CN104245925A - 用于提高病毒感染性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用用炔烃修饰的生物分子，诸如脂肪酸、碳水化合物和脂质标记的病毒来治疗感染有病毒的植物、昆虫或动物或者来提高病毒，诸如人免疫缺陷病毒的感染性的方法。还提供了用炔烃修饰的生物分子，诸如脂肪酸、碳水化合物或类异戊二烯脂质标记病毒，诸如人免疫缺陷病毒的方法。用炔烃修饰的生物分子标记的病毒可以与药学上可接受的赋形剂组合以产生药物组合物，其任选地含有另一种抗病毒剂和/或递送剂，诸如脂质体。

Description

用于提高病毒感染性的方法
交叉引用
本申请要求2012年1月26日提交的序列号为61/591,047的美国临时申请的优先权权益，该临时申请通过引用以其整体并入本文。
背景
感染人、动物、植物和昆虫的病毒为大家所熟知。这些宿主被病毒感染可以导致疾病，除非合适的免疫应答可以获得以中和该感染。能够引起免疫应答所必需的免疫组分的疫苗已经开发出来以预防在人和动物中被病毒感染，其中值得注意的实例分别是流感疫苗和狂犬病疫苗。
疫苗通常含有类似于引起疾病的病毒的药剂。该药剂可以是弱化的(减毒的)或被杀死的(灭活的)形式的病毒。全病毒疫苗的生产一般从病毒在原代细胞(例如流感病毒)中或者在诸如培养的人或者动物细胞(例如脊髓灰质炎病毒)的连续细胞系中的生长开始。为了在这样的细胞中繁殖病毒，病毒必须首先感染细胞。因此，需要提高用于制备疫苗的病毒的感染性的方法。
病毒还用于制备由研究人员使用的病毒载体，该病毒载体在研究或者基因治疗环境中将遗传物质递送到细胞和生物体中。这样的病毒载体是非天然存在的病毒。为了将遗传物质递送到细胞中，该载体需要感染细胞。因此，需要具有增加的感染性的病毒载体，以改进可以被递送到靶细胞或生物体的遗传物质的量。
概述
本发明的一个方面是增强人免疫缺陷病毒的感染性的方法，所述方法包括使所述病毒与以有效增强病毒的感染性的量的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触。
在一些实施方案中，所述病毒是在细胞中。在这些的一些中，所述细胞是人动物细胞或非人动物细胞。
在一些实施方案中，所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
在一些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸或其生理学上可接受的盐具有下式：
Y-CH2-X-CO2H [I]
其中，Y是H或乙炔基；以及当Y是乙炔基时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中所述碳中的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；或者，当Y是H时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中用乙炔基替代在所述碳之一上的至少一个氢，并且其中所述碳中不具有与其相连的乙炔基的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接并且不具有与其相连的乙炔基的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；其中，R1是H或包含1到6个碳的烷基。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，Y是乙炔基。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，X是直链碳链。
在包括使所述病毒与[I 1]接触的某些实施方案中，X是包含8到15个碳的碳链。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，X是碳链，其中所述碳链的所有碳均为碳。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，X是碳链，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是15-乙炔基十五烷酸或其生理学上可接受的盐。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是12-乙炔基十二烷酸或其生理学上可接受的盐。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是：
[Ⅱ]
或其生理学上可接受的盐。
在包括使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是：
[Ⅲ]
或其生理学上可接受的盐。
在包含使所述病毒与[I]接触的某些实施方案中，Y是乙炔基，X是直链碳链，并且所述直链碳链包含8到15个碳。在这些的一些中，碳链的所有碳均为碳，而在其他中，所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在一些实施方案中，所述接触在溶液中进行，所述溶液包含动物血清、氨基酸、缓冲剂、脂肪酸、葡萄糖、激素、无机盐、脂质、金属离子螯合剂、肽、表面活性剂、微量金属和维生素中的至少一种。
本发明的另一个方面是增强人免疫缺陷病毒的感染性的方法，所述方法包括使所述病毒感染的细胞与以有效增强所述病毒的感染性的量的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触。
在一些实施方案中，所述细胞是人动物细胞或非人动物细胞。
在一些实施方案中，所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
在一些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸或其生理学上可接受的盐具有式[I]，其取代基如上所述。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，Y是乙炔基。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，X是直链碳链。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，X是包含8到15个碳的碳链。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，X是碳链，其中所述碳链的所有碳均为碳。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，X是碳链，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是15-乙炔基十五烷酸或其生理学上可接受的盐。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是12-乙炔基十二烷酸或其生理学上可接受的盐。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是[II]或其生理学上可接受的。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是[III]或其生理学上可接受的。
在包括使所述病毒感染的细胞与[I]接触的某些实施方案中，Y是乙炔基，X是直链碳链，并且所述直链碳链包含8到15个碳。在这些的一些中，所述碳链的所有碳均为碳，而在其他中，在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在一些实施方案中，所述接触在溶液中进行，所述溶液包含动物血清、氨基酸、缓冲剂、脂肪酸、葡萄糖、激素、无机盐、脂质、金属离子螯合剂、肽、表面活性剂、微量金属和维生素中的至少一种。
本发明的另一个方面是人免疫缺陷病毒，其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分；其中所述部分是非天然存在的。
在一些实施方案中，所述病毒是HIV-1。
在一些实施方案中，所述病毒是灭活的。
在一些实施方案中，所述病毒是减毒的。
在一些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分具有下式：
Y-CH2-X-CO- [IV]
其中，Y是H或乙炔基；以及当Y是乙炔基时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中所述碳中的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；或者，当Y是H时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中用乙炔基替代在所述碳之一上的至少一个氢，并且其中所述碳中不具有与其相连的乙炔基的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接并且不具有与其相连的乙炔基的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；其中，R1是H或包含1到6个碳的烷基。
在包含[IV]的某些实施方案中，Y是乙炔基。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是直链碳链。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是包含8到15个碳的碳链。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是碳链，其中所述碳链的所有碳均为碳。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是碳链，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是15-乙炔基十五烷基。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是12-乙炔基十二烷基。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是　
[V]。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是
[VI]。
在包含[IV]的某些实施方案中，Y是乙炔基，X是直链碳链，并且所述直链碳链包含8到15个碳。在这些的一些中，所述碳链的所有碳均为碳，而在其他中，在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分通过酰胺或硫酯键与所述病毒连接。
本发明的另一个方面是包含人免疫缺陷病毒的组合物，所述人免疫缺陷病毒包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分、或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分；其中所述部分是非天然存在的。
在一些实施方案中，所述病毒是HIV-1。
在一些实施方案中，所述病毒是灭活的。
在一些实施方案中，所述病毒是减毒的。
在一些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分具有式[IV]，其取代基如上所述。
在包含[IV]的某些实施方案中，Y是乙炔基。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是直链碳链。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是包含8到15个碳的碳链。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是碳链，其中所述碳链的所有碳均为碳。
在包含[IV]的某些实施方案中，X是碳链，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是15-乙炔基十五烷基。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是12-乙炔基十二烷基。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是[Ⅴ]。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是[VI]。
在包含[IV]的某些实施方案中，Y是乙炔基，X是直链碳链，并且所述直链碳链包含8到15个碳。在这些的一些中，所述碳链的所有碳均为碳，而在其他中，在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
