JP4645650B2 - 光制御ペプチド及び光制御ペプチドを用いたペプチド−蛋白質複合体形成の制御方法 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド−蛋白質複合体形成の光制御に関し、より詳しくは、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチド、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを製造する方法、及び光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを用いたペプチド−蛋白質複合体形成の光制御に関する。
【０００２】
【背景技術】
一般的に、蛋白質と相互作用する活性ペプチドは、光反応性をもたない。
蛋白質のフォールディング反応に関する構造解析の分野において、T.Okuno, S.Hirota, and O.Yamauchi, Biochemistry, 39, 7538-7545(2000)には、光照射により解離する修飾基を蛋白質に導入して蛋白質の構造を不安定なものとし、前記の修飾基を導入した蛋白質に光照射して蛋白質のフォールディング反応を開始させる技術が記載されている。
Y.Tatsu, T.Nishigaki, A.Darszon, and N.Yumoto, FEBS Letters, 525, 20-24(2002)には、ペプチド−蛋白質複合体形成の光制御について、ペプチドに光照射により解離する修飾基を導入し、光照射により修飾基が外れることを利用して、ペプチドと蛋白質との複合体形成を制御する試みが記載されている。
しかし、ペプチドに前記の修飾基を導入しても、ペプチドの構造変化を制御できておらず、ペプチドによる蛋白質の認識を完全に遮蔽することが困難であった。また、生理活性な前記ペプチドを体内に導入して利用しようとした場合、酵素によって分解されてしまうという欠点があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の目的
本発明の目的は、蛋白質認識ペプチドと目的蛋白質との複合体形成において、蛋白質を認識するための構造変化が光制御される新規なペプチドを用いて、ペプチド−蛋白質複合体形成を光制御する方法を提供することである。
【０００４】
発明の概要
本発明者等は、上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを用いることにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。
【０００５】
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１） 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、光照射して前記光解離性架橋基を解離させて前記環状構造を解き、前記環状構造を解かれたペプチドと機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させるための蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチド。
【０００６】
（２） 前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基：
【化７】
（式中、Ｒは二価基を表す。）
である、（１）に記載のペプチド。
【０００７】
（３） 前記光解離性架橋基が、
【化８】
（式中、Ｒはアルキレン基を表す。）
である、（１）に記載のペプチド。
【０００８】
（４） 前記光解離性架橋基が、
【化９】
である、（１）に記載のペプチド。
【０００９】
（５） 前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシステイン同士間、リジン同士間、又はシステインとリジンとの間のいずれかを架橋している、（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
【００１０】
（６） 膜透過性ペプチドが付加されている、（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチド。
【００１１】
（７） ペプチドの一端がナノビーズに固定されている、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチド。
【００１２】
（８） 前記ナノビーズが磁気ビーズである、（７）に記載のペプチド。
【００１３】
（９） 架橋されるべきペプチド分子の２箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる、（１）に記載のペプチドを製造する方法。
【００１４】
（１０） 前記ペプチド分子として、前記２箇所の側鎖官能基間に機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドを含むペプチド分子を用いる、（９）に記載のペプチドの製造方法。
【００１５】
（１１） 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
【化１０】
（式中、Ｒは二価基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
を用いる、（９）又は（１０）に記載のペプチドの製造方法。
【００１６】
（１２） 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
【化１１】
（式中、Ｒはアルキレン基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
を用いる、（９）又は（１０）に記載のペプチドの製造方法。
【００１７】
（１３） 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
【化１２】
（式中、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
を用いる、（９）又は（１０）に記載のペプチドの製造方法。
【００１８】
（１４） 前記２箇所の側鎖官能基が、システインのＳＨ基とＳＨ基、リジンのＮＨ３ ＋基とＮＨ３ ＋基、又はシステインのＳＨ基とリジンのＮＨ３ ＋基のいずれかである、（９）〜（１３）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
【００１９】
（１５） 前記架橋反応によって得られたペプチドに膜透過性ペプチドを付加する、（９）〜（１４）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
（１６） 前記架橋反応によって得られたペプチドをナノビーズに固定する、（９）〜（１５）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
（１７） 前記ナノビーズが磁気ビーズである、（１６）に記載のペプチドの製造方法。
【００２０】
（１８） 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドに、
光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。
【００２１】
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドを生体内へ投与して、
前記環状構造を形成しているペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。
前記光照射する光が紫外線である、前記の反応制御方法。
前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基：
【００２２】
【化１３】
（式中、Ｒは二価基を表す。）
である、前記の反応制御方法。
【００２３】
前記光解離性架橋基が、
【化１４】
（式中、Ｒはアルキレン基を表す。）
である、前記の反応制御方法。
【００２４】
前記光解離性架橋基が、
【化１５】
である、前記の反応制御方法。
【００２５】
前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシステイン同士間、リジン同士間、又はシステインとリジンとの間のいずれかを架橋している、前記の反応制御方法。
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドに、膜透過性ペプチドが付加されている、前記の反応制御方法。
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドの一端がナノビーズに固定されている、前記の反応制御方法。
前記ナノビーズが磁気ビーズである、前記の反応制御方法。
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドの一端を磁気ビーズに固定させ、
前記磁気ビーズに固定されたペプチドを生体内へ投与して、
前記磁気ビーズに固定されたペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれた磁気ビーズに固定されたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとを反応させて複合体を形成させ、
形成された複合体を磁石にて回収し、
回収された複合体を質量分析装置を用いて同定する方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを用いることにより、光照射を開始としてペプチドの構造変化を制御できる。光解離性架橋基を介して分子内で架橋された蛋白質認識ペプチドは前記光解離性架橋基と共に環状構造を形成しており、目的蛋白質と共存させても、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることができないため、ペプチドと蛋白質は相互作用しない。しかし、ペプチドに光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解かれ、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが可能となるため、ペプチドと蛋白質が相互作用して複合体形成を開始する。
