DE69637229T2 - Lipidisierung hydrophiler Moleküle - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung der Anmeldung Nr. 08/349,717, die am 25. Januar 1995 angemeldet wurde.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gebiete der Biologie und Medizin. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen, die beim Erhöhen der Absorption und Retention von hydrophilen Molekülen, insbesondere Peptiden und Proteinen, in Säugetieren nützlich sind.
  • Fortschritte in der Biotechnologie haben die Herstellung großer Mengen therapeutisch aktiver und reiner Proteine und Peptide möglich gemacht. Gleichzeitig können die therapeutischen Effekte der meisten dieser Mittel nur erreicht werden, wenn sie durch invasive Wege, wie beispielsweise durch Injektion, verabreicht werden. Weil die meisten Proteine kurze Halbwertszeiten aufweisen, können effektive Konzentrationen dieser Mittel nur aufrechterhalten werden, wenn sie durch häufige Injektionen verabreicht werden.
  • Obwohl die Verabreichung von Proteinen durch Injektion das effektivste Mittel ihrer Zuführung in vivo ist, ist die Patiententoleranz für viele Injektionen sehr schlecht. Zudem ist die Verabreichung von Medikamenten auf Injektionswegen eine Facharbeit und erfordert Übung; dieses Geschick und Übung müssen nicht immer auf Patienten übertragbar sein. In Fällen, in denen Proteinmedikamente eine lebensrettende Rolle haben, kann die Verabreichung durch den Injektionsweg von den Patienten akzeptiert werden. In Fällen, in denen Proteinmedikamente jedoch nur eine von mehreren möglichen Therapien sind, ist es unwahrscheinlich, dass Injektionen von Proteinen und Peptiden von den Patienten akzeptiert werden. Alternative Protein- und Peptidzuführwege müssen deshalb entwickelt werden.
  • Alternative Protein- und Peptidzuführwege können bukkale, nasale, orale, pulmonale, rektale und okulare Wege umfassen. Diese Wege sind ohne Ausnahme weniger effektiv als die parenteralen Verabreichungswege. Diese Protein- und Peptidzuführwege sind jedoch immer noch bei weitem attraktiver als die parenteralen Wege, weil sie den Patienten Vorteile und Einfluss bieten. Der orale Weg ist besonders attraktiv, weil er der angenehmste und Patienten-willfährigste ist.
  • Schleimhautbarrieren, die das Innere des Körpers von dem Äußeren trennen (z.B. GI, okulare, pulmonale, rektale und nasale Schleimhaut) enthalten eine Schicht aus dichtverbundenen Monolagern, die den Transport von Molekülen streng regulieren. Einzelne Zellen in Barrieren sind durch dichte bzw. feste Verbindungsstellen verbunden, die einen Eintritt in den intrazellulären Raum regulieren. Die Schleimhaut ist folglich bei dem ersten Niveau eine physikalische Barriere, durch die ein Transport von entweder dem transzellulären oder dem parazellulären Weg abhängt [Lee, V.H.L. (1988) CRC. Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5, 69-97].
  • Ein parazellulärer Transport durch wassergefüllte, dichte Verbindungsstellen ist auf kleine Moleküle (MW < 1kDa) beschränkt und ist im wesentlichen ein Diffusionsprozess, der durch einen Konzentrationsgradienten durch die Schleimhaut angetrieben wird [Lee, (1988), vorstehend; Artursson, P., und Magnusson, C. (1990) J. Pharm. Sci. 79, 595-600]. Die dichten Verbindungsstellen umfassen weniger als 0,5% des Gesamtoberflächenbereichs der Schleimhaut [Gonzalez-Mariscal, L.M. et al (1985) J. Membrane. Biol. 86, 113-125; Vetvicka, V., und Lubor, F. (1988) CRC Critical Rev. Ther. Drug Deliv. Sys. 5, 141-170]; deshalb spielen sie eine untergeordnete Rolle bei dem Transport von Proteinmedikamenten durch die Schleimhaut.
  • Der transzelluläre Transport von kleinen Medikamenten tritt unter der Voraussetzung effizient auf, dass die physiochemischen Eigenschaften des Medikaments zum Transportieren durch die hydrophoben Zellenbarrieren geeignet sind. Der transzelluläre Transport von Proteinen und Peptiden ist jedoch auf den Transzytoseprozess eingeschränkt [Shen, W.C. et al., (1992) Adv. Drug Delivery Rev. 8, 93-113]. Die Transzytose ist ein komplexer Prozess, in dem Proteine und Peptide in Vesikel von einer Seite einer Zelle aufgenommen werden und anschließend durch die Zelle zur anderen Seite der Zelle hintransportiert werden, wo sie aus den endozytischen Vesikeln abgeladen werden [Mostov, K.E., und Semister, N.E. (1985) Cell 43, 389-390]. Die Zellmembran von Schleimhautbarrieren ist eine hydrophobe Lipiddoppelschicht, die keine Affinität zu hydrophilen, geladenen Makromolekülen wie Proteine und Peptide aufweist. Zudem können Schleimhautzellen Muzin sekretieren, das als eine Barriere für den Transport vieler Makromoleküle wirken kann [Edwards, P. (1978) British Med. Bull. 34, 55-56]. Deshalb ist, wenn nicht ein spezifischer Transportmechanismus für ein Protein und Peptid vorhanden ist, ihr inhärenter Transport durch Schleimhautbarrieren beinahe vernachlässigbar.
  • Zudem besitzen Schleimhautbarrieren, um eine dichte physikalische Barriere für den Transport von Proteinen und Peptiden bereitzustellen, Enzyme, die Proteine und Peptide vor, nach und während ihres Durchgangs durch die Schleimhaut abbauen können. Diese Barriere wird als enzymatische Barriere bezeichnet. Die enzymatische Barriere besteht aus Endo- und Exopeptidaseenzymen, die Proteine und Peptide an ihren Enden oder innerhalb ihrer Struktur spalten. Die enzymatische Aktivität verschiedener Schleimhaut wurde untersucht und die Resultate zeigten, dass eine beträchtliche Proteaseaktivität in den Homogensten bukkaler, nasaler, rektaler und vaginaler Schleimhaut von Albinokaninchen vorhanden ist und dass diese Aktivitäten mit jenen vergleichbar sind, die in dem Ilium vorhanden sind [Lee et al. (1988) vorstehend]. Die enzymatische Barriere wird deshalb ungeachtet der betrachteten Schleimhaut eine große Rolle bei dem Abbau der Protein- und Peptid-Moleküle spielen.
  • Die N- und die C-Enden von Peptiden sind geladen und die Gegenwart von geladenen Seitenketten verleihen diesen Makromolekülen hoch-hydrophile Eigenschaften. Zudem bedeutet die Gegenwart von geladenen Seitenketten, dass Proteine und Peptide starke Wasserstoff-Bindungsfähigkeiten aufweisen; es wurde gezeigt, dass diese H-Bindungsfähigkeit eine große Rolle bei der Hemmung des Transports von sogar kleinen Peptiden durch Zellmembrane spielt [Conradi, R.A. et al. (1991) Pharma Res. 8, 1453-1460]. Die Größe und die hydrophile Natur von Proteinen und Peptiden vereinigen sich deshalb, um ihren Transport durch Schleimhautbarrieren stark einzuschränken.
  • Ein Zugang, der verwendet wurde, um die physikalische Natur der Schleimhautbarrieren zu ändern, ist die Verwendung von Penetrationsverstärkern. Die Verwendung von Penetrationsverstärkern basiert auf der Zerstörung der Zellbarrieren durch die Verwendung von Mitteln mit geringem Molekulargewicht, die Zellmembrane auflockern bzw. verflüssigen [Kaji, H. et al (1985) Life Sci. 37, 523-530], dichte Verbindungsstellen öffnen [Inagaki, M. et al. (1985) Rhinology 23, 213-221] und Poren in den Zellmembranen erzeugen können [Gordon, S. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7419-7423; Lee, V.H.L. et al (1991) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, CRC Press 8, 91-192]. Die Verwendung dieser Mittel führt zu einem unspezifischen Verlust an Barrierenintegrität und kann zu der Absorption einer Vielzahl von großen Molekülen führen, die zu Zellen in vivo toxisch sein können.
  • Proteasehemmer wurden mit Proteinen und Peptiden zusammen verabreicht und haben eine begrenzte Aktivität bei einer Verbesserung der Absorption dieser Makromoleküle in vivo gezeigt [Kidron, M. et al (1982) Life Sci. 31, 2837-2841; Takaroi, K. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137, 682-687]. Die Sicherheit und die Langzeiteffekte dieses Zugangs müssen noch gründlich untersucht werden.
  • Der Prodrug-Zugang basiert auf den Modifikationen von Peptiden auf eine Weise, die sie vor Enzymabbau und -erkennung schützen wird. Dies wird durch Ersetzen der D-Formen von Aminosäuren in der Struktur von Peptiden, die Blockierung von ungeschützten Gruppen an Peptiden durch Amidierung und Acylierung, die Inversion der Chiralität von Peptiden und die Einführung von Konformationszwängen in der Peptidstruktur erreicht. Die Synthese von Prodrugs ist nur auf kleine Peptide anwendbar, die leicht identifizierbare Aktivitätsdomänen haben.
  • Eine Größenreduktion ist ein anderer realisierbarer Zugang, um das Transportpotential von Proteinen zu erhöhen. Die Wirkstellen von Proteinen müssen jedoch kartografisch erfasst bzw. gemappt werden, bevor eine Größenreduktion versucht werden kann. Es ist im Allgemeinen schwierig, diesen Zugang auf die Mehrheit von Proteinen anzuwenden.
