KR20230136686A - 알포트 증후군의 치료 방법 - Google Patents

알포트 증후군의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 miR-21에 대해 표적화된 수정된 올리고뉴클레오티드를 이용하는, 알포트 증후군의 치료 방법이다. 특정 구현예에서, miR-21에 대해 표적화된 수정된 올리고뉴클레오티드는 알포트 증후군을 앓고 있는 대상자의 신장 기능을 향상시키고/향상시키거나 섬유증을 감소시킨다. 특정 구현예에서, miR-21에 대해 표적화된 수정된 올리고뉴클레오티드 투여는 알포트 증후군을 앓고 있는 대상자의 말기 신장 질환의 발병을 지연시킨다. 특정 구현예에서, miR-21에 대해 표적화된 수정된 올리고뉴클레오티드는 알포트 증후군을 앓고 있는 대상자의 투석 또는 신장 이식의 필요성을 지연시킨다.

Description

알포트 증후군의 치료 방법{METHODS FOR TREATMENT OF ALPORT SYNDROME}
본 발명은 알포트 증후군의 치료 방법 및 알포트 증후군의 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
기저막의 주요 구성성분인 제4형 콜라겐은 6개의 알파 사슬인 알파-1 콜라겐(제4형), 알파-2 콜라겐(제4형), 알파-3 콜라겐(제4형), 알파-4 콜라겐(제4형), 알파-5 콜라겐(제4형) 및 알파-6 콜라겐(제4형)으로 이루어진 패밀리이다. 제4형 콜라겐의 알파-3, 알파-4 및 알파-6 사슬은 신장에 의한 혈액 여과라는 중요한 기능을 수행하는 사구체 기저막(GBM)의 콜라겐 그물망의 핵심적인 구성성분이다.
알포트 증후군은 비정상적인 유형의 사구체 기저막(GBM)이 생겨, 간질성 섬유증, 사구체 경화증 및 최종적으로 신장 기능의 상실로 이어지는 유전적 형태의 신장 질병을 의미한다. 이 질병은 또한 흔히 청각 장애 및 안구 이상을 특징으로 한다. 알포트 증후군은 각각 제4형 콜라겐의 알파3(제4형), 알파4(제4형) 및 알파5(제4형) 사슬을 암호화하는 Col4a3, Col4a4 또는 Col4a5의 돌연변이에 의해 유발된다. X 염색체 상의 Col4a5 유전자의 돌연변이는 X 연관형의 알포트 증후군을 유발하는데, 이는 이러한 질병의 모든 사례 중 85%를 차지한다. 상염색체 열성 형태는 Col4a3 또는 Col4a4 중 어느 하나의 각 카피의 돌연변이 유전에 의한 것으로, Col4a3 또는 Col4a4 각각은 2번 염색체 상에 위치한다. 드문 상염색체 우성 형태는 Col4a3 또는 Col4a4 유전자 중 어느 하나의 우성 음성 돌연변이 유전으로부터 기인한다. X 연관형은 여성보다는 남성에서 더 심각하며, 남성의 대부분의 사례에서 말기 신장 질환(end-stage renal disease, ESRD)으로 진행된다. 상염색체 형태는 남성과 여성에서 비슷한 중증도를 나타낸다. 이 질병의 대부분의 사례는 유전된 돌연변이로부터 기인하지만, 일부 사례는 Col4aA 유전자들 중 하나에서의 새로 발생한(de novo) 돌연변이 때문이다.
본 발명은 알포트 증후군을 앓는 대상자 또는 알포트 증후군 의심 대상자에게 12 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 수정된 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 알포트 증후군의 치료 방법에 관한 것으로, 이때, 수정된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 miR-21에 상보적이다. 특정 구현예에서, 대상자는 수정된 올리고뉴클레오티드 투여 전에 알포트 증후군을 앓고 있다고 진단된 바 있다. 특정 구현예에서, 대상자는, 수정된 올리고뉴클레오티드 투여 전에, 대상자의 신장 조직에서 증가된 수준의 miR-21을 나타냄이 확인되었다. 특정 구현예에서, 대상자는, 수정된 올리고뉴클레오티드 투여 전에, 대상자의 소변 또는 혈액에서 증가된 수준의 miR-21을 나타냄이 확인되었다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 알포트 증후군을 앓는 대상자 또는 알포트 증후군 의심 대상자에 대한 miR-21에 상보적인 수정된 올리고뉴클레오티드의 투여는 신장 기능 향상; 말기 신장 질환의 발병 지연; 투석 시간 지연; 신장 이식 시간 지연; 및/또는 대상자의 기대 수명 향상이 가능할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 알포트 증후군을 앓는 대상자 또는 알포트 증후군 의심 대상자에 대한 miR-21에 상보적인 수정된 올리고뉴클레오티드의 투여는 혈뇨 감소; 혈뇨 발병 지연; 단백뇨 감소; 단백뇨 발병 지연; 신장 섬유증 감소; 섬유증의 추가적인 진행 둔화; 및/또는 섬유증의 추가적인 진행 중단을 가져올 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 대상자는 제4형 콜라겐의 알파 3 사슬을 암호화하는 유전자의 돌연변이, 제4형 콜라겐의 알파 4 사슬을 암호화하는 유전자의 돌연변이, 또는 제4형 콜라겐의 알파 5 사슬을 암호화하는 유전자의 돌연변이로부터 선택된 돌연변이가 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 대상자는 남성이다. 특정 구현예에서, 대상자는 여성이다. 특정 구현예에서, 대상자는 혈뇨 및/또는 단백뇨가 있는 것으로 확인된다. 특정 구현예에서, 대상자는 신장 기능이 감소되었다. 특정 구현예에서, 대상자는 향상된 신장 기능을 필요로 한다.
본원에 제공된 임의의 구현예는 대상자의 혈액에서 혈액 요소 질소를 측정하는 단계; 대상자의 혈액에서 크레아티닌을 측정하는 단계; 대상자의 크레아티닌 청소율을 측정하는 단계; 대상자의 단백뇨를 측정하는 단계; 대상자의 알부민:크레아티닌 비율을 측정하는 단계; 및/또는 대상자의 사구체 여과율을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예는 대상자의 소변에서 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제(NAG) 단백질을 측정하는 단계; 대상자의 소변에서 호중성의 젤라티나아제 관련 리포칼린(NGAL) 단백질을 측정하는 단계; 대상자의 소변에서 신장 손상 분자(KIM-1) 단백질을 측정하는 단계; 대상자의 소변에서 인터류킨-18(IL-18) 단백질을 측정하는 단계; 대상자의 소변에서 단핵구 화학주성 단백질(MCP1) 수준을 측정하는 단계; 대상자의 소변에서 결합조직 성장인자(CTGF) 수준을 측정하는 단계; 대상자의 소변에서 제4형 콜라겐(Col IV) 단편을 측정하는 단계; 대상자의 소변에서 제3형 콜라겐(Col III) 단편을 측정하는 단계; 및/또는 대상자의 소변에서 발세포 단백질 수준을 측정하는 단계로서, 이때, 발세포 단백질은 네프린 및 포도신으로부터 선택되는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 구현예는 대상자의 혈액에서 시스타틴 C 단백질을 측정하는 단계; 대상자의 혈액에서 베타 트레이스(β-trace) 단백질(BTP)을 측정하는 단계; 및 대상자의 혈액에서 2-마이크로글로불린(B2M)을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 방법은 대상자의 감소된 혈액 요소 질소; 대상자의 혈액에서의 감소된 크레아티닌; 대상자의 향상된 크레아티닌 청소율; 대상자의 감소된 단백뇨; 대상자의 감소된 알부민:크레아티닌 비율; 및/또는 대상자의 향상된 사구체 여과율로부터 선택된, 대상자의 신장 기능의 하나 이상의 마커를 향상시킬 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법은 대상자의 소변에서의 감소된 NAG; 대상자의 소변에서의 감소된 NGAL; 대상자의 소변에서의 감소된 KIM-1; 대상자의 소변에서의 감소된 IL-18; 대상자의 소변에서의 감소된 MCP1; 대상자의 소변에서의 감소된 CTGF; 대상자의 소변에서의 감소된 제4형 콜라겐 단편; 대상자의 소변에서의 감소된 제3형 콜라겐 단편; 및 대상자의 소변에서의 감소된 발세포 단백질 수준(이때, 발세포 단백질은 네프린 및 포도신으로부터 선택됨)으로부터 선택된, 대상자의 신장 기능의 하나 이상의 마커를 향상시킬 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법은 대상자의 혈액에서의 감소된 시스타틴 C 단백질, 대상자의 혈액에서의 감소된 베타 트레이스 단백질(BTP), 및 대상자의 혈액에서의 감소된 2-마이크로글로불린(B2M)으로부터 선택된, 신장 기능의 하나 이상의 마커를 향상시킬 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 단백뇨는 알부민뇨이다. 알부민뇨는 높은 정상 알부민뇨, 미세알부민뇨 또는 거대알부민뇨일 수 있다.
특정 구현예에서, 알포트 증후군은 X 연관형의 알포트 증후군이다. 특정 구현예에서, 알포트 증후군은 상염색체 형태의 알포트 증후군이다.
본원에 제공된 임의의 구현예는 안지오텐신 II 전환효소(ACE) 저해제, 안지오텐신 II 수용체 차단제(ARB), 혈압강하제, 비타민 D 유사체, 경구 인산염 결합제, 투석 및 신장 이식으로부터 선택된, 적어도 하나의 추가적인 요법을 행하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 구현예에서, 안지오텐신 II 전환효소(ACE) 저해제는 캅토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 퀴나프릴, 포시노프릴 및 라미프릴로부터 선택된다. 임의의 이러한 구현예에서, 안지오텐신 II 수용체 차단제(ARB)는 칸데사르탄, 일베사르탄, 올메사르탄, 로사르탄, 발사르탄, 텔미사르탄 및 에프로사르탄으로부터 선택된다. 임의의 이러한 구현예에서, ACE 저해제는 실라자프릴, 페린도프릴 및 트란돌라프릴로부터 선택된다.
특정 구현예에서, ACE 저해제는 0.5 내지 1mg/m2/일(day), 1 내지 6mg/m2/일, 1 내지 2mg/m2/일, 2 내지 4mg/m2/일, 또는 4 내지 8mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, ARB는 6.25 내지 150mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 임의의 이러한 구현예에서, ARB는 6.25mg/m2/일, 10mg/m2/일, 12.5mg/m2/일, 18.75mg/m2/일, 37.5mg/m2/일, 50mg/m2/일, 또는 150mg/m2/일의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 요법은 알도스테론 길항제이다. 특정 구현예에서, 알도스테론 길항제는 스피로놀락톤이다. 특정 구현예에서, 스피로놀락톤은 1일 10 내지 35mg 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 스피로놀락톤은 1일 25mg의 용량으로 투여된다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 miR-21(SEQ ID NO: 1)의 핵염기 서열에 적어도 90% 상보적, 적어도 95% 상보적, 또는 100% 상보적이다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 8 내지 30개, 12 내지 25개, 또는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 본원에 제공된 임의의 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 본원에 제공된 임의의 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 수정된 뉴클레오시드를 포함한다. 수정된 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드 및 LNA 뉴클레오시드로부터 선택될 수 있다. 수정된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 수정된 뉴클레오시드간 결합을 포함할 수 있다. 수정된 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드간 결합은 수정된 뉴클레오시드간 결합일 수 있다. 특정 구현예에서, 수정된 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'SEQ ID NO: 3)의 구조를 나타낼 수 있는데, 이때, 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타내고, 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
8 내지 30개, 12 내지 25개, 또는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 수정된 올리고뉴클레오티드로서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 miR-21에 상보적인 수정된 올리고뉴클레오티드의 알포트 증후군 치료를 위한 용도가 본원에 제공된다.
도 1. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스의 신장 기능을 향상시킨다. (a) 9주에서의 혈액 요소 질소(BUN) 및 (b) 3주, 5주, 7주 및 9주에서의 소변 알부민/크레아티닌 비율. *는 통계적 유의도를 나타낸다.
도 2. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스에서 사구체 경화증을 방지한다. 0(경화증 없음)부터 4(완전 경화증)에 이르는 반정량적 경화증 점수를 이용하여 사구체 경화증을 평가하였다(n=10).
도 3. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스에서 섬유증을 감소시킨다. (a) 신장에서 피크로시리우스(시리우스) 레드 염색된 섬유증의 정량(n=6) 및 (b) GAPDH에 대해 정규화된 Col1a1 전사물의 정량적 PCR(n=6). *는 통계적 유의도를 나타낸다.
도 4. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스에서 신장 손상을 감소시킨다. (a) 9주령 마우스의 신장 박편의 신장 손상 순위 점수. (b) 사구체 반월체의 비율(n=5). (c) 세관 손상의 정량화(n=5). *는 통계적 유의도를 나타낸다.
도 5. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스에서 (a) 대식세포 침투를 감소시키고, (b) 근섬유모세포를 감소시킨다. (a) 9주령 마우스의 신장 박편의 F4/80 염색의 정량화(n=5). (b) 9주령 마우스의 신장 박편의 αSMA의 정량화(n=5). *는 통계적 유의도를 나타낸다.
도 6. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스에서 활성 산소종을 감소시킨다. (a) 항-miR-21로 처리한 Col4a3-/- 마우스 또는 PBS 대조군의 소변에서의 과산화수소의 정량(n=8; *는 통계적 유의도를 나타낸다); (b) 항-miR-21로 처리한 Col4a3-/- 마우스 또는 PBS 대조군, 및 야생형 마우스의 신장 조직에서의 DES의 정량(군당 n=3; *는 통계적 유의도를 나타낸다).
도 7. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스에서 발세포 수를 향상시킨다. 항-miR-21로 처리한 Col4a3-/- 마우스 또는 PBS 대조군의 사구체에서의 WT1 양성 세포 수의 정량(n=3; p=0.005).
도 8. 항-miR-21은 Col4a3-/- 마우스의 수명을 증가시킨다. (a) 항-miR-21로 처리한 Col4a3-/- 마우스 또는 PBS 대조군의 체중(p < 0.01); (b) 항-miR-21로 처리한 Col4a3-/- 마우스 또는 PBS 대조군의 수명(p < 0.001).
