JPH05500421A - アミノ酸チオヒダントイン法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノ酸チオヒダントイン法および試薬１、光尻生侠五公団 本発明は、アミノ酸チオヒダントインを形成し、ペプチドのＣ−末端アミノ酸を 決定し、そのＣ−末端ペプチド端部がらのペプチドを配列決定するための方法に 関するものであり、またこの方法に有用な試薬に関するものである。

２．１考ス藍 クロムウェル・エル・ディーら、バイオケミストリイ８　：　４７３５（１９６ ９）。

エドマン・ビー、アクタ・ケミ力・スカンディナビ力、４：２７７　（１９５０ ）。

ホウク・ディー・エイチら、アナリティヵル・バイオケミストリイ、１６６　： 　２９８（１９８７）。

ケンナー・ジー・ダブリュら、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアティ 、６７３（１９５３）　。

メウス・ジェイ・エルら、バイオケミストリイ、１６　：　３７５０（１９８２ ）。

ミラー・エム・ジェイら、ジャーナル・オプ・オーガニック・ケミストリイ、４ ２　：　１７５０（１９７７）。

ミラー・シー・ジーら、′テクエックス・イン・プロティン・ケミストリイ°　 （ツユ−・ティ・イー著）、アカデミツク・プレス、６７〜７８頁（１９８９） 。

ミラー・シー・ジーら、アブストンラクトＴ１８８、第３回プロティン・ソサイ アティのシンポジウム、ワシントン州シアトル（１９８９年７月２９日−８月２ 日）。

パーハム・エム・イーら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサー チ・コミユニケイジョン８０　：　７（１９７Ｂ）　。

ランガラジャン・エム、“プロティン／ペプチド・シーケンス・アナリシス：現 在の方法論”　（ポラン・エイ・ニス著）、ＣＲＣブレス、１３６〜１４４頁（ １９８８）。

シベリイ・ジエイ・イーら、Ｔ　Ｉ　Ｂ　Ｓ　１４　：　２４６（１９８９）。

スターク・ジー・アール、メソフズ・イン・エンザイモロジイ（ヒルス・シー・ エイチ・ダブリュら著）、２５Ｓ、３６９頁、アカデミツク・プレス（１９７２ ）。

タール・ジー・イー、′プロティン・シーケンス分析方法“、（ウィツトマン・ ジーボルド・ビー著）、スブリンガー・ベルラグ、１２９〜１５１頁（１９８８ ）。

ウッドワード・アール・ビーら、テトラヘドロン、補遺＃７．４１５〜４４０（ １９６６）　。

ウッドワード・アール・ビーら、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイアテ ィ、８３　：　１００７−１００９（１９６１）　。

ヤマシタ・ニス、ビオシミ力・工・ビオフィジカ・アクタ、２２９　：　３０１ 〜２０９（１９７１）　。

３、！ ペプチドのアミノ酸シーケンス、即ち、ペプチドの一次構造の決定は、ペプチド の構造を理解し、同時に修飾または部分的に変更した形で所望の性質を得るよう にペプチドを操作するための主流をなす、さらに、ペプチドのアミノ酸シーケン スは、ペプチドの遺伝子コードシーケンスを同定するため、ペプチドを組換えて 生成するため、および／またはペプチドの座位特異的変異体を生成するための種 々の組換えＤＮＡ法に有用である。

Ｎ−末端配列決定に使用するための方法は良く知られている（例えば、エドマン ）、Ｎ−末端配列決定方法は比較的容易で信親性があるにも拘らず、利用し難い かまたはこの方法によって得ることの困難なＣ−末端アミノ酸シーケンス情報を 入手することが望まれることが多い、特にプロティンのコード領域のＣ−末端部 が、恐ら（ｃＤＮＡクローンに存在することになる、ポリＡ尾部に最も近い末端 に相当するので、カルボキシル末端シーケンスについての情報は一定のタイプの 組換え体ＤＮＡ法に有用であるかも知れない。

