UA116639C2

UA116639C2 - Способи лікування синдрому альпорта

Info

Publication number: UA116639C2
Application number: UAA201504453A
Authority: UA
Inventors: Джеремі Даффілд; Балкрішен Бхат; Дідре Маккенна
Original assignee: Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк.
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2013-08-10
Publication date: 2018-04-25
Also published as: MY183921A; JP2020073479A; WO2014058881A1; HUE045858T2; SG11201502748RA; EP2906698B1; KR20200118245A; IL262200A; ES2753174T3; IL237768B; CA2885605A1; KR20230136686A; TW201420120A; US20180298385A1; UY35069A; JP2018080190A; JP2015536301A; US20160319283A1; KR102349184B1; SI2906698T1

Abstract

Винахід належить до застосування модифікованого олігонуклеотиду в одержанні лікарського засобу для застосування в способі лікування синдрому Альпорта, який включає введення суб'єкту, що має синдром Альпорта або з підозрою на нього, модифікованого олігонуклеотиду, де модифікований олігонуклеотид складається з 12-25 зв'язаних нуклеозидів, і де нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду комплементарна miR-21

Description

(57) Реферат:

Винахід належить до застосування модифікованого олігонуклеотиду в одержанні лікарського засобу для застосування в способі лікування синдрому Альпорта, який включає введення суб'єкту, що має синдром Альпорта або з підозрою на нього, модифікованого олігонуклеотиду, де модифікований олігонуклеотид складається з 12-25 зв'язаних нуклеозидів, і де нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду комплементарна тік-21

Фігура 1

А. 12 ж 100 є 7 г з - 50 в 2 о. анти-тіК-21 Контроль ж р: 0,0008

В. те Соїбацяь «ре Сомаза- «анти-тік-21 15 -а М ж ж га - 10 ж ш рж 5

Ж 5 а 5 і 5 о о 7 4 б 8 1

Тижні

ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ

У даному документі забезпечені способи та композиції для лікування синдрому Альпорта.

ОПИС ВІДОМОГО РІВНЯ ТЕХНІКИ

Колаген ІМ типу, головний компонент базальної мембрани, являє собою сукупність із шести альфа-ланцюгів: колаген альфа-1 (ІМ типу), колаген альфа-2 (ІМ типу), колаген альфа-3 (ІМ типу), колаген альфа-4 (ІМ типу), колаген альфа-5 (ІМ типу) та колаген альфа-б (ІМ типу).

Ланцюги альфа-3, альфа-4 та альфа-6 колагену ІМ є основними компонентами колагенової сітки гломерулярної базальної мембрани (ЗВМ), яка здійснює важливу функцію фільтрації крові ниркою.

Синдром Альпорта являє собою спадкову форму захворювання нирок, за якої утворюється аномальний тип гломерулярної базальної мембрани, що призводить до інтерстиціального фіброзу, гломерулосклерозу та, у кінцевому результаті, втрати функції нирок. Захворювання також часто характеризується порушеннями слуху та аномаліями очей. Синдром Альпорта спричиняється мутацією СоіІ4аЗз, Соі4а4 або СоЇ4а5, які кодують ланцюги альфаз(ІМ), альфад(ІМ) та альфаб(ІМ) колагену ІМ типу, відповідно. Мутації гена Соі4аб5 у Х-хромосомі спричиняють Х-зчеплену форму синдрому Альпорта, на яку припадає 8595 всіх випадків захворювання. Аутосомно-рецесивна форма виникає внаслідок успадкування мутацій в кожній копії або Соі4а3, або СоІ4а4, кожний з яких розташований у хромосомі 2. Рідкісна аутосомно- домінантна форма виникає внаслідок успадкування домінантно-негативної мутації або гена

Соі4аз3, або СоІ4а4. Х-зчеплена форма є більш важкою у чоловіків, ніж у жінок, причому у чоловіків більшість випадків прогресує до термінальної стадії ниркової недостатності (ЕКО).

Аутосомна форма характеризується подібною важкістю у чоловіків та жінок. Більшість випадків захворювання виникає унаслідок спадкової мутації, але деякі випадки виникають унаслідок де помо мутації одного з генів Соі4аА.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

У даному документі забезпечені способи лікування синдрому Альпорта, які включають уведення суб'єктові що має синдром Альпорта або з підозрою на нього, модифікованого олігонуклеотиду, який складається з 12-25 зв'язаних нуклеозидів, де нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду комплементарна тік-21. У конкретних варіантах здійснення у

Зо суб'єкта був діагностований синдром Альпорта перед введенням модифікованого олігонуклеотиду. У конкретних варіантах здійснення перед введенням модифікованого олігонуклеотиду була визначена наявність підвищеного рівня тік-21 у тканині нирок суб'єкта. У конкретних варіантах здійснення перед введенням модифікованого олігонуклеотиду була визначена наявність підвищеного рівня тіВ-21 у сечі або крові суб'єкта.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, введення модифікованого олігонуклеотиду, комплементарного птік-21, суб'єктові що має синдром

Альпорта або з підозрою на нього, може поліпшити функцію нирок; відстрочити початок термінальної стадії ниркової недостатності; відстрочити час діалізу; відстрочити час трансплантації нирок та/або збільшити очікувану тривалість життя у суб'єкта.

Альпорта або з підозрою на нього, може знизити гематурію; відстрочити початок розвитку гематурії; знизити протеїнурію; відстрочити початок розвитку протеїнурії; знизити фіброз нирок; сповільнити подальше прогресування фіброзу та/"або припинити подальше прогресування фіброзу.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, суб'єкт може мати мутацію, вибрану з мутації гена, який кодує ланцюг альфа З колагену ІМ типу, мутацію гена, який кодує ланцюг альфа 4 колагену ІМ типу, або мутацію гена, який кодує ланцюг альфа 5 колагену ІМ типу. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт є чоловіком. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт є жінкою. У конкретних варіантах здійснення суб'єкта ідентифікують як такого, який має гематурію та/або протеїнурію. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт має знижену функцію нирок. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт потребує поліпшеної функції нирок.

Будь-який з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, може передбачати вимірювання рівня азоту сечовини в крові суб'єкта; вимірювання рівня креатиніну в крові суб'єктах вимірювання у суб'єкта кліренсу креатиніну; вимірювання у суб'єкта ступеня протеїнурії; вимірювання у суб'єкта співвідношення альбумін:креатинін та/або вимірювання у суб'єкта швидкості гломерулярної фільтрації.

Будь-який з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, може передбачати вимірювання рівня білка М-ацетил-В-О-глюкозамінідаза (МАС) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня бо білка ліпокалін, асоційованого з желатиназою нейтрофілів (МА), у сечі суб'єкта; вимірювання білка молекула ниркового ушкодження-! (КІМ-1) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня білка інтерлейкін-18 (І/-18) у сечі суб'єктах вимірювання рівнів моноцитарного хемоатрактантного білка (МСРІ) у сечі суб'єкта; вимірювання рівнів фактора росту сполучної тканини (СТО) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня фрагментів колагену ІМ (Со! ІМ) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня фрагментів колагену ПІ (Со! ІІ) у сечі суб'єкта та/або вимірювання рівнів білка подоцитів у сечі суб'єкта, де білок подоцитів вибраний з нефрину та подоцину. Будь-який з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, може передбачати вимірювання рівня цистатину С у крові суб'єкта; вимірювання рівня білка р-ігасе ргоїєїп (ВТР) у крові суб'єкта та вимірювання рівня 2- мікроглобуліну (В2М) у крові суб'єкта.

Будь-який зі способів, забезпечених у даному документі, може поліпшити один або декілька маркерів функції нирок, вибраних зі зниженого рівня азоту сечовини в крові суб'єкта; зниженого рівня креатиніну в крові суб'єкта; поліпшеного кліренсу креатиніну у суб'єкта; зниженої протеїнурії у суб'єктах; зниженого співвідношення альбумін:креатинін у суб'єкта та/або збільшеної швидкості гломерулярної фільтрації у суб'єкта. Будь-який зі способів, забезпечених у даному документі, може поліпшити один або декілька маркерів функції нирок у суб'єкта, вибраних зі зниженого рівня МАС у сечі суб'єкта; зниженого рівня МОАЇ у сечі суб'єкта; зниженого рівня КІМ-1 у сечі суб'єкта; зниженого рівня І/-18 у сечі суб'єкта; зниженого рівня

МСРІ у сечі суб'єкта; зниженого рівня СТОЕ у сечі суб'єкта; зниженого рівня фрагментів колагену ІМ у сечі суб'єкта; зниженого рівня фрагментів колагену І у сечі суб'єкта та знижених рівнів білка подоцитів у сечі суб'єкта, де білок подоцитів вибраний з нефрину та подоцину. Будь- який зі способів, забезпечених у даному документі, може поліпшити один або декілька маркерів функції нирок, вибраних зі зниженого рівня рівня цистатину С у крові суб'єкта; зниженого рівня білка Др-ігасе ргоївіп (ВТР) у крові суб'єкта та зниженого рівня 2-мікроглобуліну (В2М) у крові суб'єкта.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, протеїнурія являє собою альбумінурію. Альбумінурія може являти собою альбумінурію на верхній межі норми, мікроальбумінурію або макроальбумінурію.

У конкретних варіантах здійснення синдром Альпорта являє собою Х-зчеплену форму синдрому Альпорта. У конкретних варіантах здійснення синдром Альпорта являє собою

Зо аутосомну форму синдрому Альпорта.

Будь-який з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, може передбачати застосування щонайменше одного додаткового типу терапії, вибраного із застосування інгібітора ангіотензин-ІІ-перетворюючого ферменту (АСЕ), блокатора рецепторів ангіотензину ІЇ (АКВ), антигіпертензивного засобу, аналога вітаміну ЮО, перорального засобу, що зв'язує фосфати, діалізу та трансплантації нирки. У будь-яких із цих варіантів здійснення інгібітори ангіотензин-ІІ-перетворюючого ферменту (АСЕ) вибрані з каптоприлу, еналаприлу, лізиноприлу, беназеприлу, хінаприлу, фозиноприлу та раміприлу. У будь-яких із цих варіантів здійснення блокатори рецепторів ангіотензину ІІ (АКВ) вибрані з кандесартану, ірбесартану, олмесартану, лозартану, валсартану, телмісартану та епросартану. У будь-яких з цих варіантів здійснення інгібітор АСЕ вибраний з цилазаприлу, периндоприлу та трандолаприлу.

У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вводять при дозі в діапазоні від 0,5 до 1 мг/м2/доба, від 1 до 6 мг/м2/доба, від 1 до 2 мг/м-/доба, від 2 до 4 мг/ме"/доба або від 4 до 8 мг/м2/доба.

У конкретних варіантах здійснення АКВ вводять при дозі в діапазоні від 6,25 до 150 мг/м2/доба. У будь-яких з цих варіантів здійснення АКВ вводять при дозі 6,25 мг/ме/доба, 10 мг/м2/доба, 12,5 мг/м2/доба, 18,75 мг/м-/доба, 37,5 мг/мг/доба, 50 мг/м-/доба або 150 мг/м-/доба.

У конкретних варіантах здійснення щонайменше один додатковий тип терапії являє собою антагоніст альдостерону. У конкретних варіантах здійснення антагоніст альдостерону являє собою спіронолактон. У конкретних варіантах здійснення спіронолактон вводять при дозі в діапазоні від 10 до 35 мг щодня. У конкретних варіантах здійснення спіронолактон вводять при дозі 25 мг щодня.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду щонайменше на 9095 комплементарна, щонайменше на 9595 комплементарна або на 10095 комплементарна нуклеотидній послідовності тік-21 (З5ЕО ІО МО: 1).

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, модифікований олігонуклеотид складається з 8-30, 12-25 або 15-25 зв'язаних нуклеозидів. У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, модифікований олігонуклеотид складається з 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 зв'язаних нуклеозидів. У будь-якому з 60 варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, модифікований олігонуклеотид складається з 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 зв'язаних нуклеозидів.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, модифікований олігонуклеотид містить щонайменше один модифікований нуклеозид. Модифікований нуклеозид може бути вибраний із 5-СЕЇ-нуклеозиду, 2'-О-метоксіетилнуклеозиду та ІМА- нуклеозиду. Модифікований олігонуклеотид може містити щонайменше один модифікований міжнуклеозидний зв'язок. Кожний міжнуклеозидний зв'язок модифікованого олігонуклеотиду може являти собою модифікований міжнуклеозидний зв'язок. У конкретних варіантах здійснення модифікований міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, модифікований олігонуклеотид може мати структуру 5'-АєСзАТОвАСтТОвТаАОзААСсС»вТАв-3" (ЗЕО ІО МО: 3), де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-О-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2'-МОЕ-нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5-сСЕїнуклеозиди; і кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

У даному документі забезпечується застосування модифікованого олігонуклеотиду, який складається з 8-30, 12-25 або 15-25 зв'язаних нуклеозидів, де нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду комплементарна тік-21, для лікування синдрому Альпорта.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Фігура 1. Анти-тівй-21 поліпшує функцію нирок у мишей Соі4аЗ3-/-. Рівень азоту сечовини в крові (ВОМ) в момент часу 9 тижнів (А) та співвідношення альбумін/креатинін у сечі у тижні 3, 5, 7 та 9 (В). " вказує на статистичну значущість.

Фігура 2. Анти-тій-21 попереджає розвиток гломерулосклерозу у мишей Соі4аЗз-/-.

Гломерулосклероз оцінювали із використанням напівкількісного індексу склерозу в діапазоні від

О (відсутність склерозу) до 4 (виражений склероз) (п-10).

Фігура 3. Анти-тіВв-21 знижує фіброз у мишей Соідаз-/-. (А) Кількісне визначення фіброзу, зафарбованого у червоний колір із використанням пікросиріусу (сиріусу), у нирці (п-б) та (В) кількісна ПЛР для транскриптів СоІ1а1, нормалізованих відносно ЗАРОН (п-б). " вказує на статистичну значущість.

Зо Фігура 4. Анти-тій-21 знижує показник рангової оцінки ниркового ушкодження у мишей

Соі4аз-/-. (А) Ранговий показник ниркового ушкодження із використанням зрізів нирок у мишей віком 9 тижнів. (В) Відносна кількість гломерулярних серпоподібних утворень (п-5). (С) Кількісне визначення ушкодження ниркових канальців (п-5). " вказує на статистичну значущість.

Фігура 5. Анти-тій-21 знижує інфільтрацію макрофагів (А) та зменшує кількість міофібробластів (В) у мишей Соїі4аЗ3-/-. (А) Кількісне визначення Е4/80 з використанням барвника на зрізах нирок у мишей віком 9 тижнів (п-5). (В) Кількісне визначення ЧЗМА з використанням барвника на зрізах нирок у мишей віком 9 тижнів (п--5). " вказує на статистичну значущість.

Фігура 6. Анти-тіВ-21 знижує кількість реакційноздатних частинок кисню у мишей Соі4аз-/-. (А) Кількісне визначення перекису водню у сечі мишей СоіІ4а3-/-, яких обробляли анти-тіВв-21 або РВЗ-контролем (п-8; " вказує на статистичну значущість); (В) кількісне визначення ОЕЗ у тканині нирок мишей Соі4а3-/-, яких обробляли анти-тій-21 або РВЗ-контролем, та у мишей дикого типу (п-З на групу; "вказує на статистичну значущість).

Фігура 7. Анти-тів-21 збільшує кількість подоцитів у мишей СоіІ4аЗз3-/-. Кількісне визначення числа М/Т1-позитивних клітин у клубочку мишей Соі4а3-/-, яких обробляли анти-тів-21 або

РВ5-контролем (п-3; р-0,005).

Фігура 8. Анти-тів-21 збільшує тривалість життя мишей Соі4аЗз-/-. (А) Вага мишей СоіІ4аз-/-, яких обробляли анти-тів-21 або РВ5-контролем (р « 0,01); (В) тривалість життя мишей СоіІ4аз3- /-, яких обробляли анти-тів-21 або РВ5-контролем (р « 0,001).

Фігура 9. Анти-тіВв-21 поліпшує функцію нирок та збільшує тривалість життя мишей Соідаз-/- дозозалежним чином (п-10-13 на групу обробки). (А) Рівень азоту сечовини у крові в момент часу 7 тижнів; (В) тривалість життя мишей Соі4аз3-/-, яких обробляли анти-тів-21 при декількох дозах, один раз на тиждень (ОМ) або двічі на тиждень (ВІМУ), або РВ5-контролем.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

Якщо не зазначено інше, усі технічні та наукові терміни, використані в даному документі, мають те саме значення, яке звичайно розуміє фахівець у галузі техніки, до якої відноситься даний винахід. Якщо не наведені конкретні визначення, номенклатура, використовувана стосовно аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії та медичної і фармацевтичної хімії, а також їх способи і методики, описані у даному документі, добре відомі та широко 60 застосовуються в даній галузі техніки. У випадку, якщо в даному документі є декілька визначень термінів, перевагу мають визначення з даного розділу. Для хімічного синтезу, хімічного аналізу, одержання, складання та доставки фармацевтичних препаратів, а також лікування суб'єктів можна застосовувати стандартні методики. Такі конкретні методики та способи можна знайти, наприклад, в "Сагропуагаїе Моайісайноп5 іп Апіїзепхе Кезеагсп" за редакцією Запдмі та Соок,

Атегісап Спетісаї! Босієїу, Умазпіпдіоп О.С., 1994; та в "Кетіпдіоп'є Ріаптасешіса! зЗсіепсев, "

Маск Рибіїзніпа Со., Еавіоп, Ра., 18-е видання, 1990; і при цьому вони включені в даний документ за допомогою посилання для будь-яких цілей. У припустимих випадках усі патенти, заявки на патенти, опубліковані заявки та публікації, послідовності з СЕМВАМК, веб-сайти та інші опубліковані матеріали, на які посилаються по всьому повному розкриттю в даному документі, якщо не зазначено інше, включені за допомогою посилання у повному обсязі. Якщо посилання робиться на ШОКІ. або інший подібний ідентифікатор або адресу, то розуміють, що такі ідентифікатори можуть змінюватися, і конкретна інформація в інтернеті може змінюватися, але шляхом пошуку в інтернеті можна знайти еквівалентну інформацію. Посилання на неї свідчать про доступність та публічне поширення такої інформації.