  • Bestimmte Liganden können aufgrund ihrer Eigenschaften die Zellaufnahme- und Transporteigenschaften von Proteinen und Peptiden ändern. Das Wesentliche dieses Zugangs ist, dass ein Zell-impermeantes Protein oder Peptid kovalent an einen Träger gebunden ist, der in die Zellen in hohem Maße transportiert wird. Die Mechanismen, durch den die Trägerliganden endozytosiert und transzytosiert werden, sind beim Entscheiden der Eignung des Trägers zur Verbesserung des Transports von Proteinen und Peptiden wichtig. Makromolekulare Träger sind hydrophil und verteilen sich nicht in die Membran. Der Transport von großen polymeren Trägern in die Zellen wird deshalb von der Affinität des Trägers zu der Zellmembran vermittelt. Im Allgemeinen beginnt die Aufnahme eines makromolekularen Konjugats mit der Bindung an die Zellmembran. Die Bindung des Trägers an die Zellen kann spezifisch (z.B. Binden von Antikörpern an Zelloberflächenantigene), unspezifisch (Binden von kationischen Liganden an Zelloberflächenzucker) oder Rezeptor-vermittelt (Binden von Transferrin oder Insulin an ihre Rezeptoren) sein. Wenn der Träger an die Zelloberfläche gebunden ist, wird er in Vesikel aufgenommen. Diese Vesikel werden dann stufenweise verarbeitet und können auf verschiedene Wegen geführt werden. Ein Weg ist das Recyceln des Vesikels zurück zu der Membran, von der es invaginiert war. Ein anderer Weg, der für das Konjugat zerstörend ist, ist die Fusion mit Lysosomen. Ein alternativer Weg und einer, der zu der Transzytose des Konjugats führt, ist die Fusion des Vesikels mit der Membran, die der Seite gegenüberliegt, von der es abgeleitet wurde.
  • Das korrekte Gleichgewicht zwischen dem Endozytose- und Transytose-Prozess bestimmt die Zuführung eines Proteinkonjugats zu seinem Ziel. Zum Beispiel kann die Endozytose das Ausmaß bestimmen, mit dem ein Konjugat von der Zielzelle aufgenommen wird, aber die Transzytose bestimmt, ob ein Konjugat sein Ziel erreicht oder nicht [Shen et al. (1992), vorstehend]. Für eine erfolgreiche Absorption durch den GI-Trakt muss ein Konjugat die Apikalmembran der GI-Schleimhaut binden, in den Schleimhautzellen initialisiert werden, durch die Zellen zugeführt werden und schließlich von der basolateralen Membran freigesetzt werden.
  • Die gegenwärtige Literatur enthält viele Berichte, die zeigen, dass unspezifische Träger, wie beispielsweise Polylysine [Shen, W.C., und Ryser, H.J.P. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 7589-7593] und Lektine [Broadwell, R.D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 632-646] und spezifische Träger, wie beispielsweise Transferrin [Wan, J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 13446-13450], Asialoglycoprotein [Seth, R. et al. (1993) J. Infect. Diseases 168, 994-999] und Antikörper [Vitetta, E.S. (1990) J. Clin. Immunol. 10, 15S-18S] die Endozytose von Proteinen in Zellen verbessern können. Berichte, die sich mit transzytotischen Trägern für Proteine befassen, sind weniger und sehr wenig Untersuchungen haben den Transport von Proteinkonjugaten durch die Zellbarrieren quantifiziert. Es wurde gezeigt, dass Weizenkeimagglutinin [Broadwell et al. (1988), vorstehend] und ein Anti-Transferrin/Methotrexat-Konjugat [Friden, P.M., und Wlus, L.R. (1993) Adv. Exp. Med. Biol. 331, 129-136] durch die Blut-Hirn-Schranke in vivo transzytosiert werden. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Meerettichperoxidase-(HRP) Polylysin-Konjugate und ein HRP- Transferrin-Konjugat durch Zellmonolayer in vitro transzytosiert werden [Wan, J. und Shen, W.C. (1991) Pharm. Res. 8, S-5; Taub, M.E., und Shen, W.C. (1992) J. Cell. Physiol. 150, 283-290; Wan, J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 13446-13450, vorstehend].
  • Fettsäuren, als Bestandteile von Phospholipiden, machen den Hauptteil von Zellmembranen aus. Sie sind im Handel erhältlich und relativ billig. Aufgrund ihrer Lipidnatur können Fettsäuren sich leicht in der Zellmembran verteilen und mit ihr auf eine nicht toxische Weise Wechselwirken. Fettsäuren stellen deshalb potentiell die nützlichsten Trägerliganden zur Zuführung von Proteinen und Peptiden dar. Strategien, die Fettsäuren in der Zuführung von Proteinen und Peptiden verwenden können, umfassen die kovalente Modifikation von Proteinen und Peptiden und die Verwendung von Fettsäureemulsionen.
  • Einige Untersuchungen haben die erfolgreiche Verwendung von Fettsäureemulsionen zur Zuführung von Proteinen und Peptiden in vivo berichtet [Yoshikawa, H. etal. (1985) Pharm. Res. 2, 249-251; Fix, J.A. et al. Am J. Physiol. 251, G332-G340]. Der Mechanismus, durch den Fettsäureemulsionen die Absorption von Proteinen und Peptiden unterstützen können, ist noch nicht bekannt. Fettsäureemulsionen können dichte Verbindungsstellen öffnen, Membrane aufschließen, die Proteine und Peptide vor der GI-Umgebung tarnen, Proteine und Peptide durch die Schleimhaut als ein Teil ihrer Absorption tragen [Smith, P. et al. (1992) Adv. Drug Delivery Rev. 8, 253-290]. Der letztere Mechanismus wurde vorgeschlagen, ist aber mit dem gegenwärtigen Wissen über den Fettabsorptionsmechanismus inkonsistent.
  • Eine logischere Strategie zur Zuführung von Proteinen und Peptiden durch das GI-Epithelium ist, Fettsäuren als unspezifische Membran-adsorbierende Mittel zu verwenden. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass ein unspezifisches Membranbindungsmittel, das mit einem Protein verknüpft ist, die Transzytose eines Protein-Konjugats durch Zellen in vitro unterstützen kann [Wan, J. et al. (1990) J. Cell. Physiol. 145, 9-15; Taub und Shen (1992), vorstehend]. Es wurde gezeigt, dass eine Fettsäurekonjugation die Aufnahme von Makromolekülen in und durch Zellmembrane verbessern kann [Letsinger, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553-6556; Kabanov, A. et al. (1989) Protein Eng. 3, 19-42]. Nichtsdestoweniger gab es Schwierigkeiten beim Konjugieren von Fettsäuren mit Proteinen und Peptiden, einschließlich: (1) der Mangel an Löslichkeit von Fettsäuren in der wässerigen Lösung für die Konjugationsreaktion; (2) der Verlust von biologischer Aktivität von Proteinen und Peptiden nach Fettsäureacylierung; und (3) der Mangel an Löslichkeit von Fettsäure-konjugierter Peptide in wässerigen Lösungen [siehe, z.B., Hashimoto, M. et al., Pharm. Res. 6, 171-176 (1989); Martins, M.B.F. et al., Biochimie 72, 671-675 (1990); Muranishi, S. et al, Pharm. Res. 8, 649-652 (1991); Robert S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 447-454 (1993)].
  • Andere Konjugate, die Peptide und/oder Proteine enthalten, sind im Stand der Technik bekannt, wie nun kurz beschrieben werden, wobei die gepunktete Linie den Teil des Konjugats anzeigt, der der Lipid-haltigen Hälfte der Erfindung entspricht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Säurederivaten von Sulfhydryl-haltigen Verbindungen (zum Beispiel, Peptide, Proteine oder Oligonucleodide, die Sulfhydrylgruppen enthalten oder modifiziert sind, um sie zu enthalten), die Fettsäurekonjugierte Produkte mit einer Disulfid-Verknüpfung umfassen, zur Zuführung der Sulfhydryl-haltigen Verbindungen zu Säugetierzellen. Diese Modifizierung erhöht deutlich die Absorption dieser Verbindungen von Säugetierzellen in Bezug auf die Absorptionsgeschwindigkeit bzw. -rate der unkonjugierten Verbindungen und verlängert Blut- und Geweberetention der Verbindung. Zudem ist die Disulfidverknüpfung in dem Konjugat ziemlich labil in den Zellen und erleichtert folglich eine intrazelluläre Freisetzung der intakten Verbindungen von den Fettsäure-Hälften. Reagenzien und Verfahren zur Herstellung der Fettsäurederivate werden ebenfalls bereitgestellt. Folglich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Lipid-haltigen Hälfte bei der Herstellung einer Verbindung zur Zuführung einer Sulfhydrylgruppen-haltigen Verbindung in Säuretierzellen, wobei die Lipid-haltige Hälfte eine Verbindung der allgemeinen Formel V ist; A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(=O)R3 Vwobei die Verbindung zum Einbringen einer Sulfhydrylgruppen-haltigen Verbindung die allgemeine Formel VI hat; P-S-S-CH2-C(COR3)R1NHC(=O)R2 VIwobei A ein aromatischer aktivierender Rest ist; P eine Komponente ist, welche von der Sulfhydrylgruppen-enthaltenden Verbindung der allgemeinen Formel PSH abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden, Proteinen und Oligonucleotiden; R1 Wasserstoff oder Aryl ist; R2 eine Lipid-enthaltende Komponente ist, enthaltend eine Lipidgruppe; und R3 -OH, eine Lipid-enthaltende Komponente, enthaltend eine Lipidgruppe oder eine Aminosäurekette, enthaltend eine oder zwei Aminosäuren, die mit -CO2H oder COR2 enden, ist.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen besser verstanden werden, in denen:
  • 1 die Aufnahme von BBI, BBIssPla und BBIOlein in Caco-2-Zellen veranschaulicht;
  • 2 die Bioverteilung von BBI und BBIssPal in Blut, Nieren, Lungen und Leber von CF-1 Mäusen im Anschluss an iv-Verabreichung veranschaulicht;
  • 3 die Bioverteilung von BBI und BBIssOlein in Blut, Nieren, Lungen und Leber von CF-1 Mäusen im Anschluss an iv-Verabreichung veranschaulicht;
  • 4 die Bioverteilung von BBI und BBIssPal in CF-1 Mäusen im Anschluss an ip-Verabreichung veranschaulicht;
  • 5 Transzytose und Akkumulation von BBI, BBIssPal(2) und BBIssPal(4) durch und in Caco-2-Zellen veranschaulicht; und
  • 6 das Resultat einer G50 Gelfiltrationsanalyse eines Basalmediums von Caco-2-Zellen veranschaulicht, die tranzytosiertes BBI, BbissPal(2) und BBIssPal(4) enthalten.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird eine Sulfhydryl-haltige Verbindung (zum Beispiel, ein Biopolymer, wie hier nachstehend definiert) an ein Fettsäurederivat durch eine reversible, biologisch abbaubare Disulfidbindung gebunden. Es wird erwartet, dass ein derartiges Konjugat an die Apikalseite einer Zellmembran bindet, die basolaterale Membran des GI-Epitheliums als eine Folge von Membrantransport und Umwandlung erreicht und in ein interstitielles Fluid als eine Folge einer Disulfidbindungsredukion freigesetzt wird.
