CN109757108A - 具有治疗遗传疾病的改善特征的包含双环支架部分的前体mRNA剪接转换或调节寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了反义剪接转换寡核苷酸，其具有增强用于治疗、改善、预防和/或延迟神经肌肉疾病如DMD的临床适用性的改善特征。

Description

具有治疗遗传疾病的改善特征的包含双环支架部分的前体 mRNA剪接转换或调节寡核苷酸
技术领域
本发明涉及反义寡核苷酸领域，更具体地涉及用于治疗遗传疾病，更具体地神经肌肉疾病的剪接转换寡核苷酸(splice-switching oligonucleotide)。本发明特别涉及如本文进一步定义的具有增强临床适用性的改善特征的寡核苷酸的用途。
背景技术
反义寡核苷酸(AON)处于许多疾病和病症的临床(前)开发中，包括癌症、炎性病症、心血管疾病和神经变性和神经肌肉疾病。它们的作用机制针对各种靶，例如RNaseH介导的细胞核或细胞质中靶RNA的降解，细胞核中的剪接调节(外显子保留(外显子增加、外显子包含，exon inclusion)或跳跃)或通过细胞质中核糖体亚基结合的空间位阻的翻译抑制。首次描述剪接调节或剪接转换寡核苷酸(SSO)用于校正人β-珠蛋白前体mRNA中的异常剪接(Dominski和Kole，1993)，并且目前正在用于研究多种遗传疾病，包括但不限于囊性纤维化(CFTR基因，Friedman等，1999)、乳腺癌(BRCA1基因，Uchikawa等，2007)、前列腺癌(FOLH1基因，Williams等，2006)、炎性疾病(IL-5R病和MyD88基因，Karras等，2001，Vickers等，2006)、眼白化病1型(OA1基因，Vetrini等，2006)、共济失调性毛细血管扩张症(ATM基因，Du等，2007)、痣样基底细胞癌综合征(PTCH1基因，Uchikawa等，2007)、甲基丙二酸血症(MUT基因，Rincon等，2007)、早产(COX-2基因，Tyson-Capper等，2006)、动脉粥样硬化(APOB基因，Khoo等，2007)、丙酸血症(PCCA，PCCB基因，Rincon等，2007)、白血病(c-myc和WT1基因，Renshaw等，2004，Giles等，1999)、营养不良性大疱性表皮松解症(COL7A1基因，Goto等，2006)、家族性高胆固醇血症(APOB基因，Disterer等，2013)、激光诱导的脉络膜新生血管形成和角膜移植排斥反应(KDR基因，Uehara等，2013)、肥厚性心肌病(MYBPC3基因，Gedicke-Hornung等，2013)、乌谢尔综合征(USH1C基因，Lentz等，2013)、福山型先天性肌营养不良症(FKTN基因，Taniguchi-Ikeda等，2011)、激光诱导的脉络膜新生血管形成(FLT1基因，Owen等，2012)、癌症(STAT3和bcl-X基因，Zammarchi等，2011，Mercatante等，2002)和Hutchinson-Gilford早衰(LMNA基因，Osorio等，2011)、Miyoshi肌病(DYSF基因，Wein等，2010)、脊髓小脑性共济失调1型(ATXN1基因，Gao等，2008)、阿尔茨海默病/FTDP-17tau蛋白病(MAPT基因，Peacey等，2012)、肌强直性营养不良(CLC1基因，Wheeler等，2007)和亨廷顿氏病(Evers等，2014)。然而，剪接转换AON在治疗神经肌肉疾病杜氏肌营养不良症(DMD)和脊髓性肌营养不良症(脊髓性肌萎缩症(SMA)类型)方面进展最快。
杜氏肌营养不良症(DMD)和贝克型肌营养不良症(BMD)是最常见的儿童形式的肌营养不良症。DMD是一种严重的致命性神经肌肉疾病，导致12岁前依赖轮椅支持，患者通常因呼吸或心力衰竭而在30岁之前死亡。它是通过读取一个或多个外显子的移码缺失(约67％)或重复(约7％)或通过2.24Mb DMD基因中的点突变(约25％)引起的，导致功能性肌营养不良蛋白(抗肌萎缩蛋白、抗肌营养不良蛋白，dystrophin)缺乏。BMD也是由DMD基因的突变引起的，但这些维持开放阅读框，产生半功能性肌营养不良蛋白，并导致通常显著更温和的表型和更长的寿命。在过去十年，为了恢复转录物的破坏阅读框而进行的剪接的特定修饰已经成为DMD的有希望的治疗方法(van Ommen等，2008；Yokota等，2007；van Deutekom等，2007；Goemans等，2011；Voit等，2014；Cirak等，2011)。使用高度序列特异性剪接转换反义寡核苷酸(AON)，其结合侧接于或含有突变的外显子并且干扰其剪接信号，可以在DMD前体mRNA的加工过程中诱导该外显子的跳跃。尽管产生了截短的转录物，但是恢复了开放阅读框并且产生了与BMD患者中发现的类似的蛋白质。AON诱导的外显子跳跃提供了一种用于DMD患者的突变特异性因此个性化的治疗方法。由于大多数突变聚集在外显子45至55周围，因此对于具有不同突变的许多患者而言，一个特定外显子的跳跃可能具有治疗性。外显子51的跳跃适用于最大的患者亚组(约13％)，包括外显子45至50、48至50、50或52缺失的那些。应用的AON经过化学修饰以抵抗内切核酸酶、外切核酸酶和RNaseH，以促进RNA结合和双链体稳定性。目前正在研究不同的AON化学物质以诱导DMD的矫正外显子跳跃，包括2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA(2OMePS；Voit等，2014)、磷二酰胺吗啉代(PMO；Cirak等，2011)、三环DNA(tcDNA；Goyenvalle等，2015)和肽核酸(PNA；Gao等，2015)。尽管AON通常不能被健康的肌肉纤维很好地吸收，但DMD以及由激活的卫星细胞和受损的且因此更具渗透性的纤维膜表征的最终病理学中的肌营养不良蛋白缺乏实际上促进了更好的吸收。在肌营养不良蛋白缺陷型mdx小鼠模型的研究中，与野生型小鼠相比，2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA寡核苷酸确实表现出在不同肌肉组中高达10倍的吸收(Heemskerk等，2010)。尽管最近在DMD患者中使用2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA和磷二酰胺吗啉代AON的I/II期结果证实了AON在肌肉活组织检查中的存在，但是不同的化学修饰似乎导致肌肉的差异吸收和分布。此外，在两项研究中，治疗后新型肌营养不良蛋白的水平仍然有限，这挑战了该领域以开发具有改善特征的寡核苷酸，从而增强治疗指数和临床适用性。
脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性疾病，其影响6000名新生儿中的1名，并且是由运动神经元基因1(SMN1)的存活突变引起的。其导致脊髓中运动神经元的进行性损失和随后的随意肌萎缩。临床严重程度取决于几乎相同的SMN2基因中天然存在的外显子7增加(包含，inclusion)水平和SMN2的拷贝数。在SMN2中，外显子7剪接增强子位点的C>T转换通常导致不稳定的外显子7跳跃的同种型和全长同种型水平不足(Khoo和Krainer，2009)。然而，有效的SMN2外显子7增加可以通过用剪接转换AON阻断内含子7的5'区域(ISS-N1；Singh等，2006；Hua等，2008)中的内含子剪接沉默子来实现。基于成功的小鼠研究(Hua等，2010，2011；Passini等，2011)，候选AON(ISIS-SMNRx、ISIS396443或nusinersen)目前正由IONIS Pharmaceuticals(Carlsbad，CA)进行临床开发。在1期研究中，将单个9mg剂量的ISIS-SMNRx直接注射到鞘内空间导致广泛分布在中枢神经系统中以及SMA患儿的一些运动功能改善(Swoboda等，2014，Chiriboga等，2016)。然而，可能需要全身性SSO递送以减轻心脏病理学并增加外周运动神经元功能并因此增加存活。
全身性施用的AON(例如剪接转换AON)的临床疗效取决于多种因素，例如施用途径、生物稳定性、生物分布、组织内分布、靶细胞吸收、以及到所需细胞内位置(核)的路径。这些因素至少部分取决于AON的化学结构。本发明的一部分显示AON支架中的某些化学修饰可导致AON显示出可能用于治疗遗传疾病的改善特征。
总之，为了增强诸如剪接转换AON的AON用于诸如DMD、BMD或SMA的遗传疾病的治疗适用性，需要具有优化的化学特征的AON。
具体实施方式
寡核苷酸
在第一方面中，本发明提供了一种寡核苷酸，其包含2'-取代的单体，优选地2'-取代的RNA单体，和硫代磷酸酯骨架或由通过硫代磷酸酯骨架连接(linkage)所连接的2'-取代的单体，优选地2'-取代的RNA单体组成，并且包含双环核酸(BNA)支架修饰，并且包含5-甲基嘧啶碱基，其优选地用作通过剪接调节(例如通过外显子跳跃或外显子保留，两者都是剪接转换形式)治疗疾病或病症的药物。上下文中优选的疾病是杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy)、贝克型肌营养不良症(Becker Muscular Dystrophy)和脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy)。
对于本申请中描述的寡核苷酸，当单体的特征未定义且从上下文不明显时，假定来自RNA单体的相应特征。
因此，在这方面中，本发明提供了一种寡核苷酸，其包含：
i)Ia)至少一个2'-取代的单体和任选地硫代磷酸酯骨架连接，或
Ib)仅2'-取代的单体，其通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接，
ii)5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基以及
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述单体是RNA单体，或衍生自RNA单体。所述寡核苷酸在本文中称为根据本发明的寡核苷酸。因此，根据本发明的优选寡核苷酸包含：
i)Ia)至少一个2'-取代的单体，优选地RNA单体或2'-O-取代的RNA单体，和任选地硫代磷酸酯骨架连接，或
Ib)仅2'-取代的单体，优选地RNA单体或2'-O-取代的RNA单体，通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接，
ii)5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基以及
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，
根据本发明的优选寡核苷酸具有少于34个寡核苷酸的长度。所述寡核苷酸可具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、或33个核苷酸。所述寡核苷酸也可以被鉴定为具有10至33个核苷酸的寡核苷酸。更优选的根据本发明的寡核苷酸具有16、17、18、19、20、21或22个核苷酸的长度，并且可以被鉴定为具有16至22个核苷酸的寡核苷酸。
在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸的长度为16至25个核苷酸。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸的长度为16至24个核苷酸。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为16至22个核苷酸。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸的长度为16、18、20或22个核苷酸。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸的长度为21、22、24或25个核苷酸。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸的长度为18、22、24或25个核苷酸。
在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为16至25个核苷酸并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子44、45、51或53。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为16至24个核苷酸并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子44、51或53。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为16至22个核苷酸并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为16、18、20或22个核苷酸并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为20或23个核苷酸并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子44。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为21、22、24或25个核苷酸并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子45。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为18、22、24或25个核苷酸并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子53。在整个申请中，对肌营养不良蛋白的提及优选被解释为对人肌营养不良蛋白的提及。
由上述((i)(Ia))包括的寡核苷酸包含至少一个2'-取代的单体，优选地2'-取代的RNA单体，并且没有硫代磷酸酯骨架连接。这种寡核苷酸可以具有仅包含磷酸二酯连接的骨架。类似地包括包含至少一个2'-取代的单体，优选地2'-取代的RNA单体，和一个或多个硫代磷酸酯骨架连接的寡核苷酸。
由上述((i)(Ib))包括的寡核苷酸不包含除2'-取代的RNA单体之外的其他单体，并且仅包含作为硫代磷酸酯骨架连接的骨架连接。类似地包括不包含除2'-取代的RNA单体之外的其他单体，并且仅包含作为磷酸二酯骨架连接的骨架连接的寡核苷酸。
如本领域技术人员已知的，寡核苷酸如RNA寡核苷酸通常由重复单体组成。这种单体最常是核苷酸或核苷酸类似物。RNA中最常见的天然存在的核苷酸是腺苷一磷酸、胞苷一磷酸、鸟苷一磷酸、胸苷一磷酸和尿苷一磷酸。它们由戊糖核糖、通过磷酸酯连接的5'-连接的磷酸基团和1'-连接的碱基组成。糖连接碱基和磷酸，因此通常称为核苷酸的支架。因此，戊糖中的修饰通常被称为支架修饰。对于严重的修饰，原始的戊糖可以完全被另一个部分取代，该部分类似地连接碱基和磷酸。因此应理解，虽然戊糖通常是支架，但支架不一定是戊糖。
碱基(有时称为核碱基)通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶、或其衍生物。胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶是嘧啶碱基，并且通常通过它们的1-氮与支架连接。腺嘌呤和鸟嘌呤是嘌呤碱基，并且通常通过它们的9-氮与支架连接。
核苷酸通常通过其5'-磷酸部分与相邻核苷酸单体的3'-羟基部分的缩合而与相邻核苷酸连接。类似地，其3'-羟基部分通常与相邻核苷酸单体的5'-磷酸连接。这形成磷酸二酯键。磷酸二酯和支架形成交替共聚物。将碱基接枝到该共聚物上，即接枝到支架部分上。由于这种特性，由寡核苷酸的连接单体形成的交替共聚物通常被称为寡核苷酸的骨架。因为磷酸二酯键将相邻单体连接在一起，所以它们通常被称为骨架连接。应当理解，当磷酸基团被修饰使得其取而代之成为类似部分例如硫代磷酸酯时，该部分仍然被称为单体的骨架连接。这被称为骨架连接修饰。一般而言，寡核苷酸的骨架因此由交替的支架和骨架连接组成。
在另一个实施例中，核碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在另一个实施例中，核碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。在另一个实施例中，核碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的修饰形式。在另一个实施例中，修饰的核碱基是次黄嘌呤、假尿嘧啶、假胞嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、乳清酸、阿马替啶(agmatidine)、赖西丁(lysidine)、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代甲基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、假异胞苷、N4-乙基胞嘧啶、N2-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)、或N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pr-AP)。在另一个实施例中，修饰的核碱基是次黄嘌呤、假尿嘧啶、假胞嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、乳清酸、阿马替啶、赖西丁、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代甲基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。
本发明的寡核苷酸包含2'-取代的硫代磷酸酯单体，优选地2'-取代的硫代磷酸酯RNA单体、2'-取代的磷酸酯RNA单体或2'-取代的混合磷酸酯/硫代磷酸酯RNA单体，或由其组成。这种寡核苷酸包含经由硫代磷酸酯或磷酸酯骨架连接或其混合物所联结、或者通过硫代磷酸酯或磷酸酯骨架连接或其混合物所连接的2'-取代的RNA单体，或由2'-取代的硫代磷酸酯RNA、2'-取代的磷酸酯RNA或其混合物组成。优选地，这种寡核苷酸由2'-取代的硫代磷酸酯RNA单体、2'-取代的磷酸酯RNA单体或其混合物组成。2'-取代的RNA优选地为2'-F、2'-O-甲基或2'-O-(2-甲氧基乙基)。2'-O-(2-甲氧基乙基)部分通常被称为2'-MOE。更优选地，2'-取代的RNA单体是2'-O-甲基RNA单体。这些化学物质是技术人员已知的。在该方面的一个优选实施例中，提供了根据本发明的寡核苷酸，其中所述2'-取代的单体是2'-取代的RNA单体、2'-F单体、2'-氨基单体、2'-O-取代的单体、2'-O-甲基单体、或2'-O-(2-甲氧基乙基)单体，优选地2'-O-甲基单体。优选地，所述2'-取代的单体是2'-取代的RNA单体，例如2'-O-甲基RNA单体。
在整个申请中，包含2'-O-甲基单体或2'-O-甲基RNA单体和硫代磷酸酯、磷酸酯或混合磷酸酯/硫代磷酸酯骨架连接的寡核苷酸可分别被包含2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA、2'-O-甲基磷酸酯RNA或2'-O-甲基磷酸酯/硫代磷酸酯RNA的寡核苷酸替换。在整个申请中，由通过硫代磷酸酯、磷酸酯或混合磷酸酯/硫代磷酸酯骨架连接所连接或者经由硫代磷酸酯、磷酸酯或混合磷酸酯/硫代磷酸酯骨架连接所联结的2'-O-甲基RNA单体组成的寡核苷酸可以被由2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA、2'-O-甲基磷酸酯RNA或2'-O-甲基磷酸酯/硫代磷酸酯RNA组成的寡核苷酸替换。
此外，本发明的寡核苷酸包含碱基修饰，其增加对靶链的结合亲和力，增加所述寡核苷酸与其靶的所得双链体的解链温度，和/或降低免疫刺激作用，和/或提高生物稳定性，和/或改善生物分布和/或组织内分布，和/或细胞吸收和运输。在一个更优选的实施例中，本发明的寡核苷酸包含5-甲基嘧啶。5-甲基嘧啶选自5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或胸腺嘧啶，其中胸腺嘧啶与5-甲基尿嘧啶相同。“胸腺嘧啶”和“5-甲基尿嘧啶”可以在整个文件中互换。优选地，本发明的寡核苷酸包含5-甲基胞嘧啶碱基或5-甲基尿嘧啶碱基中的至少一种。因此，在本发明的一个优选实施例中，提供了如上所述的寡核苷酸，其中所有胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶碱基，和/或其中所有尿嘧啶碱基是5-甲基尿嘧啶碱基。这涉及包含5-甲基胞嘧啶但不包含未取代的胞嘧啶或尿嘧啶的寡核苷酸，包含5-甲基尿嘧啶但不包含未取代的胞嘧啶或尿嘧啶的寡核苷酸，以及包含5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶但不包含未取代的胞嘧啶或尿嘧啶的寡核苷酸。其还涉及包含5-甲基胞嘧啶但不包含未取代的胞嘧啶但包含未取代的尿嘧啶的寡核苷酸，或包含5-甲基尿嘧啶但不包含未取代的尿嘧啶但包含未取代的胞嘧啶的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸包含支架修饰，其增加对靶链的结合亲和力，增加所述寡核苷酸与其靶的所得双链体的解链温度，和/或降低免疫刺激作用，和/或增加生物稳定性，和/或改善生物分布和/或组织内分布，和/或细胞吸收和运输。本发明包括那些产生双环核酸(BNA)单体的支架修饰。双环支架通常是戊糖衍生的支架，其已被化学改变以在构象上限制支架，导致上述改善的效果。双环支架的实例是其中第一环例如戊糖环与另一个环状部分形成螺环，使得两个环仅共享一个原子的支架，其中第一环例如戊糖环与另一个环状部分稠合，使得两个环共享两个相邻的原子的支架，以及其中第一环例如戊糖环通过在两个非相邻原子上与第一环状部分连接的部分形成桥接化合物的支架。这种非相邻原子被称为桥头原子(bridgehead atoms)。桥接化合物包含多个环，每个环在至少三个原子上重叠。而具有两个环的化合物(其中那些环仅在两个原子上重叠)则是稠合化合物。在一些桥接化合物中，两个桥头原子之间的最小连接被称为桥接部分，或称为桥部分。在其他桥接化合物中，当一个环是特征性环，例如核苷酸的戊糖环时，不构成该特征环的部分被称为桥接部分。由此得出，桥接双环化合物的命名是取决于上下文的。
双环化合物可包含额外的环。根据本发明的双环化合物是至少双环的，并且所述两个环构成螺环(螺烷)、稠合系统或桥接系统、或其组合。本发明不包括其中两个独立的环经由非环状连接体(连接子、接头，linker)连接，从而不形成螺环、稠合化合物或桥接化合物的支架修饰。优选的双环化合物是稠合和桥接的化合物。在更优选的实施例中，双环核酸单体(BNA)是桥接的核酸单体。如本文所述，“桥接”或“双环”核酸单体均涉及具有修饰支架的核苷酸，其与含有非BNA核苷酸的对照寡核苷酸相比，增强寡核苷酸对RNA靶的解链温度。
在一个优选的实施例中，提供了根据本发明的寡核苷酸，其中每次出现的所述双环核酸(BNA)支架修饰产生的单体独立地选自由以下组成的群组：构象限制的核苷酸(CRN，conformationally restricted nucleotide)单体、锁核酸(LNA)单体、xylo-LNA单体、α-LNA单体、α-L-LNA单体、β-D-LNA单体、2'-氨基-LNA单体、2'-(烷基氨基)-LNA单体、2'-(酰基氨基)-LNA单体、2'-N-取代-2'-氨基-LNA单体、2'-硫代-LNA单体、(2'-O,4'-C)约束(constrained)乙基(cEt)BNA单体、(2'-O,4'-C)约束甲氧基乙基(cMOE)BNA单体、2',4'-BNANC(N-H)单体、2',4'–BNANC(N-Me)单体、2',4'-BNANC(N-Bn)单体、亚乙基桥接核酸(ENA，ethylene-bridged nucleic acid)单体、碳(碳环，carba)LNA(cLNA)单体、3,4-二氢-2H-吡喃核酸(DpNA)单体、2'-C-桥接双环核苷酸(CBBN)单体、杂环桥接BNA单体(如三唑基或四唑基连接的)、酰氨基桥接BNA单体、脲桥接BNA单体、磺酰胺桥接BNA单体、双环碳环核苷酸单体、TriNA单体、α-L-TriNA单体、双环DNA(bcDNA)单体、F-bcDNA单体、三环DNA(tcDNA)单体、F-tcDNA单体、氧杂环丁烷(oxetane)核苷酸单体、衍生自2'-氨基-LNA的锁定(locked)PMO单体、胍桥接核酸(GuNA)单体、螺环丙烯桥接核酸(scpBNA，spirocyclopropylene-bridgednucleic acid)单体及其衍生物。本发明还包括在所述寡核苷酸中引入多于一种不同的支架BNA修饰。更优选地，每次出现的所述BNA支架修饰产生的单体独立地选自由以下组成的群组：构象限制的核苷酸(CRN)单体、锁核酸(LNA)单体、xylo-LNA单体、α-L-LNA单体、β-D-LNA单体、2'-氨基-LNA单体、2'-(烷基氨基)-LNA单体、2'-(酰基氨基)-LNA单体、2'-N-取代-2'-氨基-LNA单体、(2'-O,4'-C)约束乙基(cEt)LNA单体、(2'-O,4'-C)约束甲氧基乙基(cMOE)BNA单体、2',4'-BNANC(N-H)单体、2',4'–BNANC(N-Me)单体、亚乙基桥接核酸(ENA)单体、2'-C-桥接双环核苷酸(CBBN)单体及其衍生物。在优选的实施例中，BNA支架修饰产生LNA单体、ENA单体、cEt BNA单体、氧代-CBBN单体、2'-氨基-LNA单体或cMOE BNA单体。在高度优选的实施例中，BNA支架修饰产生LNA单体、ENA单体、cEt BNA单体或cMOE BNA单体。最优选地，BNA支架修饰产生LNA单体。
在整个申请中，任何包含BNA支架修饰的单体可以被包含BNA修饰的任何其他单体替换，优选地同时保留其核碱基或修饰的核碱基。换句话说，可以更换支架修饰，同时保留寡核苷酸的序列。作为非限制性实例，包含腺嘌呤的LNA单体可以被包含腺嘌呤的ENA单体替换。
包含这些BNA支架修饰的单体的结构实例如下所示，其中B是如本文前面定义的碱基，X是变体，例如杂原子或亚甲基部分，X2是羟基部分或另一个如本文前面定义的2'-取代，L是如本文前面所述的骨架连接。在文献中，这些修饰的命名通常是任意的，并且不遵循统一的约定-在本申请中，下面提供的名称旨在表示下面提供的结构。为了比较，首先显示常规RNA单体的环状支架。在下面所示的结构中，单体通常描述为3'-末端单体。当未指示手性时，每种对映体单独地参考。本发明不限于出于说明目的提供的这类单体。包含在环状部分中的杂原子可以被其他杂原子取代。
以下是上述BNA支架修饰的文献参考的非详尽概述：cEt(2'-O,4'-C约束乙基)LNA(doi：10.1021/ja710342q)、cMOE(2'-O,4'-C约束甲氧基乙基)LNA(Seth等，J.Org.Chem.2010，75，1569–1581)、2',4'-BNANC(N-H)、2',4'-BNANC(N-Me)、亚乙基桥接核酸(ENA)(doi：10.1093/nass/1.1.241)、碳LNA(cLNA)(doi：10.1021/jo100170g)、DpNA(Osawa等，J.Org.Chem.，2015，80(21)，第10474–10481页)、2'-C-桥接双环核苷酸(CBBN，如例如WO 2014/145356(MiRagen Therapeutics))、杂环桥接LNA(如例如WO 2014/126229(Mitsuoka Y等))、酰氨基桥接LNA(如例如，Yamamoto等.Org.Biomol.Chem.2015，13，3757)、脲桥接LNA(如例如Nishida等.Chem.Commun.2010，46，5283)、磺酰胺桥接LNA(如例如，WO 2014/112463(Obika S等))、双环碳环核苷(如例如WO 2015/142910(IonisPharmaceuticals))、TriNA(Hanessian等，J.Org.Chem.，2013，78(18)，第9064–9075页)、α-L-TriNA、双环DNA(bcDNA)(Bolli等，Chem Biol.1996Mar；3(3):197-206)、F-bcDNA(DOI：10.1021/jo402690j)、三环DNA(tcDNA)(Murray等，Nucl.Acids Res.，2012，第40卷，第13号6135–6143)、F-tcDNA(doi：10.1021/acs.joc.5b00184)、氧杂环丁烷核苷酸单体(NucleicAcids Res.2004，32，5791–5799)、scpNA(Horiba等，J.Org.Chem.2016，doi：10.1021/acs.joc.6b02036)、GuNA(Shrestha等，Chem.Commun.2014，doi:10.1039/C3CC46017G)。对于上面未提及的那些，参考WO2011/097641(ISIS/Ionis Pharmaceuticals)和WO2016/017422(Osaka University)，其全部内容通过引用并入本文。
包含BNA和5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基的本发明的寡核苷酸分别是指所述寡核苷酸的至少一个支架通过用BNA取代进行修饰，并结合所述寡核苷酸的至少一个胞嘧啶核碱基通过用甲基取代嘧啶环的5-位上的氢来修饰，即5-取代的胞嘧啶，和/或所述寡核苷酸的至少一个尿嘧啶核碱基通过用甲基取代嘧啶环的5-位上的质子来修饰(即5-甲基尿嘧啶)。在本发明的上下文中，表述“用甲基取代嘧啶环的5位上的氢”可以用表述“用5-甲基嘧啶取代嘧啶”替换，其中嘧啶是指仅仅尿嘧啶、仅仅胞嘧啶或两者。如果所述寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶和/或尿嘧啶，则至少一个、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶和/或尿嘧啶已经分别以这种方式修饰。优选地，所有胞嘧啶和/或尿嘧啶均已经以这种方式修饰或分别被5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶取代。显然，本发明因此仅可以按照其序列分别应用于包含至少一个胞嘧啶或尿嘧啶的寡核苷酸。
优选地，根据本发明的寡核苷酸包含RNA单体，因为RNA/RNA双链体是非常稳定的。优选地，RNA寡核苷酸包含提供RNA另外性质的修饰，例如对内切核酸酶、外切核酸酶和RNaseH的抗性、额外的杂交强度、增加的稳定性(例如在体液中)，增加或减少的柔韧性、增加的活性、减少的毒性、增加的细胞内输送、增加的细胞吸收、组织特异性等。此外，与本发明的寡核苷酸复合的mRNA优选地不易受RNaseH切割的影响。上面已经鉴定了优选的修饰。
因此，本发明提供了一种寡核苷酸，其包含2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA单体或由2'-O-甲基硫代磷酸酯RNA组成，并且包含具有或不具有5-甲基嘧啶碱基的BNA。最优选地，该寡核苷酸由通过硫代磷酸酯或磷酸酯骨架联结的2'-O-甲基RNA单体组成，并且其所有胞嘧啶和/或其所有尿嘧啶独立地分别被5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶取代，至少一个2'-O-甲基支架被BNA替换。因此，除了具有至少一个BNA支架修饰，本发明的寡核苷酸可以具有：
-被5-甲基胞嘧啶取代的至少一个以及优选地所有胞嘧啶，
-被5-甲基胞嘧啶取代的至少一个以及优选地所有胞嘧啶以及被5-甲基尿嘧啶取代的至少一个尿嘧啶，
-被5-甲基尿嘧啶取代的至少一个尿嘧啶。
在该方面的优选实施例中，提供了如上所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含1、2、3、4、5或6个单体，所述单体包含双环核酸(BNA)支架修饰，优选地桥接核酸支架修饰。
在这些实施例中，优选地是，至少一个BNA支架修饰包括在寡核苷酸的末端单体中，优选地包括在5'-末端单体中。最优选地是，两个末端单体均包括BNA支架。因此，该方面的更优选的实施例提供了根据本发明的寡核苷酸，其中至少一个双环核酸(BNA)支架修饰包括在所述寡核苷酸的末端单体中，优选地，包括在所述寡核苷酸的5'-末端单体中，更优选地，包括在所述寡核苷酸的两个末端单体中。其他优选的实施例需要末端单体及其相邻单体各自包括BNA支架。在这种情况下，寡核苷酸的前两个单体或最后两个单体各自包括BNA支架。这可以以任何方式组合，使得例如前两个和最后两个单体，或前两个和最后一个单体都包括BNA支架。当根据本发明的寡核苷酸包括含有BNA支架的末端单体时，具有BNA支架的其他单体优选地位于另一末端，或与具有BNA支架的末端单体相邻。
该方面的一个优选实施例提供了本发明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自由以下组成的群组的BNA修饰：
-在5'末端的单体中的单个BNA支架修饰，
-在3'末端的单体中的单个BNA支架修饰，
-两个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，另一个位于3'末端的单体中，
-两个BNA支架修饰，一个位于最接近5'末端的两个单体中的每一个，
-两个BNA支架修饰，一个位于最接近3'末端的两个单体中的每一个，
-三至七个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，一个位于3'末端的单体中，1-5个BNA支架修饰位于非末端残基中，
