KR101928418B1 - 잠금 핵산 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 억제제 - Google Patents

잠금 핵산 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오티드에 대한 화학적 변형 모티프에 관한 것이다. 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 증가된 인 비보 효과를 가질 수 있다. 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 효능, 전달 효과, 표적 특이성, 독성 및/또는 안정성의 하나 이상에 장점을 제공한다. 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA)의 특이적 화학적 변형 모티프 또는 패턴을 가진다. 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 miRNA 또는 mRNA와 같은 RNA를 표적화할 수 있다. 또한 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 심혈관 질환을 포함하는 다양한 질환에 대한 치료제로서 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

잠금 핵산 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 억제제{Oligonucleotide-Based Inhibitors Comprising Locked Nucleic Acid Motif}
본 발명은 mRNA 및 마이크로RNA(miRNA 또는 miR) 억제제를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드에 대한 화학적 변형 모티프에 관한 것이다. 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, miRNA 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 대상에게 투여될 때 효능(potency), 전달 효과, 표적 특이성, 안정성, 및/또는 독성에서 장점을 가질 수 있다.
안티센스-기반 치료제와 같은 올리고뉴클레오티드의 신체에 대한 전달은 여러 문제를 일으킨다. 표적에 대한 결합 친화력 및 특이성, 세포 흡수의 효율 및 뉴클레아제 저항성은 올리고뉴클레오티드-기반 치료제의 전달과 활성에서 전부 인자이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 미손상 세포들 속에 주입될 때 올리고뉴클레오티드는 공격당하고 뉴클레아제에 의해 분해되어 활성이 손실된다. 따라서, 유용한 올리고뉴클레오티드는 세포막을 투과할 수 있어야 할 뿐만 아니라 세포외 및 세포내 뉴클레아제에 대한 우수한 저항성을 가져야 한다.
폴리뉴클레오티드 유사체들이 분해를 피하기 위하여, 예를 들어, 2' 치환에 의해 제조되었다(Sproat et al., Nucleic Acids Research 17 (1989), 3373-3386). 그러나, 이런 변형들은 종종 의도된 생물학적 기능을 위한 폴리뉴클레오티드의 효능에 영향을 준다. 이러한 감소된 효능은 변형된 폴리뉴클레오티드가 표적 RNA와 안정한 이중나선(duplex)을 형성할 수 없고/없거나 세포 기관과의 상호작용이 감소하기 때문일 수 있다. 다른 변형은 잠금 핵산의 사용을 포함하며, 이는 RNA-결합 친화력을 개선시키는 효능을 가지나(Veedu and Wengel, RNA Biology 6:3, 321-323 (2009)), 인 비보 효과는 낮을 수 있다. 안티센스 치료제로 사용된 올리고뉴클레오티드는 이의 표적의 기능을 효과적으로 약화시키는 이의 표적에 대한 높은 친화력을 가져야 한다(예를 들어, mRNA 표적의 번역 억제 또는 miRNA 표적의 활성 억제). 그러나, 올리고뉴클레오티드의 변형은 이의 친화력 및 결합 특이성뿐만 아니라 이의 표적의 기능을 약화시키는 능력을 감소시킬 수 있다.
따라서, 치료제로서 올리고뉴클레오티드의 전달을 위해 기술된 다양한 방법에도 불구하고, 안정하고 효과적인 올리고뉴클레오티드-기반 억제제에 대한 개선된 화학적 변형에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드의 특이적 화학적 변형 패턴 또는 모티프가 대상에게 투여될 때 효능, 전달 효과, 표적 특이성, 안정성을 증가 및/또는 독성 프로파일을 개선할 수 있다는 발견을 부분적으로 기초로 한다. 본 발명자들은 올리고뉴클레오티드의 전달, 안정성, 효능, 특이성 및/또는 독성 프로파일을 개선하는 능력을 가진 특이적 올리고뉴클레오티드 화학적 변형 패턴 또는 모티프를 발견하였다. 예를 들어, miRNA 억제제에 대한 올리고뉴클레오티드 화학적 변형 패턴 또는 모티프는 miRNA 억제제의 전달, 안정성, 효능, 특이성 및/또는 독성 프로파일을 개선할 수 있어서, 치료 상황에서 miRNA 기능을 효과적으로 표적화한다.
본 발명은 증가된 인 비보 효과와 같은 개선된 특성을 가진 miRNA의 발현(예를 들어, 풍부함)을 억제할 수 있는 화학적 변형 패턴 또는 모티프를 가진 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이런 화학적 변형 패턴 또는 모티프는 mRNA와 같은 다른 치료제를 표적화하기 위한 다른 올리고뉴클레오티드에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 심장병 질환, 비만, 당뇨 및 다른 신진대사 이상을 포함하는 다양한 질환의 치료를 위한 신규한 치료제를 제공한다.
특이적 화학적 변형 패턴 또는 모티프를 가진 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지나 다른 화학적 변형 패턴 또는 모티프를 가진 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증가된 인 비보 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 특이적 잠금 핵산(LNA) 패턴을 가진 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지나 다른 LNA 패턴을 가진 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증가된 인 비보 효과를 가질 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 miRNA의 씨드 영역에 상보적인 서열을 포함하며, 서열은 적어도 5개 LNA를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 miRNA의 씨드 영역에 상보적인 적어도 5개의 LNA 및 적어도 하나의 비-잠금 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 비-잠금 뉴클레오티드는 씨드 영역에 상보적인 지역에 있다. 올리고뉴클레오티드는 동일한 서열과 LNA 조성 및 다른 LNA 모티프를 포함하는 제 2 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증가된 인 비보 효과를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단, 3' 말단 또는 5' 및 3' 말단 모두에 LNA를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 3개 이하의 연속된 LNA를 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 3개 이하의 연속된 LNA를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 16개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 8개 내지 20개 뉴클레오티드, 18개 내지 50개 뉴클레오티드, 10개 내지 18개 뉴클레오티드 또는 11개 내지 16개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시태양에서 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개 또는 약 18개 뉴클레오티드이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 뉴클레오티드는 16개 뉴클레오티드의 서열을 포함하며, 서열은 적어도 5개 LNA, 5' 말단에 LNA, 3' 말단에 LNA 및 3개 이하의 연속된 LNA를 포함한다. 5' 말단으로부터 3' 말단까지 올리고뉴클레오티드는 서열의 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15 및 16에 LNA를 포함할 수 있다.
본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 비-잠금 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 비-잠금 뉴클레오티드의 적어도 하나가 2' 데옥시, 2' O-알킬 또는 2' 할로이다. 다른 실시태양에서, 비-잠금 뉴클레오티드의 전부가 2' 데옥시, 2' O-알킬, 2' 할로 또는 이의 임의의 조합이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드는 2' 내지 4' 메틸렌 다리를 가진 적어도 하나의 LNA를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 5' 캡 구조, 3' 캡 구조, 또는 5' 및 3' 캡 구조를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하거나 완전히 포스포로티오에이트-결합된다. 올리고뉴클레오티드는 1개 내지 3개의 포스페이트 결합을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 펜던트(pendent) 친유성 또는 친수성 그룹을 더 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 발현 또는 활성의 억제제와 같은 RNA의 억제제이다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 억제제이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 또는 이의 단편의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 또는 완전히 상보적인 서열을 포함할 수 있다. miRNA는 임의의 조직에서 발현될 수 있거나 선택적으로 한 조직에서 발현될 수 있다. 한 실시태양에서, 조직은 심장 조직이다. 예를 들어, miRNA는 심장 조직에서 선택적으로 발현된다.
올리고뉴클레오티드는 임의의 miRNA의 억제제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 임의의 miRNA의 억제제일 수 있으나, miR-208a, miR-208b 또는 miR-499는 아니다. 이런 억제제는, 예를 들어, 전문이 참조로 본 발명에 포함된 국제공개공보 No. WO 2012/083005에 기술된다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 표 1 또는 표 2로부터 선택된 miR의 억제제이다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-24, miR-25, miR-26a, miR-497, miR-195, miR-424, let 7 패밀리 멤버(family member), miR-21, miR-199a-b, miR-214, miR-10a-b, miR-16, miR-125b, miR-146a-b, miR-221, miR-222, miR-30 패밀리 멤버, miR-126, miR-133, miR-1, miR-143, miR-145, miR-486, miR-92a, miR-320, miR-1-1, miR-1-2, miR-451, miR-378, miR-378*, miR-92, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-29, 또는 miR-33의 억제제이다.
또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 억제제일 수 있다. 예를 들어, 서열은 mRNA 또는 이의 단편의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 또는 완전히 상보적일 수 있다.
또한 본 발명에 유효량의 본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약학적으로-허용가능한 염 및 약학적으로-허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시태양에서, 약학적으로-허용가능한 담체는 콜로이드 분산 시스템, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 나노입자, 미소구체, 비드, 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 또는 리포솜을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 약학적으로-허용가능한 담체 또는 희석제는 필수적으로 식염수로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드를 생산하고 사용하는 방법을 제공한다. 세포를 본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하여 miRNA의 활성을 감소 또는 억제하는 방법이 또한 제공된다. 또한 본 발명에 세포를 본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하여 mRNA의 발현을 감소시키는 방법이 개시된다. 세포는 심장 세포와 같은 임의의 세포 형태일 수 있다. 세포는 인 비보 또는 엑스 비보일 수 있다. 한 실시태양에서, 세포는 포유류 세포이다.
RNA의 발현과 관련되거나 발현에 의해 매개된 대상의 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다. 이 방법은 대상에게 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, miRNA의 활성과 관련되거나 발현에 의해 매개된 대상의 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 대상에게 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, mRNA의 활성과 관련되거나 발현에 의해 매개된 대상의 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 대상에게 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 질환은 병적 심비대, 심근 경색, 심근 허혈, 허혈-재관류 손상, 심근병증 또는 심부전과 같은 심장 질환일 수 있다. 약학적 조성물은 정맥내, 피하, 복강 또는 근육내 투여와 같은 비경구 투여일 수 있다. 일부 실시태양에서, 투여는 심장 조직 속으로의 직접 주사에 의한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 조성물은 경구, 경피, 지속된 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 카테터 또는 설하 투여에 의해 투여된다. 또한, 대상은 인간일 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드는 약 10mg/kg 내지 약 100mg/kg, 약 10mg/kg 내지 약 50mg/kg, 약 10mg/kg 내지 약 25mg/kg의 복용량으로 투여된다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드는 약 100mg/kg 이하, 약 50mg/kg 이하, 약 25mg/kg 이하 또는 약 10mg/kg 이하의 복용량으로 투여된다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1. (a) miR-208a(SEQ ID NOs: 76-91)을 표적화하도록 설계된 16개 antimiR에 대한 LNA 및 DNA 염기의 위치. LNA 염기는 대문자로 나타내어진다. DNA 염기는 소문자로 나타내어진다. (b) antimiR-208a 화합물에 의한 MiR-208a 억제. 모든 antimiR 화합물은 좌심실에서 현저한 억제를 나타내었다. #p<0.05 vs 식염수. *p<0.05 vs. 대조군 올리고, M-10591. (c) antimiR-208a-처리 쥐의 심장 조직에 의한 실시간 PCR은 효과 및 표적 탈-억제에 대한 1차 리드아웃으로서 Dynlt1을 사용하는 인 비보 다른 표적 탈-억제를 나타내었다. #p<0.05 vs 식염수. *p<0.05 vs. 대조군 올리고, M-10591. (d) 독물학 변수의 혈청 수준. 주사 4일 후, 혈장을 모든 그룹으로부터 수집하였다. antimiR-208a 올리고뉴클레오티드 또는 대조군 올리고뉴클레오티드는 ALT 및 AST 측정에 의해 평가된 간 독성의 증가된 수준 또는 식염수 대조군과 비교한 BUN 측정에 의해 평가된 신장 독성의 증가된 수준을 나타내지 않았다. (e) 1회 25mg/kg 피하 투여 4일 후 심장, 간 및 신장으로부터의 antimiR의 정량화. 심장으로의 분포는 간과 신장보다 훨씬 낮다. 효과적인 화합물은 심장으로 더 이상 강하게 분포되지 않는다.
