ES2200051T3 - Metodos y composiciones para la lipidizacion de moleculas hidrofilas. - Google Patents

Metodos y composiciones para la lipidizacion de moleculas hidrofilas.

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Abstract

DERIVADOS DE ACIDOS GRASOS DE COMPUESTOS QUE CONTIENEN SULFHIDRILO (POR EJEMPLO, PEPTIDOS O PROTEINAS QUE CONTIENEN SULFHIDRILO) QUE COMPRENDEN PRODUCTOS CONJUGADOS CON ACIDOS GRASOS CON UN ENLACE DISULFURO SE UTILIZAN PARA LA ADMINISTRACION DE COMPUESTOS A CELULAS DE MAMIFEROS. ESTA MODIFICACION AUMENTA CONSIDERABLEMENTE LA ABSORCION DE LOS COMPUESTOS POR LAS CELULAS DE MAMIFERO EN RELACION CON LA VELOCIDAD DE ABSORCION DE LOS COMPUESTOS CONJUGADOS, ASI COMO LA RETENCION PROLONGADA EN LA SANGRE Y EN LOS TEJIDOS DE LOS COMPUESTOS. ASIMISMO, EL ENLACE DISULFURO EN EL CONJUGADO ES BASTANTE LABIL EN LAS CELULAS, FACILITANDO ASI LA LIBERACION CELULAR DE LOS COMPUESTOS INTACTOS DE LOS RADICALES DE ACIDOS GRASOS.

Description

Métodos y composiciones para la lipidización de moléculas hidrófilas.
La presente invención es refiere generalmente a los campos de la biología y la medicina. Más particularmente, la presente invención se dirige a métodos y composiciones útiles para incrementar en mamíferos la absorción y la retención de moléculas hidrófilas, en particular péptidos y proteínas.
Los avances en la biotecnología han hecho posible la producción de grandes cantidades de proteínas y péptidos terapéuticamente activos y puros. Actualmente, los efectos terapéuticos de la mayoría de estos agentes pueden alcanzarse sólo cuando se administran a través de rutas invasivas, tales como mediante inyección. Puesto que la mayoría de las proteínas tienen semi-vidas muy cortas, las concentraciones eficaces de estos agentes sólo pueden mantenerse cuando se administran mediante inyecciones frecuentes.
Aunque la administración de proteínas mediante inyección es el medio más eficaz para su aporte in vivo, la tolerancia de los pacientes a múltiples inyecciones es muy escasa. Además, la administración de fármacos a través de las rutas de inyección es un trabajo de experto y requiere entrenamiento; esta experiencia y este entrenamiento no siempre pueden ser transferibles a los pacientes. En los casos en los que los fármacos proteínicos tienen papel de salvar la vida, la administración por la ruta de inyección puede ser aceptada por los pacientes. Sin embargo, en los casos en los que los fármacos proteínicos son sólo una de varias terapias posibles, es improbable que las inyecciones de proteínas y péptidos sean aceptadas por los pacientes. Por lo tanto, necesitan desarrollarse rutas alternativas de aporte de proteínas y péptidos.
Rutas alternativas de aporte de proteínas y péptidos pueden incluir las rutas bucal, nasal, oral, pulmonar, rectal y ocular. Sin excepción, estas rutas son menos eficaces que las rutas de administración parenterales. Sin embargo, estas rutas de aporte de proteínas y péptidos son más atractivas que las rutas parenterales debido a que ofrecen comodidad y control de los pacientes. La ruta oral es particularmente atractiva debido a que es la más cómoda y conforme para el paciente.
Las barreras mucosales, separan el interior del cuerpo del exterior (por ejemplo, mucosa GI, ocular, pulmonar, rectal y nasal), comprenden una capa de monocapas celulares estrechamente unidas que regula estrictamente el transporte de moléculas. Las células individuales en las barreras están unidas mediante uniones estrechas que regulan la entrada en el espacio intercelular. De ahí que la mucosa sea en un primer nivel una barrera física, el transporte a través de la cual depende de las rutas transcelulares o paracelulares [Lee, V.H.L. (1988) CRC Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5, 69-97].
El transporte paracelular a través de uniones estrechas rellenas con agua está restringido a moléculas pequeñas (PM <1 kDa) y es esencialmente un proceso de difusión conducido por un gradiente de concentración a través de la mucosa [Lee (1988), previamente; Artursson, P. y Magnusson, C. (1990) J. Pharm. Sci. 79, 595-600]. Las uniones estrechas comprenden menos de 0,5% de la superficie específica total de la mucosa [González-Mariscal, L.M. y otros, (1985) J. Membrane. Biol. 86, 113-125; Vetvicka, V. y Lubor, F. (1988) CRC Critical Rev. Ther. Drug Deliv. Sys. 5, 141-170]; por lo tanto, juegan sólo un papel secundario en el transporte de fármacos proteínicos a través de la mucosa.
El transporte transcelular de fármacos pequeños se produce eficazmente con tal de que las propiedades fisicoquímicas del fármaco sean adecuadas para el transporte a través de barreras celulares hidrófobas. Sin embargo, el transporte transcelular de proteínas y péptidos está restringido al proceso de transcitosis [Shen, W.C. y otros, (1992) Adv. Drug Delivery Rev. 8, 93-113]. La transcitosis es un proceso complejo en el que proteínas y péptidos se recogen en vesículas desde un lado de una célula, y subsiguientemente son transportados a través de la célula a otro lado de la célula, donde se descargan de las vesículas endocíticas [Nostov, K.E. y Semister, N.E. (1985) Cell 43, 389-390]. La membrana celular de las barreras mucosales es una bicapa lipídica hidrófoba que no tiene afinidad para macromoléculas cargadas hidrófilas como proteínas y péptidos. Además, las células mucosales pueden secretar mucina que puede actuar como una barrera para el transporte de muchas macromoléculas [Edwards, P. (1978) British Med. Bull. 34, 55-56]. Por lo tanto, a no ser que existan mecanismos de transporte específicos para la proteína y el péptido, su transporte inherente a través de barreras mucosales es casi insignificante.
Además de proporcionar una barrera física estrecha para el transporte de proteínas y péptidos, las barreras mucosales poseen enzimas que pueden degradar las proteínas y los péptidos antes, después de y durante su paso a través de la mucosa. Esta barrera se denomina la barrera enzimática. La barrera enzimática consiste en enzimas endo- y exo-peptidasa que disocian proteínas y péptidos en sus terminales o dentro de su estructura. La actividad enzimática de varias mucosas se ha estudiado y los resultados demostraron que existe actividad de proteasa sustancial en los homogenados de mucosa bucal, nasal, rectal y vaginal de ratones albinos y que estas actividades son comparables con las presentes en el íleon [Lee y otros (1988), previamente]. Por lo tanto, independientemente de la mucosa que se considere la barrera enzimática presente actuará muy fuertemente en la degradación de las moléculas proteínicas y peptídicas.
Los extremos N y C de los péptidos están cargados y la presencia de cadenas laterales cargadas imparte altas características hidrófilas a estas macromoléculas. Además, la presencia de cadenas laterales cargadas significa que las proteínas y los péptidos tienen capacidades de unión con enlace de hidrógeno fuertes; se ha demostrado que esta capacidad de unión con enlace de H juega un papel principal para inhibir el transporte de péptidos incluso pequeños a través de membranas celulares [Conradi, R.A. y otros, (1991) Pharm. Res. 8, 1453-1460].
Por lo tanto, el tamaño y la naturaleza hidrófila de las proteínas y los péptidos se combinan para restringir fuertemente su transporte a través de barreras mucosales.
Un sistema que se ha usado para alterar la naturaleza física de las barreras mucosales es el uso de mejoradores de la penetración. El uso de mejoradores de la penetración se basa en la interrupción de las barreras celulares mediante el uso de agentes de bajo peso molecular que pueden fluidizar las membranas celulares [Kaji, H. y otros, (1985) Life Sci. 37, 523-530], abrir las uniones estrechas [Inagaki, M. y otros, (1985) Rhinology 23, 213-221] y crear poros en la membrana celular [Gordon, S. y otros, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7419-7423; Lee, V.H.L. y otros, (1991) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, CRC Press 8, 91-192]. El uso de estos agentes conduce a una pérdida no específica de integridad de la barrera y puede conducir a la absorción de una variedad de moléculas grandes que pueden ser tóxicas para las células in vivo.
Los inhibidores de proteasas se han co-administrado con proteínas y péptidos y han mostrado alguna actividad limitada para mejorar la absorción de estas macromoléculas in vivo [Kidron, M. y otros, (1982) Life Sci. 31, 2837-2841; Takaroi, K. y otros, (1986) Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 682-687]. La seguridad y los efectos a largo plazo de este sistema todavía no se han investigado a fondo.
El sistema de profármacos se basa en modificaciones de los péptidos de una manera que los protegerá de la degradación y el reconocimiento por enzimas. Esto se ha alcanzado mediante la sustitución de las formas de los aminoácidos en la estructura de los péptidos, el bloqueo de grupos vulnerables en péptidos mediante amidación y acilación, la inversión de la quiralidad de los péptidos y la introducción de restricciones de conformación en la estructura del péptido. La síntesis de profármacos sólo es aplicable a pequeños péptidos que tienen dominios de actividad fácilmente identificables.
