RU2707251C2 - Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение - Google Patents

Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение Download PDF

Info

Publication number
RU2707251C2
RU2707251C2 RU2018104839A RU2018104839A RU2707251C2 RU 2707251 C2 RU2707251 C2 RU 2707251C2 RU 2018104839 A RU2018104839 A RU 2018104839A RU 2018104839 A RU2018104839 A RU 2018104839A RU 2707251 C2 RU2707251 C2 RU 2707251C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
optionally substituted
modified
nucleic acid
alkyl
polynucleotide
Prior art date
Application number
RU2018104839A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2018104839A3 (ru
RU2018104839A (ru
Inventor
Фужеролль Антонин Де
Атану РОЙ
Джейсон П. ШРАМ
Сухаиб СИДДИКИ
Пол ХАТАЛА
Стефан БАНСЕЛЬ
Original Assignee
Модерна Терапьютикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48044115&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2707251(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Модерна Терапьютикс, Инк. filed Critical Модерна Терапьютикс, Инк.
Publication of RU2018104839A3 publication Critical patent/RU2018104839A3/ru
Publication of RU2018104839A publication Critical patent/RU2018104839A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2707251C2 publication Critical patent/RU2707251C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана композиция для экспрессии полипептида в клетке млекопитающего, содержащая эффективное количество множества липидных наночастиц, содержащих полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид. В одном из вариантов реализации полинуклеотид содержит (a) открытую рамку считывания, кодирующую указанный полипептид, состоящий из нуклеозидов, включая 1-метилпсевдоуридин, цитидин или 5-метилцитидин, аденозин и гуанозин, (b) 5’-UTR, (c) 3’-UTR, и (d) структуру 5′-кэпа. Изобретение расширяет арсенал средств для экспрессии полипептидов в клетке млекопитающего. 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 50 табл., 90 пр.

