発明の分野
本発明は、ヒト遺伝学、より具体的には神経筋障害の分野に関する。本発明は、本明細書にさらに定義される臨床適用性を増強する改善された特徴を有するオリゴヌクレオチドの使用に特に関する。
発明の背景
神経筋疾患は、筋肉又は神経病変(ミオパチー及びニューロパチー)のいずれかによる筋肉の機能障害によって特徴付けられる。ミオパチーは、骨格筋、心筋及び/又は平滑筋の進行性の衰弱及び変性によって特徴付けられる遺伝性筋ジストロフィーを含む。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)及びベッカー型筋ジストロフィー(BMD)は、筋ジストロフィーの最も一般的な小児型である。DMDは、12歳までに車いす補助への依存をもたらす重症で致命的な神経筋障害であり、患者は呼吸不全又は心不全により30歳までにしばしば死亡する。それは、1つ若しくは複数のエクソンの読み枠シフト欠失(約67%)若しくは重複(約7%)、又は2.24Mb DMD遺伝子中の点変異(約25%)によって引き起こされ、機能性ジストロフィンの欠如をもたらす。BMDは、DMD遺伝子中の変異によっても引き起こされるが、これらはオープンリーディングフレームを維持し、半機能性ジストロフィンタンパク質を生成し、典型的にはより軽度の表現型及びより長い生存期間をもたらす。過去10年間に、転写物の破壊された読み枠を修復するためのスプライシングの特異的修飾がDMDに対する有望な治療として出現した(van Ommenら、2008;Yokotaら、2007;van Deutekomら、2007;Goemansら、2011;Cirakら、2011)。変異に隣接する又はそれを含有するエクソンに結合し、スプライシングシグナルを妨げる高度に配列特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)を用いて、DMD mRNA前駆体のプロセシングの際にそのエクソンのスキッピングを誘導できる。生じる切断型転写物にもかかわらず、オープンリーディングフレームは修復され、BMD患者において見出されるものと類似のタンパク質が導入される。AON誘導エクソンスキッピングは変異特異的で、それ故個別化された、DMD患者のための治療アプローチを提供する。国際公開第02/024906号、国際公開第2004/083446号、国際公開第2006/112705号、国際公開第2007/135105号、国際公開第2009/139630号、国際公開第2010/050801号又は国際公開第2010/050802号に記載されているように、ジストロフィンmRNA前駆体の多くの関連エクソン(例えば、エクソン2、8、9、17、29、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60〜63、71〜78)をスキッピングするために、いくつかのオリゴヌクレオチドが現在開発中である。
変異の多くがエクソン45〜55周辺にクラスター化していることから、1つの具体的なエクソンのスキッピングは、種々の変異を有する多くの患者の治療に有効である可能性がある。エクソン51のスキッピングは、患者の最も大きなサブセット(約13%)(エクソン45〜50、48〜50、50又は52の欠失を有する患者を含む。)に適用される。適用されるAONは、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びRNaseHに抵抗性を有するように、また、RNA結合及び二重鎖安定性を促進するように化学的に修飾される。次の2つの異なるAON化学が、現在DMDにおけるエクソン51スキッピングのために開発されている:2’−O−メチルホスホロチオエートRNA AON(2OMePS、GSK2402968/PRO051)及びホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO、AVI−4658)(Goemansら、2011;Cirakら、2011)。2つの独立した第I/II相試験では、両者は、全身投与後にエクソン51スキッピングを特異的に誘導し、筋繊維膜でジストロフィン発現を少なくとも部分的に修復することが示された。AONは、通常は健常な筋繊維によっては十分に取り込まれないが、DMDでのジストロフィン欠乏(損傷され、その結果透過性が向上した繊維膜を生じる。)は実際に取り込みを促進する。ジストロフィン欠乏mdxマウスモデルでの研究では、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAオリゴヌクレオチドは、野生型マウスと比較して、種々の筋肉群における10倍までの高い取り込みを実証した(Heemskerkら、2010)。DMD患者における2’−O−メチルホスホロチオエートRNA及びホスホロジアミデートモルホリノAONの両方の近年の第I/II相結果はジストロフィー筋肉でのこの取り込みの増強を確認するが、異なる化学的修飾は筋肉による差次的取り込み及び筋肉を通じた分布を生じると考えられた。処置の3ヶ月後での両研究における新規ジストロフィンのレベルは、次世代オリゴ化学を調査するための有望だが、いまだ控えめであり、挑戦的な分野であった。
選ばれた化学の具体的な特徴は、標的転写物へのAONの送達に少なくとも部分的に影響を与える:投与経路、生体内安定性、生体内分布、組織内分布並びに細胞取り込み及び輸送。さらにオリゴヌクレオチド化学のさらなる最適化は、結合親和性及び安定性を増強し、活性を増強し、安全性を改善し、及び/又は長さを短くする又は合成及び/又は精製手順を改善することによって品物の経費を低減すると考えられている。複数の化学的修飾が研究団体に一般に及び/又は商業的に入手可能になった(2’−O−メチルRNA及び5置換ピリミジン及び2,6−ジアミノプリンなど)一方で他の大部分は得るために著しい合成の努力をいまだ示す。本明細書で明らかにされるように、特に予備的な期待の持てる結果が、ピリミジン及びプリン塩基に修飾を含有する2’−O−メチルホスホロチオエートRNAを用いて得られている。
結論として、DMDのためのAONの治療的適用性を増強するために、さらに改善された特徴を有するAONに対する必要性がある。
発明の説明
オリゴヌクレオチド:
第一の態様において、本発明は、2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格を含むか、或いはホスホロチオエート骨格によって連結された2’−O−メチルRNAモノマーからなるオリゴヌクレオチドであって、5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための薬物としての使用のためのオリゴヌクレオチドを提供する。
したがって、本発明は、2’−O−メチルRNAモノマー、ホスホロチオエート骨格、並びに5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むオリゴヌクレオチドであって、好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための薬物としての使用のためのオリゴヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格からなり、5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むオリゴヌクレオチドであって、好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための薬物としての使用のためのオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて示される「RNAモノマー」が「RNAヌクレオチド残基」としても同定され得ることは当業者に明らかである。両用語は、本明細書全体を通じて互換的に用いることができる。
本発明において、次の表現のそれぞれにおける「a」は「少なくとも1つの」を意味する。2’−O−メチルRNAモノマー、2’−O−メチルRNAヌクレオチド残基、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマー、5−メチルピリミジン塩基、2,6−ジアミノプリン塩基。
本発明において、「2’−O−メチルRNAモノマー、ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチド」が「ホスホロチオエート骨格によって連結された2’−O−メチルRNAモノマーを含むオリゴヌクレオチド」によって置き換えられることは当業者に明らかである。「2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格からなるオリゴヌクレオチド」が「ホスホロチオエート骨格によって連結された2’−O−メチルRNAモノマーからなるオリゴヌクレオチド」によって置き換えられることについても同様である。
本発明において、表現「デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための薬物としての使用のため」は、表現「デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療における使用のため」によって置き換えられる。
オリゴヌクレオチドは、34未満のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドを有する場合がある。そのようなオリゴヌクレオチドは、10〜33ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドとしても同定できる。
すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格を含み、34未満のヌクレオチドを含む(すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドを含む)。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格によって連結された2’−O−メチルRNAモノマーからなり、34未満のヌクレオチドを含む(すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドを含む)。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルRNAモノマー、ホスホロチオエート骨格を含み、34未満のヌクレオチド(すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドを含む。)と、5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基と、を含む。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格によって連結された2’−O−メチルRNAモノマーからなり、34未満のヌクレオチド(すなわち、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドを含む。)と、5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基と、を含む。
これらのオリゴヌクレオチドの各々は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための使用のためのものである。あるいは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーを治療するための薬物としての使用のためのものであり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又はからなる。そのようなオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を通じて繋がれた若しくはそれによって連結された2’−O−メチルRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなる。そのようなオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなることが好ましい。そのような化学は当業者に公知である。本明細書全体を通じて、2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAを含むオリゴヌクレオチドによって置き換えられ得る。本明細書全体を通じて、ホスホロチオエート骨格によって連結された又は通じて繋がれた2’−O−メチルRNAモノマーからなるオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなるオリゴヌクレオチドによって置き換えられ得る。
本発明において、「骨格」は、2つの糖単位又は糖単位若しくは糖部分(本明細書で後に定義される。)の修飾バージョンの間の連結(すなわちヌクレオシド間連結)を同定するために用いられる。本明細書全体を通じて、語「骨格」、「ヌクレオシド間連結」及び「連結」は互換的に用いられる場合がある。したがって、10ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、10個の糖単位又は糖単位若しくは糖部分(本明細書で後に定義される。)の修飾バージョンを連結する9個の骨格を一緒に含有する。本発明によるオリゴヌクレオチドの骨格の少なくとも1つは、2個の糖単位又は糖単位若しくは糖部分(本明細書で後に定義される。)の修飾バージョンを連結するホスホロチオエート部分からなる。したがって、RNAに存在する少なくとも1つのリン酸ジエステル骨格はホスホロチオエート部分によって置き換えられる。天然に存在するヌクレオシド間連結又は骨格は3’から5’へのリン酸ジエステル連結である。
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的鎖への結合親和性を増加させる、及び/又は前記オリゴヌクレオチドの標的と生じた二重鎖の融解温度を上昇させる、及び/又は免疫賦活効果を低減する、及び/又は生体内安定性を増加させる、及び/又は生体内分布及び/又は組織内分布及び/又は細胞取り込み及び輸送を改善する塩基修飾を含み得る。
さらに好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含む。5−メチルピリミジン塩基は、5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル及び/又はチミン(チミンは5−メチルウラシルと同一である)から選択される。
したがって、表現「5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含む」は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドに関しては、「5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び2,6−ジアミノプリン塩基からなる群から選択される塩基修飾を含む」によって置き換えられ得る。
本発明のオリゴヌクレオチドが2つ以上のそのような塩基修飾を有する場合、前記塩基修飾は同一であり得、例えば、オリゴヌクレオチド中のすべてのそのような修飾塩基は5−メチルシトシンであり得る。あるいは、前記塩基修飾は種々の塩基修飾の組み合わせであり得、例えば、オリゴヌクレオチドは1つ又は複数の5−メチルシトシン及び1つ又は複数の5−メチルウラシルを有し得る。
「チミン」及び「5−メチルウラシル」は本明細書全体を通じて互換的であり得る。また、2,6−ジアミノプリンは2−アミノアデニンと同一であり、これらの用語は本明細書全体を通じて互換的であり得る。2,6−ジアミノプリンの使用は、米国特許第7,745,420号において別の内容で開示されている。
本明細書において、用語「塩基修飾」又は「修飾塩基」は、既存の塩基(すなわちピリミジン又はプリン塩基)の修飾又は塩基の新規合成を指す。この新規合成塩基は、既存の塩基との比較により「修飾」と認定できる。5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、前記オリゴヌクレオチドのシトシン核酸塩基の少なくとも1つがピリミジン環の5位のプロトンのメチル基での置換、すなわち5置換シトシンによって修飾されている、及び/又は前記オリゴヌクレオチドのウラシル核酸塩基の少なくとも1つがピリミジン環の5位のプロトンのメチル基での置換によって修飾されている(すなわち5−メチルウラシル)、及び/又は前記オリゴヌクレオチドのアデニン核酸塩基の少なくとも1つが2位のプロトンのアミノ基での置換によって修飾されている(すなわち2,6−ジアミノプリン)。本発明において、表現「ピリミジン環の5位でのプロトンのメチル基での置換」は表現「ピリミジンの5−メチルピリミジンでの置換」によって置き換えられ得、ピリミジンはウラシルだけ、シトシンだけ又は両方を指し得る。また、本発明において、表現「アデニンの2位でのプロトンのアミノ基での置換」は表現「アデニンの2,6−ジアミノプリンでの置換」によって置き換えられ得る。前記オリゴヌクレオチドが、1、2、3、4、5、6、7、8、9個以上のシトシン、ウラシル及び/又はアデニンを含む場合、少なくとも1つ、2、3、4、5、6、7、8、9個以上のシトシン、ウラシル及び/又はアデニンはそれぞれこの方法で修飾される。すべてのシトシン、ウラシル及び/又はアデニンは、この方法で修飾される又は5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び/又は2,6−ジアミノプリンによってそれぞれ置換されることが好ましい。本発明のこの態様が、少なくとも1つのシトシン、ウラシル又はアデニンをそれらの配列中にそれぞれ含むオリゴヌクレオチドにだけ適用できることは言うまでもない。少なくとも1つの5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び/又は2,6−ジアミノプリンを含むオリゴヌクレオチドは、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び2,6−ジアミノプリンを含まないその非修飾対応物を参照することによって修飾オリゴヌクレオチドと称することができる。非修飾対応物は、未修飾シトシン、未修飾ウラシル及び未修飾アデニンを含むオリゴヌクレオチドであるとして同定される場合もある。好ましい非修飾配列は、配列番号91、93〜170を含む又はからなる次の塩基又はヌクレオチド配列の1つによって表される。
本発明者らは、本発明のオリゴヌクレオチド中の5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び/又は2,6−ジアミノプリンの存在が、前記オリゴヌクレオチドのパラメーターの少なくとも1つに好影響を有することを発見した。ここで、パラメーターは、以下に説明されるように、前記オリゴヌクレオチドの結合親和性及び/又は動態、エクソンスキッピング活性、生体内安定性、(組織内)分布、細胞取り込み及び/又は輸送、及び/又は免疫原性を含み得る。前記好影響は、組み込まれる塩基修飾の数又は百分率に相関する場合がある。エクソンスキッピング活性のパラメーターに関して、本発明者らは、いくつかのオリゴヌクレオチドに関して、核酸塩基の修飾それ自体が比較的高いレベルのエクソンスキッピングを得るために必要ではないことを見出した。これは、スプライシング工程においてエクソン内で特異的に標的化される配列の特異的役割(及び強度)に関連し得る。
結合親和性及び動態はAONの熱力学的特性に依存する。これらは、前記オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm;1本鎖RNAについては基本Tm及び隣接モデルを用いて、例えばオリゴヌクレオチド特性計算(http://www.unc.edu/〜cail/biotool/oligo/index.html又はhttp://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)で算出される)によって及び/又はオリゴヌクレオチド標的エクソン複合体の自由エネルギー(RNAストラクチャーバージョン4.5又はRNA mfoldバージョン3.5を用いて)によって、少なくとも部分的に決定される。Tmが上昇する場合、エクソンスキッピング活性は典型的には増加するが、Tmが高すぎる場合は、AONはあまり配列−特異的でなくなると予測される。許容されるTm及び自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列に依存する。したがって、これらのパラメーターの各々について好ましい範囲を与えることは難しい。
エクソンスキッピング活性は、(Aartsma−Rusら、2003)に記載されるように、標的化エクソンに隣接するDMD遺伝子特異的プライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によってAON処置筋肉細胞培養物又は筋肉組織から単離された全RNAを分析することによって好ましくは測定される。RT−PCR産生物は、1〜2%アガロースゲル上で、又はアジレント2100バイオアナライザー(Agilent Technologies、The Netherlands)で分析される。短い転写断片(標的化エクソンがスキップされる転写物を表す)の全転写産生物に対する割合は、評価される(AONによって誘導されるエクソンスキッピングの百分率として算出される)。短い断片は、標的化エクソンスキッピングの正確さ及び特異性を決定するために配列決定される場合もある。エクソンスキッピングの百分率における増加は、本発明の修飾オリゴヌクレオチド(すなわち2’−O−メチルRNAモノマー、ホスホロチオエート骨格並びに5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むオリゴヌクレオチド)について、その非修飾対応物(すなわち2’−O−メチルRNAモノマー、ホスホロチオエート骨格を含み、いかなる5−メチルピリミジン及び2,6−ジアミノプリン塩基も含まないオリゴヌクレオチド)と比較して検出できる。前記増加は、好ましくは、RT−PCRを用いて上述のように評価された検出可能な増加である。前記増加は、好ましくは少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、又は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10倍高い、又はさらに11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20倍又はそれを超えて高い増加である。
生体内分布及び生体内安定性は、Yuら、2002出典の検証されたハイブリダイゼーションライゲーションアッセイによって好ましくは少なくとも部分的に決定される。一実施形態では血漿又は均質化された組織試料は、特異的捕捉オリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベートされる。分離後に、DIG標識化オリゴヌクレオチドは複合体にライゲーションされ、抗DIG抗体連結ペルオキシダーゼを用いる検出が続く。非コンパートメント薬物動態解析がWINNONLINソフトウエアパッケージ(モデル200、バージョン5.2、Pharsight、Mountainview、CA)を用いて実施される。血漿1mL又は組織1mg当たりのAON(ug)のレベルは、曲線下面積(AUC)、ピーク濃度(Cmax)、ピーク濃度までの時間(Tmax)、終末相半減期及び吸収ラグ時間(tlag)を評価するために経時的にモニターされる。そのような好ましいアッセイは実験パートで開示されている。
AONは、TLR9及びTLR7を含むトール様受容体(TLR)を活性化することによって自然免疫応答を刺激できる(Kriegら、1995)。TLR9の活性化は、オリゴデオキシヌクレオド(ODN)中に存在する非メチル化CG配列の存在により、TLR9媒介サイトカイン放出を通じて自然免疫系を活性化する細菌性DNAを模倣することによって典型的には生じる。しかし2’−O−メチル修飾は、そのような可能な影響を顕著に低減することが示唆されている。TLR7は、RNA中のウラシルリピートを認識することが記載されている(Dieboldら、2006)。
TLR9及びTLR7の活性化は、自然免疫(マクロファージ、樹状細胞(DC)及びNK細胞)を含む一連の調和免疫応答を生じる(Kriegら、1995;Krieg、2000)。IP−10、TNFα、IL−6、MCP−1及びIFNαなどのいくつかのケモ−及びサイトカインが(Wagner、1999;Popovicら、2006)、この工程に関連している。炎症性サイトカインは、血液から、T及びB細胞などの追加的防御細胞を誘引する。これらのサイトカインのレベルは、in vitro検査によって調査できる。簡潔には、濃度を漸増させたAONと共にヒト全血はインキュベートされ、その後サイトカインのレベルは標準的な商業的に入手できるELISAキットによって決定される。そのような好ましいアッセイは実験パートに記載されている。5−メチルシトシンを有しない対応するオリゴヌクレオチドで処置した細胞と比較する、少なくとも1つの5−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドで処置した細胞でのアッセイにおける対応するサイトカイン濃度の比較によって、免疫原性の低下は上に述べた少なくとも1つのサイトカインの濃度の検出可能な減少に好ましくは対応する。
したがって、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び2,6−ジアミノプリンを含まない2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなる対応するオリゴヌクレオチド(すなわち、いわゆる非修飾オリゴヌクレオチド)と比較して、許容される若しくは減少した免疫原性及び/又はよりよい生体内分布及び/又は許容される若しくは改善されたRNA結合動態及び/又は熱力学的特性などの改善されたパラメーターを有する。前記非修飾オリゴヌクレオチドは、未修飾シトシン、未修飾ウラシル及び未修飾アデニンを含むオリゴヌクレオチドであるとして同定される場合もある。これらのパラメーターの各々は、当業者に公知の又は好ましくは本明細書に開示のアッセイを用いて評価できる。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の化学及び修飾については後述される。これらの追加的化学及び修飾は、前記オリゴヌクレオチドについて既に記載された化学、すなわち5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び/又は2,6−ジアミノプリンの存在と2’−O−メチルホスホロチオエートRNAを含む又はからなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせで存在する場合もある。
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドはRNA分子又は修飾RNA分子を含む又はからなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは1本鎖である。しかし、当業者は、1本鎖オリゴヌクレオチドが内部2本鎖構造を形成できることを理解する。しかし、このオリゴヌクレオチドは、本発明ではいまだ1本鎖オリゴヌクレオチドと称される。
上述の修飾に加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、後述の種々の核酸モノマー又はヌクレオチドなどのさらなる修飾を含む場合がある。種々の核酸モノマーが、本発明のオリゴヌクレオチドを生成するために用いられる場合がある。前記オリゴヌクレオチドは、RNAに基づくオリゴヌクレオチドと比較して少なくとも1つの骨格及び/又は糖修飾及び/又は少なくとも1つの塩基修飾を有し得る。
塩基修飾は、ヒポキサンチン、オロト酸、アグマチジン、ライシジン、2−チオピリミジン(例えば2−チオウラシル、2−チオチミン)、G−クランプ及びその誘導体、5置換ピリミジン(例えば5−ハロウラシル、5−プロピニルウラシル、5−プロピニルシトシン、5−アミノメチルウラシル、5−ヒドロキシメチルウラシル、5−アミノメチルシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーT)、7−デアザグアニン、7−デアザアデニン、7−アザ−2,6−ジアミノプリン、8−アザ−7−デアザグアニン、8−アザ−7−デアザアデニン、8−アザ−7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、スーパーG、スーパーA及びN4−エチルシトシン又はこれらの誘導体;N2−シクロペンチルグアニン(cPent−G)、N2−シクロペンチル−2−アミノプリン(cPent−AP)及びN2−プロピル−2−アミノプリン(Pr−AP)、シュードウラシル(pseudouracil)又はこれらの誘導体などの天然プリン及びピリミジン塩基(例えばアデニン、ウラシル、グアニン、シトシン及びチミン)の修飾バージョン;並びに2,6−ジフルオロトルエン又は脱塩基部位などの欠損塩基(例えば1−デオキシリボース、1,2−ジデオキシリボース、1−デオキシ−2−O−メチルリボース;又は、環酸素が窒素で置換されているピロリジン誘導体(アザリボース))などの縮重又はユニバーサル塩基、を含む。スーパーA、スーパーG及びスーパーTの誘導体の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,683,173号(Epoch Biosciences)において見出すことができる。cPent−G、cPent−AP及びPr−APは、siRNAに組み込まれた場合に免疫賦活性効果を低減することが示された(Peacock H.ら、J.Am.Chem.Soc.2011、133、9200)。
シュードウラシルは、ウリジン中に通常のN−グリコシドではなくC−グリコシドを有するウラシルの天然に存在する異性化バージョンである。シュードウリジン含有合成mRNAは、ウリジン含有mRNAと比較して改善された安全性プロファイルを有する場合がある(国際公開第2009127230号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは脱塩基部位又は脱塩基モノマーを含む。本発明において、そのようなモノマーは、脱塩基部位又は脱塩基モノマーと称される場合がある。脱塩基モノマー又は脱塩基部位は、核酸塩基を含む対応するモノマーと比較して核酸塩基を欠失しているモノマー又は構成要素である。したがって、本発明において、脱塩基モノマーは(核酸塩基を欠失している)オリゴヌクレオチドの構成要素部分である。そのような脱塩基モノマーは、オリゴヌクレオチドの遊離末端に存在又は連結又は付着又はコンジュゲートする場合がある。
さらに好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは1〜20個以上の脱塩基モノマーを含む。したがって、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個以上の脱塩基モノマーが本発明のオリゴヌクレオチド中に存在する場合がある。
脱塩基モノマーは、当業者に公知及び想定できるいかなる種類のものであってもよい。その非限定的例を以下に示す。
式中、R1及びR2は独立に、H、オリゴヌクレオチド又は他の脱塩基部位である(但し、R1及びR2の両方がHである場合並びにR1及びR2の両方がオリゴヌクレオチドである場合を除く)。脱塩基モノマーは、先に規定されたオリゴヌクレオチドの末端のいずれか又は両方に結合できる。1つ又は2つの脱塩基部位又は脱塩基モノマーに結合したオリゴヌクレオチドが10個未満のヌクレオチドを含み得ることに留意すべきである。この点に関して、本発明によるオリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチドを含み得る(任意選択で、1つ又は複数の脱塩基部位又は脱塩基モノマーをその一方又は両方の末端に含む)。
本発明のオリゴヌクレオチドは、その長さに応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33個の塩基修飾を含む場合がある。前記オリゴヌクレオチド中に1つより多い異なる塩基修飾を導入することも本発明に包含される。
糖修飾は、2’−O−アルキル又は2’−O−(置換)アルキル、例えば、2’−O−メチル、2’−O−(2−シアノエチル)、2’−O−(2−メトキシ)エチル(2’−MOE)、2’−O−(2−チオメチル)エチル、2’−O−ブチリル、2’−O−プロパルギル、2’−O−アリル、2’−O−(3−アミノ)プロピル、2’−O−(3−(ジメチルアミノ)プロピル)、2’−O−(2−アミノ)エチル、2’−O−(2−(ジメチルアミノ)エチル);2’−デオキシ(DNA);2’−O−(ハロアルコキシ)メチル(Arai K.ら、Bioorg.Med.Chem.2011,21,6285)、例えば、2’−O−(2−クロロエトキシ)メチル(MCEM)、2’−O−(2,2−ジクロロエトキシ)メチル(DCEM)、2’−O−アルコキシカルボニル、例えば、2’−O−[2−(メトキシカルボニル)エチル](MOCE)、2’−O−[2−(N−メチルカルバモイル)エチル](MCE)、2’−O−[2−(N,N−ジメチルカルバモイル)エチル](DCME);2’−ハロ、例えば、2’−F、FANA(2’−Fアラビノシル核酸)などの2’−O−修飾RNAなどのリボシル部位の修飾バージョン;カルバ糖、スルファ及びスルホ糖(sulfosugar)並びにアザ糖修飾;3’−O−アルキル(例えば3’−O−メチル、3’−O−ブチリル、3’−O−プロパルギル);4’−カルボキシ(例えば4’−カルボキシチミジン)(Hariら、);並びにそれらの誘導体を含む。
他の糖修飾は、「架橋」又は「二環」核酸(BNA)、例えば、ロックド核酸(LNA)、キシロ−LNA、α−L−LNA、β−D−LNA、cEt(2’−O,4’−C束縛(constrained)エチル)LNA、cMOEt(2’−O,4’−C束縛メトキシエチル)LNA、エチレン架橋核酸(ENA)、トリシクロDNA(tcDNA、tc−PS−DNA、例えば米国特許出願第20120149756号);3’−S−ホスホロチオレートDNA(例えばOrg.Biol.Chem.2013、11、966);二重束縛核酸(トリ−NA、例えばHanessianら、);アンロックド核酸(UNA);シクロヘキセニル核酸(CeNA)、アルトリオール(altriol)核酸(ANA)、ヘキシトール核酸(HNA)、フッ化HNA(F−HNA)、ピラノシル−RNA(p−RNA)、3’−デオキシピラノシル−DNA(p−DNA);モルホリノ(例えば、PMO、PPMO、PMOPlus、PMO−X);及びそれらの誘導体を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、その長さに応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個の糖修飾を含む場合がある。前記オリゴヌクレオチド中に1つより多い異なる糖修飾を導入することも本発明に包含される。一実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、LNA又はその誘導体を含む又はからなる。BNA誘導体は、例えばその全体が参照により組み込まれる国際公開第2011/097641号に記載されている。さらに好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、完全に2’−O−メチル修飾される。PMO−Xの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2011150408号に記載されている。
骨格修飾は、ホスホロチオエート(PS)、キラル的に純粋なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート(PS2)、ホスホノ酢酸(PACE)、ホスホノアセトアミド(PACA)、チオホスホノ酢酸、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、H−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルリン酸、メチルホスホロチオエート、エチルリン酸、エチルホスホロチオエート、ボラノリン酸、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノリン酸、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート及びそれらの誘導体などのRNA中に存在するリン酸ジエステルの修飾バージョンを含む。別の修飾は、ホスホラミダイト、ホスホラミデート、N3’→P5’ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、ホスホロチオジアミデート、スルファミン酸、ジメチレンスルホキシド、スルホン酸、トリアゾール、オキサリル、カルバメート、メチレンイミノ(MMI)、3’−S−ホスホロチオレート(Org.Biol.Chem.2013、11、966)及びチオアセトアミド核酸(TANA);並びにそれらの誘導体を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、その長さに応じて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32個の骨格修飾を含む場合がある。前記オリゴヌクレオチド中に1つより多い異なる骨格修飾を導入することも本発明に包含される。
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエート修飾を含む。より好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオエート修飾される。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の化学的修飾は、ペプチドベース核酸(PNA)、ホウ素クラスター修飾PNA、ピロリジンベースオキシペプチド核酸(POPNA)、グリコール又はグリセロールベース核酸(GNA)、トレオースベース核酸(TNA)、非環式トレオニノールベース核酸(aTNA)、モルホリノベースオリゴヌクレオチド(PMO、PPMO、PMO−X)、カチオニックモルホリノベースオリゴマー(PMOPlus)、統合塩基(integrated bases)及び骨格を有するオリゴヌクレオチド(ONIB)、ピロリジンアミドオリゴヌクレオチド(POM);及びそれらの誘導体を含む。
別の実施形態ではオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸及び/又はモルホリノホスホロジアミデート、又はその誘導体を含む。
別の実施形態ではオリゴヌクレオチドは、5’末端残基の5’位にモノチオリン酸部位及び/又は3’末端残基の3’位にモノチオリン酸部位を含む。これらのモノチオリン酸基は、オリゴヌクレオチド安定性を改善することが示されている(例えば米国特許出願第20120148664号−miRagen)。
核酸模倣技術の出現により、核酸それ自体と全体が同種である必要はなく、類似の、好ましくは同じハイブリダイゼーション特徴を有する分子を生成することが可能になった。そのような機能性等価物は、当然のことながら本発明における使用のためにも好適である。
当業者は、各糖、塩基及び/又は骨格が同様に修飾されない場合があることを理解する。いくつかの異なる修飾糖、塩基及び/又は骨格は、本発明の1つのオリゴヌクレオチド中に組み合わせられ得る。
