MX2009002856A

MX2009002856A - Conjugados polimericos que contienen porciones cargadas positivamente.

Info

Publication number: MX2009002856A
Application number: MX2009002856A
Authority: MX
Inventors: Hong Zhao; Prasanna Reddy; Ivan Horak; Jing Xia
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-15
Publication date: 2009-03-30
Also published as: AU2007296055A1; EP2076257A4; KR20090054438A; US20090202573A1; IL197160A0; EP2076257A2; CA2662520A1; BRPI0716823A2; WO2008034123A2; JP2010503414A; WO2008034123A3

Abstract

La presente invención provee conjugados poliméricos que contienen porciones cargadas positivamente; también se describen métodos de preparación de sistemas de suministro poliméricos y métodos de tratamiento de mamíferos usando los mismos.

Description

CONJUGADOS POLIMERICOS QUE CONTIENEN PORCIONES CARGADAS POSITIVAMENTE REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de las solicitudes de patente provisionales de EE. UU. Nos. de serie 60/844,944, presentada el 15 de septiembre de 2006; 60/844,945, presentada el 15 de septiembre de 2006; 60/861 ,349, presentada el 27 de noviembre de 2006; 60/861 ,350, presentada el 27 de noviembre de 2006; 60/91 1 ,734, presentada el 13 de abril de 2007; y 60/956,814, presentada el 20 de agosto de 2007, el contenido de todas las cuales se incorpora aquí como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En el pasado se había determinado que seria benéfico aumentar la carga positiva de los polímeros o conjugados que los contienen cuando se usan para el suministro de porciones biológicamente activas, tales como proteínas, péptídos, etcétera. Por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 5,730,990, de beneficiario en común, describe PEG y óxidos de polialquileno relacionados que tienen un solo grupo animo secundario o terciario unido a los mismos. La finalidad de la combinación fue la de permitir que polímeros derivados de amina impartan un efecto modulador del pl o pH al conjugado.

De esta manera, se puede ajustar a un punto deseado el punto isoeléctrico de materiales bioactivos incluidos en el conjugado. La patente '990 anteriormente mencionada ofrece una solución para contrarrestar los efectos de cambio del punto isoeléctrico observados con los polímeros activados convencionales, frecuentemente en perjuicio de la actividad óptima. Durante años, algunas terapias basadas en oligonucleótido se han beneficiado de varios avances ejemplificados por el descubrimiento y desarrollo del ARN de interferencia y microARN, y también por mejoramientos en el diseño de las composiciones, por ejemplo con el uso de esqueletos estructurales de ácido nucleico cerrado (LNA). El ARN interferente pequeño (siRNA) ha evolucionado de una herramienta de investigación a un agente terapéutico en pruebas clínicas en el transcurso de apenas unos años. Sin embargo, el suministro in vivo es todavía el obstáculo principal para realizar completamente el potencial terapéutico de las terapias basadas en oligonucleótido. Actualmente, la inyección intra-compartimental directa y la infusión continua son todavía las principales vías de administración. En consecuencia, se busca mejorar la tecnología de suministro de fármaco en el campo de los oligonucleótidos usados para fines terapéuticos. Debido al esqueleto muy cargado negativamente de los oligonucleótidos, frecuentemente es difícil que éstos atraviesen la membrana celular y exhiban su actividad biológica. Las cargas negativas impiden que los oligonucleótidos se aproximen a la membrana celular cargada negativamente y por lo tanto reducen la endocitosis. En el pasado, para manejar este problema los oligonucleótidos se han adherido o unido en complejo a péptidos cargados positivamente, lípidos catiónicos o polímeros catiónicos. Los resultados no han sido completamente satisfactorios. De esta manera, se desean mejoramientos adicionales. La presente invención maneja esta y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Para superar los problemas anteriores y mejorar la tecnología del suministro de fármaco, se proveen sistemas de suministro polimérico nuevos que contienen esqueletos cargados positivamente. En un aspecto de la presente invención, se proveen compuestos de fórmula (I): {z2}b— R i — {Zi}a en donde cada Zi es independientemente (L"i )¡ (B, )c HLi )d-(L"2)e..— (R'2)g.— (L2)e— R4 cada Z2 es un grupo bloqueador seleccionado independientemente de "(L"'i ),' (??)? (L'i )d -(L'2 2)/,e' -(R3)f — (R2)g-(R'3)r Ri es un polímero sustancialmente no antigénico; R2 y R'2 son péptidos que contienen carga positiva seleccionados independientemente, o porciones de ciclohidrocarburo que contienen nitrógeno; R3 y R'3 son agentes de dirección seleccionados independientemente; R4 es una porción biológicamente activa; ?? , ?? y ?'? son grupos de ramificación seleccionados independientemente; LL L' L L", ?_G" y ?_ " son enlazadores bifuncionales seleccionados independientemente; L2, L'2 y L"2 son enlazadores liberables seleccionados independientemente; (a) es un entero positivo, de preferencia de 1 a aproximadamente 31 , de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, muy de preferencia 1 . (b) es cero o un entero positivo, de preferencia de aproximadamente 0 a aproximadamente 31 , de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 7; (c), (c') y (c") son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente cero, 1 , 2 o 3, de preferencia cero o 1 ; (d), (d'), (i), (i') y (i") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 , 2 o 3, muy de preferencia cero o 1 ; (e) es un entero positivo, de preferencia 1 , 2 o 3, muy de preferencia 1 o 2; (e') y (e") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 , 2 o 3, muy de preferencia cero, 1 o 2; (f) y (f) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 , o 2, muy de preferencia cero o 1 ; (g) es un entero positivo, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, muy de preferencia 1 o 2; (g') es cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, muy de preferencia cero, 1 o 2; y (h) y (h') son enteros positivos seleccionados independientemente, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, de preferencia 1 , 2, 3 o 4, muy de preferencia 1 o 2; con la condición de que (g') es un entero positivo cuando (b) no es cero y todos los Z2 son grupos bloqueadores, o en combinación. En un aspecto preferido de los compuestos poliméricos, la suma de (a) y (b) es igual a aproximadamente 1 hasta aproximadamente 32. En algunas modalidades preferidas, los compuestos poliméricos pueden incluir polímeros de 4 brazos, 8 brazos, 16 brazos y 32 brazos, como se describirá e ilustrará más adelante. De preferencia se pueden usar polímeros de 4 brazos con una porción de ramificación en cada terminal de los brazos del polímero. Los compuestos poliméricos que contienen cuatro brazos y una porción de ramificación sobre los mismos pueden tener hasta 8 sitios funcionales para llevar porciones cargadas positivamente o porciones biológicamente activas. En otra modalidad preferida, los compuestos poliméricos de multibrazo aquí descritos contienen una terminal de polímero unida a una porción biológicamente activa, y las otras terminales de polímero están unidas a una porción que contiene carga positiva. En otro aspecto, los compuestos poliméricos aquí descritos contienen péptidos cargados positivamente y porciones de piperazina, por ejemplo. Las porciones que contienen carga positiva son capaces de conferir cargas positivas adicionales al polímero sustancialmente no antigénico. En otro aspecto, los péptidos cargados positivamente pueden ayudar a los compuestos poliméricos a penetrar la membrana celular. Los péptidos cargados positivamente que son preferidos pueden ser péptidos penetradores de membrana celular (CPP's), tales como por ejemplo TAT. En otro aspecto de la invención, se proveen conjugados poliméricos que contienen esqueletos cargados positivamente para neutralizar las moléculas biológicamente activas con carga negativa y mejorar la incorporación celular de las porciones biológicamente activas, tales como oligonucleótidos, ácido nucleico cerrado (LNA), ARN interferente pequeño (siRNA), aptámero, ribozima, ADN señuelo, etcétera.

En otro aspecto de la invención, las porciones biológicamente activas están unidas a la porción polimérica de los compuestos aquí descritos por medio de enlazadores liberables. Entre los enlazadores liberables pueden estar enlazadores basados en eliminación de bencilo, enlazadores basados en cierre de trialquilo, enlazadores basados en bicina, un enlace disulfuro, enlazadores que contienen hidrazona, y enlazadores que contienen tiopropionato. Alternativamente, los enlazadores liberables son enlazadores intracelulares lábiles, enlazadores extracelulares, y enlazadores ácidos lábiles. En otro aspecto de la invención, las porciones cargadas positivamente y los agentes de dirección pueden estar enlazados a la porción polimérica de los compuestos aquí descritos por medio de enlazadores permanentes y enlazadores liberables, solos o en combinación. Preferiblemente, los péptidos cargados positivamente y los agentes de dirección están enlazados por medio de enlazadores permanentes. Agentes de dirección tales como péptido RGD, ácido fólico, anticuerpo de una sola cadena (SCA), etcétera, pueden estar unidos al compuesto polimérico aquí descrito para guiar in vivo el conjugado al tejido de interés. El diseño provee una propuesta novedosa para el suministro dirigido in vivo de moléculas cargadas negativamente, tales como oligonucleótídos, y aumenta la incorporación celular de estas moléculas para tener más eficacia terapéutica. En algunos aspectos preferidos de la invención, el péptido cargado positivamente también puede ser un péptido terapéutico específico para regiones objetivo afectadas, tal como NGR, TNFa y TAT. El experto en la materia puede utilizar varios péptidos terapéuticos que contienen cargas positivas y que pueden ser suministrados de forma específica al área objetivo. En otros aspectos, los péptidos penetradores de célula pueden ser reemplazados con uno de una variedad de péptidos de dirección cargados positivamente, como TAT, RGD-TAT y NGR, por ejemplo para el suministro dirigido al sitio del tumor. Cuando los enlazadores de PEG con esqueleto cargado positivamente se conjugan con moléculas terapéuticas cargadas negativamente, tales como oligonucleótidos, la carga negativa de los oligonucleótidos se puede neutralizar y la carga neta de los conjugados puede ser positiva. La forma general de los conjugados de PEG puede ser esférica cuando se utiliza PEG de multibrazo. Debido a la propiedad de que el PEG se hidrata mucho en solución acuosa, los conjugados de PEG de multibrazo con esqueleto cargado positivamente aparecen como "mini-nanopartículas" esféricas con los oligonucleótidos embebidos en el centro. Las porciones cargadas positivamente capaces de neutralizar los oligonucleótidos cargados negativamente pueden reducir la toxicidad, y también facilitan la penetración de las membranas celulares mejorando así el suministro de los oligonucleótidos. Como resultado, se pueden suministrar in vivo oligonucleótidos muy cargados negativamente con una menor toxicidad. Una ventaja de los conjugados de polímero de la invención es que la incorporación celular se mejora uniendo péptidos muy cargados positivamente y péptidos penetradores de célula como TAT. Además, el técnico puede obtener la función de dirección añadiendo péptidos de dirección, aptámeros y folatos, etcétera. Otra ventaja es que las velocidades/sitios de liberación de las moléculas cargadas negativamente de los profármacos pueden ser modificadas. Los fármacos unidos a los compuestos poliméricos aquí descritos pueden ser liberados a velocidades modificadas, permitiendo así al técnico obtener la biodisponibilidad deseada de péptidos y oligonucleótidos terapéuticos. También se puede modificar el sitio de liberación de los agentes terapéuticos cargados negativamente, esto es, se puede lograr una liberación en diferentes compartimentos de las células. De esta manera, los sistemas de suministro polimérico aquí descritos permiten que cantidades suficientes de los agentes terapéuticos cargados negativamente estén disponibles selectivamente en el área objetivo deseada, esto es, macropinosoma y endosoma. Las modificaciones en tiempo y sitio de la liberación de los agentes terapéuticos, por si solas o en combinación, pueden ser ventajosas para el tratamiento de una enfermedad. Los compuestos poliméricos con esqueleto positivo son estables bajo condiciones amortiguadoras, y los oligonucleótidos u otros agentes terapéuticos no son excretados prematuramente del cuerpo. Una ventaja adicional de la presente invención es que los conjugados aquí descritos mejoran significativamente la incorporación celular, y regulan negativamente de forma específica el ARNm en células de cáncer en ausencia de agentes de transfección. Esta tecnología se puede aplicar a la administración in vivo de fármacos de oligonucleótido. Por ejemplo, la incorporación en células de cáncer de pulmón humano de los PEG-oligonucleótidos que incluyen los oligonucleótidos de antisentido de Bc12, siRNA de Bc12 o LNA anti-Survivin, aquí descritos, fue mayor que con los oligonucleótidos de antisentido de Bc12 o siRNA de Bc12 simples sin agentes de transfección. Además, los conjugados aquí descritos permiten una incorporación celular más alta en ausencia de agente de transfección en comparación con la asistida por agentes de transfección. Otras ventajas serán evidentes de la siguiente descripción. Para los fines de la presente invención, el término "residuo" significa aquella porción de un compuesto al que se hace referencia, esto es, PEG, oligonucleótido, etcétera, que permanece después de haber experimentado una reacción de sustitución con otro compuesto. Para los fines de la presente invención, el término "residuo polimérico" o "residuo de PEG" significa aquella porción del polímero o PEG que permanece después de haber experimentado una reacción con otros compuestos, porciones, etcétera. Para los fines de la presente invención, el término "alquilo" incluye alquilos rectos, ramificados, sustituidos, por ejemplo haloalquilo, alcoxialquílo, nitroalquilo, alquilo de ^ .¦^ 2 , preferiblemente alquilo de Ci- , cicloalquilo de C3.8, o cicloalquilo sustituido, etcétera. Para los fines de la presente invención, el término "sustituido" incluye agregar o reemplazar uno o más átomos contenidos dentro de un grupo funcional o compuesto, con uno o más átomos diferentes. Para los fines de la presente invención, los alquilos sustituidos incluyen carboxialquilos, aminoalquilos, dialquiloaminos, hidroxialquilos y mercaptoalquilos; los alquenilos sustituidos incluyen carboxialquenilos, aminoalquenilos, dialquenilaminos, hidroxialquenilos y mercaptoalquenilos; los alquinilos sustituidos incluyen carboxialquinilos, aminoalquinilos, dialquinilaminos, hidroxialquinilos y mercaptoalquinilos; los cicloalquilos sustituidos incluyen porciones tales como 4-clorociclohexilo; arilo incluye porciones tales como naftilo; arilo sustituido incluye porciones tales como 3-bromo-fenilo; aralquilo incluye porciones tales como tolilo; heteroalquilo incluye porciones tales como etil-tiofeno; heteroalquilo sustituido incluye porciones tales como 3-metoxi-tiofeno; alcoxi incluye porciones tales como metoxi; y fenoxi incluye porciones tales como 3-nitrofenoxi. Se entiende que halo incluye flúor, cloro, yodo y bromo. Para los fines de la presente invención, "ácido nucleico", "nucleótido" u "oligonucleótido" incluye ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ya sea de una sola cadena o de doble cadena, a menos que se especifique de otra manera, y puede tener cualquier modificación química. Para los fines de la presente invención, "entero positivo" incluye un entero como lo entenderán los expertos en la materia. Los términos "cantidad efectiva" y "cantidad suficiente", para los fines de la presente invención, significan una cantidad que logra un efecto deseado o efecto terapéutico, tal como dicho efecto es entendido por los expertos en la materia.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra imágenes de microscopía fluorescente que se describen en el ejemplo 63. La figura 2 muestra imágenes de microscopía confocal que se describen en el ejemplo 63. La figura 3 muestra las incorporaciones celulares que se describen en el ejemplo 64. La figura 4 muestra las incorporaciones celulares que se describen en el ejemplo 65. La figura 5 muestra la regulación negativa del ARNm de Bc12 que se describe en el ejemplo 66. La figura 6 muestra la regulación negativa de Survivin que se describe en el ejemplo 67. La figura 7 muestra la regulación negativa de Survivin que se describe en el ejemplo 68. La figura 8 muestra la regulación negativa de Survivin que se describe en el ejemplo 69. La figura 9 muestra la regulación negativa de Survivin que se describe en el ejemplo 70.

