WO2007021016A1

WO2007021016A1 - 光制御ペプチド及び光制御ペプチドを用いたペプチド－蛋白質複合体形成の制御方法

Info

Publication number: WO2007021016A1
Application number: PCT/JP2006/316278
Authority: WO
Inventors: Shun Hirota; Yuji Hamazaki
Original assignee: Shimadzu Corporation
Priority date: 2005-08-19
Filing date: 2006-08-14
Publication date: 2007-02-22
Also published as: JP4645650B2; JPWO2007021016A1; US20090042235A1

Abstract

蛋白質認識ペプチドと目的蛋白質との複合体形成において、蛋白質を認識するための構造変化が光制御されるペプチドを用いて、ペプチド-蛋白質複合体形成を光制御する方法を提供する。光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチド及びその製造方法。また、光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に機能蛋白質又はリガンドに対応するエピトープを備えたペプチドが含まれているペプチド及びその製造方法。前記エピトープを備えたペプチドか含まれているペプチドに、光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたペプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。

Description

明細書光制御ぺプチド及び光制御ぺプチドを用いたぺプチドー蛋白質複合体形成の制御方法技術分野

本発明は、ペプチド一蛋白質複合体形成の光制御に関し、より詳しくは、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたぺプチド、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたべプチドを製造する方法、及び光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたぺプチドを用いたぺプチドー蛋白質複合体形成の光制御に関する。背景技術

一般的に、蛋白質と相互作用する活性ぺプチドは、光反応性をもたない。

蛋白質のフ矛一ルディング反応に関する構造角 ¾ffの分野において、 T.Okuno, S.Hirota, and O.Yamauchi, Biochemistry, 39, 7538-7545(2000)には、光照射によリ解離する修飾基を蛋白質に導入して蛋白質の構造を不安定なものとし、前記の修飾基を導入した蛋白質に光照射して蛋白質のフォールディング反応を開始させる技術が記載されている。

YTatsu, T.Nishigaki.ADarszon, and N.Yumoto, FEBS Letters, 525， 20-24(2002)には、ぺプチドー蛋白質複合体形成の光制御について、ぺプチドに光照射により解離する修飾基を導入し、光照射により修飾基が外れることを利用して、ペプチドと蛋白質との複合体形成を制御する試みが記載されている。

しかし、ペプチドに til己の修飾基を導入しても、ペプチドの構造変化を制御できておらず、ペプチドによる蛋白質の認識を完全に遮蔽することが困難であった。また、生理活性な前記べプチドを体内に導入して利用しょうとした場合、酵素によって分解されてしまうという欠点があった。発明の開示

発明の目的

本発明の目的は、蛋白質認識ペプチドと目的蛋白質との複合体形成において、蛋白質を認識するための構造変化が光制御される新規なぺプチドを用いて、ぺプチドー蛋白質複合体形成を光制御する方法を提供することである。発明の概要

本発明者等は、上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたべプチドを用いることにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。

本発明には、以下の発明が含まれる。

( 1 ) 光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたべプチド。

( 2 ) 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているべプチド。嫌己光解離性架橋基が、次の二価の連結基

(式中、 Rは二価基を表す。)

である、（1 ) 又は（2 ) に記載のペプチド。

(4) IH光解離性架橋基が、

(式中、 Rはアルキレン基を表す。）

である、（1) 又は（2) に記載のペプチド。

(5) 前記光解離性架橋基が、

である、（1) 又は（2) に記載のペプチド。

(6) 前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシスティン同士間、リジン同士間、又はシスティンとリジンとの間のし、ずれかを架橋している、（1)〜（5)のし、ずれかに記載のぺプチド。

( 7 ) 膜性べプチドが付加されている、（ 1. ) ~ ( 6 )のし、ずれかに記載のぺプチド、。

( 8 ) ぺプチドの一端がナノビーズに固定されている、（ 1 ) 〜（ 7 )のし、ずれかに記載のぺプチド。

(9) 1515ナノビーズが磁気ビーズである、（8) に記載のペプチド。 (10) 架橋されるべきペプチド分子の 2箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる、（1) に記載のペプチドを製造する方法。

(11) 前記べプチド分子として、前記 2箇所の側鎖官能基間に機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドを含むぺプチド分子を用いる、（ 10)に記載のべプチドの製造方法。

