CN104603271B - 用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸 - Google Patents

用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及寡核苷酸和包含所述寡核苷酸的药物组合物。该寡核苷酸能结合到来自抗肌萎缩蛋白前体mRNA的第一外显子的区域和相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性，其中所述寡核苷酸适用于所述前体mRNA的所述第一外显子和第二外显子、并且优选两者之间外显子的全部延伸的跳读。

Description

用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸
技术领域
本发明涉及人类遗传学领域，更具体地涉及用于设计单一寡核苷酸的方法，该单一寡核苷酸优选地能够诱导前体mRNA(pre-mRNA)的两个或更多个外显子的跳读(略读，skipping)。本发明进一步提供所述寡核苷酸、包含所述寡核苷酸的药物组合物和如本文所确定的所述寡核苷酸的应用。
背景技术
寡核苷酸在医药中脱颖而出用于治疗遗传疾病如肌肉萎缩症。肌肉萎缩症(Muscular dystrophy，MD)是指特征在于进行性无力和骨骼肌变性的遗传疾病。杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝克氏肌肉萎缩症(Becker musculardystrophy，BMD)是最常见的儿童期形式的肌肉萎缩症，并且在本文中用于说明本发明。DMD是严重的、致命的神经肌肉病症，其导致在12岁以前对轮椅支架的依赖性，并且DMD患者在30岁以前常死于呼吸或心脏衰竭。
DMD由DMD基因中的突变引起；主要是移码缺失或一个或多个外显子重复(duplication)，小核苷酸插入或缺失，或由无义点突变引起，其通常导致功能性抗肌萎缩蛋白(肌营养不良蛋白，dystrophin)的缺乏。在过去十年期间，为了恢复DMD转录本的断裂的阅读框，特异性诱导的剪接的修饰已新兴为用于杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)的有希望的治疗(van Ommen G.J.等人，Yokota T.等人，van Deutekom等人，Goemans N.M.等人)。使用序列特异性反义寡核苷酸(AON)，其靶向侧接(侧翼，flank)或含有突变的特定外显子且干扰它的剪接信号，该外显子的跳读可以在DMD前体mRNA的加工过程中被诱导。尽管得到截短的转录本，但恢复了开放阅读框并且引入了蛋白质，其类似于在通常较温和贝克氏肌肉萎缩症患者中发现的那些。AON诱导的外显子跳读提供特定突变，和因此用于DMD患者和特别严重BMD患者的潜在个性化治疗方法。由于大多数突变紧紧环绕DMD基因中的外显子45至55，在其区域中的一个特定外显子的跳读可以用于具有各种突变患者亚群的治疗。外显子51的跳读影响最大的患者亚群(约13％)，包括具有外显子45至50、48至50、50或52的缺失的那些患者。对于一些突变，需要一个以上外显子的跳读恢复开放阅读框。例如，对于具有DMD基因中外显子46至外显子50缺失的DMD患者，仅跳读外显子45和51将是矫正性的。为了治疗这些患者，需要给予两种寡核苷酸、一种靶向外显子45而另一种靶向外显子51。已广泛研究在混合体(cocktail)中或在病毒递送的基因构建体中通过使用AON的组合使两个或更多个连续外显子跳读的可行性(Aartsma-Rus A.等人,2004；Béroud C.等人；Van Vliet L.等人；Yokota T.等人；Goyenvalle A.等人)。多外显子跳读将适用于组合的患者亚群，允许模拟已知与相对温和表型相关的缺失，并且将提供工具来解决DMD基因中热点缺失区域以外的稀有突变。对于开发包含多种寡核苷酸的药物的缺点是其药品监管当局可以把不同序列的寡核苷酸作为不同的药物，每个都需要证明稳定的生产、毒性和临床测试。因此，需要能够诱导至少两个外显子的跳读以促进治疗DMD患者的组合子群的单分子化合物。
具体实施方式
本发明提供用于设计单一寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸能够结合到第一外显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域具有至少50％的同一性。通过所述方法获得的寡核苷酸优选地能够诱导所述前体mRNA的所述第一外显子和所述第二外显子的跳读。优选地，也诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间。所得到的所述前体mRNA的转录本(其中所述外显子被跳读)是在框内的(in frame)。
寡核苷酸
在第一方面，本发明涉及寡核苷酸，其能够结合到第一外显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域具有至少50％的同一性。
该寡核苷酸优选地能够诱导所述前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读；更优选地诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间，并且其中所得转录本是在框内的。
外显子跳读干扰发生在真核细胞内的天然剪接过程。在高等真核生物中，细胞的DNA中对于蛋白质的遗传信息被编码在外显子中，其通过内含子序列彼此分离。这些内含子在某些情况下很长。真核生物的转录机制产生包含外显子和内含子的前体mRNA，同时常常已在进行前体mRNA的产生期间，剪接机制在称为剪接的过程期间通过去除内含子并连接存在于前体mRNA中的外显子产生用于蛋白质的实际编码mRNA。
能够结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域的本发明的寡核苷酸被解释为适合于结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域并适合于结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域的寡核苷酸。当以前体mRNA使用时或当与前体mRNA组合使用时，优选地在细胞内，本发明的此类寡核苷酸的特征在于它的结合特征(即能够结合)。在此背景下“能够”可由“能”替换。因此，本领域技术人员应当理解，能够结合到第一外显子的区域并能够结合到相同由核苷酸序列所限定前体mRNA内的第二外显子的区域的寡核苷酸在结构上限定所述寡核苷酸，即所述寡核苷酸具有序列，使得它与所述第一外显子的所述区域的序列反向互补并也与相同前体mRNA内所述第二外显子的所述区域的序列反向互补。对于本申请的寡核苷酸所需要的所述第一和/或所述第二外显子的所述区域反向互补的程度可小于100％。如本文进一步所提议的，可以允许一定量的错配或一个或两个缺口。可以使用如后文所说明的本发明方法来设计具有与所述第二外显子的所述区域至少50％同一性的第一外显子的区域的核苷酸序列(或具有与所述第一外显子的所述区域至少50％同一性的第二外显子的区域的核苷酸序列)，本发明的寡核苷酸能够与其结合。优选的前体mRNA是抗肌萎缩蛋白前体mRNA。抗肌萎缩蛋白前体mRNA的第一和第二外显子的优选组合和所述第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子的优选区域限定于表2中。本发明的寡核苷酸优选地能够诱导所述抗肌萎缩蛋白前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读；更优选地诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间，并且其中所得抗肌萎缩蛋白转录本为在框内的，优选地如表1中。
当转录本具有允许用于产生蛋白质的开放阅读框时，转录本为在框内的。可以通过如本领域技术人员已知的测序和/或RT-PCR分析评估mRNA的框内状态。如本领域技术人员已知的，可以使用与所述蛋白质交叉反应的抗体通过免疫荧光和/或蛋白印迹分析来分析由框内转录本的翻译产生的所获得的蛋白质。贯穿本发明，如果由RT-PCR和/或测序分析来确定所得框内转录本，或如果由免疫荧光和/或蛋白印迹分析来确定由所述框内转录本产生的蛋白质，在取决于转录本同一性的相关体外或体内系统中，如本文所确定的寡核苷酸可以说是功能性的。如后文所说明的，如果该转录本是抗肌萎缩蛋白转录本，相关系统可以是健康供体或DMD患者的肌细胞，或肌管，或者肌肉纤维(muscle fiber)或肌纤维(myofiber)。
在实施方式中，第二外显子的区域(存在于与第一外显子的区域相同的前体mRNA内)具有与如上所确定的第一外显子的区域至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％的同一性(第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子的优选区域确定于表2中)。可在所述第一和/或第二外显子的整个长度上，或在如本文对于抗肌萎缩蛋白外显子所示例说明的13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸的区域上评估同一性百分比。对于本领域技术人员显然的是，如本文所确定的第一和第二外显子是一个单一前体mRNA的两个不同外显子或在相同前体mRNA内的两个不同外显子。如本文所确定的第一外显子可位于如本文所确定的相同前体mRNA内的第二外显子的上游(即，其5'端)，或所述第二外显子可以是位于所述第一外显子的上游。优选地，所述第一外显子位于从所述第二外显子的上游。对于本领域技术人员显然的是，本发明的寡核苷酸可主要设计成能够结合到第一外显子的区域；鉴于所述第一和所述第二外显子的区域的同一性，所述寡核苷酸也可以次要地能够结合到所述第二外显子的所述区域。反向设计是可能的：本发明的寡核苷酸可以主要设计成能够结合到第二外显子的区域；鉴于所述第一和所述第二外显子的区域的同一性，所述寡核苷酸也可次要地能够结合到所述第一外显子的所述区域。
可以在所述第一外显子的整个区域上评估第一外显子的区域和第二外显子的区域之间的同一性百分比，其中该区域可以短于、长于或与本发明寡核苷酸能够结合的该区域的部分同样长。如本文所用的第一外显子的区域和第二外显子的区域也可确定为一个或多个同一性区域。优选地，限定与第二外显子的区域同一性的第一外显子的区域是同样长或长于本发明的寡核苷酸能够结合的该区域部分。必须理解的是，本发明的寡核苷酸能够结合到用于评估第一和/或第二外显子的序列同一性的所述区域的较小部分或部分重叠部分。因此应当理解的是，能够结合到第一和第二外显子的区域的寡核苷酸可以结合所述第一外显子和所述第二外显子的一部分所述区域。所述部分可以与所述第一和/或所述第二外显子的所述区域一样长。所述部分可以短于或长于所述第一和/或所述第二外显子的所述区域。所述部分可以包含在所述第一和/或所述第二外显子的所述区域内。所述部分可以与所述第一和/或所述第二外显子的所述区域重叠。该重叠可以是在所述第一和/或第二外显子的区域的5'和/或3'端的1、2、3、4、5或更多个核苷酸的重叠。寡核苷酸可以长于或短于所述第一和/或所述第二外显子的区域至少1、2、3、4、5、或更多个核苷酸，并且可以是在第一和/或第二外显子的所述区域的5'或3'端。
该区域，为13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、或最高达90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多核苷酸，用于计算在第一外显子和第二外显子之间的同一性百分比，可以是连续延伸的或可以被一个、两个、三个、四个或多个缺口(gap)中断，只要在整个区域上的同一性百分比为至少50％。
可以使用本领域技术人员已知的任何程序评估第一外显子的区域和第二外显子的区域之间的同一性百分比。优选地，如下评估所述同一性：使用在线工具EMBOSSMatcher，使用默认设置(Matrix：EDNAFULL，Gap_penalty：16，Extend_penalty：4)在第一和第二外显子之间最佳逐对对齐(pair-wise alignment)。
如本文所使用的，寡核苷酸优选地是指能够结合于、靶向、杂交于、和/或反向互补于相同前体mRNA内第一和第二外显子的区域或一部分区域的寡聚物。
如本文所确定的，寡核苷酸(即，其能够结合到相同前体mRNA内的第一外显子的区域和另一个外显子(即，第二外显子)区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性)也优选地为至少80％反向互补于所述第一外显子的所述区域且至少45％反向互补于所述第二外显子的所述区域。更优选地，所述寡核苷酸至少85％、90％、95％或100％反向互补于所述第一外显子的所述区域并且至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％反向互补于所述第二外显子的所述区域。优选但不一定在寡核苷酸的整个长度上评估反向互补。
本发明包括的寡核苷酸可以包含至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。本发明包括的寡核苷酸可以包含至多40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个核苷酸。本发明的寡核苷酸长度由包含在所述寡核苷酸中的核苷酸总数限定，不考虑存在于所述寡核苷酸中的任何修饰。如下文进一步讨论的，核苷酸可以包含某些化学修饰，但此类经修饰的核苷酸仍被认为是在本发明背景中的核苷酸。取决于寡核苷酸的化学，寡核苷酸的最佳长度可以是不同的。例如2'-O-硫代磷酸甲酯寡核苷酸的长度可以为15至30。如本文所示例的，如果进一步修饰该寡核苷酸，则最佳长度可缩短到14、13或甚至更低。
在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸不长于30个核苷酸，以限制用于降低合成效率、产率、纯度或可延伸性(scalability)、降低生物利用度和/或细胞摄取和运输、降低安全性的机会，并且限制物品的成本。在更优选的实施方式中，寡核苷酸为15至25个核苷酸。最优选地，本发明包括的寡核苷酸由20、21、22、23、24、或25个核苷酸组成。当至少100nM的所述寡核苷酸被用来转染体外的相关细胞培养物时，本发明的寡核苷酸长度优选使得该寡核苷酸的功能性或活性由诱导至少5％的第一和第二外显子(以及两者之间的任何一个或多个外显子)的跳读、或由促进形成至少5％的框内转录本限定。本文已说明所述转录本的存在的评估。相关细胞培养物是细胞培养物，其中包含所述第一和所述外显子的前体mRNA被转录且剪接成mRNA转录本。如果前体mRNA是抗肌萎缩蛋白前体mRNA，相关细胞培养物包括(分化的)肌细胞。在这种情况下，当使用至少250nM的所述寡核苷酸时，形成至少20％的框内转录本。
第一外显子的区域可至少为13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、或最高达90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸。第一外显子的区域也可限定为至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述外显子的长度。第一外显子的区域可称为同一性区域。
第二外显子的区域可至少为13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或最高达90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸。第二外显子的区域可限定为至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述外显子的长度。第二外显子的区域可称为同一性区域。
在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸能够结合到来自前体mRNA的外显子U+1(第一外显子)区域，其中相同前体mRNA内的另一个外显子D-1(第二外显子)区域具有与所述(U+1)外显子的所述区域至少50％的同一性，其中所述寡核苷酸用于所述前体mRNA的所述U+1和所述D-1外显子(以及优选地位于所述第一和所述第二外显子之间的另外的一个或多个外显子)的跳读，以获得框内转录本，其中外显子U和D被剪接在一起(例如，对于DMD，优选地如在表1中)。本发明的寡核苷酸也在本文中确定为化合物。本发明的寡核苷酸优选地为反义寡核苷酸(即AON)。寡核苷酸优选地用于所述前体mRNA的所述两个外显子(即，所述第一(U+1)和所述第二(D-1)外显子)的跳读，并且其中所得转录本(其中U直接剪接到D)为在框内的(例如，对于DMD，优选地如在表1中)。可以说，所述寡核苷酸诱导在一个单一前体mRNA中的所述两个外显子的跳读。可选地，诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间，并且所得到的转录本为在框内的。
寡核苷酸更优选地用于所述前体mRNA内所述两个外显子(即，所述第一和所述第二外显子)、以及在所述第一和所述第二外显子之间的外显子的全部延伸(全部延伸的外显子，the entire stretch of exons)的跳读，以便除去所述延伸内的任何突变，并获得转录本，其是较短的，但其具有恢复的开放阅读框从而允许蛋白质产生。
不希望受任何理论的束缚，据信由于所述两个外显子之间的至少50％的序列同一性或相似性，本发明的单一寡核苷酸能结合到且诱导两个外显子的跳读、并且优选地两者之间的外显子的全部延伸的跳读以获得较短的转录本，其为在框内的。因此在前体mRNA内，所述两个外显子可以是邻近的，或可被至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个外显子分离。包含存在于所述第一和所述第二外显子之间的一个或多个外显子的区域也可称为(多个)外显子的延伸或多外显子延伸。优选地，该多外显子延伸的第一外显子是前文确定的第一外显子，并且该多外显子延伸的最后外显子是前文确定的第二外显子。本发明的寡核苷酸也可确定为这样的寡核苷酸，其能诱导所述两个外显子的跳读或延伸的(多个)外显子的跳读或所述多外显子延伸(multiexonstretch)的跳读。在优选的实施方式中，通过使用本发明的一个单一寡核苷酸来诱导第一外显子和第二外显子二者的跳读。在优选的实施方式中，使用一个单一寡核苷酸进行多于一个、多于2、多于3、多于4、多于5、多于6、多于7、多于8、多于9、多于10、多于11、多于12、多于13、多于14、多于15、多于16、多于17个外显子、多于18、多于19、多于20、多于21、多于22、多于23、多于24、多于25、多于26、多于27、多于28、多于29、多于30、多于31、多于32、多于33、多于34、多于35、多于36、多于37、多于38、多于39、多于40、多于41、多于42、多于43、多于44、多于45、多于46、多于47、多于48、多于49、多于50个外显子的跳读，并且因此进行多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个外显子的这种跳读，不使用两个或更多个不同寡核苷酸的混合物(mixture)或混合体(cocktail)，或者不使用可以用一个或多个接头连接的两个或更多个不同寡核苷酸，或不使用转录两个或更多个不同寡核苷酸的基因构建体。在实施方式中，因此提供：本发明包括一个单一寡核苷酸，并且不包括两个或更多个不同寡核苷酸，所述单一寡核苷酸能够结合到所述第一和所述第二外显子，并且能够诱导如本文所说明的单一前体mRNA内的至少所述第一和所述第二外显子的跳读。在这种情况下，本领域技术人员理解，单词“单一”不是指为了诱导外显子跳读所需要的分子的数量。单一是指寡核苷酸的序列：本发明包括一个单一寡核苷酸序列和它的应用，并且不包括两个或更多个不同寡核苷酸序列，所述单一寡核苷酸序列能够结合到所述第一和所述第二外显子并且能够诱导如本文所说明的单一前体mRNA内的至少所述第一和所述第二外显子的跳读。这是允许仅用一个单一寡核苷酸的使一个以上外显子跳读以治疗由基因中的(罕见)突变所引起的疾病的第一个发明，条件是所述基因中的不同外显子包含具有至少50％序列同一性的区域。
如后文所限定的，本发明的寡核苷酸优选用作基于RNA调控活性的治疗的一部分。取决于其中第一和第二外显子存在的转录本的同一性，可以设计用于预防、治疗或延缓给定疾病的寡核苷酸。
已经示出，用能够结合到两个外显子的单一寡核苷酸靶向单一前体mRNA内的该两个外显子，使得mRNA缺少被靶向的外显子，以及另外地，两者之间的外显子的全部延伸(entire stretch of exons)。如本文所限定的此类单一寡核苷酸的优点是，可以治疗由这种多外显子延伸内的不同突变引起的缺陷。如果人们选择使用两个或更多个不同寡核苷酸诱导两个或更多个外显子的跳读，应该考虑到，例如，每个寡核苷酸可具有其自己的PK曲线，以及由此就必须找到这样的条件，其中它们的每个将类似地存在于同一细胞中。因此仅使用如上所确定的能结合到两个不同外显子的一个单一寡核苷酸的另一个优点是，主要地促进了生产、毒性、剂量探索和临床测试，由于这些可减少到直接生产和一个单一化合物的测试。
限定本发明寡核苷酸的以下另外的特征。
在本发明的背景中，在优选的实施方式中，寡核苷酸能够结合于、靶向、杂交于、反向互补于和/或能够抑制在至少所述第一外显子和/或所述第二外显子内至少一个剪接调控序列的功能，和/或影响至少所述第一外显子和/或所述第二外显子的结构：
其中所述寡核苷酸包含这样的序列，其能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于对于所述第一和/或第二外显子中丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白质的结合位点
和/或
其中所述寡核苷酸能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于在所述第一和/或第二外显子中的外显子剪接增强子(ESE)、外显子识别序列(ERS)和/或外显子剪接沉默子(ESS)。
更优选地，能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于第一前体mRNA外显子区域和/或第二前体mRNA外显子区域的所述寡核苷酸能够特异性抑制至少一个剪接调控序列和/或影响所述前体mRNA中的至少所述第一和/或第二外显子的结构。干扰此类剪接调控序列和/或结构具有此类元件(element)是位于外显子内的优点。通过提供如本文所限定的此类寡核苷酸，有可能有效地从剪接装置(splicing apparatus)掩蔽至少所述第一和第二外显子，以及优选地两者之间的外显子的全部延伸。剪接装置无法识别这些外显子从而导致跳读或从最终mRNA排除这些外显子。该实施方式仅专注于编码序列。据认为，这使得该方法更特异且因此是可靠的。所述寡核苷酸与前体mRNA所述第一和/或第二外显子所述区域的反向互补性优选地为至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
因此，本发明涉及反义寡核苷酸用作用于预防、延缓、改善和/或治疗受试者的疾病的药物，其中所述寡核苷酸能够结合到第一外显子的区域和第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性，
