CN102851291B - 包含抗微小rna反义寡核苷酸的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含长度为8－26个核苷酸碱基的短单链寡核苷酸的单链寡核苷酸或其缀合物，所述短单链寡核苷酸与选自miR19b、miR21、miR122a、miR155和miR375的人微小RNA互补。所述短寡核苷酸在体内在减轻miRNA阻遏中特别有效。发现将高亲和力核苷酸类似物掺入寡核苷酸内导致产生高度有效的抗微小RNA分子，其表现出经由与微小RNA靶形成几乎不可逆的双链体来起作用，而不是基于RNA切割的机制，例如与RNA酶H或RISC相关的机制。

Description

包含抗微小RNA反义寡核苷酸的药物组合物
本申请是申请号为200780015880.8、申请日为2007年3月30日、发明名称为“包含抗微小RNA反义寡核苷酸的药物组合物”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及包含含LNA的单链寡核苷酸的药物组合物，所述寡核苷酸能够抑制诱导疾病的微小RNA，特别是人微小RNAmiR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155和miR-375。
发明背景
微小RNA－基因表达的新型调节剂
微小RNA（miRNA）是小内源RNA的丰富类别，其通过与其靶mRNA碱基配对来充当基因表达的转录后调节剂。成熟miRNA通过RNA酶III核糖核酸酶Drosha（Lee等人2003）和Dicer（Hutvagner等人2001，Ketting等人2001）由较长的发夹转录物进行顺次加工。根据2005年10月的miRBase微小RNA数据库版本7.1（Griffith-Jones2004，Griffith-Jones等人2006），迄今为止超过3400种miRNA已在脊椎动物、无脊椎动物和植物中得到注释，并且对应假定基因的许多miRNA也已得到鉴定。
大多数动物miRNA通过不完全的碱基配对来识别位于3’-UTRs中的其靶位点，导致靶基因的反应抑制（Bartel2004）。越来越多的大量研究显示动物miRNA在下述方面起基本生物作用：细胞生长和凋亡（Brennecke等人2003）、造血细胞谱系分化（Chen等人2004）、寿命调节（Boehm和Slack2005）、光感受器分化（Li和Carthew2005）、同源框基因调节（Yekta等人2004、Hornstein等人2005）、神经元不对称（Johnston等人2004）、胰岛素分泌（Poy等人2004）、脑形态发生（Giraldez等人2005）、肌增殖和分化（Chen、Mandel等人2005、Kwon等人2005、Sokol和Ambros2005）、心脏发生（Zhao等人2005）和脊椎动物中的晚期胚胎发育（Wienholds等人2005）。
人疾病中的微小RNA
miRNA涉及广泛多样的人疾病。一种是脊髓性肌萎缩（SMA），由运动神经元（SMN）基因的存活减少的蛋白质水平或功能缺失突变引起的儿科神经变性疾病（Paushkin等人2002）。人SLITRK1基因中的miR-189的靶位点中的突变近期已显示与图雷特氏综合征相关（Abelson等人2005），而另一项近期研究报道丙型肝炎病毒（HCV）RNA基因组与宿主细胞微小RNA——肝特异性miR-122a相互作用，以促进其在宿主中的复制（Jopling等人2005）。其中已涉及miRNA或其加工机制的其他疾病包括由脆性X智力低下蛋白质（FMRP）的不存在引起的脆性X智力低下（FXMR）（Nelson等人2003，Jin等人2004）和迪格奥尔综合征（Landthaler等人2004）
此外，紊乱的miRNA表达模式已在许多人癌症中得到报道。例如，人miRNA基因miR15a和miR16-1在大多数B细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL）情况下是被删除或下调的，其中13种miRNA基因的独特标记近期显示与预后和进展相关（Calin等人2002，Calin等人2005）。miRNA在癌症中的作用进一步得到下述事实的支持：超过50％的人miRNA基因位于癌症相关的基因组区域中或脆性位点上（Calin等人2004）。近期，人癌症的多样性的系统表达分析揭示与正常组织比较，肿瘤中的miRNA的一般下调（Lu等人2005）。有趣的是，分化不良肿瘤的基于miRNA的分类是成功的，然而当应用于相同样品时，mRNA谱是高度不准确的。miRNA也已显示在乳腺癌（Iorio等人2005）、肺癌（Johnson等人2005）和结肠癌（Michael等人2004）中是下调的，然而在人B细胞淋巴瘤中扩增的miR-17-92簇，和在伯基特氏淋巴瘤中上调的miR-155已报道为第一种人miRNA癌基因（Eis等人2005，He等人2005）。因此，人miRNA将不仅作为生物标记用于未来的癌症诊断是高度有用的，而且快速出现为吸引人的靶用于通过寡核苷酸技术的疾病干预。
使用单链寡核苷酸抑制微小RNA
几种寡核苷酸方法已报道用于抑制miRNA。
WO03/029459（Tuschl）要求保护编码长度为18－25个核苷酸的微小RNA及其互补物，其可以包含核苷酸类似物。LNA提议为可能的核苷酸类似物，尽管未公开包含寡核苷酸的LNA。Tuschl要求保护可以在治疗中使用的miRNA寡核苷酸。
US2005/0182005公开了与最长形式的miR21互补的24聚体2’OMeRNA寡核糖核苷酸，发现其减少miR21诱导的抑制，然而包含寡核苷酸的等同DNA则不是。术语2’OMe-RNA指其中在第2'位上存在对甲基的取代的RNA类似物（2’O甲基）。
US2005/0227934（Tuschl）涉及具有高达50％DNA残基的antimir分子。还报道包含2’OMeRNA的antimir针对胰腺微小RNA使用，但看起来未公开实际的寡核苷酸结构。
US20050261218（ISIS）要求保护包含第一个区域和第二个区域的寡聚化合物，其中至少一个区域包含修饰，和寡聚化合物的部分靶向小的非编码RNA靶核酸，其中小的非编码RNA靶核酸是miRNA。要求保护长度为17－25个核苷酸的寡聚化合物。实施例涉及完全地2'OMePS化合物，21聚体和20聚体，和靶向针对一系列前miRNA和成熟miRNA靶的2’OMegapmer寡核苷酸。
Boutla等人2003（NucleicAcidsResearch31：4973-4980）描述了与果蝇中的11种不同miRNA互补的DNA反义寡核苷酸及其通过将DNA寡核苷酸注入苍蝇胚胎内灭活miRNA的用途。在11种DNA反义寡核苷酸中，只有4种构建体显示严重干扰正常发育，而剩余7种寡核苷酸不显示任何表型，可能由于其不能抑制所述miRNA。
这一方法的替代方法已由Hutvagner等人（2004）和Leaman等人（2005）报道，其中与成熟miRNA互补的2’-O-甲基反义寡核苷酸可以在体外和体内在果蝇属（Drosophila）和美丽线虫（C.elegans）用作短干扰RNA（siRNA）和miRNA功能的潜在和不可逆的抑制剂，从而诱导功能缺失表型。这种方法的缺点是在转染和注射实验中需要高2’-O-甲基寡核苷酸浓度（100微摩尔），这对动物可能是有毒的。这种方法近期应用于小鼠研究，通过使与4种不同miRNA互补的2’-O-甲基反义寡核苷酸和胆固醇缀合用于在体内沉默miRNA（Krützfedt等人2005）。这些所谓的antagomirs通过静脉内注射施用于小鼠。尽管这些实验导致内源性miRNA在体内的有效沉默，这发现是特异性、有效的和长效的，主要缺点是需要高剂量（80mg/kg）2’-O-Meantagomir用于有效沉默。
使用LNA修饰的寡核苷酸抑制miRNA先前已由Chan等人CancerResearch2005，65（14）6029-6033，Lecellier等人Science2005，308，557-560，Naguibneva等人NatureCellBiology20068（3），278-84和等人Gene2006,（Availableonline24February2006）进行描述。在所有情况下，LNA修饰的抗-mir寡核苷酸与整个成熟的微小RNA互补，即长度为20－23个核苷酸，其阻遏分子的有效体内摄取和广泛的生物分布。
Naguibneva（Naguibneva等人NatureCellBiology20068描述了mixmerDNA-LNA-DNA反义寡核苷酸抗-mir在体外抑制微小RNAmiR-181功能的用途，其中8个LNA核苷酸的区块位于侧面分别为在5'末端上的6DNA核苷酸，和在3'末端上的9DNA核苷酸的分子中心。这种反义设计的主要缺点是由于侧面DNA末端的低核酸酶抗性的低体内稳定性。
尽管Chan等人（Chan等人CancerResearch2005，65（14）6029-6033），和等人（等人Gene2006,（2006年2月24日在线可获得）未公开在其研究中使用的LNA修饰的抗-mir分子的设计，Lecellier等人（Lecellier等人Science2005，308，557-560）描述了gapmerLNA-DNA-LNA反义寡核苷酸抗-mir抑制微小RNA功能的用途，其中4个LNA寡核苷酸的区块分别位于5'末端和3'末端，其中13个DNA核苷酸的窗口在分子的中心。由于抗-mir寡核苷酸中的13核苷酸DNA串，这种反义设计的主要缺点是低体内摄取以及低体内稳定性。
因此，本领域需要能够抑制微小RNA的改进的寡核苷酸。
发明概述
本发明基于下述发现：设计为以高亲和力与miRNA靶结合的短寡核苷酸的使用在体内减轻由微小RNA造成的mRNA阻遏中是高度有效的。
尽管不希望受任何特定理论束缚，但本文公开的证据指出miRNA在体内的高度有效靶向通过设计寡核苷酸来达到，目的是在体内与miRNA靶形成高度稳定的双链体。这通过在短的例如10－17个或10－16个核苷酸碱基寡核苷酸中使用高亲和力核苷酸类似物例如至少一个LNA单元和适当地进一步的高亲和力核苷酸类似物来达到，所述高亲和力核苷酸类似物例如LNA、2'-氟核苷酸类似物的2’-MOERNA，。在一个方面，目的是产生这样长度的寡核苷酸，其不可能形成siRNA复合物（即短寡核苷酸），并且具有高亲和力核苷酸类似物的足够负荷，使得寡核苷酸几乎永久与其miRNA靶粘着，与miRNA靶有效形成稳定和无功能的双链体。已发现此类设计明显比现有技术寡核苷酸更有效，特别是gapmer和blockmer设计以及具有长的长度例如20－23聚体的寡核苷酸。术语2'氟-DNA指其中在2'位置上存在氟取代的DNA类似物（2’F）。
本发明提供了药物组合物，其包含长度为8－17个，例如10－17个，例如8－16个或10－16个核苷酸碱基单元的寡核苷酸，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，其中所述单链寡核苷酸的至少一个核苷酸碱基单元是高亲和力核苷酸类似物，例如锁定核酸（LNA）核苷酸碱基单元，和其中所述单链寡核苷酸与选自人微小RNAmiR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155和miR-375的人微小RNA序列互补。
本发明提供了药物组合物，其包含长度为10－26个核苷酸碱基单元的寡核苷酸，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，其中所述寡核苷酸包含从3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列3’acgttt5’（SEQIDNO6，5’tttgca3’），其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和任选地其中所述寡核苷酸不包含超过7个连续DNA单元的区域。
本发明提供了药物组合物，其包含长度为10－26个核苷酸碱基单元的寡核苷酸，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，其中所述寡核苷酸包含从3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列3’ctcaca5’（SEQIDNO7，5’acactc3'），其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和任选地其中所述寡核苷酸不包含超过7个连续DNA单元的区域。
本发明提供了药物组合物，其包含长度为10－26个核苷酸碱基单元的寡核苷酸，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，其中所述寡核苷酸包含从3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列3’ttacga5’（SEQIDNO8，5’agcatt3’），其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和任选地其中所述寡核苷酸不包含超过7个连续DNA单元的区域。
本发明提供了药物组合物，其包含长度为10－26个核苷酸碱基单元的单链寡核苷酸，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，其中所述寡核苷酸包含从3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列3’acaagc5’（SEQIDNO9，5’cgaaca3’），其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中所述寡核苷酸不包含超过7个连续DNA单元的区域。
本发明提供了药物组合物，其包含长度为10－26个核苷酸碱基单元的单链寡核苷酸，和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂，其中所述寡核苷酸包含从3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列3’cgaata5’（SEQIDNO10，5’ataagc3’），其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中所述寡核苷酸不包含超过7个连续DNA单元的区域。
高亲和力核苷酸类似物是导致这样的寡核苷酸的核苷酸类似物，所述寡核苷酸与互补RNA核苷酸具有比等同DNA核苷酸的结合亲和力更高的热双链体稳定性。这一般通过测量Tm来测定。
当使用靶向针对特异性miRNA的这些短的、高亲和力寡核苷酸时，我们未鉴定到任何显著的脱靶效应。事实上，本文提供的证据指出对mRNA表达的影响是由于在mRNA内的针对靶miRNA（初级mRNA靶）的互补序列的存在，或对由初级mRNA靶调节的mRNA（次级mRNA靶）的次级影响。未鉴定到毒性效应，指出无显著有害的脱靶效应。
本发明进一步提供了根据本发明的寡核苷酸，例如可以形成药物组合物的组成部分的那些，用于制备用于治疗与微小RNA的存在或过量表达（上调）相关的疾病或医学病症的药物的用途。
本发明进一步提供了用于治疗与微小RNA的存在或过量表达相关的疾病或医学病症的方法，其包括给需要治疗的人施用根据本发明的组合物（例如药物组合物）。
本发明进一步提供了用于减少细胞或生物中的miRNA的有效量的方法，其包括给所述细胞或生物施用根据本发明的组合物（例如药物组合物）或单链寡核苷酸。在这种背景中减少有效量指存在于细胞或生物中的功能miRNA的减少。应认识到根据本发明优选的寡核苷酸并非一直显著减少细胞或生物中的miRNA的实际量，因为它们一般与其miRNA靶形成非常稳定的双链体。
本发明进一步提供了用于细胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括给所述细胞或生物施用根据本发明的组合物（例如药物组合物）或单链寡核苷酸。
本发明进一步提供了长度为8－16个例如8－16个例如10－16个核苷酸碱基的单链寡核苷酸，用于制备用于治疗与微小RNA的存在或过量表达相关的疾病或医学病症的药物的用途。
本发明进一步提供了用于治疗与微小RNA的存在或过量表达相关的疾病或医学病症的方法，其包括给需要治疗的人施用长度为8－16个例如10－16个核苷酸碱基的单链寡核苷酸。
本发明进一步提供了用于减少细胞或生物中的miRNA靶的有效量（即，可用于阻遏靶mRNA的miRNA量）的方法，其包括给所述细胞或生物施用包含8－16个例如10－16个核苷酸碱基的单链寡核苷酸的组合物（例如药物组合物）。
本发明进一步提供了用于细胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括给所述细胞或生物施用包含8－16个例如10－16个核苷酸碱基的单链寡核苷酸（或包含所述寡核苷酸的组合物）。
本发明进一步提供了用于合成针对选自人微小RNAmiR-19b，miR-21，miR-122A，miR-155和miR-375的人微小RNA的单链寡核苷酸例如本文描述的单链寡核苷酸的方法，所述方法包括下述步骤：
a.任选选择由3'末端计数的第1个核苷酸碱基，其为核苷酸类似物，例如LNA核苷酸碱基。
b.任选选择由3'末端计数的第2个核苷酸碱基，其为核苷酸类似物，例如LNA核苷酸碱基。
c.选择对应miRNA种区域的单链寡核苷酸的区域，其中所述区域如本文定义的。
d.任选选择如本文定义的第7个和第8个核苷酸碱基。
e.任选选择1－10个进一步的核苷酸碱基，其可以选自核苷酸（x）和核苷酸类似物（X）例如LNA。
f.任选选择如本文定义的单链寡核苷酸的5'区域。
g.任选选择如本文定义的单链寡核苷酸的5'末端。
其中所述合成通过步骤a－g中定义的区域的顺次合成来进行，其中所述合成可以以3'－5'（a至g）或5'－3'（g至a）方向来进行，和其中所述单链寡核苷酸与miRNA靶的序列互补。
在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸设计为不受RISC募集或介导RISC指导的miRNA靶切割。已考虑到通过使用与miRNA靶互补的长寡核苷酸，例如21或22聚体，特别是RNA寡核苷酸，或RNA‘类似物’寡核苷酸，寡核苷酸可以就RISC复合物结合而言竞争靶mRNA，且由此经由引入作为底物竞争miRNA的寡核苷酸来减轻miRNA靶mRNA的miRNA阻遏。
然而，本发明寻求通过提供与成熟微小RNA能够互补，且在某些情况下明显几乎不可逆结合的寡核苷酸来阻止此类不希望有的靶mRNA切割或翻译抑制。这看起来导致针对降解或切割（例如通过RISC或RNA酶H或其他核酸内切酶或核酸外切酶）的保护形式，这可能不导致细胞内的miRNA的基本或甚至显著减少（例如，如使用LNA探针通过RNA印迹检测的），但确保如通过去阻遏分析测量的miRNA的有效量显著减少。因此，在一个方面，本发明提供了这样的寡核苷酸，其有目的地设计为不与RISC复合物相容，但通过寡核苷酸经由滴定来去除miRNA。尽管不希望受本发明的寡核苷酸为何如此有效的具体理论的束缚，与基于RNA的寡核苷酸类似（或完全的2’OMe寡核苷酸），看起来根据本发明的寡核苷酸通过miRNA功能的非竞争性抑制来起作用，因为它们有效去除从细胞质中可获得的miRNA，其中作为现有技术寡核苷酸提供了备选miRNA底物，这可以充当竞争抑制剂，取决于细胞质中的寡核苷酸浓度、以及靶mRNA和miRNA的浓度，其有效性将相差很远。
尽管不希望受任何具体理论的束缚，但使用与miRNA靶（即miRNA）几乎相似长度的寡核苷酸可能存在的一个可能性是寡核苷酸可以与miRNA靶形成siRNA样双链体，这是将减少寡核苷酸的有效性的情况。还可能寡核苷酸其自身可以用作RISC复合物内的指导链，从而产生非特异性靶的RISC指导的降解的可能性，这仅碰巧与寡核苷酸指导具有足够的互补性。
通过选择用于靶向miRNA序列的短寡核苷酸，避免了此类问题。
掺入LNA的短寡核苷酸由试剂区域已知，例如LNA（参见例如WO2005/098029和W02006/069584）。然而，设计用于诊断或试剂用途的分子在设计方面与用于药学用途的那些非常不同。例如，试剂寡聚体的末端核苷酸碱基一般不是LNA，而是DNA，并且核苷间键一般与用于在本发明的寡核苷酸中使用的优选键硫代磷酸酯不同。本发明因此提供了寡核苷酸自身的新型类别。
本发明进一步提供了如在本发明的药物组合物的背景中描述的（单链）寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含
i）至少一个硫代磷酸酯键和/或
ii）至少一个3'末端LNA单元，和/或
iii）至少一个5'末端LNA单元。
对于大多数治疗用途优选的是寡核苷酸是完全硫代磷酸酯化的－用于在CNS中使用的治疗寡核苷酸例外，例如在其中硫代磷酸酯化可以是毒性的脑或脊柱中，和由于不存在核酶，甚至在连续DNA单元之间也可以使用磷酸二酯键。如本文提及的，根据本发明的寡核苷酸的其他优选方面是第2个3'核苷酸碱基，和/或第9个和第10个（由3'末端）也可以是LNA。
本发明人已发现其他方法来避免RNA切割（例如血清中的核酸外切酶降解，或根据本发明的寡核苷酸的RISC相关切割是可能的，并且像这样本发明还提供了包含下述的单链寡核苷酸：
a.在由3'末端计数的第1和2位上的LNA单元和/或
b.在同样由3'末端计数的第9位和/或第10位上的LNA单元，和/或
c.1个或2个5'LNA单元。
尽管这些其他方面的利益可能由更长的寡核苷酸，例如长度高达26个核苷酸碱基单元的核苷酸可见，但考虑这些特征还可以与本文提及的较短寡核苷酸一起使用，例如本文描述的8－17个、8－16个、10－17个或10－16个核苷酸碱基的寡核苷酸。高度优选的是寡核苷酸包含高亲和力核苷酸类似物，例如本文提及的那些，最优选LNA单元。
本发明人因此已惊奇地发现包含以特定顺序的锁定核酸（LNA）单元的精心设计的单链寡核苷酸显示对微小RNA的显著沉默，导致减少的微小RNA水平。发现所述寡核苷酸与所谓的种子序列的紧密结合是重要的，所述种子序列是由靶微小RNA的5'末端计数的核苷酸2－8或2－7。靶微小RNA的核苷酸1是非配对碱基，并且最可能隐藏在Ago2蛋白质的结合袋中。尽管不希望受具体理论束缚，但本发明人考虑通过选择种区域的序列，特别是对于在与种区域互补的区域中包含LNA优选LNA单元的寡核苷酸，miRNA和寡核苷酸之间的双链体在靶向miRNA中特别有效，避免脱靶效应，并且可能提供阻止RISI指导的miRNA功能的进一步特征。
本发明人已惊奇地发现当LNA修饰的单链寡核苷酸在3'末端上不包含对应这种非配对的核苷酸1的核苷酸时，微小RNA沉默甚至更加增强。进一步发现在根据本发明的寡核苷酸的3'末端中的2个LNA单元使得所述寡核苷酸是高度核酸酶抗性的。
进一步发现在对应从靶微小RNA的5'末端计数的第10和11位的位置中具有至少一个核苷酸类似物例如LNA核苷酸的本发明的寡核苷酸可以预防本发明的寡核苷酸的切割。
因此，在本发明的一个方面涉及长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，其中
i）由3'末端计数的第1个核苷酸是锁定核酸（LNA）单元；
ii）由3'末端计数的第2个核苷酸是LNA单元；和
iii）由3'末端计数的第9个和/或第10个核苷酸是LNA单元。
本发明进一步提供了用作药物的如本文定义的寡核苷酸。
本发明进一步涉及包含本文定义的寡核苷酸和药学上可接受的载体的组合物。
如上文提及的，微小RNA涉及众多疾病。因此，本发明的第四个方面涉及如本文定义的寡核苷酸用于制备用于治疗与微小RNA表达相关的疾病的药物的用途，所述疾病选自脊髓性肌萎缩、图雷特氏综合征、丙型肝炎、脆性X智力低下、迪格奥尔综合征和癌症，例如慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、肺癌和结肠癌，特别是癌症。
本发明的一个进一步方面是通过使靶微小RNA与如本文定义的寡核苷酸接触来减少靶微小RNA的水平的方法，其中所述寡核苷酸
1.与靶微小RNA互补
2.在3'末端上不包含对应靶微小RNA的第1个5'末端核苷酸的核苷酸。
本发明进一步提供了包含选自SEQIDNO20、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO28、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO82、SEQIDNO83、SEQIDNO84、SEQIDNO85、SEQIDNO86、SEQIDNO87、SEQIDNO88和SEQIDNO89的核苷酸碱基序列的寡核苷酸；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；和其中LNA胞嘧啶是任选被甲基化的，或其缀合物。
本发明进一步提供了包含选自SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO90、SEQIDNO91、SEQIDNO92、SEQIDNO93、SEQIDNO94、SEQIDNO95、SEQIDNO96、SEQIDNO97、SEQIDNO98、SEQIDNO99、SEQIDNO100和SEQIDNO101的核苷酸碱基序列的寡核苷酸；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；和其中LNA胞嘧啶是任选被甲基化的，或其缀合物。
本发明进一步提供了包含选自SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO31、SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO34、SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO102、SEQIDNO103、SEQIDNO104和SEQIDNO105的核苷酸碱基序列的寡核苷酸；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；和其中LNA胞嘧啶是任选被甲基化的，或其缀合物。
