TW201420120A - 用於治療奧爾波特綜合症之方法 - Google Patents

用於治療奧爾波特綜合症之方法 Download PDF

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Abstract

本文中提供了使用靶向於miR-21之經修飾寡核苷酸治療奧爾波特綜合症之方法。在某些實施方式中，一靶向於miR-21之經修飾寡核苷酸在患有奧爾波特綜合症之受試者中改善腎功能和/或減少纖維化。在某些實施方式中，給予一靶向於miR-21之經修飾寡核苷酸延遲了患有奧爾波特綜合症之受試者中終末期腎病的發作。在某些實施方式中，一靶向於miR-21之經修飾寡核苷酸延遲了患有奧爾波特綜合症之受試者中對透析或腎移植之需要。

Description

用於治療奧爾波特綜合症之方法
本文中提供用於治療奧爾波特綜合症之方法及組合物。
IV型膠原蛋白(基底膜的一主要組分)係以下六種α鏈的家族：α-1膠原蛋白(IV型)、α-2膠原蛋白(IV型)、α-3膠原蛋白(IV型)、α-4膠原蛋白(IV型)、α-5膠原蛋白(IV型)和α-6膠原蛋白(IV型)。膠原蛋白IV之α-3、α-4和α-6鏈係腎小球基底膜(GBM)之膠原蛋白網路之基礎組分，該腎小球基底膜執行腎臟過濾血液之關鍵功能。
奧爾波特綜合症係遺傳性形式腎臟疾病，其中異常類型腎小球基底膜(GBM)產生，導致間質纖維化、腎小球硬化和最終腎功能喪失。該疾病還經常以聽覺缺陷和眼部異常為特徵。奧爾波特綜合症由分別編碼IV型膠原蛋白α3(IV)、α4(IV)和α5(IV)鏈的Col4a3、Col4a4或Col4a5中之突變引起。X染色體上Col4a5基因中之突變引起X連鎖形式之奧爾波特綜合症，其佔據全部疾病病例85%。一常染色體隱性形式歸因於Col4a3亦或Col4a4 任一者之每個拷貝中之突變之遺傳，每個突變均位於上2號染色體上。稀有常染色體顯性形式歸因於Col4a3或Col4a4基因中之顯性-負向突變的遺傳。X連鎖形式在雄性中比雌性中更嚴重，其中雄性中大部分病例發展成終末期腎病(ESRD)。常染色體形式在雄性和雌性中具有相似嚴重性。本病大部分病例歸因於遺傳性突變，但是一些病例歸因於在Col4aA基因之一中之從頭突變。
在此提供了治療奧爾波特綜合症之多種方法，包括向患有或疑似患有奧爾波特綜合症之受試者給予由12至25個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸，其中這種經修飾寡核苷酸之核鹼基序列與miR-21互補。在某些實施方式中，在給予這種經修飾寡核苷酸之前，該受試者已經被診斷為患有奧爾波特綜合症。在某些實施方式中，在給予這種經修飾寡核苷酸之前，該受試者被確定為在受試者腎組織中具有增加水平之miR-21。在某些實施方式中，在給予這種經修飾寡核苷酸之前，該受試者被確定為在受試者之尿或血液中具有增加水平之miR-21。
在本文提供之任一實施方式中，向患有或疑似患有奧爾波特綜合症之受試者給予與miR-21互補之經修飾寡核苷酸可以在受試者中改善腎功能；延遲終末期腎病發作；延遲進行透析之時間；延遲進行腎移植之時間；和/或改善預期壽命。
在本文提供之任一實施方式中，向患有或疑似患有奧爾波特綜合症之受試者給予與miR-21互補之經修飾寡核苷酸可以減少血尿；延遲血尿之發作；減少蛋白尿；延遲蛋白尿之發作；減少腎纖維化；減緩纖維化之進一步進展；和/或制止纖維化之進一步進展。
在本文提供之任一實施方式中，受試者可以具有選自以下項之突變：在編碼IV型膠原蛋白α3鏈之基因中之突變、在編碼IV型膠原蛋白α4鏈之基因中之突變或在編碼IV型膠原蛋白α5鏈之基因中之突變。在某些實施方式中，受試者係雄性。在某些實施方式中，受試者係雌性。在某些實施方式中，受試者被鑒定為患有血尿和/或蛋白尿。在某些實施方式中，受試者具有降低之腎功能。在某些實施方式中，受試者需要改善之腎功能。
本文中提供之任一實施方式可以包括測量在受試者之血液中之血尿素氮；測量受試者之血液中之肌酐；測量受試者中之肌酐清除率；測量受試者中之蛋白尿；測量受試者中之白蛋白：肌酐比率；和/或測量受試者中之腎小球濾過率。
在此提供之任一實施方式可以包括測量受試者尿中的N-乙醯基-β-D-胺基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白；測量受試者尿中之嗜中性粒細胞明膠酶相關脂籠蛋白(NGAL)；測量受試者尿中之腎損傷分子-1(KIM-1)蛋白；測量受試者尿中之白細胞介素-18(IL-18)蛋白；測量受試者尿中之單核細胞趨化蛋白(MCP1)水平；測量受試者尿中之結締組織生長因數(CTGF)水平；測量受試者尿中之IV型膠原蛋白(Col IV)片段；測量受試者尿中之III型膠原蛋 白(Col III)片段；和/或測量平受試者尿中之足細胞蛋白水平，其中該足細胞蛋白選自nephrin和podocin。在此提供之任一實施方式可以包括測量受試者血液中之半胱胺酸蛋白酶抑制劑C蛋白；測量受試者血液中之β-痕量蛋白(BTP)；並且測量受試者血液中之2-微球蛋白(B2M)。
在此提供之任一方法可以改善受試者中之腎功能之一或多種標記，該等標記選自以下項：受試者中減少之血尿素氮；受試者血液中減少之肌酐；受試者中改善之肌酐清除率；受試者中減少之蛋白尿；受試者中降低之白蛋白：肌酐比率；和/或受試者中改善之腎小球濾過率。在此提供之任一方法可以改善受試者中之腎功能之一或多種標記，該等標記選自以下項：受試者尿中減少之NAG；受試者尿中減少之NGAL；受試者尿中減少之KIM-1；受試者尿中減少之IL-18；受試者尿中減少之MCP1；受試者尿中減少之CTGF；受試者尿中減少之膠原蛋白IV片段；受試者尿中減少之III型膠原蛋白片段；受試者尿中減少之足細胞蛋白水平，其中該足細胞蛋白選自nephrin和podocin。在此提供之任一方法可以改善腎功能之一或多種標記，該等標記選自以下項：受試者血液中減少之半胱胺酸蛋白酶抑制劑C蛋白、受試者血液中減少之β-痕量蛋白(BTP)和受試者血液中減少之2-微球蛋白(B2M)。
在本文提供之任一實施方式中，蛋白尿係白蛋白尿。白蛋白尿可以是高正常(high normal)白蛋白尿、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。
在某些實施方式中，奧爾波特綜合症係X連鎖形式之奧爾波特綜合症。在某些實施方式中，奧爾波特綜合症係常染色體形式之奧爾波特綜合症。
在此提供之任一實施方式可以包括給予至少一個選自以下項之額外療法：血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)、抗高血壓劑、維生素D類似物、口服磷酸鹽結合劑、透析以及腎移植。在該等實施方式任一者中，血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑選自卡托普利、依那普利、賴諾普利、貝那普利、喹那普利、福辛普利以及雷米普利。在該等實施方式任一者中，血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)選自坎地沙坦、厄貝沙坦、奧美沙坦、氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦以及依普羅沙坦。在該等實施方式任一者中，ACE抑制劑選自西拉普利、培哚普利以及群多普利。
在某些實施方式中，以範圍從0.5至1mg/m2/日、從1至6mg/m2/日、從1至2mg/m2/日、從2至4mg/m2/日或從4至8mg/m2/日之劑量給予ACE抑制劑。
在某些實施方式中，以範圍從6.25至150mg/m2/日之劑量給予ARB。在該等實施方式的任一者中，以6.25mg/m2/日、10mg/m2/日、12.5mg/m2/日、18.75mg/m2/日、37.5mg/m2/日、50mg/m2/日、或150mg/m2/日之劑量給予ARB。
在某些實施方式中，該至少一種額外療法係醛固酮拮抗劑。在某些實施方式中，醛固酮拮抗劑係螺內酯。在某些實施方式中，以範圍從每日10mg至35mg之劑量給予螺內酯。在某些實施方式中，以每日25mg之劑量給予螺內酯。
在本文提供之任一實施方式中，經修飾寡核苷酸之核鹼基序列與miR-21之核鹼基序列(SEQ ID NO：1)至少90%互補、至少95%互補或100%互補。
在本文提供之任一實施方式中，經修飾寡核苷酸由8至30個、12至25個或15至25個連接之核苷組成。在本文提供之任一實施方式中，經修飾寡核苷酸由12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個連接之核苷組成。在本文提供之任一實施方式中，經修飾寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21或22個連接之核苷組成。
在本文提供之任一實施方式中，經修飾寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷。經修飾核苷可以選自S-cEt核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷以及LNA核苷。經修飾寡核苷酸可以包含至少一個經修飾核苷間鍵。經修飾寡核苷酸的每個核苷間鍵可以是經修飾核苷間鍵。在某些實施方式中，經修飾核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在本文提供之任一實施方式中，經修飾寡核苷酸可以具有結構5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷，並且每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在此提供了一種由8至30個、12至25個或15至25個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸用於治療奧爾波特綜合症之用途，其中這種經修飾寡核苷酸之核鹼基序列與miR-21互補。
詳細說明
除非另外限定，否則在此使用之所有技術術語和科學術語均具有與熟習該項技術者通常理解之相同含義。除非提供具體定義，否則與在此所述之分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學相關所使用之命名以及程式和技術係本領域熟知并且通常使用之那些。在本文中所用術語存在多個定義之情況下，在這個部分中之那些定義居於優先。標準技術可以用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及受試者之治療。某些此類技術和程式可以例如在“Carbohydrate Modifications in Antisense Research(《反義研究中之碳水化合物修飾》)”Sangvi(桑格維)和Cook(庫克)編，American Chemical Society(美國化學學會)，Washington D.C.(華盛頓)，1994；以及“Remington's Pharmaceutical Sciences”(《雷明頓氏藥物科學》)，Mack Publishing Co.(Mack出版公司)，Easton(伊斯頓)，Pa.(賓夕法尼亞州)，第18版，1990中找到；並且出於任何目的將該等文獻藉由引用特此結合。在允許情況下，除非另外指出，在此的整個揭露中自始至終參考的全部專利案、專利申請案、公開之申請和出版物、GENBANK序列、網站和其他公開之材料均藉由引用以其全文結合在此。在提到URL或其他此類識別碼或位址之情況下，應理解為此類識別碼可以變化並且互聯網上之具體資訊可以變化，但是可以藉由搜索互聯網找到等同資訊。對其參考之文獻表明此類資訊之可獲取性和公共傳播性。
在揭露和描述本發明之組合物和方法之前，應當理解在此使用之術語之目的僅在於描述具體實施方式而並非旨在是限制性的。必須指出，除非上下文另外清楚地指明，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式“一/一個/一種(a/an)”和“該(the)”包括複數指示物。
定義
“奧爾波特綜合症”意指一遺傳性形式腎臟疾病，其中異常水平之腎小球基底膜(GBM)產生，導致間質纖維化、腎小球硬化和最終腎功能喪失。該疾病還經常以聽覺缺陷和眼部異常為特徵。
“血尿”意指尿中存在紅細胞。
“白蛋白尿”意指尿中存在過量白蛋白，並且包括而不局限于正常白蛋白 尿、高正常白蛋白尿、微量白蛋白尿以及大量白蛋白尿。正常情況下，由足細胞，腎小球基底膜和內皮細胞組成之腎小球濾過通透性屏障預防血清蛋白洩漏至尿中。白蛋白尿可以反映腎小球濾過通透性屏障之損傷。白蛋白尿可以從24小時尿樣、過夜尿樣或隨取尿樣計算。
“高正常白蛋白尿”意指升高之白蛋白尿，其特徵在於(i)每24小時排泄15至<30mg白蛋白至尿中和/或(ii)在雄性中白蛋白/肌酐比率為1.25至<2.5mg/mmol(或10至<20mg/g)或在雌性中1.75至<3.5mg/mmol(或15至<30mg/g)。
“微量白蛋白尿”意指升高之白蛋白尿，其特徵在於(i)每24小時排泄30至300mg白蛋白至尿中和/或(ii)在雄性中白蛋白/肌酐比率為2.5至<25mg/mmol(或20至<200mg/mmol)或在雌性中3.5至<35mg/mmol(或30至<300mg/g)。
