien tolerada sin signos evidentes de toxicidad relacionada con el tratamiento en ratones portadores de tumores de hfgado Hep3B.
La Figura 14 ilustra datos que demuestran que el tratamiento con SNALP 1:57 que contiene ARNip de PLK-1 causo un aumento significativo en la supervivencia de ratones portadores de tumores Hep3B.
La Figura 15 ilustra datos que demuestran que el tratamiento con SNALP 1:57 que contiene ARNip de PLK-1 redujo los niveles de ARNm de PLK-1 el 50 % en tumores Hep3B intrahepaticos que crecen en ratones 24 horas despues de la administracion de SNALP.
La Figura 16 ilustra datos que demuestran que un producto de escision especffico de ARNm de PLK-1 fue detectable por 5' RACE-PCR en ratones tratados con SNALP 1:57 que contenfa ARNip de PLK-1. Se cargaron 10 pl de producto de PCR/pocillo en un gel al 1,5 % de agarosa. Carriles N.° (1) marcador de peso molecular (MW); (2) PBS raton 1; (3) PBS raton 2; (4) PBS raton 3; (5) Luc SNALP raton 1; (6) Luc SNALP raton 2; (7) PLK SNALP raton 1; (8) PLK SNALP raton 2; (9) PLK SNALP raton 3; y (10) sin control de molde.
La Figura 17 ilustra datos que demuestran que los ratones tratados con SNALP 1:57 de control (Luc) presentaron mitosis normales en tumores Hep3B (paneles superiores), mientras que los ratones tratados con SNALP 1:57 que contenfa ARNip de PLK-1 presentaron numerosas mitosis anomalas y apoptosis de celulas tumorales en tumores Hep3B (paneles inferiores).
La Figura 18 ilustra datos que demuestran que multiples dosis de SNALP 1:57 PLK-1 que contenfan PEG-cDSA indujeron la regresion de tumores subcutaneos (S.C.) Hep3B establecidos.
La Figura 19 ilustra datos que demuestran el silenciamiento de ARNm de PLK-1 usando SNALP 1:57 PLK en tumores Hep3B S.C. tras una unica administracion intravenosa de SNALP.
La Figura 20 ilustra datos que demuestran que PLK-1 PEG-cDSA SNALP inhibio el crecimiento de tumores Hep3B S.C. grandes.
La Figura 21 ilustra datos que demuestran el silenciamiento de ARNm de PLK-1 derivado de tumor en tumores intrahepaticos Hep3B.
La Figura 22 ilustra datos que demuestran el perfil de eliminacion de la sangre de SNALP 1:57 PLK-1 que contiene o bien PEG-cDMA o bien PEG-cDSA.
Descripcion detallada de la invencion
I. Introduccion
La presente invencion se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento que las partfculas de lfpido que comprenden de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles de un lfpido cationico, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles de un lfpido no cationico y de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles de un lfpido conjugado proporcionan ventajas cuando se usan para la administracion in vitro o in vivo de un agente activo, tal como un acido nucleico terapeutico (por ejemplo, un ARN interferente). En particular, como se ilustra por los ejemplos en el presente documento, en el presente documento se describen partfculas de acido nucleico-lfpido (SNALP) estables que confieren actividad ventajosamente elevada del acido nucleico encapsulado (por ejemplo, un ARN interferente tal como ARNip) y tolerabilidad mejorada de las formulaciones in vivo, produciendo un aumento significativo en el fndice terapeutico en comparacion con las composiciones de partfculas de acido nucleico-lfpido previamente descritas. Adicionalmente, las SNALP descritas en el presente documento son estables en circulacion, por ejemplo, resistentes a la degradacion por nucleasas en suero, y son sustancialmente no toxicas para los mamfferos tales como los seres humanos. Como ejemplo no limitante, la Figura 3 del Ejemplo 4 muestra que una realizacion de SNALP de la invencion ("SNALP 1:57") fue mas de 10 veces mas eficaz en comparacion con una partfcula de acido nucleico- lfpido previamente descrita ("SNALP 2:30") en mediar en el silenciamiento de genes diana a una dosis 10 veces mas baja. Similarmente, la Figura 2 del Ejemplo 3 muestra que la formulacion "SNALP 1:57" fue sustancialmente mas eficaz en el silenciamiento de la expresion de un gen diana en comparacion con las partfculas de acido nucleico-
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lipido previamente descritas ("SNALP 2:40").
En ciertas realizaciones, la presente divulgacion proporciona composiciones mejoradas para la administracion de ARN interferente tal como moleculas de ARNip. En particular, los ejemplos en el presente documento ilustran que las formulaciones de partfculas de lipido mejoradas descritas en el presente documento son altamente eficaces en regular por disminucion los niveles de ARNm y/o de protefna de genes diana. Ademas, los ejemplos en el presente documento ilustran que la presencia de ciertas relaciones molares de componentes de lipido produce actividad mejorada o potenciada de estas formulaciones de partfculas de lipido de la presente divulgacion. Por ejemplo, las formulaciones "SNALP 1:57" y "SNALP 1:62" descritas en el presente documento son particularmente ventajosas debido a que proporcionan eficacia y tolerabilidad mejoradas in vivo, son estables en suero, son sustancialmente no toxicas, son capaces de acceder a sitios extravasculares, y son capaces de llegar a poblaciones de celulas diana.
Las partfculas de lipido y las composiciones de la presente divulgacion pueden usarse para una variedad de fines, que incluyen la administracion de agentes terapeuticos asociados o encapsulados a celulas, tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona metodos de tratamiento de enfermedades o trastornos en un sujeto en necesidad de los mismos, poniendo en contacto el sujeto con una partfcula de lipido descrita en el presente documento que comprende uno o mas agentes terapeuticos adecuados.
Diversas realizaciones a modo de ejemplo de las partfculas de lipido de la presente divulgacion, ademas de las composiciones y formulaciones que las comprenden, y su uso para administrar agentes terapeuticos y modular la expresion de genes y protefnas diana, se describen en mas detalle mas adelante.
II. Definiciones
Como se usa en el presente documento, los siguientes terminos tienen los significados atribuidos a ellos, a menos que se especifique lo contrario.
El termino "ARN interferente" o "ARNi" o "secuencia de ARN interferente" se refiere a ARN monocatenario (por ejemplo, miARN maduro) o ARN bicatenario (es decir, ARN duplex tal como ARNip, ARNia o pre-miARN) que es capaz de reducir o inhibir la expresion de un gen diana o secuencia (por ejemplo, mediando en la degradacion o inhibiendo la traduccion de ARNm que son complementarios a la secuencia de ARN interferente) cuando el ARN interferente esta en la misma celula que el gen diana o secuencia. ARN interferente se refiere asf al ARN monocatenario que es complementario a una secuencia de ARNm diana o al ARN bicatenario formado por dos hebras complementarias o por una unica hebra auto-complementaria. El ARN interferente puede tener identidad sustancial o completa con el gen diana o secuencia, o puede comprender una region de correspondencia (es decir, un motivo de correspondencia). La secuencia del ARN interferente puede corresponderse con el gen diana de longitud completa, o una subsecuencia del mismo.
El ARN interferente incluye "ARN interferente pequeno" o "ARNip", por ejemplo, ARN interferente de aproximadamente 15-60, 15-50 o 15-40 nucleotidos (duplex) de longitud, mas normalmente aproximadamente 1530, 15-25 o 19-25 nucleotidos (duplex) de longitud, y tiene preferentemente aproximadamente 20-24, 21-22 o 21-23 nucleotidos (duplex) de longitud (por ejemplo, cada secuencia complementaria del ARNip bicatenario tiene 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 o 19-25 nucleotidos de longitud, preferentemente aproximadamente 20-24, 21-22 o 21-23 nucleotidos de longitud, y el ARNip bicatenario tiene aproximadamente 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 o 19-25 pares de bases de longitud, preferentemente aproximadamente 18-22, 19-20 o 19-21 pares de bases de longitud). Los duplex de ARNip pueden comprender nucleotidos protuberantes en 3' de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 nucleotidos o aproximadamente 2 a aproximadamente 3 nucleotidos y extremos fosfato de 5'. Ejemplos de ARNip incluyen, sin limitacion, una molecula de polinucleotidos bicatenaria ensamblada a partir de dos moleculas de cadenas separadas, en la que una hebra es la hebra codificante y la otra es la hebra no codificante complementaria; una molecula de polinucleotidos bicatenaria ensamblada a partir de una molecula monocatenaria, donde las regiones codificantes y no codificantes estan unidas por un conector basado en acido nucleico o no basado en acido nucleico; una molecula de polinucleotidos bicatenaria con una estructura secundaria de horquilla que tiene regiones codificantes y no codificantes auto-complementarias; y una molecula de polinucleotidos monocatenaria circular con dos o mas estructuras de lazo y un tallo que tiene regiones codificantes y no codificantes auto-complementarias, donde el polinucleotido circular puede procesarse in vivo o in vitro para generar una molecula de ARNip bicatenaria activa.
Preferentemente, los ARNip se sintetizan qufmicamente. El ARNip tambien puede generarse por escision de ARNbc mas largo (por ejemplo, ARNbc superior a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud) con la RNasa III de E. coli o Dicer. Estas enzimas procesan el ARNbc en ARNip biologicamente activo (veanse, por ejemplo, Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:14236 (2002); Byrom et al., Ambion TechNotes, 10(1 ):4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001); y Robertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968)). Preferentemente, los ARNbc tienen al menos 50 nucleotidos a aproximadamente 100, 200, 300, 400 o 500 nucleotidos de longitud. Un ARNbc puede ser tan largo como 1000, 1500, 2000, 5000 nucleotidos de longitud, o mas largo. El ARNbc puede codificar un transcrito de genes entero o un transcrito de genes parcial. En ciertos casos, el ARNip puede ser codificado por un
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plasmido (por ejemplo, transcrito como secuencias que se pliegan automaticamente en duplex con lazos en horquilla).
Como se usa en el presente documento, el termino "motivo de correspondencia" o "region de correspondencia" se refiere a una porcion de una secuencia de ARN interferente (por ejemplo, ARNip, ARNia, miARN) que no tiene el 100 % de complementariedad con su secuencia diana. Un aRn interferente puede tener al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas regiones de correspondencia. Las regiones de correspondencia pueden ser contiguas o puede estar separadas por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o mas nucleotidos. Los motivos o regiones de correspondencia pueden comprender un unico nucleotido o pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o mas nucleotidos.
Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapeuticamente eficaz" de un agente activo o agente terapeutico tal como un ARN interferente es una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, por ejemplo, una inhibicion de la expresion de una secuencia diana en comparacion con el nivel de expresion normal detectado en ausencia de un aRn interferente. La inhibicion de la expresion de un gen diana o secuencia diana se logra cuando el valor obtenido con un ARN interferente con respecto al control es aproximadamente el 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, o el 0 %. Ensayos adecuados para medir la expresion de un gen diana o secuencia diana incluyen, por ejemplo, examen de niveles de protefna o ARN usando tecnicas conocidas para aquellos expertos en la materia, tales como transferencias puntuales, transferencias Northern, hibridacion in situ, ELISA, inmunoprecipitacion, funcion enzimatica, ademas de ensayos fenotfpicos conocidos para aquellos expertos en la materia.
Por "disminuir", "disminucion", "reducir" o "reduccion" de una respuesta inmunitaria por un ARN interferente se pretende significar una disminucion detectable de una respuesta inmunitaria a un ARN interferente dado (por ejemplo, un ARN interferente modificado). La cantidad de disminucion de una respuesta inmunitaria por un ARN interferente modificado puede determinarse con respecto al nivel de una respuesta inmunitaria en presencia de un ARN interferente no modificado. Una disminucion detectable puede ser aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, el 100 %, o mas baja que la respuesta inmunitaria detectada en presencia del ARN interferente no modificado. Una disminucion en la respuesta inmunitaria al ARN interferente normalmente se mide por una disminucion en la produccion de citocinas (por ejemplo, IFNy, IFNa, TNFa, IL-6 o IL-12) por una celula respondedora in vitro o una disminucion en la produccion de citocinas en los sueros de un sujeto mamffero despues de la administracion del ARN interferente.
Como se usa en el presente documento, el termino "celula respondedora" se refiere a una celula, preferentemente una celula de mamffero, que produce una respuesta inmunitaria detectable cuando se pone en contacto con un ARN interferente inmunoestimulante tal como un ARNip no modificado. Celulas respondedoras a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, celulas dendrfticas, macrofagos, celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP), esplenocitos, y similares. Respuestas inmunitarias detectables incluyen, por ejemplo, produccion de citocinas o factores de crecimiento tales como TNF-a, IFN-a, IFN-p, IFN-y, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF, y combinaciones de los mismos.
"Identidad sustancial" se refiere a una secuencia que se hibrida con una secuencia de referencia en condiciones rigurosas, o con una secuencia que tiene un porcentaje de identidad especffico en una region especificada de una secuencia de referencia.
La expresion "condiciones de hibridacion rigurosas" se refiere a condiciones en las que un acido nucleico se hibridara con su secuencia diana, normalmente en una mezcla compleja de acidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias mas largas se hibridan especfficamente a temperaturas mas altas. Un amplia gufa sobre la hibridacion de acidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas estan seleccionadas para ser aproximadamente 5-10 °C mas bajas que el punto de fusion termico (Tm) para la secuencia especffica a un pH de fuerza ionica definida. La Tm es la temperatura (bajo fuerza ionica definida, pH y concentracion nucleica) a la que el 50 % de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio (como las secuencias diana estan presentes en exceso, a Tm, el 50 % de las sondas estan ocupadas en equilibrio). Tambien pueden lograrse condiciones rigurosas con la adicion de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridacion selectiva o especffica, una serial positiva es al menos dos veces la hibridacion de fondo, preferentemente 10 veces la hibridacion de fondo.
Condiciones de hibridacion rigurosas a modo de ejemplo pueden ser del siguiente modo: 50 % de formamida, 5x SSC y 1 % de SDS, incubar a 42 °C, o, 5x SSC, 1 % de SDS, incubar a 65 °C, con lavado en 0,2x SSC, y 0,1 % de SDS a 65 °C. Para PCR, una temperatura de aproximadamente 36 °C es tfpica para la amplificacion de baja rigurosidad, aunque las temperaturas de hibridacion pueden variar entre aproximadamente 32 °C y 48 °C dependiendo de la longitud del cebador. Para amplificacion por PCR de alta rigurosidad, una temperatura de aproximadamente 62 °C es tfpica, aunque las temperaturas de hibridacion de alta rigurosidad pueden oscilar de
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aproximadamente 50 °C a aproximadamente 65 °C, dependiendo de la longitud del cebador y la especificidad. Condiciones de ciclo tfpicas para tanto las amplificaciones de alta como de baja rigurosidad incluyen una fase de desnaturalizacion de 90 °C-95 °C durante 30 s-2 min, una fase de hibridacion que dura 30 s-2 min, y una fase de extension de aproximadamente 72 °C durante 1-2 min. Los protocolos y pautas para reacciones de amplificacion de alta y baja rigurosidad se proporcionan, por ejemplo, en Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990).
Los acidos nucleicos que no se hibridan entre sf bajo condiciones rigurosas son todavfa sustancialmente identicos si los polipeptidos que codifican son sustancialmente identicos. Esto se produce, por ejemplo, cuando se crea una copia de un acido nucleico usando la maxima degeneracion de codones permitida por el codigo genetico. En tales casos, los acidos nucleicos normalmente se hibridan bajo condiciones de hibridacion moderadamente rigurosas. "Condiciones de hibridacion moderadamente rigurosas" a modo de ejemplo incluyen una hibridacion en un tampon de 40 % de formamida, NaCl 1 M, 1 % de SDS a 37 °C, y un lavado en 1X SSC a 45 °C. Una hibridacion positiva es al menos dos veces el fondo. Aquellos expertos habituales reconoceran facilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridacion y de lavado alternativas para proporcionar condiciones de rigurosidad similar. Pautas adicionales para determinar parametros de hibridacion se proporcionan en numerosas referencias, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.
Los terminos "sustancialmente identicos" o "identidad sustancial", en el contexto de dos o mas acidos nucleicos, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje de nucleotidos especificado que es el mismo (es decir, al menos aproximadamente el 60 %, preferentemente al menos aproximadamente el 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o el 95 % de identidad en una region especificada), cuando se comparan y alinean para correspondencia maxima en una ventana de comparacion, o region disenada como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o por alineamiento manual e inspeccion visual. Esta definicion, cuando el contexto lo indica, tambien se refiere analogamente al complemento de una secuencia. Preferentemente, la identidad sustancial existe en una region que tiene al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 nucleotidos de longitud.
Para comparacion de secuencias, normalmente una secuencia actua de una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Si se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se entran en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan parametros de programa de algoritmo de secuencia. Pueden usarse parametros de programa por defecto, o pueden designarse parametros alternativos. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basado en los parametros de programa.
Una "ventana de comparacion", como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de una cualquiera de varias posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de aproximadamente 5 a aproximadamente 60, normalmente aproximadamente 10 a aproximadamente 45, mas normalmente aproximadamente 15 a aproximadamente 30, en la que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias esten optimamente alineadas. Metodos de alineamiento de secuencias para la comparacion son muy conocidos en la tecnica. El alineamiento optimo de secuencias para la comparacion puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), por la busqueda por el metodo de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineamiento manual e inspeccion visual (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (suplemento de 1995)).
Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se usan, con los parametros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los acidos nucleicos descritos en el presente documento. El software para realizar analisis de BLAST esta publicamente disponible mediante el centro Nacional para Informacion Biotecnologica (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
El algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad por la que una correspondencia entre dos secuencias de nucleotidos se producina por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con el acido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, mas preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo mas preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.
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El termino "acido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polfmero que contiene al menos dos desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos en tanto forma mono como bicatenaria e incluye ADN y ARN. El ADN puede estar en forma de, por ejemplo, moleculas antisentido, ADN de plasmido, ADN pre-condensado, un producto de PCR, vectores (P1, pAc, BAC, YAC, cromosomas artificiales), casetes de expresion, secuencias quimericas, ADN cromosomico, o derivados y combinaciones de estos grupos. El ARN puede estar en forma de ARNip, ARN interferente asimetrico (ARNia), microARN (miARN), ARNm, ARNt, ARNr, ARNt, ARN vfrico (ARNv), y combinaciones de los mismos. Los acidos nucleicos incluyen acidos nucleicos que contienen analogos de nucleotidos conocidos o restos o enlaces de esqueleto modificados, que son sinteticos, que existen de forma natural, y que no existen de forma natural, y que tienen propiedades de union similares como el acido nucleico de referencia. Ejemplos de tales analogos incluyen, sin limitacion, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2'-O-metilrribonucle6tidos y acidos nucleicos peptfdicos (PNA). A menos que se limite especfficamente, el termino engloba acidos nucleicos que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales que tienen propiedades de union similares como el acido nucleico de referencia. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de acidos nucleicos particular tambien engloba implfcitamente variantes conservativamente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codon degenerado), alelos, ortologos, SNP, y secuencias complementarias, ademas de la secuencia explfcitamente indicada. Especfficamente, las sustituciones de codon degenerado pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posicion de uno o mas codones seleccionados (o todos) esta sustituida con restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:9198 (1994)). Los "nucleotidos" contienen una desoxirribosa (ADN) o ribosa (ARN) de azucar, una base, y un grupo fosfato. Los nucleotidos se unen juntos mediante los grupos fosfato. Las "bases" incluyen purinas y pirimidinas, que incluyen ademas los compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina, y analogos naturales, y derivados sinteticos de purinas y pirimidinas, que incluyen, pero no se limitan a, modificaciones que ponen nuevos grupos reactivos tales como, pero no se limitan a, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y haluros de alquilo.
El termino "gen" se refiere a una secuencia de acidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende secuencias codificantes de longitud parcial o de longitud entera necesarias para la produccion de un polipeptido o polipeptido precursor.
"Producto genico", como se usa en el presente documento, se refiere a un producto de un gen tal como un transcrito de ARN o un polipeptido.
El termino "lfpido" se refiere a un grupo de compuestos organicos que incluye, pero no se limita a, esteres de acidos grasos y se caracterizan por ser insolubles en agua, pero solubles en muchos disolventes organicos. Se dividen normalmente en al menos tres clases: (1) "lfpidos simples" que incluyen grasas y aceites, ademas de ceras; (2) "lfpidos compuestos", que incluyen fosfolfpidos y glicolfpidos; y (3) "lfpidos derivados", tales como esteroides.
Una "partfcula de lfpido" se usa en el presente documento para referirse a una formulacion de lfpido que puede usarse para administrar un agente activo o agente terapeutico, tal como un acido nucleico (por ejemplo, un ARN interferente), a un sitio diana de interes. En la partfcula de lfpido de la presente divulgacion, que normalmente se forma a partir de un lfpido cationico, un lfpido no cationico y un lfpido conjugado que previene la agregacion de la partfcula, el agente activo o agente terapeutico puede encapsularse en el lfpido, protegiendo asf el agente de la degradacion enzimatica.
Como se usa en el presente documento, el termino "SNALP" se refiere a una partfcula de acido nucleico-lfpido estable. Una SNALP representa una partfcula hecha de lfpidos (por ejemplo, un lfpido cationico, un lfpido no cationico y un conjugado de lfpido que previene la agregacion de la partfcula), en el que el acido nucleico (por ejemplo, ARNip, ARNia, miARN, ADNmc, ADNbc, ARNmc, ARN de horquilla pequena (ARNhp), ARNbc, o un plasmido, que incluye plasmidos de los que se transcribe un ARN interferente) se encapsula completamente dentro del lfpido. Como se usa en el presente documento, el termino "SNALP" incluye una SPLP, que es el termino usado para referirse a una partfcula de acido nucleico-lfpido que comprende un acido nucleico (por ejemplo, un plasmido) encapsulado dentro del lfpido. SNALP y SPLP normalmente contienen un lfpido cationico, un lfpido no cationico y un conjugado de lfpido (por ejemplo, un conjugado de PEG-lfpido). SNALP y SPLP son extremadamente utiles para aplicaciones sistemicas, ya que pueden presentar vidas en circulacion prolongadas tras la inyeccion intravenosa (i.v.), pueden acumularse en sitios distales (por ejemplo, sitios ffsicamente separados del sitio de administracion), y pueden mediar en la expresion del gen transfectado o silenciar la expresion del gen diana en estos sitios distales. SPLP incluyen "pSPLP", que comprenden un complejo de agente de condensacion-acido nucleico encapsulado como se expone en la publicacion PCT N.° WO 00/03683.
Las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) normalmente tienen un diametro medio de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, o de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no toxicas. Ademas, los acidos nucleicos, cuando estan presentes en las partfculas de lfpido, son resistentes en solucion acuosa a la degradacion con una nucleasa. Partfculas de acido nucleico-lfpido y su metodo de preparacion se desvelan en, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20040142025 y 20070042031.
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Como se usa en el presente documento, "lipido encapsulado" puede referirse a una partfcula de lipido que proporciona un agente activo o agente terapeutico, tal como un acido nucleico (por ejemplo, un ARN interferente), con encapsulacion completa, encapsulacion parcial, o ambos. En una realizacion preferida, el acido nucleico esta completamente encapsulado en la partfcula de lipido (por ejemplo, para formar una SPLP, pSPLP, SNALP, u otra partfcula de acido nucleico-lfpido).
El termino "conjugado de lipido" se refiere a un conjugado de lipido que inhibe la agregacion de partfculas de lipido. Tales conjugados de lipido incluyen, pero no se limitan a, oligomeros de poliamida (por ejemplo, conjugados de ATTA-lfpido), conjugados de PEG-lfpido, tales como PEG acoplado a dialquiloxipropilos, PEG acoplado a diacilgliceroles, pEg acoplado a colesterol, PEG acoplado a fosfatidiletanolaminas, PeG acoplado a ceramidas (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.885.613), lfpidos de PEG cationicos, y mezclas de los mismos. El PEG puede conjugarse directamente con el lipido o puede unirse al lipido mediante un resto conector. Puede usarse cualquier resto conector adecuado para acoplar el PEG con un lipido que incluye, por ejemplo, restos conectores que no contienen ester y restos conectores que contienen ester. En realizaciones preferidas, se usan restos conectores que no contienen ester.
El termino "lipido anfipatico" se refiere, en parte, a cualquier material adecuado en el que la porcion hidrofoba del material de lipido se orienta a una fase hidrofoba, mientras que la porcion hidrofila se orienta hacia la fase acuosa. Las caracterfsticas hidrofilas derivan de la presencia de grupos polares o cargados, tales como hidratos de carbono, grupos fosfato, carboxflico, sulfato, amino, sulfhidrilo, nitro, hidroxilo, y otros grupos similares. La hidrofobia puede conferirse por la inclusion de grupos apolares que incluyen, pero no se limitan a, grupos de hidrocarburo alifatico saturado e insaturado de cadena larga y tales grupos sustituidos con uno o mas grupo(s) aromatico(s), cicloalifatico(s) o heterocfclico(s). Ejemplos de compuestos anfipaticos incluyen, pero no se limitan a, fosfolfpidos, aminolfpidos y esfingolfpidos.
Ejemplos representativos de fosfolfpidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, acido fosfatfdico, palmitoiloleoilfosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina y dilinoleoilfosfatidilcolina. Otros compuestos que carecen de fosforo, tales como esfingolfpido, familias de glucoesfingolfpido, diacilgliceroles y p-aciloxiacidos, tambien estan dentro del grupo designado como lfpidos anfipaticos. Adicionalmente, los lfpidos anfipaticos descritos anteriormente pueden mezclarse con otros lfpidos que incluyen trigliceridos y esteroles.
El termino "lipido neutro" se refiere a cualquiera de varias especies de lipido que existen o bien en una forma de ion bipolar no cargada o bien neutra a un pH seleccionado. A pH fisiologico, tales lfpidos incluyen, por ejemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrosidos y diacilgliceroles.
El termino "lipido no cationico" se refiere a cualquier lipido anfipatico, ademas de cualquier otro lipido neutro o lipido anionico.
El termino "lipido anionico" se refiere a cualquier lipido que esta negativamente cargado a pH fisiologico. Estos lfpidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilgliceroles, cardiolipinas, diacilfosfatidilserinas, acidos diacilfosfatfdicos, N-dodecanoilfosfatidiletanolaminas, N-succinilfosfatidiletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas,
lisilfosfatidilgliceroles, palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), y otros grupos modificadores anionicos unidos a lfpidos neutros.
El termino "lipido cationico" se refiere a cualquiera de varias especies de lfpidos que llevan una carga positiva neta a un pH seleccionado, tal como pH fisiologico (por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0). Se ha encontrado sorprendentemente que los lfpidos cationicos que comprenden cadenas de alquilo con multiples sitios de insaturacion, por ejemplo, al menos dos o tres sitios de insaturacion, son particularmente utiles para formar partfculas de lipido con elevada fluidez de la membrana. Se han descrito varios lfpidos cationicos y analogos relacionados, que tambien son utiles en la presente invencion, en las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20060083780 y 20060240554; las patentes de EE.UU. N.° 5.208.036; 5.264.618; 5.279.833; 5.283.185; 5.753.613; y 5.785.992; y publicacion PCT N.° WO 96/10390. Ejemplos no limitantes de lfpidos cationicos se describen en detalle en el presente documento. En algunos casos, los lfpidos cationicos comprenden un grupo de cabeza de amina terciaria protonable (por ejemplo, titula el pH), cadenas de alquilo C18, enlaces eter entre el grupo de cabeza y las cadenas de alquilo, y 0 a 3 dobles enlaces. Tales lfpidos incluyen, por ejemplo, DSDMA, DLinDMA, DLenDMA y DODMA.
El termino "lipido hidrofobo" se refiere a compuestos que tienen grupos apolares que incluyen, pero no se limitan a, grupos de hidrocarburo alifatico saturado e insaturado de cadena larga y tales grupos opcionalmente sustituidos con uno o mas grupo(s) aromatico(s), cicloalifatico(s) o heterocfclico(s). Ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, diacilglicerol, dialquilglicerol, N,N-dialquilamino, 1,2-diaciloxi-3-aminopropano y 1,2-dialquil-3-aminopropano.
El termino "fusogenico" se refiere a la capacidad de una partfcula de lipido, tal como una SNALP, para fusionarse
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con las membranas de una celula. Las membranas pueden ser o bien la membrana plasmatica o bien membranas que rodean organulos, por ejemplo, endosoma, nucleo, etc.
Como se usa en el presente documento, el termino "solucion acuosa" se refiere a una composicion que comprende por completo, o en parte, agua.
Como se usa en el presente documento, el termino "solucion organica de lfpido" se refiere a una composicion que comprende por completo, o en parte, un disolvente organico que tiene un lfpido.
"Sitio distal", como se usa en el presente documento, se refiere a un sitio ffsicamente separado, que no se limita a un lecho capilar adyacente, pero incluye sitios ampliamente distribuidos en todo un organismo.
"Estable en suero", en relacion con partfculas de acido nucleico-lfpido tales como SNALP, significa que la partfcula no se degrada significativamente despues de la exposicion a un suero o ensayo de nucleasa que degradarfa significativamente el ADN o ARN libre. Ensayos adecuados incluyen, por ejemplo, un ensayo en suero estandar, un ensayo de DNasa, o un ensayo de RNasa.
"Administracion sistemica", como se usa en el presente documento, se refiere a la administracion de partfculas de lfpido que conduce a una amplia biodistribucion de un agente activo o agente terapeutico, tal como un ARN interferente dentro de un organismo. Algunas tecnicas de administracion pueden conducir a la administracion sistemica de ciertos agentes, pero no otros. Administracion sistemica significa que una cantidad util, preferentemente terapeutica, de un agente se expone a la mayorfa de las partes del cuerpo. Para obtener la amplia biodistribucion generalmente se requiere una vida en sangre tal que el agente no sea rapidamente degradado o eliminado (tal como por organos de primer paso (hfgado, pulmon, etc.) o por la rapida union a celulas no especfficas) antes de llegar a un sitio de enfermedad distal al sitio de administracion. La administracion sistemica de partfculas de lfpido puede ser mediante cualquier medio conocido en la tecnica que incluye, por ejemplo, intravenoso, subcutaneo e intraperitoneal. En una realizacion preferida, la administracion sistemica de partfculas de lfpido es por administracion intravenosa.
"Administracion local", como se usa en el presente documento, se refiere a la administracion de un agente activo o agente terapeutico tal como un ARN interferente directamente a un sitio diana dentro de un organismo. Por ejemplo, un agente puede ser localmente administrado por inyeccion directa en un sitio de enfermedad tal como un tumor u otro sitio diana tal como un sitio de inflamacion o un organo diana tal como el hfgado, corazon, pancreas, rinon, y similares.
El termino "mamffero" se refiere a cualquier especie de mamffero tal como un ser humano, raton, rata, perro, gato, hamster, cobaya, conejo, ganado, y similares.
El termino "cancer" se refiere a cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de celulas anomalas. El termino incluye todos los canceres conocidos y afecciones neoplasicas, tanto si se caracterizan como malignas, benignas, tejido blando, o solidas, como canceres de todos los estadios y grados que incluyen canceres pre- y post-metastasicos. Ejemplos de diferentes tipos de cancer incluyen, pero no se limitan a, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer rectal, cancer anal, cancer de las vfas biliares, cancer de intestino delgado, cancer de estomago (gastrico), cancer de esofago; cancer de vesfcula biliar, cancer de hfgado, cancer pancreatico, cancer de apendice, cancer de mama, cancer de ovario; cancer de cuello uterino, cancer de prostata, cancer renal (por ejemplo, carcinoma de celulas renales), cancer del sistema nervioso central, glioblastoma, cancer de piel, linfomas, coriocarcinomas, canceres de cabeza y cuello, sarcomas osteogenicos y canceres de sangre. Ejemplos no limitantes de tipos especfficos de cancer de hfgado incluyen carcinoma hepatocelular (HCC), cancer de hfgado secundario (por ejemplo, producido por la metastasis de algun otro tipo de celula de cancer no de hfgado) y hepatoblastoma. Como se usa en el presente documento, un "tumor" comprende una o mas celulas cancerosas.
III. Descripcion de las realizaciones
La presente divulgacion proporciona novedosas partfculas de lfpido estables en suero que comprenden uno o mas agentes activos o agentes terapeuticos, metodos de preparacion de las partfculas de lfpido, y metodos de suministro y/o administracion de las partfculas de lfpido (por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno).
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona partfculas de lfpido que comprenden: (a) uno o mas agentes activos o agentes terapeuticos; (b) uno o mas lfpidos cationicos que comprenden de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; (c) uno o mas lfpidos no cationicos que comprenden de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; y (d) uno o mas lfpidos conjugados que inhiben la agregacion de partfculas que comprenden de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En ciertas realizaciones, el agente activo o agente terapeutico esta completamente encapsulado dentro de la porcion de lfpido de la partfcula de lfpido de forma que el agente activo o agente terapeutico en la partfcula de lfpido sea
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resistente en solucion acuosa a la degradacion enzimatica, por ejemplo, por una nucleasa o proteasa. En ciertas otras realizaciones, las partfculas de lfpido son sustancialmente no toxicas para los mairnferos tales como los seres humanos.
En algunas realizaciones, el agente activo o agente terapeutico comprende un acido nucleico. En ciertos casos, el acido nucleico comprende una molecula de ARN interferente tal como, por ejemplo, un ARNip, ARNia, miARN, o mezclas de los mismos. En ciertos otros casos, el acido nucleico comprende ADN monocatenario o bicatenario, ARN, o un hnbrido de ADN/ARN tal como, por ejemplo, un oligonucleotido antisentido, una ribozima, un plasmido, un oligonucleotido inmunoestimulante, o mezclas de los mismos.
En otras realizaciones, el agente activo o agente terapeutico comprende un peptido o polipeptido. En ciertos casos, el peptido o polipeptido comprende un anticuerpo tal como, por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo; un anticuerpo humanizado, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano recombinante, un anticuerpo Primatized™, o mezclas de los mismos. En ciertos otros casos, el peptido o polipeptido comprende una citocina, un factor de crecimiento, un factor apoptosico, un factor inductor de la diferenciacion, un receptor de la superficie celular, un ligando, una hormona, una molecula pequena (por ejemplo, molecula organica pequena o compuesto), o mezclas de los mismos.
En realizaciones preferidas, el agente activo o agente terapeutico comprende un ARNip. En una realizacion, la molecula de ARNip comprende una region bicatenaria de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleotidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25 o 19-25 nucleotidos de longitud, o 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleotidos de longitud). Las moleculas de ARNip descritas en el presente documento son capaces de silenciar la expresion de una secuencia diana in vitro y/o in vivo.
En algunas realizaciones, la molecula de ARNip comprende al menos un nucleotido modificado. En ciertas realizaciones preferidas, la molecula de ARNip comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o mas nucleotidos modificados en la region bicatenaria. En ciertos casos, el ARNip comprende de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 100 % (por ejemplo, aproximadamente el 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o el 100 %) de nucleotidos modificados en la region bicatenaria. En realizaciones preferidas, menos de aproximadamente el 25 % (por ejemplo, menos de aproximadamente el 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, o el 5 %) o de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 25 % (por ejemplo, de aproximadamente el 1 %-25 %, 5 %-25 %, 10 %-25 %, 15 %-25 %, 20 %-25 %, o el 10 %-20 %) de los nucleotidos en la region bicatenaria comprenden nucleotidos modificados.
En otras realizaciones, la molecula de ARNip comprende nucleotidos modificados que incluyen, pero no se limitan a, nucleotidos de 2'-O-metilo (2'OMe), nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluor (2'F), 2'-desoxi-nucleotidos, nucleotidos de 2'-O- (2-metoxietilo) (MOE), nucleotidos de acido nucleico bloqueado (LNA), y mezclas de los mismos. En realizaciones preferidas, el ARNip comprende nucleotidos de 2'OMe (por ejemplo, nucleotidos de purina y/o pirimidina de 2'OMe) tal como, por ejemplo, nucleotidos de 2'OMe-guanosina, nucleotidos de 2'OMe-uridina, nucleotidos de 2'OMe- adenosina, nucleotidos de 2'OMe-citosina, y mezclas de los mismos. En ciertos casos, el ARNip no comprende nucleotidos de 2'OMe-citosina. En otras realizaciones, el ARNip comprende una estructura de lazo en horquilla.
