KR100574597B1 - α1β1 인테그린 수용체 저해제 및 ＴＧＦ-β1 저해제의신장 질환의 치료용 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신장 질환(예컨대, 신장 사구체신염 및/또는 신장 섬유증)을 치료(즉, 질환의 발병의 지연, 진행의 지연 및/또는 역전)하는 방법을 제공한다. 특정한 이들 방법은 TGF-β1 저해제와 임의적으로 병용하여 α1β1 인테그린 수용체 저해제를 투여하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 마우스가 정상적인 콜라겐 타입 4 조성을 발현시키지 않고(즉, 콜라겐 α3(Ⅳ), α4(Ⅳ), 및 α5(Ⅳ) 사슬을 사구체 기저막에 혼입시키지 않는다) α1β1 인테그린 수용체를 발현시키지 않는 것을 특징으로 하는 신장 질환용 마우스 모델을 제공한다.

Description

α1β1 인테그린 수용체 저해제 및 ＴＧＦ-β1 저해제의 신장 질환의 치료용 용도 {USE OF α1β1 INTEGRIN RECEPTOR INHIBITORS AND TGF-β1 INHIBITORS IN THE TREATMENT OF KIDNEY DISEASE}

발명의 분야

본 발명은 사구체신염 및/또는 섬유증을 특징으로 하는 신장 질환의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신장 질환에서 α1β1 인테그린 수용체 저해제의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신장 질환에서 TGF-β1 저해제와 병용하여 α1β1 인테그린 수용체 저해제를 사용하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

미국에서는, 현재 약 12,000명의 사람들이 앨포트(Alport) 증후군을 가지고 살고 있다. 이러한 유전 질환은 단지 투석과 신장 이식에 의해서만 치료될 수 있는 진행성 신장 질환을 초래한다. 이식된 신장은 일반적으로 거부반응을 나타낸다. 따라서, 대안적인 치료법이 필요하다. 그러나, 상기 질환의 발병 또는 진행에 관한 메카니즘을 다루는 치료법은 현재로서 존재하지 않는다. 따라서, 필요한 것은 질병의 발병 및/또는 진행의 메카니즘을 공격하는 치료법으로, 신장 사구체신염 및 신장 섬유증과 같은 질환 상태를 실질적으로 늦출 수 있는 치료법이다.

많은 신장 질환이 매트릭스 항상성의 변화과 관련이 있으며, 상기 변화에서 구조 분자의 합성 및 턴오버(turnover)의 정밀한 균형이 방해된다. 일례로서, 앨포트 증후군은 진행성 신장 장해를 초래하는 질환이고, 감각신경성 청각 상실과 관련이 있다. 남성 보인자는 대부분 병에 걸리며 초미세구조 연구 결과 이환된 개개인의 사구체 기저막(GBM)에 이상이 있는 것으로 밝혀졌다. 20,000명중 약 1명이 앨포트 증후군을 가지며, 이 사실은 상기 질환을 보다 만연하는 공지된 유전 질환중의 하나로 만든다[참조: 예컨대, Atkin et al., "Alport Syndrome" In R.W. Schrier & C.W. Gottschalk(Eds.), Disease of the Kidney, 4th ed., Chap. 19, Little Brown, Boston, pp. 617-641, 1988]. X-연관된 앨포트 증후군은 콜라겐 4A5 유전자에서 임의의 일련의 돌연변이에 기인한다[참조: Barker et al., Science, 348:1224-1227, 1990]. 상기 유전자에서 60개 이상의 상이한 돌연변이가 확인되었다. 앨포트 증후군의 상염색체형은 X-연관형과 동일한 범위의 표현형으로 나타나며 기저막 콜라겐 유전자 4A3(COL4A3) 또는 4A4(COL4A4)에서의 돌연변이에 기인한다[참조: 예컨대, Lemmink et al., Hum. Mol. Gen., 3:1269-1273, 1994, and Mochizuki et al., Nature Genet., 8:77-81, 1994]. 기타 기저막의 질환은 콜라겐 4A3의 NC1 도메인상의 에피토프에 대한 급성 자가면역 반응에 기인하는 굿파스튜어(Goodpasture) 증후군[참조: Hudson et al., Kidney Int., 43: 135-139, 1993], 및 콜라겐 4A5 및 4A6 모두의 결실과 관련된 양성 평활근 종양인 범발성 평활근종[참조: Zhou et al., Science, 261:1167-1169, 1993]을 포함한다.

기저막은 신체의 거의 모든 기관 및 조직과 관련된 분화된 세포외 구조이다. 기저막은 일반적으로 세포와 결합 조직 사이의 경계에서 발견되지만, 신장 사구체(즉, 모세혈관의 다발)의 경우에서와 같이, 상피 세포와 내피 세포 사이에서도 발견될 수 있다. 기저막의 주된 구조 재료는 타입 Ⅳ 콜라겐, 라미닌, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴, 및 종종 피브로넥틴 및 타입 Ⅴ 콜라겐을 포함한다. 모든 기저막에서 최고로 나타나는 성분은 기저막에서만 발견되는 독특한 콜라겐 타입인 타입 Ⅳ 콜라겐이다. 천연 형태에서, 타입 Ⅳ는 모든 콜라겐과 같이, 6개 알파 사슬(4A1 내지 4A6)의 독특한 조합으로 구성된 3중 헬릭스에 어셈블링된 3개의 콜라겐 분자로 구성된다. 4A1 및 4A2 사슬(α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬로도 지칭)이 가장 일반적이다[참조: Timpl, J. Biochem., 180:487-502, 1989]. 타입 Ⅳ 콜라겐은 간질성 콜라겐과는 많은 방식에서 차이가 있다. 알파 사슬 회합의 헬릭스 구조는 기타 콜라겐에서 관찰되는 글리신-X-Y 모티프와 완전하게 부착되어 있지 않으며; 4-히드록시프롤린 보다는 3-히드록시프롤린을 함유하고, 탄수화물이 풍부하다. 결과적인 콜라겐의 상부구조는 기저막 콜라겐의 닭장 철망형 망상구조이다. 이러한 망상구조는 그 위에 부속 분자(라미닌, 헤파린 술페이트 등)가 결합하는 기본구조이다.

기저막은 매우 이질적인 구조이며, 이는 그의 다양한 기능적 성질의 원인이 된다. 이들 구조의 복잡성에 관한 이해는 아직 불충분하다. 몇가지 새로운 기저막 콜라겐 사슬(알파 3, 4, 5, 및 6 사슬)이 최근 발견되었을 뿐이다[참조: 예컨대, Gunwar et al., J. Biol. Chem., 266:15318-15324, 1990; Hostikka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1606-1610, 1990; Butkowski et al., J. Biol. Chem., 262:7874-7877, 1987; and Zhou et al., Science 261:1167-1169, 1993]. 흥미롭게도, 상기 새로운 사슬은 특정한 조직(예컨대, 신장의 사구체, 눈의 데시멧트 막(Decimet's membrane), 수정체, 피부, 폐, 고환, 와우각)에서만 발견되었다[참조: 예컨대, Kleppel et al., Am. J. Pathol., 134:813-825, 1989, and Tryggvason et al., Kidney Int., 43:38-44, 1993]. 기저막 어셈블리 및 기능에서 이러한 새로운 사슬의 역할은 현재로서 알려져 있지 않다. 이러한 새로운 기저막 콜라겐은 콜라겐 타입 4A1(α1(Ⅳ)) 및 4A2(α2(Ⅳ))의 망상구조와는 구별되는 별개의 망상구조를 형성하는 것으로 생각된다.

신장 사구체 기저막(GBMs)은 한외여과 과정에 필수적인 것이다(즉, 상기 과정에서 혈액이 여과되어, 예컨대 뇨의 형태로 배설되는 대사물질을 제거한다). 앨포트 증후군은 세포외 매트릭스의 대량 축적 및 손상된 기저막을 초래하는 결과, 소상 및 분절성 사구체신염(즉, 신장 사구체의 모세혈관 루프의 염증)을 일으켜, 결국 치명적인 요독증(즉, 신장 장해의 결과 혈액중 과량의 우레아가 존재)이 초래된다. 또한, 다수의 동일한 세포외 매트릭스 분자(예컨대, 콜라겐 타입 Ⅰ, 피브로넥틴, 라미닌, 및 콜라겐 타입 Ⅳ)는 IDDM(인슐린 의존성 당뇨병) 신염을 가진 환자의 GBM에 점차적으로 축적된다. 그러나, 이러한 질환에서 GBM은 비후되지만, 앨포트 증후군의 특징인 GBM의 소상 박화 및 분열(분할)은 없다.

인테그린은 기저 라미나 및 세포외 매트릭스의 성분과 결합하는 이종이량체 막투과 당단백 수용체의 일종이다. 이들은 세포 응집 및 기저 라미나에 세포를 고정시키는 것과 관련된 유착 분자로서 작용한다. 이들은 신호를 핵에 변환시키고, 유전자 발현, 특히 세포 이동 및 세포 분화에 대한 유전자 발현을 조절하는 것과 관련되어 있다[참조: Hynes, Cell, 69: 11-25, 1992]. 20개가 넘는 상이한 인테그린 수용체가 공지되어 있고, 이들은 약 14개의 상이한 알파 서브유닛 및 약 8개의 상이한 베타 서브유닛을 포함한다[참조: DiSimone, Curr. Opin. Cell Biol., 6: 182-194, 1994].

신장 사구체에는, 별개의 셋트의 인테그린 수용체가 존재한다. 이들은 메산쥼 매트릭스(즉, 신장 사구체에서 모세혈관 루프를 지지하는 것을 보조하는 막) 또는 내장 상피 세포와 관련이 있다[참조: Patey et al., Cell Adhesion Commun., 2:159-167, 1994]. 성인 사구체 내장 상피 세포상에서 가장 우세한 인테그린 수용체는 α3β1 이종이량체이다[참조: Adler, Am, J. Pathol., 141:571-578, 1992: and Patey et al., Cell Adhesion Commun., 2:159-167, 1994]. β5 서브유닛은 성인 내장 상피 세포에서 발현되는 것으로 증명되었고[참조: Yamada et al., Cell Adhesion Communic., 3:311-325, 1995], α1, α3, α5, αⅤ, β1, 및 β3 인테그린 수용체는 신장 형태발생 동안 발생적으로 발현된다[참조: Korhonen et al., Lab. Invest., 62:616-625, 1990; Wada et al., J. Cell. Biol., 132:1161-1176, 1996; and Yamada et al., Cell Adhesion Communic., 3:311-325, 1995]. α1β1 이종이량체 인테그린 수용체는 신장 사구체의 메산쥼 세포의 표면에서 확인된 유일한 인테그린 수용체이다.

α3 인테그린 수용체 서브유닛의 유전자 녹아웃 마우스가 생산되었다. 그 자손은 출생 직후 신장 기능 부전으로 사망한다[참조: Kreidberg et al., Dev., 122:3537-3547, 1996]. 이 모델의 신생아에서 GBM의 초미세구조 병리학은 진전된 앨포트 증후군에서 관찰된 것과 상당히 유사하다. 기저막은 희박화된(rarefied) 것(즉, 불규칙적으로 비후, 박화, 및 분열)으로 나타나며 내장 상피 세포의 족돌기(foot process)가 융합된 것으로 나타난다. α3β1 수용체에 대한 한 리간드가 타입 Ⅳ 콜라겐이고[참조: Krishnamurti et al., Lab. Invest., 74:650-665, 1996; and Rupprecht et al., Kidney Int., 49:1575-1582, 1996], 이 수용체가 내장 상피 세포 및 GBM 사이의 접촉면을 따라 국재화되어 있기 때문에[참조: Baraldi et al., Nephron, 66:295-301, 1994], α3 인테그린 녹아웃에 대하여 상기 기재된 관찰은 이러한 인테그린/리간드 상호작용이 기저막 발생에서 중요한 역할을 하는 모델을 지지한다.

정상적인 동물에서, 출생시까지 태아 사구체 기저막(GBM)의 타입 Ⅳ 콜라겐은 오직 α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬(고전적인 콜라겐 사슬로 지칭)만을 포함한다. 출생 직후에, 발생적 전환이 일어나 α3(Ⅳ), α4(Ⅳ), 및 α5(Ⅳ) 사슬(새로운 콜라겐 사슬로 지칭)이 GBM에서 명백하게 검출가능하며, α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬은 메산쥼 매트릭스에 주로 국재화된다[참조: Minor & Sanes, J. Cell. Biol., 127:879-891, 1994].

성인의 신장에서, α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬을 포함하는 GBM의 박층이 내피 세포층에 인접하여 위치하는 반면, 대다수의 전체 두께의 GBM은 α3(Ⅳ), α4(Ⅳ), 및 α5(Ⅳ) 사슬을 포함한다[참조: Desjardins & Bendayan, J. Cell. Biol., 113:689-700, 1991; and Kashtan et al., J. Clin. Invest.,78:1035-1044,1996]. 2개의 상이한 셋트의 콜라겐 사슬이 별개의 망상구조를 형성함을 시사하는 생화학적 증거가 있다[참조: Kleppel et al., J. Biol. Chem., 267:4137-4142,1992]. 가족성 신염에서, α3(Ⅳ), α4(Ⅳ), 또는 α5(Ⅳ) 유전자의 무효 돌연변이(null mutation)(즉, 유전자 발현을 소실시키는 돌연변이)는 GBM에서 모든 3개 사슬의 부재를 초래하며, 이는 GBM 상부구조의 고분자 어셈블리에서 필수적인 회합에 기인하는 것으로 추정된다. 이는 GBM의 전체 두께를 통하여 α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬의 존재를 초래한다. 따라서, 앨포트 신장(즉, 앨포트 증후군을 가진 개체의 신장)에서 내장 상피 세포의 표면상의 타입 Ⅳ 콜라겐 수용체는 비특징적인 타입 Ⅳ 콜라겐 사슬 조성의 GBM과 직접 접촉한다. 1개 이상의 연구에서 이러한 상이한 조성을 가진 타입 Ⅳ 콜라겐에 부착되는 내장 상피 세포의 상대적 능력에 관하여 언급하였으며, 내장 상피 세포는 고전적인 α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬과 직접 비교할 때 새로운 사슬로 구성된 기저막에 보다 현저히 우수하게 부착되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 부착은 α3 인테그린 수용체에 대한 항체로 차단될 수 있었다.

앨포트 증후군의 상염색체형에 대한 마우스 모델이 COL4A3 프로콜라겐 유전자의 표적화된 돌연변이발생에 의해 창제되었다[참조: Cosgrove et al., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996]. 상기 동물 모델은 동종번식 129Sv/J 배경에서 약 4주령에서 단백뇨의 발증과 함께, 진행성 사구체신염이 발병하며, 신부전으로 인한 사망의 평균 주령은 약 8.5주이다. GBM에서 초미세구조의 변화는 단백뇨가 발증되기 훨씬 전인 1주령에서 관찰되며, 대부분의 사구체의 GBM 전체에 3주령까지 관찰된다. 라미닌-1, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 및 엔탁틴을 포함한 세포외 매트릭스 성분이 GBM에 축적된다. 이러한 마우스는 본원에서 "앨포트" 마우스로서 지칭된다.

신장 질환의 진행과 관련하여 GBM 및 메산쥼에 세포외 매트릭스 및 메산쥼이 축적되는 것은 환자 및 실험 동물 시스템 모두에서 다양한 사구체 질환에 공통되는 특징이다[참조: 예컨대, Goyal & Wiggins, Am. Soc. Nephrol., 1:1334-1342, 1991; Wilson et al., Contrib. Nephrol. Basel, Karger, 118:126-134, 1996: Razzaque et al., Clin. Nephrol. 46:213-214, 1996; Yoshioka et al., Kidney Int., 35:1203-1211, 1989: and Klahr et al., N. Engl. J. Med., 318:1657-1666, 1988]. 당뇨병에서, 이러한 효과의 1차적인 매개자는 만성적인 높은 글루코오스 수준으로 인해 비효소적으로 글리코실화된 혈청 단백질에 대한 장기간의 노출인 것으로 생각된다[참조: Doi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2873-2877, 1992; and Roy et al., J. Clin. Invest., 93:483-442, 1994].

진행성 사구체 질환의 대다수에 있어서, 전환 성장 인자 TGF-β1의 과생성은 섬유증(즉, 섬유 조직의 형성)을 초래하는 세포외 매트릭스의 축적과 밀접하게 관련이 있는 것 같다[참조: 예컨대, Border & Ruoslahti, Nature(London), 346:371-374, 1992: Yang et al., J. Am. Soc. Nephrol., 5:1610-1617, 1995; and Yamamoto et al., Kidney Int., 45:916-927, 1994]. 자가면역성 신염에 대한 한 동물 모델에서, TGF-β1에 대한 항체, 또는 대응 mRNA의 안티센스 올리고누클레오티드를 주사한 결과 진행성 사구체신염 및 세포외 매트릭스의 축적이 억제되었다[참조: Border et al., Nature(London), 346:371-374, 1990; and Akagi et al., Kidney Int., 50:148-155, 1996].

랫트의 GBM의 기저막 콜라겐의 반감기는 ³H-프롤린을 사용한 펄스-추적 연구에 기초하여 16 내지 40일인 것으로 추정되었다[참조: Daha et al., Nephron. 22:522-528, 1978]. 이는 헤파린 술페이트 프로테오글리칸의 턴오버(t_1/2=20시간), 또는 GBM에서 기타 술페이트화된 고분자의 턴오버(t_1/2=20 내지 60시간)와 비교하여 매우 느리다. 앨포트 마우스 모델의 GBM에서 기저막 단백질의 축적[참조: Cosgrove et al., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996]은 이러한 단백질의 합성 및 분해 양자 모두에서의 변화의 순 효과일 것이다. GBM 및 메산쥼 매트릭스 모두의 턴오버와 관련된 프로테아제중에서, 가장 특징적인 것은 메탈로프로테이나제 MMP-2(72kD 콜라게나제) 및 MMP-9(92kD 콜라게나제) 뿐만 아니라 MMP-3(스트로모라이신-1)이다. 이러한 효소들은 타입 Ⅳ 콜라겐 뿐만 아니라 다양한 기타 세포외 매트릭스 성분을 분해할 것이다.

메산쥼 세포(및 아마 기타 사구체 세포 유형)도 메탈로프로테이나제에 대한 천연의 저해제를 생성한다. 이들은 TIMP's(메탈로프로테이나제의 조직 저해제)로 지칭된다. 이들은 비교적 저분자량의 당단백이다. 이들중에서, TIMP-1은 스트로몰라이신-1 및 MMP-9에 특이적인 반면, TIMP-2 및 TIMP-3은 MMP-2를 저해할 것이다[참조: Goldberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8207-8211, 1989; Staskus et al., J. Biol. Chem., 266:449-454, 1991; and Stetler-Stevenson et al., J. Biol. Chem., 264:17374-17378, 1989].

메탈로프로테이나제 및 이들의 대응 저해제의 조절은 유사하게 GBM 턴오버의 적당한 수준을 유지하는 역할을 한다. 사구체에서 이러한 단백질을 엔코딩하는 유전자의 조절에 관해서는 거의 알려진 바가 없으나, 인테그린 수용체/ECM(세포외 매트릭스) 상호작용을 통한 신호 변환은 이러한 과정에서 중요한 일면일 수 있다.

앨포트 증후군에 대한 동물 모델, 특히 질병 진행이 현저하게 지연된 모델에 대한 필요성이 남아있다. 또한, 예컨대 앨포트 증후군 및 인슐린 의존성 당뇨병을 포함하여, 메산쥼 매트릭스 확장, 및 사구체 기저막 및 관상간극 (tubulointerstitium)에 진행성 매트릭스 축적과 관련된 신장 질환을 치료하기 위한 새로운 치료법에 대한 필요성이 남아있다.

요약

본 발명은 환자(바람직하게는 포유동물, 및 보다 바람직하게는 사람)에서 신장 질환을 치료하거나 억제하는(즉, 질환의 발병 지연, 진행 지연 및/또는 역전) 다양한 치료법을 제공한다. 상기 신장 질환은, 바람직하게는 신장 사구체신염, 신장 섬유증, 또는 양자 모두를 포함한다. 이러한 질환은, 예컨대 앨포트 증후군, IDDM 신염, 메산쥼 증식성 사구체신염, 막증식성 사구체신염, 반월형 사구체신염, 당뇨병성 신병증, 및 신장 간질성 섬유증과 관련될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 방법은 환자에게 유효량의 α1β1 인테그린 수용체 저해제를 투여하는 것을 포함한다. 이 α1β1 인테그린 수용체 저해제는 신장 세포의 표면상의 α1β1 인테그린 수용체 결합 부위와 결합하는 차단제일 수 있다. 상기 차단제는 라미닌, 피브로넥틴, 엔탁틴, 및 콜라겐 타입 4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질의 적어도 9량체인 펩티드 단편일 수 있다. 대안적으로, 상기 차단제는 항체일 수 있다. 기타 메카니즘에 의해 α1β1 인테그린 수용체를 저해시키는(즉, 불활성화시키는) 기타 약물이 사용될 수도 있다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 환자에게 α1β1 인테그린 수용체 저해제에 추가하여 유효량의 TGF-β1 저해제를 투여하는 것을 포함한다. 이들 저해제는 동시에(즉, 혼합물로서) 또는 순차적으로 투여될 수 있다. TGF-β1 저해제는 TGF-β1과 비가역적으로 결합하여 TGF-β1이 수용체와 결합하는 능력을 저해시키는 약물일 수 있다. 대안적으로, TGF-β1 저해제는 신장 세포의 핵에 신호를 변환하는 TGF-β1의 능력을 저해시키는 약물일 수 있다. 후자 유형의 저해제는 바람직하게는 타크롤리무스(tacrolimus)(FK506으로 시판)와 같은 칼시누린(calineurin) 저해제이다. 기타 메카니즘에 의해 TGF-β1을 저해시키는(즉, 불활성화시키는) 기타 약물도 사용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명은 환자에서 앨포트 증후군의 발병을 지연시키고/거나 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 방법은 신장 세포의 α1β1 인테그린 수용체를 통한 신호 변환을 저해시키는 약물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 환자의 신장 세포 표면상의 α1β1 인테그린 수용체 결합 부위를 차단시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 환자에게 유효량의 TGF-β1 저해제를 투여함으로써 보다 강화될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명은 환자에서 인슐린 의존성 당뇨병에서 신장 질환의 발병을 지연시키고/거나 진행을 지연시키는 방법도 제공한다. 한 구현예에서, 본 방법은 신장 세포의 α1β1 인테그린 수용체를 통한 신호 변환을 저해시키는 약물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 방법은 신장 세포 표면상의 α1β1 인테그린 수용체 결합 부위를 차단시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 환자에게 TGF-β1 저해제를 투여함으로써 보다 강화될 수 있다.