“大量蛋白尿”意指升高之白蛋白尿，其特徵在於每24小時排泄超過300mg白蛋白至尿中和/或(ii)在雄性中白蛋白/肌酐比率>25mg/mmol(或>200mg/g)或在雌性中>35mg/mmol(或>300mg/g)。
“白蛋白/肌酐比率”意指尿白蛋白(mg/dL)/尿肌酐(g/dL)之比率，並且表述為mg/g。在某些實施方式中，白蛋白/肌酐比率可以從隨取尿樣中計算，並且可以用作24小時時期內之白蛋白排泄量之估量。
“估計之腎小球濾過率(eGFR)或“腎小球濾過率(GFR)”意指腎臟怎樣良好過濾肌酐之量度，並且用作每分鐘多少血液經過腎小球之估量。正常結 果範圍可以是從90-120mL/分鐘/1.73m2。低於60mL/分鐘/1.73m2持續3個月或更多個月之水平可以是慢性腎臟疾病之指示。低於15mL/分鐘/1.73m2水平可以是腎衰竭之指示。
“蛋白尿”意指尿中存在過多血清蛋白。蛋白尿特徵在於每24小時排泄>250mg蛋白至尿中和/或尿蛋白對肌酐比率0.20mg/mg。與蛋白尿相關聯而升高的血清蛋白包括而不局限於白蛋白。
“血尿素氮”或“BUN”意指血液中處於尿素形式之氮量之量度。肝臟在尿素循環中產生尿素作為蛋白消化之廢棄產物，並且尿素由腎臟從血液移除。正常人成人血液可以含有7至21mg之間之尿素氮/100ml血液(7-21mg/dL)。血尿素氮之量度用於指示腎健康。如果腎臟不能正常地將尿素從血液移除，則受試者之BUN升高。
“終末期腎病(ESRD)”意指腎功能完全或幾乎完全衰竭。
“受損之腎功能”意指相對于正常腎功能而言降低之腎功能。
“纖維化”意指器官或組織中過多纖維結締組織之形成或發育。在某些實施方式中，纖維化作為修復過程或反應過程出現。在某些實施方式中，纖維化應答於損傷或損害而出現。術語“纖維化”應理解為器官或組織中形成或發育過多之纖維結締組織作為修復過程或反應過程，與形成纖維組織作為器官或組織之正常組分相反。
“減緩進一步進展”意指降低某種醫學狀況移向晚期狀態之速率。
“制止進一步進展”意指使某種醫學狀況停止向晚期狀態進展。
“延遲進行透析之時間”意指維持足夠腎功能從而延遲對透析治療之需要。
“延遲進行腎移植之時間”意指維持足夠腎功能從而延遲對腎移植之需要。
“改善預期壽命”意指藉由治療受試者中之疾病的一或多個症狀延長受試者之壽命。
“抗miR”意指具有與微RNA互補之核鹼基序列之寡核苷酸。在某些實施方式中，抗miR係經修飾寡核苷酸。
其中“miR-X”表示特定微RNA之“抗miR-X”意指具有與miR-X互補之核鹼基序列之寡核苷酸。在某些實施方式中，抗miR-X與miR-X完全互補(即，100%互補)。在某些實施方式中，抗miR-X與miR-X互補至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在某些實施方式中，抗miR-X係經修飾寡核苷酸。
“miR-21”意指具有核鹼基序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO：1)之成熟miRNA。
“miR-21莖-環序列”意指具有核鹼基序列UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO：2)之莖-環序列。
“靶核酸”意指寡聚化合物被設計成與其雜交之核酸。
“靶向”意指設計和選擇將與靶核酸雜交之核鹼基序列之過程。
“靶向於”意指具有將允許與靶核酸雜交之核鹼基序列。
“調節”意指功能、量或活性之擾動。在某些實施方式中，調節意指功能、量或活性之升高。在某些實施方式中，調節意指功能、量或活性之降低。
“表達”意指任何功能和步驟，借助所述功能和步驟，基因編碼資訊轉化成在細胞中存在和發揮作用之結構。
“核鹼基序列”意指寡聚化合物或核酸中之連續核鹼基之順序，典型地以5'至3'方向列出，與任何糖、鍵和/或核鹼基修飾無關。
“連續核鹼基”意指在核酸中彼此緊密相鄰之核鹼基。
“核鹼基互補性”意指兩個核鹼基經氫鍵非共價配對之能力。
“互補”意指一核酸能夠與另一核酸或寡核苷酸雜交。在某些實施方式中，互補物指能夠與靶核酸雜交之寡核苷酸。
“完全互補”意指寡核苷酸之每個核鹼基能夠與靶核酸中每個相應位置處之核鹼基配對。在某些實施方式中，寡核苷酸與微RNA完全互補，即寡核苷酸之每個核鹼基與微RNA中之相應位置處之核鹼基互補。在某些實施方式中，其中每個核鹼基與微RNA莖-環序列之區域內部之核鹼基具有互補性之寡核苷酸與微RNA莖-環序列完全互補。
“互補性百分比”意指寡核苷酸中與靶核酸之等長度部分互補之核鹼基之百分比。藉由以下方式計算互補性百分比：將寡核苷酸與靶核酸中相應位置處之核鹼基互補之核鹼基之數目除以寡核苷酸中核鹼基之總數。
“一致性百分比”意指第一核酸中與第二核酸內之相應位置處之核鹼基相 同之核鹼基之數目除以第一核酸中之核鹼基之總數。在某些實施方式中，第一核酸係微RNA並且第二核酸係微RNA。在某些實施方式中，第一核酸係寡核苷酸並且第二核酸係寡核苷酸。
“雜交”意指藉由核鹼基互補性而發生之互補性核酸之退火。
“錯配”意指第一核酸之核鹼基不能夠與第二核酸之相應位置處之核鹼基進行沃森-克裡克(Watson-Crick)配對。
在核鹼基序列之背景下，“一致”意指具有相同核鹼基序列，與糖、鍵和/或核鹼基修飾無關並且與任何存在之嘧啶之甲基化狀態無關。
“微RNA”意指長度在18和25個核鹼基之間之內源性非編碼RNA，它係Dicer酶切割前微RNA之產物。成熟微RNA之實例被發現於稱作miRBase之微RNA數據庫(http：//microrna.sanger.ac.uk/)中。在某些實施方式中，微RNA縮寫為“微RNA”或“miR”。
“前微RNA”或“前-miR”意指具有髮夾結構之非編碼RNA，它係稱作Drosha之雙鏈RNA特異性核糖核酸酶切割初級miR(pri-miR)之產物。
“莖-環序列”意指具有髮夾結構並且含有成熟微RNA序列之RNA。前微RNA序列和莖-環序列可以重疊。莖-環序列之實例被發現於稱作miRBase之微RNA數據庫(http：//microrna.sanger.ac.uk/)中。
“初級微RNA”或“初級miR”意指具有髮夾結構之非編碼RNA，它係雙鏈RNA特異性核糖核酸酶Drosha之底物。
“微RNA前體”意指一轉錄物，它源自基因組DNA並包含非編碼、結構 化之包含一或多個微RNA序列之RNA。例如，在某些實施方式中，微RNA前體係前微RNA。在某些實施方式中，微RNA前體係初級微RNA。
“微RNA調節之轉錄物”意指受微RNA調節之轉錄物。
“種子序列”意指這樣一核鹼基序列：包含成熟微RNA序列5'-端之核鹼基1至9中之6至8個連續核鹼基。
“種子匹配序列”意指與種子序列互補並且與種子序列具有相同長度之核鹼基序列。
“寡聚化合物”意指包含多個連接之單體亞基之化合物。低聚化合物包括寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指包含多個連接之核苷之化合物，該等核苷之每一個可以彼此獨立地是經修飾或未經修飾。
“天然存在之核苷間鍵”意指核苷之間的3'至5'磷酸二酯鍵。
“天然糖”意指DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中發現之糖。
“核苷間鍵”意指相鄰核苷之間之共價鍵。
“連接之核苷”意指由共價鍵連接的核苷。
“核鹼基”意指能夠非共價地與另一核鹼基配對之雜環部分。
“核苷”意指與糖部分連接之核鹼基。
“核苷酸”意指具有與核苷之糖部分共價連接之磷酸酯基團之核苷。
“包含由多個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸之化合物”意指這樣一化合物，它包含具有指定數目之連接核苷之經修飾寡核苷酸。因此，該化合物 可以包含額外取代基或結合物。除非另外指明，該化合物不包括除那些經修飾寡核苷酸之外之任何額外核苷。
“經修飾寡核苷酸”意指相對于天然存在之末端、糖、核鹼基、和/或核苷間鍵具有一或多種經修飾寡核苷酸。經修飾寡核苷酸可以包含未經修飾核苷。
“單鏈經修飾寡核苷酸”意指不與互補鏈雜交之經修飾寡核苷酸。
“經修飾核苷”意指具有不同于天然存在核苷之任何變化之核苷。經修飾核苷可以具有經修飾糖和未經修飾核鹼基。經修飾核苷可以具有經修飾糖和經修飾核鹼基。經修飾核苷可以具有天然糖和經修飾核鹼基。在某些實施方式中，經修飾核苷係雙環核苷。在某些實施方式中，經修飾核苷係非雙環核苷。
“經修飾核苷間鍵”意指不同于天然存在核苷間鍵之任何變化。
“硫代磷酸酯核苷間鍵”意指核苷之間其中非橋接原子之一係硫原子之鍵。
“經修飾糖部分”意指不同于天然糖之取代和/或任何變化。
“未經修飾核鹼基”意指RNA或DNA之天然存在之雜環鹼基：嘌呤鹼基-腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基-胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)以及尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”意指包含附接至5位置之甲基之胞嘧啶。
“非甲基化胞嘧啶”意指不具有附接至5位置之甲基之胞嘧啶。
“經修飾核鹼基”意指不是未修飾核鹼基之任何核鹼基。
“糖部分”意指天然存在之呋喃糖基或經修飾糖部分。
“經修飾糖部分”意指經取代糖部分或糖替代物。
“2'-O-甲基糖”或“2'-OMe糖”意指在2'位置具有O-甲基修飾之糖。
“2'-O-甲氧基乙基糖”或“2'-MOE糖”意指在2'位置具有O-甲氧基乙基修飾之糖。
“2'-氟”或“2'-F”意指在2'位置具有氟修飾之糖。
“雙環糖部分”意指包含4至7元環之經修飾的糖部分(包括但不局限於呋喃糖基)，該4至7元環包含連接了該4至7元環的兩個原子的一個橋從而形成第二環，導致雙環結構。在某些實施方式中，該4至7元環係糖環。在某些實施方式中，該4至7元環係呋喃糖基。在某些此類實施方式中，該橋連接呋喃糖基之2'-碳和4'-碳。非限制之示例性雙環糖部分包括LNA、ENA,cEt、S-cEt和R-cEt。
“鎖核酸(LNA)糖部分”意指在4'與2'呋喃糖環原子之間包含(CH2)-O橋之經取代糖部分。
“ENA糖部分”意指在4'和2'呋喃糖環原子之間包含(CH2)2-O橋之經取代糖部分。
“約束乙基(cEt)糖部分”意指在4'與2'呋喃糖環原子之間包含CH(CH3)-O橋之經取代糖部分。在某些實施方式中，CH(CH3)-O橋被約束為S取向。在某些實施方式中，(CH2)2-O被約束為R取向。
“S-cEt糖部分”意指在4'與2'呋喃糖環原子之間包含S-約束之CH(CH3)-O橋之經取代糖部分。
“R-cEt糖部分”意指在4'與2'呋喃糖環原子之間包含R-約束之CH(CH3)-O橋之經取代糖部分。
“2'-O-甲基核苷”意指具有2'-O-甲基糖修飾之2'-修飾核苷。
“2'-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2'-O-甲氧基乙基糖修飾之2'-修飾核苷。2'-O-甲氧基乙基核苷可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。
“2'-氟核苷”意指具有2'-氟糖修飾之2'-修飾核苷。2'-氟核苷可以包含修飾或未經修飾核鹼基。
“雙環核苷”意指具有雙環糖部分之2'-修飾核苷。雙環核苷可以具有修飾或未經修飾核鹼基。
“cEt核苷”意指包含cEt糖部分之核苷。cEt核苷可以包含修飾或未經修飾核鹼基。
“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分之核苷。
“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分之核苷。
“β-D-去氧核糖核苷”意指天然存在之DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”意指天然存在之RNA核苷。
“LNA核苷”意指包含LNA糖部分之核苷。
“ENA核苷”意指包含ENA糖部分之核苷。
“受試者”意指被選擇用於治療或療法之人類或非人類動物。
“對其有需要的受試者”意指被鑒定為需要療法或治療之受試者。
“疑似患有......之受試者”係展現疾病的一或多種臨床指標之受試者。
“給予”意指向受試者提供藥劑或組合物，並且包括但不局限於由醫學專業人士給予和自我給予。
“腸胃外給予”意指藉由注射或輸注之給予。腸胃外給予包括但不局限于皮下給予、靜脈內給予和肌內給予。
“皮下給予”意指緊靠皮膚下的給予。
“靜脈內給予”意指給予至靜脈中。
“同時給予”指兩種或更多種藥劑以任何方式之共給予，其中兩種藥物的藥理作用在患者中同時顯現。同時給予不要求兩種藥劑在單一藥物組合物中、以相同劑型或藉由相同給予途徑給予。兩種藥劑之作用不需要在相同時間顯現它們自身。該等作用僅需要重疊一段時間並且不需要是同延之。
“持續期”意指期間活性或事件繼續之時間段。在某些實施方式中，治療持續期係期間給予藥劑或藥物組合物之劑量之時間段。
“療法”意指疾病治療方法。在某些實施方式中，療法包括但不局限於化療、放療或給予藥劑。
“治療”意指應用一或多種用於治癒或改善疾病之具體程式。在某些實施方式中，具體程式係給予一或多種藥劑。
“改善”意指減輕病狀或疾病之至少一種指標之嚴重性。在某些實施方式中，改善包括延遲或延緩一病狀或疾病之一或多種指標之進展。指標之嚴重 性可以由熟習該項技術者已知之主觀或客觀量度確定。