本发明进一步提供了包含选自SEQIDNO47、SEQIDNO48、SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51、SEQIDNO52、SEQIDNO53、SEQIDNO54、SEQIDNO55、SEQIDNO106、SEQIDNO107、SEQIDNO108和SEQIDNO109的核苷酸碱基序列的寡核苷酸；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；和其中LNA胞嘧啶是任选被甲基化的，或其缀合物。
本发明进一步提供了包含选自SEQIDNO65、SEQIDNO66、SEQIDNO67、SEQIDNO68和SEQIDNO69、SEQIDNO38、SEQIDNO39、SEQIDNO40、SEQIDNO41、SEQIDNO42、SEQIDNO43、SEQIDNO44、SEQIDNO45和SEQIDNO46的核苷酸碱基序列的寡核苷酸；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；和其中LNA胞嘧啶是任选被甲基化的，或其缀合物。
在一个实施方案中，寡核苷酸可以具有1－17个核苷酸碱基的核苷酸碱基序列，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸碱基，和像这样此类实施方案中的寡核苷酸可以是本文公开的寡核苷酸内的连续子序列。
本发明的本发明人已惊奇地发现包含特定核心DNA序列和在所述核心序列中的锁定核酸（LNA）的特定长度的反义寡核苷酸显示优异的微小RNA抑制性质。
附图简述
图1.在表达miR-122a的细胞系Huh-7中用不同LNA抗-miR寡核苷酸处理对靶核酸表达的影响。显示的是与未处理的细胞（模拟试验）比较，衍生自miR-122a特异性qRT-PCR的miR-122a（任意单位）的量。LNA抗-miR寡核苷酸分别以2个浓度1和100nM使用。还包括的是对SPC3349（在本文中也称为SPC3549）的错配对照（SPC3350）。
图2.使用miR-122a实时RT-PCR，在体内在小鼠肝中，与SPC3372比较，SPC3548和SPC3549的LNA抗-miR-122aknock-down剂量应答的评估。
图2b.在用不同LNA-抗miR处理后在小鼠肝中的miR-122水平。LNA-抗miR分子SPC3372和SPC3649通过3次i.p.注射经过6天时期每隔一日以指示剂量施用于正常小鼠内，并在最后一次剂量后48小时处死。从小鼠肝中提取出总RNA，miR-122通过miR-122特异性qPCR进行测量。
图3.与接受盐水的对照小鼠比较，在LNA-抗miR-122a处理的小鼠中的血浆胆固醇水平的评估。
图4a.使用实时定量RT-PCR，与盐水对照小鼠比较，在LNA抗miR-122a处理的小鼠中的相对BckdkmRNA水平的评估。
图4b.使用实时定量RT-PCR，与盐水对照小鼠比较，在LNA抗miR-122a处理的小鼠中的相对醛缩酶AmRNA水平的评估。
图4c.使用实时定量RT-PCR，与盐水对照小鼠（动物1－3）比较，在LNA抗miR-122a处理的小鼠（动物4－30）中的GAPDHmRNA水平的评估。
图5.使用miR-122a实时RT-PCR，在体内在小鼠肝中，LNA-抗miRTM-122aknock-down剂量应答的评估。6组动物（5只小鼠/组）以下列方式进行处理。组1动物通过i.v.用0.2ml盐水注射连续3天，组2接受2.5mg/kgSPC3372，组3接受6.25mg/kg，组4接受12.5mg/kg和组5接受25mg/kg，而组6接受25mg/kgSPC3373（错配LNA-抗miRTM寡核苷酸），全都以相同方式。实验进行重复（因此n=10）且显示合并的结果。
图6.比较SPC3649与SPC3372的RNA印迹。对来自每个组中的1只小鼠的总RNA实施miR-122特异性RNA印迹。指出在LNA-抗miR和miR-122之间形成的成熟miR-122和双链体（阻断的微小RNA）。
图7.小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或盐水处理连续3天，且在最后一次剂量后1、2或3周处死。还包括的是来自在最后一次剂量后24小时处死的动物的值（实施例11“旧设计”）。miR-122水平通过qPCR进行评估，且在每个单个时间点上相对于盐水组的平均值进行标准化。还包括的是来自在最后一次剂量后24小时处死的动物的值（显示平均值和SD，n=7，24小时n=10）。处死日9、16或23对应在最后一次剂量后1、2或3周处死。
图8.小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或盐水处理连续3天，且在最后一次剂量后1、2或3周处死。还包括的是来自在最后一次剂量后24小时处死的动物的值（实施例11“旧设计”）。测量血浆胆固醇且在每个时间点上相对于盐水组进行标准化（显示平均值和SD，n=7，24小时n=10）。
图9.通过miR-122a的SPC3372抑制的剂量依赖性miR-122a靶mRNA诱导。小鼠如上文描述的用不同SPC3372剂量处理连续3天，且在最后一次剂量后24小时处死。对由肝提取的总RNA实施qPCR。具有预测的miR-122靶位点且观察到由微阵列分析上调的基因使用qPCR通过增加的SPC3372剂量就剂量依赖性诱导进行研究。对于指示基因对来自最后一次剂量后24小时处死的2－3只小鼠/组的总肝RNA实施qPCR。图9中显示的是相对于盐水组的mRNA水平，n=2－3（2.5－12.5mg/kg/天：n=2，无SD）。还显示的是错配对照（mm，SPC3373）。
图10.SPC3372处理后的miR-122a靶mRNA的瞬时诱导。NMRI雌性小鼠用25mg/kg/天SPC3372连同盐水对照处理连续3天，且分别在最后一次剂量后1、2或3周处死。RNA由肝提取，并且经由qPCR研究通过微阵列数据选择的预测miR-122a靶mRNA的mRNA水平。分析来自每个组的3个动物。
图11.通过SPC3372处理在肝中的Vldlr的诱导。与先前实施例（图10）中相同的肝RNA样品就Vldlr诱导进行研究。
图12.小鼠血浆中的miR-122a/SPC3372双链体的稳定性。SPC3372和SPC3372/miR-122a双链体的稳定性在小鼠血浆中于37℃经过96小时进行测试。图12中显示的是SYBR-Gold染色的PAGE。
图13.经由SPC3372隔离成熟miR-122a导致双链体形成。图13中显示的是由miR-122a特异性探针探测的（上图）和由Let-7特异性探针重新探测的（下图）膜。使用miR-122探针，可以检测到2个条带，一个对应成熟miR-122和一个对应SPC3372和miR-122之间的双链体。
图14.通过肝切片的原位杂交评估的经由SPC3372的miR-122a隔离连同SPC3372分布。来自处理动物的肝冷冻切片
图15.在miR-122LNA-抗miR处理的小鼠中的肝基因表达。盐水和LNA-抗miR处理小鼠通过基因组广泛表达谱使用AffymetrixMouseGenome4302.0阵列进行比较。（a，1）显示的是在处理后24小时LNA-抗miR-122处理的和盐水处理的小鼠肝样品中显示差异表达的探针数目。（b，2）在差异表达基因中的miR-122种子序列的存在。曲线图显示在其3'UTR中具有至少一个miR-122种子识别序列的转录物百分比。随机：产生随机序列且搜索miR-122种子识别序列。在LNA-抗miR处理小鼠中的瞬间肝基因表达谱。小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或盐水处理连续3天，且在最后一次剂量后1、2或3周处死。还包括的是来自最后一次剂量后24小时处死的动物的值。（c，3）还对来自不同时间点的RNA样品实施表达分析。在处理后24小时、1周或3周LNA-抗miR和盐水处理小鼠之间鉴定为差异表达的基因的表达谱的分层聚类分析。（d，4）随着时间过去跟踪在处理后24小时LNA-抗miR和盐水处理小鼠之间鉴定为差异表达的基因的表达谱。在LNA-抗miR处理小鼠方法1中随着时间-过程上调和下调的基因的表达比，指出LNA-抗miR处理的可逆效应。
图16.用SPC3372和3595处理对小鼠肝中的miR-122水平的影响。
图17.用SPC3372和3595处理对小鼠肝中的醛缩酶A水平的影响。
图18.用SPC3372和3595处理对小鼠肝中的Bckdk水平的影响。
图19.用SPC3372和3595处理对小鼠肝中的CD320水平的影响。
图20.用SPC3372和3595处理对小鼠肝中的Ndrg3水平的影响。
图21.在高胆固醇血症和正常小鼠中用SPC3649长期处理对血浆总胆固醇的影响。血浆的每周样品每周一次得自SPC3649处理和盐水对照小鼠，随后为血浆总胆固醇的评估。小鼠用5mg/kgSPC3649、SPC3744或盐水每周处理2次。给出的正常小鼠进行平行处理。
图22.在高胆固醇血症和正常小鼠中用SPC3649长期处理对miR-122水平的影响。
图23.在高胆固醇血症和正常小鼠中用SPC3649长期处理对醛缩酶A水平的影响。
图24.在高胆固醇血症和正常小鼠中用SPC3649长期处理对Bckdk水平的影响。
图25.在高胆固醇血症和正常小鼠中用SPC3649长期处理对AST水平的影响。
图26.在高胆固醇血症和正常小鼠中用SPC3649长期处理对ALT水平的影响。
图27.在Huh-7细胞模型中SPC3649对HCV复制的调节。在用不同LNA-抗miR（SPC3648、SPC3649和SPC3550）和2’OMeantago-mir-122分子转染后在Huh-7细胞中的HCVRNA的RNA印迹分析（上图）。定量杂交信号强度且相对于在每个泳道中的血影蛋白mRNA进行标准化（下图）。
图28.在内源性表达miR-19b的细胞系HeLa中经由miR-19b阻断寡核苷酸对具有miR-19b靶的花虫萤光素酶的功能去阻遏。“miR-19b靶”是具有miR-19b靶但不与寡聚体阻断miR-19b共转染的质粒，且因此表示完全miR-19b阻遏的花虫萤光素酶表达。
图29.在内源性表达miR-122的细胞系Huh-7中经由miR-122阻断寡核苷酸对具有miR-122靶的花虫萤光素酶的功能去阻遏。“miR-122靶”是具有miR-122靶但不与寡聚体阻断miR-122共转染的相应质粒，且因此表示完全miR-122阻遏的花虫萤光素酶表达。
图30.举例说明根据本发明的寡核苷酸和微小RNA靶的比对的图。
发明详述
本发明的寡核苷酸典型地是单链的。因此应当理解在本发明的背景中，术语寡核苷酸可以与术语单链寡核苷酸互换使用。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含与人微小RNA互补的长度为8－17个核苷酸碱基，例如10－17个核苷酸碱基的短（单链）寡核苷酸。短寡核苷酸在体内减轻miRNA阻遏方面特别有效。发现将高亲和力核苷酸类似物掺入寡核苷酸内导致高度有效的抗微小RNA分子，其表现出经由与微小RNA靶形成几乎不可逆的双链体来起作用，而不是基于RNA切割的机制，例如与RNA酶H或RISC相关的机制。
高度优选的是根据本发明的单链寡核苷酸包含与人微小RNA种区域100％互补的连续核苷酸碱基序列的区域。
优选的是根据本发明的单链寡核苷酸与成熟的人微小RNA序列互补。
根据本发明优选的寡核苷酸与选自has-miR19b、hsa-miR21、hsa-miR122、hsa-miR142a7b、hsa-miR155、hsa-miR375的miRNA序列互补。
在一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在3'末端上不包含对应靶微小RNA的第1个5'末端核苷酸的核苷酸碱基。
在一个实施方案中，由3’末端计数，根据本发明的单链寡核苷酸的第1个核苷酸碱基是核苷酸类似物例如LNA单元。
在一个实施方案中，由3’末端计数，根据本发明的单链寡核苷酸的第2个核苷酸碱基是核苷酸类似物例如LNA单元。
在一个实施方案中，由3’末端计数，根据本发明的单链寡核苷酸的第9个和/或第10个核苷酸是核苷酸类似物例如LNA单元。
在一个实施方案中，由3’末端计数，根据本发明的单链寡核苷酸的第9个核苷酸碱基是核苷酸类似物例如LNA单元。
在一个实施方案中，由3’末端计数，根据本发明的单链寡核苷酸的第10个核苷酸碱基是核苷酸类似物例如LNA单元。
在一个实施方案中，由3’末端计数，根据本发明的单链寡核苷酸的第9个和第10个核苷酸碱基是核苷酸类似物例如LNA单元。
在一个实施方案中，根据本发明的单链寡核苷酸不包含超过5个连续DNA核苷酸单元的区域。在一个实施方案中，根据本发明的单链寡核苷酸不包含超过6个连续DNA核苷酸单元的区域。在一个实施方案中，根据本发明的单链寡核苷酸不包含超过7个连续DNA核苷酸单元的区域。在一个实施方案中，根据本发明的单链寡核苷酸不包含超过8个连续DNA核苷酸单元的区域。在一个实施方案中，根据本发明的单链寡核苷酸不包含超过3个连续DNA核苷酸单元的区域。在一个实施方案中，根据本发明的单链寡核苷酸不包含超过2个连续DNA核苷酸单元的区域。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少由至少2个连续核苷酸类似物单元例如至少2个连续LNA单元组成的区域。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少由至少3个连续核苷酸类似物单元例如至少3个连续LNA单元组成的区域。
在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸不包含超过7个连续DNA核苷酸类似物单元例如LNA单元的区域。在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸不包含超过6个连续DNA核苷酸类似物单元例如LNA单元的区域。在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸不包含超过5个连续DNA核苷酸类似物单元例如LNA单元的区域。在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸不包含超过4个连续DNA核苷酸类似物单元例如LNA单元的区域。在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸不包含超过3个连续DNA核苷酸类似物单元例如LNA单元的区域。在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸不包含超过2个连续DNA核苷酸类似物单元例如LNA单元的区域。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸的第1或2个3'核苷酸碱基对应微小RNA序列的第2个5'核苷酸。
在一个实施方案中，如由单链寡核苷酸的区域3'末端测量的单链寡核苷酸的核苷酸碱基单元1－6（包括端点在内）与微小RNA种区域的序列互补。
在一个实施方案中，如由单链寡核苷酸的区域3'末端测量的单链寡核苷酸的核苷酸碱基单元1－7（包括端点在内）与微小RNA种区域的序列互补。
在一个实施方案中，如由单链寡核苷酸的区域3'末端测量的单链寡核苷酸的核苷酸碱基单元2－7（包括端点在内）与微小RNA种区域的序列互补。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸在与miRNA种区域互补的区域内的位置中包含至少一个核苷酸类似物单元，例如至少一个LNA单元。在一个实施方案中，单链寡核苷酸在与miRNA种区域互补的区域内的位置中可以包含1－6个或1－7个核苷酸类似物单元，例如1－6个和1－7个LNA单元。
在一个实施方案中，与微小RNA种区域的序列互补的单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列选自以3'－5'方向读取的（X）Xxxxxx,（X）xXxxxx,（X）xxXxxx,（X）xxxXxx,（X）xxxxXx和（X）xxxxxX，其中“X”指核苷酸类似物，（X）指可选存在的核苷酸类似物例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸在与miRNA种区域互补的位置中包含至少2个核苷酸类似物单元，例如至少2个LNA单元。
在一个实施方案中，与miRNA种区域的序列互补的单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列选自（X）XXxxxx、（X）XxXxxx、（X）XxxXxx、（X）XxxxXx、（X）XxxxxX、（X）xXXxxx、（X）xXxXxx、（X）xXxxXx、（X）xXxxxX、（X）xxXXxx、（X）xxXxXx、（X）xxXxxX、（X）xxxXXx、（X）xxxXxX和（X）xxxxXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，（X）指可选存在的核苷酸类似物例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸在与miRNA种区域互补的位置中包含至少3个核苷酸类似物单元，例如至少3个LNA单元。
在一个实施方案中，与微小RNA种区域的序列互补的单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列选自（X）XXXxxx、（X）xXXXxx、（X）xxXXXx、（X）xxxXXX、（X）XXxXxx、（X）XXxxXx、（X）XXxxxX、（X）xXXxXx、（X）xXXxxX、（X）xxXXxX、（X）XxXXxx、（X）XxxXXx、（X）XxxxXX、（X）xXxXXx、（X）xXxxXX、（X）xxXxXX、（X）xXxXxX和（X）XxXxXx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，（X）指可选存在的核苷酸类似物例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸在与miRNA种区域互补的位置中包含至少4个核苷酸类似物单元，例如至少4个LNA单元。
在一个实施方案中，与微小RNA种区域的序列互补的单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列选自（X）xxXXX、（X）xXxXXX、（X）xXXxXX、（X）xXXXxX、（X）xXXXXx、（X）XxxXXXX、（X）XxXxXX、（X）XxXXxX、（X）XxXXx、（X）XXxxXX、（X）XXxXxX、（X）XXxXXx、（X）XXXxxX、（X）XXXxXx和（X）XXXXxx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，（X）指可选存在的核苷酸类似物例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元
在一个实施方案中，单链寡核苷酸在与miRNA种区域互补的位置中包含至少5个核苷酸类似物单元，例如至少5个LNA单元。
在一个实施方案中，与微小RNA种区域的序列互补的单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列选自（X）xXXXXX、（X）XxXXXX、（X）XXxXXX、（X）XXXxXX、（X）XXXXxX和（X）XXXXXx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，（X）指可选存在的核苷酸类似物例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸在与miRNA种区域互补的位置中包含6个或7个核苷酸类似物单元，例如6个或7个LNA单元。
在一个实施方案中，与微小RNA种区域的序列互补的单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列选自XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX和XXXXXXx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，由单链寡核苷酸的3’末端计数，在第7－8位的两个核苷酸碱基基序选自xx、XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，由单链寡核苷酸的3’末端计数，在第7－8位的两个核苷酸碱基基序选自XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少12个核苷酸碱基，和其中由单链寡核苷酸的3’末端计数，在第11－12位的两个核苷酸碱基基序选自xx、XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少12个核苷酸碱基，和其中由单链寡核苷酸的3’末端计数，在第11－12位的两个核苷酸碱基基序选自XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少13个核苷酸碱基，和其中由3’末端计数，在第11－13位的三个核苷酸碱基基序选自xxx、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，由单链寡核苷酸的3’末端计数，在第11－13位的三个核苷酸碱基基序选自Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少14个核苷酸碱基，和其中由3’末端计数，在第11－14位的四个核苷酸碱基基序选自xxxx、Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX和XXXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，由3’末端计数，在单链寡核苷酸的第11－14位的四个核苷酸碱基基序选自Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX和XXXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含15个核苷酸碱基，和其中由3’末端计数，在第11－15位的五个核苷酸碱基基序选自Xxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx、XxXxx、XxxXx、XxxxX、xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX、XXXxx、XXxxX、XxxXX、xXXXx、xxXXX、XXxXX、XxXxX、XXXXx、XXXxX、XXxXX、XxXXXX、xXXXX和XXXXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含16个核苷酸碱基，和其中由单链寡核苷酸的3’末端计数，在第11－16位的六个核苷酸碱基基序选自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、XxXXxx、XxXxXx、XxXxxX、XxxXXx、XxxXxX、XxxxXX、xXXXxx、xXXxXx、xXXxxX、xXxXXx、xXxXxX、xXxxXX、xxXXXx、xxXXxX、xxXxXX、xxxXXX、XXXXxx、XXXxxX、XXxxXX、XxxXXX、xxXXXX、xXxXXX、XxXxXX、XXxXxX、XXXxXx、xXXxXX、XxXXxX、XXxXXx、xXXXxX、XxXXXx、xXXXXx、xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX、XXXXXx和XXXXXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，由3’末端计数，在单链寡核苷酸的第11－16位的六个核苷酸碱基基序是xxXxxX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，3个最5’末端的核苷酸碱基选自Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中“X”指核苷酸类似物例如LNA单元，例如LNA单元，和“x”指DNA或RNA核苷酸单元。
在一个实施方案中，“x”指DNA单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸在5'末端包含核苷酸类似物单元例如LNA单元。
在一个实施方案中，核苷酸类似物单元例如X独立地选自：2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元。
在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸的所有核苷酸碱基都是核苷酸类似物单元。
在一个实施方案中，核苷酸类似物单元例如X独立地选自：2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元和LNA单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含所述至少一个LNA类似物单元和至少一个除LNA以外的其它核苷酸类似物单元。
在一个实施方案中，非LNA核苷酸类似物单元独立地选自2’-OMe-RNA单元和2’-氟-DNA单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸由至少一个序列XYX或YXY组成，其中X是LNA和Y是2’-OMe-RNA单元或2’-氟-DNA单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸的核苷酸碱基序列由交替的X和Y单元组成。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含交替的LNA和DNA单元（Xx）或（xX）。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含交替LNA后接2个DNA单元的基序（Xxx）、xXx或xxX。
