CN104718295A - 用于治疗奥尔波特综合征的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了使用靶向于miR-21的修饰的寡核苷酸治疗奥尔波特综合征的方法。在某些实施例中，一种靶向于miR-21的修饰的寡核苷酸在患有奥尔波特综合征的受试者中改善肾功能和/或减少纤维化。在某些实施例中，给予一种靶向于miR-21的修饰的寡核苷酸延迟了患有奥尔波特综合征的受试者中终末期肾病的发作。在某些实施例中，一种靶向于miR-21的修饰的寡核苷酸延迟了患有奥尔波特综合征的受试者中对透析或肾移植的需要。

Description

用于治疗奥尔波特综合征的方法
发明领域
本文中提供用于治疗奥尔波特综合征的方法和组合物。
相关技术说明
IV型胶原蛋白(基底膜的一种主要组分)是以下六种α链的家族：α-1胶原蛋白(IV型)、α-2胶原蛋白(IV型)、α-3胶原蛋白(IV型)、α-4胶原蛋白(IV型)、α-5胶原蛋白(IV型)和α-6胶原蛋白(IV型)。胶原蛋白IV的α-3、α-4和α-6链是肾小球基底膜(GBM)的胶原蛋白网络的基础组分，该肾小球基底膜执行肾脏过滤血液的关键功能。
奥尔波特综合征是遗传性形式的肾脏疾病，其中异常类型的肾小球基底膜(GBM)产生，导致间质纤维化、肾小球硬化和最终肾功能丧失。该疾病还经常以听觉缺陷和眼部异常为特征。奥尔波特综合征由分别编码IV型胶原蛋白α3(IV)、α4(IV)和α5(IV)链的Col4a3、Col4a4或Col4a5中的突变引起。X染色体上Col4a5基因中的突变引起X连锁形式的奥尔波特综合征，其占据全部疾病病例的85％。一种常染色体隐性形式归因于Col4a3亦或Col4a4任一者的每个拷贝中的突变的遗传，每个突变均位于上2号染色体上。稀有常染色体显性形式归因于Col4a3或Col4a4基因中的显性-负向突变的遗传。X连锁形式在雄性中比雌性中更严重，其中雄性中的大部分病例发展成终末期肾病(ESRD)。常染色体形式在雄性和雌性中具有相似的严重性。本病的大部分病例归因于遗传性突变，但是一些病例归因于在Col4aA基因之一中的从头突变。
发明概述
在此提供了治疗奥尔波特综合征的多种方法，包括向患有或疑似患有奥尔波特综合征的受试者给予由12至25个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，其中这种修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-21互补。在某些实施例中，在给予这种修饰的寡核苷酸之前，该受试者已经被诊断为患有奥尔波特综合征。在某些实施例中，在给予这种修饰的寡核苷酸之前，该受试者被确定为在受试者的肾组织中具有增加水平的miR-21。在某些实施例中，在给予这种修饰的寡核苷酸之前，该受试者被确定为在受试者的尿或血液中具有增加水平的miR-21。
在本文提供的任一实施例中，向患有或疑似患有奥尔波特综合征的受试者给予与miR-21互补的修饰的寡核苷酸可以在受试者中改善肾功能；延迟终末期肾病发作；延迟进行透析的时间；延迟进行肾移植的时间；和/或改善预期寿命。
在本文提供的任一实施例中，向患有或疑似患有奥尔波特综合征的受试者给予与miR-21互补的修饰的寡核苷酸可以减少血尿；延迟血尿的发作；减少蛋白尿；延迟蛋白尿的发作；减少肾纤维化；减缓纤维化的进一步进展；和/或制止纤维化的进一步进展。
在本文提供的任一实施例中，受试者可以具有选自以下项的突变：在编码IV型胶原蛋白α3链的基因中的突变、在编码IV型胶原蛋白α4链的基因中的突变或在编码IV型胶原蛋白α5链的基因中的突变。在某些实施例中，受试者是雄性。在某些实施例中，受试者是雌性。在某些实施例中，受试者被鉴定为患有血尿和/或蛋白尿。在某些实施例中，受试者具有降低的肾功能。在某些实施例中，受试者需要改善的肾功能。
本文中提供的任一实施例可以包括测量在受试者的血液中的血尿素氮；测量受试者的血液中的肌酐；测量受试者中的肌酐清除率；测量受试者中的蛋白尿；测量受试者中的白蛋白:肌酐比率；和/或测量受试者中的肾小球滤过率。
在此提供的任一实施例可以包括测量受试者的尿中的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白；测量受试者的尿中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)；测量受试者的尿中的肾损伤分子-1(KIM-1)蛋白；测量受试者的尿中的白细胞介素-18(IL-18)蛋白；测量受试者的尿中的单核细胞趋化蛋白(MCP1)水平；测量受试者的尿中的结缔组织生长因子(CTGF)水平；测量受试者的尿中的IV型胶原蛋白(Col IV)片段；测量受试者的尿中的III型胶原蛋白(Col III)片段；和/或测量平受试者的尿中的足细胞蛋白水平，其中该足细胞蛋白选自nephrin和podocin。在此提供的任一实施例可以包括测量受试者的血液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白；测量受试者的血液中的β-痕量蛋白(BTP)；并且测量受试者的血液中的2-微球蛋白(B2M)。
在此提供的任一方法可以改善受试者中的肾功能的一种或多种标记，这些标记选自以下项：受试者中减少的血尿素氮；受试者的血液中减少的肌酐；受试者中改善的肌酐清除率；受试者中减少的蛋白尿；受试者中降低的白蛋白:肌酐比率；和/或受试者中改善的肾小球滤过率。在此提供的任一方法可以改善受试者中的肾功能的一种或多种标记，这些标记选自以下项：受试者的尿中减少的NAG；受试者的尿中减少的NGAL；受试者的尿中减少的KIM-1；受试者的尿中减少的IL-18；受试者的尿中减少的MCP1；受试者的尿中减少的CTGF；受试者的尿中减少的胶原蛋白IV片段；受试者的尿中减少的III型胶原蛋白片段；受试者的尿中减少的足细胞蛋白水平，其中该足细胞蛋白选自nephrin和podocin。在此提供的任一方法可以改善肾功能的一种或多种标记，这些标记选自以下项：受试者的血液中减少的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白、受试者的血液中减少的β-痕量蛋白(BTP)和受试者的血液中减少的2-微球蛋白(B2M)。
在本文提供的任一实施例中，蛋白尿是白蛋白尿。白蛋白尿可以是高正常(high normal)白蛋白尿、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。
在某些实施例中，奥尔波特综合征是X连锁形式的奥尔波特综合征。在某些实施例中，奥尔波特综合征是常染色体形式的奥尔波特综合征。
在此提供的任一实施例可以包括给予至少一个选自以下项的额外疗法：血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、抗高血压剂、维生素D类似物、口服磷酸盐结合剂、透析以及肾移植。在这些实施例的任一个中，血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂选自卡托普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、喹那普利、福辛普利以及雷米普利。在这些实施例的任一个中，血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)选自坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦以及依普罗沙坦。在这些实施例的任一个中，ACE抑制剂选自西拉普利、培哚普利以及群多普利。
在某些实施例中，以范围从0.5至1mg/m2/日、从1至6mg/m2/日、从1至2mg/m2/日、从2至4mg/m2/日或从4至8mg/m2/日的剂量给予ACE抑制剂。
在某些实施例中，以范围从6.25至150mg/m2/日的剂量给予ARB。在这些实施例的任一个中，以6.25mg/m2/日、10mg/m2/日、12.5mg/m2/日、18.75mg/m2/日、37.5mg/m2/日、50mg/m2/日、或150mg/m2/日的剂量给予ARB。
在某些实施例中，该至少一种额外疗法是醛固酮拮抗剂。在某些实施例中，醛固酮拮抗剂是螺内酯。在某些实施例中，以范围从每日10mg至35mg的剂量给予螺内酯。在某些实施例中，以每日25mg的剂量给予螺内酯。
在本文提供的任一实施例中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-21的核碱基序列(SEQ ID NO:1)至少90％互补、至少95％互补或100％互补。
在本文提供的任一实施例中，修饰的寡核苷酸由8至30个、12至25个或15至25个连接的核苷组成。在本文提供的任一实施例中，修饰的寡核苷酸由12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连接的核苷组成。在本文提供的任一实施例中，修饰的寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21或22个连接的核苷组成。
在本文提供的任一实施例中，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷。修饰的核苷可以选自S-cEt核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷以及LNA核苷。修饰的寡核苷酸可以包含至少一个修饰的核苷间键。修饰的寡核苷酸的每个核苷间键可以是修饰的核苷间键。在某些实施例中，修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在本文提供的任一实施例中，修饰的寡核苷酸可以具有结构5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO:3)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在此提供了一种由8至30个、12至25个或15至25个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸用于治疗奥尔波特综合征的用途，其中这种修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-21互补。
附图简述
图1.抗miR-21改善Col4a3-/-小鼠的肾功能。在第9周的血尿素氮(BUN)(A)和在第3、5、7和9周的尿白蛋白/肌酐比率(B)。*指示统计显著性。
图2.抗miR-21预防Col4a3-/-小鼠中的肾小球硬化。使用范围从0(无硬化)至4(完全硬化)(n＝10)的半定量硬化评分来评估肾小球硬化。
图3.抗miR-21减少Col4a3-/-小鼠中的纤维化。(A)肾脏中天狼猩(Sirius)红染色的纤维化的定量(n＝6)和(B)Col1a1转录物针对GAPDH归一化的定量PCR(n＝6)。*指示统计显著性。
图4.抗miR-21降低Col4a3-/-小鼠中的肾损伤等级。(A)9周龄小鼠的肾切片的肾损伤等级评分。(B)肾小球新月体的比例(n＝5)。(C)肾小管损伤的定量(n＝5)。*指示统计显著性。
图5抗miR-21在Col4a3-/-小鼠中减少巨噬细胞浸润(A)并减少肌成纤维细胞(B)。(A)9周龄小鼠的肾切片的F4/80染色的定量(n＝5)。(B)9周龄小鼠的肾切片的αSMA染色的定量(n＝5)。*指示统计显著性。
图6.抗miR-21减少Col4a3-/-小鼠中的活性氧种类。(A)用抗miR-21或PBS对照处理的Col4a3-/-小鼠的尿中的过氧化氢的定量(n＝8；*指示统计显著性)；(B)用抗miR-21或PBS对照处理的Col4a3-/-小鼠中和野生型小鼠中的肾组织中的DES的定量(每组n＝3；*指示统计显著性)。
图7.抗miR-21改善Col4a3-/-小鼠中的足细胞数目。用抗miR-21或PBS对照处理的Col4a3-/-小鼠的肾小球中WT1-阳性细胞数目的定量(n＝3；p＝0.005)。
图8.抗miR-21增加Col4a3-/-小鼠的寿命。(A)用抗miR-21或PBS对照处理的Col4a3-/-小鼠的重量(p<0.01)；(B)用抗miR-21或PBS对照处理的Col4a3-/-小鼠的寿命(P<0.001)。
图9.抗miR-21以剂量-反应方式改善Col4a3-/-小鼠的肾功能并增加其寿命(每个处理组n＝10-13)。(A)在7周时的血尿素氮；(B)用抗miR-21以多剂量每周一次(QW)或每周二次(BIW)或用PBS对照处理的Col4a3-/-小鼠的寿命。
详细说明