El ARNip puede comprender nucleotidos modificados en una hebra (es decir, codificante o no codificante) o ambas hebras de la region bicatenaria de la molecula de ARNip. Preferentemente, los nucleotidos de uridina y/o guanosina se modifican en posiciones selectivas en la region bicatenaria del duplex de ARNip. Con respecto a las modificaciones del nucleotido de uridina, al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o mas de los nucleotidos de uridina en la hebra codificante y/o no codificante puede ser un nucleotido de uridina modificado tal como un nucleotido de 2'OMe-uridina. En algunas realizaciones, cada nucleotido de uridina en la hebra codificante y/o no codificante es un nucleotido de 2'OMe-uridina. Con respecto a las modificaciones de los nucleotidos de guanosina, al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o mas de los nucleotidos de guanosina en la hebra codificante y/o no codificante puede ser un nucleotido de guanosina modificado tal como un nucleotido de 2'OMe-guanosina. En algunas realizaciones, cada nucleotido de guanosina en la hebra codificante y/o no codificante es un nucleotido de 2'OMe-guanosina.
En ciertas realizaciones, pueden modificarse al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, o mas motivos 5'-GU- 3' en una secuencia de ARNip, por ejemplo, introduciendo desapareamientos para eliminar los motivos 5'-GU-3' y/o introduciendo nucleotidos modificados tales como nucleotidos de 2'OMe. El motivo 5'-GU-3' puede estar en la hebra codificante, la hebra no codificante, o ambas hebras, de la secuencia de ARNip. Los motivos 5'-GU-3' pueden estar adyacentes entre sf o, alternativamente, pueden estar separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o mas nucleotidos.
En algunas realizaciones preferidas, una molecula de ARNip modificado es menos inmunoestimulante que una secuencia de ARNip no modificado correspondiente. En tales realizaciones, la molecula de ARNip modificado con propiedades inmunoestimulantes reducidas retiene ventajosamente la actividad de iARN contra la secuencia diana. En otra realizacion, las propiedades inmunoestimulantes de la molecula de ARNip modificado y su capacidad para silenciar la expresion del gen diana pueden equilibrarse u optimizarse por la introduccion de modificaciones de
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2'OMe mfnimas y selectivas dentro de la secuencia de ARNip tal como, por ejemplo, dentro de la region bicatenaria del duplex de ARNip. En ciertos casos, el ARNip modificado es al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,
94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % menos inmunoestimulante que el ARNip no modificado correspondiente. Sera rapidamente evidente para aquellos expertos en la materia que las propiedades inmunoestimulantes de la molecula de ARNip modificado y la molecula de ARNip no modificado correspondiente pueden ser determinadas, por ejemplo, midiendo los niveles de INF-a y/o IL-6 de aproximadamente dos a aproximadamente doce horas despues de la administracion sistemica en un mamffero o transfeccion de una celula respondedora de mamffero usando un sistema de administracion basado en lfpidos apropiado (tal como el sistema de administracion de SNALP desvelado en el presente documento).
En ciertas realizaciones, una molecula de ARNip modificado tiene una CI50 (es decir, concentracion inhibitoria al 50 %) inferior o igual a diez veces la del ARNip no modificado correspondiente (es decir, el ARNip modificado tiene una CI50 que es inferior o igual a diez veces la CI50 del ARNip no modificado correspondiente). En otras realizaciones, el ARNip modificado tiene una CI50 inferior o igual a tres veces la de la secuencia de ARNip no modificado correspondiente. En aun otras realizaciones, el ARNip modificado tiene una CI50 inferior o igual a dos veces la del ARNip no modificado correspondiente. Sera rapidamente evidente para aquellos expertos en la materia que puede generarse una curva de dosis-respuesta y los valores de CI50 para el ARNip modificado y el ARNip no modificado correspondiente pueden determinarse facilmente usando metodos conocidos para aquellos expertos en la materia.
En otra realizacion mas, una molecula de ARNip modificado es capaz de silenciar al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %,
95 %, o el 100 % de la expresion de la secuencia diana con respecto a la secuencia de ARNip no modificado correspondiente.
En algunas realizaciones, la molecula de ARNip no comprende modificaciones del esqueleto de fosfato, por ejemplo, en la hebra codificante y/o no codificante de la region bicatenaria. En otras realizaciones, el ARNip comprende una, dos, tres, cuatro, o mas modificaciones del esqueleto de fosfato, por ejemplo, en la hebra codificante y/o no codificante de la region bicatenaria. En realizaciones preferidas, el ARNip no comprende modificaciones del esqueleto de fosfato.
En realizaciones adicionales, el ARNip no comprende 2'-desoxi-nucleotidos, por ejemplo, en la hebra codificante y/o no codificante de la region bicatenaria. En realizaciones aun adicionales, el ARNip comprende uno, dos, tres, cuatro, o mas 2'-desoxi-nucleotidos, por ejemplo, en la hebra codificante y/o no codificante de la region bicatenaria. En realizaciones preferidas, el ARNip no comprende 2'-desoxi-nucleotidos.
En ciertos casos, el nucleotido en el extremo 3' de la region bicatenaria en la hebra codificante y/o no codificante no es un nucleotido modificado. En ciertos otros casos, los nucleotidos cerca del extremo 3' (por ejemplo, dentro de uno, dos, tres, o cuatro nucleotidos del extremo 3') de la region bicatenaria en la hebra codificante y/o no codificante no son nucleotidos modificados.
Las moleculas de ARNip descritas en el presente documento pueden tener nucleotidos protuberantes en 3' de uno, dos, tres, cuatro, o mas nucleotidos en uno o ambos lados de la region bicatenaria, o pueden carecer de nucleotidos protuberantes (es decir, tener extremos romos) en uno o ambos lados de la region bicatenaria. Preferentemente, el ARNip tiene nucleotidos protuberantes en 3' de dos nucleotidos en cada lado de la region bicatenaria. En ciertos casos, el nucleotido protuberante en 3' en la hebra no codificante tiene complementariedad con la secuencia diana y el nucleotido protuberante en 3' en la hebra codificante tiene complementariedad con una hebra complementaria de la secuencia diana. Alternativamente, los nucleotidos protuberantes en 3' no tienen complementariedad con la secuencia diana o la hebra complementaria de la misma. En algunas realizaciones, los nucleotidos protuberantes en 3' comprenden uno, dos, tres, cuatro, o mas nucleotidos tales como 2'-desoxi (2'H)-nucleotidos. En ciertas realizaciones preferidas, los nucleotidos protuberantes en 3' comprenden nucleotidos de desoxitimidina (dT) y/o uridina. En otras realizaciones, uno o mas de los nucleotidos en los nucleotidos protuberantes en 3' en uno o ambos lados de la region bicatenaria comprenden nucleotidos modificados. Ejemplos no limitantes de nucleotidos modificados se describen anteriormente e incluyen nucleotidos de 2'OMe, nucleotidos de 2'-desoxi-2'F, 2'-desoxi- nucleotidos, nucleotidos de 2'-O-2-MOE, nucleotidos de LNA, y mezclas de los mismos. En realizaciones preferidas, uno, dos, tres, cuatro, o mas nucleotidos en los nucleotidos protuberantes en 3' presentes en la hebra codificante y/o no codificante del ARNip comprenden nucleotidos de 2'OMe (por ejemplo, nucleotidos de purina y/o pirimidina de 2'OMe) tales como, por ejemplo, nucleotidos de 2'OMe-guanosina, nucleotidos de 2'OMe-uridina, nucleotidos de 2'OMe-adenosina, nucleotidos de 2'OMe-citosina, y mezclas de los mismos.
El ARNip puede comprender al menos uno o una mezcla (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o mas) de secuencias de ARNip no modificado y/o modificado que silencian la expresion del gen diana. La mezcla de ARNip puede comprender secuencias que se dirigen a la misma region o dominio (por ejemplo, un "punto caliente") y/o a diferentes regiones o dominios de uno o mas genes diana. En ciertos casos, uno o mas (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o mas) ARNip modificados que
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silencian la expresion del gen diana estan presentes en una mezcla. En ciertos otros casos, una o mas (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o mas) secuencias de ARNip no modificado que silencian la expresion del gen diana estan presentes en una mezcla.
En algunas realizaciones, la hebra no codificante de la molecula de ARNip comprende o consiste en una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % complementaria a la secuencia diana o una porcion de la misma. En otras realizaciones, la hebra no codificante de la molecula de ARNip comprende o consiste en una secuencia que es el 100 % complementaria a la secuencia diana o una porcion de la misma. En realizaciones adicionales, la hebra no codificante de la molecula de ARNip comprende o consiste en una secuencia que se hibrida especfficamente con la secuencia diana o una porcion de la misma.
En realizaciones adicionales, la hebra codificante de la molecula de ARNip comprende o consiste en una secuencia que es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % identica a la secuencia diana o una porcion de la misma. En realizaciones adicionales, la hebra codificante de la molecula de ARNip comprende o consiste en una secuencia que es el 100 % identica a la secuencia diana o una porcion de la misma.
En las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP que comprende un ARN interferente tal como ARNip), el lfpido cationico puede comprender, por ejemplo, uno o mas de los siguientes: 1,2- dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 2,2- dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA; "XTC2"), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminopropil)-[1,3]- dioxolano (DLin-K-C3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(4-dimetilaminobutil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C4-DMA), 2,2-dilinoleil-5- dimetilaminometil-[1,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N-metilpepiazino-[1,3]-dioxolano (DLin-K-MPZ), 2,2- dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C- DAP), 1,2-dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1 -linoleoil-2- linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin- TMA.Cl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N- metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2- propanodiol (DOaP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), cloruro de N,N-dioleil- N,N-dimetilamonio (DODAC), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), 1,2-diesteariloxi-N,N- dimetilaminopropano (DSDMA), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), 3- (N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Chol), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N- hidroxietilamonio (DMRIE), 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-
propanaminiotrifluoroacetato (DOSPA), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3- beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano (CLinDMA), 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'- oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina (DMOBA), 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP), 1,2-N,N'-dilinoleilcarbamil-3- dimetilaminopropano (DLincarbDAP), o mezclas de los mismos. En ciertas realizaciones preferidas, el lfpido cationico es DLinDMA, DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), o mezclas de los mismos.
La sfntesis de lfpidos cationicos tales como DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLin-K6- DMA y DLin-K-MPZ, ademas de lfpidos cationicos adicionales, se describe en la solicitud provisional de EE.UU. N.° 61/104.212, presentada el 9 de octubre de 2008. La sfntesis de lfpidos cationicos tales como DLin-K-DMA, DLin-C- DAP, DLin-DAC, DLin-MA, DLinDAP, DLin-S-DMA, DLin-2-DMAP, DLin-TMA.Cl, DLin-TAP.Cl, DLin-MPZ, DLinAP, DOAP y DLin-EG-DMA, ademas de lfpidos cationicos adicionales, se describe en la solicitud PCT N.° PCT/US08/88676, presentada el 31 de diciembre de 2008. La sfntesis de lfpidos cationicos tales como CLinDMA, ademas de lfpidos cationicos adicionales, se describe en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20060240554.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el lfpido cationico puede comprender de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a
aproximadamente el 85 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 80 % en moles,
de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 75 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 70 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 65 % en moles, o de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 60 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En otras realizaciones, el lfpido cationico puede comprender de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles, de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles, de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 80 % en moles, de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 75 % en moles, de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 70 % en moles, o de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 65 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En aun otras realizaciones, el lfpido cationico puede comprender de aproximadamente el 60 % en moles a
aproximadamente el 90 % en moles, de aproximadamente el 60 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles,
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de aproximadamente el 60 % en moles a aproximadamente el 80 % en moles, de aproximadamente el 60 % en moles a aproximadamente el 75 % en moles, o de aproximadamente el 60 % en moles a aproximadamente el 70 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En todavfa otras realizaciones, el lfpido cationico puede comprender de aproximadamente el 65 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles, de aproximadamente el 65 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles, de aproximadamente el 65 % en moles a aproximadamente el 80 % en moles, o de aproximadamente el 65 % en moles a aproximadamente el 75 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En realizaciones adicionales, el lfpido cationico puede comprender de aproximadamente el 70 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles, de aproximadamente el 70 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles, de aproximadamente el 70 % en moles a aproximadamente el 80 % en moles, de aproximadamente el 75 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles, de aproximadamente el 75 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles, o de aproximadamente el 80 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En realizaciones adicionales, el lfpido cationico puede comprender (al menos) aproximadamente el 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, o el 90 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lfpido total presente en la partfcula.
En las partfculas de lfpido de la presente divulgacion (por ejemplo, SNALP que comprende un ARN interferente tal como ARNip), el lfpido no cationico puede comprender, por ejemplo, uno o mas lfpidos anionicos y/o lfpidos neutros. El lfpido no cationico puede comprender uno de los siguientes componentes de lfpido neutro: (1) colesterol o un derivado del mismo; (2) un fosfolfpido; o (3) una mezcla de un fosfolfpido y colesterol o un derivado del mismo.
Ejemplos de derivados de colesterol incluyen, pero no se limitan a, colestanol, colestanona, colestenona, coprostanol, colesteril-2'-hidroxietil eter, colesteril-4'-hidroxibutil eter, y mezclas de los mismos. La sfntesis de colesteril-2'-hidroxietil eter se describe en el presente documento.
El fosfolfpido puede ser un lfpido neutro que incluye, pero no se limita a, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleiol-fosfatidilglicerol (POPG), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil- fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil- fosfatidiletanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de huevo (EPC), y mezclas de las mismas. En ciertas realizaciones preferidas, el fosfolfpido es DPPC, DSPC, o mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el lfpido no cationico (por ejemplo, uno o mas fosfolfpidos y/o colesterol) puede comprender de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 60 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 60 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 60 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 60 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 60 % en moles, de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 55 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 55 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 55 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 55 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 55 % en moles, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 50 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 50 % en moles o de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 50 % en moles del lfpido total presente en la partfcula. Cuando el lfpido no cationico es una mezcla de un fosfolfpido y colesterol o un derivado de colesterol, la mezcla puede comprender hasta aproximadamente el 40, 50, o 60 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En otras realizaciones, el lfpido no cationico (por ejemplo, uno o mas fosfolfpidos y/o colesterol) puede comprender de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, o de aproximadamente el 40 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
En aun otras realizaciones, el lfpido no cationico (por ejemplo, uno o mas fosfolfpidos y/o colesterol) puede comprender de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente
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el 45 % en moles, o de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En todavfa otras realizaciones, el lipido no cationico (por ejemplo, uno o mas fosfolipidos y/o colesterol) puede comprender de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, o de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En realizaciones adicionales, el lipido no cationico (por ejemplo, uno o mas fosfolipidos y/o colesterol) puede comprender de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, o de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En realizaciones aun adicionales, el lipido no cationico (por ejemplo, uno o mas fosfolipidos y/o colesterol) puede comprender de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, o de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En realizaciones adicionales, el lipido no cationico (por ejemplo, uno o mas fosfolipidos y/o colesterol) puede comprender (al menos) aproximadamente el 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o el 60 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lipido total presente en la partfcula.
En ciertas realizaciones, el lipido no cationico comprende colesterol o un derivado del mismo de aproximadamente el 31,5 % en moles a aproximadamente el 42,5 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Como ejemplo no limitante, una partfcula de lipido libre de fosfolfpido descrita en el presente documento puede comprender colesterol o un derivado del mismo a aproximadamente el 37 % en moles del lipido total presente en la partfcula. En otras realizaciones preferidas, una partfcula de lipido libre de fosfolfpido descrita en el presente documento puede comprender colesterol o un derivado del mismo de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 40 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 32 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 32 % en moles a aproximadamente el 42 % en moles, de aproximadamente el 32 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 34 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 34 % en moles a aproximadamente el 42 % en moles, de aproximadamente el 34 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, o aproximadamente el 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o el 45 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lipido total presente en la partfcula.
En ciertas otras realizaciones preferidas, el lipido no cationico comprende una mezcla de: (i) un fosfolfpido de aproximadamente el 4 % en moles a aproximadamente el 10 % en moles del lipido total presente en la partfcula; y (ii) colesterol o un derivado del mismo de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Como ejemplo no limitante, una partfcula de lipido que comprende una mezcla de un fosfolfpido y colesterol puede comprender DPPC a aproximadamente el 7 % en moles y colesterol a aproximadamente el 34 % en moles del lipido total presente en la partfcula. En otras realizaciones, el lipido no cationico comprende una mezcla de: (i) un fosfolfpido de aproximadamente el 3 % en moles a aproximadamente el 15 % en moles, de aproximadamente el 4 % en moles a aproximadamente el 15 % en moles, de aproximadamente el 4 % en moles a aproximadamente el 12 % en moles, de aproximadamente el 4 % en moles a aproximadamente el 10 % en moles, de aproximadamente el 4 % en moles a aproximadamente el 8 % en moles, de aproximadamente el
5 % en moles a aproximadamente el 12 % en moles, de aproximadamente el 5 % en moles a aproximadamente el 9 % en moles, de aproximadamente el 6 % en moles a aproximadamente el 12 % en moles, de aproximadamente el
6 % en moles a aproximadamente el 10 % en moles, o aproximadamente el 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o el 15 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lipido total presente en la partfcula; y (ii) colesterol o un derivado del mismo de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 40 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente
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el 28 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 28 % en moles a aproximadamente el 38 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 38 % en moles, de aproximadamente el 32 % en moles a aproximadamente el 36 % en moles, o aproximadamente el 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o el 45 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lfpido total presente en la partfcula.
En realizaciones preferidas adicionales, el lfpido no cationico comprende una mezcla de: (i) un fosfolfpido de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; y (ii) colesterol o un derivado del mismo de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles del lfpido total presente en la partfcula. Como ejemplo no limitante, una partfcula de lfpido que comprende una mezcla de un fosfolfpido y colesterol puede comprender DPPC a aproximadamente el 20 % en moles y colesterol a aproximadamente el 20 % en moles del lfpido total presente en la partfcula. En otras realizaciones, el lfpido no cationico comprende una mezcla de: (i) un fosfolfpido de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 20 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, de aproximadamente el 12 % en moles a aproximadamente el 28 % en moles, de aproximadamente el 14 % en moles a aproximadamente el 26 % en moles, o aproximadamente el 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o el 30 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lfpido total presente en la partfcula; y (ii) colesterol o un derivado del mismo de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 20 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, de aproximadamente el 12 % en moles a aproximadamente el 28 % en moles, de aproximadamente el 14 % en moles a aproximadamente el 26 % en moles, o aproximadamente el 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o el 30 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lfpido total presente en la partfcula.
En las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP que comprende un ARN interferente tal como ARNip), el conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas puede comprender, por ejemplo, uno o mas de los siguientes: un conjugado de polietilenglicol (PEG)-lfpido, un conjugado de poliamida (ATTA)-lfpido, un conjugado de polfmero cationico-lfpido (CPL), o mezclas de los mismos. En una realizacion preferida, las partfculas de acido nucleico-lfpido comprenden o bien un conjugado de PEG-lfpido o bien un conjugado de ATTA-lfpido. En ciertas realizaciones, el conjugado de PEG-lfpido o conjugado de ATTA-lfpido se usa junto con un CPL. El conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas puede comprender un PEG-lfpido que incluye, por ejemplo, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolfpido, un PEG- ceramida (Cer), o mezclas de los mismos. El conjugado de PEG-DAA puede ser PEG-dilauriloxipropilo (C12), un PEG-dimiristiloxipropilo (C14), un PEG-dipalmitiloxipropilo (C16), un PEG-diesteariloxipropilo (C18), o mezclas de los mismos.
Conjugados de PEG-lfpido adicionales adecuados para su uso en la invencion incluyen, pero no se limitan a, mPEG2000-1,2-di-O-alquil-sn3-carbomoilglicerido (pEg-C-DOMG). La sfntesis de PEG-C-DOMG se describe en la solicitud PCT N.° PCT/US08/88676, presentada el 31 de diciembre de 2008. Conjugados de PEG-lfpido aun adicionales adecuados para su uso en la invencion incluyen, sin limitacion, 1-[8'-(1,2-dimiristoil-3-propanoxi)- carboxamido-3',6'-dioxaoctanil]carbamoil-u>-metil-poli(etilenglicol) (2KPEG-DMG). La sfntesis de 2KPEG-DMG se describe en la patente de EE.UU. N.° 7.404.969.
El resto de PEG de los conjugados de PEG-lfpido descritos en el presente documento pueden comprender un peso molecular promedio que oscila de aproximadamente 550 daltons a aproximadamente 10.000 daltons. En ciertos casos, el resto de PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente el 750 daltons a aproximadamente 5.000 daltons (por ejemplo, de aproximadamente 1.000 daltons a aproximadamente 5.000 daltons, de aproximadamente 1.500 daltons a aproximadamente 3.000 daltons, de aproximadamente 750 daltons a aproximadamente 3.000 daltons, de aproximadamente 750 daltons a aproximadamente 2.000 daltons, etc.). En realizaciones preferidas, el resto de pEg tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2.000 daltons o aproximadamente 750 daltons.
En algunas realizaciones, el conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas es un CPL que tiene la formula: A-W-Y, en la que A es un resto de lfpido, W es un polfmero hidrofilo e Y es un resto policationico. W puede ser un polfmero seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), poliamida, acido polilactico, acido poliglicolico, copolfmeros de acido polilactico/acido poliglicolico, o combinaciones de los mismos, el polfmero que tiene un peso molecular de aproximadamente 250 a aproximadamente 7000 daltons. En algunas realizaciones, Y tiene al menos 4 cargas positivas a un pH seleccionado. En algunas realizaciones, Y puede ser lisina, arginina, asparagina, glutamina, derivados de los mismos, o combinaciones de los mismos.
En ciertos casos, el conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas (por ejemplo, conjugado de PEG-
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lipido) puede comprender de aproximadamente el 0,1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles, de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles, de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles, de aproximadamente el 0,6 % en moles a aproximadamente el 1,9 % en moles, de aproximadamente el 0,7 % en moles a aproximadamente el 1,8 % en moles, de aproximadamente el 0,8 % en moles a aproximadamente el 1,7 % en moles, de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 1,8 % en moles, de aproximadamente el 1,2 % en moles a aproximadamente el 1,8 % en moles, de aproximadamente el 1,2 % en moles a aproximadamente el 1,7 % en moles, de aproximadamente el 1,3 % en moles a aproximadamente el 1,6 % en moles, de aproximadamente el 1,4 % en moles a aproximadamente el 1,5 % en moles, o aproximadamente el 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o el 2 % en moles (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) del lipido total presente en la particula.
En las particulas de lipido descritas en el presente documento, el agente activo o agente terapeutico puede ser completamente encapsulado dentro de la porcion de lipido de la particula, protegiendo asf el agente activo o agente terapeutico de la degradacion enzimatica. En realizaciones preferidas, un SNALP que comprende un acido nucleico tal como un ARN interferente (por ejemplo, ARNip) esta completamente encapsulado dentro de la porcion de lipido de la particula, protegiendo asf el acido nucleico de la degradacion por nucleasas. En ciertos casos, el acido nucleico en el SNALP no es sustancialmente degradado despues de exposicion de la particula a una nucleasa a 37 °C durante al menos aproximadamente 20, 30, 45 o 60 minutos. En ciertos otros casos, el acido nucleico en el SNALP no es sustancialmente degradado despues de la incubacion de la particula en suero a 37 °C durante al menos aproximadamente 30, 45 o 60 minutos o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 o 36 horas. En otras realizaciones, el agente activo o agente terapeutico (por ejemplo, acido nucleico tal como ARNip) se compleja con la porcion de lipido de la particula. Uno de los beneficios de las formulaciones descritas en el presente documento es que las composiciones de particulas de lipido son sustancialmente no toxicas para los mamfferos tales como los seres humanos.
El termino "completamente encapsulado" indica que el agente activo o agente terapeutico en la particula de lipido no se degrada significativamente despues de la exposicion a suero o un ensayo de nucleasa o proteasa que degradarfa significativamente el ADN libre, ARN, o protefna. En un sistema completamente encapsulado, preferentemente menos de aproximadamente el 25 % del agente activo o agente terapeutico en la particula se degrada en un tratamiento que normalmente degradarfa el 100 % del agente activo libre o agente terapeutico, mas preferentemente se degrada menos de aproximadamente el 10 %, y lo mas preferentemente menos de aproximadamente el 5 % del agente activo o agente terapeutico en la particula. En el contexto de agentes terapeuticos de acido nucleico, la encapsulacion completa puede determinarse por un ensayo Oligreen®. Oligreen® es una tincion de acido nucleico fluorescente ultra-sensible para cuantificar oligonucleotidos y ADN monocatenario o ARN en solucion (disponible de Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA). "Completamente encapsulado" tambien indica que las particulas de lipido son estables en suero, es decir, que no se descomponen rapidamente en sus partes componentes tras la administracion in vivo.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion de particulas de lipido (por ejemplo, SNALP) que comprende una pluralidad de particulas de lipido. En realizaciones preferidas, el agente activo o agente terapeutico (por ejemplo, acido nucleico) esta completamente encapsulado dentro de la porcion de lipido de las particulas de lipido (por ejemplo, SNALP), de forma que de aproximadamente el 30 % a aproximadamente 100 %,
de aproximadamente el 40 % a aproximadamente 100 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente 100 %,
de aproximadamente el 60 % a aproximadamente 100 %, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente 100 %,
de aproximadamente el 80 % a aproximadamente 100 %, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente 100 %,
de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 95 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior) de las particulas de lipido (por ejemplo, SNALP) tienen el agente activo o agente terapeutico encapsulado en ellas.
Normalmente, las particulas de lipido (por ejemplo, SNALP) descritas en el presente documento tienen una relacion de lfpido:agente activo (por ejemplo, lfpidoiacido nucleico) (relacion masa/masa) de aproximadamente 1 a aproximadamente 100. En algunos casos, la relacion de lfpido:agente activo (por ejemplo, lfpido:acido nucleico) (relacion masa/masa) oscila de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 2 a aproximadamente 25, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20, de aproximadamente 4 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. En realizaciones preferidas, las particulas de lipido descritas en el presente documento tienen una relacion de lfpido:agente activo (por ejemplo, lfpido:acido nucleico) (relacion masa/masa) de aproximadamente 5 a aproximadamente 15, por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior).
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Normalmente, las partfculas de lipido (por ejemplo, SNALP) descritas en el presente documento tienen un diametro medio de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm. En realizaciones preferidas, las partfculas de lipido (por ejemplo, SNALP) descritas en el presente documento tienen un diametro medio de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 40 nm a
aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 50 nm a
aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 60 nm a
aproximadamente 110 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 60 nm a
aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 80 nm, o menos de aproximadamente 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 nm o 80 nm (o cualquier fraccion de los mismos o intervalo en su interior).
En una realizacion especffica de la presente divulgacion, la SNALP comprende: (a) uno o mas ARN interferentes no modificados y/o modificados (por ejemplo, ARNip, ARNia, miARN) que silencian la expresion del gen diana; (b) un lipido cationico que comprende de aproximadamente el 56,5 % en moles a aproximadamente el 66,5 % en moles del lipido total presente en la partfcula; (c) un lipido no cationico que comprende de aproximadamente el 31,5 % en moles a aproximadamente el 42,5 % en moles del lipido total presente en la partfcula; y (d) un conjugado de lipido que inhibe la agregacion de partfculas que comprende de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Esta realizacion especffica de SNALP se denomina generalmente en el presente documento la formulacion "1:62". En una realizacion preferida, el lipido cationico es DLinDMA o DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), el lipido no cationico es colesterol, y el conjugado de lipido es un conjugado de PEG-DAA. Aunque estas son realizaciones preferidas de la formulacion 1:62, aquellos expertos en la materia apreciaran que pueden usarse otros lfpidos cationicos, lfpidos no cationicos (incluyendo otros derivados de colesterol) y lfpidos conjugados en la formulacion 1:62 como se describe en el presente documento.
En una realizacion especffica de la invencion, la SNALP comprende: (a) uno o mas ARN interferentes no modificados y/o modificados (por ejemplo, ARNip, ARNia, miARN) que silencian la expresion del gen diana; (b) un lipido cationico que comprende de aproximadamente el 52 % en moles a aproximadamente el 62 % en moles del lipido total presente en la partfcula; (c) un lipido no cationico que comprende de aproximadamente el 36 % en moles a aproximadamente el 47 % en moles del lipido total presente en la partfcula; y (d) un conjugado de lipido que inhibe la agregacion de partfculas que comprende de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Esta realizacion especffica de SNALP se denomina generalmente en el presente documento la formulacion "1:57". En una realizacion preferida, el lipido cationico es DLinDMA o DLin-K- C2-DMA ("XTC2"), el lipido no cationico es una mezcla de un fosfolfpido (tal como DPPC) y colesterol, en la que el fosfolfpido comprende de aproximadamente el 5 % en moles a aproximadamente el 9 % en moles del lipido total presente en la partfcula (por ejemplo, aproximadamente 7,1 % en moles) y el colesterol (o derivado de colesterol) comprende de aproximadamente el 32 % en moles a aproximadamente el 37 % en moles del lipido total presente en la partfcula (por ejemplo, aproximadamente 34,3 % en moles), y PEG-lfpido es un PEG-DAA (por ejemplo, PEG- cDMA). En otra realizacion preferida, el lipido cationico es DLinDMA o DLin-K-C2-DMA ("xTc2"), el lipido no cationico es una mezcla de un fosfolfpido (tal como DPPC) y colesterol, en la que el fosfolfpido comprende de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles del lipido total presente en la partfcula (por ejemplo, aproximadamente 20 % en moles) y el colesterol (o derivado de colesterol) comprende de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles del lipido total presente en la partfcula (por ejemplo, aproximadamente 20 % en moles), y PEG-lfpido es un PEG-DAA (por ejemplo, PEG-cDMA). Aunque estas son realizaciones preferidas de la formulacion 1:57, aquellos expertos en la materia apreciaran que pueden usarse otros lfpidos cationicos, lfpidos no cationicos (incluyendo otros fosfolfpidos y otros derivados de colesterol), y lfpidos conjugados en la formulacion 1:57 como se describe en el presente documento.
En realizaciones preferidas, la formulacion 1:62 de SNALP es un sistema de tres componentes que esta libre de fosfolfpido y comprende aproximadamente 1,5 % en moles de PEG-cDMA (o PEG-cDSA), aproximadamente 61,5 % en moles de DLinDMA (o XTC2) y aproximadamente 36,9 % en moles de colesterol (o derivado del mismo). En otras realizaciones preferidas, la formulacion 1:57 de SNALP es un sistema de cuatro componentes que comprende aproximadamente 1,4 % en moles de PEG-cDMA (o PEG-cDSA), aproximadamente 57,1 % en moles de DLinDMA (o XTC2), aproximadamente 7,1 % en moles de DPPC y aproximadamente 34,3 % en moles de colesterol (o derivado del mismo). En aun otras realizaciones preferidas, la formulacion 1:57 de SNALP es un sistema de cuatro componentes que comprende aproximadamente 1,4 % en moles de PEG-cDMA (o PEG-cDSA), aproximadamente 57,1 % en moles de DLinDMA (o XTC2), aproximadamente 20 % en moles de DPPC y aproximadamente 20 % en moles de colesterol (o derivado del mismo). Debe entenderse que estas formulaciones de SNALP son formulaciones objetivo, y que la cantidad de lipido (tanto cationico como no cationico) presente y la cantidad de conjugado de lipido presente en las formulaciones de SNALP puede variar.
La presente divulgacion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una partfcula de lipido (por ejemplo, SNALP) descrita en el presente documento y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona un metodo de introduccion de uno o mas agentes
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activos o agentes terapeuticos (por ejemplo, acido nucleico) en una celula, que comprende poner en contacto la celula con una partfcula de lfpido (por ejemplo, SNALP) descrita en el presente documento. En una realizacion, la celula esta en un mairnfero y el mairnfero es un ser humano. En otra realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para la administracion in vivo de uno o mas agentes activos o agentes terapeuticos (por ejemplo, acido nucleico), que comprende administrar a un sujeto mairnfero una partfcula de lfpido (por ejemplo, SNALP) descrita en el presente documento. En una realizacion preferida, el modo de administracion incluye, pero no se limita a, oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intrarticular, intralesional, intratraqueal, subcutanea y intradermica. Preferentemente, el sujeto mairnfero es un ser humano.
En una realizacion, al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o el 25 % de la dosis total inyectada de las partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) esta presente en plasma aproximadamente 8, 12, 24, 36 o 48 horas despues de la inyeccion. En otras realizaciones, mas de aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 % y tanto como aproximadamente el 60 %, 70 % o el 80 % de la dosis total inyectada de las partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) esta presente en plasma aproximadamente 8, 12, 24, 36 o 48 horas despues de la inyeccion. En ciertos casos, mas de aproximadamente el 10 % de una pluralidad de las partfculas esta presente en el plasma de un mairnfero aproximadamente 1 hora despues de la administracion. En ciertos otros casos, la presencia de las partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) es detectable al menos aproximadamente 1 hora despues de la administracion de la partfcula. En ciertas realizaciones, la presencia de un agente activo o agente terapeutico tal como un ARN interferente (por ejemplo, ARNip) es detectable en celulas de pulmon, tngado, tumor, o en un sitio de inflamacion aproximadamente 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 o 96 horas despues de la administracion. En otras realizaciones, la regulacion por disminucion de la expresion de una secuencia diana por un agente activo o agente terapeutico, tal como un ARN interferente (por ejemplo, ARNip), es detectable aproximadamente 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 o 96 horas despues de la administracion. En aun otras realizaciones, la regulacion por disminucion de la expresion de una secuencia diana por un agente activo o agente terapeutico, tal como un ARN interferente (por ejemplo, ARNip), se produce preferencialmente en celulas tumorales o en celulas en un sitio de inflamacion. En realizaciones adicionales, la presencia o efecto de un agente activo o agente terapeutico tal como un ARN interferente (por ejemplo, ARNip) en celulas en un sitio proximal o distal al sitio de administracion o en celulas del pulmon, tngado, o un tumor, es detectable aproximadamente el 12, 24, 48, 72 o 96 horas, o aproximadamente 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26 o 28 dfas despues de la administracion. En realizaciones adicionales, las partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) se administran por via parenteral o por via intraperitoneal.
En algunas realizaciones, las partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) son particularmente utiles en metodos para la administracion terapeutica de uno o mas acidos nucleicos que comprenden una secuencia de ARN interferente (por ejemplo, ARNip). En particular, es un objeto de la presente divulgacion proporcionar metodos in vitro y in vivo para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un mairnfero (por ejemplo, un roedor tal como un raton o un primate tal como un ser humano, chimpance o mono) regulando por disminucion o silenciando la transcripcion y/o traduccion de una o mas secuencias de acidos nucleicos diana o genes de interes. Como ejemplo no limitante, los metodos descritos en el presente documento son utiles para la administracion in vivo de ARN interferente (por ejemplo, ARNip) al hugado y/o tumor de un sujeto mairnfero. En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno esta asociada a la expresion y/o expresion en exceso de un gen y la expresion o expresion en exceso del gen se reducen por el ARN interferente (por ejemplo, ARNip). En ciertas otras realizaciones, una cantidad terapeuticamente eficaz de la partfcula de lfpido (por ejemplo, SNALP) puede administrarse al mairnfero. En algunos casos, un ARN interferente (por ejemplo, ARNip) se formula en una SNALP, y las partfculas se administran a pacientes que requieren tal tratamiento. En otros casos, se eliminan celulas de un paciente, el ARN interferente (por ejemplo, ARNip) se administra in vitro (por ejemplo, usando una SNALP descrita en el presente documento), y las celulas se reinyectado en el paciente.