또한, 환자에서 신장 섬유증을 억제하는 방법이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 방법은 환자에서 TGF-β1 활성을 감소시키면서 환자의 신장 세포의 α1β1 인테그린 수용체를 저해시키는 것을 포함한다. 이러한 활성은 환자에게 TGF-β1과 비가역적으로 결합하여 TGF-β1이 그의 수용체와 결합하는 능력을 저해시키는 약물을 투여함으로써 감소될 수 있다. 대안적으로, 이러한 활성은 신장 세포의 핵에 신호를 변환시키는 TGF-β1의 능력을 저해시킬 수 있는 약물을 투여함으로써 감소될 수 있다.

또다른 구현예에서, 앨포트 증후군을 가진 환자의 GBM에서 매트릭스 축적을 억제시키는 방법이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 방법은 환자에서 TGF-β1 활성을 감소시키는 것을 포함한다. 이는 본원에 기술된 TGF-β1 저해제를 투여함으로써 달성될 수 있다.

특히 바람직한 구현예에서, 환자에게 칼시누린 저해제, 바람직하게는 타크롤리무스를 투여함으로써 신장 섬유증을 억제하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명은 신장 질환에 대한 마우스 모델을 제공하며, 상기 마우스는 콜라겐 α3(Ⅳ) 유전자를 녹아웃시키는 결과 GBM에서 정상적인 콜라겐 타입 4 조성을 발현시키지 못한다. 즉, 상기 마우스는 콜라겐 α3(Ⅳ), α4(Ⅳ), 또는 α5(Ⅳ) 사슬을 사구체 기저막으로 혼입시키지 못한다(따라서, GBM은 그의 타입 Ⅳ 콜라겐 사슬 조성에 관하여 오직 콜라겐 α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬만을 포함한다). 또한, α1 서브유닛 유전자를 녹아웃시키는 결과 α1β1 인테그린 수용체를 발현시키지 못한다.

이중 녹아웃 마우스에서는, 종래 기술의 앨포트 마우스 모델과 비교하여 단백뇨의 발증이 지연된다. 또한, 상기 동물은 앨포트 동복자와 비교하여 거의 두배 오래 생존한다. 앨포트 마우스의 사망 평균 주령인 약 8주에서, 이중 녹아웃은 현저하게 감소된 사구체 질병 경과를 나타낸다. 즉, 동일한 주령의 앨포트 마우스에 비하여, 이중 녹아웃 마우스는 초미세구조 손상이 현저히 감소되며 GBM 희박화(raefication)가 훨씬 적고 족세포 족돌기가 거의 소멸하지 않는다. 또한, 앨포트 마우스에 비하여 GBM에서 피브로넥틴, 라미닌-1, 및 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 축적의 약화가 일어나는 반면, 엔탁틴 및 타입 Ⅳ 콜라겐의 축적은 변화가 없다. 이러한 결과는 앨포트 신장 질환 발병에서 α1β1 인테그린 수용체에 대한 특이적 역할이 존재함을 시사한다. 이는 단일 α1 인테그린 녹아웃이 신장 생리 또는 기능에 명백한 영향을 미치지 않는다는 것을 고려하면 주목할 만하다.

이 마우스는 사구체신염 및/또는 섬유증을 특징으로 하는 앨포트 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병, 및 기타 질환을 연구하는데 사용될 수 있다. 이 마우스는 또한 앨포트 증후군 및 인슐린 의존성 당뇨병 및 세포외 매트릭스 축적 및/또는 섬유증을 특징으로 하는 기타 질환을 치료하는 데 사용될 수 있는 약물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 1주일 간격으로 마우스로부터 뇨를 수집하여 연구한 앨포트 대 이중 돌연변이 마우스에서 단백뇨의 발증을 예시한다. 수자는 뇨 수집시의 마우스의 주령(주)을 표시하였다. A=앨포트 마우스; B=이중 돌연변이 마우스; Mr=분자량 표준.

도 2는 대조 및 이중 돌연변이 마우스에서 사구체 모세혈관 루프에 대한 초미세구조적 손상을 예시한다. 정상 마우스(A), 앨포트 마우스(B), 및 이중 돌연변이 마우스(C)의 신피질을 7주째에 에폭시 수지에 포매시켜 수집하였다. 초박 절편을 염색하여 투과 전자 현미경으로 분석하였다. 화살표는 족돌기를 나타낸다. C=모세혈관 내강; U= 비뇨 공간. 배율 바아는 0.5㎛를 나타낸다.

도 3은 정상, 앨포트, 및 이중 돌연변이 마우스에서 세포외 매트릭스 단백질의 면역형광 분석의 결과를 제공한다. 신피질의 동결된 한랭절편을 Y-축 표지상에 표시된 세포외 매트릭스 단백질에 특이적인 항체와 반응시켰다. 적당한 플루오레신-콘쥬게이션된 2차 항체를 사용하여 신호가 생성되었고, 영상을 디지털로 수집하고 사이토비젼 울트라 소프트웨어(Cytovision Ultra software)(Applied Imaging, Inc)를 사용하여 처리하였다. 화살표는 사구체 모세혈관 루프를 나타낸다. 4A1,2=콜라겐 α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 사슬; Lam-1=라미닌-1; Fib=피브로넥틴; HSP=헤파린 술페이트 프로테오글리칸; ent=엔탁틴. α1+/+=α1 인테그린 유전자에서 동형접합성 정상; α1-/-=α1 인테그린 유전자에서 동형접합성 돌연변이체; α3(Ⅳ)+/+=α3(Ⅳ) 콜라겐 유전자에서 동형접합성 정상; α3(Ⅳ)-/-=α3(Ⅳ) 콜라겐 유전자에서 동형접합성 돌연변이체.

도 4는 앨포트 신장 질환 진행의 시간경과 동안 총 신장으로부터 얻은 mRNA의 노던 분석의 결과를 도시한다. 지정된 시점(주)에서 수집된 신장으로부터 분리된 총 RNA를 변성 아가로즈 겔상에서 분별시키고, 나일론 위에 블롯팅시켜, TGF-β1, 또는 사구체 기저막 및/또는 세포외 매트릭스의 다양한 성분을 엔코딩하는 뮤린 cDNA로 프로빙하였다. 패널에 예시된 데이터를 생성하기 위해 사용된 프로브는 하기와 같다: A, TGF-β1; B, 콜라겐 α1(Ⅳ); C, 콜라겐 α2(Ⅳ); D, 피브로넥틴; E, 엔탁틴; F, 라미닌 β1 사슬; G, 라미닌 β2 사슬.

도 5는 앨포트 신장 질환 진행 동안 mRNA 유도의 정량적 분석을 도시한다. X-선 필름에 노출시킨 후, 도 4를 생성하는데 사용된 막을 바이오래드(BioRad) GS-525 인영상기(phosphorimager)를 사용하여 분석하였다. 플롯팅된 값은 정상 동복자에서 관찰된 것에 대한 앨포트 샘플에서 특이적 mRNA의 폴드 유도를 나타낸다. 모든 밴드를 배경에 대하여 공제하였다. 분석된 특이적 mRNA 종은 삽입도에 표시되어 있다.

도 6은 단백뇨 후의 앨포트 마우스에서 특이적 전사체의 원위치(in situ) 하이브리드화 분석을 예시한다. 정상 동복자의 신장(A, D, G, 및 J)을 앨포트 마우스의 신장(B, E, H, 및 K)을 따라 분석하였다. 안티센스 프로브는 콜라겐 α1(Ⅳ)(A 및 B), TGF-β1(D 및 E), 피브로넥틴(G 및 H), 엔탁틴(J 및 K), 또는 라미닌 β1 사슬(M 및 N)의 NC1 도메인에 대하여 특이적이었다. 세균 β-갈락토시다제에 특이적인 프로브는 비특이적 결합에 대한 대조로서 사용하였다(C, F, I, L, 및 O).

도 7은 정상 및 앨포트 마우스의 조직 절편에서 TGF-β1에 대한 이뮤노퍼옥시다제 염색을 예시한다. 파라핀 포매된 절편을 이뮤노퍼옥시다제 검출을 사용하여 TGF-β1의 활성형에 대하여 염색하였다. P=족세포; M=메산쥼 세포.

도 8은 정상 및 앨포트 사람 신피질에서 TGF-β1 mRNA에 대한 RNase 검출 분석을 예시한다. 총 RNA를 정상 및 앨포트 사람 신피질로부터 분리시키고, 각 10㎍에 대해 사람 TGF-β1 안티센스 메시지의 방사성 표지된 부분을 프로브로서 사용하여 RNase 보호 분석을 수행하였다. 상기 검정 결과 264bp 보호된 단편이 얻어진다. 분자 크기 마커는 방사성표지된 MSP1 컷 PBR322이고, 적당한 단편이 비교용으로 표시된다. N=정상; A=앨포트.

도 9는 정상 마우스, 앨포트 마우스, α1 인테그린 결핍 마우스, 및 α1 인테그린 및 콜라겐 α3(Ⅳ)이 둘다 결핍된 마우스의 신피질로부터 얻은 RNA의 노던 블롯을 예시한다. 총 RNA를 지정된 유전자형을 가진 7주령 마우스(동복자)의 신피질로부터 분리하였다: +/+=대립유전자 모두에서 정상; -/-=대립유전자 모두에서 돌연변이.

도 10은 α1 인테그린에 특이적인 중화 항체를 주사한 7주령 앨포트 동물의 GBM의 투과 전자 현미경사진이다. GBM의 규칙적인 3층 형태 및 소상 비후 영역의 부재에 유의한다. 배율은 10,500배이다.

도 11은 129Sv/J 앨포트 마우스에서 GBM 초미세구조에 대한 TGF-β1 저해제의 효과를 예시한다. 동물을 FK506 또는 TGF-β1 가용성 수용체로 처리하였다. 신피질을 에폭시에 포매시키고, 절단하여 아세트산 우라닐 및 시트르산 납으로 염 색시키고, 투과 전자 현미경에 의해 분석하였다. A=대조; B=미처리 앨포트; C=FK506으로 처리한 앨포트; D=가용성 TGF-β1 수용체로 처리한 앨포트. 배율은 11,000배이다.

도 12는 처리 대 미처리 129Sv/J 앨포트 마우스 사구체의 주사 전자 현미경사진이다. 도 11에서 사용한 마우스의 신피질을 동결 건조하여, 파괴시키고, 아세트산 우라닐 및 시트르산 납으로 염색하고, 확인된 사구체를 노출시켜 주사 전자 현미경을 사용하여 사진촬영하였다. A=대조; B=주사하지 않은 앨포트; C=TGF-β1 가용성 수용체로 처리한 앨포트 마우스. 배율은 2500배이다.

도 13은 129Sv/J 앨포트 마우스에서 뇨 알부민에 대한 약물 처리의 효과를 설명한다. 약물 처리의 기간 동안, 뇨를 수집하여, 동결건조시키고, 0.5㎕ 등량을 폴리아크릴아미드 겔상에서 분별시켰다. 겔을 쿠마시 블루로 염색시켜 가시화하였다. 최초 2개의 레인은 주사하지 않은 대조였고, 다음 2개(Ⅰ군)는 FK506을 주사하였으며, 세 번째 군(Ⅱ 군)은 가용성 TGF-β1 수용체를 주사하였다. 하부의 수자는 뇨 수집시에 마우스의 주령(주)을 나타낸다. C=대조; A= 앨포트.

도 14는 이중 녹아웃 마우스에서 GBM 초미세구조에 대한 TGF-β1 저해제의 효과를 예시한다. 동물들을 처리하지 않거나, FK506 또는 TGF-β1 가용성 수용체로 처리하였다. 신피질을 에폭시에 포매시켜, 절단하고, 아세트산 우라닐 및 시트르산 납으로 염색하여, 투과 전자 현미경에 의해 분석하였다. A=주사하지 않은 대조; B=주사하지 않은 이중 녹아웃; C=FK506으로 처리한 이중 녹아웃; D=TGF-β1에 대한 가용성 수용체로 처리한 이중 녹아웃. 배율은 8000배이다.

도 15는 TGF-β1 저해제로 처리한 10주령 이중 녹아웃 마우스에서 정상적인 사구체 구조의 예를 예시한다. TGF-β1 저해제로 처리한 마우스에서 약 25%의 사구체는 대조 동물의 사구체와 형태학적으로 구별되지 않았다. 동물들을 처리하지 않거나, FK506으로 처리하였다. 신피질을 에폭시에 포매시켜, 절단하고, 아세트산 우라닐 및 시트르산 납으로 염색하여, 투과 전자 현미경에 의해 분석하였다. A=주사하지 않은 대조; B=FK506으로 처리한 이중 녹아웃.

도 16은 이중 녹아웃 마우스에서 뇨 알부민에 대한 약물 처리의 효과를 설명한다. 약물 치료의 기간 동안, 뇨를 수집하여, 동결건조시키고, 0.5㎕ 등량을 폴리아크릴아미드 겔상에서 분별시켰다. 겔을 쿠마시 블루로 염색시켜 가시화하였다. 뇨 수집시에 마우스의 주령(주)을 도면 하부에 표시한다. A=주사하지 않은 이중 녹아웃; B=가용성 수용체를 주사한 이중 녹아웃; C=FK506을 주사한 대조 마우스; D=FK506을 주사한 이중 녹아웃.

도 17은 앨포트 대 이중 녹아웃 마우스의 사구체의 주사 전자 현미경사진이다. 7주령 마우스의 신피질을 동결 건조하여, 파쇄시키고, 아세트산 우라닐 및 시트르산 납으로 염색하고, 확인된 사구체를 노출시켜 주사 전자 현미경을 사용하여 사진촬영하였다. A=대조; B=앨포트; C=이중 녹아웃.

도 18은 정상 및 돌연변이 마우스에서 라미닌 α2 사슬에 대한 이중 면역형광 염색을 도시한다. 사구체 기저막을 엔탁틴 특이적 1차 항체 및 FITC 콘쥬게이션된 2차 항체를 사용하여 녹색으로 염색하였다. 라미닌 α2 사슬을 텍사스 레드 (Texas red) 콘쥬게이션된 2차 항체를 사용하여 적색으로 염색하였다. 모세혈관 루프에서 공동국재화는 황색 염색을 초래한다. Ⅰ군은 7주령 마우스의 사구체이다; A=주사하지 않은 대조; B=가용성 수용체를 주사한 앨포트; D=주사하지 않은 이중 녹아웃. Ⅱ군은 2주령 마우스의 사구체이다; A=대조; B=앨포트. 화살표는 사구체의 모세혈관 루프에서 면역염색을 나타낸다.

도 19는 2주령 정상 마우스 대 앨포트 마우스의 GBM의 투과 전자 현미경사진이다. 신피질을 에폭시에 포매시켜 절단시키고, 아세트산 우라닐 및 시트르산 납으로 염색하여 투과 전자 현미경으로 분석하였다. A=대조; B=앨포트.

도 20은 정상 대 앨포트 마우스에서 세포 매트릭스 분자 또는 메탈로프로테이나제 저해제를 엔코딩하는 RNA의 신장에서의 발현에 대한 TGF-β1 저해제의 효과를 설명한다. FK506으로 처리(Ⅰ) 또는 미처리된(NI) 7주령 정상(C) 또는 앨포트(A) 마우스의 신장으로부터 총 RNA를 분리하였다. RNA를 변성 아가로즈 겔상에서 분별시키고, 세포외 매트릭스 분자 또는 메탈로프로테이나제 저해제를 엔코딩하는 방사성표지된 프로브와 하이브리드화시킴으로써 분석하였다. 하이브리드화 후에, 막을 세척하고 X-선 필름에 노출시켰다. 사용된 프로브를 패널의 왼쪽에 표시하였다. α1(Ⅳ)=콜라겐 α1(Ⅳ); fn=피브로넥틴; ent=엔탁틴; Timp2=메탈로프로테이나제 저해제 Timp-2; Timp3=메탈로프로테이나제 저해제 Timp-3.

도 21은 정상 대 이중 녹아웃 마우스에서 세포 매트릭스 분자 또는 메탈로프로테이나제 저해제를 엔코딩하는 RNA의 신장에서의 발현에 대한 TGF-β1 저해제의 효과를 설명한다. FK506으로 처리(Ⅰ), TGF-β1 가용성 수용체로 처리(Ⅱ), 또는 미처리된(NI) 10주령 정상(C) 또는 이중 녹아웃(Dko) 마우스의 신장으로부터 총 RNA를 분리하였다. RNA를 변성 아가로즈 겔상에서 분별시키고, 세포외 매트릭스 분자 또는 메탈로프로테이나제 저해제를 엔코딩하는 방사성표지된 프로브와 하이브리드화시킴으로써 분석하였다. 하이브리드화 후에, 막을 세척하고 X-선 필름에 노출시켰다. 사용된 프로브를 패널의 왼쪽에 표시하였다. α1(Ⅳ)=콜라겐 α1(Ⅳ); fn=피브로넥틴; ent=엔탁틴; Timp2=메탈로프로테이나제 저해제 Timp-2; Timp3=메탈로프로테이나제 저해제 Timp-3.

도 22는 TGF-β1 저해제를 사용하여 이중 녹아웃 마우스의 관상간극에 매트릭스 축적을 저해시키는 것을 예시한다. 10주령 정상 또는 이중 녹아웃 마우스의 신장을 플라스틱에 포매시키고, 1μM 절편을 존스 실버 메탄아민(Jones silver methenamine) 방법을 사용하여 염색하였다. A=정상 신장; B=이중 녹아웃 신장, 주사하지 않음; C=FK506으로 처리한 이중 녹아웃 신장; D=TGF-β1 가용성 수용체로 처리한 이중 녹아웃 신장.

도 23은 TGF-β1 저해제를 사용하여 이중 녹아웃 마우스의 관상간극에 콜라겐 타입 Ⅳ 축적을 저해시키는 것을 예시한다. 10주령 정상 또는 이중 녹아웃 마우스의 신장을 플라스틱에 포매시키고, 1μM 절편을 콜라겐 타입 Ⅰ에 특이적인 항체를 사용하여 면역염색시켰다. 염색은 벡터 라보라토리즈(Vector laboratories)로부터 구입한 스트렙트아비딘 AEC 염색 키트를 사용하여 현색시켰다. A=정상 신장; B=이중 녹아웃 신장, 주사하지 않음; C=FK506으로 처리한 이중 녹아웃 신장; D=TGF-β1 가용성 수용체로 처리한 이중 녹아웃 신장.

도 24는 TGF-β1 저해제를 사용한 이중 녹아웃 마우스의 관상간극에서 피브 로넥틴 축적의 저해를 예시한다. 10주 된 정상 또는 이중 녹아웃 마우스의 신장을 플라스틱에 포매시키고, 1μM 절편을 피브로넥틴에 특이적인 항체를 사용하여 면역염색시켰다. 염색은 벡터 라보라토리즈(Vector laboratories)로부터 구입한 스트렙트아비딘 AEC 염색 키트를 사용하여 현색시켰다. A=정상 신장; B=이중 녹아웃 신장, 주사하지 않음; C=FK506으로 처리한 이중 녹아웃 신장; D=TGF-β1 가용성 수용체로 처리한 이중 녹아웃 신장.

바람직한 구현예의 상세한 설명

본 발명은 사구체신염 및 신장 섬유증과 같은 질병 상태의 발병 및/또는 진행을 실질적으로 지연시킬 수 있는 방법인, 신장 질환의 메카니즘을 공격하는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 심지어 이러한 질병상태를 역전시킬 수 있는 것으로 생각된다. 특히, 본 발명은 메산쥼 증식성 사구체신염, 막증식성 사구체신염, 반월형 사구체신염, 당뇨병성 신병증, 및 신장 간질성 섬유증의 발생과 같이, 신장 사구체에서 사구체신염 및 신장 섬유증의 존재 또는 발병 위험성의 증가와 관련된 신장 질환의 치료 방법을 제공한다. 사구체신염은 GBM에서 비후, 박화, 및/또는 분열 불규칙성과 전형적으로 관련된 사구체 손상을 포함한다. 이는 관상간극 섬유증의 공통적인 경로가 될 수 있다. 이들 상태는 관상간극에 근섬유아세포의 출현 및 매트릭스의 축적(콜라겐 타입 I, 피브로넥틴, 라미닌, 및 콜라겐 타입 Ⅳ를 포함)을 전형적인 특징으로 한다. 본 발명의 방법에서 사용된 치료제의 유효성은 이들 특징중 하나 이상을 평가함으로써 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 특히 신장 사구체 및 관상 간극내에 일반적으로 세포외 매트릭스의 축적의 존재, 또는 발병 위험성의 증가와 관련된 신장 신장 질환을 가진 환자를 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 연구하기 위한 마우스 모델을 제공한다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 앨포트 증후군에 대한 마우스 모델을 제공한다. 이 마우스 모델은 불활성화된 콜라겐(타입 Ⅳ) 분자와 조합된 불활성화된 α1β1 인테그린 수용체를 포함한다. 한 바람직한 구현예에서, 콜라겐(타입 Ⅳ) 분자는 콜라겐(타입 Ⅳ)의 α3 서브유닛의 발현을 파괴함으로써 불활성화된다. 결과적으로 마우스는 GBM에 α3(Ⅳ), α4(Ⅳ), 또는 α5(Ⅳ) 사슬을 혼입시키지 않는다.