当業者は、オリゴヌクレオチドの多数の合成誘導体があることも認識する。骨格修飾は、ホスホロチオエート(PS)、キラル的に純粋なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート(PS2)、ホスホノ酢酸(PACE)、ホスホノアセトアミド(PACA)、チオホスホノ酢酸、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、H−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルリン酸、メチルホスホロチオエート、エチルリン酸、エチルホスホロチオエート、ボラノリン酸、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノリン酸、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート及びそれらの誘導体などのRNA中に存在するリン酸ジエステルの修飾バージョンを含む。別の修飾は、ホスホラミダイト、ホスホラミデート、N3’→P5’ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、ホスホロチオジアミデート、スルファミン酸、ジメチレンスルホキシド、スルホン酸及びチオアセトアミド核酸(TANA);並びにそれらの誘導体を含む。
RNA/RNA二重鎖が非常に安定であることから、前記オリゴヌクレオチドはRNAを含むことが好ましい。RNAオリゴヌクレオチドが、例えばエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びRNaseHに対する耐性、追加的ハイブリダイゼーション強度、(例えば体液中での)安定性の増加、可動性の増加又は減少、活性の増加、毒性の低減、細胞内輸送の増加、組織特異性などの追加的特性を有するRNAを提供する修飾を含むことは好ましい。さらに本発明のオリゴヌクレオチドと複合体化したmRNAは、好ましくはRNaseH切断に感受性ではない。好ましい修飾は上に同定されている。
したがって、本発明は、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、5−メチルピリミジン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を通じて繋がれた2’−O−メチルRNAモノマーからなり、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンは、独立に5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び/又は2,6−ジアミノプリンによってそれぞれ置換されていることが最も好ましい。本発明に包含され、本明細書で開示される好ましい修飾及び非修飾オリゴヌクレオチドは、表1に示す配列番号14〜90の内の1つから選択される塩基若しくはヌクレオチド配列の1つを含む又はからなる。表現「配列番号14〜90から選択されるヌクレオチド又は塩基配列によって表されるオリゴヌクレオチド」は、表現「配列番号14〜90の1つから選択されるヌクレオチド又は塩基配列によって表されるオリゴヌクレオチド」又は表現「配列番号14〜90の一覧表から選択されるヌクレオチド又は塩基配列によって表されるオリゴヌクレオチド」によって置き換えることができる。本明細書に参照する配列番号の他の群についても同様である。
好ましい非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号14〜90の1つに由来するものであり、配列番号91、93〜170から選択される塩基又はヌクレオチド配列の1つを含む又はからなる(本発明に包含され、本明細書に開示される)。
修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号14〜90の1つに由来するものであり、配列番号92、171〜213、215から選択される塩基又はヌクレオチド配列の1つを含む又はからなる(本発明に包含され、本明細書に開示される)。
配列表中に同一の2つの配列が存在すること、すなわち、配列番号91は配列番号132と同一であり、配列番号92は配列番号199と同一であることに留意されたい。
これらのオリゴヌクレオチドの各々を表す配列は表1〜3及び配列表に開示されている。最も好ましいオリゴヌクレオチドは以下により詳細に記載される。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、
少なくとも1つ、好ましくはすべてのシトシンが5−メチルシトシンで置換されているもの、
少なくとも1つ、好ましくはすべてのシトシンが5−メチルシトシンで置換され、かつ少なくとも1つ、好ましくはすべてのウラシルが5−メチルウラシルで置換されているもの、
少なくとも1つ、好ましくはすべてのシトシンが5−メチルシトシンで置換され、かつ少なくとも1つ、好ましくはすべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンで置換されているもの、
少なくとも1つ、好ましくはすべてのシトシンが5−メチルシトシンで置換され、かつ少なくとも1つ、好ましくはすべてのウラシルが5−メチルウラシルで置換され、かつ少なくとも1つ、好ましくはすべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンで置換されているもの、
少なくとも1つ、好ましくはすべてのウラシルが5−メチルウラシルで置換されているもの、
少なくとも1つ、好ましくはすべてのウラシルが5−メチルウラシルで置換され、かつ少なくとも1つ、好ましくはすべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンで置換されているもの、又は
少なくとも1つ、好ましくはすべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンで置換されているもの
であり得る。
しかし、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの又は少なくとも2つの又は少なくとも半分の又はすべてのシトシンが5−メチルシトシンで置換されているものでもあり得る。好ましくは配列番号14〜90に基づく本発明の非修飾オリゴヌクレオチドがx個のシトシンを有する場合、xは1〜33の範囲の整数であり、本発明の対応する修飾オリゴヌクレオチドは1、2、3、…(x−2)、(x−1)、x個の5−メチルシトシンを有し得る。
そのような非修飾オリゴヌクレオチドにおいてxが3である場合、対応する修飾オリゴヌクレオチド中の5−メチルシトシンの数は、1、2又は3個である。
そのような非修飾オリゴヌクレオチドにおいてxが4である場合、対応する修飾オリゴヌクレオチドにおける5−メチルシトシンの数は1、2、3又は4個である。
そのような非修飾オリゴヌクレオチドにおいてxが5である場合、対応する修飾オリゴヌクレオチドにおける5−メチルシトシンの数は1、2、3、4又は5個である。
そのような非修飾オリゴヌクレオチドにおいてxが6である場合、対応する修飾オリゴヌクレオチドにおける5−メチルシトシンの数は1、2、3、4、5又は6個である。
そのような非修飾オリゴヌクレオチドにおいてxが7である場合、対応する修飾オリゴヌクレオチドにおける5−メチルシトシンの数は1、2、3、4、5、6又は7個である。
そのような非修飾オリゴヌクレオチドにおいてxが8である場合、対応する修飾オリゴヌクレオチドにおける5−メチルシトシンの数は1、2、3、4、5、6、7又は8個である。
5−メチルウラシルでのウラシル置換及び2,6−ジアミノプリンでのアデニン置換についても同様。
本発明のオリゴヌクレオチドは、DMDのための薬物としての使用のためであることが好ましく、前記オリゴヌクレオチドは治療用RNA調節における使用のためであることがより好ましい。したがって、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DMD又は個体のDNAのコードセンス鎖由来のジストロフィンmRNA前駆体の特異的配列に逆相補的であるオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、前記mRNA前駆体の前記配列に対して結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる。DMDに関するRNA調節の対象は、疾患の経過を妨げることができる最終目的を伴って、転写物のオープンリーディングフレームを修復し、短いが(さらに)機能性のジストロフィンタンパク質の発現を誘導するために、DMD又はジストロフィンmRNA前駆体中の1つ又は複数の特異的エクソンをスキップすることである。
したがって、好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞において、器官において、組織において及び/又は個体においてDMD又はジストロフィンmRNA前駆体におけるエクソンスキッピングを誘導するために用いられる。エクソンスキッピングによって、成熟DMD又はスキップされたエクソンを含有しないジストロフィンmRNAが生じ、それにより前記エクソンがアミノ酸をコードする場合、さらに短いタンパク質産生物の発現をもたらすことができる。エクソンのスキッピングは、スプライシング調節エレメント、スプライス部位及び/又はイントロン分岐点配列を含む特異的エクソン内部配列へのAONの結合によって好ましくは誘導される。
本明細書において、DMD mRNA前駆体は、ジストロフィンタンパク質をコードしているDMD遺伝子のmRNA前駆体を好ましくは意味する。変異体DMD mRNA前駆体は、罹患していないヒトの野生型DMD mRNA前駆体と比較して、BMD又はDMD患者の変異を有するmRNA前駆体に対応し、異常なタンパク質(BMD)(のレベルの低下)又は機能性ジストロフィンの欠如(DMD)を生じる。DMD mRNA前駆体はジストロフィンmRNA前駆体とも称される。DMD遺伝子は、ジストロフィン遺伝子と称されることもある。ジストロフィンとDMDとは、本明細書全体を通じて互換的に用いられ得る。
患者は、本明細書で後に定義されるDMD若しくはBMDを有する患者又は患者の遺伝的背景のためにDMD若しくはBMDを発症しやすい患者を意味することを好ましくは意図する。DMD患者の場合では、使用されるオリゴヌクレオチドは前記患者のDMD遺伝子中に存在する1つの変異を好ましくは補正し、BMDタンパク質様のタンパク質を生成する。前記タンパク質は、好ましくは、本明細書で後に定義される機能性又は半機能性ジストロフィンである。BMD患者の場合、使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記患者のBMD遺伝子中に存在する1つの変異を補正し、前記BMD患者に元々存在していたジストロフィンよりも機能的なジストロフィンを生成する。
本明細書において、機能性ジストロフィンは、好ましくは、配列番号1に同定するアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ジストロフィンである。本明細書において、半機能性ジストロフィンは、好ましくはそのN末端部分(N末端の最初の240アミノ酸)における作用性結合ドメイン、システインリッチドメイン(アミノ酸3361〜3685まで)及びC末端ドメイン(C末端の最後の325アミノ酸)(当業者に知られているように、これらのドメインの各々は野生型ジストロフィンに存在する。)を有するタンパク質に対応するBMD様ジストロフィンである。本明細書に示すアミノ酸は、配列番号1によって示される野生型ジストロフィンのアミノ酸に対応する。換言すると、機能性又は半機能性ジストロフィンは、野生型ジストロフィンと少なくとも同程度の活性を示すジストロフィンである。「少なくとも同程度の」は好ましくは、野生型機能性ジストロフィンの対応する活性の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は100%を意味する。これに関して、機能性ジストロフィンの活性は、好ましくはアクチンへの及びジストロフィン関連糖タンパク質複合体(DGC又はDAPC)への結合である(Ehmsen Jら、2002)。
当業者に知られているように、アクチンへの及びDGC若しくはDAPC複合体へのジストロフィンの結合は、ジストロフィーが疑われる筋肉についての治療前及び/又は治療後のコントロール(非DMD)生検から、全タンパク質抽出物を用いる共免疫沈降又は複合体の異なるメンバーと反応する種々の抗体を用いる横断面の免疫蛍光分析のいずれかによって可視化され得る。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを罹患している個体又は患者は、典型的にはジストロフィンをコードしている遺伝子(DMD又はジストロフィン遺伝子)中に(完全なタンパク質の合成を妨害する)変異を有する、すなわち中途の終止コドンがC−末端の合成を妨害する。ベッカー型筋ジストロフィーではジストロフィン遺伝子も野生型と比較して変異を有するが、変異は典型的には中途の終止コドンを生じず、C−末端は典型的には合成される。結果として、野生型タンパク質と必ずしも同程度の活性ではないが、少なくとも同じ種類の活性を有する機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質が合成される。典型的にはBMD患者のゲノムは、N末端部分(N末端の最初の240アミノ酸)、システインリッチドメイン(アミノ酸3361〜3685まで)及びC末端ドメイン(C末端の最後の325アミノ酸)を含むが、大部分の場合にはその中央桿状ドメインが野生型ジストロフィンのものよりも短いジストロフィンタンパク質をコードする(Monacoら、1988)。DMDの治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導エクソンスキッピングは、典型的にはエクソンをスキッピングすることによってmRNA前駆体中(好ましくは中央桿状ドメイン中)の中途の終止を克服し、オープンリーディングフレームを補正し、(タンパク質はより小さな桿状ドメインの結果としていくらか小さいが)C−末端を含むジストロフィンタンパク質の残りの合成を可能にすることを対象とする。好ましい実施形態では、DMDを有し、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドで処置されている個体は、野生型ジストロフィンと少なくとも同程度の活性を示すジストロフィンを提供される。前記個体がデュシェンヌ患者である又はデュシェンヌ患者であると疑われる場合、機能性又は半機能性ジストロフィンは、BMDを有する個体のジストロフィンである。典型的には、前記ジストロフィンはアクチン及びDGC又はDAPCの両方と相互作用できるが、その中央桿状ドメインは野生型ジストロフィンのものよりも短い場合があることがより好ましい(Monacoら、1988)。野生型ジストロフィンの中央桿状ドメインは24個のスペクトリン様リピートを含む。例えば、本明細書で提供するジストロフィンの中央桿状ドメインは、アクチンに及びDGCに結合できる限り、5〜23、10〜22又は12〜18個のスペクトリン様リピートを含み得る。
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて個体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの1つ又は複数の症状を緩和することは、任意の次のアッセイによって評価できる:歩けなくなるまでの時間の延長、筋力の改善、重量物を持ち上げる能力の改善、床から起き上がるために要する時間の改善、9メートル歩行時間の改善、4段上るために要する時間の改善、脚機能グレード(leg function grade)の改善、肺機能の改善、心臓機能の改善、生活の質の改善。これらのアッセイの各々は当業者に公知である。一例としてManzurら(2008)の発表は、これらのアッセイの各々の詳細な説明を示している。これらのアッセイの各々について、アッセイで測定されたパラメーターの検出可能な改善又は延長が見出されると、それはデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの1つ又は複数の症状が本発明のオリゴヌクレオチドを用いて個体において緩和されていることを好ましくは意味する。検出可能な改善又は延長は、好ましくはHodgettsら(2006)に記載の統計的に有意な改善又は延長である。代替的に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの1つ又は複数の症状の緩和は、筋繊維の機能、完全性及び/又は生存時間の改善を測定することによって評価できる。好ましい方法では、DMD若しくはBMD患者の1つ若しくは複数の症状は、緩和される及び/又はDMD若しくはBMD患者由来の1つ若しくは複数の筋肉細胞の1つ又は複数の特徴は改善される。そのような症状又は特徴は、細胞、組織レベル又は患者自身についても評価できる。
患者由来の筋肉細胞の1つ又は複数の特徴の緩和は、患者由来の筋原細胞又は筋肉細胞での次の任意のアッセイによって評価できる:筋肉細胞によるカルシウム取り込みの低減、コラーゲン合成の低下、形態の変化、脂質生合成の変化、酸化ストレスの低下、及び/又は筋繊維の機能、完全性及び/又は生存時間の改善。これらのパラメーターは、筋肉生検の横断面の免疫蛍光及び/又は組織化学的分析を用いて通常評価される。
筋繊維の機能、完全性及び/又は生存時間の改善は、次のアッセイの少なくとも1つを用いて評価できる:血液中のクレアチンキナーゼの検出可能な減少、ジストロフィーであると疑われる筋肉の生検横断面中の筋繊維の壊死の検出可能な減少及び/又はジストロフィーであると疑われる筋肉の生検横断面における筋繊維の直径の均一性の検出可能な増加。これらのアッセイの各々は当業者に公知である。
クレアチンキナーゼは、Hodgettsら(2006)に記載されるように血液中に検出できる。クレアチンキナーゼにおける検出可能な減少は、治療前の同じDMD又はBMD患者におけるクレアチンキナーゼの濃度と比較して5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上の減少を意味し得る。
筋繊維の壊死の検出可能な減少は、好ましくは筋肉生検において、より好ましくは、Hodgettsら(2006)に記載されるように生検横断面を用いて評価される。壊死の検出可能な減少は、面積の5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上の減少(壊死は生検横断面を用いて同定された)である場合がある。減少は、治療前の同じDMD又はBMD患者において評価された壊死と比較することによって測定される。
筋繊維の直径の均一性の検出可能な増加は、好ましくは筋肉生検横断面において、より好ましくはHodgettsら(2006)に記載されるように評価される。増加は、治療前の同じDMD又はBMD患者における筋繊維の直径の均一性との比較によって測定される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質(典型的にはDMDの場合)を提供し、前記個体における異常なジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させることができる(典型的にはBMDの場合)ことが好ましい。
異常なジストロフィンmRNA、又は異常なジストロフィンタンパク質の産生を減少させることは、好ましくは異常なジストロフィンmRNA、又は異常なジストロフィンタンパク質の初期量の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%以下を意味し、RT PCR(mRNA)又は免疫蛍光又はウエスタンブロット分析(タンパク質)によってまだ検出可能である。異常なジストロフィンmRNA又はタンパク質は、本明細書において少機能性(less functional)(前述の野生型機能性ジストロフィンタンパク質と比較)又は非機能性ジストロフィンmRNA又はタンパク質とも称される。非機能性ジストロフィンタンパク質は、好ましくはアクチン及び/又はDGCタンパク質複合体のメンバーに結合できないジストロフィンタンパク質である。非機能性ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンmRNAは、タンパク質の無処理のC−末端を有するジストロフィンタンパク質を典型的には有しない又はコードしない。機能性又は半機能性ジストロフィンmRNA又はタンパク質の検出は、異常なジストロフィンmRNA又はタンパク質についてと同様に行うことができる。
DMD患者に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質が提供されると、DMDの原因の少なくとも一部は除かれる。したがって、DMDの症状が少なくとも部分的に緩和されることが期待される。スキッピング頻度の増強もDMD又はBMD個体の筋肉細胞において産生される機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを増加させる。
エクソンは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての有効な標的であることが示されているスプライシング調節エレメントを含む1つ又は複数の特異的配列を含有する(Aartsma−Rusら、2010)。したがって一実施形態は、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供するためのオリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体エクソン中のこれらのスプライシング制御エレメントを特異的に対して結合する、標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は遮断する配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体中のこれらのスプライシング制御エレメントに対して結合及び/又は標的化及び/又はハイブリダイズ及び/又は遮断できる。さらに、両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識される場合にだけ、エクソンが生じるmRNA中に含まれることから、スプライス部位は本発明のオリゴヌクレオチドの他の標的である。したがって一実施形態は、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供するためのオリゴヌクレオチドであって、ジストロフィンmRNA前駆体のエクソンのスプライス部位の一方又は両方に特異的に対して結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は遮断する配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体のエクソンのこれらのスプライス部位の一方又は両方に対して結合及び/又は標的化、ハイブリダイズ及び/又は遮断できる。通常エクソンのスプライス部位は、前記エクソン中に存在する1、2、3個以上のヌクレオチド及び隣接する又は近隣のイントロン中に存在する1、2、3以上のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ジストロフィンmRNA前駆体のイントロン領域に単独で結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが用いられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、前記イントロン領域に結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる。しかし、これは必要ではない。イントロン特異的配列及びエクソン特異的配列に標的化する及び/又は結合する及び/又はハイブリダイズする及び/又は標的化できる及び/又は結合できる及び/又はハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。当然のことながらオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンエクソン又はイントロンの配列全体に対して結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする必要はない。そのようなオリゴヌクレオチドもジストロフィンエクソン又はイントロンの配列全体に対して結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる必要はない。そのようなエクソン又はイントロンの一部に対して特異的に結合、標的化及び/又はハイブリダイズする及び/又は特異的に結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドは、好ましい。オリゴヌクレオチドが用いられ、前記オリゴヌクレオチドは、ジストロフィンエクソン及び/又はイントロンの少なくとも一部(前記部分は少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドを有する)に好ましくは逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる。
ジストロフィンmRNA前駆体のスプライシングは、イントロン分岐点及び隣接イントロンのスプライス部位が関与する2つの連続エステル転移反応を介して生じる。したがってオリゴヌクレオチドは、エクソンスキッピングのために用いられ、前記オリゴヌクレオチドは、そのような分岐点及び/又はスプライス部位に対して結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる配列を含む。前記スプライス部位及び/又は分岐点は、ジストロフィンmRNA前駆体中に存在することが好ましい。
スプライス部位が共通配列を含有することから、スプライス部位に対して結合可能である及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド部分又はその機能性等価物の使用は、偶然のハイブリダイゼーションの危険を含む。スキップされるエクソン部位以外の他のスプライス部位への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、スプライシング工程の正確さを容易に妨げる場合がある。スプライス部位に対して結合する及び/又はハイブリダイズする及び/又は標的化する及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドの使用に関連するこれら及び他の潜在的な問題を克服するために、最も好ましい実施形態は、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供するためのオリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチド又はその機能性等価物は、ジストロフィンmRNA前駆体エクソンの特異的部分に対して結合する及び/又はハイブリダイズする及び/又は標的化する及び/又は結合できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は標的化できる。エクソンは、非コードイントロン配列に典型的にはさらに特異的であるコード配列を含有する。ジストロフィンmRNA前駆体エクソンの特異的部分に対して結合する及び/又はハイブリダイズする及び/又は標的化する及び/又は結合できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は標的化できる前記オリゴヌクレオチドは、前記ジストロフィンmRNA前駆体中の予測される(anticpated)エクソンのスプライシング制御配列及び/又は構造を特異的に遮断、妨げる及び/又は阻害できることが好ましい。そのようなスプライシング制御配列及び/又は構造を妨げることは、そのようなエレメントがエクソン内に位置づけられる有利点を有する。配列関連標的外効果についての危険性は、したがって限定的である。スキップされるエクソンの内部のオリゴヌクレオチドを提供することによって、スプライシング装置からエクソンを遮蔽できる。したがってスキップされるエクソンを認識するスプライシング装置の不全は、最終mRNAからのエクソンの排除をもたらす。本実施形態は、スプライシング機構(エクソンの接合)の酵素工程を直接妨げない。これは、方法をさらに特異的及び/又は信頼できるものにすると考えられる。エクソンに任意の点で結合可能である及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は結合する及び/又はハイブリダイズする及び/又は標的化するオリゴヌクレオチドは、前記エクソンのスキッピングを誘導できることが見出されている。
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能性等価物又は等価物を含む場合がある。オリゴヌクレオチドの機能性等価物又は等価物は、好ましくは本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを意味し、1つ又は複数のヌクレオチドが置換されており、前記機能性等価物又は等価物の活性は、少なくともある程度保持されている。オリゴヌクレオチドの機能性等価物又は等価物を含む前記オリゴヌクレオチドの活性は、機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供することが好ましい。オリゴヌクレオチドの機能性等価物又は等価物を含む前記オリゴヌクレオチドの前記活性は、したがって、機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質の量を定量することによって好ましくは評価される。本明細書において、好ましくは、機能性又は半機能性ジストロフィンは、アクチン及びDGC(又はDAPC)タンパク質複合体のメンバーに結合できるジストロフィンであるとして定義される。オリゴヌクレオチドの前記機能性等価物の前記活性の評価は、好ましくはRT−PCR及び配列決定(RNAレベルで;特異的エクソンスキッピングの検出のために)によって、又は免疫蛍光及びウエスタンブロット分析(タンパク質レベルで:タンパク質修復の検出のために)によって行われる。前記活性は、それが機能性等価物又は等価物が由来する前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも50%又は少なくとも60%又は少なくとも70%又は少なくとも80%又は少なくとも90%又は少なくとも95%以上を示す場合に好ましくは少なくともある程度保持されている。本明細書全体を通じて、オリゴヌクレオチドという語が用いられる場合、それは本明細書に記載のその機能性等価物又はその等価物によって置き換えられ得る。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの等価物又は機能性等価物は修飾を含む。本明細書全体を通じて、オリゴヌクレオチドという語が用いられる場合、特に断らない限り、それは本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって置き換えられ得る。
したがって、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、ジストロフィンmRNA前駆体エクソンに逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる配列を含む又はからなるヌクレオチド配列よって表される、オリゴヌクレオチド又はその機能性等価物又はその等価物の使用は、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル及び2,6−ジアミノプリンのいずれも含まないそれらの対応物(すなわち、いわゆる非修飾オリゴヌクレオチド)と比較して、前記オリゴヌクレオチドのパラメーター(本明細書で先に定義されている。)の少なくとも1つに好影響を有すると考えられ、したがって、患者のDMD若しくはBMD細胞及び/又はDMD若しくはBMD患者において治療結果の改善を呈すると考えられる。そのような治療結果は、
DMD若しくはBMDの1つ又は複数の症状を緩和すること、及び/又は
患者由来の筋肉細胞の1つ又は複数の特徴を緩和すること、及び/又は
前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供すること、及び/又は
前記個体における異常なジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に低下させること
によって特徴付けられ得る。
これらの特性の各々は本明細書において既に説明されている。
オリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体エクソン44〜55の少なくとも一部に対して結合する及び/又は標的化する及び/又は逆相補的である及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は逆相補的である配列を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。しかし、前記オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドであり得る。本明細書全体を通じて、オリゴヌクレオチドを表す前記配列は塩基又はヌクレオチド配列と称されることもある。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体のエクソンの一部に対して結合する及び/又は標的化する及び/又は逆相補的である及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は標的化できることが可能である配列を含む又はからなるヌクレオチド配列又は塩基配列によって表されることが好ましい。前記結合又は標的化部分は、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%又は少なくとも95%、又は98%及び100%までであり得る。オリゴヌクレオチドはヌクレオチド又は塩基配列によって表され得、前記ヌクレオチド又は塩基配列は、本明細書に記載のジストロフィンmRNA前駆体のエクソン44〜55からなる群から選択されるエクソンの少なくとも一部及び追加的隣接配列に対して結合する及び/又は標的化する及び/又は逆相補的である及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は標的化できる配列を含む。さらに好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの前記結合部分又は標的化部分の長さは、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドである。いくつかの種類の隣接配列が使用され得る。隣接配列は、前記オリゴヌクレオチドへのタンパク質の結合を改変するために、又は前記オリゴヌクレオチドの熱力学的特性を改変するために使用されることが好ましく、標的RNA結合親和性を改変するために使用されることがより好ましい。別の好ましい実施形態では、追加的隣接配列は、前記エクソン中に存在しないジストロフィンmRNA前駆体の配列に逆相補的である。そのような隣接配列は、前記エクソンの分岐点及び/又はスプライス部位受容体若しくはドナー共通配列を含む又はからなる配列に好ましくは結合及び/又は標的化可能である。好ましい実施形態では、そのような隣接配列は、前記エクソンに隣接するジストロフィンmRNA前駆体のイントロンの配列を含む又はからなる配列に対して結合及び/又は標的化可能である。
好ましい一実施形態は、機能性若しくは半機能性ジストロフィンタンパク質を前記個体に提供するためのオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチド又はその機能性等価物又はその等価物は、
ジストロフィンmRNA前駆体エクソン(閉構造)の別の部分にハイブリダイズするジストロフィンmRNA前駆体エクソンの領域に対して結合する、結合できる、標的化する、ハイブリダイズする又は逆相補的である配列、及び
前記ジストロフィンmRNA前駆体(開構造)中にハイブリダイズしないジストロフィンmRNA前駆体エクソンの領域に対して結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は逆相補的である及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる配列
を含む配列又は塩基配列によって表される、オリゴヌクレオチドを提供する。
本実施形態に関して特許出願国際公開第2004/083446号を参照する。RNA分子は、主に同じRNA内の相補的な又は部分的に相補的なストレッチの塩基対形成のために強固な二次構造を示す。RNA中の構造がRNAの機能において役割を果たすと長い間考えられてきた。理論に制約されることなく、エクソンのRNAの二次構造がスプライシング工程を構築することにおいて役割を果たすと考えられる。その構造を通じて、エクソンはmRNAに含まれる必要がある部分として認識される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはエクソンの構造を妨げることができ、したがって、前記エクソンのスプライシング装置を妨げることができ、スプライシング装置からエクソンをマスキングでき、それにより前記エクソンのスキッピングを誘導できる。多数のオリゴヌクレオチドが実際にこの能力を含み、他よりもいくらか効率的であることが見出された。理論に制約されることなく、開構造を有する重複がオリゴヌクレオチドの浸潤効率を改善する(すなわちオリゴヌクレオチドが構造に侵入できる効率を増加させる)、一方で閉構造を有する重複は次にエクソンのRNAの二次構造を妨げる効率を増加させると考えられる。閉及び開両方の構造への部分的逆相補性の長さは極度に制限されてはいないことが見出されている。本発明者らは、いずれの構造でも種々の長さの逆相補性を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物で高い効率を観察した。(逆)相補性という用語は、本明細書において生理的条件下で核酸の別のストレッチにハイブリダイズできる核酸のストレッチを指して用いられる。ハイブリダイゼーション条件は本明細書において後述される。したがって、相補性の領域中のすべての塩基が反対鎖の塩基と対合できることが絶対に要求されるわけではない。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する場合、例えば相補鎖上の塩基と塩基対合しない残基を組み込みたい場合がある。細胞中の環境条件下ではミスマッチは、ある程度許容される場合があり、ヌクレオチドのストレッチは相補部分にハイブリダイズできる。