La reducción en el tamaño es otro sistema factible para incrementar el potencial de transporte de proteínas. Sin embargo, los sitios activos de proteínas necesitan cartografiarse antes de que pueda intentarse la reducción del tamaño. En general, este sistema es difícil de aplicar a la mayoría de las proteínas.
Los ligandos portadores, en virtud de sus propiedades, pueden alterar la captación celular las características de transporte de proteínas y péptidos. La esencia de este sistema es que una proteína o un péptido que no puede penetrar en las células se liga covalentemente a un portador que es altamente transportado al interior de las células. Los mecanismos a través de los cuales los ligandos portadores se someten a endocitosis y transcitosis son importantes para decidir la idoneidad del portador para mejorar el transporte de proteínas y péptidos. Los portadores macromoleculares son hidrófilos y no se reparten en la membrana. Por lo tanto, el transporte de grandes portadores polímeros al interior de las células está mediado por la afinidad del portador para la membrana celular. Generalmente, la captación de un conjugado macromolecular comienza con la unión a la membrana celular. La unión del portador a la membrana puede ser específica (por ejemplo, la unión de anticuerpos a antígenos de la superficie celular), no específica (unión de ligandos catiónicos o lectinas a azúcares de la superficie celular), o mediada por receptores (unión de transferrina o insulina a sus receptores). Una vez que el portador se ha unido a la superficie celular, es recogido en vesículas. Estas vesículas pueden procesarse a continuación por etapas y pueden dirigirse a varias rutas. Una ruta es el reciclado de la vesícula de nuevo hasta la membrana de la que se invaginó. Otra ruta, que es destructiva para el conjugado, es la fusión con lisosomas. Una ruta alternativa, y una que conduce a la transcitosis del conjugado, es la fusión de la vesícula con la membrana opuesta al lado del que se derivaba.
El equilibrio correcto entre los procesos de endocitosis y transcitosis determina el aporte de un conjugado proteínico a su diana. Por ejemplo, la endocitosis puede determinar la extensión hasta que la que un conjugado es recogido por la célula diana, pero la transcitosis determina si un conjugado alcanza o no su diana [Shen y otros (1992), previamente]. Para la absorción satisfactoria a través del tracto GI, un conjugado debe unirse a la membrana apical de la mucosa GI, internalizarse en las células mucosales, aportarse a través de las células y finalmente liberarse de la membrana vasolateral.
La literatura actual contiene muchos informes que demuestran que los portadores no específicos, tales como las polilisinas [Shen, W.C. y Ryser, H.J.P. (1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78 7589-7593] y las lectinas [Broadwell, R.D. y otros, (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 632-646] y los portadores específicos, tales como transferrina [Wan, J. y otros, (1992) J. Biol. Chem. 267, 13446-13450], asialoglicoproteína [Seth, R y otros, (1993) J. Infect. Diseases 168, 994-999] y los anticuerpos [Vitetta, E.S. (1990) J. Clin. Immunol. 10, 15S-18S], pueden mejorar la endocitosis de proteínas hacia el interior de células. Los informes que tratan de portadores transcitóticos para proteínas son menos, y muy pocos estudios han cuantificado el transporte de conjugados proteínicos a través de barreras celulares. Se ha observado que la aglutinina de germen de trigo [Broadwell y otros (1988), previamente] y un conjugado de anti-transferrina/metotrexato [Friden, P.M. y Walus, L.R. (1993) Adv. Exp. Med. Biol. 331, 129-136] se someten a transcitosis a través de la barrera sangre-cerebro in vivo. Además, se ha observado que los conjugados de polilisina de peroxidasa de rábano picante (HRP) y un conjugado de transferrina de HRP se someten a transcitosis a través de monocapas celulares in vitro [Wan, J. y Shen, W. C. (1991) Pharm. Res. 8, S-5; Taub, M.E. y Shen, W.C. (1992) J. Cell. Physiol. 150, 283-290; Wan, J. y otros, (1992) J. Biol. Chem. 267, 13446-13450, previamente].
Los ácidos grasos, como constituyentes de los fosfolípidos, constituyen el grueso de las membranas celulares. Están disponibles comercialmente y son relativamente económicos. Debido a su naturaleza lipídica, los ácidos grasos pueden repartirse fácilmente en e interactuar con la membrana celular de un modo atóxico. Por lo tanto, los ácidos grasos representan potencialmente los ligandos portadores más útiles para el aporte de proteínas y péptidos. Estrategias que pueden usar ácidos grasos en el aporte de proteínas y péptidos incluyen la modificación covalente de proteínas y péptidos y el uso de emulsiones de ácido graso.
Algunos estudios han presentado el uso satisfactorio de emulsiones de ácido graso para aportar péptidos y proteínas in vivo [Yoshikawa, H. y otros, (1985) Pharm. Res. 2, 249-251; Fix, J.A. y otros, Am. J. Physiol. 251, 6332-G340]. El mecanismo a través del cual las emulsiones de ácido graso pueden promover la absorción de proteínas y péptidos todavía no es conocido. Las emulsiones de ácido graso pueden abrir uniones estrechas, solubilizar membranas, disfrazar las proteínas y los péptidos del ambiente GI y transporta proteínas y péptidos a través de la mucosa GI como parte de su absorción [Smith, P. y otros, (1992) Adv. Drug Delivery Rev. 8, 253-290]. Se ha propuesto el último mecanismo, pero no está de acuerdo con el conocimiento actual acerca del mecanismo de la absorción de grasas.
Una estrategia más lógica para aportar proteínas y péptidos a través del epitelio GI es hacer uso de ácidos grasos como agentes adsorbentes de la membrana no específicos. Varios estudios han mostrado que un agente que se une a la membrana no específico conectado a una proteína puede promover la transcitosis de un conjugado proteínico a través de células in vitro [Wan, J. y otros, (1990) J. Cell. Physiol. 145, 9-15; Taub y Shen (1992), previamente]. También se ha demostrado que la conjugación de ácidos grasos mejora la captación de macromoléculas en y a través de membranas celulares [Letsinger, R. y otros, (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 6553-6556; Kabanov, A. y otros, (1989) Protein Eng. 3, 39-42]. Sin embargo, ha habido dificultades para conjugar ácidos grasos a péptidos y proteínas, incluyendo: (1) la falta de solubilidad de ácidos grasos en la solución acuosa para la reacción de conjugación; (2) la pérdida de actividad biológica de péptidos y proteínas después de la acilación de ácidos grasos; y (3) la falta de solubilidad de péptidos conjugados con ácidos grasos en soluciones acuosas [véase, por ejemplo, Hashimoto, M. y otros, Pharm. Res. 6, 171-176 (1989); Martins, M.B.F. y otros, Biochimie 72, 671-675 (1990); Muranishi, S. y otros, Pharm. Res. 8, 649-652 (1991); Robert, S. y otros, Biochem. Biophys Res. Commun. 196, 447-454 (1993)].
Se conocen otros conjugados de la técnica anterior que comprenden péptidos y/o proteínas, que se describen ahora brevemente, indicando una línea punteada la porción del conjugado correspondiente al resto que contiene lípido de la invención.
El compuesto N,N'-bis(\gamma-L-glutamil)-L-cisteína se describe en un método para la nutrición parenteral en la reivindicación 12 de WO-A-91-16067 y como un componente de una composición cosmética blanqueadora en las páginas 2-3 de EP-A-0-482-766. La estructura de la N,N'-bis(\gamma-L-glutamil)-L-cisteína es como sigue:
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N,N'-bis(\gamma-L-glutamil)-L-cisteína
Este compuesto es así un derivado \gamma-glutamílico de cisteína.
El compuesto ácido 2,2'-ditiobis ((1-aminoetilen)carbonilimino)dihexanodioico se describe en el Archivo de Registro STN, Número de Registro 23130-02-1. La estructura del ácido 2,2'-ditiobis((1-aminoetilen)carbonilimino)dihexanodioico es como sigue:
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ácido 2,2'-ditiobis((1-aminoetilen)carbonilimino)dihexanodioico
Este compuesto es así un derivado \delta-(\alpha-amino)adipílico de cisteína.
El compuesto Glu-Cys-Cys(Gly)-Glu se describe en Chemical Abstracts, 106, número de extracto 156843v (1987). La estructura de Glu-Cys-Cys(Gly)-Glu (= disulfuro mixto de glutationa-\gamma-glutamilcisteína) es como sigue:
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Glu-Cys-Cys(Gly)-Glu
Este compuesto es así un derivado de glutationa que contiene un grupo \gamma-glutamilo.
Los compuestos de las estructuras I, II y III se describe en Patent Abstracts of Japan, 13, extracto C-566 (1988).
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donde n es de 1 a aproximadamente 10, y
a: X = -COOH;
b: X = -CONH_{2}; y
c: X = -H.
Estas descripciones incluyen, entre otras, N-di-biotinil-3-nitro-2-piridilsulfenil-L-cisteína (estructura Ia, n = 1), 3-nitro-2-piridilsulfenil-L-cisteína (estructura IIa, n = 1) y N-t-butoxicarbonil-3-nitro-2-piridilsulfenil-L-cisteína (estructura III).
De ahí que ninguno de estos documentos describan conjugados que contienen lípidos.
