KR100438268B1 - 친수성분자의지질화방법및조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 디설피드 결합을 갖는 지방산 포합 생성물을 포함하는 설프히드릴 함유 화합물(예를 들면, 설프히드릴 함유 펩티드 또는 단백질)의 지방산 유도체는 포유동물 세포에 상기 화합물을 전달하기 위해 사용된다. 이러한 변형은 비포합 화합물의 흡수 속도에 비해 포유 동물 세포에 의한 화합물의 흡수를 크게 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 상기 화합물의 혈액 및 조직 잔류를 연장시킨다. 또한, 포합체 내의 디설피드 결합은 세포내에서 크게 불안정하므로, 지방산 부분으로부터 무처리 화합물의 세포내 방출을 촉진시킨다.

Description

친수성 분자의 지질화 방법 및 조성물{METHOD AND COMPOSITIONS FOR LIPIDIZATION OF HYDROPHILIC MOLECULES}
신체의 내부를 외부와 분리시키는 점막 관문(關門)(예, 위장, 안구, 폐, 직장 및 비강 점막)은 분자의 수송을 엄격하게 조절하는 강하게 연결된 세포 단층의 층을 포함하고 있다. 관문내 각각의 세포는 세포내 공간으로의 유입을 조절하는 융합막에 의해 연결되어 있다. 따라서, 점막은 제1 레벨에서 트랜스세포성(trans cellular) 또는 파라세포성(para cellular) 경로에 따라 달라지는 물리적 차단, 수송층이다[리, 브이.에이치.엘. (1988),CRC, Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5, 69-97].
물로 채워진 융합막을 통한 파라세포성 수송은 작은 분자(MW〈1kDa)에 국한된 것으로서, 실질적으로 점막을 통한 농도 구배로 구동되는 확산 과정이다[리 (1988), 상동; 아더슨, 피. 및 맥너슨, 씨. (1990),J. Pharm. Sci. 79, 595-600]. 융합막은 점막의 총 표면적의 0.5% 미만을 차지한다[곤잘레스-마리스칼, 엘.엠. 일동 (1985)J. Membrane, Biol. 86, 113-125; 베트비카, 브이. 및 루버, 에프. (1988)CRC Critical Rev. Ther. Drug Deliv. Sys. 5, 141-170] 따라서, 이 융합막은 점막을 통한 단백질 약물의 수송에 있어서 그 역할이 미소하다.
작은 약물의 트랜스세포성 수송은, 약물의 물리화학적 특성이 소수성 세포 차단층을 통해 수송하기에 적절할 경우 효과적으로 발생한다. 그러나, 단백질 및 펩티드의 트랜스세포성 수송은 트랜스사이토시스(transcytosis)법으로 제한되어 있다[셴, 더블유. 씨. 일동 (1992),Adv. Drug Delivery Rev. 8, 93-113]. 트랜스사이토시스란, 단백질 및 펩티드가 세포의 한 면으로부터 소포체내로 흡수된 후, 그 세포를 통해 세포의 다른 면으로 이동되고, 여기서 세포내 소포체로부터 방출되는 복합 과정이다[모스토프, 케이.이. 및 세미스터, 엔.이. (1985)Cell 43, 389-390]. 점막 관문의 세포 막은 소수성 지질 이동층으로 되어 있어, 단백질 및 펩티드와 같은 친수성의 하전된 거대 분자에 대해 친화성이 없다. 또한, 점막 세포는 많은 거대 분자의 수송에 대한 차단층으로서 작용할 수 있는 뮤신을 분비할 수 있다[에드워드, 피. (1978)British Med. Bull. 34, 55-56]. 그러므로, 단백질 및 펩티드에 대한 특정 수송 메카니즘이 존재하지 않는다면, 점막 차단층을 통한 단백질 및 펩티드의 고유 수송은 거의 무시할 수 있다.
점막 관문은, 단백질 및 펩티드의 수송에 대해 강력한 물리적 차단층을 제공하는 것 이외에, 단백질 및 펩티드가 점막을 통과하기 전, 후 및 그 과정에서 이들을 분해시킬 수 있는 효소를 보유한다. 이러한 차단층은 효소 차단층이라고 부른다. 효소 차단층은, 단백질 및 펩티드를 그 말단에서 또는 그 구조내에서 분해하는엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 효소로 구성된다. 일부 점막의 효소 활성이 연구되고 있으며, 그 결과 알비노 토끼의 협측, 비측, 직장 및 질내 점막의 균질물내에 실질적인 프로테아제 활성이 존재하고, 이러한 활성은 장골내에 존재하는 것과 비견할 만함을 입증하였다[리 일동 (1988), 상동]. 따라서, 연구 중인 점막과는 상관없이, 효소 차단층은 단백질 및 펩티드 분자의 분해시에 강한 특징을 나타낸다.
펩티드의 N 및 C 말단은 하전되어 있으며, 하전된 측쇄가 존재하면 이들 거대 분자상에 고도의 친수성 특성이 부여된다. 또한, 하전된 측쇄가 존재한다는 것은 단백질 및 펩티드에 강한 수소 결합능이 있음을 의미하며, 이러한 H-결합능은 작은 펩티드라도 세포 막을 통해 수송되는 것을 억제하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었다[콘래디, 알. 에이. 일동 (1991),Pharm. Res. 8, 1453-1460]. 그러므로, 단백질 및 펩티드의 크기 및 친수성 특성이 조합되어 점막 관문을 통한 이의 수송을 엄격히 제한한다.
점막 관문의 물리적 특성을 변경하는데 사용되어 온 하나의 접근법은 투과 증진제를 사용하는 것이다. 투과 증진제의 사용은, 세포 막을 유동화시키고[카지, 에이치. 일동, (1985)Life Sci. 37, 523-530], 융합막을 개방시키며[이나가키, 엠. 일동 (1985)Rhinology 23, 213-221], 세포막내에 기공을 형성할 수 있는[고돈, 에스. 일동 (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7419-7423; 리, 브이.에이치.엘. 일동 (1991)Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, CRC Press 8, 91-192] 저 분자량 제제로 세포 차단층을 파괴하는 것을 기초로 한다. 이들 제제의 사용은 차단층 통합의 비특이적 손실을 초래하며, 생체내에서 세포에 독성일 수 있는 각종 거대 분자의 흡수를 야기할 수 있다.
프로테아제 억제제는 단백질 및 펩티드와 동시 투여될 수 있으며, 생체 내에서 이들 거대 분자의 흡수를 증진시키는데 있어서 일부 제한된 활성을 나타낸다[키드론, 엠. 일동 (1982)Life Sci. 31. 2837-2841; 다카로이, 케이. 일동 (1986)Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 682-687]. 이 방법의 안전성 및 장기간의 효과는 철저하게 조사되어야 한다.
프로드럭(prodrug)법은 효소의 분해 및 인식으로부터 펩티드를 보호하는 방식으로 펩티드를 변형시키는 것을 기초로 한 것이다. 이는, 펩티드 구조 중 아미노산의 D-형태의 치환, 펩티드 상에서 아미드화 반응 및 아실화 반응에 의해 공격받기 쉬운 기의 차단, 펩티드의 키랄성의 전화 및 펩티드 구조 중 배좌 제약의 도입으로 달성할 수 있다. 프로드럭의 합성은 쉽게 동정가능한 활성 도메인을 포함하는 작은 펩티드에만 적용할 수 있다.
크기의 감소는 단백질의 수송 가능성을 증가시키는 또 다른 실행가능한 방법이다. 그러나, 크기 감소를 시도하기 전에 단백질의 활성 분위를 지도화해야 한다. 일반적으로, 이러한 방법은 대부분의 단백질에 응용하기가 어렵다.
담체 리간드의 특성에 의해, 단백질 및 펩티드의 세포 흡수와 수송 특성을 변경시킬 수 있다. 이 방법의 본질은, 세포 비투과성 단백질 또는 펩티드가 세포내로 고도로 수송되는 담체에 공유적으로 부착된다는 것이다. 담체 리간드가 엔도사이토시스(endocytosis) 및 트랜스사이토시스(transcytosis)되는 메카니즘은 단백질 및 펩티드의 수송을 증진시키기 위한 담체의 적합성을 결정하는데 중요하다. 거대분자 담체는 친수성이며, 막내로 분배되지 않는다. 따라서, 거대 중합체 담체의 세포내로의 수송은 세포막에 대한 담체의 친화력에 의해 매개된다. 일반적으로, 거대분자 접합체의 흡수는 세포막에 결합함으로써 개시된다. 세포에 대한 담체의 결합은 특이적(예컨대 항체의 세포 표면 항원에 대한 결합), 비특이적(양이온성 리간드 또는 렉틴의 세포 표면 당에 대한 결합), 또는 수용체 매개형(트랜스페린 또는 인슐린의 이의 수용체에 대한 결합)일 수 있다. 일단 담체가 세포 표면에 결합하면, 소포체로 흡수된다. 그 다음 이들 소포체는 단계별로 처리되어, 여러 경로로 루트가 결정될 수 있다. 한 경로는 함입된 막으로 소포체를 다시 재순환시키는 것이다. 접합체에 대해 파괴성이 있는 다른 경로는 리포좀과 융합시키는 것이다. 융합체의 트랜스사이토시스를 유도하는 대체 경로는 이것이 유도된 면의 대향되는 막과 소포체를 융합시키는 것이다.
