KR20150131365A - 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 - Google Patents

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KR20150131365A
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커트 베이글
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미라젠 세러퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 이들 개개의 사용 방법 및 합성 방법을 더 제공한다.

Description

브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드{Bridged Bicyclic Nucleosides}
본 발명은 환자에게 투여될 때 합성, 효력, 전달 효과, 표적 특이성, 안정성, 및/또는 독성에서 이점을 가지는 변형된 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제를 위한 올리고뉴클레오티드 화학 패턴 또는 모티프는 억제제의 전달, 안정성, 효력, 특이성 및/또는 독성 프로파일을 개선시키는 잠재력을 가지며 이는 치료적 맥락에서 RNA 작용을 효과적으로 표적화하기 위하여 필요하다.
본 발명은 적어도 하나의 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드(CBBN)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 이런 올리고뉴클레오티드의 사용 방법 및 합성 방법뿐만 아니라 합성 중간체를 더 제공한다. 다양한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 효력, 전달 효과, 표적 특이성, 안정성, 및/또는 독성에서 이점을 제공하는 안티센스 억제제이다.
한 양태에서, 본 발명은 구조식 I을 가진 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드(CBBN)를 제공한다:
Figure pct00001
구조식 I
여기서 X는 N 또는 S이며; W1 및 W2는 독립적으로 H, 알코올 보호기, 포스페이트 에스터, 포스포로티오에이트 에스터, 다이- 또는 트라이-포스페이트 또는 포스포로아미다이트이며; W3는 독립적으로 없거나, H, O, 아민 보호기, 포스포로아미다이트, 포스포로아미데이트 에스터, 포스포로다이아미데이트 에스터, 메틸, 알킬, 사이클로알킬, 카복시아마이드, 당, 지방산 또는 본 발명에 기술된 다른 컨쥬게이트 분자, R이 아릴, 선형 또는 고리 알킬 또는 알켄일인 -C1 -4(O)R, 또는 -COOR, 당, 지방산, 또는 약물 컨쥬게이트와 같은 다른 분자 컨쥬게이트이며; B는 핵염기이다. 일부 실시태양에서, 핵염기는 피리미딘 염기이다. 다른 실시태양에서, 핵염기는 퓨린 염기이다.
다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 내에 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드의 숫자는 변할 수 있다. 예를 들어, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드의 숫자는 뉴클레오티드의 적어도 약 10%, 뉴클레오티드의 적어도 약 25%, 뉴클레오티드의 적어도 약 50%, 또는 뉴클레오티드의 적어도 약 75%일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 길이도 또한 변할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이 또는 약 10 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10개 뉴클레오티드 미만 길이(예를 들어, 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드) 또는 약 8개 뉴클레오티드 미만 길이(예를 들어, 약 5 내지 약 8개 뉴클레오티드)일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-플루오로 및 2' 내지 4' 브리지 구조로부터 선택된 2' 변형을 가진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합 및/또는 포스포로다이아미데이트 결합과 같은 주쇄 변형을 더 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 퓨린 및/또는 피리미딘 염기 변형을 포함한다. 예를 들어, 염기 변형은 피리미딘 염기의 C-5 위치 및/또는 퓨린 염기의 C-8 위치일 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 모르포리노 뉴클레오티드를 포함한다.
다양한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 인간 마이크로RNA의 뉴클레오티드 서열과 적어도 실질적으로 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 인간 miR-15a, miR-15b, miR-29, miR-92, miR-143, miR-145, miR-195, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-378, miR-451 및/또는 miR-499 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 인간 마이크로RNA의 뉴클레오티드 서열과 완전히 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드의 서열은 안티센스 억제에 의해 miRNA를 모방하거나 miRNA를 표적으로 하도록 설계될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 유효량의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 또는 리포솜을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 약학적 조성물은 수성 제제이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 mRNA 표적 또는 마이크로RNA 표적을 감소 또는 억제하는 것을 포함하여 안티센스 작용에 의해 RNA를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포를 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 단계를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 세포는 포유류 세포일 수 있다. 한 실시태양에서, 세포는, 예를 들어, 심장 세포일 수 있다. 다른 실시태양에서, 세포는 인비보 또는 엑스비보로 올리고뉴클레오티드와 접촉될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 miRNA를 표적화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여, 마이크로RNA와 관련되거나 이에 의해 매개된 피험자의 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 실시태양에서, 약학적 조성물은 표적 조직에 비경구 투여에 의해 또는 직접 주사에 의해 투여된다. 다른 실시태양에서, 약학적 조성물은 경구, 경피, 지속된 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 카테터 또는 설하 투여에 의해 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드 또는 상응하는 포스포로아미다이트 또는 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드-함유 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어, 출발 재료로서, 리보오스를 사용하고, 메틸 4,4-비스메실옥시메틸-2-하이드록시메틸퓨라노오스 유도체로 변환하고, 뒤이어 유도체의 글리코실화를 포함한다. 그런 후에 글리코실화 재료의 2-하이드록시메틸기는 보호된 아민으로 변환된 후 상응하는 4-메실옥시메틸기에 의해 뉴클레오시드의 알파면 상에서 고리를 형성하여 완전히 보호된 아자-바이사이클릭 뉴클레오시드를 생성하며 이는 표준 보호기 화학을 통해 뉴클레오시드 포스포아미다이트로 쉽게 전환된다. 선택적인 합성 방법은 전문이 참조로 본 발명에 포함된, 2014년 3월16일 출원된 "Synthesis of Bicyclic Nucleosides"라는 제목의 커트 베일의 미국 가특허 출원에 기술된다.
본 발명의 다른 양태 및 실시태양은 다음 상세한 설명과 실시예로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a-c는 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 합성을 예시한다.
도 2는 포스포로다이아미데이트 결합에 의해 연결된 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드를 예시한다.
도 3a는 예시적 다이메톡시트리틸(DMTr)-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 예시한다. 도 3b는 DMTr-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 내부 포스포아미다이트 유도체를 예시한다. 도 3c는 예시적 DMTr- 및 트라이플루오로아세테이트-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 예시한다. 도 3d는 예시적 DMTr-보호 지방산 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 예시한다. 도 3e는 예시적 DMTr-보호 당 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 예시한다.
도 4a는 예시적 다이메톡시트리틸(DMTr)-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트의 합성을 예시한다. 도 4b는 DMTr-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 내부 포스포아미다이트 유도체의 합성을 예시한다. 도 4c는 예시적 DMTr-보호 지방산 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트의 합성을 예시한다. 도 4d는 예시적 DMTr-보호 당 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트의 합성을 예시한다.
도 5a는 잠금 핵산(LNA), 이의 아미노LNA 대응물뿐만 아니라 O,4'-C-에틸렌-브리지드 뉴클레오시드(oxoENA) 및 이의 아미노ENA 대응물에 대한 친화력 증가(△Tm, c/변형)의 비교 도표를 제공한다. 도 5b는 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드(aminoCBBN)와 이의 oxoCBBN 대응물에 대한 친화력 증가(△Tm, c/변형)의 비교 도표를 제공한다. 도시된 대로, 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드는 이의 oxoCBBN 대응물보다 변형당 훨씬 더 많은 친화력을 부여한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 내의 단일 및 다중 aminoCBBN 변형은 LNA 뉴클레오시드의 친화력과 동일하거나 더 큰 친화력을 부여한다.
도 6은 이중-루시페라제 리포터 분석법에서 측정된 miR-208a 발현에 대한 다양한 miR-208a 억제제의 효과를 나타낸다. 화합물 M-10591, M-10101, M-11919, 및 M-11920의 활성이 측정된다. 화합물 M-10591은 비-표적 대조군이다. 화합물 M-10101, 혼합 9 LNA/7 DNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 최적화된 miR208a 억제제이다. M10101 화합물은 전문이 참조로 본 발명에 포함된, 미국특허 No. 8,642,751에 기술된다. 화합물 M-10919 및 M-11920은 혼합 LNA/DNA/aminoCBBN 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이며 모체 화합물(M-10101)의 LNA 티미딘들이 각각 1 또는 2 aminoCBBN 잔기로 대체된다. 도시된 대로, 여러 LNA 잔기가 aminoCBBN 잔기로 대체되는 화합물 M-11920은 최적 M-10101 화합물의 모든 활성을 보유한다.
본 발명은 적어도 하나의 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 변형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 이런 올리고뉴클레오티드에 대한 사용 방법 및 합성 방법을 더 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 합성, 효력, 전달 효과, 표적 특이성, 안정성, 및/또는 독성에서 이점을 제공할 수 있다. 한 예시적 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리간드 및/또는 약물 화합물을 아민과 같은 브리징 모이어티에 부착함으로써 세포 또는 조직을 표적화하는데 이점을 제공하는 새로운 컨쥬게이션 전략을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 효능, 안정성 및/또는 독성에서 치료 이점을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 구조식 I을 가진 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드(CBBN)를 제공한다:
Figure pct00002
구조식 I
여기서 X는 N 또는 S이다. 한 실시태양에서, X는 N이다. 다른 실시태양에서, X는 S이다.
다양한 실시태양에서, W1 및 W2는 독립적으로 H, 알코올 보호기, 포스페이트 에스터, 포스포로티오에이트 에스터, 다이- 또는 트라이-포스페이트 또는 포스포로아미다이트이며; W3는 독립적으로 없거나, H, O, 아민 보호기, 포스포로아미다이트, 포스포로아미데이트 에스터, 포스포로다이아미데이트 에스터, 메틸, 알킬, 사이클로알킬, 카복시아마이드, 당, 지방산 또는 본 발명에 기술된 다른 컨쥬게이트 분자, R이 아릴, 선형 또는 고리 알킬 또는 알켄일인 -C1 -4(O)R, 또는 -COOR, 당, 지방산, 또는 약물 컨쥬게이트와 같은 다른 분자 컨쥬게이트이다.
다양한 실시태양에서, 알코올 보호기는 4,4'-다이메톡시트리틸, 아세틸, 실릴, 또는 산 불안정성 에터로부터 선택된다. 한 실시태양에서, W1 및 W2는 각각 4,4'-다이메톡시트리티일, 아세틸, 실릴, 또는 산 불안정성 에터로부터 선택된 알코올 보호기이다. 다양한 실시태양에서, 아민 보호기는 카보벤질옥시(Cbz), p-메톡시벤질 카본일(Moz 또는 MeOZ), tert-부틸옥시카본일(BOC), 9-플루오렌일메틸옥시카본일(FMOC), 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 벤질(Bn), 트라이플루오로아세틸(tfa)이다. 한 실시태양에서, W3는 카복시벤질, tert-부톡시카본일 또는 트라이플루오로아세트아미딜로부터 선택된 아민 보호기이다.
다양한 실시태양에서, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드는 2'-데옥시-2'-C, 4'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드(2'-CBBN)이다.
다양한 실시태양에서, 옥소-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드는 2'-데옥시-2'-C, 4'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드이며, 2'C 및 4'C는 산소를 통해 연결되어 3개의 원자 결합(-C-O-C-)을 형성한다(oxoCBBN).
다양한 실시태양에서, 아미노-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 또는 아자-2'-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드는 2'-데옥시-2'-C, 4'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드이며, 2'C 및 4'C는 질소를 통해 연결되어 3개의 원자 결합(-C-N-C-)을 형성한다(aminoCBBN).
다양한 실시태양에서, 티오-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드는 2'-데옥시-2'-C, 4'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드이며, 2'C 및 4'C는 황을 통해 연결되어 3개의 원자 결합(-C-S-C-)을 형성한다(thioCBBN).
다양한 실시태양에서, 아미노-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드 및 티오-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 각각 아미노-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 및 티오-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 포스포에스터이다.
다양한 실시태양에서, 잠금 뉴클레오시드는 뉴클레오시드의 리보오스 고리의 2' 및 4' 위치 사이에 2개 원자 결합을 가진 2'-옥소-4'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드(LNA)이다. 중심 당은 2.5-다이옥사바이사이클로[2.2.1]헵테인 구조를 형성한다.
다양한 실시태양에서, ENA 및 옥소ENA는 뉴클레오시드의 리보오스 고리의 2' 및 4' 위치 사이에 3개 원자 결합을 가진 2'-옥소-4'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드이다. 중심 당은 2.6-다이옥사바이사이클로[3.2.1]옥테인 구조를 형성한다.
다양한 실시태양에서, 아미노ENA 및 아자ENA는 뉴클레오시드의 리보오스 고리의 2' 및 4' 위치 사이에 3개 원자 결합을 가진 2'-아자-4'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드이다. 중심 당은 6-아자-2-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인 구조를 형성한다.
다양한 실시태양에서, B는 핵염기이다. 핵염기 또는 염기는 변형될 수 있는 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 한 실시태양에서, 핵염기는 퓨린 염기이다. 다른 실시태양에서, 핵염기는 피리미딘 염기이다. 다양한 실시태양에서, 핵염기는 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민 및 시토신 또는 이의 유도체 또는 치환체와 같은 자연 핵염기로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명은 비 자연적으로 발생하는 핵염기의 사용을 고려한다. 특정 실시태양에서, 비 자연적으로 발생하는 핵염기는 핵염기의 고리 원자들 중 임의의 것이 다른 원자로 대체되는 염기일 수 있다. 예를 들어, CH는 N으로 대체될 수 있고 그 반대일 수 있다. 이런 변형은 하나 이상의 위치에서 일어날 수 있다. 비 자연적으로 발생하는 염기의 다른 예는 자연적으로 발생하는 염기의 2- 및 4-치환체가 역전되는 염기이다. 추가 퓨린 및/또는 피리미딘 염기 변형은 전문이 참조로 본 발명에 포함된 WO 2012/061810에 기술된다. 일부 실시태양에서, 염기 변형은 카복사미노, 카바모일 또는 카바미드기와 같은 아미노 카본일이다. 다양한 실시태양에서 변형은 하나 이상의 피리미딘 염기의 C-5 위치 및/또는 하나 이상의 퓨린 염기의 C-8 위치이다. 예시적 핵염기는 9-N-아데닌, 9-N-구아닌, 티미딘, 시티딘, 우리딘, 5-메틸-시토신, 이노신, 5-치환 우리딘, 5-치환 시토신, 2-아미노아데노신 또는 5-메틸시토신을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 전문이 참조로 포함된 WO 2012/083005 및 미국특허 공개공보 No. 2013/0345288에 기술된 잠금 뉴클레오티드로서 위치될 수 있다. 예를 들어, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드의 숫자와 위치는 올리고뉴클레오티드가 높은 효율로 miR-15a, miR-15b, miR-208a, miR-208b, 및/또는 miR-499 활성을 감소 또는 억제하는 것일 수 있다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 4개 초과 또는 3개 초과 또는 2개 초과의 연속된 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 가진 일련의 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 2개 초과의 연속된 비 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 가진 일련의 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 연속된 비 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드의 단지 1회 출현될 수 있다. 예시적 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 정확하게 9개 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드 및 7개 비-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 가진다. 예를 들어, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드의 패턴은 적어도 위치 1, 6, 10, 13 및 15가 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 특정 실시태양에서, 적어도 위치 1, 5, 10, 및 16은 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이다. 특정 실시태양에서, 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15 및 16은 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이며 나머지 위치는 비-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이다. 다른 실시태양에서, 위치 1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 15 및 16은 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이며 나머지 위치는 비-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시태양에서, 위치 1, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 14 및 16은 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이며 나머지 위치는 비-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이다. 비-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 비-잠금 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이, 약 8 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 10 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 12 내지 약 16개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 5 내지 약 8개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 8개 뉴클레오티드 길이, 약 9개 뉴클레오티드 길이, 약 10개 뉴클레오티드 길이, 약 11개 뉴클레오티드 길이, 약 12개 뉴클레오티드 길이, 약 13개 뉴클레오티드 길이, 약 14개 뉴클레오티드 길이, 약 15개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 16개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 16개 뉴클레오티드 이하 길이, 약 12개 뉴클레오티드 이하 길이, 약 10개 뉴클레오티드 이하 길이, 또는 약 8개 뉴클레오티드 이하 길이이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적어도 1, 적어도 3, 적어도 5 또는 적어도 7개 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단지 1, 2 또는 3개 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시태양에서, 뉴클레오티드의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 100%가 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드이다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드로 완전히 구성되지 않는다. 예를 들어, 이 단락에서 기술된 실시태양은 아미노 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DNA- 또는 RNA-기초일 수 있고 및/또는 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄 또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 단위와 같은 하나 이상의 핵산 변형을 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 유도체는 하나 이상의 단일 가닥 및/또는 하나 이상의 이중 가닥 영역을 자리 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 리보자임일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전문이 참조로 본 발명에 포함된 WO 2012/061810에 기술된 대로 퓨린 및/또는 피리미딘 염기 변형을 가진 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 염기 변형은 일반적으로 카복사미노, 카바모일 또는 카바미드기와 같은 아미노 카본일이다. 다양한 실시태양에서 변형은 하나 이상의 피리미딘 염기의 C-5 위치 및/또는 하나 이상의 퓨린 염기의 C-8 위치이다.