Перед тим, як будуть розкриті та описані дані композиції та способи, слід розуміти, що термінологія, використана в даному документі, служить тільки для цілей опису конкретних варіантів здійснення та не призначена бути обмежувальною. Слід зазначити, що використані в описі та формулі винаходу, що додається, форми однини включають посилання на множину, якщо з контексту явно не випливає інше.

Визначення "Синдром Альпорта" означає спадкову форму захворювання нирок, за якої утворюється аномальний рівень гломерулярної базальної мембрани (ОВМ), що призводить до інтерстиціального фіброзу, гломерулосклерозу та, у кінцевому результаті, втрати функції нирок.

Захворювання також часто характеризується порушеннями слуху та аномаліями очей. "Гематурія" означає присутність еритроцитів у сечі. "Альбумінурія" означає присутність надлишкового альбуміну в сечі та без обмежень включає альбумінурію у межах норми, альбумінурію на верхній межі норми, мікроальбумінурію та макроальбумінурію. У нормі бар'єр проникності гломерулярної фільтрації, який складається з подоцитів, гломерулярної базальної мембрани та ендотеліальних клітин, запобігає витіканню

Зо сироваткового білка у сечу. Альбумінурія може відображати ушкодження гломерулярного бар'єра проникності. Альбумінурію можна розраховувати виходячи зі зразка сечі, одержаного за 24 години, зразка сечі, одержаного за ніч, або разового зразка сечі. "Альбумінурія на верхній межі норми" означає підвищену альбумінурію, яка характеризується (ї) екскрецією від 15 до «30 мг альбуміну у сечу за 24 години та/або (ії) співвідношенням альбумін/креатинін від 1,25 до «2,5 мг/ммоль (або від 10 до «20 мг/г) у чоловіків або від 1,75 до «3,5 мг/ммоль (або від 15 до «30 мг/г) у жінок. "Мікроальбумінурія" означає підвищену альбумінурію, яка характеризується (ї) екскрецією від ЗО до 300 мг альбуміну у сечу за 24 години та/або (ії) співвідношенням альбумін/креатинін від 2,5 до «25 мг/ммоль (або від 20 до «200 мг/г) у чоловіків або від 3,5 до «35 мг/ммоль (або від 30 до «300 мг/г) у жінок. "Макроальбумінурія" означає підвищену альбумінурію, яка характеризується екскрецією більше 300 мг альбуміну у сечу за 24 години та/або (ії) співвідношенням альбумін/креатинін 225 мг/ммоль (або »200 мг/г) у чоловіків або »35 мг/ммоль (або »300 мг/г) у жінок. "Співвідношення альбумін/креатинін" означає співвідношення альбуміну сечі (мг/дл) до креатиніну сечі (г/дл) та його виражають у вигляді мг/г. У конкретних варіантах здійснення співвідношення альбумін/креатинін можна розраховувати виходячи з разового зразка сечі та можна застосовувати для того, щоб оцінити екскрецію альбуміну протягом періоду 24 години. "Розрахована швидкість гломерулярної фільтрації (ес) або "швидкість гломерулярної фільтрації (ЗЕК)" означає вимірювання фільтрації креатиніну нирками і застосовується для того, щоб оцінити кількість крові, яка проходить через клубочки за хвилину. Результати у межах норми можуть знаходитися у діапазоні 90-120 мл/хв./1,73 м". Рівні нижче за 60 мл/хв.11,73 м? протягом З або більше місяців можуть вказувати на хронічне захворювання нирок. Рівні нижче за 15 мл/хв./1,73 м? можуть вказувати на ниркову недостатність. "Протеїнурія" означає присутність надлишку сироваткових білків у сечі. Протеїнурія може характеризуватися екскрецією » 250 мг білка в сечу за 24 години та/або співвідношенням білка у сечі до креатиніну 2 0,20 мг/мг. Сироваткові білки, рівень яких підвищений у зв'язку з протеїнурією, без обмеження включають альбумін. "Рівень азоту сечовини в крові" або "ВОМ" означає міру кількості азоту в крові у формі сечовини. У печінці сечовина утворюється в циклі сечовини у якості побічного продукту бо розщеплення білка, і при цьому сечовина видаляється з крові нирками. У нормі кров дорослої людини може містити 7-21 мг азоту сечовини на 100 мл (7-21 мг/дл) крові. Вимірювання азоту сечовини в крові використовують у якості показника здоров'я нирок. Якщо нирки не здатні видаляти сечовину з крові за нормальних умов, рівень ВИМ у суб'єкта підвищується. "Термінальна стадія ниркової недостатності (ЕЗКО)" означає повну або майже повну втрату функції нирок. "Порушена функція нирок" означає знижену функцію нирок у порівнянні з нормальною функцією нирок. "Фіброз" означає утворення або розвиток надлишкової фіброзної сполучної тканини в органі або тканині. У конкретних варіантах здійснення фіброз має місце як репаративний або реактивний процес. У конкретних варіантах здійснення фіброз має місце у відповідь на ураження або ушкодження. Вираз "фіброз" слід розуміти як утворення або розвиток надлишкової фіброзної сполучної тканини в органі або тканині в якості репаративного або реактивного процесу, на відміну від утворення фіброзної тканини як нормальної складової органа або тканини. "Сповільнює подальше прогресування" означає зниження швидкості, з якою медичне порушення змінюється до запущеного стану. "Припиняє подальше прогресування" означає зупинку прогресування медичного порушення до запущеного стану. "Відстрочувати час діалізу" означає підтримання достатньої функції нирок таким чином, що потреба в лікуванні за допомогою діалізу стає відстроченою. "Відстрочувати час трансплантації нирок" означає підтримання функції нирок таким чином, що потреба в нирці для трансплантації стає відстроченою. "Збільшує очікувану тривалість життя" означає продовження життя суб'єкта за допомогою лікування одного або декількох симптомів захворювання у суб'єкта. "Анти-тік" означає олігонуклеотид з нуклеотидною послідовністю, комплементарною мікроРНК. У конкретних варіантах здійснення анти-тії являє собою модифікований олігонуклеотид. "Анти-тів-Х", де "тік-Х" позначає конкретну мікроРНК, означає олігонуклеотид з нуклеотидною послідовністю, комплементарною тік-хХ. У конкретних варіантах здійснення анти-

Зо тів-Х повністю комплементарна (тобто на 10095 комплементарна) тік-Х. У конкретних варіантах здійснення анти-тів-Х щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956 або щонайменше на 9595 комплементарна тік-Х. У конкретних варіантах здійснення анти-тів-Х являє собою модифікований олігонуклеотид. "тів-21" означає зрілу мікро?Р НК із нуклеотидною послідовністю

ОДаСООАОСАСАСООСпАцС ОСА (5ЕО І МО: 1). "Послідовність тік-21 зі структурою типу стебло-петля" означає послідовність зі структурою типу стебло-петля Кк! нуклеотидною послідовністю оосасарАдаСООАОСАЧаАСОовАосСООпАСОвСООвпААОСОСАОааСААСАССАсСОСаАаИся

СОвОСОСсАСА (5ЕО ІО МО: 2). "Цільова нуклеїнова кислота" означає нуклеїнову кислоту, з якою призначено гібридизувати олігомерну сполуку. "Націлювання" означає процес конструювання та вибору нуклеотидної послідовності, яка буде гібридизуватися з цільовою нуклеїновою кислотою. "Націлений на" означає наявність нуклеотидної послідовності, яка дозволить здійснювати гібридизацію з цільовою нуклеїновою кислотою. "Модуляція" означає відхилення функції, кількості або активності. У конкретних варіантах здійснення модуляція означає збільшення функції, кількості або активності. У конкретних варіантах здійснення модуляція означає зменшення функції, кількості або активності. "Експресія" означає будь-які функції та етапи, завдяки яким інформація, яка кодується геном, перетворюється на структури, що присутні та функціонують в клітині. "Нуклеотидна послідовність" означає порядок суміжних нуклеїнових основ в олігомерній сполуці або нуклеїновій кислоті, як правило, перелічених в орієнтації 5'-3", незалежно від будь- якої модифікації цукрів, зв'язків та/або нуклеїнових основ. "Суміжні нуклеїнові основи" означають нуклеїнові основи, що безпосередньо прилягають одна до одної в нуклеїновій кислоті. "Комплементарність нуклеїнових основ" означає здатність двох нуклеїнових основ до нековалентного спарювання за допомогою утворення водневих зв'язків. "Комплементарний" означає, що одна нуклеїнова кислота здатна гібридизуватися з іншою нуклеїновою кислотою або олігонуклеотидом. У конкретних варіантах здійснення 60 комплементарний відноситься до олігонуклеотиду, здатного гібридизуватися із цільовою нуклеїновою кислотою. "Повністю комплементарний" означає, що кожна нуклеїнова основа олігонуклеотиду здатна утворювати пару з нуклеїновою основою в кожному відповідному положенні в цільовій нуклеїновій кислоті У конкретних варіантах здійснення олігонуклеотид повністю комплементарний мікроРНК, тобто кожна нуклеїнова основа олігонуклеотиду комплементарна нуклеїновій основі у відповідному положенні в мікроРНК. У конкретних варіантах здійснення олігонуклеотид, де кожна нуклеїнова основа є комплементарною нуклеїновій основі у ділянці послідовності мікроРНК зі структурою типу стебло-петля, повністю комплементарний послідовності мікроРНК зі структурою типу стебло-петля. "Процентна комплементарність" означає процентну частку нуклеїнових основ олігонуклеотиду, комплементарних частині цільової нуклеїнової кислоти, що має таку ж довжину. Процентну комплементарність обчислюють шляхом ділення числа нуклеїнових основ олігонуклеотиду, комплементарних нуклеїновим основам у відповідних положеннях у цільовий нуклеїновій кислоті, на загальне число нуклеїнових основ в олігонуклеотиді. "Процентна ідентичність" означає число нуклеїнових основ у першій нуклеїновій кислоті, ідентичних нуклеїновим основам у відповідних положеннях у другій нуклеїновій кислоті, поділене на загальне число нуклеїнових основ у першій нуклеїновій кислоті. У конкретних варіантах здійснення перша нуклеїнова кислота являє собою мікроРНК, і друга нуклеїнова кислота являє собою мікроРНК. У конкретних варіантах здійснення перша нуклеїнова кислота являє собою олігонуклеотид, і друга нуклеїнова кислота являє собою олігонуклеотид. "Гібридизувати" означає гібридизацію комплементарних нуклеїнових кислот, що відбувається в результаті комплементарності нуклеїнових основ. "Незбіжність" означає нуклеїнову основу першої нуклеїнової кислоти, нездатну утворювати пару з нуклеїновою основою у відповідному положенні другої нуклеїнової кислоти. "Ідентична" стосовно нуклеотидних послідовностей означає наявність такої ж нуклеотидної послідовності незалежно від модифікацій цукрів, зв'язків та/або нуклеїнових основ і незалежно від метильованого стану будь-яких присутніх піримідинів. "МікроРНК" означає ендогенну некодуючу РНК, що має довжину від 18 до 25 нуклеїнових основ, яка є продуктом розщеплення пре-мікроРНК за допомогою ферменту дайсер. Приклади зрілих мікроРНК знаходяться у базі о даних мікроРНК, відомій як тікКВавзе (пер://тісгогпа.запдег.ас.ик/). У конкретних варіантах здійснення мікроРНК скорочують як "мікроРНК" або "тів". "Пре-мікроР НК" або "пре-тік" означає некодуючу РНК, що має шпилькову структуру, яка є продуктом розщеплення при-тік за допомогою рибонуклеази, специфічної щодо дволанцюгових РНК, відомої як Ого5па. "Послідовність зі структурою типу стебло-петля" означає РНК, що має шпилькову структуру і містить послідовність зрілої мікроРНК. Послідовності пре-мікроРНК і послідовності зі структурами типу стебло-петля можуть перекриватися. Приклади послідовностей зі структурами типу стебло-петля знаходяться у базі даних мікроРНК, відомій як тікВазе (пер//тістотпа.запдег.ас.ик/). "При-мікроР НК" або "при-тік" означає некодуючу РНК, що має шпилькову структуру, яка є субстратом для рибонуклеази Ого5па, специфічної щодо дволанцюгових РНК. "Попередник мікроРНК" означає транскрипт, що походить від геномної ДНК та містить некодуючу структуровану РНК, яка містить одну або декілька послідовностей мікроРНК.

Наприклад, у конкретних варіантах здійснення попередник мікроРНК являє собою пре- мікроРНК. У конкретних варіантах здійснення попередник мікроРНК являє собою при-мікроР НК. "МікроРНК-регульований транскрипт" означає транскрипт, регульований за допомогою мікроРНК. "Послідовність затравки" означає нуклеотидну послідовність, що містить від 6 до 8 суміжних нуклеїнових основ з нуклеїнових основ 1-9 5-кінця послідовності зрілої мікроРНК. "Відповідна послідовності затравки" означає нуклеотидну послідовність, комплементарну послідовності затравки, та таку, що має однакову довжину з послідовністю затравки. "Олігомерна сполука" означає сполуку, що містить декілька зв'язаних мономерних субодиниць. Олігомерні сполуки включають олігонуклеотиди. "Олігонуклеотид" означає сполуку, що містить декілька зв'язаних нуклеозидів, кожний з яких може бути модифікованим або немодифікованим незалежно один від одного. "Міжнуклеозидний зв'язок, що зустрічається в природі" означає 3-5'-фосфодіефірний зв'язок між нуклеозидами. "Природний цукор" означає цукор, який виявляють в ДНК (2'-Н) або РНК (2'-ОН). бо "Міжнуклеозидний зв'язок" означає ковалентний зв'язок між суміжними нуклеозидами. (с;

"Зв'язані нуклеозиди" означають нуклеозиди, з'єднані за допомогою ковалентного зв'язку. "Нуклеїнова основа" означає гетероциклічний фрагмент, здатний до нековалентного спарювання з іншою нуклеїновою основою. "Нуклеозид" означає нуклеїнову основу, зв'язану із цукровим фрагментом. "Нуклеотид" означає нуклеозид, що має фосфатну групу, ковалентно зв'язану із цукровою частиною нуклеозиду. "Сполука, що містить модифікований олігонуклеотид, який складається з" ряду зв'язаних нуклеозидів, означає сполуку, що включає модифікований олігонуклеотид, який має встановлене число зв'язаних нуклеозидів. Таким чином, сполука може включати додаткові замісники або кон'югати. Якщо не зазначено інше, сполука не включає будь-які додаткові нуклеозиди, окрім нуклеозидів модифікованого олігонуклеотиду. "Модифікований олігонуклеотид" означає олігонуклеотид, що має одну або декілька модифікацій, що стосуються кінця, цукру, нуклеїнової основи та/або міжнуклеозидного зв'язку, що зустрічаються в природі. Модифікований олігонуклеотид може містити немодифіковані нуклеозиди. "Одноланцюговий модифікований олігонуклеотид" означає модифікований олігонуклеотид, що не гібридизується з комплементарним ланцюгом. "Модифікований нуклеозид" означає нуклеозид, що має будь-яку зміну в порівнянні з нуклеозидом, що зустрічається в природі. Модифікований нуклеозид може мати модифікований цукор і немодифіковану нуклеїнову основу. Модифікований нуклеозид може мати модифікований цукор і модифіковану нуклеїнову основу. Модифікований нуклеозид може мати природний цукор і модифіковану нуклеїнову основу. У конкретних варіантах здійснення модифікований нуклеозид являє собою біциклічний нуклеозид. У конкретних варіантах здійснення модифікований нуклеозид являє собою нуклеозид, який відрізняється від біциклічного. "Модифікований міжнуклеозидний зв'язок" означає будь-яку зміну в порівнянні з міжнуклеозидним зв'язком, що зустрічається в природі. "Фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок" означає зв'язок між нуклеозидами, де один з немісткових атомів є атомом сірки.