도 9. 항-miR-21은 용량 의존적인 방식으로 Col4a3-/- 마우스의 신장 기능을 향상시키고, 수명을 증가시킨다(처리군당 n= 10~13). (a) 7주차의 혈액 요소 질소; (b) 주 1회(QW) 또는 주 2회(BIW) 다중 용량의 항-miR-21로 처리한 Col4a3-/- 마우스, 또는 PBS 대조군의 수명.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 나타낸다. 구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기술된 분석화학, 합성 유기화학, 그리고 의약화학 및 약화학과 관련되어 이용되는 명명법, 절차 및 기법은 당해 기술 분야에서 널리 알려지고 흔히 사용되는 것들이다. 본원의 용어에 대한 정의가 여러 개 있는 경우, 본 절의 정의가 우선한다. 화학 합성, 화학 분석, 약제 조제, 제형화 및 전달, 그리고 대상자 치료에 일반적인 기법이 이용될 수 있다. 그러한 특정 기법 및 절차는 예를 들어, 문헌 "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994 및 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18th edition, 1990에서 찾아볼 수 있으며, 이 문헌들은 임의의 목적을 위해 참조로 본원에 통합된다. 허용되는 경우, 본원의 전체 개시 내용에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 출판물, GENBANK 서열, 웹사이트 및 기타 간행물은 달리 언급되지 않는 한 전체가 참조로 통합된다. URL 또는 기타 그러한 식별자 또는 주소에 대하여 언급한 경우, 그러한 식별자가 변경될 수 있고, 인터넷에 관한 자세한 정보가 변경될 수 있으나, 인터넷 검색에 의해 동등한 정보가 발견될 수 있음을 이해하여야 한다. 그에 대한 참조 표시는 그러한 정보의 이용 가능성 및 공중으로의 보급의 증거가 된다.
본 발명의 조성물 및 방법을 개시하고 기술하기 전에, 본원에 사용된 전문용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐, 제한하고자 하는 의도로 사용된 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 맥락상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
정의
"알포트 증후군"은 비정상적인 수준의 사구체 기저막(GBM)이 생겨, 간질성 섬유증, 사구체 경화증 및 최종적으로 신장 기능의 상실로 이어지는 유전적 형태의 신장 질병을 의미한다. 이 질병은 또한 흔히 청각 장애 및 안구 이상을 특징으로 한다.
"혈뇨"는 소변에 적혈구가 존재함을 의미한다.
"알부민뇨"는 소변에 과잉의 알부민이 존재함을 의미하며, 제한 없이, 정상 알부민뇨, 높은 정상 알부민뇨, 미세알부민뇨 및 거대알부민뇨를 포함한다. 정상적으로, 발세포, 사구체 기저막 및 상피세포로 구성된 사구체 여과 투과성 장벽은 혈청 단백질이 소변으로 새는 것을 방지한다. 알부민뇨는 사구체 여과 투과성 장벽의 손상을 반영할 수 있다. 알부민뇨는 24시간 소변 시료, 하룻밤 소변(overnight urine) 시료 또는 일회성 소변(spot-urine) 시료로부터 계산될 수 있다.
"높은 정상 알부민뇨"는 (i) 24시간당 15 내지 <30mg의 알부민의 소변으로의 배출 및/또는 (ii) 남성에서 1.25 내지 <2.5mg/mmol(또는 10 내지 <20mg/g) 또는 여성에서 1.75 내지 <3.5mg/mmol(또는 15 내지 <30mg/g)의 알부민/크레아티닌 비율을 특징으로 하는 높은 알부민뇨를 의미한다.
"미세 알부민뇨"는(i) 24시간당 30 내지 300mg의 알부민의 소변으로의 배출 및/또는 (ii) 남성에서 2.5 내지 <25mg/mmol(또는 20 내지 <200mg/g) 또는 여성에서 3.5 내지 <35mg/mmol(또는 30 내지 <300mg/g)의 알부민/크레아티닌 비율을 특징으로 하는 높은 알부민뇨를 의미한다.
"거대 알부민뇨"는 (i) 24시간당 300mg을 초과하는 알부민의 소변으로의 배출 및/또는 (ii) 남성에서 >25mg/mmol(또는 >200mg/g) 또는 여성에서 >35mg/mmol(또는 >300mg/g)의 알부민/크레아티닌 비율을 특징으로 하는 높은 알부민뇨를 의미한다.
"알부민/크레아티닌 비율"은 소변 크레아티닌(g/dL)당 소변 알부민(mg/dL)의 비율을 의미하며, mg/g으로 표현된다. 특정 구현 예에서, 알부민/크레아티닌 비율은 일회성 소변 시료로부터 계산될 수 있고, 24시간의 기간에 걸친 알부민 배출의 추정치로 이용될 수 있다.
"예상 사구체 여과율(eGFR)" 또는 "사구체 여과율(GFR)"은 신장이 얼마나 크레아티닌을 잘 여과하고 있는지의 측정치를 의미하며, 분당 얼마나 많은 혈액이 사구체를 통과하는지의 추정치로 이용된다. 정상적인 결과는 90~120mL/min/1.73m2의 범위일 수 있다. 3개월 이상 60mL/min/1.73m2 미만의 수준은 만성 신장 질병의 지표일 수 있다. 15mL/min/1.73m2 미만의 수준은 신부전의 지표일 수 있다.
"단백뇨"는 소변에서 과잉의 혈청 단백질의 존재를 의미한다. 단백뇨는 24시간당 > 250mg의 단백질의 소변으로의 배출 및/또는 = 0.20mg/mg의 소변 단백질 대 크레아티닌 비율을 특징으로 할 수 있다. 단백뇨와 연관되어 상승된 혈청 단백질로는 제한 없이 알부민을 포함한다.
"혈액 요소 질소" 또는 "BUN"은 요소의 형태로 혈액에 있는 질소의 양을 측정한 값을 의미한다. 간은 단백질 소화의 폐기물로서 요소 회로에서 요소를 생성하며, 요소는 신장에 의해 혈액으로부터 제거된다. 정상적인 인간 성인 혈액은 100ml의 혈액당 7 내지 21mg(7~21mg/dL)의 요소 질소를 함유할 수 있다. 혈액 요소 질소의 측정치는 신장 건강의 지표로 이용된다. 신장이 혈액으로부터 정상적으로 요소를 제거할 수 없다면, 대상자의 BUN은 상승한다.
"말기 신장 질환(ESRD)"은 완전한 또는 거의 완전한 신장 기능 부전을 의미한다.
"손상된 신장 기능"은 정상적인 신장 기능에 비해 쇠약해진 신장 기능을 의미한다.
"섬유증"은 기관 또는 조직의 과도한 섬유 결합 조직의 형성 또는 발달을 의미한다. 특정 구현예에서, 섬유증은 회복 또는 반응성 과정으로 발생한다. 특정 구현예에서, 섬유증은 손상 또는 부상에 대한 반응으로 발생한다. "섬유증"이라는 용어는 기관 또는 조직의 정상적인 구성성분으로서의 섬유 조직의 형성과는 반대로, 회복 또는 반응성 과정으로서 기관 또는 조직의 과도한 섬유 결합 조직의 형성 또는 발달로 이해된다.
"추가적인 진행을 늦춘다(둔화시킨다)"는 의학적 병태가 악화된 상태로 진전되는 속도를 감소시킴을 의미한다.
"추가적인 진행을 중단시킨다"는 의학적 병태가 악화된 상태로 진전되는 것을 중단시킴을 의미한다.
"투석 시간을 지연시킨다"는 충분한 신장 기능을 유지시켜 투석 치료의 필요성이 지연됨을 의미한다.
"신장 이식 시간을 지연시킨다"는 충분한 신장 기능을 유지시켜 신장 이식의 필요성이 지연됨을 의미한다.
"기대 수명을 향상시킨다"는대상자의 질병의 하나 이상의 증상을 치료함으로써 대상자의 수명을 연장함을 의미한다.
"항-miR"은 마이크로RNA에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 특정 구현예에서, 항-miR은 수정된 올리고뉴클레오티드이다.
"항-miR-X"(여기서 “miR-X"는 특정 마이크로RNA를 표시함)는 miR-X에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 특정 구현예에서, 항-miR-X는 mir-X에 완전히 상보적(즉, 100% 상보적)이다. 특정 구현예에서, 항-miR-X는 mir-X에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상보적이다. 특정 구현예에서, 항-miR-X는 수정된 올리고뉴클레오티드이다.
"miR-21"은 핵염기 서열 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO: 1)을 가지고 있는 성숙한 miRNA를 의미한다.
"miR-21 스템-루프 서열"은 핵염기 서열 UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO: 2)을 가지고 있는 스템-루프 서열을 의미한다.
"표적 핵산"은 올리고머 화합물이 혼성화하도록 설계된 핵산을 의미한다.
"표적화"는 표적 핵산에 혼성화할 핵염기 서열을 설계하고 선택하는 과정을 의미한다.
"표적화된"은 표적 핵산에 혼성화할 수 있게 할 핵염기 서열을 가지고 있음을 의미한다.
"조절"은 기능, 양, 또는 활성의 변동을 의미한다. 특정 구현예에서, 조절은 기능, 양, 또는 활성의 증가를 의미한다. 특정 구현예에서, 조절은 기능, 양, 또는 활성의 감소를 의미한다.
"발현"은 유전자의 암호화된 정보가 세포 내에서 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 임의의 작용 및 단계를 의미한다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 결합 및/또는 핵염기 수정과는 관계 없이, 일반적으로 5'에서 3'방향으로 나열된, 올리고머 화합물 또는 핵산 내의 인접한 핵염기들의 순서를 의미한다.
"인접한 핵염기"는 핵산 내에서 서로 바로 옆에 인접한 핵염기를 의미한다.
"핵염기 상보성"은 두 개의 핵염기가 수소결합을 통해 비공유적으로 짝을 이루는 능력을 의미한다.
"상보적"이란 하나의 핵산이 다른 핵산 또는 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있음을 의미한다. 특정 구현예에서, 상보적임은 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
"완번히 상보적"이란 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기가 표적 핵산 내의 각 상응하는 위치의 핵염기와 짝을 이룰 수 있음을 의미한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA에 완전히 상보적이다. 즉, 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기가 마이크로RNA에서 상응하는 위치의 핵염기에 상보적이다. 특정 구현예에서, 각각의 핵염기가 마이크로RNA 스템-루프 서열 영역 내의 핵염기에 대해 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA 스템-루프 서열에 완전히 상보적이다.
"상보성 백분율"이란 표적 핵산 중 동등한 길이 부분에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드의 핵염기 백분율을 의미한다. 상보성 백분율은 표적 핵산 내의 상응하는 위치의 핵염기에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 핵염기 수를 올리고뉴클레오티드 내의 총 핵염기 수로 나누어 계산한다.
"동일성 백분율"이란 제1 핵산 내의 총 핵염기 수로 나눈, 제2의 핵산 내의 상응하는 위치의 핵염기와 동일한 제1 핵산의 핵염기 수를 의미한다. 특정 구현예에서, 제1 핵산은 마이크로RNA이고, 제2 핵산은 마이크로RNA이다. 특정 구현예에서, 제1 핵산은 올리고뉴클레오티드이고, 제2 핵산은 올리고뉴클레오티드이다.
"혼성화"란 핵염기 상보성을 통해 발생하는 상보적인 핵산의 어닐링(annealing)을 의미한다.
"틀린 짝(mismatch)"이란 제2 핵산의 상응하는 위치의 핵염기와 짝을 이룰 수 없는 제1 핵산의 핵염기를 의미한다.
핵염기 서열의 맥락에서 "동일한"은 당, 결합, 및/또는 핵염기 수정과 관계 없이, 그리고, 존재하는 임의의 피리미딘의 메틸 상태와는 관계 없이, 동일한 핵염기 서열을 가지고 있음을 의미한다.
"마이크로RNA"는 18 내지 25개의 핵염기 길이의 내생성 비 암호화 RNA를 의미하며, 이는 프리-마이크로RNA의 효소 다이서(Dicer)의 절단 생성물이다. 성숙한 마이크로RNA의 예는 miRBase로 알려진 마이크로RNA 데이터베이스(http://microrna.sanger.ac.uk/)에서 찾아볼 수 있다. 특정 구현예에서, 마이크로RNA는 "마이크로RNA" 또는 "miR"로 축약된다.
"프리-마이크로RNA" 또는 "프리-miR"은 머리핀 구조를 가지고 있는 비 암호화 RNA를 의미하며, 이는 Drosha로 알려진 이중 가닥 RNA에 특이적인 리보핵산 가수분해효소의 절단 생성물이다.
"스템-루프 서열"은 머리핀 구조를 가지고 있고, 성숙한 마이크로RNA 서열을 함유하는 RNA를 의미한다. 프리-마이크로RNA 서열과 스템-루프 서열은 중첩될 수 있다. 스템-루프 서열의 예는 miRBase로 알려진 마이크로RNA 데이터베이스(http://microrna.sanger.ac.uk/)에서 찾아볼 수 있다.
"프라이-마이크로RNA" 또는 "프라이-miR"은 이중 가닥 RNA에 특이적인 리보핵산 가수분해효소 Drosha의 기질인, 머리핀 구조를 가지고 있는 비 암호화 RNA를 의미한다.
"마이크로RNA 전구체"는 게놈 DNA로부터 비롯되며, 하나 이상의 마이크로RNA 서열을 포함하는 비 암호화, 구조화된 RNA를 포함하는 전사체를 의미한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 마이크로RNA 전구체는 프리-마이크로RNA이다. 특정 구현예에서, 마이크로RNA 전구체는 프라이-마이크로RNA이다.
"마이크로RNA 조절 전사체"는 마이크로RNA에 의해 조절되는 전사체를 의미한다.
"시드 서열(seed sequence)"은 성숙한 마이크로RNA 서열 중 5' 말단의 1번 내지 9번의 핵염기에서 6 내지 8개의 인접한 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 의미한다.
"시드 매치 서열(seed match sequence)"은 시드 서열에 상보적이고, 시드 서열과 동일한 길이의 핵염기 서열을 의미한다.
"올리고머 화합물"은 다수의 연결된 단량체 서브유닛을 포함하는 화합물을 의미한다. 올리고머 화합물은 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
"올리고뉴클레오티드"는 다수의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 화합물로, 뉴클레오시드 각각은 서로 무관하게, 수정 또는 비수정될 수 있는 화합물을 의미한다.
"자연적으로 발생하는 뉴클레오시드간 결합"은 뉴클레오시드 사이의 3'에서 5'으로의 인산디에스테르 결합을 의미한다.
"천연 당" DNA(2'-H) 또는 RNA(2'-OH)에서 발견되는 당을 의미한다.
"뉴클레오시드간 결합"은 인접한 뉴클레오시드 사이의 공유적 결합을 의미한다.
"연결된 뉴클레오시드"는 공유적 결합에 의해 이어진 뉴클레오시드를 의미한다.
"핵염기"는 또 다른 핵염기와 비공유적으로 짝을 이룰 수 있는 헤테로고리 잔기를 의미한다.
"뉴클레오시드"는 당 잔기에 연결된 핵염기를 의미한다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산염 기를 가지고 있는 뉴클레오시드를 의미한다.
다수의 연결된 뉴클레오시드"로 이루어진 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물"은 지정된 수의 연결된 뉴클레오시드를 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 의미한다. 따라서, 화합물은 추가적인 치환기 또는 접합체를 포함할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 화합물은 수정된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 이상의 임의의 추가적인 뉴클레오시드를 포함하지 않는다.