除非另外限定，否则在此使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非提供具体定义，否则与在此所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关所使用的命名以及程序和技术是本领域熟知的和通常使用的那些。在本文中所用术语存在多个定义的情况下，在这个部分中的那些定义居于优先。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者的治疗。某些此类技术和程序可以例如在“Carbohydrate Modifications in Antisense Research(《反义研究中的碳水化合物修饰》)”Sangvi(桑格维)和Cook(库克)编，American Chemical Society(美国化学学会)，Washington D.C.(华盛顿)，1994；以及“Remington's Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿氏药物科学》)，Mack Publishing Co.(Mack出版公司)，Easton(伊斯顿)，Pa.(宾夕法尼亚州)，第18版，1990中找到；并且出于任何目的将这些文献通过引用特此结合。在允许的情况下，除非另外指出，在此的整个披露中自始至终参考的全部专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站和其他公开的材料均通过引用以其全文结合在此。在提到URL或其他此类识别码或地址的情况下，应理解为此类识别码可以变化并且互联网上的具体信息可以变化，但是可以通过搜索互联网找到等同的信息。对其参考的文献表明此类信息的可获取性和公共传播性。
在披露和描述本发明的组合物和方法之前，应当理解在此使用的术语的目的仅在于描述具体实施例而并非旨在是限制性的。必须指出，除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。
定义
“奥尔波特综合征”意指一种遗传性形式的肾脏疾病，其中异常水平的肾小球基底膜(GBM)产生，导致间质纤维化、肾小球硬化和最终肾功能丧失。该疾病还经常以听觉缺陷和眼部异常为特征。
“血尿”意指尿中存在红细胞。
“白蛋白尿”意指尿中存在过量的白蛋白，并且包括而不局限于正常白蛋白尿、高正常白蛋白尿、微量白蛋白尿以及大量白蛋白尿。正常情况下，由足细胞，肾小球基底膜和内皮细胞组成的肾小球滤过通透性屏障预防血清蛋白泄漏至尿中。白蛋白尿可以反映肾小球滤过通透性屏障的损伤。白蛋白尿可以从24小时尿样、过夜尿样或随取尿样计算。
“高正常白蛋白尿”意指升高的白蛋白尿，其特征在于(i)每24小时排泄15至<30mg白蛋白至尿中和/或(ii)在雄性中白蛋白/肌酐比率为1.25至<2.5mg/mmol(或10至<20mg/g)或在雌性中1.75至<3.5mg/mmol(或15至<30mg/g)。
“微量白蛋白尿”意指升高的白蛋白尿，其特征在于(i)每24小时排泄30至300mg白蛋白至尿中和/或(ii)在雄性中白蛋白/肌酐比率为2.5至<25mg/mmol(或20至<200mg/g)或在雌性中3.5至<35mg/mmol(或30至<300mg/g)。
“大量蛋白尿”意指升高的白蛋白尿，其特征在于每24小时排泄超过300mg白蛋白至尿中和/或(ii)在雄性中白蛋白/肌酐比率>25mg/mmol(或>200mg/g)或在雌性中>35mg/mmol(或>300mg/g)。
“白蛋白/肌酐比率”意指尿白蛋白(mg/dL)/尿肌酐(g/dL)的比率，并且表述为mg/g。在某些实施例中，白蛋白/肌酐比率可以从随取尿样中计算，并且可以用作24小时时期内的白蛋白排泄量的估量。
“估计的肾小球滤过率(eGFR)或“肾小球滤过率(GFR)”意指肾脏怎样良好过滤肌酐的量度，并且用作每分钟多少血液经过肾小球的估量。正常结果范围可以是从90-120mL/分钟/1.73m2。低于60mL/分钟/1.73m2持续3个月或更多个月的水平可以是慢性肾脏疾病的指示。低于15mL/分钟/1.73m2的水平可以是肾衰竭的指示。
“蛋白尿”意指尿中存在过多的血清蛋白。蛋白尿特征在于每24小时排泄>250mg蛋白至尿中和/或尿蛋白对肌酐比率≥0.20mg/mg。与蛋白尿相关联而升高的血清蛋白包括而不局限于白蛋白。
“血尿素氮”或“BUN”意指血液中处于尿素形式的氮的量的量度。肝脏在尿素循环中产生尿素作为蛋白消化的废弃产物，并且尿素由肾脏从血液移除。正常人成人血液可以含有7至21mg之间的尿素氮/100ml血液(7-21mg/dL)。血尿素氮的量度用于指示肾健康。如果肾脏不能正常地将尿素从血液移除，则受试者的BUN升高。
“终末期肾病(ESRD)”意指肾功能完全或几乎完全衰竭。
“受损的肾功能”意指相对于正常的肾功能而言降低的肾功能。
“纤维化”意指器官或组织中过多纤维结缔组织的形成或发育。在某些实施例中，纤维化作为修复过程或反应过程出现。在某些实施例中，纤维化应答于损伤或损害而出现。术语“纤维化”应理解为器官或组织中形成或发育过多的纤维结缔组织作为修复过程或反应过程，与形成纤维组织作为器官或组织的正常组分相反。
“减缓进一步进展”意指降低某种医学状况移向晚期状态的速率。
“制止进一步进展”意指使某种医学状况停止向晚期状态进展。
“延迟进行透析的时间”意指维持足够的肾功能从而延迟对透析治疗的需要。
“延迟进行肾移植的时间”意指维持足够的肾功能从而延迟对肾移植的需要。
“改善预期寿命”意指通过治疗受试者中的疾病的一个或多个症状延长受试者的寿命。
“抗miR”意指具有与微RNA互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR是修饰的寡核苷酸。
其中“miR-X”表示特定微RNA的“抗miR-X”意指具有与miR-X互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR-X与miR-X完全互补(即，100％互补)。在某些实施例中，抗miR-X与miR-X互补至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在某些实施例中，抗miR-X是修饰的寡核苷酸。
“miR-21”意指具有核碱基序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO:1)的成熟miRNA。
“miR-21茎-环序列”意指具有核碱基序列UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO:2)的茎-环序列。
“靶核酸”意指寡聚化合物被设计成与其杂交的核酸。
“靶向”意指设计和选择将与靶核酸杂交的核碱基序列的过程。
“靶向于”意指具有将允许与靶核酸杂交的核碱基序列。
“调节”意指功能、量或活性的扰动。在某些实施例中，调节意指功能、量或活性的升高。在某些实施例中，调节意指功能、量或活性的降低。
“表达”意指任何功能和步骤，借助所述功能和步骤，基因的编码信息转化成在细胞中存在和发挥作用的结构。
“核碱基序列”意指寡聚化合物或核酸中的连续核碱基的顺序，典型地以5'至3'方向列出，与任何糖、键和/或核碱基修饰无关。
“连续核碱基”意指在核酸中彼此紧密相邻的核碱基。
“核碱基互补性”意指两个核碱基经氢键非共价配对的能力。
“互补的”意指一个核酸能够与另一个核酸或寡核苷酸杂交。在某些实施例中，互补物指能够与靶核酸杂交的寡核苷酸。
“完全互补的”意指寡核苷酸的每个核碱基能够与靶核酸中每个相应位置处的核碱基配对。在某些实施例中，寡核苷酸与微RNA完全互补，即寡核苷酸的每个核碱基与微RNA中的相应位置处的核碱基互补。在某些实施例中，其中每个核碱基与微RNA茎-环序列的区域内部的核碱基具有互补性的寡核苷酸与微RNA茎-环序列完全互补。
“互补性百分比”意指寡核苷酸中与靶核酸的等长度部分互补的核碱基的百分比。通过以下方式计算互补性百分比：将寡核苷酸的与靶核酸中的相应位置处的核碱基互补的核碱基的数目除以寡核苷酸中核碱基的总数。
“一致性百分比”意指第一核酸中与第二核酸内的相应位置处的核碱基相同的核碱基的数目除以第一核酸中的核碱基的总数。在某些实施例中，第一核酸是微RNA并且第二核酸是微RNA。在某些实施例中，第一核酸是寡核苷酸并且第二核酸是寡核苷酸。
“杂交”意指通过核碱基互补性而发生的互补性核酸的退火。
“错配”意指第一核酸的核碱基不能够与第二核酸的相应位置处的核碱基进行沃森-克里克(Watson-Crick)配对。
在核碱基序列的背景下，“一致”意指具有相同的核碱基序列，与糖、键和/或核碱基修饰无关并且与任何存在的嘧啶的甲基化状态无关。
“微RNA”意指长度在18和25个核碱基之间的内源性非编码RNA，它是Dicer酶切割前微RNA的产物。成熟微RNA的实例被发现于称作miRBase的微RNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中。在某些实施例中，微RNA缩写为“微RNA”或“miR”。
“前微RNA”或“前-miR”意指具有发夹结构的非编码RNA，它是称作Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割初级miR(pri-miR)的产物。
“茎-环序列”意指具有发夹结构并且含有成熟微RNA序列的RNA。前微RNA序列和茎-环序列可以重叠。茎-环序列的实例被发现于称作miRBase的微RNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中。
“初级微RNA”或“初级miR”意指具有发夹结构的非编码RNA，它是双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha的底物。
“微RNA前体”意指一种转录物，它源自基因组DNA并包含非编码、结构化的包含一个或多个微RNA序列的RNA。例如，在某些实施例中，微RNA前体是前微RNA。在某些实施例中，微RNA前体是初级微RNA。
“微RNA调节的转录物”意指受微RNA调节的转录物。
“种子序列”意指这样一种核碱基序列：包含成熟微RNA序列5'-端的核碱基1至9中的6至8个连续核碱基。
“种子匹配序列”意指与种子序列互补并且与种子序列具有相同长度的核碱基序列。
“寡聚化合物”意指包含多个连接的单体亚基的化合物。低聚化合物包括寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指包含多个连接的核苷的化合物，这些核苷的每一个可以彼此独立地是修饰或未修饰的。
“天然存在的核苷间键”意指核苷之间的3'至5'磷酸二酯键。
“天然糖”意指DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中发现的糖。
“核苷间键”意指相邻核苷之间的共价键。
“连接的核苷”意指由共价键连接的核苷。
“核碱基”意指能够非共价地与另一个核碱基配对的杂环部分。
“核苷”意指与糖部分连接的核碱基。
“核苷酸”意指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸酯基团的核苷。
“包含由多个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸的化合物”意指这样一种化合物，它包含具有指定数目的连接核苷的修饰的寡核苷酸。因此，该化合物可以包含额外的取代基或结合物。除非另外指明，该化合物不包括除那些修饰的寡核苷酸之外的任何额外核苷。
“修饰的寡核苷酸”意指相对于天然存在的末端、糖、核碱基、和/或核苷间键具有一种或多种修饰的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸可以包含未修饰的核苷。
“单链修饰的寡核苷酸”意指不与互补链杂交的修饰的寡核苷酸。
“修饰的核苷”意指具有不同于天然存在核苷的任何变化的核苷。修饰的核苷可以具有修饰的糖和未修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有天然糖和修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的核苷是双环核苷。在某些实施例中，修饰的核苷是非双环核苷。
“修饰的核苷间键”意指不同于天然存在核苷间键的任何变化。
“硫代磷酸酯核苷间键”意指核苷之间其中非桥接原子之一是硫原子的键。
“修饰的糖部分”意指不同于天然糖的取代和/或任何变化。
“未修饰的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环碱基：嘌呤碱基-腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基-胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)以及尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”意指包含附接至5位置的甲基的胞嘧啶。
“非甲基化胞嘧啶”意指不具有附接至5位置的甲基的胞嘧啶。
“修饰的核碱基”意指不是未修饰核碱基的任何核碱基。
“糖部分”意指天然存在的呋喃糖基或修饰的糖部分。
“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
“2'-O-甲基糖”或“2'-OMe糖”意指在2'位置具有O-甲基修饰的糖。
“2'-O-甲氧基乙基糖”或“2'-MOE糖”意指在2'位置具有O-甲氧基乙基修饰的糖。
“2'-氟”或“2'-F”意指在2'位置具有氟修饰的糖。
“双环糖部分”意指包含一个4至7元环的修饰的糖部分(包括但不局限于呋喃糖基)，该4至7元环包含连接了该4至7元环的两个原子的一个桥从而形成第二环，导致双环结构。在某些实施例中，该4至7元环是糖环。在某些实施例中，该4至7元环是呋喃糖基。在某些此类实施例中，该桥连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳。非限制的示例性双环糖部分包括LNA、ENA，cEt、S-cEt和R-cEt。
“锁核酸(LNA)糖部分”意指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含(CH2)-O桥的取代的糖部分。