-三至六个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，一个位于3'末端的单体中，1-4个BNA支架修饰位于非末端残基中，
-三至五个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，一个位于3'末端的单体中，1-3个BNA支架修饰位于非末端残基中，
-三或四个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，一个位于3'末端的单体中，并且一个或两个BNA支架修饰位于非末端残基中，
-三个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，一个位于3'末端的单体中，一个BNA支架修饰位于非末端残基中，
-四至六个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，一个位于3'末端的单体中，2-4个BNA支架修饰位于非末端残基中，以及
-四或五个BNA支架修饰，其中一个位于5'末端的单体中，一个位于3'末端的单体中，2-3个BNA支架修饰位于非末端残基中。
当根据本发明的寡核苷酸包含或由以下所表示的序列组成时：SEQ ID NO：8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、266、272、278、284、290、296、302、308、314、320、326、332、338、344、350、356、362、368、374、380、386、392、398、404、410、416、422、428、434、440、446、452、458、464、470、476、482、488、494、500、506、512、518、524、530、536、542、548、554、560、566、572、578、584、590、596、602、608、614、620、626、632、638、644、650、656、662、668、674、680、686、692、698、704、710、716、722、728、734、740、746、752、758、764、770、776、782、788、794、800、806、812、818、824、830、836、842、848、854、860、866、872、878、884、890、896、902、908、914、920、926、932、938、944、950、956、962、968、974、980、986、992、998、1004、1010、1016、1022、1028、1034、1040、1046、1052、1058、1064、1070、1076、1082、1088、1094、1100、1106、1112、1118、1124、1130、1136、1142、1148、1154、1160、1166、1172、1178、1184、1190、1196、1202、1208、1214、1220、1226、1232、1238、1244、1250、1256、1262、1268、1274、1280、1286、1292、1298、1304、1310、1316、1322、1328、1334、1340、1346、1352、1358、1364、1370、1376、1382、1388、1394、1400、1406、1412、1418、1424、1430、1436、1442、1448、1454、1460、1466、1472、1478、1484、1490、1496、1502、1508、1514、1520、1526、1532、1538、1544、1550、1556、1562、1568、1574、或1580，优选地至少一个BNA支架修饰包含在所述寡核苷酸中。
当根据本发明的寡核苷酸包含或由以下所表示的序列组成时：SEQ ID NO：9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219、225、231、237、243、249、255、261、267、273、279、285、291、297、303、309、315、321、327、333、339、345、351、357、363、369、375、381、387、393、399、405、411、417、423、429、435、441、447、453、459、465、471、477、483、489、495、501、507、513、519、525、531、537、543、549、555、561、567、573、579、585、591、597、603、609、615、621、627、633、639、645、651、657、663、669、675、681、687、693、699、705、711、717、723、729、735、741、747、753、759、765、771、777、783、789、795、801、807、813、819、825、831、837、843、849、855、861、867、873、879、885、891、897、903、909、915、921、927、933、939、945、951、957、963、969、975、981、987、993、999、1005、1011、1017、1023、1029、1035、1041、1047、1053、1059、1065、1071、1077、1083、1089、1095、1101、1107、1113、1119、1125、1131、1137、1143、1149、1155、1161、1167、1173、1179、1185、1191、1197、1203、1209、1215、1221、1227、1233、1239、1245、1251、1257、1263、1269、1275、1281、1287、1293、1299、1305、1311、1317、1323、1329、1335、1341、1347、1353、1359、1365、1371、1377、1383、1389、1395、1401、1407、1413、1419、1425、1431、1437、1443、1449、1455、1461、1467、1473、1479、1485、1491、1497、1503、1509、1515、1521、1527、1533、1539、1545、1551、1557、1563、1569或1575，优选地，仅所述寡核苷酸的5'-末端单体包含BNA支架修饰。
当根据本发明的寡核苷酸包含或由以下所表示的序列组成时：SEQ ID NO：10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208,、214、220、226、232、238、244、250、256、262、268、274、280、286、292、298、304、310、316、322、328、334、340、346、352、358、364、370、376、382、388、394、400、406、412、418、424、430、436、442、448、454、460、466、472、478、484、490、496、502、508、514、520、526、532、538、544、550、556、562、568、574、580、586、592、598、604、610、616、622、628、634、640、646、652、658、664、670、676、682、688、694、700、706、712、718、724、730、736、742、748、754、760、766、772、778、784、790、796、802、808、814、820、826、832、838、844、850、856、862、868、874、880、886、892、898、904、910、916、922、928、934、940、946、952、958、964、970、976、982、988、994、1000、1006、1012、1018、1024、1030、1036、1042、1048、1054、1060、1066、1072、1078、1084、1090、1096、1102、1108、1114、1120、1126、1132、1138、1144、1150、1156、1162、1168、1174、1180、1186、1192、1198、1204、1210、1216、1222、1228、1234、1240、1246、1252、1258、1264、1270、1276、1282、1288、1294、1300、1306、1312、1318、1324、1330、1336、1342、1348、1354、1360、1366、1372、1378、1384、1390、1396、1402、1408、1414、1420、1426、1432、1438、1444、1450、1456、1462、1468、1474、1480、1486、1492、1498、1504、1510、1516、1522、1528、1534、1540、1546、1552、1558、1564、1570或1576，优选地，仅所述寡核苷酸的3'-末端单体包含BNA支架修饰。
当根据本发明的寡核苷酸包含或由以下所表示的序列组成时：SEQ ID NO：11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221、227、233、239、245、251、257、263、269、275、281、287、293、299、305、311、317、323、329、335、341、347、353、359、365、371、377、383、389、395、401、407、413、419、425、431、437、443、449、455、461、467、473、479、485、491、497、503、509、515、521、527、533、539、545、551、557、563、569、575、581、587、593、599、605、611、617、623、629、635、641、647、653、659、665、671、677、683、689、695、701、707、713、719、725、731、737、743、749、755、761、767、773、779、785、791、797、803、809、815、821、827、833、839、845、851、857、863、869、875、881、887、893、899、905、911、917、923、929、935、941、947、953、959、965、971、977、983、989、995、1001、1007、1013、1019、1025、1031、1037、1043、1049、1055、1061、1067、1073、1079、1085、1091、1097、1103、1109、1115、1121、1127、1133、1139、1145、1151、1157、1163、1169、1175、1181、1187、1193、1199、1205、1211、1217、1223、1229、1235、1241、1247、1253、1259、1265、1271、1277、1283、1289、1295、1301、1307、1313、1319、1325、1331、1337、1343、1349、1355、1361、1367、1373、1379、1385、1391、1397、1403、1409、1415、1421、1427、1433、1439、1445、1451、1457、1463、1469、1475、1481、1487、1493、1499、1505、1511、1517、1523、1529、1535、1541、1547、1553、1559、1565、1571或1577，优选地，仅所述寡核苷酸的5'-末端单体和3'-末端单体均包含BNA支架修饰。
当根据本发明的寡核苷酸包含或由以下所表示的序列组成时：SEQ ID NO：12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234、240、246、252、258、264、270、276、282、288、294、300、306、312、318、324、330、336、342、348、354、360、366、372、378、384、390、396、402、408、414、420、426、432、438、444、450、456、462、468、474、480、486、492、498、504、510、516、522、528、534、540、546、552、558、564、570、576、582、588、594、600、606、612、618、624、630、636、642、648、654、660、666、672、678、684、690、696、702、708、714、720、726、732、738、744、750、756、762、768、774、780、786、792、798、804、810、816、822、828、834、840、846、852、858、864、870、876、882、888、894、900、906、912、918、924、930、936、942、948、954、960、966、972、978、984、990、996、1002、1008、1014、1020、1026、1032、1038、1044、1050、1056、1062、1068、1074、1080、1086、1092、1098、1104、1110、1116、1122、1128、1134、1140、1146、1152、1158、1164、1170、1176、1182、1188、1194、1200、1206、1212、1218、1224、1230、1236、1242、1248、1254、1260、1266、1272、1278、1284、1290、1296、1302、1308、1314、1320、1326、1332、1338、1344、1350、1356、1362、1368、1374、1380、1386、1392、1398、1404、1410、1416、1422、1428、1434、1440、1446、1452、1458、1464、1470、1476、1482、1488、1494、1500、1506、1512、1518、1524、1530、1536、1542、1548、1554、1560、1566、1572或1578，优选地，所述寡核苷酸的仅两个最5'-末端单体均包含BNA支架修饰。
当根据本发明的寡核苷酸包含或由以下所表示的序列组成时：SEQ ID NO：13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、265、271、277、283、289、295、301、307、313、319、325、331、337、343、349、355、361、367、373、379、385、391、397、403、409、415、421、427、433、439、445、451、457、463、469、475、481、487、493、499、505、511、517、523、529、535、541、547、553、559、565、571、577、583、589、595、601、607、613、619、625、631、637、643、649、655、661、667、673、679、685、691、697、703、709、715、721、727、733、739、745、751、757、763、769、775、781、787、793、799、805、811、817、823、829、835、841、847、853、859、865、871、877、883、889、895、901、907、913、919、925、931、937、943、949、955、961、967、973、979、985、991、997、1003、1009、1015、1021、1027、1033、1039、1045、1051、1057、1063、1069、1075、1081、1087、1093、1099、1105、1111、1117、1123、1129、1135、1141、1147、1153、1159、1165、1171、1177、1183、1189、1195、1201、1207、1213、1219、1225、1231、1237、1243、1249、1255、1261、1267、1273、1279、1285、1291、1297、1303、1309、1315、1321、1327、1333、1339、1345、1351、1357、1363、1369、1375、1381、1387、1393、1399、1405、1411、1417、1423、1429、1435、1441、1447、1453、1459、1465、1471、1477、1483、1489、1495、1501、1507、1513、1519、1525、1531、1537、1543、1549、1555、1561、1567、1573或1579，优选地，所述寡核苷酸的仅两个最3'-末端单体均包含BNA支架修饰。
当根据本发明的寡核苷酸包含或由不是SEQ ID NO：1580的SEQ ID NO所表示的序列组成时，所述寡核苷酸优选地包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，并且所述寡核苷酸优选地包含至少一个2'-O-甲基硫代磷酸酯单体，更优选地仅包含2'-O-甲基硫代磷酸酯单体。当根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：1580所表示的序列组成时，所述寡核苷酸优选地包含胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶，并且所述寡核苷酸优选地包含至少一个2'-O-甲基硫代磷酸酯单体，更优选地仅包含2'-O-甲基硫代磷酸酯单体。每当SEQ ID NO引用T或U且所述单体包含BNA支架修饰时，所述单体(即所述引用)可任选地分别被U或T替换。每当SEQID NO引用C或5-甲基-C并且所述单体包含BNA支架修饰时，所述引用可任选地分别被5-甲基-C或C替换。
在整个本申请中，除非另外明确说明，否则BNA支架修饰可总是包含在寡核苷酸中。但是，为了易读起见，并不总是明确说明。这意指每当称寡核苷酸包含或仅由特定种类的单体组成时，这并不排除在提及BNA支架修饰存在的情况下存在BNA支架修饰。例如，仅由2'-O-甲基RNA单体组成的寡核苷酸然而可以包含具有BNA支架修饰的单体。这将从上下文中显而易见(例如，当AON被认为仅由一种单体组成时，但仍然也包含BNA支架修饰。)
在该方面的优选实施例中，提供了根据本发明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与外显子和/或非外显子区域的至少一部分互补(优选地反向互补)或结合或靶向或杂交，优选地其中所述寡核苷酸包含或由与外显子识别序列(ERS)、外显子剪接沉默子(ESS)、内含子剪接沉默子(ISS)、SR蛋白结合位点、或其他剪接元件、信号或结构的至少一部分互补或结合或靶向或杂交的序列组成。当该寡核苷酸是互补时，应理解其也可以是反向互补的。在本申请中，术语“互补”包括正向互补和反向互补序列，这根据上下文对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在该上下文中，与根据本发明的寡核苷酸互补或与其结合，或其靶向或与其杂交的优选序列是肌营养不良蛋白外显子，例如肌营养不良蛋白前体mRNA外显子2至78。优选的肌营养不良蛋白外显子是外显子2至78，更优选地外显子10至60，最优选地外显子44至55，优选的非外显子区域是内含子1至78。与寡核苷酸互补或与其结合，或其靶向或与其杂交的更优选的外显子是肌营养不良蛋白前体mRNA外显子44、45、51、52、53和55。与寡核苷酸互补，或与其结合，或其靶向或与其杂交的优选外显子是肌营养不良蛋白前体mRNA外显子44、45、51、52、53和55。最优选地，该寡核苷酸与选自外显子44、45、51、52、53和55的肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的至少一部分杂交，并且具有10至33个核苷酸的长度，更优选地16至22个核苷酸。因此，在一个优选的实施例中，提供了根据本发明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是互补的，优选地与外显子和/或非外显子区域的至少一部分反向互补，其中所述外显子和/或非外显子区域的至少一部分具有10至33个核苷酸的长度，优选地16至22个核苷酸。更优选地，所述外显子和/或非外显子区域的至少一部分具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸的长度。因此，优选地是，所述外显子和/或非外显子区域的至少一部分具有至多33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸的长度。最优选的长度是16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。
另外，在上下文中，与根据本发明的寡核苷酸互补，或与其结合，或其靶向或与其杂交的其他优选序列是SMN2剪接调节元件，优选地例如内含子6和7中的那些，更优选地，例如内含子7中的剪接沉默子ISS-N1。
因此，在一个优选的实施例中，提供了根据本发明的寡核苷酸，其中所述外显子和/或非外显子区域在DMD基因或SMN基因中。SMN基因可以是SMN1基因或SMN2基因，优选地SMN2基因。
优选地，本发明的寡核苷酸由核苷酸序列表示，所述核苷酸序列包括或由能够结合、靶向或与肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子的一部分互补的序列组成。所述结合或靶向部分可以是本发明的寡核苷酸的长度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或至少95％、或98％和高达100％。寡核苷酸可以由核苷酸序列表示，所述核苷酸序列包含与本文定义的肌营养不良蛋白前体mRNA的至少一部分结合、靶向或互补的序列和另外的侧接(侧翼)序列。在一个更优选的实施例中，所述寡核苷酸的所述结合或靶向部分的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。可以使用几种类型的侧接序列。优选地，侧接序列用于修饰蛋白质与所述寡核苷酸的结合，或修饰所述寡核苷酸的热力学性质，更优选地修饰靶RNA结合亲和力。在另一个优选的实施例中，另外的侧接序列与不存在于所述外显子中的肌营养不良蛋白前体mRNA的序列互补。该侧接序列优选地能够结合或靶向包含或由所述外显子的分支点和/或剪接位点受体或供体共有序列组成。在一个优选的实施例中，该侧接序列能够结合或靶向包含或由与所述外显子相邻的肌营养不良蛋白前体mRNA的内含子的序列组成的序列。
根据本发明的优选的寡核苷酸是其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示的那些寡核苷酸：包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-1607组成的核苷酸序列，或包含或由ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-1607的片段组成的核苷酸序列，优选地其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示：包含或由SEQ ID NO：453-613或SEQ ID NO：1592-1605或SEQ ID NO：1607组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ ID NO：453-613或SEQ ID NO 1592-1605或SEQ ID NO：1607的片段组成的核苷酸序列，更优选地，其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示：包含或由SEQ ID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、486、483、1592、1593、1594、1595、1596、1597、1598、1599、1600、1601、1602、1603、1604、1605或1607组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ ID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、486、483、1592、1593、1594、1595、1596、1597、1598、1599、1600、1601、1602、1603、1604、1605或1607的片段组成的核苷酸序列。在本发明的上下文中，SEQID NO的片段优选地是指包含或由来自所述SEQ ID NO的至少10个连续核苷酸组成的核苷酸序列。
根据本发明的更优选的寡核苷酸是其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示的那些寡核苷酸：包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或SEQ ID NO：3000-6048组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或SEQ IDNO：3000-6048的片段组成的核苷酸序列，更优选地，其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示：包含或由SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548或4568组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548或4568的片段组成的核苷酸序列。
根据本发明的更优选的寡核苷酸是其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示的那些寡核苷酸：包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或SEQ ID NO：3000-6048组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或SEQ IDNO：3000-6048的片段组成的核苷酸序列，优选地，其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示：包含或由SEQ ID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、483或486组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ ID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、483或486的片段组成的核苷酸序列，更优选地，其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示：包含或由SEQ ID NO：452-613、4528-4572组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ IDNO：452-613、4528-4572的片段组成的核苷酸序列，最优选地，其中所述寡核苷酸由以下核苷酸序列表示：包含或由SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548或4568组成的核苷酸序列，或包含或由SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548或4568的片段组成的核苷酸序列。
优选的AON是其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节的那些，优选地，所述前体mRNA剪接调节改变蛋白质的产生或组成，其优选地包含外显子跳跃或外显子保留，其中所述前体mRNA剪接调节最优选地包含外显子跳跃。这种前体mRNA剪接调节优选地用于本文稍后定义的治疗应用的上下文中。
前体mRNA剪接调节的目的可以是改变蛋白质的产生，最常见的是RNA编码的蛋白质。该产生可以通过增加或减少所述产生的水平来改变。该产生也可以通过改变实际产生的蛋白质的组成来改变，例如当前体mRNA剪接调节导致包含或排除一个或多个外显子，以及导致具有不同氨基酸序列的蛋白质时。优选地，具有不同氨基酸序列的这种蛋白质具有比由于疾病或病症产生的蛋白质更多的功能性，或具有更好的功能性，或具有至少一种改变的性质。
在DMD的情况下，可以应用前体mRNA剪接调节以跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA中的一个或多个特异性外显子，以恢复转录物的开放阅读框并诱导更短但(更多)功能性肌营养不良蛋白的表达，最终目标是能够干扰疾病的进程。类似的策略允许干扰BMD的进程。在SMA的情况下，可以应用前体mRNA剪接调节以增强SMN2基因中外显子7的保留(增加、包含，inclusion)，并提高运动神经元蛋白的存活水平，从而减少脊髓中运动神经元的损失和随后的随意肌萎缩。因此，在一个优选的实施例中，提供了根据本发明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，其中所述前体mRNA剪接调节改变与疾病或病症相关的蛋白质的产生，优选地，其中所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)或脊髓性肌萎缩症(SMA)。
优选地，AON用于治疗性前体mRNA的剪接调节。AON优选地是与衍生自个体的DNA编码链的肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA的特异性序列互补的寡核苷酸。该寡核苷酸结合或靶向所述前体mRNA的所述序列。在本发明的上下文中，治疗性前体mRNA可以被称为参与遗传疾病的基因的患病前体mRNA。因此，治疗性前体mRNA的剪接的调节允许治疗所述遗传疾病。
在DMD或BMD的情况下，可以应用前体mRNA剪接调节以跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA中的一个或多个特异性外显子，以恢复转录物的开放阅读框并诱导更短但(更多)功能性肌营养不良蛋白的表达，最终目标是能够延迟或甚至阻止疾病的进展。
在一个优选的实施例中，本发明的寡核苷酸用于诱导细胞、器官、组织和/或个体中肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子跳跃。外显子跳跃导致不含有跳跃的外显子的成熟的肌营养不良蛋白mRNA，因此，当所述外显子编码氨基酸时，可以导致较短蛋白质产物的表达。至少一个外显子的跳跃优选地通过AON与包含剪接调节元件、剪接位点和/或内含子分支点序列的特异性外显子-居间序列的结合来诱导。
在一个优选的实施例中，本发明还包括如上所述的寡核苷酸，其适用于跳跃多个外显子，有时称为多跳跃(multiskipping)。根据本发明的这种寡核苷酸能够结合相同前体mRNA内的第一外显子区域和第二外显子区域，其中所述第二外显子的所述区域与所述第一外显子的所述区域具有至少50％的同一性。这些寡核苷酸优选地能够诱导所述前体mRNA的所述第一外显子和所述第二外显子的跳跃。优选地，还诱导另外的(一个或多个)外显子的跳跃，其中所述另外的外显子优选地位于所述第一和第二外显子之间。其中所述外显子被跳跃的所述前体mRNA的所得转录物是框内的。WO2014007620中提供了此类寡核苷酸的更多细节。
如本文所定义，DMD前体mRNA优选地是指编码肌营养不良蛋白的DMD基因的前体mRNA。与未受影响的人的野生型DMD前体mRNA相比，突变的DMD前体mRNA对应于具有突变的BMD或DMD患者的前体mRNA，导致(降低水平的)异常蛋白(BMD)，或缺乏功能性肌营养不良蛋白(DMD)。DMD前体mRNA也被称为肌营养不良蛋白前体mRNA。DMD基因也可被称为肌营养不良蛋白基因。肌营养不良蛋白和DMD在整个申请中可互换使用。
患者优选地意指患有如本文后面定义的DMD或BMD的患者或由于他或她的遗传背景而易于发展DMD或BMD的患者。在DMD患者的情况下，使用的寡核苷酸优选地纠正所述患者的DMD基因中存在的一个突变并产生看起来像BMD蛋白的蛋白质：所述蛋白质优选地为如本文后面定义的功能性或半功能性肌营养不良蛋白。在BMD患者的情况下，所使用的寡核苷酸优选地纠正所述患者的BMD基因中存在的一个突变并产生肌营养不良蛋白，其比最初存在于所述BMD患者中的肌营养不良蛋白更具功能性。
如本文所定义，功能性肌营养不良蛋白优选地是野生型肌营养不良蛋白，其对应于具有SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的蛋白质。如本文所定义，半功能性肌营养不良蛋白优选地是BMD样肌营养不良蛋白，其对应于其N末端部分具有作用结合结构域(N末端的前240个氨基酸)、富含半胱氨酸的结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C末端的最后325个氨基酸)的蛋白质，这些结构域各自存在于本领域技术人员已知的野生型肌营养不良蛋白中。本文指出的氨基酸对应于SEQ ID NO：1所示的野生型肌营养不良蛋白的氨基酸。换句话说，功能性或半功能性肌营养不良蛋白是至少在某种程度上表现出野生型肌营养不良蛋白的活性的肌营养不良蛋白。“至少在某种程度上”优选地意指野生型功能性肌营养不良蛋白的相应活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在上下文下，功能性肌营养不良蛋白的活性优选地与肌动蛋白和肌营养不良蛋白相关的糖蛋白复合物(DGC或DAPC)结合(Ehmsen J等，2002)。
肌营养不良蛋白与肌动蛋白和DGC或DAPC复合物的结合可以通过使用总蛋白质提取物的免疫共沉淀或使用与不同于对照(非DMD)活组织检查的复合物的成员反应的各种抗体的切片的免疫荧光分析，从来自治疗前和/或治疗后疑似肌营养不良的肌肉可视化，如本领域技术人员已知的。