En Molecular Immunity, vol. 31, Nº15, pp 1191-1199, Hvang y otros describen inmunógenos en los que se usa un grupo palmitoílo para anclar un péptido antigénico a la membrana de un liposoma.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos y composiciones para usar en la conjugación de ácidos grasos a moléculas hidrófilas y para mejorar la biodisponibilidad de péptidos y proteínas.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención, derivados de ácido graso de compuestos que contienen sulfhidrilo (por ejemplo, péptidos, proteínas u oligonucleótidos que contienen o están modificados para contener grupos sulfhidrilo) que comprenden productos conjugados con ácidos grasos con un enlace disulfuro se emplean para el aporte de los compuestos que contienen sulfhidrilo a células de mamífero. Esta modificación incrementa notablemente la absorción de los compuestos por las células de mamífero con relación al grado de absorción de los compuestos no conjugados, así como prolonga la retención de los compuestos en sangre y tejidos. Por otra parte, enlace disulfuro en el conjugado es bastante lábil en las células y facilita así la liberación intracelular del compuesto intacto de los restos de ácido graso. También se proporcionan reaccionantes y métodos para la preparación de los derivados de ácido graso.
Breve descripción de los dibujos
La invención puede entenderse mejor con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1 ilustra la captación de BBI, BBIssPal y BBIssOleic en células Caco-2;
la figura 2 ilustra la biodistribución de BBI y BBIssPal en sangre, riñones, pulmones e hígado de ratones CF-1 después de la administración iv;
la figura 3 ilustra la biodistribución de BBI y BBIssOleic en sangre, riñones, pulmones e hígado de ratones CF-1 después de la administración iv;
la figura 4 ilustra la biodistribución de BBI y BBIssPal en ratones CF-1 después de la administración ip;
la figura 5 ilustra la transcitosis y la acumulación de BBI, BBIssPal(2) y BBIssPal(4) a través y hacia el interior de células Caco-2; y
la figura 6 ilustra los resultados del análisis de filtración en gel G50 de medio basal de células Caco-2 que contienen BBI, BBIssPal(2) y BBIssPal(4) transcitosados.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo con la presente invención, un compuesto que contiene sulfhidrilo (por ejemplo, un biopolímero, según se define más adelante aquí) se liga a un derivado de ácido graso a través de un enlace disulfuro biodegradable reversible. Se esperaría que tal conjugado se uniera al lado apical de una membrana celular, alcanzara la membrana vasolateral del epitelio GI como resultado del transporte la renovación de la membrana y se liberara en el fluido intersticial como resultado de la reducción del enlace disulfuro.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan conjugados de la fórmula general VI
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en la que P es un residuo derivado de un compuesto que contiene sulfhidrilo; R^{1} es hidrógeno o arilo; R^{2} es un resto que contiene lípido (según se define más adelante aquí); y R^{3} es -OH, un resto que contiene lípido o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO_{2}H o -COR^{2}. Estos conjugados son particularmente útiles para incrementar la absorción y prolongar la retención en la sangre y los tejidos del compuesto que contiene sulfhidrilo PSH.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para incrementar la absorción o prolongar la retención en sangre y tejidos en un mamífero de un compuesto que contiene sulfhidrilo de la fórmula general PSH, en los que un conjugado de fórmula general VI se forma a partir del compuesto que contiene sulfhidrilo y el conjugado se administra a continuación al mamífero (por ejemplo, en una solución acuosa o una unidad de dosificación oral).
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan compuestos de la fórmula general V
VA-S-S-CH_{2}-CR^{1}-(NHCOR^{2})C(=O)R^{3}
en la que A es un residuo activador aromático (según se define más adelante aquí) y R^{1}, R^{2} y R^{3} son como se definen previamente. Los compuestos de fórmula general V son particularmente útiles en la preparación de conjugados de fórmula general VI a partir de compuestos que contienen sulfhidrilo de fórmula general PSH.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método para formar conjugados de fórmula general VI a partir de compuestos que contienen sulfhidrilo de fórmula general PSH, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula general PSH con un compuesto de fórmula general V. La reacción se lleva a cabo típicamente con un exceso (por ejemplo, un exceso de dos veces a diez veces) del compuesto de fórmula general V durante un período de tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 37ºC en una solución acuosa tamponadora adecuada (por ejemplo, tampones de fosfato, bicarbonato y borato). Preferiblemente, la reacción se lleva a cabo en tampón de bicarbonato, 
\hbox{pH 8.}
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan compuestos de la fórmula general III
IIIA-S-S-CH_{2}-CR^{1}(NH_{2})C(=O)R^{3'}
en la que R^{3'} es -OH o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO_{2}H y A y R^{1} son como se definen previamente. Los compuestos de fórmula general III son útiles para preparar los compuestos de fórmula general V. Los compuestos de fórmula general III se preparan adecuadamente haciendo reaccionar un compuesto de fórmula general II
IIH-S-CH_{2}-CR^{1}(NH2)C(=O)R^{3'}
con un compuesto de fórmula general A-S-S-A o A-S-S-A', en el que A' es diferente de A y es un residuo activador aromático. Estos reaccionantes están disponibles comercialmente [por ejemplo, 2,2'-ditiopiridina y ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)] o pueden prepararse mediante procedimientos sintéticos habituales bien conocidos por los expertos en la técnica.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan métodos para la preparación de compuestos de fórmula general IV en la que R^{2} es un grupo lipídico, en los que un compuesto de fórmula general III se hace reaccionar con un grupo lipídico activado de fórmula general X-O_{2}C-B o X-OC-B, en el que X es un grupo activador de lípidos (según se define más adelante aquí) y B es un grupo lipídico (según se define más adelante aquí). Los compuestos de fórmula general X-O_{2}C-B o X-OC-B pueden prepararse fácilmente de una manera conocida de por sí.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona un uso de un resto que contiene lípido en la fabricación de un medicamento para el aporte de un compuesto que contiene grupos sulfhidrilo a células de mamífero, en donde el grupo que contiene sulfhidrilo se selecciona de péptidos, proteínas y oligonucleótidos que contienen o están modificados para contener un grupo sulfhidrilo y en donde el compuesto que contiene sulfhidrilo está conjugado al resto que contiene lípido a través de un enlace disulfuro.
Para la preparación de un compuesto de fórmula general III, en un procedimiento ejemplar, cantidades molares generalmente iguales de un compuesto de fórmula general II y un compuesto de fórmula A-S-S-A o A-S-S-A' pueden mezclarse adecuadamente en un disolvente orgánico polar (por ejemplo etanol). El producto de fórmula general III puede a continuación aislarse adecuadamente mediante cristalización en un disolvente orgánico no polar (por ejemplo, benceno). Por supuesto, otros procedimientos adecuados también serían evidentes para los que trabajan en la especialidad.
Para la preparación de X-O_{2}C-B o X-OC-B, un ácido graso, por ejemplo, puede hacerse reaccionar con: (a) N-hidroxisuccinimida y un reaccionante de carbodiimida para formar un éster activo H-hidroxisuccinimidílico; (b) anhídrido trifluoroacético para formar un anhídrido de ácido graso; o (c) cloruro de tionilo para formar un cloruro de ácido graso. También pueden emplearse adecuadamente procedimientos alternativos para introducir estos u oros grupos activadores de lípidos.
Para los propósitos de la presente invención, el término "resto que contiene lípido" se refiere a un grupo lipídico de por sí o a un grupo basado en hidrocarburo (en particular, uno o más aminoácidos) que comprende un grupo lipídico. Por el término "grupo lipídico" se entiende un sustituyente hidrófobo que comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 26 átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 19 átomos de carbono. Grupos lipídicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: palmitilo (C_{15}H_{31}); oleílo (C_{15}H_{29}); estearilo (C_{17}H_{35}); colato y desoxicolato.
Por "residuo activador aromático" se entiende un resto que sirve para hacer al grupo disulfuro de los compuestos de fórmula general V más lábil a la reacción de desplazamiento con los compuestos que contienen sulfhidrilo de fórmula general PSH (y así, sirve como un buen grupo de salida). Un grupo activador aromático actualmente preferido es el 2-piridilo; otros grupos activadores aromáticos adecuados incluyen 4-nitrofenilo.
El término "grupo activador de lípidos" se refiere para los propósitos de la presente invención a un resto que hace a un grupo carboxilipídico al que está unido reactivo con un compuesto de fórmula general III. Un grupo activador de lípidos actualmente preferido es el éster N-hidroxisuccinimidílico; otros grupos activadores de lípidos adecuados incluyen cloruro de ácido y anhídrido de ácido.
Aunque la presente invención contempla la preparación y el uso de conjugados de fórmula general VI que comprenden una amplia gama de compuestos que contienen grupos sulfhidrilo, es particularmente ventajoso emplear los métodos y las composiciones de la presente invención para la preparación de conjugados que comprenden biopolímeros. Biopolímeros de interés incluyen péptidos, proteínas y oligonucleótidos (según se definen aquí más adelante). Como será fácilmente evidente para los que trabajan en la especialidad, los biopolímeros o los biopolímeros tiolados que contienen grupos sulfhidrilo pueden comprender una pluralidad de restos correspondientes en estructura a los conjugados de fórmula general VI (es decir, grupos que tienen la estructura de los compuestos de fórmula general VI menos el resto P).