엔도사이토시스 및 트랜스사이토시스 간의 올바른 균형으로 단백질 접합체의 표적에의 전달이 결정된다. 예를 들면, 엔도사이토시스는 표적 세포가 접합체를 흡수하는 정도를 결정할 수 있으나, 트랜스사이토시스는 접합체가 그 표적에 도달하는지 여부를 결정한다[셴 일동 (1992) 상동]. 위장관을 통한 성공적인 흡수를 위해서, 접합체는 위장 점막의 정단 막에 결합하여, 점막 세포내로 내면화된 다음, 세포를 통해 전달되고 최종적으로 염기성 측막으로부터 방출되어야 한다.
최근의 문헌에는 비특이적 담체, 예컨대 폴리리신[셴, 더블유.씨. 및 라이저, 에이치.제이.피. (1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 787589-7593] 및 렉틴[브로드웰, 알.디. 일동 (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 632-646]과 특이적담체, 예컨대, 트랜스페린[완, 제이. 일동 (1992)J. Biol. Chem. 267, 13446-13450], 아시알로당단백질[세쓰, 알. 일동 (1993)J. Infect. Diseases 168, 994-999] 및 항체[비테타, 이.에스. (1990)J. Clin. Immunol. 10, 15S-18S]가 단백질의 세포내로의 엔도사이토시스를 증진시킬 수 있음을 입증하는 많은 보고들이 있다. 단백질에 대한 트랜스사이토시스 담체와 관련된 보고는 매우 드물며, 세포 차단층을 통한 단백질 접합체의 수송을 정량 분석한 연구는 거의 없다. 소맥 배아 아글루티닌[브로드웰 일동 (1988), 상동] 및 안티트랜스페린/메토트렉세이트 접합체[프라이덴, 피.엠. 및 웰러스, 엘.알. (1993)Adv. Exp. Med. Biol. 331, 129-136]는 생체내에서 혈뇌관문을 통해 트랜스사이토시스되는 것으로 알려져 있다. 또한, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)의 폴리리신 접합체 및 HRP의 트랜스페린 접합체는 시험관내에서 세포 단층을 통해 트랜스사이토시스되는 것으로 밝혀졌다[완, 제이. 및 셴, 더블유.씨. (1991)Pharm. Res. 8, S-5; 탑, 엠.이. 및 셴, 더블유.씨 (1992)J. Cell. Physiol. 150, 283-290; 완, 제이. 일동 (1992)J. Biol. Chem. 267, 13446-13450 상동].
인지질의 성분으로서의 지방산은 거대한 세포막을 형성한다. 지방산은 시판되며, 비교적 저렴하다. 이의 지질 특성으로 인해, 지방산은 비독성 방식으로 세포막 내로 쉽게 분배되어 세포막과 상호작용한다. 따라서, 지방산은 잠재적으로 단백질 및 펩티드의 전달에 가장 유용한 담체 리간드이다. 단백질 및 펩티드의 전달에 있어서 지방산을 사용할 수 있는 방법은 단백질 및 펩티드의 공유적 변형 및 지방산 에멀젼의 사용을 포함한다.
지방산 에멀젼을 성공적으로 사용하여 생체내에서 펩티드 및 단백질을 전달하는 몇몇의 연구가 보고되어 있다[요시카와, 에이치. 일동 (1985)Pharm. Res. 2. 249-251; 픽스, 제이.에이 일동Am. J. Physiol. 251, G332-G340]. 지방산 에멀젼이 단백질 및 펩티드의 흡수를 촉진시킬 수 있는 메카니즘은 아직 알려지지 않았다. 지방산 에멀젼은 융합막을 개방시키고, 막을 용해시키며, 위장 환경으로부터 단백질 및 펩티드를 위장시키고, 이의 흡수의 일부로서 위장-점막을 통해 단백질 및 펩티드를 운반할 수 있다[스미쓰, 피. 일동 (1992)Adv. Drug. Delivery Rev. 8, 253-290]. 후자의 메카니즘이 제안되고 있으나, 지방 흡수의 메카니즘에 관한 통상의 지식과는 일치하지 않는다.
위장 상피를 통해 단백질 및 펩티드를 전달하는 더욱 논리적인 방법은 비특이적 막 흡착제로서 지방산을 이용하는 것이다. 일부 연구로부터, 단백질에 결합된 비특이적 막 결합제가 시험관내에서 세포를 통해 단백질 집합체의 트랜스사이토시스를 촉진할 수 있음을 확인하였다[완, 제이. 일동 (1990)J. Cell. Physiol. 145, 9-15; 탑 및 셴 (1992), 상동]. 또한, 지방산 접합체는 세포막내로 그리고 세포막을 통해서 거대 분자의 흡수를 개선시키는 것으로 입증되었다[렛싱어, 알. 일동 (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556; 카바노프, 에이. 일동 (1989)Protein Eng. 3, 39-42]. 그럼에도 불구하고, 펩티드 및 단백질에 지방산을 접합시키는데 어려움이 있다. 예를 들면 (1) 접합 반응용 수용액에서 지방산의 용해도 부족; (2) 지방산의 아실화 후에 펩티드 및 단백질의 생물학적 활성의 손실; 및 (3) 수용액에서 지방산-집합된 펩티드의 용해도 부족 등이 있다[예컨대, 하시모토, 엠.일동.Pharm. Res. 6, 171-176 (1989); 마틴스, 엠.비.에프. 일동,Biochimie 72, 671-675 (1990); 무라니시, 에스. 일동,Pharm. Res. 8, 649-652 (1991); 로버트, 에스. 일동,Biochem, Biophys. Res. Commun.196, 447-454 (1993)].
본 출원은 1995년 1월 25일자로 출원된 일련번호 제08/349,717호의 CIP 출원이다.
본 발명은 일반적으로 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 포유 동물에서 친수성 분자, 특히 펩티드 및 단백질의 흡수 및 유지를 증가시키는데 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
생물 공학의 진보로 치료학적으로 활성이 있고 순수한 단백질 및 펩티드를 대량으로 제조할 수 있게 되었다. 현재, 이들 제제의 대부분은 침입성 경로, 예컨대 주사로 투여되는 경우에만 그 치료적 효과를 얻을 수 있다. 대부분의 단백질은 그 반감기가 매우 짧기 때문에, 주사로 자주 투여하는 경우에만 이들 제제의 유효 농도를 유지할 수 있다.
주사로 단백질을 투여하는 것이 생체내에서 이를 전달하는 가장 효과적인 수단이지만, 다수회 주사에 대한 환자의 내성은 매우 불량하다. 또한, 주사 경로로 약물을 투여하는 것은 숙련을 요하는 일로서 훈련이 필요하다. 이러한 기술 및 훈련이 환자에게 항상 전달가능한 것은 아니다. 단백질 약물이 생명을 살리는 역할을 하는 경우에는, 주사 경로에 의한 투여를 환자가 용인할 수 있다. 그러나, 단백질약물이 단지 몇 가지 가능한 치료법 중의 하나일 경우에는, 단백질 및 펩티드 주사를 환자가 용인할 것 같지 않다. 그러므로, 단백질 및 펩티드 전달의 대체 경로를 개발해야 한다.
단백질 및 펩티드 전달의 대체 경로의 예로는 협측, 비측, 경구, 폐, 직장 및 안구 경로가 있다. 예외 없이, 이러한 경로는 비경구 투여 경로보다 덜 효과적이다. 그러나, 단백질 및 펩티드 전달의 이러한 경로는 환자에게 편리성과 조절을 제공할 수 있기 때문에 비경구 경로보다 훨씬 더 효과적이다. 경구 경로는 편리성 및 환자 순응성이 가장 크기 때문에 특히 효과적이다.
본 발명은 하기에 첨부된 도면을 참고로 하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 Caco-2 세포에서의 BBI, BBIssPal 및 BBIssOleic의 흡수량을 나타낸다.
도 2는 정맥내 투여 후 CF-1 마우스의 혈액, 신장, 폐 및 간에서의 BBI 및BBIssPal의 생체분포를 나타낸다.
도 3은 정맥내 투여 후 CF-1 마우스의 혈액, 신장, 폐 및 간에서의 BBI 및 BBIssOleic의 생체분포를 나타낸다.