도 2. (a) miR-208b(SEQ ID NOs: 92-100)을 표적화하도록 설계된 9개 antimiR에 대한 LNA 및 DNA 염기의 위치. LNA 염기는 대문자로 나타내어진다. DNA 염기는 소문자로 나타내어진다. (b) antimiR-208b 화합물에 의한 MiR-208b 억제. 모든 antimiR 화합물은 좌심실에서 현저한 miR-208b 억제를 나타내었다. (c) antimiR-208b-처리 쥐의 심장 조직에 의한 실시간 PCR은 효과 및 표적 탈-억제에 대한 1차 리드아웃으로서 Dynlt1을 사용하는 인 비보 다른 표적 탈-억제를 나타내었다. *p<0.05 vs 식염수.
도 3. 사일런싱. (a) miR-378(SEQ ID NOs: 101-107)을 표적화하도록 설계된 7개 antimiR에 대한 LNA 및 DNA 염기의 위치. LNA 염기는 대문자로 나타내어진다. DNA 염기는 소문자로 나타내어진다. (b) antimiR-378 화합물에 의한 MiR-378 억제. 모든 antimiR 화합물은 좌심실에서 현저한 miR-378 억제를 나타내었다. (c) antimiR-378-처리 쥐의 심장 조직에 의한 실시간 PCR은 효과 및 표적 탈-억제에 대한 1차 리드아웃으로서 Gfpt2를 사용하는 인 비보 다른 표적 탈-억제를 나타내었다. #p<0.05 vs 식염수.
도 4. (a) miR-29(SEQ ID NOs: 108-114)을 표적화하도록 설계된 7개 antimiR에 대한 LNA 및 DNA 염기의 위치. LNA 염기는 대문자로 나타내어진다. DNA 염기는 소문자로 나타내어진다. (b) 심장(상부 패널), 간(중간 패널) 및 신장(바닥 패널)에서 antimiR-29 화합물에 의한 MiR-29 패밀리 억제. 모든 antimiR 화합물은 심장, 간 및 신장에서 현저한 miR-29 패밀리 억제를 나타내었다. (c) antimiR-29-처리 쥐의 심장(상부 패널), 간(중간 패널) 및 신장(바닥 패널)에 의한 실시간 PCR은 효과 및 표적 탈-억제에 대한 1차 리드아웃으로서 Dnmt3b 및 Mcl1을 사용하는 인 비보 다른 표적 탈-억제를 나타내었다. *p<0.05 vs 식염수; #p<0.05 vs. 대조군 올리고뉴클레오티드 M-10591. (d) 1회 25mg/kg 피하 투여 4일 후 심장 및 간으로부터의 antimiR 화합물의 정량화. 심장으로의 분포는 간과 신장보다 훨씬 낮다. 더욱 효과적인 화합물은 덜 효과적인 화합물과 비교하여 심장으로 더 이상 강하게 분포되지 않는다.
도 5. (a) miR-199a(SEQ ID NOs: 115-119)을 표적화하도록 설계된 5개 antimiR에 대한 LNA 및 DNA 염기의 위치. LNA 염기는 대문자로 나타내어진다. DNA 염기는 소문자로 나타내어진다. (b) 심장, 폐, 간(Li) 및 신장(K)에서 antimiR-199a 화합물에 의한 MiR-199a 억제. 모든 antimiR 화합물은 심장, 폐, 간 및 신장에서 현저한 miR-199a 억제를 나타내었다. (c) antimiR-199-처리 쥐의 심장, 폐, 간(Li) 및 신장(K)에 의한 실시간 PCR은 효과 및 표적 탈-억제에 대한 1차 리드아웃으로서 Ddr1을 사용하는 인 비보 다른 표적 탈-억제를 나타내었다. M-10518은 여러 조직에 걸쳐 표적 탈-억제를 일치하게 나타내는 것으로 보였다. *p<0.05 vs 식염수.
도 6. antimiR-92a-치료 쥐의 심장 조직으로부터 분리된 내피 세포에 의한 실시간 PCR은 효과 및 표적 탈-억제에 대한 1차 리드아웃으로서 Map2K4을 사용하는 인 비보 다른 표적 탈-억제를 나타내었다. *p<0.05 vs. 식염수.
본 발명은 올리고뉴클레오티드의 특이적 화학적 변형 패턴 또는 모티프가 대상에게 투여될 때 효능, 전달 효과, 표적 특이성, 안정성 및/또는 독성을 개선할 수 있다는 발견을 부분적으로 기초로 한다. 특이적 화학적 변형 패턴 또는 모티프를 가진 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지나 다른 화학적 변형 패턴 또는 모티프를 가진 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증가된 인 비보 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 특이적 LNA/DNA 패턴을 가진 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지나 다른 LNA/DNA 패턴을 가진 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증가된 인 비보 효과를 가질 수 있다.
본 발명은 일부 실시태양에서 miRNA 또는 mRNA와 같은 RNA 종의 발현 또는 풍부함을, 특이적 방식으로, 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물 및 다양한 심혈관 질환과 같이, miRNA 또는 mRNA와 같은 RNA와 관련되거나 관여하는 질환 또는 이상을 가진 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 다양한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 효능, 전달 효과, 표적 특이성, 독성 및/또는 안정성의 하나 이상에서 장점을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 mRNA 또는 miRNA와 같은 RNA의 발현 또는 풍부함을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지나 다른 화학적 변형 모티프 또는 패턴을 가진 다른 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증가된 인 비보 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드는 각각 miRNA를 표적화하는 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진다. 제 1 올리고뉴클레오티드는 제 2 올리고뉴클레오티드와 다른 화학적 변형 모티프 또는 패턴을 가진다. 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 모두는 miRNA의 발현 또는 풍부함을 감소시킬 수 있다. 그러나, 제 1 화학적 변형 모티프를 가진 제 1 올리고뉴클레오티드는, 하나 이상의 miRNA의 표적의 탈-억제량으로 측정한 대로, 다른 화학적 변형 모티프를 가진 제 2 올리고뉴클레오티드와 비교하여 더 높은 인 비보 효과를 가진다.
miRNA와 같은 RNA 종의 발현 또는 풍부함을 감소시키는데 올리고뉴클레오티드의 활성은 인 비트로 및/또는 인 비보로 측정될 수 있다. 예를 들어, miRNA 활성의 억제가 인 비트로로 측정될 때, 활성은 본 발명에 기술된 대로, 이중 루시페라제 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 이중 루시페라제 활성에서 측정된 대로, 약 50nM 이하의 농도에서 또는 다른 실시태양에서, 40nM 이하, 20nM 이하 또는 10nM 이하에서 이런 활성을 현저하게 억제한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는, 이중 루시페라제 분석법에서 측정된 대로, 약 50nM 이하, 40nm 이하, 30nM 이하 또는 20nM 이하의 miRNA 할성의 억제에 대한 IC50을 가질 수 있다. 구입할 수 있는 제품 PsiCHECKTM(Promega)에 의해 예시화된 이중 루시페라제 분석법은 탐지가능한 단백질(예를 들어, 레닐라 루시페라제)에 대한 유전자의 3'UTR에서 miR 인식 부위의 배치를 필요로 한다. 구조체는 표적 miRNA와 공동 발현되어, 억제제 활성은 신호의 변화에 의해 측정될 수 있다. 탐지가능한 단백질(예를 들어, 반딧불이 루시페라제)을 암호화하는 제 2 유전자는 동일한 플라스미드 상에 포함될 수 있고, 신호들의 비율은 antimiR 활성의 지표로서 측정되었다.
선택적으로 또는 추가로, miRNA와 같은 RNA 종의 발현 또는 풍부함을 감소시키는데 올리고뉴클레오티드의 활성은 본 발명에 기술된 것과 같은 적절한 생쥐 또는 쥐 모델에서 측정될 수 있으며, miRNA의 억제(예를 들어, 적어도 50%)는 약 50mg/kg 이하, 약 25mg/kg 이하, 약 10mg/kg 이하 또는 약 5mg/kg 이하의 복용량과 같은 올리고뉴클레오티드 복용량에서 관찰된다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드의 활성은 설명이 참조로 본 발명에 포함된 WO 2008/016924에 기술된 동물 모델에서 측정된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 약 10mg/kg 이하 또는 약 5mg/kg 이하와 같은 약 50mg/kg 이하, 약 25mg/kg 이하의 복용량에서 적어도 50% 표적 miRNA 억제 또는 표적 탈-억제를 나타낼 수 있다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 생쥐에게 정맥 또는 피하로 투여될 수 있고 올리고뉴클레오티드는 식염수로 제제화될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 인 비보 효과는 본 발명에 기술된 것과 같은 적절한 생쥐 또는 쥐 모델에서 miRNA의 표적의 하나 이상의 수준 또는 탈-억제량에 의해 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 약 50mg/kg 이하, 약 25mg/kg 이하, 약 10mg/kg 이하 또는 약 5mg/kg 이하의 복용량에서 적어도 50% 표적 탈-억제를 나타낼 수 있다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 생쥐에게 정맥 또는 피하로 투여될 수 있고 올리고뉴클레오티드는 식염수로 제제화될 수 있다.
