WO2022224968A1 - ポリスルフィド標識用アルキル化剤及びそれを用いたポリスルフィドの標識方法 - Google Patents

ポリスルフィド標識用アルキル化剤及びそれを用いたポリスルフィドの標識方法 Download PDF

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polysulfide
labeling
alkylating agent
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啓太郎 梅澤
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地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/18—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode

Definitions

  • the present invention relates to an alkylating agent for labeling polysulfides and a method for labeling polysulfides using the same. According to the present invention, polysulfide structures can be accurately labeled and detected.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a method of modifying a thiol group with, for example, iodoacetamide (IAM) or ⁇ -(4-hydroxyphenyl)ethyliodoacetamide (HPE-IAM) and detecting by mass spectrometry is known.
  • IAM iodoacetamide
  • HPE-IAM ⁇ -(4-hydroxyphenyl)ethyliodoacetamide
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having a substituent and having 1 to 6 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, A substituted cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a substituted alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and R 1 and R 2 are R 1 and R having a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms together with the carbon atom to which 2 is bonded, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms having a substituent, an aryl group having 6 to 12 carbon atoms, and a substituent an aryl group having 6 to 12 carbon atoms, a 3- to 7-membered heterocyclic group, or a 3- to 7-membere
  • the alkylating agents are highly reactive and sufficiently react with thiol groups that do not contain polysulfides, making identification difficult. It is believed that this is because it becomes difficult, or because there is a possibility of decomposing the (S)n structure of the reduced polysulfide structure (-(S)n-SH). It is believed that the alkylating agent for labeling polysulfides of the present invention can sufficiently label polysulfides by suppressing decomposition of the polysulfide structure while suppressing reaction with thiol groups that do not contain polysulfides.
  • polysulfides can be labeled and detected more efficiently than conventional alkylating agents.
  • detection of polysulfides can contribute to elucidation of pathological mechanisms related to polysulfide proteins, and various biochemical studies such as oxidative stress studies and signal transduction studies.
  • FIG. Figure 10 is a mass spectrometric profile of NECFLQHK, the 99th-106th peptide of HSA.
  • the polysulfide-labeling alkylating agent of the present invention has a functional group suitable for labeling a polysulfide structure.
  • the polysulfide labeling functional group is a group capable of labeling a polysulfide group while suppressing reaction with a thiol group that does not contain polysulfide, and is a group capable of labeling the (S)n structure of the polysulfide structure (-(S)n-SH). It is a group that suppresses excessive decomposition.
  • the polysulfide-labeling alkylating agent can efficiently label polysulfides and detect polysulfides.
  • the polysulfide labeling functional group of the present invention has the following formula (1): is a group represented by The functional group for polysulfide labeling of the present invention is, but not limited to, for reduced polysulfide labeling or for oxidized polysulfide labeling.
  • R 1 and R 2 are not limited as long as they do not have a functional group having higher reactivity with the polysulfide structure than X.
  • R 1 and R 2 are, for example, each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms having a substituent, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, a substituent A cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms having a substituent.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, normal propyl group, isopropyl group, normal butyl group, isobutyl group, secondary butyl group, tertiary butyl group and normal pentyl group. , isopentyl, neopentyl, tertiary pentyl, normal-hexyl, and isohexyl groups.
  • a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms is preferably a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms.
  • cycloalkyl groups having 3 to 7 carbon atoms include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl groups.
  • the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is preferably an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a linear alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Examples of alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms include methoxy, ethoxy, normal propoxy, isopropoxy, normal butoxy, isobutoxy, secondary butoxy, tertiary butoxy, and normal pentyl.
  • An oxy group, an isopentyloxy group, a neopentyloxy group, a normalhexyloxy group, or an isohexyloxy group can be mentioned.
  • substituents examples include, but are not limited to, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 12 carbon atoms.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and the cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms are as described above.
  • the aryl group having 6 to 12 carbon atoms includes a phenyl group and a naphthyl group.
  • the substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, the substituted cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, or the substituted alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, the hydrogen atom of each group is is a group substituted by a substituent.
  • the number of carbon atoms of 1 to 6 in the "substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms" does not include the number of carbon atoms of the substituent.
  • the substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably a substituted alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and having a substituent. is.
  • substituted alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms include branched alkyl groups, cycloalkylalkyl groups, and arylalkyl groups.
  • the substituted cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms is preferably a substituted cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms.
  • the substituted cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms specifically includes an alkylcycloalkyl group or a saturated or unsaturated polycyclic hydrocarbon group.
  • the substituted alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is preferably a substituted alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a linear alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms having a substituent. is.
  • the substituted alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms specifically includes an alkylalkoxy group, a cycloalkylalkoxy group, or an arylalkoxy group.
  • R 1 and R 2 are, for example, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms together with the carbon atom to which R 1 and R 2 are bonded, a substituted cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, It may be an aryl group having 6 to 12 carbon atoms having a substituent, a 3- to 7-membered heterocyclic group, or a 3- to 7-membered heterocyclic group having a substituent.
  • the cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms is preferably a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms, more preferably a cycloalkyl group having 4 or 5 carbon atoms.
  • cycloalkyl groups having 3 to 7 carbon atoms include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl groups.
  • substituents include, but are not limited to, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 12 carbon atoms.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and the cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms are as described above.
  • the aryl group having 6 to 12 carbon atoms includes a phenyl group and a naphthyl group.
  • the substituted cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms is preferably a substituted cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms, more preferably a substituted cycloalkyl group having 4 or 5 carbon atoms. be.
  • the substituted cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms specifically includes an alkylcycloalkyl group or a saturated or unsaturated polycyclic hydrocarbon group.
  • the 3- to 7-membered heterocyclic group is not particularly limited, it is preferably a 3- to 6-membered heterocyclic ring.
  • a heteroatom contained in the heterocyclic ring includes an oxygen atom (O), a nitrogen atom (N), or a sulfur atom (S).
  • the number of heteroatoms contained in the heterocyclic ring is also not limited, but the upper limit is preferably 4 or less, more preferably 3 or less, and still more preferably 2 or less.
  • the heterocyclic group may be a saturated heterocyclic group or an unsaturated heterocyclic group.
  • 3- to 7-membered heterocyclic ring examples include oxetane, oxetene, pyrrolidine, pyrrole, tetrahydrofuran, tetrahydrothiophene, imidazolidine, oxazolidine, dioxolane, piperidine, tetrahydropyran, pyran, thiane, thiopyran, morpholine, oxazine, Dioxane, dioxin, azepan, oxepane, thiepan.
  • X is a halogen atom, a methanesulfonyloxy group ( OSO2CH3 ), a trifluoromethanesulfonyloxy group ( OSO2CF3 ), or a paratoluenesulfonyloxy group ( OSO2C6H4CH3 ) , preferably It is a halogen atom.
  • a halogen atom includes a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, preferably a chlorine atom or a bromine atom.
  • X is a halogen atom other than an iodine atom, a methanesulfonyloxy group, a trifluoromethanesulfonyloxy group, or a p-toluenesulfonyloxy group, preferably a halogen atom other than an iodine atom , a methanesulfonyloxy group, or a p-toluenesulfonyloxy group, and more preferably a halogen atom other than an iodine atom.
  • the compound containing a polysulfide labeling functional group of the present invention has, for example, the following formula (2): (R 1 , R 2 and X are the same as in formula (1)) is represented by R 3 is not limited as long as it does not have a functional group having higher reactivity with the polysulfide structure than X. Also, since R 3 is separated from X, which is a reactive group with polysulfide, it hardly affects the reaction between the functional group of the present invention and the polysulfide structure.
  • heteroatoms include sulfur, oxygen, or nitrogen atoms.
  • the number of heteroatoms contained in R 3 is not limited, but the sulfur atom, oxygen atom, or nitrogen atom is each independently 0 to 20, preferably 0 to 10, more preferably 0-5.
  • a group containing biotin can be used as the group for R 3 . Since biotin has a high affinity with avidin, for example, by using avidin beads, only a substance containing a biotin structure in a contaminant sample is bound to the avidin beads, and by releasing this, a compound containing a biotin structure is obtained. can be used in various analyses, in a purified state. That is, by using a group containing biotin as the group of R3 , it becomes possible to purify a protein containing a polysulfide structure or a peptide digest thereof, thereby improving analytical sensitivity.
  • a group containing an alkynyl group can be used as the group for R 3 .
  • An alkynyl group and an azide group for example, undergo a triazole cyclization reaction (Huisgen cycloaddition reaction or click chemistry) in the presence of a copper catalyst to bond. Therefore, any compound containing an azide group can be easily attached. That is, by using a group containing an alkynyl group as the group for R3 , various substances can be attached to the alkylating agent.
  • a group containing a stable isotope can also be used as the group for R3 .
  • tag pairs with the same molecular structure as stable isotope-free labeling reagents (light elements) but with different mass numbers can be prepared.
  • a heavy element is used as the stable isotope element, and specific examples thereof include 2 H, 13 C, 15 N, 18 O, and 34 S, but are not limited thereto.
  • the alkylating agents of the present invention may also include salts of said compounds.
  • Specific salts include salts with inorganic bases, organic bases, or metal alkoxides. Salts can be formed by mixing the compounds with inorganic bases, organic bases, or metal alkoxides.
  • Inorganic bases capable of forming salts include hydroxides, carbonates, hydrogen carbonates, acetates or hydrides of alkali metals (e.g. lithium, sodium or potassium); alkaline earth metals (e.g. magnesium , calcium, or barium) hydroxides or hydrides.
  • organic bases capable of forming salts include dimethylamine, triethylamine, piperazine, pyrrolidine, piperidine, 2-phenylethylamine, benzylamine, ethanolamine, diethanolamine, pyridine, and collidine;
  • metal alkoxides include sodium methoxide and potassium. tert-butoxide, magnesium methoxide, and the like.
  • the alkylating agent of the present invention can modify the thiol group (-SH group) of the reduced polysulfide structure ( R4- (S)n-SH) of proteins and the like.
  • X of the polysulfide-labeling functional group of the present invention and the hydrogen atom of the thiol group are eliminated as HX, and the thiol group is modified with an alkylating agent.
  • Specific reduced polysulfides include hydrodisulfide (hydropersulfide: R 4 -S—S—H), hydrotrisulfide (R 4 —S—S—S—H), or hydrotetrasulfide (R 4 - S—S—S—H) and the like.
  • the alkylating agent of the present invention can modify the polysulfide site (-(S)n-) of the oxidized polysulfide structure ( R4 -S-(S)n - S-R5) of proteins and the like.