  • Die vorliegende Erfindung Erfindung bezieht sich auf Konjugate der allgemeinen Formel VI
    Figure 00090001
    in der P ein Rest ist, der von einer Sulfhydryl-haltigen Verbindung abgeleitet ist; R1 Wasserstoff oder Aryl ist; R2 eine Lipid-haltige Hälfte (wie hier nachstehend definiert) ist; und R3 -OH, eine Lipid-haltige Hälfte oder eine Aminosäurenkette ist, die ein oder 2 Aminosäuren enthält und mit -CO2H oder -COR2 endet. Diese Konjugate sind besonders zur Erhöhung der Absorption und Verlängerung der Blut- und Geweberetention der Sulfhydrylhaltigen Verbindung PSH nützlich.
  • Weiterhin werden Verfahren zur Erhöhung der Absorption oder Verlängerung der Blut- und Geweberetention in einem Säugetier einer Sulfhydryl-haltigen Verbindung der allgemeinen Formel PSH offenbart und bereitgestellt, in denen ein Konjugat der allgemeinen Formel VI aus der Sulfhydryl-haltigen Verbindung gebildet wird und das Konjugat dann dem Säugetier (zum Beispiel, in einer wässerigen Lösung oder einer oralen Dosierungseinheit) verabreicht wird.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verbindungen der allgemeinen Formel V A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(=O)R3 V in der A ein aromatischer, aktivierender Rest (wie hier nachstehend definiert) ist und R1, R2 und R3 wie vorstehend definiert sind. Die Verbindungen der allgemeinen Formel V sind besonders zur Herstellung von Konjugaten der allgemeinen Formel VI aus Sulfhydrylhaltigen Verbindungen der allgemeinen Formel PSH nützlich.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Bildung von Konjugaten der allgemeinen Formel VI aus Sulfhydryl-haltigen Verbindungen der allgemeinen Formel PSH, das Reagieren einer Verbindung der allgemeinen Formel PSH mit einer Verbindung der allgemeinen Formel V umfasst. Die Reaktion wird typischerweise mit einem Überschuss (z.B., einem zweifachen bis zehnfachen Überschuss) der Verbindung der allgemeinen Formel V über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 37°C in einer geeigneten wässerigen Pufferlösung (z.B., Phosphat-, Hydrogencarbonat- und Boratpuffer) durchgeführt. Vorzugsweise wird die Reaktion in Hydrogencarbonatpuffer, pH 8 durchgeführt.
  • Weiterhin werden Verbindungen der allgemeinen Formel III offenbart A-S-S-CH2-CR1(NH2)C(=O)R3 IIIin der R3' -OH oder eine Aminosäurenkette ist, die ein oder zwei Aminosäuren enthält und mit -CO2H endet; A und R1 wie vorstehend definiert sind. Die Verbindungen der allgemeinen Formel III sind zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel V nützlich. Die Verbindungen der allgemeinen Formel III werden geeignet durch Reagieren einer Verbindung der allgemeinen Formel II H-S-CH2-CR1(NH2)C(=O)R3 IImit einer Verbindung der allgemeinen Formel A-S-S-A oder A-S-S-A' hergestellt, in der A' von A verschieden ist und ein aromatischer, aktivierender Rest ist. Die Recktanten sind entweder im Handel erhältlich [z.B., 2,2'-Dithiopyridin und 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)] oder können durch Routinesyntheseverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind.
  • Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel V offenbart, in denen R2 eine Lipidgruppe ist, wobei eine Verbindung der allgemeinen Formel III mit einer aktivierten Lipidgruppe der allgemeinen Formel X-O2C-B oder X-OC-B reagiert wird, in der X eine Lipid-aktivierende Gruppe (wie hier nachstehend definiert) ist und B eine Lipidgruppe (wie hier nachstehend definiert) ist. Verbindungen der allgemeinen Formel X-O2C-B oder X-OC-B können sofort auf eine per se bekannte Weise hergestellt werden.
  • Zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel III in einem beispielhaften Verfahren können im Allgemeinen gleiche molare Mengen einer Verbindung der allgemeinen Formel II und einer Verbindung der allgemeinen Formel A-S-S-A oder A-S-S-A' geeignet in einem polaren organischen Lösungsmittel (z.B. Ethanol) gemischt werden. Das Produkt der allgemeinen Formel III kann dann geeignet durch Kristallisierung aus einem unpolaren organischen Lösungsmittel (z.B., Benzol) isoliert werden. Natürlich werden dem Fachmann ebenfalls andere geeignete Verfahren klar sein.
  • Zur Herstellung von X-O2C-B oder X-OC-B kann zum Beispiel eine Fettsäure reagiert werden mit: (a) N-Hydroxysuccinimid und einem Carbodiimidreagens, um einen aktiven H-Hydroxysuccinimidylester zu bilden; (b) Trifluoressigsäureanhydrid, um ein Fettsäureanhydrid zu bilden; oder (c) Thionylchlorid, um ein Fettsäurechlorid zu bilden. Alternative Verfahren können ebenfalls geeignet verwendet werden, um diese oder andere Lipid-aktivierende Gruppen einzuführen.
  • Für Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „Lipid-haltige Hälfte" entweder per se eine Lipidgruppe oder eine Gruppe auf Kohlenwasserstoffbasis (insbesondere eine oder mehrere Aminosäuren), die eine Lipidgruppe enthält. Mit dem Ausdruck „Lipidgruppe" ist ein hydrophober Substituent gemeint, der etwa 4 bis etwa 26 Kohlenstoffatome, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 19 Kohlenstoffatome, enthält. Geeignete Lipidgruppen umfassen die folgenden, sind aber nicht darauf beschränkt: Palmityl (C15H31); Oleyl (C15H29); Stearyl (C17H35); Cholat; und Desoxycholat.
  • Mit „aromatischer, aktivierender Rest" ist eine Hälfte gemeint, die dazu dient, die Disulfidgruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel V labiler für die Austauschreaktion mit den Sulfhydryl-haltigen Verbindungen der allgemeinen Formel PSH zu machen (und dient folglich als eine gute Abgangsgruppe). Eine gegenwärtig bevorzugte aromatische, aktivierende Gruppe ist 2-Pyridyl; andere geeignete aromatische, aktivierende Gruppen umfassen 4-Nitrophenyl.
  • Der Ausdruck „Lipid-aktivierende Gruppe" bezeichnet für Zwecke der vorliegenden Erfindung eine Hälfte, die eine Carboxylipidgruppe, an die sie gebunden ist, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III reaktiver macht. Eine gegenwärtig bevorzugte Lipidaktivierende Gruppe ist N-Hydroxysuccinimidylester; andere geeignete Lipid-aktivierende Gruppen umfassen Säurechlorid und Säureanhydrid.
  • Während die vorliegende Erfindung die Herstellung und Verwendung von Konjugaten der allgemeinen Formel VI beabsichtigt, die einen breiten Bereich von Verbindungen umfasst, die Sulfhydryl-haltige Gruppen enthalten, ist es besonders vorteilhaft, die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Konjugaten einzusetzen, die Biopolymere enthalten. Interessante Biopolymere umfassen Peptide, Proteine und Oligonucleodide (wie hier nachstehend definiert). Wie es dem Fachmann klar sein wird, können Biopolymere oder thiolierte Biopolymere, die Sulfhydrylgruppen enthalten, eine Vielzahl von Hälften enthalten, die strukturell den Konjugaten der allgemeinen Formel VI entsprechen (d. h., Gruppen mit der Struktur der Verbindungen der allgemeinen Formel VI minus der Hälfte P).