在包含[IV]的某些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分通过酰胺或硫酯键与所述病毒连接。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有科技术语具有如本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同意思。为了可以更容易地理解本发明，首先对某些术语作出定义。另外的定义将在详述部分阐明。在有冲突的情况下，将以本说明书（包括定义）为准。
如本文使用的“炔烃修饰的脂肪酸”是指一种包含炔基并且具有下式的脂肪酸：R-炔烃，其中R包含具有至少一个羧酸官能团的烃链，其一般是但不是必须在末端位置。
如本文使用的“炔烃修饰的碳水化合物”是指一种包含炔基并且具有下式的碳水化合物，R-炔烃，其中R是碳水化合物。
如本文使用的“炔烃修饰的类异戊二烯脂质”是指一种含有异戊二烯的脂质或其衍生物。所述炔烃修饰的类异戊二烯包含炔基并且具有下式，R-炔烃，其中R是含有异戊二烯的脂质，诸如C15法呢基类异戊二烯脂质或C20香叶基香叶基类异戊二烯脂质或其衍生物，包括但不限于乙炔基法呢基二磷酸酯、乙炔基法呢基醇、乙炔基香叶基香叶基二磷酸酯或乙炔基香叶基香叶基醇。
如本文使用的“动物病毒”是指感染非人动物细胞或人动物细胞的病毒。非人动物病毒感染非人动物细胞。在某些情况下，感染非人动物细胞的病毒也能够感染人动物细胞。人动物病毒感染人动物细胞。在某些情况下，感染人动物细胞的病毒也能够感染非人动物细胞。
如本文使用的“生物分子”是指蛋白质、肽、氨基酸、糖蛋白、核酸、核苷酸、核苷、寡核苷酸、糖、寡糖、脂质、激素、蛋白聚糖、碳水化合物、多肽、多核苷酸、多糖，其具有在有生命的生物体中发现的分子的典型特征并且可以是天然存在的或者可以是人造的(在自然界中无法发现以及与在自然界中发现的分子不完全相同)。
如本文使用的“点击化学(click chemistry)”是指在叠氮化物和末端炔烃之间的Huisgen环加成或1,3-偶极环加成的铜(I)催化的变体来形成1,2,4-三唑。这样的化学反应可以使用，但不限于简单的杂原子有机反应物，并且是可靠的、选择性的、立体特异性的和放热的。
如本文使用的“环加成”是指这样的化学反应，其中2个或更多个π(pi)-电子体系(例如，不饱和分子或相同分子的不饱和部分)结合以形成环状产物，其中存在键多样性(bond multiplicity)的净减少。在环加成中，π (pi)电子用于形成新的π(pi)键。环加成的产物称作“加成化合物”或“环加成化合物”。不同类型的环加成是本领域已知的，包括但不限于[3+2]环加成和Diels-Alder反应。[3+2]环加成(其也称作1,3-偶极环加成)发生在1,3-偶极和亲偶极物之间，并且通常用于构建五元杂环。术语“[3+2]环加成”也包括由Bertozzi等人在J. Am. Chem. Soc., 2004, 126:15046-15047中描述的叠氮化物和环辛炔和二氟环辛炔之间的“无铜” [3+2]环加成。
如本文使用的“DNA病毒”是指具有脱氧核糖核酸(DNA)作为它的遗传物质的病毒。DNA病毒一般是双链的，但是也可以是单链的。
如本文使用的“基因治疗”是指将异源核酸，诸如DNA或RNA，转移至患有寻找这种疗法或治疗的病症(disorder)或状况(condition)的人动物、非人动物、植物或昆虫的靶细胞中。如本文使用的，基因治疗包括但不限于将异源核酸，诸如DNA，转移至病毒中，该病毒可以被转移至患有寻找这种疗法或治疗的病症或状况的人动物、非人动物、植物或昆虫中。所述核酸，诸如DNA，被引入选定的靶细胞中，例如直接地或间接地，其引入方式使得异源核酸，诸如DNA，被表达并且产生由此编码的治疗性产物。可选地，异源核酸，例如DNA，可以以某些方式介导编码治疗性产物的DNA的表达，或者它可以编码在某些方式上作为治疗性产物的产物，诸如肽或RNA，或其直接地或间接地介导治疗性产物的表达。基因治疗还包括但不限于递送编码基因产物的核酸，它替代有缺陷的基因，或者补充由它引入其中的人动物、非人动物、植物、昆虫或其细胞产生的基因产物。所引入的核酸可以包括但不限于编码治疗性化合物的核酸。编码治疗性产物的异源核酸，例如DNA，可以在引入受折磨的宿主的细胞之前被修饰，以增强或者相反改变产物或其表达。基因治疗还可以包括但不限于递送基因表达的抑制剂或阻遏物或其他调节剂。
如本文使用的“糖蛋白”是指已经被糖基化的蛋白质，以及已经在体内或在体外经酶促修饰以包含碳水化合物基团的那些蛋白质。
如本文使用的“HIV”和“人免疫缺陷病毒”是指人免疫缺陷病毒1和2 (HIV-1和HIV-2)。
如本文使用的“感染性”是指病毒进入或离开细胞的能力。
如本文使用的“昆虫病毒”是指感染昆虫细胞的病毒。某些昆虫病毒，例如，未修饰的杆状病毒或修饰的杆状病毒(BacMam)，还可以感染非人动物细胞和/或人动物细胞。
如本文使用的“植物病毒”是指感染植物细胞的病毒。
如本文使用的“药学上可接受的赋形剂”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、稀释剂、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药学活性物质，这些试剂的应用是本领域众所周知的。
如本文使用的“生理上可以接受的盐”是指对细胞健康或完整性是无害的无机盐或有机盐，包括但不限于缓冲盐。对于生理学上可接受的盐，这些盐的应用是本领域众所周知的。
如本文使用的“蛋白质”和“多肽”在一般意义上用于包括任意长度的氨基酸残基的聚合物。术语“肽”在本文中用于指具有少于100个氨基酸残基的多肽，通常少于10个氨基酸残基的多肽。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文使用的“报道分子”是指能够与本发明的修饰的翻译后修饰的蛋白质连接并且被直接地或间接地检测到的任何部分。报道分子包括但不限于生色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、串联染料(tandem dye)、颗粒、半抗原、酶和放射性同位素。优选的报道分子包括荧光团、荧光蛋白、半抗原和酶。
如本文使用的“RNA病毒”是指具有核糖核酸(RNA)作为它的遗传物质的病毒。RNA病毒通常是单链的，但是也可以是双链的。
如本文使用的术语“个体”意图包括人和非人动物、植物和昆虫。个体可以包括具有病毒感染或其他病症(包括但不限于HIV感染)的人患者。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、山羊、马、鸡、猪、两栖动物、爬行动物等。
如本文使用的“治疗（treatment）”或“治疗（treating）”是指治疗性或预防性措施。所述治疗可以施用给具有病症(在个体是动物的情况下，所述病症可以包括但不限于医学病症)或最终可能罹患该病症的个体，以便预防、治愈、延迟、减轻病症或复发性病症的严重性和/或改善其一种或多种症状，或者以便延长个体的生存期超过在没有这种治疗存在下的预期值。
如本文使用的“治疗有效量”或“有效量”意思是这样的化合物的量，当为了治疗疾病而施用给非人动物或人动物、植物、昆虫或其他个体时，其足以实现所述疾病的这种治疗。“有效量”将随化合物、疾病和它的严重性以及待治疗的个体的年龄、体重等而变化。
如本文使用的术语“病毒载体”，根据其领域中认可的含义来使用。它是指一种核酸载体构建体，其包括病毒来源的至少一种元件并且可以包装入病毒载体颗粒。病毒载体颗粒能被用于将DNA、RNA或其他核酸转移到细胞中的目的，无论在体外还是在体内。
如本文使用的“病毒”是指称为病毒的实体的大组的任一种。病毒通常含有围绕遗传物质的RNA或DNA核心的蛋白质外壳，但是没有半透性膜，并且仅能够在活细胞中生长和扩增。用于本文提供的方法和组合物的病毒包括但不限于任何人动物病毒、非人动物病毒、植物或昆虫病毒。术语“病毒”在它的范围内包括在自然界中存在的病毒，在本文中称为“天然存在的病毒”。术语“病毒”在它的范围内还包括天然存在的已经遗传工程化的病毒，在本文中称为“非天然存在的病毒”。病毒基因或围绕该基因的核酸的这样的工程化包括但不限于可以改变病毒加工的那些，所述病毒加工例如病毒感染性、病毒DNA复制、病毒蛋白质合成、病毒颗粒装配和成熟，以及病毒颗粒释放。这样的工程化还可以引入用于在病毒中插入异源的DNA或RNA的位点，其可以包括非病毒基因，在本文中被称为“外源基因”。
必须注意，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外指明。因而，例如，当提及“病毒”时包括复数病毒，除非上下文另外指明。
尽管已经参考本发明的优选实施方案具体地显示和描述了本发明，但是本领域技术人员将会理解，可以在其中做出在形式和细节方面的各种不同变化，而不脱离由所附权利要求书包括的本发明的范围。另外，所述的材料、方法和实施例仅仅是说明性的，无意是限制性的。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用将它们整体并入。
发明详述
本公开内容涉及用于制备治疗病毒的感染的疫苗、以及制备用于体内基因治疗和体外转染细胞的病毒载体的炔烃修饰的生物分子(诸如脂肪酸或碳水化合物)的用途，以及包含含有炔烃修饰的生物分子的病毒的药物组合物。申请人已出人意料地发现，这些炔烃修饰的生物分子在与病毒接触时具有提高病毒感染性的能力。令人惊奇地发现，用这些炔烃修饰的生物分子标记的病毒深刻地影响病毒的感染性，并且用这些炔烃修饰的生物分子标记病毒提高病毒向宿主细胞的进入。不希望受任何理论的约束，在通常被未修饰的生物分子(诸如饱和脂肪酸，例如肉豆蔻酸和棕榈酸)占据的位点处用炔烃修饰的生物分子对病毒蛋白进行翻译后修饰，似乎可以导致病毒感染性的提高。
点击化学
叠氮化物和末端或内部炔烃可以经历1,3-偶极环加成(Huisgen环加成)反应，产生1,2,3-三唑。但是，该反应需要长反应时间和高温。可选地，叠氮化物和末端炔烃可以在室温下经历铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)。这样的铜(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成，也称作点击化学，是Huisgen 1,3-偶极环加成的变体，其中有机叠氮化物和末端炔烃反应以生成1,2,3-三唑的1,4-区域异构体。Sharpless等人描述了点击化学反应的实例(美国专利申请公开号20050222427，PCT/US03/17311；Lewis W G等人，Angewandte Chemie-Int′l Ed.41(6): 1053; 在Kolb，H.C.等人，Angew. Chem. Inst. Ed. 2001, 40: 2004-2021中综述的方法)，其开发了以高收率且以在杂原子链接(与碳-碳键相反)中的极少副反应的彼此反应的试剂，以便创建化合物的文库。
点击化学已经用于标记和检测目标蛋白。例如，CLICK-IT® (Invitrogen, Carlsbad, CA)反应是一种两步标记技术，包括将修饰的代谢前体(诸如叠氮化物修饰的脂肪酸、叠氮化物修饰的碳水化合物或叠氮化物修饰的类异戊二烯脂质)掺入到蛋白质中作为化学“手柄(handle)”，随后在叠氮化物和炔烃之间进行化学选择性连接(或“点击”反应)。在点击反应中，用对应的含有叠氮化物或含有炔烃的染料或半抗原检测经修饰的蛋白质。CLICK-IT®代谢标记试剂已经用于监测蛋白质的翻译后修饰，诸如酰化、糖基化和异戊烯化(prenylation)，并且包括：1)叠氮化物修饰的脂肪酸，诸如CLICK-IT®棕榈酸叠氮化物(即，15-叠氮基十五烷酸)和CLICK-IT®肉豆蔻酸叠氮化物(即，12-叠氮基十二烷酸)，它们分别用于标记棕榈酰化蛋白和肉豆蔻酰化蛋白；2)叠氮化物修饰的碳水化合物，包括用于标记O-连接的糖蛋白的CLICK-IT® GalNAz (四乙酰化N-叠氮基乙酰基半乳糖胺)，用于标记唾液酸修饰的糖蛋白的CLICK-IT® ManNAz (四乙酰化N-叠氮基乙酰基-D-甘露糖胺)，以及用于标记O-GlcNAz修饰的糖蛋白的CLICK-IT® GlcNAz (四乙酰化N-叠氮基乙酰基葡糖胺)；以及3)叠氮化物修饰的类异戊二烯脂质，诸如CLICK-IT®法呢醇叠氮化物和CLICK-IT®香叶基香叶醇叠氮化物。如上面所指出的，申请人已经出人意料地发现，这些炔烃修饰的生物分子提高了病毒的感染性。
糖基化
糖基化是一个酶促过程，其中碳水化合物与细胞中的蛋白质、脂质或其他有机分子相连接。糖蛋白是由与碳水化合物共价连接的蛋白质构成的生物分子。某些翻译后修饰会在蛋白质上添加糖部分(碳水化合物)，从而形成糖蛋白。在糖蛋白中发现的常见单糖包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和N-乙酰基神经氨酸(NANA，也称作唾液酸)。N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)是神经氨酸(包括NANA)的前体。两个相同或不同的单糖可以连接到一起形成二糖。更多个单糖的添加会导致递增长度的寡糖的形成。另外，所述糖部分可以是糖基。