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(前記開構造又は前記閉構造のいずれか)の逆相補的部分は、少なくとも3個、より好ましくは少なくとも4個の連続的なヌクレオチドを含む。逆相補的領域は、好ましくは、組み合わされた場合にそれらがmRNA前駆体中のエクソンに特異的であるように設計される。そのような特異性は、系の他のmRNA(前駆体)中の実際の配列に依存することから、種々の長さの逆相補的領域とともに作出され得る。1つ又は複数の他のmRNA前駆体もオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるというリスクは、オリゴヌクレオチドのサイズの増加とともに減少する。逆相補性の領域中にミスマッチを含むが、mRNA前駆体中の標的化領域にはハイブリダイズする能力を保持しているアンチセンスオリゴヌクレオチドが本発明において使用可能であることは明らかである。しかし、少なくとも逆相補的部分は、1つ又は複数の逆相補的領域中にそのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドより高い効率及び高い特異性を通常有することから、そのようなミスマッチを含まないことが好ましい。より高いハイブリダイゼーション強度(すなわち反対鎖内の相互作用の数の増加)は、系のスプライシング機構を妨げる工程の効率の増加において好適であると考えられる。逆相補性は90〜100%が好ましい。一般にこれは、20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおいて1又は2個のミスマッチを、40ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおいて1〜4個のミスマッチを許容する。したがって、本発明者らは、10〜50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおいて1、2、3、4、5個のミスマッチを有する場合がある。0、1又は2個のミスマッチが10〜50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおいて存在することが好ましい。
構造(すなわち開構造及び閉構造)は、エクソンが属するmRNA前駆体の内容において十分分析される。そのような構造は、実際のRNAにおいて分析できる。しかし、構造モデル化プログラムを用いてRNA分子の(最も低いエネルギーコストでの)二次構造を非常に良く予測することが現在可能である。好適なプログラムの非限定的例は、RNA構造バージョン4.5又はRNA mfoldバージョン3.5(Zukerら、2003)である。当業者は、好適な再現性でエクソンの期待できる構造を、所与のヌクレオチド配列に予測できる。最良の予測は、そのようなモデリングが前記エクソン及び隣接イントロン配列両方を伴って提供される場合に得られる。全長mRNA前駆体の構造をモデル化する必要は典型的にはない。
オリゴヌクレオチドが対象とする開構造及び閉構造は好ましくは相互に隣接する。このようにオリゴヌクレオチドの開構造へのアニーリングが閉構造の開放を誘導し、直ちにアニーリングはこの閉構造に進行すると考えられる。この作用を通じて、それまでの閉構造は異なるコンホメーションになる。しかし、潜在的(隠された(cryptic))スプライス受容体及び/又はドナー配列が標的化エクソン内に存在する場合、新規エクソンインクルージョンシグナル又はスプライシング制御配列、エレメント、構造若しくはシグナルが生成され、異なる(ネオ)エクソン(すなわち、異なる5’末端、異なる3’末端、又はその両方を有する。)が明らかになることがある。この種の活性は、標的化エクソンがmRNAから排除されることから本発明の範囲内である。(標的化エクソンの一部を含有する)新規エクソンのmRNA中での存在は、標的化エクソン(それ自体が)排除されるという事実を変化させない。ネオエクソンのインクルージョンは、時折生じるだけの副作用として観察される場合がある。エクソンスキッピングが、変異の結果として破壊されるジストロフィンのオープンリーディングフレーム(の一部)を修復するために用いられる場合、2つの可能性がある。1つは、ネオエクソンが読み枠の修復において機能的である、一方で他の場合には読み枠は修復されないことである。エクソンスキッピングの手段によってジストロフィン読み枠を修復するためのオリゴヌクレオチドを含む化合物を選択する場合、これらの状態下でこれらのオリゴヌクレオチドを含むこれらの化合物だけが選択され、(ネオエクソンを含む又は含まない)ジストロフィンオープンリーディングフレームを修復するエクソンスキッピングを実際に生じることは当然のことながら明白である。
さらに提供されるのは、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供するためのオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチド又はその機能性等価物又はその等価物は、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、ジストロフィンmRNA前駆体のエクソンのRNA中のセリン−アルギニン(SR)タンパク質についての結合部位に逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる配列を含むヌクレオチド又は塩基配列によって表される。特許出願国際公開第2006/112705号において本発明者らは、エクソンスキッピングを誘導することにおけるエクソン内部アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性と前記AONの標的mRNA前駆体部位において(例えばESEfinderによって)予測されるSR結合部位の存在との間の相関の存在を開示した。したがって、一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ジストロフィンエクソンのRNAにおけるSR(Ser−Arg)タンパク質のための(推定)結合部位を決定すること、並びに、前記RNAに逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを含み、前記(推定)結合部位に少なくとも部分的に重複する対応する化合物を製造することを含む方法によって生成される。用語「少なくとも部分的に重複」は、SR結合部位の単一のヌクレオチドだけの重複及び前記結合部位の複数のヌクレオチド並びに前記結合部位の完全な重複を含むこととして本明細書において定義される。本実施形態は、前記RNAの二次構造から前記RNA(閉構造)の別の部分にハイブリダイズされる領域及び前記構造(開構造)にハイブリダイズされない領域を決定すること、並びに次に前記(推定)結合部位に少なくとも部分的に重複し、前記閉構造の少なくとも一部に重複し、前記開構造の少なくとも一部に重複するオリゴヌクレオチドを生成することを好ましくはさらに含む。このように本発明者らは、mRNA前駆体からmRNAへのエクソンインクルージョンを妨げられるオリゴヌクレオチドを得る機会を増加させる。最初に選択されるSR−結合領域が要求される開−閉構造を有さず、その場合、別の(第二)SRタンパク質結合部位が選択され、次いで、開−閉構造の存在について検査されることは可能である。この工程は、SRタンパク質結合部位及び(部分的に重複する)開−閉構造を含有する配列が同定されるまで継続される。次いで、この配列は、前記配列に逆相補的であるオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するためのそのような方法は、記載された順序を逆にすることによっても実行される、すなわち最初に(ジストロフィンエクソン由来のRNAの二次構造から)前記RNA(閉構造)の別の部分にハイブリダイズされる構造になる領域及び前記構造(開構造)中にハイブリダイズされない領域を決定すること並びに次に前記オリゴヌクレオチド少なくとも一部が前記閉構造に逆相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも別の一部が前記開構造に逆相補的であるオリゴヌクレオチドを生成することを含んでオリゴヌクレオチドを生成する。次いでこれには、SRタンパク質結合部位が前記開/閉構造に少なくとも重複するかどうかを決定することが続く。このように国際公開第2004/083446号の方法は改善される。さらに別の実施形態では選択は、同時に実行される。
いかなる理論にも制約されることなく、SRタンパク質結合部位を対象とする又は標的化するオリゴヌクレオチドの使用は、SRタンパク質のSRタンパク質の結合部位への結合を(少なくとも部分的に)損ない、破壊されたスプライシング又は損なわれたスプライシングを生じると現在考えられている。
開/閉構造及びSRタンパク質結合部位は、部分的に重複することが好ましく、さらに好ましい開/閉構造は、SRタンパク質結合部位に完全に重複する又はSRタンパク質結合部位が開/閉構造に完全に重複する。これは、エクソンインクルージョンの破壊の改善を可能にする。
共通スプライス部位及び分岐点イントロン配列に加えて、多数の(すべてではないが)エクソンは、これだけに限らないがスプライソソームによる本来のスプライス部位の認識を促進するためのエクソンスプライシングエンハンサー(ESE)配列などのスプライシング制御配列を含有する(Cartegniら、2002;及びCartegniら、2003)。SRタンパク質と称される、スプライシング因子のサブグループは、これらのESEに結合でき、U1及びU2AFなどの他のスプライシング因子を(明らかにされていない)スプライス部位に動員する。4個の最も豊富なSRタンパク質(SF2/ASF、SC35、SRp40及びSRp55)の結合部位は、詳細に分析されており、これらの結果はESEfinder(これらのSRタンパク質についての潜在的結合部位を予測するウェブ情報源)で実行される(Cartegniら、2002;及びCartegniら、2003)。オリゴヌクレオチドの有効性と、前記オリゴヌクレオチドによって標的化される部位でのSF2/ASF、SC35及びSRp40結合部位の存在/欠如と、の間には相関がある。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、SRタンパク質に対する結合部位に逆相補的である及び/又は標的化する及び/又は結合する及び/又はハイブリダイズする及び/又は標的化できる及び/又は結合できる及び/又はハイブリダイズできる上記オリゴヌクレオチドを提供する。前記SRタンパク質は、SF2/ASF又はSC35又はSRp40が好ましい。
一実施形態では、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、転写物においてジストロフィンエクソンのスプライシングを補正するために必要である制御RNA配列に特異的に対して結合することができる若しくは標的化することができる及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド若しくはその機能性等価物又はその等価物を用いることによって、DMD患者に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質が提供される。いくつかのcis−作用性RNA配列が転写物中のエクソンのスプライシングの補正のために必要である。特に、エクソンスプライシングエンハンサー(ESE)、エクソン認識配列(ERS)及び/又はエクソンスプライシングサイレンサー(ESS)などのエレメントは、構成的及び代替的エクソンの特異的及び効率的なスプライシングを制御するために同定される。エレメントに対して結合する及び/又は標的化する及び/又は逆相補的である及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又はハイブリダイズできる及び/又は標的化できる配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド又は塩基特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)を用いて、それらの制御機能は乱され、DMDについて示されるようにエクソンはスキップされる。したがって、好ましい一実施形態では、エクソンスプライシングエンハンサー(ESE)、エクソン認識配列(ERS)及び/又はエクソンスプライシングサイレンサー(ESS)に逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド若しくはその機能性等価物又はその等価物は用いられる。
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンmRNA前駆体エクソン44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54又は55の少なくとも一部に逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる配列又は塩基配列を含む又はからなり、前記部分は少なくとも10ヌクレオチドを有する。しかし、前記部分は、少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドを有する場合もある。上述のジストロフィンエクソンに関して、本発明者らは、オリゴヌクレオチドが結合する及び/又は逆相補的である及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる前記エクソンのヌクレオチドのストレッチ(以下に規定される配列番号2〜13)を提供する。
エクソン44のスキッピングに関して、
5’−GCGAUUUGACAGAUCUGUUGAGAAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUCUUAAG−3’(配列番号2)
エクソン45のスキッピングに関して、
5’−GAACUCCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUUGUCAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAAGAAAUAAUUCAGCAAUCCUCAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAAUUGGGAAGCCUGAAUCUGCGGUGGCAGGAGGUCUGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAAGAG−3’(配列番号3)
エクソン46のスキッピングに関して、
5’−GCUAGAAGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUUUUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUCAAG−3’(配列番号4)
エクソン47のスキッピングに関して、
5’−UUACUGGUGGAAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGAUAAAG−3’(配列番号5)
エクソン48のスキッピングに関して、
5’−GUUUCCAGAGCUUUACCUGAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUGCUGCUGUGGUUAUCUCCUAUUAGGAAUCAGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGAAGGACCAUUUGACGUUCAG−3’(配列番号6)
エクソン49のスキッピングに関して、
5’−GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCCAGUGAAG−3’(配列番号7)
エクソン50のスキッピングに関して、
5’−AGGAAGUUAGAAGAUCUGAGCUCUGAGUGGAAGGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGGAGCCU−3’(配列番号8)
エクソン51のスキッピングに関して、
5’−CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGGCAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAAG−3’(配列番号9)
エクソン52のスキッピングに関して、
5’−GCAACAAUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCUAGAACAAUCAUUACGGAUCGAA−3’(配列番号10)
エクソン53のスキッピングに関して、
5’−UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGCUUGAGUCAUGGAAGGAGGGUCCCUAUACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACAGAAACCAAG−3’(配列番号11)
エクソン54のスキッピングに関して、
5’−CAGUUGGCCAAAGACCUCCGCCAGUGGCAGACAAAUGUAGAUGUGGCAAAUGACUUGGCCCUGAAACUUCUCCGGGAUUAUUCUGCAGAUGAUACCAGAAAAGUCCACAUGAUAACAGAGAAUAUCAAUGCCUCUUGGAGAAGCAUUCAUAAAAG−3’(配列番号12)
エクソン55のスキッピングに関して、
5’−GGUGAGUGAGCGAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUGGCAA−3’(配列番号13)
したがって、好ましいオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号2〜13から選択されるエクソンヌクレオチド配列のうちの1つの配列内の10〜33ヌクレオチドの連続的なストレッチに対して結合する及び/又は逆相補的である及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる。
好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
上記配列番号2〜13から選択されるエクソンヌクレオチド配列のうちの1つの配列内の10〜33ヌクレオチドの連続的なストレッチに対して結合する及び/又は逆相補的である及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする及び/又は結合できる及び/又は標的化できる及び/又はハイブリダイズできる。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
より好ましいオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号14〜90を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号14〜90の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。配列番号14〜90は表1に示されている。これに関して、「5−メチルピリミジン」は少なくとも1つの5−メチルピリミジンを意味する。したがって「少なくとも1つの5−メチルピリミジン」は、少なくとも1つの5−メチルシトシン及び/又は少なくとも1つの5−メチルウラシルを意味する。
したがって、好ましい非修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは、X=C、Y=U、Z=Aである配列番号14〜90のヌクレオチド又は塩基配列の1つに由来し、及び/又は配列番号91、93、94〜170によって表される。これらの非修飾オリゴヌクレオチドの各々は、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び2,6−ジアミノプリンを含まない。配列番号91は配列番号132と同一であることに留意されたい。
また、好ましい修飾オリゴヌクレオチドは配列番号14〜90のヌクレオチド又は塩基配列の1つに由来し、少なくとも1つの5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は少なくとも1つの2,6−ジアミノプリン(すなわち少なくとも1つのXはm5C=X1であり及び/又は少なくとも1つのYはm5U=Y1であり及び/又は少なくとも1つのZはa2A=Z1である。)を含む。配列番号92は配列番号199と同一であることに留意されたい。さらに好ましい修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号92、171〜213、215、217、218、219を含む又はからなるヌクレオチド又は塩基配列によって表される。さらに好ましい修飾オリゴヌクレオチド(すべてのX=m5C=X1及び/又はすべてのY=m5U=Y1及び/又はすべてのZ=a2A=Z1)は、最も好ましいヌクレオチド又は塩基配列(配列番号15、21、31、40、52及び57)に由来し、配列番号92、171〜174、185〜188、199、200、202〜215、217、218、219によって表される。最も好ましい修飾オリゴヌクレオチドは表3に開示されている。
本発明において、配列番号14〜90の断片又は配列番号91〜219の断片は、前記配列番号14〜90からの又は前記配列番号91〜219からの少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含む又はからなるヌクレオチド又は塩基配列を好ましくは意味する。
そのようなより好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号14〜90、91、93〜170を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号14〜90、91、93〜170の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
さらに好ましいオリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号14〜90、92、171〜215、217、218、219を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号14〜90、92、171〜215、217、218、219の断片を含む若しくはからなり、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。配列番号14〜90、92及び171〜215、217、218、219の内の好ましい配列(すなわち好ましいヌクレオチド又は塩基配列)は、配列番号15、21、31、40、43、52、57、59、171〜174、185〜188、199、200、202〜213、215、217、218、219を含み、より好ましくは配列番号40、43、52、57、59、208、207、200、210、206、171、173、199、213、185、187を含む。
そのようなさらに好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号14〜90、91、93〜170、216を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号14〜90、91、93〜170の断片を含む若しくはからなり、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
そのような修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号92、171〜213、215、217、218、219を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号92、171〜213、215、217、218、219の断片を含む若しくはからなり、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって表されることがさらに好ましい。さらに好ましい修飾オリゴヌクレオチドは、最も好ましいヌクレオチド又は塩基配列(配列番号15、21、31、40、52及び57)に由来し、配列番号92、171〜174、185〜188、199、200、202〜213、215、217、218、219を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号92、171〜174、185〜188、199、200、202〜213、215、217、218、219の断片を含む若しくはからなり、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。
ジストロフィンmRNA前駆体由来のエクソン44のスキッピングを誘導するために好ましいオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号14を含み、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号14の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号14の断片によって表される。
したがって、配列番号14由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号94によって表され、配列番号94の好ましい断片は配列番号143によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号94を含み、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号94の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号94の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号14の好ましい断片は配列番号63を含み、配列番号94の好ましい断片は配列番号143を含み、前記好ましい断片の各々は、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号15を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号15の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号15の断片によって表される。
したがって、配列番号15由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号95によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号95を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号95の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号95の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号15の好ましい断片は配列番号64を含み、配列番号95の好ましい断片は配列番号144を含み、前記断片の各々は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号15若しく95若しくは64若しくは144を含む若しくはからなり、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号15若しくは95若しくは64若しくは144の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列であって、前記断片は配列番号15若しくは95若しくは64若しくは144の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置き換えられており、
配列番号15を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号15の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号15の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置き換えられており、
配列番号204を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号204の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号204の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置き換えられており、
配列番号208を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号208の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号208の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置き換えられており、すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置き換えられており、
配列番号205を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号205の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号205の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンは2,6−ジアミノプリンによって置き換えられており、
配列番号207を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号207の連続したヌクレオチド若しくは塩基なくとも10個を含む若しくはからなる配列番号207の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号16を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号16の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号16の断片によって表される。
したがって、配列番号16由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号96によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号96を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号96の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号96の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号17を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号17の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号17の断片によって表される。
したがって、配列番号17由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号97によって表され、配列番号97の好ましい断片は配列番号145によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号97を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号97の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号97の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号17の好ましい断片は配列番号65を含み、配列番号97の好ましい断片は配列番号145を含み、前記断片の各々は、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号18を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号18の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号18の断片によって表される。
したがって、配列番号18由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号98によって表され、配列番号98の好ましい断片は配列番号146によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号18の好ましい断片は配列番号66を含み、配列番号98の好ましい断片は配列番号146を含み、前記断片の各々は、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号98を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号98の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号98の断片によって表される。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号19を含み、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号19の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号19の断片によって表される。
したがって、配列番号19由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号99によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号99を含み、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号99の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号99の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号20を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号20の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号20の断片によって表される。
したがって、配列番号20由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号100によって表され、配列番号100の好ましい断片は配列番号147、148又は149によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号100を含み23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号100の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号100の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号20の好ましい断片は配列番号67を含み、配列番号100の好ましい断片は配列番号147を含み、前記断片の各々は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号20の別の好ましい断片は配列番号68を含み、配列番号100の別の好ましい断片は配列番号148を含み、前記断片の各々は、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号20の別の好ましい断片は配列番号69を含み、配列番号100の別の好ましい断片は配列番号149を含み、前記断片の各々は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
ジストロフィンmRNA前駆体由来のエクソン45のスキッピングを誘導するために好ましいオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号21を含み、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号21の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号21の断片によって表される。
したがって、配列番号21由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号101によって表され、配列番号101の好ましい断片は配列番号150、151又は152によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号101を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号101の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号101の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号21の好ましい断片は配列番号70を含み、配列番号101の好ましい断片は配列番号150を含み、前記断片の各々は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号21の別の好ましい断片は配列番号71を含み、配列番号101の別の好ましい断片は配列番号151を含み、前記断片の各々は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号21の別の好ましい断片は配列番号72を含み、配列番号101の別の好ましい断片は配列番号152を含み、前記断片の各々は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号21を含む若しくはからなり、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号21の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列であって、前記断片は配列番号21の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置き換えられており、
配列番号21を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号21の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号21の断片によって表されることがより好ましい。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号200を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号200の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号200の断片によって特に表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置き換えられており、すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置き換えられており、