３つの一般的なアプローチがＣ−末端ペプチド配列決定のために提案された：酵 素によるもの、物理的方法によるもの、化学的方法によるものである。これらの 方法とその固有の限界は上記引用の親の出願において要約した。簡単に述べると 、酵素による決定も物理的方法による決定も、今までのところ十分には証明され ていない。このことを考慮して、Ｃ−末端アミノ酸残基を決定するため、および Ｃ−末端配列決定のための化学的方法の開発にかなりの努力がなされた。Ｃ−末 端配列決定に固有な難点は、Ｎ−末端アミノ基での比較的容易な付加とは対象的 に、カルボキシル基の反応性が比較的乏しいことである。Ｃ−末端配列決定のた めに提案された反応法の中で、３つの方法が特に注目されている。

第１の方法では、ペプチドのＣ−末端部でカルボキシアミド誘導体を生成し、続 いてビス（１，Ｉ−）リフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンと反応させて、再 配列して短かくなったカルボキシアミドペプチドとＣ−末端アミノ酸のアルデヒ ド誘導体に加水分解する誘導体を生成する（パーハム）、この方法は反応が停止 する前の３〜６サイクルに対してのみうまく行われる。第２の関連あるアプロー チでは、カルボキシ末端はロッセン再配列を行うようにピバロイルヒドロキサメ ートと反応させる。この方法のひとつの限界は化学作用がアスパラギン酸とグル タミン酸残基を開裂しないことである（ミラー、１９７７）。

最も広く研究されたＣ−末端の化学反応は、チオヒダントイン（Ｔ）（）反応で ある。ＴＨ法を行うための一般的方法の一つでは、カルボキシル基を無水酢酸の ような無水物を、イソチオシアン酸）（ＩＴＣ）塩または酸の存在で活性化して 、Ｃ−末端ＩＴＣ中間体を介してＣ−末端ペブチジル−ＴＨを生成する（スター ク、１９７２）　、ペプチジル−ＴＨは開裂して短くなったペプチドとＣ−末端 アミノ酸Ｔ）（を生成し、これは例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ　 Ｌ　Ｃ）によって同定することができる。この方法におけるカンプリング条件は 代表的には６０〜７０℃にて約９０分を要しくメウス）、ペプチド中のアミノ酸 側鎖の若干が分解されてしまうことが多い、さらに、無水物試薬は比較的不安定 であり、従って貯蔵の問題がある。

穏和な条件で行うことができるＣ−末端ＴＨ配列決定法は本発明者と共同研究者 の一人（ホウク）によって発表されている。試薬としてトリメチルシリルイソチ オシアネート（ＴＭＳＩＴＣ）を使用するとき、ペプチドを無水酢酸を用いて１ ５分間５０℃で活性化し、次いでさらに３０分間５０℃にてＴＭＳ−ＩＴＣと反 応させてＴＨ生成が行なわれた。この方法は上述のように、反応性の大きい無水 物活性化剤にペプチドがさらされる欠点゛がある。さらに、また上記の関連して いるＴＨ生成方法と同様に、ＴＨ−アミノ酸反応生成物はラセミ化され、従って この方法はＤ−およびＬ−形態のアミノ酸を識別するためには使用できない。

前記ＴＨ生成を含むＣ−末端配列決定方法は一般にラセミ化生成物に導く、ホス ホリルイソチオシアナチデート試薬を用いるＣ−末端反応の改良が提案されてい る（ケンナー）、ＴＨは生成されるが、この反応が極めて有用となるには、ゆっ くりすぎた。ミラーらは関連している方法を提案したが、メルカプトベンゾチア ゾール誘導体を使用している。この化合物を使用するための合理性は、チアゾー ル環の開環と同時に環化を起こすことができることである。

４．１里生量！ 本発明のひとつの一般的な目的は、比較的穏和な反応条件で、特に無水物活性化 剤の使用を含まない条件下に、比較的速いＣ−末端ペプチジルＴＨの形成を含む Ｃ−末端ペプチド配列決定法を提供することである。