Para los propósitos de la presente invención, el término "péptido" se refiere a cadenas de aminoácidos que comprenden de 2 a 50 aminoácidos y el término "proteína" a cadenas de aminoácidos que comprenden más de 50 aminoácidos. Las proteínas y los péptidos pueden aislarse de fuentes naturales o prepararse por medios bien conocidos en la técnica, tales como tecnología de DNA recombinante o síntesis en fase sólida. Se contempla que los péptidos y las proteínas usados de acuerdo con la invención pueden comprender sólo aminoácidos L presentes en la naturaleza, combinaciones de aminoácidos L y otros aminoácidos (incluyendo aminoácidos R y aminoácidos modificados) o sólo aminoácidos distintos de aminoácidos L. Para formar un conjugado de fórmula general I, el péptido o la proteína debe tener al menos un grupo tiol reactivo. En muchos casos, el péptido o la proteína contiene residuos de cisteína (un aminoácido que comprende un grupo tiol). Un péptido o una proteína que no contiene un grupo tiol puede modificarse mediante procedimientos bien conocidos de por sí para los que trabajan en la especialidad; en particular, pueden emplearse particularmente para este propósito agentes tiolantes bien conocidos [por ejemplo, 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) y 2-iminotiolano (reactivo de Traut)].
El término "oligonucleótido" se refiere a cadenas que comprenden dos o más ácidos nucleicos presentes en la naturaleza o modificados, por ejemplo secuencias de ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA) presentes en la naturaleza o recombinantes. Para la formación de un conjugado de acuerdo con la presente invención, el oligonucleótido debe modificarse mediante reacciones de tiolación a fin de contener un grupo sulfhidrilo para la conexión con el resto que contiene lípido. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo habitualmente de una manera conocida de por sí. Por ejemplo, un oligonucleótido puede acoplarse a cistamina usando carbodiimida y subsiguientemente reducirse mediante ditiotreitol para generar un grupo sulfhidrilo libre.
En una clase preferida de compuestos de fórmula general VI, R^{1} es hidrógeno, R^{2} es un resto lipídico y R^{3} es -OH. Este tipo de conjugado se deriva adecuadamente de cisteína. En otra clase preferida de conjugado de acuerdo con la presente invención, R^{1} es hidrógeno, R^{2} es -CH_{2}CH_{2}CH(NH_{2})CO_{2}H o -CH_{2}CH_{2}CH(NHCO-lípido)CO-lípido y R^{3} es -NHCH_{2}CO_{2}H o -NHCH_{2}CO-lípido, en el que al menos uno de R^{2} y R^{3} comprende un resto lipídico. Este tipo de conjugado se deriva adecuadamente de glutationa.
La síntesis de un compuesto ejemplar de fórmula general VI (en la que P es una proteína) se ilustra en el Esquema I. Por supuesto, como será fácilmente apreciado por los expertos en la técnica, también podía desarrollarse una variedad de esquemas sintéticos alternativos.
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Los conjugados de ácido graso de la presente invención son solubles en la mayoría de las soluciones tamponadoras en las que son solubles las proteínas y los péptidos. En particular, cualesquiera grupos ácido carboxílico libres se cargan a pH neutro y por lo tanto mejoran la solubilidad de los conjugados. Esto facilita mucho la formación de los conjugados con portadores o adyuvantes farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración de las proteínas o los péptidos a un paciente mediante las rutas oral u otras.
Una ventaja particular de acuerdo con la presente invención es que el enlace disulfuro entre el resto de ácido graso y el péptido o la proteína puede reducirse fácilmente. Por lo tanto, las moléculas de péptido o proteína activas se liberan de forma intacta dentro de los tejidos o las células diana. Por otra parte, el resto de ácido graso de los conjugados comprende sólo aminoácidos y moléculas lipídicas que son atóxicos para los mamíferos, en particular los seres humanos.
La invención puede entenderse mejor con referencia a los ejemplos adjuntos, que están destinados para propósitos de ilustración solamente y no debe considerarse en ningún sentido que limiten el alcance la de la invención según se define en las reivindicaciones adjuntas a la misma.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de N-palmitil-2-piridilditiocisteína (Pal-PDC)
Una solución enfriada con hielo de L-cisteína (I) (3,0 g) en etanol (50 ml) se añadió gota a gota a una solución agitada de 2,2-ditiopiridina (II) (7,5 g) en etanol (30 ml) y se dejó que la reacción avanzara a 25ºC durante 18 horas. La solución se centrifugó para retirar cualquier precipitado y el sobrenadante se redujo en volumen hasta 40 ml usando un evaporador giratorio. Subsiguientemente, la mezcla de reacción se añadió gota a gota a 400 ml de benceno enfriado con hielo. La PDC (III), que cristalizaba en benceno, se aisló mediante filtración, se redisolvió en 40 ml de etanol y a continuación se recristalizó en 400 ml de benceno enfriado con hielo según se describe previamente. El producto recristalizado se aisló mediante filtración, se secó bajo vacío durante la noche y finalmente se almacenó a -20ºC en un desecador.
La PDC (100 mg) (III) se disolvió en 5 ml de DMF y se mezcló con 100 \mul de trietilamina, y la suspensión resultante se hizo reaccionar con el éster N-hidroxisuccinimídico de ácido palmítico (IV) (250 mg) en DMF (5 ml) a 25ºC durante 24 horas, tiempo durante el cual la suspensión se volvía transparente. Esta solución se diluyó con 40 ml de agua enfriada con hielo, pH 3,0, y el precipitado, que contenía Pal-PDC (V) y ácido palmítico, se aisló mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos. La Pal-PDC (V) se separó del ácido palmítico mediante suspensión del precipitado en agua, pH 7,0, que disolvía la Pal-PDC (V), pero no el ácido palmítico. La Pal-PDC (V) se purificó adicionalmente usando dos etapas más de precipitación con ácido según se describe previamente.
Ejemplo 2 Síntesis de conjugados
A no ser que se indique otra cosa, todos los reaccionantes finales usados en las etapas de conjugación (Pal-PDC y PDC) se analizaron usando placas de cromatografía en capa fina (TLC) revestida con sílice que contienen indicadores fluorescentes. Estas placas no se activaron calentando antes de ninguno de los análisis. Para el análisis habitual de los reaccionantes sintetizados, se aplicaron a las placas 5 \mul de una solución etanólica que contenía el reaccionante (5 mg/ml). Subsiguientemente, las placas se desarrollaron en cámaras de disolvente, equilibradas con la fase móvil. Una vez que el frente de disolvente se había trasladado una distancia suficiente, las placas se retiraron, se secaron y se estudiaron bajo una lámpara UV. Las posiciones de las manchas se marcaron sobre las placas inmediatamente y se hizo un dibujo de la placa y las manchas. El valor de Rf para cada mancha visualizada se calculó y se registró. La composición de las fases móviles usadas en los análisis se ajustaban para proporcionar una separación óptima de las manchas de reaccionantes.
Para propósitos de ilustración, se sintetizaron conjugados de BBI. El BBI es una proteína hidrófila que tiene baja captación hacia las células y no está biodisponible oralmente. Además, el BBI es estable en el tracto GI y resiste la degradación por las proteasas de mamífero en el intestino [Yavelow, J. y otros (1983) Cancer Res. 43, 2454s-2459_{s}]. El uso de BBI para la quimioprevención puede aceptarse sólo si puede desarrollarse una forma absorbible oralmente de BBI.
Se disolvió BBI (20 mg) en 1 ml de una solución de bicarbonato sódico (0,2 M, pH 8,0) y se hizo reaccionar con SPDP (5 mg/100 \mul de DMF) durante 2 horas a 25ºC. Después de la purificación de BBI-PDP usando cromatografía de filtración en gel Sephadex® G50, la derivación con PDP del BBI se estimó midiendo la liberación del resto de tiopiridina después de la reducción de BBI-PDP con ditiotreitol (DTT). Usando este procedimiento, aproximadamente 4 grupos amino por molécula de BBI se modificaban con SPDP. El nivel de derivación de BBI podía controlarse ajustando el pH del tampón de reacción; la modificación de BBI podía ajustarse a partir de un grupo amino por molécula de BBI cuando la reacción se llevaba a cabo a pH 7, hasta 4,5 grupos amina modificados cuando la reacción se llevaba a cabo a pH 8,5.
Se redujo BBI-PDP (20 mg) en PBS (1 ml, pH 5,0) con DTT (25 mM) durante 30 minutos y subsiguientemente se eluyó de una columna Sephadex® G50. Las fracciones de BBI que contiene sulfhidrilo, que se eluían con el volumen de huecos de la columna, se identificaron usando el reactivo de Elman, y a continuación se hicieron reaccionar con un exceso de 3 veces (por grupo sulfhidrilo en el BBI) de Pal-PDC (V) en PBS, pH 7,0, durante 16 horas a 4ºC. La mezcla de reacción se acidificó a continuación hasta pH 3,0 usando HCl (1 M) y se dejó sobre hielo durante 30 minutos. El sobrenadante se analizó separadamente usando una columna de filtración en gel Sephadex G25. El precipitado, que contenía el conjugado de disulfuro de palmitilo de BBI, BBIssPal (VI), y el reaccionante en exceso, se aisló mediante centrifugación, se disolvió en DMF (2 ml) y se eluyó de una columna Sephadex® LH20 usando DMF. Las fracciones de BBIssPal (VI) que se eluían con el volumen de huecos de la columna, se aislaron, se dializaron 3 veces contra 500 volúmenes de agua y a continuación se liofilizaron. El rendimiento del conjugado usando este procedimiento era aproximadamente 80% (en peso). La conjugación de Pal-PDC a BBI se confirmó y se cuantificó después de la conjugación de Pal-PDC (V) marcado con [3H] a BBI usando condiciones de conjugación idénticas a las descritas previamente. Además, usando un procedimiento idéntico, se sintetizó el BBI conjugado a ácido oleico (BBIssOleic).