配列番号21若しくは配列番号209を特に含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号21若しくは209の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号21若しくは209の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンで置き換えられており、
配列番号21若しくは配列番号210を特に含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号21若しくは210の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号21若しくは210の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有する。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号22を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号22の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号22の断片によって表される。
したがって、配列番号22由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号102によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号102を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号102の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号102の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号23を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号23の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号23の断片によって表される。
したがって、配列番号23由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号103によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号103を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号103の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号103の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号24を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号24の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号24の断片によって表される。
したがって、配列番号24由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号104によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号104を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号104の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号104の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号25を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号25の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号25の断片によって表される。
したがって、配列番号25由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号105によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号105を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号105の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号105の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号26を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号26の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号26の断片によって表される。
したがって、配列番号26由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号106によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号106を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号106の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号106の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号27を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号27の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号27の断片によって表される。
したがって、配列番号27由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号107によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号107を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号107の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号107の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号28を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号28の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号28の断片によって表される。
したがって、配列番号28由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号108によって表される。表1に記載の配列番号28及び配列番号108は各々7位にヒポキサンチン塩基を含む。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号108を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号108の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号108の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号29を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号29の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号29の断片によって表される。
したがって、配列番号29由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号109によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号109を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号109の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号109の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号30を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号30の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号30の断片によって表される。
したがって、配列番号30由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号110によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号110を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号110の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号110の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
ジストロフィンmRNA前駆体からエクソン51のスキッピングを誘導するための好ましいオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号31を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号31の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号31の断片によって表される。
したがって、配列番号31由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号111によって表され、配列番号111の好ましい断片は配列番号153又は154によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号111を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号111の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号111の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号31の好ましい断片は配列番号73を含み、配列番号111の好ましい断片は配列番号153を含み、前記断片の各々は、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号31の別の好ましい断片は配列番号74を含み、配列番号111の別の好ましい断片は配列番号154を含み、前記断片の各々は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号31を含む若しくはからなり、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号31の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列であって、前記断片は配列番号31の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号31若しくは配列番号215を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号31若しくは配列番号215の少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含む若しくはからなる配列番号31若しくは配列番号215の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号202を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号202の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号202の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号203を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号203の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号203の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号206を含み、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号206の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号206の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号32を含み、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号32の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号32の断片によって表される。
したがって、配列番号32由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号112によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号112を含み、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号112の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号112の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAを含み、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号33を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号33の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号33の断片によって表される。
したがって、配列番号33由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号113によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号113を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号113の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号113の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号34を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号34の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号34の断片によって表される。
したがって、配列番号34由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号114によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号114を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド配列によって、又は配列番号114の少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含む若しくはからなる配列番号114の断片によって表される。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号34の好ましい断片は配列番号93(PS1116:5’−CAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCU−3’)を含む又はからなる。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号34若しくは93若しくは114を含む若しくはからなり、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号34若しくは93若しくは114の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列であって、前記断片は配列番号34若しくは93若しくは114の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号34を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号34の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号34の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号34を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基によって、又は配列番号34の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号34の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号35を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号35の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号35の断片によって表される。
したがって、配列番号35由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号115によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号115を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号115の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号115の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号36を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号36の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号36の断片によって表される。
したがって、配列番号36由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号116によって表され、配列番号116の好ましい断片は配列番号155又は156又は157によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエオートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号116を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号116の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号116の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号36の好ましい断片は配列番号75を含み、配列番号116の好ましい断片は配列番号155を含み、前記断片の各々は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号36の別の好ましい断片は配列番号76を含み、配列番号116の別の好ましい断片は配列番号156を含み、前記断片の各々は、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号36の別の好ましい断片は配列番号77を含み、配列番号116の別の好ましい断片は配列番号157を含み、前記断片の各々は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号37を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号37の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号37の断片によって表される。
したがって、配列番号37由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号117によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号117を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号117の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号117の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11,12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデノシンが、本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号38を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号38の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号38の断片によって表される。
したがって、配列番号38由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号118によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号118を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号118の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号118の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
ジストロフィンmRNA前駆体からエクソン52のスキッピングを誘導するための好ましいオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号39を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号39の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号39の断片によって表される。
したがって、配列番号39由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号119によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号119を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号119の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号119の断片によって表される。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号201を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号201の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号201の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有する。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号40を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号40の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号40の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、配列番号40由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号120によって表され、配列番号120の好ましい断片は配列番号158又は159又は160によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号120を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号120の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号120の断片によって表される。
配列番号40の好ましい断片は配列番号78を含み、配列番号120の好ましい断片は配列番号158を含み、各断片は15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号40の別の好ましい断片は配列番号79を含み、配列番号120の別の好ましい断片は配列番号159を含み、各断片は13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号40の別の好ましい断片は配列番号80を含み、配列番号120の別の好ましい断片は配列番号160を含み、各断片は10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号40若しくは120を含む若しくはからなり、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号40若しくは120の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列であって、前記断片は配列番号40若しくは120の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号40を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号40の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号40の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号171を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号171の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号171の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号40の4個のシトシンのすべてが配列番号171に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2又は3個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号172を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号172の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号172の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号40の7個のウラシルのすべてが配列番号172に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのウラシルの1、2、3、4、5又は6個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号173を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号173の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号173の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号40の5個のアデニンのすべてが配列番号173に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1、2、3又は4個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号174を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号174の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号174の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号174を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号174の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号174の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号40の4個のシトシンのすべて及び7個のウラシルのすべてが配列番号174に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2若しくは3個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5若しくは6個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号175を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号175の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号175の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号175を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド配列によって、又は配列番号175の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号175の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号40の4個のシトシンのすべて及び5個のアデニンのすべてが配列番号175に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2若しくは3個及び/又はこれらのアデニンの1、2、3若しくは4個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号176を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号176の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号176の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号40の5個のアデニンのすべて及び7個のウラシルのすべてが配列番号176に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1、2、3若しくは4個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5若しくは6個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、すべてのシトシンが5−メチルウラシルによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号177を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号177の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号177の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号40の4個のシトシンのすべて及び7個のウラシルのすべて及び5個のアデニンのすべてが配列番号177に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2若しくは3個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5若しくは6個及び/又はこれらのアデニンの1、2、3若しくは4個が修飾されている場合が含まれる。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号41を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド配列若しくは塩基によって、又は配列番号41の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号41の断片によって表される。
したがって、配列番号41由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号121によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号121を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号121の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号121の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号42を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号42の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号42の断片によって表される。
したがって、配列番号42由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号122によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号122を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号122の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号122の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号43を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号43の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号43の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号43若しくは123を含む若しくはからなり、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号43若しくは123の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列であって、前記断片は配列番号43若しくは123の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド配列によって表される。したがって、配列番号43由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号123によって表され、配列番号123の好ましい断片は配列番号161によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号123を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号123の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号123の断片によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号43を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号43の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号43の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号178を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号178の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号178の断片によって表される。また、配列番号43の6個のシトシンのすべてが配列番号178に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4又は5個が修飾されている場合が含まれる。