En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) que comprende moleculas de ARN interferente asimetrico (ARNia) que silencian la expresion de un gen diana y metodos de uso de tales partfculas para silenciar la expresion del gen diana.
En una realizacion, la molecula de ARNia comprende una region bicatenaria (duplex) de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleotidos (de pares de bases) de longitud, en la que la molecula de ARNia comprende una hebra no codificante que comprende nucleotidos protuberantes en 5' y 3', y en la que la molecula de ARNia es capaz de silenciar la expresion del gen diana.
En ciertos casos, la molecula de ARNia comprende una region bicatenaria (duplex) de aproximadamente 12-20, 1219, 12-18, 13-17 o 14-17 nucleotidos (de pares de bases) de longitud, mas normalmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos (de pares de bases) de longitud. En ciertos otros casos, los nucleotidos protuberantes en 5' y 3' en la hebra no codificante comprenden secuencias que son complementarias a la secuencia de ARN diana, y pueden comprender opcionalmente ademas secuencias no de direccionamiento. En algunas realizaciones, cada uno de los nucleotidos protuberantes en 5' y 3' en la hebra no codificante comprende o consiste en uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, o mas nucleotidos.
En otras realizaciones, la molecula de ARNia comprende nucleotidos modificados seleccionados del grupo que consiste en nucleotidos de 2'OMe, nucleotidos de 2'F, 2'-desoxi-nucleotidos, nucleotidos de 2'-O-MOE, nucleotidos
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de LNA, y mezclas de los mismos. En una realizacion preferida, la molecula de ARNia comprende nucleotidos de 2'OMe. Como ejemplo no limitante, los nucleotidos de 2'OMe pueden seleccionarse del grupo que consiste en nucleotidos de 2'OMe-guanosina, nucleotidos de 2'OMe-uridina, y mezclas de los mismos.
En un aspecto relacionado, la presente divulgacion proporciona partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) que comprenden moleculas de microARN (miARN) que silencian la expresion de un gen diana y metodos de uso de tales composiciones para silenciar la expresion del gen diana.
En una realizacion, la molecula de miARN comprende aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleotidos de longitud, en la que la molecula de miARN es capaz de silenciar la expresion del gen diana.
En ciertos casos, la molecula de miARN comprende aproximadamente 15-50, 15-40 o 15-30 nucleotidos de longitud, mas normalmente aproximadamente 15-25 o 19-25 nucleotidos de longitud, y tiene preferentemente aproximadamente 20-24, 21-22 o 21-23 nucleotidos de longitud. En una realizacion preferida, la molecula de miARN es una molecula de miARN madura que se dirige a una secuencia de ARN de interes.
En algunas realizaciones, la molecula de miARN comprende nucleotidos modificados seleccionados del grupo que consiste en nucleotidos de 2'OMe, nucleotidos de 2'F, 2'-desoxi-nucleotidos, nucleotidos de 2'-O-MOE, nucleotidos de LNA, y mezclas de los mismos. En una realizacion preferida, la molecula de miARN comprende nucleotidos de 2'OMe. Como ejemplo no limitante, los nucleotidos de 2'OMe pueden seleccionarse del grupo que consiste en nucleotidos de 2'OMe-guanosina, nucleotidos de 2'OMe-uridina, y mezclas de los mismos.
Como tales, las partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) son ventajosas y adecuadas para su uso en la administracion de agentes activos o agentes terapeuticos tales como acido nucleico (por ejemplo, ARN interferente tal como ARNip, ARNia y/o miARN) a un sujeto (por ejemplo, un mamffero tal como un ser humano) debido a que son estables en circulacion, de un tamano requerido para el comportamiento farmacodinamico produciendo acceso a sitios extravasculares, y son capaces de llegar a las poblaciones de celulas diana.
IV. Agentes activos
Los agentes activos (por ejemplo, agentes terapeuticos) incluyen cualquier molecula o compuesto capaz de ejercer un efecto deseado sobre una celula, tejido, organo o sujeto. Tales efectos pueden ser, por ejemplo, biologicos, fisiologicos y/o cosmeticos. Los agentes activos pueden ser cualquier tipo de molecula o compuesto que incluye, pero no se limita a, acidos nucleicos, peptidos, polipeptidos, moleculas pequenas, y mezclas de los mismos. Ejemplos no limitantes de acidos nucleicos incluyen moleculas de ARN interferente (por ejemplo, ARNip, ARNia, miARN), oligonucleotidos antisentido, plasmidos, ribozimas, oligonucleotidos inmunoestimulantes, y mezclas de los mismos. Ejemplos de peptidos o polipeptidos incluyen, sin limitacion, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos; anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos recombinantes, anticuerpos Primatized™), citocinas, factores de crecimiento, factores apoptosicos, factores inductores de la diferenciacion, receptores de la superficie celular y sus ligandos, hormonas, y mezclas de los mismos. Ejemplos de moleculas pequenas incluyen, pero no se limitan a, moleculas organicas pequenas o compuestos tales como cualquier agente o farmaco convencional conocido para aquellos expertos en la materia.
En algunas realizaciones, el agente activo es un agente terapeutico, o una sal o derivado del mismo. Los derivados de agente terapeutico pueden ser ellos mismos terapeuticamente activos o pueden ser profarmacos, que llegan a ser activos tras la modificacion adicional. Asf, en una realizacion, un derivado de agente terapeutico retiene alguna o toda de la actividad terapeutica en comparacion con el agente no modificado, mientras que en otra realizacion, un derivado de agente terapeutico es un profarmaco que carece de actividad terapeutica, pero llega a ser activo tras la modificacion adicional.
A. Acidos nucleicos
En ciertas realizaciones, las partfculas de lfpido de la presente divulgacion estan asociadas con un acido nucleico, produciendo una partfcula de acido nucleico-lfpido (por ejemplo, SNALP). En algunas realizaciones, el acido nucleico esta completamente encapsulado en la partfcula de lfpido. Como se usa en el presente documento, el termino "acido nucleico" incluye cualquier oligonucleotido o polinucleotido, conteniendo los fragmentos hasta 60 nucleotidos generalmente denominados oligonucleotidos, y fragmentos mas largos denominados polinucleotidos. En realizaciones particulares, los oligonucleotidos son de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleotidos de longitud. El acido nucleico puede administrarse solo en las partfculas de lfpido descritas en el presente documento, o en combinacion (por ejemplo, co-administrarse) con partfculas de lfpido que comprenden peptidos, polipeptidos, o moleculas pequenas tales como farmacos convencionales.
En el contexto de la presente invencion, los terminos "polinucleotido" y "oligonucleotido" se refieren a un polfmero u oligomero de monomeros de nucleotidos o nucleosidos que consiste en bases que existen de forma natural, azucares y enlaces interazucar (esqueleto). Los terminos "polinucleotido" y "oligonucleotido" tambien incluyen
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polfmeros u oligomeros que comprenden monomeros que no existen de forma natural, o porciones de los mismos, que funcionan similarmente. Tales oligonucleotidos modificados o sustituidos son formas frecuentemente preferidas con respecto a las nativas debido a propiedades tales como, por ejemplo, captacion celular potenciada, inmunogenicidad reducida y elevada estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleotidos se clasifican generalmente como desoxirribooligonucleotidos o ribooligonucleotidos. Un desoxirribooligonucleotido consiste en un azucar de 5 carbonos denominado desoxirribosa unido covalentemente con fosfato en los carbonos 5' y 3' de este azucar para formar un polfmero no ramificado alternante. Un ribooligonucleotido consiste en una estructura de repeticion similar donde el azucar de 5 carbonos es ribosa.
El acido nucleico que esta presente en una partfcula de lfpido-acido nucleico segun la presente divulgacion incluye cualquier forma de acido nucleico que sea conocida. Los acidos nucleicos usados en el presente documento pueden ser ADN o ARN monocatenario, o ADN o ARN bicatenario, o hfbridos de ADN-ARN. Ejemplos de ADN bicatenario se describen en el presente documento e incluyen, por ejemplo, genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y de terminacion, y sistemas auto-replicantes tales como ADN vfrico o de plasmido. Ejemplos de ARN bicatenario se describen en el presente documento e incluyen, por ejemplo, ARNip y otros agentes de iARN tales como ARNia y pre-miARN. Acidos nucleicos monocatenarios incluyen, por ejemplo, oligonucleotidos antisentido, ribozimas, miARN maduro y oligonucleotidos de formacion de triplex.
Los acidos nucleicos pueden ser de diversas longitudes, generalmente dependientes de la forma particular de acido nucleico. Por ejemplo, en realizaciones particulares, los plasmidos o genes pueden ser de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 100.000 restos de nucleotidos de longitud. En realizaciones particulares, los oligonucleotidos pueden oscilar de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleotidos de longitud. En diversas realizaciones relacionadas, los oligonucleotidos, tanto monocatenarios, bicatenarios, como de hebra triple, pueden oscilar en longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nucleotidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleotidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleotidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud.
En realizaciones particulares, un oligonucleotido (o una hebra del mismo) se hibrida especificamente con o es complementario a una secuencia de polinucleotidos diana. Los terminos "especificamente hibridable" y "complementario", como se usan en el presente documento, indican un grado de complementariedad suficiente tal que se produce union estable y especffica entre la diana de ADN o ARN y el oligonucleotido. Se entiende que un oligonucleotido no necesita ser el 100 % complementario a su secuencia de acidos nucleicos diana para ser especificamente hibridable. En realizaciones preferidas, un oligonucleotido es especificamente hibridable cuando la union del oligonucleotido a la secuencia diana interfiere con la funcion normal de la secuencia diana para producir una perdida de utilidad o expresion de la misma, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union no especffica del oligonucleotido a secuencias no diana en condiciones en las que la union especffica se desea, es decir, bajo condiciones fisiologicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapeutico, o, en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que los ensayos se realizan. Asf, el oligonucleotido puede incluir 1, 2, 3, o mas sustituciones de bases en comparacion con la region de un gen o secuencia de ARNm que esta siendo elegida como diana o con la que se hibrida especificamente.
1. ARNip
Un componente de ARNip de una partfcula de acido nucleico-lfpido de la presente invencion es capaz de silenciar la expresion de un gen diana de interes. Cada hebra del duplex de ARNip normalmente tiene aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleotidos de longitud, p refe rente me nte aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud. En ciertas realizaciones, el ARNip comprende al menos un nucleotido modificado. El ARNip modificado es generalmente menos inmunoestimulante que una secuencia de ARNip no modificado correspondiente y retiene actividad de iARN contra el gen diana de interes. En algunas realizaciones, el ARNip modificado contiene al menos un nucleotido de purina o pirimidina de 2'OMe tal como un nucleotido de 2'OMe-guanosina, 2'OMe-uridina, 2'OMe-adenosina y/o 2'OMe-citosina. En realizaciones preferidas, uno o mas de los nucleotidos de uridina y/o guanosina se modifican. Los nucleotidos modificados pueden estar presentes en una hebra (es decir, codificante o no codificante) o ambas hebras del ARNip. La secuencias de ARNip puede tener nucleotidos protuberantes (por ejemplo, nucleotidos protuberantes en 3' o 5' como se describen en Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) o Nykanen et al., Cell, 107:309 (2001)), o pueden carecer de nucleotidos protuberantes (es decir, tener extremos romos).
El ARNip modificado generalmente comprende de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 100 % (por ejemplo, aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o el 100 %) de nucleotidos modificados en la region bicatenaria del duplex de ARNip. En ciertas realizaciones, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o mas de los nucleotidos en la region bicatenaria del ARNip comprenden nucleotidos modificados.
En algunas realizaciones, menos de aproximadamente el 25 % (por ejemplo, menos de aproximadamente el 25 %,
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5 %, 4 %, 3 %, 2 % o el 1 %) de los nucleotidos en la region bicatenaria del ARNip comprenden nucleotidos modificados.
En otras realizaciones, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 25 % (por ejemplo, de aproximadamente el 1 %-25 %, 2 %-25 %, 3 %-25 %, 4 %-25 %, 5 %-25 %, 6 %-25 %, 7 %-25 %, 8 %-25 %, 9 %-25 %, 10 %-25 %,
11 %-25 %, 12 %-25 %, 13 %-25 %, 14 %-25 %, 15 %-25 %, 16 %-25 %, 17 %-25 %, 18 %-25 %, 19 %-25 %, 20 %-
25 %, 21 %-25 %, 22 %-25 %, 23 %-25 %, 24 %-25 %, etc.) o de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 % (por ejemplo, de aproximadamente el 1 %-20 %, 2 %-20 %, 3 %-20 %, 4 %-20 %, 5 %-20 %, 6 %-20 %, 7 %- 20 %, 8 %-20 %, 9 %-20 %, 10 %-20 %, 11 %-20 %, 12 %-20 %, 13 %-20 %, 14 %-20 %, 15 %-20 %, 16 %-20 %,
17 %-20 %, 18 %-20 %, 19 %-20 %, 1 %-19 %, 2 %-19 %, 3 %-19 %, 4 %-19 %, 5 %-19 %, 6 %-19 %, 7 %-19 %, 8 %-19 %, 9 %-19 %, 10 %-19 %, 11 %-19 %, 12 %-19 %, 13 %-19 %, 14 %-19 %, 15 %-19 %, 16 %-19 %, 17 %- 19 %, 18 %-19 %, 1 %-18 %, 2 %-18 %, 3 %-18 %, 4 %-18 %, 5 %-18 %, 6 %-18 %, 7 %-18 %, 8 %-18 %, 9 %-
18 %, 10 %-18 %, 11 %-18 %, 12 %-18 %, 13 %-18 %, 14 %-18 %, 15 %-18 %, 16 %-18 %, 17 %-18 %, 1 %-17 %,
2 %-17 %, 3 %-17 %, 4 %-17 %, 5 %-17 %, 6 %-17 %, 7 %-17 %, 8 %-17 %, 9 %-17 %, 10 %-17 %, 11 %-17 %,
12 %-17 %, 13 %-17 %, 14 %-17 %, 15 %-17 %, 16 %-17 %, 1 %-16 %, 2 %-16 %, 3 %-16 %, 4 %-16 %, 5 %-16 %,
6 %-16 %, 7 %-16 %, 8 %-16 %, 9 %-16 %, 10 %-16 %, 11 %-16 %, 12 %-16 %, 13 %-16 %, 14 %-16 %, 15 %- 16 %, 1 %-15 %, 2 %-15 %, 3 %-15 %, 4 %-15 %, 5 %-15 %, 6 %-15 %, 7 %-15 %, 8 %-15 %, 9 %-15 %, 10 %- 15 %, 11 %-15 %, 12 %-15 %, 13 %-15 %, 14 %-15 %, etc.) de los nucleotidos en la region bicatenaria del ARNip comprenden nucleotidos modificados.
En realizaciones adicionales, por ejemplo, cuando una o ambas hebras del ARNip se modifican selectivamente en los nucleotidos de uridina y/o guanosina, el ARNip modificado resultante puede comprender menos de aproximadamente el 30 % de nucleotidos modificados (por ejemplo, menos de aproximadamente el 30 %, 29 %, 28 %, 27 %, 26 %, 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o el 1 % de nucleotidos modificados) o de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 % de nucleotidos modificados (por ejemplo, de aproximadamente el 1 %-30 %, 2 %-30 %,
3 %-30 %, 4 %-30 %, 5 %-30 %, 6 %-30 %, 7 %-30 %, 8 %-30 %, 9 %-30 %, 10 %-30 %, 11 %-30 %, 12 %-30 %,
13 %-30 %, 14 %-30 %, 15 %-30 %, 16 %-30 %, 17 %-30 %, 18 %-30 %, 19 %-30 %, 20 %-30 %, 21 %-30 %, 22 %- 30 %, 23 %-30 %, 24 %-30 %, 25 %-30 %, 26 %-30 %, 27 %-30 %, 28 %-30 %, o 29 %-30 % de nucleotidos modificados).
a. Seleccion de secuencias de ARNip
Pueden identificarse secuencias de ARNip adecuadas usando cualquier medio conocido en la tecnica. Normalmente, los metodos descritos en Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001) y Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001) se combinan con las reglas de diseno racional expuestas en Reynolds et al., Nature Biotech., 22(3):326-330 (2004).
Generalmente, la secuencia de nucleotidos 3' del codon de iniciacion AUG de un transcrito del gen diana de interes es barrido para secuencias de dinucleotidos (por ejemplo, AA, NA, CC, GG o UU, en las que N = C, G o U) (vease, por ejemplo, Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001)). Los nucleotidos inmediatamente 3' a las secuencias de dinucleotidos se identifican como posibles secuencias de ARNip (es decir, una secuencia diana o una secuencia de hebra codificante). Normalmente, los 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, o mas nucleotidos inmediatamente 3' a las secuencias de dinucleotidos se identifican como posibles secuencias de ARNip. En algunas realizaciones, la secuencia de dinucleotidos es una secuencia de AA o NA y los 19 nucleotidos inmediatamente 3' al dinucleotido AA o NA se identifican como posibles secuencias de ARNip. Las secuencias de ARNip estan normalmente separadas diferentes posiciones a lo largo de la longitud del gen diana. Para potenciar adicionalmente la eficiencia de silenciamiento de las secuencias de ARNip, pueden analizarse posibles secuencias de ARNip para identificar sitios que no contienen regiones de homologfa con otras secuencias codificantes, por ejemplo, en la celula diana u organismo. Por ejemplo, una secuencia de ARNip adecuada de aproximadamente 21 pares de bases normalmente no tendra mas de 16-17 pares de bases contiguos de homologfa con secuencias codificantes en la celula diana u organismo. Si las secuencias de ARNip van a expresarse a partir de un promotor Pol III de ARN, se seleccionan las secuencias de ARNip que carecen de mas de 4 A o T contiguas.
Una vez se ha identificado una posible secuencia de ARNip, puede disenarse una secuencia complementaria (es decir, una secuencia de hebra no codificante). Tambien puede analizarse una posible secuencia de ARNip usando una variedad de criterios conocidos en la tecnica. Por ejemplo, para potenciar su eficiencia de silenciamiento, las secuencias de ARNip pueden analizarse por un algoritmo de diseno racional para identificar secuencias que tienen una o mas de las siguientes caracterfsticas: (1) contenido de G/C de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 60 % de G/C; (2) al menos 3 A/U en las posiciones 15-19 de la hebra codificante; (3) sin repeticiones internas; (4) una A en la posicion 19 de la hebra codificante; (5) una A en la posicion 3 de la hebra codificante; (6) un U en la posicion 10 de la hebra codificante; (7) sin G/C en la posicion 19 de la hebra codificante; y (8) sin G en la posicion 13 de la hebra codificante. Las herramientas de diseno de ARNip que incorporan algoritmos que asignan valores adecuados de cada una de estas caracterfsticas y son utiles para la seleccion de ARNip pueden encontrarse en, por ejemplo,
http://boz094.ust.hk/iARN/siRNA. Un experto en la materia apreciara que secuencias con una o mas de las
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caracterfsticas anteriores pueden seleccionarse para analisis y prueba adicionales como posibles secuencias de ARNip.
Adicionalmente, las posibles secuencias de ARNip con uno o mas de los siguientes criterios pueden eliminarse frecuentemente como ARNip: (1) secuencias que comprenden un tramo de 4 o mas de la misma base en una fila; (2) secuencias que comprenden homopolfmeros de G (es decir, para reducir posibles efectos no especfficos debidos a caracterfsticas estructurales de estos polfmeros; (3) secuencias que comprenden motivos de base triple (por ejemplo, GGG, CCC, AAA o TTT); (4) secuencias que comprenden tramos de 7 o mas G/C en una fila; y (5) secuencias que comprenden repeticiones directas de 4 o mas bases dentro de los candidatos produciendo estructuras de pliegue hacia abajo internas. Sin embargo, un experto en la materia apreciara que secuencias con una o mas de las anteriores caracterfsticas pueden todavfa seleccionarse para analisis y prueba adicionales como posibles secuencias de ARNip.
En algunas realizaciones, las secuencias de ARNip pueden analizarse adicionalmente basandose en la asimetrfa del duplex de ARNip como se describe en, por ejemplo, Khvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003); y Schwarz et al., Cell, 115:199-208 (2003). En otras realizaciones, pueden analizarse adicionalmente secuencias de ARNip basandose en la estructura secundaria en el sitio diana como se describe en, por ejemplo, Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318:303-310 (2004). Por ejemplo, la estructura secundaria en el sitio diana puede modelarse usando el algoritmo de Mfold (disponible en
http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi) para seleccionar secuencias de ARNip que favorecen la accesibilidad en el sitio diana donde esta presente menos estructura secundaria en forma de apareamiento de bases y tallo-lazo.
Una vez se ha identificado una posible secuencia de ARNip, la secuencia puede analizarse para la presencia de cualquier propiedad inmunoestimulante, por ejemplo, usando un ensayo de citocinas in vitro o un modelo animal in vivo. Motivos en la hebra codificante y/o no codificante de la secuencia de ARNip, tales como motivos ricos en GU (por ejemplo, 5'-GU-3', 5'-UGU-3', 5'-GUGU-3', 5'-UGUGU-3', etc.), tambien pueden proporcionar una indicacion de si la secuencia puede ser inmunoestimulante. Una vez se encuentra que una molecula de ARNip es inmunoestimulante, puede entonces modificarse para reducir sus propiedades inmunoestimulantes como se describe en el presente documento. Como ejemplo no limitante, una secuencia de ARNip puede ponerse en contacto con una celula respondedora de mamffero en condiciones tales que la celula produzca una respuesta inmunitaria detectable para determinar si el ARNip es un ARNip inmunoestimulante o no inmunoestimulante. La celula respondedora de mamffero puede ser de un mamffero intacto (es decir, un mamffero que no ha estado previamente en contacto con el producto genico de la secuencia de ARNip). La celula respondedora de mamffero puede ser, por ejemplo, una celula mononuclear de sangre periferica (CMSP), un macrofago, y similares. La respuesta inmunitaria detectable puede comprender la produccion de una citocina o factor de crecimiento tal como, por ejemplo, TNF-a, IFN-a, IFN-p, IFN-y, IL-6, IL-12, o una combinacion de los mismos. Una molecula de ARNip identificada como que es inmunoestimulante puede entonces modificarse para reducir sus propiedades inmunoestimulantes reemplazando al menos uno de los nucleotidos en la hebra codificante y/o no codificante con nucleotidos modificados. Por ejemplo, menos de aproximadamente el 30 % (por ejemplo, menos de aproximadamente el 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, o el 5 %) de los nucleotidos en la region bicatenaria del duplex de ARNip pueden sustituirse con nucleotidos modificados tales como nucleotidos de 2'OMe. El ARNip modificado puede entonces ponerse en contacto con una celula respondedora de mamffero como se ha descrito anteriormente para confirmar que sus propiedades inmunoestimulantes han sido reducidas o suprimidas.
Ensayos in vitro adecuados para detectar una respuesta inmunitaria incluyen, pero no se limitan a, la tecnica de inmunoensayo de sandwich de anticuerpo monoclonal doble de David et al. (patente de EE.UU. N.° 4.376.110); ensayos de sandwich de anticuerpo monoclonal-policlonal Wide et al., en Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh (1970)); el metodo de "transferencia Western" de Gordon et al. (patente de EE.UU. N.° 4.452.901); inmunoprecipitacion de ligando marcado (Brown et al., J. Biol. Chem., 255:4980-4983 (1980)); enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA) como se describen, por ejemplo, por Raines et al., J. Biol. Chem., 257:5154-5160 (1982); tecnicas inmunocitoqufmicas, que incluyen el uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39:477 (1980)); y neutralizacion de actividad (Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2396-2400 (1984)). Ademas de los inmunoensayos descritos anteriormente, estan disponibles varios otros inmunoensayos, que incluyen aquellos descritos en las patentes de EE.UU. N.° 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; y 4.098.876.
Un ejemplo no limitante de un modelo in vivo para detectar una respuesta inmunitaria incluye un ensayo de induccion de citocinas de raton in vivo como se describe en, por ejemplo, Judge et al., Mol. Ther., 13:494-505 (2006). En ciertas realizaciones, el ensayo puede realizarse del siguiente modo: (1) puede administrarse ARNip por inyeccion intravenosa estandar en la vena lateral de la cola; (2) puede recogerse sangre por puncion cardfaca aproximadamente 6 horas despues de la administracion y procesarse como plasma para analisis de citocinas; y (3) pueden cuantificarse citocinas usando kits de ELISA de sandwich segun las instrucciones del fabricante (por ejemplo, IFN-a de raton y humano (PBL Biomedical; Piscataway, NJ); IL-6 y TNF-a humanos (eBioscience; San Diego, CA); e IL-6, TNF-a e IFN-y de raton (BD Biosciences; San Diego, CA)).
Estan comercialmente disponibles anticuerpos monoclonales que se unen especfficamente a citocinas y factores de
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crecimiento de multiples fuentes y pueden generarse usando metodos conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) y Harlow y Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1999)). La generacion de anticuerpos monoclonales ha sido previamente descrita y puede llevarse a cabo mediante cualquier medio conocido en la tecnica (Buhring et al., en Hybridoma, Vol. 10, N.° 1, pp. 77-78 (1991)). En algunos metodos, el anticuerpo monoclonal se marca (por ejemplo, con cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoqufmicos, bioqufmicos, electricos, opticos o qufmicos) para facilitar la deteccion.
b. Generacion de moleculas de ARNip
Puede proporcionarse ARNip en varias formas que incluyen, por ejemplo, como uno o mas duplex de ARN interferente pequeno (ARNip) aislados, como ARN bicatenario (ARNbc) mas largo, o como ARNip o ARNbc transcrito de un casete transcripcional en un plasmido de ADN. Las secuencias de ARNip pueden tener nucleotidos protuberantes (por ejemplo, nucleotidos protuberantes en 3' o 5' como se describe en Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001) o Nykanen et al., Cell, 107:309 (2001), o pueden carecer de nucleotidos protuberantes (es decir, para tener extremos romos).
Puede usarse una poblacion de ARN para proporcionar ARN de precursor largos, o ARN de precursor largos que tienen identidad sustancial o completa con una secuencia diana seleccionada, para preparar los ARNip. Los ARN pueden aislarse de celulas o tejido, sintetizarse y/o clonarse segun metodos muy conocidos para aquellos expertos en la materia. El ARN puede ser una poblacion mixta (obtenida de celulas o tejido, transcrita de ADNc, sustrafda, seleccionada, etc.), o puede representar una unica secuencia diana. El ARN puede ser que exista de forma natural (por ejemplo, aislado de muestras tisulares o de celulas), sintetizarse in vitro (por ejemplo, usando T7 o SP6 polimerasa y productos de PCR o un ADNc clonado), o sintetizarse qufmicamente.
Para formar un ARNbc largo, para ARN sinteticos, el complemento tambien se transcribe in vitro y se hibrida para formar un ARNbc. Si se usa una poblacion de ARN que existe de forma natural, tambien se proporcionan complementos de ARN (por ejemplo, para formar ARNbc para la digestion por RNAsa III de E. coli o Dicer), por ejemplo, por transcripcion de ADNc correspondientes a la poblacion de ARN, o usando ARN polimerasas. Los ARN de precursor se hibridan entonces para formar ARN bicatenarios para la digestion. Los ARNbc pueden ser directamente administrados a un sujeto o pueden digerirse in vitro antes de la administracion.
Metodos de aislamiento de ARN, sfntesis de ARN, hibridacion de acidos nucleicos, preparacion y cribado de bibliotecas de ADNc, y realizacion de PCR, son muy conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, Gubler y Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., arriba; Ausubel et al., arriba), ya que son los metodos de PCR (veanse las patentes de EE.UU. N.° 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)). Las bibliotecas de expresion tambien son muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Textos basicos adicionales que desvelan los metodos generales de uso en la presente invencion incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994).
Preferentemente, los ARNip se sintetizan qufmicamente. Los oligonucleotidos que comprenden las moleculas de ARNip descritas en el presente documento pueden sintetizarse usando cualquiera de una variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, tales como aquellas descritas en Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); y Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997). La sfntesis de oligonucleotidos hace uso de grupos de proteccion y acoplamiento de acidos nucleicos comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y fosforamiditos en el extremo 3'. Como ejemplo no limitante, pueden realizarse sfntesis a pequena escala en un sintetizador de Applied Biosystems usando un protocolo a escala de 0,2 pmoles. Alternativamente, pueden realizarse sfntesis a la escala de 0,2 pmoles en un sintetizador de placa de 96 pocillos de Protogene (Palo Alto, CA). Sin embargo, tambien esta dentro del alcance de la presente divulgacion una escala mas grande o mas pequena de sfntesis. Reactivos adecuados para la sfntesis de oligonucleotidos, metodos para la desproteccion de ARN y metodos para la purificacion de ARN son conocidos para aquellos expertos en la materia.
Tambien pueden sintetizarse moleculas de ARNip mediante una tecnica de sfntesis en tandem, en la que ambas cadenas se sintetizan como un unico fragmento de oligonucleotidos continuo o hebra separada por un conector escindible que es posteriormente escindido para proporcionar fragmentos separados o hebras que se hibridan para formar el duplex de ARNip. El conector puede ser un conector de polinucleotido o un conector de no nucleotido. La sfntesis de ARNip en tandem puede ser facilmente adaptada a tanto plataformas de sfntesis multi-pocillo/multi-placa, ademas de plataformas de sfntesis a gran escala empleando reactores discontinuos, columnas de sfntesis, y similares. Alternativamente, pueden ensamblarse moleculas de ARNip a partir de dos oligonucleotidos distintos, en los que un oligonucleotido comprende la hebra codificante y el otro comprende la hebra no codificante del ARNip. Por ejemplo, cada hebra puede sintetizarse por separado y unirse juntas por hibridacion o ligacion tras la sfntesis y/o desproteccion. En ciertos otros casos, las moleculas de ARNip pueden sintetizarse como un unico fragmento de oligonucleotido continuo, donde las regiones codificantes y no codificantes auto-complementarias se hibridan para formar un duplex de ARNip que tiene estructura secundaria de horquilla.
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c. Modificacion de secuencias de ARNip
En ciertos aspectos, las moleculas de ARNip comprenden un duplex que tiene dos hebras y al menos un nucleotido modificado en la region bicatenaria, en los que cada hebra tiene aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleotidos de longitud. Ventajosamente, el ARNip modificado es menos inmunoestimulante que una secuencia de ARNip no modificado correspondiente, pero retiene la capacidad de silenciar la expresion de una secuencia diana. En realizaciones preferidas, el grado de modificaciones qufmicas introducido en la molecula de ARNip da un equilibrio entre la reduccion o supresion de las propiedades inmunoestimulantes del ARNip y la retencion de actividad de iARN. Como ejemplo no limitante, una molecula de ARNip que se dirige a un gen de interes puede ser mfnimamente modificado (por ejemplo, modificado menos de aproximadamente el 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o el 5 %) en nucleotidos de uridina y/o guanosina selectivos dentro del duplex de ARNip para eliminar la respuesta inmunitaria generada por el ARNip mientras que se retiene su capacidad para silenciar la expresion del gen diana.
Ejemplos de nucleotidos modificados adecuados para su uso en la invencion incluyen, pero no se limitan a, ribonucleotidos que tienen un grupo 2'-O-metilo (2'OMe), 2'-desoxi-2'-fluor (2'F), 2'-desoxi, 5-C-metilo, 2'-O-(2- metoxietilo) (MOE), 4'-tio, 2'-amino o 2'-C-alilo. Nucleotidos modificados que tienen una conformacion Northern tal como aquellos descritos en, por ejemplo, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984), tambien son adecuados para su uso en moleculas de ARNip. Tales nucleotidos modificados incluyen, sin limitacion, nucleotidos de acido nucleico bloqueado (LNA) (por ejemplo, nucleotidos de 2'-O, 4'-C-metileno-(D-ribofuranosilo), nucleotidos de 2'-O-(2-metoxietilo) (MOE), nucleotidos de 2'-metil-tio-etilo, nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluor (2'F), nucleotidos de 2'-desoxi-2'-cloro (2'Cl) y 2'-azido-nucleotidos. En ciertos casos, las moleculas de ARNip descritas en el presente documento incluyen uno o mas nucleotidos de abrazadera en G. Un nucleotido de abrazadera en G se refiere a un analogo de citosina modificado en el que las modificaciones confieren la capacidad al enlace de hidrogeno tanto de caras de Watson-Crick como de Hoogsteen de un nucleotido de guanina complementario dentro de un duplex (vease, por ejemplo, Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 120:8531-8532 (1998)). Ademas, los nucleotidos que tienen un analogo de base de nucleotido tal como, por ejemplo, C-fenilo, C-naftilo, otros derivados aromaticos, inosina, azolcarboxamidas y derivados de nitroazol tales como 3-nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol y 6-nitroindol (vease, por ejemplo, Loakes, Nucl. Acids Res., 29:2437-2447 (2001)) pueden incorporarse en moleculas de ARNip.
En ciertas realizaciones, las moleculas de ARNip pueden comprender ademas una o mas modificaciones qufmicas tales como resto de terminacion terminal, modificaciones del esqueleto de fosfato, y similares. Ejemplos de restos de terminacion terminales incluyen, sin limitacion, restos abasicos desoxi invertidos, modificaciones de glicerilo, nucleotidos de 4',5'-metileno, nucleotidos de 1-(p-D-eritrofuranosilo), 4'-tio-nucleotidos, nucleotidos carbocfclicos, nucleotidos de 1,5-anhidrohexitol, L-nucleotidos, a-nucleotidos, nucleotidos de base modificada, nucleotidos de treo- pentofuranosilo, 3',4'-seco-nucleotidos acfclicos, nucleotidos de 3,4-dihidroxibutilo acfclicos, nucleotidos de 3,5- dihidroxipentilo acfclicos, restos de nucleotidos 3'-3'-invertidos, restos abasicos 3'-3'-invertidos, restos de nucleotidos 3'-2'-invertidos, restos abasicos 3'-2'-invertidos, restos de nucleotidos 5'-5'-invertidos, restos abasicos 5'-5'-invertidos, restos abasicos de desoxi 3'-5'-invertidos, fosfato de 5'-amino-alquilo, fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3- aminopropilo, fosfato de 6-aminohexilo, fosfato de 1,2-aminododecilo, fosfato de hidroxipropilo, fosfato de 1,4- butanodiol, 3'-fosforamidato, 5'-fosforamidato, hexilfosfato, aminohexilfosfato, 3'-fosfato, 5'-amino, 3'-fosforotioato, 5'- fosforotioato, fosforoditioato, y metilfosfonato de enlace o no enlace o restos de 5'-mercapto (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.998.203; Beaucage et al., Tetrahedron 49:1925 (1993)). Ejemplos no limitantes de modificaciones del esqueleto de fosfato (es decir, que producen enlaces internucleotfdicos modificados) incluyen sustituciones de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriester, morfolino, amidato, carbamato, carboximetilo, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal y alquilsililo (vease, por ejemplo, Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, en Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417 (1995); Mesmaeker et al., Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, en Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)). Tales modificaciones qufmicas pueden producirse en el extremo 5' y/o extremo 3' de la hebra codificante, hebra no codificante, o ambas hebras del ARNip.
En algunas realizaciones, la hebra codificante y/o no codificante de la molecula de ARNip puede comprender ademas un nucleotido protuberante en 3' que tiene aproximadamente 1 a aproximadamente 4 (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) 2'-desoxirribonucleotidos y/o cualquier combinacion de nucleotidos modificados y no modificados. Ejemplos adicionales de nucleotidos modificados y tipos de modificaciones qufmicas que pueden introducirse en las moleculas de ARNip se describen, por ejemplo, en la patente de RU N.° GB 2.397.818 B y las publicaciones de patente de EE.UU. N.°20040192626, 20050282188 y20070135372.