“ENA糖部分”意指在4'和2'呋喃糖环原子之间包含(CH2)2-O桥的取代的糖部分。
“约束乙基(cEt)糖部分”意指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含CH(CH3)-O桥的取代的糖部分。在某些实施例中，CH(CH3)-O桥被约束为S取向。在某些实施例中，(CH2)2-O被约束为R取向。
“S-cEt糖部分”意指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含S-约束的CH(CH3)-O桥的取代的糖部分。
“R-cEt糖部分”意指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含R-约束的CH(CH3)-O桥的取代的糖部分。
“2'-O-甲基核苷”意指具有2'-O-甲基糖修饰的2'-修饰核苷。
“2'-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2'-O-甲氧基乙基糖修饰的2'-修饰核苷。2'-O-甲氧基乙基核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“2'-氟核苷”意指具有2'-氟糖修饰的2'-修饰核苷。2'-氟核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“双环核苷”意指具有双环糖部分的2'-修饰核苷。双环核苷可以具有修饰或未修饰的核碱基。
“cEt核苷”意指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分的核苷。
“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分的核苷。
“β-D-脱氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。
“LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。
“ENA核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。
“受试者”意指被选择用于治疗或疗法的人类或非人类动物。
“对其有需要的受试者”意指被鉴定为需要疗法或治疗的受试者。
“疑似患有……的受试者”是展现疾病的一种或多种临床指标的受试者。
“给予”意指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不局限于由医学专业人士给予和自我给予。
“肠胃外给予”意指通过注射或输注的给予。肠胃外给予包括但不局限于皮下给予、静脉内给予和肌内给予。
“皮下给予”意指紧靠皮肤下的给予。
“静脉内给予”意指给予至静脉中。
“同时给予”指两种或更多种药剂以任何方式的共给予，其中两种药物的药理作用在患者中同时显现。同时给予不要求两种药剂在单一药物组合物中、以相同剂型或通过相同的给予途径给予。两种药剂的作用不需要在相同时间显现它们自身。这些作用仅需要重叠一段时间并且不需要是同延的。
“持续期”意指期间活性或事件继续的时间段。在某些实施例中，治疗持续期是期间给予药剂或药物组合物的剂量的时间段。
“疗法”意指疾病治疗方法。在某些实施例中，疗法包括但不局限于化疗、放疗或给予药剂。
“治疗”意指应用一种或多种用于治愈或改善疾病的具体程序。在某些实施例中，具体程序是给予一种或多种药剂。
“改善”意指减轻病状或疾病的至少一种指标的严重性。在某些实施例中，改善包括延迟或延缓一种病状或疾病的一种或多种指标的进展。指标的严重性可以由本领域技术人员已知的主观或客观量度确定。
“存在发展风险”意指其中受试者易倾向于发展病状或疾病的状态。在某些实施例中，存在发展病状或疾病风险的受试者展现出该病状或疾病的一种或多种症状，但是未展现足够数目的被诊断患有该病状或疾病的症状。在某些实施例中，存在发展病状或疾病风险的受试者展现出该病状或疾病的一种或多种症状，但是被诊断患有该病状或疾病的需求程度较小。
“预防发作”意指预防在存在发展一种病状或疾病风险的受试者中该病状或疾病的发展。在某些实施例中，存在发展疾病或病状风险的受试者接受与已经患有该疾病或病状的受试者所接受的治疗相似的治疗。
“延迟发作”意指延迟在存在发展一种病状或疾病风险的受试者中该病状或疾病的发展。在某些实施例中，存在发展一种病状或疾病风险的受试者接受与已经患有该疾病或病状的受试者所接受的治疗相似的治疗。
“治疗剂”意指用于治愈、改善或预防疾病的药剂。
“剂量”意指在单次给予中提供的指定数量的药剂。在某些实施例中，剂量可以在两个或更多个大丸剂、片剂或注射中给予。例如，在某些实施例中，其中希望皮下给予的情况下，所希望的剂量需要不易被单次注射所容纳的体积。在此类实施例中，两次或更多次注射可以用来实现所希望的剂量。在某些实施例中，剂量可以按两次或更多次注射给予，以便使个体中的注射部位反应最小化。在某些实施例中，剂量作为缓慢输注给予。
“剂量单位”意指提供药剂的形式。在某些实施例中，剂量单位是含有冻干的寡核苷酸的小瓶。在某些实施例中，剂量单位是含有复水的寡核苷酸的小瓶。
“治疗有效量”指向动物提供治疗益处的药剂的量。
“药物组合物”意指包含药剂的适用于给予至个体的物质混合物。例如，药物组合物可以包含无菌水溶液。
“药剂”意指在给予至受试者时提供治疗作用的物质。
“活性药物成分”意指药物组合物中提供所需作用的物质。
“改善的器官功能”意指器官功能向正常限制的变化。在某些实施例中，通过测量在受试者的血液或尿中发现的分子评价器官功能。例如，在某些实施例中，改善的肾功能由血尿素氮减少、蛋白尿减少、白蛋白尿减少等量度。
“可接受的安全谱(safety profile)”意指处于临床可接受限值之内的副作用的样式。
“副作用”意指除所希望的作用之外，可归因于治疗的生理反应。在某些实施例中，副作用包括而不局限于注射部位反应、肝功能检验异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常以及肌病。此类副作用可以直接或间接地检测到。例如，血清中增加的氨基转移酶水平可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，增加的胆红素可以指示肝毒性或肝功能异常。
“受试者依从性”意指受试者遵循所推荐的或指定的疗法。
“依从”意指受试者遵循所推荐的疗法。
“推荐的疗法”意指由医学专业人士推荐的用于治疗、改善或预防疾病的治疗。
如在此使用的术语“血液”包括全血和血液部分(如血清和血浆)。
概述
奥尔波特综合征是一种遗传性形式的肾脏疾病，其中异常水平的肾小球基底膜(GBM)产生，导致间质纤维化、肾小球硬化，并且典型地导致终末期肾病。在奥尔波特综合征的处理中，主要治疗目的是维持肾功能和预防终末期肾病的发作(ESRD)，这进而改善患有奥尔波特综合征的受试者的预期寿命。
奥尔波特综合征特征在于因GBM组成缺陷所致的进行性纤维化，因此GBM形态和功能的改善是所希望的。在此证明了靶向于miR-21的修饰的寡核苷酸在奥尔波特综合征的实验模型中改善肾功能。额外地，肾小球硬化和纤维化在抗miR-21治疗后减少。在此进一步证明了抗miR-21在奥尔波特综合征的实验模型中改善存活。就此，这些靶向于miR-21的修饰的寡核苷酸可用于治疗奥尔波特综合征。
本发明的某些用途
在此提供了用于治疗奥尔波特综合征的多种方法，包括向患有或疑似患有奥尔波特综合征的受试者给予与miR-21互补的修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，在给予这种修饰的寡核苷酸之前，该受试者已经被诊断为患有奥尔波特综合征。可以通过评估以下参数实现奥尔波特综合征的诊断，这些参数包括而不局限于受试者的家族史、临床特征(包括而不局限于蛋白尿、白蛋白尿、血尿、受损的GFR、聋症和/或眼部变化)和组织活检结果。可以针对IV型胶原蛋白α-3、α-4和α-5链的存在或不存在而对肾活检物进行测试。额外地，可以通过肾活检材料的电子显微术检测肾小球的结构变化。可以针对IV型胶原蛋白α-5链的存在而对皮肤活检物进行测试，该IV型胶原蛋白α-5链正常情况下存在于皮肤中并且几乎总是不存在于患有X连锁形式奥尔波特综合征的雄性受试者中。奥尔波特综合征的诊断还可以包括筛查在Col4a3、Col4a4或Col4a5基因的一者或多者中的突变。
在某些实施例中，miR-21的水平在患有奥尔波特综合征的受试者的肾中增加。在某些实施例中，在给予之前，受试者被确定为在肾中具有增加水平的miR-21。可以从肾活检材料测量miR-21水平。在某些实施例中，在给予之前，受试者被确定为在该受试者的尿或血液中具有增加水平的miR-21。
在某些实施例中，给予与miR-21互补的修饰的寡核苷酸导致一种或多种临床有益的结果。在某些实施例中，给予改善肾功能。在某些实施例中，给予延迟终末期肾病的发作。在某些实施例中，给予延迟了进行透析的时间。在某些实施例中，给予延迟了进行肾移植的时间。在某些实施例中，给予改善受试者的预期寿命。
在某些实施例中，给予减少肾纤维化。在某些实施例中，给予减缓肾纤维化的进一步进展。在某些实施例中，给予制止肾纤维化的进一步进展。在某些实施例中，给予减少血尿。在某些实施例中，给予延迟血尿的发作。在某些实施例中，给予减少蛋白尿。在某些实施例中，给予延迟蛋白尿的发作。
患有或疑似患有奥尔波特综合征的受试者可以具有选自以下项的突变：在编码IV型胶原蛋白α3链的基因(Col4a3)中的突变、在编码IV型胶原蛋白α4链的基因(Col4a4)中的突变或在编码IV型胶原蛋白α5链的基因(Col4a5)中的突变。在某些实施例中，受试者是雄性。在某些实施例中，受试者是雌性。
在某些实施例中，受试者具有受损的肾功能。在某些实施例中，受试者需要改善的肾功能。在某些实施例中，受试者被鉴定为患有受损的肾功能。在某些实施例中，受试者被鉴定为患有血尿。在某些实施例中，受试者被鉴定为患有蛋白尿。
在本文提供的任一实施例中，受试者可以经历某些测试以评估肾功能。此类测试包括而不局限于测量受试者中的血尿素氮；测量受试者的血液中的肌酐；测量受试者的血液中的肌酐清除率；测量受试者中的蛋白尿；测量受试者中的白蛋白:肌酐比率；测量受试者中的肾小球滤过率；以及测量受试者中的尿排出量。
在本文提供的任一实施例中，尿或血液中存在的蛋白可以用于评估肾功能。肾功能的此类测试包括但不局限于：测量受试者的尿中的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白；测量受试者的尿中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)；测量受试者的尿中的肾损伤分子-1(KIM-1)蛋白；测量受试者的尿中的白细胞介素-18(IL-18)蛋白；测量受试者的尿中的结缔组织生长因子(CTGF)水平；测量受试者的尿中的单核细胞趋化蛋白1(MCP1)水平；测量受试者的尿中的IV型胶原蛋白(Col IV)片段；测量受试者的尿中的III型胶原蛋白(Col III)片段水平；测量受试者的血液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白；测量受试者的血液中的β-痕量蛋白(BTP)；以及测量受试者的血液中的2-微球蛋白(B2M)。在本文提供的任一实施例中，可以在尿中测量足细胞损伤的标记。此类蛋白包括nephrin和podocin。可以例如使用可商购的试剂盒、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)对这些蛋白进行定量。
在本文提供的任一实施例中，给予靶向于miR-21的修饰的寡核苷酸改善受试者中的一种或多种肾功能标记。肾功能标记的改善包括而不局限于：受试者中减少的血尿素氮；受试者的血液中减少的肌酐；受试者中改善的肌酐清除率；受试者中减少的蛋白尿；受试者中降低的白蛋白:肌酐比率；受试者中改善的肾小球滤过率；和/或受试者中增加的尿排出量。
某些额外疗法
对于奥尔波特综合征或在此列出的任何病状的治疗可以包括多于一种疗法。就此，在本文的某些实施例中提供了用于治疗患有或疑似患有奥尔波特综合征的受试者的多种方法，这些方法包括除了给予具有与miR-21互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸之外，还给予至少一种疗法。
在某些实施例中，该至少一个额外疗法包括一种药剂。
在某些实施例中，药剂包括血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)。在某些实施例中，血管紧张素II受体阻滞剂是坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦或依普罗沙坦。
在某些实施例中，药剂包括血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂。在某些实施例中，ACE抑制剂是卡托普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、喹那普利、福辛普利或雷米普利。
在某些实施例中，药剂是抗高血压剂。抗高血压剂用于控制受试者的血压。
在某些实施例中，药剂是维生素D类似物。维生素D类似物可以用于限制受试者中甲状旁腺激素的产生。
在某些实施例中，药剂是减少饮食性磷酸盐吸收的口服磷酸盐结合剂。
在某些实施例中，药剂包括免疫抑制剂。在某些实施例中，免疫抑制剂是皮质类固醇、环磷酰胺或吗替麦考酚酯。