Зо "Модифікований цукровий фрагмент" означає заміщення та/або будь-яку зміну в порівнянні із природним цукром. "Немодифікована нуклеїнова основа" означає гетероциклічні основи РНК або ДНК, що зустрічаються в природі, пуринові основи аденін (А) та гуанін (С) і піримідинові основи тимін (Т), цитозин (С) (включаючи 5-метилцитозин) та урацил (). "Б-метилцитозин" означає цитозин, що містить метильну групу, приєднану до положення 5. "Неметильований цитозин" означає цитозин, що не має метильної групи, приєднаної до положення 5. "Модифікована нуклеїнова основа" означає будь-яку нуклеїнову основу, що не є немодифікованою нуклеїновою основою. "Цукровий фрагмент" означає фуранозил, що зустрічається в природі, або модифікований цукровий фрагмент. "Модифікований цукровий фрагмент" означає заміщений цукровий фрагмент або замінник цукру. "2'-ЮО-метиловий цукор" або "2'ОМе-цукор" означає цукор, що має О-метилову модифікацію в 2-положенні. "2'-О-метоксіетиловий цукор" або "2'-МОЕ-цукор" означає цукор, що має О-метоксіетилову модифікацію в 2'- положенні. "2'-фтор" або "2-Е" означає цукор, що має модифікацію фтором в 2'-положенні. "Біциклічний цукровий фрагмент" означає модифікований цукровий фрагмент, що містить 4- 7--ленне кільце (включаючи без обмежень фуранозил), яке містить місток, що з'єднує два атоми 4-7-членного кільця з утворенням другого кільця, що дає в результаті біциклічну структуру. У конкретних варіантах здійснення 4-7-ч-ленне кільце є кільцем цукру. У конкретних варіантах здійснення 4-7-ч-ленне кільце являє собою фуранозил. У таких конкретних варіантах здійснення місток з'єднує 2-вуглець і 4-вуглець фуранозилу. Необмежуючі ілюстративні біциклічні цукрові фрагменти включають І МА, ЕМА, сЕїЇ, 5-СЕїЇ та Б-сЕЇї. "Цукровий фрагмент закритої нуклеїнової кислоти (МА)" означає заміщений цукровий фрагмент, що містить місток (СНг»г)-О між 4" і 2" атомами кільця фуранози. "Цукровий фрагмент ЕМА" означає заміщений цукровий фрагмент, що містить місток (СНг)»-

О між 4" і 2" атомами кільця фуранози. бо "Цукровий фрагмент із закріпленим етилом (СЕ) означає заміщений цукровий фрагмент,

який містить місток СН(СНЗз)-О між 4" і 2" атомами кільця фуранози. У конкретних варіантах здійснення місток СН(СНз)-О закріплений в 5-орієнтації. У конкретних варіантах здійснення (СНег)2-О закріплений в К-орієнтації. "Цукровий фрагмент 5-СЕРК означає заміщений цукровий фрагмент, що містить 9- закріплений місток СН(СНЗз)-О між 4" і 2" атомами кільця фуранози. "Цукровий фрагмент К-СЕК означає заміщений цукровий фрагмент, що містить К- закріплений місток СН(СНЗ)-О між 4" і 2" атомами кільця фуранози. "2'-О-метилнуклеозид" означає 2'-модифікований нуклеозид, що має 2'-О-метилову модифікацію цукру. "2-О-метоксіетилнуклеозид" означає 2'-модифікований нуклеозид, що має 2-0- метоксіетилову модифікацію цукру. 2'-О-метоксіетилнуклеозид може містити модифіковану або немодифіковану нуклеїнову основу. "2і-фторнуклеозид" означає 2'-модифікований нуклеозид, що має 2'-фтормодифікацію цукру. 2-фторнуклеозид може містити модифіковану або немодифіковану нуклеїнову основу. "Біциклічний нуклеозид" означає 2'- модифікований нуклеозид, що має біциклічний цукровий фрагмент. Біциклічний нуклеозид може мати модифіковану або немодифіковану нуклеїнову основу. "сСБі-нуклеозид" означає нуклеозид, що містить цукровий фрагмент СЕЇ. сСЕЇ-нуклеозид може містити модифіковану або немодифіковану нуклеїнову основу. "5-СЕЇ-нуклеозид" означає нуклеозид, що містить цукровий фрагмент З5-СЕЇ. "А-СБі-нуклеозид" означає нуклеозид, що містить цукровий фрагмент К-сСЕЇї. «В-О-дезоксирибонуклеозид" означає ДНК-нуклеозид, що зустрічається в природі. «В-О-рибонуклеозид" означає РНК-нуклеозид, що зустрічається в природі. "'ГМА-нуклеозид" означає нуклеозид, що містить цукровий фрагмент І МА. "ЕМА-нуклеозид" означає нуклеозид, що містить цукровий фрагмент ЕМА. "Суб'єкт" означає людину або тварину, відмінну від людини, відібрану для лікування або терапії. "Суб'єкт, що потребує цього" означає суб'єкта, якого ідентифікують як такого, який потребує терапії або лікування.

Зо "Суб'єкт, що імовірно має" означає суб'єкта, у якого проявляється один або декілька клінічних індикаторів захворювання. "Введення" означає надання суб'єктові фармацевтичного засобу або композиції та включає, без обмежень, уведення медичним працівником і самостійне введення. "Парентеральне введення" означає введення за допомогою ін'єкції або інфузії.

Парентеральне введення включає, без обмежень, підшкірне введення, внутрішньовенне введення та внутрішньом'язове введення. "Підшкірне введення" означає введення безпосередньо під шкіру. "Внутрішньовенне введення" означає введення у вену. "Що вводяться одночасно" відноситься до спільного введення двох або більше засобів будь- яким способом, за якого фармакологічні ефекти обох проявляються у пацієнта в один і той же час. При одночасному введенні не потрібно, щоб обидва засоби вводили в одній фармацевтичній композиції, в одній і тій же лікарській формі або одним і тим же шляхом уведення. Не потрібно, щоб ефекти обох засобів проявлялися в один і той же час. Потрібно тільки, щоб ефекти перекривалися протягом певного періоду часу, і не потрібно, щоб вони були однакової протяжності в часі. "Тривалість" означає період часу, протягом якого триває активність або подія. У конкретних варіантах здійснення тривалість лікування являє собою період часу, протягом якого вводять дози фармацевтичного засобу або фармацевтичної композиції. "Терапія" означає спосіб лікування захворювання. У конкретних варіантах здійснення терапія включає без обмежень хіміотерапію, променеву терапію або введення фармацевтичного засобу. "Лікування" означає застосування однієї або декількох конкретних процедур, застосовуваних для лікування або полегшення перебігу захворювання. У конкретних варіантах здійснення конкретна процедура являє собою введення одного або декількох фармацевтичних засобів. "Полегшення перебігу" означає зменшення тяжкості щонайменше одного індикатора стану або захворювання. У конкретних варіантах здійснення полегшення перебігу включає відстрочку або вповільнення прогресування одного або декількох індикаторів стану або захворювання.

Тяжкість індикаторів може визначатися за допомогою суб'єктивних або об'єктивних заходів, відомих фахівцям у даній галузі техніки. бо "З підвищеним ризиком розвитку" означає статус, при якому суб'єкт схильний до розвитку стану або захворювання. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт з підвищеним ризиком розвитку стану або захворювання проявляє один або декілька симптомів стану або захворювання, але не проявляє достатнього числа симптомів, щоб у нього можна було діагностувати стан або захворювання. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт з підвищеним ризиком розвитку стану або захворювання проявляє один або декілька симптомів стану або захворювання, але меншою мірою, ніж потрібно для діагностування стану або захворювання. "Попередити початок" означає попередити розвиток стану або захворювання у суб'єкта з підвищеним ризиком розвитку захворювання або стану. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт з підвищеним ризиком розвитку захворювання або стану одержує лікування, подібне лікуванню, яке одержує суб'єкт, у якого вже є захворювання або стан. "Відстрочити початок" означає відстрочити розвиток стану або захворювання у суб'єкта з підвищеним ризиком розвитку захворювання або стану. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт з підвищеним ризиком розвитку захворювання або стану одержує лікування, подібне лікуванню, яке одержує суб'єкт, у якого вже є захворювання або стан. "Терапевтичний засіб" означає фармацевтичний засіб, застосовуваний для лікування, полегшення перебігу або попередження захворювання. "Доза" означає встановлену кількість фармацевтичного засобу, передбачену в одному введенні. У конкретних варіантах здійснення дозу можна вводити у двох або більше болюсах, таблетках або ін'єкціях. Наприклад, у конкретних варіантах здійснення, де необхідне підшкірне введення, для необхідної дози потрібний об'єм, який нелегко надати за допомогою однієї ін'єкції. У таких варіантах здійснення можна застосовувати дві або більше ін'єкцій для досягнення необхідної дози. У конкретних варіантах здійснення дозу можна вводити у двох або більше ін'єкціях для того, щоб звести до мінімуму реакцію в місці ін'єкції у індивіда. У конкретних варіантах здійснення дозу вводять за допомогою повільної інфузії. "Одиниця дозування" означає форму, у якій забезпечений фармацевтичний засіб. У конкретних варіантах здійснення одиниця дозування являє собою флакон, що містить ліофілізований олігонуклеотид. У конкретних варіантах здійснення одиниця дозування являє собою флакон, що містить відновлений олігонуклеотид. "Терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості фармацевтичного засобу, що

Зо забезпечує терапевтичну користь тварині. "Фармацевтична композиція" означає суміш речовин, придатну для введення індивідові, що включає фармацевтичний засіб. Наприклад, фармацевтична композиція може містити стерильний водний розчин. "Фармацевтичний засіб" означає речовину, що забезпечує терапевтичний ефект при введенні суб'єктові. "Активний фармацевтичний інгредієнт" означає речовину у фармацевтичній композиції, що забезпечує необхідний ефект. "Поліпшена функція органа" означає зміну функції органа убік нормального діапазону значень. У конкретних варіантах здійснення функцію органа визначають шляхом вимірювання рівня молекул, що виявляються в крові або сечі суб'єкта. Наприклад, у конкретних варіантах здійснення поліпшену функцію нирок визначають за зниженням рівня азоту сечовини в крові, зниженням протеїнурії, зниженням альбумінурії і т.п. "Прийнятний профіль безпеки" означає картину побічних ефектів, що перебуває в клінічно прийнятних межах. "Побічний ефект" означає фізіологічну відповідь, пов'язану з лікуванням, відмінну від необхідних ефектів. У конкретних варіантах здійснення побічні ефекти включають, без обмежень, реакції в місці ін'єкції, аномалії функціональних проб печінки, аномалії ниркової функції, гепатотоксичність, нефротоксичність, аномалії центральної нервової системи та види міопатії. Такі побічні ефекти можна виявити прямо або опосередковано. Наприклад, підвищені рівні амінотрансферази в сироватці можуть вказувати на гепатотоксичність або аномалію функції печінки. Наприклад, підвищений рівень білірубіну може вказувати на гепатотоксичність або аномалію функції печінки. "Дотримання суб'єктом схеми лікування" означає дотримання суб'єктом вказівок щодо рекомендованої або призначеної терапії. "Додержуватися припису" означає дотримання суб'єктом вказівок щодо рекомендованої терапії. "Рекомендована терапія" означає лікування, рекомендоване медичним працівником для лікування, полегшення перебігу або попередження захворювання.

Вираз "кров", використовуваний у даному документі, охоплює цільну кров та фракції крові, 60 наприклад, сироватку та плазму.

Огляд "Синдром Альпорта" являє собою спадкову форму захворювання нирок, за якої утворюється аномальний рівень гломерулярної базальної мембрани (СВМ), що призводить до інтерстиціального фіброзу, гломерулосклерозу та, як правило, призводить до термінальної стадії ниркової недостатності. При терапії синдрому Альпорта первинною метою лікування є підтримання функції нирок та попередження початку розвитку термінальної стадії ниркової недостатності (ЕБКО), що, у свою чергу, збільшує очікувану тривалість життя суб'єктів з синдромом Альпорта.

Синдром Альпорта характеризується фіброзом, що прогресує, внаслідок порушень структури СВМ, таким чином, поліпшення морфології та функції ВМ є необхідними. У даному документі продемонстрували, що модифікований олігонуклеотид, націлений на тпік-21, поліпшує функцію нирок в експериментальній моделі синдрому Альпорта. Крім того, знижується вираженість гломерулосклерозу та фіброзу після обробки анти-тій-21. Також у даному документі продемонстрували, що анти-тів-21 поліпшує виживання в експериментальній моделі синдрому Альпорта. Тому дані модифіковані олігонуклеотиди, націлені на тік-21, придатні для лікування синдрому Альпорта.

Конкретні шляхи застосування даного винаходу

У даному документі забезпечені способи лікування синдрому Альпорта, які включають уведення суб'єктові що має синдром Альпорта або з підозрою на нього, модифікованого олігонуклеотиду, комплементарного іпік-21.

У конкретних варіантах здійснення у суб'єкта був діагностований синдром Альпорта перед введенням модифікованого олігонуклеотиду. Діагноз синдром Альпорта можна встановити за допомогою оцінки параметрів, включаючи, без обмежень, сімейний анамнез суб'єкта, клінічні ознаки (включаючи, без обмежень, протеїнурію, альбумінурію, гематурію, порушену СЕК, глухоту та/або зміни очей) та результати біопсії тканини. Зразки із біопсії нирок можна тестувати на присутність або відсутність ланцюгів альфа-3, альфа-4 та альфа-5 колагену ІМ типу. Крім того, структурні зміни в клубочку можна виявляти за допомогою електронної мікроскопії матеріалу з біопсії нирок. Зразки із біопсії шкіри можна тестувати на присутність ланцюга альфа-5 колагену ЇМ типу, який у нормі присутній у шкірі та звичайно відсутній у суб'єктів

Зо чоловічої статі з Х-зчепленою формою синдрому Альпорта. Встановлення діагнозу синдром

Альпорта також може передбачати скринінг щодо мутацій одного або декількох генів СоїЇ4аз,

Соі4а4 або Сода.

У конкретних варіантах здійснення рівні тік-21 підвищуються у нирці суб'єкта, що має синдром Альпорта. У конкретних варіантах здійснення перед введенням визначають, що суб'єкт має підвищений рівень тік-21 у нирці. Рівні тік-21 можна вимірювати виходячи з матеріалу з біопсії нирок. У конкретних варіантах здійснення перед введенням визначають, що суб'єкт має підвищений рівень тівВ-21 у сечі або крові суб'єкта.

У конкретних варіантах здійснення введення модифікованого олігонуклеотиду, комплементарного тік-21, приводить до одного або декількох сприятливих клінічних результатів. У конкретних варіантах здійснення введення поліпшує функцію нирок. У конкретних варіантах здійснення введення відстрочує початок розвитку термінальної стадії ниркової недостатності. У конкретних варіантах здійснення введення відстрочує час діалізу. У конкретних варіантах здійснення введення відстрочує час трансплантації нирок. У конкретних варіантах здійснення застосування збільшує очікувану тривалість життя суб'єкта.

У конкретних варіантах здійснення введення знижує фіброз нирок. У конкретних варіантах здійснення введення сповільнює подальше прогресування фіброзу нирок. У конкретних варіантах здійснення введення припиняє подальше прогресування фіброзу нирок. У конкретних варіантах здійснення застосування знижує гематурію. У конкретних варіантах здійснення застосування відстрочує початок розвитку гематурії. У конкретних варіантах здійснення застосування знижує протеїнурію. У конкретних варіантах здійснення застосування відстрочує початок розвитку протеїнурії.

Суб'єкт, що має синдром Альпорта або з підозрою на нього, може мати мутацію гена, який кодує ланцюг альфа З колагену ІМ типу (СоіІ4аЗ3), мутацію гена, який кодує ланцюг альфа 4 колагену ЇМ типу (СоІ4а4), або мутацію гена, який кодує ланцюг альфа 5 колагену ІМ типу (Соіа5). У конкретних варіантах здійснення суб'єкт є чоловіком. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт є жінкою.

У конкретних варіантах здійснення суб'єкт має порушення функції нирок. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт потребує поліпшеної функції нирок. У конкретних варіантах здійснення суб'єкта ідентифікують як такого, який має порушення функції нирок. У конкретних бо варіантах здійснення суб'єкта ідентифікують як такого, який має гематурію. У конкретних варіантах здійснення суб'єкта ідентифікують як такого, який має протеїнурію.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, щодо суб'єкта можна здійснювати певні дослідження для оцінки функції нирок. Такі дослідження включають без обмеження вимірювання рівня азоту сечовини в крові суб'єкта; вимірювання рівня креатиніну в крові суб'єкта; вимірювання кліренсу креатиніну в крові суб'єкта; вимірювання у суб'єкта ступеня протеїнурії; вимірювання у суб'єкта співвідношення альбумін:креатинін; вимірювання у суб'єкта швидкості гломерулярної фільтрації та вимірювання у суб'єкта кількості виділеної сечі.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, білки, присутні у сечі або крові, можна використовувати для оцінки функції нирок. Такі дослідження включають без обмеження вимірювання рівня білка М-ацетил-В-ЮО-глюкозамінідаза (МАС) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня білка ліпокалін, асоційованого з желатиназою нейтрофілів (МСА), у сечі суб'єктах; вимірювання білка молекула ниркового ушкодження-! (КІМ-1) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня білка інтерлейкін-18 (ІІ -18) у сечі суб'єкта; вимірювання рівнів фактора росту сполучної тканини (СТОР) у сечі суб'єкта; вимірювання рівнів моноцитарного хемоатрактантного білка 1 (МСРІ) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня фрагментів колагену ІМ (Со! ІМ) у сечі суб'єкта; вимірювання рівнів фрагментів колагену ПІ (Со! ПІ) у сечі суб'єкта; вимірювання рівня цистатину

С у крові суб'єкта; вимірювання рівня білка р-ігасе ргоївїп (ВТР) у крові суб'єкта та вимірювання рівня 2-мікроглобуліну (В2М) в крові суб'єкта. У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, маркери ушкодження подоцитів можна вимірювати у сечі. Такі білки включають нефрин та подоцин. Кількісний аналіз білків, наприклад, за допомогою ферментного імуносорбентного аналізу (ЕГІЗА) або радіоіїмуноаналізу (КІА) із використанням комерційно доступних наборів.

У будь-якому з варіантів здійснення, забезпечених у даному документі, введення модифікованого олігонуклеотиду, націленого на тік-21, поліпшує один або декілька маркерів функції нирок у суб'єкта. Поліпшення маркерів функції нирок включають без обмеження знижений рівень азоту сечовини в крові суб'єкта; знижений рівень креатиніну в крові суб'єкта; поліпшений кліренс креатиніну у суб'єктах; знижену протеїнурію у суб'єкта; знижене співвідношення альбумін:креатинін у суб'єкта; збільшену швидкість гломерулярної фільтрації у суб'єкта та підвищену кількість виділеної сечі у суб'єкта.

Конкретні додаткові типи терапії

Способи лікування синдрому Альпорта або будь-якого зі станів, перерахованих у даному документі, можуть включати застосування більше одного типу терапії. Відповідно, у конкретних варіантах здійснення в даному документі забезпечені способи лікування суб'єкта, що має синдром Альпорта або з підозрою на нього, які включають застосування щонайменше одного типу терапії на додаток до введення модифікованого олігонуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну тік-21.