“存在發展風險”意指其中受試者易傾向於發展病狀或疾病之狀態。在某些實施方式中，存在發展病狀或疾病風險的受試者展現出該病狀或疾病的一或多種症狀，但是未展現足夠數目之被診斷患有該病狀或疾病之症狀。在某些實施方式中，存在發展病狀或疾病風險之受試者展現出該病狀或疾病的一或多種症狀，但是被診斷患有該病狀或疾病之需求程度較小。
“預防發作”意指預防在存在發展一病狀或疾病風險之受試者中該病狀或疾病之發展。在某些實施方式中，存在發展疾病或病狀風險之受試者接受與已經患有該疾病或病狀之受試者所接受之治療相似之治療。
“延遲發作”意指延遲在存在發展一病狀或疾病風險之受試者中該病狀或疾病之發展。在某些實施方式中，存在發展一病狀或疾病風險之受試者接受與已經患有該疾病或病狀之受試者所接受之治療相似之治療。
“治療劑”意指用於治癒、改善或預防疾病之藥劑。
“劑量”意指在單次給予中提供之指定數量之藥劑。在某些實施方式中，劑量可以在兩個或更多個大丸劑、片劑或注射中給予。例如，在某些實施方式中，其中希望皮下給予情況下，所希望之劑量需要不易被單次注射所容納之體積。在此類實施方式中，兩次或更多次注射可以用來實現所希望之劑量。在某些實施方式中，劑量可以按兩次或更多次注射給予，以便使個體中之注射部位反應最小化。在某些實施方式中，劑量作為緩慢輸注給予。
“劑量單位”意指提供藥劑之形式。在某些實施方式中，劑量單位係含有 凍乾之寡核苷酸之小瓶。在某些實施方式中，劑量單位係含有複水之寡核苷酸之小瓶。
“治療有效量”指向動物提供治療益處之藥劑之量。
“藥物組合物”意指包含藥劑之適用於給予至個體之物質混合物。例如，藥物組合物可以包含無菌水溶液。
“藥劑”意指在給予至受試者時提供治療作用之物質。
“活性藥物成分”意指藥物組合物中提供所需作用之物質。
“改善之器官功能”意指器官功能向正常限制之變化。在某些實施方式中，藉由測量在受試者之血液或尿中發現之分子評價器官功能。例如，在某些實施方式中，改善之腎功能由血尿素氮減少、蛋白尿減少、白蛋白尿減少等量度。
“可接受之安全譜(safety profile)”意指處於臨床可接受限值之內副作用之樣式。
“副作用”意指除所希望的作用之外，可歸因於治療之生理反應。在某些實施方式中，副作用包括而不局限於注射部位反應、肝功能檢驗異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常以及肌病。此類副作用可以直接或間接地檢測到。例如，血清中增加之胺基轉移酶水平可以指示肝毒性或肝功能異常。例如，增加之膽紅素可以指示肝毒性或肝功能異常。
“受試者依從性”意指受試者遵循所推薦的或指定之療法。
“依從”意指受試者遵循所推薦之療法。
“推薦之療法”意指由醫學專業人士推薦之用於治療、改善或預防疾病之治療。
如在此使用的術語“血液”包括全血和血液部分(如血清和血漿)。
概述
奧爾波特綜合症係一遺傳性形式的腎臟疾病，其中異常水平之腎小球基底膜(GBM)產生，導致間質纖維化、腎小球硬化，並且典型地導致終末期腎病。在奧爾波特綜合症的處理中，主要治療目的係維持腎功能和預防終末期腎病之發作(ESRD)，這進而改善患有奧爾波特綜合症之受試者之預期壽命。
奧爾波特綜合症特徵在於因GBM組成缺陷所致之進行性纖維化，因此GBM形態和功能之改善係所希望的。在此證明了靶向於miR-21之經修飾寡核苷酸在奧爾波特綜合症的實驗模型中改善腎功能。額外地，腎小球硬化和纖維化在抗miR-21治療後減少。在此進一步證明了抗miR-21在奧爾波特綜合症的實驗模型中改善存活。就此，該等靶向於miR-21之經修飾寡核苷酸可用於治療奧爾波特綜合症。
本發明之某些用途
在此提供了用於治療奧爾波特綜合症的多種方法，包括向患有或疑似患有奧爾波特綜合症之受試者給予與miR-21互補之經修飾寡核苷酸。
在某些實施方式中，在給予這種經修飾寡核苷酸之前，該受試者已經被診斷為患有奧爾波特綜合症。可以藉由評估以下參數實現奧爾波特綜合症之 診斷，該等參數包括而不局限於受試者之家族史、臨床特徵(包括而不局限於蛋白尿、白蛋白尿、血尿、受損的GFR、聾症和/或眼部變化)和組織活檢結果。可以針對IV型膠原蛋白α-3、α-4和α-5鏈之存在或不存在而對腎活檢物進行測試。額外地，可以藉由腎活檢材料的電子顯微術檢測腎小球的結構變化。可以針對IV型膠原蛋白α-5鏈之存在而對皮膚活檢物進行測試，該IV型膠原蛋白α-5鏈正常情況下存在於皮膚中並且幾乎總是不存在於患有X連鎖形式奧爾波特綜合症之雄性受試者中。奧爾波特綜合症之診斷還可以包括篩查在Col4a3、Col4a4或Col4a5基因的一者或多者中的突變。
在某些實施方式中，miR-21之水平在患有奧爾波特綜合症之受試者腎中增加。在某些實施方式中，在給予之前，受試者被確定為在腎中具有增加水平的miR-21。可以從腎活檢材料測量miR-21水平。在某些實施方式中，在給予之前，受試者被確定為在該受試者之尿或血液中具有增加水平的miR-21。
在某些實施方式中，給予與miR-21互補之經修飾寡核苷酸導致一或多種臨床有益結果。在某些實施方式中，給予改善腎功能。在某些實施方式中，給予延遲終末期腎病之發作。在某些實施方式中，給予延遲了進行透析之時間。在某些實施方式中，給予延遲了進行腎移植之時間。在某些實施方式中，給予改善受試者之預期壽命。
在某些實施方式中，給予減少腎纖維化。在某些實施方式中，給予減緩腎纖維化之進一步進展。在某些實施方式中，給予制止腎纖維化之進一步進 展。在某些實施方式中，給予減少血尿。在某些實施方式中，給予延遲血尿的發作。在某些實施方式中，給予減少蛋白尿。在某些實施方式中，給予延遲蛋白尿之發作。
患有或疑似患有奧爾波特綜合症之受試者可以具有選自以下項之突變：在編碼IV型膠原蛋白α3鏈的基因(Col4a3)中的突變、在編碼IV型膠原蛋白α4鏈之基因(Col4a4)中之突變或在編碼IV型膠原蛋白α5鏈之基因(Col4a5)中之突變。在某些實施方式中，受試者係雄性。在某些實施方式中，受試者係雌性。
在某些實施方式中，受試者具有受損腎功能。在某些實施方式中，受試者需要改善之腎功能。在某些實施方式中，受試者被鑒定為患有受損之腎功能。在某些實施方式中，受試者被鑒定為患有血尿。在某些實施方式中，受試者被鑒定為患有蛋白尿。
在本文提供之任一實施方式中，受試者可以經歷某些測試以評估腎功能。此類測試包括而不局限於測量受試者中之血尿素氮；測量受試者血液中之肌酐；測量受試者血液中之肌酐清除率；測量受試者中之蛋白尿；測量受試者中之白蛋白：肌酐比率；測量受試者中的腎小球濾過率；以及測量受試者中之尿排出量。
在本文提供之任一實施方式中，尿或血液中存在之蛋白可以用於評估腎功能。腎功能的此類測試包括但不局限於：測量受試者尿中之N-乙醯基-β-D-胺基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白；測量受試者尿中之嗜中性粒細胞明膠酶相關 脂籠蛋白(NGAL)；測量受試者尿中之腎損傷分子-1(KIM-1)蛋白；測量受試者尿中之白細胞介素-18(IL-18)蛋白；測量受試者尿中之結締組織生長因數(CTGF)水平；測量受試者尿中之單核細胞趨化蛋白1(MCP1)水平；測量受試者尿中之IV型膠原蛋白(Col IV)片段；測量受試者尿中之III型膠原蛋白(Col III)片段水平；測量受試者血液中之半胱胺酸蛋白酶抑制劑C蛋白；測量受試者血液中之β-痕量蛋白(BTP)；以及測量受試者血液中之2-微球蛋白(B2M)。在本文提供之任一實施方式中，可以在尿中測量足細胞損傷之標記。此類蛋白包括nephrin和podocin。可以例如使用可商購的試劑盒、藉由酶聯免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫測定(RIA)對該等蛋白進行定量。
在本文提供之任一實施方式中，給予靶向於miR-21之經修飾寡核苷酸改善受試者中的一或多種腎功能標記。腎功能標記的改善包括而不局限於：受試者中減少之血尿素氮；受試者血液中減少之肌酐；受試者中改善之肌酐清除率；受試者中減少之蛋白尿；受試者中降低之白蛋白：肌酐比率；受試者中改善之腎小球濾過率；和/或受試者中增加之尿排出量。
某些額外療法
對於奧爾波特綜合症或在此列出之任何病狀之治療可以包括多於一種療法。就此，在本文的某些實施方式中提供了用於治療患有或疑似患有奧爾波特綜合症之受試者之多種方法，該等方法包括除了給予具有與miR-21互補之核鹼基序列之經修飾寡核苷酸之外，還給予至少一種療法。
在某些實施方式中，該至少一個額外療法包括一藥劑。
在某些實施方式中，藥劑包括血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)。在某些實施方式中，血管緊張素II受體阻滯劑係坎地沙坦、厄貝沙坦、奧美沙坦、氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦或依普羅沙坦。
在某些實施方式中，藥劑包括血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑。在某些實施方式中，ACE抑制劑係卡托普利、依那普利、賴諾普利、貝那普利、喹那普利、福辛普利或雷米普利。
在某些實施方式中，藥劑係抗高血壓劑。抗高血壓劑用於控制受試者之血壓。
在某些實施方式中，藥劑係維生素D類似物。維生素D類似物可以用於限制受試者中甲狀旁腺激素之產生。
在某些實施方式中，藥劑係減少飲食性磷酸鹽吸收的口服磷酸鹽結合劑。
在某些實施方式中，藥劑包括免疫抑制劑。在某些實施方式中，免疫抑制劑係皮質類固醇、環磷醯胺或嗎替麥考酚酯。
在某些實施方式中，藥劑係環孢黴素、HMG-輔酶A抑制劑、血管肽酶抑制劑或TGF-β拮抗劑。
在某些實施方式中，額外療法係基因治療。在某些實施方式中，該基因治療提供正常Col4a3基因。在某些實施方式中，該基因治療提供正常Col4a4基因。在某些實施方式中，該基因治療提供正常Col4a5基因。
在某些實施方式中，額外療法係透析。在某些實施方式中，額外療法係腎移植。
在某些實施方式中，藥劑包括抗炎劑。在某些實施方式中，抗炎劑係甾體抗炎劑(steroidal anti-inflammatory agent)。在某些實施方式中，甾體抗炎劑(steroid anti-inflammatory agent)係皮質類固醇。在某些實施方式中，皮質類固醇係潑尼松。在某些實施方式中，抗炎劑係非甾體抗炎藥。在某些實施方式中，非甾體抗炎劑係布洛芬、COX-I抑制劑或COX-2抑制劑。
在某些實施方式中，藥劑係阻斷針對纖維化信號的一或多種反應的藥劑。
在某些實施方式中，藥劑包括抗糖尿病劑。抗糖尿病劑包括但不局限於雙胍類、葡糖苷酶抑制劑、胰島素、磺醯脲類和噻唑烷二酮類。
某些微RNA核鹼基序列
在此所述之經修飾寡核苷酸具有與miR-21(SEQ ID NO：1)或其前體(SEQ ID NO：2)互補之核鹼基序列。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸之每個核鹼基能夠與miR-21或其前體之核鹼基序列中每個相應位置處之核鹼基發生配對。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸之核鹼基序列可以相對於miR-21或前體序列之核鹼基序列具有一或多個錯配鹼基對，並且仍能夠與其靶序列雜交。
由於miR-21序列被包含於miR-21前體序列之內，具有與miR-21互補之核鹼基序列之經修飾寡核苷酸也與miR-21前體之區域互補。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由等於miR-21長度之多個連接之核苷組成。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸之連接核苷的數目係小於miR-21的長度。具有小於miR-21長度之多個連接核苷之經修飾寡核苷酸(其中經修飾寡核苷酸的每個核鹼基與miR-21相應位置處的每個核鹼基互補)被認為是具有與miR-21序列之區域完全互補之核鹼基序列之經修飾寡核苷酸。例如，由19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸(其中每個核鹼基與22個核鹼基長度的miR-21之相應位置互補)與miR-21的19-核鹼基區域完全互補。這種經修飾寡核苷酸與miR-21的19核鹼基部分具有100%互補性並且被視為與miR-21 100%互補。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸包含與種子序列互補之核鹼基序列，即經修飾寡核苷酸包含種子匹配序列。在某些實施方式中，種子序列係六聚物種子序列。在某些此類實施方式中，種子序列係miR-21之核鹼基1-6。在某些此類實施方式中，種子序列係miR-21之核鹼基2-7。在某些此類實施方式中，種子序列係miR-21之核鹼基3-8。在某些實施方式中，種子序列係七聚物種子序列。在某些此類實施方式中，七聚物種子序列係miR-21之核鹼基1-7。在某些此類實施方式中，七聚物種子序列係miR-21之核鹼基2-8。在某些實施方式中，種子序列係八聚物種子序列。在某些此類實施方式中，八聚物種子序列係miR-21之核鹼基1-8。在某些實施方式中，八聚物種子序列係miR-21之核鹼基2-9。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸具有相對於miR-21或其前體之核鹼基序列存在一錯配之核鹼基序列。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸具有相對於miR-21或其前體之核鹼基序列存在兩個錯配之核鹼基序列。在某些此類實施方式中，經修飾寡核苷酸具有相對於miR-21或其前體之核鹼基序列存在不多於兩個錯配之核鹼基序列。在某些此類實施方式中，錯配之核鹼基係連續的。在某些此類實施方式中，錯配之核鹼基不是連續的。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸的連接之核苷之數目大於miR-21之長度。在某些此類實施方式中，額外核苷之核鹼基與miR-21莖-環序列之核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸之連接之核苷之數目比miR-21之長度多出1個。在某些此類實施方式中，該額外核苷位於寡核苷酸的5'末端。在某些此類實施方式中，該額外核苷位於寡核苷酸之3'末端。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸之連接之核苷之數目比miR-21之長度多出2個。在某些此類實施方式中，這兩個額外核苷位於寡核苷酸之5'末端。在某些此類實施方式中，這兩個額外核苷位於寡核苷酸之3'末端。在某些此類實施方式中，一額外核苷位於5'末端處並且一額外核苷位於寡核苷酸的3'末端處。在某些實施方式中，寡核苷酸的一區域可以與miR-21之核鹼基序列完全互補，但是整個經修飾寡核苷酸不是與miR-21完全互補。例如，由24個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸(其中核苷1至22之核鹼基各自與22個核鹼基長度的miR-21之相應位置互補)具有與miR-21之核鹼基序列完全互補之22-核苷部分並且與miR-21之核鹼基序列具有大約92%總體互補性。