  • Specific oxidized polysulfides include trisulfide (R 4 -SSSR 5 ), tetrasulfide (R 4 -SSSSR 5 ), and the like.
  • the mechanism by which the alkylating agent of the present invention can label polysulfides more efficiently than conventional alkylating agents has not been elucidated in detail, but can be presumed as follows. However, the present invention is not limited by the following assumptions.
  • the group X in the present invention is a group that participates in the reaction of bonding with a thiol group. In the traditional alkylating agents iodoacetamide (IAM) or ⁇ -(4-hydroxyphenyl)ethyliodoacetamide (HPE-IAM), this X is iodine (I).
  • a thiol group containing a polysulfide structure (R 4 -(S)n-SH) has a pK a that is the negative common logarithm of the acid dissociation constant than a thiol group not containing a polysulfide (R 4 -SH). Since it is low, R 4 -(S)n-SH is more reactive.
  • alkylating agents in which X is iodine (I) and R 1 and R 2 are hydrogen are known to inherently have high reactivity to R 4 —SH, and regardless of the presence or absence of polysulfide groups, alkylating agents to thiol groups are known to be highly reactive.
  • R 1 and R 2 are groups located close to X, although they are not directly involved in the reaction with the thiol group.
  • R 1 and R 2 are hydrogen atoms (H). Since the hydrogen atom has a small molecular weight, it does not hinder the reaction between R 4 —SH and X as a steric structure, and exhibits high reactivity with R 4 —SH.
  • R 1 and R 2 are groups located close to X, although they are not directly involved in the reaction with the thiol group.
  • R 1 and R 2 are hydrogen atoms (H). Since the hydrogen atom has a small molecular weight, it does not hinder the reaction between the thiol group and X as a steric structure. It is presumed that the reactivity between the thiol group and X can be suppressed by substituting this hydrogen atom (H) with a group having a large molecular weight to cause steric hindrance. Since R 3 is distant from X, it hardly affects the reaction between the thiol group and X.
  • X is a group that reacts with a hydrogen atom of a thiol group and leaves as XH, such as a halogen atom.
  • a methanesulfonyloxy group, a trifluoromethanesulfonyloxy group, and a p-toluenesulfonyloxy group also have the property of reacting with a hydrogen atom and leaving as XH based on the same reaction mechanism as the halogen atom.
  • the method for labeling polysulfides of the present invention includes the step of contacting polysulfides with the alkylating agent of the present invention.
  • Polysulfides labeled by the labeling method of the present invention include, for example, a reduced thiol group (R 4 -(S)n-SH) having a polysulfide structure shown in FIG. 1B and an oxidized polysulfide structure (R 4 -S-( S) nSR 5 ).
  • H in the thiol group reacts with X in the alkylating agent (XZ) of the present invention to form HX and leave to modify the thiol group (R 4 -(S)nSZ).
  • Cysteine residues in conventional proteins were thought to be thiol groups with only one sulfur atom, as shown by the reduced thiol group (Cys-SH) in FIG. 1A.
  • Cys-SH reduced thiol group
  • the alkylating agent of the present invention also reacts with polysulfide contained in the oxidized cysteine-forming site, and X of the alkylating agent (XZ) is eliminated and reacted to form R 4 —(S)n—S— Presumably labeled as Z or R 5 -(S)nSZ.
  • conventional alkylating agents have high reactivity and sometimes excessively decompose the -(S)n- structure of a persulfide structure or a trisulfide structure.
  • polysulfides can be efficiently labeled by using an alkylating agent that suppresses excessive reaction.
  • the reaction temperature in the polysulfide labeling method of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 4 to 37°C, preferably 25 to 37°C.
  • the reaction time in the polysulfide labeling method of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 30 minutes to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
  • the buffer used in the polysulfide labeling method of the present invention is not particularly limited as long as the labeling reaction proceeds. A liquid can be used.
  • Substances to be labeled by the polysulfide labeling method of the present invention are not particularly limited as long as they are substances having polysulfides, but examples thereof include proteins and peptide hormones.
  • Specific specimens are not limited as long as they contain substances having polysulfides, but cells, cell extracts, cell supernatants, biopsy specimens, organ extracts, blood, plasma, serum, saliva , cerebrospinal fluid, semen, or urine.
  • the method for detecting polysulfides of the present invention includes the step of analyzing, by mass spectrometry, a protein containing polysulfides labeled by the method for labeling polysulfides.
  • mass spectrometry method mass spectrometry methods commonly used in this field can be used, except that a specimen labeled by a polysulfide labeling method is used.
  • proteins containing labeled polysulfides are digested with an enzyme (eg, trypsin, endoproteinase Glu-C, Lys-C, pepsin, chymotrypsin, or clostripain). The digested proteins are analyzed by mass spectrometry.
  • alkylating agent 1 in which R 1 and R 2 are hydrogen atoms and X is chlorine atom (Cl) was produced.
  • chloroacetic acid 105 mg, 1.13 mmol
  • tyramine 151 mg, 1.10 mmol
  • N,N,N',N'-tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium tetrafluoroborate 350 mg, 11.6 mmol
  • alkylating agent 2 was produced in which R 1 is a hydrogen atom, R 2 is a methyl group, and X is a bromine atom (Br).
  • 2-bromopropionic acid 100 mg, 0.66 mmol
  • tyramine 100 mg, 0.72 mmol
  • propylphosphonic anhydride 50% ethyl acetate solution, 500 ⁇ L
  • N,N-dimethylformamide 2 mL
  • N,N-diisopropylethylamine (172 ⁇ L) and 4-dimethylaminopyridine (22 mg) were added and stirred at room temperature for 2 hours.
  • the collected ethyl acetate layer was washed twice with water and once with saturated brine, dried over sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Alkylating agents having polysulfide-labeling functional groups shown in the table below can be produced by using a method similar to the above method and a reaction material corresponding to the desired product.
  • alkylating agents having polysulfide-labeling functional groups listed in the table below can be produced.
  • HSA polysulfidated HSA
  • 2 mL microtube was dissolved by adding ultrapure water (100 ⁇ L).
  • 2 ⁇ L of a 150 mM sodium disulfide aqueous solution prepared in advance was added thereto, and reacted at 37° C. for 1 hour.
  • This solution was purified using a PD SpinTrap G-25 column (manufactured by Cytiva) according to the protocol recommended by the company to remove excess sodium disulfide and eluted with ultrapure water.
  • Ultrapure water was further added to this eluate to prepare 500 ⁇ L, and ultrafiltration was performed using an Amicon Ultra-0.5 mL centrifugal filter (molecular weight cutoff: 3 kDa, manufactured by Merck Millipore) using a centrifuge ( 14,000 ⁇ g, 30 minutes), ultrapure water was added to the concentrate to make 500 ⁇ L, and the ultrafiltration operation was repeated once more to obtain polysulfidated HSA.
  • the peptide fraction eluted from the chip with 80% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution was dried with a centrifugal concentrator. This was used as a sample for mass spectrometric measurement.
  • NanoESI was used as the ion source of the mass spectrometer, and ionization was performed at a spray voltage of 2.00 kV, a capillary temperature of 275°C, and an S-lens RF level of 50.0V.
  • MS scan range was set to m/z 350-1500
  • AGC automatic gain control
  • target was set to 3 ⁇ 10 6 charges
  • MS data was acquired in positive mode
  • NCE Normalized Collision Energy
  • AGC automatic gain control
  • the MS/MS data were obtained with a target of 1 ⁇ 10 5 Charges.
  • the acquired data was analyzed with PEAKSXPro (Infocom) or Proteome Discoverer 2.4 SP1 (Thermo Fisher Scientific).
  • Peptides (-SZ, -SSZ, -SSSZ) are shown in Table 10.
  • Example 1>> alkylating agent 1 obtained in Production Example 1 was used as the alkylating agent, and polysulfides in polysulfidated human serum albumin (HSA) were analyzed.
  • HSA human serum albumin
  • the procedure of Comparative Example 1 was repeated except that alkylating agent 1 was used instead of HPE-IAM to analyze the polysulfides of polysulfidated HSA. Table 10 shows the results.
  • Example 2>> alkylating agent 2 obtained in Production Example 2 was used as the alkylating agent, and polysulfides in polysulfidated human serum albumin (HSA) were analyzed.
  • HSA human serum albumin
  • the procedure of Comparative Example 1 was repeated except that alkylating agent 2 was used instead of HPE-IAM to analyze the polysulfides of polysulfidated HSA. Table 10 shows the results.
  • Example 3>> alkylating agent 3 obtained in Production Example 3 was used as the alkylating agent, and polysulfides in polysulfidated human serum albumin (HSA) were analyzed.
  • HSA human serum albumin
  • the procedure of Comparative Example 1 was repeated except that alkylating agent 3 was used instead of HPE-IAM to analyze the polysulfides of polysulfidated HSA. Table 10 shows the results.
  • FIG. 3 shows examples of peptides identified by mass spectrometry.
  • NECFLQHK which is the 99th-106th peptide of HSA, it was confirmed that alkylating agent 1 is labeled at the 101st polysulfidated cysteine residue.
  • a biotinylated alkylating agent containing a biotin residue represented by the following formula (4) was produced.
  • a biotinylated alkylating agent was produced according to the following reaction scheme.
  • Biotin-PEG3-azide (103 mg) was added to a 30 mL flask and dissolved in methanol (10 mL). Vacuum degassing and argon replacement were performed, a catalytic amount of palladium carbon was added, vacuum degassing and hydrogen gas replacement were performed, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction solution was filtered through celite, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain the target compound. (97.0 mg, 98.1%)
  • the biotinylated alkylating agent obtained in Production Example 4 was used to analyze polysulfides in human plasma proteins.
  • the human plasma sample and the albumin/IgG-removed sample were each subjected to protein precipitation using ProteoExtract (registered trademark) Protein Precipitation Kit (Merck Millipore) according to the company's recommended protocol.
  • the precipitated protein was redissolved using 20 mM sodium acetate aqueous solution (pH 5.5, 6 M urea, containing 0.1% RapiGest (Waters)), and the protein concentration was measured.
  • plasma proteins Analysis results using plasma proteins are shown below.
  • 63 proteins were identified to contain persulfide moieties, of which 7 proteins contained trisulfide structures. That is, it was possible to enrich the polysulfide structure using a biotinylated alkylating agent, which improved the detection sensitivity of polysulfides.
  • a comparative alkylating agent 1 was produced in which R 1 and R 2 in the following formula (6) are hydrogen atoms, X is an iodine atom (I), and R 3 is an alkynyl group.