Las moleculas de ARNip descritas en el presente documento pueden comprender opcionalmente uno o mas no nucleotidos en una o ambas hebras del ARNip. Como se usa en el presente documento, el termino "no nucleotido" se refiere a cualquier grupo o compuesto que puede incorporarse en una cadena de acido nucleico en el sitio de una o mas unidades de nucleotido, que incluyen sustituciones de azucar y/o fosfato, y permite que las bases restantes presenten su actividad. El grupo o compuesto es abasico porque no contiene una base de nucleotido comunmente reconocida tal como adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina y, por tanto, carece de una base en la posicion 1'.
En otras realizaciones, la modificacion qufmica del ARNip comprende unir un conjugado a la molecula de ARNip. El conjugado puede unirse en el extremo 5' y/o 3' de la hebra codificante y/o no codificante del ARNip mediante una
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union covalente tal como, por ejemplo, un conector biodegradable. El conjugado tambien puede unirse al ARNip, por ejemplo, mediante un grupo carbamato u otro grupo de enlace (veanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20050074771, 20050043219 y 20050158727). En ciertos casos, el conjugado es una molecula que facilita la administracion del ARNip en una celula. Ejemplos de moleculas de conjugado adecuadas para la union a ARNip incluyen, sin limitacion, esteroides tales como colesterol, glicoles tales como polietilenglicol (PEG), albumina de suero humano (HSA), acidos grasos, carotenoides, terpenos, acidos biliares, folatos (por ejemplo, acido folico, analogos de folato y derivados de los mismos), azucares (por ejemplo, galactosa, galactosamina, N- acetilgalactosamina, glucosa, manosa, fructosa, fucosa, etc.), fosfolipidos, peptidos, ligandos para receptores celulares capaces de mediar en la captacion celular, y combinaciones de los mismos (veanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. 20030130186, 20040110296 y 20040249178; la patente de EE.UU. N.° 6.753.423). Otros ejemplos incluyen el resto lipofilo, vitamina, polfmero, peptido, protefna, acido nucleico, molecula pequena, oligosacarido, agrupacion de hidratos de carbono, intercalador, ligando del surco menor, agente de escision, y las moleculas de conjugado de agente de reticulacion descritas en las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20050119470 y 20050107325. Aun otros ejemplos incluyen la 2'-O-alquilamina, 2'-O-alcoxialquilamina, poliamina, pirimidina modificada con C5-cationico, peptido cationico, grupo guanidinio, grupo amidininio, moleculas de conjugado de aminoacido cationico descritas en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20050153337. Ejemplos adicionales incluyen el grupo hidrofobo, compuesto activo de membrana, compuesto penetrante en celula, senal que se dirige a celula, modificador de la interaccion y moleculas de conjugado de estabilizador esterico descritas en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20040167090. Ejemplos adicionales incluyen las moleculas de conjugado descritas en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20050239739. El tipo de conjugado usado y el grado de conjugacion con la molecula de ARNip pueden evaluarse para perfiles farmacocineticos mejorados, biodisponibilidad y/o estabilidad del ARNip, mientras que se retiene la actividad de iARN. Como tal, un experto en la materia puede cribar moleculas de ARNip que tienen diversos conjugados unidos a las mismas para identificar aquellas que tienen propiedades mejoradas y actividad de iARN completa usando cualquiera de una variedad de modelos de cultivo celular in vitro o animales in vivo muy conocidos.
d. Genes diana
El componente de ARNip de las partfculas de acido nucleico-lfpido descrito en el presente documento puede usarse para regular por disminucion o silenciar la traduccion (es decir, expresion) de un gen de interes. Genes de interes incluyen, pero no se limitan a, genes asociados a infeccion vfrica y supervivencia, genes asociados a enfermedades y trastornos metabolicos (por ejemplo, enfermedades y trastornos del hfgado), genes asociados a tumorigenesis y transformacion celular (por ejemplo, cancer), genes angiogenicos, genes inmunomoduladores tales como aquellos asociados a respuestas inflamatorias y auto-inmunitarias, genes de receptor de ligando, y genes asociados a trastornos neurodegenerativos.
Genes asociados a infeccion vfrica y supervivencia incluyen aquellos expresados por un virus con el fin de unirse, entrar en y replicarse en una celula. Son de particular interes secuencias vfricas asociadas a enfermedades vfricas cronicas. Secuencias vfricas de particular interes incluyen secuencias de filovirus tales como virus del Ebola y virus de Marburgo (vease, por ejemplo, Geisbert et al., J. Infect. Dis., 193:1650-1657 (2006)); arenavirus tales como el virus de Lassa, virus de Junin, virus de Machupo, virus de Guanarito y virus de Sabia (Buchmeier et al., Arenaviridae: the viruses and their replication, en: FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (2001)); virus de la gripe tales como virus de la gripe A, B y C (vease, por ejemplo, Steinhauer et al., Annu Rev Genet., 36:305-332 (2002); y Neumann et al., J Gen Virol., 83:2635-2662 (2002)); virus de la hepatitis (veanse, por ejemplo, Hamasaki et al., FEBS Lett., 543:51 (2003); Yokota et al., EMBO Rep., 4:602 (2003); Schlomai et al., Hepatology, 37:764 (2003); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2014 (2003); y FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (2001)); virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Banerjea et al., Mol. Ther., 8:62 (2003); Song et al., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289:1494 (2003); Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:183 (2003)); virus del herpes (Jia et al., J. Virol., 77:3301 (2003)); y virus del papiloma humano (VPH) (Hall et al., J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang et al., Oncogene, 21:6041 (2002)).
Secuencias de acidos nucleicos de filovirus a modo de ejemplo que pueden ser silenciadas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de acidos nucleicos que codifican protefnas estructurales (por ejemplo, VP30, VP35, nucleoprotefna (NP), protefna de polimerasa (L-pol)) y protefnas asociadas a membrana (por ejemplo, VP40, glucoprotefna (GP), VP24). Secuencias del genoma completo para el virus del Ebola se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank NC_002549; AY769362; NC_006432; NC_004161; AY729654; AY354458; AY142960; AB050936; AF522874; AF499101; AF272001; y AF086833. Las secuencias de VP24 del virus del Ebola se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank U77385 y AY058897. Las secuencias de L-pol del virus del Ebola se

exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank X67110. Las secuencias de VP40 del virus del Ebola se

exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank AY058896. Las secuencias de NP del virus del Ebola se

exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank AY058895. Las secuencias de GP del virus del Ebola se
exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank AY058898; Sanchez et al., Virus Res., 29:215-240 (1993); Will et al., J. Virol., 67:1203-1210 (1993); Volchkov et al., FEBS Lett., 305:181-184 (1992); y la patente de EE.UU. N.° 6.713.069. Secuencias del virus del Ebola adicionales se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank L11365 y X61274. Secuencias del genoma completo para el virus de Marburgo se exponen en, por ejemplo, N.° de
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acceso de Genbank NC_001608; AY430365; AY430366; y AY358025. Las secuencias de GP del virus de Marburgo se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank AF005734; AF005733; y AF005732. Las secuencias de VP35 del virus de Marburgo se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank AF005731 y AF005730. Secuencias del virus de Marburgo adicionales se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank X64406; Z29337; AF005735; y Z12132. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirige a las secuencias de acidos nucleicos del virus del Ebola y del virus de Marburgo incluyen aquellos descritos en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20070135370.
Secuencias de acidos nucleicos del virus de la gripe a modo de ejemplo que pueden ser silenciadas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de acidos nucleicos que codifican nucleoprotefna (NP), protefnas de la matriz (M1 y M2), protefnas no estructurales (NS1 y NS2), ARN polimerasa (PA, PB1, PB2), neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA). Secuencias de NP de la gripe A se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank NC_004522; AY818138; AB166863; AB188817; AB189046; AB189054; AB189062; AY646169; AY646177; AY651486; AY651493;
AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501; AY651502;
AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308;
AY818138; y AY818140. Secuencias de PA de la gripe A se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank AY818132; AY790280; AY646171; AY818132;AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605;
AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621; AY651619; AY770995; y AY724786. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirige a las secuencias de acidos nucleicos del virus de la gripe incluyen aquellos descritos en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20070218122.
Secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis a modo de ejemplo que pueden ser silenciadas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de acidos nucleicos implicadas en la transcripcion y traduccion (por ejemplo, En1, En2, X, P) y secuencias de acidos nucleicos que codifican protefnas estructurales (por ejemplo, protefnas de nucleo que incluyen protefnas C y relacionadas con C, protefnas de la capside y de la envoltura que incluyen protefnas S, M y/o L, o fragmentos de las mismas) (vease, por ejemplo, FIELDS VIROLOGY, arriba). Secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis C (VHC) a modo de ejemplo que pueden ser silenciadas incluyen, pero no se limitan a, la region no traducida 5' (5'-UTR), la region no traducida 3' (3'-UTR), la region del codon de iniciacion de la traduccion de poliprotefnas, la secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), y/o secuencias de acidos nucleicos que codifican la protefna de nucleo, la protefna E1, la protefna E2, la protefna p7, la protefna NS2, la proteasa NS3/helicasa, la protefna NS4A, la protefna NS4B, la protefna NS5A, y/o la ARN polimerasa dependiente de ARN de NS5B. Secuencias del genoma de VHC se exponen en, por ejemplo, N.° de acceso de Genbank NC_004102 (genotipo 1a de VHC), AJ238799 (genotipo 1b de VHC), NC_009823 (genotipo 2 de VHC), NC_009824 (genotipo 3 de VHC), NC_009825 (genotipo 4 de VHC), NC_009826 (genotipo 5 de VHC) y NC_009827 (genotipo 6 de VHC). Secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis A se exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank NC_001489; secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis B se exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank NC_003977; secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis D se exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank NC_001653; secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis E se exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank NC_001434; y secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis G se exponen en, por ejemplo, N° de acceso de GenBank NC_001710. El silenciamiento de secuencias que codifican genes asociados a infeccion vfrica y supervivencia puede usarse convenientemente en combinacion con la administracion de agentes convencionales usados para tratar la afeccion vfrica. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirige a las secuencias de acidos nucleicos del virus de la hepatitis incluyen aquellos descritos en las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20060281175, 20050058982 y 20070149470; la patente de EE.UU. N.° 7.348.314; y la solicitud provisional de EE.UU. N.° 61/162.127, presentada el 20 de marzo de 2009.
Genes asociados a enfermedades y trastornos metabolicos (por ejemplo, trastornos en los que el hfgado es la diana y enfermedades y trastornos del hfgado) incluyen, por ejemplo, genes expresados en dislipidemia (por ejemplo, receptores X del hugado tales como LXRa y LXRp (N.° de acceso de Genbank NM_007121), receptores X farnesoides (FXR) (N° de acceso de GenBank NM_005123), protefna de union al regulador del elemento de esterol (SREBP), proteasa del sitio 1 (SIP), 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A reductasa (HMG coenzima-A reductasa), apolipoprotefna B (ApoB) (N° de acceso de GenBank NM_000384), apolipoprotefna CiII (ApoC3) (N.° de acceso de Genbank NM_000040 y NG_008949 REGION: 5001..8164) y apolipoprotefna E (ApoE) (N.° de acceso de Genbank NM_000041 y NG_007084 REGION: 5001 ..8612)); y diabetes (por ejemplo, glucosa 6-fosfatasa) (veanse, por ejemplo, Forman et al., Cell, 81:687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol., 9:72 (1995), Zavacki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7909 (1997); Sakai et al., Cell, 85:1037-1046 (1996); Duncan et al., J. Biol. Chem., 272:12778-12785 (1997); Willy et al., Genes Dev., 9:1033-1045 (1995); Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272:3137-3140 (1997); Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996); y Peet et al., Cell, 93:693-704 (1998)). Un experto en la materia apreciara que los genes asociados a enfermedades y trastornos metabolicos (por ejemplo, enfermedades y trastornos en los que el hfgado es una diana y enfermedades y trastornos del hfgado) incluyen genes que se expresan en el mismo hfgado tambien y genes expresados en otros organos y tejidos. El silenciamiento de secuencias que codifican genes asociados a enfermedades y trastornos metabolicos puede usarse convenientemente en combinacion con la administracion de agentes convencionales usados para tratar la enfermedad o trastorno. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirigen al gen ApoB incluyen aquellas descritas en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20060134189. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip
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que se dirigen al gen ApoC3 incluyen aquellas descritas en la solicitud provisional de EE.UU. N.° 61/147.235, presentada el 26 de enero de 2009.
Ejemplos de secuencias de genes asociados a tumorigenesis y transformacion de celulas (por ejemplo, cancer u otra neoplasia) incluyen cinesinas mitoticas tales como Eg5 (KSP, KIF11; N° de acceso de GenBank NM_004523); serina/treonina cinasas tales como cinasa 1 similar a polo (PLK-1) (N° de acceso de GenBank NM_005030; Barr et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5:429-440 (2004)); tirosina cinasas tales como WEE1 (N.° de acceso de Genbank NM_003390 y NM_001143976); inhibidores de la apoptosis tales como XIAP (N° de acceso de GenBank NM_001167); subunidades de signalosoma COP9 tales como CSN1, CSN2, CSN3, CSN4, CSN5 (JAB1; N° de acceso de GenBank NM_006837); CSN6, CSN7A, CSN7B y CSN8; ubiquitina ligasas tales como cOp1 (RFWD2; N.° de acceso de Genbank NM_022457 y NM_001001740); e histona desacetilasas tales como HDAC1, hDaC2 (N° de acceso de GenBank NM_001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, etc. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirigen a los genes Eg5 y XIAP incluyen aquellas descritas en la solicitud de patente de EE.UU. N.° 11/807.872, presentada el 29 de mayo de 2007. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirigen al gen PLK-1 incluyen aquellas descritas en las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20050107316 y 20070265438; y la solicitud de patente de EE.UU. N.° 12/343.342, presentada el 23 de diciembre de 2008. Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirigen al gen CSN5 incluyen aquellas descritas en la solicitud provisional de EE.UU. N.° 61/045.251, presentada el 15 de abril de 2008p.
Ejemplos adicionales de secuencias de genes asociados a tumorigenesis y transformacion de celulas incluyen secuencias de translocacion tales como los genes de fusion MLL, BCR-aBl (Wilda et al., Oncogene, 21:5716
(2002) ; Scherr et al., Blood, 101:1566 (2003)), TEL-AML1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, AML1-ETO y AML1-MTG8 (Heidenreich et al., Blood, 101:3157 (2003)); secuencias expresadas en exceso tales como genes de multirresistencia a farmaco (Nieth et al., FEBS Lett., 545:144 (2003); Wu et al, Cancer Res. 63:1515 (2003)), ciclinas (Li et al., Cancer Res., 63:3593 (2003); Zou et al., Genes Dev., 16:2923 (2002)), beta-catenina (Verma et al., Clin Cancer Res., 9:1291 (2003)), genes de telomerasa (Kosciolek et al., Mol Cancer Ther., 2:209 (2003)), c-MYC, N- MYC, BCL-2, receptores del factor de crecimiento (por ejemplo, EGFR/ErbB1 (N.° de acceso de Genbank NM_005228, NM_201282, NM_201283 y NM_201284; veanse, por tanto, Nagy et al. Exp. Cell Res., 285:39-49
(2003) , ErbB2/HER-2 (N.° de acceso de Genbank NM_004448 y NM_001005862), ErbB3 (N.° de acceso de Genbank NM_001982 y NM_001005915) y ErbB4 (N.° de acceso de Genbank NM_005235 y NM_001042599); y secuencias mutadas tales como RAS (revisado en Tuschl y Borkhardt, Mol. Interventions, 2:158 (2002)). Ejemplos no limitantes de moleculas de ARNip que se dirigen al gen EGFR incluyen aquellas descritas en la solicitud de patente de EE.UU. N.° 11/807.872, presentada el 29 de mayo de 2007.
El silenciamiento de secuencias que codifican enzimas de reparacion de ADN encuentran uso en combinacion con la administracion de agentes quimioterapeuticos (Collis et al., Cancer Res., 63:1550 (2003)). Genes que codifican protefnas asociadas a la migracion de tumor tambien son secuencias diana de interes, por ejemplo, integrinas, selectinas y metaloproteinasas. Los ejemplos anteriores no son exclusivos. Aquellos expertos en la materia entenderan que cualquier secuencia de gen completo o parcial que facilita o promueve la tumorigenesis o transformacion de celulas, crecimiento tumoral, o migracion de tumores puede incluirse como secuencia molde.
Los genes angiogenicos son capaces de promover la formacion de nuevos vasos. Es de particular interes el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Reich et al., Mol. Vis., 9:210 (2003)) o VEGFR. Secuencias de ARNip que se dirigen al VEGFR se exponen en, por ejemplo, el documento GB 2396864; publicacion de patente de EE.UU. N.° 20040142895; y documento CA 2456444.
Los genes antiangiogenicos son capaces de inhibir la neovascularizacion. Estos genes son particularmente utiles para tratar aquellos canceres en los que la angiogenesis desempena una funcion en el desarrollo patologico de la enfermedad. Ejemplos de genes antiangiogenicos incluyen, pero no se limitan a, endostatina (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.174.861), angiostatina (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.639.725) y VEGFR2 (vease, por ejemplo, Decaussin et al., J. Pathol., 188: 369-377 (1999)).
Genes inmunomoduladores son genes que modulan una o mas respuestas inmunitarias. Ejemplos de genes inmunomoduladores incluyen, sin limitacion, citocinas tales como factores de crecimiento (por ejemplo, TGF-a, TGF- □P, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF, etc.), interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-12 (Hill et al., J. Immunol., 171:691 (2003)), IL-15, IL-18, IL-20, etc.), interferones (por ejemplo, IFN-a, IFN-P, IFN-y, etc.) y TNF. Los genes Fas y de ligando Fas tambien son secuencias diana inmunomoduladoras de interes (Song et al., Nat. Med., 9:347 (2003)). Genes que codifican las moleculas de senalizacion secundarias en celulas hematopoyeticas y linfoides tambien estan incluidas en la presente divulgacion, por ejemplo, las cinasas de la familia Tec tales como la tirosina cinasa de Bruton (Btk) (Heinonen et al., FEBS Lett., 527:274 (2002)).
Ligandos de receptores celulares incluyen ligandos que son capaces de unirse a receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de insulina, receptor de EPO, receptores acoplados a protefna G, receptores con actividad de tirosina cinasas, receptores de citocina, receptores de factor de crecimiento, etc.), para modular (por ejemplo, inhibir, activar, etc.) la via fisiologica en la que participa el receptor (por ejemplo, modulacion del nivel de glucosa, desarrollo de celulas sangufneas, mitogenesis, etc.). Ejemplos de ligandos de receptores celulares incluyen, pero no se limitan
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a, citocinas, factores de crecimiento, interleucinas, interferones, eritropoyetina (EPO), insulina, glucagon, ligandos de receptor acoplado a protema G, etc. Moldes que codifican una expansion de repeticiones de trinucleotidos (por ejemplo, repeticiones CAG) encuentran uso en silenciar las secuencias patogenas en trastornos neurodegenerativos producidos por la expansion de repeticiones de trinucleotidos, tales como atrofia muscular espinobulbar y enfermedad de Huntington (Caplen et al., Hum. Mol. Genet., 11:175 (2002)).
Ademas de su utilidad en silenciar la expresion de cualquiera de los genes anteriormente descritos para fines terapeuticos, los ARNip descritos en el presente documento tambien son utiles en aplicaciones de investigacion y desarrollo, ademas de aplicaciones de diagnostico, profilacticas, de pronostico, clmicas y otras sanitarias. Como ejemplo no limitante, el ARNip puede usarse en estudios de validacion de dianas dirigidos a probar si un gen de interes tiene el potencial de ser una diana terapeutica. El ARNip tambien puede usarse en estudios de identificacion de dianas que pretenden descubrir genes como posibles dianas terapeuticas.
2. ARNia
Al igual que el ARNip, el ARN interferente asimetrico (ARNia) puede reclutar el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y conducir a silenciamiento eficaz de una variedad de genes en celulas de mairnfero mediando en la escision espedfica de secuencia de la secuencia diana entre el nucleotido 10 y 11 con respecto al extremo 5' de la hebra no codificante (Sun et al., Nat. Biotech., 26:1379-1382 (2008)). Normalmente, una molecula de ARNia comprende un duplex de ARN corto que tiene una hebra codificante y una hebra no codificante, en el que el duplex contiene nucleotidos protuberantes en los extremos 3' y 5' de la hebra no codificante. El ARNia es generalmente asimetrico debido a que la hebra codificante es mas corta en ambos extremos cuando se compara con la hebra no codificante complementaria. En algunos aspectos, pueden disenarse, sintetizarse e hibridarse moleculas de ARNia en condiciones similares a aquellas usadas para moleculas de ARNip. Como ejemplo no limitante, pueden seleccionarse y generarse secuencias de ARNia usando los metodos descritos anteriormente para seleccionar secuencias de ARNip.
En otra realizacion, los duplex de ARNia de diversas longitudes (por ejemplo, aproximadamente 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17 o 14-17 pares de bases, mas normalmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 pares de bases) pueden disenarse con nucleotidos protuberantes en los extremos 3' y 5' de la hebra no codificante para dirigirse a un ARNm de interes. En ciertos casos, la hebra codificante de la molecula de ARNia tiene aproximadamente 10-25, 12-20, 1219, 12-18, 13-17 o 14-17 nucleotidos de longitud, mas normalmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos de longitud. En ciertos otros casos, la hebra no codificante de la molecula de ARNia tiene aproximadamente 15-60, 15-50 o 15-40 nucleotidos de longitud, mas normalmente aproximadamente 15-30, 15-25 o 19-25 nucleotidos de longitud, y tiene preferentemente aproximadamente 20-24, 21-22 o 21-23 nucleotidos de longitud.
En algunas realizaciones, el nucleotido protuberante no codificante en 5' contiene uno, dos, tres, cuatro, o mas nucleotidos que no son elegidos como diana (por ejemplo, "AA", "UU", "dTdT", etc.). En otras realizaciones, el nucleotido protuberante no codificante en 3' contiene uno, dos, tres, cuatro o mas nucleotidos que no son elegidos como diana (por ejemplo, "AA", "UU", "dTdT", etc.). En ciertos aspectos, las moleculas de ARNia descritas en el presente documento pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados, por ejemplo, en la region bicatenaria (duplex) y/o en los nucleotidos protuberantes no codificantes. Como ejemplo no limitante, las secuencias de ARNia pueden comprender uno o mas de los nucleotidos modificados descritos anteriormente para las secuencias de ARNip. En una realizacion preferida, la molecula de ARNia comprende nucleotidos de 2'OMe tales como, por ejemplo, nucleotidos de 2'OMe-guanosina, nucleotidos de 2'OMe-uridina, o mezclas de los mismos.
En ciertas realizaciones, las moleculas de ARNia pueden comprender una hebra no codificante que se corresponde con la hebra no codificante de una molecula de ARNip, por ejemplo, una de las moleculas de ARNip descritas en el presente documento. En otras realizaciones, las moleculas de ARNia pueden usarse para silenciar la expresion de cualquiera de los genes diana expuestos anteriormente, tales como, por ejemplo, genes asociados a infeccion vmca y supervivencia, genes asociados a enfermedades y trastornos metabolicos, genes asociados a tumorigenesis y transformacion de celulas, genes angiogenicos, genes inmunomoduladores tales como aquellos asociados a respuestas inflamatorias y auto-inmunitarias, genes de receptor de ligando, y genes asociados a trastornos neurodegenerativos.
3. miARN
Generalmente, los microARN (miARN) son moleculas de ARN monocatenarias de aproximadamente 21-23 nucleotidos de longitud que regulan la expresion genica. Los miARN estan codificados por genes a partir de cuyo ADN se transcriben, pero los miARN no se traducen en protema (ARN no codificante); en su lugar, cada transcrito primario (un pri-miARN) se procesa en una estructura de tallo-lazo corta denominado un pre-miARN y finalmente en un miARN maduro funcional. Moleculas de miARN maduras son o bien parcialmente o bien completamente complementarias a una o mas moleculas de ARN mensajero (ARNm), y su funcion principal es regular por disminucion la expresion genica. La identificacion de moleculas de miARN se describe, por ejemplo, en Lagos- Quintana et al., Science, 294:853-858; Lau et al., Science, 294:858-862; y Lee et al., Science, 294:862-864.
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Los genes que codifican miARN son mucho mas largos que la molecula de miARN madura procesada. Los miARN se transcriben primero como transcritos primarios o pri-miARN con una terminacion y cola de poli-A y se procesan a estructuras cortas de tallo-lazo de ~70 nucleotidos conocidas como pre-miARN en el nucleo celular. Este procesamiento se realiza en animales por un complejo de protefna conocido como el complejo microprocesador, que consiste en la nucleasa Drosha y la protefna de union a ARN bicatenario Pasha (Denli et al., Nature, 432:231-235 (2004)). Estos pre-miARN se procesan entonces en miARN maduro en el citoplasma por interaccion con la endonucleasa Dicer, que tambien inicia la formacion del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) (Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001). O bien la hebra codificante o bien la hebra no codificante de ADN pueden servir de moldes para dan lugar a miARN.
Cuando Dicer escinde el tallo-lazo de pre-miARN, se forman dos moleculas de ARN cortas complementarias, pero solo una se integra en el complejo de RISC. Esta hebra se conoce como la hebra gufa y esta seleccionada por la protefna argonauta, la RNasa catalfticamente activa del complejo RISC, basandose en la estabilidad del extremo 5' (Preall et al., Curr. Biol., 16:530-535 (2006)). La hebra restante, conocida como la hebra anti-gufa o pasajera, se degrada como un sustrato de complejo de RISC (Gregory et al., Cell, 123:631-640 (2005)). Despues de la integracion en el complejo de RISC activo, los miARN se emparejan en bases con sus moleculas de ARNm complementarias e inducen la degradacion de ARNm diana y/o el silenciamiento traduccional.
Las moleculas de miARN de mamffero son normalmente complementarias a un sitio en la 3' UTR de la secuencia de ARNm diana. En ciertos casos, la hibridacion del miARN con el ARNm diana inhibe la traduccion de protefnas bloqueando la maquinarfa de traduccion de protefnas. En ciertos otros casos, la hibridacion del miARN con el ARNm diana facilita la escision y degradacion del ARNm diana mediante un proceso similar a la interferencia por ARN (iARN). El miARN tambien puede dirigir la metilacion de sitios genomicos que se corresponden con ARNm elegido como diana. Generalmente, los miARN funcionan en asociacion con un complemento de protefnas conjuntamente denominado el miRNP.
En ciertos aspectos, las moleculas de miARN descritas en el presente documento tienen aproximadamente 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50 o 15-40 nucleotidos de longitud, mas normalmente aproximadamente 1530, 15-25 o 19-25 nucleotidos de longitud, y tienen preferentemente aproximadamente 20-24, 21-22 o 21-23 nucleotidos de longitud. En ciertos otros aspectos, las moleculas de miARN pueden comprender uno o mas nucleotidos modificados. Como ejemplo no limitante, las secuencias de miARN pueden comprender uno o mas de los nucleotidos modificados descritos anteriormente para la secuencias de ARNip. En una realizacion preferida, la molecula de miARN comprende nucleotidos de 2'OMe tales como, por ejemplo, nucleotidos de 2'OMe-guanosina, nucleotidos de 2'OMe-uridina, o mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, las moleculas de miARN pueden usarse para silenciar la expresion de cualquiera de los genes diana expuestos anteriormente, tales como, por ejemplo, genes asociados a infeccion vfrica y supervivencia, genes asociados a enfermedades y trastornos metabolicos, genes asociados a tumorigenesis y transformacion de celulas, genes angiogenicos, genes inmunomoduladores tales como aquellos asociados a respuestas inflamatorias y auto-inmunitarias, genes de receptor de ligando, y genes asociados a trastornos neurodegenerativos.
En otras realizaciones, uno o mas agentes que bloquean la actividad de un miARN que se dirige a un ARNm de interes se administran usando una partfcula de lfpido descrita en el presente documento (por ejemplo, una partfcula de acido nucleico-lfpido). Ejemplos de agentes de bloqueo incluyen, pero no se limitan a, oligonucleotidos de bloqueo esterico, oligonucleotidos de acido nucleico bloqueado y morfolino-oligonucleotidos. Tales agentes de bloqueo pueden unirse directamente al miARN o al sitio de union de miARN en el ARNm diana.
4. Oligonucleotidos antisentido
En una realizacion, el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido dirigido a un gen diana o secuencia de interes. Los terminos "oligonucleotido antisentido" o "antisentido" incluyen oligonucleotidos que son complementarios a una secuencia de polinucleotidos elegida como diana. Los oligonucleotidos antisentido son hebras de ADN o ARN individuales que son complementarias a una secuencia elegida. Los oligonucleotidos de ARN antisentido previenen la traduccion de hebras de ARN complementarias uniendose al ARN. Los oligonucleotidos de ADN antisentido pueden usarse para dirigir un ARN complementario (codificante o no codificante) especffico. Si se produce la union, este hfbrido de ADN/ARN puede ser degradado por la enzima RNasa H. En una realizacion particular, los oligonucleotidos antisentido comprenden de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nucleotidos, mas preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos. El termino tambien engloba oligonucleotidos antisentido que pueden no ser exactamente complementarios al gen diana deseado. Asf, la invencion puede utilizarse en casos donde actividades especfficas no de diana se encuentran con antisentido, o donde una secuencia antisentido que contiene uno o mas desapareamientos con la secuencia diana es la mas preferida para un uso particular.
Se ha demostrado que los oligonucleotidos antisentido son inhibidores eficaces y elegidos como diana de la sfntesis de protefnas, y, por consiguiente, pueden usarse para inhibir especfficamente la sfntesis de protefnas por un gen elegido como diana. La eficacia de los oligonucleotidos antisentido para inhibir la sfntesis de protefnas esta bien
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establecida. Por ejemplo, la sfntesis de poligalacturonasa y el receptor de acetilcolina de tipo 2 de muscarina se inhiben por oligonucleotidos antisentido dirigidos a sus secuencias de ARNm respectivas (veanse las patentes de EE.UU. N.° 5.739.119 y 5.759.829). Ademas, se han demostrado ejemplos de inhibicion antisentido con la protefna nuclear ciclina, el gen de multirresistencia a farmaco (MDR1), ICAM-1, E-selectina, STK-1, receptor de GABAA estriatal y EGF humano (veanse, Jaskulski et al., Science, 240:1544-6 (1988); Vasanthakumar et al., Cancer Commun., 1:225-32 (1989); Peris et al., Brain Res Mol Brain Res., 15;57:310-20 (1998); y las patentes de EE.UU. N.° 5.801.154; 5.789.573; 5.718.709 y 5.610.288). Ademas, tambien se han descrito construcciones antisentido que inhiben y pueden usarse para tratar una variedad de proliferaciones celulares anormales, por ejemplo, cancer (veanse las patentes de EE.UU. N.° 5.747.470; 5.591.317; y 5.783.683).
Se conocen en la tecnica metodos de produccion de oligonucleotidos antisentido y pueden ser facilmente adaptados para producir un oligonucleotido antisentido que dirige cualquier secuencia de polinucleotidos. La seleccion de secuencias de oligonucleotidos antisentido especfficas para una secuencia diana dada se basa en el analisis de la secuencia diana elegida y la determinacion de la estructura secundaria, Tm, energfa de union y estabilidad relativa. Pueden seleccionarse oligonucleotidos antisentido basandose en su incapacidad relativa para formar dfmeros, horquillas, u otras estructuras secundarias que reducirfan o prohibirfan la union especffica al ARNm diana en una celula hospedadora. Regiones diana altamente preferidas del ARNm incluyen aquellas regiones en o cerca del codon de iniciacion de la traduccion AUG y aquellas secuencias que son sustancialmente complementarias a regiones 5' del ARNm. Estos analisis de estructuras secundarias y consideraciones de seleccion de sitios diana pueden realizarse, por ejemplo, usando v.4 del software de analisis de cebadores OLIGO (Molecular Biology Insights) y/o el software del algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)).
5. Ribozimas
Segun otra realizacion de la presente divulgacion, las partfculas de acido nucleico-lfpido estan asociadas con ribozimas. Las ribozimas son complejos de ARN-protefna que tienen dominios catalfticos especfficos que poseen actividad de endonucleasa (veanse, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:8788-92 (1987); y Forster et al., Cell, 49:211-20 (1987)). Por ejemplo, un gran numero de ribozimas aceleran las reacciones de transferencia de fosfoester con un alto grado de especificidad, escindiendo frecuentemente solo uno de varios fosfoesteres en un sustrato de oligonucleotido (veanse, Cech et al., Cell, 27:487-96 (1981); Michel et al., J. Mol. Biol., 216:585-610 (1990); Reinhold-Hurek et al., Nature, 357:173-6 (1992)). Esta especificidad ha sido atribuida al requisito que el sustrato se une mediante interacciones de apareamiento de bases especfficas a la secuencia de gufa interna ("IGS") de la ribozima antes de la reaccion qufmica.
Actualmente se conocen al menos seis variedades basicas de moleculas de ARN enzimaticas que existen de forma natural. Cada una puede catalizar la hidrolisis de enlaces fosfodiester de ARN en trans (y asf puede escindir otras moleculas de ARN) bajo condiciones fisiologicas. En general, los acidos nucleicos enzimaticos actuan uniendose primero a un ARN. Tal union se produce mediante la porcion de union diana de un acido nucleico enzimatico que se mantiene en estrecha proximidad a una porcion enzimatica de la molecula que actua escindiendo el ARN diana. Asf, el acido nucleico enzimatico reconoce primero y luego se une al ARN diana mediante emparejamiento de bases complementario, y una vez unido al sitio correcto, actua enzimaticamente para cortar el ARN diana. La escision estrategica de un ARN diana tal destruira su capacidad para dirigir la sfntesis de una protefna codificada. Despues de que se haya unido un acido nucleico enzimatico y haya escindido su diana de ARN, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.
La molecula de acido nucleico enzimatica puede formarse en un ARN de cabeza de martillo, de horquilla, de virus de la hepatitis 6, de intron de grupo I o de RNasaP (en asociacion con una secuencia gufa de ARN), o motivo de ARN de Neurospora VS, por ejemplo. Ejemplos especfficos de motivos de cabeza de martillo se describen en, por ejemplo, Rossi et al., Nucleic Acids Res., 20:4559-65 (1992). Ejemplos de motivos de horquilla se describen en, por ejemplo, el documento EP 0360257, Hampel et al., Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hampel et al., Nucleic Acids Res., 18:299-304 (1990); y la patente de EE.UU. N.° 5.631.359. Un ejemplo del motivo del virus de la hepatitis 6 se describe en, por ejemplo, Perrotta et al., Biochemistry, 31:11843-52 (1992). Un ejemplo del motivo de RNasaP se describe en, por ejemplo, Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849-57 (1983). Ejemplos del motivo de ribozima de ARN de Neurospora Vs se describe en, por ejemplo, Saville et al., Cell, 61:685-96 (1990); Saville et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8826-30 (1991); Collins et al., Biochemistry, 32:2795-9 (1993). Un ejemplo del intron del grupo I se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 4.987.071. Caracterfsticas importantes de moleculas de acidos nucleicos enzimaticas usadas segun la presente divulgacion son aquellas que tienen un sitio de union a sustrato especffico que es complementario a una o mas de las regiones de aDn o ARN de gen diana, y aquellas que tienen secuencias de nucleotidos dentro de o que rodean ese sitio de union a sustrato que confiere una actividad de escision de ARN para la molecula. Asf, las construcciones de ribozima no necesitan limitarse a motivos especfficos mencionados en el presente documento.
Se conocen en la tecnica metodos de produccion de una ribozima dirigida a cualquier secuencia de polinucleotidos. Pueden disenarse ribozimas como se describe en, por ejemplo, las publicaciones PCT N.° WO 93/23569 y WO 94/02595, y sintetizarse para ser probadas in vitro y/o in vivo como se describe en el presente documento.