在一个实施方案中，至少一个DNA或非LNA核苷酸类似物单元在选自上文提及的任何一个实施方案中鉴定为LNA核苷酸单元的位置的位置中由LNA核苷酸碱基替换。
在一个实施方案中，“X”指LNA单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少2个核苷酸类似物单元，例如至少3个核苷酸类似物单元，例如至少4个核苷酸类似物单元，例如至少5个核苷酸类似物单元，例如至少6个核苷酸类似物单元，例如至少7个核苷酸类似物单元，例如至少8个核苷酸类似物单元，例如至少9个核苷酸类似物单元，例如至少10个核苷酸类似物单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少2个LNA单元，例如至少3个LNA单元，例如至少4个LNA单元，例如至少5个LNA单元，例如至少6个LNA单元，例如至少7个LNA单元，例如至少8个LNA单元，例如至少9个LNA单元，例如至少10个LNA单元。
在一个实施方案中，其中至少一个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤，例如1－10个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤，例如2、3、4、5、6、7、8或9个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一个实施方案中，至少2个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少3个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少4个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少5个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少6个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少7个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少8个核苷酸类似物例如LNA单元是胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一个优选实施方案中，核苷酸类似物与互补RNA核苷酸的热双链体稳定性高于等同DNA核苷酸与所述互补RNA核苷酸的结合亲和力。
在一个实施方案中，核苷酸类似物对单链寡核苷酸赋予增强的血清稳定性。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸与互补单链RNA分子形成A-螺旋构象。
2个RNA分子之间的双链体一般以A型构象存在，而2个DNA分子的双链体一般以B型构象存在。DNA和RNA分子之间的双链体一般以中间体构象（A/B型）存在。核苷酸类似物例如β-D-氧LNA的使用可以用于促进更A型样构象。标准圆二色（CD）或NMR分析用于测定本发明的寡核苷酸和互补RNA分子之间的双链体的形成。
因为经由RISC复合物的募集被认为依赖miRNA/mRNA靶的特定结构构象，所以在一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸可以与互补RNA分子形成A/B型双链体。
然而，我们已测定促进A型结构的核苷酸类似物的使用也是有效的，例如LNA的α-L异构体。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸与互补单链RNA分子形成A/B型构象。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸与互补单链RNA分子形成A型构象。
在一个实施方案中，根据本发明的单链寡核苷酸不介导对互补单链RNA分子的基于RNA酶H的切割。一般地一段至少5个（一般在RNA酶H募集方面无效）、更优选至少6个、更优选至少7个或8个连续DNA核苷酸碱基（或可以募集RNA酶H的备选核苷酸碱基，例如αL-氨基LNA）是需要的，以使寡核苷酸在RNA酶H的募集中有效。
EP1222309提供了用于测定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于测定募集RNA酶H的能力。如果当与互补RNA靶一起提供时，使用由EP1222309的实施例91－95提供的方法，它具有如以pmol/l/分钟测量的，至少1％、例如至少5％、例如至少10％或小于20％的等同仅DNA寡核苷酸（不含2'取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之间具有磷酸二酯连接基团）的起始速率，则认为化合物能够募集RNA酶H。
如果当与互补RNA靶和RNA酶H一起提供时，使用由EP1222309的实施例91－95提供的方法，如以pmol/l/分钟测量的RNA酶H起始速率小于1％、例如小于5％、例如小于10％或小于20％的使用等同仅DNA寡核苷酸测定的起始速率，所述寡核苷酸不含2'取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之间具有磷酸二酯连接基团，则认为化合物基本上不能募集RNA酶H，。
在一个高度优选的实施方案中，本发明的单链寡核苷酸能够与具有磷酸二酯核苷间键的互补单链RNA核酸分子（一般为所述单链寡核苷酸的约相同长度）形成双链体，其中双链体具有至少约60℃的Tm，事实上优选单链寡核苷酸能够与具有磷酸二酯核苷间键的互补单链RNA核酸分子形成双链体，其中双链体具有约70℃－约95℃的Tm，例如约70℃－约90℃的Tm，例如约70℃－约85℃的Tm。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸能够与具有磷酸二酯核苷间键的互补单链DNA核酸分子形成双链体，其中双链体具有约50℃－约95℃的Tm，例如约50℃－约90℃，例如至少约55℃，例如至少约60℃，或不超过约95℃。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸可以具有14－16个核苷酸碱基，包括15个核苷酸碱基的长度。
在一个实施方案中，LNA单元独立地选自以D-β和L-α构型或其组合的氧-LNA、硫代-LNA和氨基-LNA。
在一个具体实施方案中，LNA单元可以是ENA分子。
在一个实施方案中，LNA单元是βD氧-LNA。
在一个实施方案中，LNA单元是α-L氨基LNA。
在一个优选实施方案中，单链寡核苷酸包含3－17个LNA单元。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少一个不同于磷酸酯的核苷间连接基团。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含磷酸二酯键和硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯核苷间键。
在一个实施方案中，本发明的单链寡核苷酸的所有核苷间键都是磷酸二酯键。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物包含载体例如盐水或缓冲盐水。
在一个实施方案中，用于合成靶向针对人微小RNA的单链寡核苷酸的方法以3'－5'方向a－f来进行。
用于合成根据本发明的单链寡核苷酸的方法可以使用标准固相寡核苷酸合成来进行。
可以与上述实施方案组合的本发明的进一步实施方案如权利要求中显示且在标题‘进一步的实施方案’下。
定义
术语‘核苷酸碱基’指核苷酸，例如DNA和RNA，和核苷酸类似物。
在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”（或简单地“寡聚体”）指由2个或更多核苷酸碱基的共价键形成的分子。当在本发明的寡核苷酸（也称为单链寡核苷酸）的背景中使用时，在一个实施方案中，术语“寡核苷酸”可以具有例如8－26个核苷酸碱基，例如10－26个核苷酸碱基，例如12－26个核苷酸碱基。在一个优选实施方案中，如本文详述的，本发明的寡核苷酸具有8－17个核苷酸碱基，例如20－27个核苷酸碱基例如8－16个核苷酸碱基，例如12－15个核苷酸碱基的长度。
在一个此类实施方案中，本发明的寡核苷酸可以具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸碱基的长度。
应认识到对于较短的寡核苷酸，可能必须增加（高亲和力）核苷酸类似物例如LNA的部分。因此，在一个实施方案中，至少约30％的核苷酸碱基是核苷酸类似物，例如至少约33％、例如至少约40％、或至少约50％或至少约60％、例如至少约66％、例如至少约70％、例如至少约80％、或至少约90％。还将显而易见的是寡核苷酸可以包含仅由核苷酸类似物序列组成的核苷酸碱基序列。
在本文中，术语“含氮碱基”意欲涵盖嘌呤和嘧啶，例如DNA核苷酸碱基A、C、T和G，RNA核苷酸碱基A、C、U和G，以及非DNA/RNA核苷酸碱基，例如5-甲基胞嘧啶（MeC）、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2,6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤，特别是MeC。应当理解非DNA/RNA核苷酸碱基的实际选择将依赖寡核苷酸意欲靶向的微小RNA链中存在的相应（或匹配）核苷酸。例如，在相应的核苷酸是G的情况下，通常必须选择能够与G建立氢键的非DNA/RNA核苷酸碱基。在这种具体情况下，当相应的核苷酸是G时，优选的非DNA/RNA核苷酸碱基的一般例子是MeC。
术语“核苷间连接基团”意指能够使2种核苷酸碱基共价偶联在一起的基团，例如在DNA单元之间，在DNA单元和核苷酸类似物之间，在2个非LNA单元之间，在非LNA单元和LNA单元之间，和在2个LNA单元之间等。优选例子包括磷酸酯、磷酸二酯基团和硫代磷酸酯基团。
核苷间键可以选自：-O-P（O）2-O-、-O-P（O,S）-O-、-O-P（S）2-O-、-S-P（O）2-O-、-S-P（O,S）-O-、-S-P（S）2-O-、-O-P（O）2-S-、-O-P（O,S）-S-、-S-P（O）2-S-、-O-PO（RH）-O-、O-PO（OCH3）-O-、-O-PO（NRH）-O-、-O-PO（OCH2CH2S-R）-O-、-O-PO（BH3）-O-、-O-PO（NHRH）-O-、-O-P（O）2-NRH-、-NRH-P（O）2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-，和/或核苷间键可以选自：-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-,-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。适当地，在某些实施方案中，如上文提供的含硫（S）核苷间键可以是优选的。
如在寡核苷酸的上下文中使用的，术语“对应/相应”指本发明的化合物的核苷酸碱基序列及其反向互补物之间的比较，或在一个实施方案中，在核苷酸碱基序列和等同（相同）核苷酸碱基序列之间，所述等同核苷酸碱基序列可以例如包含其他核苷酸碱基但包含相同的碱基序列或其互补物。核苷酸类似物与其等同或相应的天然核苷酸直接比较。形成序列的反向互补物的序列称为序列的互补序列。
当提及如本文提及的核苷酸分子的长度时，该长度对应单体单元即核苷酸碱基的数目，与那些单体单元是核苷酸还是核苷酸类似物无关。就核苷酸碱基而言，术语单体和单元在本文中可互换使用。
应当理解当术语“约”在具体值或值范围的背景中使用时，公开内容应包括提及的具体值或范围。
优选的DNA类似物包括其中2'-H基团由除-OH（RNA）外的取代进行取代的DNA类似物，例如通过用-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH或-F取代。
优选的RNA类似物包括已在其2'-OH基团中进行修饰的RNA类似物，例如通过用除-OH（RNA）外的基团取代，例如-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH或-F。
在一个实施方案中，核苷酸类似物是“ENA”。
当在本文背景中使用时，术语“LNA单元”、“LNA单体”、“LNA残基”、“锁定核酸单元”、“锁定核酸单体”或“锁定核酸残基”指二环核苷类似物。LNA单元特别在WO99/14226、WO00/56746、WO00/56748、WO01/25248、WO02/28875、WO03/006475和WO03/095467中得到描述。LNA单元还可以就其化学式而言进行定义。因此，如本文所使用的，“LNA单元”具有下文方案1中所示的化学结构：
方案1
其中
X选自O、S和NRH，其中RH是H或C1-4-烷基；
Y是（-CH2）r，其中r是1－4的整数；和
B是含氮碱基。
当在本发明的背景中提及由其相应的LNA取代DNA单元时，术语“相应的LNA单元”意指DNA单元已由包含与其已替换的DNA单元相同的含氮碱基的LNA单元进行替换，例如包含含氮碱基A的DNA单元的相应LNA单元也包含含氮碱基A。例外是当DNA单元包含碱基C时，相应的LNA单元可以包含碱基C或碱基MeC，优选MeC。
在本文中，术语“非LNA单元”指不同于LNA单元的核苷，即，术语“非LNA单元”包括DNA单元以及RNA单元。优选的非LNA单元是DNA单元。
术语“单元”、“残基”和“单体”在本文中可互换使用。
在本文背景中，术语“缀合物”意指通过使如本文描述的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分的共价连接而形成的异质分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的例子包括大分子试剂例如蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物、或其组合。一般地蛋白质可以是对于靶蛋白的抗体。典型的聚合物可以是聚乙二醇。
术语“至少一个”包含大于或等于1的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。
术语“一”如关于核苷酸、试剂、LNA单元等使用时，意指一个或多个。特别地，表达“选自……的组分（例如核苷酸、试剂、LNA单元等）”意指可以选择一个或多个所述组分。因此，表达如“选自A、B和C的组分”意欲包括A、B和C的所有组合，即，A、B、C、A+B、A+C、B+C和A+B+C。
术语“硫代-LNA单元”指其中方案1中的X是S的LNA单元。硫代LNA单元可以是β-D型和α-L型。一般地，硫代-LNA单元的β-D型是优选的。硫代-LNA单元的β-D型和α-L型在方案3中分别显示为化合物3A和3B。
术语“氨基-LNA单元”指其中方案1中的X是NH或NRH的LNA单元，其中RH是氢或C1-4-烷基。氨基-LNA单元可以是β-D型和α-L型。一般地，氨基-LNA单元的β-D型是优选的。氨基-LNA单元的β-D型和α-L型在方案4中分别显示为化合物4A和4B。
术语“氧-LNA单元”指其中方案1中的X是O的LNA单元。氧-LNA单元可以是β-D型和α-L型。一般地，氧-LNA单元的β-D型是优选的。氧-LNA单元的β-D型和α-L型在方案5中分别显示为化合物5A和5B。
在本文背景中，术语“C1-6-烷基”意指线性或分支饱和烃链，其中最长的链具有1－6个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基。分支烃链意指在任何碳上由烃链取代的C1-6-烷基。
在本文背景中，术语“C1-4-烷基”意指线性或分支饱和烃链，其中最长的链具有1－4个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。分支烃链意指在任何碳上由烃链取代的C1-4-烷基。
当在本文中使用时，术语“C1-6-烷氧基”意指C1-6-烷基-氧，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基和己氧基。
在本文背景中，术语“C2-6-烯基”意指具有2－6个碳原子且包含一个或多个双键的线性或分支烃基团。C2-6-烯基的举例说明性例子包括烯丙基、高-烯丙基、乙烯基、巴豆基、丁烯基、丁二烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基和己二烯基。不饱和（双键）的位置可以在沿着碳链的任何位置上。
在本文背景中，术语“C2-6-炔基”意指具有2－6个碳原子且包含一个或多个三键的线性或分支烃基团。C2-6-炔基的举例说明性例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基。不饱和（三键）的位置可以在沿着碳链的任何位置上。超过一个键可以是这样不饱和的，使得“C2-6-炔基”是如本领域技术人员已知的二炔或烯二炔（enedi-yne）。
如本文所使用的，“杂交”意指在互补的核苷或核苷酸碱基之间的氢键合，其可以是沃森-克里克、Hoogsteen、可逆的Hoogsteen氢键合等。通常在DNA中发现的4个核苷酸碱基是G、A、T和C，其中G与C配对，和A与T配对。在RNA中，T由尿嘧啶（U）替换，这随后与A配对。参与标准双链体形成的核苷酸碱基中的化学基团构成沃森-克里克面。Hoogsteen在数年后显示嘌呤核苷酸碱基（G和A）除其沃森-克里克面外还具有Hoogsteen面，其可以由双链体的外面识别，并且用于经由氢键合结合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋结构。
在本发明的背景中，“互补性”指2个核苷酸序列彼此之间用于精确配对的能力。例如，如果在寡核苷酸的某一位置上的核苷酸能够与在DNA或RNA分子的相应位置上的核苷酸氢键合，那么寡核苷酸和DNA或RNA被认为在那个位置上彼此互补。当寡核苷酸中足够数目的核苷酸可以与靶DNA或RNA中的相应核苷酸形成氢键合以使得能够形成稳定的复合物时，DNA或RNA链被认为彼此互补。为了在体外或体内稳定，寡核苷酸的序列无需与靶微小RNA100％互补。术语“互补性”和“可特异性杂交”因此暗示寡核苷酸与靶分子足够强烈和特异的结合，以提供对于靶的正常功能的所需干扰，同时使得非靶RNA的功能不受影响。
在一个优选例子中，本发明的寡核苷酸与人微小RNA序列，例如本文提及的微小RNA序列之一100％互补。
在一个优选例子中，本发明的寡核苷酸包含与人微小RNA序列的种区域100％互补的连续序列。
微小RNA是衍生自内源基因的短的、非编码RNA，所述内源基因充当基因表达的转录后调节剂。它们通过RNA酶III酶Dicer由称为前miRNA的更长的（约70－80nt）发夹样前体进行加工。微小RNA在称为miRNPs的核糖核蛋白复合物中装配且通过反义互补性识别其靶位点，由此介导其靶基因的下调。在miRNA及其靶位点之间接近完全或完全的互补性导致靶mRNA切割，而微小RNA和靶位点之间有限的互补性导致靶基因的翻译抑制。
在本发明的背景中的术语“微小RNA”或“miRNA”意指由18－25个核苷酸组成的RNA寡核苷酸。在功能术语中，miRNA一般是调节性内源RNA分子。
术语“靶微小RNA”或“靶miRNA”或“miRNA靶”指在人疾病中具有生物作用的微小RNA，例如在癌症中上调的、致癌miRNA或肿瘤抑制miRNA，从而是用于所述疾病的治疗干预的靶。
术语“靶基因”或“靶mRNA”指微小RNA的调节mRNA靶，其中基于miRNA及其靶位点之间接近完全或完全的互补性，所述“靶基因”或“靶mRNA”由微小RNA进行转录后调节，导致靶mRNA切割；或有限的互补性，通常赋予所谓的种子序列（miRNA的核苷酸2－7）和靶位点之间的互补性，导致靶mRNA的翻译抑制。
在本发明的背景中，寡核苷酸是单链的，这指其中寡核苷酸在不存在互补寡核苷酸的情况，即它不是双链寡核苷酸复合物，例如siRNA。在一个实施方案中，根据本发明的组合物不包含进一步的寡核苷酸，其与5个或更多连续核苷酸碱基的单链寡核苷酸具有互补性的区域，例如8个或更多，或12个或更多连续核苷酸碱基。认为进一步的寡核苷酸不与单链寡核苷酸共价连接。
本发明的含LNA寡核苷酸
尽管LNA单元和非LNA单元可以以众多方式进行组合以形成寡核苷酸，但本发明的发明人已惊奇地发现，特定核心DNA序列和所述DNA序列中LNA单元的特定存在导致对微小RNA的特别高的抑制。在本发明的寡核苷酸的所述核心序列中LNA单元的这种存在使得所述寡核苷酸高度抵抗核酸酶。
核心序列外的核苷酸可以是LNA单元和/或非LNA单元。在一个实施方案中，核心序列外的非LNA单元是DNA单元。
核心序列
为了使本发明的反义寡核苷酸尽可能有效地抑制其靶微小RNA，在本发明的反义寡核苷酸和相应的靶微小RNA之间需要存在一定程度的互补性。
对于本发明的寡核苷酸特别重要的是与相应的靶微小RNA由5'末端计数的第3－8位互补。在某些靶微小RNA中由5'末端计数的核苷酸1是非配对碱基，并且最可能隐藏在Ago2蛋白质的结合袋中。因此，本发明的寡核苷酸在由3'末端计数的第1位中可以具有或不具有核苷酸，其对应相应的靶微小RNA由5'末端计数的核苷酸1。在某些情况下，相应的靶微小RNA由5'末端计数的前2个核苷酸可以是不匹配的。
本发明的寡核苷酸的核心序列因此是由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位的DNA序列，对应相应的靶微小RNA由5'末端计数的第3－8位。
miR-19b
一种特定靶微小RNA称为miR-19b。由5'末端计数的第3－8位的miR-19b的序列是ugcaaa（参见GenBank基因座AJ421740和AJ421739）。相应的DNA序列是acgttt。本发明的发明人已进一步发现为了使对靶微小RNA的抑制达到最大，本发明的寡核苷酸在其核心序列中必须包含至少一个LNA单元。
因此，本发明的第一个方面涉及根据本发明的寡核苷酸，例如长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，具有由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位，优选第2－7位或第3－8位的DNA序列：
acgttt（SEQIDNO6）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
与靶微小RNA进一步的核苷酸的互补性可以增强对所述靶微小RNA的抑制。因此，一个实施方案是如上所述的寡核苷酸，具有包含由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位，优选第2－8位或第3－9位的DNA序列：
acgttta，（SEQIDNO70）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位，优选第2－9位或第3－10位的DNA序列：
acgtttag,（SEQIDNO71）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另外一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位，优选第2－10位或第3－11位的DNA序列：
acgtttagg,（SEQIDNO72）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
miR-122a
另一种有利的靶微小RNA是miR-122a。由5'末端计数第3－8位的miR-122a的序列是gagugu（参见miRBase条目HGNC：MIRN122A）。相应的DNA序列是ctcaca。
因此，本发明的第二个方面涉及根据本发明的寡核苷酸，例如长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，具有由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位，优选第2－7位或第3－8位的DNA序列：
ctcaca，（SEQIDNO7）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
一个实施方案涉及如上所述的miR-122aantagomir寡核苷酸，具有由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位，优选第2－8位或第3－9位的DNA序列：
ctcacac，（SEQIDNO73）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位，优选第2－9位或第3－10位的DNA序列：
ctcacact，（SEQIDNO74）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另外一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位，优选第2－10位或第3－11位的DNA序列：
ctcacactg，（SEQIDNO75）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
miR-155
另一种有利的靶微小RNA是miR-155。由5'末端计数第3－8位的miR-155的序列是aaugcu（参见miRBase条目HGNC：MIRN155）。相应的DNA序列是ttacga。
因此，本发明的第三个方面涉及根据本发明的寡核苷酸，例如长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，具有由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位，优选第2－7位或第3－8位的DNA序列：
ttacga，（SEQIDNO8）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在一个实施方案中，如上所述的miR-155antagomir寡核苷酸具有由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位，优选第2－8位或第3－9位的DNA序列：