某些經修飾寡核苷酸
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸具有結構5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷，並且每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸具有結構5'-AECSATCSASGTCSUSGAUSASAGCSUsAE-3'(SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷，並且每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸具有結構5'-MeCEASASTECSUSAEAEUSASAEGECSTEAS-3'(SEQ ID NO：4)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷；上標“Me”指示核苷之鹼基上的5-甲基，並且每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸具有結構5'-AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-3'(SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸包含一或多個5-甲基胞嘧啶。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸的每個胞嘧啶包含5-甲基胞嘧啶。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由8至30個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由12至25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由15至30個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由15至25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由15至19個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由15至16個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由19至24個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由21至24個連接之核苷組成。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由8個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由9個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由10個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由11個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由12個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由13個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由14個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由15個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由16個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由17個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由18個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由19個連接之核苷組成。在某些 實施方式中，經修飾寡核苷酸由20個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由21個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由22個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由23個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由24個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸由25個連接之核苷組成。
某些修飾
在某些實施方式中，在此提供之寡核苷酸可以包含針對核鹼基、糖和/或核苷間鍵的一或多種修飾，並且因而是經修飾寡核苷酸。修飾之核鹼基、糖和/或核苷間鍵可以因為令人希望之特性而優先於未修飾之形式而被選用，該等特性例如像增強的細胞攝取、針對其他寡核苷酸或核酸標靶的增強之親和力以及在核酸酶存在下增強之穩定性。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸包含一或多個經修飾核苷。在某些此類實施方式中，經修飾核苷係穩定核苷。穩定核苷之實例係糖經修飾核苷。
在某些實施方式中，經修飾核苷係糖經修飾核苷。在某些此類實施方式中，糖經修飾核苷可以進一步包含天然或修飾的雜環鹼基部分和/或天然或經修飾核苷間鍵，並且可以包括獨立於糖修飾之其他修飾。在某些實施方式中，糖經修飾核苷係2'-修飾核苷，其中糖環在來自天然核糖或2'-去氧核糖的2'碳處修飾。
在某些實施方式中，2'-修飾核苷具有雙環糖部分。在某些此類實施方式 中，雙環糖部分係處於α組態之D糖。在某些此類實施方式中，雙環糖部分係處於β組態之D糖。在某些此類實施方式中，雙環糖部分係處於α組態之L糖。在某些此類實施方式中，雙環糖部分係處於β組態之L糖。
包含此類雙環糖部分的核苷稱作雙環核苷或BNA。在某些實施方式中，雙環核苷包括但不局限於如下所描繪的(A)α-L-亞甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(B)β-D-亞甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(C)亞乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')BNA；(D)胺氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA；(E)氧胺基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA；(F)甲基(亞甲基氧基)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(也稱作約束乙基或cEt)；(G)亞甲基-硫代(4'-CH2-S-2')BNA；(H)亞甲基-胺基(4'-CH2-N(R)-2')BNA；(I)甲基碳環(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA；(J)c-MOE(4'-CH2-OMe-2')BNA和(K)丙烯碳環(4'-(CH2)3-2')BNA。
其中Bx係核鹼基部分，並且R獨立地是H、保護基或C1-C12烷基。
在某些實施方式中，2'-修飾核苷包含選自以下項的2'-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N-(CH3)2和O-CH2-C(=O)-N(H)CH3。
在某些實施方式中，2'-修飾核苷包含選自以下項的2'-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些實施方式中，糖經修飾核苷係4'-硫代修飾核苷。在某些實施方式中，糖經修飾核苷係4'-硫代-2'經修飾核苷。4'-硫代修飾核苷具有其中4'-O被替代為4'-S的β-D-核糖核苷。4'-硫代-2'-修飾核苷係其中2'-OH被替代為2'-取代基的4'-硫代修飾核苷。適合的2'-取代基包括2'-OCH3、2'-O-(CH2)2-OCH3和2'-F。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸包含一或多個核苷間修飾。在某些此類實施方式中，經修飾寡核苷酸的每個核苷間鍵係經修飾核苷間鍵。在某些實施方式中，經修飾核苷間鍵包含磷原子。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷間 鍵。在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸的每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸包含一或多個修飾之核鹼基。在某些實施方式中，修飾之核鹼基選自5-(羥甲基)胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤和7-去氮腺嘌呤。在某些實施方式中，修飾之核鹼基選自7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-胺基吡啶和2-吡啶酮。在某些實施方式中，修飾之核鹼基選自5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些實施方式中，修飾之核鹼基包含多環雜環。在某些實施方式中，修飾之核鹼基包含三環雜環。在某些實施方式中，修飾之核鹼基包含啡[口咢][口井]衍生物。在某些實施方式中，啡[口咢][口井]可以經進一步修飾以形成本領域中稱作G形鉗之核鹼基。
在某些實施方式中，經修飾寡核苷酸與增強所產生之反義寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取的一或多種部分結合。在某些這類實施方式中，該部分係膽固醇部分。在某些實施方式中，該部分係脂質部分。用於結合的另外的部分包括碳水化合物、磷脂、生物素、啡[口井]、葉酸鹽、菲啶、蒽醌、吖啶、螢光素、羅丹明、香豆素和染料。在某些實施方式中，該碳水化合物部分係N-乙醯基-D-半乳糖胺(GalNac)。在某些實施方式中，結合基團直接附接至寡核苷酸。在某些實施方式中，結合基團經由連接部分而附接至經修飾寡核苷酸，該連接部分選自胺基、羥基、羧酸、巰基、不飽和(例如、雙 鍵或三鍵)、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸鹽(SMCC)、6-胺基己酸(AHEX或AHA)、取代的C1-C10烷基、經取代或經未取代C2-C10烯基以及經取代或經未取代C2-C10炔基。在某些此類實施方式中，取代基選自羥基、胺基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巰基、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些此類實施方式中，化合物包含具有一或多個穩定基團之經修飾寡核苷酸，該等穩定基團附接至經修飾寡核苷酸的一或兩個末端以增強多種特性，例如，核酸酶穩定性。穩定基團中包括帽結構。該等末端修飾保護經修飾寡核苷酸免於核酸外切酶降解，並且可以幫助在細胞內部之遞送和/或定位。這種帽可以存在於5'-末端處(5'-帽)，或可以存在於3'-末端處(3'-帽)，或可以存在於兩個末端處。帽結構包括例如反轉之去氧非鹼基帽。