"수정된 올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 발생하는 말단, 당, 핵염기 및/또는 뉴클레오시드간 결합에 대해, 하나 이상의 수정이 이루어진 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 수정된 올리고뉴클레오티드는 수정되지 않은 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
"단일 가닥 수정된 올리고뉴클레오티드"는 상보적인 가닥에 혼성화되지 않는 수정된 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"수정된 뉴클레오시드"는 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드로부터 임의의 변경이 이루어진 뉴클레오시드를 의미한다. 수정된 뉴클레오시드는 수정된 당과 수정되지 않은 핵염기를 가지고 있을 수 있다. 수정된 뉴클레오시드는 수정된 당과 수정된 핵염기를 가지고 있을 수 있다. 수정된 뉴클레오시드는 천연 당과 수정된 핵염기를 가지고 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 수정된 뉴클레오시드는 두고리 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 수정된 뉴클레오시드는 두고리가 아닌 뉴클레오시드이다.
"수정된 뉴클레오시드간 결합"은 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드간 결합으로부터의 임의의 변경을 의미한다.
"포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합"은 뉴클레오시드 사이의 결합을 의미하며, 여기서 비가교 원자들 중 하나는 황 원자이다.
"수정된 당 잔기"는 천연 당의 치환 및/또는 임의의 변경을 의미한다.
"수정되지 않은 핵염기"는 RNA 또는 DNA의 자연적으로 발생하는 헤테로고리 염기로, 퓨린 염기인 아데닌(A)과 구아닌(G), 그리고 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C)(5-메틸시토신 포함) 및 우라실(U)을 의미한다.
"5-메틸시토신"은 5번 위치에 부착된 메틸 기를 포함하는 시토신을 의미한다.
"비 메틸화 시토신"은 5번 위치에 부착된 메틸 기를 가지고 있지 않은 시토신을 의미한다.
"수정된 핵염기"는 수정되지 않은 핵염기가 아닌 임의의 핵염기를 의미한다.
"당 잔기"란 자연적으로 발생하는 퓨라노실 또는 수정된 당 잔기를 의미한다.
"수정된 당 잔기"는 치환된 당 잔기 또는 당 대용체(sugar surrogate)를 의미한다.
"2'-O-메틸 당" 또는 "2'-OMe 당"은 2' 위치가 O-메틸로 수정된 당을 의미한다.
"2'-O-메톡시에틸 당" 또는 "2'-MOE 당"은 2' 위치가 O-메톡시에틸로 수정된 당을 의미한다.
"2'-플루오로" 또는 "2'-F"는 2' 위치가 플루오로로 수정된 당을 의미한다.
"두고리 당 잔기"는 제2 고리를 형성하기 위하여 4 내지 7원 고리의 두 원자를 연결하는 다리를 포함하여 두고리 구조가 되게 하는, 4 내지 7원 고리(퓨라노실을 포함하나 이에 한정되지 않음)를 포함하는 수정된 당 잔기를 의미한다. 특정 구현예에서, 4 내지 7원 고리는 당 고리이다. 특정 구현예에서 4 내지 7원 고리는 퓨라노실이다. 그러한 특정 구현예에서, 다리는 퓨라노실의 2' 탄소와 4' 탄소를 연결한다.
비 제한적인 예시적인 두고리 당 잔기로는 LNA, ENA, cEt, S-cEt 및 R-cEt를 포함한다.
"잠금 핵산(LNA) 당 잔기"는 4' 및 2' 퓨라노스 고리 원자 사이에 (CH2)-O 다리를 포함하는 치환된 당 잔기를 의미한다.
"ENA 당 잔기"는 4' 및 2' 퓨라노스 고리 원자 사이에 (CH2)2-O 다리를 포함하는 치환된 당 잔기를 의미한다.
"제한 에틸(cEt) 당 잔기"는 4' 및 2' 퓨라노스 고리 원자 사이에 CH(CH3)--O 다리를 포함하는 치환된 당 잔기를 의미한다. 특정 구현예에서, CH(CH3)--O 다리는 S 방향으로 제한된다. 특정 구현예에서, (CH2)2-O는 R 방향으로 제한된다.
"S-cEt 당 잔기"는 4' 및 2' 퓨라노스 고리 원자 사이에 S-제한된 CH(CH3)--O 다리를 포함하는 치환된 당 잔기를 의미한다.
"R-cEt 당 잔기"는 4' 및 2' 퓨라노스 고리 원자 사이에 R-제한된 CH(CH3)--O 다리를 포함하는 치환된 당 잔기를 의미한다.
"2'-O-메틸" 뉴클레오시드는 2'-O-메틸 당 수정이 이루어진 2'-수정된 뉴클레오시드를 의미한다.
"2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드"는 2'-O-메톡시에틸 당 수정이 이루어진 2'-수정된 뉴클레오시드를 의미한다. 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드는 수정된 또는 수정되지 않은 핵염기를 포함할 수 있다.
"2'-플루오로 뉴클레오시드"는 2'-플루오로 당 수정이 이루어진 2'-수정된 뉴클레오시드를 의미한다. 2'-플루오로 뉴클레오시드는 수정된 또는 수정되지 않은 핵염기를 포함할 수 있다.
"두고리 뉴클레오시드"는 두고리 당 잔기를 보유하는 2'-수정된 뉴클레오시드를 의미한다. 두고리 뉴클레오시드는 수정된 또는 수정되지 않은 핵염기를 가지고 있을 수 있다.
"cEt 뉴클레오시드"는 cEt 당 잔기를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. cEt 뉴클레오시드는 수정된 또는 수정되지 않은 핵염기를 포함할 수 있다.
"S-cEt 뉴클레오시드"는 S-cEt 당 잔기를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
"R-cEt 뉴클레오시드"는 R-cEt 당 잔기를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
"β-D-데옥시리보뉴클레오시드"는 자연 발생적인 DNA 뉴클레오시드를 의미한다. "β-D-리보뉴클레오시드"는 자연 발생적인 RNA 뉴클레오시드를 의미한다.
"LNA 뉴클레오시드"는 LNA 당 잔기를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
"ENA 뉴클레오시드"는 ENA 당 잔기를 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다.
"대상자"는 치료 또는 요법을 위해 선택된 인간 또는 비 인간 동물을 의미한다.
"필요로 하는 대상자"는 대상자가 요법 또는 치료를 필요로 하는 것으로 확인된 상태를 의미한다.
"의심 대상자"는 질병의 하나 이상의 임상적인 지표를 나타내는 대상자를 의미한다.
"투여"는 대상자에게 약학적 작용제 또는 조성물을 제공하는 것을 의미하고, 전문 의료진에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"비경구 투여"는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여는 피하 투여, 정맥 내 투여, 또는 근육 내 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"피하 투여"는 피부 바로 밑에 투여함을 의미한다.
"정맥 내 투여"는 정맥으로 투여함을 의미한다.
"병용 투여" 는 두 작용제의 약리 효과가 동시에 환자에서 나타나는 임의의 방식으로 이루어지는 두 가지 작용제의 공동 투여를 나타낸다. 병용 투여 시 두 가지 작용제가 단일의 약학적 조성물로, 동일한 투여 형태로, 또는 동일한 투여 경로로 투여될 필요는 없다. 두 가지 작용제의 효과가 동시에 나타나지 않아도 된다. 효과가 일정 기간 중첩되기만 하면 되고, 동일한 시간에 걸칠 필요는 없다.
"지속기간"은 활성 또는 사건이 계속되는 기간을 의미한다. 특정 구현예에서, 치료 지속기간은 약학적 작용제 또는 약학적 조성물 투여량이 투여되는 기간이다.
"요법"은 질병 치료 방법을 의미한다. 특정 구현예에서, 요법은 화학요법, 방사선 요법, 또는 약학적 작용제의 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"치료"는 질병의 치유 또는 경감을 위해 사용된 하나 이상의 특정 절차의 적용을 의미한다. 특정 구현예에서, 특정 절차는 하나 이상의 약학적 작용제의 투여이다.
"경감하다" 는 병태 또는 질병의 적어도 하나의 지표의 중증도를 완화하는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 경감은 병태 또는 질병의 하나 이상의 지표 진행의 지연 또는 속도 둔화를 포함한다. 지표의 중증도는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 주관적 또는 객관적 방법에 의해 결정될 수 있다.
"발달 위험"은 대상자가 병태 또는 질병을 발달시킬 성향이 있는 상태임을 의미한다. 특정 구현예에서, 병태 또는 질병을 발달시킬 위험이 있는 대상자는 병태 또는 질병의 하나 이상의 증상을 나타내지만, 병태 또는 질병으로 진단될 만큼 충분한 수의 증상은 나타내지 않는다. 특정 구현예에서, 병태 또는 질병을 발달시킬 위험이 있는 대상자는 병태 또는 질병의 하나 이상의 증상을 나타내지만, 병태 또는 질병으로 진단되는 데 필요한 정도보다 적게 나타낸다.
"개시 예방"은 질병 또는 병태를 발달시킬 위험이 있는 대상자에서 병태 또는 질병의 발달을 예방함을 의미한다. 특정 구현예에서, 질병 또는 병태를 발달시킬 위험이 있는 대상자는 이미 질병 또는 병태를 앓는 대상자가 받는 치료와 비슷한 치료를 받는다.
"개시 지연"은 질병 또는 병태를 발달시킬 위험이 있는 대상자에서 병태 또는 질병의 발달을 지연시킴을 의미한다. 특정 구현예에서, 질병 또는 병태를 발달시킬 위험이 있는 대상자는 이미 질병 또는 병태를 앓는 대상자가 받는 치료와 비슷한 치료를 받는다.
"치료제"는 질병의 치유, 경감 또는 예방에 사용되는 약학적 작용제를 의미한다.
"용량"은 단일 투여에 제공되는 약학적 작용제의 지정된 양을 의미한다. 특정 구현예에서, 용량은 둘 이상의 볼러스, 정제, 또는 주사로 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 피하 투여가 바람직한 경우, 원하는 용량은 단일 주사로 쉽게 수용되지 않는 부피를 필요로 한다. 그러한 구현예에서, 원하는 용량을 달성하기 위하여 2회 이상의 주사가 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 개체 내에서 주사 부위 반응을 최소화하기 위하여 용량은 2회 이상의 주사로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서는, 용량이 느린 주입으로 투여된다.
"투여량 단위"는 약학적 작용제가 제공되는 형태를 의미한다. 특정 구현예에서, 투여량 단위는 냉동 건조된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 바이알이다. 특정 구현예에서, 투여량 단위는 재구성된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 바이알이다.
"치료적으로 유효한 양"은 동물에게 치료적 유익을 제공하는 약학적 작용제의 양을 나타낸다.
"약학적 조성물"은 약학적 작용제를 포함하는, 개체에 투여하기에 적합한 물질들의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 멸균 수성 용액을 포함할 수 있다.
"약학적 작용제"는 대상자에게 투여 시 치료 효과를 제공하는 물질을 의미한다.
"활성 제약 성분"은 원하는 효과를 제공하는 약학적 조성물 내의 물질을 의미한다.
"개선된 기관 기능"은 정상 한계를 향한 기관 기능의 변화를 의미한다. 특정 구현예에서, 기관 기능은 대상자의 혈액에서 발견된 분자를 측정함으로써 평가한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 향상된 신장 기능은 혈액 요소 질소의 감소, 단백뇨의 감소, 알부민뇨의 감소 등으로 측정된다.
"허용 가능한 안전 프로파일"은 임상적으로 허용 가능한 한계 내의 부작용 패턴을 의미한다.
"부작용"은 치료에 기인한 원하는 효과 이외의 생리적 반응을 의미한다. 특정 구현예에서, 부작용은 제한 없이 주사 부위 반응, 간 기능 시험 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 이상 및 근 질환을 포함한다. 그러한 부작용은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 혈청 내의 증가된 아미노기 전달효소 수준은 간 독성 또는 간 기능 이상을 지시할 수 있다. 예를 들어, 증가된 빌리루빈은 간 독성 또는 간 기능 이상을 지시할 수 있다.
"대상자 준수성"은 대상자가 권고된 또는 처방된 요법을 지키는 것을 의미한다.
"준수하다"는 대상자가 권고된 요법을 지키는 것을 의미한다.
"권고된 요법"은 질병을 치료, 경감, 지연 또는 예방하고자 전문 의료진이 권고한 치료를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "혈액"은 전혈 및, 혈청과 혈장과 같은 혈액 분획을 포괄한다.
개요
알포트 증후군은 비정상적인 수준의 사구체 기저막(GBM)이 생겨, 간질성 섬유증, 사구체 경화증으로 이어지는 유전적 형태의 신장 질병으로, 전형적으로는 말기 신장 질환을 초래한다. 알포트 증후군의 관리에서, 치료의 주목적은 신장 기능을 유지하고, 말기 신장 질환(ESRD)의 발병을 예방하는 것이며, 이는 결과적으로 알포트 증후군을 앓는 대상자의 기대 수명을 향상시킨다.
알포트 증후군은 GBM 구성의 결함으로 인한 점진적 섬유증을 특징으로 하며, 따라서 GBM 형태 및 기능의 향상이 바람직하다. miR-21에 대해 표적화된 수정된 올리고뉴클레오티드는 알포트 증후군의 실험 모델에서 신장 기능을 향상시킨다는 점이 본원에서 증명된다. 추가적으로, 항-miR-21 치료 후에 사구체 경화증 및 섬유증이 감소된다. 항-miR-21이 알포트 증후군의 실험 모델에서 생존을 향상시킨다는 점이 본원에서 추가적으로 증명된다. 따라서, miR-21에 대해 표적화된 이들 수정된 올리고뉴클레오티드는 알포트 증후군의 치료에 유용하다.
본 발명의 특정 용도
miR-21에 상보적인 수정된 올리고뉴클레오티드를 알포트 증후군을 앓고 있는 대상자 또는 알포트 증후군 의심 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 알포트 증후군의 치료 방법이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 대상자는 수정된 올리고뉴클레오티드 투여 전에 알포트 증후군으로 진단된 바 있다. 알포트 증후군의 진단은 제한 없이, 대상자의 가족 이력, (제한 없이 단백뇨, 알부민뇨, 혈뇨, 손상된 GFR, 난청 및/또는 시각 변화를 포함하는) 임상적 특질 및 조직 생체검사 결과를 포함하는 요소들의 평가를 통해 달성될 수 있다. 신장 생체검사는 IV형 콜라겐 알파-3, 알파-4, 및 알파-5 사슬의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있다. 추가적으로, 신장 생체검사 물질의 전자 현미경에 의해 사구체의 구조적인 변화가 검출될 수 있다. 피부 생체검사는 피부에 정상적으로 존재하나 알포트 증후군의 X 연관형을 나타내는 남성 대상자에서는 거의 항상 부존재하는 IV형 콜라겐 알파-5 사슬의 존재에 대해 시험할 수 있다. 알포트 증후군의 진단은 Col4a3, Col4a4, 또는 Col4a5 유전자 중 하나 이상의 돌연변이에 대한 스크리닝도 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, miR-21의 수준은 알포트 증후군을 앓는 대상자의 신장에서 증가된다. 특정 구현예에서, 투여 전에, 대상자는 신장에서 증가된 수준의 miR-21을 나타냄을 확인 받는다. miR-21 수준은 신장 생체검사 물질로부터 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상자는 투여 전에 대상자의 소변 또는 혈액에서 증가된 수준의 miR-21을 나타내는 것으로 확인된다.