  • Iodoacetic acid 145 mg, 0.78 mmol
  • propargylamine 43 mg, 0.47 mmol
  • N,N-dimethylformamide 1.5 mL
  • alkylating agent 7 was produced in which R 1 in the following formula (8) is a hydrogen atom, R 2 is a methyl group, X is a bromine atom (Br), and R 3 is an alkynyl group.
  • 2-Bromopropionic acid (119 mg, 0.78 mmol) and propargylamine (43 mg, 0.47 mmol) were added to a 10 mL eggplant flask, dissolved in N,N-dimethylformamide (1 mL), and stirred at room temperature.
  • N,N-diisopropylethylamine (200 ⁇ L) and COMU (366 mg, 0.86 mmol) were added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • R 1 in the following formula (9) is a hydrogen atom
  • R 2 is a methyl group
  • X is a bromine atom (Br)
  • R 3 is an alkylating agent containing stable isotopes of carbon and nitrogen and an alkynyl group. 8 was produced.
  • elements marked with an asterisk correspond to stable isotopes of carbon and nitrogen ( 13 C and 15 N), respectively.
  • the alkylating agent 8 was prepared according to the following reaction scheme.
  • H-Phe-alkyne ( 13 C 9 , 15 N) (13.6 mg, 0.064 mmol) and Tetramethyl-O-(N-succinimidyl) uronium tetrafluoroborate (38.6 mg, 0.128 mmol) were added to a 10 mL eggplant flask.
  • a compound of the following formula (13) was synthesized. After adding L-phenylalanine-N-FMOC (30.4 mg, 0.078 mmol) and Tetramethyl-O-(N-succinimidyl) uronium tetrafluoroborate (35.3 mg, 0.117 mmol) to a 10 mL eggplant flask and drying well , N,N-dimethylformamide (300 ⁇ L), propargylamine (8.6 mg, 0.47 mmol) and N,N-diisopropylethylamine (30 ⁇ L) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • H-Phe-alkyne (9.5 mg, 0.047 mmol) and Tetramethyl-O-(N-succinimidyl) uronium tetrafluoroborate (30.0 mg, 0.100 mmol) were added to a 10 mL eggplant flask, dried well, and then N , N-dimethylformamide (200 ⁇ L), (R)-(+)-2-bromopropionic acid (14.3 mg, 0.094 mmol), N,N-diisopropylethylamine (20 ⁇ L) were added, and the mixture was stirred at room temperature. Stirred for 2.5 hours.
  • alkylating agents 5 to 9 and comparative alkylating agent 1 were used to analyze polysulfides in human plasma proteins (HSA). 10 ⁇ g of polysulfidated HSA was added to a 0.5 mL microtube, and 3.6 ⁇ L of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 6 M urea was added for dilution.
  • alkylating agents in which R 2 is an ethyl group also detect polysulfides such as persulfides (-SSZ) and trisulfides (-SSSZ). rate improved. Furthermore, in compounds containing an alkynyl group at R 3 , persulfide (—S—S—Z) and trisulfide (—S—S—Z) were obtained by substituting X from iodine atom (I) to chlorine atom (Cl) (Example 9). -SSSZ) was improved.
  • the polysulfide detection rate was also improved by substituting a methyl group for R 2 from a hydrogen atom and substituting a bromine atom (Br) for X from an iodine atom (I) (Example 10). Furthermore, when comparing Examples 10, 11, and 12, it was found that even in compounds containing an alkynyl group and a stable isotope, if the structures of X and R 1 were the same, there was no significant difference in the polysulfide detection rate. .
  • Example 16>> Biotinylation and Tryptic Digestion of Human Plasma Proteins
  • the human plasma sample and the albumin/IgG-removed sample were each subjected to protein precipitation using ProteoExtract (registered trademark) Protein Precipitation Kit (Merck Millipore) according to the company's recommended protocol.
  • the precipitated protein was redissolved using 20 mM sodium acetate aqueous solution (pH 6.0, 6 M urea) and the protein concentration was measured.
  • the reaction solution was diluted with 490 ⁇ L of 30% acetonitrile/0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution, and after adding 1 ⁇ L of 50% trifluoroacetic acid aqueous solution, using a cation exchange column (Monospin (registered trademark) SCX, GL Sciences), It was purified according to the company's recommended protocol to remove unreacted alkylating agents and biotin compounds.
  • a cation exchange column Monospin (registered trademark) SCX, GL Sciences
  • Peptides were eluted with 100 ⁇ L each of 500 mM ammonium acetate aqueous solution (30% acetonitrile 4% trifluoroacetic acid) and 500 mM ammonium acetate aqueous solution (30% acetonitrile), dried with a centrifugal concentrator, and used as a sample for avidin purification. .
  • the beads were recovered by centrifugation, and after removing the supernatant, the beads were washed three times with PBS (2.5% acetonitrile) and twice with ultrapure water.
  • the beads were suspended in 50 ⁇ L of 50 mM Tris-hydrochloric acid aqueous solution (2.5% acetonitrile, pH 7.5), irradiated with ultraviolet rays (365 nm) for 1 hour, the suspension after irradiation was filtered, and the filtrate was used for peptide desalting. ⁇ Desalted using a concentration tip (GL-Tip SDB, manufactured by GL Sciences), and dried the peptide fraction eluted from the tip with 80% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution with a centrifugal concentrator. Then, the dried product was dissolved in 2% acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution, and this was used as a sample for mass spectrometric
  • the alkylating agent of the present invention can be used to detect the polysulfide structure of polysulfide proteins.

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Abstract

本発明の目的は、（Ｓ）ｎ構造を有するポリスルフィドを効率的に標識するアルキル化剤を提供することである。　前記課題は、本発明の下記式（１）：（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基、置換基を有する炭素数１～６のアルキル基、炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換基を有する炭素数１～６のアルコキシ基であり、Ｒ１及びＲ２は、Ｒ１及びＲ２が結合している炭素原子と一緒になって炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、炭素数６～１２のアリール基、置換基を有する炭素数６～１２のアリール基、３～７員の複素環基、又は置換基を有する３～７員の複素環基であり、Ｘは、ハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基であり、Ｒ１及びＲ２がいずれも水素原子の場合、Ｘはヨウ素原子以外のハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基である）で表されるポリスルフィド標識用官能基によって解決することができる。

Description

ポリスルフィド標識用アルキル化剤及びそれを用いたポリスルフィドの標識方法
　本発明は、ポリスルフィド標識用アルキル化剤及びそれを用いたポリスルフィドの標識方法に関する。本発明によれば、ポリスルフィド構造を正確に標識および検出することができる。
　近年、硫黄原子が連結したパースルフィド、トリスルフィド、又はテトラスルフィドなどのポリスルフィド構造を含む分子種が、生体内に多く存在していることが明らかになっている。例えば、チオール（－ＳＨ）基に複数の硫黄原子が付加したポリスルフィド構造（－（Ｓ）ｎ－ＳＨ）を有するシステインやその酸化型構造（－Ｓ－（Ｓ）ｎ－Ｓ－）を含むタンパク質が報告されており、これらのタンパク質は、高い求核性又は抗酸化活性を示すことが報告されている。しかしながら、複雑な化学特性を有するポリスルフィドは、検出が難しいことからその生理機能は十分に解明されていない。
「ネイチャー・コミュニケーションズ（NATURE COMMUNICATIONS）」（英国）２０１７年、第８巻、ｐ１１１７－ 「レドックス・バイオロジー（Redox Biology 21 (2019) 101096）」（日本）２０１９年、第２１巻、ｐ１０１０９６－
　ポリスルフィドの検出方法としては、チオール基を、例えばヨードアセトアミド（ＩＡＭ）又はβ－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ）で修飾して、質量分析により検出する方法が知られている（非特許文献１及び２）。しかしながら、従来のチオール基標識用のアルキル化剤は、十分にポリスルフィドを検出（標識）できなかった。