在糖蛋白中，碳水化合物可以通过N-糖基化或O-糖基化与蛋白质组分连接。N-糖基化通常通过在天冬酰胺或精氨酸侧链上的氮而发生，从而形成经由酰胺基的N-糖苷键。O-糖基化通常发生在羟赖氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸侧链的羟基氧处，从而形成O-糖苷键。GalNAc和GlcNAc都是O-连接的碳水化合物。唾液酸发现于N-和O-连接的碳水化合物上。
蛋白质糖基化是最丰富的翻译后修饰之一，并且在生物系统的控制中起重要作用。例如，糖基化影响蛋白质折叠，并且可以帮助稳定蛋白质和防止它们的降解。糖基化也可以影响蛋白质与其他分子结合的能力，并且介导细胞内或细胞间的信号传递途径。例如，碳水化合物修饰对于宿主-病原体相互作用、炎症、发育和恶性肿瘤而言是重要的(Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97-130; Lasky, L. A. Annu. Rev. Biochem. 1995, 64, 113-139. (c) Capila, I.; Linhardt, R. J. Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 391-412; Rudd, P. M.; Elliott, T.; Cresswell, P.; Wilson, I. A.; Dwek, R. A. Science 2001, 291, 2370-2376)。一种这样的共价修饰是O-GlcNAc糖基化，它是D-N-乙酰基葡糖胺对丝氨酸和苏氨酸残基的共价修饰(Wells, L.; Vosseller, K.; Hart, G. W. Science 2001, 291, 2376-2378; Zachara, N. E.; Hart, G. W. Chem. Rev. 2002, 102, 431)。O-GlcNAc修饰发现于从秀丽隐杆线虫(C. elegans)到人的所有高等真核生物体中，并且已经被证实是普遍存在的、可诱导的和高度动态的，从而提示与磷酸化类似的调节作用。
脂肪酸酰化
脂肪酸酰化是一个酶促过程，其中脂肪酸与细胞中的蛋白质相连接。该过程可以影响蛋白质的功能以及它的细胞定位，并且是细胞和病毒两种起源的蛋白质所共有的(Towler等人, Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83:2812-16)。肉豆蔻酸和棕榈酸是与蛋白质连接的两种最常见的脂肪酸(Olson等人, J Biol Chem 261(5):2458-66)。一般而言，肉豆蔻酸经由酰胺键连接至可溶性蛋白和膜蛋白的氨基端甘氨酸(其在N-甲硫氨酸残基除去过程中暴露)，尽管它还可以连接至其他氨基酸上。肉豆蔻酰化还可以发生在翻译后，例如，当蛋白酶切割多肽并暴露甘氨酸残基时。棕榈酸经由酯键或硫酯键与膜蛋白相连接。肉豆蔻酰化和棕榈酰化似乎在膜隔室之间蛋白质的亚细胞运输中以及在调节蛋白质-蛋白质相互作用中起重要作用。
脂肪酸具有2个截然不同的区域：长的疏水性烃链和羧酸基团，所述羧酸基团通常在溶液中离子化(COO-)，是极端亲水的，且容易形成酯和酰胺。天然的脂肪酸通常具有4到28个碳的链(通常是无支链的和偶数的)，并且可以是饱和的或不饱和的。饱和脂肪酸在烃链中不含有双键，包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。不饱和脂肪酸在烃链中含有至少一个双键，包括肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、杉皮酸(sapienic acid)、油酸、亚油酸、α-亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。
异戊烯化
蛋白质异戊烯化涉及类异戊二烯脂质(诸如法呢基或香叶基-香叶基部分)与靶蛋白的C-端半胱氨酸的连接(McTaggert, Cell Mol Life Sci 2006, 63:255-67)。这些反应由法呢基转移酶、香叶基香叶基转移酶和Rab香叶基香叶基转移酶催化(Magee和Seabra, Biochem J 2003, 376:e3-4)。由于类异戊二烯脂质的疏水性质，大多数异戊烯化蛋白质与膜结合。大多数法呢基化蛋白质参与细胞信号传递，其中膜结合对于功能而言是重要的。对于通过专门的异戊烯基结合域介导蛋白质-蛋白质结合而言，类异戊二烯脂质也是重要的。
在病毒中的翻译后修饰
许多病毒蛋白被翻译后修饰(包括但不限于糖基化、酰化和异戊烯化)广泛地修饰。在许多情况下，病毒感染宿主细胞和/或逃避免疫系统需要这些翻译后修饰。翻译后修饰在病毒学中是特别重要的，因为，一般而言，病毒基因组是较小的，因而存在增强的编码节约(frugality)的压力。通过利用宿主的翻译后机制，病毒可以开发出多条途径并用最小的基因组发挥作用，因为单个翻译后修饰就可以改变蛋白质的功能或细胞的位置。
例如，在HIV和猴免疫缺陷病毒(SIV)中，糖基化在感染性循环的多个阶段中起重要作用。在感染过程中，病毒糖蛋白影响病毒蛋白gp120和gp41与宿主细胞CD4受体和CXCR4和CCR5共受体的结合(Chen等人, Virus Res 2001, 79:91-101)。糖基化负责gp160 (gp120和gp41的前体)的正确折叠和加工(Land等人, Biochimie 2001, 83: 783-90)，并且可以增强HIV和SIV与不同细胞类型(包括树突状细胞)的相互作用(Geijtenbeek等人, Curr Top Microbiol Immunol 2003, 276:31-54)。gp120在HIV生物学中的正常作用是，经由在靶细胞上表达的CD4受体和CXCR4和CCR5共受体，启动病毒与细胞的结合。当gp120结合CD4时，在gp120中发生构象变化，所述构象变化暴露出共受体结合位点，并触发gp41中的构象变化。在gp41中的构象变化依次暴露出在gp41中的融合肽，所述融合肽介导病毒包膜和靶细胞之间的融合(Chen等人, Virus Res 2001, 79:91-101)。在gp120中的单个残基(N197)处的一种碳水化合物的变化，会将病毒嗜性(viral tropism)从CD4嗜性彻底改变成CD4 不依赖性的(Kolchinksy等人, J Virol 2001, 75:3435-43)。改变高甘露糖相对于在gp120中存在的复杂型碳水化合物(含有唾液酸)的总比率，会影响病毒与靶细胞的结合程度(Fenouillet等人, J Gen Virol 1991, 1919-26)。在感染以后，包膜前体蛋白(gp160)切割成gp120和gp41需要糖基化。在从被感染的细胞释放病毒以后，糖基化对于免疫逃避而言也是重要的，因为包膜糖基化的变化显著地改变针对病毒的体液免疫应答(Kwong等人, Nature 2002, 420:678-82; Shi等人, J Gen Virol 2005, 86:3385-96)。
病毒蛋白的酰化对于HIV生物学而言也是重要的。HIV芽殖是一个复杂的过程，其涉及许多细胞蛋白和病毒蛋白的协调作用(Resh, Trends Microbiol 2001, 9:57; Freed, J Virol 2002, 76:4679-87)。HIV芽殖指向在膜筏中富含的质膜区域(Lindwasser等人, J Virol 2001, 75:7913-24; Nguyen等人, J Virol 2000, 74:3264-72; Ono等人, Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:13925-30; Hermida-Matsumoto等人, J Virol 2000, 74:8670-79)，所述膜筏以前被称作脂质筏(Pike等人, J Lipid Res 2006, 47:1597-98)，其通过衣壳蛋白多聚蛋白前体(pr55 gag)的N-端甘氨酸的肉豆蔻酰化(Lindwasser等人, J Virol 2001, 75:7913-24; Nguyen等人, J Virol 2000, 74:3264-72; Ono等人, Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:13925-30)。gp120蛋白通过棕榈酰化指向膜筏(Yang等人, Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:9871-75)。膜筏在几种细胞过程(包括胞吞、囊泡运输、胆固醇分选、细胞凋亡和通过T细胞受体的信号传递)中起重要作用(Jordan等人, J Immunol 2003, 171:78-87; Viola等人, Apmis 1999, 107:615-23; Viola等人, Science 1999, 283:680-82; Bezombes等人, Curr Med Chem Anti-Canc Agents 2002, 3:263-70; Kabouridis等人, Eur J Immunol 2000, 30:954-63)。HIV蛋白向这些区域的指向，可以允许病毒粒子更有效地劫持这些途径，因而可能解释了与AIDS的疾病进展有关的复杂致病性。实际上，从HIV颗粒中除去胆固醇(一种重要的膜筏组分)，会通过至少两种机理导致失活：丧失与靶细胞融合的能力和丧失病毒粒子完整性(导致病毒的透化) (Guyader等人, J Virol 2002, 76:10356-64; Campbell等人, J Virol 2004, 78:10556-65; Viard等人, J Virol 2002, 76:11584-595; Campbell等人, Aids 2002, 16:2253-61; Liao等人, AIDS Res Hum Retroviruses 2003, 19:675-87; Graham等人, J Virol 2003, 77:8237-48)。
病毒还可以使用宿主细胞机制，通过添加类异戊二烯脂质(诸如法呢基和香叶基香叶基基团)来修饰病毒蛋白。例如，异戊烯化在丁型肝炎病毒(HDV)的生命周期中起重要作用，所述丁型肝炎病毒是与乙型肝炎病毒有关的急性和慢性肝病的病原体(Einav和Glenn, J Antimicrobial Chemotherapy 2003, 52:883-86)。HDV蛋白之一(大δ抗原(LHDAg))对于病毒装配而言是关键性的，并且在体外翻译系统中和在完整细胞中均发生法呢基化(Einav和Glenn, J Antimicrobial Chemotherapy 2003, 52:883-86)。在HDV的小鼠模型中，通过使用法呢基转移酶抑制剂抑制异戊烯化，阻止HDV装配并清除HDV病毒血症，从而强调了异戊烯化在某些病毒的生命周期中的重要性(Einav和Glenn, J Antimicrobial Chemotherapy 2003, 52:883-86)。
与HIV、SIV和HDV类似，其他病毒依赖于病毒蛋白的翻译后修饰，来介导向宿主细胞中的进入和/或逃避宿主免疫系统。因而，预期本文描述的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物和炔烃修饰的类异戊二烯脂质具有宽范围的活性(诸如提高病毒的感染性)，具有凭借感染细胞的病毒数增加实现了细胞培养物中病毒的更高滴度这一结果。该培养的病毒可以用于制造抗病毒的疫苗。
使用方法
1. 生产经标记的病毒的方法
本公开提供一种生产用炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐标记的病毒的方法，所述方法包括使所述病毒与炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触，从而生产所述经标记的病毒。
在一些实施方案中，所述病毒与炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触，而在其他实施方案中，当病毒与炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触时，所述病毒是在细胞中。在一个实施方案中，所述脂肪酸是通过细胞中的酰化反应(例如棕榈酰化或肉豆蔻酰化)连接于蛋白质上的脂肪酸。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸的脂肪酸部分是饱和的或不饱和的，并且具有含偶数个碳原子的烃链，例如4-30个碳原子。合适的不饱和游离脂肪酸具有含12-24个碳原子的烃链，并且包括棕榈油酸、油酸、亚油酸、α和γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十四碳烯酸。合适的饱和脂肪酸具有含4-28个碳原子的烃链，并且优选地选自丁酸或异丁酸、琥珀酸、己酸、己二酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。需要理解的是，所述炔烃修饰的脂肪酸，无论是否天然地存在，都可以通过化学取代进行修饰，所述化学取代包括但不限于短链烷基化，如甲基化或乙酰化、酯化以及其他保持其提高病毒感染性的能力的衍生化。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是饱和脂肪酸，例如15-乙炔基十五烷酸、12-乙炔基十二烷酸或其生理学上可接受的盐。在另一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是饱和脂肪酸，例如：