  • Für Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „Peptid" Aminosäurenketten, die zwei bis 50 Aminosäuren enthalten und der Ausdruck „Protein" Aminosäureketten, die mehr als 50 Aminosäuren enthalten. Die Proteine und Peptide können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder durch Mittel hergestellt werden, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, wie beispielsweise rekombinante DNA-Technologie oder Festphasensynthese. Es ist beabsichtigt, dass die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide und Proteine nur natürlich vorkommende L-Aminosäuren, Kombinationen aus L-Aminosäuren und anderen Aminosäuren (einschließlich R-Aminosäuren und modifizierten Aminosäuren) oder nur Aminosäuren, die anders sind als L-Aminosäuren, enthalten können. Um ein Konjugat der allgemeinen Formel I zu bilden, muss das Peptid oder Protein wenigstens eine reaktive Thiolgruppe tragen. In vielen Fällen enthält das Peptid oder Protein Cysteinreste (eine Aminosäure, die eine Thiolgruppe enthält). Ein Peptid oder Protein, das keine Thiolgruppe enthält, kann durch Verfahren modifiziert werden, dem Fachmann per se wohl bekannt sind; insbesondere können wohl bekannte Thiolierungsmittel [z.B., N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) und 2-Iminothiolan (Trauts Reagens)] routinemäßig zu diesem Zwecke eingesetzt werden.
  • Der Ausdruck „Oligonucleodid" bezeichnet Ketten, die zwei oder mehrere natürlichvorkommende oder modifizierte Nukleinsäuren, zum Beispiel natürlich vorkommende oder rekombinante Desoxyribonukleinsäuren-(DNA) und Ribonukleinsäuren-(RNA) Sequenzen enthalten. Zur Bildung eines Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung muss das Oligonucleodid durch Thiolierungsreaktionen modifiziert werden, um eine Sulfhydrylgruppe zur Verknüpfung mit der Lipid-haltigen Hälfte zu enthalten. Derartige Modifikationen können routinemäßig auf eine per se bekannte Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein Oligonucleodid mit Cystamin unter Verwendung von Carbodiimid gekuppelt werden und anschließend durch Dithiothreitol reduziert werden, um eine freie Sulfhydrylgruppe zu erzeugen.
  • In einer bevorzugten Klasse von Verbindungen der allgemeinen Formel VI ist R1 Wasserstoff, R2 eine Lipid-Hälfte und R3 -OH. Dieser Konjugattyp ist geeignet von Cystein abgeleitet. In einer anderen bevorzugten Konjugatklasse gemäß der vorliegenden Erfindung ist R1 Wasserstoff, ist R2 -CH2CH2CH(NH2)CO2H oder -CH2CH2CH(NHCO-Lipid)CO-Lipid und ist R3 -NHCH2CO2H oder -NHCH2CO-Lipid, in der wenigstens einer von R2 und R3 eine Lipid-Hälfte enthält. Dieser Konjugattyp ist geeignet von Glutathion abgeleitet.
  • Die Synthese einer beispielhaften Verbindung der allgemeinen Formel VI (in der P ein Protein ist), ist in Schema I veranschaulicht. Natürlich können, wie es dem Fachmann sofort klar sein wird, eine Vielfalt alternativer Syntheseschemen ebenfalls sofort entwickelt werden.
  • Figure 00140001
  • Die Fettsäurekonjugate der vorliegenden Erfindung sind in den meisten Pufferlösungen löslich, in denen Proteine und Peptide löslich sind. Insbesondere sind irgendwelche freien Carbonsäuregruppen bei neutralem pH geladen und verbessern deshalb die Löslichkeit der Konjugate. Dies erleichtert die Formulierung der Konjugate mit geeigneten, pharmazeutisch-akzeptablen Trägern oder Zusatzstoffen zur Verabreichung der Proteine oder Peptide an einen Patienten oral oder durch andere Wege bedeutend.
  • Es ist ein besonderer Vorteil gemäß der vorliegenden Erfindung, dass die Disulfid-Verknüpfung zwischen der Fettsäure-Hälfte und dem Peptid oder Protein sofort reduziert werden kann. Die aktiven Peptid- oder Proteinmoleküle werden deshalb in intakter Form innerhalb der Zielgewebe oder -zellen freigesetzt. Weiterhin enthält die Fettsäure-Hälfte des Konjugats nur Aminosäuren und Lipidmoleküle, die für Säugetiere, insbesondere Menschen, nicht toxisch sind.
  • Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die begleitenden Beispiele besser verstanden werden, die nur zu Veranschaulichungszwecken beabsichtigt sind und nicht in irgendeinem Sinne betrachtet werden sollen, der den Schutzumfang der Erfindung einschränkt, wie in den hier beigefügten Ansprüchen definiert.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Synthese von N-Palmityl-2-pyridyldithiocystein (Pal-PDC)
  • Eine eiskalte Lösung aus L-Cystein (I) (3,0 g) in Ethanol (50 ml) wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung aus 2,2-Dithiopyridin (II) in Ethanol (30 ml) gegeben und der Reaktion wurde erlaubt, bei 25°C 18 Std. lang zu verlaufen. Die Lösung wurde zentrifugiert, um irgendein Präzipitat zu entfernen und der Überstand wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers auf ein Volumen von 40 ml reduziert. Anschließend wurde die Reaktionsmischung tropfenweise zu 400 ml eiskaltem Benzol zugegeben. PDC (III), das in Benzol kristallisierte, wurde durch Filtration isoliert, in 40 ml Ethanol wieder aufgelöst und dann in 400 ml eiskaltem Benzol umkristallisiert, wie vorstehend beschrieben. Das umkristallisierte Produkt wurde durch Filtration isoliert, über Nacht unter Vakuum getrocknet und schließlich bei -20°C in einem Exsikkator gelagert.
  • PDC (100 mg) (III) wurde in 5 ml DMF gelöst und mit 100 μl Triethylamin gemischt und die resultierende Suspension wurde mit dem N-Hydroxysuccinimidester der Palmitinsäure (IV) (250 mg) in DMF (5 ml) bei 25°C 24 Std. lang reagiert, wobei die Suspension während dieser Zeit klar wurde. Diese Lösung wurde mit 40 ml eiskaltem Wasser, pH 3,0 verdünnt und das Präzipitat, das Pal-PDC (V) und Palmitinsäure enthielt, wurde durch Zentrigugation bei 10000 Upm für 30 Min. isoliert. Pal-PDC (V) wurde von Palmitinsäure durch Supension des Präzipitats in Wasser, pH 7,0 getrennt, welches Pal-PDC (V), aber nicht Palmitinsäure löst. Pal-PDC (V) wurde unter Verwendung zwei weiterer Säurepräzipitationsstufen gereinigt, wie vorstehend beschrieben.
  • Beispiel 2
  • Synthese von Konjugaten
  • Wenn nicht anders angegeben, wurden die Endreagenzien in den Konjugationsstufen (Pal-PDC und PDC) unter Verwendung von Kieselgel-beschichteter Dünnschichtchromatographie-(DC) Platten analysiert, die Fluoreszenzindikatoren enthielten. Diese Platten wurden nicht durch Erwärmen vor irgendeiner der Analysen aktiviert. Für die Routineanalyse der synthetisierten Reagenzien wurden 5 μl einer ethanolischen Lösung, die das Reagenz (5 mg/ml) enthielt, auf die Platten aufgebracht. Anschließend wurden die Platten in Lösungsmittelkammern entwickelt, mit der mobilen Phase äquilibriert. Wenn die Lösungsmittelfront einen ausreichenden Abstand zurückgelegt hatte, wurden die Platten entfernt, getrocknet und unter einer UV-Lampe untersucht. Die Positionen der Flecken wurden auf den Platten sofort markiert und eine Zeichnung der Platten und Flecken wurde gemacht. Der Rf-Wert jedes sichtbaren Flecks wurde berechnet und aufgezeichnet. Die Zusammensetzung der in den Analysen verwendeten mobilen Phasen wurde eingestellt, um eine maximale Trennung der Reagenzflecken bereitzustellen.
  • Für Veranschaulichungszwecke wurden Konjugate von BBI synthetisiert. BBI ist ein hydrophiles Protein, das eine niedrige Aufnahme in Zellen aufweist und nicht oral biologisch verfügbar ist. Zudem ist BBI in dem GI-Trakt stabil und widersteht einem Abbau durch Sägetierproteasen im Darm [Yavelow, J. et al. (1983) Cancer Res. 43, 2454s-2459s]. Die Verwendung von BBI zur Chemovorbeugung kann nur akzeptiert werden, wenn eine oral absorbierbare Form von BBI entwickelt werden kann.
  • BBI (20 mg) wurde in 1 ml Natriumhydrogencarbonatlösung (0,3 M, pH 8,0) gelöst und mit SPDP (5 mg/100 μl DMF) 2 Std. lang bei 25°C reagiert. Nach Reinigung von BBI-PDP unter Verwendung von Sephadex® G 50 Gelfiltrationschromatographie wurde die PDP-Derivatisierung von BBI durch Messung der Freisetzung der Thiopyridin-Hälfte nach Reduktion von BBI-PDP mit Dithiothreitol (DTT) geschätzt. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden etwa 4 Aminogruppen pro BBI-Molekül mit SPDP modifiziert. Der Derivatisierungspegel konnte durch Einstellen des pH des Reaktionspuffers gesteuert werden; die Modifizierung von BBI konnte von einer Amingruppe pro BBI-Molekül, wenn die Reaktion bei pH 7 durchgeführt wurde, bis 4,5 modifizierten Amingruppen eingestellt werden, wenn die Reaktion bei pH 8,5 durchgeführt wurde.