특정 구현예에서, miR-21에 상보적인 수정된 올리고뉴클레오티드의 투여는 하나 이상의 임상적으로 유익한 결과를 가져온다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 신장 기능을 향상시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 말기 신장 질환의 발병을 지연시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 투석 시간을 지연시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 신장 이식 시간을 지연시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 대상자의 기대 수명을 향상시킨다.
특정 구현예에서, 이러한 투여는 신장 섬유증을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 신장 섬유증의 추가적인 진행을 늦춘다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 신장 섬유증의 추가적인 진행을 중단시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 혈뇨를 감소시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 혈뇨 발병을 지연시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 단백뇨를 감소시킨다. 특정 구현예에서, 이러한 투여는 단백뇨 발병을 지연시킨다.
알포트 증후군을 앓고 있는 대상자 또는 알포트 증후군 의심 대상자는 제4형 콜라겐의 알파 3 사슬을 암호화하는 유전자(Col4a3)의 돌연변이, 제4형 콜라겐의 알파 4 사슬을 암호화하는 유전자(Col4a4)의 돌연변이, 또는 제4형 콜라겐의 알파 5 사슬을 암호화하는 유전자(Col4a5)의 돌연변이가 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 대상자는 남성이다. 특정 구현예에서, 이러한 대상자는 여성이다.
특정 구현예에서, 이러한 대상자는 손상된 신장 기능을 나타낸다. 특정 구현예에서, 이러한 대상자는 향상된 신장 기능을 필요로 한다. 특정 구현예에서, 이러한 대상자는 손상된 신장 기능을 나타내는 것으로 확인된다. 특정 구현예에서, 이러한 대상자는 혈뇨를 나타내는 것으로 확인된다. 특정 구현예에서, 이러한 대상자는 단백뇨를 나타내는 것으로 확인된다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 대상자는 신장 기능을 평가하는 특정 시험을 치르게 될 수 있다. 그러한 시험으로는 대상자의 혈액 요소 질소의 측정, 대상자의 혈액에서 크레아티닌 측정, 대상자의 혈액에서 크레아티닌 청소율 측정, 대상자의 단백뇨 측정, 대상자의 알부민:크레아티닌 비율 측정, 대상자의 사구체 여과율 측정 및 대상자의 소변 배출량 측정을 제한 없이 포함한다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 소변 또는 혈액에 존재하는 단백질은 신장 기능을 평가하는 데에 이용될 수 있다. 그러한 신장 기능 시험으로는 대상자의 소변에서 N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제(NAG) 측정, 대상자의 소변에서 호중성의 젤라티나아제 관련 리포칼린(NGAL) 단백질 측정, 대상자의 소변에서 신장 손상 분자-1(KIM-1) 단백질 측정, 대상자의 소변에서 인터류킨-18(IL-18) 단백질 측정, 대상자의 소변에서 결합조직 성장인자(CTGF) 수준 측정, 대상자의 소변에서 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP1) 수준 측정, 대상자의 소변에서 제4형 콜라겐(Col IV) 단편 측정, 대상자의 소변에서 제3형 콜라겐(Col III) 단편 수준 측정, 대상자의 혈액에서 시스타틴 C 단백질 측정, 대상자의 혈액에서 베타 트레이스 단백질(BTP) 측정, 및 대상자의 혈액에서 2-마이크로글로불린(B2M) 측정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 제공된 임의의 구현예에서, 발세포 손상의 마커는 소변에서 측정될 수 있다. 그러한 단백질로는 네프린과 포도신을 포함한다. 이러한 단백질은 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하는, 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA), 또는 방사면역분석법(RIA)에 의해 정량화될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, miR-21에 대해 표적화된 수정된 올리고뉴클레오티드의 투여는 대상자의 신장 기능의 하나 이상의 마커를 향상시킨다. 신장 기능 마커의 향상으로는 대상자의 감소된 혈액 요소 질소, 대상자의 혈액에서 감소된 크레아티닌, 대상자의 향상된 크레아티닌 청소율, 대상자의 감소된 단백뇨, 대상자의 감소된 알부민:크레아티닌 비율, 대상자의 향상된 사구체 여과율, 및/또는 대상자의 증가된 소변 배출량을 제한 없이 포함한다.
특정 추가 요법
알포트 증후군 또는 본원에 열거된 임의의 병태의 치료는 두 가지 이상의 요법을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, miR-21에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계 이외에, 적어도 하나의 요법을 행하는 단계를 포함하는, 알포트 증후군을 앓고 있는 대상자 또는 알포트 증후군 의심 대상자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 요법은 약학적 작용제를 포함한다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 안지오텐신 II 수용체 차단제(ARB)를 포함한다. 특정 구현예에서, 안지오텐신 II 수용체 차단제는 칸데사르탄, 일베사르탄, 올메사르탄, 로사르탄, 발사르탄, 텔미사르탄 또는 에프로사르탄이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 안지오텐신 II 전환효소(ACE) 저해제를 포함한다. 특정 구현예에서, ACE 저해제는 캅토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 퀴나프릴, 포시노프릴, 또는 라미프릴이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 혈압강하제이다. 혈압강하제는 대상자의 혈압을 조절하는 데에 이용된다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 비타민 D 유사체이다. 비타민 D 유사체는 대상자의 부갑상선 호르몬의 생성을 제한하는 데에 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 식이성 인산염 흡수를 감소시키는 경구 인산염 결합제이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 면역억제제를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역억제제는 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드 또는 미코페놀레이트 모페틸이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 시클로스포린, HMG 보조효소 A 저해제, 바소펩티다아제 저해제, 또는 TGF 베타 길항제이다.
특정 구현예에서, 추가적인 요법은 유전자 요법이다. 특정 구현예에서, 이러한 유전자 요법은 정상적인 Col4a3 유전자를 제공한다. 특정 구현예에서, 이러한 유전자 요법은 정상적인 Col4a4 유전자를 제공한다. 특정 구현예에서, 이러한 유전자 요법은 정상적인 Col4a5 유전자를 제공한다.
특정 구현예에서, 추가적인 요법은 투석이다. 특정 구현예에서, 추가적인 요법은 신장 이식이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 항염증제를 포함한다. 특정 구현예에서, 항염증제는 스테로이드성 항염증제이다. 특정 구현예에서, 스테로이드 항염증제는 코르티코스테로이드이다. 특정 구현예에서, 코르티코스테로이드는 프레드니손이다. 특정 구현예에서, 항염증제는 비스테로이드 항염증제이다. 특정 구현예에서, 비스테로이드 항염증제는 이부프로펜, COX-I 저해제, 또는 COX-2 저해제이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 섬유 형성 신호에 대한 하나 이상의 반응을 차단하는 약학적 작용제이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 항당뇨병약을 포함한다. 항당뇨병약은 비구아니드, 글루코시다아제 저해제, 인슐린, 설포닐우레아 및 티아졸리딘디온을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 마이크로RNA 핵염기 서열
본원에 기술된 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21(SEQ ID NO: 1)에 상보적인 핵염기 서열, 또는 이의 전구체(SEQ ID NO: 2)를 가지고 있다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기는 miR-21의 핵염기 서열 또는 이의 전구체 내의 각각의 상응하는 위치의 핵염기와 염기 짝짓기를 거칠 수 있다. 특정 구현예에서 수정된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 miR-21의 핵염기 서열 또는 전구체 서열에 대해, 하나 이상의 잘못 짝지어진 염기 쌍을 가지고 있을 수 있어, 그 표적 서열에 혼성화할 수 있는 채로 있다.
miR-21 서열은 miR-21 전구체 서열 내에 함유되어 있으므로, miR-21에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21 전구체의 영역에 대해 또한 상보적이다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21의 길이와 동일한 다수의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 연결된 뉴클레오시드의 수는 miR-21의 길이보다 적다. miR-21의 길이보다 적은 수의 연결된 뉴클레오시드를 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드로서, 이때, 수정된 올리고뉴클레오티드의 각각의 핵염기가 miR-21의 상응하는 위치의 각각의 핵염기에 상보적인, 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21 서열의 영역에 완전히 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드라고 간주된다. 예를 들어, 19개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 수정된 올리고뉴클레오티드로서, 여기서 각각의 핵염기가 22개의 핵염기 길이인 miR-21의 상응하는 위치에 상보적인, 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21의 19개 핵염기 영역에 대해 완전히 상보적이다. 그러한 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21의 전체 길이에 대해 대략 86%의 전체 상보성을 나타내며, miR-21의 19개 핵염기 부분에 대해 100% 상보성을 나타낸다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 시드 서열에 상보적인 핵염기 서열을 포함한다. 즉, 수정된 올리고뉴클레오티드는 시드 매치 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 시드 서열은 6량체 시드 서열이다. 그러한 특정 구현예에서, 시드 서열은 miR-21의 핵염기 1~6이다. 그러한 특정 구현예에서, 시드 서열은 miR-21의 핵염기 2~7이다. 그러한 특정 구현예에서, 시드 서열은 miR-21의 핵염기 3~8이다. 특정 구현예에서, 시드 서열은 7량체 시드 서열이다. 그러한 특정 구현예에서, 7량체 시드 서열은 miR-21의 핵염기 1~7이다. 그러한 특정 구현예에서, 7량체 시드 서열은 miR-21의 핵염기 2~8이다. 특정 구현예에서, 시드 서열은 8량체 시드 서열이다. 그러한 특정 구현예에서, 8량체 시드 서열은 miR-21의 핵염기 1~8이다. 그러한 특정 구현예에서, 8량체 시드 서열은 miR-21의 핵염기 2~9이다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21의 핵염기 서열, 또는 이의 전구체에 대해, 하나의 틀린 짝을 가지고 있는 핵염기 서열을 가지고 있다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21의 핵염기 서열, 또는 이의 전구체에 대해, 두 개의 틀린 짝을 가지고 있는 핵염기 서열을 가지고 있다. 그러한 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21의 핵염기 서열, 또는 이의 전구체에 대해, 둘 이하의 틀린 짝을 가지고 있는 핵염기 서열을 가지고 있다. 그러한 특정 구현예에서, 잘못 짝지어진 핵염기는 인접해 있다. 그러한 특정 구현예에서, 잘못 짝지어진 핵염기는 인접하지 않는다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 연결된 뉴클레오시드의 수는 miR-21의 길이보다 많다. 그러한 특정 구현예에서, 추가적인 뉴클레오시드의 핵염기는 miR-21 스템-루프 서열의 핵염기에 대해 상보적이다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 연결된 뉴클레오시드의 수는 miR-21의 길이보다 하나 더 많다. 그러한 특정 구현예에서, 추가적인 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드의 5 말단에 있다. 그러한 특정 구현예에서, 추가적인 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 연결된 뉴클레오시드의 수는 miR-21의 길이보다 두 개 더 많다. 그러한 특정 구현예에서, 두 개의 추가적인 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 있다. 그러한 특정 구현예에서, 두 개의 추가적인 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있다. 그러한 특정 구현예에서, 하나의 추가적인 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하고, 하나의 추가적인 뉴크레오시드는 3' 말단에 위치한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 영역은 miR-21의 핵염기 서열에 완전히 상보적일 수 있으나, 전체 수정된 올리고뉴클레오티드가 miR-21에 완전히 상보적이지는 않는다. 예를 들어, 24개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 수정된 올리고뉴클레오티드로서, 여기서, 뉴클레오시드 1에서 23까지의 핵염기가 22개의 핵염기 길이인 miR-21의 상응하는 위치에 각각 상보적인, 수정된 올리고뉴클레오티드는 miR-21의 핵염기 서열에 대해 완전히 상보적인 22개의 뉴클레오시드 부분을 가지고 있고, miR-21의 핵염기 서열에 대해 대략 96%의 전체 상보성을 나타낸다.
특정의 수정된 올리고뉴클레오티드
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO: 3)의 구조를 가지고 있는데, 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타내며, 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 5'-AECSATCSASGTCSUSGAUSASAGCSUsAE-3'(SEQ ID NO: 3)의 구조를 가지고 있는데, 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타내며, 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 5'-MeCEASASTECSUSAEAEUSASAEGECSTEAS-3' SEQ ID NO: 4)의 구조를 가지고 있는데, 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타내고, 윗첨자 "Me"는 뉴클레오시드의 염기 상의 5-메틸 기를 나타내며, 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 5'-AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-3' SEQ ID NO: 3)의 구조를 가지고 있는데, 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타내며, 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 5-메틸시토신을 포함한다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 각각의 시토신은 5-메틸시토신을 포함한다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 8 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 12 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 15 내지 19개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 15 내지 16개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 19 내지 24개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 21 내지 24개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 8개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 9개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 10개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 11개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 12개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 13개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 14개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 15개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 16개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 17개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 18개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 19개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 20개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 21개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 22개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 23개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 24개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진다.
특정 수정
특정 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 핵염기, 당 및/또는 뉴클레오시드간 결합에 대해 하나 이상의 수정을 포함할 수 있으며, 따라서, 수정된 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 증진된 세포 섭취, 기타 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 표적에 대한 향상된 친화도 및 핵산 가수분해효소 존재 시 증가된 안정성과 같은 바람직한 특성 때문에, 수정된 핵염기, 당 및/또는 뉴클레오시드간 결합이 수정되지 않은 형태에 대해 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 수정된 뉴클레오시드를 포함한다. 그러한 특정 구현예에서, 수정된 뉴클레오시드는 안정 뉴클레오시드이다. 안정 뉴클레오시드의 예는 당이 수정된 뉴클레오시드이다.
특정 구현예에서, 수정된 뉴클레오시드는 당이 수정된 뉴클레오시드이다. 그러한 특정 구현예에서, 당이 수정된 뉴클레오시드는 천연 또는 수정된 헤테로고리 염기 및/또는 천연 또는 수정된 뉴클레오시드간 결합을 더 포함할 수 있으며, 당 수정과는 무관한 추가적인 수정을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 당이 수정된 뉴클레오시드는 2'-수정된 뉴클레오시드로서, 이때, 당 고리는 천연 리보오스 또는 2'-데옥시-리보오스로부터 2'-탄소에서 수정된다.