患有杜氏肌营养不良症的个体或患者通常在编码肌营养不良蛋白的基因(DMD或肌营养不良蛋白基因)中具有突变，其阻止完整蛋白质的合成，即，过早终止密码子(提前终止密码子，premature stop codon)阻止C-末端的合成。在贝克型肌营养不良症中，肌营养不良蛋白基因还包含与野生型相比的突变，但该突变通常不会导致过早终止密码子，并且通常合成C-末端。结果，合成了功能性或半功能性肌营养不良蛋白，其至少具有与野生型蛋白质相同的活性类型，但不一定具有相同的活性量。BMD患者的基因组通常编码肌营养不良蛋白，其包含N末端部分(N末端的前240个氨基酸)、富含半胱氨酸的结构域(氨基酸3361至3685)和C末端结构域(C-末端的最后325个氨基酸)，但在大多数情况下，其中心杆状结构域比野生型肌营养不良蛋白短(Monaco等，1988)。用于治疗DMD的反义寡核苷酸诱导的外显子跳跃通常用于通过跳跃外显子(优选在中心杆状结构域中)来克服前体mRNA中的过早终止，以纠正开放阅读框并允许合成包括C-末端的剩余的肌营养不良蛋白，尽管蛋白质由于较小的杆状结构域而略微较小。在一个优选的实施例中，将向患有DMD并由本文定义的寡核苷酸治疗的个体提供至少在一定程度上表现出野生型肌营养不良蛋白活性的肌营养不良蛋白。更优选地，如果所述个体是杜氏患者或疑似杜氏患者，则功能性或半功能性肌营养不良蛋白是患有BMD的个体的肌营养不良蛋白：通常所述肌营养不良蛋白能够与肌动蛋白和DGC或DAPC相互作用，但其中心杆状结构域可能短于野生型肌营养不良蛋白(Monaco等，1988)。野生型肌营养不良蛋白的中心杆状结构域包含24个血影蛋白(spectrin)样重复序列。例如，如本文提供的肌营养不良蛋白的中心杆状结构域可包含5至23、10至22或12至18个血影蛋白样重复序列(spectrin-like repeat)，只要其可结合肌动蛋白和DGC。
使用本发明的寡核苷酸减轻个体中杜氏肌营养不良症或贝克型肌营养不良症的一种或多种症状可以通过以下任何测定来评估：延长失去行走的时间、改善肌肉力量、改善提举重物的能力、改善从地板上站起来的时间、改善9米步行时间、改善四层爬楼所需的时间、改善腿部功能等级、改善肺功能、改善心脏功能、改善生活质量。这些测定中的每一种都是技术人员已知的。例如，Manzur等人(2008)的出版物对这些测定中的每一种进行了广泛的解释。对于这些测定中的每一种，一旦发现在测定中测量的参数的可检测的改善或延长，优选地意指杜氏肌营养不良症或贝克型肌营养不良症的一种或多种症状在使用本发明的寡核苷酸的个体中已经减轻。如Hodgetts等人(2006)所述，可检测的改善或延长优选地是统计学上显著的改善或延长。替代地，杜氏肌营养不良症或贝克型肌营养不良症的一种或多种症状的减轻可以通过测量肌纤维功能、完整性和/或存活的改善来评估。在一个优选的方法中，DMD或BMD患者的一种或多种症状得到减轻和/或来自DMD或BMD患者的一种或多种肌细胞的一种或多种特征得到改善。可以在细胞、组织水平上或对患者自身评估这些症状或特征。
可以通过对来自患者的肌原细胞或肌细胞的以下任何测定来评估来自患者的肌细胞的一种或多种特征的减轻：肌细胞的钙摄取减少、胶原合成减少、形态改变、脂类生物合成改变、降低的氧化应激和/或改善的肌纤维功能、完整性和/或存活。通常使用肌肉活组织检查的切片的免疫荧光和/或组织化学分析来评估这些参数。
肌纤维功能、完整性和/或存活的改善可以使用以下测定中的至少一种来评估：血液中肌酸激酶的可检测的减少、疑似营养不良的肌肉的活组织检查切片中肌纤维的坏死的可检测的减少、和/或疑似营养不良的肌肉的活组织检查切片中肌纤维直径的均匀性的可检测的增加。这些测定中的每一种是技术人员已知的。
如Hodgetts等人(2006)所述，可以检测血液中肌酸激酶。与治疗前同一DMD或BMD患者的肌酸激酶浓度相比，肌酸激酶的可检测的减少可能意指减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
优选地，在肌肉活组织检查中评估肌纤维坏死的可检测的减少，更优选地如Hodgetts等人(2006)所述，使用活组织检查切片。可检测到的坏死的减少可能是使用活组织检查切片已确定坏死的区域的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少。通过与治疗前在同一DMD或BMD患者中评估的坏死相比较来测量减少。
优选地，在肌肉活组织检查切片中评估肌纤维直径的均匀性的可检测的增加，更优选地如Hodgetts等人(2006年)所述。通过与治疗前在同一DMD或BMD患者中肌纤维直径的均匀性相比较来测量增加。
优选地，本发明的寡核苷酸向所述个体提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白(通常在DMD的情况下)并且能够至少部分地减少所述个体中异常肌营养不良蛋白的产生(通常在BMD的情况下)。
减少异常肌营养不良蛋白mRNA或异常肌营养不良蛋白的产生，优选地意指异常肌营养不良蛋白mRNA或异常肌营养不良蛋白的初始量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少，仍可通过RT-PCR(mRNA)或免疫荧光或蛋白质印迹分析(蛋白质)检测到。异常肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质在本文中也被称为功能较弱(与本文先前定义的野生型功能性肌营养不良蛋白相比)或非功能性肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质。非功能性肌营养不良蛋白优选地是不能结合肌动蛋白和/或DGC蛋白复合物的成员的肌营养不良蛋白。非功能性肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白mRNA通常不具有或不编码具有蛋白质的完整C末端的肌营养不良蛋白。功能性或半功能性肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质的检测可以如异常肌营养不良蛋白mRNA或蛋白质那样进行。
一旦向DMD患者提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白，至少部分DMD原因被去除。因此，预期到，DMD的症状被至少部分减轻，或症状恶化的速率降低，导致下降更缓慢。增强的跳跃频率还增加DMD或BMD个体的肌细胞中产生的功能性或半功能性肌营养不良蛋白的水平。
脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种遗传性疾病，通常是致命的，其由存活运动神经元SMN基因编码的SMN蛋白的损失引起。SMN基因SMN1和SMN2位于5号染色体上，SMA是由两条染色体中缺失SMN1引起的。SMN2虽然几乎与SMN1相同，但在提供SMN蛋白方面效果较差。SMN1编码一种普遍表达的38kDa SMN蛋白，其为snRNP组装(细胞存活的必要过程)所必需的。SMN1和SMN2的不同之处在于外显子7的第6位的C至T的关键突变(SMN2的转录物中的C6U)。C6U不会改变编码序列，但足以导致SMN2中的外显子7跳跃。这导致不稳定的截短蛋白SMN这导。SMA的严重程度受SMN2(其中有多个拷贝)产生其SMN蛋白的效率的影响。在SMA患者中，SMN2通常因为外显子7跳跃而不能补偿SMN1的损失，产生不稳定的截短蛋白SMN，产，其不能确保细胞存活。目前，对SMA的可用治疗包括预防和管理慢性运动单位(motor unit)损失的继发效应。没有可用于治疗或预防SMA的药物疗法。用于剪接转换的反义技术可用于提供用于SMA治疗的新疗法。有效的药剂可以改变SMN2前体mRNA的剪接，并且可能在治疗上是有用的。SMA的另一个分子基础可以是点突变(E134K)。
优选的AON相对于细胞中外显子7缺失的SMN2mRNA增强含外显子7的SMN2mRNA的水平。优选的AON优选地具有足够的长度和互补性(更优选地如本文后面所定义)，使得AON特异性地与SMN2基因内的区域杂交，使得细胞中含外显子7的SMN2mRNA相对于外显子缺失的SMN2mRNA的水平增强。优选的AON包含或由SEQ ID NO：1400-1579组成。更优选的AON包含或由SEQ ID NO：1490组成。在SMA的情况下，可以应用前体mRNA剪接调节以在SMN2前体mRNA中包括一个或多个外显子，优选地外显子7，从而通过增加含外显子7的SMN2mRNA或蛋白质的表达来提高功能性SMN2水平。这最终目标是能够延迟或甚至终止疾病的进展。
在一个优选的实施例中，AON用于诱导细胞、器官、组织和/或个体中SMN前体mRNA(优选地SMN2前体mRNA)的外显子7增加。外显子保留优选地产生成熟SMN mRNA，其含有否则跳跃的外显子7，因此可以导致更多功能性蛋白质产物的表达。包含至少一个外显子(优选地外显子7)优选地通过AON与包括剪接调节元件、剪接位点和/或内含子分支点序列(intronic branchpoint sequence)的特异性序列(特定序列)(优选地内含子-居间序列)的结合来诱导。
如本文所定义，SMN1前体mRNA优选地是指编码SMN蛋白的SMN1基因的前体mRNA。如本文所定义，SMN2前体mRNA优选地是指编码SMN蛋白的SMN2基因的前体mRNA。在讨论患有SMA的受试者的前体mRNA的情况下，SMN2前体mRNA有时也被称为SMN前体mRNA；这是因为在SMA患者中，不存在SMN1基因，因此所有SMN前体mRNA都是SMN2前体mRNA。在这种情况下，SMN2基因也可被称为SMN基因。
患者优选地意指患有如本文定义的SMA的患者或由于他或她的遗传背景而易于发展SMA的患者。在SMA患者的情况下，使用的寡核苷酸优选地促进包含存在于所述患者的SMN2基因中的外显子7并产生功能性SMN蛋白而不是SMN不是蛋白：所述蛋白优选地是如本文后面所定义的功能性或半功能性SMN。在SMA患者的情况下，所使用的寡核苷酸将优选地抑制或降低所述患者的SMN2基因中存在的一种突变的作用，并产生增加水平的SMN蛋白，其将比最初存在于所述SMA患者中的SMN蛋白(通常是SMN通常蛋白)更具功能性。优选地，SMN蛋白与SMN更具蛋白的比率变化有利于功能性SMN蛋白。治疗后检测到的SMN蛋白与SMN治疗蛋白的优选摩尔比为5：4、5：3、5：2、5：1或10：1。最优选地，不再能够检测到SMN选地蛋白，或仅检测到痕量。
如本文所定义，功能性SMN蛋白优选地是野生型SMN，其对应于具有SEQ ID NO：1581中所示氨基酸序列的蛋白质。优选地，功能性SMN蛋白包含外显子7。该外显子7在SEQID NO：1584中鉴定。换句话说，功能性或半功能性SMN蛋白是至少在某种程度上表现出野生型SMN蛋白的活性的SMN蛋白。“至少在某种程度上”优选地意指野生型功能性SMN蛋白的相应活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在上下文中，如技术人员已知的，功能性SMN蛋白的优选活性涉及端粒酶再生、转录调节和细胞运输。功能性SMN蛋白的更优选活性是功能性snRNP组装体的形成，以及与Sm蛋白(Smith蛋白)的相互作用。
功能性SMN与Sm D1和D3蛋白的富含Arg和Gly的C末端尾部结合(Selenko等，2001)。可以进行体外结合测定以研究这种相互作用，例如通过表达Sm D1和Sm D3的C末端尾部作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白和随后用分离的SMN蛋白进行下拉实验。功能较弱的SMN将显示较少或没有相互作用。可以使用总蛋白质提取物进行这样的测定。替代地，可以使用与外显子7编码的区域，或与该区域的一部分或与仅存在于包含外显子7的SMN中的折叠相互作用的各种抗体，通过活组织检查切片的免疫荧光分析来检测包含外显子7的SMN。如技术人员所知，与非SMA(对照)活组织检查进行比较可能是合适的。
在一个优选的实施例中，将向患有SMA并通过本文定义的AON治疗的个体提供SMN蛋白，其至少在一定程度上表现出野生型SMN蛋白的活性，通常由SMN1基因编码。更优选地，如果所述个体是SMA患者或疑似SMA患者，则功能性SMN蛋白是包含外显子7的SMN蛋白，通常由SMN1基因编码。
使用AON减轻个体中SMA的一种或多种症状可以通过以下任何测定来评估：受试者体重增加的改善、受试者的运动活性的改善、以及受试者或运动神经元细胞的存活时间的增加、以及功能性SMN产生的增加。这些参数中的每一个都是技术人员已知的，并且可以常规地进行测定。对于这些测定中的每一种，一旦发现在测定中测量的参数的可检测的改善或延长，优选地意味着在使用根据本发明的寡核苷酸的个体中已经减轻了SMA的一种或多种症状。可检测的改善或延长优选地是统计学上显著的改善或延长。替代地，可以通过测量肌肉功能、完整性和/或存活的改善来评估SMA的一种或多种症状的减轻。在一个优选的方法中，SMA患者的一种或多种症状得到减轻和/或来自SMA患者的一种或多种肌细胞的一种或多种特征得到改善。可以在细胞、组织水平上或对患者自身评估这些症状或特征。
可以通过对来自患者的细胞的以下任何测定来评估来自患者的运动神经元细胞的一种或多种特征的减轻：钙摄取减少、snRNP产生减少、胶原合成减少、形态改变、脂类生物合成改变、降低的氧化应激和/或改善的肌肉功能、完整性和/或存活。通常使用活组织检查(例如肌肉活组织检查)的切片的免疫荧光和/或组织化学分析来评估这些参数。
优选地使用活组织检查切片，在肌肉活组织检查中评估运动神经元存活的可检测的增加。与未治疗的对照样品相比，或与已知或以前的存活率相比，可检测的存活率的增加可能为增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。通过与治疗前在同一SMA患者中评估的存活率进行比较来测量增加。
如本领域技术人员已知的，可以评估运动神经元存活率的可检测的增加，例如使用Lunn等，2004中描述的方法。
优选地，AON为所述个体提供功能性或半功能性SMN蛋白，并且能够至少部分地减少所述个体中异常SMN蛋白如SMN并且的产生。
减少异常SMN mRNA或异常SMN蛋白的产生，优选地意指异常SMN mRNA或异常SMN蛋白的初始量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更少，仍可通过RT-PCR(mRNA)或免疫荧光或蛋白质印迹分析(蛋白质)检测到。异常SMN mRNA或蛋白在本文中也被称为功能较弱(与本文先前定义的野生型功能性SMN蛋白相比)或非功能性SMN mRNA或蛋白。非功能性SMN蛋白质优选地是不能结合Sm蛋白和/或不能促进或妨碍snRNP组装的SMN蛋白质。非功能性SMN蛋白或SMN mRNA通常不具有或不编码由外显子7编码的氨基酸序列。功能性或半功能性SMN mRNA或蛋白的检测可以如异常SMN mRNA或蛋白那样进行。
一旦向SMA患者提供功能性或半功能性SMN蛋白，至少部分SMA原因被去除。因此，预期到，SMA的症状被至少部分减轻，或症状恶化的速率降低，导致下降更缓慢。增强的包含频率还增加SMA个体的细胞中产生的功能性或半功能性SMN蛋白的水平。
外显子和内含子含有一个或多个特异性序列，其包含已显示出作为反义寡核苷酸的有效靶标的剪接调节元件。因此，一个实施例提供了用于向所述个体提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白或SMN蛋白的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含特异地结合和/或阻断肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA外显子或内含子中的这些剪接调节元件的序列。另外，由于当剪接体复合物识别两个剪接位点时，仅外显子包含在所得mRNA中，因此剪接位点是本发明寡核苷酸的其他靶标。因此，一个实施例提供了用于向所述个体提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白或SMN蛋白的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含特异地结合和/或阻断肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA的外显子的一个或两个剪接位点的序列。通常，外显子的剪接位点包含存在于所述外显子中的1、2、3或更多个核苷酸以及存在于相邻或邻接内含子中的1、2、3或更多个核苷酸。在一个实施例中，使用仅结合肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA的内含子区的寡核苷酸。然而，这不是必需的：还可以使用靶向或结合内含子特异性序列以及外显子特异性序列的寡核苷酸。当然，寡核苷酸不一定与肌营养不良蛋白或SMN2外显子或内含子的整个序列结合。特异结合该外显子或内含子的一部分的寡核苷酸是优选的。使用一种寡核苷酸，所述寡核苷酸优选地与外显子和/或内含子的至少一部分互补、结合或靶向，所述部分具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。
通过涉及内含子分支点和相邻内含子的剪接位点的两个连续酯交换反应，发生前体mRNA的剪接。因此，寡核苷酸优选地用于外显子跳跃，其中所述寡核苷酸包含与该分支点和/或剪接位点结合的序列。优选地，所述剪接位点和/或分支点存在于肌营养不良蛋白前体mRNA中。
由于剪接位点含有共有序列，因此使用包含能够结合剪接位点的序列的寡核苷酸部分或其功能等同物，涉及混杂杂交(promiscuous hybridization)的风险。所述寡核苷酸与除了待跳跃的外显子的位点之外的其他剪接位点的杂交可能容易干扰剪接过程的准确性。为了克服与使用结合剪接位点的寡核苷酸相关的这些和其他潜在问题，最优选的实施例提供了用于向所述个体提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白或SMN蛋白的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其功能等同物结合肌营养不良蛋白前体mRNA外显子或SMN2前体mRNA外显子或内含子的特定部分。外显子含有通常比非编码内含子序列更具特异性的编码序列。优选地，结合肌营养不良蛋白前体mRNA外显子的特定部分的所述寡核苷酸能够特异性地阻断、干扰和/或抑制所述肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA中的预期外显子的剪接调节序列和/或结构。干扰这种剪接调节序列和/或结构具有这样的优点：这些元件位于外显子内。因此，与序列相关的脱靶效应的风险是有限的。在外显子跳跃的情况下，通过提供用于要跳跃的外显子内部的寡核苷酸，可以掩蔽外显子免于剪接装置。因此，剪接装置不能识别出要跳跃的外显子导致外显子从最终mRNA中排除。在外显子保留的情况下，通过提供用于阻断例如内含子剪接沉默子(ISS)的寡核苷酸，实现了外显子保留的增加。AON与ISS区域的杂交可以替代反式作用的负性抑制因子和/或可以展开干扰在要包含的外显子的5'剪接位点处的U1小核RNA结合的顺式作用的RNA茎环。这些实施例不直接干扰剪接机器(机制)的酶促过程(外显子的连接)。认为这允许该方法更具特异性和/或更可靠。
在本发明的上下文中，本发明的寡核苷酸可包含寡核苷酸的功能等同物。寡核苷酸的功能等同物优选地是指如本文所定义的寡核苷酸，其中一个或多个核苷酸已经被取代，并且其中所述功能等同物的活性在至少一定程度上保持。优选地，包含寡核苷酸的功能等同物的所述寡核苷酸的活性是提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白或SMN蛋白。因此，优选地通过定量功能性或半功能性肌营养不良蛋白或SMN蛋白的量来评估包含寡核苷酸的功能等同物的所述寡核苷酸的所述活性。功能性或半功能性肌营养不良蛋白在本文中优选地被定义为能够结合肌动蛋白和DGC(或DAPC)蛋白质复合物成员的肌营养不良蛋白。寡核苷酸的所述功能等同物的所述活性的评估优选地通过RT-PCR和测序(在RNA水平上；用于检测特异性外显子跳跃(DMD)或包含(SMA))，或通过免疫荧光和蛋白质印迹分析(在蛋白质水平上：用于检测蛋白质修复)来进行。当所述活性表示衍生功能等同物的所述寡核苷酸的相应活性的至少50％、或至少60％、或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％或更多时，其优选地在至少一定程度上保持。在整个本申请中，当使用单词寡核苷酸时，可以用本文定义的其功能等同物代替。在整个本申请中，当使用单词寡核苷酸时，除非另有说明，否则其可以被本文定义的反义寡核苷酸代替。
因此，使用根据本发明的寡核苷酸或其功能等同物，其包含2'-O-甲基单体，优选地2'-O-甲基RNA单体，或由2'-O-甲基RNA组成以及任选地包含硫代磷酸酯，并且包含具有或不具有5-甲基嘧啶(即5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)碱基的至少一个BNA支架修饰，并且由包含或由与肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA外显子或内含子互补、结合或靶向或杂交的序列组成的核苷酸序列表示，被认为当与其不包含如本文前面所述的具有/或不具有5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶的任何BNA支架修饰的对应物相比时，对所述寡核苷酸的至少一个参数具有积极作用(如本文已经定义的那样)，因此被认为在患者的DMD或BMD或SMA细胞中和/或在DMD或BMD或SMA患者中表现出改善的治疗结果。这种治疗结果的特征可在于减轻DMD或BMD或SMA的一种或多种症状。这种治疗结果还可以或者替代地通过以下表征：
-降低一种或多种所述症状的增加或恶化的速率，和/或
-减轻患者肌细胞的一种或多种特征和/或
-向所述个体提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白或SMN蛋白和/或
-减少脊髓中运动神经元的损失，和/或
-减少随意肌的萎缩，和/或至少部分减少所述个体中异常肌营养不良蛋白的产生。
这些特征中的每一个都已在本文中定义。
优选地，寡核苷酸由包含或由与肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA的至少一部分结合、靶向或互补的序列组成的核苷酸序列表示，所述寡核苷酸具有至少10个核苷酸的长度。但是，所述寡核苷酸的长度可以是至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。
一个优选的实施例提供了用于向所述个体提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白或SMN蛋白的寡核苷酸，所述寡核苷酸或其功能等同物由包含以下的序列表示：
-与肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA外显子的区域结合、靶向、杂交或互补的序列，所述肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA外显子的区域与肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA外显子的另一部分杂交(封闭结构)，以及
-与肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA外显子的区域结合、靶向、杂交或互补的序列，所述肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA外显子的区域未在所述肌营养不良蛋白或SMN2前体mRNA中杂交(开放结构)。
对于该实施例，参考WO 2004/083446专利申请。RNA分子表现出强二级结构，主要是由于同一RNA内的互补或部分互补链段的碱基配对。长期以来一直认为RNA中的结构在RNA的功能中起作用。不受理论束缚，据认为，外显子的RNA的二级结构在构建剪接过程中起作用。通过其结构，外显子被认为是需要包含在mRNA中的一部分。在一个实施例中，寡核苷酸能够干扰外显子的结构，因此能够干扰所述外显子的剪接装置，掩蔽外显子免于剪接装置，从而诱导所述外显子的跳跃。已经发现许多寡核苷酸确实包含这种能力，一些比其他寡核苷酸更有效。不受理论束缚，认为与开放结构的重叠提高了寡核苷酸的侵入效率(即提高了寡核苷酸可以进入结构的效率)，而与封闭结构的重叠随后提高了干扰外显子的RNA的二级结构的效率。发现与封闭结构和开放结构部分互补的长度不受严格限制。我们已观察到，利用包含在任一结构中具有可变互补长度的寡核苷酸的化合物的高效率。术语(反向)互补性在本文中用于指在生理条件下可与另一段核酸杂交的一段核酸。反义链通常被认为与匹配的有义链(正义链)互补。在此上下文下，反义寡核苷酸与其靶标互补。杂交条件稍后在文中定义。因此，并非绝对需要互补区域中的所有碱基都能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计反义寡核苷酸时，可能想要掺入例如不与互补链上的碱基进行碱基配对的残基。可以在一定程度上允许错配，如果在细胞中的情况下，核苷酸链段能够与互补部分杂交。
在一个优选的实施例中，反义寡核苷酸的互补部分(针对所述开放或所述封闭结构)包含至少3个，更优选地至少4个连续核苷酸。优选地将互补区进行设计，使得当组合时，它们对前体mRNA中的外显子具有特异性。可以用不同长度的互补区产生这种特异性，因为这取决于系统中其他(前体)mRNA中的实际序列。一种或多种其他前体mRNA也能够与寡核苷酸杂交的风险随着所述寡核苷酸的大小增加而降低。显然，在互补区域中包含错配但保留与前体mRNA中的靶区域杂交的能力的反义寡核苷酸可用于本发明。然而，优选地，至少互补部分不包含这样的错配，因为这些通常比在一个或多个互补区域中具有这种错配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特异性。据认为，较高的杂交强度(即增加与相对链的相互作用的数量)有利于提高干扰系统的剪接机器的过程的效率。
优选地，对于适合诱导单外显子跳跃的AON，互补性为90-100％。通常，这允许在20个核苷酸的寡核苷酸中存在1或2个错配或在40个核苷酸的寡核苷酸中存在1至4个错配。因此，我们可能在10至50个核苷酸的寡核苷酸中具有1、2、3、4、5个错配。优选地，在10至50个核苷酸的寡核苷酸中存在0、1或2个错配。
对于所谓的多跳跃AON(能够结合同一前体mRNA内的第一外显子区域和另一外显子(即第二外显子)区域的AON，其中所述第二外显子的所述区域与所述第一外显子的所述区域具有至少50％同一性)，优选地与所述第一外显子的所述区域存在至少80％互补性，与所述第二外显子的所述区域存在至少45％互补性。更优选地，所述反义寡核苷酸与所述第一外显子的所述区域具有至少85％、90％、95％或100％互补性，并与所述第二外显子的所述区域具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补性。优选地但不一定在寡核苷酸的整个长度上评估互补性。
对于这种所谓的多跳跃AON，第一外显子的区域可以是至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或多达90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸。第一外显子的区域也可以定义为所述外显子的长度的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。第一外显子的区域可以称为同一性区域。
对于这种所谓的多跳跃AON，第二外显子的区域可以是至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或至多90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸。第二外显子的区域可以定义为所述外显子的长度的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。第二外显子的区域可以称为同一性区域。在WO2014007620中描述了所谓的多跳跃AON的优选附加特性。
最好在外显子所在的前体mRNA的情况下分析结构(即开放和封闭结构)。可以在实际RNA中分析这种结构。但是，目前可以使用结构建模程序很好地预测RNA分子的二级结构(以最低的能量成本)。合适程序的非限制性实例是RNA结构版本4.5或RNA mfold版本3.5(Zuker等，2003)。本领域技术人员将能够在给出核苷酸序列下以合适的再现性预测外显子的可能结构。当向这种建模程序提供所述外显子和侧接内含子序列时，获得最佳预测。通常不必建模整个前体mRNA的结构。
寡核苷酸的寡核苷酸所针对的开放和封闭结构优选地彼此相邻。据认为，以这种方式，寡核苷酸退火到开放结构诱导了封闭结构的打开，从而退火进行到该封闭结构中。通过该动作，先前封闭的结构呈现出不同的构造。然而，当靶向外显子中存在潜在的(隐蔽的)剪接受体和/或供体序列时，偶尔会产生新的外显子保留信号，其定义不同的(新)外显子，即具有不同的5'末端，不同的3'末端，或两者。这种类型的活性在本发明的范围内，因为靶向的外显子被排除在mRNA之外。在mRNA中存在包含部分靶向外显子的新外显子并未改变靶向外显子本身被排除的事实。包含新外显子可被视为仅偶尔发生的副作用。当使用外显子跳跃来恢复由于突变而被破坏的(部分)肌营养不良蛋白的开放阅读框时，存在两种可能性。一个是新外显子在恢复阅读框中起作用，而在另一种情况下，阅读框没有被恢复。当选择包含寡核苷酸的化合物用于通过外显子跳跃恢复肌营养不良蛋白阅读框时，显然，在这些条件下，仅选择那些包含那些寡核苷酸的化合物，其在具有或不具有新外显子下确实导致恢复肌营养不良蛋白开放阅读框的外显子跳跃。
还提供了用于向所述个体提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其功能等同物是如上所述的寡核苷酸，即其包含2'-O-甲基单体或由2'-O-甲基单体组成，优选地2'-O-甲基RNA单体，并且任选地包含硫代磷酸酯，并且还包含具有或不具有5-甲基嘧啶(即5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)的BNA支架，并且由核苷酸序列表示，所述核苷酸序列包含与肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子的RNA中的丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白的结合位点互补或结合或靶向或杂交的序列。在WO 2006/112705专利申请中，我们已经公开了外显子-内部反义寡核苷酸在诱导外显子跳跃中的有效性与所述AON的靶前体mRNA位点中存在预测的SR结合位点(例如通过ESEfinder)之间存在相关性。因此，在一个实施例中，产生寡核苷酸，其包括确定肌营养不良蛋白外显子的RNA中的SR(Ser-Arg)蛋白的(推定的)结合位点，并产生包含与所述RNA互补、结合或靶向或杂交并至少部分重叠所述(推定的)结合位点的寡核苷酸的相应化合物。术语“至少部分重叠”在本文中定义为包含仅重叠SR结合位点的单个核苷酸以及所述结合位点的多个核苷酸以及所述结合位点的完全重叠。该实施例优选进一步包括从所述RNA的二级结构确定与所述RNA的另一部分杂交的区域(封闭结构)和在所述结构中未杂交的区域(开放结构)，并随后产生寡核苷酸，其至少部分地重叠所述(推定的)结合位点并且重叠所述封闭结构的至少一部分并且重叠所述开放结构的至少一部分。以这种方式，我们增加了获得能够干扰从前体mRNA到mRNA的外显子保留的寡核苷酸的机会。第一选择的SR结合区可能不具有所需要的开放-封闭结构，在这种情况下，选择另一个(第二)SR蛋白结合位点，然后测试其是否存在开放-封闭结构。继续该过程直至鉴定出含有SR蛋白结合位点以及(n个)(部分重叠)开放-封闭结构的序列。然后将该序列用于设计与所述序列互补的寡核苷酸。
这种产生反义寡核苷酸的方法也通过逆转所述顺序进行，即首先产生寡核苷酸，其包括从肌营养不良蛋白外显子的RNA的二级结构确定呈现与所述RNA的另一部分杂交的结构的区域(封闭结构)和在所述结构中未杂交的区域(开放结构)，随后产生寡核苷酸，其中至少一部分的所述寡核苷酸与所述封闭结构互补，并且其中至少另一部分的所述寡核苷酸与所述开放结构互补。然后确定SR蛋白结合位点是否至少与所述开放/封闭结构重叠。以这种方式改进了WO 2004/083446的方法。在又另一个实施例中，同时执行选择。
不希望受任何理论束缚，目前认为使用针对或靶向SR蛋白结合位点的寡核苷酸导致(至少部分地)损害SR蛋白与SR蛋白结合位点的结合，其导致破坏或受损的剪接。
优选地，开放/封闭结构与SR蛋白结合位点部分重叠，甚至更优选地，开放/封闭结构与SR蛋白结合位点完全重叠或SR蛋白结合位点与开放/封闭结构完全重叠。这允许改善外显子保留的破坏。
除了共有剪接位点和分支点内含子序列外，许多(如果不是全部)外显子包含剪接调节序列，例如但不限于外显子剪接增强子(ESE)序列，以促进剪接体识别真正的剪接位点(Cartegni等，2002；以及Cartegni等，2003)。剪接因子的一个亚组(称为SR蛋白)可以与这些ESE结合并募集其他剪接因子例如U1和U2AF到(弱定义的)剪接位点。已经详细分析了四种最丰富的SR蛋白(SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55)的结合位点，这些结果在ESEfinder中实施，ESEfinder是预测这些SR蛋白的潜在结合位点的网络来源(Cartegni等，2002；和Cartegni等，2003)。在AON用于外显子跳跃的实施例中，AON的有效性与所述AON靶向的位点中存在/不存在SF2/ASF、SC35和SRp40结合位点之间存在相关性。在一个优选的实施例中，本发明因此提供如上所述的寡核苷酸，其与SR蛋白的结合位点互补或靶向或结合。优选地，所述SR蛋白是SF2/ASF或SC35或SRp40。在AON用于外显子保留的实施例中，AON的有效性与所述AON靶向的位点中存在U1小核RNA结合位点或异质核核糖核蛋白(hnRNP)结合位点或小核核糖核蛋白(snRNP)之间存在相关性。在一个优选的实施例中，本发明提供如上所述的寡核苷酸，其与snRNA的结合位点互补或靶向或结合，例如U1小核RNA、snRNP或hnRNP。