이 마우스 모델은 초기 질환이, 기저막 비후, 박화, 분열, 및 족세포 족돌기의 소멸, 또는 이들의 조합을 특징으로 하는 사구체 기저막 손상과 관련된 메산쥼 매트릭스의 확장 및 메산쥼 세포 증식을 특징으로 하는 앨포트 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병, 및 기타 신장 질환에서 발생되는 신장 기능부전의 치료제를 시험하는 방법에서 사용될 수 있다.

한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 사구체 질환의 진행에서 사구체신염 및/또는 섬유증(관상간극에서 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 타입 Ⅰ, 및 콜라겐 타입 Ⅳ를 포함한 세포외 매트릭스의 축적 및 근섬유아세포의 출현에 의해 증명)의 발병을 지연시키거나(뇨중 알부민의 출현으로 측정), 진행을 지연시키거나(뇨중 혈청 알부민의 수준이 증가하는 속도로 측정) 심지어 역전(뇨중 혈청 알부민의 수준이 증가하는 속도로 측정)시키는 방법으로서 α1β1 인테그린 수용체의 작용을 차단 또는 불활성화시키는 저해제를 제공한다. 하기에서 보다 상세히 설명되는 합성 또는 천연의 다양한 약물이 사용될 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 앨포트 신장 질환 발병 및 기타 이러한 신장 질환에서 TGF-β1의 역할에 관한 것이다. 단백뇨의 발증 후에 TGF-β1에 대한 mRNA 수준의 현저한 증가가 본원에서 사용된 마우스 모델에서 관찰된다. 원위치 하이브리드화는 단백뇨의 발증 이전에 TGF-β1에 대한 mRNA를 거의 또는 전혀 생성하지 않는 족세포가 단백뇨의 발증 이후 말기 신장 질환까지 TGF-β1에 대한 mRNA를 대량 발현시킴을 나타낸다. 피브로넥틴, COL4A1 및 COL4A2, 및 엔탁틴을 엔코딩하는 mRNA의 활성화가 거의 동시에 관찰된다. 따라서, TGF-β1의 수준을 감소시키는 방법은 사구체신염 및/또는 섬유증과 같은 신장 질환을 치료하기 위한 다른 메카니즘이 된다. TGF-β1 활성을 저해시키는 효과는 뇨중 알부민의 출현 시점(발병) 및 뇨중 알부민의 증가 속도 및/또는 근섬유아세포의 출현(관상간극에서) 및/또는 GBM 및 관상간극에 세포외 매트릭스 분자의 축적을 결정함으로써 측정될 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 α1 인테그린 결핍 앨포트 마우스에 TGF-β1 저해제를 사용함으로써, 사구체신염의 발병 및 진행의 지연 및/또는 섬유증의 방지에 있어서 α1β1 인테그린 저해제 및 TGF-β1 저해제의 병용 치료의 상승작용에 관한 것이다.

마우스 모델

GBM에서 비후, 박화, 또는 분열 불규칙성과 관련되며 관상간극에서 매트릭스의 축적(콜라겐 타입 Ⅰ, 피브로넥틴, 라미닌, 및 콜라겐 타입 Ⅳ를 포함) 및 근섬유아세포의 출현을 특징으로 하는 관상간극 섬유증의 공통적인 경로인 진행성 사구체 손상과 관련된 앨포트 증후군 및 기타 질환을 가진 환자를 관리하는 중요한 측면은 질병 진행의 원인 및/또는 메카니즘을 결정하는 것이다. 예컨대, 콜라겐 α3(Ⅳ) 또는 α4(Ⅳ) 유전자의 돌연변이 결과 상염색체 열성형인 앨포트 증후군이 초래되고, α5(Ⅳ) 유전자의 돌연변이 결과 X-연관형인 질환이 초래되지만, 이러한 돌연변이 자체는 진행성 신장 질환을 "초래"하지 않는다. 대신, 콜라겐 α3(Ⅳ), α4(Ⅳ) 또는 α5(Ⅳ)의 부재는 α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 콜라겐 사슬을 포함하는 태아형 GBM이 지속되는 결과가 되는 것으로 나타난다. 이러한 태아형 GBM은 사람의 생애의 첫 10년 정도 동안(또는 마우스 모델에서는 약 첫 3주)은 적당한 사구체 필터이다. 그러나, 이 시기 이후에, 태아형 GBM은 유효하게 기능하지 않는 것으로 나타난다. 예컨대, 앨포트 증후군을 가진 한 환자에서, 앨포트 증후군을 가진 9세 환자의 GBM 초미세구조 연구 결과 비교적 정상적인 초미세구조인 것으로 나타났다[참조: Cangiotti et al., Nephrol. Dial. Transplant., 11:1829-1834, 1996]. 그러나, 18세에서는 동일한 환자의 GBM 초미세구조는 진전된 앨포트 사구체신염을 나냈다.

앨포트 증후군에서, 사람의 기저막은 기저막의 완전성(integrity)이 뇨중 알부민의 점진적인 증가로 모니터링될 수 있는 경우, 5 내지 10세까지는 비교적 정상이다. 생검 연구 결과 기저막 초미세구조가 단백뇨 이전 앨포트 환자에서 정상임이 확인되었다. 초미세구조적으로, GBM 질환은 GBM의 불규칙적인 비후 및 박화에 의해 증명된다. 막의 분열은 단백뇨와 함께 관찰되는 현미혈뇨(즉, 소수의 적혈구가 뇨중에서 검출가능)의 원인인 것으로 생각된다.

앨포트 신장 질환 발병 및 진행의 메카니즘에 관하여는 알려진 바가 거의 없다; 그러나, GBM 성분의 축적 및 GBM의 희박화는 단백분해에 대하여 막의 감수성 증가, 및/또는 정상적인 조절 경로의 변화에 기인한 매트릭스 분자의 합성 증가때문일 수 있는 것으로 추측되어 왔다.

따라서, 사람 표본의 연구에 내재하는 한계 때문에 앨포트 증후군에 대한 모델의 필요성이 있었다. 사람은 상기 질환의 진행에서 중증도의 범위를 나타내는데, 이는 아마 유전적인 배경의 차이 때문일 것이다. 질병 발병 및 진행의 분자적 특성을 언급하는 의미있는 연구들은 사람에서는 논리적으로 불가능하여, 앨포트 신장 질환 연구의 진전이 제한된다.

상염색체성 앨포트 증후군에 대한 마우스 모델은 타입 Ⅳ 콜라겐 α3(Ⅳ) 사슬을 엔코딩하는 유전자의 목적하는 돌연변이유발에 의해 생산되었다[참조: Cosgrove et al., Genes Devel., 10:2981-2992, 1996]. 상기 동물 모델은 진행성 사구체신염이 발병하였다. GBM에서 초미세구조적 변화는 1주령에서 관찰되었다. 이러한 마우스는 본원에서 "앨포트" 마우스로 언급된다.

또한, 마우스는 α1 인테그린 수용체 서브유닛을 엔코딩하는 유전자의 목적하는 돌연변이유발에 의해 생산되었다[참조: Gardner et al., Dev. Biol., 175:301-313, 1996]. 이 인테그린 서브유닛은 인테그린 β1 서브유닛와 이종이량체를 형성하여 생물학적 활성인 α1β1 인테그린 이종이량체를 형성하며, 이는 신장 사구체에서 메산쥼 세포의 표면에서 발견된다. 인테그린 α1β1 수용체는 메산쥼 매트릭스에서 발견되는 유일한 인테그린 수용체이며, 메산쥼 매트릭스에 배타적으로 국재화되어 있다. 콜라겐 매트릭스에 대한 섬유 세포의 유착성 변화 이외에, 녹아웃 마우스는 뚜렷한 표현형을 가지지 않는다. 마우스는 정상적으로 발육, 번식하며, 정상적인 수명으로 살아간다. 이러한 마우스에서 신부전 및 사구체의 분자 조성 또는 초미세구조에 명백한 차이는 없다. α1β1 이종이량체 인테그린 수용체가 신장 사구체의 메산쥼 세포의 표면에서 확인된 유일한 인테그린 수용체이기 때문에, 이 수용체의 부재가 정상적인 신장 발육 및/또는 기능에 영향을 미치지 않는다는 것은 놀라운 것이었다. 이는 그것이 필요하지 않거나 많은 경로들이 그의 부재를 보상할 수 있음을 시사한다.

본 발명은 새로운 이중 녹아웃(즉, 이중 돌연변이) 마우스 모델을 제공한다. 이것은 인테그린 α1 수용체 서브유닛 유전자 및 콜라겐 α3(Ⅳ) 유전자 모두가 결핍된 돌연변이체를 생성하기 위하여 α1 녹아웃 마우스종을 콜라겐 α3(Ⅳ) 녹아웃 종(앨포트 마우스)과 이종교배시킴으로써 개발되었다. α1β1 인테그린 수용체의 부재가 정상적인 신장 발육 및 기능에서 명백하게 역할을 하지 않을지라도, 메산쥼 매트릭스는 메탈로프로테이나제 및 예컨대 TGF-β1과 같은 사이토카인에 대한 합성 부위이고 앨포트 사구체신염의 초기 단계는 메산쥼 세포 증식 및 메산쥼 매트릭스의 확장과 관련되므로, α1β1 인테그린 수용체가 신장 발병에서 특이적인 역할을 하는 것으로 생각된다. 사실, 인테그린 α1 콜라겐 α3(Ⅳ) 이중 녹아웃의 연구는 상당히 특이하고 중요하다. 하기 논의는 본 발명의 이중 녹아웃 마우스의 많은 특성을 기술한다.

신장 필터의 완전성의 바람직한 총괄 평가는 단백뇨(즉, 뇨중의 과량의 혈청 단백의 존재)이다. 도 1에 예시된 바와 같이, 이중 녹아웃에서는 단백뇨의 발증이 1주 이상까지 지연되었고, 앨포트(즉, 콜라겐 α3(Ⅳ) 유전자 결핍이지만, α1 인테그린 서브유닛 유전자를 포함)이었던 동복자에서 약 6주 내지 약 6.5주인 것에 대하여 약 9주 내지 약 9.5주에서 피크를 나타냈다. 단백뇨(즉, 뇨중 혈청 알부민의 존재)의 발증 및 속도는 본 발명의 방법의 유효성을 평가하는 우수한 척도이다. 혈청 알부민 수준은 겔 전기영동 및 쿠마시 블루 염색(뇨 1㎕의 등량을 사용) 또는 시판용 스틱 시험에 의해 측정될 수 있다. 신장 질환에 의한 평균 사망 주령은 마우스가 129Sv/J 또는 129Sv 배경인지 여부와 상관없이 앨포트 마우스에서 약 8 내지 9주이다(이러한 점을 확인하기 위하여 10마리 이상의 마우스를 각 유전적 배경에 대하여 말기까지 진행시켰다). 이중 녹아웃은 평균 약 15주 내지 약 16.5주령까지 생존한다.

따라서, α1β1 인테그린 수용체를 제거한 것은 앨포트 신장 질환 발병 및 진행에 현저한 영향을 미쳤다. 또한, α1β1 수용체가 없는 마우스는 시험된 기타 마우스에 비하여 개선된 사구체 기능을 나타냈다. α3(Ⅳ) 유전자를 발현하지 않고 α1 녹아웃 돌연변이에 대하여 이형접합성인 동물에서, 사구체 기능 및 질환 진행에서 중간정도의 개선이 있었고, 이는 α1 인테그린이 앨포트 신장 질환 진행에 용량 의존적인 효과를 나타냈음을 예시한다(즉, α1 인테그린 발현을 절반으로 감소시킨 것은 앨포트 마우스 및 이중 녹아웃의 중간인 보호 효과를 제공하였다). α1 인테그린 돌연변이에 대하여 이형접합성인 앨포트 동물에서 이러한 중간 보호 효과는 α1β1 인테그린 수용체의 부분적 저해가 유용한 잇점을 제공한다는 것을 예시한다. 이것은 사람에서 사용될 경우 α1β1 인테그린 수용체의 저해를 포함하는 요법에 적용되므로 중요한 발견이다.

투과 전자 현미경적 분석은 콜라겐 α3(Ⅳ) 및 α1 인테그린 대립유전자 양자 모두에서 정상(대조), 콜라겐 α3(Ⅳ)에서 무효 및 α1 인테그린에서 정상(앨포트), 또는 콜라겐 α3(Ⅳ) 및 α1 인테그린 양자 모두에서 무효(이중 녹아웃)인 7주령 마우스의 신장에 관하여 수행하였다. 이러한 시점은 이 주령의 앨포트 마우스가 말기에 근접하기 때문에 선택하였다. 도 2에 선택된 패널은 5개 이상의 상이한 사구체 영역을 나타낸다. 도 2에 예시된 바와 같이, 정상 마우스의 사구체 모세혈관 루프(도 2A)는 균일한 두께 및 규칙적인 족돌기(모든 3개의 패널에서 족돌기는 화살표로 표시된다)를 갖는 3층 기저막을 가졌다. 앨포트 마우스의 모세혈관 루프(도 2B)는 소상 비후 및 박화를 갖는 희박화된 기저막(진전된 질환의 특징)을 나타내었다. 신장 여과 효율에 영향을 주는 것으로 생각되는 성질인 족돌기는 증대되고, 융합된 것으로 나타났다. 이중 녹아웃에서(도 2c), 기저막은 앨포트 마우스(도 2b)에서 보다 훨씬 덜 영향을 받았다. 기저막이 대조의 경우 보다 얇아진 반면, 휠씬 덜 희박화되었고, 족세포의 족돌기는 대개 정상인 것으로 나타났다. 앨포트 마우스에서, 약 40%의 사구체가 섬유성인 반면, 이중 돌연변이에서는 단지 5% 만이 섬유성이었다.

면역형광 분석은 도 2에서 사용한 동일한 동물로부터 얻은 동결된 신피질을 사용하여 수행하였다. 상기 조직을, 앨포트 신장 질환 진행과 관련하여 GBM에 축적되는 것으로 공지된 단백질에 특이적인 항체와 반응시켰다. 도 3의 결과는 콜라겐 COL4A1(α1(Ⅳ)) 및 4A2(α2(Ⅳ)) 사슬의 분포가 앨포트 사구체 및 이중 돌연변이체의 사구체 양자 모두에 대하여 동일하였음을 예시한다. 두 경우 모두에서, 모세혈관 루프(도 3의 모든 패널에서 화살표로 표시) 및 메산쥼 매트릭스는 양성이었다(도 3B, C). 라미닌-1은 대조에 비하여 앨포트 마우스의 GBM에 현저한 축적을 나타내었으나(도 3D를 도 3E와 비교), 이중 돌연변이체에서는(도 3F), 라미닌-1의 축적은 앨포트 사구체의 경우(도 3E)와 비교하여 현저하게 약화되었다. 피브로넥틴은 정상적으로 오직 메산쥼 매트릭스에만 국재화되어 있으나, 앨포트 마우스에서는 메산쥼 매트릭스 뿐만 아니라 GBM에 국재화되어 있는 것으로 발견되었다(도 3H). 놀랍게도, 이중 돌연변이체에서는 모세혈관 루프에 피브로넥틴의 축적은 관찰되지 않는다(도 3I). 이러한 결과는 매우 재현성이 있었다. 대조적으로, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대한 염색은 대조(도 3J) 또는 앨포트 마우스(도 3K)에 비하여 이중 돌연변이체(도 3L)의 메산쥼 매트릭스에서 약화된 염색을 나타냈다. GBM에 엔탁틴의 축적은 앨포트 및 이중 돌연변이체 샘플 모두에서 관찰되었고, 양자 사이에 식별가능한 차이는 없었다(도 3N 및 도 3O).

종합하면, 이들 데이터는 이중 돌연변이체에서 α1 무효 돌연변이는 앨포트 신장 질환 진행의 지연을 초래함을 예시한다. 이것은 생리학적 수준(도 1에 도시된 바와 같이 단백뇨의 발증 지연) 및 초미세구조적 수준(도 2에 도시된 바와 같이 GBM 손상 및 족돌기 소멸의 감소) 모두에서 명백하다. 도 3에 제공된 면역형광 연구는 α1β1 인테그린 수용체의 제거가 GBM 및 메산쥼 매트릭스 양자 모두에서 세포외 매트릭스 성분의 축적에 특이적인 변화를 초래함을 예시한다. 따라서, 본 발명은 신장 세포 표면상에 α1β1 인테그린 수용체 결합 부위가 차단되는 것을 특징으로 하는 치료 방법을 포함한다. 이러한 치료 방법은 하기에서 보다 상세히 기술된다.

또한, 도 9는 사이토카인 TGF-β1이 앨포트 마우스에서 유도되는 반면, α1인테그린 돌연변이를 추가로 갖는 앨포트 마우스에서는 유도되지 않음을 나타낸다. 따라서, α1β1 인테그린의 부재하에서, 사구체 기저막에서 매트릭스의 축적의 감소에 대한 원인이 되는 TGF-β1 유도는 관찰되지 않으므로, 신장 질환이 진행하는 속도가 현저히 감소한다. 신장 질환에서 TGF-β1의 이러한 역할은 하기 섹션에서 보다 상세히 논의된다.

TGF-β1의 역할

본원의 데이터는 TGF-β1이 본원에서 사용된 마우스 모델의 특정 사구체 세포 유형(족세포)에서 유도됨을 명백히 증명한다. TGF-β1 mRNA의 유도는 상기 모델에서 진행성 사구체신염과 관련하여 사구체 기저막에 축적되는 것으로 공지된 매트릭스 분자(예컨대, 라미닌, 피브로넥틴, 엔탁틴, 및 타입 Ⅳ 콜라겐)를 엔코딩하는 유전자의 유도에 의해 반영된다. 또한, 본원의 데이터는 TGF-β1이 사람의 앨포트 신피질에서 유도됨을 나타낸다. 이것은 사람의 앨포트 신장에서 일어나는 것을 모방하는 능력에서 상기 동물 모델의 타당성을 지지한다.

TGF-β1의 역할을 증명하기 위하여, 총 RNA를 앨포트 동물의 신장으로부터 분리시켰고 α1(Ⅳ) 및 α2(Ⅳ) 콜라겐 사슬, 엔탁틴, 라미닌 β1 또는 β2 사슬, 피브로넥틴, 또는 TGF-β1에 특이적인 방사성표지된 프로브로 프로빙시켰다. 도 4의 결과는 라미닌 β1을 제외한 이러한 모든 단백질에 대한 mRNA는 앨포트 마우스 모델에서 단백뇨의 발증 후에 유도됨을 예시한다. 이러한 동일한 시간경과에 대한 노던 블롯을 라미닌 α1, 라미닌 β2, 라미닌 γ1, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 코아 단백질, 및 콜라겐 α4(Ⅳ), 및 α5(Ⅳ) 사슬에 대하여 수행하였다. 대조를 돌연변이체와 비교할 때 이러한 다른 기저막 단백질에 대한 mRNA 수준에서 유의한 차이는 나타나지 않았다.

노던 분석의 결과는 상기 시간경과 동안 특이적 mRNA 발현에서 상대적인 변화를 직접 정량하기 위해 분석되었다. 도 5는 특이적 mRNA 수준의 유도가 6주 주령에서 최초로 나타남을 예시한다. 8주까지, mRNA 수준은 피크를 이루고, TGF-β1 및 피브로넥틴을 엔코딩하는 mRNA는, 대조 마우스에 비하여 각각 6.6배 및 9.4배가 유도되었다. 콜라겐 α1(Ⅳ), α2(Ⅳ), 및 엔탁틴에 대한 mRNA 수준은 8주까지 모두 약 3배 유도되었다. 대조적으로, 이들 동일한 총 RNA 노던 블롯에 의해 측정될 때, 신장 질환 진행의 임의의 시점에서 라미닌 β1 및 β2 사슬을 엔코딩하는 mRNA의 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다.

사구체는 신장의 총 질량의 작은 비율만을 포함한다. 사구체내의 개개의 세포 유형은 보다 낮은 비율을 포함한다. 따라서, 총 신장 RNA의 노던 블롯은 사구체, 또는 특정한 사구체 세포 유형에 특이적일 수 있는 메시지의 유도를 검출할 가능성이 없다. TGF-β1, 또는 상이한 기저막 성분을 엔코딩하는 mRNA가 특정한 사구체 세포 유형에서 유도되었는지 여부를 검사하기 위하여, mRNA에 특이적인 디곡시게닌 표지된 안티센스 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드화를 수행하였다. 그 결과는 도 6에 도시된다. 정상 마우스에서, TGF-β1(도 6D), 피브로넥틴(도 6G) 및 라미닌 β1(도 6M)에 대한 전사체가 오직 메산쥼 세포에만 국재화된 반면, 앨포트 마우스에서는 이러한 동일한 전사체(각각 도 6E, H, 및 N)가 이 사구체 세포 유형에서 유전자 활성화를 예시하는 족세포(사구체의 외측상에 있는 세포의 고리)에 뚜렷이 국재화된다. 콜라겐 α1(Ⅳ)의 족세포 활성화도 분명히 나타난다(도 6B를 6A와 비교). 사구체 족세포에서 매트릭스 단백질을 엔코딩하는 유전자의 활성화는 GBM 조성의 변화를 초래할 수 있다.