La figura 10 muestra la regulación negativa de Survivin que se describe en el ejemplo 71 . La figura 1 1 muestra la regulación negativa de Survivin que se describe en el ejemplo 72. La figura 12 muestra la regulación negativa de Survivin que se describe en el ejemplo 73.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION A. Generalidades En un aspecto de la presente invención, se proveen compuestos poliméricos de fórmula (I): {¾b — i {Z^a en donde cada ? es independientemente (L" i)i (Bi)c ^)d-(r2)e.— (R'2)g.— (L2)e— R4 cada ?2 es un grupo bloqueador seleccionado ndependientemente de Ri es un polímero sustancialmente no antigénico; F*2 y R'2 son péptidos que contienen carga positiva seleccionados independientemente, o ciclohidrocarburos que contienen nitrógeno; R3 y R'3 son agentes de dirección seleccionados independientemente; R4 es una porción biológicamente activa; ?? , ?? y ?'? son grupos de ramificación seleccionados independientemente; l_i, L'i, L", ?_ ' y ?_ " son enlazadores bifuncionales seleccionados independientemente; L2, L'2 y L"2 son enlazadores liberables seleccionados independientemente; (a) es un entero positivo, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 31 , de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, muy de preferencia 1 . (b) es cero o un entero positivo, de preferencia de aproximadamente 0 a aproximadamente 31 , de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 7; (c), (c') y (c") son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente cero, 1 , 2 o 3, de preferencia cero o 1 ; (d), (d'), (i), (i') y (i") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 , 2 o 3, muy de preferencia cero o 1 ; (e) es un entero positivo, de preferencia 1 , 2 o 3, muy de preferencia 1 o 2; (e') y (e") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 , 2 o 3, muy de preferencia cero, 1 o 2; (f) y (f) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 , o 2, muy de preferencia cero o 1 ; (g) es un entero positivo, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, muy de preferencia 1 o 2; (g') es cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, muy de preferencia cero, 1 o 2; y (h) y (h') son enteros positivos seleccionados independientemente, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, de preferencia 1 , 2, 3 o 4, muy de preferencia 1 o 2; con la condición de que (g') es un entero positivo cuando (b) no es cero, y todos los Z2 son grupos bloqueadores, (L""i ),"-(B" , )c" o en combinación. Para los fines de la presente invención, las unidades de repetición (a) y (b) adyacentes a un corchete pueden representar el número total de brazos de polímero unidos al grupo descrito en el corchete, excepto cuando se utilizan PEG's de tipo U-PEG o (PEG)2-Lys como parte de los compuestos poliméricos aquí descritos. La suma de (a) y (b) puede ser 1 o 3 para el U-PEG utilizado, aunque hay dos brazos de polímero. Los compuestos poliméricos aquí descritos pueden incluir mPEG cuando (a) es 1 y (b) es cero. La terminal de polímero de mPEG puede estar enlazada tanto a la porción cargada positivamente como al material biológicamente activo. Cuando se utiliza bisPEG en los compuestos poliméricos aquí descritos, la suma de (a) y (b) es 2, en donde Z2 no es un grupo bloqueador o cuando (b) es 1. En un aspecto preferido de la invención, la suma de (a) + (b) es igual a 1 hasta 32; de esta manera, los compuestos poliméricos incluyen preferiblemente hasta 32 brazos de polímero, esto es, 1 , 2, 3, 4, 8, 16 o 32. Dentro de esta modalidad, los compuestos poliméricos pueden incluir preferiblemente de 1 a 8 brazos de polímero, en donde la suma de (a) + (b) puede ser de 1 a 8. Preferiblemente, la porción polimérica incluye 4 brazos de polímero, en donde la suma de (a) + (b) es 4. En otro aspecto preferido, los compuestos poliméricos aquí descritos contienen una terminal de polímero unida a una porción biológicamente activa, y cada terminal de polímero restante está unida a porciones que contienen carga positiva y agente de dirección. Alternativamente, están unidos más brazos de polímero de la porción polimérica a porciones cargadas positivamente que a la porción biológicamente activa. Esta característica puede conferir una carga positiva suficiente para neutralizar la carga negativa de la porción biológicamente activa, tal como oligonucleótidos. Para los fines de la presente invención, cuando el grupo de ramificación está presente en los compuestos aquí descritos, cualquier porción presente después de la porción de ramificación hacia el extremo distal de cada brazo de polímero, se multiplica por el grado de ramificación, esto es, x 2. (h) y (IV) representan el número de terminales hechas de acuerdo con la ramificación. En una modalidad, (h) y (?') pueden ser 2 cada una, en donde se utiliza un grupo de ramificación, tal como ácido aspártico. En otras modalidades que incluyen uno o más grupos de ramificación, (h) y (?') pueden ser 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 32, o más. Las porciones de ramificación pueden incluir por lo menos tres grupos funcionales. Cuando una porción de ramificación que tiene tres grupos funcionales, tales como ácido aspártico, está enlazada a la terminal del brazo de polímero, cada brazo de polímero puede proveer sitios funcionales, por lo menos el doble del número de brazos de polímero. Se pueden contemplar dentro de los compuestos aquí descritos porciones de ramificación múltiples. En otra modalidad, (h) y (?') pueden ser 1 cuando no se utiliza un grupo de ramificación. En otra modalidad preferida, se pueden enlazar polímeros de cuatro brazos a una porción de ramificación en cada terminal de los brazos de polímero. Los compuestos poliméricos que contienen cuatro brazos y una porción de ramificación sobre los mismos, tales como ácido aspártico, pueden tener 8 sitios funcionales para llevar porciones cargadas positivamente o una porción biológicamente activa. El grupo bloqueador se puede seleccionar de H, NH2, OH, C02H, alcoxí de Ci_6 y alquilo de Ci-6. Preferiblemente, cuando se utiliza un polímero lineal como mPEG en los compuestos aquí descritos, el grupo bloqueador puede incluir metoxi. Cuando (b) no es cero y todas las porciones Z2 son grupos bloqueadores, (L -iB" , )^. o en combinación, (g') es por lo menos 1 , de tal manera que la porción cargada positivamente y la porción biológicamente activa pueden ser utilizadas en el mismo brazo de polímero. En un aspecto preferido de la invención, cuando (b) no es cero, cada Z2 incluye (L', )d. (U2)e. (R3)f (R2)g-(R'3)f J y de esta manera, tos compuestos aquí descritos tienen la fórmula (II): Todas las terminales de polímero pueden ser activadas y enlazadas a las porciones cargadas positivamente, agentes de dirección o porciones biológicamente activas, en lugar de incluir un grupo bloqueador o (L"" , )r-(B" , )c ' . Por lo tanto, los polímeros contemplados en este aspecto pueden incluir bis-PEG's, U-PEG, y PEG's de multibrazo. En otra modalidad preferida, (a) es 1. La suma de (a) y (b) puede ser un entero positivo de 1 a 31 , de preferencia de 1 a 7, muy de preferencia 4 (polímeros de cuatro brazos). En otro aspecto preferido, (b) es mayor que (a), de modo que más terminales de polímero pueden tener porciones cargadas positivamente que la porción biológicamente activa, para neutralizar suficientemente la carga negativa de la porción biológicamente activa, tal como oligonucleótido. Para los fines de la presente invención, cuando los valores para enlazadores bifuncionales, grupos de ramificación, enlazadores Iiberables, porciones que contienen carga positiva y agentes de dirección, son enteros positivos iguales o mayores de 2, las porciones pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad que contiene dos o más enlazadores Iiberables, en donde (e) es mayor o igual que 2, los enlazadores Iiberables pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad particular, en los compuestos aquí descritos está presente un enlazador basado en eliminación de bencilo adyacente a un enlazador que contiene hidrazona. En otra modalidad, se pueden usar péptidos cargados positivamente iguales o diferentes en la misma terminal de polímero. En una modalidad preferida, los compuestos aquí descritos tienen la fórmula: z (CH2CH20), ? (lllb), y en donde (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2300, en donde el peso molecular total de la porción polimérica es de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 100,000 Dalton; cada Z es o Z2 en donde: cada Zi es independientemente (L'\ )i (B, ) (L i )d-(L"2)e..— ( R'2)g — (L2)e — R4 cada Z2 es un grupo bloqueador seleccionado independientemente, (L' i )d- (L'2)e' (R3)f — (R2)g-(R'3)f O L2, L'2 y L"2 son independientemente enlazadores liberables seleccionados de disulfuro, enlazadores que contienen hidrazona, enlazadores que contienen tiopropionato, enlazadores basados en eliminación de bencilo, enlazadores basados en cierre de trialquilo y enlazadores basados en bicina, péptidos escindibles por enzimas lisosomales y péptidos escindibles por catepsina B; (c) , (c') y (c") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 , 2 o 3, de preferencia cero o 1 ; (d) , (d'), (i), (i') e (i") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 ó 2; (e) es un entero positivo, de preferencia 1 ó 2; (e') y (e") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 ó 2; (f) y (f") son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 ó 2; (g) es un entero positivo, de preferencia 1 ó 2, de preferencia 1 ; (g') es cero o un entero positivo, de preferencia cero, 1 ó 2; (h) y (h') son independientemente un entero positivo, de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, preferiblemente 1 , 2, 3 ó 4, muy de preferencia 1 ó 2; y todas las otras variables son como se define anteriormente, con la condición de que (g') es un entero positivo cuando todos los Z2 son grupos bloqueadores, (L-^r-ÍB",)^ o en combinación. Cuando los compuestos poliméricos tienen cuatro brazos de polímero, (n) puede ser de 4 a aproximadamente 455. El experto en la materia puede apreciar valores (n) opcionales para otros polímeros de multibrazo. Preferiblemente, todas las porciones Z2 son (? ),. (B'-|)c. ((L ),. (L'2)e. (R3)f (R2)g-(R'3) Un polímero de cuatro brazos activado que incluye una porción de ramificación se ilustra más abajo en la fórmula (lile') En un aspecto preferido de la presente invención, los conjugados de polímero de multibrazo contienen una terminal de brazo de polimero unida a una porción biológicamente activa, y todas las otras terminales de brazo de polimero están unidas a un grupo que contiene carga positiva. En un aspecto adicional de la presente invención, los conjugados de polímero de multibrazo contienen una terminal de brazo de polímero unida a una porción biológicamente activa, y todas las otras terminales de brazo de polímero están unidas a un grupo que contiene carga positiva y un agente de dirección.

B. Polímeros sustancialmente no antigénicos Preferiblemente, los polímeros utilizados en los compuestos aquí descritos son polímeros solubles en agua y sustancialmente no antigénicos, tales como óxidos de polialquileno (PAO's). En un aspecto de la invención, los compuestos aquí descritos incluyen un óxido de polialquileno lineal, ramificado terminalmente, o de multibrazo. En algunas modalidades preferidas de la invención, el óxido de polialquileno incluye polietilenglicol y polipropilenglicol. El óxido de polialquileno tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 100,000 Dalton, de preferencia de aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 60,000 Dalton. Muy preferiblemente, el óxido de polialquileno puede ser de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 25,000; de preferencia de aproximadamente 12,000 Dalton a aproximadamente 20,000 Dalton, cuando están unidos proteínas u oligonucleótidos, o alternativamente de aproximadamente 20,000 Dalton a aproximadamente 45,000 Dalton, de preferencia de aproximadamente 30,000 Dalton a aproximadamente 40,000 Dalton, cuando se utilizan compuestos farmacéuticamente activos en los compuestos aquí descritos (moléculas pequeñas que tienen un peso molecular promedio menor de 1 ,500 Dalton). El óxido de polialquileno incluye polietilenglicoles y polipropílenglicoles. Muy preferiblemente, el óxido de polialquileno incluye polietilenglicol (PEG). El PEG generalmente se representa con la estructura: -0-(CH2CH20)n- en donde (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,300, y depende del número de brazos de polímero cuando se usan polímeros de multibrazo. Alternativamente, la porción de polietilenglicol (PEG) de la invención se puede representar con la estructura: -Y71-(CH2CH20)n-CH2CH2Y71- , -Y71-(CH2CH20)n-CH2C(=Y22)-Y7i- . -Y7 C(=Y72)-(CH2)a2-Y73-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a2-C(=Y72)-Y71- y -Y7 (CR71 R72)a2-Y73-(CH2)b2-0-(CH2CH20)n-(CH2)b2-Y73- en donde: Y71 y Y73 son independientemente O, S, SO, SO2, NR73 o un enlace, Y72 es O, S, o NR74; R7i_7 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6, alquenilo de C2_6, alquinilo de C2.6, alquilo ramificado de C3.ig, cicloalquilo de C3-8, alquilo de d-6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2.6 sustituido, cicloalquilo de C3-8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de C1-6, heteroalquilo de C1-6 sustituido, alcoxi de Ci_6, ariloxi, heteroalcoxi de C -6, heteroariloxi, alcanoilo de C2.6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2.6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido; (a2) y (b2) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 6, de preferencia 1 ; y (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2300. Derivados de U-PEG o ramificados se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 5,643,575, 5,919,455, 6, 1 13,906 y 6,566,506, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. Una lista no limitativa de dichos polímeros corresponde a los sistemas de polímero (i) - (vií) con las siguientes estructuras: O II m-PEG N-C, \ CH — (Y63CH2)w61C(=0)- H / m-PEG — N— C O o II H m-PEG-0 — C — N (CH2)4 CH (Y63CH2)w61 C(=0)- -PEG-0 — C o II o II H m-PEG-0 — C — N \ (CH2)w62 HC (Y63CH2)w61 C(=0)- (v), y (CH2)w63 m-PEG-O — C N II H en donde: Yei-62 son independientemente O, S o NR61 ; Y63 es O, NR62, S, SO, o SO2 (w62), (w63) y (w64) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 3; (w61 ) es 0 o 1 ; mPEG es metoxi-PEG en donde PEG es como se define anteriormente y el peso molecular total de la porción de polímero es de aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 100,000 Dalton; y R61 y R62 son independientemente las mismas porciones que se pueden usar para R73. En otro aspecto, los polímeros incluyen PEG-OH de multibrazo o productos "star-PEG" como los que se describen en el Catálogo de Sistemas de Suministro de Fármaco de NOF Corp., versión 8, abril de 2006, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los conjugados de polímero de multibrazo contienen cuatro brazos de polímero o más, de preferencia cuatro u ocho brazos de polímero. Para fines de ilustración más no de limitación, el residuo de polietilenglicol (PEG) de multibrazo puede ser: en donde: (x) es cero y un entero positivo, esto es, de aproximadamente 0 aproximadamente 28; y (n) es el grado de polimerización.

En una modalidad particular de la presente invención, el PEG de lultibrazo tiene la estructura: H2C O — (CH2CH20)nH I HC O — (CH2CH20)nH CH2 1 O I en donde (n) es un entero positivo. En una modalidad preferida de la invención, los polímeros tienen un peso molecular total de aproximadamente 5,000 Da a aproximadamente 60,000 Da, de preferencia de 12,000 Da a 40,000 Da.

En otra modalidad particular, el PEG de multibrazo tiene la estructura: en donde (n) es un entero positivo. En una modalidad preferida de la invención, el grado de polimerización (n) del polímero de multibrazo es de aproximadamente 28 a aproximadamente 350, para dar polímeros con un peso molecular total de aproximadamente 5,000 Da a aproximadamente 60,000 Da; de preferencia, de aproximadamente 65 a aproximadamente 270, para dar polímeros con un peso molecular total de 12,000 Da a 45,000 Da. Esto representa el número de unidades repetidas en la cadena de polímero, y depende del peso molecular del polímero. Los polímeros pueden ser convertidos a un polímero adecuadamente activado usando las técnicas de activación descritas en las patentes de EE. UU. Nos. 5, 122,614, o 5,808,096. Específicamente, dicho PEG puede ser de la fórmula: O en donde: (u') es un entero de aproximadamente 4 a aproximadamente 455; y hasta 3 porciones terminales del residuo están bloqueadas con un metilo u otro alquilo inferior. En algunas modalidades preferidas, los cuatro brazos del PEG pueden ser convertidos en grupos activadores adecuados para facilitar la unión de grupos aromáticos. Tales compuestos, antes de la conversión, incluyen: HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u.— O O — (CH2CH20)u--CH2CH2— OH H3C-(OCH2CH2)u - (CH2CH20)u -CH2CH2-OH Las sustancias poliméricas aquí incluidas son preferiblemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitativa de tales polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol, poliol polioxietílenado, copolimeros de los mismos y copolimeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua del copolímero de bloque. En una modalidad adicional, y como una alternativa a los polímeros basados en PAO, se pueden usar uno o más materiales efectivamente no antigénicos, tales como dextrano, alcohol polivinílico, polímeros basados en carbohidrato, hidroxipropilmetacrilamída (HPMA), óxidos de polialquileno, o copolimeros de los mismos; véase también la patente de EE. UU. No. 6, 153,655, de beneficiario en común, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los expertos en la materia entenderán que el mismo tipo de activación se utiliza como se describe aquí para PAO's tales como PEG. Los expertos en la materia, además, se darán cuenta de que la lista anterior es únicamente ilustrativa y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades aquí descritas. Para los fines de la presente invención, "sustancialmente o efectivamente no antigénicos" significa todos los materiales conocidos que son inocuos y no provocan una respuesta inmune apreciable en los mamíferos. En algunos aspectos, se pueden utilizar polímeros que tienen grupos amino terminales para hacer los compuestos aquí descritos. Los métodos de preparación de polímeros que contienen aminas terminales con alta pureza se describen en las solicitudes de patente de EE. UU. 1 1/508,507 y 1 1/537, 172, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Por ejemplo, polímeros que tienen azidas se hacen reaccionar con un agente reductor de fosfina, tal como trifenilfosfina, o un agente reductor de borohidruro de metal alcalino, tal como NaBH4. Alternativamente, los polímeros que incluyen grupos salientes reaccionan con sales de amina protegidas tales como la sal de potasio de imidodicarbonato de metíl-ter-butilo (KNMeBoc), o la sal de potasio de imidodicarbonato de di-ter-butílo (KNBoc2), seguido por desprotección del grupo amino protegido. La pureza de los polímeros que contienen las aminas terminales formados mediante estos procesos, es mayor de 95%, aproximadamente; de preferencia mayor de 99%. En aspectos alternativos, en los sistemas de suministro poliméricos aquí descritos se pueden utilizar polímeros que tienen grupos de ácido carboxílico terminales. Los métodos de preparación de polímeros que tienen ácidos carboxílicos terminales con alta pureza se describen en la solicitud de patente de EE. UU. No. 1 1/328,662, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los métodos incluyen preparar primero un éster de alquilo terciario de un óxido de polialquileno, seguido por conversión al derivado de ácido carboxílico del mismo. El primer paso de la preparación de los ácidos carboxílicos de PAO incluye formar un intermediario tal como éster t-butílico de ácido carboxílico de óxido de polialquileno. Este intermediario se forma haciendo reaccionar un PAO con un haloacetato de t-butilo, en presencia de una base como t-butóxido de potasio. Una vez formado el intermediario de éster t-butílico, el derivado de ácido carboxílico del óxido de polialquileno puede ser provisto fácilmente con una pureza mayor de 92%, de preferencia mayor de 97%, de preferencia mayor de 99%, muy de preferencia mayor de 99.5%.

C. Porciones que contienen carga positiva Los compuestos poliméricos aquí descritos pueden contener péptidos cargados positivamente o ciclohidrocarburos que contienen nitrógeno. Las porciones que contienen carga positiva son capaces de conferir cargas positivas adicionales al polímero sustancialmente no antigénico. Los péptidos cargados positivamente pueden ayudar a los compuestos poliméricos a penetrar la membrana celular. Los péptidos penetradores de célula (CPP) contienen aminoácidos cargados positivamente, tales como arginina y lisina. Los CPP también facilitan el suministro dirigido de los compuestos poliméricos aquí descritos. En un aspecto de la presente invención, se pueden utilizar uno o más péptidos en los compuestos aquí descritos. Los péptidos cargados positivamente se pueden utilizar en los compuestos en varias combinaciones diferentes. Para fines ilustrativos y no limitativos se proveen combinaciones opcionales. En una modalidad, se pueden unir en una fila múltiples unidades de los péptidos, tales como dos secuencias TAT. en donde (w) es un entero positivo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 7, y (y) es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 7. En otra modalidad, para mejorar la incorporación celular, cada dos o más péptidos se pueden enlazar con cada una de las terminales de brazo de polímero por medio de un grupo de ramificación. en donde (w) es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, y (y) es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 7. Los péptidos pueden contener de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 aminoácidos cargados positivamente, de preferencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, muy de preferencia de 3 a 10. En una modalidad preferida, los péptidos cargados positivamente incluyen péptidos penetradores de célula (CPP's), tales como TAT, Penetratin y (Arg)9; véase Curr Opin Pharmacol., octubre de 2006; 6(5):509-14, "Cell-penetrating peptides as vectors for peptide, protein and oligonucleotide delivery", cuyo contenido se incorpora aqui como referencia. En un aspecto, los péptidos cargados positivamente pueden incluir aminoácidos naturales o aminoácidos no naturales. Preferiblemente, los péptidos incluyen arginina, lisina y análogos relacionados. Los péptidos pueden ser secuencias aleatorias de aminoácidos o partes de péptidos penetradores de célula naturales, o sus derivados. Para los fines de la presente invención, los péptidos contemplados en los compuestos poliméricos aqui descritos pueden incluir cisteína en el extremo de los péptidos o dentro de los péptidos para conjugación adicional o introducción de enlace disulfuro. Una modalidad preferida de la presente invención incluye péptido cargado positivamente de trans-activador de la proteína de transcripción (TAT). Para los fines de la presente invención, el término "TAT" se entiende como una porción de trans-activador de la proteína de activación de transcripción que incluye una secuencia de péptido de YGRKKRRQRRR, por ejemplo, HS-CYGRKKRRQRRR-CONH2. C-TAT: CYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO. 1 ) En otra modalidad preferida, el péptido cargado positivamente puede ser poliarginina, tal como (Arg)5, o NH(Me)-Sar-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-CONH2 ("Sar-(Arg)5"). C-(Arg)9: CRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 2) Otros grupos de péptido adecuados para su inclusión en la presente serán evidentes para los expertos en la materia, siempre que incluyan un número suficiente de grupos con carga positiva. La longitud del péptido también varia de acuerdo con las necesidades del técnico y el número de grupos de carga positiva deseados (provistos por los aminoácidos). En algunas modalidades preferidas, los péptidos contendrán de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de preferencia de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, muy de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos cargados positivamente; véase también Zhao, H., et al, Bioconjugate Chem. , 2005, 16: 758-766, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Cuando los péptidos cargados positivamente están unidos a una porción de dirección tal como SCA, se puede insertar un enlazador para conjugar SCA con los péptidos cargados positivamente. También se contemplan los enlazadores conocidos para los expertos en la materia dentro de los compuestos aquí descritos. En un aspecto alternativo, las porciones que contienen carga positiva incluyen ciciohidrocarburos que contienen nitrógeno. Las porciones que contienen nitrógeno corresponden a la fórmula: en donde (aa) es un entero positivo de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, de preferencia 2 o 3, muy de preferencia 2; (bb) es 1 , 2 o 3; (ce) es 1 o 2; (dd) es un entero positivo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, de preferencia 1 ; Ríen se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo de Ci_6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo de C3-19 ramificado, cicloalquilo de C3_8, alquilo de Ci.6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, cicloalquilo de C3_a sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de C1-6, heteroalquilo de C i .6 sustituido, alcoxi de C^, ariloxi, heteroalcoxi de C i-6, heteroariloxi, alcanoilo de C2-6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2-6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, y arilcarboniloxi sustituido; y (q) es un entero positivo de aproximadamente 2 a aproximadamente 30. En una modalidad preferida, (q) es de aproximadamente 3 a aproximadamente 18, y de esta manera cada terminal de los brazos de polímero contiene de 3 hasta 18 unidades de ciciohidrocarburo. Muy preferiblemente, (q) es de aproximadamente 3 a 9. En una modalidad preferida, el ciciohidrocarburo que contiene nitrógeno se puede seleccionar de: y Preferiblemente, la porción de ciciohidrocarburo que contiene nitrógeno contiene piperazina.