Ejemplo 3 Transporte de conjugados
Células de carcinoma de colon humano (Caco-2) se separaron de matraces de cultivo madre de 25 cm^{2} usando una incubación de 10 minutos a 37ºC con 0,05 ml de una solución de tripsina/EDTA (tripsina al 0,5%, EDTA 5,3 mM). Las células se suspendieron a continuación en 5 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco, complementado con suero bovino fetal (FBS) al 15%, L-glutamina (1%) y aminoácidos esenciales (1%), y se contaron usando un contador Counter.
Las células Caco-2 suspendidas en 1,5 ml de medio se sembraron en la cámara apical de los cultivos polarizados ("transwells") a una densidad de 0,5 millones de células por inserción. Se añadieron a continuación 2,5 ml del medio a las cámaras basales de cada cultivo polarizado. Se dejó que las células se ligaran durante 2 días sin perturbación y a continuación fueron alimentadas cada día hasta que se realizaban los experimentos. Las células se mantuvieron durante aproximadamente 10-20 días antes de los experimentos y se alimentaban 24 horas antes de cada experimento. Las monocapas celulares desarrollaban una resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de aproximadamente
500-600 \Omega cm^{2} a menos de una semana de la siembra y mantenían esta resistencia durante hasta 21 días después de la siembra.
La radioyodación de BBI y BBIssPal se llevó a cabo usando el método de la cloramina-T [McConahey, P.C. y Dixon, F.J. (1980) Meth. Enzymol. 70, 221-247]. Monocapas celulares confluentes de 14 días se lavaron una vez con, y a continuación se inocularon en, medio de Dulbecco libre de suero a 37ºC durante 30 minutos. Subsiguientemente, el medio de incubación se reemplazó por medio libre de suero que contenía ^{125}I-BBI (10 \mug/ml), como BBI natural o como BBIssPal o BBIssOleic, y las monocapas se incubaron durante 60 minutos más a 37ºC. Las monocapas se lavaron a continuación 3 veces con PBS enfriada con hielo y a continuación se expusieron a tripsina (0,5%, EDTA 5,3 mM) durante 10 minutos a 37ºC. Las células separadas se transfirieron a tubos, se aislaron mediante centrifugación, se lavaron 3 veces usando PBS enfriada con hielo, se ensayaron con respecto a la radiactividad acumulada usando un contador gamma y finalmente se ensayaron con respecto a la proteína celular usando el método publicado [Lowry, O.H. y otros (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275].
En algunos experimentos, se determinó la captación de ^{125}I-BBIssPal reducido. Se redujo ^{125}I-BBIssPal con DTT (50 mM) a 60ºC durante 5 minutos, seguido por 25 minutos adicionales a 37ºC. En experimentos de control, el 
\hbox{ ^{125} I-BBIssPal}
se expuso en el medio a las mismas temperaturas sin exponerse a DTT.
La captación de ^{125}I-BBIssPal en presencia de BSA (libre de ácido graso) se determinó como sigue. Se incubó 
\hbox{ ^{125} I-BBIssPal}
con medio que contenía BSA al 0,1% durante 30 minutos a 37ºC antes de añadirse a las monocapas celulares. En algunos experimentos de captación, la BSA se mezcló en primer lugar con un exceso molar de 3 veces de ácido palmítico, y a continuación se incubó con los conjugados antes de los experimentos. En los experimentos, en los que se determinaba la captación de ^{125}I-BBIssPal en medio que contenía FBS, los conjugados se añadieron simplemente al medio que contenía la cantidad requerida de FBS.
Monocapas celulares confluentes, de 2 a 3 semanas de edad, y que tenían un valor de TEER de aproximadamente 500 \Omega cm^{2}, se incubaron en primer lugar con MEM de Dulbecco que contenía 1% de FBS durante 30 minutos a 37ºC. Subsiguientemente, el medio de incubación se retiró y los conjugados de ^{125}I-BBI (10 \mug/ml) en 1,5 ml del medio se añadieron a la cámara apical de los cultivos polarizados. Se añadieron 2,5 ml del medio a la cámara basal y los cultivos polarizados se incubaron a 37ºC. En momentos predeterminados, el medio de la cámara basal (2,5 ml) de cada cultivo polarizado se retiró y se contó con respecto a la radiactividad usando un contador gamma. En cada experimento, típicamente se tomaron siete muestras 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 horas después de la incubación. Después de que se tomaran las muestras de 24 horas, las monocapas celulares se enjuagaron 3 veces con PBS enfriada con hielo, se cortaron de los insertos y se contaron con respecto a la radiactividad acumulada usando un contador gamma.
La integridad de los conjugados de ^{125}I-BBI transportados a través de las monocapas se estudió usando cromatografía de filtración en gel Sephadex G50. Brevemente, después de que el medio basal se muestreara a las 24 horas, se centrifugaron 1,0 ml del medio a 2000 rpm y a continuación se eluyeron de una columna G50 (10 ml) usando PBS; se recogieron fracciones de 1 ml y la radiactividad asociada a las fracciones se determinó usando un contador gamma. Los conjugados intactos se eluían con el volumen de huecos de la columna y los fragmentos menores que 1 kDa se eluían en o por encima del volumen de la columna.
Los resultados de la captación de ^{125}I-BBI, como la proteína libre o en forma conjugada a ácido palmítico, en presencia de diferentes cantidades de FBS añadida se muestran en la Tabla 1. Cuando los conjugados se incubaban con las células en medio libre de suero, la captación de BBIssPal era aproximadamente 140 veces superior que la de BBI. En presencia de medio que contenía 1% de FBS, la internalización de BBIssPal se incrementaba 35 veces sobre la de BBI. Incrementar la concentración en suero adicionalmente hasta 10% provocaba una disminución adicional en la captación de BBIssPal en las células hasta sólo un nivel 10 veces superior que el de BBI natural. La internalización de BBIssPal en células Caco-2 se reducía drásticamente en presencia de suero hasta 14% y 2,3% de la de los valores libres de suero para medios que contenían 1% y 10% de FBS, respectivamente.
TABLA 1
Captación (ng de BBI/mg de proteína celular)/h
libre de suero 1% de FBS 10% de FBS
BBI 3,9 \pm 0,19 2,2 \pm 0,17 1,3 \pm 0,02
BBIssPal 540,0 \pm 24,13 78,5 \pm 3,41 12,9 \pm 0,02
Las monocapas celulares se incubaron con conjugados marcados con ^{125}I a 10 \mug/ml durante 60 minutos a 37ºC. Los resultados presentados son la media de 3 monocapas \pm SEM. Los experimentos de captación se llevaron a cabo en medio de Dulbecco, en presencia y ausencia de FBS añadida.
Puesto que se cree que la captación de BBIssPal en las células está mediada por los ligandos de ácido palmítico en el conjugado, se estudió la captación de ^{125}I-BBIssPal en células Caco-2 antes y después de la reducción con DTT. Puesto que la presencia de suero en el medio de incubación tenía un efecto inhibidor sobre la captación de los conjugados al interior de las células, la captación se estudió en medio libre de suero. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La captación de ^{125}I-BBIssPal no tratado en el interior de las células era 80 veces superior que la de ^{125}I-BBI. La exposición de 
\hbox{ ^{125} I-BBI}
a DTT no provocaba una reducción en la captación. En contraste, al reducción de ^{125}I-BBIssPal con DTT reducía la captación del conjugado al interior de las células en aproximadamente 80%. La reducción de BBIssPal con DTT provoca la separación del ácido palmítico del conjugado. De ahí que la captación de ^{25}I-BBIssPal estuviera mediada por el ligando hidrófobo ácido palmítico. TABLA 2
Captación (ng de BBI/mg de proteína celular)/h
No tratado Tratado con DTT
BBI 4,8 \pm 0,00 5,2 \pm 0,00
BBIssPal 381,7 \pm 0,03 46,5 \pm 0,00
La captación celular de ^{125}I-BBI, como la proteína natural o como BBIssPal se determinó antes y después de la reducción con DTT (50 mM) durante 5 minutos a 60ºC y 25 minutos a 37ºC.
Se sabe que la albúmina de suero bovino (BSA) es un portador de ácidos grasos in vivo y contiene regiones hidrófobas que pueden unirse estrechamente a ácidos grasos. Puesto que la captación de ^{125}I-BBIssPal se reducía en presencia de suero, se investigó la posibilidad de que BBIssPal unido a BSA estuviera presente en FBS. La captación celular de ^{125}I-BBIssPal y ^{125}I-BBI en presencia de medio que contenía BSA libre de grasa o BSA cargado con ácido graso se estudió y los resultados se muestran en la Tabla 3. En presencia de medio libre de BSA, la captación de ^{125}I-BBIssPal al interior de las células era 80 veces superior que la de BBI, como se esperaba a partir de los resultados obtenidos en los experimentos previos. Cuando estaba presente en el medio BSA sin grasa (BSA libre de ácido graso) (0,1%), la captación de ^{125}I-BBIssPal se reducía en 82%, mientras que la captación de ^{125}I-BBI no estaba afectada. En presencia de BSA cargado con ácido graso (0,1%), que se producía aderezando BSA libre de grasa con un exceso molar de 3 de ácido palmítico, la captación de ^{125}I-BBI de nuevo no estaba afectada. Por lo tanto, el ^{125}I-BBIssPal se une fuertemente a BSA y esta unión depende del número de ácidos grasos ya unidos a BSA.