사이토카인의 활성 이소형에 특이적인 항체를 사용한 이뮤노퍼옥시다제 검출에 기초한 TGF-β1 단백질 데이터는 TGF-β1 mRNA에 대한 원위치 하이브리드화 분석에 의해 얻은 데이터를 확증한다. 도 7에 도시된 데이터는 족세포에서 TGF-β1 mRNA의 증가된 발현으로 단백질로의 번역이 증가함을 예시한다.

TGF-β1에 대한 데이터는 마우스 모델을 사용하여 얻었기 때문에, 사이토카인에 대한 mRNA 수준이 앨포트 대 대조 환자로부터 얻은 사람 신피질에서 상승되었는지를 결정하기 위하여 RNase 보호 분석이 수행되었다. 도 8의 데이터는 대조에 비하여 사람의 앨포트 신피질에서 TGF-β1 mRNA의 3 내지 4배 상승을 예시한다. 이는 사이토카인이 또한 사람의 앨포트 신장에서 과발현됨을 증명한다. 따라서, TGF-β1의 활성을 저해시키는 것은 앨포트 증후군, 특히 GBM에서 매트릭스 축적을 억제, 및 바람직하게는 예방하기 위한 타당한 치료 프로토콜을 제공한다.

상기 논의한 바와 같이, 도 9는 TGF-β1이 앨포트 마우스에서 유도되는 반면, α1 인테그린 돌연변이를 추가로 갖는 이중 녹아웃 마우스에서는 유도되지 않음을 나타낸다. 따라서, α1β1 인테그린의 부재하에서, 사구체 기저막에서 매트릭스의 축적의 감소의 원인이 되는 TGF-β1 유도는 관찰되지 않으므로, 신장 질환이 진행하는 속도가 현저하게 감소한다.

인테그린 α1β1 수용체를 차단시키고(또는 불활성화) TGF-β1을 저해시키는 것은 신장 질환(특히, 앨포트 신장 질환)의 발병, 진행의 약화, 및/또는 역전에 현저하게 상승 작용을 한다. 이러한 상승적 효과는, 3가지 상이한 방식으로 TGF-β1 활성을 차단하는 2개의 상이한 약물을 예로서 사용하여 증명된다. 양자 모두는 그 결과가 약물 치료의 부작용이라기 보다는 TGF-β1 활성을 저해시키는 것에 기인한 것임을 확인하기 위하여 연구되었다.

첫번째 예는 후지사와 파마슈티칼 컴파니 리미티드(Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan)에 의해 제조된 타크롤리무스 또는 FK506으로 지칭되는 약물이다. 이 약물은 일반적으로 장기 이식 후에 거부반응을 방지하기 위한 면역저해제로서 사용된다. 상기 약물은 세린 트레오닌 포스파타제인, 칼시누린으로 불리는 T-세포 수용체의 중요한 서브유닛, 및 T-세포 수용체 신호 전환의 중요 부분을 저해함으로써 작용한다. 최근에 검토된 바와 같이[참조: Crabtree, Cell, 96:611-614, 1999], 칼시누린은 다양한 수용체의 서브유닛이다. 이러한 수용체중의 하나는 최근 TGF-β1에 대한 것으로 보고되었다[참조: Wang et al., Cell, 86:435-444, 1996]. 약물 FK506은 TGF-β1 저해제로서 시험되었다. 따라서, 적당한 투여량의 FK506으로 마우스를 치료하는 것은 TGF-β1 타입 Ⅰ/타입 Ⅱ 수용체 신호 전환을 저해할 것이다.

FK506이 TGF-β1을 저해시키는 외에 다른 생물학적 활성을 가지기 때문에(T-세포 저해에 의한 강력한 면역억제가 가장 주목할 만함), 제 2의 TGF-β1 저해제가 평가되었다. 이러한 제 2의 저해제는 바이오젠 인코포레이티드(Biogen Inc., Cambridge, MA)에 의해 개발중인 실험단계의 약물이다. 이 약물은 사이토카인의 경쟁적 저해제이고, 불활성인 가용성 수용체 복합체로서 활성 사이토카인을 흡수한다. 이는 가용성 키메라 TGF-βRⅡ/IgG1 뮤린 융합 단백질이다[참조: 국제 공개 WO98/48024]. 기술된 실험에서는 저해제의 25㎍을 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 1주에 2회 주사하였다.

FK506 및 바이오젠사의 가용성 TGF-β1 저해제의 활성 방식 및 가능한 부작용이 상이하게 때문에, 두 약물 모두와 일치된 동물 모델 시스템을 사용하여 행한 관찰은 TGF-β1 활성의 저해에 기인한 것으로 결론지어진다.

2가지 유형의 실험이 수행되었다. 두 약물 모두 TGF-β1 저해의 생물학적 효과 그 자체를 검토하기 위하여 129 Sv/J 마우스 모델(앨포트 마우스)을 사용하여 시험하였다. 둘째로, 두 약물 모두 TGF-β1 저해와 조합된 α1β1 인테그린 저해의 생물학적 효과를 검토하기 위하여 이중 녹아웃 마우스 모델에서 시험하였다. 모든 경우에서, 본원에 제공된 데이터는 고도의 콘시스턴시로 3회 이상 반복하였다.

TGF-β1이 앨포트 마우스 모델에서 저해된 경우, 유리한 몇가지 효과가 있다. 기저막 형태가 전체적으로 개선되지만, 현저한 족돌기 소실이 여전히 관찰된다. 따라서, TGF-β1은 매트릭스 축적율을 감소시킴으로써 GBM 형태를 개선할 수 있으나, 족돌기를 기초로 하는 메카니즘에 대하여는 현저한 효과를 나타내지 않는다. 이는 단독 투여된 TGF-β1 저해제가 개선을 제공할지라도, 앨포트 증후군 또는 기타 이러한 질환의 모든 특성을 개선시키는데 성공할 가능성이 없음을 의미한다. 이중 녹아웃 마우스에서, 10주령까지 대부분의 족돌기는 정상적으로 보이지만, GBM에 현저한 매트릭스 축적이 있다. 이러한 동일한 동물을 임의의 TGF-β1 저해제를 사용하여 4주령에서 시작하여 치료하고, 10주령에서 조직을 수집할 경우, 약 30%의 사구체는 정상적인 마우스의 사구체와 초미세구조적으로 구별되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 치료 프로토콜에서 현저한 개선은 α1β1 인테그린 수용체 저해제와 병용하여 TGF-β1 저해제를 사용하여 얻어질 수 있다.

TGF-β1 저해제중 어느 하나로 처리된 앨포트 마우스 또는 이중 녹아웃으로부터 얻은 신장의 특정 mRNA에 관한 노던 블롯 데이터는 TGF-β1 또는 α1β1 인테그린 녹아웃 돌연변이가 GBM에 축적되는 매트릭스 분자를 엔코딩하는 이들 메시지의 발현에 영향을 미치는 방식간에 뚜렷한 차이가 있음을 증명한다. 메탈로프로테이나제(매트릭스 메탈로프로테이나제 2(MMP-2)를 포함) 및 이들의 대응하는 저해제(TIMP-2 및 TIMP-3을 포함)를 엔코딩하는 mRNA는 GBM을 포함하는 분자의 턴오버율을 조절하는 것으로 생각되며, 또한 TGF-β1 저해제중 어느 하나로 처리된 앨포트 마우스 대 아중 녹아웃 마우스에서 상이하게 영향을 받는다. 특히, 정상 마우스에서 매우 높은 수준으로 발현되는 Timp-3은 앨포트 마우스 및 이중 녹아웃에서 억제된다. TGF-β1 저해제를 사용한 이중 녹아웃 마우스의 처리는 TIMP-3의 억제를 방지하고, mRNA를 대조 마우스에서 관찰되는 것과 대등한 수준으로 회복시킨다(도 21).

이와 동일한 경향에 따라, 라미닌 α2 발현은 정상적으로는 메산쥼 매트릭스에 엄격하게 한정된다. 라미닌 α2의 침착은 앨포트 GBM 질환 발병과 관련하여 확인된 가장 초기의 분자적 변화이고, 기저막 비후가 최초로 검출되는 때와 동시에 나타난다. 이중 녹아웃 마우스의 GBM에서 라미닌 α2의 침착은 7주령에서 조차 관찰되지 않는다(도 18, 1D군). SV/J 앨포트 마우스에 TGF-β1 저해제를 투여하면 라미닌 α2의 침착이 저해되지 않는다(도 18, 1C군). 이것은 질환 진행의 지연에서 α1β1 대 TGF-β1이 작용하는 방식의 또다른 차이점을 강조하며, 왜 병용 투여가 상승적 잇점을 제공하는가를 확실한 증거와 함께 증명한다.

TGF-β1이 족세포 족돌기의 소실을 저해하지 못한 것은 라미닌 α2에 관한 관찰과 직접적으로 관련이 있는 것으로 생각된다. 라미닌은 알파, 베타, 및 감마 사슬로 구성된 이종삼량체를 형성한다. 기저막에서, 이들은 서로 가교되어 기저막의 필수적인 부분인 시트형 상부구조를 형성한다. 라미닌은 인테그린 수용체와 상호작용하는 것으로 공지되어 있으며, 조직 기능의 분화 및 유지에 중요한 역할을 한다. 정상 마우스에서, GBM은 α5, β2, 및 γ1 사슬의 이종삼량체인 라미닌-11을 주로 함유한다. 이 라미닌은 족세포 표면상의 인테그린 α3β1 수용체와 높은 친화도로 결합하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 상호작용은 족돌기를 형성하는 복잡한 세포골격 구조를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. α2 사슬을 함유한 라미닌 이종삼량체(라미닌-2 및 라미닌-4)는 α3β1 인테그린과 결합하지 않는다. 따라서, GBM에서 라미닌-2 사슬의 존재는 정상적인 기질(라미닌-11)과 α3β1 인테그린의 결합을 저해함으로써 족돌기 소멸이 관찰되는 결과를 초래한다. 언급한 바와 같이, 이중 녹아웃에서, 라미닌 α2의 침착이 저해되고, 이는 이 마우스종에서 족돌기의 유지와 적절한 상관관계가 있다.

추가의 관찰은 간질성 섬유증의 문제에 관한 것이다. 간질성 섬유증은 앨포트 증후군 진행에서 후기에 발생한다. 129Sv/J 앨포트 마우스 모델에서, 7주 이전에는 섬유증이 관찰되지 않으며, 평균 사망 주령은 8주이다. 그러나, 이중 녹아웃에서는, 섬유증의 발병은 8 내지 9주이고, 평균 사망 주령인 15주까지 진행한다. 따라서, 이중 녹아웃은 섬유증의 연구에 우수한 모델이다. 이중 녹아웃 마우스에서 섬유증의 현저한 경과가 있으며, 이는 TGF-β1 저해제를 사용함으로써 크게 방지될 수 있다.

처리 방법

한 측면에서, 본 발명은 사구체 질환, 특히 진행성 사구체신염 및/또는 섬유증의 발병(시판용 스틱 시험 또는 겔 전기영동 및 겔 염색 방법을 사용하여, 검출가능한 수준의 뇨중 혈청 알부민의 출현에 의해 측정)을 지연시키고 진행(상기 측정된 알부민 수준이 시간의 함수로서 증가하는 속도를 측정함으로써 결정)을 지연시키거나, 심지어 역전시키는 방법으로서 α1β1 인테그린 수용체의 기능을 차단 또는 불활성화시키기 위한 저해제(예컨대, 차단제)의 용도에 관한 것이다. 이들은, 예컨대 라미닌, 타입 Ⅳ 콜라겐, 피브로넥틴, 및 엔탁틴과 같이, α1β1 인테그린 수용체와 결합하는 단백질의 적어도 9량체인 펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 수용체/α1β1 수용체의 리간드 부위내에서 결합하는 작은 분자들이 단백질/α1β1 인테그린 수용체 연구에 기초하여 창조될 수 있다. α1β1 인테그린 수용체의 결합 부위에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편들이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 항체 또는 항체 단편들은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항-이디오타입 항체, 동물 유래의 항체, 인간화된 항체 및 키메라 항체를 포함한다.

α1β1 인테그린 수용체에 대한 결합 부위를 차단하는 약물(인위적 리간드)이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 약물의 예는 중화 항체, 펩티드, 단백분해성 단편 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 약물은 수용체를 통한 신호 전환을 차단하는 것으로 생각된다. 이러한 치료제의 유효성은, 예컨대 TGF-β1, 피브로넥틴, 라미닌 사슬 등의 유전자 발현에 대한 다운스트림 효과를 사구체 기저막의 형태적 변화에 의해, 및/또는 단백뇨의 발증 및 진행 속도의 감소로 증명되는 사구체의 개선에 의해 평가함으로써 결정될 수 있다.

α1β1 인테그린 기능을 중화시키는 항체는 실시예 및 도 10에 제공된다. 리간드와 α1β1 인테그린의 상호작용을 차단할 수 있는 가용성 약물이 신장 질환 발병에 대하여 α1 유전자 녹아웃 돌연변이와 동일한 효과를 나타냄을 예시하기 위한 예로서, 파브리(Fabbri) 등의 문헌[Tissue Antigens, 48:47-51, 1996]에 기재된 항체를 수득하였다. 이 항체는 주사되어(400ng/주사, 주 3회, 복강내투여), 이중 돌연변이체에서 관찰된 바와 동일한 방식으로 앨포트 마우스 모델에서 사구체 기저막 손상을 저해시키는 것으로 나타났다.

다른 측면에서, 본 발명은 사구체 질환, 특히 진행성 사구체신염의 진행에서 매트릭스의 축적을 지연시키는 방법으로서 TGF-β1의 수준을 감소시키는 약제의 용도에 관한 것이다. 따라서, 이러한 약물은 앨포트 증후군 환자 및 인슐린 의존성 당뇨병 뿐만 아니라 특히 진행성 사구체신염, 또는 신장 섬유증의 공통적인 경로가 되는 메산쥼 매트릭스의 확장, 메산쥼 세포의 증식, 사구체 기저막에 매트릭스의 퇴적 결과 비후, 박화, 분열, 또는 몇가지 이러한 불규칙성, 족세포 족돌기의 소실, 또는 상기 기재한 징후의 몇가지 조합을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다(이를 방지하기 위하여 α1β1 인테그린 저해제 및 TGF-β1 저해제의 병용 요법이 특히 유효하다). 이러한 목적으로, 당해분야에서 기술된 바와 같은 안티센스 요법은 TGF-β1 또는 α1β1 인테그린 수용체 단백질의 발현을 차단하는데 사용될 수 있다. 다양한 합성 또는 천연 약물이 사용될 수 있다.

수용체와 상호작용하는 TGF-β1 사이토카인의 능력을 중화시키는 약물이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 약물의 예는 중화 항체, 미국 특허 제 5,260,301호(Nakanishi et al.)에 개시된 것(예컨대, FK506 또는 타크롤리무스 및 구조적으로 관련된 화합물)과 같은 칼시누린 저해제(즉, 마크로라이드), 국제 공개 WO9848024(Biogen Inc.)에 개시된 가용성 재조합 TGF-β1 수용체(예컨대, 가용성 키메라 TGF-βRⅡ/IgG1 융합 단백질)와 같은 가용성 수용체, 상기 수용체의 펩티드 단편, 또는 사이토카인과 비가역적으로(또는 안정하게) 결합하는 능력을 갖고 수용체와 결합하는 능력을 저해시키는 소정의 이러한 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 신호를 핵에 전환시키는 TGF-β1의 능력을 저해시키는 약물이 사용될 수 있다. 이러한 치료제의 유효성은, 예컨대 TGF-β1, 피브로넥틴, 라미닌 사슬 등의 유전자 발현에 대한 다운스트림 효과를 사구체 기저막의 형태적 변화에 의해, 및/또는 단백뇨의 발증 및 진행 속도의 감소로 증명되는 사구체의 개선에 의해 평가함으로써 결정될 수 있다.

한 실시예에서, FK506 또는 사이클로스포린 A는 TGF-β1 수용체의 칼시누린 부분을 저해시키는데 사용되어, 몇가지 다른 신장 질환에 대하여 개시되었된 바와 같이[참조: Wang et al., Cell 86:435-444, 1996 and Muller et al., Endocrinol, 3:1926-1934, 1989], 수용체 복합체를 통한 신호 전환을 저해하고, 이로써 동일한 신장 질환에 대하여 기재되었던 바와 같이[참조: Callis et al., Pediatr. Nephrol., 6:140-144, 1992], 단백뇨의 발증을 저해(알려지지 않은 메카니즘을 통하여)할 수 있다. 본 발명 이전에는 앨포트 증후군, 당뇨병 또는 신장 사구체에서 세포외 매트릭스의 증가와 관련된 질환에 대한 이러한 것이 추천된 바 없었다.

특히, 본 발명은 α1β1 인테그린 수용체 및 TGF-β1을 저해하여 앨포트 증후군과 관련된 섬유증 및 사구체 질환 양자 모두를 방지하는데 상승적인 효과를 가지는 병용 요법의 효과를 예시한다. GBM 비후, 박화, 분열, 족세포 족돌기의 소멸중 하나 이상, 또는 상기의 임의의 조합에 의해 명백히 나타나는 진행성 기저막 손상, 메산쥼 매트릭스의 확장, 메산쥼 세포의 증식을 포함하는 기타 질환이 또한 이 치료로부터 이익을 얻게 될 것이다. 또한, 본 발명자들은 앨포트 증후군에서 관상간극의 섬유증을 방지하는데 병용 치료의 유효성을 예시한다. 섬유증은 공통된 경로이며, 이에 대한 메카니즘은 섬유증이 관련되는 모든 신장 질환에 대해 동일한 것으로 생각된다. 따라서, 섬유증의 치료에 있어서 이러한 병용 요법의 유효성은 섬유증을 초래하는 경로를 시작한 기초가 되는 원인에 상관없이 모든 형태의 신장 섬유증에 적용가능한 것이어야 한다.

본 발명의 방법에 사용되는 약물은 약제학적으로 허용되는 담체와 배합되어투여될 수 있다. 본 발명의 약물은 약제학적 조성물(즉, 제형)로 제형화된 다음, 본 발명의 방법에 따라, 사람인 환자와 같은 포유동물에게 선택된 투여 경로에 적합한 다양한 형태로 투여된다. 제형은 전형적으로 비경구 투여(피하, 근육내, 복강내, 및 정맥내 투여를 포함) 또는 약물의 안정성을 허용하는 기타 방법에 적합한 것을 포함한다.

약물학적으로 허용되는 적당한 담체는 액체, 반고체, 미분된 고체, 또는 이들의 조합의 형태일 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형은 편의상 약물의 멸균 수성 제제, 또는 약물을 포함하는 멸균 분말의 분산제제로서, 바람직하게는 투여받는 자의 혈액과 등장인 것들을 포함한다. 액상 제제에 포함될 수 있는 등장화제는 당, 완충제, 및 염화나트륨이다. 약물의 용액은 물에서, 임의적으로 비독성 계면활성제와 혼합되어 제조될 수 있다. 약물의 분산제제는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 식물유, 글리세롤 에스테르, 및 이들의 혼합물에서 제조될 수 있다. 최종적인 제형은 멸균되고, 제조 및 저장 조건하에서 안정하다. 필요한 유동성은, 예컨대 리포좀의 사용에 의해, 분산제제인 경우 적당한 입자 크기를 사용함으로써, 또는 계면활성제를 사용함으로써 달성될 수 있다. 액상 제제의 멸균은 약물의 생물활성을 유지시키는 임의의 편리한 방법, 바람직하게는 멸균 여과에 의해 달성될 수 있다. 산제를 제조하는 바람직한 방법은 멸균 주사 용액을 진공 건조 및 동결 건조시키는 것을 포함한다. 추후의 미생물 오염은 다양한 항미생물제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 치메로살 등을 포함한 항균제, 항바이러스제 및 항진균제를 사용하여 방지될 수 있다. 장기간에 걸친 약물의 흡수는 지연화제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

상기 성분에 부가하여, 본 발명의 제형은 희석제, 완충제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 증점제(thickener), 윤활제, 보존제(항산화제 포함) 등을 포함한 하나 이상의 부속 성분을 추가로 포함할 수 있다. 제형은 편의상 1회 투여 형태로 제공될 수 있고 약학 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

본원에 기재된 약물의 유용한 투여량(즉, 목적하는 효과를 제공하는 유효량)은 시험관내 활성 및 동물 모델에서 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스, 및 기타 동물에서의 유효 투여량을 사람에 대해 외삽시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 정맥 주사용 약물의 1일 2회 약 150mg/kg 내지 약 300mg/kg 투여량. 투여되는 적당한 투여량은 일반적으로, 예컨대 Ⅱ상 효소 발현의 명백한 증가, 또는 본원에 기재된 기타 특징을 유도함으로써, 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양이다.

실시예

본 실시예에서, 두 가지의 상이한 동물 모델에 관하여 설명한다. 첫번째는 콜라겐 α3(IV)를 발현시키지 않고 α1 인테그린이 정상이며 문헌[Cosgrove et al., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996]에 기재된 "앨포트(Alport)" 마우스 모델이며, 두번째는 "이중 녹아웃(double knockout)" 마우스라고 일컬어지며 앨포트 마우스를 α1 인테그린 유전자가 없는 마우스와 교배시킴으로써 유도되는 마우스 모델이다. 앨포트 마우스와 이중 녹아웃 마우스 사이에는 사구체 질환을 지연시키는 α1β1 인테그린 작용을 차단하는 효능을 설명하는 역할을 하는 차이점들이 있다. 이러한 효과를 이하 상세히 설명한다.