이런 또는 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 투여 후 안정할 수 있고, 투여 이후에 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주 또는 적어도 6주 이상 동안 혈액 순환 또는 표적 기관에서 탐지될 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 덜 빈번한 투여, 더 낮은 복용량 및/또는 더 긴 기간의 치료 효과를 제공할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 또는 miRNA와 같은 RNA의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상보적일 수 있다. 일부 실시태양에서, miRNA는 miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아니다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 LNA, 적어도 5개, 적어도 7개 또는 적어도 9개 LNA를 포함한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 LNA 및 비-잠금 뉴클레오티드의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개 또는 적어도 7개 또는 적어도 9개 잠금 뉴클레오티드 및 적어도 1개의 비-잠금 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 길이 및 잠금 뉴클레오티드의 수와 위치는 올리고뉴클레오티드가 각각 본 발명에 기술된 대로, 인 비트로 루시페라제 분석법에서 약 50nM 이하의 올리고뉴클레오티드 농도 또는 적절한 생쥐 또는 쥐 모델에서, 약 50mg/kg 이하 또는 약 25mg/kg 이하의 복용량에서, mRNA 발현 또는 miRNA 발현과 같은 RNA 발현 또는 풍부함을 감소시키는 것이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 억제제이며, 올리고뉴클레오티드의 길이 및 잠금 뉴클레오티드의 수와 위치는 올리고뉴클레오티드가 본 발명에 기술된 것과 같이, 적절한 생쥐 또는 쥐 모델에서, 약 50mg/kg 이하 또는 약 25mg/kg 이하의 복용량에서, 표적 탈-억제에 의해 측정된 대로 miRNA 활성을 감소시키는 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있으며 서열은 적어도 5개 LNA, 서열의 5' 말단에서 LNA, 서열의 3' 말단에서 LNA 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있으며 서열은 적어도 5개 LNA, 서열의 5' 말단에서 LNA, 서열의 3' 말단에서 LNA 또는 이의 임의의 조합을 포함하며, 3개 이하의 뉴클레오티드가 연속된 LNA이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 3개 이하의 연속된 LNA를 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개 LNA, 서열의 5' 말단에서 LNA, 서열의 3' 말단에서 LNA 및 3개 이하의 연속된 LNA를 가진 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 5개 LNA, 서열의 5' 말단에서 LNA, 서열의 3' 말단에서 LNA 및 3개 이하의 연속된 LNA를 가진 서열을 포함할 수 있으며, 서열은 적어도 길이가 16개 뉴클레오티드이다. 서열은 mRNA 또는 miRNA와 같은 RNA에 실질적으로 또는 완전히 상보적일 수 있으며, 실질적으로 상보적인 서열은 표적 서열에 대해 1 내지 4개 미스매치(예를 들어, 1 또는 2개 미스매치)를 가질 수 있다. 한 실시태양에서, 표적 서열은 miRNA이어서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 억제제 또는 antimiR이다. miRNA는 표 1 또는 표 2에 나열된 것들과 같은 임의의 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예시적 miRNA 치료 용도는 아래 표에 나열된 US 및 PCT 특허 참조에 개시되며, 이의 각각은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다. miRNA의 성숙 및 사전-처리된 형태는 표 2에 나열된 특허 참조에 개시되며, 이런 기술은 참조로 본 발명에 포함된다.
miRNA miRNA 서열 SEQ ID NO :
1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU 1
100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 2
10a UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG 3
10b UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG 4
125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 5
126 UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG 6
128 UCACAGUGAACCGGUCUCUUU 7
133a UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG 8
133b UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA 9
139 UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG 10
143 UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC 11
145 GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU 12
146a UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU 13
146b UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU 14
150 UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG 15
15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 16
15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 17
16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 18
181b AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 19
195 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC 20
197 UUCACCACCUUCUCCACCCAGC 21
199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC 22
199b-5p CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC 23
199b-3p ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA 24
208a AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU 25
208b AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU 26
20a UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG 27
21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 28
214 ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU 29
22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 30
221 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 31
222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 32
224 CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU 33
23a AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 34
24 UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG 35
25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA 36
26a UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 37
26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 38
28 AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 39
29a UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA 40
29b UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU 41
29c UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA 42
30a UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG 43
30b UGUAAACAUCCUACACUCAGCU 44
30c UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC 45
30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 46
30e UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG 47
33a GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA 48
33b GUGCAUUGCUGUUGCAUUGC 49
34a UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 50
34b CAAUCACUAACUCCACUGCCAU 51
34c AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC 52
320 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 53
342-3p UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU 54
382 GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG 55
422a ACUGGACUUAGGGUCAGAAGGC 56
378 ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG 57
378* CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU 58
424 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA 59
451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU 60
483-3p UCACUCCUCUCCUCCCGUCUU 61
484 UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 62
486-5p UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG 63
497 CAGCAGCACACUGUGGUUUGU 64
499 UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU 65
542-5p UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA 66
92a UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 67
92b UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 68
let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 69
let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 70
let-7c UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 71
let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 72
let-7e UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 73
let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 74
let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 75
miRNA 징후 참조문헌
miR-208a/miR-208b/miR-499 병적 심비대, 심근 경색, 심부전 WO 2008/016924 (208a)
WO 2009/018492 (208b/499)
miR-208a/miR-208b 신진대사 이상(비만, 고지혈증, 당뇨, 신진대사 증후군, 고콜레스테롤혈증; 지방간) PCT/US2012/059349, 2012년 10월9일 출원
miR-15/miR-16/miR-195 병적 심비대, 심근 경색, 심부전 WO 2009/062169
miR-29 경화반(취약형 경화반)을 섬유화 조직으로 전환하는 전섬유화제; 콜라겐 퇴적 유도 WO 2009/018493
miR-126 병적 신혈관신생 WO 2010/019574
miR-145 근육 손상 WO 2007/070483
miR-1/miR-133 근육 손상(다른 시간에 조합하여 사용된 각 miRNA의 길항제/효현제) WO 2007/070483
miR-451 다혈구증 WO 2012/148373
miR-378/miR-378* 신진대사 이상(비만, 고지혈증, 당뇨, 신진대사 증후군, 고콜레스테롤혈증; 지방간);
병적 심비대, 심근 경색, 심부전		 WO 2011/153542
miR-92 혈관생성 및 혈관 복구를 촉진한다 US 2010/0324118 A1
miR-34a 심근 경색 US 2012/0238619 A1
miR-145 폐동맥 고혈압 WO 2012/153135
miR-33 스타틴-유도 간독성, 담즙 정체, 증가하는 HDL 콜레스테롤 US 20110281933 A1
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-24, miR-25, miR-26a, miR-497, miR-195, miR-424, let 7 패밀리 멤버, miR-21, miR-199a-b, miR-214, miR-10a-b, miR-16, miR-125b, miR-146a-b, miR-221, miR-222, miR-30 패밀리 멤버, miR-126, miR-133, miR-1, miR-143, miR-145, miR-486, miR-92a, miR-320, miR-1-1, miR-1-2, miR-451, miR-378, miR-378*, miR-92, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-29, 또는 miR-33으로 이루어지나, 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된 miRNA에 실질적으로 또는 완전히 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, miRNA는 전문이 참조로 본 발명에 포함된 국제공개공보 No. WO 2012/083005에 기술된 것과 같이, miR208a, miR208b 또는 miR-499가 아니다. 일부 실시태양에서, miRNA는 신장, 간 또는 심장 조직과 같은 특이적 조직에서 발현된다. 또 다른 실시태양에서, miRNA는 신장, 간 또는 심장 조직과 같은 조직에서 선택적으로 발현된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 miRNA의 씨드 영역에 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 서열은 적어도 5개 LNA를 포함한다. "miRNA의 씨드 영역"은 miRNA의 5' 말단에서 염기 2 내지 9에 미치는 부분이다. miRNA는 표 1 또는 표 2에 나열된 것들과 같은 임의의 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. miRNA는 miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-24, miR-25, miR-26a, miR-497, miR-195, miR-424, let 7 패밀리 멤버, miR-21, miR-199a-b, miR-214, miR-10a-b, miR-16, miR-125b, miR-146a-b, miR-221, miR-222, miR-30 패밀리 멤버, miR-126, miR-133, miR-1, miR-143, miR-145, miR-486, miR-92a, miR-320, miR-1-1, miR-1-2, miR-451, miR-378, miR-378*, miR-92, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-29, 또는 miR-33일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, miRNA는 miR208a, miR208b 또는 miR-499가 아니다. 서열은 mRNA 또는 miRNA와 같은 RNA에 실질적으로 또는 완전히 상보적일 수 있다. 일부 실시태양에서, miRNA는 신장, 간 또는 심장 조직과 같은 특이적 조직에서 발현된다. 또 다른 실시태양에서, miRNA는 신장, 간 또는 심장 조직과 같은 조직에서 선택적으로 발현된다. 일부 실시태양에서, miRNA는 심근세포, 근육세포, 섬유아세포, 민무늬근세포, 내피세포 및 단핵구를 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 세포 형태에서 선택적으로 발현된다.
miRNA의 씨드 영역에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드(서열은 적어도 5개 LNA를 포함한다)는 5' 말단 또는 3' 말단 또는 5' 및 3' 말단 모두에 LNA를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 적어도 5개 LNA, 5' 말단에 LNA 및/또는 3' 말단에 LNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 3개 이하의 연속된 LNA를 포함한다. 일부 실시태양에서, 서열은 길이가 적어도 16개 뉴클레오티드이다. miRNA의 씨드 영역에 상보적인 서열은 실질적으로 상보적 또는 완전히 상보적일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 잠금 핵산(LNAs) 잔기 또는 "잠금 뉴클레오티드"를 포함한다. LNA는 예를 들어, 미국특허 6,268,490; 6,316,198; 6,403,566; 6,770,748; 6,998,484; 6,670,461; 및 7,034,133에서 기술되며, 이들 모두는 전문이 본 발명에 참조로 포함된다. LNA는 "잠금" 형태 및/또는 바이사이클릭 구조를 형성하는 리보스 당 모이어티의 2' 및 4' 탄소들 사이에 추가적인 다리를 포함하는 변형된 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이다. 일 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 구조식 A에 나타난 구조를 가진 하나 이상의 LNA를 포함한다. 선택적으로 또는 추가로, 올리고뉴클레오티드는 구조식 B에 나타난 구조를 가진 하나 이상의 LNA를 포함할 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 올리고뉴클레오티드는 구조식 C에 나타난 구조를 가진 하나 이상의 LNA를 포함한다.
Figure 112015002001373-pct00001
본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 사용될 수 있는 다른 적절한 잠금 뉴클레오티드는 미국특허 6,403,566 및 6,833,361에 서술된 것을 포함하며, 이들 모두는 전체로써 본 발명에 참조로 포함된다.