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 변형을 가진 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 본 발명에 사용된 용어 "2' 변형"은 OH 이외의 임의의 2' 그룹을 포함한다. 일부 실시태양에서, 2' 변형은 (치환될 수 있는) O-알킬, 할로, 데옥시(H) 및 2' 내지 4' 메톡시 브리지드 뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 2' 변형은 O-메틸 및 플루오르로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 퓨린 뉴클레오티드는 각각 2'OMe를 가지며 피리미딘 뉴클레오티드는 각각 2'F를 가진다. 특정 실시태양에서, 1 내지 약 5개의 2'위치, 또는 약 1 내지 약 3개의 2'위치는 변형되지 않은 상태로 (예를 들어, 2'하이드록실로) 남는다.
본 발명에 따른 2'변형은 또한 소수의 탄화수소 치환기들을 포함한다. 탄화수소 치환기는 알킬, 알켄일, 알카인일, 및 알콕시알킬을 포함하며, 여기서 알킬 (알콕시의 알킬 부분 포함), 알켄일 및 알카인일은 치환되거나 또는 비치환될 수 있다. 알킬, 알켄일, 및 알카인일은 C1, C2 또는 C3과 같은 C1 내지 C10 알킬, 알켄일 또는 알카인일일 수 있다. 탄화수소 치환기는 한 개 또는 두 개 또는 세 개의 비-탄소 원자를 포함할 수 있으며, N, O, 및/또는 S로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 2' 변형은 O-알킬, O-알켄일, 및 O-알카인일과 같은 알킬, 알켄일, 및 알카인일을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 예시적인 2' 변형은 2'-O-알킬(2'OMe 또는 2'OEt와 같은 C1-3 알킬), 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모, 및 2'-아이오도와 같은 적어도 하나의 2'-할로 변형(예를 들어, 2'하이드록실 대신에)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 2'할로 변형은 플루오로이다. 올리고뉴클레오티드는 1 내지 약 5개의 2'-할로 변형(예를 들어, 플루오로), 또는 1 내지 약 3개의 2'-할로 변형(예를 들어, 플루오로)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 비-2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드 위치에서 모두 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시태양에서, 2'-플루오로기는 독립적으로 다이-, 트라이-, 또는 비-메틸화된다.
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'-데옥시 변형(예를 들어, 2'하이드록실의 경우 H)을 가질 수 있으며, 일부 실시태양들에서, 약 1 내지 약 10개의 2'-데옥시 변형을 함유한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 모두가 전체로써 본 발명에 참조로 포함된 미국특허 6,268,490, 미국특허 6,316,198, 미국특허 6,403,566, 미국특허 6,770,748, 미국특허 6,998,484, 미국특허 6,670,461, 및 미국특허 7,034,133에서 기술된 대로, 적어도 하나의 잠금 뉴클레오티드(LNA)를 더 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 아래 구조식 A로 나타낸 구조를 가진 하나 이상의 LNA를 함유한다. 선택적으로 또는 추가로, 올리고뉴클레오티드는 구조식 B로 나타낸 구조를 가진 하나 이상의 LNA를 함유할 수 있다.
Figure pct00003
본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 포함될 수 있는 다른 적절한 잠금 뉴클레오티드는 미국특허 6,403,566 및 미국특허 6,833,361에 서술된 것을 포함하며, 이들 모두는 전체로써 본 발명에 참조로 포함된다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 변형 또는 "캡"을 추가로 포함한다. 캡은 5' 및/또는 3'-캡 구조일 수 있다. 용어 "캡" 또는 "말단-캡"은 (말단 리보뉴클레오티드에 대한) 올리고뉴클레오티드의 양쪽 말단에서 화학 변형을 포함하며 5'말단 상의 마지막 두 개의 뉴클레오티드 및 3'말단 상의 마지막 두 개의 뉴클레오티드 사이의 결합에서 변형을 포함한다. 본 발명에서 서술된 캡 구조는 RNA 표적 또는 세포 기관과의 분자 상호작용을 손상시키지 않고 올리고뉴클레오티드의 엑소뉴클레아제에 대한 저항성을 증가시킨다. 이러한 변형들은 이들의 증가된 인비트로 또는 인비보 효력을 기반으로 선택될 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡) 또는 3'-말단 (3'-캡)에서 또는 양쪽 말단 모두에서 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 5'- 및/또는 3'-캡은 포스포로티오에이트 모노포스페이트, 무염기 잔기 (모이어티), 포스포로티오에이트 결합, 4'-티오 뉴클레오티드, 카보사이클릭 뉴클레오티드, 포스포로다이티오에이트 결합, 반전된 뉴클레오티드(inverted nucleotide) 또는 반전된 무염기 모이어티(inverted abasic mioety)(2'-3'또는 3'-3'), 포스포로다이티오에이트 모노포스페이트, 및 메틸포스포네이트 모이어티로부터 독립적으로 선택된다. 포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트 결합(들)은, 캡 구조의 일부인 경우, 일반적으로 5'말단 상의 두 개의 말단 뉴클레오티드 및 3'말단 상의 두 개의 말단 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 포스포로티오에이트 모노포스페이트를 가진다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 올리고뉴클레오티드의 5'및/또는 3'말단에 있을 수 있다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 아래에 서술된 B가 염기이고, R이 2' 변형인 다음 구조에 의해 정의된다:
Figure pct00004
포스포로티오에이트 결합은 5'및 3' 말단 상의 마지막 2개의 뉴클레오티드들(예를 들어, 캡 구조의 일부로서) 사이에 존재할 수 있거나 포스포다이에스터 결합과 교대로 존재할 수 있다. 이런 실시태양 또는 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 5'및 3'말단 중 하나 또는 모두에서 적어도 하나의 말단 무염기 잔기를 포함할 수 있다. 무염기 모이어티는 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민과 같은 일반적으로 인정되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기를 포함하지 않는다. 따라서 이러한 무염기 모이어티는 뉴클레오티드 염기가 부족하거나 또는 1'위치에서 다른 비-뉴클레오티드 염기 화학 그룹을 가진다. 예를 들어, 무염기 뉴클레오티드는 역 무염기 뉴클레오티드(reverse abasic nucleotide)일 수 있으며, 예를 들어, 역 무염기 포스포아미다이트는 (3'아미다이트 대신) 5'아미다이트를 통해 결합되고 5'-5'포스페이트 결합을 초래한다. 폴리뉴클레오티드의 5'및 3'말단에 대한 역 무염기 뉴클레오시드의 구조가 아래에 도시된다.
Figure pct00005
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다. 포스포로티오에이트 결합은 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 절단(cleavage)에 대해 보다 저항성으로 만들기 위해 사용되었다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 부분적으로 포스포로티오에이트 결합될 수 있거나, 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합은 포스포다이에스터 결합과 번갈아 올 수 있다. 그러나, 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 완전히 포스포로티오에이트 결합된다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 1개 내지 약 5개 또는 약 1개 내지 약 3개 포스페이트 결합을 가진다. 추가 실시태양에서, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합된다.
또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 포스페이트 결합을 포함할 수 있다. 예시적 변형 포스페이트 결합은 아래 구조식 II 및 III으로 도시된다:
Figure pct00006
구조식 II
Figure pct00007
구조식 III
도시된 대로, R1 및 R2는 독립적으로 H, 알킬, 알켄일, 옥소 아릴, 벤질, 할로겐, -OH, -NH2, 알콕시, 알코올 보호기, 또는 아미노 보호기 및, 구조식 II에 대해, LNA 또는 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드와 같은 바이사이클릭 결합으로부터 선택된다. X 및 Y는 독립적으로 H, O, S, -CO2H, 알킬, 알켄일, 아릴, 벤질 카복실레이트, -N(알킬)2, -N(알켄일)2, -N(아릴)2, -N(벤질)2, -NH2, -BH2 또는 보레이트 에스터로부터 선택된다. B는 변형될 수 있는 퓨린 또는 피리미딘 염기와 같은 독립적으로 선택된 핵염기일 수 있다. 도시된 대로, 폴리뉴클레오티드는 (도 2에 도시된 대로) 부분적으로 포스포로다이아미다이트 결합될 수 있다. 그러나, 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 완전히 포스포로다이아미다이트 결합된다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 5개 또는 1 내지 3개 포스페이트 결합을 가진다. 다른 실시태양에서, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 (구조식 II 및 III에 도시된 대로) 변형 포스페이트 결합에 의해 모두 결합된다.
또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 모르폴리노 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 모르폴리노 뉴클레오티드는 아래 구조식 IV에 예시된 대로 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드에 결합될 수 있다.
Figure pct00008
구조식 IV
구조식 IV에 도시된 대로, R1은 독립적으로 H, 알킬, 알켄일, 옥소 아릴, 벤질, 할로겐, -OH, -NH2, 알콕시, 알코올 보호기, 또는 아미노 보호기로부터 선택된다. X 및 Y는 독립적으로 H, O, S, -CO2H, 알킬, 알켄일, 아릴, 벤질 카복실레이트, -N(알킬)2, -N(알켄일)2, -N(아릴)2, -N(벤질)2, -NH2, -BH2 또는 보레이트 에스터로부터 선택된다. B는 변형될 수 있는 퓨린 또는 피리미딘 염기와 같은 독립적으로 선택된 핵염기일 수 있다.
본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드는 mRNA 또는 miRNA를 포함하는 RNA 분자를 억제하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 아래 표 1에 나열된 성숙한 miRNA와 같은 성숙한 miRNA를 모방하거나 표적화하기 위한 염기 서열을 가진다. 올리고뉴클레오티드는 이런 또는 다른 실시태양에서, pre- 또는 pri-miRNA 형태를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 인간 miRNA 서열의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 인간 miRNA 서열의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일하다. 예시적 올리고뉴클레오티드는 아래 표 1에 나열된 성숙한 miRNA와 같은 성숙한 miRNA를 표적화하도록 적어도 부분적으로 상보적이다(즉, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 95%, 또는 100% 상보적)이다. 이런 안티센스 및 센스 서열은, 예를 들어, 스템 및 루프 부분을 함유하는 shRNA 또는 다른 RNA 구조 속에 포함될 수 있다. 이런 서열은, 다른 것들 중에서, 심장비대, 심근경색, 심부전(예를 들어, 울혈성 심부전), 혈관 손상, 및/또는 병적 심장 섬유증을 치료 또는 완화하기 위해 miRNA 기능을 모방하거나 표적화하는데 유용하다. 예시적 miRNA 치료 용도가 아래 표 2에 나열된 US 및 PCT 특허 참조문헌에 개시되며, 이의 각각은 전문이 본 발명에 참조로 포함된다. miRNA의 성숙한 및 선처리 형태가 아래 나열된 특허 참조문헌에 개시되며, 이런 설명은 또한 참조로 본 발명에 포함된다.
miRNA miRNA 서열 참조문헌
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miRNA 조절 방향 증상 참조문헌
miR-208a/miR-208b/miR-499 길항제 병적 심비대, 심근 경색, 심부전 WO 2008/016924 (208a)
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miR-208a/miR-208b 길항제 신진대사 이상(비만, 고지혈증, 당뇨, 신진대사 증후군, 고콜레스테롤혈증; 지방간) PCT/US2012/059349
miR-15/miR-16/miR-195 길항제 병적 심비대, 심근 경색, 심부전 WO 2009/062169
miR-29 효현제 조직 섬유증(심장, 폐, 간, 신장) WO 2009/018493
miR-29 길항제 경화반을 섬유화 조직으로 전환하는 전섬유화제 WO 2009/018493
miR-126 효현제 혈관생성, 혈관 무결성 및 혈관 복구를 촉진 WO 2010/019574
miR-126 길항제 병적 신혈관신생 WO 2010/019574
miR-206 효현제 근육 손상 WO 2007/070483
miR-206/miR-1 효현제 신경병증 상태 마비(ALS, 척수 손상, 중증근육무력증) WO 2009/117418
miR-143 효현제 재협착/신내막 형성 WO 2009/105759
miR-1/miR-133 효현제/길항제 근육 손상(다른 시간에 조합하여 사용된 각 miRNA의 길항제/효현제) WO 2007/070483
miR-451 길항제 다혈구증 WO 2012/148373
miR-451 효현제 빈혈 WO 2012/148373
miR-378/miR-378* 길항제 신진대사 이상(비만, 고지혈증, 당뇨, 신진대사 증후군, 고콜레스테롤혈증; 지방간);
병적 심비대, 심근 경색, 심부전		 WO 2011/153542
miR-92 길항제 혈관생성 및 혈관 복구를 촉진한다 US 2010/0324118 A1
miR-92 효현제 종양 혈관생성 억제 US 2010/0324118 A1
miR-34a 길항제 심근 경색 US 2012/0238619 A1
miR-145 길항제 폐동맥 고혈압 WO 2012/153135
miR-33 길항제 스타틴-유도 간독성, 담즙 정체, 증가하는 HDL 콜레스테롤 US 20110281933 A1
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miR-15a 또는 b, miR-29, miR-92, miR-143, miR-145, miR-195, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-378, miR-451 및/또는 miR-499의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 예시적 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 인간 miR-208a, miR-208b, miR-378, miR-451 및/또는 miR-499 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 인간 miR-208a, miR-208b, miR-378, miR-451 및/또는 miR-499 서열과 실질적으로 동일하다. 본 발명에 사용된 "실질적으로 상보적인" 또는 "실질적으로 동일한"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 적어도 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적이거나 동일한 서열을 의미한다.
본 발명은 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드, 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드 또는 상응하는 포스포로아미다이트 또는 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드-함유 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어, 출발 재료로서, 리보오스를 사용하고, 메틸 4,4-비스메실옥시메틸-2-하이드록시메틸퓨라노오스 유도체로 변환하고, 뒤이어 유도체의 글리코실화를 포함한다. 그런 후에 글리코실화 재료의 2-하이드록시메틸기는 보호된 아민으로 변환된 후 상응하는 4-메실옥시메틸기에 의해 뉴클레오시드의 알파면 상에서 고리를 형성하여 완전히 보호된 아자-바이사이클릭 뉴클레오시드를 생성하며 이는 표준 보호기 화학을 통해 뉴클레오시드 포스포아미다이트로 쉽게 전환된다. 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드에 대한 예시적 합성 계획이 본 발명에 도시된다. 선택적인 합성 방법은 전문이 참조로 본 발명에 포함된, 2014년 3월16일 출원된 "Synthesis of Bicyclic Nucleosides"라는 제목의 커트 베일의 미국 가특허 출원에 기술된다.