D. Porciones biológicamente activas Los compuestos aquí descritos se pueden usar para suministrar varias moléculas cargadas negativamente. Los compuestos de polímero mejoran la incorporación celular así como también la biodistribución de moléculas cargadas negativamente. Las moléculas cargadas negativamente pueden incluir compuestos farmacéuticamente activos (compuestos de peso molecular bajo que tienen un peso molecular promedio menor de 1 ,500 Dalton), enzimas, proteínas, oligonucleótídos, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena y péptidos. Las porciones biológicamente activas pueden ser porciones que contienen -NH2, porciones que contienen -OH, y porciones que contienen -SH. En una modalidad preferida, las porciones biológicamente activas incluyen un oligonucleótido. Los siguientes términos se definen para apreciar más completamente el alcance de la presente invención. El técnico apreciará que los términos "ácido nucleico" o "nucleótido" se aplican a ácido desoxirribonucleico ("ADN"), ácido ribonucleico ("ARN"), ya sea de una sola cadena o de doble cadena, a menos que se especifique de otra manera, y cualquier modificación química de los mismos. Un "oligonucleótido" es generalmente un polinucleótido relativamente corto, por ejemplo cuya longitud varía de aproximadamente 2 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótídos, de preferencia de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 30 nucleótidos. Los oligonucleótídos de acuerdo con la invención generalmente son ácidos nucleicos sintéticos, y son de una sola cadena, a menos que se especifique de otra manera. Los términos "polinucleótido" y "ácido polinucleico" también se usan como sinónimos en la presente. El término "antisentido", como se usa aquí, se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN especifica que codifica un producto de gen o que codifica una secuencia de control. El término "cadena de antisentido" se usa con respecto a una cadena de ácido nucleico que es complementaria a la cadena de "sentido". En la operación normal del metabolismo celular, la cadena de sentido de una molécula de ADN es la cadena que codifica polipéptidos u otros productos de gen. La cadena de sentido sirve como un molde para la síntesis de un transcrito de ARN mensajero ("ARNm") (una cadena de antisentido), que a su vez dirige la síntesis de cualquier producto de gen codificado. Se pueden producir moléculas de ácido nucleico de antísentido por medio de métodos conocidos, que incluyen la síntesis por ligación de los genes de interés en una orientación inversa, en un promotor viral que permite la síntesis de una cadena complementaria. Una vez introducida en una célula, esta cadena transcrita se combina con secuencias naturales producidas por la célula para formar dúplex. Estos dúplex bloquean entonces la transcripción o traducción posteriores. De esta manera, se pueden generar fenotipos mutantes. Se sabe que la designación "negativa" o (-) se refiere a la cadena de antisentido, y que "positiva" o (+) se refiere a la cadena de sentido. En una modalidad preferida, la elección para la conjugación es un oligonucleótido (o "polinucleótido"), y después de la conjugación el objetivo es referido como un residuo de un oligonucleótido. Los oligonucleótidos se pueden seleccionar de entre cualquiera de los oligonucleótidos y oligodesoxinucleótidos conocidos con esqueletos de fosforodiéster o esqueletos de fosforotioato. Los oligonucleótidos (análogos) no se limitan a una sola especie de oligonucleótido, sino que más bien se diseñan para funcionar con una amplia variedad de tales porciones, entendiéndose que se pueden unir enlazadores a una o más de las terminales 3' o 5', usualmente los grupos P0 o S04 de un nucleótido. Los oligonucleótidos incluyen oligonucleótidos de antisentido, ARN interferente pequeño (siRNA), micro-ARN (miARN), aptámero, etcétera. Los oligonucleótidos o derivados de oligonucleótido pueden incluir de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 ácidos nucleicos, preferiblemente polinucleótidos relativamente cortos, por ejemplo que varían en longitud de aproximadamente 2 nucleotidos a aproximadamente 200 nucleotidos, o de preferencia de aproximadamente 10 nucleotidos a aproximadamente 30 nucleotidos. Además, los oligonucleótidos pueden contener un esqueleto de fosforodiéster natural o esqueleto de fosforotioato o cualquier otro esqueleto modificado análogo, tal como LNA (ácido nucleico cerrado), PNA (ácido nucleico con esqueleto de péptido), tñciclo-ADN; ODN de señuelo (oligonucleótido de doble cadena), ARN (secuencia de ARN catalítico), ribozimas, oligonucleótidos Spiegelmer (oligonucleótidos L-conformacionales), oligómeros CpG, etcétera, como los que se describen en Tides, 2002, "Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences", 6-8 de mayo de 2002, Las Vegas, Nevada, y Oligonucleotide & Peptide Technologies", 18 y 19 de noviembre de 2003, Hamburgo, Alemania, el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia. Opcionalmente, los oligonucleótidos de acuerdo con la invención también pueden incluir cualquier análogo y derivado de nucleótido adecuado conocido, que incluyen los que se enlistan más abajo en el cuadro 1 .

CUADRO 1 Análogos y derivados de nucleótido representativos 4-acetilcitidina 5-metoxiaminometil-2-tiouridina 5-(carboxihidroximetil)uridina beta, D-manosilqueuosina 2'-0-metilcitidina 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina 5-metoxicarbonilmetiluridina 5-carboximetilaminometiluridina 5-metoxiuridina Dihidrouridina 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina 2'-0-metilseudouridina N-((9-beta-D-ribofuranosil-2- metilt¡opur¡n-6-il)carbamoil)treonina D-galactosilqueuosina N-((9-beta-D-ribofuranosilpurin-6-il)N- metilcarbamoil)treonina 2'-0-metilguanosina éster metílico del ácido uridin-5- oxiacético Inosina ácido uridin-5-oxiacét¡co N6-isopenten¡ladenosina Wybutoxosína 1 -metiladenosina Seudouridína 1 -metilseudouridina Queuosina -metilguanosina 2-tíocitidina 1 -metilinosina 5-metil-2-tiouridina CUADRO 1 (Continuación) Las modificaciones de oligonucleótidos contempladas en la invención incluyen, por ejemplo, la adición o sustitución de nucleótidos seleccionados con grupos funcionales o porciones que permiten un enlace covalente de un oligonucleótido con un polímero deseable, o la adición o sustitución de porciones funcionales que incorporan en un oligonucleótido carga adicional, polaridad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y funcionalidad. Tales modificaciones incluyen, sin limitación, modificaciones de azúcar en la posición 2', modificación de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodouracilo, modificaciones de esqueleto, metilaciones, combinaciones de apareamiento de bases, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y combinaciones análogas. Las modificaciones de oligonucleótido también pueden incluir modificaciones 3' y 5', tales como bloqueo. A continuación se proveen estructuras de análogos de nucleósido ilustrativos.

Boranofosfatos Véanse más ejemplos de análogos de nucleósido en Freier y Altmann; Nucí. Acid Res. , 1997, 25, 4429-4443, y Uhlmann; Curr. Opinión in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. En un aspecto preferido de la presente invención, el oligonucleótido está involucrado en las células de tumor objetivo, o regula negativamente una proteína involucrada en la resistencia de las células de tumor a la terpia anticancerosa. Por ejemplo, en la presente invención se puede usar cualquier proteína celular conocida, tal como bd -2, para regulación negativa con oligonucleótidos de antisentido, para la terapia del cáncer; véase la solicitud de patente de EE. UU. No. 10/822,205, presentada el 9 de abril de 2004, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Una lista no limitativa de oligonucleótidos terapéuticos preferidos incluye oligonucleótidos de antisentido de HIF-1a, y oligonucleótidos de antisentido de Survivin. Los oligonucleótidos pueden ser por ejemplo un oligonucleótido que tiene una secuencia de oligonucleótidos igual o sustancialmente similar a la Genasense (a/k/a oblimersen sodio, producida por Genta Inc., Berkeley Heights, Nueva Jersey). El Genasense es un oligonucleótido de antisentido de fosforotioato de 18 elementos, TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO: 6), que es complementario a los primeros seis codones de la secuencia de iniciación del ARNm de bc1 -2 humano (el ARNm de bc1 -2 humano es conocido y se describe por ejemplo como la SEQ ID NO: 19 en la patente de EE. UU. No. 6,414, 134, que se incorpora aquí como referencia). La Administración de Fármacos y Alimentos de EE. UU. (FDA) otorgó el estatus de "Fármaco Huérfano" a Genasense en agosto de 2000. Las modalidades preferidas incluyen: (i) LNA de antisentido de Survivin (SEQ ID NO: 3) mC3-Ts-mC3-As_as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mC3-As-Gs-c > en donde las letras mayúsculas representan LNA, la "s" representa un esqueleto de fosforotioato, (i¡) siRNA de antisentido de Bc12: SENTIDO: 5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3' (SEQ ID NO: 4) ANTISENTIDO: 3'- dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5 ' (SEQ ID NO: 5), en donde dT representa ADN; (iii) Genasense (oligonucleótido de antisentido de fosforotioato) (SEQ ID NO: 6): ^s"cs"^s"^s-cs"cs"3s"9s"cs"9s"^s"9s"cs"9s"cs"cs"cs"as"^ en donde las letras minúsculas representas ADN y "s" representa esqueleto de fosforotioato; (iv) LNA de antisentido de HIF1a (SEQ ID: 7) 5'- sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa -3' (SEQ ID NO: 7), en donde las letras mayúsculas representan LNA y la "s" representa esqueleto de fosforotioato.

LNA incluye el biciclonucleótido 2'-O, 4'-C-metileno como se muestra abajo: Monómero de LNA -configuración ß-D- Véase la descripción detallada de LNA de Survivin descrita en la solicitud de patente de EE. UU. No. de serie 1 1/272, 124, titulada "LNA Oligonucleotides and the Treatmemt of Cáncer"; y 10/776,934, titulada "Oligomeric Compounds for the Modulation Survivin Expression", el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia; véase también la solicitud de patente de EE. UU. No de serie 10/407,807, titulada "Oligomeric Compounds for the Modulation HIF-1 Alpha Expression"; y 1 1/271 ,686, titulada "Potent LNA Oligonucleotides for Inhibition of HIF-1A Expression", el contenido de las cuales también se incorpora aquí como referencia. Los oligonucleótidos utilizados en los compuestos aquí descritos se pueden modificar con enlazadores (CH2)w-annino en el extremo 5' o 3' de los oligonucleótidos, en donde (w) en este aspecto es un entero positivo, o de preferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de preferencia 6. Los oligonucleótidos modificados pueden ser NH-(CH2)w-OI¡gonucleótido, como se muestra más abajo H-(CH2)w Oligonucleótido Enlazador liberable donde (y) es un entero de aproximadamente aproximadamente 7. En una modalidad preferida, el extremo 5' de la cadena de sentido de siRNA está modificado. Por ejemplo, el siRNA utilizado en los conjugados poliméricos se modifica con un 5'-C6-NH2. Una modalidad particular de la presente invención utiliza siRNA de Bc12 que tiene la secuencia: SENTIDO: 5'-(NH2-C6)GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3' ANTISENTIDO: 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5'. En un aspecto alternativo, los compuestos aquí descritos pueden incluir oligonucleótidos modificados con enlazadores (CH2)w-amino que contienen éster impedido; véanse las solicitudes provisionales de EE. UU. Nos. 60/844,942, titulada "Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers"; y 60/845,028, titulada "Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers for Oligonucleotide Delivery", el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia. Los compuestos poliméricos pueden liberar los oligonucleótidos sin una cola de amina. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden tener la estructura: Oligonucleótido En otro aspecto alternativo, los oligonucleótidos se pueden modificar con enlazadores (CH2)w-sulfhidrilo (tio-oligonucleótidos) Los tio-oligonucleótidos se pueden usar para conjugación directa con cisteína del péptido cargado positivamente, o por medio del grupo maleimidilo. Los tio-oligonucleótidos pueden tener la estructura SH-(CH2)w-OI¡gonucleót¡do. Los tio-oligonucleótidos también pueden incluir un éster impedido que tiene la estructura: péptido H2NOC-(R9)-Cys-HN-RL- -PEG-RL-NH-Cys Los oligonucleótidos se pueden modificar con una cola de C&-NH2, una cola de C6-SH, o una cola de éster impedido. Los oligonucleótidos modificados ejemplares incluyen: (i) Genasense modificado con una cola de C6-NH2: 5'- NH2- C6- stscstscsCsCsasgsCsgstsgsCsgsCsCsast -3' S ,0-P-T-sC-sT-sC-sC-sC-sA-sG-sC-sG-sT-sG-sC-sG-sC-sC-sA-sT ?,?' ?' (ii) LNA de antisentido de HIF 1 a modificado con una cola de C6- ??2; 5'- NH2-C6- sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa -3'; (¡ii) LNA de antisentido de Survivin modificado con una cola de C6-NH2 5'- NH2- C6- smCsTsmCsAsastscscsastsgsgsmCsAsGsc -3'; (iv) LNA de antisentido de Survivin modificado con una cola de Ce-SH: 5'- HS- C6- smCsTsmCsAsastscscsastsgsgsmCsAsGsc -3'; (v) Genasense modificado con una cola de éster impedido E. Agentes de dirección Se pueden añadir agentes de dirección a los compuestos poliméricos aquí descritos para guiar los conjugados al área objetivo in vivo. Los agentes de dirección permiten que porciones biológicamente activas cargadas negativamente, tales como oligonucleótidos, tengan eficacia terapéutica en el área objetivo, esto es, en el sitio del tumor. El suministro dirigido in vivo de moléculas cargadas negativamente, tales como oligonucleótidos, incrementa la incorporación celular de estas moléculas mejorando la eficacia terapéutica. En algunos aspectos, algunos péptidos penetradores de célula pueden ser reemplazados con una variedad de péptidos de dirección para el suministro dirigido al sitio del tumor. En un aspecto preferido de la invención, la porción de dirección, tal como un anticuerpo de una sola cadena (SCA) o anticuerpo de unión de antígeno de una sola cadena, anticuerpo monoclonal, péptidos de adhesión celular, tales como péptidos de RGD y Selectin, péptidos penetradores de célula (CPP's) tales como TAT, Penetratin y (Arg)g, ligandos de receptor, moléculas de carbohidrato de dirección o lectinas, oligonucleótido, derivados de oligonucleótido como ácido nucleico cerrado (LNA) y aptámeros, o similares, permiten dirigir específicamente fármacos citotóxicos a regiones objetivo; véase J Pharm Sci., septiembre de 2006; 95(9): 1856-72: "Cell adhesión molecules for targeted drug delivery", cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Las porciones de dirección preferidas incluyen anticuerpos de una sola cadena (SCA's) o fragmentos variables de una sola cadena de anticuerpos (sFv). El SCA contiene dominios de anticuerpo que pueden unirse o reconocer a moléculas especificas de células de tumor objetivo. Además de mantener un sitio de unión de antígeno, un SCA pegilado por medio de enlazadores puede reducir la antigenicidad y aumentar la vida media del SCA en la corriente sanguínea. Los términos "anticuerpo de una sola cadena" (SCA), "molécula o anticuerpo de unión de antígeno de una sola cadena" o "Fv de una sola cadena" (sFv) se usan intercambiablemente. El anticuerpo de una sola cadena tiene afinidad de unión por el antigeno. El anticuerpo de una sola cadena (SCA) o Fvs de una sola cadena ha sido construido de varias maneras. Una descripción de la teoría y producción de proteínas de unión de antígeno de una sola cadena se encuentra en la solicitud de patente de EE. UU. No. 10/915,069, y en la patente de EE. UU. No. 6,824,782, de beneficiario en común, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Normalmente, los dominios de SCA o Fv se pueden seleccionar de entre anticuerpos monoclonales conocidos por sus abreviaciones en la literatura, tales como 26-10, MOPC 315, 741 F8, 520C9, McPC 603, D1 .3, phOx murina, phOx humana, RFL3.8 sTCR, 1A6, Sel 55-4, 18-2-3,4-4-20, 7A4-1 , B6.2, CC49,3C2,2c, MA- 5C5/K12GO, Ox, etc. (véase, Huston, J. S. er a/., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Huston, J. S. et al., SIM News 38(4) (Supl.): 1 1 (1988); McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10: 1 14 (1990); McCartney, J. E. er a/. , resultados no publicados (1990); Nedelman, M. A. et al., J. Nuclear Med. 32 (Supl.): 1005 (1991 ); Huston, J. S. et al., en: "Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications", Parte B, editado por J. J. Langone, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991 ); Huston, J. S. et al., en: "Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology", Epenetos, A. A. (Ed.), Londres, Chapman & Hall (1993); Bird, R. E. et al., Science 242:423-426 (1988); Bedzyk, W. D. eí al., J. Biol. Chem. 265:18615-18620 (1990); Colcher, D. et al., J. Nat. Cáncer inst. 82:1 191 -1 197 (1990); Gibbs, R. A. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4001 -4004 (1991 ); Milenio, D. E. et al., Cáncer Research 51:6363-6371 (1991); Pantoliano, M. W. eí al., Biochemistry 30:10117-10125 (1991); Chaudhary, V. K. et al., Nature 339:394-397 (1989); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990); Batra, J. K. eí al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171:1-6 (1990); Batra, J. K. eí al., J. Biol. Chem. 265:15198-15202 (1990); Chaudhary, V. K. eí al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 87:9491-9494 (1990); Batra, J. K. eí al., Mol. Cell. Biol. 11:2200-2205 (1991); Brinkmann, U. eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8616-8620 (1991); Seetaram, S. eí al., J. Biol. Chem. 266:17376-17381 (1991); Brinkmann, U. eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3075-3079 (1992); Glockshuber, R. eí al., Biochemistry 29:1362-1367 (1990) ; Skerra, A. eí al., Bio/Technol. 9:273-278 (1991); Pack, P. eí ai, Biochemistry 31:1579-1534 (1992); Clackson, T. eí ai, Nature 352:624-628 (1991) ; Marks, J. D. eí ai, J. Mol. Biol.222:581-597 (1991); Iverson, B. L. eí al., Science 249:659-662 (1990); Roberts, V. A. eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6654-6658 (1990); Condra, J. H. eí al., J. Biol. Chem.265:2292-2295 (1990) ; Laroche, Y. eí al., J. Biol. Chem.266:16343-16349 (1991); Holvoet, P. eí al., J. Biol. Chem. 266:19717-19724 (1991); Anand, N. N. eí al., J. Biol. Chem. 266:21874-21879 (1991); Fuchs, P. eí al., Biol Technol. 9:1369-1372 (1991) ; Breitling, F. et al., Gene 104:104-153 (1991); Seehaus, T. et al., Gene 114:235-237 (1992); Takkinen, K. eí al., Protein Engng. 4:837-841 (1991); Dreher, M. L. eí al., J. Immunol. Methods 139:197-205 (1991); Mottez, E. eí al., Eur. J. Immunol. 21:467-471 (1991); Traunecker, A. eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8646-8650 (1991); Traunecker, A. eí al., EMBO J.10:3655- 3659 (1991 ); Hoo, W. F. S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:4759-4763 (1993)). Todas estas publicaciones se incorporan aquí como referencia. Una lista no limitativa de grupos de dirección incluye el factor de crecimiento celular endotelial, FGF2, somatostatina y análogos de somatostatina, transferrin, melanotropina, ApoE y péptidos de ApoE, factor de Willebrand y péptidos del factor de Willebrand, proteína de fibra adenoviral y péptidos de proteína de fibra adenoviral, PD1 y péptidos de PD1 , EGF y péptidos de EGF, péptidos de RGD, folato, etcétera. También se pueden utilizar en los compuestos aquí descritos otros agentes de dirección opcionales que serán apreciados por el experto en la materia. Preferiblemente, los agentes de dirección incluyen anticuerpo de una sola cadena (SCA), péptidos de RGD, Selectin, TAT, Penetratín, (Arg)9, ácido fólico, etcétera, y algunas de las estructuras preferidas de estos agentes son: C-TAT: (SEQ ID NO: 1 ) CYGRKKRRQRRR; C-(Arg)9: (SEQ ID NO: 2) CRRRRRRRRR; RGD puede ser lineal o cíclico: O el ácido fólico es un residuo de Arg9 puede incluir un residuo de cisteína para conjugación, tal como CRRRRRRRRR, y TAT puede añadir una cisteína adicional al extremo del péptido, tal como CYGRKKRRQRRRC. Para los fines de la presente invención, las abreviaciones usadas en la especificación y las figuras representan las siguientes estructuras: (i) C-diTAT = CYGRKKRRQRRRYGRKKRRQRRR-NH2; (ii) RGD lineal = RGDC; (iii) RGD cíclico = c-RGDfC; (iv) RGD-TAT = CYGRKKRRQRRRGGGRGDS-NH2; y (v) Arg9 F. Enlazadores liberables En un aspecto preferido de la invención, los compuestos aquí descritos contienen una porción biológicamente activa unida a un enlazador liberable. Una ventaja de la invención es que la porción biológicamente activa puede ser liberada de manera controlada. Entre los enlazadores liberables están enlazadores basados en eliminación de bencilo, enlazadores basados en cierre de trialquilo (o basados en lactonización de cierre de trialquilo), enlazadores basados en bicina, enlazadores lábiles al ácido, enlazadores escindibles por enzimas lisosomales y péptidos escindibles por catepsina B. Entre los enlazadores lábiles al ácido pueden estar el enlace disulfuro, enlazadores que contienen hidrazona y enlazadores que contienen tiopropionato. Alternativamente, los enlazadores liberables son enlazadores lábiles intracelulares, enlazadores extracelulares y enlazadores lábiles al ácido. Los enlazadores liberables tienen la fórmula: -Val-Cit- Gly-Phe-Leu-Gly- -Ala-Leu-Ala-Leu-, -Phe-Lys-, -Val-Cit-C(=0)-CH2OCH2-C(=0)-, -Val-Cit-C(=0)-CH2SCH2-C(=0)-, y -NHCH(CH3)-C(=0)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=0)- en donde, Y11-19 es independientemente O, S o NR48; R31 -48, R50-51 y A51 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo de d-6, alquilo de C3.12 ramificado, cicloalquilo de C3-8, alquilo de Ci-6 sustituido, cicloalquilo de C3_8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de C1-6, heteroalquilo de Ci-6 sustituido, alcoxi de C1-6, fenoxi y heteroalcoxi de Ci_6; Ar es una porción arilo o heteroarilo; Ln.15 son espaciadores bifuncionales seleccionados independientemente; J y J' se seleccionan independientemente de porciones transportadas activamente a una célula objetivo, porciones hidrofóbicas, porciones enlazadoras bifuncionales, y combinaciones de las mismas; (c11), (h11), (k11), (111), (m11) y (n11) son enteros positivos seleccionados independientemente, de preferencia 1; (a11), (e11), (g 11 ), (¡11), (o11) y (q 1 ) son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente 1; y (b11), (x11), (x'11), (f11), (¡11) y (p11) son independientemente cero o uno. Varios enlazadores liberables, basados en eliminación de bencilo o basados en cierre de trialquilo, se describen por ejemplo en las patentes de EE. UU. Nos. 6,180,095, 6,720,306, 5,965,119, 6624,142 y 6,303,569, de beneficiario en común, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. Los enlazadores basados en bicina también se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 7,122,189 y 7087,229, de beneficiario en común, y las solicitudes de patentes de EE. UU. Nos. 10/557,522, 11/502,108, y 11/011 ,818; el contenido de todas ellas se incorpora aquí como referencia. Preferiblemente, los oligonucleótidos se enlazan a la porción polimérica de los compuestos aquí descritos por medio de enlazadores lábiles al ácido. Sin limitarse a ninguna teoría, los enlazadores lábiles al ácido facilitan la liberación de los oligonucleótidos de los compuestos poliméricos originales dentro de las células y específicamente en el lisosoma, endosoma o macropinosoma. En un aspecto alternativo de la invención, los péptidos cargados positivamente y los agentes de dirección también pueden estar enlazados a la porción polimérica de los compuestos aquí descritos por medio de enlazadores liberables, tales como los enlazadores lábiles al ácido.