앨포트 마우스는 129 Sv/J 순종인 유전적 배경상태에 있으며, 이중 녹아웃 마우스는 97.5% 순종인 129 Sv 배경상태에 있다. 이에 대한 예외는 도 4, 5, 및 6를 도출하는데 사용한 동물이다. 이들 실험을 앨포트 마우스 모델의 연혁의 초기에 수행하였으며, 예를 들면 키메라성 숫컷을 C57B1/6 암컷과 교배시킨 후, 생성되는 이형접합체를 교배시켜 F2 세대인 동형접합성 앨포트 마우스를 생성시켰다. 이러한 세대는 앨포트 동물 모델의 최초의 설명에서 사용된 동물과 동일한 세대이다[문헌: Cosgrove et al., Genes Devel., 10:2981-2992, 1996]. 이는 녹아웃 표현형의 동정을 신속하게 하기 때문에 초기 유전자 녹아웃 연구에 있어서 통상적인 것이다. 특이적 mRNA 유도와 관련하여, 이들 F2의 마우스로부터 얻은 결과는 순종 129 Sv/J 녹아웃에 대해 얻은 결과와 일치한다. 앨포트 마우스 대 이중 녹아웃 마우스의 비교 분석을 제공하는 모든 실험은 동종번식 계통에 대해서 수행되었음에 유의해야 한다.

두 동물 모델에서 섬유증의 발병 뿐만 아니라, 신장 질환의 진행에 대한 TGF-β1의 역할을 시험하였다. 이는 매우 다양한 방식으로 작용하는 두 가지의 상이한 TGF-β1 저해제를 시험함으로써 수행하였다. 두 가지의 상이한 저해제(FK506 및 가용성 TGFβ1 수용체)의 사용은 그 효과가 사용된 약물의 부작용이 아니라 TGF-β1 저해에 기인하는 것이라는 증거를 제공한다. FK506은 TGF-β1의 과발현과 관련된 진행성 섬유증을 치료하는 치료제일 수 있다.

상이한 동물 모델 및 기재된 약물 치료를 분석하는 과정에서, 시종일관 일정하게 유지된 특이적 평가 과정이 있다. 세 가지의 상이한 부위를 평가하였다. 첫 번째는 신장 기능을 검사하여, 사구체 필터의 전체적인 완전성에 대한 평가를 제공하였다. 이는 혈청 알부민의 뇨중 배설량을 시험함으로써 수행하였다. 두번째는 광학 및 전자 현미경 수준 모두에서 조직의 구조적 완전성을 시험하였다. 투과 및 주사 전자 현미경 방법 양자 모두를 사용하였다. 이러한 방법들은 이러한 상이한 조건 하에 신장의 조직병리학적 정도를 측정하도록 고안되었다. 마지막으로, 분자적 분석 시험을 수행하여, 특이적 유전자에서 어떠한 변화가 일어나는지 및 이러한 상이한 조건의 결과로서 대응하는 단백질이 존재하는지를 시험하였다. 이들은 노던 블롯, 원위치 하이브리드화, 및 RNase 보호를 사용하여 특이적 RNA에 주목하고, 특이적 단백질에 대해 면역조직화학 검출법을 사용하여 시험하였다. 상이한 동물 모델과 상이한 동물 모델에 사용된 약물 치료의 분석에 대하여 상기 특이적 방법이 반복되기 때문에, 불필요한 언급을 피하기 위해서, 상기 방법들을 모든 경우에 동일하게 수행하였으므로(일상적인 습관에서 기대될 수 있는 한), 한 번 기재한 다음, 이후의 특정 실시예에서 인용함을 여기서 밝혀둔다.

당업자들이 이용가능하며, 본 발명을 유사하게 성공적으로 수행하도록 하는 다수의 대안적인 기술 및 방법들이 존재한다. 모든 시약은, 달리 명시하지 않는 한, 미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)로부터 얻었다. 본원에 기재된 모든 연구에 사용된 PBS는 미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니로부터 제품 번호 P-4417의 정제의 형태로 구입하여, 이들 각각의 정제를 200ml의 물에 재구성하여 pH 7.4 PBS를 제조하였다.

방법

I. 신장 기능

A. 단백질 분석: 뇨중 단백질의 초기 측정은 알부스틱스(Albustix)(Miles Laboratories, Elkhart, IN)를 사용하고, 키트가 장착된 칼라 챠트로부터 상대적인 양을 판독함으로써 수행하였다.

뇨 샘플을 일주일 간격으로 수집하였으며, 0.5㎕를 10% 변성 아크릴아미드 겔을 통해서 전기영동법에 의해 분별시켰다. 겔 중의 단백질을 쿠마시 블루 (coomassie blue)로 염색하여 사진촬영하였다. 우혈청 알부민을 분자량 표준물로 사용하였다.

II. 구조 완전성

A. 투과 전자현미경: 신선한 외부 신피질을 4% 파라포름알데히드에 침지시키고, 2시간 동안 고정시키고, PBS(pH 7.4)중에 5℃로 저장하였다. 조직을 0.1M의 소렌슨 완충액(Sorenson's buffer)(소렌슨 완충액은 100ml의 200mM 일염기성 인산나트륨 및 400ml의 200mM 이염기성 인산나트륨을 500ml의 물과 혼합하고, pH를 7.4로 조정함으로써 제조하였다)으로 완전히 세척하고(4℃에서 각각 10분씩 5회), 1 시간 동안 소렌슨 완충액 중의 1% 오스뮴 테트록사이드에 후고정시켰다. 그 후, 조직을 등급화된 에탄올(각각 10분씩 차례로 70%, 80%, 90%, 100%), 및 최종적으로 프로필렌 옥사이드 중에서 탈수시키고, 제조자에 의해 기재된 방법에 따라서 폴리/베드 812 에폭시 수지(Poly/Bed 812 epoxy resin)(Polysciences, Inc., Warrington, PA)에 포매시켰다. 간단히 설명하면, 42ml의 폴리베드 812를 26ml의 도데실숙신산 무수물(DDSA, Polysciences, Inc.) 및 24ml의 나드산 메틸 무수물(nadic methyl anhydride)(Polysciences Inc.)과 혼합하였다. 1.5ml의 2,4,6 트리(디메틸 아미노메틸)페놀을 촉매로서 가하고, 표본을 포매시키는데 필요한 정도까지 활성화된 수지를 10ml 분취량으로 동결시켰다. 사구체를 톨루이딘 블루로 염색된 1㎛(미크론) 절편에서 동정하고, 얇은 절편을 레이쳐드 정 울트라컷 E 울트라마이크로톰(Reichert Jung Ultracut E Ultramicrotome)(Cambridge Instrument Co., Vienna, Austria)을 사용하여 70nm(나노메터) 두께로 절단하였다. 단편을 그리드(grid)상에 마운팅하고, 공지된 방법을 이용하여 아세트산 우라닐 및 시트르산 납으로 염색하였다. 그리드-마운팅된 절편을 시험하고 필립스 CM10 전자현미경(Phillips CM10 electron microscope)을 사용하여 사진을 촬영하였다.

B. 주사 전자현미경: 작은 조각(약 2mm 입방체)의 신장 피질을 3% 인산염 완충된 글루타르알데히드에 고정시킨 다음, 1% 인산염 완충된 오스뮴 테트록사이드에 후고정하였다. 샘플을 이어서 등급화된 알코올중에서 탈수시키고, 이산화탄소 중에서 임계점 건조시켰다. 입방체를 이어서 면도날의 에지로 압력을 가하여 조각들로 파쇄하고, 파쇄된 표면이 상부로 향하게 하면서 스터브(stub)상에 아교로 마운팅하였다. 표면을 공지된 방법을 사용하여 금/팔라듐으로 스퍼터(sputter) 코팅시키고, 주사 전자 현미경으로 가시화하였다.

C. 존스 실버 메텐아민 염색(Jones Silver Methenamine Stain): 문헌[Burns and Bretschschneider, Thin is in: plastic embedding of tissue for light microscopy, Educational Products Division, American Society of Clinical Pathologists, Chicago, IL, pp. 24-25, 1981]에 기재된 방법을 사용하여 파라핀 포매된 신장에 대해서 존스 염색을 수행하였다.

III. 분자적 분석

A. 노던 블롯 분석: 신장을 제거하여 액체 질소에서 스냅 동결시키고 막자사발 및 막자를 사용하여 액체 질소중의 분말로 분쇄하였다. 분말을 신장 당 5 ml의 시약을 사용하여 트리졸(TRIZOL) 시약(GibCo/BRL, Grand Island, NY)에 가용화시켰다. 전체 세포 RNA를 제조자의 지시에 따라서 추출하였다. 20㎍의 RNA를 80V에서 4시간 동안 전기영동에 의해서 1.0% 아가로즈/포름알데히드/MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판술폰산) 겔 상에서 분별시켰다. 겔을 물에 45시간 동안 침지시키고, 운반 완충액으로서 750 mM 암모늄 아세테이트(물 중의)를 이용하여 밤새 모세관 블롯에 의해서 하이본드 N(Hybond N)(비하전된 나일론, New England Nuclear, Inc., Boston, MA)으로 옮겼다. RNA를 스트라타링커(Stratalinker)(Stratagene, Inc., LaJolla, CA)를 사용하여 블롯에 UV 가교시켰다. 블롯을 50% 포름아미드, 10X 덴하트 용액(Denhardt's solution), 1M NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% SDS, 및 200㎍/ml의 음파처리 및 변성된 연어 정액 DNA(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 포함하는 용액에 예비하이브리드화시켰다. 프로브(³²P-표지된 cDNA 프로브 단편)를 랜덤 프라이밍 DNA 표지화 키트(Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 10⁹ cpm/㎍의 농도로 랜덤 프라이밍시킴으로써 표지화하였다. 예비하이브리드화 및 하이브리드화 완충액은 5X 식염수-시트르산 나트륨 완충액(SSC), 5X 덴하트 용액, 0.5% 소듐 도데실 술페이트(SDS), 및 200㎍/ml의 음파처리 및 변성된 연어 정액 DNA로 구성되었다. 필터를 적어도 5시간 동안 예비하이브리드화시키고, 이어서 하이브리드화 용액 ml당 1백만 DPM(분당 붕괴)의 프로브를 사용하여 밤새 하이브리드화시켰다. 필터를 이어서 높은 엄격성(stringency)(물 중의 300mM NaCl, 30mM 소듐 시트레이트, 및 0.2% 소듐 도데실 술페이트로 구성된 용액중의 65℃에서 각각 30분 동안 2회)에서 세척하고, X-레이 필름에 노출시켰다. RNA 제조물의 품질 및 로딩의 콘시스턴시는 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고 18S 및 28S 리보좀성 RNA 밴드를 겔 영상기 2000 디지털 영상화 시스템 장치 및 소프트웨어 패키지(Gel Imager 2000 digital imaging system instrument and software packge)(Applied Imaging, Santa Clara, CA)를 사용하여 스캐닝함으로써 평가하였다. 적절한 비율의 리보좀성 밴드는 RNA 제조물이 일관된 고품질이었음을 확인시켜 주었다. 정량적 밀도측정 스캐닝으로 샘플 로딩에서 단지 10% 변화만이 확인되었다. 진행성 섬유증에 수반되는 세포 생리에서의 변화가 그러한 대조 프로브를 신뢰할 수 없게 한다는 우려 때문에 대조 프로브가 아닌 상기 도구를 사용하였다. 발현에서의 정량적인 차이는 바이오래드 GS-525 인영상기(BioRad GS-525 phosphorimager)(Bio Rad, Inc., Hercules, CA)를 사용한 인영상 분석에 의해서 평가하였고, 배경 하이브리드화를 공제하였다.

프로브를 상이한 기저막 콜라겐 cDNA의 공지된 서열 및 관련된 단백질에 대한 공지된 서열을 사용한 PCR 증폭에 의해서 뮤린 신장 5' 스트레치 cDNA 라이브러리(Clonetech)로부터 분리하였다. 기저막 콜라겐 프로브의 경우에, 보존된 NCl 도메인을 엔코딩하는 서열을 증폭시켰다. 사용된 프라이머 및 조건은 문헌[Miner and Sanes, J. Cell Biol., 127:879-891, 1994]에 기재된 바와 동일하였다. 콜라겐 COL4A1의 경우에, 프라이머[문헌: Muthukumaran et al., J. Biol. Chem., 264:6310-6317, 1989]는 센스, 5'TCTGTGGACCATGGCTTC3' (서열번호 1); 안티센스, 5'TTCTCATGCACACTTGGC3'(서열번호 2)이었다. 콜라겐 COL4A2의 경우에, 프라이머[문헌: Saus et al., J. Biol. Chem., 264:6318-6324, 1989]는 센스, 5'GGCTACCTCCTGGTGAAG3'(서열번호 3); 안티센스, 5'TTCATGCACACTTGGCAG3'(서열번호 4)이었다. COL4A1 및 COL4A2 모두 동일한 조건하에 증폭시켰다. 비리온(a x 10⁶)을 고온 스타트(95℃에서 10분)후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1 분을 이용한 35 사이클의 PCR로 증폭시켰다. 프로브를 서브클로닝시키고 DNA 서열 분석에 의해서 확인하였다.

기저막 관련된 단백질에 대한 프로브를 기저막 콜라겐과 동일한 라이브러리로부터 증폭시켰다. 프라이머를 3'서열로부터 취하였다. HSPG 코아 단백질의 경우에, 프라이머[문헌: Noonan et al., J. Biol. Chem., 263:16379-16387, 1988]는 센스, 5'CGGGCCACATTCTCC3'(서열번호 5); 안티센스, 5'GGAGTGGCCGTTGCATT3'(서열번호 6)이었다. 라미닌 B2(Laminin B2)의 경우에, 프라이머[문헌: Sasaki and Yamada, J. Biol. Chem., 262:17111-17117, 1987]는 센스 5'ACCAGTACCAAGGCGGA3'(서열번호 7); 안티센스, 5'TCATTGAGCTTGTTCAGG3'(서열번호 8)이었다. 라미닌 B1의 경우에, 프라이머[문헌: Sasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:935-939, 1987]는 센스 5'TAGAGGTTATTTTGCAGCAGA3'(서열번호 9); 안티센스 5'TTGGATATCCTCATCAGCTTG3'(서열번호 10)이었다. 엔탁틴(entactin)의 경우에, 프라이머[문헌: Mann et al., EMBO Journal, 8:65-72, 1989]는 센스 5'GTGGTTTACTGGACAGACATC3'(서열번호 11); 안티센스, 5'CCAATCTGTCCAATAAAGG3'(서열번호 12)이었다. 라미닌 A 사슬의 경우에, 프라이머[문헌: Duetzmann et al., Eur. J. Biochem., 177:35-45, 1988]는 센스 5'ACACACTCCAAGCCCACAAAAGCAAG3'(서열번호 13); 안티센스 5'GAGGGAAGACTCCTTGTAGGTCAA3'(서열번호 14)이었다. S-라미닌의 경우에, 프라이머[문헌: Hunter et al., Nature, 338:229-234, 1989]는 센스, 5'GCAGAGCGGGCACGGAGC3'(서열번호 15); 안티센스, 5'TGTACCTGCCATCCTCTCCTG3'(서열번호 16)이었다. PCR 조건은 상기 타입 IV 콜라겐 사슬에 대해서 사용된 조건과 동일하였다.

MMP-2, Timp2, 및 Timp3에 대한 프로브는 RT-PCR에 의해서 13일령 마우스 태아로부터 얻은 전체 RNA를 사용하여 분리하였다. MMP-2에 대한 프라이머 세트는 mRNA의 237 bp 단편을 증폭시키며[문헌: Reponen et al., J. Biol. Chem., 267:7856-7862, 1992], 상류 프라이머 5'CCC CTA TCT ACA CCT ACA CCA3'(서열번호 17) 및 하류 프라이머 5'TGT CAC TGT CCG CCA AAT AAA3'(서열번호 18)을 포함하였다. Timp-2에 대한 프라이머 세트는 mRNA의 195 bp 단편을 증폭시키고[문헌: Shimizu et al., Gene, 114:291-292, 1992], 상류 프라이머 5'CAG AAG AAG AGC CTG AAC CAC A3'(서열번호 19) 및 하류 프라이머 5'GTA CCA CGC GCA AGA ACC3'(서열번호 20)을 포함하였다. Timp-3에 대한 프라이머 세트는 mRNA의 337 bp 단편을 증폭시키고[문헌: Apte et al., Developmental Dynamics, 200:177-197, 1994], 상류 프라이머 5'GGT CTA CAC TAT TAA GCA GAT GAA G3'(서열번호 21) 및 하류 프라이머 5'AAA ATT GGA GAG CAT GTC GGT(서열번호 22)를 포함하였다. 세 가지 프로브 모두에 있어서, 전체 RNA중의 1㎍을 제조자에 의해서 기재된 프로토콜에 따라서 깁코 수퍼스크립트 플러스 역전사효소 및 하류 프라이머를 사용함으로써 역전사시켰다. 반응의 1/10은 PFU 중합효소(Stratagene, Inc.)를 사용하는 40사이클의 고온 스타트 PCR로 증폭시켰다.

TGF-β1 프로브는 사람 프로브를 필요로 하는 RNase 보호를 제외하고는 에이취. 엘. 모시스(H.L. Moses)[문헌: Miller et al., Mol. Endodrinol., 3:1926-1934, 1989]로부터 얻었다. 이러한 프로브의 경우에, TGF-β1의 24개 염기쌍의 단편을 사람 신장 cDNA 라이브러리(Clonetech, Palo Alto, CA)로부터 PCR에 의해서 증폭시켰다. 사용된 프라이머 세트는 GCA GAA GTT GGC ATG GTA G(서열번호 23)(하부) 및 GGA CAT CAA CGG GTT CAC TA(서열번호 24)(상부)였다. 단편을 PFU 중합효소(Statagene)로 재증폭시켰고, 평활 말단을 pBluescript SK + 플라스미드 내로 연결시켰다.

B. 원위치 하이브리드화: 신장을 초기에 완만한 경심장 관류(PBS중의 4% 파라포름알데히드를 사용)에 의해서 고정시켰다. 동물을 먼저 아버틴(Avertin)(2,2,2-트리브로모에탄올, Aldrich Chemical Co., Milwalkee, WI)을 사용하여 심마취시켰다. 흉부 공동을 개방하고, 투베르쿨린 니들(tuberculin needle)로 천공함으로써 우심실에 작은 구멍을 형성시켜서 관류액이 배출되게 하였다. 관류 완충액을 함유하는 30ml 주사기에 연결된 제 2의 투베르쿨린 니들을 좌심실의 심첨에 삽입하였다. 분당 약 3ml의 속도로 체중 g당 1ml의 고정제를 관류시켰다. 적합하게 고정된 신장은 단단하였고, 대리석 무늬의 외관을 나타냈다. 관류 후에, 신장 캡슐을 홍체 겸자로 제거하고, 신장을 세로로 절반으로 절단하고(신우, 수질 및 피질을 이등분함), 추가로 한 시간 동안 4℃에서 고정제내에 위치시켰다. 고정된 반쪽들을 파라핀에 포매시키고, 6㎛으로 절단하고, 수퍼프로스트 플러스 현미경 슬라이드(SUPERFROST PLUS microscope slide)(Fisher Scientific, Inc., Pittsberg, PA)상으로 옮겼다. 슬라이드를 60℃의 슬라이드 가온기 상에서 20분 동안 베이킹시키고, 사용될 때까지 4℃에서 저장하였다(슬라이드는 6 주일까지 유용하다). 대조군 및 앨포트 동복자의 신장을 하이브리드화 과정 동안 초래될 수 있는 미세한 차이를 조절하기 위해서 나란히 포매시켰다.

슬라이드를 60℃의 진공 오븐에서 1시간 동안 가온하고, 크실렌으로 3회 연속 2분 세척하여 왁스를 제거하였다. 조직을 에탄올 중에서 탈수시키고, 0.2N HCl에서 15분 동안 인큐베이팅함으로써 단백질을 제거시키고, PBS로 세척하고, 37℃에서 10분 동안 3㎍/ml의 프로테이나제 K(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)로 소화시켰다. PBS중의 2mg/ml 글리신으로 세척함으로써 소화를 중지시켰다. 단계적인 에탄올 용액으로 조직을 탈수(실온에서 각각 10분 동안 70%, 80%, 90%, 100%)시킨 후에, 이하와 같은 변화를 주면서 제니우스 원위치 하이브리드화 키트(Genius in situ Hybridization Kit)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)와 함께 기재된 프로토콜에 따라서 조직을 예비하이브리드화시키고, 하이브리드화시키고, 세척하였다. 예비 하이브리드화 및 하이브리드화 용액 둘 모두에서, 10mg/ml의 페놀/클로로포름-추출된 베이커 효모 tRNA가 포함되었다. 이러한 단계는 비특이적 신호를 현저하게 감소시켰다. 하이브리드화 후에, 조직을 50℃에서 2X SSC로 2회 세척하고, 이어서, 실온에서 6분 동안 RNase A로 소화시켰다. RNase A의 양을 각각의 프로브에 대해서 측정하였다(200ng/ml 내지 5㎍/ml 범위). 음성 대조 프로브는 세균 β-갈락토시다제 또는 네오마이신 포스포트랜스페라제에 대한 코딩서열을 포함한다. 모든 프로브는 길이가 약 200개 염기였으며 BlueScript SK+(Statagene, Inc., LaJolla, CA)의 SacI 부위 내로 클로닝되고, T3 측으로부터 전사되었다(선형화 후에). 유일한 예외는 TGF-β이며, 이는 974개 염기이고 pmT 벡터 내로 클로닝되었다.