고체상 합성에 의해, 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성이 주지되어 있고 전문이 참조로 본 발명에 포함된, Caruthers et al., "New Chemical Methods for Synthesizing Polynucleotides," Nucleic Acids Symp. Ser., (7):215-23 (1980)에 의해 재검토된다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 사용한 선택된 뉴클레오티드 모노머(들)에 따라 변할 것이다. 예시적 실시태양에서, 합성에 사용된 뉴클레오티드 모노머는 다이메톡시트리틸(DMTr)-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트, DMTr-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 내부 포스포아미다이트 유도체, DMTr- 및 트라이플루오로아세테이트-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트, DMTr-보호 지방산 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트 및 DMTr-보호 당 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다(각각 도 3a-3e 참조). 특정 실시태양에서, 연장된 결합 시간이 다이메톡시트리틸(DMTr)-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트, DMTr- 및 트라이플루오로아세테이트-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트, DMTr-보호 지방산 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트 및 DMTr-보호 당 컨쥬게이트 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성에 필요할 수 있다. 특정 실시태양에서, DMTr-보호 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 내부 포스포아미다이트 유도체를 필요로 하는 올리고뉴클레오티드 합성의 경우, 표준 올리고뉴클레오티드 합성 사이클은 Ac2O/염기를 사용하는 일반적인 캐핑 시약(capping reagent)을 비-표적 캐핑 시약으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 선택적으로, 합성은 포스포아미다이트 결합 사이클 직후이나 표준 캐핑 단계 이전에 합성 사이클에 안정한 아민 반응성 컨쥬게이트 또는 보호기로 새롭게 결합된 올리고뉴클레오티드를 처리함으로써 변형될 수 있다(그러나 바람직한 경우, 나중에 제거될 수 있다).
올리고뉴클레오티드는 다양한 고분자 어셈블리 또는 조성물 내에 포함될 수 있다. 전달을 위한 이러한 복합체는 다양한 리포솜, 나노입자, 및 미셀을 포함할 수 있으며 환자로의 전달을 위해 제제화된다. 복합체는 세포막 침투를 개시하기 위해 하나 이상의 융합 유도성(fusogenic) 또는 친유성(lipophilic) 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분자들은 예를 들어, 미국특허 7,404,969 및 미국특허 7,202,227에서 서술되며, 그 전체가 본 발명에 참조로서 포함된다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 참조로서 포함된 WO 2010/129672에 기술된 것과 같은 세포 전달을 보조하기 위한 펜던트 친유성 그룹을 더 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 하나를 포함하는 다수의 치료적 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5개 miRNA 억제제를 사용할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다양한 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 약학적 조성물은 의도된 사용에 적합한 형태로 제조될 것이다. 일반적으로, 이는 발열원(pyrogens) 뿐만 아니라 인간 또는 동물에 해로울 수 있는 다른 불순물이 없는 조성물의 제조를 필요로 할 것이다. 예시적인 전달/제제 시스템은 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 상업적으로 구입가능한 본 발명의 핵산을 심장 및 골격 근육 조직으로 전달하기에 적합한 지방 에멀전은 Intralipid®, Liposyn®, Liposyn®II, Liposyn®III, Nutrilipid, 및 다른 유사한 지질 에멀전을 포함한다. 인비보 전달 비히클로 사용하기 위한 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜(즉, 인공 막소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 예시적인 제제가 그 전체로 본 발명에 참조로서 포함되는 US 특허 5,981,505; US 특허 6,217,900; US 특허 6,383,512; US 특허 5,783,565; US 특허 7,202,227; US 특허 6,379,965; US 특허 6,127,170; US 특허 5,837,533; US 특허 6,747,014; 및 WO 2003/093449에서 개시된다.
약학적 조성물 및 제제는 전달 비히클을 안정하게 만들고 표적 세포에 의해 흡수될 수 있도록 적절한 염 및 완충액을 사용할 수 있다. 본 발명의 수성 조성물은 억제제 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 리포솜 또는 다른 복합체)를 포함하는 유효량의 전달 비히클을 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에서 용해되거나 또는 분산된다. "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약리학적으로 허용 가능한"은 동물 또는 인간에게 투여된 경우 해롭거나, 알러지이거나, 또는 다른 부반응들을 나타내지 않는 분자 또는 조성물을 말한다. 본 발명에서 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 인간에게 투여하기에 적합한 의약과 같은 의약을 제제화하는데 사용하기에 적합한 하나 이상의 용매, 완충액, 용액, 분산매, 코팅, 항균성 및 항진균성 물질, 등장성 및 흡수 지연 물질 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질들을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 보조적인 활성 성분들이 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 또는 전달은 표적 조직이 그 경로를 통해 이용할 수 있는 한 임의의 경로를 통할 수 있다. 예를 들어, 투여는 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사, 또는 표적 조직(예를 들어, 심장 조직) 내로의 직접 주사에 의할 수 있다. 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드의 안정성 및/또는 효력은 피하, 피내 및 근육내를 포함하는 편리한 투여 경로를 고려한다. 또한 miRNA 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 카테터 시스템 또는 치료 물질을 심장으로 전달하기 위해 관상 순환을 격리시키는 시스템에 의해 투여될 수 있다. 치료 물질을 심장 및 관상 맥관구조로 전달하기 위한 다양한 카테터 시스템은 당업계에 알려져 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 카테터-기반 전달 방법 또는 관상 격리 방법의 일부 비 제한적인 예들은 그 전체가 본 발명에 참조로서 포함되는 미국특허 6,416,510; 미국특허 6,716,196; 미국특허 6,953,466, WO 2005/082440, WO 2006/089340, 미국특허공보 2007/0203445, 미국특허공보 2006/0148742, 및 미국특허공보 2007/0060907에 개시된다.
또한 조성물 또는 제제는 비경구 또는 복막내로 투여될 수 있다. 예로써, 유리 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로써의 콘주게이트의 용액은 물에서 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합하여 제조될 수 있다. 또한 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서 이들 제제들은 미생물의 성장을 막기 위해 일반적으로 방부제를 포함한다.
주사 용도 또는 카테터 전달에 적합한 약학적 형태는 예를 들어, 살균 수성 용액 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말 를 포함한다. 일반적으로 이들 제제는 살균되며 쉬게 주입할 수 있을 정도로 유동성이다. 제제는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며 세균 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대비하여 보관되어야 한다. 적합한 용매 또는 분산매는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물 오일을 포함할 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등의 다양한 항균 및 항진균 물질에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에서 사용하여 이루어질 수 있다.
살균 주사 용액은 적절한 양의 컨주게이트를 용매에 원하는 임의의 다른 성분(예를 들어, 상기에서 열거한 것)과 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균 활성 성분들을 기본적인 분산매와 원하는 다른 성분들, 예를 들어 앞에서 열거한 것들을 포함하는 살균 비히클에 혼합함으로써 제조된다. 살균 주사 용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 상기 살균-여과된 용액으로부터 어떠한 추가적으로 요구되는 성분들을 더한 활성 성분(들)의 파우더를 생산하는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다.
제제화 시에, 용액들은 바람직하게는 투약 제제에 적합한 방식 및 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 제제는 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약 형태로 쉽게 투여될 수 있다. 수용액에서 비경구적 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 일반적으로 적절하게 완충되고, 액상 희석액은 먼저 예를 들어 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성을 만든다. 이러한 수용액은 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특히 본 명세서의 관점에서, 당업계의 통상적인 기술을 가진자에게 이미 알려진 바대로 살균 수성 매질이 사용된다. 예로써, 단일 복용량은 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해되고 1000ml의 피하주액 유체(hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나 또는 예정된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참조). 치료받는 대상의 질환에 따라 용량의 일부 변화는 필연적으로 생기게 된다. 투여에 대해 책임을 지는 사람은 어떤 일이 있어도 개개의 대상을 위한 적합한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여에 있어, 제형들은 FDA 생물학 기준 사무국에 의해 요구되는 살균성, 발열원성, 일반 안전 및 순도 기준을 만족해야만 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 RNA 발현 또는 활성을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 이런 실시태양에서, 이 방법은 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드(또는 이의 약학적 조성물)를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 올리고뉴클레오티드는 세포에 의해 발현된 RNA 전사체에 혼성화된다(예를 들어, 적어도 실질적으로 상보적이다). 일부 실시태양에서, RNA는 mRNA 또는 miRNA이다.
다른 양태에서, 본 발명은 RNA 또는 이의 발현과 관련되거나 이에 의해 매개된 피험자의 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, RNA는 mRNA 또는 miRNA이다. 본 발명에 따른 예방 또는 치료 방법은 유효량의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 필요로 한다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드를 (예를 들어, 본 발명에 기술된 조성물 또는 제제의 일부로서) 포유동물 세포로 전달하는 방법, 및 포유류 환자에서 질환의 진행을 치료, 경감, 또는 예방하는 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물은 표적 세포(예를 들어, 포유류 세포)와 인 비트로 또는 인 비보로 접촉될 수 있다. 세포는 심장 세포일 수 있다.
본 방법은 일반적으로 동일한 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 포유류 환자 또는 집단의 표적 세포들에게 투여하는 단계를 포함한다. 이미 서술된대로 올리고뉴클레오티드는 (예를 들어, miRNA의 발현 또는 활성을 억제하도록 디자인된 뉴클레오티드 서열을 가진) miRNA 억제제이다. 예를 들어, miRNA 억제제가 miR-208 패밀리 miRNA의 억제제인 경우, 환자는 miR-208 패밀리 발현과 관련된, 매개된 또는 이로부터 초래된 질환을 가질 수 있다. 이런 질환은, 예를 들어, 심장비대, 심근경색, 심부전(예를 들어, 울혈성 심부전), 혈관 손상, 혈관재협착(restenosis), 또는 병적 심장 섬유증, 암 또는 표 2에 나열된 특허공개공보에 기술된 이상을 포함하는 다른 miRNA 관련 이상을 포함한다. 따라서, 본 발명은 이러한 질환을 치료하기 위한, 및 이러한 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 용도를 제공한다.
특정 실시태양에서, 환자(예를 들어, 인간 환자)는, 예를 들어, 오래된 조절되지 않는 고혈압(long standing uncontrolled hypertension), 고쳐지지 않는 심장판막증(uncorrected valvular disease), 만성 협심증(chronic angina), 새로운 심근경색(recent myocardial infarction), 울혈성 심부전, 심장 질병에 대한 선천적인 소인 및 병적 비대증(pathological hypertrophy)을 포함하는 하나 이상의 위험 인자를 가진다. 선택적으로 또는 추가적으로, 환자는 예를 들어, 심장 비대에 대한 유전적 소인을 가진 것으로, 또는 예를 들어, 심장 비대의 가족력을 가지는 것으로 진단될 수 있다.
이런 양태에서, 본 발명은 심부전 또는 심장 비대를 가진 환자에서 증가된 운동 능력, 감소된 입원, 더 나은 삶의 질, 감소된 이환률 및/또는 감소된 사망률을 제공할 수 있다.
특정 실시태양에서, 심장 조직에서 마이크로RNA의 활성 또는 환자 혈청에서 측정된 마이크로RNA의 활성은 감소되거나 억제된다.
다양한 실시태양에서, 약학적 조성물은 비경구 투여에 의해 또는 심장 조직에 직접 주사에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내, 피하 또는 근육내일 수 있다. 일부 실시태양에서, 조성물은 경구, 경피, 지속된 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 카테터 또는 설하 투여에 의해 투여된다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 50mg/kg 이하의 복용량, 약 25mg/kg 이하의 복용량, 약 10mg/kg 이하의 복용량, 또는 약 5mg/kg 이하의 복용량으로 투여된다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 치료 후 miRNA 억제제의 제거 또는 청소를 더 포함한다. 예를 들어, 억제제에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드는 억제제의 기능을 약화 또는 정지시키기 위해 치료 후 투여될 수 있다.
표 1 및 2의 참조문헌을 포함하는 본 발명에 인용된 모든 참조문헌은 모든 목적이 참조로 본 발명에 포함된다.
실시예
실시예 1: 2'-C- 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드의 생산
이 실시예는 아민 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드의 생산을 위한 주요 중간체의 예시적 합성을 기술한다(도 1 참조).
메틸 -D-리보오스(2)
3개의 500mL 배양병(Schott Bottle)에 D-리보오스(1) (90 g, 599 mmol), 암베릴스트 15 (H+) (90 g, 599 mmol), 및 동일하게 나뉜(즉, 각 배양병에 30g씩) 분자 트랩 팩 (90 g, 599 mmol)을 첨가하였다. 각 병에 동일한 양의 메탄올(부피: 1350 ml, 즉. 450 mL/bottle)을 채워서 무색 용액을 생성하였다. 모든 병을 17시간 동안 오비탈 교반기 @250rpm/25℃에 놓았다. 반응 과정은 전개 용액으로서 15% MeOH/DCM에 보호되지 않은 리보오스에 의한 공동-스팟(co-spot)과 비교된 반응 혼합물의 TLC에 의해 관찰하였다. 당을 숯불에 의해 하네시안 균주(Hannessian's Stain)를 통해 시각화하였다.
용액을 유리 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 촉매와 분자 트랩 팩을 과량의 MeOH(30g의 암베릴스트 및 트랩 팩을 함유한 ~500mL/Bottle)으로 세척하였다. 메탄올을 용액을 15mL의 TEA (5 mL/reaction bottle)를 첨가하여 염기성으로 만들었다. 혼합물을 농축하여 건조하였다. 잔여물을 다이클로로메테인(3 x 200 mL)으로 공동 증발시켜 잔여 MeOH를 공비혼합물로 만들었다. 잔여물을 밤새 고진공하에서 건조시켜 97.55g(99%)의 메틸-D-리보오스(2)를 생성하였고 추가 정제 없이 사용하였다.
메틸 5-O-( TBDPS )-α,β-D- 리보퓨라노시드 (3)
1L 둥근 바닥 플라스크에 메틸-D-리보오스(2, 60.12 g, 366 mmol) 및 DIEA (128 ml, 732 mmol)를 DMF(부피: 400ml)에 용해하여 무색 용액을 생성하였다. 플라스크를 아르곤으로 세척하고 아이스 바스에서 0℃로 냉각하였다. TBDPS-Cl (99 ml, 385 mmol)를 10분 동안 적하하여 첨가하고 혼합물을 밤새 실온에 도달하게 하였다.
반응 혼합물을 포화 NaHCO3 (1 L)의 용액 속에 부었다. 수성상을 EtOAc (3 x 300mL)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 물(1 x 400 mL)과 염수(1 x 400 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축하여 어두운 갈색 오일을 생성하였고 4개의 동일한 분량으로 나누고 100mL/min에서 75분 동안 표준 0-100% EtOAc/Hex 농도구배를 흘리고 뒤이어 @100% EtOAc 7분 고정에 의한 실리카 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 순수한 부분을 혼합하여 무색 오일로서 121.59g(82%)의 메틸 5-O-(TBDPS)-α,β-D-리보퓨라노시드(3)를 생성하였다.
메틸 5-O-( TBDPS )-2,3-O-비스(4- 클로로벤질 )-α,β-D- 리보퓨라노시드 (4)
2L 둥근 바닥 플라스크에 메틸 5-O-(TBDPS)-α,β-D-리보퓨라노시드(3, 55.0 g, 137 mmol)를 계량하였다. 재료를 40℃와 고진공에서 톨루엔(2 x 100 mL)으로 공동 증발시켰다. 플라스크에 환류 응축기를 장착하고 출발 재료를 톨루엔(부피: 500mL) 속 아르곤 하에서 용해하였다. 수소화나트륨(21.86 g, 547 mmol)을 ~5g 분량으로 첨가하여 회색 현탁액을 생성하였다. 혼합물을 60℃에서 30분 동안 가열한 후 아이스 바스로 실온으로 냉각하였다. 1-클로로-4-(클로로메틸)벤젠(66.0 g, 410 mmol)을 격렬히 교반하면서 ~15g 분량으로 첨가하였다. 혼합물을 가열하고 환류하에서 밤새 교반하였다.