在一个实施例中，通过使用如上所述的寡核苷酸或其功能等同物，即包含2'-O-甲基单体，优选地2'-O-甲基RNA单体，或由2'-O-甲基RNA组成并且包含具有或不具有5-甲基嘧啶(即5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶)碱基的至少一个BNA支架并且能够特异结合或靶向转录物中肌营养不良蛋白外显子的正确剪接所必需的调节RNA序列的寡核苷酸，向DMD患者提供功能性或半功能性肌营养不良蛋白。转录物中外显子的正确剪接需要几个顺式作用RNA序列。特别地，鉴定诸如外显子剪接增强子(ESE)、外显子识别序列(ERS)和/或外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)的元件以调节组成和替代外显子的特异和有效剪接。使用与元件结合、靶向或互补的序列特异性反义寡核苷酸(AON)，其调节功能受到干扰，从而跳跃或包含外显子，如DMD或SMA所示。因此，在一个优选的实施例中，使用与外显子剪接增强子(ESE)、外显子识别序列(ERS)和/或外显子剪接沉默子(ESS)和/或内含子剪接沉默子(ISS)互补、结合或靶向的寡核苷酸或其功能等同物。
在一个优选的实施例中，适于诱导单个外显子跳跃的本发明的寡核苷酸包含或由与肌营养不良蛋白前体mRNA外显子44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55的至少一部分互补或结合或靶向或杂交的序列组成，所述部分具有至少10个核苷酸。但是，所述部分也可具有至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。对于以上鉴定的肌营养不良蛋白外显子，我们从所述外显子提供一段核苷酸(SEQ ID NO：2至7)，寡核苷酸优选地与外显子结合或互补或靶向或杂交。
在一个优选的实施例中，适用于本文前面定义的所谓的多跳跃的本发明的寡核苷酸诱导下述肌营养不良蛋白外显子的跳跃：外显子8至19、外显子9至22、外显子9至30、外显子10至18、外显子10至30、外显子10至42、外显子10至47、外显子10至57、外显子10至60、外显子11至23、外显子13至30、外显子23至42、外显子34至53、外显子40至53、外显子44至56、外显子45至51、外显子45至53、外显子45至55、外显子45至60或外显子56至60。优选地，根据本发明的这种所谓的多跳跃寡核苷酸包含或由以下序列组成：该序列能够与肌营养不良蛋白前体mRNA的第一外显子区域结合、靶向、杂交和/或反向互补，使得反向互补部分是本发明的所述寡核苷酸长度的至少30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，甚至更优选地至少70％，甚至更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％或甚至更优选地至少95％，或甚至更优选地98％以及最优选地至多100％。在上下文中，第一外显子优选地为如本文所定义的肌营养不良蛋白前体mRNA的外显子8、9、10、11、13、23、34、40、44、45或56。所述寡核苷酸可包含另外的侧接序列。在一个更优选的实施例中，所述寡核苷酸的所述反向互补部分的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。可以使用几种类型的侧接序列。优选地，侧接序列用于修饰蛋白质与所述寡核苷酸的结合，或修饰所述寡核苷酸的热力学性质，更优选地修饰靶RNA结合亲和力。在另一个优选的实施例中，另外的侧接序列与不存在于所述外显子中的肌营养不良蛋白前体mRNA的序列反向互补。
优选的寡核苷酸包括：
i)Ia)至少一个2'-取代的单体，优选地RNA单体或2'-O-取代的RNA单体，和任选地硫代磷酸酯骨架连接，或
Ib)仅2'-取代的单体，优选地RNA单体或2'-O-取代的RNA单体，通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接，
ii)5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基和
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，
并与选自SEQ ID NO：2至7的以下外显子核苷酸序列中至少一个内至少10个以及至多33个核苷酸的连续链段结合或互补或靶向或杂交，外显子核苷酸序列更优选地选自：
5’-GCGAUUUGACAGAUCUGUUGAGAAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUCUUAAG-3’(SEQ ID NO：2)，用于跳跃或至少跳跃外显子44；
5’-GAACUCCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUUGUCAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAAGAAAUAAUUCAGCAAUCCUCAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAAUUGGGAAGCCUGAAUCUGCGGUGGCAGGAGGUCUGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAAGAG-3’(SEQ ID NO：3)，用于跳跃或至少跳跃外显子45；
5’-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGGCAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAAG-3’(SEQ ID NO：4)，用于跳跃或至少跳跃外显子51；
5’-GCAACAAUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCUAGAACAAUCAUUACGGAUCGAA-3’(SEQ ID NO：5)，用于跳跃或至少跳跃外显子52；
5’-UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGCUUGAGUCAUGGAAGGAGGGUCCCUAUACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACAGAAACCAAG-3’(SEQ ID NO：6)，用于跳跃或至少跳跃外显子53；
5’-GGUGAGUGAGCGAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUGGCAA-3’(SEQ ID NO：7)，用于跳跃或至少跳跃外显子55。
另一个优选的寡核苷酸包括：
i)Ia)至少一个2'-取代的单体，优选地RNA单体或2'-O-取代的RNA单体，和任选地硫代磷酸酯骨架连接，或
Ib)仅2'-取代的单体，优选地RNA单体或2'-O-取代的RNA单体，通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接，
ii)5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基和
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，
并且包含选自SEQ ID NO：6065至6070的至少一种以下核苷酸序列的至少10个以及至多33个核苷酸的连续链段，核苷酸序列更优选地选自：
5’-CUUAAGAUACCAUUUGUAUUUAGCAUGUUCCCAAUUCUCAGGAAUUUGUGUCUUUCUGAGAAACUGUUCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAAUAUCUUUAUAUCAUAAUGAAAACGCCGCCAUUUCUCAACAGAUCUGUCAAAUCGC-3’(SEQ ID NO：6065)，用于跳跃至少外显子44，
5’-CUCUUUUUUCUGUCUGACAGCUGUUUGCAGACCUCCUGCCACCGCAGAUUCAGGCUUCCCAAUUUUUCCUGUAGAAUACUGGCAUCUGUUUUUGAGGAUUGCUGAAUUAUUUCUUCCCCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUGGAGUUC-3’(SEQ ID NO：6066)，用于跳跃至少外显子45，
5’-CUUCUGCUUGAUGAUCAUCUCGUUGAUAUCCUCAAGGUCACCCACCAUCACCCUCUGUGAUUUUAUAACUUGAUCAAGCAGAGAAAGCCAGUCGGUAAGUUCUGUCCAAGCCCGGUUGAAAUCUGCCAGAGCAGGUACCUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAGUUUGGAGAUGGCAGUUUCCUUAGUAACCACAGGUUGUGUCACCAGAGUAACAGUCUGAGUAGGAG-3’(SEQ ID NO：6067)，用于跳跃至少外显子51，
5’-UUCGAUCCGUAAUGAUUGUUCUAGCCUCUUGAUUGCUGGUCUUGUUUUUCAAAUUUUGGGCAGCGGUAAUGAGUUCUUCCAACUGGGGACGCCUCUGUUCCAAAUCCUGCAUUGUUGC-3’(SEQ ID NO：6068)，用于跳跃至少外显子52，
5’-CUUGGUUUCUGUGAUUUUCUUUUGGAUUGCAUCUACUGUAUAGGGACCCUCCUUCCAUGACUCAAGCUUGGCUCUGGCCUGUCCUAAGACCUGCUCAGCUUCUUCCUUAGCUUCCAGCCAUUGUGUUGAAUCCUUUAACAUUUCAUUCAACUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUCUUGUACUUCAUCCCACUGAUUCUGAAUUCUUUCAA-3’(SEQ ID NO：6069)，用于跳跃至少外显子53，
5’-UUGCCAUUGUUUCAUCAGCUCUUUUACUCCCUUGGAGUCUUCUAGGAGCCUUUCCUUACGGGUAGCAUCCUGUAGGACAUUGGCAGUUGUUUCAGCUUCUGUAAGCCAGGCAAGAAACUUUUCCAGGUCCAGGGGGAACUGUUGCAGUAAUCUAUGAGUUUCUUCCAAAGCAGCCUCUCGCUCACUCACC-3’(SEQ ID NO：6070)，用于跳跃至少外显子55。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：8-271或SEQ IDNO：1608-2099或SEQ ID NO：3000-3184表示的核苷酸序列组成。这些寡核苷酸优选地用于跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA外显子44。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：272-451或SEQID NO：3185-4527表示的核苷酸序列组成。这些寡核苷酸优选地用于跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA外显子45。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：452-613或SEQID NO：4528-4572表示的核苷酸序列组成。在更优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548或4568表示的核苷酸序列组成。这些寡核苷酸优选地用于跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA外显子51。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：842-1159或SEQID NO：4573-6048表示的核苷酸序列组成。这些寡核苷酸优选地用于跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA外显子53。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：614-841表示的核苷酸序列组成。这些寡核苷酸优选地用于跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA外显子52。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含或由SEQ ID NO：1160-1399表示的核苷酸序列组成。这些寡核苷酸优选地用于跳跃肌营养不良蛋白前体mRNA外显子55。
SEQ ID NO：6065-6070表示SEQ ID NO：2-7的反向互补序列。在一个更优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸具有10至33个核苷酸的长度并且包含：
i)仅2'-取代的单体，优选地RNA单体或2'-O-取代的RNA单体，通过硫代磷酸酯骨架连接和/或通过磷酸二酯连接所连接，
ii)5-甲基胞嘧啶碱基，和
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，
并且包含选自SEQ ID NO：6065至6070(优选地SEQ ID NO：6067)的至少一个核苷酸序列的至少10个以及至多33个核苷酸的连续链段。
在一个甚至更优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸具有10至33个核苷酸的长度并且包含：
i)仅2'-取代的单体，优选地2'-O-取代的RNA单体，通过硫代磷酸酯骨架连接所连接，
ii)5-甲基胞嘧啶碱基，和
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，
并且包含选自SEQ ID NO：6065至6070(优选地SEQ ID NO：6067)的至少一个核苷酸序列的至少10个以及至多33个核苷酸的连续链段。在更优选的实施例中，这种寡核苷酸具有至少两个包含BNA支架修饰的单体。
在这些实施例中，优选所述连续链段的长度为至少16至26个核苷酸，或16至25个核苷酸。在另一个实施例中，所述连续链段的长度为16至24个核苷酸。在另一个实施例中，所述连续链段的长度为16至22个核苷酸。在另一个实施例中，所述连续链段的长度为16、18、20或22个核苷酸。在另一个实施例中，所述连续链段的长度为21、22、24或25个核苷酸。在另一个实施例中，所述连续链段的长度为18、22、24或25个核苷酸。本发明的寡核苷酸优选地由所述连续链段组成。
更优选的寡核苷酸包含至少一个2'-取代的单体和任选的硫代磷酸酯骨架连接，或者仅通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接的2'-取代的单体，包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基并包含至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，并且由包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-1607组成的核苷酸序列表示，或由包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-1607的片段组成的核苷酸序列表示。更优选的寡核苷酸包含至少一个2'-取代的单体和任选的硫代磷酸酯骨架连接，或者仅通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接的2'-取代的单体，包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基并包含至少一种包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，并且由包含或由SEQID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或SEQ ID NO：3000-6048组成的核苷酸序列表示，或由包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或SEQ ID NO：3000-6048的片段组成的核苷酸序列表示。所述寡核苷酸优选地具有16-30个核苷酸的长度，更优选地16-24个核苷酸，最优选地19、22或22个核苷酸。更优选的寡核苷酸如上所述，并且由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：9-13、15-19、21-25、27-31、33-37、39-43、45-49、51-55、57-61、63-67、69-73、75-79、81-85、87-91、93-97、99-103、105-109、111-115、117-121、123-127、129-133、135-139、141-145、147-151、153-157、159-163、165-169、171-175、177-181、183-187、189-193、195-199、201-205、207-211、213-217、219-223、225-229、231-235、237-241、243-247、249-253、255-259、261-265、267-271、273-277、279-283、285-289、291-295、297-301、303-307、309-313、315-319、321-325、327-331、333-337、339-343、345-349、351-355、357-361、363-367、369-373、375-379、381-385、387-391、393-397、399-403、405-409、411-415、417-421、423-427、429-433、435-439、441-445、447-451、453-457、459-463、465-469、471-475、477-481、483-487、489-493、495-499、501-505、507-511、513-517、519-523、525-529、531-535、537-541、543-547、549-553、555-559、561-565、567-571、573-577、579-583、585-589、591-595、597-601、603-607、609-613、615-619、621-625、627-631、633-637、639-643、645-649、651-655、657-661、663-667、669-673、675-679、681-685、687-691、693-697、699-703、705-709、711-715、717-721、723-727、729-733、735-739、741-745、747-751、753-757、759-763、765-769、771-775、777-781、783-787、789-793、795-799、801-805、807-811、813-817、819-823、825-829、831-835、837-841、843-847、849-853、855-859、861-865、867-871、873-877、879-883、885-889、891-895、897-901、903-907、909-913、915-919、921-925、927-931、933-937、939-943、945-949、951-955、957-961、963-967、969-973、975-979、981-985、987-991、993-997、999-1003、1005-1009、1011-1015、1017-1021、1023-1027、1029-1033、1035-1039、1041-1045、1047-1051、1053-1057、1059-1063、1065-1069、1071-1075、1077-1081、1083-1087、1089-1093、1095-1099、1101-1105、1107-1111、1113-1117、1119-1123、1125-1129、1131-1135、1137-114、1143-1147、1149-1153、1155-1159、1161-1165,、1167-1171、1173-1177、1179-1183、1185-1189、1191-1195、1197-1201、1203-1207、1209-1213、1215-1219、1221-1225、1227-1231、1233-1237、1239-1243、1245-1249、1251-1255、1257-1261、1263-1267、1269-1273、1275-1279、1281-1285、1287-1291、1293-1297、1299-1303、1305-1309、1311-1315、1317-1321、1323-1327、1329-1333、1335-1339、1341-1345、1347-1351、1353-1357、1359-1363、1365-1369、1371-1375、1377-1381、1383-1387、1389-1393、1395-1399、1401-1405、1407-1411、1413-1417、1419-1423、1425-1429、1431-1435、1437-1441、1443-1447、1449-1453、1455-1459、1461-1465、1467-1471、1473-1477、1479-1483、1485-1489、1491-1495、1497-1501、1503-1507、1509-1513、1515-1519、1521-1525、1527-1531、1533-1537、1539-1543、1545-1549、1551-1555、1557-1561、1563-1567、1569-1573、1575-1579、1592-2099或3000-6048，或由包含或由以下的片段组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO:9-13、15-19、21-25、27-31、33-37、39-43、45-49、51-55、57-61、63-67、69-73、75-79、81-85、87-91、93-97、99-103、105-109、111-115、117-121、123-127、129-133、135-139、141-145、147-151、153-157、159-163、165-169、171-175、177-181、183-187、189-193、195-199、201-205、207-211、213-217、219-223、225-229、231-235、237-241、243-247、249-253、255-259、261-265、267-271、273-277、279-283、285-289、291-295、297-301、303-307、309-313、315-319、321-325、327-331、333-337、339-343、345-349、351-355、357-361、363-367、369-373、375-379、381-385、387-391、393-397、399-403、405-409、411-415、417-421、423-427、429-433、435-439、441-445、447-451、453-457、459-463、465-469、471-475、477-481、483-487、489-493、495-499、501-505、507-511、513-517、519-523、525-529、531-535、537-541、543-547、549-553、555-559、561-565、567-571、573-577、579-583、585-589、591-595、597-601、603-607、609-613、615-619、621-625、627-631、633-637、639-643、645-649、651-655、657-661、663-667、669-673、675-679、681-685、687-691、693-697、699-703、705-709、711-715、717-721、723-727、729-733、735-739、741-745、747-751、753-757、759-763、765-769、771-775、777-781、783-787、789-793、795-799、801-805、807-811、813-817、819-823、825-829、831-835、837-841、843-847、849-853、855-859、861-865、867-871、873-877、879-883、885-889、891-895、897-901、903-907、909-913、915-919、921-925、927-931、933-937、939-943、945-949、951-955、957-961、963-967、969-973、975-979、981-985、987-991、993-997、999-1003、1005-1009、1011-1015、1017-1021、1023-1027、1029-1033、1035-1039、1041-1045、1047-1051、1053-1057、1059-1063、1065-1069、1071-1075、1077-1081、1083-1087、1089-1093、1095-1099、1101-1105、1107-1111、1113-1117、1119-1123,、1125-1129、1131-1135、1137-1141、1143-1147、1149-1153、1155-1159、1161-1165、1167-1171、1173-1177、1179-1183、1185-1189、1191-1195、1197-1201、1203-1207、1209-1213、1215-1219、1221-1225、1227-1231、1233-1237、1239-1243、1245-1249、1251-1255、1257-1261、1263-1267、1269-1273、1275-1279、1281-1285、1287-1291、1293-1297、1299-1303、1305-1309、1311-1315、1317-1321、1323-1327、1329-1333、1335-1339、1341-1345、1347-1351、1353-1357、1359-1363、1365-1369、1371-1375、1377-1381、1383-1387、1389-1393、1395-1399、1401-1405、1407-1411、1413-1417、1419-1423、1425-1429、1431-1435、1437-1441、1443-1447、1449-1453、1455-1459、1461-1465、1467-1471、1473-1477、1479-1483、1485-1489、1491-1495、1497-1501、1503-1507、1509-1513、1515-1519、1521-1525、1527-1531、1533-1537、1539-1543、1545-1549、1551-1555、1557-1561、1563-1567、1569-1573、1575-1579、1592-2099或3000-6048。在本发明的上下文中，SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或SEQ ID NO：3000-6048的片段优选地是指包含或由来自所述SEQ ID NO.的至少10个连续核苷酸组成的核苷酸序列。
更优选的寡核苷酸包含至少一个2'-取代的单体，优选地RNA单体，和任选的硫代磷酸酯骨架连接，或者仅通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接的2'-取代的单体，包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基，并且包含至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，并且由包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或由SEQ IDNO：3000-6048组成的核苷酸序列表示，或由包含或由SEQ ID NO：8-1580或SEQ ID NO：1592-2099或由SEQ ID NO：3000-6048的片段组成的核苷酸序列表示，长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸。