前述のように、光によってその環状構造の開環が制御され、それによってペプチド−蛋白質複合体形成が制御されるペプチドは、いわゆる光制御ペプチドである。
また、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドが環状構造を有することにより酵素によって分解されにくく、生体内に前記蛋白質認識ペプチドを導入した場合でも多くを有効利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
まず、本発明の新規な環状構造を有するペプチドについて説明する。本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドは、前記架橋基と共に環状構造を形成している。
後述する複合体形成のためには、環状構造を形成している部分には、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドであることが重要である。このような蛋白質認識部位は、もともとペプチドに存在してもよく、また人為的に付加されたものであってもよい。
本明細書において、「目的蛋白質」とは、機能蛋白質及びリガンドと同義である。「機能蛋白質」とは、生体内の酵素や受容体等をいう。「蛋白質認識ペプチド」とは、蛋白質認識部位を有するペプチドであり、目的蛋白質と相互作用してペプチド−蛋白質複合体を形成する。
【００２８】
本発明の光解離性架橋基として、次の化学式（I）で表される二価の連結基が挙げられる。
【化１６】
（式中、Ｒは二価基を表す。）
【００２９】
具体的には、次の化学式（II）で表される二価の連結基が挙げられる。
【化１７】
（式中、Ｒはアルキレン基を表す。）
【００３０】
上述のように式中のＲとして、結合可能な二価の有機基が挙げられ、二価の有機基として例えばアルキレン基が挙げられる。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。アルキレン基は適宜置換基を有していてもよい。アルキレン基は、上記式において、−ＣＨ２−基のパラ位を占めるとよい。
本発明の光解離性架橋基として、さらに具体的には、次の化学式（III）で表される二価の連結基が挙げられる。光で解離するものがあれば、他の光解離性架橋基も用いることができる。
【００３１】
【化１８】
【００３２】
前記光解離性架橋基は、ペプチド分子内のシステイン同士間、リジン同士間、又はシステインとリジンの間のいずれかを架橋することが好ましい。システイン及びリジンは、もともとペプチド分子内に存在するものであってもよく、また、ペプチドに人為的に付加されたものであってもよい。
【００３３】
次に、前述した本発明の新規な環状構造を有するペプチドの製造方法について説明する。本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドの製造方法では、架橋されるべきペプチド分子の２箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる。
原料となる架橋されるべきペプチド分子は、天然に存在するものであってもよく、合成されたものであってもよい。
【００３４】
架橋反応に用いる光解離性架橋基を含む化合物としては、次の化学式（IV）で表される化合物が挙げられる。
【化１９】
（式中、Ｒは二価基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
【００３５】
具体的には、次の化学式（V）で表される化合物が挙げられる。
【化２０】
（式中、Ｒはアルキレン基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
上述のように式中のＲとして、結合可能な二価の有機基が挙げられ、二価の有機基として例えばアルキレン基が挙げられる。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。アルキレン基は適宜置換基を有していてもよい。
ハロゲン原子としては、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）等が挙げられる。
【００３６】
前記架橋反応に用いる光解離性架橋基を含む化合物として、さらに具体的には、次の化学式（VI）で表される化合物が挙げられる。
【化２１】
（式中、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
【００３７】
その一例として、次の化学式（VII）で表される２，５−ジ（ブロモメチル）ニトロベンゼン（2,5-Di(bromomethyl)nitrobenzene（ＤＢＭＮＢ））がある。Ｘが臭素であることにより、後述する光解離性架橋基がシステインのＳＨ基間を架橋する場合に、ＳＨ基への修飾が容易である。
【００３８】
【化２２】
【００３９】
前記２箇所の側鎖官能基は、システインのＳＨ基とＳＨ基、リジンのＮＨ３ ＋基とＮＨ３ ＋基、又はシステインのＳＨ基とリジンのＮＨ３ ＋基のいずれかであることが好ましい。
架橋反応は、当技術分野で通常用いられる方法によって行われる。
【００４０】
図１は、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを製造する方法の実施形態例を示す。
図１において、架橋されるべき鎖状のペプチド分子（１）が、光解離性架橋基を含む化合物２，５−ジ（ブロモメチル）ニトロベンゼン（ＤＢＭＮＢ））と反応して、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチド（２）が製造される。図１では、ペプチド分子内のシステインのＳＨ基間を架橋するため、ＳＨ基への修飾の容易な臭素を有するＤＢＭＮＢを用いている。
図１では、ペプチド分子内の２箇所のシステインのＳＨ基とＤＢＭＮＢとが反応している。システインのＳＨ基とＤＢＭＮＢのＢｒが結合するＣＨ２基とが反応し図のように架橋構造を有するペプチドが製造される。架橋反応は、当技術分野で通常用いられる方法によって行われる。
図１の架橋構造を有するペプチドは、光照射すると、ニトロ基に隣接する−ＣＨ２基とＳとの結合が切断され、環状構造は１箇所で切断される。ペプチドに残った架橋基の残基は、ペプチドが立体構造をとることを妨げず、また目的蛋白質と複合体を形成する場合にも複合体形成を妨げない。
【００４１】
本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドに、膜透過性ペプチドを付加してもよい。光解離性架橋基が膜透過性ペプチド分子の側鎖官能基と誤って架橋反応しないために、膜透過性ペプチドは架橋反応が終了してから付加することが好ましい。膜透過性ペプチドは、環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がある場合には、鎖状部分の一端に付加されることが好ましい。環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がない場合には、環状構造を形成している部分に直接付加されてもよい。膜透過性ペプチドを付加することにより、細胞内にペプチドを導入することが可能になる。
細胞内に本発明のペプチドを導入する方法として、上述のように膜透過性ペプチドを付加する方法の他に、通常のインジェクションや、電気パルスによって導入する方法がある。後述するように、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドがナノビーズに固定されている場合には、ガス圧や火薬を使って打ち込む方法がある。
【００４２】
図２は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ膜透過性ペプチドを付加した本発明のペプチドの一例である。図２では、前記環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分の一端に膜透過性ペプチドが付加されている。
図２のペプチドは、膜透過性ペプチドが付加されていることにより体内に投与された後膜内に容易に取り込まれる。光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解け、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが可能になるため、膜内の目的蛋白質と相互作用して複合体を形成することができる。
【００４３】
本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドは、ペプチドの一端がナノビーズに固定されていてもよい。ナノビーズは、環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がある場合には、鎖状部分の一端に付加される。環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がない場合には、環状構造を形成している部分の一箇所に直接付加されてもよい。
前述のように光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドに膜透過性ペプチドが付加されている場合には、前記膜透過性ペプチドを介してナノビーズに固定されてもよい。
前記ナノビーズは磁気ビーズであってもよい。磁気ビーズに固定されたペプチドは、体内に投与された場合に、磁石によって回収することができる。
【００４４】