　従って、本発明の目的は、（Ｓ）ｎ構造を有するポリスルフィドを効率的に標識するアルキル化剤を提供することである。また、（Ｓ）ｎ構造を有するポリスルフィドを効率的に標識するポリスルフィド標識方法及びポリスルフィドの検出方法を提供することである。
　本発明者は、（Ｓ）ｎ構造を有するポリスルフィドを効率的に標識するアルキル化剤について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、アルキル化剤であるヨードアセトアミドを改変することにより、ポリスルフィドを効率的に標識できるアルキル化剤が得られることを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基、置換基を有する炭素数１～６のアルキル基、炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換基を有する炭素数１～６のアルコキシ基であり、Ｒ１及びＲ２は、Ｒ１及びＲ２が結合している炭素原子と一緒になって炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、炭素数６～１２のアリール基、置換基を有する炭素数６～１２のアリール基、３～７員の複素環基、又は置換基を有する３～７員の複素環基であり、Ｘは、ハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基であり、Ｒ１及びＲ２がいずれも水素原子の場合、Ｘはヨウ素原子以外のハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基である）で表されるポリスルフィド標識用官能基、
［２］［１］に記載の官能基を有する化合物又はその塩を含むポリスルフィド標識用アルキル化剤、
［３］ポリスルフィドに、［２］に記載のアルキル化剤を接触させる工程を含む、ポリスルフィドの標識方法、及び
［４］［３］のポリスルフィドの標識方法によって、標識されたポリスルフィドを含むタンパク質を質量分析法で分析する工程を含む、ポリスルフィド構造の検出方法、
に関する。
　本発明者らは、従来のアルキル化剤が、ポリスルフィドを十分に検出（標識）できない理由は、アルキル化剤の反応性が高く、ポリスルフィドを含まないチオール基にも十分反応してしまい、識別が困難となるため、あるいは還元型ポリスルフィド構造（－（Ｓ）ｎ－ＳＨ）の（Ｓ）ｎ構造を分解する可能性があるためであると考えている。本発明のポリスルフィド標識用アルキル化剤は、ポリスルフィドを含まないチオール基との反応を抑制しつつ、ポリスルフィド構造の分解を抑制することによって、ポリスルフィドを十分に標識できると考えられる。
　本発明のポリスルフィド標識用アルキル化剤によれば、従来のアルキル化剤と比較して、効率的にポリスルフィドを標識及び検出することができる。また、ポリスルフィドを検出することによって、ポリスルフィドタンパク質が関係する病態メカニズムの解明、並びに酸化ストレス研究、及びシグナル伝達研究などの様々な生化学研究に貢献することができる。
従来知られていた、システイン残基中のチオール基（還元型）及びジスルフィド結合（酸化型）を示した図（Ａ）、及びポリスルフィド構造を有するチオール基（還元型）及びポリスルフィド結合（酸化型）を示した図（Ｂ）である。 従来のアルキル化剤がパースルフィド構造又はトリスルフィド構造を分解することを示した模式図である。 ＨＳＡの９９－１０６番目のペプチドであるＮＥＣＦＬＱＨＫの質量分析を示したプロファイルである。
［１］ポリスルフィド標識用アルキル化剤
　本発明のポリスルフィド標識用アルキル化剤は、ポリスルフィド構造の標識に適した官能基を有する。前記ポリスルフィド標識用官能基は、ポリスルフィドを含まないチオール基との反応を抑制しつつ、ポリスルフィド基を標識できる基であり、またポリスルフィド構造（－（Ｓ）ｎ－ＳＨ）の（Ｓ）ｎ構造の過剰な分解が抑制される基である。本発明のポリスルフィド標識用官能基を有することにより、ポリスルフィド標識用アルキル化剤は、効率的にポリスルフィドを標識し、そしてポリスルフィドを検出することができる。
《ポリスルフィド標識用官能基》
　本発明のポリスルフィド標識用官能基は、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で表される基である。本発明のポリスルフィド標識用官能基は、限定されるものではないが、還元型ポリスルフィド標識用又は酸化型ポリスルフィド標識用である。
　Ｒ１及びＲ２は、Ｘと比較して、ポリスルフィド構造との反応性が高い官能基を有さない限りにおいて限定されるものではない。
　Ｒ１及びＲ２は、例えば、それぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基、置換基を有する炭素数１～６のアルキル基、炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換基を有する炭素数１～６のアルコキシ基である。
　炭素数１～６のアルキル基は、好ましくは炭素数１～３のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１～３の直鎖状のアルキル基である。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、第三級ブチル基、ノルマルペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、第三級ペンチル基、ノルマルへキシル基、及びイソへキシル基が挙げられる。
　炭素数３～７のシクロアルキル基は、好ましくは炭素数４～６のシクロアルキル基である。炭素数３～７のシクロアルキル基としては、具体的にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、又はシクロヘプチル基が挙げられる。
　炭素数１～６のアルコキシ基は、好ましくは炭素数１～３のアルコキシ基であり、より好ましくは炭素数１～３の直鎖状のアルコキシ基である。炭素数１～６のアルコキシ基としては、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、ノルマルプロポキシ基、イソプロポキシ基、ノルマルブトキシ基、イソブトキシ基、第二級ブトキシ基、第三級ブトキシ基、ノルマルペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ノルマルヘキシルオキシ基、又はイソヘキシルオキシ基が挙げられる。
　前記置換基は、限定されるものではないが、炭素数１～６のアルキル基、炭素数３～７のシクロアルキル基、又は炭素数６～１２のアリール基が挙げられる。炭素数１～６のアルキル基、及び炭素数３～７のシクロアルキル基は、前記の通りである。炭素数６～１２のアリール基としては、フェニル基又はナフチル基が挙げられる。
　前記置換基を有する炭素数１～６のアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、又は置換基を有する炭素数１～６のアルコキシ基は、それぞれの基の水素原子が、置換基に置換された基である。なお、「置換基を有する炭素数１～６のアルキル基」の炭素数１～６には、置換基の炭素数は含まない。
　置換基を有する炭素数１～６のアルキル基は、好ましくは置換基を有する炭素数１～３のアルキル基であり、より好ましくは置換基を有する炭素数１～３の直鎖状のアルキル基である。置換基を有する炭素数１～６のアルキル基としては、具体的には分岐アルキル基、シクロアルキルアルキル基、又はアリールアルキル基が挙げられる。
　置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基は、好ましくは置換基を有する炭素数４～６のシクロアルキル基である。置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基としては、具体的にはアルキルシクロアルキル基、又は飽和又は不飽和の多環式炭化水素基、が挙げられる。
　置換基を有する炭素数１～６のアルコキシ基は、好ましくは置換基を有する炭素数１～３のアルコキシ基であり、より好ましくは置換基を有する炭素数１～３の直鎖状のアルコキシ基である。置換基を有する炭素数１～６のアルコキシ基としては、具体的には、アルキルアルコキシ基、シクロアルキルアルコキシ基、又はアリールアルコキシ基が挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２は、例えば、Ｒ１及びＲ２が結合している炭素原子と一緒になって炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数６～１２のアリール基、３～７員の複素環基、又は置換基を有する３～７員の複素環基であってもよい。
　炭素数３～７のシクロアルキル基は、好ましくは炭素数４～６のシクロアルキル基であり、より好ましくは炭素数４又は５のシクロアルキル基である。炭素数３～７のシクロアルキル基としては、具体的にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、又はシクロヘプチル基が挙げられる。
　前記置換基は、限定されるものではないが、炭素数１～６のアルキル基、炭素数３～７のシクロアルキル基、又は炭素数６～１２のアリール基が挙げられる。炭素数１～６のアルキル基、及び炭素数３～７のシクロアルキル基は、前記の通りである。炭素数６～１２のアリール基としては、フェニル基又はナフチル基が挙げられる。
　置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基は、好ましくは置換基を有する炭素数４～６のシクロアルキル基であり、より好ましくは置換基を有する炭素数４又は５のシクロアルキル基である。置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基としては、具体的にはアルキルシクロアルキル基、又は飽和又は不飽和の多環式炭化水素基が挙げられる。
　３～７員の複素環基は、特に限定されるものではないが、３～６員の複素環が好ましい。複素環に含まれるヘテロ原子としては酸素原子（Ｏ）、窒素原子（Ｎ）、又は硫黄原子（Ｓ）が挙げられる。複素環に含まれるヘテロ原子の数も限定されないが、上限は好ましくは４以下であり、より好ましくは３以下であり、更に好ましくは２以下である。また、複素環基は、飽和の複素環基でもよく、不飽和の複素環基でもよい。３～７員の複素環としては、具体的には、オキセタン、オキセテン、ピロリジン、ピロール、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、イミダゾリジン、オキサゾリジン、ジオキソラン、ピペリジン、テトラヒドロピラン、ピラン、チアン、チオピラン、モルホリン、オキサジン、ジオキサン、ジオキシン、アゼパン、オキセパン、チエパンが挙げられる。
　Ｘは、ハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基（ＯＳＯ２ＣＨ３）、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基（ＯＳＯ２ＣＦ３）、又はパラトルエンスルホニルオキシ基（ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）であり、好ましくはハロゲン原子である。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子が挙げられるが、好ましくは、塩素原子、又は臭素原子である。
　Ｒ１及びＲ２がいずれも水素原子の場合、Ｘはヨウ素原子以外のハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基であり、好ましくはヨウ素原子以外のハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基であり、より好ましくはヨウ素原子以外のハロゲン原子である。
　本発明のポリスルフィド標識用官能基を含む化合物は、例えば下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （Ｒ１、Ｒ２、及びＸは、式（１）と同じである）
で表される。
　Ｒ３は、Ｘと比較して、ポリスルフィド構造との反応性が高い官能基を有さない限りにおいて限定されるものではない。また、Ｒ３は、ポリスルフィドとの反応基であるＸから離れているため、本発明の官能基と、ポリスルフィド構造との反応へほとんど影響を与えない。従って、Ｘと比較して、ポリスルフィド構造との反応性が高い官能基を有さない限りにおいて限定されるものではないが、例えば、炭素数１～１００のヘテロ原子を含むことのある炭化水素基（ヒドロカルビル基）が挙げられる。ヘテロ原子としては、硫黄原子、酸素原子、又は窒素原子が挙げられる。Ｒ３に含まれるヘテロ原子の数は限定されるものではないが、硫黄原子、酸素原子、又は窒素原子はそれぞれ独立して、０～２０であり、好ましくは０～１０であり、より好ましくは０～５である。
　前記Ｒ３の基として、例えばビオチンを含む基を用いることができる。ビオチンは、アビジンと高い親和性を持つため、例えばアビジンビーズを用いることで、夾雑試料の中からビオチン構造を含む物質のみをアビジンビーズに結合させ、これを遊離させることにより、ビオチン構造を含む化合物を精製した状態で様々な分析に用いることができる。すなわち、Ｒ３の基としてビオチンを含む基を用いることによって、ポリスルフィド構造を含むタンパク質やそのペプチド消化物の精製が可能となり、分析感度を向上させることができる。
　前記Ｒ３の基として、例えばアルキニル基を含む基を用いることができる。アルキニル基は、例えばアジド基と、銅触媒存在下でトリアゾール環化反応（ヒュスゲン環化付加反応、又はクリックケミストリー）を起こし、結合する。従って、アジド基を含む任意の化合物を容易に結合させることができる。すなわち、Ｒ３の基としてアルキニル基を含む基を用いることによって、さまざまな物質をアルキル化剤に結合させることができる。
　また、Ｒ３の基として、安定同位体を含む基を用いることもできる。Ｒ３の基の一部の元素を安定同位体元素（重元素）に置き換えることで、安定同位体非含有標識試薬（軽元素）と同じ分子構造で異なる質量数のタグペアを調製することができる。本発明においても、ポリスルフィド標識分子の一部の元素を安定同位体元素に置き換えることで、特定のタンパク質やペプチド消化物のポリスルフィド含有率を相対的に定量することが可能となる。安定同位体元素としては重元素が用いられ、具体的には、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、又は３４Ｓなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のアルキル化剤は、前記化合物の塩を含んでもよい。具体的な塩としては、無機塩基、有機塩基、又は金属アルコキシドとの塩が挙げられる。塩は、前記化合物と、無機塩基、有機塩基、又は金属アルコキシドとの混合により生成しうる。