반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 500mL의 EtOAc로 희석하였다. 혼합물을 EtOH (50 mL)의 느린 첨가로 급랭하여 공기 발생을 최소화하였다. 혼합물을 EtOAc로 1.5L로 더 희석하고 10% Na2CO3 (2 x 500 mL) 및 sat NaCl (1 x 500 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축하였다. 미정제 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 생성물을 0-30% EtOAc/헥세인 농도구배로 용출하였다. 순수한 수집된 부분을 혼합하여 황색 오일로서 메틸 5-O-(TBDPS)-2,3-O-비스(4-클로로벤질)-α,β-D-리보퓨라노시드(4, 62.15 g, 70%)를 생성하였다.
메틸 5-O-( TBDPS )-3-O-(4- 클로로벤질 )-α-D- 리보퓨라노시드 (5)
1L 둥근 플라스크에 메틸 5-O-(TBDPS)-2,3-O-비스(4-클로로벤질)-α,β-D-리보퓨라노시드(4, 65g, 100mmol)를 600mL DCM에 용해하여 노란색 용액을 생성하였다. 혼합물을 아르곤 하에서 0℃로 냉각하였다. 염화주석(IV)(150 ml, 150 mmol)을 10분 동안 천천히 첨가하면서 용액을 깨끗한, 어두운 갈색 용액을 변했다. 반응 혼합물을 교반하면서 아르곤 하에서 4℃에서 밤새 저장하였다.
반응 혼합물을 DCM (250 mL)으로 희석하고 4L 분별깔때기에 500mL의 DI 물에 첨가하였다. 혼합물을 격렬하게 흔들고 분리시켰다. 모든 유기 및 에멀젼/침전물을 유지하고 제 2 분취량의 500mL 물로 세척하였다. 모든 유기 및 에멀젼/침전물을 유지하고 500mL의 물속 10% Na2CO3로 세척하였다. 에멀젼을 MeOH의 첨가와 기계적 교반을 통해 환원시켰다. 모든 유기 및 에멀젼/침전물을 유지하고 최종적으로 500mL 염수로 세척하였다. 다시, 에멀젼을 MeOH의 첨가와 기계적 교반을 통해 환원시켰다. 유기상을 제거하고 MgSO4 현탁액을 통해 건조시켰다. 잔여 에멀젼 및 수성상을 MgSO4 현탁액과 혼합된 추가 DCM (2 x 100 mL)으로 추출하였다. 유기상을 여과하고 갈색 오일로 농축하였다. 미정제 생성물을 0-30% EtOAc/헥세인 농도구배를 가진 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 순수한 수집된 부분을 혼합하여 황색 오일로서 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-α-D-리보퓨라노시드(5, 41.20g, 78%)를 생성하였다.
메틸 5-O-( TBDPS )-3-O-(4- 클로로벤질 )-2-옥소-α-D- 리보퓨라노시드 (6)
1L 둥근 바닥 플라스크에 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-α-D-리보퓨라노시드(5, 41.00g, 78mmol) 및 TEMPO (1.215 g, 7.78 mmol)를 DCM(부피: 250ml)에 용해하여 유기 용액을 생성하였다. 아이도벤젠 다이아세테이트(37.6 g, 117 mmol)를 첨가하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다.
반응 혼합물을 DCM으로 500mL로 희석하고 포화 소듐 티오설페이트 용액(2x300mL) 및 염수(1x300mL)로 세척하였다. 유기상을 Mg2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축하였다. 유기 잔여물을 고진공 하에서 50℃로 3시간 동안 건조하였다. 황색 오일로서 미정제 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-2-옥소-α-D-리보퓨라노시드(6, 40.50, "99%")를 후속 반응에 사용하였다.
메틸 5-O-( TBDPS )-3-O-(4- 클로로벤질 )-2- 데옥시 -2-메틸렌-α-D- 리보퓨라노시드 (7)
2000mL 둥근 바닥 플라스크에 메틸트라이페닐포스포늄 브로마이드(6, 26.6 g, 75 mmol)를 에터(비: 20.00, 부피: 1500 ml)에 현탁하여 백색 현탁액을 생성하였다. 플라스크를 아르곤으로 세척하고 아이스 바스에서 0℃로 냉각하였다. 소듐 t-펜톡사이드(7.39 g, 67 mmol)를 벤젠(비: 1.000, 부피: 75 ml)에 용해하고 현탁액에 한 번에 첨가하였다. 플라스크를 다시 아르곤으로 세척하고 2시간 동안 실온에 도달하게 하였다. 현탁액을 추가로 4시간 동안 교반하였다. 그런 후에 현탁액을 아세톤/드라이 아이스 바스에 -72℃로 냉각하였다. 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-2-옥소-α-D-리보퓨라노시드(19.56 g, 37.25 mmol)를 추가 에터(비: 1.067, 부피: 40 ml)에 용해하였다. 탄수화물 용액을 주사기를 통해 첨가하고 반응 혼합물을 4℃에서 17시간 동안 교반하였다.
TLC는 반응이 완료되었다는 것을 나타내었다(15% EtOAc/Hex). 반응 혼합물을 sat NH4Cl (2 x 500 mL) 및 염수 (1 x 250 mL)로 세척하였다. 수성상을 에터(150mL)로 재추출하였다. 유기상을 혼합하고 염수 세척(1 x 250 mL)과 Na2SO4의 첨가로 건조시켰다. 유기상을 여과하고 농축하였다. 헥세인 속 0-20% EtOAc 농도구배를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제를 실행하였다. 순수한 부분을 혼합하고 농축하여 건조시켜 무색 오일로서 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-메틸렌-α-D-리보퓨라노시드(7, 14.79 g, 28.3 mmol, 76 % 수율)를 생성하였다.
메틸 5-O-( TBDPS )-3-O-(4- 클로로벤질 )-2- 데옥시 -2-α- 하이드록시메틸 -α-D-리보퓨라노시드(8)
아르곤 하에서, 9-BBN(8.97 g, 73.5 mmol)을 실온에서 THF(300ml) 속 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-메틸렌-α-D-리보퓨라노시드(7, 28.50 g, 54.5 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, TLC는 모든 출발 재료가 소비되었다는 것을 나타내었다.
소듐 퍼보레이트 테트라하이드레이트(33.9 g, 221 mmol) 및 물(80 mL)을 첨가하고 혼합물을 추가 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 유기상을 분리하고, 수성상을 400mL로 희석한 후 에틸 아세테이트(3x250mL)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 MgSO4 위에서 건조하였다. 용매를 제거하고, 생성물을 0-60%의 에틸 아세테이트/헥세인 농도구배로 용출하는 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 부분을 혼합하고 농축하여 건조시켜 무색 오일로서 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-하이드록시메틸-α-D-리보퓨라노시드(8, 26.39 g, 48.8 mmol, 90 % 수율)를 생성하였다.
메틸 3-O-(4- 클로로벤질 )-2- 데옥시 -2-α-(4,4'- 다이메톡시트라이틸옥시메틸 ) -α-D- 리보퓨라노시드 (10)
1L 둥근 바닥 플라스크에 피리딘(200ml) 속 메틸 5-O-(TBDPS)-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-하이드록시메틸-α-D-리보퓨라노시드(8, 26.30 g, 48.6 mmol)를 아르곤 하에서 용해하여 무색 용액을 생성하였다. DMTr-Cl(20.58 g, 60.8 mmol)를 한 번에 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 트라이틸레이션(trytrilation) 반응을 20분 동안 교반하면서 50mL의 MeOH 첨가로 급랭하고 혼합물을 EtOAc로 750mL로 희석하였다. 유기상을 포화 NaHCO3 용액 (3 x 350 mL) 및 염수 (1 x 150 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축시켜 건조하였다.
미정제 생성물(9)을 THF(부피:70ml)에 용해하였다. THF 속 1.0M TBAF(72.9 ml, 72.9 mmol)을 혼합물에 첨가하고 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. TBAF의 첨가로 어둡고, 뿌연 색의 용액을 생성하였다. 혼합물을 농축하여 건조하고 헥세인 속 3% TEA로 선처리된 330g ISCO 실리카 컬럼에 도포하였다. 생성물을 50 minutes @100 mL/min 동안 헥세인 속 0-60% EtOAc 농도구배로 용출하였다. 순수한 부분을 혼합하고 농축하여 무색 오일로서 메틸 3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시메틸)-α-D-리보퓨라노시드(10, 27.17 g, 44.9 mmol, 92 % 수율)을 생성하였다.
메틸 5-옥소-3-O-(4- 클로로벤질 )-2- 데옥시 -2-α-(4,4'- 다이메톡시트라이틸옥시메틸 ) -α-D- 리보퓨라노시드 (11)
1L 둥근 바닥 플라스크에 메틸 3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시메틸)-α-D-리보퓨라노시드(10, 27.15g, 44.9mmol) 및 DCC(27.8g, 135mmol)를 DMSO(166 ml, 2333 mmol)에 용해하여 무색 용액을 생성하였다. 피리딘 (5.44 ml, 67.3 mmol) 및 TFA (1.728 ml, 22.43 mmol)를 40mL의 DMSO에 혼합하였고 최종 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 플라스크를 덮고 실온에서 밤새 교반하였다.
물(25mL)을 첨가하고 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응물을 500mL EtOAc로 희석하고 여과하였다. 침전물을 추가 200mL의 EtOAc로 세척하였다. 혼합된 유기상을 염수(5 x 400 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 생성물을 0-100% EtOAc/Hex 농도구배를 가진 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 순수한 부분을 혼합하고 농축하여 백색 거품으로서 메틸 5-옥소-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시메틸)-α-D-리보퓨라노시드(11, 25.22 g, 41.8 mmol, 93 % 수율)를 생성하였다.
메틸 4-C- 하이드록시메틸 -3-O-(4- 클로로벤질 )-2- 데옥시 -2-α-(4,4'- 다이메톡시트라이틸옥시메틸 ) -α-D- 리보퓨라노시드 (12)
2L 둥근 바닥 플라스크에 메틸 5-옥소-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시메틸)-α-D-리보퓨라노시드(11, 25.20 g, 41.8 mmol)를 다이옥세인(1000 ml)에 용해하여 무색 용액을 생성하였다. 포름알데하이드(249 ml, 3343 mmol)를 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 아이스 바스에서 0℃로 냉각하였다. 플라스크에 750mL 압력 균일 강하 깔때기를 장착하고 2.0M 수산화나트륨(606 ml, 1212 mmol)을 30분 동안 첨가하여 뿌연 백색 용액을 생성하였다. 혼합물을 교반하면서 42시간 동안 실온에 도달하게 하였다. 용액은 투명하게 변했다. 용액을 인산나트륨, 일염기, 일수화물(86g, 627mmol)의 첨가로 중화시켰다. 용액을 부피의 약 1/3로 농축하고 500mL의 물로 희석하고 DCM (3 x 300 mL)으로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 염수(1 x 300 mL)로 세척한 후 Na2SO4위에서 건조하였다. 용매를 제거하고 생성물을 0-10%의 MeOH/DCM 농도구배로 용출하는 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 부분을 혼합하고 농축하여 건조시켜 무색 오일로서 메틸 4-C-하이드록시메틸-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시메틸)-α-D-리보퓨라노시드(12, 22.50 g, 35.4 mmol, 85 % 수율)를 생성하였다.
메틸 5-O-메실-4-C-( 메실옥시메틸 )-3-O-(4- 클로로벤질 )-2- 데옥시 -2-α-( 하이드록시메틸 )-α-D- 리보퓨라노시드 (14)
1L 둥근 바닥 플라스크에 메틸 4-C-하이드록시메틸-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시메틸)-α-D-리보퓨라노시드(12, 22.50 g, 35.4 mmol)를 아르곤 하에서 피리딘(200ml)에 용해시켜 무색 용액을 생성하였다. 혼합물을 아이스 바스에서 0℃로 냉각하였다. 메실-Cl(8.28 ml, 106 mmol)을 10분 동안 적하하여 교반하는 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 메실화 반응을 0℃로 냉각하여 급랭하고 15mL의 물을 20분 동안 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 750mL로 희석하고 염수 (3 x 400 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축시켜 건조하였다.
미정제 생성물(13)을 800mL의 AcOH에 용해하였다. 물(200mL)을 교반하는 용액에 첨가하였다. 용액을 2.5시간 동안 실온에서 교반한 후 500mL의 물로 희석하였다. 혼합물을 약 400mL로 농축하고 추가 250mL의 물로 희석하였다. 용액을 고진공하에서 농축하여 건조시켰다. 잔여물을 220g ISCO 실리카 컬럼에 도포하고 생성물을 0-100% EtOAc/헥세인 농도구배로 용출하였다. 순수한 부분을 혼합하고 농축하여 건조시켜 무색 오일로서 메틸 5-O-메실-4-C-(메실옥시메틸)-3-O-(4-클로로벤질)-2-데옥시-2-α-(하이드록시메틸)-α-D-리보퓨라노시드(14, 10.01 g, 20.47 mmol, 57.8 % 수율)를 생성하였다.
((2S,3R,4S)-2- 아세톡시 -4-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-5,5-비스((( 메틸설폰일 ) 옥 시) 메틸 ) 테트라하이드로퓨란 -3-일) 메틸 아세테이트(16)
((3S,4R,5S)-3-((4-클로로벤질)옥시)-4-(하이드록시메틸)-5-메톡시테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(3.41 g, 6.97 mmol)을 교반 막대를 구비하고 격막 밀봉된 100mL 둥근 바닥 플라스크 속에 계량하였다. 플라스크를 0℃로 냉각하고 피리딘(부피:25ml)과 무수 아세트산(1.316 ml, 13.95 mmol)으로 채웠다. 혼합물을 6시간 동안 실온에 도달하게 하였다. 혼합물을 0℃로 냉각하고 MeOH (1 mL)을 첨가하고 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하여 건조하고 EtOAc (100 mL)에 재용해하였다. 유기상을 수성 1% HCl (50 mL), 포화 중탄산나트륨 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축시켜 건조하였다.
최종 오일을 100mL 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (9.98 ml, 174 mmol) 및 무수 아세트산 (2.63 ml, 27.9 mmol)로 재용해하였다. H2SO4 (0.037 ml, 0.697 mmol)를 첨가하고 플라스크를 격벽 밀봉하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 물(100 mL)로 희석하고 EtOAc (3 x 75 mL)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 포화 중탄산나트륨 (2x100 mL) 및 염수 (1x100 mL)로 조심스럽게 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축시켜 건조하여 추가 정제 없이 사용된 옅은 노란색 오일로서 3.15g의 미정제 ((2S,3R,4S)-2-아세톡시-4-((4-클로로벤질)옥시)-5,5-비스(((메틸설폰일)옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)메틸 아세테이트(3.15g, 5.64 mmol, 81 % 수율)를 생성하였다.
ESI-MS: 617 (M + 아세테이트)-
((3R,4S)-4-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-2-( 티미딘 -일)5,5-비스((( 메틸설폰일 ) 옥시 )메틸) 테트라하이드로퓨란 -3-일) 메틸 아세테이트(17)
N,O-비스(트라이메틸실릴)아세트아마이드 (4.07 ml, 16.64 mmol)를 무수 아세토나이트릴(20ml) 속 ((3R,4S)-2-아세톡시-4-((4-클로로벤질)옥시)-5,5-비스(((메틸설폰일)옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)메틸 아세테이트 (3.10 g, 5.55 mmol) 및 티민 (0.874 g, 6.93 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 재환류하여 투명한 용액을 생성하였다. 용액을 40℃로 냉각하고 TMS-OTf (1.303 ml, 7.21 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 4시간 동안 60℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각하고, CH2Cl2 (100 mL)로 희석하고 포화 NaHCO3 (2 x 100 mL) 및 염수 (1 x 100mL)로 세척하였다. 유기상을 건조하고(Na2SO4), 감압하에서 농축하고, 잔여물을 표준 바이오티지 아이소레라 농도구배(standard Biotage Isolera gradient) (0-10% v/v MeOH/CH2Cl2) 상의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체 재료로서 ((3R,4S)-4-((4-클로로벤질)옥시)-2-(티미딘-일)5,5-비스(((메틸설폰일)옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)메틸 아세테이트(2.84 g, 4.54 mmol, 82 % 수율)를 얻었다.