Description

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей в электронном формате. Файл списка последовательностей под названием M009SQLST.txt был создан 3 октября 2012 года и имеет размер 9859 байт. Информация списка последовательностей в электронном формате включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет временной патентной заявки США № 61/542533, поданной 3 октября 2011 года, под названием "Modified Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, and Uses Thereof", содержание которой включено в качестве ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, в которых используются модифицированные нуклеиновые кислоты для модулирования функции клеток. Модифицированные нуклеиновые кислоты по изобретению могут кодировать пептиды, полипептиды или множество белков. Кодируемые молекулы можно использовать в качестве терапевтических средств и/или диагностических средств.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Встречающиеся в природе РНК синтезируются из четырех основных рибонуклеотидов: ATP, CTP, UTP и GTP, однако они могут содержать посттранскрипционно модифицированные нуклеотиды. Кроме того, в РНК идентифицировано приблизительно сто различных модификаций нуклеозидов (Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197). Однако роль модификаций нуклеозидов в иммуностимулирующем потенциале и в эффективности трансляции РНК неизвестна.
Предшествующие методологии обеспечения экспрессии белков имеют множество проблем. Например, гетерологичная ДНК, введенная в клетку, может наследоваться дочерними клетками (независимо от того, встроилась ли гетерологичная ДНК в хромосому) или потомками. Введенная ДНК может встраиваться в геномную ДНК клетки-хозяина с некоторой частотой, что приводит к изменениям и/или повреждению геномной ДНК клетки-хозяина. Кроме того, до получения белка необходимо осуществить множество стадий. После проникновения в клетку ДНК должна транспортироваться в ядро, где она транскрибируется в РНК. Затем РНК, транскрибированная с ДНК, должна проникнуть в цитоплазму, где она транслируется в белок. Эта необходимость множества стадий процессинга обеспечивает латентный период перед тем, как будет получен представляющий интерес белок. Кроме того, трудно достигнуть экспрессии ДНК в клетках; часто ДНК проникает в клетки, но не экспрессируется или экспрессируется на недостаточных уровнях или в недостаточных концентрациях. Особенно это может быть проблемой, когда ДНК вводят в клетки, такие как первичные клетки или модифицированные клеточные линии.
В данной области существует потребность в биологических средствах для осуществления модулирования внутриклеточной трансляции нуклеиновых кислот.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем описании представлены, среди прочих, модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты, которые могут демонстрировать сниженный врожденный иммунный ответ при введении в популяцию клеток, как in vivo, так и ex vivo.
Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, которые могут быть выделенными или очищенными. Эти полинуклеотиды могут кодировать один или несколько представляющих интерес полипептидов и содержат последовательность ряда связанных нуклеозидов или нуклеотидов, содержащих по меньшей мере один модифицированный нуклеозид или нуклеотид по сравнению с химической структурой нуклеозида или нуклеотида A, G, U или C. Полинуклеотиды также могут содержать 5’-UTR, содержащую по меньшей мере одну последовательность Козака, 3’-UTR и по меньшей мере одну структуру 5′-кэпа. Кроме того, выделенные полинуклеотиды могут содержать концевую часть поли-A и могут быть очищенными.
Выделенные полинуклеотиды по изобретению также содержат по меньшей мере одну структуру 5′-кэпа, выбранную из группы, состоящей из кэпа 0, кэпа 1, ARCA, инозина, N1-метилгуанозина, 2′фторгуанозина, 7-деазагуанозина, 8-оксогуанозина, 2-аминогуанозина, LNA-гуанозина и 2-азидогуанозина.
Модификации полинуклеотидов по изобретению могут быть осуществлены на нуклеозидном основании и/или сахарной части нуклеозидов, которые содержатся в полинуклеотиде.
В некоторых вариантах осуществления модификацию осуществляют на основании нуклеиновой кислоты и она выбрана из группы, состоящей из псевдоуридина или N1-метилпсевдоуридина.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеозид не является псевдоуридином (ψ) или 5-метилцитидином (m5C).
В некоторых вариантах осуществления множество модификаций включены в модифицированную нуклеиновую кислоту или в один или несколько индивидуальных нуклеозидов или нуклеотидов. Например, модификации нуклеозида могут включать одну или несколько модификаций оснований нуклеиновой кислоты и сахара.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются новые структурные элементы, например нуклеозиды и нуклеотиды, для получения модифицированных полинуклеотидов и способ их синтеза и производства.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим модифицированные полинуклеотиды, описанные в настоящем описании. Также они могут дополнительно включать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов, выбранных из растворителя, водного растворителя, неводного растворителя, диспергирующей среды, разбавителя, дисперсии, суспендирующей добавки, поверхностно-активного вещества, изотонического агента, загустителя или эмульгатора, консерванта, липида, липидоидов, липосомы, липидной наночастицы, наночастиц типа сердцевина-оболочка, полимера, липоплексного пептида, белка, клетки, гиалуронидазы и их смесей.
Также предусматриваются способы, в которых используются полинуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты по изобретению. В этом случае полинуклеотиды можно составлять любыми способами, известными в данной области, или можно вводить любым из нескольких путей, включающих инъекцию внутрикожным, подкожным или внутримышечным способом.
Введение модифицированных нуклеиновых кислот по изобретению может быть осуществлено посредством двух или более равных или неравных разделенных доз. В некоторых вариантах осуществления уровень полипептида, продуцируемого у индивидуума при введении разделенных доз полинуклеотида, превышает уровни, продуцируемые путем введения той же общей суточной дозы полинуклеотида в качестве однократного введения.
Обнаружение модифицированных нуклеиновых кислот или кодируемых полипептидов можно проводить в жидкости организма индивидуума или пациента, где жидкость организма выбрана из группы, состоящей из периферической крови, сыворотки, плазмы, асцитной жидкости, мочи, цереброспинальной жидкости (CSF), мокроты, слюны, костного мозга, синовиальной жидкости, внутриглазной жидкости, амниотической жидкости, ушной серы, грудного молока, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, семенной жидкости, жидкости предстательной железы, куперовой жидкости или предэякулята, пота, фекальных масс, волос, слез, жидкости кисты, плевральной и перитонеальной жидкости, перикардиальной жидкости, лимфы, химуса, хилуса, желчи, интерстициальной жидкости, менструальных жидкостей, гноя, кожного сала, рвотной массы, вагинальных секретов, секретов слизистых оболочек, жидкости стула, сока поджелудочной железы, жидкостей лаважа из полостей пазух, бронхолегочной аспирированной жидкости, жидкости полости бластоцеля и пуповинной крови.
В некоторых вариантах осуществления введение проводят в соответствии с режимом дозирования, который выполняют в течение периода нескольких часов, суток, недель, месяцев или лет, и оно может быть осуществлено с использованием одного или нескольких устройств, выбранных из многоигольных инъекционных систем, катетера или люминальных систем, и ультразвуковых, электрических или излучающих систем.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. В настоящем описании описаны способы и материалы для применения в рамках настоящего изобретения; также можно использовать другие пригодные способы и материалы, известные в данной области. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не являются ограничивающими. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, регистрационные записи баз данных и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет решающим.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из представленного ниже подробного описания и фигур, и из формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Представленные выше и другие задачи, признаки и преимущества будут очевидны из представленного ниже описания конкретных вариантов осуществления изобретения, как проиллюстрировано на прилагаемых чертежах, в которых на различных изображениях условные обозначения относятся к одинаковым частям. Чертежи не обязательно представлены в масштабе, вместо этого внимание обращено на иллюстрацию принципов различных вариантов осуществления изобретения.
На фиг.1 представлен спектр и графики аналитических результатов для N4-Me-CTP (NTP соединения 1). На фиг.1A представлен спектр ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в DMSO и на фиг.1B представлен спектр ЯМР в D2O, на фиг.1C представлены результаты масс-спектрометрии (MS), и на фиг.1D представлены результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для N4-метилцитидина (N4-Me-цитидин, соединение 1).
На фиг.2 представлены результаты ВЭЖХ для N4-Me-CTP (NTP соединения 1).
На фиг.3 представлены аналитические результаты для 2’-OMe-N, N-ди-Me-CTP (NTP соединения 2). На фиг.3A представлен спектр ЯМР. На фиг.3B представлены результаты MS. На фиг.3C представлены результаты ВЭЖХ для 2’-O-метил-N4,N4-диметилцитидина (2’-OMe-N,N-ди-Me-цитидин, соединение 2).
На фиг.4 представлены результаты ВЭЖХ для 2’-OMe-N, N-ди-Me-CTP (NTP соединения 2).
На фиг.5 представлены результаты ВЭЖХ для 5-метоксикарбонилметокси-UTP (NTP соединения 3).
На фиг.6 представлены аналитические результаты для 3-метилпсевдоуридина (соединение 4). На фиг.6A представлен спектр ЯМР для 3-метилпсевдоуридина (соединение 4) и на фиг.6B представлены результаты ВЭЖХ для 3-метилпсевдоуридина (соединение 4).
На фиг.7 представлены аналитические результаты для 5-TBDMS-OCH2-цитидина (соединение 6). На фиг.7A представлен спектр ЯМР, на фиг.7B представлены результаты MS, и на фиг.7C представлены результаты ВЭЖХ для 5-TBDMS-OCH2-цитидина (соединение 6).
На фиг.8 представлены аналитические результаты для 5-трифторметилуридина (соединение 8). На фиг.8A представлен спектр ЯМР, на фиг.8B представлены результаты MS, и на фиг.8C представлены результаты ВЭЖХ для 5-трифторметилуридина (соединение 8).
На фиг.9 представлены результаты спектра ЯМР для 5-(метоксикарбонил)метилуридина (соединение 9).
На фиг.10 представлен график, на котором показана вариабельность экспрессии белков (GCSF; дорожка B) и цитокинов (интерферон-альфа (IFNa); дорожка A, и фактор некроза опухоли-альфа (TNFa); дорожка C) в зависимости от процентной модификации.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится, среди прочего, к модифицированным нуклеозидам, модифицированным нуклеотидам и модифицированным нуклеиновым кислотам, которые проявляют улучшенные терапевтические свойства, включая, но не ограничиваясь ими, сниженный врожденный иммунный ответ при введении в популяцию клеток.
Поскольку в данной области остается потребность в терапевтических средствах, направленных на множество препятствий эффективному модулированию внутриклеточной трансляции и процессинга нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды или их фрагменты, авторы изобретения показали, что определенные модифицированные последовательности мРНК обладают потенциалом в качестве терапевтических средств с преимуществами, выходящими за пределы только ускользания от, избегания или уменьшения иммунного ответа.
Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность путем предоставления соединений на основе нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов, которые кодируют представляющий интерес полипептид (например, модифицированную мРНК) и которые обладают структурными и/или химическими признаками, которые устраняют одну или несколько проблем уровня техники, например, признаками, которые пригодны для оптимизации терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот при одновременном сохранении структурной и функциональной целостности, преодолении порога экспрессии, повышении уровней экспрессии, времени полужизни и/или концентраций белка, оптимизации локализации белка и избегании вредоносных биологических ответов, таких как иммунный ответ и/или пути деградации.
В рамках настоящего изобретения предусматриваются, частично, полинуклеотиды, кодирующие представляющие интерес полипептиды, которые химически модифицированы для повышения одного или нескольких из стабильности и/или клиренса в тканях, рецепторного захвата и/или кинетики, доступа композиций к клеткам, вовлечения аппарата транскрипции, времени полужизни мРНК, эффективности трансляции, ускользания от иммунной системы, способности к продуцированию белка, эффективности секреции (когда это применимо), доступности для кровообращения, времени полужизни белка и/или модулирования статуса, функции и/или активности клеток.
Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты по изобретению, включающие комбинацию модификаций, описанных в настоящем описании, имеют улучшенные свойства, что делает их более пригодными в качестве терапевтических средств.
Было определено, что модель уровня техники "все или ничего" является совершенно недостаточной для описания биологических явлений, ассоциированных с терапевтической применимостью модифицированной мРНК. Авторы настоящего изобретения определили, что для повышения продукции белка можно учитывать природу модификации или комбинации модификаций, процентную модификацию и исследовать более одного цитокина или показателя для определения эффективности и профиля риска конкретной модифицированной мРНК.
В одном аспекте изобретения способы определения эффективности модифицированной по сравнению с немодифицированной мРНК вовлекают измерение и анализ одного или нескольких цитокинов, экспрессия которых запускается путем введения экзогенной нуклеиновой кислоты по изобретению. Эти величины сравнивают с введением немодифицированной нуклеиновой кислоты или со стандартным показателем, таким как ответ цитокинов, поли-IC, R-848, или другим стандартом, известным в данной области.
Одним примером стандартного показателя, разработанного в рамках настоящего изобретения, является показатель соотношения уровня или количества кодируемого полипептида (белка), продуцируемого в клетке, ткани или организме, и уровня или количества одного или нескольких (или панели) цитокинов, экспрессия которых запускается в клетке, ткани или организме в результате введения или контакта с модифицированной нуклеиновой кислотой. Такие соотношения обозначают в настоящем описании как соотношение белок:цитокин или соотношение "PC". Чем более высоким является соотношение PC, тем более эффективной является модифицированная нуклеиновая кислота (полинуклеотид, кодирующий измеренный белок). Предпочтительные соотношения PC, на цитокин, по настоящему изобретению могут составлять более 1, более 10, более 100, более 1000, более 10000 или более. Модифицированные нуклеиновые кислоты, имеющие более высокие соотношения PC, чем модифицированная нуклеиновая кислота с отличающейся или немодифицированной конструкцией, являются предпочтительными.
Далее, соотношение PC можно определять по процентной модификации полинуклеотида. Например, можно определять нормализованную к 100% модифицированной нуклеиновой кислоте продукцию белка в качестве функции уровня цитокина (или риска) или профиля цитокинов.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения, посредством химических соединений, цитокинов или процентной модификации, относительной эффективности любого конкретного модифицированного полинуклеотида путем сравнения соотношения PC для модифицированной нуклеиновой кислоты (полинуклеотида).
В другом варианте осуществления химически модифицированная мРНК является по существу нетоксичной и немутагенной.
В одном варианте осуществления модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть химически модифицированными на поверхности большой бороздки, тем самым нарушая взаимодействия с основными партнерами по связыванию большой бороздки, которые могут вызвать врожденные иммунные ответы. Кроме того, эти модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты можно использовать для доставки груза, например, поддающегося обнаружению или терапевтического средства, к биологической мишени. Например, нуклеиновые кислоты можно ковалентно связывать с грузом, например, поддающимся обнаружению или терапевтическим средством, через линкер, присоединенный к нуклеиновому основанию или сахарной части. Композиции и способы, описанные в настоящем описании, можно использовать, in vivo и in vitro, как внеклеточно, так и внутриклеточно, а также в анализах, таких как бесклеточные анализы.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, содержащим нуклеотид, который нарушает связывание взаимодействующего, например, связывающегося, с большой бороздкой партнера с нуклеиновой кислотой, где нуклеотид обладает сниженной аффинностью связывания с взаимодействующими с большой бороздкой партнерами.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидам, которые содержат химические модификации, где нуклеотид обладает измененным связыванием с взаимодействующими с большой бороздкой партнерами.
В некоторых вариантах осуществления химические модификации расположены на обращенной к большой бороздке поверхности основания нуклеиновой кислоты, и где химические модификации могут включать замену или замещение атома пиримидина нуклеинового основания амином, SH, алкилом (например, метилом или этилом) или галогеном (например, хлором или фтором).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к химическим модификациям, расположенным на сахарной части нуклеотида.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к химическим модификациям, расположенным на фосфатном остове нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления химические модификации изменяют электрохимию поверхности большой бороздки нуклеиновой кислоты.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидам, которые содержат химические модификации, где нуклеотид снижает врожденный клеточный иммунный ответ по сравнению с врожденным клеточным иммунным ответом, индуцируемым соответствующей немодифицированной нуклеиновой кислотой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей мере два нуклеотида, причем последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотид, который нарушает связывание взаимодействующего с большой бороздкой партнера с последовательностью нуклеиновой кислоты, где нуклеотид обладает сниженной аффинностью связывания со связывающимся с большой бороздкой партнером.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим соединение, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой реакционную смесь. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой клеточную культуру. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит РНК-полимеразу и кДНК-матрицу. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из аденозина, цитозина, гуанозина и урацила.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способам получения фармацевтического состава, содержащего физиологически активный секретируемый белок, включающим трансфекцию первой популяции клеток человека фармацевтической нуклеиновой кислотой, полученной способами, описанными в настоящем описании, где секретируемый белок является активным в отношении второй популяции клеток человека.
В некоторых вариантах осуществления секретируемый белок способен взаимодействовать с рецептором на поверхности по меньшей мере одной клетки, присутствующей во второй популяции.
В некоторых вариантах осуществления секретируемый белок представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF).
В некоторых вариантах осуществления вторая популяция содержит миелобластные клетки, которые экспрессируют рецептор G-CSF.
В определенных вариантах осуществления в рамках настоящего изобретения предусматриваются комбинированные терапевтические средства, содержащие одну или несколько модифицированных нуклеиновых кислот, содержащих транслируемые области, которые кодируют белок или белки, которые усиливают иммунитет млекопитающего, вместе с белком, который индуцирует антителозависимую клеточную токсичность. Например, в рамках настоящего изобретения предусматриваются терапевтические средства, содержащие одну или несколько нуклеиновых кислот, которые кодируют трастузумаб и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). В частности, такие комбинированные лекарственные средства пригодны у пациентов с раком молочной железы Her2+, у которых развилась индуцированная устойчивость к трастузумабу (см., например, Albrecht, Immunotherapy. 2(6):795-8 (2010)).
В одном варианте осуществления подразумевается, что соединения по настоящему изобретению являются стабильными. Кроме того, понятно, что определенные признаки настоящего изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предоставлены в комбинации в одном варианте осуществления. Напротив, различные признаки настоящего изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предоставлены по отдельности или в любой подходящей подкомбинации.
Модифицированные нуклеотиды, нуклеозиды и полинуклеотиды по изобретению
В настоящем описании в нуклеотиде, нуклеозиде или полинуклеотиде (таком как нуклеиновые кислоты по изобретению, например, молекула мРНК) термины "модификация" или, в соответствующих случаях, "модифицированный" относятся к модификации в отношении рибонуклеотидов A, G, U или C. Главным образом, в настоящем описании не подразумевают, что эти термины относятся к модификациям рибонуклеотидов во встречающихся в природе 5′-концевых частях кэпа мРНК. В полипептиде термин "модификация" относится к модификации части по сравнению с каноническим набором из 20 аминокислот.
Модификации могут представлять собой различные отличающиеся модификации. В некоторых вариантах осуществления, где нуклеиновая кислота представляет собой мРНК, кодирующая область, фланкирующие области и/или концевые области могут содержать одну, две или более (необязательно отличающихся) нуклеозидных или нуклеотидных модификаций. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полинуклеотид, введенный в клетку, может проявлять сниженную деградацию в клетке по сравнению с немодифицированным полинуклеотидом.
Полинуклеотиды могут включать любую полезную модификацию, такую как модификация сахара, основания нуклеиновой кислоты или межнуклеозидной связи (например, связывающего фосфата/фосфодиэфирной связи/фосфодиэфирного остова). Например, большая бороздка полинуклеотида или обращенная к большой бороздке поверхность основания нуклеиновой кислоты могут содержать одну или несколько модификаций. Один или несколько атомов пиримидинового основания нуклеиновой кислоты (например, на поверхности большой бороздки) могут быть заменены или замещены необязательно замещенным амино, необязательно замещенным тиолом, необязательно замещенным алкилом (например, метилом или этилом) или галогеном (например, хлором или фтором). В определенных вариантах осуществления модификации (например, одна или несколько модификаций) присутствуют в каждом из сахара и межнуклеозидной связи. Модификации в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой модификации рибонуклеиновых кислот (РНК), дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), например, замена 2’-OH рибофуранизильного кольца на 2’-H, нуклеиновые кислоты с треозой (TNA), нуклеиновые кислоты с гликолем (GNA), пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), замкнутые нуклеиновые кислоты (LNA) или их гибриды). Дополнительные модификации описаны в настоящем описании.
Как описано в настоящем описании, полинуклеотиды по изобретению по существу не индуцируют врожденный иммунный ответ в клетке, в которую введен полинуклеотид (например, мРНК). Признаки индуцированного врожденного иммунного ответа включают 1) увеличенную экспрессию провоспалительных цитокинов, 2) активацию внутриклеточных PRR (RIG-I, MDA5 и т.д.), и/или 3) терминацию или снижение трансляции белка.
В определенных вариантах осуществления может быть желательным, чтобы модифицированная молекула нуклеиновой кислоты, введенная в клетку, деградировалась внутриклеточно. Например, деградация модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты может быть предпочтительной, если является желательным точный период времени продуцирования белка. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей домен деградации, который способен действовать направленным образом в клетке. В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим нуклеозид или нуклеотид, которые могут нарушать связывание взаимодействующего, например, связывающегося, с большой бороздкой партнера с полинуклеотидом (например, где модифицированный нуклеотид обладает сниженной аффинностью связывания с взаимодействующим с большой бороздкой партнером по сравнению с немодифицированным нуклеотидом).
Полинуклеотиды необязательно могут включать другие агенты (например, индуцирующие РНК-i агенты, агенты РНК-i, миРНК (siRNA), кшРНК (shRNA), микроРНК (miRNA), антисмысловые РНК, рибозимы, каталитические ДНК, тРНК, РНК, которые индуцируют образование тройной спирали, аптамеры, векторы и т.д.). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут включать одну или несколько матричных РНК (мРНК), имеющих один или несколько модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов (т.е. модифицированные молекулы мРНК). Подробно описание этих полинуклеотидов следуют далее.
Полинуклеотиды
Полинуклеотиды по изобретению включают первую область связанных нуклеозидов, кодирующую представляющий интерес полипептид, первую фланкирующую область, расположенную на 5′-конце первой области, и вторую фланкирующую область, расположенную на 3′-конце первой области.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (Ia) или формулу (Ia-1):
Figure 00000001
,
или формулу их фармацевтически приемлемых солей или их стереоизомеров, где U представляет собой O, S, N(RU)nu или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2, и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил;
Figure 00000002
представляет собой одинарную связь или отсутствует;
каждый из R1’, R2’, R1", R2", R1, R2, R3, R4 и R5, если присутствует, независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, или отсутствует; где комбинация R3 с одним или несколькими из R1’, R1", R2’, R2" или R5 (например, комбинация R1’ и R3, комбинация R1" и R3, комбинация R2’ и R3, комбинация R2" и R3 или комбинация R5 и R3), связанных вместе, могут образовывать необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен и, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный гетероциклил (например, бициклический, трициклический или трициклический гетероциклил); где комбинация R5 с одним или несколькими из R1’, R1", R2’ или R2" (например, комбинация R1’ и R5, комбинация R1" и R5, комбинация R2′ и R5 или комбинация R2" и R5), связанных вместе, могут образовывать необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен и, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный гетероциклил (например, бициклический, трициклический или тетрациклический гетероциклил); и где комбинация R4 с одним или несколькими из R1’, R1", R2’, R2", R3 или R5, связанных вместе, могут образовывать необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен и, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный гетероциклил (например, бициклический, трициклический или тетрациклический гетероциклил);
каждый из m’ и m" независимо представляет собой целое число от 0 до 3 (например, от 0 до 2, от 0 до 1, от 1 до 3 или от 1 до 2);
каждый из Y1, Y2 и Y3 независимо представляет собой O, S, Se, -NRN1-, необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный арил или отсутствует;
каждый Y4 независимо представляет собой H, гидрокси, тиол, боранил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или необязательно замещенный амино;
каждый Y5 независимо представляет собой O, S, Se, необязательно замещенный алкилен (например метилен) или необязательно замещенный гетероалкилен;
n представляет собой целое число от 1 до 100000; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты (например, пурин, пиримидин или их производные), где комбинация B и R1’, комбинация B и R2’, комбинация B и R1" или комбинация B и R2", взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, необязательно могут образовывать бициклическую группу (например, бициклический гетероциклил) или где комбинация B, R1" и R3 или комбинация B, R2" и R3 необязательно могут образовывать трициклическую или тетрациклическую группу (например, трициклический или тетрациклический гетероциклил, такой как в формуле (IIo)-(IIp) настоящего описания).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает модифицированную рибозу. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (Ia-2)-(Ia-5) или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера.
Figure 00000003
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (Ib) или формулу (Ib-1):
Figure 00000004
,
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где
U представляет собой O, S, N(RU)nu или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил;
Figure 00000002
представляет собой одинарную связь или отсутствует;
каждый из R1, R3’, R3" и R4 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил или отсутствует; и где комбинация R1 и R3’ или комбинация R1 и R3", взятые вместе, могут образовывать необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен (например, образуя замкнутую нуклеиновую кислоту);
каждый R5 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или отсутствует;
каждый из Y1, Y2 и Y3 независимо представляет собой O, S, Se, NRN1-, необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил;
каждый Y4 независимо представляет собой H, гидрокси, тиол, боранил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или необязательно замещенный амино;
n представляет собой целое число от 1 до 100000; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (Ic):
Figure 00000005
, или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где
U представляет собой O, S, N(RU)nu или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил;
Figure 00000002
представляет собой одинарную связь или отсутствует;
каждый из B1, B2 и B3 независимо представляет собой основание нуклеиновой кислоты (например, пурин, пиримидин или их производные, как описано в настоящем описании), H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил, где один и только один из B1, B2 и B3 представляет собой основание нуклеиновой кислоты;
каждый из Rb1, Rb2, Rb3, R3 и R5 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил;
каждый из Y1, Y2 и Y3 независимо представляет собой O, S, Se, -NRN1-, необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил;
каждый Y4 независимо представляет собой H, гидрокси, тиол, боранил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или необязательно замещенный амино;
каждый Y5 независимо представляет собой O, S, Se, необязательно замещенный алкилен (например, метилен) или необязательно замещенный гетероалкилен;
n представляет собой целое число от 1 до 100000; и
где кольцо, включающее U, может включать одну или несколько двойных связей.
В конкретных вариантах осуществления кольцо, включающее U, не имеет двойной связи между U-CB3Rb3 или между CB3Rb3-CB2Rb2.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (Id):
Figure 00000006
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где U представляет собой O, S, N(RU)nu или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил;
каждый R3 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил;
каждый из Y1, Y2 и Y3 независимо представляет собой O, S, Se, -NRN1-, необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил;
каждый Y4 независимо представляет собой H, гидрокси, тиол, боранил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или необязательно замещенный амино;
каждый Y5 независимо представляет собой O, S, необязательно замещенный алкилен (например, метилен) или необязательно замещенный гетероалкилен;
n представляет собой целое число от 1 до 100000; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты (например, пурин, пиримидин или их производные).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (Ie):
Figure 00000007
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера,
где каждый из U’ и U" независимо представляет собой O, S, N(RU)nu или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил;
каждый R6 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил;
каждый Y5’ независимо представляет собой O, S, необязательно замещенный алкилен (например, метилен или этилен) или необязательно замещенный гетероалкилен;
n представляет собой целое число от 1 до 100000; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты (например, пурин, пиримидин или их производные).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (If) или (If-1):
Figure 00000008
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера,
где каждый из U’ и U" независимо представляет собой O, S, N, N(RU)nu или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил (например, U’ представляет собой O и U" представляет собой N);
Figure 00000002
представляет собой одинарную связь или отсутствует;
каждый из R1’, R2’, R1", R2", R3 и R4 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил или отсутствует; и где R1’ в комбинации с R3, R1" в комбинации с R3, R2’ в комбинации с R3 или R2" в комбинации с R3, взятые вместе, могут образовывать необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен (например, образуя замкнутую нуклеиновую кислоту); каждый из m’ и m" независимо представляет собой целое число от 0 до 3 (например, от 0 до 2, от 0 до 1, от 1 до 3 или от 1 до 2);
каждый из Y1, Y2 и Y3 независимо представляет собой O, S, Se, -NRN1-, необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный арил или отсутствует;
каждый Y4 независимо представляет собой H, гидрокси, тиол, боранил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или необязательно замещенный амино;
каждый Y5 независимо представляет собой O, S, Se, необязательно замещенный алкилен (например, метилен) или необязательно замещенный гетероалкилен;
n представляет собой целое число от 1 до 100000; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты (например, пурин, пиримидин или их производные).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) кольцо, включающее U, имеет одну или две двойных связи.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) каждый из R1, R1’ и R1", если присутствует, представляет собой H. В следующих вариантах осуществления каждый из R2, R2’ и R2", если присутствует, независимо представляет собой H, галоген (например, фтор), гидрокси, необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси) или необязательно замещенный алкоксиалкокси. В конкретных вариантах осуществления алкоксиалкокси представляет собой -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил. В некоторых вариантах осуществления s2 равно 0, s1 равно 1 или 2, s3 равно 0 или 1, и R’ представляет собой C1-6алкил.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)), каждый из R2, R2’ и R2", если присутствует, представляет собой H. В следующих вариантах осуществления каждый из R1, R1’ и R1", если присутствует, независимо представляет собой H, галоген (например, фтор), гидрокси, необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси) или необязательно замещенный алкоксиалкокси. В конкретных вариантах осуществления алкоксиалкокси представляет собой -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил. В некоторых вариантах осуществления s2 равно 0, s1 равно 1 или 2, s3 равно 0 или 1, и R’ представляет собой C1-6 алкил.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) каждый из R3, R4 и R5 независимо представляет собой H, галоген (например, фтор), гидрокси, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси) или необязательно замещенный алкоксиалкокси. В конкретных вариантах осуществления R3 представляет собой H, R4 представляет собой H, R5 представляет собой H, или все из R3, R4 и R5 представляют собой H. В конкретных вариантах осуществления R3 представляет собой C1-6 алкил, R4 представляет собой C1-6 алкил, R5 представляет собой C1-6 алкил, или все из R3, R4 и R5 представляют собой C1-6 алкил. В конкретных вариантах осуществления оба из R3 и R4 представляют собой H, и R5 представляет собой C1-6 алкил.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) R3 и R5, связанные вместе, образуют необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен и, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный гетероциклил (например, бициклический, трициклический или тетрациклический гетероциклил, такой как транс-3’,4’-аналоги), где R3 и R5, связанные вместе, образуют гетероалкилен (например, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, где каждый из b1, b2 и b3 независимо представляет собой целое число от 0 до 3).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) R3 и один или несколько из R1’, R1", R2′, R2" или R5, связанные вместе, образуют необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен и, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный гетероциклил (например, бициклический, трициклический или тетрациклический гетероциклил), R3 и один или несколько из R1’, R1", R2′, R2" или R5, связанные вместе, образуют гетероалкилен (например, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, где каждый из b1, b2 и b3 независимо представляет собой целое число от 0 до 3).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) R5 и один или несколько из R1’, R1", R2′ или R2", связанные вместе, образуют необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен и, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, обеспечивают необязательно замещенный гетероциклил (например, бициклический, трициклический или тетрациклический гетероциклил), R5 и один или несколько из R1’, R1", R2′ или R2", связанные вместе, образуют гетероалкилен (например, -(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3-, где каждый из b1, b2 и b3 независимо представляет собой целое число от 0 до 3).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) каждый Y2 независимо представляет собой O, S или -NRN1-, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил. В конкретных вариантах осуществления Y2 представляет собой NRN1-, где RN1 представляет собой H или необязательно замещенный алкил (например, C1-6 алкил, такой как метил, этил, изопропил или н-пропил).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) каждый Y3 независимо представляет собой O или S.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) R1 представляет собой H; каждый R2 независимо представляет собой H, галоген (например, фтор), гидрокси, необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси) или необязательно замещенный алкоксиалкокси (например, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, такой, где s2 равно 0, s1 равно 1 или 2, s3 равно 0 или 1 и R’ представляет собой C1-6 алкил); каждый Y2 независимо представляет собой O или -NRN1-, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил (например, где RN1 представляет собой H или необязательно замещенный алкил (например, C1-6 алкил, такой как метил, этил, изопропил или н-пропил)); и каждый Y3 независимо представляет собой O или S (например, S). В следующих вариантах осуществления R3 представляет собой H, галоген (например, фтор), гидрокси, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси) или необязательно замещенный алкоксиалкокси. В следующих вариантах осуществления каждый Y1 независимо представляет собой O или -NRN1-, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил (например, где RN1 представляет собой H или необязательно замещенный алкил (например, C1-6 алкил, такой как метил, этил, изопропил или н-пропил)); и каждый Y4 независимо представляет собой H, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или необязательно замещенный амино.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) каждый R1 независимо представляет собой H, галоген (например, фтор), гидрокси, необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси) или необязательно замещенный алкоксиалкокси (например, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, такой, где s2 равно 0, s1 равно 1 или 2, s3 равно 0 или 1, и R’ представляет собой C1-6 алкил); R2 представляет собой H; каждый Y2 независимо представляет собой O или -NRN1-, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил (например, где RN1 представляет собой H или необязательно замещенный алкил (например, C1-6 алкил, такой как метил, этил, изопропил или н-пропил)); и каждый Y3 независимо представляет собой O или S (например, S). В следующих вариантах осуществления R3 представляет собой H, галоген (например, фтор), гидрокси, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси) или необязательно замещенный алкоксиалкокси. В следующих вариантах осуществления каждый Y1 независимо представляет собой O или -NRN1-, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил (например, где RN1 представляет собой H или необязательно замещенный алкил (например, C1-6 алкил, такой как метил, этил, изопропил или н-пропил)); и каждый Y4 независимо представляет собой H, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или необязательно замещенный амино.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) кольцо, включающее U, находится в конфигурации β-D (например, β-D-рибо).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) кольцо, включающее U, находится в конфигурации α-L (например, α-L-рибо).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)) один или несколько B не являются псевдоуридином (ψ) или 5-метилцитидином (m5C).
В некоторых вариантах осуществления от приблизительно 10% до приблизительно 100% от числа n оснований нуклеиновой кислоты B не являются ψ или m5C (например, от 10% до 20%, от 10% до 35%, от 10% до 50%, от 10% до 60%, от 10% до 75%, от 10% до 90%, от 10% до 95%, от 10% до 98%, от 10% до 99%, от 20% до 35%, от 20% до 50%, от 20% до 60%, от 20% до 75%, от 20% до 90%, от 20% до 95%, от 20% до 98%, от 20% до 99%, от 20% до 100%, от 50% до 60%, от 50% до 75%, от 50% до 90%, от 50% до 95%, от 50% до 98%, от 50% до 99%, от 50% до 100%, от 75% до 90%, от 75% до 95%, от 75% до 98%, от 75% до 99% и от 75% до 100% от числа n B не являются ψ или m5C). В некоторых вариантах осуществления B не является ψ или m5C.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидов (например, формулы (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If-1), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr)), когда B представляет собой немодифицированное основание нуклеиновой кислоты, выбранное из цитозина, гуанина, урацила и аденина, тогда по меньшей мере один из Y1, Y2 или Y3 не является O.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает модифицированную рибозу. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIa)-(IIc):
Figure 00000009
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера. В конкретных вариантах осуществления U представляет собой O или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил (например, U представляет собой -CH2- или -CH-). В других вариантах осуществления каждый из R1, R2, R3, R4 и R5 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил или отсутствует (например, каждый R1 и R2 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси; каждый R3 и R4 независимо представляет собой H или необязательно замещенный алкил; и R5 представляет собой H или гидрокси), и
Figure 00000002
представляет собой одинарную связь или двойную связь.
В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIb-1)-(IIb-2):
Figure 00000010
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера. В некоторых вариантах осуществления U представляет собой O или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил (например, U представляет собой -CH2- или -CH-). В других вариантах осуществления каждый из R1 и R2 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил или отсутствует (например, каждый из R1 и R2 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси, например, H, галоген, гидрокси, алкил или алкокси). В конкретных вариантах осуществления R2 представляет собой гидрокси или необязательно замещенный алкокси (например, метокси, этокси или любой алкокси, описанный в настоящем описании).
В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIc-1)-(IIc-4):
Figure 00000011
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера.
В некоторых вариантах осуществления U представляет собой O или C(RU)nu, где nu представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RU независимо представляет собой H, галоген или необязательно замещенный алкил (например, U представляет собой -CH2- или -CH-). В некоторых вариантах осуществления каждый из R1, R2 и R3 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный гидроксиалкокси, необязательно замещенный амино, азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил или отсутствует (например, каждый R1 и R2 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси, например, H, галоген, гидрокси, алкил или алкокси; и каждый R3 независимо представляет собой H или необязательно замещенный алкил). В конкретных вариантах осуществления R2 представляет собой необязательно замещенный алкокси (например, метокси или этокси, или любой алкокси, описанный в настоящем описании). В конкретных вариантах осуществления R1 представляет собой необязательно замещенный алкил, и R2 представляет собой гидрокси. В других вариантах осуществления R1 представляет собой гидрокси, и R2 представляет собой необязательно замещенный алкил. В следующих вариантах осуществления R3 представляет собой необязательно замещенный алкил.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает ациклическую модифицированную рибозу. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IId)-(IIf):
Figure 00000012
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает ациклический модифицированный гексит. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIg)-(IIj):
Figure 00000013
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает сахарную часть, имеющую уменьшенное или расширенное кольцо рибозы. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIk)-(IIm):
Figure 00000014
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где каждый из R1’, R1", R2’ и R2" независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси или отсутствует; и где R2’ в комбинации с R3 или R2" в комбинации с R3, взятые вместе, могут образовывать необязательно замещенный алкилен или необязательно замещенный гетероалкилен.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает замкнутую модифицированную рибозу. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIn):
Figure 00000015
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где R3’ представляет собой O, S или -NRN1-, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил, и R3" представляет собой необязательно замещенный алкилен (например, -CH2-, -CH2CH2- или -CH2CH2CH2-) или необязательно замещенный гетероалкилен (например -CH2NH-, -CH2CH2NH-, -CH2OCH2- или -CH2CH2OCH2-) (например, R3′ представляет собой O и R3" представляет собой необязательно замещенный алкилен (например, -CH2-, -CH2CH2- или -CH2CH2CH2-)).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIn-1)-(II-n2):
Figure 00000016
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где R3’ представляет собой O, S или -NRN1-, где RN1 представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный арил, и R3" представляет собой необязательно замещенный алкилен (например -CH2-, -CH2CH2- или -CH2CH2CH2-) или необязательно замещенный гетероалкилен (например -CH2NH-, -CH2CH2NH-, -CH2OCH2- или -CH2CH2OCH2-) (например, R3’ представляет собой O и R3" представляет собой необязательно замещенный алкилен (например -CH2-, -CH2CH2- или -CH2CH2CH2-)).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает замкнутую модифицированную рибозу, которая образует тетрациклический гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область) включает число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (IIo):
Figure 00000017
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где R12a, R12c, T1’, T1", T2’, T2", V1 и V3 являются такими, как описано в настоящем описании.
Любая из формул для полинуклеотидов может включать одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем описании (например, формулы (b1)-(b43)).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам получения полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один нуклеотид, который нарушает связывание взаимодействующего с большой бороздкой партнера с нуклеиновой кислотой, где полинуклеотид содержит число n нуклеозидов, имеющих формулу (Ia), как определено в настоящем описании:
Figure 00000018
причем способ включает реакцию соединения формулы (IIIa), как определено в настоящем описании:
Figure 00000019
с РНК-полимеразой и кДНК-матрицей.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам амплификации полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один нуклеотид, который нарушает связывание связывающегося с большой бороздкой партнера с полинуклеотидной последовательностью, причем способ включает: реакцию соединения формулы (IIIa), как определено в настоящем описании, с праймером, кДНК-матрицей и РНК-полимеразой.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам получения полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один нуклеотид, который нарушает связывание взаимодействующего с большой бороздкой партнера с нуклеиновой кислотой, где полинуклеотид содержит число n нуклеозидов, имеющих формулу (Ia-1), как определено в настоящем описании:
Figure 00000020
причем способ включает реакцию соединения формулы (IIIa-1), как определено в настоящем описании:
Figure 00000021
с РНК-полимеразой и кДНК-матрицей.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам амплификации полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один нуклеотид (например, модифицированную молекулу мРНК), который нарушает связывание связывающегося с большой бороздкой партнера с полинуклеотидной последовательностью, причем способ включает: реакцию соединения формулы (IIIa-1), как определено в настоящем описании, с праймером, кДНК-матрицей и РНК-полимеразой.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам получения полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один нуклеотид, который нарушает связывание взаимодействующего с большой бороздкой партнера с последовательностью нуклеиновой кислоты, где полинуклеотид содержит число n нуклеозидов, имеющих формулу (Ia-2), как определено в настоящем описании:
Figure 00000022
причем способ включает реакцию соединения формулы (IIIa-2), как определено в настоящем описании:
Figure 00000023
с РНК-полимеразой и кДНК-матрицей.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам амплификации полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один нуклеотид (например, модифицированную молекулу мРНК), который нарушает связывание связывающегося с большой бороздкой партнера с полинуклеотидом, причем способ включает реакцию соединения формулы (IIIa-2), как определено в настоящем описании, с праймером, кДНК-матрицей и РНК-полимеразой.
В некоторых вариантах осуществления реакцию можно повторять от 1 до приблизительно 7000 раз. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, B может представлять собой основание нуклеиновой кислоты формулы (b1)-(b43).
Полинуклеотиды необязательно могут включать 5′- и/или 3′-фланкирующие области, которые описаны в настоящем описании.
Модифицированные нуклеотиды и нуклеозиды
Настоящее изобретение также включает структурные элементы, например, модифицированные рибонуклеозиды, модифицированные рибонуклеотиды, полинуклеотидов, например, модифицированных молекул РНК (или мРНК). Например, эти структурные элементы могут быть пригодными для получения полинуклеотидов по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления структурный элемент имеет формулу (IIIa) или (IIIa-1):
Figure 00000024
или формулу его фармацевтически приемлемой соли или его стереоизомера, где заместители являются такими, как описано в настоящем описании (например, для формулы (Ia) и (Ia-1)), и где когда B представляет собой немодифицированное основание нуклеиновой кислоты, выбранное из цитозина, гуанина, урацила и аденина, тогда по меньшей мере один из Y1, Y2 или Y3 не является O.
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, имеет формулу (IVa)-(IVb):
Figure 00000025
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где B является таким, как описано в настоящем описании (например, любой из (b1)-(b43)).
В конкретных вариантах осуществления формулу (IVa) или (IVb) комбинируют с модифицированным урацилом (например, любой из формул (b1)-(b9), (b21)-(b23) и (b28)-(b31), такой как формулы (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)). В конкретных вариантах осуществления формулу (IVa) или (IVb) комбинируют с модифицированным цитозином (например, любой из формул (b10)-(b14), (b24), (b25) и (b32)-(b36), такой как формула (b10) или (b32)). В конкретных вариантах осуществления формулу (IVa) или (IVb) комбинируют с модифицированным гуанином (например, любой из формул (b15)-(b17) и (b37)-(b40)). В конкретных вариантах осуществления формулу (IVa) или (IVb) комбинируют с модифицированным аденином (например, любой из формул (b18)-(b20) и (b41)-(b43)).
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, имеет формулу (IVc)-(IVk):
Figure 00000026
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где B является таким, как описано в настоящем описании (например, любой из (b1)-(b43)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IVc)-(IVk) комбинируют с модифицированным урацилом (например, любая из формул (b1)-(b9), (b21)-(b23) и (b28)-(b31), такая как формула (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IVc)-(IVk) комбинируют с модифицированным цитозином (например, любая из формул (b10)-(b14), (b24), (b25) и (b32)-(b36), такая как формула (b10) или (b32)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IVc)-(IVk) комбинируют с модифицированным гуанином (например, любая из формул (b15)-(b17) и (b37)-(b40)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IVc)-(IVk) комбинируют с модифицированным аденином (например, любая из формул (b18)-(b20) и (b41)-(b43)).
В других вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, имеет формулу (Va) или (Vb):
Figure 00000027
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где B является таким, как описано в настоящем описании (например, любой из (b1)-(b43)).
В других вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, имеет формулу (IXa)-(IXd):
Figure 00000028
Figure 00000029
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где B является таким, как описано в настоящем описании (например, любой из (b1)-(b43)).
В конкретных вариантах осуществления любое из соединений формул (IXa)-(IXd) комбинируют с модифицированным урацилом (например, любая из формул (b1)-(b9), (b21)-(b23) и (b28)-(b31), такая как формула (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)). В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXa)-(IXd) комбинируют с модифицированным цитозином (например, любая из формул (b10)-(b14), (b24), (b25) и (b32)-(b36), такая как формула (b10) или (b32)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXa)-(IXd) комбинируют с модифицированным гуанином (например, любая из формул (b15)-(b17) и (b37)-(b40)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXa)-(IXd) комбинируют с модифицированным аденином (например, любая из формул (b18)-(b20) и (b41)-(b43)).
В других вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, имеет формулу (IXe)-(IXg):
Figure 00000030
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где B является таким, как описано в настоящем описании (например, любой из (b1)-(b43)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXe)-(IXg) комбинируют с модифицированным урацилом (например, любая из формул (b1)-(b9), (b21)-(b23) и (b28)-(b31), такая как формула (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)).
В конкретных вариантах осуществления одну из формул (IXe)-(IXg) комбинируют с модифицированным цитозином (например, любая из формул (b10)-(b14), (b24), (b25) и (b32)-(b36), такая как формула (b10) или (b32)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формулы (IXe)-(IXg) комбинируют с модифицированным гуанином (например, любая из формул (b15)-(b17) и (b37)-(b40)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXe)-(IXg) комбинируют с модифицированным аденином (например, любая из формул (b18)-(b20) и (b41)-(b43)).
В других вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, имеет формулу (IXh)-(IXk):
Figure 00000031
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где B является таким, как описано в настоящем описании (например, любая из (b1)-(b43)). В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXh)-(IXk) комбинируют с модифицированным урацилом (например, любая из формул (b1)-(b9), (b21)-(b23) и (b28)-(b31), такая как формула (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)). В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXh)-(IXk) комбинируют с модифицированным цитозином (например, любая из формул (b10)-(b14), (b24), (b25) и (b32)-(b36), такая как формула (b10) или (b32)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXh)-(IXk) комбинируют с модифицированным гуанином (например, любая из формул (b15)-(b17) и (b37)-(b40)). В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXh)-(IXk) комбинируют с модифицированным аденином (например, любая из формул (b18)-(b20) и (b41)-(b43)).
В других вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, имеет формулу (IXl)-(IXr):
Figure 00000032
или формулу их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где каждый r1 и r2 независимо представляет собой целое число от 0 до 5 (например, от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5) и B является таким, как описано в настоящем описании (например, любой из (b1)-(b43)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXl)-(IXr) комбинируют с модифицированным урацилом (например, любая из формул (b1)-(b9), (b21)-(b23) и (b28)-(b31), такая как формула (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXl)-(IXr) комбинируют с модифицированным цитозином (например, любая из формул (b10)-(b14), (b24), (b25) и (b32)-(b36), такая как формула (b10) или (b32)).
В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXl)-(IXr) комбинируют с модифицированным гуанином (например, любая из формул (b15)-(b17) и (b37)-(b40)). В конкретных вариантах осуществления одно из соединений формул (IXl)-(IXr) комбинируют с модифицированным аденином (например, любая из формул (b18)-(b20) и (b41)-(b43)).
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, может быть выбрана из группы, состоящей из:
Figure 00000033
Figure 00000034
или их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5 (например, от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5).
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, может быть выбрана из группы, состоящей из:
Figure 00000035
или их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5 (например, от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5) и s1 является таким, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в нуклеиновую кислоту (например, РНК, мРНК, полинуклеотид), представляет собой модифицированный уридин (например, выбранный из группы, состоящей из:
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000048
Figure 00000049
Figure 00000050
Figure 00000051
Figure 00000052
или их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где Y1, Y3, Y4, Y6 и r являются такими, как описано в настоящем описании (например, каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5, такое как от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5)).
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, представляет собой модифицированный цитидин (например, выбранный из группы, состоящей из:
Figure 00000053
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Figure 00000057
или их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где Y1, Y3, Y4, Y6 и r являются такими, как описано в настоящем описании (например, каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5, такое как от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5)). Например, молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, может представлять собой:
Figure 00000058
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5 (например, от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5).
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, представляет собой модифицированный аденозин (например, выбранный из группы, состоящей из:
Figure 00000059
Figure 00000060
Figure 00000061
Figure 00000062
Figure 00000063
Figure 00000064
Figure 00000065
Figure 00000066
,
или их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где Y1, Y3, Y4, Y6 и r являются такими, как описано в настоящем описании (например, каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5, такое как от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5)).
В некоторых вариантах осуществления молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, представляет собой модифицированный гуанозин (например, выбранный из группы, состоящей из:
Figure 00000067
Figure 00000068
Figure 00000069
Figure 00000070
Figure 00000071
Figure 00000072
Figure 00000073
Figure 00000074
Figure 00000075
Figure 00000076
Figure 00000077
или их фармацевтически приемлемой соли или их стереоизомера, где Y1, Y3, Y4, Y6 и r являются такими, как описано в настоящем описании (например, каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5, такое как от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5)).
В некоторых вариантах осуществления химическая модификация большой бороздки может включать замену C-группы в положении C-5 кольца (например, для пиримидинового нуклеозида, такого как цитозин или урацил) на N (например, замена группы >CH в C-5 на группу >NRN1, где RN1 представляет собой H или необязательно замещенный алкил). Например, молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, может представлять собой:
Figure 00000078
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5 (например, от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5).
В другом варианте осуществления химическая модификация большой бороздки может включать замену водорода в положении C-5 цитозина на галоген (например, Br, Cl, F или I) или необязательно замещенный алкил (например, метил). Например, молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, может представлять собой:
Figure 00000079
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5 (например, от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5).
В другом варианте осуществления химическая модификация большой бороздки может включать конденсированное кольцо, которое образовано NH2 в положении C-4 и атомом углерода в положении C-5. Например, молекула структурного элемента, которая может быть включена в полинуклеотид, может представлять собой:
Figure 00000080
или его фармацевтически приемлемую соль или его стереоизомер, где каждый r независимо представляет собой целое число от 0 до 5 (например, от 0 до 3, от 1 до 3 или от 1 до 5).
Модификации сахара
Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды (например, молекулы структурных элементов), которые могут быть включены в полинуклеотид (например, РНК или мРНК, как описано в настоящем описании), могут быть модифицированы по сахару рибонуклеиновой кислоты. Например, 2′-гидроксильная группа (OH) может быть модифицирована или заменена рядом различных заместителей. Иллюстративные замены в 2′-положении включают, но не ограничиваются ими, H, галоген, необязательно замещенный C1-6 алкил; необязательно замещенный C1-6 алкокси; необязательно замещенный C6-10 арилокси; необязательно замещенный C3-8 циклоалкил; необязательно замещенный C3-8 циклоалкокси; необязательно замещенный C6-10 арилокси; необязательно замещенный C6-10 арил-C1-6 алкокси, необязательно замещенный C1-12 (гетероциклил)окси; сахар (например, рибоза, пентоза или любой сахар, описанный в настоящем описании); полиэтиленгликоль (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, где R представляет собой H или необязательно замещенный алкил, и n представляет собой целое число от 0 до 20 (например, от 0 до 4, от 0 до 8, от 0 до 10, от 0 до 16, от 1 до 4, от 1 до 8, от 1 до 10, от 1 до 16, от 1 до 20, от 2 до 4, от 2 до 8, от 2 до 10, от 2 до 16, от 2 до 20, от 4 до 8, от 4 до 10, от 4 до 16 и от 4 до 20); "замкнутые" нуклеиновые кислоты (LNA), в которых 2′-гидроксил связан через C1-6 алкиленовый или C1-6 гетероалкиленовый мостик с 4’-углеродом того же рибозного сахара, где иллюстративные мостики включают метиленовые, пропиленовые, простые эфирные или амино мостики; аминоалкил, как определено в настоящем описании; аминоалкокси, как определено в настоящем описании; амино, как определено в настоящем описании, и аминокислоту, как определено в настоящем описании.
Как правило, РНК включает группу сахара рибозы, которая представляет собой 5-членное кольцо, имеющее кислород. Иллюстративные неограничивающие модифицированные нуклеотиды включают замену кислорода в рибозе (например, на S, Se или алкилен, такой как метилен или этилен); внесение двойной связи (например, для замены рибозы циклопентенилом или циклогексенилом); уменьшение кольца рибозы (например, с образованием 4-членного кольца циклобутана или оксетана); расширение кольца рибозы (например, с образованием 6- или 7-членного кольца, имеющего дополнительный атом углерода или гетероатом, такой как в случае ангидрогексита, альтрита, маннита, циклогексанила, циклогексенила и морфолино, который также имеет фосфорамидатный остов); полициклические формы (например, трицикло; и "разомкнутые" формы, такие как нуклеиновая кислота с гликолем (GNA) (например, R-GNA или S-GNA, где рибоза заменена элементами гликоля, связанными с фосфодиэфирными связями), нуклеиновая кислота с треозой (TNA, где рибоза заменена α-L-треофуранозилом-(3′→2′)) и пептидная нуклеиновая кислота (PNA, где 2-аминоэтилглициновые связи заменяют рибозу и фосфодиэфирный остов). Группа сахара также может содержать один или несколько атомов углерода, которые обладают противоположной стереохимической конфигурацией относительно конфигурации соответствующего атома углерода в рибозе. Таким образом, полинуклеотидная молекула может включать нуклеотиды, содержащие, например, арабинозу, в качестве сахара.
Модификации основания нуклеиновой кислоты
Настоящее изобретение относится к модифицированным нуклеозидам и нуклеотидам. Как описано в настоящем описании. "нуклеозид" определяют как соединение, содержащее молекулу сахара (например, пентозу или рибозу) или ее производное в комбинации с органическим основанием (например, пурином или пиримидином) или его производным (также обозначаемым в настоящем описании как "основание нуклеиновой кислоты"). Как описано в настоящем описании, "нуклеотид" определяют как нуклеозид, включающий фосфатную группу. В некоторых вариантах осуществления нуклеозиды и нуклеотиды, описанные в настоящем описании, обычно являются химически модифицированными на поверхности большой бороздки. Иллюстративные неограничивающие модификации включают аминогруппу, тиольную группу, алкильную группу, группу галогена или любую группу, описанную в настоящем описании. Модифицированные нуклеотиды можно синтезировать любым подходящим способом, как описано в настоящем описании (например, химическими, ферментативными или рекомбинантными способами для включения одного или нескольких модифицированных или неприродных нуклеозидов).
Модифицированные пары нуклеотидных оснований охватывают не только стандартные пары оснований аденозин-тимин, аденозин-урацил или гуанозин-цитозин, но также пары оснований, образованные между нуклеотидами и/или модифицированными нуклеотидами, содержащими нестандартные или модифицированные основания, где расположение доноров водородных связей и акцепторов водородных связей позволяет образование водородных связей между нестандартным основанием и стандартным основанием или между двумя комплементарными нестандартными структурами оснований. Одним примером таких нестандартных пар оснований являются пары оснований между модифицированным нуклеотидом инозином и аденином, цитозином или урацилом.
Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать модифицированное основание нуклеиновой кислоты. Примеры оснований нуклеиновой кислоты, встречающихся в РНК, включают, но не ограничиваются ими, аденин, гуанин, цитозин и урацил. Примеры оснований нуклеиновой кислоты, встречающихся в ДНК, включают, но не ограничиваются ими, аденин, гуанин, цитозин и тимин. Эти основания нуклеиновых кислоты можно модифицировать или полностью заменять для обеспечения полинуклеотидных молекул, обладающих улучшенными свойствами, например, устойчивостью к нуклеазам, стабильностью, и эти свойства могут проявляться нарушением связывания связывающегося с большой бороздкой партнера. Например, нуклеозиды и нуклеотиды, описанные в настоящем описании, могут быть химически модифицированы на поверхности большой бороздки. В некоторых вариантах осуществления химические модификации большой бороздки могут включать аминогруппу, тиольную группу, алкильную группу или группу галогена.
В таблице 1 ниже представлены химические поверхности каждого канонического нуклеотида. Окружностями указаны атомы, составляющие соответствующие химические области.
Figure 00000081
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой модифицированный урацил. Иллюстративные модифицированные соединения урацила включают соединения формулы (b1)-(b5):
Figure 00000082
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
Figure 00000083
представляет собой одинарную или двойную связь;
каждый из T1’, T1", T2′ и T2" независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси или необязательно замещенный тиоалкокси, или комбинация T1’ и T1" или комбинация T2′ и T2", связанных вместе (например, как в T2), образуют O (оксо), S (тио) или Se (селено);
каждый из V1 и V2 независимо представляет собой O, S, N(RVb)nv или C(RVb)nv, где nv представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RVb независимо представляет собой H, галоген, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный галогеналкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный аминоалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил), необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный ациламиноалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил), необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил или необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси (например, необязательно замещенный любым заместителем, описанным в настоящем описании, таким как заместители, выбранные из (1)-(21) для алкила);
R10 представляет собой H, галоген, необязательно замещенную аминокислоту, гидрокси, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил;
R11 представляет собой H или необязательно замещенный алкил;
R12a представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный карбоксиалкил (например, необязательно замещенный гидрокси), необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиаминоалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил; и
R12c представляет собой H, галоген, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный амино, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил.
Другие иллюстративные модифицированные соединения урацила включают соединения, имеющие формулу (b6)-(b9):
Figure 00000084
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
Figure 00000083
представляет собой одинарную или двойную связь;
каждый из T1’, T1", T2′ и T2" независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси или необязательно замещенный тиоалкокси, или комбинация T1’ и T1", связанных вместе (например, как в T1), или комбинация T2′ и T2", связанных вместе (например, как в T2), образуют O (оксо), S (тио) или Se (селено), или каждый T1 и T2 независимо представляет собой O (оксо), S (тио) или Se (селено);
каждый W1 и W2 независимо представляет собой N(RWa)nw или C(RWa)nw, где nw представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RWa независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси;
каждый V3 независимо представляет собой O, S, N(RVa)nv или C(RVa)nv, где nv представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RVa независимо представляет собой H, галоген, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкгетероциклил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси или необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил или сульфоалкилом), необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный ациламиноалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил), необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил, необязательно замещенный алкоксикарбонилацил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкил (например, необязательно замещенный гидрокси и/или O-защитной группой), необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиаминоалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил (например, необязательно замещенный любым заместителем, описанным в настоящем описании, таким как заместители, выбранные из (1)-(21) для алкила), и где RVa и R12c, взятые вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, могут образовывать необязательно замещенный циклоалкил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероциклил (например, 5- или 6-членное кольцо);
R12a представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный карбоксиалкил (например, необязательно замещенный гидрокси и/или O-защитной группой), необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиаминоалкил, необязательно замещенный карбамоилалкил или отсутствует;
R12b представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный алкарил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкгетероциклил, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкоксикарбонилацил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкил (например, необязательно замещенный гидрокси и/или O-защитной группой), необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиаминоалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил,
где комбинация R12b и T1’ или комбинация R12b и R12c, связанных вместе, могут образовывать необязательно замещенный гетероциклил; и
R12c представляет собой H, галоген, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный амино, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил.
Кроме того, иллюстративные модифицированные соединения урацила включают соединения, имеющие формулу (b28)-(b31):
Figure 00000085
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый из T1 и T2 независимо представляет собой O (оксо), S (тио) или Se (селено);
каждый RVb’ и RVb" независимо представляет собой H, галоген, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный галогеналкил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил или сульфоалкил), необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный ациламиноалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил), необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил, необязательно замещенный алкоксикарбонилацил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкил (например, необязательно замещенный гидрокси и/или O-защитной группой), необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиаминоалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил (например, необязательно замещенный любым заместителем, описанным в настоящем описании, таким как заместители, выбранные из (1)-(21) для алкила) (например, RVb’ представляет собой необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил или необязательно замещенный аминоалкил, например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил или сульфоалкил);
R12a представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный карбоксиаминоалкил, необязательно замещенный аминоалкил (например, например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил или сульфоалкил), необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил; и
R12b представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил (например, например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил или сульфоалкил), необязательно замещенный алкоксикарбонилацил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил.
В конкретных вариантах осуществления T1 представляет собой O (оксо), и T2 представляет собой S (тио) или Se (селено). В других вариантах осуществления T1 представляет собой S (тио), и T2 представляет собой O (оксо) или Se (селено). В некоторых вариантах осуществления RVb’ представляет собой H, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси.
В других вариантах осуществления каждый R12a и R12b независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил или необязательно замещенный гидроксиалкил. В конкретных вариантах осуществления R12a представляет собой H. В других вариантах осуществления как R12a, так и R12b представляют собой H.
В некоторых вариантах осуществления каждый RVb’ в R12b независимо представляет собой необязательно замещенный аминоалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например, трифторацетил или сульфоалкил), необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил или необязательно замещенный ациламиноалкил (например, замещенный N-защитной группой, такой как любая из защитных групп, описанных в настоящем описании, например трифторацетил). В некоторых вариантах осуществления амино и/или алкил необязательно замещенного аминоалкила замещен одним или несколькими из необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного сульфоалкила, необязательно замещенного карбокси (например, замещенного O-защитной группой), необязательно замещенного гидрокси (например, замещенного O-защитной группой), необязательно замещенного карбоксиалкила (например, замещенного O-защитной группой), необязательно замещенного алкоксикарбонилалкила (например, замещенного O-защитной группой) или N-защитной группы. В некоторых вариантах осуществления необязательно замещенный аминоалкил замещен необязательно замещенным сульфоалкилом или необязательно замещенным алкенилом. В конкретных вариантах осуществления как R12a, так и RVb" представляют собой H. В конкретных вариантах осуществления T1 представляет собой O (оксо), и T2 представляет собой S (тио) или Se (селено).
В некоторых вариантах осуществления RVb’ представляет собой необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил.
В конкретных вариантах осуществления необязательный заместитель для R12a, R12b, R12c или RVa представляет собой группу полиэтиленгликоля (например, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил); или группу амино-полиэтиленгликоля (например, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил).
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой модифицированный цитозин. Иллюстративные модифицированные соединения цитозина включают соединения формулы (b10)-(b14):
Figure 00000086
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый из T3′ и T3" независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси или необязательно замещенный тиоалкокси, или комбинация T3′ и T3", связанных вместе (например, как в T3), образует O (оксо), S (тио) или Se (селено);
каждый V4 независимо представляет собой O, S, N(RVc)nv или C(RVc)nv, где nv представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RVc независимо представляет собой H, галоген, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкгетероциклил или необязательно замещенный алкинилокси (например, необязательно замещенный любым заместителем, описанным в настоящем описании, таким как заместители, выбранные из (1)-(21) для алкила), где R13b в комбинации с RVc могут быть взяты вместе с образованием необязательно замещенного гетероциклила;
каждый V5 независимо представляет собой N(RVd)nv, или C(RVd)nv, где nv представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RVd независимо представляет собой H, галоген, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкгетероциклил или необязательно замещенный алкинилокси (например, необязательно замещенный любым заместителем, описанным в настоящем описании, таким как заместители, выбранные из (1)-(21) для алкила) (например, V5 представляет собой -CH или N);
каждый из R13a и R13b независимо представляет собой H, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенный ацилоксиалкил, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси, где R13b в комбинации с R14, взятые вместе, могут образовывать необязательно замещенный гетероциклил;
каждый R14 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный галогеналкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил (например, замещенный O-защитной группой), необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный ацилоксиалкил, необязательно замещенный амино (например, -NHR, где R представляет собой H, алкил, арил или фосфорил), азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкгетероциклил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил; и
каждый из R15 и R16 независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил или необязательно замещенный алкинил.
Кроме того, иллюстративные модифицированные соединения цитозина включают соединения, имеющие формулу (b32)-(b35):
Figure 00000087
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый из T1 и T3 независимо представляет собой O (оксо), S (тио) или Se (селено);
каждый из R13a и R13b независимо представляет собой H, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенный ацилоксиалкил, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси, где R13b в комбинации R14, взятые вместе, могут образовывать необязательно замещенный гетероциклил;
каждый R14 независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный галогеналкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил (например, замещенный O-защитной группой), необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный ацилоксиалкил, необязательно замещенный амино (например, -NHR, где R представляет собой H, алкил, арил или фосфорил), азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкгетероциклил, необязательно замещенный аминоалкил (например, гидроксиалкил, алкил, алкенил или алкинил), необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил; и
каждый из R15 и R16 независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил или необязательно замещенный алкинил (например, R15 представляет собой H, и R16 представляет собой H или необязательно замещенный алкил).
В некоторых вариантах осуществления R15 представляет собой H, и R16 представляет собой H или необязательно замещенный алкил. В конкретных вариантах осуществления R14 представляет собой H, ацил или гидроксиалкил. В некоторых вариантах осуществления R14 представляет собой галоген. В некоторых вариантах осуществления как R14, так и R15 представляют собой H. В некоторых вариантах осуществления как R15, так и R16 представляют собой H. В некоторых вариантах осуществления каждый из R14, и R15, и R16 представляет собой H. В следующих вариантах осуществления каждый из R13a и R13b независимо представляет собой H или необязательно замещенный алкил.
Следующие неограничивающие примеры модифицированных соединений цитозина включают соединения формулы (b36):
Figure 00000088
,
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый R13b независимо представляет собой H, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенный ацилоксиалкил, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси, где R13b в комбинации с R14b, взятые вместе, могут образовывать необязательно замещенный гетероциклил;
каждый R14a и R14b независимо представляет собой H, галоген, гидрокси, тиол, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный галогеналкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил (например, замещенный O-защитной группой), необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси, необязательно замещенный аминоалкокси, необязательно замещенный алкоксиалкокси, необязательно замещенный ацилоксиалкил, необязательно замещенный амино (например, -NHR, где R представляет собой H, алкил, арил, фосфорил, необязательно замещенный аминоалкил или необязательно замещенный карбоксиаминоалкил), азидо, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкгетероциклил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил или необязательно замещенный аминоалкинил; и
каждый R15 независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил или необязательно замещенный алкинил.
В конкретных вариантах осуществления R14b представляет собой необязательно замещенную аминокислоту (например, необязательно замещенный лизин). В некоторых вариантах осуществления R14a представляет собой H.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой модифицированный гуанин. Иллюстративные модифицированные соединения гуанина включают соединения формулы (b15)-(b17):
Figure 00000089
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый из T4’, T4", T5′, T5", T6’ и T6" независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси, и где комбинация T4’ и T4" (например, как в T4) или комбинация T5′ и T5" (например, как в T5) или комбинация T6’ и T6", связанных вместе (например, как в T6), образует O (оксо), S (тио) или Se (селено);
каждый из V5 и V6 независимо представляет собой O, S, N(RVd)nv или C(RVd)nv, где nv представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RVd независимо представляет собой H, галоген, тиол, необязательно замещенную аминокислоту, циано, амидин, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси, необязательно замещенный алкинилокси (например, необязательно замещенный любым заместителем, описанным в настоящем описании, таком как заместитель, выбранный из (1)-(21) для алкила), необязательно замещенный тиоалкокси или необязательно замещенный амино; и
каждый из R17, R18, R19a, R19b, R21, R22, R23 и R24 независимо представляет собой H, галоген, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный амино или необязательно замещенную аминокислоту.
Иллюстративные модифицированные соединения гуанозина включают соединения формулы (b37)-(b40):
Figure 00000090
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый из T4’ независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил или необязательно замещенный алкокси, и каждый T4 независимо представляет собой O (оксо), S (тио) или Se (селено);
каждый из R18, R19a, R19b и R21 независимо представляет собой H, галоген, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный тиоалкокси, необязательно замещенный амино или необязательно замещенную аминокислоту.
В некоторых вариантах осуществления R18 представляет собой H или необязательно замещенный алкил. В следующих вариантах осуществления T4 представляет собой оксо. В некоторых вариантах осуществления каждый из R19a и R19b независимо представляет собой H или необязательно замещенный алкил.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой модифицированный аденин. Иллюстративные модифицированные соединения аденина включают соединения формулы (b18)-(b20):
Figure 00000091
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый V7 независимо представляет собой O, S, N(RVe)nv или C(RVe)nv, где nv представляет собой целое число от 0 до 2 и каждый RVe независимо представляет собой H, галоген, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкенилокси или необязательно замещенный алкинилокси (например, необязательно замещенный любым заместителем, описанным в настоящем описании, таким как заместители, выбранные из (1)-(21) для алкила);
каждый R25 независимо представляет собой H, галоген, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный тиоалкокси или необязательно замещенный амино;
каждый из R26a и R26b независимо представляет собой H, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный карбамоилалкил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный алкокси или группу полиэтиленгликоля (например, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил); или группу амино-полиэтиленгликоля (например, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил);
каждый R27 независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный тиоалкокси или необязательно замещенный амино;
каждый R28 независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил или необязательно замещенный алкинил; и
каждый R29 независимо представляет собой H, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный карбамоилалкил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный алкокси или необязательно замещенный амино.
Иллюстративные модифицированные соединения аденина включают соединения формулы (b41)-(b43):
Figure 00000092
или их фармацевтически приемлемую соль или их стереоизомер, где
каждый R25 независимо представляет собой H, галоген, тиол, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный тиоалкокси или необязательно замещенный амино;
каждый из R26a и R26b независимо представляет собой H, необязательно замещенный ацил, необязательно замещенную аминокислоту, необязательно замещенный карбамоилалкил, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный гидроксиалкил, необязательно замещенный гидроксиалкенил, необязательно замещенный гидроксиалкинил, необязательно замещенный алкокси или группу полиэтиленгликоля (например, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил); или группу амино-полиэтиленгликоля (например, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил); и
каждый R27 независимо представляет собой H, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный тиоалкокси или необязательно замещенный амино.
В некоторых вариантах осуществления R26a представляет собой H, и R26b представляет собой необязательно замещенный алкил. В некоторых вариантах осуществления каждый из R26a и R26b независимо представляет собой необязательно замещенный алкил. В конкретных вариантах осуществления R27 представляет собой необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси или необязательно замещенный тиоалкокси. В других вариантах осуществления R25 представляет собой необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкокси или необязательно замещенный тиоалкокси.
В конкретных вариантах осуществления необязательный заместитель для R26a, R26b или R29 представляет собой группу полиэтиленгликоля (например, -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил); или группу амино-полиэтиленгликоля (например, -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил).
В некоторых вариантах осуществления B может иметь формулу (b21):
Figure 00000093
где X12 независимо представляет собой O, S, необязательно замещенный алкилен (например, метилен) или необязательно замещенный гетероалкилен, xa представляет собой целое число от 0 до 3, и R12a и T2 являются такими, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления B может иметь формулу (b22):
Figure 00000094
где R10’ независимо представляет собой необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил, и R11, R12a, T1 и T2 являются такими, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления B может иметь формулу (b23):
Figure 00000095
где R10 представляет собой необязательно замещенный гетероциклил (например, необязательно замещенный фурил, необязательно замещенный тиенил или необязательно замещенный пирролил), необязательно замещенный арил (например, необязательно замещенный фенил или необязательно замещенный нафтил) или любой заместитель, описанный в настоящем описании (например, для R10); и где R11 (например, H или любой заместитель, описанный в настоящем описании), R12a (например, H или любой заместитель, описанный в настоящем описании), T1 (например, оксо или любой заместитель, описанный в настоящем описании) и T2 (например, оксо или любой заместитель, описанный в настоящем описании) являются такими, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления B может иметь формулу (b24):
Figure 00000096
где R14’ независимо представляет собой необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил, необязательно замещенный алкарил, необязательно замещенный алкгетероциклил, необязательно замещенный аминоалкил, необязательно замещенный аминоалкенил, необязательно замещенный аминоалкинил, необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкенил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкинил, необязательно замещенный алкоксикарбонилалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкокси, необязательно замещенный карбоксиалкил или необязательно замещенный карбамоилалкил, и R13a, R13b, R15 и T3 являются такими, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления B может иметь формулу (b25):
Figure 00000097
где R14’ представляет собой необязательно замещенный гетероциклил (например, необязательно замещенный фурил, необязательно замещенный тиенил или необязательно замещенный пирролил), необязательно замещенный арил (например, необязательно замещенный фенил или необязательно замещенный нафтил) или любой заместитель, описанный в настоящем описании (например, для R14 или R14’); и где R13a (например, H или любой заместитель, описанный в настоящем описании), R13b (например, H или любой заместитель, описанный в настоящем описании), R15 (например, H или любой заместитель, описанный в настоящем описании) и T3 (например, оксо или любой заместитель, описанный в настоящем описании) являются такими, как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты, выбранное из группы, состоящей из цитозина, гуанина, аденина и урацила. В некоторых вариантах осуществления B может представлять собой:
Figure 00000098
В некоторых вариантах осуществления модифицированное основание нуклеиновой кислоты представляет собой модифицированный урацил. Иллюстративные основания нуклеиновой кислоты и нуклеозиды, имеющие модифицированный урацил, включают псевдоуридин (ψ), пиридин-4-он-рибонуклеозид, 5-азауридин, 6-азауридин, 2-тио-5-азауридин, 2-тиоуридин (s2U), 4-тиоуридин (s4U), 4-тиопсевдоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 5-гидроксиуридин (ho5U), 5-аминоаллилуридин, 5-галогенуридин (например, 5-йодуридин или 5-бромуридин), 3-метилуридин (m3U), 5-метоксиуридин (mo5U), уридин-5-оксиуксусную кислоту (cmo5U), метиловый эфир уридин-5-оксиуксусной кислоты (mcmo5U), 5-карбоксиметилуридин (cm5U), 1-карбоксиметилпсевдоуридин, 5-карбоксигидроксиметилуридин (chm5U), метиловый эфир 5-карбоксигидроксиметилуридина (mchm5U), 5-метоксикарбонилметил-уридин (mcm5U), 5-метоксикарбонилметил-2-тиоуридин (mcm5s2U), 5-аминометил-2-тиоуридин (nm5s2U), 5-метиламинометилуридин (mnm5U), 5-метиламинометил-2-тиоуридин (mnm5s2U), 5-метиламинометил-2-селеноуридин (mnm5se2U), 5-карбамоилметилуридин (ncm5U), 5-карбоксиметиламинометилуридин (cmnm5U), 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин (cmnm5s2U), 5-пропинилуридин, 1-пропинилпсевдоуридин, 5-тауринометилуридин (τm5U), 1-тауринометилпсевдоуридин, 5-тауринометил-2-тиоуридин(τm5s2U), 1-тауринометил-4-тиопсевдоуридин, 5-метилуридин (m5U, т.е. имеющий основание нуклеиновой кислоты дезокситимин), 1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 5-метил-2-тиоуридин (m5s2U), 1-метил-4-тиопсевдоуридин (m1s4ψ), 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 3-метилпсевдоуридин (m3ψ), 2-тио-1-метилпсевдоуридин, 1-метил-1-деазапсевдоуридин, 2-тио-1-метил-1-деазапсевдоуридин, дигидроуридин (D), дигидропсевдоуридин, 5,6-дигидроуридин, 5-метилдигидроуридин (m5D), 2-тиодигидроуридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-метоксиуридин, 2-метокси-4-тиоуридин, 4-метоксипсевдоуридин, 4-метокси-2-тиопсевдоуридин, N1-метилпсевдоуридин, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин (acp3U), 1-метил-3-(3-амино-3-карбоксипропил)псевдоуридин (acp3ψ), 5-(изопентениламинометил)уридин (inm5U), 5-(изопентениламинометил)-2-тиоуридин (inm5s2U), α-тиоуридин, 2′-O-метилуридин (Um), 5,2′-O-диметилуридин (m5Um), 2′-O-метилпсевдоуридин (ψm), 2-тио-2′-O-метилуридин (s2Um), 5-метоксикарбонилметил-2′-O-метилуридин (mcm5Um), 5-карбамоилметил-2′-O-метилуридин (ncm5Um), 5-карбоксиметиламинометил-2′-O-метилуридин (cmnm5Um), 3,2′-O-диметилуридин (m3Um) и 5-(изопентениламинометил)-2′-O-метилуридин (inm5Um) 1-тиоуридин, дезокситимидин, 2'-F-арауридин, 2ʹ-F-уридин, 2ʹ-OH-арауридин, 5-(2-карбометоксивинил)уридин и 5-[3-(1-Е-пропениламино)уридин].
В некоторых вариантах осуществления модифицированное основание нуклеиновой кислоты представляет собой модифицированный цитозин. Иллюстративные основания нуклеиновой кислоты и нуклеозиды, имеющие модифицированный цитозин, включают 5-азацитидин, 6-азацитидин, псевдоизоцитидин, 3-метилцитидин (m3C), N4-ацетилцитидин (ac4C), 5-формилцитидин (f5C), N4-метилцитидин (m4C), 5-метилцитидин (m5C), 5-галогенцитидин (например, 5-йодцитидин), 5-гидроксиметилцитидин (hm5C), 1-метилпсевдоизоцитидин, пирролоцитидин, пирролопсевдоизоцитидин, 2-тиоцитидин (s2C), 2-тио-5-метилцитидин, 4-тиопсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метилпсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метил-1-деазапсевдоизоцитидин, 1-метил-1-деазапсевдоизоцитидин, зебуларин, 5-азазебуларин, 5-метилзебуларин, 5-аза-2-тиозебуларин, 2-тиозебуларин, 2-метоксицитидин, 2-метокси-5-метилцитидин, 4-метоксипсевдоизоцитидин, 4-метокси-1-метилпсевдоизоцитидин, лизидин (k2C), α-тиоцитидин, 2′-O-метилцитидин (Cm), 5,2′-O-диметилцитидин (m5Cm), N4-ацетил-2′-O-метилцитидин (ac4Cm), N4,2′-O-диметилцитидин (m4Cm), 5-формил-2′-O-метилцитидин (f5Cm), N4,N4,2′-O-триметилцитидин (m4 2Cm), 1-тиоцитидин, 2ʹ-F-арацитидин, 2ʹ-F-цитидин и 2ʹ-OH-арацитидин.
В некоторых вариантах осуществления модифицированное основание нуклеиновой кислоты представляет собой модифицированный аденин. Иллюстративные основания нуклеиновой кислоты и нуклеозиды, имеющие модифицированный аденин, включают 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 2-амино-6-галогенпурин (например, 2-амино-6-хлорпурин), 6-галогенпурин (например, 6-хлорпурин), 2-амино-6-метилпурин, 8-азидоаденозин, 7-деазааденин, 7-деаза-8-азааденин, 7-деаза-2-аминопурин, 7-деаза-8-аза-2-аминопурин, 7-деаза-2,6-диаминопурин, 7-деаза-8-аза-2,6-диаминопурин, 1-метиладенозин (m1A), 2-метиладенин (m2A), N6-метиладенозин (m6A), 2-метилтио-N6-метиладенозин (ms2m6A), N6-изопентениладенозин (i6A), 2-метилтио-N6-изопентениладенозин (ms2i6A), N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин (io6A), 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин (ms2io6A), N6-глицинилкарбамоиладенозин (g6A), N6-треонилкарбамоиладенозин (t6A), N6-метил-N6-треонилкарбамоиладенозин (m6t6A), 2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозин (ms2g6A), N6,N6-диметиладенозин (m6 2A), N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин (hn6A), 2-метилтио-N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин (ms2hn6A), N6-ацетиладенозин (ac6A), 7-метиладенин, 2-метилтиоаденин, 2-метоксиаденин, α-тиоаденозин, 2′-O-метиладенозин (Am), N6,2′-O-диметиладенозин (m6Am), N6,N6,2′-O-триметиладенозин (m6 2Am), 1,2′-O-диметиладенозин (m1Am), 2′-O-рибозиладенозин (фосфат) (Ar(p)), 2-амино-N6-метилпурин, 1-тиоаденозин, 8-азидоаденозин, 2ʹ-F-арааденозин, 2ʹ-F-аденозин, 2ʹ-OH-арааденозин и N6-(19-аминопентаоксанонадецил)аденозин.
В некоторых вариантах осуществления модифицированное основание нуклеиновой кислоты представляет собой модифицированный гуанин. Иллюстративные основания нуклеиновых кислот и нуклеозиды, имеющие модифицированный гуанин, включают инозин (I), 1-метилинозин (m1I), виозин (imG), метилвиозин (mimG), 4-деметилвиозин (imG-14), изовиозин (imG2), вибутозин (yW), пероксивибутозин (o2yW), гидроксивибутозин (OHyW), недостаточно модифицированный гидроксивибутозин (OHyW*), 7-деазагуанозин, квеуозин (Q), эпоксиквеуозин (oQ), галактозилквеуозин (galQ), маннозилквеуозин (manQ), 7-циано-7-деазагуанозин (preQ0), 7-аминометил-7-деазагуанозин (preQ1), археозин (G+), 7-деаза-8-азагуанозин, 6-тиогуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин, 7-метилгуанозин (m7G), 6-тио-7-метилгуанозин, 7-метилинозин, 6-метоксигуанозин, 1-метилгуанозин (m1G), N2-метилгуанозин (m2G), N2,N2-диметилгуанозин (m2 2G), N2,7-диметилгуанозин (m2,7G), N2,N2,7-диметилгуанозин (m2,2,7G), 8-оксогуанозин, 7-метил-8-оксо-гуанозин, 1-метил-6-тиогуанозин, N2-метил-6-тиогуанозин, N2,N2-диметил-6-тиогуанозин, α-тиогуанозин, 2′-O-метилгуанозин (Gm), N2-метил-2′-O-метилгуанозин (m2Gm), N2,N2-диметил-2′-O-метилгуанозин (m2 2Gm), 1-метил-2′-O-метилгуанозин (m1Gm), N2,7-диметил-2′-O-метилгуанозин (m2,7Gm), 2′-O-метилинозин (Im), 1,2′-O-диметилинозин (m1Im), 2′-O-рибозилгуанозин (фосфат) (Gr(p)), 1-тиогуанозин, О6-метилгуанозин, 2ʹ-F-арагуанозин и 2ʹ-F-гуанозин.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотид может быть модифицирован на поверхности большой бороздки. Например, такие модификации включают замену водорода в положении C-5 урацила или цитозина алкилом (например, метилом) или галогеном.
Основание нуклеиновой кислоты нуклеотида может быть независимо выбрано из пурина, пиримидина, аналога пурина или пиримидина. Например, каждое основание нуклеиновой кислоты может быть независимо выбрано из аденина, цитозина, гуанина, урацила или гипоксантина. В другом варианте осуществления основание нуклеиновой кислоты также может включать, например, встречающиеся в природе и синтетические производные основания, включая пиразолo[3,4-d]пиримидины, 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген (например, 8-бром), 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, деазагуанин, 7-деазагуанин, 3-деазагуанин, деазааденин, 7-деазааденин, 3-деазааденин, пиразоло[3,4-d]пиримидин, имидазо[1,5-a]1,3,5-триазиноны, 9-деазапурины, имидазо[4,5-d]пиразины, тиазолo[4,5-d]пиримидины, пиразин-2-оны, 1,2,4-триазин, пиридазин; и 1,3,5-триазин. Когда нуклеотиды представлены с использованием краткого обозначения A, G, C, T или U, каждая буква относится к репрезентативному основанию и/или его производным, например, A включает аденин или аналоги аденина, например, 7-деазааденин).
В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид представляет собой соединение формулы XI:
Figure 00000099
,
где:
Figure 00000083
обозначает одинарную или двойную связь;
Figure 00000002
обозначает необязательную одинарную связь;
U представляет собой O, S, -NRa- или -CRaRb-, когда
Figure 00000083
обозначает одинарную связь, или U представляет собой -CRa-, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь;
Z представляет собой H, C1-12 алкил или C6-20 арил, или Z отсутствует, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь; и
Z может представлять собой -CRaRb- и образует связь с A;
A представляет собой H, OH, NHR, где R = алкил или арил, или фосфорил, сульфат, -NH2, N3, азидо, -SH, N представляет собой аминокислоту, или пептид, содержащий 1-12 аминокислот;
D представляет собой H, OH, NHR, где R = алкил или арил, или фосфорил, -NH2, -SH, аминокислоту, пептид, пептид, содержащий 1-12 аминокислот, или группу формулы XII:
Figure 00000100
,
или A и D вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, образуют 5-членное кольцо;
X представляет собой O или S;
каждый из Y1 независимо выбран из -ORa1, -NRa1Rb1 и -SRa1;
каждый из Y2 и Y3 независимо выбран из O, -CRaRb-, NRc, S или линкера, содержащего один или несколько атомов, выбранных из группы, состоящей из C, O, N и S;
n равно 0, 1, 2 или 3;
m равно 0, 1, 2 или 3;
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, C2-12 алкинил или C6-20 арил;
Rc представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля;
каждый из Ra1 и Rb1 независимо представляет собой H или противоион; и
-ORc1 представляет собой OH при pH приблизительно 1 или -ORc1 представляет собой O- при физиологических значениях pH;
при условии, что кольцо, охватывающее переменные A, B, D, U, Z, Y2 и Y3, не может представлять собой рибозу.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты, выбранное из группы, состоящей из цитозина, гуанина, аденина и урацила.
В некоторых вариантах осуществления основание нуклеиновой кислоты представляет собой пиримидин или его производное.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой соединение формулы XI-a:
Figure 00000101
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой соединение формулы XI-b:
Figure 00000102
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой соединение формулы XI-c1, XI-c2 или XI-c3:
Figure 00000103
Figure 00000104
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой соединение формулы XI:
Figure 00000105
,
где:
Figure 00000083
обозначает одинарную или двойную связь;
Figure 00000002
обозначает необязательную одинарную связь;
U представляет собой O, S, -NRa- или -CRaRb-, когда
Figure 00000083
обозначает одинарную связь, или U представляет собой -CRa-, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь;
Z представляет собой H, C1-12 алкил или C6-20 арил, или Z отсутствует, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь; и
Z может представлять собой -CRaRb- и образует связь с A;
A представляет собой H, OH, сульфат, -NH2, -SH, аминокислоту или пептид, содержащий 1-12 аминокислот;
D представляет собой H, OH, -NH2, -SH, аминокислоту, пептид, содержащий 1-12 аминокислот, или группу формулы XII:
Figure 00000106
,
или A и D, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют 5-членное кольцо;
X представляет собой O или S;
каждый из Y1 независимо выбран из -ORa1, -NRa1Rb1 и -SRa1;
каждый из Y2 и Y3 независимо выбран из O, -CRaRb-, NRc, S или линкера, содержащего один или несколько атомов, выбранных из группы, состоящей из C, O, N и S;
n равно 0, 1, 2 или 3;
m равно 0, 1, 2 или 3;
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XIII:
Figure 00000107
,
где:
V представляет собой N или положительно заряженный NRc;
R3 представляет собой NRcRd, -ORa или -SRa;
R4 представляет собой H или необязательно может образовывать связь с Y3;
R5 представляет собой H, -NRcRd или -ORa;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, C2-12 алкинил или C6-20 арил;
Rc представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля;
каждый из Ra1 и Rb1 независимо представляет собой H или противоион; и
-ORc1 представляет собой OH при pH приблизительно 1 или -ORc1 представляет собой O- при физиологических значениях pH.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой:
Figure 00000108
,
где R3 представляет собой -OH, -SH или
Figure 00000109
.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой:
Figure 00000110
.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой:
Figure 00000111
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой соединение формулы I-d:
Figure 00000112
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой соединение, выбранное из группы, состоящей из:
Figure 00000113
Figure 00000114
Figure 00000115
или их фармацевтически приемлемую соль.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды представляют собой соединение, выбранное из группы, состоящей из:
Figure 00000116
Figure 00000117
Figure 00000118
или их фармацевтически приемлемую соль.
Модификации межнуклеотидной связи
Модифицированные нуклеотиды, которые могут быть включены в полинуклеотидную молекулу, могут быть модифицированными по межнуклеозидной связи (например, фосфатный остов). В настоящем описании, в контексте полинуклеотидного остова, выражения "фосфатный" и "фосфодиэфирный" используют взаимозаменяемо. Фосфатные группы основной цепи можно модифицировать путем замены одного или нескольких атомов кислорода отличающимся заместителем. Кроме того, модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать полную замену немодифицированной фосфатной части другой межнуклеозидной частью, как описано в настоящем описании. Примеры модифицированных фосфатных групп включают, но не ограничиваются ими, фосфоротиоат, фосфороселенаты, боранофосфаты, боранофосфатные сложные эфиры, гидрофосфонаты, фосфорамидаты, фосфородиамидаты, алкил- или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. В фосфородитиоатах оба несвязывающих атома кислорода заменены серой. Фосфатный линкер также может быть модифицирован путем замены связывающего кислорода азотом (мостиковые фосфорамидаты), серой (мостиковые фосфоротиоаты) и углеродом (мостиковые метиленфосфонаты).
α-тио-замещенную фосфатную часть вносят для сообщения стабильности полимерам РНК и ДНК через неприродные фосфоротиоатные связи остова. Фосфоротиоатная ДНК и РНК имеют повышенную устойчивость к нуклеазам и, следовательно, более длительное время полужизни в клеточном окружении. Без связи с теорией, ожидается, что связанные фосфоротиоатом полинуклеотидные молекулы также уменьшают врожденный иммунный ответ через более слабое связывание/активацию молекул врожденного клеточного иммунитета.
В конкретных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид включает альфа-тионуклеозид (например, 5′-O-(1-тиофосфат)аденозин, 5′-O-(1-тиофосфат)цитидин (α-тиоцитидин), 5′-O-(1-тиофосфат)гуанозин, 5′-O-(1-тиофосфат)уридин или 5′-O-(1-тиофосфат)псевдоуридин).
Другие межнуклеозидные связи, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включая межнуклеозидные связи, которые не содержат атома фосфора, описаны в настоящем описании ниже.
Комбинации модифицированных сахаров, оснований нуклеиновых кислот и межнуклеозидных связей
Полинуклеотиды по изобретению могут включать комбинацию модификаций сахара, основания нуклеиновой кислоты и/или межнуклеозидной связи. Эти комбинации могут включать любую одну или несколько модификаций, описанных в настоящем описании. Например, любые из нуклеотидов, описанных в настоящем описании в формулах (Ia), (Ia-1)-(Ia-3), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) и (IXa)-(IXr), можно комбинировать с любым из оснований нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем описании (например, в формулах (b1)-(b43) или любых других формулах, описанных в настоящем описании).
Синтез полинуклеотидных молекул
Полинуклеотидные молекулы для применения в соответствии с изобретением можно получать в соответствии с любым пригодным способом, как описано в настоящем описании. Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, используемые в синтезе полинуклеотидных молекул, описанных в настоящем описании, можно получать из легкодоступных исходных материалов с использованием следующих общих способов и методик. Когда предоставлены типичные или предпочтительные условия процесса (например, температуры реакции, время, молярные соотношения реагентов, растворители, давление и т.д.), квалифицированный специалист может быть способен оптимизировать и разработать дополнительные условия процесса. Оптимальные условия реакции могут варьировать, в зависимости от конкретных используемых реагентов и растворителей, однако такие условия могут быть определены специалистом в данной области с помощью методик стандартного оптимизирования.
Мониторинг способов, описанных в настоящем описании, можно проводить любым подходящим способом, известным в данной области. Например, мониторинг образования продукта можно проводить спектроскопическими способами, такими как ядерная магнитно-резонансная спектроскопия (например, 1H или 13C), инфракрасная спектроскопия, спектрофотометрия (например, УФ-видимая) или масс-спектрометрия, или хроматографией, такой как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или тонкослойная хроматография.
Получение полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению может вовлекать внесение и удаление защитной группы на различные химические группы. Специалист в данной области может без труда определить потребность во внесении и удалении защитных групп и может выбрать подходящие защитные группы. Химия защитных групп описана, например, в Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., Wiley & Sons, 1991, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Реакции процессов, описанных в настоящем описании, можно проводить в подходящих растворителях, которые может без труда выбрать специалист в области органического синтеза. Подходящие растворители могут быть по существу нереакционноспособными в отношении исходных материалов (реагентов), промежуточных соединений или продуктов при температурах, при которых проводят реакции, т.е. при температурах, которые могут находиться от температуры замерзания растворителя до температуры кипения растворителя. Конкретную реакцию можно проводить в растворителе или смеси более чем одного растворителя. В зависимости от конкретной стадии реакции, можно выбирать подходящие растворители.
Разделение рацемических смесей модифицированных полинуклеотидов или нуклеиновых кислот (например, полинуклеотиды или модифицированные молекулы мРНК) можно проводить любым из многочисленных способов, известных в данной области. Иллюстративный способ включает фракционную перекристаллизацию с использованием "хиральной разделяющей кислоты", которая является оптически активной солеобразующей органической кислотой. Подходящие разделяющие агенты для способов фракционной перекристаллизации представляют собой, например, оптически активные кислоты, такие как D- и L-формы виннокаменной кислоты, диацетилвиннокаменной кислоты, дибензоилвиннокаменной кислоты, миндальной кислоты, яблочной кислоты, молочной кислоты или различных оптически активных камфорсульфоновых кислот. Разделение рацемических смесей также можно проводить путем элюирования на колонке, упакованной оптически активным разделяющим агентом (например, динитробензоилфенилглицин). Специалист в данной области может определить подходящую композицию растворителей для элюирования.
Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды (например, молекулы структурных элементов) можно получать в соответствии со способами синтеза, описанными в Ogata et al., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal et al., Nucl. Acids Res. 22(1):72-78, (1994); Fukuhara et al., Biochemistry, 1(4):563-568 (1962); и Xu et al., Tetrahedron, 48(9):1729-1740 (1992), каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Полинуклеотиды по изобретению могут быть или могут не быть единообразно модифицированными вдоль всей длины молекулы. Например, один или несколько или все типы нуклеотидов (например, пурин или пиримидин, или любой один или несколько или все из A, G, U, C) могут быть единообразно модифицированными в полинуклеотиде по изобретению, или в его данной области с заданной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотиды X в полинуклеотиде по изобретению (или в его данной области последовательности) являются модифицированными, где X может представлять собой любые из нуклеотидов A, G, U, C, или любую из комбинаций A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C или A+G+C.
Различные модификации сахаров, модификации нуклеотидов и/или межнуклеозидных связей (например, структур остова) могут существовать в различных положениях в полинуклеотиде. Специалисту в данной области будет понятно, что нуклеотидные аналоги или другая модификация(и) могут быть расположены в любом положении(ях) полинуклеотида, так чтобы функция полинуклеотида существенно не снижалась. Модификация также может представлять собой 5′- или 3′-концевую модификацию. Полинуклеотид может содержать от приблизительно 1% до приблизительно 100% модифицированных нуклеотидов (либо в отношении общего содержания нуклеотидов, либо в отношении одного или нескольких типов нуклеотидов, т.е. любого одного или нескольких из A, G, U или C) или любой промежуточный процент (например, от 1% до 20%, от 1% до 25%, от 1% до 50%, от 1% до 60%, от 1% до 70%, от 1% до 80%, от 1% до 90%, от 1% до 95%, от 10% до 20%, от 10% до 25%, от 10% до 50%, от 10% до 60%, от 10% до 70%, от 10% до 80%, от 10% до 90%, от 10% до 95%, от 10% до 100%, от 20% до 25%, от 20% до 50%, от 20% до 60%, от 20% до 70%, от 20% до 80%, от 20% до 90%, от 20% до 95%, от 20% до 100%, от 50% до 60%, от 50% до 70%, от 50% до 80%, от 50% до 90%, от 50% до 95%, от 50% до 100%, от 70% до 80%, от 70% до 90%, от 70% до 95%, от 70% до 100%, от 80% до 90%, от 80% до 95%, от 80% до 100%, от 90% до 95%, от 90% до 100% и от 95% до 100%).
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает модифицированный пиримидин (например, модифицированный урацил/уридин/U или модифицированный цитозин/цитидин/C). В некоторых вариантах осуществления урацил или уридин (как правило: U) в полинуклеотидной молекуле может быть заменен посредством от приблизительно 1% до приблизительно 100% модифицированного урацила или модифицированного уридина (например, от 1% до 20%, от 1% до 25%, от 1% до 50%, от 1% до 60%, от 1% до 70%, от 1% до 80%, от 1% до 90%, от 1% до 95%, от 10% до 20%, от 10% до 25%, от 10% до 50%, от 10% до 60%, от 10% до 70%, от 10% до 80%, от 10% до 90%, от 10% до 95%, от 10% до 100%, от 20% до 25%, от 20% до 50%, от 20% до 60%, от 20% до 70%, от 20% до 80%, от 20% до 90%, от 20% до 95%, от 20% до 100%, от 50% до 60%, от 50% до 70%, от 50% до 80%, от 50% до 90%, от 50% до 95%, от 50% до 100%, от 70% до 80%, от 70% до 90%, от 70% до 95%, от 70% до 100%, от 80% до 90%, от 80% до 95%, от 80% до 100%, от 90% до 95%, от 90% до 100% и от 95% до 100% модифицированного урацила или модифицированного уридина). Модифицированный урацил или уридин могут быть заменены соединением, имеющим одну уникальную структуру, или множеством соединений, имеющих различных структуры (например, 2, 3, 4 или более уникальных структур, как описано в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления цитозин или цитидин (в общем: C) в полинуклеотидной молекуле может быть заменен модифицированным цитозином или модифицированным цитидином на от приблизительно 1% до приблизительно 100% (например, от 1% до 20%, от 1% до 25%, от 1% до 50%, от 1% до 60%, от 1% до 70%, от 1% до 80%, от 1% до 90%, от 1% до 95%, от 10% до 20%, от 10% до 25%, от 10% до 50%, от 10% до 60%, от 10% до 70%, от 10% до 80%, от 10% до 90%, от 10% до 95%, от 10% до 100%, от 20% до 25%, от 20% до 50%, от 20% до 60%, от 20% до 70%, от 20% до 80%, от 20% до 90%, от 20% до 95%, от 20% до 100%, от 50% до 60%, от 50% до 70%, от 50% до 80%, от 50% до 90%, от 50% до 95%, от 50% до 100%, от 70% до 80%, от 70% до 90%, от 70% до 95%, от 70% до 100%, от 80% до 90%, от 80% до 95%, от 80% до 100%, от 90% до 95%, от 90% до 100% и от 95% до 100% модифицированного цитозина или модифицированного цитидина). Модифицированный цитозин или цитидин могут быть заменены соединением, имеющим одну уникальную структуру, или множеством соединений, имеющих различные структуры (например, 2, 3, 4 или более уникальных структур, как описано в настоящем описании).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам синтеза полинуклеотида (например, первая область, первая фланкирующая область или вторая фланкирующая область), включающего число n связанных нуклеозидов, имеющих формулу (Ia-1):
Figure 00000119
включающим:
a) реакцию нуклеотида формулы (IV-1):
Figure 00000120
с фосфорамидитом соединения формулы (V-1):
Figure 00000121
где Y9 представляет собой H, гидрокси, фосфорил, пирофосфат, сульфат, амино, тиол, необязательно замещенную аминокислоту или пептид (например, включающий от 2 до 12 аминокислот); и каждый P1, P2 и P3 независимо представляет собой подходящую защитную группу; и
Figure 00000122
обозначает твердую подложку;
с получением полинуклеотида формулы (VI-1):
Figure 00000123
, и
b) окисление или сульфуризацию полинуклеотида формулы (V) с получением полинуклеотида формулы (VII-1):
Figure 00000124
и
c) удаление защитных групп с получением полинуклеотида формулы (Ia).
В некоторых вариантах осуществления стадии a) и b) повторяют от 1 до приблизительно 10000 раз. В некоторых вариантах осуществления способы, кроме того, включают нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из A, C, G и U: аденозина, цитозина, гуанозина и урацила. В некоторых вариантах осуществления основание нуклеиновой кислоты может представлять собой пиримидин или его производное. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид является транслируемым.
Другие компоненты полинуклеотидов являются необязательными и в некоторых вариантах осуществления являются пригодными. Например, предусматривается 5′-нетранслируемая область (UTR) и/или 3′UTR, где любой или оба из них могут независимо содержать одну или несколько различных нуклеотидных модификаций. В таких вариантах осуществления нуклеотидные модификации также могут присутствовать в транслируемой области. Также предусматриваются полинуклеотиды, содержащие последовательность Козака.
Комбинации нуклеотидов
Следующие примеры модифицированных нуклеотидов и комбинаций модифицированных нуклеотидов представлены ниже в таблице 2. Эти комбинации модифицированных нуклеотидов можно использовать для получения полинуклеотидов по изобретению. Если нет иных указаний, модифицированные нуклеотиды могут полностью заменять природные нуклеотиды полинуклеотидов по изобретению. В качестве неограничивающего примера, природный нуклеотид уридин может быть заменен модифицированным нуклеозидом, описанным в настоящем описании. В другом неограничивающем примере природный нуклеотид уридин может быть частично заменен (например, приблизительно 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99,9%) по меньшей мере одним из модифицированных нуклеозидов, описанных в настоящем описании.
Таблица 2
Модифицированный нуклеотид Комбинация модифицированных нуклеотидов
α-тиоцитидин α-тиоцитидин/5-йодуридин
α-тиоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
α-тиоцитидин/α-тиоуридин
α-тиоцитидин/5-метилуридин
α-тиоцитидин/псевдоуридин
приблизительно 50% остатков цитозина представляют собой α-тиоцитидин
псевдоизоцитидин псевдоизоцитидин/5-йодуридин
псевдоизоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
псевдоизоцитидин/α-тиоуридин
псевдоизоцитидин/5-метилуридин
псевдоизоцитидин/псевдоуридин
приблизительно 25% остатков цитозина представляют собой псевдоизоцитидин
псевдоизоцитидин/приблизительно 50% остатков уридина представляют собой N1-метилпсевдоуридин и приблизительно 50% остатков уридина представляют собой псевдоуридин
псевдоизоцитидин/приблизительно 25% остатков уридина представляют собой N1-метилпсевдоуридин и приблизительно 25% остатков уридина представляют собой псевдоуридин
(например, 25% N1-метилпсевдоуридин/75% псевдоуридин)
пирролоцитидин пирролоцитидин/5-йодуридин
пирролоцитидин/N1-метилпсевдоуридин
пирролоцитидин/α-тиоуридин
пирролоцитидин/5-метилуридин
пирролоцитидин/псевдоуридин
приблизительно 50% остатков цитозина представляют собой пирролоцитидин
5-метилцитидин 5-метилцитидин/5-йодуридин
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин
5-метилцитидин/α-тиоуридин
5-метилцитидин/5-метилуридин
5-метилцитидин/псевдоуридин
приблизительно 25% остатков цитозина представляют собой 5-метилцитидин
приблизительно 50% остатков цитозина представляют собой 5-метилцитидин
5-метилцитидин/5-метоксиуридин
5-метилцитидин/5-бромуридин
5-метилцитидин/2-тиоуридин
5-метилцитидин/приблизительно 50% остатков уридина представляют собой 2-тиоуридин
приблизительно 50% остатков уридина представляют собой 5-метилцитидин/приблизительно 50% остатков уридина представляют собой 2-тиоуридин
N4-ацетилцитидин N4-ацетилцитидин/5-йодуридин
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин
N4-ацетилцитидин/α-тиоуридин
N4-ацетилцитидин/5-метилуридин
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин
приблизительно 50% остатков цитозина представляют собой N4-ацетилцитидин
приблизительно 25% остатков цитозина представляют собой N4-ацетилцитидин
N4-ацетилцитидин/5-метоксиуридин
N4-ацетилцитидин/5-бромуридин
N4-ацетилцитидин/2-тиоуридин
приблизительно 50% остатков цитозина представляют собой N4-ацетилцитидин/приблизительно 50% остатков уридина представляют собой 2-тиоуридин
Определенные модифицированные нуклеотиды и комбинации нуклеотидов исследованы авторами настоящего изобретения. Эти данные описаны во временной заявке США № 61/404413, поданной 1 октября 2010 года, под названием Engineered Nucleic Acids and Methods of Use Thereof, патентной заявке США № 13/251840, поданной 3 октября 2011 года, под названием Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, в настоящее время аннулированной, патентной заявке США № 13/481127, поданной 25 мая 2012 года, под названием Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, международной публикации патента № WO2012045075, поданной 3 октября 2011 года, под названием Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, публикации патента США № US20120237975, поданной 3 октября 2011 года, под названием Engineered Nucleic Acids and Method of Use Thereof, и международной публикации патента № WO2012045082, которые включены в качестве ссылок в полном объеме.
Следующие примеры комбинаций модифицированных нуклеотидов представлены в таблице 3 ниже. Эти комбинации модифицированных нуклеотидов можно использовать для получения полинуклеотидов по изобретению.
Таблица 3
Модифицированный нуклеотид Комбинация модифицированных нуклеотидов
модифицированный цитидин, имеющий одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты формулы (b10) модифицированный цитидин (b10)/псевдоуридин
модифицированный цитидин (b10)/N1-метилпсевдоуридин
модифицированный цитидин (b10)/5-метоксиуридин
модифицированный цитидин (b10)/5-метилуридин
модифицированный цитидин (b10)/5-бромуридин
модифицированный цитидин (b10)/2-тиоуридин
приблизительно 50% цитидина заменено на модифицированный цитидин (b10)/приблизительно 50% остатков уридина представляют собой 2-тиоуридин
модифицированный цитидин, имеющий одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты формулы (b32) модифицированный цитидин (b32)/псевдоуридин
модифицированный цитидин (b32)/N1-метилпсевдоуридин
модифицированный цитидин (b32)/5-метоксиуридин
модифицированный цитидин (b32)/5-метилуридин
модифицированный цитидин (b32)/5-бромуридин
модифицированный цитидин (b32)/2-тиоуридин
приблизительно 50% остатков цитидина заменено модифицированным цитидином (b32)/приблизительно 50% остатков уридина представляют собой 2-тиоуридин
модифицированный уридин, имеющий одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты формулы (b1) модифицированный уридин (b1)/N4-ацетилцитидин
модифицированный уридин (b1)/5-метилцитидин
модифицированный уридин, имеющий одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты формулы (b8) модифицированный уридин (b8)/N4-ацетилцитидин
модифицированный уридин (b8)/5-метилцитидин
модифицированный уридин, имеющий одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты формулы (b28) модифицированный уридин (b28)/N4-ацетилцитидин
модифицированный уридин (b28)/5-метилцитидин
модифицированный уридин, имеющий одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты формулы (b29) модифицированный уридин (b29)/N4-ацетилцитидин
модифицированный уридин (b29)/5-метилцитидин
модифицированный уридин, имеющий одно или несколько оснований нуклеиновой кислоты формулы (b30) модифицированный уридин (b30)/N4-ацетилцитидин
модифицированный уридин (b30)/5-метилцитидин
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% остатков цитозина заменено соединением формулы (b10)-(b14), (b24), (b25) или (b32)-(b35) (например, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100%, например, соединения формулы (b10) или (b32)).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% остатков урацила заменено соединением формулы (b1)-(b9), (b21)-(b23) или (b28)-(b31) (например, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100%, например, соединения формулы (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% остатков цитозина заменено соединением формулы (b10)-(b14), (b24), (b25) или (b32)-(b35) (например, формулы (b10) или (b32)), и по меньшей мере 25% остатков урацила заменено соединением формулы (b1)-(b9), (b21)-(b23) или (b28)-(b31) (например формулы (b1), (b8), (b28), (b29) или (b30)) (например, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100%).
