JPS63246382A - ビオチニル試薬及びそれを用いるビオチニル化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なＳＨ基特異的ビオチニル化試薬及びそれ
を用いる生理活性物質のビオチニル化法に関するもので
ある。

本発明で得られるビオチニル試薬は、現在行なわれてい
る種々のアビジン−ビオチンシステムにきわめて有利に
利用できる。したがって本発明は、免疫分析その他の生
体内微量分析、化学分析のほか、生理活性物質の精製の
技術分野においても重用されるものである。

（従来の技術） 従来、種々のアッセイ系や生理活性物質の精製において
、その感度を高める目的でアビジンとビオチンの親和性
を利用したシステムが開発されている。そして、ビオチ
ン標識物質はこの系において、必須である（「化学大辞
典１」共立（昭４２−９−１０）ｐ２２１）。

生理活性物質のビオチニル化は、一般に生理活性物質分
子中の数種の官能基に対してそれぞれに活性なビオチニ
ル化試薬を用いて行なわれる。その主なものは■アミノ
基に反応性を有する例えばｄ−ビオチニル−Ｎ−ハイド
ロキシスクシンイミドエステルなどであり、他の活性エ
ステルも用いられている。

その他には■光反応を利用して非選択的にビオチニル化
するフォトビオチン、■フェノールやイミダゾールに反
応性を有するジアゾニウム塩をもつもの、■ＳＨ基に反
応性を有する有機水銀を有するビオチンあるいはアルキ
ルハライドを有するビオチン等が挙げられる。

（発明が解決しようとする問題点）゛ これらの試薬は、それぞれ有用な物質ではあるが次の様
な欠点は不可避である。

１、従来主に使用されていた上記■の試薬は、蛋白質に
組み込まれる場合、不特定多数のアミノ基に対してビオ
チンが導入されるため、蛋白質によっては活性に重要な
アミノ基の修飾が起り、蛋白質の活性の低下がみられる
。

２、上記■■も、同様のことが言える。特に■の試薬で
は、その特異性が低く特異的な修飾には向かない。

３、上記■の試薬は、ＳＨ基に対してビオチニル化を行
なうものである。しかしながら、有機水銀とＳＨ基との
反応は、その選択性も高いが蛋白質に使用した時ＳＨ基
のみでなく他の官能基に結合することが報告されている
。　（Ｋｌａｐｐｅｒ、Ｍ、Ｈ，。

Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，（バイオケミカルバイオフィジカルリ
サーチコミニュケーション）、旦、１７２（１９７０）
。

Ｄｕｋｅ、　Ｊ、、　ｅｔ、ａｌ、、（１９７１）　Ｂ
、Ｂ、Ａ（バイオケミカル、バイオフィジカルアクタ）
　２２９．１５５など）また、水銀化合物の為その取り
扱いや廃棄にも問題があった。更にハロゲン化アルキル
とＳＨ基の反応は１選択性が低く、イミダゾール基、ア
ミノ基、チオエーテル基、フェノール基とも反応性を有
し１反応条件の設定が難しい。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記した欠点を解決するためになされたもの
であって、高い反応性で特異的に生理活性物質をその活
性を低下させずにビオチニル化でき、なおかつ、水性及
び有機性溶媒それぞれに対し高い溶解性を有する安定で
安全なビオチニル化試薬をスクリーニングした。しかし
ながら、既知の化合物の中には目的とするビオチニル化
試薬は発見することができなかった。

そこで、発想を転換して、新規化合物の中から目的化合
物を開発する以外に途がないとの観点にたった。そして
、鋭意研究の結果、新規化合物を合成するに当り、先ず
第一に、ビオチニル化の標的としてＳＨ基を選択した。