，
或其生理学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物是N-连接的碳水化合物或O-连接的碳水化合物。在又另一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物是N-乙炔基乙酰基半乳糖胺、N-乙炔基乙酰基-D-甘露糖胺或N-乙炔基乙酰基葡萄糖胺。所述炔烃修饰的碳水化合物任选地包括促进进入细胞中的部分，包括但不限于四乙酰基部分。因此，在另一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物是四乙酰化的N-乙炔基乙酰基半乳糖胺、四乙酰化的N-乙炔基乙酰基-D-甘露糖胺或四乙酰化的N-乙炔基乙酰基葡萄糖胺。
在另一个实施方案中，所述炔烃修饰的类异戊二烯脂质包含法呢基基团或香叶基香叶基基团，并且包括但不限于乙炔基法呢基二磷酸酯、乙炔基法呢基醇、乙炔基香叶基香叶基二磷酸酯或乙炔基香叶基香叶基醇。
病毒可以是任何人动物病毒、非人动物病毒、植物病毒、昆虫病毒。在一个实施方案中，所述动物是人，以及所述病毒是人免疫缺陷病毒。在一些实施方案中，所述病毒是人免疫缺陷病毒，而在某些实施方案中，所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
2. 提高病毒感染性的方法
还提供一种提高病毒感染性的方法，所述方法包括使所述病毒与以有效提高所述病毒的感染性的量的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触。
在一些实施方案中，所述病毒与炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触，而在其他实施方案中，当病毒与炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触时，所述病毒是在细胞中。
本文讨论可以用于本方法的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物和炔烃修饰的类异戊二烯脂质、以及病毒的某些实施方案。
用炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质、其生理学上可接受的盐标记的病毒对治疗个体中的病毒感染或其他病症是否有效，可以采用本领域已知的多种测定中的任何一种进行确定。例如，病毒感染的现有动物模型或者体外模型均可以用于确定给定的化合物对降低病毒负荷是否有效。
本发明的经标记的病毒可以用作以活的、减毒形式的的疫苗，但通常它是灭活的。
疫苗可以包括全病毒，其感染性已经被灭活。灭活疫苗可以如下生产：通过将所述病毒在细胞培养物中进行繁殖，并且通过在由蔗糖或其他高密度介质所形成的密度梯度中进行高速离心而将其从被感染的细胞和培养基中纯化。可选地，所述病毒可以通过层析进行纯化。所纯化的病毒的感染性通过化学处理(例如福尔马林灭活，如同用于生产灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗)、辐射或热处理将病毒灭活而被破坏。
减毒病毒是其中毒力已经被降低的病毒。生长行为被认可作为病毒减毒的指示物。一般而言，如果病毒株丧失其在宿主细胞中重复复制的能力或者仅仅具有降低的能力，那么该病毒株被认为是减毒的。减毒可以通过不同的方法实现，包括病毒在细胞培养物中的连续传代、通过化学处理的抗原性修饰、重组病毒或者嵌合病毒的构建、病毒基因组的诱变、某些基因区域的缺失或者插入、温度敏感性突变体的选择或者辐射。可选地，本发明的经标记的病毒可以是减毒的天然病毒分离株或具有引起临床疾病的能力降低的感染性病毒cDNA或RNA。
本发明的经标记的病毒当用作疫苗时可以在细胞培养系统中繁殖。用于病毒/疫苗生产的细胞可以是细胞系，例如在体外连续生长的细胞，或者作为生物反应器中的单细胞悬浮培养物，或者作为组织培养瓶或滚瓶的细胞支持物表面上的单层。用于病毒生产的细胞系的一些实例是：人胎儿肺细胞系MRC-5，其用来制造脊髓灰质炎病毒，以及人胎儿肺细胞系WI-38，其用来制造麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒(MMR II) (Merck Sharp & Dohme)。
原代动物细胞也可以用于制备疫苗。可以用于病毒生产的原代细胞的实例是鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)。这些细胞用于生产麻疹和日本脑炎病毒(Pasteur Merieux)、腮腺炎病毒(由Provaccine制造)、狂犬病病毒(由Chiron Berhing GmbH & Co.制造)、黄热病病毒(由Aprilvax制造)、流感病毒(由Wyeth Labs和SmithKline & Beecham制造)和修饰的痘苗病毒Ankara (MVA)。
CEF细胞常常被使用，因为许多病毒疫苗通过将强毒的致病病毒在CEF细胞中进行连续传代而减毒来制备。减毒病毒优选不在人细胞上繁殖，因为担心病毒可能变成在人来源的细胞中具有复制能力。如果施用于人，特别是如果个体是免疫受损的，则已恢复了在人细胞中复制能力的病毒代表了健康风险。
3. 提高用于体外转染和体内基因治疗的病毒的感染性的方法
还提供一种提高转染病毒的感染性的方法，所述方法包括使所述病毒与以有效提高所述病毒的感染性的量的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触。在一些实施方案中，所述病毒与炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触，而在其他实施方案中，当病毒与炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触时，所述病毒是在细胞中。
本文讨论可以用于本方法的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物和炔烃修饰的类异戊二烯脂质，以及病毒的某些实施方案。
用炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐标记的病毒对提高病毒的感染性是否有效，可以采用本领域已知的多种测定中的任何一种进行确定。
本发明的经标记的病毒由于它提高的感染性可以在体内用作病毒载体用于基因治疗，以将外源基因引入完整的生物体中，如人动物、非人动物、昆虫或植物。本发明的经标记的病毒还可以在体外用作病毒载体用于转染，即用于向细胞中引入外源基因，以便在人动物、非人动物、昆虫或植物细胞中进行表达。
分子生物学中的标准技术可用于产生本文提供的经标记的病毒，其可以表达非病毒的基因。这样的技术包括各种核酸操作技术、核酸转移方案、核酸扩增方案和本领域中已知的其他分子生物学技术。例如，通过使用寡核苷酸介导的位点定向诱变，可以将点突变引入目的基因中。
本发明的方法可用于提供本发明的经标记的病毒，可以在将外源基因引入到所述病毒之前或之后。示例性的外源基因产物包括但不限于蛋白质和RNA分子。
本发明的经标记的病毒可以在宿主细胞中表达可检测的基因产物、治疗性基因产物、用于制造或收获的基因产物、或者用于抗体收获的抗原性基因产物。
这样的宿主细胞可以是一群单一类型的细胞或不同类型细胞的混合物。宿主细胞可以包括培养的细胞系、原代细胞和增殖性细胞。这些宿主细胞可以包括多种多样的人动物细胞或非人动物细胞中的任何一种，例如对本发明的经标记的病毒感染敏感的哺乳动物、鸟类和昆虫的细胞和组织，例如鸡胚细胞、兔细胞、仓鼠细胞和猴肾细胞。合适的宿主细胞包括但不限于造血细胞(全能细胞、干细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、APC、树突状细胞、非人细胞等)、肺细胞、气管细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞(例如骨骼肌、心肌或平滑肌)、成纤维细胞、以及细胞系，包括例如CV-1、BSC40、Vero、BSC40和BSC-1和人HeLa细胞。用于转染这些宿主细胞的方法、表型选择转化体的方法和其他这样的方法都是本领域已知的。
本发明的经标记的病毒可用于修饰生物体以表达外源基因，其修饰还可以含有一个或多个调节序列以调节外源基因的表达。正如本领域中已知的，调节序列可以允许外源基因的组成型表达或者可以允许外源基因的诱导型表达。进一步，所述调节序列可以允许控制外源基因的表达水平。
经标记的病毒
还提供一种经标记的病毒，其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分。在一些实施方案中，这些部分是非天然存在的。
在一些实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物部分包含可以从多种市售可得和/或本领域技术人员广泛知道的碳水化合物中选出的碳水化合物。在一些实施方案中，所述碳水化合物可以是天然存在的。可以理解的是，所述炔烃修饰的碳水化合物部分，无论是否天然存在，都可以被修饰，例如通过短链烷基化如甲基化或乙酰化、酯化以及其他保持提高所述病毒感染性的能力的衍生化。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物部分含有另一个的促进进入细胞的部分，其包括但不限于一个或多个乙酰基部分。因此，在一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物部分的碳水化合物是N-连接的碳水化合物或O-连接的碳水化合物的四乙酰化形式。在仍另一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物部分可以由四乙酰化的N-叠氮基乙酰基半乳糖胺、四乙酰化的N-叠氮基乙酰基-D-甘露糖胺或四乙酰化的N-叠氮基乙酰基葡萄糖胺构成。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物部分可以是通过细胞中的糖基化反应直接地或间接地与蛋白质连接的部分。在一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物可以是N-连接的碳水化合物或O-连接的碳水化合物部分。在仍另一个实施方案中，所述炔烃修饰的碳水化合物可以是N-乙炔基乙酰基半乳糖胺部分、N-乙炔基乙酰基-D-甘露糖胺部分或N-乙炔基乙酰基葡萄糖胺部分。
在一些实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分包含脂肪酸。所述脂肪酸可以选自市售可得和/或本领域技术人员广泛知道的种类繁多的脂肪酸。在一些实施方案中，所述脂肪酸可以被选择以防止、抑制和/或延迟细胞的病毒感染。在一些实施方案中，所述脂肪酸可以是天然存在的。
在一个实施方案中，所述脂肪酸可以是饱和的或不饱和的，并且具有偶数个碳原子的烃链，例如4-30个碳原子。合适的不饱和脂肪酸具有含12-24个碳原子的烃链，并且可以选自棕榈油酸、油酸、亚油酸、α和γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十四碳烯酸。合适的饱和脂肪酸具有含4-28个碳原子的烃链，并且可以选自丁酸或异丁酸、琥珀酸、己酸、己二酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸。另外，用炔烃、酮或其他小分子（其已显示是代谢上相容的棕榈酸、硬脂酸和花生酸）替换炔烃修饰的部分中的脂肪酸是可以的。需要理解的是，所述含有炔烃的脂肪酸部分，无论是否天然存在，都可以通过化学取代进行修饰，所述化学取代包括但不限于短链烷基化如甲基化或乙酰化、酯化以及其他保持提高病毒感染性的能力的衍生化。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是饱和脂肪酸部分，例如15-乙炔基十五烷基或12-乙炔基十二烷基。在另一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是饱和脂肪酸部分，诸如：
或
。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是可通过在细胞中的酰化反应(例如，棕榈酰化或肉豆蔻酰化)与所述病毒的蛋白连接的部分。