G. Enlazadores bifuncionales En otro aspecto de la invención, los péptidos cargados positivamente y los agentes de dirección se pueden enlazar a la porción polimérica de los compuestos aquí descritos por medio de enlazadores permanentes y enlazadores liberables, solos o en combinación. Preferiblemente, los péptidos cargados positivamente y los agentes de dirección se enlazan por medio de enlazadores permanentes. Los enlazadores bifuncionales incluyen aminoácidos o derivados de aminoácido. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales o no naturales. También se contemplan dentro del alcance de la invención derivados y análogos de los aminoácidos naturales, y también varios aminoácidos no naturales conocidos (D o L), hidrofóbicos o no hídrofóbicos. Una lista no limitativa adecuada de aminoácidos no naturales incluye ácido 2- aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutirico, ácido piperidinico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-aminobutírico, desmosina, ácido 2,2-diaminopimélico, ácido 2,3-diamino propiónico, n-etilglicina, N-etilasparagina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metil-isoleucina, 6-N-metil-lisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina y ornitina. Algunos residuos de aminoácido preferidos incluyen glicina, alanina, metionina y sarcosina. Alternativamente, los enlazadores bifuncionales se pueden seleccionar de: -[C(=0)1V(CR22R23),[C(=0)]V- , -[C(=0)]v(CR22R23),-0[C(=0)]v.- , -[C(=0)]V(CR22R23),-NR26[C(=0)]V- , -[C(=0)]vO(CR22R23)«[C(=0)]v- , -[C(=0)]vO(CR22R23),0[C(=0)]v- , -[C(=0)]vO(CR22R23),NR26[C(=0)lv- , -[C(=0)]vNR21(CR22R23),[C(=0)]v- , -[C(=0)]vNR21(CR22R23),0[C(=0)]v.- , -[C(=0)]vNR21(CR22R23),NR26[C(=0)]v- , -[C(=0)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t [C(=0)]v - , -[C(=0)]v(CR22R23),NR26-(CR28R29)t-[C(=0)]v- , -[C(=0)]v(CR22R23),S-(CR28R29)f[C(=0)]v- , -[C(=0)]vO(CR22R23),0-(CR28R29)r[C(=0)]v.- , -[C(=0)]vO(CR22R23),NR26-(CR28R29)t'[C(=0)]v - , -[C(=0)]vO(CR22R23),S-(CR28R29)t.[C(=0)]v- , -[C(=0)]vNR21(CR22R23),O-(CR28R29), [C(=0)]v- , -[C(=O)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29), [C(=0)]v.- , -[C(=O)]vNR21(CR22R23),S-(CR28R29MC(=0)]v- , -[C(=0)]v(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v- , -[C(=0)]v(CR22R23CR28R29O),[C(=0)]v - , -[C(=O)]vO(CR22R23CR28R290),NR26[C(=0)]v- , -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v - , -[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v- , -[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v- , -[C(=O)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25). [C(=0)]v- , -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)r[C(=0)]v- , -[C(=0)]VNR21(CR22R23CR28R290),(CR24R25).'[C(=0)]V- , -[C(=0)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t O[C(=0)]v - , -[C(=O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t{C(=0)]v.- , -[C(=0)]v(CR22R23),(CR24R25CR28R290)t NR26[C(=0)]v- , -[C(=O)]vO(CR22R23CR28R290),(CR24R25), 0[C(=0)]v- , -[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R290), [C(=0)]v- , -[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R290)t NR26[C(=O)]v. -[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R290),(CR24R25)t O[C(=0)]v- -[C(=0)]vNR21(CR22R23),(CR24R25CR28R290)t [C(=0)]v- , -[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)rNR26[C(=0)]v- R2 -29 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo de C1 -6, alquilo de C3.i2 ramificado, cicloalquilo de C3_8, alquilo de Ci_6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de Ci_6, heteroalquilo de d-6 sustituido, alcoxi de Ci_6, fenoxi y heteroalcoxi de C^; (t) y (f) son independientemente cero o un entero positivo, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 12, de preferencia un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, muy de preferencia 1 o 2; y (v) y (?') son independientemente cero o 1 . Preferiblemente, los enlazadores bifuncionales se pueden seleccionar de. -[C(=0)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=0)-(CH2)2- , -[C(=0)]rNH(CH2)2(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)], - , -[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)2NH[C(=0)]r - , -[C(=0)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s [C(=0)]r - , -[C(=0)]r NH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s [C(=0)]r - , -[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)[C(=0)]r - , -[C(=0)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s.[C(=0)]r- , -[C(=0)]rNH(CH2CH20)(CH2)NH[C(=0)]r- , -[C(=0)]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r- , -[C(=0)]rNH(CH2CH20)s(CH2)s-[C(=0)]r- , -[C(=0)]rNHCH2CH2NH[C(=0)]r- , -[C(=0)]rNH(CH2CH2)20[C(=0)], - , -[C(=0)]rNH(CH2CH20)[C(=0)]r- , -[C(=0)]rNH(CH2CH20)2[C(=0)]r- , -[C(=0)]rNH(CH2)3[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2CH20)2NH[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2)20(CH2)2[C(=0)]r - , -[C(=0)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2CH2)NH[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2CH2)0[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2)3NH[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2)30[C(=0)]r- , -[C(=0)]rO(CH2)3[C(=0)]r- , -[C(=0)]rCH2NHCH2[C(=0)]r- , -[C(=0)]fCH2OCH2[C(=0)]r- , -[C(=0)]rCH2SCH2[C(=0)]r- , -[C(=0)]rS(CH2)3[C(=0)]r- , -[C(=0)]r(CH2)3[C(=0)]r , — [C(=0)]rOCH2-<^^-CH2NH[C(=0)],- — [C(=0)]rOCH2HT^ -CH20[C(=0)]r.— -[C(=0)]rNHCH2-^v /HCH20[C(=0)]r.— en donde (r) y (r') son independientemente cero o 1 , con la condición de que (r) y (r') no son cero al mismo tiempo. En aspectos alternativos adicionales de la invención, los enlazadores bifuncionales incluyen: Estos grupos bifuncionales permiten que un segundo agente sea conjugado directamente y por lo tanto eliminan la necesidad de añadir un grupo funcional para conjugación con un segundo agente. En una modalidad alternativa, los enlazadores bifuncionales incluyen estructuras que corresponden a las mostradas arriba, pero en lugar de grupos maleimidilo tienen grupos tales como vinilo, residuos de sulfona, amino, carboxi, mercapto, tiopropionato, hidrazida, carbazato, etc., en lugar de maleimidilo.

H. Grupos de ramificación Las terminales de brazo de polímero de los compuestos aquí descritos pueden estar ramificadas para permitir una carga múltiple de porciones biológicamente activas, porciones cargadas positivamente o agentes de dirección. Preferiblemente, los grupos de ramificación proveen más terminales de brazo de polímero disponibles para las porciones cargadas positivamente. Los grupos de ramificación pueden tener por lo menos tres sitios funcionales. El número de terminales de brazo de polímero se multiplica por el grado de ramificación. Cuando un grupo de ramificación que tiene tres sitios funcionales está enlazado a los compuestos poliméricos, provee dos terminales para la conjugación. Los grupos de ramificación se pueden seleccionar de: en donde: R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo de d-6- alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo ramificado de C3.i9> cicloalquilo de C3-8, alquilo de C1-6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de Ci_6, heteroalquilo de d-6 sustituido, alcoxi de Ci_6, ariloxi, heteroalcoxi de d-6, heteroariloxi, alcanoilo de C2-6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2-6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2.6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido; (d ), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c"6), (c7) y (c8) son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente cero o un entero positivo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de preferencia cero, 1 ó 2; y (d1 ), (d2), (d3), (d4), (d5) y (d7) son independientemente cero o un entero positivo, preferiblemente cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de preferencia cero o un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 4. Varios grupos de ramificación también se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 6, 153,655, 6,395,266 y 6,638,499, de beneficiario en común, el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia. También se contemplan dentro de los compuestos aquí descritos otros grupos de ramificación opcionales conocidos de los expertos en la materia. Preferiblemente, los grupos de ramificación incluyen: Muy preferiblemente, el grupo de ramificación incluye ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y cisteína. En un aspecto adicional, se pueden usar uno o más grupos de ramificación en cada terminal de los brazos de polímero.

I. Modalidades preferidas que corresponden a la fórmula I En una modalidad preferida, los compuestos poliméricos tienen las fórmulas: (la) (R'3)f-(R2)g-(l-'2)e'-(L,i )d' ?(?·?)? en donde: (e) es 1 o 2; (e') es 0, 1 o 2; y (f) es 0 o 1 , (Ib) Rr ¦(Bi)c -(Ll )d-(L"2)e"— (R'2)g-— (L2)e — R4 en donde (g') es un entero positivo. Por ejemplo, los conjugados preparados de acuerdo presente invención son: 20 Survivin H ° ' .NN /XS"S"C"TAT"S"S "5' -C6-LNA-Survivin O COOH NH-TAT-S-S-5'-C6-LNA-Survivin PEG Y 5'-Cfi-LNA-Surviv¡n O COOH en donde: C-TAT es un residuo de -S-CYGRKKRRQRRR-CONH2; NH-5'-C6-GS es derivado de Genasense, un oligonucleótido de antisentido de fosforotioato de 18 elementos TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO: 1 ) S 5' 3' -NH — (CH2)6— O-P— T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T c- -LNA-Survivin es S 5' 3' NH-(CH2)6-0-P— mC3-Ts-mC3-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mC3-As-Gs-c O T RGD es: En una modalidad preferida de la invención, los compuestos poliméricos incluyen: El extremo 5' de la cadena de sentido del dúplex de siRNA es modificado a una cola de C6-amino para conjugación con enlazadores de PEG.

J. Síntesis de los sistemas de suministro polimérico Generalmente, los conjugados se pueden hacer uniendo secuencialmente el polímero, el agente citotóxico, la porción que contiene la carga positiva, y la porción de dirección, al enlazador multifuncional. El orden exacto de adición no está limitado a ese orden y, como será evidente para el experto en la materia, hay aspectos en los cuales el PEG puede agregarse primero al enlazador multifuncional, seguido por la adición del fármaco citotóxico unido liberablemente, seguido por la adición de la porción que contiene la carga positiva y el agente de dirección, como el anticuerpo monoclonal. En los ejemplos que se dan más abajo se dan detalles con respecto a algunos aspectos preferidos de esta modalidad. En un aspecto de la invención, en primer lugar un compuesto polimérico que contiene un grupo OH o un grupo saliente se puede hacer reaccionar con un nucleófilo que contiene una porción enlazadora liberable, y después se hace reaccionar con otro nucleófilo que contiene un grupo funcional en el extremo distal. El enlazador liberable se puede conjugar con un compuesto biológicamente activo y el grupo funcional se puede enlazar con porciones que contienen carga positiva. Alternativamente, el compuesto polimérico conjugado con una porción biológicamente activa y porciones que contienen carga positiva, se puede hacer reaccionar adicionalmente con una porción de dirección para preparar el conjugado polimérico final que contiene los tres componentes de la invención. Por ejemplo, el técnico puede utilizar menos equivalentes del nucleófilo en comparación con el número de grupos salientes en el polímero para formar un intermediario polimérico que contiene tanto enlazador como grupo saliente. Además, este intermediario se puede hacer reaccionar con una porción que contiene carga positiva, y después alternativamente con una porción de dirección para formar el conjugado polimérico multisustituido con compuesto biológicamente activo, porción que contiene carga positiva, y un agente de dirección. Alternativamente, el polímero se puede activar con diferentes grupos para proveer diferentes reactividades químicas hacia varias porciones nucleofílicas. Por ejemplo, diferentes grupos protectores tales como éster ter-Bu y éster metílico de terminales de ácido carboxílico, se pueden desproteger selectiva y gradualmente para proveer varios grados de grupo activo para ser conjugados con diferentes agentes biológicamente activos, tales como agente citotóxico y agente de dirección. Como se muestra en el esquema A, el grupo maleimidilo y el éster succinimidilo pueden reaccionar selectivamente con porciones que contienen SH o NH2, respectivamente. Todas las reacciones aquí descritas son reacciones químicas estándares con los pasos y condiciones necesarias conocidas por los expertos en la materia. Las reacciones sintéticas aquí descritas, por lo tanto, no requieren mayor experimentación. La unión del compuesto nucleofílico con el PEG u otro polímero se puede hacer usando técnicas sintéticas químicas estándares muy conocidas. La porción de polímero activada, tal como SC-PEG, PEG-amina, PEG ácidos, etcétera, se puede obtener de cualquier fuente comercial o puede ser sintetizada por el técnico sin mayor experimentación. Alternativamente, la unión del compuesto nucleofilico con la porción de polímero se efectúa en presencia de un agente de acoplamiento. Una lista no limitativa de agentes de acoplamiento adecuados incluyen 1 ,3-diisopropilcarbodiimida (DIPC), cualquier dialquil-carbodiimida adecuada, halogenuros de 2-halo-1 -alquil-piridinio (reactivos de Mukaiyama), 1 -(3-dimetilam¡nopropil)-3-etilcarbod¡imida (EDC), anhídrido cíclico del ácido propanofosfónico (PPACA) y fenildiclorofosfatos, etcétera, que están disponibles por ejemplo de fuentes comerciales como Sigma-Aldrich Chemical, o se sintetizan utilizando las técnicas conocidas. Preferiblemente, las reacciones se efectúan en un disolvente inerte como cloruro de metileno, cloroformo, DMF, o mezclas de los mismos. Preferiblemente, las reacciones se efectúan en presencia de una base como dimetílaminopiridina (DMAP), diisopropiletilamina, piridina, trietilamina, etcétera, para neutralizar cualquier ácido generado. Las reacciones se pueden efectuar a una temperatura de aproximadamente 0 °C hasta aproximadamente 22 °C (temperatura ambiente). Algunas modalidades particulares preparadas mediante los métodos aquí descritos incluyen: En un aspecto, los compuestos poliméricos con porciones cargadas positivamente para neutralizar la carga negativa y mejorar la incorporación celular de porciones biológicamente activas tales como oligonucleótidos, pueden tener los siguientes aspectos alternativos: (i) oligonucleótidos modificados con enlazadores (CH2)w-amino en el extremo 5' o 3' de los oligonucleótidos; (ii) oligonucleótidos modificados con enlazadores (CH2)W-sufhidrilo en el extremo 5' o 3' de los oligonucleótidos; (¡ii) oligonucleótidos modificados con enlazadores (CH2)w-amino o enlazadores (CH2)w-sufhidrilo que contienen un éster impedido, que pueden liberar los oligonucleótidos sin cola de amino ni cola de tío; (iv) se pueden añadir uno o más péptidos cargados positivamente, por ejemplo dos péptidos cargados positivamente, tales como las secuencias TAT, para mejorar la incorporación celular; (v) se pueden añadir uno o más enlazadores liberables. Una descripción con respecto a la formación de oligonucleótidos que contienen éster impedido se da en la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/845,028, de beneficiario en común, titulada "Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers For Oligonucleotide Delivery", cuyo contenido se incorpora aquí como referencia; véase el esquema de reacción del esquema B.

K. Métodos de tratamiento En vista de lo anterior, también se proveen métodos de tratamiento de un mamífero, que comprenden administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que contiene un compuesto de fórmula (I) de la presente invención a un paciente en necesidad del mismo. En un aspecto particular de la invención, también se proveen métodos de tratamiento de un paciente que tiene una malignidad o cáncer, que comprende administrar al paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que contiene el compuesto de fórmula (I). En aspectos alternativos, el cáncer tratado puede ser uno o más de los siguientes: tumores sólidos, linfomas, cáncer de pulmón de célula pequeña, leucemia linfocítica aguda (ALL), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del ovario, cáncer gástrico, etcétera. Las composiciones son útiles para el tratamiento de enfermedad neoplásica, reducción de la carga de tumor, prevención de metástasis de neoplasmas, y prevención de recurrencias de tumor /crecimientos neoplásicos en los mamíferos. Otro aspecto de la presente invención provee métodos de tratamiento de varias condiciones médicas en los mamíferos. Brevemente, a un mamífero en necesidad de dicho tratamiento se le puede administrar cualquier porción biológicamente activa que se pueda unir al polímero PEG cargado positivamente. Cualquier oligonucleótido, etcétera, que tiene efectos terapéuticos en estado no conjugado, se puede usar en su forma conjugada, preparado como se describe en la presente. La cantidad de la composición, por ejemplo usada como un profármaco, que se administa, dependerá de la molécula original incluida. Generalmente, la cantidad usada de profármaco en los métodos de tratamiento es la cantidad que logra eficientemente el resultado terapéutico deseado en los mamíferos. Naturalmente, las dosificaciones de los diversos compuestos de profármaco varían un poco dependiendo del compuesto original, la velocidad de hidrólisis in vivo, el peso molecular del polímero, etcétera. En un aspecto adicional de la invención, se proveen métodos de administración de polinucleótidos (oligonucleótidos), preferiblemente oligonucleótidos de antisentido, a células de mamífero. Los métodos incluyen suministrar una cantidad efectiva de un conjugado preparado como se describe en la presente para la condición tratada, que dependerá de la eficacia de los polinucleótidos para dichas condiciones. Por ejemplo, si los oligonucleótidos no conjugados (por ejemplo oligonucleótidos de antisentido de BCL2, oligonucleótidos de antisentido de Survivin) son eficaces contra ciertos tipos de cáncer o células neoplásicas, el método incluiría suministrar a las células que tienen susceptibilidad a los oligonucleótidos simples, un conjugado de polímero que contiene los oligonucleótidos. El suministro se puede hacer in vivo como parte de una composición farmacéutica adecuada, o directamente a las células en un medio ex vivo. En un tratamiento particular, se pueden usar conjugados políméricos que incluyen los oligonucleótidos (SEQ ID NO. 3, SEQ ID NOs: 4 y 5, y SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 7).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven para proveer una mayor apreciación de la invención, pero de ningún modo restringen el alcance efectivo de la invención. Los números en negritas citados en los ejemplos corresponden a los que se muestran en los esquemas A-L. En todos los ejemplos se usan abreviaturas tales como DCM (diclorometano), DIEA (diisopropiletilamina), DMAP (4-dimetilaminopiridina), DMF (?,?'-dimetilformamida), DSC (carbonato de disuccinimidilo), EDC (1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida), IPA (¡sopropanol), NHS (N-hidroxisuccinimida), PEG (polietilenglicol), SCA-SH (anticuerpo de una sola cadena), SN38 (7-etil-10-hidroxicamptotecina), TBDPS (ter-butil-dipropilsililo), y TEA (trietilamina).

Procedimientos generales. Todas las reacciones se hicieron bajo una atmósfera de nitrógeno seco o argón. Se usaron reactivos comerciales sin mayor purificación. Todos los compuestos de PEG se secaron al vacío por medio de destilación azeotrópica de tolueno antes de usarse. Se obtuvieron espectros de RMN de 1H a 300 MHz y espectros de RMN de 13C a 75.46 MHz, utilizando un espectrómetro de RMN Vahan Mercury 300 y cloroformo deuterado como disolvente, a menos que se especifique de otra manera. Los desplazamientos químicos (d) se reportan en partes por millón (ppm) abajo del tetrametilsilano (TMS).

Método de HPLC.