ttacgat，（SEQIDNO76）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位，优选第2－9位或第3－10位的DNA序列：
ttacgatt，（SEQIDNO77）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另外一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位，优选第2－10位或第3－11位的DNA序列：
ttacgatta，（SEQIDNO78）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
miR-375
另外一种有利的靶微小RNA是miR-375。由5'末端计数第3－8位的miR-375的序列是uguucg（参见miRBase条目HGNC：MIRN375）。相应的DNA序列是acaagc。
因此，本发明的第四个方面涉及根据本发明的寡核苷酸，例如长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，具有由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位，优选第2－7位或第3－8位的DNA序列：
acaagc，（SEQIDNO9）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在一个实施方案中，如上所述的miR-375antagomir寡核苷酸具有由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位，优选第2－8位或第3－9位的DNA序列：
acaagca，（SEQIDNO79）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位，优选第2－9位或第3－10位的DNA序列：
acaagcaa，（SEQIDNO80）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
在另外一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位，优选第2－10位或第3－11位的DNA序列：
acaagcaag,（SEQIDNO81）
其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
核心序列中的核苷酸的修饰
如上所述，在本发明的寡核苷酸的核心序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。本发明人已进一步发现对靶微小RNA的抑制可以通过确保所述核心序列中的2个LNA单元由至少一个DNA单元分隔开得到进一步增加。
因此，本发明的一个实施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位，优选第2－7位或第3－8位的至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。
本发明人也已发现对靶微小RNA的抑制可以通过确保核心序列中的2个LNA单元由至多2个DNA单元分隔开得到再进一步增加。因此，在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位，优选第2－7位或第3－8位的连续DNA单元的数目为至多2个。
所述发现应用于核心序列其本身，即该发现应用于对应核心序列的本发明的寡核苷酸的位置。因此，另一个实施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位，优选第2－8位或第3－9位的至少2个，例如2个、3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。进一步的实施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位，优选第2－8位或第3－9位的连续DNA单元的数目为至多2个。
另外一个实施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位，优选第2－9位或第3－10位的至少2个，例如2个、3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。进一步的实施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位，优选第2－9位或第3－10位的连续DNA单元的数目为至多2个。
另外一个实施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位，优选第2－10位或第3－11位的至少2个，例如2个、3个、4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。再进一步的实施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位，优选第2－10位或第3－11位的连续DNA单元的数目为至多2个。
核心序列外的核苷酸的修饰
如上所述，核心序列外的核苷酸可以是LNA单元和/或非LNA单元。在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的寡核苷酸，其中核心序列外的LNA单元的数目为至少一个，例如1个、2个、3个和4个，和其中所述LNA单元由至少一个非LNA单元分隔开。在一个进一步的实施方案中，核心序列外的置换方式是这样的，使得核心序列外的连续非LNA单元的数目为至多2个。
由3’末端计数，在第3－8位中的核苷酸的修饰。
在涉及由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的修饰的下述实施方案中，LNA单元可以由其他核苷酸类似物，例如本文提及的那些进行替换。因此，“X”可以选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元。“x”优选是DNA或RNA，最优选DNA。
在本发明的一个有利的实施方案中，本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中进行修饰。这种序列的设计可以由存在的非LNA单元的数目或由存在的LNA单元的数目进行定义。在前者的一个优选实施方案中，由3’末端计数第3－8位中的至少一个，例如1个核苷酸是非LNA单元。在另一个实施方案中，由3’末端计数第3－8位中的至少2个，例如2个核苷酸是非LNA单元。在另外一个实施方案中，由3’末端计数第3－8位中的至少3个，例如3个核苷酸是非LNA单元。在另外一个实施方案中，由3’末端计数第3－8位中的至少4个，例如4个核苷酸是非LNA单元。在另一个实施方案中，由3’末端计数第3－8位中的至少5个，例如5个核苷酸是非LNA单元。在另一个实施方案中，由3’末端计数第3－8位中的所有6个核苷酸都是非LNA单元。在一个优选实施方案中，所述非LNA单元是DNA单元。
备选定义的，在一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含至少一个LNA单元。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含1个LNA单元。在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx和xxxxxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。
在另一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含至少2个LNA单元。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含2个LNA单元。在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX和xxxxXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个优选实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX和xxxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个更优选的实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX和xxxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个更加优选的实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自xXxXxx、xXxxXx和xxXxXx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个最优选的实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式是xXxXxx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。
在另外一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含至少3个LNA单元。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含3个LNA单元。在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自XXXxxx、xXXXxx、xxXXXx、xxxXXX、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个优选实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个更优选的实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX和xXxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个更加优选的实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式是xXxXxX或XxXxXx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在一个最优选的实施方案中，在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式是xXxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。
在一个进一步的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含至少4个LNA单元。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含4个LNA单元。在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自xxXXXX、xXxXXX、xXXxXX、xXXXxX、xXXXXx、XxxXXX、XxXxXX、XxXXxX、XxXXXx、XXxxXX、XXxXxX、XXxXXx、XXXxxX、XXXxXx和XXXXxx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。
在一个再进一步的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含至少5个LNA单元。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含5个LNA单元。在由3’末端计数第3－8位中的核苷酸的置换方式可以选自xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX和XXXXXx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。
优选地，根据本发明的寡核苷酸在由3’末端计数第3－8位中包含1个或2个LNA单元。这对于由寡聚体：微小RNA双链体（在结构上类似RNA：RNA双链体的双链体）形成的A螺旋的稳定性被认为是有利的。
在一个优选实施方案中，所述非LNA单元是DNA单元。
寡核苷酸长度的变化
本发明的寡核苷酸的长度无需确切匹配靶微小RNA的长度。事实上具有短寡核苷酸，例如10－17个或10－16个核苷酸碱基被认为是有利的。
在一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有8－24个核苷酸的长度，例如10－24个，12－24个核苷酸，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的长度，优选10－22个，例如12－22个核苷酸的长度，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸的长度，更优选10－20个，例如12－20个核苷酸的长度，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的长度，更加优选10－19个，例如12－19个核苷酸的长度，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸的长度，例如10－18个，例如12－18个核苷酸的长度，例如10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸的长度，更优选10－17个，例如12－17个核苷酸的长度，例如10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸的长度，更优选10－16个，例如12－16个核苷酸的长度，例如10、11、12、13、14、15或16个核苷酸的长度。
由3'末端向5'末端计数，从第11位开始的核苷酸的修饰
由3'末端向5'末端计数，从第11位开始的核苷酸的置换方式可以包括核苷酸类似物单元（例如LNA）或可以不包括。在一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含由3'末端向5'末端计数，从第11位开始的至少一个核苷酸类似物单元（例如LNA），例如1个核苷酸类似物单元。在另一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含由3'末端向5'末端计数，从第11位开始的至少2个核苷酸类似物单元（例如LNA），例如2个核苷酸类似物单元。
在涉及从寡核苷酸的第11位到5’末端的核苷酸碱基中的核苷酸的修饰的下述实施方案中，LNA单元可以由其他核苷酸类似物，例如本文提及的那些进行替换。因此，“X”可以选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元。“x”优选是DNA或RNA，最优选DNA。
在一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有下述置换方式，其由从3'末端向5'末端计数的核苷酸11开始重复：xXxX或XxXx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在另一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有下述置换方式，其由从3'末端向5'末端计数的核苷酸11开始重复：XxxXxx、xXxxXx或xxXxxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在另外一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸具有下述置换方式，其由从3'末端向5'末端计数的核苷酸11开始重复：XxxxXxxx、xXxxxXxx、xxXxxxXx或xxxXxxxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。
由3'末端向5'末端计数，从第11位开始的核苷酸的具体置换方式取决于根据本发明的寡核苷酸中的核苷酸的数目。在一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含12个核苷酸，和由3’末端计数第11－12位的置换方式选自xX和Xx，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更优选的实施方案中，由3’末端计数第11－12位的置换方式是xX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。备选地，无LNA单元存在于由3’末端计数第11－12位中，即置换方式是xx。
在一个更优选的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含13个核苷酸，和由3’末端计数第11－13位的置换方式选自Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更优选的实施方案中，由3’末端计数第11－13位的置换方式选自xXx、xxX和xXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个最优选的实施方案中，由3’末端计数第11－13位的置换方式是xxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。备选地，无LNA单元存在于由3’末端计数第11－13位中，即置换方式是xxx。
在另外一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含14个核苷酸，和由3’末端计数第11－14位的置换方式选自Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX和xxXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更优选的实施方案中，由3’末端计数第11－14位的置换方式是xXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。备选地，无LNA单元存在于由3’末端计数第11－14位中，即置换方式是xxxx。
在一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含15个核苷酸，和由3’末端计数第11－15位的置换方式选自Xxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx、XxXxx、XxxXx、XxxxX、xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX和XxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个优选实施方案中，由3’末端计数第11－15位的置换方式选自xxXxx、XxXxx、XxxXx、xXxXx、xXxxX和xxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更优选的实施方案中，由3’末端计数第11－15位的置换方式选自xxXxx、xXxXx、xXxxX和xxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更加优选的实施方案中，由3’末端计数第11－15位的置换方式选自xXxxX和xxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个最优选的实施方案中，由3’末端计数第11－15位的置换方式是xxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。备选地，无LNA单元存在于由3’末端计数第11－15位中，即置换方式是xxxxx。
在一个再进一步优选的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含16个核苷酸，和由3’末端计数第11－16位的置换方式选自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、XxXXxx、XxXxXx、XxXxxX、XxxXXx、XxxXxX、XxxxXX、xXXXxx、xXXxXx、xXXxxX、xXxXXx、xXxXxX、xXxxXX、xxXXXx、xxXXxX、xxXxXX和xxxXXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个优选实施方案中，由3’末端计数第11－16位的置换方式选自XxxXxx、xXxXxx、xXxxXx、xxXxXx、xxXxxX、XxXxXx、XxXxxX、XxxXxX、xXxXxX、xXxxXX和xxXxXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更优选的实施方案中，由3’末端计数第11－16位的置换方式选自xXxXxx、xXxxXx、xxXxXx、xxXxxX、xXxXxX、xXxxXX和xxXxXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更加优选的实施方案中，由3’末端计数第11－16位的置换方式选自xxXxxX、xXxXxX、xXxxXX和xxXxXX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个更加优选的实施方案中，由3’末端计数第11－16位的置换方式选自xxXxxX和xXxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。在其一个最优选的实施方案中，由3’末端计数第11－16位的置换方式是xxXxxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。备选地，无LNA单元存在于由3’末端计数第11－16位中，即置换方式是xxxxxx。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在5'末端包含LNA单元。在另一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在由5'末端计数的前2个位置上包含LNA单元。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含13个核苷酸，和从3'末端开始的置换方式是XXxXxXxxXXxxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。关于这个实施方案从3'末端开始的优选序列是CCtCaCacTGttA，其中大写字母指LNA单元中的含氮碱基，和小写字母指非LNA单元中的含氮碱基。
在另一个特别优选的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含15个核苷酸，和从3'末端开始的置换方式是XXxXxXxxXXxxXxX，其中“X”指LNA单元，和“x”指非LNA单元。关于这个实施方案从3'末端开始的优选序列是CCtCaCacTGttAcC，其中大写字母指LNA单元中的含氮碱基，和小写字母指非LNA单元中的含氮碱基。
核苷间连接基团的修饰
寡核苷酸中的典型核苷间连接基团是磷酸基，但这些可以由不同于磷酸酯的核苷间连接基团替换。在本发明的一个进一步有利的实施方案中，本发明的寡核苷酸在其核苷间连接基团结构中进行修饰，即经修饰的寡核苷酸包含不同于磷酸酯的核苷间连接基团。因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包含至少一个
不同于磷酸酯的核苷间连接基团的具体例子
（-O-P（O）2-O-）包括-O-P（O,S）-O-、-O-P（S）2-O-、-S-P（O）2-O-、-S-P（O,S）-O-、-S-P（S）2-O-、-O-P（O）2-S-、-O-P（O,S）-S-、-S-P（O）2-S-、-O-PO（RH）-O-、O-PO（OCH3）-O-、-O-PO（NRH）-O-、-O-PO（OCH2CH2S-R）-O-、-O-PO（BH3）-O-、-O-PO（NHRH）-O-、-O-P（O）2-NRH-、-NRH-P（O）2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH是氢或C1-4-烷基。
当核苷间连接基团被修饰时，核苷间连接基团优选是硫代磷酸酯基团（-O-P（O,S）-O-）。在一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸的所有核苷间连接基团都是硫代磷酸酯。
关于具体微小RNA的设计
下表提供了如与现有技术类型的分子比较根据本发明的寡核苷酸的例子，例如用于药物组合物中的那些。
不含上标M或F的大写字母指LNA单元。小写字母=DNA，除了粗体小写字母=RNA。LNA胞嘧啶可以任选是甲基化的。后有上标M的大写字母指2’OMERNA单元，后有上标F的大写字母指2’氟DNA单元，小写字母指DNA。在一个实施方案中，上述寡聚体可以完全是硫代磷酸酯，但可以使用如本文所描述的其他核苷酸碱基连接键。在一个实施方案中，核苷酸碱基连接键都是磷酸二酯。认为对于在脑/脊髓内的应用优选使用磷酸二酯键，例如对于使用靶向miR21的抗miR。