예시적 실시태양들에서, 잠금 뉴클레오티드는 예를 들어 구조식 A에 도시된 대로, 2' 내지 4' 메틸렌 다리를 가진다. 다른 실시태양에서, 다리는 치환될 수 있고 2' 위치에 에터 결합을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있는 메틸렌 또는 에틸렌 그룹을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 mRNA 또는 miRNA에 대한 안티센스 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나 이루어질 수 있다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA에 직접 연결된 안티센스 서열을 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 생리학적 조건하에서 내인성 miRNA에 혼성화하기 위해 miRNA 서열에 충분히 상보적인 안티센스 서열을 포함한다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 성숙한 miRNA 서열에 적어도 부분적으로 상보적인, 예를 들어, 표 1, 표 2의 miRNA 또는 다음 miRNA 중 임의의 하나: miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-24, miR-25, miR-26a, miR-497, miR-195, miR-424, let 7 패밀리 멤버, miR-21, miR-199a-b, miR-214, miR-10a-b, miR-16, miR-125b, miR-146a-b, miR-221, miR-222, miR-30 패밀리 멤버, miR-126, miR-133, miR-1, miR-143, miR-145, miR-486, miR-92a, miR-320, miR-1-1, miR-1-2, miR-451, miR-378, miR-378*, miR-92, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-29, 또는 miR-33와 같으나 이에 제한되지 않는 성숙한 miRNA 서열에 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, miRNA는 miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아니다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-24, miR-25, miR-26a, miR-497, miR-195, miR-424, let 7 패밀리 멤버, miR-21, miR-199a-b, miR-214, miR-10a-b, miR-16, miR-125b, miR-146a-b, miR-221, miR-222, miR-30 패밀리 멤버, miR-126, miR-133, miR-1, miR-143, miR-145, miR-486, miR-92a, miR-320, miR-1-1, miR-1-2, miR-451, miR-378, miR-378*, miR-92, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-29, 또는 miR-33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miRNA와 같으나 이에 제한되지 않는 성숙한 miRNA 서열에 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, miRNA는 miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아니다.
올리고뉴클레오티드는 일반적으로 성숙한 miRNA를 표적화하도록 설계된 뉴클레오티드 서열을 가진다. 올리고뉴클레오티드는, 이런 또는 다른 실시태양에서, pre- 또는 pri-miRNA 형태를 표적화하도록 선택적으로 설계될 수 있다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 완전히 상보적인(성숙한) miRNA 서열에 대해 1 내지 5(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4) 미스매치를 포함하는 서열을 갖도록 설계될 수 있다. 일부 실시태양에서, miRNA는 miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아니다. 특정 실시태양에서, 이런 안티센스 서열은, 예를 들어, 스템 및 루프 부분을 포함하는 shRNA 또는 다른 RNA 구조 속에 포함될 수 있다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA의 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인(즉, 충분히 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, miRNA는 miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아니다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miRAN의 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함하고, 필수적으로 이루어지거나 이루어질 수 있다. 이런 문맥에서, "필수적으로 이루어진다"는 추가 뉴클레오티드(들)이 이중 루시페라제 분석법 또는 생쥐 모델에서 표적 miRNA 활성의 올리고뉴클레오티드 억제에 실질적으로 영향을 주지 않는 한(20% 이하의 IC50의 증가로 정의), 5' 및 3' 말단의 각각 또는 모두 상에 뉴클레오티드의 선택적 첨가(예를 들어, 하나 또는 둘)를 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 길이가 약 8개 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 18개 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 18개 뉴클레오티드, 또는 약 11개 내지 약 16개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시태양에서 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개 또는 약 18개 뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 16개 뉴클레오티드이다.
올리고뉴클레오티드는 일반적으로 적어도 약 5개, 적어도 약 7개 또는 적어도 약 9개 LNA를 포함하나, 다양한 실시태양에서 LNA로 완전히 이루어지지 않는다. 일반적으로, LNA의 수와 위치는 올리고뉴클레오티드가 mRNA 또는 miRNA 활성을 감소시키는 것이다. 한 실시태양에서, LNA의 수와 위치는 올리고뉴클레오티드가 LNA의 다른 수 및/또는 위치를 가진 올리고뉴클레오티드와 비교하여 증가된 인 비보 효과를 가지는 것이다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 4개 이상 또는 3개 이상 연속된 LNA를 가진 일련의 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 3개 이하의 연속된 LNA를 포함한다. 이런 또는 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 씨드 영역에 실질적으로 또는 완전히 상보적인 지역 또는 서열을 포함할 수 있으며, 지역 또는 서열은 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시태양에서, miRNA는 miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아니다.
다양한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개 잠금 뉴클레오티드 및 7개 비-잠금 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. LNA의 패턴은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 적어도 위치 1, 6, 10, 13 및 15가 LNA인 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, LNA의 패턴은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 적어도 위치 1, 6, 10, 11, 13 및 16이 LNA인 것일 수 있다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15 및 16이 LNA이며 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 위치 1, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 14 및 16이 LNA이며 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15 및 16이 LNA이며 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이며, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 억제제이다.
예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15 및 16이 LNA이며 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이며, 올리고뉴클레오티드는 miRNA에 적어도 부분적으로 상보적이며, miRNA는, 일부 실시태양에서, miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아닐 수 있다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 14 및 16이 LNA이며 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이며, 올리고뉴클레오티드는 miRNA에 적어도 부분적으로 상보적이며, miRNA는, 일부 실시태양에서, miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아닐 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 3' 말단까지, 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15 및 16이 LNA이며 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이며, 올리고뉴클레오티드는 miRNA의 씨드 영역에 적어도 부분적으로 상보적이며, miRNA는, 일부 실시태양에서, miR-208a, miR-208b 또는 miR-499가 아닐 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 표 3, 5, 6, 7, 8 또는 9로부터 선택된다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 M-10101, M-10707, M-11192, M-11185, M-10518 또는 M-11127로부터 선택된 화합물이다.
비-잠금 뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오티드는 2' 하이드록실에 대한 2' 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 변형은 2' 데옥시일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 2'-변형된 뉴클레오티드의 합체(incorporation)는 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오티드의 저항성 및 상보적인 RNA와의 열적 안정성을 모두 증가시킬 수 있다. 2' 위치에서의 다양한 변형들은 RNA 표적 또는 세포 기관과의 분자 상호작용을 손상시키지 않고 증가된 뉴클레아제 민감성을 제공하는 것들로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 이러한 변형들은 이들의 증가된 인 비트로 또는 인 비보 효능을 기반으로 선택될 수 있다. miRNA 억제에 대한 증가된 효능(예를 들어, IC50)을 측정하는 예시적인 방법이 본 발명에서 기술되며, 이중 루시페라제 분석법 및 인 비보 miRNA 발현 또는 표적 탈-억제를 포함한다.
일부 실시태양에서, 2' 변형은 (치환될 수 있는) O-알킬, 할로 및 데옥시(H)로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 실질적으로 모든, 또는 모든 비-잠금 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 2' 위치는, 특정 실시태양에서 변형될 수 있는데, 예를 들어 O-알킬 (예를 들어, O-메틸), 할로 (예를 들어, 플루오르), 데옥시 (H), 및 아미노로부터 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 2' 변형은 O-메틸 및 플루오르로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 퓨린 뉴클레오티드는 각각 2'OMe를 가지며 피리미딘 뉴클레오티드는 각각 2'-F를 가진다. 특정 실시태양에서, 1 내지 약 5개의 2' 위치, 또는 약 1 내지 약 3개의 2' 위치는 변형되지 않은 상태로 (예를 들어, 2' 하이드록실들로) 남겨 진다.
본 발명에 따른 2' 변형은 또한 소수의 탄화수소 치환기들을 포함한다. 탄화수소 치환기는 알킬, 알켄일, 알카인일, 및 알콕시알킬을 포함하며, 여기서 알킬 (알콕시의 알킬 부분 포함), 알켄일 및 알카인일은 치환되거나 또는 비치환될 수 있다. 알킬, 알켄일, 및 알카인일은 C1, C2 또는 C3과 같은 C1 내지 C10 알킬, 알켄일 또는 알카인일일 수 있다. 탄화수소 치환기는 한 개 또는 두 개 또는 세 개의 비-탄소 원자를 포함할 수 있으며, N, O, 및/또는 S로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 2' 변형은 O-알킬, O-알켄일, 및 O-알카인일과 같은 알킬, 알켄일, 및 알카인일을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 예시적인 2'변형은 2'-O-알킬 (2'OMe 또는 2'OEt와 같은 C1-3 알킬), 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 2'-플루오르, 2'-클로로, 2'-브로모, 및 2'-아이도와 같은 적어도 하나의 2'-할로 변형(예를 들어, 2'하이드록실 대신에)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 2'할로 변형은 플루오르이다. 올리고뉴클레오티드는 1 내지 약 5개의 2'-할로 변형(예를 들어, 플루오르), 또는 1 내지 약 3개의 2'-할로 변형(예를 들어, 플루오르)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 비-잠금 위치에서 모두 2'-플루오르인 뉴클레오티드, 또는 모든 비-잠금 피리미딘 뉴클레오티드 상에 2'-플루오르를 포함한다. 특정 실시태양에서, 2'-플루오르기는 독립적으로 다이-, 트라이-, 또는 비-메틸화된다.
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'-데옥시 변형(예를 들어, 2'하이드록실의 경우 H)을 가질 수 있으며, 일부 실시태양들에서, 비-잠금 위치에 2 내지 약 10개의 2'-데옥시 변형을 함유하거나 모든 비-잠금 위치에 2'-데옥시를 함유한다.
예시적인 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 비-잠금 위치에서 2'OMe로 변형된 2'위치를 포함한다. 선택적으로, 비-잠금 퓨린 뉴클레오티드는 2'위치에서 2'OMe로 변형되고, 비-잠금 피리미딘 뉴클레오티드는 2'위치에서 2'-플루오르로 변형된다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 변형 또는 "캡"을 추가로 포함한다. 캡은 5' 및/또는 3'-캡 구조일 수 있다. 용어 "캡" 또는 "말단-캡"은 (말단 리보뉴클레오티드에 대한) 올리고뉴클레오티드의 양쪽 말단에서 화학 변형을 포함하며 5'말단 상의 마지막 두 개의 뉴클레오티드 및 3'말단 상의 마지막 두 개의 뉴클레오티드 사이의 결합에서 변형을 포함한다. 본 발명에서 서술된 캡 구조는 RNA 표적 또는 세포 기관과의 분자 상호작용을 손상시키지 않고 올리고뉴클레오티드의 엑소뉴클레아제에 대한 저항성을 증가시킨다. 이러한 변형들은 이들의 증가된 인 비트로 또는 인 비보 효능을 기반으로 선택될 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡) 또는 3'-말단 (3'-캡)에서 또는 양쪽 말단 모두에서 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 5'- 및/또는 3'-캡은 포스포로티오에이트 모노포스페이트, 무염기 잔기 (모이어티), 포스포로티오에이트 결합, 4'-티오 뉴클레오티드, 카보사이클릭 뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트 결합, 반전된 뉴클레오티드(inverted nucleotide) 또는 반전된 무염기 모이어티(inverted abasic mioety)(2'-3'또는 3'-3'), 포스포로디티오에이트 모노포스페이트, 및 메틸포스포네이트 모이어티로부터 독립적으로 선택된다. 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합(들)은, 캡 구조의 일부인 경우, 일반적으로 5'말단 상의 두 개의 말단 뉴클레오티드 및 3'말단 상의 두 개의 말단 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 포스포로티오에이트 모노포스페이트를 가진다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 엑소뉴클레아제의 작용을 억제함으로써 더 높은 효능을 지원할 수 있다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3'말단에 있을 수 있다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 아래에 서술된 B가 염기이고, R이 2'변형인 다음 구조에 의해 정의된다:
Figure 112015002001373-pct00002
캡 구조가 잠금 뉴클레오티드의 화학적 성질을 지원할 수 있는 경우, 캡 구조는 본 발명에 기술된 대로 LNA를 합체할 수 있다.