C. RNase 보호 검정: 실험은 키트와 함께 제공된 프로토콜에 따라서 RPAⅡ 키트(Ambion, Inc., Austin, TX)를 사용하여 수행하였다. 프로브의 경우에, TGF-β1의 264개 염기쌍의 단편을 사람 신장 cDNA 라이브러리(Clonetech, Palo Alto, CA)로부터 PCR에 의해서 증폭시켰다. 사용된 프라이머 세트는 GCA GAA GTT GGC ATG GTA G(서열번호 25)(하부) 및 GGA CAT CAA CGG GTT CAC TA(서열번호 26)(상부)였다. 단편을 PFU 중합효소(Stratagene)로 재증폭시키고, 평활 말단을 pBluescript SK + 플라스미드(Stratagene)내로 연결시켰다. 안티센스 프로브를 T7 프로모터로부터 생성시켰다.

D. 면역형광분석: 신선한 신장을 제거하고, 3mm 두께 절편으로 절단하고, 티슈 테크 OCT(Tissue Tek OCT) 수성 화합물(product number 4583, Miles Laboratories, Elkhart, IN)에 포매시키고, -150℃ 냉동기에 넣어 동결시켰다. 절편을 마이크롬 타입 HM505N(Zeiss, Inc., Walldorf, Germany) 저온유지장치를 사용하여 3미크론으로 절단하고, 폴리-L-리신-코팅된 슬라이드 상에서 해동시켰다. 슬라이드는 기저막 콜라겐 특이적 항체로 염색하는데 사용되는 경우에는 냉각된(-20℃) 95% 에탄올에 침지시키거나, 기저막 관련 단백질에 특이적인 항체로 염색하는 경우에는 냉각된(20℃) 아세톤에 침지시킴으로써 15분 동안 고정시켰다. 슬라이드를 밤새 공기 건조시키고, 사용될 때까지 -80℃에서 건조 저장하였다.

샘플을 주위온도에 도달하게 하고, 이어서 실온에서 PBS(pH 7.4)로 3회 세척하였다. 타입 IV 콜라겐에 대한 항체로 염색하는 경우에, 조직을 0.1M 글리신과 6M 우레아(pH 3.5)로 전처리하여 단백질을 변성시키고 항원성 부위를 노출시켰다. 1차 항체의 적절한 희석액(실험적으로 측정됨)을 샘플에 가하고, 가습된 박스에서 5℃로 3시간 동안 반응시켰다. 항체를 PBS(pH 7.4)중의 5% 탈지 분유의 용액 내로 희석시켰다. 탈지 분유의 사용은 배경 형광을 실질적으로 감소시켰다. 샘플을 실온에서 각각 10분 동안 PBS(pH7.4)로 4회 세척하여 1차 항체를 제거하고, 이어서, 적절한 FITC-콘쥬게이션된 2차 시약과 반응시켰다. 모든 2차 시약을 희석제로서 PBS중의 7% 탈지 분유를 사용하여 1:100 희석액으로 사용하였다. 2차 시약을 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 슬라이드를 이어서 냉각된 PBS(pH7.4)로 4회 세척한 후에, 안티-페이드 마운팅 배지(anti-fade mounting media)(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 적용시켰다. 샘플을 투명한 손톱 광택제를 사용하여 유리 커버 슬립 하에 밀봉하였다. 슬라이드를 1000 배율로 사진 촬영하였다. 존스 실버 메텐아민 염색을 플라스틱 포매된 표본 상에서 수행하였다.

COL4A1 및 COL4A2에 대한 염소 항혈청을 서던 바이로테크놀로지(Southern Biotechnology, Inc., Birmingham, AL)로부터 구매하였다. 이러한 항체는 제조자에 의해 교차 반응성에 대해서 시험되었고, 이들 사슬에 대한 다른 항체 제조물에 대해서 관찰된 것과 일치하는 사구체의 염색 패턴을 생성시켰다[문헌: Miner and Sanes, J. Cell. Biol., 127:879-891, 1994]. 항-헤파린 술페이트 프로테오글리칸(HSPG) 항체는 EHS 마우스 종양으로부터 정제된 HSPG 코아 단백질에 대해서 생성된 랫트 모노클로날 항체이다. 항체는 제조자(Chemicon International, Temecula, CA)에 의해 웨스턴 블롯 및 도트 블롯 면역검정 및 문헌[문헌: Horiguchi et al., J. Histochem. Cytochem., 37:961-970, 1989]에 기재된 바와 같이 라미닌, 콜라겐 타입 IV, 피브로넥틴, 및 엔탁틴과의 교차 반응에 대해서 시험되었다. 항-라미닌-1 항체는 토끼 항혈청이다. 면역원은 EHS 기저막으로부터 정제되었고 시그마 이뮤노케미칼스(Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO)로부터 구매하였다. 제조자(Sigma)에 의해 수행된 도트 블롯 면역검정으로 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 및 콘트로이틴 술페이트 타입 A, B, 및 C에 대한 교차반응성의 부재를 확인하였다. 항-피브로넥틴은 사람 혈장으로부터 정제된 피브로넥틴에 대해서 생성된 토끼 항혈청이다. 이러한 항 피브로넥틴은 제조자(Sigma Immunochemicals)에 의해 도트 블롯 면역검정을 사용하여 콜라겐 IV, 라미닌, 비트로넥틴, 및 콘드로이틴 술페이트 A, B, 및 C에 대한 교차 반응성에 대해서 시험되었다. 항-엔탁틴은 면역원으로서 EHS 유도된 엔탁틴을 사용하여 생성시킨 랫트 모노클로날 항체이다. 이러한 시약은 업스테이트 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Upstate Biotechnology Incorporated, Lake Placid, NY)로부터 구매하였으며, 웨스턴 블롯 분석에 의해서 다른 주요 기저막 성분과의 교차 반응성의 부재 뿐만 아니라 적절한 면역활성에 대해서 시험되었다[문헌: Ljubimov et al., Exp. Cell Res., 165:530-540, 1986].

면역형광 및 존스 염색된 이미지를, 어플라이드 이미징 사이토비젼 울트라 이미지 분석 시스템(Applied Imaging Cytovision Ultra image analysis system)(Applied Imaging Inc.)와 인터페이스된 올림프스 BH2 RFLA 형광현미경을 사용하여 기록하고 처리하였다. 이미지는 고분해능 흑백 비디오 카메라를 사용하여 포착하였다. 이들 이미지를 시스템 소프트웨어를 사용하여 변화시켰다. 이미지를 처리하는데 있어서, 현미경상에서 직접적으로 관찰된 형광에 아주 근접되도록 주의를 하였다.

E. 이뮤노퍼옥시다제 검출(Immunoperoxidase Detection): 이뮤노퍼옥시다제 검출 방법을 관상간극(tubulointerstitium)중의 피브로넥틴 및 콜라겐 타입 I 뿐만 아니라 사구체중의 TGF-β1에 대한 면역염색에 사용하였다. 콜라겐 타입 I 항체는 토끼 항-마우스이며, 바이오지너시스, 인코포레이티드(Biogenesis, Inc.)(Sandown, NH)로부터 구매하였다. 항혈청을 이뮤노퍼옥시다제 염색을 위하여 1:100 희석액으로 사용하였다. 사용된 피브로넥틴 항체는 면역형광염색에 대한 것과 동일한 항체를 사용하였으며(시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)로부터 얻은 토끼 항-사람 피브로넥틴 항혈청), 1:100 희석액으로 사용하였다. 2차 시약은 벡터 라보라토리즈(Vector laboratories)(Burlingame, CA)로부터 구매한 비오티닐화된 항-토끼 항체이며, 1:100의 희석액으로 사용하였다. 조직을 파라핀에 포매시키고(원위치 하이브리드화에 대해서 기재된 방법과 동일한 방법을 이용), 3미크론으로 절편화하였다. 파라핀을 제거한 절편을 100mM 트리스-HCl(pH 7.4)중의 5㎍의 프로테이나제 K(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)로 전처리하여 에피토프를 노출시켰다. 프로테이나제 소화는 PBS중의 2mg/ml 글리신중에서 30초 동안 인큐베이팅함으로써 중지시켰다. 왁스를 제거한 프로테이나제 K-처리 조직을 PBS로 3회 세척하고, 1차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 3회 세척하고, 이어서 비오티닐화된 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS(pH7.4)로 3회 세척한 후에, 슬라이드를 스트렙트아비딘 호스 라디쉬 퍼옥시다제(streptavidin horse radish peroxidase)(3㎍/ml, Vector Laboratories)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. PBS로 3회 세척한 후에, 항체 결합을 제조자에 의해 기재된 방법에 따라서 AEC 기질 시스템(Vector AEC SK-4200, Vector Laboratories)으로 현색시켰다.

TGF-β1의 경우에, 1차 항체는 PBS(모든 항체에 대해 희석제로서 사용되었다)중의 7% 탈지 분유로 1:15 희석액으로 사용된 치킨 α-사람 TGF-β1이었다. 이를 실온에서 3시간 이상 반응시켰다. 2차 항체는 TGF-β1(Vector Laboratories Burlingame, CA)에 대한 비오티닐화된 염소 항-치킨이었으며, 1:100 희석액으로 적용되었으며, 1시간 이상 동안 반응시켰다. 3회 세척 후에, 이뮤노퍼옥시다제 검출을 AEC 키트(Vector LAboratories, Burlingame, CA)를 사용하여 수행하였다.

실시예 1

앨포트/α1 인테그린 이중 돌연변이체의 생산

앨포트 증후군의 상염색체형에 대한 마우스 모델을 본 발명 이전에 기재된 문헌[Cosgrove et al., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996]에 기재된 바와 같이 COL4A3 프로콜라겐 유전자의 표적화된 돌연변이발생에 의해서 생성시켰다. 이러한 마우스 모델은 본원에서 "앨포트 마우스(Alport mouse)"라 일컬어지며, 접수 번호 2908로 바 하버, 메인(Bar Harbor, Maine)에 소재하는 잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories)로부터 입수가능하다. 129 Sv/J 배경 상태에 있는 이러한 α3(IV) 녹아웃 마우스를 교잡하여(순종 129 Sv에 이어서 순종 129 Sv인 인테그린 α1 무효 마우스로 5회 연속 역교잡), 97.5% 이상 순종 129 Sv인 "이중 녹아웃" 마우스를 생성시켰다. α1 녹아웃 마우스는 미국 캘리포니아 라졸라(LaJolla, CA)에 소재하는 스크립스 인스티튜트(Scripps Institute)의 험프레이 가드너(Humphrey Gardner)에 의해서 제공되었고, 문헌[Gardner et al., Dev. Biol., 175:301-313, 1996]에 기재되어 있다.

실시예 2

마우스 모델에서 앨포트 신장 질환 진행의 평가

본 실시예에서 연구된 마우스는 콜라겐 α3(IV)을 발현시키지 않으며 α1 인테그린에 대해서는 정상인 앨포트 마우스(잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine)로부터 얻음), 및 콜라겐 α3(IV) 또는 인테그린 α1을 발현시키지 않는 이중 녹아웃(즉, 이중 돌연변이체)을 포함한다. 이중 돌연변이체는 97.5% 129 Sv 및 2.5% Sv/J 배경이었다.

마우스로부터 일주일 간격으로 뇨를 수집하고, 단백질 분석을 방법 섹션에서 기재하고 있는 바와 같이 수행하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 콜라겐 α3(IV)을 발현시키지 않으며 α1 인테그린에 대해서 정상인 동물의 경우에, 단백뇨의 발증에 의해서 측정되는 앨포트 신장 질환 발병에 대한 평균 주령(6 마리에 대한 연구)은 3.5주 내지 4주였다. 단백뇨는 신속하게 진행하여, 6 내지 6.5주령에서 피크 수준에 도달하였다. 이러한 유전자형의 동물(9마리가 시험됨)은 9주령을 초과하여 생존하지 못했다. 혈액 우레아 질소 수준(BUN)은 7 내지 7.5주령에서 상승하였다. 이중 돌연변이체(4 마리가 이들 측정에 시험됨)에서, 단백뇨의 발증은 5 내지 5.5주령이었으며, 보다 서서히 진행되어, 9 내지 9.5주에 피크 수준에 도달하였다. 신부전증에 기인된 평균 사망 주령은 15주 내지 16.5주였다. 발병된 동물은 10 내지 11주령에서 BUN이 상승하였다.

실시예 3

이중 녹아웃 마우스 모델의 특성화

세 가지의 상이한 동물 세트(정상 대조군, α3(IV) 유전자를 발현시키지 않으며 α1 인테그린에 대해서 정상인 동물(앨포트 마우스), 및 이중 돌연변이체)를 많은 상이한 기술을 이용하여 4 내지 7주령에서 분석하였다.

투과 전자 현미경 분석을 수행하여 기저막 완전성을 평가하였다. 4주령(데이터는 기재되지 않음)에서, 앨포트 동복자는 100%의 사구체 모세관 루프(loop)중에서 희박화된 기저막을 나타냈다. 이중 돌연변이체는 약간의 사구체 기저막(GEM) 희박화(즉, 불규칙적인 비후, 박화, 및 분열)를 나타냈지만, 이는 드물고 거의 확장되어 있지 않았다. 이중 돌연변이체에서 약 20%의 사구체는 명백한 기저막 희박화를 전혀 나타내지 않았다. 이 시점에서 앨포트 마우스의 약 5%의 사구체는 섬유성이지만, 이중 돌연변이 동복자에서는 섬유성 사구체가 발견되지 않았다. 도 2는 7주령까지 이들 상이한 마우스의 사구체 기저막 손상 특성의 정도를 도시하고 있다. 전형적인 사구체 모세혈관 루프가 예시되고 있다. 이러한 발생 시점의 앨포트 마우스의 사구체 기저막은 사실상 모든 사구체에서 심하게 손상되어 있다. 도 2B에서 전체적인 불규칙적 비후 및 박화, 및 족세포 족돌기의 광범위한 소멸이 명백히 나타난다. 그러나, 이중 녹아웃에서는(도 2C), GBM은 대부분의 경우에 약간의 작은 불규칙성 이외에는 초미세구조적으로 정상이며, 족세포의 족돌기는 정상의 구조를 유지한다(도 2A의 정상 마우스에 대해서 화살표로 나타낸 영역을 도 2C에서의 이중 녹아웃 마우스와 비교). 이러한 시점에서, 앨포트 마우스에서 30% 내지 50%의 사구체가 섬유성인 반면, 이중 돌연변이 동물에서는 5% 미만이 섬유성이었다.

7주령 마우스의 주사 전자 현미경 분석(데이타는 기재되지 않음)은 앨포트 마우스가 족세포의 족돌기의 현저한 팽화를 나타내어, 이들 세포의 정상적으로 안정하고 복잡한 구조를 파괴하였음을 나타내었다. 이러한 족돌기의 소멸은 앨포트 사구체신염에 대해서 기재되어 왔다. 이중 돌연변이체에서는, 구조는 완벽하지 않지만, 대조 마우스의 사구체에서 관찰된 구조와 아주 유사하였다. 이러한 족돌기의 팽화는 사구체 필터의 차단을 초래하며, 요독증을 초래한다. 따라서, 이러한 발견은 앨포트 동복자에 비하여 이중 돌연변이체에서 사구체 기능 개선과 관련하여 현저하다.

7주령 마우스로부터 얻은 전체 신장의 파라핀 포매된 마운트를 존스 방법(Jones's Method)을 이용하여 염색하고 섬유성 사구체의 총수를 계수하였다(데이터는 기재되지 않음). 실질적으로는 앨포트 마우스의 모든 사구체는 어느 정도 영향을 받았다. 대부분은 사구체 과세포충실성 및 메산쥼 매트릭스의 확장을 나타내었고, 약 1/3이 섬유성이었다. 반면, 이중 돌연변이 마우스의 사구체는 메산쥼 매트릭스 및 세포충실성에 관해서 대개 정상이었다. 약 25%는 메산쥼 세포 증식의 증거를 나타냈고, 5%는 섬유성이었다. 분석을 두 가지의 상이한 마우스 세트에서 반복하여 매우 유사한 결과를 얻었다.

면역형광 분석을 동일한 동물로부터 얻은 동결된 신피질을 사용하여 수행하였다. 이러한 조직을 앨포트 신장 질환 진행과 관련하여 GBM에서 축적되는 것으로 공지된 단백질에 특이적인 항체와 반응시켰다. 이들에는 라미닌-1(Lam-1)(1:200 희석액으로 사용됨), 콜라겐 α1(IV) 및 α2(IV) 사슬(COL 4A1,2)(1:15 희석액으로 사용됨), 피브로넥틴(Fib)(1:200 희석액으로 사용됨), 헤파린 술페이트 프로테오글리칸(HSP)(1:100 희석액으로 사용됨), 및 엔탁틴(ent)(1:200 희석액으로 사용됨)이 포함된다. 모든 항체를 PBS 중의 7% 탈지 분유로 희석하였다. 결과를 도 3에 도시한다. 7주령에서, 모든 이들 성분은 대조군에 비하여 앨포트 마우스의 GBM에서 현저하게 상승하였다. 섬유성 사구체에서는, 모든 이들 성분이 풍부하였다. 이중 돌연변이체에서, 콜라겐 α1(IV) 및 α2(IV) 사슬에 대한 면역염색은 비섬유성 사구체에서 앨포트 마우스에 대한 면역염색과 대등하였다. 이러한 사항은, 이중 돌연변이체에서 GBM의 타입 IV 콜라겐 조성이 앨포트 마우스에서의 조성(즉, 오직 콜라겐 α1(IV) 및 α2(IV) 사슬만을 포함)과 동일하기 때문에 예측된 것이다. 라미닌-1 및 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대한 염색은 앨포트 마우스에 비하여 이중 돌연변이체의 GBM에서 현저하게 감소하였고(도 3F를 도 3E와, 도 3L을 도 3K와 각각 비교), 이중 돌연변이의 GBM에서 피브로넥틴에 대한 명확한 염색은 없었고(도 3I), 이것은 앨포트 마우스의 GBM에서 풍부하였다(도 3H). 이들 단백질에 대한 메산쥼 매트릭스에서의 면역염색은 이중 돌연변이체와 앨포트 마우스 사이에서 대등하였지만, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸의 경우에, 메산쥼 염색은 정상의 대조(도 3J) 또는 앨포트 마우스(도 3K)에 비하여 이중 돌연변이체(도 3L)에서 감소하였다.

노던 블롯 분석은 7주령 정상 마우스, 앨포트 마우스 및 이중 돌연변이 마우스의 전체 신피질로부터 분리된 RNA를 사용하여 수행하였다. 20㎍의 각각의 RNA 샘플을 아가로즈 겔에서 분별시키고, 모세관 블롯에 의해서 나일론으로 옮기고, 일부의 마우스 TGF-β1 cDNA에 상응하는 방사성 표지된 프로브에 하이브리드화시켰다. 일련의 높은 엄격성 세척 후에, 막을 X-레이 필름에 노출시켰다. 도 9는 TGF-β1이 앨포트 마우스(대조군인 왼쪽으로부터 두 번째 레인과 비교하여 왼쪽으로부터 4번째 레인)에서는 유도된 반면, α1 인테그린 돌연변이(이중 녹아웃)(대조군인 왼쪽으로부터 두 번째 레인과 비교하여 왼쪽으로부터 세 번째 레인)를 갖는 앨포트 마우스에서는 유도되지 않음을 나타내고 있다. 이 데이터는 본 연구자들이 α1 저해제의 효과가 TGF-β1의 억제에 의해서 조정될 수 있는지를 추측하게 하였다. 따라서, 이하 기재되고 있는 TGF-β1 저해제 실험은 이러한 문제를 명백히 밝혀내기 위하여 수행하였다.

실시예 4

단백뇨 이후 앨포트 신장 질환 진행에서 TGF-β1의 역할

조직은 129 Sv/J 파운더(founder) 동물을 C57B1/6 배경으로 F-2 역교배하여 얻었다(상기 참조). 실험은 2회 이상 수행하였다(두 가지의 상이한 동물 세트로부터 얻은 표본에 대하여 수행). 본원에 기재된 데이터에 대한 결과는 명백하며 일관되었다.

이들 실험은 두가지 점을 예증하기 위하여 수행하였다. 첫 번째는 앨포트 신장 질환 진행과 관련하여 축적되는 매트릭스 단백질을 엔코딩하는 mRNA 및 TGF-β1 mRNA의 유도 사이에 일시적인 상호관련이 있는가이며, 두 번째는 이들 mRNA가 사구체에서 실질적으로 유도되는가 하는 것이다(신장의 습윤 중량의 단지 5%가 사구체이기 때문에, 전체 신피질중의 특이적 mRNA의 유도가 진행성 섬유증 및 사구체신염의 문제와 더욱 관련이 있다).

6주령에서 시작하여 12주령까지 2주 간격으로 앨포트 동물과 대조 동복자의 신장으로부터 전체 RNA를 분리하였다. 본 연구에 사용된 F2 마우스에서의 단백뇨는 마우스가 약 5.5 내지 6주령일 때 시작되었다(데이터는 기재되지 않음). RNA를 변성된 아가로즈 겔 상에서 분별시키고, 나일론 지지체로 옮기고, α1(IV) 또는 α2(IV) 콜라겐 사슬, 엔탁틴, 라미닌 β1 또는 β2 사슬, 피브로넥틴, 또는 TGF-β1에 특이적인 방사성 표지된 프로브로 프로빙하였다. 도 4에서의 결과는 라미닌 β1을 제외하고는 상기 모든 단백질에 대한 mRNA가 앨포트 마우스 모델에서의 단백뇨의 발증 후에 유도됨을 예시한다.