在一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸可以具有选自下述的5'－3'核苷酸碱基序列：
LdLddLLddLdLdLL（新设计）
LdLdLLLddLLLdLL（增强的新设计）
LMLMMLLMMLMLMLL（新设计-2’MOE）
LMLMLLLMMLLLMLL（增强的新设计-2’MOE）
LFLFFLLFFLFLFLL（新设计-2’氟）
LFLFLLLFFLLLFLL（增强的新设计-2’氟）
LddLddLddL（d）（d）（L）（d）（d）（L）（d）‘每第3个’
dLddLddLdd（L）（d）（d）（L）（d）（d）（L）‘每第3个’
ddLddLddLd（d）（L）（d）（d）（L）（d）（d）‘每第3个’
LMMLMMLMML（M）（M）（L）（M）（M）（L）（M）‘每第3个’
MLMMLMMLMM（L）（M）（M）（L）（M）（M）（L）‘每第3个’
MMLMMLMMLM（M）（L）（M）（M）（L）（M）（M）‘每第3个’
LFFLFFLFFL（F）（F）（L）（F）（F）（L）（F）‘每第3个’
FLFFLFFLFF（L）（F）（F）（L）（F）（F）（L）‘每第3个’
FFLFFLFFLF（F）（L）（F）（F）（L）（F）（F）‘每第3个’
dLdLdLdLdL（d）（L）（d）（L）（d）（L）（d）‘每第2个’
LdLdLdLdL（d）（L）（d）（L）（d）（L）（d）（L）‘每第2个’
MLMLMLMLML（M）（L）（M）（L）（M）（L）（M）‘每第2个’
LMLMLMLML（M）（L）（M）（L）（M）（L）（M）（L）‘每第2个’
FLFLFLFLFL（F）（L）（F）（L）（F）（L）（F）‘每第2个’
LFLFLFLFL（F）（L）（F）（L）（F）（L）（F）（L）‘每第2个’
其中L=LNA单元，d=DNA单元，M=2’MOERNA，F=2’氟，和括号中的残基是可选存在的。
根据本发明的寡核苷酸的具体例子可以选自tgCatGgaTttGcaCa（SEQIDNO82），tgCatGgaTttGcaC（SEQIDNO83），CatGgaTttGcaC（SEQIDNO84），tGcAtGgAtTtGcAc（SEQIDNO85），cAtGgAtTtGcAc（SEQIDNO86），CatGGatTtGcAC（SEQIDNO87），TgCatGGatTtGcAC（SEQIDNO88），TgCaTgGaTTtGcACa（SEQIDNO89），cCatTgtCacActCca（SEQIDNO90），cCatTgtAacTctCca（SEQIDNO91），ccAttGtcAcaCtcCa（SEQIDNO92），cCatTgtCacActCc（SEQIDNO93），atTgtCacActCc（SEQIDNO94），ccAttGtcAcaCtcC（SEQIDNO95），AttGtcAcaCtcC（SEQIDNO96），aTtGtCaCaCtCc（SEQIDNO97），AttGTcaCaCtCC（SEQIDNO98），CcAttGTcaCaCtCC（SEQIDNO99），CcaTtgTcacActcCa（SEQIDNO100），CCAttgtcacacTCCa（SEQIDNO101），tCacGatTagCatTaa（SEQIDNO102），aTcaCgaTtaGcaTta（SEQIDNO103），TcAcGaTtAgCaTtAa（SEQIDNO104），AtcAcGaTtAgCaTta（SEQIDNO105），gAgcCgaAcgAacAa（SEQIDNO106），gcCgaAcgAacAa（SEQIDNO107），GaGcCgAaCgAaCaA（SEQIDNO108）和GcCgAaCgAaCaA（SEQIDNO109）；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基，其中大写C指MeC。
应认识到上述具体例子中的LNA/DNA核苷酸碱基的设计可以应用于根据本发明的其他寡核苷酸。
缀合物
本发明还提供了包含根据本发明的寡核苷酸的缀合物。
在本发明的一个实施方案中，寡聚化合物与配体/缀合物连接，这可以例如用于增加反义寡核苷酸的细胞摄取。这种缀合可以在末端位置5’/3’-OH上发生，但配体还可以在糖和/或碱基上发生。特别地，反义寡核苷酸可以与之缀合的生长因子可以包含转铁蛋白或叶酸。转铁蛋白-聚赖氨酸-寡核苷酸复合物或叶酸-聚赖氨酸-寡核苷酸复合物可以制备用于被表达高水平的转铁蛋白或叶酸受体的细胞摄取。缀合物/配体的其他例子是胆固醇部分，双链体嵌入剂例如吖啶，聚L-赖氨酸，用一个或多个核酸酶抗性连接基团例如单硫代磷酸酯的“封端”等。本发明还提供了缀合物，其包含如本文所描述的根据本发明的化合物，和与所述化合物共价附着的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在其中本发明的化合物由指定核酸组成的一个实施方案中，如本文公开的，化合物还可以包含与所述化合物共价附着的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分（例如，不包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物）。非核苷酸碱基部分可以例如是或包含甾醇例如胆固醇。
因此，应认识到本发明的寡核苷酸，例如在药物（治疗）制剂中使用的寡核苷酸可以包含进一步的非核苷酸碱基组分，例如本文定义的缀合物。
LNA单元
在一个优选实施方案中，LNA单元具有下文方案1中所示的一般化学结构：
方案1
其中
X选自O、S和NRH，其中RH是H或C1-4-烷基；
Y是（-CH2）r，其中r是1－4的整数；和
B是含氮碱基。
在本发明的一个优选实施方案中，r是1或2，特别是1，即优选LNA单元具有下文方案2中所示的化学结构：
方案2
其中X和B如上定义。
在一个有利的实施方案中，掺入本发明的寡核苷酸中的LNA单元独立地选自硫代-LNA单元、氨基-LNA单元和氧-LNA单元。
因此，硫代-LNA单元可以具有下文方案3中所示的化学结构：
方案3
其中B如上定义。
优选地，硫代-LNA单元是其β-D型，即具有上文3A中所示的结构。
同样地，氨基-LNA单元可以具有下文方案4中所示的化学结构：
方案4
其中B和RH如上定义。
优选地，氨基-LNA单元是其β-D型，即具有上文4A中所示的结构。
氧-LNA单元可以具有下文方案5中所示的化学结构：
方案5
其中B如上定义。
优选地，氧-LNA单元是其β-D型，即具有上文5A中所示的结构。
如上所述，B是可以是天然或非天然来源的含氮碱基。含氮碱基的具体例子包括腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、5-甲基胞嘧啶（MeC）、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、尿嘧啶（U）、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2,6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
末端基团
末端基团的具体例子包括选自下述的末端基团：氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷硫基、氨基、Prot-N（RH）-、Act-N（RH）-、单或二（C1-6-烷基）氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-烯基、任选取代的C2-6-烯氧基、任选取代的C2-6-炔基、任选取代的C2-6-炔氧基、单磷酸包括保护的单磷酸、单硫代磷酸酯包括保护的单硫代磷酸酯、二磷酸酯包括保护的二磷酸酯、二硫代磷酸酯包括保护的二硫代磷酸酯、三磷酸酯包括保护的三磷酸酯、三硫代磷酸酯包括保护的三硫代磷酸酯，其中Prot是用于-OH、-SH和-NH（RH）的保护基团，和Act是用于-OH、-SH和-NH（RH）的活化基团，和RH是氢或C1-6-烷基。
磷酸酯保护基团的例子包括S-乙酰硫代乙基（acetylthioethyl）（SATE）和S-特戊酰硫代乙基（叔丁基-SATE）。
末端基团的再进一步的例子包括DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团、配体、羧基、sulphono、羟甲基、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、氨甲基、Prot-N（RH）-CH2-、Act-N（RH）-CH2-、羧甲基、sulphonomethyl，其中Prot是用于-OH、-SH和-NH（RH）的保护基团，和Act是用于-OH、-SH和-NH（RH）的活化基团，和RH是氢或C1-6-烷基。
用于-OH和-SH基团的保护基团的例子包括取代的三苯甲基，例如4,4'-二甲氧基三苯甲氧基（DMT），4-单甲氧基三苯甲氧基（MMT）；三苯甲氧基，任选取代的9-（9-苯基）占吨氧基（pixyl），任选取代的甲氧基四氢吡喃氧基（mthp）；硅烷氧基，例如三甲硅烷氧基（TMS），三异丙基硅烷氧基（TIPS），叔丁基二甲基硅烷氧基（TBDMS），三乙基硅烷氧基，苯基二甲基硅烷氧基；叔丁基醚；缩醛（包括2个羟基）；酰氧基，例如乙酰基或卤素取代的乙酰基，例如氯代乙酰氧基或氟代乙酰氧基，异丁酰氧基，特戊酰氧基，苯甲酰氧基和取代的苯甲酰基，甲氧基甲基氧基（MOM），苄醚或取代的苄醚例如2,6-二氯苄氧基（2,6-Cl2Bzl）。此外，当Z或Z*是羟基时，它们可以通过与固体载体附着进行保护，任选经由接头。
胺保护基团的例子包括芴甲氧羰基氨基（Fmoc），叔丁氧基羰基氨基（BOC），三氟乙酰氨基，烯丙氧基羰基氨基（alloc，AOC），Z-苯甲氧基羰基氨基（Cbz），取代的苯甲氧基羰基氨基，例如2-氯苯甲氧基羰基氨基（2-ClZ），单甲氧基三苯甲基氨基（MMT），二甲氧基三苯甲基氨基（DMT），邻苯二甲酰氨基，和9-（9-苯基）占吨基氨基（pixyl）。
活化基团优选介导与其他残基和/或核苷酸单体的偶联，并且在偶联已完成后，活化基团一般转变成核苷间键。此类活化基团的例子包括任选取代的O-亚磷酰胺，任选取代的O-磷酸三酯，任选取代的O-磷酸二酯，任选取代的H-膦酸酯，和任选取代的O-膦酸酯。在本文背景中，术语“亚磷酰胺”意指式-P（ORx）-N（Ry）2的基团，其中Rx指任选取代的烷基，例如甲基、2-氰乙基或苯甲基，和每个Ry指任选取代的烷基，例如乙基或异丙基，或-N（Ry）2基团形成吗啉代基团（-N（CH2CH2）2O）。Rx优选指2-氰乙基，和2个Ry优选是相同的且指异丙基。因此，特别优选的亚磷酰胺是N,N-二异丙基-O-（2-氰乙基）-亚磷酰胺。
最优选的末端基团是羟基、巯基和氨基，特别是羟基。
治疗和药物组合物
如最初解释的，本发明的寡核苷酸将构成具有改善性质的合适药物。有效和安全药物的设计要求各种参数如亲和性/特异性、生物流体中的稳定性、细胞摄取、作用方式、药代动力学性质和毒性的细调。
因此，在一个进一步的方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂。优选地所述载体是盐水或缓冲盐水。
在一个再进一步的方面，本发明涉及用作药物的根据本发明的寡核苷酸。
如应当理解的，剂量取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性，从数天持续至数月的疗程，或直至实现治愈或达到疾病状态的减少。最佳的给药方案可以由患者体内的药物积聚的测量进行计算。最佳剂量可以依个别寡核苷酸的相对功效而变。一般地，它可以基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50进行估计。一般而言，剂量为0.01μg－1g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次，或甚至每2－10年给予1次或通过连续输注给予数小时直至数月。关于给药的重复率可以基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度进行估计。成功治疗后，可能希望使患者经历维持疗法以防止疾病状态的复发。
药物组合物
如上所述，本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的至少一种寡核苷酸作为活性成分。应当理解根据本发明的药物组合物任选包含药物载体，并且药物组合物任选包含进一步的化合物，例如化学疗法化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物和/或免疫调节化合物。
本发明的寡核苷酸可以“就这样”使用，或以各种药学上可接受的盐的形式使用。如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”指保留本文鉴定的寡核苷酸的所需生物活性和显示最低限度的不希望有的毒理学效应的盐。此类盐的非限制性例子可以与有机氨基酸形成，和与金属阳离子或与由铵、N，N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺、四乙铵或乙二胺形成的阳离子形成的碱加成盐，所述金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等。
在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸可以是前药的形式。寡核苷酸在性质上是带负电荷的离子。由于细胞膜的亲脂性质，与中性或亲脂等同物比较，寡核苷酸的细胞摄取是减少的。这种极性‘阻碍’可以通过使用前药法得到避免（参见例如Crooke，R.M.（1998）inCrooke，S.T.AntisenseresearchandApplication.Springer-Verlag，Berlin，Germany，第131卷，第103-140页）。
药学上可接受的结合剂和辅剂可以构成所配制药物的组成部分。
用于递送本文描述的治疗剂的递送方法的例子以及药物制剂的细节、盐可以在其他地方得到详细描述，例如通过引用合并入本文的美国临时申请60/838,710和60/788,995，和同样通过引用合并入本文的丹麦申请PA200600615。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂或含脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分包括但不限于预先形成的液体、自身乳化的固体和自身乳化的半固体。药物至肿瘤组织的递送可以通过载体介导的递送得到增强，所述载体包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒和微球体（DassCR.JPharmPharmacol2002；54（1）：3-27）。可以方便地以单位剂型存在的本发明的药物制剂可以根据医药工业众所周知的常规技术进行制备。此类技术包括使活性成分与药学载体或赋形剂接触的步骤。一般而言，制剂通过下述进行制备：使活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀地和密切地接触，和随后必要时使产物成型。本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一种，例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶和栓剂。本发明的组合物还可以在水性、非水性或混合介质中配制为悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加悬浮液的粘性的物质，所述物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。本发明的化合物还可以与活性药物物质例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗细菌药或抗生素缀合。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以包含靶向第一微小RNA的一种或多种寡核苷酸化合物，和靶向第二微小RNA靶的一种或多种另外的寡核苷酸化合物。两种或更多组合化合物可以一起或顺次使用。
本文公开的化合物对于如上所述的许多治疗应用有用。一般而言，本发明的治疗方法包括给哺乳动物特别是人施用治疗有效量的寡核苷酸。在某一实施方案中，本发明提供了包含（a）一种或多种本发明的化合物，和（b）一种或多种化学治疗剂的药物组合物。当与本发明的化合物一起使用时，此类化学治疗剂可以单独、顺次或与一种或多种其他此类化学治疗剂组合或与放射疗法组合使用。本领域技术人员已知的所有化学治疗剂作为与根据本发明的化合物的组合疗法引入本文。其他活性剂例如抗炎药包括但不限于非甾体抗炎药和皮质类固醇，抗病毒药物和免疫调节药物也可以在本发明的组合物中进行组合。两种或更多组合化合物可以一起或顺次使用。
可以通过本发明的药物组合物治疗的治疗适应症的例子：
肿瘤抑制基因原肌球蛋白1（TPM1）mRNA已指示为miR-21的靶。Myotrophin（mtpn）mRNA已指示为miR-375的靶。
在一个再进一步的方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸用于制备用于治疗选自下述的疾病的药物的用途：动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症；癌症，成胶质细胞瘤，乳腺癌，淋巴瘤，肺癌；糖尿病，代谢紊乱；成肌细胞分化；免疫病症。
本发明进一步涉及根据本发明的寡核苷酸用于在治疗选自下述的疾病中的用途：动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症；癌症，成胶质细胞瘤，乳腺癌，淋巴瘤，肺癌；糖尿病，代谢紊乱；成肌细胞分化；免疫病症。
本发明提供了用于治疗患有选自下述的疾病或病状的受试者的方法：动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症；癌症，成胶质细胞瘤，乳腺癌，淋巴瘤，肺癌；糖尿病，代谢紊乱；成肌细胞分化；免疫病症，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的寡核苷酸或药物组合物的步骤。
癌症
在一个再进一步的方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。在另一个方面，本发明涉及用于治疗癌症或针对癌症预防的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的寡核苷酸或其缀合物，或本发明的药物组合物。
此类癌症可以包括淋巴网状内皮细胞瘤形成、成淋巴细胞性白血病、脑肿瘤、胃肿瘤、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、结缔组织肿瘤、淋巴瘤和实体瘤。
在本发明的化合物或其缀合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途中，所述癌症可以适当地是实体瘤的形式。有利地，在用于治疗本文公开的癌症的方法中，所述癌症可以适当地是实体瘤的形式。
此外，所述癌症也适当地是癌。癌一般选自恶性黑素瘤、基底细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、复发性表浅膀胱癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、宫颈癌、宫颈发育不良、喉乳头状瘤病、结肠癌、结肠直肠癌和类癌瘤。更一般地，所述癌选自恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和肾细胞癌。恶性黑素瘤一般选自浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、肢端黑素瘤、无黑素性黑素瘤和结缔组织增生性黑素瘤。
备选地，癌症可以适当地是肉瘤。肉瘤一般是选自骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤和卡波济氏肉瘤的形式。
备选地，癌症可以适当地是神经胶质瘤。
一个进一步的实施方案涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物进一步包含选自下述的化学治疗剂：肾上腺皮质类固醇例如泼尼松，氟美松或地塞米松；六甲蜜胺（六甲蜜胺、六甲三聚氰胺（HMM））；氨磷汀（阿密磷定）；氨格鲁米特（氨鲁米特）；安吖啶（M-AMSA）；阿那曲唑（瑞宁得）；雄激素，例如睾酮；天冬酰胺酶（优适宝）；卡介苗；比卡鲁胺（康士得）；争光霉素（博来霉素）；白消安（马利兰）；卡铂（伯尔定）；卡莫司汀（BCNU，BiCNU）；苯丁酸氮芥（瘤可宁）；2-氯脱氧腺苷（2-CDA，克拉屈滨，克拉立平）；顺铂（顺氯氨铂）；胞嘧啶阿糖核苷（阿糖胞苷）；达卡巴嗪（DTIC）；更生霉素（放线菌素-D，更生霉素）；道诺霉素（柔红霉素）；多西他赛（泰索帝）；多柔比星（阿霉素）；表柔比星；雌氮芥（emcyt）；雌激素，例如己烯雌酚（DES）；依托泊苷（VP-16，VePesid，凡毕复）；氟达拉滨（福达华）；氟他米特（氟他胺）；5-FUDR（氟尿苷）；5-氟尿嘧啶（5-FU）；吉西他滨（健择）；戈舍瑞林（zodalex）；赫赛汀（曲妥珠单抗）；羟基尿素（羟基脲）；依达比星（伊达比星）；异环磷酰胺；IL-2（阿地白介素，阿地白介素）；干扰素α（甘乐能，罗扰素）；依立替康（camptosar）；亮丙瑞林（乙酸亮丙瑞林）；左旋咪唑（左旋咪唑片）；罗莫司汀（CCNU）；mechlorathamine（氮芥，氮芥）；美法仑（爱克兰）；巯嘌呤（巯基嘌呤，6-MP）；氨甲蝶呤（氨甲蝶呤钠）；丝裂霉素-C（mutamucin）；米托蒽醌（诺消灵）；奥曲肽（善得定）；喷司他丁（2-脱氧助间型霉素，喷司他丁）；普利霉素（光辉霉素，普卡霉素）；丙卡巴肼（甲苯肼）；链佐星；三苯氧胺（诺瓦得士）；泰素（紫杉醇）；替尼泊苷（威猛；VM-26）；噻替派；托泊替康（和美新）；维甲酸（vesanoid，全反式维甲酸）；长春碱（valban）；长春新碱（安可平）和长春瑞滨（诺维本）。适当地，进一步的化学治疗剂选自紫杉烷类例如泰素、紫杉醇或多西他赛。
类似地，本发明进一步涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述治疗进一步包含施用选自下述的进一步的化学治疗剂：肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松，氟美松或地塞米松；六甲蜜胺（六甲蜜胺、六甲三聚氰胺（HMM））；氨磷汀（阿密磷定）；氨格鲁米特（氨鲁米特）；安吖啶（M-AMSA）；阿那曲唑（瑞宁得）；雄激素，例如睾酮；天冬酰胺酶（优适宝）；卡介苗；比卡鲁胺（康士得）；争光霉素（博来霉素）；白消安（马利兰）；卡铂（伯尔定）；卡莫司汀（BCNU，BiCNU）；苯丁酸氮芥（瘤可宁）；2-氯脱氧腺苷（2-CDA，克拉屈滨，克拉立平）；顺铂（顺氯氨铂）；胞嘧啶阿糖核苷（阿糖胞苷）；达卡巴嗪（DTIC）；更生霉素（放线菌素-D，更生霉素）；道诺霉素（柔红霉素）；多西他赛（泰索帝）；多柔比星（阿霉素）；表柔比星；雌氮芥（emcyt）；雌激素，例如己烯雌酚（DES）；依托泊苷（VP-16，VePesid，凡毕复）；氟达拉滨（福达华）；氟他米特（氟他胺）；5-FUDR（氟尿苷）；5-氟尿嘧啶（5-FU）；吉西他滨（健择）；戈舍瑞林（zodalex）；赫赛汀（曲妥珠单抗）；羟基尿素（羟基脲）；依达比星（伊达比星）；异环磷酰胺；IL-2（阿地白介素，阿地白介素）；干扰素α（甘乐能，罗扰素）；依立替康（camptosar）；亮丙瑞林（乙酸亮丙瑞林）；左旋咪唑（左旋咪唑片）；罗莫司汀（CCNU）；mechlorathamine（氮芥，氮芥）；美法仑（爱克兰）；巯嘌呤（巯基嘌呤，6-MP）；氨甲蝶呤（氨甲蝶呤钠）；丝裂霉素-C（mutamucin）；米托蒽醌（诺消灵）；奥曲肽（善得定）；喷司他丁（2-脱氧助间型霉素，喷司他丁）；普利霉素（光辉霉素，普卡霉素）；丙卡巴肼（甲苯肼）；链佐星；三苯氧胺（诺瓦得士）；泰素（紫杉醇）；替尼泊苷（威猛；VM-26）；噻替派；托泊替康（和美新）；维甲酸（vesanoid，全反式维甲酸）；长春碱（valban）；长春新碱（安可平）和长春瑞滨（诺维本）。适当地，所述治疗进一步包含选自紫杉烷类例如泰素、紫杉醇或多西他赛的进一步的化学治疗剂的施用。
备选说明的，本发明进一步涉及用于治疗癌症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的寡核苷酸或其缀合物，或根据本发明的药物组合物，且进一步包括施用进一步的化学治疗剂。所述进一步的施用可以是这样的，使得进一步的化学治疗剂与本发明的化合物缀合，存在于药物组合物中，或在分开制剂中施用。
感染性疾病
考虑本发明的化合物可广泛地应用于广泛范围的感染性疾病，例如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感嗜血杆菌、麻疹、腮腺炎和风疹。
Hsa-miR122在丙型肝炎感染中指示，并且像这样靶向miR-122的根据本发明的寡核苷酸可以用于治疗丙型肝炎感染。
因此，在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物用于制备用于治疗感染性疾病的药物的用途，以及用于治疗感染性疾病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或其缀合物，或根据本发明的药物组合物。
炎性疾病
炎症应答是生物针对感染原攻击的基本防御机制，并且它也牵涉许多急性或慢性疾病包括自身免疫病症的发病机理。尽管是对抗病原体所需的，但炎症性爆发的效应可以是破坏性的。因此通常必须使用抗炎药来限制炎症的症状学。炎症是通常由组织损害触发的复杂过程，其包括大批酶的激活，血管通透性和血流体外渗的增加，细胞迁移和化学介质的释放，全都指向破坏和修复损害组织。