　塩を形成しうる無機塩基としては、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、又はカリウム等）の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、酢酸塩、又は水素化物；アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム、カルシウム、又はバリウム）の水酸化物、又は水素化物等が挙げられる。
　塩を形成しうる有機塩基としては、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ピペラジン、ピロリジン、ピペリジン、２－フェニルエチルアミン、ベンジルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピリジン、又はコリジン等；金属アルコキシドとしては、ナトリウムメトキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、又はマグネシウムメトキシド等が挙げられる。
　本発明のアルキル化剤は、タンパク質などの還元型ポリスルフィド構造（Ｒ４－（Ｓ）ｎ－ＳＨ）のチオール基（－ＳＨ基）を修飾することができる。具体的には、本発明のポリスルフィド標識用官能基のＸと、チオール基の水素原子が、ＨＸとなって脱離し、チオール基がアルキル化剤によって修飾される。具体的な還元型ポリスルフィドとしては、ヒドロジスルフィド（ヒドロパースルフィド：Ｒ４－Ｓ－Ｓ－Ｈ）、ヒドロトリスルフィド（Ｒ４－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｈ）、又はヒドロテトラスルフィド（Ｒ４－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｈ）などが挙げられる。
　更に、本発明のアルキル化剤は、タンパク質などの酸化型ポリスルフィド構造（Ｒ４－Ｓ－（Ｓ）ｎ－Ｓ－Ｒ５）のポリスルフィド部位（－（Ｓ）ｎ－）を修飾することができる。具体的な酸化型ポリスルフィドとしては、トリスルフィド（Ｒ４－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｒ５）、又はテトラスルフィド（Ｒ４－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｒ５）などが挙げられる。
《作用》
　本発明のアルキル化剤が、従来のアルキル化剤と比較して、効率的にポリスルフィドを標識できる機構は、詳細に解明されたわけではないが、以下のように推定することができる。しかしながら、本発明は下記の推定によって、限定されるものではない。
　本発明における基Ｘは、チオール基との結合の反応に関与する基である。従来のアルキル化剤であるヨードアセトアミド（ＩＡＭ）又はβ－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ）では、このＸがヨウ素（Ｉ）である。
　一般的に、ポリスルフィド構造を含むチオール基（Ｒ４－（Ｓ）ｎ－ＳＨ）は、ポリスルフィドを含まないチオール基（Ｒ４－ＳＨ）よりも酸解離定数の負の常用対数であるｐＫａが低いため、Ｒ４－（Ｓ）ｎ－ＳＨのほうが反応性に富む。一方、Ｘがヨウ素（Ｉ）、Ｒ１、Ｒ２が水素のアルキル化剤は元来Ｒ４－ＳＨに対する反応性が高いことが知られており、ポリスルフィド基の有無にかかわらずチオール基への高い反応性を示し、Ｒ４－（Ｓ）ｎ－ＳＨへの反応選択性が低い。このヨウ素（Ｉ）をＲ４－ＳＨとの反応性の低いフッ素原子、塩素原子、臭素原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基に置換することによって、Ｒ４－（Ｓ）ｎ－ＳＨへの反応性を損なわずＲ４－ＳＨとの反応性を落とすことで、ポリスルフィド構造への反応選択性を向上できると推定される。
　一方、Ｒ１及びＲ２は、チオール基との反応に直接関与する基ではないが、Ｘの近くに位置する基である。従来のアルキル化剤であるヨードアセトアミド（ＩＡＭ）又はβ－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ）では、このＲ１及びＲ２が、水素原子（Ｈ）である。水素原子は分子量が小さいため、Ｒ４－ＳＨとＸとの反応を立体構造として阻害することがなく、Ｒ４－ＳＨに対しても高い反応性を示す。この水素原子（Ｈ）を、分子量の大きな基に置換し、立体障害を生じさせることによって、Ｒ４－ＳＨとＸとの反応性を抑制することができると推定される。
　また、ヨウ素（Ｉ）は、チオール基との反応性が高いが、反応性が高すぎるために、ポリスルフィドの－（Ｓ）ｎ－構造を過剰に分解してしまうことがあった。このヨウ素（Ｉ）をチオール基との反応性の低いフッ素原子、塩素原子、臭素原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基に置換することによって、－（Ｓ）ｎ－構造の分解を抑制し、ポリスルフィドを効率的に標識することができると推定される。
　一方、Ｒ１及びＲ２は、チオール基との反応に直接関与する基ではないが、Ｘの近くに位置する基である。従来のアルキル化剤であるヨードアセトアミド（ＩＡＭ）又はβ－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ）では、このＲ１及びＲ２が、水素原子（Ｈ）である。水素原子は分子量が小さいため、チオール基とＸとの反応を立体構造として阻害することがない。この水素原子（Ｈ）を、分子量の大きな基に置換し、立体障害を生じさせることによって、チオール基とＸとの反応性を抑制することができると推定される。
　なお、Ｒ３はＸから距離的に離れているため、チオール基とＸとの反応へほとんど影響を与えない。従って、様々な基を用いることができると推定される。
　Ｘは、チオール基の水素原子と反応してＸＨとして脱離する基であり、例えばハロゲン原子が挙げられる。また、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、パラトルエンスルホニルオキシ基も、ハロゲン原子と同様の反応メカニズムに基づいて、水素原子と反応してＸＨとして脱離する性質を有する。
［２］ポリスルフィドの標識方法
　本発明のポリスルフィドの標識方法は、ポリスルフィドに、本発明のアルキル化剤を接触させる工程を含む。
　本発明の標識方法によって標識されるポリスルフィドは、例えば図１Ｂに示すポリスルフィド構造を有する還元型のチオール基（Ｒ４－（Ｓ）ｎ－ＳＨ）及び酸化型のポリスルフィド構造（Ｒ４－Ｓ－（Ｓ）ｎ－Ｓ－Ｒ５）を含む。還元型のポリスルフィドを例にとると、チオール基のＨと本発明のアルキル化剤（Ｘ－Ｚ）のＸとが反応して、ＨＸとなって脱離し、チオール基が修飾される（Ｒ４－（Ｓ）ｎ－Ｓ－Ｚ）。従来のタンパク質のシステイン残基は、図１Ａの還元型チオール基（Ｃｙｓ－ＳＨ）に示されているように、１つの硫黄原子のみ有するチオール基であると考えられていた。最近、生体内で図１Ｂに示されるポリスルフィド構造が存在することが示された。本発明の標識方法は、これらのポリスルフィド構造を標識することができる。また本発明のアルキル化剤は酸化型システイン形成箇所に含まれるポリスルフィドとも反応し、アルキル化剤（Ｘ－Ｚ）のＸが離脱して反応することで、Ｒ４－（Ｓ）ｎ－Ｓ－ＺないしＲ５－（Ｓ）ｎ－Ｓ－Ｚとして標識されると推定される。
　図２に示すように、従来のアルキル化剤は反応性が高いため、パースルフィド構造、又はトリスルフィド構造の－（Ｓ）ｎ－構造を過剰に分解することがあった。そのため、例えばチオール基と、そこに硫黄原子がさらに付加したポリスルフィド基（パースルフィド構造やトリスルフィド構造）を区別することができなった。
　本発明のポリスルフィドの標識方法によれば、過剰な反応を抑制したアルキル化剤を用いることにより、効率的にポリスルフィドを標識することができる。
　本発明のポリスルフィドの標識方法における反応温度は、特に限定されるものではないが、例えば４～３７℃であり、好ましくは２５～３７℃である。
　本発明のポリスルフィドの標識方法における反応時間は、特に限定されるものではないが、例えば３０分～４８時間であり、好ましくは１～２４時間である。
　本発明のポリスルフィドの標識方法に用いる緩衝液は、標識反応が進行する限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばリン酸緩衝液、トリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、又は炭酸アンモニウム緩衝液を用いることができる。
　本発明のポリスルフィドの標識方法によって標識される物質は、ポリスルフィドを有する物質である限りにおいて、特に限定されないが、例えばタンパク質、又はペプチドホルモンが挙げられる。具体的な検体としては、ポリスルフィドを有する物質を含む検体である限りにおいて限定されるものではないが、細胞、細胞抽出液、細胞上清、バイオプシー検体、臓器抽出液、血液、血漿、血清、唾液、髄液、精液、又は尿などが挙げられる。
　本発明のポリスルフィドの検出方法は、前記ポリスルフィドの標識方法によって標識されたポリスルフィドを含むタンパク質を質量分析法で分析する工程を含む。質量分析法は、ポリスルフィドの標識方法によって標識された検体を用いることを除いては、本分野で通常使用されている質量分析法を用いることができる。
　例えば、標識されたポリスルフィドを含むタンパク質を酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、又はクロストリパイン）で消化する。消化されたタンパク質を質量分析装置で分析する。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《製造例１》
　本製造例では、Ｒ１及びＲ２が水素原子、Ｘが塩素原子（Ｃｌ）のアルキル化剤１を製造した。
　１０ｍＬフラスコに、クロロ酢酸（１０５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、チラミン（１５１ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（３５０ｍｇ，１１．６ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、室温にて攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．２８ｍＬ）を加え、室温にて１時間攪拌した。水を加えて反応を停止し、酢酸エチルにて抽出し、回収した酢酸エチル層を水で２回、飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝５０／５０→２５／７５）、目的化合物を得た。（７４．３ｍｇ、収率３２．９％）
HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+ calcd for C10H12ClNNaO2: 236.04488; found: 236.04391 (error: 1.0 mDa)
《製造例２》
　本製造例では、Ｒ１が水素原子、Ｒ２がメチル基、そしてＸが臭素原子（Ｂｒ）のアルキル化剤２を製造した。
　１０ｍＬフラスコに、２－ブロモプロピオン酸（１００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、チラミン（１００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、プロピルホスホン酸無水物（５０％酢酸エチル溶液、５００μＬ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、室温にて攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７２μＬ）及び４－ジメチルアミノピリジン（２２ｍｇ）を加え、室温にて２時間攪拌した。水を加えて反応を停止し、酢酸エチルにて抽出し、回収した酢酸エチル層を水で２回、飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７０／３０→３０／７０）、目的化合物を得た。（１５１ｍｇ、収率８４．４％）
HRMS-ESI (m/z): [2M+H]+ calcd for C22H29Br2N2O4: 545.04886; found: 545.04728 (error: 1.6 mDa)
《製造例３》
　本製造例では、Ｒ１が水素原子、Ｒ２がメチル基、そしてＸがヨウ素原子（Ｉ）のアルキル化剤３を製造した。
　製造原料の２－ブロモプロピオン酸に代えて、２－ヨードプロピオン酸を用いたことを除いては、製造例３の操作を繰り返して、アルキル化剤を得た。
HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+ calcd for C11H14INNaO2: 341.99614; found: 341.99548 (error: 0.7 mDa)
　前記の方法と同様の方法と、目的物に対応する反応資材を用いることにより、下表に記載するポリスルフィド標識用官能基を有するアルキル化剤が製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　更に、下表に記載するポリスルフィド標識用官能基を有するアルキル化剤が製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
《比較例１》
　本比較例では、アルキル化剤として、下記式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 のＲ１及びＲ２が水素原子、Ｘがヨウ素原子（Ｉ）のβ－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ）（Toronto Research Chemicals社）を用い、ポリスルフィド化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のポリスルフィドを分析した。
（ポリスルフィド化ＨＳＡの製造）
　２ｍＬマイクロチューブにＨＳＡ（４ｍｇ）を加え、超純水（１００μＬ）を加えて溶解した。ここに、予め調製した１５０ｍＭ二硫化ナトリウム水溶液を２μＬ加え、３７度にて１時間反応させた。この溶液をＰＤ　ＳｐｉｎＴｒａｐ　Ｇ－２５カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いて、同社の推奨プロトコルに従って精製し、過剰な二硫化ナトリウムを除去し、超純水にて溶出した。この溶出液に更に超純水を加えて５００μＬに調製し、アミコンウルトラ－０．５ｍＬ遠心式フィルター（分画分子量：３ｋＤａ、メルクミリポア社製）を用いて遠心分離機にて限外濾過し（１４，０００ｘｇ、３０分）、濃縮液に超純水を加えて５００μＬとし、限外濾過操作をもう一度繰り返し、ポリスルフィド化ＨＳＡを得た。