Модификации, включающие линкер и груз
Нуклеотидное основание может быть ковалентно связано в любом химически подходящем положении с грузом, например, поддающимся обнаружению агентом или лекарственным средством. Например, основание нуклеиновой кислоты может представлять собой деазааденозин или деазагуанозин, и линкер может быть присоединен в положениях C-7 или C-8 деазааденозина или деазагуанозина. В других вариантах осуществления основание нуклеиновой кислоты может представлять собой цитозин или урацил, и линкер может быть присоединен к положениям N-3 или C-5 цитозина или урацила. На схеме 1 ниже представлен иллюстративный модифицированный нуклеотид, где основание нуклеиновой кислоты, аденин, связано с линкером по углероду C-7 7-деазааденина. Кроме того, на схеме 1 представлен модифицированный нуклеотид с линкером и грузом, например, поддающимся обнаружению агентом, встроенным на 3’-конец мРНК. Расщепление дисульфидной связи и 1,2-присоединение тиольной группы к пропаргиловому сложному эфиру высвобождает поддающийся обнаружению агент. Остальная структура (представленная, например, в качестве pApC5Parg на схеме 1) представляет собой ингибитор. Принципом структуры модифицированных нуклеотидов является то, что присоединенный ингибитор пространственно препятствует способности полимеразы включать второе основание. Таким образом, важно, чтобы связь была достаточной длинной, чтобы обеспечить эту функцию и чтобы ингибитор был в стереохимической ориентации, которая ингибирует или препятствует присоединению второго и последующих нуклеотидов к растущей полинуклеотидной цепи.
Figure 00000125
Линкер
Термин "линкер", как используют в рамках изобретения, относится к группе атомов, например, 10-1000 атомов, и он может включать атомы или группы, такие как, но не ограничиваясь ими, углерод, амино, алкиламино, кислород, сера, сульфоксид, сульфонил, карбонил и имин. Линкер может быть присоединен к модифицированному нуклеозиду или нуклеотиду по основанию нуклеиновой кислоты или части сахара на первом конце, и к грузу, например, поддающемуся обнаружению агенту или терапевтическому средству, на втором конце. Линкер имеет достаточную длину, чтобы она не препятствовала встраиванию в последовательность нуклеиновой кислоты.
Примеры химических групп, которые можно включать в линкер, включают, но не ограничиваются ими, алкильную, алкеновую, алкиновую, амидо, простую эфирную, простую тиоэфирную или сложноэфирную группу. Цепь линкера также может содержать часть насыщенного, ненасыщенного или ароматического кольца, включая полициклические и гетероароматические кольца, где гетероароматическое кольцо представляет собой арильную группу, содержащую от одного до четырех гетероатомов N, O или S. Конкретные примеры линкеров включают, но не ограничиваются ими, ненасыщенные алканы, полиэтиленгликоли и полимеры декстрана.
Например, линкер может включать мономерные элементы этилена или пропиленгликоля, например, диэтиленгликоль, дипропиленгликоль, триэтиленгликоль, трипропиленгликоль, тетраэтиленгликоль или тетраэтиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления линкер может включать двухвалентную алкильную, алкенильную и/или алкинильную часть. Линкер может включать сложноэфирную, амидную или простую эфирную часть.
Другие примеры включают расщепляемые части в линкере, например, такие как дисульфидная связь (-S-S-) или азосвязь (-N=N-), которые могут быть расщеплены с использованием восстановителя или фотолиза. Расщепляемая связь, включенная в линкер и присоединенная к модифицированному нуклеотиду при расщеплении, приводит, например, к короткому "остатку" или химической модификации на нуклеотиде. Например, после расщепления полученный остаток на нуклеотидном основании, который образовал часть модифицированного нуклеотида и встроился в полинуклеотидную цепь, является нереакционноспособным и не должен быть химически нейтрализован. Это увеличивает легкость, с которой последующий нуклеотид может встраиваться в процессе секвенирования полимерной матрицы нуклеиновой кислоты. Например, условия включают использование трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), дитиотреитола (DTT) и/или других восстановителей для расщепления дисульфидной связи. Селективно расщепляемая связь, которая включает амидосвязь, может расщепляться, например, при использовании TCEP или других восстановителей и/или фотолиза. Селективно расщепляемая связь, которая включает сложноэфирную связь, может расщепляться, например, кислым или основным гидролизом.
Груз
Способы и композиции, описанные в настоящем описании, пригодны для доставки груза к биологической мишени. Груз можно использовать, например, для мечения (например, поддающийся обнаружению агент, такой как флуорофор) или для терапевтических целей (например, цитотоксин или другое лекарственное средство).
Груз: терапевтические средства
В некоторых вариантах осуществления груз представляет собой лекарственное средство, такое как цитотоксин, радиоактивный ион, химиотерапевтическое или другое терапевтическое средство. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредоносным для клеток. Примеры включают таксол, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидрокси антрацин дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, майтанзиноиды, например, майтанзинол (см. патент США № 5208020), CC-1065 (см. патенты США №№ 5475092, 5585499, 5846545) и их аналоги или гомологи. Радиоактивные ионы включают, но не ограничиваются ими, йод (например, йод 125 или йод 131), стронций 89, фосфор, палладий, цезий, иридий, фосфат, кобальт, иттрий 90, самарий 153 и празеодимий. Другие лекарственные средства включают, но не ограничиваются ими, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие средства (например, мехлорэтамин, тиотепу, хлорамбуцил, CC-1065, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин C и цис-дихлордиаминплатину(II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (AMC)) и антимитотические средства (например, винкристин, винбластин, таксол и майтанзиноиды).
Груз: поддающиеся обнаружению агенты
Примеры поддающихся обнаружению веществ включают различные органические низкомолекулярные соединения, неорганические соединения, наночастицы, ферменты или субстраты ферментов, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, хемилюминесцентные материалы, радиоактивные материалы и контрастные вещества. Такие оптически обнаруживаемые метки включают, например, но не ограничиваются ими, 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатстилбен-2,2'-дисульфоновую кислоту; акридин и производные: акридин, акридинизотиоцианат; 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновую кислоту (EDANS); 4-амино-N-[3-винилсульфонил)фенил]нафталимид-3,5-дисульфонат; N-(4-анилино-1-нафтил)малеинимид; антраниламид; BODIPY; бриллиантовый желтый; кумарин и производные; кумарин, 7-амино-4-метилкумарин (AMC, Coumarin 120), 7-амино-4-трифторметилкоулуарин (Coumaran 151); цианиновые красители; цианозин; 4',6-диаминидино-2-фенилиндол (DAPI); 5',5"-дибромпирогаллолсульфонафталеин (бромпирогаллоловый красный); 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин; диэтилентриамин пентаацетат; 4,4'-диизотиоцианатодигидро-стилбен-2,2'-дисульфоновую кислоту; 4,4'-диизотиоцианатостиблен-2,2'-дисульфоновую кислоту; 5-[диметиламино]-нафталин-1-сульфонилхлорид (DNS, дансилхлорид); 4-диметиламинофенилазофенил-4'-изотиоцианат (DABITC); эозин и производные; эозин, эозин изотиоцианат, эритрозин и производные; эритрозин B, эритрозин, изотиоцианат; этидий; флуоресцеин и производные; 5-карбоксифлуоресцеин (FAM), 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил)аминофлуоресцеин (DTAF), 2',7'-диметокси-4'5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеин, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, QFITC, (XRITC); флуорескамин; IR144; IR1446; малахитовый зеленый изотиоцианат; 4-метилумбеллиферонортокрезолфталеин; нитротирозин; парарозанилин; феноловый красный; B-фикоэритрин; o-фталдиальдегид; пирен и производные: пирен, пирен бутират, сукцинимидил-1-пирен; бутиратные квантовые точки; реактивный красный 4 (CibacronTM Brilliant Red 3B-A), родамин и производные: 6-карбокси-X-родамин (ROX), 6-карбоксиродамин (R6G), лиссамин родамин B, сульфонилхлорид родамин (Rhod), родамин B, родамин 123, родамин X изотиоцианат, сульфородамин B, сульфородамин 101, сульфонилхлоридное производное сульфородамина 101 (техасский красный); N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA); тетраметилродамин; тетраметилродамин изотиоцианат (TRITC); рибофлавин; розоловую кислоту; хелатные производные тербия; цианин-3 (Cy3); цианин-5 (Cy5); цианин-5,5 (Cy5.5), цианин-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta Blue; фталоцианин; и нафталоцианин. В некоторых вариантах осуществления поддающейся обнаружению меткой является флуоресцентный краситель, такой как Cy5 и Cy3.
Примеры люминесцентного материала включают люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин.
Примеры подходящего радиоактивного материала включают 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 201Tl, 125I, 35S, 14C или 3H, 99mTc (например, пертехнетат (техненат(VII), TcO4 -), либо прямо, либо непрямо, или другие радиоизотопы, обнаруживаемые путем прямого подсчета радиоактивного излучения или сцинтилляционного подсчета.
Кроме того, можно использовать контрастные агенты, например, контрастные агенты для MRI или ЯМР, для рентгенограммы, CT, визуализации Рамана, оптической когерентной томографии, визуализации по поглощению, ультразвуковой визуализации или термической визуализации. Иллюстративные контрастные агенты включают золото (например, золотые наночастицы), гадолиний (например, хелатированный Gd), оксиды железа (например, суперпарамагнитный оксид железа (SPIO), наночастицы монокристаллического оксида железа (MION) и сверхмалые частицы суперпарамагнитного оксида железа (USPIO)), хелаты марганца (например, Mn-DPDP), сульфат бария, йодированные контрастные среды (иогексол), микропузырьки или перфторуглероды.
В некоторых вариантах осуществления поддающийся обнаружению агент представляет собой не поддающийся обнаружению предшественник, который становится поддающимся обнаружению при активации. Примеры включают флуорогенные конструкции тетразин-флуорофор (например, тетразин-BODIPY FL, тетразин-Oregon Green 488 или тетразин-BODIPY TMR-X) или активируемые ферментом флуорогенные агенты (например, PROSENSE (VisEn Medical)).
Когда соединения являются ферментативно меченными, например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, ферментативную метку обнаруживают путем определения преобразования соответствующего субстрата в продукт.
Анализы in vitro, в которых можно использовать эти композиции, включают твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммунопреципитацию, иммунофлуоресценцию, ферментный иммуноанализ (EIA), радиоиммунный анализ (RIA) и анализ с использованием вестерн-блоттинга.
Настоящим изобретением предусматриваются метки, отличные от меток, описанных в настоящем описании, включая другие оптически обнаруживаемые метки. Метки можно присоединять к модифицированному нуклеотиду по настоящему изобретению в любом положении с использованием стандартных химических реакций, так чтобы метка удалялась из основания, к которому она присоединена, при расщеплении поддающегося расщеплению линкера.
Груз: проникающие в клетку грузы
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты также могут включать груз, который может представлять собой проникающую в клетку часть или агент, который повышает внутриклеточную доставку композиций. Например, композиции могут включать проникающую в клетку пептидную последовательность, которая облегчает доставку во внутриклеточное пространство, например, происходящий из ВИЧ пептид TAT, пенетратины, транспортаны, или происходящие из hCT проникающие в клетку пептиды, см., например, Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611; и Deshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49. Композиции также можно составлять так, чтобы они включали проникающий в клетку агент, например в липосомах, который усиливает доставку композиции во внутриклеточное пространство.
Груз: биологические мишени
Модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно использовать для доставки груза к любой биологической мишени, для которой существует или может быть получен специфический лиганд. Лиганд может связываться с биологической мишенью либо ковалентно, либо нековалентно.
Иллюстративные биологические мишени включают биополимеры, например, антитела, нуклеиновые кислоты, такие как РНК и ДНК, белки, ферменты; иллюстративные белки включают ферменты, рецепторы и ионные каналы. В некоторых вариантах осуществления мишенью является тканеспецифический или специфичный к типу клеток маркер, например, белок, который специфически экспрессируется на выбранной ткани или типе клеток. В некоторых вариантах осуществления мишенью является рецептор, такой как, но не ограничиваясь ими, рецепторы плазматической мембраны и ядерные рецепторы; более конкретные примеры включают сопряженные с G-белком рецепторы, белки клеточных пор, белки-переносчики, экспрессируемые на поверхности антитела, белки HLA, белки MHC и рецепторы факторов роста.
Синтез модифицированных нуклеотидов
Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, описанные в настоящем описании, можно получать из легкодоступных исходных материалов с использованием следующих общих способов и методик. Понятно, что когда приведены типичные или предпочтительные условия процессов (т.е. температура реакции, время, молярное соотношение реагентов, растворители, давление и т.д.), также можно использовать другие условия процесса, если нет иных указаний. Оптимальные условия реакции могут варьировать, в зависимости от конкретных используемых реагентов или растворителей, однако такие условия могут быть определены специалистом в данной области с помощью стандартных методик оптимизации.
Мониторинг процессов, описанных в настоящем описании, можно проводить любым подходящим способом, известным в данной области. Например, мониторинг образования продуктов можно проводить спектроскопическими способами, такими как ядерная магнитно-резонансная спектроскопия (например, 1H или 13C), инфракрасная спектроскопия, спектрофотометрия (например, УФ-видимая) или масс-спектрометрия, или хроматографией, такой как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или тонкослойная хроматография.
Получение модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов может вовлекать внесение и удаление защитной группы на различные химические группы. Специалист в данной области может без труда определить потребность во внесении и удалении защитных групп и может выбрать подходящие защитные группы. Химия защитных групп описана, например, в Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., Wiley & Sons, 1991, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Реакции процессов, описанных в настоящем описании, можно проводить в подходящих растворителях, которые может без труда выбрать специалист в области органического синтеза. Подходящие растворители могут быть по существу нереакционноспособными в отношении исходных материалов (реагентов), промежуточных соединений или продуктов при температурах, при которых проводят реакции, т.е. при температурах, которые могут находиться от температуры замерзания растворителя до температуры кипения растворителя. Конкретную реакцию можно проводить в растворителе или смеси более чем одного растворителя. В зависимости от конкретной стадии реакции, можно выбирать подходящие растворители.
Разделение рацемических смесей модифицированных нуклеозидов и нуклеотидов можно проводить любым из многочисленных способов, известных в данной области. Иллюстративный способ включает фракционную перекристаллизацию с использованием "хиральной разделяющей кислоты", которая является оптически активной солеобразующей органической кислотой. Подходящие разделяющие агенты для способов фракционной перекристаллизации представляют собой, например, оптически активные кислоты, такие как D- и L-формы виннокаменной кислоты, диацетилвиннокаменной кислоты, дибензоилвиннокаменной кислоты, миндальной кислоты, яблочной кислоты, молочной кислоты или различных оптически активных камфорсульфоновых кислот. Разделение рацемических смесей также можно проводить путем элюирования на колонке, упакованной оптически активным разделяющим агентом (например, динитробензоилфенилглицин). Специалист в данной области может определить подходящую композицию растворителей для элюирования.
Иллюстративные способы синтеза модифицированных нуклеотидов, которые включены в полинуклеотиды, например, РНК или мРНК, представлены ниже на схемах с 2 по 12. На схеме 2 представлен общий способ фосфорилирования нуклеозидов, включая модифицированные нуклеозиды.
Figure 00000126
Для контроля реакции можно использовать различные защитные группы. Например, на схеме 3 представлено использование множества стадий внесения и удаления защитных групп для обеспечения фосфорилирования в 5′-положении сахара, а не 2′- и 3′-гидроксильных групп.
Figure 00000127
Модифицированные нуклеотиды можно синтезировать любым подходящим способом. На схемах 4, 5 и 8 представлены иллюстративные способы синтеза модифицированных нуклеотидов, имеющих модифицированное пуриновое основание нуклеиновой кислоты; и на схемах 6 и 7 представлены иллюстративные способы синтеза модифицированных нуклеотидов, имеющих модифицированный псевдоуридин или псевдоизоцитидин, соответственно.
Figure 00000128
Figure 00000129
Figure 00000130
Figure 00000131
Figure 00000132
На схемах 9 и 10 представлены иллюстративные способы синтеза модифицированных нуклеотидов. На схеме 11 представлен неограничивающий биоаналитический способ получения нуклеотидов.
Figure 00000133
Figure 00000134
На схеме 12 представлен иллюстративный синтез модифицированного урацила, где положение N1 на поверхности большой бороздки модифицировано посредством R12b, как описано в настоящем описании, и 5′-положение рибозы является фосфорилированным. T1, T2, R12a, R12b и r являются такими, как описано в настоящем описании. Этот синтез, а также его оптимизированную версию, можно использовать для модификации поверхности большой бороздки других пиримидиновых оснований нуклеиновой кислоты и пуриновых оснований нуклеиновой кислоты (см. например, формулы (b1)-(b43)) и/или для внесения одной или нескольких фосфатных групп (например, в 5′-положении сахара). Эту реакцию алкилирования также можно использовать для включения одной или нескольких необязательно замещенных алкильных групп в любую реакционноспособную группу (например, аминогруппу) в любом основании нуклеиновой кислоты, описанном в настоящем описании (например, аминогруппы на поверхности пар оснований Уотсона-Крика для цитозина, урацила, аденина и гуанина).
Figure 00000135
Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды также можно получать в соответствии со способами синтеза, описанными в Ogata et al. Journal of Organic Chemistry 74:2585-2588, 2009; Purmal et al. Nucleic Acids Research 22(1):72-78, 1994; Fukuhara et al. Biochemistry 1(4):563-568, 1962; и Xu et al. Tetrahedron 48(9):1729-1740, 1992, каждый из которых включен в качестве ссылки в полном объеме.
Модифицированные нуклеиновые кислоты
Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам (или полинуклеотидам), включающим РНК, такие как мРНК, которые содержат один или несколько модифицированных нуклеозидов (называемые "модифицированными нуклеиновыми кислотами") или нуклеотидов, как описано в настоящем описании, которые обладают пригодными свойствами, включая отсутствие значительной индукции врожденного иммунного ответа клетки, в которую введена мРНК. Поскольку эти модифицированные нуклеиновые кислоты повышают эффективность продукции белка, внутриклеточное удержание нуклеиновых кислот и жизнеспособность клеток, контактировавших с ними, а также обладают сниженной иммуногенностью, эти нуклеиновые кислоты, обладающие этими свойствами, также называют в настоящем описании "улучшенными нуклеиновыми кислотами".
Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают сниженной аффинностью связывания со взаимодействующим, например, связывающимся, с большой бороздкой партнером. Например, нуклеиновые кислоты содержат по меньшей мере один нуклеотид, который химически модифицирован на обращенной к большой бороздке поверхности, как описано в настоящем описании.
Термин "нуклеиновая кислота" в его наиболее широком значении включает любое соединение и/или вещество, которое представляет собой или может быть включено в олигонуклеотидную цепь. В этом контексте термин "нуклеиновая кислота" используют синонимично с полинуклеотидом. Иллюстративные нуклеиновые кислоты для применения в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничиваются ими, одну или несколько ДНК, РНК, включая матричную мРНК (мРНК), их гибридов, индуцирующих РНК-i агентов, агентов РНК-i, миРНК (siRNA), кшРНК (shRNA), микроРНК (miRNA), антисмысловых РНК, рибозимов, каталитических ДНК, РНК, которые индуцируют образование тройной спирали, аптамеров, векторов и т.д., подробно описанных в настоящем описании.
Предусматриваются модифицированные нуклеиновые кислоты, содержащие транслируемую область и одну, две или более двух различных нуклеозидных модификаций. В некоторых вариантах осуществления модифицированная нуклеиновая кислота проявляет сниженную деградацию в клетке, в которую введена нуклеиновая кислота, относительно соответствующей немодифицированной нуклеиновой кислоты. Иллюстративные нуклеиновые кислоты включают рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), нуклеиновые кислоты с треозой (TNA), нуклеиновые кислоты с гликолем (GNA) или их гибрид. В предпочтительных вариантах осуществления модифицированная нуклеиновая кислота включает матричные РНК (мРНК). Как описано в настоящем описании, нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению по существу не индуцируют врожденный иммунный ответ клетки, в которую мРНК введена.
В определенных вариантах осуществления является желательной внутриклеточная деградация модифицированной нуклеиновой кислоты, введенной в клетку, например, если является желательным точный период времени продуцирования белка. Таким образом, настоящее изобретение относится к модифицированной нуклеиновой кислоте, содержащей домен деградации, которая способна действовать направленным образом в клетке.
Другие компоненты нуклеиновой кислоты являются необязательными и в некоторых вариантах осуществления являются пригодными. Например, предусматривается 5’-нетранслируемая область (UTR) и/или 3’UTR, где любая или обе из них независимо могут содержать одну или несколько отличающихся нуклеозидных модификаций. В таких вариантах осуществления нуклеозидные модификации также могут присутствовать в транслируемой области. Также предусматриваются нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность Козака.
Кроме того, предусматриваются нуклеиновые кислоты, содержащие одну или несколько интронных нуклеотидных последовательностей, которые могут вырезаться из нуклеиновой кислоты.
Кроме того, предусматриваются нуклеиновые кислоты, содержащие участок внутренней посадки рибосомы (IRES). IRES может выступать в качестве единственного участка связывания рибосом, или он может служить в качестве одного из множества участков связывания рибосом в мРНК. мРНК, содержащая более одного функционального участка связывания рибосом, может кодировать несколько пептидов или полипептидов, которые транслируются рибосомами независимо ("полицистронная мРНК"). Когда нуклеиновые кислоты предоставляются с IRES, кроме того, необязательно предоставляется вторая транслируемая область. Примеры последовательностей IRES, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, последовательности из пикорнавирусов (например, FMDV), вирусов паразитов (CFFV), вирусов полиомиелита (PV), вирусов энцефаломиокардита (ECMV), вируса ящура (FMDV), вирусов гепатита C (HCV), вирусов классической свиной лихорадки (CSFV), вируса лейкоза мышей (MLV), вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) или вирусов паралича сверчков (CrPV).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, содержащим по меньшей мере два нуклеотида, последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотид, который нарушает связывание связывающегося с большой бороздкой партнера с последовательностью нуклеиновой кислоты, где нуклеотид обладает сниженной аффинностью связывания со связывающимся с большой бороздкой партнером.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой соединение формулы XI-a:
Figure 00000136
,
где:
Figure 00000083
обозначает необязательную двойную связь;
Figure 00000002
обозначает необязательную одинарную связь;
U представляет собой O, S, -NRa- или -CRaRb-, когда
Figure 00000083
обозначает одинарную связь, или U представляет собой -CRa-, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь;
A представляет собой H, OH, фосфорил, пирофосфат, сульфат, -NH2, -SH, аминокислоту, пептид, содержащий 2-12 аминокислот;
X представляет собой O или S;
каждый Y1 независимо выбран из -ORa1, -NRa1Rb1 и -SRa1;
каждый из Y2 и Y3 независимо выбран из O, -CRaRb-, NRc, S или линкера, содержащего один или несколько атомов, выбранных из группы, состоящей из C, O, N и S;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, C2-12 алкинил или C6-20 арил;
Rc представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля;
каждый из Ra1 и Rb1 независимо представляет собой H или противоион;
-ORc1 представляет собой OH при pH приблизительно 1, или -ORc1 представляет собой O- при физиологических значениях pH; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты;
при условии, что кольцо, охватывающее переменные A, B, D, U, Z, Y2 и Y3, не может представлять собой рибозу.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XII-a, XII-b или XII-c:
Figure 00000137
,
где:
Figure 00000083
обозначает одинарную или двойную связь;
X представляет собой O или S;
каждый из U и W независимо представляет собой C или N;
V представляет собой O, S, C или N;
где когда V представляет собой C, тогда R1 представляет собой H, C1-6 алкил, C1-6 алкенил, C1-6 алкинил, галоген или -ORc, где каждый из C1-20 алкила, C2-20 алкенила, C2-20 алкинила необязательно замещен посредством -OH, -NRaRb, -SH, -C(O)Rc, -C(O)ORc, -NHC(O)Rc или -NHC(O)ORc;
и где когда V представляет собой O, S или N, тогда R1 отсутствует;
R2 представляет собой H, -ORc, -SRc, -NRaRb или галоген;
или когда V представляет собой C, тогда R1 и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное кольцо, необязательно замещенное 1-4 заместителями, выбранными из галогена, -OH, -SH, -NRaRb, C1-20 алкила, C2-20 алкенила, C2-20 алкинила, C1-20 алкокси или C1-20 тиоалкила;
R3 представляет собой H или C1-20 алкил;
R4 представляет собой H или C1-20 алкил; где когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь, тогда R4 отсутствует, или N-R4, взятые вместе, образуют положительно заряженный N, замещенный C1-20 алкилом;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-20 алкил, C2-20 алкенил, C2-20 алкинил или C6-20 арил; и
Rc представляет собой H, C1-20 алкил, C2-20 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XII-a1, XII-a2, XII-a3, XII-a4 или XII-a5:
Figure 00000138
В некоторых вариантах осуществления основание нуклеиновой кислоты представляет собой пиримидин или его производное.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит множество структурно уникальных соединений формулы XI-a.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% остатков цитозина заменены соединением формулы XI-a (например, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100%).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% остатков урацила заменены соединением формулы XI-a (например, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100%).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% остатков цитозина и 25% остатков урацила заменены соединением формулы XI-a (например, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100%).
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является транслируемой.
В некоторых вариантах осуществления, когда нуклеиновая кислота включает нуклеотид, модифицированный линкером и грузом, например, как описано в настоящем описании, нуклеотид, модифицированный линкером и грузом, находится на 3’-конце нуклеиновой кислоты.
Взаимодействующие с большой бороздкой партнеры
Как описано в настоящем описании, выражение "взаимодействующий с большой бороздкой партнер" относится к распознающим РНК рецепторам, которые обнаруживают и отвечают на РНК-лиганды через взаимодействия, например, связывание, с обращенной к большой бороздке поверхностью нуклеотида или нуклеиновой кислоты. Соответственно, у РНК-лигандов, содержащих модифицированные нуклеотиды или нуклеиновые кислоты, как описано в настоящем описании, снижены взаимодействия со связывающимися с большой бороздкой партнерами, и, таким образом, снижен врожденный иммунный ответ, или экспрессия и секреция провоспалительных цитокинов, или и то, и другое.
Пример взаимодействующих, например, связывающихся, с большой бороздкой партнеров включают, но не ограничиваются ими, следующие нуклеазы и хеликазы. В мембранах TLR (Toll-подобные рецепторы) 3, 7 и 8 могут отвечать на одноцепочечные и двухцепочечные РНК. В цитоплазме представители суперсемейства 2 хеликаз класса DEX(D/H) и ATP-азы могут распознавать РНК для инициации противовирусных ответов. Эти хеликазы включают RIG-I (индуцируемый ретиноевой кислотой ген I) и MDA5 (ассоциированный с дифференцировкой меланомы ген 5). Другие примеры включают ген Laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2), содержащие домен HIN-200 белки или содержащие хеликазный домен белки.
Предупреждение или снижение врожденного клеточного иммунного ответа
Термин "врожденный иммунный ответ" включает клеточный ответ на экзогенные одноцепочечные нуклеиновые кислоты, как правило, вирусного или бактериального происхождения, который вовлекает индукцию экспрессии цитокинов и высвобождение, в частности, интерферонов, и гибель клетки. Синтез белка также снижается в ходе врожденного иммунного ответа. Хотя является преимущественным устранение иммунного ответа в клетке, который запускается введением экзогенных нуклеиновых кислот, настоящее изобретение относится к модифицированным нуклеиновым кислотам, таким как мРНК, которые существенно снижают иммунный ответ, включая передачу сигнала интерферонами, без полного устранения такого ответа. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ снижен на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9% или более чем на 99,9% по сравнению с иммунным ответом, индуцируемым соответствующей немодифицированной нуклеиновой кислотой. Такое снижение можно измерять по уровню экспрессии или активности интерферонов типа 1 или экспрессии регулируемых интерфероном генов, таких как toll-подобные рецепторы (например, TLR7 и TLR8). Снижение или отсутствие индукции врожденного иммунного ответа также можно измерять по уменьшению гибели клеток после одного или нескольких введений модифицированных РНК в клеточную популяцию; например, клеточная гибель на 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% или более чем 95% меньше, чем частота гибели клеток, наблюдаемая в случае соответствующей немодифицированной нуклеиновой кислоты. Более того, гибель клеток может произойти в менее чем 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% или менее 0,01% клеток, с которыми контактировали модифицированные нуклеиновые кислоты.
В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеиновые кислоты, включая полинуклеотиды и/или молекулы мРНК, модифицированы таким образом, чтобы не индуцировать или только минимально индуцировать иммунный ответ в рецепиентной клетке или организме. Такой запуск или активация ускользания от или избегания иммунного ответа является новым признаком модифицированных полинуклеотидов по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к повторяющемуся введению (например, трансфекции) модифицированных нуклеиновых кислот в популяцию клеток-мишеней, например, in vitro, ex vivo или in vivo. Стадию контактирования клеточной популяции можно повторять один или несколько раз (как, например, два, три, четыре, пять или более пяти раз). В некоторых вариантах осуществления стадию контактирования клеточной популяции с модифицированными нуклеиновыми кислотами повторяют то количество раз, которое является достаточным для достижения заданной эффективности трансляции белка в клеточной популяции. Учитывая сниженную цитотоксичность популяции клеток-мишеней, обеспечиваемую модификациями нуклеиновых кислот, такие повторяющиеся трансфекции достижимы в разнообразном наборе типов клеток in vitro и/или in vivo.
Варианты полипептидов
Предусматриваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют варианты полипептидов, которые обладают определенной идентичностью с эталонной полипептидной последовательностью. Термин "идентичность", как известно в данной области, относится к взаимосвязи между последовательностями двух или более пептидов при определении путем сравнения последовательностей. В данной области "идентичность" также означает степень родственности последовательностей между пептидами при определении по количеству совпадений между цепями из двух или более аминокислотных остатков. "Идентичность" определяет процент идентичных совпадений для меньшей из двух или более последовательностей с выравниванием пропусков (при их наличии), осуществляемым с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (т.е. "алгоритмов"). Идентичность родственных пептидов можно без труда вычислять известными способами. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида имеет такую же или сходную активность с эталонным полипептидом. Альтернативно, вариант имеет измененную активность (например, увеличенную или сниженную) относительно эталонного полипептида. Как правило, варианты конкретного полинуклеотида или полипептида по настоящему изобретению имеют по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичность последовательности с последовательностью конкретного эталонного полинуклеотида или полипептида при определении с помощью программ выравнивания последовательностей и параметров, описанных в настоящем описании и известных специалистам в данной области.
Как понятно специалистам в данной области, фрагменты белков, функциональные белковые домены и гомологичные белки также считаются находящимися в объеме настоящего изобретения. Например, в рамках настоящего изобретения предусматривается любой белковый фрагмент эталонного белка (что означает полипептидную последовательность, по меньшей мере на один аминокислотный остаток более короткую, чем эталонная полипептидная последовательность, но в остальном идентичную), имеющий длину 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более 100 аминокислот. В другом примере любой белок, который включает цепь из приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50 или приблизительно 100 аминокислот, которые приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95% или приблизительно на 100% идентичны любой из последовательностей, описанных в настоящем описании, можно использовать в соответствии с настоящем изобретением. В определенных вариантах осуществления белковая последовательность, подлежащая применению в соответствии с настоящим изобретением, включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более мутаций, как показано в любой из последовательностей, представленных или упоминаемых в настоящем описании.
Библиотеки полипептидов
Также предусматриваются библиотеки полинуклеотидов, содержащие нуклеозидные модификации, где полинуклеотиды индивидуально содержат первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, такой как антитело, связывающий белок партнер, каркасный белок и другие полипептиды, известные в данной области. Предпочтительно, полинуклеотиды представляют собой мРНК в форме, пригодной для прямого введения в заданную клетку-хозяина, которая в свою очередь синтезирует кодируемый полипептид.
В определенных вариантах осуществления несколько вариантов белка, каждый с отличающейся аминокислотной модификацией(ями), получают и исследуют для определения наилучшего варианта с точки зрения фармакокинетики, стабильности, биосовместимости и/или биологической активности, или биофизического свойства, такого как уровень экспрессии. Такая библиотека может содержать 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 или более 109 возможных вариантов (включая замены, делеции одного или нескольких остатков, и инсерцию одного или нескольких остатков).
Комплексы полипептид-нуклеиновая кислота
Надлежащая трансляция белка вовлекает физическую агрегацию ряда полипептидов и нуклеиновых кислот, ассоциированных с мРНК. Настоящее изобретение предусматривает комплексы белок-нуклеиновая кислота, содержащие транслируемую мРНК, имеющую одну или несколько нуклеозидных модификаций (например, по меньшей мере две различных нуклеозидных модификации) и один или несколько полипептидов, связанных с мРНК. Как правило, белки предоставляют в количестве, эффективном для предупреждения или снижения врожденного иммунного ответа клетки, в которую введен комплекс.
Нетранслируемые модифицированные нуклеиновые кислоты
Как описано в настоящем описании, предусматриваются мРНК, имеющие последовательности, которые являются по существу нетранслируемыми. Такие мРНК являются эффективными в качестве вакцины при введении млекопитающему.
Также предусматриваются модифицированные нуклеиновые кислоты, которые содержат одну или несколько некодирующих областей. Такие модифицированные нуклеиновые кислоты обычно являются нетранслируемыми, но способны связываться и изолировать один или несколько компонентов аппарата трансляции, таких как рибосомальный белок или транспортная РНК (тРНК), тем самым эффективно снижая экспрессию белка в клетке. Модифицированная нуклеиновая кислота может содержать малую ядерную РНК (мя-РНК), микро-РНК (микроРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или Piwi-взаимодействующую РНК (pi-РНК).
Синтез модифицированных нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты для применения в соответствии с настоящим изобретением можно получать любым доступным способом, включая, но не ограничиваясь ими, химический синтез, ферментативный синтез, который обычно называют транскрипцией in vitro, ферментативное или химическое расщепление более длинного предшественника и т.д. Способы синтеза РНК известны в данной области (см., например, Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; и Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005; которые обе включены в настоящее описание в качестве ссылок).
Модифицированные нуклеиновые кислоты не должны быть единообразно модифицированными по всей длине молекулы. В различных положениях нуклеиновой кислоты могут существовать различные нуклеотидные модификации и/или структуры остова. Специалисту в данной области будет понятно, что нуклеотидные аналоги или другая модификация(и) могут быть расположены в любом положении(ях) нуклеиновой кислоты, так что функция нуклеиновой кислоты по существу не снижается. Модификация также может представлять собой 5’- или 3’-концевую модификацию. Нуклеиновые кислоты могут содержать минимум один и максимум 100% модифицированных нуклеотидов, или любой процент между ними, такой как по меньшей мере 5% модифицированных нуклеотидов, по меньшей мере 10% модифицированных нуклеотидов, по меньшей мере 25% модифицированных нуклеотидов, по меньшей мере 50% модифицированных нуклеотидов, по меньшей мере 80% модифицированных нуклеотидов или по меньшей мере 90% модифицированных нуклеотидов. Например, нуклеиновые кислоты могут содержать модифицированный пиримидин, такой как урацил или цитозин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100% урацила в нуклеиновой кислоте заменено модифицированным урацилом. Модифицированный урацил может быть заменен соединением, имеющим одну уникальную структуру, или он может быть заменен множеством соединений, имеющих различные структуры (например, 2, 3, 4 или более уникальных структур). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100% цитозина в нуклеиновой кислоте заменено модифицированным цитозином. Модифицированный цитозин может быть заменен соединением, имеющим одну уникальную структуру, или он может быть заменен множеством соединений, имеющих различные структуры (например, 2, 3, 4 или более уникальных структур).
Как правило, наиболее короткой длиной модифицированной мРНК по настоящему изобретению может быть длина последовательности мРНК, которая является достаточной для кодирования дипептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования трипептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования тетрапептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования пентапептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования гексапептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования гептапептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования октапептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования нонапептида. В другом варианте осуществления длина последовательности мРНК является достаточной для кодирования декапептида.
Примеры дипептидов, которые могут кодировать модифицированные последовательности нуклеиновых кислот, включают, но не ограничиваются ими, карнозин и ансерин.
В следующем варианте осуществления мРНК имеет длину более 30 нуклеотидов. В другом варианте осуществления молекула РНК имеет длину более 35 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 40 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 45 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 55 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 60 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 80 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 90 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 100 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 120 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 140 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 160 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 180 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 200 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 250 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 300 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 350 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 400 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 450 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 500 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 600 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 700 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 800 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 900 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1000 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1100 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1200 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1300 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1400 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1500 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1600 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 1800 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 2000 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 2500 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 3000 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 4000 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина составляет по меньшей мере 5000 нуклеотиды, или более 5000 нуклеотидов.
Например, модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно получать с использованием способов, которые известны специалистам в области синтеза нуклеиновых кислот.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, например, ферментативным, получения последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотид, который нарушает связывание связывающегося с большой бороздкой партнера с последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит соединение формулы XI-a:
Figure 00000139
,
где:
нуклеотид имеет сниженную аффинность связывания со связывающимся с большой бороздкой партнером;
Figure 00000083
обозначает необязательную двойную связь;
Figure 00000002
обозначает необязательную одинарную связь;
U представляет собой O, S, -NRa- или -CRaRb-, когда
Figure 00000083
обозначает одинарную связь, или U представляет собой -CRa-, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь;
A представляет собой H, OH, фосфорил, пирофосфат, сульфат, -NH2, -SH, аминокислоту, пептид, содержащий 2-12 аминокислот;
X представляет собой O или S;
каждый Y1 независимо выбран из -ORa1, -NRa1Rb1 и -SRa1;
каждый из Y2 и Y3 независимо выбран из O, -CRaRb-, NRc, S или линкера, содержащего один или несколько атомов, выбранных из группы, состоящей из C, O, N и S;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, C2-12 алкинил или C6-20 арил;
Rc представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля;
каждый из Ra1 и Rb1 независимо представляет собой H или противоион;
-ORc1 представляет собой OH при pH приблизительно 1, или -ORc1 представляет собой O- при физиологических значениях pH; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты;
при условии, что кольцо, охватывающее переменные A, B, D, U, Z, Y2 и Y3, не может представлять собой рибозу, причем способ включает реакцию соединения формулы XIII:
Figure 00000140
,
с РНК-полимеразой и кДНК-матрицей.
В некоторых вариантах осуществления реакцию повторяют от 1 до приблизительно 7000 раз.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XII-a, XII-b или XII-c:
Figure 00000141
,
где:
Figure 00000083
обозначает одинарную или двойную связь;
X представляет собой O или S;
каждый из U и W независимо представляет собой C или N;
V представляет собой O, S, C или N;
где когда V представляет собой C, тогда R1 представляет собой H, C1-6 алкил, C1-6 алкенил, C1-6 алкинил, галоген или -ORc, где каждый из C1-20 алкила, C2-20 алкенила, C2-20 алкинила необязательно замещен -OH, -NRaRb, -SH, -C(O)Rc, -C(O)ORc, -NHC(O)Rc или -NHC(O)ORc;
и где когда V представляет собой O, S или N, тогда R1 отсутствует;
R2 представляет собой H, -ORc, -SRc, -NRaRb или галоген;
или когда V представляет собой C, тогда R1 и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное кольцо, необязательно замещенное 1-4 заместителями, выбранными из галогена, -OH, -SH, -NRaRb, C1-20 алкила, C2-20 алкенила, C2-20 алкинила, C1-20 алкокси или C1-20 тиоалкила;
R3 представляет собой H или C1-20 алкил;
R4 представляет собой H или C1-20 алкил; где когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь, тогда R4 отсутствует, или N-R4, взятые вместе, образует положительно заряженный N, замещенный C1-20 алкилом;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-20 алкил, C2-20 алкенил, C2-20 алкинил или C6-20 арил; и
Rc представляет собой H, C1-20 алкил, C2-20 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XII-a1, XII-a2, XII-a3, XII-a4 или XII-a5:
Figure 00000142
В некоторых вариантах осуществления способы, кроме того, включают нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из аденозина, цитозина, гуанозина и урацила.
В некоторых вариантах осуществления основание нуклеиновой кислоты представляет собой пиримидин или его производное.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотид, который нарушает связывание связывающегося с большой бороздкой партнера с последовательностью нуклеиновой кислоты, причем способ включает:
реакцию соединения формулы XI-d:
Figure 00000143
,
где:
нуклеотид имеет сниженную аффинность связывания со связывающимся с большой бороздкой партнером;
Figure 00000083
обозначает одинарную или двойную связь;
Figure 00000002
обозначает необязательную одинарную связь;
U представляет собой O, S, -NRa- или -CRaRb-, когда
Figure 00000083
обозначает одинарную связь, или U представляет собой -CRa-, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь;
Z представляет собой H, C1-12 алкил или C6-20 арил, или Z отсутствует, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь; и
Z может представлять собой -CRaRb- и образует связь с A;
A представляет собой H, OH, фосфорил, пирофосфат, сульфат, -NH2, -SH, аминокислоту или пептид, содержащий 1-12 аминокислот;
X представляет собой O или S;
каждый Y1 независимо выбран из -ORa1, -NRa1Rb1 и -SRa1;
каждый из Y2 и Y3 независимо выбран из O, -CRaRb-, NRc, S или линкера, содержащего один или несколько атомов, выбранных из группы, состоящей из C, O, N и S;
n равно 0, 1, 2 или 3;
m равно 0, 1, 2 или 3;
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, C2-12 алкинил или C6-20 арил;
Rc представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля;
каждый из Ra1 и Rb1 независимо представляет собой H или противоион; и
-ORc1 представляет собой OH при pH приблизительно 1, или -ORc1 представляет собой O- при физиологических значениях pH;
при условии, что кольцо, охватывающее переменные A, B, D, U, Z, Y2 и Y3, не может представлять собой рибозу, с праймером, кДНК-матрицей и РНК-полимеразой.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XII-a, XII-b или XII-c:
Figure 00000144
,
где:
Figure 00000083
обозначает одинарную или двойную связь;
X представляет собой O или S;
каждый из U и W независимо представляет собой C или N;
V представляет собой O, S, C или N;
где когда V представляет собой C, тогда R1 представляет собой H, C1-6 алкил, C1-6 алкенил, C1-6 алкинил, галоген или -ORc, где каждый из C1-20 алкила, C2-20 алкенила, C2-20 алкинила необязательно замещен -OH, -NRaRb, -SH, -C(O)Rc, -C(O)ORc, -NHC(O)Rc или -NHC(O)ORc;
и где когда V представляет собой O, S или N, тогда R1 отсутствует;
R2 представляет собой H, -ORc, -SRc, -NRaRb или галоген;
или когда V представляет собой C, тогда R1 и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное кольцо, необязательно замещенное 1-4 заместителями, выбранными из галогена, -OH, -SH, -NRaRb, C1-20 алкила, C2-20 алкенила, C2-20 алкинила, C1-20 алкокси или C1-20 тиоалкила;
R3 представляет собой H или C1-20 алкил;
R4 представляет собой H или C1-20 алкил; где когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь, тогда R4 отсутствует, или N-R4, взятые вместе, образуют положительно заряженный N, замещенный C1-20 алкилом;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-20 алкил, C2-20 алкенил, C2-20 алкинил или C6-20 арил; и
Rc представляет собой H, C1-20 алкил, C2-20 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XII-a1, XII-a2, XII-a3, XII-a4 или XII-a5:
Figure 00000145
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из аденозина, цитозина, гуанозина и урацила.
В некоторых вариантах осуществления основание нуклеиновой кислоты представляет собой пиримидин или его производное.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам синтеза фармацевтической нуклеиновой кислоты, включающим стадии:
a) предоставления комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), которая кодирует представляющий интерес фармацевтический белок;
b) выбора нуклеотида, о котором известно, что он нарушает связывание связывающегося с большой бороздкой партнера с нуклеиновой кислотой, где нуклеотид обладает сниженной аффинностью связывания со связывающимся с большой бороздкой партнером; и
c) контактирования предоставленной кДНК и выбранного нуклеотида с РНК-полимеразой в таких условиях, чтобы синтезировалась фармацевтическая нуклеиновая кислота.
В следующих вариантах осуществления фармацевтическая нуклеиновая кислота представляет собой рибонуклеиновую кислоту (РНК).
В следующем аспекте настоящего изобретения модифицированные нуклеиновые кислоты можно получать с использованием способов твердофазного синтеза.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам синтеза нуклеиновой кислоты, включающей соединение формулы XI-a:
Figure 00000146
,
где:
Figure 00000083
обозначает необязательную двойную связь;
Figure 00000002
обозначает необязательную одинарную связь;
U представляет собой O, S, -NRa- или -CRaRb-, когда
Figure 00000083
обозначает одинарную связь, или U представляет собой -CRa-, когда
Figure 00000083
обозначает двойную связь;
A представляет собой H, OH, фосфорил, пирофосфат, сульфат, -NH2, -SH, аминокислоту, пептид, содержащий 2-12 аминокислот;
X представляет собой O или S;
каждый Y1 независимо выбран из -ORa1, -NRa1Rb1 и -SRa1;
каждый из Y2 и Y3 независимо выбран из O, -CRaRb-, NRc, S или линкера, содержащего один или несколько атомов, выбранных из группы, состоящей из C, O, N и S;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, C2-12 алкинил или C6-20 арил;
Rc представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля;
каждый из Ra1 и Rb1 независимо представляет собой H или противоион;
-ORc1 представляет собой OH при pH приблизительно 1, или -ORc1 представляет собой O- при физиологических значениях pH; и
B представляет собой основание нуклеиновой кислоты;
при условии, что кольцо, охватывающее переменные A, B, U, Z, Y2 и Y3, не может представлять собой рибозу;
включающим:
a) реакцию нуклеотида формулы XIII-a:
Figure 00000147
,
с фосфорамидитным соединением формулы XIII-b:
Figure 00000148
,
где:
Figure 00000149
обозначает твердую подложку; и
каждый из P1, P2 и P3 независимо представляет собой подходящие защитные группы;
с получением нуклеиновой кислоты формулы XIV-a:
Figure 00000150
;
и b) окисление или сульфуризацию нуклеиновой кислоты формулы XIV-a с получением нуклеиновой кислоты формулы XIVb:
Figure 00000151
;
и c) удаление защитных групп с получением нуклеиновой кислоты формулы XI-a.
В некоторых вариантах осуществления способы, кроме того, включают нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из аденозина, цитозина, гуанозина и урацила.
В некоторых вариантах осуществления B представляет собой основание нуклеиновой кислоты формулы XIII:
Figure 00000152
,
где:
V представляет собой N или положительно заряженную NRc;
R3 представляет собой NRcRd, -ORa или -SRa;
R4 представляет собой H или необязательно может образовывать связь с Y3;
R5 представляет собой H, -NRcRd или -ORa;
каждый из Ra и Rb независимо представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, C2-12 алкинил или C6-20 арил; и
Rc представляет собой H, C1-12 алкил, C2-12 алкенил, фенил, бензил, группу полиэтиленгликоля или группу амино-полиэтиленгликоля.
В некоторых вариантах осуществления стадии a) и b) повторяют от 1 до приблизительно 10000 раз.
Применение модифицированных нуклеиновых кислот
Терапевтические средства
Модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно использовать в качестве лекарственных средств. Например, модифицированную нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем описании, можно вводить животному или индивидууму, где модифицированная нуклеиновая кислота транслируется in vivo с образованием терапевтического пептида у животного или индивидуума. Таким образом, в рамках настоящего изобретения предусматриваются композиции, способы, наборы и реагенты для лечения или предупреждения заболевания или состояний у человека и других млекопитающих. Активные лекарственные средства по настоящему изобретению включают модифицированные нуклеиновые кислоты, клетки, содержащие модифицированные нуклеиновые кислоты или полипептиды, транслируемые с модифицированных нуклеиновых кислот, полипептиды, транслируемые с модифицированных нуклеиновых кислот, клетки, с которыми контактировали модифицированные нуклеиновые кислоты, или полипептиды, транслированные с модифицированных нуклеиновых кислот, ткани, содержащие клетки, содержащие модифицированные нуклеиновые кислоты, и органы, содержащие ткани, содержащие клетки, содержащие модифицированные нуклеиновые кислоты.
Предусматриваются способы индукции трансляции синтетического или рекомбинантного полинуклеотида для продукции полипептида в популяции клеток с использованием модифицированных нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании. Такая трансляция может быть in vivo, ex vivo, in culture или in vitro. Популяцию клеток подвергают контакту с эффективным количеством композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая имеет по меньшей мере одну нуклеозидную модификацию и транслируемую область, кодирующую полипептид. Популяцию подвергают контакту в таких условиях, чтобы нуклеиновая кислота была локализована в одной или нескольких клетках клеточной популяции и рекомбинантный полипептид транслировался в клетке с нуклеиновой кислоты.
Эффективное количество композиции предоставляют, исходя из, по меньшей мере частично, ткани-мишени, типа клеток-мишени, средств введения, физических характеристик нуклеиновой кислоты (например, размер и степень модифицированных нуклеозидов) и других определяющих факторов. Как правило, эффективное количество композиции обеспечивает белковую продукцию в клетке предпочтительно более эффективно, чем композиция, содержащая соответствующую немодифицированную нуклеиновую кислоту. Увеличенная эффективность может быть продемонстрирована по увеличенной клеточной трансфекции (т.е. проценту клеток, трансфицированных нуклеиновой кислотой), увеличенной трансляции белка с нуклеиновой кислоты, сниженной деградации нуклеиновой кислоты (как продемонстрировано, например, по увеличению продолжительности трансляции белка с модифицированной нуклеиновой кислоты), или сниженному врожденному иммунному ответу клетки-хозяина или повышенной терапевтической применимости.
Аспекты настоящего изобретения относятся к способам индукции трансляции in vivo рекомбинантного полипептида у млекопитающего, нуждающегося в этом. В этом отношении, эффективное количество композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая имеет по меньшей мере одну нуклеозидную модификацию и транслируемую область, кодирующую полипептид, вводят индивидууму с использованием способов доставки, описанных в настоящем описании. Нуклеиновую кислоту предоставляют в количестве и с учетом других условий так, чтобы нуклеиновая кислота была локализована в клетке или клетках индивидуума и рекомбинантный полипептид транслировался в клетке с нуклеиновой кислоты. На клетку, в которой локализована нуклеиновая кислота или ткань, в которой присутствует клетка, можно осуществлять нацеливание посредством одного или более одного раундов введения нуклеиновой кислоты.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к трансплантации клеток, содержащих модифицированные нуклеиновые кислоты, млекопитающему. Введение клеток млекопитающему известно средним специалистам в данной области, такое как местная имплантация (например, местное или подкожное введение), доставка в орган или системная инъекция (например, внутривенная инъекция или ингаляция) как есть состава клеток в фармацевтически приемлемом носителе. Композиции, содержащие модифицированные нуклеиновые кислоты, составляют для введения внутримышечно, трансартериально, внутрибрюшинно, внутривенно, интраназально, подкожно, эндоскопически, трансдермально или интратекально. В некоторых вариантах осуществления композицию составляют для длительного высвобождения.
Индивидуум, которому вводят лекарственное средство, страдает или имеет риск развития заболевания, нарушения или болезнетворного состояния. Предусматриваются способы идентификации, диагностики и классификации индивидуумов на этом основании, которые могут включать клинический диагноз, уровни биомаркеров, полногеномные исследования ассоциации (GWAS) и другие способы, известные в данной области.
В определенных вариантах осуществления введенная модифицированная нуклеиновая кислота направляет продукцию одного или нескольких рекомбинантных полипептидов, которые обеспечивают функциональную активность, которая по существу отсутствует в клетке, в которую транслирован рекомбинантный полипептид. Например, отсутствующая функциональная активность по природе может быть ферментативной, структурной или регулирующей гены.
В других вариантах осуществления введенная модифицированная нуклеиновая кислота направляет продукцию одного или нескольких рекомбинантных полипептидов, которые заменяют полипептид (или множество полипептиды), которые по существу отсутствуют в клетке, в которой рекомбинантный полипептид транслируется. Такое отсутствие может быть следствием генетической мутации кодирующего гена или его регуляторного каскада. В других вариантах осуществления введенная модифицированная нуклеиновая кислота направляет продукцию одного или нескольких рекомбинантных полипептидов для дополнения количества полипептида (или множества полипептидов), который присутствует в клетке, в которой рекомбинантный полипептид транслируется. Альтернативно, рекомбинантный полипептид функционирует, осуществляя антагонизм активности эндогенного белка, присутствующего в клетке или на поверхности клетки или секретируемого из клетки. Обычно активность эндогенного белка является вредоносной для индивидуума, например, вследствие мутации эндогенного белка, приводящей к измененной активности или локализации. Кроме того, рекомбинантный полипептид осуществляет антагонизм, прямо или непрямо, активности биологической части, присутствующей в клетке, на поверхности клетки или секретируемой из клетки. Примеры подлежащих антагонизму биологических частей включают липиды (например, холестерин), липопротеин (например, липопротеин низкой плотности), нуклеиновую кислоту, углевод или низкомолекулярный токсин.
Рекомбинантные белки, описанные в настоящем описании, конструируют для локализации в клетке, потенциально в конкретном компартменте, таком как ядро, и их конструируют для секреции из клетки или транслокации на плазматическую мембрану клетки.
Как описано в настоящем описании, пригодным признаком модифицированных нуклеиновых кислот по настоящему изобретению является способность снижать, ускользать от, избегать или устранять врожденный иммунный ответ клетки на экзогенную нуклеиновую кислоту. Предусматриваются способы проведения титрования, снижения или устранения иммунного ответа в клетке или популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления клетку подвергают контакту с первой композицией, которая содержит первую дозу первой экзогенной нуклеиновой кислоты, включающей транслируемую область и по меньшей мере одну нуклеозидную модификацию, и определяют уровень врожденного иммунного ответа клетки на первую экзогенную нуклеиновую кислоту. Затем клетку подвергают контакту со второй композицией, которая включает вторую дозу первой экзогенной нуклеиновой кислоты, вторую дозу, содержащую меньшее количество первой экзогенной нуклеиновой кислоты по сравнению с первой дозой. Альтернативно, клетку подвергают контакту с первой дозой второй экзогенной нуклеиновой кислоты. Вторая экзогенная нуклеиновая кислота может содержать один или несколько модифицированных нуклеозидов, которые могут быть одинаковыми или отличаются от первой экзогенной нуклеиновой кислоты, или, альтернативно, вторая экзогенная нуклеиновая кислота может не содержать модифицированные нуклеозиды. Стадии контактирования клетки с первой композицией и/или второй композицией можно повторять один или несколько раз. Кроме того, необязательно определяют эффективность продукции белка (например, трансляции белка) в клетке, и клетку можно вновь неоднократно трансфицировать первой и/или второй композицией до тех пор, пока не будет достигнута заданная эффективность продукции белка.
Терапевтические средства от заболеваний и состояний
Предусматриваются способы лечения или предупреждения симптома заболевания, характеризующегося отсутствующей или аберрантной активностью белка, путем восстановления отсутствующей активности белка или устранения аберрантной активности белка. Вследствие быстрой инициации белковой продукции после введения модифицированных мРНК по сравнению с вирусными ДНК-векторами, соединения по настоящему изобретению являются особенно преимущественными в отношении лечения острых заболеваний, таких как сепсис, инсульт и инфаркт миокарда. Более того, отсутствие регуляции транскрипции модифицированных мРНК по настоящему изобретению является преимущественным в том, что достижимо точное титрование при продуцировании белка. Многие заболевания характеризуются отсутствующей (или по существу сниженной, так что надлежащая функция белка не выполняется) активностью белка. Такие белки могут не присутствовать, присутствуют в очень низких количествах или по существу являются нефункциональными. Настоящее изобретение относится к способу лечения таких состояний или заболеваний у индивидуума путем введения нуклеиновой кислоты или терапевтических средств на основе клеток, содержащих модифицированные нуклеиновые кислоты, предусматриваемые в рамках настоящего изобретения, где модифицированные нуклеиновые кислоты кодируют белок, который восстанавливает активность белка, отсутствующую в клетках-мишенях индивидуума.
Заболевания, характеризующиеся дисфункциональной или аберрантной активностью белка, включают, но не ограничиваются ими, злокачественную опухоль и пролиферативные заболевания, генетические заболевания (например, кистозный фиброз), аутоиммунные заболевания, диабет, нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания и метаболические заболевания. Настоящее изобретение относится к способу лечения таких состояний или заболеваний у индивидуума путем введения нуклеиновой кислоты или терапевтических средств на основе клеток, содержащих модифицированные нуклеиновые кислоты, предусматриваемые в рамках настоящего изобретения, где модифицированные нуклеиновые кислоты кодируют белок, который осуществляет антагонизм или иным образом устраняет нарушенную активность белка, присутствующую в клетке индивидуума.
Конкретными примерами дисфункционального белка являются варианты с миссенс-мутациями и нонсенс-мутациями гена регулятора трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе (CFTR), которые продуцируют дисфункциональный или нефункциональный, соответственно, вариант белка CFTR, который вызывает кистозный фиброз.
Таким образом, предусматриваются способы лечения кистозного фиброза у млекопитающего путем контакта клетки индивидуума с модифицированной нуклеиновой кислотой, имеющей транслируемую область, которая кодирует функциональный полипептид CFTR, в таких условиях, чтобы в клетке присутствовало эффективное количество полипептида CTFR. Предпочтительными клетками-мишенями являются эпителиальные клетки, такие как клетки легкого, и способы введения определяются с учетом ткани-мишени; т.е. для доставки в легкое молекулы РНК составляют для введения путем ингаляции.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения гиперлипидемии у индивидуума путем введения в клеточную популяцию индивидуума модифицированной молекулы мРНК, кодирующей сортилин, белок, недавно охарактеризованный с помощью геномных исследований, тем самым смягчая гиперлипидемию у индивидуума. Ген SORT1 кодирует трансмембранный белок транс-сети Гольджи (TGN), называемый сортилином. Генетические исследования показали, что один из пяти индивидуумов имеет однонуклеотидный полиморфизм, rs12740374, в локусе 1p13 гена SORT1, который предрасполагает их к наличию низких уровней липопротеина низкой плотности (LDL) и липопротеина очень низкой плотности (VLDL). Каждая копия минорного аллеля, присутствующего приблизительно у 30% людей, изменяет уровень холестерина LDL на 8 мг/дл, в то время как две копии минорного аллеля, присутствующие приблизительно у 5% популяции, снижают холестерин LDL на 16 мг/дл. Было показано, что носители минорного аллеля имеют на 40% сниженный риск инфаркта миокарда. В функциональных исследованиях на мышах in vivo описано, что сверхэкспрессия SORT1 в ткани печени мыши приводила к значительно более низким уровням LDL-холестерина, вплоть до на 80% более низким, и что подавление SORT1 увеличивало уровень холестерина LDL приблизительно на 200% (Musunuru K et al. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature 2010; 466:714-721).
Способы клеточной доставки нуклеиновой кислоты
Способы по настоящему изобретению усиливают доставку нуклеиновой кислоты в популяцию клеток in vivo, ex vivo или in culture. Например, клеточную культуру, содержащую множество клеток-хозяев (например, эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей или млекопитающих), подвергают контакту с композицией, которая содержит улучшенную нуклеиновую кислоту, имеющую по меньшей мере одну нуклеозидную модификацию и, необязательно, транслируемую область. Композиция также обычно содержит реагент для трансфекции или другое соединение, которое увеличивает эффективность захвата улучшенной нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева. Улучшенная нуклеиновая кислота проявляет увеличенное удержание в популяции клеток относительно соответствующей немодифицированной нуклеиновой кислоты. Удержание улучшенной нуклеиновой кислоты превышает удержание немодифицированной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления оно по меньшей мере приблизительно на 50%, 75%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200% или более чем на 200% превышает удержание немодифицированной нуклеиновой кислоты. Такое преимущество удержания может обеспечиваться одним раундом трансфекции улучшенной нуклеиновой кислоты, или оно может быть достигнуто после повторных раундов трансфекции.
В некоторых вариантах осуществления улучшенную нуклеиновую кислоту доставляют в популяцию клеток-мишеней с одной или несколькими дополнительными нуклеиновыми кислотами. Такая доставка может происходить одновременно, или улучшенную нуклеиновую кислоту доставляют перед доставкой одной или нескольких дополнительных нуклеиновых кислот. Дополнительные одна или несколько нуклеиновых кислот могут представлять собой модифицированные нуклеиновые кислоты или немодифицированные нуклеиновые кислоты. Понятно, что исходное присутствие улучшенных нуклеиновых кислот по существу не индуцирует врожденный иммунный ответ клеточной популяции, и, более того, что врожденный иммунный ответ не будет активироваться посредством последующего присутствия немодифицированных нуклеиновых кислот. В этом отношении, улучшенная нуклеиновая кислота сама по себе может не содержать транслируемую область, если белок, присутствие которого является желательным в популяции клеток-мишеней, транслируется с немодифицированных нуклеиновых кислот.
Нацеливающие части
В вариантах осуществления настоящего изобретения модифицированные нуклеиновые кислоты предоставляют для экспрессии связывающего белок партнера или рецептора на поверхности клетки, который функционирует, нацеливая клетку на конкретную область ткани или взаимодействуя с конкретным соединением, либо in vivo, либо in vitro. Подходящие связывающие белок партнеры включают антитела и их функциональные фрагменты, каркасные белки или пептиды. Кроме того, модифицированные нуклеиновые кислоты можно использовать для направления синтеза и внеклеточной локализации липидов, углеводов или других биологических соединений.
Постоянное подавление экспрессии генов
Способ эпигенетического подавления экспрессии генов у млекопитающего, включающий нуклеиновую кислоту, где транслируемая область кодирует полипептид или полипептиды, способные направлять специфическое к последовательности метилирование гистона H3 для инициации образования гетерохроматина и снижения транскрипции гена в области конкретных генов для подавления гена. Например, мутация с приобретением функции в гене Janus-киназы 2 ответственна за группу миелопролиферативных заболеваний.
Доставка поддающегося обнаружению или терапевтического средства к биологической мишени
Модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно использовать в ряде различных сценариев, в которых является желательной доставка вещества ("груза") к биологической мишени, например, доставка поддающихся обнаружению веществ для обнаружения мишени, или доставка лекарственного средства. Способы обнаружения могут включать способы визуализации как in vitro, так и in vivo, например, иммуногистохимию, биолюминесцентную визуализацию (BLI), магнитно-резонансную томографию (MRI), позитронно-эмиссионную томографию (PET), электронную микроскопию, рентгеновскую компьютерную томографию, визуализацию Рамана, оптическую когерентную томографию, визуализацию по поглощению, термическую визуализацию, визуализацию по отражению флуоресценции, флуоресцентную микроскопию, флуоресцентную молекулярно-томографическую визуализацию, ядерную магнитно-резонансную томографию, рентгеновскую визуализацию, ультразвуковую визуализацию, фотоакустическую визуализацию, лабораторные анализы, или в любой ситуации, где требуется мечение/окрашивание/визуализация.
Например, модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно использовать для перепрограммирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (клеток iPS), которые затем можно использовать для прямого отслеживания клеток, которые трансфицированы, по сравнению со всеми клетками в кластере. В другом примере лекарственное средство, которое связано с модифицированной нуклеиновой кислотой через линкер и является флуоресцентно меченным, можно использовать для отслеживания лекарственного средства in vivo, например, внутриклеточно. Другие примеры включают использование модифицированной нуклеиновой кислоты для обратимой доставки лекарственного средства в клетки.
Модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно использовать при внутриклеточном нацеливании груза, например, поддающегося обнаружению или лекарственного средства, в конкретную органеллу. Иллюстративные внутриклеточные мишени могут включать ядерную локализацию для улучшенного процессинга мРНК, или последовательность ядерной локализации (NLS), связанную с мРНК, содержащей ингибитор.
Кроме того, модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно использовать для доставки лекарственных средств в клетки или ткани, например, у живых животных. Например, модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, можно использовать для доставки высокополярных химиотерапевтических средств для уничтожения клеток злокачественной опухоли. Модифицированные нуклеиновые кислоты, связанные с лекарственным средством через линкер, могут способствовать его проникновению, позволяя лекарственному средству проникать в клетку для достижения внутриклеточной мишени.
В другом примере модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты можно связывать с вирусным ингибиторным пептидом (VIP) через расщепляемый линкер. Расщепляемый линкер будет высвобождать VIP и краситель в клетку. В другом примере модифицированные нуклеозиды, модифицированные нуклеотиды и модифицированные нуклеиновые кислоты можно присоединять через линкер к ADP-рибозилату, который ответственен за действие некоторых бактериальных токсинов, таких как холерный токсин, дифтерийный токсин и коклюшный токсин. Эти белки токсинов представляют собой ADP-рибозилтрансферазы, которые модифицируют белки-мишени в клетках человека. Например, холерный токсин осуществляет ADP-рибозилирование G-белков, обеспечивая массивную секрецию жидкости из выстилки тонкого кишечника, что приводит к опасной для жизни диарее.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение относится к белкам, полученным из модифицированных мРНК. Фармацевтические композиции необязательно могут содержать одно или несколько дополнительных терапевтически активных веществ. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления предусматривается способ введения фармацевтических композиций, содержащих модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько белков, подлежащих доставке индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят человеку. Для целей настоящего изобретения выражение "активный ингредиент", как правило, относится к белку, кодирующему белок или содержащему белок комплексу, как описано в настоящем описании.
Хотя описание фармацевтических композиций, предусматриваемых в рамках настоящего изобретения, главным образом, направлено на фармацевтические композиции, которые пригодны для введения человеку, квалифицированному специалисту будет понятно, что такие композиции обычно пригодны для введения животным всех видов. Модификация фармацевтических композиций, пригодных для введения человеку для того, чтобы сделать композиции пригодными для введения различным животным, хорошо понятна, и обычный квалифицированный ветеринар-фармацевт может спланировать и/или выполнить такую модификацию с использованием только обычного, или даже без него, экспериментирования. Индивидуумы, предусматриваемые для введения фармацевтических композиций, включают, но не ограничиваются ими, человека и/или других приматов; млекопитающих, включая имеющих коммерческое значение млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, коты, собаки, мыши и/или крысы; и/или птицы, включая имеющих коммерческое значение птиц, таких как куры, утки, гуси и/или индейки.
Составы фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании, можно получать любым способом, который известен или будет разработан в будущем в области фармакологии. Как правило, такие способы получения включают стадию объединения активного ингредиента с эксципиентом и/или одним или несколькими другими вспомогательными ингредиентами, а затем, если необходимо и/или желательно, придание формы и/или упаковывание продукта в желаемую единицу для однократного дозирования или многократного дозирования.
Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно получать, упаковывать и/или продавать в общей массе, в качестве единичной дозы и/или в качестве множества единичных доз. Как используют в рамках изобретения, "единичная доза" представляет собой определенное количество фармацевтической композиции, содержащей заданное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента, как правило, равно дозировке активного ингредиента, которую вводят индивидууму, и/или удобной части такой дозировки, например, такой как половина или треть такой дозировки.
Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого эксципиента и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением варьирует, в зависимости от особенностей, размера и/или состояния индивидуума, подвергаемого лечению, и, кроме того, в зависимости от пути введения композиции. В качестве примера, композиция может содержать от 0,1% до 100% (масс./масс.) активного ингредиента.
Кроме того, фармацевтические составы могут содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, который, как используют в рамках изобретения, включает любые и все растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие носители, диспергирующие или суспендирующие добавки, поверхностно-активные вещества, обеспечивающие изотоничность вещества, загустители или эмульгаторы, консерванты, твердые связующие вещества, смазывающие вещества и т.п., пригодные для конкретной желаемой дозированной формы. В Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; включенная в настоящее описание в качестве ссылки) описаны различные эксципиенты, используемые для составления фармацевтических композиций, и известные способы их получения. За исключением случаев, когда общепринятый эксципиент несовместим с веществом или его производными, как, например, вследствие возникновения какого-либо нежелательного биологического эффекта или иного вредоносного взаимодействия с любым другим компонентом(ами) фармацевтической композиции, его применение предусматривается в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый эксципиент является чистым по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100%. В некоторых вариантах осуществления эксципиент одобрен для применения у человека и для ветеринарного применения. В некоторых вариантах осуществления эксципиент одобрен United States Food and Drug Administration. В некоторых вариантах осуществления эксципиент представляет собой эксципиент фармацевтической категории. В некоторых вариантах осуществления эксципиент удовлетворяет стандартам United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), British Pharmacopoeia и/или International Pharmacopoeia.
Фармацевтически приемлемые эксципиенты, используемые для изготовления фармацевтических композиций, включают, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, диспергирующие и/или гранулирующие агенты, поверхностно-активные вещества и/или эмульгаторы, дезинтегрирующие вещества, связующие вещества, консерванты, буферные вещества, смазывающие вещества и/или масла. Такие эксципиенты необязательно могут быть включены в фармацевтические составы. В композиции могут присутствовать эксципиенты, такие как масло какао и воск для суппозиториев, красители, покровные вещества, подсластители, вкусовые добавки и/или отдушки, в зависимости от мнения составителя.
Иллюстративные разбавители включают, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, дикальций фосфат, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, лактозу натрия фосфата, сахарозу, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, инозитол, хлорид натрия, сухой крахмал, кукурузный крахмал, порошковый сахар и т.д. и/или их комбинацию.
Иллюстративные гранулирующие и/или диспергирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, картофельный крахмал, кукурузный крахмал, тапиоковый крахмал, натрия крахмала гликолят, глины, альгиновую кислоту, гуаровую камедь, цитрусовую пульпу, агар, бентонит, целлюлозу и древесные продукты, природную губку, катионообменные смолы, карбонат кальция, силикаты, карбонат натрия, сшитый поли(винилпирролидон) (кросповидон), натрий карбоксиметилкрахмал (натрия крахмала гликолят), карбоксиметилцеллюлозу, сшитую натрий-карбоксиметилцеллюлозу (кроскармеллозу), метилцеллюлозу, преджелатинизированный крахмал (крахмал 1500), микрокристаллический крахмал, нерастворимый в воде крахмал, кальций-карбоксиметилцеллюлозу, алюмосиликат магния (Veegum), лаурилсульфат натрия, четвертичные соединения аммония, и т.д. и/или их комбинации.
Иллюстративные поверхностно-активные вещества и/или эмульгаторы включают, но не ограничиваются ими, природные эмульгаторы (например, гуммиарабик, агар, альгиновая кислота, альгинат натрия, трагакант, хондрукс, холестерин, ксантан, пектин, желатин, яичный желток, казеин, ланолин, холестерин, воск и лецитин), коллоидные глины (например бентонит [силикат алюминия] и Veegum® [алюмосиликат магния]), производные аминокислот с длинной цепью, высокомолекулярные спирты (например, стеариловый спирт, цетиловый спирт, олеиловый спирт, триацетинмоностеарат, дистеарат этиленгликоля, глицерилмоностеарат и моностеарат пропиленгликоля, поливиниловый спирт), карбомеры (например, карбоксиполиметилен, полиакриловая кислота, полимер акриловой кислоты и карбоксивиниловый полимер), каррагинан, производные целлюлозы (например, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, порошковая целлюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза), сложные эфиры сорбитана и жирных кислот (например, полиоксиэтилен сорбитан монолаурат [Tween®20], полиоксиэтилен сорбитан [Tween®60], полиоксиэтилен сорбитан моноолеат [Tween®80], сорбитан монопальмитат [Span®40], сорбитан моностеарат [Span®60], сорбитан тристеарат [Span®65], глицерил моноолеат, сорбитан моноолеат [Span®80]), сложные эфиры полиоксиэтилена (например, полиоксиэтилен моностеарат [Myrj®45], полиоксиэтилен гидрогенизированный касторовое масло, полиэтоксилированное касторовое масло, полиоксиметилен стеарат и Solutol®), сложные эфиры сахарозы и жирных кислот, сложные эфиры полиэтиленгликоля и жирных кислот (например, Cremophor®), простые эфиры полиоксиэтилена (например, лауриловый эфир полиоксиэтилена [Brij®30]), поли(винилпирролидон), монолаурат диэтиленгликоля, триэтаноламинолеат, олеат натрия, олеат калия, этилолеат, олеиновую кислоту, этиллаурат, лаурилсульфат натрия, Pluronic®F 68, Poloxamer®188, бромид цетримония, хлорид цетилпиридиния, хлорид бензалкония, докузат натрий, и т.д. и/или их комбинации.
Иллюстративные связующие вещества включают, но не ограничиваются ими, крахмал (например, кукурузный крахмал и крахмальная паста); желатин; сахара (например, сахароза, глюкоза, декстроза, декстрин, меласса, лактоза, лактит, маннит); природные и синтетические камеди (например, гуммиарабик, альгинат натрия, экстракт ирландского мха, камедь кассии, гхатти камедь, клейковину лузги, карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, ацетат целлюлозы, поли(винилпирролидон), алюмосиликат магния (Veegum®) и арабиногалактан лиственницы); альгинаты; оксида полиэтилен; полиэтиленгликоль; неорганические соли кальция; кремниевую кислоту; полиметакрилаты; воск; воду; спирт; и т.д.; и их комбинации.
Иллюстративные консерванты могут включать, но не ограничиваются ими, антиоксиданты, хелатирующие агенты, противомикробные консерванты, противогрибковые консерванты, спиртовые консерванты, кислотные консерванты и/или другие консерванты. Иллюстративные антиоксиданты включают, но не ограничиваются ими, альфа-токоферол, аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, монотиоглицерин, метабисульфит калия, пропионовую кислоту, пропилгаллат, аскорбат натрия, бисульфит натрия, метабисульфит натрия и/или сульфит натрия. Иллюстративные хелатирующие агенты включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), моногидрат лимонной кислоты, динатрий эдетат, дикалий эдетат, эдетовую кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту, фосфорную кислоту, эдетат натрия, виннокаменную кислоту и/или тринатрий эдетат. Иллюстративные противомикробные консерванты включают, но не ограничиваются ими, хлорид бензалкония, хлорид бензэтония, бензиловый спирт, бронопол, цетримид, хлорид цетилпиридиния, хлоргексидин, хлорбутанол, хлоркрезол, хлорксиленол, крезол, этиловый спирт, глицерин, гексетидин, имидмочевину, фенол, феноксиэтанол, фенилэтиловый спирт, нитрат фенилртути, пропиленгликоль и/или тимеросал. Иллюстративные противогрибковые консерванты включают, но не ограничиваются ими, бутилпарабен, метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен, бензойную кислоту, гидроксибензойную кислоту, бензоат калия, сорбат калия, бензоат натрия, пропионат натрия и/или сорбиновую кислоту. Иллюстративные спиртовые консерванты включают, но не ограничиваются ими, этанол, полиэтиленгликоль, фенол, фенольные соединения, бисфенол, хлорбутанол, гидроксибензоат и/или фенилэтиловый спирт. Иллюстративные кислотные консерванты включают, но не ограничиваются ими, витамин A, витамин C, витамин E, бета-каротин, лимонную кислоту, уксусную кислоту, дегидроуксусную кислоту, аскорбиновую кислоту, сорбиновую кислоту и/или фитиновую кислоту. Другие консерванты включают, но не ограничиваются ими, токоферол, ацетат токоферола, детероксим мезилат, цетримид, бутилиованный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), этилендиамин, лаурилсульфат натрия (SLS), сульфат натрий-лаурилового эфира (SLES), бисульфит натрия, метабисульфит натрия, сульфит калия, метабисульфит калия, Glydant Plus®, Phenonip®, метилпарабен, Germall®115, Germaben®II, NeoloneTM, KathonTM и/или Euxyl®.
Иллюстративные буферные средства включают, но не ограничиваются ими, цитратные буферные растворы, ацетатные буферные растворы, фосфатные буферные растворы, хлорид аммония, карбонат кальция, хлорид кальция, цитрат кальция, глубионат кальция, глуцептат кальция, глюконат кальция, d-глюконовую кислоту, глицерофосфат кальция, лактат кальция, пропионовую кислоту, левулинат кальция, пентановую кислоту, двухосновный фосфат кальция, фосфорную кислоту, трехосновный фосфат кальция, фосфат-гидроксид кальция, ацетат калия, хлорид калия, глюконат калия, смеси калия, двухосновный фосфат калия, одноосновный фосфат калия, смеси фосфата калия, ацетат натрия, бикарбонат натрия, хлорид натрия, цитрат натрия, лактат натрия, двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат натрия, смеси фосфата натрия, трометамин, гидроксид магния, гидроксид алюминия, альгиновую кислоту, не содержащую пирогенов воду, изотонический солевой раствор, раствор Рингера, этиловый спирт, и т.д. и/или их комбинации.
Иллюстративные смазывающие вещества включают, но не ограничиваются ими, стеарат магния, стеарат кальция, стеариновую кислоту, диоксид кремния, тальк, солод, глицерилбегенат, гидрогенизированные растительные масла, полиэтиленгликоль, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, лейцин, лаурилсульфат магния, лаурилсульфат натрия и т.д. и их комбинации.
Иллюстративные масла включают, но не ограничиваются ими, миндальное масло, масло из косточек абрикоса, масло авокадо, масло бабассу, масло бергамота, масло семян черной смородины, масло огуречника, можжевеловое масло, масло ромашки, масло канолы, масло тмина, масло карнаубы, касторовое масло, коричное масло, масло какао, кокосовое масло, жир печени трески, масло кофе, кукурузное масло, хлопковое масло, жир эму, эвкалиптовое масло, масло первоцвета вечернего, рыбий жир, льняное масло, гераниол, тыквенное масло, масло из виноградных косточек, масло лесного ореха, масло иссопа, изопропилмиристат, масло жожобы, масло из плодов лакового дерева, лавандин, масло лаванды, масло лимона, масло кубебы, масло австралийского ореха, масло просвирник, масло из семян манго, масло из семян пенника лугового, норковый жир, масло мускатного ореха, оливковое масло, масло апельсина, масло исландского берикса, пальмовое масло, пальмоядровое масло, масло из персиковых косточек, арахисовое масло, маковое масло, масло семян тыквы, рапсовое масло, масло из рисовых отрубей, розмариновое масло, сафлоровое масло, сандаловое масло, масло сасанквы, масло чабера, облепиховое масло, кунжутное масло, масло из семян дерева ши, кремниевое масло, соевое масло, подсолнечное масло, масло чайного дерева, масло чертополоха, масло цубаки, масло ветивер, масло грецкого ореха и масло зародышей пшеницы. Иллюстративные масла включают, но не ограничиваются ими, бутилстеарат, каприловый триглицерид, каприновый триглицерид, циклометикон, диэтилсебакат, диметикон 360, изопропилмиристат, минеральное масло, октилдодеканол, олеиловый спирт, кремниевое масло и/или их комбинации.
Жидкие дозированные формы для перорального и парентерального введения включают, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и/или эликсиры. В дополнение к активным ингредиентам, жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, например, такие как вода или другие растворители, солюбилизаторы и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное, масло зародышей, оливковое масло, касторовое масло и кунжутные масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, и их смеси. Помимо инертных разбавителей пероральные композиции могут включать адъюванты, такие как смачивающие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подсластители, вкусовые добавки и/или отдушки. В определенных вариантах осуществления для парентерального введения композиции смешивают с солюбилизаторами, такими как Cremophor®, спирты, масла, модифицированные масла, гликоли, полисорбаты, циклодекстрины, полимеры и/или их комбинации.
Инъецируемые препараты, например, стерильные инъецируемые водные или масляные суспензии, можно составлять в соответствии с уровнем техники с использованием подходящих диспергирующих средств, смачивающих веществ и/или суспендирующих веществ. Стерильные инъецируемые препараты могут представлять собой стерильные инъецируемые растворы, суспензии и/или эмульсии в нетоксичных парентерально приемлемых разбавителях и/или растворителях, например, в качестве раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, находятся вода, раствор Рингера, U.S.P. и изотонический раствор хлорида натрия. В качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные жирные масла. Для этой цели можно использовать любое легкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Для получения инъецируемых препаратов можно использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.
Инъецируемые составы можно стерилизовать, например, путем фильтрации через удерживающий бактерии фильтр, и/или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъецируемой среде перед применением.
Для продления эффекта активного ингредиента часто является желательным замедление всасывания активного ингредиента при подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществлять с использованием жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в воде. В этом случае скорость всасывания лекарственного средства зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, осуществляют замедленное всасывание парентерально вводимой лекарственной формы путем растворения или суспендирования лекарственного средства в масляном носителе. Инъецируемые депо-формы получают путем формирования микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера и природы конкретного используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Примеры других биодеградируемых полимеров включают сложные поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Депо-инъецируемые составы получают путем заключения лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.
Композиции для ректального или вагинального введения, как правило, представляют собой суппозитории, которые можно получать путем смешения композиций с подходящими не вызывающими раздражения эксципиентами, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск суппозиториев, которые являются твердыми при температуре окружающей среды, но жидкими при температуре тела и, таким образом, плавятся в прямой кишке или вагинальной полости и высвобождают активный ингредиент.
Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах активный ингредиент смешан по меньшей мере с одним инертным фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как цитрат натрия или дикальций фосфат, и/или наполнителями или разбавителями (например, крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота), связующими веществами (например карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидинон, сахароза и гуммиарабик), увлажнителями (например, глицерин), дезинтегрирующими веществами (например, агар, карбонат кальция, картофель или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенные силикаты и карбонат натрия), задерживающими растворение средствами (например, парафин), ускоряющими всасывание средствами (например, четвертичные соединения аммония), смачивающими веществами (например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина), сорбентами (например, каолин и бентонитовая глина) и смазывающими веществами (например, тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия) и их смесями. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированная форма может содержать буферные средства.
Твердые композиции сходного типа можно использовать в качестве наполнителей в мягких и твердых заполненных желатиновых капсул с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п. Твердые дозированные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно получать с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильное покрытие и другие покрытия, хорошо известные в области составления фармацевтических препаратов. Они необязательно могут содержать замутняющие агенты и могут иметь такую композицию, что они высвобождают активный ингредиент(ы) только, или предпочтительно, в определенной части кишечного тракта, необязательно замедленным образом. Примеры композиции для погружения, которые можно использовать, включают полимерные вещества и воск. Твердые композиции сходного типа можно использовать в качестве наполнителей в мягких и твердых заполненных желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, таких как высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Дозированные формы для местного и/или трансдермального введения композиции могут включать мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, порошки, растворы, спреи, ингалируемые средства и/или пластыри. Как правило, активный ингредиент смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым эксципиентом и/или любыми необходимыми консервантами и/или буферами, в зависимости от обстоятельств. Кроме того, в настоящем описании предусматривается использование трансдермальных пластырей, которые часто имеют дополнительное преимущество обеспечения контролируемой доставки соединения в организм. Такие дозированные формы можно получать, например, путем растворения и/или диспергирования соединения в надлежащей среде. Альтернативно или дополнительно, скорость можно контролировать посредством либо предоставления контролирующей скорость мембраны и/либо диспергирования соединения в полимерной матрице и/или геле.
Подходящие устройства для применения в целях доставки внутрикожных фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании, включают короткоигольные устройства, такие как устройства, описанные в патентах США 4886499; 5190521; 5328483; 5527288; 4270537; 5015235; 5141496 и 5417662. Внутрикожные композиции можно вводить с помощью устройств, которые ограничивают эффективную длину проникновения иглы в кожу, таких как устройства, описанные в публикации PCT WO 99/34850, и их функциональные эквиваленты. Пригодными являются устройства для струйного инжектирования, которые доставляют жидкие композиции в кожу через устройство для струйного инжектирования жидкостей и/или через иглу, которая проходит через роговой слой и обеспечивает струю, которая достигает слоя дермы. Устройства для струйного инжектирования описаны, например, в патентах США 5480381; 5599302; 5334144; 5993412; 5649912; 5569189; 5704911; 5383851; 5893397; 5466220; 5339163; 5312335; 5503627; 5064413; 5520639; 4596556; 4790824; 4941880; 4940460; и публикациях PCT WO 97/37705 и WO 97/13537. Пригодными являются баллистические устройства для доставки порошка/частиц, в которых используется сжатый газ для ускорения вакцины в порошковой форме через наружные слои кожи в слой дермы. Альтернативно или дополнительно, общепринятые шприцы можно использовать в классическом способе внутрикожного введения Манту.
Составы, пригодные для местного введения, включают, но не ограничиваются ими, жидкие и/или полужидкие препараты, такие как мази, лосьоны, эмульсии типа "масло в воде" и/или "вода в масле", такие как кремы, мази и/или пасты, и/или растворы и/или суспензии. Составы для местного введения могут содержать, например, от приблизительно 1% до приблизительно 10% (масс./масс.) активного ингредиента, хотя концентрация активного ингредиента может достигать предела растворимости активного ингредиента в растворителе. Составы для местного введения, кроме того, могут содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем описании.
Фармацевтическую композицию можно получать, упаковывать и/или продавать в составе, пригодном для легочного введения через полость рта. Такой состав может содержать сухие частицы, которые содержат активный ингредиент и которые имеют диаметр в диапазоне от приблизительно 0,5 нм до приблизительно 7 нм или от приблизительно 1 нм до приблизительно 6 нм. Удобно, чтобы такие композиции имели форму сухих порошков для введения с использованием устройства, содержащего емкость с сухим порошком, в который может быть направлен поток пропеллента для диспергирования порошка и/или с использованием распределяющего контейнера с самодвижущимся растворителем/порошком, таким как устройство, содержащее активный ингредиент, растворенный и/или суспендированный в пропелленте с низкой температурой кипения в закрытом контейнере. Такие порошки содержат частицы, где по меньшей мере 98% частиц по массе имеют диаметр более 0,5 нм и по меньшей мере 95% частиц по количеству имеют диаметр менее 7 нм. Альтернативно, по меньшей мере 95% частиц по массе имеют диаметр более 1 нм и по меньшей мере 90% частиц по количеству имеют диаметр менее 6 нм. Композиции в виде сухого порошка могут включать твердый разбавитель в виде тонкоизмельченного порошка, такого как сахар, и удобным образом предоставляются в единичной дозированной форме.
Пропелленты с низкой температурой кипения включают жидкие пропелленты, имеющие температуру кипения ниже 65°F (18°С) при атмосферном давлении. Как правило, пропеллент может составлять 50%-99,9% (масс./масс.) композиции, и активный ингредиент может составлять 0,1%-20% (масс./масс.) композиции. Кроме того, пропеллент может содержать дополнительные ингредиенты, такие как жидкое неионное и/или твердое анионное поверхностно-активное вещество и/или твердый разбавитель (который может иметь размер частиц того же порядка, что и частицы, содержащие активный ингредиент).
Фармацевтические композиции, составленные для легочной доставки, могут обеспечивать активный ингредиент в форме капель раствора и/или суспензии. Такие составы можно получать, упаковывать и/или продавать в качестве водных и/или разбавленных спиртовых растворов и/или суспензий, необязательно стерильных, содержащих активный ингредиент, и их можно удобным образом вводить с использованием любого устройства для распыления и/или пульверизации. Такие составы, кроме того, могут содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая, но не ограничиваясь ими, вкусовую добавку, такую как сахарин натрий, летучее масло, буферное вещество, поверхностно-активное вещество и/или консервант, такой как метилгидроксибензоат. Капли, предоставляемые этим путем введения, могут иметь средний диаметр в диапазоне от приблизительно 0,1 нм до приблизительно 200 нм.
Составы, описанные в настоящем описании в качестве пригодных для легочной доставки, пригодны для интраназальной доставки фармацевтической композиции. Другой состав, пригодный для интраназального введения, представляет собой грубый порошок, содержащий активный ингредиент и имеющий средний размер частиц приблизительно от 0,2 мкм до 500 мкм. Такой состав вводят подобно тому, как нюхают табак, т.е. путем быстрой ингаляции через носовой канал из контейнера порошка, удерживаемого вблизи носа.
Составы, пригодные для назального введения могут содержать, например, от приблизительно только 0,1% (масс./масс.) и вплоть до 100% (масс./масс.) активного ингредиента, и могут содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем описании. Фармацевтическую композицию можно получать, упаковывать и/или продавать в составе, пригодном для буккального введения. Такие составы могут быть, например, в форме таблеток и/или пастилок, изготовленных с использованием общепринятых способов, и могут содержать, например, от 0,1% до 20% (масс./масс.) активного ингредиента, остальную часть, содержащую перорально растворимую и/или деградируемую композицию и, необязательно, один или несколько дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем описании. Альтернативно, составы, пригодные для буккального введения, могут содержать порошок и/или аэрозолированный и/или распыленный раствор и/или суспензию, содержащую активный ингредиент. Такие порошковые, аэрозолированные и/или аэрозолированные составы, в дисперсном состоянии, могут иметь средний размер частиц и/или размер капель в диапазоне от приблизительно 0,1 нм до приблизительно 200 нм, и, кроме того, могут содержать один или несколько каких-либо дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем описании.
Фармацевтическую композицию можно получать, упаковывать и/или продавать в составе, пригодном для офтальмологического введения. Такие составы могут быть, например, в форме глазных капель, включающих, например, раствор и/или суспензию 0,1/1,0% (масс./масс.) активного ингредиента в водном или масляном жидком эксципиенте. Такие капли, кроме того, могут содержать буферные вещества, соли и/или один или несколько других из каких-либо дополнительных ингредиентов, описанных в настоящем описании. Другие офталомологически вводимые составы, которые являются пригодными, включают составы, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме и/или в липосомальном препарате. Предусматривается, что ушные капли и/или глазные капли находятся в объеме настоящего изобретения.
Общие принципы составления и/или изготовления фармацевтических средств могут быть найдены, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (включенная в настоящее описание в качестве ссылки).
Введение
Настоящее изобретение относится к способам, включающим введение белков или комплексов в соответствии с настоящим изобретением индивидууму, нуждающемуся в этом. Белки или комплексы, или их фармацевтические, визуализирующие, диагностические или профилактические композиции, можно вводить индивидууму с использованием любого количества и пути введения, эффективного для профилактики, лечения, диагностики или визуализации заболевания, нарушения и/или состояния (например, заболевание, нарушение и/или состояние, связанное с дефицитом кратковременной памяти). Точное требуемое количество будет варьировать от индивидуума к индивидууму, в зависимости от вида, возраста и общего состояния индивидуума, тяжести заболевания, конкретной композиции, ее пути введения, ее режима и т.п. Композиции в соответствии с настоящим изобретением, как правило, составляют в единичной дозированной форме для простоты введения и единообразия дозировки. Однако будет понятно, что общее суточное применение композиций по настоящему изобретению будет определяться лечащим врачом в соответствии с его профессиональным мнением. Конкретный терапевтически эффективный, профилактически эффективный или соответствующим образом визуализирующий уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от различных факторов, включающих подвергаемое лечению нарушение и тяжесть нарушения; активность конкретного используемого соединения; конкретную используемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания пациента; время введения, путь введения и скорость экскреции конкретного используемого соединения; длительность лечения; лекарственные средства, используемые в комбинации или по совпадению с конкретным используемым соединением; и сходные факторы, хорошо известные в области медицины.
Белки, подлежащие доставке и/или их фармацевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие композиции можно вводить животным, таким как млекопитающие (например, люди, домашние животные, кошки, собаки, мыши, крысы и т.д.). В некоторых вариантах осуществления их фармацевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие композиции вводят человеку.
Белки, подлежащие доставке, и/или их фармацевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие композиции по настоящему изобретению можно вводить любым путем. В некоторых вариантах осуществления белки и/или их фармацевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие композиции вводят одним или несколькими из множества путей, включающих пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, внутрикостномозговой, интратекальный, подкожный, внутрижелудочковый, чрескожный, внутрикожный, ректальный, интравагинальный, внутрибрюшинный, местный (например, посредством порошков, мазей, кремов, гелей, лосьонов и/или капель), через слизистую оболочку, назальный, буккальный, энтеральный, витреальный, внутриопухолевый, сублингвальный; путем внутритрахеального вливания, бронхиального вливания и/или ингаляции; такой как пероральный спрей, назальный спрей и/или аэрозоль, и/или через катетер в портальной вене. В некоторых вариантах осуществления белки или комплексы и/или их фармацевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие композиции вводят путем системной внутривенной инъекции. В конкретных вариантах осуществления белки или комплексы и/или их фармацевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие композиции можно вводить внутривенно и/или перорально. В конкретных вариантах осуществления белки или комплексы и/или их фармацевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие композиции можно вводить так, чтобы позволить белку или комплексу пройти через гематоэнцефалический барьер, сосудистый барьер или другой эпителиальный барьер.
Однако настоящее изобретение охватывает доставку белков или комплексов и/или их фармацевтических, профилактических, диагностических или визуализирующих композиций любым подходящим путем, учитывая возможные достижения науки в области доставки лекарственных средств.
Как правило, наиболее подходящий путь введения будет зависеть от различных факторов, включающих природу белка или комплекса, содержащего белки, связанные по меньшей мере с одним средством, подлежащим доставке (например, его стабильность в условиях желудочно-кишечного тракта, в кровотоке и т.д.), состояние пациента (например, то, способен ли пациент переносить конкретные пути введения) и т.д. Настоящее изобретение охватывает доставку фармацевтических, профилактических, диагностических или визуализирующих композиций любым подходящим путем, учитывая возможные достижения науки в области доставки лекарственных средств.
В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению можно вводить на уровнях доз, достаточных для доставки от приблизительно 0,0001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг массы тела индивидуума в сутки, один или несколько раз в сутки, для достижения желаемого терапевтического, диагностического, профилактического или визуализирующего эффекта. Желаемую дозировку можно доставлять три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, раз в двое суток, раз в трое суток, раз в неделю, каждые две недели, каждые три недели и каждые четыре недели. В определенных вариантах осуществления желаемую дозировку можно доставлять с использованием множества введений (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати или более введений).
Белки или комплексы можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими, профилактическими, диагностическими или визуализирующими средствами. Под "в комбинации с" подразумевают, что средства необходимо вводить в одно и то же время и/или составлять для доставки вместе, хотя эти способы доставки находятся в пределах объема настоящего изобретения. Композиции можно вводить одновременно, до или после одного или нескольких других желаемых терапевтических средств или медицинских процедур. Как правило, каждое средство можно вводить в дозе и/или по расписанию, установленному для этого средства. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает доставку фармацевтических, профилактических, диагностических или визуализирующих композиций в комбинации со средствами, которые повышают их биодоступность, снижают и/или модифицируют их метаболизм, ингибируют их экскрецию и/или модифицируют их распределение в организме.
Кроме того, понятно, что терапевтические, профилактические, диагностические или визуализирующие активные вещества, используемые в комбинации, можно вводить вместе в одной композиции или их можно вводить по отдельности в различных композициях. Как правило, ожидается, что средства, используемые в комбинации, можно использовать на уровнях, которые не превышают уровней, при которых их используют по отдельности. В некоторых вариантах осуществления уровни, используемые в комбинации, будут более низкими, чем уровни, используемые по отдельности.
Для конкретной комбинации способов терапии (терапевтических средств или процедур) для применения в комбинированном режиме, учитывается совместимость желаемых терапевтических средств и/или процедур и желаемый терапевтический эффект, которого намереваются достигнуть. Также будет понятно, что используемые способы терапии могут обеспечивать желаемый эффект для одного и того же нарушения (например, композицию, пригодную для лечения злокачественной опухоли по настоящему изобретению можно вводить одновременно с химиотерапевтическим средством), или они могут обеспечивать различные эффекты (например, контроль каких-либо неблагоприятных явлений).
Наборы
Настоящее изобретение относится к различным наборам для удобного и/или эффективного осуществления способов по настоящему изобретению. Как правило, наборы содержат достаточные количества и/или численность компонентов, чтобы позволить пользователю осуществить многократное введение индивидууму(ам) и/или провести многократные эксперименты.
В одном аспекте изобретение относится к наборам для продуцирования белка, включающим первую выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую транслируемую область и модификацию нуклеиновой кислоты, где нуклеиновая кислота способна ускользать от или избегать индукции врожденного иммунного ответа в клетке, в которую введена первая выделенная нуклеиновая кислота, и упаковку и инструкции.
В одном аспекте изобретение относится к наборам для продуцирования белка, включающим: первую выделенную модифицированную нуклеиновую кислоту, содержащую транслируемую область, предоставленную в количестве, эффективном для продуцирования желаемого количества белка, кодируемого транслируемой областью при введении в клетку-мишень; вторую нуклеиновую кислоту, содержащую ингибиторную нуклеиновую кислоту, предоставленную в количестве, эффективном для существенного ингибирования врожденного иммунного ответа в клетке; и упаковку и инструкции.
В одном аспекте изобретение относится к наборам для продуцирования белка, включающим первую выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую транслируемую область и нуклеозидную модификацию, где нуклеиновая кислота проявляет сниженную деградацию клеточной нуклеазой, и упаковку и инструкции.
В одном аспекте изобретение относится к наборам для продуцирования белка, включающим первую выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую транслируемую область и по меньшей мере две различных нуклеозидных модификации, где нуклеиновая кислота проявляет сниженную деградацию клеточной нуклеазой, и упаковку и инструкции.
В одном аспекте изобретение относится к наборам для продуцирования белков, включающим первую выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую транслируемую область и по меньшей мере одну нуклеозидную модификацию, где нуклеиновая кислота проявляет сниженную деградацию клеточной нуклеазой; вторую нуклеиновую кислоту, содержащую ингибиторную нуклеиновую кислоту; и упаковку и инструкции.
В некоторых вариантах осуществления первая выделенная нуклеиновая кислота содержит матричную РНК (мРНК). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере один нуклеозид, выбранный из группы, состоящей из пиридин-4-онрибонуклеозида, 5-азауридина, 2-тио-5-азауридина, 2-тиоуридина, 4-тиопсевдоуридина, 2-тиопсевдоуридина, 5-гидроксиуридина, 3-метилуридина, 5-карбоксиметилуридина, 1-карбоксиметилпсевдоуридина, 5-пропинилуридина, 1-пропинил-псевдоуридина, 5-тауринометилуридина, 1-тауринометилпсевдоуридина, 5-тауринометил-2-тиоуридина, 1-тауринометил-4-тиоуридина, 5-метилуридина, 1-метилпсевдоуридина, 4-тио-1-метилпсевдоуридина, 2-тио-1-метилпсевдоуридина, 1-метил-1-деаза-псевдоуридина, 2-тио-1-метил-1-деазапсевдоуридина, дигидроуридина, дигидропсевдоуридина, 2-тиодигидроуридин, 2-тиодигидропсевдоуридина, 2-метоксиуридина, 2-метокси-4-тиоуридина, 4-метокси-псевдоуридина, 4-метокси-2-тиопсевдоуридина или любого нуклеозида, описанного в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере один нуклеозид, выбранный из группы, состоящей из 5-азацитидина, псевдоизоцитидина, 3-метилцитидина, N4-ацетилцитидина, 5-формилцитидина, N4-метилцитидина, 5-гидроксиметилцитидина, 1-метилпсевдоизоцитидина, пирролоцитидина, пирролопсевдоизоцитидина, 2-тиоцитидина, 2-тио-5-метилцитидина, 4-тио-псевдоизоцитидина, 4-тио-1-метилпсевдоизоцитидина, 4-тио-1-метил-1-деазапсевдоизоцитидина, 1-метил-1-деаза-псевдоизоцитидина, зебуларина, 5-азазебуларина, 5-метилзебуларина, 5-аза-2-тиозебуларина, 2-тиозебуларина, 2-метоксицитидина, 2-метокси-5-метилцитидина, 4-метоксипсевдоизоцитидина, 4-метокси-1-метилпсевдоизоцитидина или любого нуклеозида, описанного в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере один нуклеозид, выбранный из группы, состоящей из 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина, 7-деазааденина, 7-деаза-8-азааденина, 7-деаза-2-аминопурина, 7-деаза-8-аза-2-аминопурина, 7-деаза-2,6-диаминопурина, 7-деаза-8-аза-2,6-диаминопурина, 1-метиладенозина, N6-метиладенозина, N6-изопентениладенозина, N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозина, 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозина, N6-глицинилкарбамоиладенозина, N6-треонилкарбамоиладенозина, 2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозина, N6,N6-диметиладенозина, 7-метиладенина, 2-метилтиоаденина, 2-метоксиаденина или любого нуклеозида, описанного в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере один нуклеозид, выбранный из группы, состоящей из инозина, 1-метилинозина, виозина, вибутозина, 7-деазагуанозина, 7-деаза-8-азагуанозина, 6-тиогуанозина, 6-тио-7-деазагуанозина, 6-тио-7-деаза-8-азагуанозина, 7-метилгуанозина, 6-тио-7-метилгуанозина, 7-метилинозина, 6-метоксигуанозина, 1-метилгуанозина, N2-метилгуанозина, N2,N2-диметилгуанозина, 8-оксогуанозина, 7-метил-8-оксогуанозина, 1-метил-6-тиогуанозина, N2-метил-6-тиогуанозина, N2,N2-диметил-6-тиогуанозина или любого нуклеозида, описанного в настоящем описании.
В другом аспекте изобретение относится к композициям для продуцирования белка, содержащим первую выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую транслируемую область и нуклеозидную модификацию, где нуклеиновая кислота проявляет сниженную деградацию клеточной нуклеазой, и клетку млекопитающих, пригодную для трансляции транслируемой области первой нуклеиновой кислоты.
Определения
В различных разделах настоящего описания заместители соединений по настоящему изобретения описаны в качестве групп или диапазонов. В частности, подразумевается, что настоящее изобретение включает каждую индивидуальную подкомбинацию представителей таких групп и диапазонов. Например, в частности подразумевается, что термин "C1-6 алкил" индивидуально обозначает метил, этил, C3 алкил, C4 алкил, C5 алкил и C6 алкил.
Приблизительно: Как используют в рамках изобретения, термин "приблизительно" означает +/- 10% от указанной величины.
Введенный в комбинации: Как используют в рамках изобретения, термин "введенный в комбинации" или "комбинированное введение" означает, что два или более средств вводят индивидууму в одно и то же время или в пределах такого интервала, чтобы могло существовать перекрывание эффекта каждого средства у пациента. В некоторых вариантах осуществления их можно вводить в пределах 60, 30, 15, 10, 5 или 1 минуты друг от друга. В некоторых вариантах осуществления интервалы между введениями средств являются настолько малыми, чтобы обеспечивать комбинаторный (например, синергический) эффект.
Животное: Как используют в рамках изобретения, термин "животное" относится к любому представителю царства животных. В некоторых вариантах осуществления "животное" относится к человеку на любой стадии развития. В некоторых вариантах осуществления "животное" относится к не являющимся человеком животным на любой стадии развития. В определенных вариантах осуществления не являющимся человеком животным является млекопитающее (например, грызун, мышь, крыс, кролик, обезьяна, собака, кошка, овца, крупный рогатый скот, примат или свинья). В некоторых вариантах осуществления животные включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих, птиц, пресмыкающихся, земноводных, рыб и червей. В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой трансгенное животное, полученное способами генной инженерии животное или клон.
Представляющие интерес антигены или желаемые антигены: Как используют в рамках изобретения, термины "представляющие интерес антигены" или "желаемые антигены" включают белки и другие биомолекулы, предусматриваемые в рамках настоящего изобретения, которые иммуноспецифическим образом связываются антителами, и их фрагменты, мутанты, варианты и изменения, описанные в настоящем описании. Примеры представляющих интерес антигенов включают, но не ограничиваются ими, инсулин, инсулиноподобный фактор роста, hGH, tPA, цитокины, такие как интерлейкины (IL), например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, интерферон (IFN) альфа, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега или IFN-тау, фактор некроза опухоли (TNF), такой как TNF-альфа и TNF-бета, TNF-гамма, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 и VEGF.
Приблизительно: Как используют в рамках изобретения, термин "приблизительно" или "примерно", применяемый к одной или нескольким представляющим интерес величинам, относится к величине, которая сходна с указанной эталонной величиной. В определенных вариантах осуществления термин "приблизительно" или "примерно" относится к диапазону величин, который находится в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любом направлении (более или менее) от указанной эталонной величины, если нет иных указаний или иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое количество превышает 100% от возможной величины).
Ассоциированный с: Как используют в рамках изобретения, термины "ассоциированный с", "конъюгированный", "соединенный", "присоединенный" и "связанный" при использовании в отношении двух или более частей означает, что части физически ассоциированы или соединены друг с другом либо прямо, либо через одну или несколько дополнительных частей, которые служат в качестве линкерного агента, с образованием структуры, которая является достаточно стабильной, чтобы части оставались физически ассоциированными в условиях, в которых структуру используют, например, физиологических условиях. "Ассоциация" не должна осуществляться строго через прямое образование ковалентных химических связей. Также это может указывать на образование ионных или водородных связей или связанность на основе гибридизации, достаточно стабильную, чтобы "ассоциированные" элементы оставались физическим ассоциированными.
Биологически совместимый: Как используют в рамках изобретения, термин "биологически совместимый" означает совместимый с живыми клетками, тканями, органами или системами, что обеспечивает небольшой риск или отсутствие риска повреждения, токсичности или отторжения иммунной системой.
Биоразлагаемый: Как используют в рамках изобретения, термин "биоразлагаемый" означает способный распадаться на нетоксичные продукты под действием живых организмов.
Биологически активный: Как используют в рамках изобретения, выражение "биологически активный" относится к характеристике любого вещества, которое обладает активностью в биологической системе и/или организме. Например, вещество, которое при введении в организм обладает биологическим эффектом на этот организм, считают биологически активным. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению можно считать биологически активным, если часть полинуклеотида является биологически активной или имитирует активность, считающуюся биологически значимой.
Химические термины: Ниже предоставлено определение различных химических терминов от "ацила" до "тиола".
Термин "ацил", как используют в рамках изобретения, обозначает водород или алкильную группу (например, галогеналкильную группу), как определено в настоящем описании, которая связана с исходной молекулярной группой через карбонильную группу, как определено в настоящем описании, и иллюстрируется формилом (т.е. карбоксиальдегидная группа), ацетилом, трифторацетилом, пропионилом, бутаноилом и т.п. Иллюстративные незамещенные ацильные группы включают от 1 до 7, от 1 до 11 или от 1 до 21 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа, кроме того, замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании.
Термин "ациламино", как используют в рамках изобретения, обозначает ацильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через аминогруппу, как определено в настоящем описании (т.е. -N(RN1)-C(O)-R, где R представляет собой H или необязательно замещенную C1-6, C1-10 или C1-20 алкильную группу (например, галогеналкил) и RN1 является таким, как определено в настоящем описании). Иллюстративные незамещенные ациламиногруппы включают от 1 до 41 атомов углерода (например, от 1 до 7, от 1 до 13, от 1 до 21, от 2 до 7, от 2 до 13, от 2 до 21 или от 2 до 41 атомов углерода). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании, и/или аминогруппа представляет собой -NH2 или -NHRN1, где RN1 независимо представляет собой OH, NO2, NH2, NRN2 2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, алкил, арил, ацил (например, ацетил, трифторацетил или другие группы ациламино, описанные в настоящем описании) или алкоксикарбонилалкил, и каждый RN2 может представлять собой H, алкил или арил.
Термин "ациламиноалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает ацильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с аминогруппой, которая в свою очередь связана с исходной молекулярной группой через алкильную группу, как определено в настоящем описании (т.е. -алкил-N(RN1)-C(O)-R, где R представляет собой H или необязательно замещенную C1-6, C1-10 или C1-20 алкильную группу (например, галогеналкил) и RN1 является таким, как определено в настоящем описании). Иллюстративные незамещенные ациламиногруппы включают от 1 до 41 атомов углерода (например, от 1 до 7, от 1 до 13, от 1 до 21, от 2 до 7, от 2 до 13, от 2 до 21 или от 2 до 41 атомов углерода). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании, и/или аминогруппа представляет собой -NH2 или -NHRN1, где RN1 независимо представляет собой OH, NO2, NH2, NRN2 2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, алкил, арил, ацил (например, ацетил, трифторацетил или другие ацильные группы, описанные в настоящем описании) или алкоксикарбонилалкил, и каждый RN2 может представлять собой H, алкил или арил.
Термин "ацилокси", как используют в рамках изобретения, обозначает ацильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через атом кислорода (т.е. -O-C(O)-R, где R представляет собой H или необязательно замещенную C1-6, C1-10 или C1-20 алкильную группу). Иллюстративные незамещенные ацилоксигруппы включают от 1 до 21 атомов углерода (например, от 1 до 7 или от 1 до 11 атомов углерода). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании.
Термин "ацилоксиалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает ацильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с атомом кислорода, который в свою очередь связан с исходной молекулярной группой через алкильную группу (т.е. -алкил-O-C(O)-R, где R представляет собой H или необязательно замещенную C1-6, C1-10 или C1-20 алкильную группу). Иллюстративные незамещенные ацилоксиалкильные группы включают от 1 до 21 атомов углерода (например, от 1 до 7 или от 1 до 11 атомов углерода). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа независимо дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании.
Термин "алкарильный", как используют в рамках изобретения, обозначает арильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через группу алкилена, как определено в настоящем описании. Иллюстративные незамещенные алкарильные группы имеют от 7 до 30 атомов углерода (например, от 7 до 16 или от 7 до 20 атомов углерода, такие как C1-6 алк-C6-10 арил, C1-10 алк-C6-10 арил или C1-20 алк-C6-10 арил). В некоторых вариантах осуществления каждый из алкилена и арила может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании для соответствующих групп. Другие группы, которым предшествует приставка "алк-", определяют аналогичным образом, где "алк" относится к C1-6 алкилену, если нет иных указаний, и присоединенная химическая структура является такой, как определено в настоящем описании.
Термин "алкциклоалкил" обозначает циклоалкильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через алкиленовую группу, как определено в настоящем описании (например, алкиленовая группа из от 1 до 4, от 1 до 6, от 1 до 10 или от 1 до 20 атомов углерода). В некоторых вариантах осуществления каждый из алкилена и циклоалкила может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании для соответствующей группы.
Термин "алкенил", как используют в рамках изобретения, обозначает одновалентные прямые или разветвленные группы, если нет иных указаний, из от 2 до 20 атомов углерода (например, от 2 до 6 или от 2 до 10 атомов углерода), содержащие одну или несколько углерод-углеродных двойных связей и иллюстрируемые этенилом, 1-пропенилом, 2-пропенилом, 2-метил-1-пропенилом, 1-бутенилом, 2-бутенилом и т.п. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Алкенильные группы необязательно могут быть замещены 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, которые независимо выбраны из амино, арила, циклоалкила или гетероциклила (например, гетероарил), как определено в настоящем описании, или любой из иллюстративных алкильных групп заместителей, описанных в настоящем описании.