図３は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ磁気ビーズに固定された本発明のペプチドの一例である。図３では、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドの一端が磁気ビーズに固定されている。図３のペプチドは、体内に投与された後光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解け、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが可能になるため、体内の目的蛋白質と相互作用して複合体を形成することができる。形成された複合体は磁石で回収することができるため、回収物の解析が可能となる。
【００４５】
次に、前述した本発明の新規な環状構造を有するペプチドを用いた、ペプチド−蛋白質複合体形成の反応制御方法について説明する。本発明の反応制御方法は、光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドに、光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる反応制御方法である。
光は、用いられる光解離性架橋基を解離させることができるあらゆる波長の光を用いることができる。
【００４６】
図４は、本発明の反応制御方法の一例を模式的に示す。以下、図４を参照して本発明のペプチド−蛋白質複合体形成の反応制御法を説明する。
図４においては、機能蛋白質として細胞内シグナル伝達蛋白質において広くみられるＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ（ドメイン）蛋白質を用いている。また、環状構造を有するペプチドとして、環状構造を形成している部分にＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎの認識部位を有し、ＤＢＭＮＢを介して分子内で架橋されたペプチドを用いている。
ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎを認識するペプチドは、ポリプロリンタイプＩＩへリックス構造を有するが、図４に示すようにＤＢＭＮＢを介して架橋している場合には自由な立体構造をとることができず、ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎと共存しても複合体を形成しない。
【００４７】
架橋されたペプチドに光照射すると、光解離性架橋基が解離してペプチドは本来の立体構造をとることができＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎを認識するため、図４に模式的に示されている複合体を形成することができる。以上のようにして、機能蛋白質ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ認識ペプチドとの複合体形成が光制御される。
【００４８】
前述の光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドは、環状構造を有するので、生体内に投与しても酵素によって分解されないため、生体内におけるペプチド−蛋白質複合体形成の光制御も可能である。
光は、用いられる光解離性架橋基を解離させることができるあらゆる波長の光を用いることができる。今回用いている架橋基では、紫外線の反応効率が良いため、紫外線を用いている。
【００４９】
さらに、本発明の複合体を質量分析装置を用いて同定する方法を説明する。本発明は、光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドの一端を磁気ビーズに固定させ、前記磁気ビーズに固定されたペプチドを生体内へ投与して、前記磁気ビーズに固定されたペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれた磁気ビーズに固定されたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとを反応させて複合体を形成させ、形成された複合体を磁石にて回収し、回収された複合体を質量分析装置を用いて同定する方法である。
【００５０】
前記ペプチドは、膜透過性ペプチドを介して磁気ビーズに固定されてもよい。膜透過性ペプチドを付加することにより、生体内に投与した際に膜内に容易に取り込まれる。
また、前記環状構造を形成している部分に受容体の構造を導入しておき、磁気ビーズに固定して生体内に投与する。前述の受容体の構造が導入されたペプチドは、生体内で受容体と遭遇しても相互作用しないが、光照射することにより、前記光解離性架橋基が解離して環状構造が解かれ、ペプチドと受容体と反応する生理活性物質との相互作用が可能になり、複合体が形成される。形成された複合体を磁石にて回収し、回収された複合体を質量分析装置を用いて同定すれば、前記受容体と反応する生理活性物質が何であるかを解析同定することができる。
【実施例】
【００５１】
１）光解離性架橋基を含む化合物ＤＢＭＮＢの合成
５０ ｍｌのナスフラスコに、２，５−ジ（ヒドロキシメチル）ニトロベンゼン（2,5-Di(hydroxymethyl)nitrobenzene） ０．９２ｇ（５ｍｍｏｌ）、トリフェニルフォスフィン（triphenylphosphine）２．６２ｇ（１０ｍｍｏｌ）、及びカーボン テトラブロマイド（carbon tetrabromide） ３．３２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を入れ、脱水ジエチルエーテル２０ｍｌに懸濁して懸濁液を得た。次に、容器内を窒素置換し、酸素及び外気の水分が入らないようにセプタムで密栓した。
【００５２】
前記容器内の懸濁液を恒温槽で２５℃に保ちながら６時間攪拌し、その後室温で２日間攪拌した。得られた反応液をエバポレーターで減圧して溶媒を留去した。残渣を数１０ｍｌのクロロホルムで溶かし、シリカゲルのカラム（直径２．５ｃｍＸ３ｃｍ）を通過させ、溶出液を全て回収した。さらに洗浄用のクロロホルム（約２００ｍｌ）をカラムに通し、溶出液に色が出なくなるまで回収した。回収した溶液を５００ｍｌのナスフラスコに移し、エバポレーターに取り付け４０℃でクロロホルムを減圧除去した。
得られた反応物をスパチュラの先に少量取り、３ｍｌ程度のアセトンで薄めた後、薄層板につけ、ヘキサン（hexane） : 酢酸エチル（ethyl acetate） = ５：１（容量比）混合溶媒で展開し、目的物の有無を紫外線で確認した。目的物は薄層板の開始線のすぐ上に検出された。
【００５３】
反応物を数１０ｍｌのヘキサンに溶かし、ヘキサンで懸濁・沈殿させたシリカゲルに通した。さらに、ヘキサン : 酢酸エチル= ５：１（容量比）の混合溶媒をカラムに通し、溶出液を約４０ｍｌのフラクションに分けて回収し、それぞれのフラクションについて薄層クロマトグラフィーを用いて不純物の有無を調べた。純粋なフラクションを目的物質が溶出されなくなるまで回収した。回収したフラクションをナスフラスコに移し、エバポレーターで溶媒を留去した。残渣を回収後、遮光して保存した。
【００５４】
上述のようにして得られた化合物を、ＥＩ＋ ＭａｓｓでＪＥＯＬ ＧＣｍａｔｅ、溶媒クロロホルム、２０ｅＶの条件で質量分析を行ったところ、得られた化合物は、次の化学式（VII）で表される２，５−ジ（ヒドロキシメチル）ニトロベンゼン（ＤＢＭＮＢ）であることが確認された。
【００５５】
【化２３】
【００５６】
２）ペプチド分子と光解離性架橋基を含む化合物ＤＢＭＮＢとの架橋反応
プロリンリッチなペプチド分子ＲＬＰ１：Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser Lys （配列表の配列番号１）の両端にシステインをつけたペプチドＲＬＰ１−２Ｃ：Cys Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser Lys Cys （配列表の配列番号２）をペプチドの固相合成法により合成した。
【００５７】
ＲＬＰ１−２Ｃと上記１）において合成されたＤＢＭＮＢとを、下記の手順で架橋反応させ、目的の分子内架橋されたペプチドを単離精製した。
前処理として、ＲＬＰ１−２Ｃに2-メルカプトエタノールを加えてＳ−Ｓ結合を切断した後、透析により2-メルカプトエタノールを除去した。前処理したＲＬＰ１−２Ｃ（２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ）、ｐＨ７．０）／ＤＢＭＮＢ（ジメチルフォルムアミド）＝９／１（体積比）で混合させて、混合後のＲＬＰ１−２ＣとＤＢＭＮＢの濃度がそれぞれ１０μＭになるように調整した。調製した混合液を５０℃で４０分架橋反応させた。
得られたペプチドを陽イオン交換カラムＣＭ５２に吸着させた。前記カラムを１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗って余分なＤＢＭＮＢ等を除いた。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した３ＭのＮａＣｌでペプチドを溶出させた。次に、得られた溶出液についてＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られたペプチドを超純水（ミリＱ水）で透析して脱塩し、凍結乾燥した。
【００５８】
上述のようにして得られた分子内架橋されたペプチドについて、以下の条件で質量分析を行った。
使用装置：AXIMA-CFR レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（島津製作所製）
引き出し電圧：２０kV
飛行モード：Reflectron
検出イオン：Positive
マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)） 10mg/ml in 0.1% トリフルオロ酢酸、50% アセトニトリル（MeCN）飽和溶液
測定：レーザー光での分解を考慮して、積算回数１０、５０、２００の３回の測定を行った。
【００５９】
結果を図５に示す。グラフの横軸は質量／電荷（Mass/Charge）、縦軸はイオンの相対強度を示す。グラフの上段、中段、下段はそれぞれ積算回数２００回、５０回、１０回の測定結果を示す。