도 4는 복막내 투여 후 CF-1 마우스의 BBI 및 BBIssPal의 생체분포를 나타낸다.
도 5는 Caco-2 세포를 통해 그 세포 내로의 BBI, BBIssPal(2) 및 BBIssPal(4)의 트랜스사이토시스 및 축적을 나타낸다.
도 6은 트랜스사이토시스된 BBI, BBIssPal(2) 및 BBIssPal(4)를 포함하는 Caco-2 세포에서 얻은 염기성 매체의 G50 겔 여과 분석의 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 의하면, 설프히드릴 함유 화합물(예를 들면, 이하에 정의되는 생체 중합체)은 가역적이고 생분해성인 디설피드 결합을 통해 지방산 유도체에 결합되어 있다. 이러한 결합체는 세포막의 정단면에 결합하고, 막 수송 및 회전의 결과로서 위장-상피의 염기성 측막에 도달한 다음, 디설피드 결합의 환원 결과로서 간질성 유체내로 방출될 것으로 예측된다.
본 발명의 제1 측면은, 하기 화학식 VI으로 표시되는 화합물의 접합체를 제공하는 것이다 :
Figure pct00001
상기 식에서, P는 설프히드릴 함유 화합물에서 유도된 잔기이고;
R1은 수소, 저급 알킬 또는 아릴이며;
R2는 지질 함유 부분(하기에서 정의됨)이고;
R3은 -OH, 지질 함유 부분, 또는 1 또는 2개의 아미노산을 포함하고 -CO2H 또는 -COR2가 말단에 있는 아미노산 사슬이다. 상기 접합체는 설프히드릴 함유 화합물인 PSH의 흡수를 증가시키고, 혈액 및 조직에서의 유지를 연장시키는데 특히 유용하다.
본 발명의 제2 측면은, 포유류에서 화학식 PSH의 설프히드릴 함유 화합물의 흡수를 증가시키거나 또는 혈액 및 조직에서의 유지를 연장시키는 방법을 제공하는데, 이 방법에서 설프히드릴 함유 화합물로부터 화학식 VI의 접합체를 형성한 다음, 이를 포유류에게 투여한다(예를 들면, 수용액 또는 경구 투여 단위로).
본 발명의 제3 측면은 하기 화학식 V의 화합물을 제공한다 :
Figure pct00002
상기 식에서, A는 방향족 활성화 잔기(하기에서 정의됨)이며;
R1, R2및 R3는 상기 정의된 바와 같다. 화학식 V의 화합물은 화학식 PSH의 설프히드릴 함유 화합물로부터 화학식 VI의 접합체를 제조하는데 특히 유용하다.
본 발명의 제4 측면은 화학식 PSH의 화합물을 화학식 V의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하며 화학식 PSH의 설프히드릴 함유 화합물로부터 화학식 VI의 접합체를 형성하는 방법을 제공한다. 통상적으로 이 반응은 약 1~약 24시간 동안 약 4℃~약 37℃의 온도에서 적절한 완충 수용액(예컨대, 인산염, 중탄산염 및 붕산염 완충액)내에서 화학식 V의 화합물 과량(예, 2배~10배 과량)을 사용하여 실시한다. 이 반응은 pH 8의 중탄산염 완충 용액에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제5 측면은, 하기 화학식 III의 화합물을 제공한다 :
Figure pct00003
상기 식에서, R3'은 -OH, 또는 1 또는 2개의 아미노산을 포함하고 -CO2H가 말단에 있는 아미노산 사슬이며, A 및 R1은 상기 정의된 바와 같다. 화학식 III의 화합물은 화학식 V의 화합물을 제조하는데 유용하다. 화학식 III의 화합물은 하기 화학식 II의 화합물을 화학식 A-S-S-A 또는 A-S-S-A' [여기서, A'는 A와 다르고, 방향족 활성화 잔기임]의 화합물과 반응시켜 제조하는 것이 적절하다.
Figure pct00004
이러한 반응물은 시판되거나[예, 2,2'-디티오피리딘 및 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)] 또는 당업자에게 공지된 통상의 합성 절차에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 제6 측면은 R2가 지질기인 화학식 V의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 화학식 III의 화합물을 화학식 X-O2C-B 또는 X-OC-B[여기서, X는 하기에서 정의되는 바와 같은 지질 활성화기이며, B는 하기에서 정의되는 바와 같은 지질기임]의 활성화된 지질기와 반응시킨다. 화학식 X-O2C-B 또는 X-OC-B의 화합물은 공지된 방법으로 용이하게 제조할 수 있다.
화학식 III의 화합물을 제조하기 위한 예시적인 절차로서, 일반적으로 동몰량의 화학식 II의 화합물과 화학식 A-S-S-A 또는 A-S-S-A'의 화합물을 극성 유기 용매(예, 에탄올)내에서 적절하게 혼합할 수 있다. 그 다음, 화학식 III의 생성물을 비극성 유기 용매(예, 벤젠)로부터 결정화시켜 분리하는 것이 적절하다. 물론, 기타 적절한 절차가 당업자에게는 자명할 것이다.
X-O2C-B 또는 X-OC-B를 제조하기 위해서, 지방산을, 예컨대 (a) N-히드록시숙신이미드 및 카르보디이미드 제제와 반응시켜 H-히드록시숙신이미딜 활성 에스테르를 형성하거나, (b) 트리플루오로아세트산 무수물과 반응시켜 지방산 무수물을형성하거나, 또는 (c) 티오닐 클로라이드와 반응시켜 지방산 염화물을 형성할 수 있다. 별도의 절차를 적절히 사용하여 상기 지질 활성화기 또는 기타 지질 활성화 기를 도입할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "지질 함유 부분"은 그 자체의 지질기이거나 또는 지질기를 포함하는 탄화수소계 기(특히, 1개 이상의 아미노산)를 의미한다. 용어 "지질 기"는 탄소 원자수가 약 4~약 26개, 바람직하게는 약 5~약 19개인 소수성 치환체를 의미한다. 적절한 지질기의 비제한적인 예로는 팔미틸(C15H31); 올레일(C15H29); 스테아릴(C17H35); 콜레이트; 및 데옥시콜레이트 등이 있다.
용어 "방향족 활성화 잔기"는 화학식 V의 화합물의 디설피드 기를, 화학식 PSH의 설프히드릴 함유 화합물과의 치환 반응에 대해 더욱 불안정하게 하는 작용을 하는(그리하여 우수한 이탈기로서 작용하는) 부분을 의미한다. 본 발명의 바람직한 방향족 활성화 기는 2-피리딜이며; 기타 적절한 방향족 활성화 기로는 4-니트로페닐이 있다.
본 발명에서 용어 "지질 활성화 기"는 이 기가 결합된 카르복시지질 기가 화학식 III의 화합물과 반응성을 갖게 하는 부분을 의미한다. 본 발명의 바람직한 지질 활성화 기는 N-히드록시숙신이미딜 에스테르이며; 기타 적절한 지질 활성화 기로는 산 염화물 및 산 무수물이 있다.
본 발명은 설프히드릴 기를 함유하는 각종 화합물을 포함하는 화학식 VI의 접합체의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것으로서, 생체중합체를 포함하는 접합체를 제조하는데 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하는 것이 특히 유리하다. 해당 생체중합체로는 펩티드, 단백질 및 올리고뉴클레오티드(하기에서 정의됨)가 있다. 당업자에게는 명백한 바와 같이, 설프히드릴 기를 포함하는 생체중합체 또는 티올화된 생체중합체는 화학식 VI의 접합체에 상응하는 다수의 부분(즉, 화학식 VI의 화합물에서 P 부분을 제한 구조를 갖는 기)을 구조내에 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "펩티드"는 2~50개의 아미노산을 포함하는 아미노산 사슬을 의미하고, 용어 "단백질"은 50개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 사슬을 말한다. 단백질 및 펩티드는 천연원으로부터 분리하거나 또는 당분야에 공지된 수단, 예컨대, 재조합 DNA 기술 또는 고체 상태의 합성에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 펩티드 및 단백질은 자연 발생적 L-아미노산만을, L-아미노산과 기타 아미노산(예, R-아미노산 및 변형 아미노산)의 조합물을, 또는 L-아미노산 이외의 아미노산만을 포함할 수 있음이 예상된다. 화학식 I의 접합체를 형성하기 위해서, 펩티드 또는 단백질은 하나 이상의 반응성 티올 기를 보유해야 한다. 많은 경우에 있어서, 펩티드 또는 단백질은 시스테인 잔기(티올기를 함유하는 아미노산)를 포함한다. 티올기를 포함하지 않는 펩티드 또는 단백질은 당 분야에서 그 자체로서 공지된 절차로 변형시킬 수 있으며, 특히, 공지된 티올화제[예, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 2-이미노티올란(트라우트 제제)]를 일반적으로 이러한 용도로 사용할 수 있다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 2 이상의 자연 발생적 핵산 또는 변형 핵산, 예컨대, 자연 발생적 또는 재조합 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA) 서열들을포함하는 사슬을 나타낸다. 본 발명에 따라 접합체를 형성하기 위해서, 올리고뉴클레오티드는 티올화 반응으로 변형시켜 지질 함유 부분과 결합하기 위한 설프히드릴 기를 포함해야 한다. 이러한 변형은 그 자체의 공지된 방법으로 통상적으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 카르보디이미드를 사용하여 시스타민에 커플링시킨 다음 디티오트레이톨로 환원시켜 유리 설프히드릴 기를 생성할 수 있다.