在某些实施例中，药剂是环孢霉素、HMG-辅酶A抑制剂、血管肽酶抑制剂或TGF-β拮抗剂。
在某些实施例中，额外疗法是基因治疗。在某些实施例中，该基因治疗提供正常的Col4a3基因。在某些实施例中，该基因治疗提供正常的Col4a4基因。在某些实施例中，该基因治疗提供正常的Col4a5基因。
在某些实施例中，额外疗法是透析。在某些实施例中，额外疗法是肾移植。
在某些实施例中，药剂包括抗炎剂。在某些实施例中，抗炎剂是甾体抗炎剂(steroidal anti-inflammatory agent)。在某些实施例中，甾体抗炎剂(steroid anti-inflammatory agent)是皮质类固醇。在某些实施例中，皮质类固醇是泼尼松。在某些实施例中，抗炎剂是非甾体抗炎药。在某些实施例中，非甾体抗炎剂是布洛芬、COX-I抑制剂或COX-2抑制剂。
在某些实施例中，药剂是阻断针对纤维化信号的一种或多种反应的药剂。
在某些实施例中，药剂包括抗糖尿病剂。抗糖尿病剂包括但不局限于双胍类、葡糖苷酶抑制剂、胰岛素、磺酰脲类和噻唑烷二酮类。
某些微RNA核碱基序列
在此所述的修饰的寡核苷酸具有与miR-21(SEQ ID NO:1)或其前体(SEQ ID NO:2)互补的核碱基序列。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核碱基能够与miR-21或其前体的核碱基序列中每个相应位置处的核碱基发生配对。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列可以相对于miR-21或前体序列的核碱基序列具有一个或多个错配碱基对，并且仍能够与其靶序列杂交。
由于miR-21序列被包含于miR-21前体序列之内，具有与miR-21互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸也与miR-21前体的区域互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由等于miR-21长度的多个连接的核苷组成。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接核苷的数目是小于miR-21的长度。具有小于miR-21长度的多个连接核苷的修饰的寡核苷酸(其中修饰的寡核苷酸的每个核碱基与miR-21相应位置处的每个核碱基互补)被认为是具有与miR-21序列的区域完全互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。例如，由19个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸(其中每个核碱基与22个核碱基长度的miR-21的相应位置互补)与miR-21的19核碱基区域完全互补。这种修饰的寡核苷酸与miR-21的19核碱基部分具有100％互补性并且被视为与miR-21100％互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含与种子序列互补的核碱基序列，即修饰的寡核苷酸包含种子匹配序列。在某些实施例中，种子序列是六聚物种子序列。在某些此类实施例中，种子序列是miR-21的核碱基1-6。在某些此类实施例中，种子序列是miR-21的核碱基2-7。在某些此类实施例中，种子序列是miR-21的核碱基3-8。在某些实施例中，种子序列是七聚物种子序列。在某些此类实施例中，七聚物种子序列是miR-21的核碱基1-7。在某些此类实施例中，七聚物种子序列是miR-21的核碱基2-8。在某些实施例中，种子序列是八聚物种子序列。在某些此类实施例中，八聚物种子序列是miR-21的核碱基1-8。在某些实施例中，八聚物种子序列是miR-21的核碱基2-9。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有相对于miR-21或其前体的核碱基序列存在一个错配的核碱基序列。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有相对于miR-21或其前体的核碱基序列存在两个错配的核碱基序列。在某些此类实施例中，修饰的寡核苷酸具有相对于miR-21或其前体的核碱基序列存在不多于两个错配的核碱基序列。在某些此类实施例中，错配的核碱基是连续的。在某些此类实施例中，错配的核碱基不是连续的。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷的数目大于miR-21的长度。在某些此类实施例中，额外核苷的核碱基与miR-21茎-环序列的核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷的数目比miR-21的长度多出1个。在某些此类实施例中，该额外核苷位于寡核苷酸的5'末端。在某些此类实施例中，该额外核苷位于寡核苷酸的3'末端。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷的数目比miR-21的长度多出2个。在某些此类实施例中，这两个额外核苷位于寡核苷酸的5'末端。在某些此类实施例中，这两个额外核苷位于寡核苷酸的3'末端。在某些此类实施例中，一个额外核苷位于5'末端处并且一个额外核苷位于寡核苷酸的3'末端处。在某些实施例中，寡核苷酸的一个区域可以与miR-21的核碱基序列完全互补，但是整个修饰的寡核苷酸不是与miR-21完全互补。例如，由24个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸(其中核苷1至22的核碱基各自与22个核碱基长度的miR-21的相应位置互补)具有与miR-21的核碱基序列完全互补的22核苷部分并且与miR-21的核碱基序列具有大约92％总体互补性。
某些修饰的寡核苷酸
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有结构5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO:3)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有结构5'-AECSATCSASGTCSUSGAUSASAGCSUsAE-3'(SEQ ID NO:3)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有结构5'-MeCEASASTECSUSAEAEUSASAEGECSTEAS-3'(SEQ ID NO:4)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷；上标“Me”指示核苷的碱基上的5-甲基，并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有结构5'-AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-3'(SEQ ID NO:3)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷；并且每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个胞嘧啶包含5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由12至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至19个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至16个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由19至24个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由21至24个连接的核苷组成。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由9个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由10个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由11个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由12个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由13个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由14个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由17个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由21个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由22个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由23个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由24个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由25个连接的核苷组成。
某些修饰
在某些实施例中，在此提供的寡核苷酸可以包含针对核碱基、糖和/或核苷间键的一种或多种修饰，并且因而是修饰的寡核苷酸。修饰的核碱基、糖和/或核苷间键可以因为令人希望的特性而优先于未修饰的形式而被选用，这些特性例如像增强的细胞摄取、针对其他寡核苷酸或核酸标靶的增强的亲和力以及在核酸酶的存在下增强的稳定性。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷。在某些此类实施例中，修饰的核苷是稳定核苷。稳定核苷的实例是糖修饰的核苷。
在某些实施例中，修饰的核苷是糖修饰的核苷。在某些此类实施例中，糖修饰的核苷可以进一步包含天然或修饰的杂环碱基部分和/或天然或修饰的核苷间键，并且可以包括独立于糖修饰的其他修饰。在某些实施例中，糖修饰的核苷是2'-修饰的核苷，其中糖环在来自天然核糖或2'-脱氧核糖的2'碳处修饰。
在某些实施例中，2'-修饰的核苷具有双环糖部分。在某些此类实施例中，双环糖部分是处于α构型的D糖。在某些此类实施例中，双环糖部分是处于β构型的D糖。在某些此类实施例中，双环糖部分是处于α构型的L糖。在某些此类实施例中，双环糖部分是处于β构型的L糖。
包含此类双环糖部分的核苷称作双环核苷或BNA。在某些实施例中，双环核苷包括但不局限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(B)β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(C)亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')BNA；(D)氨氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA；(E)氧氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA；(F)甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(也称作约束乙基或cEt)；(G)亚甲基-硫代(4'-CH2-S-2')BNA；(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA；(I)甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA；(J)c-MOE(4'-CH2-OMe-2')BNA和(K)丙烯碳环(4'-(CH2)3-2')BNA。
其中Bx是核碱基部分，并且R独立地是H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施例中，2'-修饰的核苷包含选自以下项的2'-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N-(CH3)2和O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3。