配列番号43の好ましい断片は配列番号81を含み、配列番号123の好ましい断片は配列番号161を含み、前記断片の各々は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号179を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号179の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号179の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号43の11個のウラシルのすべてが配列番号179に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのウラシルの1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号180を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号180の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号180の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号43の2個のアデニンのすべてが配列番号180に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号181を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号181の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号181の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号181を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号181の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号181の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号43の6個のシトシンのすべて及び11個のウラシルのすべてが配列番号181に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4若しくは5個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号182を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号182の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号182の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号182を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号182の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号182の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号43の6個のシトシンのすべて及び2個のアデニンのすべてが配列番号182に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4若しくは5個及び/又はこれらのアデニンの1個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号183を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号183の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号183の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号43の2個のアデニンのすべて及び11個のウラシルのすべてが配列番号183に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号184を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号184の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号184の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号43の6個のシトシンのすべて及び11個のウラシルのすべて及び2個のアデニンのすべてが配列番号184に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4若しくは5個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個及び/又はこれらのアデニンの1個が修飾されている場合が含まれる。
ジストロフィンmRNA前駆体由来のエクソン53のスキッピングを誘導するための好ましいオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号44を含み、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号44の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号44の断片によって表される。
したがって、配列番号44由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号124によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号124を含み、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号124の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号124の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号45を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号45の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号45の断片によって表される。
したがって、配列番号45由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号125によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号125を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号125の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号125の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号46を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号46の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号46の断片によって表される。
したがって、配列番号46由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号126によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号126を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号126の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号126の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号47を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号47の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号47の断片によって表される。
したがって、配列番号47由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号127によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号127を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号127の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号127の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号48を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号48の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号48の断片によって表される。
したがって、配列番号48由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号128によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号128を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号128の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号128の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号49を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号49の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号49の断片によって表される。
したがって、配列番号49由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号129によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号129を含み、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号129の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号129の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号50を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号50の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号50の断片によって表される。
したがって、配列番号50由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号130によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号130を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号130の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号130の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号51を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号51の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号51の断片によって表される。
したがって、配列番号51由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号131によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号131を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号131の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号131の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号52を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号52の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号52の断片によって表される。
したがって、配列番号52由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号91によって表され、配列番号91の好ましい断片は配列番号162、163又は164によって表される。配列番号91は配列番号132と同一である。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号91を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号91の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号191の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号52若しくは91を含む若しくはからなり、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号52若しくは91の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列であって、前記断片は配列番号51若しくは91の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号52を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号52の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号52の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
配列番号52の好ましい断片は配列番号82を含み、配列番号91の好ましい断片は配列番号162を含み、前記断片の各々は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号52の別の好ましい断片は配列番号83を含み、配列番号91の別の好ましい断片は配列番号163を含み、前記断片の各々は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号52の別の好ましい断片は配列番号84を含み、配列番号91の別の好ましい断片は配列番号164を含み、前記断片の各々は、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号52の最も好ましい断片は配列番号91(PS229L:5’−GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC−3’)を含む又はからなる。配列番号52の別の最も好ましい断片は配列番号92(PS524:5’−GUUGXXUXXGGUUXUGAAGGUGUUX−3’(ここでXは5−メチルシトシン))を含む又はからなる。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号82、83、84、91若しくは92若しくは162若しくは163若しくは164を含む若しくはからなり、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号82、83、84、91若しくは92若しくは162若しくは163若しくは164の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列であって、前記断片は配列番号82、83、84、91若しくは92若しくは162若しくは163若しくは164の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号82、83、84若しくは92を含み、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号82、83、84若しくは92の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号82、83、84若しくは92の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号92は配列番号199と同一である。また、配列番号52の6個のシトシンのすべてが配列番号92に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4又は5個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
そのシトシンの2つが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号218を含み、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号218の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号218の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
そのシトシンの3つが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号219を含み、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号219の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号219の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
そのシトシンの4つが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号217を含み、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号217の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号217の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号211を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号211の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号211の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号211を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号211の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号211の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号52の9個のウラシルのすべてが配列番号211に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのウラシルの1、2、3、4、5、6、7又は8個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号212を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号212の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号212の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号212を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号212の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号212の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号52の6個のシトシンのすべて及び9個のウラシルのすべてが配列番号212に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4若しくは5個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5、6、7若しくは8個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号213を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号213の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号213の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号52の2個のアデニンのすべてが配列番号213に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1個が修飾されている場合が含まれる。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号53を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号53の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号53の断片によって表される。
したがって、配列番号53由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号133によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号133を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号133の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号133の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号54を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号54の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号54の断片によって表される。
したがって、配列番号54由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号134によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号134を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号134の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号134の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号55を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号55の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号55の断片によって表される。
したがって、配列番号55由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号135によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号135を含み、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号135の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号135の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号56を含み、33、34若しくは35ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号56の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号56の断片によって表される。
したがって、配列番号56由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号136によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号136を含み、33、34若しくは35ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号136の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号136の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
ジストロフィンmRNA前駆体からエクソン55のスキッピングを誘導するための好ましいオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号57を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号57の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号57の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号57を含む若しくはからなり、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号57の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列であって、前記断片は配列番号57の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド配列によって表される。
したがって、配列番号57由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号137によって表され、配列番号137の好ましい断片は配列番号165又は166によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号137を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号137の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号137の断片によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号57を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号57の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号57の断片によって表されることがより好ましい。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号185を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号185の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号185の断片によって表される。また、配列番号57の8個のシトシンのすべてが配列番号185に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4、5、6又は7個が修飾されている場合が含まれる。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
配列番号57の好ましい断片は配列番号85を含み、配列番号137の好ましい断片は配列番号165を含み、前記断片の各々は、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号57の別の好ましい断片は配列番号86を含み、配列番号137の別の好ましい断片は配列番号166を含み、前記断片の各々は、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号186を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号186の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号186の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号57の7個のウラシルのすべてが配列番号186に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのウラシルの1、2、3、4、5又は6個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号187を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号187の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号187の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号57の5個のアデニンのすべてが配列番号187に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1、2、3又は4個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号188を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号188の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号188の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号188を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号188の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号188の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号57の8個のシトシンのすべて及び7個のウラシルのすべてが配列番号188に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4、5、6若しくは7個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5若しくは6個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号189を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号189の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号189の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号189を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号189の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号189の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号57の8個のシトシンのすべて及び5個のアデニンのすべてが配列番号189に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4、5、6若しくは7個及び/又はこれらのアデニンの1、2、3若しくは4個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンよって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号190を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号190の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号190の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号57の5個のアデニンのすべて及び7個のウラシルのすべてが配列番号190に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1、2、3若しくは4個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5若しくは6個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンよって置換されており、すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号191を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号191の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号191の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号57の8個のシトシンのすべて及び7個のウラシルのすべて及び5個のアデニンのすべてが配列番号191に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3、4、5、6若しくは7個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4、5若しくは6個及び/又はこれらのアデニンの1、2、3若しくは4個が修飾されている場合が含まれる。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号58を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号58の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号58の断片によって表される。
したがって、配列番号58由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号138によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号138を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号138の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号138の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号58若しくは138を含む若しくはからなり、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号58若しくは138の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列であって、前記断片は配列番号58若しくは138の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号58を含み、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号58の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号58の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号59を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号59の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号59の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
そのような好ましいオリゴヌクレオチドはまた、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
配列番号59を含む若しくはからなり、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号59の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列であって、前記断片は配列番号59の少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる、ヌクレオチド配列によって表される。
したがって、配列番号59由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号139によって表され、配列番号139の好ましい断片は配列番号167又は168又は169又は170によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号139を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号139の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号139の断片によって表される。
そのようなオリゴヌクレオチドは、前述の5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、
配列番号59を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号59の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号59の断片によって表されることがより好ましい。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号192を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号192の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号192の断片によって表される。また、配列番号59の5個のシトシンのすべてが配列番号192に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3又は4個が修飾されている場合が含まれる。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