화학식 VI의 화합물의 하나의 바람직한 유형은 R1이 수소이고, R2가 지질 부분이며, R3가 -OH인 화합물이다. 이러한 유형의 접합체는 시스테인으로부터 유도되는 것이 적절하다. 본 발명에 따른 기타 바람직한 유형의 접합체는 R1이 수소이고, R2가 -CH2CH2CH(NH2)CO2H 또는 -CH2CH2CH(NHCO-지질)CO-지질이며, R3가 -NHCH2CO2H 또는 -NHCH2CO-지질이다[여기서, R2및 R3중 하나 이상은 지질 부분을 포함함]. 이러한 유형의 접합체는 글루타티온으로부터 유도되는 것이 적절하다.
화학식 VI의 대표적인 화합물[여기서, P는 단백질임]의 합성법은 하기 반응식 1에 예시되어 있다. 물론, 당업자에게는 자명한 바와 같이, 각종 대체 합성 반응식을 용이하게 개발할 수 있다.
Figure pct00005
본 발명의 지방산 접합체는 단백질과 펩티드가 가용성인 대부분의 완충 용액
에서 용해 가능하다. 구체적으로, 임의의 유리 카르복실산기는 중성 pH에서 하전되어 있으므로 접합체의 용해도를 향상시킨다. 이는 환자에게 단백질 또는 펩티드를 경구 또는 다른 경로를 통해 투여하기 위한 접합체와 적절한 약학적 허용 담체 또는 보조제의 배합을 상당히 용이하게 한다.
본 발명에 의하면, 지방산 부분과 펩티드 또는 단백질간의 디설피드 결합이 쉽게 환원될 수 있다는 것이 특히 유용한 장점이다. 그러므로, 활성 펩티드 또는 단백질 분자는 표적 조직 또는 세포에서 완전한 형태로 방출된다. 또한, 접합체의지방산 부분은 포유류, 특히 인간에 대해 독성이 없는 아미노산과 지질 분자만을 포함한다.
본 발명은 이하의 실시예를 참조하면 더욱 명확히 이해될 것이며, 이들 실시예는 예시적인 것에 불과할 뿐이고, 첨부된 청구의 범위에 의해 정하여지는 본 발명의 보호범위를 한정하는 것으로 해석해서는 안된다.
본 발명의 목적은 친수성 분자에 지방산을 접합시키고, 펩티드 및 단백질의 생체적합성을 개선시키는데 사용하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명에 의하면, 디설피드 결합을 갖는 지방산 접합된 생성물을 포함하는 설프히드릴 함유 화합물의 지방산 유도체(예를 들면, 설프히드릴 기를 포함하거나 또는 이를 포함하도록 변형된 펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드)는 설프히드릴 함유 화합물을 포유류 세포에 전달하는데 사용된다. 이러한 변형으로 비접합된 화합물의 흡수율에 비해서 포유류 세포에 의한 화합물의 흡수가 현저히 증가되고, 화합물의 혈액 및 조직의 유지가 연장된다. 또한, 집합체내의 디설피드 결합은 세포내에서 매우 불안정하여 지방산 부분으로부터 손상되지 않은 화합물의 세포내 방출을 용이하게 한다. 지방산 유도체의 제조 시약 및 방법도 제공한다.
실시예 1
N-팔미틸-2-피리딜디티오시스테인(Pal-PDC)의 합성
에탄올(50 ㎖)중 L-시스테인(I)(3.0 g)의 빙냉된 용액을 에탄올(30 ㎖)중 교반된 2,2-디티오피리딘(II)(7.5 g) 용액에 적가한 다음, 25℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 그 용액을 원심분리하여 임의의 침전물을 제거하고, 회전식 증발기를 사용해서 상청액을 40 ㎖ 부피로 줄였다. 이어서, 반응 혼합물을 빙냉된 벤젠 400 ㎖에 적가하였다. 벤젠 중에서 결정화된 PDC(III)를 여과시켜 분리하고, 에탄올 40 ㎖에 재용해시킨 다음, 전술한 바와 같이 빙냉된 벤젠 400 ㎖ 중에서 재결정화시켰다. 재결정화된 생성물을 여과로 분리하고, 진공하에 밤새 건조시킨 후, 마지막으로 건조기에서 -20℃에서 보관하였다.
PDC(100 ㎎)(III)를 DMF 5 ㎖에 용해시키고, 트리에틸아민 100㎕와 혼합한 다음, 생성된 상청액을 DMF(5 ㎖)중 팔미트산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르(IV)(250 ㎎)와 25℃에서 24시간동안 반응시켰으며, 이 과정에서 현탁액이 투명해졌다. 이 용액을 pH 3.0의 빙냉수 40 ㎖로 희석하고, Pal-PDC(V) 및 팔미트산을 함유하는 침전물을 10000rpm 하에 30분 동안 원심분리로 분리하였다. Pal-PDC(V)를 용해시키지만 팔미트산은 용해시키지 않는 pH 7.0의 수중 침전물의 현탁액으로, Pal-PDC(V)를 팔미트산으로부터 분리하였다. 전술한 바와 같은 2 이상의 산 침전 단계를 사용하여 Pal-PDC(V)를 추가로 정제하였다.
실시예 2
접합체의 합성
특별한 언급이 없는 한, 접합 단계에 사용된 모든 최종 시약들(Pal-PDC 및 PDC)은 형광 지시약을 함유하는 실리카 피복된 박층 크로마토그래피(TLC) 평판을 사용하여 분석하였다. 이 평판은 임의의 분석 전에 가열로 활성화시키지 않았다. 합성된 시약의 통상적인 분석을 실시하기 위하여, 당해 시약(5 ㎎/㎖)을 함유하는 에탄올 용액 5 ㎖을 평판에 가하였다. 이어서, 평판을 용매 챔버에서 전개시켜 이동상과 평형을 이루도록 하였다. 일단, 용매 선단이 충분한 거리까지 이동하면, 평판을꺼내어 건조시키고, UV-램프하에 조사하였다. 스폿의 위치가 즉시 평판상에 나타났으며, 평판과 스폿을 인출하였다. 가시화된 각 스폿의 Rf 값을 계산하여 기록하였다. 분석에 사용된 이동상의 조성을 조정하여 시약 스폿의 최적의 분리를 제공하였다.
예시 목적으로, BBI의 접합체를 합성하였다. BBI는 세포내로의 흡수율이 낮고 경구적으로 생체 이용성이 없는 친수성 단백질이다. 또한, BBI는 위장관에서 안정하고 소화관에서 포유류의 프로테아제에 의한 분해에 내성이 있다[야베로우, 제이. 일동, (1983)Cancer. Res. 43, 2454s-2459s]. 화학적 예방을 위한 BBI의 사용은, BBI의 경구 흡수가능한 형태를 생성할 수 있을 경우에만 허용될 수 있다.
BBI(20 ㎎)를 중탄산나트륨 용액(0.3M, pH 8.0) 1 ㎖에 용해시키고, 25℃에서 2시간 동안 SPDP(5 ㎎/100 ㎕ DMF)와 반응시켰다. 세파덱스(등록상표) G50 겔-여과 크로마토그래피를 사용하여 BBI-PDP를 정제한 후에, 디티오트레이톨(DTT)을 이용하여 BBI-PDP를 환원시킨 다음 티오피리딘 부분의 방출량을 측정하므로써 BBI의 PDP-유도체화 정도를 추정하였다. 이러한 절차를 사용하여, BBI 분자당 약 4개의 아미노기를 SPDP로 변형시켰다. BBI의 유도체화 정도는 반응 완충액의 pH를 조정하므로써 제어할 수 있는데, 반응을 pH 7에서 수행할 경우 BBI 분자당 1개의 아민기로부터, 반응을 pH 8.5에서 수행할 경우 변형되는 4.5개의 아민기의 범위로 BBI의 변형을 조정할 수 있다.