在某些实施例中，2'-修饰的核苷包含选自以下项的2'-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些实施例中，糖修饰的核苷是4'-硫代修饰的核苷。在某些实施例中，糖修饰的核苷是4'-硫代-2'修饰的核苷。4'-硫代修饰的核苷具有其中4'-O被替代为4'-S的β-D-核糖核苷。4'-硫代-2'-修饰的核苷是其中2'-OH被替代为2'-取代基的4'-硫代修饰的核苷。适合的2'-取代基包括2'-OCH3、2'-O-(CH2)2-OCH3和2'-F。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个核苷间修饰。在某些此类实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间键是修饰的核苷间键。在某些实施例中，修饰的核苷间键包含磷原子。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的核碱基选自5-(羟甲基)胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤。在某些实施例中，修饰的核碱基选自7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在某些实施例中，修饰的核碱基选自5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施例中，修饰的核碱基包含多环杂环。在某些实施例中，修饰的核碱基包含三环杂环。在某些实施例中，修饰的核碱基包含吩噁嗪衍生物。在某些实施例中，吩噁嗪可以经进一步修饰以形成本领域中称作G形钳的核碱基。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸与增强所产生的反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多种部分结合。在某些这类实施例中，该部分是胆固醇部分。在某些实施例中，该部分是脂质部分。用于结合的另外的部分包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在某些实施例中，该碳水化合物部分是N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNac)。在某些实施例中，结合基团直接附接至寡核苷酸。在某些实施例中，结合基团经由连接部分而附接至修饰的寡核苷酸，该连接部分选自氨基、羟基、羧酸、巯基、不饱和(例如、双键或三键)、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基以及取代或未取代的C2-C10炔基。在某些此类实施例中，取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些此类实施例中，化合物包含具有一个或多个稳定基团的修饰的寡核苷酸，这些稳定基团附接至修饰的寡核苷酸的一个或两个末端以增强多种特性，例如，核酸酶稳定性。稳定基团中包括帽结构。这些末端修饰保护修饰的寡核苷酸免于核酸外切酶降解，并且可以帮助在细胞内部的递送和/或定位。这种帽可以存在于5'-末端处(5'-帽)，或可以存在于3'-末端处(3'-帽)，或可以存在于两个末端处。帽结构包括例如反转的脱氧非碱基帽。
某些药物组合物
在此提供了包含寡核苷酸的药物组合物。在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含一种化合物，该化合物包含一种修饰的寡核苷酸，这种修饰的寡核苷酸由15至25个连接的核苷组成并且具有与miR-21互补的核碱基序列。在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含一种化合物，该化合物由修饰的寡核苷酸组成，这种修饰的寡核苷酸由8至30个连接的核苷组成并且具有与miR-21互补的核碱基序列。在某些实施例中，本文中提供的药物组合物包含一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至25个连接的核苷组成并且具有与miR-21互补的核碱基序列。
适合的给予途径包括但不局限于口服、直肠、透粘膜、肠道、肠内、局部、栓剂、通过吸入、鞘内、心内、心室内、腹膜内、鼻内、眼内、肿瘤内和肠胃外(例如，静脉内、肌内、髓内和皮下)。在某些实施例中，鞘内给予药物以实现局部暴露而非全身暴露。例如，可以将药物组合物直接注射在实现所希望作用的区域内(例如，注射至肾中)。
在某些实施例中，以剂量单位(例如，片剂、胶囊、大丸剂等)的形式给予药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含了剂量在选自以下项的范围内的修饰的寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg和400mg至600mg。在某些实施例中，此类药物组合物包含了剂量选自以下项的修饰的寡核苷酸：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg和800mg。在某些此类实施例中，药物组合物包含了剂量选自以下项的修饰的寡核苷酸：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg和800mg。
在某些实施例中，药剂是无菌冻干的修饰的寡核苷酸，它用适合的稀释剂(例如，无菌注射用水或无菌注射用盐水)复水。在稀释入盐水后，将复水的产物作为皮下注射剂或作为静脉内输注剂给予。冻干的药品由已经在注射用水中或在注射用盐水中制备的并在制备期间用酸或碱调节至pH 7.0-9.0的并且随后经冻干的修饰的寡核苷酸组成。冻干的修饰的寡核苷酸可以是25-800mg寡核苷酸。可以理解这包括25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775和800mg修饰的冻干寡核苷酸。另外，在一些实施例中，冻干的修饰的寡核苷酸是选自以下范围内的量的寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg和400mg至600mg。可以将冻干的药品包装在2mL的I型透明玻璃小瓶(经硫酸铵处理)中，将该小瓶用用溴化丁基橡胶塞塞住并用铝FLIP-顶封密封。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物可以按本领域已确立的使用水平额外地含有药物组合物中常规发现的其他辅助组分。因此，例如，组合物可以含有额外的相容性药物活性材料，例如像止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以含有在实际配制本发明组合物的不同剂型时有用的额外材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时，此类材料不应当过度干扰本发明组合物的组分的生物活性。可以将制剂灭菌，并且如果希望的话，将其与并没有与制剂的寡核苷酸有害地相互作用的助剂混合，这些助剂例如是润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
脂质部分已经以多种方法用于核酸疗法中。在一种方法中，将核酸引入由阳离子脂质和中性脂质的混合物制成的预制脂质体或脂质复合物。在另一种方法中，在中性脂质不存在的情况下形成DNA与单-或多-阳离子脂质的复合物。在某些实施例中，选择脂质部分以增加药剂向特定细胞或组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分以增加药剂向脂肪组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分以增加药剂向肌肉组织的分布。
在某些实施例中，脂肪乳剂(INTRALIPID)用于制备包含寡核苷酸的药物组合物。脂肪乳剂是经制备用于静脉内给予的脂肪乳液。它由10％大豆油、1.2％卵黄磷脂、2.25％甘油和注射用水组成。此外，已经添加氢氧化钠以调节pH，从而终产物pH范围是6至8.9。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含与核酸复合的多胺化合物或脂质部分。在某些实施例中，此类制品包含一种或多种各自具有由式(Z)定义的结构的化合物或其药学上可接受的盐，
其中对于每次出现，每个Xa和Xb独立地是C1-6亚烷基；n是0、1、2、3、4或5；每个R独立地是H，其中在该制品中至少约80％的式(Z)化合物分子中的至少n+2个R部分不是H；m是1、2、3或4；Y是O、NR2或S；R1是烷基、烯基或炔基，其中每一者可任选地被一个或多个取代基取代；并且R2是H、烷基、烯基或炔基，其中每一者可任选地被一个或多个取代基取代；条件是如果n＝0，则至少n+3个R部分不是H。此类制品被描述于PCT公开WO/2008/042973中，将其通过引用以其全文结合在此以便公开脂质制品。某些额外的制品被描述于Akinc等人，Nature Biotechnology(《自然生物技术》)26,561-569(2008年5月1日)中，将其通过引用以其全文结合在此以便公开脂质制品。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含一种或多种修饰的寡核苷酸以及一种或多种赋形剂。在某些此类实施例中、赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施例中，使用已知的技术制备在此提供的药物组合物，这些技术包括但不局限于混合、溶解、造粒、制作糖衣丸(dragee-making)、研碎、乳化、封装、包裹或压片方法。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物是一种液体(例如，混悬剂、酏剂和/或溶液)。在某些此类实施例中，使用本领域已知的成分制备液体药物组合物，这些成分包括但不局限于水、二醇、油、醇类、调味剂、防腐剂和着色剂。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物是固体(例如，粉末、片剂和/或胶囊)。在某些此类实施例中，使用本领域中已知的成分制备包含一种或多种寡核苷酸的固体药物组合物，这些成分包括但不局限于淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物被配制为储库制品。某些此类储库制品典型地比非储库制品作用更持久。在某些实施例中，通过(例如皮下或肌内)植入或通过肌内注射给予此类制品。在某些实施例中，储库制品可以使用合适的聚合材料或疏水材料(例如，在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂来制备，或制备为难溶衍生物(例如制备为难溶盐)。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不局限于脂质体和乳液。某些递送系统对于制备某些药物组合物(包括包含疏水化合物的那些)是有用的。在某些实施例中，使用了某些有机溶剂，如二甲基亚砜。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含一种或多种组织特异性递送分子，这些递送分子被设计成将本发明的一种或多种药剂递送至特定组织或细胞类型。例如，在某些实施例中，药物组合物包括用组织特异性抗体包覆的脂质体。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含缓释系统。这种缓释系统的非限制性实例是固体疏水聚合物的半透性基质。在某些实施例中，取决于它们的化学性质，缓释系统可以经数小时、数日、数周或数月的时期释放药剂。
在某些实施例中，制备药物组合物以便通过注射(例如，静脉内、皮下、肌内等)给予。在某些此类实施例中，药物组合物包含载体并且配制在水溶液(例如水或生理相容性缓冲液(如Hank溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液))中。在某些实施例中，包含其他成分(例如，有助于溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施例中，使用适当的液体载体、助悬剂等来制备可注射用混悬剂。用于注射的某些药物组合物以单位剂型(例如，在安瓿或在多剂量容器中)提供。用于注射的某些药物组合物是在油质或水质媒介物中的混悬剂、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。适合用于注射用药物组合物中的某些溶剂包括但不局限于亲脂性溶剂和脂肪油如芝麻油、合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)，和脂质体。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。可任选地，此类混悬剂还可以含有合适的稳定剂或增加药剂溶解度以允许制备高度浓缩溶液的药剂。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含治疗有效量的修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该治疗有效量足以预防、减轻或改善疾病症状或延长正在治疗的受试者的存活。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力之内。
在某些实施例中，将在此提供的一种或多种修饰的寡核苷酸配制为前药。在某些实施例中，当在体内给予时，前药化学地转化成在生物学上、药学上或治疗上更有活性的寡核苷酸形式。在某些实施例中，前药是有用的，因为它们比相应的活性形式更易给予。例如，在某些情况下，前药可以比相应的活性形式更具有生物可用性(例如，通过口服给予)。在某些情况下，与相应的活性形式相比，前药可以具有改善的溶解度。在某些实施例中，前药比相应的活性形式具有更小水溶性。在某些情况下，在水溶解性有损于活动性时，这类前药拥有优越的跨细胞膜传送作用。在某些实施例中，前药是酯。在某些此类实施例中，给予时，酯以代谢方式水解成羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物是相应的活性形式。在某些实施例中，前药包含括与酸基团结合的短肽(聚氨基酸)。在某些此类实施例中，该肽在给予时被切割以形成相应的活性形式。