本発明の他の目的は、Ｃ−末端配列決定に使用するための新規な試薬を提供する ことである。

本発明のさらに他の目的は、少な（とも若干の配列決定反応の反応物を固体支持 体に封鎖する条件下に行うことができるＣ−末端配列決定法を提供することであ る。

本発明のさらに一般的な目的は、アミノ酸ＴＨを生成するための方法および固定 化試薬を提供することである。

本発明は、−面においては、遊離カルボン酸基を有する保護されたアミノ酸のチ オヒダントイン（ＴＨ）を生成するための方法を含む。保護されたアミノ酸は、 イソチオシアン酸およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物と共に 、アミノ酸のカルボン酸基が脱プロトン化する条件下に反応させる。関連した観 点では、本発明はペプチドのＣ−末端アミノ酸残基を決定するための方法を含む 、ペプチドは、イソチオシアン酸およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混 合無水物と共に、Ｃ−末端アミノ酸のカルボン酸基が脱プロトン化する条件下に 反応させて、相当するＣ−末端ペプチジルチオヒダントイン（ＴＨ）を生成する 。

ペプチジル＝ＴＨ結合のＣ−末端加水分解はアミノ酸ＴＨを脱離し、これは次に 、例えば、ＨＰＬＣによって、アミノ酸ＴＨ付加物として同定することができる 。

本方法に用いられる混合無水物試薬のひとつの実施態様は次の形態を有する： Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｃ＝Ｓ　（式中Ａはアルキル、了り−ル、またはアリールオキシ基 である）。

ひとつの一般的な実施態様では、Ｎ−保護アミノ酸またはペプチドを、溶液相混 合無水物試薬と反応させる。

本発明の他の一般的な実施態様では、Ｎ−保護アミノ酸またはペプチドは、イソ チオシアン酸およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物を用いて誘 導された固体支持体と、アミノ酸のカルボキシル基を脱プロトン化する塩基性条 件下に接触させる。溶液中に生成したアミノ酸ＴＨは、例えば生成物を固体支持 体から溶離することによって、固体支持体から分離される。

好ましくは、アシルＩＴＣ支持体は次の形態を有する：（式中、Ａは固体支持体 に結合したアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリールオキシ基である）、 固体支持体はウッドワード試薬Ｋまたは無水物試薬を用いて活性化し、続いて両 者の場合においてＩＴＣと反応させて、またはここに開示されたタイプの溶液相 アシルＩＴＣと反応させて、誘導することができる。

Ｃ−末端ペプチド配列決定に使用するために、さらに本発明の方法は、残りのペ プチドからＣ−末端アミノ酸ＴＨを開裂し、開裂したアミノ酸ＴＨを、例えばＨ ＰＬＣによって同定することを含む、固相試薬を用いる実施態様では、ペプチジ ルＴＨは好ましくは、残りのペプチドからペプチジルＴＨを開裂するように、開 裂試薬効果を有する第２の固体支持体と接触させる。ペプチドは好ましくは、イ オン交換結合によって、または開裂反応中に形成する共有結合によって固体支持 体に保持される。溶液相中のアミノ酸ＴＨを溶離した後、残りのペプチドを脱離 して、さらにシーケンス決定用に再循環させる。

他の面において、本発明はイソチオシアン酸およびカルボン酸または炭酸の混合 無水物を用いて誘導され、好ましくは次の形態を有する活性化支持体を含む： （式中、Ａは固体支持体に結合したアルキル、アルコキシ、了り−ルまたはアリ ールオキシ基である）。

また、本発明の形成する部分は固相Ｃ−末端配列決定用システムである。このシ ステムは前記タイプの活性化支持体、および好ましくは、（ｉ）アミノ酸ＴＨを 脱離するようにペプチジルＴＨを開裂し、（ｉｆ）残りのペプチドを支持体に結 合することができる第２の固体支持を含む、残りのペプチドはアミノ酸ＴＨを回 収した後に支持体から選択的に脱離することができる。このシステムは逐次のＣ −末端ペプチド決定のために、一連のこのような支持体を含むことができる。