在一些实施方案中，所述病毒可以是任何人动物病毒、非人动物病毒、植物病毒、昆虫病毒。在一些实施方案中，所述病毒是人免疫缺陷病毒。在某些实施方案中，所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
病毒
炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物或炔烃修饰的类异戊二烯脂质靶向大部分病毒所共有的翻译后修饰，并因此代表了新的一类具有提高广谱病毒的感染性的潜力的药剂。原则上，这些化合物可以用于提高人动物病毒、非人动物病毒、植物病毒或昆虫病毒的感染性。在一些实施方案中，所述病毒是植物病毒。在一些实施方案中，所述病毒是昆虫病毒。在其他实施方案中，所述病毒是非人动物病毒。在仍其他实施方案中，所述病毒是人动物病毒。在一个实施方案中，所述病毒是感染非人哺乳动物的病毒，例如哺乳动物家畜动物，包括但不限于牛、马、猪、山羊或绵羊。
在其他实施方案中，病毒是DNA病毒。DNA病毒包括但不限于属于下述科之一的病毒：腺病毒、星状病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、乳多空病毒和痘病毒。在其他实施方案中，病毒是RNA病毒。RNA病毒包括但不限于属于下述科之一的病毒：沙粒病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、冠状病毒、丝状病毒、黄病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、弹状病毒和披膜病毒。
1. 非人动物病毒
在涉及非人动物的本发明的方法中，非人动物病毒可以选自小RNA病毒属(picornavirus)，诸如牛肠道病毒、猪肠道病毒B、口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、牛鼻炎B病毒、ljungan病毒、马鼻炎B病毒、爱知病毒(aichi virus)、牛嵴病毒(bovine kobuvirus)、猪捷申病毒(porcine teschovirus)、猪萨佩洛病毒(porcine sapelovirus)、猴萨佩洛病毒、禽萨佩洛病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸭甲型肝炎病毒或猴肠道病毒A；瘟病毒属(pestivirus)，诸如边境病病毒、牛病毒性腹泻病毒或经典猪瘟病毒；动脉炎病毒属(arterivirus)，诸如马动脉炎病毒、猪生殖和呼吸综合征病毒、乳酸脱氢酶升高病毒或猴出血热病毒；冠状病毒属(coronavirus)，诸如牛冠状病毒、猪冠状病毒、猫冠状病毒或犬冠状病毒；副粘病毒属(paramyxovirus)，诸如亨德拉病毒、尼帕病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒和牛呼吸道合胞病毒；正粘病毒属(orthomyxovirus)，诸如甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒；呼肠孤病毒属(reovirus)，诸如蓝舌病毒；猪圆环病毒，疱疹病毒属(herpesvirus)，诸如假性狂犬病病毒或牛疱疹病毒1型；非洲猪瘟病毒属(asfarvirus)，诸如非洲猪瘟病毒；逆转录病毒属(retrovirus)，诸如猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、绵羊肺腺瘤病逆转录病毒或山羊关节炎脑炎病毒；黄病毒属(flavivirus)，诸如黄热病病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒或牛病毒性腹泻病毒；或弹状病毒属(rhabdovirus)，诸如狂犬病病毒。
2. 人动物病毒
在涉及人动物的本发明的方法中，人动物病毒可以选自腺病毒、星状病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、乳多空病毒、痘病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、冠状病毒、丝状病毒、黄病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、弹状病毒或披膜病毒。
在一些实施方案中，所述腺病毒包括但不限于人腺病毒。在一些实施方案中，所述星状病毒包括但不限于哺乳动物星状病毒。在一些实施方案中，所述嗜肝DNA病毒包括但不限于乙型肝炎病毒。在一些实施方案中，所述疱疹病毒包括但不限于单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、水痘带状疱疹病毒、蔷薇疹病毒和卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)-相关的疱疹病毒。在一些实施方案中，所述乳多空病毒包括但不限于人乳头瘤病毒和人多瘤病毒。在一些实施方案中，所述痘病毒包括但不限于天花病毒(variola virus)、痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、天花病毒(smallpox virus)、假牛痘病毒、丘疹状口炎病毒、塔纳痘病毒、雅巴猴瘤病毒和传染性软疣病毒。在一些实施方案中，所述沙粒病毒包括但不限于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、拉沙病毒、玻利维亚出血热病毒(machupo virus)和胡宁病毒(junin virus)。在一些实施方案中，所述布尼亚病毒包括但不限于汉坦病毒、内罗毕病毒、正布尼亚病毒和白蛉热病毒。在一些实施方案中，所述杯状病毒包括但不限于水疱性疹病毒(vesivirus)、诺罗病毒(norovirus)，诸如诺沃克病毒和扎幌病毒。在一些实施方案中，所述冠状病毒包括但不限于人冠状病毒(严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体)。在一些实施方案中，所述丝状病毒包括但不限于埃博拉病毒和马尔堡病毒。在一些实施方案中，所述黄病毒包括但不限于黄热病病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒、牛病毒性腹泻病毒、科萨努尔森林病病毒和波瓦生脑炎病毒。在一些实施方案中，所述正粘病毒包括但不限于甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。在一些实施方案中，所述副粘病毒包括但不限于副流感病毒、腮腺炎病毒(腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、肺病毒，诸如人呼吸道合胞病毒和亚急性硬化性全脑炎病毒。在一些实施方案中，所述小RNA病毒包括但不限于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、甲型肝炎病毒、埃可病毒和肠道病毒。在一些实施方案中，所述呼肠孤病毒包括但不限于科罗拉多蜱传热病毒和轮状病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括但不限于慢病毒，诸如人免疫缺陷病毒和人T淋巴营养病毒(HTLV)。在一些实施方案中，所述弹状病毒包括但不限于狂犬病病毒(lyssavirus)，诸如狂犬病病毒(rabies virus)、水疱性口炎病毒和传染性造血坏死病毒。在一些实施方案中，所述披膜病毒包括但不限于甲病毒，诸如罗斯河病毒、奥绒绒（O'nyong'nyong）病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒和西方马脑炎病毒和风疹病毒。
3. 植物病毒
在涉及植物的本发明的方法中，所述植物病毒可以选自苜蓿花叶病毒属、青葱病毒属、α潜隐病毒属、环斑病毒属(anulavirus)、苹果锈果类病毒属(apscaviroid)、黄金葛病毒属、燕麦病毒属、鳄梨白斑类病毒属、杆状DNA病毒属、菜豆金色花叶病毒属、甜菜坏死黄脉病毒属、β潜隐病毒属、β弯曲病毒科、雀麦花叶病毒属、大麦黄化花叶病毒属、毛状病毒属、香石竹潜隐病毒属、麝香石竹斑驳病毒属、花椰菜花叶病毒属、木薯叶脉花叶病毒属、樱桃锉叶病毒属、长线形病毒属(closterovirus)、椰子死亡类病毒属、锦紫苏类病毒属、豇豆花叶病毒属、毛形病毒属(crinivirus)、黄瓜花叶病毒属、甜菜曲顶病毒属(curtovirus)、细胞质弹状病毒属、香石竹环斑病毒属、碗豆耳突花叶病毒属、幽影病毒属(umbravirus)和B-型卫星病毒属、蚕豆病毒属、斐济病毒属、真菌传杆状病毒属、大麦病毒属、啤酒花矮化类病毒属、悬钩子病毒属、等轴不稳环斑病毒属、甘薯病毒属、黄矮病毒属、玉米褪绿斑驳病毒属、橙桑花叶病毒属、玉米雷亚朵非纳病毒属、玉米线条病毒属、矮缩病毒属(nanovirus)、坏死病毒属、线虫传多角体病毒属、细胞核弹状病毒属、油橄榄病毒属、蛇形病毒属(ophiovirus)、水稻病毒属、黍花叶病毒属(panicovirus)、花生丛簇病毒属、牵牛花叶脉透明样病毒属(petuvirus)、植物呼肠孤病毒属、马铃薯卷叶病毒属、马铃薯帚顶病毒属(pomovirus)、马铃薯纺锤形块茎类病毒属、马铃薯X病毒属、马铃薯Y病毒属、呼肠孤病毒属、弹状病毒属、黑麦草花叶病毒属、温州蜜柑矮缩病毒属、SbCMV-样病毒属、伴生病毒属、南方菜豆花叶病毒属、纤细病毒属、TNsatV-样卫星病毒属、烟草花叶病毒属、番茄假曲顶病毒属、蕃茄斑萎病毒属、苹果退绿叶斑病毒属、小麦花叶病毒属、水稻衰退杆状样病毒属、芜菁黄花叶病毒属、幽影病毒属(umbravirus)、巨脉病毒属、葡萄属病毒属或水稻矮化病毒属。
4. 昆虫病毒
在涉及昆虫病毒的本发明的方法中，所述昆虫病毒可以选自浓核病毒属(densovirus)，诸如鹿眼蛱蝶(Junonia coenia)浓核病毒、家蚕(Bombyx mori)浓核病毒、埃及伊蚊(Aedes aegypti)浓核病毒或黑胸大蠊(Periplanta fuliginosa)浓核病毒；虹彩病毒属(iridovirus)，诸如虹彩病毒6型；绿色虹彩病毒属(chloriridovirus)，杆状病毒属(baculovirus)，诸如核型多角体病毒或粒状病毒；多DNA病毒属(polydnavirus)，诸如姬蜂病毒或茧蜂病毒；昆虫痘病毒属(entomopox viru)，诸如昆虫痘病毒A属、昆虫痘病毒B属或昆虫痘病毒C属；囊泡病毒属(ascovirus)，诸如草地贪夜蛾囊泡病毒1a型(Spodoptera frugiperda ascovirus 1a)、粉纹夜蛾囊泡病毒2a型(Trichoplusia ni ascovirus 2a)或美双缘姬蜂囊泡病毒4a型(Diadromus pulchellus ascovirus 4a)；昆虫小RNA病毒属(picornavirus)，诸如蜜蜂急性麻痹病毒、果蝇P、C或A病毒、蜜蜂X病毒或蚕软化病病毒；杯状病毒属(calicivirus)；野田村病毒属(nodavirus)，诸如黑蟑螂病毒、兽棚病毒(flock house virus)、野田村病毒、pariacoto病毒或舞毒蛾病毒。
组合疗法
在一个实施方案中，包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒和至少一种抗病毒剂的药物组合物可以在组合疗法中施用。在一些实施方案中，所述经标记的病毒可以是灭活的或减毒的。所述疗法用于治疗病毒感染，包括但不限于HIV感染。在该背景下，术语“组合”是指包含炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其组合的病毒和抗病毒剂基本上同一个时间地(同时地或连续地)给予。在一个实施方案中，如果连续地给予，在第二种开始施用时，两种中的第一种在治疗部位处仍是以有效浓度可检测的。在另一个实施方案中，如果连续地给予，在第二种开始施用时，两种中的第一种在治疗部位处不是以有效浓度而可检测的。
例如，所述组合疗法可以包括与至少一种另外的抗病毒剂共同配制和/或共同施用的包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒。尽管提供了抗病毒剂的具体实例，但是原则上，所述经标记的病毒可以与可用于治疗病毒感染的任何药物组合物组合。这样的组合疗法可以有利地使用所给予的药剂的较低剂量，从而避免与各种单一疗法有关的可能的毒性或并发症。此外，本文公开的另外的抗病毒剂作用于病毒感染的途径或阶段，是累加在所述经标记的病毒所影响的病毒感染的途径或阶段之上或与其不同，因而预期会增强所述经标记的病毒的作用和/或与所述作用协同。另外的抗病毒剂可以包括至少一种逆转录酶抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂、病毒融合抑制剂、病毒整合酶抑制剂、糖苷酶抑制剂、病毒神经氨酸酶抑制剂、M2蛋白抑制剂、两性霉素B、羟基脲、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素和反义寡核苷酸。