在某些实施例中，通过修饰药物活性化合物产生前药，从而活性化合物将在体内给予时再生。可以设计前药来改变药物的代谢稳定性或转运特征、掩蔽副作用或毒性、改善药物的味道或者改变药物的其他特征或特性。鉴于知晓体内药效动力学过程和药物代谢，一旦已知药物活性化合物，则本领域技术人员可以设计出该化合物的前药(参见，例如，Nogrady(诺格拉迪)(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach(《医药化学一种生物化学途径》)，Oxford University Press(牛津大学出版社)，New York(纽约)，第388-392页)。
某些额外疗法
对与miR-21相关联的疾病的治疗可以包括多于一种疗法。就此，在本文某些实施例中提供了治疗患有或疑似患有与miR-21相关联的疾病的受试者的多种方法，该方法包括除了给予具有与该微RNA互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸之外，还给予至少一种疗法。
在某些实施例中，该至少一种额外疗法包括一种药剂。
在某些实施例中，药剂包括抗炎剂。在某些实施例中，抗炎剂是甾体抗炎剂(steroidal anti-inflammatory agent)。在某些实施例中，甾体抗炎剂(steroid anti-inflammatory agent)是皮质类固醇。在某些实施例中，皮质类固醇是泼尼松。在某些实施例中，抗炎剂是非甾体抗炎药。在某些实施例中，非甾体抗炎剂是布洛芬、COX-I抑制剂或COX-2抑制剂。
在某些实施例中，药剂包括抗糖尿病剂。抗糖尿病剂包括但不局限于双胍类、葡糖苷酶抑制剂、胰岛素、磺酰脲类以及噻唑烷二酮类。
在某些实施例中，药剂包括但不局限于利尿药(例如螺内酯、依普利酮、呋塞米)、正性肌力药(例如多巴酚丁胺、米力农)、地高辛、血管舒张药、血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂(例如是卡托普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、喹那普利、福辛普利、和雷米普利)、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)(例如坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦、依普罗沙坦)、钙通道阻滞剂、硝酸异山梨酯、肼苯哒嗪、硝酸盐(例如单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯)、肼苯哒嗪、β-阻滞剂(例如卡维地洛、美托洛尔)以及钠尿肽(例如奈西立肽)。在某些实施例中，ACE抑制剂选自西拉普利、培哚普利以及群多普利。
在某些实施例中，以0.025至0.1mg/kg体重的剂量给予ACE抑制剂。在某些实施例中，以0.125至1.0mg/kg体重的剂量给予ACE抑制剂。在某些实施例中，以范围从1至6mg/m2/日的剂量给予ACE抑制剂。在某些实施例中，以范围从1至2mg/m2/日的剂量给予ACE抑制剂。在某些实施例中，以范围从2至4mg/m2/日的剂量给予ACE抑制剂。在某些实施例中，以范围从0.5至1mg/m2/日的剂量给予ACE抑制剂。
在某些实施例中，以范围从1至6mg/m2/日的剂量给予雷米普利。在某些实施例中，以范围从1至2mg/m2/日的剂量给予雷米普利。在某些实施例中，以范围从2至4mg/m2/日的剂量给予依那普利。在某些实施例中，以范围从4至8mg/m2/日的剂量给予赖诺普利。在某些实施例中，以范围从4至8mg/m2/日的剂量给予贝那普利。在某些实施例中，以范围从4至8mg/m2/日的剂量给予福辛普利。在某些实施例中，以范围从4至8mg/m2/日的剂量给予喹那普利。在某些实施例中，以范围从1至2mg/m2/日的剂量给予西拉普利。在某些实施例中，以范围从1至2mg/m2/日的剂量给予培多普利。在某些实施例中，以范围从0.5至1mg/m2/日的剂量给予群多普利。
在某些实施例中，以范围从6.25至150mg/m2/日的剂量给予ARB。在某些实施例中，以6.25mg/m2/日的剂量给予ARB。在某些实施例中，以10mg/m2/日的剂量给予ARB。在某些实施例中，以12.5mg/m2/日的剂量给予ARB。在某些实施例中，以18.75mg/m2/日的剂量给予ARB。在某些实施例中，以37.5mg/m2/日的剂量给予ARB。在某些实施例中，以50mg/m2/日的剂量给予ARB。在某些实施例中，以150mg/m2/日的剂量给予ARB。
在某些实施例中，以12.5mg/m2/日的剂量给予氯沙坦。在某些实施例中，以12.5mg/m2/日的剂量给予氯沙坦。在某些实施例中，以6.25mg/m2/日的剂量给予坎地沙坦。在某些实施例中，以37.5mg/m2/日的剂量给予厄贝沙坦。在某些实施例中，以10mg/m2/日的剂量给予替米沙坦。在某些实施例中，以18.75mg/m2/日的剂量给予缬沙坦。在某些实施例中，以150mg/m2/日的剂量给予依普罗沙坦。
在某些实施例中，药剂是醛固酮拮抗剂。在某些实施例中，醛固酮拮抗剂是螺内酯。在某些实施例中，以范围从每日10mg至35mg的剂量给予螺内酯。在某些实施例中，以每日25mg的剂量给予螺内酯。
在某些实施例中，药剂包括类肝素。在某些实施例中，类肝素是戊聚糖多硫酸盐。
在某些实施例中，药剂是阻断针对纤维化信号的一种或多种反应的药剂。
在某些实施例中，药剂是抗结缔组织生长因子疗法。在某些实施例中，抗-CTGF疗法是针对CTGF的单克隆抗体。
在某些实施例中，额外疗法可以是增强身体免疫系统的药剂，它包括低剂量环磷酰胺、胸腺刺激素，维生素和营养补充剂(例如，抗氧化剂，包括维生素A、C、E、β-胡萝卜素、锌、硒、谷胱甘肽、辅酶Q-10和紫锥花提取物)以及疫苗(例如，免疫刺激复合物(ISCOM)，其包含了将抗原和佐剂的多聚体呈递进行联合的疫苗制剂)。
在某些实施例中，选择额外疗法以治疗或改善本发明的一种或多种药物组合物的副作用。此类副作用包括而不局限于注射部位反应、肝功能检验异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。例如，血清中增加的氨基转移酶水平可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，增加的胆红素可以指示肝毒性或肝功能异常。
额外药剂的其他实例包括但不局限于：免疫球蛋白，包括但不局限于静脉内免疫球蛋白(IVIg)；镇痛药(例如，醋氨酚)；水杨酸酯；抗生素；抗病毒剂；抗真菌剂；肾上腺素能的调节剂；激素(例如，合成代谢类固醇、雄激素、雌激素、降钙素、孕激素、生长抑素(somatostan)和甲状腺激素)；免疫调节剂；肌肉松弛药；抗组胺药；骨质疏松剂(例如，双膦酸盐、降钙素和雌激素)；前列腺素，抗肿瘤剂；精神病治剂药；镇静剂；毒栎或毒漆树产物；抗体；以及疫苗。
某些试剂盒
本发明还提供试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含本发明的一种或多种化合物，这些化合物包含修饰的寡核苷酸，其中该寡核苷酸的核碱基序列与miR-21的核碱基序列互补。与miR-21互补的化合物可以具有在此所述的任何核苷样式。在一些实施例中，与miR-21互补的化合物可以存在于小瓶之内。多个小瓶，如10个，可以存在于例如分配包装中。在一些实施例中，制造小瓶，使得它是注射器可及的。试剂盒也可以含有使用与miR-21互补的化合物的说明书。
在一些实施例中，可以使用试剂盒以用于将与miR-21互补的化合物给予至受试者。在此类情况下，除了与miR-21互补的化合物之外，试剂盒可以进一步包含以下中的一项或多项：注射器、酒精棉拭子、棉球和/或纱布垫。在一些实施例中，与miR-21互补的化合物可以存在于预填充注射器(如带有例如27号1/2英寸针头连同针套的单次剂量注射器)中，而非小瓶中。多个预填充注射器，如10个，可以存在于例如分配包装中。试剂盒还可以含有给予与miR-21互补的化合物的说明书。
某些实验模型
在某些实施例中，本发明提供在实验模型中使用和/或测试本发明的修饰的寡核苷酸的方法。本领域技术人员能够选择和修改此类实验模型的方案以评估本发明的药剂。
总体上，首先在培养的细胞中对修饰的寡核苷酸进行测试。适合的细胞类型包括与希望在体内向其递送修饰的寡核苷酸的细胞类型相关的那些。例如，对于在此所述方法的研究适合的细胞类型包括原代细胞或培养的细胞。
在某些实施例中，在培养的细胞中对修饰的寡核苷酸干扰miR-21的活性的程度进行评价。在某些实施例中，可以通过测量微RNA的水平对微RNA活性的抑制进行评价。可替代地，可以对预测或验证的微RNA调节的转录物的水平进行测量。微RNA活性的抑制可以导致miR-21-调节的转录物和/或由miR-21-调节的转录物所编码的蛋白增加。另外，在某些实施例中，可以对某些表型结果进行测量。
几种动物模型是熟练的技术人员可用于在人疾病模型中研究miR-21的。例如，可以在奥尔波特综合征的实验模型例如Col4a3敲除小鼠(Col4a3-/-小鼠)中研究miR-21的抑制剂。该疾病在小鼠模型中的严重性取决于携带Col4a3突变的小鼠的遗传背景。例如，相对于C57BL/6J背景，该疾病的发作和进展总体上在129X1/SvJ上更快速。因而，可以选择Col4a3-/-小鼠的遗传背景以改变疾病的发作和进展。额外的模型包括X连锁的常染色体隐性或常染色体显性奥尔波特综合征的犬模型。参见例如Kashtan(卡什坦)，Nephrol.Dial.Transplant(《肾脏病透析移植》)，2002,17:1359-1361。
某些定量测定
可以通过本领域已知的多种方法评价给予修饰的寡核苷酸后反义抑制miR-21的效果。在某些实施例中，这些方法用于定量体外或体内细胞或组织中的微RNA水平。在某些实施例中，通过微阵列分析测量微RNA水平的变化。在某些实施例中，通过过几种可商购的PCR测定之一，如微RNA测定(Applied Biosystems)测量微RNA水平的变化。在某些实施例中，通过测量miR-21的标靶的mRNA和/或蛋白水平评价miR-21的反义抑制。miR-21的反义抑制总体上导致微RNA的标靶的mRNA和/或蛋白的水平增加。
标靶结合测定(Target Engagement Assay)
可以通过测量标靶结合来评价用抗miR或微RNA模拟物对微RNA活性的调节。在某些实施例中，通过mRNA的微阵列概况分析测量标靶结合。对受到抗miR或微RNA模拟物调节(增加或减少)的mRNA的序列检索微RNA种子序列，以比较作为微RNA的标靶的mRNA的调节作用与不作为微RNA的标靶的mRNA的调节作用。以这种方式，可以将抗miR与miR-21或miR-21模拟物与其标靶的相互作用进行评估。在抗miR的情况下，筛选其表达水平增加的mRNA的以下mRNA序列，这些mRNA序列包含与互补于抗miR的微RNA匹配的种子。
实例
提供以下实例以便更充分地说明本发明的一些实施例。然而，它们无论如何不应当被解释为限制本发明的宽广范围。本领域普通技术人员将易于在不偏离本发明的精神的情况下，采用本发明的基本原理而设计出各种化合物。
实例1：奥尔波特综合征模型中的抗miR-21
在129sv遗传背景上的Col4a3-/-小鼠自发形成与人奥尔波特综合征相似的严重肾病。就此，使用Col4a3-/-小鼠作为奥尔波特综合征的实验模型。
在奥尔波特综合征的Col4a3-/-模型中测试与miR-21互补的修饰的寡核苷酸(抗miR-21化合物)。使用野生型小鼠作为对照小鼠。
抗miR-21化合物的结构是5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO:3)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在3周龄时，将小鼠进行基因分型以鉴定Col4a3-/-小鼠。从3周龄至9周龄，将性别匹配的同窝小鼠用抗miR-21或PBS处理。将抗miR-21以25mg/kg的剂量皮下给予，每周2次。处理组是：(1)野生型小鼠，给予PBS，n＝8；(2)Col4a3-/-小鼠，给予PBS，n＝12；(3)Col4a3-/-小鼠，给予抗miR-21，n＝12。使用Col4a3-/-小鼠的野生型同窝仔作为野生型对照小鼠。每周收集过夜尿样(大约16小时)。在第9周结束时收获血浆和肾。分析体液样品和组织样品以确定肾功能、肾损伤和肾小球硬化以及间质纤维化的变化。
血液或尿的终点包括测量血尿素氮(BUN)、白蛋白尿、白蛋白/肌酐比率、肾小球滤过率。组织学分析包括评估肾小球硬化、间质纤维化、肾小管损伤、巨噬细胞浸润和肌成纤维细胞的存在。
在第9周测量血尿素氮(BUN)。通过MannWhitney检验计算统计显著性。如图1A中所示，相对于研究结束时PBS处理的对照动物，在用抗miR-21处理的动物中观察到BUN统计学上显著减少。总体上观察到减少的BUN(图1A)，以及仅在雄性小鼠中(与对照雄性小鼠中的大约25mg/dL相比大约90mg/dL)和仅在雌性小鼠观察到减少的BUN(与对照雌性小鼠中的大约25mg/dL相比大约70mg/dL)(未示出)。Col4a3+/+小鼠中的BUN是大约12.5mg/kL(处于正常限值之内；未示出)。BUN是肾功能的血液标记。较高的BUN与更差的肾功能相关。BUN减少指示肾损伤和损害减少以及功能改善。