蛋白質においてＳＨ基は、多くはジスルフィドの形で存
在し、蛋白質の骨格形成に関与しており、比較的機能中
心に少ないこと、また分子中のＳＨ基の数も他の官能基
に比べると少ないこと。そしてこれらのことは、Ｓ１１
基のビオチニル化は、蛋白の機能の低下をまねきにくく
、更に、計画的な、特異性をもたせたビオチニル化を可
能にすると考えられることから、ビオチニル化の標的と
してＳＨ基を選択したのである。

そして第二に、Ｓ８反応性の特異性を増すために、チオ
ール基の修飾物質中量も特異性の高い、高反応性ジスル
フィドを反応性基として選び、各種の新規化合物を数多
く合成した。その中で、特に一般式［１］で示される新
規化合物が安定性、溶解性にすぐれており生理活性物質
中のチオール基の特異的ビオチニル化に有用であるとい
う知見を得、本発明に到達した。

すなわち本発明は、一般式（Ｉ）で示される化合物を、
Ｓｌｉ基に特異的なビオチニル化試薬として使用する点
を重要なポイントとするものである。この化合物は、そ
れ自体、文献未載の新規化合物であり、これがビオチニ
ル化試薬として利用できることも従来未知の新規事項で
ある。

本発明において、　ＳＨ基を有する生理活性物質とは、
分子内に元来ＳＨ基を有するか、ジスルフィド結合の還
元により生じたＳｌ＋基を有するものか、あるいは、新
たに導入されたＳＨ基を有するものであリ、例えば蛋白
質、糖蛋白質、天然及び合成ペプチド、天然及び合成重
合体等の高分子物質、及び例えばＳＨ基を有する低分子
化合物を広く意味する。

前記一般式ＣＩ）で示される本発明の化合物はλ （但し式中Ｘは−０００−１−ＣＯＮＨ，又は水素原子
であり、ｎは１〜１０の整数を表わす）をｄ−ビオチニ
ル−Ｎ−ハイドロキシスクシンイミドエステル（ｍ）と
反応させることにより得ることができる。

上記の反応は、適当な溶媒の存在下で一般式（＋１）と
（ｍ）を接触させることにより容易に遂行される。

なお、上記原料化合物である式（ｎ）の化合物は、例え
ば次式で示されるＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−５−３
−ニトロ−２−ピリジルスルフェニルシスティンを、（
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＮＰＹＳ）として市販）しｆ１３リ　
　　しりすｈ 例えば酸で処理することによって容易に得られ。

例えば式（ＩＩ　）　（Ｘ　＝　Ｃ００Ｈ）の化合物が
得られるのである。

上記した化合物（ｎ）と（ＩＩＩ）の反応において、使
用される溶媒としては、本反応に悪影響を与えないもの
であれば特に限度はない。そのような溶媒の好適な例と
しては、ジメチルホルムアミド、テトラハイドロフラン
、ジメチルスルホキシド等があげられる。ｄ−ビオチニ
ル−Ｎ−ハイドロキシスクシンイミドエステル（ｍ）の
反応当量は、化学的理論量でよいが１反応を速やかに進
行させて目的化合物の収率を高めるために過剰量を使用
するのが好ましく、アミン成分（■）１モルに約１．２
ないし１．５モル程度の使用が好ましい、また、反応を
より早くすすめるために、触媒として）ＩＯＢＴ　（Ｎ
−ハイドロキシベンゾトリアゾール）を約０．１当量加
えてもよい０反応温度に特に限定はないが、副反応を抑
えて目的化合物の収率を高めるためには比較的低温で反
応を行うのが好ましく、通常約０℃ないし室温で行なわ
れる０反応に要する時間は、アミン成分、溶媒の種類の
反応温度によっても異なるが１〜２日で反応は完結する
。

反応終了後、前記一般式（Ｉ）を有する本発明の化合物
は、常法によって、反応混合物から採取される。例えば
反応混合物を濾過し、濾液より溶媒を減圧留去し、残渣
を有機溶媒で洗滌した後、水に溶かし、ゲル濾過で精製
することにより高純度のものが得られる。