  • BBI-PDP (20 mg) in PBS (1 ml, pH 5,0) wurde mit DTT (25 mM) 30 Min. lang reduziert und anschließend von einer Sephadex® G50 Säule eluiert. Die Sulfhydryl-haltigen BBI-Fraktionen, die an der Säule mit Leervolumenanteil eluiert wurden, wurden unter Verwendung von Elman's Reagens identifiziert und dann mit einem 3-fachen Überschuss (pro Sulfhydrylgruppe an BBI) Pal (V) in PBS, pH 7,0 16 Std. lang bei 4°C reagiert. Die Reaktionsmischung wurde dann unter Verwendung von HCl (1M) auf pH 3,0 angesäuert und 30 Min. lang auf Eis gelassen. Der Überstand wurde separat unter Verwendung einer Sephadex G25 Gelfiltrationssäule analysiert. Das Präzipitat, das das Palmityldisulfidkonjugat von BBI, BBIssPal (VI) und das Überschussreagens enthielt, wurde durch Zentrifugation isoliert, in DMF (2 ml) gelöst und von einer Sephadex® LH20 Säule unter Verwendung von DMF eluiert. BBIssPal (VI) Fraktionen, die bei einem Säulenleervolumen eluiert wurden, wurden isoliert, 3 Mal gegen 500 Volumen Wasser dialysiert und dann lypophilisiert. Die Ausbeute des Konjugats unter Verwendung dieses Verfahrens betrug etwa 80 (Gewichts-)%. Die Konjugation von Pal-PDC zu BBI wurde bestätigt und nach der Konjugation von [3H]-markiertem Pal-PDC (V) zu BBI unter Verwendung identischer Konjugationsbedingungen wie jene quantifiziert, die vorstehend beschrieben sind. Das Oleinsäure-konjugierte BBI (BBIssOlein) wurde ebenfalls unter Verwendung eines identischen Verfahrens synthetisiert.
  • Beispiel 3
  • Transport von Konjugaten
  • Menschliche Dickdarmkrebszellen (Caco-2) wurden von 25 cm2 Vorratskulturflasche unter Verwendung einer 10-minütigen Inkubation bei 37°C mit 0,5 ml einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,5% Trypsin, 5,3 mM EDTA) entnommen. Die Zellen wurden dann in 5 ml Dulbecco's minimalen lebensnotwendigen Medium suspendiert, das mit 15% fötalem Rinderserum (FBS), 1-Glutamin (1%) und essentiellen Aminosäuren (1%) ergänzt war und unter Verwendung eines Coulter-Counters gezählt.
  • Suspendierte Caco-2-Zellen in 1,5 ml Medium wurden in die Apikal-Kammer der Transwell bei einer Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro Einsatz angesetzt. 2,5 ml des Mediums wurden dann zu den Basalkammern jeder Transwell gegeben. Den Zellen wurde erlaubt, 2 Tage ohne Störung anzuhaften und sie wurden dann jeden anderen Tag versorgt, bis die Experimente durchgeführt wurden. Die Zellen wurden etwa 14-20 Tage vor den Experimenten gehalten und 24 Std. vor jedem Experiment versorgt. Die Zellmonolayer entwickelten einen transepthelialen elektrischen Widerstand (TEER) von etwa 500-600 Ω cm2 innerhalb einer Woche des Ansatzes und hielten diesen Widerstand bis zu 21 Tage nach dem Ansetzen.
  • Radioiodierung von BBI und BBIssPal wurde unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens [McConahey, P.C. und Dixon, F.J. (1980) Meth. Enzymol. 70, 221-247] durchgeführt. Konfluierende, 14 Tage alte Zellmonolayer wurden einmal mit serumfreien Dulbecco-Medium gewaschen und dann darin bei 37°C 30 Min. lang inkubiert. Anschließend wurde das Inkubationsmedium durch serumfreies Medium ersetzt, das 125I-BBI (10 μg/ml), entweder als natives oder als BBIssPal oder BBIssOlein, enthielt und die Monolager wurden weiterhin 60 Min. lang bei 37°C inkubiert. Die Monolager wurden dann dreimal mit eiskalter PBS gewaschen und Trypsin (0,5%, EDTA 5,3 mM) 10 Mm. lang bei 37°C ausgesetzt. Die abgetrennten Zellen wurden in Rohre überführt, durch Zentrifugation isoliert, dreimal unter Verwendung eiskalter PBS gewaschen, unter Verwendung eines Gamma-Zählers auf akkumulierte Radioaktivität untersucht und schließlich auf Zellprotein unter Verwendung des veröffentlichten Verfahrens [Lowry, O.H. et al. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275] untersucht.
  • In einigen Experimenten wurde die Aufnahme von reduziertem 125I-BBIssPal in Zellen bestimmt. 125I-BBIssPal wurde mit DDT (50 mM) bei 60°C 5 Min. lang reduziert, gefolgt von weiteren 25 Min. bei 37°C. In Kontrollexperimenten wurde 125I-BBIssPal in Medium den gleichen Temperaturen ausgesetzt, aber ohne DDT ausgesetzt zu werden.
  • Die Aufnahme von 125-I-BBIssPal in der Gegenwart von BSA (fettsäurefrei) wurde wie folgt bestimmt. 125I-BBIssPal wurde mit Medium, das 0,1% BSA enthielt, 30 Min. lang bei 37°C inkubiert, bevor es zu den Monozellschichten zugegeben wurde. In einigen Aufnahmeexperimenten wurde BSA zuerst mit einem dreifachen molaren Überschuss Palmitinsäure gemischt und dann vor den Experimenten mit den Konjugaten inkubiert. In den Experimenten, in denen die Aufnahme von 125I-BBIssPal in dem Medium bestimmt wurde, das FBS enthielt, wurde das Konjugat einfach zu dem Medium zugegeben, das die erforderliche Menge FBS enthielt.
  • Konfluierende Zellmonolayer, 2 bis 3 Wochen alt, und mit einem TEER-Wert von etwa 500 Ω cm2, wurden zuerst 30 Min. lang bei 37°C mit Dulbecco's MEM inkubiert, das 1% FBS enthielt. Anschließend wurde das Inkubationsmedium entfernt und die 125I-BBI-(10 μg/ml) Konjugate in 1,5 ml Medium wurden zu der Apikalkammer der Transwell zugegeben. Zu der Basalkammer wurden 2,5 ml des Mediums zugegeben und die Transwell wurden bei 37°C inkubiert. Bei vorbestimmten Zeiten wurde das gesamte Basalkammermedium (2,5 ml) jeder Transwell entfernt und unter Verwendung eines Gamma-Zählers die Radioaktivität gezählt. In jedem Experiment wurden typischerweise sieben Proben bei 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 24 Std. nach Inkubation genommen. Nach den 24 Std. wurden Proben genommen, die Zellmonolayer wurden dreimal mit eiskalter PBS gespült, aus den Einsätzen geschnitten und die akkumulierte Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählers gezählt.
  • Die Integrität der 125I-BBI-Konjugate, die durch die Monolager transportiert wurden, wurde unter Verwendung von Sephadex G50 Gelfiltrationschromatographie untersucht. Kurz nachdem das Basalmedium bei 24 Std. untersucht wurde, wurden 1,0 ml des Mediums bei 2000 Upm zentrifugiert und dann von einer G50 Säule (10 ml) unter Verwendung von PBS eluiert; 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und die Fraktionen-zugehörige Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählers bestimmt. Intakte Konjugate, die bei einem Säulenleervolumen eluiert wurden, und Fragmente, die kleiner als 1 kDa waren, wurden bei oder über dem Säulenvolumen eluiert.
  • Die Resultate der Aufnahme von 125I-BBI, entweder als freies Protein oder in konjugierter Form zu Pamitinsäure, in der Gegenwart verschiedener Mengen zugesetztem FBS sind in Tabelle 1 gezeigt. Wenn die Konjugate mit den Zellen in serumfreien Medium inkubiert wurden, war die Aufnahme von BBIssPal etwa 140-fach höher als die von BBI. In der Gegenwart von Medium, das 1% FBS enthielt, war die Internalisierung von BBIssPal 35-fach mal erhöht als die von BBI. Weiteres Erhöhen der Serumkonzentration auf 10% verursachte eine weitere Abnahme bei der Aufnahme von BBIssPal in die Zellen auf nur einen 10-fach höheren Pegel als der von nativem BBI. Die Internalisierung von BBIssPal in Caco-2-Zellen wurde drastisch in der Gegenwart von Serum auf 14% bzw. 2,3% des der serumfreien Werte für 1% bzw. 10% FBS-haltigem Medium reduziert. TABELLE 1
    Aufnahme (ng/BBI/mg Zellprotein)/Std.
    serumfrei 1% FBS 10% FBS
    BBI 3,9 ± 0,19 2,2 ± 0,17 1,3 ± 0,02
    BBIssPal 540,0 ± 24,13 78,5 ± 3,41 12,9 ± 0,02
  • Die Zellmonolayer wurden mit 125I-markierten Konjugaten bei 10 μg/ml 60 Min. lang bei 37°C inkubiert. Die dargestellten Resultate sind der Durchschnitt von drei Monolager ± SEM. Die Aufnahme-Experimente wurden in einem Dulbecco Medium in der Gegenwart und Abwesenheit von zugesetztem FBS durchgeführt.