Термин "алкенилокси" обозначает химический заместитель формулы -OR, где R представляет собой C2-20 алкенильную группу (например, C2-6 или C2-10 алкенил), если нет иных указаний. Иллюстративные алкенилоксигруппы включают этенилокси, пропенилокси и т.п. В некоторых вариантах осуществления алкенильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании (например, гидроксигруппа).
Термин "алкгетероарил" относится к гетероарильной группе, как определено в настоящем описании, связанной с исходной молекулярной группой через алкиленовую группу, как определено в настоящем описании. Иллюстративные незамещенные алкгетероарильные группы имеют от 2 до 32 атомов углерода (например, от 2 до 22, от 2 до 18, от 2 до 17, от 2 до 16, от 3 до 15, от 2 до 14, от 2 до 13 или от 2 до 12 атомов углерода, такие как C1-6 алк-C1-12 гетероарил, C1-10 алк-C1-12 гетероарил или C1-20 алк-C1-12 гетероарил). В некоторых вариантах осуществления каждый из алкилена и гетероарила может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании для соответствующей группы. Алкгетероарильные группы представляют собой подгруппу алкгетероциклильных групп.
Термин "алкгетероциклил" обозначает гетероциклильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через алкиленовую группу, как определено в настоящем описании. Иллюстративные незамещенные алкгетероциклильные группы имеют от 2 до 32 атомов углерода (например, от 2 до 22, от 2 до 18, от 2 до 17, от 2 до 16, от 3 до 15, от 2 до 14, от 2 до 13 или от 2 до 12 атомов углерода, такие как C1-6 алк-C1-12 гетероциклил, C1-10 алк-C1-12 гетероциклил или C1-20 алк-C1-12 гетероциклил). В некоторых вариантах осуществления каждый из алкилена и гетероциклила может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании для соответствующей группы.
Термин "алкокси" обозначает химический заместитель формулы -OR, где R представляет собой C1-20 алкильную группу (например, C1-6 или C1-10 алкил), если нет иных указаний. Иллюстративные алкоксигруппы включают метокси, этокси, пропокси (например, н-пропокси и изопропокси), трет-бутокси и т.п. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании (например, гидрокси или алкокси).
Термин "алкоксиалкокси" обозначает алкоксигруппу, которая замещена алкоксигруппой. Иллюстративные незамещенные алкоксиалкоксигруппы включают от 2 до 40 атомов углерода (например, от 2 до 12 или от 2 до 20 атомов углерода, такие как C1-6 алкокси-C1-6 алкокси, C1-10 алкокси-C1-10 алкокси или C1-20 алкокси-C1-20 алкокси). В некоторых вариантах осуществления каждая алкоксигруппа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании.
Термин "алкоксиалкил" обозначает алкильную группу, которая замещена алкоксигруппой. Иллюстративные незамещенные алкоксиалкильные группы включают от 2 до 40 атомов углерода (например, от 2 до 12 или от 2 до 20 атомов углерода, такие как C1-6 алкокси-C1-6 алкил, C1-10 алкокси-C1-10 алкил или C1-20 алкокси-C1-20 алкил). В некоторых вариантах осуществления каждый из алкила и алкокси может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании для соответствующей группы.
Термин "алкоксикарбонил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкокси, как определено в настоящем описании, связанный с исходной молекулярной группой через атом карбонила (например, -C(O)-OR, где R представляет собой H или необязательно замещенную C1-6, C1-10 или C1-20 алкильную группу). Иллюстративный незамещенный алкоксикарбонил включает от 1 до 21 атомов углерода (например, от 1 до 11 или от 1 до 7 атомов углерода). В некоторых вариантах осуществления алкоксигруппа дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании.
Термин "алкоксикарбонилацил", как используют в рамках изобретения, обозначает ацильную группу, как определено в настоящем описании, которая замещена алкоксикарбонильной группой, как определено в настоящем описании (например, -C(O)-алкил-C(O)-OR, где R представляет собой необязательно замещенную C1-6, C1-10 или C1-20 алкильную группу). Иллюстративный незамещенный алкоксикарбонилацил включает от 3 до 41 атомов углерода (например, от 3 до 10, от 3 до 13, от 3 до 17, от 3 до 21 или от 3 до 31 атомов углерода, такие как C1-6 алкоксикарбонил-C1-6 ацил, C1-10 алкоксикарбонил-C1-10 ацил или C1-20 алкоксикарбонил-C1-20 ацил). В некоторых вариантах осуществления каждая алкокси и алкильная группа дополнительно независимо замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании (например, гидроксигруппой) для каждой группы.
Термин "алкоксикарбонилалкокси", как используют в рамках изобретения, обозначает алкоксигруппу, как определено в настоящем описании, которая замещена алкоксикарбонильной группой, как определено в настоящем описании (например, -O-алкил-C(O)-OR, где R представляет собой необязательно замещенную C1-6, C1-10 или C1-20 алкильную группу). Иллюстративный незамещенный алкоксикарбонилалкокси включает от 3 до 41 атомов углерода (например, от 3 до 10, от 3 до 13, от 3 до 17, от 3 до 21 или от 3 до 31 атомов углерода, такие как C1-6 алкоксикарбонил-C1-6 алкокси, C1-10 алкоксикарбонил-C1-10 алкокси или C1-20 алкоксикарбонил-C1-20 алкокси). В некоторых вариантах осуществления каждая алкоксигруппа дополнительно независимо замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании (например, гидроксигруппой).
Термин "алкоксикарбонилалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, которая замещена алкоксикарбонильной группой, как определено в настоящем описании (например, -алкил-C(O)-OR, где R представляет собой необязательно замещенную C1-20, C1-10 или C1-6 алкильную группу). Иллюстративный незамещенный алкоксикарбонилалкил включает от 3 до 41 атомов углерода (например, от 3 до 10, от 3 до 13, от 3 до 17, от 3 до 21 или от 3 до 31 атомов углерода, таких как C1-6 алкоксикарбонил-C1-6 алкил, C1-10 алкоксикарбонил-C1-10 алкил или C1-20 алкоксикарбонил-C1-20 алкил). В некоторых вариантах осуществления каждая алкильная и алкоксигруппа дополнительно независимо замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании (например, гидроксигруппой).
Термин "алкоксикарбонилалкенил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкенильную группу, как определено в настоящем описании, которая замещена алкоксикарбонильной группой, как определено в настоящем описании (например, -алкенил-C(O)-OR, где R представляет собой необязательно замещенную C1-20, C1-10 или C1-6 алкильную группу). Иллюстративный незамещенный алкоксикарбонилалкенил включает от 4 до 41 атомов углерода (например, от 4 до 10, от 4 до 13, от 4 до 17, от 4 до 21 или от 4 до 31 атомов углерода, такие как C1-6 алкоксикарбонил-C2-6 алкенил, C1-10 алкоксикарбонил-C2-10 алкенил или C1-20 алкоксикарбонил-C2-20 алкенил). В некоторых вариантах осуществления каждая алкильная, алкенильная и алкоксигруппа дополнительно независимо замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании (например, гидроксигруппой).
Термин "алкоксикарбонилалкинил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкинильную группу, как определено в настоящем описании, которая замещена алкоксикарбонильной группой, как определено в настоящем описании (например, -алкинил-C(O)-OR, где R представляет собой необязательно замещенную C1-20, C1-10 или C1-6 алкильную группу). Иллюстративный незамещенный алкоксикарбонилалкинил включает от 4 до 41 атомов углерода (например, от 4 до 10, от 4 до 13, от 4 до 17, от 4 до 21 или от 4 до 31 атомов углерода, такой как C1-6 алкоксикарбонил-C2-6 алкинил, C1-10 алкоксикарбонил-C2-10 алкинил или C1-20 алкоксикарбонил-C2-20 алкинил). В некоторых вариантах осуществления каждая алкильная, алкинильная и алкоксигруппа дополнительно независимо замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как описано в настоящем описании (например, гидроксигруппой).
Термин "алкил", как используют в рамках изобретения, включает как неразветвленные, так и разветвленные насыщенные группы из от 1 до 20 атомов углерода (например, от 1 до 10 или от 1 до 6), если нет иных указаний. Примерами алкильных групп являются метил, этил, н- и изопропил, н-, втор-, изо- и трет-бутил, неопентил и т.п., и необязательно могут быть замещены одной, двумя, тремя или, в случае алкильных групп из двух атомов углерода или более, четырьмя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из: (1) C1-6 алкокси; (2) C1-6 алкилсульфинила; (3) амино, как определено в настоящем описании (например, незамещенный амино (т.е. -NH2) или замещенный амино (т.е. -N(RN1)2, где RN1 является таким, как определено для амино); (4) C6-10 арил-C1-6 алкокси; (5) азидо; (6) галогена; (7) (C2-9 гетероциклил)окси; (8) гидрокси, необязательно замещенный O-защитной группой; (9) нитро; (10) оксо (например, карбоксиальдегид или ацил); (11) C1-7 спироциклила; (12) тиоалкокси; (13) тиола; (14) -CO2RA’, необязательно замещенного O-защитной группой и где RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-20 алкила (например C1-6 алкил), (b) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенил), (c) C6-10 арила, (d) водорода, (e) C1-6 алк-C6-10 арила, (f) амино-C1-20 алкила, (g) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; (15) -C(O)NRB’RC’, где каждый из RB’ и RC’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила, и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (16) -SO2RD’, где RD’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) C1-6 алк-C6-10 арила, и (d) гидрокси; (17) -SO2NRE’RF’, где каждый из RE’ и RF’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (18) -C(O)RG’, где RG’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил), (b) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенил), (c) C6-10 арила, (d) водорода, (e) C1-6 алк-C6-10 арила, (f) амино-C1-20 алкила, (g) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; (19) -NRH’C(O)RI’, где RH’ выбран из группы, состоящей из (a1) водорода и (b1) C1-6 алкила, и RI’ выбран из группы, состоящей из (a2) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил), (b2) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенил), (c2) C6-10 арила, (d2) водорода, (e2) C1-6 алк-C6-10 арила, (f2) амино-C1-20 алкила, (g2) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h2) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; (20) -NRJ’C(O)ORK’, где RJ’ выбран из группы, состоящей из (a1) водорода и (b1) C1-6 алкила, и RK’ выбран из группы, состоящей из (a2) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил), (b2) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенил), (c2) C6-10 арила, (d2) водорода, (e2) C1-6 алк-C6-10 арила, (f2) амино-C1-20 алкила, (g2) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h2) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; и (21) амидина. В некоторых вариантах осуществления каждая из этих групп может быть дополнительно замещенной, как описано в настоящем описании. Например, алкиленовая группа C1-алкарил может быть дополнительно замещена оксогруппой для получения соответствующего арилоильного заместителя.
Термин "алкилен" и приставка "алк-", как используют в рамках изобретения, обозначает насыщенную двухвалентную углеводородную группу, образованную из прямого или разветвленного насыщенного углеводорода путем удаления двух атомов водорода, и ее примером являются метилен, этилен, изопропилен и т.п. Термин "Cx-y алкилен" и приставка "Cx-y алк-" обозначает алкиленовые группы, имеющие от x до y атомов углерода. Иллюстративными значениями для x являются 1, 2, 3, 4, 5 и 6, и иллюстративными значениями для y являются 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 (например, C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10 или C2-20 алкилен). В некоторых вариантах осуществления алкилен может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании для алкильной группы.
Термин "алкилсульфинил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, связанную с исходной молекулярной группой через группу -S(O)-. Иллюстративные незамещенные алкилсульфинильные группы имеют от 1 до 6, от 1 до 10 или от 1 до 20 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании.
Термин "алкилсульфинилалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную алкилсульфинильной группой. Иллюстративные незамещенные алкилсульфинилалкильные группы имеют от 2 до 12, от 2 до 20 или от 2 до 40 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления каждая алкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании.
Термин "алкинил", как используют в рамках изобретения, обозначает одновалентные прямые или разветвленные группы из от 2 до 20 атомов углерода (например, от 2 до 4, от 2 до 6 или от 2 до 10 атомов углерода), содержащие тройную углерод-углеродную связь, и их примером являются этинил, 1-пропинил и т.п. Алкинильные группы могут быть необязательно замещены 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, которые независимо выбраны из арила, циклоалкила или гетероциклила (например, гетероарила), как определено в настоящем описании, или любой из иллюстративных алкильных групп заместителя, описанных в настоящем описании.
Термин "алкинилокси" обозначает химический заместитель формулы -OR, где R представляет собой C2-20 алкинильную группу (например, C2-6 или C2-10 алкинил), если нет иных указаний. Иллюстративные алкинилоксигруппы включают этинилокси, пропинилокси и т.п. В некоторых вариантах осуществления алкинильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании (например, гидроксигруппой).
Термин "амидин", как используют в рамках изобретения, обозначает группу -C(=NH)NH2.
Термин "амино", как используют в рамках изобретения, обозначает -N(RN1)2, где каждый RN1 независимо представляет собой H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, N-защитную группу, алкил, алкенил, алкинил, алкокси, арил, алкарил, циклоалкил, алкциклоалкил, карбоксиалкил (например, необязательно замещенный O-защитной группой, такой как необязательно замещенные арилалкоксикарбонильные группы или любые O-защитные группы, описанные в настоящем описании), сульфоалкил, ацил (например, ацетил, трифторацетил или другие ацилы, описанные в настоящем описании), алкоксикарбонилалкил (например, необязательно замещенный O-защитной группой, такой как необязательно замещенный арилалкоксикарбонильными группами или любыми O-защитными группами, описанными в настоящем описании), гетероциклил (например, гетероарил) или алкгетероциклил (например, алкгетероарил), где каждая из этих указанных групп RN1 может быть необязательно замещенной, как определено в настоящем описании для каждой группы; или два RN1, взятые вместе, образуют гетероциклил или N-защитную группу, и где каждый RN2 независимо представляет собой H, алкил или арил. Аминогруппы могут представлять собой незамещенный амино (т.е. -NH2) или замещенный амино (т.е. -N(RN1)2). В предпочтительном варианте осуществления амино представляет собой -NH2 или -NHRN1, где RN1 независимо представляет собой OH, NO2, NH2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, алкил, карбоксиалкил, сульфоалкил, ацил (например, ацетил, трифторацетил или другие ацилы, описанные в настоящем описании), алкоксикарбонилалкил (например, трет-бутоксикарбонилалкил) или арил, и каждый RN2 может представлять собой H, C1-20 алкил (например, C1-6 алкил) или C6-10 арил.
Термин "аминокислота", как описано в настоящем описании, относится к молекуле, имеющей боковую цепь, аминогруппу и кислотную группу (например, карбоксигруппу -CO2H или сульфогруппу -SO3H), где аминокислота связана с исходной молекулярной группой через боковую цепь, аминогруппу или кислотную группу (например, боковую цепь). В некоторых вариантах осуществления аминокислота связана с исходной молекулярной группой через карбонильную группу, где боковая цепь или аминогруппа связана с карбонильной группой. Иллюстративные боковые цепи включают необязательно замещенный алкил, арил, гетероциклил, алкарильный, алкгетероциклил, аминоалкил, карбамоилалкил и карбоксиалкил. Иллюстративные аминокислоты включают аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, гидроксинорвалин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, норвалин, орнитин, фенилаланин, пролин, пирролизин, селеноцистеин, серин, таурин, треонин, триптофан, тирозин и валин. Аминокислотные группы могут быть необязательно замещены одной, двумя, тремя или, в случае аминокислотных групп двумя атомами углерода или более, четырьмя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из: (1) C1-6 алкокси; (2) C1-6 алкилсульфинила; (3) амино, как определено в настоящем описании (например, незамещенный амино (т.е. -NH2) или замещенный амино (т.е. -N(RN1)2, где RN1 является таким, как определено для амино); (4) C6-10 арил-C1-6 алкокси; (5) азидо; (6) галогена; (7) (C2-9 гетероциклил)окси; (8) гидрокси; (9) нитро; (10) оксо (например, карбоксиальдегид или ацил); (11) C1-7 спироциклила; (12) тиоалкокси; (13) тиола; (14) -CO2RA’, где RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил), (b) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенил), (c) C6-10 арила, (d) водорода, (e) C1-6 алк-C6-10 арила, (f) амино-C1-20 алкила, (g) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; (15) -C(O)NRB’RC’, где каждый из RB’ и RC’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (16) -SO2RD’, где RD’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) C1-6 алк-C6-10 арила и (d) гидрокси; (17) -SO2NRE’RF’, где каждый из RE’ и RF’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (18) -C(O)RG’, где RG’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил), (b) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенил), (c) C6-10 арила, (d) водорода, (e) C1-6 алк-C6-10 арила, (f) амино-C1-20 алкила, (g) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; (19) -NRH’C(O)RI’, где RH’ выбран из группы, состоящей из (a1) водорода и (b1) C1-6 алкила, и RI’ выбран из группы, состоящей из (a2) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил), (b2) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенил), (c2) C6-10 арила, (d2) водорода, (e2) C1-6 алк-C6-10 арила, (f2) амино-C1-20 алкила, (g2) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h2) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; (20) -NRJ’C(O)ORK’, где RJ’ выбран из группы, состоящей из (a1) водорода и (b1) C1-6 алкила, и RK’ выбран из группы, состоящей из (a2) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил), (b2) C2-20 алкенила (например, C2-6 алкенила), (c2) C6-10 арила, (d2) водорода, (e2) C1-6 алк-C6-10 арила, (f2) амино-C1-20 алкила, (g2) полиэтиленгликоля -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и R’ представляет собой H или C1-20 алкил, и (h2) амино-полиэтиленгликоля -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, где s1 представляет собой целое число от 1 до 10 (например, от 1 до 6 или от 1 до 4), каждый из s2 и s3 независимо представляет собой целое число от 0 до 10 (например, от 0 до 4, от 0 до 6, от 1 до 4, от 1 до 6 или от 1 до 10), и каждый RN1 независимо представляет собой водород или необязательно замещенный C1-6 алкил; и (21) амидина. В некоторых вариантах осуществления каждая из этих групп может быть дополнительно замещена, как описано в настоящем описании.
Термин "аминоалкокси", как используют в рамках изобретения, обозначает алкоксигруппу, как определено в настоящем описании, замещенную аминогруппой, как определено в настоящем описании. Каждый из алкила и амино может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для соответствующей группы (например, CO2RA’, где RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода и (d) C1-6 алк-C6-10 арила, например, карбокси).
Термин "аминоалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную аминогруппой, как определено в настоящем описании. Каждый из алкила и амино может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для соответствующей группы (например, CO2RA’, где RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода и (d) C1-6 алк-C6-10 арила, например, карбокси, и/или N-защитной группы).
Термин "аминоалкенил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкенильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную аминогруппой, как определено в настоящем описании. Каждый из алкенила и амино может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для соответствующей группы (например, CO2RA’, где RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода, и (d) C1-6 алк-C6-10 арила, например, карбокси и/или N-защитной группы).
Термин "аминоалкинил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкинильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную аминогруппой, как определено в настоящем описании. Каждый из алкинила и амино может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для соответствующей группы (например, CO2RA’, где RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода и (d) C1-6 алк-C6-10 арила, например, карбокси и/или N-защитной группы).
Термин "арил", как используют в рамках изобретения, обозначает моноциклическую, бициклическую или полициклическую карбоциклическую кольцевую систему, имеющую одно или два ароматических кольца, и его примером является фенил, нафтил, 1,2-дигидронафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, антраценил, фенантренил, флуоренил, инданил, инденил и т.п., и он может быть необязательно замещен 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из: (1) C1-7 ацила (например, карбоксиальдегид); (2) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил, C1-6 алкокси-C1-6 алкил, C1-6 алкилсульфинил-C1-6 алкил, амино-C1-6 алкил, азидо-C1-6 алкил, (карбоксиальдегид)-C1-6 алкил, галоген-C1-6 алкил (например, перфторалкил), гидрокси-C1-6 алкил, нитро-C1-6 алкил или C1-6 тиоалкокси-C1-6 алкил); (3) C1-20 алкокси (например, C1-6 алкокси, такой как перфторалкокси); (4) C1-6 алкилсульфинила; (5) C6-10 арила; (6) амино; (7) C1-6 алк-C6-10 арила; (8) азидо; (9) C3-8 циклоалкила; (10) C1-6 алк-C3-8 циклоалкила; (11) галогена; (12) C1-12 гетероциклила (например, C1-12 гетероарил); (13) (C1-12 гетероциклил)окси; (14) гидрокси; (15) нитро; (16) C1-20 тиоалкокси (например, C1-6 тиоалкокси); (17) -(CH2)qCO2RA’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (18) -(CH2)qCONRB’RC’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где RB’ и RC’ независимо выбраны из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (19) -(CH2)qSO2RD’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где RD’ выбран из группы, состоящей из (a) алкила, (b) C6-10 арила, и (c) алк-C6-10 арила; (20) -(CH2)qSO2NRE’RF’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где каждый из RE’ и RF’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (21) тиола; (22) C6-10 арилокси; (23) C3-8 циклоалкокси; (24) C6-10 арил-C1-6 алкокси; (25) C1-6 алк-C1-12 гетероциклила (например, C1-6 алк-C1-12 гетероарил); (26) C2-20 алкенила; и (27) C2-20 алкинила. В некоторых вариантах осуществления каждая из этих групп может быть дополнительно замещена, как описано в настоящем описании. Например, алкиленовая группа C1-алкарила или C1-алкгетероциклила может быть дополнительно замещена оксогруппой с получением соответствующей арилоильной и (гетероциклил)оильной группы заместителя.
Термин "арилалкокси", как используют в рамках изобретения, обозначает алкарильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через атом кислорода. Иллюстративные незамещенные арилалкоксигруппы включают от 7 до 30 атомов углерода (например, от 7 до 16 или от 7 до 20 атомов углерода, такие как C6-10 арил-C1-6 алкокси, C6-10 арил-C1-10 алкокси или C6-10 арил-C1-20 алкокси). В некоторых вариантах осуществления арилалкоксигруппа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как определено в настоящем описании.
Термин "арилалкоксикарбонил", как используют в рамках изобретения, обозначает арилалкоксигруппу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через карбонил (например, -C(O)-O-алкиларил). Иллюстративные незамещенные арилалкоксигруппы включают от 8 до 31 атомов углерода (например, от 8 до 17 или от 8 до 21 атомов углерода, такие как C6-10 арил-C1-6 алкоксикарбонил, C6-10 арил-C1-10 алкоксикарбонил или C6-10 арил-C1-20 алкоксикарбонил). В некоторых вариантах осуществления арилалкоксикарбонильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как определено в настоящем описании.
Термин "арилокси" обозначает химический заместитель формулы -OR′, где R′ представляет собой арильную группу из от 6 до 18 атомов углерода, если нет иных указаний. В некоторых вариантах осуществления арильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как определено в настоящем описании.
Термин "арилоил", как используют в рамках изобретения, обозначает арильную группу, как определено в настоящем описании, которая связана с исходной молекулярной группой через карбонильную группу. Иллюстративные незамещенные арилоильные группы имеют от 7 до 11 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления арильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как определено в настоящем описании.
Термин "азидо" обозначает группу -N3, которая также может быть изображена как -N=N=N.
Термин "бициклический", как используют в рамках изобретения, относится к структуре, имеющей два кольца, которые могут быть ароматическими или неароматическими. Бициклические структуры включают спироциклильные группы, как определено в настоящем описании, и два кольца, которые имеют один или несколько мостиков, где такие мостики могут включать один атом или цепь, включающую два, три или более атомов. Иллюстративные бициклические группы включают бициклическую карбоциклильную группу, где первое и второе кольца представляют собой карбоциклильные группы, как определено в настоящем описании; бициклические арильные группы, где первое и второе кольца представляют собой арильные группы, как определено в настоящем описании; бициклические гетероциклильные группы, где первое кольцо представляет собой гетероциклильную группу и второе кольцо представляет собой карбоциклильную группу (например, арил) или гетероциклильную группу (например, гетероарил); и бициклические гетероарильные группы, где первое кольцо представляет собой представляет собой гетероарильную группу и второе кольцо представляет собой карбоциклильную группу (например, арил) или гетероциклильную группу (например, гетероарил). В некоторых вариантах осуществления бициклическая группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как определено в настоящем описании для циклоалкильных, гетероциклильных и арильных групп.
Термин "боранил", как используют в рамках изобретения, обозначает -B(RB1)3, где каждый RB1 независимо выбран из группы, состоящей из H и необязательно замещенного алкила. В некоторых вариантах осуществления боранильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 заместителями, как определено в настоящем описании для алкила.
Термины "карбоциклический" и "карбоциклильный", как используют в рамках изобретения, относятся к необязательно замещенной C3-12 моноциклической, бициклической или трициклической структуре, в которой кольца, которые могут быть ароматическими или неароматическими, образованы атомами углерода. Карбоциклические структуры включают циклоалкильные, циклоалкенильные и арильные группы.
Термин "карбамоил", как используют в рамках изобретения, обозначает -C(O)-N(RN1)2, где значение каждого RN1 указано в определении "амино", представленном в настоящем описании.
Термин "карбамоилалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную карбамоильной группой, как определено в настоящем описании. Алкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании.
Термин "карбамил", как используют в рамках изобретения, относится к карбаматной группе, имеющей структуру -NRN1C(=O)OR или -OC(=O)N(RN1)2, где значение каждого RN1 указано в определении "амино", представленном в настоящем описании, и R представляет собой алкил, циклоалкил, алкциклоалкил, арил, алкарил, гетероциклил (например, гетероарил) или алкгетероциклил (например, алкгетероарил), как определено в настоящем описании.
Термин "карбонил", как используют в рамках изобретения, обозначает группу C(O), которая также может быть обозначена как C=O.
Термин "карбоксиальдегид" обозначает ацильную группу, имеющую структуру -CHO.
Термин "карбокси", как используют в рамках изобретения, означает -CO2H.
Термин "карбоксиалкокси", как используют в рамках изобретения, обозначает алкоксигруппу, как определено в настоящем описании, замещенную карбоксигруппой, как определено в настоящем описании. Алкоксигруппа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для алкильной группы, и карбоксигруппа может быть необязательно замещена одним или несколькими O-защитными группами.
Термин "карбоксиалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную карбоксигруппой, как определено в настоящем описании. Алкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании, и карбоксигруппа может быть необязательно замещена одной или несколькими O-защитными группами.
Термин "карбоксиаминоалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает аминоалкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную карбокси, как определено в настоящем описании. Каждый из карбокси, алкила и амино может быть дополнительно замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для соответствующей группы (например, CO2RA’, где RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода, и (d) C1-6 алк-C6-10 арила, например, карбокси и/или N-защитной группы и/или O-защитной группы).
Термин "циано", как используют в рамках изобретения, обозначает группу -CN.
Термин "циклоалкокси" обозначает химический заместитель формулы -OR, где R представляет собой C3-8 циклоалкильную группу, как определено в настоящем описании, если нет иных указаний. Циклоалкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании. Иллюстративные незамещенные циклоалкоксигруппы имеют от 3 до 8 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления циклоалкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании.
Термин "циклоалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает одновалентную насыщенную или ненасыщенную неароматическую циклическую углеводородную группу из от трех до восьми атомов углерода, если нет иных указаний, и ее примером является циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, бициклический гептил и т.п. Когда циклоалкильная группа включает углерод-углеродную двойную связь, циклоалкильная группа может быть обозначена как "циклоалкенильная" группа. Иллюстративные циклоалкенильные группы включают циклопентенил, циклогексенил и т.п. Циклоалкильные группы по настоящему изобретению необязательно могут быть замещены: (1) C1-7 ацилом (например, карбоксиальдегид); (2) C1-20 алкилом (например, C1-6 алкил, C1-6 алкокси-C1-6 алкил, C1-6 алкилсульфинил-C1-6 алкил, амино-C1-6 алкил, азидо-C1-6 алкил, (карбоксиальдегид)-C1-6 алкил, галоген-C1-6 алкил (например, перфторалкил), гидрокси-C1-6 алкил, нитро-C1-6 алкил или C1-6 тиоалкокси-C1-6 алкил); (3) C1-20 алкокси (например, C1-6 алкокси, такой как перфторалкокси); (4) C1-6 алкилсульфинилом; (5) C6-10 арилом; (6) амино; (7) C1-6 алк-C6-10 арилом; (8) азидо; (9) C3-8 циклоалкилом; (10) C1-6 алк-C3-8 циклоалкилом; (11) галогеном; (12) C1-12 гетероциклилом (например, C1-12 гетероарил); (13) (C1-12 гетероциклил)окси; (14) гидрокси; (15) нитро; (16) C1-20 тиоалкокси (например, C1-6 тиоалкокси); (17) -(CH2)qCO2RA’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (18) -(CH2)qCONRB’RC’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где RB’ и RC’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C6-10 алкила, (c) C6-10 арила, и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (19) -(CH2)qSO2RD’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где RD’ выбран из группы, состоящей из (a) C6-10 алкила, (b) C6-10 арила и (c) C1-6 алк-C6-10 арила; (20) -(CH2)qSO2NRE’RF’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где каждый из RE’ и RF’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C6-10 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (21) тиола; (22) C6-10 арилокси; (23) C3-8 циклоалкокси; (24) C6-10 арил-C1-6 алкокси; (25) C1-6 алк-C1-12 гетероциклила (например, C1-6 алк-C1-12 гетероарил); (26) оксо; (27) C2-20 алкенила; и (28) C2-20 алкинила. В некоторых вариантах осуществления каждая из этих групп может быть дополнительно замещена, как описано в настоящем описании. Например, алкиленовая гурппа C1-алкарила или a C1-алкгетероциклила может быть дополнительно замещена оксогруппой для получения соответствующей арилоильной и (гетероциклил)оильной группы заместителя.
Термин "диастереомер", как используют в рамках изобретения, означает стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга и не налагаются друг на друга.
Термин "эффективное количество" средства, как используют в рамках изобретения, представляет собой количество, достаточное для обеспечения благоприятных или желательных результатов, например, клинических результатов, и, фактически, "эффективное количество" зависит от контекста, в котором его применяют. Например, в контексте введения средства, которое осуществляет лечение злокачественной опухоли, эффективное количество средства представляет собой, например, количество, достаточное для обеспечения лечения, как определено в настоящем описании, злокачественной опухоли по сравнению с ответом, полученным без введения средства.
Термин "энантиомер", как используют в рамках изобретения, означает каждую оптически активную форму соединения по изобретению, имеющую оптическую чистоту или избыток энантиомера (как определяют способами, стандартными в данной области) по меньшей мере 80% (т.е. по меньшей мере 90% одного энантиомера и не более 10% другого энантиомера), предпочтительно по меньшей мере 90% и более предпочтительно по меньшей мере 98%.
Термин "галоген", как используют в рамках изобретения, обозначает галоген, выбранный из брома, хлора, йода или фтора.
Термин "галогеналкокси", как используют в рамках изобретения, обозначает алкоксигруппу, как определено в настоящем описании, замещенную группой галогена (т.е. F, Cl, Br или I). Галогеналкокси может быть замещен одной, двумя, тремя или, в случае алкильных групп из двух или более атомов углерода, четырьмя галогенами. Галогеналкоксигруппы включают перфторалкокси (например -OCF3), -OCHF2, -OCH2F, -OCCl3, -OCH2CH2Br, -OCH2CH(CH2CH2Br)CH3 и -OCHICH3. В некоторых вариантах осуществления галогеналкоксигруппа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для алкильных групп.
Термин "галогеналкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную группой галогена (т.е. F, Cl, Br или I). Галогеналкил может быть замещен одним, двумя, тремя или, в случае алкильных групп из двух атомов углерода или более, четырьмя галогенами. Галогеналкильные группы включают перфторалкилы (например, -CF3), -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CH2CH2Br, -CH2CH(CH2CH2Br)CH3 и -CHICH3. В некоторых вариантах осуществления галогеналкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для алкильных групп.
Термин "гетероалкилен", как используют в рамках изобретения, относится к алкиленовой группе, как определено в настоящем описании, в которой каждый из одного или двух составляющих атомов углерода заменены азотом, кислородом или серой. В некоторых вариантах осуществления группа гетероалкилена может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании для алкиленовых групп.
Термин "гетероарил", как используют в рамках изобретения, обозначает подгруппу гетероциклилов, как определено в настоящем описании, которые являются ароматическими: т.е. они содержат 4n+2 pi-электроны в моноциклической или полициклической кольцевой системе. Иллюстративные незамещенные гетероарильные группы имеют от 1 до 12 (например, от 1 до 11, 1 до 10, от 1 до 9, от 2 до 12, от 2 до 11, от 2 до 10 или от 2 до 9) атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления гетероарил замещен 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено для гетероциклильной группы.
Термин "гетероциклил", как используют в рамках изобретения обозначает 5-, 6- или 7-членное кольцо, если нет иных указаний, содержащее один, два, три или четыре гетероатома, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. 5-Членное кольцо имеет от нуля до двух двойных связей, и 6- и 7-членные кольца имеют от нуля до трех двойных связей. Иллюстративные незамещенные гетероциклильные группы имеют от 1 до 12 (например, от 1 до 11, 1 до 10, от 1 до 9, от 2 до 12, от 2 до 11, от 2 до 10 или от 2 до 9) атомов углерода. Термин "гетероциклил" также обозначает гетероциклическое соединение, имеющее мостиковую полициклическую структуру, в которой один или несколько атомов углерода и/или гетероатомов соединяют мостиковой связью два не являющихся соседними члена моноциклического кольца, например, хинуклидинильную группу. Термин "гетероциклил" включает бициклические, трициклические и тетрациклические группы, в которых любое из описанных выше гетероциклических колец является конденсированным с одним, двумя или тремя карбоциклическими кольцами, например, арильным кольцом, циклогексановым кольцом, циклогексеновым кольцом, циклопентановым кольцом, циклопентеновым кольцом или другим моноциклическим гетероциклическим кольцом, таким как индолил, хинолил, изохинолил, тетрагидрохинолил, бензофурил, бензотиенил и т.п. Примеры конденсированных гетероциклилов включают тропаны и 1,2,3,5,8,8a-гексагидроиндолизин. Гетероциклические группы включают пирролил, пирролинил, пирролидинил, пиразолил, пиразолинил, пиразолидинил, имидазолил, имидазолинил, имидазолидинил, пиридил, пиперидинил, гомопиперидинил, пиразинил, пиперазинил, пиримидинил, пиридазинил, оксазолил, оксазолидинил, изоксазолил, изоксазолидинил, морфолинил, тиоморфолинил, тиазолил, тиазолидинил, изотиазолил, изотиазолидинил, индолил, индазолил, хинолил, изохинолил, хиноксалинил, дигидрохиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, фталазинил, бензимидазолил, бензотиазолил, бензоксазолил, бензотиадиазолил, фурил, тиенил, тиазолидинил, изотиазолил, триазолил, тетразолил, оксадиазолил (например, 1,2,3-оксадиазолил), пуринил, тиадиазолил (например, 1,2,3-тиадиазолил), тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиенил, дигидротиенил, дигидроиндолил, дигидрохинолил, тетрагидрохинолил, тетрагидроизохинолил, дигидроизохинолил, пиранил, дигидропиранил, дитиазолил, бензофуранил, изобензофуранил, бензотиенил и т.п., включая их дигидро- и тетрагидроформы, где одна или несколько двойных связей восстановлены или заменены атомами водорода. Другие иллюстративные гетероциклилы включают: 2,3,4,5-тетрагидро-2-оксооксазолил; 2,3-дигидро-2-оксо-1H-имидазолил; 2,3,4,5-тетрагидро-5-оксо-1H-пиразолил (например, 2,3,4,5-тетрагидро-2-фенил-5-оксо-1H-пиразолил); 2,3,4,5-тетрагидро-2,4-диоксо-1H-имидазолил (например, 2,3,4,5-тетрагидро-2,4-диоксо-5-метил-5-фенил-1H-имидазолил); 2,3-дигидро-2-тиоксо-1,3,4-оксадиазолил (например, 2,3-дигидро-2-тиоксо-5-фенил-1,3,4-оксадиазолил); 4,5-дигидро-5-оксо-1H-триазолил (например, 4,5-дигидро-3-метил-4-амино-5-оксо-1H-триазолил); 1,2,3,4-тетрагидро-2,4-диоксопиридинил (например, 1,2,3,4-тетрагидро-2,4-диоксо-3,3-диэтилпиридинил); 2,6-диоксопиперидинил (например, 2,6-диоксо-3-этил-3-фенилпиперидинил); 1,6-дигидро-6-оксопиримидинил; 1,6-дигидро-4-оксопиримидинил (например, 2-(метилтио)-1,6-дигидро-4-оксо-5-метилпиримидин-1-ил); 1,2,3,4-тетрагидро-2,4-диоксопиримидинил (например, 1,2,3,4-тетрагидро-2,4-диоксо-3-этилпиримидинил); 1,6-дигидро-6-оксо-пиридазинил (например, 1,6-дигидро-6-оксо-3-этилпиридазинил); 1,6-дигидро-6-оксо-1,2,4-триазинил (например, 1,6-дигидро-5-изопропил-6-оксо-1,2,4-триазинил); 2,3-дигидро-2-оксо-1H-индолил (например, 3,3-диметил-2,3-дигидро-2-оксо-1H-индолил и 2,3-дигидро-2-оксо-3,3′-спиропропан-1H-индол-1-ил); 1,3-дигидро-1-оксо-2H-изоиндолил; 1,3-дигидро-1,3-диоксо-2H-изоиндолил; 1H-бензопиразолил (например, 1-(этоксикарбонил)-1H-бензопиразолил); 2,3-дигидро-2-оксо-1H-бензимидазолил (например, 3-этил-2,3-дигидро-2-оксо-1H-бензимидазолил); 2,3-дигидро-2-оксобензоксазолил (например, 5-хлор-2,3-дигидро-2-оксобензоксазолил); 2,3-дигидро-2-оксобензоксазолил; 2-оксо-2H-бензопиранил; 1,4-бензодиоксанил; 1,3-бензодиоксанил; 2,3-дигидро-3-оксо-4H-1,3-бензотиазинил; 3,4-дигидро-4-оксо-3H-хиназолинил (например, 2-метил-3,4-дигидро-4-оксо-3H-хиназолинил); 1,2,3,4-тетрагидро-2,4-диоксо-3H-хиназолил (например, 1-этил-1,2,3,4-тетрагидро-2,4-диоксо-3H-хиназолил); 1,2,3,6-тетрагидро-2,6-диоксо-7H-пуринил (например, 1,2,3,6-тетрагидро-1,3-диметил-2,6-диоксо-7H-пуринил); 1,2,3,6-тетрагидро-2,6-диоксо-1H-пуринил (например, 1,2,3,6-тетрагидро-3,7-диметил-2,6-диоксо-1H-пуринил); 2-оксобенз[c,d]индолил; 1,1-диоксо-2H-нафт[1,8-c,d]изотиазолил; и 1,8-нафтилендикарбоксамидо. Дополнительные гетероциклические группы включают 3,3a,4,5,6,6a-гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)-ил и 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептан-2-ил, гомопиперазинил (или диазепанил), тетрагидропиранил, дитиазолил, бензофуранил, бензотиенил, оксепанил, тиепанил, азоканил, оксеканил и тиоканил. Гетероциклические группы также включают группы формулы
Figure 00000153
где
E′ выбран из группы, состоящей из -N- и -CH-; F′ выбран из группы, состоящей из -N=CH-, -NH-CH2-, -NH-C(O)-, -NH-, -CH=N-, -CH2-NH-, -C(O)-NH-, -CH=CH-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -OCH2-, -O- и -S-; и G′ выбран из группы, состоящей из -CH- и -N-. Любая из гетероциклильных групп, упомянутых в настоящем описании, необязательно может быть замещена одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из: (1) C1-7 ацила (например, карбоксиальдегид ); (2) C1-20 алкила (например, C1-6 алкил, C1-6 алкокси-C1-6 алкил, C1-6 алкилсульфинил-C1-6 алкил, амино-C1-6 алкил, азидо-C1-6 алкил, (карбоксиальдегид)-C1-6 алкил, галоген-C1-6 алкил (например, перфторалкил), гидрокси-C1-6 алкил, нитро-C1-6 алкил или C1-6 тиоалкокси-C1-6 алкил); (3) C1-20 алкокси (например, C1-6 алкокси, такой как перфторалкокси); (4) C1-6 алкилсульфинила; (5) C6-10 арила; (6) амино; (7) C1-6 алк-C6-10 арила; (8) азидо; (9) C3-8 циклоалкила; (10) C1-6 алк-C3-8 циклоалкила; (11) галогена; (12) C1-12 гетероциклила (например, C2-12 гетероарил); (13) (C1-12 гетероциклил)окси; (14) гидрокси; (15) нитро; (16) C1-20 тиоалкокси (например, C1-6 тиоалкокси); (17) -(CH2)qCO2RA’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и RA’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила, (c) водорода и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (18) -(CH2)qCONRB’RC’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где RB’ и RC’ независимо выбраны из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (19) -(CH2)qSO2RD’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где RD’ выбран из группы, состоящей из (a) C1-6 алкила, (b) C6-10 арила и (c) C1-6 алк-C6-10 арила; (20) -(CH2)qSO2NRE’RF’, где q представляет собой целое число от нуля до четырех, и где каждый из RE’ и RF’ независимо выбран из группы, состоящей из (a) водорода, (b) C1-6 алкила, (c) C6-10 арила и (d) C1-6 алк-C6-10 арила; (21) тиола; (22) C6-10 арилокси; (23) C3-8 циклоалкокси; (24) арилалкокси; (25) C1-6 алк-C1-12 гетероциклила (например, C1-6 алк-C1-12 гетероарил); (26) оксо; (27) (C1-12 гетероциклил)имино; (28) C2-20 алкенила; и (29) C2-20 алкинила. В некоторых вариантах осуществления каждая из этих групп может быть дополнительно замещена, как описано в настоящем описании. Например, алкиленовая группа C1-алкарила или C1-алкгетероциклила может быть дополнительно замещена оксогруппой с получением соответствующей арилоильной и (гетероциклил)оильной группы заместителя.
Термин "(гетероциклил)имино", как используют в рамках изобретения, обозначает гетероциклильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через иминогруппу. В некоторых вариантах осуществления гетероциклильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании.
Термин "(гетероциклил)окси", как используют в рамках изобретения, обозначает гетероциклильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через атом кислорода. В некоторых вариантах осуществления гетероциклильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании.
Термин "(гетероциклил)оил", как используют в рамках изобретения, обозначает гетероциклильную группу, как определено в настоящем описании, связанную с исходной молекулярной группой через карбонильную группу. В некоторых вариантах осуществления гетероциклильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как определено в настоящем описании.
Термин "углеводород", как используют в рамках изобретения, обозначает группу, состоящую только из атомов углерода и водорода.
Термин "гидрокси", как используют в рамках изобретения, обозначает группу -OH. В некоторых вариантах осуществления гидроксигруппа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей (например, O-защитные группы), как определено в настоящем описании для алкила.
Термин "гидроксиалкенил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкенильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную посредством от одной до трех гидроксигрупп при условии, что не более одной гидроксигруппы может быть связано с одним атомом углерода алкильной группы, и его примером является дигидроксипропенил, гидроксиизопентенил и т.п. В некоторых вариантах осуществления гидроксиалкенильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей (например, O-защитными группами), как определено в настоящем описании для алкила.
Термин "гидроксиалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную посредством от одной до трех гидроксигрупп при условии, что не более одной гидроксигруппы может быть связано с одним атомом углерода алкильной группы, и его примером является гидроксиметил, дигидроксипропил и т.п. В некоторых вариантах осуществления гидроксиалкильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей (например, O-защитных групп), как определено в настоящем описании для алкила.
Термин "гидроксиалкинил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкинильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную посредством от одной до трех гидроксигрупп, при условии, что не более одной гидроксигруппы может быть связано с одним атомом углерода алкильной группы. В некоторых вариантах осуществления гидроксиалкинильная группа может быть замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей (например, O-защитными группами), как определено в настоящем описании для алкила.
Термин "изомер", как используют в рамках изобретения, означает любой таутомер, стереоизомер, энантиомер или диастереомер любого соединения по изобретению. Понятно, что соединения по изобретению могут иметь один или несколько хиральных центров и/или двойных связей и, таким образом, существуют в качестве стереоизомеров, таких как изомеры по двойной связи (т.е. геометрические изомеры E/Z) или диастереомеры (например, энантиомеры (т.е. (+) или (-)) или цис/транс изомеры). В соответствии с изобретением химические структуры, представленные в настоящем описании, и, таким образом, соединения по изобретению охватывают все соответствующие стереоизомеры, т.е. как стереомерно чистую форму (например, геометрически чистую, энантиомерно чистую или диастереомерно чистую), так и энантиомерные и стереоизомерные смеси, например, рацематы. Энантиомерные и стереоизомерные смеси соединений по изобретению, как правило, можно разделять на их составляющие энантиомеры или стереоизомеры хорошо известными способами, такими как хиральная фазовая газовая хроматография, хиральная фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, кристаллизация соединения в качестве хирального солевого комплекса или кристаллизация соединения в хиральном растворителе. Энантиомеры и стереоизомеры также можно получать из стереоизомерно или энантиомерно чистых промежуточных соединений, реагентов и катализаторов хорошо известными способами асимметричного синтеза.
Термин "N-защищенный амино", как используют в рамках изобретения, относится к аминогруппе, как определено в настоящем описании, с которой связана одна или две N-защитных группы, как определено в настоящем описании.
Термин "N-защитная группа", как используют в рамках изобретения, обозначает группы, предназначенные для защиты аминогруппы от нежелательных реакций в процессе синтеза. Широко используемые N-защитные группы описаны в Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition (John Wiley & Sons, New York, 1999), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. N-защитные группы включают ацильные, арилоильные или карбамильные группы, такие как формил, ацетил, пропионил, пивалоил, трет-бутилацетил, 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, фталил, o-нитрофеноксиацетил, α-хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4-нитробензоил и хиральные вспомогательные реагенты, такие как защищенные или незащищенные D,L- или D,L-аминокислоты, такие как аланин, лейцин, фенилаланин и т.п.; сульфонилсодержащие группы, такие как бензолсульфонил, п-толуолсульфонил и т.п.; образующие карбамат группы, такие как бензилоксикарбонил, п-хлорбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-метоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5-триметоксибензилоксикарбонил, 1-(п-бифенилил)-1-метилэтоксикарбонил, α,α-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил, диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2,2,2,-трихлорэтоксикарбонил, феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, флуоренил-9-метоксикарбонил, циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, фенилтиокарбонил и т.п., алкарильные группы, такие как бензил, трифенилметил, бензилоксиметил и т.п., и силильные группы, такие как триметилсилил и т.п. Предпочтительные N-защитные группы представляют собой формил, ацетил, бензоил, пивалоил, трет-бутилацетил, аланил, фенилсульфонил, бензил, трет-бутилоксикарбонил (Boc) и бензилоксикарбонил (Cbz).
Термин "нитро", как используют в рамках изобретения, обозначает группу -NO2.
Термин "O-защитная группа", как используют в рамках изобретения, обозначает группы, предназначенные для защиты кислородсодержащих групп (например, фенол, гидроксил или карбонил) от нежелательных реакций в процессе синтеза. Широко используемые O-защитные группы описаны в Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition (John Wiley & Sons, New York, 1999), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. Иллюстративные O-защитные группы включают ацильные, арилоильные или карбамильные группы, такие как формил, ацетил, пропионил, пивалоил, трет-бутилацетил, 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, фталил, o-нитрофеноксиацетил, α-хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, трет-бутилдиметилсилил, три-изопропилсилилоксиметил, 4,4'-диметокситритил, изобутирил, феноксиацетил, 4-изопропилфеноксиацетил, диметилформамидино и 4-нитробензоил; алкилкарбонильные группы, такие как ацил, ацетил, пропионил, пивалоил и т.п.; необязательно замещенные арилкарбонильные группы, такие как бензоил; силильные группы, такие как триметилсилил (TMS), трет-бутилдиметилсилил (TBDMS), три-изопропилсилилоксиметил (TOM), триизопропилсилил (TIPS) и т.п.; группы, образующие с гидроксилом простой эфир, такие как метил, метоксиметил, тетрагидропиранил, бензил, п-метоксибензил, тритил и т.п.; алкоксикарбонилы, такие как метоксикарбонил, этоксикарбонил, изопропоксикарбонил, н-изопропоксикарбонил, н-бутилоксикарбонил, изобутилоксикарбонил, втор-бутилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил, 2-этилгексилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, метилоксикарбонил и т.п.; алкоксиалкоксикарбонильные группы, такие как метоксиметоксикарбонил, этоксиметоксикарбонил, 2-метоксиэтоксикарбонил, 2-этоксиэтоксикарбонил, 2-бутоксиэтоксикарбонил, 2-метоксиэтоксиметоксикарбонил, аллилоксикарбонил, пропаргилоксикарбонил, 2-бутеноксикарбонил, 3-метил-2-бутеноксикарбонил и т.п.; галогеналкоксикарбонилы, такие как 2-хлорэтоксикарбонил, 2-хлорэтоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил и т.п.; необязательно замещенные арилалкоксикарбонильные группы, такие как бензилоксикарбонил, п-метилбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2,4-динитробензилоксикарбонил, 3,5-диметилбензилоксикарбонил, п-хлорбензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, флуоренилметилоксикарбонил и т.п.; и необязательно замещенные арилоксикарбонильные группы, такие как феноксикарбонил, п-нитрофеноксикарбонил, o-нитрофеноксикарбонил, 2,4-динитрофеноксикарбонил, п-метилфеноксикарбонил, м-метилфеноксикарбонил, o-бромфеноксикарбонил, 3,5-диметилфеноксикарбонил, п-хлорфеноксикарбонил, 2-хлор-4-нитрофеноксикарбонил и т.п.); замещенные алкильные, арильные и алкарильные простые эфиры (например, тритил; метилтиометил; метоксиметил; бензилоксиметил; силоксиметил; 2,2,2,-трихлорэтоксиметил; тетрагидропиранил; тетрагидрофуранил; этоксиэтил; 1-[2-(триметилсилил)этокси]этил; 2-триметилсилилэтил; трет-бутиловый простой эфир; п-хлорфенил, п-метоксифенил, п-нитрофенил, бензил, п-метоксибензил и нитробензил); силиловые простые эфиры (например, триметилсилил; триэтилсилил; триизопропилсилил; диметилизопропилсилил; трет-бутилдиметилсилил; трет-бутилдифенилсилил; трибензилсилил; трифенилсилил и дифенилметилсилил); карбонаты (например, метил, метоксиметил, 9-флуоренилметил; этил; 2,2,2-трихлорэтил; 2-(триметилсилил)этил; винил, аллил, нитрофенил; бензил; метоксибензил; 3,4-диметоксибензил; и нитробензил); карбонил-защитные группы (например, ацетальные и кетальные группы, такие как диметилацеталь, 1,3-диоксолан и т.п.; ацилальные группы; и дитиановые группы, такие как 1,3-дитианы, 1,3-дитиолан и т.п.); защитные группы карбоновых кислот (например, сложноэфирные группы, такие как метиловый сложный эфир, бензиловый сложный эфир, трет-бутиловый сложный эфир, сложные ортоэфиры и т.п.; и группы оксазолина.
Термин "оксо", как используют в рамках изобретения, обозначает =O.
Термин "перфторалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, где каждый водородный радикал, связанный с алкильной группой, заменен фторидным радикалом. Примерами перфторалкильных групп являются трифторметил, пентафторэтил и т.п.
Термин "перфторалкокси", как используют в рамках изобретения, обозначает алкоксигруппу, как определено в настоящем описании, где каждый водородный радикал, связанный с алкоксигруппой, заменен фторидным радикалом. Примерами перфторалкоксигрупп являются трифторметокси, пентафторэтокси и т.п.
Термин "спироциклил", как используют в рамках изобретения, обозначает C2-7 алкиленовый дирадикал, оба конца которого связаны с одним и тем же атомом углерода исходной группы с образованием спироциклической группы, и также C1-6 гетероалкиленовый дирадикал, оба конца которого связаны с одним и тем же атомом. Гетероалкиленовый радикал, образующий спироциклильную группу, может содержать один, два, три или четыре гетероатома, независимо выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. В некоторых вариантах осуществления спироциклильная группа включает от одного до семи атомов углерода, исключая атом углерода, с которым связан дирадикал. Спироциклильные группы по изобретению необязательно могут быть замещены 1, 2, 3 или 4 заместителями, представленными в настоящем описании в качестве необязательных заместителей для циклоалкильных и/или гетероциклильных групп.
Термин "стереоизомер", как используют в рамках изобретения, относится ко всем возможным различным изомерным, а также конформационным формам, которыми может обладать соединение (например, соединение любой формулы, описанной в настоящем описании), в частности, всем возможным стереохимически и конформационно изомерным формам, всем диастереомерам, энантиомерам и/или конформерам основной молекулярной структуры. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в различных таутомерных формах, причем все из них включены в объем настоящего изобретения.
Термин "сульфоалкил", как используют в рамках изобретения, обозначает алкильную группу, как определено в настоящем описании, замещенную сульфогруппой -SO3H. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании, и сульфогруппа может быть дополнительно замещена одной или несколькими O-защитными группами (например, как описано в настоящем описании).
Термин "сульфонил", как используют в рамках изобретения, обозначает группу -S(O)2-.
Термин "тиоалкарильный", как используют в рамках изобретения, обозначает химический заместитель формулы -SR, где R представляет собой алкарильную группу. В некоторых вариантах осуществления алкарильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании.
Термин "тиоалкгетероциклил", как используют в рамках изобретения, обозначает химический заместитель формулы -SR, где R представляет собой алкгетероциклильную группу. В некоторых вариантах осуществления алкгетероциклильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании.
Термин "тиоалкокси", как используют в рамках изобретения, обозначает химический заместитель формулы -SR, где R представляет собой алкильную группу, как определено в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа может быть дополнительно замещена 1, 2, 3 или 4 группами заместителей, как описано в настоящем описании.
Соединение: Как используют в рамках изобретения, термин "соединение" включает все стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры и изотопы представленных структур.
Соединения, описанные в настоящем описании, могут быть асимметричными (например, имеющими один или несколько стереоцентров). Подразумеваются все стереоизомеры, такие как энантиомеры и диастереомеры, если нет иных указаний. Соединения по настоящему изобретению, которые содержат асимметрично замещенные атомы углерода, можно выделять в оптически активных и рацемических формах. Способы получения оптически активных форм из оптических активных исходных материалов известны в данной области, такие как разделение рацемических смесей или стереоселективный синтез. В соединениях, описанных в настоящем описании, также может присутствовать множество геометрических изомеров олефинов, двойных связей C=N и т.п., и все такие стабильные изомеры предусматриваются в рамках настоящего изобретения. Цис- и транс-геометрические изомеры соединений по настоящему изобретению описаны и их можно выделять в качестве смеси изомеров или в качестве разделенных изомерных форм.
Соединения по настоящему изобретению также включают таутомерные формы. Таутомерные формы являются результатом обмена между одинарной связью и соседней двойной связью и одновременной миграции протона. Таутомерные формы включают прототропные таутомеры, которые представляют собой изомерные состояния протонирования, имеющие одинаковую эмпирическую формулу и общий заряд. Примеры прототропных таутомеров включают кето-енольные пары, пары амид-имидная кислота, пары лактам-лактим, пары амид-имидная кислота, пары енамин-имин и кольцевые формы, где протон может занимать два или более положений в гетероциклической системе, такие как 1H- и 3H-имидазол, 1H-, 2H- и 4H-1,2,4-триазол, 1H- и 2H-изоиндол и 1H- и 2H-пиразол. Таутомерные формы могут находиться в равновесии или могут быть пространственно запертыми в одну форму путем подходящей замены.
Соединения по настоящему изобретению также включают все изотопы атомов, встречающихся в промежуточном соединении или конечных соединениях. "Изотопы" относятся к атомам, имеющим одно и то же атомное число, но разные массовые числа вследствие отличающегося количества нейтронов в ядрах. Например, изотопы водорода включают тритий и дейтерий.
Соединения и соли по настоящему изобретению можно получать в комбинации с молекулами растворителя или воды, образующими сольваты и гидраты, обычными способами.
Консервативный: Как используют в рамках изобретения, термин "консервативный" относится к нуклеотидным или аминокислотным остаткам полинуклеотидной последовательности или полипептидной последовательности, соответственно, которые представляют собой остатки, которые являются неизмененными в одном и том же положении двух или более сравниваемых последовательностей. Нуклеотиды или аминокислоты, которые являются относительно консервативными, представляют собой нуклеотиды и аминокислоты, которые являются консервативными среди более родственных последовательностей, чем нуклеотиды или аминокислоты, встречающиеся где-либо в последовательностях.
В некоторых вариантах осуществления две или более последовательностей называют "полностью консервативными", если они на 100% идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательностей называют "высококонсервативными", если они по меньшей мере на 70% идентичны, по меньшей мере на 80% идентичны, по меньшей мере на 90% идентичны или по меньшей мере на 95% идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательности называют "высококонсервативными", если они приблизительно на 70% идентичны, приблизительно на 80% идентичны, приблизительно на 90% идентичны, приблизительно на 95%, приблизительно на 98% или приблизительно на 99% идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательностей называют "консервативными", если они по меньшей мере на 30% идентичны, по меньшей мере на 40% идентичны, по меньшей мере на 50% идентичны, по меньшей мере на 60% идентичны, по меньшей мере на 70% идентичны, по меньшей мере на 80% идентичны, по меньшей мере на 90% идентичны или по меньшей мере на 95% идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления две или более последовательностей называют "консервативными", если они приблизительно на 30% идентичны, приблизительно на 40% идентичны, приблизительно на 50% идентичны, приблизительно на 60% идентичны, приблизительно на 70% идентичны, приблизительно 80% идентичны, приблизительно на 90% идентичны, приблизительно на 95% идентичны, приблизительно на 98% идентичны или приблизительно на 99% идентичны друг другу. Консервативность последовательности может применяться в отношении всей длины последовательности олигонуклеотида или полипептида, или она может применяться к ее части, области или характерному элементу.
Циклический или циклизованный: Как используют в рамках изобретения, термин "циклический" относится к присутствию непрерывной петли. Циклические молекулы не должны быть кольцевыми, связанными только с образованием непрерывной цепи субъединиц. Циклические молекулы, такие как мРНК по настоящему изобретению, могут представлять собой отдельные элементы или мультимеры или содержат один или несколько компонентов комплекса или структуры более высокого порядка.
Цитостатический: Как используют в рамках изобретения, "цитостатический" относится к ингибированию, снижению, подавлению роста, деления или увеличения количества клеток (например, клеток млекопитающих (например, клеток человека)), бактерий, вирусов, грибов, простейших, паразитов, прионов или их комбинаций.
Цитотоксический: Как используют в рамках изобретения, "цитотоксический" относится к уничтожению или обеспечению повреждающего, токсического или гибельного эффекта на клетку (например, клетку млекопитающего (например, клетку человека)), бактерию, вирус, гриб, простейшее, паразита, прион или их комбинацию.
Доставка: Как используют в рамках изобретения, "доставка" относится к акту или способу доставки соединения, вещества, элемента, части, транспортируемого вещества или груза.
Средство для доставки: Как используют в рамках изобретения, "средство для доставки" относится к любому веществу, которое облегчает, по меньшей мере частично, доставку in vivo полинуклеотида к клеткам-мишеням.
Дестабилизированный: Как используют в рамках изобретения, термин "дестабилизированный", "дестабилизировать" или "дестабилизирующая область" означает область или молекулу, которая менее стабильна, чем исходная форма дикого типа или нативная форма той же области или молекулы.
Поддающаяся обнаружению метка: Как используют в рамках изобретения, "поддающаяся обнаружению метка" относится к одному или нескольким маркерам, сигналам или частям, которые присоединены, включены или ассоциированы с другим элементом, который легко обнаруживается способами, известными в данной области, включая радиографию, флуоресценцию, хемилюминесценцию, ферментативную активность, поглощение и т.п. Поддающиеся обнаружению метки включают радиоизотопы, флуорофоры, хромофоры, ферменты, красители, ионы металлов, лиганды, такие как биотин, авидин, стрептавидин и гаптены, квантовые точки и т.п. Поддающиеся обнаружению метки могут быть расположены в любом положении в пептидах или белках, описанных в настоящем описании. Они могут располагаться в аминокислотах, пептидах или белках, или расположены на N- или C-концах.
Расщеплять: Как используют в рамках изобретения, термин "расщеплять" означает разрушать на мелкие фрагменты или компоненты. При указании на полипептиды или белки, расщепление приводит к продуцированию пептидов.
Дистальный: Как используют в рамках изобретения, термин "дистальный" означает расположенный вдали от центра или вдали от представляющей интерес точки или области.
Кодируемый сигнал расщепления белка: Как используют в рамках изобретения, "кодируемый сигнал расщепления белка" относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует сигнал расщепления белка.
Полученный способами инженерии: Как используют в рамках изобретения, варианты осуществления изобретения являются "полученными способами инженерии", когда они сконструированы так, чтобы иметь признак или свойство, структурные или химические, которые варьируют относительно исходной молекулы дикого типа или нативной молекулы.
Экспрессия: Как используют в рамках изобретения, "экспрессия" последовательности нуклеиновой кислоты относится к одному или нескольким из следующих явлений: (1) продуцирование РНК-матрицы с последовательности ДНК (например, путем транскрипции); (2) процессинг РНК-транскрипта (например, путем сплайсинга, редактирования, образования 5′-кэпа и/или процессинга 3′-конца); (3) трансляция РНК в полипептид или белок; и (4) посттрансляционная модификация полипептида или белка.
Признак: Как используют в рамках изобретения, "признак" относится к характеристике, свойству или отличительному элементу.
Состав: Как используют в рамках изобретения, "состав" включает по меньшей мере полинуклеотид и средство для доставки.
Фрагмент: "Фрагмент", как используют в рамках изобретения, относится к части. Например, фрагменты белков могут содержать полипептиды, полученные путем расщепления полноразмерного белка, выделенного из культивируемых клеток.
Функциональный: Как используют в рамках изобретения, "функциональная" биологическая молекула представляет собой биологическую молекулу в форме, в которой она проявляет свойство и/или активность, которые ее характеризуют.
Гомология: Как используют в рамках изобретения, термин "гомология" относится к общей родственности между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновых кислот (например, молекулы ДНК и/или молекулы РНК) и/или между полипептидными молекулами. В некоторых вариантах осуществления полимерные молекулы считаются "гомологичными" друг другу, если их последовательности являются по меньшей мере на 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичными или сходными. Термин "гомологичный" неизбежно относится к сравнению по меньшей мере двух последовательностей (полинуклеотидные или полипептидные последовательности). В соответствии с изобретением, две полинуклеотидные последовательности считаются гомологичными, если полипептиды, которые они кодируют, идентичны по меньшей мере приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 99% на протяжении по меньшей мере одного участка по меньшей мере приблизительно из 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления гомологичные полинуклеотидные последовательности характеризуются способностью кодировать участок из по меньшей мере 4-5 уникальных заданных аминокислот. Для полинуклеотидных последовательностей длиной менее 60 нуклеотидов гомологию определяют по способности кодировать участок из по меньшей мере 4-5 уникальных заданных аминокислот. В соответствии с изобретением две белковых последовательности считаются гомологичными, если белки по меньшей мере приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80% или 90% идентичны на протяжении по меньшей мере одного участка из по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот.
Идентичность: Как используют в рамках изобретения, термин "идентичность" относится к общей родственности между полимерными молекулами, например, между олигонуклеотидными молекулами (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. Вычисление процентной идентичности двух полинуклеотидных последовательностей, например, можно проводить путем выравнивания двух последовательностей для целей оптимального сравнения (например, пропуски можно вносить в одну или обе из первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания и неидентичными последовательностями можно пренебрегать для целей сравнения). В определенных вариантах осуществления длина последовательности, выравниваемой для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают нуклеотиды в соответствующих положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы идентичны в этом положении. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, являющихся общими для последовательностей, с учетом количества пропусков и длины каждого пропуска, который необходимо вносить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с использованием математического алгоритма. Например, процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с использованием таких способов, как способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics и Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки. Например, процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с использованием алгоритма Meyers и Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), который включен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы веса остатков PAM120, штрафа за продолжение пропуска 12 и штрафа за пропуск 4. Альтернативно, процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с использованием программы GAP в пакете программ GCG с использованием матрицы NWSgapdna.CMP. Способы, обычно используемые для определения процентной идентичности между последовательностями, включают, но не ограничиваются ими, способы, описанные в Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988); включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Способы определения идентичности закодированы в общедоступных компьютерных программах. Иллюстративное компьютерное программное обеспечение для определения гомологии между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются ими, пакет программ GCG, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984), BLASTP, BLASTN and FASTA Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990).
Ингибировать экспрессию гена: Как используют в рамках изобретения, выражение "ингибировать экспрессию гена" означает обеспечивать уменьшение количества продукта экспрессия гена. Продукт экспрессии может представлять собой РНК, транскрибируемую с гена (например, мРНК), или полипептид, транслируемый с мРНК, транскрибируемой с гена. Как правило, снижение уровня мРНК приводит к снижению уровня полипептида, транслируемого с него. Уровень экспрессии можно определять с использованием стандартных способов измерения мРНК или белка.
In vitro: Как используют в рамках изобретения, термин "in vitro" относится к явлениям, которые происходят в искусственной среде, например, в пробирке или реакционной емкости, в культуре, в чашке Петри и т.д., а не в организме (например, животном, растении или микроорганизме).
In vivo: Как используют в рамках изобретения, термин "in vivo" относится к явлениям, которые происходят в организме (например, животном, растении или микроорганизме или их клетке или ткани).
Выделенный: Как используют в рамках изобретения, термин "выделенный" относится к веществу или элементу, который отделен от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми он был ассоциирован (либо в природе, либо в экспериментальных условиях). Выделенные вещества могут иметь различные уровни чистоты относительно веществ, с которыми они были ассоциированы. Выделенные вещества и/или элементы могут быть отделены от по меньшей мере приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или более других компонентов, с которыми они были первоначально ассоциированы. В некоторых вариантах осуществления выделенные вещества являются более чем приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или более чем приблизительно на 99% чистыми. Как используют в рамках изобретения, вещество является "чистым", если оно по существу свободно от других компонентов. По существу выделенный: Под "по существу выделенным" подразумевают, что соединение по существу отделено от среды, в которой оно было образовано или обнаружено. Частичное выделение может включать, например, композицию, обогащенную соединением по настоящему изобретению. Выделение по существу может включать композиции, содержащие по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 97% или по меньшей мере приблизительно 99% по массе соединения по настоящему изобретению или его соли. Способы выделения соединений и их солей являются общепринятыми в данной области.
Линкер: Как используют в рамках изобретения, линкер относится к группе атомов, например, 10-1000 атомов, и он может состоять из атомов или групп, таких как, но не ограничиваясь ими, углерод, амино, алкиламино, кислород, сера, сульфоксид, сульфонил, карбонил и имин. Линкер может быть связан с модифицированным нуклеозидом или нуклеотидом на основании нуклеиновой кислоты или части сахара на первом конце и с грузом, например, поддающимся обнаружению, или терапевтическим средством, на втором конце. Линкер может быть достаточной длины, чтобы не препятствовать включению в последовательность нуклеиновой кислоты. Линкер можно использовать для любой подходящей цели, как, например, для образования мультимеров (например, посредством связывания двух или более полинуклеотидов) или конъюгатов, а также для введения груза, как описано в настоящем описании. Примеры химических групп, которые могут быть включены в линкер, включают, но не ограничиваются ими, алкил, алкенил, алкинил, амидо, амино, простой эфир, простой тиоэфир, сложный эфир, алкилен, гетероалкилен, арил или гетероциклил, каждый из которых может быть необязательно замещенным, как описано в настоящем описании. Примеры линкеров включают, но не ограничиваются ими, ненасыщенные алканы, полиэтиленгликоли (например, мономерные элементы этиленгликоля или пропиленгликоль, например, диэтиленгликоль, дипропиленгликоль, триэтиленгликоль, трипропиленгликоль, тетраэтиленгликоль, или тетраэтиленгликоль) и полимеры декстрана. Другие примеры включают, но не ограничиваются ими, расщепляемые части в линкере, например, такие как дисульфидная связь (-S-S-) или азосвязь (-N=N-), которая может расщепляться с использованием восстановителя или фотолиза. Неограничивающие примеры селективно расщепляемой связи включают амидосвязь, которая может быть расщеплена, например, с использованием трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), или других восстановителей и/или фотолиза, а также сложную эфирную связь, которая может быть расщеплена, например, гидролизом кислотой или основанием.
Модифицированный: Как используют в рамках изобретения, "модифицированный" относится к измененному состоянию или структуре молекулы по изобретению. Молекулы могут быть модифицированы множеством способов, в том числе химически, структурно и функционально. В одном варианте осуществления молекулы мРНК по настоящему изобретению модифицированы путем встраивания неприродных нуклеозидов и/или нуклеотидов, например, относительно природных рибонуклеотидов A, U, G и C. Неканонические нуклеотиды, такие как структуры кэпа, не считаются "модифицированными", хотя они отличаются по химической структуре от рибонуклеотидов A, C, G, U.
Встречающийся в природе: Как используют в рамках изобретения, "встречающийся в природе" означает существующий в природе без искусственного влияния.
Не являющееся человеком позвоночное: Как используют в рамках изобретения, "не являющееся человеком позвоночное" включает всех позвоночных, за исключением Homo sapiens, включая дикие и домашние виды. Примеры не являющихся человеком позвоночных включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих, таких как альпака, бантенг, бизон, верблюд, кошка, крупный рогатый скот, олень, собака, обезьяна, гайал, коза, морская свинка, лошадь, лама, мул, свинья, кролик, северный олень, овца, азиатский буйвол и як.
Нецелевой: Как используют в рамках изобретения, "нецелевой" относится к любому непредусмотренному эффекту в отношении любой одной или нескольких мишеней, генов или клеточных транскриптов.
Открытая рамка считывания: Как используют в рамках изобретения, "открытая рамка считывания" или "ORF" относится к последовательности, которая не содержит стоп-кодона в данной рамке считывания.
Функционально связанный: Как используют в рамках изобретения, выражение "функционально связанный" относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более молекулами, конструкциями, транскрипциями, элементами, частями и т.п.
Паратоп: Как используют в рамках изобретения, "паратоп" относится к антигенсвязывающему центру антитела.
Пациент: Как используют в рамках изобретения, "пациент" относится к индивидууму, который может обратиться за лечением или который может нуждаться в лечении, которому требуется лечение, которому проводят лечение или которому будут проводить лечение, или индивидууму, который находится под присмотром обученного специалиста по конкретному заболеванию или состоянию.
Необязательно замещенный: В настоящем описании выражение в форме "необязательно замещенный X" (например, необязательно замещенный алкил) является эквивалентным "X, где X является необязательно замещенным" (например, "алкил, где указанный алкил является необязательно замещенным"). Оно не подразумевает значения, что признак "X" (например, алкил) сам по себе необязателен.
Пептид: Как используют в рамках изобретения, "пептид" имеет длину менее или равной 50 аминокислот, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот в длину.
Фармацевтически приемлемый: Выражение "фармацевтически приемлемый" используют в настоящем описании для обозначении соединений, материалов, композиций и/или дозированных форм, которые по мнению квалифицированного медицинского специалиста пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергического ответа или другой проблемы или осложнения, в соответствии с приемлемым соотношением польза/риск.
Фармацевтически приемлемые эксципиенты: Выражение "фармацевтически приемлемый эксципиент", как используют в рамках изобретения, относится к любому ингредиенту, отличному от соединений, описанных в настоящем описании (например, носитель, способный суспендировать или растворять активное соединение), и обладающему свойством являться по существу нетоксичным и не вызывающим воспаления у индивидуума. Эксципиенты могут включать, например: антиадгезивы, антиоксиданты, связующие вещества, покрытия, добавки для прессования, дезинтегрирующие агенты, красители (красящие вещества), смягчающие средства, эмульгаторы, наполнители (разбавители), пленкообразующие вещества или покрытия, вкусовые добавки, отдушки, вещества, способствующие скольжению (усилители текучести), смазывающие вещества, консерванты, печатные краски, сорбенты, суспендирующие или диспергирующие вещества, подсластители и гидратационную воду. Иллюстративные эксципиенты включают, но не ограничиваются ими: бутилированный гидрокситолуол (BHT), карбонат кальция, фосфат кальция (двухосновный), стеарат кальция, кроскармеллозу, сшитый поливинилпирролидон, лимонную кислоту, кросповидон, цистеин, этилцеллюлозу, желатин, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, лактозу, стеарат магния, мальтит, маннит, метионин, метилцеллюлозу, метилпарабен, микрокристаллическую целлюлозу, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, повидон, преджелатинизированный крахмал, пропилпарабен, ретинилпальмитат, шеллак, диоксид кремния, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, цитрат натрия, натрия крахмала гликолят, сорбит, крахмал (кукурузный), стеариновую кислоту, сахарозу, тальк, диоксид титана, витамин A, витамин E, витамин C и ксилит.
Фармацевтически приемлемые соли: Также настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемым солям соединений, описанных в настоящем описании. Как используют в рамках изобретения, "фармацевтически приемлемые соли" относится к производным описанных соединений, где исходное соединение модифицировано путем преобразования существующей части кислоты или основания в ее солевую форму (например, путем реакции группы свободного основания с подходящей органической кислотой). Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются ими, соли минеральных или органических кислот и основных остатков, таких как амины; щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты; и т.п. Репрезентативные кислотно-аддитивные соли включают ацетат, адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфоросульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептонат, гексаноат, гидробромид, гидрохлорид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат, ундеканоат, валерат и т.п. Репрезентативные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают соли натрия, лития, калия, кальция, магния и т.п., а также нетоксичные соли аммония, четвертичные соли аммония и катионов аминов, включая, но не ограничиваясь ими, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и т.п. Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению включают общепринятые нетоксичные соли исходного соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно синтезировать из исходного соединения, которое содержит основную или кислотную часть, общепринятыми химическими способами. Как правило, такие соли можно получать путем реакции формы свободной кислоты или основания этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или органическом растворителе, или в смеси двух из них; как правило, предпочтительными являются неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Перечень подходящих солей может быть найден в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, и Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, и Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977), каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Фармакокинетика: Как используют в рамках изобретения, "фармакокинетика" относится к любому одному или нескольким свойствам молекулы или соединения, в отношении определения судьбы вещества, введенного в живой организм. Фармакокинетику подразделяют на несколько областей, включающих степень и скорость всасывания, распределение, метаболизм и экскрецию. Это обычно обозначают как ADME, где: (A) всасывание представляет собой процесс проникновения вещества в кровоток; (D) распределение представляет собой распространение или рассеивание веществ в жидкостях и тканях организма; (M) метаболизм (или биотрансформация) представляет собой необратимую трансформацию исходных соединений в дочерние метаболиты; и (E) экскреция (или элиминация) относится к элиминации веществ из организма. В редких случаях некоторые лекарственные средства необратимо накапливаются в ткани организма.
Фармацевтически приемлемый сольват: Термин "фармацевтически приемлемый сольват", как используют в рамках изобретения, означает соединение по изобретению, где молекулы подходящего растворителя включены в кристаллическую решетку. Подходящий растворитель является физиологически переносимым в вводимой дозировке. Например, сольваты можно получать путем кристаллизации, перекристаллизации или преципитации из раствора, который включает органические растворители, воду или их смесь. Примерами подходящих растворителей являются этанол, вода (например, моно-, ди- и тригидраты), N-метилпирролидинон (NMP), диметилсульфоксид (DMSO), N,N’-диметилформамид (DMF), N,N’-диметилацетамид (DMAC), 1,3-диметил-2-имидазолидинон (DMEU), 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2-(1H)-пиримидинон (DMPU), ацетонитрил (ACN), пропиленгликоль, этилацетат, бензиловый спирт, 2-пирролидон, бензилбензоат и т.п. Когда вода представляет собой растворитель, сольват называют "гидратом".
Физико-химический: Как используют в рамках изобретения, "физико-химический" означает имеющий отношение или связанный с физическим и/или химическим свойством.
Предупреждение: Как используют в рамках изобретения, термин "предупреждение" относится к частично или полностью замедленному возникновению инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния; частичному или полному замедлению возникновения одного или нескольких симптомов, признаков или клинических проявлений конкретной инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния; частичному или полному замедлению появления одного или нескольких симптомов, признаков или проявлений конкретной инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния; частичному или полному замедлению прогрессирования инфекции, конкретного заболевания, нарушения и/или состояния; и/или уменьшению риска развития патологии, ассоциированной с инфекцией, заболеванием, нарушением /или состоянием.
Пролекарство: Также настоящее изобретение относится к пролекарствам соединений, описанных в настоящем описании. Как используют в рамках изобретения, "пролекарства" относятся к любому веществу, молекуле или элементу, которые находятся в форме, обуславливающей действие этого вещества, молекулы или элемента в качестве терапевтического средства при химическом или физическом изменении. Пролекарства могут быть ковалентно связаны или изолированы каким-либо образом, и они высвобождаются или конвертируются в активную лекарственную часть перед, при или после введения млекопитающему. Пролекарства можно получать путем модификации функциональных групп, присутствующих в соединениях таким образом, что модифицированные группы расщепляются, либо путем стандартного манипулирования, либо in vivo, до исходных соединений. Пролекарства включают соединения, где гидроксильная, амино, сульфгидрильная или карбоксильная группы связаны с любой группой, которая, при введении млекопитающему, отщепляется с образованием свободной гидроксильной, амино, сульфгидрильной или карбоксильной группы, соответственно. Получение и применение пролекарств рассмотрено в T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, и в Bioreversible Drugs in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Пролиферировать: Как используют в рамках изобретения, термин "пролиферировать" означает расти, распространяться или увеличиваться или обеспечивать быстрый рост, распространение или увеличение. "Пролиферативный" означает обладающий способностью пролиферировать. "Антипролиферативный" означает имеющий свойства, противоположные или не относящиеся к пролиферативным свойствам.
Участок расщепления белка: Как используют в рамках изобретения, "участок расщепления белка" относится к участку, в котором можно проводить контролируемое расщепление аминокислотной цепи химическими, ферментативными или фотохимическими способами.
Сигнал расщепления белка: Как используют в рамках изобретения, "сигнал расщепления белка" относится по меньшей мере к одной аминокислоте, которая метит или маркирует полипептид для расщепления.
Представляющий интерес белок: Как используют в рамках изобретения, термины "представляющие интерес белки" или "желаемые белки" включают белки, предусматриваемые в рамках настоящего изобретения, и их фрагменты, мутанты, варианты и изменения.
Проксимальный: Как используют в рамках изобретения, термин "проксимальный" означает расположенный вблизи центра или представляющей интерес точки или области.
Очищенный: Как используют в рамках изобретения, "очищать", "очищенный", "очистка" означает делать по существу чистым или очищать от нежелательных компонентов, загрязняющих материалов, примесей или дефектных материалов.
Образец: Как используют в рамках изобретения, термин "образец" или "биологический образец" относится к подгруппе его тканей, клеток или составных частей (например, жидкости организма, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, слизь, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, цереброспинальную жидкость, слюну, амниотическую жидкость, амниотическую пуповинную кровь, мочу, вагинальную жидкость и семенную жидкость). Кроме того, образец может включать гомогенат, лизат или экстракт, полученный из целого организма или подгруппы его тканей, клеток или составных частей, или их фракцию или часть, включая, но не ограничиваясь ими, например, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфу, поверхностные срезы кожи, дыхательных, кишечных и мочеполовых трактов, слезы, слюну, молоко, клетки крови, опухоли, органы. Кроме того, образец относится к среде, такой как питательный бульон или гель, которая может содержать клеточные компоненты, такие как белки или молекула нуклеиновой кислоты.
Сигнальные последовательности: Как используют в рамках изобретения, выражение "сигнальные последовательности" относится к последовательности, которая может направлять транспорт или локализацию белка.
Значительный или значительно: Как используют в рамках изобретения, термины "значительный" или "значительно" используют синонимично с термином "по существу".
Единичная доза: Как используют в рамках изобретения, "единичная доза" представляет собой дозу любого терапевтического средства, введенного в одной дозе/за один раз/одним путем/через одну точку контакта, т.е. событие однократного введения.
Сходство: Как используют в рамках изобретения, термин "сходство" относится к общей родственности между полимерными молекулами, например, между полинуклеотидными молекулами (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. Вычисление процентного сходства полимерных молекул друг с другом можно проводить аналогично вычислению процентной идентичности, за исключением того, что при вычислении процентного сходства учитывают консервативные замены, как понятно в данной области.
Разделенная доза: Как используют в рамках изобретения, "разделенная доза" представляет собой разделение единичной дозы или общей суточной дозы на две или более доз.
Стабильный: Как используют в рамках изобретения "стабильный" относится к соединению, которое является достаточно прочным, чтобы выдержать выделение до подходящей степени чистоты из реакционной смеси, и предпочтительно способно к составлению в эффективное терапевтическое средство.
Стабилизированный: Как используют в рамках изобретения, термин "стабилизировать", "стабилизированный", "стабилизированная область" означает сделать или стать стабильным.
Индивидуум: Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" или "пациент" относится к любому организму, которому можно вводить композицию по изобретению, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических и/или терапевтических целей. Типичные индивидуумы включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, не являющиеся человеком приматы и люди) и/или растения.
По существу: Как используют в рамках изобретения, термин "по существу" относится к качественному состоянию проявления полной или практически полной степени или меры представляющей интерес характеристики или свойства. Специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, или даже никогда, достигают завершения и/или протекают до завершенности или достигают или исключают абсолютный результат. Термин "по существу", таким образом, используется в настоящем описании для охвата потенциального отсутствия завершенности, присущей многим биологическим и химическим явлениям.
По существу равный: Как используют в рамках изобретения в отношении временных различий между дозами, термин означает плюс/минус 2%.
По существу одновременно: Как используют в рамках изобретения и в отношении множества доз, термин означает в пределах 2 секунд.
Страдающий от: Индивидуум, который является "страдающим от" заболевания, нарушения и/или состояния, имеет диагностированное у него заболевание, нарушение и/или состояние или проявляет один или несколько их симптомов.
Предрасположенный: Индивидуум, который является "чувствительным" к заболеванию, нарушению и/или состоянию, не имеет диагностированного у него заболевания, нарушения и/или состояния и/или может не проявлять их симптомы, но обладает склонностью к развитию заболевания или его симптомов. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, который является предрасположенным к заболеванию, нарушению и/или состоянию (например, злокачественная опухоль), может характеризоваться одним или несколькими из следующих: (1) генетическая мутация, ассоциированная с развитием заболевания, нарушения и/или состояния; (2) генетический полиморфизм, ассоциированный с развитием заболевания, нарушения и/или состояния; (3) увеличенная или сниженная экспрессия и/или активность белка и/или нуклеиновой кислоты, ассоциированных с заболеванием, нарушением и/или состоянием; (4) привычки и/или образ жизни, ассоциированные с развитием заболевания, нарушения и/или состояния; (5) семейный анамнез заболевания, нарушения и/или состояния; и (6) контакт и/или инфицирование микробом, ассоциированным с развитием заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума, предрасположенного к заболеванию, нарушению и/или состоянию, разовьется заболевание, нарушение и/или состояние. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума, предрасположенного к заболеванию, нарушению и/или состоянию, не разовьется заболевание, нарушение и/или состояние.
Синтетический: Термин "синтетический" означает продуцированный, полученный и/или изготовленный человеком. Синтез полинуклеотидов или полипептидов или других молекул по настоящему изобретению может быть химическим или ферментативным.
Заданные клетки: Как используют в рамках изобретения, "заданные клетки" относятся к любой одной или нескольким представляющим интерес клеткам. Клетки могут находиться in vitro, in vivo, in situ или в ткани или органе организма. Организм может представлять собой любое животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека и наиболее предпочтительно пациента.
Терапевтическое средство: Термин "терапевтическое средство" относится к любому средству, которое при введении индивидууму обладает терапевтически, диагностическим и/или профилактическим эффектом и/или индуцирует желаемый биологический и/или фармакологический эффект.
Терапевтически эффективное количество: Как используют в рамках изобретения, термин "терапевтически эффективное количество" означает количество средства, подлежащего доставке (например, нуклеиновая кислота, лекарственное средство, терапевтическое средство, диагностическое средство, профилактическое средство и т.д.), которое является достаточным при введении индивидууму, страдающему или предрасположенному к инфекции, заболеванию, нарушению и/или состоянию, для лечения, улучшения симптомов, диагностики, предупреждения и/или замедления возникновения инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния.
Терапевтически эффективный исход: Как используют в рамках изобретения, термин "терапевтически эффективный исход" означает исход, который является достаточным у индивидуума, страдающего или предрасположенного к инфекции, заболеванию, нарушению и/или состоянию, для лечения, улучшения симптомов, диагностики, предупреждения и/или замедления возникновения инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния.
Общая суточная доза: Как используют в рамках изобретения, "общая суточная доза" представляет собой количество, введенное или назначенное за период 24 ч. Его можно вводить в качестве единичной дозы.
Фактор транскрипции: Как используют в рамках изобретения, термин "фактор транскрипции" относится к ДНК-связывающему белку, который регулирует транскрипцию ДНК в РНК, например, посредством активации или подавления транскрипции. Некоторые факторы транскрипции осуществляют регуляцию транскрипции самостоятельно, в то время как другие факторы действуют совместно с другими белками. Некоторые факторы транскрипции могут как активировать, так и подавлять транскрипцию в определенных условиях. Как правило, факторы транскрипции связывают определенную заданную последовательность или последовательности, высокосходные с определенной консенсусной последовательностью в регуляторной области гена-мишени. Факторы транскрипции могут регулировать транскрипцию гена-мишени отдельно или в комплексе с другими молекулами.
Лечение: Как используют в рамках изобретения, термин "лечение" относится к частичному или полному ослаблению, смягчению, улучшению, облегчению, замедлению возникновения, ингибированию прогрессирования, снижению тяжести и/или снижению встречаемости одного или нескольких симптомов или признаков конкретной инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния. Например, "лечение" злокачественной опухоли может относиться к ингибированию выживания, роста и/или распространения опухоли. Лечение можно проводить индивидууму, который не проявляет признаков заболевания, нарушения и/или состояния, и/или индивидууму, который проявляет только ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния, для цели снижения риска развития патологии, ассоциированной с заболеванием, нарушением и/или состоянием.
Немодифицированный: Как используют в рамках изобретения, "немодифицированный" относится к любому веществу, соединению или молекуле перед изменением каким-либо образом. Немодифицированный может, но не всегда, относиться к дикому типу или нативной форме биомолекулы. Молекулы могут претерпевать серию модификаций, когда каждая модифицированная молекула может служить в качестве "немодифицированной" исходной молекулы для последующей модификации.
Эквиваленты и объем
Специалистам в данной области будет понятно или они будут способны определить с использованием не более чем стандартного экспериментирования многие эквиваленты конкретным вариантам осуществления в соответствии с изобретением, описанным в настоящем описании. Объем настоящего изобретения не ограничивается описанным выше описанием, а скорее является таким, как указано в прилагаемой формуле изобретения.
В формуле изобретения форма единственного числа может означать один или несколько, если контекст не указывает на обратное или, в ином случае, если это не очевидно из контекста. Пункты формулы изобретения или описание, включающие "или" между одним или несколькими представителями группы, считаются удовлетворенными, если один, более одного или все из группы представителей присутствуют в, используются в или иным образом имеют отношение к данному продукту или процессу, если не указано обратное, или в ином случае, если не очевидно из контекста. Изобретение включает варианты осуществления, в которых именно один представитель группы присутствует в, используется в или иным образом имеет отношение к данному продукту или процессу. Изобретение включает варианты осуществления, в которых более одного или все из группы представителей присутствуют в, используются в или иным образом имеют отношение к данному продукту или процессу.
Также следует отметить, что термин "содержащий" является открытым и позволяет, но не требует, включение дополнительных элементов или стадий. Когда в настоящем описании используют термин "содержащий", термин "состоящий из", таким образом, также охватывается и описан.
Когда приведены диапазоны, включены конечные значения. Более того, следует понимать, что если нет иных указаний или, в ином случае, если не очевидно из контекста и знаний специалиста в данной области, величины, которые выражены в качестве диапазонов, могут принимать любое конкретное значение или поддиапазон в указанном диапазоне в различных вариантах осуществления изобретения, до десятой части единицы нижней границы диапазона, если контекст явно не указывает на иное.
Кроме того, следует понимать, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который относится к уровню техники, может быть прямо исключен из любого одного или нескольких пунктов изобретения. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными специалисту в данной области, они могут быть исключены, даже если исключение не указано в настоящем описании прямо. Любой конкретный вариант осуществления композиций по изобретению (например, любая нуклеиновая кислота или белок, кодируемый ей; любой способ получения; любой способ применения и т.д.) могут быть исключены из любого одного или нескольких пунктов формулы изобретения по любой причине, как связанной, так и не связанной с существованием уровня техники.
Все цитированные источники, например, ссылки, публикации, базы данных, регистрационные записи в базах данных и статьи, цитированные в настоящем описании, включены в настоящую заявку в качестве ссылок, даже если не указаны прямо в ссылке. В случае противоречия утверждений цитированного источника и настоящей заявки, утверждение в настоящей заявке будет решающим.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение дополнительно описано в представленных ниже примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанного в формуле изобретения.
Пример 1. Транскрипция модифицированной мРНК in vitro
A. Материалы и способы
Модифицированные мРНК по изобретению получают с использованием стандартных лабораторных способов и материалов для транскрипции in vitro, за исключением того, что смесь нуклеотидов содержит модифицированные нуклеотиды. Открытая рамка считывания (ORF) представляющего интерес гена фланкируется 5'-нетранслируемой областью (UTR), содержащей мощный сигнал инициации трансляции Козака, и 3'-UTR альфа-глобина, которая терминируется последовательностью олиго(dT) для присоединения по матрице поли-A-концевой части к мРНК, не включающим аналоги аденозина. Содержащие аденозин мРНК синтезируют без последовательности олиго(dT), чтобы обеспечить посттранскрипционное добавление поли-(A)-концевой части поли(A)-полимеразой.
Модифицированные мРНК можно модифицировать для снижения клеточного врожденного иммунного ответа. Модификации для снижения клеточного ответа могут включать псевдоуридин (ψ) и 5-метилцитидин (5meC, 5mc или m5C). (См., Kariko K et al. Immunity 23:165-75 (2005), Kariko K et al. Mol Ther 16:1833-40 (2008), Anderson B.R. et al. NAR (2010); включенную в настоящее описание в качестве ссылки).
ORF также может включать вышележащие или нижележащие вставки (такие как, но не ограничиваясь ими, β-глобин, метки и т.д.), может быть упорядочена с помощью оптимизирующей программы, такой как, но не ограничиваясь этим, ДНК2.0 (Menlo Park, CA), и может содержать множество участков клонирования, которые могут иметь участок распознавания XbaI. После получения конструкции ее можно воспроизводить и трансформировать в химически компетентные E. coli.
Для настоящего изобретения используют компетентные клетки E. coli NEB DH5-alpha. Трансформацию проводят в соответствии с инструкциями NEB с использованием 100 нг плазмиды. Протокол является следующим:
Разморозить пробирку компетентных клеток E. coli NEB 5-alpha на льду в течение 10 минут.
Добавить 1-5 мкл с 1 пг-100 нг плазмиды ДНК в клеточную культуру. Осторожно постучать по пробирке 4-5 раз для смешения клеток и ДНК. Не встряхивать.
Поместить смесь на лед на 30 минут. Не перемешивать.
Выполнить тепловой шок при 42°C в течение 30 секунд. Не перемешивать.
Поместить на лед на 5 минут. Не перемешивать.
Добавить в смесь пипеткой 950 мкл SOC комнатной температуры.
Поместить в условия при 37°C на 60 минут. Энергично встряхивать (250 об/мин) или качать.
Нагреть чашки для селекции до 37°C.
Перемешать клетки тщательно путем постукивания по пробирке и переворачивания.
Распределить 50-100 мкл каждого разведения на чашку для селекции и инкубировать в течение ночи при 37°C. Альтернативно инкубировать при 30°C в течение 24-36 часов или 25°C в течение 48 часов.
Затем единичную колонию используют для инокуляции 5 мл среды для роста LB с использованием подходящего антибиотика, а затем позволяют расти (250 об/мин, 37°C) в течение 5 часов. Затем ее используют для инокуляции 200 мл культуральной среды и позволяют расти в течение ночи в тех же условиях.
Для выделения плазмиды (вплоть до 850 мкг) проводят maxi prep с использованием набора Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep Kit (Carlsbad, CA), в соответствии с инструкциями изготовителя.
Для получения кДНК для транскрипции In Vitro (IVT), плазмиду (пример которой представлен на фиг.3) сначала линеаризуют с использованием фермента рестрикции, такого как XbaI. Типичное рестрикционное расщепление посредством XbaI будет включать следующее: 1,0 мкг плазмиды; 1,0 мкл 10x буфера; 1,5 мкл XbaI; вплоть до 10 мкл dH20; инкубируемые при 37°C в течение 1 ч. При выполнении в лабораторном масштабе (<5 мкг) реакционную смесь очищают с использованием набора Invitrogen’s PURELINK™ PCR Micro Kit (Carlsbad, CA) согласно инструкциям изготовителя. Может потребоваться очистка в большем масштабе с помощью продукта, который имеет большую нагрузочную способность, такого как стандартный набор Invitrogen PURELINK™ PCR Kit (Carlsbad, CA). После очистки линеаризованный вектор количественно определяют с использованием NanoDrop и анализируют для подтверждения линеаризации с использованием агарозного гель-электрофореза.
B. Агарозный гель-электрофорез модифицированной мРНК
Индивидуальные модифицированные мРНК (200-400 нг в объеме 20 мкл) наносят на лунку неденатурирующего 1,2% агарозного геля с Agarose E-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA) и разделяют в течение 12-15 минут в соответствии с протоколом изготовителя.
C. Агарозный гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР
Индивидуальные обратно транскрибированные продукты ПЦР (200-400 нг) наносят на лунку неденатурирующего 1,2% агарозного геля Agarose E-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA) и разделяют в течение 12-15 минут в соответствии с протоколом изготовителя.
D. Количественное определение модифицированной мРНК с помощью Nanodrop и данные УФ-спектров
Модифицированные мРНК в буфере TE (1 мкл) используют для считывания поглощения в УФ области на Nanodrop для количественного определения каждой модифицированной мРНК из реакции транскрипции in vitro (кривые поглощения в УФ области не представлены).
Пример 2. Трансфекция модифицированной мРНК
A. Обратная трансфекция
Для экспериментов, проводимых в 24-луночных покрытых коллагеном планшетах для культивирования тканей, кератиноциты высевают при плотности клеток 1×105. Для экспериментов, проводимых в 96-луночных покрытых коллагеном планшетах для культивирования тканей, кератиноциты высевают при плотности клеток 0,5×105. Для каждой модифицированной мРНК, подлежащей трансфекции, модифицированную мРНК:RNAIMAXTM получают, как описано, и смешивают с клетками в многолуночном планшете в течение 6 часов после посева клеток до того, как клетки прикрепились к планшету для культивирования тканей.
B. Прямая трансфекция
В 24-луночном покрытом коллагеном планшете для культивирования тканей кератиноциты высевают при плотности клеток 0,7×105. Для экспериментов, проводимых в 96-луночном покрытом коллагеном культуральном планшете, кератиноциты высевают при плотности клеток 0,3×105. Затем кератиноциты выращивают до смыкания монослоя >70% в течение 24 часов. Для каждой модифицированной мРНК, подлежащей трансфекции, модифицированную мРНК:RNAIMAXTM получают, как описано, и трансфицируют в клетки в многолуночном планшете в течение 24 часов после посева клеток и прикрепления к планшету для культивирования тканей.
C. Скрининг трансляции модифицированной мРНК: ELISA для G-CSF
Кератиноциты выращивают в среде EpiLife с добавкой S7 от Invitrogen до смыкания монослоя >70%. Кератиноциты подвергают обратной транскрипции с 300 нг указанной химически модифицированной мРНК в комплексе с RNAIMAXTM от Invitrogen. Альтернативно, кератиноциты подвергают прямой трансфекции 300 нг модифицированной мРНК в комплексе с RNAIMAXTM от Invitrogen. Комплекс РНК:RNAIMAXTM формируют путем первоначальной инкубации РНК с средой без добавок EPILIFE® в 5X разведении по объему в течение 10 минут при комнатной температуре.
Во второй емкости реагент RNAIMAXTM инкубируют со средой без добавок EPILIFE® в 10X разведении по объему в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем емкость с РНК смешивают с емкостью с RNAIMAXTM и инкубируют в течение 20-30 при комнатной температуре, а затем капельно добавляют к клеткам. Концентрацию секретируемого huG-CSF в культуральной среде измеряют через 18 часов после трансфекции для каждой из химически модифицированных мРНК в трех экземплярах. Секрецию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) человека из трансфицированных кератиноцитов человека количественно определяют с использованием набора для ELISA от Invitrogen или R&D Systems (Minneapolis, MN) в соответствии с инструкциями изготовителя.
D. Доза модифицированной мРНК и продолжительность: ELISA для G-CSF
Кератиноциты выращивают в среде EPILIFE® с добавкой S7 от Invitrogen при смыкании монослоя >70%. Кератиноциты подвергают обратной транскрипции с 0 нг, 46,875 нг, 93,75 нг, 187,5 нг, 375 нг, 750 нг или 1500 нг модифицированной мРНК в комплексе с RNAIMAXTM от Invitrogen. Комлекс модифицированная мРНК:RNAIMAXTM формируют так, как описано. Концентрацию секретируемого huG-CSF в культуральной среде измеряют через 0, 6, 12, 24 и 48 часов после трансфекции для каждой концентрации каждой модифицированной мРНК в трех экземплярах. Секрецию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) человека из трансфицированных кератиноцитов человека количественно определяют с использованием набора для ELISA от Invitrogen или R&D Systems в соответствии с инструкциями изготовителя.
Пример 3. Клеточный врожденный иммунный ответ на модифицированные нуклеиновые кислоты: ELISA для IFN-бета и ELISA TNF-альфа
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для фактора некроза опухоли-α (TNF-α) человека, интерферона-β (IFN-β) человека и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) человека, секретируемого из трансфицированных in vitro клеток, исследуют для обнаружения клеточного врожденного иммунного ответа.
Кератиноциты выращивают в среде EPILIFE® с добавкой для роста кератиноцитов человека без гидрокортизона от Invitrogen при смыкании монослоя >70%. Кератиноциты подвергают обратной транскрипции с 0 нг, 93,75 нг, 187,5 нг, 375 нг, 750 нг, 1500 нг или 3000 нг указанной химически модифицированный мРНК в комплексе с RNAIMAXTM от Invitrogen, как описано, в трех экземплярах. Секретируемый TNF-α в культуральной среде измеряют через 24 часа после трансфекции для каждой из химически модифицированных мРНК с использованием набора для ELISA от Invitrogen в соответствии с протоколами изготовителя.
Секретируемый IFN-β количественно определяют через 24 часа после трансфекции для каждой из химически модифицированных мРНК с использованием набора для ELISA от Invitrogen в соответствии с протоколами изготовителя. Концентрацию секретируемого hu-G-CSF измеряют через 24 часа после трансфекции для каждой из химически модифицированных мРНК. Секрецию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) человека из трансфицированных кератиноцитов человека количественно определяют с использованием набора для ELISA от Invitrogen или R&D Systems (Minneapolis, MN) в соответствии с инструкциями изготовителя. Эти данные указывают на то, какая из модифицированных мРНК способна индуцировать сниженный врожденный клеточный иммунный ответ по сравнению с природными и другими химически модифицированными полинуклеотидами или эталонными соединениями путем измерения иллюстративных цитокинов 1 типа TNF-альфа и IFN-бета.
Пример 4. Анализ пролиферации клеток, индуцированных модифицированной мРНК гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека
Кератиноциты человека выращивают в среде EPILIFE® с добавкой S7 от Invitrogen при смыкании монослоя >70% в 24-луночном покрытом коллагеном планшете для сокультивирования тканей TRANSWELL® (Corning, Lowell, MA). Кератиноциты подвергают обратной транскрипции с 750 нг указанной химически модифицированной мРНК в комплексе с RNAIMAXTM от Invitrogen, как описано, в трех экземплярах. Комплекс модифицированная мРНК:RNAIMAXTM формируют, как описано. Среду для кератиноцитов заменяют 6-8 часов после трансфекции. Через 42 часа после трансфекции, вкладыш в 24-луночный планшет TRANSWELL® с полупроницаемой полиэфирной мембраной с размером пор 0,4 мкм помещают в культуральный планшет, содержащий кератиноциты, трансфицированные модифицированной мРНК hu-G-CSF.
Миелобластные клетки человека, клетки Kasumi-1 или KG-1 (0,2×105 клеток), высевают в лунку с вкладышем, и пролиферацию клеток количественно определяют через 42 часа после начала сокультивирования с использованием анализа пролиферации клеток CyQuant Direct Cell Proliferation Assay (Invitrogen) в объеме 100-120 мкл в 96-луночном планшете. Пролиферацию миелобластных клеток, индуцированную hu-G-CSF, кодируемым модифицированной мРНК, выражают в качестве процентной клеточной пролиферации, нормализованной к не подвергнутым трансфекции контрольным лункам с сокультурой кертиноциты/миелобласты. Концентрацию секретируемого hu-G-CSF в лунках сокультуры кератиноцитов и миелобластов измеряют через 42 часа после начала сокультивирования для каждой модифицированной мРНК в двух экземплярах. Секрецию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) человека количественно определяют с использованием набора для ELISA от Invitrogen в соответствии с инструкциями изготовителя.
Трансфицированную модифицированную мРНК hu-G-CSF в питающих клетках кератиноцитов человека и нетрансфицированных миелобластных клетках человека выявляют способом ОТ-ПЦР. Тотальную РНК из образцов клеток экстрагируют и лизируют с использованием набора RNAEASY® (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Экстрагированную тотальную РНК подвергают ОТ-ПЦР для специфической амплификации модифицированной мРНК G-CSF с использованием набора PROTOSCRIPT® M-MuLV Taq RT-PCR kit (New England BioLabs, Ipswich, MA) в соответствии с инструкциями изготовителя со специфичными к hu-G-CSF праймерами. Продукты ОТ-ПЦР визуализируют электрофорезом в 1,2% агарозном геле.
Пример 5. Цитотоксичность и апоптоз
В этом эксперименте демонстрируется жизнеспособность клеток, цитотоксичность и апоптоз для различных трансфицированных модифицированной мРНК клеток кератиноцитов человека in vitro. Кератиноциты выращивают в среде EPILIFE® с добавкой для роста кератиноцитов человека без гидрокортизона от Invitrogen при смыкании монослоя >70%. Кератиноциты подвергают обратной трансфекции с 0 нг, 46,875 нг, 93,75 нг, 187,5 нг, 375 нг, 750 нг, 1500 нг, 3000 нг или 6000 нг модифицированной мРНК в комплексе с RNAIMAXTM от Invitrogen. Формируют комплекс модифицированная мРНК:RNAIMAXTM. Концентрацию секретируемого huG-CSF в культуральной среде измеряют через 0, 6, 12, 24 и 48 часов после трансфекции для каждой концентрации каждой модифицированной мРНК в трех экземплярах. Секрецию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) человека из трансфицированных кератиноцитов человека количественно определяют с использованием набора для ELISA от Invitrogen или R&D Systems в соответствии с инструкциями изготовителя. Жизнеспособность, цитотоксичность и апоптоз клеток измеряют через 0, 12, 48, 96 и 192 часа после трансфекции с использованием набора APOTOX-GLOTM от Promega (Madison, WI) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Пример 6. Среда для сокультивирования
Модифицированная мРНК, содержащая химически отличающиеся модифицированные нуклеотиды, кодирующие гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) человека, может стимулировать пролиферацию некомпетентных для трансфекции клеток в среде для сокультивирования. Сокультура включает высокотрансфицируемый тип клеток, таких как кератиноциты, и некомпетентный для трансфекции тип клеток, таких как лейкоциты (WBC). Модифицированную мРНК, кодирующую G-CSF, можно трансфицировать в высокотрансфицируемые клетки, обеспечивая продуцирование и секрецию белка G-CSF во внеклеточную среду, где G-CSF действует подобным паракринному образом, стимулируя пролиферацию лейкоцитов, экспрессирующих рецептор G-CSF. Увеличенную в количестве популяцию WBC можно использовать для лечения пациентов с иммунодефицитом или частичного восстановления популяции WBC у иммунодефицитного пациента и, таким образом, снижения риска оппортунистических инфекций.
В другом примере высокотрансфицируемую клетку, такую как фибробласт, трансфицируют определенными факторами роста для способствования и стимуляции роста, поддержания или дифференцировки слаботрансфицируемых эмбриональных стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Пример 7. Кэппирование 5’-гуанозином на модифицированных нуклеиновых кислотах (модифицированных мРНК)
A. Материалы и способы
Клонирование, синтез генов и секвенирование вектора проводили с помощью DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA). ORF подвергали рестрикционному расщеплению с использованием XbaI и использовали для синтеза кДНК с использованием ПЦР с наращиванием концевой части или без наращивания концевой части. Продукт кДНК ПЦР с наращиванием концевой части использовали в качестве матрицы для реакции синтеза модифицированной мРНК с использованием 25 мкМ каждой смеси модифицированных нуклеотидов (все модифицированные нуклеотиды были синтезированы на заказ и приобретены от TriLink Biotech, San Diego, CA за исключением пирроло-C трифосфата, приобретенного от Glen Research, Sterling VA; немодифицированные нуклеотиды приобретали от Epicenter Biotechnologies, Madison, WI) и набора для полного синтеза мРНК CellScript MEGASCRIPT™ (Epicenter Biotechnologies, Madison, WI). Реакцию транскрипции in vitro проводили в течение 4 часов при 37°C. К модифицированным мРНК, включающим аналоги аденозина, добавляли поли(A)-концевую часть с использованием дрожжевой поли(A)-полимеразы (Affymetrix, Santa Clara, CA). В реакции ПЦР использовали HiFi PCR 2X MASTER MIX™ (Kapa Biosystems, Woburn, MA). Модифицированные мРНК подвергали посттранскрипционному кэппированию с использованием рекомбинантного фермента для кэппирования вируса коровьей оспы (New England BioLabs, Ipswich, MA) и рекомбинантной 2’-o-метилтрансферазы (Epicenter Biotechnologies, Madison, WI) для получения структуры 5’-гуанозин-кэп 1. Структуру кэпа 2 и структуры кэпа 2 можно получать с использованием дополнительных 2’-o-метилтрансфераз. Транскрибированный in vitro продукт мРНК разделяли на агарозном геле и визуализировали. Модифицированную мРНК очищали с помощью набора для очистки Ambion/Applied Biosystems (Austin, TX) MEGAClear RNA™ purification kit. В случае ПЦР использовали бор для очистки PURELINK™ PCR purification kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Продукт количественно определяли на устройстве NANODROP™ UV Absorbance (ThermoFisher, Waltham, MA). Качественное определение, качественное определение поглощения в УФ-области и визуализацию продукта проводили на 1,2% агарозном геле. Продукт ресуспендировали в буфере TE.
B. 5’-кэппирование структуры модифицированной нуклеиновой кислоты (мРНК)
5’-Кэппирование модифицированной РНК можно осуществлять одновременно с реакцией транскрипции in vitro с использованием следующих химических аналогов РНК-кэпа для получения структуры кэпа 5’-гуанозина в соответствии с протоколами изготовителя: 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G (кэп ARCA); G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). 5’-Кэппирование модифицированной мРНК можно осуществлять посттранскрипционно с использованием фермента для кэппирования вируса коровьей оспы с получением структуры "кэп 0":m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). Структуру кэпа 1 можно получать с использованием как фермента для кэппирования вируса коровьей оспы, так и 2’-O-метилтрансферазы с получением: m7G(5')ppp(5')G-2’-O-метила. Структуру кэпа 2 можно получать из структуры кэпа 1 с последующим 2’-o-метилированием третьего с 5’-конца нуклеотида с использованием 2’-O-метилтрансферазы. Структуру кэпа 3 можно получать из структуры кэпа 2 с последующим 2’-o-метилированием четвертого с 5’-конца нуклеотида с использованием 2’-O-метилтрансферазы. Ферменты предпочтительно происходят из рекомбинантного источника.
После трансфекции в клетки млекопитающих модифицированные мРНК обладают стабильностью 12-18 часов или более 18 часов, например, 24, 36, 48, 60, 72 или более 72 часов.
Пример 8. Синтез N4-метилцитидина (соединение 1) и N4-метил-CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000154
Уридин подвергали силилированию с получением трисилилированного соединения, которое очищали на колонке, активировали посредством POCl3/триазола двойной перегонки в безводных условиях, а затем подвергали нуклеофильному замещению с 40% водным раствором метиламина. Таким образом, после хроматографической очистки получали N4-метил-2’,3’,5’-три-O-TBDMS-цитидин. Из полученного продукта удаляли защитную группу с помощью TBAF, а затем очищали с помощью системы растворителей этанол-этилацетат (3:1) с получением соединения 1. Конечный продукт охарактеризовывали с помощью ЯМР (в DMSO); MS: 258 (M+H)+, 280 (M+Na)+ и 296 (M+K)+; и ВЭЖХ: чистота 99,35% (фиг.1A-1D). Чистота при ВЭЖХ 98% (фиг.2).
Пример 9. Синтез 2’-OMe-N,N-ди-Me-цитидина (соединение 1) и 2’-OMe-N,N-ди-Me-CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000155
2’-O-Метилуридин подвергали силилированию с получением дисилилированного соединения. Очищенный 2’-O-метил-3’,5’-ди-O-TBDMS-уридин активировали посредством POCl3 и имидазола двойной перегонки в безводных условиях, а затем подвергали нуклеофильному замещению с гидрохлоридом диметиламина в среде с триэтиламином для улавливания HCl. Промежуточное соединение N4,N4,2’-три-O-метил-3’,5’-бис-O-TBDMS-уридин очищали флэш-хроматографией и получали в виде белого вспененного вещества. Из полученного соединения удаляли защитную группу с помощью TBAF, а затем очищали с получением ~400 мг конечного продукта соединения 2 в виде белого вспененного вещества. ES MS: m/z 308 (M+Na)+, 386 (M+H)+; ВЭЖХ: чистота 99,49% (фиг.3A-3C).
Для синтеза соответствующего NTP, 70 мг нуклеозидного соединения 2 обеспечивало 23 мг 2’-OMe-N,N-ди-Me-CTP после очистки на ионообменной и обращенно-фазовой колонках. ВЭЖХ: чистота 95% (фиг.4).
Пример 10. Синтез 5-метоксикарбонилметоксиуридина (соединение 3) и 5-метоксикарбонилметокси-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000156
Уридин 3-a в воде обрабатывали избыточным количеством брома, а затем продували воздухом для удаления брома. Реакционную смесь обрабатывали пиридином при контролируемой скорости и температуре. В процессе реакции нестабильное промежуточное соединение с бромом 3-b постепенно преобразовывалось в промежуточное соединение с ди-гидроксилом 3-c, которое, предположительно, дегидратировалось до стабильного 5-гидроксиуридина 3-d. Затем в 5-гидроксиуридин вносили защитную 2’,3’-изопропилиденовую группу с получением соединения 3-g. Реакция с соединением 3-f обеспечивала соединение 3.
60-70 мг нуклеозида обеспечивало >21 мг желаемого трифосфата после двух стадий очистки на колонке ВЭЖХ и двух стадий лиофилизации. ВЭЖХ: чистота 98% (фиг.5).
Пример 11. Синтез 3-метилпсевдоуридина (соединение 2) и 3-метилпсевдо-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000157
Псевдоуридин 4-a подвергали реакции с Ac2O с получением ацетил-защищенного псевдоуридина 4-b. Затем N1 подвергали селективной защите с помощью POM с получением соединения 4-c. Метилирование N3 с последующим удалением защитной группы обеспечило соединение 4 (~400 мг). Молекулярная формула: C10H14N2O6, молекулярная масса: 258,23 г/моль; внешний вид: белое твердое вещество; условиях хранения: хранить при 25°C; ВЭЖХ: чистота 98,51%; 1H ЯМР (DMSO-d 6 ): δ 11,17 (д, 1H, J=3,0 Гц), 7,56 (д, 1H, J=3,6 Гц), 4,91 (д, 1H, J=3,6 Гц), 4,79 (т, 1H, J=4,2 Гц), 4,70 (д, 1H, J=4,2 Гц), 4,49 (д, 1H, J=3,0 Гц), 3,82-3,88 (м, 2H), 3,66-3,67 (м, 1H), 3,57-3,61 (м, 1H), 3,40-3,47 (м, 1H), 3,09 (с, 3H); MS: 281 (M+Na)+) (фиг.6A и 6B).
Альтернативные пути можно использовать для получения соединения 4. Например, псевдоуридин можно повергать реакции с O-защитной группой (например, как описано в настоящем описании, такой как TMS) и подвергать реакции с N-защитной группой (например, как описано в настоящем описании, такой как ацетил в N1). Затем N3 основания нуклеиновой кислоты можно подвергать реакции с алкилирующим средством (например, диметиламин/диметоксиметил) с получением соединения 4, имеющего N- и O-защитные группы. Наконец, из полученного соединения можно удалять защитную группу (например, в щелочных условиях, таких как NH3/MeOH) с получением соединения 4.
Пример 12. Синтез N-Ac, 5-Ac-OCH 2 -цитидина (соединение 5)
Figure 00000158
В уридин 5-a вносили защитную группу с получением соединения изопропилидена 5-b, которое подвергали реакции с (CHCO)n. Уксусную кислоту с каталитическим количеством TFA использовали для получения желаемого селективно ацилированного соединения 5-f (выход 30%). Дальнейшее тритилирование группы 5’-OH приводило к желаемому ортогонально защищенному соединению 5-g.
Соединение 5-g обрабатывали POCl3 и триазолом с получением соединения 5-h вместе с деацилированным соединением 5-i. Ацетилирование этих двух соединений обеспечило деацилированное полностью защищенное соединение 5-j. Удаление защитной группы из соединения 5-j с помощью уксусной кислоты в условиях нагревания приводило к трем продуктом, одним из которых было соединение 5.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Для получения соединения 5 можно использовать альтернативные пути, такие как начиная с цитидина в качестве исходного материала. В таких случаях 5-положение можно подвергать реакции с галогеном или галогенирующим агентом (например, любым из описанных в настоящем описании, таким как I2/мета-хлорпероксибензойная кислота), который можно вытеснять алкилирующим агентом. Кроме того, такие способы могут включать использование одной или нескольких N- или O-защитных групп (например, любых из описанных в настоящем описании, как например, силилирование и ацетилирование) для защиты аминогруппы цитидина и/или гидроксильных групп части сахара.
Пример 13. Синтез 5-TBDMS-OCH 2 -цитидина (соединение 6)
Figure 00000159
Соединение 5-гидроксиурацила ’-b гликозилировали с получением соединения 6’-d (выход 28%), которое подвергали силилированию с получением соединения 6’-e. Активация защищенного уридина обеспечивала желаемое соединение 6 после дальнейшего аминирования и удаления защитной группы (800 мг конечного соединения). Молекулярная формула: C16H29N3O6Si; молекулярная масса: 387,50 6 г/моль; внешний вид: белое твердое вещество; условия хранения: хранить при 25°C; ВЭЖХ: чистота 97,57%; 1H ЯМР (CDCl3): δ 7,81 (с, 1H), 7,40 (уш.с, 1H), 6,49 (уш.с, 1H), 5,79 (д, 1H, J=2,4 Гц), 5,3-5,32 (м, 1H), 5,00-5,07 (м, 2H), 4,30-4,45 (м, 2H), 3,90-3,94 (м, 2H), 3,80-3,83 (м, 1H), 3,50-3,70 (м, 2H), 0,87 (с, 9H), 0,05 (с, 6H); MS: 388 (M+H)+, 410 (M+Na)+ (фиг.7A-7C).
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 14. Синтез 5-трифторметилцитидина (соединение 7)
Figure 00000160
Соединение 7-A гликозилировали с получением соединения 7-B, которое обрабатывали 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлоридом (TPSCl) для активации карбонильной группы и для обеспечения восстановительного аминирования. Удаление защитной группы обеспечивало соединение 7. Вместо TPSCl можно использовать альтернативные активирующие агенты, такие как 2,4,6-триметилбензолсульфонилхлорид.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 15. Синтез 5-трифторметилуридина (соединение 8)
Figure 00000161
5-Трифторметилурацил 8-A гликозилировали тетра-O-ацетилрибозой и желаемый тризащищенный 5-трифторметилуридин 8-B получали с высоким выходом. Дальнейшее удаление защитной группы обеспечило желаемое соединение 8, которое охарактеризовывали с помощью результатов ЯМР, MS и ВЭЖХ. MS: 313 (M+H)+, 335 (M+Na)+; ВЭЖХ: чистота 98,87% (фиг.8A-8C).
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 16. Синтез 5-(метоксикарбонил)метилуридина (соединение 9)
Figure 00000162