특정 구현예에서, 2'-수정된 뉴클레오시드는 두고리 당 잔기를 가지고 있다. 그러한 특정 구현예에서, 두고리 당 잔기는 알파 배열의 D 당이다. 그러한 특정 구현예에서, 두고리 당 잔기는 베타 배열의 D 당이다. 그러한 특정 구현예에서, 두고리 당 잔기는 알파 배열의 L 당이다. 그러한 특정 구현예에서, 두고리 당 잔기는 베타 배열의 L 당이다.
그러한 두고리 당 잔기를 포함하는 뉴클레오시드를 두고리 뉴클레오시드 또는 BNA라 한다. 특정 구현예에서, 두고리 뉴클레오시드는 아래 도시된 바와 같은 (A) α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA; (B) β-D-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') BNA; (C) 에틸렌옥시(4'-(CH2)2-O-2') BNA; (D) 아미노옥시(4'-CH2-O-N(R)-2') BNA; (E) 옥시아미노(4'-CH2-N(R)-O-2') BNA; (F) 메틸(메틸렌옥시)(4'-CH(CH3)-O-2') BNA (제한 에틸 또는 cEt라고도 함); (G) 메틸렌-티오(4'-CH2-S-2') BNA; (H) 메틸렌-아미노(4'-CH2-N(R)-2') BNA; (I) 메틸 탄소고리(4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA; (J) c-MOE(4'-CH2-OMe-2') BNA 및 (K) 프로필렌 탄소고리(4'-(CH2)3-2') BNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이때, Bx는 핵염기 잔기이고, R은 독립적으로, H, 보호기, 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구현예에서, 2'-수정된 뉴클레오시드는 F, NH2, N3, OCF3, O-CH3, O(CH2)3NH2, CH2-CH=CH2, O-CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 N 치환된 아세트아미드 (O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)(여기서, 각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H, 아미노 보호기 또는 치환된 또는 치환되지 않은 C1-C10 알킬임)로부터 선택된 2'-치환기를 포함한다.
특정 구현예에서, 2'-수정된 뉴클레오시드는 F, OCF3, O-CH3, OCH2CH2OCH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(CH3)2, -O(CH2)2O(CH2)2N-(CH3)2, 및 O-CH2-C(=O)-N(H)CH3로부터 선택된 2'-치환기를 포함한다.
특정 구현예에서, 2'-수정된 뉴클레오시드는 F, O-CH3, 및 OCH2CH2OCH3로부터 선택된 2'-치환기를 포함한다.
특정 구현예에서, 당이 수정된 뉴클레오시드는 4'-티오 수정된 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 당이 수정된 뉴클레오시드는 4'-티오-2'-수정된 뉴클레오시드이다. 4'-티오 수정된 뉴클레오시드는 4'-O가 4'-S로 교체된 β-D-리보뉴클레오시드를 가지고 있다. 4'-티오-2'-수정된 뉴클레오시드는 2' 치환기로 교체된 2'-OH를 가지고 있는, 4'-티오 수정된 뉴클레오시드이다. 적합한 2' 치환기는 2'-OCH3, 2'-O-(CH2)2-OCH3 및 2'-F를 포함한다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오시드간 수정을 포함한다. 그러한 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드간 결합은 수정된 뉴클레오시드간 결합이다. 특정 구현예에서, 수정된 뉴클레오시드간 결합은 인 원자를 포함한다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 수정된 핵염기를 포함한다. 특정 구현예에서, 수정된 핵염기는 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 수정된 핵염기는 2 아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 수정된 핵염기는 다고리 헤테로사이클을 포함한다. 특정 구현예에서, 수정된 핵염기는 세 고리 헤테로사이클을 포함한다. 특정 구현예에서, 수정된 핵염기는 페녹사진 유도체를 포함한다. 특정 구현예에서, 페녹사진은 당해 기술 분야에서 G 클램프로 알려져 있는 핵염기를 형성하기 위하여 더 수정될 수 있다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드는 그 결과에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증진시키는 하나 이상의 잔기에 접합된다. 특정 구현예에서, 이러한 잔기는 콜레스테롤 잔기이다. 특정 구현예에서, 이러한 잔기는 지질 잔기이다. 접합을 위한 추가적인 잔기로는 탄수화물, 인지질, 바이오틴, 페나진, 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 특정 구현예에서, 탄수화물 잔기는 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNac)이다. 특정 구현예에서, 접합 기는 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 부착된다. 특정 구현예에서, 접합 기는 아미노, 하이드록실, 카르복시산, 티올, 불포화(예컨대, 이중결합 또는 삼중결합), 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(ADO), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산--1-카르복실레이트(SMCC), 6-아미노헥산산(AHEX 또는 AHA), 치환된 C1~C10 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 C2~C10 알케닐, 및 치환된 또는 치환되지 않은 C2~C10 알키닐로부터 선택된 연결 잔기에 의해, 수정된 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 그러한 특정 구현예에서, 치환기는 하이드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로, 티올, 티오알콕시, 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 선택된다.
그러한 특정 구현예에서, 화합물은 예를 들어, 핵산 가수분해효소 안정성과 같은 성질을 증진시키기 위하여 수정된 올리고뉴클레오티드의 한 쪽 말단 또는 양 말단에 부착된 하나 이상의 안정기를 가지고 있는, 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 캡 구조는 안정기에 포함된다. 이러한 말단 수정은 수정된 올리고뉴클레오티드를 핵산말단 가수분해효소 분해로부터 보호하고, 전달 및/또는 세포 내 국재화를 도울 수 있다. 캡은 5' 말단(5' 캡), 또는 3' 말단(3' 캡)에 존재할 수 있거나, 양 말단에 존재할 수 있다. 캡 구조로는 예를 들어, 전화(inverted) 데옥시 무염기 캡을 포함한다.
특정 약학적 조성물
올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, miR-21에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 8 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, miR-21에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 12 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, miR-21에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 포함한다.
적합한 투여 경로로는 경구, 직장, 경점막, 장, 경장, 국소, 좌제, 흡입을 통해, 경막 내, 심장 내, 심실 내, 복강 내, 비강 내, 안구 내, 종양 내 및 비경구(예컨대, 정맥 내, 근육 내, 골수 내 및 피하)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 약학적 경막 내의 것들은 전신 노출보다는 국소 노출을 달성하고자 투여된다. 예를 들어, 약학적 조성물은 원하는 효과를 나타내야 하는 부분에 직접적으로 주입될 수 있다(예컨대, 신장 내부로).
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 투여량 단위 형태(예컨대, 정제, 캡슐, 볼러스 등)로 투여된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 25mg 내지 800mg, 25mg 내지 700mg, 25mg 내지 600mg, 25mg 내지 500mg, 25mg 내지 400mg, 25mg 내지 300mg, 25mg 내지 200mg, 25mg 내지 100mg, 100mg 내지 800mg, 200mg 내지 800mg, 300mg 내지 800mg, 400mg 내지 800mg, 500mg 내지 800mg, 600mg 내지 800mg, 100mg 내지 700mg, 150mg 내지 650mg, 200mg 내지 600mg, 250mg 내지 550mg, 300mg 내지 500mg, 300mg 내지 400mg 및 400mg 내지 600mg로부터 선택된 범위 내의 용량으로 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 그러한 약학적 조성물은 25mg, 30mg, 35mg, 40mg, 45mg, 50mg, 55mg, 60mg, 65mg, 70mg, 75mg, 80mg, 85mg, 90mg, 95mg, 100mg, 105mg, 110mg, 115mg, 120mg, 125mg, 130mg, 135mg, 140mg, 145mg, 150mg, 155mg, 160mg, 165mg, 170mg, 175mg, 180mg, 185mg, 190mg, 195mg, 200mg, 205mg, 210mg, 215mg, 220mg, 225mg, 230mg, 235mg, 240mg, 245mg, 250mg, 255mg, 260mg, 265mg, 270mg, 270mg, 280mg, 285mg, 290mg, 295mg, 300mg, 305mg, 310mg, 315mg, 320mg, 325mg, 330mg, 335mg, 340mg, 345mg, 350mg, 355mg, 360mg, 365mg, 370mg, 375mg, 380mg, 385mg, 390mg, 395mg, 400mg, 405mg, 410mg, 415mg, 420mg, 425mg, 430mg, 435mg, 440mg, 445mg, 450mg, 455mg, 460mg, 465mg, 470mg, 475mg, 480mg, 485mg, 490mg, 495mg, 500mg, 505mg, 510mg, 515mg, 520mg, 525mg, 530mg, 535mg, 540mg, 545mg, 550mg, 555mg, 560mg, 565mg, 570mg, 575mg, 580mg, 585mg, 590mg, 595mg, 600mg, 605mg, 610mg, 615mg, 620mg, 625mg, 630mg, 635mg, 640mg, 645mg, 650mg, 655mg, 660mg, 665mg, 670mg, 675mg, 680mg, 685mg, 690mg, 695mg, 700mg, 705mg, 710mg, 715mg, 720mg, 725mg, 730mg, 735mg, 740mg, 745mg, 750mg, 755mg, 760mg, 765mg, 770mg, 775mg, 780mg, 785mg, 790mg, 795mg 및 800mg으로부터 선택된 용량으로 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 특정 구현예에서, 그 약학적 조성물은25mg, 50mg, 75mg, 100mg, 150mg, 200mg, 250mg, 300mg, 350mg, 400mg, 500mg, 600mg, 700mg 및 800mg으로부터 선택된 수정된 올리고뉴클레오티드 용량을 포함한다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 적합한 희석제, 예컨대, 주사용 멸균수 또는 주사용 멸균 식염수로 재구성되는, 멸균 냉동 건조시킨 수정된 올리고뉴클레오티드이다. 재구성된 생성물은 식염수로 희석한 후, 피하 주사로 또는 정맥 내 주입으로 투여된다. 냉동 건조시킨 약품은 주사용수 또는 주사용 식염수에 준비하고, 준비 과정에서 산 또는 염기로 pH 7.0~9.0으로 조정한 다음, 냉동 건조시킨, 수정된 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 냉동 건조시킨 수정된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 25~800mg일 수 있다. 이는 수정된 냉동 건조 올리고뉴클레오티드 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 및 800mg을 포괄하는 것임을 이해하여야 한다. 나아가, 일부 구현예에서, 냉동 건조시킨 수정된 올리고뉴클레오티드는 25mg 내지 800mg, 25mg 내지 700mg, 25mg 내지 600mg, 25mg 내지 500mg, 25mg 내지 400mg, 25mg 내지 300mg, 25mg 내지 200mg, 25mg 내지 100mg, 100mg 내지 800mg, 200mg 내지 800mg, 300mg 내지 800mg, 400mg 내지 800mg, 500mg 내지 800mg, 600mg 내지 800mg, 100mg 내지 700mg, 150mg 내지 650mg, 200mg 내지 600mg, 250mg 내지 550mg, 300mg 내지 500mg, 300mg 내지 400mg 및 400mg 내지 600mg으로부터 선택된 양적 범위 내의 올리고뉴클레오티드이다. 냉동 건조시킨 약품은 브로모부틸 고무 마개로 막고, 알루미늄 FLIP-OFF® 오버실(overseal)로 밀봉한 2mL의 I형 투명 유리 (황산 암모늄 처리된) 바이알에 포장될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 약학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 기타 부속 구성성분들을 기술 분야에서 확립된 이용 수준으로 추가적으로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어, 가려움약, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가적인, 적합성 있는, 약학적으로 활성을 나타내는 물질을 함유할 수 있거나, 염료, 착향료, 보존제, 항산화제, 불투명체, 증점안정제 및 안정제와 같은, 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는 데 유용한 추가 물질을 함유할 수 있다. 그러나, 그러한 물질들은 추가 시 본 발명의 조성물의 구성성분의 생물학적 활성을 지나치게 방해해서는 안 된다. 제형은 멸균시킬 수 있으며, 원한다면, 제형의 올리고뉴클레오티드(들)과 유해하게 상호 작용하지 않는 보조 작용제, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치기 위한 염, 완충액, 착색제, 착향료 및/또는 방향 물질 등과 혼합할 수 있다.
지질 잔기는 다양한 방법의 핵산 요법에 이용되었다. 한 방법에서, 핵산은 미리 형성된 리포좀 또는, 양이온성 지질 및 중성 지질의 혼합물로 이루어진 리포플렉스 안으로 도입된다. 또 다른 방법에서는, 단일 또는 다중 양이온성 지질과의 DNA 복합체가 중성 지질 없이 형성된다. 특정 구현예에서, 지질 잔기는 특정 세포 또는 조직으로 약학적 작용제의 분포를 증가시키기 위해 선택된다. 특정 구현예에서, 지질 잔기는 지방 조직으로 약학적 작용제의 분포를 증가시키기 위하여 선택된다. 특정 구현예에서, 지질 잔기는 근육 조직으로 약학적 작용제의 분포를 증가시키기 위해 선택된다.