其中所述第一和所述第二外显子在所述受试者的相同前体mRNA内，其中所述结合引起所述第一外显子和所述第二外显子的跳读，并且优选地引起从所述第一外显子开始的多外显子延伸的跳读，并且包含存在于所述第一和所述第二外显子之间的一个或多个外显子，并且至多引起在所述第一和所述第二外显子之间的外显子的全部延伸的跳读，和
其中获得框内转录本，其允许产生功能性或半功能性的蛋白质。
优选地，如本文所说明的，所述寡核苷酸能够诱导在所述第一外显子和所述第二外显子之间的外显子的全部延伸的跳读。
更优选地，如本文所说明的，所述寡核苷酸的所述结合能够干扰在所述第一和第二外显子的所述区域中的至少一个剪接调控序列，和/或干扰所述第一和/或所述第二外显子的二级结构，和/或干扰包含所述前体mRNA中至少所述第一和/或所述第二外显子的二级结构。后文给出优选的剪接调控序列。
因此，一个优选的实施方式涉及本发明的寡核苷酸，其能够结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域和/或结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中相同前体mRNA内的所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性(例如，对于DMD，优选地如在表2中)，其中所述寡核苷酸能够诱导所述前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读；产生在框内的转录本(例如，对于DMD，优选地如在表1或表6中)。所述寡核苷酸为个体提供具有功能性或半功能性蛋白质，并且所述寡核苷酸进一步包括：
-能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于第一和/或第二前体mRNA外显子区域的序列，其杂交于第一和/或第二前体mRNA外显子的另一个部分(闭合结构)，和/或
-能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于所述第一和/或第二前体mRNA外显子区域的序列，其不杂交在所述前体mRNA中(开放结构)。
对于该实施方式，参考WO 2004/083446专利申请。RNA分子显示出强的二级结构，这主要是由于相同RNA内的反向互补或部分反向互补延伸的碱基配对。长期以来一直认为RNA中的结构在RNA的功能上起作用。没有被理论所束缚，据信外显子的RNA的二级结构在构造剪接过程中起作用。通过它的结构，外显子被识别为需要被包括在mRNA中的一部分。在实施方式中，寡核苷酸能够干扰至少所述第一外显子并且也可能所述第二外显子且也可能两者之间延伸的外显子的结构，并且因此通过由剪接装置掩蔽所述外显子，能够干扰所述第一和也可能所述第二外显子且也可能两者之间延伸的外显子的剪接，并且从而引起所述外显子的跳读。没有被理论所束缚，据认为，具有开放结构的重叠改善寡核苷酸的入侵效率(即增加与其寡核苷酸可以进入结构的效率)，然而具有闭合结构的重叠随后增加干扰外显子RNA二级结构的效率。据发现，部分反向互补于闭合和开放结构的长度未受到极大限制。用在任一种结构中具有可变长度的反向互补性的寡核苷酸，我们已观察到高效率。在本文中术语反向互补性(reverse-complementarity)用于指核酸的延伸，其可以在生理条件下杂交于核酸的另一个延伸。后文限定杂交条件。因此不绝对要求，在反向互补区域中的所有碱基都能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计寡核苷酸时，可以希望并入例如一个或多个残基，其不与反向互补链上的碱基进行碱基配对。如果在细胞内的环境下，核苷酸的延伸仍能够杂交于反向互补部分，则可以允许一定程度上的错配。在本发明的背景中，优选在本发明寡核苷酸中存在错配，因为在实施方式中，所述寡核苷酸至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％反向互补于第一外显子的区域和/或第二外显子的区域。如前文所确定的，由于所述寡核苷酸能结合到所述第一外显子的区域和所述第二外显子的区域，在所述寡核苷酸中的错配的存在是本发明的优选特征。
在本文中限定允许在本发明的反义寡核苷酸中存在错配的其他优点，并且类似于由肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对碱基的核苷酸的存在提供的那些：避免CpG的存在、避免或减少潜在的多聚或聚集、避免四链体(quadruplex)结构、允许设计具有改善的RNA结合动力学和/或热力学性能的寡核苷酸。
优选地，寡核苷酸与所述第一和/或第二外显子之间同一性区域的反向互补为45％至65％、50％至75％，但更优选地65％至100％或70％至90％或75％至85％，或80％至95％。一般而言，这允许在20个核苷酸的寡核苷酸中有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个错配。因此，我们可以在40个核苷酸的寡核苷酸中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、或22个错配。优选地，在40个核苷酸的寡核苷酸中存在小于14个错配。错配的数量是这样的使得本发明的寡核苷酸仍能结合于、杂交于、靶向所述第一外显子的区域和所述第二外显子的区域，从而诱导至少所述第一和所述第二外显子的跳读且诱导如本文所说明的框内转录本的产生。优选地，如前文所说明的，使用至少100nM的所述寡核苷酸来体外转染相关细胞培养物，以至少5％的效率获得框内转录本的产生。
应当指出，本发明包括与第一外显子的区域不具有任何错配并且其可以与如本文所限定第二外显子的相应区域具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21或22个错配的寡核苷酸。然而，本发明也包括与第二外显子的区域不具有任何错配并且其可以与如本文所限定第一外显子的相应区域具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、或22个错配的寡核苷酸。最后，本发明包括与第一外显子的区域可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21或22个错配并且其可以与如本文所限定第二外显子的相应区域具有22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个错配的寡核苷酸。本文再次，应当理解，在本发明的寡核苷酸中错配的数量是这样的使得所述寡核苷酸仍能结合于、杂交于、靶向如本文所说明的所述第一外显子的区域和所述第二外显子的区域。
本发明的寡核苷酸优选不跨越在如本文所限定第一外显子的区域和第二外显子的区域的对比中的缺口。优选使用如前文所说明的在线工具EMBOSS Matcher进行对比。然而，如前文所提到的，在具体情况下本发明的寡核苷酸可能需要跨越缺口。所述缺口优选地仅为一个缺口。所述缺口优选横跨(spanning)少于3个核苷酸，最优选地仅一个核苷酸。缺口的数量和长度是这样的使得本发明的寡核苷酸仍能结合于、杂交于、靶向所述第一外显子的区域和所述第二外显子的区域，从而诱导至少所述第一和所述第二外显子的跳读且诱导如本文所说明的框内转录本的产生。
最好在其中外显子存在的前体mRNA的背景中分析结构(即，开放和闭合结构)。可以在实际RNA中进行分析此类结构。然而，目前可以使用结构建模程序相当好地预测RNA分子的二级结构(以最低能源成本)。合适程序的非限制性实例是Mfold网络服务器(Zuker,M.)。
本领域技术人员将能够以适当的再现性预测可能的外显子，给定核苷酸序列的结构。当为此类建模程序提供所述外显子和侧接内含子序列时，获得最好的预测。通常不需要模拟整个前体mRNA的结构。
本发明的寡核苷酸的退火可以影响靶RNA(即包含至少第一和/或第二外显子的区域)的局部折叠或3D结构或构象。不同的构象可以导致由剪接机制识别的结构的破坏。然而，当潜在(隐蔽的(cryptic))剪接受体和/或供体序列存在于第一和/或第二靶向外显子内时，偶尔产生限定不同的(新)外显子的新结构，即具有不同的5'末端、不同的3'末端或两者兼有。当从mRNA排除靶向外显子时，这种类型的活动在本发明的范围之内。在mRNA中包含部分所述第一和/或第二靶向外显子的新外显子的存在不改变因此靶向外显子被排除的事实。包含的新外显子可以视为仅是偶尔发生的副作用。当外显子跳读被用于恢复由于突变破坏的转录本的(部分)开放阅读框时，有两种可能性。之一是新外显子在阅读框的恢复中是有功能的，而在另一种情况下阅读框不恢复。当通过多个外显子跳读的方式选择用于恢复开放阅读框的寡核苷酸时，当然清楚，在这些条件下，仅选择确实引起恢复具有或不具有新外显子的给定转录本开放阅读框的外显子跳读的那些寡核苷酸。
此外，在另一个优选的实施方式中，提供本发明的寡核苷酸，其能够结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域和相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性(在表2或表6中确定用于抗肌萎缩蛋白外显子的优选区域)，其中所述寡核苷酸能够诱导所述前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读；产生在框内的转录本(对于DMD，优选地如在表1或表6中)。所述寡核苷酸提供具有功能性或半功能性蛋白质的所述个体，并且所述寡核苷酸进一步包括：能够结合于、靶向、杂交于、反向互补于和/或能抑制在前体mRNA外显子的RNA中用于丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白质的一个或多个结合位点的功能的序列。
在WO 2006/112705专利申请中，我们已公开在诱导外显子跳读中外显子内部反义寡核苷酸(AON)有效性之间的相关性的存在，和在所述AON的靶前体mRNA位点中假定SR结合位点的存在。因此，在一个实施方式中，产生如本文所限定的所述寡核苷酸，其包括确定用于所述第一和/或所述外显子RNA中的SR蛋白质的一个或多个(假定的)结合位点，并且产生能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于所述RNA和至少部分地重叠所述(假定的)结合位点的相应寡核苷酸。术语“至少部分地重叠”在本文中限定为包括SR结合位点的仅单一核苷酸以及一个或多个所述结合位点的多个核苷酸的重叠，以及一个或多个所述结合位点的完全重叠。该实施方式优选地进一步包括：从第一和/或第二外显子的二级结构确定：杂交于所述第一和/或第二外显子的另一个部分(闭合结构)的区域和不在所述结构(开放结构)中杂交的区域，并且随后产生寡核苷酸，其至少部分地重叠一个或多个所述(假定的)结合位点并且其重叠至少部分所述闭合结构且重叠至少部分所述开放结构并具有结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于第一和第二外显子两者。通过这种方式，我们增加获得寡核苷酸的机会，其能够干扰将所述第一和第二外显子(并且如果适用的话，两者之间的外显子的全部延伸)从前体mRNA包含在mRNA中。不希望受任何理论的束缚，目前认为，使用针对SR蛋白质结合位点的寡核苷酸导致(至少部分地)损害SR蛋白质与所述结合位点的结合，其导致破坏或损害的剪接。
优选地，本发明的寡核苷酸能够结合的相同前体mRNA内的第一外显子的区域和/或第二外显子的区域包含开放/闭合结构和/或SR蛋白质结合位点，更优选地，所述开放/闭合结构和所述SR蛋白质结合位点部分地重叠，并且甚至更优选的所述开放/闭合结构完全重叠SR蛋白质结合位点，或SR蛋白质结合位点完全重叠开放/闭合结构。这允许对于外显子包含的进一步提高的破坏。
除了共有(consensus)剪接位点序列，许多(如果不是全部)外显子包含剪接调控序列如外显子剪接增强子(ESE)序列以通过剪接体促进真正剪接位点的识别(Cartegni L等人.2002；和Cartegni L等人,2003)。剪接因子的亚组，称为SR蛋白质，可以结合到这些ESE且招募其他剪接因子如U1和U2AF到(弱限定的)剪接位点。已详细分析四个最丰富的SR蛋白质(SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55)的结合位点(Cartegni L等人.2002；和Cartegni L等人,2003)。在由所述寡核苷酸约束的(bound by)、杂交和/或靶向的一部分第一外显子中，寡核苷酸的有效性和SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55结合位点的存在/不存在之间存在相关性。在优选的实施方式中，本发明因此提供寡核苷酸，其结合于、杂交于、靶向和/或反向互补于用于SR蛋白质的结合位点。优选地，所述SR蛋白质是SF2/ASF或SC35，SRp40或SRp55。在一个实施方式中，寡核苷酸结合于、杂交于、靶向和/或反向互补于第一外显子中用于SF2/ASF、SC35、SRp40或SRp55蛋白质的结合位点和第二外显子中用于不同的SF2/ASF、SC35、SRp40或SRp55蛋白质的结合位点。在更优选的实施方式中，寡核苷酸结合于、杂交于、靶向和/或反向互补于第一外显子中用于SF2/ASF、SC35、SRp40或SRp55蛋白质的结合位点和第二外显子中用于类似的SF2/ASF、SC35、SRp40或SRp55蛋白质的相应结合位点。
在一个实施方式中，通过使用能够结合、靶向存在于第一和/或第二外显子中的调控RNA序列(需要其用于使转录本中的一个或多个所述外显子正确剪接)的寡核苷酸，为患者提供功能性或半功能性蛋白质。需要几个顺式作用RNA序列用于转录本中外显子的正确剪接。特别地，补充元件如外显子剪接增强子(ESE)被确定为调控组成型(constitutive)和可替代的外显子的特异的和有效的剪接。使用包含结合到或能够结合到所述第一和/或第二外显子中的补充元件之一的寡核苷酸的化合物，它们的调控功能受到干扰使得外显子被跳读。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸能够结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域和相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性，其中所述寡核苷酸能够诱导所述前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读；其中所述第一外显子的所述区域和/或所述第二外显子的所述区域包括外显子剪接增强子(ESE)、外显子识别序列(ERS)和/或剪接增强子序列(SES)，和/或其中所述寡核苷酸能够结合于、靶向、能够抑制和/或反向互补于所述外显子剪接增强子(ESE)、外显子识别序列(ERS)和/或剪接增强子序列(SES)。
以下公开本发明的寡核苷酸的优选化学作用。
寡核苷酸通常被称为具有类似于天然核酸的基本杂交特征的寡聚物。已在本发明说明书的末尾处专用于限定的部分中限定杂交。在本申请中，可互换地使用术语寡核苷酸和寡聚物。不同类型的核苷可以被用于产生本发明的所述寡核苷酸。相比于天然存在的基于核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可以包括至少一个修饰的核苷间键和/或至少一种糖修饰和/或至少一种碱基修饰。
“修饰的核苷间键”是指存在RNA和DNA中天然存在的磷酸二酯的修饰版本。与本发明相容的核苷间键修饰的实例是硫代磷酸酯(PS)、手性纯硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(PS2)、膦酰基乙酸酯(phosphonoacetate，PACE)、膦酰基乙酰胺(phosphonoacetamide，PACA)、硫代膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酰胺、硫代磷酸酯前药、H-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼化磷酸酯(boranophosphate)、硼化硫代磷酸酯(boranophosphorothioate)、硼化磷酸甲酯、硼化硫代磷酸甲酯、硼化膦酸甲酯、硼化硫代膦酸甲酯和它们的衍生物。另一个修饰包括亚磷酰胺(phosphoramidite)、氨基磷酸酯(磷酰胺，phosphoroamidate)、N3'→P5'氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(磷二酰胺，phosphorodiamidate)、硫代氨基磷酸酯、硫代二氨基磷酸酯、氨基磺酸酯、二亚甲基砜、磺酸酯、亚甲基亚胺(methyleneimino，MMI)、草酰和硫代乙酰胺核酸(TANA)；和它们的衍生物。取决于它的长度，本发明的寡核苷酸可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个骨架修饰。在所述寡核苷酸中引入一个以上不同的骨架修饰也包括在本发明内。
还包括在本发明内的是包含核苷间键的寡核苷酸，当相比于天然存在的核苷间键时，其关于彼此连接的核苷原子可以是不同的。在这方面，本发明的寡核苷酸可以包括至少一个解释为3'-3'、5'-5'、2'-3'、2'-5'、2'-2'连接单体的核苷间键。位置编号可不同于其他化学体，但该想法保持在本发明的范围内。
在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯修饰。在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸是完全硫代磷酸酯修饰的。
“糖修饰”是指存在RNA和DNA中作为天然存在的核糖基部分的修饰版本(即呋喃糖基部分)，如二环糖、四氢吡喃、吗啉代、2'-修饰的糖、3'-修饰的糖、4'-修饰的糖、5'-修饰的糖和4'-取代的糖。合适的糖修饰的实例包括但不限于，2'-O-修饰的RNA核苷酸残基、如2'-O-烷基或2'-O-(取代的)烷基，例如2'-O-甲基、2'-O-(2-氰基乙基)、2'-O-(2-甲氧基)乙基(2'-MOE)、2'-O-(2-硫甲基)乙基、2'-O-丁酰基、2'-O-炔丙基、2'-O-烯丙基、2'-O-(2-氨基)丙基、2'-O-(2-(二甲基氨基)丙基)、2'-O-(3-氨基)丙基、2'-O-(3-(二甲基氨基)丙基)、2'-O-(2-氨基)乙基、2'-O-(3-胍基)丙基(如在专利申请WO 2013/061295中所描述的，金山大学(University of the Witwatersrand)，通过引用将其全文结合于此)，2'-O-(2-(二甲基氨基)乙基)；2'-O-(卤代烷氧基)甲基(Arai K.等人)，例如2'-O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)，2'-O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)；2'-O-烷氧基羰基，例如2'-O-[2-(甲氧羰基)乙基](MOCE)，2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基](MCE)，2'-O-[2-(N,N-二甲基氨基甲酰基)乙基](DMCE)；2'-O-[甲基氨基羰基]甲基；2'-叠氮基；2'-氨基和2'-取代的氨基；2'-卤基，例如2'-F，FANA(2'-F阿拉伯糖基核酸)；碳环糖和氮杂糖修饰；3'-O-烷基，例如3'-O-甲基，3'-O-丁酰基，3'-O-炔丙基；2',3'-二脱氧基；和它们的衍生物。
另一种糖修饰包括“桥接”或“双环”核酸(BNA)修饰的糖部分，如在以下物质中发现的：例如锁核酸(LNA)、xylo-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、cEt(2'-O,4'-C受限乙基)LNA、cMOEt(2'-O,4'-C受限甲氧基乙基)LNA、乙烯桥接核酸(ENA)、BNANC[N-Me](如在Chem.Commun.2007,3765-3767Kazuyuki Miyashita等人中所描述的，通过引用将其全文结合于此)、CRN(如在专利申请WO 2013/036868(Marina Biotech，通过引用将其全文结合于此)中所描述的)；解锁核酸(UNA)或其他无环核苷(如在美国专利申请US 2013/0130378(Alnylam Pharmaceuticals)中所描述的，通过引用将其全文结合于此)；5'-甲基取代的BNA(如在美国专利申请13/530218中所描述的，其通过引用将其全文结合于此)；环己烯基核酸(CeNA)、阿卓糖醇(altriol)核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化HNA(F-HNA)、吡喃-RNA(p-RNA)、3'-脱氧吡喃-DNA(p-DNA)；或其他修饰的糖部分，如吗啉代(PMO)、阳离子吗啉代(PMOPlus)、PMO-X；三环DNA；三环-PS-DNA；和它们的衍生物。BNA衍生物是例如在WO 2011/097641中描述的，通过引用将其全文结合于此。PMO-X的实例是在WO2011150408中描述的，通过引用将其全文结合于此。取决于它的长度，本发明的寡核苷酸可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个糖修饰。在所述寡核苷酸中引入一个以上不同的糖修饰也包括在本发明中。
在一个实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含选自以下的至少一种糖修饰：2'-O-甲基、2'-O-(2-甲氧基)乙基、2'-F、吗啉代、桥接核苷酸或BNA，或者寡核苷酸包含桥接核苷酸和2'-脱氧核糖核苷酸二者(BNA/DNA混合聚体(mixmers))。已示出包含2'-氟代(2'-F)核苷酸的寡核苷酸能招募白细胞介素增强子结合因子2和3(ILF2/3)并且从而能在被靶向的前体mRNA中诱导外显子跳读(Rigo F等人，WO2011/097614)。
在另一个实施方式中，如本文所限定的寡核苷酸包含LNA或其衍生物或由LNA或其衍生物组成。更优选地，用选自以下的糖修饰在其全长上进行根据本发明的寡核苷酸：2'-O-甲基、2'-O-(2-甲氧基)乙基、吗啉代、桥接核酸(BNA)或BNA/DNA混合聚体。在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸是被完全2'-O-甲基修饰的。