配列番号59の好ましい断片は配列番号87を含み、配列番号139の好ましい断片は配列番号167を含み、前記断片の各々は、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号59の別の好ましい断片は配列番号88を含み、配列番号139の別の好ましい断片は配列番号168を含み、前記断片の各々は、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号59の別の好ましい断片は配列番号89を含み、配列番号139の別の好ましい断片は配列番号169を含み、前記断片の各々は、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。配列番号59の別の好ましい断片は配列番号90を含み、配列番号139の別の好ましい断片は配列番号170を含み、前記断片の各々は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号193を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号193の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号193の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号59の6個のウラシルのすべてが配列番号193に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのウラシルの1、2、3、4又は5個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号194を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号194の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号194の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号59の6個のアデニンのすべてが配列番号194に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1、2、3、4又は5個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号195を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号195の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号195の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号195を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号195の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号195の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号59の5個のシトシンのすべて及び6個のウラシルのすべてが配列番号195に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3若しくは4個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4若しくは5個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、
配列番号196を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号196の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号196の断片によって表されることがより好ましい。したがって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号196を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号196の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号196の断片によって表される。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号59の5個のシトシンのすべて及び6個のアデニンのすべてが配列番号196に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3若しくは4個及び/又はこれらのアデニンの1、2、3、4若しくは5個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号197を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号197の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号197の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号59の6個のアデニンのすべて及び6個のウラシルのすべてが配列番号197に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのアデニンの1、2、3、4若しくは5個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4若しくは5個が修飾されている場合が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、
2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、
すべてのアデニンが2,6−ジアミノプリンによって置換されており、すべてのシトシンが5−メチルシトシンによって置換されており、すべてのウラシルが5−メチルウラシルによって置換されており、
配列番号198を含み、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号198の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号198の断片によって表されることがより好ましい。そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。また、配列番号59の5個のシトシンのすべて及び6個のウラシルのすべて及び6個のアデニンのすべてが配列番号198に表されているように修飾されている場合に限定されない。これらのシトシンの1、2、3若しくは4個及び/又はこれらのウラシルの1、2、3、4若しくは5個及び/又はこれらのアデニンの1、2、3、4若しくは5個が修飾されている場合が含まれる。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号60を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号60の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号60の断片によって表される。
したがって、配列番号60由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号140によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号140を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号140の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号140の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号61を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号61の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号61の断片によって表される。
したがって、配列番号61由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号141によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号141を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号141の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号141の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、より好ましくは5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含み、配列番号62を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号62の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号62の断片によって表される。
したがって、配列番号62由来の非修飾オリゴヌクレオチドは配列番号142によって表される。
したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAモノマーを含む又は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAからなり、配列番号142を含み、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号142の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなる配列番号142の断片によって表される。
そのような断片は、好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32又は33ヌクレオチドの長さを有する。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、5−メチルピリミジン(すなわち5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル)及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むことがより好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドは、すべてのシトシン及び/又はすべてのウラシル及び/又はすべてのアデニンが本明細書に記載のように置換又は修飾されていることがさらに好ましい。
組成物:
第2の態様では、「オリゴヌクレオチド」という標題のセクションに記載されているオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。この組成物は、好ましくは上記オリゴヌクレオチドを含む又はからなる。
好ましい実施形態では、前記組成物は、医薬としての使用のためのものである。したがって、前記組成物は医薬組成物である。医薬組成物は通常、薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は本明細書に記載の化合物を含み、任意選択でさらに、薬学的に許容される製剤、充填剤、防腐剤、可溶化剤、担体、希釈剤、賦形剤、塩、アジュバント及び/又は溶媒を含む。そのような薬学的に許容される担体、充填剤、防腐剤、可溶化剤、希釈剤、塩、アジュバント、溶媒及び/又は賦形剤は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第20版、Baltimore、MD:Lippincott Williams & Wilkins、2000に見出され得る。本発明に記載されている化合物は少なくとも1つのイオン化基を有し得る。イオン化基は塩基又は酸であり得、電荷を帯びていても又は中性であってもよい。イオン化基は、反対の電荷を保有する適切な対イオンとのイオン対として存在してもよい。カチオン性対イオンの例は、ナトリウム、カリウム、セシウム、トリス、リチウム、カルシウム、マグネシウム、トリアルキルアンモニウム、トリエチルアンモニウム及びテトラアルキルアンモニウムである。アニオン性対イオンの例は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、乳酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ジクロロ酢酸塩及びクエン酸塩である。対イオンの例は記載されている(例えば、Kumar、2008、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられている)。
好ましい実施形態では、組成物は本発明のオリゴヌクレオチド及び対イオンとしてナトリウムを含む。前記組成物中に存在する前記オリゴヌクレオチドはまた、そのナトリウム形態のオリゴヌクレオチドと命名され得る。
別の好ましい実施形態では、組成物は、本発明のオリゴヌクレオチド並びに対イオンとしてカルシウム及び/又はマグネシウムを含む。前記組成物中に存在する前記オリゴヌクレオチドはまた、そのカルシウム若しくはマグネシウム又は混合されたカルシウム/マグネシウム形態のオリゴヌクレオチドと命名され得る。
本発明のオリゴヌクレオチド及び対イオンを含むそのような種類の組成物は、オリゴヌクレオチドの対イオン塩を製剤化することにより、又は適切な量の前記塩をオリゴヌクレオチドに添加することによってのいずれかで得られ得る。前記オリゴヌクレオチドの免疫賦活効果に対するオリゴヌクレオチドを含む組成物中に存在するカルシウム塩のプラス効果は記載されている(例えば、特許出願国際公開第2012021985号(Replicor)、その全体は参照により本明細書に組み込まれている)。
医薬組成物は、前記化合物の安定性、溶解性、吸収性、バイオアベイラビリティ、活性、薬物動態、薬力学及び細胞取り込みを増強する助剤、特に錯体、ナノ粒子、微小粒子、ナノチューブ、ナノゲル、ヒドロゲル、ポロキサマー又はプルロニック、ポリマーソーム、コロイド、微小気泡、ベシクル、ミセル、リポプレックス及び/又はリポソームを形成できる賦形剤を含み得る。ナノ粒子の例には、ポリマーナノ粒子、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、シリカナノ粒子、脂質ナノ粒子、糖粒子、タンパク質ナノ粒子及びペプチドナノ粒子が含まれる。
好ましい組成物は、前記組成物及び/又は前記オリゴヌクレオチドの組織及び/又は細胞に対する及び/又は組織及び/又は細胞中への標的化及び/又は送達を増強することをさらに補助できる少なくとも1種の賦形剤を含む。好ましい組織又は細胞は筋肉組織又は細胞である。
これらの賦形剤の多くは当該技術分野において公知であり(例えばBruno、2011を参照のこと)、第1の種類の賦形剤と分類され得る。第1の種類の賦形剤の例には、ポリマー(例えば、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ−2−ヒドロキシプロピレンイミン(pHP)、ポリプロピレンイミン(PPI)、デキストラン誘導体、ブチルシアノアクリレート(PBCA)、ヘキシルシアノアクリレート(PHCA)、ポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリアミン(例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、カダベリン)、キトサン、ポリ(アミドアミン)(PAMAM)、ポリ(エステルアミン)、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)シクロデキストリン、ヒアルロン酸、コロミン酸及びそれらの誘導体)、デンドリマー(例えばポリ(アミドアミン))、脂質{例えば、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)、ジオレオイルジメチルアンモニウムクロライド(DODAC)、ホスファチジルコリン誘導体[例えば、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)]、リゾ−ホスファチジルコリン誘導体[例えば、1−ステアロイル−2−リゾ−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(S−LysoPC)、スフィンゴミエリン、2−{3−[ビス−(3−アミノ−プロピル)−アミノ]−プロピルアミノ}−N−ジテトラセジルカルバモイルメチルアセトアミド(RPR209120)、ホスホグリセロール誘導体[例えば、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホグリセロール、ナトリウム塩(DPPG−Na)、ホスファチジン酸(phosphaticid acid)誘導体[1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジン酸、ナトリウム塩(DSPA)、ホスファチジルエタノールアミン誘導体[例えば、ジオレオイル−L−R−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DSPE)、2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPhyPE),]、N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウム(DOTAP)、N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウム(DOTMA)、1,3−ジ−オレオイルオキシ−2−(6−カルボキシ−スペルミル−プロピルアミド(DOSPER)、(1,2−ジミリスチオールキシプロピル−3−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム(DMRIE)、(N1−コレステリルオキシカルボニル−3,7−ジアザノナン−1,9−ジアミン(CDAN)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB)、1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロール−3−ホスホコリン(POPC)、(b−L−アルギニル−2,3−L−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレリル−アミドトリヒドロクロライド(AtuFECT01)、1,,N,N−ジメチル−3−アミノプロパン誘導体[例えば、1,2−ジステアロイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン](DSDMA)、1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン(DoDMA)、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)、ホスファチジルセリン誘導体[1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリン、ナトリウム塩(DOPS)]、コレステロール}タンパク質(例えば、アルブミン、ゼラチン、アテロコラーゲン)及びペプチド(例えば、プロタミン、PepFects、NickFects、ポリアルギニン、ポリリシン、CADY、MPG)が含まれる。
別の好ましい組成物は、第2のタイプの賦形剤に分類される少なくとも1種の賦形剤を含み得る。第2のタイプの賦形剤は、本発明の組成物及び/又はオリゴヌクレオチドの、組織及び/又は細胞(例えば筋組織又は細胞)に対する及び/又は組織及び/又は細胞内中への標的化及び/又は送達を増強するために本明細書に記載のコンジュゲート基を含み得る。両方の種類の賦形剤は、本明細書に記載の1つの単一組成物内に一緒に混合され得る。
当業者は、本発明に使用するための化合物を製剤化し、送達するために上記又は他の代替の賦形剤及び送達系の1つ又は複数を選択、混合及び/又は適合できる。
本発明のそのような医薬組成物は、設定時間において有効濃度で動物、好ましくは哺乳動物に投与され得る。より好ましい哺乳動物はヒトである。本発明に従って使用するための本明細書に記載のオリゴヌクレオチド又は組成物は、本明細書に記載の疾患又は状態を罹患している又は発症するリスクのある個体のin vivoでの細胞、組織及び/又は器官への直接投与に好適であり得、in vivo、ex vivo又はin vitroで直接投与され得る。投与は、局所、全身及び/又は非経口経路、例えば静脈内、皮下、腹腔内、髄腔内、筋肉内、眼内、鼻腔、尿生殖器、皮内、真皮、腸内、硝子体内、陰茎海綿体内、大脳内、髄腔内、硬膜外又は経口経路経由であり得る。
本発明のそのような医薬組成物は、経口送達のためにエマルション、懸濁剤、丸薬、錠剤、カプセル剤若しくは軟質ゲルの形態又は気道及び肺に送達するためにエアロゾル若しくは乾燥粉末の形態でカプセル化され得ることが好ましい。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記疾患の治療に使用されることが既に知られている別の化合物と一緒に使用され得る。そのような他の化合物は、炎症を減少させるため、好ましくは筋組織炎症を減少させるため、及び/又は筋繊維機能、完全性及び/又は生存を改善するための補助化合物のため、及び/又は心臓機能を改善、増加若しくは修復するために使用され得る。例としては、これらに限定されないが、ステロイド、好ましくは(糖質)コルチコステロイド、ACE阻害剤(好ましくはペリンドプリル)、アンジオテンシンII1型受容体遮断薬(好ましくはロサルタン)、腫瘍壊死因子−アルファ(TNFα)阻害剤、TGFβ阻害剤(好ましくはデコリン)、ヒト組換えビグリカン、mIGF−1源、ミオスタチン阻害剤、マンノース−6−リン酸、酸化防止剤、イオンチャネル阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤(好ましくはシルデナフィル又はタダラフィルなどのPDE5阻害剤)、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDAC阻害剤、アンドロゲン受容体モジュレーター、クレアチン、クレアチンリン酸及び/又はL−アルギニンがある。そのような組み合わされた使用は逐次使用であり得、各成分は別個の組成物で投与され得る。あるいは、各成分は単一組成物中で一緒に使用され得る。
使用:
さらなる態様では、医薬若しくは治療の一部として使用するための、先のセクションに記載されている組成物又はオリゴヌクレオチドの使用、又は前記オリゴヌクレオチドがその活性を細胞内に与える適用が提供される。
本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物は、DMD又はBMDを予防、遅延、治癒、改善及び/又は治療するための医薬又は治療の一部としての使用のためのものであることが好ましい。
方法:
さらなる態様では、個体、前記個体の細胞、組織又は器官における先のセクションに記載の状態又は疾患を予防、治療、治癒、改善及び/又は遅延する方法が提供される。その方法は、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする前記個体又は対象に投与するステップを含む。
本発明に係る方法において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド又は組成物は、本明細書に記載の疾患のいずれかに罹患している個体のin vivoでの細胞、組織及び/又は器官への投与に好適であり得、in vivo、ex vivo又はin vitroで投与され得る。必要とする個体又は対象は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドが放射性標識又は蛍光標識と共に提供される、診断するための方法が提供される。
一実施形態では、本発明の方法において、オリゴヌクレオチド又は組成物の濃度は0.01nM〜1μMの範囲である。使用される濃度は0.05〜500nM又は0.1〜500nM又は0.02〜500nM又は0.05〜500nMであることがより好ましく、1〜200nMであることがさらに好ましい。
本発明に係るオリゴヌクレオチド又は組成物の用量範囲は好ましくは、厳格なプロトコール要件が存在する臨床試験(in vivoでの使用)における上昇用量研究に基づいて設計される。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、0.01〜200mg/kg又は0.05〜100mg/kg又は0.1〜50mg/kg又は0.1〜20mg/kg、好ましくは0.5〜10mg/kgの範囲の用量で使用され得る。
上述のオリゴヌクレオチド又は組成物の濃度又は用量の範囲は、in vitro又はex vivoでの使用に好ましい濃度又は用量である。当業者は、使用されるオリゴヌクレオチド、治療される標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベル、使用される培地、並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件に応じて、使用されるオリゴヌクレオチドの濃度又は用量がさらに変更され得、さらに最適化される必要があり得ることを理解するであろう。
本明細書において、「含む」という動詞及びその活用は、その非限定的な意味で、その用語に続く項目が含まれるが、特に述べられていない項目を排除しないことを意味するように使用される。さらに、「からなる」という動詞は「から本質的になる」によって置き換えられ得、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド又は組成物が、特に規定されているもの以外の追加成分を含んでもよく、該追加成分は本発明の固有の特徴を変化させないことを意味する。さらに、不定冠詞「1つの(a)」又は「1つの(an)」による要素の参照は、1つ及び1つのみの要素が存在することが文脈上明らかでない限り、1つより多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「1つの(a)」又は「1つの(an)」は通常「少なくとも1つ」を意味する。
本明細書に記載されている各実施形態は、特に断らない限り、一緒に組み合わされ得る。本明細書で引用されるすべての特許及び参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
定義:
本明細書全体を通じて、「結合する」、「標的する」、「ハイブリダイズする」という用語は、本明細書で特定されているmRNA前駆体の一部に対して逆相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、交換可能に使用され得る。
さらに、本明細書全体を通じて、「結合できる」、「標的できる」、「ハイブリダイズできる」という表現は、本明細書に特定されており、そのための条件が見出され得るmRNA前駆体の一部に対して逆相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、交換可能に使用され得、前記オリゴヌクレオチドは前記mRNA前駆体の前記一部に結合、標的又はハイブリダイズできる。
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的オリゴマー化合物(例えば、アンチセンス化合物及びその標的核酸)の対合を指す。特定の機構に限定されないが、対合の最も一般的な機構は、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基(核酸塩基)間の水素結合(ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であり得る。)を伴う。例えば、天然塩基アデニンは、水素結合の形成により対になる天然核酸塩基チミン及びウラシルに対して相補的な核酸塩基である。天然塩基グアニンは天然塩基シトシン及び5−メチルシトシンに対して相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは種々の状況下で起こり得る。
本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」とは、別の核酸部位にハイブリダイズするより高い親和性で1つの核酸部位にハイブリダイズするオリゴマー化合物の能力を指す。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは1つより多い標的部位に特異的にハイブリダイズする。
本発明において、「ハイブリダイズする」は、特に断らない限り、細胞、好ましくは筋肉細胞中の生理学的条件下で使用される。
本明細書において、「ヌクレオシド」とは、複素環塩基部分及び糖部分を含む化合物を指す。ヌクレオシドには、これらに限定されないが、天然に存在するヌクレオシド(DNA及びRNAに見出される)、脱塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド及び糖修飾ヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドは種々の置換基のいずれかで修飾され得る。
本明細書において、「糖部分」とは、天然(フラノシル)又は修飾糖部分又は糖代用物を意味する。
本明細書において、「修飾糖部分」とは、化学的に修飾されたフラノシル糖又は非フラノシル糖部分を意味する。また、三環系糖、二環系糖、テトラヒドロピラン、モルホリン、2’修飾糖、4’修飾糖、5’修飾糖及び4’置換糖を含むフラノシル糖類似体及び誘導体もこの用語に含まれる。
本明細書において、「糖修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
本明細書において、「糖代用物」とは、天然に存在するヌクレオシドのフラノース環と置き換えることができる構造を指す。特定の実施形態では、糖代用物は非フラノース(又は4’置換フラノース)環又は環系若しくは開放系である。そのような構造は、6員環などの天然フラノース環に対して単純な変化を含み、あるいは、ペプチド核酸に使用される非環系と同様により複雑であり得る。糖代用物には、限定されないが、モルホリン及びシクロヘキセニル及びシクロヘキシトールが含まれる。糖代用物基を有するほとんどのヌクレオシドにおいて、複素環塩基部分は一般にハイブリダイゼーションを可能にするように維持される。
本明細書において、「ヌクレオチド」とは、修飾又は非修飾リン酸塩連結基又は非リン酸塩ヌクレオシド間連結をさらに含むヌクレオシドを指す。
本明細書において、「連結ヌクレオシド」は、リン酸塩連結により連結していてもいなくてもよく、それ故「連結ヌクレオチド」を含む。
本明細書において、「核酸塩基」とは、ヌクレオシドの複素環塩基部分を指す。核酸塩基は天然に存在するものであっても修飾されたものであってもよく、したがって、これらに限定されないが、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン及び5−メチルシトシンなどのそれらの類似体を含む。特定の実施形態では、核酸塩基は、別の核酸の塩基に水素結合できる任意の原子又は原子の集団を含み得る。
本明細書において、「修飾ヌクレオシド」とは、天然に存在するRNA又はDNAヌクレオシドと比較して少なくとも1つの修飾を含むヌクレオシドを指す。そのような修飾は糖部分及び/又は核酸塩基であり得る。
本明細書において、「Tm」とは、二本鎖の核酸の二本の鎖が分離する温度である融解温度を意味する。Tmはしばしば二本鎖の安定又は相補的RNA分子に対するアンチセンス化合物の結合親和性の尺度として使用される。
本明細書において、「2’修飾」又は「2’置換」とは、H又はOH以外の2’位に置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。2’修飾ヌクレオシドには、限定されないが、糖環の2つの炭素原子を接続する架橋が2’炭素及び糖環の別の炭素を接続する二環式ヌクレオシド並びにアリル、アミノ、アジド、チオ、O−アリル、O−C1−C10アルキル、−OCF3、O−(CH2)2−O−CH3、2’−O(CH2)2SCH3、O−(CH2)2−O−N(Rm)(Rn)又はO−CH2−C(=O)−N(Rm)(Rn)(式中、Rm及びRnの各々は独立してH又は置換若しくは非置換C1−C10アルキルである)などの非架橋2’置換を有するヌクレオシドが含まれる。2’修飾ヌクレオシドは、例えば糖の他の位置及び/又は核酸塩基において他の修飾をさらに含み得る。
本明細書において、「2’−OMe」又は「2’−OCH3」又は「2’−O−メチル」とは、各々、糖環の2’位にて−OCH3基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書において、「MOE」又は「2’−MOE」又は「2’−OCH2CH2OCH3」又は「2’−O−メトキシエチル」とは、各々、糖環の2’位において−OCH2CH2OCH3基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書において、「アデニン類似体」という用語は、オリゴマー内に組み込まれる場合、RNA又はDNAの相補鎖のチミン又はウラシルのいずれかとワトソン−クリック塩基対を形成できる化学的に修飾されたプリン核酸塩基を意味する。
本明細書において、「ウラシル類似体」という用語は、オリゴマー内に組み込まれる場合、RNA又はDNAの相補鎖のアデニンのいずれかとワトソン−クリック塩基対を形成できる化学的に修飾されたピリミジン核酸塩基を意味する。
本明細書において、「チミン類似体」という用語は、オリゴマー内に組み込まれる場合、RNA又はDNAの相補鎖のアデニンとワトソン−クリック塩基対を形成できる化学的に修飾されたピリミジン核酸塩基を意味する。
本明細書において、「シトシン類似体」という用語は、オリゴマー内に組み込まれる場合、RNA又はDNAの相補鎖のグアニンとワトソン−クリック塩基対を形成できる化学的に修飾されたピリミジン核酸塩基を意味する。例えば、シトシン類似体は5−メチルシトシンであり得る。
本明細書において、「グアニン類似体」という用語は、オリゴマー内に組み込まれる場合、RNA又はDNAの相補鎖のシトシンとワトソン−クリック塩基対を形成できる化学的に修飾されたプリン核酸塩基を意味する。
本明細書において、「グアノシン」という用語は、グアニン又はグアニン類似体核酸塩基を含むヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを指す。
本明細書において、「ウリジン」という用語は、ウラシル又はウラシル類似体核酸塩基を含むヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを指す。
本明細書において、「チミジン」という用語は、チミン又はチミン類似体核酸塩基を含むヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを指す。
本明細書において、「シチジン」という用語は、シトシン又はシトシン類似体核酸塩基を含むヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを指す。
本明細書において、「アデノシン」という用語は、アデニン又はアデニン類似体核酸塩基を含むヌクレオシド又は糖修飾ヌクレオシドを指す。
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連結ヌクレオシドを含む化合物を指す。特定の実施形態では、複数のヌクレオシドのうちの1つ又は複数が修飾される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは1つ又は複数のリボヌクレオシド(RNA)及び/又はデオキシリボヌクレオシド(DNA)を含む。
本明細書において、「オリゴヌクレオシド」とは、ヌクレオシド間連結のどれもリン原子を含有しないオリゴヌクレオチドを指す。本明細書において、オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオシドを含む。
本明細書において、「修飾オリゴヌクレオチド」又は「化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも1つの修飾糖、修飾核酸塩基及び/又は修飾ヌクレオシド間連結若しくは骨格を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書において、「ヌクレオシド間連結」又は「骨格」とは、隣接するヌクレオシド間の共有結合を指す。
本明細書において、「天然に存在するヌクレオシド間連結」とは、3’から5’ホスホジエステル連結を指す。
本明細書において、「修飾ヌクレオシド間連結」とは、天然に存在するヌクレオシド間連結以外の任意のヌクレオシド間連結を指す。
本明細書において、「オリゴマー化合物」とは、2つ以上の基礎構造を含むポリマー構造を指す。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は一本鎖オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は二本のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖である。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は1つ又は複数のコンジュゲート基及び/又は末端基を含む一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドである。
本明細書において、「コンジュゲート」とは、オリゴヌクレオチド又はオリゴマー化合物に結合した原子又は原子の基を指す。一般に、コンジュゲート基は、限定されないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷及びクリアランスを含む、コンジュゲート基が結合する化合物の1つ又は複数の性質を修飾する。コンジュゲート基は化学分野において慣用的に使用され、直接又は任意選択の連結部分若しくは連結基を介して、オリゴマー化合物などの親化合物に連結される。特定の実施形態では、コンジュゲート基には、限定されないが、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素が含まれる。特定の実施形態では、コンジュゲートは末端基である。特定の実施形態では、コンジュゲートは、3’若しくは5’末端ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの内部ヌクレオシドに結合される。
本明細書において、「コンジュゲート連結基」とは、コンジュゲートをオリゴヌクレオチド又はオリゴマー化合物に結合するために使用される任意の原子又は原子の基を指す。当該技術分野で知られているものなどの連結基又は二官能性連結部分は本発明に従う。
本明細書において、「アンチセンス化合物」とは、オリゴマー化合物を指し、その少なくとも一部は、そのオリゴマー化合物がハイブリダイズする標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、前記標的核酸の活性、プロセシング又は発現を調節する。