  • Weil angenommen wurde, dass die BBIssPal-Aufnahme in die Zellen durch die Palmitinsäureliganden an dem Konjugat vermittelt wird, wurde die Aufnahme von 125I-BSSIssPal in Caco-2-Zellen vor und nach der Reduktion mit DDT untersucht. Weil die Gegenwart von Serum in dem Inkubationsmedium einen hemmenden Effekt auf die Aufnahme der Konjugate in den Zellen hatte, wurde die Aufnahme in serumfreien Medium untersucht. Die Resultate sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Aufnahme von unbehandeltem 125I-BBIssPal in die Zellen war 80-fach höher als die von 125I-BBI. Die Aussetzung von 125I-BBI zu DDT verursachte keine Reduktion der Aufnahme. Im Gegenteil die Reduktion von 125I-BBIssPal mit DDT reduzierte die Aufnahme des Konjugats in die Zellen um etwa 80%. Die Reduktion von BBIssPal mit DDT verursacht die Abtrennung der Palmitinsäure aus dem Konjugat. Die Aufnahme von 125I-BBIssPal wurde durch den hydrophoben Palmitinsäureliganden vermittelt. TABELLE 2
    Aufnahme (ng/BBI/mg Zellprotein)/Std.
    unbehandelt DTT-behandelt
    BBI 4,8 ± 0,00 5,2 ± 0,00
    BBIssPal 381,7 ± 0,03 46,5 ± 0,00
  • Die Zellaufnahme von 125I-BBI, entweder als natives Protein oder als BBIssPal, wurde vor und nach Reduktion mit DDT (50 mM) 5 Min. lang bei 60°C und 25 Min. bei 37°C bestimmt.
  • Es ist bekannt, dass Rinderserumalbumin (BSA) ein Träger für Fettsäuren in vivo ist und hydrophobe Regionen enthält, die Fettsäuren dicht bzw. fest binden können. Weil die Aufnahme von 125I-BBIssPal in der Gegenwart von Serum reduziert war, wurde die Möglichkeit untersucht, dass 125I-BBIssPal an BSA bindet. Die Zellaufnahme von 125I-BBIssPal und 125I-BBI wurde in der Gegenwart von Medium untersucht, das fettfreies BSA oder Fettsäure-beladenes BSA enthielt, und die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt. In der Gegenwart BSA-freien Mediums war die Aufnahme von 125I-BBIssPal in die Zellen 80-fach höher als die von BBI, wie es von den Resultaten erwartet wurde, die in den vorangehenden Experimenten erhalten wurden. Wenn nicht-fetthaltiges BSA (fettsäurefreies BSA) (0,1%) in dem Medium vorhanden war, war die Aufnahme von 125I-BBIssPal um 82% reduziert, während die Aufnahme von 125I-BBI nicht beeinflusst wurde. In der Gegenwart von Fettsäure-beladenem BSA (0,1%), das durch Versetzen von fettfreiem BSA mit einem 3-molaren Überschuss Palmitinsäure hergestellt wurde, wurde die Aufnahme von 125I-BBI wieder nicht beeinflusst. Deshalb bindet 125I-BBIssPal stark an BSA und diese Bindung ist von der Anzahl an Fettsäuren abhängig, die bereits an BSA gebunden sind. TABELLE 3
    Aufnahme (ng/BBI/mg Zellprotein)/Std.
    serumfrei BSA BSA/FS
    BBI 4,8 ± 0,00 4,8 ± 0,00 3,9 ± 0,00
    BBIssPal 380,0 ± 0,03 69,7 ± 0,00 258,9 ± 0,00
  • Die Aufnahmeexperimente wurden in Dulbecco Medium, in der Gegenwart und Abwesenheit von zugesetztem, fettsäurefreiem BSA (BSA) oder fettsäurebeladenem BSA (BSA/FS) durchgeführt. Die Resultate von Untersuchungen der Aufnahme von 125I-BBI, entweder als das native BBI oder in konjugierter Form zu Palmitinsäure oder Oleinsäure, in Caco-2-Zellen in der Gegenwart serumfreien Mediums sind in 1 dargestellt. Die Resultate sind als der Durchschnitt ng von internalisisertem BBI ± SEM, n = 3. Die Aufnahme von 125I-BBIssPal in die Zellen war etwa 100-fach höher als die von 125I-BBI. Genauso war die Aufnahme von 125I-BBIssOlein in die Zellen etwa 108-fach höher als 125BBI. Der Unterschied zwischen der Aufnahme von 125I-BBIssPal und 125I-BBIssOlein war nicht bedeutend.
  • Beispiel 4
  • Bioverteilungs-Assays
  • Weibliche CF-1 Mäuse, 2 bis 3 Wochen alt, die jeweils 20-25 g wogen, mit freiem Zugang zu Nahrungsmitteln und Wasser vor den Experimenten, wurden für die Tierexperimente verwendet. 125I-BBI (3 mg/kg), als natives BBI oder als BBIssPal- oder BBIssOlein-Konjugat, wurde den Tieren durch die Schwanzvene verabreicht. Bei 0,5, 3 und 24 Std. nach Injektion wurden 3 Tiere jeder Experimentgruppe geopfert und ihre Blut (200 μl), die Nieren, die Lungen und die Leber wurden entfernt, mit eiskalter PBS gespült und die akkumulierte Radioaktivität wurde untersucht. Die Gewichte der Organe wurden aufgezeichnet und verwendet, um die Konzentration der Konjugate in den Organen einzustellen.
  • In ip-Bioverteilungsuntersuchungen wurde 125I-BBI (3 mg/kg), entweder als natives BBI oder als BBIssPal, in den unteren linken Quadranten der Bauchhöhle jedes Tieres verabreicht. Jedes Tier wurde dann auf die Weise behandelt, die vorstehend für die iv-Bioverteilungsuntersuchungen beschrieben ist.
  • Die Resultate der Bioverteilungsuntersuchung von BBI und BBIssPal im Anschluss an eine iv-Verabreichung sind in 2 als die pro Organ ± SEM akkumulierte%-Dosis gezeigt. Die Resultate zeigen an, dass BBIssPal, während BBI schnell aus dem Körper ausgeschieden wurde, ohne hohe Blutpegel zu erreichen, in dem Blut bei einem relativ hohen Pegel akkumuliert wurde und offensichtlich langsamer aus dem Kreislauf entfernt wurde. Die Leberakkumulierung von BBIssPal war etwa 5-fach höher als die von BBI, und BBIssPal-Pegel verblieben in der Leber sogar bei 24 Std. nach Injektion hoch. Die Lungenakkumulierung von BBIssPal war etwa 2-fach höher als die von BBI, aber dieses Resultat kann durch das restliche Blut verursacht worden sein, das in dem Organ nach seiner Exzision vorhanden ist. Natürlich verblieb BBIssPal länger und bei einem höheren Pegel in dem Blut und in der Leber. Andererseits war die Nieren-Clearance von BBIssPal etwa 4-fach niedriger als von nativem BBI.
  • Die iv-Bioverteilung von BBI und BBIssOlein wurde ebenfalls in CF-1 Mäusen untersucht. Die Resultate sind in 3 als die pro Organ ± SEM akkumulierte%-Dosis, n = 3, bei 0,5, 3 und 24 Std. gezeigt. Die Bioverteilung von BBIssOlein war sehr ähnlich zu der von BBIssPal. Wie für BBIssPal beobachtet wurde, wies BBIssOlein höhere Blutpegel als BBI auf und wurde offensichtlich langsamer aus dem Kreislauf ausgeschieden. Die Blutpegel von BBIssOlein waren etwa 4-fach höher als jene von BBI an den gleichen Zeitpunkten. Die Nieren-Clearance von BBIssOlein war etwa 4-fach niedriger und die Leberakkumulierung etwa 4-fach höher als natives BBI. Die Retention von BBIssOlein in der Leber war verlängert, wobei bedeutende Pegel des Konjugats in der Leber sogar 24 Std. nach Injektion vorhanden waren. Die Lungenpegel von BBIssOlein waren etwa 2-fach höher als native BBI-Pegel, aber das reichere restliche Blut in den Lungen könnte diese Beobachtung erklären.
  • Die ip-Bioverteilung von 125I-BBIssPal in CF-1 Mäusen ist in 4 als die durchschnittliche%-Dosis-Akkumulation pro Organ ± Bereich (Balken) bei 0,5 Std. (4A), 3 Std. (4B), oder 24 Std. (4C) nach Injektion gezeigt. Die Nierenakkumulierung von 125I-BBIssPal war 4-fach niedriger als die von nativem 125I-BBI für die Zeitpunkte 0,5 Std. und 3 Std. Bei 24 Std. wurden die 125I-BBIssPal-Pegel in den Nieren höher als 125I-BBI. Der Blutpegel von 125I-BBIssPal war ähnlich zu dem von 125I-BBI bei 0,5 Std., 1,5-fach höher als BBI bei 3 Std. und etwa 3-fach höher als BBI bei 24 Std. Die Leberakkumulierung von 125I-BBIssPal war 1,5-fach höher als 125I-BBI bei 0,5 Std., 2,5-fach höher bei 3 Std. und etwa 4-fach höher bei 24 Std. Relativ große Mengen an 125I-BBIssPal waren in der Leber und den Nieren bei 24 Std. vorhanden.