次に、ＳＨ基を有する物質への本発明の化合物の導入、
つまりビオチニル化は、両者を適当な溶媒の存在下に接
触することにより容易に遂行される。

使用される溶媒としては、本反応に悪影響を与えないも
のであれば特に制限はない。本反応は、ＳＨ基を有する
物質の性質により水性溶媒中でも有機溶媒中でも行なえ
るが、溶媒の好適な例としては、水性溶媒であれば種々
のａ衝液、有機溶媒であればジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド、テトラハイドロフラン等があげら
れる。

水性溶媒のｐＨは特に限定しないが、好適な例としては
４〜９の範囲がよい。

一般式（１）のＳｌｌ基に対する反応当量は化学的理論
量でよいが、反応を速やかに進行させ目的物の収率を高
めるために過剰量を使用するのが好ましく、ＳＨ基１モ
ルに対し約１．２ないし１０モル程度の使用が好ましい
。反応温度に特に限定はないが、副反応を抑えて目的物
の収率を高めるためには、比較的低温で反応を行うのが
好ましく通常約ｏ℃ないし室温で行なわれる。反応に要
する時間はＳ１１基を有する物質や溶媒の種類、反応温
度によっても異なるが数分〜数時間で完結する。

反応終了後、ビオチニル化された物質は、常法によって
反応混合物から採取される。例えば１反応液をそのまま
カラムにかけ分離することにより高純度のものが得られ
る。

このようにしてビオチニル化された物質は、アビジン−
ビオチンシステムにより各種の用途に広範に使用するこ
とができる。

以下、実施例及び応用例により本発明をより詳しく説明
するが本発明はこれに限定されるものではない。

実施例Ｉ Ｎ−ｄ−ビオチニル−５−３−二トロー２−ピリジルス
ルフェニル−Ｌ−システィンＮａ塩 Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−５−３−二トロー２−ピ
リジルスルフェニル−Ｌ−システィン４１３＋ａｇを、
アニソール３６０μＱの存在下０℃でトリフルオロ酢酸
２ｍＱを加え、攪拌する。９０分後、室温でトリフルオ
ロ酢酸を減圧留去し、油状物を得る。これを、水冷下、
ジメチルホルムミド１０ｍＱに溶かし、攪拌下トリエチ
ルアミンを加えて中和し、更に１当量のトリエチルアミ
ンを加える。

アミン成分が析出するが、そのままｄ−ビオチニル−Ｎ
−ハイドロキシスクシンイミドエステル３４０ｍｇを加
えて攪拌する１反応が進むに従い、アミン成分は徐々に
溶ける。７２時間攪拌後、微量の不溶物を濾去し、溶媒
を減圧留去後、残渣を水に溶かし、酢酸エチルで洗浄す
る。水層をＮａ、ＧＯ，でｐＨ８にし、水を溶出液とす
るセファデックスＧ−１５カラムでゲル濾過し、目的物
の両分を分収し、凍結乾燥することにより目的化合物が
黄色毛羽状粉末として７０％の収量で得られる。

融点　１３２〜１３３℃（ｄｅｃ、） Ｒｆ　　　Ｏ，３１（ＣＨＣＩ２３：　ＭｅＯＨ：　Ａ
ｃ０Ｈ＝９　：　１　：　０．５）紫外吸収スペクトル ＵＶ桿ｎｍ（［）　：　３５２（２７０ｇ）　、　２７
２（５９４０）、　２２７（１０９２０）実施例２ Ｎ−ｄ−ビオチニル−３−３−ニトロ−２−ピリジルス
ルフェニル−Ｌ−システィンＮａ塩による補体第一成分
Ｃ１ｑのビオチニル化 補体第一成分Ｃ１ｑは、分子量約４０万の糖蛋白質であ
り、補体結合性抗原抗体複合体に特異的に結合する性質
を有する。　Ｃ１ｑは、その分子内のアミノ基を修飾す
ると失活する。そこでＣｌｑ分子内にあるジスルフィド
結合を還元することにより生成したＳＨ基のビオチニル
化を行った。