某些藥物組合物
在此提供了包含寡核苷酸的藥物組合物。在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含一化合物，該化合物包含一經修飾寡核苷酸，這種經修飾寡核苷酸由15至25個連接之核苷組成並且具有與miR-21互補之核鹼基序列。在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含一化合物，該化合物由經修飾寡核苷酸組成，這種經修飾寡核苷酸由8至30個連接之核苷組成並且具有與miR-21互補之核鹼基序列。在某些實施方式中，本文中提供之藥物組合物包含一化合物，其包含經修飾寡核苷酸，所述經修飾寡核苷酸由12至25個連接之核苷組成並且具有與miR-21互補之核鹼基序列。
適合的給予途徑包括但不局限於口服、直腸、透粘膜、腸道、腸內、局部、栓劑、藉由吸入、鞘內、心內、心室內、腹膜內、鼻內、眼內、腫瘤內和腸胃外(例如，靜脈內、肌內、髓內和皮下)。在某些實施方式中，鞘內給予藥物以實現局部暴露而非全身暴露。例如，可以將藥物組合物直接注射在實現所希望作用之區域內(例如，注射至腎中)。
在某些實施方式中，以劑量單位(例如，片劑、膠囊、大丸劑等)形式給予藥物組合物。在一些實施方式中，藥物組合物包含了劑量在選自以下項的範圍內之經修飾寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg和400mg至600mg。在某些實施方式中，此類藥物組合物包含了劑量選自以下項之經修飾寡核苷酸：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290 mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg和800mg。在某些此類實施方式中，藥物組合物包含了劑量選自以下項之經修飾寡核苷酸：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg和800mg。
在某些實施方式中，藥劑係無菌凍乾之經修飾寡核苷酸，它用適合的稀釋劑(例如，無菌注射用水或無菌注射用鹽水)複水。在稀釋入鹽水後，將複水的產物作為皮下注射劑或作為靜脈內輸注劑給予。凍乾的藥品由已經在注射用水中或在注射用鹽水中製備並在製備期間用酸或鹼調節至pH 7.0-9.0的 並且隨後經凍乾之經修飾寡核苷酸組成。凍乾之經修飾寡核苷酸可以是25-800mg寡核苷酸。可以理解這包括25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775和800mg修飾的凍乾寡核苷酸。另外，在一些實施方式中，凍乾之經修飾寡核苷酸係選自以下範圍內的量的寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg和400mg至600mg。可以將凍乾的藥品包裝在2mL的I型透明玻璃小瓶(經硫酸銨處理)中，將該小瓶用用溴化丁基橡膠塞塞住並用鋁FLIP-OFF®頂封密封。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物可以按本領域已確立的使用水平額外地含有藥物組合物中常規發現之其他輔助組分。因此，例如，組合物可以含有額外的相容性藥物活性材料，例如像止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可以含有在實際配製本發明組合物的不同劑型時有用的額外材料，如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩定劑。然而，當添加時，此類材料不應當過度干擾本發明組合物的組分之生物活性。可以將製劑滅菌，並且如果希望的話，將其與並沒有與製劑的寡核苷酸有害 地相互作用之助劑混合，該等助劑例如是潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓的鹽類、緩衝劑、著色劑、調味劑和/或芳香物質等。
脂質部分已經以多種方法用於核酸療法中。在一種方法中，將核酸引入由陽離子脂質和中性脂質的混合物製成的預製脂質體或脂質複合物。在另一種方法中，在中性脂質不存在的情況下形成DNA與單-或多-陽離子脂質之複合物。在某些實施方式中，選擇脂質部分以增加藥劑向特定細胞或組織之分佈。在某些實施方式中，選擇脂質部分以增加藥劑向脂肪組織之分佈。在某些實施方式中，選擇脂質部分以增加藥劑向肌肉組織之分佈。
在某些實施方式中，脂肪乳劑(INTRALIPID)用於製備包含寡核苷酸的藥物組合物。脂肪乳劑係經製備用於靜脈內給予之脂肪乳液。它由10%大豆油、1.2%卵黃磷脂、2.25%甘油和注射用水組成。此外，已經添加氫氧化鈉以調節pH，從而終產物pH範圍係6至8.9。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含與核酸複合之多胺化合物或脂質部分。在某些實施方式中，此類製品包含一或多種各自具有由式(Z)定義的結構的化合物或其藥學上可接受之鹽，
其中對於每次出現，每個Xa和Xb獨立地是C1-6亞烷基；n係0、1、2、3、4或5；每個R獨立地是H，其中在該製品中至少約80%之式(Z)化合物 分子中的至少n+2個R部分不是H；m係1、2、3或4；Y係O、NR2或S；R1係烷基、烯基或炔基，其中每一者可任選地被一或多個取代基取代；並且R2係H、烷基、烯基或炔基，其中每一者可任選地被一或多個取代基取代；條件係如果n=0，則至少n+3個R部分不是H。此類製品被描述於PCT公開WO/2008/042973中，將其藉由引用以其全文結合在此以便公開脂質製品。某些額外的製品被描述於Akinc等人，Nature Biotechnology(《自然生物技術》)26,561-569(2008年5月1日)中，將其藉由引用以其全文結合在此以便公開脂質製品。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含一或多種經修飾寡核苷酸以及一或多種賦形劑。在某些此類實施方式中、賦形劑選自水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、澱粉酶、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。
在某些實施方式中，使用已知的技術製備在此提供之藥物組合物，該等技術包括但不局限於混合、溶解、造粒、製作糖衣丸(dragee-making)、研碎、乳化、封裝、包裹或壓片方法。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物係一液體(例如，混懸劑、酏劑和/或溶液)。在某些此類實施方式中，使用本領域已知的成分製備液體藥物組合物，該等成分包括但不局限于水、二醇、油、醇類、調味劑、防腐劑和著色劑。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物係固體(例如，粉末、片劑 和/或膠囊)。在某些此類實施方式中，使用本領域中已知之成分製備包含一或多種寡核苷酸的固體藥物組合物，該等成分包括但不局限於澱粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、粘合劑和崩解劑。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物被配製為儲庫製品。某些此類儲庫製品典型地比非儲庫製品作用更持久。在某些實施方式中，藉由(例如皮下或肌內)植入或藉由肌內注射給予此類製品。在某些實施方式中，儲庫製品可以使用合適的聚合材料或疏水材料(例如，在可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂來製備，或製備為難溶衍生物(例如製備為難溶鹽)。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含遞送系統。遞送系統的實例包括但不局限於脂質體和乳液。某些遞送系統對於製備某些藥物組合物(包括包含疏水化合物的那些)係有用的。在某些實施方式中，使用了某些有機溶劑，如二甲基亞碸。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含一或多種組織特異性遞送分子，該等遞送分子被設計成將本發明的一或多種藥劑遞送至特定組織或細胞類型。例如，在某些實施方式中，藥物組合物包括用組織特異性抗體包覆的脂質體。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含緩釋系統。這種緩釋系統的非限制性實例係固體疏水聚合物的半透性基質。在某些實施方式中，取決於它們之化學性質，緩釋系統可以經數小時、數日、數周或數月之時期釋放藥劑。
在某些實施方式中，製備藥物組合物以便藉由注射(例如，靜脈內、皮下、肌內等)給予。在某些此類實施方式中，藥物組合物包含載體並且配製在水溶液(例如水或生理相容性緩衝液(如Hank溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩衝液))中。在某些實施方式中，包含其他成分(例如，有助於溶解或充當防腐劑的成分)。在某些實施方式中，使用適當的液體載體、助懸劑等來製備可注射用混懸劑。用於注射之某些藥物組合物以單位劑型(例如，在安瓿或在多劑量容器中)提供。用於注射的某些藥物組合物係在油質或水質媒介物中的混懸劑、溶液或乳液，並且可以含有配製劑，例如助懸劑、穩定劑和/或分散劑。適合用於注射用藥物組合物中的某些溶劑包括但不局限於親脂性溶劑和脂肪油如芝麻油、合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)，和脂質體。水性注射混懸劑可以含有增加混懸劑粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。可任選地，此類混懸劑還可以含有合適的穩定劑或增加藥劑溶解度以允許製備高度濃縮溶液的藥劑。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含治療有效量之經修飾寡核苷酸。在某些實施方式中，該治療有效量足以預防、減輕或改善疾病症狀或延長正在治療的受試者之存活。確定治療有效量完全處於熟習該項技術者的能力之內。
在某些實施方式中，將在此提供之一或多種經修飾寡核苷酸配製為前藥。在某些實施方式中，當在體內給予時，前藥化學地轉化成在生物學上、藥學上或治療上更有活性之寡核苷酸形式。在某些實施方式中，前藥係有用 的，因為它們比相應的活性形式更易給予。例如，在某些情況下，前藥可以比相應的活性形式更具有生物可用性(例如，藉由口服給予)。在某些情況下，與相應的活性形式相比，前藥可以具有改善之溶解度。在某些實施方式中，前藥比相應的活性形式具有更小水溶性。在某些情況下，在水溶解性有損于活動性時，這類前藥擁有優越的跨細胞膜傳送作用。在某些實施方式中，前藥係酯。在某些此類實施方式中，給予時，酯以代謝方式水解成羧酸。在某些情況下，含有羧酸的化合物係相應之活性形式。在某些實施方式中，前藥包含括與酸基團結合之短肽(聚胺基酸)。在某些此類實施方式中，該肽在給予時被切割以形成相應之活性形式。
在某些實施方式中，藉由修飾藥物活性化合物產生前藥，從而活性化合物將在體內給予時再生。可以設計前藥來改變藥物的代謝穩定性或轉運特徵、掩蔽副作用或毒性、改善藥物之味道或者改變藥物之其他特徵或特性。鑒於知曉體內藥效動力學過程和藥物代謝，一旦已知藥物活性化合物，則熟習該項技術者可以設計出該化合物的前藥(參見，例如，Nogrady(諾格拉迪)(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach(《醫藥化學一生物化學途徑》)，Oxford University Press(牛津大學出版社)，New York(紐約)，第388-392頁)。
某些額外療法
對與miR-21相關聯的疾病的治療可以包括多於一種療法。就此，在本文某些實施方式中提供了治療患有或疑似患有與miR-21相關聯的疾病的受試者 之多種方法，該方法包括除了給予具有與該微RNA互補之核鹼基序列之經修飾寡核苷酸之外，還給予至少一種療法。
在某些實施方式中，該至少一種額外療法包括一藥劑。
在某些實施方式中，藥劑包括抗炎劑。在某些實施方式中，抗炎劑係甾體抗炎劑(steroidal anti-inflammatory agent)。在某些實施方式中，甾體抗炎劑(steroid anti-inflammatory agent)係皮質類固醇。在某些實施方式中，皮質類固醇係潑尼松。在某些實施方式中，抗炎劑係非甾體抗炎藥。在某些實施方式中，非甾體抗炎劑係布洛芬、COX-I抑制劑或COX-2抑制劑。
在某些實施方式中，藥劑包括抗糖尿病劑。抗糖尿病劑包括但不局限於雙胍類、葡糖苷酶抑制劑、胰島素、磺醯脲類以及噻唑烷二酮類。