Las mezclas de reacción y la pureza de los intermediarios y productos finales se monitorearon con un instrumento de HPLC Beckman Coulter System Gold®. Utiliza una columna de fase inversa ZORBAX® 300SB C8 (150 x 4.6 mm), o una columna de fase inversa Phenomenex Júpiter® 300A C18 (150 x 4.6 mm), con un detector de UV de arreglo de diodo 168, usando un gradiente de acetonitrilo 10%-90% en ácido trifuoroacético (TFA) al 0.05%, a una velocidad de flujo de 1 mL/min.

ESQUEMA A Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 1-3 a. jj Amortiguador de MAL-PEG5k-NHS + H2N -^^,0-P-T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T Fosfato OH 7 8 1 2 °" 5'C6NH2 -Genasense, GS § C-TAT AL-PEG5kC0 - ~~ 0-P-T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T _ TAT-C-PEG5k-5'C6NH2-GS H 0" Amortiguador , de fosfato pH 4 ? 7 0 S Amortiguador de AL-PEG5k-NHS + Ho ~^— ^0-P-T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T Fosfato pH 7 8 2 °" 5'C6NH2-Genasense, GS C-d¡TAT MAL-PEG5kC0 -N — ^ 0-P-T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T - diTAT-C-PEG5k-5'CgNH2-GS H 0" Amortiguador c de fosfato pH 0 3 / o ESQUEMA B Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 4-13 ESQUEMA C Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 14-20 Bsmoc-GIy-OH r? -CTAT -C-(Arg) OÜgO = Oligo I (ARNsi), R = R1 = -CTAT R = TATC-, RGDfC-, RGDC-. SCA-S- C-TAT = CYGRKKRRQRRR-NH2 Oligo = LNA (Survivin), LNA (HIFI-a), ARNSÍ, ant¡-Bci2 ESQUEMA D Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 21 -26 A 9 BsmocOSu ° -??µ BsmocHNv 24 R = C-TAT, RGDIC, RGDC, SCA-SH C-TAT = CYGRKKRRQRRR-N'H2 Otico = LNA (Suiwii). LNA (HIFt-a). ARNsi. ant'-Bcl2 ESQUEMA E Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 27-31 HCI 4N en dioxano PEG (n brazos) OligoS H H OligoS, 0- ¦ 0 -S-R HOOC 0 0 CO0H n - 1 33a-l- i : n = 8, Oligo = Oligo I, R = R1 = -C-TAT 33b-l-Rj : n = 4, Oligo = Oligo I, R = R1 = -C-TAT Oligo I = LNA-Suwivin R1 -C-TAT OligO II = LNA-Survivin alterado R2 = -C-Argg R3 = -C-TAT-RGD R4 = -C-RGD R5 = cRGDfC- R = TATC-, RGDíC-, RGDC-, SCA-S- C-TAT = CYGRK RRORRR-NH2 Oligo = LIMA (Survivin), LNA (HIFI-a), ARNsi. anti-Bcl2 ESQUEMA F Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 32-34 NH2-YGRK(Dde)K(Dde) RRQRRR-C(NPys) PEG (8 brazos)-OCONHS DMF 2% NH2-NH2 PEG (8 brazos)-OCONH-YGRK(Dde)K(Dde)RRQRRR-C(NPys) . 34 DMF Oligo-SH PEG (8 brazos)-OCONH-YGRKKRRQRRR-C(NPys) ~ 35 Amortiguador de fosfato pH 6.5 8arm-PEG-OCONH-YGRKKRRQRRR-C-S-S-OI¡go 36 R = TATC-, RGDfC-, RGDC-. SCA-S- C-TAT = CYGRKKRRQRRR-NH -¿ Oligo = LNA (Survivin), LNA (HIFI-a), ARNSÍ, anti-Bci2 ESQUEMA G Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 35-38 40 R = TATC-, RGDÍC-, RGDC-, SCA-S- C-TAT = CYGRK RRQRRR-NH2 Oligo = LNA (Survivin), LNA (HIFI-a), siRNA, an1i-Bc!2 ESQUEMA H Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 39-41 R - TATC-. RGDÍC-, RGDC-, SCA S- C-TAT = CYGR KRRQRRR-NH2 OI¡go = LNA(Survivin), LNA (HIFI-a), ARNSÍ, ant¡-Bd2 0 ESQUEMA i Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 42-49 54 55 R = TATC-, RGDfC-, RGDC-, SCA-S- C-TAT = CYGRKKRRQRRR-NH2 Oligo = LNA (Survivin), LNA (HIFI-a), ARNSÍ. anti-Bci2 ESQUEMA J Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 50-53 R = TATC-, RGDiC-, RGDC-, SCA-S- C-TAT = CYGRKKRRQRRR-NH2 fgo = LNA (Survivin), LNA (HIF1-a), ARNSÍ, ant¡-Bci2 ESQUEMA K Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 54-58 R - C-TAT R = TATC-, RGOfC-, RGDC-, SCA-S- C-TAT = CYGRKKRRQ Rñ-HH2 Oligo^ LNA(Surviv¡n),LNA¡HIF1-a), ARNSÍ, anti-Bci2 ESQUEMA L Métodos de síntesis descritos en los ejemplos 59-62 (exceso) 67 R = TATC-, GDÍC-, RGOC-, SCA-S- C-TAT = CYGRK RRORRR-NH2 Oligo = LNA (S.wivin), LNA (HIFVa), : ARNSÍ, anti-Bci2 EJEMPLO 1 Compuesto 3 A una solución del compuesto 2 (10 mg, 1.7 µ????) en amortiguador PBS (5 mL, pH 7.8), se le agregó Mal-PEG5k-NHS de NOF Corp. (100 mg, 17 umol), y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 20 mL de agua y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ (10 mm x 1 .5 mm, volumen de lecho ~ 16 mL), que previamente se equilibró con 20 mM de amortiguador Tris-HCI, pH 7.0 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna de amortiguador A para eliminar el exceso de enlazador de PEG. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de NaCI 1 M en 20 mM de amortiguador de Tris-HCI, pH 7.0, amortiguador B, en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos a una velocidad de flujo de 10 mL/min. El producto eluido se desaló utilizando una columna de desalación HiPrep (50 mL), y se liofilizó para dar el compuesto 3; rendimiento de 6 mg (equivalente de oligonucleótido, 60 %).

EJEMPLO 2 Compuesto 4 A una solución del compuesto 3 en amortiguador PBS (6 mL, pH 7.0), se le agregó péptido C-Tat (5 mg, 3 µ????), y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó a 20 ml_ con agua y se cargó en una columna de intercambio catiónico fuerte Resource S (10 mm x 1.5 mm, volumen de lecho ~ 16 mL), que se equilibró previamente con amortiguador de K2HPO 100 mM, urea 5M, pH 6.5 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna de amortiguador A para eliminar el compuesto PEG-oligo que no reaccionó. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de KBr 2M (amortiguador B) en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos a una velocidad de flujo de 10 mL/min. El producto eluido se desaló utilizando la columna de desalación HiPrep (50 mL), y se liofilizó para dar el compuesto 4, rendimiento de 2 mg (equivalente de oligonucleótido, 30%).

EJEMPLO 3 Compuesto 5 A una solución del compuesto 3 en amortiguador PBS (6 mL, pH 7.0), se le agregó péptido C-diTat (10 mg, 3 µ????), y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó a 20 mL con agua y se cargó en una columna de intercambio catiónico fuerte Resource S (10 mm x 1 .5 mm, volumen de lecho ~ 16 mL), que se equilibró previamente con amortiguador de K2HP04 100 mM, urea 5M, pH 6.5 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna de amortiguador A para eliminar el compuesto PEG-oligo que no reaccionó. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de KBr 2 M (amortiguador B) en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos, a una velocidad de flujo de 10 mL/min. El producto eluido se desaló utilizando una columna de desalación HiPrep (50 mL), y se liofilizó para dar el compuesto 5; rendimiento de 2 mg (equivalente de oligonucleótido, 30%).

EJEMPLO 4 Compuesto 6 A una solución de isobutirato de etilo (35 g) en THF (500 mL), a - 78 °C, se le agregó butil-litio ( 1 .6 M, 200 mL), y la solución se agitó 1 hora a la misma temperatura. Se le agregó 1 ,5-dibromopentano (100 g) y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se vació en bicarbonato de sodio acuoso (500 mL). La capa orgánica se evaporó. El residuo se purificó por medio de una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo al 10% en hexano, para dar el compuesto 6 como un liquido (29.2 g, rendimiento 36.7%).

EJEMPLO 5 Compuesto 7 Se calentó 7-bromo-2,2-dimetilheptanoato de etilo (compuesto 6, 26.5 g) con azida de sodio (13 g) en DMF (500 mL) a 100 °C durante 2 horas.

La mezcla se concentró y el residuo se purificó por medio de una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo al 10% en hexano, para dar el compuesto 7 como un líquido (20.5 g, rendimiento 90.3%).

EJEMPLO 6 Compuesto 8 Se calentó 7-azido-2,2-dimetilheptanoato de etilo (compuesto 7, 20.5 g) con hidróxido de sodio (10 g, 85%) en etanol (500 mL) durante 2 horas bajo reflujo. La mezcla se concentró y se le agregó agua (400 mL). La mezcla se acidificó con ácido clorhídrico concentrado a pH 2 y se extrajo con acetato de etilo (500 mL). La capa orgánica se concentró y el residuo se purificó por medio de una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo al 50% en hexano, para dar el compuesto 8 como un líquido (17.1 g, rendimiento 95%).

EJEMPLO 7 Compuesto 9 Se disolvió ácido 7-azido-2,2-dimetilheptanoico (compuesto 8, 8 g) en diclorometano (200 mL). Se le agregó cloruro de oxalilo (6.4 g) y la mezcla se puso en reflujo durante 2 horas y se evaporó. El residuo se disolvió en diclorometano (100 mL) y se agregó a 3'-acetil-timidina (5.85 g) en piridina (100 mL). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y se vació en bicarbonato de sodio acuoso (500 mL). La mezcla se extrajo con diclorometano (500 mL) y la capa orgánica se concentró. El residuo se purificó por medio de una columna de gel de sílice, eluyendo con metanol al 5% en diclorometano, para dar el compuesto 9 como un sólido incoloro (5.6 g, rendimiento 61 %).

EJEMPLO 8 Compuesto 10 Se hidrogenó 5'-(7-azido-2,2-dimetilheptanoil)-3'-acetiltimidina (compuesto 9, 4.65 g) en metanol (200 mL) bajo 2.1 kg/cm2 en presencia de Pd/C (10%, 0.5 g), durante 1 hora. La mezcla se filtró y el filtrado se evaporó para dar el compuesto 10 como un sólido (4.4 g, rendimiento 100%).

EJEMPLO 9 Compuesto 11 Se agitaron 5'-(7-amino-2,2-dimetilheptanoil)-3'-acetiltimidina (compuesto 10, 4.4 g), trietilamina (4 mL) y cloruro de 4-metoxitritilo (7.5 g) en piridina (100 mL) durante 10 horas. Se le agregó metilamina (40%, 10 mL) y la solución se agitó durante 2 horas. La mezcla se vació en bicarbonato de sodio acuoso (500 mL) y se extrajo con diclorometano (500 mi). La capa orgánica se concentró. El residuo se purificó por medio de una columna de gel de sílice, eluyendo con metanol 5% en diclorometano, para dar el compuesto 11 como un sólido incoloro (4.9 g, rendimiento 71 %).

EJEMPLO 10 Compuesto 12 Se agitaron 5'-(7-[(MMT-amino)-2,2-dimetilheptanoil]-timidina (compuesto 11 , 4.9 g), N,N-tetraisopropil-cianoetil-fosforamidita (3 g) y tetrazol (0.5 g) en acetonitrilo (50 mL), durante la noche. La mezcla se vació en bicarbonato de sodio acuoso (500 mi) y se extrajo con diclorometano (500 mL). La capa orgánica se concentró. El residuo se purificó por medio de una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo al 50% en hexano, para dar el compuesto 12 como un sólido incoloro (4.5 g, rendimiento 71 %).

EJEMPLO 11 Compuesto 14 El compuesto 12 se trasfirió a Trilink Biotechnologies, CA, para usarse como el último monómero en la síntesis del oligonucleótido. El grupo Mmt se desprotegió después de la síntesis y el oligonucleótido se purificó por RP-HPLC; el compuesto 14 se obtuvo como la amina libre para su conjugación con PEG.

EJEMPL0 12 Compuesto 15 A una solución del compuesto 14 (10 mg, 1.7 µ????) en amortiguador PBS (5 mL, pH 7.8), se le agregó m30kSCPEG (520 mg, 17 µGp??), y se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó a 50 mL con agua y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ (10 mm x 1 .5 mm, volumen de lecho ~ 16 mL), que previamente se equilibró con amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.4 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna de amortiguador A para eliminar el exceso de enlazador de PEG. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de NaCI 1 M en amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.4, amortiguador B, en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos, a una velocidad de flujo de 10 mL/min. El producto eluido se desaló utilizando una columna de desalación HiPrep (50 mL), y se liofilizó para dar el compuesto 15; rendimiento de 6 mg (equivalente de oligonucleótido, 60%).

EJEMPL0 13 Compuesto 16 A una solución del compuesto 14 (10 mg, 1.7 µ????) en amortiguador PBS (5 mL, pH 7.8), se le agregó m30PEG-RNL8a-NHS (520 mg, 17 µ?a??), y se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó a 50 mL con agua y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ, (10 mm x 1 .5 mm, volumen de lecho ~ 16 mL), que se equilibró previamente con amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.4 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna de amortiguador A para eliminar el exceso de enlazador de PEG. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de NaCI 1 M en amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.4, amortiguador B, en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos, a una velocidad de flujo de 10 mL/min. El producto eluido se desaló usando una columna de desalación HiPrep (50 mL), y se liofilizó para dar un sólido; rendimiento de 5 mg (equivalente de oligonucleótido, 50%).

EJEMPLO 14 Compuesto 17 Se disolvió Boc-ext-amina (1.7 g, 6.4 mmol, 1 eq.) en 4 ml_ de DMF. Esta solución se agregó a 15 mL de solución acuosa saturada de NaHCO3 y después se enfrió a 0 °C. Después se le agregó maleimida (1 g, 6.4 mmol, 1 eq.) y la mezcla de reacción se agitó 15 minutos, seguido por la adición de 30 mL de agua. La reacción se continuó agitando durante 20 minutos a 0 °C. El pH se ajustó a 3.5 agregando H2S04, seguido por tres extracciones con diclorometano. La capa orgánica combinada se lavó una vez con HCI 0.1 N y después una vez con salmuera; se secó y se evaporó al vacio. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna con acetato de etilo /hexano (8:2, v/v): 13C RMN d 28.28, 36.86, 40.19, 67.58, 69.67, 70.00, 78.86, 133.89, 155.63, 170.31 .

EJEMPLO 15 Compuesto 18 A una solución de Boc-ext-maleimida (0.1 g) en 5 mL de DCM anhidro, a temperatura ambiente, se le agregó TFA (2.5 mL). La reacción se monitoreó por TLC y se determinó que estaba completa después de 1 .5 horas. El disolvente se evaporó al vacío para dar el compuesto 18: 13C RMN d 37.26, 39.98, 66.12, 68.36, 69.77, 69.83, 134.1 1 , 160.44, 171.01 .

EJEMPLO 16 Compuesto 19 A una solución de Bsmoc-Gly (0.5 g, 1.7 mmol, 1 eq.) y 3,5-dimetil-4-hidroxi-bencil-OTBS (0.448 g, 1 .7 mol, 1 eq.) en 50 mL de DCM anhidro, se le agregó DMAP (0.042 g, 0.34 mol, 5 eq.). La mezcla se enfrió a 0 °C y después se le agregó EDC (0.408 g, 0.002125 mmol, 0.8 eq.). La solución turbia resultante se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La solución de reacción transparente se lavó con HCI 0.1 N y agua. La capa orgánica combinada se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó al vacío para dar el compuesto 19: 13C RMN (CDCI3-CD3OD, 1 : 1 , v/v) d 42.10, 56.49, 120.93, 125.21 , 129.66, 130.00, 130.18, 133.60, 136.37, 138.63, 155.74, 171 .31 .

EJEMPLO 17 Compuesto 20 A una solución del compuesto 19 (0.089 g, 0.163 mmol, 1 .2 eq.) en 5 mL de DCM anhidro, se le agregó 4-piperidin-piperidina (0.0247 g, 0.147 mmol, 0.9 eq.) a temperatura ambiente. La reacción se monitoreó por TLC y estaba completa después de 4 horas, al cabo de las cuales se le agregó 20KSCPEG (4 brazos) (2.72 g, 0.136 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó parcialmente al vacío y el residuo resultante se precipitó de éter, seguido por recristalización del sólido de DMF/IPA para dar el compuesto 20: 13C RMN d -5.53, 16.02, 18.05, 25.04, 25.62, 42.01 , 63.87, 63.95, 67.31 -72.85 (PEG), 125.66, 129.14, 138.36, 146.02, 151 .00, 155.96, 167.65, 168.1 12.

EJEMPL0 18 Compuesto 21 El compuesto 20 (1 07g, 0.05 mmol, 1 eq.) y maleimida amino-3,6-dioxaoctanoica (0.60 g, 1 .75 mmol, 35 eq.) se disolvieron en 20 mL de DCM, seguido por enfriamiento en un baño de hielo. Se le agregó DIPEA (0.609 mL, 5.5 mmol, 70 eq.) hasta alcanzar un pH de 7-8. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 6.5 horas, seguido por eliminación parcial del disolvente al vacio. Después, el sólido se precipitó con éter y se guardó en un matraz en el refrigerador durante la noche. Después, el sólido se filtró y se recristalizó de DMF/IPA para dar el compuesto 21 : 13C RMN d -5.30, 16.28, 18.32, 25.86, 36.90, 40.67, 42.30, 63.72, 64.27, 67.64, 69.23-71 .28 (PEG), 125.98, 129.39, 133.92, 138.76, 146.24, 156.08, 167.79, 170.34.

EJEMPLO 19 Compuesto 22 El compuesto 21 (0.95 g) se disolvió en 4 mL de CH3CN y 2 mL de agua, seguido por la adición de 10 mL de ácido acético. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente, seguido por eliminación del disolvente al vacio. El sólido se precipitó con éter y después se recristalizó de DMF/IPA para dar el alcohol: 13C RMN d 15.93, 36.58, 40.35, 41.98, 63.37, 63.60, 67.31 , 68.21 -70.88 (PEG), 126.46, 129.31 , 133.69, 138.67, 146.27, 155.79, 167.58, 170.05. El alcohol bencílico desprotegido (1 g, 0.05 mmol, 1 eq.) se disolvió en 2 mL de DMF y 20 mL de DCM, seguido por enfriamiento de la solución a 0 °C. Se le agregó DSC (0.1024 g, 0.4 mmol, 8 eq.) y piridina (0.029 mi, 0.36 mmol, 7.2 eq.). La mezcla de reacción se calentó gradualmente a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó parcialmente al vacío, seguido por precipitación del sólido con éter. Después, el producto crudo se recristalizó de DMF/IPA: 3C RMN d 16.13, 25.24, 36.79, 40.56, 42.21 , 63.61 , 64.16, 67.54, 69.52-71 .29 (PEG), 126.76, 128.56, 130.42, 133.86, 148.01 , 155.99, 167.56, 168.20, 170.26.

EJEMPLO 20 Compuesto 23a-l-R1 (n = 8, Oligo I = siRNA, R1 = -C-TAT) El compuesto 22a (737 mg, 0.0369 mmol) se hizo reaccionar con siRNA (50 mg, 0.00368 mmol) en 30 mL de amortiguador PBS 10 x, pH 7.4. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 4 horas. El material crudo se purificó en Poros con una fase móvil A: 20 mmol de Tris, pH 7.0, y B: 20 mmol de Tris, NaCI 2M, pH 7.0, y después se desaló con amortiguador de fosfato pH 7.0; rendimiento de 16.6 (eq. de oligo). Después, 15 mg de este material (eq. de oligo) se disolvieron en 7 mL de amortiguador de fosfato pH 7.0. Se le agregó SH-TAT (64 mg, 0.039 mmol) bajo nitrógeno. La reacción procedió durante 1.5 horas, seguido por purificación en una resina Source 5S. La columna se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se desaló en una columna de desalación HiPrep con agua y se liofilizó; rendimiento 2.4 mg (eq. de oligo).

EJEMPLO 20A Compuesto 23a-ll-R1 (n = 8, Oligo II = FITC-Genasense, R1 = -C-TAT) El compuesto 22a se hizo reaccionar con FITC-Genasense, seguido por reacción con HS-C-TAT, bajo las mismas condiciones de reacción del ejemplo 20, para dar el producto.

EJEMPLO 20B Compuesto 23a-ll-R2 (n = 8, Oligo II = FITC-Genasense, R1 = -C-Arq9) El compuesto 22a se hizo reaccionar con FITC-Genasense, seguido por reacción con HS-C-Argg, bajo las mismas condiciones de reacción del ejemplo 20, para dar el producto.