(12) 前記光解離性架橋基を含む化合物として、

(式中、！¾はニ価基を表し、 Xは脱離性基又はハロゲン原子を表す。)

を用いる、（10) 又は（1 1) に記載のペプチドの製造方法。

(13) 前記光解離性架橋基を含む化合物として、

(式中、 Rはアルキレン基を表し、 Xは脱離性基又はハロゲン原子を表す。)

を用いる、（10) 又は（1 1) に記載のペプチドの製造方法。

( 14) 前記光解離性桀橋基を含む化合物として、

(式中、 Xは脱離性基叉はハロゲン原子を表す。）

を用いる、（10) 又は（1 1) に記載のペプチドの製造方法。

(15) 前記 2箇所の側鎖官能基が、システィンの S H基と S H基、リジンの N H ₃ ⁺ 基と NH₃+基、又はシスティンの SH基とリジンの NH ₃+基のいずれかである、（10) 〜（14) のし、ずれかに記載のペプチドの製造方法。

(16) Ϊ己架橋反応によって得られたぺプチドに膜性ぺプチドを付加する、（ 1 0) ~ (15) のいずれかに記載のペプチドの製造方法。

(17) 前記架橋反応によって得られたぺプチドをナノビーズに固定する、（ 10 )〜 (16) のしゝずれかに記載のペプチドの製造方法。

(18) 前記ナノビーズが磁気ビーズである、 (17) に記載のぺプチドの製造方法。

(19) 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているべプチドに、

光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたぺプチドと MIB機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。 (20) 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているペプチドを生体内へ投与して前記環状構造を形成しているべプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたぺプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。

(21) 前記光照射する光が紫外線である、（19)又は（20) に記載の反応制御方法。前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基

(式中、 Rは二価基を表す。）

である、（19) ~ (21) のし、ずれかに記載の反応制御方法。

(23) 前記光解離性架橋基が.

(式中、 Rはアルキレン基を表す。) である、（19) ~ (21) のいずれかに記載の反応制御方法。 (24) 前記光解離性架橋基が、

である、（19) 〜（21) のしゝずれかに記載の反応制御方法。

(25) 前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシスティン同士間、リジン同士間、又はシスティンとリジンとの間のいずれかを架橋している、（19) ~ (24)のいずれかに記載の反応制御方法

(26) 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているべプチドに、膜透過性べプチドが付加されている、（19) 〜（25) のしゝずれかに記載の反応制御方法。

(27) 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、.前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているべプチドの一端がナノビーズに固定されている、（19) 〜（26) のしゝずれかに記載の反応制御方法。

(28) 前記ナノビーズが磁気ビーズである、 (27) に記載の反応制御方法。光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、 MIB環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピト一プを備えたぺプチドが含まれているべプチドの一端を磁気ビーズに固定させ、

前記磁気ビーズに固定されたべプチドを生体内へ投与して、

前記磁気ビーズに固定されたべプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれた磁気ビーズに固定されたぺプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとを反応させて複合体を形成させ、

形成された複合体を磁石にて回収し、

回収された複合体を質量分析装置を用いて同定する方法。本発明によれば、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドを用いる,ことにより、光照射を開始としてペプチドの構造変化を制御できる _Q光解離性架橋基を介して分子内で架橋された蛋白質認識ペプチドは前記光解離性架橋基と共に環状構造を形成しており、目的蛋白質と共存させても、ペプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることができないため、ぺプチドと蛋白質は相互作用しない。しかし、ぺプチドに光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解かれ、ぺプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが可能となるため、ペプチドと蛋白質が相互作用して複合体形成を開始する。前述のように、光によってその環状構造の開環が制御され、それによつてペプチドー蛋白質複合体形成が制御されるぺプチドは、しゝゎゆる光制御べプチドである。

また、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたべプチドが状構造を有することにより酵素によって^ されにくく、生体内に前記蛋白質認識ペプチドを導入した場合でも多くを有効利用することができる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたぺプチドを製造する方法の実施形態例を示す図である。

図 2は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するぺプチドが含まれており、 g 且つ膜透過性ぺプチドを付加した本発明のぺプチドの一例を示す図である。

図 3は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するぺプチドが含まれておリ、且つ磁気ビーズに固定された本発明のペプチドの一例を示す図である。