특정 구현예에서, 인트라리피드는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 데 이용된다. 인트라리피드는 정맥 내 투여를 위해 제조된 지방 유화액이다. 그것은 10% 콩기름, 1.2% 난황 인지질, 2.25% 글리세린 및 주사용수로 이루어진다. 게다가, pH를 조정하여 최종 생성물의 pH 범위가 6 내지 8.9가 되도록 수산화나트륨이 첨가되었다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 폴리아민 화합물 또는 핵산과 복합체를 이룬 지질 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 그러한 제제는 각각이 개별적으로 식 (Z)에 의해 정의된 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 가지고 있는 하나 이상의 화합물을 포함하는데,
이때, 각각의 경우에 각각의 Xa 및 Xb는 독립적으로 C1-6 알킬렌이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; 각각의 R은 독립적으로 H로, 이때, 제제 내의 식 (Z)의 화합물의 분자들 중 적어도 약 80%에서의 R 잔기의 적어도 n + 2는 H가 아니며; m은 1, 2, 3 또는 4이고; Y는 O, NR2, 또는 S이고; R1은 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고; 이의 각각은 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되고; R2는 H, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고; 이의 각각은 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되며; 다만, n = 0인 경우, R 잔기의 적어도 n + 3은 H가 아니다. 그러한 제제는 PCT 공개 WO/2008/042973호에 기술되어 있으며, 이는 지질 제제에 대한 개시를 위해 전체가 참조로 본원에 통합된다. 특정의 추가적인 제제는 Akinc et al., Nature Biotechnology 26, 561 - 569 (01 May 2008)에 기술되어 있으며, 이는 지질 제제에 대한 개시를 위해 전체가 참조로 본원에 통합된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 하나 이상의 수정된 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 부형제를 포함한다. 그러한 특정 구현예에서, 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀라아제, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 규산, 점성이 있는 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 혼합, 용해, 입화, 당제 제조, 분쇄, 유화, 캡슐화, 포괄(entrapping) 또는 정제화 과정을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 기법을 이용하여 제조된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 액체(예컨대, 현탁액, 엘릭서 및/또는 용액)이다. 그러한 특정 구현예에서, 액체 약학적 조성물은 물, 글리콜, 오일, 알코올, 착향료, 보존제 및 착색제를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 기술 분야에 공지된 성분들을 이용하여 제조된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 고체(예컨대, 산제, 정제 및/또는 캡슐)이다. 그러한 특정 구현예에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고체 약학적 조성물은 전분, 당, 희석제, 입화제, 윤활제, 바인더 및 붕해제를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 기술 분야에 공지된 성분들을 이용하여 제조된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 저장 제제로 제형화된다. 그러한 특정 저장 제제는 전형적으로 비 저장 제제보다 더 오래 작용한다. 특정 구현예에서, 그러한 제제는 이식에 의해(예를 들어, 피하로 또는 근육 내로) 또는 근육 내 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 저장 제제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 적합한 오일 내의 유화액) 또는 이온 교환 수지를 이용하여, 또는 소량 용해되는 유도체, 예를 들어, 소량 용해되는 염으로 제조된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 전달 시스템을 포함한다. 전달 시스템의 예로는 리포좀 및 유화액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 전달 시스템은 소수성 화합물을 포함하는 것들을 포함하는 특정 약학적 조성물을 제조하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 디메틸설폭사이드와 같은 특정 유기 용매가 이용된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 약학적 작용제를 특이적인 조직 또는 세포 유형에 전달하고자 설계된 하나 이상의 조직 특이적 전달 분자를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 조직 특이적 항체로 코팅된 리포좀을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 지효성 시스템을 포함한다. 그러한 지효성 시스템의 비제한적인 예는 고체 소수성 고분자의 반투과성 매트릭스이다. 특정 구현예에서, 지효성 시스템은 그것들의 화학적 속성에 따라, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐 약학적 작용제를 방출할 수 있다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 주사(예컨대, 정맥 내, 피하, 근육 내 등) 투여용으로 제조된다. 그러한 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 담체를 포함하고, 물 또는 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리적 식염수 완충액과 같은 수성 용액 내에 제형화된다. 특정 구현예에서, 기타 성분들이 포함된다(예컨대, 가용성을 보조하거나 보존제로 작용하는 성분들). 특정 구현예에서, 주사 가능한 현탁액이 적당한 액체 담체, 현탁화제 등을 이용하여 제조된다. 특정 주사용 약학적 조성물은 예컨대, 앰플 또는 복수 용량의 용기 내에 단위 투여량 형태로 존재한다. 특정 주사용 약학적 조성물은 유성 또는 수성 용제 내의 현탁액, 용액 또는 유화액이고, 현탁화제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형을 위한 작용제를 함유할 수 있다. 주사용 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 특정 용매로는 친유성 용매와 참기름과 같은 지방유, 에틸 올레산 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르 및 리포좀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 수성 주사 현탁액은 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같이, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 또한, 그러한 현탁액은 적합한 안정제, 또는 매우 농축된 용액을 제조할 수 있도록 약학적 작용제의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 수정된 올리고뉴클레오티드를 치료적으로 유효한 양으로 포함한다. 특정 구현예에서, 치료적으로 유효한 양은 질병의 증상을 예방, 완화, 또는 경감시키거나, 치료 받는 대상자의 생존을 연장시키기에 충분하다. 치료적으로 유효한 양의 결정은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 능력 범위 내에 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 하나 이상의 수정된 올리고뉴클레오티드는 전구약물로 제형화된다. 특정 구현예에서, 생체 내 투여 시, 전구약물은 생물학적으로, 약학적으로 또는 치료적으로 더욱 활성을 나타내는 올리고뉴클레오티드 형태로 화학적으로 전환된다. 특정 구현예에서, 전구약물은 상응하는 활성형보다 투여에 용이하기 때문에 유용하다. 예를 들어, 특정 경우에, 전구약물은 상응하는 활성형보다 (예컨대, 경구 투여를 통해) 더욱 생체 이용가능성이 있을 수 있다. 특정 경우에, 전구약물은 상응하는 활성형과 비교하여 향상된 용해도를 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, 전구약물은 상응하는 활성형보다 더 낮은 수용성을 나타낸다. 특정 경우에, 그러한 전구약물은 수용성이 이동성에 불리한 경우에, 세포막을 가로지르는 우수한 전달력을 보유한다. 특정 구현예에서, 전구약물은 에스테르이다. 그러한 특정 구현예에서, 에스테르는 투여 시 카르복시산으로 대사적으로 가수분해된다. 특정 경우에, 화합물을 함유하는 카르복시산은 상응하는 활성형이다. 특정 구현예에서, 전구약물은 산 기에 결합된 짧은 펩티드(폴리아미노산)을 포함한다. 그러한 특정 구현예에서, 투여 시 펩티드가 절단되어 상응하는 활성형을 형성한다.
특정 구현예에서, 활성 화합물이 생체 내 투여 시 재생되도록 약학적으로 활성이 있는 화합물을 수정함으로써 전구약물이 생성된다. 대사 안정성 또는 약물의 수송 특성을 바꾸기 위해, 부작용 또는 독성을 가리기 위해, 약물의 향미를 개선하기 위해, 또는 약물의 기타 특성 또는 성질을 바꾸기 위해, 전구약물을 설계할 수 있다. 약력학적 과정 및 생체 내 약물 대사에 관한 지식에 의해 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 일단 약학적으로 활성이 있는 화합물이 공지되면 화합물의 전구약물을 설계할 수 있다(예컨대, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392 참조).
특정 추가 요법
miR-21과 관련된 질병의 치료는 두 가지 이상의 요법을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 마이크로RNA에 상보적인 핵염기 서열을 가지고 있는 수정된 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계 이외에, 적어도 하나의 요법을 행하는 단계를 포함하는, miR-21과 관련된 질병을 앓고 있는 대상자 또는 miR-21과 관련된 질병을 앓고 있다고 의심되는 대상자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 요법은 약학적 작용제를 포함한다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 항염증제를 포함한다. 특정 구현예에서, 항염증제는 스테로이드성 항염증제이다. 특정 구현예에서, 스테로이드성 항염증제는 코르티코스테로이드이다. 특정 구현예에서, 코르티코스테로이드는 프레드니손이다. 특정 구현예에서, 항염증제는 비스테로이드 항염증제이다. 특정 구현예에서, 비스테로이드 항염증제는 이부프로펜, COX-I 저해제, 또는 COX-2 저해제이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 항당뇨병약을 포함한다. 항당뇨병약은 비구아니드, 글루코시다아제 저해제, 인슐린, 설포닐우레아, 티아졸리딘디온을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 이뇨제(예컨대, 스프리오노락톤, 에플러레논, 푸로세미드), 근육수축제(예컨대, 도부타민, 밀리논), 디곡신, 혈관확장제, 안지오텐신 II 전환효소(ACE) 저해제(예컨대, 캅토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 퀴나프릴, 포시노프릴 및 라미프릴), 안지오텐신 II 수용체 차단제(ARB)(예컨대, 칸데사르탄, 일베사르탄, 올메사르탄, 로사르탄, 발사르탄, 텔미사르탄 및 에프로사르탄), 칼슘 채널 차단제, 이소소르비드 디니트레이트, 하이드랄라진, 질산염(예컨대, 이소소르비드 모노니트레이트, 이소소르비드 디니트레이트), 하이드랄라진, 베타 차단제(예컨대, 카르베디롤, 메토프롤롤) 및 나트륨이뇨펩티드(예컨대, 네시리티드)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, ACE 저해제는 실라자프릴, 페린도프릴 및 트란돌라프릴로부터 선택된다.
특정 구현예에서, ACE 저해제는 0.025 내지 0.1mg/kg 체중의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ACE 저해제는 0.125 내지 1.0mg/kg 체중의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ACE 저해제는 1 내지 6mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ACE 저해제는 1 내지 2mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ACE 저해제는 2 내지 4mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ACE 저해제는 0.5 내지 1mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, 라미프릴은 1 내지 6mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 라미프릴은 1 내지 2mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 에날라프릴은 2 내지 4mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 리시노프릴은 4 내지 8mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 베나제프릴은 4 내지 8mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 포시노프릴은 4 내지 8mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 퀴나프릴은 4 내지 8mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 실라자프릴은 1 내지 2mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 페린프릴은 1 내지 2mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 트란돌라프릴은 0.5 내지 1mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, ARB는 6.25 내지 150mg/m2/일 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ARB는 6.25mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ARB는 10mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ARB는 12.5mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ARB는 18.75mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ARB는 37.5mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ARB는 50mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ARB는 150mg/m2/일의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, 로사르탄은 12.5mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 로사르탄은 12.5mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 칸데사르탄은 6.25mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 일베사르탄은 37.5mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 텔미사르탄은 10mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 발사르탄은 18.75mg/m2/일의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 에스프레사르탄은 150mg/m2/일의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 알도스테론 길항제이다. 특정 구현예에서, 알도스테론 길항제는 스피로놀락톤이다. 특정 구현예에서, 스피로놀락톤은 1일 10 내지 35mg 범위의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 스피로놀락톤은 1일 25mg의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 헤파리노이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 헤파리노이드는 펜토산 폴리설페이트이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 섬유 형성 신호에 대한 하나 이상의 반응을 차단하는 약학적 작용제이다.
특정 구현예에서, 약학적 작용제는 항결합조직 성장인자 요법이다. 특정 구현예에서, 항CTGF 요법은 CTGF에 대한 단일 클론 항체이다.
특정 구현예에서, 추가적인 요법은 저용량 시클로포스파미드, 타이모스티뮬린, 비타민 및 영양보충제(예컨대, 비타민 A, C, E, 베타 카로틴, 아연, 셀레늄, 글루타티온, 코엔자임 Q-10 및 에키네시아를 포함하는 항산화제) 및 백신, 예컨대, 항원을 다중 결합하여 제시한 것과 보조제를 결합한 백신 제형을 포함하는 면역자극 복합체(ISCOM)를 포함하는, 신체의 면역 체계를 증진시키는 약학적 작용제일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 약학적 조성물의 부작용을 치료 또는 경감시키기 위하여 추가적인 요법이 선택된다. 그러한 부작용은 주사 부위 반응, 간 기능 시험 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 이상 및 근 질환을 제한 없이 포함한다. 예를 들어, 혈청 내의 증가된 아미노기 전달효소 수준은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 빌리루빈은 간 독성 또는 간 기능 이상을 나타낼 수 있다.
추가적인 약학적 작용제의 추가적인 예로는 정맥 내 면역글로불린(IVIg)을 포함하나 이에 한정되지 않는 면역글로불린; 진통제(예컨대, 아세트아미노펜); 살리실산; 항생제; 항바이러스제; 항진균제; 아드레날린 작용성 조절제; 호르몬(예컨대, 단백동화 스테로이드, 안드로겐, 에스트로겐, 칼시토닌, 프로게스틴, 소마토스탄 및 갑상선 호르몬); 면역조절제; 근육 이완제; 항히스타민제; 골다공증 작용제(예컨대, 바이포스포네이트, 칼시토닌 및 에스트로겐); 프로스타글란딘, 항신생물제; 정신치료제; 진정제; 옻나무 생성물; 항체; 및 백신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 키트
본 발명은 또한 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 수정된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함하며, 이때, 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 miR-21의 핵염기 서열에 대해 상보적이다. miR-21에 상보적인 화합물은 본원에 기술된 임의의 뉴클레오시드 패턴을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, miR-21에 상보적인 화합물은 바이알 내에 존재할 수 있다. 10개와 같은, 다수의 바이알이 예를 들어, 조제 팩 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이알은 주사기로 이용할 수 있도록 제조된다. 키트는 또한 miR-21에 상보적인 화합물의 이용설명서를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 대상자에게 miR-21에 상보적인 화합물을 투여하기 위하여 이용될 수 있다. 그러한 경우에, miR-21에 상보적인 화합물 이외에, 키트는 하나 이상의 다음과 같은 것들을 더 포함할 수 있다: 주사기, 알코올 면봉, 약솜 및/또는 거즈. 일부 구현예에서, miR-21에 상보적인 화합물은 바이알보다는 (예를 들어, 바늘 가드(needle guard)가 구비된 27게이지, ½인치 바늘을 구비한 1회 용량 주사기와 같이) 미리 채워진 주사기 내에 존재할 수 있다. 10개와 같이, 다수의 미리 채워진 주사기가 예를 들어 조제 팩 내에 존재할 수 있다. 키트는 또한 miR-21에 상보적인 화합물의 투여 설명서를 함유할 수 있다.
특정 실험 모델
특정 구현예에서, 본 발명은 실험 모델에서 본 발명의 수정된 올리고뉴클레오티드를 이용 및/또는 시험하는 방법을 제공한다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 약학적 작용제를 평가하기 위하여 그러한 실험 모델에 대한 프로토콜을 선택하고 수정할 수 있다.
일반적으로, 수정된 올리고뉴클레오티드는 우선 배양된 세포에서 시험한다. 적합한 세포 유형으로는, 수정된 올리고뉴클레오티드의 전달이 생체 내에서 바람직한 세포 유형과 관련이 있는 세포들을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법 연구에 적합한 세포 유형으로는 1차 또는 배양된 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 수정된 올리고뉴클레오티드가 miR-21의 활성을 방해하는 정도는 배양된 세포에서 평가한다. 특정 구현예에서, 마이크로RNA 활성의 저해는 마이크로RNA 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다. 대안적으로, 예측된 또는 검증된 마이크로RNA 조절 전사체의 수준을 평가할 수 있다. 마이크로RNA 활성의 저해는 miR-21 조절 전사체 및/또는 miR-21 조절 전사체에 의해 암호화된 단백질의 증가를 초래할 수 있다. 나아가, 특정 구현예에서, 특정 표현형의 결과를 측정할 수 있다.
인간 질병 모델에서 miR-21 연구를 위한 여러 가지 동물 모델은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이용할 수 있다. 예를 들어, miR-21의 저해제는 알포트 증후군의 실험 동물, 예를 들어 Col4a3 유전자 제거 마우스(Col4a3 -/- 마우스)에서 연구될 수 있다. 마우스 모델에서 질병의 중증도는 Col4a3 돌연변이를 지니는 마우스의 유전적 배경에 의해 결정된다. 예를 들어, 질병의 발병 및 진행은 C57BL/6J 배경에 비해 129X1/SvJ에서 대개는 더 빠르다. 따라서, Col4a3 -/- 마우스의 유전적 배경은 질병의 발병 및 진행에 변화를 주기 위하여 선택될 수 있다. 추가적인 모델로는 X 연관형, 상염색체 열성 또는 상염색체 우성 알포트 증후군의 개 모델을 포함한다. 예를 들어, Kashtan, Nephrol. Dial. Transplant, 2002, 17: 1359-1361 참조.