在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含至少一种糖修饰和至少一个修饰的核苷间键。此类修饰包括基于肽的核酸(肽核酸，PNA)、硼簇修饰的PNA、基于吡咯烷的氧基肽核酸(POPNA)、基于乙二醇或丙三醇的核酸(GNA)、基于苏糖的核酸(TNA)、基于无环苏氨醇的核酸(aTNA)、基于吗啉代的寡核苷酸(PMO、PPMO、PMO-X)、基于阳离子吗啉代的寡聚物(PMOPlus、PMO-X)、具有整合的碱基和骨架的寡核苷酸(ONIB)、吡咯烷酰胺寡核苷酸(POM)；和它们的衍生物。在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含肽核酸骨架和/或吗啉代二氨基磷酸酯骨架或它们的衍生物。在更优选的实施方式中，根据本发明的寡核苷酸是2'-O-甲基硫代磷酸酯(2’-O-methyl phosphorothioate)修饰的，即包含至少一个2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰，优选地，根据本发明的寡核苷酸是完全被2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的。优选地，2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸或完全2'-O-甲基硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸是RNA寡核苷酸。
如本文所确定的，术语“碱基修饰”或“修饰的碱基”是指RNA和/或DNA中天然存在的碱基(即嘧啶或嘌呤碱基)或从头合成的碱基的修饰。此类从头合成碱基通过相较于现有的碱基可描述为“修饰的”。
除了上述修饰，本发明的寡核苷酸可以包含进一步的修饰如以下所描述的不同类型的核酸核苷酸残基或核苷酸。不同类型的核酸核苷酸残基可以用于产生本发明的寡核苷酸。相比于基于RNA或DNA的寡核苷酸，所述本发明的寡核苷酸可具有至少一个骨架和/或糖修饰和/或至少一种碱基修饰。
寡核苷酸可以包含天然碱基嘌呤(腺嘌呤、鸟嘌呤)或嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)和/或如下所限定的修饰的碱基。在本发明的背景中，可以由胸腺嘧啶替代尿嘧啶。
碱基修饰包括天然嘌呤和嘧啶碱基(例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的修饰版本，如次黄嘌呤、乳清酸、agmatidine、赖西丁、假尿嘧啶、假胸腺嘧啶、N1-甲基假尿嘧啶、2-硫代嘧啶(例如2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶)、2,6-二氨基嘌呤、G-钳及其衍生物、5-取代的嘧啶(例如5-卤代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶、超级T)、5-辛基嘧啶、5-噻吩嘧啶、5-辛炔-1-基嘧啶、5-乙炔基嘧啶、5-(吡啶基酰胺)、5-异丁基、5-苯基，如在专利申请US 2013/0131141(RXi)中所描述的，通过引用将其全文结合于此；7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、超级G、超级A和N4-乙基胞嘧啶或它们的衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)和N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pr-AP)或它们的衍生物；以及简并碱基或通用碱基如2,6-二氟甲苯，或者不存在的碱基如脱碱基位点(例如1-脱氧核糖、1,2-双脱氧核糖、1-脱氧-2-O-甲基核糖；或吡咯烷衍生物，其中环上氧被氮取代(氮杂核糖))。超级A、超级G和超级T衍生物的实例可以见于美国专利US 6683173(Epoch Biosciences)，通过引用将其全文结合于此。当并入siRNA中时，cPent-G、cPent-AP和Pr-AP示出以减少免疫刺激作用(Peacock H.等人)，并且对于假尿嘧啶和N1-甲基假尿嘧啶示出类似的特征(美国专利申请US 2013/0123481，modeRNA Therapeutics，通过引用将其全文结合于此)。
贯穿整个文档，‘胸腺嘧啶’和‘5-甲基尿嘧啶’可互换。以此类推，‘2,6-二氨基嘌呤’与‘2-氨基腺嘌呤’相同，并且这些术语可贯穿整个文档互换。
在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含至少一个5-甲基胞嘧啶和/或至少一个5-甲基尿嘧啶和/或至少一个2,6-二氨基嘌呤碱基，其应当理解的是，所述寡核苷酸的至少一个胞嘧啶核酸碱基已通过用甲基基团取代嘧啶环的5-位置上的质子而修饰(即5-甲基胞嘧啶)，和/或所述寡核苷酸的至少一个尿嘧啶核酸碱基已通过用甲基基团取代嘧啶环的5-位置上的质子而修饰(即5-甲基尿嘧啶)，和/或所述寡核苷酸的至少一个腺嘌呤核酸碱基已通过用氨基基团取代2-位置上的质子而修饰(即2,6-二氨基嘌呤)。在本发明的背景中，表述“在嘧啶环的5-位置上用甲基基团取代质子”可由表述“用5-甲基嘧啶取代嘧啶”替代，其中嘧啶仅涉及尿嘧啶、或仅胞嘧啶或两者皆有。同样地，在本发明的背景中，表述“在腺嘌呤的位置2上用氨基基团取代质子”可由表述“用2,6-二氨基嘌呤取代腺嘌呤”替代。如果所述寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤，则至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤分别可被这种方式修饰。在优选的实施方式中，所有的胞嘧啶、所有的尿嘧啶和/或所有的腺嘌呤已被这种方式修饰或分别由5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2,6-二氨基嘌呤替代。
发现在本发明的寡核苷酸中存在5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2,6-二氨基嘌呤对所述寡核苷酸的至少一个参数或至少一个参数的改善具有积极影响。在这种情况下，参数可以包括：如下所说明的所述寡核苷酸的结合亲和力和/或动力学、沉默活性、生物稳定性、(组织内)分布、细胞摄取和/或运输和/或免疫原性。
由于已知如上所提及的几个修饰增加Tm值并且因此增强某种核苷酸与其靶mRNA上的其配对物的结合，在本发明的背景中，可探索这些修饰以促进本发明的寡核苷酸与第一和第二外显子的区域二者的结合。由于本发明寡核苷酸的序列不能100％反向互补于第一外显子和/或第二外显子的给定区域，可以优选地在反向互补于所述外显子的所述第一和/或所述第二区域的核苷酸位置处应用增加Tm的修饰如桥接的核苷酸或BNA(如LNA)或选自5-甲基嘧啶和/或2,6-二氨基嘌呤的碱基修饰。
结合亲和力和/或结合或杂交动力学取决于AON的热力学性能。这些至少部分地由以下项确定，所述寡核苷酸的熔融温度(Tm；用例如寡核苷酸性能计算器计算(http://www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html或http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)，对于单链RNA使用基础Tm和最近邻模型)，和/或寡核苷酸-靶外显子复合物的自由能(使用RNA structure版本4.5或RNA mfold版本3.5)。如果增加Tm，则外显子跳读活性通常增加，但当Tm太高时，预期AON成为较少序列特异性的。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，难以给出对于这些参数中的每个的优选范围。
优选地如下限定本发明寡核苷酸的活性：
-缓解与存在于第一和/或第二外显子中的突变和/或存在于起始于所述第一并结束于所述第二外显子的延伸中的突变有关的疾病的一种或多种症状，优选缓解一种或多种DMD或BMD的症状；和/或
-缓解一个或多个来自患者的细胞、优选地来自患者的肌细胞的特征；和/或
-未所述个体提供功能性或半功能性蛋白质、优选地功能性或半功能性的抗肌萎缩蛋白质；和/或
-至少部分地减少所述个体中异常蛋白质的产生，优选地至少部分地减少所述个体中异常抗肌萎缩蛋白质的产生。已在后文中限定这些特征中的每个和用于评估它们的试验。
通过与无任何5-甲基胞嘧啶、无任何5-甲基尿嘧啶和无任何2,6-二氨基嘌呤碱基的寡核苷酸的相应活性相比，预期包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2,6-二氨基嘌呤碱基的本发明的优选寡核苷酸示出增加的活性。在活性方面的这种差异可至少为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。优选地至少部分地由改编自Yu等人,2002的经验证的杂交连接试验确定生物分布和生物稳定性。在实施方式中，用特异性捕获寡核苷酸探针孵育血浆或均质化的组织样本。分离之后，将DIG标记的寡核苷酸连接到复合物，并且随后使用抗DIG抗体连接的过氧化物酶检测。使用WINNONLIN软件包(模型200，版本5.2，加拿大Mountainview的Pharsight)进行非间隔药代动力学分析。随着时间的推移监测AON(ug)每mL血浆或mg组织的水平以评估曲线下面积(AUC)、峰浓度(Cmax)、时间对峰浓度(Tmax)、终末半衰期和吸收滞后时间(tlag)。已在实验部分中公开此类优选试验。
寡核苷酸可以通过激活Toll样受体(TLR)(包括TLR9和TLR7)刺激先天免疫应答(Krieg A.M.,等人,1995)。通常由于存在于寡脱氧核糖核苷酸(ODN)中的非甲基化CG序列的存在而发生TLR9的激活，通过模拟细菌DNA其凭借TLR9介导的细胞因子释放激活先天免疫系统。然而，2'-O-甲基修饰可显著减少此类可能的影响。已描述TLR7识别RNA中的尿嘧啶重复(Diebold S.S.,等人,2006)。
TLR9和TLR7的激活引起一组协调的免疫应答，其包括先天免疫(巨噬细胞、树突状细胞(DC)和NK细胞)(Krieg A.M.,等人,1995；Krieg A.M.,等人2000)。几种趋化因子和细胞因子如IP-10、TNFα、IL-6、MCP-1和IFNα(Wagner H.,等人,1999；Popovic P.J.,等人,2006)已牵涉在该过程中。炎性细胞因子吸引来自血液的另外的防御细胞，如T细胞和B细胞。可以通过体外测试研究这些细胞因子的水平。简而言之，用增加浓度的寡核苷酸来培养人全血，其后，由标准商购的ELISA试剂盒确定细胞因子的水平。在用包含至少一个5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2,6-二氨基嘌呤的寡核苷酸处理的细胞中，其相比于用不具有5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶或2,6-二氨基嘌呤的相应寡核苷酸处理的细胞，通过相比于试验中相应细胞因子的浓度，免疫原性的降低优选对应于上述至少一个细胞因子浓度的可检测的降低。
因此，通过相比于无5-甲基胞嘧啶、无5-甲基尿嘧啶且无2,6-二氨基嘌呤的相应寡核苷酸，本发明的优选寡核苷酸具有改善的参数，如可接受的或降低的免疫原性和/或更好的生物分布和/或可接受或改善的RNA结合动力学和/或热力学性能。可以使用本领域技术人员已知的试验评估这些参数中的每个。
本发明的优选寡核苷酸包含RNA分子或修饰的RNA分子或由RNA分子或修饰的RNA分子组成。在优选的实施方式中，寡核苷酸是单链的。然而本领域技术人员应当理解可能的是，单链寡核苷酸可以形成内部双链结构。然而，在本发明的背景中，该寡核苷酸仍命名为单链寡核苷酸。相比于双链siRNA寡核苷酸，单链寡核苷酸具有几个优点：(i)预期它的合成易于两个互补的siRNA链；(ii)有更广范围的化学修饰可以增强细胞中的摄取、更好的(生理学)稳定性并可以降低潜在一般性不利影响；(iii)siRNA具有对于非特异性作用的更高可能性(包括脱靶基因)和夸大的药理学(例如，通过治疗计划或剂量控制有效性和选择性较低的可能性)，(iv)siRNA较少可能在细胞核中起作用并且不能针对内含子。
在另一个实施方式中，本发明的寡核苷酸包含脱碱基位点或脱碱基单体。在本发明的背景中，此类单体可称为脱碱基位点或脱碱基单体。通过相比于包含核酸碱基的相应核苷酸残基，脱碱基单体是缺少核酸碱基的核苷酸残基或结构单元(building block)。在本发明中，脱碱基单体是寡核苷酸但缺乏核酸碱基的结构单元部分。此类脱碱基单体可存在于(present)或连接于(link)或附着于(attach)或结合于(conjugate)寡核苷酸的游离末端。
在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含1-10或多个脱碱基单体。因此，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个脱碱基单体可以存在于本发明的寡核苷酸中。
脱碱基单体可为由本领域技术人员已知和可想到的任何类型，其非限制性实例描述如下：
这里，R1和R2独立地为H、寡核苷酸或其他一个或多个脱碱基位点，条件是R1和R2不同时为H，并且R1和R2不同时为寡核苷酸。如前文所说明的，一个或多个脱碱基单体可附着于寡核苷酸的任一或两个末端。应当指出，附着于一个或两个脱碱基位点或脱碱基单体的寡核苷酸可以包含小于10个的核苷酸。在这方面，根据本发明的寡核苷酸可以包含至少10个核苷酸，可选地包括在一个或两个末端处的一个或多个脱碱基位点或脱碱基单体。在美国专利申请US 2013/013378(Alnylam Pharmaceuticals)中描述由本发明所包括的脱碱基位点的其他实例，通过引用将其全文结合于此。
取决于它的长度，本发明的寡核苷酸可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基修饰。在所述寡核苷酸中引入一个以上不同的碱基修饰也包括在本发明内。
因此，在一个实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含：
(a)至少一种碱基修饰，其选自2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、2,6-二氨基嘌呤；和/或
(b)至少一种糖修饰、其选自2'-O-甲基、2'-O-(2-甲氧基)乙基、2'-O-脱氧(DNA)、2'-F、吗啉代、桥接核苷酸或BNA，或者寡核苷酸包含桥接核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸(BNA/DNA混合聚体)二者；和/或
(c)至少一种骨架修饰，其选自硫代磷酸酯或二氨基磷酸酯。
在另一个实施方式中，根据本发明的寡核苷酸包含：
(a)至少一种碱基修饰，其选自5-甲基嘧啶和2,6-二氨基嘌呤；和/或
(b)至少一种糖修饰，其为2'-O-甲基；和/或
(c)至少一种骨架修饰，其为硫代磷酸酯。
在实施方式中，相比于天然存在的基于核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸包含至少一个修饰，更优选地
(a)至少一种碱基修饰，其优选地选自2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、更优选地选自5-甲基嘧啶和2,6-二氨基嘌呤；和/或
(b)至少一种糖修饰，其优选地选自2'-O-甲基、2'-O-(2-甲氧基)乙基、2'-O-脱氧(DNA)、2'-F、吗啉代、桥接核苷酸或BNA，或寡核苷酸包含桥接核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸(BNA/DNA混合聚体)二者，更优选地，糖修饰是2'-O-甲基；和/或
(c)至少一种骨架修饰，其优选地选自硫代磷酸酯或二氨基磷酸酯，更优选地，骨架修饰是硫代磷酸酯。
因此，根据本发明的这个实施例的寡核苷酸包含碱基修饰(a)并且无糖修饰(b)和无骨架修饰(c)。根据本发明的这个方面的另一个优选寡核苷酸包含糖修饰(b)并且无碱基修饰(a)和无骨架修饰(c)。根据本发明的这个方面的另一个优选寡核苷酸包含骨架修饰(c)并且无碱基修饰(a)和无糖修饰(b)。另外，不具有上述修饰的寡核苷酸被理解为包含在本发明中，以及包含以下的寡核苷酸：两个，即(a)和(b)、(a)和(c)和/或(b)和(c)，或所有三个修饰(a)，(b)和(c)，如上述所限定。
在优选的实施方式中，用一个或多个相同修饰在其全长上修饰根据本发明的寡核苷酸，修饰选自(a)碱基修饰之一；和/或(b)糖修饰之一；和/或(c)骨架修饰之一。
随着核酸模拟技术的出现，已成为可能的是，产生与核酸自身在种类上而不一定在量的方面具有类似的、优选相同的杂交特征的分子。此类功能性等价物当然也适用于在本发明中使用。
在另一个优选的实施方式中，寡核苷酸包含肌苷、次黄嘌呤、通用碱基、简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷或核苷酸，或它们的功能性等价物。如下文所说明的，在本发明的寡核苷酸中使用肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸是非常有吸引力的。肌苷例如是已知修饰的碱基，其可以与以下三种碱基配对：尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶。肌苷是当次黄嘌呤经由β-N9-糖苷键附着于核糖环(也称为呋喃核糖)时形成的核苷。通常在tRNA中发现肌苷(I)并且对于在摆动碱基对中的遗传密码的正确翻译是必不可少的。摆动碱基对可存在于G和U之间，或在一边是I而在另一边是U、A或C之间。这些在RNA二级结构的形成中至关重要。它的热力学稳定性可比与沃森-克里克碱基对的热力学稳定性。通过在反密码子的第一碱基中使用修饰的碱基对，遗传密码弥补用于三联体密码子(64)的氨基酸(20)数量中的差距。
在本发明的寡核苷酸中使用肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的第一个优点允许人们设计寡核苷酸，其能够结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域并且能够结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中来自所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性。换句话说，在本发明的寡核苷酸中肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的存在允许所述寡核苷酸结合到所述前体mRNA的第一外显子的区域和第二外显子的区域。
在本发明的寡核苷酸中使用肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的第二个优点允许人们设计寡核苷酸，其跨越(span)单核苷酸多态性(SNP)，而不用担心该多态性会破坏寡核苷酸的退火效率。因此，在本发明中，使用此类碱基允许设计可以用于具有在由本发明寡核苷酸靶向的前体mRNA延伸内的SNP的个体的寡核苷酸。
在本发明的寡核苷酸中使用肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的第三个优点是，当所述寡核苷酸通常包含CpG时，如本文所确定的，如果将它设计为互补于第一前体mRNA外显子的一部分。在寡核苷酸中CpG的存在通常与所述寡核苷酸的增加的免疫原性相关(Dorn A.和Kippenberger S.,)。该增加的免疫原性是不希望的，由于它可引起肌纤维的破裂。在所述寡核苷酸中，预期在一个、两个或更多个CpG中由肌苷取代鸟嘌呤提供具有降低的和/或可接受水平的免疫原性的寡核苷酸。可以在动物模型中通过以所述动物的肌肉活组织检查评估CD4+和/或CD8+细胞和/或炎性单核细胞渗透的存在来评估免疫原性。也可以在用本发明的寡核苷酸处理的动物或人的血液中，通过使用本领域技术人员已知的标准免疫测定检测中和抗体和/或识别所述寡核苷酸的抗体的存在来评估免疫原性。通过相比于在动物的相应肌肉活组织检查中每个细胞类型的量(在用具有至少一个肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的相应寡核苷酸处理前或经其处理)，免疫原性的增加优选对应于这些细胞类型中的至少一种的可检测的增加。可替代地，可以通过使用标准免疫测定检测中和抗体或识别所述寡核苷酸的抗体的存在或增加量来评估免疫原性的增加。通过相比于在动物的相应肌肉活组织检查中相应细胞类型的量(在用不具有肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的相应寡核苷酸处理前或经其处理)，免疫原性的降低优选对应于这些细胞类型中的至少一种的可检测的降低。可替代地，可以通过使用标准免疫测定的所述化合物和/或中和抗体的不存在或降低量来评估免疫原性的降低。
在本发明的寡核苷酸中使用肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的第四个优点是，避免或降低寡核苷酸的潜在多聚体化或聚集。例如已知的，包含G-四分体(G-quartet)基序的寡核苷酸具有通过四个单链寡核苷酸的Hoogsteen碱基配对形成四链体、多聚体或聚集体的倾向(Cheng A.J.和Van DykeM.W.)，其当然是不希望的：其结果是预期寡核苷酸的效率被降低。优选地通过本领域技术人员已知的标准聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳技术评估多聚体化或聚集。在优选的实施方式中，少于20％或15％、10％、7％、5％或更少的本发明寡核苷酸的总量具有使用上述试验评估的多聚体化或聚集的能力。
在本发明的寡核苷酸中使用肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的第五个优点是，因此也避免了四链体结构，其已与抗血栓形成活性(Macaya R.F.,等人)以及与结合到并抑制巨噬细胞清除剂受体(SuzukiK.,等人)相关。
在本发明的寡核苷酸中使用肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸的第六个优点是，允许设计具有改善的RNA结合动力学和/或热力学性能的寡核苷酸。至少部分地由以下确定RNA结合动力学和/或热力学性能，寡核苷酸的熔融温度(Tm；用寡核苷酸性能计算器(http://www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html)计算，对于单链RNA使用基础Tm和最近邻模型)，和/或AON-靶外显子复合物的自由能(使用RNA structure版本4.5)。如果Tm太高，寡核苷酸预期成为较少特异性的。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，难以为这些参数中的每个给出优选范围。可接受的Tm范围可以在35℃和85℃之间并且可接受的自由能范围可以在15kcal/mol和45kcal/mol之间。
取决于它的长度，本发明的寡核苷酸可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个肌苷(次黄嘌呤)和/或通用碱基和/或简并碱基和/或含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸或其功能性等价物。
优选地，由于RNA/RNA双链非常稳定，本发明的所述寡核苷酸包含RNA。优选的是RNA寡核苷酸包含为RNA提供另外的性能的修饰，例如对核酸内切酶、核酸外切酶和RNA酶H的抗性，另外的杂交强度，增加的稳定性(例如在体液中)，增加或降低的柔性，降低的毒性，增加的细胞内运输，组织特异性等。已在上文中确定优选的修饰。