図 4は、本発明の反応制御方法の一例を模式的に示す図である。

図 5は、実施例で得られた分子内架橋されたぺプチドの質量分析結果を示すチヤ一トである。図 6は、実施例で得られた未架橋のぺプチド（R L P 1— 2 C)、分子内架橋されたぺプチド、及び分子内架橋されたべプチドに紫外線照射を行ったものをサンプルとする S D S

- P A G Eの結果を示す図である。

図 7は、実施例で得られた混合液 ( I ) と混合液（I I ) とをサンプルとする C Dスぺクトルの結果を示す図である。発明を実施するための形態

まず、本発明の新規な環状冓造を有するペプチドについて説明する。本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたぺプチドは、前記架橋基と共に環状構造を形成している。後述する複合体形成のためには、環状構造を形成している部分には、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピ卜一プを備えたぺプチド、すなわち蛋白質認識部位が含まれていることが重要である。このような蛋白質認識部位は、もともとべプチドに存在してもよく、また人為的に付加されたものであってもよい。

本明細書において、 Γ目的蛋白質」とは、機能蛋白質及びリガンドと同義である。「機能蛋白質」とは、生体内の瞧ゃ受容体等をいう。「蛋白質認識ペプチド」とは、蛋白質認識部位を有するぺプチドであり、目的蛋白質と相互作用してぺプチドー蛋白質複合体を形成する。

本発明の光解離性架橋基として、次の化学式 ( I ) で表される二価の連結基が挙げられる。

(式中、 Rは二価基を表す。）

具体的には、次の化学式 ( Π ) で表される二価の連結基が挙げられる。

(式中、 Rはアルキレン基を表す。）

上述のように式中の Rとして、結合可能な二価の有機基が挙げられ、二価の有機基として例えばアルキレン基が挙げられる。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。アルキレン基は適宜置換基を有していてもよい。アルキレン基は、上記式において、一C H ₂—基のパラ位を占めるとよい。

本発明の光解離性架橋基として、さらに具体的には、次の化学式（m) で表される二価の連結基が挙げられる。光で解離するものがあれば、他の光解離性架橋基も用いることができる。

前記光解離性架橋基は、ペプチド分子内のシスティン同士間、リジン同士間、又はシスティンとリジンの間のいずれかを架橋することが好ましし、。システィン及びリジンは、もともとペプチド分子内に存在するものであってもよく、また、ペプチドに人為的に付加されたものであってもよし次に、前述した本発明の新規な環状構造を有するぺプチドの製造方法について説明する。本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたぺプチドの製造方法では、架橋されるべきぺプチド分子の 2箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる。

原料となる架橋されるべきペプチド分子は、天然に存在するものであってもよく、合成されたものであってもよい。

架橋反応に用いる光解離性架橋基を含む化合物としては、次の化学式 (IV) で表される化合物が挙げられる。

具体的には、次の化学式 ( V ) で表される化合物が挙げられる。

(式中、 Rはアルキレン基を表し、 Xは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）

上述のように式中の Rとして、結合可能な二価の有機基が挙げられ、二価の有機基として例えばアルキレン基力《挙げられる。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等が挙げられる。アルキレン基は適宜置換基を有していてもよい。ハロゲン原子としては、フッ素（F)、塩素（C 1)、臭素 (Br). ヨウ素（I)等が挙げられる。

前記架橋反応に用いる光解離性架橋基を含む化合物として、さらに具体的には、次の化学式 (VI) で表される化合物が挙げられる。

(式中、 Xは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）

その一例として、次の化学式 (VII) で表される 2， 5—ジ（プロモメチル）ニトロベンゼン（2,5-Di(bramomethyl)nitrobenzene (DBMNB))がある。 X力《臭素であることによリ、後述する光解離性架橋基がシスティンの SH基間架橋する場合に、 SH基への修飾が容易であ。

前記 2箇所の側鎖官能基は、システィンの SH基と SH基、リジンの NH₃ ⁺基と NH₃ ⁺ 基、又はシスティンの S H基とリジンの N H ₃ ⁺基のいずれかであること力好ましい。架橋反応は、当技術分野で通常用いられる方法によって行われる。