ESI-MS: 624 (M)-
((3R,4S)-3-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-4-( 하이드록시메틸 )-5-( 티미딘 -일) 테트라하이드로퓨란 -2,2- 다이일 ) 비스 (메틸렌) 다이메테인설포네이트 (19)
교반 막대가 장착된 100mL 둥근 바닥 플라스크에 ((3R,4S)-4-((4-클로로벤질)옥시)-2-(티미딘-일)-5,5-비스(((메틸설폰일)옥시)메틸)테트라하이드로퓨란-3-일)메틸 아세테이트 (2.84 g, 4.54 mmol)를 메탄올(부피: 20ml)에 용해하였다. 소듐 메톡사이드(0.123 g, 2.272 mmol)를 첨가하고 플라스크를 덮고 실온에서 밤새 교반하였다. TLC (100% EtOAc)는 반응이 완료되었다는 것을 나타내었다. 반응 혼합물을 진공하에서 증발시켜 건조하였고 25g 바이오티지 SNAP 컬럼에 장착된 3g 바이오티지 샘플렛에 직접 도포하였다. 생성물을 40-100% EtOAc/Hex 농도구배로 용출하여 백색 거품으로 ((3R,4S)-3-((4-클로로벤질)옥시)-4-(하이드록시메틸)-5-(티미딘-일)테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(2.32 g, 3.98 mmol, 88 % 수율)를 새성하였다.
ESI-MS: 582 (M)-
((3R,4S)-5-( 티미딘 -일)-3-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-4-( 하이드록시메틸 ) 테트라하이드로퓨란 -2,2- 다이일 )비스(메틸렌) 다이메테인설포네이트 (20)
((3R,4S)-3-((4-클로로벤질)옥시)-4-(하이드록시메틸)-5-(티미딘-일)테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(1.0 g, 1.715 mmol) 및 피리딘(10ml)의 혼합물에 TMS-Cl (0.219 ml, 1.715 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 1시간 교반 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 염화 벤조일(0.199 ml, 1.715 mmol)을 주사기로 적하하여 첨가하였다. 그런 후에 아이스-바스를 제거하고 반응 혼합물을 48시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응물을 물(2mL)을 첨가하여 급랭하고; 실온에서 15분 동안 교반 후, 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석하고 수성 5% HCl (2 x 25 mL), 포화 NaHCO3 (1 x 25 mL) 및 염수 (1 x 25 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 진공하에서 농축시켜 건조하였다. 잔여물을 25g 바이오티지 SNAP 컬럼에 장착된 최소 DCM을 가진 3g 바이오티지 샘플렛에 도포하였다. 원하는 생성물을 40-100% EtOAc/Hex 농도구배로 용출하여 백색 거품으로 ((3R,4S)-5-(3-벤조일-5-메틸-2,4-다이옥소-3,4-다이하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3-((4-클로로벤질)옥시)-4-(하이드록시메틸)테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(0.87g, 1.266mmol, 73.8% 수율)를 생성하였다.
티미딘의 N-벤조일 보호는 3:2 비로 2개의 C-5 메틸 싱글렛과 2개의 C-6 프로톤 싱글렛을 발생시키는 부분입체이성질체 혼합물을 생성한다. α-아노머의 경우:
1H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ7.89 (s, 1H, 부분입체이성질체 1), 7.87 (d, J = 1.3 Hz, 1H, 부분입체이성질체 2), 7.67 - 7.60 (m, 1H), 7.60 - 7.39 (m, 3H), 7.39 - 7.17 (m, 5H), 6.02 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.67 - 4.46 (m, 3H), 4.42 - 4.26 (m, 5H), 3.87 - 3.73 (m, 2H), 3.02 (s, 3H), 2.98 (s, 2H), 2.82 (p, J = 6.5 Hz, 1H), 2.03 (s, 3H, 부분입체이성질체 1), 1.94 (s, 3H, 부분입체이성질체 2).
((3S,4R,5R)-4-((( tert - 부톡시 -(2,2,2- 트라이플루오로에톡시 ) 다이카본일 )아미노) 메틸 )-3-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-5-(3- 벤조일 - 티미딘 -일) 테트라하이드로퓨란 -2,2-일)비스(메틸렌) 다이메테인설포네이트 (21)
교반 막대가 장착된 20mL 살균 섬광 바이알(scintillation vial)에 ((3S,4R)-5-(3-벤조일-티미딘-일)-3-((4-클로로벤질)옥시)-4-(하이드록시메틸)테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(0.25g, 0.364 mmol), (2,2,2-트라이플루오로에틸)-tert-부틸-이미노다이카보네이트(0.088g, 0.364mmol), 및 트라이페닐포스핀(0.095g, 0.364mmol)을 계량하였다. 바이알에 THF(부피: 4 ml) 및 DIAD를 채우고 THF 속 1.0M 용액(0.364 ml, 0.364 mmol)을 적하하여 첨가하였다. 밤새 교반 후, 반응 혼합물을 진공하에서 농축하여 건조하고 25g 바이오티지 SNAP 컬럼에 도포하였다. 생성물을 40-100% EtOAc/헥세인 농도구배로 용출하여 백색 거품으로 ((3S,4R,5R)-4-(((tert-부톡시-(2,2,2-트라이플루오로에톡시)다이카본일)아미노)메틸)-3-((4-클로로벤질)옥시)-5-(3-벤조일-티미딘-일)테트라하이드로퓨란-2,2-일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(0.228g, 0.25mmol, 68.7% 수율)를 생성하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ7.94 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.15 (s, 1H), 5.99 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.49 (qd, J = 8.3, 3.4 Hz, 2H), 4.41 - 4.24 (m, 6H), 3.94 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.20 - 3.05 (m, 1H), 2.98 (s, 2H), 2.97 (s, 4H), 1.92 (s, 3H), 1.46 (s, 9H). ESI-MS: 971 (M + 아세테이트)-
((3S,4R,5R)-4-((( tert - 부톡시카본일 )아미노) 메틸 )-3-((4- 클로로벤질 ) 옥시 -5-(티미딘-일) 테트라하이드로퓨란 -2,2- 다이일 )비스(메틸렌) 다이메테인설포네이트 (22)
자석 교반 막대를 구비한 20mL 스크루 캡 섬광 바이알에 ((3S,4R,5R)-4-(((tert-부톡시-(2,2,2-트라이플루오로에톡시)다이카본일)아미노)메틸-3-((4-클로로벤질)옥시)-5-(3-벤조일-티미딘-일)테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(125 mg, 0.137 mmol)를 계량하였다. 바이알에 THF(부피: 1.5 ml) 및 물속 2.0M LiOH(1.507ml, 3.01mmol)를 채우고, 덮고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (7 mL)로 희석하고 포화 중탄산나트륨(1 x 5 mL) 및 염수 (1 x 5 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 진공하에서 농축시켜 건조시켜 후속 반응에서 미정제로 사용하기에 충분히 순수한 옅은 백색 거품으로 ((3S,4R,5R)-4-(((tert-부톡시카본일)아미노)메틸)-3-((4-클로로벤질)옥시-5-(티미딘-일)테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(80 mg, 0.117 mmol, 86 % 수율)를 생성하였다.
1H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ8.61 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.13 (s, 1H), 6.04 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 4.74 - 4.64 (m, 1H), 4.59 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.50 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.40 - 4.23 (m, 6H), 4.00 - 3.89 (m, 1H), 3.44 (dd, J = 13.6, 6.7 Hz, 1H), 3.17 (ddd, J = 14.3, 8.4, 5.8 Hz, 1H), 3.09 (s, 3H), 3.00 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.32 (s, 9H). ESI-MS: 681 (M)-
(1R,5R,7R,8S)- tert -부틸 8-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-7-( 티미딘 -일)-5-((( 메틸설폰일 ) 옥시 ) 메틸 ))-6-옥사-3- 아자바이사이클로[3.2.1]옥테인 -3- 카복실레이트 (23)
10mL 원뿔형 반응 바이알에서 ((3S,4R,5R)-4-(((tert-부톡시카본일)아미노)메틸)-3-((4-클로로벤질)옥시)-5-(티미딘-일)테트라하이드로퓨란-2,2-다이일)-비스(메틸렌)다이메테인설포네이트(60 mg, 0.076 mmol)를 테트라하이드로퓨란(7ml)에 용해하였다. 수소화나트륨, 오일 속 60% 현탁액(12.21 mg, 0.305 mmol)을 한 번에 바이알에 첨가하였고, 바이알에 교반 막대와 테프론-정렬 격벽 스크루-캡을 장착하였고 혼합물을 55℃에서 밤새 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각하고 교반하면서 MeOH 몇 방울로 급랭하였다. 혼합물을 EtOAc (10 mL)로 희석하고 수성 포화 중탄산나트륨(2 x 10 mL) 및 염수 (1 x 10 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 진공하에서 농축시켜 최소량의 DCM에 용해하고 10g 바이오티지 SNAP 컬럼에 장착된 1g 바이오티지 샘플렛에 도포된 각색 거품을 생성하였다. 생성물을 0-100% EtOAc/헥세인 농도구배로 용출하여 백색 거품으로서 (1R,5R,7R,8S)-tert-부틸 8-((4-클로로벤질)옥시)-7-(티미딘-일)-5-(((메틸설폰일)옥시)메틸))-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인-3-카복실레이트(35 mg, 0.060 mmol, 78 % 수율)를 생성하였다.
결정화는 TLC/컬럼 크로마토그래피에 의해 분해될 수 없는 3:2 혼합물로 N-부분입체이성질체의 혼합물을 생성한다. 적은 부분입체이성질체의 존재는 (*)로 표시된 여러 뚜렷한 신호를 생성한다. 1H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ8.63 (s, 1H), 8.59* (s), 7.62 (s, 1H), 7.58* (s), 7.40 - 7.27 (m, 2H), 7.23 (d, J = 8.1 Hz, 3H), 5.80* (s), 5.79 (s, 1H), 4.66 - 4.44 (m, 2H), 4.44 - 4.27 (m, 2H), 4.09 - 3.92 (m, 2H), 3.79 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 3.61* (d, J=12.6 Hz), 3.36 - 3.10 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 2.81* (s), 2.70 (s, 1H), 1.94 (s, 3H), 1.46 (s, 9H), 1.44* (s). ESI-MS: 585 (M)-
1-((1R,5R,7R,8S)-8-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-5-( 하이드록시메틸 )-6-옥사-3- 아자바이사이클로[3.2.1]옥탄 -7-일)- 티미딘 (24)
10mL 유리 반응 바이알에서 (1R,5R,7R,8S)-tert-부틸 8-((4-클로로벤질)옥시)-7-(티미딘-일)-5-(((메틸설폰일)옥시)메틸)-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인-3-카복실레이트(35 mg, 0.060 mmol) 및 소듐 벤조에이트(17.21 mg, 0.119 mmol)를 DMF (2 ml)에 용해하였다. 바이알에 교반 막대와 테프론-정렬 스크루-캡 격벽으로 밀봉하였다. 혼합물을 오일 바스에서 105℃로 밤새 가열하였다. 모든 구성요소가 용액에 영향을 미쳤다. 바이알을 오일 바스로부터 제거하고 10uL 제거하여 TLC를 통해 반응 완결을 평가하였다. 백색 결정이 냉각시에 즉시 형성되기 시작하였다. TLC는 반응이 단지 50% 완료되었다는 것을 나타내었고, 따라서 추가 분량의 소듐 벤조에이트(17.21 mg, 0.119 mmol)를 1mL DMF와 함께 첨가하여 교반하였다. 혼합물을 추가 48시간 동안 105℃로 가열하였고 TLC 분석을 위해 주기적으로 분취량을 제거하였다. 두꺼운 침전물은 2일 동안 105℃로 가열 이후에도 결코 용액에 완전히 영향을 미치지 않았으나, 반응은 탐지가능한 분해 없이 완료되었다.
반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, EtOAc (10 mL)로 희석하고 포화 중탄산염 용액(2 x 10 mL) 및 염수 (1 x 10 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 진공하에서 농축시켰다. 잔여물을 MeOH(2ml)에 재용해하고 소듐 메톡사이드(6.45 mg, 0.119 mmol)를 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었다는 것을 나타내었고 혼합물을 농축하여 건조하였다. 최종 잔여물을 1mL의 1:1 DCM/TFA에 재용해하고 30분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축하여 건조하고 최소량의 DCM을 사용하는 4g RediSep Rf 실리카 컬럼에 도포하였다. 생성물을 3% TEA를 함유하는 0-100% EtOAc/Hex 농도구배로 용출하였다. 생성물 부분을 혼합하고 농축하여 건조하였다. 최종 백색 분말을 DCM(3mL)에 재용해하고 포화 중탄산염 용액(1 x 5mL)으로 세척하였다. 수성 부분을 70/30 클로로폼/아이소프로판올 (2 x 5 mL)으로 재추출하였다. 유기상을 혼합하고 MgSO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축하여 백색 분말로서 1-((1R,5R,7R,8S)-8-((4-클로로벤질)옥시)-5-(하이드록시메틸)-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄-7-일)-티미딘(17mg, 0.042mmol, 69.8% 수율)을 생성하였다.
1H NMR (400 MHz, 아세토나이트릴-d3) δ8.05 (q, J = 1.2 Hz, 1H), 7.36 (s, 4H), 5.94 (s, 1H), 4.52 (dd, J = 38.6, 11.9 Hz, 2H), 4.14 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 33.9, 12.3 Hz, 2H), 3.09 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.89 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 2.75 (dd, J = 13.0, 3.2 Hz, 1H), 2.57 - 2.50 (m, 1H), 2.34 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 1.98 - 1.90 (m, 2H), 1.81 (d, J = 1.1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, CD3CN) δ165.01, 151.22, 138.07, 136.98, 133.72, 130.05, 129.23, 109.19, 87.42, 85.04, 73.06, 71.38, 61.04, 45.85, 43.60, 41.58, 12.71.
(1R,5R,7R,8S)- tert -부틸-8-((4- 클로로벤질 ) 옥시 )-7-( 티미딘 -일)-5-( 하이드록시메틸 )-6-옥사-3- 아자바이사이클로[3.2.1]옥탄 -3- 카복실레이트 (25)
(1R,5R,7R,8S)-tert-부틸 8-((4-클로로벤질)옥시)-7-(티미딘-일)-5-(((메틸설폰일)옥시)메틸)-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인-3-카복실레이트(1.0 g, 1.47 mmol) 및 소듐 벤조에이트(0.63 g, 4.40 mmol)를 교반 막대를 구비한 100mL 둥근 바닥 플라스크 속에 계량하였다. 플라스크에 DMF(10mL)를 채우고, 격벽 밀봉하고 40시간 동안 100℃로 가열하였다. TLC (65% EtOAc/Hex)는 반응이 완료되었다는 것을 나타내었다. 혼합물을 포화 중탄산나트륨(100 mL)으로 희석하고 에틸 아세테이트(3x50mL)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 염수로 세척하고 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 진공하에서 농축시켜 다이옥세인(20mL) 및 2M NaOH (3 mL)의 혼합물에 용해된 갈색 고체를 생성하였다. 혼합물을 50℃로 밤새 데웠다. 반응 혼합물을 진공하에서 고체로 농축하고 50g 바이오티지 SNAP 실리카 컬럼에 도포하고 7개 컬럼 부피 상에서 50-100% 헥세인 속 EtOAc의 농도구배를 사용하고 7개 컬럼 부피에 대해 100% EtOAc에서 고정하여 용출하였다. 부분을 함유하는 생성물을 혼합하고 진공하에서 농축하여 백색 거품으로서 (1R,5R,7R,8S)-8-((4-클로로벤질)옥시)-7-(티미딘-일)-5-(하이드록시메틸)-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카복실레이트(0.63 g, 1.24 mmol, 84.6%)를 생산하였다.