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La actividad de ribozima puede optimizarse alterando la longitud de los brazos de union de ribozima o sintetizando qufmicamente ribozimas con modificaciones que previenen su degradacion por ribonucleasas del suero (veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT N.° WO 92/07065, WO 93/15187, WO 91/03162 y WO 94/13688; EP 92110298.4; y las patentes de EE.UU. N.° 5.334.711, que describen diversas modificaciones qufmicas que pueden hacerse a los restos de azucar de moleculas de ARN enzimaticas), modificaciones que potencian su eficacia en celulas, y eliminacion de bases del tallo II para acortar los tiempos de sfntesis de ARN y reducir los requisitos qufmicos.
6. Oligonucleotidos inmunoestimulantes
Los acidos nucleicos asociados a partfculas de lfpido de la presente divulgacion pueden ser inmunoestimulantes, que incluyen oligonucleotidos inmunoestimulantes (ISS; mono o bicatenarios) capaces de inducir una respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto, que puede ser un mamffero tal como un ser humano. Los ISS incluyen, por ejemplo, ciertos palfndromos que conducen a estructuras secundarias de horquilla (vease Yamamoto et al., J. Immunol., 148:4072-6 (1992)), o motivos CpG, ademas de otras caracterfsticas de ISS conocidas (tales como dominios multi-G; vease; la publicacion PCT N.° WO 96/11266).
Se considera que los acidos nucleicos inmunoestimulantes no son especfficos de secuencia cuando no se requiere que se unan especfficamente a y reduzcan la expresion de una secuencia diana con el fin de provocar una respuesta inmunitaria. Asf, ciertos acidos nucleicos inmunoestimulantes pueden comprender una secuencia correspondiente a una region de un gen que existe de forma natural o ARNm, pero pueden todavfa considerarse acidos nucleicos inmunoestimulantes no especfficos de secuencia.
En una realizacion, el acido nucleico u oligonucleotido inmunoestimulante comprende al menos un dinucleotido de CpG. El oligonucleotido o dinucleotido de CpG puede estar sin metilar o metilado. En otra realizacion, el acido nucleico inmunoestimulante comprende al menos un dinucleotido de CpG que tiene una citosina metilada. En una realizacion, el acido nucleico comprende un unico dinucleotido de CpG, en el que la citosina en el dinucleotido de CpG esta metilada. En una realizacion alternativa, el acido nucleico comprende al menos dos dinucleotidos de CpG, en el que al menos una citosina en los dinucleotidos de CpG esta metilada. En una realizacion adicional, cada citosina en los dinucleotidos de CpG presente en la secuencia esta metilada. En otra realizacion, el acido nucleico comprende una pluralidad de dinucleotidos de CpG, en el que al menos uno de los dinucleotidos de CpG comprende una citosina metilada. Ejemplos de oligonucleotidos inmunoestimulantes adecuados para su uso en las composiciones y metodos de la presente divulgacion se describen en la solicitud PCT N.° PCT/US08/88676, presentada el 31 de diciembre de 2008, publicaciones PCT N.° WO 02/069369 y WO 01/15726, la patente de EE.UU. N.° 6.406.705, y Raney et al., J. Pharm. Exper. Ther., 298:1185-92 (2001). En ciertas realizaciones, los oligonucleotidos usados en las composiciones y metodos de la divulgacion tienen un esqueleto de fosfodiester ("PO") o un esqueleto de fosforotioato ("PS"), y/o al menos un resto de citosina metilado en un motivo de CpG.
B. Otros agentes activos
En ciertas realizaciones, el agente activo asociado a las partfculas de lfpido de la presente divulgacion puede comprender una o mas protefnas terapeuticas, polipeptidos, o moleculas organicas pequenas o compuestos. Ejemplos no limitantes de tales agentes terapeuticamente eficaces o farmacos incluyen farmacos de oncologfa (por ejemplo, farmacos de quimioterapia, agentes terapeuticos hormonales, agentes inmunoterapeuticos, agentes radioterapeuticos, etc.), agentes hipolipemiantes, farmacos antivfricos, compuestos antiinflamatorios, antidepresivos, estimulantes, analgesicos, antibioticos, medicacion anticonceptiva, antipireticos, vasodilatadores, antiangiogenicos, agentes citovasculares, inhibidores de la transduccion de senales, farmacos cardiovasculares tales como agentes antiarrftmicos, hormonas, vasoconstrictores y esteroides. Estos agentes activos pueden administrarse solos en las partfculas de lfpido de la presente divulgacion, o en combinacion (por ejemplo, co-administrarse) con partfculas de lfpido de la presente divulgacion que comprenden acido nucleico tal como ARN interferente.
Ejemplos no limitantes de farmacos de quimioterapia incluyen farmacos basados en platino (por ejemplo, oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino, satraplatino, etc.), agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfan, melfalan, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, etc.), antimetabolitos (por ejemplo, 5-fluorouracilo (5-FU), azatioprina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, pemetrexed, raltitrexed, etc.), alcaloides de planta (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (taxol), docetaxel, etc.), inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, irinotecan (CPT-11; Camptosar), topotecan, amsacrina, etoposido (VP16), fosfato de etoposido, teniposido, etc.), antibioticos antitumorales (por ejemplo, doxorubicina, adriamicina, daunorubicina, epirubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), inhibidores de tirosina cinasas (por ejemplo, gefitinib (Iressa®), sunitinib (Sutent®; SU11248), erlotinib (Tarceva®; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (Gleevec®; STI571), dasatinib (BMS-354825), leflunomida (SU101), vandetanib (Zactima™; ZD6474), etc.), sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, estereoisomeros de los mismos, derivados de los mismos, analogos de los mismos, y combinaciones de los mismos.
Ejemplos de agentes terapeuticos hormonales convencionales incluyen, sin limitacion, esteroides (por ejemplo,
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dexametasona), finasterida, inhibidores de aromatasa, tamoxifeno y goserelina, ademas de otros agonistas de hormonas liberadoras de gonadotropina (GnRH).
Ejemplos de agentes inmunoterapeuticos convencionales incluyen, pero no se limitan a, inmunoestimulantes (por ejemplo, Bacillus Calmette-Guerin (BCG), levamisol, interleucina-2, alfa-interferon, etc.), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD20, anti-HER2, anti-CD52, anti-HLA-DR y anti-VEGF), inmunotoxinas (por ejemplo, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD33-caliqueamicina, conjugado de anticuerpo monoclonal anti-CD22-exotoxina de Pseudomonas, etc.) y radioinmunoterapia (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-CD20 conjugado con 111In, 90Y o 131I, etc.).
Ejemplos de agentes radioterapeuticos convencionales incluyen, pero no se limitan a, radionuclidos tales como 47Sc 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm 166Ho, 177Lu, 186'
Re, 188Re
211At y 212Bi,
opcionalmente conjugados con anticuerpos dirigidos contra antfgenos de tumor.
Farmacos de oncologfa adicionales que pueden usarse segun la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a, alkeran, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, araC, trioxido de arsenico, bexaroteno, biCNU, carmustina, CCNU, celecoxib, cladribina, ciclosporina A, citosina arabinosido, citoxano, dexrazoxano, DTIC, estramustina, exemestano, FK506, gemtuzumab-ozogamicina, Hydrea, hidroxiurea, idarubicina, interferon, letrozol, leustatina, leuprolida, litretinofna, megastrol, L-PAM, mesna, metoxsalen, mitramicina, mostaza de nitrogeno, pamidronato, pegademasa, pentostatina, porfimer sodio, prednisona, rituxan, estreptozocina, STI-571, taxotere, temozolamida, VM-26, toremifeno, tretinofna, ATRA, valrubicina y velban. Otros ejemplos de farmacos de oncologfa que pueden usarse segun la presente divulgacion son elipticina y analogos o derivados de elipticina, epotilonas, inhibidores de cinasas intracelulares y camptotecinas.
Ejemplos no limitantes de agentes hipolipemiantes para tratar una enfermedad o trastorno de lfpidos asociado a trigliceridos elevados, colesterol y/o glucosa incluyen estatinas, fibratos, ezetimiba, tiazolidindionas, niacina, beta- bloqueantes, nitroglicerina, antagonistas del calcio, aceite de pescado, y mezclas de los mismos.
Ejemplos de farmacos antivfricos incluyen, pero no se limitan a, abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, arbidol, atazanavir, atripla, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de la entrada, famciclovir, combinaciones de dosis fija, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidores de la fusion, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidores de integrasa, interferon tipo III (por ejemplo, moleculas de IFN-A tales como IFN-A1, IFN-A2 e IFN-A3), interferon tipo II (por ejemplo, IFN-y), interferon tipo I (por ejemplo, IFN-a tal como IFN-a PEGilado, IFN-p, IFN-k, IFN-6, IFN-e, IFN-t, IFN-u> y IFN-Z), interferon, lamivudina, lopinavir, lovirida, MK-0518, maraviroc, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, analogos de nucleosido, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidores de la proteasa, inhibidores de la transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, potenciadores sinergicos, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina, sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, estereoisomeros de los mismos, derivados de los mismos, analogos de los mismos, y mezclas de los mismos.
V. Partfculas de ifpido
Las partfculas de lfpido de la presente divulgacion normalmente comprenden un agente activo o agente terapeutico, un lfpido cationico, un lfpido no cationico, y un conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas. En algunas realizaciones, el agente activo o agente terapeutico esta completamente encapsulado dentro de la porcion de lfpido de la partfcula de lfpido de forma que el agente activo o agente terapeutico en la partfcula de lfpido sea resistente en solucion acuosa a la degradacion enzimatica, por ejemplo, por una nucleasa o proteasa. En otras realizaciones, las partfculas de lfpido descritas en el presente documento son sustancialmente no toxicas para los mamfferos tales como los seres humanos. Las partfculas de lfpido de la presente divulgacion normalmente tienen un diametro medio de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, o de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm.
En realizaciones preferidas, las partfculas de lfpido de la presente divulgacion son partfculas de acido nucleico-lfpido (SNALP) estables en suero que comprenden un ARN interferente (por ejemplo, ARNip, ARNia y/o miARN), un lfpido cationico (por ejemplo, un lfpido cationico de formulas I, II y/o III), un lfpido no cationico (por ejemplo, colesterol solo o mezclas de uno o mas fosfolfpidos y colesterol), y un conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de las partfculas (por ejemplo, uno o mas conjugados de PEG-lfpido). Las SNALP pueden comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas moleculas de ARN interferente no modificado y/o modificado. Las partfculas de acido nucleico-lfpido y su metodo de preparacion se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 5.753.613; 5.785.992; 5.705.385; 5.976.567; 5.981.501; 6.110.745; y 6.320.017; y publicacion PCT N.° WO 96/40964.
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A. Lfpidos cationicos
Puede usarse cualquiera de una variedad de lfpidos cationicos en las partfculas de lipido de la presente divulgacion (por ejemplo, SNALP), tanto solos como en combinacion con uno o varios de otras especies de lfpidos cationicos o especies de lfpidos no cationicos.
Lfpidos cationicos que son utiles en la presente invencion pueden ser cualquiera de varias especies de lipido que llevan una carga positiva neta a pH fisiologico. Tales lfpidos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de N,N-dioleil- N,N-dimetilamonio (DODAC), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), 1,2-diesteariloxi-N,N- dimetilaminopropano (DSDMA), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), 3- (N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Chol), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N- hidroxietilamonio (DMRIE), 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-
propanaminiotrifluoroacetato (DOSPA), dioctadecilamidoglicilespermina (PERROS), 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3- beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano (CLinDMA), 2-[5'-(colest-5-en-3.beta.-oxi)-3'- oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina (DMOBA), 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP), 1,2-N,N'-dilinoleilcarbamil-3- dimetilaminopropano (DLincarbDAP), 1,2-dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DLinCDAP), y mezclas de los mismos. Varios estos lfpidos y analogos relacionados se han descrito en las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20060083780 y 20060240554; las patentes de EE.UU. N.° 5.208.036; 5.264.618; 5.279.833; 5.283.185; 5.753.613; y 5.785.992; y la publicacion PCT N.° WO 96/10390. Adicionalmente, estan disponibles varias preparaciones comerciales de lfpidos cationicos y pueden usarse en la presente invencion. Estas incluyen, por ejemplo, LIPOFECTIN® (liposomas cationicos comercialmente disponibles que comprenden DOTMa y DOPE, de GIBCO/BRL, Grand Island, Nueva York, EE.UU.); LIPoFeCTAMINE® (liposomas cationicos comercialmente disponibles que comprenden DOSPA y DOPE, de GIBCO/BRL); y tRAnSFECTAM® (liposomas cationicos comercialmente disponibles que comprenden DOGS de Promega Corp., Madison, Wisconsin, eE.UU.).
Adicionalmente, lfpidos cationicos de formula I que tienen las siguientes estructuras son utiles en la presente invencion.
R2 OR3 (I),
en la que R1 y R2 estan seleccionados independientemente y son H o alquilos C1-C3, R3 y R4 estan seleccionados independientemente y son grupos alquilo que tienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 atomos de carbono, y al menos uno de R3 y R4 comprende al menos dos sitios de insaturacion. En ciertos casos, R3 y R4 son los dos los mismos, es decir, R3 y R4 son ambos linoleflo (C18), etc. En ciertos otros casos, R3 y R4 son diferentes, es decir, R3 es tetradecatrienilo (C14) y R4 es linoleflo (C18). En una realizacion preferida, el lipido cationico de formula I es simetrico, es decir, R3 y R4 son los dos iguales. En otra realizacion preferida, tanto R3 como R4 comprenden al menos dos sitios de insaturacion. En algunas realizaciones, R3 y R4 estan seleccionados independientemente del grupo que consiste en dodecadienilo, tetradecadienilo, hexadecadienilo, linoleflo e icosadienilo. En una realizacion preferida, R3 y R4 son ambos linoleflo. En algunas realizaciones, R3 y R4 comprenden al menos tres sitios de insaturacion y estan seleccionados independientemente de, por ejemplo, dodecatrienilo, tetradecatrienilo, hexadecatrienilo, linolenilo e icosatrienilo. En realizaciones particularmente preferidas, el lipido cationico de formula I es 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA) o 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA).
Ademas, lfpidos cationicos de formula II que tienen las siguientes estructuras son utiles en la presente invencion.
R2
I X"
R1-----N+-----R3
R4 (II),
en la que R1 y R2 estan seleccionados independientemente y son H o alquilos C1-C3, R3 y R4 estan seleccionados independientemente y son grupos alquilo que tienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 atomos de carbono, y al menos uno de R3 y R4 comprende al menos dos sitios de insaturacion. En ciertos casos, R3 y R4 son ambos iguales, es decir, R3 y R4 son ambos linoleflo (C18), etc. En ciertos otros casos, R3 y R4 son diferentes, es decir, R3 es tetradecatrienilo (C14) y R4 es linoleflo (C18). En una realizacion preferida, los lfpidos cationicos de la presente invencion son simetricos, es decir, R3 y R4 son los dos iguales. En otra realizacion preferida, tanto R3 como R4 comprenden al menos dos sitios de insaturacion. En algunas realizaciones, R3 y R4 estan seleccionados
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independientemente del grupo que consiste en dodecadienilo, tetradecadienilo, hexadecadienilo, linoleflo e icosadienilo. En una realizacion preferida, R3 y R4 son ambos linoleflo. En algunas realizaciones, R3 y R4 comprenden al menos tres sitios de insaturacion y estan seleccionados independientemente de, por ejemplo, dodecatrienilo, tetradecatrienilo, hexadecatrienilo, linolenilo e icosatrienilo.
Ademas, los lfpidos cationicos de formula III que tienen las siguientes estructuras (o sales de los mismos) son utiles en la presente invencion.
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en la que R1 y R2 son tanto iguales como diferentes e independientemente alquilo C12-C24 opcionalmente sustituido, alquenilo C12-C24 opcionalmente sustituido, alquinilo C12-C24 opcionalmente sustituido, o acilo C12-C24 opcionalmente sustituido; R3 y R4 son tanto iguales como diferentes e independientemente alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C1-C6 opcionalmente sustituido o alquinilo C1-C6 opcionalmente sustituido, o R3 y R4 pueden unirse para formar un anillo heterocfclico opcionalmente sustituido de 4 a 6 atomos de carbono y 1 o 2 heteroatomos elegidos de nitrogeno y oxfgeno; R5 esta o bien ausente o bien es hidrogeno o alquilo C1-C6 para proporcionar una amina cuaternaria; m, n y p son tanto los mismos como diferentes e independientemente cualquiera de 0 o 1 con la condicion de que m, n y p no sean simultaneamente 0; q es 0, 1, 2, 3 o 4; y Y y Z son tanto los mismos como diferentes e independientemente O, S o NH.
En algunas realizaciones, el lfpido cationico de formula III es 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin- K-C2-DMA; "XTC2"), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminopropil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(4- dimetilaminobutil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C4-DMA), 2,2-dilinoleil-5-dimetilaminometil-[1,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N-metilpepiazino-[1,3]-dioxolano (DLin-K-MPZ), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin- K-DMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleioxi-3-
(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3- dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin- MPZ), 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodiol (dOaP), 1,2- dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), o mezclas de los mismos. En realizaciones preferidas, el lfpido cationico de formula III es DLin-K-C2-DMA (XTC2).
El lfpido cationico normalmente comprende de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 85 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 80 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 75 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 70 % en moles, de aproximadamente el 50 % en moles a aproximadamente el 65 % en moles, o de aproximadamente el 55 % en moles a aproximadamente el 65 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
Sera rapidamente evidente para un experto en la materia que dependiendo del uso previsto de las partfculas, las proporciones de los componentes pueden variarse y la eficiencia de administracion de una formulacion particular puede medirse usando, por ejemplo, un ensayo de parametros de liberacion endosomica (ERP).
B. Lfpidos no cationicos
Los lfpidos no cationicos usados en las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) pueden ser cualquiera de una variedad de lfpidos sin carga, de ion bipolar o anionicos neutros capaces de producir un complejo estable.
Ejemplos no limitantes de lfpidos no cationicos incluyen fosfolfpidos tales como lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de huevo (ESM), cefalina, cardiolipina, acido fosfatfdico, cerebrosidos, dicetilfosfato, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleiol-fosfatidilglicerol (POPG), 4-(N-maleimidometil)- ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), lisofosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina, y mezclas de los mismos. Tambien pueden usarse otros fosfolfpidos de
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diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidiletanolamina. Los grupos acilo en estos lipidos son preferentemente grupos acilo derivados de acidos grasos que tienen cadenas de carbono C10-C24, por ejemplo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo, estearoflo u oleoflo.
Ejemplos adicionales de lipidos no cationicos incluyen esteroles tales como colesterol y derivados del mismo tales como colestanol, colestanona, colestenona, coprostanol, colesteril-2'-hidroxietil eter, colesteril-4'-hidroxibutil eter, y mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, el lipido no cationico presente en las particulas de lipido (por ejemplo, SNALP) comprende o consiste en colesterol o un derivado del mismo, por ejemplo, una formulacion de particulas de lipido libres de fosfolfpido. En otras realizaciones, el lipido no cationico presente en las particulas de lipido (por ejemplo, SNALP) comprende o consiste en uno o mas fosfolfpidos, por ejemplo, una formulacion de particulas de lipido libres de colesterol. En realizaciones adicionales, el lipido no cationico presente en las particulas de lipido (por ejemplo, SNALP) comprende o consiste en una mezcla de uno o mas fosfolfpidos y colesterol o un derivado del mismo.
Otros ejemplos de lipidos no cationicos adecuados para su uso en la presente invencion incluyen lipidos que no contienen fosforo tales como, por ejemplo, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, estearato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polfmeros acrflicos anfoteros, laurilsulfato de trietanolamina, amidas de acidos grasos polietiloxiladas con sulfato de alquil-arilo, bromuro de dioctadecildimetilamonio, ceramida, esfingomielina, y similares.
En algunas realizaciones, el lipido no cationico comprende de aproximadamente el 13 % en moles a aproximadamente el 49,5 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 25 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, o de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En ciertas realizaciones descritas en el presente documento, el colesterol presente en particulas de lipido libres de fosfolfpido comprende de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 45 % en moles, o de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Como ejemplo no limitante, una partfcula de lipido libre de fosfolfpido puede comprender colesterol a aproximadamente el 37 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En ciertas otras realizaciones, el colesterol presente en las particulas de lipido que contienen una mezcla de fosfolfpido y colesterol comprende de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles, de aproximadamente el 30 % en moles a aproximadamente el 35 % en moles, o de aproximadamente el 35 % en moles a aproximadamente el 40 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Como ejemplo no limitante, una
partfcula de lipido que comprende una mezcla de fosfolfpido y colesterol puede comprender colesterol a
aproximadamente el 34 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En realizaciones adicionales, el colesterol presente en las particulas de lipido que contienen una mezcla de fosfolfpido y colesterol comprende de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, o de aproximadamente el 17 % en moles
a aproximadamente el 23 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Como ejemplo no limitante, una
partfcula de lipido que comprende una mezcla de fosfolfpido y colesterol puede comprender colesterol a
aproximadamente el 20 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
En las realizaciones descritas en el presente documento donde las particulas de lipido contienen una mezcla de fosfolfpido y colesterol o un derivado de colesterol, la mezcla puede comprender hasta aproximadamente el 40, 45, 50, 55 o el 60 % en moles del lipido total presente en la partfcula. En ciertos casos, el componente de fosfolfpido en la mezcla puede comprender de aproximadamente el 2 % en moles a aproximadamente el 12 % en moles, de aproximadamente el 4 % en moles a aproximadamente el 10 % en moles, de aproximadamente el 5 % en moles a aproximadamente el 10 % en moles, de aproximadamente el 5 % en moles a aproximadamente el 9 % en moles, o de aproximadamente el 6 % en moles a aproximadamente el 8 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Como ejemplo no limitante, una partfcula de lipido que comprende una mezcla de fosfolfpido y colesterol puede comprender un fosfolfpido tal como DPPC o DSPC a aproximadamente el 7 % en moles (por ejemplo, en una mezcla con aproximadamente 34 % en moles de colesterol) del lipido total presente en la partfcula. En ciertos otros casos, el componente de fosfolfpido en la mezcla puede comprender de aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 30 % en moles, de aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles, o de aproximadamente el 17 % en moles a aproximadamente el 23 % en moles del lipido total presente en la partfcula. Como otro ejemplo no limitante, una partfcula de lipido que comprende una mezcla de fosfolfpido y colesterol puede comprender un fosfolfpido tal como DPPC o DSPC a aproximadamente el 20 % en moles (por ejemplo, en una mezcla con aproximadamente 20 % en moles de colesterol) del lipido total presente en la partfcula.
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C. Conjugado de ifpido
Ademas de lipidos cationicos y no cationicos, las partfculas de lipido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) comprenden un conjugado de lipido. El conjugado de lipido es util porque previene la agregacion de partfculas. Lipidos conjugados adecuados incluyen, pero no se limitan a, conjugados de pEG-lfpido, conjugados de ATTA-lfpido, conjugados de polfmero cationico-lfpido (CPL), y mezclas de los mismos. En ciertas realizaciones, las partfculas comprenden o bien un conjugado de PEG-lfpido o bien un conjugado de ATTA-lfpido junto con un CPL.
En una realizacion preferida, el conjugado de lipido es un PEG-lfpido. Ejemplos de PEG-lfpidos incluyen, pero no se limitan a, PEG acoplado a dialquiloxipropilos (PEG-DAA) como se describe en, por ejemplo, la publicacion PCT N.° WO 05/026372, pEg acoplado a diacilglicerol (PEG-DAG) como se describe en, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. N.° 20030077829 y 2005008689, PEG acoplado a fosfolfpidos tales como fosfatidiletanolamina (PEG-PE), PEG conjugado con ceramidas como se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.885.613, PEG conjugado con colesterol o un derivado del mismo, y mezclas de los mismos. PEG-lfpidos adicionales incluyen, sin limitacion, PEG-C-DOMG, 2KPEG-DMG, y una mezcla de los mismos.
PEG es un polfmero soluble en agua lineal de unidades de repeticion de etileno-PEG con dos grupos hidroxilo terminales. Los PEG se clasifican por sus pesos moleculares; por ejemplo, PEG 2000 tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2.000 daltons, y PEG 5000 tiene un peso molecular promedio de aproximadamente
5.000 daltons. Los PEG estan comercialmente disponibles de Sigma Chemical Co. y otras companfas e incluyen, por ejemplo, los siguientes: monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES) y monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM). Otros PEG tales como aquellos descritos en las patentes de EE.UU. N.° 6.774.180 y 7.053.150 (por ejemplo, mPEG (20 KDa) amina) tambien son utiles para preparar los conjugados de PEG-lfpido descritos en el presente documento. Ademas, el monometoxipolietilenglicol-acido acetico (MePEG-CH2COOH) es particularmente util para preparar conjugados de PEG-lfpido que incluyen, por ejemplo, conjugados de PEG-DAA.
El resto de PEG de los conjugados de PEG-lfpido descritos en el presente documento puede comprender un peso molecular promedio que oscila de aproximadamente 550 daltons a aproximadamente 10.000 daltons. En ciertos casos, el resto de PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente el 750 daltons a aproximadamente
5.000 daltons (por ejemplo, de aproximadamente 1.000 daltons a aproximadamente 5.000 daltons, de aproximadamente 1.500 daltons a aproximadamente 3.000 daltons, de aproximadamente 750 daltons a aproximadamente 3.000 daltons, de aproximadamente 750 daltons a aproximadamente 2.000 daltons, etc.). En realizaciones preferidas, el resto de pEg tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2.000 daltons o aproximadamente 750 daltons.
En ciertos casos, el PEG puede estar opcionalmente sustituido con un grupo alquilo, alcoxi, acilo o arilo. El PEG puede conjugarse directamente con el lipido o puede unirse al lipido mediante un resto conector. Puede usarse cualquier resto conector adecuado para acoplar el PEG a un lipido que incluye, por ejemplo, restos conectores que no contienen ester y restos conectores que contienen ester. En una realizacion preferida, el resto conector es un resto conector que no contiene ester. Como se usa en el presente documento, el termino "resto conector que no contiene ester" se refiere a un resto conector que no contiene un enlace ester carboxflico (-OC(O)-). Restos conectores que no contienen ester adecuados incluyen, pero no se limitan a, amido (-C(O)NH-), amino (-NR-), carbonilo (-C(O)-), carbamato (-NHC(O)O-), urea (-NHC(O)NH-), disulfuro (-S-S-), eter (-O-), succinilo (- (O)CCH2CH2C(O)-), succinamidilo (-NHc(o)CH2CH2C(O)NH-), eter, disulfuro, ademas de combinaciones de los mismos (tales como un conector que contiene tanto un resto conector carbamato como un resto conector amido). En una realizacion preferida, se usa un conector de carbamato para acoplar el PEG al lipido.
En otras realizaciones, se usa un resto conector que contiene ester para acoplar el PEG al lipido. Restos conectores que contienen ester adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato (-OC(O)O-), succinoflo, esteres de fosfato (-O- (O)POH-O-), esteres de sulfonato, y combinaciones de los mismos.
Pueden conjugarse fosfatidiletanolaminas que tienen una variedad de grupos de cadena de acilo de longitudes de cadena y grados de saturacion variables con PEG para formar el conjugado de lipido. Tales fosfatidiletanolaminas estan comercialmente disponibles, o pueden aislarse o sintetizarse usando tecnicas convencionales conocidas para aquellos expertos en la materia. Se prefieren las fosfatidiletanolaminas que contienen acidos grasos saturados o insaturados con longitudes de cadena de carbono en el intervalo de C10 a C20. Tambien pueden usarse fosfatidiletanolaminas con acidos mono- o digrasos insaturados y mezclas de acidos grasos saturados e insaturados. Fosfatidiletanolaminas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil- fosfatidiletanolamina (DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE).
El termino "ATTA" o "poliamida" se refiere a, sin limitacion, los compuestos descritos en las patentes de EE.UU. N.° 6.320.017 y 6.586.559. Estos compuestos incluyen un compuesto que tiene la formula:
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en la que R es un miembro seleccionado del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo y acilo; R1 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo; u opcionalmente, R y R1 y el nitrogeno al que estan unidos, forman un resto azido; R2 es un miembro del grupo seleccionado de hidrogeno, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y una cadena lateral de un aminoacido; R3 es un miembro seleccionado del grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, hidroxi, alcoxi, mercapto, hidrazino, amino y NR4R5, en la que R4 y R5 son independientemente hidrogeno o alquilo; n es 4 a 80; m es 2 a 6; p es 1 a 4; y q es 0 o 1. Sera evidente para aquellos expertos en la materia que pueden usarse otras poliamidas en los compuestos de la presente divulgacion.
El termino "diacilglicerol" se refiere a un compuesto que tiene 2 cadenas de acilo grasas, R1 y R2, ambos de los cuales tienen independientemente entre 2 y 30 carbonos unidos a la posicion 1 y 2 de glicerol por enlaces ester. Los grupos acilo pueden estar saturados o tener grados de insaturacion variables. Grupos acilo adecuados incluyen, pero no se limitan a, laurilo (C12), miristilo (C14), palmitilo (C16), estearilo (C18) e icosilo (C20). En realizaciones preferidas, R1 y R2 son iguales, es decir, R1 y R2 son ambos miristilo (es decir, dimiristilo), R1 y R2 son ambos
estearilo (es decir, diestearilo), etc. Los diacilgliceroles tienen la siguiente formula general:
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El termino "dialquiloxipropilo" se refiere a un compuesto que tiene 2 cadenas de alquilo, R1 y R2, ambos de los cuales tienen independientemente entre 2 y 30 carbonos. Los grupos alquilo pueden estar saturados o tener grados de insaturacion variables. Los dialquiloxipropilos tienen la siguiente formula general:
ch2o-r1
CHO-R2
ch2‘ (VI).
En una realizacion preferida, el PEG-lfpido es un conjugado de PEG-DAA que tiene la siguiente formula:
ch2o-r1
CHO-R2
CH2-L-PEG (vii),
en la que R1 y R2 estan seleccionados independientemente y son grupos alquilo de cadena larga que tienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 22 atomos de carbono; PEG es un polietilenglicol; y L es un resto conector que no contiene ester o un resto conector que contiene ester como se ha descrito anteriormente. Los grupos alquilo de cadena larga pueden estar saturados o insaturados. Grupos alquilo adecuados incluyen, pero no se limitan a, laurilo (C12), miristilo (C14), palmitilo (C16), estearilo (C18) e icosilo (C20). En realizaciones preferidas, R1 y R2 son iguales, es decir, R1 y R2 son ambos miristilo (es decir, dimiristilo), R1 y R2 son ambos esterarilo (es decir, diestearilo), etc.
En la formula VII anterior, el PEG tiene un peso molecular promedio que oscila de aproximadamente 550 daltons a aproximadamente 10.000 daltons. En ciertos casos, el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente
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750 daltons a aproximadamente 5.000 daltons (por ejemplo, de aproximadamente 1.000 daltons a aproximadamente
5.000 daltons, de aproximadamente 1.500 daltons a aproximadamente 3.000 daltons, de aproximadamente 750 daltons a aproximadamente 3.000 daltons, de aproximadamente 750 daltons a aproximadamente 2.000 daltons, etc.). En realizaciones preferidas, el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2.000 daltons o aproximadamente 750 daltons. El PEG puede estar opcionalmente sustituido con alquilo, alcoxi, acilo o arilo. En ciertas realizaciones, el grupo hidroxilo terminal esta sustituido con un grupo metoxi o metilo.
En una realizacion preferida, "L" es un resto conector que no contiene ester. Conectores que no contienen ester adecuados incluyen, pero no se limitan a, un resto conector de amido, un resto conector de amino, un resto conector de carbonilo, un resto conector de carbamato, un resto conector de urea, un resto conector de eter, un resto conector de disulfuro, un resto conector de succinamidilo, y combinaciones de los mismos. En una realizacion preferida, el resto conector que no contiene ester es un resto conector de carbamato (es decir, un conjugado de PEG-C-DAA). En otra realizacion preferida, el resto conector que no contiene ester es un resto conector de amido (es decir, un conjugado de PEG-A-DAA). En otra realizacion preferida mas, el resto conector que no contiene ester es un resto conector de succinamidilo (es decir, un conjugado de PEG-S-DAA).
En realizaciones particulares, el conjugado de PEG-lfpido esta seleccionado de:
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L (PEG-C-DMA);
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(PEG-C-DOMG).
Los conjugados de PEG-DAA se sintetizan usando tecnicas convencionales y reactivos conocidos para aquellos expertos en la materia. Se reconocera que los conjugados de PEG-DAA contendran diversos enlaces amida, amina, eter, tio, carbamato y urea. Aquellos expertos en la materia reconoceran que los metodos y reactivos para formar estos enlaces son muy conocidos y estan facilmente disponibles. Vease, por ejemplo, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992); Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989); y Furniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5th ed. (Longman 1989). Tambien se apreciara que cualquier grupo funcional presente puede requerir proteccion y desproteccion en diferentes puntos en la sfntesis de los conjugados de PEG-DAa. Aquellos expertos en la materia reconoceran que tales tecnicas son muy conocidas. Vease, por ejemplo, Green y Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991).
Preferentemente, el conjugado de PEG-DAA es un conjugado de dilauriloxipropilo (C12EPEG, conjugado de dimiristiloxipropilo (C14EPEG, un conjugado de dipalmitiloxipropilo (C16)-PEG, o un conjugado de diesteariloxipropilo (C18)-PEG. Aquellos expertos en la materia apreciaran facilmente que otros dialquiloxipropilos pueden usarse en los conjugados de PEG-DAA de la presente divulgacion.
Ademas de lo anterior, sera rapidamente evidente para aquellos expertos en la materia que pueden usarse otros polfmeros hidrofilos en lugar de PEG. Ejemplos de polfmeros adecuados que pueden usarse en lugar de PEG incluyen, pero no se limitan a, polivinilpirrolidona, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida y polidimetilacrilamida, acido polilactico, acido poliglicolico, y celulosas derivatizadas tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.
Ademas de los componentes anteriores, las partfculas (por ejemplo, SNALP o SPLP) de la presente divulgacion pueden comprender ademas lfpidos de poli(etilenglicol) (PEG) cationico o CPL (vease, por ejemplo, Chen et al., Bioconj. Chem., 11:433-437 (2000)). SPLP y SPLP-CPL adecuados para su uso en la presente divulgacion, y metodos de preparacion y uso de SPLP y SPLP-CPL, se desvelan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 6.852.334 y publicacion PCT N.° WO 00/62813.
CPL adecuados incluyen compuestos de formula VIII:
A-W-Y (VIII)
en la que A, W y Y son como se describen a continuacion.
Con referencia a la formula VIII, "A" es un resto de lfpido tal como un lfpido anfipatico, un lfpido neutro, o un lfpido
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hidrofobo que actua de un anclaje de lipido. Ejemplos de lipidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, diacilglicerolilos, dialquilglicerolilos, N,N-dialquilaminos, 1,2-diaciloxi-3-aminopropanos y 1,2-dialquil-3- aminopropanos.
"W" es un polfmero o un oligomero tal como un polfmero hidrofilo u oligomero. Preferentemente, el polfmero hidrofilo es un polfmero biocompatible que es no inmunogenico o posee baja inmunogenicidad inherente. Alternativamente, el polfmero hidrofilo puede ser debilmente antigenico si se usa con adyuvantes apropiados. Polfmeros no inmunogenicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, PEG, poliamidas, acido polilactico, acido poliglicolico, copolfmeros de acido polilactico/acido poliglicolico, y combinaciones de los mismos. En una realizacion preferida, el polfmero tiene un peso molecular de aproximadamente 250 a aproximadamente 7.000 daltons.
"Y" es un resto policationico. El termino resto policationico se refiere a un compuesto, derivado o grupo funcional que tiene una carga positiva, preferentemente al menos 2 cargas positivas a un pH seleccionado, preferentemente pH fisiologico. Restos policationicos adecuados incluyen aminoacidos basicos y sus derivados tales como arginina, asparagina, glutamina, lisina e histidina; espermina; espermidina; dendrfmeros cationicos; poliaminas; azucares de poliamina; y aminopolisacaridos. Los restos policationicos pueden ser lineales, tales como tetralisina lineal, ramificada o dendrfmera en estructura. Los restos policationicos tienen entre aproximadamente 2 y aproximadamente 15 cargas positivas, preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 12 cargas positivas, y mas preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 cargas positivas a valores de pH seleccionados. La seleccion del resto policationico a emplear puede determinarse por el tipo de aplicacion de partfcula que se desea.