（アルキル化剤を用いたポリスルフィド化ＨＳＡのアルキル化及びトリプシン消化）
　０．５ｍＬマイクロチューブに、ポリスルフィド化ＨＳＡを１０μｇ加え、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を８μＬ加えて希釈した。この溶液に、２０ｍＭアルキル化剤（エタノール溶液）を１μＬ添加し、次いで０．１μｇ／μＬトリプシン溶液を１μＬ加え、３７度にて１６時間静置した。１０％トリフルオロ酢酸水溶液を１μＬ加えて３７度にて３０分静置し、トリプシン消化を終了させたのち、ペプチド脱塩・濃縮用チップ（ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ、ＧＬサイエンス社製）を用いて脱塩し、８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液にてチップから溶出したペプチド分画を遠心濃縮装置にて乾燥し、乾固物を２％アセトニトリル　０．１％ギ酸水溶液に溶解し、これを質量分析計測用サンプルとした。
（質量分析ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる計測）
　液体クロマトグラフィー（ＬＣ）にＵｌｔｉＭａｔｅＴＭ　３０００　ＴＳＬＣｎａｎｏシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、質量分析部（ＭＳ／ＭＳ）にＱ　ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ　ハイブリッド四重極－オービトラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を搭載したｎａｎｏ　ＥＳＩ　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置を用いてペプチドの分析を行った。
　ＬＣ分離のトラップカラムには、Ａｃｃｌａｉｍ　ＰｅｐＭａｐ１００、Ｃ１８（５μｍ、１００Å、内径３００μｍｘ５ｍｍ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、分析カラムにはＮＴＣＣ－３６０／７５－３－１２５（Ｃ１８，粒子径０．３μｍ、内径０．０７５ｍｍｘ１２５ｍｍ，日京テクノス社）を用いた。移動相は、０．１％ギ酸水溶液（Ｓｏｌｖｅｎｔ　Ａ）及び０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（Ｓｏｌｖｅｎｔ　Ｂ）を用い、流速０．３μＬ／ｍｉｎにて、以下の溶媒組成になるように送液した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　質量分析計のイオンソースにはｎａｎｏＥＳＩを用い、Ｓｐｒａｙ　ｖｏｌｔａｇｅ　２．００ｋＶ、キャピラリー温度２７５度、Ｓ－ｌｅｎｓ　ＲＦ　ｌｅｖｅｌ　５０．０Ｖにてイオン化を行った。ＭＳスキャン範囲をｍ／ｚ　３５０－１５００、ＡＧＣ（ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｇａｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ）ｔａｒｇｅｔを３ｘ１０６Ｃｈａｒｇｅｓとし、ポジティブモードにてＭＳデータを取得し、次いでＮＣＥ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　Ｅｎｅｒｇｙ）を２７に設定し、ＡＧＣ（ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｇａｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ）ｔａｒｇｅｔを１ｘ１０５ＣｈａｒｇｅｓとしてＭＳ／ＭＳデータを取得した。取得したデータはＰＥＡＫＳＸＰｒｏ（インフォコム社）ないしはＰｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　２．４　ＳＰ１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて解析した。
　ＨＳＡの３４番、７５番、１０１番、１２４番、１７７番、２６５番、３９２番、４８７番、５６７番のシステイン残基にアルキル化剤（Ｚ）が標識されたペプチド（－Ｓ－Ｚ、－Ｓ－Ｓ－Ｚ、－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｚ）の検出強度の割合を表１０に示す。
《実施例１》
　本実施例では、アルキル化剤として製造例１で得たアルキル化剤１を用い、ポリスルフィド化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のポリスルフィドを分析した。
　ＨＰＥ－ＩＡＭに代えて、アルキル化剤１を用いたことを除いては、比較例１の操作を繰り返して、ポリスルフィド化ＨＳＡのポリスルフィドを分析した。結果を表１０に示す。
《実施例２》
　本実施例では、アルキル化剤として製造例２で得たアルキル化剤２を用い、ポリスルフィド化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のポリスルフィドを分析した。
　ＨＰＥ－ＩＡＭに代えて、アルキル化剤２を用いたことを除いては、比較例１の操作を繰り返して、ポリスルフィド化ＨＳＡのポリスルフィドを分析した。結果を表１０に示す。
《実施例３》
　本実施例では、アルキル化剤として製造例３で得たアルキル化剤３を用い、ポリスルフィド化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のポリスルフィドを分析した。
　ＨＰＥ－ＩＡＭに代えて、アルキル化剤３を用いたことを除いては、比較例１の操作を繰り返して、ポリスルフィド化ＨＳＡのポリスルフィドを分析した。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１０に示すように、Ｘをヨウ素原子（Ｉ）から塩素原子（Ｃｌ）に置換することによって、パースルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｚ）及びトリスルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｚ）などのポリスルフィドの検出率が向上した。また、Ｒ２を水素原子からメチル基に置換することによっても、ポリスルフィドの検出率が向上した。
　また、質量分析測定により同定されたペプチドの例を図３に示す。ＨＳＡの９９－１０６番目のペプチドであるＮＥＣＦＬＱＨＫにおいて、ポリスルフィド化した１０１番目のシステイン残基に、アルキル化剤１が標識されていることが確認された。
《製造例４》
　本製造例では下記式（４）で表されるビオチン残基を含むビオチン化アルキル化剤を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　ビオチン化アルキル化剤は、下記の反応式に従って製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ３－ａｍｉｎｅの製造法）
　３０ｍＬフラスコに、ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ３－ａｚｉｄｅ（１０３ｍｇ）を加え、メタノール（１０ｍＬ）に溶解した。減圧脱気及びアルゴン置換を行い、パラジウム炭素を触媒量加え、真空脱気及び水素ガス置換を行い、室温にて終夜攪拌した。反応液をセライト濾過し、濾液を減圧濃縮し、目的化合物を得た。（９７．０ｍｇ、９８．１％）
（ビオチン化アルキル化剤の製造法）
　１０ｍＬフラスコに、ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ３－ａｍｉｎｅ（２２．０ｍｇ、５２．６ｍｍｏｌ）、クロロ酢酸（８．６ｍｇ、１１３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート（２５．２ｍｇ，８３．８ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５００μＬ）に溶解し、室温にて攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４μＬ）を加え、更に室温にて２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ジクロロメタン／メタノール＝９９／１→８０／２０）、目的化合物を得た。（１９．１ｍｇ、７３．５％）
HRMS-ESI (m/z): [M+Na]+ calcd for C20H35ClN4NaO6S: 517.18580; found: 517.18684 (error: 1.0 mDa)
《実施例４》
　本実施例では、製造例４で得られたビオチン化アルキル化剤を用いて、ヒト血漿タンパク質のポリスルフィドを分析した。
（ヒト血漿サンプルからのアルブミン及びＩｇＧの除去）
　ヒト血漿サンプル５０μＬをＰＢＳ　５０μＬに希釈し、Ａｌｂｕｍｉｎ＆ＩｇＧ　Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ＳｐｉｎＴｒａｐ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて、同社の推奨プロトコルに従ってアルブミン及びＩｇＧを除去した。以後の分析実験においては、このアルブミン／ＩｇＧを除去したサンプル及び、これらを除去しないサンプルの両方を用いた。
（ヒト血漿タンパク質のビオチン化及びトリプシン消化）
　ヒト血漿サンプル及び、アルブミン／ＩｇＧ除去サンプルを、それぞれＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（メルクミリポア社）を用いて、同社の推奨プロトコルに従ってタンパク沈殿処理を行った。沈殿タンパク質を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．５、６Ｍ尿素、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ社）含有）を用いて再溶解し、タンパク濃度を測定した。
　この再溶解サンプルから、それぞれタンパク量が５０μｇになるように溶液を分取し、５０ｍＭ　トリス－塩酸水溶液（ｐＨ７．５、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ社）含有）を加え、タンパク質の終濃度が０．５μｇ／μＬに、尿素の終濃度が１Ｍ以下になるように調製した。この溶液に、２ｍＭビオチン化アルキル化剤（ジメチルスルホキシド溶液）を１μＬ添加し、０．５μｇ／μＬトリプシン溶液を２μＬ加え、３７度にて１６時間静置した。１０％トリフルオロ酢酸水溶液を１μＬ加え、３７度にて３０分静置し、反応を終了させた。この溶液を、陽イオン交換カラム（ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＣＸ、ＧＬサイエンス社）を用いて、同社の推奨プロトコルに従って精製し、未反応のビオチン化アルキル化剤を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４水溶液（１Ｍ　ＫＣｌ、２５％アセトニトリル、ｐＨ３．０）を１００μＬ用いてペプチドの溶出を行い、アビジン精製用サンプルとして用いた。
（アビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）ビーズによるビオチン化ペプチドの濃縮回収）
　ペプチド溶出液１００μＬを２ｍＬマイクロチューブに移し、ＰＢＳを１５０μＬ加えて希釈し、次いでアビジンビーズ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）　Ａｇａｒｏｓｅ　ＨＣ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））を１０μＬ添加し、ローテーターを用いて室温にて２時間攪拌した。ビーズを遠心分離にて回収し、上清を除去後、ビーズをＰＢＳ（５％アセトニトリル）にて４回、ＰＢＳにて３回、超純水にて３回洗浄した。このビーズに８０％アセトニトリル水溶液（０．２％ギ酸、０．１％トリフルオロ酢酸含有）を５０μＬ加え、７０度にて１０分振盪攪拌してビオチン化ペプチドを溶出し、室温に戻した後遠心分離し、上清を回収した。残ったビーズに８０％アセトニトリル水溶液（０．２％ギ酸、０．１％トリフルオロ酢酸含有）を５０μＬ加え、上清を回収し、これらの上清を混合したのち遠心濃縮装置にて乾燥し、乾固物を２％アセトニトリル０．１％ギ酸水溶液に溶解し、これを質量分析計測用サンプルとした。
　質量分析装置及び測定条件は、移動相の混合比率を以下のように変更したこと以外は、比較例１の操作を繰り返した。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　血漿タンパク質を用いた解析結果を以下に示す。
　血漿タンパク質において、６３種類のタンパク質にパースルフィド部位が含まれ、うち７種類のタンパク質にトリスルフィド構造が含まれることが同定された。
　すなわち、ビオチン化アルキル化剤を用いて、ポリスルフィド構造を濃縮することが可能であり、ポリスルフィドの検出感度が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（キモトリプシンを用いたポリスルフィド化ＨＳＡの消化及びポリスルフィド分析）
《実施例５～７、及び比較例２》
　本実施例及び比較例では、製造例１～３のアルキル化剤１～３及び比較例１のアルキル化剤を用い、ポリスルフィド化ヒト血漿タンパク質（ＨＳＡ）のポリスルフィドを分析した。