本発明のこれらの目的および他の目的および特徴は、次に示す本発明の詳細な説 明を図面と共に合わせて読むときに一層完全に明らかになるだろう。

皿皿互囚見星五皿 図１は本発明を実施する際に使用できるイソチオシアン酸（化合物１−Ｖ）の混 合無水物を示し； 図２は、本発明に従って、ペプチジルＩＴＣ化合物を形成するため、ペプチドカ ルボキシル基とアルキルアシルＩＴＣ試薬との提案された反応機構を示し； 図３は、アミノ＃ＴＨと短くなったペプチドを形成するため、ペプチジルチオヒ ダントイン（ＴＨ）の生成と末端アミノ酸ＴＨの加水分解の提案された機構を示 し； 図４Ａと４Ｂは、従来技術の方法に従って無水酢酸中でＴＭＳ−ＩＴＣを用いる 方法（４Ａ）、および本発明に従ってベンゾイル−ＩＴＣ混合無水物試薬を用い る方法（４Ｂ）で、形成されたＣ−末端アミノ酸−ＴＨの比較収率を示すＨＰＬ Ｃクロマトグラムであり； 図５Ａと５Ｂは、Ｃ−末端ロイシン（Ｌ）、およびＣ−末端メチオニン（Ｍ）に ついて、それぞれ生成したアミノ酸−ＴＨ化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示 し； ｌｆｆ１６Ａと６Ｂはペンタペプチドロイシンエンケファリン（ＴＯＧＦＬ）の Ｃ−末端配列決定における第１および第２サイクルのそれぞれのＨＰＬＣクロマ トグラムを示し；図７Ａと７Ｂは、従来技術の方法に従って無水酢酸中でＴＭＳ −ＩＴＣを用いてＩｌｅを反応させ（７Ａ）、および本発明方法に従ってベンゾ イル−ＩＴＣ混合無水物反応で反応させて（７Ｂ）生成したｌ１ｅ−ＴＨのＨＰ ＬＣクロマトグラムを示し；図８はＣ−末端ペプチド配列決定のための本発明方 法の使用を示し； 図９はＣ−末端アミノ酸−フェニルＴＨ誘導体を生成するため用いることができ るメルカプトベンゾチアゾールの合成を示し；図１０は、メルカプトベンゾチア ゾール化合物とＣ−末端アミノ酸との提案された反応を示し、続いて開裂してア ミノ酸−フェニールＴＨ化合物を生成する反応を示し；図１１は、支持体上のカ ルボキシル基を活性化するためウッドワード試薬Ｋを使用する活性化固体支持体 を形成するための反応工程を示し５ 図１２は、支持体上のカルボキシル基を活性化するため酸無水物を用いる固体支 持体を形成するための反応工程を示し；図１３は、支持体上のカルボキシル基を 活性化するため溶液相アシル−ＩＴＣを用いる活性化固体支持体を形成するため の反応工程を示し； 図１４は、炭酸とＴＴＣの混合無水物を用いて誘導された活性化固体支持体を形 成するための反応工程を示し；図１５Ａと１５Ｂは、本発明に従って活性化アシ ルＩＴＣ支持体を用いるペプチド反応によってペプチジルＴＨを形成しく１５Ａ ）、ペプチジル−ＩＴＣの環化によってペプチジルＴＨを形成する（１５Ｂ）た めの反応様式図を示し； 図１６は、各化合物に対して示されたカルボニル炭素、スルホニル硫黄原子およ びＩＴＣ炭素原子について、計算された原子電荷をもつ種々の混合無水物ＩＴＣ 化合物を示し；図１７は、カチオン交換樹脂によってペプチジルＴＨを開裂し、 残りのペプチドを樹脂支持体に結合する工程を示し；図１８は、ヒドロキシルア ミノ基を用いて誘導された固体支持体によってペプチジルＴＨを開裂し、続いて 残りのペプチドを樹脂支持体から加水分解により脱離する工程を示し；図１９は 、本発明によるＣ−末端配列決定操作の工程を示す図である。