일부 실시태양에서 포스포로티오에이트 결합은 5'및 3'말단상의 마지막 2개의 뉴클레오티드(예를 들어, 캡 구조의 일부로서)들 사이에 존재할 수 있거나 포스포다이에스터 결합과 교대로 존재할 수 있다. 이런 실시태양 또는 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 5'및 3'말단 중 하나 또는 모두에서 적어도 하나의 말단 무염기 잔기를 포함할 수 있다. 무염기 모이어티는 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민과 같은 일반적으로 인정되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기를 포함하지 않는다. 따라서 이러한 무염기 모이어티는 뉴클레오티드 염기가 부족하거나 또는 1'위치에서 다른 비-뉴클레오티드 염기 화학 그룹을 가진다. 예를 들어, 무염기 뉴클레오티드는 역 무염기 뉴클레오티드(reverse abasic nucleotide)일 수 있으며, 예를 들어, 역 무염기 포스포라미디트는 (3'아미디트 대신) 5'아미디트를 통해 결합되고 5'-5'포스페이트 결합을 초래한다. 폴리뉴클레오티드의 5'및 3'말단에 대한 역 무염기 뉴클레오시드의 구조가 아래에 도시된다.
Figure 112015002001373-pct00003
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다. 포스포로티오에이트 결합은 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 절단(cleavage)에 대해 보다 저항성으로 만들기 위해 사용되었다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 부분적으로 포스포로티오에이트 결합될 수 있거나, 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합은 포스포디에스터 결합과 번갈아 올 수 있다. 그러나, 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 완전히 포스포로티오에이트 결합된다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 내지 5개 또는 1개 내지 3개 포스페이트 결합을 가진다.
일부 실시태양에서, 뉴클레오티드는 참조로 본 발명에 포함된 WO 2012/061810에 기술된 대로 하나 이상의 카복스아미도-변형 염기들을 가지며, 본 발명에 개시된 모든 예시적 피리미딘 카복스아미도 변형에 대해 헤테로사이클릭 치환기를 포함한다.
고체상 합성법(solid phase synthesis)에 의한 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성은 잘 알려져 있으며 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 새로운 화학적 방법( New Chemical Methods for Synthesizing Polynucleotides). Caruthers MH, Beaucage SL, Efcavitch JW, Fisher EF, Matteucci MD, Stabinsky Y. Nucleic Acids Symp . Ser . 1980;(7):215-23에서 검토되었다.
올리고뉴클레오티드는 다양한 고분자 어셈블리 또는 조성물 내에 포함될 수 있다. 전달을 위한 이러한 복합체는 다양한 리포솜, 나노입자, 및 미셀을 포함할 수 있으며 환자로의 전달을 위해 제제화된다. 복합체는 세포막 침투를 개시하기 위해 하나 이상의 융합 유도성(fusogenic) 또는 친유성(lipophilic) 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분자들은 예를 들어, 미국특허 7,404,969 및 미국특허 7,202,227에서 서술되며, 그 전체가 본 발명에 참조로서 포함된다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드는 지방산 및 전문이 본 발명에 참조로서 포함된 WO 2010/129672에 기술된 것과 같은 세포 전달을 보조하기 위한 펜던트 친유성 그룹을 더 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 특정 조직을 표적화하는 펜던트 친유성 그룹을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 만노스-6-포스페이트와 같은 당 모이어티 또는 N-아세틸 글루코사민과 같은 아미노 당에 접합될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다양한 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 약학적 조성물은 의도된 사용에 적합한 형태로 제조될 것이다. 일반적으로, 이는 발열원(pyrogens) 뿐만 아니라 인간 또는 동물에 해로울 수 있는 다른 불순물이 없는 조성물의 제조를 필요로 할 것이다. 예시적인 전달/제제 시스템은 콜로이드 분산 시스템, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 나노입자, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 상업적으로 이용 가능한 본 발명의 핵산을 심장 및 골격 근육 조직으로 전달하기에 적합한 지방 에멀전은 Intralipid®, Liposyn®, Liposyn®II, Liposyn®III, Nutrilipid, 및 다른 유사한 지질 에멀전을 포함한다. 인 비보 전달 비히클로 사용하기 위한 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜(즉, 인공 막소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 예시적인 제제가 전부가 전문이 본 발명에 참조로서 포함되는 US 특허 Nos. 5,981,505; 6,217,900; 6,383,512; 5,783,565; 7,202,227; 6,379,965; 6,127,170; 5,837,533; US 6,747,014; 및 WO03/093449에서 개시된다.
조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 하나를 포함하는 다수의 치료적 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 2, 3, 4 또는 5개 miRNA 억제제를 사용할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다른 치료제와 조합으로 사용될 수 있다. 조합은 또한 세포를 하나 이상의 구별된 조성물 또는 제제와 동시에 접촉시킴으로써 성취될 수 있다. 선택적으로, 조합은 연속적으로 투여될 수 있다.
일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 살균수와 일반적인 식염수를 포함하는, 적절한 희석액과 함께 제제화함으로써, 통상적인 피하 또는 정맥 투여를 위해 제제화된다.
약학적 조성물 및 제제는 전달 비히클을 안정하게 만들고 표적 세포에 의해 흡수될 수 있도록 적절한 염 및 완충액을 사용할 수 있다. 본 발명의 수성 조성물은 억제제 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 리포솜, 나노입자 또는 다른 복합체)를 포함하는 유효량의 전달 비히클을 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에서 용해되거나 또는 분산된다. "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약리학적으로 허용 가능한"은 동물 또는 인간에게 투여된 경우 해롭거나, 알러지이거나, 또는 다른 부반응들을 나타내지 않는 분자 또는 조성물을 말한다. 본 발명에서 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 인간에게 투여하기에 적합한 의약과 같은 의약을 제제화하는데 사용하기에 적합한 하나 이상의 용매, 완충액, 용액, 분산매, 코팅, 항균성 및 항진균성 물질, 등장성 및 흡수 지연 물질 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질들을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 보조적인 활성 성분들이 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 또는 전달은 표적 조직이 그 경로를 통해 이용할 수 있는 한 임의의 경로를 통할 수 있다. 예를 들어, 투여는 국소 또는 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 관상동맥내, 경막내 또는 정맥내 주사, 또는 표적 조직(예를 들어, 심장 조직) 내로의 직접 주사에 의할 수 있다. 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드의 안정성 및/또는 효능은 피하, 피내, 정맥내 및 근육내를 포함하는 편리한 투여 경로를 고려한다. 또한 본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은 카테터 시스템 또는 치료 물질을 심장으로 전달하기 위해 관상 순환을 격리시키는 시스템에 의해 투여될 수 있다. 치료 물질을 심장 및 관상 맥관구조로 전달하기 위한 다양한 카테터 시스템은 당업계에 알려져 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 카테터-기반 전달 방법 또는 관상 격리 방법의 일부 비제한적인 예들은 전부가 전문이 본 발명에 참조로서 포함되는 미국특허 Nos. 6,416,510; 6,716,196; 및 6,953,466; PCT 공개공보 Nos. WO 2005/082440 및 WO 2006/089340; 및 미국특허 공개공보 Nos. 2007/0203445, 2006/0148742, 및 2007/0060907에 개시된다.
또한 조성물 또는 제제는 비경구 또는 복막내로 투여될 수 있다. 예로써, 유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로써 콘주게이트의 용액은 물에서 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합하여 제조될 수 있다. 또한 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서 이들 제제들은 미생물의 성장을 막기 위해 일반적으로 방부제를 포함한다.
주사 용도 또는 카테터 전달에 적합한 약학적 형태는 예를 들어, 살균 수성 용액 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말 를 포함한다. 일반적으로 이들 제제는 살균되며 쉬운 주입성이 존재할 정도로 유동성이다. 제제는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며 세균 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대비하여 보관되어야 한다. 적합한 용매 또는 분산매는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물 오일을 포함할 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등의 다양한 항균 및 항진균 물질에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에서 사용하여 이루어질 수 있다.
살균 주사 용액은 적절한 양의 컨주게이트를 용매에 원하는 임의의 다른 성분(예를 들어, 상기에서 열거한 것)과 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균 활성 성분들을 기본적인 분산매와 원하는 다른 성분들, 예를 들어 앞에서 열거한 것들을 포함하는 살균 비히클에 혼합함으로써 제조된다. 살균 주사 용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 상기 살균-여과된 용액으로부터 어떠한 추가적으로 요구되는 성분들을 더한 활성 성분(들)의 파우더를 생산하는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다.
제제에서, 용액들은 되도록 투약 제제에 적합한 방식 및 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 제제는 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약 형태로 쉽게 투여될 수 있다. 수용액에서 비경구적 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 일반적으로 적절하게 완충되고, 액상 희석액은 먼저 예를 들어 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성을 만든다. 이러한 수용액은 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특히 본 명세서의 관점에서, 당업계의 통상적인 기술을 가진자에게 이미 알려진 바대로 살균 수성 매질이 사용된다. 예로써, 단일 복용량은 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해되고 1000ml의 피하주액 유체(hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나 또는 예정된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참조). 치료받는 대상의 질환에 따라 용량의 일부 변화는 필연적으로 생기게 된다. 투여에 대해 책임을 지는 사람은 어떤 일이 있어도 개개의 대상을 위한 적합한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여에 있어, 제형들은 FDA 생물학 기준 사무국에 의해 요구되는 살균성, 발열원성, 일반 안전 및 순도 기준을 만족해야만 한다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드를 (예를 들어, 본 발명에 기술된 조성물 또는 제제의 일부로서) 세포로 전달하는 방법, 및 대상에서 질환의 진행을 치료, 경감, 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명에 사용된 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간 및 다른 영장류(예를 들어, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 가정용 포유류(예를 들어, 개 및 고양이), 실험실 동물(예를 들어, 생쥐, 쥐 및 기니 피그와 같은 설치류) 및 새(예를 들어, 닭, 칠면조 및 가금류와 같은 가정용, 야생용 및 경기용 새, 오리, 거위 등)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물을 의미한다. 일부 실시태양에서, 대상은 포유류이다. 다른 실시태양에서, 포유류는 인간이다.
올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물은 표적 세포(예를 들어, 포유류 세포)와 인 비트로 또는 인 비보로 접촉될 수 있다. 세포는 신장, 간, 혈관 또는 심장 세포일 수 있다.