Ｃ１ｑ　２　ｍｇを含む、０．０５Ｍトリス（ヒドロキ
シアミノメチル）アミノメタン、１Ｍ塩化ナトリウム、
０．００５ＥＤＴＡ、１０％スクロースの水溶液（ｐＨ
７，４）　１　ｒｍＱに、　０．１Ｍジチオスレイトー
ル１０μＱを加え、室温下、６０分間ゆるやかに攪拌し
、反応液をセファデックスＧ−２５カラムに通し、蛋白
質画分を回収する。

この蛋白質画分を、限界濾過で約１．５−まで濃縮し、
これを、水冷下、ゆるやかに攪拌しながら、２５μｇの
実施例１で得たＮ−ｄ−ビオチニル−５−３−二トロー
２−ピリジルスルフェニル−し−システィンＮａ塩を加
える。４℃でそのまま１０分間攪拌する。反応の終了を
ＵＶ３５２ｎｍにおける吸収の消失により確認後、セフ
ァデックスＧ−２５カラムに通し、蛋白質画分４ｍｍを
（ＯＤ、０．２０１）回収することによりビオチニル化
標識Ｃ１ｑが得られる。

応用例１ 合成したビオチニルＣ１（ＩのＥＬＩＳＡ系への応用ウ
シ血清アルブミンを２０μｇ／ＩＩＩＱの濃度で燐酸緩
衝液食塩液に溶解し、９６六マイクロタイタープレート
に２００μΩづつ分注し、室温で２時間保持しウェルに
吸着させた。

遊離のウシ血清アルブミンを除いた後、ゼラチン・ベロ
ナール緩衝液を分注し、室温で３時間保持した。これを
除いた後に、ウサギ抗ウシ血清アルブミン抗血清（ゼラ
チン・ベロナール緩衝液で１００〜３２００倍に段階希
釈）５０μＱおよびビオチニルＣ１９（ゼラチン・ベロ
ナール緩衝液で５０倍希釈）５０μＱを加え、室温６０
分静置した。

各ウェルを洗浄後、これにアビジン−パーオキシダーゼ
（ＰＢＳで２００倍希釈）　５０μＱを加え、室温で３
０分静置し、上で述べたように洗浄した各ウェルにパー
オキシダーゼの基質であるＡＢＴＳ（２，２’−アジノ
ジ（３−エチルベンズチアゾリン）−６フースルボン酸
）／Ｈ，０，１００μＱを加え、３０分間発色させて４
１４ｎｍの吸収を測ることにより、抗ウシ血清アルブミ
ン抗血清の濃度に相関した吸光度がＯ，Ｄ、１．７９３
〜０．０６０の値で得られた。

（発明の効果） 本発明のビオチニル試薬は、従来のビオチニル化試薬と
異なり各種生理活性物質を特異的に且つ安定にビオチニ
ル化することが出来るものである。

そして特にアビジンとの相互作用によって、免疫分析、
酵素免疫分析、その他のバイオアッセイ、各種化学分析
が好適に実施できるのみでなく、各種生理活性物質の分
離精製もきわめて容易にできる。

したがって本発明は、バイオテクノロジー、医療、生化
学、診断、検査、分析といった広い技術分野で重要な役
割を果すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （但し式中Ｘは−ＣＯＯ＾−、−ＣＯＮＨ＿２又は水素
   原子であり、ｎは１〜１０の整数を表わす） で示される化合物からなるビオチニル化試薬。 ２、次の式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中Ｘは−ＣＯＯ＾−、−ＣＯＮＨ＿２又は水素原子
   であり、ｎは１〜１０の整数で表わす） で示される化合物からなるビオチニル化試薬とＳＨ基を
   有する物質あるいは前もって還元またはＳＨ基導入によ
   りＳＨ基を生じさせた物質とを反応させ、該物質をビオ
   チニル化することを特徴とするビオチニル化法。