Σ朋！」ＩＬＴ驚肌 ■、ご２　法および°−・ 本発明のひとつの一般的な実施態様では、アミノ酸ＴＨの生成はＮ−保護アミノ 酸またはペプチドと溶液相混合無水物試薬を反応させて行われる。即ち、イソチ オシアン酸およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物は遊離（固定 化していない）形態である。Ｎ−保護アミノ酸またはペプチドは、下記に示すよ うに、溶液中にあるかまたは固体支持体に固定化されている。この方法で使用さ れる混合無水物試薬はここでは溶液相試薬と呼ばれ、下記のセクション■で述べ る面相混合無水物試薬からの試薬と区別される。同様に、Ｎ保護アミノ酸または ペプチドが溶液相試薬を反応させる一般的方法は、溶液相方法と呼ばれる。“溶 液相方法”はアミノ酸、またはさらに代表的には、ペプチドが固定化される固相 支持体を含むことができることは評価されるであろう。

ＩＡ、曵澄」１１１に釆 本発明方法に用いられる試薬はイソチオシアン酸（ＩＴＣ）及びカルボン酸、炭 酸またはスルホン酸の混合無水物である。いくつかの例示的な混合無水物試薬を 図１に示す、これは次のものを含む： （ａ）アセチルＩＴＣ（１）およびベンゾイルＩＴＣ（Ｉ［）によって例示され るような、アルキルまたはアリールアシル−ＩＴＣ化合物。このアルキル基は、 メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル、および不飽和化合物を含み炭素−炭素 結合によってアシル炭素に結合した関連する炭化水素化合物のようなアルキルお よびシクロアルキル化合物の群から選ばれる。アリール基はベンゼン、置換した ベンゼン、またはアリール環炭素原子を介してアシル炭素に結合した関連する化 合物であることができる。これら２種類の化合物はまた、ここでは、Ｃｏ−Ｎ結 合の加水分解がカルボン酸およびＨＮＣ３を生成するので、ＩＴＣおよびカルボ ン酸の混合無水物と呼ばれる； （ｂ）エトキシアシル−ＩＴＣ（ＩＩＩ）またはベンゾキシカルボニルＩＴＣ（ ■）によって例示されるような、アルコキシまたはアリールオキシカルボニル− ＩＴＣ化合物。この化合物のエーテル結合アルキルまたはアリールグループは（ ａ）に記載したようなものである。これら２種類の化合物はまた、ここでは、ｃ Ｏ−Ｎ結合の加水分解が炭酸およびＨＮＣ３を生成するので、ＩＴＣと炭酸の混 合無水物と呼ばれる；そして（ｃ）ベンジルスルホニル−ＩＴＣ（Ｖ）によって 例示されるような、アルキルまたはアリールスルホニル−ＩＴＣ化合物、この化 合物のアルキルまたは了り−ルグループは（ａ）に記載したようなものである。

これら２種類の化合物はまた、ここでは、Ｃ０−Ｎ結合の加水分解がスルホン酸 およびＨＮＣ８を生成するので、ＩＴＣとスルホン酸の混合無水物と呼ばれる； 本発明のひとつの好適例では、溶液相試薬は、（ａ）に記載したように、カルボ ン酸とＩＴＣの混合無水物であり、次の一般式： Ａ−Ｃ−Ｎ＝Ｃ−３，式中のＡはアルキルまたはアリール基のような任意の炭素 を含有する基であり、ＴＨ形成反応に使用される非水溶媒において試薬を溶解し 、記載されることになっているイソチオシアン化反応において、ペプチドアシル 基に対して反応性がある。