본 방법은 일반적으로 올리고뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 조성물을 대상 또는 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 기술된 올리고뉴클레오티드는 mRNA 또는 miRNA 억제제일 수 있다. 일부 실시태양에서, miRNA 억제제는 miR-208a 억제제, miR-208b 억제제 또는 miR-499 억제제가 아니다. 따라서, 환자는 mRNA 또는 miRNA의 발현 또는 조절장애와 관련이 있는, 이에 의해 매개된 또는 이로부터 초래한 질환을 가질 수 있다. 이러한 질환은 심비대, 심근 경색, 심부전(예를 들어, 울혈성 심부전), 심근 허혈, 허혈-재관류 손상, 혈관 손상, 말초 동맥 질환, 취약형 경화반, 혈관재협착(restenosis), 또는 병적 심장 섬유증과 같은 심혈관 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 질환은 신진대사 이상, 신장 이상(예를 들어, 신장 허혈), 간 질환 또는 폐 질환을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 질환을 치료하기 위한, 및 이런 치료법을 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드 및 조성물의 용도를 제공한다.
특정 실시태양에서, 대상(예를 들어, 인간 환자)은, 예를 들어, 오래된 조절되지 않는 고혈압(long standing uncontrolled hypertension), 고쳐지지 않는 심장판막증(uncorrected valvular disease), 만성 협심증(chronic angina), 새로운 심근경색(recent myocardial infarction), 울혈성 심부전, 심장 질병에 대한 선천적인 소인 및 병적 비대증(pathological hypertrophy)과 같으나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 위험 인자를 가진다. 선택적으로 또는 추가적으로, 환자는 예를 들어, 심장 비대에 대한 유전적 소인을 가진 것으로, 또는 예를 들어, 심장 비대의 가족력을 가지는 것으로 진단될 수 있다.
이 양태에서, 본 발명은 심부전 또는 심장 비대를 가진 환자에서 향상된 운동 부하, 감소된 입원 기간, 더 나은 삶의 질, 감소된 이환율 및/또는 감소된 사망률을 제공할 수 있다.
특정 실시태양에서, 심장 조직과 같은 관심 조직에서 또는 혈청에서 측정된 miRNA의 활성은 감소되거나 억제된다.
다양한 실시태양에서, 약학적 조성물은 경구 투여에 의해 또는 심장 조직에 직접 주사에 의해 투여된다. 경구 투여는 정맥내, 피하 또는 근육내일 수 있다. 일부 실시태양에서, 조성물은 경구, 경피, 지속된 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 카테터 또는 설하 투여에 의해 투여된다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 25mg/kg 이하의 복용량 또는 약 10mg/kg 이하의 복용량, 또는 약 5mg/kg 이하의 복용량으로 투여된다. 이런 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 치료 후 miRNA 억제제의 제거 또는 청소를 더 포함한다. 예를 들어, 억제제에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드(예를 들어, miRNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드)는 억제제의 기능을 약화 또는 정지시키기 위해 치료 후 투여될 수 있다.
본 발명은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 하는 다음 추가예에 의해 추가로 설명된다. 당업자는, 본 발명의 관점에서, 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시태양에 대한 여러 변화가 가능할 수 있고 동등한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야한다.
본 명세서에 언급된 모든 공개공보 및 특허 및 특허 출원은 각 개별 공개공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함될 것으로 암시된 것과 동일한 정도로 참조로 본 발명에 포함된다.
실시예
실시예 1. AntimiR-208a의 인 비보 효과.
LNA 염기의 위치가 동일한 길이 및 LNA 백분율의 microRNA 억제제(antimiRs)의 인 비보 효과에 영향을 미치는지를 결정하기 위해서, 다른 LNA 변형 패턴을 가진 여러 antimiR을 설계하고 miRNA 기능을 억제하는 효과를 인 비보로 테스트하였다.
변하는 Tm 측정값을 가진 miR-208a에 대한 16개 antimiR(도 1a)를 아래 표 3에 나타낸 대로 설계하였다.
분자 # 별칭 서열 길이 LNA / DNA 예측된 Tm
M-10101 208a_LNA_DNA_16_PS lCs;dTs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA (SEQ ID NO: 76) 16 9/7 81
M-10679 208a LNA C_T_DNA_16_1 lCs;dTs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;dA
(SEQ ID NO: 77) 		16 9/7 93
M-10680 208a_LNA_opt_1 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 78) 		16 9/7 90
M-10681 208a_LNA_opt_2 lCs;dTs;lTs;lTs;dTs;lTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA
(SEQ ID NO: 79) 		16 9/7 93
M-10682 208a_LNA_opt_3 lCs;dTs;lTs;dTs;lTs;dTs;lGs;dCs;lTs;dCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA
(SEQ ID NO: 80) 		16 9/7 86
M-10683 208a_LNA_opt_4 lCs;dTs;dTs;lTs;lTs;dTs;lGs;dCs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 81) 		16 9/7 92
M-10673 208a_LNA_opt_5 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA
(SEQ ID NO: 82) 		16 9/7 93
M-11184 208a_10626 lCs;dTs;lTs;lTs;dTs;dTs;lGs;lCs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 83) 		16 9/7 83
M-11293 208a_scr2_1 lCs;dTs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;dCs;lTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA
(SEQ ID NO: 84) 		16 9/7 86
M-11294 208a_scr2_2 lCs;lTs;dTs;dTs;dTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA
(SEQ ID NO: 85) 		16 9/7 77
M-11295 208a_scr2_3 lCs;lTs;dTs;dTs;dTs;lTs;lGs;dCs;dTs;lCs;lGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 86) 		16 9/7 76
M-11296 208a_scr2_4 lCs;dTs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 87) 		16 9/7 80
M-11297 208a_scr2_5 lCs;lTs;dTs;dTs;lTs;dTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 88) 		16 9/7 87
M-11298 208a_scr2_6 lCs;dTs;lTs;dTs;lTs;dTs;lGs;lCs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 89) 		16 9/7 83
M-11299 208a_scr2_7 lCs;dTs;dTs;lTs;lTs;dTs;lGs;lCs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 90) 		16 9/7 83
M-11300 208a_scr2_8 lCs;lTs;dTs;dTs;lTs;dTs;lGs;dCs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 91) 		16 9/7 88
표기의 설명
데옥시 A dA
데옥시 G dG
데옥시 C dC
데옥시 T dT
lna A lA
lna G lG
lna C lC
lna T lT
데옥시 A P=S dAs
데옥시 G P=S dGs
데옥시 C P=S dCs
데옥시 T P=S dTs
lna A P=S lAs
lna G P=S lGs
lna C P=S lCs
lna T P=S lTs
이런 antimiR은 25mg/kg의 복용량으로 6-8주령 쥐들(Sprague Dawley rats)에 피하로 등쪽으로 주사하였다(그룹당 n = 4)). 주사 부피는 1.0mL이었다. 유사한 LNA 및 DNA 백분율(9/7)을 가진 대조군 올리고뉴클레오티드를 화학적 대조군으로 사용하였다. 이 분자 번호는 M-10591이며 예쁜꼬마선충(C. elegans) - 특이적 miRNA를 표적화하도록 설계되었다. 1회 복용 4일 후, 이 쥐들을 희생시키고 혈장을 간 및 신장 독물학 변수를 위해 수집하였다. 또한, 심장, 간 및 신장을 miRNA 억제, 표적 탈-억제 및 antimiR-분포 정량화를 포함하는 분자 분석을 위해 수집하였다. RNA를 심장 조직으로부터 분리하였고 실시간 PCR을 실행하였다. miR-208a에 대해 설계된 모든 antimiR은 miR-208a의 현저한 억제를 나타내었고 모든 antimiR이 심장 조직에 전달되었음을 암시한다(도 1b). miR-208a 억제가 인 비보 효과와 상관 있는지 측정하기 위해서, miR-208a 표적들을 miR-208a 표적, Dynlt1에 대한 실시간 PCR을 실행함으로써 탈-억제에 대해 평가하였다. 놀랍게도, 테스트된 16개 antimiR 중 단지 4개만이 Dynlt1의 현저한 탈-억제를 나타내었다(도 1c).
이런 antimiR 중 임의의 것에 의한 치료가 증가된 간 및/또는 신장 독물학 변수를 초래하였는지를 측정하기 위해서, ALT, AST 및 BUN에 대한 ELISA를 실행하여 간과 신장 기능을 평가하였다. antimiR-치료 그룹은 간 또는 신장 독물학 변수에 어떠한 증가도 나타내지 않았다(도 1d).
화합물들 사이의 효과 차이가 효과적인 분자에 대한 더 나은 심장 분포 때문인지를 측정하기 위해서, 효과를 나타낸 2개 antimiR(M-10101 및 M-10683) 및 효과를 나타내지 않은 2개 antimiR(M-10673 및 M-10681)에 대한 심장, 간 및 신장에 대한 antimiR 분포를 평가하였다. ELISA-기반 분포 분석은 비-효과적인 화합물과 비교된 효과적인 화합물에 대해 더 나은 심장 존재를 나타내지 않았다. 사실, 비-효과적인 화합물은 모든 조직에 대해 더 낮은 분포를 나타낸 것으로 보였다(도 1e).
이런 데이터는 antimiR 내의 다른 LNA 및 DNA 배치가 심장과 관련이 있기 때문에 현저하게 다른 antimiR 효과를 초래하는 것을 암시하며, M-10101의 LNA/DNA "모티프"는 심장 효과에 대해 최고 화합물인 것으로 보인다.
실시예 2. AntimiR-208b의 인 비보 효과.