优选的序列包括SEQ ID NO：452-613和SEQ ID NO：1592-1605和SEQ ID NO：1607，更优选地SEQ ID NO：453-457、459-463、465-469、471-475、477-481、483-487、489-493、495-499、501-505、507-511、513-517、519-523、525-529、531-535、537-541、543-547、549-553、555-559、561-565、567-571、573-577、579-583、585-589、591-595、597-601、603-607、609-613、1592-1605和1607，甚至更优选地SEQ ID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、483、486、1592、1593、1594、1595、1596、1597、1598、1599、1600、1601、1602、1603、1604、1605或1607。最优选的序列是SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：8-271或SEQ ID NO：1608-2099或SEQ ID NO：3000-3184组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子44，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅通过硫代磷酸酯骨架连接所连接的2'-取代的单体；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：9-13、15-19、21-25、27-31、33-37、39-43、45-49、51-55、57-61、63-67、69-73、75-79、81-85、87-91、93-97、99-103、105-109、111-115、117-121、123-127、129-133、135-139、141-145、147-151、153-157、159-163、165-169、171-175、177-181、183-187、189-193、195-199、201-205、207-211、213-217、219-223、225-229、231-235、237-241、243-247、249-253、255-259、261-265或267-271。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：272-451或SEQ ID NO：3185-4527组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子45，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅通过硫代磷酸酯骨架连接所连接的2'-取代的单体；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：273-277、279-283、285-289、291-295、297-301、303-307、309-313、315-319、321-325、327-331、333-337、339-343、345-349、351-355、357-361、363-367、369-373、375-379、381-385、387-391、393-397、399-403、405-409、411-415、417-421、423-427、429-433、435-439、441-445或447-451。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：452-613或SEQ ID NO：1592-1605或SEQ ID NO:4528-4572组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅通过硫代磷酸酯骨架连接所连接的2'-取代的单体；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：453-457、459-463、465-469、471-475、477-481、483-487、489-493、495-499、501-505、507-511、513-517、519-523、525-529、531-535、537-541、543-547、549-553、555-559、561-565、567-571、573-577、579-583、585-589、591-595、597-601、603-607、609-613、1592-1605或1607，甚至更优选地，SEQ ID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、483、486、1592、1593、1594、1595、1596、1597、1598、1599、1600、1601、1602、1603、1604、1605或1607，最优选地，SEQ ID NO：1592、1593、1594、1595、1596、1597、1598、1599、1600、1601、1602、1603、1604、1605或1607，甚至更优选地，SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1592(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1593(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCT)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1594(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在其相邻单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1595(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1596(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1597(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在其相邻单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1598(AAGGAAGAUGGCAUUUCU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1599(AAGGAAGAUGGCAUUUCT)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1600(AAGGAAGAUGGCAUUUCU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在其相邻单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1601(GGAAGAUGGCAUUUCU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1602(GGAAGAUGGCAUUUCT)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1603(GGAAGAUGGCAUUUCU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在其相邻单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1604(TCAAGGAAGAUGGCAU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1605(TCAAGGAAGAUGGCAU)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在其相邻单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1607(CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在任何单体中都不包含BNA支架修饰，包含胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1607(CUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在任何单体中都包含至少一个BNA支架修饰，优选地仅在5'末端单体、3'-末端单体、5'-末端和3'-末端单体、两个最5'-末端单体或两个最3'-末端单体中，包含胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：455(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCT)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中以及在3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：459(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4528(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中、其相邻单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4531(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中、其相邻单体、距5'-末端的第13个单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4532(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中、其相邻单体、距5'-末端的第9个单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4533(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中、其相邻单体、距5'-末端的第9个单体、距5'-末端的第13个单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4535(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCT)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体中、其相邻单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4542(TCAAGGAAGAUGGCAUUUCT)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体、距5'-末端的第13个单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4548(CAAGGAAGAUGGCAUUUCT)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体、其相邻单体、距5'-末端的第8个单体、距5'-末端的第12个单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：4568(GGUAAGUUCUGUCCAAGC)组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51，在5'-末端单体、其相邻单体、距5'-末端的第6个单体以及其3'-末端单体中包含BNA支架修饰，在其他单体中不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：614-841组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子52，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体，通过硫代磷酸酯骨架连接所连接；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：615-619、621-625、627-631、633-637、639-643、645-649、651-655、657-661、663-667、669-673、675-679、681-685、687-691、693-697、699-703、705-709、711-715、717-721、723-727、729-733、735-739、741-745、747-751、753-757、759-763、765-769、771-775、777-781、783-787、789-793、795-799、801-805、807-811、813-817、819-823、825-829、831-835或837-841。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：842-1159或SEQ ID NO:4573-6048组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子53，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体，通过硫代磷酸酯骨架连接所连接；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：843-847、849-853、855-859、861-865、867-871、873-877、879-883、885-889、891-895、897-901、903-907、909-913、915-919、921-925、927-931、933-937、939-943、945-949、951-955、957-961、963-967、969-973、975-979、981-985、987-991、993-997、999-1003、1005-1009、1011-1015、1017-1021、1023-1027、1029-1033、1035-1039、1041-1045、1047-1051、1053-1057、1059-1063、1065-1069、1071-1075、1077-1081、1083-1087、1089-1093、1095-1099、1101-1105、1107-1111、1113-1117、1119-1123、1125-1129、1131-1135、1137-1141、1143-1147、1149-1153或1155-1159。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1160-1399组成的核苷酸序列表示，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子55，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体，通过硫代磷酸酯骨架连接所连接；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：1161-1165、1167-1171、1173-1177、1179-1183、1185-1189、1191-1195、1197-1201、1203-1207、1209-1213、1215-1219、1221-1225、1227-1231、1233-1237、1239-1243、1245-1249、1251-1255、1257-1261、1263-1267、1269-1273、1275-1279、1281-1285、1287-1291、1293-1297、1299-1303、1305-1309、1311-1315、1317-1321、1323-1327、1329-1333、1335-1339、1341-1345、1347-1351、1353-1357、1359-1363、1365-1369、1371-1375、1377-1381、1383-1387、1389-1393或1395-1399。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1400-1579组成的核苷酸序列表示，并且用于包含SMN2的前体mRNA的外显子7，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体，通过硫代磷酸酯骨架连接所连接；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1606组成的核苷酸序列表示，其中其不包含BNA支架修饰，或包含或由SEQ ID NO：1490组成，其中其在任何单体中都包含BNA支架修饰，优选地仅在5'末端单体、3'-末端单体、5'-末端和3'-末端单体、两个最5'-末端单体、或两个最3'-末端单体中。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1400-1441组成的核苷酸序列表示，并且用于靶向SMN2的前体mRNA的内含子6，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体，通过硫代磷酸酯骨架连接所连接；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：1401-1405、1407-1411、1413-1417、1419-1423、1425-1429、1431-1435、1437-1441。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，最优选地16至22个核苷酸。
在一个优选的实施例中，寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1442-1579组成的核苷酸序列表示，并且用于靶向SMN2的前体mRNA的内含子7，并包括以下一种或多种：
-至少一个2'-取代的单体；
-至少一个硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体；
-仅硫代磷酸酯骨架连接；
-仅2'-取代的单体，通过硫代磷酸酯骨架连接所连接；
-5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基；
-仅5-甲基胞嘧啶碱基而不是胞嘧啶碱基；
-至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
优选地，所述寡核苷酸包含仅2'-取代的单体，仅硫代磷酸酯骨架连接，和至少一个包含BNA支架修饰的单体。更优选地，所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：1443-1447、1449-1453、1455-1459、1461-1465、1467-1471、1473-1477、1479-1483、1485-1489、1491-1495、1497-1501、1503-1507、1509-1513、1515-1519、1521-1525、1527-1531、1533-1537、1539-1543、1545-1549、1551-1555、1557-1561、1563-1567、1569-1573、1575-1579。最优选地，所述寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1490组成的核苷酸序列表示，其中其在任何单体中都包含BNA支架修饰，优选地仅在5'末端单体、3'-末端单体、5'-末端和3'-末端单体、两个最5'-末端单体、或两个最3'-末端单体中。优选地，所述寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，更优选地16至22个核苷酸，最优选地18个单体。
在一个优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：1606(UCACUUUCAUAAUGCUGG)组成的核苷酸序列表示，并且用于靶向SMN2的前体mRNA的内含子7，在任何单体中都不包含BNA支架修饰，包含5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶，包含仅硫代磷酸酯连接，并且还包含仅2'-O-甲基RNA单体。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其中与不包含双环核酸(BNA)支架修饰的相应寡核苷酸相比，所述寡核苷酸具有改善的参数。我们发现在本发明的寡核苷酸中存在具有5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶的BNA对所述寡核苷酸的至少一个参数具有积极作用。在上下文中，参数可以包括：结合亲和力和/或动力学、外显子跳跃活性、生物稳定性、(组织内)分布、细胞吸收和/或运输、和/或所述寡核苷酸的免疫原性，如下所述。
结合亲和力和动力学取决于寡核苷酸的热力学性质。这些至少部分地由所述寡核苷酸的解链温度(Tm；用例如寡核苷酸性质计算器计算(可通过因特网访问，例如www.unc.edu/～cail/biotool/oligo/index.html或例如eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)对于单链RNA，使用基本Tm和最近邻居模型(nearestneighbor model))，和/或寡核苷酸-靶外显子复合物的自由能(使用RNA结构版本4.5或RNAmfold版本3.5)确定。如果Tm增加，则外显子跳跃活性通常增加，但是当Tm过高时，预期寡核苷酸变得具有较低的序列特异性。可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，难以给出这些参数中的每一个的优选范围。
外显子跳跃活性优选地通过使用上述靶向外显子侧接的DMD基因特异性引物，通过逆转录酶定量或数字微滴聚合酶链反应(digital droplet polymerase chainreaction)(RT-qPCR或RT-ddPCR)分析从寡核苷酸处理的肌细胞培养物或肌肉组织分离的总RNA来测量(Aartsma-Rus等，2003，Spitali等，2013)。评估较短转录物片段(表示其中跳跃靶向外显子的转录物)与全部转录物产物的比率(计算为寡核苷酸诱导的外显子跳跃的百分比)。还可以对较短片段进行测序以确定靶向外显子跳跃的正确性和特异性。
在某些实施例中，RNA调节活性可以是核酸或蛋白质的量的增加或减少。在某些实施例中，此类活性可以是核酸或蛋白质的剪接变体的比率的变化。反义活性的检测和/或测量可以是直接的或间接的。在某些实施例中，反义活性通过观察细胞或动物中的表型变化来评估。
如本文所用和上文所解释的，“调节”可以指与调节之前的功能或活性相比时，功能或活性的量或质量的扰动。例如，调节包括改变，基因表达的增加(刺激或诱导)或减少(抑制或降低)。作为另一个实例，表达的调节可以包括扰动前体mRNA加工的剪接位点选择，导致与未被扰动的情况相比，存在的特定剪接变体的量的变化。作为另一个实例，调节包括扰动蛋白质的翻译。
生物分布和生物稳定性优选地至少部分地由改编自Yu等人，2002的经验证的杂交连接测定法确定。在一个实施例中，将血浆或匀浆组织样品与特异性捕获寡核苷酸探针一起温育。分离后，将DIG标记的寡核苷酸连接到复合物上，然后使用抗DIG抗体连接的过氧化物酶进行检测。使用WINNONLIN软件包(型号200，版本5.2，Pharsight，Mountainview，CA)进行非房室药代动力学分析。随时间监测每mL血浆或mg组织的寡核苷酸水平(μg)以评估曲线下面积(AUC)、峰值浓度(Cmax)、峰值浓度时间(Tmax)、最终半衰期和吸收滞后时间(tlag)。这种优选的测定已在实验部分中公开。
因此，与仅通过省略BNA支架修饰与本发明的寡核苷酸不同的相应寡核苷酸进行比较，本发明的优选寡核苷酸具有改善的参数，例如可接受的或降低的免疫原性和/或更好的生物分布和/或可接受或改善的RNA结合动力学和/或热力学性质，即通过与相同序列的寡核苷酸比较，也包含2'-O-甲基取代的单体，5'-甲基胞嘧啶和/或5'-甲基尿嘧啶，任选地硫代磷酸酯，但没有BNA修饰支架。这些参数中的每一个可以使用本领域技术人员已知的测定法评估，或优选地如本文所公开的。
寡核苷酸的进一步化学修饰
以下定义了本发明的寡核苷酸的其他化学和修饰。这些另外的化学和修饰可以与已经针对所述寡核苷酸，即存在具有或不具有5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶的至少1个BNA支架修饰，和/或包含或由具有任选的硫代磷酸酯骨架连接的2'-O-甲基单体组成的寡核苷酸定义的化学组合存在。
本发明的优选的寡核苷酸包含或由RNA分子或修饰的RNA分子组成。在一个优选的实施例中，寡核苷酸是单链的。技术人员将理解，单链寡核苷酸可能形成内部双链结构。然而，在本发明的上下文中，该寡核苷酸仍称为单链寡核苷酸。
除了上述修饰之外，本发明的寡核苷酸可以包含其他修饰，例如如下所述的不同类型的核酸单体或核苷酸。不同类型的核酸单体可用于产生本发明的寡核苷酸。与基于RNA的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸可具有至少一个主链，和/或支架修饰和/或至少一个碱基修饰。
碱基修饰可以包括天然嘌呤和嘧啶碱基的修饰形式(例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)，例如次黄嘌呤、假尿嘧啶、假胞嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、乳清酸、阿马替啶、赖西丁、2-硫代嘧啶(例如2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶)、G-钳及其衍生物、5-取代的嘧啶(例如5-卤代尿嘧啶、5-卤代甲基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、超级T、或例如Kumar等J.Org.Chem.2014，79，5047；Leszczynska等Org.Biol.Chem.2014，12，1052所述)、吡唑并[1,5-a]-1,3,5-三嗪C-核苷(例如Lefoix等J.Org.Chem.2014，79，3221所述)、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、超级G、超级A、硼化胞嘧啶(例如等Bioorg.Med.Chem.2014，22，3906)、假异胞苷、C(Pyc)(例如Yamada等Org.Biomol.Chem.2014，12，2255)和N4-乙基胞嘧啶、或其衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)、或N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pr-AP)、碳水化合物修饰的尿嘧啶(例如Kaura等Org.Lett.2014，16，3308)、氨基酸修饰的尿嘧啶(例如Guenther等Chem.Commun.2014，50，9007)；或其衍生物；以及简并或通用碱基，如2,6-二氟甲苯或缺乏碱基(absent base)如脱碱基位点(如1-脱氧核糖、1,2-二脱氧核糖、1-脱氧-2-O-甲基核糖；或吡咯烷衍生物，其中环氧已被氮代替(氮杂核糖(azaribose))。超级A、超级G和超级T的衍生物的实例可以在美国专利6,683,173(Epoch Biosciences)中找到，其全部内容通过引用并入本文。当掺入siRNA中时，显示cPent-G、cPent-AP和Pr-AP降低免疫刺激作用(Peacock H.等J.Am.Chem.Soc.2011，133，9200)。修饰碱基的实例描述于例如WO2014/093924(ModeRNA)中。
取决于其长度，本发明的寡核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个碱基修饰。本发明还包括在所述寡核苷酸中引入多于一个不同的碱基修饰。
除了已经描述的BNA支架修饰之外，支架修饰可以包括核糖基部分的修饰形式，例如2'-O-修饰的RNA，例如2'-O-烷基或2'-O-(取代的)烷基，例如2'-O-甲基、2'-O-(2-氰基乙基)、2'-O-(2-甲氧基)乙基(2'-MOE)、2'-O-(2-硫代甲基)乙基、2'-O-丁酰基、2'-O-炔丙基、2'-O-缩醛酯(例如Biscans等Bioorg.Med.Chem.2015，23，5360)、2'-O-烯丙基、2'-O-(2S-甲氧基丙基)、2'-O-(N-(氨基乙基)氨基甲酰基)甲基)(2'-AECM)、2'-O-(2-羧乙基)和氨基甲酰基衍生物(Yamada等Org.Biomol.Chem.2014，12，6457)、2'-O-(2-氨基)丙基、2'-O-(2-(二甲基氨基)丙基)、2'-O-(2-氨基)乙基、2'-O-(2-(二甲基氨基)乙基)；2'-脱氧(DNA)；2'-O-(卤代烷氧基)甲基(Arai K.等Bioorg.Med.Chem.2011，21，6285)，例如，2'-O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)、2'-O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)；2'-O-烷氧基羰基，例如，2'-O-[2-(甲氧基羰基)乙基](MOCE)、2'-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基](MCE)、2'-O-[2-(N,N-二甲基氨基甲酰基)乙基](DCME)、2'-O-[2-(甲硫基)乙基](2'-MTE)、2'-(ω-O-丝氨醇)；2'-卤代，例如2'-F、FANA(2'-F阿拉伯糖基核酸)；2’,4'-二氟-2'-脱氧；碳环糖(carbasugar)和氮杂糖修饰；3'-O-取代的例如3'-O-甲基、3'-O-丁酰基、3'-O-炔丙基；4'-取代的例如4'-氨基甲基-2'-O-甲基或4'-氨基甲基-2'-氟；5'-取代的例如5'-甲基或CNA(等ACS Chem.Biol.2014，22，6227)及其衍生物。
取决于其长度，除了至少1个BNA支架修饰之外，本发明的寡核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32或33个支架修饰。本发明还包括在所述寡核苷酸中引入超过一个不同的支架修饰。
其他修饰包括解锁核酸(UNA，unlocked nucleic acid)；环己烯基核酸(CeNA)、F-CeNA、环己基核酸(CNA)、核糖-环己基核酸(r-CNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化HNA(F-HNA)、吡喃糖基-RNA(p-RNA)、3'-脱氧吡喃糖基-DNA(p-DNA)及其衍生物。具有呋喃糖和非呋喃糖糖环的氟化核酸类似物的实例也包括在内，并描述于例如等J.Org.Chem.2014，79，8877中。
取决于其长度，除了至少1个BNA支架修饰之外，本发明的寡核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个支架修饰。在一个优选的实施例中，本发明的寡核苷酸是完全2'-O-甲基修饰的并且包含1、2、3、4、5或6个BNA支架修饰。
根据本发明的寡核苷酸可包含骨架连接修饰。骨架连接修饰可以是但不限于RNA中存在的磷酸二酯的修饰形式，例如硫代磷酸酯(PS)、手性纯的硫代磷酸酯、(R)-硫代磷酸酯、(S)-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(PS2)、膦酰基乙酸酯(PACE)、膦酰基乙酰胺(PACA)、硫代膦酰基乙酸酯(硫代PACE)、硫代膦酰基乙酰胺、硫代磷酸酯前药、H-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸酯、硼烷磷酸甲酯、硼烷硫代磷酸甲酯、硼烷膦酸甲酯、硼烷硫代膦酸甲酯、磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯及其衍生物。另一种修饰包括磷酰基胍、亚磷酰胺、氨基磷酸酯、N3'→P5'磷酰胺酯(N3'→P5'氨基磷酸酯)、磷酰二胺酯、硫代磷酰二胺酯(硫代磷酸二酰胺化物)、氨基磺酸酯、二亚甲基亚砜、酰胺、磺酸酯、硅氧烷、硫化物、砜、甲酰基、硫代甲酰基、亚甲基甲酰基、烯基、亚甲基肼基、磺酰胺、酰胺、三唑、草酰基、氨基甲酸酯、亚甲基亚氨基(MMI)和硫代乙酰氨基核酸(TANA)；及其衍生物。手性纯的硫代磷酸酯连接的实例描述于例如WO2014/010250和WO2017/062862(WaVe Life Sciences)中。磷酰基胍连接的实例描述于WO2016/028187(Noogen)中。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式，以及3’→3’和2’→5’连接。
取决于其长度，本发明的寡核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个骨架连接修饰。本发明还包括在所述寡核苷酸中引入多于一个不同的骨架修饰。
在一个优选的实施例中，本发明的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯修饰。在一个更优选的实施例中，本发明的寡核苷酸是完全硫代磷酸酯修饰的。在另一个优选的实施例中，本发明的寡核苷酸包含至少一个磷酸。
本发明的寡核苷酸的其他化学修饰包括用氘或氚取代任何一个或多于一个的氢原子，其实例可见例如WO2014/022566(Ased)或WO2015/011694(Celgene)。
随着核酸模拟技术的出现，可能产生与核酸本身在种类上具有类似的，优选地相同的杂交特征但在量上不一定的分子。这些功能等同物当然也适用于本发明。
技术人员将理解，不是每个支架、碱基和/或骨架可以以相同的方式修饰。几种不同的修饰支架、碱基和/或骨架可以组合成本发明的单个寡核苷酸。
在一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，其中：
a)至少一个单体具有式I：
其中：
B是核碱基；
X是F、-NR1R2或-OR；
R是烯基或任选取代的烷基，其中任选的取代基(如果存在)是卤素、OR1、NR1R2或SR1；
R1是H、烷基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，各自独立地任选地进一步被卤素、羟基或烷基取代；
R2是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
b)其中至少一个单体包含BNA支架修饰并具有式II：
其中：
B1是核碱基；
Z-Y是选自以下的二价基团：-(CH2)nO-、-C(CH2CH2)O-、-CH2WCH2-、-(CH2)nNR3-、-CH2S(Om)-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2N(R3)O-、-CH2CH2-、-C(O)NR3-、-CH＝CHO-、-CH2SO2NR3-和–NHC(O)NH-；
n是1或2；
m是0、1或2；
W是O、S或NR3；
R3是H、C(O)R4、-C(＝NH)NR5R5、苄基或任选取代的烷基，其中任选的取代基(如果存在)选自卤素和烷氧基；
R4是烷基、环烷基或芳基；
R5是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
c)其中单体通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯骨架连接加以连接；以及
d)其中寡核苷酸中的至少一个核碱基是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。
如本文所用，术语“寡核苷酸的其余部分”通常涉及相邻单体。如技术人员将理解的，当式I或式II的单体是末端单体时，寡核苷酸的其余部分可以是-H。对于式I或式II的任何单体，其余部分都可以是相邻单体。相反，对于式I或式II的任何单体，至多单个其余部分可构成末端，因此例如为-H。如技术人员所理解的，整个寡核苷酸仅具有两个末端。
Z-Y是二价基团。优选地，这样的二价基团通过其文本表示的左侧上的键连接到支架的4'-位(靠近Z)，并通过其文本表示的右侧上的键连接到支架的2'-位(靠近Y)。例如，当二价基团被称为-CH2-O-时，优选地是，-CH2-连接到支架的4'-位，-O-连接到支架的2'-位。这将形成LNA单体。
所述寡核苷酸优选地用于根据本发明的方法或组合物。根据d)的所述核碱基可以是B或B1或另一个核碱基。
在另一个实施例中，X是F或-OR。在另一个实施例中，X是F。在另一个实施例中，X是-OR。在另一个实施例中，X是F、-OCH3或-O-CH2CH2OCH3。在另一个实施例中，X是-OCH3或-O-CH2CH2OCH3。在另一个实施例中，X是-OCH3。在另一个实施例中，X是F或-OCH3。在另一个实施例中，X是F或-O-CH2CH2OCH3。
在另一个实施例中，R是未取代的烷基。在另一个实施例中，R为CH3或乙基。在另一个实施例中，R是CH3。在另一个实施例中，R为乙基。在另一个实施例中，R是被卤素、OR1、NR1R2或SR1取代的烷基。在另一个实施例中，R是被OR1或NR1R2取代的烷基。在另一个实施例中，R是被OR1取代的烷基。