PBS(1 ㎖, pH 5.0)중 BBI-PDP(20 ㎎)를 30분 동안 DTT(25 mM)로 환원시킨 다음, 세파덱스(등록상표) G50 컬럼으로부터 용출시켰다. 컬럼의 공극 용적에서 용출된 설프히드릴 함유 BBI 분획은 엘만 시약을 사용하여 확인하고, 이어서 PBS, pH 7.0중 3 배 과량의(BBI 상의 설프히드릴기당) Pal-PDC(V)와 16시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물은 HCl(1M)을 사용해서 pH 3.0으로 산성화시키고, 30분 동안 빙상에 방치하였다. 상청액은 세파덱스 G25 겔-여과 컬럼을 사용하여 별도로 분석하였다. BBI의 팔미틸 디설피드 접합체인 BBIssPal(VI)를 함유하는 침전물과 과량의 시약을 원심분리로 분리하고, DMF(2 ㎖)에 용해시킨 후에, DMF를 사용하여 세파덱스(등록상표) LH20 컬럼으로부터 용출시켰다. 컬럼의 공극 용적에서 용출된 BBIssPal(VI) 분획물을 분리하고, 500 부피의 물로 3회 투석하고, 이어서 동결건조하였다. 이러한 절차를 사용한 접합체의 수율은 약 중량% 이었다. 전술한 바와 동일한 접합 조건을 사용하여 BBI에 [3H]-표지화된 Pal-PDC(V)를 접합시킨 후에 BBI에 대한 Pal-PDC의 접합체를 확인 및 정량하였다. 또한 동일한 절차를 사용하여, 올레산 접합된 BBI(BBIssOleic)를 합성하였다.
실시예 3
접합체의 수송
트립신/EDTA 용액(0.5% 트립신, 5.3 mM EDTA) 0.5 ㎖와 함께 37℃에서 10분간 항온 처리하는 방법을 사용하여 인간 결장 암세포(Caco-2)를 25㎠ 원료 배양 플라스크로부터 분리하였다. 이어서 세포를 15% 태아 소혈청(FBS), L-글루타민(1%) 및 필수 아미노산(1%)이 보충된 둘베코 최소 필수 배지 5 ㎖에 현탁시키고, 쿠울터 계수기를 사용하여 계수했다.
배지 1.5 ㎖ 중에 현탁된 Caco-2 세포를 삽입부당 0.5×106세포의 밀도로 트랜스웰(transwell)의 정상 챔버내로 접종하였다. 이어서 배지 2.5 ㎖를 각 트랜스웰의 기저 챔버에 첨가하였다. 2일 동안 방해하지 않고 세포를 부착시킨 상태로 방치한 후에, 실험을 수행할 때가지 격일로 세포를 공급하였다. 실험에 앞서 세포를 약 14∼20일 동안 유지시키고, 매회 실험하기 24시간 전에 세포를 공급하였다. 접종한 지 1 주일 이내에 세포 단층은 약 500∼600Ω㎠의 상피를 통한 전기 저항(TEER)을 형성하였으며, 이 저항은 접종 후 최대 21일 동안 유지되었다.
클로라민-T 방법을 사용하여 BBI 및 BBIssPal의 방사능 요오드화 반응을 수행했다[맥코나헤이, P.C. 및 딕슨 F.J. (1980)Meth. Enzymol. 70, 221-247]. 융합성의 14일령의 세포 단층을 무혈청 둘베코 배지를 사용해서 1회 세척한 후에, 37℃에서 30분 동안 항온 처리하였다. 이어서, 항온 배지를125I-BBI(10 ㎍/㎖)를 천연-BBI로서, 또는 BBIssPal이나 BBIssOleic으로서 함유하는 무혈청 배지로 교체하고, 단층을 추가의 60분 동안 37℃에서 항온 배양하였다. 이어서 단층을 빙냉된 PBS로 3회 세척한 후에, 37℃에서 10분 동안 트립신(0.5%, EDTA 5.3 mM)에 노출시켰다. 분리한 세포를 관으로 옮기고, 원심분리로 분리하고, 빙냉된 PBS를 사용하여 3회 세척한 후에, 감마 계수기를 사용하여 축적된 방사능에 대해 분석하였으며, 최종적으로 공개된 방법[로우리, 오.에이치. 일동 (1951)J. Biol. Chem. 193, 265-275]을 사용하여 세포 단백질에 대해 분석하였다.
일부의 실험에서는, 환원된125I-BBIssPal의 세포내로의 흡수량을 측정하였다.125I-BBIssPal은 60℃에서 5분 동안, 추가의 25분 동안 37℃에서 DTT(50 mM)로 환원시켰다. 대조 실험에서,125I-BBIssPal을 DTT에 노출시키지 않고 동일한 온도로 배지에 노출시켰다.
BSA(무 지방산) 존재하에125I-BBIssPal의 흡수는 다음과 같이 측정하였다.125I-BBIssPal을 0.1% BSA를 함유하는 배지를 사용하여 37℃에서 30분 동안 항온 처리한 후에 세포 단층에 첨가하였다. 일부의 흡수 실험에서는, 먼저 BSA를 3 배 몰과량의 팔미트산과 혼합한 다음, 실험에 앞서 접합체와 함께 항온처리하였다. FBS를 함유하는 배지에서125I-BBIssPal의 흡수를 측정하는 실험에서는, 소요량의 FBS를 함유하는 배지에 단순히 접합체를 첨가하였다.
2 내지 3 주령이고 TEER 값이 약 500 Ω㎠인 융합성 세포 단층은, 먼저 1% FBS를 함유하는 둘베코의 MEM을 사용하여 37℃에서 30분 동안 항온 처리하였다. 이어서, 항온 배지를 제거하고, 배지 1.5 ㎖중125I-BBI(10 ㎍/㎖) 접합체를 트랜스웰의 정상 챔버에 첨가하였다. 기저 챔버에 배지 2.5 ㎖를 첨가하고 트랜스웰을 37℃에서 항온처리하였다. 소정의 시간에, 전체 기저 챔버 배지(2.5 ㎖)를 각각의 트랜스웰로부터 제거하고, 감마 계수기를 사용하여 방사능에 대해 계수하였다. 각 실험에서, 통상적으로 7개의 샘플을 항온처리 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 24시간에 분취하였다. 24시간 후에, 샘플을 분취하고, 세포 단층을 빙냉된 PBS로 3회 세정하고, 삽입부로부터 분리한 후에, 감마 계수기를 사용하여 축적된 방사능에 대해 계수하였다.
단층을 통해 수송된125I-BBI 접합체의 통합성은 세파덱스 G50 겔-여과 크로마토그래피를 사용하여 연구하였다. 요컨대, 기본 배지를 24시간 째에 분취한 후에, 배지 1.0 ㎖를 2000 rpm 하에 원심분리하고, 이어서 PBS를 사용하여 G50 컬럼(10 ㎖)으로부터 용출시켰으며; 1 ㎖의 분획을 수거하고, 분획-관련 방사능을 감마 계수기를 사용하여 측정하였다. 컬럼의 공극 용적에서 완전한 접합체가 용출되었으며, 1 kDa 보다 작은 단편은 상기 컬럼 용적 또는 그 상부에서 용출되었다.
상이한 양으로 첨가된 FBS의 존재하에서, 유리 단백질 또는 팔미트산에 접합된 상태로125I-BBI의 흡수 결과를 하기 표 1에 제시하였다. 접합체를 무혈청 배지중에서 세포와 함께 항온처리한 경우, BBIssPal의 흡수량은 BBI 흡수량보다 대략 140 배 많았다. 1% FBS를 함유하는 배지의 존재하에서, BBIssPal의 내면화는 BBI의 그것에 비해 35배 증가하였다. 혈청 농도를 10% 더 증가시키면, 세포내로의 BBIssPal의 흡수가 감소되어 천연-BBI의 흡수에 비해서 단지 10배 더 높은 레벨이 된다. 혈청의 존재하에 Cacl-2 세포내로의 BBIssPal의 내면화는, 각각 1% 및 10% FBS 함유 배지에서 무혈청인 경우의 내면화 수치에 비하여 14% 및 2.3%로 급감하였다.
Figure pct00006
세포 단층을 37℃에서 60분 동안 10 ㎍/㎖의 농도하에125I-표지화된 접합체와 함께 항온 처리하였다. 제시된 결과는 3개의 단층±SEM의 평균치이다. 흡수 실험은 첨가된 FBS의 존재 및 부재하에, 둘베코 배지 중에서 수행하였다.
세포내로의 BBIssPal의 흡수는 접합체상의 팔미트산 리간드가 매개하는 것으로 생각되므로, DTT로 환원시키기 전후에125I-BBIssPal의 Caco-2 세포내로의 흡수를 연구하였다. 항온처리 배지내에 혈청이 존재하면 세포내로의 접합체의 흡수 억제 효과를 나타내기 때문에, 흡수는 무혈청 배지에서 연구하였다. 그 결과를 하기 표 2에 제시하였다. 미처리된125I-BBIssPal의 세포내로의 흡수는125I-BBI의 흡수량보다 80배 더 높았다. DTT에125I-BBI를 노출시켜도 흡수량이 감소되지 않았다. 대조적으로125I-BBIssPal을 DTT로 환원시키면 세포내로의 접합체의 흡수량이 약 80% 감소하였다. DTT로 BBIssPal을 환원시키면 접합체로부터 팔미트산이 분리된다. 그러므로,125I-BBIssPal의 흡수는 소수성인 팔미트산 리간드가 매개하였다.