특정 정량 분석법
수정된 올리고뉴클레오티드 투여 후의 miR-21의 안티센스 저해 효과는 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 방법으로 평가할 수 있다. 특정 구현예에서, 이들 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 세포 또는 조직의 마이크로RNA 수준을 정량하는 데 이용된다. 특정 구현예에서, 마이크로RNA 수준 변화는 마이크로어레이 분석에 의해 측정된다. 특정 구현예에서, 마이크로RNA 수준 변화는 TaqMan®마이크로RNA 분석법(Applied Biosystems)과 같은 여러 가지 상업용 PCR 분석법 중 하나에 의해 측정한다. 특정 구현예에서, miR-21의 안티센스 저해는 miR-21의 표적의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 측정하여 평가한다. miR-21의 안티센스 저해는 일반적으로 마이크로RNA 표적의 mRNA 및/또는 단백질 수준의 증가를 초래한다.
표적 관여 분석법
항-miR 또는 마이크로RNA 모방체를 이용한 마이크로RNA 활성의 조절은 표적 관여를 측정하여 평가할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 관여는 mRNA의 마이크로어레이 프로파일링에 의해 측정한다. 마이크로RNA의 표적인 mRNA의 조절을 마이크로RNA의 표적이 아닌 mRNA의 조절과 비교하기 위하여, 항-miR 또는 마이크로RNA 모방체에 의해 조절되는(증가 또는 감소되는) mRNA의 서열을 마이크로RNA 시드 서열에 대해 검색한다. 이러한 방식으로, 항-miR과 miR-21의 상호작용 또는 miR-21 모방체와 그 표적의 상호작용을 평가할 수 있다. 항-miR의 경우, 항-miR과 상보적인 마이크로RNA에 대한 시드 매치를 포함하는 mRNA 서열에 대해 발현 수준이 증가되는 mRNA를 스크리닝한다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 일부 구현예를 더욱 완전히 설명하기 위하여 제시한 것이다. 그러나, 그것들을 결코 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 식으로 해석해서는 안 된다.
당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않고 다양한 화합물을 설계하기 위하여 본 발견의 근본적인 원리를 용이하게 채택할 것이다.
실시예 1: 알포트 증후군 모델에서의 항-miR-21
129sv 유전적 배경의 Col4a3 -/- 마우스는 인간 알포트 증후군과 유사한 중증 신장 질환을 자발적으로 발달시킨다. 따라서, Col4a3 -/- 마우스를 알포트 증후군의 실험 모델로서 이용한다.
miR-21에 상보적인 수정된 올리고뉴클레오티드(항-miR-21 화합물)을 알포트 증후군의 Col4a3 -/- 모델에서 시험하였다. 야생형 마우스를 대조군 마우스로 이용하였다.
항-miR-21 화합물의 구조는 5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO: 3)인데, 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타낸다. 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
3주령에, Col4a3-/- 마우스를 확인하고자 마우스의 유전자형을 조사하였다. 3주령부터 9주령까지, 성 맞춤 마우스 한배 새끼를 항-miR-21 또는 PBS로 처리하였다. 항-miR-21은 주 2회, 25mg/kg의 용량으로 피하로 투여하였다. 처리군은 (1) 야생형 마우스, PBS 투여, n = 8; (2) Col4a3-/- 마우스, PBS 투여, n = 12; (3) Col4a3-/- 마우스, 항-miR-21 투여, n = 12였다. Col4a3-/- 마우스의 야생형 한배 새끼를 야생형 대조군 마우스로 이용하였다. 매주 야간뇨 시료(대략 16시간)를 수집하였다. 혈장과 신장은 9주 말에 채취하였다. 신장 기능의 변화, 신장 손상 및 사구체 경화증 및 간질성 섬유증을 확인하고자 체액 및 조직 시료를 분석하였다.
혈액 또는 소변에서 종말점으로는 혈액 요소 질소(BUN), 알부민뇨, 알부민/크레아티닌 비율, 사구체 여과율의 측정치를 포함하였다. 조직학적 분석으로는 사구체 경화증, 간질성 섬유증, 세관 손상, 대식세포 침투 및 근섬유모세포의 존재에 대한 평가를 포함하였다.
혈액 요소 질소(BUN)를 9주차에 측정하였다. 통계적 유의도는 만 휘트니 검증으로 계산하였다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 연구 말기에, PBS 처리된 대조군 동물에 비해 항-miR-21로 처리된 동물에서 BUN의 통계적으로 유의미한 감소가 관찰되었다. 감소된 BUN은 전체적으로 관찰되었을 뿐만 아니라(도 1a), 수컷 마우스 단독에서도(대조군 수컷 마우스에서의 대략 25mg/dL에 비해 대략 90mg/dL), 그리고 암컷 마우스 단독에서도(대조군 암컷 마우스에서 대략 25mg/dL에 비해 대략 70mg/dL) 관찰되었다(데이터 미도시). Col4a3+/+ 마우스의 BUN은 대략 12.5 mg/kL(정상 한계 내; 미도시)였다. BUN은 신장 기능의 혈액 마커이다. BUN이 더 높을수록 더 불량한 신장 기능과 관련이 있다. BUN의 감소는 감소된 신장 부상 및 손상과 향상된 기능의 지표이다.
알부민뇨는 매주 1호의 빈도로 16시간에 걸쳐 수집된 소변 시료 내의 알부민을 ELISA에 의해 측정하고, 소변 크레아니틴 배설에 대해 정규화하여 평가하였다. 모든 분석은 연구 말기에 동시에 수행하였다. 도 1b에 나타난 바와 같이, Col4a3-/- 마우스는 중증 알부민뇨를 발달시킨다. 그러나 항-miR-21로 처리된 마우스는 소변 알부민 대 크레아티닌 비율의 감소로 검출된 바와 같이 훨씬 적은 알부민뇨를 발달시켰다. 이러한 감소는 7주에 관찰되어 9주까지 지속되었다. Col4a3-/- 마우스의 야생형 한배 새끼는 예상했던 대로 알부민뇨를 나타내지 않았다. 알부민뇨는 사구체 및 세관 손상의 민감한 척도이다. 알부민 대 크레아티닌 비율의 감소는 사구체 및/또는 세관 질병의 감소를 나타낸다.
또한, 알포트 증후군은 사구체 경화증의 점진적인 발달 및 부적절한 사구체 유출이 일어남에 따라 발생하는 상당한 간질성 신장 섬유증을 특징으로 한다. 따라서, 경화성 병변(모세관 루프의 손실+섬유증 또는 유리질증)에 대한 사구체의 맹검 채점법(blinded scoring)으로 사구체 경화증을 평가하였다. 맹검 관찰자가 각 마우스로부터 30개의 사구체를 연속적으로 채점하였다. 점수는 0~4였다(여기서 0 = 정상; 1 = 경화증에 의해 영향을 받은 사구체가 < 25%인 경우; 2 = 25~50%가 경화증에 의해 영향을 받음; 3 = 50~75%가 경화증에 의해 영향을 받음; 4 = 75~100%가 경화증에 의해 영향을 받음). 질병이 없는 사구체의 비율은 항-miR-21로 처리된 마우스에서 훨씬 높았고, 중간 정도로 또는 심하게 영향을 받은 사구체(2~4점)가 있는 사구체의 비율은 PBS로 처리된 마우스에서 유의미하게 높았다(도 2). Col43a-/- 마우스의 야생형 한배 새끼(WT)에서도 사구체를 채점하였다. PBS 처리된 Col4a3-/- 동물 및 항-miR-21 Col4a3-/- 동물로부터 피코시리우스 레드로 염색된 전체 시상 박편에서 계량 형태학적으로 간질성 섬유증을 측정하였다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 간질성 섬유증의 통계적으로 유의미한 감소가 항-miR-21 처리된 Col4a3-/- 마우스에서 관찰되었다. 또한, 주된 병리학적 기질 단백질인 콜라겐 Ia(1)(Col1a1)에 대한 전사물을 대상으로 한 정량적 PCR 결과, 항-miR-21 처리된 Col4a3-/-마우스의 신장 조직이 이러한 병리학적 콜라겐을 훨씬 더 적게 생산함을 보여주었다(도 3b).
과요오드산 쉬프(PAS) 반응에 의해 염색된, 파라핀 포매 및 파라포름알데히드(4%)로 고정시킨 조직 박편에서 신장 조직 손상을 평가하였다. 처음에는 신장 박편을 세관 및 사구체 손상과 염증을 기초로 하여 전반적인 손상에 대해 순위를 매겼다. 부상은 세관 확장, 브러시 보더 상실, 세포 침투, 사구체 염증, 간질성 부종 및 세포 괴사를 포함한 다양한 인자를 기초로 하여 평가하였다. 전반적인 손상에 대해 맹검 방식으로 신장 박편을 순위를 매기고, 신장 손상 순위 점수를 부여하였다. Col4a3 -/- 마우스의 신장 박편은 유의미하게 더 낮은 신장 손상 순위 점수를 나타냈는데, 이는 더 적은 신장 손상의 지표이다(도 4a). 이를 더욱 상세히 분석하기 위하여, 사구체를 사구체 반월체를 가지고 있는 비율에 대해 맹검 관찰자가 평가하였다. 반월체는 보먼 주머니 내의 세포의 증식으로, 보먼 강 내의 세포들로 이루어진 2층 이상으로 정의된다. 반월체는 사구체 손상의 확립된 마커이다. 항-miR-21을 받은 Col4a3-/- 마우스에서는 반월체가 있는 사구체의 비율은 대략 44%였던 반면, PBS 대조군 처리를 받은 마우스에서는 반월체가 있는 사구체의 비율은 대략 19%였다(도 4b). Col4a3+/+ 한배 새끼에서는, 반월체가 있는 사구체의 비율은 5% 미만이었다(미도시). 신장의 네프론의 세관 또한 부상 부위이다. 세관 부상은 각각의 신장의 전체 시상 박편을 커버하는 연속적인 영상 위에 격자를 덧씌워 평가하였다. 맹검 방식으로 세관의 부상을 격자의 각 칸에서 평가하였다. 세관 부상은 세관 확장/편평의 존재, 브러시 보더 상실, 세포 침투 및 세포 괴사를 기초로 하여 평가하였다. 이러한 특질들이 존재할 경우 격자 상의 그 칸에 양의 점수가 매겨진다. 세관 부상이 있는 칸들의 %인 전체 점수가 각 영상에 적용된다. 그 신장으로부터의 모든 영상에 대해 이 값의 평균을 낸다. 그런 다음, 각각의 신장에 대한 평균 점수를 통계 분석의 대상으로 삼았다. 나타난 바와 같이, 세관 손상 점수는 PBS를 받는 Col4a3-/-에 비해, 항-miR-21로 처리된 Col4a3-/- 마우스에서 유의미하게 더 낮았다(도 4c). Col4a3+/+ 한배 새끼의 세관 손상 점수는 10% 미만이었다(미도시).
신장 시료에 대한 추가적인 조직학적 분석을 수행하여 대식세포 침투, 내피 안정성 및 근섬유모세포 침착을 평가하였다. F4/80 염색으로 판단된 바와 같이, 대식세포 침투는 PBS 처리된 Col4a3-/- 대조군 마우스에 비해 항-miR-21 처리된 Col4a3-/- 마우스에서 감소되었다(도 5a). CD31에 대한 면역 세포 화학적 염색은 PBS 처리된 Col4a3-/- 대조군 마우스에 비해 항-miR-21 처리된 Col4a3-/- 마우스에서 내피 안정성의 향상을 나타내었다(미도시). 알파-SMA의 검출은 PBS 처리된 Col4a3-/- 대조군 마우스에 비해 항-miR-21 처리된 Col4a3-/- 마우스에서 근섬유모세포 침착의 감소를 나타냈다(도 5b). Col4a3+/+ 마우스에서, 알파-SMA 염색은 대략 5%였다(미도시).
활성 산소종(ROS)은 정상적인 세포 대사의 부산물이다. 세포 스트레스 도중, 과도한 ROS는 세포 및 세포기관 막의 지질 과산화를 유발할 수 있어, 구조 건전성 및 세포 수송 및 에너지 생산을 위한 능력의 붕괴를 초래한다. 신장에서는, 세포 스트레스 도중 생성된 ROS는 신장 손상을 유발할 수 있다. Col4a3-/- 마우스에서 miR-21의 저해 후에 ROS의 생성이 감소되는지를 평가하기 위하여, 항-miR-21 및 PBS 처리된 마우스에서 소변의 과산화수소 수준을 측정하였다. 소변의 과산화수소 수준은 항-miR-21를 받은 마우스에서 유의미하게 감소되었다(도 6a). Col4a3+/+ 마우스에서, 소변의 과산화수소 수준은 5μM 미만이었다(미도시). 나아가, ROS의 척도인, 디하이드로에티듐(DHE)을 이용한 신장 조직의 면역 세포 화학적 염색은 PBS 처리된 대조군 마우스와 비교할 때, 항-miR-21 처리된 Col4a3-/- 마우스의 신장 조직에서 ROS의 감소를 보여주었다(도 6b). Col4a3+/+ 마우스에서, 10% 미만의 DHE 염색이 관찰되었다(미도시). 이러한 데이터는 항-miR-21로 처리된 Col4a3-/- 마우스에서의 소변 및 신장 조직 모두에서 ROS의 감소를 보여준다. 따라서, 항-miR-21이 신장 손상을 감소시킬 수 있는 한 가지 메커니즘으로는 활성 산소종 생성의 감소를 포함할 수 있다.
항-miR-21로 처리한 Col4a3-/- 마우스의 신장에서의 단백질의 면역학적 블로팅은 Col4a3-/- 마우스에 비해 신장에서 MPV17L 단백질 양이 증가하였음을 보여주었다. MPV17L은 활성 산소종의 대사에 연루된 미토콘드리아 내막 단백질로, 산화적 스트레스에 대해 보호한다. 따라서, 항-miR-21 처리 후의 ROS의 생성 감소는 적어도 부분적으로는 증가된 MPV17L 수준 때문에 일어날 수 있다. 항-miR-21의 기계론적 효과를 더 조사하기 위하여, PBS 또는 항-miR-21로 처리된 Col4a3-/- 마우스의 신장을 면역학적으로 블로팅하여 PPAR-알파 단백질을 측정하였다. 항-miR-21 처리는 PPAR-알파 단백질을 증가시켜, 대사 경로의 자극을 시사하였다.
발세포는 고도로 분화된 상피세포로, 사구체 여과 장벽의 필수적인 구성성분이다. 발세포 상실은 단백뇨를 초래할 수 있고, 일부 질병 상태에서는 사구체 경화증을 초래할 수 있다. Col4a3-/- 마우스에서 miR-21의 저해에 의해 발세포 수가 영향을 받는지를 평가하기 위하여, 항-miR-21 및 PBS 처리된 마우스에서 발세포 수를 측정하였다. 발세포 수는 PBS 처리 마우스에 비해 항-miR-21을 받은 Col4a3-/- 마우스에서 유의미하게 증가되었으며, Col4a3-/- 마우스의 야생형 한배 새끼에서 관찰된 발세포 수와 비슷하였다(도 7). 따라서, 항-miR-21이 알포트 증후군의 모델에서 신장 손상을 감소시킬 한 가지 메커니즘은 발세포 상실을 방지하거나 감소시키는 것에 의해서이다.