積算回数５０回において、主なピークとして１２４８．６４、１２８０．７３、１２９３．１９、１３１１．９１、１３２４．６６、１４３３．７０、１４５７．７１、１４５９．７４、１４７３．６７が観測され、得られたペプチドは、ＲＬＰ１−２ＣがＤＢＭＮＢにより分子内で架橋されたペプチドであることが確認できた。
【００６０】
次に、未架橋のペプチド(ＲＬＰ１−２Ｃ)、分子内架橋されたペプチド、及び、分子内架橋されたペプチドに紫外線照射を行ったものについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図６に示す。レーンＭはマーカー、レーン１，２は未架橋のペプチド、レーン３は分子内架橋されたペプチド、レーン４は分子内架橋されたペプチドに紫外線照射を行ったものについての結果である。その結果、レーン３を見ると、レーン１，２との比較から分子内架橋されたペプチドは環状構造を有し、分子サイズがコンパクトであることが確認された。
なお、レーン５は分子内架橋されたペプチドと後述するＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとを共存させた混合液に紫外線を照射したものについての結果である。
【００６１】
３）ペプチド−蛋白質複合体形成の光制御
機能蛋白質としてＰＩ３−ＫαのＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ蛋白質を用いた。ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎはＲＬＰ１と相互作用する。上述のようにして得られた分子内架橋されたペプチドとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で混合し、分子内架橋されたペプチドが１００ｍｉｃｒｏＭ、ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎが２０ｍｉｃｒｏＭとされた混合液（Ｉ）を得た。
【００６２】
次に、混合液（Ｉ）に紫外線照射を行った。紫外線照射機としてContinuum社製Minilite IIを用い、波長３５５ｎｍのパルス光（Ｎｄ−ＹＡＧレーザーの３倍波、パルス幅５ｎｓ、１０Ｈｚ、パルス強度４ｍＪ／ｃｍ２）を４℃で３０分間照射した。紫外線を照射することによって分子内架橋されたペプチドにおけるシステインとＤＢＭＮＢとの一方の結合を切断した。これを混合液（ＩＩ）とした。
混合液（Ｉ）および混合液（ＩＩ）について、室温で円偏光二色性（Circular Dichroism（ＣＤ））スペクトルを観測した。用いた試料液を以下に示す。
【００６３】
（ｉ） 混合液（Ｉ）
（ｉｉ） 混合液（ＩＩ）
（ｉｉｉ） 未架橋のペプチドＲＬＰ１ １００ｍｉｃｒｏＭ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）
（ｉｖ） 分子内架橋されたペプチド（ただし、紫外線照射は行われていない。）１００ｍｉｃｒｏＭ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）
（ｖ） ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ ２０ｍｉｃｒｏＭ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）
（ｖｉ） 未架橋のペプチドＲＬＰ１とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で混合し、未架橋のペプチドが１００ｍｉｃｒｏＭ、ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎが２０ｍｉｃｒｏＭとされた混合液
【００６４】
結果を、図７に示す。グラフの横軸は円偏光の波長（Wavelength/nm）を、縦軸は円偏光二色性の大きさ（Δθ/mdeg）を表す。図７のグラフにおいて、darkは混合液（Ｉ）のＣＤスペクトル（ｉ）から分子内架橋されたペプチドのＣＤスペクトル（ｉｖ）とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎのＣＤスペクトル（ｖ）とを差し引いた差スペクトルを示す。また、lightは混合液（ＩＩ）のＣＤスペクトル（ｉｉ）から混合液（Ｉ）のＣＤスペクトル（ｉ）を差し引いた差スペクトルを示す。
【００６５】
darkの差スペクトルには正や負のピークが検出されず、分子内架橋されたペプチドとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎの特異的認識部位における相互作用が存在しないことが示された。lightのスペクトルには２２０ｎｍ付近に正のピークが観測された。
一方、未架橋のペプチドＲＬＰ１とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとの混合液のＣＤスペクトル（ｖｉ）から、未架橋のペプチドのＣＤスペクトル（ｉｉｉ）とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎのＣＤスペクトル（ｖ）とを差し引いた差スペクトルにおいて、２２０ｎｍ付近に正のピークが観測された。このピークは、複合体形成によるものである。
【００６６】
これらの結果より、紫外線照射によって、分子内架橋されたペプチドの環状構造が解かれ、前記環状構造が解かれたペプチドとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとが複合体形成したことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
図１は、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを製造する方法の実施形態例を示す図である。
図２は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ膜透過性ペプチドを付加した本発明のペプチドの一例を示す図である。
図３は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ磁気ビーズに固定された本発明のペプチドの一例を示す図である。
図４は、本発明の反応制御方法の一例を模式的に示す図である。
図５は、実施例で得られた分子内架橋されたペプチドの質量分析結果を示すチャートである。
図６は、実施例で得られた未架橋のペプチド (ＲＬＰ１−２Ｃ)、分子内架橋されたペプチド、及び分子内架橋されたペプチドに紫外線照射を行ったものをサンプルとするＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
図７は、実施例で得られた混合液（Ｉ）と混合液（ＩＩ）とをサンプルとするＣＤスペクトルの結果を示す図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> SHIMADZU CORPORATION
<120> Optical Controllability Peptide and Method for Controlling Reaction of Forming Peptide-Protein Complex Using the Optical Controllability Peptide
<130> G106141WO
<150> JP 2005-238275
<151> 2005-08-19
<160> 2
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Designed peptide to act on PI3-Kα SH3 domain
<400> 1
Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser Lys
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Designed peptide to act on PI3-Kα SH3 domain
<400> 2
Cys Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser LysCys
1 5 10
【０００１】
本発明は、ペプチド−蛋白質複合体形成の光制御に関し、より詳しくは、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチド、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを製造する方法、及び光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを用いたペプチド−蛋白質複合体形成の光制御に関する。
【０００２】
【背景技術】
一般的に、蛋白質と相互作用する活性ペプチドは、光反応性をもたない。
蛋白質のフォールディング反応に関する構造解析の分野において、T.Okuno, S.Hirota, and O.Yamauchi, Biochemistry, 39, 7538-7545(2000)には、光照射により解離する修飾基を蛋白質に導入して蛋白質の構造を不安定なものとし、前記の修飾基を導入した蛋白質に光照射して蛋白質のフォールディング反応を開始させる技術が記載されている。
Y.Tatsu, T.Nishigaki, A.Darszon, and N.Yumoto, FEBS Letters, 525, 20-24(2002)には、ペプチド−蛋白質複合体形成の光制御について、ペプチドに光照射により解離する修飾基を導入し、光照射により修飾基が外れることを利用して、ペプチドと蛋白質との複合体形成を制御する試みが記載されている。
しかし、ペプチドに前記の修飾基を導入しても、ペプチドの構造変化を制御できておらず、ペプチドによる蛋白質の認識を完全に遮蔽することが困難であった。また、生理活性な前記ペプチドを体内に導入して利用しようとした場合、酵素によって分解されてしまうという欠点があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の目的