所述至少一种逆转录酶抑制剂包括但不限于一种或多种核苷类似物，诸如齐多夫定(AZT)、去羟肌苷(ddI)、扎西他滨(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韦(ABC)、恩曲他滨(FTC)、恩替卡韦(INN)、阿立他滨(ATC)、Atevirapine、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦和缬更昔洛韦；一种或多种核苷酸类似物，诸如替诺福韦(富马酸替诺福韦二吡呋酯)、阿德福韦(bis-POM PMPA)、PMPA和西多福韦；或一种或多种非核苷逆转录酶抑制剂，诸如依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦啶和依曲韦林。
所述至少一种病毒蛋白酶抑制剂包括但不限于替拉那韦、达芦那韦、茚地那韦、洛匹那韦、呋山那韦、阿扎那韦、沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦和氨普那韦。
所述至少一种病毒融合抑制剂包括但不限于CD4拮抗剂，诸如可溶性CD4，或与CD4结合的抗体，诸如TNX-355、BMS-806；CCR5拮抗剂，诸如SCH-C、SCH-D、UK-427,857、马拉韦罗、维立韦罗，或与CCR5结合的抗体，诸如PRO-140；CXCR4拮抗剂，例如，AMD3100或AMD070；或gp41的拮抗剂，诸如恩夫韦肽。
所述至少一种病毒整合酶抑制剂包括但不限于拉替拉韦。
所述至少一种糖苷酶抑制剂包括但不限于SC-48334或MDL-28574。
所述至少一种病毒神经氨酸酶抑制剂包括但不限于奥塞米韦、培拉米韦、扎那米韦和拉尼米韦。神经氨酸酶是在流感病毒的表面上的蛋白质，其介导病毒从受感染的细胞的释放(Bossart-Whitaker等人, J Mol Biol, 1993, 232:1069-83)。所述流感病毒使用病毒血凝素蛋白附着于细胞膜上。所述血凝素蛋白会结合至在宿主细胞膜中的糖蛋白上存在的唾液酸部分。为了从细胞中释放出病毒，神经氨酸酶必须从宿主糖蛋白中经酶促切割唾液酸基团。因而，抑制神经氨酸酶会阻止流感病毒从受感染的细胞中的释放。
所述至少一种M2抑制剂包括但不限于金刚烷胺和金刚乙胺(rimantidine)。M2是在流感病毒的病毒被膜中发现的一种离子通道蛋白(Henckel等人, J Biol Chem, 1998, 273:6518-24)。所述M2蛋白在控制流感病毒的脱壳中起重要作用，从而导致病毒粒子内容物释放进入宿主细胞的细胞质中。阻断M2会抑制病毒复制。
本文公开的包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒可以与其他治疗剂组合使用，以治疗如在下文中进一步详细讨论的具体病毒感染。
用于治疗HIV感染的药剂的非限制性实例包括但不限于这种病毒（所述病毒经过修饰使得其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分），其与下述中的至少一种组合：齐多夫定(AZT)，去羟肌苷(ddI)，扎西他滨(ddC)，司他夫定(d4T)，拉米夫定(3TC)，阿巴卡韦(ABC)，恩曲他滨(FTC)，恩替卡韦(INN)，阿立他滨(ATC)，替诺福韦(富马酸替诺福韦二吡呋酯)，阿德福韦(bis-POM PMPA)依法韦仑，奈韦拉平，地拉韦啶，依曲韦林，替拉那韦，达芦那韦，茚地那韦，洛匹那韦，呋山那韦，阿扎那韦，沙奎那韦，利托那韦，茚地那韦，奈非那韦，氨普那韦，CD4拮抗剂，诸如可溶性CD4，或与CD4结合的抗体，诸如TNX-355、BMS-806，CCR5拮抗剂，诸如SCH-C、SCH-D、UK-427,857、马拉韦罗、维立韦罗，或与CCR5结合的抗体，诸如PRO-140，CXCR4拮抗剂，例如，AMD3100或AMD070，或gp41的拮抗剂，诸如恩夫韦肽。
可以用于治疗HIV感染的组合疗法的具体实例包括但不限于这种病毒（所述病毒经过修饰使得其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分），其与下述组合：1)替诺福韦、恩曲他滨和依法韦仑；2)洛匹那韦和利托那韦；3)拉米夫定和齐多夫定；4)阿巴卡韦、拉米夫定和齐多夫定；5)拉米夫定和阿巴卡韦；或6)替诺福韦和恩曲他滨。
用于治疗疱疹病毒感染的药剂的非限制性实例包括但不限于这种病毒（所述病毒经过修饰使得其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分），其与下述组合：阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、西多福韦、膦甲酸、更昔洛韦和缬更昔洛韦。
用于治疗流感病毒感染的药剂的非限制性实例包括但不限于这种病毒（所述病毒经过修饰使得其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分），其与下述组合：金刚烷胺、金刚乙胺、奥塞米韦、培拉米韦、扎那米韦和拉尼米韦。
用于治疗呼吸道合胞病毒感染的药剂的非限制性实例包括但不限于这种病毒（所述病毒经过修饰使得其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分），其与利巴韦林组合。
因此，本发明的另一个方面涉及试剂盒，所述试剂盒用于进行包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒与其他治疗剂的组合施用。在一个实施方案中，所述试剂盒包含：配制在药用赋形剂中的包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒，和在适当时配制在一种或多种单独的药物制剂中的至少一种抗病毒剂。
组合物和施用方法
还提供的是适合药用和施用给患者的组合物。所述组合物包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒或本文的任何病毒。
在一些实施方案中，所述组合物包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒，其中所述病毒是灭活的。在一些实施方案中，所述组合物包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒，其中所述病毒是减毒的。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述组合物包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒，其中所述病毒是天然存在的病毒。在一些实施方案中，所述组合物包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒，其中所述病毒是非天然存在的病毒。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分包含这样的脂肪酸，其可以是饱和的或不饱和的，并且具有偶数个碳原子的烃链，例如4-30个碳原子。合适的不饱和的脂肪酸具有含12-24个碳原子的烃链，并且可以选自棕榈油酸、油酸、亚油酸、α和γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十四碳烯酸。合适的饱和脂肪酸具有含6-28个碳原子的烃链，并且可以选自丁酸或异丁酸、琥珀酸、己酸、己二酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸。另外，用炔烃、酮或其他小分子（其已显示是代谢上相容的棕榈酸、硬脂酸和花生酸）替换炔烃修饰的部分中的脂肪酸是可以的。需要理解的是，所述含有炔烃的脂肪酸部分，无论是否天然地存在，都可以通过化学取代进行修饰，所述化学取代包括但不限于短链烷基化如甲基化或乙酰化、酯化以及其他保持提高病毒感染性的能力的衍生化。
在一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸部分是饱和脂肪酸部分，例如15-乙炔基十五烷基或12-乙炔基十二烷基。在另一个实施方案中，所述炔烃修饰的脂肪酸是饱和脂肪酸部分，例如：
或
。
所述药物组合物也可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本发明的组合物可以被配制成与它施用的预计途径相容。完成施用的方法是本领域普通技术人员已知的。所述组合物可以经局部或口服施用，或者能够跨粘膜传递。组合物的施用实例包括口服摄入或吸入。施用也可以是静脉内的、腹膜内的、肌内的、腔内的、皮下的、皮肤的或经皮的。
用于真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括下述组分中的至少一种：无菌的稀释剂，诸如水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及张度剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH。这样的制剂可以包封在安瓿瓶、一次性注射器或多次剂量小瓶中。
用于静脉内施用的溶液或悬浮液包括载体，诸如生理盐水、抑菌水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)、乙醇或多元醇。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的和可易于注射的流体。经常使用卵磷脂或表面活性剂来获得适当的流动性。所述组合物还必须在制造和贮存条件下是稳定的。利用抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以实现防止微生物。在许多情况下，可以在所述组合物中包括等张剂(糖)、多元醇(甘露醇和山梨醇)或氯化钠。通过加入延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现所述组合物的延长吸收。
口服组合物包括惰性稀释剂或可食用载体。所述组合物可以包封在明胶中或压制成片剂。为了口服施用目的，可以将包含病毒的组合物与赋形剂混合（其中所述病毒包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分），并置入片剂、糖锭或胶囊。在所述组合物中可以包括药学上相容的粘合剂或辅料。所述片剂、糖锭和胶囊可以含有：(1)粘合剂，诸如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；(2)赋形剂，诸如淀粉或乳糖；(3)崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；(4)润滑剂，诸如硬脂酸镁；(5)助流剂，诸如胶体二氧化硅；或(6)甜味剂或增香剂。
还可以通过经粘膜或经皮途径施用所述组合物。通过使用锭剂、鼻喷雾、吸入器或栓剂，可以实现经粘膜施用。还可以通过使用含有组合物的本领域已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏实现经皮施用。就经粘膜施用或经皮施用而言，使用适合要渗透的屏障的渗透剂。
就吸入给药而言，从加压容器或分配器(其含有推进剂(例如，液体或气体))或喷雾器中，以气溶胶喷雾形式递送包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒。在某些实施方案中，所述病毒与载体一起制备，以保护所述化合物免于从身体内快速消除掉。经常使用可生物降解的聚合物(例如，乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸)。用于制备这样的制剂的方法是本领域技术人员已知的。
在其他实施方案中，所述组合物包含用于将包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒递送到细胞中的递送剂，其包括但不限于脂质体。脂质体(也称作脂囊泡)是从极性脂质分子制成的胶体颗粒，所述脂质分子来源于天然来源或化学合成。这样的由弯曲的脂质双层构成的球形封闭结构，通常用于包封药物(其经常是细胞毒性的)，以便降低毒性和/或增加效力。脂质体包封的药物制剂经常以干燥的(例如冷冻干燥)形式提供，其随后在即将施用之前用水溶液重构。这样做是为了使例如细胞毒性药物渗漏到水溶液中的可能性最小化，并从而减少脂质体的包封效应。