9-e
В уридин 9-a вносили защитную группу с получением соединения 9-b (выход 98%). Это соединение бромировали избытком брома в присутствии уксусного ангидрида и уксусной кислоты. Получали 5-бром-аналог 9-c (выход 60%) и далее подвергали бензоилированию с получением желаемого соединения 9-d (выход 64%). 5-Бром-соединение 9-d конденсировали с диметилмалонатом в щелочных условиях с получением арилированного малоната и полностью защищенного сложного диэфира 9-e (выход 50%). После декарбоксилирования и удаления защитной группы получали соединение 9, подтвержденное с помощью ЯМР (фиг.9).
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 17. Синтез 5-(метоксикарбонил)метил-2'-O-метилуридина (2-OMe-MCM5U) (соединение 10)
Figure 00000163
Аналогично стратегии синтеза соединения 9, выше, 2’-O-метилуридин 10-a подвергали ацилированию и бромировали с получением соединения 10-c. Дальнейшее бензоилирование обеспечило 5-бром-аналог 10-d, который конденсировали с диметилмалонатом с получением продукта 10-e (выход 45%). Декарбоксилирование и удаление защитной группы обеспечило соединение 10.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 18. Синтез 5-трифторацетиламинометил-2-тиоуридина (соединение 11)
Figure 00000164
Гликозилирование 2-тиоурацила 11-a обеспечило соединение 11-c, из которого можно удалять защитную группу с помощью любого подходящего реагента для удаления защитной группы. В частности, LiOH обеспечил желаемый продукт 11-d (выход 80-90%). Защита изопропилиденом обеспечила соединение 11-e (выход 90%). Дальнейшее 5-гидроксилметилирование обеспечивало соединение 11-f. Хлорирование, азидирование и дальнейшее восстановление обеспечило соединение метиламин 11-i, которое ацетилировали с получением соединения 11.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 19. Синтез 5-метиламинометил-2-уридина (соединение 12)
Figure 00000165
Соединение 12 можно получать любым пригодным способом (например, см. схемы (i) и (ii) выше). Например, защищенный урацил можно гликозилировать, а затем аминировать с получением соединения 12. При необходимости можно проводить дополнительные стадии внесения защитной группы, удаления защитной группы и активации. Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 20. Синтез 5-TFA-метиламинометил-2-уридина (соединение 13)
Figure 00000166
В уридин 13-a вносили защитную группу изопропилидена с получением соединения 13-b, а затем его подвергали 5-гидроксиметилированию с получением соединения 13-c. Хлорирование и последующее аминирование обеспечили соединение 13-e, в которое можно вносить защитную группу с получением 13-f. Последующее удаление защитной группы обеспечило соединение 13.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 21. Синтез 5-карбоксиметиламинометилуридина (соединение 14)
Figure 00000167
В уридин 14-a вносили защитную группу изопропилидена с получением соединения 14-b, а затем его подвергали 5-аминоалкилированию в реакции Манниха с получением соединения 14-c. Метилирование обеспечило четвертичный амин 14-d. Последующие стадии аминирования и удаления защитной группы можно использовать для получения соединения 14. Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 22. Альтернативный синтез 5-метиламинометил-2-уридина (соединение 12) и 5-карбоксиметиламинометил-2-уридина (соединение 14)
Figure 00000168
В дополнение к стратегиям, предоставленным выше для соединений 12 и 14, также можно использовать следующую стратегию. 5-Метилуридин A можно подвергать силилированию с получением соединения B. После монобромирования радикала полученное промежуточное соединение бромид C можно использовать для удаления защитной группы из аналогов соединения 12 и соединения 14. Затем алкиламинирование бромидного соединения C может обеспечить соединения D и E, из которых можно удалять защитную группу с получением соединений 14 и 12, соответственно. Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 23. Синтез диметилпсевдоуридина (соединение 15) и диметилпсевдо-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000169
Нуклеозиды можно фосфорилировать любым пригодным способом. Например, как показано выше, нуклеозиды можно подвергать реакции с оксихлоридом фосфора, а затем обрабатывать монофосфатным промежуточным соединением с бис(трибутиламмоний)пирофосфатом (TBAPP) с получением трифосфата.
Пример 24. Синтез 2’-C-метиладенозина (соединение 16) и 2’-C-метил ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000170
Приблизительно 5 г соединения 16-2 получали из 5 г соединения 16-1 через реакцию с перйодинаном Десс-Мартина. Соединение 16-2 подвергали реакции с MeMgI/TiCl4/-78°C с получением соединения 16-3, и неочищенное соединение 16-3 (6 г) прямо подвергали реакции с бензилхлоридом с получением соединения 16-4. Реакция с основанием нуклеиновой кислоты и удаление защитной группы обеспечили соединение 16 (0,56 г).
Пример 25. Синтез изомеров 2’-C-метилцитидина (соединение 17 и соединение 18) и 2’-C-метил UTP (NTP указанных соединений)
Figure 00000171
Приблизительно 17,4 г соединения 17-3 получали из 20 г соединения 17-1. Затем 2’-окисление и алкилирование MeMgI обеспечило 300 мг соединения 17-5a и 80 мг соединения 17-5b. Приблизительно 9 г соединения 17-5a (приблизительно на 90% чистое) и 2,1 г соединения 17-5b (чистое) получали из 17,4 г соединения 17-3 в 2 партиях. Удаление N- и O-защитных групп обеспечило соединения 17 и 18.
Пример 26. Синтез 2’-C-метилгуанозина (соединение 19) и 2’-C-метил GTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000172
2’-Окисление защищенной рибозы 19-1 и последующее алкилирование посредством MeMgCl обеспечило соединение 19-3. В полученное соединение далее вносили защитную группу с получением соединения 19-4, и из 3,1 г соединения 19-4 получали 1,56 г соединения 19-5a. Последующее йодирование и удаление защитной группы обеспечило соединение 19 (приблизительно на 90% чистое, 50 мг).
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 27. Синтез 2’-C-метилуридина (соединение 20) и 2’-C-метил UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000173
2’-Окисление защищенной рибозы 20-1 и последующее алкилирование посредством MeMgCl обеспечило соединение 20-3. В полученное соединение далее вносили защитную группу с получением соединения 20-4. Реакция с урацилом и удаление защитной группы обеспечили чистое соединение 20 (50 мг).
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 28. Синтез (S)-2’-C-метиладенозина (соединение 21) и (S)-2’-C-метил ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000174
Из соединения 21-1 (5 г) удаляли защитную группу с получением соединения 21-2a, и окисление хрома обеспечило соединение 21-3a. Алкилирование через путь [i] (5 экв. MeMgI в простом эфире при -50°C) обеспечило соединение 21-4. Необязательно, выход может быть улучшен через путь [ii] посредством защиты аминогруппы с получением соединения 21-3b, а затем алкилирования в положении 2’-C с получением соединения 21-4a. Соединение 21-3a алкилировали с получением неочищенного соединения 21-4 (3 г, 20% соединения 3a в этом неочищенном продукте), где продукт можно необязательно очищать. Удаление защитной группы из соединения 21-4 обеспечило соединение 21 (выход 50%).
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 29. Синтез (S)-2’-C-метилгуанозина (соединение 22) и (S)-2’-метил-GTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000175
Приблизительно 30 г соединения 22-1 подвергали силилированию с получением соединения 22-2 на трех стадиях. Дальнейшее внесение защитной группы обеспечило соединение 22-3, и окисление с перйодинаном Десс-Мартина обеспечило соединение 22-4 (1,6 г) в двух партиях. 2’-C алкилирование (5 экв. MeMgI в простом эфире, от -50°C до к.т.) обеспечило соединение 22-5, и последующие стадии удаления защитной обеспечили соединение 22.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 30. Синтез (S)-2’-C-метилуридина (соединение 23) и (S)-2’-C-метил-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000176
В уридин 23-1 (2,0 г) вносили защитную группу TIPDSCl2 (1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан) с получением соединения 23-2. Окисление обеспечило соединение 23-3, и 2’-C алкилирование обеспечило соединение 23-4, которое можно необязательно очищать с помощью препаративной ВЭЖХ перед следующей стадией. Затем удаление защитной группы обеспечило желаемое соединение 23.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 31. Синтез 4’-C-метиладенозина (соединение 24) и 4’-C-метил-ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000177
1,2:5,6-Ди-O-изопропилиден-α-D-глюкофуранозу 24-1 преобразовывали посредством последовательных стадий окисления, восстановления и внесения защитной группы с получением соединения 24-4. Первую стадию окисления с получением соединения 24-2 можно осуществлять с помощью любых подходящих реагентов, таких как 0,75 экв. дихромата пиридиния (PDC) с 1 экв. Ac2O или 1,2 экв. перйодинана Десс-Мартина. Последующее удаление защитной группы, формилирование и восстановление обеспечили соединение 24-7, после чего следовали стадии внесения защитной группы и деоксигенации с получением соединения 24-10. Посредством последовательных стадий внесения защитной группы и удаления защитной группы из 1 г соединения 24-10 получали приблизительно 0,4 г соединения 24-14. Присоединение N6-бензоиладенина и последующее удаление защитной группы обеспечили соединение 24.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 32. Синтез 4’-C-метилцитидина (соединение 25) и 4’-C-метил-CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000178
Аналогично стратегии, представленной выше для соединения 24, соединение 25-14 получали с соединением 25-1. Добавление цитидина и последующее удаление защитной группы обеспечили соединение 25.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 33. Синтез 4’-C-метилгуанозина (соединение 26) и 4’-C-метил-GTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000179
Аналогично стратегии, описанной выше для соединения 24, соединение 26-14 получали с соединением 26-1. Добавление 2-амино-6-хлорпурина, последующее окисление, а затем удаление защитной группы обеспечили соединение 26.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 34. Синтез 4’-C-метилуридина (соединение 27) и 4’-C-метил-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000180
Аналогично стратегии, описанной выше для соединения 24, соединение 27-14 получали с соединением 27-1. Добавление урацила и последующее удаление защитной группы обеспечили соединение 27.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 35. Синтез 2’-O,4’-C-метиленаденозина (соединение 28) и 2’-O,4’-C-метилен-ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000181
Аналогично стратегии, описанной выше для соединения 24, соединение 28-7 получали с соединением 28-1. Последующее мезилирование, удаление защитной группы и ацетилирование обеспечили соединение 28-10, после которых следовало добавление N6-бензоиладенина и последующая внутренняя циклизация. Различные стадии внесения защитной группы и удаления защитной группы обеспечили соединение 28.
Пример 36. Синтез 5-метил-2’-O,4’-C-метиленцитидина (соединение 29) и 5-метил-2’-O,4’-C-метилена-CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000182
Соединение альдофуранозы 29-1 подвергали реакции посредством различных стадий внесения защитной группы, и затем добавляли 5-метилурацил с получением соединения 29-5. Последующие стадии внутренней циклизации, удаления защитной группы, внесения защитной группы и аминирования обеспечили соединение 29.
Пример 37. Синтез 2’-O,4’-C-метиленгуанозина (соединение 30) и 2’-O,4’-C-метилен-GTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000183
Аналогично стратегии, описанной выше для соединения 29, соединение альдофуранозы 30-1 подвергали реакции посредством различных стадий внесения защитной группы, а затем добавляли 2-амино-6-хлорпурин с получением соединения 30-5. Последующие стадии внутренней циклизации, аминирования и удаления защитной группы обеспечили соединение 30.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 38. Синтез 2’-O,4’-C-метиленуридина (соединение 31) и 2’-O,4’-C-метилен-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000184
Аналогично стратегии, описанной выше для соединения 24, соединение 31-7 получали с соединением 31-1. Последующее мезилирование, удаление защитной группы и ацетилирование обеспечили соединение 30-10. Добавление урацила и последующая внутренняя циклизация обеспечили соединение 31-12, и различные стадии внесения защитной группы и удаления защитной группы обеспечили соединение 31. Последующая реакция с трифосфатом (например, как описано в настоящем описании) обеспечила NTP соединения 31, который можно необязательно очищать (например, посредством ВЭЖХ).
Пример 39. Синтез 2’-хлораденозина (соединение 32) и 2’-хлор ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000185
В арабиноаденозин 32-1 вносили защитную группу посредством стадий 1 и 2, а затем хлорировали с получением соединения 32-4. Последующее удаление защитной группы обеспечило соединение 32, и реакция с трифосфатом обеспечила NTP соединения 32.
Пример 40. Синтез 2’-йодаденозина (соединение 33) и 2’-йод-ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000186
В арабиноаденозин 33-1 вносили защитную группу посредством стадий 1 и 2, а затем йодировали с получением соединения 33-4. Последующее удаление защитной группы обеспечило соединение 33, и реакция с трифосфатом в DMF обеспечила NTP соединения 33.
Пример 41. Синтез 2’-бромцитидина (соединение 34) и 2’-бром CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000187
В арабиноцитидин 34-1 вносили защитную группу в различных условиях, а затем бромировали с получением соединения 34-4. Необязательно, реакция может обеспечить соединение 34-4 через соединение 34-3a в любых пригодных условиях внесения защитной группы, таких как (i) 1,5 экв. Et3N, 1 экв. DMAP, 1,2 экв. TfCl, в DCM (10 мл); (ii) 3 экв. DMAP, 1,2 экв. TfCl в DCM (15 мл); или (iii) 15 экв. DMAP, 1,5 экв. Tf2O, в DCM (15 мл) при от -10°C до 0°C в течение 2 часов. В частности, 55 мг соединения 34-3a получали в условиях реакции (iii). Последующее удаление защитной группы обеспечило соединение 34, и реакция с трифосфатом в DMF обеспечила NTP соединения 34. Неочищенный продукт 34 можно необязательно очищать перед фосфорилированием.
Пример 42. Синтез 2’-хлоргуанозин (соединение 35) и 2’-хлор GTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000188
В гуанозин 35-1 вносили защитную группу в различных условиях, а затем подвергали ацетилированию с получением соединения 35-4. Реакцию из соединения 35-2 в соединение 35-3 проводили с 2 экв. DMAP, 2 экв. Et3N, 3 экв. Tf2O в 1,2-дихлорэтане (10 мл) при 40°C в течение 4 часов. После очистки получали приблизительно 55 мг соединения 35-3.
Желаемое соединение 35 можно получать любым пригодным способом. Например, как показано выше, соединение 35-4 можно обрабатывать с последующими стадиями внесения защитной группы, хлорирования и удаления защитной группы с получением соединения 35. Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 43. Синтез 2’-йодуридина (соединение 36) и 2’-йод-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000189
В O2,2′-циклоуридин 36-1 вносили защитную группу с получением соединения 36-2. Последующее йодирование, необязательно опосредуемое селеном, обеспечило соединение 36. Реакцию с трифосфатом проводили для получения NTP соединения 36. Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 44. Синтез 2’-O,4’-C-метиленаденозина (соединение 37) и 2’-O,4’-C-метилен-ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000190
Аналогично стратегии, описанной выше для соединения 24, соединение 37-7 получали с соединением 37-1. Последующее мезилирование, удаление защитной группы и ацетилирование обеспечили соединение 37-10. Добавление урацила и последующая внутренняя циклизация обеспечили соединение 37-12. Различные стадии внесения защитной группы и удаления защитной группы обеспечили соединение 37.
Для получения соответствующего NTP можно проводить реакцию с трифосфатом (например, любым из описанных в настоящем описании). Необязательно, NTP можно очищать (например, с использованием колонки Sephadex DEAE-A25), лиофилизировать или упаривать (например, из EtOH).
Пример 45. Синтез циклопентендиолцитидина (соединение 38) и циклопентендиол-CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000191
В D-рибозу вносили защитную группу, а затем подвергали аллилированию с получением соединения 38-4, которое затем подвергали циклизации и восстанавливали с получением соединения 38-7. Обмен олефинов и последующее окисление обеспечили соединение 38-9, и последующие реакции восстановления и присоединения N-бензоилурацила обеспечили соединение 38-14. Дополнительные реакции внесения защитной группы и удаления защитной группы обеспечили соединение 38, и реакция с трифосфатом (например, в любых подходящих условиях реакции, таких как условия, описанные в настоящем описании или в патенте США № 7893227, включенном в настоящее описание в качестве ссылки) обеспечила NTP соединения 38.
Пример 46. Синтез 2’-метилуридина (соединение 39) и 2’-метил-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000192
В уридин 39-1 вносили защитную группу, а затем его окисляли с помощью 2 экв. перйодинана Десс-Мартина с получением соединения 39-3. Последующие стадии реакции Виттига, гидрогенизации и удаления защитной группы обеспечили соединение 39.
Пример 47. Синтез 2’-метилцитидина (соединение 40) и 2’-метил-CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000193
В цитидин 40-1 вносили защитную группу, а затем его окисляли с получением соединения 40-3. Последующие стадии реакции Виттига, гидрогенизации и удаления защитной группы обеспечили соединение 40.
Пример 48. Синтез N-ацетилцитидина (соединение 41) и N-ацетил-CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000194
Раствор N-ацетилцитидина (соединение 41) (103,0 мг, 0,36 ммоль) добавляли к протонной губке (115,72 мг, 0,54 ммоль, 1,50 экв.) в 1,0 мл триметилфосфата (TMP) и 1,0 мл безводного тетрагидрофурана (THF). Раствор перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (67,2 мкл, 0,72 ммоль, 2,0 экв.), а затем перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (1,28 г, 2,34 ммоль, 6,5 экв.) и трибутиламина (350,0 мкл, 1,45 ммоль, 4,0 экв.) в 2,5 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 24,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A в течение 3,0 мин, а затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 16,81-17,80 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 41. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 49. Синтез 5-метоксиуридина (соединение 42) и 5-метокси UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000195
Раствор 5-метоксиуридина (соединение 42) (69,0 мг, 0,25 ммоль, вместе с нагреванием для обеспечения его растворимости) добавляли к протонной губке (80,36 мг, 0,375 ммоль, 1,50 экв.) в 0,7 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (46,7 мкл, 0,50 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (894,60 мг, 1,63 ммоль, 6,50 экв.) и трибутиламина (243,0 мкл, 1,00 ммоль, 4,0 экв.) в 2,0 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 17,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A для 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 16,57-17,51 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 42. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 50. Синтез 5-формилцитидина (соединение 43) и 5-формил CTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000196
Раствор 5-формилцитидина (соединение 43) (48,4 мг, 0,18 ммоль, вместе с нагреванием, чтобы обеспечить его растворимость) добавляли к протонной губке (57,86 мг, 0,27 ммоль, 1,50 экв.) в 0,7 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (33,6 мкл, 0,36 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (642,0 мг, 1,17 ммоль, 6,50 экв.) и трибутиламина (175,0 мкл, 0,72 ммоль, 4,0 экв.) в 1,7 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 12,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A в течение 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 17,04-17,87 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 43. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 51. Синтез 3-метилуридина (соединение 44) и 3-метил UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000197
Раствор 3-метилуридина (соединение 44) (45,80 мг, 0,18 ммоль) добавляли к протонной губке (57,86 мг, 0,27 ммоль, 1,50 экв.) в 0,5 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (33,6 мкл, 0,36 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (652,0 мг, 1,19 ммоль, 6,60 экв.) и трибутиламина (175,0 мкл, 0,72 ммоль, 4,0 экв.) в 1,3 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 12,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A в течение 3,0 мин, а затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 18,52-19,57 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 44. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 52. Синтез N1-метилпсевдоуридина (соединение 45) и N1-метилпсевдо-UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000198
Раствор N1-метилпсевдоуридина (соединение 45) (96,6 мг, 0,374 ммоль, вместе с нагреванием, чтобы обеспечить его растворимость) добавляли к протонной губке (120,0 мг, 0,56 ммоль, 1,50 экв.) в 0,8 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (70,0 мкл, 0,75 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (1,36 г, 2,47 ммоль, 6,60 экв.) и трибутиламина (362,0 мкл, 1,5 ммоль, 4,0 экв.) в 2,5 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 17,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A для 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 15,91-17,01 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали и подвергали реакции трифосфорилирования с получением NTP соединения 45. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 53. Синтез 5-метоксикарбонилэтенилуридина (соединение 46) и 5-метоксикарбонилэтенил UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000199
Раствор 5-метоксикарбонилэтенилуридина (соединение 46) (102,0 мг, 0,31 ммоль) добавляли к протонной губке (99,65 мг, 0,46 ммоль, 1,50 экв.) в 0,8 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (57,8 мкл, 0,62 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (1,12 г, 2,05 моль, 6,60 экв.) и трибутиламина (300,0 мкл, 1,24 ммоль, 4,0 экв.) в 2,5 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 20,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A для 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 21,56-23,21 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 46. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 54. Синтез 5-аминопропенилуридина (соединение 47) и 5-аминопропенил UTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000200
В 5-аминопропенилуридин 47 вносили защитную группу и раствор с защищенным соединением 47 (86,0 мг, 0,22 ммоль) добавляли к протонной губке (70,7 мг, 0,33 ммоль, 1,50 экв.) в 0,7 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (41,1 мкл, 0,44 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (784,6 мг, 1,43 ммоль, 6,50 экв.) и трибутиламина (213,0 мкл, 0,88 ммоль, 4,0 экв.) в 1,6 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 15,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. К реакционной смеси добавляли 18,0 мл концентрированного гидроксида аммония для удаления трифторацетильной группы. Затем ее оставляли при перемешивании в течение ночи. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A в течение 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 16,14-17,02 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 47. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 55. Синтез N-PEG аденозина (соединение 48) и N-PEG ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000201
В N-PEG аденозин 48 вносили защитную группу, и раствор с защищенным соединением 48 (100,0 мг, 0,15 ммоль) добавляли к протонной губке (49,3 мг, 0,23 ммоль, 1,50 экв.) в 0,65 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (28,0 мкл, 0,3 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (537,7 мг, 0,98 ммоль, 6,50 экв.) и трибутиламина (146,0 мкл, 0,6 ммоль, 4,0 экв.) в 1,2 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 10,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. К реакционной смеси добавляли 18,0 мл концентрированного гидроксида аммония для удаления трифторацетильной группы. Затем ее оставляли при перемешивании в течение ночи. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A в течение 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 24,5-25,5 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 48. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 56. Синтез N-метиладенозина (соединение 49) и N-метил ATP (NTP указанного соединения)
Figure 00000202
Раствор N-метиладенозина (соединение 49) (70,0 мг, 0,25 ммоль) добавляли к протонной губке (79,29 мг, 0,37 ммоль, 1,50 экв.) в 0,7 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (46,66 мкл, 0,50 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (888,85 мг, 1,62 ммоль, 6,50 экв.) и трибутиламина (241,0 мкл, 1,0 ммоль, 4,0 экв.) в 1,3 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 16,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A в течение 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 19,62-20,14 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 49. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 57. Синтез N,N-диметилгуанозина (соединение 50) и N,N-диметил GTP (NTP указанного соединения)
Figure 00000203
Раствор N,N-диметилгуанозина (соединение 50) (65,8 мг, 0,21 ммоль) добавляли к протонной губке (68,58 мг, 0,32 ммоль, 1,50 экв.) в 0,7 мл триметилфосфата (TMP) и перемешивали в течение 10 минут при 0°C. К раствору капельно добавляли оксихлорид фосфора (POCl3) (39,20 мкл, 0,42 ммоль, 2,0 экв.), а затем его перемешивали в течение 2 часов в атмосфере N2. Через 2 часа раствор подвергали реакции со смесью пирофосфата бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) (751,67 мг, 1,37 ммоль, 6,50 экв.) и трибутиламина (204,0 мкл, 0,84 ммоль, 4,0 экв.) в 1,5 мл диметилформамида. Приблизительно через 15 минут реакцию гасили 14,0 мл 0,2 M бикарбоната триэтиламмония (TEAB), и прозрачный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь лиофилизировали в течение ночи, и неочищенную реакционную смесь очищали посредством ВЭЖХ (Shimadzu, Kyoto Japan, препаративная колонка Phenomenex C18, 250×21,20 мм, 10,0 микрон; градиент: 100% A в течение 3,0 мин, затем 1% B/мин, A = 100 мМ буфер TEAB, B = ACN; скорость потока: 10,0 мл/мин; время удержания: 19,27-19,95 мин). Фракции, содержавшие желаемое соединение, объединяли и лиофилизировали с получением NTP соединения 50. Реакции трифосфорилирования проводили в колбе с двумя горлышками, высушенной пламенем, в атмосфере N2. Нуклеозиды и протонную губку сушили над P2O5 в вакууме в течение ночи перед применением. Мониторинг образования монофосфатов проводили с помощью LCMS.
Пример 58. Общие способы синтеза трифосфатов NTP
Figure 00000204
Нуклеозид i можно фосфорилировать любым подходящим способом для получения соединения трифосфата ii. Например, нуклеозид можно добавлять к протонной губке и триметилфосфату (TMP) и охлаждать (например, до -40°C). Можно капельно добавлять оксихлорид фосфора (POCl3) перед реакцией с пирофосфатом бистрибутиламмония (TBAPP или (n-Bu3NH)2H2P2O7) и трибутиламином. Затем реакцию можно быстро гасить бикарбонатом триэтиламмония (TEAB). Иллюстративные условия представлены в патенте США № 7893227, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.
После реакции фосфорилирования реакционную смесь можно необязательно лиофилизировать, очищать (например, посредством ионообменной хроматографии и/или ВЭЖХ) или преобразовывать в соль натрия (например, путем растворения в MeOH и добавления перхлората натрия в ацетоне).
Пример 59: ПЦР для получения кДНК
Реакции ПЦР для получения кДНК проводят с использованием 2x KAPA HIFITM HotStart ReadyMix от Kapa Biosystems (Woburn, MA). Эта система включает 2x KAPA ReadyMix 12,5 мкл; прямой праймер (10 мкМ), 0,75 мкл; обратный праймер (10 мкМ), 0,75 мкл; кДНК-матрицу, 100 нг; и dH2O, разбавленную до 25,0 мкл. Условия реакции представляют собой 95°C в течение 5 мин и 25 циклов из 98°C в течение 20 сек, затем 58°C в течение 15 сек, затем 72°C в течение 45 сек, затем 72°C в течение 5 мин, а затем 4°C для терминации.
Обратный праймер по настоящему изобретению включает поли-T120 для поли-A120 в мРНК. Другие обратные праймеры с более длинными или более короткими участками поли-T можно использовать для корректирования длины поли-A-концевой части в мРНК.
Реакционнную смесь очищают с использованием набора Invitrogen’s PURELINKTM PCR Micro Kit (Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя (вплоть до 5 мкг). Для реакций большего объема требуется очистка с использованием продукта с большей производительностью. После очистки кДНК количественно определяют с использованием NanoDrop и анализируют с помощью агарозного гель-электрофореза для подтверждения того, что кДНК имеет ожидаемый размер. Затем кДНК подвергают анализу с использованием секвенирования, а затем подвергают реакции транскрипции in vitro.
Пример 60. Транскрипция in vitro (IVT)
Реакция транскрипции in vitro обеспечивает образование мРНК, содержащей модифицированные нуклеотиды или модифицированную РНК. Исходную смесь нуклеотидтрифосфатов (NTP) изготавливают в собственной лаборатории с использованием природных и неприродных NTP.
Типичная реакция транскрипции in vitro включает следующее:
Матричная кДНК 1,0 мкг
10x буфер для транскрипции (400 мМ Tris-HCl pH 8,0, 190 мМ MgCl2, 50 мМ DTT, 10 мМ спермидин) 2,0 мкл
Изготовленные NTP (по 25 мМ каждого) 7,2 мкл
Ингибитор РНКазы 20 Е
РНК-полимераза T7 3000 Е
dH20 вплоть до 20,0 мкл
Инкубация при 37°C в течение 3 ч-5 ч.
Неочищенную смесь IVT можно хранить при 4°C в течение ночи для очистки на следующие сутки. Затем 1 Е не содержащей РНКазы ДНКазы используют для расщепления исходной матрицы. После инкубации в течение 15 минут при 37°C, мРНК очищают с использованием набора Ambion’s MEGACLEARTM Kit (Austin, TX) в соответствии с инструкциями изготовителей. Этот набор может очищать вплоть до 500 мкг РНК. После очистки РНК количественно определяют с использованием NanoDrop и анализируют с помощью агарозного гель-электрофореза для подтверждения того, что РНК имеет надлежащий размер и что не произошло деградации РНК.
РНК-полимераза T7 может быть выбрана из РНК-полимеразы T7, РНК-полимеразы T3 и мутантных полимераз, таких как, но не ограничиваясь ими, новые полимеразы, способные включать модифицированные NTP, а также полимеразы, описанные Liu (Esvelt et al. (Nature (2011) 472(7344):499-503 и в публикации США № 20110177495), которые распознают различные промоторы, причем в Ellington (Chelliserrykattil and Ellington, Nature Biotechnology (2004) 22(9):1155-1160) описан вариант РНК-полимеразы T7 для транскрипции 2’-O-метил РНК, и Sousa (Padilla and Sousa, Nucleic Acids Research (2002) 30(24):e128), где описан двойной мутант РНК-полимеразы T7; включенные в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Пример 61. Ферментативное кэппирование мРНК
Кэппирование мРНК проводят следующим образом, где смесь включает: РНК IVT 60 мкг-180 мкг и dH20 вплоть до 72 мкл. Смесь инкубируют при 65°C в течение 5 минут для денатурации РНК, а затем ее сразу переносят на лед.
Затем протокол включает смешение 10x буфера для кэппирования (0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 60 мМ KCl, 12,5 мМ MgCl2) (10,0 мкл); 20 мМ GTP (5,0 мкл); 20 мМ S-аденозилметионина (2,5 мкл); ингибитора РНКаз (100 Е); 2′-O-метилтрансферазы (400 Е); кэппирующего фермента вируса коровьей оспы (гуанилилтрансфераза) (40 Е); dH20 (вплоть до 28 мкл); и инкубацию при 37°C в течение 30 минут для 60 мкг РНК или вплоть до 2 часов для 180 мкг РНК.
Затем мРНК очищают с использованием набора Ambion’s MEGACLEAR™ Kit (Austin, TX) в соответствии с инструкциями изготовителя. После очистки РНК количественно определяют с использованием NANODROPTM (ThermoFisher, Waltham, MA) и анализируют с помощью агарозного гель-электрофореза для подтверждения того, что РНК имеет надлежащий размер и что не произошло деградации РНК. Продукт РНК также можно секвенировать путем проведения ПЦР с обратной транскрипцией для получения кДНК для секвенирования.
Пример 62. Реакция присоединения поли-A-концевой части
Без поли-T в кДНК, реакцию присоединения поли-A-концевой части необходимо проводить до очистки конечного продукта. Это можно осуществлять путем смешения кэппированной РНК IVT (100 мкл); ингибитора РНКаз (20 Е); 10x буфера для присоединения концевой части (0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2,5 M NaCl, 100 мМ MgCl2)(12,0 мкл); 20 мМ ATP (6,0 мкл); поли-A-полимеразы (20 U); dH2O вплоть до 123,5 мкл и инкубации при 37°C в течение 30 мин. Если поли-A-концевая часть уже находится в транскрипте, тогда реакцию присоединения концевой части можно пропустить и перейти прямо к очистке с помощью набора Ambion’s MEGACLEAR™ kit (Austin, TX) (вплоть до 500 мкл). Предпочтительно поли-A-полимераза является рекомбинантным ферментом, экспрессируемым в дрожжах.
Для исследований, проведенных и описанных в настоящем описании, поли-A-концевую часть кодируют в матрице IVT так, чтобы она имела длину 160 нуклеотидов. Однако следует понимать, что процессивность или целостность реакции присоединения поли-A-концевой части может не всегда приводить точно к 160 нуклеотидам. Таким образом поли-A-концевые части размером приблизительно 160 нуклеотидов, например, приблизительно 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 или 165 нуклеотидов, находятся в объеме изобретения.
Пример 63. Способ скрининга экспрессии белка
A. Электрораспылительная ионизация
Биологический образец, который может содержать белки, кодируемые модифицированной РНК, введенной индивидууму, получают и анализируют в соответствии с протоколом изготовителя для электрораспылительной ионизации (ESI) с использованием 1, 2, 3 или 4 масс-анализаторов. Биологический образец также можно анализировать с использованием системы тандемной ESI масс-спектрометрии.
Профили белковых фрагментов или целых белков сравнивают с известными контролями для данного белка и определяют идентичность путем сравнения.
B. Лазерная десорбция/ионизация в присутствии матрицы
Биологический образец, который может содержать белки, кодируемые модифицированной РНК, введенной индивидууму, получают и анализируют в соответствии с протоколом изготовителя для лазерной десорбции/ионизации в присутствии матрицы (MALDI).
Профили белковых фрагментов или целых белков сравнивают с известными контролями для данного белка и определяют идентичность путем сравнения.
C. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия-масс-спектрометрия
Биологический образец, который может содержать белки, кодируемые модифицированной РНК, можно обрабатывать ферментом трипсином для расщепления белков, содержащихся в нем. Полученные пептиды анализируют жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией-масс-спектрометрей (LC/MS/MS). Пептиды фрагментируют в масс-спектрометре с получением диагностических профилей, которые можно сопоставлять с базами данных белковой последовательности через компьютерные алгоритмы. Расщепленный образец можно разбавлять для достижения 1 нг или менее исходного материала для данного белка. Биологические образцы, содержащие простую буферную основу (например воду или летучие соли), поддаются прямому расщеплению в растворе; более комплексные основы (например детергент, нелетучие соли, глицерин) требуют дополнительной стадии очистки для облегчения анализа образца.
Профили белковых фрагментов или целых белков сравнивают с известными контролями для данного белка и идентичность определяют путем сравнения.
Пример 64. Исследование цитокинов: PBMC
A. Выделение и культивирование PBMC
50 мл крови человека от двух доноров получали от Research Blood Components (партии KP30928 и KP30931) в пробирках с гепарином натрия. Для каждого донора кровь объединяли и разбавляли до 70 мл посредством DPBS (SAFC Bioscience 59331C, партия 071M8408) и разделяли равномерно между двумя 50-мл коническими пробирками. 10 мл Ficoll Paque (GE Healthcare 17-5442-03, партия 10074400) осторожно распределяли под слой крови. Пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 минут при низком ускорении и торможении. Пробирки извлекали, и слои лейкоцитарных пленок PBMC осторожно переносили в свежие 50-мл конические пробирки и промывали DPBS. Пробирки центрифугировали при 1450 об/мин в течение 10 минут.
Супернатант аспирировали, и осадки с PBMC ресуспендировали и промывали в 50 мл DPBS. Пробирки центрифугировали при 1250 об/мин в течение 10 минут. Эту стадию повторяли, и осадок с PBMC ресуспендировали в 19 мл Optimem I (Gibco 11058, партия 1072088) и подсчитывали. Суспензии клеток доводили до концентрации 3,0×10^6 клеток/мл живых клеток.
Затем эти клетки высевали на 96-луночные планшеты для культивирования ткани с круглым дном (Costar 3799) на донора в количестве 50 мкл на лунку. В пределах 30 минут в каждую лунку добавляли смеси для трансфекции в объеме 50 мкл на лунку. Через 4 часа после трансфекции среду дополняли 10 мкл эмбриональной телячьей сывороткой (Gibco 10082, партия 1012368).
B. Препарат для трансфекции
Модифицированную мРНК, кодирующую G-CSF человека (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть длиной приблизительно 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) (содержащая либо (1) природные NTP, (2) 100% замещение 5-метилцитидином и псевдоуридином, или (3) 100% замещение 5-метилцитидином и N1-метилпсевдоуридином; мРНК, кодирующую люциферазу (последовательность кДНК IVT, представленная в SEQ ID NO: 2; последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3, поли-A-концевая часть длиной приблизительно 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности, 5’-кэп, кэп 1, полностью модифицирована 5-метилцитозином в каждом остатке цитозина и заменой на псевдоуридин в каждом участке уридина) (содержащая либо (1) природные NTP, либо (2) 100% замену на 5-метилцитидин и псевдоуридин) и агонист TLR R848 (Invivogen tlrl-r848) разбавляли до 38,4 нг/мкл в конечном объеме 2500 мкл Optimem I.
Отдельно, 110 мкл Lipofectamine 2000 (Invitrogen 11668-027, партия 1070962) разбавляли 6,76 мл Optimem I. В 96-луночном планшете девять аликвот каждой мРНК по 135 мкл, положительный контроль (R-848) или отрицательный контроль (Optimem I) добавляли к 135 мкл разбавленного Lipofectamine 2000. Планшет, содержащий материал, подлежащий переносу, инкубировали в течение 20 минут. Затем смеси для трансфекции переносили в каждый из планшетов с PBMC человека в количестве 50 мкл на лунку. Затем планшеты инкубировали при 37°C. Через 2, 4, 8, 20 и 44 часа каждый планшет извлекали из инкубатора, и супернатанты замораживали.
После удаления последнего планшета супернатанты анализировали с использованием набора для ELISA для G-CSF человека (Invitrogen KHC2032) и набора для ELISA для IFN-альфа человека (Thermo Scientific 41105-2). Каждые условия исследовали в двух экземплярах.
C. Анализ белка и врожденного иммунного ответа
Оценивали способность немодифицированной и модифицированной мРНК продуцировать кодируемый белок (продукция G-CSF) с течением времени, а также способность мРНК запускать распознавание врожденным иммунитетом при измерении по продукции интерферона-альфа. Использование культур PBMC in vitro является общепризнанным способом измерения иммуностимулирующего потенциала олигонуклеотидов (Robbins et al., Oligonucleotides 2009 19:89-102).
Результаты интерполировали относительно стандартной кривой для каждого планшета для ELISA с использованием четырехпараметрической аппроксимации логистической кривой. В таблицах 4 и 5 представлено среднее значение для 3 отдельных доноров PBMC продукции G-CSF, интерферона-альфа (IFN-альфа) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа) с течением времени при измерении с помощью специфического для них ELISA.
В ELISA для G-CSF, для каждого момента времени вычитали фоновый сигнал для условий без обработки Lipofectamine 2000 (LF2000). Данные продемонстрировали, что специфическая продукция белка G-CSF человека мононуклеарными клетками периферической крови человека наблюдается в случае мРНК G-CSF, содержащей природные NTP, 100% замену на 5-метилцитидин и псевдоуридин, или 100% замену на 5-метилцитидин и N1-метилпсевдоуридин. Продукция G-CSF была значительно увеличена при использовании мРНК, модифицированной 5-метилцитидином и N1-метилпсевдоуридином, относительно мРНК, модифицированной 5-метилцитидином и псевдоуридином мРНК.
Что касается распознавания врожденным иммунитетом, хотя обе модифицированные химические структуры мРНК в большой степени препятствовали продукции IFN-альфа и TNF-альфа относительно положительных контролей (R848, p(I)p(C)), не существовало значимых отличий между этими химическими структурами. Модифицированная 5-метилцитидином и псевдоуридином мРНК приводила к низким, но поддающимся обнаружению уровням продукции IFN-альфа и TNF-альфа, в то время как модифицированная 5-метилцитидином и N1-метилпсевдоуридином мРНК приводила к отсутствию поддающейся обнаружению продукции IFN-альфа и TNF-альфа.
Следовательно, было определено, что, в дополнение к необходимости рассмотрения более одного цитокина-маркера активации врожденного иммунного ответа, неожиданно было обнаружено, что комбинации модификаций обеспечивают различные уровни клеточного ответа (продукция белка и активация иммунной системы). Было показано, что модификация N1-метилпсевдоуридином обеспечивает дополнительную защиту относительно стандартной комбинации 5-метилцитидин/псевдоуридин, исследованную другими исследователями, обеспечивая в два раза большее количество белка и снижение активации иммунной системы практически в 150 раз (TNF-альфа).
Учитывая, что PBMC содержат большой набор сигнализаторов распознавания РНК врожденным иммунитетом и также способны к трансляции белка, они обеспечивают пригодную систему для исследования взаимозависимости этих двух каскадов. Известно, что на трансляцию мРНК может отрицательно влиять активация таких каскадов врожденного иммунитета (Kariko et al. Immunity (2005) 23:165-175; Warren et al. Cell Stem Cell (2010) 7:618-630). С использованием PBMC в качестве системы для анализа in vitro можно установить корреляцию между трансляцией (в этом случае продукцией белка G-CSF) и продукцией цитокинов (в этом случае иллюстрируемой продукцией белков IFN-альфа и TNF-альфа). Лучшая продукция белка коррелирует с более низкой индукцией каскада активации врожденного иммунитета, и исходя из этого соотношения новые химические структуры можно оценивать положительно (таблица 6).
В этом исследовании соотношение PC для двух химических модификаций: псевдоуридина и N1-метилпсевдоуридина, в обоих случаях с 5-метилцитозином, составляло 4742/141=34 по сравнению с 9944/1=9944 для цитокина IFN-альфа. Для цитокина TNF-альфа эти две химические структуры имели соотношения PC 153 и 1243, соответственно, что указывает на то, что для любого цитокина N1-метилпсевдоуридин является лучшей модификацией. В таблицах 4 и 5 "NT" означает "не исследовали".
Таблица 4
G-CSF
G-CSF: среднее значение для 3 доноров (пг/мл)
G-CSF
5-метил цитозин/псевдоуридин		 4742
G-CSF
5-метилцитозин/
N1-метилпсевдоуридин		 9944
Люцифераза 18
LF2000 16
Таблица 5
IFN-альфа и TNF-альфа
IFN-альфа: среднее значение для 3 доноров (пг/мл) TNF-альфа: среднее значение для 3 доноров (пг/мл)
G-CSF
5-метилцитозин/
псевдоуридин		 141 31
G-CSF
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин		 1 8
P(I)P(C) 1104 NT
R-848 NT 1477
LF2000 17 25
Таблица 6
Соотношение G-CSF и цитокинов
G-CSF/IFN-альфа (соотношение) G-CSF/TNF-альфа (соотношение)
5-метил цитозин/
псевдо-уридин 		5-метилцитозин/
N1-метилпсевдо-уридин 		5-метил цитозин/
псевдо-уридин 		5-метил-цитозин/N1-метилпсевдо-уридин
Соотношение PC 34 9944 153 1243
Пример 65. Диапазоны химических модификаций модифицированной мРНК
Было показано, что модифицированные нуклеозиды, такие как, но не ограничиваясь ими, химические модификации 5-метилцитозина и псевдоуридина снижают врожденный иммунный ответ и увеличивают экспрессию РНК в клетках млекопитающих. Неожиданно и ранее неизвестно, что эффекты этих химических модификаций могут варьировать, когда уровень химической модификации конкретного нуклеотида составляет менее 100%. Ранее полагали, что польза от химической модификации может быть получена с использованием менее чем полной замены модифицированным нуклеозидом и в опубликованных отчетах отсутствуют указания на утрату пользы до тех пор, пока уровень замещения модифицированным нуклеозидом не составит менее 50% (Kariko et al., Immunity (2005) 23:165-175).
Однако теперь было показано, что польза от химической модификации прямо коррелирует со степенью химической модификации, и ее необходимо рассматривать с учетом более чем одного показателя иммунного ответа. Такая польза включает усиленную продукцию белка или трансляцию мРНК и снижение или устранение стимуляции врожденного иммунного ответа при измерении по профилям цитокинов и показателям индуцирующих факторов иммунного ответа.
Усиленную трансляцию мРНК и снижение или отсутствие стимуляции врожденного иммунитета наблюдают в случае 100% замены модифицированным нуклеозидом. Меньшие проценты замещения приводят к меньшей трансляции и большей стимуляции врожденного иммунитета, причем немодифицированная мРНК демонстрирует более низкую трансляцию и более высокую стимуляцию врожденного иммунитета.
Исследования на PBMC in vitro : Процентная модификация
480 нг мРНК G-CSF, модифицированной 5-метилцитозином (5mC) и псевдоуридином (псевдо-U), или немодифицированной мРНК G-CSF трансфицировали с 0,4 мкл Lipofectamine 2000 в мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от трех здоровых доноров крови (D1, D2 и D3). мРНК G-CSF (SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) была полностью модифицирована 5mC и псевдо-U (100% модификация), не модифицирована 5mC и псевдо-U (0% модификация) или была частично модифицирована 5mC и псевдо-U так, чтобы мРНК содержала 75% модификацию, 50% модификацию или 25% модификацию. Контрольный образец люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная посредством 5meC и псевдоU) также анализировали в отношении экспрессии G-CSF. Для TNF-альфа и IFN-альфа также анализировали контрольные образцы из Lipofectamine 2000, LPS, R-848, люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная 5mC и псевдо-U) и P(I)P(C). Супернатант собирали и анализировали с помощью ELISA через 22 часа после трансфекции для определения экспрессии белка. Экспрессия G-CSF представлена в таблице 7, и экспрессия IFN-альфа и TNF-альфа представлена в таблице 8. Экспрессия IFN-альфа и TNF-альфа может быть вторичным эффектом трансфекции мРНК G-CSF. В таблицах 7, 8 и на фиг.10 показано, что уровень химической модификации G-CSF, интерферона альфа (IFN-альфа) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа) варьирует, когда мРНК не полностью модифицирована и тенденция к варьированию не была одинаковой для каждой мишени.
Как упоминалось выше, с использованием PBMC в качестве системы для анализа in vitro можно установить корреляцию между трансляцией (в этом случае продукции белка G-CSF) и продукцией цитокинов (в этом случае иллюстрируемой продукцией белка IFN-альфа). Лучшая продукция белка коррелирует с более низкой индукцией каскада активации врожденного иммунитета, и, исходя из этого соотношения, процентную модификацию химической структуры можно оценивать положительно (таблица 9). Как вычислено из таблиц 7 и 8 и показано в таблице 9, полная модификация на 5-метилцитидин и псевдоуридин демонстрирует значительно лучшее соотношение продукции белок/цитокин, чем без какой-либо модификации (природная мРНК G-CSF) (в 100 раз для IFN-альфа и в 27 раз для TNF-альфа). Частичная модификация демонстрирует линейную взаимосвязь с меньшей модификацией, обеспечивающей более низкое соотношение белок/цитокин.
Таблица 7
Экспрессия G-CSF
Экспрессия G-CSF (пг/мл)
D1 D2 D3
100% модификация 1968,9 2595,6 2835,7
75% модификация 566,7 631,4 659,5
50% модификация 188,9 187,2 191,9
25% модификация 139,3 126,9 102,0
0% модификация 194,8 182,0 183,3
Люцифераза 90,2 0,0 22,1
Таблица 8
Экспрессия IFN-альфа и TNF-альфа
Экспрессия IFN-альфа (пг/мл) Экспрессия TNF-альфа (пг/мл)
D1 D2 D3 D1 D2 D3
100% модификация 336,5 78,0 46,4 115,0 15,0 11,1
75% модификация 339,6 107,6 160,9 107,4 21,7 11,8
50% модификация 478,9 261,1 389,7 49,6 24,1 10,4
25% модификация 564,3 400,4 670,7 85,6 26,6 19,8
0% модификация 1421,6 810,5 1260,5 154,6 96,8 45,9
LPS 0,0 0,6 0,0 0,0 12,6 4,3
R-848 0,5 3,0 14,1 655,2 989,9 420,4
P(I)P(C) 130,8 297,1 585,2 765,8 2362,7 1874,4
Только липид 1952,2 866,6 855,8 248,5 82,0 60,7
Таблица 9
Соотношение PC и эффект процента модификации
%
Моди-фика-
ция 		Среднее значение
G-CSF (пг/мл) 		Среднее значение
IFN-a (пг/мл) 		Среднее значение
TNF-a
(пг/мл) 		G-CSF/IFN-
альфа
(соотно-
шение PC) 		G-CSF/TNF-альфа
(соотно-
шение PC)
100 2466 153 47 16 52
75 619 202 47 3,1 13
50 189 376 28 0,5 6,8
25 122 545 44 0,2 2,8
0 186 1164 99 0,16 1,9
Пример 66. Модифицированная РНК, трансфицированная в PBMC
500 нг мРНК G-CSF, модифицированной 5-метилцитозином (5mC) и псевдоуридином (псевдо-U), или немодифицированной мРНК G-CSF трансфицировали с 0,4 мкл Lipofectamine 2000 в мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от трех нормальных доноров крови (D1, D2 и D3). мРНК G-CSF (SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) была полностью модифицирована 5mC и псевдо-U (100% модификация), не модифицирована 5mC и псевдо-U (0% модификация) или частично модифицирована 5mC и псевдо-U так, чтобы мРНК содержала 50% модификацию, 25% модификацию, 10% модификацию, 5% модификацию, 1% модификацию или 0,1% модификацию. Контрольный образец mCherry (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 6; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная 5meC и псевдоуридином) и G-CSF, полностью модифицированный 5-метилцитозином и псевдоуридином (контроль G-CSF), также анализировали в отношении экспрессии G-CSF. Для фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа) и интерферона-альфа (IFN-альфа) также анализировали контрольные образцы из Lipofectamine 2000, LPS, R-848, люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная 5mC и псевдо-U) и P(I)P(C). Супернатант собирали через 6 часов и 18 часов после трансфекции и анализировали с помощью ELISA для определения экспрессии белка. Экспрессия G-CSF, IFN-альфа и TNF-альфа для донора 1 представлена в таблице 10, для донора 2 представлена в таблице 11 и для донора 3 представлена в таблице 12.
Полная 100% модификация 5-метилцитидином и псевдоуридином приводила к наибольшей трансляции белка (G-CSF) и наименьшее количество цитокина продуцировалось у всех трех доноров PBMC человека. Снижение уровней модификации приводит к большей продукции цитокинов (IFN-альфа и TNF-альфа), таким образом, далее подчеркивая важность полной модификации для снижения уровня цитокинов и для увеличения трансляции белка (о чем свидетельствует в данном случае продукция G-CSF).
Таблица 10
Донор 1
G-CSF (пг/мл) IFN-альфа (пг/мл) TNF-альфа (пг/мл)
6 часов 18 часов 6 часов 18 часов 6 часов 18 часов
100% модификация 1815 2224 1 13 0 0
75% модификация 591 614 0 89 0 0
50% модификация 172 147 0 193 0 0
25% модификация 111 92 2 219 0 0
10% модификация 138 138 7 536 18 0
1% модификация 199 214 9 660 18 3
0,1% модификация 222 208 10 597 0 6
0% модификация 273 299 10 501 10 0
Контрольный G-CSF 957 1274 3 123 18633 1620
mCherry 0 0 0 10 0 0
Без обработки N/A N/A 0 0 1 1
Таблица 11
Донор 2
G-CSF (пг/мл) IFN-альфа (пг/мл) TNF-альфа (пг/мл)
6 часов 18 часов 6 часов 18 часов 6 часов 18 часов
100% Модификация 2184 2432 0 7 0 11
75% Модификация 935 958 3 130 0 0
50% Модификация 192 253 2 625 7 23
25% Модификация 153 158 7 464 6 6
10% Модификация 203 223 25 700 22 39
1% Модификация 288 275 27 962 51 66
0,1% Модификация 318 288 33 635 28 5
0% Модификация 389 413 26 748 1 253
Контрольный G-CSF 1461 1634 1 59 481 814
mCherry 0 7 0 1 0 0
Без обработки N/A N/A 1 0 0 0
Таблица 12
Донор 3
G-CSF (пг/мл) IFN-альфа (пг/мл) TNF-альфа (пг/мл)
6 часов 18 часов 6 часов 18 часов 6 часов 18 часов
100% Модификация 6086 7549 7 658 11 11
75% Модификация 2479 2378 23 752 4 35
50% Модификация 667 774 24 896 22 18
25% Модификация 480 541 57 1557 43 115
10% Модификация 838 956 159 2755 144 123
1% Модификация 1108 1197 235 3415 88 270
0,1% Модификация 1338 1177 191 2873 37 363
0% Модификация 1463 1666 215 3793 74 429
Контрольный G-CSF 3272 3603 16 1557 731 9066
mCherry 0 0 2 645 0 0
Без обработки N/A N/A 1 1 0 8
Пример 67. Скрининг модификации с помощью обратных мутаций способом Microames
Уровень техники и способы
Скрининг Microames является версией полного анализа с предварительной инкубацией Ames. Он обнаруживает как мутации со сдвигом рамки считывания, так и мутации с заменой пар оснований, с использованием четырех тестовых штаммов Salmonella (TA97a, TA98, TA100 и TA1535) и одного штамма Escherichia coli (WP2 uvrA pKM101). Штаммы TA97a и TA98 обнаруживают мутации со сдвигом рамки считывания, и TA100, TA1535 и WP2 uvrA pKM101 обнаруживают мутации с заменой пар оснований. В этом испытании Ames уменьшенного масштаба используется минимальное количество соединения, его проводят с метаболической активацией или без нее (фракция S9), и в нем используются многолуночные планшеты. Это испытание представляет собой анализ с помощью микробов для обнаружения мутагенного потенциала исследуемых соединений.
Скрининг microAmes для исследуемых образцов с 5-метилцитидином, псевдоуридином или N’-метилпсевдоуридином исследовали в двух экземплярах со штаммами TA97a, TA98, TA100, TA1535 и WP2 uvrA pKM101 в присутствии и в отсутствие системы метаболической активации (фракция микросом индуцированных печени крысы S9 AROCLORTM 1254) в количестве 0,25, 2,5, 12,5, 25, 75 и 250 мкг/лунка. Соединения положительного контроля использовали в 4 различных концентрациях для обеспечения того, что система анализа является чувствительной к известным мутагенным соединениям. DMSO использовали в качестве контроля в виде носителя. Положительный контроль и контроль в виде носителя дали ожидаемые результаты, что демонстрирует, что скрининг microAmes является достаточно чувствительным для обнаружения мутагенов.
Результаты
В случае 5-метилцитозина преципитатов не наблюдали в случае какого-либо тестового штамма как с метаболической активацией, так и без нее. Цитотоксичности (уменьшение фонового "газона" и/или количества ревертантов) не наблюдали ни для какого штамма, как с метаболической активацией, так и без нее. Не было увеличения количества колоний ревертантов по сравнению с контролем в виде носителя ни в одном штамме с метаболической активацией или без нее. Таким образом, 5-метилцитидин не был мутагенным вплоть до 250 мкг/лунка в штаммах TA97a, TA98, TA100, TA1535 и WP2 uvrA pKM101 с метаболической активацией или без нее в условиях скрининга microAmes.
В случае псевдоуридина преципитатов не наблюдали ни для какого тестового штамма, как с метаболической активацией, так и без нее. Цитотоксичность (уменьшение количества ревертантов) наблюдали для штамма TA100 без метаболической активации. Цитотоксичности (уменьшение фонового "газона" и/или количества ревертантов) не наблюдали ни для какого другого штамма, как с метаболической активацией, так и без нее. Не было увеличения количества колоний ревертантов по сравнению с контролем в виде носителя ни в одном штамме с метаболической активацией или без нее. Таким образом, псевдоуридин не был мутагенным в количестве вплоть до 75 мкг/лунка в штамме TA100 без метаболической активации и вплоть до 250 мкг/лунка в штаммах TA97a, TA98, TA1535 и WP2 uvrA pKM101 с метаболической активацией или без нее и в штамме TA100 без метаболической активации в условиях этого скрининга microAmes.
В случае модификации N1-метилпсевдоуридином, преципитатов не наблюдали ни для какого тестового штамма с метаболической активацией или без нее. Цитотоксичности (уменьшение фонового "газона" и/или количества ревертантов) не наблюдали ни в одном штамме, как с метаболической активацией, так и без нее. Не было увеличения количества колоний ревертантов по сравнению с каким-либо контролем в виде носителя ни в одном штамме с метаболической активацией или без нее. N1-метилпсевдоуридин не был мутагенным в количестве вплоть до 250 мкг/лунка в штаммах TA97a, TA98, TA100, TA1535 и WP2 uvrA pKM101 с метаболической активацией или без нее в условиях этого скрининга microAmes. Было обнаружено, что N1-метилпсевдоуридин является менее мутагенным, чем псевдоуридин.
Сравнение в этом испытании microAMES 5-метилцитидина, псевдоуридина и N1-метилпсевдоуридина показало, что они в основном являются немутагенными. Однако особый интерес представляло различие между псевдоуридином и N1-метилпсевдоуридином, где псевдоуридин продемонстрировал цитотоксический ответ в одном бактериальном штамме, в котором N1-метилпсевдоуридин не продемонстрировал. Эти испытания microAMES регулярно используют в качестве части доклинической оценки безопасности соединения, и они подчеркивают важное отличие между N1-метилпсевдоуридином и псевдоуридином.
Пример 68. Токсичность нуклеозидтрифосфатов (NTP)
Цитотоксичность природных и модифицированных нуклеозидтрифосфатов (NTP), отдельно или в комбинации с другими основаниями, анализировали в клетках почки эмбриона человека 293 (HEK293) в отсутствие реагента для трансфекции. Клетки HEK293 высевали на 96-луночные планшеты при плотности 30000 клеток на лунку, имеющие 0,75 мкл RNAiMAXTM (Invitrogen, Carlsbad, CA) на лунку в общем объеме лунки 100 мкл. 10 мкл NTP, приведенных в таблице 12, комбинировали с 10 мкл разведения липида и инкубировали в течение 30 минут для формирования комплекса, а затем к комплексу NTP добавляли 80 мкл суспензии клеток HEK293.
Природные и модифицированные NTP трансфицировали в концентрации 2,1 нМ, 21 нМ, 210 нМ, 2,1 мкМ, 21 мкМ, 210 мкМ или 2,1 мМ. NTP в комбинации трансфицировали в общей концентрации NTP 8,4 нМ, 84 нМ, 840 нМ, 8,4 мкМ, 84 мкМ, 840 мкМ и 8,4 мМ. В качестве контроля модифицированную мРНК G-CSF (SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная 5-метилцитозином и псевдоуридином) трансфицировали в клетки HEK293 в концентрации 8,4 нМ. Цитотоксичность NTP и модифицированной мРНК G-CSF анализировали через 4, 24, 48 и 72 часа после добавления клеток HEK293 с использованием анализа CYTO TOX-GLOTM от Promega (Madison, WI) в соответствии с протоколом изготовителя, за исключением того, что вместо встряхивания планшетов для лизиса клеток использовали пипетирование.
В таблице 13 и 14 показан процент жизнеспособных клеток для каждого из исследованных NTP, комбинаций NTP и контролей. Не наблюдали токсичности в случае индивидуальных NTP по сравнению с необработанными клетками. Эти данные демонстрируют, что введение индивидуальных NTP, включая 5-метилцитидин, псевдоуридин и N1-метилпсевдоуридин, в клетки млекопитающих не является токсичным в дозах, в 1000000 раз превышающих эффективную дозу при введении в качестве модифицированной мРНК.
Таблица 13
Цитотоксичность индивидуальных NTP
Цитотоксичность индивидуальных NTP
Время Доза
2,1 мМ 210 мкМ 21 мкМ 2,1 мкМ 210 нМ 21 нМ 2,1 нМ
Аденин 4 ч 90,03 85,97 91,20 90,23 90,36 93,21 93,48
24 ч 88,42 87,31 86,86 86,81 86,94 87,19 86,44
48 ч 93,71 90,55 89,94 89,80 89,17 91,13 92,12
72 ч 97,49 94,81 93,83 94,58 92,22 93,88 95,74
Цитозин 4 ч 90,51 89,88 91,41 90,49 88,95 93,11 93,34
24 ч 86,92 86,33 85,72 86,70 86,12 86,16 85,78
48 ч 94,23 87,81 87,28 87,73 85,36 88,95 88,99
72 ч 97,15 92,34 92,22 88,93 88,22 91,80 94,22
Гуанин 4 ч 90,96 90,14 91,36 90,60 90,00 92,84 93,33
24 ч 86,37 85,86 85,93 86,13 86,35 85,50 85,41
48 ч 93,83 87,05 88,18 87,89 85,31 87,92 89,57
72 ч 97,04 91,41 92,39 92,30 92,19 92,55 93,72
Урацил 4 ч 90,97 89,60 91,95 90,90 91,05 92,90 93,15
24 ч 87,68 86,48 85,89 86,75 86,52 87,23 87,63
48 ч 94,39 88,98 89,11 89,44 88,33 88,89 91,28
72 ч 96,82 93,45 93,63 94,60 94,50 94,53 95,51
Псевдоуридин 4 ч 92,09 92,37 91,35 92,02 92,84 91,96 92,26
24 ч 88,38 86,68 86,05 86,75 85,91 87,59 87,31
48 ч 88,62 87,79 87,73 87,66 87,82 89,03 91,99
72 ч 96,87 89,82 94,23 93,54 92,37 94,26 94,25
5-метилцитозин 4 ч 92,01 91,54 91,16 91,31 92,31 91,40 92,23
24 ч 87,97 85,76 84,72 85,14 84,71 86,37 86,35
48 ч 87,29 85,94 85,74 86,18 86,44 87,10 88,18
72 ч 96,08 88,10 92,26 90,92 89,97 92,10 91,93
N1-метилпсевдо-уридин 4 ч 92,45 91,43 91,48 90,41 92,15 91,44 91,89
24 ч 88,92 86,48 85,17 85,72 85,89 86,85 87,79
48 ч 89,84 86,02 87,52 85,85 87,38 86,72 87,81
72 ч 96,80 93,03 93,83 92,25 92,40 92,84 92,98
Без обработки 4 ч 92,77 -- -- -- -- -- --
24 ч 87,52 -- -- -- -- -- --
48 ч 92,95 -- -- -- -- -- --
72 ч 96,97 -- -- -- -- -- --
Таблица 14
Цитотоксичность NTP в комбинации
Цитотоксичность комбинации NTP
Время Доза
8,4 мМ 840 мкМ 84 мкМ 8,4 мкМ 840 нМ 84 нМ 8,4 нМ
Псевдоуридин/5-метил-цитозин/Аденин/
Гуанин 		4 ч 92,27 92,04 91,47 90,86 90,87 91,10 91,50
24 ч 88,51 86,90 86,43 88,15 88,46 86,28 87,51
48 ч 88,30 87,36 88,58 88,13 87,39 88,72 90,55
72 ч 96,53 94,42 94,31 94,53 94,38 94,36 93,65
N1-метилпсевдоуридин/5-метилцитозин/
Аденин/Гуанин 		4 ч 92,31 91,71 91,36 91,15 91,30 90,86 91,38
24 ч 88,19 87,07 86,46 87,70 88,13 85,30 87,21
48 ч 87,17 86,53 87,51 85,85 84,69 87,73 86,79
72 ч 96,40 94,88 94,40 93,65 94,82 92,72 93,10
модифици-рованная мРНК G-CSF 4 ч na na na na na na 92,63
24 ч na na na na na na 87,53
48 ч na na na na na na 91,70
72 ч na na na na na na 96,36
Пример 69. Исследование врожденного иммунного ответа в фибробластах BJ
Первичные фибробласты крайней плоти человека (BJ fibroblasts) получали от American Type Culture Collection (ATCC) (каталожный номер # CRL-2522) и выращивали в минимальной эссенциальной среде Игла (ATCC, каталожный номер # 30-2003), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой при 37°C в 5% CO2. Фибробласты BJ высевали на 24-луночный планшет при плотности 300000 клеток на лунку в 0,5 мл культуральной среды. 250 нг модифицированной мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной 5-метилцитозином и псевдоуридином (Gen1) или полностью модифицированной 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином (Gen2), имеющей кэп 0, кэп 1 или не имеющей кэпа, трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, каталожный номер #11668-019) в соответствии с протоколом изготовителя. Также трансфицировали контрольные образы из поли I:C (PIC), Lipofectamine 2000 (Lipo), природной люциферазы мРНК (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) и природной мРНК G-CSF. Через 18 часов клетки собирали, тотальную РНК выделяли и обрабатывали DNASE® с использованием набора RNeasy micro kit (каталожный номер #74004) в соответствии с протоколом изготовителя. 100 нг тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с использованием набора для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК (каталожный номер #4368814) в соответствии с протоколом изготовителя. Затем кДНК анализировали в отношении экспрессии генов врожденного иммунного ответа посредством количественной ПЦР в реальном времени с использованием SybrGreen на устройстве Biorad CFX 384 в соответствии с протоколом изготовителя. В таблице 15 представлен уровень экспрессии транскриптов генов врожденного иммунного ответа относительно гена домашнего хозяйства HPRT (гипоксантинфосфорибозилтрансфераза), и он выражен в качестве кратной индукции относительно HPRT. В таблице панель стандартных показателей включает: RIG-I представляет собой индуцируемый ретиноевой кислотой ген 1, IL6 представляет собой интерлейкин-6, OAS-1 представляет собой олигоаденилатсинтетазу 1, IFNb представляет собой интерферон-бета, AIM2 представляет собой отсутствующий в меланоме-2, IFIT-1 представляет собой индуцируемый интерфероном белок с тетратрикопептидными повторами 1, PKR представляет собой протеинкиназу R, TNFa представляет собой фактор некроза опухоли альфа, и IFNa представляет собой интерферон альфа.
Таблица 15
Уровни транскриптов генов врожденного иммунного ответа
Состав RIG-I IL6 OAS-1 IFNb AIM2 IFIT-1 PKR TNFa IFNa
Природная Люцифераза 71,5 20,6 20,778 11,404 0,251 151,218 16,001 0,526 0,067
Природный G-CSF 73,3 47,1 19,359 13,615 0,264 142,011 11,667 1,185 0,153
PIC 30,0 2,8 8,628 1,523 0,100 71,914 10,326 0,264 0,063
G-CSF ген 1-UC 0,81 0,22 0,080 0,009 0,008 2,220 1,592 0,090 0,027
G-CSF Gen1-Cap0 0,54 0,26 0,042 0,005 0,008 1,314 1,568 0,088 0,038
G-CSF ген 1-кэп 1 0,58 0,30 0,035 0,007 0,006 1,510 1,371 0,090 0,040
G-CSF ген 2-UC 0,21 0,20 0,002 0,007 0,007 0,603 0,969 0,129 0,005
G-CSF ген 2-кэп 0 0,23 0,21 0,002 0,0014 0,007 0,648 1,547 0,121 0,035
G-CSF ген 2-кэп 1 0,27 0,26 0,011 0,004 0,005 0,678 1,557 0,099 0,037
Lipo 0,27 0,53 0,001 0 0,007 0,954 1,536 0,158 0,064
Пример 70. Обнаружение врожденного иммунного ответа in vivo
В попытках определить важность различных химических модификаций мРНК для продукции белков и цитокинового ответа in vivo, самкам мышей BALB/C (n=5) внутримышечно инъецируют мРНК G-CSF (мРНК GCSF, немодифицированная) (мРНК последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности) с 5’-кэпом кэп 1, мРНК G-CSF, полностью модифицированной 5-метилцитозином и псевдоуридином (мРНК GCSF 5mc/pU), мРНК G-CSF, полностью модифицированной 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином (мРНК GCSF 5mc/N1pU) с или без 5’-кэпа (мРНК GCSF 5mc/N1 pU, без кэпа), или контроль в виде либо R848, либо 5% сахарозы, как описано в таблице 16.
Таблица 16
Схема дозирования
Состав Путь доза (мкг/мышь) Доза (мкл)
мРНК GCSF, немодифицированная в/м 200 50
мРНК GCSF, 5mc/pU в/м 200 50
мРНК GCSF, 5mc/N1pU в/м 200 50
мРНК GCSF, 5mc/N1pU, без кэпа в/м 200 50
R848 в/м 75 50
5% сахароза в/м - 50
Без введения в/м - -
Взятие крови проводят через 8 часов после введения. С использованием ELISA уровни белка G-CSF, TNF-альфа и IFN-альфа определяют с помощью ELISA. Через 8 часов после дозирования извлекают мышцу из области инъекции и используют количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (QPCR) для определения уровней мРНК RIG-I, PKR, AIM-2, IFIT-1, OAS-2, MDA-5, IFN-бета, TNF-альфа, IL-6, G-CSF, CD45 в мышце.
Пример 71. Исследование по обнаружению врожденного иммунного ответа in vivo
Самкам мышей BALB/C (n=5) инъецировали внутримышечно мРНК G-CSF (мРНК GCSF, немодифицированая) (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности;) с 5’-кэпом кэп 1, мРНК G-CSF, полностью модифицированную 5-метилцитозином и псевдоуридином (мРНК GCSF, 5mc/pU), мРНК G-CSF, полностью модифицированную 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином (мРНК GCSF, 5mc/N1pU) с или без 5’-кэпа (мРНК GCSF, 5mc/N1 pU, без кэпа) или контроль в виде либо R848, либо 5% сахарозы, как описано в таблице 17. Взятие крови проводят через 8 часов после введения и с использованием ELISA уровни белка G-CSF и интерферона-альфа (IFN-альфа) определяют с помощью ELISA и как показано в таблице 17.
Как показано в таблице 17, немодифицированная 5mc/pU, и модифицированная 5mc/N1pU мРНК G-CSF приводила к экспрессии G-CSF человека в сыворотке мыши. Модифицированная 5mC/N1pU мРНК G-CSF без кэпа продемонстрировала отсутствие экспрессии G-CSF человека в сыворотке, подчеркивая важность наличия структуры 5’-кэпа для трансляции белка.
Как и ожидалось, в группах, в которые вводили R848, только 5% сахарозу, и в группе без обработки белок G-CSF человека не экспрессировался. Важно, что значимые отличия наблюдали в продукции цитокина при измерении по IFN-альфа мыши в сыворотке. Как и ожидалось, немодифицированная мРНК G-CSF продемонстрировала устойчивый цитокиновый ответ in vivo (больше, чем положительный контроль R848). Модифицированная 5mc/pU мРНК G-CSF продемонстрировала низкий, но поддающийся обнаружению цитокиновый ответ in vivo, в то время как модифицированная 5mc/N1pU мРНК не продемонстрировала поддающегося обнаружению IFN-альфа в сыворотке (и также как животные, которым вводили носитель, или животные без введения).
Также ответ модифицированной 5mc/N1pU мРНК был одинаковым, независимо от того, была ли она кэппирована. Эти результаты in vivo подтверждают заключение о том, 1) что немодифицированная мРНК вызывает устойчивый врожденный иммунный ответ, 2) что она снижается, но не устраняется, посредством 100% включения модификации 5mc/pU, и 3) что включение модификации 5mc/N1pU приводит к отсутствию поддающегося обнаружению цитокинового ответа.
Наконец, учитывая, что эти инъекции проводят в 5% сахарозе (которая сама по себе не имеет эффекта), этот результат должен точно отражать иммуностимулирующий потенциал этих модификаций.
Из данных очевидно, что модифицированные N1pU молекулы продуцируют больше белка, одновременно имея небольшой эффект на экспрессию IFN-альфа или не имея его. Также очевидно, что в случае этой химической модификации для продуцирования белка требуется кэппирование. Соотношение белок:цитокин, равное 748, по сравнению с соотношением PC для немодифицированной мРНК (PC=9) означает, что эта химическая модификация является лучшей в отношении эффектов или биологических последствий, ассоциированных с IFN-альфа.
Таблица 17
G-CSF человека и IFN-альфа мыши в сыворотке
Состав Путь Доза (мкг/мышь) Доза (мкл) Белок G-CSF (пг/мл) Экспрессия IFN-альфа (пг/мл) Соотношение PC
мРНК GCSF, немодифицированная в/м 200 50 605,6 67,01 9
мРНК GCSF, 5mc/pU в/м 200 50 356,5 8,87 40
мРНК GCSF, 5mc/N1pU в/м 200 50 748,1 0 748
мРНК GCSF, 5mc/N1pU, без кэпа в/м 200 50 6,5 0 6,5
R848 в/м 75 50 3,4 40,97 .08
5% сахароза в/м - 50 0 1,49 0
Без введения в/м - - 0 0 0
Пример 72: Доставка in vivo c использованием липоплексов
A. Модифицированная РНК G-CSF человека
Состав, содержащий 100 мкг одной из двух версий модифицированной мРНК G-CSF человека (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) (G-CSF, полностью модифицированный 5-метилцитозином и псевдоуридином (G-CSF), или G-CSF, полностью модифицированный 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином (G-CSF-N1) в липоплексе с 30% по объему RNAIMAXTM и доставленный в 150 мкл внутримышечно (в/м) и в 225 мкл внутривенно (в/в) мышам C57/BL6.
В трех контрольных группах вводили либо 100 мкг модифицированной мРНК люциферазы (последовательность кДНК IVT, представленная в SEQ ID NO: 2; последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3, поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности, 5’-кэп, кэп 1, полностью модифицированная 5-метилцитозином в каждом участке цитозина и с заменой на псевдоуридин в каждом участке уридина) внутримышечно (Luc-unsp, в/м) или 150 мкг модифицированной мРНК люциферазы внутривенно (Luc-unsp, в/м) или 150 мкл буфера для составления внутримышечно (буфер, в/м). Через 6 часов после введения состава проводили взятие сыворотки для измерения количества белка G-CSF человека в сыворотке мыши с помощью ELISA для G-CSF человека, и результаты представлены в таблице 18.
Эти результаты демонстрируют, что мРНК G-CSF человека, модифицированная 5-метилцитозином/псевдоуридином и 5-метилцитозином/N1-метилпсевдоуридином, может приводить к специфической экспрессии G-CSF человека в сыворотке при доставке посредством в/в или в/м пути введения в липоплексном составе.
Таблица 18
G-CSF человека в сыворотке (в/м и в/в путь введения)
Состав Путь G-CSF (пг/мл)
G-CSF в/м 85,6
G-CSF-N1 в/м 40,1
G-CSF в/в 31,0
G-CSF-N1 в/в 6,1
Luc-unsp в/м 0,0
Luc-unsp в/в 0,0
Буфер в/м 0,0
B. Сравнение модифицированной РНК G-CSF человека
Состав, содержащий 100 мкг либо модифицированной мРНК G-CSF человека в липоплексе с 30% по объему RNAIMAXTM с модификацией 5-метилцитозином (5mc) и псевдоуридином (ψ) (G-CSF-ген-1-липоплекс), модифицированной мРНК G-CSF человека с модификацией 5mc и ψ в солевом растворе (G-CSF-ген 1-солевой раствор), модифицированной мРНК G-CSF с модификацией N1-5-метилцитозином (N1-5mc) и ψ в липоплексе с 30% по объему RNAIMAXTM (G-CSF-ген 2-липоплекс), модифицированной мРНК G-CSF человека с модификацией N1-5mc и ψ в солевом растворе (G-CSF-ген 2-солевой раствор), модифицированной люциферазой с модификацией 5mc и ψ в липоплексе с 30% по объему RNAIMAXTM (Luc-липоплекс), либо мРНК люциферазы, полностью модифицированной модификациями 5mc и ψ, в солевом растворе (Luc-солевой раствор) доставляли внутримышечно (в/м) или подкожно (п/к) и в контрольной группе для каждого способа введения вводили дозу 80 мкл буфера для составления (буфер F.) мышам C57/BL6. Через 13 часов после инъекции сыворотку и ткань из каждой области инъекции получали от каждой мыши и анализировали с помощью ELISA для G-CSF для сравнения уровней белка G-CSF человека. Результаты для белка G-CSF человека в сыворотке мыши после внутримышечного введения и подкожного введения представлены в таблице 19.
Эти результаты демонстрируют, что модифицированная 5-метилцитозином/псевдоуридином и 5-метилцитозином/N1-метилпсевдоуридином мРНК G-CSF человека может приводить к специфической экспрессии белка G-CSF человека в сыворотке при доставке в/м или п/к путем введения, как в составе с солевым растворе, так и в липоплексном составе. Как показано в таблице 19, модифицированная 5-метилцитозином/N1-метилпсевдоуридином мРНК G-CSF человека, как правило, демонстрирует увеличенную продукцию белка G-CSF человека относительно модифицированной 5-метилцитозином/псевдоуридином мРНК G-CSF человека.
Таблица 19
Белок G-CSF человека в сыворотке мыши
Состав G-CSF (пг/мл)
в/м путь инъекции п/к путь инъекции
G-CSF-ген 1-липоплекс 13,988 42,855
GCSF-ген 1-солевой раствор 9,375 4,614
GCSF-ген 2-липоплекс 75,572 32,107
GCSF-ген 2-солевой раствор 20,190 45,024
Luc-липоплекс 0 3,754
Luc-солевой раствор 0,0748 0
Буфер F. 4,977 2,156
Пример 73. Введение в несколько областей: внутримышечное и подкожное
Модифицированную мРНК G-CSF человека (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), модифицированная в качестве либо гена 1, либо гена 2 (модификация 5-метилцитозином (5mc) и псевдоуридином (ψ), G-CSF-ген 1; или модификация N1-5-метилцитозином (N1-5mc) и ψ, G-CSF-ген 2) и составленную в солевом растворе доставляли мышам посредством внутримышечной (IM) или подкожной (SC) инъекции. Проводили инъекцию четырех доз или 2x 50 мкг (две области) каждые сутки в течение трех суток (интервал 24 ч). Четвертую дозу вводили за 6 часов до взятия крови и анализа CBC. Контроли включали люциферазу (последовательность кДНК для IVT, представленная в SEQ ID NO: 2; последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3, поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности, 5’-кэп, кэп 1, полностью модифицированная 5-метилцитозином в каждом участке цитозина и с заменой псевдоуридином в каждом участке уридина) или буфер для составления (буфер F.). У мышей проводили взятие крови через 72 часа после первой инъекции мРНК (через 6 часов после последней дозы мРНК) для определения эффекта кодируемого мРНК G-CSF человека на количество нейтрофилов. Режим дозирования представлен в таблице 20, так же как и конечные количества нейтрофилов (тысячи/мкл). В таблице 20 звездочка (*) указывает на статистическую значимость при p<0,05.
В случае внутримышечного введения данные демонстрируют четырехкратное увеличение количества нейтрофилов выше контроля на 3 сутки для мРНК гена 1 G-CSF и двукратное увеличение для мРНК G-CSF гена 2. В случае подкожного введения данные демонстрируют двукратное увеличение количества нейтрофилов выше контроля на 3 сутки для мРНК G-CSF гена 2.
Эти данные демонстрируют, что модифицированная как 5-метилцитидином/псевдоуридином, так и 5-метилцитидином/N1-метилпсевдоуридином мРНК может быть биологически активной, о чем свидетельствует специфическое увеличение количества нейтрофилов в крови.
Таблица 20
Режим дозирования
Группа Введение Путь N= Доза
(мкг/мышь) 		Доза
об. (мкл/ мышь) 		Носитель для дози-рования Нейтрофилы
Тысячи/мкл
1 G-CSF
(ген 1) 		в/м 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 840*
2 G-CSF
(ген 1) 		п/к 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 430
3 G-CSF
(ген 2) 		в/м 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 746*
4 G-CSF
(ген 2) 		п/к 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 683
5 Luc
(ген 1) 		в/м 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 201
6 Luc
(ген 1) 		п/к 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 307
7 Luc
(ген 2) 		в/м 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 336
8 Luc
(ген 2) 		п/к 5 2×50 мкг
(четыре дозы) 		50 Буфер F. 357
9 Буфер F. в/м 4 0 (четыре дозы) 50 Буфер F. 245
10 Буфер F. п/к 4 0 (четыре дозы) 50 Буфер F. 509
11 Без введения - 4 - 312
Пример 74. Внутривенное введение
Модифицированную мРНК G-CSF человека (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), модифицированную модификацией 5-метилцитозином (5mc) и псевдоуридином (ψ) (ген 1); или не имеющую модификаций и составленную в 10% липоплексе (RNAIMAXTM) доставляли мышам в дозе 50 мкг РНК и в объеме 100 мкл посредством внутривенной инъекции (IV) на 0, 2 и 4 сутки. Нейтрофилы измеряли на 1, 5 и 8 сутки. Контроли включали неспецифическую РНК млекопитающих или буфер для составления отдельно (буфер F.). У мышей проводили взятие крови на 1, 5 и 8 сутки для определения эффекта кодируемого мРНК G-CSF человека на увеличение количества нейтрофилов. Режим дозирования представлен в таблице 21, так же как и конечные количества нейтрофилов (тысячи/мкл; K/мкл).
В случае внутривенного введения данные показали от четырех- до пятикратного увеличения количества нейтрофилов относительно контроля на 5 сутки для модифицированной мРНК G-CSF, но не для немодифицированной мРНК G-CSF или неспецифических контролей. Формула крови возвращалась к исходному уровню через четверо суток после последней инъекции. Не наблюдали других изменений в популяциях лейкоцитов.
В таблице 21 звездочкой (*) указана статистическая значимость при p<0,001 по сравнению с буфером.
Эти данные демонстрируют, что составленная в липоплексе модифицированная 5-метилцитидином/псевдоуридином мРНК может быть биологически активной при доставке в/в путем введения, на что указывает специфическое увеличение количества нейтрофилов в крови. Никакие другие подгруппы клеток не изменялись значительно. Немодифицированная мРНК G-CSF, введенная сходным образом, продемонстрировала отсутствие фармакологического эффекта на количество нейтрофилов.
Таблица 21
Режим дозирования
Группа Введение N Доза
об. (мкл/
мышь) 		Дозиро-вание
Носитель 		Нейтрофилы
K/мкл
1 G-CSF
(ген 1),
1 сутки		 5 100 10% липоплекс 2,91
2 G-CSF
(ген 1),
5 сутки		 5 100 10% липоплекс 5,32*
3 G-CSF
(ген 1),
8 сутки		 5 100 10% липоплекс 2,06
4 G-CSF (без модификации),
1 сутки		 5 100 10% липоплекс 1,88
5 G-CSF (без модификации),
5 сутки		 5 100 10% липоплекс 1,95
6 G-CSF (без модификации),
8 сутки		 5 100 10% липоплекс 2,09
7 РНК-контроль,
1 сутки		 5 100 10% липоплекс 2,90
8 РНК-контроль,
5 сутки		 5 100 10% липоплекс 1,68
9 РНК-контроль,
8 сутки		 4 100 10% липоплекс 1,72
10 Буфер F.,
1 сутки		 4 100 10% липоплекс 2,51
11 Буфер F.,
5 сутки		 4 100 10% липоплекс 1,31
12 Буфер F.,
8 сутки		 4 100 10% липоплекс 1,92
Пример 75: Пути введения
Исследования проводили для изучения разделенного дозирования с использованием различных путей введения. Исследования с использованием множества путей подкожной или внутримышечной инъекции в один момент времени планировали и проводили для изучения способов увеличения экспозиции лекарственного средства на основе модифицированной мРНК и увеличения продукции белка. В дополнение к обнаружению экспрессируемого белкового продукта, также проводили оценку физиологической функции белков путем анализа образцов исследованного животного.
Неожиданно было определено, что разделенное дозирование модифицированной мРНК обеспечивает более высокое продуцирование белка и фенотипические ответы, чем в случае схем однократного дозирования или многократного дозирования.
Схема эксперимента с разделенной дозой вовлекала использование модифицированной мРНК эритропоэтина (EPO) человека (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 5; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), или модифицированной мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), вводимой в буфере отдельно или составленной с 30% липоплексом (RNAIMAXTM). Носитель для дозирования (буфер) состоял из 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ Na+-фосфата (1,4 мМ одноосновного фосфата натрия; 0,6 мМ двухосновного фосфата натрия) и 0,5 мМ EDTA, pH 6,5. pH корректировали с использованием гидроксида натрия, и конечный раствор стерилизовали фильтрацией. мРНК была модифицирована 5-метил-C (5meC) в каждом участке цитозина и заменой на псевдоуридин в каждом участке уридина.
4 мышам на группу проводили введение внутримышечно (в/м), внутривенно (в/в) или подкожно (п/к) по схеме дозирования, приведенной в таблице 22. Взятие сыворотки всех мышей проводили через 13 часов после инъекции, извлекали ткань из области инъекции для групп внутримышечного и подкожного введения, и селезенку, печень и почки извлекали в случае группы внутривенного введения. Результаты группы внутримышечного введения и группы подкожного введения представлены в таблице 23.
Таблица 22
Схема дозирования
Группа Введение Путь Доза
Модифици-рованной
мРНК 		Общая доза Носитель для дози-рования
1 Липоплекс-модифици-рованная мРНК EPO человека в/м 4×100 мкг +
30% Липоплекс		 4×70 мкл Липоплекс
2 Липоплекс-модифици-рованная мРНК EPO человека в/м 4×100 мкг 4×70 мкл Буфер
3 Липоплекс-модифици-рованная мРНК EPO человека п/к 4×100 мкг +
30% Липоплекс		 4×70 мкл Липоплекс
4 Липоплекс-модифици-рованная мРНК EPO человека п/к 4×100 мкг 4×70 мкл Буфер
5 Липоплекс-модифици-рованная мРНК EPO человека в/м 200 мкг +
30% Липоплекс		 140 мкл Липоплекс
6 Липоплекс-модифици-рованная мРНК люциферазы в/м 100 мкг +
30% Липоплекс		 4×70 мкл Липоплекс
7 Липоплекс-модифици-рованная мРНК люциферазы в/м 100 мкг 4×70 мкл Буфер
8 Липоплекс-модифици-рованная мРНК люциферазы п/к 100 мкг +
30% Липоплекс		 4×70 мкл Липоплекс
9 Липоплекс-модифици-рованная мРНК люциферазы п/к 100 мкг 4×70 мкл Буфер
10 Липоплекс-модифици-рованная мРНК EPO человека в/м 200 мкг +
30% Липоплекс		 140 мкл Липоплекс
11 Буфер для составления в/м 4× многократное дозирование 4×70 мкл Буфер
Таблица 23
Белок EPO человека в сыворотке мыши (в/м путь инъекции)
Состав EPO (пг/мл)
в/м путь инъекции п/к путь инъекции
Epo-Липоплекс 67,1 2,2
Luc-Липоплекс 0 0
Epo-Солевой раствор 100,9 11,4
Luc-Солевой раствор 0 0
Буфер для составления 0 0
Пример 76: Доставка in vivo с использованием различных соотношений липидов
Модифицированную мРНК доставляли мышам C57/BL6 для оценки различных соотношений липидов и конечной экспрессии белка. Составы с 100 мкг модифицированной мРНК EPO человека (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 5; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная 5-метилцитозином и псевдоуридином) в липоплексе с 10%, 30% или 50% RNAIMAXTM, 100 мкг модифицированной мРНК люциферазы (последовательность кДНК IVT, представленная в SEQ ID NO: 2; последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3, поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности, 5’-кэп, кэп 1, полностью модифицированная 5-метилцитозином в каждом участке цитозина и с заменой на псевдоуридин в каждом участке уридина) в липоплексе с 10%, 30% или 50% RNAIMAXTM или буфер для составления вводили внутримышечно мышам в однократной дозе объемом 70 мкл. Через 13 часов после инъекции проводили взятие сыворотку для проведения ELISA для EPO в целях определения уровня белка EPO человека у каждой мыши. Результаты ELISA для EPO человека, представленные в таблице 24, демонстрируют, что модифицированный EPO человека, экспрессируемый в мышце, секретируется в сыворотку для каждого из различных процентов RNAIMAXTM.
Таблица 24
Белок EPO человека в сыворотке мыши (в/м путь введения)
Состав EPO (пг/мл)
Epo + 10% RNAiMAX 11,4
Luc + 10% RNAiMAX 0
Epo + 30% RNAiMAX 27,1
Luc + 30% RNAiMAX 0
Epo + 50% RNAiMAX 19,7
Luc + 50% RNAiMAX 0
Буфер F 0
Пример 77: Доставка in vivo модифицированной РНК у крыс
Продукцию белка с модифицированной мРНК оценивали путем доставки модифицированной мРНК G-CSF или модифицированной мРНК фактора IX самкам крыс Sprague Dawley (n=6). Крысам инъецировали 400 мкг в 100 мкл мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной 5-метилцитозином и псевдоуридином (G-CSF, ген 1), мРНК G-CSF, полностью модифицированной 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином (G-CSF, ген 2), или мРНК фактора IX (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 6; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной 5-метилцитозином и псевдоуридином (фактор IX, ген 1), восстановленной из лиофилизированной формы в 5% сахарозе. Взятие крови проводили через 8 часов после инъекции, и уровень белка G-CSF в сыворотке измеряли с помощью ELISA. В таблице 25 показаны уровни белка G-CSF в сыворотке через 8 часов.
Эти результаты демонстрируют, что модифицированная мРНК как G-CSF гена 1, так и G-CSF гена 2 может продуцировать белок G-CSF человека у крысы после однократной внутримышечной инъекции, и что продукция белка G-CSF человека увеличивается при использовании химической структуры гена 2 относительно химической структуры гена 1.
Таблица 25
Белок G-CSF в сыворотке крысы (в/м путь инъекции)
Состав Белок G-CSF (пг/мл)
G-CSF, ген 1 19,37
G-CSF, ген 2 64,72
Фактор IX, ген 1 2,25
Пример 78. Химическая модификация: исследования in vitro
A. Скрининг в PBMC in vitro
500 нг мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной химической модификацией, указанной в таблицах 26 и 27, трансфицировали с 0,4 мкл Lipofectamine 2000 в мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от трех здоровых доноров крови. Также анализировали контрольные образцы LPS, R848, P(I)P(C) и mCherry (мРНК последовательность, представленная в SEQ ID NO: 4; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности, 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная 5-метилцитозином и псевдоуридином). Супернатант собирали и хранили замороженным до анализа ELISA для определения экспрессии белка G-CSF и индукции цитокинов интерферона-альфа (IFN-α) и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). Экспрессия белка G-CSF представлена в таблице 26, экспрессия IFN-α и TNF-α представлена в таблице 27.
Данные в таблице 26 демонстрируют, что многие, но не все, химические модификации можно использовать, чтобы продуктивно продуцировать G-CSF человека в PBMC. Следует отметить, что 100% замена на N1-метилпсевдоуридин демонстрирует наиболее высокий уровень продукции G-CSF человека (практически в 10-раз более высокий, чем сам псевдоуридин). Когда N1-метилпсевдоуридин используют в комбинации с 5-метилцитидином, также продуцируется высокий уровень белка G-CSF человека (это также выше, чем когда псевдоуридин используют в комбинации с 5-метилцитидином).
Учитывая обратную взаимосвязь между продукцией белка и продукцией цитокинов в PBMC, сходную тенденцию также наблюдают в таблице 27, где 100% замена на N1-метилпсевдоуридин приводит к отсутствию индукции цитокинов (аналогично контролям только с трансфекцией) и псевдоуридин демонстрирует поддающуюся обнаружению индукцию цитокинов, которая находится выше фонового уровня.
Другие модификации, такие как N6-метиладенозин и α-тиоцитидин, по-видимому, увеличивают стимуляцию цитокинов.
Таблица 26
Химические модификации и экспрессия белка G-CSF
Химические модификации Экспрессия белка G-CSF (пг/мл)
Донор 1 Донор 2 Донор 3
Псевдоуридин 2477 1909 1498
5-метилуридин 318 359 345
N1-метилпсевдоуридин 21495 16550 12441
2-тиоуридин 932 1000 600
4-тиоуридин 5 391 218
5-метоксиуридин 2964 1832 1800
5-метилцитозин и псевдоуридин
(1-ый набор) 		2632 1955 1373
5-метилцитозин и N1-метилпсевдоуридин (1-й набор) 10232 7245 6214
2’-фторгуанозин 59 186 177
2’-фторуридин 118 209 191
5-метилцитозин и псевдоуридин
(2-ой набор) 		1682 1382 1036
5-метилцитозин и N1-метилпсевдоуридин (2-й набор) 9,564 8509 7141
5-бромуридин 314 482 291
5-(2-карбометоксивинил)уридин 77 286 177
5-[3(1-E-пропениламино)уридин] 541 491 550
α-тиоцитидин 105 264 245
5-метилцитозин и псевдоуридин
(3-й набор) 		1595 1432 955
N1-метиладенозин 182 177 191
N6-метиладенозин 100 168 200
5-метилцитидин 291 277 359
N4-ацетилцитидин 50 136 36
5-формилцитидин 18 205 23
5-метилцитозин и псевдоуридин
(4-й набор) 		264 350 182
5-метилцитозин и N1-метилпсевдоуридин (4-й набор) 9505 6927 5405
LPS 1209 786 636
mCherry 5 168 164
R848 709 732 636
P(I)P(C) 5 186 182
Таблица 27
Химические модификации и экспрессия цитокинов
Химические Модификации Экспрессия IFN-α (пг/мл) Экспрессия TNF-α (пг/мл)
Донор 1 Донор 2 Донор 3 Донор
1 		Донор 2 Донор 3
Псевдоуридин 120 77 171 36 81 126
5-метилуридин 245 135 334 94 100 157
N1-метилпсевдо-уридин 26 75 138 101 106 134
2-тиоуридин 100 108 154 133 133 141
4-тиоуридин 463 258 659 169 126 254
5-метоксиуридин 0 64 133 39 74 111
5-метилцитозин и псевдоуридин
(1-й набор) 		88 94 148 64 89 121
5-метилцитозин и N1-метилпсевдо-уридин
(1-й набор) 		0 60 136 54 79 126
2’-фторгуанозин 107 97 194 91 94 141
2’-фторуридин 158 103 178 164 121 156
5-метилцитозин и псевдоуридин
(2-й набор) 		133 92 167 99 111 150
5-метилцитозин
и N1-метил-псевдоуридин
(2-й набор) 		0 66 140 54 97 149
5-бромуридин 95 86 181 87 106 157
5-(2-карбо-метоксивинил)-уридин 0 61 130 40 81 116
5-[3(1-E-пропениламино)-уридин] 0 58 132 71 90 119
α-тиоцитидин 1138 565 695 300 273 277
5-метилцитозин и псевдоуридин
(3-й набор) 		88 75 150 84 89 130
N1-метиладенозин 322 255 377 256 157 294
N6-метиладенозин 1935 1065 1492 1080 630 857
5-метилцитидин 643 359 529 176 136 193
N4-ацетилцитидин 789 593 431 263 67 207
5-формилцитидин 180 93 88 136 30 40
5-метилцитозин и псевдоуридин
(4-й набор) 		131 28 18 53 24 29
5-метилцитозин и N1-метил-псевдоуридин
(4-й набор) 		0 0 0 36 14 13
LPS 0 67 146 7004 3974 4020
mCherry 100 75 143 67 100 133
R848 674 619 562 11179 8546 9907
P(I)P(C) 470 117 362 249 177 197
B. Скрининг в клетках HeLa in vitro
За сутки до трансфекции 20000 клеток HeLa (ATCC № CCL-2; Manassas, VA) собирали путем обработки раствором трипсин-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) и высевали в общий объем 100 мкл среды EMEM (дополненной 10% FCS и 1x Glutamax) на лунку в 96-луночный планшет для культивирования клеток (Corning, Manassas, VA). Клетки выращивали при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение ночи. На следующие сутки 83 нг модифицированной РНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) с химической модификацией, описанной в таблице 28, разбавляли OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY) до конечного объема 10 мкл. В качестве реагента для трансфекции использовали Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) и 0,2 мкл разбавляли OPTI-MEM до конечного объема 10 мкл. После инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут, оба раствора объединяли и инкубировали в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре. Затем 20 мкл объединенного раствора добавляли к 100 мкл среды для культивирования клеток, содержавшей клетки HeLa, и инкубировали при комнатной температуре.
После инкубации в течение от 18 до 22 часов клетки, экспрессирующие люциферазу, лизировали 100 мкл буфера для пассивного лизиса (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкциями изготовителя. Аликвоты лизатов переносили в белые непрозрачные полистироловые 96-луночные планшеты (Corning, Manassas, VA) и комбинировали с 100 мкл полного раствора для анализа люциферазы (Promega, Madison, WI). Объемы лизатов корректировали или разбавляли до тех пор, пока не обнаруживалось не более 2 относительных световых единиц (RLU) на лунку для образцов с наиболее высоким сигналом, и RLU для каждой исследованной химической структуры представлены в таблице 28. Устройство для считывания планшетов представляло собой BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Фоновый сигнал планшетов без реагента составлял приблизительно 200 относительных световых единиц на лунку.
Эти результаты демонстрируют, что многие, но не все, химические модификации можно использовать для продуктивного продуцирования G-CSF человека в клетках HeLa. Следует отметить, что замена на 100% N1-метилпсевдоуридин демонстрирует наиболее высокий уровень продуцирования G-CSF человека.
Таблица 28
Относительные световые единицы люциферазы
Химическая модификация RLU
N6-метиладенозин (m6a) 534
5-метилцитидин (m5c) 138428
N4-ацетилцитидин (ac4c) 235412
5-формилцитидин (f5c) 436
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A1 48659
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A1 190924
Псевдоуридин 655632
1-метилпсевдоуридин (m1u) 1517998
2-тиоуридин (s2u) 3387
5-метоксиуридин (mo5u) 253719
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание B1 317744
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B1 265871
5-бромуридин 43276
5-(2-карбовинил)уридин 531
5-(3-1E-пропениламино)уридин 446
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A2 295824
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A2 233921
5-метилуридин 50932
α-тиоцитидин 26358
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание B2 481477
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B2 271989
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A3 438831
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A3 277499
Немодифицированная люцифераза 234802
C. Скрининг In vitro в лизатах ретикулоцитов кролика
мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) модифицировали химической модификацией, приведенной в таблице 29, и ее разбавляли в стерильной не содержавшей нуклеаз воде до конечного количества 250 нг в 10 мкл. Разбавленную люциферазу добавляли к 40 мкл свежеприготовленного лизата ретикулоцитов кролика, и реакцию трансляции in vitro проводили в стандартной 1,5-мл полипропиленовой реакционной пробирке (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) при 30°C в сухом нагревающем блоке. Анализ трансляции проводили с набором лизата ретикулоцитов кролика (обработанного нуклеазой) (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкциями изготовителя. Реакционный буфер дополняли смесью один к одному из предоставленных исходных растворов аминокислот, лишенных либо лейцина, либо метионина, что обеспечивало реакционную смесь, содержавшую достаточные количества обеих аминокислот для обеспечения эффективной трансляции in vitro.
После инкубации в течение 60 минут реакцию останавливали путем помещения реакционных пробирок на лед. Аликвоты реакции трансляции in vitro, содержавшие модифицированную РНК люциферазы, переносили в белые непрозрачные полистироловые 96-луночные планшеты (Corning, Manassas, VA) и комбинировали с 100 мкл полного раствора для анализа люциферазы (Promega, Madison, WI). Объемы реакционных смесей для трансляции in vitro доводили или разбавляли до тех пор, пока не обнаруживалось не более 2 относительных световых единиц (RLU) на лунку для образцов с наиболее высоким сигналом, и RLU для каждой исследованной химической структуры представлены в таблице 29. Устройство для считывания планшетов представляло собой BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Фоновый сигнал планшетов без реагента составлял приблизительно 200 относительных световых единиц на лунку.
Эти результаты бесклеточной трансляции очень точно коррелируют с результатами продукции белка в HeLa, причем одни и те же модификации обычно работают или не работают в обеих системах. Одним примечательным исключением является модифицированная 5-формилцитидином мРНК люциферазы, которая работала в бесклеточной системе трансляции, но не в системе трансфекции на основе клеток HeLa. Сходное отличие между двумя анализами также наблюдали в случае модифицированной 5-формилцитидином мРНК G-CSF.
Таблица 29
Относительные световые единицы люциферазы
Химическая модификация RLU
N6-метиладенозин (m6a) 398
5-метилцитидин (m5c) 152989
N4-ацетилцитидин (ac4c) 60879
5-формилцитидин (f5c) 55208
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A1 349398
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A1 205465
Псевдоуридин 587795
1-метилпсевдоуридин (m1u) 589758
2-тиоуридин (s2u) 708
5-метоксиуридин (mo5u) 288647
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание B1 454662
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B1 223732
5-бромуридин 221879
5-(2-карбовинил)уридин 225
5-(3-1E-пропениламино)уридин 211
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A2 558779
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A2 333082
5-метилуридин 214680
α-тиоцитидин 123878
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание B2 487805
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B2 154096
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A3 413535
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A3 292954
Немодифицированная люцифераза 225986
Пример 79. Химическая модификация: исследования in vivo
А. Скрининг in vivo модифицированной мРНК G-CSF
Мышам Balb-C (n=4) внутримышечно инъецируют в каждую нижнюю конечность модифицированную мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированную химическими модификациями, указанными в таблице 30, составленную в 1xPBS. Также исследуют контроль в виде модифицированной мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1; полностью модифицированная псевдоуридином и 5-метилцитозином) и контроль в виде PBS. Через 8 часов проводят взятие сыворотки для определения уровней белка G-CSF с помощью ELISA.
Таблица 30
G-CSF
мРНК Химические модификации
G-CSF Псевдоуридин
G-CSF 5-метилуридин
G-CSF 2-тиоуридин
G-CSF 4-тиоуридин
G-CSF 5-метоксиуридин
G-CSF 2’-фторуридин
G-CSF 5-бромуридин
G-CSF 5-[3(1-E-пропениламино)уридин]
G-CSF альфа-тиоцитидин
G-CSF 5-метилцитидин
G-CSF N4-ацетилцитидин
G-CSF псевдоуридин и 5-метилцитозин
G-CSF N1-метилпсевдоуридин и 5-метилцитозин
Люцифераза псевдоуридин и 5-метилцитозин
PBS нет
В. Скрининг in vivo модифицированной мРНК люциферазы
Мышам Balb-C (n=4) подкожно инъецировали 200 мкл, содержащие от 42 до 103 мкг модифицированной мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной химическими модификациями, указанными в таблице 31, составленной в 1xPBS. Также исследовали контроль в виде PBS. Дозировки модифицированной мРНК люциферазы также указаны в таблице 31. Через 8 часов после дозирования мышей визуализировали для определения экспрессии люциферазы. За двадцать минут до визуализации мышам внутрибрюшинно инъецировали раствор D-люциферина в количестве 150 мг/кг. Затем животных подвергали анестезии, и получали изображения с помощью системы визуализации IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Биолюминесценцию измеряли в качестве общего потока (фотоны/секунда) для всей мыши.
Как продемонстрировано в таблице 31, все химические структуры модифицированной мРНК люциферазы продемонстрировали активность in vivo, за исключением 2’-фторуридина. Кроме того, модифицированная мРНК 1-метилпсевдоуридина продемонстрировала очень высокую экспрессию люциферазы (в 5 раз более высокая экспрессия, чем в случае содержащей псевдоуридин мРНК).
Таблица 31
Скрининг люциферазы
мРНК Химические модификации Доза (мкг) мРНК Объем дозы (мл) Экспрессия люциферазы (фотон/ секунда)
Люцифераза 5-метилцитидин 83 0,72 1,94E+07
Люцифераза N4-ацетилцитидин 76 0,72 1,11E07
Люцифераза Псевдоуридин 95 1,20 1,36E+07
Люцифераза 1-метилпсевдоуридин 103 0,72 7,40E+07
Люцифераза 5-метоксиуридин 95 1,22 3,32+07
Люцифераза 5-метилуридин 94 0,86 7,42E+06
Люцифераза 5-бромуридин 89 1,49 3,75E+07
Люцифераза 2’-фторгуанозин 42 0,72 5,88E+05
Люцифераза 2’-фторцитидин 47 0,72 4,21E+05
Люцифераза 2’-фторуридин 59 0,72 3,47E+05
PBS нет - 0,72 3,16E+05
Пример 80. Скрининг in vivo комбинации модифицированной мРНК люциферазы
Мышам Balb-C (n=4) подкожно инъецировали 200 мкл с 100 мкг модифицированной мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной с помощью химических модификаций, указанных в таблице 32, составленной в 1x PBS. Также исследовали контроль в виде PBS. Дозировки модифицированной мРНК люциферазы также указаны в таблице 29. Через 8 часов после дозирования мышей визуализировали для определения экспрессии люциферазы. За двадцать минут до визуализации мышам внутрибрюшинно инъецировали раствор D-люциферина в количестве 150 мг/кг. Затем животных подвергали анестезии, и изображения получали с помощью системы визуализации IVIS Lumina II (Perkin Elmer). Биолюминесценцию измеряли в качестве общего потока (фотоны/секунда) для всей мыши.
Как продемонстрировано в таблице 32, все модифицированные химические структуры мРНК люциферазы (в комбинации) продемонстрировали активность in vivo. Дополнительное присутствие N1-метилпсевдоуридина в модифицированной мРНК (с N4-ацетилцитидином или 5 метилцитидином) продемонстрировало более высокую экспрессию, чем экспрессия, когда те же комбинации исследовали с использованием псевдоуридина. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что содержащая N1-метилпсевдоуридин мРНК люциферазы обеспечивает увеличенную экспрессию белка in vivo, как при использовании отдельно (таблица 31), так и при использовании в комбинации с другими модифицированными нуклеотидами (таблица 32).
Таблица 32
Комбинации для скрининга люциферазы
мРНК Химические модификации Экспрессия люциферазы (фотон/секунда)
Люцифераза N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 4,18E+06
Люцифераза N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 2,88E+07
Люцифераза 5-метилцитидин/5-метоксиуридин 3,48E+07
Люцифераза 5-метилцитидин/5-метилуридин 1,44E+07
Люцифераза 5-метилцитидин/где 50% уридина заменено 2-тиоуридином 2,39E+06
Люцифераза 5-метилцитидин/псевдоуридин 2,36E+07
Люцифераза 5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 4,15E+07
PBS Нет 3,59E+05
Пример 81. Стабильность модифицированной РНК
A. Хранение модифицированной РНК
Эксперименты по стабильности проводили для лучшего понимания условий хранения для сохранения целостности модифицированной РНК. Немодифицированную мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), мРНК G-CSF, полностью модифицированную 5-метилцитозином и псевдоуридином, и мРНК G-CSF, полностью модифицированную 5-метилцитозином и псевдоуридином в липоплексе с 0,75% по объему RNAIMAXTM, хранили при 50°C, 40°C, 37°C, 25°C, 4°C или -20°C. После хранения мРНК в течение 0 часов, 2 часов, 6 часов, 24 часов, 48 часов, 5 суток и 14 суток, мРНК анализировали гель-электрофорезом с использованием системы Bio-Rad EXPERIONTM. Модифицированную, немодифицированную и липоплексную мРНК G-CSF также хранили в RNASTABLE® (Biomatrica, Inc. San Diego, CA) при 40°C или воде при -80°C или 40°C в течение 35 суток, а затем анализировали гель-электрофорезом.
Все образцы мРНК без стабилизатора были стабильными после хранения в течение 2 недель при 4°C или -20°C. Модифицированная мРНК G-CSF с липоплексом или без него была более стабильной, чем немодифицированная G-CSF при хранении при 25°C (стабильна до 5 суток относительно 48 часов), 37°C (стабильна до 24 часов относительно 6 часов) и 50°C (стабильна до 6 часов относительно 2 часов). Немодифицированная мРНК G-CSF, модифицированная мРНК G-CSF с липоплексом или без него выдерживали 12 циклов замораживания/размораживания.
Образцы мРНК, хранившиеся в стабилизаторе при 40°C, продемонстрировали сходную стабильность с образцами мРНК, хранившимися в воде при -80°C после 35 суток, в то время как мРНК, хранившаяся в воде при 40°C, продемонстрировала значительную деградацию после 18 суток.
Пример 82. Жизнеспособность клеток в фибробластах BJ
Первичные фибробласты крайней плоти человека (BJ fibroblasts) получали от American Type Culture Collection (ATCC) (каталожный номер #CRL-2522) и выращивали в минимальной эссенциальной среде Игла (ATCC, каталожный номер # 30-2003), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой при 37°C, в 5% CO2. Фибробласты BJ высевали на 24-луночный планшет при плотности 130000 клеток на лунку в 0,5 мл культуральной среды. 250 нг модифицированной мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной 5-метилцитозином и псевдоуридином (ген 1) или полностью модифицированной 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином (ген 2), трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, каталожный номер # 11668-019) в соответствии с протоколом изготовителя. Также трансфицировали контрольные образцы в виде Lipofectamine 2000 (LF2000) и немодифицированной мРНК G-CSF. Образцы модифицированной мРНК или контрольные образцы трансфицировали каждые сутки в течение 4 суток. Жизнеспособность клеток после трансфекции оценивали через 6 часов и 24 часа после первой трансфекции (T1, 6 часов, или T1, 24 часов), и через 24 часа после второй (T2, 24 часа) и четвертой трансфекции (T4, 24 часа).
Для определения жизнеспособности клеток культуральную среду полностью извлекали, и клетки промывали один раз посредством 600 мкл стерильного PBS без Ca2+/Mg2+ (Gibco/Life Technologies, Manassas, VA) для смывания слабоприкрепленных клеток. PBS удаляли и выбрасывали. Очищенные фибробласты в каждой лунке обрабатывали 220 мкл разбавленного исходного раствора CELL TITER GLO® (Promega, каталожный номер #G7570) (исходный раствор CELL TITER GLO® далее разбавляли 1:1 равным количеством стерильного PBS). Для соскребания клеток с планшета и ускорения процесса лизиса использовали стерильный наконечник пипетки.
Для двух интервалов времени, T1, 24 часа, и T2, 24 часа, использовали альтернативный протокол. Клетки промывали PBS, как описано выше, а затем трипсинизировали раствором трипсин/EDTA (Gibco/Life Technologies, Manassas, VA). Клетки открепляли и собирали в 500 мкл среды, содержавшей ингибитор трипсина. Клетки собирали центрифугированием при 1200 rcf в течение 5 минут. Клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл PBS. Эту суспензию клеток держали на льду, и 100 мкл этой суспензии комбинировали со 100 мкл неразбавленного раствора Cell Titer Glo.
Затем все лизаты CELL TITER GLO® инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. 20 мкл лизатов переносили в белый непрозрачный полистироловый 96-луночный планшет (Corning, Manassas, VA) и комбинировали с 100 мкл разбавленного раствора CELL TITER GLO®. Использованное устройство для считывания планшетов представляло собой устройство от BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT), и абсолютные величины нормализовывали к сигналу необработанных фибробластов BJ до 100% жизнеспособности клеток. Процентная жизнеспособность для фибробластов BJ представлена в таблице 33.
Важно, что все из этих экспериментов проводят в отсутствие какого-либо интерферона или других ингибиторов цитокинов и, таким образом, они отражают точный показатель цитотоксичности различных мРНК.
Эти результаты демонстрируют, что повторяющаяся трансфекция фибробластов BJ немодифицированной мРНК приводит к утрате жизнеспособности клеток, которая заметна уже через 24 ч после первой трансфекции (T1, 24 часа) и продолжает быть заметной и более выражена в последующие моменты времени.
Также происходит утрата жизнеспособности при повторяющейся трансфекции модифицированной 5-метилцитидином и псевдоуридином мРНК, которая заметна через 24 часа после четвертой ежесуточной трансфекции (T4, 24 часа). Не наблюдали утраты жизнеспособности клеток в ходе этого эксперимента при использовании модифицированной 5-метилцитидином и N1-метилпсевдоуридином мРНК. Эти результаты демонстрируют, что содержащая 5-метилцитидин и N1-метилпсевдоуридин мРНК имеет увеличенную жизнеспособность клеток при анализе с повторяющейся трансфекцией. Способность неоднократно вводить модифицированную мРНК является важной для большинства терапевтических применений, и, соответственно, также является важной возможность этого без цитотоксичности. Без связи с теорией, полагают, что отвечающие гены после однократной трансфекции могут обеспечивать снижение продукции белка, индукцию цитокинов и в конечном итоге утрату жизнеспособности клеток. Эти результаты согласуются с содержащей N1-метилпсевдоуридин мРНК, демонстрирующей улучшенный профиль в этом отношении относительно как немодифицированной мРНК, так и модифицированной псевдоуридином мРНК.
Таблица 33
Процентная жизнеспособность
T1, 6 часов T1, 24 часа T2, 24 часа T4, 24 часа
ген 1 G-CSF 81 108 91 65
ген 2 G-CSF 99 102 128 87
Немодифицированный G-CSF 101 72 74 42
LF2000 99 80 114 106
Без обработки 100 100 100 100
Пример 83. Врожденный иммунный ответ в фибробластах BJ
Первичные фибробласты крайней плоти человека (BJ fibroblasts) получают от American Type Culture Collection (ATCC) (каталожный номер #CRL-2522) и выращивают в минимальной эссенциальной среде Игла (ATCC, каталожный номер # 30-2003), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой при 37°C, в 5% CO2. Фибробласты BJ высевают на 24-луночный планшет при плотности 130000 клеток на лунку в 0,5 мл культуральной среды. 250 нг модифицированной мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированной 5-метилцитозином и псевдоуридином (ген 1) или полностью модифицированной 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином (ген 2), трансфицируют с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, каталожный номер # 11668-019) в соответствии с протоколом изготовителя. Также трансфицируют контрольные образцы в виде Lipofectamine 2000 и немодифицированной мРНК G-CSF (природный G-CSF). Клетки трансфицируют в течение пяти последовательных суток. Комплексы трансфекции удаляют через четыре часа после каждого раунда трансфекции.
Культуральный супернатант анализируют в отношении секретируемого GCSF (R&D Systems, каталожный номер #DCS50), фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа) и интерферона альфа (IFN-альфа) с помощью ELISA каждые сутки после трансфекции в соответствии с протоколами изготовителей. Клетки анализируют в отношении жизнеспособности с использованием CELL TITER GLO® (Promega, каталожный номер #G7570) через 6 ч и 18 ч после первого раунда трансфекции и каждые вторые сутки после этого. В то же время из собранных клеток тотальную РНК выделяют и обрабатывают DNASE® с использованием набора RNAEASY micro kit (каталожный номер #74004) в соответствии с протоколом изготовителя. 100 нг тотальной РНК используют для синтеза кДНК с использованием набора для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems, каталожный номер #4368814) в соответствии с протоколом изготовителя. Затем кДНК анализируют в отношении экспрессии генов врожденного иммунного ответа способом количественной ПЦР в реальном времени с использованием SybrGreen на устройстве Biorad CFX 384 в соответствии с протоколом изготовителя.
Пример 84. Транскрипция in vitro полимеразой T7 дикого типа
мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) и мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) были полностью модифицированными различными химическими структурами и комбинациями химических структур, приведенных в таблицах 34-37, с использованием полимеразы T7 дикого типа, как описано ранее.
Выход реакций трансляции определяли посредством спектрофотометрического измерения (OD260), и выход люциферазы представлен в таблице 34, и выход G-CSF представлен в таблице 36.
Модифицированную мРНК люциферазы и G-CSF также подвергали ферментативной реакции кэппирования, и каждую реакцию кэппирования модифицированной мРНК оценивали в отношении выхода с помощью спектрофотометрического измерения (OD260), и правильный размер оценивали с использованием биоанализатора. Выход реакции кэппирования для люциферазы представлен в таблице 35 и для G-CSF в таблице 37.
Таблица 34
Химическая структура для транскрипции люциферазы in vitro
Химическая модификация Выход (мг)
N6-метиладенозин 0,99
5-метилцитидин 1,29
N4-ацетилцитидин 1,0
5-формилцитидин 0,55
Псевдоуридин 2,0
N1-метилпсевдоуридин 1,43
2-тиоуридин 1,56
5-метоксиуридин 2,35
5-метилуридин 1,01
α-тиоцитидин 0,83
5-Br-уридин (5Bru) 1,96
5-(2-карбометоксивинил)уридин 0,89
5-(3-1E-пропениламино)уридин 2,01
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 1,34
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1,26
5-метилцитидин/5-метоксиуридин 1,38
5-метилцитидин/5-бромуридин 0,12
5-метилцитидин/5-метилуридин 2,97
5-метилцитидин/половина остатков уридина модифицированы 2-тиоуридином 1,59
5-метилцитидин/2-тиоуридин 0,90
5-метилцитидин/псевдоуридин 1,83
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1,33
Таблица 35
Кэппирующая химическая структура и выход для модифицированной мРНК люциферазы
Химическая модификация Выход (мг)
5-метилцитидин 1,02
N4-ацетилцитидин 0,93
5-формилцитидин 0,55
Псевдоуридин 2,07
N1-метилпсевдоуридин 1,27
2-тиоуридин 1,44
5-метоксиуридин 2
5-метилуридин 0,8
α-тиоцитидин 0,74
5-Br-уридин (5Bru) 1,29
5-(2-карбометоксивинил)уридин 0,54
5-(3-1E-пропениламино)уридин 1,39
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 0,99
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1,08
5-метилцитидин/5-метоксиуридин 1,13
5-метилцитидин/5-метилуридин 1,08
5-метилцитидин/половина остатков уридина модифицированы 2-тиоуридином 1,2
5-метилцитидин/2-тиоуридин 1,27
5-метилцитидин/псевдоуридин 1,19
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1,04
Таблица 36
Химическая структура для транскрипции in vitro и выход для модифицированной мРНК G-CSF
Химическая модификация Выход (мг)
N6-метиладенозин 1,57
5-метилцитидин 2,05
N4-ацетилцитидин 3,13
5-формилцитидин 1,41
Псевдоуридин 4,1
N1-метилпсевдоуридин 3,24
2-тиоуридин 3,46
5-метоксиуридин 2,57
5-метилуридин 4,27
4-тиоуридин 1,45
2'-F-уридин 0,96
α-тиоцитидин 2,29
2'-F-гуанозин 0,6
N-1-метиладенозин 0,63
5-Br-уридин (5Bru) 1,08
5-(2-карбометоксивинил)уридин 1,8
5-(3-1E-пропениламино)уридин 2,09
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 1,72
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1,37
5-метилцитидин/5-метоксиуридин 1,85
5-метилцитидин/5-метилуридин 1,56
5-метилцитидин/половина остатков уридина модифицированы 2-тиоуридином 1,84
5-метилцитидин/2-тиоуридин 2,53
5-метилцитидин/псевдоуридин 0,63
N4-ацетилцитидин/2-тиоуридин 1,3
N4-ацетилцитидин/5-бромуридин 1,37
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1,25
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 2,24
Таблица 37
Кэппирующая химическая структура и выход для модифицированной мРНК G-CSF
Химическая модификация Выход (мг)
N6-метиладенозин 1,04
5-метилцитидин 1,08
N4-ацетилцитидин 2,73
5-формилцитидин 0,95
Псевдоуридин 3,88
N1-метилпсевдоуридин 2,58
2-тиоуридин 2,57
5-метоксиуридин 2,05
5-метилуридин 3,56
4-тиоуридин 0,91
2'-F-уридин 0,54
α-тиоцитидин 1,79
2'-F-гуанозин 0,14
5-Br-уридин (5Bru) 0,79
5-(2-карбометоксивинил)уридин 1,28
5-(3-1E-пропениламино)уридин 1,78
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 0,29
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 0,33
5-метилцитидин/5-метоксиуридин 0,91
5-метилцитидин/5-метилуридин 0,61
5-метилцитидин/половина остатков уридина модифицированы 2-тиоуридином 1,24
5-метилцитидин/псевдоуридин 1,08
N4-ацетилцитидин/2-тиоуридин 1,34
N4-ацетилцитидин/5-бромуридин 1,22
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1,56
Пример 85. Транскрипция in vitro с мутантной полимеразой T7
мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) и мРНК GCSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) полностью модифицировали различными химическими структурами и комбинациями химических структур, приведенными в таблицах 38-41, с использованием мутантной полимеразы T7 (набор для транскрипции Durascribe® T7 Transcription kit (каталожный номер № DS010925) (Epicentre®, Madison, WI)).
Выход реакций трансляции определяли посредством спектрофотометрического измерения (OD260), и выход для люциферазы представлен в таблице 38, и выход для G-CSF представлен в таблице 40.
Модифицированную мРНК люциферазы и G-CSF также подвергали ферментативной реакции кэппирования, и каждую реакцию кэппирования модифицированной мРНК оценивали в отношении выхода с помощью спектрофотометрического измерения (OD260), и правильный размер оценивали с использованием биоанализатора. Выход реакции кэппирования для люциферазы представлвен в таблице 39, и выход для G-CSF представлен в таблице 41.
Таблица 38
Химическая структура для транскрипции in vitro и выход для модифицированной мРНК люциферазы
Химическая модификация Выход (мкг)
2’-фторцитозин 71,4
2’-фторуридин 57,5
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A 26,4
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A 73,3
N1-ацетилцитидин/2-фторуридин 202,2
5-метилцитидин/2-фторуридин 131,9
2-фторцитозин/псевдоуридин 119,3
2-фторцитозин/N1-метилпсевдоуридин 107,0
2-фторцитозин/2-тиоуридин 34,7
2-фторцитозин/5-бромуридин 81,0
2-фторцитозин/2-фторуридин 80,4
2-фторгуанин/5-метилцитозин 61,2
2-фторгуанин/5-метилцитозин/псевдоуридин 65,0
2-фторгуанин/5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 41,2
2-фторгуанин/псевдоуридин 79,1
2-фторгуанин/N1-метилпсевдоуридин 74,6
5-метилцитидин/псевдоуридин, испытание B 91,8
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B 72,4
2’-фтораденозин 190,98
Таблица 39
Кэппирующая химическая структура и выход для модифицированной мРНК люциферазы
Химическая модификация Выход (мкг)
2’-фторцитозин 19,2
2’-фторуридин 16,7
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A 7,0
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A 21,5
N1-ацетилцитидин/2-фторуридин 47,5
5-метилцитидин/2-фторуридин 53,2
2-фторцитозин/псевдоуридин 58,4
2-фторцитозин/N1-метилпсевдоуридин 26,2
2-фторцитозин/2-тиоуридин 12,9
2-фторцитозин/5-бромуридин 26,5
2-фторцитозин/2-фторуридин 35,7
2-фторгуанин/5-метилцитозин 24,7
2-фторгуанин/5-метилцитозин/псевдоуридин 32,3
2-фторгуанин/5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 31,3
2-фторгуанин/псевдоуридин 20,9
2-фторгуанин/N1-метилпсевдоуридин 29,8
5-метилцитидин/псевдоуридин, испытание B 58,2
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B 44,4
Таблица 40
Химическая структура для транскрипции in vitro и выход для модифицированной мРНК G-CSF
Химическая модификация Выход (мкг)
2’-фторцитозин 56,5
2’-фторуридин 79,4
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A 21,2
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A 77,1
N1-ацетилцитидин/2-фторуридин 168,6
5-метилцитидин/2-фторуридин 134,7
2-фторцитозин/псевдоуридин 97,8
2-фторцитозин/N1-метилпсевдоуридин 103,1
2-фторцитозин/2-тиоуридин 58,8
2-фторцитозин/5-бромуридин 88,8
2-фторцитозин/2-фторуридин 93,9
2-фторгуанин/5-метилцитозин 97,3
2-фторгуанин/5-метилцитозин/псевдоуридин 96,0
2-фторгуанин/5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 82,0
2-фторгуанин/псевдоуридин 68,0
2-фторгуанин/N1-метилпсевдоуридин 59,3
5-метилцитидин/псевдоуридин, испытание B 58,7
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B 78,0
Таблица 41
Кэппирующая химическая структура и выход для модифицированной мРНК G-CSF
Химическая модификация Выход (мкг)
2’-фторцитозин 16,9
2’-фторуридин 17,0
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A 10,6
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A 22,7
N1-ацетилцитидин/2-фторуридин 19,9
5-метилцитидин/2-фторуридин 21,3
2-фторцитозин/псевдоуридин 65,2
2-фторцитозин/N1-метилпсевдоуридин 58,9
2-фторцитозин/2-тиоуридин 41,2
2-фторцитозин/5-бромуридин 35,8
2-фторцитозин/2-фторуридин 36,7
2-фторгуанин/5-метилцитозин 36,6
2-фторгуанин/5-метилцитозин/псевдоуридин 37,3
2-фторгуанин/5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 30,7
2-фторгуанин/псевдоуридин 29,0
2-фторгуанин/N1-метилпсевдоуридин 22,7
5-метилцитидин/псевдоуридин, испытание B 60,4
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B 33,0
Пример 86. 2’-O-метил- и 2’-фтор-соединения
мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) продуцировали в качестве полностью модифицированных версий с химическими структурами, представленными в таблице 42, и транскрибировали с использованием мутантной полимеразы T7 (набор для транскрипции Durascribe® T7 Transcription kit (каталожный номер № DS010925) (Epicentre®, Madison, WI). 2’-Фтор-содержащую мРНК получали с использованием Durascribe T7, однако 2’O-метил-содержащую мРНК нельзя было транскрибировать с использованием Durascribe T7.
Включение 2’O-метил-модифицированной мРНК можно проводить с использованием других мутантных полимераз T7 (Nat Biotechnol. (2004) 22:1155-1160; Nucleic Acids Res. (2002) 30:e138). Альтернативно, 2’OMe-модификации можно вносить посттранскрипционно с использованием ферментативных способов.
Внесение модификаций на 2’-группу сахара имеет множество потенциальных преимуществ. Известно, что замены 2’-OMe, такие как замены на 2’-фтор, защищают от нуклеаз, и также было показано, что они устраняют распознавание врожденной иммунной системой при включении в другие нуклеиновые кислоты, такие как миРНК и антисмысловая РНК (Crooke, ed. Antisense Drug Technology, 2nd edition; Boca Raton: CRC press, включенная в полном объеме).
Затем 2’-фтор-модифицированную мРНК трансфицировали в клетки HeLa для оценки продукции белка в клеточном контексте, и ту же мРНК также оценивали в бесклеточной системе ретикулоцитов кролика. Контроль в виде немодифицированной люциферазы (природная люцифераза) использовали для обоих экспериментов по транскрипции, также анализировали контроль в виде трансфекции без обработки и имитирующей трансфекции (Lipofectamine 2000 отдельно) для трансфекции клеток HeLa и контроль без РНК для лизатов ретикулоцитов кролика.
Для экспериментов по трансфекции HeLa, за сутки до трансфекции, 20000 клеток HeLa (ATCC № CCL-2; Manassas, VA) собирали посредством обработки раствором трипсин-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) и высевали в общем объеме 100 мкл среды EMEM (дополненной 10% FCS и 1x Glutamax) на лунку в 96-луночном планшете для культивирования тканей (Corning, Manassas, VA). Клетки выращивали при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение ночи. На следующие сутки 83 нг 2’-фтор-содержащей модифицированной РНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) с химической модификацией, описанной в таблице 42, разбавляли OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY) до конечного объема 10 мкл. В качестве реагента для трансфекции использовали Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) и 0,2 мкл разбавляли OPTI-MEM до конечного объема 10 мкл. После инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут, оба раствора объединяли и инкубировали в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре. Затем 20 мкл объединенного раствора добавляли к 100 мкл среды для культивирования клеток, содержавшей клетки HeLa, и инкубировали при комнатной температуре. После инкубации в течение от 18 до 22 часов клетки, экспрессирующие люциферазу, лизировали 100 мкл буфера для пассивного лизиса (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкциями изготовителя. Аликвоты лизатов переносили в белые непрозрачные полистироловые 96-луночные планшеты (Corning, Manassas, VA) и комбинировали с 100 мкл полного раствора для анализа люциферазы (Promega, Madison, WI). Объемы лизатов корректировали или разбавляли до тех пор, пока не обнаруживалось не более 2 относительных световых единиц (RLU) на лунку для образцов с наиболее высоким сигналом, и RLU для каждой исследованной химической структуры представлены в таблице 42. Устройство для считывания планшетов представляло собой BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Фоновый сигнал планшетов без реагента составлял приблизительно 200 относительных световых единиц на лунку.
Для анализа лизата ретикулоцитов кролика, 2’-фтор-содержащую мРНК люциферазы разбавляли в стерильной не содержавшей нуклеаз воде до конечного количества 250 нг в 10 мкл и добавляли до 40 мкл свежеприготовленный лизат ретикулоцитов кролика, и реакцию трансляции in vitro проводили в стандартной 1,5-мл полипропиленовой реакционной пробирке (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) при 30°C в сухом нагревающем блоке. Анализ трансляции проводили с набором лизата ретикулоцитов кролика (обработанного нуклеазой) (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкциями изготовителя. Реакционный буфер дополняли смесью один к одному предоставленных исходных растворов аминокислот, лишенных либо лейцина, либо метионина, что обеспечивало реакционную смесь, содержавшую достаточные количества обеих аминокислот для обеспечения эффективной трансляции in vitro. После инкубации в течение 60 минут реакцию останавливали путем помещения реакционных пробирок на лед.
Аликвоты реакции трансляции in vitro, содержавшие модифицированную РНК люциферазы, переносили в белые непрозрачные полистироловые 96-луночные планшеты (Corning, Manassas, VA) и комбинировали с 100 мкл полного раствора для анализа люциферазы (Promega, Madison, WI). Объемы реакционных смесей для трансляции in vitro доводили или разбавляли до тех пор, пока не обнаруживалось не более 2 относительных световых единиц (RLU) на лунку для образцов с наиболее высоким сигналом, и RLU для каждой исследованной химической структуры представлены в таблице 43. Устройство для считывания планшетов представляло собой BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Фоновый сигнал планшетов без реагента составлял приблизительно 160 относительных световых единиц на лунку.
Как можно видеть из таблицы 42 и 43, множество 2’-фтор-содержащих соединений являются активными in vitro и продуцируют белок люциферазы.
Таблица 42
Клетки HeLa
Химическая модификация Концентрация (мкг/мл) Объем (мкл) Выход (мкг) RLU
2’-фтораденозин 381,96 500 190,98 388,5
2’-фторцитозин 654,56 500 327,28 2420
2’-фторгуанин 541795 500 270,90 11705,5
2’-фторуридин 944,005 500 472,00 6767,5
Природная люцифераза N/A N/A N/A 133853,5
Имитация N/A N/A N/A 340
Без обработки N/A N/A N/A 238
Таблица 43
Лизаты ретикулоцитов кролика
Химическая модификация RLU
2’-фтораденозин 162
2’-фторцитозин 208
2’-фторгуанин 371509
2’-фторуридин 258
Природная люцифераза 2159,968
Без РНК 156
Пример 87. Люцифераза в клетках HeLa с использованием комбинации модификаций
Для оценки с использованием 2’-фтор-модифицированной мРНК в комбинации с другой серией модификацированной мРНК транскрибировали с использованием либо полимеразы T7 дикого типа (не содержащие фтора соединения), либо с использованием мутантных полимераз T7 (фторсодержащие соединения), как описано в примере 86. Все модифицированные мРНК исследовали с помощью трансфекции клеток HeLa in vitro.
За сутки до трансфекции 20000 клеток HeLa (ATCC № CCL-2; Manassas, VA) собирали посредством обработки раствором трипсин-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) и высевали в общем объеме 100 мкл среды EMEM (дополненной 10% FCS и 1x Glutamax) на лунку в 96-луночный планшет для культивирования клеток (Corning, Manassas, VA). Клетки выращивали при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение ночи. На следующие сутки 83 нг модифицированной РНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) с химической модификацией, описанной в таблице 44, разбавляли OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY) до конечного объема 10 мкл. В качестве реагента для трансфекции использовали Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) и 0,2 мкл разбавляли OPTI-MEM до конечного объема 10 мкл. После инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут, оба раствора объединяли и инкубировали в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре. Затем 20 мкл объединенного раствора добавляли к 100 мкл среды для культивирования клеток, содержавшей клетки HeLa, и инкубировали при комнатной температуре.
После инкубации в течение от 18 до 22 часов клетки, экспрессирующие люциферазу, лизировали 100 мкл буфера для пассивного лизиса (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкциями изготовителя. Аликвоты лизатов переносили в белые непрозрачные полистироловые 96-луночные планшеты (Corning, Manassas, VA) и комбинировали с 100 мкл полного раствора для анализа люциферазы (Promega, Madison, WI). Объемы лизатов корректировали или разбавляли до тех пор, пока не обнаруживалось не более 2 относительных световых единиц (RLU) на лунку для образцов с наиболее высоким сигналом, и RLU для каждой исследованной химической структуры представлены в таблице 44. Устройство для считывания планшетов представляло собой BioTek Synergy H1 (BioTek, Winooski, VT). Фоновый сигнал планшетов без реагента составлял приблизительно 200 относительных световых единиц на лунку.
Как видно из таблицы 44, большинство комбинаций модификаций обеспечивало мРНК, которая продуцировала функциональный белок люциферазы, включая все не содержащие фтор соединения и многие из комбинаций, содержащих 2’-фтор-модификации.
Таблица 44
Люцифераза
Химическая модификация RLU
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 113796
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 316326
5-метилцитидин/5-метоксиуридин 24948
5-метилцитидин/5-метилуридин 43675
5-метилцитидин/половина остатков уридина модифицированы 2-тиоуридином 41601
5-метилцитидин/2-тиоуридин 1102
5-метилцитидин/псевдоуридин 51035
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 152151
N4-ацетилцитидин/2-фторуридинтрифосфат 288
5-метилцитидин/2-фторуридинтрифосфат 269
2-фторцитозинтрифосфат/псевдоуридин 260
2-фторцитозинтрифосфат/N1-метилпсевдоуридин 412
2-фторцитозинтрифосфат/2-тиоуридин 427
2-фторцитозинтрифосфат/5-бромуридин 253
2-фторцитозинтрифосфат/2-фторуридинтрифосфат 184
2-фторгуанинтрифосфат/5-метилцитидин 321
2-фторгуанинтрифосфат/5-метилцитидин/псевдоуридин 207
2-фторгуанин/5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 235
2-фторгуанин/псевдоуридин 218
2-фторгуанин/N1-метилпсевдоуридин 247
5-метилцитидин/псевдоуридин, испытание A 13833
5-метилцитидин/N-метилпсевдоуридин, испытание A 598
2'-фторцитозинтрифосфат 201
2'-фторуридинтрифосфат 305
5-метилцитидин/псевдоуридин, испытание B 115401
5-метилцитидин/N-метилпсевдоуридин, испытание B 21034
Природная люцифераза 30801
Без обработки 344
Имитация 262
Пример 88. Транскрипция G-CSF in vitro
Для оценки активности всех различных химических модификаций в контексте второй открытой рамки считывания, авторы настоящего изобретения повторили эксперименты, ранее проведенные с использованием мРНК люциферазы, для мРНК G-CSF человека. мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) полностью модифицировали химическими структурами, представленными в таблицах 45 и 46, с использованием полимеразы T7 дикого типа (для всех не содержащих фтор соединений) или мутантной полимеразы T7 (для всех фторсодержащих соединений). Мутантную полимеразу T7 приобретали из коммерческих источников (набор для транскрипции Durascribe® T7 Transcription kit (каталожный номер № DS010925) (Epicentre®, Madison, WI).
Модифицированную РНК в таблицах 45 и 46 трансфицировали in vitro в клетки HeLa или добавляли к лизатам ретикулоцитов кролика (250 нг модифицированной мРНК), как указано. Также анализировали контроль в виде имитирующей трансфекции без обработки (реагент для трансфекции отдельно), G-CSF, полностью модифицированный 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином, или контроль в виде люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1), полностью модифицированный 5-метилцитозином и N1-метилпсевдоуридином. Экспрессию белка G-CSF определяли способом ELISA, и величины представлены в таблицах 45 и 46. В таблице 45 "NT" означает "не исследовали".
Как показано в таблице 45, многие, но не все, химические модификации приводили к продукции белка G-CSF человека. Эти результаты для клеточных и бесклеточных систем трансляции коррелируют очень высоко, причем одни и те же модификации обычно работали или не работали в обеих системах. Одним примечательным исключением является модифицированная 5-формилцитидином мРНК G-CSF, которая работала в бесклеточной системе трансляции, но не в системе трансфекции на основе клеток HeLa. Сходные отличия между этими двумя анализами также наблюдали для модифицированной 5-формилцитидином мРНК люциферазы.
Как продемонстрировано в таблице 46, многие, но не все, модифицированные структуры мРНК G-CSF (при использовании в комбинации) продемонстрировали активность in vivo. Кроме того, присутствие N1-метилпсевдоуридина в модифицированной мРНК (с N4-ацетилцитидином или 5-метилцитидином) продемонстрировало более высокую экспрессию, чем когда те же комбинации исследовали с использованием псевдоуридина. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что содержащая N1-метилпсевдоуридин мРНК G-CSF приводит к увеличенной экспрессии белка in vitro.
Таблица 45
Экспрессия G-CSF
Химическая модификация белок G-CSF (пг/мл)
Клетки HeLa 		белок G-CSF (пг/мл)
лизаты ретикулоцитов кролика
Псевдоуридин 1150909 147875
5-метилуридин 347045 147250
2-тиоуридин 417273 18375
N1-метилпсевдоуридин NT 230000
4-тиоуридин 107273 52375
5-метоксиуридин 1715909 201750
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание A 609545 119750
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание A 1534318 110500
2'-фторгуанозин 11818 0
2'-фторуридин 60455 0
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание B 358182 57875
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание B 1568636 76750
5-бромуридин 186591 72000
5-(2-карбометоксивинил)уридин 1364 0
5-[3(1-E-пропениламино)уридин] 27955 32625
α-тиоцитидин 120455 42625
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание C 882500 49250
N1-метиладенозин 4773 0
N6-метиладенозин 1591 0
5-метилцитидин 646591 79375
N4-ацетилцитидин 39545 8000
5-формилцитидин 0 24000
5-метилцитозин/псевдоуридин, испытание D 87045 47750
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, испытание D 1168864 97125
Имитация 909 682
Без обработки 0 0
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, контроль 1106591 NT
Контроль в виде люциферазы NT 0
Таблица 46
Комбинированные химические структуры в клетках HeLa
Химическая модификация Белок G-CSF (пг/мл)
Клетки HeLa
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 537273
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1091818
5-метилцитидин/5-метоксиуридин 516136
5-метилцитидин/5-бромуридин 48864
5-метилцитидин/5-метилуридин 207500
5-метилцитидин/2-тиоуридин 33409
N4-ацетилцитидин/5-бромуридин 211591
N4-ацетилцитидин/2-тиоуридин 46136
5-метилцитозин/псевдоуридин 301364
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин 1017727
N4-ацетилцитидин/2-фторуридинтрифосфат 62273
5-метилцитидин/2-фторуридинтрифосфат 49318
2-фторцитозинтрифосфат/псевдоуридин 7955
2-фторцитозинтрифосфат/N1-метилпсевдоуридин 1364
2-фторцитозинтрифосфат/2-тиоуридин 0
2-фторцитозинтрифосфат/5-бромуридин 1818
2-фторцитозинтрифосфат/2-фторуридинтрифосфат 909
2-фторгуанинтрифосфат/5-метилцитидин 0
2-фторгуанинтрифосфат/5-метилцитидин/псевдоуридин 0
2-фторгуанинтрифосфат/5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 1818
2-фторгуанинтрифосфат/псевдоуридин 1136
2-фторгуанинтрифосфат/2-фторцитозин трифосфат/N1-метилпсевдоуридин 0
5-метилцитидин/псевдоуридин 617727
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 747045
5-метилцитидин/псевдоуридин 475455
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 689091
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, контроль 1 848409
5-метилцитозин/N1-метилпсевдоуридин, контроль 2 581818
Имитация 682
Без обработки 0
Люцифераза, 2-фторцитозинтрифосфат 0
Люцифераза, 2-фторуридинтрифосфат 0
Пример 89. Скрининг химических структур
В приведенных ниже таблицах (таблицы 47-49) обобщена основная часть данных скрининга in vitro и in vitro с различными соединениями, представленными в предшествующих примерах. Высокая корреляция существует между клеточными и бесклеточными анализами трансляции. Замены одними и теми же химическими структурами, как правило, демонстрируют высокое соответствие при исследовании в контексте как мРНК люциферазы, так и мРНК G-CSF. Наконец, мРНК, содержащая N1-метилпсевдоуридин, демонстрирует очень низкий уровень экспрессии белка с от небольшой до неподдающейся обнаружению стимуляцией цитокинов in vitro и in vivo, и превосходит мРНК, содержащую псевдоуридин, как in vitro, так и in vivo.
мРНК люциферазы (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 3; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) и мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) модифицировали встречающимися в природе и не встречающимися в природе химическими структурами, описанными в таблицах 47 и 48, или комбинацией химических структур, описанных в таблице 48, и исследовали с использованием способов, описанных в настоящем описании.
В таблицах 47 и 48 "*" относится к реакции транскрипции in vitro с использованием мутантной полимеразы T7 (набор для транскрипции Durascribe® T7 Transcription kit (каталожный номер № DS010925) (Epicentre®, Madison, WI); "**" относится ко второму результату реакции транскрипции in vitro с использованием мутантной полимеразы T7 (набор для транскрипции Durascribe® T7 Transcription kit (каталожный номер № DS010925) (Epicentre®, Madison, WI); "***" относится к продукции, наблюдаемой при бесклеточной трансляции (лизаты ретикулоцитов кролика); продукция белка в HeLa оценивается как "+", "+/-" и "-"; при указании на PBMC из G-CSF "++++" означает более 6000 пг/мл G-CSF, "+++" означает более 3000 пг/мл G-CSF, "++" означает более 1500 пг/мл G-CSF, "+" означает более 300 пг/мл G-CSF, "+/-" означает 150-300 пг/мл G-CSF, и фоновый уровень составлял приблизительно 110 пг/мл; при указании на цитокин из PBMC "++++" означает более 1000 пг/мл интерферона-альфа (IFN-альфа), "+++" означает более 600 пг/мл IFN-альфа, "++" означает более 300 пг/мл IFN-альфа, "+" означает более 100 пг/мл IFN-альфа, "-" означает менее 100 пг/мл, и фоновый уровень составлял приблизительно 70 пг/мл; и "NT" означает "не исследовали". В таблице 48 продукцию белка оценивали с использованием мутантной полимеразы T7 (набор для транскрипции Durascribe® T7 Transcription kit (каталожный номер № DS010925) (Epicentre®, Madison, WI).
Таблица 47
Встречающиеся в природе
Общее название (обозначение) IVT (Luc) IVT (G-CSF) Белок (Luc; HeLa) Белок (G-CSF; HeLa) Белок (G-CSF; PBMC) Цитокины (G-CSF; PBMC) Белок in vivo (Luc) Белок in vivo (G-CSF)
1-метиладенозин (m1A) Не сработал Сработал NT - +/- ++ NT NT
N6-метиладенозин (m6A) Сработал Сработал - - +/- ++++ NT NT
2'-O-метиладенозин (Am) Не сработал* Не проводили NT NT NT NT NT NT
5-метилцитидин (m5C) Сработал Сработал + + + ++ + NT
2'-O-метилцитидин (Cm) Не сработал* Не проводили NT NT NT NT NT NT
2-тиоцитидин (s2C) Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
N4-ацетилцитидин (ac4C) Сработал Сработал + + +/- +++ + NT
5-формилцитидин (f5C) Сработал Сработал -*** -*** - + NT NT
2'-O-метилгуанозин (Gm) Не сработал* Не проводили NT NT NT NT NT NT
инозин (I) Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
псевдоуридин (Y) Сработал Сработал + + ++ + + NT
5-метилуридин (m5U) Сработал Сработал + + +/- + NT NT
2'-O-метилуридин (Um) Не сработал* Не проводили NT NT NT NT NT NT
1-метилпсевдоуридин (m1Y) Сработал Сработал + Не проводили ++++ - + NT
2-тиоуридин (s2U) Сработал Сработал - + + + NT NT
4-тиоуридин (s4U) Не сработал Сработал + +/- ++ NT NT
5-метоксиуридин (mo5U) Сработал Сработал + + ++ - + NT
3-метилуридин (m3U) Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
Таблица 48
Не встречающиеся в природе
Общее название IVT (Luc) IVT (G-CSF) Белок (Luc; HeLa) Белок (G-CSF; HeLa) Белок (G-CSF; PBMC) Цитокины (G-CSF; PBMC) Белок in vivo (Luc) Белок in vivo (G-CSF)
2'-F-ара-гуанозин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
2'-F-ара-аденозин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
2'-F-ара-цитидин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
2'-F-ара-уридин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
2'-F-гуанозин Не сработал/ Сработал** Сработал/
Не сработал**		 +** +/- - + + NT
2'-F-аденозин Не сработал/ Сработал** Не сработал/
Не сработал**		 -** NT NT NT NT NT
2'-F-цитидин Не сработал/
Сработал**		 Не сработал/
Сработал**		 +** NT NT NT + NT
2'-F-уридин Не сработал/ Сработал** Сработал/
Сработал**		 +** + +/- + - NT
2'-OH-ара-гуанозин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
2'-OH-ара-аденозин Не проводили Не проводили NT NT NT NT NT NT
2'-OH-ара-цитидин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
2'-OH-ара-уридин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
5-Br-Уридин Сработал Сработал + + + + +
5-(2-карбометокси-винил)уридин Сработал Сработал - - +/- -
5-[3-(1-E-пропениламино)
уридин] (также химическая структура 5) 		Сработал Сработал - + + -
N6-(19-амино-пентаоксанона-децил) A Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
2-диметиламино гуанозин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
6-азацитидин Не сработал Не сработал NT NT NT NT NT NT
a-Тиоцитидин Сработал Сработал + + +/- +++ NT NT
Псевдоизоцитидин NT NT NT NT NT NT NT NT
5-Йодуридин NT NT NT NT NT NT NT NT
a-Тиоуридин NT NT NT NT NT NT NT NT
6-Азауридин NT NT NT NT NT NT NT NT
Дезокситимидин NT NT NT NT NT NT NT NT
a-тиогуанозин NT NT NT NT NT NT NT NT
8-оксогуанозин NT NT NT NT NT NT NT NT
O6-метилгуанозин NT NT NT NT NT NT NT NT
7-деазагуанозин NT NT NT NT NT NT NT NT
6-хлорпурин NT NT NT NT NT NT NT NT
a-тиоаденозин NT NT NT NT NT NT NT NT
7-деазааденозин NT NT NT NT NT NT NT NT
5-йодцитидин NT NT NT NT NT NT NT NT
В таблице 49 продукция белка в HeLa оценивается с помощью "+", "+/-" и "-"; при указании на G-CSF из PBMC "++++" означает более 6000 пг/мл G-CSF, "+++" означает более 3000 пг/мл G-CSF, "++" означает более 1500 пг/мл G-CSF, "+" означает более 300 пг/мл G-CSF, "+/-" означает 150-300 пг/мл G-CSF, и фоновое значение составляло приблизительно 110 пг/мл; при указании на цитокин из PBMC "++++" означает более 1000 пг/мл интерферона-альфа (IFN-альфа), "+++" означает более 600 пг/мл IFN-альфа, "++" означает более 300 пг/мл IFN-альфа, "+" означает более 100 пг/мл IFN-альфа, "-" означает более 100 пг/мл, и фоновое значение составляло приблизительно 70 пг/мл; "WT" относится к полимеразе T7 дикого типа, "MT" относится к мутантной полимеразе T7 (набор для транскрипции Durascribe® T7 Transcription kit (каталожный номер № DS010925) (Epicentre®, Madison, WI), и "NT" означает не исследовали.
Таблица 49
Комбинация химических структур
Аналог цитидина Аналог уридина Пу-рин IVT Luc IVT (G-CSF) Белок (Luc; HeLa) Белок (G-CSF; HeLa) Белок (G-CSF; PBMC) Цитокины (G-CSF; PBMC) Белок in vivo (Luc)
N4-ацетил-цитидин псевдоуридин A,G Сработал WT Сработал WT + + NT NT +
N4-ацетил-цитидин N1-метилпсевдо-уридин A,G Сработал WT Сработал WT + + NT NT +
5-метил-цитидин 5-метокси-уридин A,G Сработал WT Сработал WT + + NT NT +
5-метил-цитидин 5-бромуридин A,G Сработал WT Сработал WT Не про-води-ли + NT NT
5-метил-цитидин 5-метил-уридин A,G Сработал WT Сработал WT + + NT NT +
5-метил-цитидин 50% 2-тиоуридин; 50% уридин A,G Сработал WT Сработал WT + NT NT NT +
5-метил-цитидин 100% 2-тиоуридин A,G Сработал WT Сработал WT - + NT NT
5-метил-цитидин псевдоуридин A,G Сработал WT Сработал WT + + ++ + +
5-метил-цитидин N1-метил-псевдоуридин A,G Сработал WT Сработал WT + + ++++ - +
N4-ацетил-цитидин 2-тиоуридин A,G Не прово-дили Сработал WT Не проводили + NT NT NT
N4-ацетил-цитидин 5-бромуридин A, G Не прово-дили Сработал WT Не проводили + NT NT NT
N4-ацетил-цитидин 2-Фторуридин трифосфат A,G Сработал Сработал - + NT NT NT
5-метил-цитидин 2-Фторуридин трифосфат A,G Сработал Сработал - + NT NT NT
2-Фторцито-зин трифосфат псевдоуридин A,G Сработал Сработал - + NT NT NT
2-Фторцито-зин трифосфат N1-метил-псевдоуридин A,G Сработал Сработал - +/- NT NT NT
2-Фторцито-зин трифосфат 2-тиоуридин A,G Сработал Сработал - - NT NT NT
2-Фторцитозин трифосфат 5-бромуридин A,G Сработал Сработал - +/- NT NT NT
2-Фторцито-зин трифосфат 2-Фторуридин трифосфат A,G Сработал Сработал - +/- NT NT NT
5-метил-цитидин уридин A,2 Фтор GTP Сработал Сработал - - NT NT NT
5-метил-цитидин псевдоуридин A,2 Фтор GTP Сработал Сработал - - NT NT NT
5-метил-цитидин N1-метил-псевдоуридин A,2 Фтор GTP Сработал Сработал - +/- NT NT NT
2-Фторцито-зин трифосфат псевдоуридин A,2 Фтор GTP Сработал Сработал - +/- NT NT NT
2-Фторцито-зин трифосфат N1-метил-псевдоуридин A,2 Фтор GTP Сработал Сработал - - NT NT NT
Пример 90. 2-фтор-химические структуры в PBMC
Способность модифицированной мРНК G-CSF (последовательность мРНК, представленная в SEQ ID NO: 1; поли-A-концевая часть приблизительно из 160 нуклеотидов, не показанная в последовательности; 5’-кэп, кэп 1) запускать врожденный иммунный ответ определяли путем измерения продукции интерферона-альфа (IFN-альфа) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа). Использование культур PBMC in vitro является общепризнанным способом измерения иммуностимулирующего потенциала олигонуклеотидов (Robbins et al., Oligonucleotides 2009 19:89-102), и способы трансфекции описаны в настоящем описании. В таблице 50 представлено среднее значение продукции интерферона-альфа (IFN-альфа) и фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа) с течением времени при измерении с помощью специфической ELISA для 2 или 3 отдельных доноров PBMC. Также анализировали контроли R848, P(I)P(C), LPS и Lipofectamine 2000 (L2000).
Что касается распознавания врожденной иммунной системой, хотя обе модифицированные химические структуры мРНК в большой степени препятствовали продукции IFN-альфа и TNF-альфа относительно положительных контролей (R848, P(I)P(C)), 2-фторсоединения снижают продукцию IFN-альфа и TNF-альфа даже ниже, чем другие комбинации, и комбинации N4-ацетилцитидин повышают профиль цитокинов.
Таблица 50
IFN-альфа и TNF-альфа
IFN-альфа:
Среднее значение для 3 доноров (пг/мл) 		TNF-альфа:
Среднее значение для 2 доноров (пг/мл)
L2000 1 361
P(I)P(C) 482 544
R848 45 8235
LPS 0 6889
N4-ацетилцитидин/псевдоуридин 694 528
N4-ацетилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 307 283
5-метилцитидин/5-метоксиуридин 0 411
5-метилцитидин/5-бромуридин 0 270
5-метилцитидин/5-метилуридин 456 428
5-метилцитидин/2-тиоуридин 274 277
N4-ацетилцитидин/2-тиоуридин 0 285
N4-ацетилцитидин/5-бромуридин 44 403
5-метилцитидин/псевдоуридин 73 332
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 31 280
N4-ацетилцитидин/2-фторуридинтрифосфат 35 32
5-метилцитидин/2-фторуридинтрифосфат 24 0
2-фторцитидинтрифосфат/N1-метилпсевдоуридин 0 11
2-фторцитидинтрифосфат/2-тиоуридин 0 0
2-фторцитидин/трифосфат-5-бромуридин 12 2
2-фторцитидинтрифосфат/2-фторуридинтрифосфат 11 0
2-фторцитидинтрифосфат/5-метилцитидин 14 23
2-фторцитидинтрифосфат/5-метилцитидин/псевдоуридин 6 21
2-фторцитидинтрифосфат/5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 3 15
2-фторцитидинтрифосфат/псевдо-уридин 0 4
2-фторцитидинтрифосфат/N1-метилпсевдоуридин 6 20
5-метилцитидин/псевдоуридин 82 18
5-метилцитидин/N1-метилпсевдоуридин 35 3
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Следует понимать, что хотя настоящее изобретение описано с помощью его подробного описания, представленное выше описание предназначено для иллюстрации, но не для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в объеме представленной ниже формулы изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> MODEРНК THERAPEUTICS
<120> МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ, НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И
ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> M009.20/2030.1009PCT
<140> PCT/US12/XXXXX
<141> 2012-10-03
<150> 61/542,533
<151> 2011-10-03
<160> 6
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 758
<212> РНК
<213> Homo Sapiens
<400> 1
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug gccggucccg 60
cgacccaaag ccccaugaaa cuuauggccc ugcaguugcu gcuuuggcac ucggcccucu 120
ggacagucca agaagcgacu ccucucggac cugccucauc guugccgcag ucauuccuuu 180
ugaagugucu ggagcaggug cgaaagauuc agggcgaugg agccgcacuc caagagaagc 240
ucugcgcgac auacaaacuu ugccaucccg aggagcucgu acugcucggg cacagcuugg 300
ggauucccug ggcuccucuc ucguccuguc cgucgcaggc uuugcaguug gcagggugcc 360
uuucccagcu ccacuccggu uuguucuugu aucagggacu gcugcaagcc cuugagggaa 420
ucucgccaga auugggcccg acgcuggaca cguugcagcu cgacguggcg gauuucgcaa 480
caaccaucug gcagcagaug gaggaacugg ggauggcacc cgcgcugcag cccacgcagg 540
gggcaaugcc ggccuuugcg uccgcguuuc agcgcagggc ggguggaguc cucguagcga 600
gccaccuuca aucauuuuug gaagucucgu accgggugcu gagacaucuu gcgcagccgu 660
gaagcgcugc cuucugcggg gcuugccuuc uggccaugcc cuucuucucu cccuugcacc 720
uguaccucuu ggucuuugaa uaaagccuga guaggaag 758
<210> 2
<211> 1838
<212> ДНК
<213> Homo Sapiens
<400> 2
taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc 60
caccatggaa gatgcgaaga acatcaagaa gggacctgcc ccgttttacc ctttggagga 120
cggtacagca ggagaacagc tccacaaggc gatgaaacgc tacgccctgg tccccggaac 180
gattgcgttt accgatgcac atattgaggt agacatcaca tacgcagaat acttcgaaat 240
gtcggtgagg ctggcggaag cgatgaagag atatggtctt aacactaatc accgcatcgt 300
ggtgtgttcg gagaactcat tgcagttttt catgccggtc cttggagcac ttttcatcgg 360
ggtcgcagtc gcgccagcga acgacatcta caatgagcgg gaactcttga atagcatggg 420
aatctcccag ccgacggtcg tgtttgtctc caaaaagggg ctgcagaaaa tcctcaacgt 480
gcagaagaag ctccccatta ttcaaaagat catcattatg gatagcaaga cagattacca 540
agggttccag tcgatgtata cctttgtgac atcgcatttg ccgccagggt ttaacgagta 600
tgacttcgtc cccgagtcat ttgacagaga taaaaccatc gcgctgatta tgaattcctc 660
gggtagcacc ggtttgccaa agggggtggc gttgccccac cgcactgctt gtgtgcggtt 720
ctcgcacgct agggatccta tctttggtaa tcagatcatt cccgacacag caatcctgtc 780
cgtggtacct tttcatcacg gttttggcat gttcacgact ctcggctatt tgatttgcgg 840
tttcagggtc gtacttatgt atcggttcga ggaagaactg tttttgagat ccttgcaaga 900
ttacaagatc cagtcggccc tccttgtgcc aacgcttttc tcattctttg cgaaatcgac 960
acttattgat aagtatgacc tttccaatct gcatgagatt gcctcagggg gagcgccgct 1020
tagcaaggaa gtcggggagg cagtggccaa gcgcttccac cttcccggaa ttcggcaggg 1080
atacgggctc acggagacaa catccgcgat ccttatcacg cccgagggtg acgataagcc 1140
gggagccgtc ggaaaagtgg tccccttctt tgaagccaag gtcgtagacc tcgacacggg 1200
aaaaaccctc ggagtgaacc agaggggcga gctctgcgtg agagggccga tgatcatgtc 1260
aggttacgtg aataaccctg aagcgacgaa tgcgctgatc gacaaggatg ggtggttgca 1320
ttcgggagac attgcctatt gggatgagga tgagcacttc tttatcgtag atcgacttaa 1380
gagcttgatc aaatacaaag gctatcaggt agcgcctgcc gagctcgagt caatcctgct 1440
ccagcacccc aacattttcg acgccggagt ggccgggttg cccgatgacg acgcgggtga 1500
gctgccagcg gccgtggtag tcctcgaaca tgggaaaaca atgaccgaaa aggagatcgt 1560
ggactacgta gcatcacaag tgacgactgc gaagaaactg aggggagggg tagtctttgt 1620
ggacgaggtc ccgaaaggct tgactgggaa gcttgacgct cgcaaaatcc gggaaatcct 1680
gattaaggca aagaaaggcg ggaaaatcgc tgtctgataa gctgccttct gcggggcttg 1740
ccttctggcc atgcccttct tctctccctt gcacctgtac ctcttggtct ttgaataaag 1800
cctgagtagg aaggcggccg ctcgagcatg catctaga 1838
<210> 3
<211> 1796
<212> РНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug gaagaugcga 60
agaacaucaa gaagggaccu gccccguuuu acccuuugga ggacgguaca gcaggagaac 120
agcuccacaa ggcgaugaaa cgcuacgccc ugguccccgg aacgauugcg uuuaccgaug 180
cacauauuga gguagacauc acauacgcag aauacuucga aaugucggug aggcuggcgg 240
aagcgaugaa gagauauggu cuuaacacua aucaccgcau cguggugugu ucggagaacu 300
cauugcaguu uuucaugccg guccuuggag cacuuuucau cggggucgca gucgcgccag 360
cgaacgacau cuacaaugag cgggaacucu ugaauagcau gggaaucucc cagccgacgg 420
ucguguuugu cuccaaaaag gggcugcaga aaauccucaa cgugcagaag aagcucccca 480
uuauucaaaa gaucaucauu auggauagca agacagauua ccaaggguuc cagucgaugu 540
auaccuuugu gacaucgcau uugccgccag gguuuaacga guaugacuuc guccccgagu 600
cauuugacag agauaaaacc aucgcgcuga uuaugaauuc cucggguagc accgguuugc 660
caaagggggu ggcguugccc caccgcacug cuugugugcg guucucgcac gcuagggauc 720
cuaucuuugg uaaucagauc auucccgaca cagcaauccu guccguggua ccuuuucauc 780
acgguuuugg cauguucacg acucucggcu auuugauuug cgguuucagg gucguacuua 840
uguaucgguu cgaggaagaa cuguuuuuga gauccuugca agauuacaag auccagucgg 900
cccuccuugu gccaacgcuu uucucauucu uugcgaaauc gacacuuauu gauaaguaug 960
accuuuccaa ucugcaugag auugccucag ggggagcgcc gcuuagcaag gaagucgggg 1020
aggcaguggc caagcgcuuc caccuucccg gaauucggca gggauacggg cucacggaga 1080
caacauccgc gauccuuauc acgcccgagg gugacgauaa gccgggagcc gucggaaaag 1140
ugguccccuu cuuugaagcc aaggucguag accucgacac gggaaaaacc cucggaguga 1200
accagagggg cgagcucugc gugagagggc cgaugaucau gucagguuac gugaauaacc 1260
cugaagcgac gaaugcgcug aucgacaagg augggugguu gcauucggga gacauugccu 1320
auugggauga ggaugagcac uucuuuaucg uagaucgacu uaagagcuug aucaaauaca 1380
aaggcuauca gguagcgccu gccgagcucg agucaauccu gcuccagcac cccaacauuu 1440
ucgacgccgg aguggccggg uugcccgaug acgacgcggg ugagcugcca gcggccgugg 1500
uaguccucga acaugggaaa acaaugaccg aaaaggagau cguggacuac guagcaucac 1560
aagugacgac ugcgaagaaa cugaggggag ggguagucuu uguggacgag gucccgaaag 1620
gcuugacugg gaagcuugac gcucgcaaaa uccgggaaau ccugauuaag gcaaagaaag 1680
gcgggaaaau cgcugucuga uaagcugccu ucugcggggc uugccuucug gccaugcccu 1740
ucuucucucc cuugcaccug uaccucuugg ucuuugaaua aagccugagu aggaag 1796
<210> 4
<211> 854
<212> РНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug guauccaagg 60
gggaggagga caacauggcg aucaucaagg aguucaugcg auucaaggug cacauggaag 120
guucggucaa cggacacgaa uuugaaaucg aaggagaggg ugaaggaagg cccuaugaag 180
ggacacagac cgcgaaacuc aaggucacga aagggggacc acuuccuuuc gccugggaca 240
uucuuucgcc ccaguuuaug uacgggucca aagcauaugu gaagcauccc gccgauauuc 300
cugacuaucu gaaacucagc uuucccgagg gauucaagug ggagcggguc augaacuuug 360
aggacggggg uguagucacc guaacccaag acucaagccu ccaagacggc gaguucaucu 420
acaaggucaa acugcggggg acuaacuuuc cgucggaugg gccggugaug cagaagaaaa 480
cgaugggaug ggaagcguca ucggagagga uguacccaga agauggugca uugaaggggg 540
agaucaagca gagacugaag uugaaagaug ggggacauua ugaugccgag gugaaaacga 600
cauacaaagc gaaaaagccg gugcagcuuc ccggagcgua uaaugugaau aucaaguugg 660
auauuacuuc acacaaugag gacuacacaa uugucgaaca guacgaacgc gcugagggua 720
gacacucgac gggaggcaug gacgaguugu acaaaugaua agcugccuuc ugcggggcuu 780
gccuucuggc caugcccuuc uucucucccu ugcaccugua ccucuugguc uuugaauaaa 840
gccugaguag gaag 854
<210> 5
<211> 725
<212> РНК
<213> Homo sapiens
<400> 5
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug ggagugcacg 60
agugucccgc gugguugugg uugcugcugu cgcucuugag ccucccacug ggacugccug 120
ugcugggggc accacccaga uugaucugcg acucacgggu acuugagagg uaccuucuug 180
aagccaaaga agccgaaaac aucacaaccg gaugcgccga gcacugcucc cucaaugaga 240
acauuacugu accggauaca aaggucaauu ucuaugcaug gaagagaaug gaaguaggac 300
agcaggccgu cgaagugugg caggggcucg cgcuuuuguc ggaggcggug uugcgggguc 360
aggcccuccu cgucaacuca ucacagccgu gggagccccu ccaacuucau gucgauaaag 420
cggugucggg gcuccgcagc uugacgacgu ugcuucgggc ucugggcgca caaaaggagg 480
cuauuucgcc gccugacgcg gccuccgcgg caccccuccg aacgaucacc gcggacacgu 540
uuaggaagcu uuuuagagug uacagcaauu uccuccgcgg aaagcugaaa uuguauacug 600
gugaagcgug uaggacaggg gaucgcugau aagcugccuu cugcggggcu ugccuucugg 660
ccaugcccuu cuucucuccc uugcaccugu accucuuggu cuuugaauaa agccugagua 720
ggaag 725
<210> 6
<211> 1536
<212> РНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaau gcagcgcguc 60
aacaugauua uggccgaauc gccgggacuc aucacaaucu gccucuuggg uuaucucuug 120
ucggcagaau guaccguguu cuuggaucac gaaaacgcga acaaaauucu uaaucgcccg 180
aagcgguaua acuccgggaa acuugaggag uuugugcagg gcaaucuuga acgagagugc 240
auggaggaga aaugcuccuu ugaggaggcg agggaagugu uugaaaacac agagcgaaca 300
acggaguuuu ggaagcaaua cguagauggg gaccagugug agucgaaucc gugccucaau 360
gggggaucau guaaagauga caucaauagc uaugaaugcu ggugcccguu uggguuugaa 420
gggaagaacu gugagcugga ugugacgugc aacaucaaaa acggacgcug ugagcaguuu 480
uguaagaacu cggcugacaa uaagguagua ugcucgugca cagagggaua ccggcuggcg 540
gagaaccaaa aaucgugcga gcccgcaguc ccguucccuu gugggagggu gagcguguca 600
cagacuagca aguugacgag agcggagacu guauuccccg acguggacua cgucaacagc 660
accgaagccg aaacaauccu cgauaacauc acgcagagca cucaguccuu caaugacuuu 720
acgagggucg uaggugguga ggacgcgaaa cccggucagu uccccuggca ggugguauug 780
aacggaaaag ucgaugccuu uuguggaggu uccauuguca acgagaagug gauugucaca 840
gcggcacacu gcguagaaac aggagugaaa aucacgguag uggcgggaga gcauaacauu 900
gaagagacag agcacacgga acaaaagcga aaugucauca gaaucauucc acaccauaac 960
uauaacgcgg caaucaauaa guacaaucac gacaucgcac uuuuggagcu ugacgaaccu 1020
uuggugcuua auucguacgu caccccuauu uguauugccg acaaagagua uacaaacauc 1080
uucuugaaau ucggcuccgg guacguaucg ggcuggggca gaguguucca uaaggguaga 1140
uccgcacugg uguugcaaua ccucagggug ccccucgugg aucgagccac uugucugcgg 1200
uccaccaaau ucacaaucua caacaauaug uucugugcgg gauuccauga aggugggaga 1260
gauagcugcc agggagacuc aggggguccc cacgugacgg aagucgaggg gacgucauuu 1320
cugacgggaa uuaucucaug gggagaggaa ugugcgauga aggggaaaua uggcaucuac 1380
acuaaagugu cacgguaugu caauuggauc aaggaaaaga cgaaacucac gugaucagcc 1440
agcgcugccu ucugcggggc uugccuucug gccaugcccu ucuucucucc cuugcaccug 1500
uaccucuugg ucuuugaaua aagccugagu aggaag 1536
<---