一个实施方式因此提供包含至少一个修饰的寡核苷酸。优选的修饰的寡核苷酸是完全2'-O-甲基修饰的。在本发明的一个实施方式中，寡核苷酸包含含有2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核糖核苷酸修饰和桥接核酸修饰(BNA，如上文例举的)的混合寡核苷酸或由含有2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核糖核苷酸修饰和桥接核酸修饰(BNA，如上文例举的)的混合寡核苷酸组成。在本发明的另一个实施方式中，寡核苷酸包含含有2'-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯修饰和桥接核酸(BNA，如上文例举的)的混合寡核苷酸或由含有2'-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯修饰和桥接核酸(BNA，如上文例举的)的混合寡核苷酸组成。在本发明的另一个实施方式中，寡核苷酸包含含有桥接核酸(BNA，如上文列举的)修饰和寡脱氧核糖核苷酸修饰的混合寡核苷酸或由含有桥接核酸(BNA，如上文列举的)修饰和寡脱氧核糖核苷酸修饰的混合寡核苷酸组成。相比于仅由桥接核酸组成的等价物，该特定组合包含更好的序列特异性，并且当与由2'-O-甲基硫代磷酸酯寡(脱氧)核糖核苷酸修饰组成的寡核苷酸比较时包含改善的功效。
如本发明中所描述的化合物可以优选具有可电离基团。可电离基团可以是碱或酸，并且可以是带电的或中性的。可电离基团可以以与具有携带相反电荷的合适平衡离子的离子对存在。阳离子平衡离子的实例是钠、钾、铯、Tris、锂、钙、镁、三烷基铵、三乙基铵和四烷基铵。阴离子平衡离子的实例是氯化物、溴化物、碘化物、乳酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐和柠檬酸盐。已描述平衡离子的实例(例如Kumar L,)，通过引用将其全文结合于此。在美国专利申请2012046348(Replicor)中已将应用二价或三价平衡离子的实例、具体地Ca2+描述为添加积极特征到选择的寡核苷酸，通过引用将其全文结合于此。优选的二价或三价平衡离子选自以下列表或组：钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜和锌。优选的二价平衡离子是钙。因此，本发明包括制备、获得和使用包含本发明的寡核苷酸和以上确定的任何其他平衡离子优选钙的组合物。此类用于制备包含所述寡核苷酸和所述平衡离子优选钙的所述组合物的方法可以是如下：可以将本发明的寡核苷酸溶解在药学上可接受的含水赋形剂中，并逐渐地将包含所述平衡离子的溶液添加到溶解的寡核苷酸使得寡核苷酸螯合物保持可溶。
因此，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸已与包含优选Ca2+的此类平衡离子的组合物接触，以形成包含通过此类如本文所确定的平衡离子连接的两个或更多个相同寡核苷酸的寡核苷酸螯合物。包含寡核苷酸螯合物的组合物，其包含通过平衡离子优选钙连接的两个或更多个相同寡核苷酸，因此包括在本发明中。
用于设计寡核苷酸的方法
因此，在本发明的另一方面，提供了用于设计寡核苷酸的方法，其中所述方法产生如上文所确定的寡核苷酸。
该方法包括以下步骤：
(a)识别相同前体mRNA中的第一和第二外显子的框内组合，其中所述第二外显子的区域具有与所述第一外显子的区域至少50％的同一性；
(b)设计能够结合到所述第一外显子的所述区域和所述第二外显子的所述区域的寡核苷酸，和
(c)其中所述结合引起所述第一外显子和所述第二外显子的跳读，优选地引起从所述第一外显子开始且包含存在于所述第一和所述第二外显子之间的一个或多个外显子的多外显子延伸的跳读，并且至多引起在所述第一和所述第二外显子之间的外显子的全部延伸的跳读。
在此类方法的步骤b)中，优选地设计所述寡核苷酸使得它的结合干扰在所述前体mRNA中所述第一和/或第二外显子的所述区域中的至少一个剪接调控序列。
可替代地或与剪接调控序列的干扰组合，所述寡核苷酸的结合优选地干扰包含所述前体mRNA中的至少所述第一和/或所述第二外显子的二级结构。
通过该方法可获得的寡核苷酸能够诱导所述前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读。优选地诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间，并且其中所得mRNA转录本为在框内的。寡核苷酸优选地能够诱导所述第一外显子和所述第二外显子之间的外显子的全部延伸的跳读。在实施方式中，所述第一外显子和所述第二外显子的所述区域包含剪接调控元件，以便所述寡核苷酸的结合能够干扰在所述第一和第二外显子的所述区域中的至少一个剪接调控序列。也包括的是，所述寡核苷酸的结合干扰包含所述前体mRNA中的至少所述第一和/或所述第二外显子的二级结构。优选的剪接调控序列包括用于丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白质的结合位点、外显子剪接增强子(ESE)、外显子识别序列(ERS)和/或外显子剪接沉默子(ESS)。
已在本文中限定该方法的每个特征，或是本领域技术人员已知的。
优选的寡核苷酸
优选地，本发明的寡核苷酸用于用作药物，更优选地，所述化合物用于在RNA调整疗法中使用。更优选的，所述RNA调整产生破坏的转录阅读框的矫正和/或期望或预期蛋白质的表达的恢复。本发明的方法和本发明的寡核苷酸因此在原则上应可以用于与破坏阅读框的突变的存在(导致异常转录本和/或编码蛋白质的不存在和/或异常蛋白质的存在)相关联的任何疾病。在优选的实施方式中，本发明的方法和本发明的寡核苷酸应用于携带重复序列并因此具有相对高序列同一性(即，如本文所限定的，在第二外显子的区域和第一外显子的区域之间至少50％、60％、70％、80％的序列同一性)的区域的疾病相关基因。非限制性实例是具有以下的基因：血影蛋白样重复(如，如本文所描述的涉及杜兴氏肌肉萎缩症的DMD基因)、Kelch样重复(如涉及家族高钾性高血压的KLHL3基因(Louis-Dit-Picard H等人)、涉及慢性淋巴细胞性白血病的KLHL6基因(Puente XS等人)、涉及色素性视网膜炎的KLHL7基因(Friedman JS等人)、涉及舍格伦氏综合症的KLHL7/12基因(UchidaK等人)、涉及末梢肌病的KLHL9基因(Cirak S等人)、涉及巨轴索神经病的KLHL16或GAN基因(Bomont P等人)、涉及数种癌症的KLHL19或KEAP1基因(Dhanoa BS等人)、涉及早幼粒细胞性白血病的KLHL20基因(Dhanoa BS等人)、或涉及脑肿瘤的KLHL37或ENC1基因(Dhanoa BS等人))、FGF样重复、EGF样重复(如涉及CADASIL的NOTCH3基因(Chabriat H等人)、涉及癌症或代谢性骨病的SCUBE基因、涉及神经精神障碍和特发性全身性癫痫的neurexin-1(NRXN1)基因(Moller RS等人)、涉及动脉粥样硬化和冠心病的Del-1基因，Tenascin-C(TNC)基因(Mollie A等人)、涉及马凡综合症的THBS3基因或Fibrillin(FBN1)基因(Rantamaki T等人))、Ankyrin样重复(如涉及扩张型心肌病的ANKRD1基因(Dubosq-Bidot L等人)、涉及KBG综合症的ANKRD2基因、ANKRD11基因(Sirmaci A等人)、涉及血小板减少(Noris P等人)或糖尿病(Raciti GA等人)的ANKRD26基因、涉及多发性硬化的ANKRD55基因(Alloza I等人)、或涉及末梢脊髓性肌萎缩的TRPV4基因(Fiorillo C等人))、HEAT样重复(如涉及亨廷顿氏病的htt基因)、膜联蛋白(Annexin)样重复、富含亮氨酸的重复(如涉及特发性复发性流产的NLRP2和NLRP7基因(Huang JY等人)、涉及帕金森氏病的LRRK2基因(Abeliovich A等人)、涉及阿尔兹海默氏病或脑膜炎的NLRP3基因(Heneka MT等人)、涉及肾衰竭的NALP3基因(Knauf F等人)、或涉及urofacial综合症的LRIG2基因(Stuart HM等人))、或丝氨酸蛋白酶抑制因子结构域(如涉及Netherton综合症的SPINK5基因(Hovnanian A等人)，如AndradeM.A.等人所述。
在本发明的背景中，优选的前体mRNA或转录本是抗肌萎缩蛋白前体mRNA或转录本。该优选的前体mRNA或转录本优选地为人类的前体mRNA或转录本。与存在于抗肌萎缩蛋白前体mRNA中的突变的存在相关联的疾病是取决于突变的DMD或BMD。在本发明的背景中使用的优选组合和来自抗肌萎缩蛋白前体mRNA的第一和第二外显子的区域在表2中确定。
在优选的实施方式中，本发明的化合物用于在细胞中、在器官中、在组织中和/或在患者中优选地在BMD或DMD患者中、或在源自所述患者的细胞、器官、组织中诱导外显子跳读。外显子跳读产生不包含被跳读的外显子的成熟mRNA，并且因此，当用于氨基酸的所述外显子编码可引起改变的、内部截短的但部分至主要的功能性抗肌萎缩蛋白产物的表达。用于外显子跳读的技术当前指向AON或AON转录基因构建体的使用。时下探讨外显子跳读技术以抗击遗传性肌肉萎缩症。最近我们和其他人已报道关于AON诱导外显子跳读治疗旨在恢复来自mdx小鼠和DMD患者细胞中的抗肌萎缩蛋白前体mRNA的阅读框的有希望的结果(Heemskerk H.,等人；Cirak S.,等人；Goemans等人)。通过具体外显子的靶向跳读，严重的DMD表型(缺乏功能性抗肌萎缩蛋白)被转换成较温和的BMD表型(表达功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白)。优选地通过靶向外显子内部序列的AON的结合诱导外显子的跳读。
下面，由其中存在第一和第二外显子的突变抗肌萎缩蛋白前体mRNA说明本发明。如本文所限定的，抗肌萎缩蛋白前体mRNA优选地指编码抗肌萎缩蛋白质的DMD基因的前体mRNA。突变的抗肌萎缩蛋白前体mRNA对应于具有突变的BMD或DMD患者的前体mRNA，当相比于不受影响的人的野生型DMD前体mRNA时，其产生(降低水平的)异常蛋白质(BMD)，或导致功能性抗肌萎缩蛋白(DMD)的不存在。抗肌萎缩蛋白前体mRNA也称为DMD前体mRNA。抗肌萎缩蛋白基因也可称为DMD基因。可贯穿整个申请互换使用抗肌萎缩蛋白和DMD。
患者优选地意在指具有如后文所限定的DMD或BMD的患者，或由于他(或她)的遗传背景易于发展DMD或BMD的患者。在DMD患者的情况下，所使用的化合物将优选地纠正作为存在于所述患者的DMD基因中的突变并且因此将优选地产生看起来像来自BMD患者的抗肌萎缩蛋白质的抗肌萎缩蛋白质：所述蛋白质将优选地为如后文所限定的功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白。在BMD患者的情况下，本发明的反义寡核苷酸将优选地修饰作为存在于所述患者的BMD基因中的突变，并且将优选地产生比原本存在于所述BMD患者中的抗肌萎缩蛋白更具功能性的抗肌萎缩蛋白。
如本文所限定的，功能性抗肌萎缩蛋白优选为对应于具有如SEQ ID NO:1中所确定的氨基酸序列的蛋白质的野生型抗肌萎缩蛋白。功能性抗肌萎缩蛋白优选为这样的抗肌萎缩蛋白，其具有在它的N末端部分中的作用结合结构域(在N末端处的前240个氨基酸)、富含半胱氨酸的结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(在C末端处的后325个氨基酸)，这些结构域的每个存在于如本领域技术人员已知的野生型抗肌萎缩蛋白中。本文所示的氨基酸对应于由SEQ ID NO:1所表示的野生型抗肌萎缩蛋白的氨基酸。换句话说，功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白是这样的抗肌萎缩蛋白，其至少在一定程度上表现出野生型抗肌萎缩蛋白的活性。“至少在一定程度上”优选地指至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％的野生型功能性抗肌萎缩蛋白的相应活性。在这种情况下，功能性抗肌萎缩蛋白的活性优选地结合到肌动蛋白且与抗肌萎缩蛋白相关的糖蛋白复合物(DGC)或(DAGC)相互作用(Ehmsen J等人)。如本领域技术人员已知的，由怀疑为营养不良的肌肉的活组织检查，可以通过使用总蛋白质提取物的共免疫沉淀或横截面的免疫荧光分析使抗肌萎缩蛋白与肌动蛋白和DGC复合物的结合可视化。
患有DMD的个体通常在编码抗肌萎缩蛋白的基因中具有突变，其妨碍完整蛋白质的合成，例如过早终止妨碍C末端的合成。在BMD中，抗肌萎缩蛋白基因也包括突变，但该突变不破坏开放阅读框，并且C末端被合成。结果，产生(半)功能性或功能性抗肌萎缩蛋白质，其具有与野生型蛋白质在类型上类似、但是在量上并不一定类似的活性。BMD个体的基因组通常编码这样的抗肌萎缩蛋白质：其包含N末端部分(在N末端处的前240个氨基酸)、富含半胱氨酸的结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(在C末端处的后325个氨基酸)，但在大多数情况下，它的中心杆状结构域可短于野生型抗肌萎缩蛋白的那个(Monaco A.P.,等人)。
用于治疗DMD的外显子跳读通常针对通过使侧接或包含突变的外显子被跳读来绕过前体mRNA中的过早终止。这允许矫正开放阅读框和合成内部截短但包括C-末端的抗肌萎缩蛋白质。在优选的实施方式中，具有DMD且用本发明的寡核苷酸处理的个体将合成这样的抗肌萎缩蛋白，其至少在一定程度上表现出野生型抗肌萎缩蛋白的类似活性。更优选地，如果所述个体是DMD患者或被怀疑为DMD患者，(半)功能性抗肌萎缩蛋白是具有BMD的个体的抗肌萎缩蛋白：通常所述抗肌萎缩蛋白能与肌动蛋白和DGC或DAGC相互作用(Ehmsen J.,等人,Monaco A.P.,等人)。
野生型抗肌萎缩蛋白的中心杆状结构域包含24个血影蛋白样重复(Ehmsen J.,等人)。在许多情况下，BMD样蛋白质中的中心杆状结构域短于野生型抗肌萎缩蛋白的那个(Monaco A.P.,等人)。例如，如本文所提供的抗肌萎缩蛋白的中心杆状结构域可以包含5至23、10至22或12至18个血影蛋白样重复，只要它可以与肌动蛋白和DGC结合。
可以通过任何以下试验来评估使用本发明化合物缓解个体中的DMD或BMD的一种或多种症状：到丧失行走的时间的延长、改善的肌肉强度、改善的举起重量的能力、改善的从地板上升所需的时间、改善的9米的行走时间、改善的用于攀爬四个楼梯所需的时间、改善的腿的功能等级、改善的肺功能、改善的心脏功能、改善的生活质量。这些试验中的每个是本领域技术人员已知的。作为实例，Manzur等人(Manzur A.Y.等人)的出版物为这些试验中的每个给出大量解释。对于这些试验中的每个，一经发现在试验中所测量的参数的可检测改善或延长，它就将优选地意味着使用本发明的化合物在个体中缓解DMD或BMD的一种或多种症状。可检测改善或延长优选为统计学上显著的改善或延长，如Hodgetts等人(Hodgetts S.,等人)所描述的。可替代地，可以通过测量肌纤维功能、完整性和/或存活的改善来评估DMD或BMD的一种或多种症状的缓解。在优选方法中，缓解了DMD或BMD患者的一种或多种症状和/或改善了来自DMD或BMD患者的一种或多种肌细胞的一个或多个特征。可以在细胞、组织水平上或在患者自身上评估此类症状或特征。
可以通过任何在来自该患者的肌原性细胞或肌细胞上的以下试验来评估来自DMD或BMD患者的肌细胞的一个或多个特征的缓解：降低的由肌细胞的钙摄取、降低的胶原蛋白合成、改变的形态学、改变的脂质生物合成、降低的氧化应激和/或改善的肌纤维功能、完整性和/或存活。通常使用肌肉活组织检查的横截面的免疫荧光和/或组织化学分析来评估这些参数。
可以使用以下试验中的至少一个来评估改善的肌纤维功能、完整性和/或存活：血液中肌酸激酶的可检测的降低，怀疑为营养不良的肌肉的活组织检查横截面中的肌纤维坏死的可检测的降低，和/或怀疑为营养不良的肌肉的活组织检查横截面中的肌纤维直径均匀性的可检测增加。这些试验中的每个是本领域技术人员已知的。
如Hodgetts等人(Hodgetts S.,等人)所描述的，可以在血液中检测肌酸激酶。肌酸激酶的可检测的降低可意味着相比于在治疗前相同DMD或BMD患者中肌酸激酶的浓度5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的降低。
优选地在肌肉活组织检查中、更优选地如Hodgetts等人(Hodgetts S.,等人)所描述的使用活组织检查评估横截面肌纤维坏死的可检测的降低。坏死的可检测的降低可以是其中已使用活组织检查横截面确定坏死的面积的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的降低。通过与如在治疗前相同DMD或BMD患者中所评估的坏死相比来测量降低。
优选地在肌肉活组织检查横截面中、更优选地如Hodgetts等人(Hodgetts S.,等人)所描述的评估肌纤维直径均匀性的可检测增加。通过与在治疗前相同DMD或BMD患者中肌纤维直径的均匀性对比来测量增加。
优选地，本发明的寡核苷酸为个体提供具有(较高水平的)功能性和/或(半)功能性抗肌萎缩蛋白质(对于DMD和BMD)，和/或能用于至少部分地降低所述个体中异常抗肌萎缩蛋白质的产生。在这种情况下，“一个(a)”功能性和/或“一个”半功能性抗肌萎缩蛋白可意味着可以产生几种形式的功能性和/或半功能性抗肌萎缩蛋白。当第一和第二外显子之间至少50％同一性的区域与其他第一和第二外显子之间至少50％同一性中的一个或多个其他区域重叠时，并且当所述寡核苷酸能够结合到所述重叠部分使得外显子的几个不同延伸被跳读并产生几种不同框内转录本时，这是可以预期的。这种情况在实施例4中示出，其中根据本发明的一个单一寡核苷酸(PS816；SEQ ID NO:1679)能诱导几种框内转录本的产生，其所有的转录本共享外显子10作为第一外显子，并且其中第二外显子可以是13、14、15、18、20、27、30、31、32、35、42、44、47、48或55。
较高水平是指通过与在用本发明的寡核苷酸治疗开始前患者中功能性和/或(半)功能性抗肌萎缩蛋白质的相应水平相比，功能性和/或(半)功能性抗肌萎缩蛋白质水平的增加。优选地使用免疫荧光或蛋白印迹分析(蛋白质)来评估所述功能性和/或(半)功能性抗肌萎缩蛋白质的水平。
降低异常抗肌萎缩蛋白mRNA或异常抗肌萎缩蛋白质的产生优选地意味着，通过RTPCR(mRNA)或免疫荧光或蛋白印迹分析(蛋白质)仍可检测90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少初始量的异常抗肌萎缩蛋白mRNA或异常抗肌萎缩蛋白质。在本文中，异常抗肌萎缩蛋白mRNA或蛋白质也称作较少功能性(与如前文所限定的野生型功能性抗肌萎缩蛋白质相比)或非功能性抗肌萎缩蛋白mRNA或蛋白质。非功能性抗肌萎缩蛋白质优选为不能结合肌动蛋白和/或DGC蛋白质复合物成员的抗肌萎缩蛋白质。非功能性抗肌萎缩蛋白质或抗肌萎缩蛋白mRNA通常不具有，或不编码具有蛋白质的完整C-末端的抗肌萎缩蛋白质。在优选的实施方式中，应用外显子跳读(也称为RNA-调整或剪接-切换)技术。
增加功能性和/或半功能性抗肌萎缩蛋白mRNA和/或蛋白质的产生优选地意味着，通过与在治疗开始时可检测的所述mRNA和/或蛋白质的可检测的量相比，这样的功能性和/或半功能性抗肌萎缩蛋白mRNA和/或蛋白质是可检测的，或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的增加。可以使用RT-PCR(mRNA)或免疫荧光或蛋白印迹分析(蛋白质)进行所述检测。
在另一个实施方式中，本发明的化合物为所述个体提供功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白质。如前文所说明的，该功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白质或mRNA可检测为异常抗肌萎缩蛋白质或mRNA。
通过所述两个外显子(所述第一和所述第二外显子)的靶向共跳读(co-skipping)，可以诱导一个或多个另外的外显子的跳读，其中所述一个或多个另外的外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间，并且其中所产生的抗肌萎缩蛋白转录本为在框内的(优选地如在表1或表6中)，DMD或严重的BMD表型被转换成较温和的BMD或甚至无症状表型。优选地如下诱导所述两个外显子的共跳读：通过使寡核苷酸结合到来自抗肌萎缩蛋白前体mRNA的第一外显子的区域并通过使寡核苷酸结合到抗肌萎缩蛋白前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性。优选地，所述第一和所述第二抗肌萎缩蛋白外显子和在其中的同一性区域是如表2或表6中确定的。所述寡核苷酸优选表现出与非外显子序列无重叠。所述寡核苷酸优选不与至少不在存在于内含子中的这些范围内的剪接位点重叠。朝向外显子内部序列的所述寡核苷酸优选不包含反向互补于相邻内含子的序列。优选地应用外显子跳读技术使得所述两个外显子、优选一个或多个另外的外显子、更优选位于所述第一和所述第二外显子之间的那些不存在，从产生自DMD前体mRNA的mRNA产生用于(较高的)表达的更多的(半)功能性(虽然较短的)抗肌萎缩蛋白质的编码区域。在这种情况下(通常BMD患者)，抑制包含所述两个外显子、优选位于所述第一和所述第二外显子之间的另外的外显子优选地意味着：
-如通过RT-PCR所评估的，原始的、异常的(较少功能性的)抗肌萎缩蛋白mRNA的水平降低至少5％，或者如通过使用抗抗肌萎缩蛋白抗体的免疫荧光或蛋白印迹分析所评估的，相应异常抗肌萎缩蛋白质水平降低至少2％；和/或
-编码半功能性或功能性抗肌萎缩蛋白质的框内转录本是可检测的，或如通过RT-PCR(mRNA水平)所评估的，它的水平增加至少5％，或如通过使用抗抗肌萎缩蛋白抗体(蛋白质水平)的免疫荧光或蛋白印迹所评估的，它的水平增加至少2％。
降低异常的、较少功能性或非功能性抗肌萎缩蛋白质优选地至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，并且优选地线内地(in line)或平行于检测或更多功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白转录本或蛋白质的增加产量。在这种情况下(通常是DMD患者)，抑制包含所述两个外显子、优选位于所述第一和所述第二外显子之间的一个或多个另外的外显子的优选地意味着，(较高水平的)更多功能性或(半)功能性抗肌萎缩蛋白质或mRNA被提供给所述个体。
一旦为DMD患者提供(较高水平的)(更多)功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白质，则至少部分地缓解DMD的原因。因此，随后将预期，DMD的症状被充分降低。本发明进一步提供这样的领悟：当使用针对(或能够结合于或杂交于或反向互补于或能够靶向)所述延伸的外部外显子两者的单一寡核苷酸时，诱导或增强来自包含所述外显子的前体mRNA的至少两个抗肌萎缩蛋白外显子的整个延伸的跳读。贯穿在优选的实施方式中的应用，如本文所限定的，本发明的寡核苷酸因此至少80％反向互补于所述第一外显子的所述区域且至少45％反向互补于所述第二外显子的所述区域，其中所述第一和第二外显子对应于待跳读的外显子延伸的外部外显子。更优选地，所述寡核苷酸至少85％、90％、95％或100％反向互补于所述第一外显子的所述区域且至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％反向互补于所述第二外显子的所述区域。增强的跳读频率也增加DMD或BMD个体的肌细胞中产生的更多(半)功能性抗肌萎缩蛋白质的水平。