  • Beispiel 5
  • In Vitro Transformationsuntersuchungen
  • Transformationsassays wurden unter Verwendung von C3H 10T1/2(Klon8)-Zellen gemäß den veröffentlichten Empfehlungen durchgeführt [Reznikoff, C.A. et al. (1973) Cancer. Res. 33, 3239-3249; Reznikoff, C.A. et al. (1973) Cancer. Res. 33, 3231-3248]. Vorratskulturen von mycoplasmafreien Zellen wurden durch Passieren von 50.000 Zellen pro 75 cm2 Gefäß alle sieben Tage erhalten. Unter Verwendung dieses Plans wurden die Zellen immer etwa zwei Tage vor Erreichen von Konfluenz passiert. Die Vorratskultur wurde in Eagle's Basalmedium gezüchtet, die mit 10% FBS, Penicillin (100 Einheiten) und Streptomycin (100 μg) ergänzt war, und für den Transformationsassay bei Passieren von 9 zu 14 verwendet. Die Zellen wurden durch Behandeln der Vorratszellen mit Trypsin (0,1%) in PBS 5 Min. lang und Quenchen des Trypsins mit 5 ml des Mediums passiert. Diese Prozedur war angepasst, eine spontane Transformation in den Vorratskulturen zu minimieren und die Effizienz des Anlegens einer Plattenkultur in den Petrischalen zu maximieren. Der FBS-Vorrat, der in den Kulturen verwendet wurde, war vor-gescreent, um zu sichern, dass das Serum in der Lage war, die Expression und die Züchtung der transformierten Zellen zu unterstützen.
  • Für die Transformationsassays wurden C3H 10T1/2-Zellen (1000/Schale) in 60 mm Petrischalen angesetzt und ihnen wurde erlaubt, in einer befeuchteten CO2-Atmosphäre in Eagle's Basalmedium, das mit 10% FBS, Penicillin (100 Einheiten) und Streptomycin (100 μg) ergänzt war, 24 Std. lang zu wachsen. Anschließend wurden die Zellen durch Behandlung mit 25 μl aus dem 3-Methylcholanthren (MCA) in Acetonvorratslösung (0,25 mg/ml) bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml MCA (5 μg/ml) initiiert. Den Zellen wurde erlaubt, in der Gegenwart des Karzigonens oder Lösungsmittels 24 Std. lang zu wachsen und das Medium in jeder Schale wurde dann durch frisches Medium ersetzt, das kein Karzinogen oder Lösungsmittel enthielt. Das Medium in den Schalen wurde zweimal pro Woche in den ersten zwei Wochen des Assays und danach einmal die Woche in den restlichen vier Wochen des Assays ersetzt. In den Experimenten, die zur Bestimmung der Transformationshemmungsaktivität der Konjugate ausgelegt waren, wurden die Zellen in dem Medium beibehalten, das keine zugegebenen Konjugate enthielt.
  • Sechs Wochen nach der Karzinogenbehandlung wurden die Zellen unter einem Mikroskop auf Adhärenz zu den Kulturschalen untersucht und wurden mit PBS gewaschen und dann in 100% Methanol fixiert. Die fixierten Monolager wurden dann mit Giemsa-Färbung angefärbt. 20 Schalen pro Gruppe wurden in jedem Experiment behandelt. Zusätzlich zu den Testgruppen enthielten alle Transformationsassays wenigstens drei andere Gruppen: Negativkontrolle (nicht mit Karzinogen oder Lösungsmittel behandelt), Acetonkontrolle (mit 25 μl Aceton behandelt) und Positivkontrolle [behandelt mit MCA (1 μg/ml) in 25 μl Aceton]. Die transformierten Foci (Durchmesser > 3 mm) in den Platten wurden unter einem Mikroskop untersucht und entsprechend den veröffentlichten Richtlinien als Type I, II; oder II klassifiziert [Landolph, J.R. (1985) Transformation assay of established cell lines: Mechanism and Application (Ed. Kanunaga, T. und Yamasaki, H.) IARC Scientific Publications, Lyon, Frankreich, Seiten 185-201]. Mit wenigen Worten, Typ 3 Foci waren dicht, vielschichtig, basophil, Zellwachstumsflächen, die mit Giemsa zu einer fiefblauen Farbe anfärbten und grobe, sich kreuzende Ränder aufwiesen. Typ II Foci waren ebenfalls dicht, vielschichtig, Zellwachstumsflächen, aber wurden mit Giemsa zu einer violetten Farbe gefärbt und wiesen weichere, definiertere Ränder im Vergleich zu Typ II Foci auf. Typ I Foci wurden in dem Assay nicht gezählt.
  • Die Effizienz zur Anlegung einer Plattenkultur (PE) der Zellen wurde ebenfalls in Verbindung mit jedem der Transformationsassys untersucht. Zur Bestimmung der PE der Zellen in den verschiedenen Behandlungsgruppen wurden Zellen (200 Zellen/Schale) in drei 60 mm Petrischalen pro Experimentgruppe in einer Kultur angesetzt und auf die identische Weise wie die Transformationsassayzellen behandelt. Die Zellen in diesen Assays wurden an 10 Tagen terminiert, mit 100% Methanol fixiert und mit Giemsa angefärbt; die Kolonien von 50 Zellen oder mehr, die unter einem Mikroskop sichtbar waren, wurden dann gezählt. Die Effizienz zur Anlegung einer Plattenkultur ist als die (Anzahl von Kolonien/Anzahl von angesetzten Zellen)*100 definiert.
  • Die in vitro Anti-Transformationsaktivität von BBI, BBIssPal und BBIssOlein ist in Tabelle 4 gezeigt. BBI wurde, entweder als das freie Protein oder in konjugierter Form zu Palmitin- oder Oleinsäure, zu den Kulturen bei 1,0 μg/ml in die ersten drei Wochen der Transformationsassayzeitdauer zugegeben, die sofort nach der MCA-Behandlung begann.
  • MCA-behandelte Zellen wurden 3-Methylcholanthren, in 25 μl Aceton gelöst, bei einer Konzentration von 1 μg/ml 24 Std. lang ausgesetzt. Aceton-behandelte Zellen wurden nur 25 μl Aceton 24 Std. lang ausgesetzt. Die Testgruppen wurden MCA 24 Std. lang und dann den Konjugaten in den ersten drei Wochen des Assays ausgesetzt. Unbehandelte Zellen wurden weder MCA noch Aceton ausgesetzt. Statistische Analyse (Chi-Quadrat): Gruppe 4 gegen 3, p < 0,05; Gruppe 5 gegen 3, 0,05 < p < 0,1; Gruppe 6 gegen 3, p < 0,05. Kontroll-, unbehandelte Zellen erreichten Konfluenz in den Schalen etwa 14 Tage nach Ansetzens, bildeten gut adhärente, kontakthemmende Monolager. Diese Schalen enthielten keine transformierten Foci an dem Ende der Assayzeitdauer. Die Aceton-behandelten Zellen erreichten ebenfalls Konfluenz und bildeten gut adhärente Monolager 14 Tage nach Ansetzen und enthielten keine transformierten Foci. Die MCA-behandelten Schalen enthielten jedoch morphologisch transformierte Foci: 6 der gezählten 19 Schalen enthielten Typ III Foci. Die BBI-behandelte Gruppe enthielt keine transformierten Foci, was anzeigte, dass BBI eine MCA-induzierte Transformation in diesen Zellen verhindern kann. Die BBIssPal-behandelten Zellen enthielten einen Typ II Focus aus den 20 Schalen, die in dem Assay gezählt wurden. Die BBIssOlein-behandelten Zellen enthielten keine transformierten Foci. Die PE aller Gruppen in diesem Assay betrugen zwischen 20% bis 25%. Wie in der Tabelle 4 gezeigt, behielten sowohl BBIssPal als auch BBIssOlein die ursprüngliche biologische Aktivität von BBI. TABELLE 4
    Behandlungsgruppe Effizienz beim Plattenanlegen (%) Nr. von Schalen mit tranformierten Foci/Nr. von Schalen Fraktion von Schalen, die transformierte Foci enthielten
    1. Kontrolle – unbehandelt 23 ± 1,5 0/20 0
    2. Negativkontrollen – Aceton-behandelt 22 ± 2,0 0/20 0
    3. Positivkontrollen – MCA – behandelt 21 ± 3,0 6/19 0,32
    4. Test-MCA behandelt +BBI 24 ± 2,0 0/20 0
    5. Test-MCA behandelt +BBIssPal 23 ± 3,0 1/20 0,05
    6. Test-MCA behandelt+ BBIssOlein 24 ± 3,5 0/20 0
  • Beispiel 6
  • Transport von Einzel- und Mehrfach-Konjugaten
  • Studien zum Transport von Apikalmembran-gebundenen 125I-BBIssPal wurden unter Verwendung von Transwells und Platten mit sechs Vertiefungen durchgeführt. In den Experimenten mit Platten mit sechs Vertiefungen wurde 125I-BBI oder 125I-BBIssPal (10 μg/ml) mit Caco-2-Zellen in serumfreien Medium 1 Std. lang bei 37°C inkubiert.
  • Anschließend wurden die Zellen dreimal mit eiskalter PBS gewaschen und dann in zwei Gruppen geteilt. In der ersten Gruppe wurde die Internalisierung der Konjugate nach Trypsinisierung und Isolierung der Zellen bestimmt. In der zweiten Gruppe wurden die Zellen mit serumfreien Medium reinkubiert und die Freisetzung der Konjugate von den Zellen wurde 24 Std. lang verfolgt; Medium wurde bei stündlichen Intervallen entfernt und auf Radioaktivität gezählt. An dem Ende der Verfolgungszeitdauer wurden die Zellen trypsiniert, isoliert und auf akkumulierte Radioaktivität gezählt. Die Gesamtzählungen in jedem Experiment (Medium + Zell-cpms) wurden bestimmt und die% der Gesamtzählungen wurde bestimmt, die zu verschiedenen Zeiten freigesetzt wurden.