在某些實施方式中，藥劑包括但不局限於利尿藥(例如螺內酯、依普利酮、呋塞米)、正性肌力藥(例如多巴酯丁胺、米力農)、地高辛、血管舒張藥、血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑(例如是卡托普利、依那普利、賴諾普利、貝那普利、喹那普利、福辛普利、和雷米普利)、血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)(例如坎地沙坦、厄貝沙坦、奧美沙坦、氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦、依普羅沙坦)、鈣通道阻滯劑、硝酸異山梨酯、肼苯噠嗪、硝酸鹽(例如單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯)、肼苯噠嗪、β-阻滯劑(例如卡維地洛、美托洛爾)以及鈉尿肽(例如奈西立肽)。在某些實施方式中，ACE抑制劑選自西拉普利、培哚普利以及群多普利。
在某些實施方式中，以0.025至0.1mg/kg體重之劑量給予ACE抑制劑。 在某些實施方式中，以0.125至1.0mg/kg體重之劑量給予ACE抑制劑。在某些實施方式中，以範圍從1至6mg/m2/日之劑量給予ACE抑制劑。在某些實施方式中，以範圍從1至2mg/m2/日之劑量給予ACE抑制劑。在某些實施方式中，以範圍從2至4mg/m2/日之劑量給予ACE抑制劑。在某些實施方式中，以範圍從0.5至1mg/m2/日之劑量給予ACE抑制劑。
在某些實施方式中，以範圍從1至6mg/m2/日之劑量給予雷米普利。在某些實施方式中，以範圍從1至2mg/m2/日之劑量給予雷米普利。在某些實施方式中，以範圍從2至4mg/m2/日之劑量給予依那普利。在某些實施方式中，以範圍從4至8mg/m2/日之劑量給予賴諾普利。在某些實施方式中，以範圍從4至8mg/m2/日之劑量給予貝那普利。在某些實施方式中，以範圍從4至8mg/m2/日之劑量給予福辛普利。在某些實施方式中，以範圍從4至8mg/m2/日之劑量給予喹那普利。在某些實施方式中，以範圍從1至2mg/m2/日之劑量給予西拉普利。在某些實施方式中，以範圍從1至2mg/m2/日之劑量給予培多普利。在某些實施方式中，以範圍從0.5至1mg/m2/日之劑量給予群多普利。
在某些實施方式中，以範圍從6.25至150mg/m2/日之劑量給予ARB。在某些實施方式中，以6.25mg/m2/日之劑量給予ARB。在某些實施方式中，以10mg/m2/日之劑量給予ARB。在某些實施方式中，以12.5mg/m2/日之劑量給予ARB。在某些實施方式中，以18.75mg/m2/日之劑量給予ARB。在某些實施方式中，以37.5mg/m2/日之劑量給予ARB。在某些實施方式中，以50 mg/m2/日之劑量給予ARB。在某些實施方式中，以150mg/m2/日之劑量給予ARB。
在某些實施方式中，以12.5mg/m2/日之劑量給予氯沙坦。在某些實施方式中，以12.5mg/m2/日之劑量給予氯沙坦。在某些實施方式中，以6.25mg/m2/日之劑量給予坎地沙坦。在某些實施方式中，以37.5mg/m2/日之劑量給予厄貝沙坦。在某些實施方式中，以10mg/m2/日之劑量給予替米沙坦。在某些實施方式中，以18.75mg/m2/日之劑量給予纈沙坦。在某些實施方式中，以150mg/m2/日之劑量給予依普羅沙坦。
在某些實施方式中，藥劑係醛固酮拮抗劑。在某些實施方式中，醛固酮拮抗劑係螺內酯。在某些實施方式中，以範圍從每日10mg至35mg之劑量給予螺內酯。在某些實施方式中，以每日25mg之劑量給予螺內酯。
在某些實施方式中，藥劑包括類肝素。在某些實施方式中，類肝素係戊聚糖多硫酸鹽。
在某些實施方式中，藥劑係阻斷針對纖維化信號的一或多種反應的藥劑。
在某些實施方式中，藥劑係抗結締組織生長因數療法。在某些實施方式中，抗CTGF療法係針對CTGF的單克隆抗體。
在某些實施方式中，額外療法可以是增強身體免疫系統之藥劑，它包括低劑量環磷醯胺、胸腺刺激素，維生素和營養補充劑(例如，抗氧化劑，包括維生素A、C、E、β-胡蘿蔔素、鋅、硒、谷胱甘肽、輔酶Q-10和紫錐花提 取物)以及疫苗(例如，免疫刺激複合物(ISCOM)，其包含了將抗原和佐劑之多聚體呈遞進行聯合之疫苗製劑)。
在某些實施方式中，選擇額外療法以治療或改善本發明的一或多種藥物組合物之副作用。此類副作用包括而不局限於注射部位反應、肝功能檢驗異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常和肌病。例如，血清中增加的胺基轉移酶水平可以指示肝毒性或肝功能異常。例如，增加的膽紅素可以指示肝毒性或肝功能異常。
額外藥劑的其他實例包括但不局限於：免疫球蛋白，包括但不局限於靜脈內免疫球蛋白(IVIg)；鎮痛藥(例如，醋胺酚)；水楊酸酯；抗生素；抗病毒劑；抗真菌劑；腎上腺素能的調節劑；激素(例如，合成代謝類固醇、雄激素、雌激素、降鈣素、孕激素、生長抑素(somatostan)和甲狀腺激素)；免疫調節劑；肌肉鬆弛藥；抗組胺藥；骨質疏鬆劑(例如，雙膦酸鹽、降鈣素和雌激素)；前列腺素，抗腫瘤劑；精神病治劑藥；鎮靜劑；毒櫟或毒漆樹產物；抗體；以及疫苗。
某些試劑盒
本發明還提供試劑盒。在一些實施方式中，試劑盒包含本發明的一或多種化合物，該等化合物包含經修飾寡核苷酸，其中該寡核苷酸之核鹼基序列與miR-21之核鹼基序列互補。與miR-21互補的化合物可以具有在此所述的任何核苷樣式。在一些實施方式中，與miR-21互補的化合物可以存在於小瓶之內。多個小瓶，如10個，可以存在於例如分配包裝中。在一些實施方式 中，製造小瓶，使得它係注射器可及的。試劑盒也可以含有使用與miR-21互補的化合物的說明書。
在一些實施方式中，可以使用試劑盒以用於將與miR-21互補的化合物給予至受試者。在此類情況下，除了與miR-21互補的化合物之外，試劑盒可以進一步包含以下中的一項或多項：注射器、酒精棉拭子、棉球和/或紗布墊。在一些實施方式中，與miR-21互補的化合物可以存在於預填充注射器(如帶有例如27號½英寸針頭連同針套的單次劑量注射器)中，而非小瓶中。多個預填充注射器，如10個，可以存在於例如分配包裝中。試劑盒還可以含有給予與miR-21互補的化合物的說明書。
某些實驗模型
在某些實施方式中，本發明提供在實驗模型中使用和/或測試本發明之經修飾寡核苷酸之方法。熟習該項技術者能夠選擇和修改此類實驗模型的方案以評估本發明之藥劑。
總體上，首先在培養的細胞中對經修飾寡核苷酸進行測試。適合的細胞類型包括與希望在體內向其遞送經修飾寡核苷酸的細胞類型相關的那些。例如，對於在此所述方法的研究適合的細胞類型包括原代細胞或培養之細胞。
在某些實施方式中，在培養之細胞中對經修飾寡核苷酸干擾miR-21之活性之程度進行評價。在某些實施方式中，可以藉由測量微RNA之水平對微RNA活性之抑制進行評價。可替代地，可以對預測或驗證的微RNA調節的轉錄物的水平進行測量。微RNA活性的抑制可以導致miR-21-調節的轉錄物 和/或由miR-21-調節的轉錄物所編碼之蛋白增加。另外，在某些實施方式中，可以對某些表型結果進行測量。
幾種動物模型係熟練的技術人員可用于在人疾病模型中研究miR-21的。例如，可以在奧爾波特綜合症之實驗模型例如Col4a3敲除小鼠(Col4a3 -/- 小鼠)中研究miR-21之抑制劑。該疾病在小鼠模型中的嚴重性取決於攜帶Col4a3突變的小鼠之遺傳背景。例如，相對於C57BL/6J背景，該疾病之發作和進展總體上在129X1/SvJ上更快速。因而，可以選擇Col4a3 -/- 小鼠的遺傳背景以改變疾病的發作和進展。額外的模型包括X連鎖的常染色體隱性或常染色體顯性奧爾波特綜合症之犬模型。參見例如Kashtan(卡什坦)，Nephrol.Dial.Transplant(《腎臟病透析移植》)，2002,17：1359-1361。
某些定量測定
可以藉由本領域已知之多種方法評價給予經修飾寡核苷酸後反義抑制miR-21之效果。在某些實施方式中，該等方法用於定量體外或體內細胞或組織中的微RNA水平。在某些實施方式中，藉由微陣列分析測量微RNA水平之變化。在某些實施方式中，藉由幾種可商購的PCR測定之一，如TaqMan®微RNA測定(Applied Biosystems)測量微RNA水平之變化。在某些實施方式中，藉由測量miR-21的標靶的mRNA和/或蛋白水平評價miR-21之反義抑制。miR-21的反義抑制總體上導致微RNA的標靶的mRNA和/或蛋白之水平增加。
標靶結合測定(Target Engagement Assay)
可以藉由測量標靶結合來評價用抗miR或微RNA模擬物對微RNA活性之調節。在某些實施方式中，藉由mRNA的微陣列概況分析測量標靶結合。對受到抗miR或微RNA模擬物調節(增加或減少)之mRNA之序列檢索微RNA種子序列，以比較作為微RNA之標靶之mRNA之調節作用與不作為微RNA之標靶之mRNA之調節作用。以這種方式，可以將抗miR與miR-21或miR-21模擬物與其標靶之相互作用進行評估。在抗miR情況下，篩選其表達水平增加的mRNA的以下mRNA序列，該等mRNA序列包含與互補於抗miR之微RNA匹配之種子。
圖1.抗miR-21改善Col4a3-/-小鼠的腎功能。在第9周之血尿素氮(BUN)(A)和在第3、5、7和9周之尿白蛋白/肌酐比率(B)。*指示統計顯著性。
圖2.抗miR-21預防Col4a3-/-小鼠中之腎小球硬化。(A)使用範圍從0(無硬化)至4(完全硬化)(n=10)之半定量硬化評分來評估腎小球硬化。
圖3.抗miR-21減少Col4a3-/-小鼠中之纖維化。(A)腎臟中天狼猩(Sirius)紅染色之纖維化之定量(n=6)和(B)Col1a1轉錄物針對GAPDH歸一化之定量PCR(n=6)。*指示統計顯著性。
圖4.抗miR-21降低Col4a3-/-小鼠中之腎損傷等級。(A)9周齡小鼠之腎切片的腎損傷等級評分。(B)腎小球新月體之比例(n=5)。(C)腎小管損傷之定量(n=5)。*指示統計顯著性。
圖5抗miR-21在Col4a3-/-小鼠中減少巨噬細胞浸潤(A)並減少肌成纖維細胞(B)。(A)9周齡小鼠腎切片之F4/80染色之定量(n=5)。(B)9周齡小鼠腎切片的αSMA染色之定量(n=5)。*指示統計顯著性。
圖6.抗miR-21減少Col4a3-/-小鼠中之活性氧種類。(A)用抗miR-21或PBS對照處理之Col4a3-/-小鼠尿中之過氧化氫之定量(n=8；*指示統計顯著性)；(B)用抗miR-21或PBS對照處理之Col4a3-/-小鼠中和野生型小鼠中之腎組織中DES之定量(每組n=3；*指示統計顯著性)。
圖7.抗miR-21改善Col4a3-/-小鼠中之足細胞數目。用抗miR-21或PBS對照處理之Col4a3-/-小鼠腎小球中WT1-陽性細胞數目之定量(n=3；p=0.005)。
圖8.抗miR-21增加Col4a3-/-小鼠之壽命。(A)用抗miR-21或PBS對照處理之Col4a3-/-小鼠之重量(p<0.01)；(B)用抗miR-21或PBS對照處理之Col4a3-/-小鼠之壽命(P<0.001)。
圖9.抗miR-21以劑量-反應方式改善Col4a3-/-小鼠之腎功能並增加其壽命(每個處理組n=10-13)。(A)在7周時血尿素氮；(B)用抗miR-21以多劑量每週一次(QW)或每週二次(BIW)或用PBS對照處理的Col4a3-/-小鼠的壽命。
實例
提供以下實例以便更充分地說明本發明一些實施方式。然而，它們無論如何不應當被解釋為限制本發明之寬廣範圍。熟習該項技術者將易於在不偏離本發明精神情況下，採用本發明之基本原理而設計出各種化合物。
實例1：奧爾波特綜合症模型中之抗miR-21
在129sv遺傳背景上的Col4a3 -/- 小鼠自發形成與人奧爾波特綜合症相似之嚴重腎病。就此，使用Col4a3 -/- 小鼠作為奧爾波特綜合症的實驗模型。
在奧爾波特綜合症的Col4a3 -/- 模型中測試與miR-21互補之經修飾寡核苷酸(抗miR-21化合物)。使用野生型小鼠作為對照小鼠。
抗miR-21化合物之結構係5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3' (SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷。每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在3周齡時，將小鼠進行基因分型以鑒定Col4a3-/-小鼠。從3周齡至9周齡，將性別匹配之同窩小鼠用抗miR-21或PBS處理。將抗miR-21以25mg/kg的劑量皮下給予，每週2次。處理組係：(1)野生型小鼠，給予PBS,n=8；(2)Col4a3-/-小鼠，給予PBS,n=12；(3)Col4a3-/-小鼠，給予抗miR-21,n=12。使用Col4a3-/-小鼠的野生型同窩仔作為野生型對照小鼠。每週收集過夜尿樣(大約16小時)。在第9周結束時收穫血漿和腎。分析體液樣品和組織樣品以確定腎功能、腎損傷和腎小球硬化以及間質纖維化之變化。
血液或尿之終點包括測量血尿素氮(BUN)、白蛋白尿、白蛋白/肌酐比率、腎小球濾過率。組織學分析包括評估腎小球硬化、間質纖維化、腎小管損傷、巨噬細胞浸潤和肌成纖維細胞的存在。
在第9周測量血尿素氮(BUN)。藉由MannWhitney檢驗計算統計顯著性。如圖1A中所示，相對于研究結束時PBS處理的對照動物，在用抗miR-21處理的動物中觀察到BUN統計學上顯著減少。總體上觀察到減少之BUN(圖1A)，以及僅在雄性小鼠中(與對照雄性小鼠中的大約25mg/dL相比大約90mg/dL)和僅在雌性小鼠觀察到減少之BUN(與對照雌性小鼠中大約25mg/dL相比大約70mg/dL)(未示出)。Col4a3+/+小鼠中的BUN係大約 12.5mg/kL(處於正常限值之內；未示出)。BUN係腎功能之血液標記。較高之BUN與更差的腎功能相關。BUN減少指示腎損傷和損害減少以及功能改善。