Figure pct00007
천연 단백질로서 또는 BBIssPal로서의125I-BBI의 세포 흡수는 60℃에서 5분, 37℃에서 25분 동안 DTT(50 mM)로 환원시키기 전후에 측정하였다.
소 혈청 알부민(BSA)은 생체내 지방산의 담체이며 지방산을 강하게 결합시킬 수 있는 소수성 영역을 포함하는 것으로 알려져 있다.125I-BBIssPal의 흡수는 혈청의 존재하에 감소하기 때문에, FBS에 존재하는 BSA에 BBIssPal이 결합할 확률을 조사하였다. 무지방 BSA 또는 지방산이 적재된 BSA를 함유하는 배지의 존재하에125I-BBIssPal 및125I-BBI의 세포 흡수를 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 제시하였다. BSA가 없는 배지의 존재하에,125I-BBIssPal의 세포내로의 흡수는 BBI의 흡수보다 80 배 더 많았으며. 이러한 결과는 앞선 실험에서 얻어진 결과로부터 예측한 바와 같다. 탈지-BSA(무지방산 BSA)(0.1%)가 배지에 존재하는 경우,125I-BBIssPal의 흡수는 82% 감소하는 반면125I-BBI의 흡수는 영향을 받지 않았다. 무지방 BSA를 3 배 몰 과량의 팔미트산으로 스파이크(spiking)하므로써 생성된 지방산 적재형 BSA(0.1%)의 존재하에서,125I-BBI의 흡수는 마찬가지로 영향을 받지 않았다. 그러므로,125I-BBIssPal은 BSA에 강하게 결합하며, 이러한 결합은 기존에 BSA에 결합된 지방산의 수에 좌우된다.
Figure pct00008
첨가된 무지방산 BSA(BSA) 또는 지방산 적재형 BSA(BSA/FA)의 존재및 부재하에 듈베코 배지에서 흡수 실험을 수행하였다. 무혈청 배지의 존재하에서 천연-BBI 또는 팔미트산 또는 올레산에 접합된 형태로서125I-BBI의 Caco-2 세포내로의 흡수에 대한 연구 결과를 도 1에 도시하였다. 결과는 내면화된 BBI의 평균 ng ± SEM, n=3으로서 나타내었다.125I-BBIssPal의 세포내로의 흡수는125I-BBI의 흡수보다 약 100 배 더 높았다. 유사하게125I-BBIssOleic의 세포내로의 흡수는125I-BBI의 흡수보다 약 108 배 더 높았다.125I-BBIssPal과125I-BBIssOleic의 흡수 차이는 유의 수준이 아니었다.
실시예 4
생체분포(biodistribution) 분석
각각 체중이 20∼25g인 2∼3 주령의 암컷 CF-1 마우스들을, 실험 전에 음식과 물에 자류롭게 접근할 수 있게 한 후에, 동물 실험용으로 사용하였다. 천연-BBI로서 또는 BBIssPal이나 BBIssOleic 접합체로서,125I-BBI(3 ㎎/kg)를 꼬리 정맥을 통해 동물에게 투여하였다. 주사한지 0.5, 3 및 24 시간 후에, 각각의 실험 그룹으로부터 3 마리의 동물을 치사시키고, 그 혈액(200㎕), 신장, 폐 및 간을 적출하여 빙냉된 PBS로 세정하고, 축적 방사능에 대해 분석하였다. 기관의 중량을 기록하고 기관내의 접합체 농도를 조정하는데 사용하였다.
복강내 생체분포 연구에 있어서, 천연-BBI로서 또는 BBIssPal로서125I-BBI(3 ㎎/kg)를 각 동물의 복강의 좌측 하부 1/4 내로 투여하였다. 이어서 정맥내 생체분포 연구에 대해 기술한 방식으로 동물을 처리하였다.
정맥내 투여 후 BBI 및 BBIssPal의 생체분포 결과는 기관 1g당 축적된 투여량(%)± SEM으로서 도 2에 도시되어 있다. 이 결과로부터, BBI는 높은 혈액 농도에 도달하는 일 없이 신체로부터 신속하게 배출되는 반면, BBIssPal은 혈액 중에서 비교적 고농도로 축적된 다음 순환계로부터 비교적 서서히 제거되는 것으로 확인되었다. 신장 생체분포 결과는, BBI가 신장에서 신속하게 축적되는 반면에, BBIssPal은 그렇지 않음을 보여준다. BBIssPal의 간 축적량은 BBI 보다 약 5 배 더 높으며, BBIssPal 농도는 주사한 지 24시간 후에도 간에서 높게 유지되었다. 또한 BBIssPal의 폐 축적량은 BBI 보다 약 2 배 더 높았지만, 이 결과는 기관의 절제후에 기관에 존재하는 잔류 혈액에 의해 유발될 수 있다. BBIssPal은 혈액 및 간에서 보다 장시간 동안 고농도로 유지되는 것이 명백하다. 그 반면에, BBIssPal의 신장내 제거율은 천연-BBI 보다 약 4-배 더 낮았다.
또한 CF-1 마우스에서 BBI 및 BBIssOleic의 정맥내 생체 분포를 연구하였다. 그 결과는 0.5, 3 및 24 시간 째에 기관 1 g 당 축적 투여량% ±SEM, n=3으로서 도 3에 도시하였다. BBIssOleic의 생체분포는 BBIssPal과 매우 유사하였다. BBIssPal에 대해 관찰된 바와 같이, BBIssOleic은 BBI 보다 높은 혈중 농도를 나타내며, 순환계로부터 더욱 서서히 제거되는 것으로 나타났다. BBIssOleic의 혈중 농도는 동일한 시점에서 BBI의 농도보다 약 4 배 더 높았다. BBIssOleic의 신장 제거율은 천연-BBI 보다 약 4 배 더 낮고, 간 축적량은 천연-BBI보다 약 4 배 더 높았다. 간내에서 BBIssOleic의 유지가 지연되었으며, 주사한 지 24시간 후에 조차도 간에 존재하는 접합체의 농도가 유의적이었다. BBIssOleic의 폐 농도는 천연-BBI의 농도보다 약 2배 더 높았지만, 폐의 잔류 혈액이 더 많다는 것이 이러한 관찰 결과의 원인이될 수 있다.
CF-1 마우스에서125I-BBIssPal의 복강내 생체 분포를, 투여한 지 0.5시간(도 4A), 3시간(도 4B) 또는 24시간(도 4C)후에 기관 1 g당 평균 축적 투여량± 범위(막대)로서 도 4에 나타내었다.125I-BBIssPal의 신장 축적량은 0.5 및 3시간의 시점에서 천연125I-BBI 보다 4 배 더 낮았다. 24시간 째에 신장에서125I-BBIssPal 농도는125I-BBI 보다 더 높았다.125I-BBIssPal의 혈중 농도는 0.5시간 째에125I-BBI의 혈중 농도와 유사하였고, 3시간 째에 BBI보다 1.5 배 더 높았으며, 24시간 째에 BBI의 농도보다 약 3 배 더 높았다.125I-BBIssPal의 간 축적량은 0.5시간 째에125I-BBI 보다 1.5 배 더 높았고, 3시간 째에 2.5 배 더 높았으며, 24시간 째에 약 4 배 더 높았다. 24시간 째에 간과 신장에는 비교적 다량의125I-BBIssPal이 존재하였다.
실시예 5
시험관내 형질전환 연구
C3H 10T1/2(클론 8) 세포를 사용하여 공지된 문헌에 제안된 방법[레즈니코프, 씨.에이. 일동 (1973)Cancer. Res. 33, 3239-3249; 레즈니코프, 씨.에이.일동 (1973)Cancer. Res. 33, 3231-3238]에 따라서 형질전환 분석을 수행하였다. 마이코플라즈마가 없는 세포의 원료 배양액은, 7일 간격으로 75 ㎠ 플라스크에서 50,000 세포를 계대 배양하여 유지시켰다. 이러한 스케쥴을 사용하여, 항상 전면배양되기 약 2일 전에 세포를 계대 배양하였다. 원료 배양액을 10% FBS, 페니실린(100 단위) 및 스트렙토마이신(100 ㎍)이 보충된 이글 기본 배지에서 증식시켜서, 9 내지 14회의 계대 배양시 형질전환 분석에 사용하였다. 원료 세포를 PBS 중 트립신(0.1%)으로 5분 동안 처리하고, 배지 5 ㎖를 사용하여 트립신을 급냉시키므로써 세포를 계배 배양하였다. 이러한 절차는 원료 배양액 내에서 자발적인 형질전환을 최소화하고 페트리 접시에서 평판배양 효율을 최대화시는데 적합하다. 배양액에 사용된 FBS 원료는 사전에 검색하여 혈청이 형질전환된 세포의 발현 및 증식을 유지할 수 있도록 하였다.