Claims (13)

1. Композиция для экспрессии полипептида в клетке млекопитающего, содержащая эффективное количество множества липидных наночастиц, содержащих полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, где указанный выделенный полинуклеотид содержит:
(a) открытую рамку считывания, кодирующую указанный полипептид, состоящий из нуклеозидов, включая 1-метилпсевдоуридин, цитидин или 5-метилцитидин, аденозин и гуанозин,
(b) 5’-UTR,
(c) 3’-UTR, и
(d) структуру 5′-кэпа,
причем при введении в клетку млекопитающего полинуклеотид обеспечивает повышенную экспрессию кодируемого полипептида относительно соответствующего полинуклеотида, содержащего открытую рамку считывания, состоящую из нуклеотидов, включая псевдоуридин, цитидин, аденозин и гуанозин.
2. Композиция по п.1, где полинуклеотид дополнительно содержит концевую часть поли-A.
3. Композиция по п.1 или 2, где структура 5'-кэпа выбрана из группы, состоящей из кэпа 0, кэпа 1, ARCA, инозина, N1-метилгуанозина, 2′-фторгуанозина, 7-деазагуанозина, 8-оксогуанозина, 2-аминогуанозина, LNA-гуанозина и 2-азидогуанозина.
4. Композиция по любому из пп.1-3, где выделенный полинуклеотид вводят в общей суточной дозе от 1 мкг до 150 мкг.
5. Композиция по любому из пп.1-4, где композицию вводят инъекцией.
6. Композиция по п.5, где инъекция является внутрикожной, подкожной или внутримышечной.
7. Композиция по п.5 или 6, где инъекцию осуществляют с использованием одного или нескольких устройств, выбранных из многоигольных инъекционных систем, катетера или люминальных систем, и ультразвуковых, электрических или излучающих систем.
8. Композиция по любому из пп.1-7, в которой композицию вводят в двух или более равных или неравных разделенных дозах.
RU2018104839A 2011-10-03 2012-10-03 Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение RU2707251C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161542533P 2011-10-03 2011-10-03
US61/542,533 2011-10-03