Las cargas en los restos policationicos pueden estar o bien distribuidas alrededor del resto de partfcula entera, o alternativamente, pueden ser una concentracion discreta de densidad de carga en un area particular del resto de partfcula, por ejemplo, un pico de carga. Si la densidad de carga esta distribuida en la partfcula, la densidad de carga puede estar igualmente distribuida o desigualmente distribuida. Todas las variaciones de distribucion de carga del resto policationico estan englobadas por la presente divulgacion.
El lipido "A" y el polfmero no inmunogenico "W" pueden unirse por diversos metodos y preferentemente por union covalente. Metodos conocidos para aquellos expertos en la materia pueden usarse para la union covalente de "A" y "W". Enlaces adecuados incluyen, pero no se limitan a, enlaces amida, amina, carboxilo, carbonato, carbamato, ester e hidrazona. Sera evidente para aquellos expertos en la materia que "A" y "W" deben tener grupos funcionales complementarios para efectuar el enlace. La reaccion de estos dos grupos, uno en el lipido y el otro en el polfmero, proporcionara el enlace deseado. Por ejemplo, cuando el lipido es un diacilglicerol y el hidroxilo terminal se activa, por ejemplo con NHS y DCC, para formar un ester activo, y entonces se hace reaccionar con un polfmero que contiene un grupo amino, tal como con una poliamida (veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 6.320.017 y 6.586.559), se formara un enlace amida entre los dos grupos.
En ciertos casos, el resto policationico puede tener un ligando unido, tal como un ligando de direccionamiento o un resto quelante para complejar el calcio. Preferentemente, despues de que el ligando se una, el resto cationico mantiene una carga positiva. En ciertos casos, el ligando que esta unido tiene una carga positiva. Ligandos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un compuesto o dispositivo con un grupo funcional reactivo e incluyen lipidos, lipidos anfipaticos, compuestos de vehfculo, compuestos de bioafinidad, biomateriales, biopolfmeros, dispositivos biomedicos, compuestos analfticamente detectables, compuestos terapeuticamente activos, enzimas, peptidos, protefnas, anticuerpos, inmunoestimulantes, radiomarcas, fluorogenos, biotina, farmacos, haptenos, ADN, ARN, polisacaridos, liposomas, virosomas, micelas, inmunoglobulinas, grupos funcionales, otros restos de direccionamiento, o toxinas.
El conjugado de lipido (por ejemplo, PEG-lfpido) normalmente comprende de aproximadamente el 0,1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles, de aproximadamente el 0,5 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles, de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 2 % en moles, de aproximadamente el 0,6 % en moles a aproximadamente el 1,9 % en moles, de aproximadamente el 0,7 % en moles a aproximadamente el 1,8 % en moles, de aproximadamente el 0,8 % en moles a aproximadamente el 1,7 % en moles, de aproximadamente el 0,9 % en moles a aproximadamente el 1,6 % en moles, de aproximadamente el 0,9 % en moles a aproximadamente el 1,8 % en moles, de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 1,8 % en moles, de aproximadamente el 1 % en moles a aproximadamente el 1,7 % en moles, de aproximadamente el 1,2 % en moles a aproximadamente el 1,8 % en moles, de aproximadamente el 1,2 % en moles a aproximadamente el 1,7 % en moles, de aproximadamente el 1,3 % en moles a aproximadamente el 1,6 % en moles, o de aproximadamente el 1,4 % en moles a aproximadamente el 1,5 % en moles del lipido total presente en la partfcula.
Un experto habitual en la materia apreciara que la concentracion del conjugado de lipido puede variarse dependiendo del conjugado de lipido empleado y la tasa a la que la partfcula de acido nucleico-lfpido va a ser fusogenica.
Controlando la composicion y concentracion del conjugado de lipido, puede controlarse la tasa a la que el conjugado de lipido intercambia la partfcula de acido nucleico-lfpido y, a su vez, la tasa a la que la partfcula de acido nucleico-
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lipido llega a ser fusogenica. Por ejemplo, cuando un conjugado de PEG-fosfatidiletanolamina o un conjugado de PEG-ceramida se usa como el conjugado de lipido, la tasa a la que la particula de acido nucleico-lfpido llega a ser fusogenica puede variarse, por ejemplo, variando la concentracion del conjugado de lipido, variando el peso molecular del PEG, o variando la longitud de cadena y el grado de saturacion de los grupos de cadena de acilo en la fosfatidiletanolamina o la ceramida. Ademas, pueden usarse otras variables que incluyen, por ejemplo, pH, temperatura, fuerza ionica, etc., para variar y/o controlar la tasa a la que la particula de acido nucleico-lfpido llega a ser fusogenica. Otros metodos que pueden usarse para controlar la tasa a la que la particula de acido nucleico-lfpido llega a ser fusogenica seran evidentes para aquellos expertos en la materia tras la lectura de la presente divulgacion.
VI. Preparacion de partfculas de lipido
Las partfculas de lipido descritas en el presente documento, por ejemplo, SNALP, en las que un agente activo o agente terapeutico tal como un ARN interferente se encapsula en una bicapa lipfdica y se protege de la degradacion, pueden formarse por cualquier metodo conocido en la tecnica que incluye, pero no se limita a, un metodo de mezcla continua o un proceso de dilucion directa.
En realizaciones preferidas, los lfpidos cationicos son lfpidos de formula I, II y III, o combinaciones de los mismos. En otras realizaciones preferidas, los lfpidos no cationicos son esfingomielina de huevo (ESM), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DoPc), 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, PE 14:0 (1,2-dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE)), PE 16:0 (1,2-dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE)), PE 18:0 (1,2-diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE)), PE 18:1 (1,2-dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE)), trans PE 18:1 (1,2-dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE)), PE 18:018:1 (1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE)), PE 16:0-18:1 (1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (POPE)), polfmeros basados en polietilenglicol (por ejemplo, PEG 2000, PEG 5000, diacilgliceroles modificados con PEG, o dialquiloxipropilos modificados con PEG), colesterol, o combinaciones de los mismos.
En ciertas realizaciones, la presente divulgacion proporciona SNALP producidas mediante un metodo de mezcla continua, por ejemplo, un proceso que incluye proporcionar una solucion acuosa que comprende un acido nucleico tal como un aRn interferente en un primer recipiente, proporcionar una solucion organica de lipido en un segundo recipiente, y mezclar la solucion acuosa con la solucion organica de lipido de forma que la solucion organica de lipido se mezcle con la solucion acuosa de manera que produzca sustancialmente instantaneamente un liposoma que encapsula el acido nucleico (por ejemplo, ARN interferente). Este proceso y el aparato para llevar a cabo este proceso se describen en detalle en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20040142025.
La accion de introducir continuamente las soluciones de lipido y de tampon en un entorno de mezcla, tal como en una camara de mezcla, producen una dilucion continua de la solucion de lipido con la solucion de tampon, produciendo asf un liposoma sustancialmente instantaneamente con la mezcla. Como se usa en el presente documento, la expresion "diluir continuamente una solucion de lipido con una solucion de tampon" (y variaciones) generalmente significa que la solucion de lipido se diluye suficientemente rapidamente en un proceso de hidratacion con fuerza suficiente para efectuar la generacion de vesfculas. Mezclando la solucion acuosa que comprende un acido nucleico con la solucion organica de lipido, la solucion organica de lipido se somete a dilucion escalonada continua en presencia de la solucion de tampon (es decir, solucion acuosa) para producir una particula de acido nucleico-lfpido.
Las SNALP formadas usando el metodo de mezcla continua normalmente tienen un tamano de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, o de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm. Las partfculas asf formadas no se agregan y estan opcionalmente dimensionadas para lograr un tamano de particula uniforme.
En otra realizacion, la presente divulgacion proporciona SNALP producidas mediante un proceso de dilucion directa que incluye formar una solucion de liposoma e introducir inmediatamente y directamente la solucion de liposomas en un recipiente de recogida que contiene una cantidad controlada de tampon de dilucion. En aspectos preferidos, el recipiente de recogida incluye uno o mas elementos configurados para agitar el contenido del recipiente de recogida para facilitar la dilucion. En un aspecto, la cantidad de tampon de dilucion presente en el recipiente de recogida es sustancialmente igual al volumen de solucion de liposomas introducido en el mismo. Como ejemplo no limitante, una solucion de liposomas en 45 % de etanol cuando se introduce en el recipiente de recogida que contiene un volumen igual de tampon de dilucion dara ventajosamente partfculas mas pequenas.
En otra realizacion mas, la presente divulgacion proporciona SNALP producidas mediante un proceso de dilucion directa en el que un tercer recipiente que contiene tampon de dilucion se acopla de forma fluida con una segunda region de mezcla. En esta realizacion, la solucion de liposomas formada en una primera region de mezcla se mezcla inmediatamente y directamente con tampon de dilucion en la segunda region de mezcla. En aspectos preferidos, la segunda region de mezcla incluye un conector en T dispuesto de manera que los flujos de solucion de liposomas y el tampon de dilucion se encuentren como flujos opuestos a 180°; sin embargo, pueden usarse conectores que
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proporcionan angulos mas bajos, por ejemplo, de aproximadamente 27° a aproximadamente 180°. Un mecanismo de bomba suministra un flujo controlable de tampon a la segunda region de mezcla. En un aspecto, el caudal de tampon de dilucion proporcionado a la segunda region de mezcla esta controlado para ser sustancialmente igual al caudal de solucion de liposomas introducido a la misma desde la primera region de mezcla. Esta realizacion permite ventajosamente mas control del flujo de tampon de la mezcla de dilucion con la solucion de liposomas en la segunda region de mezcla, y por tanto tambien la concentracion de solucion de liposomas en tampon a traves del segundo proceso de mezcla. Tal control del caudal del tampon de dilucion permite ventajosamente la formacion de tamano de partfcula pequeno a concentraciones reducidas.
Estos procesos y los aparatos para llevar a cabo estos procesos de dilucion directa se describen en detalle en la publicacion de patente de EE.uU. N.° 20070042031.
Las SNALP formadas usando el proceso de dilucion directa normalmente tienen un tamano de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, o de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm. Las partfculas asf formadas no se degradan y se dimensionan opcionalmente para lograr un tamano de partfcula uniforme.
Si se necesita, las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) pueden dimensionarse por cualquiera de los metodos disponibles para dimensionar liposomas. El dimensionado puede realizarse con el fin de lograr un intervalo de tamano deseado y distribucion relativamente estrecha de tamanos de partfcula.
Estan disponibles varias tecnicas para dimensionar las partfculas a un tamano deseado. Un metodo de dimensionado, usado para liposomas e igualmente aplicable a las presentes partfculas, se describe en la patente de EE.UU. N.° 4.737.323. El sonicar una suspension de partfculas bien por sonicacion en bano o por sondas produce una reduccion de tamano progresiva a partfculas de menos de aproximadamente 50 nm de tamano. La homogenizacion es otro metodo que se basa en la energfa de cizallamiento para fragmentar partfculas mas grandes en mas pequenas. En un procedimiento de homogenizacion tfpico, se recirculan partfculas a traves de un homogeneizador de emulsiones estandar hasta que se observan tamanos de partfcula seleccionados, normalmente entre aproximadamente 60 y aproximadamente 80 nm. En ambos metodos, la distribucion del tamano de partfcula puede monitorizarse por discriminacion del tamano de partfculas por haz laser convencional, o QELS.
La extrusion de las partfculas a traves de una membrana de policarbonato de poro pequeno o una membrana ceramica asimetrica tambien es un metodo eficaz para reducir los tamanos de partfcula a una distribucion de tamano relativamente bien definida. Normalmente, la suspension se somete a ciclos a traves de la membrana una o mas veces hasta que se logra la distribucion del tamano de partfcula deseada. Las partfculas pueden extruirse a traves de membranas de poros sucesivamente mas pequenos, para lograr una reduccion gradual en el tamano.
En algunas realizaciones, los acidos nucleicos en las SNALP se precondensan como se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. N.° 09/744.103.
En otras realizaciones, los metodos comprenderan ademas anadir policationes no de lfpido que son utiles para efectuar la lipofeccion de celulas usando las presentes composiciones. Ejemplos de policationes no de lfpido adecuados incluyen bromuro de hexadimetrina (comercializado con la marca comercial POLYBRENE®, de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, EE.UU.) u otras sales de hexadimetrina. Otros policationes adecuados incluyen, por ejemplo, sales de poli-L-ornitina, poli-L-arginina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, polialilamina y polietilenimina. La adicion de estas sales es preferentemente despues de que las partfculas se hayan formado.
En algunas realizaciones, las relaciones de acido nucleico a lfpido (relacion masa/masas) en una SNALP formada oscilaran de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,2, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 0,1, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,08. La relacion de los materiales de partida tambien entra dentro de este intervalo. En otras realizaciones, la preparacion de SNALP usa aproximadamente 400 pg de acido nucleico por 10 mg de lfpido total o una relacion masica de acido nucleico a lfpido de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,08 y, mas preferentemente, aproximadamente 0,04, que se corresponde con 1,25 mg de total lfpido por 50 pg de acido nucleico. En otras realizaciones preferidas, la partfcula tiene una relacion masica de acido nucleico:lfpido de aproximadamente 0,08.
En otras realizaciones, las relaciones de lfpido a acido nucleico (relacion masa/masas) en una SNALP formada oscilaran de aproximadamente 1 (1:1) a aproximadamente 100 (100:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 100 (100:1), de aproximadamente 1 (1:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 2 (2:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 3 (3:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 4 (4:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 50 (50:1), de aproximadamente 1 (1:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 2 (2:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 3 (3:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 4 (4:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 25 (25:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente
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20 (20:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 15 (15:1), de aproximadamente 5 (5:1) a aproximadamente 10 (10:1), aproximadamente 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), 10 (10:1), 11 (11:1), 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1) o 15 (15:1). La relacion de los materiales de partida tambien entra dentro de este intervalo.
Como se trato previamente, el conjugado de lfpido puede incluir ademas un CPL. Una variedad de metodos generales de preparacion de SNALP-CPL (SNALp que contiene CPL) se tratan en el presente documento. Dos tecnicas generales incluyen la tecnica de "post-insercion", es decir, insercion de un CPL en, por ejemplo, una SNALP pre-formada, y la tecnica "estandar", en la que el CPL se incluye en la mezcla de lfpido durante, por ejemplo, las etapas de formacion de SNALP. La tecnica de post-insercion produce SNALP que tiene CPL principalmente en la cara externa de la membrana bicapa de SNALP, mientras que tecnicas convencionales proporcionan SNALP que tienen CPL en tanto las caras internas como externas. El metodo es especialmente util para vesfculas hechas de fosfolfpidos (que pueden contener colesterol) y tambien para vesfculas que contienen PEG-lfpidos (tales como PEG- DAA y PEG-DAG). Metodos de preparacion de SNALP-CPL se ensenan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N.° 5.705.385; 6.586.410; 5.981.501; 6.534.484; y 6.852.334; la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20020072121; y la publicacion PCT N.° WO 00/62813.
VII. Kits
La presente divulgacion tambien proporciona partfculas de lfpido (por ejemplo, SNALP) en forma de kit. El kit puede comprender un recipiente que esta compartimentalizado para contener los diversos elementos de las partfculas de lfpido (por ejemplo, los agentes activos o agentes terapeuticos tales como acidos nucleicos y los componentes de lfpido individuales de las partfculas). En algunas realizaciones, el kit puede comprender ademas un desestabilizador de membrana endosomico (por ejemplo, iones calcio). El kit normalmente contiene las composiciones de partfculas de lfpido de la presente divulgacion, preferentemente en forma deshidratada, con instrucciones para su rehidratacion y administracion.
Como se explico en el presente documento, las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) pueden ser confeccionadas para dirigirse preferencialmente a tejidos, organos, o tumores particulares de interes. En ciertos casos, el direccionamiento preferencial de partfculas de lfpido tales como SNALP puede llevarse a cabo controlando la propia composicion de la partfcula. Por ejemplo, como se expone en el Ejemplo 11, se ha encontrado que la formulacion de SNALP 1:57 PEG-cDSA puede usarse para dirigir preferencialmente tumores fuera del hfgado, mientras que la formulacion de SNALP 1:57 PEG-cDMA puede usarse para dirigir preferencialmente el hfgado (incluyendo tumores del hfgado).
En ciertos otros casos, puede desearse tener un resto de direccionamiento unido a la superficie de la partfcula de lfpido para potenciar adicionalmente el direccionamiento de la partfcula. Metodos de union de restos de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpos, protefnas, etc.) a lfpidos (tales como aquellos usados en las presentes partfculas) son conocidos para aquellos expertos en la materia.
VII. Administracion de partfculas de lfpido
Una vez formadas, las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) son utiles para la introduccion de agentes activos o agentes terapeuticos (por ejemplo, acidos nucleicos tales como ARN interferente) en celulas. Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona metodos de introduccion de un agente activo o agente terapeutico tal como un acido nucleico (por ejemplo, ARN interferente) en una celula. Los metodos se llevan a cabo in vitro o in vivo formando primero las partfculas como se ha descrito anteriormente y luego poniendo en contacto las partfculas con las celulas durante un periodo de tiempo suficiente para que ocurra la administracion del agente activo o agente terapeutico a las celulas.
Las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) pueden adsorberse a casi cualquier tipo de celula con la que se mezclan o ponen en contacto. Una vez adsorbidas, las partfculas pueden o bien ser endocitosadas por una porcion de las celulas, intercambiar lfpidos con membranas celulares, o bien fusionarse con las celulas. La transferencia o incorporacion de la porcion de agente activo o agente terapeutico (por ejemplo, acido nucleico) de la partfcula puede tener lugar mediante una cualquiera de estas vfas. En particular, cuando tiene lugar la fusion, la membrana de partfcula se integra en la membrana celular y el contenido de la partfcula se combina con el fluido intracelular.
Las partfculas de lfpido descritas en el presente documento (por ejemplo, SNALP) pueden administrarse tanto solas como en una mezcla con un vehfculo farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, solucion salina fisiologica o tampon fosfato) seleccionado segun la via de administracion y la practica farmaceutica estandar. Generalmente, se empleara solucion salina tamponada normal (por ejemplo, NaCl 135-150 mM) como el vehfculo farmaceuticamente aceptable. Otros vehfculos adecuados incluyen, por ejemplo, agua, agua tamponada, 0,4 % de solucion salina, 0,3 % de glicina, y similares, que incluyen glucoprotefnas para estabilidad potenciada, tal como albumina, lipoprotefna, globulina, etc. Vehfculos adicionales adecuados se describen en, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985). Como se usa en el presente documento, "vehfculo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, vehfculos,
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recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retraso de la absorcion, tampones, soluciones de vehfculo, suspensiones, coloides, y similares. La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion alergica o similar no deseada cuando se administran a un ser humano.
El vehfculo farmaceuticamente aceptable se anade generalmente tras la formacion de partfculas. Asf, despues de formarse la partfcula, la partfcula puede diluirse en vehfculos farmaceuticamente aceptables tales como solucion salina tamponada normal.
La concentracion de partfculas en las formulaciones farmaceuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,05 %, normalmente en o al menos aproximadamente del 2 al 5 %, a como mucho aproximadamente del 10 al 90 % en peso, y se seleccionaran principalmente por volumenes de fluido, viscosidades, etc., segun el modo particular de administracion seleccionado. Por ejemplo, la concentracion puede aumentarse para reducir la carga de fluido asociada al tratamiento. Esto puede ser particularmente deseable en pacientes que tienen insuficiencia cardfaca congestiva asociada a aterosclerosis o hipertension grave. Alternativamente, pueden diluirse partfculas compuestas de lfpidos irritantes a concentraciones bajas para reducir la inflamacion en el sitio de administracion.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden esterilizarse por tecnicas de esterilizacion convencionales muy conocidas. Pueden envasarse soluciones acuosas para su uso o filtrarse bajo condiciones asepticas y liofilizarse, siendo la preparacion liofilizada combinada con una disolucion acuosa esteril antes de la administracion. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun se requiera para aproximarse a las condiciones fisiologicas, tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato sodico, lactato de sodio, cloruro sodico, cloruro de potasio y cloruro de calcio. Adicionalmente, la suspension de partfculas puede incluir agentes protectores de lfpidos que protegen los lfpidos contra los danos por radicales libres y peroxidativos de lfpidos con el almacenamiento. Son adecuados extintores de radicales libres lipofilos, tales como alfa-tocoferol y quelantes especfficos de hierro solubles en agua, tales como ferrioxamina.
A. Administracion in vivo
Se ha logrado la administracion sistemica para terapia in vivo, por ejemplo, administracion de un acido nucleico terapeutico a una celula diana distal mediante sistemas del cuerpo tales como la circulacion, usando partfculas de acido nucleico-lfpido tales como aquellas descritas en las publicaciones PCT N.° WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152 y WO 04/002453. La presente divulgacion tambien proporciona partfculas de lfpido completamente encapsuladas que protegen al acido nucleico de la degradacion por nucleasas en suero, son no inmunogenicas, son de tamano pequeno y son adecuadas para dosificacion repetida.
Para administracion in vivo, la administracion puede ser en cualquier modo conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante inyeccion, administracion por via oral, inhalacion (por ejemplo, intranasal o intratraqueal), administracion transdermica, o administracion rectal. La administracion puede llevarse a cabo mediante dosis unicas o divididas. Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por via parenteral, es decir, por via intrarticular, por via intravenosa, por via intraperitoneal, por via subcutanea o por via intramuscular. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas se administran por via intravenosa o por via intraperitoneal por una inyeccion en bolo (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.286.634). La administracion intracelular de acido nucleico tambien se ha tratado en Straubringer et al., Methods Enzymol., 101:512 (1983); Mannino et al., Biotechniques, 6:682 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989); y Behr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993). Todavfa otros metodos de administracion de terapeuticos basados en lfpidos se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 3.993.754; 4.145.410; 4.235.871; 4.224.179; 4.522.803; y 4.588.578. Las partfculas de lfpido pueden administrarse por inyeccion directa en el sitio de enfermedad o mediante inyeccion en un sitio distal del sitio de enfermedad (vease, por ejemplo, Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71(1994)).
Las composiciones de la presente divulgacion, tanto solas como en combinacion con otros componentes adecuados, pueden prepararse en formulaciones en aerosol (es decir, pueden ser "nebulizadas") para ser administradas mediante inhalacion (por ejemplo, por via intranasal o por via intratraqueal) (vease, Brigham et al., Am. J. Sci., 298:278 (1989)). Las formulaciones en aerosol pueden disponerse en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrogeno, y similares.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por esprays intranasales, inhalacion y/u otros vehfculos de administracion de aerosol. Metodos de administracion de composiciones de acidos nucleicos directamente a los pulmones mediante esprays nasales de aerosol se han descrito, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N.° 5.756.353 y 5.804.212. Asimismo, la administracion de farmacos usando resinas de micropartfculas intranasales y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (patente de EE.UU. 5.725.871) tambien es muy conocida en las tecnicas farmaceuticas. Similarmente, la administracion de farmaco transmucosa en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la patente de EE.UU. N.° 5.780.045.
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Formulaciones adecuadas para la administracion parenteral, tales como, por ejemplo, por vfas intrarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal y subcutanea, incluyen soluciones acuosas y no acuosas para inyeccion esteril isotonica, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos que convierten la formulacion en isotonica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension, solubilizantes, espesantes, estabilizadores y conservantes. En la practica de la presente invencion, las composiciones se administran preferentemente, por ejemplo, por infusion intravenosa, por via oral, por via topica, por via intraperitoneal, por via intravesical, o por via intratecal.
Generalmente, cuando se administran por via intravenosa, las formulaciones de partfculas de lfpido se formulan con un vehfculo farmaceutico adecuado. Muchos vehfculos farmaceuticamente aceptables pueden emplearse en las composiciones y metodos de la presente divulgacion. Formulaciones adecuadas para su uso en la presente invencion se encuentran, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985). Puede usarse una variedad de vehfculos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solucion salina al 0,4 %, 0,3 % de glicina, y similares, y pueden incluir glucoprotefnas para estabilidad potenciada, tales como albumina, lipoprotefna, globulina, etc. Generalmente, se empleara solucion salina tamponada normal (NaCl 135-150 mM) como el vehfculo farmaceuticamente aceptable, pero seran suficientes otros vehfculos adecuados. Estas composiciones pueden esterilizarse por tecnicas de esterilizacion de liposomas convencionales, tales como filtracion. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun se requiera para aproximarse a las condiciones fisiologicas, tales como agentes de ajuste de pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato sodico, lactato de sodio, cloruro sodico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. Estas composiciones pueden esterilizarse usando las tecnicas citadas anteriormente o, alternativamente, pueden producirse en condiciones esteriles. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso o filtrarse bajo condiciones asepticas y liofilizarse, siendo la preparacion liofilizada combinada con una disolucion acuosa esteril antes de la administracion.
En ciertas aplicaciones, las partfculas de lfpido desveladas en el presente documento pueden administrarse mediante administracion por via oral al individuo. Las partfculas pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, pfldoras, pastillas para chupar, elixires, enjuague bucal, suspensiones, esprays orales, jarabes, obleas, y similares (veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 5.641.515, 5.580.579 y 5.792.451). Estas formas de dosificacion orales tambien pueden contener los siguientes: aglutinantes, gelatina; excipientes, lubricantes y/o aromatizantes. Cuando la forma de dosificacion unitaria es una capsula, puede contener, ademas de los materiales descritos anteriormente, un vehfculo lfquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma ffsica de la unidad de dosificacion. Por supuesto, cualquier material usado en la preparacion de cualquier forma de dosificacion unitaria debe ser farmaceuticamente puro y sustancialmente no toxico en las cantidades empleadas.
Normalmente, estas formulaciones orales pueden contener al menos aproximadamente el 0,1 % de las partfculas de lfpido o mas, aunque el porcentaje de las partfculas puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 1 % o el 2 % y aproximadamente el 60 % o el 70 % o mas del peso o volumen de la formulacion total. Naturalmente, la cantidad de partfculas en cada composicion terapeuticamente util puede prepararse de tal forma que se obtenga una dosificacion adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, semivida biologica, via de administracion, estabilidad en almacen del producto, ademas de otras consideraciones farmacologicas, seran contemplados por un experto en la materia de la preparacion de tales formulaciones farmaceuticas, y como tal, puede ser deseable una variedad de dosificaciones y pautas de tratamiento.
Las formulaciones adecuadas para administracion por via oral pueden consistir en: (a) soluciones lfquidas, tales como una cantidad eficaz de un agente terapeutico envasado tal como acido nucleico (por ejemplo, ARN interferente) suspenso en diluyentes tales como agua, solucion salina o PEG 400; (b) capsulas, sobres o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de un agente terapeutico tal como acido nucleico (por ejemplo, ARN interferente), como lfquidos, solidos, granulos o gelatina; (c) suspensiones en un lfquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimido pueden incluir uno o mas de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidon de mafz, almidon de patata, celulosa microcristalina, gelatina, dioxido de silicio coloidal, talco, estearato de magnesio, acido estearico, y otros excipientes, colorantes, cargas, aglutinantes, diluyentes, agentes de tamponamiento, agentes humidificantes, conservantes, aromatizantes, colorantes, agentes disgregantes y vehfculos farmaceuticamente compatibles. Las formas de pastilla para chupar pueden comprender un agente terapeutico tal como acido nucleico (por ejemplo, ARN interferente) en un aroma, por ejemplo, sacarosa, ademas de pastillas que comprenden el agente terapeutico en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o emulsiones de sacarosa y goma arabiga, geles, y similares que contienen, ademas del agente terapeutico, vehfculos conocidos en la tecnica.
En otro ejemplo de su uso, las partfculas de lfpido pueden incorporarse en una amplia variedad de formas de dosificacion topica. Por ejemplo, una suspension que contiene partfculas de acido nucleico-lfpido tales como SNALP puede formularse y administrarse como geles, aceites, emulsiones, cremas topicas, pastas, pomadas, lociones, espumas, mousses, y similares.
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Cuando se preparan preparaciones farmaceuticas de las partfculas de lipido descritas en el presente documento , es preferible usar cantidades de las partfculas que se han purificado para reducir o eliminar partfculas vacfas o partfculas con agentes terapeuticos tales como acido nucleico asociado a la superficie externa.
Los metodos de la presente divulgacion pueden ponerse en practica en una variedad de hospedadores. Hospedadores preferidos incluyen especies de mamffero, tales como primates (por ejemplo, seres humanos y chimpances, ademas de otros primates no humanos), caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por ejemplo, ratas y ratones), lagomorfos y cerdos.
La cantidad de partfculas administrada dependera de la relacion de agente terapeutico (por ejemplo, acido nucleico) a lipido, el agente terapeutico particular (por ejemplo, acido nucleico) usado, la enfermedad o trastorno que esta tratandose, la edad, peso y afeccion del paciente, y el criterio del profesional clfnico, pero generalmente estara entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, p refe rente me nte entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 108-1010 partfculas por administracion (por ejemplo, inyeccion).
B. Administracion in vitro
Para aplicaciones in vitro, la administracion de agentes terapeuticos tales como acidos nucleicos (por ejemplo, ARN interferente) puede ser a cualquier celula cultivada en cultivo, tanto de planta como de origen animal, vertebrado o invertebrado, y de cualquier tejido o tipo. En realizaciones preferidas, las celulas son celulas de animales, mas preferentemente celulas de mamffero, y lo mas preferentemente celulas humanas.
El contacto entre las celulas y las partfculas de lipido, cuando se lleva a cabo in vitro, tiene lugar en un medio biologicamente compatible. La concentracion de partfculas varfa ampliamente dependiendo de la aplicacion particular, pero es generalmente entre aproximadamente 1 pmol y aproximadamente 10 mmoles. El tratamiento de las celulas con las partfculas de lipido se lleva a cabo generalmente a temperaturas fisiologicas (aproximadamente 37 °C) durante periodos de tiempo de aproximadamente 1 a 48 horas, preferentemente de aproximadamente 2 a 4 horas.
En un grupo de realizaciones preferidas, una suspension de partfculas de lipido se anade a celulas sembradas el 6080 % confluentes que tienen una densidad celular de aproximadamente el 103 a aproximadamente 105 celulas/ml, mas preferentemente aproximadamente 2 x 104 celulas/ml. La concentracion de la suspension anadida a las celulas es preferentemente de aproximadamente 0,01 a 0,2 pg/ml, mas preferentemente aproximadamente 0,1 pg/ml.
Usando un ensayo de parametros de liberacion endosomica (ERP), puede optimizarse la eficiencia de administracion de las SNALP u otra partfcula de lipido descrita en el presente documento. Un ensayo de ERP se describe en detalle en la publicacion de patente de EE.UU. N.° 20030077829. Mas particularmente, el fin de un ensayo de ERP es distinguir el efecto de diversos lfpidos cationicos y componentes de lfpidos auxiliares de SNALP basandose en su efecto relativo sobre la union/captacion o fusion con/desestabilizacion de la membrana endosomica. Este ensayo permite determinar cuantitativamente como un componente de la SNALP u otra partfcula de lipido afecta la eficiencia de administracion, optimizando asf la SNALP u otra partfcula de lipido. Normalmente, un ensayo de ERP mide la expresion de una protefna indicadora (por ejemplo, luciferasa, p-galactosidasa, protefna verde fluorescente (GFP), etc.), y en algunos casos, una formulacion de SNALP optimizada para un plasmido de expresion tambien sera apropiada para encapsular un ARN interferente. En otros casos, un ensayo de ERP puede adaptarse para medir la regulacion por disminucion de la transcripcion o traduccion de una secuencia diana en presencia o ausencia de un ARN interferente (por ejemplo, ARNip). Comparando los ERP para cada una de las diversas SNALP u otras partfculas de lipido, puede determinarse facilmente el sistema optimizado, por ejemplo, la SNALP u otra partfcula de lipido que tiene la mayor captacion en la celula.
C. Celulas para la administracion de partfculas de lipido
Las composiciones y metodos de la presente divulgacion se usan para tratar una amplia variedad de tipos de celulas, in vivo e in vitro. Celulas adecuadas incluyen, por ejemplo, celulas precursoras (madre) hematopoyeticas, fibroblastos, queratinocitos, hepatocitos, celulas endoteliales, celulas esqueleticas y de musculo liso, osteoblastos, neuronas, linfocitos quiescentes, celulas terminalmente diferenciadas, celulas primarias lentas o no en reproduccion, celulas del parenquima, celulas linfoides, celulas epiteliales, celulas oseas, y similares. En realizaciones preferidas, un agente activo o agente terapeutico tal como un ARN interferente (por ejemplo, ARNip) se administra a celulas cancerosas tales como, por ejemplo, celulas de cancer de pulmon, celulas de cancer de colon, celulas de cancer rectal, celulas de cancer anal, celulas de cancer de las vfas biliares, celulas de cancer del intestino delgado, celulas de cancer de estomago (gastrico), celulas de cancer de esofago, celulas de cancer de vesfcula biliar, celulas de cancer de hfgado, celulas de cancer pancreatico, celulas de cancer del apendice, celulas de cancer de mama, celulas de cancer de ovario, celulas de cancer cervical, celulas de cancer de prostata, celulas de cancer renal, celulas de cancer del sistema nervioso central, celulas de tumor de glioblastoma, celulas de cancer de piel, celulas de linfoma, celulas de tumor de coriocarcinoma, celulas de cancer de cabeza y cuello, celulas de tumor de sarcoma osteogenico, y celulas de cancer de sangre.
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La administracion in vivo de partfculas de lipido tales como SNALP que encapsulan un ARN interferente (por ejemplo, ARNip) es apta para dirigirse a celulas de cualquier tipo de celula. Los metodos y composiciones pueden emplearse con celulas de una amplia variedad de vertebrados, que incluyen mamiferos, tales como, por ejemplo, caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por ejemplo, ratones, ratas y cobayas), lagomorfos, cerdos y primates (por ejemplo, monos, chimpances y seres humanos).
Hasta el punto que pueda requerirse el cultivo de tejido de celulas, es muy conocido en la tecnica. Por ejemplo, Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3a Ed., Wiley-Liss, New York (1994), Kuchler et al., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977), y las referencias citadas en su interior proporcionan una gufa general al cultivo de celulas. Los sistemas de celulas cultivadas frecuentemente estaran en forma de monocapas de celulas, aunque tambien se usan suspensiones de celulas.
D. Deteccion de partfculas de lipido
En algunas realizaciones, las partfculas de lipido de la presente divulgacion (por ejemplo, SNALP) son detectables en el sujeto a aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas horas. En otras realizaciones, las partfculas de lipido de la presente divulgacion (por ejemplo, SNALP) son detectables en el sujeto a aproximadamente 8, 12, 24, 48, 60, 72 o 96 horas, o aproximadamente 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25 o 28 dfas despues de la administracion de las partfculas. La presencia de las partfculas puede detectarse en las celulas, tejidos u otras muestras biologicas del sujeto. Las partfculas pueden detectarse, por ejemplo, por deteccion directa de las partfculas, deteccion de un acido nucleico terapeutico tal como una secuencia de ARN interferente (por ejemplo, ARNip), deteccion de la secuencia diana de interes (es decir, detectando la expresion o expresion reducida de la secuencia de interes), o una combinacion de los mismos.