藉由ELISA以及相對於尿肌酐排泄量進行歸一化，測量尿樣中的白蛋白而評價白蛋白尿，其中以每週一次的頻率經16小時收集該等尿樣。全部分析均在研究結束時的相同時間進行。如圖1B中所示，Col4a3-/-小鼠發展出嚴重白蛋白尿。然而，用抗miR-21處理的小鼠發展成輕得多的白蛋白尿，如藉由尿白蛋白對肌酐比率減少所檢測。這種減少在第7周觀察到並持續至第9周。如預期，Col4a3-/-小鼠的野生型同窩仔不展現白蛋白尿。白蛋白尿係腎小球和腎小管損傷的敏感量度。白蛋白對肌酐比率的減少指示腎小球和/或腎小管疾病減輕。
奧爾波特綜合症特徵還在於腎小球硬化進展性發展以及當不適當的腎小球洩漏出現時出現的顯著的腎間質纖維化。因此，藉由對腎小球的硬化損害(毛細血管袢喪失+纖維化或玻璃樣變性)進行不知情評分(blinded scoring)來對腎小球硬化進行評價。由不知情的觀察者依次對來自每只小鼠的30個腎小球進行評分。評分係從0-4，其中0=正常；1=<25%腎小球受硬化影響；2=25%-50%腎小球受硬化影響；3=50%-75%腎小球受硬化影響；4=75%-100%腎小球受硬化影響。在用抗miR-21處理之小鼠中，無病情腎小球之比例高得多，而在用PBS處理之小鼠中，中等或嚴重受影響之腎小球(評分2-4)之比例顯著較高(圖2)。同樣在Col43a-/-小鼠的野生型同窩仔(WT) 中對腎小球進行評分。在用天狼猩紅染色的來自PBS處理和抗miR-21處理的Col4a3-/-動物之完整矢狀切片中，以形態測定方式對間質纖維化進行測量。如圖3A中所示，在抗miR-21處理之Col4a3-/-小鼠中觀察到間質纖維化之統計顯著性降低。此外，主要病理性基質蛋白膠原蛋白Iα(1)(Col1a1)的轉錄物的定量PCR顯示，來自抗miR-21處理的Col4a3-/-小鼠的腎組織顯示這種病理性膠原蛋白之產生少得多(圖3B)。
在石蠟包埋和多聚甲醛(4%)固定的藉由高碘酸-西夫(PAS)反應染色的組織切片中對腎組織損傷進行評價。首先，將腎切片就基於腎小管的總體損傷和腎小球損傷和炎症進行排序。基於多種因素評價損傷，所述因素包括腎小管膨大、刷狀緣喪失、細胞浸潤、腎小球炎症、間質水腫和細胞壞死。將腎切片以不知情方式就總體損傷進行排序並且給予腎損傷等級評分。來自Col4a3-/-小鼠的腎切片顯示顯著較低的腎損傷等級評分，這表明較輕的腎損傷(圖4A)。為了更詳細地分析這一點，由不知情的觀察者針對具有腎小球新月體的比例而對腎小球進行評估。新月體係包曼囊(Bowman’s capsule)內部細胞的增殖，由包曼腔(Bowman’s space)內部2層的細胞定義。新月體係充分確立的腎小球損傷標記。在接受抗miR-21的Col4a3-/-小鼠中，具有新月體的腎小球之比例係大約44%，而在接受PBS對照處理的小鼠中，具有新月體之腎小球之比例係大約19%(圖4B)。在Col4a3+/+同窩仔中，具有新月體的腎小球的比例小於5%(未示出)。腎臟腎單位的腎小管也是損傷部位。藉由在覆蓋每只腎的完整矢狀切片的順序圖像上疊加網格而對腎小管損 傷進行評價。以不知情的方式，在網格每個方格內對腎小管的損傷進行評價。基於腎小管膨大/扁平、刷狀緣喪失、細胞浸潤和細胞壞死之存在而對腎小管損傷進行評價。該等特徵的存在導致對網格上該方格之正評分。總體評分應用於每幅圖像，該評分係具有腎小管損傷的方格之百分數。對於來自這只腎的全部圖像，將這種總評分平均化。每只腎之平均評分隨後經歷統計分析。如所顯示，相對於接受PBS的Col4a3-/-，在抗miR-21處理的Col4a3-/-小鼠中腎小管損傷評分顯著較低(圖4C)。在Col4a3+/+同窩仔中腎小管損傷評分小於10%(未示出)。
進行腎樣品的額外組織學分析以評估巨噬細胞浸潤、內皮穩定性和肌成纖維細胞沈積。如藉由F4/80染色判定，與PBS處理的Col4a3-/-對照小鼠相比，在抗miR-21處理的Col4a3-/-小鼠中巨噬細胞浸潤減少(圖5A)。CD31的免疫細胞化學染色證明與PBS處理的Col4a3-/-對照小鼠相比，在抗miR-21處理的Col4a3-/-小鼠中內皮穩定性改善(未示出)。α-SMA的檢測揭示出與PBS處理的Col4a3-/-對照小鼠相比，在抗miR-21處理的Col4a3-/-小鼠中肌成纖維細胞沈積減少(圖5B)。在Col4a3+/+小鼠中，α-SMA染色係大約5%(未示出)。
活性氧種類(ROS)係正常細胞代謝的副產物。在細胞應激期間，過量的ROS可以引起細胞和細胞器膜的脂質過氧化，導致結構完整性以及細胞轉運和能量生產能力之破壞。在腎中，細胞應激期間產生的ROS可以引起腎損傷。為了評價在抑制miR-21後ROS生成是否在Col4a3-/-小鼠中減少，在抗 miR-21和PBS處理之小鼠中對尿過氧化氫水平進行測量。尿過氧化氫水平在接受抗miR-21之小鼠中顯著地降低(圖6A)。在Col4a3+/+小鼠中，尿過氧化氫水平小於5μM(未示出)。另外，採用二氫乙啶(DHE)的腎組織免疫細胞化學染色(其係ROS之量度)顯示，與PBS處理之對照小鼠相比，在抗miR-21處理之Col4a3-/-小鼠的腎組織中ROS減少(圖6B)。在Col4a3+/+小鼠中，觀察到小於10%的DHE染色(未示出)。該等數據證明了抗miR-21處理之Col4a3-/-小鼠之尿和腎組織中ROS之減少。因此，抗miR-21可以藉以減少腎損傷的一機制可能包括活性氧種類生成之減少。
在抗miR-21處理的Col4a3-/-小鼠腎中的蛋白之免疫印跡揭示了相對於Col4a3-/-小鼠而言腎中MPV17L蛋白之量增加。MPV17L係參與活性氧種類代謝並保護免遭氧化應激的線粒體內膜蛋白。因而，抗miR-21處理後ROS的產生減少可以至少部分地因增加的MPV17L水平而出現。為了進一步探索抗miR-21之機理性作用，藉由PBS處理或抗miR-21處理的Col4a3-/-小鼠之腎免疫印跡，測量PPAR-α蛋白。抗miR-21處理增加PPAR-α蛋白，表明對代謝途徑之刺激。
足細胞係作為腎小球濾過屏障的必需組分之高度特化上皮細胞。足細胞喪失可以導致蛋白尿，並且在一些疾病狀態中導致腎小球硬化。為評估足細胞數目是否受Col4a3-/-小鼠中miR-21的抑制之影響，在抗miR-21和PBS處理之小鼠中對足細胞數目進行測量。相對於PBS處理的小鼠，在接受抗miR-21之Col4a3-/-小鼠中足細胞數目顯著地增加，並且與Col4a3-/-小鼠的野生型 同窩仔中觀察到的足細胞數目是可比較的(圖7)。因此，抗miR-21可以藉以在奧爾波特綜合症模型中減少腎損傷的一機制係預防或減少足細胞損失。
使用以下抗miR-21化合物實施一項相似之研究：抗miR-21化合物#1(上文)：5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO：3)抗miR-21化合物#2：5'-AECSATCSASGTCSUSGAUSASAGCSUSAE-3'(SEQID NO：3)；抗miR-21化合物#3：5'-MeCEASASTECSUSAEAEUSASAEGECSTEAS-3'(SEQ ID NO：4)；和抗miR-21化合物#4：5'-AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-3'(SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷；並且上標“Me”指示核苷之鹼基上的5-甲基。每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
將每種化合物以25mg/kg之劑量給予至三周齡Col4a3-/-小鼠，每週二次，持續9周。對照組包括用PBS處理的Col4a3-/-小鼠和Col4a3-/-小鼠的野生型同窩仔。每個處理組含有10至12只小鼠。對於化合物#1、2和4，終點如上文所述進行評估，並且包括BUN、尿白蛋白對肌酐比率、腎損傷(PAS染色)、腎小球硬化和具有新月體的腎小球的比例。對於化合物#3，終點包括BUN、尿白蛋白對肌酐比率和膠原蛋白基因表達(作為纖維化的量度)，如上文所述進行評估。
與上文描述的結果一致，抗miR-21化合物#1改善了評價的全部終點。抗miR-21化合物#2的功效類似於化合物#1，在BUN、尿白蛋白對肌酐比率、腎損傷、腎小球硬化的程度和具有新月體的腎小球的百分比方面觀察到改善。化合物#3的功效類似於化合物#1，在BUN、尿白蛋白對肌酐比率和Col1a1表達方面存在改善。抗miR-21化合物#4，儘管有效性比測試的其他化合物低，仍導致BUN、腎損傷、腎小球硬化的程度和具有新月體之腎小球的百分比之改善。
綜上所述，該等數據顯示在奧爾波特綜合症模型中，抗miR-21處理減弱腎功能喪失和白蛋白尿形成。腎小球硬化和間質纖維化明顯減弱並且近端腎小管得到保護。由於抗miR-21在Col4a3-/-小鼠中預防腎功能的進行性喪失並且減弱腎小球病情和腎小管-間質病情，故而抗miR-21係人奧爾波特綜合症的治療劑。
實例2：奧爾波特綜合症模型中抗miR-21的升高
為了評價奧爾波特綜合症實驗模型中miR-21的失調，在從小鼠收穫的腎組織中對miR-21水平進行測量。從全腎分離RNA並藉由定量PCR測量miR-21。相對於野生型小鼠中的miR-21水平，在Col4a3-/-小鼠中miR-21水平升高大約3倍。
因此，可以將接受奧爾波特綜合症治療的受試者鑒定為在給予治療之前在腎活檢材料、尿或血液中具有升高之miR-21。
實例3：奧爾波特綜合症模型中的存活研究
野生型小鼠總體上生活2至3年(或730天至1095天)。在129X1/SvJ背景上的Col4a3-/-小鼠中，終末期腎衰竭可以早至2月齡出現。在C57BL/6J背景上的Col4a3-/-小鼠中，終末期腎衰竭可以早至6月齡出現。無論什麼樣的背景，Col4a3-/-小鼠的壽命均顯著短於野生型小鼠。就此，任何遺傳背景上的Col4a3-/-小鼠均可以充當奧爾波特綜合症中終末期腎衰竭的模型並且可以用於評估候選治療劑對預期壽命的影響。
將小鼠進行基因分型以鑒定Col4a3-/-小鼠。將抗miR-21以範圍從10至25mg/kg的劑量皮下給予，每週1次或2次持續直至1年。可以給予PBS作為對照治療。在整個研究期間按周或按月時間表收集過夜尿樣(大約16小時)。記錄每只小鼠在死亡時的年齡。在死亡時或在研究結束時採集血漿和腎。分析體液樣品和組織樣品以確定腎功能、腎小球硬化和纖維化之變化。
對體液樣品和組織樣品進行分析以確定腎功能、腎損傷和腎小球硬化和間質纖維化之變化。血液或尿的終點包括測量血尿素氮(BUN)、白蛋白尿、白蛋白/肌酐比率、腎小球濾過率。組織學分析包括評估腎小球硬化、間質纖維化、腎小管損傷、巨噬細胞浸潤以及肌成纖維細胞之存在。
相對於PBS處理的對照小鼠，在抗miR-21處理的小鼠中觀察到終末期腎衰竭發作的延遲和增加的預期壽命，表明抗miR-21係可以增加患有奧爾波特綜合症之受試者的預期壽命的治療劑。
抗miR-21增加奧爾波特綜合症模型中之存活-單劑量研究
為評估抗miR-21對奧爾波特綜合症實驗模型中存活的影響，將抗miR- 21化合物給予至Col4a3-/-小鼠。
抗miR-21化合物的結構係5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷。每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
將129X1/SvJ背景上的Col4a3+/1小鼠(雜合子)雜交以產生Col4a3-/-小鼠。在3周齡，將小鼠進行基因分型以鑒定Col4a3-/-小鼠。處理組係：(1)Col4a3+/+小鼠(野生型同窩仔)，給予PBS，每週二次，n=12；(2)Col4a3-/-小鼠，給予PBS，每週二次，n=12；(3)Col4a3-/-小鼠，皮下給予25mg/kg抗miR-21，每週二次，n=12。從第3周至第16周，每週二次給予治療。每週測量動物重量，並且記錄壽命。
如預期，在約9周齡處開始，Col4a3-/-小鼠經歷體重減輕，並且死亡在9周齡和11周齡之間發生。如圖8A中所示，抗miR-21增加峰值體重並且顯著地延遲體重減輕(p<0.01)。如圖8B中所示，抗miR-21顯著地增加壽命(p<0.001)。因此，用抗miR-21處理不僅延遲Col4a3-/-小鼠的體重減輕，而且重要地改善其存活。
抗miR-21增加奧爾波特綜合症模型中之存活-劑量反應研究
為評估奧爾波特綜合症實驗模型中抗miR-21對存活的劑量反應影響，將幾種劑量的抗miR-21化合物給予至Col4a3-/-小鼠。
抗miR-21化合物的結構係5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3' (SEQ ID NO：3)，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷。每個核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