У конкретних варіантах здійснення щонайменше один додатковий тип терапії включає фармацевтичний засіб.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають блокатори рецепторів ангіотензину ІІ (АКВ). У конкретних варіантах здійснення блокатор рецепторів ангіотензину ЇЇ являє собою кандесартан, ірбесартан, олмесартан, лозартан, валсартан, телмісартан або епросартан.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають інгібітори ангіотензин-

ІІ-перетворюючого ферменту (АСЕ). У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ являє собою каптоприл, еналаприл, лізиноприл, беназеприл, хінаприл, фозиноприл або раміприл.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою антигіпертензивний засіб. Антигіпертензивні засоби застосовують для регуляції тиску крові у суб'єкта.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою аналог вітаміну 0.

Аналоги вітаміну ЮО можна застосовувати для обмеження утворення паратироїдного гормона у суб'єкта.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою пероральний засіб, що зв'язує фосфати, який знижує всмоктування фосфатів, що надходять з їжею.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають імуносупресивні засоби. У конкретних варіантах здійснення імуносупресивний засіб являє собою кортикостероїд, циклофосфамід або мікофенолату мофетил.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою циклоспорин, інгібітор НМО-коензиму А, інгібітор вазопептидази або антагоніст ТОЕ-бета.

У конкретних варіантах здійснення додатковий тип терапії являє собою генну терапію. У конкретних варіантах здійснення генна терапія забезпечує нормальний ген Соі4аз. У конкретних бо варіантах здійснення генна терапія забезпечує нормальний ген СоіІ4а4. У конкретних варіантах здійснення генна терапія забезпечує нормальний ген Соїі4а5.

У конкретних варіантах здійснення додатковий тип терапії являє собою діаліз. У конкретних варіантах здійснення додатковий тип терапії являє собою трансплантацію нирок.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають протизапальні засоби.

У конкретних варіантах здійснення протизапальний засіб являє собою стероїдний протизапальний засіб. У конкретних варіантах здійснення стероїдний протизапальний засіб являє собою кортикостероїд. У конкретних варіантах здійснення кортикостероїд являє собою преднізон. У конкретних варіантах здійснення протизапальний засіб являє собою нестероїдний протизапальний лікарський засіб. У конкретних варіантах здійснення нестероїдний протизапальний засіб являє собою ібупрофен, інгібітор СОХ-І або інгібітор СОХ-2.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою фармацевтичний засіб, який блокує одну або декілька відповідей на фіброгенні сигнали.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають протидіабетичний засіб. Протидіабетичні засоби включають без обмеження бігуаніди, інгібітори глюкозидази, інсуліни, сульфонілсечовини та тіазолідендіони.

Конкретні нуклеотидні послідовності мікроРНнК

Модифіковані олігонуклеотиди, описані у даному документі, мають нуклеотидну послідовність, комплементарну тік-21 (5ЕО ІЮ МО: 1) або її попередникові (ЗЕО ІЮ МО: 2). У конкретних варіантах здійснення кожна нуклеїнова основа модифікованого олігонуклеотиду здатна піддаватися спарюванню основ з нуклеїновою основою в кожному відповідному положенні в нуклеотидній послідовності тік-21 або її попередника. У конкретних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду може мати одну або декілька пар основ з порушенням комплементарності стосовно нуклеотидної послідовності тік- 21 або послідовності попередника і залишається здатною гібридизуватися з її цільовою послідовністю.

Оскільки послідовність тік-21 міститься в послідовності попередника тік-21, модифікований олігонуклеотид, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну тік-21, також комплементарний ділянці попередника тік-21.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з числа зв'язаних нуклеозидів, яке дорівнює довжині тік-21.

У конкретних варіантах здійснення число зв'язаних нуклеозидів модифікованого олігонуклеотиду менше довжини тік-21. Модифікований олігонуклеотид із числом зв'язаних нуклеозидів, яке менше довжини Ітій-21, де кожна нуклеїнова основа модифікованого олігонуклеотиду є комплементарною кожній нуклеїновій основі у відповідному положенні тік- 21, вважається модифікованим олігонуклеотидом з нуклеотидною послідовністю, яка повністю комплементарна ділянці послідовності ітік-21. Наприклад, модифікований олігонуклеотид, що складається з 19 зв'язаних нуклеозидів, де кожна нуклеїнова основа комплементарна відповідному положенню тік-21, яка має довжину 22 нуклеїнові основи, є повністю комплементарним ділянці тікК-21 довжиною 19 нуклеїнових основ. Такий модифікований олігонуклеотид характеризується 100 95 комплементарністю до частини ітік-21 довжиною 19 нуклеїнових основ та вважається на 100 95 комплементарним тік-21.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид містить нуклеотидну послідовність яка є комплементарною послідовності затравки, тобто модифікований олігонуклеотид містить послідовність, відповідну послідовності затравки. У конкретних варіантах здійснення послідовність затравки являє собою послідовність затравки з шести нуклеїнових основ. У таких конкретних варіантах здійснення послідовність затравки є нуклеїновими основами 1-6 тінв-21. У таких конкретних варіантах здійснення послідовність затравки є нуклеїновими основами 2-7 тіВ-21. У таких конкретних варіантах здійснення послідовність затравки є нуклеїновими основами 3-8 тів-21. У конкретних варіантах здійснення послідовність затравки являє собою послідовність затравки із семи нуклеїнових основ. У таких конкретних варіантах здійснення послідовність затравки із семи нуклеїнових основ є нуклеїновими основами 1-7 тів-21. У таких конкретних варіантах здійснення послідовність затравки із семи нуклеїнових основ є нуклеїновими основами 2-8 тіВ-21. У конкретних варіантах здійснення послідовність затравки являє собою послідовність затравки із восьми нуклеїнових основ. У таких конкретних варіантах здійснення послідовність затравки із восьми нуклеїнових основ є нуклеїновими основами 1-8 тіВ-21. У конкретних варіантах здійснення послідовність затравки із восьми нуклеїнових основ є нуклеїновими основами 2-9 тів-21.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид має нуклеотидну послідовність з однією незбіжністю стосовно нуклеотидної послідовності тік-21 або її бо попередника. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид має нуклеотидну послідовність з двома незбіжностями стосовно нуклеотидної послідовності тік-21 або її попередника. У таких конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид має нуклеотидну послідовність з не більш ніж двома незбіжностями стосовно нуклеотидної послідовності тік-21 або її попередника. У таких конкретних варіантах здійснення незбіжні нуклеїнові основи є суміжними. У таких конкретних варіантах здійснення незбіжні нуклеїнові основи не є суміжними.

У конкретних варіантах здійснення число зв'язаних нуклеозидів модифікованого олігонуклеотиду більше довжини тік-21. У таких конкретних варіантах здійснення нуклеїнова основа додаткового нуклеозиду є комплементарною нуклеїновій основі послідовності тік-21 зі структурою типу стебло-петля. У конкретних варіантах здійснення число зв'язаних нуклеозидів модифікованого олігонуклеотиду на одну одиницю більше довжини тік-21. У таких конкретних варіантах здійснення додатковий нуклеозид перебуває на 5'-кінці олігонуклеотиду. У таких конкретних варіантах здійснення додатковий нуклеозид перебуває на 3'-кінці олігонуклеотиду. У конкретних варіантах здійснення число зв'язаних нуклеозидів модифікованого олігонуклеотиду на дві одиниці більше довжини тік-21. У таких конкретних варіантах здійснення два додаткові нуклеозиди перебувають на 5'-кінці олігонуклеотиду. У таких конкретних варіантах здійснення два додаткові нуклеозиди перебувають на 3'-кінці олігонуклеотиду. У таких конкретних варіантах здійснення один додатковий нуклеозид розташований на 5'-кінці, і один додатковий нуклеозид розташований на 3'-кінці олігонуклеотиду. У конкретних варіантах здійснення ділянка олігонуклеотиду може бути повністю комплементарною нуклеотидній послідовності тік-21, але весь модифікований олігонуклеотид не є повністю комплементарним тік-21. Наприклад, модифікований олігонуклеотид, що складається з 24 зв'язаних нуклеозидів, де кожна нуклеїнова основа нуклеозидів 1-22 комплементарна відповідному положенню тік-21, яка має довжину 22 нуклеїнові основи, має частину з 22 нуклеозидів, яка є повністю комплементарною нуклеотидній послідовності птік-21 і характеризується приблизно 9295 загальною комплементарністю з нуклеотидною послідовністю тік-21.

Конкретні модифіковані олігонуклеотиди

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид має структуру 5-

АЕС5АТОСЗАСТОСТОАОЗААДССоТАвє-3" (ЗЕО ІЮ МО: 3), де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-ЮО-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2--МОЕ-нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5-СБЕЇї- нуклеозиди; і кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

АєС5АТОСвАваТОвОв а АОвАвАсСОвОвАє-3" (ЗЕБЕО ІО МО: 3), де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-ЮО-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2--МОЕ-нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5- сЕі-нуклеозиди; і кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

МебеЕАБАвТЕСвИ5АєАєОвАвАєС Св ТЕАв-3" (ЗЕО ІЮ МО: 4), де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-ЮО-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2--МОЕ-нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5-СБЕЇї- нуклеозиди; верхній індекс "Ме" означає 5-метильну групу при основі нуклеозиду; і кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

АєС5АєТЕС5АєСєЕ ТЕС ТЕ АОвААсСІіСвзОвАв-3" (ЗЕО ІЮ МО: 3), де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-ЮО-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2--МОЕ-нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5- сЕі-нуклеозиди; і кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид містить один або декілька

БбБ-метилцитозинів. У конкретних варіантах здійснення кожний цитозин модифікованого олігонуклеотиду передбачає 5-метилцитозин.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 8-30 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 12-25 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 15-30 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 15-25 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних 60 варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 15-19 зв'язаних нуклеозидів.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 15-16 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 19-24 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 21-24 зв'язаних нуклеозидів.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 8 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 9 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 10 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 11 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 12 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 13 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 14 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 15 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 16 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 17 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 18 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 19 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 20 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 21 зв'язаного нуклеозиду. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 22 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 23 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 24 зв'язаних нуклеозидів. У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид складається з 25 зв'язаних нуклеозидів.

Конкретні модифікації

У конкретних варіантах здійснення олігонуклеотиди, забезпечені в даному документі, можуть містити одну або декілька модифікацій нуклеїнової основи, цукру та/або міжнуклеозидного зв'язку, і тому являють собою модифікований олігонуклеотид. Модифіковані нуклеїнова основа,

Зо цукор та/або міжнуклеозидний зв'язок можуть бути вибрані з перевагою над немодифікованою формою завдяки необхідним властивостям, таким як, наприклад, підвищене поглинання клітиною, підвищена спорідненість щодо інших олігонуклеотидів або мішеней, що відносяться до нуклеїнових кислот, та підвищена стабільність у присутності нуклеаз.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид містить один або декілька модифікованих нуклеозидів. У таких конкретних варіантах здійснення модифікований нуклеозид являє собою стабілізуючий нуклеозид. Прикладом стабілізуючого нуклеозиду є нуклеозид з модифікованим цукром.

У конкретних варіантах здійснення модифікований нуклеозид являє собою нуклеозид з модифікованим цукром. У таких конкретних варіантах здійснення нуклеозиди з модифікованим цукром можуть додатково містити природний або модифікований фрагмент гетероциклічної основи та/або природний або модифікований міжнуклеозидний зв'язок і можуть включати додаткові модифікації незалежно від модифікації цукру. У конкретних варіантах здійснення нуклеозид з модифікованим цукром являє собою 2'-модифікований нуклеозид, де цукрове кільце є модифікованим при 2" атомі вуглецю природної рибози або 2'-дезоксирибози.

У конкретних варіантах здійснення 2'-модифікований нуклеозид має біциклічний цукровий фрагмент. У таких конкретних варіантах здійснення біциклічний цукровий фрагмент являє собою ЮО-цукор в альфа-конфігурації. У таких конкретних варіантах здійснення біциклічний цукровий фрагмент являє собою ЮО-цукор у бета-конфігурації. У таких конкретних варіантах здійснення біциклічний цукровий фрагмент являє собою І -цукор в альфа-конфігурації. У таких конкретних варіантах здійснення біциклічний цукровий фрагмент являє собою І -цукор у бета- конфігурації.

Нуклеозиди, що містять такі біциклічні цукрові фрагменти, називають біциклічними нуклеозидами або ВМА. У конкретних варіантах здійснення біциклічні нуклеозиди включають, без обмеження, (А) а-І -метиленоксі (4'-СН2-0-2"7) ВМА; (В) В-О-метиленоксі (4-СНг-0О-2") ВМА; (С) етиленоксі (4-(СНг)2-0-273 ВМА; (0) амінооксі (4-СН2г-0О-М(Н)-2") ВМА; (Е) оксіаміно (4-СНе-

М(2Т)-О-2") ВМА; (ЕР) метил(метиленоксі) (4-СН(СНз)-О-23 ВМА (що також називають закріпленим етилом або сЕЮ; (5) метилентіо (4'-СН2-5-2"73 ВМА; (Н) метиленаміно (4-СН2-М(В)- 2") ВМА; (І) метилкарбоциклічний (4-СНо-СН(СНз)-2") ВМА; (У) с-МОЕ (4-СН»-ОМе-2") ВМА та (К) пропіленкарбоциклічний (4-(СНг)з-2") ВМА, як зображено нижче.

З О. ,Вх З о. ВХ

З /- о -о0 лад, пл, (А) (В) (С) с О. ,Вх З О. Вх З о. Вх хх Кк Ал, кед,

Кк (0) (Б) (В) б-о жк Вк о0в- ВХ о00- ою, вх « р Ше Кк т 5 ке ту

ЩЕ о -К і ее ЇМ (Н) ЕТ О)

Халл ( ) Зно жу сн

Її дю, ВХ фе ВХ х и - зе Ж У с / й ії К

ТУ) пре Кк) т, СН, п де Вх являє собою фрагмент нуклеїнової основи, і К незалежно являє собою Н, захисну групу або Сі-С:галкіл.

У конкретних варіантах здійснення 2'-модифікований нуклеозид містить групу, що є замісником в 2'-положенні, вибрану з Е, ОСЕз, О-СНз, ОСНСН»гОСснН», 2-О(СН2г)26 ЗОН», О-(СН?г)»-

Оо-М(СНз)»-, О(ССНг 25 О(СНг) а М(СНзі)» і О-СН2г-С(-0)-М(Н)СН.

У конкретних варіантах здійснення 2'-модифікований нуклеозид містить групу, що є замісником в 2--положенні, вибрану з Е, О-СНз і ОСНгСНгОСснН».

У конкретних варіантах здійснення нуклеозид з модифікованим цукром являє собою 4'-тіо- модифікований нуклеозид. У конкретних варіантах здійснення нуклеозид з модифікованим цукром являє собою 4"-тіо-2і-модифікований нуклеозид. 4"-Тіо-модифікований нуклеозид містить

В-О-рибонуклеозид, де 4"-О замінений 4-5. 4-Тіо-2г-модифікований нуклеозид являє собою 4'- тіо-модифікований нуклеозид, у якого 2'-ОН замінений групою, що є замісником в 2'-положенні.

Придатні групи, що є замісниками в 2'-положенні, включають 2'-ОСН», 2'-0-(СНг)2-ОСН:з та 2-Е.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид містить одну або декілька міжнуклеозидних модифікацій. У таких конкретних варіантах здійснення кожний міжнуклеозидний зв'язок модифікованого олігонуклеотиду являє собою модифікований міжнуклеозидний зв'язок. У конкретних варіантах здійснення модифікований міжнуклеозидний зв'язок містить атом фосфору.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид містить щонайменше один фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок. У конкретних варіантах здійснення кожний міжнуклеозидний зв'язок модифікованого олігонуклеотиду являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид містить одну або декілька модифікованих нуклеїнових основ. У конкретних варіантах здійснення модифікована нуклеїнова основа вибрана з 5-гідроксиметилцитозину, 7-деазагуаніну та 7-деазааденіну. У конкретних варіантах здійснення модифікована нуклеїнова основа вибрана з 7-деазааденіну, 7-

Зо деазагуанозину, 2-амінопіридину та 2-піридону. У конкретних варіантах здійснення модифікована нуклеїнова основа вибрана з 5-заміщених піримідинів, б-азапіримідинів і М-2, М-б і О-6-заміщених пуринів, включаючи 2-амінопропіладенін, 5-пропінілурацил та 5- пропінілцитозин.

У конкретних варіантах здійснення модифікована нуклеїнова основа містить поліциклічний гетероцикл. У конкретних варіантах здійснення модифікована нуклеїнова основа містить трициклічний гетероцикл. У конкретних варіантах здійснення модифікована нуклеїнова основа містить похідну феноксазину. У конкретних варіантах здійснення феноксазин може бути додатково модифікованим з утворенням нуклеїнової основи, відомої з рівня техніки як С-сіатр.

У конкретних варіантах здійснення модифікований олігонуклеотид сполучений з одним або декількома фрагментами, які підвищують активність, впливають на розподіл у клітині або поглинання клітиною одержаних у результаті антисенсових олігонуклеотидів. У таких конкретних варіантах здійснення фрагмент являє собою фрагмент холестерину. У конкретних варіантах здійснення фрагмент являє собою ліпідний фрагмент. Додаткові фрагменти для сполучення включають вуглеводи, фосфоліпіди, біотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахінон, акридин, флуоресцеїни, родаміни, кумарини та барвники. У конкретних варіантах здійснення вуглеводний фрагмент являє собою М-ацетил-О-галактозамін (СаїЇМас). У конкретних варіантах здійснення сполучена група приєднана безпосередньо до олігонуклеотиду. У конкретних варіантах здійснення сполучена група приєднана до модифікованого олігонуклеотиду за допомогою з'єднувального фрагмента, вибраного з аміно, гідроксилу, карбонової кислоти, тіолу, ненасичених зв'язків (наприклад, подвійних або потрійних зв'язків), 8- аміно-3,6-діоксаоктанової кислоти (АБО), сукцинімідил-4-(М-малеіїмідометил)циклогексан-1- карбоксилату (5МСС), 6-аміногексанової кислоти (АНЕХ або АНА), заміщеного С1-С1балкілу, заміщеного або незаміщеного С2-С1балкенілу та заміщеного або незаміщеного С2-С1балкінілу.