EJEMPLO 21 Compuesto 24 Se disolvió la sal de ácido trifluoroacético del ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (0.50 g, 0.18 mmol) en 12 mi de acetonitrilo/agua (1/1 ). El pH de esta solución fue ~4. Se le agregó TEA para ajustar el pH a 8-9. El pH se mantuvo entre 8-9. Después de la adición de Bsmoc-OSu (0.61 g, 0.18 mmol), el pH bajó a 6. Se le agregó más TEAe para llevar el pH de regreso a 8-9. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos, y el pH permaneció a 8-9 al final de la reacción. La mezcla de reacción se diluyó con agua (5 mL) y se extrajo con DCM para eliminar cualquier material inicial remanente. La capa acuosa se acidificó con HCI 0.1 N y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó al vacio, para dar el compuesto 24 como un aceite amarillo claro (0.45 g, 65% rendimiento): 13C RMN d 173.3, 156.1 , 139.5, 137.2, 134.1 , 130.8, 130.7, 134.1 , 130.8, 130.4, 130.3, 125.8, 121 .7, 71 .4, 70.4, 70.3, 68.8, 57.1 , 41 .3, 25.8 EJEMPLO 22 Compuesto 25 A una solución del compuesto 24 (0.41 g, 0.107 mmol) y 3,5-dimetil-4-hidroxi-bencil-OTBS (0.283 g, 0.107 mmol) en 40 ml_ de DCM anhidro (40 ml_), se le agregó DMAP (26mg, 0.021 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y después se le agregó EDC (0.245g, 0.128 mmol). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 20 horas. La mezcla se diluyó con agua, se extrajo con DCM, y se secó sobre sulfato de sodio. El disolvente se evaporó al vacío para dar 0.65 g de producto crudo. La purificación en una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo/hexano (1 : 1 , v/v), dio el compuesto 25 (0.59 g, 88% de rendimiento): 13C RMN d 168.2, 155.4, 146.2, 139.5, 138.9, 136.9, 129.4, 126.2, 125.2, 121.3, 70.2, 69.9, 68.1 , 64.4, 56.4, 41 .1 , 26.1 , 25.9, 18.5, 16.6, 16.5.

EJEMPLO 23 Compuesto 26 A una solución del compuesto 25 (363 mg, 0.6 mmol, 1 .2 eq.) en 200 mL de DCM anhidro, se le agregó 4-piperidin-piperidina (90.9 mg, 0.54 mmol, 0.9 eq.) a temperatura ambiente. La reacción se monitoreó por TLC y estaba completa después de 4 horas, al cabo de las cuales se le agregó 20KSCPEG (8 brazos) (10 g, 0.5 mmol, 1 eq.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó parcialmente al vacío y el residuo resultante se precipitó de éter, seguido por recristalización de los sólidos de DMF/IPA, para dar el compuesto 26 (9.1 g): 13C RMN (75.4 MHz, CDCI3): d -5.35, 16.28, 18.26, 25.25, 25.80, 40.56, 61 .40, 63.66, 64.16, (68.05-73.64, PEG), 125.92, 129.26, 1 38.64, 145.99, 151 .21 , 156.01 , 167.88, 168.20.

EJEMPLO 24 Compuesto 27 A una solución del compuesto 26 (9.2 g, 0.46 mmol, 1 eq.) y maleimida amino-3,6-dioxaoctanoica (5.5 g, 16.1 mmol, 35 eq.) en 200 mL de DCM anhidro, a 0 °C, se le agregó DIEA amina (5.6 mL, 32.2 mmol, 70 eq.) hasta alcanzar un pH de 7-8. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 5 horas, seguida por una eliminación parcial del disolvente al vacio.

Después, el residuo se precipitó agregando éter etílico y el matraz se guardó en el refrigerador durante la noche. Después, el sólido se filtró y se recristalizó de DMF/IPA para dar el compuesto 27 (7 g): 13C RMN d -5.69, 15.90, 17.87, 25.45, 36.44, 40.20, 42.30, 63.19, 64.36, 67.14, 68.05-72.68 (PEG), 125.51 , 128.88, 133.57, 138.19, 145.64, 155.64, 167.45, 169.90.

EJEMPLO 25 Compuesto 28 El Compuesto 27 (7 g) se disolvió en 50 mL de acetonitrilo y 1 1 mL de agua, seguido por la adición de 22 mL de ácido acético. La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente, seguido por eliminación de los disolventes al vacio. El residuo se precipitó con éter y después se recristalizó de DMF/IPA: 13C RMN d 15.97, 36.58, 40.33, 63.35, 63.60, 67.29, 69.08-71 .06 (PEG), 126.50, 129.20, 133.68, 138.73, 146.27, 155.76, 167.55, 170.03. El compuesto desprotegido (7 g, 0.35 mmol, 1 eq.) se disolvió en 14 mL de DMF y 140 mL diclorometano, seguido por enfriamiento de la solución a 0 °C. Se le agregó DSC (717 mg, 2.8 mmol, 8 eq.) y piridina (0.204 mL, 2.52 mmol, 7.2 eq.). La mezcla de reacción se calentó gradualmente a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó parcialmente al vacio, seguido por precipitación del sólido con éter etílico. El sólido crudo se recristalizó de DMF/IPA. 3C RMN d 16.13, 22.40, 25.18, 36.73, 40.50, 42.32, 63.54 67.47, 69.24-71 .20 (PEG), 126.70, 128.53, 130.27, 133.81 , 148.01 , 155.93 167.55, 168.17, 170.20.

EJEMPLO 26 Compuesto 29 El compuesto 28 (1 .5 g, 0.075 mmol) se hizo reaccionar con HIF1 -a (20 mg, 0.0036 mmol) en 8 mL de amortiguador de fosfato pH 7.8. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 2 horas. El material crudo se purificó en una resina Source 15Q. La columna se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se desaló en una columna de desalación HiPrep con agua y se liofilizó. El rendimiento del producto fue de 17.7 (eq. oligo). De este producto, 8.85 mg (eq. oligo) se hicieron reaccionar con 93 mg de HS-TAT en 5 mL de amortiguador de fosfato pH 7.0. El producto se purificó en una resina Source 15S y se desaló; rendimiento 1.7 mg (eq. oligo).

EJEMPLO 27 Compuesto 30 Una solución de HCI 4 N en dioxano (70 mL) se agregó a BocCys(Npys)-OH (1 , 5 g, 13.32 mmol). La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y después se vació en 700 mL de éter etílico. El sólido se filtró a través de un embudo fritado grueso sin aplicar vacío hasta el final. La torta se lavó con éter etílico (3 x 50 mL) y después se secó al vacío a temperatura ambiente durante la noche. 1H RMN (CD3OD) d 8.93 ( 1 H, dd, J = 1 .5, 4.7 Hz), 8.66 (1 H, dd, J = 1.5, 8.20 Hz), 7.59 ( 1 H, dd, J = 4.7, 8.2 Hz), 4.24 (1 H, dd, J = 4.1 , 9.4 Hz), 3.58 (1 H, dd, J = 4.1 , 14.9 Hz), 3.36 (1 H, dd, J = 9.4, 15.2 Hz). 13C RMN (75.4 MHz, CDCI3): d 169.40, 156.27, 154.64, 144.13, 135.246, 123.10, 52.77, 39.27.

EJEMPLO 28 Compuesto 31a A una solución del compuesto 30 (1.82 g, 5.55 mmol) en DMF/DCM (25 mL/45 mL) se le agregó 20KPEG-SC (8 brazos) (7.30 g, 0.35 mmol). Después se le agregó DIEA (3 mL, 16.8 mmol) y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y después se precipitó con DCM/Et20 a 0 °C. El sólido se filtró y después se disolvió en 80 mL de DC . Después de la adición de 20 mL de HCI 0.1 N, la mezcla se agitó 5 minutos y después se trasfirió a un embudo de separación; la capa orgánica se separó y se lavó nuevamente con HCI 0.1 N (20 mL) y salmuera (20 mL). La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se precipitó con DCM/EÍ20 a 0 °C. El sólido se filtró y se secó en el horno de vacio a 30 °C durante por lo menos 2 horas: 13C RMN d 170.90, 156.66, 155.68, 153.86, 142.41 , 1 33.85, 121 .24, 72.96-69.30, 64.08, 53.01 , 41 .82.

EJEMPLO 29 Compuesto 31b A una solución del compuesto 30 (765 mg, 2.33 mmol) en DMF/DCM (20 mL/40 mL) se le agregó 20KPEG-SC (4 brazos) (6.0 g, 0.29 mmol). Después se le agregó DIEA (1 .2 mL, 6.96 mmol) y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y después se precipitó con DC /Et20. El sólido se filtró y después se disolvió en 60 mL de DCM. Después de agregar 15 mL de HCI 0.1 N, la mezcla se agitó 5 minutos y después se transfirió a un embudo de separación; la capa orgánica se separó y se lavó nuevamente con HCI 0.1 N (15 mL) y salmuera (15 mL). La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se precipitó con DCM/Et20.

El sólido se filtró y se secó en el horno de vacio a 30 °C durante por lo menos 2 horas: 13C RMN d 170.76, 156.53, 155.57, 153.85, 142.37, 133.79, 121.23, 72.44-69.30, 63.99, 52.95, 45.36, 41 .82.

EJEMPLO 30 Compuesto 32a-l (n = 4, Oligo I = LNA de Survivin) A una solución de C6-tio-LNA-survivin (120 mg, 0.021 mmol) en 60 mL de amortiguador de fosfato pH 6.5, se le agregó el compuesto 31a (2.3 mg, 0.107 mmol), y la solución se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El avance de la reacción se verificó por medio de HPLC de intercambio de aniones. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y se cargó en una columna de intercambio aniónico Poros. El producto se eluyó con un gradiente utilizando el sistema amortiguador Tris.HCI 20 mM, NaCI 2M, a pH 7.0. El rendimiento después de la desalación fue de 80 mg (eq. oligo).

EJEMPLO 30A Compuesto 32b-l (n = 4, Oligo I = LNA de Survivin) A una solución de C6-tio-LNA-survivin (300 mg, 0.054 mmol) en 1 50 mL de amortiguador de fosfato pH 6.5, se le agregó el compuesto 31 b (4.8 g, 0.273 mmol), y la solución se agitó 1 hora a temperatura ambiente. El avance de la reacción se verificó por HPLC de intercambio aniónico. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y se cargó en una columna de intercambio aniónico Poros. El producto se eluyó con un gradiente utilizando el sistema amortiguador Tris.HCI 20 mM, NaCI 2M, a pH 7.0. El rendimiento después de la desalación fue de 225 mg (eq. oligo).

EJEMPLO 31 Compuesto 33a-l-R1 (n = 8, Oligo I = LNA de Survivin, R = R1 = -C-TAT) El compuesto 32a (80 mg eq. oligo, 0.0142 mmol) se disolvió en 20 mi de amortiguador (urea 5M, KH2P04 100 mM). La solución se enfrió a 0 °C bajo nitrógeno y después se le agregó el péptido C-TAT (329 mg, 0.198 mmol). Se observó el color amarillo intenso. Se siguió agitando la reacción durante 1 .5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno a 0 °C, y después se purificó por cromatografía de intercambio catiónico usando la resina Source 15S. La columna (10 mm x 10 mm) se equilibró con el amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5) por tres volúmenes de columna, y después la muestra se cargó en la columna. El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se liofilizó y se desaló en una columna de desalación HiPrep con amortiguador PBS 50 mM, pH 7.4. Después, la solución desalada se concentró a aproximadamente 1 mg (eq. oligo) /mi de solución. El rendimiento del producto fue de 21 .75 mg (eq. oligo).

EJEMPLO 31 A Compuesto 33a-l-R2 (n =84, Oligo I = LNA de Survivin, R = R2 = -C-Arg9) El compuesto 32a se hizo reaccionar con C-Arg9 bajo las condiciones de reacción descritas en el ejemplo 31 para dar el producto.

EJEMPLO 31 B Compuesto 33a-l-R3 (n =84, Oligo I = LNA de Survivin, R = R3 = -C-TAT- RGD) El compuesto 32a se hizo reaccionar con C-TAT-RGD bajo las condiciones de reacción descritas en el ejemplo 31 para dar el producto.

EJEMPLO 31 C Compuesto 33b-l-Ri (n = 4, Oligo I, R = R1 = -C-TAT) El compuesto 32b (20 mg eq. oligo, 0.0035mmol) se disolvió en 10 mi de amortiguador (urea 5M, KH2P04 100 mM). La solución de enfrió a 0 °C bajo nitrógeno y después se le agregó el péptido C-TAT (52 mg, 0.0315 mmol). Se observó el color amarillo intenso. Se siguió agitando la reacción durante 1 .5 horas bajo nitrógeno a 0 °C, y después se purificó por cromatografía de intercambio catiónico usando la resina Source 1 5S. La columna (10 mm x 10 mm) se equilibró con el amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5) por tres volúmenes de columna, y entonces la muestra se cargó en la columna. El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se liofilizó y se desaló en una columna de desalación HiPrep con amortiguador PBS 50 mM, pH 7.4. La solución desalada se concentró entonces a aproximadamente 1 mg (eq. oligo) /mi de solución; el rendimiento del producto fue de 12.5 mg (eq. oligo).

EJEMPLO 32 Compuesto 34 A una solución de 20KSCPEG (8 brazos) (1 eq.) en DMF, se le agregó péptido (16 eq.). Después se le agregó DIEA (32 eq.) y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se precipitó con DCM/Et20 a 0 °C. El sólido se filtró y después se disolvió en agua. El sólido crudo se purificó usando una cromatografía de fase inversa de C18. El pico del producto se recogió y se liofilizó para formar un sólido.

EJEMPLO 33 Compuesto 35 El compuesto 34 se agregó a una solución de hidrazina al 2% en DMF, y la solución se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se cargó en una columna de fase inversa y se purificó. El pico del producto se recogió y se liofilizó.

EJEMPLO 34 Compuesto 36 El compuesto 35 (1 eq.) se disolvió en 20 mi de amortiguador (urea 5M, 100 mM KH2P04). La solución se enfrió a 0 °C bajo nitrógeno y después se le agregó el Oligo-SH (8 eq.). Se siguió agitando la reacción durante 1.5 horas bajo nitrógeno a 0 °C y después se purificó por cromatografía de intercambio catiónico, usando la resina de Source 15S. La columna (10 mm x 10 mm) se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5) por tres volúmenes de columna, y después la muestra se cargó en la columna. El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se liofilizó y se desaló en una columna de desalación HiPrep con amortiguador PBS 50 mM pH 7.4. La solución desalada se concentró entonces hasta aproximadamente 1 mg (eq. oligo) /mL de solución.

EJEMPLO 35 Compuesto 37 A una solución de carbonato de PEG-succinimidilo (8 brazos) (1 eq.) en diclorometano, se le agregó sal clorhidrato de H-Cys(StBu)-OH (1 eq.) y diisopropiletilamina (1 eq.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 horas. El disolvente se eliminó parcialmente, seguido por precipitación con éter etílico. El producto crudo se recogió por filtración y se cristalizó de 2-propanol.

EJEMPLO 36 Compuesto 38 El compuesto 37 (1 eq.) y maleimida amino-3,6-dioxaoctanoica (35 eq.) se disolvieron en diclorometano, seguido por enfriamiento de la solución en un baño de hielo. Se le agregó diisopropiletilamina (70 eq.) hasta alcanzar un pH de 7-8. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 6.5 horas, seguida por la eliminación parcial del disolvente al vacio. Después, el sólido se precipitó con éter y se guardó en el matraz en el refrigerador durante la noche. Después el sólido se filtró y se recristalizó de DMF/IPA.

EJEMPLO 37 Compuesto 39 El compuesto 38 (215 mg, 0.01 mmol, 1 eq.) se disolvió en amortiguador (urea 5M, KH2PO4 100 mM). La solución se enfrió a 0 °C bajo nitrógeno y después se le agregó SH-TAT (250 mg, 14 eq.). La reacción se siguió agitando durante 1.5 horas bajo nitrógeno a 0 °C, seguido por la purificación en una resina Source 15S. La columna se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se liofilizó y se desaló en una columna de desalación HiPrep, usando PBS 50 mM (pH 7.4). La solución desalada se concentró entonces a aproximadamente 1 mg/mL de solución.

EJEMPLO 38 Compuesto 40 A una solución del compuesto 39 (1 eq.) en agua se le agregó ditiotreitol (2 eq.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y después se eliminó el disolvente. El material crudo se cristalizó de isopropanol y después se mezcló con Oligo-S-S-Py (3 eq.) en amortiguador de fosfato 100 mM, pH 6.5, a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se purificó en una resina Source 15S. La columna se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se liofilizó y se desaló en una columna de desalación HiPrep con PBS 50 mM (pH 7.4). La solución desalada se concentró entonces hasta aproximadamente 1 mg/mL de solución.

EJEMPLO 39 Compuesto 41 Se disolvió 20kPEG-OH (8 brazos) (2.0 g, 0.1 mmol) en DCM (20 mL). Se le agregó TEA (1 .62 g, 16.0 mmol). Esta solución se agregó a cloruro de acriloilo (0.724 g) en DCM (10 mL) a 0 °C durante 1 hora. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante la noche. Esta solución se agregó a IPA/éter (250 mL / 250 mL) a 0 °C. El sólido formado se filtró. El sólido húmedo se disolvió en DCM y se lavó con HCI 0.4 N. La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio y se filtró a través de celite. El disolvente se eliminó y el residuo se recristalizó de DCM/éter. 13C RMN (75.4 MHz, CDCI3): d 165.5, 130.5, 127.8, 71.0-67.1 (PEG), 63.2.

EJEMPLO 40 Compuesto 42 A una solución de C6-tio-LNA-survivin (100 mg, 0.018 mmol) en 60 mL de amortiguador de fosfato pH 8.0, se le agregó el compuesto 41 (3.6 g, 0.18 mmol), y la solución se agitó 1 hora a temperatura ambiente. El avance de la reacción se verificó por HPLC de intercambio aniónico. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y se cargó en una columna de intercambio aniónico Poros. El producto se eluyó usando un gradiente con el sistema amortiguador Tris.HCI 20 mM, NaCI 2M, a pH 7.0. El rendimiento después de la desalación fue de 60 mg (eq. oligo).

EJEMPLO 41 Compuesto 43 El compuesto 42 (8 mg, 0.0014 mmol, eq. oligo) se mezcló con SH-TAT-RGD (1 1 1 mg, 0.0496 mmol) en 3 mL de amortiguador (urea 5M, KH2P04 100 mM) bajo nitrógeno. La reacción procedió durante 2 horas. El producto crudo se purificó sobre resina Source 5S. La columna se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2PO4 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se desaló en una columna de desalación HiPrep, se liofilizó y produjo 57 pg.

EJEMPLO 42 Compuesto 46 A 1 ,2-di(pir¡din-2-il)disulfano (compuesto 44) (8.8 g, 39.9 mmol) en 50 mL de acetato de etilo anhidro, se le agregó ácido 3-mercaptopropanoico (4.2 g, 39.9 mmol) en la oscuridad, seguido por 13 gotas de eterato de trifluoroborano. La reacción se agitó durante 5 horas en la oscuridad y después se filtró. Después se agregaron al sólido 50 mL de acetato de etilo frío. Después, el filtrado se evaporó en un rotavapor hasta aproximadamente 50 mL de solución del compuesto 45. A esta solución se le agregó carbazato de t-butilo (4.8 g, 36.3 mmol), seguido por DCC (7.5 g, 36.3 mmol). La reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente en la oscuridad y después se filtró, se evaporó y se purificó por cromatografía en columna, usando una mezcla 1 : 1 de hexano/acetato de etilo, para dar 8.1 g de producto del compuesto 46. 13C RMN d 170.1 , 158.9, 155.2, 149.5, 137.0, 121 .1 , 120.4, 81 .5, 34.9, 33.7, 28.2.

EJEMPLO 43 Compuesto 47 A 2-(3-(piridin-2-ildisulfanil)propanoil)hidrazincarboxilato de ter-butilo (compuesto 46) (8.1 g, 24.6 mmol) en 64 mL de DCM se le agregaron 16 mL de TFA a O °C. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de terminada la reacción el disolvente se evaporó en un rotavapor y el residuo se precipitó de 20/300 mL de DCM/Et2O a 0 °C. El sólido se filtró y se secó para obtener 5.5 g del compuesto 47: 3C RMN d 173.8, 159.6, 147.9, 138.5, 121.1 , 120.7, 33.4, 32.2.

EJEMPLO 44 Compuesto 49 A 3,3-dietoxipropan-1 -amina (compuesto 48) (5.2 g, 35.3 mmol) en 30 mL de DCM, se le agregó Fmoc-OSu (24 g, 70.6 mmol) a 0 °C, y después se calentó a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente hasta que no se observó material inicial en una TLC. Después, la reacción se diluyó con 30 mL de agua DI. La capa acuosa se extrajo con 2 x 30 mL de DCM y entonces la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó por cromatografía en columna usando DCM como el disolvente de elución para obtener 5.7 g del compuesto 49: 13C RMN d 156.2, 143.9, 141.2, 127.5, 126.9, 125.0, 1 19.8, 102.2, 66.5, 61 .8, 47.3, 37.2, 33.3, 15.4.