ESI-MS: 506 (M)-
(1R,5R,7R,8S)- 8-하이드록시 -7-( 티미딘 -일)-5-( 하이드록시메틸 )-3-(2,2,2- 트라이플루오로아세틸 )-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인(26)
(1R,5R,7R,8S)-tert-부틸 8-(하이드록시)-7-(티미딘-일)-5-(하이드록시메틸)-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인-3-카복실레이트(0.6 g, 1.18 mmol)를 에탄올(25mL)에 용해하고 500mL Parr 수소화 용기에 옮겼다. 펄만 촉매(Pearlman's Catalyst)(0.35g) 및 한 방울의 빙초산을 한 번 첨가하고 혼합물을 수소 분위기(40psi) 하에서 4시간 동안 Parr 수소화기 상에서 교반하였다. TLC는 반응이 완료되고 스팟-투-스팟(spot-to-spot)인 것을 나타내었다(DMC 속 5% 메탄올). 혼합물을 상당량의 메탄올로 이미 세척한 셀라이트의 한 층을 통해 조심스럽게 여과하였다. 셀라이트 층을 에틸 아세테이트(100mL)와 에탄올(100mL)로 세척하였다. 여과물을 진공하에서 대략 5mL로 농축하고 20mL 유리 섬광 바이알에 옮겼다. 재료를 진공하에서 건조하여 추가 정제 없이 사용된 옅은 백색 분말을 생성하였다.
유리 섬광 바이알에 미세 교반 막대를 장착하고 다이클로로메테인(2mL)과 트라이플루오로아세트산(2mL)을 채웠다. 바이알을 밀봉하고 30분 동안 교반하기 시작하였다. 미세 교반 막대를 제거하고 휘발성 물질을 진공하에서 제거하였다. 최종 오일을 톨루엔 (2 x 4 mL), 메탄올 (1 x 4 mL) 및 DCM (2 x 4 mL)과 공동 증발시켜 바이알에 옅은 백색 분말/잔여물을 생산하였다. 잔여물을 섬광 바이알에서 미세 교반 막대로 메탄올(5mL)에 재용해하였다.에틸 트라이플루오로아세테이트(2.00 mL, 16.9 mmol) 및 TEA (0.410 mL, 3.54 mmol)를 첨가하고, 바이알을 밀봉하고 혼합물을 밤새 교반하기 시작하였다. 20시간 후, 혼합물의 TLC는 출발 재료가 완전히 소비되고 새로운 생성물이 형성되었다는 것을 나타내었다. 휘발성 물질을 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 EtOAc (2 x 5 mL) 및 톨루엔 (2 x 5 mL)으로 공동 증발시켜 다음 트라이틸화 단계에서 직접 사용하기 위한 (1R,5R,7R,8S)-8-하이드록시-7-(티미딘-일)-5-(하이드록시메틸)-3-(2,2,2-트라이플루오로아세틸)-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인(0.30 g, 79.8%)을 생성하였다. 미정제 재료의 1H NMR은 대략 55:45 비의 부분입체이성질체의 혼합물이 형성되었다는 것을 나타내었다(아노머 신호의 적분에 의해).
(1R,5R,7R,8S)- 8-하이드록시 -7-( 티미딘 -일)-5-((4,4'- 다이메톡시트라이틸옥 시) 메틸 -3-(2,2,2- 트라이플루오로아세틸 )-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인(27)
50mL 둥근 바닥 플라스크에서, (1R,5R,7R,8S)-8-하이드록시-7-(티미딘-일)-5-(하이드록시메틸)-3-(2,2,2-트라이플루오로아세틸)-6-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥테인 (0.28 g, 0.74 mmol)을 피리딘(2x10mL)와 공동 증발시켰다. 플라스크에 무수 피리딘(7mL)을 채우고 DMTr-Cl 을 용액에 한 번 첨가하였다. 플라스크를 밀봉하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC는 모든 출발 재료가 소비되었다는 것을 나타내었다(95% EtOAc/Hex 또는 5% MeOH/DCM). 반응을 메탄올(0.5mL)의 첨가로 급랭하고 30분 동안 교반하고, 수성 포화 NaHCO3 (30 mL)를 첨가하였다. 수성상을 EtOAc (3 x 20 mL)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 염수(1x20mL)로 세척하고 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 진공하에서 농축시켜 갈색 거품을 형성하였다. 고체를 최소량의 DCM에 용해하고 헥세인 속 TEA의 25% 용액 60mL로 선처리되고 30% EtOAc/Hex 200mL로 평형화된 50g 바이오티지 실리카 SNAP 컬럼에 도포하였다. 생성물을 10개 컬럼 부피 위에서 뒤이어 헥세인 속 30-100% EtOAc의 농도구배로 컬럼을 용출하고 100% EtOAc의 4개 컬럼 부피로 용출하였다. 순수한 생성물을 함유하는 부분을 혼합하고 농축하여 백색 거품으로 DMTr-(N-tfa)-아미노CBBN을 생성하였다. 두 1H 및 19F NMR은 2개의 뚜렷한 부분입체이성질체를 나타낸다. 1H NMR 도표에서 별표는 부분입체이성질체 프로톤이 대략 55:45 비로 분석되는 피크를 나타낸다.
1H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ7.72* (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.68* (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.49 - 7.38 (m, 4H), 7.35 - 7.20 (m, 14H), 6.93 - 6.78 (m, 8H), 5.73* (s, 1H), 5.68* (s, 1H), 4.55 - 4.36 (m, 3H), 4.05* (s, 2H), 4.01* (s,2H), 3.94 - 3.84 (m, 1H), 3.79 (q, J = 0.7 Hz, 13H), 3.64 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 3.57 - 3.38 (m, 4H), 3.38 - 3.15 (m, 4H), 2.70* (d, J = 3.6 Hz, 1H), 2.65* (t, J = 4.0 Hz, 1H), 1.47* (s, 3H), 1.41* (s, 3H), 1.28 (bs, 2H). 19F NMR (376 MHz, cdcl3) δ-68.61, -68.90.
ESI MS: 680 (M)-
(1R,5R,7R,8S)- 7-( 티미딘 -일)-5-((4,4'- 다이메톡시트라이틸옥시 ) 메틸 --3-(2,2,2-트 라이플루오로 아세틸)-6,8-옥사-3- 아자바이사이클로[3.2.1]옥테인 -8-O-(2-사이아노에틸)-N,N- 다이아이소프로필포스포아미다이트 (28)
5'-O- DMTr - aCBBN ( tfa ) 아미다이트
5'-O-DMTr-aCBBN(tfa)(0.32 g, 0.47 mmol)를 교반 막대가 장착된 100mL 둥근 바닥 플라스크에 계량하였다. 플라스크를 다이클로로메테인(7mL)로 채우고 교반하기 시작하였다. 2-사이아노에틸 N,N,N',N'-테트라아이소프로필포스포다이아미다이트(0.283 g, 0.94 mmol)를 주사기로 계량하고 용액에 한 번 첨가하고 4,5-다이사이아노이미다졸(55.44 mg, 0.47 mmol)을 첨가하였다. 플라스크를 즉시 격벽 밀봉하고 밤새 교반하였다. 과정에서 20시간에서 TLC는 단지 소량의 출발 재료가 존재하며 트라이틸 양성이며 5% 메탄올/DCM w/UV 시각화에 의한 현상 이후 하네시안 염색으로 처리할 때 출발 뉴클레오시드와 유사하게 까맣게 보이는 새로운 두 점을 가진다. 반응물을 수성 포화 NaHCO3 (50 mL)의 첨가로 급랭하였다. 수성상을 에틸 아세테이트(4x20mL)로 추출하였다. 유기상을 혼합하고 수성 포화 NaHCO3 용액(2x50mL)과 염수(1x20mL)로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 위에서 건조하고, 여과하고 농축시켜 무색 오일을 생성하였다. 미정제 생성물을 최소량의 DCM에 용해하고 헥세인 속 TEA의 25% 용액 60mL로 선처리되고 30% 에틸 아세테이트/헥세인 150mL로 평형화된 50g 바이오티지 실리카 SNAP 컬럼에 도포하였다. 생성물을 10개 컬럼 부피 위에서 뒤이어 헥세인 속 30-100% EtOAc의 농도구배로 컬럼을 용출하고 100% EtOAc의 4개 컬럼 부피로 용출하였다. 순수한 생성물을 함유하는 부분을 혼합하고 농축하여 백색 거품으로 DMTr-(N-tfa)-아미노CBBN 아미다이트를 생성하였다. 31P 및 1H NMR은 예상한 대로, 고리 아민의 tfa 보호 및 포스피틸화 반응로부터 발생하는 개별 부분입체이성질체에 각각 해당하는 4개의 뚜렷한 생성물의 존재를 나타낸다.
31P NMR (162 MHz, CD3CN) δ150.03, 149.97, 147.46. 1:1:2의 상대 강도. 19F NMR (376 MHz, CD3CN) δ-69.30, -69.31, -69.47, -69.47.
ESI MS: 904.8 (M + Na+)+
실시예 2: 2'-C- 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트 및 컨쥬게이트의 생산
도 4a에 예시된 다이메톡시트리틸 ( DMTr )-보호 아민 2'-C- 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 포스포아미다이트(30)의 합성
화합물 24를 포름알데하이드와 소듐 사이아노보로하이드라이드(J. Org . Chem.,　1972,　37, pp 1673-1674, Borch conditions) 또는 ZnCl2/NaBH4와 같은 유사한 환원제의 존재하에서 환원 아민화시킴으로써 화합물 30을 합성하였다. 환원성 메틸화 이후, 3'-OH를 에탄올에 생성물을 용해하고 혼합물을 수소 분위기(40psi)에서 펄만 촉매 및 소량의 아세트산을 사용하여 촉매 수소화시킴으로써 벗겨냈다. 미정제 환원 혼합물은 4,4'-다이메톡시트라이틸 클로라이드의 피리딘 용액의 적하 첨가에 의해 냉각된 피리딘 용액에서 직접 트라이틸화될 수 있다. 혼합물을 밤새 교반하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제된 5'-다이메톡시트라이틸-뉴클레오시드를 생산하였다. 정제된 뉴클레오시드를 다이클로로메테인 속 결합 촉매로서 2-사이아노에틸,N,N,N',N',-테트라아이소프로필포스포다이아미다이트(1.5-2당량) 및 4,5-다이사이아노이미다졸(1.1-2 당량)을 사용하여 포스포틸화시켰다. 반응을 적어도 24시간 동안 포화 중탄산나트륨 용액으로 급랭할 때까지 48시간 정도까지 교반하였고 컬럼 크로마토그래피하여 포스포로아미다이트 30을 생성하였다. 화합물 30은 합성 올리고뉴클레오티드 속에 포함하기 위한 자동화 고체상 올리고뉴클레오티 합성에 사용하기에 적합하다.
도 4b에 예시된 DMTr -보호 아민 2'-C- 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 내부 포스포아미다이트 유도체(32)의 합성
먼저 화합물 27을 수성 LiOH/THF 용액을 사용하여 트라이플로우로아세트아마이드 보호기의 알칼리성 가수분해시킴으로써 두 단계로 화합물 27로부터 화합물 32를 합성하였다. 수성 용액을 포화 중탄산나트륨으로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출할 수 있다. 그런 후에 미정제 뉴클레오시드는 4-10 당량의 무수 TEA 또는 DIEA로 선처리된 2-사이아노에틸 포스포로다이클로리다이트에 의해 포스포틸화될 수 있다. 최종 포스포아미다이트는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제되었고 여기서 실리카겔은 적절한 이동상으로 용출하기 전에 헥세인 속 3% TEA의 여러 컬럼 부피로 선처리되었다. 포스포아미다이트는 또한 분해를 예방하기 위해 소량의 TEA와 함께 저장되어야 한다. 화합물 32는 합성 올리고뉴클레오티드 속에 포함하기 위한 자동화 고체상 올리고뉴클레오티 합성에 사용하기에 적합하다. 자동화 고체상 올리고뉴클레오티 합성에서 결합 및 산화 단계 이후 적절한 캐핑제(capping reagent)를 사용하는데 주의가 필요하다. 무수 아세트산은 바이사이클릭 질소 상에 아세트아미드를 가진 최종 보호 올리고뉴클레오티드를 생산할 것이다. 다른 활성화 에스터 또는 무수물은 자동화 고체상 올리고뉴클레오티 합성의 나머지에 의한 진행 이전 바이사이클릭 질소 중심에서 직접 컨쥬게이트를 만드는데 사용될 수 있다.
도 4c에 예시된 DMTr -보호 지방산 컨쥬게이트 아민 2'-C- 브리지드 바이사이 클릭 뉴클레오시드(33)의 합성
화합물 33을 피리딘 용액에서 TMS-Cl에 의한 3'-OH의 일시적 보호를 사용함으로써 화합물 31로부터 직접 합성하였다. 반응 4시간 후, 혼합물을 아이스 바스에서 냉각하고 스테아로일 클로라이드를 교반하면서 적하하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에 도달하게 하였다. 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액의 첨가로 급랭하고, 에틸 아세테이트로 추출하고 유기상을 건조하였다. 미정제 재료를 THF 속 재용해하여 농축하고 THF 속 TBAF 용액(1.25당량)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 직접 실시하여 화합물 33을 생성하였다. 화합물 33은 화합물 27 내지 28의 변환에 대해 기술된 포스포아미다이트 합성에 잘 따른다.
도 4d에 예시된 DMTr -보호 당 컨쥬게이트 아민 2'-C- 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드의 합성
화합물 34를 결합제로서 HBTU, 5-[(2S,3S,4R,5R,6R)-4,5-다이아세톡시-6-(아세톡시메틸)-3-아세틸아미노테트라하이드로-2H-피란-2-일]발레르산(WO 200973809에 기술된 절차를 통해 제조된 GalNAc-C5 산) 및 DMF 용액 속 적어도 1 당량의 N-메틸모르폴린을 사용함으로써 화합물 31로부터 직접 합성하였다. 반응의 완료시(4-17시간), 혼합물을 포화 중탄산나트륨으로 용액으로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기상을 건조하고, 미정제 재료를 농축하고 잔여물을 직접 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 33을 생성하였다. 화합물 33은 화합물 27 내지 28의 변환에 대해 기술된 포스포아미다이트 합성에 잘 따른다.
실시예 3: 2'-C- 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 가진 올리고뉴클레오티드의 합성
일반적인 합성 방법
당과 염기 변형을 가진 짧은 가닥의 올리고뉴클레오티드는 일단 변형된 뉴클레티드가 합성되고 유리 5' 및 3'-하이드록시기가 적절한 반응기에 의해 차단되어 뉴클레오티드 모노머가된 후 제조될 수 있다. 예를 들어, 포스포아미다이트 화학을 사용하는 자동화 고체상 합성이 사용될 수 있다(McBride et al., Tetrahedron Letters 24:245-248 (1983) 및 Sinha et al., Tetrahedron Letters 24:5843-5846 (1983) 참조). 수소 포스포네이트 화학과 같은 관련 방법과 함께 포스포아미다이트 화학은 올리고뉴클레오티드 화학에서 이들의 용도에 대해 광범위하게 재검토되었다(예를 들어, Beaucage et al., Tetrahedron 48:2223-2311(1992) 참조). 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 동안, 일련의 뉴클레오티드 모노머는, 이들의 포스포아미다이트 유도체를 통해, 성장하는 올리고뉴클레오티드 가닥의 사슬 연장의 방향, 5'-작용기 또는 3'-작용기의 방향에 따라, 소정의 순서로 서로 연속적으로 부착된다.