У таких конкретних варіантах здійснення група, що є замісником, вибрана з гідроксилу, аміно, алкоксі, карбоксі, бензилу, фенілу, нітро, тіолу, тіоалкоксі, галогену, алкілу, арилу, алкенілу та алкінілу.

У таких конкретних варіантах здійснення сполука містить модифікований олігонуклеотид, що має одну або декілька стабілізуючих груп, які приєднані до одного або обох кінців модифікованого олігонуклеотиду для поліпшення властивостей, таких як, наприклад, стабільності стосовно впливу нуклеаз. Стабілізуючі групи включають сар-структури. Ці кінцеві модифікації захищають модифікований олігонуклеотид від руйнування екзонуклеазами та можуть сприяти доставці та/або розташуванню в клітині. Сар може бути присутньою на 5'-кінці (5-сар), або на 3'-кінці (3'-сар), або може бути присутньою на обох кінцях. Сар-структури включають, наприклад, сар з інвертованої послідовності дезоксирибози без азотистих основ.

Конкретні фармацевтичні композиції

У даному документі забезпечені фармацевтичні композиції, що містять олігонуклеотиди. У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, містить сполуку, яка містить модифікований олігонуклеотид, що складається з 15-25 зв'язаних нуклеозидів та має нуклеотидну послідовність, комплементарну тік-21 або її попередникові. У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, містить сполуку, яка складається з модифікованого олігонуклеотиду, що складається з 8-30 зв'язаних нуклеозидів та має нуклеотидну послідовність, комплементарну тік-21 або її попередникові. У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, містить сполуку, яка містить модифікований олігонуклеотид, що складається 3 12-25 зв'язаних нуклеозидів та має нуклеотидну послідовність, комплементарну тік-21 або її попередникові.

Прийнятні шляхи введення включають, без обмеження, пероральний, ректальний, трансмукозальний, інтестинальний, ентеральний, місцевий, у вигляді супозиторіїв, за допомогою інгаляції, інтратекальний, інтракардіальний, інтравентрикулярний, інтраперитонеальний, інтраназальний, інтраокулярний, внутрішньопухлинний та парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, інтрамедулярний та підшкірний). У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні препарати для інтратекального введення вводять для досягнення локальних, а не системних впливів. Наприклад, фармацевтичні композиції можна вводити безпосередньо в ділянку для необхідного ефекту (наприклад, у нирку).

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у формі одиниці дозування (наприклад, таблетки, капсули, болюса і т.п-). У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції містять модифікований олігонуклеотид при дозі в межах діапазону, вибраного з від 25 мг до 800 мг, від 25 мг до 700 мг, від 25 мг до 600 мг, від 25 мг до 500 мг, від 25 мг до 400 мг, від 25 мг до 300 мг, від 25 мг до 200 мг, від 25 мг до 100 мг, від 100 мг до 800 мг, від 200 мг до 800 мг, від 300 мг до 800 мг, від 400 мг до 800 мг, від 500 мг до 800 мг, від 600 мг до 800 мг, від 100 мг до 700 мг, від 150 мг до 650 мг, від 200 мг до 600 мг, від 250 мг до 550 мг, від 300 мг до 500 мг, від З0О0О мг до 400 мг та від 400 мг до 600 мг. У конкретних варіантах бо здійснення такі фармацевтичні композиції містять модифікований олігонуклеотид у дозі,

вибраній з 25 мг, 30 мг, 35 мг, 40 мг, 45 мг, 50 мг, 55 мг, 60 мг, 65 мг, 70 мг, 75 мг, 80 мг, 85 мг, 90 мг, 95 мг, 100 мг, 105 мг, 110 мг, 115 мг, 120 мг, 125 мг, 130 мг, 135 мг, 140 мг, 145 мг, 150 мг, 155 мг, 160 мг, 165 мг, 170 мг, 175 мг, 180 мг, 185 мг, 190 мг, 195 мг, 200 мг, 205 мг, 210 мг, 215 мг, 220 мг, 225 мг, 230 мг, 235 мг, 240 мг, 245 мг, 250 мг, 255 мг, 260 мг, 265 мг, 270 мг, 270 мг, 280 мг, 285 мг, 290 мг, 295 мг, 300 мг, 305 мг, 310 мг, 315 мг, 320 мг, 325 мг, 330 мг, 335 мг, 340 мг, 345 мг, 350 мг, 355 мг, 360 мг, 365 мг, 370 мг, 375 мг, 380 мг, 385 мг, 390 мг, 395 мг, 400 мг, 405 мг, 410 мг, 415 мг, 420 мг, 425 мг, 430 мг, 435 мг, 440 мг, 445 мг, 450 мг, 455 мг, 460 мг, 465 мг, 470 мг, 475 мг, 480 мг, 485 мг, 490 мг, 495 мг, 500 мг, 505 мг, 510 мг, 515 мг, 520 мг, 525 мг, 530 мг, 535 мг, 540 мг, 545 мг, 550 мг, 555 мг, 560 мг, 565 мг, 570 мг, 575 мг, 580 мг, 585 мг, 590 мг, 595 мг, 600 мг, 605 мг, 610 мг, 615 мг, 620 мг, 625 мг, 630 мг, 635 мг, 640 мг, 645 мг, 650 мг, 655 мг, 660 мг, 665 мг, 670 мг, 675 мг, 680 мг, 685 мг, 690 мг, 695 мг, 700 мг, 705 мг, 710 мг, 715 мг, 720 мг, 725 мг, 730 мг, 735 мг, 740 мг, 745 мг, 750 мг, 755 мг, 760 мг, 765 мг, 770 мг, 775 мг, 780 мг, 785 мг, 790 мг, 795 мг і 800 мг. У таких конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить дозу модифікованого олігонуклеотиду, вибрану з 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг і 800 мг.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою стерильний ліофілізований модифікований олігонуклеотид, який відновлюють придатним розчинником, наприклад, стерильною водою для ін'єкцій або стерильним сольовим розчином для ін'єкцій.

Відновлений продукт уводять як підшкірну ін'єкцію або як внутрішньовенну інфузію після розведення в сольовому розчині. Продукт на основі ліофілізованого лікарського засобу складається з модифікованого олігонуклеотиду, який одержували у воді для ін'єкцій або в сольовому розчині для ін'єкцій, доводили до рН 7,0-9,0 за допомогою кислоти або основи під час одержання, а потім ліофілізували. Ліофілізований модифікований олігонуклеотид може складати 25-800 мг олігонуклеотиду. Зрозуміло, що діапазон включає 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 і 800 мг модифікованого ліофілізованого олігонуклеотиду. Крім того, у деяких варіантах здійснення ліофілізований модифікований олігонуклеотид означає кількість олігонуклеотиду в межах діапазону, вибраного з від 25 мг до 800 мг, від 25 мг до 700 мг, від 25 мг до 600 мг, від 25 мг до 500 мг, від 25 мг до 400 мг, від 25 мг до 300 мг, від 25 мг до 200 мг, від 25 мг до 100 мг, від 100 мг до 800 мг, від 200 мг до 800 мг, від 300 мг до 800 мг, від 400 мг до 800 мг, від 500 мг до 800 мг, від 600 мг до 800 мг, від 100 мг до 700 мг, від 150 мг до 650 мг, від 200 мг до 600 мг, від 250 мг до 550 мг, від 300 мг до 500 мг, від 300 мг до 400 мг та від 400 мг до 600 мг. Продукт на основі ліофілізованого лікарського засобу може бути упакований в 2 мл флакон типу І із прозорого скла (оброблений сульфатом амонію), закритий пробкою із бромбутилової гуми та ущільнений алюмінієвою кришкою ЕІ ІР-ОГЕФ.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні композиції, забезпечені в даному документі, можуть додатково містити інші допоміжні компоненти, які традиційно мають місце у фармацевтичних композиціях, при їхніх рівнях застосування, встановлених у галузі техніки.

Таким чином, наприклад, композиції можуть містити додаткові сумісні фармацевтично активні матеріали, такі як, наприклад, протисвербіжні засоби, в'яжучі засоби, місцеві анестетики або протизапальні засоби, або можуть містити додаткові матеріали, застосовувані при фізичному складанні різних лікарських форм композицій згідно з даним винаходом, такі як барвники, ароматизуючі засоби, консерванти, антиоксиданти, замутнювачі, загусники та стабілізатори.

Однак такі матеріали при додаванні не повинні надмірно перешкоджати біологічним активностям компонентів композицій згідно з даним винаходом. Склади можна стерилізувати та при необхідності змішувати з допоміжними засобами, наприклад, змащувальними речовинами, консервантами, стабілізаторами, змочувальними засобами, емульгаторами, солями, що впливають на осмотичний тиск, буферами, барвниками, віддушками та/або ароматичними речовинами та т.п., які не мають шкідливого впливу на олігонуклеотид(и) складу.

Ліпідні фрагменти застосовувалися при різних видах терапії нуклеїновими кислотами в різноманітних способах. В одному способі нуклеїнову кислоту вводять у попередньо утворені ліпосоми або ліпоплекси, одержані із сумішей катіонних ліпідів та нейтральних ліпідів. В іншому способі ДНК-комплекси з моно- або полікатіонними ліпідами утворюються без присутності нейтрального ліпіда. У конкретних варіантах здійснення ліпідний фрагмент вибирають для підвищення розподілу фармацевтичного засобу у визначеній клітині або тканині. У конкретних варіантах здійснення ліпідний фрагмент вибирають для поліпшення розподілу фармацевтичного засобу в жировій тканині. У конкретних варіантах здійснення ліпідний фрагмент вибирають для поліпшення розподілу фармацевтичного засобу в м'язовій тканині.

У конкретних варіантах здійснення ІМТКАГСІРІО застосовують для одержання бо фармацевтичної композиції, що містить олігонуклеотид. Іпігайріїй є жировою емульсією,

одержаною для внутрішньовенного введення. В її складі міститься 10 95 соєвої олії, 1,2 95 фосфоліпідів яєчного жовтка, 2,25 95 гліцерину та вода для ін'єкцій. Крім того, для доведення рн так, щоб рН кінцевого продукту перебував у діапазоні 6-8,9, додавали гідроксид натрію. а Ь

Х Я ХОою

К.М в МК. п

У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена у даному документі, містить сполуку поліаміну або ліпідний фрагмент, що утворює комплекс із нуклеїновою кислотою. У конкретних варіантах здійснення такі препарати містять одну або декілька сполук, при цьому кожна окремо має структуру, визначену формулою (7), або їх фармацевтично прийнятну сіль, де кожний ХЗ2 та ХУ для кожного випадку незалежно являє собою С.-валкілен; п дорівнює 0, 1, 2, 3,4 або 5; кожний МК незалежно являє собою Н, де щонайменше пж2 К-фрагментів у щонайменше приблизно 80 95 молекул сполуки формули (7) у препараті не є Н; т дорівнює 1, 2,

З або 4; У являє собою О, МЕ? або 5; В! являє собою алкіл, алкеніл або алкініл; кожний з яких необов'язково заміщений одним або декількома замісниками; і КЕ? являє собою Н, алкіл, алкеніл або алкініл; кожний з яких необов'язково заміщений одним або декількома замісниками; за умови, що якщо п-0, тоді щонайменше пя-3 К-фрагментів не є Н. Такі препарати описані в публікації РСТ УУО/2008/042973, яка включена в даний документ за допомогою посилання у всій повноті для розкриття ліпідних препаратів. Деякі додаткові препарати описані в АКіпс еї аї.,

Маїйге Віоїесппоїоду 26, 561-569 (1 травня 2008 року), яка включена в даний документ за допомогою посилання у всій повноті для розкриття ліпідних препаратів.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні композиції, забезпечені у даному документі, містять один або декілька модифікованих олігонуклеотидів та один або декілька наповнювачів. У таких конкретних варіантах здійснення наповнювачі вибирають з води, сольових розчинів, спирту, поліеєтиленгліколів, желатину, лактози, амілази, стеарату магнію, тальку, кремнієвої кислоти, в'язкого парафіну, гідроксиметилцелюлози та полівінілпіролідону.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичну композицію, забезпечену в даному документі, одержують із використанням відомих способів, включаючи без обмеження способи змішування, розчинення, гранулювання, одержання драже, розтирання в порошок, емульгування, інкапсуляції, захоплювання або таблетування.

Зо У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, являє собою рідину (наприклад, суспензію, міцний настій та/або розчин). У таких конкретних варіантах здійснення рідку фармацевтичну композицію одержують із використанням інгредієнтів, відомих з рівня техніки, включаючи без обмеження воду, гліколі, масла, спирти, ароматизуючі засоби, консерванти та барвники.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена у даному документі, являє собою тверду речовину (наприклад, порошок, таблетку та/або капсулу). У таких конкретних варіантах здійснення тверду фармацевтичну композицію, що містить один або декілька олігонуклеотидів, одержують із використанням інгредієнтів, відомих з рівня техніки, включаючи без обмеження крохмалі, цукри, розріджувачі, засоби для грануляції, змащувальні речовини, зв'язувальні речовини та засоби для поліпшення розпадання.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, складена у вигляді депо-препарату. Такі визначені депо-препарати, як правило, мають більш тривалу дію, ніж препарати, що не відносяться до депо-препаратів. У конкретних варіантах здійснення такі препарати вводять шляхом імплантації (наприклад, підшкірно або внутрішньом'язово) або шляхом внутрішньом'язової ін'єкції. У конкретних варіантах здійснення депо-препарати одержують із використанням придатних полімерних або гідрофобних матеріалів (наприклад, емульсія в прийнятному маслі) або іонообмінних смол, або у вигляді важкорозчинних похідних, наприклад, у вигляді важкорозчинної солі.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, містить систему доставки. Приклади систем доставки включають без обмеження ліпосоми та емульсії. Деякі системи доставки застосовують для одержання деяких фармацевтичних композицій, включаючи такі, що містять гідрофобні сполуки. У конкретних варіантах здійснення використовують деякі органічні розчинники, такі як диметилсульфоксид.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, містить одну або декілька тканиноспецифічних молекул для доставки, розроблених для доставки одного або декількох фармацевтичних засобів згідно з даним винаходом до конкретних типів тканин або клітин. Наприклад, у конкретних варіантах здійснення фармацевтичні композиції включають ліпосоми, покриті тканиноспецифічним антитілом.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, містить систему сповільненого вивільнення. Необмежуючий приклад такої системи сповільненого вивільнення являє собою напівпроникну матрицю із твердих гідрофобних полімерів. У конкретних варіантах здійснення системи сповільненого вивільнення можуть, залежно від їхньої хімічної природи, вивільняти фармацевтичні засоби протягом декількох годин, днів, тижнів або місяців.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичну композицію одержують для введення шляхом ін'єкції (наприклад, внутрішньовенної, підшкірної, внутрішньом'язової і т. д.). У таких конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить носій і складена у водному розчині, такому як вода або фізіологічно сумісні буфери, такі як розчин Хенкса, розчин Рингера або фізіологічний сольовий буфер. У конкретних варіантах здійснення включають інші інгредієнти (наприклад, інгредієнти, які сприяють розчинності або служать у якості консервантів). У конкретних варіантах здійснення суспензії, які ін'єктгують, одержують із застосуванням придатних рідких носіїв, суспендувальних засобів і т.п. Деякі фармацевтичні композиції для ін'єкцій представлені в стандартній лікарській формі, наприклад, в ампулах або в багатодозових контейнерах. Деякі фармацевтичні композиції для ін'єкцій є суспензіями, розчинами або емульсіями в масляних або водних середовищах і можуть містити засоби для складання, такі як суспендувальні, стабілізуючі та/або диспергувальні засоби. Деякі розчинники, прийнятні для застосування у фармацевтичних композиціях для ін'єкцій, включають без обмеження ліпофільні розчинники та жирні олії, такі як кунжутна олія, синтетичні ефіри жирних кислот, такі як етилолеат або тригліцериди, та ліпосоми. Водні суспензії для ін'єкцій можуть містити речовини, які підвищують в'язкість суспензії, такі як натрію карбоксиметилцелюлоза, сорбіт або декстран. Необов'язково такі суспензії можуть також містити придатні стабілізатори або засоби, які підвищують розчинність фармацевтичних засобів, що дозволяє одержувати висококонцентровані розчини.

Зо У конкретних варіантах здійснення фармацевтична композиція, забезпечена в даному документі, містить модифікований олігонуклеотид у терапевтично ефективній кількості. У конкретних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для попередження, полегшення або зменшення інтенсивності симптомів захворювання або для подовження виживання суб'єкта, який підлягає лікуванню. Визначення терапевтично ефективної кількості знаходиться в межах можливостей фахівця в даній галузі техніки.

У конкретних варіантах здійснення один або декілька модифікованих олігонуклеотидів, забезпечених у даному документі, складають у вигляді проліків. У конкретних варіантах здійснення при введенні іп мімо проліки хімічним шляхом перетворюються на біологічно, фармацевтично або терапевтично більш активну форму олігонуклеотиду. У конкретних варіантах здійснення проліки придатні з огляду на те, що їх легше вводити, аніж відповідну активну форму. Наприклад, у деяких випадках проліки можуть бути більш біодоступними (наприклад, при пероральному введенні), ніж відповідна активна форма. У деяких випадках проліки можуть мати поліпшену розчинність у порівнянні з відповідною активною формою. У конкретних варіантах здійснення проліки менш водорозчинні, ніж відповідна активна форма. У деяких випадках таким пролікам властива відмінна передача через клітинні мембрани, причому водорозчинність шкідливо впливає на рухливість. У конкретних варіантах здійснення проліки являють собою складний ефір. У таких конкретних варіантах здійснення після введення складний ефір метаболічно гідролізується до карбонової кислоти. У конкретних випадках сполука, що містить карбонову кислоту, перебуває у відповідній активній формі. У конкретних варіантах здійснення проліки містять короткий пептид (поліамінокислоту), зв'язаний з кислотною групою. У таких конкретних варіантах здійснення пептид розщеплюється після введення з утворенням відповідної активної форми.