図 1は、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたべプチドを製造する方法の実施形態例を示す。

図 1において、架橋されるべき鎖状のぺプチド分子 ( 1 ).が、光解離性架橋基を含む化合物 2, 5—ジ（プロモメチル）ニトロベンゼン（DBMNB)) と反応して、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチド（2) が製造される。図 1では、ペプチド分子内のシスティンの S H基間を架橋するため、 S H基への修飾の容易な臭素を有する D BM N Bを用いている。

図 1では、ペプチド分子内の 2箇所のシスティンの S H基と D BM N Bとが反応している。システィンの S H基と D B M N Bの B r力結合する C H ₂基とが反応し図のように架橋構造を有するペプチドが製造される。架橋反応は、当技術分野で通常用いられる方法によって行われる。

図 1の架橋構造を有するぺプチドは、光照射すると、ニトロ基に隣接する一 C H ₂基と Sとの結合カ沏断され、環状構造は 1箇所で切断される。ペプチドに残った架橋基の残基は、ぺプチドが立体構造をとることを妨げず、また目的蛋白質と複合体を形成する場合にも複合体形成を妨げない。

' 本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチドに、膜透過性ペプチドを付加してもよい。光解離性架橋基が膜性べプチド分子の側鎖官能基と誤って架橋反応しないために、膜 iS 性ペプチドは架橋反応が終了してから付加することが好ましい。膜舰性ペプチドは、環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がある場合には、鎖状部分の一端に付加されることが好ましい。環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がない場合には、環状構造を形成している部分に直接付加されてもよい。膜議性べプチドを付加することによリ、細胞内にぺプチドを導入することが^ r能になる。

細胞内に本発明のぺプチドを導入する方法として、上述のように膜 Jii 性ぺプチドを付加する方法の他に、通常のインジェクションや、電気パルスによって導入する方法がある。後述するように、本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたぺプチドがナノビーズに固定されている場合には、ガス圧や火薬を使って打ち込む方法がある。

図 2は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するぺプチドが含まれておリ、且つ膜性べプチドを付加した本発明のぺプチドの一例である。図 2では、前記環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分の一端に膜 ¾性べプチドが付加されている。図 2のぺプチドは、 B奠性べプチドが付加されていることによリ体内に投与された後膜内に容易に取り込まれる。光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解け、ぺプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが^ r能になるため、膜内の目的蛋白質と相互作用して複合体を形成することができる。

本発明の光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたべプチドは、ペプチドの一端がナノビーズに固定されていてもよい。ナノビーズは、環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がある場合には、鎖状部分の一端に付加される。環状構造を形成している部分以外の鎖状の部分がなし、場合には、環状構造を形成している部分の一箇所に直接付加されてもよい。

前述のように光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたぺプチドに膜性べプチドが付加されている場合には、前記膜性ペプチドを介してナノビーズに固定されてもよい。

前記ナノビーズは磁気ビーズであってもよい。磁気ビーズに固定されたペプチドは、体内に投与された場合に、磁石によって回収することができる。

図 3は、環状構造を有している部分に蛋白質認識部位を有するぺプチドが含まれておリ、且つ磁気ビーズに固定された本発明のぺプチドの一例である。図 3では、光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたべプチドの一端が磁気ビーズに固定されている。図 3のぺプチドは、体内に投与された後光照射すると、光解離性架橋基が解離して環状構造が解け、ぺプチドが蛋白質を認識するための立体構造をとることが能になるため、体内の目的蛋白質と相互作用して複合体を形成することができる。形成された複合体は磁石で回収することができるため、回収物の解析が可能となる。次に、前述した本発明の新規な環状構造を有するペプチドを用いた、ペプチド一蛋白質複合体形成の反応制御方法について説明する。本発明の反応制御方法は、光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたべプチドが含まれてし、るぺプチドに、光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたぺプチドと IB機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる反応制御方法である。

光は、用いられる光解離性架橋基を解離させることができるあらゆる波長の光を用いることができる。

図 4は、本発明の反応制御方法の一例を模式的に示す。以下、図 4を参照して本発明のぺプチドー蛋白質複合体形成の反応制御法を説明する。

図 4においては、機能蛋白質として細胞内シグナル伝達蛋白質において広くみられる P I 3-Ka SH3 doma i n (ドメイン）蛋白質を用いている。また、環状構造を有するペプチドとして、環状構造を形成している部分に P I 3— Kひ SH3 d oma i nの認識部位を有し、 DBMNBを介して分子内で架橋されたペプチドを用いている。