TABLA 3
Captación (ng de BBI/mg de proteína celular)/h
libre de suero BSA BSA/FA
BBI 4,8 \pm 0,00 4,8 \pm 0,00 3,9 \pm 0,00
BBIssPal 380,0 \pm 0,03 69,7 \pm 0,00 258,9 \pm 0,00
Los experimentos de captación se llevaron a cabo en medio de Dulbecco, en presencia y ausencia de BSA libre de ácido graso añadido (BSA) o BSA cargado con ácido graso (BSA/FA). Los resultados de los estudios de la captación de ^{125}I-BBI, como el BBI natural o en forma conjugada a ácido palmítico u oleico, en células Caco-2 en presencia de medio libre de suero, se presentan en la figura 1. Los resultados se muestran como los ng de BBI internalizada \pm SEM, n = 3. La captación de ^{125}I-BBIssPal al interior de las células era aproximadamente 100 veces superior que la de ^{125}I-BBI. De forma similar, la captación de ^{125}I-BBIssOleic al interior de las células era aproximadamente 108 veces superior que la de ^{125}I-BBI. La diferencia entre la captación de ^{125}I-BBIssPal y ^{125}I-BBIssOleic no era significativa.
Ejemplo 4 Ensayos de biodistribución
Ratones CF-1 hembra, de 2 a 3 semanas de edad, que pesaban 20-25 g cada uno, con acceso libre a alimento y agua antes de los experimentos, se usaron para los experimentos en animales. ^{125}I-BBI (3 mg/kg), como BBI natural o como conjugado de BBIssPal o BBIssOleic, se administró a los animales a través de la vena de la cola. A las 0,5, 3 y 24 horas después de la inyección, 3 animales de cada grupo experimental fueron sacrificados y su sangre (200 \mul), los riñones, los pulmones y el hígado se retiraron, se enjuagaron en PBS enfriada con hielo y se ensayaron con respecto a la radiactividad acumulada. Los pesos de los órganos se registraron y se usaron para ajustar la concentración de los conjugados en los órganos.
En los estudios de biodistribución ip, se administró ^{125}I-BBI (3 mg/kg), como el BBI natural o como BBIssPal, al cuadrante izquierdo inferior de la cavidad abdominal de cada animal. Los animales fueron tratados a continuación de la manera descrita para los estudios de biodistribución iv.
Los resultados de la biodistribución de BBI y BBIssPal después de la administración iv se muestran en la figura 2 como el % de dosis acumulada por g de órgano \pm SEM. Los resultados indicaban que aunque el BBI era excretado rápidamente del cuerpo sin alcanzar altos niveles en sangre, el BBIssPal se acumulaba en la sangre a un nivel relativamente alto y aparentemente era eliminada más lentamente de la circulación. Los resultados de la biodistribución en los riñones indicaban que aunque el BBI se acumulaba rápidamente en los riñones, BBIssPal no. La acumulación en el hígado de BBIssPal era aproximadamente 5 veces superior que la de BBI, y los niveles de BBIssPal permanecían altos en el hígado incluso 24 horas después de la inyección. La acumulación en los pulmones de BBIssPal también era aproximadamente 2 veces superior que la de BBI, pero este resultado puede haber sido provocado por la sangre residual presente en el órgano después de su extirpación. Claramente, BBIssPal se retenía más tiempo y a un nivel superior en la sangre y el hígado. Por otra parte, la depuración por los riñones de BBIssPal era aproximadamente 4 veces inferior que la de BBI natural.
La biodistribución iv de BBI y BBIssOleic también se estudió en ratones CF-1. Los resultados se presentan en la figura 3 como % de dosis acumulada por g del órgano \pm SEM, n = 3, a las 0,5, 3 y 24 horas. La biodistribución de BBIssOleic era muy similar a BBIssPal. Como se observaba para BBIssPal, BBIssOleic tenía niveles en sangre superiores que BBI y aparentemente se depuraba más lentamente de la circulación. Los niveles en sangre de BBIssOleic eran aproximadamente 4 veces superiores que los de BBI en los mismos puntos temporales. La depuración por los riñones de BBIssOleic era aproximadamente 4 veces inferior, y la acumulación en el hígado aproximadamente 4 veces superior que la de BBI natural. La retención de BBIssOleic en el hígado se prolongaba, con niveles significativos del conjugado presentes en el hígado incluso 24 horas después de la inyección. Los niveles en los pulmones de BBIssOleic eran aproximadamente 2 veces superiores que los niveles de BBI natural, pero la sangre residual superior en los pulmones podía explicar esta observación.
La biodistribución ip de ^{125}I-BBIssPal en ratones CF-1 se muestra en la figura 4 como el % medio de acumulación de dosis por órgano \pm intervalo (bares) a las 0,5 horas (figura 4A), las 3 horas (figura 4B) o las 24 horas después de la inyección (figura 4C). La acumulación en los riñones de ^{125}I-BBIssPal era 4 veces inferior que la de ^{125}I-BBI natural para los puntos temporales de 0,5 y 3 horas. A las 24 horas, los niveles de ^{125}I-BBIssPal eran superiores en los riñones que los de ^{125}I-BBI. El nivel en sangre de ^{125}I-BBIssPal era similar al de ^{125}I-BBI a las 0,5 horas, 1,5 veces superior que el de BBI a las 3 horas y aproximadamente 3 veces superior que BBI a las 24 horas. La acumulación en el hígado de ^{125}I-BBIssPal era 1,5 veces superior que la de ^{125}I-BBI a las 0,5 horas, 2,5 veces superior a las 3 horas y aproximadamente 4 veces superior a las 24 horas. Estaban presentes cantidades relativamente grandes de ^{125}I-BBIssPal en el hígado y en los riñones a las 24 horas.
Ejemplo 5 Estudios de transformación in vitro
Se llevaron a cabo ensayos de transformación usando células C3H 10T1/2 (clon 8) de acuerdo con las recomendaciones publicadas [Reznikoff, C.A. y otros (1973) Cancer Res. 33, 3239-3249; Reznikoff, C.A. y otros (1973) Cancer Res. 33, 3231-3238]. Se mantuvieron cultivos madre de células libres de micoplasmas haciendo pasar 50.000 células por matraz de 75 cm^{2} cada 7 días. Usando este esquema, las células siempre se hacían pasta aproximadamente 2 días antes de alcanzar la confluencia. El cultivo madre se hizo crecer en medio basal de Eagle complementado con FBS al 10%, penicilina (100 unidades) y estreptomicina (100 \mug) y se usó para los ensayos de transformación en las pasadas de 9 a 14. Las células se hicieron pasar tratando las células madre con tripsina (0,1%) en PBS durante 5 minutos y extinguiendo la tripsina con 5 ml del medio. Este procedimiento se adaptó para minimizar la transformación espontánea en los cultivos madre y maximizar la eficacia de cultivo en placa en las cápsulas de Petri. La reserva de FBS usada en los cultivos se rastreó previamente para asegurar que el suero podía soportar la expresión y el crecimiento de las células transformadas.
Para los ensayos de transformación, se sembraron células C3H 10T1/2 (1000/cápsula) en cápsulas de Petri de 60 mm y se dejaron crecer en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada en medio basal de Eagle, complementado con FBS al 10%, penicilina (100 unidades) y estreptomicina (100 \mug), durante 24 horas. Subsiguientemente, las células se iniciaron mediante el tratamiento con 25 \mul del 3-metilcolantreno (MCA) en solución de reserva de acetona (0,25 mg/ml) hasta una concentración final de 1 \mug/ml de MCA (5 \mug/5 ml). Las células se dejaron crecer en presencia del carcinógeno o de disolvente durante 24 horas y el medio de cada cápsula se reemplazó a continuación por medio reciente que no contenía carcinógeno o disolvente. El medio en las cápsulas se reemplazó dos veces por semana durante las dos primeras semanas del ensayo y a continuación una vez a la semana para las cuatro semanas restantes del ensayo. En los experimentos diseñados para determinar la actividad inhibidora de la transformación de los conjugados, las células se mantuvieron en el medio que contenía los conjugados (1 \mug/ml) durante las primeras tres semanas del ensayo; a continuación, las células se mantuvieron en medio que no contenía conjugados añadidos.
Seis semanas después del tratamiento con carcinógeno, las células se inspeccionaron bajo un microscopio con respecto a la adherencia a las cápsulas de cultivo y se lavaron con PBS y a continuación se fijaron en metanol al 100%. Las monocapas fijadas se tiñeron a continuación con tinte de Giemsa. Se trataron 20 cápsulas por grupo en cada experimento. Además de los grupos de prueba, todos los ensayos de transformación contenían al menos otros tres grupos: control negativo (no tratado con carcinógeno o disolvente), control de acetona (tratado con 25 \mul de acetona) y control positivo [tratado con MCA (1 \mug/ml) en 25 \mul de acetona]. Los focos transformados (>3 mm de diámetro) en las placas se estudiaron bajo un microscopio y se clasificaron de acuerdo con las pautas publicadas como tipos I, II o III [Landolph, J.R. (1985) Transformation assay of established cell lines: Mechanism and Application (ed. Kakunaga, T. y Yamasaki, H.) IARC Scientific Publications, Lyon, Francia, pp. 185-201]. Brevemente, los focos de tipo III eran áreas vasófilas densas de varias capas de crecimiento celular que se teñían hasta un color azul intenso con Giemsa y tenían bordes entrecruzados rugosos. Los focos de tipo II también eran áreas densas de varias capas de crecimiento celular, pero se teñían hasta un color púrpura con Giemsa y tenían bordes más lisos y más definidos en comparación con los focos de tipo III. Los focos de tipo I no se puntuaban en el ensayo.