在另一个实施例中，R1是H或未取代的烷基。在另一个实施例中，R1是未取代的烷基。在另一个实施例中，R1是CH3。在另一个实施例中，R2是H。在另一个实施例中，R2是烷基。在另一个实施例中，R2是CH3。
在另一个实施例中，Z-Y是选自以下的二价基团：-(CH2)nO-、-C(CH2CH2)O-、-CH2WCH2-、-CH2NR3-、-CH2S(Om)-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2CH2-、-C(O)NR3-、-CH＝CHO-、-CH2SO2NR3-和–NHC(O)NH-。在另一个实施例中，Z-Y是选自以下的二价基团：–(CH2)nO-、-CH2WCH2-、-CH2NR3-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2CH2-和-C(O)NR3-。在另一个实施例中，Z-Y选自-(CH2)nO-、-CH2NR3-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2CH2-和-C(O)NR3-。在另一个实施例中，Z-Y选自-(CH2)nO-、-CH2OCH2-、-CH2NR3CH2-和-CH2NR3-。在另一个实施例中，Z-Y选自–(CH2)nO-、-CH2OCH2-、-CH2NHCH2-、-CH2NH-、-CH2N(CH3)CH2-和-CH2N(CH3)-。在另一个实施例中，Z-Y选自-CH2O-、-CH2OCH2-、-CH2NHCH2-和-CH2NH-。在另一个实施例中，Z-Y选自-CH2O-、-CH2OCH2-或-CH2NH-。在另一个实施例中，Z-Y选自-(CH2)nO-、-CH(CH3)O-和-CH(CH2OCH3)O-。在另一个实施例中，Z-Y是-(CH2)nO-。在另一个实施例中，Z-Y是-CH2CH2O-。在另一个实施例中，Z-Y是-CH2O-。在另一个实施例中，Z-Y是-CH2NH-。
在另一个实施例中，W为O、S或NH。在另一个实施例中，W为O。在另一个实施例中，W为S。在另一个实施例中，W为O、NH或NCH3。在另一个实施例中，W为O或NH。在另一个实施例中，W为NH。
在另一个实施例中，R3为H、-C(O)R4或未取代的烷基。在另一个实施例中，R3为H、-C(O)R4或CH3。在另一个实施例中，R3为H、-C(O)CH3或CH3。
在另一个实施例中，R4是烷基。在另一个实施例中，R4是CH3。
在另一个实施例中，R5是H。在另一个实施例中，R5是烷基。
在另一个实施例中，X为F、-OCH3或-O-CH2CH2OCH3；Z-Y为–(CH2)nO-、-CH2OCH2-、-CH2NR3CH2-或-CH2NR3-。在另一个实施例中，X为F、-OCH3或-OCH2CH2OCH3；Z-Y为-(CH2)nO-、-CH2OCH2-、-CH2NHCH2-或-CH2NH、-CH2N(CH3)CH2-或-CH2N(CH3)-。在另一个实施例中，X为F、-OCH3或-O-CH2CH2OCH3；以及Z-Y为-CH2O-、-CH2OCH2-、-CH2NHCH2-或-CH2NH-。在另一个实施例中，X为F、-OCH3或-OCH2CH2OCH3；Z-Y选自–CH2O-、-CH2OCH2-和-CH2NH-。在另一个实施例中，X为F或-OCH3；Z-Y选自–CH2O-、-CH2OCH2-和-CH2NH-。在另一个实施例中，X为F或-OCH3；Z-Y为-CH2O-。
在另一个实施例中，寡核苷酸中的至少一个B是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。在另一个实施例中，寡核苷酸中的至少一个B1是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。在另一个实施例中，寡核苷酸中的所有胞嘧啶核碱基都是5-甲基胞嘧啶。在另一个实施例中，寡核苷酸中的所有尿嘧啶核碱基都是5-甲基尿嘧啶。
在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，其中：
a)至少一个单体具有式I，其中
B是核碱基；
X是F、-NR1R2或-OR；
R是任选取代的烷基，其中任选的取代基(存在时)是卤素、OR1、NR1R2或SR1；
R1是H、烷基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，各自独立地任选地进一步被卤素、羟基或烷基取代；
R2是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
b)其中至少一个单体包含BNA支架修饰；
c)其中单体通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯骨架连接加以连接；以及
d)其中寡核苷酸中的至少一个核碱基是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。
在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，其中：
a)至少一个单体具有式I，其中
B是核碱基；
X是F、-NR1R2或-OR；
R是任选取代的烷基，其中任选的取代基(存在时)是卤素、OR1、NR1R2或SR1；
R1是H、烷基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，各自独立地任选地进一步被卤素、羟基或烷基取代；
R2是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
b)其中至少一个单体包含BNA支架修饰并具有式Ⅱ，其中B1和Z-Y如以上定义；
c)其中单体通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯骨架连接加以连接；以及
d)其中寡核苷酸中的至少一个核碱基是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。
在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为CRN、LNA、Xylo-LNA、α-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、2’-氨基-LNA、2’-(烷基氨基)-LNA、2’-(酰基氨基)-LNA、2’-硫代-LNA、cEtBNA、cMOE BNA、cLNA、酰胺基桥接LNA；2’,4’-BNANC(N-H)；2’,4’-BNANC(N-Me)；2’,4’-BNANC(N-Bn)、CBBN、ENA、DpNA、磺酰胺桥接BNA、脲桥接BNA、双环碳环核苷酸、TriNA、α-L-TriNA、bcDNA、tcDNA、F-bcDNA、F-tcDNA、杂环桥接BNA、衍生自2’-氨基-LNA的锁定PMO、GuNA或scpNA。
在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为CRN、LNA、Xylo-LNA、α-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、2’-氨基-LNA、2’-(烷基氨基)-LNA、2’-(酰基氨基)-LNA、2’-硫代-LNA、cEtBNA、cMOE BNA、cLNA、酰胺基桥接LNA；2’,4’-BNANC(N-H)；2’,4’-BNANC(N-Me)；2’,4’-BNANC(N-Bn)、CBBN、ENA、DpNA、磺酰胺桥接BNA、脲桥接BNA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为CRN、LNA、Xylo-LNA、α-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、2’-氨基-LNA或2’-(烷基氨基)-LNA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为CRN、LNA、2’-氨基-LNA或CBBN。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为CRN、LNA或2’-氨基-LNA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为LNA、Xylo-LNA、α-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、2’-氨基-LNA、2’-(烷基氨基)-LNA、2’-(酰基氨基)-LNA、2’-硫代-LNA、cEt BNA、cMOE BNA或cLNA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为LNA、2’-氨基-LNA、2’-(烷基氨基)-LNA、2’-硫代-LNA、cEtBNA、cMOE BNA或cLNA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为LNA、2’-氨基-LNA、2’-(烷基氨基)-LNA、2’,4’-BNANC(N-H)；2’,4’-BNANC(N-Me)、CBBN或ENA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为LNA、2’-氨基-LNA、2’,4’-BNANC(N-H)、CBBN或ENA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为LNA、CBBN或ENA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为LNA或ENA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为LNA。
在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为2’,4’-BNANC(N-H)；2’,4’-BNANC(N-Me)；2’,4’-BNANC(N-Bn)、CBBN、ENA、磺酰胺桥接BNA或脲桥接BNA。在另一个实施例中，BNA支架修饰产生单体，其为2’,4’-BNANC(N-H)；2’,4’-BNANC(N-Me)、CBBN或ENA。
在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，其中：
a)至少一个单体具有式I，其中
B是核碱基；
X是F、-OCH3或-O-CH2CH2OCH3；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
b)其中至少一个单体包含BNA支架修饰并具有式Ⅱ，其中
B1是核碱基；
Z-Y是选自以下的二价基团：–(CH2)nO-、-C(CH2CH2)O-、-CH2WCH2-、-CH2NR3-、-CH2S-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2CH2-、-C(O)NR3-、-CH＝CHO-、-CH2SO2NR3-和–NHC(O)NH-；
n是1或2；
W是O、S或NR3；
R3是H、-C(O)R4、-C(＝NH)NR5R5、苄基或任选取代的烷基，其中任选的取代基(存在时)选自卤素和烷氧基；
R4是烷基、环烷基或芳基；
R5是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
c)其中单体通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯骨架连接加以连接；以及
d)其中寡核苷酸中的至少一个核碱基是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。
在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，其中：
a)至少一个单体具有式I，其中
B是核碱基；
X是F、-OCH3或-O-CH2CH2OCH3；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
b)其中一个或两个单体包含BNA支架修饰并具有式II，其中
B1是核碱基；
Z-Y是选自以下的二价基团：–(CH2)nO-、-C(CH2CH2)O-、-CH2WCH2-、-CH2NR3-、-CH2S-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2CH2-、-C(O)NR3-、-CH＝CHO-、-CH2SO2NR3-和–NHC(O)NH-；
n是1或2；
W是O、S或NR3；
R3是H、-C(O)R4、-C(＝NH)NR5R5、苄基或任选取代的烷基，其中任选的取代基(存在时)选自卤素和烷氧基；
R4是烷基、环烷基或芳基；
R5是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
c)其中单体通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯骨架连接加以连接；以及
d)其中寡核苷酸中的至少一个核碱基是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。
在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，其中所有不包含BNA支架修饰的单体(“非BNA单体”)是式I的修饰单体。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，具有一个或两个式I的非BNA单体。在另一个实施例中，寡核苷酸的长度为10至33个核苷酸，具有一个式I的非BNA单体。
在另一个实施例中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6或7个包含BNA支架修饰的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6或7个包含BNA支架修饰并具有式II的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含1、2、3或4个包含BNA支架修饰的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含1、2、3或4个包含BNA支架修饰并具有式II的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含1、2或3个包含BNA支架修饰的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含1、2或3个包含BNA支架修饰并具有式II的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含1或2个包含BNA支架修饰的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含1或2个包含BNA支架修饰并具有式II的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含两个包含BNA支架修饰的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含两个包含BNA支架修饰并具有式II的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含一个包含BNA支架修饰的单体。在另一个实施例中，寡核苷酸包含一个包含BNA支架修饰并具有式II的单体。
在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GGAAGAUGGCAU(SEQ ID NO：6072)。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由以下组成的群组的序列：SEQID NO：453、455、456、453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、483、486、525、531、538、539、540、543、545、546和4528-4572。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO：453、455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO：453、455和456。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：455和459组成的群组的序列。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO：4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由以下组成的群组的序列：SEQ ID NO：459、4528、4531、4532、4533和4542。
在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GGAAGAUGGCAU(SEQ ID NO：6072)并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：452-613或SEQ ID NO：4528-4572组成的群组的序列，并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：453、455和456组成的群组的序列，并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ IDNO：455和459组成的群组的序列，并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。
在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GGUAAGUUCNGUCCAAGC(SEQID NO：6073)，其中N是T或U。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GGUAAGUUCNGUCCAAGC(SEQ ID NO：6073)，其中N是T或U，并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：4565-4571组成的群组的序列。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQID NO：4565-4571组成的群组的序列，用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。
在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：4561-4564和SEQ ID NO：4572组成的群组的序列。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：4561-4564和SEQ ID NO：4572组成的群组的序列，并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51。
在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CCCAAUUUUUCCUG(SEQ IDNO：6074)。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CCCAAUGCCAUCCUG(SEQ IDNO：6075)。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：3185、3573、3855、4198和4401组成的群组的序列。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：3185、3573、3855和4401组成的群组的序列。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CCCAAUUUUUCCUG(SEQ ID NO：6074)并且用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子45。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CCCAAUGCCAUCCUG(SEQ ID NO：6075)并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子45。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：3185、3573、3855、4198和4401组成的群组的序列，并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子45。在另一个实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：3185、3573、3855和4401组成的群组的序列，并用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子45。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CUUCUGUUAGCC(SEQ ID NO：6076)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为20个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：29表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列UAUUUAGCA(SEQ ID NO：6077)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为23个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：161表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GGAAUUUGU(SEQ ID NO：6078)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为23个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：119表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CUCAACAGA(SEQ ID NO：6079)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为23个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：233表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
当根据本发明的寡核苷酸用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子44时，优选地，其包含SEQ ID NO：6076-6079表示的序列。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GCCCAAU(SEQ ID NO：6080)。这种寡核苷酸的长度优选为16至26个核苷酸，更优选为25个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：3185表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CCAAUUUU(SEQ ID NO：6081)。这种寡核苷酸的长度优选为16至26个核苷酸，更优选为24个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：3573表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GCCCAAU(SEQ ID NO：6082)。这种寡核苷酸的长度优选为16至26个核苷酸，更优选为25个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：3855表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列UCUGACAACA(SEQ ID NO：6083)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为22个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：4198表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列CAAUGCCAUCC(SEQ ID NO：6084)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为21个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：4401表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
当根据本发明的寡核苷酸用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子45时，优选地，其包含SEQ ID NO：6074、6075或6080-6084所表示的序列。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列AAGAUGGCAU(SEQ ID NO：6085)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为22个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：459表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列UAAGUUCUGUCCAA(SEQ IDNO：6086)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为18个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：4565表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
当根据本发明的寡核苷酸用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子51时，优选地，其包含SEQ ID NO：6072、6073、6085或6086所表示的序列。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GUUGCCUCCGGUUC(SEQ IDNO：6087)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为18个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：845表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GGUUCUG(SEQ ID NO：6088)。这种寡核苷酸的长度优选为16至26个核苷酸，更优选为25个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：863表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列GAUUCUGAAU(SEQ ID NO：6089)。这种寡核苷酸的长度优选为16至24个核苷酸，更优选为22个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：4987表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列ACUUCAUC(SEQ ID NO：6090)。这种寡核苷酸的长度优选为16至26个核苷酸，更优选为24个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：5174表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列UUCCAUGA(SEQ ID NO：6091)。这种寡核苷酸的长度优选为16至26个核苷酸，更优选为24个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：5446表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中，根据本发明的寡核苷酸包含序列UGUUGCCU(SEQ ID NO：6092)。这种寡核苷酸的长度优选为16至26个核苷酸，更优选为24个核苷酸。在本文中，优选的实施例是由SEQ ID NO：5765表示的核苷酸序列组成的反义寡核苷酸。
当根据本发明的寡核苷酸用于跳跃肌营养不良蛋白的前体mRNA的外显子53时，优选地，其包含SEQ ID NO：6087-6092所表示的序列。
组合物
在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种本发明寡核苷酸的组合物，优选地其中所述组合物包含至少一种赋形剂，和/或其中所述寡核苷酸包含至少一种结合(缀合，conjugated)配体，其可以进一步有助于增强将所述组合物和/或所述寡核苷酸靶向和/或递送至组织和/或细胞和/或进入组织和/或细胞中。本文所述的组合物在本文中称为根据本发明的组合物。根据本发明的组合物可包含一种或多于一种根据本发明的寡核苷酸。在本发明的上下文中，赋形剂可以是不同的分子，但其也可以是结合部分。在第一种情况下，赋形剂可以是填充剂，例如淀粉。在后一种情况下，赋形剂可以是例如与根据本发明的寡核苷酸连接的靶向配体。
在该方面的优选实施例中，此类组合物可进一步包含阳离子两亲化合物(CAC)或阳离子两亲药物(CAD)。CAC通常是趋溶酶体剂和可以缓冲内体(核内体，endosome)和溶酶体的弱碱(Mae等，Journal of Controlled Release 134:221–227，2009)。与不包含所述CAC的类似组合物相比，进一步包含CAC的组合物优选具有改进的RNA调节参数。不受理论束缚，据认为，这是因为CAC可以帮助本发明的寡核苷酸到达其活性位点，例如通过促进内体逃逸。包含在本发明组合物中的优选CAC是托瑞米芬及其衍生物、类似物和代谢物，例如N-去甲基托瑞米芬、他莫昔芬、阿非昔芬、克罗米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬、米罗昔芬和萘福昔定。这些CAC共有共同的1,1-二苯基乙烯部分。当化合物与本文所述的化合物不同之处仅在于通过少量取代或修饰时，所述化合物是这种化合物的衍生物，并且也可以看作其类似物。化合物的代谢物是一类特殊的衍生物。对于本领域已知的化合物，代谢物通常也是已知的。当提及化合物的代谢物时，至少提及所有这些已知的代谢物。例如，N-去甲基托瑞米芬是托瑞米芬的已知代谢物。
在一个优选的实施例中，所述组合物用作药物。因此，所述组合物是药物组合物。药物组合物通常包含药学上接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含如本文所定义的化合物，并且任选地还包含药学上可接受的制剂、填充剂、防腐剂、增溶剂、载体、稀释剂、赋形剂、盐、佐剂和/或溶剂。这种药学上可接受的载体、填充剂、防腐剂、增溶剂、稀释剂、盐、佐剂、溶剂和/或赋形剂可以例如参见Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第20版.Baltimore，MD：Lippincott Williams&Wilkins，2000。本发明中描述的化合物可具有至少一个可电离基团。可电离基团可以是碱或酸，并且可以带电或中性。可电离基团可以作为具有携带相反电荷的适当的抗衡离子的离子对存在。阳离子抗衡离子的实例是钠、钾、铯、Tris、锂、钙、镁、三烷基铵、三乙基铵和四烷基铵。阴离子抗衡离子的实例是氯化物、溴化物、碘化物、乳酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、二氯乙酸盐、酒石酸盐、乳酸盐和柠檬酸盐。已经描述了抗衡离子的实例[例如，Kumar，2008]，其全部内容通过引用并入本文]。
药物组合物可包含增强所述化合物的稳定性、溶解性、吸收性、生物利用度、活性、药代动力学、药效学、细胞吸收和细胞内运输的助剂，特别是能够形成复合物、纳米颗粒、微粒、纳米管、纳米凝胶、水凝胶、泊洛沙姆或普朗尼克、聚合物囊泡(polymersome)、胶体、微泡、囊泡、胶束、脂质复合物和/或脂质体的赋形剂。纳米颗粒的实例包括聚合物纳米颗粒、(混合的)金属纳米颗粒、碳纳米颗粒、金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、脂质纳米颗粒、糖颗粒、蛋白质纳米颗粒和肽纳米颗粒。纳米颗粒和寡核苷酸的组合的实例是球形核酸(SNA)，例如Barnaby等Cancer Treat.Res.2015，166，23。