상기와 동일한 시간경과에 대한 노던 블롯을 라미닌 α1, 라미닌 β2, 라미닌 γ1, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 코아 단백질, 및 콜라겐 α4(IV), 및 α5(IV) 사슬(데이터는 기재되지 않음)에 대해서도 수행하였다. 이들 다른 기저막 단백질에 대한 mRNA 수준의 유의차는 대조군을 돌연변이체와 비교하는 경우 명백하지 않았다.

노던 분석의 결과는 시간경과 동안 특이적 mRNA 발현의 상대적인 변화를 직접적으로 정량하는 인영상기를 사용함으로써 분석되었다. 도 5는 특이적 mRNA 수준의 유도가 6주령, 또는 비뇨기 공간내의 단백질이 F2 마우스에서 최대수준에 달하는 시간 부근에서 최초로 나타남을 예시하고 있다[문헌: Cosgrove et al., Genes Dev., 10:2981-2992, 1996]. 8주까지, mRNA 수준이 피크가 되며, TGF-β1과 피브로넥틴을 엔코딩하는 mRNA는 각각 대조군의 마우스에 비해서 6.6 배 및 9.4배 더 유도되었다. 콜라겐 α1(IV), α2(IV), 및 엔탁틴에 대한 mRNA 수준은 모두 8주까지 3배 유도되었다. 반면, 라미닌 β1 및 β2 사슬을 엔코딩하는 mRNA의 현저한 변화는, 동일한 전체 RNA 노던 블롯에 의해서 측정될 때, 신장 질환 진행중의 어느 시점에서도 관찰되지 않았다.

TGF-β1 또는 상이한 기저막 성분을 엔코딩하는 mRNA가 특정의 사구체 세포유형에서 유도되었는지를 시험하기 위해서, mRNA에 특이적인 디곡시게닌-표지된 안티센스 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드화를 수행하였다. PBS중의 4% 파라포름알데히드에 의한 심장 관류 후에 10주령 F2 앨포트 마우스 및 정상의 대조 동복자로부터 신장을 수집하여, 방법 섹션에 기재된 원위치 하이브리드화 분석을 위해서 처리하였다. 안티센스 프로브는 콜라겐 α1(IV), TGF-β1, 피브로넥틴, 엔탁틴, 또는 라미닌 β1 사슬의 NC1 도메인에 특이적이었다. 세균 β-갈락토시다제에 특이적인 프로브를 비특이적 결합에 대한 대조(음성 대조)로서 사용하였는데, 그 이유는 이러한 프로브가 노던 블롯(데이터는 기재되지 않음)상에서 전체 마우스 신장 RNA에 하이브리드화되지 않았기 때문이다. 대조 프로브를 각각의 특이적 프로브와 동일한 시간에서 하이브리드화시키고, 하이브리드화 과정 후에 동일한 농도의 RNase A로 처리하였다. RNase A 처리를 α1(IV), TGF-β1, 및 피브로넥틴에 대해서는 0.25㎍/ml으로 수행하였고, 엔탁틴 및 라미닌 β1에 대해서는 3㎍/ml로 수행하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6의 결과는, 시험된 모든 특이적 mRNA에 대하여, COL4A3 녹아웃 마우스(앨포트 마우스)의 사구체의 내장 상피 세포(족세포)에서 상승된 수준이 명백하게 관찰됨을 예시하고 있다. 콜라겐 α1(IV) 사슬의 경우에, 대조에서 mRNA의 발현이 사구체의 메산쥼 세포 및 내피 세포 둘 모두에서 관찰되는데(도 6A), 이러한 결과는 이들 분자가 성숙한 동물에서 국재되어 있는 곳과 일치하고 있다. 돌연변이체에서는, 대조 샘플의 메산쥼 세포 염색과 비교하여 보다 어둡게 염색되는 것으로 입증되는 바와 같이, 메산쥼 매트릭스에서 발현이 상승될 수 있지만, 대조 및 돌연변이체 사이의 가장 명백한 차이는 족세포에 상응하는 사구체의 외부 경계선에 늘어선 염색된 세포의 고리이다(도 6B). 대조 사구체에서 피브로넥틴 발현은 메산쥼 세포에서 주로 관찰되었다(도 6D). 메산쥼 세포의 염색이 또한 돌연변이체에서 관찰되지만, 족세포는 현저한 수준의 피브로넥틴 mRNA를 명백하게 발현하고 있다(도 6E). TGF-β1의 발현은 대조 동물의 사구체에서 아주 약하지만, 약간의 특이적 염색이 대조 동물의 메산쥼 세포에서 관찰된다(도 6G). 돌연변이체에서, TGF-β1 mRNA 수준은 메산쥼 세포, 내피세포, 및 또한 족세포에서 현저하게 상승되었다(도 6H). 엔탁틴의 경우에, mRNA가 대조군의 족세포에 국재화되는데, 이는 이 단백질이 GBM에 특이적으로 국재화되어 있기 때문에 예측할 수 없는 것은 아니었다. 우연히도, 약간의 메산쥼 세포 특이적 염색이 대조군 동물에서 관찰된다. 돌연변이체에서 내장 상피 세포의 염색이 상승된 발현을 나타내는 듯하지만, 이러한 사항은 정량적인 검정이 아니며, 대조와 돌연변이체 사이의 차이가 너무 작아 명확하지 않다(도 6J를 도 6K와 비교).

노던 블롯은 라미닌 β1 사슬에 대한 mRNA 수준이 시간 경과에 따라 시종일관 대조 대 돌연변이체에서 변화되지 않았음을 나타냈다. 이러한 동일한 메시지에 대한 원위치 하이브리드화 분석은 대조 신장의 사구체에서 예측되는 메산쥼 세포 특이적 국재화를 예시하였다(도 6M). 그러나, 돌연변이 마우스의 사구체에서는, mRNA가 내장 상피 세포에서 명백하게 유도된다(도 6N).

조직 샘플을 3주령 및 5주령에서 수거하고, 동일한 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드화에 의해서 분석하였다. 이들 사구체에서의 염색 패턴은 정상의 동복자 패턴과는 식별할 수 없었다(데이터는 기재되지 않음). 이러한 결과는 족세포에서의 이들 유전자의 활성화가 단백뇨의 개시 후에 발생됨을 시사한다.

사이토카인의 활성 이소형에 특이적인 항체를 사용한 이뮤노퍼옥시다제 검출에 기초한 TGF-β1 단백질 데이터는 TGF-β1 mRNA에 대한 원위치 하이브리드화 분석에 의해서 얻은 데이터를 입증한다(도 7B의 면역염색을 도 7A와 비교). 이러한 결과는 족세포내의 TGF-β1 mRNA의 상승된 발현이 상승된 단백질로 번역됨을 설명하고 있다.

RNase 보호 분석은 사이토카인에 대한 mRNA 수준이 앨포트 환자 대 대조 환자의 사람 신피질에서도 상승되는지를 측정하기 위해서 수행하였다. 사람 앨포트 신피질을 15세 소년으로부터 이식수술 동안 제거하였다. 표본은 중간 수준으로 난절(scarification)하였으며, 약 50%의 사구체 섬유증이 있었다. 표본을 즉시 옮겨 액체 질소중에서 스냅 동결시켰다. 정상인의 신장 RNA은 클론테크(Clonetech, Palo Alto, CA)로부터 구매하였고, 정상인 공급원 컬렉션으로부터 풀링된 샘플이었다. 앨포트 표본으로부터 얻은 RNA를 마우스 신장에 사용된 방법과 동일한 방법을 사용하여 분리하였다. RNA를 아가로즈 겔 상에서 10㎍으로 분별시키고 에티듐 브로마이드로 겔을 염색(물 중의 10㎍/ml)함으로써 완전성에 관하여 시험하였다. 정상 샘플 및 앨포트 샘플 모두는 28S 및 18S 리보솜 RNA 밴드의 상대적인 양을 기준으로 손상이 없었다. RNase 보호 시험을 상기 방법에 따라서 수행하였다. 도 8의 데이터는 대조군과 비교하여 사람 앨포트 신피질에서 TGF-β1 mRNA가 3 내지 4배 상승함을 예시한다. 이러한 결과는 사이토카인이 사람 앨포트 신장에서도 과발현되고 있음을 입증한다. 이러한 데이터는 본 기술이 인체에 적용될 가능성을 실증하고 있다.

실시예 5

α1β1 인테그린을 차단하기 위한 중화 항체의 용도

리간드와 α1β1 인테그린의 상호작용을 차단할 수 있는 가용성 약제가 앨포트 신장 질환 발병에 대해 α1 유전자 녹아웃 돌연변이와 동일한 효과를 초래할 수 있음을 설명하고자 하는 예로서, 문헌[Fabbri et al., Tissue Antigens, 48:47-51, 1996]에 기재된 항체를 얻었다. 이러한 항체를 2주령에서 시작하여 앨포트 마우스내로 주사(400ng/주사, 주 3회, 복강내)하였다. 동물을 6주령에 모아서, 기저막을 투과 전자 현미경으로 분석하였다. 도 10에서 입증되고 있는 바와 같이, 이들 처리된 동물의 기저막은 대개 규칙적이며, 정상의 3층 외관을 가지고 있었다. 항체에 대한 면역반응에 기인하는 내피 세포 팽화가 관찰되었다. 이들 결과는 인테그린 α1β1 수용체를 차단하는 가용성 약제가 이중 녹아웃 마우스 계통에서 관찰되는 바와 동일한 방식으로 앨포트 GBM 질환 진행을 지연시킬 것임을 설명하고 있다.

실시예 6

앨포트(129 Sv/J) 마우스 모델에서 TGF-β1 억제 단독의 효과

실험 프로토콜은 FK506(2㎍/체중g, 복강내 주사, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan), 또는 가용성 TGF-β1 수용체(25㎍/주사, 꼬리 정맥을 통하여 정맥내 주사, Biogen Inc., Cambridge, MA)을 3주령에서 시작하여 주 2회 주사하는 것이었다. 신장을 7주령에서 수집하여 기재된 분석을 실시하였다.

다양한 조건하에서 기저막의 초미세구조에 대한 투과 전자 현미경 분석이 도 11에 도시되어 있다. 도 11A는 정상의 미처리 동물로부터 얻은 사구체 모세혈관 루프를 나타낸다. 규칙적인 족돌기와 3층 기저막 염색에 주목해야 한다. 도 11B는 전형적인 7주령 129Sv/J 앨포트 마우스의 모세혈관 루프를 나타낸다. GBM의 팽화된 족돌기 및 전체적인 소상 비후(gross focal thickening)에 주목해야 한다. 도 11C는 FK506으로 처리된 7주령 앨포트 마우스의 전형적인 모세혈관 루프를 예시하는 도면이다. 기저막 비후가 없음이 명백하며, 이는 약물이 GBM에서 매트릭스 축적율을 감소시키는 것을 시사한다. 그러나, 족돌기 구조의 명백한 결핍과 함께 족돌기의 현저한 정도의 팽화가 존재한다. 동일한 결과가 TGF-β1 가용성 수용체를 주사한 마우스에서 관찰된다(도 11D). 이러한 데이터는 TGF-β1 저해제가 불규칙적인 GBM 비후를 억제할 수 있지만, 진전된 앨포트 GBM 질환과 관련된 족돌기 구조에서의 변화를 억제할 수 없음을 예시한다.

일부의 신장 표본을 주사 전자 현미경으로 관찰하였다. 사구체를 신피질의 동결 파쇄에 의해서 노출시키고, 보우만 캡슐(Bowman's capsule)을 제거하여, 사구체의 모세혈관 루프르 덮고 있는 족세포의 외층을 노출시켰다. 정상의 사구체는 도 12A에 예시되고 있으며, 도 12A에서 족세포의 복잡한 구조는 분지된 족돌기가 모세혈관 루프 주위를 둘러싸고 있다는 명백한 증거이다. 전형적인 7주령 앨포트 마우스에서, 사구체의 족세포 표면은 미세한 필라멘트성 가지가 팽화에 의해 소실되어 명백하게 결여되어 있다(도 12B). TGF-β1에 대한 가용성 수용체 또는 FK506으로 처리된 앨포트 동물에서, 사구체 표면은 미처리된 앨포트 마우스의 사구체 표면과 매우 동일하다(도 12C). 이러한 결과는 TGF-β1만의 차단은 진전된 앨포트 사구체 질환과 관련된 족돌기 구조의 변화에 대하여는 방지하지 않음을 명백하게 입증하고 있다.

단백뇨는 약물 처리 동안 일주일 간격으로 수집한 동결건조된 뇨의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 측정하였다. 상기한 바와 같이, 뇨중의 알부민의 존재 및 다량의 알부민은 사구체 필터의 완전성에 대한 종합적인 평가를 제공한다. 도 13은 TGF-β1 저해제의 투여가 단백뇨의 발증을 지연시키지만, 뇨중 알부민의 높은 수준으로의 진행은 매우 신속(1주일)하게 발생됨을 설명하고 있다. 이러한 결과는 TGF-β1 저해제가 단독으로 사용되는 경우 단백뇨의 발증은 지연시키지만 사구체 필터를 개선시키지는 않음을 시사한다. 이러한 특성은 이들 저해제가 상기기재되고 도 11 및 도 12에 설명되고 있는 족세포의 족돌기 소멸을 방지하지 못하는 것과 직접적으로 관련되는 듯하다.

정상의 동복자에게 약물을 투여한 결과 주사하지 않은 정상의 마우스와 비교할 때 식별가능한 차이가 없었음에 주목해야 한다.

실시예 7

이중 녹아웃 (DKO) 마우스에 대한 TGF-β1 저해제의 효과

마우스(콜라겐 α3(IV) 및 인테그린 α1 유전자 양자 모두가 없는 DKO 마우스)에게 약 4주령에서 시작하여 TGF-β1 저해제 FK506(2㎍/체중g, 주 2회, 복강내 주사) 또는 비오겐사의 TGF-β1 가용성 수용체(주사당 25㎍, 주 2회, 정맥내 주사)을 주사하였다. 신장을 약 10주령에서 수집하여 분석하였다. 10주령 시점을 선택한 것은, 이중 녹아웃에서 질환이 전형적으로 GBM의 현저한 불규직적인 비후가 관찰되는 정도까지 진행되고, 동물이 말기의 신부전증으로 진행되기 시작하기 때문이다. 따라서, TGF-β1 저해제가 추가의 보호 잇점을 제공한다면, 이러한 잇점은 GBM 질환 진행의 말기에 명백할 것이다. 투과 전자 현미경 분석은 저해제를 주사한 마우스와 미처리된 이중 녹아웃 마우스 사이에서 아주 명백하고 일관된 차이를 나타냈다. 이러한 차이의 전형적인 예는 도 14에 설명되어 있다. 도 14B는 10주령 이중 녹아웃 마우스에서의 사구체 모세혈관 루프의 전형적인 특징을 설명하고 있다. 주목할 만한 사항은 앨포트 사구체신염 진행에 특징적인 기저막 비후의 현저한 포켓이다. 족세포의 족돌기는 진행되는 질환 상태에서도 잘 발육된 슬릿 횡경막과 함께 고도의 규칙적인 구조를 지니고 있다. 이중 녹아웃 마우스의 이러한 특성은 앨포트 마우스에서는 없는 특성이다(족돌기를 도 12B에 도시된 족돌기와 비교).

이중 녹아웃 마우스가 TGF-β1 저해제로 처리되는 경우에, 소상 GBM 비후 및 족돌기 소멸의 현저한 감소가 있었다(도 14C는 FK506으로 처리된 마우스이며, 도 14D는 가용성 TGF-β1 수용체로 처리된 마우스이다). 대부분 사구체의 GBM은 완전하게 정상인 초미세구조를 지니지 못하지만(도 14D에서 명백한 중간의 GBM 불규칙성에 주목), 이 발생 단계에서 미처리된 이중 녹아웃 동물(도 14B)의 대부분의 사구체 모세혈관 루프에서 명백한 GBM 비후의 현저한 포켓이 완전히 결여되어 있다. 이러한 방식으로 시험된 약 25%의 사구체에서, TGF-β1 저해제는 DKO 사구체가 정상의 마우스의 사구체와 구별될 수 없을 정도로 사구체 초미세구조를 회복시켰다(도 15A는 10주령 정상 마우스의 GBM을 나타내며; 도 15B는 FK506으로 처리된 10주령 이중 녹아웃의 GBM을 나타낸다). 이러한 결과가 비조작된 앨포트 동물 모델에서 말기 신부전의 평균 주령의 2주 후라는 것을 검토하여 보면, 이러한 결과는 실제로 독특하고 놀라운 발견이다.

단백뇨는 이들 동일한 마우스에서 치료 동안 매주 수집하여 시험하였다. 샘플(1㎕의 약 1/2과 동일)을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해서 분석하였다. 알부민을 쿠마시 블루로 염색하여 가시화시켰다. 도 16에 나타낸 결과는 FK506(도 16D) 또는 TGF-β1에 대한 가용성 수용체(도 16B)에 의한 두 처리 모두가 미처리된 이중 녹아웃 마우스(도 16A)에 비해서 사구체 필터의 성능을 상당히 개선시킴을 설명하고 있다. 도 16C는 FK506으로 처리된 정상 마우스에 대한 뇨중 단백질을 나타낸다. 주목할 만한 사항은 FK506으로 처리된 DKO 마우스(도 16D) 및 정상 마우스 둘 모두에서 모든 시점에서 명백한 확산 군의 밴드이다. 이러한 결과는 약물로 처리된 마우스에서 항상 관찰되며, 이는 이식 후에 약물로 처리된 일부 환자에서 보고된 신독성 효과와 관련되는 듯하다[문헌: Solez et al., Transplantation, 66:1736-1740, 1998].

실시예 8

앨포트 사구체신염의 발병 및 진행을 지연시키는 α1 인테그린 차단제 및 TGF-β1 저해제의 상승효과에 대한 메카니즘

도 11, 도 12 및 도 14에 예시된 데이터에서는, α1 인테그린 차단제가 TGF-β1 차단제와 상승 작용하는 이유는 α1 저해가 개선된 족세포 족돌기 구조를 유도하는 반면, TGF-β1 저해는 GBM에서 매트릭스 침착 감소를 유도하기 때문임을 시사한다. 도 17은 족세포 족돌기 구조를 개선시키는데 있어서의 α1 인테그린 차단제의 역할을 보다 실증하기 위하여 제공된다. 신피질은 도 12에 설명된 것과 동일한 방식으로 제조하였다. 도 17A는 7주령 정상 마우스로부터 얻은 사구체의 표면을 도시하고 있다. 도 17B는 7주령 앨포트 마우스로부터 얻은 사구체를 도시하고 있다. 족돌기 소멸에 기인된 족세포 구조의 상실에 주목해야 한다. 도 17C는 7주령 이중 녹아웃 마우스로부터 얻은 사구체의 표면을 도시하고 있다. 정상 족돌기 구조의 거의 완벽한 회복에 주목해야 한다. 이들 데이터는 족돌기가 이중 녹아웃 마우스에서 우수한 형태를 나타내는 도 14B에 도시된 투과 전자 현미경에 의해서 제공된 횡단면도와 일치되고 있다.

실시예 9

α1 인테그린 차단 효과

상기 현상에 대한 가능한 메카니즘을 시험하는데 있어서, 라미닌 사슬을 평가하였다. 사구체 기저막에서 발견되는 주된 라미닌은 라미닌 11이라는 것이 공지되어 있기 때문에[문헌: Miner et al., J. Cell Biol., 137:65-701, 1997], 앨포트 GBM에서 새로운 라미닌의 출현은 GBM에 대한 족세포 결합 상실의 원인이 될 수 있는 것으로 생각되었다. 사실, 앨포트 GBM의 라미닌 조성을 시험하는 경우, 정상의 마우스에서 정상적으로는 메산쥼 매트릭스에만 배타적으로 국재화되는 라미닌 α2 사슬이 앨포트 마우스의 GBM에서 발견되었다. 도 18은 이중 형광 표지화 프로토콜을 이용하여 면역염색된 일련의 사구체 패널을 도시하고 있다.

이중 형광 분석에서, 신선한 신피질을 티슈 테크(Tissue Tek) 수성 포매 화합물에 포매시키고, 스냅 동결시켜 저온유지장치에서 4미크론으로 절단하였다. 슬라이드를 냉각된 (-20℃) 100% 아세톤에서 10분 동안 후고정시키고, 이어서 밤새 공기 건조시켰다. 조직을 PBS중에서 각각 10분 동안 3회 세척함으로써 재수화시켰다. 1차 항체를 함께 7% 탈지 분유(BioRad)로 희석시켰다. 항-엔탁틴 항체(Chemicon Inc.)를 1:200의 희석액으로 사구체 기저막에 대한 공지된 마아커로 사용하였다. 라미닌 α2 사슬 특이적 항체는 피터 유르첸코 박사(Dr. Peter Yurchenco, Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ)로부터 얻었다. 라미닌 α2 사슬에 대한 이러한 항체의 특이성은 문헌[Cheng et al., J. Biol. Chem., 272:31525-31532, 1997]에 설명되어 있다. 항체는 1:10의 농도로 사용하였다. 1차 항체를 가습된 디쉬 중에서 4℃에서 밤새 반응시켰다. 슬라이드를 냉각된 PBS 중에서 10분 동안 3회 세척한 다음, 함께 첨가한 2차 항체와 반응시켰다. 2차 항체는 라미닌 α2의 경우 텍사스 레드-콘쥬게이션된 항-토끼, 엔탁틴의 경우 FITC-콘쥬게이션된 항-랫트이었고, 이들 둘 모두 1:100 희석액(Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 사용하였다. 2차 시약을 4℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 슬라이드를 PBS로 각각 10분 동안 3회 세척하고, 한방울의 벡타쉴드 항-페이드 마운팅 배지(Vectashield anti-fade mounting media)(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 글래스 커버슬립 하에서 밀봉하기 전에 적용시켰다. 각각의 항체에 대한 이미지를 사이토비젼 울트라 이미지 분석 시스템(Cytovision Ultra image analysis system)(Applied Imaging, Inc.)과 인터페이스된 BH-2 에피형광분석 현미경을 사용하여 디지털적으로 오버레이시켰다.