M-10101의 효과적인 LNA/DNA 모티프가 추가 miRNA에 대해 효과적인 상태인지를 테스트하기 위해서, miR-208b, miR-29, miR-378, miR-199a 및 miR-92a를 포함하는 다른 miRNA에 대한 이들의 서브세트를 테스트하였다. 모든 실험 설계는 실시예 1에 기술된 것과 같이 miR-208a에 대해 실행한 것과 동일하였다.
miR-208a 스크린에 대해 발견된 것과 유사한 LNA 및 DNA 배치를 가진 miR-208b에 대한 9개 antimiR를 합성하였고(도 2a), 아래 표 5에 나타낸 대로(표기의 설명은 표 4에 기술된 것과 같다), 변하는 Tm 측정값을 갖도록 설계하였다:
분자 # 별칭 서열 길이 LNA / DNA 예측된 Tm
M-10707 208b_10101 lCs;dCs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA
(SEQ ID NO: 92) 		16 9/7 82
M-11283 208b_10679 lCs;dCs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;dA
(SEQ ID NO: 93) 		16 9/7 91
M-11284 208b_10680 lCs;dCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 94) 		16 9/7 89
M-11285 208b_10681 lCs;dCs;lTs;lTs;dTs;lTs;dGs;lTs;lTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA
(SEQ ID NO: 95) 		16 9/7 94
M-11286 208b_10682 lCs;dCs;lTs;dTs;lTs;dTs;lGs;dTs;lTs;dCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA
(SEQ ID NO: 96) 		16 9/7 86
M-11287 208b_10683 lCs;dCs;dTs;lTs;lTs;dTs;lGs;dTs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 97) 		16 9/7 93
M-11288 208b_10673 lCs;dCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA
(SEQ ID NO: 98) 		16 9/7 91
M-11289 208b_10626 lCs;dCs;lTs;lTs;dTs;dTs;lGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 99) 		16 9/7 89
M-11290 208b_LNA_opt6 lCs;lCs;dTs;dTs;lTs;dTs;lGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA
(SEQ ID NO: 100) 		16 9/7 92
이런 antimiR은 25mg/kg의 복용량으로 6-8주령 쥐들(Sprague Dawley rats)에 피하로 등쪽으로 주사하였다(그룹당 n = 4)). 주사 부피는 1.0mL이었다. 유사한 LNA 및 DNA 백분율(9/7)을 가진 대조군 올리고뉴클레오티드를 화학적 대조군으로 사용하였다. 이 분자 번호는 M-10591이며 예쁜꼬마선충(C. elegans) - 특이적 miRNA를 표적화하도록 설계되었다. 1회 복용 4일 후, 이 쥐들을 희생시키고 심장을 miRNA 억제 및 표적 탈-억제를 포함하는 분자 분석을 위해 수집하였다. RNA를 심장 조직으로부터 분리하였고 실시간 PCR을 실행하였다. miR-208b에 대해 설계된 모든 antimiR은 miR-208b의 현저한 억제를 나타내었고 모든 antimiR이 심장 조직에 전달되었음을 암시한다(도 2b). miR-208b 억제가 인 비보 효과와 상관 있는지 측정하기 위해서, 실시간 PCR을 실행함으로써 miR-208b 표적, Dynlt1을 탈-억제에 대해 평가하였다. 놀랍게도, 단지 M-10707이 Dynlt1의 현저한 탈-억제를 나타내었고(도 2c), 이는 miR-208a에 대해 최고 효과를 나타낸 동일한 LNA/DNA 모티프이다(도 1c).
이런 데이터는 M-10101 및 M-10707(동일하다)의 LNA/DNA 모티프가 인 비보 심장 효과를 전달한다는 것을 암시한다.
실시예 3. AntimiR-378의 인 비보 효과.
모티프 M-10101이 miR-208 패밀리를 넘어 연장하는지를 측정하기 위해서, miR-208a 스크린(도 3a)에 대해 발견된 것과 유사한 LNA 및 DNA 배치를 가지며, 아래 표 6에 나타낸 대로(표기의 설명은 표 4에 기술된 것과 같다), 변하는 Tm 측정값을 가진 miR-378에 대한 7개 antimiR을 설계하고 합성하였다:
분자 # 별칭 서열 길이 LNA / DNA 예측된 Tm
M-11192 378_10101 lCs;dTs;dGs;dAs;lCs;lTs;dCs;lCs;dAs;lAs;lGs;dTs;lCs;dCs;lAs;lGs
(SEQ ID NO: 101) 		16 9/7 86
M-11193 378_10680 lCs;dTs;lGs;lAs;lCs;lTs;dCs;lCs;dAs;lAs;dGs;dTs;lCs;dCs;dAs;lGs
(SEQ ID NO: 102) 		16 9/7 89
M-11194 378_10681 lCs;dTs;lGs;lAs;dCs;lTs;dCs;lCs;lAs;lAs;dGs;dTs;lCs;dCs;lAs;dGs
(SEQ ID NO: 103) 		16 9/7 89
M-11195 378_10682 lCs;dTs;lGs;dAs;lCs;dTs;lCs;dCs;lAs;dAs;lGs;dTs;lCs;dCs;lAs;lGs
(SEQ ID NO: 104) 		16 9/7 86
M-11196 378_10683 lCs;dTs;dGs;lAs;lCs;dTs;lCs;dCs;lAs;lAs;dGs;lTs;dCs;lCs;dAs;lGs
(SEQ ID NO: 105) 		16 9/7 91
M-11197 378_10673 lCs;dTs;lGs;lAs;lCs;lTs;dCs;lCs;dAs;lAs;dGs;dTs;lCs;dCs;lAs;dGs
(SEQ ID NO: 106) 		16 9/7 95
M-11198 378_10626 lCs;dTs;lGs;lAs;dCs;dTs;lCs;lCs;dAs;lAs;dGs;lTs;dCs;lCs;dAs;lGs
(SEQ ID NO: 107) 		16 9/7 95
이런 antimiR은 25mg/kg의 복용량으로 6-8주령 쥐들(Sprague Dawley rats)에 피하로 등쪽으로 주사하였다(그룹당 n = 4)). 주사 부피는 1.0mL이었다. 유사한 LNA 및 DNA 백분율(9/7)을 가진 대조군 올리고뉴클레오티드를 화학적 대조군으로 사용하였다. 이 분자 번호는 M-10591이며 예쁜꼬마선충(C. elegans) - 특이적 miRNA를 표적화하도록 설계되었다. 1회 복용 4일 후, 이 쥐들을 희생시키고 심장을 miRNA 억제 및 표적 탈-억제를 포함하는 분자 분석을 위해 수집하였다. RNA를 심장 조직으로부터 분리하였고 실시간 PCR을 실행하였다. miR-378에 대해 설계된 모든 antimiR은 miR-378의 현저한 억제를 나타내었고 모든 antimiR이 심장 조직에 전달되었음을 암시한다(도 3b). miR-378 억제가 인 비보 효과와 상관 있는지 측정하기 위해서, 실시간 PCR을 실행함으로써 miR-378 표적, Gfpt2를 탈-억제에 대해 평가하였다. 놀랍게도, 단지 M-11192이 Gfpt2의 현저한 탈-억제를 나타내었고(도 3c), 이는 심장에서 miR-208a 및 miR-208b에 대해 최고 효과를 나타낸 LNA/DNA 모티프와 동일하다(도 1c 및 2c).
이런 데이터는 M-10101, M-10707 및 M-11192(동일하다)의 LNA/DNA 모티프가 인 비보 심장 효과를 전달한다는 것을 강하게 암시한다.
실시예 4. AntimiR-29의 인 비보 효과.
이런 모티프가 추가 miRNA 패밀리에서 효과를 전달하는지를 측정하기 위해서 miR-208a 스크린에 대해 발견된 것과 유사한 LNA 및 DNA 배치를 가진 miR-29b에 대한 7개 antimiR(도 4a)을 합성하였다. 이들의 상응하는 예측된 Tm 값을 가진 이런 antimiR의 서열 및 변형 패턴은 아래 표 7에 나타낸 것과 같다(표기의 설명은 표 4에 기술된 것과 같다):
분자 # 별칭 서열 길이 LNA / DNA 예측된 Tm
11185 29b_10101 lGs;dAs;dTs;dTs;lTs;lCs;dAs;lAs;dAs;lTs;lGs;dGs;lTs;dGs;lCs;lTs
(SEQ ID NO: 108) 		16 9/7 84
11186 29b_10680 lGs;dAs;lTs;lTs;lTs;lCs;dAs;lAs;dAs;lTs;dGs;dGs;lTs;dGs;dCs;lTs
(SEQ ID NO: 109) 		16 9/7 91
11187 29b_10681 lGs;dAs;lTs;lTs;dTs;lCs;dAs;lAs;lAs;lTs;dGs;dGs;lTs;dGs;lCs;dTs
(SEQ ID NO: 110) 		16 9/7 87
11188 29b_10682 lGs;dAs;lTs;dTs;lTs;dCs;lAs;dAs;lAs;dTs;lGs;dGs;lTs;dGs;lCs;lTs
(SEQ ID NO: 111) 		16 9/7 82
11189 29b_10683 lGs;dAs;dTs;lTs;lTs;dCs;lAs;dAs;lAs;lTs;dGs;lGs;dTs;lGs;dCs;lTs
(SEQ ID NO: 112) 		16 9/7 85
11190 29b_10673 lGs;dAs;lTs;lTs;lTs;lCs;dAs;lAs;dAs;lTs;dGs;dGs;lTs;dGs;lCs;dTs
(SEQ ID NO: 113) 		16 9/7 96
11191 29b_10626 lGs;dAs;lTs;lTs;dTs;dCs;lAs;lAs;dAs;lTs;dGs;lGs;dTs;lGs;dCs;lTs
(SEQ ID NO: 114) 		16 9/7 82
이런 antimiR은 25mg/kg의 복용량으로 6-8주령 쥐들(Sprague Dawley rats)에 피하로 등쪽으로 주사하였다(그룹당 n = 4)). 주사 부피는 1.0mL이었다. 유사한 LNA 및 DNA 백분율(9/7)을 가진 대조군 올리고뉴클레오티드를 화학적 대조군으로 사용하였다. 이 분자 번호는 M-10591이며 예쁜꼬마선충(C. elegans) - 특이적 miRNA를 표적화하도록 설계되었다. 1회 복용 4일 후, 이 쥐들을 희생시키고 심장, 간 및 신장을 miRNA 억제, 표적 탈-억제 및 antimiR-분포 정량화를 포함하는 분자 분석을 위해 수집하였다. RNA를 심장, 간 및 신장 조직으로부터 분리하였고 실시간 PCR을 실행하였다. miR-29에 대해 설계된 모든 antimiR은 모든 조직에서 miR-29 패밀리 멤버의 현저한 억제를 나타내었고 이는 모든 antimiR이 이런 3개 조직에 전달되었음을 암시한다(도 4b).
miR-29 패밀리 억제가 인 비보 효과와 상관 있는지 측정하기 위해서, 실시간 PCR을 실행함으로써 miR-29 표적들, Mcl1 및 Dnmt3b를 탈-억제에 대해 평가하였다. 놀랍게도, 단지 M-11185가 심장에서 Mcl1의 현저한 탈억제 및 Dnmt3b의 경향성 있는 탈-억제를 나타내었고(도 4c), 심장에서 miR-208a, miR-208b 및 miR-378에 대해 최고 효과를 나타낸 동일한 LNA/DNA 모티프이다(도 1c, 2c 및 3c). 놀랍게도, 모든 antimiR-29 화합물은 간에서 Mcl1의 탈-억제를 나타내는 것으로 보였고, 이런 모티프가 심장 효과를 제공하는 반면 다른 화합물은 다른 조직에서 활성이라는 견해를 발전시킨다.
화합물들 사이의 효과 차이가 효과적인 분자에 대한 더 나은 심장 분포 때문인지를 측정하기 위해서, 모든 antimiR-29 화합물에 대한 심장 및 간으로의 antimiR 분포를 정량화하였다. ELISA-기반 분포 분석은 덜 효과적인 화합물과 비교된 가장 효과적인 화합물(M-11185)에 대해 더 나은 심장 존재를 나타내지 않았다. 효과가 화합물들 사이에서 비슷한 간 조직의 경우에, 분포 또한 유사하였다(도 4d).