P I 3-K SH3 d oma i nを認識するペプチドは、ポリプロリンタイプ I I ヘリックス構造を有する力《、図 4に示すように D B M N Bを介して架橋している場合には自由な立体構造をとることができず、 P I 3— Ka SH3 d oma i ηと共存しても複合体を形成しない。

架橋されたべプチドに光照射すると、光解離性架橋基が解離してぺプチドは本来の立体構造をとることができ Ρ I 3— Κ a SH3 doma i nを認識するため、図.4に模式的に示されている複合体を形成することができる。以上のようにして、機能蛋白質 P I 3 -K SH3 d oma i ηと Ρ I 3—Κ SH3 d om a i η認識ペプチドとの複合体形成が光制御される。

前述の光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応する工ピトープを備えたぺプチドが含まれているべプチドは、環状構造を有するので、生体内に投与しても酵素によって分解されないため、生体内におけるペプチド一蛋白質複合体形成の光制御も可能である。

光は、用いられる光解離性架橋基を解離させることができるあらゆる波長の光を用いることができる。今回用いている架橋基では、紫外線の反応効率が良いため、紫外線を用いている。さら (こ、本発明の複合体を質量分析装置を用しゝて同定する方法を説明する。本発明は、光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているべプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているぺプチドの一端を磁気ビーズに固定させ、前記磁気ビーズに固定されたべプチドを生体内へ投与して、 ΙϋϊΒ磁気ビーズに固定されたぺプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれた磁気ビーズに固定されたべプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとを反応させて複合体を形成させ、形成された複合体を磁石にて回収し、回収された複合体を質量分析装置を用いて同定する方法である。

前記ペプチドは、膜舰性ペプチドを介して磁気ビーズに固定されてもよい。

ぺプチドを付加することにより、生体内に投与した際に膜内に容易に取り込まれる。また、前記環状構造を形成している部分に受容体の構造を導入しておき、磁気ビーズに固定して生体内に投与する。前述の受容体の構造が導入されたペプチドは、生体内で受容体と遭遇しても相互作用しないが、光照射することにより、前記光解離性架橋基が解離して環状構造が解かれ、ぺプチドと受容体と反応する生理活性物質との相互作用が可能になリ、複合体が形成される。形成された複合体を磁石にて回収し、回収された複合体を質量分析装置を用いて同定すれば、前記受容体と反応する生画舌性物質が何であるかを解析同定することができる。実施例

1 ) 光解離性架橋基を含む化合物 D BMN Bの合成

5 0 m lのナスフラスコに、 2， 5—ジ（ヒドロキシメチル）ニトロベンゼン (2,5-Di(hydrox methyl)nitrobenzene) 0. 9 2 g ( 5 mm o I )、トリ.フエニルフォスフィン（triphenylphosphine) 2. 6 2 g ( 1 Omm o I )、及びカーボンテ卜ラブロマイド（carbon tetrabramide) 3. 3 2 g ( 1 0 mm o I ) を入れ、脱水ジェチルエーテル 2 Om Iに懸濁して懸濁液得た。次に、雜内を窒素置換し、酸素及び外気の水分が入らないようにセプタムで密栓した。

前記容器内の懸濁液を恒温槽で 2 5°Cに保ちながら 6時間攪神し、その後室温で 2日間攪禅した。得られた反応液をエバポレーターで減圧して溶媒を留去した。残渣を数 1 Om Iのクロ口ホルムで溶かし、シリカゲルのカラム（直径 2. 5 cmX3 cm) を通過させ、溶出液を全て回収した。さらに洗浄用のクロ口ホルム（約 2 OOm l) をカラムに通し、溶出液に色が出なくなるまで回収した。回収した溶液を 5 OOm lのナスフラスコに移し、ェ /くポレータ一に取リ付け 40 °Cでク口口ホルムを減圧除去した。

得られた反応物をスパチュラの先に少量取り、 3m I程度のアセトンで薄めた後、薄層板につけ、へキサン（hexane) ：酢酸ェチル（ethyl acetate) = 5 : 1 (容量比）混合溶媒で展開し、目的物の有無を紫外線で確認した。目的物は薄層板の開始線のすぐ上に検出された。