在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物用于制备用于治疗炎性疾病的药物的用途，以及用于治疗炎性疾病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或其缀合物，或根据本发明的药物组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，炎性疾病是风湿病和/或结缔组织疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮（SLE）或狼疮、硬皮病、多肌炎、炎性肠病、皮肌炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、脉管炎、牛皮癣关节炎、银屑病性剥脱性皮炎、寻常天疱疮和干燥综合征，特别是炎性肠病和克罗恩氏病。
备选地，炎性疾病可以是非风湿性炎症，如滑囊炎、滑膜炎、囊炎、腱炎和/或创伤性和/或运动性起源的其他炎性病损。
代谢疾病
代谢疾病是由体内天然产生的化学物质的积聚引起的病症。这些疾病通常是严重的，某些甚至是威胁生命的。其他可以减慢身体发育或引起智力低下。具有这些病症的大多数婴儿起初不显示明显的病征。出生时的正确筛选通常可以发现这些问题。使用早期诊断和治疗，代谢疾病通常可以进行有效处理。
在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物用于制备用于治疗代谢疾病的药物的用途，以及用于治疗代谢疾病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或其缀合物，或根据本发明的药物组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，代谢疾病选自淀粉样变性病、生物素酰胺酶、OMIM（在线人类孟德尔遗传）、克-纳二氏综合征、糖尿病、FabrySupport&InformationGroup、脂肪酸氧化障碍、半乳糖血症、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）缺乏症、戊二酸尿症、戊二酸血症的国际组织、戊二酸血症I型、戊二酸血症II型、戊二酸血症I型、戊二酸血症II型、F-HYPDRR－家族性低磷酸盐血症、抗维生素D佝偻病、克拉伯病、长链3羟酰CoA脱氢酶缺乏症（LCHAD）、甘露糖苷病群、枫糖尿病、线粒体病症、粘多糖病综合征：尼曼皮克病、有机酸血症、PKU、庞贝氏病、卟啉症、代谢综合征、高脂血症和遗传性脂代谢紊乱、三甲基胺尿症：臭鱼症和尿素循环病症。
肝病
在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物用于制备用于治疗肝病的药物的用途，以及用于治疗肝病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或其缀合物，或根据本发明的药物组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，肝病选自胆道闭锁、Alagille综合征、α-1抗胰蛋白酶、酪氨酸血症、新生儿肝炎和威尔逊氏病。
其他用途
本发明的寡核苷酸可以作为研究试剂用于诊断、治疗和预防。在研究中，寡核苷酸可以用于特异性抑制细胞和实验动物中的靶基因的合成，从而促进靶的功能分析或其作为用于治疗干预的靶的有效性的评估。在诊断中，寡核苷酸可以通过RNA印迹、原位杂交或类似技术用于检测和定量细胞和组织中的靶表达。对于治疗，怀疑具有可以通过调节靶的表达进行治疗的疾病或病症的动物或人通过施用依照本发明的寡核苷酸化合物进行治疗。进一步提供的是通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的寡核苷酸化合物或组合物，治疗怀疑患有或倾向于患与靶的表达相关的疾病或病状的动物特别是小鼠和大鼠和治疗人的方法。
靶向miR-122a的寡核苷酸的治疗用途
在实施例部分，证实靶向miR-122a的LNA-抗miRTM例如SPC3372减少血浆胆固醇水平。因此，本发明的另一个方面是上文描述的靶向miR-122a的寡核苷酸作为药物的用途。
本发明的另外一个方面是上文描述的靶向miR-122a的寡核苷酸用于制备用于治疗增加的血浆胆固醇水平的药物的用途。技术人员应当理解增加的血浆胆固醇水平是不希望有的，因为它增加各种病状例如动脉粥样硬化的危险。
本发明的另外一个方面是上文描述的靶向miR-122a的寡核苷酸用于上调Nrdg3、AldoA、Bckdk或CD320的mRNA水平的用途。
进一步的实施方案：
下述实施方案可以与如本文所描述的本发明的其他实施方案进行 组合：
1.长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，其具有由3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列：acgttt，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换；或其缀合物。
2.长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，其具有由3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列：ctcaca，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换；或其缀合物。
3.长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，其具有由3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列：ttacga，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换；或其缀合物。
4.长度为12－26个核苷酸的寡核苷酸，其具有由3’末端计数第2－7位或第3－8位的核心DNA序列：acaagc；其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换；或其缀合物。
5.根据实施方案1－4中任一项的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位的至少2个，例如2个或3个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。
6.根据实施方案5的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位的连续DNA单元的数目为至多2个。
7.根据实施方案6的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位的每第2个核苷酸是LNA单元。
8.根据实施方案6的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位的每第3个核苷酸是LNA单元。
9.根据实施方案6的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位的核苷酸的置换方式选自：xxXxxX、xxXxXx、xXxxXx、xXxXxx、XxxXxx、xXxXxX、XxXxXx、XxxXxX和XxXxxX；其中“X”指LNA单元，和“x”指DNA单元。
10.根据实施方案9的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－6位、第2－7位或第3－8位的核苷酸的置换方式选自xxXxxX、xXxxXx、XxxXxx、xXxXxX和XxXxXx；其中“X”指LNA单元，和“x”指DNA单元。
11.根据实施方案1的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的DNA序列：acgttta，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
12.根据实施方案2的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的DNA序列：ctcacac，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
13.根据实施方案3的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的DNA序列：ttacgat，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
14.根据实施方案4的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的DNA序列：acaagca，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
15.根据实施方案11－14中任一项的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的至少2个，例如2个、3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。
16.根据实施方案15的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的连续DNA单元的数目为至多2个。
17.根据实施方案16的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的每第2个核苷酸是LNA单元。
18.根据实施方案16的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的每第3个核苷酸是LNA单元。
19.根据实施方案16的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的核苷酸的置换方式选自xxXxxXx、xxXxXxx、xXxxXxx、xxXxXxX、xXxxXxX、xXxXxxX、xXxXxXx、XxxXxxX、XxxXxXx、XxXxxXx、XxXxXxx和XxXxXxX；其中“X”指LNA单元，和“x”指DNA单元。
20.根据实施方案19的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－7位、第2－8位或第3－9位的核苷酸的置换方式选自xxXxxXx、xXxxXxx、XxxXxxX、xXxXxXx、XxXxXxX和XxXxXxx；其中“X”指LNA单元，和“x”指DNA单元。
21.根据实施方案11的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的DNA序列：acgtttag，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
22.根据实施方案12的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的DNA序列：ctcacact，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
23.根据实施方案13的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的DNA序列：ttacgatt，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
24.根据实施方案14的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的DNA序列：acaagcaa，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
25.根据实施方案21－24中任一项的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的至少2个，例如2个、3个或4个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。
26.根据实施方案25的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的连续DNA单元的数目为至多2个。
27.根据实施方案26的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的每第2个核苷酸是LNA单元。
28.根据实施方案26的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的每第3个核苷酸是LNA单元。
29.根据实施方案26的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的核苷酸的置换方式选自xxXxxXxx、xxXxxXxX、xxXxXxxX、xxXxXxXx、xXxxXxxX、xXxxXxXx、xXxXxxXx、xXxXxXxx、XxxXxxXx、XxxXxXxx、XxXxxXxx、xXxXxXxX、XxXxXxxX、XxXxxXxX、XxxXxXxX和XxXxXxXx；其中“X”指LNA单元，和“x”指DNA单元。
30.根据实施方案29的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－8位、第2－9位或第3－10位的核苷酸的置换方式选自xxXxxXxx、xXxxXxxX、XxxXxxXx、xXxXxXxX、XxXxXxXx和XxXxXxxX；其中“X”指LNA单元，和“x”指DNA单元。
31.根据实施方案21的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的DNA序列：acgtttagg，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
32.根据实施方案22的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的DNA序列：ctcacactg，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
33.根据实施方案23的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的DNA序列：ttacgatta，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
34.根据实施方案24的寡核苷酸或其缀合物，其具有由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的DNA序列：acaagcaag，其中所述序列中的至少一个，例如1个，优选至少2个，例如2个，更优选至少3个，例如3个，更加优选至少4个，例如4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换。
35.根据实施方案21－24中任一项的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的至少2个，例如2个、3个、4个或5个DNA单元已由其相应的LNA单元置换，和其中LNA单元由至少一个DNA单元分隔开。
36.根据实施方案35的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的连续DNA单元的数目为至多2个。
37.根据实施方案36的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的每第2个核苷酸是LNA单元。
38.根据实施方案36的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的每第3个核苷酸是LNA单元。
39.根据实施方案36的寡核苷酸或其缀合物，其中由3’末端计数第1－9位、第2－10位或第3－11位的核苷酸的置换方式选自xxXxxXxxX、xxXxxXxXx、xxXxXxxXx、xxXxXxXxx、xXxxXxxXx、xXxxXxXxx、xXxXxxXxx、XxxXxxXxx、xxXxXxXxX、xXxxXxXxX、xXxXxxXxX、xXxXxXxxX、XxxXxxXxX、XxxXxXxxX、XxXxxXxxX、XxxXxXxXx、XxXxxXxXx、XxXxXxxXx、XxXxXxXxx和XxXxXxXxX；其中“X”指LNA单元，和“x”指DNA单元。
40.根据任何前述实施方案的寡核苷酸或其缀合物，其中所述核苷酸具有12－24个核苷酸的长度，例如12－22个核苷酸的长度，优选12－20个核苷酸的长度，例如12－19个核苷酸的长度，更优选12－18个核苷酸的长度，例如12－17个核苷酸的长度，更加优选12－16个核苷酸的长度。
41.根据实施方案1的寡核苷酸，其具有选自tgMeCatGgaTttGcaMeCa、tgMeCatGgaTttGcaMeC、MeCatGgaTttGcaMeC、tGcAtGgAtTtGcAc、cAtGgAtTtGcAc、MeCatGGatTtGcAMeC、TgMeCatGGatTtGcAMeC和TgMeCaTgGaTTtGcACa的序列；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；或其缀合物。（SEQIDNO82－89）
42.根据实施方案2的寡核苷酸，其具有选自cMeCatTgtCacActMeCca、cMeCatTgtAacTctMeCca、ccAttGtcAcaMeCtcMeCa、cMeCatTgtMeCacActMeCc、atTgtMeCacActMeCc、ccAttGtcAcaMeCtcMeC、AttGtcAcaMeCtcMeC、aTtGtMeCaCaMeCtMeCc、AttGTcaMeCaMeCtMeCMeC、MeCcAttGTcaMeCaMeCtMeCMeC、MeCcaTtgTcacActcMeCa和MeCMeCAttgtcacacTMeCMeCa的序列；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；或其缀合物。（SEQIDNO90－101）
43.根据实施方案3的寡核苷酸，其具有选自tMeCacGatTagMeCatTaa、aTcaMeCgaTtaGcaTta、TcAcGaTtAgMeCaTtAa、AtcAcGaTtAgMeCaTta的序列；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；或其缀合物。（SEQIDNO102－105）。
44.根据实施方案4的寡核苷酸，其具有选自gAgcMeCgaAcgAacAa、gcMeCgaAcgAacAa、GaGcMeCgAaMeCgAaMeCaA和GcMeCgAaMeCgAaMeCaA的序列；其中小写字母标示DNA单元的含氮碱基，和大写字母标示LNA单元的含氮碱基；或其缀合物。（SEQIDNO106－109）。
45.根据任何前述实施方案的寡核苷酸或其缀合物，其中寡核苷酸包含至少一个不同于磷酸二酯的核苷间连接基团。
46.根据实施方案45的寡核苷酸或其缀合物，其中所述不同于磷酸二酯的核苷间连接基团是硫代磷酸酯。
47.根据实施方案46的寡核苷酸或其缀合物，其中所有核苷间连接基团都是硫代磷酸酯。
48.根据任何前述实施方案的寡核苷酸或其缀合物，其中所述LNA单元独立地选自硫代-LNA单元、氨基-LNA单元和氧-LNA单元。
49.根据实施方案48的寡核苷酸或其缀合物，其中所述LNA单元是β-D-型。
50.根据实施方案48的寡核苷酸或其缀合物，其中所述LNA单元是β-D-型的氧-LNA单元。
51.根据任何前述实施方案的寡核苷酸或其缀合物用作为药物。
52.药物组合物，其包含根据实施方案1－50中任一项的寡核苷酸或其缀合物和药学上可接受的载体。
53.根据实施方案52的组合物，其中所述载体是盐水或缓冲盐水。
54.根据实施方案1－50中任一项的寡核苷酸或其缀合物或根据实施方案52的组合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
55.用于治疗癌症的方法，其包括施用根据实施方案1－50中任一项的寡核苷酸或其缀合物或根据实施方案52的组合物的步骤。
56.根据实施方案1－50中任一项的寡核苷酸或其缀合物或根据实施方案52的组合物用于制备用于治疗增加的血浆胆固醇水平的药物的用途。
57.根据实施方案1－50中任一项的寡核苷酸或其缀合物或根据实施方案52的组合物用于上调Nrdg3、AldoA、Bckdk或CD320的mRNA水平的用途。
实验
实施例1：单体合成
LNA单体构件及其衍生物根据公开的操作和本文引用的参考文献进行制备，参见，例如WO03/095467A1和D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch（2002）PreparationofLNAPhosphoramidites，Synthesis6，802-808.
实施例2：寡核苷酸合成
寡核苷酸使用亚磷酰胺法在Expedite8900/MOSS合成仪（多重寡核苷酸合成系统（MultipleOligonucleotideSynthesisSystem））以1μmol或15μmol规模进行合成。对于更大规模的合成，使用OligoPilot（GEHealthcare）。在合成结束时（带DMT），寡核苷酸在室温下使用氨水1－2小时从固体载体上切下，且在65℃进一步脱保护4小时。寡核苷酸通过反相HPLC（RT-HPLC）进行纯化。在DMT-基团去除后，寡核苷酸通过AE-HPLC、RP-HPLC和CGE进行表征，分子量由ESI-MS进一步证实。关于更多细节参见下文。
LNA-固体载体的制备：
LNA琥珀酰半酯的制备
将5’-O-Dmt-3’-羟基-LNA单体（500mg）、琥珀酸酐（12eq.）和DMAP（1.2eq.）溶解于DCM（35mL）中。使反应在室温下搅拌过夜。用NaH2PO40.1MpH5.5（2x）和盐水（1x）萃取后，有机层用无水Na2SO4进行进一步干燥、过滤且蒸发。半酯衍生物以95％产率获得并且无需任何进一步纯化即可使用。
LNA-载体的制备
将上文制备的半酯衍生物（90μmol）溶解于最小量的DMF中，且加入DIEA和pyBOP（90μmol），并一起混合1分钟。使这种预活化的混合物与LCAA-CPG（80-120筛目，300mg）在手动合成器中组合且搅拌。在室温下1.5小时后，载体被滤掉且用DMF、DCM和MeOH进行洗涤。干燥后，载量测定为57μmol/g（参见TomBrown，DorcasJ.S.Brown.Modernmachine-aidedmethodsofoligodeoxyribonucleotidesynthesis.In：F.Eckstein，editor.OligonucleotidesandAnaloguesAPracticalApproach.Oxford：IRLPress，1991：13-14）。
寡核苷酸的延伸
亚磷酰胺（A（bz），G（ibu），5-甲基-C（bz））或T-β-氰乙基亚磷酰胺）的偶联通过使用溶于乙腈的5’-O-DMT-保护的amidite溶液和溶于乙腈（0.25M）的DCI（4,5-二氰基咪唑）作为活化剂来进行。硫醇化通过使用苍耳烷氯化物（0.01M于乙腈：吡啶10％中）来进行。剩余试剂是一般用于寡核苷酸合成的那些。
经由RP-HPLC的纯化：
柱：XterraRP18
流速：3mL/分钟
缓冲液：0.1M乙酸铵pH8和乙腈
缩写：
DMT：二甲氧三苯甲基
DCI：4,5-二氰基咪唑
DMAP：4-二甲氨基吡啶
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
THF：四氢呋喃
DIEA：N，N-二异丙基乙胺
PyBOP：苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸盐
Bz：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
实施例3：LNA抗-miR寡核苷酸的设计和解链温度
靶微小RNA：
miR-122a：5'-uggagugugacaaugguguuugu-3'SEQIDNO：1
miR-122a3'至5'：3'-uguuugugguaacagugugaggu-5'（SEQIDNO：1反向）
表1LNA抗-miR寡核苷酸序列和T m ：
小写字母：DNA，大写字母：LNA（所有LNAC都是甲基化的），有下划线的：错配
解链温度针对成熟的miR-122a序列进行评估，使用硫代磷酸酯连接的的合成miR-122aRNA寡核苷酸。
LNA抗-miR/miR-122a寡聚体双链体在500μl无RNA酶H20中稀释至3μM，这随后与500μl2x二聚化缓冲液进行混合（最终的寡聚体/双链体浓度1.5μM，2xTm缓冲液：200mMNaCl，0,2mMEDTA，20mMNaP，pH7,0，DEPC处理以去除RNA酶）。混合物首先加热至95℃3分钟，随后允许冷却至室温（RT）30分钟。
RT温育后，Tm使用PETemplab软件（PerkinElmer）在Lambda40UV/VIS分光光度计与peltier温度编程器（progammer）PTP6上进行测量。温度从20℃上升至95℃且随着再次降至20℃，连续记录在260nm处的吸收。解链和退火的一阶导数和局部最大值用于评估解链/退火点（Tm），两者应给出相似/相同Tm值。对于一阶导数，91个点用于计算斜度。
通过置换抗mir寡核苷酸和互补RNA分子，上述测定法可以用于测定其他寡核苷酸例如根据本发明的寡核苷酸的Tm。
然而，在一个实施方案中，Tm可以对互补DNA（硫代磷酸酯键）分子制得。一般地，针对DNA互补分子测量的Tm比关于等同RNA互补物的Tm低约10℃。使用DNA互补物测量的Tm因此可以在其中双链体具有极高Tm的情况下使用。
解链温度（Tm）测量：
寡聚体与miR-122RNA互补物 Tm
SPC3372+miR-122a，RNA 69℃