本発明の目的は、蛋白質認識ペプチドと目的蛋白質との複合体形成において、蛋白質を認識するための構造変化が光制御される新規なペプチドを用いて、ペプチド−蛋白質複合体形成を光制御する方法を提供することである。
【０００４】
発明の概要
本発明者等は、上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを用いることにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。
【０００５】
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１） 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、光照射して前記光解離性架橋基を解離させて前記環状構造を解き、前記環状構造を解かれたペプチドと機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させるための蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチド。
【０００６】
（２） 前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基：
【化７】
（式中、Ｒは二価基を表す。）
である、（１）に記載のペプチド。
【０００７】
（３） 前記光解離性架橋基が、
【化８】
（式中、Ｒはアルキレン基を表す。）
である、（１）に記載のペプチド。
【０００８】
（４） 前記光解離性架橋基が、
【化９】
である、（１）に記載のペプチド。
【０００９】
（５） 前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシステイン同士間、リジン同士間、又はシステインとリジンとの間のいずれかを架橋している、（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
【００１０】
（６） 膜透過性ペプチドが付加されている、（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチド。
【００１１】
（７） ペプチドの一端がナノビーズに固定されている、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチド。
【００１２】
（８） 前記ナノビーズが磁気ビーズである、（７）に記載のペプチド。
【００１３】
（９） 架橋されるべきペプチド分子の２箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる、（１）に記載のペプチドを製造する方法。
【００１４】
（１０） 前記ペプチド分子として、前記２箇所の側鎖官能基間に機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドを含むペプチド分子を用いる、（９）に記載のペプチドの製造方法。
【００１５】
（１１） 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
【化１０】
（式中、Ｒは二価基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
を用いる、（９）又は（１０）に記載のペプチドの製造方法。
【００１６】
（１２） 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
【化１１】
（式中、Ｒはアルキレン基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
を用いる、（９）又は（１０）に記載のペプチドの製造方法。
【００１７】
（１３） 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
【化１２】
（式中、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
を用いる、（９）又は（１０）に記載のペプチドの製造方法。
【００１８】
（１４） 前記２箇所の側鎖官能基が、システインのＳＨ基とＳＨ基、リジンのＮＨ３ ＋基とＮＨ３ ＋基、又はシステインのＳＨ基とリジンのＮＨ３ ＋基のいずれかである、（９）〜（１３）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
【００１９】
（１５） 前記架橋反応によって得られたペプチドに膜透過性ペプチドを付加する、（９）〜（１４）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
（１６） 前記架橋反応によって得られたペプチドをナノビーズに固定する、（９）〜（１５）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
（１７） 前記ナノビーズが磁気ビーズである、（１６）に記載のペプチドの製造方法。
【００２０】
（１８） 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドに、
光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。
【００２１】
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドを生体内へ投与して、
前記環状構造を形成しているペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。
前記光照射する光が紫外線である、前記の反応制御方法。
前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基：
【００２２】
【化１３】
（式中、Ｒは二価基を表す。）
である、前記の反応制御方法。
【００２３】
前記光解離性架橋基が、
【化１４】
（式中、Ｒはアルキレン基を表す。）
である、前記の反応制御方法。
【００２４】
前記光解離性架橋基が、
【化１５】
である、前記の反応制御方法。
【００２５】
前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシステイン同士間、リジン同士間、又はシステインとリジンとの間のいずれかを架橋している、前記の反応制御方法。
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドに、膜透過性ペプチドが付加されている、前記の反応制御方法。
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドの一端がナノビーズに固定されている、前記の反応制御方法。
前記ナノビーズが磁気ビーズである、前記の反応制御方法。
光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドの一端を磁気ビーズに固定させ、
前記磁気ビーズに固定されたペプチドを生体内へ投与して、
前記磁気ビーズに固定されたペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれた磁気ビーズに固定されたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとを反応させて複合体を形成させ、
形成された複合体を磁石にて回収し、
回収された複合体を質量分析装置を用いて同定する方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを用いることにより、光照射を開始としてペプチドの構造変化を制御できる。光解離性架橋基を介して分子内で架橋された蛋白質認識ペプチドは前記光解離性架橋基と共に環状構造を形成しており、目的蛋白質と共存させても、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることができないため、ペプチドと蛋白質は相互作用しない。しかし、ペプチドに光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解かれ、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが可能となるため、ペプチドと蛋白質が相互作用して複合体形成を開始する。
前述のように、光によってその環状構造の開環が制御され、それによってペプチド−蛋白質複合体形成が制御されるペプチドは、いわゆる光制御ペプチドである。
また、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドが環状構造を有することにより酵素によって分解されにくく、生体内に前記蛋白質認識ペプチドを導入した場合でも多くを有効利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
まず、本発明の新規な環状構造を有するペプチドについて説明する。本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドは、前記架橋基と共に環状構造を形成している。
後述する複合体形成のためには、環状構造を形成している部分には、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドであることが重要である。このような蛋白質認識部位は、もともとペプチドに存在してもよく、また人為的に付加されたものであってもよい。
本明細書において、「目的蛋白質」とは、機能蛋白質及びリガンドと同義である。「機能蛋白質」とは、生体内の酵素や受容体等をいう。「蛋白質認識ペプチド」とは、蛋白質認識部位を有するペプチドであり、目的蛋白質と相互作用してペプチド−蛋白質複合体を形成する。
【００２８】
本発明の光解離性架橋基として、次の化学式（I）で表される二価の連結基が挙げられる。
【化１６】
（式中、Ｒは二価基を表す。）
【００２９】