反応物を数 1 Om Iのへキサンに溶力、し、へキサンで懸濁'沈殿させたシリカゲルに通した。さらに、へキサン：酢酸ェチル = 5： 1 (容量比）の混合溶媒をカラムに通し、溶出液を約 40m Iのフラクションに分けて回収し、それぞれのフラクションについて薄層クロマトグラフィーを用いて不純物の有無を調べた。純粋なフラクションを目的物質が溶出されなくなるまで回収した。回収したフラクションをナスフラスコに移し、エバポレータ —で溶媒を留去した。残渣を回収後、遮光して保存した。

上述のようにして得られた化合物を、 E I + Massで JEOL GCma t e、溶媒クロロホルム、 20 eVの条件で質量分析を行ったところ、得られた化合物は、次の化学式（VE) で表される 2, 5—ジ（ヒドロキシメチル）ニトロベンゼン（DBMNB) であることが確認された。

2) ぺプチド分子と光解離性架橋基を含む化合物 DBMNBとの架橋反応

プロリンリツチなぺプチド分子 R LP 1 ： Arg Lys Leu. Pro ProArg SerLys (配列表の配列番号 1 ) の両端にシスティンをつけたぺ.プチド R L P 1— 2 C： CysArg Lys Leu Pro ProArgSerLysCys (配列表の配列番号 2) をペプチドの固相合成法により合成した。

RLP1— 2Cと上記 1) において合成された DBMNBとを、下記の手順で架橋反応させ、目的の分子内架橋されたペプチドを単離精製した。

前処理として、 RLP 1—2Cに 2-メルカプトエタノールを加えて S— S結合を切断した後、透析により 2-メルカプトエタノールを除去した。前処理した RLP1—2C (20 mMリン醮籠液（KPB)、 pH7. 0) /DBMNB (ジメチルフオル厶アミド） =9 / 1 (籠比）で混合させて、混合後の RLP1—2Cと DBMN Bの濃度がそれぞれ 1 0 U Mになるように調整した。調製した混合液を 50°Cで 40分架橋反応させた。

得られたペプチドを陽イオン交換カラム CM 52に吸着させた。前記カラムを 1 OmM のリン醮 β液（ Ρ Η 7. 0 ) で洗って余分な DBMN Β等を除いた。 10 mMのリン酸緩衝液 (pH7. 0) に溶解した 3 Mの N a C Iでぺプチドを溶出させた。次に、得られた溶出液について G— 25カラムでゲルろ過を行った。得られたぺプチドを超純水（ミリ。水）で透析して脱塩し、凍結乾燥した。上述のようにして得られた分子内架橋されたぺプチドについて、以下の条件で質量分析を了った。使用装置： AXIMA-CFR レーザ一イオン化飛行時間型質量分析装置（島津製作所製）引き出し電圧： 20kV

飛行モード： Reflectran

検出イオン： Positive

マ卜リックス： —シァノー 4ーヒドロキシ桂皮酸 ( Qf-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)) 10mg/ml in 0.1% トリフルォロ酢酸、 50%ァセトニトリル（MeCN) 飽和溶液

測定：レーザー光での^を考慮して、積算回数 10、 50、 200の 3回の測定を行つた。結果を図 5に示す。グラフの横軸は質量/電荷（Mass/Charge)、縦軸はイオンの相対強度を示す。グラフの上段、中段、下段はそれぞれ積算回数 200回、 50回、 10回の測定結果を示す。

積算回数 50回において、主なピークとして 1248. 64、 1280. 73、 129 3. 19、 1311. 91、 1324. 66、 1433. 70、 1457. 71、 145 9. 74、 1473. 67カ観測され、得られたぺプチドは、し 1ー2〇が0巳1\/1 Bによリ分子内で架橋されたべプチドであることが確認できた。次に、未架橋のぺプチド（R L P 1 _ 2 C)、分子内架橋されたべプチド、及び、分子内架橋されたべプチドに紫外線照射を行ったものについて、 S D S— P A G Eを行った。結果を図 6に示す。レーン Mはマーカー、レーン 1, 2は未架橋のペプチド、レーン 3は分子内架橋されたぺプチド、レーン 4は分子内架橋されたべプチドに紫外線照射を行ったものについての結果である。その結果、レーン 3を見ると、レーン 1， 2との比較から分子内架橋されたペプチドは環状構造を有し、分子サイズがコンパクトであることが廳忍された。