У конкретних варіантах здійснення проліки одержують шляхом модифікації фармацевтично активної сполуки так, щоб активна сполука утворювалася після введення іп мімо. Проліки можуть бути розроблені для того, щоб змінити метаболічну стабільність або транспортні характеристики лікарського засобу для того, щоб захистити від побічних ефектів або токсичності, поліпшити запах лікарського засобу або змінити інші характеристики або властивості лікарського засобу. Виходячи зі знань щодо фармакодинамічних процесів і метаболізму лікарського засобу іп мімо фахівець у даній галузі техніки, як тільки фармацевтично бо активна сполука стала відомою, може розробити проліки сполуки (див., наприклад, Модгаду

(1985) Медісіпа! Спетівігу А Віоспетіса! Арргоасп, Охота Опімегейу Ргез55, Мем ХоїКк, радез 388-

Конкретні додаткові типи терапії

Лікування захворювання, асоційованого з тік-21, може передбачати більш ніж один тип терапії. Тому, у конкретних варіантах здійснення в даному документі передбачені способи лікування суб'єкта, що має захворювання або з підозрою на захворювання, асоційоване з тік- 21, які включають застосування щонайменше одного типу терапії додатково до введення модифікованого олігонуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну мікроРНК.

У конкретних варіантах здійснення протизапальний засіб являє собою стероїдний протизапальний засіб. У конкретних варіантах здійснення стероїдний протизапальний засіб являє собою кортикостероїд. У конкретних варіантах здійснення кортикостероїд являє собою преднізон. У конкретних варіантах здійснення протизапальний засіб являє собою нестероїдні протизапальні лікарські засоби. У конкретних варіантах здійснення нестероїдний протизапальний засіб являє собою ібупрофен, інгібітор СОХ-Ї або інгібітор СОХ-2.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають протидіабетичні засоби. Протидіабетичні засоби включають без обмеження бігуаніди, інгібітори глюкозидази, інсуліни, сульфонілсечовини та тіазолідендіони.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають без обмеження діуретики (наприклад, спіронолактон, еплеренон, фуросемід), інотропні препарати (наприклад, добутамін, мілринон), дигоксин, вазодилататори, інгібітори ангіотензин-ІІ-перетворюючого ферменту (АСЕ) (наприклад, каптоприл, еналаприл, лізиноприл, беназеприл, хінаприл, фозиноприл та раміприл), блокатори рецептора ангіотензину ІІ (АКВ) (наприклад, кандесартан, ірбесартан, олмесартан, лозартан, валсартан, телмісартан, епросартан), блокатори кальцієвих каналів, динітрат ізосорбіду, гідралазин, нітрати (наприклад, мононітрат ізосорбіду, динітрат ізосорбіду), гідралазин, бета-блокатори (наприклад, карведилол, метопролол) та натрійуретичні

Зо пептиди (наприклад, незиритид). У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вибраний з цилазаприлу, периндоприлу та трандолаприлу.

У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вводять при дозі 0,025-0,1 мг/кг маси тіла. У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вводять при дозі 0,125-1,0 мг/кг маси тіла. У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вводять при дозі в діапазоні від 1 до 6 мг/м2/доба.

У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вводять при дозі в діапазоні від 1 до 2 мг/ме/доба. У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вводять при дозі в діапазоні від 2 до 4 мг/мг/доба. У конкретних варіантах здійснення інгібітор АСЕ вводять при дозі в діапазоні від 0,5 до 1 мг/ме/доба.

У конкретних варіантах здійснення раміприл вводять при дозі в діапазоні від 1 до 6 мг/мг/доба. У конкретних варіантах здійснення раміприл вводять при дозі в діапазоні від 1 до 2 мг/мг/доба. У конкретному варіанті здійснення еналаприл вводять при дозі в діапазоні від 2 до 4 мг/мг/доба. У конкретному варіанті здійснення лізиноприл вводять при дозі в діапазоні від 4 до 8 мг/ме/доба. У конкретному варіанті здійснення беназеприл вводять при дозі в діапазоні від 4 до 8 мг/ме/доба. У конкретному варіанті здійснення фозиноприл вводять при дозі в діапазоні від 4 до 8 мг/м"/доба. У конкретному варіанті здійснення хінаприл вводять при дозі в діапазоні від 4 до 8 мг/мге/доба. У конкретному варіанті здійснення цилазаприл вводять при дозі в діапазоні від 1 до 2 мг/м2/доба. У конкретному варіанті здійснення перинприл вводять при дозі в діапазоні від 1 до 2 мг/м2/доба. У конкретному варіанті здійснення трандолаприл вводять при дозі в діапазоні від 0,5 до 1 мг/ме/доба.

У конкретних варіантах здійснення АКВ вводять при дозі в діапазоні від 6,25 до 150 мг/м2/доба.

У конкретних варіантах здійснення АКВ вводять при дозі 6,25 мг/мг/доба. У конкретних варіантах здійснення АКВ вводять при дозі 10 мг/м"/доба. У конкретних варіантах здійснення

АЕВ вводять при дозі 12,5 мг/м"/доба. У конкретних варіантах здійснення АРВ вводять при дозі 18,75 мг/мг/доба.

У конкретних варіантах здійснення АКВ вводять при дозі 37,5 мг/мг/доба. У конкретних варіантах здійснення АКВ вводять при дозі 50 мг/мг/доба. У конкретних варіантах здійснення

АРВ вводять при дозі 150 мг/м-/доба.

У конкретних варіантах здійснення лозартан вводять при дозі 12,5 мг/м-/доба. У конкретних 60 варіантах здійснення лозартан вводять при дозі 12,5 мг/мг7/доба. У конкретних варіантах здійснення кандесартан вводять при дозі 6,25 мг/м"/доба. У конкретних варіантах здійснення ірбесартан вводять при дозі 37,5 мг/мг/доба. У конкретних варіантах здійснення телмісартан вводять при дозі 10 мг/м"/доба. У конкретних варіантах здійснення валсартан вводять при дозі 18,75 мг/мг/доба. У конкретних варіантах здійснення еспресартан вводять при дозі 150 мг/м-/доба.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою антагоніст альдостерону. У конкретних варіантах здійснення антагоніст альдостерону являє собою спіронолактон. У конкретних варіантах здійснення спіронолактон вводять при дозі в діапазоні від 10 до 35 мг щодобово. У конкретних варіантах здійснення спіронолактон вводять при дозі 25 мг щодня.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичні засоби включають гепариноїди. У конкретних варіантах здійснення гепариноїд являє собою полісульфат пентозану.

У конкретних варіантах здійснення фармацевтичний засіб являє собою тип терапії на основі антитіла до фактора росту сполучної тканини. У конкретних варіантах здійснення тип терапії на основі антитіла до СТОЕ являє собою моноклональне антитіло до СТОР.

У конкретних варіантах здійснення додатковий тип терапії може являти собою фармацевтичний засіб, який підсилює імунну систему організму, в тому числі низькодозовий циклофосфамід, тимостимулін, вітаміни та харчові добавки (наприклад, антиоксиданти, в тому числі вітаміни А, С, Е, бета-каротин, цинк, селен, глутатіон, кофермент 0-10 та ехінацея), а також вакцини, наприклад, імуностимулюючий комплекс (ІЗСОМ), що містить вакцинний склад, у якому об'єднані мультимерна система презентації антигену та ад'ювант.

У конкретних варіантах здійснення додатковий тип терапії вибирають для лікування або зменшення інтенсивності побічного ефекту однієї або декількох фармацевтичних композицій за даним винаходом. Такі побічні ефекти включають, без обмеження, реакції в місці ін'єкції, аномалії функціональних проб печінки, аномалії ниркової функції, гепатотоксичність, нефротоксичність, аномалії центральної нервової системи та форми міопатії. Наприклад, підвищені рівні амінотрансферази в сироватці можуть вказувати на гепатотоксичність або

Зо аномалію функції печінки. Наприклад, підвищений рівень білірубіну може вказувати на гепатотоксичність або аномалію функції печінки.

Інші приклади додаткових фармацевтичних засобів включають, без обмежень, імуноглобуліни, включаючи, без обмежень, імуноглобулін для внутрішньовенного введення (ІМІд); анальгетики (наприклад, ацетамінофен); саліцилати; антибіотики; противірусні засоби; протигрибкові засоби; модифікатори адренергічних рецепторів; гормони (наприклад, анаболічні стероїди, андроген, естроген, кальцитонін, прогестин, соматостатин і тироїдні гормони); імуномодулятори; міорелаксанти; антигістамінні засоби; засоби проти остеопорозу (наприклад, бірфосфонати, кальцитонін та естрогени); простагландини, протипухлинні засоби; психотерапевтичні засоби; седативні засоби; продукти, отримані із сумаха, що вкорінюється, або сумаха отруйного; антитіла та вакцини.

Конкретні набори

Даний винахід також передбачає набори. У деяких варіантах здійснення набори містять одну або декілька сполук за даним винаходом, що містять модифікований олігонуклеотид, де нуклеотидна послідовність олігонуклеотиду комплементарна нуклеотидній послідовності тік- 21. Сполуки, комплементарні тік-21, можуть містити будь-який з нуклеозидних патернів, описаних у даному документі. У деяких варіантах здійснення сполуки, комплементарні тік-21, можуть знаходитися у флаконі. Декілька флаконів, наприклад 10, можуть знаходитися, наприклад, в розподільних упаковках. У деяких варіантах здійснення флакон виготовлений таким чином, щоб було зручно використовувати шприц. Набір також може містити інструкції щодо застосування сполук, комплементарних ітпік-21.

У деяких варіантах здійснення набори можна застосовувати для введення суб'єкту сполуки, комплементарної тік-21. У таких випадках на додаток до сполук, комплементарних тік-21, набір також може містити одне або декілька з наступного: шприц, тампон, просочений спиртом, ватяну кульку та/або марлеву прокладку. У деяких варіантах здійснення сполуки, комплементарні тік-21, можуть знаходитися в попередньо заповненому шприці (такому як шприци з разовою дозою, наприклад, з калібром голки 27, голкою 2 дюйма з ковпачком для голки), а не у флаконі. Декілька попередньо заповнених шприців, наприклад 10, можуть знаходитися, наприклад, в розподільних упаковках. Набір також може містити інструкції щодо введення сполук, комплементарних тів-21. бо Конкретні експериментальні моделі

У конкретних варіантах здійснення даний винахід передбачає способи застосування та/або тестування модифікованих олігонуклеотидів за даним винаходом в експериментальній моделі.

Фахівці в даній галузі техніки мають можливість вибирати та модифікувати протоколи для таких експериментальних моделей для оцінки фармацевтичного засобу за даним винаходом.

Зазвичай модифіковані олігонуклеотиди спочатку випробовують на клітинах, які культивуються. Прийнятні типи клітин включають ті, які належать до типу клітин, для якого необхідна доставка модифікованого олігонуклеотиду іп мімо. Наприклад типи клітин, що є прийнятними для дослідження способів, описаних у даному документі, включають клітини первинної культури або клітини, які культивуються.

У конкретних варіантах здійснення ступінь, до якого модифікований олігонуклеотид перешкоджає активності тік-21, оцінюють на клітинах, які культивуються. У конкретних варіантах здійснення інгібування активності мікроРНК можна оцінювати шляхом вимірювання рівнів мікроРНК. В альтернативному випадку, можна виміряти рівень передбаченого або підтвердженого мікроРНК-регульованого транскрипту. Інгібування активності мікроРНК може привести в результаті до підвищення кількості тік-21-регульованого транскрипту та/або білка, кодованого тік-21-регульованим транскриптом. Крім того, у конкретних варіантах здійснення можна вимірювати деякі фенотипічні результати.

Фахівцям у даній галузі техніки для дослідження тік-21 на моделях захворювання людини доступні декілька тваринних моделей. Наприклад, інгібітори тік-21 можна досліджувати в експериментальній моделі синдрому Альпорта, наприклад, миші, нокаутні за Соі4аз (миші

СоІ4аз7). Важкість захворювання у мишиній моделі залежить від генетичного фону миші, що має мутацію СоіІ4аз3. Наприклад, початок розвитку та прогресування захворювання, як правило, є більш швидкими при 129 х 1/5му у порівнянні з фоном С57ВІ /6). Відповідно, генетичний фон миші СоібаЗ3" можна вибирати так, щоб змінювати початок розвитку та прогресування захворювання. Додаткові моделі включають собачі моделі Х-зчепленого, аутосомно- рецесивного або аутосомно-домінантного синдрому Альпорта. Див., наприклад, Казпап,

Мернтгої. Оіаї!. Ткапзріапі, 2002, 17: 1359-1361.

Конкретні кількісні аналізи

Ефекти антисенсового інгібування ітік-21 після введення модифікованих олігонуклеотидів

Зо можна оцінювати за допомогою різноманітних способів, відомих з рівня техніки. У конкретних варіантах здійснення такі способи застосовують для проведення кількісного аналізу рівнів мікроРНК у клітинах або тканинах іп міїго або іп мімо. У конкретних варіантах здійснення зміни рівнів мікроРНК вимірюють за допомогою мікроматричного аналізу. У конкретних варіантах здійснення зміни рівнів мікроРНК вимірюють за допомогою одного з декількох комерційно доступних ПЛР-аналізів, наприклад, аналіз мікроРНК ТадМапе (Арріїей Віозувбіет5). У конкретних варіантах здійснення антисенсове інгібування Іпік-21 оцінюють за допомогою вимірювання рівня мРНК та/або білка мішені тік-21. Антисенсове інгібування тів-21, як правило, приводить у результаті до підвищення рівня мРНК та/або білка мішені мікроРНК.

Аналіз дії на мішень

Модуляцію активності мікроРНК за допомогою анти-тік або імітатора мікроРНК можна оцінювати шляхом вимірювання дії на мішень. У конкретних варіантах здійснення дію на мішень вимірюють за допомогою мікроматричного визначення профілю мРНК. Для послідовностей

МРНК, які модулюються (активність або підвищується, або знижується) за допомогою анти-тій або імітатора мікроРНК, виконується пошук послідовностей затравок мікроРНК для порівняння модуляції мРНК, які є мішенями мікроРНК, з модуляцією мРНК, які не є мішенями мікроРНК.

Таким чином, можна оцінювати взаємодію анти-тіюк з тік-21 або імітатора тік-21 з його мішенями. У випадку анти-тік проводиться скринінг послідовностей мРНК, рівні експресії яких підвищуються, відносно послідовностей мРНК, які містять збіг затравки з мікроРНК, до якої комплементарна анти-тів.

ПРИКЛАДИ

Наступні приклади представлені для того, щоб більш повно проілюструвати деякі варіанти здійснення даного винаходу. Однак їх не слід розглядати як такі, що обмежують широкий об'єм даного винаходу.

Фахівцеві в даній галузі техніки буде легко застосовувати основні принципи даного розкриття для розробки різних сполук без відхилення від сутності даного винаходу.

Приклад 1. Анти-тів-21 у моделі синдрому Альпорта

У мишей Соі4аз3-- на генетичному фоні 1295м спонтанно розвивається важке захворювання нирок, подібне до синдрому Альпорта у людини. Тому мишей Соі4а3-- використовують у якості експериментальної моделі синдрому Альпорта. бо Модифіковані олігонуклеотиди, комплементарні тік-21 (сполуки анти-тів-21), тестували у моделі Соїма3-- синдрому Альпорта. Мишей дикого типу використовували у якості контрольних мишей.

Структура сполуки анти-тів-21 являє собою 5'-АєС5АТтТОСвАатТОвТалИОвААСсС»тТАв-3" (БЕ

ІЮ МО: 3), де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-0- дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2'-МОБ- нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5-СЕЇІ-нуклеозиди. Кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

У віці З тижні мишей генотипували для ідентифікації мишей СоіІд4аЗ3-/-. Починаючи з віку З тижні до віку 9 тижнів підібраних за статтю мишей з одного приплоду обробляли анти-тів-21 або РВ5. Анти-тіВв-21 вводили підшкірно при дозі 25 мг/кг двічі на тиждень. Група обробки були наступними: (1) миші дикого типу, введення РВ5, п-8; (2) миші СоіІ4аз3-/-, введення РВ5, п-12; (3) миші СоІ4аз-/-, введення анти-тів-21, п-12. Мишей дикого типу з одного приплоду з мишами

Соі4аз-/- використовували у якості контрольних мишей дикого типу. Зразок сечі, одержаний за ніч (приблизно 16 годин) збирали раз на тиждень. Плазму та нирки відбирали наприкінці тижня 9. Зразки рідини та тканини аналізували для визначення змін функції нирок, ураження нирок, а також гломерулосклерозу та інтерстиціального фіброзу.

Кінцеві показники у крові або сечі включали вимірювання рівня азоту сечовини в крові (ВОМ), альбумінурії, співвідношення альбумін/креатинін, швидкості гломерулярної фільтрації.

Гістологічний аналіз включав оцінку гломерулосклерозу, інтерстиціального фіброзу, ушкодження канальців, інфільтрації макрофагів та присутності міофібробластів.

Рівень азоту сечовини в крові (ВОМ) вимірювали у тиждень 9. Статистичну значущість розраховували за допомогою критерію Манна-Уїтні. Як показано на фігурі 1А, статистично значуще зниження ВОМ спостерігали у тварин, яких обробляли анти-тіВв-21, у порівнянні з обробленими РВ5 контрольними тваринами наприкінці дослідження. Знижений ВИМ спостерігали взагалі (фігура ТА), так само, як і у тільки самців миші (приблизно 90 мг/дл порівняно з приблизно 25 мг/дл у контрольних самців миші) та у тільки самок миші (приблизно 70 мг/дл порівняно з приблизно 25 мг/дл у контрольних самок миші), що не показано). ВОМ у мишей Соі4аЗ-/- складав приблизно 12,5 мг/кл (у межах нормального діапазону значень; не показано). ВОМ являє собою маркер функції нирок, який визначають у крові. Більш високий ВОМ

Зо корелює з гіршою функцією нирок. Зниження ВИМ вказує на знижене ушкодження та ураження нирок та поліпшену функцію.