올리고뉴클레오티드 가닥은 제어된 미세구 유리 또는 폴리스티렌 수지 비드와 같은 불용성 모이어티에 부착된다. 각 모노머의 부착 방법은 일반적으로 다음 단계 1 내지 단계 5로 구성된다. 단계 1은 반응성 작용기의 보호를 필요로 한다. 일반적인 반응성 작용기는 말단 뉴클레오시드의 5'-하이드록실기이다. 이 작용기는 주로 산 처리에 의해 제거될 수 있는 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT)로 보호된다. DMT 모이어티의 특징들 중 하나는 산 탈보호 동안 밝은 오렌지색 DMT 양이온을 형성한다는 것이다. 이 양이온은 이전 결합 단계의 완성을 판단하는 목적으로 480 내지 500nm의 파장에서 관찰될 수 있는 리포터 그룹으로 효과적으로 작용한다. 대부분의 상업적으로 구입가능한 자동화 합성제는 배출된 DMT 양이온를 관찰하는 능력을 가진다. 이런 데이터는 작동자에게 합성이 임의의 소정의 단계에서 실패했는지 아닌지의 즉각적 표시를 제공한다. 단계 2는 포스포아미다이트 유도체 및 활성제의 첨가에 의한 결합을 필요로 한다. 포스포아미다이트 유도체는 주로 뉴클레오시드 포스포아미다이트이다. 그러나, 다른 유기 모이어티로 유도화된 포스포아미다이트일 수 있다. 단계 3는 미반응 말단 작용기의 캐핑을 필요로 한다. 이 단계는 실패 서열에 대한 추가 결합을 예방하는 불활성 보호기를 제공한다. 단계 4는 3가 포스파이트로부터 안정한 5가 상태로 새롭게 형성된 포스포로 뉴클레오티드 주쇄 결합의 산화를 필요로 한다. 이 산화 단계는 포스페이트 뉴클레오티드를 생성하는 산호-기반 산화제 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 생성하는 황화 산화제에 의해 실행될 수 있다. 단계 5는 세척 단계 이후 과정의 반복을 필요로 한다.
인간 miR-208a의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 절단된, 16개 뉴클레오티드 서열은 MerMade-12 자동화 올리고뉴클레오티드 합성 시스템 (Bioautomation, Plano, TX, USA)에서 1μmol 스케일로 합성되었다. 합성제는 당업자에게 공지된 표준 디트라이틸화(detritylation), 활성제 및 캐핑 용액을 사용하여 작동되었다. 올리고뉴클레오티드 사슬 연장은 각 데옥시뉴클레오티드 아미다이트에 대해 420초의 단일 결합, LNA 아미다이트에 대해 전체 900초 지속하는 이중 결합 및 DMTr-aCBBN(tfa) 아미다이트와 같은 새로운 뉴클레오시드 아미다이트에 대해 전체 1800초 지속하는 삼중 결합을 사용하여 영향을 받았다. 각 결합 사이클 이후 0.025M 요오드 용액 또는 0.2M PADS 산화 용액에 의한 산화가 실행되어 각각 포스포다이에스터 또는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합을 생성하였다. 비변형된 항-208a DNA 서열은 티미딘 LNA(lT), 티미딘 옥소CBBN(bT), 시티딘옥소CBBN(bC) 또는 티미딘 아미노CBBN(abT) 뉴클레오티드로 선택적으로 대체된 9개 2'-데옥시티미딘 잔기를 포함한다. 티미딘 LNA 아미다이트는 상업적 소스로부터 구입하였고 보고된 분광학적 데이터와 일치한다(Singh, S. K.; Nielsen, P.; Koshkin, A. A.; Wengel, J. Chem.Commun. 1998, 455-6 참조). 티미딜-2'-C,4'-C-브리지드 바이사이클로뉴클레오시드(티미딘 옥소CBBN, bT) 및 시티딜2'-C,4'-C-브리지드 바이사이클로뉴클레오시드(시티딘 옥소CBBN, bC)를 문헌 절차와 모든 분광학적 데이터 일치 보고 값에 따라 합성하였다(U.S. Patent No. 6,403,566, Wang,G., Girardet,J., Gunic,E. Tetrahedron 55, 1999, 7707-7724 참조). 뉴클레오티드의 나머지는 자연 항-208a RNA 서열에 해당하는 염기를 가진 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 LNA 뉴클레오티드로 구성되었다. 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합은 염기를 따라 "s"(예를 들어, abTs 또는 dGs)로 표시되는 반면, 염기를 따른 문자가 포스포다이에스터 인터 뉴클레오티드 결합을 나타내지 않는다(예를 들어, abT 또는 dG).
화합물 M-11915의 제조: dC.dT.dT.dT.dT.dT. dG .dC.abT.dC. dG .dT.dC.dT.dT.dA
포스포아미다이트 시약(28)을 단일 개질된 아미노CBBN 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 상업적 합성 시약들 및 0.025M 아이오딘 용액을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 포스포아미다이트 시약들을 앞서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오타이드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화(characterization)를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 4845.2, 측정치 4844.0 (M)-.
화합물 M-11916의 제조: dC.dT.dT.dT.dT.abT. dG .dC.abT.dC. dG .dT.dC.dT.dT.dA
포스포아미다이트 시약(28)을 이중 개질된 아미노CBBN 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 상업적 합성 시약들 및 0.025M 아이오딘 용액을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 포스포아미다이트 시약들을 앞서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오타이드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 4886.2, 측정치 4885.2 (M)-.
화합물 M-11917의 제조: dC.dT.dT.dT.abT.abT. dG .dC.abT.dC. dG .dT.dC.dT.dT.dA
포스포아미다이트 시약(28)을 삼중 개질된 아미노CBBN 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 상업적 합성 시약들 및 0.025M 아이오딘 용액을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 포스포아미다이트 시약들을 앞서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오타이드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 4927.3, 측정치 4926.1 (M)-.
화합물 M-11918의 제조: dC.dT.dT.dT.abT.abT. dG .dC.dT.dC. dG .dT.dC.dT.dT.dA
포스포아미다이트 시약(28)을 이중 개질된 아미노CBBN 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 상업적 합성 시약들 및 0.025M 아이오딘 용액을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 포스포아미다이트 시약들을 앞서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오타이드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 4886.2, 측정치 4885.0 (M)-.
화합물 M-11919의 제조: lCs . dTs . dTs . dTs . abTs . abTs . dGs . lCs . dTs . lCs . lGs . dTs . lCs . dTs . lTs .lA
포스포아미다이트 시약(28)을 키메릭 DNA/LNA/아미노CBBN 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 1:1 피리딘/ACN 중의 0.2M PADS를 산화 용액으로 바꾸어 상업적 합성 시약들을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 포스포아미다이트 시약들을 앞서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오타이드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 5379.3, 측정치 5378.3 (M)-.
화합물 M-11920의 제조: lCs . dTs . dTs . dTs . lTs . lTs . dGs . lCs . dTs . lCs . lGs . dTs . lCs . dTs . abTs .lA
포스포아미다이트 시약(28)을 키메릭 DNA/LNA/아미노CBBN 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 1:1 피리딘/ACN 중의 0.2M PADS를 산화 용액으로 바꾸어 상업적 합성 시약들을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 포스포아미다이트 시약들을 "절단형 뉴클레오타이드의 일반적인 합성 방법(General Synthetic Methodology of Truncated Nucleotides)"에서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오타이드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 5366.3, 측정치 5365.3 (M)-.
화합물 M-10930의 제조: dC.dT.dT.dT.dT.dT. dG .dC.bT.dC. dG .dT.dC.dT.dT.dA
티미딜-2'-C,4'-C-가교된 바이사이클로뉴클레오사이드 포스포아미다이트(예를 들어, U.S. 특허 번호 제 6,403,566호 및 Wang,G., Girardet,J., Gunic,E.의 논문 [Tetrahedron 55, 1999, 7707-7724]을 참조)을 단일 개질된 옥소CBBN 올리고뉴클레오타이드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 상업적 합성 시약들 및 0.025M 아이오딘 용액을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 모든 포스포아미다이트 시약들을 앞서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오타이드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오타이드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오타이드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 4846.1, 측정치 4845.8 (M)-.
화합물 M-10924의 제조: bC.bT.bT.bT.bT.bT. dG .bC.bT.bC. dG .bT.bC.bT.bT.dA
티미딜-2'-C,4'-C-브리지드 바이사이클로뉴클레오시드 포스포아미다이트 및 N-Bz-시티딜-2'-C,4'-C-브리지드 바이사이클로뉴클레오시드 포스포아미다이트(예를 들어, U.S. 특허 번호 제 6,403,566호 및 Wang,G., Girardet,J., Gunic,E.의 논문 [Tetrahedron 55, 1999, 7707-7724]을 참고하라)을 단일 개질된 옥소CBBN 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용하였다. 올리고뉴클레오티드를 바이오오토메이션 MerMade-12 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성 시스템을 사용하여 합성하였다. 합성을 상업적 합성 시약들 및 0.025M 아이오딘 용액을 사용하여 DMT-ON 모드에서 제조업자의 권장방법에 따라 수행하였다. 모든 포스포아미다이트 시약들을 앞서 설명된 바와 같이 적절한 커플링 사이클 동안 아세토나이트릴 중의 0.1M 용액으로서 첨가하였다. 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단을 17시간 동안 55℃에서 농축된 수성 암모늄 하이드록사이드의 용액으로 CPG 결합된 올리고뉴클레오티드의 가열을 통해 수행하였다. 생성된 올리고뉴클레오티드의 수용액을 Waters Sep-Pak® Vac C18 카트리지 상에 조질의 DMT-ON 올리고뉴클레오티드 용액을 로딩하고, 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 DMT-ON 올리고뉴클레오티드 탈염 방법을 사용하여 용리함으로써 추가로 정제하였다. 생성물의 특성화를 당 분야에 지식을 가진 자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Waters Acuity SQ 탐지기(Detector)로 Waters AllianceMD HPLC에 장착된 XBridge OST C18 2.5 um 컬럼을 사용하여 HPLC-MS 질량 분광분석법에 의해 수행하였다: 계산치 5350.6, 측정치 5350.2 (M)-
실시예 4: 2'-C- 브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 가진 올리고뉴클레오티드의 기능적 특징
용융점( Tm )의 측정
용융점(Tm)은 안타센스 및 마이크로RNA 표적에 대한 약물로서 합성 올리고뉴클레오티드 서열을 설계할 때 중요한 파라미터이다. 활성을 결정하는 초과 또는 미만의 특정 Tm 임계값이 없다. 그러나, Tm은 안타센스 및 마이크로RNA 억제제 올리고뉴클레오티드 약물에 대해 현저하게 증가되어야 한다고 인식된다. 게다가, 합성 올리고뉴클레오티드 약물의 뉴클레오티드 주쇄의 화학적 변형(예를 들어, 포스포로티오에이트)은 주로 인비보 생분해에 대한 안정성을 제공하는데 사용된다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 뉴클레오티드 포스페이트 주쇄 변형은 주로 이의 표적 내에서 이중이 된 올리고뉴클레오티드 약물의 Tm에 감소를 일으킨다. 따라서, 자연 DNA 또는 RNA, 2'-OMe RNA 및 다른 유사 뉴클레오티드 단위에서 고유한 것보다 높은 이의 표적 서열에 대항하는 합성 올리고뉴클레오티드 약물의 Tm에서 현저한 증가가 합성 올리고뉴클레오티드 약물이 충분한 특이성, 표적 결합 및 표적에 의해 제어된 세포 과정의 궁극적인 하강 제어를 갖는데 필요하다.
변형 16개 뉴클레오티드 포스포다이에스터 가닥의 용융점(Tm)을 측정하고 자연 포스포다이에스터 DNA 뉴클레오티드를 가진 동일한 16개 뉴클레오티드 서열의 Tm과 비교하였다. 구체적으로, 동일한 핵염기를 가진 2'-데옥시뉴클레오시드 또는 옥소CBBN 뉴클레오티드와 비교된 상대적 아미노CBBN 용융점(Tm)은 아미노-변형 16개 뉴클레오티드 길이 포스포다이에스터 가닥의 용융점과 2'-데옥시뉴클레오시드 또는 옥소CBBN 포스포다이에스터 DNA 뉴클레오티드를 사용하는 동일한 16개 뉴클레오티드 서열의 용융점의 차이를 측정함으로써 포함 기준(incorporation basis)에 의해 측정하였다. 치환의 Tm 차이는 이들이 서열의 동일한 위치에 위치될 때만 비교되었다. 아미노-LNA 및 이의 옥소-LNA 대응물에 대한 필적할만한 값은 문헌 참조를 통해 얻어졌다(Singh, S.K., Kumar, R., Wengel J. J. Org. Chem., Vol. 63, No. 26, 1998 참조).
예를 들어, 변형된 항-208a 올리고뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드 및 포스페이트 주쇄로 구성된 상보적 서열, 22개 뉴클레오티드 길이에 연결되었다. 상보적 서열은 내인성 성숙한 miRNA와 동일하였다. 열적 변성 온도(Tm)은 용융 곡선의 제 1 유래점의 최대로서 측정되었다(A260 vs. Temp). 이중체는 0.9% NaCl 버퍼 속 1μM로 구성되었다. 온도를 1℃/min으로 25℃로부터 95℃까지 증가시켰고 260nm에서 OD를 30초당 다시 읽었다. Tm 값은 적어도 2개 측정값의 평균이다.
성숙한 인간 miR-208a의 뉴클레오티드 서열에 상보적인, 16개 뉴클레오티드 서열의 다양한 변형에 대한 이중체 용융 온도는 Varian Cary 1E UV-Vis 분광 측광기를 사용하여 측정하였다. 테스트된 항-miRNA 208a 올리고뉴클레오티드 서열은 완전한 DNA 포스포다이에스터(화합물 M-10931), dT 잔기 대신에 1, 2 또는 3개 아미노CBBN 티미딘 잔기를 가진 4개 DNA 포스포다이에스터 올리고뉴클레오티드(화합물 M-11915, M-11916, M-11917, 및 M-11918), 혼합 9개 LNA/7개 DNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(화합물 M-10101) 및 모체 화합물, 화합물 M-10101의 LNA 티미딘이 1 또는 2개 아미노CBBN 잔기로 대체된 2개의 혼합 LNA/DNA/아미노CBBN 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 이중체는 0.9% NaCl 버퍼 속 1μM로 구성되었다. 온도를 1℃/min으로 25℃로부터 95℃까지 증가시켰고 260nm에서 OD를 30초당 다시 읽었다.