具体的には、次の化学式（II）で表される二価の連結基が挙げられる。
【化１７】
（式中、Ｒはアルキレン基を表す。）
【００３０】
上述のように式中のＲとして、結合可能な二価の有機基が挙げられ、二価の有機基として例えばアルキレン基が挙げられる。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。アルキレン基は適宜置換基を有していてもよい。アルキレン基は、上記式において、−ＣＨ２−基のパラ位を占めるとよい。
本発明の光解離性架橋基として、さらに具体的には、次の化学式（III）で表される二価の連結基が挙げられる。光で解離するものがあれば、他の光解離性架橋基も用いることができる。
【００３１】
【化１８】
【００３２】
前記光解離性架橋基は、ペプチド分子内のシステイン同士間、リジン同士間、又はシステインとリジンの間のいずれかを架橋することが好ましい。システイン及びリジンは、もともとペプチド分子内に存在するものであってもよく、また、ペプチドに人為的に付加されたものであってもよい。
【００３３】
次に、前述した本発明の新規な環状構造を有するペプチドの製造方法について説明する。本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドの製造方法では、架橋されるべきペプチド分子の２箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる。
原料となる架橋されるべきペプチド分子は、天然に存在するものであってもよく、合成されたものであってもよい。
【００３４】
架橋反応に用いる光解離性架橋基を含む化合物としては、次の化学式（IV）で表される化合物が挙げられる。
【化１９】
（式中、Ｒは二価基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
【００３５】
具体的には、次の化学式（V）で表される化合物が挙げられる。
【化２０】
（式中、Ｒはアルキレン基を表し、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
上述のように式中のＲとして、結合可能な二価の有機基が挙げられ、二価の有機基として例えばアルキレン基が挙げられる。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。アルキレン基は適宜置換基を有していてもよい。
ハロゲン原子としては、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）等が挙げられる。
【００３６】
前記架橋反応に用いる光解離性架橋基を含む化合物として、さらに具体的には、次の化学式（VI）で表される化合物が挙げられる。
【化２１】
（式中、Ｘは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）
【００３７】
その一例として、次の化学式（VII）で表される２，５−ジ（ブロモメチル）ニトロベンゼン（2,5-Di(bromomethyl)nitrobenzene（ＤＢＭＮＢ））がある。Ｘが臭素であることにより、後述する光解離性架橋基がシステインのＳＨ基間を架橋する場合に、ＳＨ基への修飾が容易である。
【００３８】
【化２２】
【００３９】
前記２箇所の側鎖官能基は、システインのＳＨ基とＳＨ基、リジンのＮＨ３ ＋基とＮＨ３ ＋基、又はシステインのＳＨ基とリジンのＮＨ３ ＋基のいずれかであることが好ましい。
架橋反応は、当技術分野で通常用いられる方法によって行われる。
【００４０】
図１は、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを製造する方法の実施形態例を示す。
図１において、架橋されるべき鎖状のペプチド分子（１）が、光解離性架橋基を含む化合物２，５−ジ（ブロモメチル）ニトロベンゼン（ＤＢＭＮＢ））と反応して、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチド（２）が製造される。図１では、ペプチド分子内のシステインのＳＨ基間を架橋するため、ＳＨ基への修飾の容易な臭素を有するＤＢＭＮＢを用いている。
図１では、ペプチド分子内の２箇所のシステインのＳＨ基とＤＢＭＮＢとが反応している。システインのＳＨ基とＤＢＭＮＢのＢｒが結合するＣＨ２基とが反応し図のように架橋構造を有するペプチドが製造される。架橋反応は、当技術分野で通常用いられる方法によって行われる。
図１の架橋構造を有するペプチドは、光照射すると、ニトロ基に隣接する−ＣＨ２基とＳとの結合が切断され、環状構造は１箇所で切断される。ペプチドに残った架橋基の残基は、ペプチドが立体構造をとることを妨げず、また目的蛋白質と複合体を形成する場合にも複合体形成を妨げない。
【００４１】
本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドに、膜透過性ペプチドを付加してもよい。光解離性架橋基が膜透過性ペプチド分子の側鎖官能基と誤って架橋反応しないために、膜透過性ペプチドは架橋反応が終了してから付加することが好ましい。膜透過性ペプチドは、環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がある場合には、鎖状部分の一端に付加されることが好ましい。環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がない場合には、環状構造を形成している部分に直接付加されてもよい。膜透過性ペプチドを付加することにより、細胞内にペプチドを導入することが可能になる。
細胞内に本発明のペプチドを導入する方法として、上述のように膜透過性ペプチドを付加する方法の他に、通常のインジェクションや、電気パルスによって導入する方法がある。後述するように、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドがナノビーズに固定されている場合には、ガス圧や火薬を使って打ち込む方法がある。
【００４２】
図２は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ膜透過性ペプチドを付加した本発明のペプチドの一例である。図２では、前記環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分の一端に膜透過性ペプチドが付加されている。
図２のペプチドは、膜透過性ペプチドが付加されていることにより体内に投与された後膜内に容易に取り込まれる。光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解け、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが可能になるため、膜内の目的蛋白質と相互作用して複合体を形成することができる。
【００４３】
本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドは、ペプチドの一端がナノビーズに固定されていてもよい。ナノビーズは、環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がある場合には、鎖状部分の一端に付加される。環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がない場合には、環状構造を形成している部分の一箇所に直接付加されてもよい。
前述のように光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドに膜透過性ペプチドが付加されている場合には、前記膜透過性ペプチドを介してナノビーズに固定されてもよい。
前記ナノビーズは磁気ビーズであってもよい。磁気ビーズに固定されたペプチドは、体内に投与された場合に、磁石によって回収することができる。
【００４４】
図３は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ磁気ビーズに固定された本発明のペプチドの一例である。図３では、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドの一端が磁気ビーズに固定されている。図３のペプチドは、体内に投与された後光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解け、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが可能になるため、体内の目的蛋白質と相互作用して複合体を形成することができる。形成された複合体は磁石で回収することができるため、回収物の解析が可能となる。
【００４５】
次に、前述した本発明の新規な環状構造を有するペプチドを用いた、ペプチド−蛋白質複合体形成の反応制御方法について説明する。本発明の反応制御方法は、光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドに、光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる反応制御方法である。
光は、用いられる光解離性架橋基を解離させることができるあらゆる波長の光を用いることができる。
【００４６】
図４は、本発明の反応制御方法の一例を模式的に示す。以下、図４を参照して本発明のペプチド−蛋白質複合体形成の反応制御法を説明する。
図４においては、機能蛋白質として細胞内シグナル伝達蛋白質において広くみられるＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ（ドメイン）蛋白質を用いている。また、環状構造を有するペプチドとして、環状構造を形成している部分にＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎの認識部位を有し、ＤＢＭＮＢを介して分子内で架橋されたペプチドを用いている。
ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎを認識するペプチドは、ポリプロリンタイプＩＩへリックス構造を有するが、図４に示すようにＤＢＭＮＢを介して架橋している場合には自由な立体構造をとることができず、ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎと共存しても複合体を形成しない。
【００４７】
架橋されたペプチドに光照射すると、光解離性架橋基が解離してペプチドは本来の立体構造をとることができＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎを認識するため、図４に模式的に示されている複合体を形成することができる。以上のようにして、機能蛋白質ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ認識ペプチドとの複合体形成が光制御される。
【００４８】
前述の光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドは、環状構造を有するので、生体内に投与しても酵素によって分解されないため、生体内におけるペプチド−蛋白質複合体形成の光制御も可能である。
光は、用いられる光解離性架橋基を解離させることができるあらゆる波長の光を用いることができる。今回用いている架橋基では、紫外線の反応効率が良いため、紫外線を用いている。
【００４９】
さらに、本発明の複合体を質量分析装置を用いて同定する方法を説明する。本発明は、光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドの一端を磁気ビーズに固定させ、前記磁気ビーズに固定されたペプチドを生体内へ投与して、前記磁気ビーズに固定されたペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれた磁気ビーズに固定されたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとを反応させて複合体を形成させ、形成された複合体を磁石にて回収し、回収された複合体を質量分析装置を用いて同定する方法である。
【００５０】
前記ペプチドは、膜透過性ペプチドを介して磁気ビーズに固定されてもよい。膜透過性ペプチドを付加することにより、生体内に投与した際に膜内に容易に取り込まれる。
また、前記環状構造を形成している部分に受容体の構造を導入しておき、磁気ビーズに固定して生体内に投与する。前述の受容体の構造が導入されたペプチドは、生体内で受容体と遭遇しても相互作用しないが、光照射することにより、前記光解離性架橋基が解離して環状構造が解かれ、ペプチドと受容体と反応する生理活性物質との相互作用が可能になり、複合体が形成される。形成された複合体を磁石にて回収し、回収された複合体を質量分析装置を用いて同定すれば、前記受容体と反応する生理活性物質が何であるかを解析同定することができる。
【実施例】
【００５１】
１）光解離性架橋基を含む化合物ＤＢＭＮＢの合成
５０ ｍｌのナスフラスコに、２，５−ジ（ヒドロキシメチル）ニトロベンゼン（2,5-Di(hydroxymethyl)nitrobenzene） ０．９２ｇ（５ｍｍｏｌ）、トリフェニルフォスフィン（triphenylphosphine）２．６２ｇ（１０ｍｍｏｌ）、及びカーボン テトラブロマイド（carbon tetrabromide） ３．３２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を入れ、脱水ジエチルエーテル２０ｍｌに懸濁して懸濁液を得た。次に、容器内を窒素置換し、酸素及び外気の水分が入らないようにセプタムで密栓した。
【００５２】
前記容器内の懸濁液を恒温槽で２５℃に保ちながら６時間攪拌し、その後室温で２日間攪拌した。得られた反応液をエバポレーターで減圧して溶媒を留去した。残渣を数１０ｍｌのクロロホルムで溶かし、シリカゲルのカラム（直径２．５ｃｍＸ３ｃｍ）を通過させ、溶出液を全て回収した。さらに洗浄用のクロロホルム（約２００ｍｌ）をカラムに通し、溶出液に色が出なくなるまで回収した。回収した溶液を５００ｍｌのナスフラスコに移し、エバポレーターに取り付け４０℃でクロロホルムを減圧除去した。
得られた反応物をスパチュラの先に少量取り、３ｍｌ程度のアセトンで薄めた後、薄層板につけ、ヘキサン（hexane） : 酢酸エチル（ethyl acetate） = ５：１（容量比）混合溶媒で展開し、目的物の有無を紫外線で確認した。目的物は薄層板の開始線のすぐ上に検出された。
【００５３】
反応物を数１０ｍｌのヘキサンに溶かし、ヘキサンで懸濁・沈殿させたシリカゲルに通した。さらに、ヘキサン : 酢酸エチル= ５：１（容量比）の混合溶媒をカラムに通し、溶出液を約４０ｍｌのフラクションに分けて回収し、それぞれのフラクションについて薄層クロマトグラフィーを用いて不純物の有無を調べた。純粋なフラクションを目的物質が溶出されなくなるまで回収した。回収したフラクションをナスフラスコに移し、エバポレーターで溶媒を留去した。残渣を回収後、遮光して保存した。
【００５４】
上述のようにして得られた化合物を、ＥＩ＋ ＭａｓｓでＪＥＯＬ ＧＣｍａｔｅ、溶媒クロロホルム、２０ｅＶの条件で質量分析を行ったところ、得られた化合物は、次の化学式（VII）で表される２，５−ジ（ヒドロキシメチル）ニトロベンゼン（ＤＢＭＮＢ）であることが確認された。
【００５５】
【化２３】
【００５６】
２）ペプチド分子と光解離性架橋基を含む化合物ＤＢＭＮＢとの架橋反応
プロリンリッチなペプチド分子ＲＬＰ１：Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser Lys （配列表の配列番号１）の両端にシステインをつけたペプチドＲＬＰ１−２Ｃ：Cys Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser Lys Cys （配列表の配列番号２）をペプチドの固相合成法により合成した。
【００５７】
ＲＬＰ１−２Ｃと上記１）において合成されたＤＢＭＮＢとを、下記の手順で架橋反応させ、目的の分子内架橋されたペプチドを単離精製した。
前処理として、ＲＬＰ１−２Ｃに2-メルカプトエタノールを加えてＳ−Ｓ結合を切断した後、透析により2-メルカプトエタノールを除去した。前処理したＲＬＰ１−２Ｃ（２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ）、ｐＨ７．０）／ＤＢＭＮＢ（ジメチルフォルムアミド）＝９／１（体積比）で混合させて、混合後のＲＬＰ１−２ＣとＤＢＭＮＢの濃度がそれぞれ１０μＭになるように調整した。調製した混合液を５０℃で４０分架橋反応させた。
得られたペプチドを陽イオン交換カラムＣＭ５２に吸着させた。前記カラムを１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗って余分なＤＢＭＮＢ等を除いた。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した３ＭのＮａＣｌでペプチドを溶出させた。次に、得られた溶出液についてＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られたペプチドを超純水（ミリＱ水）で透析して脱塩し、凍結乾燥した。
【００５８】
上述のようにして得られた分子内架橋されたペプチドについて、以下の条件で質量分析を行った。
使用装置：AXIMA-CFR レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（島津製作所製）
引き出し電圧：２０kV
飛行モード：Reflectron
検出イオン：Positive
マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)） 10mg/ml in 0.1% トリフルオロ酢酸、50% アセトニトリル（MeCN）飽和溶液
測定：レーザー光での分解を考慮して、積算回数１０、５０、２００の３回の測定を行った。
【００５９】
結果を図５に示す。グラフの横軸は質量／電荷（Mass/Charge）、縦軸はイオンの相対強度を示す。グラフの上段、中段、下段はそれぞれ積算回数２００回、５０回、１０回の測定結果を示す。
積算回数５０回において、主なピークとして１２４８．６４、１２８０．７３、１２９３．１９、１３１１．９１、１３２４．６６、１４３３．７０、１４５７．７１、１４５９．７４、１４７３．６７が観測され、得られたペプチドは、ＲＬＰ１−２ＣがＤＢＭＮＢにより分子内で架橋されたペプチドであることが確認できた。
【００６０】
次に、未架橋のペプチド(ＲＬＰ１−２Ｃ)、分子内架橋されたペプチド、及び、分子内架橋されたペプチドに紫外線照射を行ったものについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図６に示す。レーンＭはマーカー、レーン１，２は未架橋のペプチド、レーン３は分子内架橋されたペプチド、レーン４は分子内架橋されたペプチドに紫外線照射を行ったものについての結果である。その結果、レーン３を見ると、レーン１，２との比較から分子内架橋されたペプチドは環状構造を有し、分子サイズがコンパクトであることが確認された。
なお、レーン５は分子内架橋されたペプチドと後述するＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとを共存させた混合液に紫外線を照射したものについての結果である。
【００６１】
３）ペプチド−蛋白質複合体形成の光制御
機能蛋白質としてＰＩ３−ＫαのＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ蛋白質を用いた。ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎはＲＬＰ１と相互作用する。上述のようにして得られた分子内架橋されたペプチドとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で混合し、分子内架橋されたペプチドが１００ｍｉｃｒｏＭ、ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎが２０ｍｉｃｒｏＭとされた混合液（Ｉ）を得た。