  • In den Transwell-Experimenten wurden die Konjugate mit der Apikalseite der Zellen 1 Std. lang bei 37°C inkubiert. Die Transwell wurden dann dreimal mit eiskalter PBS gespült und dann mit serumfreien Medium reinkubiert. Die Freisetzung der Konjugate in das Apikal- und Basalmedium wurde 24 Std. lang durch Zählen des ganzen Basal- oder des Apikalmediums zu verschiedenen Zeiten verfolgt. Die an dem Ende der Verfolgungszeitdauer erhaltenen Zählungen (Transwell + Medienzählungen wurden addiert, und die Freisetzung der Konjugate (% der Gesamtmenge) zu verschiedenen Zeiten wurde berechnet. Um zu sichern, dass die in den Transwell bei 24 Std. erhaltenen Zählungen auf die Gegenwart der Konjugate in den Zellen und nicht auf eine unspezifische Bindung an den Kunststoff zurückzuführen sind, wurden die Transwell 10 Min. lang Trypsin ausgesetzt, dreimal mit eiskalter PBS gespült und anschließend auf akkumulierte Radioaktivität gezählt.
  • BBI wurde mit 2 oder 4 Palmitinsäuren modifiziert und der Transport wurde in Transwells bestimmt. Der kumulative Transport von BBI, mit 4 Palmitinsäuren modifiziertem BBI [BBIssPal(4)] und, mit 2 Palmitinsäuren modifiziertem BBI [BBIssPal(2)] in Caco-2-Monolagern ist in 5A gezeigt; die Resultate sind als BBI (ng/Monolayer) ± SEM, n = 3 ausgedrückt. Die Ordnung des Transportausmaßes war BBIssPal(4) > BBI > BBIssPal(2). Die Resultate der Internalisierung der Konjugate in die gleichen Zellen ist in 5B als die ng internalisiertem BBI pro Monolager gezeigt. Wie erwartet, wies BBIssPal(4) die höchste Aufnahme in die Zellen auf, gefolgt von BBIssPal(2) und BBI. Die bei 24 Std. aus den Transwell erhaltenen Basalmedien wurden unter Verwendung einer G50 Säule analysiert; die Resultate sind in 6 gezeigt. Wie vorher beobachtet wurde, wurde weder BBI noch BBIssPal(4) durch die Monolager transzytosiert. Eine kleine, aber bedeutende Menge der Basalmedien von BBIssPal(2) bestand aus intaktem Konjugat. Diese Menge bestand aus etwa 10 bis etwa 20% der in dem Basalmedium vorhandenen Gesamtradioaktivität.
  • Beispiel 7
  • Hautabsorption von BBIssPal
  • Frisch hergestellte Häute haarloser Mäuse wurden auf kleinen Ringen angebracht. Auf jede angebrachte Haut wurde eine 5 μl Probe 125I-markiertes BBI oder BBIssPal bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml auf eine Fläche von 0,38 cm2 aufgebracht. Zwei Hautstücke wurden pro Behandlung verwendet. Die Haute wurden bei Raumtemperatur (23°C) in einer befeuchteten Umgebung gehalten. Nach 30 Minuten wurde die Oberfläche der Haute zuerst sorgfältig mit PBS gespült; die Haute wurden anschließend abgenommen und zweimal mit 100 ml PBS durchtränkt. Die Häute wurden dann mit Filterpapieren abgetupft und in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Menge an BBI, die in den Häuten verblieb, wurde unter Verwendung der spezifischen Radioaktivität des markierten BBI oder BBIssPal berechnet. Die Absorption von BBI und BBIssPal in die Maushäute war 0,14 bzw. 1,6 μg/cm2. Dies zeigt, dass mehr als ein 10-facher Anstieg der BBI-Absorption in die Haut erreicht wurde, wenn das Polypeptid unter Verwendung von Pal-PDC modifiziert wurde.
  • Beispiel 8
  • Synthese von pamitylierter Meerrettichperoxidase (HRPssPal)
  • Zehn Milligramm Meerrettichperoxidase (Molekulargewicht 40.000; Sigma P 8375) in 0,5 PBS wurden mit 2 ml SPDP in 0,1 ml DMF bei 25°C zwei Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Verdünnen mit 0,5 ml PBS beendet, und in 500 ml PBS bei 4°C dialysiert. Nach 24 Stunden wurde die Lösung in dem Dialyseschlauch entfernt, durch Zugabe von 50 μl 1M DTT reduziert und durch Verwendung einer Sephadex G-50 Säule getrennt. Fraktionen des Leervolumens der Säule wurden gepoolt und mit einem 10-fachen molaren Überschuss an Pal-PDC in Borat-Puffer, pH 9,6 bei 25°C 4 Stunden lang gemischt. Die Reaktionsmischung wurde dann erschöpfend 3 Tage lang bei 4°C dialysiert und es wurde geschätzt, dass das Endprodukt 10 Palmitinsäurereste pro Molekül HPR enthielt. Die HRP Moleküle behielten etwa 20% der ursprünglichen Enzymaktivität.
  • Beispiel 9
  • Zellaufnahme von HRPssPal
  • Konfluierende Monolager von Mausfibroblasten L929 Zellen in Kulturgruppenplatten mit 6 Vertiefungen wurden in serumfreiem Medium mit 30 μg/ml HRP, entweder als die native Form oder als das Palmitinsäure-Konjugat (HRPssPal), inkubiert. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden Monolager dreimal mit PBS gewaschen und dann in 1 ml 0,05% Triton-X100 gelöst. Zellzugehöriges HRP wurde durch Messen der enzymatischen Aktivität in jedem Zellextrakt bestimmt und die Resultate wurden zu ng HRP pro Zellmonolayer umgewandelt. Resultate zeigten an, dass Zellaufnahmen von HRP und HRPssPal 7 bzw. 229 HRP pro Zellmonolayer waren. Deshalb wurde ein 30-facher Zellaufnahmeanstieg durch Modifizierung von HRP mit Pal-PDC erreicht.
  • Beispiel 10
  • Lipidisierung von Oligonucleodiden
  • Ein Antisense 21mer Oligonucleodid, das komplementär zu der mRNA der Monoaminoxidase B ist, wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens thioliert. Das Oligonucleodid wird mit einem zweifachen molaren Überschuss an Cystamin in der Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimidreagenzes, EDC, gemischt. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei 25°C gehalten und ein zweifacher Überschuss DDT zu Cystamin wird zugegeben, um Disulfidbindungen zu reduzieren. Nach Trennung des Oligonucleodids von dem freien Cystamin und DDT unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule wird eine kleine Menge des thiolierten Oligonucleodids mit Ellman's Reagenz reagiert und die Konzentration an Sulfhydrylgruppen unter Verwendung der Extinktion bei 412 nm (unter Voraussetzung eines ε von 1,36 × 104M-1) bestimmt. Anschließend wird die Anzahl an Sulfhydrylgruppen pro Oligonucleodidmolekül bestimmt. Das thiolierte Oligonucleodid wird in Hydrogencarbonatpuffer, pH 8, mit Pal-PDC in einem zweifachen molaren Überschuss zu der Anzahl an Sulfhydrylgruppen in dem Oligonucleodid gemischt. Das palmitylierte Oligonucleodid wird unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule gereinigt.
  • IN DER BESCHREIBUNG ZITIERTE LITERTURSTELLEN
  • Diese Liste von Literaturstellen, die vom Anmelder zitiert wurden, dient nur der Bequemlichkeit des Lesers. Sie stellt keinen Teil der Europäischen Patentschrift dar. Obwohl beim Zusammenstellen der Literaturstellen mit großer Sorgfalt gearbeitet wurde, können Fehler und Auslassungen nicht ausgeschlossen werden und das EPA schließ in diesem Zusammenhang jegliche Verantwortung aus.
  • In der Beschreibung zitierte Nichtpatentliteratur
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Claims (6)

  1. Verwendung einer Lipid-enthaltenden Komponente zur Herstellung einer Verbindung zum Einbringen einer Sulfhydrylgruppen-haltigen Verbindung in Säugetierzellen, wobei die Lipid-enthaltende Komponente eine Verbindung der allgemeinen Formel V ist; A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(=O)R3 Vwobei die Verbindung zum Einbringen einer Sulfhydrylgruppen-haltigen Verbindung die allgemeine Formel VI hat; P-S-S-CH2-C(COR3)R1NHC(=O)R2 VIwobei A ein aromatischer aktivierender Rest ist; P eine Komponente ist, welche von der Sulfhydrylgruppen-enthaltenden Verbindung der allgemeinen Formel PSH abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden, Proteinen und Oligonucleotiden; R1 Wasserstoff oder Aryl ist; R2 eine Lipid-enthaltende Komponente ist, enthaltend eine Lipidgruppe; und R3 -OH, eine Lipid-enthaltende Komponente, enthaltend eine Lipidgruppe oder eine Aminosäurekette, enthaltend eine oder zwei Aminosäuren, die mit -CO2H oder COR2 enden, ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei A 2-Pyridyl oder 4-Nitrophenyl ist.
  3. Verwendung nach den Ansprüchen 1-2, wobei R1 Wasserstoff ist, R2 eine Lipidgruppe ist und R3 -OH ist.
  4. Verwendung nach den Ansprüchen 1-2, wobei R1 Wasserstoff ist, R2 -CH2CH2CH(NH2)CO2H oder -CH2CH2CH(NHCO-Lipid)CO-Lipid ist und R3 -NHCH2CO2H oder -NHCH2CO-Lipid ist, worin mindestens einer aus R2 und R3 eine Lipidgruppe enthält.
  5. Verwendung nach den Ansprüchen 1-2, wobei die Lipidgruppe ein hydrophober Substituent ist, der 4 bis 26 Kohlenstoffatome enthält.
  6. Verwendung nach den Ansprüchen 1-2, wobei die Lipidgruppe ein hydrophober Substituent ist, der 5 bis 19 Kohlenstoffatome enthält.
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