아미노CBBN 변형을 가진 포스포다이에스터 올리고뉴클레오티드는 균일하게 더 높은 용융 온도를 가졌고, 따라서, 이들의 완전한 DNA 대응물보다 상보적인 서열에 대해 더 높은 친화력을 가졌다(표 3 참조). 친화력 증가는 DNA에 대해 5-9℃/변형의 순서이었다. 친화력의 이런 증가는 LNA 및 아미노LNA에 대한 문헌 값와 동일하게 좋거나 더 좋다.
aminoCBBN , 포스페이트 주쇄 Tm 연구, RNA 보체
Oligo # Oligo Name 서열 T m △ T m ,DNA △ T m /mod
10931 208a_DNA_PO dC;dT;dT;dT;dT;dT;dG;dC;dT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 53.1 0 NA
10924 208a_CBBN C_T_DNA_16_3_PO bC;bT;bT;bT;bT;bT;dG;bC;bT;bC;dG;bT;bC;bT;bT;dA 89.8 36.7 2.8
10930 208a_1CBBN_DNA_PO dC;dT;dT;dT;dT;dT;dG;dC;bT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 58.3 5.3 5.3
11915 208a_1aminoCBBN_DNA_PO dC;dT;dT;dT;dT;dT;dG;dC;abT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 62.0 8.9 8.9
11916 208a_2aminoCBBN_DNA_PO dC;dT;dT;dT;dT;abT;dG;dC;abT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 64.6 11.5 5.8
11917 208a_3aminoCBBN_DNA_PO dC;dT;dT;dT;abT;abT;dG;dC;abT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 67.5 14.4 4.8
11918 208a_2aminoCBBN_DNA_PO_isomer dC;dT;dT;dT;abT;abT;dG;dC;dT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 63.6 10.5 5.2
표기의 설명
deoxy A dA oxoCBBN A bA
deoxy G dG oxoCBBN G bG
deoxy C dC oxoCBBN C bC
deoxy T dT OxoCBBN T bT
lna A lA aminoCBBN A abA
lnaG lG aminoCBBN G abG
lna C lC aminoCBBN C abC
lna T lT aminoCBBN T abT
deoxy A P=S dAs
deoxy G P=S dGs
deoxy C P=S dCs
deoxy T P=S dTs
lna A P=S lAs
lnaG P=S lGs
lna C P=S lCs
lna T P=S lTs
옥소-유사체, LNA-T에 대한 아미노LNA-T의 비교는 아미노LNA-T가 LNA-T보다 이의 보체에 대해 덜 안정하다는 것을 나타낸다. 유사하게, 아미노ENA-T는 옥소 유사체이 매우 적은 이중 안정화 효과를 갖는 것으로 보인다. 놀랍게도, 옥소CBBN-T 유사체에 대한 아미노CBBN-T의 비교는 아미노CBBN 변형이 2-4℃/변형만큼 옥소CBBN-T보다 현저하게 더욱 안정하다는 것을 나타낸다(표 5 및 도 5 참조). 이론에 한정되기 않기를 바라며, LNA의 2'-O, 프로톤 수용체는 아미노LNa의 경우와 같이 2'-위치에 프로톤 제공자에 의해 대체될 때보다 이중 수화 및 안정성에 대해 더욱 안정한 효과를 가진다고 주장된다. 반대로, 아미노CBBN은 이의 옥소CBBN 유사체보다 이중 수화 및 안정성에 대해 훨씬 더 긍정적인 효과를 갖는 것으로 보이며 임의의 다른 2',4'-카본-브리지드-바이사이클릭 뉴클레오시드에서 볼 수 없는 Tm 증가를 제공한다(도 5 참조).
aminoCBBN , PS 주쇄 10101-유사 Tm 연구, RNA 보체

Oligo #
Oligo 명칭
서열
T m
△ T m ,parent
△ T m /m od
10101 208a_10101 lCs;dTs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 86.7 NA NA
11919 208a_10101_1aminoCBBN_PS lCs;dTs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;abTs;lA 80.04 -6.66 -6.66
11920 208a_10101_2minoCBBN_PS lCs;dTs;dTs;dTs;abTs;abTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lT;lA 85.125 -1.575 -0.7875
아미노-뉴클레오시드, 포스페이트 주쇄 Tm 연구, RNA 보체
DNA_9mer_PO_3LNA-T dG;lT;dG;dA;lT;dA;lT;dG;dC 50 NA NA
DNA_9mer_PO_3aminoLNA-T dG;alT;dG;dA;alT;dA;alT;dG;dC 47 -1 -1
10930 208a_1CBBN_DNA_PO dC;dT;dT;dT;dT;dT;dG;dC;bT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 58.3 NA NA
11915 208a_1aminoCBBN_DNA_PO dC;dT;dT;dT;dT;dT;dG;dC;abT;dC;dG;dT;dC;dT;dT;dA 62.0 +3.7 +3.7
항-208a 올리고뉴클레오티드의 세포 배양 활성
miR-208a를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포주를 생성하였다. 구체적으로, miR-208a를 발현하는 miRNA 발현 벡터(Cell BioLabs, Inc.)를 HeLa 세포 속에 형질감염시켰다. 그런 후에 세포를 푸로마이신 선택 스크린을 사용하여 선택하고 qPCR에 의해 측정된 탐지가능한 miR-208a 발현을 가진 클론을 분리하였다(Ct 값 = ~30).
세포를 웰당 10,000 세포를 가진 검은 벽 96웰 플레이트에 심었다. 심은 후 24시간 후, 세포를 레닐라 유전자의 3'UTR에서 miR-208a 결합 위치 및 miR-208a 억제제(화합물 M-11919, M-11920, 및 M-10101)를 함유하는 이중-루시페라제 플라스미드로 형질감염시켰다. 화합물 M-10591은 비 표적 대조군이었다. 세포를 37℃에서 24기간 동안 배양한 후 반딧불이(형질감염 정규화) 및 레닐라 수준을 이중-루시페라제 리포터 분석 시스템(Promega)을 사용하는 발광에 의해 측정하였다. 데이터를 단지 miR-208a 이중 루시페라제 플라스미드만으로 처리된 세포에 정규화하였다(pis check 208a). pis check 2 세포를 miR-208a 결합 위치를 포함하지 않는 이중 루시페라제 플라스미드로 처리하였다.
결과는 화합물 M-11920은 단지 LNA/DNA 염기를 포함하는 최적화된 miR208a 억제제인 화합물 M-10101과 필적할만한 활성을 가진다는 것을 입증한다(도 6 참조). 따라서, 아미노CBBN을 가진 LNA 잔기의 다중 대체는 miR028a 억제 활성의 완전한 보유를 초래한다. 화합물 M-11919는 다른 2개 억제제와 비교하여 약간 적은 활성을 가진다(도 6 참조). 화합물 M-11919의 활성은 화합물 M-11919이 M-11920 화합물보다 miR-208a RNA에 대해 적은 친화성을 가진다는 것을 나타내는 Tm 데이터와 관련이 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Miragen Therapeutics, Inc. Vagle, Kurt <120> BRIDGED BICYCLIC NUCLEOSIDES <130> MIRG-035/01WO 308934-2402 <140> PCT/US2014/030100 <141> 2014-03-16 <150> US 61/791,704 <151> 2013-03-15 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ucacagugaa ccggucucuu u 21 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 uuuggucccc uucaaccagc ug 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 uuuggucccc uucaaccagc ua 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 ucuacagugc acgugucucc ag 22 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 ucucccaacc cuuguaccag ug 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 aacauucauu gcugucggug ggu 23 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 uagcagcaca gaaauauugg c 21 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 uucaccaccu ucuccaccca gc 22 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 cccaguguuu agacuaucug uuc 23 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 acaguagucu gcacauuggu ua 22 <210> 21 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 uggaauguaa ggaagugugu gg 22 <210> 22 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 auaagacgag caaaaagcuu gu 22 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 auaagacgaa caaaagguuu gu 22 <210> 24 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 25 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 acagcaggca cagacaggca gu 22 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 28 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 agcuacaucu ggcuacuggg u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 aucacauugc cagggauuuc c 21 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 uucaaguaau ccaggauagg cu 22 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 uucaaguaau ucaggauagg u 21 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 aaggagcuca cagucuauug ag 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 36 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 uagcaccauu ugaaaucggu ua 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 uguaaacauc cuacacucag cu 22 <210> 40 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 41 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 uguaaacauc cccgacugga ag 22 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 uguaaacauc cuugacugga ag 22 <210> 43 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 ucucacacag aaaucgcacc cgu 23 <210> 44 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 gaaguuguuc gugguggauu cg 22 <210> 45 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 acuggacuua gggucagaag gc 22 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 acuggacuug gagucagaag g 21 <210> 47 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 cagcagcaau ucauguuuug aa 22 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 ucacuccucu ccucccgucu u 21 <210> 49 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 ucaggcucag uccccucccg au 22 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 uccuguacug agcugccccg ag 22 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 cagcagcaca cugugguuug u 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 uuaagacuug cagugauguu u 21 <210> 53 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 ucggggauca ucaugucacg aga 23 <210> 54 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 uauugcacuu gucccggccu gu 22 <210> 55 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 uauugcacuc gucccggccu cc 22 <210> 56 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 57 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 ugagguagua gguugugugg uu 22 <210> 58 <211> 22 <212> RNA 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<223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <400> 71 nnnnnngnnn gnnnna 16 <210> 72 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_DNA_PO <400> 72 ctttttgctc gtctta 16 <210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_CBBN C_T_DNA_16_3_PO <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(6) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic cytidine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <400> 73 nnnnnngnnn gnnnna 16 <210> 74 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_1CBBN_DNA_PO <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n may be an oxo-2'-C-bridged bicyclic thymidine <400> 74 ctttttgcnc gtctta 16 <210> 75 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_1aminoCBBN_DNA_PO <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n may be an amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <400> 75 ctttttgcnc gtctta 16 <210> 76 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_2aminoCBBN_DNA_PO <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n may be an amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n may be an amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <400> 76 cttttngcnc gtctta 16 <210> 77 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_3aminoCBBN_DNA_PO <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n may be an amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> may be an amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <400> 77 ctttnngcnc gtctta 16 <210> 78 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_2aminoCBBN_DNA_PO_isomer <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n may be an amino-2'-C-bridged bicyclic thymidine <400> 78 ctttnngctc gtctta 16 <210> 79 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide 208a_10101 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n may be an 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Claims (51)

  1. 적어도 하나의 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 구조식 I의 구조를 가지는 것인 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00009
    구조식 I
    상기 식에서,
    X는 N 또는 S이고;
    W1 및 W2는 독립적으로, H, 알코올 보호기, 포스페이트 에스터, 포스포로티오에이트 에스터, 다이- 또는 트라이-포스페이트 또는 포스포로아미다이트, 또는 5' 또는 3' 측면 상에 하나 이상의 뉴클레오티드이며;
    W3는 독립적으로, 없거나, H, O, 아민 보호기, 포스포로아미다이트, 포스포로아미데이트 에스터, 포스포로다이아미데이트 에스터, 메틸, 알킬, 사이클로알킬, 카복시아마이드, 당, 지방산 또는 다른 분자 컨쥬게이트, R이 아릴, 선형 또는 고리 알킬 또는 알켄일인 -C1 -4(O)R, 또는 -COOR, 당, 지방산, 또는 약물 컨쥬게이트와 같은 다른 분자 컨쥬게이트이고; 및
    B는 핵염기이다.
  3. 제 2 항에 있어서,
    X는 N인 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 2 항에 있어서,
    X는 S인 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    알코올 보호기는 4,4'-다이메톡시트리틸 분자, 아세틸, 실릴, 또는 산 불안정성 에터로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아민 보호기는 카보벤질옥시(Cbz), p-메톡시벤질 카본일(Moz 또는 MeOZ), tert-부틸옥시카본일(BOC), 9-플루오렌일메틸옥시카본일(FMOC), 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 벤질(Bn), 또는 트라이플루오로아세틸(tfa)로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵염기는 퓨린 염기인 올리고뉴클레오티드.
  8. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵염기는 피리미딘 염기인 올리고뉴클레오티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    5 내지 9개의 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드를 가진 올리고뉴클레오티드.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 25%의 뉴클레오티드가 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 50%의 뉴클레오티드가 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  12. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 75%의 뉴클레오티드가 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 50개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 25개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 10개 미만, 또는 8개 미만의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 또는 2' 내지 4' 브리지 구조로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 완전히 포스포로티오에이트 결합되는 올리고뉴클레오티드.
  19. 제 17 항에 있어서,
    1 내지 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합인 올리고뉴클레오티드.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 변형된 포스페이트 결합을 포함하고, 이는 선택적으로 포스포로다이아미데이트 결합인 올리고뉴클레오티드.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 결합으로 완전히 결합되고, 이는 선택적으로 포스포로다이아미데이트 결합인 올리고뉴클레오티드.
  23. 제 21 항에 있어서,
    1개 내지 3개의 포스페이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오티드는 포스포로다이아미데이트 결합되는 올리고뉴클레오티드.
  25. 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포스포로다이아미데이트 결합은 하기 구조식으로 도시되는 올리고뉴클레오티드:
    Figure pct00010

    여기서
    R1, R2, 및 R3는 각각 독립적으로, H, 알킬, 알켄일, 옥소, 아릴, 벤질, 할로겐, -OH, -NH2, 알콕시, 알코올 보호기, 또는 아미노 보호기이고,
    B는 핵염기이다.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 퓨린 및/또는 피리미딘 염기 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 염기 변형은 카복사미도인 올리고뉴클레오티드.
  28. 제 26 항에 있어서,
    상기 염기 변형은 퓨린에 대하여 C-8 위치 또는 피리미딘에 대하여 C-5 위치에서 카복사미도 잔기인 올리고뉴클레오티드.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 모르폴리노 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 마이크로RNA의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  31. 제 30 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 표 1에서 선택된 인간 마이크로RNA의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일하거나 상보적인 올리고뉴클레오티드.
  32. 제 31 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 표 1에서 선택된 인간 마이크로RNA의 뉴클레오티드 서열과 완전이 동일하거나 상보적인 올리고뉴클레오티드.
  33. 제 30 항에 있어서,
    인간 마이크로RNA는 표 2에서 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  34. 제 30 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 인간 miR-15a, miR-15b, miR-208a, miR-208b, miR-378, miR-451 및/또는 miR-499 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드.
  35. 제 34 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열은 인간 miR-208a, miR-208b, miR-378, miR-451 및/또는 miR-499 서열에 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드.
  36. 구조식 I의 구조를 가진 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드:
    Figure pct00011
    구조식 I
    상기 식에서,
    X는 N이고;
    W1 및 W2는 독립적으로, H, 알코올 보호기, 포스페이트 에스터, 포스포로티오에이트 에스터, 다이- 또는 트라이-포스페이트 또는 포스포로아미다이트이며;
    W3는 독립적으로, H, 아민 보호기, 포스포로아미다이트, 포스포로아미데이트 에스터, 포스포로다이아미데이트 에스터, 메틸, 알킬, 사이클로알킬, 카복시아마이드, 당, 지방산, 다른 분자 컨쥬게이트, R이 아릴, 선형 또는 고리 알킬 또는 알켄일인 -C1 -4(O)R, 또는 -COOR, 당, 지방산, 또는 약물 컨쥬게이트와 같은 다른 분자 컨쥬게이트이고; 및
    B는 핵염기이다.
  37. 구조식 I의 구조를 가진 2'-C-브리지드 바이사이클릭 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드:
    Figure pct00012
    구조식 I
    상기 식에서,
    X는 S이고;
    W1 및 W2는 독립적으로, H, 알코올 보호기, 포스페이트 에스터, 포스포로티오에이트 에스터, 다이- 또는 트라이-포스페이트 또는 포스포로아미다이트이며;
    W3는 독립적으로, 없거나, O, 지방산 또는 다른 분자 컨쥬게이트이고; 및
    B는 핵염기이다.
  38. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항의 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유효량 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체는 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 또는 리포솜을 포함하는 약학적 조성물.
  40. 제 38 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 수성 제제인 약학적 조성물.
  41. 세포를 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 또는 제38 항 내지 제 40 항의 약학적 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는 세포에서 mRNA 표적 또는 마이크로RNA 표적을 감소 또는 억제하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    마이크로RNA는 표 1 또는 표 2에 기재되거나, miR-208a, miR-208b, miR-378, miR-451 및/또는 miR-499인 방법.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,
    세포는 포유류 세포인 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    세포는 심장 세포인 방법.
  45. 제 43 항에 있어서,
    세포는 인비보 또는 엑스비보인 방법.
  46. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여, 표 2의 마이크로RNA와 관련되거나 이에 의해 매개된 피험자의 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    질환은 심장 질환인 방법.
  48. 제 46 항에 있어서,
    심장비대, 심근경색, 심부전, 혈관 손상, 병적 심장 섬유증, 또는 표 2에 기술된 질환인 방법.
  49. 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 비경구 투여에 의해 또는 심장 조직에 직접 주사에 의해 투여되는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    비경구 투여는 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내인 방법.
  51. 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 지속된 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 카테터 또는 설하 투여에 의해 투여되는 방법.
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