SPC3648+miR-122a，RNA 74℃
SPC3649+miR-122a，RNA 79℃
寡聚体与DNA互补物 Tm
SPC3372+122R，DNA 57℃
SPC3649+122R，DNA 66℃
应认识到关于具有极高Tm的寡核苷酸，上述Tm测定法可能不足以测定Tm。在此类情况下，硫代磷酸酯DNA互补分子的使用可以进一步降低Tm。
甲酰胺的使用在寡核苷酸杂交分析中是常规的（参见Hutton1977，NAR4（10）3537-3555）。在上文测定法中，15％甲酰胺的包括一般使Tm降低约9℃，和50％甲酰胺的包括一般使Tm降低约30℃。使用这些比，因此可以测定寡核苷酸针对其互补RNA（磷酸二酯）分子的比较Tm，甚至当双链体的Tm例如高于95℃时（在不存在甲酰胺的情况下）。
对于具有极高Tm的寡核苷酸，测定Tm的备选方法是进行滴定且使其在凝胶上运行以察看单链对双链体，并且通过那些浓度和比测定涉及△G的Kd（解离常数）以及Tm。
实施例4：LNA寡核苷酸在人或大鼠血浆中的稳定性
LNA寡核苷酸稳定性在来自人或大鼠的血浆（它还可以是小鼠、猴或狗血清）中进行测试。在45μl血浆中，加入5μlLNA寡核苷酸（以20μM的终浓度）。LNA寡核苷酸在血浆中于37℃温育0－96小时（血浆就核酸酶活性测试高达96小时且在核酸酶切割模式中未显示出差异）。
在指定时间时，样品在液氮中进行速冻。在血浆中的2μL（等于40pmol）LNA寡核苷酸通过添加15μL水和3μL6x载量染料（Invitrogen）进行稀释。使用10bp梯（Invitrogen，USA10821-015）作为标记。向1μl梯中，加入1μl6x载量和4μl水。样品进行混合，加热至65℃10分钟且装载至预运行凝胶（16％丙烯酰胺，7MUREA，1xTBE，在50Watt下预运行1小时），且在50－60Watt下运行2小时。随后，染色用在1xTBE中的1xSyBRGold（分子探针）染色15分钟。条带使用来自BioRad的phosphoimager进行显现。
实施例5：体外模型：细胞培养
LNA寡核苷酸对靶核酸表达（量）的影响可以在各种细胞类型中的任何一种中进行测试，条件是靶核酸以可测量水平存在。靶可以通过编码所述核酸的核酸的瞬时或稳定转染进行内源表达。
靶核酸的表达水平使用例如RNA印迹分析（包括微小RNARNA）、定量PCR（包括微小RNAqPCR）、核糖核酸酶保护测定法进行常规测定。提供下述细胞类型用于举例说明性目的，但其他细胞类型可以常规使用，条件是靶在所选择的细胞类型中表达。
细胞如下所述在合适的培养基中进行培养，且于37℃在95－98％湿度和5％CO2下进行维持。细胞每周常规传代2－3次。
15PC3：人前列腺癌细胞系15PC3由Dr.F.Baas，NeurozintuigenLaboratory，AMC，TheNetherlands友情捐赠，且在DMEM（Sigma）+10％胎牛血清（FBS）+GlutamaxI+庆大霉素中进行培养。
PC3：人前列腺癌细胞系PC3购自ATCC，且在含谷氨酰胺的F12Coon’s（Gibco）+10％FBS+庆大霉素中进行培养。
518A2：人黑素瘤癌细胞系518A2由Dr.B.Jansen，SectionofexperimentalOncology，MolecularPharmacology，DepartmentofClinicalPharmacology，UniversityofVienna友情捐赠，且在DMEM（Sigma）+10％胎牛血清（FBS）+GlutamaxI+庆大霉素中进行培养。
HeLa：宫颈癌细胞系HeLa在包含10％胎牛血清庆大霉素的MEM（Sigma）中在37℃、95％湿度和5％CO2下进行培养。
MPC-11：鼠类多发性骨髓瘤细胞系MPC-11购自ATCC，且在含4mMGlutamax+10％马血清的DMEM中进行维持。
DU-145：人前列腺癌细胞系DU-145购自ATCC，且在含Glutamax+10％FBS的RPMI中进行维持。
RCC-4+/-VHL：用表达VHL的质粒或空质粒稳定转染的人肾癌细胞系RCC4购自ECACC，且根据制造商说明书进行维持。
786-0：人肾细胞癌细胞系786-0购自ATCC，且根据制造商说明书进行维持。
HUVEC：人脐静脉内皮细胞系HUVEC购自Camcrex，且在EGM-2培养基中进行维持。
K562：人慢性髓细胞性白血病细胞系K562购自ECACC，且在含Glutamax+10％FBS的RPMI中进行维持。U87MG：人成胶质细胞瘤细胞系U87MG购自ATCC，且根据制造商说明书进行维持。
B16：鼠类黑素瘤细胞系B16购自ATCC，且根据制造商说明书进行维持。
LNCap：人前列腺癌细胞系LNCap购自ATCC，且在含Glutamax+10％FBS的RPMI中进行维持。
Huh-7：人肝、上皮样在含10％FBS、2mMGlutamaxI、1x非必需氨基酸、庆大霉素25μg/ml的EaglesMEM中进行培养。
L428：（DeutscheSammlungfürMikroorganismen（DSM，Braunschwieg，Germany））：人B细胞淋巴瘤在补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640中进行维持。
L1236：（DeutscheSammlungfürMikroorganismen（DSM，Braunschwieg，Germany））：人B细胞淋巴瘤在补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640中进行维持。
实施例6：体外模型：用LNA抗-miR反义寡核苷酸处理
表达miR-122a的细胞系Huh-7根据优化的lipofectamine2000（LF2000，Invitrogen）方案（如下）用LNA抗-miR以1和100nM浓度进行转染。
Huh-7细胞在含10％FBS、2mMGlutamaxI、1x非必需氨基酸、庆大霉素25μg/ml的EaglesMEM中进行培养。细胞在转染前一天以2.5ml的总体积在6孔平板中进行种植（300000细胞/孔）。在转染当天，制备在Optimem（Invitrogen）中稀释的包含LF2000的溶液（1.2mloptimem+3.75μlLF2000/孔，最终2.5μgLF2000/ml，最终总体积1.5ml）。
LNA寡核苷酸（LNA抗-miR）也在optimem中进行稀释。285μloptimem+15μlLNA寡核苷酸（关于终浓度100nM的10μM寡核苷酸原液和关于终浓度1nM的0.1μM寡核苷酸原液）。细胞在optimem中洗涤1次，然后将1.2mloptimem/LF2000混合物加入每个孔中。细胞在室温下在LF2000混合物中温育7分钟，其中在300μl寡核苷酸optimem溶液加入后。
细胞与寡核苷酸和lipofectamine2000一起进一步温育4小时（在37℃，5％CO2下在常规细胞培养箱中）。这4小时后，去除培养基/混合物且加入常规完全培养基。允许细胞生长另外20小时。细胞在转染后24小时收获在Trizol（Invitrogen）中。RNA根据标准Trizol方案根据制造商的说明书（Invitrogen）进行提取，特别是在总RNA提取中保留微小RNA。
实施例7：体外和体内模型：经由微小RNA特异性定量PCR分析寡核苷酸对miR表达的抑制
RNA样品中的miR-122a水平在ABI7500Fast实时PCR仪器（AppliedBiosystems，USA）上进行评估，使用miR-122a特异性qRT-PCR试剂盒、mirVana（Ambion，USA）和miR-122a引物（Ambion，USA）。操作根据制造商方案来进行。
结果：
与100nM的先前设计模型包括“每第3个”和“gap-mer”（SPC3370，SPC3372，SPC3375）基序比较，miR-122a特异性新LNA抗-miR寡核苷酸设计（即SPC3349（也称为SPC3549））在1nM时在抑制miR-122a中更有效。未发现错配对照抑制miR-122a（SPC3350）。结果显示于图1中。
实施例8：使用miRNA微阵列表达分析评估LNAantago-mirknock-down特异性。
A）用于miRNA微阵列分析的RNA标记
总RNA使用Trizol试剂（Invitrogen）进行提取，和3'末端使用T4RNA连接酶和Cy3-或Cy5-标记的RNA接头（5-PO4-rUrUrU-Cy3/dT-3或5-PO4-rUrUrU-Cy5/dT-3）进行标记。标记反应包含2－5μg总RNA、15μMRNA接头、50mMTris-HCl（pH7.8）、10mMMgCl2、10mMDTT、1mMATP、16％聚乙二醇和5单位T4RNA连接酶（Ambion，USA），且于30℃温育2小时，随后为T4RNA连接酶于80℃5分钟的热灭活。
B）微阵列杂交和杂交后洗涤
包含在miRBase微小RNA数据库版本7.1中所有的来自小鼠（小家鼠(Musmusculus））和人（智人(Homosapiens)）的注释miRNA的探针的LNA修饰的寡核苷酸捕获探针（包括一组阳性和阳性对照探针）购自Exiqon（Exiqon，Denmark），且用于印制微阵列用于miRNA分析。捕获探针包含5'末端C6-氨基修饰的接头，且通过调整LNA含量和捕获探针的长度设计为具有针对互补靶miRNA72℃的Tm。捕获探针在150mM磷酸钠缓冲液（pH8.5）中稀释至10μM的终浓度，且使用来自BioRobotics的MicroGridII阵列器（arrayer）在45％湿度和室温下一式四份地印迹到Codelink载玻片（AmershamBiosciences）上。印迹的载玻片如由制造商推荐的进行后处理。
标记的RNA在包含4xSSC、0.1％SDS、1μg/μlHerringSpermDNA和38％甲酰胺的杂交混合物中于65℃与LNA微阵列杂交过夜。杂交载玻片在2xSSC、0.025％SDS中于65℃洗涤3次，随后在0.08xSSC中洗涤3次，和最后在0.4xSSC中在室温下洗涤3次。
C）阵列扫描、图像分析和数据处理
微阵列使用ArrayWorx扫描仪（AppliedPrecision，USA）根据制造商的建议进行扫描。将扫描的图像输入到TIGRSpotfinder版本3.1（Saeed等人，2003）内用于提取平均斑点强度和中间局部本底强度，排除具有在中间局部本底+4x标准差下的强度的斑点。本底相关的强度使用变异稳定标准化包版本1.8.0（Huber等人，2002）就R（www.r-project.org）进行标准化。重复斑点的强度使用MicrosoftExcel求平均值。显示>100％的变异系数的探针从进一步的数据分析中排除。
实施例9：经由原位杂交检测微小RNA，经由原位杂交检测在福尔 马林固定石蜡包埋的组织切片中的微小RNA
A）用于原位杂交的福尔马林固定、石蜡包埋的切片的制备
重新找到记录的石蜡包埋的样品且以5－10mm切片进行切片，并且使用浮选技术固定在带正电的载玻片中。载玻片贮存于4℃直至进行原位实验。
B）原位杂交
载玻片上的切片在二甲苯中进行脱石蜡化，然后通过乙醇稀释系列（从100％－25％）进行再水化。将载玻片浸入DEPC处理的水中且实施HCl和0.2％甘氨酸处理，在4％多聚甲醛中进行再固定，且用乙酸酐/三乙醇胺进行处理；载玻片在2次处理之间以1XPBS的几次洗涤进行漂洗。载玻片于50℃在hyb溶液(50％甲酰胺、5XSSC、500mg/mL酵母tRNA、1XDenhardt）中进行预杂交30分钟。随后，将与每种选择的miRNA互补的3pmolFITC-标记的LNA探针（Exiqon，Denmark）加入hyb溶液中，且在比探针预期的Tm低20－25℃的温度下（一般为45－55℃取决于miRNA序列）杂交1小时。于65℃在0.1X和0.5XSCC中洗涤后，根据厂商的建议使用GenpointFluorescein（FITC）试剂盒（DakoCytomation，Denmark）进行酪胺信号扩增反应。最后，载玻片用ProlongGold溶液进行固定。在使用落射荧光显微镜证明所选择的miRNA的表达前允许荧光反应显色16－24小时。
经由斑马鱼、爪蟾属和小鼠胚胎的全包埋原位杂交检测微小RNA
所有洗涤和温育步骤在2mleppendorf管中进行。胚胎于4℃在溶于PBS的4％多聚甲醛中固定过夜，且随后通过等级系列（溶于PBST（包含0.1％Tween-20的PBS）的25％MeOH、溶于PBST的50％MeOH、溶于PBST的75％MeOH）转移至100％甲醇且贮存于-20℃长达数月。在原位杂交的第一天时，胚胎通过在溶于PBST的75％MeOH、溶于PBST的50％MeOH、溶于PBST的25％MeOH和100％PBST（4x5分钟）中顺次温育5分钟进行再水化。
鱼、小鼠和爪蟾属胚胎用蛋白酶K（溶于PBST的10g/ml）于37℃处理45分钟，在溶于PBS的4％多聚甲醛中再固定20分钟，且用PBST洗涤3x5分钟。在水中短暂洗涤后，内源性碱性磷酸酶活性通过使胚胎在0.1M三乙醇胺和2.5％乙酸酐中温育10分钟进行封闭，随后为在水中的短暂洗涤和在PBST中的5x5分钟洗涤。随后将胚胎转移至杂交缓冲液（50％甲酰胺、5xSSC、0.1％Tween、9.2mM柠檬酸、50ug/ml肝素、500ug/ml酵母RNA）中在杂交温度下2－3小时。杂交在包含与每种选择的miRNA互补的10nM3’DIG-标记的LNA探针（RocheDiagnostics）的新鲜预热的杂交缓冲液中进行。杂交后洗涤在杂交温度下通过在HM-（不含肝素和酵母RNA的杂交缓冲液）、75％HM-/25％2xSSCT（包含0.1％Tween-20的SSC）、50％HM-/50％2xSSCT、25％HM-/75％2xSSCT、100％2xSSCT中顺次温育15分钟，和在0.2xSSCT中温育2x30分钟来进行。
然后，通过在75％0.2xSSCT/25％PBST、50％0.2xSSCT/50％PBST、25％0.2xSSCT/75％PBST和100％PBST中顺次温育10分钟将胚胎转移至PBST。在封闭缓冲液（溶于PBST的2％绵羊血清/2mg：mlBSA）中封闭1小时后，胚胎在包含anti-DIG-APFAB片段（Roche，1/2000）的封闭缓冲液中于4℃温育过夜。第二天，斑马鱼胚胎在PBST中洗涤6x15分钟，小鼠和热带爪蟾（X.tropicalis）胚胎在包含2mM左旋咪唑的TBST中洗涤6x1小时，随后于4℃2天，伴随洗涤缓冲液的常规更新。
抗体后的洗涤之后，胚胎在染色缓冲液（100mMtrisHClpH9.5、50mMMgCl2、100mMNaCl、0.1％tween20）中洗涤3x5分钟。染色在补充有4.5l/mlNBT（Roche，50mg/ml原液）和3.5l/mlBCIP（Roche，50mg/ml原液）的缓冲液中完成。反应用溶于PBST的1mMEDTA进行终止，且将胚胎贮存于4℃。在成像前，胚胎经由增加的甲醇系列（溶于PBST的25％MeOH、溶于PBST的50％MeOH、溶于PBST的75％MeOH、100％MeOH）在Murray’s溶液（2：1苯甲酸苄酯：苯甲醇）中进行封固。
实施例10：体外模型：分离和分析mRNA表达（用于mRNA分析的总RNA分离和cDNA合成）
总RNA使用RNeasyminikit（Qiagen）或使用Trizol试剂（Invitrogen）进行分离。对于使用RNeasyminikit（Qiagen）的总RNA分离，细胞用PBS进行洗涤，且向孔中直接加入补充有1％巯基乙醇的CellLysisBuffer（RTL，Qiagen）。数分钟后，样品根据制造商的说明书进行加工。
对于mRNA表达的体内分析，组织样品使用Retsch300MM匀浆器进行第一次均质化，并且总RNA如由制造商所描述的使用Trizol试剂或RNeasymini试剂盒进行分离。
第一链合成（来自mRNA的cDNA）根据制造商的说明书（Qiagen）使用OmniScriptReverseTranscriptase试剂盒或M-MLV逆转录酶（基本上如制造商（Ambion）所描述的）来进行。当使用OmniScript逆转录酶时，0.5μg总RNA每种样品调整至12μl，且与0.2μl聚（dT）12-18（0.5μg/μl）（LifeTechnologies）、2μldNTP混合物（各5mM）、2μl10xRT缓冲液、0.5μlRNAguardTMRNA酶抑制剂（33单位/ml，Amersham）和1μlOmniScript逆转录酶混合，随后于37℃温育60分钟，且于93℃热灭活5分钟。
当第一链合成使用随机十倍体和M-MLV-逆转录酶（基本上如制造商（Ambion）所描述的）来进行时，每种样品的0.25μg总RNA在H2O中调整至10.8μl。加入2μl十倍体和2μldNTP混合物（各2.5mM）。将样品加热至70℃3分钟，且立即在冰水中冷却，且加入3.25μl包含（2μl10xRT缓冲液；1μlM-MLV逆转录酶；0.25μlRNA酶抑制剂）的混合物。cDNA于42℃合成60分钟，随后为于95℃10分钟的热灭活步骤，且最后冷却至4℃。cDNA可以通过例如实时定量PCR进一步用于mRNA定量。
mRNA表达可以以本领域已知的各种方法进行测定。例如，mRNA水平可以通过例如RNA印迹分析、竞争聚合酶链式反应（PCR）、核糖核酸酶保护测定法（RPA）或实时PCR进行定量。实时定量PCR是目前优选的。RNA分析可以对总细胞RNA或mRNA来进行。
RNA分离和RNA分析的方法例如RNA印迹分析是本领域常规的，且在例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons中教导。
实施定量（PCR）可以使用可从BioRAD获得的商购可得的iQMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystem便利地完成。实时定量PCR是本领域众所周知的技术，且在例如Heid等人RealtimequantitativePCR，GenomeResearch（1996），6：986-994中教导。
实施例11：LNA寡核苷酸的体内摄取和功效
体内研究：6组动物（5只小鼠/组）以下述方式进行处理。组1动物通过i.v.用0.2ml盐水注射连续3天，组2接受2.5mg/kgSPC3372，组3接受6.25mg/kg，组4接受12.5mg/kg和组5接受25mg/kg，而组6接受25mg/kgSPC3373（错配LNA-抗miRTM寡核苷酸），全都以相同方式。所有剂量由每个动物的第0天体重进行计算。
在给药前（第0天）和最后1次剂量后24小时（第3天），将眶后血液收获在包含EDTA的管中，并且收获血浆部分且冷冻贮存于-80℃用于胆固醇分析。在处死时，解剖肝，并且将一部分切成5mm立方体且浸入5体积冰冷的RNAlater中。第二部分在液氮中进行速冻且贮存用于冷冻切片。
如上所述从肝样品中提取总RNA，且通过微小RNA特异性QPCR就miR-122a水平进行分析。图5证实用SPC3372获得的明确的剂量应答，其中IC50在约3－5mg/kg，而使用miR-122a的错配LNAantago-mirSPC3373未检测到miR-122a抑制。
实施例12：在C57/BL/J雌性小鼠中在体内的LNA-抗miR-122a剂量应答
体内研究：10组动物（雌性C57/BL6；3只小鼠/组）以下述方式进行处理。组1动物在第0天、第2天和第4天时通过i.p.用0.2ml盐水进行注射。组2－10通过i.p.用3种不同浓度（25mg/kg、5mg/kg和1mg/kg）的LNA抗miR-122a/SPC3372（组2－4），LNA抗mir-122a/SPC3548（组5－7）或LNA抗mir-122a/SPC3549（组8－10）进行给药；LNA抗mir-122a序列在表1中给出。所有3种LNA抗miR-122a寡核苷酸都靶向肝特异性miR-122a。剂量由每个动物的第0天体重进行计算。
动物在最后1次剂量后48小时（第6天）处死，将眶后血液收获在包含EDTA的管中，并且收获血浆部分且冷冻贮存于-80℃用于胆固醇分析。在处死时，解剖肝，并且将一部分切成5mm立方体且浸入5体积冰冷的RNAlater中。第二部分在液氮中进行速冻且贮存用于冷冻切片。
总RNA根据制造商的建议（Invitrogen，USA）使用Trizol试剂从肝样品中进行提取，且根据制造商的建议（Ambion，USA）通过微小RNA特异性QPCR就miR-122a水平进行分析。图2证实用所有3种LNA抗mir-122a分子（SPC3372、SPC3548、SPC3549）获得的明确的剂量应答。与SPC3372比较，SPC3548和SPC3549在体内显示出在miR-122a沉默方面显著改善的功效（如由减少的miR-122a水平可见的），其中SPC3549是最有效的（IC50约1mg/kg）。
上述实施例使用SPC3372和SPC3649使用5只小鼠/组进行重复，并且组合的数据（每组总共8只小鼠）显示于图2b中。
实施例12a：RNA印迹。
在LNA-抗miR处理的小鼠肝中，与SPC3372比较，微小RNA特异性RNA印迹显示出SPC3649所致的增强的miR-122阻断。
在这个实施例中使用的寡聚体：
SPC3649：5'-CcAttGTcaCaCtCC-3'（SEQID59）新设计
SPC3372：5'-CcAttGtcAcaCtcCa-3'（SEQID57）旧设计
决定评估SPC3649对SPC3649处理小鼠的肝中的miR-122miRNA水平的影响。LNA-抗miRSPC3649和SPC3372通过3次i.p.注射经过6天时期每隔一日以指示剂量施用于小鼠，随后在最后1次剂量后48小时处死动物。总RNA从小鼠肝中取出。miR-122水平通过微小RNA特异性RNA印迹进行评估（图6）。
正常小鼠用SPC3649处理导致显著改善的、剂量依赖性miR-122减少。进行使SPC3649与SPC3372比较的微小RNA特异性RNA印迹（图6）。如由成熟的单链miR-122的不存在以及仅存在LNA-抗miR和miR-122之间的双链体条带可见的，SPC3649在5和25mg/kg时完全阻断miR-122。比较在RNA印迹上的双链体相对于成熟条带，SPC3649看起来在1mg/kg时与SPC3372在25mg/kg时一样有效。
实施例13：在LNA抗-miR122处理的小鼠血浆中的胆固醇水平的评估
总胆固醇水平使用来自ABXPentra的比色测定法CholesterolCP在血浆中进行测量。胆固醇在酶促水解和氧化（2,3）后进行测量。将21.5μl水加入1.5μl血浆中。加入250μl试剂且在5分钟内胆固醇含量在540nM波长处进行测量。对每个动物的测量一式两份地进行。敏感性和线性用2倍稀释的对照化合物（ABXPentraN对照）进行测试。胆固醇水平通过扣除本底进行测定，且相对于盐水处理小鼠的血浆中的胆固醇水平呈现。
图3证实在第6天时与盐水对照比较，在接受SPC3548和SPC3549的小鼠中明显降低的血浆胆固醇水平。
实施例14：在LNA抗miR-122a处理的小鼠中miR-122a靶mRNA水平的评估
盐水对照和不同LNA-抗miR-122a处理的动物在最后1次剂量后48小时（第6天）处死，并且总RNA根据制造商的建议（Invitrogen，USA）使用Trizol试剂从肝样品中提取。mRNA水平通过实时定量RT-PCR分别就2种miR-122a靶基因－Bckdk（支链酮酸脱氢酶激酶，ENSMUSG00000030802）和醛缩酶A（aldoA，ENSMUSG00000030695）以及对于作为对照的GAPDH进行评估，根据制造商的说明书（Appliedbiosystems，USA）使用Taqman测定法。图4a和4b证实作为对使用所有3种LNA抗miR-122a分子（SPC3372、SPC3548、SPC3549）处理的应答，2种miR-122a靶基因Bckdk和AldoA分别明确的剂量依赖性上调。相比之下，与盐水对照动物比较，对于GAPDH对照的qPCR测定法未揭示LNA-抗miR-122a处理小鼠中的GAPDmRNA水平的任何差异（图4c）。与SPC3372处理的小鼠比较，Bckdk和AldoAmRNA水平在SPC3548和SPC3549处理的小鼠中明显更高（图4a和4b），从而证实其改善的体内功效。
实施例15：LNA寡核苷酸在体内的作用持续时间。
体内研究：2组动物（21只小鼠/组）以下述方式进行处理。组1动物通过i.v.用0.2ml盐水注射连续3天，组2以相同方式接受25mg/kgSPC3372。所有剂量由每个动物的第0天体重进行计算。
最后1次剂量（第3天）后，来自每组的7个动物分别在第9天、第16天和第23天时处死。在这之前，在每天时，将眶后血液收获在包含EDTA的管中，并且收获来自每天的血浆部分且冷冻贮存于-80℃用于胆固醇分析。在处死时，解剖肝，并且将一部分切成5mm立方体且浸入5体积冰冷的RNAlater中。第二部分在液氮中进行速冻且贮存用于冷冻切片。
总RNA如上所述由肝样品中进行提取，且通过微小RNA特异性QPCR就miR-122a水平进行分析。图7（处死日9、16或23对应在最后1次剂量后1、2或3周处死）证实与盐水对照比较，在接受SPC3372的小鼠中的2倍抑制，并且这种抑制在第16天时仍可以检测到，而到第23天时，mi122a水平接近盐水组的水平。
实施例16：LNA寡核苷酸在体内的作用持续时间
体内研究：2组动物（21只小鼠/组）以下述方式进行处理。组1动物通过i.v.用0.2ml盐水注射连续3天，组2以相同方式接受25mg/kgSPC3372。所有剂量由每个动物的第0天体重进行计算。
最后1次剂量（第3天）后，来自每组的7个动物分别在第9天、第16天和第23天时处死。在这之前，在每天时，将眶后血液收获在包含EDTA的管中，并且收获来自每天的血浆部分且冷冻贮存于-80℃用于胆固醇分析。在处死时，解剖肝，并且将一部分切成5mm立方体且浸入5体积冰冷的RNAlater中。第二部分在液氮中进行速冻且贮存用于冷冻切片。
总RNA如上所述由肝样品中进行提取，且通过微小RNA特异性QPCR就miR-122a水平进行分析。图8证实与盐水对照比较，在接受SPC3372的小鼠中的2倍抑制，并且这种抑制在第16天时仍可以检测到，而到第23天时，mi1-22a水平接近盐水组的水平。
对于实施例17－22，应用下述操作：