1. Deteccion de partfculas
Las partfculas de lipido descritas en el presente documento, tales como SNALP, pueden detectarse usando cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, una marca puede acoplarse directa o indirectamente a un componente de la partfcula de lipido usando metodos muy conocidos en la tecnica. Puede usarse una amplia variedad de marcas, dependiendo la eleccion de la marca de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugacion con el componente de partfcula de lipido, requisitos de estabilidad, e instrumentacion disponible y provisiones de deposicion. Marcas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, marcas espectrales tales como colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluorescefna y derivados, tales como isotiocianato de fluorescefna (FITC) y Oregon Green™; rodamina y derivados tales como Texas red, isotiocianato de tetrarrodimina (TRITC), etc., digoxigenina, biotina, ficoeritrina, AmCA, CyDyes™, y similares; radiomarcas tales como 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 33P, etc.; enzimas tales como peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, etc.; marcas colorimetricas espectrales tales como oro coloidal o vidrio coloreado, o perlas de plastico tales como poliestireno, polipropileno, latex, etc. La marca puede detectarse usando cualquier medio conocido en la tecnica.
2. Deteccion de acidos nucleicos
Se detectan y cuantifican en el presente documento acidos nucleicos (por ejemplo, ARN interferente) por cualquiera de varios medios muy conocidos para aquellos expertos en la materia. La deteccion de acidos nucleicos puede proceder por metodos muy conocidos tales como analisis Southern, analisis Northern, electroforesis en gel, PCR, radiomarcado, recuento por centelleo y cromatograffa de afinidad. Tambien puede emplearse metodos bioqufmicos analfticos adicionales tales como espectrofotometrfa, radiograffa, electroforesis, electroforesis capilar, cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC), cromatograffa en capa fina (TLC) y cromatograffa de hiperdifusion.
La seleccion de un formato de hibridacion de acidos nucleicos no es crftica. Los expertos en la materia conocen una variedad de formatos de hibridacion de acidos nucleicos. Por ejemplo, formatos comunes incluyen ensayos de sandwich y ensayos de competicion o de desplazamiento. Las tecnicas de hibridacion se describen generalmente en, por ejemplo, "Nucleic Acids Hybridization, A Practical Approach", Eds. Hames and Higgins, IRL Press (1985).
La sensibilidad de los ensayos de hibridacion puede potenciarse mediante el uso de un sistema de amplificacion de acidos nucleicos que multiplica el acido nucleico diana que se detecta. Se conocen tecnicas de amplificacion in vitro adecuadas para amplificar secuencias para su uso como sondas moleculares o para generar fragmentos de acido nucleico para la posterior subclonacion. Ejemplos de tecnicas suficientes para dirigir a los expertos a traves de tales metodos de amplificacion in vitro, que incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), amplificacion de Qp-replicasa y otras tecnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA™), se encuentran en Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000); y Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (2002); ademas de la patente de EE.UU. N.° 4.683.202; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990), C&EN 36; The Journal of NIH Research, 3:81 (1991); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Landegren et al., Science, 241:1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291
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(1990); Wu y Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer et al., Gene, 89:117 (1990); y Sooknanan y Malek, Biotechnology, 13:563 (1995). Metodos mejorados de clonacion de acidos nucleicos amplificados in vitro se describen en la patente de EE.UU. N.° 5.426.039. Otros metodos descritos en la materia son la amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos (NASBA™, Cangene, Mississauga, Ontario) y sistemas de Qp-replicasa. Estos sistemas pueden usarse para identificar directamente mutantes donde los cebadores de PCR o de lCr se disenan para ser extendidos o ligados solo cuando esta presente una secuencia seleccionada. Alternativamente, las secuencias seleccionadas pueden ser generalmente amplificadas usando, por ejemplo, cebadores de PCR no especfficos y sondarse despues la region diana amplificada para una secuencia especffica indicativa de una mutacion.
Acidos nucleicos para su uso como sondas, por ejemplo, en metodos de amplificacion in vitro, para su uso como sondas de genes, o como componentes inhibidores, normalmente se sintetizan qufmicamente segun el metodo de triester de fosforamidito en fase solida descrito por Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22:1859 1862 (1981), por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984). La purificacion de polinucleotidos, donde sea necesario, normalmente se realiza por o bien electroforesis en gel de acrilamida nativo o por HPLC de intercambio anionico como se describe en Pearson et al., J. Chrom., 255:137 149 (1983). La secuencia de los polinucleotidos sinteticos puede verificarse usando el metodo de degradacion qufmica de Maxam y Gilbert (1980) en Grossman y Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499.
Un medio alternativo para determinar el nivel de transcripcion es la hibridacion in situ. Los ensayos de hibridacion in situ son muy conocidos y generalmente se describen en Angerer et al., Methods Enzymol., 152:649 (1987). En un ensayo de hibridacion in situ, las celulas se fijan a un soporte solido, normalmente un portaobjetos de vidrio. Si va a sondarse ADN, las celulas se desnaturalizan con calor o alcali. Las celulas se ponen en contacto entonces con una solucion de hibridacion a una temperatura moderada para permitir la hibridacion de sondas especfficas que se marcan. Las sondas se marcan preferentemente con radioisotopos o indicadores fluorescentes.
VIII. Ejemplos
La presente invencion se describira en mayor detalle a modo de ejemplos especfficos. Los siguientes ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos, y no pretenden limitar la invencion de ninguna manera. Aquellos expertos en la materia reconoceran facilmente una variedad de parametros no crfticos que pueden cambiarse o modificarse para dar esencialmente los mismos resultados.
Ejemplo 1. Materiales y metodos.
ARNip: Todas las moleculas de ARNip usadas en estos estudios fueron qufmicamente sintetizadas por la Universidad de Calgary (Calgary, AB) o Dharmacon Inc. (Lafayette, CO). Los ARNip se desalaron e hibridaron usando procedimientos convencionales.
Encapsulacion en Ifpidos de ARNip: En algunas realizaciones, se encapsularon moleculas de ARNip en partfculas de acido nucleico-lfpido compuestas de los siguiente lfpidos: el conjugado de lfpido PEG-cDMA (3-N-[(- metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil]-1,2-dimiristiloxipropilamina); el lfpido cationico DLinDMA (1,2-dilinoleiloxi-3- (N,N-dimetil)aminopropano); el fosfolfpido DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina; Avanti Polar Lipids; Alabaster, AL); y colesterol sintetico (Sigma-Aldrich Corp.; St. Louis, MO) en la relacion molar 1,4:57,1:7,1:34,3, respectivamente. En otras palabras, los ARNip se encapsularon en SNALP de la siguiente formulacion "1:57": 1,4 % de PEG-cDMA; 57,1 % de DLinDMA; 7,1 % de DPPC; y 34,3 % de colesterol. En otras realizaciones, las moleculas de ARNip se encapsularon en SNALP libres de fosfolfpidos compuestas de los siguientes lfpidos: el conjugado de lfpido PEG-cDMA; el lfpido cationico DLinDMA; y colesterol sintetico en la relacion molar 1,5:61,5:36,9, respectivamente. En otras palabras, se encapsularon los ARNip en SNALP libres de fosfolfpido de la siguiente formulacion "1:62": 1,5 % de PEG-cDMA; 61,5 % de DLinDMA; y 36,9 % de colesterol. Para controles de vehfculo, se formaron partfculas vacfas con composicion de lfpido identicas en ausencia de ARNip. Debe entenderse que la formulacion 1:57 y la formulacion 1:62 son formulaciones diana, y que la cantidad de lfpido (tanto cationico como no cationico) presente y la cantidad de conjugado de lfpido presente en la formulacion pueden variar. Normalmente, en la formulacion 1:57, la cantidad de lfpido cationico sera el 57 % en moles ± 5 % en moles, y la cantidad de conjugado de lfpido sera el 1,5 % en moles ± 0,5 % en moles, estando el resto de la formulacion 1:57 constituido de lfpido no cationico (por ejemplo, fosfolfpido, colesterol, o una mezcla de los dos). Similarmente, en la formulacion 1:62, la cantidad de lfpido cationico sera el 62 % en moles ± 5 % en moles, y la cantidad de conjugado de lfpido sera el 1,5 % en moles ± 0,5 % en moles, estando el resto de la formulacion 1:62 constituida del lfpido no cationico (por ejemplo, colesterol).
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Ejemplo 2. ARNip de Eg5 formulados como SNALP 1:57 son potentes inhibidores del crecimiento celular in vitro.
Se prepararon formulaciones de SNALP con un ARNip que se dirige a Eg5 como el componente de acido nucleico. Eg5 es un miembro de las protemas relacionadas con kinesina que participan en funciones relacionadas con movimientos de organulos, microtubulos o cromosomas a lo largo de microtubulos. Estas funciones incluyen transporte axonal, deslizamiento de microtubulos durante la fusion o division nuclear, y disyuncion de cromosomas durante la meiosis y mitosis temprana. Eg5 desempena una funcion cntica en la mitosis de celulas de mai^ero. El ARNip de Eg5 usado en este estudio se proporciona en la Tabla 1. Las modificaciones implicaron introducir 2'OMe- uridina en posiciones seleccionadas en las hebras codificantes y no codificantes de la secuencia de ARNip de Eg5 2263, en la que el duplex de ARNip contuvo menos de aproximadamente el 20 % de nucleotidos modificados con 2'OMe.
Tabla 1. Duplex de ARNip que comprende polinucleotidos de ARN de Eg5 codificantes y no codificantes
Modificacion
Secuencia de ARNip de Eg5 2263
% modificado en 2'OMe
% modificado en la region DS
U/U
5'-CUGAAGACCUGAAGACAAUdT dT-3' 3'-dTdTGACUUCUGGACUUCUGUUA-5'
6/42 = 14,3 %
6/38 = 15,8 %
Columna 1: "U/U" = duplex de ARNip modificado en 2'OMe-uridina; Columna 2: Los nucleotidos modificados en 2'OMe se indican en negrita y subrayados. El duplex de ARNip puede comprender alternativa o adicionalmente nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluor (2'F), 2'-desoxi-nucleotidos, nucleotidos de 2'-O-(2-metoxietilo) (MOE) y/o nucleotidos de acido nucleico bloqueado (LNA). "dT" = desoxitimidina. Columna 3: Se proporcionan el numero y porcentaje de nucleotidos modificados en 2'OMe en el duplex de ARNip. Columna 4: Se proporcionan el numero y porcentaje de nucleotidos modificados en la region bicatenaria (DS) del duplex de ARNip.__________________
Los componentes de lfpido y las caractensticas ffsicas de las formulaciones de SNALP se resumen en la Tabla 2. La relacion de lfpido:farmaco se describe en unidades de mg de lfpido total por mg de acido nucleico. Se midieron el tamano medio de partfcula y la polidispersidad en un Malvern Instruments Zetasizer. Se midio la encapsulacion de acido nucleico usando un ensayo Ribogreen esencialmente como se describe en Heyes et al., Journal of Controlled Release, 107:276-287 (2005).
Tabla2. Caractensticas de las formulaciones de SNALP usadas en este estudio.
Muestra N.°
Composicion de formulacion, % en moles de PEG(2000)-C- DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol Relacion de lfpido/farmaco Caracterizacion de productos acabados
Tamano (nm)
Polidispersidad % de encapsulacion
1
2 | 40| 10 | 48 12,4 57 0,07 90
2
1,8 | 36,4 | 18,2 | 43,6 14,0 72 0,12 89
3
1,4 | 27,0 | 6,8 | 64,9 16,5 70 0,12 92
4
1,3 | 25,3 | 12,7 | 60,8 18,1 76 0,07 93
5
3,9 | 39,2 | 9,8 | 47,1 13,5 53 0,27 86
6
3,6 | 35,7 | 17,9 | 42,9 15,1 58 0,18 87
7
2,7 | 26,7 | 6,7 | 64,0 17,6 56 0,17 92
8
2,5 | 25,0 | 12,5 | 60,0 19,2 61 0,13 92
9
1,4 | 57,1 | 7,1 | 34,3 17,8 84 0,10 88
10
1,3 | 53,3 | 13,3 | 32,0 19,5 83 0,10 89
11
1,1 | 42,6 | 5,3 | 51,1 22,0 80 0,10 93
12
1,0 | 40,4 | 10,1 | 48,5 23,6 78 0,11 88
13
2,8 | 56,3 | 7,0 | 33,8 19,0 62 0,14 80
14
2,6 | 52,6 | 13,2 | 31,6 20,6 66 0,14 82
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2,1 | 42,1 | 5,3 | 50,5 23,1 71 0,16 91
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2 | 40| 10 | 48 24,7 67 0,14 92
El silenciamiento de Eg5 por transfeccion de ARNip produce la parada mitotica y apoptosis en celulas de mairnfero. La viabilidad celular tras la transfeccion con SNALp que contiene un ARNip que se dirige a Eg5 proporciona, por tanto, una lectura biologica simple de la eficiencia de transfeccion in vitro. Se evaluo la viabilidad celular de cultivos celulares in vitro usando el reactivo comercial CellTiter-Blue® (Promega Corp.; Madison, WI), un colorante de resazurina que se reduce por celulas metabolicamente activas al producto flourogenico resorufina. La lmea de celulas de cancer de colon HT29 humana se cultivo usando tecnicas estandar de cultivo tisular. 72 horas despues de la aplicacion de SNALP, se anadio el reactivo CellTiter-Blue® al cultivo para cuantificar la actividad metabolica de las celulas, que es una medida de la viabilidad celular. Los datos se presentan como un porcentaje de viabilidad celular con respecto a las celulas de control ("no tratadas") que recibieron vehfculo de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) solo.
La Figura 1 muestra que la formulacion de SNALP 1:57 que contiene ARNip de Eg5 2263 U/U estaba entre los
inhibidores mas potentes del crecimiento de celulas tumorales a todas las concentraciones de ARNip probadas (vease, Figura 1B, Muestra 9).
Ejemplo 3. ARNip de ApoB formulados como SNALP 1:57 tienen potente actividad de silenciamiento in vivo
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Se prepararon formulaciones de SNALP con un ARNip que se dirige a apolipoprotefna B (ApoB) como el componente de acido nucleico. ApoB es la principal apolipoprotefna de quilomicrones y lipoprotefnas de baja densidad (LDL). Las mutaciones en ApoB estan asociadas a hipercolesterolemia. ApoB se produce en el plasma en 2 formas principales, ApoB48 y ApoB100, que se sintetizan en el intestino e hfgado, respectivamente, debido a un 10 codon de terminacion especffico de organo. El ARNip de ApoB usado en este estudio se proporciona en la Tabla 3. Las modificaciones implicaron introducir 2'OMe-uridina o 2'OMe-guanosina en posiciones seleccionadas en las hebras codificantes y no codificantes de la secuencia de ARNip de ApoB, en la que el duplex de ARNip contuvo menos de aproximadamente el 20 % de nucleotidos modificados en 2'OMe.
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Tabla 3. Duplex de ARNip que comprende polinucleotidos de ARN de ApoB codificantes y no codificantes
Posicion
Modificacion
Secuencia de ARNip de ApoB
% modificado en 2'OMe
% modificado en la region DS
10048
U2/2 G1/2
5'-AGUGUCAUCACACUGAAUACC-3'
3'-GUUCACAGUAGUGUGACUUAU-5'
7/42 = 16,7 %
7/38 = 18,4 %
Columna 1: El numero se refiere a la posicion de nucleotido de la base de 5' de la hebra codificante con respecto a la secuencia de ARNm de ApoB de raton XM_137955. Columna 2: Los numeros se refieren a la distribucion de modificaciones qufmicas de 2'OMe en cada hebra. Columna 3: Los nucleotidos modificados en 2'OMe se indican en negrita y subrayados. El duplex de ARNip puede comprender alternativamente o adicionalmente nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluor (2'F), 2'-desoxi-nucleotidos, nucleotidos de 2'-O-(2-metoxietilo) (MOE) y/o nucleotidos de acido nucleico bloqueado (LNA). Columna 4: Se proporcionan el numero y porcentaje de nucleotidos modificados en 2'OMe en el duplex de ARNip. Columna 5: Se proporcionan el numero y porcentaje de nucleotidos modificados en la region bicatenaria (DS) del duplex de ARNip._________________________________________
Los componentes de lfpido y las caracterfsticas ffsicas de formulaciones se resumen en la Tabla 4. La relacion de lfpido:farmaco se describe en unidades de mg de total lfpido por mg de acido nucleico. El tamano de partfcula medio y la polidispersidad se midieron en un Malvern Instruments Zetasizer. La encapsulacion de acido nucleico se midio 20 usando un ensayo Ribogreen esencialmente como se describe en Heyes et al., Journal of Controlled Release, 107:276-287 (2005).
Tabla 4. Caracterfsticas de las formulaciones de SNALP usadas en este estudio.
Grupo
Nombre del lfpido de la composicion de formulacion y % en moles Relacion de lfpido/farmaco Caracterizacion de productos acabados
Tamano (nm)
Polidispersidad % de encapsulacion
2
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 2 | 40 | 10 | 48 12,4 59 0,15 93
3
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | Colesterol 2,2 | 44,4 | 53,3 10,7 55 0,17 91
4
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DOPC | Colesterol 2 | 40 | 10 | 48 12,5 59 0,16 92
5
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DMPC | Colesterol 2 | 40 | 10 | 48 12,2 56 0,11 92
6
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPE | Colesterol 1,8 | 36,4 | 18,2 | 43,6 13,8 66 0,16 93
7
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colestanol 2 | 40 | 10 | 48 12,4 56 0,12 92
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Grupo
Nombre del lipido de la composicion de formulacion y % en moles Relacion de lfpido/farmaco Caracterizacion de productos acabados
Tamano (nm)
Polidispersidad % de encapsulacion
8
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 1,4 | 27,0 | 6,8 | 64,9 16,5 60 0,10 93
9
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 1,3 | 25,3 | 12,7 | 60,8 18,1 74 0,13 92
10
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 2,5 | 25,0 | 12,5 | 60,0 19,2 60 0,13 93
11
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 1,4 | 57,1 | 7,4 | 34,3 17,8 79 0,09 94
12
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 1,0 | 40,4 | 10,1 | 48,5 23,6 72 0,11 93
13
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC 2 | 70 | 28 8,7 73 0,09 87
14
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC 1,6 | 54,7 | 43,8 11,3 65 0,11 87
Se obtuvieron ratones BALB/c (hembra, al menos 4 semanas de edad) de Harlan Labs. Despues de un periodo de aclimatacion (de al menos 7 dfas), los animales se administraron con SNALP por inyeccion intravenosa (i.v.) en la vena lateral de la cola una vez al dfa en el dfa de estudio 0 (1 dosis total por animal). La dosificacion fue 1 mg de ARNip encapsulado por kg de peso corporal, correspondiente a 10 ml/kg (redondeado a los 10 pl mas proximos). Como control negativo, se administro un grupo de animales con una inyeccion i.v. de vehfculo de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En el dfa de estudio 2, los animales se sacrificaron y se recogio tejido del hngado en RNAlater.
Se analizaron tejidos de hngado para niveles de ARNm de ApoB normalizado contra los niveles de ARNm de gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) usando el ensayo QuantiGene (Panomics; Fremont, CA) esencialmente como se describe en Judge et al., Molecular Therapy, 13:494 (2006).
La Figura 2 muestra que la formulacion de SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB 10048 U2/2 G1/2 fue la mas potente en reducir la expresion de ApoB in vivo (vease, Grupo 11).
Ejemplo 4. ARNip de ApoB formulado como SNALP 1:57 tienen potente actividad de silenciamiento in vivo.
Se prepararon formulaciones de SNALP con el ARNip de ApoB expuesto en la Tabla 3. Los componentes de lfpido y las caractensticas ffsicas de las formulaciones se resumen en la Tabla 5. La relacion de lfpido:farmaco se describe en unidades de mg de lfpido total por mg de acido nucleico. Se midieron el tamano de partfcula medio y la polidispersidad en un Malvern Instruments Zetasizer. La encapsulacion de acido nucleico se midio usando un ensayo Ribogreen esencialmente como se describe en Heyes et al., Journal of Controlled Release, 107:276-287 (2005).
Tabla 5. Caractensticas de las formulaciones de SNALP usadas en este estudio.
SNALP (relacion de L:D)
Carga de ARNip Tamano de partfcula (polidispersidad) % de encapsulacion
2:30 (13)
ApoB-10048 U2/2 G1/2 65 nm (0,16) 88
1:57 (9)
ApoB-10048 U2/2 G1/2 74 nm (0,10) 89
La formulacion de SNALP 2:30 usada en este estudio es la composicion de lfpido 2:30:20:48 como se describe en porcentajes molares de PEG-C-DMA, DLinDMA, DSPC y colesterol (en ese orden). Esta formulacion se preparo por prensa de jeringa a una relacion de lfpido a farmaco (L:D) de entrada (mg:mg) de 13:1.
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La formulacion de SNALP 1:57 usada en este estudio es la composicion de lipido 1,5:57,1:7:34,3 como se describe en porcentajes molares de PEG-C-DMA, DLinDMA, DPPC y colesterol (en ese orden). Esta formulacion se preparo por prensa de jeringa a una relacion de lipido a farmaco (L:D) de entrada (mg:mg) de 9:1.
Se obtuvieron ratones BALB/c (hembra, 4 semanas de edad) de Harlan Labs. Despues de un periodo de aclimatacion (de al menos 7 dias), los animales se administraron con SNALP por inyeccion intravenosa (i.v.) en la vena lateral de la cola una vez al dia en los dias de estudio 0, 1, 2, 3 y 4 durante un total de 5 dosis por animal. La dosificacion diaria fue o bien 1,0 (para SNALP 2:30) o bien 0,1 (para SNALP 1:57) mg de ARNip encapsulado por kg de peso corporal, correspondiente a 10 ml/kg (redondeado a los 10 pl mas proximos). Como control negativo, se administro un grupo de animales con inyecciones i.v. de vehfculo de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En el dia de estudio 7, 72 h despues del ultimo tratamiento, los animales se sacrificaron y se recogio tejido del hfgado en RNAlater.
Los tejidos del hfgado se analizaron para niveles de ARNm de ApoB normalizados contra niveles de ARNm de gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) usando el ensayo QuantiGene (Panomics; Fremont, CA) esencialmente como se describe en Judge et al., Molecular Therapy, 13:494 (2006).
La Figura 3 muestra que SNALP 1:57 que contiene ARNip de ApoB 10048 U2/2 G1/2 fue mas de 10 veces tan eficaz como la SNALP 2:30 en mediar en el silenciamiento del gen ApoB en hfgado de raton a un dosis 10 veces mas baja.
Ejemplo 5. ARNip de ApoB formulado como 1:57 o SNALP 1:62 tienen potente actividad de silenciamiento in vivo.
Se prepararon formulaciones de SNALP con el ARNip de ApoB expuesto en la Tabla 3. Los componentes de lipido y las caracterfsticas ffsicas de las formulaciones se resumen en la Tabla 6. La relacion de lfpido:farmaco se describe en unidades de mg de lipido total por mg de acido nucleico. Se midieron el tamano de partfcula medio y la polidispersidad en un Malvern Instruments Zetasizer. Se midio la encapsulacion de acido nucleico usando un ensayo Ribogreen esencialmente como se describe en Heyes et al., Journal of Controlled Release, 107:276-287 (2005).
Tabla 6. Caracterfsticas de las formulaciones de SNALP usadas en este estudio.
Grupo
Nombre del lipido de la composicion de formulacion y % en moles Relacion de lfpido/farmaco Caracterizacion de productos acabados
Tamano (nm)
Polidispersidad % de encapsulacion
2
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 1,4 | 57,1 | 7,1 | 34,3 8,9 76 0,06 89
3
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | Colesterol 1,5 | 61,5 | 36,9 8,1 76 0,04 86
4
PEG(2000)-C-DMA | DODMA | DPPC | Colesterol 1,4 | 57,1 | 7,1 | 34,3 9,0 72 0,05 95
5
PEG(5000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colesterol 1,4 | 57,1 | 7,1 | 34,3 9,6 52 0,16 89
6
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC | Colestanol 1,4 | 57,1 | 7,1 | 34,3 8,9 68 0,10 94
7
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPE | Colesterol 1,4 | 57,1 | 7,1 | 34,3 8,9 72 0,07 95
8
PEG(2000)-C-DMA | DLinDMA | DPPC 1,8 | 70,2 | 28,1 8,6 74 0,13 86
Se obtuvieron ratones BALB/c (hembra, al menos 4 semanas de edad) de Harlan Labs. Despues de un periodo de aclimatacion (de al menos 7 dias), los animales se administraron con SNALP por inyeccion intravenosa (i.v.) en la vena lateral de la cola una vez al dfa en el dfa de estudio 0 (1 dosis total por animal). La dosificacion fue 0,75 mg de ARNip encapsulado por kg de peso corporal, correspondiente a 10 ml/kg (redondeado a los 10 pl mas proximos). Como control negativo, se administro un grupo de animales con una inyeccion i.v. de vehfculo de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En el dfa de estudio 2, los animales se sacrificaron y se recogio tejido del hfgado en
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RNAlater.
Se analizaron tejidos de hfgado para niveles de ARNm de ApoB normalizados contra niveles de ARNm de gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) usando el ensayo QuantiGene (Panomics; Fremont, CA) esencialmente como se describe en Judge et al., Molecular Therapy, 13:494 (2006).
La Figura 4 muestra que las formulaciones de SNALP 1:57 y 1:62 tuvieron actividad de silenciamiento de ApoB comparable in vivo (veanse, por ejemplo, los Grupos 2 y 3).
Ejemplo 6. ARNip de ApoB formulado como SNALP 1:62 tienen potente actividad de silenciamiento in vivo.
Se prepararon formulaciones de SNALP con el ARNip de ApoB expuesto en la Tabla 3. Los componentes de lfpido y las caracterfsticas ffsicas de las formulaciones se resumen en la Tabla 7. La relacion de lfpido:farmaco se describe en unidades de mg de lfpido total por mg de acido nucleico. El tamano de partfcula medio y la polidispersidad se midieron en un Malvern Instruments Zetasizer. Se midio la encapsulacion de acido nucleico usando un ensayo Ribogreen esencialmente como se describe en Heyes et al., Journal of Controlled Release, 107:276-287 (2005).
Tabla 7. Caracterfsticas de las formulaciones de SNALP usadas en este estudio.
Grupo
Composicion de formulacion, % en moles de PEG(2000)-C- DMA | LinDMA | Colesterol Relacion de lfpido/farmaco Caracterizacion de productos acabados
Tamano (nm)
Polidispersidad % de encapsulacion
2
1,5 | 61,5 | 36,9 6,1 80 0,07 92
3
1,4 1 54,8 | 43,8 6,6 74 0,05 89
4
2,0 | 61,2 | 36,7 6,2 71 0,11 91
5
1,8 1 54,5 | 43,6 6,7 67 0,09 91
6
1,3 | 68,1 | 30,6 7,4 91 0,06 89
7
1,2 1 61,8 | 37,1 8,0 87 0,10 90
8
1,7 1 67,8 | 30,5 7,6 81 0,07 91
9
1,4 1 56,3 | 42,3 8,6 75 0,11 92
10
1,9 | 61,3 | 36,8 8,2 72 0,10 91
11
1,8 | 56,1 | 42,1 8,8 70 0,10 90
12
1,3 | 66,7 | 32,0 9,5 89 0,09 89
13
1,2 | 61,7 | 37,0 10,0 87 0,10 91
14
1,7 | 66,4 | 31,9 9,6 82 0,11 90
15
1,5 | 61,5 | 36,9 10,1 79 0,10 91
Se obtuvieron ratones BALB/c (hembra, al menos 4 semanas de edad) de Harlan Labs. Despues de un periodo de aclimatacion (de al menos 7 dfas), los animales se administraron con SNALP por inyeccion intravenosa (i.v.) en la vena lateral de la cola una vez al dfa en el dfa de estudio 0 (1 dosis total por animal). La dosificacion fue 0,1 mg de ARNip encapsulado por kg de peso corporal, correspondiente a 10 ml/kg (redondeado a los 10 pl mas proximos). Como control negativo, un grupo de animales se administro con una inyeccion i.v. de vehfculo de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En el dfa de estudio 2, los animales se sacrificaron y se recogio tejido del hfgado en RNAlater.
Se analizaron tejidos del hfgado para niveles de ARNm de ApoB normalizados contra los niveles de ARNm de gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) usando el ensayo QuantiGene (Panomics; Fremont, CA) esencialmente como se describe en Judge et al., Molecular Therapy, 13:494 (2006).
La Figura 5 muestra que la formulacion de SNALP 1:62 era uno de los inhibidores mas potentes de la expresion de ApoB a dos relaciones de lfpido:farmaco diferentes (es decir, 6,1 y 10,1) entre las formulaciones de SNALP libres de fosfolfpido probadas (vease, Grupos 2 y 15).
Ejemplo 7. El silenciamiento in vivo de la expresion de ApoB usando SNALP 1:57 preparado mediante un proceso de prensa de jeringa o bomba de engranajes.
Este estudio ilustra una comparacion de la tolerabilidad y eficacia de la formulacion de SNALP 1:57 con ARNip que se dirige a ApoB como se prepara por los diversos procesos de fabricacion. En particular, se preparo SNALP 1:57 por un proceso de prensa de jeringa o bomba de engranajes usando o bien PBS o bien tampon citrato (dilucion despues de la mezcla) y se administro por via intravenosa en ratones.
Diseno experimental
Modelo animal: Ratones BALB/c hembra, 5 semanas de edad, n=4 por grupo/jaula.
Carga de ARNip: ARNip de ApoB10048 U2/2 G1/2.
5
10
15
20
25
30
35
40
Tolerabilidad:
Grupo
Formulacion Inyeccion i.v.
ARNip mg/kg | Lfpido mg/kg
1
Vehfculo de PBS Volumen estandar de 10 ml/kg
2
Dil directa en citrato 1|57, prensa de ieringa 7 77
3
Dil directa en PBS 1|57, prensa de ieringa 7 96
4
Dil directa en PBS 1|57, bomba de engranajes 7 79
5
Dil directa en citrato 1|57, prensa de ieringa 9 99
6
Dil directa en PBS 1|57, prensa de ieringa 9 123
7
Dil directa en PBS 1|57, bomba de engranajes 9 102
Eficaci a:
Grupo
Formulacion Inyeccion i.v.
ARNip mg/kg | Lfpido mg/kg
8
Vehfculo de PBS Volumen estandar de 10 ml/kg
9
Dil directa en PBS 1|57, prensa de ieringa 0,05 0,68
10
Dil directa en PBS 1|57, bomba de engranaies 0,05 0,57
11
Dil directa en PBS 1|57, prensa de ieringa 0,1 1,36
12
Dil directa en PBS 1|57, bomba de engranaies 0,1 1,13
Formulacion:
Las formulaciones se proporcionan a 0,005 a 0,9 mg de ARNip/ml, esterilizadas en filtro de 0,22 pm en viales de plegado superior.
Detalles de formulacion:
1. La composicion de lfpido "Mezcla de citrato 1|57" usada en este estudio es 1,4:57,1:7,1:34,3 como se describe en porcentajes molares de PEG-C-DMa, DLinDMA, DPPC y colesterol (en ese orden). Esta formulacion tiene una relacion de lfpido con respecto a farmaco de entrada de 8,9.
2. El equipo de bomba de engranajes incluyo un conector en T de 0,8 mm y 400 ml/min de velocidad.
3. El ARNip usado en este estudio es ARNip de ApoB-10048 U2/2 G1/2.
Resumen de formulacion:
Tamano de partfcula L:D final
1:57 (9:1) + ARNip DOW Z prom (nm) Poli % de encap (mg:mg)
322-050807-1
Mezcla de PBS en ieringa 79 0,12 92 13,6
322-050807-2
Mezcla de citrato en ieringa 86 0,11 91 11,0
322-050807-3
Mezcla de PBS en engranaies 80 0,09 93 11,3
Procedimientos
Tratamiento: Justo antes del primer tratamiento, los animales se pesan y se calculan las cantidades de dosis basandose en el peso de animales individuales (equivalente a 10 ml/kg, redondeado a los 10 pl mas proximos). El artfculo de prueba se administra por inyeccion i.v. a traves de la vena de la cola una vez en el dfa 0 (1 dosis total por animal). El peso corporal se mide diariamente (cada 24 h) durante la duracion del estudio. Se toman diariamente observaciones en el laboratorio en sintonfa con las mediciones de peso corporal y adicionalmente como se garantizo.
Punto final de los grupos 1-7: Los animales se sacrifican en el dfa 1,24 h despues de la administracion del artfculo de prueba. Se recoge sangre por puncion cardfaca tras el sacrificio. La cantidad completa se recoge en un SST Microtainer para suero. Coagular durante 30 (a 60) min a temp. ambiente, centrifugar durante 5 min a 16.000 x g y 16 °C, invertir para confirmar que la centrifugacion esta completa, y guardar a 4 °C. Analizar el panel de bioqufmica clfnica de animales pequenos completa mas AST y SDH. Lista de las principales prioridades: ALT, AST, SDH, bilirrubina, fosfatasa alcalina, GGT, BUN, CPK, glucosa. Lista de prioridades secundarias: Creatinina, albumina, globulina, protefna total.
Punto final de los grupos 8-12: Los animales se sacrifican en el dfa 2, 48 h despues de la administracion del artfculo de prueba. Se recoge sangre por puncion cardfaca y se procesa para plasma. Inmediatamente, centrifugar durante 5 min a 16.000 x g (a 16 °C). Registrar cualquier observacion de aspecto del plasma poco usual. Tomar con pipeta el sobrenadante de plasma claro en un tubo de microcentrffuga claro y guardar a -80 °C. Se extraen los siguientes tejidos y se pesan por separado: hfgado y bazo. Se desprende la mitad inferior (no unida) del lobulo
5
10
15
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45
izquierdo del hfgado y se sumerge en > 5 volumenes de RNAlater (< 0,3 g en 1,5 ml de RNAlater en tubo de 2,0 ml), se guarda al menos 16 horas a 4 °C antes del analisis y almacenamiento a largo plazo a -20 °C o -80 °C para fines de archivo. Se espera que las formulaciones sean bien toleradas. Los ratones que presentan signos de sufrimiento asociado al tratamiento se sacrifican a criterio del personal del vivario.
Sacrificio: Los ratones se anestesian con una dosis letal de ketamina/xilazina; entonces se realiza puncion cardfaca seguido de dislocacion cervical.
Analisis de datos: La tolerabilidad de la pauta de tratamiento se monitoriza por el aspecto del animal y el comportamiento, ademas del peso corporal. Se mide la bioqufmica clfnica de la sangre por analizador automatizado. Se miden niveles de ARNm de ApoB y GAPDH en hfgado mediante ensayo de QG. Se mide la protefna en plasma ApoB mediante ELISA. Se mide el colesterol en plasma total mediante ensayo enzimatico / colorimetrico estandar.
Resultados
No hubo perdida de peso corporal o cambio en el aspecto / comportamiento del animal tras la administracion de las formulaciones de SNALP 1:57. La Figura 6 muestra que la tolerabilidad de SNALP preparada por dilucion directa en tampon citrato frente a en PBS no se diferencio significativamente en terminos de parametros de bioqufmica clfnica de la sangre. Hubo una diferencia de tolerabilidad entre el citrato en jeringa y el PBS en jeringa a dosificacion de ARNip constante, pero esto era probablemente un artefacto dependiente de las diferentes relaciones de lfpido:farmaco (L:D) finales de estas dos preparaciones.
La Figura 7 muestra que la eficacia de SNALP 1:57 preparada por bomba de engranajes fue similar a la de la misma SNALP preparada por prensa de jeringa. El perfil de tolerabilidad mejoro con el proceso de bomba de engranajes, que podrfa atribuirse al aumento de la tasa de encapsulacion inicial y la disminucion de la relacion L:D final.
Ejemplo 8. El silenciamiento in vivo de la expresion de ApoB usando SNALP 1:57 preparada mediante una dilucion directa o proceso de dilucion en lmea
Este estudio ilustra una comparacion de la tolerabilidad y eficacia de la formulacion de SNALP 1:57 con ARNip que se dirige a ApoB como se prepara por el proceso de dilucion directa o dilucion en lfnea a una relacion de lfpido con respecto a farmaco de entrada de 6:1 o 9:1.
Diseno experimental
Modelo animal: Ratones BALB/c hembra, 7 semanas de edad.