다음과 같은 항-miR-21 화합물을 이용하여 유사한 연구를 수행하였다:
항-miR-21 화합물 #1(위): 5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO: 3)
항-miR-21 화합물 #2: 5'-AECSATCSASGTCSUSGAUSASAGCSUsAE-3'(SEQ ID NO: 3);
항-miR-21 화합물 #3: 5'-MeCEASASTECSUSAEAEUSASAEGECSTEAS-3'(SEQ ID NO: 4); 및
항-miR-21 화합물 #4: 5'-AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-3'(SEQ ID NO: 3); 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타내고, 윗첨자 "Me"는 뉴클레오시드의 염기 상의 5-메틸 기를 나타낸다. 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
각각의 화합물은 9주 동안 주 2회, 25mg/kg의 용량으로 3주령의 Col4a3-/- 마우스에 투여되었다. 대조군에는 PBS로 처리된 Col4a3-/- 마우스, 그리고 Col4a3-/- 마우스의 야생형 한배 새끼가 포함되었다. 각각의 처리군은 10 내지 12마리의 마우스를 함유하였다. 화합물 #1, 2 및 4의 경우, 종말점을 위에 기술된 바와 같이 평가하였는데, BUN, 소변 알부민 대 크레아티닌 비율, 신장 손상(PAS 염색), 사구체 경화증 및 반월체가 있는 사구체의 비율을 포함하였다. 화합물 #3의 경우, 종말점으로는 위에 기술된 바와 같이 평가된, BUN, 소변 알부민 대 크레아티닌 비율 및 (섬유증의 척도로서) 콜라겐 유전자 발현을 포함하였다.
위에 기술된 결과와 일관되게, 항-miR-21 화합물 #1은 평가된 모든 종말점들을 향상시켰다. 항-miR-21 화합물 #2 둘 다의 효능은 화합물 #1의 효능과 비슷하였으며, BUN, 소변 알부민 대 크레아티닌 비율, 신장 손장, 사구체 경화증의 정도 및 반월체가 있는 사구체의 백분율에서 향상됨이 관찰되었다. 화합물 #3의 효능은 화합물 #1의 효능과 비슷하였으며, BUN, 소변 알부민 대 크레아티닌 비율 및 Col1a1 발현이 향상되었다. 항-miR-21 화합물 #4는 시험했던 다른 화합물들보다 덜 효과적이었으나, 여전히 BUN, 신장 손상, 사구체 경화증의 정도 및 반월체가 있는 사구체의 백분율에서 향상되는 결과가 나타났다.
종합하자면, 이러한 데이터는 알포트 증후군의 모델에서 항-miR-21 처리가 신장 기능의 상실 및 알부민뇨의 발달을 약화시킴을 보여준다. 사구체 경화증과 간질성 섬유증은 현저하게 약화되었으며, 근위 세뇨관은 보존되었다. 항-miR-21이 Col4a3-/- 마우스에서 신장 기능의 점진적인 상실을 방지하고, 사구체 및 세뇨관-간질성 질병을 약화시키므로, 항-miR-21은 인간 알포트 증후군의 치료제이다.
실시예 2: 알포트 증후군 모델에서 miR-21의 증가
알포트 증후군의 실험 모델에서 miR-21의 조절 장애를 평가하기 위하여, 마우스로부터 채취한 신장 조직에서 miR-21 수준을 측정하였다. 전체 신장으로부터 RNA를 분리하고, 정량적 PCR로 miR-21을 측정하였다. Col4a3-/- 마우스에서, miR-21 수준은 야생형 마우스의 miR-21 수준에 비해 대략 3배 증가되었다.
따라서, 알포트 증후군에 대한 치료를 받는 대상자는 치료 시행 전에 신장 생체검사 물질, 소변 또는 혈액에서 증가된 miR-21을 나타내는 것으로 확인될 수 있다.
실시예 3: 알포트 증후군 모델에서의 생존 연구
야생형 마우스는 일반적으로 2 내지 3년(또는 730 내지 1095일)을 산다. 129X1/SvJ 배경의 Col4a3-/- 마우스에서는 말기 신부전이 2개월령에 발생할 수 있다. C57BL/6J 배경의 Col4a3-/-에서는 말기 신부전이 6개월령에 발생할 수 있다. 배경과 상관 없이, Col4a3-/- 마우스의 수명은 야생형 마우스의 수명보다 상당히 짧다. 따라서, 임의의 유전적 배경의 Col4a3-/- 마우스는 알포트 증후군에서 말기 신부전의 모델로서 기능할 수 있고, 기대 수명에 미치는 후보 치료제의 효과를 평가하는 데에 이용될 수 있다.
Col4a3-/- 마우스를 확인하고자 마우스의 유전자형을 조사한다. 항-miR-21은 최대 1년 동안 주 1회 또는 2회, 10 내지 25mg/kg 범위의 용량으로 피하 투여된다. PBS는 대조군 처리로 투여될 수 있다. 야간뇨 시료(대략 16시간)를 연구 전반에 걸쳐 주간 또는 월간 계획으로 수집한다. 사망시의 각 마우스의 나이를 기록한다. 사망시 또는 연구 종료시에 혈장과 신장을 수집한다. 신장 기능의 변화, 사구체 경화증 및 섬유증을 확인하고자 체액 및 조직 시료를 분석한다.
신장 기능의 변화, 신장 부상 및 사구체 경화증 및 간질성 섬유증을 확인하기 위하여 체액 및 조직 시료를 분석한다. 혈액 또는 소변에서의 종말점으로는 혈액 요소 질소(BUN), 알부민뇨, 알부민/크레아티닌 비율, 사구체 여과율의 측정치를 포함한다. 조직학적 분석으로는 사구체 경화증, 간질성 섬유증, 세관 손상, 대식세포 침투 및 근섬유모세포 존재의 평가를 포함한다.
PBS 처리된 대조군 마우스에 비해, 항-miR-21 처리된 마우스에서 말기 신부전의 발병 지연 및 증가된 기대 수명이 관찰되어, 항-miR-21이 알포트 증후군 대상자의 기대 수명을 증가시킬 수 있는 치료제임을 시사한다.
항-miR-21은 알포트 증후군의 모델에서 생존을 증가시킨다-단일 용량 연구
알포트 증후군의 실험 모델에서 항-miR-21이 생존에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 항-miR-21 화합물을 Col4a3-/- 마우스에 투여하였다.
항-miR-21 화합물의 구조는 5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO: 3)로, 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타낸다. 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
129X1/SvJ 배경의 Col4a3+/1 마우스(이형 접합체)를 교배시켜 Col4a3-/- 마우스를 발생시켰다. 3주령에 Col4a3-/- 마우스를 확인하기 위하여 마우스의 유전자형을 분석하였다. 처리군은 (1) Col4a3+/+ 마우스(야생형 한배 새끼), PBS 투여, 주 2회, n = 12; (2) Col4a3-/- 마우스, PBS 투여, 주 2회, n = 12; (3) Col4a3-/- 마우스, 25mg/kg 항-miR-21 피하 투여, 주 2회, n = 12였다. 처리는 3주부터 16주까지 내내 주 2회 시행하였다. 동물 체중을 매주 측정하였고, 수명을 기록하였다.
예상했던 대로, Col4a3-/- 마우스는 약 9주령에 시작되는 체중 감량을 겪었고, 사망은 9 내지 11주령에 발생했다. 도 8a에 나타난 바와 같이, 항-miR-21은 최고점 체중을 증가시켰고, 체중 감량을 유의미하게 지연시켰다(p < 0.01). 도 8b에 도시된 바와 같이, 항-miR-21은 유의미하게 수명을 증가시켰다(p < 0.001). 따라서, 항-miR-21 처리는 체중 감량을 지연시킬 뿐만 아니라, 중요하게는 Col4a3-/- 마우스의 생존을 향상시켰다.
항-miR-21은 알포트 증후군의 모델에서 생존을 증가시킨다-용량 반응 연구
알포트 증후군의 실험 모델에서 항-miR-21이 생존에 미치는 용량 반응 효과를 평가하기 위하여, 여러 가지 용량의 항-miR-21 화합물을 Col4a3-/- 마우스에 투여하였다.
항-miR-21 화합물의 구조는 5'-AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE-3'(SEQ ID NO: 3)로, 여기서 아래 첨자가 붙지 않은 뉴클레오시드는 β-D-데옥시리보뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "E"가 붙은 뉴클레오시드는 2'-MOE 뉴클레오시드를 나타내고, 아래 첨자 "S"가 붙은 뉴클레오시드는 S-cEt 뉴클레오시드를 나타낸다. 각각의 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합이다.
3주령에 Col4a3-/- 마우스를 확인하기 위하여 마우스의 유전자형을 분석하였다. 처리군은
(1) Col4a3-/- 마우스, 주 1회 PBS 투여, n = 13;
(2) Col4a3-/- 마우스, 주 1회 12.5mg/kg 항-miR-21 투여, n = 12;
(3) Col4a3-/- 마우스, 주 1회 25mg/kg 항-miR-21 투여, n = 13;
(4) Col4a3-/- 마우스, 주 1회 50mg/kg 항-miR-21 투여, n = 12;
(5) Col4a3-/- 마우스, 주 2회 25mg/kg 항-miR-21 투여, n = 12였다.
처리는 24일차에 개시하여 시행하였다. 동물 체중은 매주 측정하였고, 수명을 기록하였다. 7주에 BUN 측정을 위해 혈액을 수집하였다.
도 9a에 나타난 바와 같이, PBS 처리된 대조군 동물에 비해, 항-miR-21로 처리된 동물에서 BUN의 감소가 관찰되었다. BUN의 감소가 관찰되었으나 강하게 용량 반응적이지는 않았는데, 아마도 본 실험에 사용된 Col4a3-/- 마우스에서 질병이 더 심했다는 사실로부터 기인할 것이다(마우스를 이전 실시예에 기술된 Col4a3-/- 마우스와는 상이한 판매 회사로부터 획득하였다). 관찰된 BUN의 감소는 감소된 신장 손상 및 부상, 그리고 향상된 기능의 지표이다.
도 9b에 나타난 바와 같이, 항-miR-21 처리는 용량 반응적인 방식으로 Col4a3-/- 마우스의 수명을 증가시켰다. 증가된 수명은 주 2회 및 주 1회 처리 모두에서 관찰되었다. 생존 중앙값은 다음과 같다: PBS, 62일; 주 1회(QW) 12.5mg/kg 항-miR-21, 72.5일; 주 1회(QW) 25mg/kg 항-miR-21, 77일; 주 1회(QW) 50mg/kg 항-miR-21, 89일; 주 2회(BIW) 25mg/kg 항-miR-21, 82.5일.
PBS 처리 대조군 마우스에 비해 항-miR-21 처리된 마우스에서 신장 기능 장애의 발병 지연 및 증가된 기대 수명이 관찰되어, 항-miR-21이 알포트 증후군 대상자의 기대 수명을 증가시킬 수 있는 치료제임을 시사하였다.
실시예 4: Col4a3-/- 마우스의 신장에서의 항-miR 분포
항-miR 화합물을 비롯한 올리고뉴클레오티드는 신장 내의 여러 가지 세포 유형으로 분배된다고 알려져 있다. Chau et al., Sci Transl Med., 2012, 121ra18에 보고된 바와 같이, 정상 마우스 또는 신장 손상을 당한 마우스(일방적인 요관 폐색, 간질성 섬유증의 모델)에 Cy3 표지를 붙인 항-miR을 투여한 후, 신장에서 최대치의 형광 강도가 근위 세뇨관 상피에서 관찰되었다. 내피, 혈관주위세포, 근섬유모세포 및 대식세포도 모두 검출 가능한 양의 Cy3 표지를 붙인 항-miR을 함유하였다. 그러나, 사구체, 특히 발세포는, 화학적으로 수정된 올리고뉴클레오티드의 공지된 분포와 일관되게, 상당한 양의 항-miR을 흡수하지 않는 것으로 나타났다(Masarjian et al., Oligonucleotides, 2004, 14, 299-310).
알포트 증후군의 마우스 모델에서 항-miR의 분포를 조사하기 위하여, Cy3 표지를 붙인 항-miR 화합물을 6주령의 군(n = 3)과 8주령의 군(n = 4)의 두 가지 상이한 Col4a3-/- 마우스 군에, 그리고 8주령의 야생형 마우스 1군(n = 3)에 투여하였다. 항-miR 화합물 투여 후 이틀이 지나, 동물을 희생시키고, 신장을 채취하여 면역학적 분석을 진행하였다.
특정 세포 유형에서 항-miR 흡수를 확인하기 위하여 여러 가지 상이한 세포적 마커에 특이적인 항체로 신장 조직 박편에 공동으로 표지를 붙였다. 알파-SMA(근섬유모세포 마커), PDGFR-베타(혈관주위세포/근섬유모세포 마커), CD31(내피세포 마커), F4/80(대식세포 마커) 및 GP38(발세포 마커)에 대해 염색을 수행하였다. 예상했던 대로, 항-miR 화합물은 근위 세뇨관 상피, 혈관주위세포, 근섬유모세포 및 대식세포로 흡수되었다. 정상 마우스 및 간질성 섬유증 마우스에서의 이전의 관찰과는 상반되게, Col4a3-/- 마우스에서는 항-miR이 발세포를 포함한 사구체로 흡수되었다.
본 출원에 기술된 바와 같이, 알포트 증후군의 실험 모델에서 항-miR-21 투여 후에 관찰된 효능은 세뇨관을 둘러싼 간질성 섬유증의 향상뿐만 아니라, (사구체 경화증이라고 알려져 있는) 사구체에서의 섬유증의 향상도 수반한다. 이러한 데이터는 그러한 향상이, 향상된 세관 구조 및 기능으로부터의 피드백에 더하여 또는 이를 대신하여, 사구체에서의 항-miR 효과와 직접적으로 관련될 수 있음을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> Regulus Therapeutics, Inc. <120> METHODS FOR TREATMENT OF ALPORT SYNDROME <130> REGUL-32930/WO-1/ORD <150> US 61/779,137 <151> 2013-03-13 <150> US 61/711,514 <151> 2012-10-09 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 2 <211> 72 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60 ggcugucuga ca 72 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 acatcagtct gataagcta 19 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 caatctaata agcta 15

Claims (1)

  1. 알포트 증후군의 치료 방법.
KR1020237031594A 2012-10-09 2013-10-08 알포트 증후군의 치료 방법 KR20230136686A (ko)

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