형질전환 분석에 있어서, C3H 10T1/2 세포(1000/접시)를 60 ㎜ 페트리 접시내로 접종하고 10% FBS, 페니실린(100 단위), 및 스트렙토마이신(100㎍)이 보충된 이글 기본 배지에서 24시간 동안 5% CO2함수 대기하에 증식시켰다. 이어서, 세포를 아세톤 원료 용액(0.25 ㎎/㎖)중 3-메틸콜란트렌(MCA) 25 ㎕를 사용하여 최종 농도 1 ㎍/㎖ MCA(5 ㎍/5㎖)로 처리하여 세포를 개시하였다. 발암성 물질 또는 용매의 존재하에 24시간 동안 세포를 증식시킨 다음, 각각의 접시내 배지를 발암성 물질이나 용매를 함유하지 않는 새로운 배지로 교체하였다. 접시내의 배지는 처음 2 주의 분석 기간 동안에는 매주 2회 교체하고, 그 후에는 남은 4 주의 분석 기간 동안 매주 1회 교체하였다. 접합체의 형질전환 억제 활성을 측정하기 위해 고안된 실험에서, 처음 3 주의 분석 기간 동안에는 접합체를 함유하는 배지(1 ㎍/㎖)에서 세포를 유지하고, 이어서 접합체가 첨가되지 않은 배지에서 세포를 유지하였다.
발암성 물질로 처리한 지 6 주 후에, 배양 접시에 대한 부착에 관하여 세포를 현미경 조사하고, PBS로 세척한 후에 100% 메탄올로 고정시켰다. 그 다음, 고정된 단층을 김사(Giemsa) 염색물질로 염색하였다. 1 그룹당 20개의 접시를 매회 실험에서 처리하였다. 테스트 그룹 이외에도, 모든 형질 전환 분석에는 3개 이상의 다른 그룹: 음성 대조군(발암성 물질 또는 용매로 처리하지 않음), 아세톤 대조군(25 ㎕의 아세톤으로 처리함) 및 양성 대조군[아세톤 25㎕중 MCA(1㎕/㎖)로 처리함]을 포함시켰다. 평판내에서 형질전환된 포커스(직경 >3㎜)를 현미경으로 조사하고, 공지된 지침에 따라 I형, II형 또는 III형으로서 분류하였다[랜돌프, J.R. (1985)Transformation assay of established cell lines: Mechanism and Application(가쿠나가 티. 및 야마사키 에이치. 편집) IARC 사이언티픽 퍼블리케이션즈, 프랑스, 리용, pp.185-201]. 요컨대, III형 포커스는 김사에 의해 진한 청색으로 염색되고 불규칙한 십자형 연부가 있는, 고밀도, 다층, 호염기성의 세포 증식 영역이다. II형 포커스는 고밀도, 다층의 세포 증식 영역이지만, 김사에 의해 자색으로 염색되고 III형 포커스에 비해 보다 매끄럽고 명확한 연부를 갖는다. I형 포커스는 이 분석에서 평가하지 않았다.
또한, 매회 형질전환 분석과 함께 세포의 평판배양 효율(PE)을 연구하였다. 상이한 처리 그룹에서 세포의 PE를 측정하기 위해서, 세포(200개 세포/접시)를 실험 그룹당 3개의 60 ㎜ 페트리 접시내로 접종하고 형질전환 분석 세포와 동일한 방식으로 처리하였다. 이러한 분석에서 세포는 10일째에 처리를 종료하고, 100% 메탄올로 고정시키고, 김사로 염색하였다. 현미경 하에서 보이는 50 세포 이상의 콜로니를 계수하였다. 평판배양 효율은 (콜로니의 수/접종된 세포의 수)*100으로서 정의하였다.
BBI, BBIssPal 및 BBIssOleic의 시험관내 형질전환 억제 활성은 하기 표 4에 제시되어 있다. 유리 단백질 또는 팔미트산이나 올레산에 접합된 형태의 BBI를, MCA 처리 직후 개시하는 형질전환 분석의 처음 3 주 동안 1.0 ㎍/㎖ 농도로 배양액에 첨가하였다. MCA-처리된 세포를 24시간 동안 1 ㎍/㎖의 농도로 아세톤 25㎕에 용해된 3-메틸콜란트렌에 노출시켰다. 아세톤-처리된 세포를 24시간 동안만 아세톤 25 ㎕에 노출시켰다. 시험 그룹을 24시간 동안 MCA에 노출시킨 다음, 분석의 처음 3 주 동안 접합체에 노출시켰다. 미처리된 세포는 MCA에도 아세톤에도 노출시키지 않았다. 통계학적 분석(X2): 그룹 4 대비 3, p<0.05; 그룹 5 대비 3, 0.05<p<0.1; 그룹 6 대비 3, p<0.05. 접종한 지 약 14일후에 접시에서 전면성장된 대조군인 미처리된 세포는 웰 접착성의 접촉-억제형 단층을 형성하였다. 이들 접시는 분석 기간의 말기에 형질전환된 포커스를 전혀 함유하지 않았다. 또한 아세톤 처리된 세포는 전면 성장하여 접종한 지 14일 후에 웰 접착성의 단층을 형성하였으나, 포커스를 함유하지 않았다. 그러나, MCA-처리된 접시는 형태학적으로 형질전환된 포커스를 함유하였으며; 19개 접시중 6개가 III형 포커스를 함유하는 것으로 기록되었다. BBI-처리된 그룹은 형질전환된 병소를 함유하지 않았으며, 이는 BBI가 이들 세포에서 MCA-유도형 형질전환을 방지할 수 있음을 시사한다. BBIssPal-처리된 세포는 이 분석에서 평가된 20개 접시중 하나의 II형 포커스를 함유하였다. BBIssOleic 처리된 세포는 형질전환된 포커스를 함유하지 않았다. 이러한 분석에 있어서 모든 그룹의 PE는 20% 내지 25% 이었다. 하기 표 4에서 입증되는 바와 같이, BBIssPal 및 BBIssOleic은 BBI의 원래의 생물학적 활성을 유지하였다.
Figure pct00009
실시예 6
단일 접합체 및 다중 접합체의 수송
정상 막 결합된125I-BBIssPal의 수송에 관한 연구를 트랜스웰 및 6-웰 평판을 사용하여 수행하였다. 6-웰 평판 실험에 있어서,125I-BBI 또는125I-BBIssPal(10 ㎍/㎖)을 무혈청 배지에서 37℃하에 1시간 동안 Caco-2 세포와 함께 항온처리하였다. 이어서 세포를 빙냉된 PBS로 3회 세정한 후 2개의 그룹으로 분류하였다. 제1 그룹에서는 세포를 트립신 처리하고 분리한 후에 접합체의 흡수를 측정하였다. 제2 그룹에서는, 세포를 무혈청 배지로 다시 항온처리하고, 세포로부터의 접합체의 방출을 24시간 동안 추적하였다. 배지를 매시간 간격으로 분리하여 방사능을 계수하였다. 추적 기간의 말기에, 세포를 트립신으로 처리하고, 분리시킨 후에, 축적 방사능에 대해 계수하였다. 매회 실험에서 총 계수 (배지+세포 cpms)를 측정하였으며, 상이한 시간에 방출된 총 계수의 %를 측정하였다.
트랜스웰 실험에서, 접합체를 정상면의 세포와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서 트랜스웰을 빙냉된 PBS로 3회 세정한 후에, 무혈청 배지로 다시 항온처리하였다. 정상 및 기저 배지내로의 접합체의 방출을 상이한 시간에 전체의 기저 또는 정상 배지를 계수하므로써 24시간 동안 추적하였다. 추적 기간의 말기에 얻어진 총 계수 (트랜스웰+배지 계수)를 더하고, 상이한 시점에서 접합체의 방출율(전체에 대한 %)을 계산하였다. 24시간 째에 트랜스웰에서 얻어진 계수가 세포내의 접합체의 존재에 기인한 것이며, 플라스틱에 대한 비특이적인 결합에 기인한 것이 아님을 확인하기 위해서, 트랜스웰을 10분 동안 트립신에 노출시키고, 빙냉된 PBS로 3회 세정한 후에, 축적 방사능에 대해 계수하였다.