このクラスの若干の化合物は商品として入手することができ、あるいは既知の方 法によって調製することができる。アシル置換ＩＴＣｓを調製する方法のひとつ は、塩基を含む乾燥した不活性溶媒中にイソチオシアネートを溶解し、徐々に所 望のアシルクロライドを添加する工程を含む。例えば、ベンゾイルＩＴＣの合成 は、不活性溶媒としてアセトニトリルまたはジクロロメタンまたはトルエン中で ベンゾイルクロライド、および塩基としてジイソプロピルエチルアミンヲ用いる 。

ＩＴＣおよび炭酸の混合無水物（ＲＯＣ（０）ＮＣ３）は、ＩＴＣ塩との反応に おいて選択されるアルキルまたはアリールエステルクロライドを用い、類似の方 法によって生成することができる。同様に、ＩＴＣおよびスルホン酸の混合無水 物は、実施例７に概略を示したように、ＩＴＣと所望のベンゼンスルホニルクロ ライドを反応させて生成される。

１Ｂ、擢豆■反息方抜 本発明方法を実施するとき、Ｃ−末端アミノ酸を同定することになっているＮ− 保護アミノ酸またはペプチドを、Ｃ−末端アミノ酸のカルボキシル基が脱プロト ン化される塩基性条件下に混合無水物試薬と反応させる。Ｃ−末端アミノ酸は、 環−窒素アミド結合によってペプチド中の終りから２番目のＣ−末端アミノ酸（ 反応はペプチドを用いる）に結合するＣ−末端アミノ酸ＴＨに変換される。

上に使用したように、“ペプチド”の語はペプチドとタンパク質の両方を含むこ とを意図しており、これらは一般に、それぞれ１００以下または以上のアミノ酸 、およびＮ−保護アミノ酸によって区別される０本方法は特にペプチドのＣ−末 端アミノ酸を決定するときに使用するために記述されるだろう、しかし、本方法 はまた遊離のＮ−保護アミノ酸からアミノ酸チオヒダントインを生成するために 応用できる。

ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基のみを同定するために本方法を使用する場合、 ペプチドは遊離の形で、すなわちアミノ末端を保護する固体支持体に結合してい ない形で反応させることができる。代表的には、Ｃ−末端アミノ酸同定の連続す る範囲が望ましい場合、Ｃ−末端配列決定のために、ペプチドをそのＮ−末端ま たはその内側類にて固体支持体に結合する。

ペプチドを固体支持体、例えば活性化ガラスピーズ、カルボキシル化またはアミ ン化樹脂ビーズ等に結合するための方法は良く知られている。実施例１に記載し た方法に用いられた好ましい手段のひとつでは、ジペプチドＬｅｕ−Ｖａｌをベ ンジルジイソチオシアネートによってアミノ化樹脂に固定化した。

遊離の形または固定化した形のいずれでも、ペプチドはＣ−末端カルボン酸基を 脱プロトン化するために有効な塩基性の、好ましくは非水の条件下に適当な溶媒 中に溶解または懸濁させる。溶媒はまた好ましくは、下記のように、チオヒダン トイン（ＴＨ）環形成において重要な触媒の役割を担うことができるピリジンを 含む、好ましい溶媒のひとつは１０％の無水ピリジンを含む無水アセトニトリル である０代表的な反応容量は１〜３＋ｓｇのペプチドにつき約１００μｍの反応 溶媒である。

上記による混合した無水物試薬を、好ましくは反応懸濁液中の反応に有効なペプ チドカルボキシル基を過剰なモルで、ペプチド懸濁液に添加する。代表的には１ ００μｌの反応溶媒につき約１０μｌの試薬を添加する。