なお、レーン 5は分子内架橋されたぺプチドと後述する P I 3— K SH3 d om a i nとを共存させた混合液に紫外線を照射したものにつし、ての結果である。

3) ペプチド.一蛋白質複合体形成の光制御

機能蛋白質として P I 3— K の SH3 d oma i n蛋白質を用いた。 Ρ Ι 3— Κα SH3 doma i nは RLP1と相互作用する。上述のようにして得られた分子内架橋されたペプチドと P I 3— Κ &Η3 d oma i nとを 1 OmMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)中で混合し、分子内架橋されたペプチドが 100m i c r oM、 P I 3-K S H 3 d oma i nが 2 Om i c r oMとされた混合液（ I ) を得た。

次に、混合液 ( I )に紫外線照射を行った。紫外線照射機として Continuum社製 Minilite IIを用い、波長 355 nmのパルス光（N d— Y AGレーザーの 3倍波、パルス幅 5 n s、 1 OHz、パルス強度 4m cm²) を 4 °Cで 30分間照射した。紫外線を照射することによって分子内架橋されたぺプチドにおけるシスティンと DBMN Bとの一方の結合を切断した。これを混合液（I I) とした。

混合液 ( I )および混合液 (I I)について、室温で円偏光二色性 (Circular Dichroism (C D)) スぺクトルを観測した。用いた試料液を以下に示す。

( i ) 混合液 ( I )

( i i ) 混合液（I I)

( i i i ) 未架橋のぺプチド R L P 1 100m i c r oM ( 1 OmMリン醮衝液、 P H7. 0)

( i v) 分子内架橋されたぺプチド（ただし、紫外線照射は行われていない。） 10 Om i c roM (1 OmMリン酸緩衝液、 p H7. O)

(v) P I 3-K SH3 doma i n 20m i c r o M ( 1 OmMリン酸謹液、 pH7. O)

(v i ) 未架橋のペプチド RLP 1と P I 3— K SH3 doma i nとを 10m Mリン薩衝液 (ρΉ7. 0 ) 中で混合し、未架橋のぺプチドカ《 100 m i c r οΜ,,Ρ I 3-Κθί SH3 d oma i n力 20m ί c r oMとされた混合液. 結果を、図⁷に示す。グラフの横軸は円偏光の波長 (Wavelength/nm) を、縦軸は円偏光二色性の大きさ（Δθ/mdeg) を表す。図 7のグラフにおいて、 darkは混合液（ I ) の C Dスぺク卜ル（ i ) から分子内架橋されたべプチドの CDスぺクトル（ i V) と P I 3— K SH3 d oma i ηの CDスペクトル（V)とを差し引.いた差スペクトルを示す。また、 lightは混合液（I I) の CDスペクトル（ί ί ) から混合液 ( I ) の CDスぺクトル（ i ) を差し引いた差スぺクトルを示す。

darkの差スぺクトルには正や負のピークが検出されず、分子内架橋されたペプチドと P I 3-K£¾ SH3 doma i nの特異的認識部位における相互作用力《存在しないこと力《示された。 lightのスぺクトルには 220 nm付近に正のピーク力敏則された。

一方、未架橋のペプチド RLP 1と P I 3— K SH3 doma i nとの混合液の CDスペクトル（v i ) から、未架橋のペプチドの CDスペクトル（ ί i i ) と P I 3— K SH3 d oma i nの CDスペクトル（v) とを差し引いた差スペクトルにおいて、 220 nm付近に正のピーク力《観測された。このピークは、複合体形成によるもので o¾る。

これらの結果より、紫外線照身寸によって、分子内架橋されたペプチドの環状構造が解かれ、前記環状構造が解かれたぺプチドと P I 3— K SH3 doma i nと力 ¾合体形成したことが確認できた。

Claims

1 . 光解離性架橋基を介して分子内で架橋されたペプチド。

2. 光解離性架橋基を介して内で架橋され、編己架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、'前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているべプチド。

3. 前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基：の

範

囲

(式中、 Rは二価基を表す.。).