BBI를 2 또는 4 팔미트산으로 변형시키고, 그 수송량을 트랜스웰에서 측정하였다. BBI, 4 팔미트산으로 변형시킨 BBI[BBIssPal(4)], 및 2 팔미트산으로 변형시킨 BBI[BBIssPal(2)]의 Caco-2 단층에서의 축적 수송량은 도 5A에 도시되어 있다; 그 결과는 BBI(ng/단층)±SEM, n=3으로서 나타낸 것이다. 수송 크기의 순서는BBIssPal(4)>BBI>BBIssPal(2)이었다. 동일한 세포 내로의 접합체의 내면화 결과는 단층 당 내면화된 BBI의 ng단위로서 도 5에 도시되어 있다. 예상한 바와 같이, BBIssPal(4)은 세포내로의 최대 흡수량을 나타내었으며, 그 다음은 BBIssPal(2) 및 BBI의 순서였다. 트랜스웰로부터 24시간 째에 얻은 기저 배지를 G50 컬럼을 사용하여 분석하였으며; 그 결과는 도 6에 도시하였다. 이전에도 관찰된 바와 같이, BBI와 BBIssPal(4)은 단층을 교차하여 트랜스사이토시스되지 않았다. 소량이지만 유효한 양의 BBIssPal(2)의 기저 배지는 완전한 접합체로 구성되었다. 그 양은 기저 배지내에 존재하는 총 방사능의 약 10 내지 약 20% 범위로 구성된다.
실시예 7
BBIssPal의 피부 흡수
제모된 마우스로부터 새로 준비한 피부를 작은 고리상에 고정시켰다. 각각의 고정된 피부에,125I-표지화된 BBI 또는 BBIssPal의 샘플 5 ㎕를 0.5 ㎎/㎖의 농도로 0.38 ㎠의 면적에 도포하였다. 피부 단편 2개를 매회 처리당 사용하였다. 피부를 습한 환경에서 실온(23℃)에 보관하였다. 30분 경과 후에, 피부의 표면을 먼저 PBS로 주의 깊게 세정한 후에, 피부를 제거하고, PBS 100 ㎖ 중에 2회 침지하였다. 이어서 피부를 여과지로 블로팅하고 감마 계수기에서 계수하였다. 피부상에 유지된 BBI의 양은 표지화된 BBI 또는 BBIssPal의 특이적인 방사능을 사용하여 계산하였다. 마우스 피부내로의 BBI 및 BBIssPal의 흡수량은 각각 0.14 및 1.6 ㎍/㎠ 이었다. 이러한 결과는 Pal-PDC를 사용하여 폴리펩티드를 변형시킬 경우 피부내로의BBI의 흡수가 10배 이상 증가함을 입증한다.
실시예 8
팔미틸화된 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPssPal)의 합성
PBS 0.5 ㎖ 중 양고추냉이 퍼옥시다제(분자량 40,000; 시그마 P8375) 10 ㎎을 25℃하에 2시간 동안 DMF 0.1 ㎖중 SPDP 2 ㎖와 혼합하였다. 0.5 ㎖ PBS로 희석하여 반응을 종료하고, 4℃하에 PBS 500 ㎖ 중에서 투석하였다. 24시간 후에, 투석 튜브내의 용액을 제거하고, 1M DTT 50㎕를 첨가하여 환원시킨 후에, 세파덱스 G-50 컬럼을 사용하여 분리하였다. 컬럼의 공극 용적에서의 분획을 모으고, 25℃에서 4시간 동안 붕산염 완충액 pH 9.6 중 10 배 몰 과량의 Pal-PDC와 혼합하였다. 이어서 반응 혼합물을 4℃에서 3일 동안 완전히 투석한 결과, 최종 생성물은 HRP 분자당 10개의 팔미트산 잔기를 함유하는 것으로 평가되었다. HRP 분자는 원래의 효소 활성의 약 20%를 보유하였다.
실시예 9
HRPssPal의 세포 흡수
6-웰 배양 클러스터 평판내의 마우스 섬유아세포 L929의 융합성 단층을, 천연 형태 또는 팔미트산 접합체(HRPssPal)로서 HRP 30 ㎍/㎖와 함께 무혈청 배지에서 항온처리하였다. 37℃에서 1 시간 후, 단층을 PBS로 3회 세척한 다음, 0.05% 트리톤-X100 1 ㎖에 용해시켰다. 세포-회합된 HRP는 각 세포 추출물에서 세포 활성을 측정하므로써 결정하고, 그 결과를 세포 단층당 HRP ng으로 환산하였다. 그 결과는 HRP 및 HRPssPal의 세포 흡수량이 각 세포 단층당 7 및 229 ng HRP 임을 시사한다.따라서, HRP를 Pal-PDC로 변형시킴으로써 세포 흡수를 30 배 증가시켰다.
실시예 10
올리고뉴클레오티드의 지질화
모노아민 옥시다제 B의 mRNA에 대해 상보적인 안티센스 21량체 올리고뉴클레오티드를 다음과 같은 절차에 따라 티올화시켰다. 올리고뉴클레오티드를 수용성 카르보디이미드 시약인 EDC의 존재하에 2 배 몰 과량의 시스타민과 혼합하였다. 그 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 유지하고, 시스타민에 대한 2배 몰 과량의 DTT를 첨가하여 디설피드 결합을 환원시켰다. 세파덱스 G-25 컬럼을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 유리 시스타민 및 DTT로부터 분리한 후에, 소량의 티올화된 올리고뉴클레오티드를 엘만 시약과 반응시키고, 412 nm 에서의 흡광도를 사용하여(ε을 1.36×104M-1로 가정) 설프히드릴기의 농도를 측정했다. 이어서, 올리고뉴클레오티드 분자당 설프히드릴기의 수를 측정하였다. 티올화된 올리고뉴클레오티드를 pH 8의 중탄산염 완충액중에서, 올리고뉴클레오티드내의 설프히드릴기의 수에 대해 2배 몰 과량으로 Pal-PDC와 혼합하였다. 팔미틸화된 올리고뉴클레오티드를 세파덱스 G-25 컬럼을 사용하여 정제하였다.
이상의 본 발명의 상세한 설명으로부터, 당업자라면 본 발명의 기술사상과 보호범위를 벗어나는 일 없이 본 발명의 필수적인 특징을 용이하게 파악할 수 있을 것이며, 나아가 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 맞게 개작할 수 있을 것이다. 상황에 따라서 실시형태의 변화와 등가물의 교체를 고려할 수 있으며, 상세한 설명에개시된 특정한 용어들은 단지 구체적인 설명의 목적으로 사용한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 결코 아니다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 VI의 화합물:
    화학식 VI
    Figure pct00010
    상기 식에서,
    P는 펩티드, 단백질 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되고;
    R1은 수소, 저급 알킬 또는 아릴이며;
    R2는 지질, -CH2CH2CH(NH2)CO-지질, CH2CH2CH(NHCO-지질)CO2H, 또는 CH2CH2CH(NHCO-지질)CO-지질이고;
    R3는 -OH;
    이때, 상기 지질은 4 내지 26개의 탄소 원자로 구성된 소수성 치환체이고, 부착된 카보닐과 결합된 지질은 지방산 아실기이다.
  2. 제1항에 있어서, R1은 수소이고, R2는 지질 기이며, R3는 -OH인 것이 특징인 화학식 VI의 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R1은 수소이고, R2는 -CH2CH2CH(NH2)CO-지질, CH2CH2CH(NHCO-지질)CO2H, 또는 CH2CH2CH(NHCO-지질)CO-지질인 것이 특징인 화학식 VI의 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지질 기는 약 C5~약 C19의 소수성 치환체인 것이 특징인 화학식 VI의 화합물.
  5. 화학식 PSH의 화합물[P는 펩티드, 단백질 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택됨]을 하기 화학식 V의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 VI의 화합물을 형성하는 방법:
    화학식 V
    Figure pct00011
    상기 식에서,
    A는 방향족 활성화 잔기이고;
    R1은 수소, 저급 알킬 또는 아릴이며;
    R2는 지질, -CH2CH2CH(NH2)CO-지질, CH2CH2CH(NHCO-지질)CO2H, 또는 CH2CH2CH(NHCO-지질)CO-지질이고;
    R3는 -OH;
    이때, 상기 지질은 4 내지 26개의 탄소 원자로 구성된 소수성 치환체이고, 부착된 카보닐과 결합된 지질은 지방산 아실기이다.
  6. 제5항에 있어서, A는 2-피리딜 또는 4-니트로페닐인 것이 특징인 화학식 VI의 화합물을 형성하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 R1은 수소이고, R2는 지질 기이며, R3는 -OH인 것이 특징인 화학식 VI의 화합물을 형성하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, R1은 수소이고, R2는 -CH2CH2CH(NH2)CO2H 또는 -CH2CH2CH(NHCO-지질)CO-지질이며, R3는 -NHCH2CO2H 또는 -NHCH2CO-지질이고, 이 때 R2및 R3중 하나 이상은 지질 기를 포함하는 것이 특징인 화학식 VI의 화합물을 형성하는 방법.
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