NMRI小鼠使用2.5－25mg/kg的日剂量用SPC3372静脉内施用连续3天。动物在最后1次剂量后24小时、1、2或3周处死。收获肝，分成片且浸入RNAlater（Ambion）中或进行速冻。RNA根据制造商的说明书（Invitrogen）用Trizol试剂从RNAlater组织中进行提取，除了沉淀的RNA在80％乙醇中进行洗涤且不涡旋。RNA根据制造商（Appliedbiosystems）用于mRNATaqManqPCR或RNA印迹（参见下文）。速冻片进行冷冻切片用于原位杂交。
此外，对于图9－14，SPC3372命名为LNA-抗miR和SPC3373（错配对照）命名为“mm”而不是使用SPC编号。
实施例17：经由miR-122a抑制SPC3372的剂量依赖性miR-122a靶mRNA诱导
小鼠如上所述用不同SPC3372剂量处理连续3天，且在最后1次剂量后24小时处死。对从肝中提取的总RNA实施qPCR。具有预测的miR-122靶位点且通过微阵列分析观察到上调的基因使用qPCR就经由增加SPC3372剂量的剂量依赖性诱导进行研究。来自在最后1次剂量后24小时处死的2－3只小鼠/组的总肝RNA就指示的基因实施qPCR。图9中显示的是相对于盐水组的mRNA水平，n=2－3（2.5－12.5mg/kg/天：n=2，无SD）。还显示的是错配对照（mm，SPC3373）。
测定的基因：具有预测的miR-122靶位点的Nrdg3AldoA，Bckdk，CD320。AldoB和Gapdh不具有预测的miR-122靶位点。
在用不同剂量的SPC3372处理后可见miR-122靶基因明确的剂量依赖性诱导。
实施例18：在SPC3372处理后miR-122a靶mRNA的瞬时诱导
NMRI雌性小鼠用25mg/kg/天SPC3372连同盐水对照处理连续3天，且分别在最后1次剂量后1、2或3周处死。RNA由肝中提取且通过微阵列数据选择的，预测的miR-122a靶mRNA的mRNA水平通过qPCR进行研究。分析来自每组的3个动物。
测定的基因：具有预测的miR-122靶位点的Nrdg3AldoA，Bckdk，CD320。Gapdh不具有预测的miR-122靶位点。
可见瞬时诱导随后恢复为正常表达水平，类似于正常miR-122a水平的恢复（图10）。
在每个单个时间点上，mRNA水平相对于个体GAPDH水平和盐水处理组的平均值进行标准化。还包括的是来自在最后1次剂量后24小时处死的动物的值。显示的是平均值和标准差，n=3（24小时n=3）。
实施例19：经由SPC3372处理肝中Vldlr的诱导
与先前实施例一样的肝RNA样品就Vldlr诱导进行研究。
在SPC3372处理后可见瞬时上调，如同其他预测的miR-122a靶mRNA一样（图11）。
实施例20：在小鼠血浆中的miR-122a/SPC3372双链体的稳定性
SPC3372和SPC3372/miR-122a双链体的稳定性在小鼠血浆中于37℃经过96小时进行测试。图12中显示的是SYBR-Gold染色的PAGE。
SPC3372经过96小时是完全稳定的。SPC3372/miR-122a双链体立即被截短（未由SPC3372涵盖的单链miR-122a区域的降解）但其后经过96小时几乎完全稳定。
预先形成的SPC3372/miR-122双链体显示出在血清中经过96小时的稳定性连同SPC3372分子的高热双链体稳定性的事实支持我们的想法：SPC3372对miR-122a的抑制是由于2种分子之间稳定双链体的形成，这也在细胞培养中得到报道（Naguibneva等人2006）。
实施例21：成熟miR-122a经由SPC3372的隔离导致双链体形成
还对肝RNA实施微小RNARNA印迹。图13中显示的是用miR-122a特异性探针探测（上图）且用Let-7特异性探针再次探测（下图）的膜。使用miR-122a探针，可以检测到2个条带，1个对应成熟的miR-122和1个对应SPC3372和miR-122之间的双链体。
为了证实miR-122的沉默，对肝RNA样品实施小RNARNA印迹分析，这显示出显著减少水平的可检测的成熟miR-122，与我们的实时RT-PCR结果一致。相反，let-7a对照的水平未改变。有趣的是，观察到改变的miR-122/SPC3372异源双链体条带的剂量依赖性积聚，暗示SPC3372不靶向miR-122进行降解，而是与微小RNA结合，从而立体阻碍其功能。
RNA印迹分析如下进行：
RNA膜的制备如Sempere等人2002中所述来完成，除了下述改变外：在甲酰胺加样缓冲液（47.5％甲酰胺、9mMEDTA、0.0125％溴酚蓝、0.0125％二甲苯蓝、0.0125％SDS）中的总RNA，10μg/泳道，装载到15％变性NovexTBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上，而不使RNA预热。在200mA时将RNA电泳转移至GeneScreen加杂交转移膜（PerkinElmer）35分钟。膜用与成熟微小RNA互补的32P-标记的LNA修饰的寡核苷酸进行探测*。LNA寡核苷酸如（Válóczi等人2004）中所述进行标记且与膜杂交，除了下述变化外：预杂交和杂交溶液包含50％甲酰胺、0.5％SDS、5xSSC、5xDenhardts溶液和20μg/ml剪切变性鲱精DNA。杂交在45℃下进行。印迹通过在Storm860扫描仪中扫描进行显现。本底膜的信号从源于miRNA条带的放射性信号中扣除。miR-122信号的值基于let-7a信号就装载差异进行校正。为了测定放射性信号的尺寸，依照供应商的建议使用DecadeMarkerSystem（Ambion）。
实施例22：通过肝切片的原位杂交评估的SPC3372对miR-122a的隔离连同SPC3372分布
对来自处理动物的肝冷冻切片实施原位杂交用于miR-122和SPC3372的检测和定位（图14）。与miR-122互补的探针可以检测miR-122a。第2种探针与SPC3372互补。图14中显示的是在10x放大倍数下的覆盖，绿色是miR-122a和SPC3372的分布和表观量，和蓝色是DAPI核染色。100x放大倍数揭示miR-122a和SPC3372在小鼠肝细胞内的细胞内分布。
来自盐水对照动物的肝切片显示在整个肝切片上的强miR-122染色模式，而来自SPC3372处理小鼠的切片显示显著减少的片状染色模式。相比之下，SPC3372分子在SPC3372处理的肝中而不是在未处理的盐水对照肝中容易地检测到。更高的放大倍数将miR-122a定位于肝细胞中的细胞质，在其中原位模式的miR-122明显区室化，而SPC3372分子在整个细胞质中均匀分布。
实施例23：微阵列分析
我们使用AffymetrixMouseGenome4302.0阵列进行来自最后1次剂量后24小时的盐水、LNA-抗miR-122处理和LNA错配对照处理的小鼠肝的总RNA样品的全基因组表达分析。阵列数据的分析揭示与盐水和LNA错配对照比较，在LNA-抗miR处理的小鼠肝中上调的455种转录物，而54种转录物是下调的（图15a）。在Ensembl数据库中总共可以鉴定415种上调和53种下调的转录物。随后就6nt序列CACTCC的存在检查差异表达的mRNA的3'非翻译区（UTR），所述序列对应成熟miR-122中的核苷酸2－7种区域的反向互补物。具有至少一个miR-122识别序列的转录物的数目在上调的转录物中是213（51％），在下调的转录物内是10（19％），而在随机序列群体中的频率是25％，暗示上调的mRNA的显著库表示肝中直接的miR-122靶（图15b）。
LNA-抗miR处理显示miR-122水平在24小时时最大的减少，在1周时50％的减少和在最后1次LNA剂量后3周时匹配盐水对照（实施例12“旧设计”）。这与在随后时间点时2个小鼠组之间显著减少数目的差异表达基因一致。在最后1次LNA剂量后24小时的509种mRNA比较，在1周后鉴定了251种差异表达的基因，但在处理后3周后仅18种基因（图15c和15d）。一般而言，在LNA-抗miR处理后24小时上调的基因随后在接下来的2周朝向对照水平恢复（图15d）。
总之，大部分在LNA-抗miR处理后上调/去阻遏的基因是miR-122靶，表明阻断miR-122的非常特异的效应。此外，上调/去阻遏的基因在处理结束后3周接近正常水平，暗示相对长的疗效，然而不引起永久改变，即效应是可逆的。
方法：
LNA-抗miR处理小鼠的基因表达分析。
将盐水和LNA-抗miR处理小鼠的肝的表达谱进行比较。NMRI雌性小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR连同盐水对照处理连续3天，且在最后1次剂量后24小时、1、2或3周处死。此外，获得在最后1次剂量后24小时用错配LNA对照寡核苷酸处理的小鼠肝的表达谱。分析来自每组的3只小鼠，产生总共21个表达谱。RNA质量和浓度分别使用Agilent2100Bioanalyzer和NanodropND-1000进行测量。总RNA根据GeneChipExpression3′-AmplificationReagentsOne-cyclecDNA试剂盒说明书（AffymetrixInc，SantaClara，CA，USA）进行加工，以产生双链cDNA。这根据制造商的说明书用作模板以产生生物素标记的cRNA。使15微克生物素标记的cRNA断裂成长度为35－200个碱基的链，其中10微克在AffymetrixMouseGenome4302.0阵列上在GeneChip杂交炉6400中使用标准操作杂交过夜。阵列进行洗涤且在GeneChipFluidicsStation450中进行染色。扫描使用GeneChipScanner3000来进行，并且图像分析使用GeneChipOperatingSoftware来进行。标准化和统计分析使用用于R编程环境27的LIMMA软件包来完成。在所有杂交中由GCOS软件报道为不存在的探针从数据集中去除。此外，将强度滤器应用于数据集以去除显示低于16的本底校正的强度的探针。数据使用分位数标准化28进行标准化。差异表达使用线性模型方法进行评估。P值使用Benjamini和Hochberg就多重检验进行调整。如果经调整的p值是p<0.05，那么检验被视为显著的。Affymetrix阵列数据的聚类和可视化使用MultiExperimentViewer软件29来完成。
靶位点预测
具有注释的3’UTR的转录物使用EnsMart数据采掘工具30从Ensembl数据库（版本41）中提取，且寻找CACTCC序列的存在，所述CACTCC序列是成熟的miR-122序列中的核苷酸2－7种子的反向互补物。作为本底对照，对应在最后1次LNA-抗miR剂量后24小时时上调和下调的转录物的平均3’UTR长度，对一组长度为1200nt的1000个序列寻找6核苷酸miR-122种子匹配。这进行500次且平均计数用于比较。
实施例24.与antagomir抑制miR-122比较，在小鼠肝中LNA-抗miR对miR-122的剂量依赖性抑制得到增强。
NMRI雌性小鼠用指示剂量的LNA-抗miR（SPC3372）连同错配对照（mm，SPC3373）、盐水和antagomir（SPC3595）处理连续3天，且在最后1次剂量后24小时处死（如实施例11“旧设计”中，n=5）。miR-122水平通过qPCR进行分析且相对于盐水处理组进行标准化。具有预测的miR-122靶位点且在表达分析中上调的基因（AldoA、Nrdg3、Bckdk和CD320）显示出通过qPCR测量的增加LNA-抗miR剂量所致的剂量依赖性去阻遏。
与antagomir处理的小鼠比较，在LNA-抗miR处理的小鼠中去阻遏对所有测试的miR-122靶mRNA（AldoA、Bckdk、CD320和Nrdg3，图17、18、19、20）都一致地更高。当通过miR-122特异性qPCR分析miR-122抑制时，这也得到表明（图16）。因此LNA-抗miR产生比相应剂量的antagomir更有效的对miR-122的功能抑制。
实施例25.在高胆固醇血症小鼠中LNA-抗miR对miR-122的抑制连同胆固醇减少和miR-122靶mRNA去阻遏。
C57BL/6J雌性小鼠在SPC3649处理开始前喂养高脂饮食13周。当在LNA-抗miR处理开始时称重时，与仅在20g下的正常小鼠的重量比较，这导致增加至30－35g的重量。高脂饮食小鼠导致约130mg/dl显著增加的血浆总胆固醇水平，因此使得与约70mg/dl的正常水平比较小鼠为高胆固醇血症。高胆固醇血症和正常小鼠都用5mg/kgSPC3649和相应的错配对照SPC3744每周i.p.处理2次，共51/2周的研究时期。血液样品每周进行收获且血浆总胆固醇在研究的整个过程期间进行测量。在小鼠处死后，肝和血液样品制备用于总RNA提取、miRNA和mRNA定量、血清转氨酶水平的测量和肝组织学。
与盐水对照小鼠比较，10天后高胆固醇血症小鼠用SPC3649处理已导致血浆总胆固醇减少约30％，且在整个研究期间维持在这个水平上（图21）。该效应在正常饮食小鼠中没有这么显著。相反，错配对照SPC3744在高胆固醇血症和正常小鼠中都不影响血浆胆固醇水平。
在用SPC3649长期处理后，miR-122抑制和miR-122靶基因mRNA去阻遏（AldoA和Bckdk）的定量揭示在高胆固醇血症和正常小鼠中可比较的谱（图22、23、24），从而证实SPC3649在这2个动物组中在miR-122拮抗方面的功效。miR-122qPCR测定法指出错配对照SPC3744也对处理的小鼠肝中的miR-122水平具有影响，虽然与SPC3649比较程度较小。这可能是与茎-环qPCR相关的减少。与这个发现一致，用错配对照SPC3744处理小鼠不导致直接的miR-122靶基因的任何功能去阻遏（图23和24），也不导致血浆胆固醇的减少（图21），暗示SPC3649介导的对miR-122的拮抗在体内是高度特异性的。
在高胆固醇血症和正常小鼠肝中的肝酶在长期SPC3649处理后进行评估。与盐水对照小鼠比较，在SPC3649处理的高胆固醇血症小鼠中未检测到丙氨酸和天冬氨酸氨基转移酶（ALT和AST）水平的变化（图25和26）。在用SPC3649长期处理后，在正常小鼠中观察到可能升高的ALT水平（图26）。
实施例26用于执行LNA-抗miR/高胆固醇血症实验和分析的方法：
小鼠和给药。
使用C57BL/6J雌性小鼠（TaconicM&BLaboratoryAnimals，Ejby，Denmark）。所有物质在生理盐水（0.9％NaCl）中配制至终浓度，允许小鼠接受10ml/kg的腹膜内注射体积。
在饮食诱导的肥胖研究中，在给药开始前小鼠接受高脂（60EN％）饮食（D12492，研究饮食）13周以增加其血液胆固醇水平。剂量方案延伸至5mg/kgLNA-抗miRTM每周2次的51/2周。血浆在整个给药期间每周收获1次。实验完成后，处死小鼠且从肝中提取RNA用于进一步的分析。还收获血清用于肝酶的分析。
总RNA提取。
将来自处死小鼠切开的肝立即贮存于RNAlater（Ambion）中。总RNA根据制造商的说明书（Invitrogen）用Trizol试剂进行提取，除了沉淀的RNA团块在80％乙醇中进行洗涤且不涡旋外。
微小RNA特异性定量RT-PCR。
miR-122和let-7a微小RNA水平根据制造商的说明书用TaqManmicroRNAAssay（AppliedBiosystems）进行定量。RT反应在水中稀释10倍，且随后根据制造商的说明书用于实时PCR扩增。来自盐水处理的动物的肝总RNA的2倍cDNA稀释系列或模拟转染的细胞cDNA反应（使用比样品中多2.5倍的总RNA）充当标准以确保扩增的线性范围（Ct对相对拷贝数）。AppliedBiosystems7500或7900实时PCR仪器用于扩增。
定量RT-PCR
所选择的基因的mRNA定量使用标准TaqMan测定法（AppliedBiosystems）来完成。逆转录反应用随机十聚体、0.5μg总RNA和来自Ambion的M-MLVRT酶根据标准方案来进行。在加入RT-PCR反应混合物中之前，第一链cDNA随后在无核酸酶的水中稀释10次。来自盐水处理的动物的肝总RNA的2倍cDNA稀释系列或模拟转染的细胞cDNA反应（使用比样品中多2.5倍的总RNA）充当标准以确保扩增的线性范围（Ct对相对拷贝数）。AppliedBiosystems7500或7900实时PCR仪器用于扩增。
代谢测量
在处死前即刻将眶窦后血液收获在EDTA包被的管中，随后分离血浆部分。血浆总胆固醇根据制造商的说明书使用ABXPentraCholesterolCP(HoribaGroup，HoribaABXDiagnostics)进行分析。
肝酶（ALT和AST）测量
来自每只单个小鼠的血清如下制备：血液样品在离心（10分钟，在室温下3000rpm）前贮存于室温2小时。在离心后，收获血清且冷冻于-20℃。
ALT和AST测量根据制造商的说明书在96孔平板中使用来自ABXPentra的ALT和AST试剂来进行。简言之，血清样品用H2O稀释2.5倍并且每种样品一式两份地进行测定。向每个孔中加入50μl稀释的样品或标准（来自ABXPentra的multical）后，将200μl37℃AST或ALT试剂混合物加入每个孔中。动态测量使用分光光度计以30秒的间隔在340nm和37℃下进行5分钟。
实施例27
LNA-抗miR（SPC3649）对丙型肝炎复制的调节
在这个实施例中使用的寡聚体（大写字母：LNA，小写字母DNA，LNAC是甲基，和LNA优选是B-D-氧（在LNA残基后的o脚注）：
SPC3649（靶向miR-122的LNA-抗miR在起始小规模合成中命名为SPC3549）
5'-mCs ocsAs otstsGs oTs ocsas mCs oas mCs ots mCs omCo-3'
SPC3648（靶向miR-122的LNA-抗miR在起始小规模合成中命名为SPC3548）
5'-As otstsGs oTs ocsas mCs oas mCs ots mCs omCo-3'
SPC3550（SPC3649的4nt错配对照）SEQID63
5'-mCs ocsAs otsts mCs oTs ogsas mCs ocs mCs otsAs omCo-3'
2'Ome抗-122：与miR-122互补的全长（23nt）2'OMe修饰的寡聚体
2'OMeCtrl：混杂的2'OMe修饰的对照
丙型肝炎（HCV）复制已显示由miR-122促进，因此拮抗miR-122已证实在体外在肝细胞瘤细胞模型中影响HCV复制。在基于Huh-7的细胞模型中评估了SPC3649减少HCV复制的功效。将不同的LNA-抗miR分子连同2’OMe反义和混杂寡核苷酸转染到Huh-7细胞内，允许HCV复制48小时。对从Huh-7细胞中提取的总RNA样品实施RNA印迹分析。
实施例28增强的靶向miR-21的LNA-抗miRTM反义寡核苷酸
来自SangerInstitutemiRBase的成熟miR-21序列：
>hsa-miR-21MIMAT0000076
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA（SEQIDNO4）
>mmu-miR-21MIMAT0000530
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA（SEQIDNO64）
化合物的序列：
SPC3521miR-215'-FAMTCAgtctgataaGCTa-3'（gap-mer设计）-（SEQIDNO65）
SPC3870miR-21（mm）5'-FAMTCCgtcttagaaGATa-3'-（SEQIDNO66）
SPC3825miR-215'-FAMTcTgtCAgaTaCgAT-3'（新设计）（SEQIDNO67）
SPC3826miR-21（mm）5'-FAMTcAgtCTgaTaAgCT-3'-（SEQIDNO68）
SPC3827miR-215'-FAMTcAGtCTGaTaAgCT-3'（新的，增强的设计）-（SEQIDNO69）
所有化合物具有完全或几乎完全硫醇化的主链且在此在5'末端还具有FAM标记。
miR-21已显示在成胶质细胞瘤（Chan等人CancerResearch2005，65（14），p6029）和乳腺癌（Iorio等人CancerResearch2005，65（16），p7065）中是上调的，且因此已被视为潜在的‘致癌’微小RNA。Chan等人也显示通过用2'OMe或LNA修饰的反义寡核苷酸拮抗miR-21在成胶质细胞瘤细胞中诱导凋亡。因此，拮抗miR-21的试剂具有成为用于治疗成胶质细胞瘤和其他实体瘤例如乳腺癌的疗法的可能性。呈现了靶向miR-21的增强的LNA修饰的寡核苷酸，LNA-抗miRTM，具有适合于上述治疗用途的抑制miR-21的惊人好的性质。
合适的治疗施用途径是例如在成胶质细胞瘤中的颅内注射、在成胶质细胞瘤和乳腺癌中的瘤内注射、以及在乳腺癌中的全身递送。
在U373成胶质细胞瘤细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系中的miR-21抑制
目前的LNA-anitmiRTM的功效通过以不同浓度连同对照寡核苷酸转染到已知表达miR-21的U373和MCF-7细胞系（或以及其他表达miR-21的细胞系）内进行评估。转染使用标准的Lipofectamine2000方案（Invitrogen）来进行。转染后24小时，收获细胞且使用Trizol方案（Invitrogen）提取总RNA。依赖使用的治疗和浓度的miR-21水平的评估通过miR-21特异性、茎-环实时RT-PCR（AppliedBiosystems）来完成，或备选地通过miR-21特异性非放射性RNA印迹分析来完成。与媒介物对照比较，检测的miR-21水平反映LNA-抗miRTM的抑制潜力。
通过miR-21靶基因上调评估的miR-21的功能抑制。
miR-21拮抗的效应通过将完全匹配的miR-21靶序列克隆在标准的花虫萤光素酶报道系统（在编码序列和3'UTR之间，psiCHECK-2，Promega）后进行研究－参见实施例29。报道构建体和LNA-抗miRTM将共转染到表达miR-21的细胞系（例如U373，MCF-7）内。细胞在转染后24小时收获到被动裂解缓冲液中，并且萤光素酶活性根据标准方案（Promega，DualLuciferaseReporterAssaySystem）进行测量。萤光素酶活性的诱导用于证实拮抗miR-21的LNA-抗miRTM的功能效应。
实施例29：用于评估LNA-抗miR和其他微小RNA靶向寡聚体对微小RNA的功能抑制的萤光素酶报道测定法：新的和增强的新设计作为优选设计用于阻断微小RNA功能的总结
在这个实施例中用于评估通过阻断各自的微小RNA克隆对具有微小RNA靶序列的萤光素酶报道分子的LNA-抗miR去阻遏影响的寡聚体（大写字母：LNA，小写字母：DNA）：
SEQIDNO如前。
编码萤光素酶的花虫和萤火虫变体的报道质粒（psiCheck-2Promega）这样进行改造，使得花虫萤光素酶的3'UTR包括与所研究的miRNA完全互补的序列的单拷贝。
内源表达所研究的miRNA的细胞（HuH-7用于miR-122a，HeLa用于miR-19b，518A2用于miR-155）用LNA-抗miR或其他miR结合寡核苷酸（完全互补即全长）和相应的微小RNA靶报道质粒使用Lipofectamine2000（Invitrogen）进行共转染。转染和萤光素酶活性的测量根据制造商的说明书（InvitorgenLipofectamine2000/PromegaDual-luciferasekit）来进行，在6孔平板中使用150000－300000细胞/孔。为了补偿不同的细胞密度和转染率，花虫萤光素酶信号用萤火虫萤光素酶信号进行标准化。所有实验一式三份地进行。
令人惊讶地，新设计和新增强设计是对于所有3种微小RNA靶miR-155、miR-19b和miR-122的最佳功能抑制剂（图27、28、29）。结果概括于下表3中。
结果概括：
设计 miR-155 miR-19b miR-122a
新增强设计 *** *** 无数据
新设计 *** *** ***
完全互补物，LNA_3 ** *** **
完全互补物，阻断 ** ** **
完全互补物，缺口 * 不显著 不显著
表3.各种设计的LNA-抗miR对内源性miR-155、miR-19b和miR-122a功能的去阻遏程度。
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Claims (9)

1.下式所示的寡核苷酸：
5'-mCs ocsAs otstsGs oTs ocsas mCs oas mCs ots mCs omCo-3'，
其中小写字母代表DNA单元，大写字母代表LNA单元，mC表示5－甲基胞嘧啶LNA，下标s表示硫代磷酸酯核苷间键，并且其中所述LNA单元是β-D-氧基LNA单元，在LNA残基之后以上标O表示。
2.药物组合物，其包含根据权利要求1的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂。
3.权利要求1的寡核苷酸在制备用于治疗疾病或医学病症的药物中的用途，其中所述疾病或医学病症选自下述中：提高的血浆胆固醇水平、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高脂血症和丙型肝炎。
4.权利要求3的用途，其中所述疾病是提高的血浆胆固醇水平。
5.权利要求3的用途，其中所述疾病是动脉粥样硬化。
6.权利要求3的用途，其中所述疾病是高胆固醇血症或高脂血症。
7.权利要求3的用途，其中所述疾病是丙型肝炎。
8.用于合成根据权利要求1的单链寡核苷酸的方法，所述方法包括下述步骤：
a.选择由3'末端计数的第1个核苷酸碱基，其为LNA核苷酸碱基，
b.选择与miR122种区域互补的所述单链寡核苷酸区域，其中所述寡核苷酸中对应于所述miR-122种区域的区域内的至少一个DNA单元已被相应的LNA单元所取代，
c.选择根据权利要求1的所述单链寡核苷酸的5'区域，
其中所述合成通过步骤a－c中定义的区域的顺次合成来进行，或者以c－a方向顺次合成来进行，和其中所述寡核苷酸的核苷酸碱基序列与人miR122微小RNA序列互补，并且其中所述寡核苷酸不包含多于5个连续DNA核苷酸单元的区域，并且其中所述寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。
9.用于体外降低细胞内miR-122靶的有效量的方法，其中包括对所述细胞施用权利要求1所述的寡核苷酸。
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