通过ELISA以及相对于尿肌酐排泄量进行归一化，测量尿样中的白蛋白而评价白蛋白尿，其中以每周一次的频率经16小时收集这些尿样。全部分析均在研究结束时的相同时间进行。如图1B中所示，Col4a3-/-小鼠发展出严重的白蛋白尿。然而，用抗miR-21处理的小鼠发展成轻得多的白蛋白尿，如通过尿白蛋白对肌酐比率减少所检测。这种减少在第7周观察到并持续至第9周。如预期，Col4a3-/-小鼠的野生型同窝仔不展现白蛋白尿。白蛋白尿是肾小球和肾小管损伤的敏感量度。白蛋白对肌酐比率的减少指示肾小球和/或肾小管疾病减轻。
奥尔波特综合征特征还在于肾小球硬化进展性发展以及当不适当的肾小球泄漏出现时出现的显著的肾间质纤维化。因此，通过对肾小球的硬化损害(毛细血管袢丧失+纤维化或玻璃样变性)进行不知情评分(blinded scoring)来对肾小球硬化进行评价。由不知情的观察者依次对来自每只小鼠的30个肾小球进行评分。评分是从0-4，其中0＝正常；1＝<25％的肾小球受硬化影响；2＝25％-50％的肾小球受硬化影响；3＝50％-75％的肾小球受硬化影响；4＝75％-100％的肾小球受硬化影响。在用抗miR-21处理的小鼠中，无病情的肾小球的比例高得多，而在用PBS处理的小鼠中，中等或严重受影响的肾小球(评分2-4)的比例显著较高(图2)。同样在Col43a-/-小鼠的野生型同窝仔(WT)中对肾小球进行评分。在用天狼猩红染色的来自PBS处理和抗miR-21处理的Col4a3-/-动物的完整矢状切片中，以形态测定方式对间质纤维化进行测量。如图3A中所示，在抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠中观察到间质纤维化的统计显著性降低。此外，主要病理性基质蛋白胶原蛋白Iα(1)(Col1a1)的转录物的定量PCR显示，来自抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠的肾组织显示这种病理性胶原蛋白的产生少得多(图3B)。
在石蜡包埋和多聚甲醛(4％)固定的通过高碘酸-西夫(PAS)反应染色的组织切片中对肾组织损伤进行评价。首先，将肾切片就基于肾小管的总体损伤和肾小球损伤和炎症进行排序。基于多种因素评价损伤，所述因素包括肾小管膨大、刷状缘丧失、细胞浸润、肾小球炎症、间质水肿和细胞坏死。将肾切片以不知情方式就总体损伤进行排序并且给予肾损伤等级评分。来自Col4a3-/-小鼠的肾切片显示显著较低的肾损伤等级评分，这表明较轻的肾损伤(图4A)。为了更详细地分析这一点，由不知情的观察者针对具有肾小球新月体的比例而对肾小球进行评估。新月体是包曼囊(Bowman’s capsule)内部细胞的增殖，由包曼腔(Bowman’s space)内部≥2层的细胞定义。新月体是充分确立的肾小球损伤标记。在接受抗miR-21的Col4a3-/-小鼠中，具有新月体的肾小球的比例是大约44％，而在接受PBS对照处理的小鼠中，具有新月体的肾小球的比例是大约19％(图4B)。在Col4a3+/+同窝仔中，具有新月体的肾小球的比例小于5％(未示出)。肾脏肾单位的肾小管也是损伤部位。通过在覆盖每只肾的完整矢状切片的顺序图像上叠加网格而对肾小管损伤进行评价。以不知情的方式，在网格的每个方格内对肾小管的损伤进行评价。基于肾小管膨大/扁平、刷状缘丧失、细胞浸润和细胞坏死的存在而对肾小管损伤进行评价。这些特征的存在导致对网格上该方格的正评分。总体评分应用于每幅图像，该评分是具有肾小管损伤的方格的百分数。对于来自这只肾的全部图像，将这种总评分平均化。每只肾的平均评分随后经历统计分析。如所显示，相对于接受PBS的Col4a3-/-，在抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠中肾小管损伤评分显著较低(图4C)。在Col4a3+/+同窝仔中肾小管损伤评分小于10％(未示出)。
进行肾样品的额外组织学分析以评估巨噬细胞浸润、内皮稳定性和肌成纤维细胞沉积。如通过F4/80染色判定，与PBS处理的Col4a3-/-对照小鼠相比，在抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠中巨噬细胞浸润减少(图5A)。CD31的免疫细胞化学染色证明与PBS处理的Col4a3-/-对照小鼠相比，在抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠中内皮稳定性改善(未示出)。α-SMA的检测揭示出与PBS处理的Col4a3-/-对照小鼠相比，在抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠中肌成纤维细胞沉积减少(图5B)。在Col4a3+/+小鼠中，α-SMA染色是大约5％(未示出)。
活性氧种类(ROS)是正常细胞代谢的副产物。在细胞应激期间，过量的ROS可以引起细胞和细胞器膜的脂质过氧化，导致结构完整性以及细胞转运和能量生产能力的破坏。在肾中，细胞应激期间产生的ROS可以引起肾损伤。为了评价在抑制miR-21后ROS生成是否在Col4a3-/-小鼠中减少，在抗miR-21和PBS处理的小鼠中对尿过氧化氢水平进行测量。尿过氧化氢水平在接受抗miR-21的小鼠中显著地降低(图6A)。在Col4a3+/+小鼠中，尿过氧化氢水平小于5μM(未示出)。另外，采用二氢乙啶(DHE)的肾组织免疫细胞化学染色(其是ROS的量度)显示，与PBS处理的对照小鼠相比，在抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠的肾组织中ROS减少(图6B)。在Col4a3+/+小鼠中，观察到小于10％的DHE染色(未示出)。这些数据证明了抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠的尿和肾组织中ROS的减少。因此，抗miR-21可以借以减少肾损伤的一种机制可能包括活性氧种类生成的减少。
在抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠的肾中的蛋白的免疫印迹揭示了相对于Col4a3-/-小鼠而言肾中MPV17L蛋白的量增加。MPV17L是参与活性氧种类代谢并保护免遭氧化应激的线粒体内膜蛋白。因而，抗miR-21处理后ROS的产生减少可以至少部分地因增加的MPV17L水平而出现。为了进一步探索抗miR-21的机理性作用，通过PBS处理或抗miR-21处理的Col4a3-/-小鼠的肾免疫印迹，测量PPAR-α蛋白。抗miR-21处理增加PPAR-α蛋白，表明对代谢途径的刺激。
足细胞是作为肾小球滤过屏障的必需组分的高度特化上皮细胞。足细胞丧失可以导致蛋白尿，并且在一些疾病状态中导致肾小球硬化。为评估足细胞数目是否受Col4a3-/-小鼠中miR-21的抑制的影响，在抗miR-21和PBS处理的小鼠中对足细胞数目进行测量。相对于PBS处理的小鼠，在接受抗miR-21的Col4a3-/-小鼠中足细胞数目显著地增加，并且与Col4a3-/-小鼠的野生型同窝仔中观察到的足细胞数目是可比较的(图7)。因此，抗miR-21可以借以在奥尔波特综合征模型中减少肾损伤的一种机制是预防或减少足细胞损失。
使用以下抗miR-21化合物实施一项相似的研究：
抗miR-21化合物#1(上文)：5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO:3)
抗miR-21化合物#2：5'-AECSATCSASGTCSUSGAUSASAGCSUsAE-3'(SEQ ID NO:3)；
抗miR-21化合物#3：5'-MeCEASASTECSUSAEAEUSASAEGECSTEAS-3'(SEQ ID NO:4)；和
抗miR-21化合物#4：5'-AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-3'(SEQ ID NO:3)；
其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷；并且上标“Me”指示核苷的碱基上的5-甲基。每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
将每种化合物以25mg/kg的剂量给予至三周龄Col4a3-/-小鼠，每周二次，持续9周。对照组包括用PBS处理的Col4a3-/-小鼠和Col4a3-/-小鼠的野生型同窝仔。每个处理组含有10至12只小鼠。对于化合物#1、2和4，终点如上文所述进行评估，并且包括BUN、尿白蛋白对肌酐比率、肾损伤(PAS染色)、肾小球硬化和具有新月体的肾小球的比例。对于化合物#3，终点包括BUN、尿白蛋白对肌酐比率和胶原蛋白基因表达(作为纤维化的量度)，如上文所述进行评估。
与上文描述的结果一致，抗miR-21化合物#1改善了评价的全部终点。抗miR-21化合物#2的功效类似于化合物#1，在BUN、尿白蛋白对肌酐比率、肾损伤、肾小球硬化的程度和具有新月体的肾小球的百分比方面观察到改善。化合物#3的功效类似于化合物#1，在BUN、尿白蛋白对肌酐比率和Col1a1表达方面存在改善。抗miR-21化合物#4，尽管有效性比测试的其他化合物低，仍导致BUN、肾损伤、肾小球硬化的程度和具有新月体的肾小球的百分比的改善。
综上所述，这些数据显示在奥尔波特综合征模型中，抗miR-21处理减弱肾功能丧失和白蛋白尿的形成。肾小球硬化和间质纤维化明显减弱并且近端肾小管得到保护。由于抗miR-21在Col4a3-/-小鼠中预防肾功能的进行性丧失并且减弱肾小球病情和肾小管-间质病情，故而抗miR-21是人奥尔波特综合征的治疗剂。
实例2：奥尔波特综合征模型中抗miR-21的升高
为了评价奥尔波特综合征实验模型中miR-21的失调，在从小鼠收获的肾组织中对miR-21水平进行测量。从全肾分离RNA并通过定量PCR测量miR-21。相对于野生型小鼠中的miR-21水平，在Col4a3-/-小鼠中miR-21水平升高大约3倍。
因此，可以将接受奥尔波特综合征治疗的受试者鉴定为在给予治疗之前在肾活检材料、尿或血液中具有升高的miR-21。
实例3：奥尔波特综合征模型中的存活研究
野生型小鼠总体上生活2至3年(或730天至1095天)。在129X1/SvJ背景上的Col4a3-/-小鼠中，终末期肾衰竭可以早至2月龄出现。在C57BL/6J背景上的Col4a3-/-小鼠中，终末期肾衰竭可以早至6月龄出现。无论什么样的背景，Col4a3-/-小鼠的寿命均显著短于野生型小鼠。就此，任何遗传背景上的Col4a3-/-小鼠均可以充当奥尔波特综合征中终末期肾衰竭的模型并且可以用于评估候选治疗剂对预期寿命的影响。
将小鼠进行基因分型以鉴定Col4a3-/-小鼠。将抗miR-21以范围从10至25mg/kg的剂量皮下给予，每周1次或2次持续直至1年。可以给予PBS作为对照治疗。在整个研究期间按周或按月时间表收集过夜尿样(大约16小时)。记录每只小鼠在死亡时的年龄。在死亡时或在研究结束时采集血浆和肾。分析体液样品和组织样品以确定肾功能、肾小球硬化和纤维化的变化。
对体液样品和组织样品进行分析以确定肾功能、肾损伤和肾小球硬化和间质纤维化的变化。血液或尿的终点包括测量血尿素氮(BUN)、白蛋白尿、白蛋白/肌酐比率、肾小球滤过率。组织学分析包括评估肾小球硬化、间质纤维化、肾小管损伤、巨噬细胞浸润以及肌成纤维细胞的存在。
相对于PBS处理的对照小鼠，在抗miR-21处理的小鼠中观察到终末期肾衰竭发作的延迟和增加的预期寿命，表明抗miR-21是可以增加患有奥尔波特综合征的受试者的预期寿命的治疗剂。
抗miR-21增加奥尔波特综合征模型中的存活-单剂量研究
为评估抗miR-21对奥尔波特综合征实验模型中存活的影响，将抗miR-21化合物给予至Col4a3-/-小鼠。
抗miR-21化合物的结构是5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO:3)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
将129X1/SvJ背景上的Col4a3+/1小鼠(杂合子)杂交以产生Col4a3-/-小鼠。在3周龄，将小鼠进行基因分型以鉴定Col4a3-/-小鼠。处理组是：(1)Col4a3+/+小鼠(野生型同窝仔)，给予PBS，每周二次，n＝12；(2)Col4a3-/-小鼠，给予PBS，每周二次，n＝12；(3)Col4a3-/-小鼠，皮下给予25mg/kg抗miR-21，每周二次，n＝12。从第3周至第16周，每周二次给予治疗。每周测量动物重量，并且记录寿命。
如预期，在约9周龄处开始，Col4a3-/-小鼠经历体重减轻，并且死亡在9周龄和11周龄之间发生。如图8A中所示，抗miR-21增加峰值体重并且显著地延迟体重减轻(p<0.01)。如图8B中所示，抗miR-21显著地增加寿命(p<0.001)。因此，用抗miR-21处理不仅延迟Col4a3-/-小鼠的体重减轻，而且重要地改善其存活。
抗miR-21增加奥尔波特综合征模型中的存活-剂量反应研究
为评估奥尔波特综合征实验模型中抗miR-21对存活的剂量反应影响，将几种剂量的抗miR-21化合物给予至Col4a3-/-小鼠。