　０．５ｍＬマイクロチューブに、ポリスルフィド化ＨＳＡを１０μｇ加え、１Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１５．５μＬ加えて希釈した。この溶液に、それぞれ１０ｍＭ実施例１～３又は比較例１（ジメチルスルホキシド溶液）を２．０μＬ添加し、次いで１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を２．０μＬ、消化酵素溶液（０．５μｇ／μＬキモトリプシン溶液）を０．５μＬ加え、３７度にて４時間静置し、次いで５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３５μＬ加えて希釈し、３７度にて１７時間静置した。１０％トリフルオロ酢酸水溶液を加えて酵素消化を終了させたのち、ペプチド脱塩・濃縮用チップ（ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ、ＧＬサイエンス社製）を用いて脱塩し、８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液にてチップから溶出したペプチド分画を遠心濃縮装置にて乾燥し、乾固物を２％アセトニトリル０．１％ギ酸水溶液に溶解し、これを質量分析計測用サンプルとした。比較例１の操作を繰り返して、ポリスルフィド化ＨＳＡのポリスルフィドを分析した。結果を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表１４に示すように、消化酵素をキモトリプシンに変更しても、実施例５～７におけるパースルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｚ）及びトリスルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｚ）などのポリスルフィドの検出率が、比較例２に比べて向上した。また、同定されたこれらのシステイン残基のうち、３４番目のシステイン残基（Ｃ３４）は還元型システインとして存在することが報告されており、また７５，２５３，２６５，３１６，３９２，４８７，５１４番目のシステイン残基は酸化型システイン（ジスルフィド結合）を形成する部位として報告されている（それぞれ、Ｃ７５－Ｃ９１、Ｃ２４５－Ｃ２５３、Ｃ２６５－Ｃ２７９、Ｃ３１６－Ｃ３６１、Ｃ３９２－Ｃ４３８、Ｃ４７６－Ｃ４８７、Ｃ５１４－Ｃ５５９の組み合わせでジスルフィド結合を形成する）。すなわち、本発明におけるアルキル化剤は、これらの個所に含まれるポリスルフィド構造をいずれも高効率に検出できる。
《製造例５》
　本製造例では、下記式（５）のＲ１が水素原子、Ｒ２がエチル基、Ｘが臭素原子（Ｂｒ）、及びＲ３にヒドロキシフェニルエチル基を含むアルキル化剤５を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 　２ｍＬチューブに、２－ブロモ酪酸（７９ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、チラミン（６５ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、プロピルホスホン酸無水物（５０％酢酸エチル溶液、４５０μＬ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５００μＬ）に溶解し、室温にて攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１６５μＬ）および４－ジメチルアミノピリジン（４ｍｇ）を加え、室温にて４５分間攪拌した。反応終了後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０→５０／５０）、目的化合物を得た。（９３．１ｍｇ、収率６９．０％）
《製造比較例１》
　本製造比較例では、下記式（６）のＲ１及びＲ２が水素原子、Ｘがヨウ素原子（I）、及びＲ３にアルキニル基を含む比較アルキル化剤１を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 　１０ｍＬナスフラスコに、ヨード酢酸（１４５ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、プロパルギルアミン（４３ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解し、室温にて攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）およびＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（２５２ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間半攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７０／３０→５０／５０）、目的化合物を得た。（１０７ｍｇ、収率６１．５％）
HRMS-ESI(m/z): [M+H]+ calcd for C5H6INO:223.9567;found:223.9565(error:-0.2 mDa)
《製造例６》
　本製造例では、下記式（７）のＲ１及びＲ２が水素原子、Ｘが塩素原子（Ｃｌ）、及びＲ３にアルキニル基を含むアルキル化剤６を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 　１０ｍＬナスフラスコに、クロロ酢酸（７７ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、プロパルギルアミン（４３ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解し、室温にて攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）およびＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（２４７ｍｇ、０．８８　ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０→５０／５０）、目的化合物を得た。（１０５ｍｇ、収率９８．０％）
HRMS-ESI(m/z): [M+H]+ calcd for C5H6ClNO:132.0211;found:132.0211(error:0.0 mDa)
《製造例７》
　本製造例では、下記式（８）のＲ１が水素原子、Ｒ２がメチル基、Ｘが臭素原子（Ｂｒ）、及びＲ３にアルキニル基を含むアルキル化剤７を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 　１０ｍＬナスフラスコに、２－ブロモプロピオン酸（１１９ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、プロパルギルアミン（４３ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、室温にて攪拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）およびＣＯＭＵ（３６６ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応終了後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０→５０／５０）、目的化合物を得た。（１０２ｍｇ、収率６８．６％）
HRMS-ESI(m/z): [M+H]+ calcd for C6H8BrNO: 189.9862;found:189.9863(error:0.1 mDa)
《製造例８》
　本製造例では、下記式（９）のＲ１が水素原子、Ｒ２がメチル基、Ｘが臭素原子（Ｂｒ）、及びＲ３に炭素及び窒素の安定同位体及びアルキニル基を含むアルキル化剤８を製造した。下記式（９）中、アスタリスク記号が付されている元素が、それぞれ炭素及び窒素の安定同位体（１３Ｃおよび１５Ｎ）に相当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　前記アルキル化剤８は、下記の反応式に従って製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　下記式（１０）の化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　１０ｍＬナスフラスコに、Ｌ－フェニルアラニン－Ｎ－ＦＭＯＣ（１３Ｃ９，９９％；１５Ｎ，９９％，ＣＮＬＭ－４３６２－Ｈ－ＰＫ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）（２８．１ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（３５．３ｍｇ，０．１１７ｍｍｏｌ）を加え、よく乾燥させた後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３００μＬ）に溶解し、プロパルギルアミン（８．６ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３０μＬ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７０／３０→３０／７０）、目的化合物Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅ（１３Ｃ９，１５Ｎ）を得た。（２７．７ｍｇ、収率９０．３％）
　次に、下記式（１１）の化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　１０ｍＬナスフラスコに、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅ（１３Ｃ９，１５Ｎ）（２７．７ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（６００μＬ）、ピペリジン（１５０μＬ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（充填剤：アミノ修飾型、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝２５／７５→０／１００）、目的化合物Ｈ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅ（１３Ｃ９，１５Ｎ）を得た。（１３．６ｍｇ、収率１００％）
　次に、下記の操作を行い、前記式（８）のアルキル化剤８を得た。１０ｍＬナスフラスコに、Ｈ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅ（１３Ｃ９，１５Ｎ）（１３．６ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（３８．６ｍｇ，０．１２８ｍｍｏｌ）を加え、よく乾燥させた後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５００μＬ）に溶解し、（Ｒ）－（＋）－２－ブロモプロピオン酸（１９．５ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２８μＬ）を加え、室温にて２時間半攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７０／３０→５０／５０）、目的化合物を得た。（１９．７ｍｇ、収率８９．１％）
HRMS-ESI(m/z): [M+H]+ calcd for C9[13C]9H17BrN[15N]O2:347.0819;found:347.0818(error: -0.1 mDa)
《製造例９》
　本製造例では、前記製造例８で得られたアルキル化剤８の安定同位体を使用していない化合物を合成した。すなわち、下記式（１２）のＲ１が水素原子、Ｒ２がメチル基、Ｘが臭素原子（Ｂｒ）、及びＲ３にアルキニル基を含み安定同位体を使用していないアルキル化剤９を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　前記アルキル化剤９は、下記の反応式に従って製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　下記式（１３）の化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 　１０ｍＬナスフラスコに、Ｌ－フェニルアラニン－Ｎ－ＦＭＯＣ（３０．４ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（３５．３ｍｇ，０．１１７ｍｍｏｌ）を加え、よく乾燥させた後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３００μＬ）に溶解し、プロパルギルアミン（８．６ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３０μＬ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝８０／２０→５０／５０）、目的化合物Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅを得た。（３２．５ｍｇ、収率９７．６％）
HRMS-ESI(m/z): [M+H]+ calcd for C27H24N2O3: 425.1860;found:425.1860(error:0.0 mDa)
　次に、下記式（１４）の化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　１０ｍＬナスフラスコに、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅ（３２．５ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２００μＬ）、ピペリジン（５０μＬ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（充填剤：アミノ修飾型、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝３０／７０→０／１００）、目的化合物Ｈ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅを得た。（９．５ｍｇ、収率６１．３％）
　次に、下記の操作を行い、前記式（１２）のアルキル化剤９を得た。１０ｍＬナスフラスコに、Ｈ－Ｐｈｅ－ａｌｋｙｎｅ（９．５ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（３０．０ｍｇ，　０．１００ｍｍｏｌ）を加え、よく乾燥させた後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２００μＬ）に溶解し、（Ｒ）－（＋）－２－ブロモプロピオン酸（１４．３ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ）を加え、室温にて２時間半攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝７０／３０→５０／５０）、目的化合物を得た。（１５．１ｍｇ、収率９５．６％）
HRMS-ESI(m/z): [M+H]+ calcd for C15H17BrN2O2:337.0546;found:337.0538(error:0.8 mDa)
《実施例８～１２、比較例３》
　本実施例及び比較例では、前記アルキル化剤５～９及び比較アルキル化剤１を用い、ヒト血漿タンパク質（ＨＳＡ）のポリスルフィドを分析した。