La eficacia de cultivo en placas (PE) de las células también se estudió junto con cada uno de los ensayos de transformación. Para determinar la PE de las células en los diferentes grupos de tratamiento, se sembraron células (200 células/cápsula) en tres cápsulas de Petri de 60 mm por grupo experimental y se trataron de una manera idéntica a las células del ensayo de transformación. Las células en estos ensayos se terminaron a los 10 días, se fijaron con metanol al 100% y se tiñeron con Giemsa; se contaron a continuación las colonias de 50 células o más visibles bajo un microscopio. La eficacia del cultivo en placa se define como el (número de colonias/número de células sembradas)*100.
La actividad anti-transformación in vitro de BBI, BBIssPal y BBIssOleic se muestra en la Tabla 4. El BBI, como la proteína libre o en forma conjugada a ácido palmítico u oleico, se añadió a los cultivos en 1,0 \mug/ml durante las tres primeras semanas del período de ensayo de transformación empezando inmediatamente después del tratamiento con MCA. Las células tratadas con MCA se expusieron a 3-metilcolantreno, disuelto en 25 \mul de acetona, a una concentración de 1 \mug/ml durante 24 horas. Las células tratadas con acetona se expusieron a 25 \mul de acetona durante sólo 24 horas. Los grupos de prueba se expusieron a MCA durante 24 horas y a continuación a los conjugados durante las tres primeras semanas del ensayo. Las células no tratadas no se expusieron ni a MCA ni a acetona. Análisis estadístico (Chi cuadrado): Grupo 4 frente a 3, p < 0,05; Grupo 5 frente a 3, 0,05 < p < 0,1; Grupo 6 frente a 3, p < 0,005. Las células no tratadas de control alcanzaban la confluencia en las cápsulas aproximadamente 14 días después de la siembra y formaban monocapas inhibidas por contacto que se adherían a los pocillos. Estas cápsulas no contenían focos transformados al final del período de ensayo. Las células tratadas con acetona también alcanzaban la confluencia y formaban monocapas que se adherían a los pocillos 14 días después de la siembra y no contenían focos transformados. Las cápsulas tratadas con MCA, sin embargo, contenían focos transformados morfológicamente: 6 de 19 cápsulas puntuadas contenían focos tipo III. El grupo tratado con BBI no contenía focos transformados, indicando que el BBI podía evitar la transformación inducida por MCA en estas células. Las células tratadas con BBIssPal contenían un foco tipo II de las 20 cápsulas puntuadas en el ensayo. Las células tratadas con BBIssOleic no contenían focos transformados. La PE de todos los grupos en este ensayo estaba entre 20% y 25%. Según se demostraba en la Tabla 4, tanto BBIssPal como BBIssOleic retenían la actividad biológica original de BBI.
TABLA 4
Grupo de tratamiento Eficacia de cultivo Nº de cápsulas con Fracción de cápsulas
en placa (%) focos transformados/ que contienen focos
Nº de cápsulas transformados
1. Controles - no tratados 23 \pm 1,5 0/20 0
2. Controles negativos - tratados con acetona 22 \pm 2,0 0/20 0
3. Controles negativos - tratados con MCA 21 \pm 3,0 6/19 0,32
4. Prueba - tratados con MCA+BBI 24 \pm 2,0 0/20 0
5. Prueba - tratados con MCA+BBIssPal 23 \pm 3,0 1/20 0,05
6. Prueba - tratados con MCA+BBIssOleic 24 \pm 3,5 0/20 0
Ejemplo 6 Transporte de conjugados simples y múltiples
Se llevaron a cabo estudios sobre el transporte de ^{125}I-BBIssPal unido a la membrana apical usando cultivos polarizados y placas de seis pocillos. En el experimento de la placa de seis pocillos, se incubó ^{125}I-BBI o ^{125}I-BBIssPal 
\hbox{(10  \mu g/ml)}
con células Caco-2 en medio libre de suero durante 1 hora a 37ºC. Subsiguientemente, las células se enjuagaron tres veces con PBS enfriada con hielo y a continuación se dividieron en dos grupos. En el primer grupo la internalización de los conjugados se determinó después de la tripsinización y el aislamiento de las células. En el segundo grupo, las células se reincubaron con medio libre de suero y la liberación de los conjugados de las células se siguió durante 24 horas; el medio se retiró a intervalos de 1 hora y se contó con respecto a la radiactividad. Al final del período de seguimiento, las células se tripsinizaron, se aislaron y se contaron con respecto a la radiactividad acumulada. Los conteos totales en cada experimento (medio + cpms de las células) se determinaron y se determinó el % de los conteos totales liberados en diferentes momentos. 
\newpage
En el experimento de cultivos polarizados, los conjugados se incubaron con el lado apical de las células durante 1 hora a 37ºC. Los cultivos polarizados se enjuagaron a continuación tres veces con PBS enfriada con hielo y a continuación se reincubaron con medio libre de suero. La liberación de los conjugados al medio apical y basal se siguió durante 24 horas contando todo el medio basal o apical en diferentes momentos. Los conteos totales obtenidos al final del período de seguimiento (se añadieron cultivos polarizados + conteos de medio, y la liberación de los conjugados (% del total) se calculó en diferentes momentos. Para asegurar que los conteos obtenidos en los cultivos polarizados a las 24 horas se debían a la presencia de los conjugados en las células y no a la unión no específica al plástico, los cultivos polarizados se expusieron a tripsina durante 10 minutos, se enjuagaron tres veces con PBS enfriada con hielo y subsiguientemente se contaron con respecto a la radiactividad acumulada.
El BBI se modificó con 2 ó 4 ácidos palmíticos y el transporte se determinó en los cultivos polarizados. El transporte acumulativo de BBI, BBI modificada con 4 ácidos palmíticos [BBIssPal(4)] y BBI modificada con 2 ácidos palmíticos [BBIssPal(2)] en monocapas de Caco-2 se muestra en la figura 5A; los resultados se expresan como BBI (ng/monocapa) \pm SEM, n = 3. El orden de la extensión del transporte era BBIssPal(4)>BBI>BBIssPal(2). Los resultados de la internalización de los conjugados en las mismas células se muestran en la figura 5B como los ng de BBI internalizados con monocapa. Según se esperaba, BBIssPal(4) tenía la captación más alta en las células, seguido por BBIssPal(2) y BBI. Los medios basales obtenidos a las 24 horas de los cultivos polarizados se analizaron usando una columna G50. Los resultados se muestran en la figura 6. Como se había observado previamente, ni BBI ni BBIssPal(4) se transcitosaban a través de las monocapas. Sin embargo, una cantidad pequeña, pero significativa, del medio basal de BBIssPal(2) consistía en conjugado intacto. Esta cantidad consistía en entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20% de la radiactividad total presente en el medio basal.
Ejemplo 7 Absorción por la piel de BBIssPal
Pieles recientemente preparadas de ratones sin pelo se montaron sobre anillos pequeños. A cada piel montada, se aplicaron 5 \mul de muestra de BBI o BBIssPal marcados con ^{125}I-BBI a una concentración de 0,5 mg/ml a un área de 0,38 cm^{2}. Se usaron dos trozos de piel por tratamiento. Las pieles se mantuvieron a temperatura ambiente (23ºC) en un ambiente humidificado. Después de 30 minutos, la superficie de las pieles se enjuagó en primer lugar cuidadosamente con PBS; subsiguientemente, las pieles se desmontaron y se embebieron dos veces en 100 ml de PBS. Las pieles se secaron a continuación con papeles de filtro y se contaron en un contador gamma. La cantidad de BBI retenida sobre las pieles se calculó usando la radiactividad específica del BBI o BBIssPal marcado. La absorción de BBI y BBIssPal en las pieles de los ratones era 0,14 y 1,6 \mug/cm^{2}, respectivamente. Esto demuestra que se alcanzaba un incremento de más de 10 veces de absorción de BBI en la piel cuando el polipéptido se modificaba usando Pal-PDC.
Ejemplo 8 Síntesis de peroxidasa de rábano picante palmitilada (HRPssPal)
Se mezclaron 10 miligramos de peroxidasa de rábano picante (peso molecular 40.000; Sigma P 8375) en 0,5 ml de PBS con 2 ml de SPDP en 0,1 ml de DMF a 25ºC durante 2 horas. La reacción se terminó mediante dilución con 0,5 ml de PBS y se dializó en 500 ml de PBS a 4ºC. Después de 24 horas, la solución del tubo de diálisis se retiró, se redujo mediante la adición de 50 \mul de DTT 1 M y se separó usando una columna Sephadex G-50. Las fracciones en el volumen de huecos de la columna se reunieron y se mezclaron con un exceso molar de 10 veces de Pal-PDC en tampón de borato, pH 9,6 a 25ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se dializó a continuación exhaustivamente a 4ºC durante 3 días y se estimó que el producto final contenía 10 residuos de ácido palmítico por molécula de HRP. Las moléculas de HRP retenían aproximadamente 20% de la actividad enzimática original.