Альбумінурію оцінювали шляхом вимірювання альбуміну у зразках сечі, які збирали протягом 16 годин з частотою один раз на тиждень, за допомогою ЕГІЗА та за допомогою нормалізації до рівня екскреції креатиніну з сечею. Всі аналізи проводили в один і той же час наприкінці дослідження. Як показано на фігурі 18, у мишей Соі4аз3-/- розвивається важка альбумінурія. Однак у мишей, яких обробляли анти-тіВв-21, розвивалася значно менша альбумінурія, що виявляли за допомогою зниження співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі. Це зниження спостерігали після тижня 7 та воно зберігалося до тижня 9. У мишей дикого типу з одного приплоду з мишами Соі4а3-/- альбумінурія не виявлялася, як і очікувалось.

Альбумінурія є чутливою мірою ураження клубочків та канальців. Зниження співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі вказує на зниження вираженості захворювання клубочків та/або канальців.

Синдром Альпорта також характеризується прогресуючим розвитком гломерулосклерозу та значним інтерстиціальним фіброзом нирок, що має місце одночасно з невідповідним витоком з клубочків. Відповідно, гломерулосклероз оцінювали із визначенням сліпим способом показника клубочків щодо склеротичних уражень (втрата капілярної петлі«фіброз або гіаліноз). Дослідник послідовно визначав показник для тридцяти клубочків від кожної миші сліпим способом.

Показник складав 0-4, де 0 - нормальний; 1 - «25 956 клубочка уражені склерозом; 2525-50 95 клубочка уражені склерозом; 3-50-75 95 клубочка уражені склерозом; 4-75-100 95 клубочка уражені склерозом. Відносна кількість клубочків, не уражених захворюванням, була набагато більшою у мишей, яких обробляли анти-тівВ-21, та відносна кількість клубочків з помірним або важким ураженням клубочків (показник 2-4) була значно більшою у мишей, яких обробляли РВ5 (фігура 2). Показник клубочків також визначали у мишей дикого типу (МУТ) з одного приплоду з мишами Соїі4За-/-. Інтерстиціальний фіброз вимірювали морфометрично на цілих сагітальний зрізах, зафарбованих у червоний колір із використанням пікросиріусу, від оброблених РВЗ та анти-тій-21 тварин Соїі4аЗ3-/- Як показано на фігурі ЗА, статистично значуще зниження інтерстиціального фіброзу спостерігали у оброблених анти-тів-21 мишей Соі4аз3-/-. Крім того, кількісна ПЛР для транскриптів основного патологічного білка матриксу колагену ІФ(1) (СоІ1а1) продемонструвала, що тканина нирок від оброблених анти-тій-21 мишей Соїідаз-/- бо характеризувалася значно меншим утворенням цього патологічного колагену (фігура ЗВ).

Ушкодження ниркової тканини оцінювали на залитих парафіном та зафіксованих параформальдегідом (4 95) зрізах тканини, зафарбованих шляхом реакції з реактивом Шифа та йодною кислотою (РАБ). Спочатку визначали ранговий показник зрізів нирок щодо загального ушкодження виходячи із ушкодження канальців та клубочків, а також запалення. Ураження оцінювали виходячи з різних факторів, у тому числі розширення канальців, втрати щіткової облямівки, інфільтрації клітин, запалення клубочків, інтерстиціального набряку та некрозу клітин. Сліпим способом визначали ранговий показник зрізів нирок щодо загального ушкодження та присвоювали ранговий показник ниркового ушкодження. Зрізи нирок від мишей

Соі4аз -/- характеризувалися значно нижчим ранговим показником ниркового ушкодження, що вказувало на менше ниркове ушкодження (фігура 4А). Для того, щоб проаналізувати це більш детально, дослідник сліпим способом оцінював клубочки щодо відносної кількості таких, що мали гломерулярні серпоподібні утворення. Серпоподібні утворення відносяться до проліферації клітин у капсулі Боумена і їх визначають як 2 2 шарів клітин у межах простору

Боумена. Серпоподібні утворення є загальноприйнятим маркером ушкодження клубочків. У мишей Соїі4аз-/-, які одержували анти-тівВ-21, відносна кількість клубочків із серпоподібними утвореннями складала приблизно 4495, тоді як у мишей, які одержували обробку РВ5- контролем, відносна кількість клубочків із серпоподібними утвореннями складала приблизно 1995 (фігура 48). У мишей СоІ4аЗ/- з одного приплоду відносна кількість клубочків із серпоподібними утвореннями складала менше 5 95 (не показано). Канальці нефронів нирки також є місцем ураження. Ураження канальців оцінювали за допомогою накладання сітки на послідовні зображення, що охоплюють цілий сагітальний зріз кожної нирки. Ураження канальців оцінювали у кожному квадраті сітки. Ураження канальців оцінювали виходячи з наявності розширення канальців/сплющення, втрати щіткової облямівки, інфільтрації клітин та некрозу клітин. Наявність цих ознак приводить у результаті до позитивного показника для цього квадрата на сітці. Загальний показник застосовують щодо кожного зображення, причому він являє собою 95 квадратів, які характеризуються ураженням канальців. Здійснюють усереднення для всіх зображень від цієї нирки. Потім проводять статистичний аналіз середнього показника для кожної нирки. Як показано, показник ушкодження канальців був значно нижчим у мишей

Соі4аз-/-, яких обробляли анти-тіВ-21, у порівнянні з СоІ4а3-/-, які одержували РВ5 (фігура 4С).

Зо Показник ушкодження канальців у мишей СоіІдаз/- з одного приплоду складав менше 10 905 (не показано).

Додатковий гістологічний аналіз зразків нирок проводили для оцінки інфільтрації макрофагів, стабільності ендотелію та відкладення міофібробластів. Виходячи з фарбування

Е4/80, інфільтрація макрофагів була зниженою у мишей СоіІ4аз3-/- оброблених анти-тів-21, порівняно з контрольними мишами Соі4а3-/-, обробленими РВЗ (фігура 5А). Імуноцитохімічне фарбування щодо СО31 продемонструвало поліпшення стабільності ендотелію у мишей

Соі4аз-/-, оброблених анти-тів-21, порівняно з контрольними мишами Соїід4а3-/-, обробленими

РВ5 (не показано) Виявлення альфа-5МА продемонструвало зниження відкладення міофібробластів у мишей СоідаЗз-/-, оброблених анти-тіВ-21, порівняно з контрольними мишами

Соі4аз-/-, обробленими РВ5 (фігура 58). У мишей СоІдаЗз-/- фарбування альфа-5МА складало приблизно 5 95 (не показано).

Реакційноздатні частинки кисню (КО5) є побічним продуктом нормального клітинного метаболізму. Під час клітинного стресу надлишок КО5 може спричиняти перекисне окиснення ліпідів мембран клітини та органел, що призводить у результаті до порушення структурної цілісності та здатності до клітинного транспорту та вироблення енергії. У нирці КО5, що утворилися під час клітинного стресу, можуть спричиняти ушкодження нирки. Для того, щоб оцінити, чи відбувалося зниження утворення КО5 після інгібування тік-21 у мишей Соі4аз-/-, рівні перекису водню в сечі вимірювали у мишей, оброблених анти-тій-21 та РВ5. Рівні перекису водню в сечі були значно зниженими у мишей, які одержували анти-тіВ-21 (фігура бА). У мишей Соі4аз-/- рівні перекису водню в сечі складали менше 5 мкМ (не показано). Крім того, імуноцитохімічне фарбування тканини нирок дигідроетидієм (ОНЕ), що є мірою КО5Б, продемонструвало зниження КОЗ у тканині нирок мишей Соі4аз3-/-, оброблених анти-тів-21, порівняно з контрольними мишами, обробленими РВ5 (фігура 68). У мишей Соі4азж/ч спостерігали менше 10 95 фарбування ОНЕ (не показано). Ці дані продемонстрували зниження

КОЗ5, як у сечі, так і у тканині нирок у мишей Соі4аз3-/-, яких обробляли анти-тів-21. Відповідно, один механізм, за допомогою якого анти-тів-21 може знижувати ниркове ушкодження, може включати зниження утворення реакційноздатних частинок кисню.

Імуноблотинг білка із нирок мишей СоідаЗз-/-, яких обробляли анти-тів-21, продемонстрував збільшення кількості білюка МРМ17І у нирці у порівнянні з мишами СоїЇда3-/-. МРМ17ІЇ являє 60 собою білок внутрішньої мембрани мітохондрій, пов'язаний з метаболізмом реакційноздатних частинок кисню, та забезпечує захист від окисного стресу. Відповідно, знижене утворення КО5 після обробки анти-тій-21 може відбуватися, щонайменше частково, завдяки підвищеним рівням МРМ171.. Для додаткового дослідження механістичних ефектів анти-тівВ-21 рівень білка

РРАН-альфа вимірювали за допомогою імуноблотингу в нирках мишей Соі4аЗ3-/-, яких обробляли РВ5 або обробляли анти-тів-21. Обробка анти-тів-21 приводила до підвищення рівня білка РРАК-аїЇрпа, що дозволяє припустити стимуляцію метаболічних шляхів.

Подоцити є високоспеціалізованими епітеліальними клітинами, які є необхідним компонентом бар'єра гломерулярної фільтрації. Втрата подоцитів може призвести до протеїнурії, а при деяких хворобливих станах - до гломерулосклерозу. Для того, щоб оцінити, чи впливало інгібування тік-21 у мишей СоідаЗз-/- на кількість подоцитів, у мишей, оброблених анти-тів-21 та РВ5, вимірювали кількість подоцитів. Кількість подоцитів значно збільшувалась у мишей Соі4аз-/-, які одержували анти-тів-21, у порівнянні з мишами, обробленими РВ5, та була аналогічною до кількості подоцитів, що спостерігали у мишей дикого типу з одного приплоду, з мишами Соїі4аз-/- (фігура 7). Відповідно, один механізм, за допомогою якого анти- тів-21 може знижувати ниркове ушкодження у моделі синдрому Альпорта, являє собою попередження або зниження втрати подоцитів.

Аналогічне дослідження проводили із застосуванням наступних сполук анти-тіВ-21.

Сполука анти-тіВ-21 Мо 1 (описана вище): 5'-АєЄС5зАТОСвАатТСвТаливААСсС»ТАв-3" (ЕС І

МО:3); сполука анти-тів-21 Мо 2: 5-АєС5АТСзАваТОСвОваАОвАвАСіСвивАв-3" (БЕО ІЮО МО: 3); сполука анти-тів-21 Мо 3: 5'-МебеЕАвАвТЕСзО5АєАєОзАвАєСєС» ТеАв-3" (ЗЕО ІЮО МО: 4) та сполука анти-тій-21 Мо 4: 5'-АєС5АєТЕС5АєСЕ ТЕС ТаАОвААСіСвОвАв-3" (ЗЕО ІЮО МО: 3); де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-О-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2'-МОЕ-нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5-сСЕЇІ-нуклеозиди; та верхній індекс "Ме" означає 5-метильну групу при основі нуклеозиду. Кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

Кожну сполуку вводили мишам Соі4аз-/- віком три тижні при дозі 25 мг/кг двічі на тиждень протягом дев'яти тижнів. Контрольні групи включали мишей Соіда3з-/-, яких обробляли РВ5, та

Зо мишей дикого типу з одного приплоду з мишами СоідаЗз-/-. Кожна група обробки включала від 10 до 12 мишей. Для сполук Мо 1, 2 та 4 кінцеві показники оцінювали як описано вище та вони включали ВИМ, співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі, ниркове ушкодження (фарбування РАбБ), гломерулосклероз та відносну кількість клубочків із серпоподібними утвореннями. Для сполуки Мо З кінцеві показники включали ВОМ, співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі та експресію гена колагену (у якості міри фіброзу), причому їх оцінювали як описано вище.

Відповідно до результатів, описаних вище, сполука анти-тій-21 Мо 1 забезпечувала поліпшення всіх кінцевих показників, які оцінювали. Ефективність обох сполук анти-тіВ-21 Мо 2 була аналогічною до ефективності сполуки Мо 1, причому з поліпшеннями, які спостерігали щодо ВИМ, співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі, ниркового ушкодження, ступеня гломерулосклерозу та процентної частки клубочків із серпоподібними утвореннями.

Ефективність сполуки Мо З була аналогічною до ефективності сполуки Мо 1, причому з поліпшеннями ВИМ, співвідношення альбуміну до креатиніну в сечі та експресії Соїта1. Сполука анти-тіВ-21 Мо 4, хоча і була менш ефективною, ніж інші сполуки, які тестували, все ще приводила у результаті до поліпшення ВОМ, ниркового ушкодження, ступеня гломерулосклерозу та процентної частки клубочків із серпоподібними утвореннями.

Разом узяті, ці дані ілюструють, що у моделі синдрому Альпорта обробка анти-тів-21 зменшує втрату функції нирок та розвиток альбумінурії. Гломерулосклероз та інтерстиціальний фіброз значно зменшувалися, а проксимальні канальці залишалися функціональними. Оскільки анти-тій-21 попереджає прогресуючу втрату функції нирок у миші СоіІ4аЗ3-/- та зменшує вираженість як гломерулярного, так і тубулоіїнтерстиціального захворювання, анти-тінй-21 являє собою терапевтичний засіб для лікування синдрому Альпорта у людини.

Приклад 2. Підвищення рівня тік-21 у моделі синдрому Альпорта

Для оцінки дисрегуляції ітік-21 в експериментальній моделі синдрому Альпорта вимірювали рівні тік-21 у тканині нирок, відібраній від мишей. РНК виділяли з цілої нирки та вимірювали тіВв-21 за допомогою кількісної ПЛР. У мишей Соіда3-/- рівні тік-21 були підвищеними приблизно у три рази у порівнянні з рівнями ітік-21 у мишей дикого типу.

Відповідно, можна ідентифікувати суб'єкта, лікування якого від синдрому Альпорта здійснюють, як такого, який має підвищений рівень ітік-21 у матеріалі з біопсії нирок, сечі або 60 крові, перед введенням засобу для лікування.

Приклад 3. Дослідження виживання у моделі синдрому Альпорта

Миші дикого типу зазвичай живуть 2-3 роки (або 730-1095 днів). У мишей СоїІ4аз-/- на фоні 129 х 1/5му) термінальна стадія ниркової недостатності може проявлятися вже у віці 2 місяці. У

Соі4аз-/- на фоні С57ВІ /6У) термінальна стадія ниркової недостатності може проявлятися вже у віці 6 місяців. Незалежно від фону тривалість життя мишей СоіІ4аЗз-/- є значно коротшою, ніж у мишей дикого типу. Тому миші Соі4а3-/- при будь-якому генетичному фоні можуть служити у якості моделі термінальної стадії ниркової недостатності при синдромі Альпорта та їх можна використовувати для оцінки ефектів кандидатних терапевтичних засобів на очікувану тривалість життя.

Мишей генотипували для ідентифікації мишей СоїЇдаз-/-. Анти-тів-21 вводили підшкірно при дозі в діапазоні від 10 до 25 мг/кг один раз або двічі на тиждень протягом до одного року. РВ5 можна вводити у якості контрольної обробки. Зразок сечі, одержаний за ніч (приблизно 16 годин), збирали при тижневому або місячному графіку протягом усього дослідження. Фіксували вік кожної миші на момент смерті. Плазму та нирки збирали на момент смерті або наприкінці дослідження. Зразки рідини та тканини аналізували для визначення змін функції нирок, гломерулосклерозу та фіброзу.

Зразки рідини та тканини аналізували для визначення змін функції нирок, ураження нирок, а також гломерулосклерозу та інтерстиціального фіброзу. Кінцеві показники у крові або сечі включали вимірювання рівня азоту сечовини в крові (ВОМ), альбумінурії, співвідношення альбумін/креатинін, швидкості гломерулярної фільтрації. Гістологічний аналіз включав оцінку гломерулосклерозу, інтерстиціального фіброзу, ушкодження канальців, інфільтрації макрофагів та присутності міофібробластів.

Спостерігали відстрочений початок розвитку термінальної стадії ниркової недостатності та збільшену очікувану тривалість життя у мишей, оброблених анти-тіВ-21, у порівнянні з контрольними мишами, обробленими РВ5, причому можна припустити, що анти-тіВв-21 являє собою терапевтичний засіб, який може збільшувати очікувану тривалість життя суб'єктів з синдромом Альпорта.

Анти-тів-21 збільшує показник виживання при дослідженні у моделі синдрому Альпорта з одноразовим введенням дози

Зо Для оцінки ефектів анти-тій-21 на виживання в експериментальній моделі синдрому

Альпорта сполуку анти-тів-21 вводили мишам Соі4аз-/-.

Структура сполуки анти-тів-21 являє собою 5'-АєС5АТОСвАатТОвТалИОвААСсС»тТАв-3" (БЕ

Мишей СоіІ4аз-/1 (гетерозиготи) при фоні 129 х 1/5м) схрещували з одержанням мишей

Соі4аз-/-. У віці З тижні мишей генотипували для ідентифікації мишей СоіІ4аз3-/-. Групи обробки були наступними: (1) миші СоіІчаз-/- (дикого типу з одного приплоду), введення РВ5 двічі на тиждень, п-12; (2) миші СоіІ4а3-/-, введення РВ5 двічі на тиждень, п-12; (3) миші СоїІдаз-/-, підшкірне введення 25 мг/кг анти-тіВ-21 двічі на тиждень, п-12. Засоби для обробки вводили двічі на тиждень від тижня З до тижня 16. Значення ваги тварин вимірювали раз на тиждень та фіксували тривалість життя.