　０．５ｍＬマイクロチューブに、ポリスルフィド化ＨＳＡを１０μｇ加え、６Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３．６μＬ加えて希釈した。この溶液に、それぞれ４０ｍＭアルキル化剤６～１０又は比較アルキル化剤１（ジメチルスルホキシド溶液）を０．５μＬ添加し、次いで消化酵素溶液（０．５μｇ／μＬトリプシン－ＬｙｓＣ混合溶液）を０．４μＬ加え、３７度にて４時間静置し、次いで５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３５μＬ加えて希釈し、３７度にて２０時間静置した。５０％トリフルオロ酢酸水溶液を１μＬ加えて酵素消化を終了させたのち、ペプチド脱塩・濃縮用チップ（ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ、ＧＬサイエンス社製）を用いて脱塩し、８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液にてチップから溶出したペプチド分画を遠心濃縮装置にて乾燥し、乾固物を２％アセトニトリル０．１％ギ酸水溶液に溶解し、これを質量分析計測用サンプルとした。
　比較例１と同様に質量分析を行った。結果を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　表１５に示すように、Ｒ２がエチル基のアルキル化剤（実施例８）もパースルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｚ）及びトリスルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｚ）などのポリスルフィドの検出率が向上した。更に、Ｒ３にアルキニル基を含む化合物においても、Ｘをヨウ素原子（Ｉ）から塩素原子（Ｃｌ）に置換すること（実施例９）によってパースルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｚ）及びトリスルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｚ）などのポリスルフィドの検出率が向上した。また、Ｒ２を水素原子からメチル基に置換し、Ｘをヨウ素原子（Ｉ）から臭素原子（Ｂｒ）に置換すること（実施例１０）によっても、ポリスルフィドの検出率が向上した。さらに、実施例１０、１１、及び１２を比較すると、アルキニル基および安定同位体を含む化合物においても、ＸおよびＲ１の構造が同じであれば、ポリスルフィド検出率に大きな差はないことが判明した。
《実施例１３～１５》
　本実施例では、製造例７で得られたアルキル化剤７をポリスルフィド化ＨＳＡに反応させた後に、アルキル化剤のアルキニル基と、アジド基を有するビオチンとを結合させた。得られた産物を質量分析することによって、ＨＳＡのポリスルフィドを分析した。
　０．５ｍＬマイクロチューブに、ポリスルフィド化ＨＳＡを５０μｇ加え、６Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１８μＬ加えて希釈した。この溶液に、製造例７で得られた４０ｍＭアルキル化剤８（ジメチルスルホキシド溶液）を２．５μＬ添加し、次いで消化酵素溶液（０．５μｇ／μＬトリプシン－ＬｙｓＣ混合溶液）を２μＬ加え、３７度にて４時間静置し、次いで５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１４０μＬ加えて希釈し、３７度にて１８時間静置した。この溶液を３２ｕｌずつ２つの０．５ｍＬマイクロチューブに分注し、一方には１０ｍＭ　ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ３－ａｚｉｄｅ（実施例１３；ジメチルスルホキシド溶液）を４ｕｌ、もう一方には１０ｍＭ　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＣ－ａｚｉｄｅ（実施例１４；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を４ｕｌ加え、それぞれのチューブに２５ｍＭトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン水溶液を１．６μＬ、２５ｍＭ硫酸銅水溶液を１．６μＬ加え、次いで１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウムを０．８μＬ加え、室温にて１時間振盪した。５０％トリフルオロ酢酸水溶液を１μＬ加えたのち、ペプチド脱塩・濃縮用チップ（ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ、ＧＬサイエンス社製）を用いて脱塩した。８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液にてチップから溶出したペプチド分画を遠心濃縮装置にて乾燥し、乾固物を２％アセトニトリル　０．１％ギ酸水溶液に溶解し、これを質量分析計測用サンプルとした。またこのうち、Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＣ－ａｚｉｄｅを結合させたサンプルに関しては、脱塩後のサンプルを一部分注し、紫外線（３６５ｎｍ）を１時間照射し、リンカー部分が光反応により開裂しているか（実施例１５）を質量分析にて確認した。
　以下に、前記の工程のスキームを示す。なお、ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧ３－ａｚｉｄｅについては記載していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　アルブミンのそれぞれ７５、１０１、１７７、２６５、３９２、４８７番目のシステインを含むペプチド消化物において、ポリスルフィド基にアルキン含有タグ分子およびアジド化合物が結合した質量数を加味したペプチドがそれぞれ同定された。すなわち、アルキン含有標識分子のポリスルフィド基への選択的な標識、及びヒュスゲン環化付加反応が進行した。加えて、ｂｉｏｔｉｎ－ＰＣ－ａｚｉｄｅを結合させたペプチドにおいては、光照射による分子構造変化を反映した質量数変化を質量分析測定にて確認したことから、刺激により開裂するリンカーを含むビオチン化合物をポリスルフィド標識試薬へ応用することが可能となった。
《実施例１６》
（ヒト血漿タンパク質のビオチン化及びトリプシン消化）
　ヒト血漿サンプル及び、アルブミン／ＩｇＧ除去サンプルを、それぞれＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（メルクミリポア社）を用いて、同社の推奨プロトコルに従ってタンパク沈殿処理を行った。沈殿タンパク質を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０、６Ｍ尿素）を用いて再溶解し、タンパク濃度を測定した。
　この再溶解サンプルから、それぞれタンパク量が７０μｇになるように溶液を分取し、２５ｍＭ　トリス－塩酸水溶液（ｐＨ７．５、６Ｍ尿素）を加え、次いで製造例７で得られた４０ｍＭのアルキル化剤７（アセトニトリル溶液）を７μＬ添加し、消化酵素溶液（０．５μｇ／μＬトリプシン－ＬｙｓＣ混合溶液）を１．４μＬ加え、タンパク質の終濃度が１．０μｇ／μＬになるように調製した。３７度にて５時間静置し、次いで２５ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３５０μＬ加えて希釈し、３７度にて１４時間静置した。
　この溶液に、１０ｍＭ　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＣ－ａｚｉｄｅ（実施例１２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を４２μＬ加え、超純水７５．６μＬで希釈し、１００ｍＭトリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン水溶液を５．６μＬ、１００ｍＭ硫酸銅水溶液を５．６μＬ加え、次いで１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウムを１１．２μＬ加え、室温にて１．５時間振盪した。反応液を３０％アセトニトリル　０．１％トリフルオロ酢酸水溶液４９０μＬで希釈し、５０％トリフルオロ酢酸水溶液を１μＬ加えたのち陽イオン交換カラム（Ｍｏｎｏｓｐｉｎ（登録商標）　ＳＣＸ、ＧＬサイエンス社）を用いて、同社の推奨プロトコルに従って精製し、未反応のアルキル化剤およびビオチン化合物を除去した。５００ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液（３０％アセトニトリル　４％トリフルオロ酢酸）および５００ｍＭ　酢酸アンモニウム水溶液（３０％アセトニトリル）をそれぞれ１００μＬ用いてペプチドの溶出を行い、遠心濃縮装置にて乾燥し、アビジン精製用サンプルとして用いた。
（アビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）ビーズによるビオチン化ペプチドの濃縮回収）
　ペプチド溶出乾固物をＰＢＳ（２．５％アセトニトリル）７０μＬに溶解し、１Ｍ　トリス－塩酸水溶液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨを７にし、ＰＢＳ（２．５％アセトニトリル）を加えて１４０μＬになるように調製した。これを１２０μＬ分注し、次いでアビジンビーズ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）　Ａｇａｒｏｓｅ　ＨＣ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））を１５μＬ添加し、ＰＢＳ（２．５％アセトニトリル）を加えて３００μＬになるように調製し、ローテーターを用いて室温にて２時間攪拌した。ビーズを遠心分離にて回収し、上清を除去後、ビーズをＰＢＳ（２．５％アセトニトリル）にて３回、超純水にて２回洗浄した。このビーズを５０ｍＭトリス－塩酸水溶液（２．５％アセトニトリル、ｐＨ７．５）５０μＬに懸濁し、紫外線（３６５ｎｍ）を１時間照射し、照射後の懸濁液をフィルター濾過し、濾液をペプチド脱塩・濃縮用チップ（ＧＬ－Ｔｉｐ　ＳＤＢ、ＧＬサイエンス社製）を用いて脱塩し、８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液にてチップから溶出したペプチド分画を遠心濃縮装置にて乾燥し、乾固物を２％アセトニトリル０．１％ギ酸水溶液に溶解し、これを質量分析計測用サンプルとした。
　質量分析測定によるプロテオーム解析の結果、血漿タンパク質において、パースルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｚ）、トリスルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｚ）、テトラスルフィド（－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｚ）を含むペプチドをそれぞれ１５０個、２５個、６個同定し、ポリスルフィドを含むタンパク質を５０種類同定した。ここでしめすＺとは、Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＣ－ａｚｉｄｅを結合させ紫外線照射により生じた分子構造を示す（実施例１４）。すなわち、アルキン含有標識分子のポリスルフィド基への選択的な標識、ｂｉｏｔｉｎ－ＰＣ－ａｚｉｄｅのヒュスゲン環化反応、アビジンビーズによる濃縮および紫外線照射によるリンカー開裂を経て、ポリスルフィド構造の濃縮が可能であり、ポリスルフィドの検出感度が向上した。
　また、特定のタンパク質におけるポリスルフィド化部位の同定を行ったところ、例えばアルブミン（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ０２７６８、Ａｌｂｕｍｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）においては９９、１２５、１４８、２０１、２８９、４１６、５００、５１１、５８２、５９１番目のシステイン残基（シグナルペプチドおよびプロペプチド切断後の配列においては７５、１０１、１２４、１７７、２６５、３９２、４７６、４８７、５５８、５６７番目のシステイン残基）にポリスルフィド構造が含まれることを検出した。これらのシステイン残基の多くは、酸化型構造（ジスルフィド結合）を形成する個所として知られている。また、α１－アンチトリプシン（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ０１００９、Ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）においては、２５６番目のシステイン残基にポリスルフィド構造が含まれることを検出した。このシステイン残基は、還元型構造として知られている。すなわち、内在性のタンパク質においても、上記構造中に含まれるポリスルフィド修飾構造の検出に成功した。
　本発明のアルキル化剤は、ポリスルフィドタンパク質のポリスルフィド構造の検出に用いることができる。

Claims (4)

  1. 　下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１～６のアルキル基、置換基を有する炭素数１～６のアルキル基、炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、炭素数１～６のアルコキシ基、又は置換基を有する炭素数１～６のアルコキシ基であり、
    Ｒ１及びＲ２は、Ｒ１及びＲ２が結合している炭素原子と一緒になって炭素数３～７のシクロアルキル基、置換基を有する炭素数３～７のシクロアルキル基、炭素数６～１２のアリール基、置換基を有する炭素数６～１２のアリール基、３～７員の複素環基、又は置換基を有する３～７員の複素環基であり、
    Ｘは、ハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基であり、
    Ｒ１及びＲ２がいずれも水素原子の場合、Ｘはヨウ素原子以外のハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基、又はパラトルエンスルホニルオキシ基である）で表されるポリスルフィド標識用官能基。
  2. 　請求項１に記載の官能基を有する化合物又はその塩を含むポリスルフィド標識用アルキル化剤。
  3. 　ポリスルフィドに、請求項２に記載のアルキル化剤を接触させる工程を含む、ポリスルフィドの標識方法。
  4. 　請求項３のポリスルフィドの標識方法によって、標識されたポリスルフィドを含むタンパク質を質量分析法で分析する工程を含む、ポリスルフィド構造の検出方法。
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