【００６２】
次に、混合液（Ｉ）に紫外線照射を行った。紫外線照射機としてContinuum社製Minilite IIを用い、波長３５５ｎｍのパルス光（Ｎｄ−ＹＡＧレーザーの３倍波、パルス幅５ｎｓ、１０Ｈｚ、パルス強度４ｍＪ／ｃｍ２）を４℃で３０分間照射した。紫外線を照射することによって分子内架橋されたペプチドにおけるシステインとＤＢＭＮＢとの一方の結合を切断した。これを混合液（ＩＩ）とした。
混合液（Ｉ）および混合液（ＩＩ）について、室温で円偏光二色性（Circular Dichroism（ＣＤ））スペクトルを観測した。用いた試料液を以下に示す。
【００６３】
（ｉ） 混合液（Ｉ）
（ｉｉ） 混合液（ＩＩ）
（ｉｉｉ） 未架橋のペプチドＲＬＰ１ １００ｍｉｃｒｏＭ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）
（ｉｖ） 分子内架橋されたペプチド（ただし、紫外線照射は行われていない。）１００ｍｉｃｒｏＭ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）
（ｖ） ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ ２０ｍｉｃｒｏＭ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）
（ｖｉ） 未架橋のペプチドＲＬＰ１とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で混合し、未架橋のペプチドが１００ｍｉｃｒｏＭ、ＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎが２０ｍｉｃｒｏＭとされた混合液
【００６４】
結果を、図７に示す。グラフの横軸は円偏光の波長（Wavelength/nm）を、縦軸は円偏光二色性の大きさ（Δθ/mdeg）を表す。図７のグラフにおいて、darkは混合液（Ｉ）のＣＤスペクトル（ｉ）から分子内架橋されたペプチドのＣＤスペクトル（ｉｖ）とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎのＣＤスペクトル（ｖ）とを差し引いた差スペクトルを示す。また、lightは混合液（ＩＩ）のＣＤスペクトル（ｉｉ）から混合液（Ｉ）のＣＤスペクトル（ｉ）を差し引いた差スペクトルを示す。
【００６５】
darkの差スペクトルには正や負のピークが検出されず、分子内架橋されたペプチドとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎの特異的認識部位における相互作用が存在しないことが示された。lightのスペクトルには２２０ｎｍ付近に正のピークが観測された。
一方、未架橋のペプチドＲＬＰ１とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとの混合液のＣＤスペクトル（ｖｉ）から、未架橋のペプチドのＣＤスペクトル（ｉｉｉ）とＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎのＣＤスペクトル（ｖ）とを差し引いた差スペクトルにおいて、２２０ｎｍ付近に正のピークが観測された。このピークは、複合体形成によるものである。
【００６６】
これらの結果より、紫外線照射によって、分子内架橋されたペプチドの環状構造が解かれ、前記環状構造が解かれたペプチドとＰＩ３−Ｋα ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎとが複合体形成したことが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
図１は、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを製造する方法の実施形態例を示す図である。
図２は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ膜透過性ペプチドを付加した本発明のペプチドの一例を示す図である。
図３は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するペプチドが含まれており、且つ磁気ビーズに固定された本発明のペプチドの一例を示す図である。
図４は、本発明の反応制御方法の一例を模式的に示す図である。
図５は、実施例で得られた分子内架橋されたペプチドの質量分析結果を示すチャートである。
図６は、実施例で得られた未架橋のペプチド (ＲＬＰ１−２Ｃ)、分子内架橋されたペプチド、及び分子内架橋されたペプチドに紫外線照射を行ったものをサンプルとするＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
図７は、実施例で得られた混合液（Ｉ）と混合液（ＩＩ）とをサンプルとするＣＤスペクトルの結果を示す図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> SHIMADZU CORPORATION
<120> Optical Controllability Peptide and Method for Controlling Reaction of Forming Peptide-Protein Complex Using the Optical Controllability Peptide
<130> G106141WO
<150> JP 2005-238275
<151> 2005-08-19
<160> 2
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Designed peptide to act on PI3-Kα SH3 domain
<400> 1
Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser Lys
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Designed peptide to act on PI3-Kα SH3 domain
<400> 2
Cys Arg Lys Leu Pro Pro Arg Ser LysCys
1 5 10
Claims (18)
- 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、光照射して前記光解離性架橋基を解離させて前記環状構造を解き、前記環状構造を解かれたペプチドと機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させるための蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチド。
- 前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基：
である、請求項１に記載のペプチド。 - 前記光解離性架橋基が、
である、請求項１に記載のペプチド。 - 前記光解離性架橋基が、
- 前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシステイン同士間、リジン同士間、又はシステインとリジンとの間のいずれかを架橋している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
- 膜透過性ペプチドが付加されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
- ペプチドの一端がナノビーズに固定されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
- 前記ナノビーズが磁気ビーズである、請求項７に記載のペプチド。
- 架橋されるべきペプチド分子の２箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる、請求項１に記載のペプチドを製造する方法。
- 前記ペプチド分子として、前記２箇所の側鎖官能基間に機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドを含むペプチド分子を用いる、請求項９に記載のペプチドの製造方法。
- 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
を用いる、請求項９又は１０に記載のペプチドの製造方法。 - 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
を用いる、請求項９又は１０に記載のペプチドの製造方法。 - 前記光解離性架橋基を含む化合物として、
を用いる、請求項９又は１０に記載のペプチドの製造方法。 - 前記２箇所の側鎖官能基が、システインのＳＨ基とＳＨ基、リジンのＮＨ３ ＋基とＮＨ３ ＋基、又はシステインのＳＨ基とリジンのＮＨ３ ＋基のいずれかである、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- 前記架橋反応によって得られたペプチドに膜透過性ペプチドを付加する、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- 前記架橋反応によって得られたペプチドをナノビーズに固定する、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
- 前記ナノビーズが磁気ビーズである、請求項１６に記載のペプチドの製造方法。
- 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する蛋白質認識部位を備えたペプチドが含まれているペプチドに、
光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。
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