在3周齡，將小鼠進行基因分型以鑒定Col4a3-/-小鼠。處理組係：(1)Col4a3-/-小鼠，給予PBS，每週一次，n=13；(2)Col4a3-/-小鼠，給予12.5mg/kg抗miR-21，每週一次，n=12；(3)Col4a3-/-小鼠，給予25mg/kg抗miR-21，每週一次，n=13；(4)Col4a3-/-小鼠，給予50mg/kg抗miR-21，每週一次，n=12；(5)Col4a3-/-小鼠，給予25mg/kg抗miR-21，每週二次，n=12；在第24日開始給予治療。每週測量動物重量，並且記錄壽命。在第7周，採集血液用於測量BUN。
如圖9A中所示，相對於PBS處理之對照動物，在抗miR-21處理之動物中觀察到BUN減少。雖然觀察BUN減少，但它不具有強烈的劑量-反應性，這可能歸因於以下事實：該疾病在用於此實驗的Col4a3-/-小鼠中更嚴重(小鼠從與先前實例中所述的Col4a3-/-小鼠不同供應商獲得)。觀察到的BUN減少表示腎損傷和損害減少以及功能改善。
如圖9B中所示，用抗miR-21處理以劑量反應方式增加了Col4a3-/-小鼠之壽命。對於每週二次和每週一次處理，均觀察到增加之壽命。中位存活期如下：PBS,62天；12.5mg/kg抗miR-21，每週一次(QW)，72.5天；25mg/kg抗miR-21，每週一次(QW)，77天；50mg/kg抗miR-21，每週一次 (QW)，89天；25mg/kg抗miR-21，每週二次(BIW)，82.5天。
相對於PBS處理的對照小鼠，在抗miR-21處理的小鼠中觀察到腎功能障礙的發作延遲和增加之預期壽命，表明抗miR-21係可以增加患有奧爾波特綜合症之受試者的預期壽命之治療劑。
實例4：Col4a3-/-小鼠的腎中的抗miR分佈
已知寡核苷酸(包括抗miR化合物)分佈於腎內部的幾種細胞類型。如Chau等人，Sci Transl Med.(《科學轉化醫學》)，2012,121ra18報導，在將Cy3-標記的抗miR給予至正常小鼠或經歷腎損傷的小鼠(單側輸尿管阻塞，一間質纖維化模型)後，腎中的最大螢光強度係在近端腎小管上皮中。內皮、周皮細胞、肌成纖維細胞和巨噬細胞也全部含有可檢測量之Cy3-標記之抗miR。然而，腎小球、特別是足細胞，未顯現出攝取顯著量之抗miR，與化學經修飾寡核苷酸的已知分佈一致(Masarjian等人，Oligonucleotides(《寡核苷酸》)，2004,14,299-310)。
為了研究抗miR在奧爾波特綜合症的小鼠模型中之分佈，將Cy3-標記的抗miR化合物給予至兩個不同組的Col4a3-/-小鼠，一個組處於6周齡(n=3)並且一個組處於8周齡(n=4)，並且給予至一個處於8周齡的野生型小鼠組(n=3)。在給予抗miR化合物後兩天，處死動物並收穫及加工腎用於組織學分析。
將腎組織的切片用針對幾種不同細胞標記具有特異性的抗體進行共標記，以便鑒定特定細胞類型中之抗miR攝取。對α-SMA(肌成纖維細胞標 記)、PDGFR-β(周皮細胞/肌成纖維細胞標記)、CD31(內皮細胞標記)、F4/80(巨噬細胞標記)和GP38(足細胞標記)進行染色。如預期，抗miR化合物被攝入近端腎小管上皮、周皮細胞、肌成纖維細胞和巨噬細胞中。與正常小鼠和患有間質纖維化的小鼠中的先前觀察結果相反，在Col4a3-/-小鼠中，抗miR被攝入腎小球中，包括被攝入足細胞中。
如在此所述，在奧爾波特綜合症實驗模型中給予抗miR-21後觀察到之功效不僅伴隨圍繞腎小管之間質纖維化改善，還伴隨腎小球內纖維化(稱作腎小球硬化)之改善。該等數據表明除了來自改善的腎小管結構和功能之回饋之外或取而代之，該等改善可能與腎小球中的抗miR-21作用直接相關。
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<223> 合成的
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Claims (30)

  1. 一種治療奧爾波特綜合症的方法，包括向一患有或疑似患有奧爾波特綜合症之受試者給予由12至25個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸，其中這種經修飾寡核苷酸之核鹼基序列與miR-21互補。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在給予這種經修飾寡核苷酸之前，該受試者已經被診斷為患有奧爾波特綜合症。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在給予這種經修飾寡核苷酸之前，該受試者被確定為在該受試者之腎、尿或血液中具有增加水平之miR-21。
  4. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該給予：a.改善腎功能；b.延遲終末期腎病發作；c.延遲進行透析之時間；d.延遲進行腎移植装置時間；和/或e.改善預期壽命。
  5. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該給予：a.減少血尿；b.延遲血尿之發作；c.減少蛋白尿；d.延遲蛋白尿之發作；e.減少腎纖維化；f.減緩纖維化之進一步進展；和/或g.制止纖維化之進一步進展。
  6. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該受試者具有一選自以下項的突變：在編碼IV型膠原蛋白α3鏈的基因中的突變、在編碼IV型膠原蛋白α4鏈的基因中的突變或在編碼IV型膠原蛋白α5鏈之基因中之突變。
  7. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該受試者係雄性。
  8. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該受試者係雌性。
  9. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該受試者被鑒定為患有血尿和/或蛋白尿。
  10. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該受試者具有降低之腎功能。
  11. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該受試者需要改善之腎功能。
  12. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，包括：a.測量該受試者血液中之血尿素氮；b.測量該受試者血液中之肌酐；c.測量該受試者中的肌酐清除率；d.測量該受試者中的蛋白尿；e.測量該受試者中的白蛋白：肌酐比率；f.測量該受試者中的腎小球濾過率；g.測量該受試者中的半胱胺酸蛋白酶抑制劑C；h.測量該受試者血液中之β-痕量蛋白(BTP)；i.測量該受試者血液中之2-微球蛋白；j.測量該受試者尿中之N-乙醯基-β-D-胺基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白；k.測量該受試者尿中之嗜中性粒細胞明膠酶相關脂籠蛋白(NGAL)； l.測量該受試者尿中之腎損傷分子-1(KIM-1)蛋白；m.測量該受試者尿中之白細胞介素-18(IL-18)蛋白；n.測量該受試者尿中之單核細胞趨化蛋白(MCP1)水平；o.測量該受試者尿中之結締組織生長因數(CTGF)水平；p.測量該受試者尿中之IV型膠原蛋白片段；q.測量該受試者尿中之III型膠原蛋白片段；和/或r.測量該受試者尿中之足細胞蛋白水平，其中該足細胞蛋白選自nephrin和podocin。
  13. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該給予改善了該受試者中的腎功能的一或多種標記，該等標記選自：a.在該受試者中減少的血尿素氮；b.在該受試者血液中減少之肌酐；c.在該受試者中改善的肌酐清除率；d.在該受試者中減少的蛋白尿；e.在該受試者中降低的白蛋白：肌酐比率；f.在該受試者中改善的腎小球濾過率；g.在該受試者血液中減少之半胱胺酸蛋白酶抑制劑C；h.在該受試者血液中減少之β-痕量蛋白(BTP)；i.在該受試者血液中減少之2-微球蛋白(B2M)； j.在該受試者尿中減少之NAG蛋白；k.在該受試者尿中減少之NGAL蛋白；l.在該受試者尿中減少之KIM-1蛋白；m.在該受試者尿中減少之IL-18蛋白；n.在該受試者尿中降低之單核細胞趨化蛋白(MCP1)水平；o.在該受試者尿中降低之結締組織生長因數(CTGF)水平；p.在該受試者尿中減少之IV型膠原蛋白片段；q.在該受試者尿中減少之III型膠原蛋白片段；和/或r.在該受試者尿中降低之足細胞蛋白水平，其中該足細胞蛋白選自nephrin和podocin。
  14. 如申請專利範圍第5、12或13項中任一項所述之方法，其中該蛋白尿係白蛋白尿。00
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該白蛋白尿係高正常白蛋白尿、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿。0
  16. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該奧爾波特綜合症係X連鎖形式之奧爾波特綜合症。
  17. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中該奧爾波特綜合症係常染色體形式之奧爾波特綜合症。
  18. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，包括給予至少一個選自以下項之額外療法：血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)、抗高血壓劑、維生素D類似物、口服磷酸鹽結合劑、透析以及腎移植。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該等血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑選自卡托普利、依那普利、賴諾普利、貝那普利、喹那普利、福辛普利以及雷米普利。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該等血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)選自坎地沙坦、厄貝沙坦、奧美沙坦、氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦以及依普羅沙坦。
  21. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中這種經修飾寡核苷酸之核鹼基序列與miR-21之核鹼基序列(SEQ ID NO：1)至少90%互補、至少95%互補或100%互補。
  22. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中這種經修飾寡核苷酸由15至25個連接之核苷組成。
  23. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中這種經修飾寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21或22個連接之核苷組成。
  24. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中這種經修飾寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷。
  25. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中這種經修飾核苷選自S-cEt核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷和LNA核苷。
  26. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中這種經修飾寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵。
  27. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中這種經修飾寡核苷酸的每個核苷間鍵係一經修飾核苷間鍵。
  28. 如申請專利範圍第23或24項所述之方法，其中這種經修飾核苷間鍵係一種硫代磷酸酯核苷間鍵。
  29. 如以上申請專利範圍中任一項所述之方法，其中這種經修飾寡核苷酸具有結構5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'，其中不後接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；後接下標“E”之核苷指示2'-MOE核苷；後接下標“S”之核苷指示S-cEt核苷，並且每個核苷間鍵係一種硫代磷酸酯核苷間鍵。
  30. 一種由12至25個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸用於治療奧爾波特綜合症之用途，其中這種經修飾寡核苷酸之核鹼基序列與miR-21互補。
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