실시예 5. AntimiR-199의 인 비보 효과.
이런 모티프가 추가 miRNA 패밀리에서 효과를 전달하는지를 측정하기 위해서 miR-208a 스크린에 대해 발견된 것과 유사한 LNA 및 DNA 배치를 가진 miR-199a에 대한 5개 antimiR(도 5a)을 합성하였다. 이들의 상응하는 예측된 Tm 값을 가진 이런 antimiR의 서열 및 변형 패턴은 아래 표 8에 나타낸 것과 같다(표기의 설명은 표 4에 기술된 것과 같다). M-10518 화합물은 M-10101(antimiR-208a), M-10707(antimiR-208b), M-11192(antimiR-378) 및 M-11185(antimiR-29)와 동일한 LNA 및 DNA 배치를 포함한다.
분자 # 별칭 서열 길이 LNA / DNA 예측된 Tm
10518 199a_10101 lGs;dTs;dAs;dGs;lTs;lCs;dTs;lGs;dAs;lAs;lCs;dAs;lCs;dTs;lGs;lGs
(SEQ ID NO: 115) 		16 9/7 93
11390 199a_10293 lGs;dTs;dAs;dGs;lTs;lCs;dTs;dGs;lAs;lAs;lCs;dAs;lCs;dTs;lGs;lGs
(SEQ ID NO: 116) 		16 9/7 92
11391 199a_10294 lGs;lTs;dAs;dGs;dTs;lCs;dTs;lGs;dAs;lAs;lCs;dAs;lCs;dTs;lGs;lGs
(SEQ ID NO: 117) 		16 9/7 86
11392 199a_10296 lGs;dTs;dAs;dGs;lTs;lCs;dTs;lGs;dAs;lAs;lCs;dAs;lCs;lTs;dGs;lGs
(SEQ ID NO: 118) 		16 9/7 92
11393 199a_10683 lGs;dTs;dAs;lGs;lTs;dCs;lTs;dGs;lAs;lAs;dCs;lAs;dCs;lTs;dGs;lGs
(SEQ ID NO: 119) 		16 9/7 86
이런 antimiR은 25mg/kg의 복용량으로 6-8주령 쥐들(Sprague Dawley rats)에 피하로 등쪽으로 주사하였다(그룹당 n = 4)). 주사 부피는 1.0mL이었다. 유사한 LNA 및 DNA 백분율(9/7)을 가진 대조군 올리고뉴클레오티드를 화학적 대조군으로 사용하였다. 이 분자 번호는 M-10591이며 예쁜꼬마선충(C. elegans) - 특이적 miRNA를 표적화하도록 설계되었다. 1회 복용 4일 후, 이 쥐들을 희생시키고 혈장을 간 및 신장 독물학 변수를 위해 수집하였다. 추가로, 심장, 폐, 간 및 신장을 miRNA 억제 및 표적 탈-억제를 포함하는 분자 분석을 위해 수집하였다. RNA를 심장, 폐, 간 및 신장 조직으로부터 분리하였고 실시간 PCR을 실행하였다. miR-199a에 대해 설계된 모든 antimiR은 모든 조직에서 miR-199a의 현저한 억제를 나타내었고 이는 모든 antimiR이 이런 4개 조직에 전달되었음을 암시한다(도 5b).
miR-199a 억제가 인 비보 효과와 상관 있는지 측정하기 위해서, 실시간 PCR을 실행함으로써 miR-199 표적, Ddr1을 탈-억제에 대해 평가하였다. 놀랍게도, miR-199a를 표적화하는 모든 antimiR은 심장에서 M-11390을 제외하고 Ddr1 표적 탈-억제를 나타내는 것으로 보였다(도 5c). 다른 조직들의 경우, 다른 화합물들은 변하는 정도의 표적 조절을 나타내었고, 그러나, M-10518(M-10101 모티프이다)은 일관되게 모든 조직에 대해 표적 탈-억제를 나타내는 것으로 보였고, 이는 이런 모티프가 인 비보 심장 및 여러 조직 효과를 전달하는 것을 암시한다.
실시예 6. AntimiR-92a의 인 비보 효과.
이런 모티프가 추가 miRNA 패밀리에서 효과를 전달하는지를 측정하기 위해서 miR-208a 스크린에 대해 발견된 것과 유사한 LNA 및 DNA 배치를 가진 miR-92a에 대한 3개 antimiR을 합성하였다. 이들의 상응하는 예측된 Tm 값을 가진 이런 antimiR의 서열 및 변형 패턴은 아래 표 9에 나타낸 것과 같다(표기의 설명은 표 4에 기술된 것과 같다). M-11127 화합물은 M-10101(antimiR-208a), M-10707(antimiR-208b), M-11192(antimiR-378), M-11185(antimiR-29) 및 M-10518(antimiR-199a)와 동일한 LNA 및 DNA 배치를 포함한다.
분자 # 별칭 서열 길이 LNA / DNA 예측된 Tm
10338 92a_LNA_16_PS lCs;dCs;lGs;dGs;dGs;lAs;dCs;lAs;dAs;lGs;lTs;dGs;lCs;lAs;dAs;lT
(SEQ ID NO: 120)		 16 9/7 85
11127 92a_LNA_16_1 lCs;dCs;dGs;dGs;lGs;lAs;dCs;lAs;dAs;lGs;lTs;dGs;lCs;dAs;lAs;lT
(SEQ ID NO: 121)		 16 9/7 89
11130 92a_LNA_16_4 lCs;dCs;lGs;dGs;dGs;lAs;dCs;dAs;lAs;lGs;lTs;dGs;lCs;lAs;dAs;lT
(SEQ ID NO: 122)		 16 9/7 86
이런 antimiR은 25mg/kg의 복용량으로 6-8주령 쥐들(Sprague Dawley rats)에 피하로 등쪽으로 주사하였다(그룹당 n = 4)). 주사 부피는 1.0mL이었다. 1회 복용 2일 후, 이런 쥐들을 희생시키고 심장으로부터의 내피 세포를 miRNA 억제 및 표적 탈-억제를 포함하는 분자 분석을 위해 수집하였다. RNA를 내피 세포로부터 분리하였고 실시간 PCR을 실행하여 miR-92a 표적, Map2K4의 탈-억제를 평가하였다. antimiR M-11127(M-10101 모티프이다)뿐만 아니라 antimiR M-11130의 투여는 내피 세포에서 Map2K4 발현에 현저한 증가를 초래하였고(도 6), 이는 이 두 억제제가 인 비보 효과를 갖는다는 것을 증명하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Miragen Therapeutics van Rooij, Eva Dalby, Christina M. Montgomery, Rusty L. <120> OLIGONUCLEOTIDE-BASED INHIBITORS COMPRISING LOCKED NUCLEIC ACID MOTIF <130> MIRG-036/02WO <150> US 61/801,533 <151> 2013-03-15 <150> US 61/662,746 <151> 2012-06-21 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 ucacagugaa ccggucucuu u 21 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 uuuggucccc uucaaccagc ug 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 uuuggucccc uucaaccagc ua 22 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 ucuacagugc acgugucucc ag 22 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 12 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 ugagaacuga auuccauggg uu 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 ugagaacuga auuccauagg cu 22 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 ucucccaacc cuuguaccag ug 22 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 aacauucauu gcugucggug ggu 23 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 uagcagcaca gaaauauugg c 21 <210> 21 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 uucaccaccu ucuccaccca gc 22 <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 cccaguguuc agacuaccug uuc 23 <210> 23 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 cccaguguuu agacuaucug uuc 23 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 acaguagucu gcacauuggu ua 22 <210> 25 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 auaagacgag caaaaagcuu gu 22 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 auaagacgaa caaaagguuu gu 22 <210> 27 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 uaaagugcuu auagugcagg uag 23 <210> 28 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 29 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 acagcaggca cagacaggca gu 22 <210> 30 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 31 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 agcuacaucu ggcuacuggg u 21 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 aucacauugc cagggauuuc c 21 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 uggcucaguu cagcaggaac ag 22 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 cauugcacuu gucucggucu ga 22 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 uucaaguaau ccaggauagg cu 22 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 uucaaguaau ucaggauagg u 21 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 aaggagcuca cagucuauug ag 22 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 41 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 uagcaccauu ugaaaucggu ua 22 <210> 43 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 44 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 uguaaacauc cuacacucag cu 22 <210> 45 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 uguaaacauc cuacacucuc agc 23 <210> 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locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> May be a phosphorothioate adenosine 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<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> May be a locked nucleic acid thymidine <400> 121 ccgggacaag tgcaat 16 <210> 122 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antimiR-92a oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> May be a phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> May be a locked nucleic acid thymidine <400> 122 ccgggacaag tgcaat 16

Claims (46)

16개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 서열은 miR-92a에 상보적이며 3개 이하의 연속된(contiguous) 잠금 핵산(LNA: locked nucleic acid)을 포함하고, 5' 말단부터 3' 말단까지 위치 1, 6, 10, 11, 13 및 16이 LNA이고, 올리고뉴클레오티드는 5'-lCs;dCs;lGs;dGs;dGs;lAs;dCs;lAs;dAs;lGs;lTs;dGs;lCs;lAs;dAs;lT-3' (SEQ ID NO: 120), 5'-lCs;dCs;dGs;dGs;lGs;lAs;dCs;lAs;dAs;lGs;lTs;dGs;lCs;dAs;lAs;lT-3' (SEQ ID NO: 121), 및 5'-lCs;dCs;lGs;dGs;dGs;lAs;dCs;dAs;lAs;lGs;lTs;dGs;lCs;lAs;dAs;lT-3' (SEQ ID NO: 122)로부터 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 비-잠금 뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비-잠금 뉴클레오티드는 2' 데옥시, 2' O-알킬 또는 2' 할로인 것인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 비-잠금 뉴클레오티드를 포함하고, 모든 비-잠금 뉴클레오티드는 2' 데옥시인 것인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
적어도 하나의 LNA는 2' 내지 4' 메틸렌 다리를 가지는 것인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 5' 캡 구조, 3' 캡 구조 또는 5' 및 3' 캡 구조를 가지는 것인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
제 6 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이의 결합이 모두 포스포로티오에이트-결합인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
펜던트 친유성 또는 친수성 그룹을 더 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 5'-lCs;dCs;lGs;dGs;dGs;lAs;dCs;lAs;dAs;lGs;lTs;dGs;lCs;lAs;dAs;lT-3' (SEQ ID NO: 120)인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 5'-lCs;dCs;dGs;dGs;lGs;lAs;dCs;lAs;dAs;lGs;lTs;dGs;lCs;dAs;lAs;lT-3' (SEQ ID NO: 121)인 올리고뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드는 5'-lCs;dCs;lGs;dGs;dGs;lAs;dCs;dAs;lAs;lGs;lTs;dGs;lCs;lAs;dAs;lT-3' (SEQ ID NO: 122)인 올리고뉴클레오티드.
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