Ejemplo 9 Captación celular de HRPssPal
Se incubaron monocapas confluentes de células L929 de fibroblastos de ratón en placas de racimo de cultivo de seis pocillos en medio libre de suero con 30 \mug/ml de HRP, como la forma natural o como el conjugado con ácido palmítico (HRPssPal). Después de 1 hora a 37ºC, las monocapas se lavaron tres veces con PBS y a continuación se disolvieron en 1 ml de 0,05% de Triton-X100. La HRP asociada a células se determinó midiendo la actividad enzimática en cada extracto celular y los resultados se convirtieron en ng de HRP por monocapa celular. Los resultados indicaban que las captaciones celulares de HRP y HRPssPal eran 7 y 229 ng de HRP por monocapa celular, respectivamente. Por lo tanto, se alcanzaba un incremento de 30 veces en la captación celular mediante la modificación de HRP con Pal-PDC.
Ejemplo 10 Lipidización de oligonucleótidos
Un oligonucleótido 21mero antisentido que es complementario al mRNA de monoamina oxidasa B se tiola usando el siguiente procedimiento. El oligonucleótido se mezcla con un exceso molar de dos veces de cistamina en presencia de un reactivo de carbodiimida soluble en agua, EDC. La mezcla se mantiene a 25ºC durante 2 horas y se añade un exceso molar de dos veces de cistamina de DTT para reducir los enlaces disulfuro. Después de separar el oligonucleótido de cistamina libre y DTT usando una columna Sephadex G-25, una pequeña cantidad del oligonucleótido tiolado se hace reaccionar con reactivo de Ellman y la concentración de grupos sulfhidrilo se determina usando la absorbancia a 412 nm (suponiendo un \xi de 1,36x10^{4} M^{-1}). Subsiguientemente, se determina el número de grupos sulfhidrilo por molécula de oligonucleótido. El oligonucleótido tiolado se mezcla en tampón de bicarbonato, pH 8, con Pal-PDC en un exceso molar de dos veces con respecto al número de grupos sulfhidrilo en el oligonucleótido. El oligonucleótido palmitilado se purifica usando una columna Sephadex G-25.
A partir de la descripción precedente, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las características esenciales de la invención y, sin apartarse del espíritu y el alcance de la misma, puede adaptar la invención a diversas utilizaciones y condiciones. Los cambios en la forma y la sustitución de equivalentes se contemplan como circunstancias que pueden sugerirse o hacerse convenientes, y cualesquiera términos específicos empleados aquí se considera en un sentido descriptivo y no con propósitos de limitación.

Claims (24)

1. Un compuesto de fórmula general VI
VIP-S-S-CH_{2}-
\melm{\delm{\para}{R ^{1} }}{C}{\uelm{\para}{COR ^{3} }}
-NHC(=O)R^{2}
en la que P se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas y oligonucleótidos; R^{1} es hidrógeno o arilo; R^{2} es un resto que contiene lípido; y R^{3} es -OH, un resto que contiene lípido o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO_{2}H o -COR^{2}.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es un grupo lipídico y R^{3} es -OH.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es -CH_{2}CH_{2}CH(NH_{2})CO_{2}H o -CH_{2}CH_{2}CH(NHCO-lípido)CO-lípido y R^{3} es -NHCH_{2}CO_{2}H o -NHCH_{2}CO-lípido en el que al menos uno de R^{2} y R^{3} comprende un grupo lipídico.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho grupo lipídico es un sustituyente hidrófobo que comprende de 4 a 26 átomos de carbono.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho grupo lipídico es un sustituyente hidrófobo que comprende de 5 a 19 átomos de carbono.
6. Un método in vitro para incrementar la absorción de un compuesto que contiene grupo sulfhidrilo seleccionado del grupo que consiste en péptidos, proteínas y oligonucleótidos hacia el interior de células de mamífero, comprendiendo dicho método:
formar a partir del compuesto que contiene sulfhidrilo un compuesto de fórmula general VI
VIP-S-S-CH_{2}-
\melm{\delm{\para}{R ^{1} }}{C}{\uelm{\para}{COR ^{3} }}
NHC(=O)R^{2}
en la que P es un resto derivado del compuesto que contiene grupo sulfhidrilo seleccionado del grupo que consiste en péptidos, proteínas y oligonucleótidos; R^{1} es hidrógeno o arilo; R^{2} es un resto que contiene lípido; y R^{3} es -OH, un resto que contiene lípido o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO_{2}H o -COR^{2}; y
administrar el compuesto de fórmula general VI a las células.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es un grupo lipídico y R^{3} es -OH.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es -CH_{2}CH_{2}CH(NH_{2})CO_{2}H o -CH_{2}CH_{2}CH(NHCO-lípido) CO-lípido y R^{3} es -NHCH_{2}CO_{2}H o -NHCH_{2}CO-lípido en el que al menos uno de R^{2} y R^{3} comprende un grupo lipídico.
9. Un método in vitro para prolongar la retención en sangre y tejidos de un compuesto que contiene grupo sulfhidrilo seleccionado del grupo que consiste en péptidos, proteínas y oligonucleótidos en células de mamífero, comprendiendo dicho método:
formar a partir del compuesto que contiene sulfhidrilo un compuesto de fórmula general VI
VIP-S-S-CH_{2}-
\melm{\delm{\para}{R ^{1} }}{C}{\uelm{\para}{COR ^{3} }}
NHC(=O)R^{2}
en la que P se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas y oligonucleótidos; R^{1} es hidrógeno o arilo; R^{2} es un resto que contiene lípido; y R^{3} es -OH, un resto que contiene lípido o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO_{2}H o -COR^{2}; y
administrar el compuesto de fórmula general VI a las células.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es un grupo lipídico y R^{3} es -OH.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es -CH_{2}CH_{2}CH(NH_{2})CO_{2}H o -CH_{2}CH_{2}CH(NHCO-lípido)CO-lípido y R^{3} es –NHCH_{2}CO_{2}H o –NHCH_{2}CO-lípido en el que al menos uno de R^{2} y R^{3} comprende un grupo lipídico.
12. Un compuesto de fórmula general V
VA-S-S-CH_{2}-CR^{1}-(NHCOR^{2})C(=O)R^{3}
en la que A es un residuo activante aromático; R^{1} es hidrógeno o arilo; R^{2} es un resto que contiene lípido; y R^{3} es -OH, un resto que contiene lípido o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO_{2}H o -COR^{2}.
13. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, en el que A es 2-piridilo o 4-nitrofenilo.
14. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es un grupo lipídico y R^{3} es -OH.
15. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es -CH_{2}CH_{2}CH(NH_{2})CO_{2}H o -CH_{2}CH_{2}CH(NHCO-lípido)CO-lípido y R^{3} es -NHCH_{2}CO{2}H o -NHCH_{2}CO-lípido en el que al menos uno de R^{2} y R^{3} comprende un grupo lipídico.
16. Un método para formar un compuesto de fórmula general VI, que comprende:
hacer reaccionar un compuesto de fórmula general PSH, en la que P se selecciona del grupo que consiste en péptidos, proteínas y oligonucleótidos, con un compuesto de fórmula general V
VA-S-S-CH_{2}-CR^{1}-(NHCOR^{2})C(=O)R^{3}
en la que A es un residuo activante aromático; R^{1} es hidrógeno o arilo; R^{2} es un resto que contiene lípido; y R^{3} es -OH, un resto que contiene lípido o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO_{2}H o -COR^{2}.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que A es 2-piridilo o 4-nitrofenilo.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es un grupo lipídico y R^{3} es -OH.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que R^{1} es hidrógeno, R^{2} es -CH_{2}CH_{2}CH(NH_{2})CO{2}H o -CH_{2}CH_{2}CH(NHCO-lípido)CO-lípido y R^{3} es -NHCH_{2}CO_{2}H o -NHCH2CO-lípido en el que al menos uno de R^{2} y R^{3} comprende un grupo lipídico.
20. Un compuesto de fórmula general III
IIIA-S-S-CH_{2}-CR^{1} (NH_{2})C(=O)R^{3'}
en la que R^{3}' es -OH o una cadena de aminoácidos que comprende uno o dos aminoácidos y que termina en -CO2H; A es un residuo activante aromático; y R^{1} es hidrógeno o arilo.
21. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 20, en el que R^{1} es hidrógeno y R^{3'} es -OH.
22. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 20, en el que R^{1} es hidrógeno y R^{3} es -NHCH_{2}CO_{2}H.
23. Uso de un compuesto de fórmula general VI, de acuerdo con y según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la fabricación de un medicamento para incrementar la absorción de un compuesto que contiene un grupo sulfhidrilo seleccionado de péptidos, proteínas y oligonucleótidos hacia el interior de células de mamífero.
\newpage
24. Uso de un compuesto de fórmula general VI, de acuerdo con y según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para prolongar la retención en sangre y tejidos de un compuesto que contiene un grupo sulfhidrilo seleccionado de péptidos, proteínas y oligonucleótidos en células de mamífero.
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