根据本发明的寡核苷酸，其被优选使用，
优选地反向互补于或能够结合或杂交于或靶向第一抗肌萎缩蛋白外显子的区域，所述区域具有至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸，
优选地反向互补于或能够结合或杂交于或靶向第二抗肌萎缩蛋白外显子的区域，所述区域具有至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸，其中相同前体mRNA内的所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性。
在本发明的背景中，寡核苷酸可以包含寡核苷酸的功能性等价物或由寡核苷酸的功能性等价物组成。寡核苷酸的功能性等价物优选地意味着如本文所限定的寡核苷酸，其中一个或多个核苷酸被取代并且其中所述功能性等价物的活性保持至少一定程度。优选地，包含寡核苷酸的功能性等价物的所述化合物的活性是提供功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白质。因此优选地通过定量功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白质的量来评估包含寡核苷酸的功能性等价物的所述化合物的所述活性。功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白在本文中优选限定为能结合肌动蛋白和DGC蛋白质复合物的成员、并且能支持肌纤维膜结构和柔性的抗肌萎缩蛋白。包含功能性寡核苷酸或等价物的化合物的所述活性的评估优选地包括RT-PCR(以在RNA水平上检测外显子跳读)和/或免疫荧光或蛋白印迹分析(以检测蛋白质表达和定位)。当它表示至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或更多的包含寡核苷酸(其中功能性等价物由其衍生)的所述化合物的相应活性时，所述活性优选保持至少一定程度。贯穿本申请，当使用单词寡核苷酸时，如本文所限定的，它可由其功能性等价物取代。
因此，寡核苷酸或其功能性等价物的使用，其包含以下序列或由以下序列组成
其能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于第一抗肌萎缩蛋白外显子的区域，
其能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于第二抗肌萎缩蛋白外显子的区域
并且
其中抗肌萎缩蛋白前体mRNA内的第二外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性，通过以下表现出DMD治疗效果：
-缓解DMD或BMD的一个或多个症状；和/或
-缓解来自患者的肌细胞的一个或多个特征；和/或
-为所述个体提供功能性或半功能性抗肌萎缩蛋白质；和/或
-至少部分地降低所述个体中异常抗肌萎缩蛋白质的产生。
已在本文中限定这些特征中的每个。
优选地，寡核苷酸包含以下序列或由以下序列组成：其能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于第一DMD或抗肌萎缩蛋白外显子的区域，其中相同前体mRNA内的第二DMD或抗肌萎缩蛋白外显子的区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50％的同一性。所述第一和第二外显子优选地选自包含外显子8至60的外显子的组，其中从第一外显子开始且包含第二外显子作为最后外显子的外显子的延伸，当被跳读时，产生框内转录本。于表1、表2或表6中给出在抗肌萎缩蛋白mRNA中的优选的框内外显子组合。
不希望受任何理论的束缚，可以通过以下方面中的一个或多个来确定第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子的同一性。在一个实施方式中，存在于第一外显子和第二外显子之间的一个或多个内含子并不是异常大的。在这种情况下，在抗肌萎缩蛋白基因中异常大的内含子可以是70、80、90、100、200kb或更大；例如内含子1(～83kb)、内含子2(～170kb)、内含子7(～110kb)、内含子43(～70kb)、内含子44(～248kb)、内含子55(～119kb)或内含子60(～96kb)。此外，在进一步的实施方式中，这些已经是表达截短的抗肌萎缩蛋白质的BMD患者的实例，其中该第一、该第二和从所述第一外显子到所述第二外显子的外显子延伸已被删除。另一个标准可以是用于组合的具有具体相关突变的DMD(和/或BMD)患者亚群的跳读外显子的相对大适用性。
在优选的实施方式中，DMD外显子的框内延伸被跳读(更优选地，在一个转录本内完全跳读)，其中由第一和第二外显子如下限定外部外显子：
-第一外显子是外显子8并且第二外显子是外显子19(适用于～7％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子9并且第二外显子是外显子22(适用于～11％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子9并且第二外显子是外显子30(适用于～14％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子10并且第二外显子是外显子18(适用于～5％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子10并且第二外显子是外显子30(适用于～13％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子10并且第二外显子是外显子42(适用于～16％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子10并且第二外显子是外显子47(适用于～29％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子10并且第二外显子是外显子57(适用于～72％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子10并且第二外显子是外显子60(适用于～72％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子11并且第二外显子是外显子23(适用于～8％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子13并且第二外显子是外显子30(适用于～10％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子23并且第二外显子是外显子42(适用于～7％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子34并且第二外显子是外显子53(适用于～42％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子40并且第二外显子是外显子53(适用于～38％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子44并且第二外显子是外显子56(适用于～40％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子45并且第二外显子是外显子51(适用于～17％的DMD患者)
-第一外显子是外显子45并且第二外显子是外显子53(适用于～28％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子45并且第二外显子是外显子55(适用于～33％的DMD患者)，
-第一外显子是外显子45并且第二外显子是外显子60(适用于～37％的DMD患者)，或
-第一外显子是外显子56并且第二外显子是外显子60(适用于～2％的DMD患者)。
因此，在实施方式中，本发明的寡核苷酸诱导以下抗肌萎缩蛋白外显子的跳读：外显子8至19、外显子9至22、外显子9至30、外显子10至18、外显子10至30、外显子10至42、外显子10至47、外显子10至57、外显子10至60、外显子11至23、外显子13至30、外显子23至42、外显子34至53、外显子40至53、外显子44至56、外显子45至51、外显子45至53、外显子45至55、外显子45至60或外显子56至60。
优选地，本发明的寡核苷酸包含以下序列或由以下序列组成，其能够结合于、靶向、杂交于和/或反向互补于抗肌萎缩蛋白前体mRNA的第一外显子的区域，使得反向互补部分为本发明的所述寡核苷酸的长度的至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％或甚至更优选至少95％、或甚至更优选98％和最优选达到100％。在这种情况下，第一外显子优选为如本文所限定的抗肌萎缩蛋白前体mRNA的外显子8、9、10、11、13、23、34、40、44、45、或56。所述寡核苷酸可以包含另外的侧翼(侧接，flanking)序列。在更优选的实施方式中，所述寡核苷酸的所述反向互补部分的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个核苷酸。可以使用几种类型的侧翼序列。优选地，侧翼序列用于修饰蛋白质与所述寡核苷酸的结合，或用于修饰所述寡核苷酸的热力学性能，更优选地用于修饰靶RNA结合亲和力。在另一个优选的实施方式中，另外的侧翼序列反向互补于不存在于所述外显子中的抗肌萎缩蛋白前体mRNA的序列。
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含以下序列或由以下序列组成，其能够结合于、靶向、杂交于并且反向互补于作为存在于抗肌萎缩蛋白前体mRNA中的至少第一抗肌萎缩蛋白外显子区域和第二抗肌萎缩蛋白外显子区域，其中所述第一和第二外显子选自以下的组：外显子8(SEQ ID NO:2)、9(SEQ ID NO:3)、10(SEQ ID NO:4)、11(SEQ ID NO:1761)、13(SEQ ID NO:1762)、18(SEQ ID NO:5)、19(SEQ ID NO:6)、22(SEQ ID NO:7)、23(SEQ IDNO:8)、30(SEQ ID NO:9)、34(SEQ ID NO:1763)、40(SEQ ID NO:1764)、42(SEQ ID NO:11)、44(SEQ ID NO:1765)、45(SEQ ID NO:12)、47(SEQ ID NO:10)、51(SEQ ID NO:1760)、53(SEQ ID NO:13)、55(SEQ ID NO:14)、56(SEQ ID NO:15)、57(SEQ ID NO:1744)或60(SEQID NO:16)，并且所述区域具有至少10个核苷酸。然而，所述区域也可具有至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸。对于上文确定的优选外显子，使用本领域中已知的技术，本领域技术人员能确定第一外显子的区域和第二外显子的区域。更优选地，如前文所说明的，使用在线工具EMBOSS Matcher。甚至更优选地，已在表2中提供第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子的优选同一性区域，本发明的寡核苷酸优选地结合于和/或至少部分地反向互补于上述区域。在这种情况下，反向互补优选为至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在本发明中待使用的优选的寡核苷酸序列能够结合于、杂交于、靶向和/或反向互补于所述第一和第二外显子之间同一性的区域，优选地来自表2，并具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸、更优选小于40个核苷酸、或更优选小于30个核苷酸、甚至更优选小于25个核苷酸、并且最优选20至25个核苷酸的长度。在这种情况下，反向互补优选为至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在实施方式中，优选的寡核苷酸使得第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子是如表1、表2或表6中所确定的，并且所述寡核苷酸能够结合到如表2或表6中所确定的并且如通过SEQID NO:17至1670、1742、1743、或1766至1777所限定的相应的第一和第二外显子的区域。
优选的寡核苷酸在表3中公开，并且包含SEQ ID NO:1671-1741或由SEQ ID NO:1671-1741组成。其他优选的寡核苷酸包含SEQ ID NO:1778-1891或由SEQ ID NO:1778-1891组成，如表6中所公开的。优选的寡核苷酸包含SEQ ID NO:1671-1741或1778-1891，并且与如表3或表6中所给定的其准确的SEQ ID NO相比，多1、2、3、4或5个核苷酸，或少1、2、3、4或5个核苷酸。这些另外的核苷酸可存在于给定的SEQ ID NO的5'或3'端。这些缺失的核苷酸可以是存在于给定的SEQ ID NO的5'或3'端的核苷酸。这些寡核苷酸中的每个可具有如上文所限定的任何化学作用或它们的组合。在通过本文的SEQ ID NO确定的每个寡核苷酸中，U可由T取代。
在下文中描述更优选的寡核苷酸。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子8并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子19，外显子8的优选区域包含SEQ ID NO:17或由SEQ ID NO:17组成，并且外显子19的优选区域包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1722或1723组成，或包含SEQ ID NO:1722或1723，并且具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子13，则外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:101或由SEQ ID NO:101组成，并且外显子13的优选区域包含SEQ ID NO:102或由SEQ ID NO:102组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子14，则外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:103或由SEQ ID NO:103组成，并且外显子14的优选区域包含SEQ ID NO:104或由SEQ ID NO:104组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子15，则外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:105或由SEQ ID NO:105组成，并且外显子15的优选区域包含SEQ ID NO:106或由SEQ ID NO:106组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子18，则外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:109或由SEQ ID NO:109组成，并且外显子18的优选区域包含SEQ ID NO:110或由SEQ ID NO:110组成。优选的寡核苷酸包含：
-如在SEQ ID NO:1679至1681、1778、1812、1813、1884至1886、1890或1891的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1814中所限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
-如在SEQ ID NO:1815至1819的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1820、1824的任一项中所限定的并具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1826、1782、1832的任一项中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1821、1825、1780的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1822的任一项中所限定的并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1823、1781、1829、1830、1831的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，
-如在SEQ ID NO:1887的任一项中所限定的并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1888或1889的任一项中所限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1827中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
-如在SEQ ID NO:1828中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子18，外显子10的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1766或由SEQ ID NO:1766组成，并且外显子18的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1767或由SEQ ID NO:1767组成。优选的寡核苷酸包含如在SEQ ID NO:1783、1833、1834、1835的任一项中所限定的碱基序列，并具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子18，外显子10的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1768或由SEQ ID NO:1768组成，并且外显子18的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1769或由SEQ ID NO:1769组成。优选的寡核苷酸包含如在SEQ ID NO:1673或1674的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28，29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子20，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:111或由SEQ ID NO:111组成，并且外显子20的优选区域包含SEQ ID NO:112或由SEQ ID NO:112组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子27，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:121或由SEQ ID NO:121组成，并且外显子27的优选区域包含SEQ ID NO:122或由SEQ ID NO:122组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子30，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:127或由SEQ ID NO:127组成，并且外显子30的优选区域包含SEQ ID NO:128或由SEQ ID NO:128组成。优选的寡核苷酸包含：
-如在SEQ ID NO:1679至1681、1812、1813、1884至1886、1890、或1891的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1814中所限定的碱基序列，并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
-如在SEQ ID NO:1675或1676中所限定的碱基序列，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
-如在SEQ ID NO:1677或1678中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1784、1836的任一项中所限定的碱基序列，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1786、1838的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1780的任一项中所限定的碱基序列，并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1785、1837的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子30，外显子10的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1772或由SEQ ID NO:1772组成，并且外显子30的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1773或由SEQ ID NO:1773组成。优选的寡核苷酸包含：
-如在SEQ ID NO:1688、1689、1839、1840、1841、1842、1843或1844的任一项中所限定的碱基序列，并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度或