优选的组合物包含至少一种赋形剂，其可以进一步有助于增强所述组合物和/或所述寡核苷酸靶向和/或递送至组织和/或细胞和/或进入组织和/或细胞中。优选的组织或细胞是肌肉组织或细胞。
许多这些赋形剂是本领域已知的(例如参见Bruno，2011)，并且可以归类为第一类赋形剂。第一类赋形剂的实例包括聚合物(例如聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯亚胺(PPI)、葡聚糖衍生物、氰基丙烯酸丁酯(PBCA)、氰基丙烯酸己酯(PHCA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、多胺(例如精胺、亚精胺、腐胺、尸胺)、壳聚糖、聚(酰氨基胺)(PAMAM)、聚(酯胺)、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)环糊精、透明质酸、多聚乙酰神经氨酸(聚唾液酸，colominic acid)及其衍生物)、树枝状聚合物(例如聚(酰氨基胺))、脂质(例如，1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、二油酰基二甲基氯化铵(DODAC)、磷脂酰胆碱衍生物[例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)]、溶血磷脂酰胆碱衍生物[例如1-硬脂酰基-2-溶血-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(S-LysoPC)]、神经鞘磷脂(鞘磷脂)、2-{3-[双-(3-氨基-丙基)-氨基]-丙基氨基}-N-二脱乙酰氨基甲酰基甲基乙酰胺(RPR209120)、磷酸甘油衍生物[例如1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油，钠盐(DPPG-Na)，磷脂酸衍生物[1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酸，钠盐(DSPA)，磷脂酰乙醇胺衍生物[例如二油酰基-L-R-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)]、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙基酰胺(DOSPER)、(1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)、(N1-胆甾醇基氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺(CDAN)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、(b-L-精氨酰基-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油酰基酰胺三盐酸盐(AtuFECT01)、N,N-二甲基-3-氨基丙烷衍生物[例如1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DoDMA)、1,2-二亚油酰基氧基-N,N-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、磷脂酰丝氨酸衍生物[1,2]-二油基-SN-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸，钠盐(DOPS)]、蛋白质(例如白蛋白、明胶、端胶原(atellocollagen))和线性或环状肽(例如鱼精蛋白、PepFects、NickFects、聚精氨酸、聚赖氨酸、CADY、MPG、细胞穿透肽(CPP)、靶向肽、细胞易位肽、内体逃逸肽)。已经描述了这种肽的实例，例如，肌肉靶向肽(例如Jirka等，Nucl.Acid Ther.2014，24，25)、CPP(例如Pip系列，包括WO2013/030569，和寡精氨酸系列，例如US9,161,948(Sarepta)，WO2016/187425(Sarepta)，以及M12肽，例如Gao等，Mol.Ther.2014，22，1333)、或血脑屏障(BBB)交叉肽，例如(分支的)ApoE衍生物(Shabanpoor等，Nucl.Acids Ther.2017，27，130)。当用作不同的化合物时，如下所述的碳水化合物和碳水化合物簇也适合用作第一类赋形剂。
另一种优选的组合物可包含至少一种分类为第二类赋形剂的赋形剂。第二类赋形剂可包含或含有如本文所述的结合基团，以增强本发明的组合物和/或寡核苷酸靶向和/或递送至组织和/或细胞和/或进入组织和/或细胞中，例如肌肉组织或细胞。结合基团可以显示一种或多种不同或相同的配体。结合基团配体的实例是例如肽、维生素、适体、碳水化合物或碳水化合物的混合物(Han等，Nature Communications，2016，doi:10.1038/ncomms10981；Cao等.，Mol.Ther.Nucleic Acids，2016，doi:10.1038/mtna.2016.46)、蛋白质、小分子、抗体、聚合物、药物。碳水化合物结合基团配体的实例是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNac)、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、葡萄糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸和麦芽三糖。碳水化合物可以多个存在，例如作为端基存在于将碳水化合物连接到组合物的组分上的树枝状或支链接头部分上。碳水化合物也可以包含在碳水化合物簇部分中，例如GalNAc簇部分。碳水化合物簇部分可包含靶向部分和任选的结合物接头。在一些实施例中，碳水化合物簇部分包含1、2、3、4、5、6或更多个GalNAc基团。如本文所用，“碳水化合物簇”是指具有与支架或连接基团连接的一个或多个碳水化合物残基的化合物(参见，例如，Maier等，"Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to aMultivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting,"Bioconjugate Chem.，2003，(14)：18-29；Rensen等，"Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins tothe Hepatic Asiaglycoprotein Receptor,"J.Med.Chem.2004，(47)：5798-5808)。在本文中，“修饰的碳水化合物”是指相对于天然存在的碳水化合物具有一种或多种化学修饰的任何碳水化合物。如本文所用，“碳水化合物衍生物”是指可以使用碳水化合物作为起始材料或中间体合成的任何化合物。如本文所用，“碳水化合物”是指天然存在的碳水化合物、修饰的碳水化合物或碳水化合物衍生物。两种类型的赋形剂可以组合在一起形成如本文所述的单一组合物。WO2017/062862(Wave Life Sciences)中描述了三价N-乙酰葡糖胺簇的实例，其还描述了一簇磺酰胺小分子。还描述了小分子舍曲林的单一结合物的实例(Ferrés-Coy等，Mol.Psych.2016，21，328)，以及结合蛋白质的小分子的结合物，包括布洛芬(例如US 6,656,730ISIS/Ionis Pharmaceuticals)、精胺(例如Noir等，J.Am.Chem Soc.2008，130，13500)、茴香酰胺(例如Nakagawa等，J.Am.Chem.Soc.2010，132，8848)和叶酸盐(例如Dohmen等，Mol.Ther.Nucl.Acids 2012，1，e7)。
寡核苷酸与适体的结合物是本领域已知的(例如Zhao等，Biomaterials2015，67，42)。
抗体和抗体片段也可以与本发明的寡核苷酸结合。在一个优选的实施例中，靶向特定关注的组织，特别是肌肉组织的抗体或其片段与本发明的寡核苷酸结合。此类抗体和/或片段的实例是例如靶向CD71(运铁蛋白受体)，例如WO2016/179257(CytoMx)和Sugo等，J.Control.Rel.2016，237，1中所述，或靶向平衡核苷转运蛋白(ENT)，例如3E10抗体，例如Weisbart等，Mol.Cancer Ther.2012，11，1中所述。
其他寡核苷酸结合物是本领域技术人员已知的，并且已在例如Winkler等，Ther.Deliv.2013，4，791，Manoharan，Antisense Nucl.Acid.Dev.2004，12，103和Ming等，Adv.Drug Deliv.Rev.2015，87，81中进行了综述。
技术人员可以选择、组合和/或改造一种或多种上述或其他替代赋形剂和递送系统，以配制和递送用于本发明的化合物。
本发明的这种药物组合物可以在设定的时间以有效浓度施用给动物，优选哺乳动物。更优选的哺乳动物是人类。如本文所定义的根据本发明使用的寡核苷酸或组合物可适合于直接施用给受本文所鉴定的疾病或病症影响或有患病风险的个体的体内细胞、组织和/或器官，和可以在体内、离体或体外直接施用。施用可以通过局部、全身和/或肠胃外途径，例如静脉内、皮下、腹膜内、鞘内、肌肉内、眼、鼻、泌尿生殖器、皮内、皮肤、肠内、玻璃体内、海绵体内、脑内、鞘内、硬膜外或口服途径。
优选地，本发明的这种药物组合物可以以用于口服递送的乳液、悬浮液、丸剂、片剂、胶囊或软凝胶的形式，或者以用于递送至呼吸道和肺部的气溶胶或干粉形式包封。
在一个实施例中，本发明的寡核苷酸可以与已知用于治疗所述疾病的另一种化合物一起使用。此类其他化合物可用于减轻炎症，优选用于减轻肌肉组织炎症，和/或用于改善肌纤维功能，完整性和/或存活和/或改善，增加或恢复心脏功能的辅助化合物。
实例为但不限于类固醇，优选(葡糖)皮质类固醇、表儿茶素、ACE抑制剂(优选培哚普利)和HDAC抑制剂、血管紧张素II 1型受体阻滞剂(优选氯沙坦)、血管紧张素肽(1-7)、肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂、NF-kB抑制剂、TGFβ抑制剂(优选核心蛋白聚糖)、人重组双糖链蛋白聚糖、mIGF-1来源、肌生长抑制素抑制剂、甘露糖-6-磷酸、抗氧化剂、离子通道抑制剂、丹曲林、蛋白酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂(优选PDE5抑制剂，如西地那非或他达拉非)和/或L-精氨酸。这种组合使用可以是顺序使用：每种组分以不同的方式施用，可能作为不同的组合物。替代地，每种化合物可以在单一组合物中一起使用。
包含在根据本发明的组合物中的化合物也可以单独提供，例如以允许顺序施用根据本发明的组合物的活性组分。在这种情况下，根据本发明的组合物是至少包含具有或不具有结合配体的根据本发明的寡核苷酸的化合物，至少一种赋形剂，和任选的如上所述的CAC的组合。
用途
在另一方面中，提供了如前面部分中所述的组合物或寡核苷酸用作药物或治疗，或其中所述寡核苷酸在细胞内发挥其活性的应用的一部分的用途。
优选地，本发明的寡核苷酸或组合物用作药物或用于预防、延迟、治愈、改善和/或治疗DMD或BMD或SMA的治疗的一部分。
在本发明该方面的一个实施例中，提供根据本发明的寡核苷酸或根据本发明的组合物，其用作优选地用于治疗、预防和/或延迟杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)或脊髓性肌萎缩症(SMA)的药物。
方法
在另一方面中，提供了一种用于在个体中，在所述个体的细胞、组织或器官中预防、治疗、治愈、改善和/或延迟前一部分中定义的病症或疾病的方法。该方法包括将本发明的寡核苷酸或组合物施用给有此需要的所述个体或受试者。
根据本发明的方法，其中如本文所定义的寡核苷酸或组合物可适合于施用给受本文所定义的任何疾病影响或有患炎性疾病风险的个体的体内细胞、组织和/或器官，可以在体内、离体或体外施用。有需要的个体或受试者优选为哺乳动物，更优选为人。替代地，受试者不是人。施用可以通过局部、全身和/或肠胃外途径，例如静脉内、皮下、鼻、眼、腹膜内、鞘内、肌肉内、海绵体内、泌尿生殖器、皮内、皮肤、肠内、玻璃体内、脑内、鞘内、硬膜外或口服途径。
在一个实施例中，在本发明的方法中，寡核苷酸或组合物的浓度范围为0.01nM至1μM。更优选地，使用的浓度为0.05至500nM、或0.1至500nM、或0.02至500nM、或0.05至500nM，甚至更优选地1至200nM。
根据本发明的寡核苷酸或组合物的剂量范围优选地基于临床试验(体内应用)中的递增剂量研究设计，其中存在严格的方案要求。如本文所定义的寡核苷酸可以以0.01至200mg/kg或0.05至100mg/kg或0.1至50mg/kg或0.1至20mg/kg，优选地0.5至10mg/kg的剂量使用。
如上给出的寡核苷酸或组合物的浓度或剂量范围是体外或离体应用的优选浓度或剂量。技术人员将理解，取决于所用寡核苷酸的特性，待治疗的靶细胞，基因靶及其表达水平，所用培养基以及转染和温育条件，所用寡核苷酸的浓度或剂量可进一步变化，并且可能需要进一步优化。
在本发明该方面的一个实施例中，提供了一种用于预防、治疗和/或延迟杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)或脊髓性肌萎缩症(SMA)的方法，其包括向受试者施用根据本发明的寡核苷酸，或根据本发明的组合物。
本发明的特定实施例
1.一种寡核苷酸，其包含：
i)Ia)至少一个2'-取代的单体和任选地硫代磷酸酯骨架连接，或
Ib)仅通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接的2'-取代的单体，
ii)5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶碱基以及
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体。
2.根据实施例1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含1、2、3或4个单体，其包含双环核酸(BNA)支架修饰，优选地桥接核酸支架修饰。
3.根据实施例1或2所述的寡核苷酸，其中至少一个双环核酸(BNA)支架修饰包含在所述寡核苷酸的末端单体中，优选在所述寡核苷酸的5'-末端单体中，更优选地在所述寡核苷酸的两个末端单体中。
4.根据实施例1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中每次出现的所述双环核酸(BNA)支架修饰产生的单体独立地选自由以下组成的群组：构象限制的核苷酸(CRN)单体、锁核酸(LNA)单体、xylo-LNA单体、α-L-LNA单体、β-D-LNA单体、2'-氨基-LNA单体、2'-(烷基氨基)-LNA单体、2'-(酰基氨基)-LNA单体、2'-N-取代-2'-氨基-LNA单体、(2'-O,4'-C)约束乙基(cEt)LNA单体、(2'-O,4'-C)约束甲氧基乙基(cMOE)BNA单体、2',4'-BNANC(N-H)单体、2',4'-BNANC(N-Me)单体、亚乙基桥接核酸(ENA)单体、2'-C-桥接双环核苷酸(CBBN)单体及其衍生物。
5.根据实施例1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述2'-取代的单体是2'-取代的RNA单体、2'-F单体、2'-氨基单体、2'-O-取代的单体、2'-O-甲基单体、或2'-O-(2-甲氧基乙基)单体，优选地2'-O-甲基单体。
6.根据实施例1至5中任一项所述的寡核苷酸，其中所有胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶碱基，和/或其中所有尿嘧啶碱基是5-甲基尿嘧啶碱基。
7.根据实施例1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度小于34个核苷酸。
8.根据实施例1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与外显子和/或非外显子区域的至少一部分互补或结合或靶向或杂交，优选地其中所述寡核苷酸包含或由与外显子识别序列(ERS)、外显子剪接沉默子(ESS)、内含子剪接沉默子(ISS)、SR蛋白结合位点、或另一剪接元件、信号或结构的至少一部分互补或结合或靶向或杂交的序列组成。
9.根据实施例8所述的寡核苷酸，其中所述外显子和/或非外显子区域的至少一部分具有10至33个核苷酸的长度。
10.根据实施例8或9所述的寡核苷酸，其中所述外显子和/或非外显子区域在DMD基因或SMN基因中。
11.根据实施例1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由包含或由SEQ ID NO：8-1580组成的核苷酸序列表示，或由包含或由SEQ ID NO：8-1580的片段组成的核苷酸序列表示，优选地，其中所述寡核苷酸由包含或由以下组成的核苷酸序列表示：SEQID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、483或486，或由包含或由以下的片段组成的核苷酸序列表示：SEQ ID NO：453、455、456、459、461、462、465、467、468、471、473、474、483或486。
12.根据实施例1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，优选地所述前体mRNA剪接调节改变蛋白质的产生或组成，其优选地包含外显子跳跃或外显子保留，其中所述RNA调节最优选地包含外显子跳跃。
13.根据实施例1至12中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，其中所述前体mRNA剪接调节改变与疾病或病症相关的蛋白质的产生，优选地，其中所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)或脊髓性肌萎缩症(SMA)。
14.根据实施例1至13中任一项所述的寡核苷酸，其中与不包含双环核酸(BNA)支架修饰的相应寡核苷酸相比，所述寡核苷酸具有改善的参数。
15.一种包含如实施例1至14中任一项所定义的寡核苷酸的组合物，优选地其中所述组合物包含至少一种赋形剂，所述赋形剂可进一步有助于增强所述组合物和/或所述寡核苷酸靶向和/或递送至组织和/或细胞和/或进入组织和/或细胞中。
16.根据实施例1至14中任一项所述的寡核苷酸，或根据权利要求15所述的组合物，其用作优选地用于治疗、预防和/或延迟杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)或脊髓性肌萎缩症(SMA)的药物。
17.一种用于预防、治疗和/或延迟杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)或脊髓性肌萎缩症(SMA)的方法，包括向受试者施用如实施例1至14中任一项所定义的寡核苷酸，或如实施例15所述的组合物。
18.一种长度为10至33个核苷酸的寡核苷酸，其中：
a)至少一个单体具有式I：
其中：
B是核碱基；
X是F、-NR1R2或-OR；
R是烯基或任选取代的烷基，其中任选的取代基(当存在时)是卤素、OR1、NR1R2或SR1；
R1是H、烷基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，各自独立地任选地进一步被卤素、羟基或烷基取代；
R2是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
b)其中至少一个单体包含BNA支架修饰并具有式II：
其中：
B1是核碱基；
Z-Y是选自以下的二价基团：-(CH2)nO-、-C(CH2CH2)O-、-CH2WCH2-、-(CH2)nNR3-、-CH2S(Om)-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2N(R3)O-、-CH2CH2-、-C(O)NR3-、-CH＝CHO-、-CH2SO2NR3-和-NHC(O)NH-；
n是1或2；
m是0、1或2；
W是O、S或NR3；
R3是H、-C(O)R4、-C(＝NH)NR5R5、苄基或任选取代的烷基，其中任选的取代基(当存在时)选自卤素和烷氧基；
R4是烷基、环烷基或芳基；
R5是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
c)其中单体通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯骨架连接加以连接；以及
d)其中寡核苷酸中的至少一个核碱基是5-甲基胞嘧啶或5-甲基尿嘧啶碱基。
19.根据实施例18所述的寡核苷酸，其中R是未取代的烷基、或-CH3或-CH2CH3。
20.根据实施例18或19所述的寡核苷酸，其中R1是CH3。
21.根据实施例18-20中任一项所述的寡核苷酸，其中X是F或-OR。
22.根据实施例18-21中任一项所述的寡核苷酸，其中X是F或-OCH3。
23.根据实施例18-22中任一项所述的寡核苷酸，其中Z-Y是选自由-(CH2)nO-、-CH(CH3)O-和-CH(CH2OCH3)O-组成的群组的二价基团。
24.根据实施例18-23中任一项所述的寡核苷酸，其中Z-Y是-CH2O-。优选地，Z是-CH2-且Y是-O-。
25.根据实施例18-24中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含序列GGAAGAUGGCAU(SEQ ID NO：6072)。
26.根据实施例18-25中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有16、17、18、19、20、21或22个核苷酸的长度。
27.根据实施例18-26中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有19、20或22个核苷酸的长度。
28.根据实施例18-27中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有20或22个核苷酸的长度。
29.根据实施例18-28中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有20个核苷酸的长度。
30.根据实施例18-28中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有22个核苷酸的长度。
31.根据实施例18-27中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有19个核苷酸的长度。
30.根据实施例18-27中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由包含或由选自以下的序列组成的序列表示：SEQ ID NO：453、455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568。
31.根据实施例18-26中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通过由选自以下的序列组成的序列表示：SEQ ID NO：453、455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568。
32.根据实施例18-31中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，优选地所述前体mRNA剪接调节改变蛋白质的产生或组成，其优选地包含外显子跳跃或外显子保留，其中所述RNA调节最优选地包含外显子跳跃。
33.根据实施例18-32中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，其中所述前体mRNA剪接调节改变与疾病或病症相关的蛋白质的产生，优选地，其中所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌营养不良症(BMD)或脊髓性肌萎缩症(SMA)。
34.根据实施例18-33中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，其中所述前体mRNA剪接调节改变与杜氏肌营养不良症(DMD)相关的蛋白质的产生。
35.根据实施例18-33中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，其中所述前体mRNA剪接调节改变与贝克型肌营养不良症(BMD)相关的蛋白质的产生。
36.根据实施例18-33中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，其中所述前体mRNA剪接调节改变与脊髓性肌萎缩症(SMA)相关的蛋白质的产生。
37.根据实施例18-36中任一项所述的寡核苷酸，其中与不包含双环核酸(BNA)支架修饰的相应寡核苷酸相比，所述寡核苷酸具有改善的参数。
定义
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变形以其非限制性含义使用，表示包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，动词“由…组成”可以被“基本上由...组成”替代，意指本文定义的寡核苷酸或组合物可以包含除特定确定的组分之外的额外组分，所述额外组分不改变本发明的独特特征。另外，由不定冠词“一(a)”或“一(an)”提及的元件不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元件。因此，不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常意指“至少一个”。
除非另有说明，否则本文中确定的每个实施例可以结合在一起。本说明书中引用的所有专利和参考文献都通过引用整体并入本文。
在整个申请中，当在反义寡核苷酸的情况下使用时，单词“结合”，“靶向”，“杂交”可以互换使用，所述反义寡核苷酸与本文确定的前体mRNA的一部分互补，优选地反向互补。在本发明的上下文中，除非另有说明，否则“杂交”在生理条件下在细胞，优选肌细胞中使用。
当结构式或化学名称被技术人员理解为具有手性中心但没有指示手性时，对于每个手性中心，单独参考外消旋混合物、纯R对映体和纯S对映体的所有三种。
每当在本发明的上下文中讨论物质的参数时，假设除非另有说明，否则在生理条件下测定、测量或表现参数。生理条件是本领域技术人员已知的，并且包括水性溶剂系统，大气压，pH值在6与8之间，温度范围为从室温至约37℃(从约20℃至约40℃)，和适当浓度的缓冲盐或其他组分。应理解，电荷通常与平衡相关。被认为携带或带有电荷的部分是发现其带有或携带这种电荷的状态比其不带有或携带这种电荷更频繁的部分。因此，本公开中指出的带电的原子可以在特定条件下不带电，并且中性部分可以在特定条件下带电，如本领域技术人员所理解的。
通常，取代用另一部分替换一部分(可能是氢)。当考虑有机分子的碳骨架时，RNA单体本身是2'-取代的，因为在其2'位具有羟基部分。因此，DNA单体不是2'-取代的，RNA单体可以被看作是2'-取代的DNA单体。当RNA单体又被2'-取代时，该取代可以替换2'-OH或2'-H。当RNA单体被2'-O-取代时，该取代替换2'-OH部分的H。作为非限制性实例，2'-O-甲基RNA是2'-取代的单体(-OMe取代-H)和2'-取代的RNA单体(-OMe取代-OH)和2'-O-取代的RNA单体(-Me取代-H)，而2'-F RNA是2'-取代的RNA单体(-F取代-OH或-H)而不是2'-O-取代的RNA单体(2'-O不再存在，或未被取代)。2'-F RNA(其中F取代2'-OH)是2'-F-2'-脱氧RNA，也是2'-F DNA。
“烯基”是指具有2至8个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃基。在某些实施例中，烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁-3-烯基、1-戊-3-烯基和1-己-5-烯基。
“烷氧基”是指式-OR的基团，其中R是烷基。在某些实施例中，烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
“烷基”是指含有1-20个碳原子的直链或支链饱和烃基，在某些实施例中包括1-6个碳原子。在某些实施例中，烷基包括1-4个碳原子，并且在某些实施例中包括1-3个碳原子。在某些实施例中，烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。
“芳基”是指单价的六至十四元、单-、二-、或三-碳环，其中单环是芳族的并且双环或三环中的至少一个环是芳族的。在某些实施例中，芳基包括苯基、萘基、茚满基和蒽基。
“环烷基”是指具有3至10个碳环原子的单环或双环，饱和或部分不饱和(但不是芳族)烃基。在某些实施例中，环烷基含有5-6个碳原子，在本文中可以称为C5-6环烷基。环烷基包括稠合、桥接和螺环烷基双环。例如，当稠合时，环烷基可包含共有相邻原子的两个环(例如，一个共价键)。当桥接时，环烷基可包含共有三个或更多个原子的两个环，通过含有至少一个原子的桥将两个桥头原子分开。当螺接时，环烷基可包含仅共有单个原子的两个环，所述单个原子即螺原子，其可以是例如季碳。在某些实施例中，环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。在某些实施例中，环烷基包括：
“卤代”表示氟、氯、溴或碘基团。“卤代”优选表示氟。“卤代”可以用卤素代替。优选的卤素是氟、氯、溴或碘。最优选的卤素是氟。
“杂芳基”是指具有5至14个环原子的单环、稠合双环或稠合三环基团，其含有一个或多个，在另一个实例中，一个、两个、三个或四个独立地选自-O-、-S(O)n-(n为0、1或2)、-N＝(三价氮)、-N(H)-和>N-氧化物的环杂原子，其余环原子为碳，其中包含单环基团的环为芳族且其中包含双环或三环基团的稠合环中的至少一个是芳族的(但不必是含有杂原子的环，例如2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-6-基)。稠合双环基团包括桥连环系统。除非另有说明，否则化合价可以位于杂芳基的任何环的任何原子上，只要化合价规则允许。
在某些实施例中，杂芳基包括，但不限于，三唑基、四唑基、吡咯基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、吲哚基、吲唑基、邻苯二甲酰亚氨基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并吡喃基、苯并噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基和四氢异喹啉基。
“杂环烷基”是指具有3至9个环原子的饱和或部分不饱和(但非芳族)单价单环基团或具有5至12个环原子的饱和或部分不饱和(但非芳族)单价双环基团，其中一个或多个环原子是独立地选自-O-、-S(O)n-(n为0、1或2)、-N＝(三价氮)或-NH-的杂原子，其余的环原子是碳。杂环烷基包括稠合、桥接和螺杂环烷基双环。例如，当稠合时，杂环烷基可包含共有相邻原子的两个环(例如，一个共价键)。当桥接时，杂环烷基可包含共有三个或更多个原子的两个环，通过含有至少一个原子的桥将两个桥头原子分开。当螺接时，杂环烷基可包含仅共有单个原子的两个环，所述单个原子即螺原子，其可以是例如季碳。在某些实施例中，杂环烷基包含一个、两个、三个或四个环杂原子，其独立地选自-O-、-S(O)n-(n为0、1或2)、-N＝(三价氮)或-NH-。
在某些实施例中，杂环烷基含有5或6个环原子。在某些实施例中，杂环烷基包括但不限于氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、二噁烯基(dioxinyl)、硫代吗啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基和四氢呋喃基。
在本发明的上下文中，待评估的参数的减少或增加是指对应于该参数的值的至少5％的变化。更优选地，该值的减少或增加是指至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、或100％的变化。在后一种情况下，属于不再存在与参数相关联的可检测值的情况。
如该文献中所述的物质作为药物的用途也可以解释为所述物质在制备药物中的用途。类似地，每当物质用于治疗或作为药物时，它也可用于制备用于治疗的药物。
词语“约”或“近似”当与数值结合使用时(例如，约10)，优选地是指值可以是给定值(10)的±0.1％内(比该值多或少0.1％)。
根据本发明的化合物或组合物优选地用于本发明的方法或用途。
如本领域技术人员将理解的，在整个本申请中，术语“BNA”、“BNA支架”、“BNA核苷酸”、“BNA核苷”、“BNA修饰”或“BNA支架修饰”，在适当情况下，可以被构象限制的支架修饰、锁定支架修饰、锁定核苷酸(锁核苷酸)、锁定核苷(锁核苷)、锁定单体或Tm增强支架修饰、或高亲和力修饰等替换。
提供以下实例仅用于说明目的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1.