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014117701A Division RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2012-10-03 Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2018104839A3 RU2018104839A3 (ru) 2019-02-22
RU2018104839A RU2018104839A (ru) 2019-02-22
RU2707251C2 true RU2707251C2 (ru) 2019-11-25

Family

ID=48044115

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018104839A RU2707251C2 (ru) 2011-10-03 2012-10-03 Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
RU2014117701A RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2012-10-03 Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014117701A RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2012-10-03 Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение

Country Status (25)

Country Link
US (4) US9428535B2 (ru)
EP (4) EP4015005A1 (ru)
JP (6) JP6113737B2 (ru)
KR (2) KR20190099538A (ru)
CN (2) CN110511939A (ru)
AU (5) AU2012318752B2 (ru)
BR (1) BR112014007852B1 (ru)
CA (1) CA2850624A1 (ru)
CY (1) CY1125029T1 (ru)
DE (1) DE19216461T1 (ru)
DK (1) DK3682905T3 (ru)
ES (1) ES2911677T3 (ru)
HK (1) HK1200730A1 (ru)
HR (1) HRP20220250T1 (ru)
HU (1) HUE057725T2 (ru)
IL (2) IL231808B (ru)
LT (1) LT3682905T (ru)
MX (1) MX354267B (ru)
PL (1) PL3682905T3 (ru)
PT (1) PT3682905T (ru)
RS (1) RS62993B1 (ru)
RU (2) RU2707251C2 (ru)
SG (2) SG11201401196WA (ru)
SI (1) SI3682905T1 (ru)
WO (1) WO2013052523A1 (ru)

Families Citing this family (280)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
BR112013000244A2 (pt) 2010-07-06 2016-05-17 Novartis Ag lipossomas com lipídeos apresentando pka vantajoso para administração de rna
ES2770335T3 (es) 2010-07-06 2020-07-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Administración de ARN para desencadenar múltiples vías inmunológicas
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
AU2011295935B2 (en) 2010-08-31 2016-02-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding RNA
CN104531812A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
KR102266691B1 (ko) 2010-10-11 2021-06-23 노파르티스 아게 항원 전달 플랫폼
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
US10738355B2 (en) 2011-05-24 2020-08-11 Tron-Translationale Onkologie An Der Universitätsmedizin Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Ggmbh Individualized vaccines for cancer
PL2717893T3 (pl) 2011-06-08 2019-12-31 Translate Bio, Inc. Kompozycje nanocząstek lipidowych i sposoby do dostarczania mRNA
JP2014522842A (ja) 2011-07-06 2014-09-08 ノバルティス アーゲー 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
ES2911677T3 (es) 2011-10-03 2022-05-20 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados, y sus usos
EP3835420A1 (en) 2011-12-05 2021-06-16 Factor Bioscience Inc. Methods and products for transfecting cells
RS63244B1 (sr) 2011-12-16 2022-06-30 Modernatx Inc Kompozicije modifikovane mrna
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US20140010861A1 (en) 2012-04-02 2014-01-09 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9890364B2 (en) 2012-05-29 2018-02-13 The General Hospital Corporation TAL-Tet1 fusion proteins and methods of use thereof
CN104603271B (zh) 2012-07-03 2019-07-19 马林生物科技有限公司 用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
US20150307542A1 (en) * 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
WO2014066239A1 (en) * 2012-10-22 2014-05-01 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 2',4'-bridged nucleosides for hcv infection
CA2890110C (en) 2012-11-01 2023-05-02 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
EP3417874A1 (en) 2012-11-28 2018-12-26 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualized vaccines for cancer
AU2013374345A1 (en) 2013-01-17 2015-08-06 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
WO2014159813A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
ES2689523T3 (es) 2013-03-14 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Composiciones a base de ARNM del gen CFTR y métodos y usos relacionados
SI2970456T1 (sl) 2013-03-14 2022-01-31 Translate Bio, Inc. Postopki in sestavki za dostavo MRNA-kodiranih protiteles
ES2797974T3 (es) 2013-03-14 2020-12-04 Translate Bio Inc Acidos ribonucleicos con nucleótidos modificados con 4-tio y procedimientos relacionados
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP4279610A3 (en) 2013-03-15 2024-01-03 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
DK2972360T3 (en) 2013-03-15 2018-05-22 Translate Bio Inc SYNERGISTIC IMPROVEMENT OF DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS THROUGH MIXED FORMULATIONS
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
KR20220025911A (ko) 2013-05-03 2022-03-03 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. Cd4+ 조절 t 세포를 증진시키기 위한 방법 및 조성물
WO2014180490A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
HUE052233T2 (hu) 2013-06-04 2021-04-28 Selecta Biosciences Inc Nem immunszuppresszív, antigénre specifikus immunterápiás ágensek ismételt beadása
CN103254253B (zh) * 2013-06-06 2015-11-18 济南卡博唐生物科技有限公司 一种制备双丙酮-d-阿洛糖的方法
JP6609246B2 (ja) 2013-06-28 2019-11-20 エスリス ゲーエムベーハー 細胞内へのｒｎａ導入用組成物
PT3019619T (pt) 2013-07-11 2021-11-11 Modernatx Inc Composições que compreendem polinucleótidos sintéticos que codificam proteínas relacionadas com crispr e sgarn sintéticos e métodos de utilização
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
JP2016530294A (ja) * 2013-09-03 2016-09-29 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． キメラポリヌクレオチド
WO2015038892A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
CN103467509A (zh) * 2013-09-27 2013-12-25 成都爱博协诺化学技术有限公司 肿瘤药物中间体的合成方法
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051173A2 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc Polynucleotide molecules and uses thereof
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
EP3062798B1 (en) 2013-11-01 2020-05-06 CureVac AG Modified rna with decreased immunostimulatory properties
ES2806575T3 (es) 2013-11-01 2021-02-18 Curevac Ag ARN modificado con propiedades inmunoestimuladoras disminuidas
CN107075515B (zh) 2013-11-22 2020-10-30 米纳治疗有限公司 C/EBPα组合物和使用方法
EP3053585A1 (en) * 2013-12-13 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
EP3082760A1 (en) 2013-12-19 2016-10-26 Novartis AG LEPTIN mRNA COMPOSITIONS AND FORMULATIONS
KR102415811B1 (ko) 2014-01-31 2022-07-04 팩터 바이오사이언스 인크. 핵산 제조 및 송달을 위한 방법 및 산물
KR20160121584A (ko) 2014-02-26 2016-10-19 에트리스 게엠베하 Rna의 위장 투여용 조성물
CN103784422B (zh) * 2014-02-28 2016-03-02 重庆医科大学附属第二医院 一种载rtPA纳米粒及其制备方法
PT3134131T (pt) 2014-04-23 2022-03-24 Modernatx Inc Vacinas de ácidos nucleicos
JP6748579B2 (ja) 2014-06-10 2020-09-02 キュアバック リアル エステート ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｒｎａ生成を強化する方法及び手段
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
EP3160959B1 (en) * 2014-06-24 2023-08-30 Translate Bio, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
WO2016011222A2 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
CA2955250A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
CN104211740B (zh) * 2014-08-20 2016-10-26 济南尚博生物科技有限公司 一种n4-苯甲酰基-d-胞苷的制备方法
WO2016045732A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
WO2016070166A2 (en) 2014-11-02 2016-05-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Messenger una molecules and uses thereof
EP3041948B1 (en) 2014-11-10 2019-01-09 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
US20170362627A1 (en) 2014-11-10 2017-12-21 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
EP3034539A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
EP3256585A4 (en) 2015-02-13 2018-08-15 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
EP3289077B1 (en) 2015-04-30 2020-04-15 CureVac AG Method for in vitro transcription using an immobilized restriction enzyme
KR20180004820A (ko) 2015-05-15 2018-01-12 큐어백 아게 적어도 하나의 mRNA 구성의 투여를 포함하는 신규 프라임-부스트 요법
US10760070B2 (en) 2015-05-29 2020-09-01 Curevac Real Estate Gmbh Method for producing and purifying RNA, comprising at least one step of tangential flow filtration
EP3303575B1 (en) 2015-05-29 2022-03-16 CureVac AG Method for adding cap structures to rna using immobilized enzymes
DK4155409T3 (da) 2015-08-10 2024-02-26 Curevac Mfg Gmbh Fremgangsmåde til at øge replikationen af et cirkulært dna-molekyle
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
CN117025590A (zh) 2015-09-21 2023-11-10 垂林克生物技术有限公司 用于合成5’-加帽rna的组合物和方法
JP6990176B2 (ja) 2015-10-05 2022-02-03 モデルナティエックス インコーポレイテッド メッセンジャーリボ核酸薬物の治療投与のための方法
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
WO2017066791A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Sugar substituted mrna cap analogs
US11866754B2 (en) 2015-10-16 2024-01-09 Modernatx, Inc. Trinucleotide mRNA cap analogs
DK3362461T3 (da) 2015-10-16 2022-05-09 Modernatx Inc Mrna-cap-analoger med modificeret phosphatbinding
MA45209A (fr) * 2015-10-22 2019-04-17 Modernatx Inc Vaccins contre les maladies sexuellement transmissibles
MD3718565T2 (ro) 2015-10-22 2022-09-30 Modernatx Inc Vaccinuri împotriva virusului respirator
WO2017098468A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Novartis Ag Label-free analysis of rna capping efficiency using rnase h, probes and liquid chromatography/mass spectrometry
WO2017109161A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Curevac Ag Method of rna in vitro transcription using a buffer containing a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid or a salt thereof
HRP20220525T1 (hr) 2015-12-23 2022-05-27 Modernatx, Inc. Postupci uporabe polinukleotida koji kodiraju ligand ox40
EP3400023A1 (en) 2016-01-10 2018-11-14 ModernaTX, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies
WO2017140345A1 (en) 2016-02-15 2017-08-24 Curevac Ag Method for analyzing by-products of rna in vitro transcription
US11920174B2 (en) 2016-03-03 2024-03-05 CureVac SE RNA analysis by total hydrolysis and quantification of released nucleosides
US20190177714A1 (en) 2016-03-24 2019-06-13 Curevac Ag Immobilized inorganic pyrophosphatase (ppase)
ES2835051T3 (es) * 2016-03-31 2021-06-21 Ethris Gmbh Secuencias de UTR mínimas novedosas
AU2017248189B2 (en) 2016-04-08 2021-04-29 Translate Bio, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
EP3443001A4 (en) 2016-04-11 2020-04-29 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
WO2017201348A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase for the treatment of galactosemia type 1
US10993918B2 (en) 2016-05-18 2021-05-04 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding citrin for the treatment of Citrullinemia type 2
LT3458083T (lt) 2016-05-18 2023-02-10 Modernatx, Inc. Polinukleotidai, koduojantys interleukiną-12 (il12), ir jų naudojimas
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
IL263079B2 (en) 2016-05-18 2024-05-01 Modernatx Inc Relaxin-encoding polynucleotides
CA3024624A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding porphobilinogen deaminase for the treatment of acute intermittent porphyria
WO2017201332A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding acyl-coa dehydrogenase, very long-chain for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
JP7114485B2 (ja) 2016-05-18 2022-08-08 モデルナティエックス インコーポレイテッド ファブリー病の治療のためのα－ガラクトシダーゼＡをコードするポリヌクレオチド
JP7194594B2 (ja) 2016-05-18 2022-12-22 モデルナティエックス インコーポレイテッド 免疫調節ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの組み合わせ及びその使用
KR101892086B1 (ko) 2016-05-19 2018-08-27 주식회사 삼양사 옥심에스테르 유도체 화합물, 이를 포함하는 광중합 개시제, 및 감광성 조성물
WO2017218524A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 Rana Therapeutics, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
JP2019520829A (ja) 2016-07-07 2019-07-25 ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド 外来性ｒｎａを発現する治療的細胞系に関連する組成物及び方法
WO2018013525A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
US10576167B2 (en) 2016-08-17 2020-03-03 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
US11279923B2 (en) 2016-11-28 2022-03-22 Curevac Ag Method for purifying RNA
EP3568158A4 (en) 2017-01-11 2020-11-18 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University R-SPONDIN SUBSTITUTION MOLECULES (RSPO)
AU2018211985A1 (en) 2017-01-26 2019-07-18 Surrozen Operating, Inc. Tissue-specific Wnt signal enhancing molecules and uses thereof
US10093706B2 (en) 2017-01-30 2018-10-09 Indiana University Research And Technology Corporation Dominant positive hnRNP-E1 polypeptide compositions and methods
WO2018141371A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Curevac Ag Purification and/or formulation of rna
US20200032274A1 (en) * 2017-02-01 2020-01-30 Moderna TX, Inc. Polynucleotide secondary structure
KR20180090135A (ko) 2017-02-02 2018-08-10 주식회사 삼양사 신규한 옥심에스테르 비페닐 화합물, 이를 포함하는 광중합 개시제 및 감광성 조성물
JP2020508056A (ja) 2017-02-22 2020-03-19 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフトＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ 遺伝子編集のための組成物および方法
EA201991747A1 (ru) 2017-02-27 2020-06-04 Транслейт Био, Инк. НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR
JP2020510426A (ja) 2017-02-28 2020-04-09 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 翻訳可能分子およびその合成
CR20190444A (es) 2017-02-28 2019-12-17 Sanofi Sa Arn terapéutico
EP3601568A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Agenovir Corporation Antiviral therapeutic
US11173190B2 (en) 2017-05-16 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mRNA encoding CFTR
EP3625246A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
US11485972B2 (en) 2017-05-18 2022-11-01 Modernatx, Inc. Modified messenger RNA comprising functional RNA elements
MX2019014412A (es) 2017-05-31 2020-02-10 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Productos terapeuticos para la enfermedad de almacenamiento de glucogeno de tipo iii.
US20200268666A1 (en) 2017-06-14 2020-08-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
WO2018231990A2 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US10034951B1 (en) 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
GB201714430D0 (en) * 2017-09-07 2017-10-25 Micol Romain Compositions and processes for targeted delivery and expression and modulation of therapeutic components in tissue
US20200208152A1 (en) 2017-09-08 2020-07-02 Mina Therapeutics Limited Stabilized sarna compositions and methods of use
EP3679138B1 (en) 2017-09-08 2023-03-22 MiNA Therapeutics Limited Hnf4a sarna compositions and methods of use
WO2019087113A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
MA50802A (fr) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des sous-unités alpha et bêta de propionyl-coa carboxylase pour le traitement de l'acidémie propionique
US11859215B2 (en) 2017-11-22 2024-01-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
JP7423521B2 (ja) 2017-11-22 2024-01-29 モダーナティエックス・インコーポレイテッド フェニルケトン尿症の治療用のフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド
KR101991903B1 (ko) 2017-12-07 2019-10-01 주식회사 삼양사 카바졸 옥심에스테르 유도체 화합물 및 이를 포함하는 광중합 개시제와 감광성 조성물
US20200325532A1 (en) 2017-12-15 2020-10-15 Novartis Ag Polya tail length analysis of rna by mass spectrometry
EP3727428A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP3735270A1 (en) 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies
HUE060791T2 (hu) 2018-04-11 2023-04-28 Enterome S A Antigén peptidek rák megelõzésére és kezelésére
WO2019197845A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Mina Therapeutics Limited Sirt1-sarna compositions and methods of use
JP7399876B2 (ja) * 2018-04-16 2023-12-18 ジョージア テック リサーチ コーポレーション 病態治療のためのＲＮＡエディターのｍＲＮＡ駆動型発現
WO2019207061A1 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Ethris Gmbh Cryoprotective agents for particulate formulations
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
JP2021529518A (ja) 2018-06-28 2021-11-04 クリスパー セラピューティクス アーゲー ドナーポリヌクレオチドの挿入によるゲノム編集のための組成物および方法
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
SG11202102058UA (en) 2018-08-30 2021-03-30 Tenaya Therapeutics Inc Cardiac cell reprogramming with myocardin and ascl1
WO2020047201A1 (en) 2018-09-02 2020-03-05 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
CA3112208A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase for the treatment of glycogen storage disease
WO2020056155A2 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex e1-alpha, e1-beta, and e2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
JP2022500444A (ja) 2018-09-14 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. クリグラー−ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドａ１をコードするポリヌクレオチド
WO2020069169A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
WO2020072914A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed rna
US11072808B2 (en) 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3891274B1 (en) 2018-12-06 2023-10-18 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating ornithine transcarbamylase deficiency
KR102228630B1 (ko) 2018-12-28 2021-03-16 주식회사 삼양사 카바졸 멀티 베타 옥심에스테르 유도체 화합물 및 이를 포함하는 광중합 개시제와 포토레지스트 조성물
GB2580963B (en) * 2019-02-01 2021-03-31 Hemispherian As Cancer therapies
CA3132840A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Obsidian Therapeutics, Inc. Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation
KR20210142678A (ko) * 2019-03-25 2021-11-25 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 그의 용도
EP3953473A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 MiNA Therapeutics Limited Sirt1-sarna compositions and methods of use
CN114375190A (zh) 2019-05-08 2022-04-19 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于皮肤和伤口的组合物及其使用方法
MX2021015097A (es) 2019-06-12 2022-04-01 Obsidian Therapeutics Inc Composiciones de ca2 y metodos para regulación ajustable.
EP3983537A1 (en) 2019-06-12 2022-04-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
WO2021007515A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
US10501404B1 (en) 2019-07-30 2019-12-10 Factor Bioscience Inc. Cationic lipids and transfection methods
CN112390838A (zh) * 2019-08-14 2021-02-23 斯微(上海)生物科技有限公司 一种改性核苷及其合成方法
JP2022545101A (ja) 2019-08-19 2022-10-25 ミナ セラピューティクス リミテッド オリゴヌクレオチドコンジュゲート組成物および使用方法
WO2021035180A1 (en) 2019-08-22 2021-02-25 New England Biolabs, Inc. Cleavage of single stranded dna having a modified nucleotide
WO2021041267A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 New England Biolabs, Inc. Enzymatic rna capping method
US20230092895A1 (en) 2019-08-30 2023-03-23 Obsidian Therapeutics, Inc. Tandem cd19 car-based compositions and methods for immunotherapy
US20210079347A1 (en) 2019-09-06 2021-03-18 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered t cells having improved persistence in culture
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
TW202128704A (zh) * 2019-10-18 2021-08-01 日商第一三共股份有限公司 雙環亞磷醯胺之製造方法
MX2022005704A (es) 2019-11-15 2022-06-08 Enterome S A Peptidos antigenicos para la prevencion y el tratamiento de malignidad de celulas b.
WO2021151001A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Outpace Bio, Inc. Chimeric polypeptides
US11576966B2 (en) 2020-02-04 2023-02-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
BR112022017551A2 (pt) 2020-03-02 2022-11-16 Tenaya Therapeutics Inc Controle de vetor genético por micrornas expressos por cardiomiócito
WO2021202788A2 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligomeric compounds and uses thereof
CN115811986A (zh) 2020-04-22 2023-03-17 生物技术欧洲股份公司 冠状病毒疫苗
US20230235298A1 (en) 2020-06-01 2023-07-27 Modernatx, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
EP4208549A1 (en) * 2020-09-04 2023-07-12 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for capping rnas
AU2021347907A1 (en) 2020-09-23 2023-04-20 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered t cells with regnase-1 and/or tgfbrii disruption have improved functionality and persistence
EP4203997A1 (en) 2020-10-26 2023-07-05 Pécsi Tudományegyetem Vaccine platform
AU2021378483A1 (en) 2020-11-12 2023-06-08 Intervet International B.V. Recombinant vectors encoding chimeric coronavirus spike proteins and use thereof
AU2021377895A1 (en) 2020-11-13 2023-06-15 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2022106860A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Pécsi Tudományegyetem Recombinant peptides for use in therapy
JP2023551072A (ja) * 2020-11-25 2023-12-06 アリダ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド Ｒｎａおよびｄｎａ修飾の多重プロファイリング
JP2024502210A (ja) 2020-12-22 2024-01-17 キュアバック エスイー ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対するＲＮＡワクチン
WO2022137181A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Crispr Therapeutics Ag Co-use of lenalidomide with car-t cells
CN112725346A (zh) * 2021-01-22 2021-04-30 青岛大学 一种增加尿酸排泄的修饰mRNA序列及其应用
US11028379B1 (en) 2021-01-27 2021-06-08 New England Biolabs, Inc. FCE mRNA capping enzyme compositions, methods and kits
WO2022164428A1 (en) 2021-01-27 2022-08-04 New England Biolabs, Inc. Faustovirus capping enzyme, mrna capping enzyme compositions, methods and kits
US20240156729A1 (en) 2021-02-26 2024-05-16 Ethris Gmbh Formulations for aerosol formation and aerosols for the delivery of nucleic acid
MX2023010055A (es) 2021-03-01 2023-11-17 Scirhom Gmbh Anticuerpos humanizados contra irhom2.
US20220288122A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered t cells with ptpn2 knockout have improved functionality and anti-tumor activity
EP4314260A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
WO2022204380A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
US20240207444A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
CA3214137A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Mina Therapeutics Limited Tmem173 sarna compositions and methods of use
CN112979721B (zh) * 2021-03-29 2023-05-09 江苏集萃分子工程研究院有限公司 一种高纯度抗肿瘤药曲氟胞苷的制备方法
CA3213771A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Scirhom Gmbh Methods of treatment using protein binders to irhom2 epitopes
WO2022214664A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Philogen S.P.A. Improved interferon-gamma mutant
IL307481A (en) 2021-04-09 2023-12-01 Selecta Biosciences Inc Synthetic nanocarriers containing an immune system suppressor combined with IL-2 receptor agonists with high affinity for increasing immune tolerance
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
WO2022256437A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
CN113372432A (zh) * 2021-06-15 2021-09-10 深圳市臻质医疗科技有限公司 一种基于化学修饰mRNA编码蛋白因子诱导和/或增强软骨损伤修复的方法
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
EP4376873A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 CRISPR Therapeutics AG Methods for manufacturing genetically engineered car-t cells
CN113651865A (zh) * 2021-08-19 2021-11-16 上海兆维科技发展有限公司 一种去除四丁基氟化铵的方法
CA3230031A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Patrick Baumhof Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
US20230128917A1 (en) 2021-09-14 2023-04-27 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells having a disrupted cd83 gene
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
CA3235867A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Munir MOSAHEB Mrna vaccine composition
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
WO2023077170A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding integrin beta-6 and methods of use thereof
WO2023084399A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells expressing masked chimeric antigen receptors specific to protein tyrosine kinase 7
WO2023096858A1 (en) 2021-11-23 2023-06-01 Senda Biosciences, Inc. A bacteria-derived lipid composition and use thereof
WO2023099884A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Mina Therapeutics Limited Pax6 sarna compositions and methods of use
WO2023107999A2 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus mrna vaccines
WO2023111913A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Crispr Therapeutics Ag Engineered anti-liv1 cell with regnase-1 and/or tgfbrii disruption
WO2023122080A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Senda Biosciences, Inc. Compositions comprising mrna and lipid reconstructed plant messenger packs
WO2023119201A2 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered t cells with disrupted casitas b-lineage lymphoma proto-oncogene-b (cblb) and uses thereof
AU2022419468A1 (en) * 2021-12-23 2024-06-27 Optimeos Life Sciences, Inc. Nanoparticles and methods of production for the encapsulation of nucleic acids
WO2023133319A1 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Selecta Biosciences, Inc. High affinity il-2 receptor agonists and synthetic nanocarrier dose sparing
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
TW202345864A (zh) 2022-02-18 2023-12-01 美商現代公司 編碼檢查點癌症疫苗之ｍＲＮＡ及其用途
WO2023166425A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions
WO2023170435A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Mina Therapeutics Limited Il10 sarna compositions and methods of use
WO2023172628A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressant in combination with high affinity il-2 receptor agonists and related dosing
WO2023173098A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 New England Biolabs, Inc. Immobilized enzyme compositions and methods
TW202403046A (zh) 2022-03-21 2024-01-16 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司 用於治療脂蛋白相關的疾病之方法及組成物
WO2023180968A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Crispr Therapeutics Ag Anti-cd19 car-t cells with multiple gene edits and therapeutic uses thereof
US20230331841A1 (en) 2022-03-23 2023-10-19 Crispr Therapeutics Ag Anti-cd83 car-t cells with regnase-1 and/or tgfbrii disruption
WO2023183568A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant in combination with high affinity il-2 receptor agonists and anti-igm agents
WO2023183909A2 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
CN114656511B (zh) * 2022-03-29 2024-04-16 上海吉量医药工程有限公司 乙酰化胞嘧啶三磷酸盐及其中间体的制备方法
CN114736260A (zh) * 2022-03-29 2022-07-12 上海吉量医药工程有限公司 一种三磷酸核苷酸盐的制备方法
WO2023187127A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer
WO2023196399A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding argininosuccinate lyase for the treatment of argininosuccinic aciduria
WO2023196950A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 New England Biolabs, Inc. Methods of higher fidelity rna synthesis
WO2023196566A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Selecta Biosciences, Inc. High affinity il-2 receptor agonists and immunosuppressants to enhance immune tolerance
WO2023223183A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Crispr Therapeutics Ag Picornaviral vectors for gene editing
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
US20240041757A1 (en) 2022-06-17 2024-02-08 Crispr Therapeutics Ag LIPID NANOPARTICLES (LNPs)-BASED OCULAR DELIVERY
WO2023248110A1 (en) 2022-06-20 2023-12-28 Crispr Therapeutics Ag Base editing proteins and uses thereof
WO2023248145A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for treating human immunodeficiency virus
WO2023248147A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for in vivo editing of stem cells
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024003786A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Crispr Therapeutics Ag Chimeric antigen receptor targeting gpc-3 and immune cells expressing such for therapeutic uses
WO2024023246A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Philogen S.P.A. Antibody binding to pd1
WO2024023804A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells having disrupted transporter associated with antigen processing binding protein (tapbp) gene
WO2024023801A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells having disrupted transporter associated with antigen processing-1 (tap-1) gene
WO2024023802A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells having disrupted transporter associated with antigen processing-2 (tap-2) gene
WO2024031087A2 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Modernatx, Inc. Internal ribosome entry sites for improved polynucleotide translation
WO2024033362A1 (en) 2022-08-08 2024-02-15 Atb Therapeutics Humanized antibodies against cd79b
WO2024042236A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Ethris Gmbh Stable lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
EP4327829A1 (en) 2022-08-26 2024-02-28 Ethris GmbH Stabilization of lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024050483A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines and uses thereof
WO2024062388A2 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells expressing chimeric antigen receptor targeting cd20
US20240156949A1 (en) 2022-10-28 2024-05-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic Acid Based Vaccine
WO2024097875A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Shattuck Labs, Inc. Fusion proteins for the treatment of nonalcoholic steatohepatitis
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
WO2024130158A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding extended serum half-life interleukin-22 for the treatment of metabolic disease
CN116284189B (zh) * 2023-05-16 2023-08-08 深圳赛陆医疗科技有限公司 一种合成MANT-GTPγS的方法
GB202406294D0 (en) 2024-05-06 2024-06-19 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Methods and compositions for producing capped mRNA

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824497A (en) * 1995-02-10 1998-10-20 Mcmaster University High efficiency translation of mRNA molecules
US20110143397A1 (en) * 2005-08-23 2011-06-16 Katalin Kariko Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells
US8278036B2 (en) * 2005-08-23 2012-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA containing modified nucleosides and methods of use thereof
RU2540017C2 (ru) * 2008-07-24 2015-01-27 Мейдзи Сейка Фарма Ко,Лтд.,Jp Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, вовлеченный в биосинтез пирипиропена а, вектор и клетка-хозяин содержащие такой полинуклеотид и способ получения предшественника пирипиропена а (варианты)