尤其包含脂质体包囊化活性成分的制剂的实例公开在美国专利号4,427,649、美国专利号4,522,811、美国专利号4,839,175、美国专利号5,569,464、EP 249 561、WO 00/38681、WO 88/01862、WO 98/58629、WO 98/00111、WO 03/105805、美国专利号5,049,388、美国专利号5,141,674、美国专利号5,498,420、美国专利号5,422,120、WO 87/01586、WO 2005/039533、US 2005/0112199和美国专利号6,228,393中，它们所有都通过引用以其整体并入本文。
含有包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒的组合物以如描述的治疗有效量给予。治疗有效量可以随个体的年龄、病况、性别和医学病况的严重性而变化。合适的剂量可以由医师基于临床适应症而确定。含有包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒的组合物可以作为大剂量(bolus dose)给予，以最大时间长度地最大化病毒的循环水平。在大剂量以后，也可以使用连续输注。
包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒的组合物，其中所述病毒是灭活的，可以通过注射胃肠外、经口、皮内、经皮、舌下给药、鼻内如吸入或经直肠给予。每个免疫剂量包括以滴度计的病毒结构，其能够在人动物或非人动物中诱导适当的免疫应答。这个剂量可以对应于Salk-型灭活脊髓灰质炎病毒疫苗中使用的剂量，包括每个剂量1.8 - 2 μg病毒蛋白和20-40抗原性D-单位的脊髓灰质炎病毒1型，4-8抗原性D-单位的脊髓灰质炎病毒2型，以及16-32抗原性D-单位的脊髓灰质炎病毒3型。该剂量也可以是另一种，如果它已经被证实是安全的和免疫原性的或者能够刺激免疫系统。
包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒的组合物，其中所述病毒是减毒的，可以方便地被配制成粘膜组合物，其可以经口、舌下、鼻内如吸入或经直肠给予。在一些实施方案中，它通过口服给予。每个免疫剂量包括以滴度计的感染性病毒或感染性RNA或cDNA，其能够在人体内产生先天性或适应性免疫系统的感染或活化，或者诱导调节性T-细胞或调节性细胞因子。该剂量可以对应用于传统的Sabin型口服活的脊髓灰质炎病毒疫苗中的剂量，包括最低105.5 - 106 TCID50的脊髓灰质炎病毒1型，105 TCID50的脊髓灰质炎病毒2型，以及105.5 – 105.8 TCID50的脊髓灰质炎病毒3型活的减毒的脊髓灰质炎病毒Sabin毒株。该剂量也可以是另一种，如果它已经被证实是安全的和感染性的或者能够活化先天性或适应性免疫系统。(TCID =组织培养物感染剂量; TCID50= 感染50%培养物的剂量)。
在某些情况下，可以有利地以剂量单位形式配制本发明的组合物，以方便施用和剂量一致性。如本文使用的剂量单位形式是指适合患者的物理上离散的单位。每个剂量单位含有与载体相组合的经计算会产生治疗效果的预定量的包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒。所述剂量单位取决于包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或述炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒的特征和要达到的特定治疗效果。
本发明的组合物的毒性和疗效可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中来确定，例如测定LD50 (使50%的群体致死的剂量)和ED50 (在50%的群体中治疗上有效的剂量)。毒性和疗效间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比率LD50/ED50。
从细胞培养物测定和动物研究得到的数据可以用于制定在人类中的剂量范围。本发明的这些组合物的剂量可以位于包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒在血液中的循环浓度范围内，其包括几乎没有毒性或没有毒性时的ED50。所述剂量可以在该范围内变化，取决于采用的剂量组合物形式和施用途径。就在本文描述的方法中使用的包含含有炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分的病毒的任何组合物而言，使用细胞培养物测定可以初步估测治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量，以实现包括IC50 (即，实现症状的半最大抑制的这种病毒的浓度)的循环血浆浓度范围。通过合适的生物测定，可以监测任何具体剂量的效果。
本发明的组合物也可以含有提供补充、附加或增强治疗功能的其他活性化合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种抗病毒剂，诸如逆转录酶抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂、病毒融合抑制剂、病毒整合酶抑制剂、糖苷酶抑制剂、两性霉素B、羟基脲、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素和反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，所述至少一种逆转录酶抑制剂包括但不限于一种或多种核苷类似物，诸如齐多夫定(AZT)、去羟肌苷(ddI)、扎西他滨(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韦(ABC)、恩曲他滨(FTC)、恩替卡韦(INN)、阿立他滨(ATC)、Atevirapine、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦和缬更昔洛韦；一种或多种核苷酸类似物，诸如替诺福韦(富马酸替诺福韦二吡呋酯)、阿德福韦(bis-POM PMPA)、PMPA和西多福韦；或一种或多种非核苷逆转录酶抑制剂，诸如依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦啶和依曲韦林。
在其他实施方案中，所述至少一种病毒蛋白酶抑制剂包括但不限于替拉那韦、达芦那韦、茚地那韦、洛匹那韦、呋山那韦、阿扎那韦、沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦和氨普那韦。
在其他实施方案中，所述至少一种病毒融合抑制剂包括但不限于CD4拮抗剂，诸如可溶性CD4，或与CD4结合的抗体，诸如TNX-355、BMS-806；CCR5拮抗剂，诸如SCH-C、SCH-D、UK-427,857、马拉韦罗、维立韦罗，或与CCR5结合的抗体，诸如PRO-140；CXCR4拮抗剂，例如，AMD3100或AMD070；或gp41的拮抗剂，诸如恩夫韦肽。
在其他实施方案中，所述至少一种病毒整合酶抑制剂包括但不限于拉替拉韦。
在其他实施方案中，所述至少一种糖苷酶抑制剂包括但不限于SC-48334或MDL-28574。

Claims (49)

1.增强人免疫缺陷病毒的感染性的方法，所述方法包括使所述病毒与以有效增强所述病毒的感染性的量的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质、或其生理学上可接受的盐接触。
2.权利要求1的方法，其中所述病毒是在细胞中。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞是人动物细胞或非人动物细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
5.权利要求1的方法，其中所述炔烃修饰的脂肪酸或其生理学上可接受的盐具有下式：
Y-CH2-X-CO2H
其中，
Y是H或乙炔基；并且
当Y是乙炔基时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中所述碳中的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；或者
当Y是H时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中用乙炔基替代在所述碳之一上的至少一个氢，并且其中所述碳中不具有与其相连的乙炔基的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接并且不具有与其相连的乙炔基的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；
其中，R1是H或包含1到6个碳的烷基。
6.权利要求5的方法，其中Y是乙炔基。
7.权利要求5的方法，其中X是直链碳链。
8.权利要求5的方法，其中X是包含8到15个碳的碳链。
9.权利要求5的方法，其中X是碳链，其中所述碳链的所有碳均为碳。
10.权利要求5的方法，其中X是碳链，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
11.权利要求5的方法，其中所述炔烃修饰的脂肪酸是15-乙炔基十五烷酸、12-乙炔基十二烷酸或其生理学上可接受的盐。
12.权利要求5的方法，其中所述炔烃修饰的脂肪酸是
，
，
或其生理学上可接受的盐。
13.权利要求5的方法，其中Y是乙炔基，X是直链碳链，并且所述直链碳链包含8到15个碳。
14.权利要求13的方法，其中所述碳链的所有碳均为碳。
15.权利要求13的方法，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
16.权利要求1的方法，其中所述接触在溶液中进行，所述溶液包含动物血清、氨基酸、缓冲剂、脂肪酸、葡萄糖、激素、无机盐、脂质、金属离子螯合剂、肽、表面活性剂、微量金属和维生素中的至少一种。
17.增强人免疫缺陷病毒的感染性的方法，所述方法包括使所述病毒感染的细胞与以有效增强所述病毒的感染性的量的炔烃修饰的脂肪酸、炔烃修饰的碳水化合物、炔烃修饰的类异戊二烯脂质或其生理学上可接受的盐接触。
18.权利要求17的方法，其中所述细胞是人动物细胞或非人动物细胞。
19.权利要求17的方法，其中所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
20.权利要求17的方法，其中所述炔烃修饰的脂肪酸或其生理学上可接受的盐具有下式：
Y-CH2-X-CO2H
其中，
Y是H或乙炔基；并且
当Y是乙炔基时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中所述碳中的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；或者
当Y是H时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中用乙炔基替代在所述碳之一上的至少一个氢，并且其中所述碳中不具有与其相连的乙炔基的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接并且不具有与其相连的乙炔基的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；
其中，R1是H或包含1到6个碳的烷基。
21.权利要求20的方法，其中Y是乙炔基。
22.权利要求20的方法，其中X是直链碳链。
23.权利要求20的方法，其中X是包含8到15个碳的碳链。
24.权利要求20的方法，其中X是碳链，其中所述碳链的所有碳均为碳。
25.权利要求20的方法，其中X是碳链，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
26.权利要求20的方法，其中所述炔烃修饰的脂肪酸是15-乙炔基十五烷酸、12-乙炔基十二烷酸或其生理学上可接受的盐。
27.权利要求20的方法，其中所述炔烃修饰的脂肪酸是
，
，
或其生理学上可接受的。
28.权利要求20的方法，其中Y是乙炔基，X是直链碳链，并且所述直链碳链包含8到15个碳。
29.权利要求28的方法，其中所述碳链的所有碳均为碳。
30.权利要求28的方法，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
31.权利要求17的方法，其中所述接触在溶液中进行，所述溶液包含动物血清、氨基酸、缓冲剂、脂肪酸、葡萄糖、激素、无机盐、脂质、金属离子螯合剂、肽、表面活性剂、微量金属和维生素中的至少一种。
32.人免疫缺陷病毒，其包含炔烃修饰的脂肪酸部分、炔烃修饰的碳水化合物部分、或炔烃修饰的类异戊二烯脂质部分；其中所述部分是非天然存在的。
33.权利要求32的病毒，其中所述病毒是HIV-1。
34.权利要求32的病毒，其中所述病毒是灭活的。
35.权利要求32的病毒，其中所述病毒是减毒的。
36.权利要求32的病毒，其中所述炔烃修饰的脂肪酸部分具有下式：
Y-CH2-X-CO-