与基于SEQ ID NO：452的不具有BNA修饰的等序AON相比，在DMD患者(缺失外显子48-50)肌细胞培养物中实施5'和/或3'BNA支架修饰的核苷酸对AON诱导的DMD外显子51跳跃(A)和肌营养不良蛋白产生(B)的影响。在这种情况下的BNA修饰是LNA(图中显示的SEQID NO涉及其中所示的BNA支架修饰产生LNA单体的SEQ ID NO)。(A)：通过一式三份RNA样品的RT-ddPCR分析测定平均外显子51跳跃百分比，误差条表示标准偏差，AON(800nM或4μm)。(B)：通过简易Western毛细管免疫测定测量平均化学发光值(来自电泳图的曲线下面积(AUC))；从高到低蛋白质浓度为负载的HC＝健康对照肌肉样品，NT＝未处理样品，AON浓度800nM。
图2.
与基于SEQ ID NO：452的不具有BNA修饰的等序AON相比，在DMD患者(缺失外显子48-50)肌细胞培养物中实施5'和/或3'BNA支架修饰的核苷酸对AON诱导的DMD外显子51跳跃的影响。A中的BNA修饰是CRN(图中所示的SEQ ID NO：453C和455C涉及其中所示的BNA支架修饰产生CRN单体的SEQ ID NO：453和455)。B中的BNA修饰是2'-氨基-2'-脱氧LNA，在本申请中称为2'-氨基-LNA(图中所示的SEQ ID NO：456A涉及其中所示的BNA支架修饰产生2'-氨基-LNA单体的SEQ ID NO：456)。通过一式三份RNA样品的RT-ddPCR分析测定平均外显子51跳跃百分比，误差条表示标准偏差，AON浓度为800nM(B)或4μm(A，B)。
图3.
在IV治疗12周后(每周100mg/kg AON)，在hDMD小鼠模型中实施5'和/或3'BNA支架修饰的核苷酸对AON诱导的DMD外显子51跳跃的影响。在这种情况下的BNA修饰是LNA(图中显示的SEQ ID NO涉及其中所示的BNA支架修饰产生LNA单体的SEQ ID NO)。通过肌肉RNA样品的RT-ddPCR分析测定平均外显子51跳跃百分比。
图4.
与基于SEQ ID NO：452的不具有BNA修饰的等序AON相比，在DMD患者(缺失外显子48-50)肌细胞培养物中实施至少一种BNA支架修饰的核苷酸对AON诱导的DMD外显子51跳跃的影响(全部为800nM)。在这种情况下的BNA修饰产生LNA(图中所示的SEQ ID NO涉及其中所示的BNA支架修饰产生LNA单体的SEQ ID NO)。外显子51跳跃水平相对于SEQ ID NO：452的平均倍数增加是基于一式三份RNA样品的RT-ddPCR分析。
图5.
与不具有BNA支架修饰的等序AON(SEQ ID NO：26(外显子44)、SEQ ID NO：6049(外显子45)和SEQ ID NO：860(外显子53)相比，在健康人肌细胞中实施5'和3'BNA支架修饰的核苷酸对AON诱导的DMD外显子44跳跃(A，SEQ ID NO：29)，外显子45跳跃(B，SEQ ID NO：3185)和外显子53跳跃(C，SEQ ID NO：863)的影响。在这种情况下的BNA修饰产生LNA(图中所示的SEQ ID NO涉及其中所示的BNA支架修饰产生LNA单体的SEQ ID NO)。平均外显子跳跃百分比是通过RNA样品的RT-ddPCR分析(n＝6)测定，误差条表示标准偏差，AON(800nM或4μm)。
实例
实例1(体外)
材料与方法
AON
反义寡核苷酸(AON)(表1，图1-3)具有硫代磷酸酯骨架，其具有2'-O-甲基单体和LNA(SEQ ID NO：452、453、455和456)，或2'-氨基-LNA(SEQ ID NO：456A)或CRN(SEQ ID NO：453C和455C)支架修饰。具有SEQ ID NO：452的AON以胞嘧啶为特征，其他SEQ ID NO以5-甲基胞嘧啶为特征。2'-氨基-LNA是指支架修饰，有时也称为2'-氨基-2'-脱氧LNA。使用OP-10合成仪(GE/)，通过标准的亚磷酰胺方案，以10μmol的比例合成AON。将AON切割并以两步顺序(二乙胺，然后浓NH4OH处理)脱保护，用HPLC纯化并溶于水中，加入过量的NaCl以交换离子。蒸发后，将AON重新溶解在水中，通过FPLC脱盐并冻干。质谱法证实了所有AON的特性，并且发现纯度(通过UPLC测定)对于所有AON是可接受的(>80％)。
表1
A＝腺苷，G＝鸟嘌呤，U＝尿嘧啶，T＝胸腺嘧啶，C＝胞嘧啶，C＝5-甲基胞嘧啶，以及T＝BNA核苷酸；2OMe详述AON在所有非BNA单体中包含2'-O-甲基取代；PS详述AON仅包含硫代磷酸酯骨架连接
剥裸(自主，Gymnotic)吸收和cDNA合成
将来自缺失外显子48-50(Δ48-50)的DMD患者的永生化成肌细胞在6孔板中培养至汇合。为了诱导肌管的形成，根据非GLP标准操作步骤，用低血清分化培养基替换增殖培养基5天，补充800nM或4μm AON(一式三份)。然后分离总RNA，并使用随机六聚体引物将1000ng RNA用作cDNA合成的输入。
数字微滴(dd)PCR分析
设计特定的Taqman小沟结合物(MGB)测定以检测具有和不具有外显子51的肌营养不良蛋白转录物产物(表2)并且购自Applied Biosystems。根据制造商的说明书(BioRad)，使用60℃的退火/延伸温度，对1μl(对于非跳跃的转录物)或4μl(对于跳跃的转录物)cDNA的20μl反应体积进行数字微滴PCR分析。数据表示为外显子跳跃百分比[N0跳跃/(N0跳跃+N0非跳跃)*100]。
表2
简易Western毛细管免疫测定
在蛋白质上样缓冲液(具有蛋白酶抑制剂(Roche)的6％1.25M Tris-HCl pH 6.8，20％甘油，15％SDS，0.0016％溴酚蓝，5％β-巯基乙醇(所有都是Sigma))中提取总蛋白质。使用Compat-Able蛋白质测定制剂试剂组(Thermo scientific)和Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo scientific)测量蛋白质浓度。对于健康的人对照细胞样品，施用50、5或0.5μg/mL，对于DMD患者细胞样品，施用100、50或10μg/mL。根据制造商的方案，使用简易Western毛细管免疫测定(Protein Simple)和WES 66-440kDa Rabbit Master试剂盒(Protein Simple cat.#PSMK20)定量肌营养不良蛋白的蛋白水平。将WES板加载生物素化的ladder标记，样品，原代兔多克隆抗肌营养不良蛋白抗体(Abcam，cat.#ab15277,，在提供的抗体稀释液中1:50稀释)，用于ladder标记检测的链霉抗生物素蛋白-HRP，第二抗兔抗体，鲁米诺-过氧化物混合物和洗涤缓冲液(所有都提供在WES master试剂盒中)。将板在室温下以2500rpm离心5分钟，并与相应的毛细管装填盒(capillary catridge)一起装入WES设备中。进行测定后，使用Compass软件分析数据。
结果
当与不具有BNA支架修饰的核苷酸的等序AON(基于SEQ ID NO：452)相比时，在AON中实施至少一个5'和/或3'BNA支架修饰的核苷酸改善了外显子51跳跃水平。图1A显示了在体外DMD患者肌细胞中低(800nM)和高(4μm)浓度的三种AON(SEQ ID NO：453、NO：455和NO：456)的这种影响。在这种情况下的BNA支架修饰是LNA。与基于SEQ ID NO：452的不具有BNA支架修饰的AON相比，具有LNA核苷酸的AON诱导4至8倍的外显子51跳跃水平。这与肌营养不良蛋白水平的甚至更高的改善相关(对于SEQ ID NO：456高达20倍)(图1B)。在800nM和/或4μm下，与基于SEQ ID NO：452的不具有BNA支架修饰的AON相比，实施5'和/或3'CRN支架修饰(SEQ ID NO：453C和455C)或2'-氨基-LNA支架修饰的(SEQ ID NO：456A)核苷酸获得了类似的效果。
实例2(在体内)
材料与方法
AON
反义寡核苷酸(AON)(表1，图3)具有完整的硫代磷酸酯骨架，其在所有非BNA单体中具有2'-O-甲基取代，5-甲基胞嘧啶和BNA支架修饰产生LNA单体(SEQ ID NOs：453、455和456)。具有SEQ ID NO：452的对照AON具有硫代磷酸酯骨架，其具有2'-O-甲基单体，胞嘧啶，并且没有BNA支架修饰。使用OP-100合成仪(GE/Oligopilot)，通过标准的亚磷酰胺方案，以1mmol的比例合成AON。将AON切割并以两步顺序(二乙胺，然后浓NH4OH处理)脱保护，用阴离子交换色谱法纯化，通过超滤/渗滤脱盐，并冻干。质谱法证实了所有AON的特性，并且发现纯度(通过UPLC测定)对于所有AON是可接受的(>85％)。
小鼠实验
该小鼠实验根据国家卫生研究院(NIH)关于实验动物护理和使用的指南进行。通过JAX Labs(USA)对hDMD小鼠进行繁殖和基因分型。将小鼠随机分组(n＝15)，考虑基线体重和雄雌分布。小鼠每周接受1次100mg/kg具有SEQ ID NO：452、453、455或456的每种AON的静脉内尾静脉注射，并且从5-6周大时开始，总共12周(SEQ ID NO：452在这种情况下不包含任何BNA支架修饰)。最后一次AON注射后4天，处死动物并收集组织样品(用PBS经心脏灌注以从组织中除去血液)。将肌肉组织样品快速冷冻并储存在-80℃下。
RNA分离和cDNA合成
通过使用MagNA Lyser Green Beads(Roche)在MagNa Lyser中研磨，将组织在1mlRNA-Bee(Bio-Connect)中匀浆。基于制造商的说明书从匀浆中提取总RNA。对于cDNA合成，使用1000ng总RNA作为输入。根据制造商的说明书(Roche)，使用随机六聚体引物和Transcriptor反转录酶在20μl反应中产生cDNA，不同之处在于，在50℃下温育40分钟而不是在55℃下温育30分钟。
数字微滴PCR分析
设计特定的Taqman小沟结合物(MGB)测定(使用Primer Express 3.0.1软件；Applied Biosystems)以检测具有和不具有外显子51的肌营养不良蛋白转录物产物(表2)并且购自Applied Biosystems。根据制造商的说明书(BioRad)，使用60℃的退火/延伸温度，对2或4μl cDNA的20μl反应体积进行数字微滴PCR分析。数据表示为外显子跳跃百分比[N0跳跃/(N0跳跃+N0非跳跃)*100]。
结果
表达全长人肌营养不良蛋白的转基因hDMD小鼠允许在小鼠实验背景中体内筛选人特异性AON。注意，该模型不是肌营养不良蛋白缺乏型且没有肌肉病理学。因此，肌肉组织对AON的吸收通常低于mdx小鼠模型。在该实验中，将具有5'和/或3'BNA-支架修饰的核苷酸的三个AON(SEQ ID NO：453、455和456，使用LNA支架修饰)与不具有BNA支架修饰的核苷酸的等序AON(SEQ ID NO：452)在12周全身(IV)hDMD研究中进行比较。图3显示了与SEQ IDNO：452的AON相比，所有含LNA的AON的体内外显子51跳跃水平的改善，SEQ ID NO：455的AON高达8倍。
实例3(体外)
AON
本发明的反义寡核苷酸(AON)(表3，图4)包含完整的硫代磷酸酯骨架，其在所有非BNA单体中具有2'-O-甲基取代，5-甲基胞嘧啶和至少一个产生LNA单体的BNA支架修饰(SEQID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568)。具有SEQ ID NO：452的对照AON包含硫代磷酸酯骨架，其具有2'-O-甲基单体，胞嘧啶，并且没有BNA支架修饰。使用OP-10合成仪(GE/Oligopilot)，通过标准的亚磷酰胺方案，以5μmol的比例合成AON。将AON切割并以两步顺序(DEA，然后浓NH4OH处理)脱保护，用阴离子交换色谱法纯化，通过尺寸排阻色谱法脱盐，并冻干。质谱法证实了所有AON的特性，并且发现纯度(通过UPLC测定)对于所有AON是可接受的(>80％)。
表3
SEQ ID NO: 化学修饰 序列
452 2OMe/PS UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU
455 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCT
459 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG
4528 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG
4531 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG
4532 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG
4533 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAG
4535 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCT
4542 2OMe/PS/LNA TCAAGGAAGAUGGCAUUUCT
4548 2OMe/PS/LNA CAAGGAAGAUGGCAUUUCT
4568 2OMe/PS/LNA GGUAAGUUCUGUCCAAGC
A＝腺苷，G＝鸟嘌呤，U＝尿嘧啶，T＝胸腺嘧啶，C＝胞嘧啶，C＝5-甲基胞嘧啶，以及T＝LNA核苷酸；2OMe详述AON在所有非BNA单体中包含2'-O-甲基取代；PS详述AON仅包含硫代磷酸酯骨架连接
剥裸(Gymnotic)吸收和cDNA合成
将来自缺失外显子48-50(Δ48-50)的DMD患者的永生化成肌细胞在6孔板中培养至汇合。为了诱导肌管的形成，根据非GLP标准操作步骤，用低血清分化培养基替换增殖培养基7天，补充800nM AON(一式三份)。然后分离总RNA，并使用随机六聚体引物将1000ngRNA用作cDNA合成的输入。
数字微滴(dd)PCR分析
设计特定的Taqman小沟结合物(MGB)测定以检测具有和不具有外显子51的肌营养不良蛋白转录物产物(表2)并且购自Applied Biosystems。根据制造商的说明书(BioRad)，使用60℃的退火/延伸温度，对1μl(对于不具有外显子跳跃的转录物)或4μl(对于具有外显子跳跃的转录物)cDNA的20μl反应体积进行数字微滴PCR分析。数据表示为外显子跳跃百分比[N0跳跃/(N0跳跃+N0非跳跃)*100]。
结果
当与不具有BNA支架修饰的等序AON(基于SEQ ID NO：452)相比时，在AON中实施至少一个BNA支架修饰的核苷酸(产生LNA单体)改善了外显子51跳跃水平。图4显示了在体外DMD患者肌细胞中，在800nM浓度下10个AON(SEQ ID NO：455、459、4528、4531、4532、4533、4535、4542、4548和4568)的这种作用。与不具有BNA支架修饰的AON(SEQ ID NO：452)相比，具有LNA核苷酸的AON诱导10至40倍的外显子51跳跃水平。
实例4(体外)
材料与方法
AON
本发明的反义寡核苷酸(AON)(表4，图5)包含完整的硫代磷酸酯骨架，其具有2'-O-甲基取代，5-甲基胞嘧啶和至少一个产生LNA单体的BNA支架修饰(SEQ ID NOs：29、3185和863)。对照AON包含完整的硫代磷酸酯骨架，其仅具有2'-O-甲基取代的单体，5-甲基胞嘧啶，并且没有BNA支架修饰(SEQ ID NO：26、6049和860；对于SEQ ID NO：6049，这些修饰使得其与SEQ ID NO：6071相同)。使用OP-10合成仪(GE/Oligopilot)，通过标准的亚磷酰胺方案，以5μmol的比例合成AON。将AON切割并以两步顺序(DEA，然后浓NH4OH处理)脱保护，用阴离子交换色谱法纯化，通过尺寸排阻色谱法脱盐，并冻干。质谱法证实了所有AON的特性，并且发现纯度(通过UPLC测定)对于所有AON是可接受的(>80％)。
表4
SEQ ID NO: 化学修饰 序列
26 2OMe/PS UCAGCUUCUGUUAGCCACUG
29 2OMe/PS/LNA TCAGCUUCUGUUAGCCACUG
6049 2OMe/PS UUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUG
3185 2OMe/PS/LNA TUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUG
860 2OMe/PS GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC
863 2OMe/PS/LNA GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC
A＝腺苷，G＝鸟嘌呤，U＝尿嘧啶，T＝胸腺嘧啶，C＝5-甲基胞嘧啶，以及T＝LNA核苷酸；2OMe详述AON在所有非BNA单体中包含2'-O-甲基取代；PS详述AON仅包含硫代磷酸酯骨架连接
剥裸(Gymnotic)吸收和cDNA合成
将来自健康供体的永生化成肌细胞在12孔板中培养至汇合。为了诱导肌管的形成，根据非GLP标准操作步骤，用低血清分化培养基替换增殖培养基7天，补充800nM或4μMAON(n＝6)。然后分离总RNA，并使用随机六聚体引物将1000ng RNA用作cDNA合成的输入。
数字微滴(dd)PCR分析
设计特定的Taqman小沟结合物(MGB)测定以检测具有和不具有外显子44、45或53的肌营养不良蛋白转录物产物(表5)并且购自Applied Biosystems。根据制造商的说明书(BioRad)，使用60℃的退火/延伸温度，对1μl(对于不具有外显子跳跃的转录物)或4μl(对于具有外显子跳跃的转录物)cDNA的20μl反应体积进行数字微滴PCR分析。数据表示为外显子跳跃百分比[N0跳跃/(N0跳跃+N0非跳跃)*100]。
表5
结果
与不具有BNA支架修饰的等序AON相比，在靶向DMD外显子44，外显子45或外显子53的AON的5'和3'末端实施产生LNA单体的BNA支架修饰在体外健康人对照肌管中提高外显子跳跃水平2至3倍。图5显示了在低(800nM)和高(4μM)浓度下，三种AON(SEQ ID NO：29(靶向外显子44)，SEQ ID NO：3185(靶向外显子45)和SEQ ID NO：863(靶向外显子53)的这种作用。注意，健康人肌管中的外显子跳跃水平通常低于DMD患者肌细胞(如实例1中所用)。这可以通过健康肌细胞中AON诱导的外显子跳跃导致的框外转录物的无义介导的衰变(nonsense-mediated decay)来解释。
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Claims (15)

1.一种长度为10至33个核苷酸的寡核苷酸，其包含：
i)仅通过硫代磷酸酯骨架连接和/或磷酸二酯连接所连接的2'-取代的单体，
ii)5-甲基胞嘧啶碱基，以及
iii)至少一个包含双环核酸(BNA)支架修饰的单体，
其中所述寡核苷酸互补或结合或靶向或杂交于肌营养不良蛋白前体mRNA外显子2至78的至少一部分。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：6065-6070，优选SEQ ID NO：6067的至少一个核苷酸序列的至少10个且最多33个核苷酸的连续链段。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含1、2、3或4个包含双环核酸(BNA)支架修饰，优选桥接核酸支架修饰的单体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中，至少一个双环核酸(BNA)支架修饰包含在所述寡核苷酸的末端单体中，优选地在所述寡核苷酸的5'-末端单体中，更优选地在所述寡核苷酸的两个末端单体中。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中，每次出现的所述双环核酸(BNA)支架修饰产生的单体独立地选自由以下组成的群组：
锁核酸(LNA)单体、构象限制核苷酸(CRN)单体、xylo-LNA单体、α-L-LNA单体、β-D-LNA单体、2'-氨基-LNA单体、2'-(烷基氨基)-LNA单体、2'-(酰基氨基)-LNA单体、2'-N-取代-2'-氨基-LNA单体、(2'-O,4'-C)约束乙基(cEt)LNA单体、(2'-O,4'-C)约束甲氧基乙基(cMOE)BNA单体、2',4'-BNANC(N-H)单体、2',4'-BNANC(N-Me)单体、亚乙基桥接核酸(ENA)单体、2'-C-桥接双环核苷酸(CBBN)单体及其衍生物，
优选地选自由LNA单体、ENA单体、cEt BNA单体、氧代-CBBN单体、2'-氨基-LNA单体和cMOE BNA单体组成的群组，
更优选地选自由LNA单体、ENA单体、cEt BNA单体、或cMOE BNA单体组成的群组，
最优选地所述BNA支架修饰产生LNA单体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述2'-取代的单体是2'-取代的RNA单体、2'-F单体、2'-氨基单体、2'-O-取代的单体、2'-O-甲基单体、或2'-O-(2-甲氧基乙基)单体，优选地2'-O-甲基单体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中，所有胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶碱基，和/或其中所有尿嘧啶碱基是5-甲基尿嘧啶碱基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸的长度小于34个核苷酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含以下序列或由以下序列组成：互补或结合或靶向或杂交于外显子识别序列(ERS)、外显子剪接沉默子(ESS)、内含子剪接沉默子(ISS)、SR蛋白结合位点、或另一剪接元件、信号或结构的至少一部分的序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸诱导前体mRNA剪接调节，优选地所述前体mRNA剪接调节改变蛋白质的产生或组成，其优选地包含外显子跳跃或外显子保留，其中所述RNA调节最优选地包含外显子跳跃。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中，与不包含双环核酸(BNA)支架修饰的相应寡核苷酸相比，所述寡核苷酸具有改善的参数。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其中：
a)至少一个单体具有式I：
其中：
B是核碱基；
X是F、-NR1R2或-OR；
R是烯基或任选取代的烷基，其中任选的取代基当存在时是卤素、OR1、NR1R2或SR1；
R1是H、烷基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基，各自独立地任选地进一步被卤素、羟基或烷基取代；
R2是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点；
b)其中至少一个单体包含BNA支架修饰并具有式II：
其中：
B1是核碱基；
Z-Y是选自以下的二价基团：-(CH2)nO-、-C(CH2CH2)O-、-CH2WCH2-、-(CH2)nNR3-、-CH2S(Om)-、-CH(CH3)O-、-CH(CH2OCH3)O-、-CH2N(R3)O-、-CH2CH2-、-C(O)NR3-、-CH＝CHO-、-CH2SO2NR3-和-NHC(O)NH-；
n是1或2；
m是0、1或2；
W是O、S或NR3；
R3是H、-C(O)R4、-C(＝NH)NR5R5、苄基或任选取代的烷基，其中任选的取代基当存在时选自卤素和烷氧基；
R4是烷基、环烷基或芳基；
R5是H或烷基；以及
表示与寡核苷酸的其余部分的连接点。
13.一种包含如权利要求1至12中任一项所定义的寡核苷酸的组合物，优选地其中，所述组合物包含至少一种赋形剂，所述赋形剂可进一步有助于增强所述组合物和/或所述寡核苷酸靶向和/或递送至组织和/或细胞和/或进入组织和/或细胞中。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求13所述的组合物，其用作优选地用于治疗、预防和/或延迟杜氏肌营养不良症(DMD)的药物。
15.一种用于预防、治疗和/或延迟杜氏肌营养不良症(DMD)的方法，其包括向受试者施用如权利要求1至12中任一项所定义的寡核苷酸、或如权利要求13所定义的组合物。
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