ＴＨ形成反応は好ましくは５０〜７０℃にて約１０〜６０分間、好ましくは約５ ０℃につき１５〜３０分間行い、ペプチド中の非カルボキシル基とＩＴＣ試薬の 反応を最小にする。これに続いて、反応混合物を室温まで冷却し、ペプチジルＴ Ｈを回収する。ペプチドを固体支持体に結合する場合、支持体回収は、支持体を 例えば敗容量のアセトニトリルを用いて洗浄し、洗浄した支持体を、例えば真空 遠心分離によって乾燥させる。ペプチドを遊離の形で反応させる場合、ペプチジ ルＴＨは、ペプチドからアミノ酸ＴＨの末端開裂を生じない溶媒系でクロマトグ ラフィー分離等によって回収することができる。

図２および３は本発明方法によるペプチジル無水物成のための反応の提案された 機構を示す。図２の上部に示したこの反応機構では、混合した無水物試薬は不安 定なＩＴＣ中間体■を介して作用し、図中の■で示されたペプチジル混合無水物 を形成する０次いで無水物は無水反応で生成した遊離のチオシアネートイオンと 反応し、四面体の中間体■を経て、図中の■で示されたペプチジルＩＴＣ化合物 を形成する。この提案された機構では、混合した無水物試薬が反応性のペプチジ ル無水物を形成する活性化試薬としても、また無水物との反応のためのチオシア ネートイオン源としても作用する。

代わりの反応機構は図２の第２のラインに示される。ここでは図中の四面体の中 間体Ｘのチオシアネート基がペプチドのカルボニルの炭素に移動し、四面体の中 間体■を形成し、これは速かに分裂して■で示されるペプチジルＩＴＣ化合物を 形成する。

引続き図２を参照すると、ペプチジル脱プロトン化（求核性の）酸素原子の反応 の親電子的な２つの可能な部位がある。第１の部位、および図２の反応図に示さ れたものは、カルボニルの炭素である。第２の部位は悪い反応生成物に導かれる チオカルボニルの炭素である０本発明の支持体で行われる実験は、生成したアミ ノ酸−ＴＨ化合物のパーセンテージに基づいて、カルボニルの炭素での一層親電 子的な置換がチオカルボニル炭素での反応を与えることを示している。従って、 例えば、アルキルおよびアリールカルボニル基（イソチオシアン酸とカルボン酸 の混合した無水物）は最高のパーセンテージの所望のＴＨ生成物を与え、さらに 一層電気陰性のエステル試薬（イソチオシアン酸と炭酸の混合した無水物）は、 さらに低いパーセンテージの所望の生成物を与える。現在の条件下では、スルホ ン酸混合無水物試薬は最低のパーセンテージの所望のＴＨ生成物を与える。

所望のペプチジルＴＨを形成するペプチジルＩＴＣ化合物ＸＩの反応は図３に示 されるが、恐らくペプチドＩＴＣ化合物中のアミドの窒素にチオシアネートの炭 素が親電子的に攻撃して速い環化によって図中のＸ■で示されたペプチジルＴＨ を形成するのであろう。環化反応はピリジンによって触媒作用を受けることがで きるが、これは既に提案された（ミラー、１９８８）ように、反応性の炭素中心 の反応性を高めるチオシアネート部分とピリジンが反応できることを示唆してい る。

本発明によるアミノ酸またはペプチジルＴＨを形成するための特殊な反応条件は 、ベンゾイル−ＩＴＣについては実施例ＩＡ、２．３、および６に、トリメチル アセチル−ＩＴＣについては実施例４に、エトキシカルボニルについては実施例 ５に、ベンゼンスルホニル−ＩＴＣについては実施例７Ｂに与えられている。

ＩＣ，アミノアシルヒ　ントインの　とにのセクションでは本発明方法の最終工 程を記載しており、これは（ａ）ＴＨをペプチドに結合するアミド結合を開裂す るために有効な開裂条件下でペプチジルＴＨを処理し、（ｂ）開裂反応によって 解離されたアミノアシルＴＨを単離し、そして（Ｃ）単離したアミノアシルＴＨ を同定する工程を含む。