-如在SEQ ID NO:1845、1846、1847、1848的任一项中所限定的碱基序列，并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1849、1850的任一项中所限定的碱基序列，并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1787、1851的任一项中所限定的碱基序列，并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子31，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:129或由SEQ ID NO:129组成，并且外显子31的优选区域包含SEQ ID NO:130或由SEQ ID NO:130组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子32，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:131或由SEQ ID NO:131组成，和外显子32的优选区域包含SEQ ID NO:132或由SEQ ID NO:132组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子35，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:137或由SEQ ID NO:137组成，并且外显子35的优选区域包含SEQ ID NO:138或由SEQ ID NO:138组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子42，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:151或由SEQ ID NO:151组成，并且外显子42的优选区域包含SEQ ID NO:152或由SEQ ID NO:152组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子44，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:153或由SEQ ID NO:153组成，并且外显子44的优选区域包含SEQ ID NO:154或由SEQ ID NO:154组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子47，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:157或由SEQ ID NO:157组成，并且外显子47的优选区域包含SEQ ID NO:158或由SEQ ID NO:158组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子48，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:159或由SEQ ID NO:159组成，并且外显子48的优选区域包含SEQ ID NO:160或由SEQ ID NO:160组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子55，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:167或由SEQ ID NO:167组成，并且外显子55的优选区域包含SEQ ID NO:168或由SEQ ID NO:168组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子57，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:169或由SEQ ID NO:169组成，并且外显子57的优选区域包含SEQ ID NO:170或由SEQ ID NO:170组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子60，外显子10的优选区域包含SEQ ID NO:173或由SEQ ID NO:173组成，并且外显子60的优选区域包含SEQ ID NO:174或由SEQ ID NO:174组成。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1673组成或包含SEQ ID NO:1673，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1675组成或包含SEQ ID NO:1675，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1677组成或包含SEQ ID NO:1677，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1679组成或包含SEQ ID NO:1679，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。优选的寡核苷酸包含碱基序列SEQ ID NO:1679并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。可选地，SEQ ID NO:1679的1、2、3、4、5、6、7个U已被T取代。在优选的实施方式中，SEQ ID NO:1679的所有U已被T取代。包含SEQ ID NO:1679的优选寡核苷酸包含上文所限定的任何化学成分：碱基修饰和/或糖修饰和/或骨架修饰。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1681组成或包含SEQ ID NO:1681，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1684组成或包含SEQ ID NO:1684，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1685组成或包含SEQ ID NO:1685，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1686组成或包含SEQ ID NO:1686，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1688组成或包含SEQ ID NO:1688，并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度。优选的寡核苷酸包含碱基序列SEQ ID NO:1688并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度。可选地，SEQ ID NO:1688的1、2、3、4、5、6个U已被T取代。在优选的实施方式中，SEQ ID NO:1688的所有U已被T取代。包含SEQ ID NO:1688的优选寡核苷酸包含上文所限定的任何化学成分：碱基修饰和/或糖修饰和/或骨架修饰。
对于由SEQ ID NO:1673、1675、1677、1679、1681、1684、1685、1686和1688所表示的每个寡核苷酸，第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子10。然而，第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子13、14、15、18、20、27、30、31、32、35、42、44、47、48、55、57或60。这意味着使用这些寡核苷酸中任一个可以发生几种框内转录本的形成，每个引起截短的但(半)功能性的抗肌萎缩蛋白质的产生。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子11并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子23，外显子11的优选区域包含SEQ ID NO:191或由SEQ ID NO:191组成，并且外显子23的优选区域包含SEQ ID NO:192或由SEQ ID NO:192组成。优选的寡核苷酸包含：
-如在SEQ ID NO:1794、1861、1795、1862的任一项中所限定的碱基序列，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1796、1863、1797、1864的任一项中所限定的碱基序列，并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1798、1865、1799、1866的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子13并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子30，外显子13的优选区域包含SEQ ID NO:285或由SEQ ID NO:285组成，并且外显子30的优选区域包含SEQ ID NO:286或由SEQ ID NO:286组成。优选的寡核苷酸包含：
-如在SEQ ID NO:1808、1867、1809、1868、1810、1869、1858、1873的任一项中所限定的碱基序列，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度
-如SEQ ID NO:1811、1870、1859、1874的任一项中所限定的碱基序列，并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1856、1871、1860、1875的任一项中所限定的碱基序列，并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1857、1872的任一项中所限定的碱基序列，并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子23并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子42，外显子23的优选区域包含SEQ ID NO:776或由SEQ ID NO:776组成，并且外显子42的优选区域包含SEQ ID NO:777或由SEQ ID NO:777组成，优选的寡核苷酸包含SEQ ID NO:1698-1703或由SEQ ID NO:1698-1703组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子34并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子53，外显子34的优选区域包含SEQ ID NO:1294或由SEQ ID NO:1294组成，并且外显子53的优选区域包含SEQ ID NO:1295或由SEQ ID NO:1295组成。优选的寡核苷酸包含：
-如在SEQ ID NO:1800、1876、1801、1877的任一项中所限定的碱基序列，并具有19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1802、1878、1803、1879的任一项中所限定的碱基序列，并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子40并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子53，外显子40的优选区域包含SEQ ID NO:1477或由SEQ ID NO:1477组成，并且外显子53的优选区域包含SEQ ID NO:1478或由SEQ ID NO:1478组成。优选的寡核苷酸包含：
-如在SEQ ID NO:1804、1880的任一项中所限定的碱基序列，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，或
-如在SEQ ID NO:1805、1881的任一项中所限定的碱基序列，并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子44并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子56，外显子44的优选区域包含SEQ ID NO:1577或由SEQ ID NO:1577组成，并且外显子56的优选区域包含SEQ ID NO:1558或由SEQ ID NO:1558组成。优选的寡核苷酸包含如在SEQID NO:1806、1882、1807、1883的任一项中所限定的碱基序列，并具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子45并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子51，外显子45的优选区域包含SEQ ID NO:1567或由SEQ ID NO:1567组成，并且外显子51的优选区域包含SEQ ID NO:1568或由SEQ ID NO:1568组成。优选的寡核苷酸包含SEQ IDNO:1730-1731或由SEQ ID NO:1730-1731组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子45并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子53，外显子45的优选区域包含SEQ ID NO:1569或由SEQ ID NO:1569组成，并且外显子53的优选区域包含SEQ ID NO:1570或由SEQ ID NO:1570组成。优选的寡核苷酸包含SEQ IDNO:1732-1737或由SEQ ID NO:1732-1737组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子45并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子55，外显子45的优选区域包含SEQ ID NO:1571或由SEQ ID NO:1571组成，并且外显子55的优选区域包含SEQ ID NO:1572或由SEQ ID NO:1572组成。优选的寡核苷酸包含SEQ IDNO:1704-1719、1788、1852、1789、1853或由SEQ ID NO:1704-1719、1788、1852、1789、1853组成。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1706组成或包含SEQ ID NO:1706，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。包含SEQ ID NO:1706并具有25个核苷酸长度的优选寡核苷酸由SEQ ID NO:1706组成。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1707组成或包含SEQ ID NO:1707，并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。包含SEQ ID NO:1707并具有25个核苷酸长度的优选寡核苷酸由SEQ ID NO:1706组成。
优选的寡核苷酸由SEQ ID NO:1713组成或包含SEQ ID NO:1713，并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。包含SEQ ID NO:1713并具有25个核苷酸长度的优选寡核苷酸由SEQ ID NO:1710组成。
优选的寡核苷酸包含如SEQ ID NO:1788、1852、1789、1853的任一项中所限定的碱基序列，并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子45并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子55，外显子45的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1774或由SEQ ID NO:1774组成，并且外显子55的另一个优选区域包含SEQ ID NO:1775或由SEQ ID NO:1775组成。优选的寡核苷酸包含如在SEQ ID NO:1790、1854、1792、1855的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子45并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子60，外显子45的优选区域包含SEQ ID NO:1577或由SEQ ID NO:1577组成，并且外显子60的优选区域包含SEQ ID NO:1578或由SEQ ID NO:1578组成。优选的寡核苷酸包含SEQ IDNO:1738-1741或由SEQ ID NO:1738-1741组成。
如果第一抗肌萎缩蛋白外显子是外显子56并且第二抗肌萎缩蛋白外显子是外显子60，外显子56的优选区域包含SEQ ID NO:1742或由SEQ ID NO:1742组成，并且外显子60的优选区域包含SEQ ID NO:1743或由SEQ ID NO:1743组成。优选的寡核苷酸包含SEQ IDNO:1720-1721或由SEQ ID NO:1720-1721组成。
更优选的寡核苷酸包含：
(a)如在SEQ ID NO:1673或1674中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
(b)如在SEQ ID NO:1675或1676中所限定的碱基序列，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
(c)如在SEQ ID NO:1677或1678中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
(d)如在SEQ ID NO:1679至1681的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
(e)如在SEQ ID NO:1684至1686的任一项中所限定的碱基序列，并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
(f)如在SEQ ID NO:1688或1689中所限定的碱基序列，并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
(g)如在SEQ ID NO:1704至1706的任一项中所限定的碱基序列，并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，
(h)如在SEQ ID NO:1707至1709的任一项中所限定的碱基序列，并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度；或
(i)如在SEQ ID NO:1710、1713至1717的任一项中所限定的碱基序列，并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
甚至更优选的寡核苷酸包含：
(a)如在SEQ ID NO:1679至1681、1778、1812、1813、1884至1886、1890、或1891任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或在SEQ ID NO:1814中所限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(b)如在SEQ ID NO:1688、1689或1839至1844中所限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(c)如在SEQ ID NO:1673或1674中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(d)如在SEQ ID NO:1675或1676中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(e)如在SEQ ID NO:1677或1678中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(f)如在SEQ ID NO:1684至1686的任一项中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(g)如在SEQ ID NO:1704至1706的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，
(h)如在SEQ ID NO:1707至1709的任一项中所限定的并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列；或
(i)如在SEQ ID NO:1710、1713至1717的任一项中所限定的并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列或
(j)如在SEQ ID NO:1815至1819的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(k)如在SEQ ID NO:1820、1824的任一项中所限定的并具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(l)如在SEQ ID NO:1826、1782、1832的任一项中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(m)如在SEQ ID NO:1821、1825、1780的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(n)如在SEQ ID NO:1822的任一项中所限定的并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(o)如在SEQ ID NO:1823、1781、1829、1830、1831的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(p)如在SEQ ID NO:1783、1833、1834、1835的任一项中所限定的并具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(q)如在SEQ ID NO:1887的任一项中所限定的并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(r)如在SEQ ID NO:1888或1889的任一项中所限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(s)如在SEQ ID NO:1827中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(t)如在SEQ ID NO:1828中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(u)如在SEQ ID NO:1784、1836的任一项中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(v)或如在SEQ ID NO:1786、1838的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(w)如在SEQ ID NO:1780的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(x)如在SEQ ID NO:1785、1837的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(y)如在SEQ ID NO:1845、1846、1847、1848的任一项中所限定的并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(z)如在SEQ ID NO:1849、1850的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(a1)如在SEQ ID NO:1787、1851的任一项中所限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(b1)如在SEQ ID NO:1788、1852、1789、1853的任一项中所限定的并具有24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(c1)如在SEQ ID NO:1790、1854、1792、1855的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(d1)如在SEQ ID NO:1794、1861、1795、1862的任一项中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(e1)如在SEQ ID NO:1796、1863、1797、1864的任一项中所限定的并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(f1)如在SEQ ID NO:1798、1865、1799、1866的任一项中所限定的并具有25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(g1)如在SEQ ID NO:1808、1867、1809、1868、1810、1869、1858、1873的任一项中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(h1)如在SEQ ID NO:1811、1870、1859、1874的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度碱基序列，或