Carga de ARNip: ARNip de ApoB10048 U2/2 G1/2.
CBCIDif:
Grupo
N.° de ratones Artfculo de prueba Dosificacion i.v.
ARNip encap.
Lfpido total
1
3 PBS - -
2
3 SNALP 1|57 (9:1) 7 mg/kg 71 mg/kg
3
3
SNALP 1|57 (9:1) 11 mg/kg 112 mg/kg
Bioquimica clinics:
Grupo
N.° de ratones Artfculo de prueba Dosificacion i.v.
ARNip encap.
Lfpido total
4
4
PBS - -
5
4 SNALP 1|57 (9:1) 9 mg/kg 92 mg/kg
6
4 SNALP 1|57 (9:1) 11 mg/kg 112 mg/kg
7
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 11 mg/kg 78 mg/kg
8
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 13 mg/kg 93 mg/kg
9
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 15 mg/kg 107 mg/kg
10
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 17 mg/kg 121 mg/kg
11
4 SNALP 1157 (9:1) 11 mg/kg 112 mg/kg
Actividad:
Grupo
N.° de ratones Artfculo de prueba Dosificacion i.v.
ARNip encap.
Lfpido total
12
4 PBS - -
13
4 SNALP 1157 (9:1) 0,05 mg/kg 0,51 mg/kg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Grupo
N.° de ratones Artfculo de prueba Dosificacion i.v.
14
4 SNALP 1157 (9:1) 0,1 mg/kg 1,02 mg/kg
15
4 SNALP 1157 (9:1) 0,2 mg/kg 2,04 mg/kg
16
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 0,05 mg/kg 0,36 mg/kg
17
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 0,1 mg/kg 0,71 mg/kg
18
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 0,2 mg/kg 1,42 mg/kg
19
4 SNALP 1|57 nuevo (6:1) 0,4 mg/kg 2,85 mg/kg
Formulacion:
Las formulaciones se proporcionan a 0,005 a 1,7 mg de ARNip/ml, esterilizadas en filtro de 0,22 pm en viales de plegado superior.
Detalles de formulacion:
1. "SNALP 1|57" usado en este estudio es la composicion de lfpido 1,4:57,1:7,1:34,3 como se describe en porcentajes molares de PEG-C-DMA, DLinDMA, DPPC y colesterol (en ese orden). Esta formulacion se preparo por bomba de engranajes a una relacion de lfpido con respecto a farmaco de entrada de 9:1 (lfpidos 28 mM) o 6:1 (lfpidos 14 mM).
2. El ARNip usado en este estudio es ARNip de ApoB-10048 U2/2 G1/2.
Resumen de formulacion:
SNALP 1|57 en lfnea con PBS en engranajes Tamano de partfcula L:D final
Z prom (nm)
Poli % de encap (mg:mg)
322-051407-1
Entrada 9:1 78 0,07 93 10,2
322-051407-2
Entrada 6:1 81 0,05 92 7,1
Procedimientos
Tratamiento: Justo antes del primer tratamiento, los animales se pesan y se calculan las cantidades de dosis basandose en el peso de animales individuales (equivalente a 10 ml/kg, redondeado a los 10 pl mas proximos). El artfculo de prueba se administra por inyeccion i.v. a traves de la vena de la cola una vez en el dfa 0 (1 dosis total por animal). El peso corporal se mide diariamente (cada 24 h) durante la duracion del estudio. Se toman diariamente observaciones en el laboratorio en sintonfa con las mediciones de peso corporal y adicionalmente como se garantizo.
Punto final: Los animales se sacrifican en el dfa 1, 24 h despues de la administracion del artfculo de prueba (Grupos 1-10) o en el dfa 2, 48 h despues de la administracion del artfculo de prueba (Grupos 11-19).
Grupos 1-3: Se recoge sangre por puncion cardfaca tras el sacrificio. La cantidad completa se recoge en un EDTA Microtainer, se mezcla inmediatamente para prevenir la coagulacion, y se envfa para analisis del perfil de CBC/Dif. Realizar autopsia rapida.
Grupos 4-11: Se recoge sangre por puncion cardfaca en un SST Microtainer para suero. Coagular durante 30 (a 60) min a temp. ambiente, centrifugar durante 5 min a 16.000 x g y 16 °C, invertir para confirmar que la centrifugacion esta completa, y guardar a 4 °C. Analizar el panel de bioqufmica clfnica de animales pequenos completa mas AST y SDH. Lista de las principales prioridades: ALT, AST, SDH, bilirrubina, fosfatasa alcalina, GGT, BUN, CPK, glucosa. Lista de prioridades secundarias: Creatinina, albumina, globulina, protefna total. Realizar autopsia rapida.
Grupos 12-19: Se recoge sangre por puncion cardfaca y se proceso para plasma: inmediatamente, centrifugar durante 5 min a 16.000 x g (a 16 °C). Registrar cualquier observacion de aspecto del plasma poco usual. Tomar con pipeta el sobrenadante de plasma claro en un tubo de microcentrffuga claro y guardar a -80 °C. Se extraen los siguientes tejidos: hfgado. El hfgado no se pesa; se desprende la mitad inferior (no unida) del lobulo izquierdo del hfgado y se sumerge en > 5 volumenes de RNAlater (< 0,3 g en 1,5 ml de RNAlater en tubo de 2,0 ml), se guarda al menos 16 horas a 4 °C antes del analisis y almacenamiento a largo plazo a -80 °C. Se espera que las formulaciones sean bien toleradas. Los ratones que presentan signos de sufrimiento asociado al tratamiento se sacrifican a criterio del personal del vivario.
Sacrificio: Los ratones se anestesian con una dosis letal de ketamina/xilazina; entonces se realiza puncion cardfaca seguido de dislocacion cervical.
Analisis de datos: La tolerabilidad de la pauta de tratamiento se monitoriza por el aspecto del animal y el comportamiento, y el peso corporal. Se mide la bioqufmica clfnica de la sangre y el perfil de CBC/Dif por analizador automatizado. Se mide de ARNm de ApoB de hfgado usando el ensayo QuantiGene. Se mide ApoB-100 de plasma
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
usando ELISA. Se mide el colesterol en plasma total usando un ensayo enzimatico estandar.
Resultados
Tolerabilidad:
La Figura 8 muestra que hubo muy poco efecto sobre el peso corporal 24 horas despues de la administracion de SNALP 1:57. La maxima perdida de peso del 3,6 ± 0,7 % se observo a la mayor dosis de farmaco de 17 mg/kg. No hubo cambio obvio en el aspecto / comportamiento del animal a ninguna de las dosificaciones probadas.
La Figura 9 muestra que no hubo cambios obvios en la cifra de plaquetas. La reduccion de plaquetas puede causar que aumente el volumen de plaquetas medio a medida que el cuerpo produce nuevas plaquetas en compensacion para la disminucion relacionada con el tratamiento. En las condiciones de este estudio, el volumen de plaquetas medio no cambio en los grupos tratados con SNALP.
La Figura 10 muestra que las elevaciones de enzimas del hfgado clfnicamente significativas (3xULN) se produjeron a dosificaciones de farmaco de 11 mg/kg para SNALP 1:57 a una relacion de lfpido:farmaco (L:D) de 10, y a 13 mg/kg a una L:D de 7. Tambien se observo una ligera tendencia de respuesta a la dosis hacia arriba en la protefna total en plasma y globulina.
Eficacia:
La Figura 11 muestra que basandose en el analisis GuantiGene de ARNm de hfgado, la potencia de SNALP de L:D mas baja era tan buena como la de SNALP de L:D mas alta a las dosificaciones de farmaco probadas. En realidad, la actividad de silenciamiento de ApoB fue identica a la de las dosificaciones de 0,05 y 0,1 mg/kg. Como tal, la potencia de SNALP 1:57 a una relacion L:D de entrada de 6:1 (relacion final de 7:1) fue similar a la potencia de SNALP 1:57 a una relacion L:D de entrada de 9:1 (relacion final de 10:1) en reducir la expresion de ApoB.
La Figura 12 muestra que los niveles de protefna ApoB y de colesterol total se redujeron a un grado similar por SNALP 1:57 a una relacion L:D de entrada 6:1 (relacion final de 7:1) y SNALP 1:57 a una relacion L:D de entrada de 9:1 (relacion final de 10:1).
Indice terapeutico:
Este estudio demuestra que tanto SNALP 1:57 a una relacion L:D de entrada de 6:1 (relacion final de 7:1) como SNALP 1:57 a una relacion L:D de entrada de 9:1 (relacion final de 10:1) causo aproximadamente el 60 % de silenciamiento de ARN de hfgado de ApoB con una dosis de farmaco de 0,1 mg/kg. Interpolando a partir de los puntos de datos disponibles en la Figura 10, una relacion L:D final de 10:1 a 10 mg/kg puede producir un grado similar de elevacion de enzimas como una relacion L:D final de 7:1 a 13 mg/kg. Usando estos puntos de actividad y toxicidad, el fndice terapeutico para SNALP 1:57 a una relacion L:D final de 10:1 es (10 mg/kg) / (0,1 mg/kg) = 100 y el fndice terapeutico para SNALP 1:57 a una relacion L:D final de 7:1 es (13 mg/kg) / (0,1 mg/kg) = 130. Usando este conjunto de datos, el fndice terapeutico para SNALP 1:57 a una relacion L:D final de 7:1 es el 30 % superior al fndice terapeutico para SNALP 1:57 a una relacion L:D final de 10:1.
Ejemplo 9. El silenciamiento in vivo de la expresion de PLK-1 usando SNALP 1:57 aumenta la supervivencia de ratones portadores de tumores Hep3B.
Se probaron ARNip de cinasa 1 similar a polo que contenfa SNALP (PLK-1) (formulacion 1:57 de SNALP: 1,4 % de PeG-cDMA; 57,1 % de DLinDMA; 7,1 % de DPPC; y 34,3 % de colesterol) para sus efectos sobre la supervivencia de ratones CD1 nu/nu portadores de tumores de hfgado Hep3B. PLK-1 es una serina/treonina cinasa que contiene dos dominios funcionales: (1) un dominio cinasa; y (2) un dominio de caja polo (vease, por ejemplo, Barr et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5:429-440 (2004)). La actividad y concentracion celular de PLK-1 son cruciales para la regulacion precisa de la division celular. PLK-1 se expresa en exceso en muchos tipos de cancer que incluyen hepatoma y cancer de colon, y la expresion de PLK-1 frecuentemente se correlaciona con mal pronostico del paciente. La expresion en exceso de PLK-1 (no mutante o inactivo para cinasas) produce multinucleacion (inestabilidad genetica). PLK-1 hiperactivo supera el punto de regulacion del dano de ADN. La expresion de PLK-1 constitutiva produce la transformacion de celulas NIH 3T3. PLK-1 fosforila el supresor de tumor p53, inhibiendo asf los efectos pro-apoptosicos de p53. El ARNip de PLK-1 usado en este estudio se proporciona en la Tabla 8. Las modificaciones implicaron introducir 2'OMe-uridina o 2'OMe-guanosina en posiciones seleccionadas en las hebras codificantes y no codificantes de la secuencia de ARNip de PLK-1, en la que el duplex de ARNip contuvo menos de aproximadamente el 20 % de nucleotidos modificados en 2'OMe.
Tabla 8. Duplex de ARNip que comprenden polinucleotidos de ARN de PLK-1 codificantes y no codificantes.
ARNip
Secuencia de ARNip de PLK-1 % modificado en region DS
PLK1424 U4/GU
5'-AGAUCACCCUCCUUCAAAU ANN-3' (SEQ ID NO.57) 6/38 = 15,8 %
3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5' (SEQ ID NO.54)
ARNip
Secuencia de ARNip de PLK-1
% modificado en region DS
PLK1424 U4/G
5'-AGAUCACCCUCCUUAAAUANN-3'
(SEQ ID NO.57)
7/38 = 18,4 %
3'-NNUCUAGUGGGAGGAAUUUAU-5'
(SEQ ID NO.56)
Columna 1: El numero despues de "PLK" se refiere a la posicion del nucleotido de la base 5' de la hebra codificante con respecto al codon de iniciacion (ATG) de la secuencia de ARNm de PLK-1 humana NM_005030. Columna 2: Nucleotidos de 2'-O-metilo (2'OMe) se indican en negrita y subrayados. El duplex de ARNip puede comprender alternativamente o adicionalmente nucleotidos de 2'-desoxi-2'-fluor (2'F), 2'-desoxi- nucleotidos, nucleotidos de 2'-O-(2-metoxietilo) (MOE) y/o nucleotidos de acido nucleico bloqueado (LNA). N = nucleotido de desoxitimidina (dT), ribonucleotido de uridina (U), o ribonucleotido que tiene complementariedad con la secuencia diana o la hebra complementaria del mismo. Columna 3: Se proporcionan el numero y porcentaje de nucleotidos modificados en la region bicatenaria (DS) del duplex de ARNip._________________
Grupos experimentales
Se sembraron 20 ratones CD1 nu/nu del siguiente modo:
Grupo
N.° de ratones Siembra de tumores SNALP N.° de ratones Dosis de SNALP i.v. Dosis de SNALP Sacrificio Ensayo
A
20 a semilla I.H. 1,5x106 Hep3B Luc 1:57 9 Dfas 11, 14, 17, 21, 25, 28, 32, 35, 39, 42 10 x 2 mg/kg Cuando estan moribundos Supervivencia Pesos corporales
B
PLK 1424 1:57 9
Artfculos de prueba
Todas las muestras se esterilizaron por filtro antes de la dilucion a la concentracion de trabajo. Todos los tubos se 10 marcaron con la fecha de formulacion, composicion de lfpido y concentracion de acido nucleico. Las muestras de SNALP se proporcionaron a 0,2 mg/ml de acido nucleico. Se requirio un mfnimo de 20 ml de cada SNALP para realizar el estudio. Las formulaciones para este estudio contuvieron:
Grupo
Descripcion del artfculo de prueba
A
Luc U/U SNALP 1:57 (lfpido 28 mM)
B
PLK1424 U4/GU SNALP 1:57 (lfpido 28 mM)
PLK1424 U4/G SNALP 1:57 (lfpido 28 mM)
15 Procedimientos
Dfa 0 Los ratones recibiran Anafen por inyeccion SC (100 pg en 20 pl de solucion salina)
inmediatamente antes de la cirugfa. Se anestesian ratones individuales por inhalacion de gas isoflurano y se aplico lubricante ocular para prevenir el excesivo secado de los ojos. Aunque se mantuvieron bajo anestesia con gas de un cono nasal, se hara una unica incision de 1,5 cm a traves de la lfnea central por debajo del esternon. Entonces se exterioriza el lobulo hepatico lateral izquierdo usando un bastoncillo de lana de algodon esterilizado en autoclave. Se inyectan 25 pl de celulas tumorales suspensas en PBS en el lobulo a un angulo bajo usando una jeringa de Hamilton de cono Luer (50 pl) y aguja de 30G (3/8"). Las celulas se inyectaran lentamente (~ 30 s) y se aplica un hisopo a la herida de puncion inmediatamente despues de la extraccion de la aguja. Despues de detenerse cualquier hemorragia (~1 min), la incision se cierra con 5-6 suturas en la pared muscular y 3-4 grapas para la piel. Las suspensiones de celulas se mezclaran minuciosamente inmediatamente antes de cada inyeccion. Los ratones se recuperaran de la anestesia en una jaula limpia revestida con papel absorbente y se monitorizaron de cerca durante 2-4 horas. Los animales se devuelven entonces al alojamiento normal.
Dfa 1 Todos los ratones seran ligeramente anestesiados por gas isoflurano y se examinaran las
suturas. Los animales recibiran entonces Anafen por inyeccion SC (100 pg en 20 pl de solucion salina).
Dfa 10 Los ratones se aleatorizaran en los grupos de tratamiento apropiados.
Dfa 11 Grupos A, B - Dfa 11: Todos los animales se administraran con SNALP a 2 mg/kg por inyeccion
i.v. mediante la vena lateral de la cola. Los ratones se dosificaran segun el peso corporal (10 ml/kg). La dosis se repetira durante 5 dfas consecutivos basandose en el peso inicial.
Dfa 14-35 Grupos A, B - Dfas 14, 17, 21, 25, 28, 32, 35: Todos los animales volveran a ser administrados
con SNALP a 2 mg/kg por inyeccion i.v. mediante la vena lateral de la cola. Los ratones se dosificaran segun el peso corporal (10 ml/kg).
Grupos de pesos corporales: Los ratones se pesaran en el dfa de la dosis durante 5 semanas, luego dos veces semanalmente hasta el cierre del estudio.
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Punto final: Se espera que la carga tumoral y las formulaciones sean bien toleradas. Los ratones que presentan signos de sufrimiento asociado al tratamiento o carga tumoral se sacrifican a criterio del personal del vivario.
Sacrificio: Los ratones se anestesian con una dosis letal de ketamina/xilazina seguido de dislocacion
cervical.
Analisis de Se ensayan supervivencia y pesos corporales.
datos:
Resultados
La Figura 13 muestra los pesos corporales medios de ratones durante la dosis terapeutica de PLK1424 SNALP en el modelo de tumor intrahepatico (I.H.) Hep3B. La pauta de tratamiento fue bien tolerada sin signos evidentes de toxicidad relacionada con el tratamiento.
La Figura 14 muestra que el tratamiento con PLK1424 formulado con SNALP 1:57 causo un aumento significativo en la supervivencia de ratones portadores de tumores Hep3B. Este efecto antitumoral in vivo se observo en ausencia de cualquier toxicidad aparente o estimulacion inmunitaria.
Ejemplo 10. El silenciamiento in vivo de la expresion de PLK-1 usando SNALP 1:57 induce la apoptosis de celulas tumorales en ratones portadores de tumores Hep3B.
Los objetivos de este estudio fueron los siguientes:
1. Determinar el nivel de silenciamiento de ARNm en tumores de hfgado Hep3B establecidos tras una administracion i.v. unica de PLK1424 SNALP.
2. Confirmar el mecanismo de silenciamiento de ARNm detectando los productos de escision de ARN especfficos usando RACE-PCR.
3. Confirmar la induccion de apoptosis de celulas tumorales por histopatologfa.
Se uso la formulacion de SNALP 1:57 (1,4 % de PEG-cDMA; 57,1 % de DLinDMA; 7,1 % de DPPC; y 34,3 % de colesterol) para este estudio.
Grupos experimentales
Se sembraron 20 ratones SCID/beige del siguiente modo:
Grupo
N.° de ratones Siembra de tumores SNALP N.° de ratones Dosis de SNALP i.v. Sacrificio Ensayo
A
20 a semilla I.H. 1x106 Hep3B PBS 6 1 x 2 mg/kg Dfa 20 24 h despues del tratamiento QG de tumor RACE-PCR de tumor Histopatologfa
Luc 1:57
7
B
PLK 1424 1:57 7
C
Articulos de prueba
Todas las muestras se esterilizaron por filtro antes de la dilucion a la concentracion de trabajo. Todos los tubos se marcaron con la fecha de formulacion, composicion de lfpido y concentracion de acido nucleico. Las muestras de SNALP se proporcionaron a 0,2 mg/ml de acido nucleico. Se requirio un mfnimo de 20 ml de cada SNALP para realizar el estudio. Las formulaciones para este estudio contuvieron:
Grupo
Descripcion del artfculo de prueba
A
PBS
B
Luc U/U SNALP 1:57
C
PLK1424 U4/GU SNALP 1:57
Procedimientos
Dfa 0 Los ratones recibiran Anafen por inyeccion SC (100 pg en 20 pl de solucion salina)
inmediatamente antes de la cirugfa. Se anestesian ratones individuales por inhalacion de gas isoflurano y se aplico lubricante ocular para prevenir el excesivo secado de los ojos. Aunque se mantuvieron bajo anestesia con gas de un cono nasal, se hara una unica incision de 1,5 cm a traves de la lfnea central por debajo del esternon. Entonces se exterioriza el lobulo hepatico lateral izquierdo usando un bastoncillo de lana de algodon esterilizado en autoclave. Se inyectan 25 pl de celulas tumorales suspensas en PBS en el lobulo a un angulo bajo usando una jeringa
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de Hamilton de cono Luer (50 pi) y aguja de 30G (3/8"). Las celulas se inyectaran lentamente (~ 30 s) y se aplica un hisopo a la herida de puncion inmediatamente despues de la extraccion de la aguja. Despues de detenerse cualquier hemorragia (~1 min), la incision de la pared muscular se cierra con 5-6 suturas. La incision de la piel se cierra entonces con 3-4 grapas metalicas para piel. Las suspensiones de celulas se mezclaran minuciosamente inmediatamente antes de cada inyeccion. Los ratones se recuperaran de la anestesia en un jaula limpia revestida con papel absorbente y se monitorizaran de cerca durante 2-4 horas. Los animales se devuelven entonces al alojamiento normal.
Dfa 1 Todos los ratones seran ligeramente anestesiados por gas isoflurano y se examinaran las
suturas. Los animales recibiran entonces Anafen por inyeccion SC (100 pg en 20 pl de solucion salina).
Dfa 7 Los ratones se aleatorizaran en los grupos de tratamiento apropiados.
Dfa 20 Grupos A-C: Los ratones se pesaran y entonces se administraran o bien con PBS, Luc, o bien
PLK1424 SNALP por inyeccion i.v. mediante la vena lateral de la cola. SNALP se dosificara a 2 mg/kg o volumen equivalente (10 ml/kg) segun el peso corporal.
Dfa 21 Grupos A-C: Todos los ratones se pesaran y entonces se sacrificaran por anestesia letal.
Los lobulos del hfgado portadores de tumor de todos los ratones en cada grupo se pesaran y recogeran en RNALater para analisis de ARN.
Punto final: Se espera que la carga tumoral y las formulaciones sean bien toleradas. Los ratones que presentan signos de sufrimiento asociado al tratamiento o carga tumoral se sacrifican a criterio del personal del vivario.
Sacrificio: Los ratones se anestesian con una dosis letal de ketamina/xilazina seguido de dislocacion
cervical.
Analisis de Analisis de ARNm de tumores del hfgado por ensayo de ADNr (QG) y RACE-PCR.
datos:
Apoptosis de celulas tumorales por histopatologfa.
Resultados
Se monitorizaron los pesos corporales del dfa 14 en adelante para evaluar la progresion del tumor. En el dfa 20, se aleatorizaron los 6 ratones que mostraron la mayor perdida de peso en cada uno de los 3 grupos y se trataron. Los seis ratones tuvieron tumores I.H. sustancialmente grandes en el sacrificio (dfa 21). El tratamiento de los 14 ratones restantes se inicio, por tanto, en el dfa 21 (dfa de sacrificio 22). 10/14 ratones tuvieron tumores sustanciales; 2/14 ratones tuvieron tumores pequenos/probables; y 2/14 ratones no tuvieron carga tumoral visible.
La Figura 15 muestra datos de ensayos QuantiGene usados para medir niveles de ARNm de PLK-1 especfficos (de tumor) humanos. Una unica dosis de 2 mg/kg de SNALP 1:57 redujo los niveles de ARNm de PLK-1 aproximadamente el 50 % en tumores Hep3B intrahepaticos que crecfan en ratones.
La Figura 16 muestra que un producto de escision especffico de ARNm de PLK-1 fue detectable en ratones tratados con PLK1424 SNALP por 5' RaCE-PCR. No fue detectable producto de PCR especffico en ratones tratados con o bien PBS o bien control (Luc) SNALP. La secuenciacion de nucleotidos del producto de PCR confirmo que el sitio de escision predicho por interferencia por ARN mediada por ARNip de PLK1424 en el ARNm de PLK-1.
La Figura 17 muestra la histologfa del tumor Hep3B en ratones tratados con o bien Luc SNALP (arriba) o bien PLK1424 SNALP (abajo). Los ratones tratados con Luc SNALP presentaron mitosis normales en tumores Hep3B, mientras que los ratones tratados con PLK1424 SNALP presentaron numerosas mitosis anomalas y apoptosis de celulas tumorales en tumores Hep3B.
Conclusion
Este ejemplo ilustra que una unica administracion de PLK1424 SNALP 1:57 a ratones portadores de tumores Hep3B indujo un significativo silenciamiento in vivo de ARNm de PLK-1. Se confirmo que esta reduccion en ARNm de PLK- 1 estaba mediada por interferencia por ARN usando analisis por 5' RACE-PCR. Y, lo que es mas importante, el silenciamiento de ARNm de PLK-1 por la formulacion de SNaLp 1:57 altero profundamente la proliferacion celular del tumor (mitosis), causando la posterior apoptosis de celulas tumorales. Como se demuestra en el ejemplo previo, este efecto antitumoral se tradujo en tiempos de supervivencia prolongados en los ratones portadores de tumor.
Ejemplo 11. Comparacion de SNALP 1:57 PLK-1 que contiene o bien PEG-cDMA o bien PEG-cDSA en un modelo de tumor Hep3B subcutaneo.
Este ejemplo demuestra la utilidad de PEG-lfpido PEG-cDSA (3-N-[(-metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil]-1,2- diesteariloxipropilamina) en la formulacion 1:57 para tumores distales de direccionamiento distal (por ejemplo, subcutaneo). En particular, este ejemplo compara la capacidad de direccionamiento de tumor de SNALP 1:57 PLK-1 que contienen o bien PEG-cDMA (C14) o bien PEG-cDSA (C18). Las lecturas son inhibicion del crecimiento tumoral y silenciamiento de ARNm de PLK1. El ARNip de PLK-1 usado fue PLK1424 U4/GU, cuya secuencia se proporciona
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en la Tabla 8.
Se establecieron tumores Hep3B subcutaneos (S.C.) en ratones Scid/beis. Se evaluo la eficacia antitumoral multidosis de SNALP 1:57 PlK-1 para los siguientes grupos (n=5 para cada grupo): (1) "Luc-cDMA" - PEG-cDMA Luc SNALP; (2) "PLK-cDMA" - PEG-cDMA PLK-1 SNALP; y (3) "PLK-cDSA" - PEG-cDSA PLK-1 SNALP. La administracion de 6 x 2 mg/kg de ARNip se inicio una vez los tumores alcanzaron aproximadamente 5 mm de diametro (dfa 10). La dosificacion se realizo en los dfas 10, 12, 14, 17, 19 y 21. Los tumores se midieron por compas calibrador dos veces a la semana.
La Figura 18 muestra que multiples dosis de SNALP 1:57 PLK-1 que contenfan PEG-cDSA indujeron la regresion de los tumores Hep3B S.C. establecidos. En particular, 5/5 tumores en los ratones tratados con PLK1-cDSA aparecieron planos, medibles solo por alteracion del color en el sitio tumoral.
La Figura 19 muestra el silenciamiento de ARNm de SNALP 1:57 PLK en tumores Hep3B S.C. tras una unica administracion de SNALP intravenosa. El grado de silenciamiento observado con PLK1-cDSA SNALP se correlaciono con la actividad antitumoral en el estudio multi-dosis mostrado en la Figura 18.
El grupo tratado con Luc-cDMA SNALP, que habfa desarrollado grandes tumores S.C. en el dfa 24, se administro entonces con PLK-cDSA SNALP en los dfas 24, 26, 28, 31, 33 y 35. No hubo dosificacion adicional de los grupos tratados con PLK-1 SNALP originales. Los resultados de este estudio de dosis cruzada con tumores establecidos grandes se proporcionan en la Figura 20, que muestra que PLK1-cDSA SNALP inhibio el crecimiento de tumores Hep3B S.C. grandes.
Una comparacion del efecto de PEG-cDMA y PEG-cDSA SNALP 1:57 en el silenciamiento de ARNm de PLK-1 se realizo usando tumores Hep3B intrahepaticos establecidos en ratones Scid/beige. Se administro una unica dosis de 2 mg/kg de SNALP 1:57 PLK-1 que contenfa o bien PEG-cDMA o bien PEG-cDSA por via intravenosa. Se recogieron muestras de hfgado / tumorales a las 24 y 96 horas despues del tratamiento con SNALP. Control = 2 mg/kg de Luc-cDMA SNALP a las 24 horas.
La Figura 21 muestra que PLK-cDMA SNALP y PLK-cDSA SNALP tuvieron actividades de silenciamiento similares despues de 24 horas, pero que PLK-cDSA SNALP puede aumentar la duracion del silenciamiento de ARNm en tumores intrahepaticos.
La Figura 22 muestra el perfil de eliminacion de sangre de SNALP 1:57 PLK-1 que contiene o bien PEG-cDMA o bien PEG-cDSA. Los prolongados tiempos de circulacion en sangre observados para PLK-cDSA SNALP pueden permitir el aumento de la acumulacion y actividad en sitios tumorales distales (por ejemplo, subcutanea).
Asf, este estudio muestra que la formulacion de SNALP 1:57 PEG-cDSA puede usarse para direccionar preferencialmente tumores fuera del hfgado, mientras que 1:57 PEG-cDMA SNALP puede usarse para dirigirse preferencialmente al hfgado.
Ejemplo 12. Sfntesis de colesteril-2'-hidroxietil eter
Etapa 1: Se cerro un matraz redondo de 250 ml que contenfa colesterol (5,0 g, 12,9 mmoles) y una barra de agitacion y se lavo con nitrogeno. Se peso cloruro de toluenosulfonilo (5,0 g, 26,2 mmoles) en un matraz redondo de 100 ml separado, tambien se cerro y se lavo con nitrogeno. Se administro piridina anhidra (2 x 50 ml) a cada matraz. Entonces se transfirio la solucion de cloruro de toluenosulfonilo, mediante canula, al matraz de 250 ml, y la reaccion se agito durante la noche. La piridina se elimino por evaporador rotatorio, y se anadio metanol (80 ml) al residuo. Este se agito entonces durante 1 hora hasta que se obtuvo una suspension homogenea. La suspension se filtro, se lavo con acetonitrilo (50 ml) y se seco a vacfo dando tosilato de colesterilo como un solido blanco esponjoso (6,0 g, 86 %).
Etapa 2: Se anadieron tosilato de colesterilo (2,0 g, 3,7 mmoles), 1,4-dioxano (50 ml) y etilenglicol (4,6 g, 74 mmoles) a un matraz de 100 ml que contenfa una barra de agitacion. El matraz se ajusto con un condensador, y se sometio a reflujo durante la noche. Entonces se elimino el dioxano por evaporador rotatorio, y la mezcla de reaccion se suspendio en agua (100 ml). La solucion se transfirio a un embudo de decantacion y se extrajo con cloroformo (3 x 100 ml). Las fases organicas se combinaron, se lavaron con agua (2 x 150 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, y el disolvente se elimino. El producto en bruto se purifico por cromatograffa en columna (5 % de acetona/hexano) dando el producto como un solido blanco (1,1 g, 69 %).
Las estructuras de los derivados de colesterol colesteril-2'-hidroxietil eter y colesteril-4'-hidroxibutil eter son las siguientes:
imagen8
Debe entenderse que la descripcion anterior pretende ser ilustrativa y no restrictiva. Muchas realizaciones seran 5 evidentes para aquellos expertos en la materia tras la lectura de la descripcion anterior. El alcance de la invencion debe, por tanto, determinarse no con referencia a la descripcion anterior, sino que debe determinarse en su lugar con referencia a las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

  1. 5
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    1. Una partfcula de acido nucleico-lfpido que comprende:
    (a) un acido nucleico;
    (b) un lfpido cationico que comprende del 50 % en moles al 65 % en moles del lfpido total presente en la partfcula;
    (c) un lfpido no cationico que comprende hasta el 49,5 % en moles del lfpido total presente en la partfcula y que comprende una mezcla de un fosfolfpido y colesterol o un derivado del mismo, en el que el colesterol o derivado del mismo comprende del 30 % en moles al 40 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; y
    (d) un conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas que comprende del 0,5 % en moles al 2 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
  2. 2. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 1, en la que el acido nucleico comprende un ARN interferente pequeno (ARNip).
  3. 3. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 2, en la que:
    (a) el ARNip comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 nucleotidos; o
    (b) el ARNip comprende al menos un nucleotido modificado; o
    (c) el ARNip comprende al menos un nucleotido de 2'-O-metilo (2'OMe); o
    (d) el ARNip tiene aproximadamente 19 a aproximadamente 25 pares de bases en longitud; o
    (e) el ARNip comprende nucleotidos protuberantes en 3'.
  4. 4. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 1, en la que:
    (a) el lfpido cationico comprende 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N- dimetilaminopropano (DLenDMA), o una mezcla de los mismos; o
    (b) el lfpido cationico comprende 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA); o
    (c) el lfpido cationico comprende del 50 % en moles al 60 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; o
    (d) el lfpido cationico comprende del 52 % en moles al 62 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
  5. 5. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 1, en la que:
    (a) el conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas comprende un conjugado de polietilenglicol (PEG)-lfpido; o
    (b) el conjugado de lfpido que inhibe la agregacion de partfculas comprende del 1 % en moles al 2 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
  6. 6. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 1, en la que:
    (a) el acido nucleico en la partfcula de acido nucleico-lfpido no se degrada sustancialmente despues de la incubacion de la partfcula en suero a 37 °C durante 30 minutos; o
    (b) el acido nucleico esta completamente encapsulado en la partfcula de acido nucleico-lfpido; o
    (c) la partfcula de acido nucleico-lfpido tiene una relacion masica de lfpido:acido nucleico de aproximadamente 5 a aproximadamente 15; o
    (d) la partfcula de acido nucleico-lfpido tiene una mediana del diametro de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm.
  7. 7. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 1, en la que:
    (a) el fosfolfpido comprende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), o una mezcla de las mismas; o
    (b) el fosfolfpido comprende del 4 % en moles al 10 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
  8. 8. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 1, en la que:
    (a) el colesterol o derivado del mismo comprende del 30 % en moles al 35 % en moles del lfpido total presente en la partfcula; o
    (b) el colesterol o derivado del mismo comprende del 32 % en moles al 36 % en moles del lfpido total presente en la partfcula y el fosfolfpido comprende del 3 % en moles al 15 % en moles del lfpido total presente en la partfcula.
  9. 9. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 5(a), en la que el conjugado de PEG-lfpido comprende un conjugado de PEG-diacilglicerol (PEG-DAG), un conjugado de PEG-dialquiloxipropilo (PEG-DAA), o una mezcla de los mismos; opcionalmente en la que el conjugado de PEG-DAA comprende un conjugado de PEG-
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    30
    dimiristiloxipropilo (PEG-DMA), un conjugado de PEG-diesteariloxipropilo (PEG-DSA), o una mezcla de los mismos; preferentemente en la que el PEG en el conjugado de PEG-DAA tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2.000 daltons.
  10. 10. La partfcula de acido nucleico-lfpido de la reivindicacion 5(a), en la que el acido nucleico es un ARNip y la partfcula de acido nucleico-lfpido comprende aproximadamente 57,1 % en moles de lfpido cationico, aproximadamente 7,1 % en moles de fosfolfpido, aproximadamente 34,3 % en moles de colesterol o un derivado del mismo, y aproximadamente 1,4 % en moles de conjugado de PEG-lfpido.
  11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende una partfcula de acido nucleico-lfpido de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  12. 12. Un metodo de introduccion de un acido nucleico en una celula, comprendiendo el metodo:
    poner en contacto la celula in vitro con una partfcula de acido nucleico-lfpido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, opcionalmente en el que la celula es una celula de mamffero.
  13. 13. Una partfcula de acido nucleico-lfpido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en un metodo para la administracion in vivo de un acido nucleico, comprendiendo el metodo administrar dicha partfcula de acido nucleico-lfpido a un sujeto mamffero.
  14. 14. La partfcula de acido nucleico-lfpido para su uso segun la reivindicacion 13, en la que la administracion esta seleccionada del grupo que consiste en oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intrarticular, intralesional, intratraqueal, subcutanea e intradermica.
  15. 15. Una partfcula de acido nucleico-lfpido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto mamffero que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha partfcula de acido nucleico-lfpido al sujeto mamffero, en la que la enfermedad o trastorno se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en una infeccion vfrica, una enfermedad o trastorno del hfgado y cancer.
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