本明細書において、「発現」とは、遺伝子が最終的にタンパク質を生じるプロセスを指す。発現には、限定されないが、転写、スプライシング、転写後修飾及び翻訳が含まれる。
本明細書において、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドであるアンチセンス化合物を指す。
本明細書において、「アンチセンス活性」とは、その標的核酸に対するアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能及び/又は測定可能な活性を指す。特定の実施形態では、そのような活性は核酸又はタンパク質の量の増加又は減少であり得る。特定の実施形態では、そのような活性は核酸又はタンパク質のスプライスバリアントの比の変化であり得る。アンチセンス活性の検出及び/又は測定は直接又は間接であり得る。特定の実施形態では、アンチセンス活性は細胞又は動物における表現型の変化を観察することによって評価される。
本明細書において、「標的核酸」とは、任意の核酸分子を指し、その発現、量又は活性はアンチセンス化合物によって調節できる。特定の実施形態では、標的核酸はDNA又はRNAである。特定の実施形態では、標的RNAはmRNA、mRNA前駆体、非コードDNA、プリマイクロRNA、プレマイクロRNA、成熟マイクロRNA、プロモーター指向性RNA(promoter−directed RNA)又は天然アンチセンス転写産物である。例えば、標的核酸は細胞遺伝子(又は遺伝子から転写されたmRNA)であり得、その発現は特定の障害若しくは疾患状態又は感染因子由来の核酸分子に関連する。特定の実施形態では、標的核酸はウイルス又は細菌核酸である。
本明細書において、「標的mRNA」とは、タンパク質をコードする予め選択されたRNA分子を指す。
本明細書において、「標的としている」又は「を標的とする」とは、特定の標的核酸分子又は標的核酸分子内のヌクレオチドの特定の領域に対するアンチセンス化合物の会合を指す。アンチセンス化合物は、それが生理学的条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために標的核酸に対して十分に相補的である場合、標的核酸を標的とする。
本明細書において、「標的部位」とは、アンチセンス化合物が結合する標的核酸の領域を指す。特定の実施形態では、標的部位は少なくとも部分的にRNA分子の3’非翻訳領域内にある。特定の実施形態では、標的部位は少なくとも部分的にRNA分子の5’非翻訳領域内にある。特定の実施形態では、標的部位は少なくとも部分的にRNA分子のコード領域内にある。特定の実施形態では、標的部位は少なくとも部分的にRNA分子のエクソン内にある。特定の実施形態では、標的部位は少なくとも部分的にRNA分子のイントロン内にある。特定の実施形態では、標的部位は少なくとも部分的にRNA分子のマイクロRNA標的部位内にある。特定の実施形態では、標的部位は少なくとも部分的にRNA分子の反復領域内にある。
本明細書において、「標的タンパク質」とは、その発現がアンチセンス化合物によって調節される、タンパク質を指す。特定の実施形態では、標的タンパク質は標的核酸によってコードされる。特定の実施形態では、標的タンパク質の発現は別様で標的核酸による影響を受ける。
本明細書において、核酸塩基に関する「相補性」とは、別の核酸塩基と塩基対合できる核酸塩基を指す。例えば、DNAにおいて、アデニン(A)はチミン(T)に対して相補的である。例えば、RNAにおいて、アデニン(A)はウラシル(U)に対して相補的である。特定の実施形態では、相補的核酸塩基とは、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合できるアンチセンス化合物の核酸塩基を指す。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置における核酸塩基が標的核酸の特定の位置において核酸塩基と水素結合できる場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置はその核酸塩基対において相補的であると考えられる。特定の修飾を含む核酸塩基は、対応する核酸塩基と対になる能力を維持できるので、依然として核酸塩基相補性であり得る。
本明細書において、核酸塩基に関して「非相補的」とは、互いに水素結合を形成しない又はそうでなければハイブリダイゼーションを支持しない核酸塩基の対を指す。
本明細書において、連結ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸に関して「相補的」とは、核酸塩基相補性によって別のオリゴマー化合物又は核酸にハイブリダイズするオリゴマー化合物の能力を指す。特定の実施形態では、アンチセンス化合物及びその標的は、各分子内の十分な数の対応する位置がアンチセンス化合物と標的との間の安定な会合を可能にするために互いに結合できる核酸塩基により占められている場合、互いに相補的である。当業者は、ミスマッチの含有が、会合を維持するオリゴマー化合物の能力を除外せずに可能であることを認識している。したがって、ミスマッチしている(すなわち、標的の対応するヌクレオチドに対して相補的な核酸塩基でない)最大約20%のヌクレオチドを含み得るアンチセンス化合物が本明細書に記載されている。アンチセンス化合物は、約15%以下、より好ましくは約10%以下、最も好ましくは5%以下のミスマッチを含有する又はミスマッチを含有しないことが好ましい。残りの核酸塩基は相補的な核酸塩基である又はそうでなければハイブリダイゼーションを破壊しない核酸塩基(例えば普遍的な塩基)である。当業者は、本明細書に提供されている化合物が、標的核酸に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも100%相補的であると認識するであろう。
本明細書において、「調節」とは、調節前の機能又は活性と比較して機能又は活性の量又は質の撹乱を指す。例えば、調節は、遺伝子発現の変化、増加(刺激又は誘導)又は減少(阻害又は低下)のいずれかを含む。さらなる例として、発現の調節は、mRNA前駆体プロセシングのスプライス部位選択を撹乱し、その結果、撹乱しなかった条件と比較して特定のスプライスバリアントの存在の量の変化が生じることを含み得る。さらなる例として、調節はタンパク質の翻訳を撹乱することを含む。
本明細書において、「モチーフ」とは、オリゴマー化合物又はその領域における修飾のパターンを指す。モチーフはオリゴマー化合物の特定のヌクレオシド及び/又は特定の連結基における修飾により規定され得る。
本明細書において、「ヌクレオシドモチーフ」とは、オリゴマー化合物又はその領域におけるヌクレオシド修飾のパターンを指す。そのようなオリゴマー化合物の連結は修飾されていてもいなくてもよい。特に断らない限り、ヌクレオシドのみを記載している本明細書におけるモチーフはヌクレオシドモチーフを意図する。したがって、そのような場合、連結は限定されない。
本明細書において、「連結モチーフ」とは、オリゴマー化合物又はその領域における連結修飾のパターンを指す。そのようなオリゴマー化合物のヌクレオシドは修飾されていてもいなくてもよい。特に断らない限り、連結のみを記載している本明細書におけるモチーフは連結モチーフを意図する。したがって、そのような場合、ヌクレオシドは限定されない。
本明細書において、「同じ修飾」とは、修飾の非存在を含む、互いに同じである天然に存在する分子に対する修飾を指す。したがって、例えば、2つの非修飾DNAヌクレオシドは、DNAヌクレオシドが修飾されていないとしても、「同じ修飾」を有する。
本明細書において、ヌクレオシド又はヌクレオシドの「種類」に関する「修飾の種類」とは、ヌクレオシドの修飾を指し、修飾及び非修飾ヌクレオシドを含む。したがって、特に断らない限り、「第1の種類の修飾を有するヌクレオシド」は非修飾ヌクレオシドであり得る。
本明細書において、「分離領域」とは、領域内のヌクレオシド及びヌクレオシド間連結がすべて同じ修飾を含み、任意の隣接する部分のヌクレオシド及び/又はヌクレオシド間連結が少なくとも1つの異なる修飾を含む、オリゴマー化合物の一部を指す。
本明細書において、「薬学的に許容される塩」とは、活性化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性効果をその塩に与えない活性化合物の塩を指す。
本明細書において、「キャップ構造」又は「末端キャップ部分」とは、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組み込まれる化学修飾を指す。
本明細書において、「独立して」という用語は、請求されるオリゴヌクレオチド内の繰り返し可変物の各存在が互いに独立して選択されることを意味する。例えば、各々の繰り返し可変物は、(i)繰り返し可変物の各々が同じである、(ii)2つ以上が同じである、又は(iii)繰り返し可変物の各々が異なり得るように選択され得る。
一般化学の定義:
本明細書において、「アルキル」とは、典型的に24個以下の炭素原子を含有する飽和直鎖又は分岐鎖炭化水素置換基又はラジカルを指す。アルキル基の例には、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、n−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが含まれる。アルキル基は典型的には1〜24個の炭素原子、より典型的には1〜12個の炭素原子(C1〜C12アルキル)を含み、1〜6個の炭素原子(C1〜C6アルキル)がより好ましい。本明細書において、「低級アルキル」という用語は1〜6個の炭素原子(C1〜C6アルキル)を含む。本明細書において、アルキル基は任意選択で1つ又は複数のさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「アルケニル」とは、典型的に24個以下の炭素原子を含有し、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素ラジカル又は置換基を指す。アルケニル基の例には、限定されないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、1−メチル−2−ブテン−1−イル、1,3−ブタジエニルなどのジエンが含まれる。アルケニル基は典型的には2〜24個の炭素原子、より典型的には2〜12個の炭素原子を含み、2〜6個の炭素原子がより好ましい。本明細書において、アルケニル基は任意選択で1つ又は複数のさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「アルキニル」とは、典型的に24個以下の炭素原子を含有し、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素ラジカル又は置換基を指す。アルキニル基の例には、限定されないが、エチニル、1−プロピニル、1−ブチニルなどが含まれる。アルキニル基は典型的には2〜24個の炭素原子、より典型的には2〜12個の炭素原子が含まれ、2〜6個の炭素原子がより好ましい。本明細書において、アルキニル基は任意選択で1つ又は複数のさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「アミノアルキル」とは、アミノ置換アルキルラジカル又は置換基を指す。この用語は、任意の位置においてアミノ置換基を有し、アミノアルキル基がそのアルキル部分を介して親分子に結合されるC1〜C12アルキル基を含むことを意味する。アミノアルキル基のアルキル及び/又はアミノ部分は置換基によりさらに置換され得る。
本明細書において、「脂肪族化合物」とは、典型的に24個以下の炭素原子を含有し、任意の2つの炭素原子間の飽和が一重、二重又は三重結合である、直鎖又は分岐鎖炭化水素ラジカル又は置換基を指す。脂肪族基は好ましくは1〜24個の炭素原子、より典型的には1〜12個の炭素原子を含有し、1〜6個の炭素原子がより好ましい。脂肪族基の直鎖又は分岐鎖は、窒素、酸素、硫黄及びリンを含む1つ又は複数のヘテロ原子によって割り込まれていてもよい。ヘテロ原子によって割り込まれているそのような脂肪族基には、これらに限定されないが、ポリアルキレングリコール、ポリアミン及びポリイミンなどのポリアルコキシが含まれる。本明細書において、脂肪族基は任意選択でさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「脂環式」又は「アリシクリル」とは、環系が脂肪族である、環式ラジカル又は置換基を指す。環系は、少なくとも1つの環が脂肪族である1つ又は複数の環を含み得る。好ましい脂環式部分は環内に5〜9個の炭素原子を有する環を含む。本明細書において、脂環式基は任意選択でさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「アルコキシ」とは、アルコキシ基がその酸素原子を介して親分子に結合される、アルキル基及び酸素原子を含むラジカル又は置換基を指す。アルコキシ基の例には、これらに限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、n−ブトキシ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシ、n−ペントキシ、ネオペントキシ、n−ヘキソキシなどが含まれる。本明細書において、アルコキシ基は任意選択でさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「ハロ」、「ハロゲン化物」及び「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される原子、ラジカル又は置換基を指す。
本明細書において、「アリール」及び「芳香族」とは、1つ又は複数の芳香環を有する単又は多環式炭素環系を含むラジカル又は置換基を指す。アリール基の例には、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニルなどが含まれる。好ましいアリール環系は1つ又は複数の環内に5〜20個の炭素原子を有する。本明細書において、アリール基は任意選択でさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「アラルキル」及び「アリールアルキル」とは、アラルキル又はアリールアルキル基がそのアルキル部分を介して親分子に結合されるアルキル基及びアリール基を含むラジカル又は置換基を指す。例には、これらに限定されないが、ベンジル、フェネチルなどが含まれる。本明細書において、アラルキル基は、任意選択で、ラジカル又は置換基を形成するアルキル、アリール又は両方の基に結合されるさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「ヘテロシクリル」とは、少なくとも1つのヘテロ原子を含み、不飽和、部分的に飽和又は完全に飽和された単又は多環式環系を含み、それによりヘテロアリール基を含む、ラジカル又は置換基を指す。ヘテロシクリルはまた、融合環の1つ若しくは複数が少なくとも1つのヘテロ原子を含有し、他の環が1つ若しくは複数のヘテロ原子を含有し得る又は任意選択でヘテロ原子を含有しない融合環系部分を含むことを意味する。複素環式基は典型的に、硫黄、窒素又は酸素から選択される少なくとも1つの原子を含む。複素環式基の例には、[1,3]ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルなどが含まれる。本明細書において、複素環式基は任意選択でさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「ヘテロアリール」及び「複素芳香環」とは、環の少なくとも1つが芳香族であり、1つ又は複数のヘテロ原子を含む、単又は多環芳香族環、環系又は融合環系を含むラジカル又は置換基を指す。ヘテロアリールはまた、融合環の1つ又は複数がヘテロ原子を含有しない系を含む融合環系を含むことを意味する。ヘテロアリール基は典型的に硫黄、窒素又は酸素から選択される1つの環原子を含む。ヘテロアリール基の例には、これらに限定されないが、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニル、などが含まれる。ヘテロアリールラジカル又は置換基は、親分子に直接又は脂肪族基若しくはヘテロ原子などの連結部分を介して結合され得る。本明細書において、ヘテロアリール基は任意選択でさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「ヘテロアリールアルキル」とは、ヘテロアリールアルキル基がそのアルキル部分を介して親分子に結合される、上記ヘテロアリール基及びアルキル部分を含むラジカル又は置換基を指す。例には、これらに限定されないが、ピリジニルメチル、ピリミジニルエチル、ナフチリジニルプロピルなどが含まれる。本明細書において、ヘテロアリールアルキル基は任意選択でヘテロアリール又はアルキル部分の1つ又は両方においてさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「単又は多環式」とは、融合又は連結される環を有する単環又は多環式系などの任意の環系を指し、脂肪族、脂環式、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アリールアルキル、複素環式、ヘテロアリール、複素芳香環及びヘテロアリールアルキルから個々に選択される単及び混合環系を包含することを意味する。そのような単及び多環式構造は、完全に飽和された、部分的に飽和された又は完全に不飽和の環を含む、均一又は種々の程度の飽和を有する環を含有し得る。各環は、複素環及びC環原子のみを含む環を生じさせるようにC、N、O及びSから選択される環原子を含み得る。複素環及びすべての炭素環は、融合環系の1つの環が炭素環原子のみを有し、他の環が2つの窒素原子を有する、例えばベンズイミダゾールなどの混合モチーフに存在し得る。単又は多環式構造は、例えば、環の1つに結合される2つのオキソ基(=O)を有するフタルイミドなどの置換基によりさらに置換され得る。別の態様では、単又は多環式構造は、直接環原子を介して、置換基又は二官能性連結部分を介して親分子に結合され得る。
本明細書において、「アシル」とは、アシル基がそのカルボニル部分を介して親分子に結合されるカルボニル部分(C=O又は−C(O)−)及びさらなる置換基Xを含むラジカル又は置換基を指す。このように、アシル基は有機酸からのヒドロキシル基の除去によって形式的に得られ、一般式−C(O)−X(式中、Xは典型的に脂肪族、脂環式又は芳香族である)を有する。「アシル」という用語はまた、一般式−Y(O)n−X(式中、Xは上記と同義であり、Y(O)nは典型的にスルホニル、スルフィニル又はリン酸塩である。)を有するヘテロアシルラジカル又は置換基を含むことを意味する。アシル基の例には、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルフィニル、脂肪族スルフィニル、芳香族リン酸塩、脂肪族リン酸塩などが含まれる。本明細書において、アシル基は任意選択でさらなる置換基を含み得る。
本明細書において、「置換基」は、所望の特性を増強するため又は所望の効果を与えるために典型的に他の置換基又は親化合物に付加される基を含む。置換基は保護されていてもいなくてもよく、親化合物内の1つの利用可能な部位又は多くの利用可能な部位に結合され得る。置換基はまた、他の置換基によりさらに置換されていてもよく、直接又はアルキル若しくはヘテロカルビル基などの連結基を介して親化合物に結合され得る。本明細書において、「ヒドロカルビル」とは、C、O及びHを含む任意の基を指す。任意の程度の飽和性を有する直鎖状、分岐鎖状及び環状基が含まれる。そのようなヒドロカルビル基は、N、O及びSから選択される1つ又は複数のヘテロ原子を含み得、1つ又は複数の置換基によりさらに置換され得る。
特に断らない限り、置換された又は「任意選択で置換された」という用語は、以下の置換基のいずれかの任意選択の存在を指す:ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル(−C(O)Raa)、カルボキシル(−C(O)O−Raa)、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換されたオキソ(−O−Raa)、アリール、アラルキル、ヘテロ環式、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ(−NRbbRcc)、イミノ(=NRbb)、アミド(−C(O)NRbbRcc又は−N(Rbb)C(O)Raa)、アジド(−N3)、ニトロ(−NO2)、シアノ(−CN)、カルバミド(−OC(O)NRbbRcc又は−N(Rbb)C(O)ORaa)、ウレイド(−N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、チオウレイド(−N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、グアニジニル(−N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc)、アミジニル(−C(=NRbb)NRbbRcc又は−N(Rbb)C(NRbb)Raa)、チオール(−SRbb)、スルフィニル(−S(O)Rbb)、スルホニル(−S(O)2Rbb)、スルホンアミジル(−S(O)2NRbbRcc又は−N(Rbb)S(O)2Rbb)及びコンジュゲート基。本明細書において、Raa、Rbb及びRccの各々は、独立して、H及び任意選択で連結された化学官能基又はさらなる置換基であり、好ましくは、これらに限定されないが、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環、及びヘテロアリールアルキルからなる群から選択される。本明細書に記載の化合物内の選択された置換基はある再帰度まで存在する。
ここで、「再帰的な置換基」とは、置換基がそれ自身の別のインスタンスを出現させ得ることを意味する。そのような置換基の再帰的性質のために、理論的には、任意の所与の請求項に多数が存在し得る。医薬化学及び有機化学の分野の当業者は、そのような置換基の総数が、目的化合物の所望の特性によって合理的に制限されることを理解している。そのような特性には、例えば、物理的特性(例えば、分子量、溶解度、log P)、適用性(例えば、標的に対する活性)及び実用的な特性(例えば、合成の容易性)が含まれる。
再帰的な置換基は本発明の意図される態様である。医薬及び有機化学の分野の当業者はそのような置換基の多様性を理解している。再帰的な置換基が本発明の請求項に存在する程度まで、総数は上記のように決定される。
本明細書において、「安定な化合物」及び「安定な構造」という用語は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離を存続するのに十分に強力である化合物及び有効な治療剤への製剤化を示すことを意味する。安定な化合物のみが本明細書において意図される。
本明細書において、特定の単位の数を示す範囲においてゼロ(0)は、単位が存在し得ないことを意味する。例えば、特定のモチーフの0〜2個の領域を含むオリゴマー化合物は、オリゴマー化合物が特定のモチーフを有する1つ又は2つのそのような領域を含み得ること、或いはオリゴマー化合物が特定のモチーフを有する領域を1つも有しなくてもよいことを意味する。分子の内部部分が非存在である場合、非存在部分に隣接する部分は互いに直接結合する。同様に、本明細書において、「なし」という用語は、特定の特徴が存在しないことを示す。
本明細書において、「類似体」又は「誘導体」とは、構造において類似であるが、化合物が作製される方法に関わらず、親化合物とは元素組成に対して異なる化合物又は部分のいずれかを意味する。例えば、類似体又は誘導体化合物は、化学的出発物質などの親化合物から作製されることを必要とされない。
以下の実施例は例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
Fig.1: (a)PS229L/PS524(配列番号52)(配列番号91(非修飾配列)及び配列番号92(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)又は(b)PS220/PS339(配列番号21)(配列番号101(非修飾配列)及び配列番号200(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)又は(c)PS524/PS1317/PS1318/PS1319(配列番号52)(配列番号92(PS524)(6個すべてのシトシンが修飾されている。)、配列番号217(PS1317)(6個のシトシンのうちの4個が修飾されている。)、配列番号218(PS1318)(6個のシトシンのうちの2個が修飾されている。)、及び配列番号219(PS1319)(6個のシトシンのうちの3個が修飾されている。)に対応)でのトランスフェクション後の分化した健常な筋肉細胞における、シトシンから5−メチルシトシンへの置換を有する又は有しないAONのin vitroでの比較。平均スキッピング率を、1つの濃度当たり3連(triplo)(n=3)(a,b)又は2連(duplo)(n=2)(c)のトランスフェクションから計算した。実線は5−メチルシトシンを有するAONを示し、点線は非置換シトシンを有するAONを示す(a,b)。
Fig.1: (a)PS229L/PS524(配列番号52)(配列番号91(非修飾配列)及び配列番号92(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)又は(b)PS220/PS339(配列番号21)(配列番号101(非修飾配列)及び配列番号200(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)又は(c)PS524/PS1317/PS1318/PS1319(配列番号52)(配列番号92(PS524)(6個すべてのシトシンが修飾されている。)、配列番号217(PS1317)(6個のシトシンのうちの4個が修飾されている。)、配列番号218(PS1318)(6個のシトシンのうちの2個が修飾されている。)、及び配列番号219(PS1319)(6個のシトシンのうちの3個が修飾されている。)に対応)でのトランスフェクション後の分化した健常な筋肉細胞における、シトシンから5−メチルシトシンへの置換を有する又は有しないAONのin vitroでの比較。平均スキッピング率を、1つの濃度当たり3連(triplo)(n=3)(a,b)又は2連(duplo)(n=2)(c)のトランスフェクションから計算した。実線は5−メチルシトシンを有するAONを示し、点線は非置換シトシンを有するAONを示す(a,b)。
Fig.2: 5−メチルシトシンを有するAON[PS524(配列番号52)(配列番号92(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)及びPS652(配列番号57)(配列番号185(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)]及び非修飾(非メチル化)シトシンを有するAON[PS229L(配列番号52)(配列番号91(非修飾配列)に対応)及びPS531(配列番号57)(配列番号137(非修飾配列)に対応)]の血漿及び筋組織プロファイルを比較した、野生型(コントロール)及びmdxマウスにおける薬物動態試験の要約。(a)1)単回sc注射後のmdxマウス対コントロールマウスにおける筋肉内のAONの平均レベルの比、2)14日目におけるいくつかのmdx筋肉内のAON(μg/g)のレベル、3)14日目における相対的な筋肉/腎臓及び筋肉/肝臓レベル、及び4)三頭筋内の異なるAONの推定半減期の薬物動態学的組織分析。(b)1)Tmax(Cmaxに到達した時点、2回の分析時点のみが含まれる(15又は60分)、2)Cmax(到達した最高血漿濃度)、3)AUC(曲線下面積、バイオアベイラビリティの指標)、及び4)Cl(24時間における血漿クリアランス)の薬物動態学的血漿分析。
Fig.3: 非修飾シトシンを有するAON[PS232(配列番号39)(配列番号119(非修飾配列)に対応)及びPS534(配列番号59)(配列番号139(非修飾配列)に対応)](黒色のバー)又は5−メチルシトシンを有するAON[PS648(配列番号39)(配列番号201(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)及びPS653(配列番号59)(配列番号192(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)](灰色のバー)の0、10、25又は50μg/mlとのインキュベーション後のヒト全血中のサイトカインレベルの分析。TNFα(a,b)、MCP−1(d,e)、IP−10(e,f)及びIL6(g,h)のレベルは市販のELISAキットを用いて決定した。各実験は4回繰り返した(n=4)。データは、各サイトカインの最も顕著な反応について示す。
Fig.3: 非修飾シトシンを有するAON[PS232(配列番号39)(配列番号119(非修飾配列)に対応)及びPS534(配列番号59)(配列番号139(非修飾配列)に対応)](黒色のバー)又は5−メチルシトシンを有するAON[PS648(配列番号39)(配列番号201(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)及びPS653(配列番号59)(配列番号192(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)](灰色のバー)の0、10、25又は50μg/mlとのインキュベーション後のヒト全血中のサイトカインレベルの分析。TNFα(a,b)、MCP−1(d,e)、IP−10(e,f)及びIL6(g,h)のレベルは市販のELISAキットを用いて決定した。各実験は4回繰り返した(n=4)。データは、各サイトカインの最も顕著な反応について示す。
Fig.3: 非修飾シトシンを有するAON[PS232(配列番号39)(配列番号119(非修飾配列)に対応)及びPS534(配列番号59)(配列番号139(非修飾配列)に対応)](黒色のバー)又は5−メチルシトシンを有するAON[PS648(配列番号39)(配列番号201(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)及びPS653(配列番号59)(配列番号192(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)](灰色のバー)の0、10、25又は50μg/mlとのインキュベーション後のヒト全血中のサイトカインレベルの分析。TNFα(a,b)、MCP−1(d,e)、IP−10(e,f)及びIL6(g,h)のレベルは市販のELISAキットを用いて決定した。各実験は4回繰り返した(n=4)。データは、各サイトカインの最も顕著な反応について示す。
Fig.3: 非修飾シトシンを有するAON[PS232(配列番号39)(配列番号119(非修飾配列)に対応)及びPS534(配列番号59)(配列番号139(非修飾配列)に対応)](黒色のバー)又は5−メチルシトシンを有するAON[PS648(配列番号39)(配列番号201(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)及びPS653(配列番号59)(配列番号192(すべてのシトシンが修飾されている。)に対応)](灰色のバー)の0、10、25又は50μg/mlとのインキュベーション後のヒト全血中のサイトカインレベルの分析。TNFα(a,b)、MCP−1(d,e)、IP−10(e,f)及びIL6(g,h)のレベルは市販のELISAキットを用いて決定した。各実験は4回繰り返した(n=4)。データは、各サイトカインの最も顕著な反応について示す。
Fig.4: 5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシルを有するAONと、これらの塩基修飾を有しない対応するAONと、の活性比較。(a)分化した健常な筋肉細胞中へのin vitroでの2連の200nMのトランスフェクション。活性は平均エクソン51(PS43:配列番号111(非修飾配列)に対応;PS559:配列番号202(すべてのウラシルが修飾されている。)に対応;PS1106:配列番号203(すべてのシトシン及びすべてのウラシルが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号31に由来)、エクソン44(PS188:配列番号95(非修飾配列)に対応;PS785:配列番号204(すべてのウラシルが修飾されている。)に対応;PS1107:配列番号205(すべてのシトシン及びすべてのウラシルが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号15に由来)又はエクソン52(PS235:配列番号120(非修飾配列)に対応;PS786:配列番号172(すべてのウラシルが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号40に由来)スキッピング率(n=2)として表した。AON配列(5’から3’)及び塩基修飾(太字、下線付きのヌクレオチド)を表の下部に示す。(b)mdxマウスの腓腹筋における20μgのPS49(非修飾配列,配列番号216)又はPS959(すべてのウラシルが修飾されている修飾配列,配列番号214)の筋肉注射。活性は平均マウスエクソン23スキッピング率(n=4)として表した。AON配列(5’から3’)及び塩基修飾(太字、下線付きのヌクレオチド)を表の下部に示す。
Fig.4: 5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシルを有するAONと、これらの塩基修飾を有しない対応するAONと、の活性比較。(a)分化した健常な筋肉細胞中へのin vitroでの2連の200nMのトランスフェクション。活性は平均エクソン51(PS43:配列番号111(非修飾配列)に対応;PS559:配列番号202(すべてのウラシルが修飾されている。)に対応;PS1106:配列番号203(すべてのシトシン及びすべてのウラシルが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号31に由来)、エクソン44(PS188:配列番号95(非修飾配列)に対応;PS785:配列番号204(すべてのウラシルが修飾されている。)に対応;PS1107:配列番号205(すべてのシトシン及びすべてのウラシルが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号15に由来)又はエクソン52(PS235:配列番号120(非修飾配列)に対応;PS786:配列番号172(すべてのウラシルが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号40に由来)スキッピング率(n=2)として表した。AON配列(5’から3’)及び塩基修飾(太字、下線付きのヌクレオチド)を表の下部に示す。(b)mdxマウスの腓腹筋における20μgのPS49(非修飾配列,配列番号216)又はPS959(すべてのウラシルが修飾されている修飾配列,配列番号214)の筋肉注射。活性は平均マウスエクソン23スキッピング率(n=4)として表した。AON配列(5’から3’)及び塩基修飾(太字、下線付きのヌクレオチド)を表の下部に示す。
Fig.5: 2,6−ジアミノプリンを有するAONと、この塩基修飾を有しない対応するAONと、の活性比較。(a)分化した健常な筋肉細胞中へのin vitroでの2連の200nMのトランスフェクション。活性は平均エクソン51(PS43:配列番号111(非修飾配列)に対応;PS403:配列番号206(すべてのアデニンが修飾されている)に対応;すべての配列は配列番号31に由来)、エクソン52(PS235:配列番号120(非修飾配列)に対応;PS897:配列番号173(すべてのアデニンが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号40に由来)又はエクソン44(PS188:配列番号95(非修飾配列)に対応;PS733:配列番号207(すべてのアデニンが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号15に由来)スキッピング率(n=2)として表した。AON配列(5’から3’)及び塩基修飾(太字、下線付きのヌクレオチド)を表の下部に示す。(b)及び(c)すべての非修飾アデニン(PS188,配列番号95)を2,6−ジアミノプリン(PS733,配列番号207)で置換したことの、in vitro安全性に対する効果。補体第二経路の活性化についてのマーカーとして、分裂因子C3a(b)及びBb(c)をサル血漿中で測定した。
Fig.5: 2,6−ジアミノプリンを有するAONと、この塩基修飾を有しない対応するAONと、の活性比較。(a)分化した健常な筋肉細胞中へのin vitroでの2連の200nMのトランスフェクション。活性は平均エクソン51(PS43:配列番号111(非修飾配列)に対応;PS403:配列番号206(すべてのアデニンが修飾されている)に対応;すべての配列は配列番号31に由来)、エクソン52(PS235:配列番号120(非修飾配列)に対応;PS897:配列番号173(すべてのアデニンが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号40に由来)又はエクソン44(PS188:配列番号95(非修飾配列)に対応;PS733:配列番号207(すべてのアデニンが修飾されている。)に対応;すべての配列は配列番号15に由来)スキッピング率(n=2)として表した。AON配列(5’から3’)及び塩基修飾(太字、下線付きのヌクレオチド)を表の下部に示す。(b)及び(c)すべての非修飾アデニン(PS188,配列番号95)を2,6−ジアミノプリン(PS733,配列番号207)で置換したことの、in vitro安全性に対する効果。補体第二経路の活性化についてのマーカーとして、分裂因子C3a(b)及びBb(c)をサル血漿中で測定した。
表1:
AONの一般構造[X=C又はm
5C、Y=U又はm
5U、Z=A又はa
2A、I=イノシン(ヒポキサンチン塩基)、X
1=m
5C、Y
1=m
5U、Z
1=a
2A]
表2:
AONの一般構造[X=C又はm
5C、Y=U又はm
5U、Z=A又はa
2A、I=イノシン(ヒポキサンチン塩基)、X
1=m
5C、Y
1=m
5U、Z
1=a
2A]
表3(最も好ましいAON):
AONの一般構造[X=C又はm
5C、Y=U又はm
5U、Z=A又はa
2A、I=イノシン(ヒポキサンチン塩基)、X
1=m
5C、Y
1=m
5U、Z
1=a
2A]
好ましい非修飾オリゴヌクレオチド(X=C、Y=U、Z=A)は、より好ましくはオリゴヌクレオチド塩基配列(配列番号14〜90)の各々に由来し、ヌクレオチド又は塩基配列の配列番号91、93〜170によって表される。
好ましい修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号14〜90のヌクレオチド又は塩基配列の1つに由来し、m5Cである少なくとも1つのX及び/又はm5Uである少なくとも1つのY及び/又はa2Aである少なくとも1つのZを含み、配列番号92、171〜213、215、217、218、219を含む又はからなるヌクレオチド又は塩基配列によって表される。より好ましい修飾オリゴヌクレオチド(すべてのX=m5C=X1及び/又はすべてのY=m5U=Y1及び/又はすべてのZ=a2A=Z1)は、最も好ましいヌクレオチド又は塩基配列(配列番号15、21、31、40、52及び57)に由来し、配列番号92、171〜174、185〜188、199、200、202〜213、215、217、218、219によって表される。最も好ましい修飾オリゴヌクレオチドは表3に開示される。