(i1)如在SEQ ID NO:1856、1871、1860、1875的任一项中所限定的并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度碱基序列，或
(j1)如在SEQ ID NO:1857、1872的任一项中所限定的并具有26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(k1)如在SEQ ID NO:1800、1876、1801、1877的任一项中所限定的并具有19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(l1)如在SEQ ID NO:1802、1878、1803、1879的任一项中所限定的并具有23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(m1)如在SEQ ID NO:1804、1880的任一项中所限定的并具有21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(n1)如在SEQ ID NO:1805、1881的任一项中所限定的并具有22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列，或
(o1)如在SEQ ID NO:1806、1882、1807、1883的任一项中所限定的并具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度的碱基序列。
根据本发明的寡核苷酸，其包含如由SEQ ID号所限定的序列或由如由SEQ ID号所限定的序列组成，也意味着包括包含如SEQ ID中所限定的碱基序列的寡核苷酸。相对于由SEQ ID所限定那些，具有修饰骨架的寡核苷酸(即修饰的糖部分和/或修饰的核苷间键)也包括在本发明内。在如本文所确定的寡核苷酸的SEQ ID NO中的每个碱基U可被修饰或被T取代。
组合物
在进一步方面，提供了包含如在题为“寡核苷酸”的先前部分中所描述的寡核苷酸的组合物。该组合物优选地包含如上所描述的寡核苷酸或由如上所描述的寡核苷酸组成。优选的组合物包含如上所限定的一种单一寡核苷酸。因此显然的是，使用一种单一寡核苷酸且不使用不同寡核苷酸的混合体获得至少所述第一和所述第二外显子的跳读。
在优选的实施方式中，所述组合物用作药物。因此所述组合物是药物组合物。药物组合物通常包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在优选的实施方式中，本发明的组合物包含如本文所限定的化合物，并且可选地进一步包含药学上可接受的制剂、填料、防腐剂、增溶剂、载体、稀释剂、赋形剂、盐、佐剂和/或溶剂。可以在例如Remington中发现此类药学上可接受的载体、填料、防腐剂、增溶剂、稀释剂、盐、佐剂、溶剂和/或赋形剂。如本发明中所描述的化合物具有至少一个可电离基团。可电离基团可以是碱或酸，并且可以是带电的或中性的。可电离基团可存在为与携带相反电荷的合适平衡离子的离子对。阳离子平衡离子的实例是钠、钾、铯、Tris、锂、钙、镁、三烷基铵、三乙基铵和四烷基铵。阴离子平衡离子的实例是氯化物、溴化物、碘化物、乳酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐和柠檬酸盐。已描述平衡离子的实例(Kumar L.，通过引用将其全文结合于此)。因此，在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸与包含此类可电离基团、优选Ca2+的组合物接触，以形成包含由如本文已限定的此类多价阳离子连接的两个或更多个相同寡核苷酸的寡核苷酸螯合物。
可进一步配制药物组合物以进一步有助于增强所述化合物的稳定性、溶解度、吸收、生物利用度、药代动力学和细胞摄取，特别是包含赋形剂或结合物(conjugate)的制剂，其能够形成复合物、纳米颗粒、微粒、纳米管、纳米凝胶、水凝胶、泊洛沙姆或普郎尼克类、聚合物囊泡、胶体、微泡、囊泡、胶束、脂质复合物和/或脂质体。纳米颗粒的实例包括聚合物纳米颗粒、金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、脂质纳米颗粒、糖颗粒、蛋白质纳米颗粒和肽纳米颗粒。
优选的组合物包含至少一种赋形剂，其可进一步有助于增强所述组合物和/或所述寡核苷酸的靶向和/或递送至和/或进入肌肉和/或细胞。细胞可以是肌细胞。
另一个优选的组合物可以包含至少一种赋形剂，其分类为第二类型的赋形剂。第二类型的赋形剂可以包含或含有如本文所述的结合基团(共轭基团，conjugate group)以增强组合物和/或本发明的寡核苷酸靶向和/或递送到组织和/或细胞和/或进组织和/或细胞，例如肌肉组织或细胞。两种类型的赋形剂可一起组合成如本文所确定的一个单一组合物。优选的结合基团在专用于限定的部分中公开。
本领域技术人员可以选择、组合和/或修改上述中的一个或多个或其他可替代的赋形剂和递送系统以配制和递送用于在本发明中使用的化合物。
本发明的此类药物组合物可以按规定时间以有效浓度给予至动物，优选哺乳动物。更优选的哺乳动物是人类。用于根据本发明使用的如本文所限定的化合物或组合物可以适合于直接给予至个体体内的细胞、组织和/或器官，优选地，所述个体患有BMD或DMD或处于发展BMD或DMD的风险中，并且可直接在体内、离体或体外给予。给予可经由全身和/或肠胃外途径，例如静脉内、皮下、心室内、鞘内、肌内、鼻内、肠内、玻璃体内、脑内、硬膜外或口服途径。
优选地，本发明的此类药物组合物可以以用于口服递送的乳液剂、悬浮剂、丸剂、片剂、胶囊剂或软凝胶剂的形式，或以用于递送到呼吸道和肺部的气雾剂或干粉剂的形式包封。
在实施方式中，本发明的化合物可以与已知要用于治疗所述疾病的另一种化合物一起使用。此类其他化合物可以用于减缓疾病的进展，用于减少异常行为或动作，用于降低肌肉组织炎症，用于改善肌纤维功能、完整性和/或存活和/或改善、增加或恢复心脏功能。实例是但不限于，类固醇，优选(葡糖)皮质类固醇、ACE抑制剂(优选培哚普利)、血管紧张素II类型1受体阻断剂(优选洛沙坦)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)抑制剂、TGFβ抑制剂(优选核心蛋白多糖)、人重组双糖链蛋白多糖、mIGF-1源、肌生成抑制蛋白(myostatin)抑制剂、甘露糖-6-磷酸盐(酯)、抗氧化剂、离子通道抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂(优选PDE5抑制剂、如西地那非或他达拉非)、L-精氨酸、多巴胺阻滞剂、金刚烷胺、丁苯那嗪和/或辅酶Q10。这种组合使用可以是顺序使用：在不同的组合物中给予每个组分。可替代地，每个化合物可以在单一组合物中一起使用。
用途
在进一步方面，提供如本文所述组合物或化合物用作药物或部分治疗的用途，或其中该化合物发挥其细胞内活性的应用。
在优选的实施方式中，本发明的化合物或组合物用作药物，其中药物用于预防、延缓、改善和/或治疗如本文所限定的疾病，优选DMD或BMD。
用于预防、延缓、改善和/或治疗疾病的方法
在进一步方面，提供用于预防、延缓、改善和/或治疗如本文所限定的疾病、优选DMD或BMD的方法。可以在个体中、在所述个体的细胞、组织或器官中预防、治疗、延缓、或改善所述疾病。该方法包括将本发明的寡核苷酸或组合物给予至需要其的所述个体或受试者。
根据本发明的方法，其中如本文所限定的寡核苷酸或组合物可以适于给予至个体的体内的细胞、组织和/或器官，所述个体优选患有BMD或DMD或者处于发展此类疾病的风险中的个体，并且可以在体内、离体或体外给予。有需要的个体或受试者优选为哺乳动物，更优选为人类。
在实施方式中，在本发明的方法中，寡核苷酸或组合物的浓度范围为0.01nM至1μM。更优选地，所使用的浓度为0.02nM至400nM、或0.05nM至400nM、或0.1nM至400nM，甚至更优选地为0.1nM至200nM。
优选地以临床试验(体内使用)中的递增剂量研究(对于其，存在严格的方案要求)为基础来设计根据本发明的寡核苷酸或组合物的剂量范围。如本文所限定的寡核苷酸可按这样的剂量使用：其范围为0.01至200mg/kg或0.05至100mg/kg或0.1至50mg/kg或0.1至20mg/kg，优选地在0.5至10mg/kg。
如上给定的寡核苷酸或组合物的浓度或剂量范围是用于体外或离体用途的优选浓度或剂量。本领域技术人员应当理解，取决于所使用的寡核苷酸、要治疗的靶细胞、基因靶和其表达水平、所使用的培养基以及转染和培养条件的同一性，所使用的所述寡核苷酸的浓度或剂量可进一步变化，并且可需要任何进一步优化。
限定
“序列同一性”，如本领域已知的，是如通过比较序列所确定的两个或更多个核酸(多核苷酸或核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“同一性(identity)”或“相似性(similarity)”的百分比表示如通过此类序列的字符串之间的匹配所确定的核酸序列之间的序列相关性的程度。在本文中“同一性”可以被“相似性”取代。优选地，通过比较如本文所确定的完整SEQ ID NO来确定同一性百分比。然而，也可以使用部分序列。在这种情况下，部分序列可意味着给定序列或SEQ ID NO的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
可以容易地通过已知方法计算“同一性”和“相似性”，其包括但不限于在以下中描述的那些方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,等人,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,等人,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,等人,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heine,G.,Academic Press,1987；以及SequenceAnalysis Primer Gribskov,M.and Devereux,J.,等人,M Stockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。
设计确定同一性的优选方法以给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编入可公开获得的计算机程序。确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))，BestFit和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。可以用于数据库相似性搜索的程序的BLAST 2.0家族包括：例如用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN。可从NCBI和其他来源(BLAST Manual,Altschul,S.,等人,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))公开获得BLAST 2.0家族程序。公知的Smith Waterman算法也可以用于确定同一性。
用于核酸比较的优选参数包括以下：算法(Algorithm)：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵(Comparison matrix)：匹配(matches)＝+10，错配(mismatch)＝0；缺口罚分(Gap Penalty)：50；缺口长度罚分(Gap Length Penalty)：3。可如上给定从位于威斯康星州Madison的Genetics Computer Group获得的Gap程序是用于核酸比较的默认参数。
确定序列相似性和同一性的另一个优选方法是通过使用算法Needleman-Wunsch(Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453,Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal,(ed.),Timewarps,string edits and macromolecules:the theory and practice of sequencecomparison,pp.1-44Addison Wesley)。
确定序列相似性和同一性的另一个优选方法是通过使用EMBOSS Matcher和Waterman-Eggert算法(两个序列的局部比对；[Schoniger and Waterman,Bulletin ofMathematical Biology 1992,Vol.54(4),pp.521-536；Vingron and Waterman,J.Mol.Biol.1994；235(1),p1-12.])。可以使用以下网站：http://www.ebi.ac.uk/Tools/ emboss/align/index.html或http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/ matcher。在该算法中使用的参数的限定见于以下网站：http://emboss.sourceforge.net/ docs/themes/AlignFormats.html#id。优选地，使用默认设置(Matrix：EDNAFULL，Gap_penalty：16，Extend_penalty：4)。Emboss Matcher提供两个序列之间的最佳局部对齐，但也提供可替代的对齐。表2公开两个不同的外显子、优选抗肌萎缩蛋白外显子之间的最佳局部对齐，其优选用于寡核苷酸设计。然而，也可以确定两个外显子之间的可替代的对齐和因此可替代的同一性区域并用于寡核苷酸设计，其也是本发明的部分。
贯穿整个申请，当在寡核苷酸反向互补于如本文所确定的前体mRNA区域的背景中使用时，单词“结合”，“靶向”，“杂交”可以可互换使用。类似地，表述“能够结合”，“能够靶向”和“能够杂交”可互换使用以指出寡核苷酸具有允许结合、靶向或杂交于靶序列的某一(certain)序列。无论何时靶序列是在本文中限定的或是本领域已知的，使用反向互补的概念，本领域技术人员能构建所述寡核苷酸的所有可能的结构。在这方面，应当理解的是，如上所讨论的，可允许本发明的寡核苷酸和第一和/或第二外显子中的靶序列之间的有限数量的序列错配或缺口，只要结合不受影响。因此，能够结合到某一靶序列的寡核苷酸可以被视为反向互补于该靶序列的寡核苷酸。在本发明的背景中，在生理条件下在细胞中、优选人细胞中使用“杂交”或“能够杂交”，除非另有说明。
如本文所使用的，“杂交”是指互补的寡聚化合物(例如，反义化合物和它的靶核酸)的配对。然而不限于具体的机制，配对的最常见机制涉及氢键，其可以是在互补核苷或核苷酸碱基(核酸碱基)之间的沃森-克里克、Hoogsteen或反向的Hoogsteen氢键。例如，天然碱基腺嘌呤是互补于天然核酸碱基胸腺嘧啶、5-甲基尿嘧啶和尿嘧啶的核酸碱基，其通过氢键的形成而配对。天然碱基鸟嘌呤是互补于天然碱基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的核酸碱基。可以在变化的情况下发生杂交。
类似地，“反向互补”用于确定能彼此杂交的两个核苷酸序列，序列之一从3'到5'取向，而另一个在反向方向上，即从5'到3'。因此，经由它们各自的核酸碱基，第一核苷酸序列上的核苷A能与第二核苷酸序列上的核苷A*配对，并且核苷B，其位于来自前述第一核苷酸序列中的核苷A的5'-位置，能与核苷B*配对，其位于来自前述第二核苷酸序列中的核苷A*的3'-位置。在本发明的背景中，第一核苷酸序列典型地为本发明的寡核苷酸，并且第二核苷酸序列是来自前体mRNA、优选抗肌萎缩蛋白前体mRNA的外显子的部分。当所述寡核苷酸至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％反向互补于所述第一和/或第二外显子的所述区域时，寡核苷酸优选被称为反向互补于外显子(第一和/或第二外显子)的区域。优选地，反向互补为至少80％、85％、90％、95％或100％。
在本发明的背景中，赋形剂包括聚合物(例如，聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯亚胺(PPI)、葡聚糖衍生物、氰基丙烯酸丁酯(PBCA)、氰基丙烯酸己酯(PHCA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚胺(例如精胺、亚精胺、腐胺、尸胺)、壳聚糖、聚(酰氨基胺)(PAMAM)、聚(酯酰胺)、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、环糊精、透明质酸、多聚乙酰神经氨酸和它们的衍生物)、树枝状聚合物(例如聚(酰氨基胺))、脂质{例如1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、二油酰基二甲基氯化铵(DODAC)、磷脂酰胆碱衍生物[例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)]、溶血-磷脂酰胆碱衍生物[例如1-硬脂酰基-2-溶血-sn-甘油-3-磷酸胆碱(S-LysoPC)]、鞘磷脂、2-{3-[双-(3-氨基-丙基)-氨基]-丙氨基}-N-双十四烷基氨甲酰甲基乙酰胺(RPR209120)、甘油磷酸衍生物[例如1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油钠盐(DPPG-Na)、磷脂酸衍生物[1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酸钠盐(DSPA)、磷脂酰乙醇胺衍生物[例如二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)]、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、1,3-二-油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰胺(DOSPER)、(1,2-肉豆蔻酰基丙基-3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)、(N1-胆固醇基氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺(CDAN)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、(b-L-精氨酰基-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油酰基-酰胺三盐酸化物(AtuFECT01)、N,N-二甲基-3-氨基丙烷衍生物[例如1,2-双硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DoDMA)、1,2-亚油醇氧基-N,N-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油醇-4-二甲基氨基甲基[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、磷脂酰丝氨酸衍生物[1,2-二油基-sn-甘油-3-磷-L-丝氨酸钠盐(DOPS)]、胆固醇}、蛋白质(例如白蛋白、明胶、去端肽胶原(atellocollagen))和肽(例如鱼精蛋白、PepFects、NickFects、聚精氨酸、聚赖氨酸、CADY、MPG)。
在本发明的背景中，结合基团选自由以下组成的组：靶向部分、稳定性增强部分、摄取增强部分、溶解性增强部分、药代动力学增强部分、药效学增强部分、活性增强部分、报告分子和药物，其中这些部分可以是肽、蛋白质、糖类、聚合物、乙二醇衍生物、维生素、脂质、多氟烷基部分、类固醇、胆固醇、荧光部分和放射性标记的部分。结合基团可以可选地受保护的，并且可以直接或经由二价或多价接头连接到本发明的寡核苷酸。