其中，
Y是H或乙炔基；并且
当Y是乙炔基时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中所述碳中的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；或者
当Y是H时，X是包含6到28个碳的直链或支链碳链，其中用乙炔基替代在所述碳之一上的至少一个氢，并且其中所述碳中不具有与其相连的乙炔基的一个或多个可以独立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此邻接并且不具有与其相连的乙炔基的一对或多对可以通过双键或三键彼此连接；
其中，R1是H或包含1到6个碳的烷基。
37.权利要求36的病毒，其中Y是乙炔基。
38.权利要求36的病毒，其中X是直链碳链。
39.权利要求36的病毒，其中X是包含8到15个碳的碳链。
40.权利要求36的病毒，其中X是碳链，其中所述碳链的所有碳均为碳。
41.权利要求36的病毒，其中X是碳链，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
42.权利要求36的病毒，其中所述炔烃修饰的脂肪酸部分是15-乙炔基十五烷基或12-乙炔基十二烷基。
43.权利要求36的病毒，其中所述炔烃修饰的脂肪酸部分是
或者
。
44.权利要求36的病毒，其中Y是乙炔基，X是直链碳链，并且所述直链碳链包含8到15个碳。
45.权利要求44的病毒，其中所述碳链的所有碳均为碳。
46.权利要求44的病毒，其中在所述碳链的碳之间的所有键均是单键。
47.权利要求36的病毒，其中所述炔烃修饰的脂肪酸部分通过酰胺或硫酯键与所述病毒连接。
48.组合物，其包含权利要求32的病毒。
49.权利要求48的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2015051268A2 (en) * 2013-10-04 2015-04-09 The Johns Hopkins University Hiv protease inhibitors against picornavirus infection
CA2955250A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
EP4126034A1 (en) * 2020-03-27 2023-02-08 Beech Tree Labs Inc. Method of treating coronavirus infection by administration of ethyl mercury or thiol derivative thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001020989A1 (en) * 1999-09-22 2001-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Therapeutic methods and compositions using viruses of the recombinant paramyxoviridae family
US7169411B1 (en) * 1997-06-13 2007-01-30 The University of Nebraska Board of Regents Composition for delivery of biological agents and methods for the preparation thereof
US20110263001A1 (en) * 2008-11-14 2011-10-27 Life Technologies Corporation Compositions and Methods for Engineering Cells

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1523965A (en) 1976-03-19 1978-09-06 Ici Ltd Pharmaceutical compositions containing steroids
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5141674A (en) 1984-03-08 1992-08-25 Phares Pharmaceutical Research N.V. Methods of preparing pro-liposome dispersions and aerosols
GB8522964D0 (en) 1985-09-17 1985-10-23 Biocompatibles Ltd Aerosol
EP0249561B1 (en) 1986-06-12 1992-05-13 The Liposome Company, Inc. Compositions using liposome-encapsulated non-steroidal anti-inflammatory drugs
US4839175A (en) 1986-07-28 1989-06-13 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced retention on mucosal tissue
SE8603812D0 (sv) 1986-09-12 1986-09-12 Draco Ab Administration of liposomes to mammals
US5049388A (en) 1986-11-06 1991-09-17 Research Development Foundation Small particle aerosol liposome and liposome-drug combinations for medical use
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
US5498420A (en) 1991-04-12 1996-03-12 Merz & Co. Gmbh & Co. Stable small particle liposome preparations, their production and use in topical cosmetic, and pharmaceutical compositions
MX9305453A (es) * 1992-09-07 1994-05-31 Virostat Na Nv Metodo para tratar infecciones virales.
CA2120197A1 (en) 1993-04-02 1994-10-03 Kenji Endo Stable aqueous dispersions containing liposomes
EP0659885A1 (en) 1993-12-21 1995-06-28 Akzo Nobel N.V. Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity
US6132765A (en) 1996-04-12 2000-10-17 Uroteq Inc. Drug delivery via therapeutic hydrogels
TW497974B (en) 1996-07-03 2002-08-11 Res Dev Foundation High dose liposomal aerosol formulations
GB2326337A (en) 1997-06-20 1998-12-23 Phares Pharma Holland Homogeneous lipid compositions for drug delivery
GR1003359B (el) 1998-12-24 2000-04-10 �.�. ����������� �.�.�.�. Λιποσωμιακο νιφλουμικο οξυ - νεο διαδερμικο αντιφλεγμονωδες φαρμακο [κεφαλη ψαροτουφεκου
AU2002214307A1 (en) 2000-11-17 2002-05-27 Takeda Chemical Industries Ltd. T cell line and use thereof
AU2003240482B2 (en) 2002-05-30 2009-03-12 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
EP1371362A1 (en) 2002-06-12 2003-12-17 Universiteit Utrecht Holding B.V. Composition for treatment of inflammatory disorders
US20050112199A1 (en) 2003-09-24 2005-05-26 Mahesh Padval Therapeutic regimens for administering drug combinations
ES2574231T3 (es) 2003-10-15 2016-06-16 Syncore Biotechnology Co., Ltd Uso de liposomas catiónicos que comprenden paclitaxel
US20050214751A1 (en) 2004-03-02 2005-09-29 Proteologics, Inc. Inhibition of viral maturation, methods and compositions related thereto
US20070020620A1 (en) * 2005-07-14 2007-01-25 Finn M G Compositions and methods for coupling a plurality of compounds to a scaffold
US8299031B2 (en) 2006-01-25 2012-10-30 Viro Pharmaceuticals Gmbh & Co. Kg Human semen enhancer of viral infection peptides (SEVI) and their use
US20100203647A1 (en) 2008-11-21 2010-08-12 The Rockefeller University Chemical Reporters of Protein Acylation
US20130157924A1 (en) 2010-04-23 2013-06-20 The Regents Of The University Of California Reducing transmission of sexually transmitted infections
US20120028335A1 (en) * 2010-07-28 2012-02-02 Life Technologies Corporation Anti-viral azide-containing compounds
AU2013212066B2 (en) * 2012-01-26 2018-11-08 Life Technologies Corporation Methods for increasing the infectivity of viruses

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7169411B1 (en) * 1997-06-13 2007-01-30 The University of Nebraska Board of Regents Composition for delivery of biological agents and methods for the preparation thereof
WO2001020989A1 (en) * 1999-09-22 2001-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Therapeutic methods and compositions using viruses of the recombinant paramyxoviridae family
US20110263001A1 (en) * 2008-11-14 2011-10-27 Life Technologies Corporation Compositions and Methods for Engineering Cells

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