である、請求の範囲第 1又は 2項に記載のぺプチド。

4. 光解離性架橋基が、

(式中、 Rはアルキレン基を表す。）

である、請求の範囲第 1又は 2項に記載のぺプチド。

5. I5光解離性架橋基が、

である、請求の範囲第 1又は 2項に記載のぺプチド。

6. 前記光解離性架橋基が、ペプチド分子内のシスティン同士間、リジン同士間、又はシスティンとリジンとの間のし、ずれかを架橋している、請求の範囲第 1又は 2項に記載のぺプチド。

7. Β ϋ性べプチドが付加されている、請求の範囲第 1又は 2項に記載のぺプチド、。

8. ペプチドの一端がナノビーズに固定されている、請求の範囲第 1又は 2項に記載のぺプチド。

9. ItiBナノビーズが磁気ビーズである、請求の範囲第 8項に記載のぺプチド。

1 0. 架橋されるべきぺプチド分子の 2箇所の側鎖官能基と、光解離性架橋基を含む化合物とを架橋反応させる、請求の範囲第 1項に記載のぺプチドを製造する方法。

1 1 . 前記べプチド分子として、前記 2箇所の側鎖官 fg¾間に機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドを含むぺプチド分子を用いる、請求の範囲第 1 0項に記載のペプチドの製造方法。

1 2. 前記光解離性架橋基を含む化合物として、

(式中、 Rはニ価基を表し、 Xは脱離性基又はハロゲン原子を表す。)

を用いる、請求の範囲第 1 0項に記載のペプチドの製造方法。

1 3. 前記光解離性架橋基を含む化合物として、

1 4, 前記光解離性架橋基を含む化合物として、

(式中、 Xは脱離性基又はハロゲン原子を表す。）

を用いる、請求の範囲第 Ί 0項に記載のペプチドの製造方法。

1 5. 前記 2箇所の側鎖官能基が、システィンの S H基と S H基、リジンの N H₃ ⁺ 基と N H ₃+基、又はシスティンの S H基とリジンの N H ₃ ⁺基のし、ずれかである、請求の範囲第 1 0項に記載のぺプチドの製造方法。

1 6. 前記架橋反応によって得られたぺプチドに fl^li 性ぺプチドを付加する、請求の範囲第 1 0項に記載のペプチドの製造方法。

1 7. 前記架橋反応によって得られたぺプチドをナノビーズに固定する、請求の範囲第 1 0項に記載のぺプチドの製造方法。

1 8. 前記ナノビーズが磁気ビーズである、請求の範囲第 1 7項に記載のぺプチドの製造方法。

1 9. 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピト一プを備えたぺプチドが含まれているべプチドに、

光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたぺプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。

2 0. 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピ卜ープを備えたぺプチドが含まれているべプチドを生体内へ投与して. 前記環状構造を形成しているペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれたぺプチドと liffi機能蛋白質又はリガンドとの反応を開始させ複合体を形成させる、反応制御方法。

2 1 . 前記光照身る光が紫外線である、請求の範囲第 1 9又は 2 0項に記載の反応制御方法。

2 2. 前記光解離性架橋基が、次の二価の連結基：

(式中、 Rは二価基を表す。）

である、請求の範囲第 1 Θ又は 2 0項に記載の反応制御方法。

2 3. 前記光解離性架橋基が、

(式中、 Rはアルキレン基を表す。）

である、請求の範囲第 1 9又は 2 0項に記載の反応制御方法。

2 4. 前記光解離性架橋基が、

2 5. 前記光解離性架橋基が、ぺプチド分子内のシスティン同士間、リジン同士間、又はシスティンとリジンとの間のいずれかを架橋している、請求の範囲第 1 9又は 2 0項に記載の反応制御方法。

2 6. 光解離性架橋基を介して分子内で架橋され、前記架橋基と共に環状構造を形成しているペプチドであって、前記環状構造を形成している部分に、機能蛋白質又はリガンドに対応するェピトープを備えたぺプチドが含まれているべプチドの一端を磁気ビーズに固定させ、

前記磁気ビーズに固定されたぺプチドを生体内へ投与して、

前記磁気ビーズに固定されたペプチドに光照射して前記光解離性架橋基を解離させて環状構造を解き、環状構造を解かれた磁気ビーズに固定されたべプチドと前記機能蛋白質又はリガンドとを反応させて複合体を形成させ、

形成された複合体を磁石にて回収し、

回収された複合体を質量分析装置を用いて同定する方法。