[実施例1]
材料及び方法:
AON:
すべてのオリゴヌクレオチド[PS220/PS399(配列番号21に基づく。)(非修飾配列の配列番号101(PS220)及びすべてのシトシンが修飾されている配列番号200(PS399)に対応);PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319(配列番号52に基づく。)(非修飾配列の配列番号91(PS229L)、6個すべてのシトシンが修飾されている配列番号92(PS524)、6個のシトシンのうちの4個が修飾されている配列番号217(PS1317)、6個のシトシンのうちの2個が修飾されている配列番号218(PS1318)、及び6個のシトシンのうちの3個が修飾されている配列番号219(PS1319)に対応);PS232/PS648(配列番号39に基づく。)(非修飾配列の配列番号119(PS232)及びすべてのシトシンが修飾されている配列番号201(PS648)に対応;PS531/PS652(配列番号57に基づく。)(非修飾配列の配列番号137(PS531)及びすべてのシトシンが修飾されている配列番号185(PS652)に対応);PS534/PS653(配列番号59に基づく。)(非修飾配列の配列番号139(PS534)及びすべてのシトシンが修飾されている配列番号192(PS653)に対応)]は2’−O−メチルホスホロチオエートRNAであり、40nmol〜4.5mmolの合成スケールで、標準的なホスホラミダイトプロトコールによってOP−10合成器(GE/AKTA Oligopilot)を用いて合成するか又は供給業者から得た。Prosensaにより合成されたオリゴヌクレオチドを切断し、2ステップの順序(DIEA、続いて濃NH4OHによる処理)で脱保護し、HPLCにより精製し、水に溶解し、過剰なNaClを交換イオンに加えた。蒸発後、化合物を水に再溶解し、FPLC又は限外濾過によって脱塩し、凍結乾燥した。質量分析により、すべての化合物の同一性を確認し、純度(UPLCにより決定した)はすべての化合物について許容されることを見出した(>75〜80%);供給業者から得た化合物は受領時の状態で使用した:PS399(ChemGenes、1μmolの合成スケール、受領時の状態で使用した)、PS1317、PS1318及びPS1319(ChemGenes、200nmolの合成スケール、受領時の状態で使用した)、PS229L、PS232、PS524及びPS648(EuroGentec、40nmolの合成スケール、受領時の状態で使用した)、PS229L(Prosensa,取得物質5.9g,純度81%)、PS524(Avecia、4.5mmolの合成スケール、純度93%)、PS534(Prosensa、2μmolの合成スケール、純度86%)、PS653(Prosensa、40nmolの合成スケール、純度77%)、PS531(Avecia,取得物質4.6g,純度85%)、PS652(Avecia,取得物質2.4g,純度84%、及び取得物質3.8g,純度82%)。本明細書に記載されているin vitroトランスフェクション実験のために、AONの50μMの希釈標準溶液を20mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中で調製した。この実施例における全血サイトカイン放出アッセイのために、ストック溶液(DNase/RNaseを含まない蒸留水(Invitrogen)中で調製した)の濃度は種々であった:PS232(8.75mg/mL)、PS534(7.02mg/mL)、PS648(8.55mg/mL)、PS653(8.12mg/mL)。
トランスフェクション及びRT−PCR分析:
非GLP標準操作手順に従って、分化したヒトの健常なコントロール筋肉細胞(筋管)に0−100−200−400nM(Fig.1a、PS229L/PS524、配列番号91/92)若しくは0−50−100−200−400−800nM(Fig.1b、PS220/PS399、配列番号101/200)の3連のAON濃度シリーズ又は400nM(Fig.1c、PS524/PS1317/PS1318/PS1319、配列番号92/217/218/219)の2連の濃度を6ウェルプレート中でトランスフェクトした。トランスフェクションのために、ポリエチレンイミン(ExGen500、Fermentas)を使用した(0.15MのNaCl中に2μl/μgAON)。上述のトランスフェクション手順を以前に報告されている材料及び方法から適合した(Aartsma−Rusら、2003)。トランスフェクションの24時間後、RNAを単離し、RT−PCRによって分析した。簡潔に述べると、ジストロフィンに特異的なcDNAを生成するために、エクソン47(PS220/PS399)又はエクソン55(PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319)におけるDMD遺伝子特異的リバースプライマーを1000ngの入力RNAに対する逆転写酵素(RT)反応において使用した。PCR分析を続いて各試料について3μlのジストロフィンcDNAで行い、エクソン45(PS220/PS399)又は53(PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319)に隣接するエクソンにおけるDMD遺伝子特異的プライマーを使用した第1及びネステッドPCRを含めた。RNA単離及びRT−PCR分析を、記載されている(Aartsma−Rusら、2003)ように非GLP標準操作手順に従って実施した。RT−PCR産物をゲル電気泳動(2%アガロースゲル)によって分析した。得られたRT−PCR断片をDNA Lab−on−a−Chip分析(Agilent)により定量した。データを「アジレント2100バイオアナライザー」ソフトウェア及びエクセル2007により処理した。転写産物の総量に対して少ない転写産物(エクソン45(PS220/PS399)又は53スキップ(PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319)を含有する)の割合を評価し(パーセンテージでエクソン45又は53スキッピング効率を表す)、非トランスフェクト細胞における割合と直接比較した。
野生型及びmdxマウスにおける薬物動態試験:
5週齢のMdx(C57B1/10ScSn−Dmdmdx/J)及び野生型(C57B1/10ScSnJ)マウスをJackson Laboratory(Maine USA)から得た。AON(配列番号91/92に対応するPS229L/PS524、配列番号137/185に対応するPS531/PS652)を、2週間にわたって1週間に3回、皮下注射により100mg/kgの用量にて生理的食塩水中で投与した。AONの血漿プロファイルを決定するために、血漿試料を、動物について以下の時間:投与後15分、1時間、2時間、6時間及び24時間の時点ごとに(AON群につき)2匹の動物から得た。血漿を得るために、静脈全血をLi−ヘパリンチューブ内に採取し、遠心分離し、分析するまで−80℃に維持した。分布分析のために、7個の器官(心臓、腎臓皮質、肝臓、横隔膜、腓腹筋、四頭筋、三頭筋)を動物の屠殺時に収集した。組織を即座に凍結させ、分析するまで−80℃に保存した。
AONハイブリダイゼーションアッセイ:
血漿及び組織中のAON(配列番号91/92に対応するPS229L/PS524、配列番号137/185に対応するPS531/PS652)の濃度を決定するために、Yuら、2002に記載されているアッセイに基づいた、AONハイブリダイゼーションアッセイを使用した。組織分布分析のために、MagNaLyzer(Roche)を使用して、2mg/mlのプロテイナーゼKを含有するprotK緩衝液(100mmol/lのトリス−HCl pH8.5、200mmol/lのNaCl、5mmol/lのEDTA、0.2%のSDS)中で60mg/mlの濃度に組織を均質化し、続いて55℃にて回転ハイブリダイゼーションオーブン中で2時間のインキュベーション(肝臓)又は4時間のインキュベーション(他のすべての器官)を行い、次いで使用するまで−20℃に保存した。すべての組織ホモジネート及び校正曲線を、60倍に希釈したプールしたmdxコントロール組織ホモジネート(腎臓、肝臓、いくつかの筋肉群)中で希釈した(アッセイの基準に合わせた)。各AONに特異的な鋳型プローブ(5’gaatagacg−抗AON−ビオチン3’、DNAリン酸オリゴヌクレオチド)及びライゲーションプローブ(p−cgtctattc−DIG DNAリン酸オリゴヌクレオチド)をハイブリダイゼーションアッセイに使用した。ホモジネートを鋳型プローブ(50nmol/l)と共に37℃にて1時間インキュベートし、ハイブリダイズした試料をストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレートに移し、37℃にて30分間インキュベートした。その後、プレートを4回洗浄し、ジゴキシゲニンで標識したライゲーション(2nmol/l)を加え、周囲温度にて30分間インキュベートした。抗DIG−POD(1:7,500〜1:30,000、Roche Diagnostics)を使用してDIG標識を検出し、それを3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン基質(Sigma Aldrich、オランダ)を用いて可視化し、酸性溶液(Sigma Aldrich)を使用して反応を停止させた。BioTek Synergy HTプレートリーダー(Beun de Ronde、Abcoude、オランダ)を使用して吸収を450nmにて測定した。100倍希釈したプールしたmdx血漿を使用して、同じプロトコールに従って血漿試料を分析した。
全血サイトカイン放出アッセイ:
選択したAON(配列番号119/201に対応するPS232/PS648及び配列番号139/192に対応するPS534/PS653)により誘導される起こり得るサイトカイン刺激を検出するために、健常なヒトボランティア由来の全血(抗凝固剤CPD)を使用した。種々のAON濃度(約1:0.01(v/v)の希釈物中に0〜50μg/mlの範囲)を血液に添加し、試料を5%CO2雰囲気下37℃にて4時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を4℃にて15分間3200×gにて遠心分離し、血漿上清を採取し、サイトカイン定量まで−20℃にて保存した。MCP−1、IL−6、TNF−α及びIP−10濃度を、サンドイッチELISA(ヒトMCP−1、IL−6、TNF−α、IP−10ELISAキット(R&D Systems))によって決定した。ヒト全血を用いた実験を3〜4回繰り返した。Fig.3は1回の実験のみに基づいているが、代表と考える。
結果:
すべてのシトシンを5−メチルシトシン(m5C)と置換したAON活性(すなわちエクソンスキッピング効率を誘導する)に対する効果を、培養した分化した健常な筋肉細胞中でin vitroで試験した。Fig.1a及び1bにおいて2つの例を示す。0−100−200−400nMを使用した用量反応トランスフェクション実験においてPS229LとPS524(=PS229L−m5C)を比較した場合(すなわちすべてのシトシンが修飾されている修飾配列の配列番号92と比較した非修飾配列の配列番号91)、PS524は200及び400nMにおいてPS229Lより明らかに効果的であった(1.9倍高いエクソン53スキッピングレベル)(Fig.1a)。同様に、0−50−100−200−400−800nMを使用した用量反応トランスフェクション実験においてPS220とPS399(=PS220−m5C)を比較した場合(すなわちすべてのシトシンが修飾されている修飾配列の配列番号200と比較した非修飾配列の配列番号101)、PS399は、特に低い濃度でPS220より明らかに効果的であった(50nMにおいて最大で10倍高いエクソン45スキッピングレベル)(Fig.1b)。これらの結果より、5−メチルシトシンの存在がAONの活性に対してプラス効果を有することが実証される。PS524(配列番号92)において、6個のシトシンのすべては5−メチルシトシン(m5C)と置換されており、これは、非修飾対応物のオリゴヌクレオチドPS229L(配列番号91)と比較してエクソンスキッピング活性に対するプラス効果を有した(Fig.1a)。そのようなプラス効果が、組み込まれた塩基修飾の数又は割合と関連し得るかどうかを試験するために、6個のシトシンのうちの4、2及び3個のそれぞれが5−メチルシトシン(m5C)と置換されているPS1317、PS1318及びPS1319を試験し、培養した分化した健常な筋肉細胞中でin vitroでPS524と直接比較した。PS1317、PS1318及びPS1319は、エクソン53スキッピングの誘導においてすべて効果的であった(それぞれ47%、37%及び45%)(Fig.1c)。しかしながら、PS524で得られたレベル(64%)と比較して、これらの結果により実際に、6個から4、3又は2個の5−メチルシトシンへの5−メチルシトシン(m5C)の数の減少が、AONのエクソンスキッピング活性に対して減少したプラス効果を導くことが示唆される。
5−メチルシトシンが生物学的安定性、生物学的分布及び/又はバイオアベイラビリティに影響を及ぼすかどうかを調べるために、野生型(コントロール)及びmdxマウスの両方において薬物動態試験を実施した。DMDについてのmdxマウスモデルはエクソン23において天然のナンセンス変異を有するので、ジストロフィン欠損である。膜におけるジストロフィンの欠損により、AONのような比較的小さい分子についての筋繊維の透過性が増加し、実際に10倍まで筋肉による2’−O−メチルホスホロチオエートRNA AON取り込みを増強することが実証されている(Heemskerkら、2010)。100mg/kgの5−メチルシトシンを含有するAON(配列番号92、185に対応するPS524、PS652)又は非修飾シトシン(配列番号91、137に対応するPS229L、PS531)を有するそれらの対応物のいずれかを2週間にわたって1週間に3回、マウスに皮下注射した。最後の注射後、異なる時点(1、7、14日目)にて、マウスを屠殺し、異なる筋肉群(心臓、横隔膜、腓腹筋、四頭筋、三頭筋)並びに肝臓及び腎臓を単離してそれらの中のAON濃度を決定した(Fig.2a)。予測されるように、すべての化合物について、mdx筋肉中の濃度(すべての試料の平均)はコントロールマウスにおける濃度より高かった。mdx対コントロールAONレベルの比は、5−メチルシトシンを有するAONについて比較的高いように見えた。より具体的には、mdxマウスにおいて、PS524及びPS652のレベルはPS229L及びPS531のレベルより2〜3倍高かった(Fig.2a)。腎臓及び肝臓(既知の毒性器官)内のAONのレベルをモニタリングすると、筋肉組織と毒性組織との間の比はより小さいままであった又はPS524についてさらに好適であった。これらの結果より、5−メチルシトシンを有するAONが、非修飾シトシンを有するAONより、筋肉によってより良く取り込まれる又は筋肉内でより安定であることが示唆される。実際に、筋肉内の半減期は、PS229L(7日)及びPS531(10日)と比較してPS524(>20日)及びPS652(25日)について、より長かった。血漿中で、注射したAONのCmax値は類似しており、これによりマウスは同等の用量を受けたことが確認される(Fig.2b)。注目すべきことに、AUC値(バイオアベイラビリティの指標として)は5−メチルシトシンを含有するAONについて1.5〜2.3倍高かった。これはより低いクリアランスに関連し、それらのより高い筋肉組織レベルを支持している。したがって、この薬物動態試験の結果により、5−メチルシトシンの存在はAONの生物学的安定性、生物学的分布及び/又はバイオアベイラビリティに対してプラス効果を有するのに対して、筋肉/毒性器官の比は非修飾シトシンを有するAONによる比と同様であることが実証される。
5−メチルシトシンを有するAON(配列番号201、192に対応するPS648、PS653)のin vitro安全性プロファイルを、非修飾シトシンを有するAON(配列番号119、139に対応するPS232、PS534)のin vitro安全性プロファイルと比較した。AONは、Toll様受容体(TLR7、TLR8、TLR9を含む)を活性化することによって自然免疫応答を刺激でき、その結果、自然免疫を含む調整された免疫応答のセットが得られる。IP−10、TNFα、IL−6及びMCP−1などのいくつかのケモカイン及びサイトカインはこの目的において役割を果たし、したがって、(市販のELISAキットを使用して)0〜50μg/mlの各AONとインキュベートしたヒト全血中でモニターした。PS232及びPS534の両方は非修飾シトシンを有し、漸増用量でTNF−α(Fig.3a,3b)、MCP−1(Fig.3c,3d)、IP−10(Fig.3e,3f)及びIL−6(Fig.3g,3h)の放出を誘導した。対照的に、PS648及びPS653(5−メチルシトシンを有する)の両方はTNF−α、IP−10及びIL−6に対する効果を有しなかった。PS648ではなく、PS653はMCP−1のみの少しの放出を誘導するように見えた。結論として、5−メチルシトシンの存在により、in vitroでのこれらのAONの安全性プロファイルが改善された。
[実施例2]
材料及び方法:
AON:
すべてのオリゴヌクレオチド[PS43/PS559/PS1106(すべて配列番号31に基づく。)(非修飾配列の配列番号111(PS43)、すべてのウラシルが修飾されている配列番号202(PS559)、並びにすべてのウラシル及びすべてのシトシンが修飾されている配列番号203(PS1106)に対応);PS188/PS785/PS1107(すべて配列番号15に基づく。)(非修飾配列の配列番号95(PS188)、すべてのウラシルが修飾されている配列番号204(PS785)、並びにすべてのウラシル及びすべてのシトシンが修飾されている配列番号205(PS1107)に対応);PS235/PS786(いずれも配列番号40に基づく。)(非修飾配列の配列番号120(PS235)及びすべてのウラシルが修飾されている配列番号172(PS786)に対応);非修飾配列のPS49(配列番号216)及びすべてのシトシンが修飾されているPS959(配列番号214)]は、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAであり、200nmol〜286.1gスケールで、標準的なホスホラミダイトプロトコールによってOP−10合成器(GE/AKTA Oligopilot)を用いて合成するか又は供給業者から得た。Prosensaにより合成されたオリゴヌクレオチドを切断し、2ステップの順序(DIEA、続いて濃NH4OHによる処理)で脱保護し、HPLCにより精製し、水に溶解し、過剰のNaClを交換イオンに加えた。蒸発後、化合物を水に溶解し、FPLC又は限外濾過により脱塩し、凍結乾燥した。質量分析により、すべての化合物の同一性を確認し、純度(UPLCにより決定した)はすべての化合物について許容されることを見出し(>75〜80%)、供給業者から得た化合物を受領時の状態で使用した:PS188(Girindus、得た生成物286.1g、純度93%)、PS785、PS786、PS1106及びPS1107(ChemGenes、200nmolの合成スケール、受領時の状態で使用した)、PS43(Prosensa、1μmolの合成スケール、純度90%)、PS559(ChemGenes、1μmolの合成スケール、受領時の状態で使用した)、PS235(Prosensa、1.92mmolの合成スケール、純度91%)。本明細書に記載されているin vitroトランスフェクション実験のために、AONの50μMの希釈標準溶液を20mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中で調製した。
トランスフェクション及びRT−PCR分析:
非GLP標準操作手順に従って、分化したヒトの健常なコントロール筋肉細胞(筋管)に200nMの一定の濃度のAONを6ウェルプレート中でトランスフェクトした。トランスフェクションのために、ポリエチレンイミン(ExGen500、Fermentas)を使用した(0.15MのNaCl中に2μl/μgAON)。上述のトランスフェクション手順を以前に報告されていた材料及び方法(Aartsma−Rusら、2003)から適合した。トランスフェクションの24時間後、RNAを単離し、RT−PCRによって分析した。簡潔に述べると、ジストロフィンに特異的なcDNAを生成するために、エクソン53(PS43/PS559/PS1106、配列番号111、202、203)、エクソン46(PS188/PS785/PS1107、配列番号95、204、205)又はエクソン54(PS235/PS786、配列番号120、172)におけるDMD遺伝子特異的リバースプライマーを、1000ngの入力RNAに対する逆転写酵素(RT)反応において使用した。その後、PCR分析を各試料について3μlのジストロフィンcDNAで行い、エクソン51(PS43/PS559/PS1106)、エクソン44(PS188/PS785/PS1107)又はエクソン52(PS235/PS786)に隣接するエクソンにおいてDMD遺伝子特異的プライマーを使用した第1及びネステッドPCRを含めた。RNA単離及びRT−PCR分析を、記載されている非GLP標準操作手順に従って実施した[Aartsma−Rusら、Hum Mol Genet 2003、12(8)、907−14]。RT−PCR生成物をゲル電気泳動(2%アガロースゲル)によって分析した。得られたRT−PCR断片を、DNA Lab−on−a−Chip分析(Agilent)によって定量した。データを「アジレント2100バイオアナライザー」ソフトウェア及びエクセル2007により処理した。転写産物の総量に対する少量の転写産物(エクソン51(PS43/PS559/PS1106)、エクソン44(PS188/PS785/PS1107)又はエクソン52スキップ(PS235/PS786)を含有する。)の割合を評価し(パーセンテージでエクソン51、44又は52スキッピング効率を表す。)、非トランスフェクト細胞における割合と直接比較した。
in vivo投与及びRT−PCR:
mdxマウスモデル(C57Bl/10ScSn−mdx/J、Charles River Laboratories)を用いた実験は地方LUMC動物倫理委員会(Animal Ethics Committee)(DEC番号11145)により承認された。イソフルランを用いて2匹のmdxマウス/群を麻酔し、次いで50μl/注射の全量に無菌食塩水中で希釈した20ugのPS49(配列番号216)又はPS959(配列番号214)を用いて両方の腓腹筋内に2日連続して筋肉注射した。最後の注射の1週間後に頸椎脱臼によって動物を屠殺し、筋肉を単離し、マグナライザーグリーンビーズチューブ(magnalyzer greenbead tube)(Roche)中で即座に凍結した。600μlのトリピュア(Tripure)(Roche)をチューブに加え、バレットブレンダー(bulletblender)機器、3×1分、速度10を使用して筋肉をホモジナイズした。溶解物を無菌のチューブに移し、それに120μlのクロロホルムを加えた。試料を激しく振盪し、氷上で5分間インキュベートし、次いで4℃にて最大速度で15分間遠心分離した。上清を別のチューブに移し、1体積のイソプロパノールを加えた。試料を混合し、少なくとも30分間、4℃にてインキュベートした。次いで試料を4℃にて最大速度で15分間遠心分離し、70%エタノールで洗浄し、続いて10分の2回目の遠心分離ステップを4℃にて最大速度で行った。RNAペレットを風乾し、DEPC処理した水に溶解した。製造業者の指示書に従ってトランスクリプター(Transcriptor)逆転写酵素(RT)(Roche Diagnostics)を使用してランダム六量体プライマーと共に400ngの全RNAを使用してcDNAを生成した。マウスエクソン22及びエクソン24に特異的なプライマーを使用した鋳型として1.5μlのcDNAを使用して50μl反応物中で30秒間94度、30秒間60度及び30秒間72度の30サイクルによってPCRを実施した。PCR生成物を2%アガロースゲル上で可視化し、アジレント2100バイオアナライザー(Agilent、Santa Clara、CA、USA)により定量した。
結果:
(PS1106、PS1107、配列番号203、205におけるように)すべての非修飾シトシンを5−メチルシトシンに置換し、すべての非修飾ウラシルを5−メチルウラシルに置換したもの及び(PS559、PS785、PS786、配列番号202、204、172におけるように)すべての非修飾ウラシルを5−メチルウラシルに置換したもののみのAON活性(すなわちエクソンスキッピング効率を誘導する)に対する効果を、培養した分化した健常な筋肉細胞中で一定の200nMのAON濃度にてin vitroで最初に試験した(Fig.4a)。5−メチルウラシルを有するAON(PS559、PS785及びPS786)は、非修飾ウラシルを有するそれらの対応物と比較してエクソンスキッピング効率を1.3〜3倍に増加した。また、非修飾シトシンを5−メチルシトシンに置き換えた場合、スキッピングレベルはさらに増加した(PS1106対PS559、配列番号203対202)又は同様であった(PS1107対PS785、配列番号205対204)。次いで、(PS49、配列番号216におけるように)すべての非修飾ウラシルを(PS959、配列番号214におけるように)5−メチルウラシルで置換したもののAON活性(すなわちエクソンスキッピング効率を誘導する)に対する効果もmdxマウスモデルの筋肉内で試験した。すべての5−メチルウラシルを有するPS959は、非修飾ウラシルを有するPS49と比較してエクソン23スキッピング効率を約3倍増加させた(n=4/AON)(Fig.4b)。これらの結果より、in vitro及びin vivoの両方で、5−メチルシトシンだけでなく、5−メチルウラシルもまた、エクソンスキッピング活性に対してプラス効果を有し得る(Fig.1にも示した)ことが実証される。さらに、これらの5−メチルピリミジンの組み合わせた使用はさらにもっと活性を増加させ得る。
[実施例3]
材料及び方法:
AON:
すべてのオリゴヌクレオチド[PS43/PS403(配列番号31に基づく。)(非修飾の配列番号111(PS43)及びすべてのアデニンが修飾されている配列番号206(PS403)に対応);PS188/PS733(配列番号15に基づく。)(非修飾の配列番号95(PS188)及びすべてのアデニンが修飾されている配列番号207(PS733)に対応);PS235/PS897(配列番号40に基づく。)(非修飾の配列番号120(PS235)及びすべてのアデニンが修飾されている配列番号173(PS897)に対応)]は、2’−O−メチルホスホロチオエートRNAであり、200nmol〜151gスケールで、標準的なホスホラミダイトプロトコールによってOP−10合成器(GE/AKTA Oligopilot)を用いて合成するか又は供給業者から得た。Prosensaにより合成されたオリゴヌクレオチドを切断し、2ステップの順序(DIEA、続いて濃NH4OHによる処理)で脱保護し、HPLCにより精製し、水に溶解し、過剰なNaClを交換イオンに加えた。蒸発後、化合物を水に再溶解し、FPLC又は限外濾過により脱塩し、凍結乾燥した。質量分析により、すべての化合物の同一性を確認し、純度(UPLCにより決定した)はすべての化合物について許容されることを見出し(>75〜80%)、供給業者から得た化合物は受領時の状態で使用した:PS188(Girindus、151gを得た、純度92%)、PS733(TriLink又はChemGenes、200nmol/1mgの合成スケール、受領時の状態で使用した、PS43(Prosensa、10μmolの合成スケール、純度86%)、PS403(ChemGenes、1μmolの合成スケール、受領時の状態で使用した)、PS235(Prosensa、1.92mmolの合成スケール、純度91%)、PS897(ChemGenes、200nmolの合成スケール、受領時の状態で使用した)。本明細書に記載されているin vitroトランスフェクション実験のために、AONの50μMの希釈標準溶液を20mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中で調製した。本明細書に記載されているin vitro補体活性化アッセイのために、PS188及びPS733の3mg/mlのストック溶液を20mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中で調製した。
トランスフェクション及びRT−PCR分析:
非GLP標準操作手順に従って、分化したヒトの健常なコントロール筋肉細胞(筋管)に200nMの一定の濃度のAONを6ウェルプレート中でトランスフェクトした。トランスフェクションのために、ポリエチレンイミン(ExGen500、Fermentas)を使用した(0.15MのNaCl中に2μl/μgAON)。上述のトランスフェクション手順を以前に報告されていた材料及び方法(Aartsma−Rusら、2003)から適合した。トランスフェクションの24時間後、RNAを単離し、RT−PCRによって分析した。簡潔に述べると、ジストロフィンに特異的なcDNAを生成するために、エクソン53(PS43/PS403、配列番号111/206)、エクソン46(PS188/PS733、配列番号95/207)又はエクソン54(PS235/PS897、配列番号120/173)におけるDMD遺伝子特異的リバースプライマーを、1000ngの入力RNAに対する逆転写酵素(RT)反応において使用した。その後、PCR分析を各試料について3μlのジストロフィンcDNAで行い、エクソン51(PS43/PS403)、エクソン44(PS188/PS733)又はエクソン52(PS235/PS897)に隣接するエクソンにおいてDMD遺伝子特異的プライマーを使用した第1及びネステッドPCRを含めた。RNA単離及びRT−PCR分析を、記載されている非GLP標準操作手順に従って実施した[Aartsma−Rusら、Hum Mol Genet 2003、12(8)、907−14]。RT−PCR生成物をゲル電気泳動(2%アガロースゲル)によって分析した。得られたRT−PCR断片を、DNA Lab−on−a−Chip分析(Agilent)によって定量した。データを「アジレント2100バイオアナライザー」ソフトウェア及びエクセル2007により処理した。転写産物の総量に対する少量の転写産物(エクソン51(PS43/PS403)、エクソン44(PS188/PS733)又はエクソン52スキップ(PS235/PS897)を含有する。)の割合を評価し(パーセンテージでエクソン51、44又は52スキッピング効率を表す。)、非トランスフェクト細胞における割合と直接比較した。
補体活性化アッセイ:
アンチセンスオリゴヌクレオチドは補体第二経路(C3a及び因子Bb(因子Bbは第2経路に特有である。)などのいくつかの分裂因子を含む。)を活性化できる。補体経路を可能な限り活性化するAONの能力をカニクイザル(LiHe血漿、CIT、France)由来の血漿中で評価した。増加させた濃度(0〜300μg/mL)のPS188(配列番号95)及びPS733(PS207)を、1:10(v/v))の希釈物中で血漿に加え、37℃にて30分間インキュベートした。試料を氷に移すことにより反応を停止させ、氷冷希釈物中で希釈を行った。Bb及びC3a濃度をELISAにより決定した(Quidel、San Diego、CA)。
結果:
すべての非修飾アデニンを2,6−ジアミノプリンに置換したもののAON活性(すなわちエクソンスキッピング効率を誘導する)に対する効果を、培養した分化した健常な筋肉細胞中で一定のAON濃度(200nM)にてin vitroで試験した。Fig.5aにおいて3つの異なるAON配列についての例を示す。2,6−ジアミノプリンを有するAON(PS403、PS897及びPS733、配列番号206、207、173)は、非修飾アデニンを有するそれらの対応物と比較して(配列番号111、95、120と比較して)エクソンスキッピング効率を2から4倍に増加させた。それらは各AONにおける2,6−ジアミノプリンの数と相関関係があるようである。
すべての非修飾アデニン(例えばPS188(配列番号95))を2,6−ジアミノプリン(例えばPS733(配列番号207))で置換することの、in vitro安全性、すなわち補体第二経路の活性化の可能性に対する効果をサル血漿中で試験した。PS188は比較的高レベルの分裂因子Bb及びC3aの両方を誘導したのに対して、PS733における2,6−ジアミノプリンは補体活性化第2経路に対する効果を完全に無効にし、Bb又はC3aレベルのいずれの増加も示さなかった(Fig.5b)。したがって、2,6−ジアミノプリンの存在はin vitroでPS188の安全プロファイルを改善しているように見えた。
これらの結果より、AONのエクソンスキッピング活性及び安全性に対する2,6−ジアミノプリンのプラス効果が実証される。
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本明細書に記載されている各実施形態は、特に断らない限り、一緒に組み合わされ得る。本明細書で引用されるすべての特許及び参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
本発明の実施形態は例えば下記実施形態1〜14を含む。
実施形態1:
デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの治療における使用のためのオリゴヌクレオチドであって、2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格を含み、5−メチルウラシル及び/又は5−メチルシトシン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含むオリゴヌクレオチド。
実施形態2:
5−メチルシトシン及び/又は5−メチルウラシル塩基を含む、実施形態1に記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態3:
2,6−ジアミノプリン塩基を含む、実施形態1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態4:
2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格を含むが、5−メチルシトシン及び5−メチルウラシル及び2,6−ジアミノプリンは含まない対応オリゴヌクレオチドと比較して改善されたパラメーターを有し、前記改善されたパラメーターは、結合親和性、動態、エクソンスキッピング活性、生体内安定性、(組織内)分布、細胞取り込み、輸送、及び/又は免疫原性である、実施形態1〜3のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態5:
長さが34ヌクレオチド未満である、実施形態1〜4のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態6:
ジストロフィンエクソン及び/又は非エクソン領域の少なくとも一部に対して逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする、実施形態1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態7:
ジストロフィンmRNA前駆体エクソン44〜55の少なくとも一部に対して逆相補的である及び/又は結合する及び/又は標的化する及び/又はハイブリダイズする配列を含む又はからなり、オリゴヌクレオチド部分が10〜33ヌクレオチドを有する、実施形態1〜6のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態8:
2’−O−メチルRNAモノマー及びホスホロチオエート骨格を含み、
配列番号52、14〜51、53〜90の1つの配列を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号52、14〜51、53〜90の1つの配列の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表され、
5−メチルウラシル及び/又は5−メチルシトシン及び/又は2,6−ジアミノプリン塩基を含む、
実施形態7に記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態9:
配列番号52、15、21、31、40、57の1つの配列を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号52、15、21、31、40、57の1つの配列の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される、実施形態8に記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態10:
配列番号92、171〜215、217、218、219の1つの配列を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号92、171〜215、217、218、219の1つの配列の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される、実施形態8又は9に記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態11:
配列番号92、171、173、185、187、200、206、207、208、210、213、217、218若しくは219の1つの配列を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列によって、又は配列番号92、171、173、185、187、200、206、207、208、210、213、217、218若しくは219の1つの配列の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド若しくは塩基配列であって、前記断片は配列番号92、171、173、185、187、200、206、207、208、210、213、217、218若しくは219の少なくとも10個の連続したヌクレオチド若しくは塩基を含む若しくはからなり、そのような断片は10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32若しくは33ヌクレオチドの長さを有する、ヌクレオチド若しくは塩基配列によって表される、実施形態10に記載のオリゴヌクレオチド。
実施形態12:
実施形態1〜11のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
実施形態13:
前記組成物及び/又は前記オリゴヌクレオチドの組織及び/又は細胞に対する及び/又は組織及び/又は細胞中への標的化及び/又は送達を増強することをさらに補助し得る少なくとも1種の賦形剤を含む、実施形態12に記載の組成物。
実施形態14:
デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの予防、治療及び/又は遅延のための方法であって、予防、治療及び/又は遅延は、実施形態1〜11のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド又は実施形態12若しくは13に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することによって行われる、方法。