EJEMPLO 45 Compuesto 50 El compuesto 49 (200 mg) se agitó en ácido fórmico al 86% (1 .1 ml_) durante 1 hora a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó en un Rotavapor a temperatura ambiente al vacío y el residuo se disolvió en DCM (30 ml_). La solución se lavó con agua (30 ml_). La capa orgánica separada se secó con sulfato de magnesio. El disolvente se eliminó completamente para dar el compuesto 50 como un sólido blanco (145 mg): 13C RMN d 156.2, 143.7, 141.2, 127.6, 126.9, 124.9, 119.9, 66.7, 47.2, 44.1 , 34.5.

EJEMPLO 46 Compuesto 51 El compuesto 47 (258.3 mg, 0.8746 mmol) y el compuesto 50 (300 mg, 0.8746 mmol) se disolvieron en THF (15 mL). Se agregaron tamices moleculares. La reacción se terminó en 10 minutos. Los tamices moleculares se filtraron después de la reacción. El disolvente se eliminó y el residuo se lavó con éter etílico, para dar el compuesto 51 crudo (385 mg).

EJEMPLO 47 Compuesto 52 Sin más purificación, el compuesto 51 (270 mg, 0.53 mmol) se trató con DMAP (0.54 g) al 10% (p/v) en DMF (5.4 mL), bajo nitrógeno, a temperatura ambiente, durante 8.5 horas, para dar el compuesto 52. A la mezcla de reacción se le agregó in situ 20kSCPEG (8 brazos) (650 mg, 0.033 mmol). La reacción se dejó a temperatura ambiente durante toda la noche. El disolvente se eliminó y el residuo se precipitó con DCM/éter. El sólido húmedo aislado se recristalizó de acetonitrilo/IPA dos veces para dar el compuesto 10 (630 mg), con isómeros E y Z: 13C RMN d 172.1 , 166.8, 159.7, 1 59.1 , 156.0, 149.1 , 149.0, 144.8, 1 36.9, 136.7, 120.7, 120.3, 1 19.7, 1 19.3, 78.0-69.2 (PEG), 63.5, 37.6, 37.5, 34.4, 34.1 , 33.2, 32.8, 32.4, 32.1 .

EJEMPLO 48 Compuesto 54 A una solución de C6-tio-LNA-survivin (10 mg, 0.0018 mmol) en 5 mL de amortiguador de fosfato pH 7.0, se le agregó el compuesto 53 (0.36 g, 0.01 8 mmol), y la solución se agitó 1 hora a temperatura ambiente. El avance de la reacción se verificó por HPLC de intercambio aniónico. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras y se cargó en una columna de intercambio amónico Poros. El producto se eluyó con un gradiente usando el sistema amortiguador Tris.HCI 20 mM, NaCI 2M, a pH 7.0. El rendimiento después de la desalación fue de 2 mg (eq. oligo).

EJEMPLO 49 Compuesto 55 El compuesto 54 (3 mg, 0.00053 mmol, eq. oligo) se mezcló con SH-TAT-RGD (16.7 mg, 0.00743 mmol) en 1 mL de amortiguador de fosfato pH 7.0 bajo nitrógeno. La reacción procedió durante 2 horas. El producto de reacción se purificó en una resina Source 15S. La columna se equilibró con un amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con un amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se desaló en una columna de desalación HiPrep y se liofilizó.

EJEMPLO 50 Compuesto 56 A una solución de 20KPEGNHS (4 brazos) (5 g, 0.25 mmol) en 50 mL de DCM anhidro, se le agregó dietilacetal de 4-aminopropionaldehido (0.04 g, 0.275 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. El disolvente se evaporó al vacio y el compuesto crudo se cristalizó con acetonitrilo/IPA, para dar el compuesto 56 como un sólido blanco (4.7 g): 13C RMN d 168.17, 155.87, 151.38, 101 .37, 70.21 , 69.89, 63.46, 61.29, 45.22, 36.78, 33.24, 25.19, 15.12.

EJEMPLO 51 Compuesto 57 A una solución del compuesto 30 (0.36 g, 0.1 17 mmol) en 10 mL de DCM anhidro, se le agregó DIPEA (0.40 mL, 0.233 mmol) a temperatura ambiente. A la mezcla agitada se le agregó una solución del compuesto 56 (4.00 g, 0.0194 mmol) en 30 mL de DCM anhidro, seguido por DMF (13 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo resultante se precipitó con DCM/éter etílico. El compuesto crudo se recristalizó con acetonitrilo/IPA, para dar el compuesto 57 como un sólido blanco (3.6 g): 13C RMN d 170.74, 156.53, 155.49, 153.75, 142.27, 133.69, 121.08, 101 .44, 70.66, 69.70, 69.17, 63.89, 63.51 , 62.71 , 61 .34, 53.37, 52.91 , 45.27, 41.74, 36.84, 33.27, 25.15, 15.15.

EJEMPLO 52 Compuesto 58 A una solución del compuesto 57 (0.70 g, 0.034 mmol) en cloroformo, se le agregó ácido fórmico (85%) (0.15 mL) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. El disolvente se evaporó al vacío. El aceite crudo se trituró con éter para dar el compuesto 58 como un sólido amarillo claro (0.65 g): 13C RMN: d 170.72, 161.87, 160.59, 156.59, 55.57, 153.76, 142.33, 133.75, 121 .14, 70.30, 69.75, 69.19, 68.59, 63.98, 63.75, 62.77, 61 .40, 53.55, 52.93, 45.31 , 43.88, 41 .76, 34.26.

EJEMPLO 53 Compuesto 59 El compuesto 58 (53 mg, 0.026 mmol) se hizo reaccionar con hidrazida de C10-survivin (6 mg, 0.885 pmol) en 2 mL de amortiguador de fosfato, pH 7.0. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 2 horas. El material crudo se purificó sobre Poros con la fase móvil A: 20 mmol Tris, pH 7.0, y B: 20 mmol Tris, NaCI 2M, pH 7.0; y después se desaló con agua; rendimiento de 1 .5 mg (eq. oligo). Se disolvieron 1 .2 mg (eq. oligo) de este material en 0.5 mL de amortiguador (urea 5M, KH2P04 100 mM). Se le agregó SH-TAT (2.3 mg, 0.00138 mmol) bajo nitrógeno. La reacción procedió durante 1 .5 horas, seguido por purificación en una resina Source 15S. La columna se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2PO4 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se desaló en una columna de desalación HiPrep con PBS pH 7.4 y se liofilizó; rendimiento 250 pg (eq. oligo).

EJEMPLO 54 Compuesto 60 A una solución de 4-hidroxi-3,5-dimetil-benzaldehído (1 .36 g, 10 mmol) en metanol anhidro (5 mL), se le agregó tetrafluoroborato de litio 1.0 M (0.3 mL), seguido por ortoformiato de trimetilo (1.378 g, 13 mmol). La mezcla de reacción se puso a reflujo durante 3 horas y después se desactivó agregando una solución saturada de bicarbonato de sodio (20 mL). La mezcla se extrajo con acetato de etilo dos veces (60 mL, 30 mL). La capa orgánica combinada se lavó con cloruro de sodio saturado (20 mL) y se secó sobre MgS04. Después de filtrar, el disolvente se evaporó al vacío, para dar el compuesto 60.

EJEMPLO 55 Compuesto 62 A una solución del compuesto 61 (10 g, 0.25 mmol) en DCM anhidro (100 mL) se le agregó el compuesto 60 (50.0 mg, 0.275 mmol), seguido por DMAP (33.6 mg, 0.275 mmol). La mezcla se puso en reflujo durante la noche. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se recristalizó con DCM/éter. El sólido húmedo se aisló y se recristalizó de CNCH3/IPA, para dar el compuesto 62.

EJEMPLO 56 Compuesto 63 A una solución del compuesto 62 (10 g, 0.25 mmol) en DCM anhidro (100 mL), se le agregó el compuesto 18 (342 mg, 1.5 mmol), seguido por DMAP (183 mg, 1 .5 mmol). La mezcla se puso en reflujo durante la noche. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se cristalizó con DCM/éter. El sólido húmedo se aisló y se recristalizó de CNCH3/IPA para dar el compuesto 63.

EJEMPLO 57 Compuesto 64 El compuesto 63 (0.7 g, 0.0175 mmol) se disolvió en cloroformo (0.6 mL). Se le agregó ácido fórmico (85%, 0.15 mL). La mezcla se agitó durante la noche. El disolvente se evaporó al vacio y el residuo se recristalizó de DCM/éter para dar el compuesto 64.

EJEMPLO 58 Compuesto 65 El compuesto 64 se mezcló con SH-TAT-RGD en amortiguador de fosfato pH 7.0 bajo nitrógeno. La reacción procedió durante 2 horas. El producto crudo se purificó en una resina Source 15S. La columna se equilibró con amortiguador A (urea 5M, KH2P04 100 mM, 25% de CH3CN, pH 6.5). El producto se eluyó con amortiguador B (KBr 2M). El producto recogido se desaló en una columna de desalación HiPrep y se liofilizó.

EJEMPLO 59 Compuesto 68 A una solución de PEG-SC (8 brazos) (5.5 g, 0.26 mmol) en 1 15 mL de DCM anhidro, se le agregó el compuesto 66 (1 17.2 mg, 0.28 mmol, 1 .1 eq.). La mezcla de reacción se agitó durante la noche y después se le agregó el compuesto 67 (1 .75 g, 4.52 mmol, 17.5 eq.) en 60 mL de THF, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 días. El disolvente se eliminó al vacío y el sólido resultante se recristalízó dos veces con IPA para dar el compuesto 68 (4.4 g): 13C RMN d 27.93, 35.19, 37.27, 52.53, 52.87, 53.03, 56.26, 56.64, 61.09, 62.77, 63.60, 69.35-70.51 (PEG), 126.67, 127.78, 128.73, 137.38, 155.87, 169.47.

EJEMPLO 60 Compuesto 69 El compuesto 68 se agregó a una mezcla disolvente de TFA/DCM (50/100 mL), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se removió al vacío y el residuo se precipitó agregando éter etílico. El sólido se filtró y se recristalízó con IPA para dar el ácido carboxílico del compuesto 3 (4.6 g): 13C RMN d 33.88, 35.54, 48.65, 49.72, 50.68, 51.48, 56.47, 56.85, 59.67, 61 .05, 64.18, 69.05-70.36 (PEG), 128.79, 129.81 , 1 56.43, 169.30. A una solución a 0 °C del ácido carboxílico (3.3 g, 0.14 mmol, 1 eq.) y 3,5-dimet¡l-4-hidroxi-bencil-OTBS (1 14 mg, 0.43 mmol, 3 eq.) en 52 mL de DCM anhidro, se le agregó DMAP (105 mg, 0.86 mmol, 6 eq.) y EDC (1 10 mg, 0.57 mmol, 4 eq.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo se precipitó con DCM/éter etílico. El sólido resultante se filtró y se recristalizó con IPA para dar el compuesto 69 (3 g): 13C RMN d -5.29, 16.35, 25.86, 34.15, 36.34, 50.01 , 51 .36, 52.12, 56.67, 56.93, 60.54, 61 .52, 63.92, 64.21 , 69.25-71 .34 (PEG), 125.98, 127.88, 128.12, 128.36, 129.23, 156.17, 169.90.

EJEMPLO 61 Compuesto 70 El compuesto 69 (3 g) se disolvió en 12 mL de acetonitrilo y 6 mL de agua, seguido por 30 mL de ácido acético. La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente, seguido por eliminación de disolvente al vacío. El sólido se precipitó con éter y después se recristalizó de DMF/IPA, para dar el alcohol desprotegido. El alcohol (2.7 g, 0.08 mmol, 1 eq.) se disolvió en 3 mL de DMF y 30 mL diclorometano, seguido por enfriamiento de la solución a 0°C. Después se le agregó DSC (170 mg, 0.65 mmol, 8 eq.), y después piridina (46 µ?, 0.57 mmol, 7.2 eq.). La mezcla de reacción se calentó gradualmente a temperatura ambiente durante la noche. El DCM se eliminó parcialmente al vacío, seguido por precipitación del sólido con éter. Después, el sólido se recristalizó de DMF/IPA, para dar el compuesto 70 (2.3 g).

EJEMPLO 62 Compuesto 71 A una solución de oligo-NH2 (3 mg, 0.5 µ?t???) en amortiguador PBS (1.5 mL, pH 7.8), se le agregó el compuesto 70 (140 mg, 5 µ????), y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó a 10 mL con agua y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Poros HQ (10 mm x 1 .5 mm, volumen de lecho -16 mL), que previamente se equilibró con amortiguador Tris-HCI 20 mM, pH 7.0 (amortiguador A). La columna se lavó con 3-4 volúmenes de columna del amortiguador A para eliminar el exceso de enlazador de PEG. Después, el producto se eluyó con un gradiente de 0% a 100% de NaCI 1 M en amortiguador de Tris-HCI 20 mM, pH 7.0, amortiguador B en 10 minutos, seguido por 100% de amortiguador B durante 10 minutos, a una velocidad de flujo de 10 mL/min. El producto eluido se desaló usando una columna de desalación HiPrep (50 mL) y se liofilizó para dar el compuesto 71 ; rendimiento 2.2 mg (equivalente de oligonucleótido, 73%).

Datos Biológicos EJEMPLO 63 Incorporación celular in vitro del compuesto 23a-H-R1 Para determinar el efecto de la conjugación de oligonucleótidos con el polímero de PEG que incluye las porciones cargadas positivamente se midió la incorporación celular en células cancerosas. El conjugado de la invención (23a-ll-R1 ) contiene siete brazos unidos a C-TAT (SEQ ID NO: 1 ), y un brazo unido al oligonucleótido de antisentido de BCL-2 5' TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO: 6). El conjugado de control es similar al compuesto 23a-ll-R1 , pero no contiene la porción TAT cargada positivamente. Tanto los oligonucleótidos del compuesto 101 como los oligonucleótidos de control se marcaron con FITC mediante los métodos provistos por el proveedor. Células de cáncer de pulmón humano A549 con medio de crecimiento FBS al 10% en una placa de 4 pocilios, se incubaron durante la noche a 37 °C. Las células se transfectaron con cada uno de los compuestos de prueba, se lavaron tres veces con PBS y se les agregó 50% de glicerol en PBS (20 mi de glicerol 100% + 20 mi de PBS), para cubrir las células sobre los portaobjetos. Los portaobjetos se guardaron a 4 °C durante la noche. Se usó microscopía fluorescente y microscopía confocal para mostrar la incorporación de los PEG-oligonucleótidos en las células. La incorporación celular de los compuestos de prueba se muestra en la figura 1 (imagen de microscopio fluorescente) y en la figura 2 (imagen de microscopio confocal).

Los datos muestran que las células de cáncer incorporan los agentes terapéuticos cargados negativamente, como los oligonucleótidos conjugados con los polímeros cargados positivamente. Los datos indican que el esqueleto de carga positiva de los polímeros permite a los oligonucleótidos terapéuticos atravesar la membrana celular y alcanzar el sitio objetivo en las células de tumor.

EJEMPLO 64 Eficiencia de la incorporación celular de 23a-ll-R1 El compuesto 23a-ll-R1 se usó para mostrar la eficiencia de incorporación celular del compuesto con o sin agentes de transfección. Células de cáncer de pulmón humano A549 en un medio que contenía 10% del medio de crecimiento FBS en una placa de 6 pocilios, se incubaron durante la noche a 37 °C. Posteriormente, el medio se retiró y las células se trataron con 1 ml/pocillo de medio de crecimiento de 10% de FBS que contenía cada uno de los compuestos de prueba. El compuesto de control es un oligonucleótido, el oligonucleótido de antisentido de BCL-2 (SEQ ID: 7), no conjugado al polímero ni a la porción cargada positivamente. Los compuestos de la invención y los de control se marcaron con FITC para mostrar la incorporación celular de los compuestos. Los resultados se dan en la figura 3. Los oligonucleótidos unidos al compuesto 23a-ll-R1 fueron tomados por las células más que los oligonucleótidos de control sin agentes de transfección. La incorporación celular de oligonucleótidos conjugados con el polímero cargado positivamente, mejoró significativamente cuando el medio contenía suero, lo que es similar al medio in vivo, en comparación con el oligonucleótido simple. Los resultados indican que los polímeros de la invención aumentan el suministro de los agentes terapéuticos cargados negativamente, tales como oligonucleótidos, a las células objetivo, y por lo tanto la terapia basada en oligonucleótidos se puede beneficiar de esta ventaja.

EJEMPLO 65 Incorporación celular de 23a-ll-R1 y 23a-ll-R2 dependiente de la dosis Para demostrar la eficiencia de la incorporación celular de los oligonucleótidos conjugados con polímeros cargados positivamente se usó citometría de flujo. Las células de cáncer de pulmón humano A549 en un medio que contenía medio de crecimiento FBS al 10% en una placa de 6 pocilios, se incubaron durante la noche a 37 °C. Posteriormente, el medio se retiró y las células se trataron con 1 ml/pocillo de medio de crecimiento FBS al 10% que contenía cada uno de los compuestos 23a-ll-R1 y los oligonucleótidos simples (SEQ ID NO:6). Después del tratamiento, las células se cosecharon, se sometieron a tripsinación, se lavaron con PBS BSA 1 % tres veces y se analizaron usando FACS. El oligonucleótido del compuesto 101 y los oligonucleótidos de control se marcaron con FITC.

Los resultados se muestran en la figura 4. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos conjugados con el polímero cargado positivamente que contienen TAT (23a-ll-R1) o Arg9 (23a-ll-R2), fueron incorporados por las células de manera dependiente de la dosis. Esta propiedad puede ser ventajosa en el tratamiento del cáncer porque los clínicos pueden ajustar la dosis de los oligonucleótidos terapéuticos dependiendo de las necesidades del paciente.

EJEMPLO 66 Regulación negativa del ARNm de BCL2 con 23a-ll-R1 Este estudio se realizó para determinar si los oligonucleótidos incorporados por las células de cáncer regulan negativamente la expresión específica de genes involucrados en el cáncer. Células A431 se transfectaron con oligonucleótidos simples y el compuesto 23a-l-R1 sin agente de transfección. El conjugado de polímero cargado positivamente contiene siRNA de TAT y BCL2. El análisis de RT-PCR del ARNm de BCL2 se muestra en la figura 5. Estos resultados muestran que tanto los oligonucleótidos del compuesto 102 como los de control regulan negativamente la expresión del ARNm de BCL2, de manera dependiente de la dosis, en las células de cáncer de pulmón humano. El conjugado de síRNA de BCL2 con los polímeros cargados positivamente mostró una regulación negativa significativamente más alta de la expresión del ARNm de BCL2, en comparación con siRNA de Bcl2 simple. Los resultados indican que los conjugados de PEG-oligonucleótido, que incluyen los oligonucleótidos de antisentido o siRNA aquí descritos, permiten el uso de siRNA como agente terapéutico.

EJEMPLO 67 Regulación negativa del ARNm de Survivin con fRGD-TATC-S-Sl7- 20KPEG(8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin en el modelo de células A549 (tumor sólido, cáncer de pulmón) Este estudio se realizó para determinar los efectos de los polímeros cargados positivamente sobre la expresión del ARNm de Survivin. Células de pulmón humano A549 se transfectaron con cada uno de los compuestos 33b-l-R4, 33b-l-R5 y 33a-l-R3, en concentraciones de 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM y 1 .6 nM. Los compuestos 33b-l-R4 ([RGD lineal-S-S]3-20KPEG(4 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin) y 33b-l-R5 ([RGD cíclico-S-S]3-20KPEG (4 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin) contienen el LNA de antisentido Survivin, pero no incluyen el péptido cargado positivamente (TAT). El compuesto 33a-l-R3 ([RGD-TATC-S-S]7-20KPEG (8 brazos)-SS-LNA de antisentido de Survivin) incluye el péptido TAT y LNA de antisentido de Survivin. La expresión del ARNm de Survivin en las células A549 tratadas con cada uno de los compuestos se midió por medio RT-PCR un día después del tratamiento. El compuesto que incluye el péptido TAT reguló negativamente de forma significativa la expresión del ARNm de Survivin, sin el agente de transfección. La regulación negativa fue dependiente de la dosis. Estos resultados se muestran en la figura 6. Ni el LNA de antisentido de Survivin de los compuestos sin el péptido TAT, ni el LNA de antisentido de Survivin simple inhibieron la expresión del ARNm de Survivin. Los datos muestran que los polímeros cargados positivamente son benéficos para el tratamiento utilizando oligonucleótidos cargados negativamente.