Як і очікувалось, у мишей СоіІ4аз3-/- спостерігалася втрата ваги, починаючи з віку приблизно 9 тижнів та смерть наставала у віці від 9 до 11 тижнів. Як показано на фігурі 8А, анти-тів-21 збільшувала максимальну масу тіла та статистично значуще відстрочувала втрату ваги (ри « 0,01). Як показано на фігурі 88, анти-тів-21 статистично значуще збільшувала тривалість життя (р « 0,001). Таким чином, обробка анти-тівВ-21 не тільки відстрочувала втрату ваги, але і значно поліпшувала виживання мишей Соі4аз-/-.

Анти-тів-21 збільшує показник виживання при дослідженні залежності доза-ефект у моделі синдрому Альпорта

Для оцінки дозозалежних ефектів анти-тій-21 на виживання в експериментальній моделі синдрому Альпорта декілька доз сполуки анти-тів-21 вводили мишам Соі4аЗз-/-.

ІЮ МО: 3), де нуклеозиди, за якими не йде нижній індекс, означають В-0- дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "Е", означають 2'-МОБ- нуклеозиди; нуклеозиди, за якими йде нижній індекс "5", означають 5-СЕІ-нуклеозиди. Кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

У віці З тижні мишей генотипували для ідентифікації мишей Соі4а3-/-. Групи обробки були (516) наступними:

(1) миші СоЇІ4аз3-/-, введення РВ5 один раз на тиждень, п-13; (2) миші СоЇІ4аз3-/-, введення 12,5 мг/кг анти-тів-21 один раз на тиждень, п-12; (3) миші СоЇІ4аЗ3-/-, введення 25 мг/кг анти-тів-21 один раз на тиждень, п-13; (4) миші СоіІ4а3-/-, введення 50 мг/кг анти-тів-21 один раз на тиждень, п-12; (5) миші СоіІ4аз3-/-, введення 25 мг/кг анти-тіВ-21 двічі на тиждень, п-12.

Засоби для обробки вводили, починаючи з дня 24. Значення ваги тварин вимірювали раз на тиждень та фіксували тривалість життя. У тиждень 7 кров збирали для вимірювання ВОМ.

Як показано на фігурі ЗА, зниження ВИМ спостерігали у тварин, яких обробляли анти-тівВ- 21, у порівнянні з обробленими РВ5 контрольними тваринами. Хоча спостерігали зниження

ВИМ, воно не було переконливо дозозалежним, можливо внаслідок того, що захворювання було більш важким у мишей Соі4аз3-/-, використовуваних у цьому експерименті (миші були одержані від іншого постачальника, ніж миші СоІ4аз-/-, описані в попередніх прикладах). Зниження ВОМ, яке спостерігали, вказує на знижене ушкодження та ураження нирок та поліпшену функцію.

Як показано на фігурі 9В, обробка анти-тів-21 збільшувала тривалість життя мишей СоіІ4аз- /- дозозалежним чином. Збільшену тривалість життя спостерігали як для обробки двічі на тиждень, так і для обробки один раз на тиждень. Значення медіанного виживання були наступними: РВ5, 62 дні; 12,5 мг/кг анти-тіВв-21 один раз на тиждень (ОММ), 72,5 дня; 25 мг/кг анти-тів-21 один раз на тиждень (ОМ), 77 днів; 50 мг/кг анти-тіВ-21 один раз на тиждень (ОМ), 89 днів; 25 мг/кг анти-тіВ-21 двічі на тиждень (ВІММ), 82,5 дня.

Спостерігали відстрочений початок розвитку ниркової дисфункції та збільшену очікувану тривалість життя у мишей, оброблених анти-тіВв-21, у порівнянні з контрольними мишами, обробленими РВ5, причому можна припустити, що анти-тіВ-21 являє собою терапевтичний засіб, який може збільшувати очікувану тривалість життя суб'єктів з синдромом Альпорта.

Приклад 4. Розподіл анти-тік у нирці мишей СоіІ4аз-/-

Олігонуклеотиди, у тому числі сполуки анти-тікК, як відомо, розподіляються у декількох типах клітин у нирці. Як повідомлялося Спаци еї аї., Зсі Тгапе! Мей., 2012, 121га18, після введення СуЗ-міченого анти-тії або нормальним мишам, або мишам, які зазнали ниркового ушкодження (однобічна обструкція сечоводу, модель інтерстиціального фіброзу), найбільша інтенсивність флуоресценції у нирці спостерігалася в епітелії проксимальних канальців. Всі

Зо вказані з ендотелію, перицитів, міофібробластів та макрофагів також містили кількості, які можуть бути виявлені, СуЗ-мічених анти-тік. Однак, клубочок, зокрема подоцити, вочевидь, не поглинають значні кількості анти-тій, що узгоджується з відомим розподілом хімічно модифікованих олігонуклеотидів (Мазагііап еї аї., ОІїдописіеоїіде5, 2004, 14, 299-310).

Для дослідження розподілу анти-птік у мишиній моделі синдрому Альпорта Суз-мічену сполуку анти-тік вводили мишам Соі4аз-/- із двох різних груп, у одній миші віком 6 тижнів (п-3), а в іншій віком 8 тижнів (п-4), а також мишам дикого типу віком 8 тижнів з однієї групи (п-3).

Через два дні після введення сполуки анти-тії тварин забивали та відбирали нирки і обробляли для гістологічного аналізу.

Зрізи тканини нирок спільно мітили антитілами, специфічними до деяких різних клітинних маркерів, для ідентифікації поглинання анти-тік конкретними типами клітин. Фарбування здійснювали для виявлення альфа-ЗМА (маркера міофібробластів), РОСЕВ-бета (маркера перицитів/міофібробластів), СОЗ31 (маркера ендотеліальних клітин), Е4/80 (маркера макрофагів) та сОРЗ8 (маркера подоцитів). Як і очікувалось, сполука анти-тікК поглиналась епітелієм проксимальних канальців, перицитами, міофібробластами та макрофагами. На противагу попереднім спостереженням щодо нормальних мишей та мишей з інтерстиціальним фіброзом, у мишей СоїІ4аЗз-/- анти-тік поглиналась клубочком, у тому числі подоцитами.

Як описано у даному документі, ефективність, яку спостерігали після введення анти-тів-21 в експериментальній моделі синдрому Альпорта, супроводжується поліпшеннями, що стосуються не тільки інтерстиціального фіброзу, що оточує канальці, але також і фіброзу в клубочках (відомого як гломерулосклероз). Ці дані дозволяють припустити, що ці поліпшення можуть бути безпосередньо пов'язані з ефектами анти-тіВ-21 у клубочках, на додаток до або замість відповіді, пов'язаної з поліпшеною структурою та функцією канальців.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«110» Регудюс Терапевтікс Інк. «120» СПОСОБИ ЛІКУВАННЯ СИНДРОМУ АЛЬПОРТА -1302 ВвЕсІЛ.-32330/50-1/ОВ0 «1503 Ц8 61/779137 «1512 2013-03-13 «1502 05 51/711514 «1512 2012-10-09 «160» й «1702 РакепсІп версія 3.5 «210» 1 «2115 22 «2127 РНК «213» Нощшо варієпа «4003: 1 пачсицайса часпчацеаші да 22 -210з3:3 2 «211з 72 «2122: РНК «2135 Ното варівепа «4002 2 пдисяддодсцад сипацсачаєс пяапцопидчас пешаваце: сапцудсааса ссасдисяаиу бо ччслиодосида са 72 «2105 3 «211» 19 «212з ДНК «2132 Штучна послідовність «22й» «2232 Синтатична «400з з асаєсваєсе дасСаваста 19 «210з 4 «-211з:5 15 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2202 «2232 Синтетична саагсслваса ачска 15

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування модифікованого олігонуклеотиду в одержанні лікарського засобу для застосування в способі лікування синдрому Альпорта, який включає введення суб'єкту, що має синдром Альпорта або з підозрою на нього, модифікованого олігонуклеотиду, де модифікований олігонуклеотид складається з 12-25 зв'язаних нуклеозидів, і де нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду комплементарна тік-21.

2. Застосування за п. 1, де перед введенням модифікованого олігонуклеотиду суб'єкту був поставлений діагноз синдрому Альпорта.

3. Застосування за п. 1, де у суб'єкта перед введенням модифікованого олігонуклеотиду була визначена наявність підвищеного рівня тів-21 у нирці, сечі або крові суб'єкта.

4. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де введення: а) поліпшує функцію нирок; р) дозволяє відстрочити початок розвитку термінальної стадії ниркової недостатності; с) дозволяє відстрочити час діалізу; а) дозволяє відстрочити час трансплантації нирки і/або е) збільшує очікувану тривалість життя.

5. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де введення: а) знижує ступінь гематурії; Юр) дозволяє відстрочити початок розвитку гематурії; с) знижує ступінь протеїнурії; а) дозволяє відстрочити початок розвитку протеїнурії; е) знижує ступінь фіброзу нирок; І) сповільнює подальше прогресування фіброзу і/або 9) припиняє подальше прогресування фіброзу.

6. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де суб'єкт має мутацію, вибрану з мутації гена, який кодує ланцюг альфа-3 колагену ІМ типу, мутацію гена, який кодує ланцюг альфа-4 Зо колагену ІМ типу, або мутацію гена, який кодує ланцюг альфа-5 колагену ІМ типу.

7. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де суб'єктом є чоловік.

8. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де суб'єктом є жінка.

9. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де суб'єкта ідентифікують як такого, що має гематурію і/або протеїнурію.

10. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де суб'єкт має знижену функцію нирок.

11. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де суб'єкт потребує поліпшеної функції нирок.

12. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де спосіб включає: а) вимірювання рівня азоту сечовини в крові суб'єкта; Б) вимірювання рівня креатиніну в крові суб'єкта; с) вимірювання у суб'єкта кліренсу креатиніну; а) вимірювання у суб'єкта ступеня протеїнурії; е) вимірювання у суб'єкта співвідношення альбумін:креатинін; у) вимірювання у суб'єкта швидкості клубочкової фільтрації; 9) вимірювання у суб'єкта рівня цистатину С; Р) вимірювання рівня білка Вр-ігасе ргоїеїп (ВТР) в крові суб'єкта; ї) вимірювання рівня 2-мікроглобуліну в крові суб'єкта; )) вимірювання рівня білка М-ацетил-Д-ЮО-глюкозамінідаза (МАС) у сечі суб'єкта; К) вимірювання рівня білка нейтрофільний желатиназа-асоційований ліпокалін (МОАГ) у сечі БО суб'єкта; І) вимірювання рівня білка молекула ушкодження нирок-1 (КІМ-1) у сечі суб'єкта; т) вимірювання рівня білка інтерлейкін-18 (ІІ -18) у сечі суб'єкта; п) вимірювання рівнів моноцитарного хемоатрактантного білка (МСР') у сечі суб'єкта; о) вимірювання рівнів фактора росту сполучної тканини (СТОР) у сечі суб'єкта; р) вимірювання рівня фрагментів колагену ІМ у сечі суб'єкта; а) вимірювання рівня фрагментів колагену ПІ у сечі суб'єкта і/або г) вимірювання рівнів білка подоцитів у сечі суб'єкта, при цьому білок подоцитів вибраний з нефрину і подоцину.

13. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де введення поліпшує у суб'єкта один або декілька маркерів функції нирок, що вибрані з: а) зниженого рівня азоту сечовини в крові суб'єкта; р) зниженого рівня креатиніну в крові суб'єкта; с) поліпшеного кліренсу креатиніну у суб'єкта; а) зниженого ступеня протеїнурії у суб'єкта; е) зниженого співвідношення альбумін:креатинін у суб'єкта; І) збільшеної швидкості клубочкової фільтрації у суб'єкта; 9) зниженого рівня цистатину С в крові суб'єкта; І) зниженого рівня білка р-ігасе ргоїеїп (ВТР) в крові суб'єкта; ї) зниженого рівня 2-мікроглобуліну (В2М) в крові суб'єкта; Ї) зниженого рівня білка МАС у сечі суб'єкта; К) зниженого рівня білка МОАЇ. у сечі суб'єкта; І) зниженого рівня білка КІМ-1 у сечі суб'єкта; т) зниженого рівня білка ІІ -18 у сечі суб'єкта; п) знижених рівнів моноцитарного хемоатрактантного білка (МОРІ) у сечі суб'єкта; о) знижених рівнів фактора росту сполучної тканини (СТОРБЕ) у сечі суб'єкта; р) зниженого рівня фрагментів колагену ІМ у сечі суб'єкта; а) зниженого рівня фрагментів колагену ПІ у сечі суб'єкта і/або г) знижених рівнів білка подоцитів у сечі суб'єкта, де білок подоцитів вибраний з нефрину та подоцину.

14. Застосування за будь-яким з пп. 5, 9, 12 або 13, де протеїнурією є альбумінурія.

15. Застосування за п. 14, де альбумінурія являє собою альбумінурію з верхньою межею норми, мікроальбумінурію або макроальбумінурію.

16. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де синдром Альпорта являє собою Х- зчеплену форму синдрому Альпорта.

17. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де синдром Альпорта являє собою аутосомну форму синдрому Альпорта.

18. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де спосіб включає застосування Зо щонайменше одного додаткового типу терапії, вибраного із інгібітора ангіотензин-!іІ- перетворюючого ферменту (АСЕ), блокатора рецепторів ангіотензину !/ (АКВ), антигіпертензивного засобу, аналога вітаміну ЮО, перорального засобу, що зв'язує фосфати, діалізу та трансплантації нирки.

19. Застосування за п. 18, де інгібітори ангіотензин-ІІ-перетворюючого ферменту (АСЕ) вибирають з каптоприлу, еналаприлу, лізиноприлу, беназеприлу, хінаприлу, фозиноприлу і раміприлу.

20. Застосування за п. 18, де блокатори рецепторів ангіотензину ІП (АКВ) вибирають з кандесартану, ірбесартану, олмесартану, лозартану, валсартану, телмісартану і епросартану.

21. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де нуклеотидна послідовність модифікованого олігонуклеотиду щонайменше на 90 95 комплементарна, щонайменше на 95 90 комплементарна або на 100 95 комплементарна нуклеотидній послідовності тік-21 (ЗЕО І МО:

1).

22. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де модифікований олігонуклеотид складається з 15-25 зв'язаних нуклеозидів.

23. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де модифікований олігонуклеотид складається з 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 зв'язаних нуклеозидів.

24. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де модифікований олігонуклеотид містить щонайменше один модифікований нуклеозид.

25. Застосування за п. 24, де модифікований нуклеозид вибирають із 5-сСЕЇ-нуклеозиду, 2-0- метоксіетилнуклеозиду і І МА-нуклеозиду.

26. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де модифікований олігонуклеотид містить щонайменше один модифікований міжнуклеозидний зв'язок.

27. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де кожний міжнуклеозидний зв'язок модифікованого олігонуклеотиду являє собою модифікований міжнуклеозидний зв'язок.

28. Застосування за п. 26 або п. 27, де модифікований міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

29. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де модифікований олігонуклеотид має структуру 5-АєС5АТОзАСТОвТаАОвААСіСьТАв-3, де нуклеозиди без подальшого нижнього індексу означають Р-Ю-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди з подальшим нижнім індексом "Е" 60 означають 2--МОЕ-нуклеозиди; нуклеозиди з подальшим нижнім індексом "5" означають 5-СЕї- Зо нуклеозиди; і кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок.

30. Застосування модифікованого олігонуклеотиду структури 5- АєС5АТОСвАсаТтОвТалОзААссС»ТАв-3! в одержанні лікарського засобу для застосування в способі лікування синдрому Альпорта, що включає введення суб'єкту, який має синдром Альпорта або з підозрою на нього, модифікованого олігонуклеотиду структури 5- АєС5АТСвАатОСвТалОвААсСіСвТАє-3, де нуклеозиди без подальшого нижнього індексу означають ДВ-Ю-дезоксирибонуклеозиди; нуклеозиди з подальшим нижнім індексом "Е" означають 2'-МОЄЕ-нуклеозиди; нуклеозиди з подальшим індексом "5" означають 9-СЕї- нуклеозиди, і кожний міжнуклеозидний зв'язок являє собою фосфоротіоатний міжнуклеозидний зв'язок. Фігура 1

А. 12 х 100- І В Е а 50 н 2 о анти-тівф-21 / Контроль ж р. 0,0008

В. нік Сода «Ве Соїда3-. «анти-тік-21 вій Ж 5 ж Г-- А 10 ш щ рж 5 Ж 5 Е 5, є І Е о о 2 4 б 8 10 Тижні

Фігура 2 в 1969 Г7сСомазу. «анти-тік-21

5.1 ШЕ сомаз. я ж я УТ У 15 ще І ж ж ща ж я ІК Е сх 51 Щ. з ЗМ ам! ШІ! ШО Ще - А Ступінь склерозу

Фігура З

А. Фіброз що 20 ж Ши в Шк че -Ра Ех - м) анти-тік-21 Контроль ж р. 0,0002

В. СоЙаї ши: виш Е! 52 а 51 -

ш. на анти-тік-21 Контроль

Фігура 4

А. щ Б 4 ЗХ в і о й я о 82 щ Хо ш анти-тіК-21 Контроль Е Е- Я Х ч а 8 "икіййіісніційнй 5, Га ЕЕ 4 -ш - З 8 2 Е У 1 ш анти-тік-21 Контроль - 5 ЧЕ ж в в'я ЩЕ - а Е анти-тів-21 Контроль

Фігура 5

А. с 12 ж 1 Е Е щ в Ге ж З йо 3 анти-тів-21 Контроль

В. - ж й " милим -2 ш. 52 а 4 я Я єї анти-тів-21 Контроль

Фігура 6

А. Перекнс водню р Ж 2; ! г 3 м Ж "о анти-тікК-21 Контроль

В. ж Е Ї іні іні нні іній нінініниніннінннінніннннінннй 3 в'н З 5 ВЕ о ха ще

Б я.

о

8.1 5 Контроль анти-ті8-21 Соїдаз" Зб