结合基团包括增强靶向、摄取、溶解性、活性、药效学、药代动力学、或降低毒性的部分。此类基团的实例包括肽(例如谷胱甘肽、聚精氨酸、RXR肽(例如参见Antimicrob.Agents Chemother.2009,53,525)、聚鸟氨酸、TAT、TP10、pAntp、聚赖氨酸、NLS、穿透肽(penetratin)、MSP、ASSLNIA、MPG、CADY、Pep-1、Pip、SAP、SAP(E)、运输蛋白(Transportan)、抗菌肽II、多粘菌素B、组胺素(histatin)、CPP5、NickFects、PepFects)、体内搬运工(vivo-porter)、蛋白质(例如抗体、亲和素、免疫球蛋白(Ig)、转铁蛋白、白蛋白)、糖类(例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、麦芽三糖、核糖、海藻糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、乳糖、蔗糖、岩藻糖、阿拉伯糖、塔罗糖、唾液酸、透明质酸、神经氨酸(neuramidinicacid)、鼠李糖、异鼠李糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、木糖、来苏糖、果糖、甘露糖-6-磷酸盐(酯)、2-脱氧核糖、己烯糖、纤维二糖(cellulobiose)、壳二糖、壳三糖)、聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯亚胺、聚乳酸、聚(酰氨基胺))、乙二醇衍生物(例如三甘醇、四乙二醇)、水溶性维生素(例如维生素B、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C)、脂溶性维生素(例如维生素A、D、D2、D3、E、K1、K2、K3)、脂质(例如棕榈基、肉豆蔻基、油基、硬脂酰、鲨肝醇基(batyl)、甘油磷脂、甘油脂、鞘脂、神经酰胺、脑苷脂、鞘氨醇、固醇、异戊烯醇、瓢儿菜醇基(erucyl)、花生四烯酰基(arachidonyl)、亚油基(linoleyl)、亚麻基(linolenyl)、二十烷醇基、丁酰基、sapeinyl、反油醇基(elaidyl)、月桂基、山嵛醇基(behenyl)、壬基、癸基、十一烷基、辛基、庚基、己基、戊基、DOPE、DOTAP、萜烯基、二萜、三萜)、多氟烷基部分(例如全氟[1H,1H,2H,2H]-烷基)、MW<1500Da的批准药物，其具有对于特异性蛋白质的亲和力(例如NSAID，如布洛芬(更多描述于美国专利US 6656730中，通过引用结合于此)、抗抑郁药、抗病毒剂、抗生素、烷化剂、抗阿米巴药、镇痛药、雄激素、ACE抑制剂、减食欲药、抗酸剂、驱虫剂、抗血管生成药、抗肾上腺素能药、抗心绞痛药、抗胆碱能药、抗凝血剂、抗惊厥药、抗糖尿病药、止泻药、抗利尿剂、解毒剂、抗真菌剂、止吐剂、抗眩晕药、抗痛风药、抗促性腺激素、抗组胺剂、抗高血脂药、抗高血压药、抗疟疾药、抗偏头痛药、抗肿瘤药、抗精神病药、抗风湿药、抗甲状腺药、抗毒素剂、镇咳药、抗焦虑药、避孕药、CNS兴奋剂、螯合剂、心血管药剂、减充血剂、皮肤病药剂、利尿药、祛痰剂、诊断剂、胃肠剂、麻醉剂、糖皮质激素、抗心律失常剂、免疫增强剂、免疫抑制剂、轻泻剂、抗麻风药、代谢药剂、呼吸药剂、粘液溶解剂、肌肉松弛剂、营养品、扩血管药、溶栓剂、宫缩剂、血管加压药)、MW<2000Da的天然化合物(例如抗生素、类二十烷酸、生物碱类、黄酮类、萜类、酶辅因子、聚酮类)、类固醇(例如泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、羊毛固醇、胆酸、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角固醇、胆固醇、氢化可的松、可的松、地夫可特)、五环三萜类(例如18β-甘草次酸、乌索酸、香树脂素、甘珀酸(carbenoloxone)、甘草次酸、甘草次酸醋酸酯、桦木酸、积雪草酸、高根二醇、齐墩果酸)、聚胺(例如精胺、亚精胺、腐胺、尸胺)、荧光部分(例如FAM、羧基荧光素、FITC、TAMRA、JOE、HEX、TET、罗丹明、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、CW800、BODIPY、AlexaFluors、Dabcyl、DNP)、报告分子(例如吖啶、生物素、地高辛、(放射性)同位素标记部分(具有例如2H、13C、14C、15N、18O、18F、32P、35S、57Co、99mTc、123I、125I、131I、153Gd))以及它们的组合。此类结合基团可直接或经由接头连接到本发明的化合物。该接头可以是二价(产生1:1结合)或多价的，产生具有一个以上结合基团的寡聚物。本领域中已知根据本发明用于直接或经由接头将此类结合基团连接到寡聚物的程序。也在本发明的背景中的是纳米颗粒的使用，将本发明的寡核苷酸与其共价连接达到某种程度上使得此类构建体被称为球形核酸(SNA)，如例如在J.Am.Chem.Soc.2008,130,12192(Hurst等人，通过引用将其全文结合于此)中所描述的。
在本文件和其权利要求书中，动词“包括”及其变形在其非限制性意义上使用，以意味着跟随该单词的各项都包括在内，但不排除没有具体提到的项目。此外，动词“组成”可被“基本上由…组成”取代，其意味着如本文所限定的寡核苷酸或组合物可以包含除具体确定的那些外的另外的一种或多种组分，所述另外的一种或多种组分不改变本发明的独特特征。另外，关于通过不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”的要素并不排除一个以上要素存在的可能性，除非上下文明确要求有一个且仅有一个要素。不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”因此通常意味着“至少一个”。
当与数值相关使用单词“约”或“大约”时(约10)，优选意味着该值可以是给定值10更多或更少1％的值。
除非另有说明，如本文所确定的每个实施方式可相互组合。本说明书中引用的所有专利和参考文献都通过引用将其全文结合于此。
提供以下实施例仅用于说明目的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
表1-表3
表1.DMD基因转录本中的可能外显子组合的列表，对于其，如果从转录本除去外显子U+1(第一外显子)至D-1(第二外显子)以及两者之间的任何外显子，则外显子U(上游)具有与外显子D(下游)的继续的开放阅读框。
表2.外显子区域的列表：如通过EMBOSS Matcher使用默认设置(Matrix：EDNAFULL，Gap_penalty：16，Extend_penalty：4)(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/ emboss_matcher/nucleotide.html)确定为最佳逐对对齐的，两个不同抗肌萎缩蛋白外显子之间的具有(部分)高序列同一性或相似性(至少50％)的序列延伸。这些外显子和优选两者之间的任何外显子的跳读将导致框内DMD转录本(如在表1中)
表3.根据本发明寡核苷酸的优选碱基序列的列表。包含这些碱基序列的寡核苷酸能够结合到两个不同DMD外显子(如表2中所示)中的高度相似性区域(具有>50％同一性的序列延伸)，并能够诱导这两个外显子和两者之间的任何外显子的跳读，以产生框内DMD转录本。
*D＝2,6-二氨基嘌呤；C＝5-甲基胞嘧啶；X＝C或5-甲基胞嘧啶,Y＝U或5-甲基尿嘧啶；Z＝A或2,6-二氨基嘌呤
表6.最优选和/或另外的外显子组合、最优选和/或另外的外显子同一性区域、和最优选和/或另外的寡核苷酸、连同它们的碱基序列、化学修饰和序列确定号的列表，其中*＝LNA、C＝5-甲基胞嘧啶、U＝5-甲基尿嘧啶、D＝2,6-二氨基嘌呤、X＝C或5-甲基胞嘧啶、Y＝U或5-甲基尿嘧啶、Z＝A或2,6-二氨基嘌呤、和<>所有2’-氟代核苷酸(如在SEQ ID NO:1844中)。
实施例1-实施例5
材料和方法
寡核苷酸的设计主要基于反向互补于两个不同DMD外显子中的特异性的、高度相似性的序列延伸，如通过EMBOSS Matcher所确定的，并如表2中所公开的。考虑的另外的序列参数是在所述序列延伸中部分开放/闭合二级RNA结构的存在(如通过RNA structure版本4.5或RNA mfold版本3.5(Zuker,M.)所预测的)和/或在所述序列延伸中假定SR-蛋白质结合位点的存在(如通过ESE-finder软件(Cartegni L,等人.2002和Cartegni L,等人,2003)所预测的)。所有AON由Prosensa Therapeutics B.V.(荷兰Leiden)合成或从商业来源(美国ChemGenes)获得，并且包含2'-O-甲基RNA和全长硫代磷酸酯(PS)骨架。所有寡核苷酸是2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA，并通过标准亚磷酰胺方案使用OP-10合成仪(Oligopilot)以10μmol规模合成。寡核苷酸以两步顺序切割和脱保护(DIEA随后浓NH4OH处理)，通过HPLC纯化并溶解在水中，并且添加过量的NaCl以交换离子。蒸发后，将化合物重新溶解在水中，通过FPLC脱盐并冻干。质谱分析法确认所有化合物的同一性，以及纯度(通过UPLC测定)对于所有化合物发现是可接受的(>80％)。对于本文所描述的体外实验，在磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中制备AON的50μM工作溶液。
组织培养，转染和RT-PCR分析
根据非GLP标准操作程序，以400nM的标准AON浓度在6孔板中转染分化的人类健康对照肌细胞(肌管)。使用聚乙烯亚胺(ExGen500；荷兰Fermentas)用于转染(2μl每μg AON,在0.15M NaCl中)。前述转染程序改编自以前报道的材料和方法(Aartsma-Rus A.,等人,2003)。在转染后24小时，分离RNA并通过RT-PCR来分析。简要地说，为了产生cDNA，在逆转录酶(RT)反应中按500-1000ng输入RNA使用随机六聚体混合物(1.6μg/μl；荷兰Roche)。随后对于每个样品按3μl的cDNA进行PCR分析，并包括使用DMD基因特异性引物(参见表4和表5)的第一和巢式PCR。根据改编自以前报道的材料和方法(Aartsma-Rus A.,等人,2002；和Aartsma-Rus A.,等人,2003)的非GLP标准操作程序进行RNA分离和RT-PCR分析。通过凝胶电泳(2％琼脂糖凝胶)分析RT-PCR产物。通过DNA微流控芯片实验室(Lab-on-a-Chip)分析(美国Agilent Technologies；DNA 7500LabChips)定量所产生的RT-PCR片段。通过“Agilent 2100Bioanalyzer”软件和Excel 2007处理数据。评估较小转录产物(包含预期的多个外显子跳读)与转录产物总量的比例(表示以百分比计的跳读效率)，并直接与非转染细胞中的较小转录产物与转录产物总量的比例相比。也从琼脂糖凝胶(QIAquick凝胶提取试剂盒，荷兰Qiagen)分离PCR片段，用于序列验证(Sanger测序，荷兰BaseClear)。
表4.用于检测被靶向的外显子的跳读的PCR引物组
表5.引物序列
结果
实施例1.在不同位点处用AON靶向外显子10和18中的具有高度相似性的序列延伸。
基于外显子10(SEQ ID NO:109)和18(SEQ ID NO:110)中的高度相似性(63％)序列延伸，设计一系列AON分散在所述序列延伸上，或者100％反向互补于外显子10(PS814；SEQ ID NO:1675，PS815；SEQ ID NO:1677，PS816；SEQ ID NO:1679)或外显子18(PS811；SEQID NO:1673)。转染后，在健康人类对照肌管培养物中，RT-PCR分析表明，所有四个AON能够诱导外显子10至18的跳读(通过序列分析确认)(图1)。PS811和PS816具有与两个外显子的最高反向互补百分比(图1B)，并且是最有效的，具有分别为70％和66％的外显子10至18跳读效率(图1C)。PS814是最低效的，以它的位置和/或较短的长度(21对25个核苷酸)和因此较低的结合亲和力或稳定性之故，其可能是固有的。在未处理细胞(NT)中没有观察到外显子10至18的跳读。这些结果是高度可再现的(外显子10至18跳读，通过PS816在20/20不同转染中)，并表明在具有高序列相似性(63％)的区域中通过使用能够结合到外显子10和18的单一AON，从外显子10至18的多外显子延伸的跳读是可行的，并且其能够诱导这些外显子和两者之间所有外显子的跳读。虽然可以在该转录本区域中获得另外的多个外显子跳读片段，但所产生的转录本其中外显子9直接剪接到19(框内转录本)，是所有实验中最丰富的。
实施例2.用不同长度的AON靶向外显子10和18中的具有高度相似性的序列延伸。
在外显子10(SEQ ID NO:109)和18(SEQ ID NO:110)中的高度相似性序列延伸内，我们评价具有不同长度的AON的影响以确定最有效的最短长度。PS816(25聚体；SEQ ID NO:1679)、PS1059(21聚体；SEQ ID NO:1684)或PS1050(15聚体；SEQ ID NO:1682)转染后，在健康人类对照肌细胞(即分化的肌管)中，RT-PCR分析表明所有三个AON能够诱导外显子10至18的跳读(通过序列分析确认)(图2A，图B)。PS816和PS1059是最有效的(分别为68％和79％)。较短的PS1050不太有效(25％)。在未处理细胞(NT)中没有观察到外显子10至18的跳读。这些结果表明，通过使用15、21和25个核苷酸的AON，从外显子10至18的多外显子延伸的跳读是可行的。预期较长AON也将正常工作。21聚体(21-mer)PS1059是最有效的、最短的候选物。15聚体PS1050是最低效的，以它的降低的反向互补于外显子18(47％；图2B)和/或与靶RNA的降低的结合亲和力或稳定性之故这可能是固有的。可能需要碱基修饰以提高Tm以及因此15聚体的结合亲和力或双链体稳定性以改善它们的生物活性。在该实验中最丰富的所产生的转录产物再次为其中外显子9直接剪接到19的转录产物(框内转录本)。
实施例3.用具有修饰的碱基化学成分的AON靶向具有外显子10和18中的高度相似性的序列延伸
选定的AON化学成分的具体特征至少部分地影响AON递送到靶转录本：给予途径、生物稳定性、生物分布、内组织分布以及细胞摄取和运输。此外，设想进一步优化寡核苷酸化学成分以增强结合亲和力和稳定性、增强活性、改善安全性，和/或通过降低长度或改善合成和/或纯化步骤降低产品成本。在外显子10(SEQ ID NO:109)和18(SEQ ID NO:110)中的高度相似性序列延伸内，我们在这里评价具有不同修饰碱基(如5-取代的嘧啶和2,6-二氨基嘌呤)的2'-O-甲基RNA AON的效果。PS816(常规2'-O-甲基RNA AON；SEQ ID NO:1679)，PS1168(其中所有A被2,6-二氨基嘌呤取代的PS816；SEQ ID NO:1681)，PS1059(常规2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA AON；SEQ ID NO:1684)，PS1138(其中所有C被5-甲基胞嘧啶取代的PS1059；SEQ ID NO:1685)，或PS1170(其中所有A由2,6-二氨基嘌呤取代的PS1059；SEQ IDNO:1686)(图3B)的转染后，在健康人类对照肌细胞(即，分化的肌管)中，RT-PCR分析表明所有五个AON能够诱导外显子10至18的跳读(通过序列分析确认)(图3)。PS816是最有效的(88％)。虽然在这些特定序列中的碱基修饰并没有进一步改善生物活性，但它们可具有对生物分布、稳定性和/或安全性的更积极效果，使得效率较低的化合物仍为临床开发所青睐。这些结果表明，通过使用具有修饰碱基的AON，从外显子10至18的多外显子延伸的跳读是可行的。在该实验中最丰富的所产生的转录产物再次为其中外显子9直接剪接到19的转录产物(框内转录本)。
实施例4.PS816诱导其他框内多外显子延伸的跳读
在外显子10(SEQ ID NO:109)和18(SEQ ID NO:110)中的高度相似性序列延伸也(部分地)存在于外显子30(SEQ ID NO:128)、31(SEQ ID NO:130)、32(SEQ ID NO:132)、42(SEQ ID NO:152)、47(SEQ ID NO:158)、48(SEQ ID NO:160)、57(SEQ ID NO:170)和60(SEQID NO:174)中(图4A，图B，表2)。我们在这里因此专注于检测400nM PS816(SEQ ID NO:1679)转染后的不同多外显子延伸跳读。对于这一目的我们使用不同的引物组(表4和表5)。的确，以RT-PCR分析，我们在多个实验中观察到框内外显子10至30、外显子10至42、外显子10至47、外显子10至57和/或外显子10至60的跳读(通过序列分析确认)，在未处理细胞中没有观察到它们。作为实例，图4C示出PS816诱导的外显子10至18、外显子10至30和外显子10至47跳读。尽管另外的多个外显子跳读事件(框内或框外)，所产生的转录本，其中外显子9直接剪接到19(框内转录本)是最可再现的且在所有实验中似乎为最丰富的。这些结果确认使用单一AON可以跨DMD基因诱导多个外显子跳读，该AON能够结合到两个不同外显子之间的高度相似性的序列延伸并且能够诱导这些外显子和两者之间所有外显子的跳读以产生框内DMD转录本。
实施例5.用具有修饰的碱基化学成分的AON靶向外显子45和55中具有高度相似性的序列延伸。
基于外显子45(SEQ ID NO:1571)和55(SEQ ID NO:1572)中的高度相似性(80％)序列延伸，设计一系列AON分散在所述序列延伸上，或者100％反向互补于外显子45(PS1185；SEQ ID NO:1706，PS1186；SEQ ID NO:1707)，或96％反向互补于外显子55(具有一个错配)(PS1188；SEQ ID NO:1713)(图5A)。在所有三个AON中，A被2,6-二氨基嘌呤取代。转染后，在健康人类对照肌管培养物中，RT-PCR分析表明PS1185、PS1186和PS1188均能够诱导外显子45至55的跳读(通过序列分析确认)(图5B)。在未处理细胞(NT)中没有观察到外显子45至55的跳读。这些结果表明，通过使用单一AON，从外显子45至55的另一个多外显子延伸的跳读是可行的，该AON能够结合到外显子45和55在具有高序列相似性(80％)的区域中，并且其能够诱导这些外显子和两者之间所有外显子的跳读。所产生的转录本其中外显子44直接剪接到56是在框内的并在多个实验中观察到。至于外显子10至18的跳读实验(实施例3)，我们在这里再次示出可有效地应用具有修饰碱基的AON。此外，用PS1188获得的结果表明，AON不需要100％反向互补于靶外显子之一，而是可以设计成混合结构，其中不存在100％反向互补于任一靶外显子。
附图说明
图1.A)PS811(SEQ ID NO:1673)、PS814(SEQ ID NO:1675)、PS815(SEQ ID NO:1677)和PS816(SEQ ID NO:1679)在外显子10和外显子18中高度相似性(63％)的顺序延伸中的位置。B)AON特征和效率。示出每个AON与外显子10或外显子18的反向互补(rev.comp.)的百分比。C)RT-PCR分析。在健康人类肌细胞(即，分化的肌管)中，所有四个AON有效地诱导从外显子10至外显子18的多外显子延伸的跳读。PS811和PS816是最有效的。在图左侧部位的方框表示PCR扩增的转录产物的含量。(M：DNA尺寸标志物；NT：未处理的细胞)
图2.A)RT-PCR分析。在健康人类肌细胞(即，分化的肌管)中，测试具有不同长度，但具有在外显子10和外显子18中高度相似性(63％)的序列延伸内的相同核心靶序列的AON。PS816(SEQ ID NO:1679)，25聚体，和PS1059(SEQ ID NO:1684)，21聚体是最有效的(分别为68％和79％的外显子10至18跳读)。15聚体PS1050(SEQ ID NO:1682)不太有效。在图左侧部位的方框表示PCR扩增转录产物的含量。(M：DNA尺寸标志物；NT：未处理的细胞)B)AON特征和效率。示出每个AON与外显子10或外显子18的反向互补(rev.comp.)的百分比。
图3.A)RT-PCR分析。在健康人类肌细胞(即，分化的肌管)中，测试具有不同碱基化学成分的AON：PS816(常规2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA AON；SEQ ID NO:1679)，PS1168(其中所有A由2,6-二氨基嘌呤取代的PS816；SEQ ID NO:1681)，PS1059(常规2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA AON；SEQ ID NO:1684)，PS1138(其中所有C由5-甲基胞嘧啶取代的PS1059；SEQ IDNO:1685)，或PS1170(其中所有A由2,6-二氨基嘌呤取代的PS1059；SEQ ID NO:1686)。对于测试的所有AON，观察到外显子10至18的跳读。PS816是最有效的(88％)。在这些特异性序列中，碱基修饰没有进一步改善生物活性。在图左侧部位的方框表明PCR扩增转录产物。(M：DNA尺寸标志物；NT：未处理的细胞)B)AON特征和效率。
图4.A)在外显子10、18、30和47中的高度相似性序列延伸作为用于PS816的多个靶。SEQ ID NO是指EMBOSS全长外显子对齐(如在表2中)。在灰色字体中，序列部分不包括在EMBOSS对齐中但其相邻于具有高反向互补于PS816的部分。B)外显子对齐和PS816反向互补(rev.comp.)百分比的概述。C)RT-PCR分析。可以通过PS816诱导多个外显子延伸跳读，这里确定为外显子10至18、外显子10至30和外显子10至47跳读。所得转录本为在框内的。在未处理细胞(NT)中没有检测到这些。在图左侧和右侧部位的方框表示PCR扩增转录产物的含量。(M：DNA尺寸标志物)
图5.A)PS1185(SEQ ID NO:1706)、PS1186(SEQ ID NO:1707)和PS1188(SEQ IDNO:1713)在外显子45和外显子55中高度相似性(80％)的序列延伸中的位置。该表总结AON特征。示出每个AON与外显子45或外显子55的反向互补(rev.comp.)的百分比。B)RT-PCR分析。在健康人类肌细胞(即，分化的肌管)中，所有三个AON有效地诱导从外显子45至外显子55的多外显子延伸的跳读。在图左侧部位的方框表示PCR扩增转录产物的含量。(M：DNA尺寸标志物；NT：未处理的细胞)
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Claims (9)

1.一种寡核苷酸，包括SEQ ID NO:1679，所述寡核苷酸具有这样的长度：所述长度是由存在于SEQ ID NO:1679中的核苷酸数量限定的或所述长度比SEQ ID NO:1679中限定的长1、2、3、4或5个核苷酸。
2.一种组合物，包含根据权利要求1所述的寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物还包含赋形剂、佐剂和/或溶剂。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含由平衡离子连接的如在权利要求1中所限定的两个或更多个相同寡核苷酸。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述平衡离子是钙。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物还包含稀释剂。
8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物还包含盐。
9.根据权利要求1所述的寡核苷酸或根据权利要求2-8中任一项所述的组合物在制备用于预防、延缓、改善和/或治疗BMD或DMD的药物中的用途。
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