Family Cites Families (1113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2008526A (en) 1932-11-03 1935-07-16 Wappler Frederick Charles Method and means for treating living tissue
US3467096A (en) 1966-04-12 1969-09-16 Ferrell S Horn Multiple hypodermic syringe arrangement
BE757653A (fr) 1969-10-21 1971-04-16 Ugine Kuhlmann Nouveaux medicaments derives d'acides nucleiques et procedes pour leur preparation
BE786542A (fr) 1971-07-22 1973-01-22 Dow Corning Dispositif d'aspiration permettant d'obtenir des echantillons de cellules
US3906092A (en) 1971-11-26 1975-09-16 Merck & Co Inc Stimulation of antibody response
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4411657A (en) 1980-05-19 1983-10-25 Anibal Galindo Hypodermic needle
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4401796A (en) 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4474569A (en) 1982-06-28 1984-10-02 Denver Surgical Developments, Inc. Antenatal shunt
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4579849A (en) 1984-04-06 1986-04-01 Merck & Co., Inc. N-alkylguanine acyclonucleosides as antiviral agents
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
EP0204401A1 (en) 1985-04-09 1986-12-10 Biogen, Inc. Method of improving the yield of polypeptides produced in a host cell by stabilizing mRNA
US5017691A (en) 1986-07-03 1991-05-21 Schering Corporation Mammalian interleukin-4
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4879111A (en) 1986-04-17 1989-11-07 Cetus Corporation Treatment of infections with lymphokines
US4886499A (en) 1986-12-18 1989-12-12 Hoffmann-La Roche Inc. Portable injection appliance
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US6090591A (en) 1987-07-31 2000-07-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
WO1989001050A1 (en) 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
EP0359789B1 (en) 1988-01-21 1993-08-04 Genentech, Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
JP2650159B2 (ja) 1988-02-24 1997-09-03 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 核酸増幅方法
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
EP0403559A1 (en) 1988-03-04 1990-12-27 Cancer Research Campaign Technology Limited Improvements relating to antigens
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
WO1989009622A1 (en) 1988-04-15 1989-10-19 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
US5021335A (en) 1988-06-17 1991-06-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In situ transcription in cells and tissues
US5168038A (en) 1988-06-17 1992-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In situ transcription in cells and tissues
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5759802A (en) 1988-10-26 1998-06-02 Tonen Corporation Production of human serum alubumin A
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
ES2116269T3 (es) 1989-03-21 1998-07-16 Vical Inc Expresion de secuencias exogenas de polinucleotidos en un vertebrado.
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5012818A (en) 1989-05-04 1991-05-07 Joishy Suresh K Two in one bone marrow surgical needle
IE66597B1 (en) 1989-05-10 1996-01-24 Akzo Nv Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5215899A (en) 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
NO904633L (no) 1989-11-09 1991-05-10 Molecular Diagnostics Inc Amplifikasjon av nukleinsyrer ved transkriberbar haarnaalsprobe.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5697901A (en) 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
US5194370A (en) 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
AU649066B2 (en) 1990-07-25 1994-05-12 Syngene, Inc. Circular extension for generating multiple nucleic acid complements
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US6140496A (en) 1990-10-09 2000-10-31 Benner; Steven Albert Precursors for deoxyribonucleotides containing non-standard nucleosides
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
US6100024A (en) 1991-02-08 2000-08-08 Promega Corporation Methods and compositions for nucleic acid detection by target extension and probe amplification
CA2736076A1 (en) 1991-03-18 1992-09-19 New York University Monoclonal and chimeric antibodies specific for human tumor necrosis factor
US5426180A (en) 1991-03-27 1995-06-20 Research Corporation Technologies, Inc. Methods of making single-stranded circular oligonucleotides
ES2134212T3 (es) 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
US5169766A (en) 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
US5199441A (en) 1991-08-20 1993-04-06 Hogle Hugh H Fine needle aspiration biopsy apparatus and method
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
US5298422A (en) 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
WO1993014778A1 (en) 1992-01-23 1993-08-05 Vical, Inc. Ex vivo gene transfer
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
JP3368603B2 (ja) 1992-02-28 2003-01-20 オリンパス光学工業株式会社 遺伝子治療用処置具
DK0563475T3 (da) 1992-03-25 2000-09-18 Immunogen Inc Konjugater af cellebindende midler og derivater af CC-1065
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US6132419A (en) 1992-05-22 2000-10-17 Genetronics, Inc. Electroporetic gene and drug therapy
US5514545A (en) 1992-06-11 1996-05-07 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for characterizing single cells based on RNA amplification for diagnostics and therapeutics
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
ES2104160T3 (es) 1992-07-31 1997-10-01 Behringwerke Ag Metodo para introducir secuencias definidas en el extremo 3' de polinucleotidos.
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
WO1994009838A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 Denver Biomaterials, Inc. Apparatus for removal of pleural effusion fluid
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
NZ261259A (en) 1993-01-12 1996-12-20 Biogen Inc Humanised recombinant anti-vla4 antibody and diagnostic compositions and medicaments
FR2703253B1 (fr) 1993-03-30 1995-06-23 Centre Nat Rech Scient Applicateur d'impulsions electriques pour traitement de tissus biologiques.
US7135312B2 (en) 1993-04-15 2006-11-14 University Of Rochester Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA
US5773244A (en) 1993-05-19 1998-06-30 Regents Of The University Of California Methods of making circular RNA
US5851829A (en) 1993-07-16 1998-12-22 Dana-Farber Cancer Institute Method of intracellular binding of target molecules
US5672491A (en) 1993-09-20 1997-09-30 The Leland Stanford Junior University Recombinant production of novel polyketides
US6432711B1 (en) 1993-11-03 2002-08-13 Diacrin, Inc. Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines
US6096503A (en) 1993-11-12 2000-08-01 The Scripps Research Institute Method for simultaneous identification of differentially expresses mRNAs and measurement of relative concentrations
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
US7435802B2 (en) 1994-01-25 2008-10-14 Elan Pharaceuticals, Inc. Humanized anti-VLA4 immunoglobulins
ES2224113T5 (es) 1994-02-16 2009-05-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polipeptido antigenico asociado al melanoma, epitopos del mismo y vacunas contra melanoma.
IL112820A0 (en) 1994-03-07 1995-05-26 Merck & Co Inc Coordinate in vivo gene expression
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
CA2184375C (en) 1994-03-18 2006-05-02 Sergei M. Gryaznov Oligonucleotide n3'-p5' phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
AU699552B2 (en) 1994-05-18 1998-12-10 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft DNA sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alpha-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms
CA2191362A1 (en) 1994-06-02 1995-12-14 Mark Selby Nucleic acid immunization using a virus-based infection/transfection system
GB9412230D0 (en) 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
AU3272695A (en) 1994-08-12 1996-03-07 Immunomedics Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5665545A (en) 1994-11-28 1997-09-09 Akzo Nobel N.V. Terminal repeat amplification method
US5641665A (en) 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
US5588960A (en) 1994-12-01 1996-12-31 Vidamed, Inc. Transurethral needle delivery device with cystoscope and method for treatment of urinary incontinence
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
PT795018E (pt) 1995-01-06 2007-12-21 Plant Res Int Bv Sequências de adn codificando enzimas de síntese de polímeros de hidratos de carbono e método para a produção de plantas transgénicas
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
EP0727187B1 (en) 1995-02-15 2003-08-06 Joseph Eldor Multiple hole spinal needle
US5707807A (en) 1995-03-28 1998-01-13 Research Development Corporation Of Japan Molecular indexing for expressed gene analysis
US5869230A (en) 1995-03-30 1999-02-09 Beth Israel Hospital Association Gene transfer into the kidney
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
FR2733762B1 (fr) 1995-05-02 1997-08-01 Genset Sa Methode de couplage specifique de la coiffe de l'extremite 5' d'un fragment d'arnm et preparation d'arnm et d'adnc complet
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US6111095A (en) 1995-06-07 2000-08-29 Merck & Co., Inc. Capped synthetic RNA, analogs, and aptamers
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US5889136A (en) 1995-06-09 1999-03-30 The Regents Of The University Of Colorado Orthoester protecting groups in RNA synthesis
US5766903A (en) 1995-08-23 1998-06-16 University Technology Corporation Circular RNA and uses thereof
US6265389B1 (en) 1995-08-31 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides
AU7073096A (en) 1995-09-19 1997-04-09 University Of Massachusetts Inhibited biological degradation of oligodeoxynucleotides
US5830879A (en) 1995-10-02 1998-11-03 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Treatment of vascular injury using vascular endothelial growth factor
US6265387B1 (en) 1995-10-11 2001-07-24 Mirus, Inc. Process of delivering naked DNA into a hepatocyte via bile duct
EP0771873A3 (en) 1995-10-27 1998-03-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Neuronal cell-specific receptor protein
CU22584A1 (es) 1995-11-17 1999-11-03 Centro Inmunologia Molecular Composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal que reconoce el antígeno de diferenciación leucocitario humano cd6 y sus usos para el diagnóstico y tratamiento de la psoriasis
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6395292B2 (en) 1996-02-02 2002-05-28 Alza Corporation Sustained delivery of an active agent using an implantable system
US6261584B1 (en) 1996-02-02 2001-07-17 Alza Corporation Sustained delivery of an active agent using an implantable system
AU1874397A (en) 1996-02-16 1997-09-02 Stichting Rega Vzw Hexitol containing oligonucleotides and their use in antisense strategies
US6534312B1 (en) 1996-02-22 2003-03-18 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
US6090391A (en) 1996-02-23 2000-07-18 Aviron Recombinant tryptophan mutants of influenza
US6300487B1 (en) 1996-03-19 2001-10-09 Cell Therapuetics, Inc. Mammalian lysophosphatidic acid acyltransferase
SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
US5712127A (en) 1996-04-29 1998-01-27 Genescape Inc. Subtractive amplification
US5853719A (en) 1996-04-30 1998-12-29 Duke University Methods for treating cancers and pathogen infections using antigen-presenting cells loaded with RNA
US7329741B2 (en) 1996-06-05 2008-02-12 Chiron Corporation Polynucleotides that hybridize to DP-75 and their use
WO1997046680A1 (en) 1996-06-05 1997-12-11 Chiron Corporation Dna encoding dp. 75 and a process for its use
AU728422B2 (en) 1996-06-21 2001-01-11 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
EP0925088A2 (en) 1996-06-28 1999-06-30 Sontra Medical, L.P. Ultrasound enhancement of transdermal transport
US5939262A (en) 1996-07-03 1999-08-17 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant RNA preparation and utilization
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
US5849546A (en) 1996-09-13 1998-12-15 Epicentre Technologies Corporation Methods for using mutant RNA polymerases with reduced discrimination between non-canonical and canonical nucleoside triphosphates
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
DE69735375T3 (de) 1996-09-24 2010-09-02 Tanox, Inc., Houston Genfamilie von apoptose-verwandten peptiden, dadurch kodierte peptide und verfahren zu deren herstellung
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
DE69733020T2 (de) 1996-10-11 2006-02-16 The Regents Of The University Of California, Oakland Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
GB9623051D0 (en) 1996-11-06 1997-01-08 Schacht Etienne H Delivery of DNA to target cells in biological systems
US5980887A (en) 1996-11-08 1999-11-09 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston Methods for enhancing angiogenesis with endothelial progenitor cells
US5759179A (en) 1996-12-31 1998-06-02 Johnson & Johnson Medical, Inc. Needle and valve assembly for use with a catheter
DK1712623T3 (da) 1997-01-21 2012-02-06 Gen Hospital Corp Udvælgelse af proteiner ved anvendelse af RNA-proteinfusioner
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6228640B1 (en) 1997-02-07 2001-05-08 Cem Cezayirli Programmable antigen presenting cell of CD34 lineage
US6251665B1 (en) 1997-02-07 2001-06-26 Cem Cezayirli Directed maturation of stem cells and production of programmable antigen presenting dentritic cells therefrom
US6696291B2 (en) 1997-02-07 2004-02-24 Merck & Co., Inc. Synthetic HIV gag genes
AU743616B2 (en) 1997-02-07 2002-01-31 Merck & Co., Inc. Synthetic HIV gag genes
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
US5914269A (en) 1997-04-04 1999-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of epidermal growth factor receptor expression
AU6972798A (en) 1997-04-18 1998-11-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibition of hiv-1 replication by a tat rna-binding domain peptide analog
US5958688A (en) 1997-04-28 1999-09-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Characterization of mRNA patterns in neurites and single cells for medical diagnosis and therapeutics
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5989911A (en) 1997-05-09 1999-11-23 University Of Massachusetts Site-specific synthesis of pseudouridine in RNA
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
US6124091A (en) 1997-05-30 2000-09-26 Research Corporation Technologies, Inc. Cell growth-controlling oligonucleotides
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6225292B1 (en) 1997-06-06 2001-05-01 The Regents Of The University Of California Inhibitors of DNA immunostimulatory sequence activity
US6887906B1 (en) 1997-07-01 2005-05-03 Isispharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
BR9815493A (pt) 1997-07-21 2000-10-31 Pharmacia & Upjohn Ab Citólise dirigida de células-alvo, agentes e composições que causam citólise, e compostos que podem ser usados para produzir os agentes
JP2001511462A (ja) 1997-07-31 2001-08-14 セント エリザベス メディカル センター オブ ボストン インク． 移植片処置法
EP2044950B1 (en) 1997-09-18 2012-06-27 The Trustees of The University of Pennsylvania Attenuated VIF DNA immunization cassettes for genetic vaccines
EP1021549A2 (en) 1997-09-19 2000-07-26 Sequitur, Inc. SENSE mRNA THERAPY
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
CA2305785A1 (en) 1997-10-07 1999-04-15 University Of Maryland Biotechnology Institute Method for introducing and expressing rna in animal cells
EP1025244A2 (en) 1997-10-20 2000-08-09 Genzyme Transgenics Corporation NOVEL MODIFIED MSP-1 NUCLEIC ACID SEQUENCES AND METHODS FOR INCREASING mRNA LEVELS AND PROTEIN EXPRESSION IN CELL SYSTEMS
US6019747A (en) 1997-10-21 2000-02-01 I-Flow Corporation Spring-actuated infusion syringe
AU1275899A (en) 1997-10-24 1999-05-17 Megabios Corporation Methods for preparing polynucleotide transfection complexes
JP2001523480A (ja) 1997-11-20 2001-11-27 バイカル インコーポレイテッド サイトカイン発現ポリヌクレオチドおよびそれらの組成物を用いた癌の処置
US7655777B2 (en) 1997-11-24 2010-02-02 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules associated with the tocopherol pathway
US6517869B1 (en) 1997-12-12 2003-02-11 Expression Genetics, Inc. Positively charged poly(alpha-(omega-aminoalkyl)lycolic acid) for the delivery of a bioactive agent via tissue and cellular uptake
AU1819499A (en) 1997-12-12 1999-06-28 Samyang Corporation Positively-charged poly{alpha-(omega-aminoalkyl)glycolic acid} for the delivery of a bioactive agent via tissue and cellular uptake
WO1999033982A2 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Chiron Corporation Human genes and gene expression products i
US6383811B2 (en) 1997-12-30 2002-05-07 Mirus Corporation Polyampholytes for delivering polyions to a cell
CA2317549C (en) 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US6190315B1 (en) 1998-01-08 2001-02-20 Sontra Medical, Inc. Sonophoretic enhanced transdermal transport
US8287483B2 (en) 1998-01-08 2012-10-16 Echo Therapeutics, Inc. Method and apparatus for enhancement of transdermal transport
US6365346B1 (en) 1998-02-18 2002-04-02 Dade Behring Inc. Quantitative determination of nucleic acid amplification products
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
US6429301B1 (en) 1998-04-17 2002-08-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Use of a ribozyme to join nucleic acids and peptides
GB9808327D0 (en) 1998-04-20 1998-06-17 Chiron Spa Antidiotypic compounds
US6395253B2 (en) 1998-04-23 2002-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Microspheres containing condensed polyanionic bioactive agents and methods for their production
US7521178B1 (en) 1998-04-23 2009-04-21 Takara Bio Inc. Method for synthesizing DNA
US20020064517A1 (en) 1998-04-30 2002-05-30 Stewart A. Cederholm-Williams Fibrin sealant as a transfection/transformation vehicle for gene therapy
US20090208418A1 (en) 2005-04-29 2009-08-20 Innexus Biotechnology Internaltional Ltd. Superantibody synthesis and use in detection, prevention and treatment of disease
JP2002515418A (ja) 1998-05-20 2002-05-28 エクスプレッション・ジェネティックス・インコーポレーテッド 肝細胞を標的とするポリエチレングリコール接合ポリ−ｌ−リシンのポリマー遺伝子キャリヤー
US6503231B1 (en) 1998-06-10 2003-01-07 Georgia Tech Research Corporation Microneedle device for transport of molecules across tissue
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
EP2428250A1 (en) 1998-07-13 2012-03-14 Genetronics, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field
TR200100254T2 (tr) 1998-07-13 2001-06-21 Expression Genetics, Inc. Eriyebilir ve bakterilerle ayrışabilir bir gen iletim taşıyıcısı olarak poly-l-lysine benzeri bir poliyester.
US6222030B1 (en) 1998-08-03 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Solid phase synthesis of oligonucleotides using carbonate protecting groups and alpha-effect nucleophile deprotection
EP1946775A3 (en) 1998-08-11 2008-08-06 Biogen Idec Inc. Combination therapies for B-cell lymphomas comprising administration of anti-CD20 antibody
GB9817662D0 (en) 1998-08-13 1998-10-07 Crocker Peter J Substance delivery
US6924365B1 (en) 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
US20090042283A1 (en) 1998-09-29 2009-02-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc., A Delaware Corporation Optimized messenger rna
EP1133513A4 (en) 1998-11-03 2002-07-03 Univ Yale MOLECULAR SENSORS CONSISTING OF SEVERAL DOMAINS OF POLYNUCLEOTIDES
WO2000027433A1 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Idec Pharmaceuticals Corporation Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transplants
KR101092132B1 (ko) 1998-11-09 2011-12-12 바이오겐 아이덱 인크. 키메라 항-ｃｄ２０항체를 이용한 순환성 종양세포와 관련된 혈액학적 악성종양의 치료법
AU2023400A (en) 1998-11-12 2000-05-29 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for inhibiting angiogenesis using trna and fragments thereof
US6210931B1 (en) 1998-11-30 2001-04-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA
US20040171980A1 (en) 1998-12-18 2004-09-02 Sontra Medical, Inc. Method and apparatus for enhancement of transdermal transport
US6444790B1 (en) 1998-12-23 2002-09-03 Human Genome Sciences, Inc. Peptidoglycan recognition proteins
CA2364921A1 (en) 1999-02-22 2000-08-31 European Molecular Biology Laboratory Translation system
US6255476B1 (en) 1999-02-22 2001-07-03 Pe Corporation (Ny) Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports
US7629311B2 (en) 1999-02-24 2009-12-08 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
DE60020677T2 (de) 1999-02-26 2006-05-04 Chiron Corp., Emeryville Mikroemulsionen mit adsorbierten makromolekülen und mikropartikeln
AU778809B2 (en) 1999-03-29 2004-12-23 Statens Serum Institut Method for producing a nucleotide sequence construct with optimised codons for an HIV genetic vaccine based on primary, early HIV isolate and synthetic envelope BX08 constructs
AU777829B2 (en) 1999-04-09 2004-11-04 Life Technologies As Process for the preparation of monodisperse polymer particles
US8663692B1 (en) 1999-05-07 2014-03-04 Pharmasol Gmbh Lipid particles on the basis of mixtures of liquid and solid lipids and method for producing same
US7820161B1 (en) 1999-05-07 2010-10-26 Biogen Idec, Inc. Treatment of autoimmune diseases
US6346382B1 (en) 1999-06-01 2002-02-12 Vanderbilt University Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto
US6611707B1 (en) 1999-06-04 2003-08-26 Georgia Tech Research Corporation Microneedle drug delivery device
WO2000075356A1 (en) 1999-06-04 2000-12-14 Lin Shi Lung Rna polymerase chain reaction
US6743211B1 (en) 1999-11-23 2004-06-01 Georgia Tech Research Corporation Devices and methods for enhanced microneedle penetration of biological barriers
US6303573B1 (en) 1999-06-07 2001-10-16 The Burnham Institute Heart homing peptides and methods of using same
CA2376634A1 (en) 1999-06-08 2000-12-14 Aventis Pasteur Immunostimulant oligonucleotide
DE05075555T1 (de) 1999-06-09 2007-02-08 Immunomedics, Inc. Immuntherapie von Autoimmunerkrankungen durch die Verwendung von B-Zell-spezifischen Antikörpern
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
EP1196426A4 (en) 1999-06-30 2003-09-03 Advanced Cell Tech Inc CYTOPLASMIC TRANSFER TO REDUCE DIFFERENTIATION OF RECEIVED CELLS
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
MXPA01013462A (es) 1999-07-09 2002-07-02 Wyeth Corp Metodos y composiciones para prevenir la formacion de arn aberrante durante la transcripcion de una secuencia plasmidica.
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20050112141A1 (en) 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20040106567A1 (en) 1999-09-07 2004-06-03 Hagstrom James E. Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
ATE492644T1 (de) 1999-09-09 2011-01-15 Curevac Gmbh Transfer von mrna unter verwendung von polykationischen verbindungen
AU7398200A (en) 1999-09-17 2001-04-24 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
US6623457B1 (en) 1999-09-22 2003-09-23 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for the transdermal administration of a substance
WO2002064799A2 (en) 1999-09-28 2002-08-22 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger rna
WO2001025488A2 (en) 1999-10-06 2001-04-12 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger rna
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
US6613026B1 (en) 1999-12-08 2003-09-02 Scimed Life Systems, Inc. Lateral needle-less injection apparatus and method
US6277974B1 (en) 1999-12-14 2001-08-21 Cogent Neuroscience, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating conditions, disorders, or diseases involving cell death
US6245929B1 (en) 1999-12-20 2001-06-12 General Electric Company Catalyst composition and method for producing diaryl carbonates, using bisphosphines
AU2019201A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Basell Technology Company B.V. Alpha-olefin polymerization catalyst system which contains an aromatic silane compound
WO2001051092A2 (en) 2000-01-07 2001-07-19 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
AU2001232485A1 (en) 2000-01-13 2001-07-24 Amsterdam Support Diagnostics B.V. A universal nucleic acid amplification system for nucleic acids in a sample
US6552006B2 (en) 2000-01-31 2003-04-22 The Regents Of The University Of California Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
CA2395811A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
EP1257584B2 (en) 2000-02-24 2013-03-06 Washington University St. Louis Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
WO2001066149A2 (en) 2000-03-03 2001-09-13 Valentis, Inc. Nucleic acid formulations for gene delivery and methods of use
AU2001249727A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for detecting and quantifying gene expression
CN1981868A (zh) 2000-03-31 2007-06-20 拜奥根Idec公司 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗－cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用
US6565572B2 (en) 2000-04-10 2003-05-20 Sdgi Holdings, Inc. Fenestrated surgical screw and method
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
CA2405701A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20010046496A1 (en) 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
US6375972B1 (en) 2000-04-26 2002-04-23 Control Delivery Systems, Inc. Sustained release drug delivery devices, methods of use, and methods of manufacturing thereof
US20040229271A1 (en) 2000-05-19 2004-11-18 Williams Richard B. Compositions and methods for the identification and selection of nucleic acids and polypeptides
WO2001092523A2 (en) 2000-05-30 2001-12-06 Curagen Corporation Human polynucleotides and polypeptides encoded thereby
WO2001093902A2 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
ATE343589T1 (de) 2000-06-23 2006-11-15 Wyeth Corp Modofiziertes morbillivirus v proteine
AU2001276619A1 (en) 2000-07-03 2002-01-14 Chiron S.P.A. Immunisation against chlamydia pneumoniae
US6440096B1 (en) 2000-07-14 2002-08-27 Becton, Dickinson And Co. Microdevice and method of manufacturing a microdevice
DE60124918T2 (de) 2000-07-21 2007-08-02 Glaxo Group Ltd., Greenford Kodon-optimierte papillomavirussequenzen
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US6696038B1 (en) 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
WO2002024873A1 (en) 2000-09-20 2002-03-28 Christopher Ralph Franks Stem cell therapy
AU2002211490A1 (en) 2000-10-04 2002-04-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of using capsid protein from flaviviruses and pestiviruses
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US7202226B2 (en) 2000-10-23 2007-04-10 Detroit R & D Augmentation of wound healing by elF-4E mRNA and EGF mRNA
US20030077604A1 (en) 2000-10-27 2003-04-24 Yongming Sun Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
AU2002226930A1 (en) 2000-11-17 2002-05-27 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Reduction of the nonspecific animal toxicity of immunotoxins by mutating the framework regions of the fv to lower the isoelectric point
WO2002046477A2 (en) 2000-12-07 2002-06-13 Chiron Corporation Endogenous retroviruses up-regulated in prostate cancer
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US7708915B2 (en) 2004-05-06 2010-05-04 Castor Trevor P Polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins therein
EP1224943A1 (en) 2001-01-19 2002-07-24 Crucell Holland B.V. Fibronectin as a tumor marker detected by phage antibodies
KR100964413B1 (ko) 2001-01-19 2010-06-15 비로노바티브 비.브이. 감응성 포유류에서 호흡계 질환을 유발하는 바이러스
US20040110191A1 (en) 2001-01-31 2004-06-10 Winkler Matthew M. Comparative analysis of nucleic acids using population tagging
EP1366196A4 (en) 2001-02-14 2004-07-07 Baylor College Medicine METHOD AND COMPOSITIONS FOR AMPLIFICATING RNA
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
US7232425B2 (en) 2001-03-02 2007-06-19 Sorenson Development, Inc. Apparatus and method for specific interstitial or subcutaneous diffusion and dispersion of medication
WO2002072844A1 (en) 2001-03-09 2002-09-19 Gene Stream Pty Ltd Novel expression vectors
JP2002262882A (ja) 2001-03-12 2002-09-17 Nisshinbo Ind Inc Ｒｎａの増幅法
FR2822164B1 (fr) 2001-03-19 2004-06-18 Centre Nat Rech Scient Polypeptides derives des arn polymerases, et leurs utilisations
US6520949B2 (en) 2001-04-02 2003-02-18 Martin St. Germain Method and apparatus for administering fluid to animals subcutaneously
DE10119005A1 (de) 2001-04-18 2002-10-24 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Proteinexpression ausgehend von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthaltend Exonukleasen
US20030171253A1 (en) 2001-04-19 2003-09-11 Averil Ma Methods and compositions relating to modulation of A20
ATE278796T1 (de) 2001-04-23 2004-10-15 Amaxa Gmbh Pufferlössung für die elektroporation und verfahren umfassend die verwendung derselben
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US6777187B2 (en) 2001-05-02 2004-08-17 Rubicon Genomics, Inc. Genome walking by selective amplification of nick-translate DNA library and amplification from complex mixtures of templates
AU2002308623A1 (en) 2001-05-08 2002-11-18 Magnatech International, L.P. Electronic length control wire pay-off system and method
US20050137155A1 (en) 2001-05-18 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA)
US8137911B2 (en) 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
CN100384480C (zh) 2001-05-30 2008-04-30 斯克里普斯研究学院 核酸传递系统
ATE464317T1 (de) 2001-06-05 2010-04-15 Curevac Gmbh Stabilisierte mrna mit erhöhtem g/c-gehalt für die gentherapie
WO2002102839A2 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Novartis Ag Novel g-protein coupled receptors and dna sequences thereof
US7785610B2 (en) 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US7547551B2 (en) 2001-06-21 2009-06-16 University Of Antwerp. Transfection of eukaryontic cells with linear polynucleotides by electroporation
JP2005503137A (ja) 2001-06-26 2005-02-03 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｇタンパク質共役レセプターおよびそのｄｎａ配列
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
WO2003029401A2 (en) 2001-07-13 2003-04-10 Advanced Research And Technology Institute Peptidoglycan recognition protein encoding nucleic acids and methods of use thereof
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
US7169750B2 (en) 2001-07-31 2007-01-30 Anormed, Inc. Methods to mobilize progenitor/stem cells
WO2003012030A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 University Of Utah, Technology Transfer Office Isoform-selective inhibitors and activators of pde3 cyclic
WO2003018798A2 (en) 2001-08-27 2003-03-06 Novartis Ag G-protein coupled receptor and dna sequences thereof
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
DE10148886A1 (de) 2001-10-04 2003-04-30 Avontec Gmbh Inhibition von STAT-1
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003042383A1 (fr) 2001-11-14 2003-05-22 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Promoteurs de replication de l'adn, facteurs associes a l'adn polymerase et utilisation de ces derniers
US20030138419A1 (en) 2001-11-16 2003-07-24 The University Of Tennessee Research Corporation Recombinant antibody fusion proteins and methods for detection of apoptotic cells
AU2002364277A1 (en) 2001-11-29 2003-06-10 Novartis Ag Method for the assessment and prognosis of sarcoidosis
CA2409775C (en) 2001-12-03 2010-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro
WO2003050258A2 (en) 2001-12-07 2003-06-19 Chiron Corporation Endogenous retrovirus polypeptides linked to oncogenic transformation
EP1578919B1 (en) 2001-12-07 2010-02-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Endogenous retrovirus up-regulated in prostate cancer
US20060275747A1 (en) 2001-12-07 2006-12-07 Hardy Stephen F Endogenous retrovirus up-regulated in prostate cancer
WO2003051923A2 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Novartis Ag Novel g-protein coupled receptors and dna sequences thereof
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
SI1474109T1 (sl) 2001-12-21 2010-11-30 Alcon Inc Uporaba sintetičnih anorganskih nanodelcev kot nosilcev za oftalmična zdravila
AU2003235707A1 (en) 2002-01-18 2003-07-30 Curevac Gmbh Immunogenic preparations and vaccines on the basis of mrna
US7741297B2 (en) 2002-02-04 2010-06-22 Oncothyreon Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
JP4460302B2 (ja) 2002-02-05 2010-05-12 ジェネンテック インコーポレイテッド タンパク質精製法
FR2835749B1 (fr) 2002-02-08 2006-04-14 Inst Nat Sante Rech Med Composition pharmaceutique ameliorant le transfert de gene in vivo
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US7354742B2 (en) 2002-02-22 2008-04-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Method for generating amplified RNA
NZ535690A (en) 2002-02-26 2009-04-30 Maxygen Inc Novel flavivirus antigens
DK1487856T3 (da) 2002-03-04 2010-10-18 Imclone Llc KDR-specifikke humane antistoffer og deres anvendelse
WO2003075892A1 (en) 2002-03-13 2003-09-18 Novartis Ag Pharmaceutical microparticles
US7074596B2 (en) 2002-03-25 2006-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues
ES2543710T3 (es) 2002-04-04 2015-08-21 Zoetis Belgium S.A. Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U
AU2003226820A1 (en) 2002-04-17 2003-10-27 Novartis Ag Method for the identification of inhibitors of the binding of are-containing mrn a and an hur protein
GB0209539D0 (en) 2002-04-26 2002-06-05 Avecia Ltd Monomer Polymer and process
EP1361277A1 (en) 2002-04-30 2003-11-12 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Optimization of transgene expression in mammalian cells
HUE057124T2 (hu) 2002-05-02 2022-04-28 Wyeth Holdings Llc Calicheamicin származék - hordozó konjugátumok
US20040018525A1 (en) 2002-05-21 2004-01-29 Bayer Aktiengesellschaft Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasma
US7374930B2 (en) 2002-05-21 2008-05-20 Expression Genetics, Inc. GLP-1 gene delivery for the treatment of type 2 diabetes
DE10224200C1 (de) 2002-05-31 2003-08-21 Artus Ges Fuer Molekularbiolog Vermehrung von Ribonukleinsäuren
AU2003237367A1 (en) 2002-06-03 2003-12-19 Chiron Corporation Use of nrg4, or inhibitors thereof, in the treatment of colon and pancreatic cancer
ATE485031T1 (de) 2002-06-28 2010-11-15 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
NZ537306A (en) 2002-07-01 2008-11-28 Kenneth S Warren Inst Inc Compositions comprising mutein recombinant tissue protective cytokines having one or more amino acid substitutions facilitating transport of a molecule via transcytosis across an endothelial cell barrier
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
GB0215509D0 (en) 2002-07-04 2002-08-14 Novartis Ag Marker genes
EP1543020B1 (en) 2002-07-16 2011-04-13 VGX Pharmaceuticals, LLC Codon optimized synthetic plasmids
AU2003252136A1 (en) 2002-07-24 2004-02-09 Ptc Therapeutics, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLEDULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY
EP1393745A1 (en) 2002-07-29 2004-03-03 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5'ends
EP1386925A1 (en) 2002-07-31 2004-02-04 Girindus AG Method for preparing oligonucleotides
US6653468B1 (en) 2002-07-31 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Universal support media for synthesis of oligomeric compounds
EP1873180B1 (en) 2002-08-14 2014-05-07 Novartis AG Ophthalmic device made from a radiation-curable prepolymer
EP1534340B1 (en) 2002-09-06 2011-11-16 Cerulean Pharma Inc. Cyclodextrin-based polymers for delivering the therapeutic agents covalently bound thereto
JP4959133B2 (ja) 2002-09-09 2012-06-20 ネクター セラピューティックス 末端カルボン酸またはそのエステルを有する水溶性ポリマー誘導体の調製方法
US7534872B2 (en) 2002-09-27 2009-05-19 Syngen, Inc. Compositions and methods for the use of FMOC derivatives in DNA/RNA synthesis
EP2330130B1 (en) 2002-10-17 2014-08-27 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
EP1795595A1 (en) 2002-10-22 2007-06-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Gene specifically expressed in postmitotic dopaminergic neuron precursor cells
CN102268428A (zh) 2002-11-21 2011-12-07 震源技术公司 使用编码双链启动子一条链的引物的方法
US7491234B2 (en) 2002-12-03 2009-02-17 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical devices for delivery of therapeutic agents
BRPI0316779B8 (pt) 2002-12-16 2023-02-28 Genentech Inc Anticorpo anti-cd20 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, composição, artigo manufaturado e formulação líquida
EP1625140A4 (en) 2002-12-23 2008-06-18 Dynavax Tech Corp BRANCHED IMMUNOMODULAR COMPOUNDS AND METHOD OF USE THEREOF
US7169892B2 (en) 2003-01-10 2007-01-30 Astellas Pharma Inc. Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems
WO2004067728A2 (en) 2003-01-17 2004-08-12 Ptc Therapeutics Methods and systems for the identification of rna regulatory sequences and compounds that modulate their function
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
US8426194B2 (en) 2003-01-21 2013-04-23 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating VEGF expression
EP2500437B1 (en) 2003-01-21 2016-11-30 PTC Therapeutics, Inc. Methods for identifying compounds that modulate untranslated region-dependent gene expression and methods of using same
US20040147027A1 (en) 2003-01-28 2004-07-29 Troy Carol M. Complex for facilitating delivery of dsRNA into a cell and uses thereof
SI3417875T1 (sl) 2003-02-10 2021-01-29 Biogen Ma Inc. Formulacija imunoglobulina in metode za njegovo pripravo
US20040167090A1 (en) 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
CA2450289A1 (en) 2003-03-20 2005-05-19 Imclone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
US7320961B2 (en) 2003-03-24 2008-01-22 Abbott Laboratories Method for treating a disease, disorder or adverse effect caused by an elevated serum concentration of an UGT1A1 substrate
EP1616033B1 (en) 2003-03-25 2010-03-03 Stratagene California Dna polymerase fusions and uses thereof
WO2004092329A2 (en) 2003-04-08 2004-10-28 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Semi-synthetic saponin analogs with carrier and immune stimulatory activities for dna and rna vaccines
MXPA05010778A (es) 2003-04-09 2005-12-12 Genentech Inc Terapia para enfermedad autoinmune en un paciente con una respuesta inadecuada a un inhibidor tnf-alfa.
CN100393367C (zh) 2003-05-05 2008-06-11 宾-古里安尼格夫大学研究及发展部 可注射的交联聚合制剂及其应用
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2361036T3 (es) 2003-05-06 2011-06-13 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Proteínas quiméricas vii-fc del factor de coagulación para el tratamiento de un trastorno hemostático.
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US9567591B2 (en) 2003-05-15 2017-02-14 Mello Biotechnology, Inc. Generation of human embryonic stem-like cells using intronic RNA
GB0313132D0 (en) 2003-06-06 2003-07-09 Ich Productions Ltd Peptide ligands
EP1636385A4 (en) 2003-06-24 2010-06-02 Mirus Bio Corp INHIBITION OF GENE FUNCTION BY IN VIVO DISTRIBUTION OF GENE EXPRESSION INHIBITORS BASED ON POLYNUCLEOTIDES IN MAMMALIAN CELLS
GB0316089D0 (en) 2003-07-09 2003-08-13 Xo Bioscience Ltd Differentiation method
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US7575572B2 (en) 2003-07-15 2009-08-18 Spinal Generations, Llc Method and device for delivering medicine to bone
US20050013870A1 (en) 2003-07-17 2005-01-20 Toby Freyman Decellularized extracellular matrix of conditioned body tissues and uses thereof
PL1648998T3 (pl) 2003-07-18 2015-03-31 Amgen Inc Specyficzne czynniki wiążące czynnik wzrostu hepatocytów
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
US8668926B1 (en) 2003-09-15 2014-03-11 Shaker A. Mousa Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists, and formulations thereof
US7135010B2 (en) 2003-09-30 2006-11-14 Damage Control Surgical Technologies, Inc. Method and apparatus for rapid deployment chest drainage
WO2005040416A1 (en) 2003-10-06 2005-05-06 Novartis Ag Use of genetic polymorphisms that associate with efficacy of treatment of inflammatory disease
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
US20050130201A1 (en) 2003-10-14 2005-06-16 Dharmacon, Inc. Splint-assisted enzymatic synthesis of polyribounucleotides
ES2341009T3 (es) 2003-11-05 2010-06-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos cd20 con afinidad de union a receptores fc y funcion efectora.
WO2005047536A2 (en) 2003-11-13 2005-05-26 Novartis Ag Detection of genomic amplification and deletion in cancer
US20070054278A1 (en) 2003-11-18 2007-03-08 Applera Corporation Polymorphisms in nucleic acid molecules encoding human enzyme proteins, methods of detection and uses thereof
US7699852B2 (en) 2003-11-19 2010-04-20 Zimmer Spine, Inc. Fenestrated bone tap and method
US20050153333A1 (en) 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
CA2548822C (en) 2003-12-08 2015-08-11 Gel-Del Technologies, Inc. Mucoadhesive drug delivery devices and methods of making and using thereof
US7674884B2 (en) 2003-12-10 2010-03-09 Novimmune S.A. Neutralizing antibodies and methods of use thereof
US8372966B2 (en) 2003-12-19 2013-02-12 University Of Cincinnati Oligonucleotide decoys and methods of use
US7674459B2 (en) 2003-12-23 2010-03-09 Genentech, Inc. Treatment of cancer with a novel anti-IL13 monoclonal antibody
WO2005072710A2 (en) 2004-01-28 2005-08-11 Johns Hopkins University Drugs and gene carrier particles that rapidly move through mucous barriers
EP1716233B1 (en) 2004-01-30 2009-08-26 Maxygen Holdings Ltd. Regulated stop codon readthrough
US7309487B2 (en) 2004-02-09 2007-12-18 George Inana Methods and compositions for detecting and treating retinal diseases
EP1716179A2 (en) 2004-02-12 2006-11-02 Morphotek, Inc. Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
EP3269738A1 (en) 2004-03-24 2018-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor
WO2005098433A2 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Novartis Ag Diagnostic assays for alzheimer’s disease
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
ES2246694B1 (es) 2004-04-29 2007-05-01 Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. Nanoparticulas pegiladas.
US20080119645A1 (en) 2004-05-05 2008-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amidites and Methods of Rna Synthesis
WO2005112894A1 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Baxter International Inc. Nucleic acid microspheres, production and delivery thereof
WO2005117557A2 (en) 2004-06-01 2005-12-15 San Diego State University Foundation Expression system
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
ATE536418T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Lipidverkapselte interferenz-rna
WO2005123114A2 (en) 2004-06-11 2005-12-29 Trustees Of Tufts College Silk-based drug delivery system
WO2006046978A2 (en) 2004-06-28 2006-05-04 Argos Therapeutics, Inc. Cationic peptide-mediated transformation
US7579444B2 (en) 2004-06-30 2009-08-25 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor IX moiety conjugates
WO2006093526A2 (en) 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
DE102004035227A1 (de) 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
US7603349B1 (en) 2004-07-29 2009-10-13 Yahoo! Inc. User interfaces for search systems using in-line contextual queries
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
US7291208B2 (en) 2004-08-13 2007-11-06 Gore Enterprise Holdings, Inc. Grooved active and passive adsorbent filters
SE0402025D0 (sv) 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
CA2478458A1 (en) 2004-08-20 2006-02-20 Michael Panzara Treatment of pediatric multiple sclerosis
HUE024999T2 (en) 2004-08-26 2016-02-29 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Introducing functional nucleic acids into mammalian cells with bacterial intact minicells
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
US7501486B2 (en) 2004-09-07 2009-03-10 Burnham Institute For Medical Research Peptides that selectively home to heart vasculature and related conjugates and methods
US8663599B1 (en) 2004-10-05 2014-03-04 Gp Medical, Inc. Pharmaceutical composition of nanoparticles
EP1811018A4 (en) 2004-10-12 2007-11-28 Tissue Targeting Japan Inc PROGENITOR FOR BRAIN DISPOSAL FROM BONE MARROW
CA2582885A1 (en) 2004-10-13 2006-04-27 Ptc Therapeutics, Inc. Compounds for nonsense suppression, use of these compounds for the manufacture of a medicament for treating somatic mutation-related diseases
US8057821B2 (en) 2004-11-03 2011-11-15 Egen, Inc. Biodegradable cross-linked cationic multi-block copolymers for gene delivery and methods of making thereof
WO2006047842A2 (en) 2004-11-08 2006-05-11 K.U. Leuven Research And Development Modified nucleosides for rna interference
WO2006058088A2 (en) 2004-11-23 2006-06-01 Ptc Therapeutics, Inc. Carbazole, carboline and indole derivatives useful in the inhibition of vegf production
US7838657B2 (en) * 2004-12-03 2010-11-23 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences
US7964571B2 (en) 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
US8354476B2 (en) 2004-12-10 2013-01-15 Kala Pharmaceuticals, Inc. Functionalized poly(ether-anhydride) block copolymers
WO2006071903A2 (en) 2004-12-28 2006-07-06 Ptc Therapeutics, Inc. Cell based methods and systems for the identification of rna regulatory sequences and compounds that modulate their functions
US8535702B2 (en) 2005-02-01 2013-09-17 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical devices having porous polymeric regions for controlled drug delivery and regulated biocompatibility
EP2287608B1 (en) 2005-03-11 2014-01-08 Firalis SAS Biomarkers for cardiovascular side-effects induced by cox-2 inhibitory compounds
US8415325B2 (en) 2005-03-31 2013-04-09 University Of Delaware Cell-mediated delivery and targeted erosion of noncovalently crosslinked hydrogels
EP1871911A2 (en) 2005-04-07 2008-01-02 Chiron Corporation Cancer-related genes (prlr)
AU2006235276A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. CACNA1E in cancer diagnosis, detection and treatment
EP1885403B1 (en) 2005-04-12 2013-05-08 Nektar Therapeutics Poly(ethyleneglycol) conjugates of Lysostaphin
CA2609788A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
KR101339628B1 (ko) 2005-05-09 2013-12-09 메다렉스, 인코포레이티드 예정 사멸 인자 1(ｐｄ-1)에 대한 인간 모노클로날 항체, 및 항-ｐｄ-1 항체를 단독 사용하거나 기타 면역 요법제와 병용한 암 치료 방법
US20070072175A1 (en) 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
US20060265771A1 (en) 2005-05-17 2006-11-23 Lewis David L Monitoring microrna expression and function
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
JP2008541770A (ja) 2005-06-03 2008-11-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 改変したフコシル化レベルを有する抗体の産生方法
US7550264B2 (en) 2005-06-10 2009-06-23 Datascope Investment Corporation Methods and kits for sense RNA synthesis
PT2279758E (pt) 2005-06-16 2015-05-27 Nektar Therapeutics Conjugados possuindo uma ligação degradável e reagentes poliméricos úteis na preparação de tais conjugados
JP5570721B2 (ja) 2005-06-17 2014-08-13 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル ナノ粒子の製造方法、システム、及び材料
US8202835B2 (en) 2005-06-17 2012-06-19 Yitzchak Hillman Disease treatment via antimicrobial peptides or their inhibitors
US8105813B2 (en) 2005-06-30 2012-01-31 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of fully 2′-modified nucleic acid transcripts
US8101385B2 (en) 2005-06-30 2012-01-24 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
WO2007014363A2 (en) 2005-07-27 2007-02-01 Genentech, Inc. Vectors for inducible expression of hairpin rna and use thereof
US20070048741A1 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Getts Robert C Methods and kits for sense RNA synthesis
EP2301535B1 (en) 2005-09-01 2014-05-28 Celgene Corporation Immunological uses of immunomodulatory compounds for vaccine and anti-infectious disease therapy
ES2443529T3 (es) 2005-09-01 2014-02-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Vacunación múltiple incluyendo meningococo del serogrupo C
US8420605B2 (en) 2005-09-07 2013-04-16 The University Of Strathclyde Hydrogel compositions
US20120021042A1 (en) 2005-09-15 2012-01-26 Steffen Panzner Efficient Method For Loading Amphoteric Liposomes With Nucleic Acid Active Substances
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
US20070087437A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Jifan Hu Methods for rejuvenating cells in vitro and in vivo
US20070105124A1 (en) 2005-11-08 2007-05-10 Getts Robert C Methods and kits for nucleic acid amplification
JP2009515539A (ja) 2005-11-18 2009-04-16 バイオライン・リミテッド 酵素的ｄｎａポリメラーゼ反応を増強するための方法
SG10201600950TA (en) 2005-11-28 2016-03-30 Genmab As Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
EP1954706B1 (en) 2005-11-30 2012-03-28 Epicentre Technologies Corporation Method using reversibly blocked tagging oligonucleotides
TWI389709B (zh) 2005-12-01 2013-03-21 Novartis Ag 經皮治療系統
US8603457B2 (en) 2005-12-02 2013-12-10 University Of Rochester Nonsense suppression and genetic codon alteration by targeted modification
CA2631714C (en) 2005-12-02 2014-09-16 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
WO2007069090A2 (en) 2005-12-06 2007-06-21 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
US7579318B2 (en) 2005-12-06 2009-08-25 Centre De La Recherche De La Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
JP2009523410A (ja) 2005-12-08 2009-06-25 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 遺伝子転写に対するｆｇｆｒ３の阻害剤の効果
CN101356270B (zh) 2005-12-13 2014-02-12 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
AU2006325030B2 (en) 2005-12-16 2012-07-26 Cellectis Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
ES2374458T3 (es) 2006-01-13 2012-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vacunas y agentes inmunoterapéuticos que utilizan il-15 optimizada en codones, y métodos para utilización de los mismos.
US20070178103A1 (en) 2006-01-30 2007-08-02 Fey Georg H CD19-specific immunotoxin and treatment method
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8476234B2 (en) 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
US20100168034A1 (en) 2006-02-20 2010-07-01 Ewha University-Industry Collaboration Foundation Peptide having cell membrane penetrating activity
EP1986695B1 (en) 2006-02-21 2015-06-03 Nektar Therapeutics Segmented degradable polymers and conjugates made therefrom
US20080038278A1 (en) 2006-02-24 2008-02-14 Jingsong Cao GPAT3 encodes a mammalian, microsomal acyl-coa:glycerol 3- phosphate acyltransferase
JP2009527572A (ja) 2006-02-24 2009-07-30 ノバルティス アーゲー 免疫原性組成物に使用するための生分解性ポリマーおよびカチオン性多糖を含むミクロ粒子
PL2676967T3 (pl) 2006-02-28 2019-12-31 Biogen Ma Inc. Metody leczenia chorób zapalnych i autoimmunologicznych za pomocą natalizumabu
US7910152B2 (en) 2006-02-28 2011-03-22 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Poly(ester amide)-based drug delivery systems with controlled release rate and morphology
GB0605217D0 (en) 2006-03-15 2006-04-26 Novartis Ag Method and compositions for assessing acute rejection
WO2007109244A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 Morehouse School Of Medicine Novel nanoparticles for delivery of active agents
JP2009534309A (ja) 2006-03-31 2009-09-24 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 治療剤の標的化送達のためのシステム
AU2007240986A1 (en) 2006-04-04 2007-11-01 Stc.Unm Swellable particles for drug delivery
EP1852127A1 (en) 2006-05-02 2007-11-07 Charité - Universitätsmedizin Berlin Use of a B-cell-depleting antibody for treatment of polyoma virus infections
JP5630998B2 (ja) 2006-05-15 2014-11-26 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 機能的粒子のためのポリマー
PL2026832T3 (pl) 2006-05-24 2012-08-31 Merck Serono Sa Skojarzony reżim interferonu beta i kladrybiny do leczenia stwardnienia rozsianego
WO2007143574A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 President And Fellows Of Harvard College Protein surface remodeling
WO2008003319A1 (en) 2006-07-04 2008-01-10 Genmab A/S Cd20 binding molecules for the treatment of copd
DK2037899T3 (da) 2006-07-07 2011-05-09 Univ Aarhus Nanopartikler til nukleinsyreafgivelse
BRPI0714430A2 (pt) 2006-07-12 2013-03-12 Novartis Ag prepolÍmero actinicamente reticulÁvel, processo para a manufatura do mesmo e lente de contato macia
EP2051993A2 (en) 2006-07-20 2009-04-29 Novartis Ag Amigo-2 inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer
WO2008013785A2 (en) 2006-07-24 2008-01-31 Singh-Broemer And Company, Inc. Solid nanoparticle formulation of water insoluble pharmaceutical substances with reduced ostwald ripening
US8304529B2 (en) 2006-07-28 2012-11-06 Life Technologies Corporation Dinucleotide MRNA cap analogs
EP2046954A2 (en) 2006-07-31 2009-04-15 Curevac GmbH NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT
DE102006035618A1 (de) 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz
WO2008019371A1 (en) 2006-08-07 2008-02-14 Genzyme Corporation Combination therapy
CA2661093A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Dicer substrate rna peptide conjugates and methods for rna therapeutics
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
CA2957056A1 (en) 2006-09-06 2008-03-13 C3 Jian, Inc. Selectively targeted antimicrobial peptides and the use thereof
AU2007293662B2 (en) 2006-09-07 2012-10-04 Crucell Holland B.V. Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus H5N1 and uses thereof
ES2360538T3 (es) 2006-09-08 2011-06-06 Johns Hopkins University Composiciones para aumentar el transporte a través de moco.
US8454948B2 (en) 2006-09-14 2013-06-04 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
GB0619182D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Leuven K U Res & Dev Oligonucleotide arrays
CA2927045A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations
WO2008073558A2 (en) 2006-10-05 2008-06-19 The Johns Hopkins University Water-dispersible oral, parenteral, and topical formulations for poorly water soluble drugs using smart polymeric nanoparticles
DE102006051516A1 (de) * 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
US8414927B2 (en) 2006-11-03 2013-04-09 Boston Scientific Scimed, Inc. Cross-linked polymer particles
US7999087B2 (en) 2006-11-15 2011-08-16 Agilent Technologies, Inc. 2′-silyl containing thiocarbonate protecting groups for RNA synthesis
US8242258B2 (en) 2006-12-03 2012-08-14 Agilent Technologies, Inc. Protecting groups for RNA synthesis
US7893227B2 (en) 2006-12-05 2011-02-22 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
US8399007B2 (en) 2006-12-05 2013-03-19 Landec Corporation Method for formulating a controlled-release pharmaceutical formulation
CN101553252A (zh) 2006-12-06 2009-10-07 诺华有限公司 包含来自于四株流感病毒的抗原的疫苗
US9034348B2 (en) 2006-12-11 2015-05-19 Chi2Gel Ltd. Injectable chitosan mixtures forming hydrogels
DK2124999T3 (da) 2006-12-18 2013-01-14 Acceleron Pharma Inc Activin-actrii antagonister og anvendelser til behandling af anæmi
WO2008140615A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Novozymes, Inc. Modified messenger rna stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells
US20100184659A1 (en) 2006-12-21 2010-07-22 Warren Jaworowicz Sustained-Release Formulations Comprising Crystals, Macromolecular Gels, and Particulate Suspensions of Biologic Agents
DE102006061015A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
WO2008078180A2 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
US8338166B2 (en) 2007-01-04 2012-12-25 Lawrence Livermore National Security, Llc Sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences in a complex mixture
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008091799A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Cell-based methods for identifying inhibitors of parkinson's disease-associated lrrk2 mutants
CN103755789B (zh) 2007-01-30 2016-12-07 埃皮瓦克斯公司 调节性t细胞表位、组合物及其用途
WO2008097926A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Yale University Transient transfection with rna
TW201907946A (zh) 2007-02-02 2019-03-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
WO2008096370A2 (en) 2007-02-05 2008-08-14 Natco Pharma Limited An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf
US8333799B2 (en) 2007-02-12 2012-12-18 C. R. Bard, Inc. Highly flexible stent and method of manufacture
US8242087B2 (en) 2007-02-27 2012-08-14 K.U.Leuven Research & Development Phosphate modified nucleosides useful as substrates for polymerases and as antiviral agents
EP1964922A1 (en) 2007-03-02 2008-09-03 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH &amp; Co. KG Improvement of protein production
TWI419902B (zh) 2007-03-02 2013-12-21 百靈佳殷格翰製藥公司 蛋白質產製之改良
US7943168B2 (en) 2007-03-05 2011-05-17 Washington University Nanoparticle delivery systems comprising a hydrophobic core and a lipid/surfactant layer comprising a membrane-lytic peptide
US20100297699A1 (en) 2007-03-20 2010-11-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic Acids Encoding Humanized Immunoglobulin That Binds Alpha4Beta7 Integrin
US8386027B2 (en) 2007-04-27 2013-02-26 Echo Therapeutics, Inc. Skin permeation device for analyte sensing or transdermal drug delivery
ES2492943T3 (es) 2007-04-30 2014-09-10 Glaxosmithkline Llc Procedimientos de administración de anticuerpos anti-IL5
WO2008135855A2 (en) 2007-05-03 2008-11-13 Pfizer Products Inc. Nanoparticles comprising a cholesteryl ester transfer protein inhibitor and a nonionizable polymer
EP3434259A1 (en) 2007-05-04 2019-01-30 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
US7682789B2 (en) 2007-05-04 2010-03-23 Ventana Medical Systems, Inc. Method for quantifying biomolecules conjugated to a nanoparticle
WO2009023311A2 (en) 2007-05-07 2009-02-19 Alba Therapeutics Corporation Transcutaneous delivery of therapeutic agents
JP5296328B2 (ja) 2007-05-09 2013-09-25 独立行政法人理化学研究所 １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
DK2476689T3 (en) 2007-05-10 2016-01-18 Agilent Technologies Inc Thiocarbonbeskyttende groups for RNA synthesis
PL2068927T3 (pl) 2007-05-14 2016-06-30 Medimmune Llc Sposoby redukcji poziomów eozynofilii
WO2008144365A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Novartis Ag Method for making dry powder compositions containing ds-rna based on supercritical fluid technology
CN101679501A (zh) 2007-05-22 2010-03-24 诺瓦提斯公司 治疗、诊断和检测fgf21-相关疾病的方法
EP2164951A2 (en) 2007-05-30 2010-03-24 The General Hospital Corporation Methods of generating pluripotent cells from somatic cells
WO2008151049A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
ES2500515T3 (es) 2007-06-19 2014-09-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Síntesis y utilización de análogos de fosforotioato antiinversos de la caperuza de ARN mensajero
EP2173872B1 (en) 2007-06-29 2014-04-02 CellScript, Inc. Copy dna and sense rna
WO2009015071A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Dharmacon, Inc. Screening of micro-rna cluster inhibitor pools
US9144546B2 (en) 2007-08-06 2015-09-29 Clsn Laboratories, Inc. Nucleic acid-lipopolymer compositions
US20090042825A1 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Majed Matar Composition, method of preparation & application of concentrated formulations of condensed nucleic acids with a cationic lipopolymer
KR20100063079A (ko) 2007-08-23 2010-06-10 노파르티스 아게 올리고뉴클레오티드의 탐지 방법
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
RU2595383C2 (ru) 2007-09-05 2016-08-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа i и типа ii
US8506928B2 (en) 2007-09-07 2013-08-13 The Regents Of The University Of California Methods and compounds for targeting tissues
CA2715078C (en) 2007-09-26 2019-07-23 Intrexon Corporation Synthetic 5'utrs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
AU2008304313B2 (en) 2007-09-26 2013-01-10 Oregon Health & Science University Cyclic undecapeptides and derivatives as multiple sclerosis therapies
ES2647538T3 (es) 2007-09-28 2017-12-22 Pfizer Inc. Direccionamiento a células de cáncer usando nanopartículas
EP2042193A1 (en) 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
WO2009046388A1 (en) 2007-10-03 2009-04-09 United States Medical Research & Material Command Cr-2 binding peptide p28 as molecular adjuvant for dna vaccines
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
WO2009046738A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc)
US10736848B2 (en) 2007-10-12 2020-08-11 Massachusetts Institute Of Technology Vaccine nanotechnology
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
EP2205277B1 (en) 2007-10-22 2017-07-26 Genmab A/S Novel antibody therapies
US8338571B2 (en) 2007-11-01 2012-12-25 University Of Rochester Recombinant factor VIII having increased stability
JP5559695B2 (ja) 2007-11-09 2014-07-23 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ４０抗体の使用
US8470771B2 (en) 2007-11-14 2013-06-25 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences Method and medicament for inhibiting the infection of influenza virus
ES2614284T3 (es) 2007-11-30 2017-05-30 Glaxo Group Limited Construcciones de unión a antígenos
US7871985B2 (en) 2007-12-10 2011-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor VII gene
SG10201408162PA (en) 2007-12-11 2015-01-29 Scripps Research Inst Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
NZ585784A (en) 2007-12-13 2012-09-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc siRNAs for the treatment and prevention of respiratory syncytial virus (RSV) infection
EP2072618A1 (en) 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
KR20100102172A (ko) 2007-12-21 2010-09-20 제넨테크, 인크. 리툭시마브-난치성 류마티스성 관절염 환자의 요법
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
EP2246422A4 (en) 2008-01-24 2012-07-25 Nat Inst Of Advanced Ind Scien POLYNUCLEOTIDE OR ITS ANALOGUE, AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION USING THE POLYNUCLEOTIDE OR ITS ANALOGUE
PT2176408E (pt) 2008-01-31 2015-04-23 Curevac Gmbh Ácidos nucleicos compreendendo a fórmula (nuglxmgnnv)a e os seus derivados como agentes/adjuvantes imunoestimuladores
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
US8343140B2 (en) 2008-02-13 2013-01-01 Intarcia Therapeutics, Inc. Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
DE102008009920A1 (de) 2008-02-15 2009-08-20 Aj Innuscreen Gmbh Mobiles Gerät für die Nukleinsäureisolierung
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
US20120027813A1 (en) 2008-02-22 2012-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
WO2009108891A2 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Egen, Inc. Modified poloxamers for gene expression and associated methods
JP2011514423A (ja) 2008-03-14 2011-05-06 エーゲン、インコーポレイテッド 生分解性架橋分枝状ポリ（アルキレンイミン）
MX2010010085A (es) 2008-03-14 2011-03-29 Biocon Ltd Un anticuerpo monoclonal y el metodo para su uso.
AU2009228163B2 (en) 2008-03-28 2012-08-30 Glaxosmithkline Llc Methods of treatment
DK2279254T3 (en) 2008-04-15 2017-09-18 Protiva Biotherapeutics Inc PRESENT UNKNOWN LIPID FORMS FOR NUCLEIC ACID ADMINISTRATION
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
DK2288336T3 (en) 2008-04-25 2017-03-13 Univ Northwestern NANOSTRUCTURES SUITABLE FOR COMPLEXATION OF CHOLESTEROL
AU2009243187C1 (en) 2008-04-28 2015-12-24 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration
US8715689B2 (en) 2008-04-30 2014-05-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Chimeric west nile/dengue viruses
US9394538B2 (en) 2008-05-07 2016-07-19 Shi-Lung Lin Development of universal cancer drugs and vaccines
EP2891501B1 (en) 2008-05-08 2016-09-21 MiniPumps, LLC Methods of manufacture of drug-delivery pumps
US8697098B2 (en) 2011-02-25 2014-04-15 South Dakota State University Polymer conjugated protein micelles
EP2281011B1 (en) 2008-05-13 2013-02-27 University Of Washington Diblock copolymers and polynucleotide complexes thereof for delivery into cells
US9738680B2 (en) 2008-05-21 2017-08-22 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
EP2297197B1 (en) 2008-05-29 2012-03-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin (epo)polypeptides that exhibit increased protease resistance and pharmaceutical compositions thereof
FR2931824B1 (fr) 2008-05-29 2014-11-28 Centre Nat Rech Scient Procede de synthese d'arn par voie chimique.
WO2009148528A2 (en) 2008-05-30 2009-12-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Assessment of chromosomal alterations to predict clinical outcome of bortezomib treatment
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
TWI451876B (zh) 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
SI2285350T1 (en) 2008-06-16 2018-03-30 Pfizer Inc. Methods for the preparation of diblock copolymers functionalized with targeting agent for use in the manufacture of therapeutic nanoparticles
ES2462090T5 (es) 2008-06-16 2017-07-12 Pfizer Inc. Nanopartículas poliméricas cargadas de fármaco y procedimientos de fabricación y uso de las mismas
US8613951B2 (en) 2008-06-16 2013-12-24 Bind Therapeutics, Inc. Therapeutic polymeric nanoparticles with mTor inhibitors and methods of making and using same
US20100009424A1 (en) 2008-07-14 2010-01-14 Natasha Forde Sonoporation systems and methods
US20110250237A1 (en) 2008-07-15 2011-10-13 O'hagan Derek Immunogenic amphipathic peptide compositions
WO2010009065A2 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Novartis Ag Amphipathic peptide compositions
EP2331561A4 (en) 2008-09-03 2013-02-27 Xenome Ltd PEPTIDE CONJUGATE LIBRARIES AND METHODS OF MAKING SAME
CA2738635C (en) 2008-09-05 2019-12-31 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution of proteins and nucleic acids
WO2010027512A2 (en) 2008-09-06 2010-03-11 Chemgenes Corporation Rna synthesis - phosphoramidites for synthetic rna in the reverse direction, and application in convenient introduction of ligands, chromophores and modifications of synthetic rna at the 3' - end
WO2010027903A2 (en) 2008-09-08 2010-03-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center Lung cancer diagnosis
WO2010030763A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Bind Biosciences, Inc. High throughput fabrication of nanoparticles
TW201438738A (zh) 2008-09-16 2014-10-16 Genentech Inc 治療進展型多發性硬化症之方法
US20120021519A1 (en) 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2010042490A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Boston Medical Center Corporation A single lentiviral vector system for induced pluripotent (ips) stem cells derivation
CA2740000C (en) 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
US8535655B2 (en) 2008-10-10 2013-09-17 Polyactiva Pty Ltd. Biodegradable polymer—bioactive moiety conjugates
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
US8603532B2 (en) 2008-10-20 2013-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Nanostructures for drug delivery
US20120015899A1 (en) 2008-10-25 2012-01-19 Plant Bioscience, Limited Modified plant virus particles and uses therefor
US8969353B2 (en) 2008-11-07 2015-03-03 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
EP2355851B1 (en) 2008-11-10 2018-04-04 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
US8734853B2 (en) 2008-11-17 2014-05-27 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth HDL particles for delivery of nucleic acids
EP2191840A1 (en) 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and melphalan
EP2196476A1 (en) 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
US8324368B2 (en) 2008-12-10 2012-12-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. GNAQ targeted dsRNA compositions and methods for inhibiting expression
US8512964B2 (en) 2008-12-12 2013-08-20 The Regents Of The University Of California Targets for treatment of hypercholesterolemia
US8563041B2 (en) 2008-12-12 2013-10-22 Bind Therapeutics, Inc. Therapeutic particles suitable for parenteral administration and methods of making and using same
ES2776126T3 (es) 2008-12-15 2020-07-29 Pfizer Nanopartículas de circulación prolongada para la liberación sostenida de agentes terapéuticos
KR20110111303A (ko) 2009-01-16 2011-10-10 글락소스미스클라인 엘엘씨 벤다무스틴 및 항-ｃｄ２０ 항체의 조합을 이용한 암의 치료
WO2010084371A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Mitoprod Novel circular interfering rna molecules
EP2391343B1 (en) 2009-01-29 2017-03-01 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
WO2010088927A1 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Curevac Gmbh Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds
US20140141089A1 (en) 2009-02-11 2014-05-22 Colorado School Of Mines Nanoparticles, Compositions Thereof, and Methods of Use, and Methods of Making the Same
AU2010218388B2 (en) 2009-02-24 2015-03-26 The Scripps Research Institute Reengineering mRNA primary structure for enhanced protein production
WO2010102065A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Bend Research, Inc. Pharmaceutical compositions of dextran polymer derivatives
WO2010141135A2 (en) 2009-03-05 2010-12-09 Trustees Of Boston University Bacteriophages expressing antimicrobial peptides and uses thereof
CA2755245A1 (en) 2009-03-13 2010-09-16 Egen, Inc. Compositions and methods for the delivery of biologically active rnas
KR101800833B1 (ko) 2009-03-20 2017-11-23 씨엘에스엔 래버러토리스, 인코퍼레이티드 폴리아민 유도체
US20120095077A1 (en) 2009-03-23 2012-04-19 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions related to modified guanine bases for controlling off-target effects in rna interference
JP5622254B2 (ja) 2009-03-31 2014-11-12 国立大学法人東京大学 二本鎖リボ核酸ポリイオンコンプレックス
EP2414387B1 (en) 2009-04-03 2015-12-16 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) variants
ES2683352T3 (es) 2009-04-13 2018-09-26 Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale Partículas de HPV y usos de las mismas
MX2011010971A (es) 2009-04-17 2012-01-19 Biogen Idec Inc Composiciones y metodos para tratar leucemia mielogena aguda.
US20100273220A1 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
BRPI1014522B8 (pt) 2009-04-27 2021-05-25 Novartis Ag anticorpo anti-actriib ou fragmento funcional, processo de produção dos mesmos, composição farmacêutica e usos
WO2010127159A2 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Intezyne Technologies, Incorporated Polymeric micelles for polynucleotide encapsulation
US8715736B2 (en) 2009-04-30 2014-05-06 Florida Agricultural And Mechanical University Nanoparticle formulations for skin delivery
US8883202B2 (en) 2009-05-05 2014-11-11 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid compositions
DE202009007116U1 (de) 2009-05-18 2010-10-14 Amoena Medizin-Orthopädie-Technik GmbH Antidekubituskissen
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
EP2440556A1 (en) 2009-06-10 2012-04-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase
TR201811076T4 (tr) 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
CN104651408A (zh) 2009-06-15 2015-05-27 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向pcsk9基因的脂质配制的dsrna
US20110097329A1 (en) 2009-06-26 2011-04-28 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for treating cancer and modulating stress granule formation
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
ES2613498T3 (es) 2009-07-01 2017-05-24 Protiva Biotherapeutics Inc. Nuevas formulaciones de lípidos para el suministro de agentes terapéuticos a tumores sólidos
WO2011005799A2 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
DE102009033507A1 (de) * 2009-07-15 2011-01-20 Niro-Plan Ag Vorrichtung und Verfahren zum Erzeugen von gekühltem Kaffee
CA2769670C (en) 2009-07-31 2018-10-02 Ethris Gmbh Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US20110070227A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Anna-Marie Novotney-Barry Treatment of Autoimmune and Inflammatory Diseases
US8859284B2 (en) 2009-10-22 2014-10-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Delivery of nanoparticles to neurons
US8449916B1 (en) 2009-11-06 2013-05-28 Iowa State University Research Foundation, Inc. Antimicrobial compositions and methods
WO2011060250A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Bend Research, Inc. Cationic dextran polymer derivatives
US9415113B2 (en) 2009-11-18 2016-08-16 University Of Washington Targeting monomers and polymers having targeting blocks
US8530429B2 (en) 2009-11-24 2013-09-10 Arch Cancer Therapeutics, Inc. Brain tumor targeting peptides and methods
DK3338765T3 (en) 2009-12-01 2019-03-04 Translate Bio Inc STEROID DERIVATIVE FOR THE SUPPLY OF MRNA IN HUMANGENETIC DISEASES
US20110245756A1 (en) 2009-12-03 2011-10-06 Rishi Arora Devices for material delivery, electroporation, sonoporation, and/or monitoring electrophysiological activity
HUE036233T2 (hu) 2009-12-06 2018-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc VIII-FC Faktor kimérás és hibrid polipeptidek, és ezek használati módszerei
US20130189741A1 (en) 2009-12-07 2013-07-25 Cellscript, Inc. Compositions and methods for reprogramming mammalian cells
CA3044884A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
EP3112467B1 (en) 2009-12-07 2018-02-14 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
WO2011069528A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Lyophilization of nucleic acids in lactate-containing solutions
WO2011072218A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Bind Biosciences Stable formulations for lyophilizing therapeutic particles
US9295649B2 (en) 2009-12-15 2016-03-29 Bind Therapeutics, Inc. Therapeutic polymeric nanoparticle compositions with high glass transition temperature or high molecular weight copolymers
JP6175237B2 (ja) 2009-12-15 2017-08-02 ファイザー・インク コルチコステロイドを含む治療用ポリマーナノ粒およびそれを製造かつ使用する方法
DE102009058769A1 (de) 2009-12-16 2011-06-22 MagForce Nanotechnologies AG, 10589 Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung
CN102791294A (zh) 2009-12-16 2012-11-21 布里格姆妇女医院股份有限公司 用于多种药物递送的粒子
WO2011075656A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
EA026374B1 (ru) 2009-12-23 2017-04-28 Новартис Аг Липиды, липидные композиции и способы их применения
US8846631B2 (en) 2010-01-14 2014-09-30 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compositions and methods
PL2539451T3 (pl) 2010-02-24 2016-08-31 Arrowhead Res Corporation Kompozycje do ukierunkowanego dostarczania siRNA
WO2011106702A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 The Johns Hopkins University Sustained delivery of therapeutic agents to an eye compartment
US20130133483A1 (en) 2010-03-08 2013-05-30 University Of Rochester Synthesis of Nanoparticles Using Reducing Gases
WO2011116072A1 (en) 2010-03-16 2011-09-22 Escape Therapeutics, Inc. Hybrid hydrogel scaffold compositions and methods of use
EP2547715A4 (en) 2010-03-16 2013-10-30 Univ Utah Res Found SPLICABLE MODIFICATIONS FOR REDUCABLE POLY (AMID ETHYLENIMINE) FOR REINFORCED NUCLEOTIDE DELIVERY
US20110230816A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Tyco Healthcare Group Lp Gels for Transdermal Delivery
US9149432B2 (en) 2010-03-19 2015-10-06 Massachusetts Institute Of Technology Lipid vesicle compositions and methods of use
US20110237975A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 United States Endoscopy Group, Inc. Multiple biopsy device
GB201005005D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Angeletti P Ist Richerche Bio New vaccine
EP2553019A1 (en) 2010-03-26 2013-02-06 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
WO2011119262A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for generating nanoparticles
US20110247090A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Intrexon Corporation Synthetic 5'UTRs, Expression Vectors, and Methods for Increasing Transgene Expression
US8808699B2 (en) 2010-04-05 2014-08-19 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) antibodies as an enhancer of immune response
EP2558074B1 (en) 2010-04-08 2018-06-06 The Trustees of Princeton University Preparation of lipid nanoparticles
JP5652830B2 (ja) 2010-04-09 2015-01-14 国立大学法人 東京大学 マイクロｒｎａ制御組換えワクシニアウイルス及びその使用
EP2813220A3 (en) 2010-04-09 2015-06-17 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Method for formulating large diameter synthetic membrane vesicles
KR101196667B1 (ko) 2010-04-15 2012-11-02 포항공과대학교 산학협력단 피에이치 민감성 금속 나노 입자를 이용한 항암제 전달 시스템
EP3072961A1 (en) 2010-04-16 2016-09-28 Children's Medical Center Corporation Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
EP2377938A1 (en) 2010-04-16 2011-10-19 Eukarys Capping-prone RNA polymerase enzymes and their applications
CA2832672A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
WO2011133868A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
US9586044B2 (en) 2010-04-28 2017-03-07 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method for increasing the permeability of an epithelial barrier
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
CN102869791A (zh) 2010-04-30 2013-01-09 诺华有限公司 用于脆性x染色体综合征(fxs)治疗的预测标记
US9254327B2 (en) 2010-05-10 2016-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US10077232B2 (en) 2010-05-12 2018-09-18 Arbutus Biopharma Corporation Cyclic cationic lipids and methods of use
US20130123338A1 (en) 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
EP2387999A1 (en) 2010-05-21 2011-11-23 CureVac GmbH Histidine-containing solution for transfection and/or injection of nucleic acids and uses thereof
JP2013531634A (ja) 2010-05-24 2013-08-08 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチド送達のための新規なアミノアルコールカチオン性脂質
WO2011153120A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
KR101590674B1 (ko) 2010-06-14 2016-02-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 세포-투과 펩티드 및 이의 용도
WO2011163121A1 (en) 2010-06-21 2011-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
WO2011161653A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
WO2012002760A2 (ko) 2010-07-01 2012-01-05 포항공과대학교 산학협력단 세균유래 마이크로베시클을 이용한 암치료 및 암진단 방법
CN103037885B (zh) 2010-07-02 2015-08-26 芝加哥大学 与蛋白A(SpA)变体相关的组合物和方法
CN103327963A (zh) 2010-07-06 2013-09-25 诺华股份有限公司 阳离子水包油乳液
ES2770335T3 (es) 2010-07-06 2020-07-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Administración de ARN para desencadenar múltiples vías inmunológicas
BR112013000244A2 (pt) 2010-07-06 2016-05-17 Novartis Ag lipossomas com lipídeos apresentando pka vantajoso para administração de rna
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
EP4180057A1 (en) 2010-07-06 2023-05-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
US9611310B2 (en) 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
MX356527B (es) 2010-07-09 2018-06-01 Bioverativ Therapeutics Inc Polipeptidos de factor ix y metodos para usarlos.
WO2012009406A2 (en) 2010-07-13 2012-01-19 University Of Utah Research Foundation Gold particles and methods of making and using the same in cancer treatment
GB201012410D0 (en) 2010-07-23 2010-09-08 Medical Res Council Intracellular immunity
US8968746B2 (en) 2010-07-30 2015-03-03 Curevac Gmbh Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012021516A2 (en) 2010-08-09 2012-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nanoparticle-oligonucletide hybrid structures and methods of use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
ES2531577T3 (es) 2010-08-20 2015-03-17 Novartis Ag Conjuntos de agujas para la administración de vacuna soluble contra la gripe
MX2013002048A (es) 2010-08-20 2013-07-03 Cerulean Pharma Inc Conjugados, particulas, composiciones y metodos relacionados.
WO2012024595A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 University Of Washington Circumferential aerosol device for delivering drugs to olfactory epithelium and brain
PT2611467T (pt) 2010-08-31 2022-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas pequenos para entrega de arn que codifica um imunogénio
US20130253168A1 (en) 2010-08-31 2013-09-26 Steven L. Colletti Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides
EP4226935A3 (en) 2010-08-31 2023-09-06 Theraclone Sciences, Inc. Human immunodeficiency virus (hiv)-neutralizing antibodies
ES2727583T3 (es) 2010-08-31 2019-10-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lípidos adecuados para la administración liposómica de ARN que codifica proteínas
AU2011295935B2 (en) 2010-08-31 2016-02-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding RNA
WO2012031205A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-polymer hybrid particles
EP2614074A1 (en) 2010-09-09 2013-07-17 The University of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
WO2012034077A2 (en) 2010-09-09 2012-03-15 The University Of Chicago Compositions and methods related to attenuated staphylococcal strains
US10307372B2 (en) 2010-09-10 2019-06-04 The Johns Hopkins University Rapid diffusion of large polymeric nanoparticles in the mammalian brain
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
ES2888231T3 (es) 2010-09-20 2022-01-03 Sirna Therapeutics Inc Lípidos catiónicos de bajo peso molecular para el suministro de oligonucleótidos
WO2012038448A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 Riboxx Gmbh Method for synthesizing rna using dna template
EP2618821A4 (en) 2010-09-24 2014-08-13 Brigham & Womens Hospital NANOSTRUCTURED GELS FOR CONTROLLED RELEASE OF CAPSUED MEDIUM
WO2012050975A2 (en) 2010-09-29 2012-04-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel circular mammalian rna molecules and uses thereof
CA2811430A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
CN104531812A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
US10078075B2 (en) 2011-12-09 2018-09-18 Vanderbilt University Integrated organ-on-chip systems and applications of the same
EP3485913A1 (en) 2010-10-21 2019-05-22 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
MX344596B (es) 2010-10-29 2016-12-20 Merck Sharp & Dohme Vacuna de subunidad recombinante del virus del dengue.
WO2012061703A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 The Johns Hopkins University Compositions and methods relating to reduced mucoadhesion
US8518871B2 (en) 2010-11-09 2013-08-27 The Regents Of The University Of California Skin permeating and cell entering (SPACE) peptides and methods of use thereof
EA027315B1 (ru) 2010-11-12 2017-07-31 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Молекула нуклеиновой кислоты и белок для индукции иммунного ответа против антигена рака предстательной железы, плазмида, вектор экспрессии, способ лечения и фармацевтическая композиция
MX344972B (es) 2010-11-16 2017-01-12 Selecta Biosciences Inc Oligonucleotidos inmunoestimulantes.
SI2640842T1 (sl) 2010-11-17 2018-09-28 Aduro Biotech, Inc. Postopki in sestavki za induciranje imunskega odziva na EGFRvIII
EP3213770B1 (en) 2010-11-19 2021-02-24 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
WO2012072096A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Biontech Ag Method for cellular rna expression
WO2012103985A2 (en) 2010-12-16 2012-08-09 Steve Pascolo Pharmaceutical composition consisting of rna having alkali metal as counter ion and formulated with dications
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
AU2011348204B2 (en) 2010-12-22 2017-03-02 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
JP5876073B2 (ja) 2010-12-29 2016-03-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 核酸の細胞内送達のための小分子複合体
CA2862765A1 (en) 2011-01-04 2012-07-12 Brown University Nanotubes as carriers of nucleic acids into cells
WO2012094574A2 (en) 2011-01-06 2012-07-12 The Johns Hopkins University Stabilized polyribonucleotide nanoparticles
US20140080766A1 (en) 2011-01-07 2014-03-20 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for macromolecular drug delivery
EP2663548B1 (en) 2011-01-11 2017-04-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
US20120189700A1 (en) 2011-01-19 2012-07-26 Zoraida Aguilar Nanoparticle Based Immunological Stimulation
JP2014505064A (ja) 2011-01-26 2014-02-27 セニックス バイオサイエンス ゲーエムベーハー 自然に存在する細胞内輸送経路を介して化合物を送達するための送達システム及びコンジュゲート
US10363309B2 (en) 2011-02-04 2019-07-30 Case Western Reserve University Targeted nanoparticle conjugates
US20140066363A1 (en) 2011-02-07 2014-03-06 Arun K. Bhunia Carbohydrate nanoparticles for prolonged efficacy of antimicrobial peptide
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
US20120207840A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Diagnostic Or Therapeutic Agents For The Treatment Of Non-Melanoma Skin Cancer
WO2012112582A2 (en) 2011-02-14 2012-08-23 Swift Biosciences, Inc. Polynucleotide primers and probes
AU2012217685B2 (en) 2011-02-15 2017-05-18 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for delivering nucleic acid to a cell
US20140081012A1 (en) 2011-02-15 2014-03-20 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle, liposomes, polymers, agents and proteins modified with reversible linkers
EP2489371A1 (en) 2011-02-18 2012-08-22 Instituto Nacional de Investigacion y Tecnologia Agraria y Alimentaria Carrier peptides for drug delivery
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
JP6091435B2 (ja) 2011-02-22 2017-03-08 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクターを用いたタンパク質の送達
US8696637B2 (en) 2011-02-28 2014-04-15 Kimberly-Clark Worldwide Transdermal patch containing microneedles
BR112013022397A2 (pt) 2011-03-02 2017-09-26 Derek O’Hagan vacinas combinadas com doses menores de antígeno e/ou adjuvante
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
AU2012225497A1 (en) 2011-03-07 2013-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods for transfecting cells with nucleic acids
WO2012125680A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Novartis Ag Methods of treating vasculitis using an il-17 binding molecule
WO2012125987A2 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Massachusetts Institute Of Technology Delivery system
KR20140012137A (ko) 2011-03-17 2014-01-29 노파르티스 아게 Hr 양성 대상체에서의 유방암용 바이오마커로서의 fgfr 및 이의 리간드
ES2785108T3 (es) 2011-03-24 2020-10-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nanoemulsiones adyuvantes con fosfolípidos
EP2691538A1 (en) 2011-03-28 2014-02-05 Novartis AG Markers associated with cyclin-dependent kinase inhibitors
CA2831392C (en) 2011-03-28 2020-04-28 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
EP2694660B1 (en) 2011-04-03 2018-08-08 The General Hospital Corporation Efficient protein expression in vivo using modified rna (mod-rna)
ES2587512T3 (es) 2011-04-04 2016-10-25 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Derivados de 2'-O-aminooximetil nucleósido para su uso en la síntesis y modificación de nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos
WO2012142132A1 (en) 2011-04-11 2012-10-18 Life Technologies Corporation Polymer particles and methods of making and using same
US11135174B2 (en) 2011-04-13 2021-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Coated mesoporous nanoparticles
WO2013158127A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Molecular Transfer, Inc. Agents for improved delivery of nucleic acids to eukaryotic cells
US20140178894A1 (en) 2011-04-20 2014-06-26 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Culture medium suitable for the culture of undifferentiated cells
JP2014518620A (ja) 2011-04-26 2014-08-07 モレキュラー エクスプレス，インコーポレイテッド リポソーム製剤
AU2012249274A1 (en) 2011-04-28 2013-10-31 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Neutralizing antibodies to Nipah and Hendra virus
JP2014512409A (ja) 2011-04-28 2014-05-22 エスティーシー． ユーエヌエム 標的送達用の多孔性ナノ粒子に担持された脂質二重層（プロトセル）及びその使用方法
EP3679933A1 (en) 2011-04-29 2020-07-15 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers to reduce immune responses to therapeutic proteins
WO2012149246A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Novartis Ag Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
WO2012151234A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Wayne State University A protein-induced pluripotent cell technology uses thereof
UA116189C2 (uk) 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
WO2012152810A1 (de) 2011-05-10 2012-11-15 Basf Se Öl-in-wasser-emulsionen
EP2707033A1 (en) 2011-05-11 2014-03-19 Ramot at Tel Aviv University, Ltd. Targeted polymeric conjugates and uses thereof
US20140072657A1 (en) 2011-05-12 2014-03-13 Helmut Vockner Novel pharmaceutical formulation
WO2012153338A2 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Liposomes comprising polymer-conjugated lipids and related uses
ES2782119T3 (es) 2011-05-13 2020-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antígenos de F de prefusión del VRS
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
CN103687957A (zh) 2011-05-17 2014-03-26 现代治疗公司 工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法
EP2710196A1 (en) 2011-05-20 2014-03-26 Kohler Co. Toilet installation system and method
ES2550192T3 (es) 2011-05-25 2015-11-05 Novartis Ag Biomarcadores para el cáncer de pulmón
US20140308363A1 (en) 2011-05-31 2014-10-16 Bind Therapeutics, Inc. Drug loaded polymeric nanoparticles and methods of making and using same
US20140094461A1 (en) 2011-06-02 2014-04-03 Novartis Ag Biomarkers for hedgehog inhibitor therapy
CA2873404C (en) 2011-06-02 2022-08-30 The Regents Of The University Of California Membrane encapsulated nanoparticles and method of use
WO2012168259A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (ptpn11) and triple-negative breast cancer
PL2717893T3 (pl) 2011-06-08 2019-12-31 Translate Bio, Inc. Kompozycje nanocząstek lipidowych i sposoby do dostarczania mRNA
ES2795110T3 (es) 2011-06-08 2020-11-20 Translate Bio Inc Lípidos escindibles
WO2012170607A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
US8636696B2 (en) 2011-06-10 2014-01-28 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Transdermal device containing microneedles
US8916696B2 (en) 2011-06-12 2014-12-23 City Of Hope Aptamer-mRNA conjugates for targeted protein or peptide expression and methods for their use
WO2012172495A1 (en) 2011-06-14 2012-12-20 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting tem8
KR20140068000A (ko) 2011-06-15 2014-06-05 크론테크 파마 아베 주사 바늘 및 장치
BR112013031762A2 (pt) 2011-06-16 2016-09-13 Novartis Ag proteínas solúveis para utilização como terapêuticos
WO2012177760A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza
US9862926B2 (en) 2011-06-27 2018-01-09 Cellscript, Llc. Inhibition of innate immune response
US9913978B2 (en) 2011-06-28 2018-03-13 Kate Broderick Miniminally invasive dermal electroporation device
US9365651B2 (en) 2011-07-01 2016-06-14 Novartis Ag Method for treating metabolic disorders by administration of an anti-ActRIIB antibody
WO2013003887A1 (en) 2011-07-04 2013-01-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Nucleic acid complex
JP2014522842A (ja) 2011-07-06 2014-09-08 ノバルティス アーゲー 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用
CA2840965C (en) 2011-07-06 2021-03-02 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
EP2729168A2 (en) 2011-07-06 2014-05-14 Novartis AG Immunogenic compositions and uses thereof
JP6059220B2 (ja) 2011-07-06 2017-01-18 ノバルティス アーゲー 核酸を含む水中油型エマルジョン
SG10201605537XA (en) 2011-07-06 2016-09-29 Novartis Ag Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
WO2013006824A2 (en) 2011-07-07 2013-01-10 Life Technologies Corporation Polymer particles, nucleic acid polymer particles and methods of making and using the same
US20130012566A1 (en) 2011-07-10 2013-01-10 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Diagnostic Or Therapeutic Agents For The Treatment of Alopecia
WO2013009717A1 (en) 2011-07-10 2013-01-17 Elisabet De Los Pinos Virion derived protein nanoparticles for delivering diagnostic or therapeutic agents for the treatment of skin-related diseases
EP2758458A4 (en) 2011-07-10 2015-10-21 Harvard College COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELF-ASSEMBLING POLYMERS WITH COMPLEMENTARY MACROSCOPIC AND MICROSCOPIC SCALE UNITS
WO2013012921A2 (en) 2011-07-20 2013-01-24 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid aptamers
GB2492999A (en) 2011-07-20 2013-01-23 Univ Central Lancashire Neutron detector
JP6018197B2 (ja) 2011-07-21 2016-11-02 クローダ インターナショナル パブリック リミティド カンパニー 分枝状ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマー並びにそれらの製造方法及び使用方法
US10030052B2 (en) 2011-07-25 2018-07-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Parvovirus Vp1 unique region polypeptides and compositions thereof
US9493549B2 (en) 2011-07-25 2016-11-15 The Rockefeller University Antibodies directed toward the HIV-1 GP120 CD4 binding site with increased potency and breadth
JP2014521687A (ja) 2011-07-29 2014-08-28 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 体液性および細胞傷害性ｔリンパ球（ｃｔｌ）免疫応答を生成する合成ナノキャリア
US9556281B2 (en) 2011-08-15 2017-01-31 The University Of Chicago Compositions and methods related to antibodies to staphylococcal protein A
KR20140051357A (ko) 2011-08-26 2014-04-30 애로우헤드 리서치 코오포레이션 Ｉｎ Ｖｉｖｏ 핵산 전달용 폴리(비닐 에스테르) 고분자
US9126966B2 (en) 2011-08-31 2015-09-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use thereof
EP2750712A2 (en) 2011-08-31 2014-07-09 Mallinckrodt LLC Nanoparticle peg modification with h-phosphonates
LT2750707T (lt) 2011-08-31 2019-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
EA201490542A1 (ru) 2011-09-01 2014-08-29 АйАрЭм ЭлЭлСи Соединения и композиции в качестве pdgfr киназных ингибиторов
US20160032284A1 (en) 2011-09-02 2016-02-04 Arrowhead Research Corportation Organic compositions to treat hsf1-related diseases
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2755986A4 (en) 2011-09-12 2015-05-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE
WO2013038375A2 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Novartis Ag Methods for making saccharide-protein glycoconjugates
JP2014531456A (ja) 2011-09-22 2014-11-27 バインド セラピューティックス インコーポレイテッド 治療用ナノ粒子と癌を治療する方法
WO2013072929A2 (en) 2011-09-23 2013-05-23 Indian Institute Of Technology Nanop article based cosmetic composition
UY34347A (es) 2011-09-26 2013-04-30 Novartis Ag Proteínas de función dual para tratar trastornos metabólicos
US9006400B2 (en) 2011-09-26 2015-04-14 Novartis Ag Fibroblast growth factor-21-Fc fusion proteins
EP2760477B1 (en) 2011-09-27 2018-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
WO2013045505A1 (en) 2011-09-28 2013-04-04 Novartis Ag Biomarkers for raas combination therapy
ES2911677T3 (es) 2011-10-03 2022-05-20 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados, y sus usos
WO2013055971A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Polymers for delivering a substance into a cell
CN104105504A (zh) 2011-10-11 2014-10-15 诺华股份有限公司 重组多顺反子核酸分子
US20190209690A9 (en) 2011-10-12 2019-07-11 The Johns Hopkins University Bioreducible Poly (Beta-Amino Ester)s For siRNA Delivery
EP2766407B1 (en) 2011-10-12 2018-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Pentablock polymers
EP3653222A1 (en) 2011-10-14 2020-05-20 Novartis AG Antibodies and methods for wnt pathway-related diseases
EP2765997A4 (en) 2011-10-14 2015-06-24 Stc Unm POROUS NANOPARTICLE-SUPPORTED LIPIDIC BILCHES (PROTOCELLS) FOR TARGETED DELIVERY, COMPRISING TRANSDERMAL DELIVERY OF CARGO MOLECULE, AND ASSOCIATED METHODS
EP3960726A1 (en) 2011-10-18 2022-03-02 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Amine cationic lipids and uses thereof
CN104093445B (zh) 2011-10-18 2016-09-07 米歇尔技术公司 药物递送医疗装置
EA034964B1 (ru) 2011-10-20 2020-04-13 Новартис Аг Биомаркеры, имеющие прогностическое значение в отношении ответа на лечение активатором альфа 7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов
JP2014532620A (ja) 2011-10-20 2014-12-08 ノバルティス アーゲー 小児の初回免疫のためのアジュバント添加インフルエンザｂウイルスワクチン
EP3915545A1 (en) 2011-10-25 2021-12-01 The University of British Columbia Limit size lipid nanoparticles and related methods
US20130110043A1 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Nanopass Technologies Ltd. Microneedle Intradermal Drug Delivery Device with Auto-Disable Functionality
US9550053B2 (en) 2011-10-27 2017-01-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Transdermal delivery of high viscosity bioactive agents
JP6151707B2 (ja) 2011-10-27 2017-06-21 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 薬物内包微小球の形成が可能なｎ−末端で官能基化されたアミノ酸誘導体
SG11201401851UA (en) 2011-10-28 2014-05-29 Presage Biosciences Inc Methods for drug delivery
WO2013062140A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Kyoto University Method for efficiently inducing differentiation of pluripotent stem cells into hepatic lineage cells
US9364542B2 (en) 2011-10-28 2016-06-14 Excelse Bio, Inc. Protein formulations containing amino acids
US9370489B2 (en) 2011-10-31 2016-06-21 Mallinckrodt Llc Combinational liposome compositions for cancer therapy
DK3091029T3 (da) 2011-10-31 2023-01-30 Hoffmann La Roche Anti-IL13-antistofformuleringer
LT2773326T (lt) 2011-11-04 2019-04-25 Nitto Denko Corporation Lipidų-nukleorūgščių dalelių sterilios gamybos būdas
WO2013067537A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Univertiy Of Notre Dame Du Lac Nanoparticle-based drug delivery
EP2773696B1 (en) 2011-11-04 2017-07-26 Agency For Science, Technology And Research Self-assembled composite ultrasmall peptide-polymer hydrogels
EP3290442A1 (en) 2011-11-04 2018-03-07 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) half-life extender constructs
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
US20130115247A1 (en) 2011-11-05 2013-05-09 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Radioisotopes For The Diagnosis And Treatment Of Malignant And Systemic Disease And The Monitoring Of Therapy
US20130116408A1 (en) 2011-11-05 2013-05-09 Aura Biosciences, Inc. Virion Derived Protein Nanoparticles For Delivering Radioisotopes For The Diagnosis And Treatment Of Malignant And Systemic Disease And The Monitoring Of Therapy
US20140294732A1 (en) 2011-11-08 2014-10-02 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute Early diagnostic of neurodegenerative diseases
US20140314787A1 (en) 2011-11-08 2014-10-23 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute Treatment for neurodegenerative diseases
WO2013070872A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and compositions for x-ray induced release from ph sensitive liposomes
EP2776459A1 (en) 2011-11-08 2014-09-17 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Rod cell-specific promoter
WO2013070653A1 (en) 2011-11-09 2013-05-16 Board Of Trustees Michigan State University Metallic nanoparticle synthesis with carbohydrate capping agent
WO2013071047A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for in vitro transcription of rna
JP6232544B2 (ja) 2011-11-11 2017-11-22 ヴァリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド サイトメガロウイルスの治療のための組成物及び方法
US9393300B2 (en) 2011-11-14 2016-07-19 Novartis Ag Immunogenic complexes of polyanionic carbomers and Env polypeptides and methods of manufacture and use thereof
AU2012338869A1 (en) 2011-11-15 2014-06-05 Novartis Ag Combination of a phosphoinositide 3-kinase inhibitor and a modulator of the Janus Kinase 2-Signal Transducer and Activator of Transcription 5 pathway
SG10202103003RA (en) 2011-11-18 2021-05-28 Regeneron Pharma Polymer protein microparticles
AU2012341081B2 (en) 2011-11-21 2015-06-04 Novartis Ag Methods of treating psoriatic arthritis (PsA) using IL-17 antagonists and PsA response or non- response alleles
WO2013078199A2 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Children's Medical Center Corporation Methods for enhanced in vivo delivery of synthetic, modified rnas
WO2013082111A2 (en) 2011-11-29 2013-06-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Geometrically engineered particles and methods for modulating macrophage or immune responses
CA2857501C (en) 2011-11-30 2020-06-23 3M Innovative Properties Company Microneedle device having a peptide therapeutic agent and an amino acid, methods of making and using the same
US9364549B2 (en) 2011-11-30 2016-06-14 Andreas Voigt Hydrophobic drug-delivery material, method for manufacturing thereof and methods for delivery of a drug-delivery composition
WO2013082529A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
US9248096B2 (en) 2011-12-02 2016-02-02 Pegasus Laboratories, Inc. Amphipathic lipid-based sustained release compositions
WO2013082590A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Invivo Therapeutics Corporation Peg based hydrogel for peripheral nerve injury applications and compositions and method of use of synthetic hydrogel sealants
EP3835420A1 (en) 2011-12-05 2021-06-16 Factor Bioscience Inc. Methods and products for transfecting cells
US8497124B2 (en) 2011-12-05 2013-07-30 Factor Bioscience Inc. Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state
WO2013085951A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Nano Precision Medical, Inc. Device having titania nanotube membrane for drug delivery
US9463247B2 (en) 2011-12-07 2016-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
GB201121070D0 (en) 2011-12-07 2012-01-18 Isis Innovation composition for delivery of biotherapeutics
EP3988537A1 (en) 2011-12-07 2022-04-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
WO2013086373A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
WO2013086486A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 President And Fellows Of Harvard College Integrated human organ-on-chip microphysiological systems
US10087422B2 (en) 2011-12-09 2018-10-02 President And Fellows Of Harvard College Organ chips and uses thereof
WO2013086526A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 The Regents Of The University Of California Liposomal drug encapsulation
US9839616B2 (en) 2011-12-12 2017-12-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Lipid nano particles comprising cationic lipid for drug delivery system
TW201330874A (zh) 2011-12-12 2013-08-01 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 含有陽離子性脂質之組合之脂質奈米粒子
JP6407028B2 (ja) 2011-12-12 2018-10-17 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ及びその断片を含むタンパク質、それをコードする核酸、並びにＭＲＳＡ感染を予防する及び治療するための組成物及びそれらの使用
US20150000936A1 (en) 2011-12-13 2015-01-01 Schlumberger Technology Corporation Energization of an element with a thermally expandable material
SG10201601349XA (en) 2011-12-13 2016-03-30 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Bacterially derived, intact minicells for delivery of therapeutic agents to brain tumors
EP2604253A1 (en) 2011-12-13 2013-06-19 Otto Glatter Water-in-oil emulsions and methods for their preparation
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
WO2013090897A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Using adaptive immunity to detect drug resistance
WO2013087083A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 Biontech Ag Particles comprising single stranded rna and double stranded rna for immunomodulation
WO2013087912A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compounds and methods for treating inflammatory diseases
CN103998087B (zh) 2011-12-16 2017-04-05 诺华股份有限公司 用于吸入分布独立性给药的雾化装置
RS63244B1 (sr) 2011-12-16 2022-06-30 Modernatx Inc Kompozicije modifikovane mrna
AU2012351948A1 (en) 2011-12-16 2014-07-10 Allergan, Inc. Ophthalmic compositions comprising polyvinyl capralactam - polyvinyl acetate - polyethylene glycol graft copolymer
WO2013090601A2 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Massachusetts Institute Of Technology Compact nanoparticles for biological applications
AU2012351967A1 (en) 2011-12-16 2014-07-17 Massachusetts Institute Of Technology Alpha-aminoamidine polymers and uses thereof
WO2013091001A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 The University Of Sydney A peptide-hydrogel composite
US9241829B2 (en) 2011-12-20 2016-01-26 Abbott Medical Optics Inc. Implantable intraocular drug delivery apparatus, system and method
WO2013096709A2 (en) 2011-12-21 2013-06-27 modeRNA Therapeutics Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
EP2793941A1 (en) 2011-12-23 2014-10-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Articles of manufacture and methods for co-administration of antibodies
WO2013101908A1 (en) 2011-12-27 2013-07-04 Massachusetts Institute Of Technology Microneedle devices and uses thereof
US10596246B2 (en) 2011-12-29 2020-03-24 Glaxosmithkline Biological Sa Adjuvanted combinations of meningococcal factor H binding proteins
US10028926B2 (en) 2012-01-06 2018-07-24 Gemphire Therapeutics Inc. Methods of reducing risk of cardiovascular disease
AU2013212066B2 (en) 2012-01-26 2018-11-08 Life Technologies Corporation Methods for increasing the infectivity of viruses
CN104245925A (zh) 2012-01-26 2014-12-24 生命科技公司 用于提高病毒感染性的方法
WO2013113325A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
EP2623121A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 Bayer Innovation GmbH Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and an antigen
JP6170074B2 (ja) 2012-02-09 2017-07-26 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 親水性ポリマー粒子およびその製造方法
EP2817345A1 (en) 2012-02-22 2014-12-31 Cerulean Pharma Inc. Conjugates, particles, compositions, and related methods
US20130243867A1 (en) 2012-02-23 2013-09-19 University Of South Florida (A Florida Non-Profit Corporation) Micelle compositions and methods for their use
WO2013130535A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Newgen Biopharma Corporation Topical delivery of hormonal and non hormonal nano formulations, methods of making and using the same
AU2013224919B2 (en) 2012-03-01 2017-12-07 Amgen Research (Munich) Gmbh Long life polypeptide binding molecules
WO2013136234A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 University Of Kwazulu-Natal Transdermal delivery devices
US10322089B2 (en) 2012-03-14 2019-06-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nanoparticles, nanoparticle delivery methods, and systems of delivery
KR20200036033A (ko) 2012-03-16 2020-04-06 메르크 파텐트 게엠베하 표적화 아미노산 지질
US10159743B2 (en) 2012-03-16 2018-12-25 The Johns Hopkins University Non-linear multiblock copolymer-drug conjugates for the delivery of active agents
CA2867381C (en) 2012-03-16 2016-09-20 The Johns Hopkins University Controlled release formulations for the delivery of hif-1 inhibitors
WO2013142349A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal sbi
US9610346B2 (en) 2012-03-23 2017-04-04 International Aids Vaccine Initiative Recombinant viral vectors
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
WO2013148186A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 President And Fellows Of Harvard College Lipid-coated nucleic acid nanostructures of defined shape
US9446132B2 (en) 2012-03-27 2016-09-20 Sima Therapeutics, Inc. Diether based biodegradable cationic lipids for siRNA delivery
BR112014018210A2 (pt) 2012-03-27 2017-07-04 Curevac Gmbh moléculas de ácido nucleico artificiais para expressão de proteína ou peptídeo melhorada
JP6301906B2 (ja) 2012-03-27 2018-03-28 キュアバック アーゲー ５’ｔｏｐｕｔｒを含む人工核酸分子
JP6298039B2 (ja) 2012-03-27 2018-03-20 キュアバック アーゲー 人工核酸分子
EP3865123A1 (en) 2012-03-29 2021-08-18 Translate Bio, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US20140010861A1 (en) 2012-04-02 2014-01-09 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
CA2868391A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Stephane Bancel Polynucleotides comprising n1-methyl-pseudouridine and methods for preparing the same
EP3563872A1 (en) 2012-04-05 2019-11-06 Massachusetts Institute Of Technology Immunostimulatory compositions and methods of use thereof
WO2013151650A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. Neurophilic nanoparticles
WO2013152351A2 (en) 2012-04-06 2013-10-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2836200B1 (en) 2012-04-08 2020-07-15 Urogen Pharma Ltd. Reverse thermal hydrogel preparations for use in the treatment of disorders of the urothelium
KR101607422B1 (ko) 2012-04-11 2016-03-29 인터자인 테크놀로지스, 인코포레이티드 안정된 미셀을 위한 블록 공중합체
EP3939572B1 (en) 2012-04-12 2024-03-27 Yale University Vehicles for controlled delivery of different pharmaceutical agents
WO2013154766A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 New York University Microrna control of ldl receptor pathway
US11001797B2 (en) 2012-04-13 2021-05-11 President And Fellows Of Harvard College Devices and methods for in vitro aerosol delivery
CA2842041A1 (en) 2012-04-18 2013-10-24 Arrowhead Research Corporation Poly(acrylate) polymers for in vivo nucleic acid delivery
AU2013249548A1 (en) 2012-04-19 2014-11-06 Sirna Therapeutics, Inc. Novel diester and triester based low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery
US10278927B2 (en) 2012-04-23 2019-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Stable layer-by-layer coated particles
IN2014DN09134A (ru) 2012-04-25 2015-05-22 Regulus Therapeutics Inc
CA2871778C (en) 2012-05-03 2022-09-13 Kala Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical nanoparticles showing improved mucosal transport
WO2013166498A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 The Johns Hopkins University Lipid-based drug carriers for rapid penetration through mucus linings
US20150087671A1 (en) 2012-05-16 2015-03-26 Micell Technologies, Inc. Low burst sustained release lipophilic and biologic agent compositions
WO2013173582A1 (en) 2012-05-17 2013-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hepatitis c virus neutralizing antibody
WO2013173693A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoparticles with enhanced entry into cancer cells
MX2014014196A (es) 2012-05-23 2015-08-14 Univ Ohio State Composiciones de nanoparticulas de albumina recubiertas con lipido y metodos de preparacion y metodo de uso de las mismas.
ES2719598T3 (es) 2012-05-25 2019-07-11 Curevac Ag Inmovilización reversible y/o liberación controlada de ácidos nucleicos contenidos en nanopartículas mediante revestimientos poliméricos (biodegradables)
US10195403B2 (en) 2012-06-06 2019-02-05 Loma Vista Medical, Inc. Inflatable medical devices
WO2013185069A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
LT2858974T (lt) 2012-06-08 2018-12-10 Nitto Denko Corporation Lipidai, skirti terapinio agento pristatymo kompozicijoms
JP6208750B2 (ja) 2012-06-08 2017-10-04 エスリス ゲーエムベーハーｅｔｈｒｉｓ ＧｍｂＨ メッセンジャーｒｎａの肺送達
WO2014014613A2 (en) 2012-06-20 2014-01-23 President And Fellows Of Harvard College Self-assembling peptides, peptide nanostructures and uses thereof
ES2658972T3 (es) 2012-06-20 2018-03-13 University Of Waterloo Sistema de administración de nanopartículas mucoadhesivas
US9803010B2 (en) 2012-06-27 2017-10-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Crystalline anti-human IL-23p19 antibodies
US9956291B2 (en) 2012-07-10 2018-05-01 Shaker A. Mousa Nanoformulation and methods of use of thyroid receptor beta1 agonists for liver targeting
EP2872120B1 (en) 2012-07-16 2017-05-03 Nanoderm Sciences, Inc. Therapeutic nanoparticles with a polymyxin b as targeting agent
EP2687252A1 (en) 2012-07-17 2014-01-22 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Drug delivery device
EP2687251A1 (en) 2012-07-17 2014-01-22 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Drug delivery device
CN112587671A (zh) 2012-07-18 2021-04-02 博笛生物科技有限公司 癌症的靶向免疫治疗
WO2014015334A1 (en) 2012-07-20 2014-01-23 Brown University System and methods for nanostructure protected delivery of treatment agent and selective release thereof
US10604543B2 (en) 2012-07-24 2020-03-31 President And Fellows Of Harvard College Self-assembly of nucleic acid nanostructures
GB201213624D0 (en) 2012-07-27 2012-09-12 Univ Ulster The Method and system for production of conjugated nanoparticles
WO2014015422A1 (en) 2012-07-27 2014-01-30 Ontario Institute For Cancer Research Cellulose-based nanoparticles for drug delivery
WO2014024193A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Prodel Pharma Ltd. Compositions and methods for rapid transmucosal delivery of pharmaceutical ingredients
US9931418B2 (en) 2012-08-07 2018-04-03 Northeastern University Compositions for the delivery of RNA and drugs into cells
WO2014026044A2 (en) 2012-08-08 2014-02-13 Presage Biosciences, Inc. Extrusion methods and devices for drug delivery
US9974886B2 (en) 2012-08-08 2018-05-22 Nanyang Technological University Methods of manufacturing hydrogel microparticles having living cells, and compositions for manufacturing a scaffold for tissue engineering
AU2013299641A1 (en) 2012-08-10 2015-03-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Drug delivery vehicle comprising conjugates between targeting polyamino acids and fatty acids
CA2884870C (en) 2012-08-13 2022-03-29 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
WO2014027006A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Edko Pazarlama Tanitim Ticaret Limited Sirketi Bioadhesive formulations for use in drug delivery
WO2014028209A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Stabilizing shear-thinning hydrogels
CA2881605A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Aaron FROESE Internal structured self assembling liposomes
US10231997B2 (en) 2012-08-15 2019-03-19 The University Of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders
WO2014039185A1 (en) 2012-09-05 2014-03-13 Creighton University Polymeric nanoparticles in a thermosensitive gel for coital-independent vaginal prophylaxis of hiv
US8703197B2 (en) 2012-09-13 2014-04-22 International Business Machines Corporation Branched polyamines for delivery of biologically active materials
EP2895156B1 (en) 2012-09-17 2019-05-08 Pfizer Inc. Process for preparing therapeutic nanoparticles
WO2014047649A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 The Regents Of The University Of California Methods for arranging and packing nucleic acids for unusual resistance to nucleases and targeted delivery for gene therapy
CA2925687A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Lipid coated nanoparticles containing agents having low aqueous and lipid solubilities and methods thereof
EP2716655A1 (en) 2012-10-04 2014-04-09 Institut Pasteur Neutralizing antibodies directed against Hepatitis C virus ectodomain glycoprotein E2
US20140100178A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Aslam Ansari Composition and methods for site-specific drug delivery to treat malaria and other liver diseases
WO2014053882A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053880A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014054026A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Liposomal drug delivery system
WO2014053879A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014053881A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2014064534A2 (en) 2012-10-05 2014-05-01 Chrontech Pharma Ab Injection needle, device, immunogenic compositions and method of use
EP2716689A1 (en) 2012-10-05 2014-04-09 National University of Ireland, Galway Polymer comprising a plurality of branches having at least one disulfide group and/or at least one vinyl group
WO2014059022A1 (en) 2012-10-09 2014-04-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles for targeted delivery of multiple therapeutic agents and methods of use
US20140106260A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Core-shell nanoparticulate compositions and methods
SG11201502896XA (en) 2012-10-16 2015-05-28 Endocyte Inc Drug delivery conjugates containing unnatural amino acids and methods for using
EP2908912B1 (en) 2012-10-18 2020-08-05 The Rockefeller University Broadly-neutralizing anti-hiv antibodies
AU2013336237A1 (en) 2012-10-22 2015-06-11 Sabag-Rfa Ltd A system for delivering therapeutic agents into living cells and cells nuclei
WO2014066912A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Vanderbilt University Polymeric nanoparticles
US20140315795A1 (en) 2012-10-26 2014-10-23 Nlife Therapeutics, S.L. Compositions and Methods for Selective Delivery of Oligonucleotide Molecules to Cell Types
WO2014066898A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The Johns Hopkins University A layer-by-layer approach to co-deliver dna and sirna via aunps: a potential platform for modifying release kinetics
US20150376581A1 (en) 2012-10-29 2015-12-31 Technische Universitaet Dortmund T7 rna polymerase variants and methods of using the same
CA2890110C (en) 2012-11-01 2023-05-02 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells
WO2014071072A2 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Pungente Michael D Novel cationic carotenoid-based lipids for cellular nucleic acid uptake
WO2014068542A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Fondazione Centro San Raffaele Novel targets in multiple myeloma and other disorders
NZ707855A (en) 2012-11-06 2018-11-30 Rochal Ind Llc Delivery of biologically-active agents using volatile, hydrophobic solvents
US9975916B2 (en) 2012-11-06 2018-05-22 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods relating to complex nucleic acid nanostructures
US9572893B2 (en) 2012-11-07 2017-02-21 Council Of Scientific And Industrial Research Nanocomplex containing cationic peptide for biomolecule delivery
WO2014072997A1 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Council Of Scientific & Industrial Research Nanocomplex containing amphipathic peptide useful for efficient transfection of biomolecules
SG10201608703SA (en) 2012-11-08 2016-12-29 Eleven Biotherapeutics Inc Il-6 antagonists and uses thereof
GB2512156A (en) 2012-11-08 2014-09-24 Novozymes Biopharma Dk As Albumin variants
TW201428101A (zh) 2012-11-08 2014-07-16 Inviragen Inc 登革熱病毒血清型４型之建構物的組成物、方法及用途
MX2020005126A (es) 2012-11-08 2022-01-27 Clearside Biomedical Inc Metodos y dispositivos para el tratamiento de trastornos oculares en sujetos humanos.
EP2916853B1 (en) 2012-11-09 2020-05-06 Velin-Pharma A/S Compositions for pulmonary delivery
US9200119B2 (en) 2012-11-09 2015-12-01 Momentive Performance Materials Inc. Silicon-containing zwitterionic linear copolymer composition
WO2014072061A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Biontech Ag Method for cellular rna expression
WO2014071963A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Biontech Ag Method for cellular rna expression
EP2916835A4 (en) 2012-11-12 2016-07-27 Redwood Bioscience Inc COMPOUNDS AND METHOD FOR PRODUCING A CONJUGATE
WO2014075047A2 (en) 2012-11-12 2014-05-15 Genvec, Inc. Malaria antigens and methods of use
GB201220354D0 (en) 2012-11-12 2012-12-26 Medpharm Ltd Dermal compositions
US9943608B2 (en) 2012-11-13 2018-04-17 Baylor College Of Medicine Multi-arm biodegradable polymers for nucleic acid delivery
WO2014078636A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid hydrogel self-assembly
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
EP2732825B1 (en) 2012-11-19 2015-07-01 Invivogen Conjugates of a TLR7 and/or TLR8 agonist and a TLR2 agonist
CN104853747B (zh) 2012-11-19 2020-06-19 理工研究与开发基金公司 用于体内递送的脂质体
US20150290328A1 (en) 2012-11-20 2015-10-15 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Formulations of active agents for sustained release
WO2014081299A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Activatable liposomes
EP2922574B1 (en) 2012-11-22 2023-05-17 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Chemically cleavable group
WO2014081300A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Channel protein activatable liposomes
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
PT3134131T (pt) 2014-04-23 2022-03-24 Modernatx Inc Vacinas de ácidos nucleicos

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824497A (en) * 1995-02-10 1998-10-20 Mcmaster University High efficiency translation of mRNA molecules
US20110143397A1 (en) * 2005-08-23 2011-06-16 Katalin Kariko Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells
US8278036B2 (en) * 2005-08-23 2012-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA containing modified nucleosides and methods of use thereof
RU2540017C2 (ru) * 2008-07-24 2015-01-27 Мейдзи Сейка Фарма Ко,Лтд.,Jp Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, вовлеченный в биосинтез пирипиропена а, вектор и клетка-хозяин содержащие такой полинуклеотид и способ получения предшественника пирипиропена а (варианты)

Also Published As

Publication number Publication date
US20170056528A1 (en) 2017-03-02
CN103974724A (zh) 2014-08-06
JP2017113029A (ja) 2017-06-29
IL231808A0 (en) 2014-05-28
JP6113737B2 (ja) 2017-04-12
RU2648950C2 (ru) 2018-04-02
AU2017213503A1 (en) 2017-08-31
JP2014530601A (ja) 2014-11-20
EP3682905B1 (en) 2021-12-01
HK1200730A1 (en) 2015-08-14
IL262667A (en) 2018-12-31
US20130123481A1 (en) 2013-05-16
AU2021201508A1 (en) 2021-04-01
EP3682905A1 (en) 2020-07-22
AU2019219843A1 (en) 2019-09-12
IL262667B (en) 2020-02-27
CN103974724B (zh) 2019-08-30
KR20190099538A (ko) 2019-08-27
ES2911677T3 (es) 2022-05-20
AU2023200127A1 (en) 2023-02-16
NZ623476A (en) 2016-09-30
JP2024036694A (ja) 2024-03-15
WO2013052523A1 (en) 2013-04-11
KR102014061B1 (ko) 2019-08-28
CY1125029T1 (el) 2023-03-24
US9428535B2 (en) 2016-08-30
IL231808B (en) 2018-11-29
RS62993B1 (sr) 2022-03-31
EP3492109A1 (en) 2019-06-05
DK3682905T3 (da) 2022-02-28
EP3492109B1 (en) 2020-03-04
RU2014117701A (ru) 2015-11-10
KR20140068245A (ko) 2014-06-05
MX2014003979A (es) 2014-08-26
SI3682905T1 (sl) 2022-04-29
DE19216461T1 (de) 2021-10-07
AU2017213503B2 (en) 2019-06-20
EP2763701A1 (en) 2014-08-13
JP2022060269A (ja) 2022-04-14
HUE057725T2 (hu) 2022-06-28
RU2018104839A3 (ru) 2019-02-22
EP2763701A4 (en) 2015-12-16
AU2012318752B2 (en) 2017-08-31
JP6574032B2 (ja) 2019-09-11
HRP20220250T1 (hr) 2022-04-29
RU2018104839A (ru) 2019-02-22
JP2019208511A (ja) 2019-12-12
US20210308283A1 (en) 2021-10-07
PL3682905T3 (pl) 2022-04-04
BR112014007852A2 (pt) 2017-04-18
AU2012318752A1 (en) 2014-04-24
EP4015005A1 (en) 2022-06-22
BR112014007852B1 (pt) 2021-11-03
MX354267B (es) 2018-02-21
CN110511939A (zh) 2019-11-29
SG10201602654SA (en) 2016-05-30
JP7019639B2 (ja) 2022-02-15
JP6388977B2 (ja) 2018-09-12
LT3682905T (lt) 2022-02-25
US20130115272A1 (en) 2013-05-09
JP2018166528A (ja) 2018-11-01
EP2763701B1 (en) 2018-12-19
CA2850624A1 (en) 2013-04-11
SG11201401196WA (en) 2014-05-29
PT3682905T (pt) 2022-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2707251C2 (ru) Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
US20240165267A1 (en) Modified nucleic acid molecules and uses thereof
US20160304552A1 (en) Modified nucleic acid molecules and uses thereof
US20160264614A1 (en) Polynucleotide molecules and uses thereof