EJEMPLO 68 Regulación negativa del ARNm de Survivin con (RGD-TATC-S-S17-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido en un modelo de células DU145 (tumor sólido, cáncer de próstata) Células DU 145 se transfectaron con los mismos compuestos usados en el ejemplo 67. Como en el ejemplo 67, el compuesto que contiene el péptido TAT mostró una regulación negativa significativa de la expresión del ARNm de Survivin. Ni el LNA de antisentido de Survivin simple ni el LNA de antisentido de Survivin de los compuestos sin el péptido cargado positivamente reguló negativamente la expresión del ARNm de Survivin en las células DU145. Estos resultados se muestran en la figura 7. Los datos indican que los polímeros cargados positivamente pueden ser benéficos para el tratamiento de varios tipos de cáncer. La regulación negativa del ARNm de Survivin se observó similarmente en el estudio con el compuesto 33a-l-R1 ((TATC-S-S)7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin) en las células DU145.

EJEMPLO 69 Regulación negativa del ARNm de Survivin con f(Arg)9C-S-S17-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin en el modelo de células A549 Células de cáncer de pulmón humano A549 se transfectaron con cada uno de los compuesto 33a-l-R2 y LNA de antisentido de Survivin simple. El compuesto 33a-l-R2 ([(Arg)9C-S-S]7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin) incluye siete terminales de brazo de polímero unidas a C(Arg)g y una terminal de brazo unida al LNA de antisentido de Survivin por medio del enlace disulfuro liberable intracelular. También se transfectaron los oligonucleótidos simples (LNA de antisentido de Survivin) con el agente de transfección lipofectamina. El compuesto que incluye (Arg)9 reguló negativamente de forma significativa la expresión del ARNm de Survivin sin el agente de transfección. Los resultados se muestran en la figura 8. Los datos indican que los polímeros de la invención que contienen el péptido cargado positivamente, tal como TAT y (Arg)g, permiten que los oligonucleótidos terapéuticos sean suministrados a un sitio objetivo dentro de las células. La terapia anticancerosa basada en oligonucleótido se puede beneficiar de los polimeros cargados positivamente.

EJEMPLO 70 Regulación negativa del ARNm de Survivin con polímeros cargados positivamente gue contienen enlazadores lábiles intracelulares Células A549 se transfectaron con el compuesto 59 y el dímero de LNA de antisentido de Survivin. El dímero del LNA de antisentido de Survivin modificado con una cola de C6-SH (LNA de antisentido de Survivin-C6-S-S-C6-LNA de antisentido de Survivin) también se transfectó con el agente de transfección. El compuesto 59 contiene un enlazador liberable basado en hidrazona. En la figura 9 se muestran los resultados de la regulación negativa del ARNm. El LNA de antisentido de Survivin unido a los polímeros por medio del enlazador de hidrazona reguló negativamente la expresión del ARNm de Survivin. Los datos indican que los oligonucleótidos de antisentido unidos por medio del enlazador de hidrazona pueden ser liberados de los polímeros dentro de la célula después de atravesar la membrana celular. Indican que en los polímeros se pueden utilizar varios tipos de enlazadores liberables, tales como enlace disulfuro, y enlazadores basados en hidrazona, para modificar la velocidad y sitio de liberación de los oligonucleótidos de antisentido desde los polímeros.

EJEMPLO 71 Regulación negativa del ARNm de Survivin con ÍRGD-TATC-S-S17-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin en el modelo de células A549 Este estudio se realizó para determinar si los polímeros cargados positivamente que contienen un agente de dirección son tan efectivos como los polímeros cargados positivamente sin un agente de dirección, y por lo tanto si los polímeros que contienen el agente de dirección se pueden utilizar para suministro dirigido. Células A549 se transfectaron con los compuestos 33a-l-R1 (TATC-S-S)7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin) y 33a-l-R3 ([RGD-TATC-S-S]7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin). En los compuestos 33a-l-R1 y 33a-l-R3, termínales de siete brazos de polímero están unidas a C-TAT y C-TAT-RGD, respectivamente. Las células también se transfectaron con el LNA de antisentido de Survivin modificado con una cola de SH-C6, con o sin el agente de transfeccíón. Ambos polímeros, con o sin el agente de dirección, regularon negativamente la expresión del ARNm de Survivin. Los resultados se muestran en la figura 10. Esta característica de los polímeros cargados positivamente es benéfica para el suministro dirigido de agente de dirección en la terapia de oligonucleótidos.

EJEMPLO 72 Inhibición específica de la expresión del ARNm de Survivin Este estudio se realizó para determinar si los oligonucleótidos inhiben selectivamente la expresión del gen después de atravesar la membrana de la célula cancerosa. Células de cáncer de pulmón humano A549 se transfectaron con los compuestos 33a-l-R1 (TATC-S-S)7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin), 33a-ll-R1 (TATC-S-S)7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de Survivin alterado), y el LNA de antisentido de Survivin simple. El compuesto 33a-ll-R1 corresponde al compuesto 33a-l-R1 , excepto que incluye nucleótidos discordantes dentro del LNA de antisentido de Survivin (LNA de Survivin alterado: 5'-smCsGsmCsAsgsaststsasgsasasAsmCsmCst -3'). El LNA de antisentido de Survivin simple también se transfectó con el agente de transfección. Los resultados se muestran en la figura 1 1 . Los resultados muestran que el LNA de antisentido de Survivin del compuesto 33a-l-R1 inhibe significativamente la expresión de ARNm de Survivin en comparación con el LNA de antisentido de Survivin discordante del compuesto 33a-ll-R1 , y con el LNA de antisentido de Survivin simple. El LNA de antisentido de Survivin que contiene nucléotidos discordantes no inhibe la expresión del gen de Survivin. La regulación negativa del ARNm es una inhibición específica. Esta característica es deseable para que la expresión de un gen no deseado sea regulada de forma selectiva en el tratamiento del cáncer.

EJEMPLO 73 Regulación negativa in vivo de Survivin en el tumor Calu-6 La eficacia de regulación negativa de Survivin de tres análogos de PEG que contienen LNA de antisentido de Survivin, se evaluó en ratones con xenoinjerto de células de tumor Calu-6 . Cada grupo se trató con los compuestos 33a-l-R1 (TATC-S-S)7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin), 33a-l-R3 ([RGD-TATC-S-S]7-20KPEG (8 brazos)-SS-LNA de antisentido de Survivin), o 33a-l-R2 ([(Arg)9C-S-S]7-20KPEG (8 brazos)-S-S-LNA de antisentido de Survivin). Después del tratamiento, los tejidos de tumor se extirparon después de sacrificar a los ratones, y se midió la expresión del ARNm de Survivin. Los tres polímeros que incluían LNA de antisentido de Survivin inhibieron significativamente la expresión del ARNm de Survivin en los tejidos de tumor, en comparación con el LNA de antisentido de Survivin simple. Los resultados se muestran en la figura 12. Los resultados demuestran que los oligonucleótidos unidos a los polímeros cargados positivamente son significativamente más eficaces que el LNA de antisentido de Survivin simple en el tratamiento del cáncer, tal como un tumor sólido.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un compuesto de fórmula (I): {Z2}b R-i {Zi}a en donde: cada Zi es independientemente (L"i)i (B, )c (L, )d-(L"2)e..— (R'2)g.— (L2)e— R4 h cada Z2 es un grupo bloqueador seleccionado independientemente de (?'·"?)G-(?"?)?·? es un polímero sustancialmente no antigénico; R2 y R'2 son péptidos que contienen carga positiva seleccionados independientemente, o porciones de ciclohidrocarburo que contienen nitrógeno; R3 y R'3 son agentes de dirección seleccionados independientemente; R es una porción biológicamente activa; ?? , ?? y ?'? son grupos de ramificación seleccionados independientemente; L ?_? , L", LI'" y ?_ " son enlazadores bifuncionales seleccionados independientemente; L2, L'2 y L"2 son enlazadores liberables seleccionados independientemente; (a) es un entero positivo; (b) es cero o un entero positivo; (c), (c') y (c") son independientemente cero o un entero positivo; (d), (d'), (i), (i') y (i") son independientemente cero o un entero positivo; (e) es un entero positivo; (e') y (e") son independientemente cero o un entero positivo; (f) y (f) son independientemente cero o un entero positivo; (g) es un entero positivo; (g') es cero o un entero positivo; y (h) y (h') son independientemente enteros positivos; con la condición de que (g') es un entero positivo cuando (b) no es cero y todos los Z2 son grupos bloqueadores, (L""1 ),.-(B"1 )C.. o en combinación. 2 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la fórmula: 3.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la suma de (a) y (b) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 32. 4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la suma de (a) y (b) es 2, 3, 4, 8, 16 ó 32. 5. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Z2 es un grupo bloqueador y (a) y (g') son 1. 6. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque (a) es 1 y (b) es un entero positivo de 1 a 7. 7 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en porciones que contienen -NH2, porciones que contienen -OH, y porciones que contienen -SH. 8. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en compuestos farmacéuticamente activos, enzimas, proteínas, oligonucleótidos, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena, y péptidos. 9. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción biológicamente activa comprende un oligonucleótido. 10.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en: oligonucleótidos de antisentido, ácidos nucleicos cerrados (LNA), ARN interferente pequeño (siRNA), micro-ARN (miARN), aptámeros, ácido nucleico péptido (PNA), oligonucleótidos de fosforodiamidato de morfolino (PMO), triciclo-ADN, oligonucleótido de doble cadena (ODN señuelo), ARN catalítico (ARNi), aptámeros, oligonucleótidos Spiegelmer, oligómeros de CpG, y en combinación. 1 1 . - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en oligonucleótidos de antisentido de Bc1 -2, oligonucleótidos de antisentido de HIF-1 a, y oligonucleótidos de antisentido de Survivin. 12. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 aminoácidos cargados positivamente. 13. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 aminoácidos cargados positivamente. 14. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido comprende CYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1 ) o CRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 2). 15. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ciclohidrocarburo que contiene nitrógeno tiene la fórmula: en donde: (aa) es un entero positivo de aproximadamente 2 a aproximadamente 10; (bb) es 1 , 2 ó 3; (ce) es 1 ó 2; (dd) es un entero positivo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5; R101 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo de Ci_6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo de C3.19 ramificado, cicloalquilo de C3.8, alquilo de C^ sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2.6 sustituido, cicloalquilo de C3-8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de Ci-6l heteroalquilo de C -6 sustituido, alcoxi de C^, ariloxi, heteroalcoxi de Ci.6, heteroariloxi, alcanoilo de C2-6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2-6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido, alcanoiloxi sustituido y arilcarboniloxi; y (q) es un entero positivo de aproximadamente 2 a aproximadamente 30. 16.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el ciclohidrocarburo que contiene nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en: 17. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente de dirección se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos monoclonales, anticuerpos de una sola cadena, péptidos de adhesión celular, péptidos penetradores de célula, ligandos de receptor, moléculas de carbohidrato de dirección o lectinas, y oligonucleótidos. 18. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente de dirección se selecciona del grupo que consiste en péptido de RGD, Selectin, TAT, Penetratin, (Arg)9 y ácido fólico. 19.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque ?? y ?? se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: (le) (lf) (lg) (Ih) en donde: R5 se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo ramificado de C3_ig, cicloalquilo de C3-8, alquilo de C -6 sustituido, alquenilo de C2-6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de C^e, heteroalquilo de Ci_6 sustituido, alcoxi de Ci.6, ariloxi, heteroalcoxi de d-6, heteroariloxi, alcanoilo de C2-6 , arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2-6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2_6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2-6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2.6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2_6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido; (d ), (c2), (c3), (c4) , (c5), (c6), (c'6) , (c"6), (c7) y (c8) son independientemente cero o un entero positivo; y (d 1 ), (d2), (d3), (d4), (d5) y (d7) son independientemente cero o un entero positivo. 20.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque B-\ y ?? se seleccionan independientemente del grupo que consiste en. 21 .- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque l_i y ?_? se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un aminoácido y un derivado de aminoácido. 22 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque l_i y ?_? se seleccionan independientemente del -[C(=0)]vO(CR22R23),0[C(=0)]v-; -[C(=0)]vO(CR22R23),NR26[C(=0)]v-; [C(=0)]vNR21(CR22R23)«[C(=0)]v-; -[C(=0)]vNR21(CR22R23),O[C(=0)]v -; [C(=0)]VNR21(CR22R23),NR26[C(=0)]V-; -[C(=O)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t -[C(=0)]v-; -[C(=0)]v(CR22R23),NR26-(CR2BR29MC(=0)]v-; -[C(=0)]v(CR22R23)tS-(CR28R29),-[C(=0)]v-; -[C(=0)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t-[C(=0)]v-; [C(=0)]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t.[C(=0)]v.-; -[C(=0)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29),iC(=0)]v-; -[C(=0)]vNR21(CR22R23),0-(CR2eR29),-[C(=0)]v-; [C(=0)]vNR21(CR22R23),NR26-(CR28R29MC(=0)]v-; -[C(=0)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29), [C(=0)]v-; -[C(=0)]v(CR22R23CR28R290),NR26[C(=0)]v-; -[C(=0)]v-(CR22R23CR28R290),[C(=0)}v-; -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290),NR26[C(=0)]v -, -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290),[C(=0)]v-; -[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R290)t-NR26[C(=0)]v-; -[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290),[C(=0)]v-; -[C(=0)]v-(CR22R23CR28R290),(CR24R25)f[C(=0)]v-; -[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t- [C(=0)]v(CR22R23CR28R290),(CR24R25),O[C(=0)]v-; -[C(=0)]v(CR22R23)t-(CR24R25CR28R290)t [C(=0)]v-; -[C(=0)]v(CR22R23),(CR24R25CR28R290)t -NR26[C(=0)]v-; -[C(=O)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25), O[C(=0)]v-; [C(=0)]vO(CR22R23),(CR24R25CR28R290),.[C(=0)]v-; -[C(=0)]vO(CR22R23)t- (CR24R25),O[C(=0)]v-; -[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t.[C(=O)]v-; -[C(=O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290), NR26[C(=O)]v-; en donde: R2i -29 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de C1 -6, alquilo de C3-12 ramificado, cicloalquilo de C3.8, alquilo de C1 -6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de d-6, heteroalquilo de Ci-6 sustituido, alcoxi de Ci.6, fenoxi y heteroalcoxi de C i_6; (t) y (f) son independientemente cero o un entero positivo; y (v) y (?') son independientemente cero o 1 . 23.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque l_i y ?_? se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: 24 - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque L2 y L'2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en enlazadores basados en eliminación de bencilo, enlazadores basados en cierre de trialquilo, enlazadores basados en bicina, enlazadores lábiles al ácido, péptidos escindibles por enzimas lisosomales y péptidos escindibles por catepsina B. 25.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el enlazador lábil al ácido se selecciona del grupo que consiste en un enlazador de disulfuro, un enlazador que contiene hidrazona, y un enlazador que contiene tiopropionato. 26.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque L2 y L'2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: 1 ' -Val-Cit-, -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Ala-Leu-Ala-Leu-, -Phe-Lys-, -Val-Cit-C(=0)-CH2OCH2-C(=0)-, -Val-Cit-C(=0)-CH2SCH2-C(=0)-, NHCH(CH3)-C(=0)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=0)-; en donde: ?„.19 independientemente O, S o NR48; R3i-48, R50-51 y A51 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de C^, alquilo de C3-i2 ramificado, cicloalquilo de C3-8, alquilo de C1 -6 sustituido, cicloalquilo de C3.8 sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, heteroalquilo de Ci.6, heteroalquilo de Ci_6 sustituido, alcoxi de C -6, fenoxi y heteroalcoxi de C-i. 6; Ar es una porción arilo o heteroarilo; Ln-15 son espaciadores bifuncionales seleccionados independientemente; J y J' se seleccionan independientemente de porciones transportadas activamente a una célula objetivo, porciones hidrofóbicas, porciones enlazadoras bifuncionales, y combinaciones de las mismas; (c1 1 ), (h1 1 ), (k1 1 ), (11 1 ), (m1 1 ) y (n1 1 ) son enteros positivos seleccionados independientemente; (a1 1 ), (e1 1 ), (g 1 1 ), (¡1 1 ), (o1 1 ) y (q 1 ) son independientemente cero o un entero positivo; y (b1 1 ), (x1 1 ), (x' ), (f1 1 ), (¡1 1 ) y (p1 1 ) son independientemente cero o uno. 27. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el grupo bloqueador se selecciona del grupo que consiste en H, NH2, OH, CO2H, alcoxi de C1 -6 y alquilo de d_6. 28. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R1 comprende un óxido de polialquileno lineal, ramificado, o de multibrazo. 29.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el óxido de polialquileno se selecciona del grupo que consiste en un polietilenglicol lineal, ramificado, o de multibrazo, y un polipropilenglicol lineal, ramificado, o de multibrazo. 30. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el óxido de polialquileno se selecciona del grupo que consiste en: -Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y7 , -Y7r(CH2CH2O)n-CH2C(=Y22)-Y71-, -Y7rC(=Y72)-(CH2)a2-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a2-C(=Y72)-Y71- y -Y7i-(CR71 R72)a2-Y73-(CH2)b2-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b2-Y73-(CR7i R72)a2-Y7i -, en donde Y71 y Y73 son independientemente O, S, SO, SO2, NR73 o un enlace; Y72 es O, S, o NR74; R7i-73 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de Ci-6l alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, alquilo ramificado de C3.i9, cicloalquilo de C3-8, alquilo de Ci-6 sustituido, alquenilo de C2.6 sustituido, alquinilo de C2-6 sustituido, cicloalquilo de C3_8 sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroalquilo de Ci_6, heteroalquilo de Ci.6 sustituido, alcoxi de C1.6, ariloxi, heteroalcoxi de Ci-6, heteroariloxi, alcanoilo de C2-6, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo de C2.6, ariloxicarbonilo, alcanoiloxi de C2_6, arilcarboniloxi, alcanoilo de C2.6 sustituido, arilcarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2.6 sustituido, ariloxicarbonilo sustituido, alcanoiloxi de C2-6 sustituido y arilcarboniloxi sustituido; (a2) y (b2) son independientemente cero o un entero positivo; y (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2300. 31 . - El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el óxido de polialquileno comprende un polietilenglicol de la fórmula -O-(CH2CH2O)n-, en donde (n) es un entero de aproximadamente 10 a aproximadamente 2,300. 32. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Ri tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2,000 Dalton a aproximadamente 100,000 Dalton. 33. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 60,000 Dalton. 34. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Ri tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 5,000 Dalton a aproximadamente 25,000 Dalton, o de aproximadamente 20,000 Dalton a aproximadamente 45,000 Dalton. 35. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en: en donde: (e) es 1 ó 2; (e') es 0, 1 ó 2; y (f) es 0 ó 1 ; y en donde (g') es un entero positivo. 36.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene la fórmula: CH30-(CH2CH20)n Z Z -(CH2CH20)n Z en donde cada Z es ?? o Z2, en donde cada ? es independientemente: -(L",)¡ (B,)e (Li)d-(L"2)e— (R'2)g — (L2)e— R4 cada Z2 es un grupo bloqueador seleccionado independientemente, L2, L'2 y L"2 son independientemente enlazadores liberables seleccionados del grupo que consiste en un enlazador de disulfuro, enlazadores que contienen hidrazona, enlazadores que contienen tiopropionato, enlazadores basados en eliminación de bencilo, enlazadores basados en cierre de trialquilo y enlazadores basados en bicina, péptidos escindibles por enzimas lisosomales y péptidos escindibles por catepsina B; (c), (c') y (c") son independientemente cero o un entero positivo; (d), (d'), (i), (i') e (i") son independientemente cero o un entero positivo; (e) es un entero positivo; (e') y (e") son independientemente cero o un entero positivo; (f) y (f) son independientemente cero o un entero positivo; (g) es un entero positivo; (g') es cero o un entero positivo; (h) y (?') son independientemente un entero positivo; y todas las otras variables son como se define anteriormente, con la condición de que (g') es un entero positivo cuando todos los Z2 son grupos bloqueadores, o en combinación. compuesto de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste en: 7 ??? Surv¡v¡n-LNA-C6-5' -C-TAT-RGD-S -LNA-Survivin PEG 5'-C6-LNA-Surviv¡n COOH y 38. - El uso de un compuesto de la reivindicación 1 en la elaboración de un medicamento para tratar tumores sólidos, linfomas, cáncer de pulmón de célula pequeña, leucemia linfocítica aguda (ALL), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer del ovario, cáncer gástrico, enfermedad neoplásica, reducción de la carga de tumor, prevención de metástasis de neoplasmas, y prevención de recurrencias de tumor /crecimientos neoplásicos en los mamíferos. 39. - Un método in vitro de administración de polinucleótidos a células de mamífero, que comprende suministrar una cantidad efectiva de un compuesto de la reivindicación 1 a una célula que requiere dicho tratamiento.