抗miR-21化合物的结构是5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO:3)，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。每个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在3周龄，将小鼠进行基因分型以鉴定Col4a3-/-小鼠。处理组是：
(1)Col4a3-/-小鼠，给予PBS，每周一次，n＝13；
(2)Col4a3-/-小鼠，给予12.5mg/kg抗miR-21，每周一次，n＝12；
(3)Col4a3-/-小鼠，给予25mg/kg抗miR-21，每周一次，n＝13；
(4)Col4a3-/-小鼠，给予50mg/kg抗miR-21，每周一次，n＝12；
(5)Col4a3-/-小鼠，给予25mg/kg抗miR-21，每周二次，n＝12；
在第24日开始给予治疗。每周测量动物重量，并且记录寿命。在第7周，采集血液用于测量BUN。
如图9A中所示，相对于PBS处理的对照动物，在抗miR-21处理的动物中观察到BUN减少。虽然观察BUN减少，但它不具有强烈的剂量-反应性，这可能归因于以下事实：该疾病在用于此实验的Col4a3-/-小鼠中更严重(小鼠从与先前实例中所述的Col4a3-/-小鼠不同的供应商获得)。观察到的BUN减少表示肾损伤和损害减少以及功能改善。
如图9B中所示，用抗miR-21处理以剂量反应方式增加了Col4a3-/-小鼠的寿命。对于每周二次和每周一次处理，均观察到增加的寿命。中位存活期如下：PBS，62天；12.5mg/kg抗miR-21，每周一次(QW)，72.5天；25mg/kg抗miR-21，每周一次(QW)，77天；50mg/kg抗miR-21，每周一次(QW)，89天；25mg/kg抗miR-21，每周二次(BIW)，82.5天。
相对于PBS处理的对照小鼠，在抗miR-21处理的小鼠中观察到肾功能障碍的发作延迟和增加的预期寿命，表明抗miR-21是可以增加患有奥尔波特综合征的受试者的预期寿命的治疗剂。
实例4：Col4a3-/-小鼠的肾中的抗miR分布
已知寡核苷酸(包括抗miR化合物)分布于肾内部的几种细胞类型。如Chau等人，Sci Transl Med.(《科学转化医学》)，2012,121ra18报道，在将Cy3-标记的抗miR给予至正常小鼠或经历肾损伤的小鼠(单侧输尿管阻塞，一种间质纤维化模型)后，肾中的最大荧光强度是在近端肾小管上皮中。内皮、周皮细胞、肌成纤维细胞和巨噬细胞也全部含有可检测量的Cy3-标记的抗miR。然而，肾小球、特别是足细胞，未显现出摄取显著量的抗miR，与化学修饰的寡核苷酸的已知分布一致(Masarjian等人，Oligonucleotides(《寡核苷酸》)，2004,14,299-310)。
为了研究抗miR在奥尔波特综合征的小鼠模型中的分布，将Cy3-标记的抗miR化合物给予至两个不同组的Col4a3-/-小鼠，一个组处于6周龄(n＝3)并且一个组处于8周龄(n＝4)，并且给予至一个处于8周龄的野生型小鼠组(n＝3)。在给予抗miR化合物后两天，处死动物并收获及加工肾用于组织学分析。
将肾组织的切片用针对几种不同细胞标记具有特异性的抗体进行共标记，以便鉴定特定细胞类型中的抗miR摄取。对α-SMA(肌成纤维细胞标记)、PDGFR-β(周皮细胞/肌成纤维细胞标记)、CD31(内皮细胞标记)、F4/80(巨噬细胞标记)和GP38(足细胞标记)进行染色。如预期，抗miR化合物被摄入近端肾小管上皮、周皮细胞、肌成纤维细胞和巨噬细胞中。与正常小鼠和患有间质纤维化的小鼠中的先前观察结果相反，在Col4a3-/-小鼠中，抗miR被摄入肾小球中，包括被摄入足细胞中。
如在此所述，在奥尔波特综合征实验模型中给予抗miR-21后观察到的功效不仅伴随围绕肾小管的间质纤维化改善，还伴随肾小球内纤维化(称作肾小球硬化)的改善。这些数据表明除了来自改善的肾小管结构和功能的反馈之外或取而代之，这些改善可能与肾小球中的抗miR-21作用直接相关。

Claims (30)

1.一种治疗奥尔波特综合征的方法，包括向一个患有或疑似患有奥尔波特综合征的受试者给予由12至25个连接的核苷组成的一种修饰的寡核苷酸，其中这种修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-21互补。
2.如权利要求1所述的方法，其中在给予这种修饰的寡核苷酸之前，该受试者已经被诊断为患有奥尔波特综合征。
3.如权利要求1所述的方法，其中在给予这种修饰的寡核苷酸之前，该受试者被确定为在该受试者的肾、尿或血液中具有增加水平的miR-21。
4.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该给予：
a.改善肾功能；
b.延迟终末期肾病发作；
c.延迟进行透析的时间；
d.延迟进行肾移植的时间；和/或
e.改善预期寿命。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该给予：
a.减少血尿；
b.延迟血尿的发作；
c.减少蛋白尿；
d.延迟蛋白尿的发作；
e.减少肾纤维化；
f.减缓纤维化的进一步进展；和/或
g.制止纤维化的进一步进展。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者具有一种选自以下项的突变：在编码IV型胶原蛋白α3链的基因中的突变、在编码IV型胶原蛋白α4链的基因中的突变或在编码IV型胶原蛋白α5链的基因中的突变。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者是雄性。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者是雌性。
9.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者被鉴定为患有血尿和/或蛋白尿。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者具有降低的肾功能。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者需要改善的肾功能。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法，包括：
a.测量该受试者的血液中的血尿素氮；
b.测量该受试者的血液中的肌酐；
c.测量该受试者中的肌酐清除率；
d.测量该受试者中的蛋白尿；
e.测量该受试者中的白蛋白:肌酐比率；
f.测量该受试者中的肾小球滤过率；
g.测量该受试者中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；
h.测量该受试者的血液中的β-痕量蛋白(BTP)；
i.测量该受试者的血液中的2-微球蛋白；
j.测量该受试者的尿中的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白；
k.测量该受试者的尿中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)；
l.测量该受试者的尿中的肾损伤分子-1(KIM-1)蛋白；
m.测量该受试者的尿中的白细胞介素-18(IL-18)蛋白；
n.测量该受试者的尿中的单核细胞趋化蛋白(MCP1)水平；
o.测量该受试者的尿中的结缔组织生长因子(CTGF)水平；
p.测量该受试者的尿中的IV型胶原蛋白片段；
q.测量该受试者的尿中的III型胶原蛋白片段；和/或
r.测量该受试者的尿中的足细胞蛋白水平，其中该足细胞蛋白选自nephrin和podocin。
13.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该给予改善了该受试者中的肾功能的一种或多种标记，这些标记选自：
a.在该受试者中减少的血尿素氮；
b.在该受试者的血液中减少的肌酐；
c.在该受试者中改善的肌酐清除率；
d.在该受试者中减少的蛋白尿；
e.在该受试者中降低的白蛋白:肌酐比率；
f.在该受试者中改善的肾小球滤过率；
g.在该受试者的血液中减少的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；
h.在该受试者的血液中减少的β-痕量蛋白(BTP)；
i.在该受试者的血液中减少的2-微球蛋白(B2M)；
j.在该受试者的尿中减少的NAG蛋白；
k.在该受试者的尿中减少的NGAL蛋白；
l.在该受试者的尿中减少的KIM-1蛋白；
m.在该受试者的尿中减少的IL-18蛋白；
n.在该受试者的尿中降低的单核细胞趋化蛋白(MCP1)水平；
o.在该受试者的尿中降低的结缔组织生长因子(CTGF)水平；
p.在该受试者的尿中减少的IV型胶原蛋白片段；
q.在该受试者的尿中减少的III型胶原蛋白片段；和/或
r.在该受试者的尿中降低的足细胞蛋白水平，其中该足细胞蛋白选自nephrin和podocin。
14.如权利要求5、12或13中任一项所述的方法，其中该蛋白尿是白蛋白尿。
15.如权利要求14所述的方法，其中该白蛋白尿是高正常白蛋白尿、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。
16.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该奥尔波特综合征是X连锁形式的奥尔波特综合征。
17.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该奥尔波特综合征是常染色体形式的奥尔波特综合征。
18.如以上权利要求中任一项所述的方法，包括给予至少一个选自以下项的额外疗法：血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、抗高血压剂、维生素D类似物、口服磷酸盐结合剂、透析以及肾移植。
19.如权利要求17所述的方法，其中这些血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂选自卡托普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、喹那普利、福辛普利以及雷米普利。
20.如权利要求17所述的方法，其中这些血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)选自坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦以及依普罗沙坦。
21.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这种修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-21的核碱基序列(SEQ ID NO:1)至少90％互补、至少95％互补或100％互补。
22.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这种修饰的寡核苷酸由15至25个连接的核苷组成。
23.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这种修饰的寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21或22个连接的核苷组成。
24.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这种修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷。
25.如权利要求21所述的方法，其中这种修饰的核苷选自S-cEt核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷和LNA核苷。
26.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这种修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
27.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这种修饰的寡核苷酸的每个核苷间键是一种修饰的核苷间键。
28.如权利要求23或24所述的方法，其中这种修饰的核苷间键是一种硫代磷酸酯核苷间键。
29.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这种修饰的寡核苷酸具有结构5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'，其中不后接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；后接下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷；后接下标“S”的核苷指示S-cEt核苷，并且每个核苷间键是一种硫代磷酸酯核苷间键。
30.一种由12至25个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸用于治疗奥尔波特综合征的用途，其中这种修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-21互补。
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