사구체 기저막 특이적 항원(엔탁틴)은 녹색이지만, 라미닌 α2 사슬은 붉은색이다. 반면, 엔탁틴 및 라미닌 α2 공동 국재화 염색은 황색이다. 도 18의 I군에서, 패널 A는 7주령 정상 마우스로부터 얻은 면역염색을 나타낸다. 여기서 라미닌 α2가 메산쥼 매트릭스에 배타적으로 국재화된다. 패널 B는 7주령 앨포트 동복자에서의 염색을 설명하고 있다. 화살표로 나타낸 모세혈관 루프는 뚜렷하게 황색으로 염색되어, 앨포트 마우스에서, 라미닌 α2가 메산쥼 매트릭스 및 사구체 기저막 모두에 국재화되어 있음을 설명하고 있다. 패널 C는 FK506으로 처리된 129Sv/J 앨포트 마우스의 사구체에서의 면역염색을 나타낸다(피질은 상기 실험에 사용되어 도 11, 도 12, 및 도 13에 표시된 동물로부터 얻었다). 여기서, 다시, 대부분의 사구체 모세혈관 루프는 황색이며, 이는 TGF-β1 활성의 저해가 앨포트 마우스의 GBM에 라미닌 α2의 축적을 방지하지 못함을 나타낸다. 그러나, 7주령 이중 녹아웃 마우스에서는, 사구체 모세혈관 루프에서 라미닌 α2 면역염색이 없었다(패널 D, 화살표). 족세포 표면상에서 우세한 인테그린 수용체는 인테그린 α3β1이다[문헌: Patey et al., Cell Adhesion and Communication, 2:159-167, 1994]. 이러한 인테그린은 대체로 GBM에 대한 족세포 결합 및 정상의 족돌기 구조의 유지에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다[문헌: Smoyer and Mundel, J. Mol. Med., 76:172-183, 1998]. 예를 들어, 인테그린 α3 유전자를 녹아웃시키면 족세포 족돌기 구조의 완전한 소멸이 초래되는 것으로 최근 밝혀졌다[문헌: Kreidberg et al., Development, 122:3537-3547, 1996]. 더욱 최근에는, 가용성 α3β1 인테그린 수용체가 생성되어, 고도의 친화도로 라미닌 α5 사슬 함유 라미닌(α5, β2, 및 γ1 사슬을 포함하는 이종삼량체인 라미닌-11과 유사)에 결합하지만, α2 사슬 함유 라미닌에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다[문헌: Eble et al., Biochemistry, 37:10945-10955, 1998]. 이러한 정보를 취합하면, 본원에 제공된 데이터는, 앨포트 마우스에서, GBM에 라미닌 α2 함유 라미닌의 점차적인 침착이 인테그린 α3β1 수용체를 통한 유착 감소를 초래하는 결과, 족돌기 소멸을 초래하는 모델을 지지한다. 인테그린 α1 사슬의 차단은 GBM에서 라미닌 α2 사슬의 침착을 감소 또는 소실시켜, 정상의 족돌기 구조의 소실을 억제한다.

이러한 점을 보다 더 실증하기 위해서, 정상의 동복자와 비교하여 2주령 Sv/J 앨포트 마우스에서 라미닌 α2 사슬 분포를 평가하였다. GBM 질환 진행의 이러한 매우 초기 단계에서, 사구체의 약 절반에 드물게 분포된 GBM 비후의 주목할 만한 "포켓(pocket)"이 있었다. 이러한 GBM 비후의 한 포켓이 도 19B에 도시되어 있다. GBM 및 족세포 족돌기는 이러한 발병 단계에서 사구체의 비환부 영역에서는 형태적으로 정상이지만, 소상 비후의 영역에서는, GBM 질환 발병의 보다 후기에 인식되는 보다 일반화된 변화와 같이, 족돌기가 팽화되고 소멸된다. 이는 라미닌 α2 침착이 족세포와 접촉된 소상 유착의 상실을 초래하는 경우, 2주령 앨포트 마우스에서 라미닌 α2의 소상 침착물이 관찰된다는 것으로 요약된다. 이는, 사실 도 18 Ⅱ군에 예시된 경우이다. 패널 B상의 화살표는 2주령 앨포트 마우스의 GBM에서 라미닌 α2의 소상 침착을 나타낸다. 이는 앨포트 마우스 모델에서 검출된 가장 초기의 분자적 변화(선천적인 유전자 돌연변이로부터 유발되는 타입 Ⅳ 콜라겐 조성의 변화 이외에)이며, 검출가능한 GBM 손상의 발증와 정확하게 상응한다.

실시예 10

TGF-β1 저해제의 α1 인테그린 차단제와의 상승 효과

도 3에 도시되고 있는 바와 같이, 앨포트 신장 질환 발병괴 관련하여 GBM 및 간질내에 축적되는 매트릭스에는 콜라겐 α1(IV) 및 α2(IV) 사슬, 피브로넥틴, 및 엔탁틴이 포함된다. 도 20(각 겔의 처음 두 레인)에 도시되어 있는 바와 같이, 각각의 이들 단백질을 엔코딩하는 mRNA는 정상의 대조군과 상대적으로 앨포트 신장에서 유도된다. TGF-β1 저해제의 주사는 유도의 정도를 실질적으로 감소시킨다(도 20에서 겔의 마지막 두 레인). 이는 TGF-β1 저해제로 처리된 Sv/J 앨포트 마우스에서 관찰된 기저막 비후 감소의 원인이 될 수 있다(도 11에 도시됨).

유사한 노던 블롯 세트가 TGF-β1 저해제로 처리되지 않거나 처리된 이중 녹아웃 마우스의 신장으로부터 얻은 RNA를 사용함으로써 수행되었다. 이에 사용된 마우스는 도 14에 나타낸 데이터를 유도하는데 사용된 마우스와 동일한 마우스이므로, 약물 주사 프로토콜은 실시예 7에 기재되어 있다. TGF-β1 저해제의 투여가 주사하지 않은 대조 마우스 대 이중 녹아웃 마우스에 비해서 매트릭스 단백질을 엔코딩하는 mRNA의 수준을 현저하게 변화시키지 않는다는 것은 도 21에 나타낸 데이터로부터 명백하다. 그러나, 프로브에 첨가할 메탈로프로테이나제 저해제 Timp-3를 엔코딩하는 mRNA의 발현에 대해서는 두드러진 효과가 있다(도 21, 마지막 줄). 레인 1 및 레인 2에서 입증되는 바와 같이, 대조 마우스와는 상대적으로 10주령 미처리 이중 녹아웃 마우스의 신장에서 Timp-3 발현에는 두드러진 감소가 있다(인영상 분석을 기준으로 9배 차이). Timp-3 발현의 이러한 감소는 FK506(레인 3 및 레인 4) 또는 TGF-β1 가용성 수용체(레인 5 및 레인 6)가 주사된 이중 녹아웃 마우스에서 관찰되지 않는다. Timp-3 발현에 대한 이러한 동일한 효과는 Sv/J 마우스(도 20, 마지막 줄)에서 관찰되었고, 이는 앨포트 마우스에서 Timp-3 mRNA의 억제를 저해시키는 능력은 α1 인테그린 및 TGF-β1의 이중 저해의 결과라기 보다는 TGF-β1 저해 저해제의 결과임을 예시한다.

이러한 관찰의 기능적인 중요성은 Timp-3이 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조절제라는 사실에 기초하며, 신장 기저막 항상성 및 질환중의 항상성의 상실에 중요한 인자인 것으로 시사되었다[문헌: Esposito et al., Kidney Int., 50:506-514, 1996; and Elliot et al., J. Am. Soc. Nephrol., 10:62-68, 1999]. Timp-3 메탈로프로테이나제 저해제의 발현 감소는 메탈로프로테이나제 활성의 상응하는 증가를 초래할 것이다. 이러한 증가는 기저막 손상을 유발하여, 매트릭스의 부수적인 축적과 함께 TGF-β1를 활성화시킬 수 있다. 이러한 사이클을 파괴하면 관찰되었던 GBM 형태의 회복에 의해서 나타나는 기저막 항상성을 회복시킬 수 있다(도 11, 도 14 및 도 15).

실시예 11

TGF-β1 저해제로 처리된 이중 녹아웃 마우스에서 간질성 섬유증의 억제

매트릭스 단백질의 상향조절 및 신장 섬유증에서 TGF-β1의 역할은 잘 입증되어 있다[문헌: Yand et al., J. Am. Soc. Nephrol., 5:1610-1617, 1994; Border and Ruoslahti, J. Clin. Invest., 90:1-7, 1992]. 이중 녹아웃 마우스에서, 신장 간질성 섬유증은 지연되지만, 약 10주령에서는 광범위하게 퍼졌으며, 약 15주령에서는 말기 신부전증으로 진행된다. TGF-β1 저해제를 주사한 동물을 간질성 섬유증에 대한 3개 마아커를 사용하여 분석하고, 저해제로 처리되지 않은 10주령 이중 녹아웃 동물과 직접 비교하였다. 실시예 7에서 도 14를 작성하기 위해 사용된 프로토콜과 동일한 프로토콜을 이용하여 동물에게 주사하였다. 도 22, 도 23 및 도 24의 경우에, 패널 A는 대조이며, 패널 B는 미처리된 이중 녹아웃이고, 패널 C는 FK506으로 처리된 이중 녹아웃이며, 패널 D는 TGF-β 가용성 수용체로 처리된 이중 녹아웃이다. 모든 이들 도면은 신피질의 저배율 50배 확대도이다. 도 22는 매트릭스의 표준 조직화학적 염색인 존스 실버 메텐아민 염색이다. 이는 매트릭스가 미처리된 마우스에서 신피질의 간질에 축적됨을 입증한다(패널 B를 패널 A와 비교). 그러나, TGF-β1 저해제로 처리된 동물의 신피질은 대조군과 구별 불가능하며 섬유증이 거의 없거나 없음을 나타냈다. 신장 간질성 섬유증에 대해서 일반적으로 사용된 분자 마아커는 콜라겐 타입 I 및 피브로넥틴을 포함한다[문헌: Yamamoto et al., Kidney Int., 45:916-927, 1994]. 도 23은 콜라겐 타입 I에 대한 면역염색을 예시하고 있다. 명백하게는, 콜라겐 타입 I은 미처리된 동물의 신피질의 간질에 축적된다(패널 B를 패널 A의 대조군과 비교). 도 23의 패널 B 및 C는 FK506 또는 가용성 수용체 각각으로 처리된 이중 녹아웃 마우스의 신장에서 콜라겐 타입 I 축적의 상대적인 부재를 예시하고 있다. 동일한 시나리오가 미처리된 이중 녹아웃(도 24B)의 피질, 및 대조와 유사하게 TGF-β1 저해제를 주사한 마우스(도 24 패널 C 및 D)의 신피질에 풍부한 피브로넥틴에 대해서 유효하다. 종합적으로는, 이들 데이터는 인테그린 알파 1 차단제와 병용한 TGF-β1 저해제가 앨포트 마우스 모델에서 간질성 섬유증을 방지(또는 지연)하는데 효과적임을 나타낸다.

본원에 참조되고 있는 모든 참조문헌, 특허, 특허출원, 및 공개문헌은 본원에 참조로 인용되고 있는 것이다. 당업자라면 본 발명이 특정의 구체예 및 실시예와 함께 상기되고 있지만, 본 발명이 제한되는 것이 아니며, 기재된 구현예, 실시예 및 용도와는 다른 다양한 구현예, 실시예, 용도, 변화 및 변형이 본 발명의 범 위를 벗어나지 않으면서 가능할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> BOYS TOWN NATIONAL RESEARCH HOSPITAL <120> USE OF a1B1 INTEGRIN RECEPTOR INHIBITORS AND TGF-B1 INHIBITORS IN THE TREATMENT OF KIDNEY DISEASE <130> 249.00010230 <140> PCT/US99/11073 <141> 1999-05-19 <150> 60/086,587 <151> 1998-05-22 <150> 09/088,766 <151> 1998-06-02 <150> 09/150,485 <151> 1998-09-09 <160> 26 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 tctgtggacc atggcttc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 ttctcatgca cacttggc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 ggctacctcc tggtgaag 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 ttcatgcaca cttggcag 18 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 cgggccacat tctcc 15 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 ggagtggccg ttgcatt 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 accagtacca aggcgga 17 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 tcattgagct tgttcagg 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 tagaggttat tttgcagcag a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 10 ttggatatcc tcatcagctt g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 11 gtggtttact ggacagacat c 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 12 ccaatctgtc caataaagg 19 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 13 acacactcca agcccacaaa agcaag 26 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 gagggaagac tccttgtagg tcaa 24 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 15 gcagagcggg cacggagc 18 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 16 tgtacctgcc atcctctcct g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 17 cccctatcta cacctacacc a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 18 tgtcactgtc cgccaaataa a 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 19 cagaagaaga gcctgaacca ca 22 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 20 gtaccacgcg caagaacc 18 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 21 ggtctacact attaagcaga tgaag 25 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 22 aaaattggag agcatgtcgg t 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 23 gcagaagttg gcatggtag 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 24 ggacatcaac gggttcacta 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 25 gcagaagttg gcatggtag 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 26 ggacatcaac gggttcacta 20

Claims (57)

1. α1β1 인테그린 수용체 저해제를 포함하는, 신장 질환을 억제하기 위한 약제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 신장 질환이 신장 사구체신염, 신장 섬유증, 또는 둘 모두를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 신장 사구체신염 또는 신장 섬유증이 앨포트 증후군, IDDM 신염, 메산쥼 증식성 사구체신염, 막증식성 사구체신염, 반월형 사구체신염, 당뇨병성 신병증, 또는 신장 간질성 섬유증과 관련됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
4. 제 1항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제가 신장 세포의 표면상의 α1β1 인테그린 수용체 결합 부위와 결합하는 α1β1 인테그린 수용체 차단제임을 특징으로 하는 약제 조성물.
5. 제 4항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 차단제가 펩티드, 중화 항체, 또는 단백분해성 단편을 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 펩티드가 라미닌, 피브로넥틴, 엔탁틴, 및 콜라겐 타입 4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질의 적어도 9량체인 단편임을 특징으로 하는 약제 조성물.
7. α1β1 인테그린 수용체 저해제를 포함하는, 인슐린 의존성 당뇨병에서 신장 질환 또는 앨포트 증후군의 발병 또는 진행을 지연시키기 위한 약제 조성물로서, α1β1 인테그린 수용체 저해제가 신장 세포 표면상의 α1β1 인테그린 수용체 결합 부위를 차단시키는 α1β1 인테그린 수용체 차단제인 약제 조성물.
8. 제 7항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 차단제가 펩티드, 중화 항체, 또는 단백분해성 단편을 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 펩티드가 라미닌, 피브로넥틴, 엔탁틴, 및 콜라겐 타입 4로 구성된 군으로부터 선택된 단백질의 적어도 9량체인 단편임을 특징으로 하는 약제 조성물.
10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 TGF-β1 저해제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
11. 제 10항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제 및 TGF-β1 저해제가 동시에 또는 순차적으로 투여됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
12. 제 10항에 있어서, TGF-β1 저해제가 TGF-β1과 비가역적으로 결합하여 TGF-β1 수용체와 결합하는 TGF-β1의 능력을 저해시킴을 특징으로 하는 약제 조성물.
13. 제 10항에 있어서, TGF-β1 저해제가 신호를 신장 세포의 핵으로 전환시키는 TGF-β1의 능력을 저해시킴을 특징으로 하는 약제 조성물.
14. 제 13항에 있어서, TGF-β1 저해제가 칼시누린 저해제임을 특징으로 하는 약제 조성물.
15. 제 14항에 있어서, 칼시누린 저해제가 타크롤리무스임을 특징으로 하는 약제 조성물.
16. 신장 세포의 α1β1 인테그린 수용체를 통한 신호 전환을 저해시키는 α1β1 인테그린 수용체 저해제를 포함하는, 인슐린 의존성 당뇨병에서 신장 질환 또는 앨포트 증후군의 발병 또는 진행을 지연시키기 위한 약제 조성물.
17. 칼시누린 저해제를 포함하는, 신장 섬유증을 억제하기 위한 약제 조성물.
18. 제 17항에 있어서, 칼시누린 저해제가 타크롤리무스임을 특징으로 하는 약제 조성물.
19. TGF-β1 활성을 감소시키는 약제를 포함하는, 앨포트 증후군 환자의 사구체 기저막(GBM)에 매트릭스 축적을 억제하기 위한 약제 조성물.
20. 마우스의 사구체 기저막에서 정상적인 콜라겐 타입 4 조성을 발현시키지 않고 α1β1 인테그린 수용체를 발현시키지 않는, 신장 질환용 마우스 모델.
21. 제 20항에 있어서, 마우스가 콜라겐 α3(Ⅳ), α4(Ⅳ), 및 α5(Ⅳ) 사슬을 사구체 기저막에 혼입시키지 않음을 특징으로 하는 마우스 모델.
22. 제 20항 또는 제 21항의 마우스 모델에 약제를 투여하는 단계를 포함하여, 신장 질환을 억제하기 위한 약제를 스크리닝하는 방법.
23. 유효량의 α1β1 인테그린 수용체 저해제를 포함하는, 신장 질환 환자에서 사구체 기저막의 불규칙성을 치료하기 위한 약제 조성물.
24. 제 23항에 있어서, 유효량의 TGF-β1 저해제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
25. 제 24항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제 및 TGF-β1 저해제가 동시에 또는 순차적으로 투여됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
26. 제 24항에 있어서, TGF-β1 저해제가 칼시누린 저해제임을 특징으로 하는 약제 조성물.
27. 제 26항에 있어서, 칼시누린 저해제가 타크롤리무스임을 특징으로 하는 약제 조성물.
28. 제 23항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제가 펩티드를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
29. 제 28항에 있어서, 펩티드가 항체임을 특징으로 하는 약제 조성물.
30. 제 23항에 있어서, 사구체 기저막의 불규칙성이 족세포 족돌기의 소멸을 초래함을 특징으로 하는 약제 조성물.
31. 제 24항에 있어서, TGF-β1 저해제가 키메라 뮤린 융합 단백질임을 특징으로 하는 약제 조성물.
32. 유효량의 α1β1 인테그린 수용체 저해제를 포함하는, 앨포트 증후군의 발병 또는 진행을 지연시키는 약제 조성물.
33. 제 32항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제가 펩티드를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
34. 제 33항에 있어서, 펩티드가 항체임을 특징으로 하는 약제 조성물.
35. 제 32항에 있어서, 유효량의 TGF-β1 저해제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
36. 제 35항에 있어서, TGF-β1 저해제가 칼시누린 저해제임을 특징으로 하는 약제 조성물.
37. 제 36항에 있어서, 칼시누린 저해제가 타크롤리무스임을 특징으로 하는 약제 조성물.
38. 제 35항에 있어서, TGF-β1 저해제가 키메라 뮤린 융합 단백질임을 특징으로 하는 약제 조성물.
39. 유효량의 α1β1 인테그린 수용체 저해제를 포함하는, 신장 질환의 발병 또는 진행을 지연시키기 위한 약제 조성물.
40. 제 39항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제가 펩티드를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
41. 제 40항에 있어서, 펩티드가 항체임을 특징으로 하는 약제 조성물.
42. 제 39항에 있어서, 유효량의 TGF-β1 저해제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
43. 제 42항에 있어서, TGF-β1 저해제가 칼시누린 저해제임을 특징으로 하는 약제 조성물.
44. 제 43항에 있어서, 칼시누린 저해제가 타크롤리무스임을 특징으로 하는 약제 조성물.
45. 제 42항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제 및 TGF-β1 저해제가 동시에 또는 순차적으로 투여됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
46. 제 42항에 있어서, TGF-β1 저해제가 키메라 뮤린 융합 단백질임을 특징으로 하는 약제 조성물.
47. 유효량의 α1β1 인테그린 수용체 저해제 및 TGF-β1 저해제를 포함하는 신장 질환의 발병 및/또는 진행을 상승적으로 지연시키기 위한 약제 조성물.
48. 제 47항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제가 펩티드를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
49. 제 48항에 있어서, 펩티드가 항체임을 특징으로 하는 약제 조성물.
50. 제 47항에 있어서, TGF-β1 저해제가 칼시누린 저해제임을 특징으로 하는 약제 조성물.
51. 제 50항에 있어서, 칼시누린 저해제가 타크롤리무스임을 특징으로 하는 약제 조성물.
52. 제 47항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제 및 TGF-β1 저해제가 동시에 투여됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
53. 제 47항에 있어서, TGF-β1 저해제가 키메라 뮤린 융합 단백질임을 특징으로 하는 약제 조성물.
54. 제 47항에 있어서, 신장 질환의 발병 및/또는 진행의 상승적 지연이 족돌기 소멸의 저해를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
55. 제 54항에 있어서, 신장 질환의 발병 및/또는 진행의 상승적 지연이 족세포 부착의 증가를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
56. 제 47항에 있어서, α1β1 인테그린 수용체 저해제가 족세포 족 돌기 구성을 개선하고 TGF-β1 저해제가 사구체 기저막의 매트릭스 축적을 감소시킴을 특징으로 하는 약제 조성물.
57. 제 47항에 있어서, 메탈로프로테이나아제 저해제 활성의 증가를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.

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