種々の開裂反応条件が知られている。　１２Ｎ　ＨＣＩ、　稀アルカリ（ケンナ ー）、または飽和水性トリエチルアミンを用いた加水分解が知られている。これ らの開裂反応は７０％までの割合の開裂を生じることが報告されているが、極端 なｐＨ条件は内部のペプチド側鎖に対して開環および／または損傷を導く。さら に最近、ｐＨ８，０にてピリジン中でアセトヒドロキサメートで処理する分裂が 報告された（メウス）。この方法は６０〜８０％までのＣ−末端ＴＨの回収率を 与える（ミラー、Ｘ９８８）。関連した方法ではアセトニトリル中で第一または 第二アミンを用いて処理することを含む。

開裂反応は代表的には、使用される開裂剤によって室温またはこれより高い温度 で１５〜６０分間行われる。反応工程は、ＴＨ脱離を最適にするために、また開 環と短くなったペプチドへの損傷を最小にするために、反応工程の間に、下記の 分析方法に従って、脱離したアミノアシルＴＨおよび／または短くなったペプチ ドの完全さを試験することによって容易に導くことができた。

実施例１〜４に記載された好適な開裂方法では、ペプチジルＴＨは室温にて１５ 分間アセトニトリル中１０％プロピルアミンを用いて処理される。実施例５に記 載された関連した方法では、ペプチジル−ＴＨは１ｍｇ／ｍｌのジチオスレイト ール（ＤＴＴ）を含有する水中でテトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムヒドロキサイ ドを用いて開裂させた。

本発明のひとつの観点によれば、酸性の条件下に行うとき、ＴＨ形成方法はＣ− 末端アミノ酸の立体異性の形を保持することが見出された。これは実施例６に示 され、ｔ−ＢＯＣ保護１１ｅは２５％Ｈ３０中でトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ ）を用いて脱保護され、図７Ｂに示されるように、単一のＬ型１１ｅ−ＴＨ化合 物を生成する。これに対して、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ− ＩＴＣ）を用いた反応によって脱保護されたｌ１ｅ−ＴＨの反応形成および１２ Ｎ　ＨＣＩを用いた脱保護（開裂）は、従来技術のＣ−末端分析方法（ホウク） に従って、図７Ａにおいてダブレットで示される２つのジアステレオマーの形態 を生じた。

開裂反応の結果を図３の下部に示す。図３の反応では、開裂によって１個のアミ ノ酸によって短くなったペプチド（化合物ＸＩＩ［）、およびＲＩ基が勿論、元 のＣ−末端アミノ酸のアミノ酸側鎖であるアミノ酸ＴＨ（ＸＩＶ）を生成する。

ペプチドまたは短くなったペプチド、またはその両方から離脱したアミノアシル ＴＨはＮ−末端アミノ酸を同定するために分析される。ペプチドが固体支持体に 結合する場合、離脱したＴＨは、分裂反応溶液を例えば真空遠心分離によって除 去し、実施例１に述べたように、アセトニトリルのような適当な溶媒で遊離した ＴＨを抽出することによって容易に分離することができる。ペプチドが開裂反応 混合物中で遊離している場合、混合物は例えば、ＨＰＬＣによって、化合物を同 定するための方法の一部として分離することができる。

脱離したアミノ酸ＴＨ化合物を、標準の方法に従って、高圧液体クロマトグラフ ィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）のような既知のクロマトグラフィー法によって同定するこ とができる。化合物の同定は都合の良いことには、カラム中の走行時間を、標準 の方法に従って調製された既知の参照用アミノ酸ＴＨの走行時間と比較すること によって行うことができる。実施例１に述べたＨＰＬＣ法が適当である０図５Ａ と５ＢはロイシンＴＨ（Ｌ−ＴＨ）およびメチオニンＴＨ（Ｍ−ＴＨ）のＨＰＬ Ｃプロフィルを示し、図６Ａと６ＢはＬ−ＴＨとフェニルアラニンＴＨ（Ｆ−Ｔ Ｈ）のＨＰＬＣプロフィルを示す。

また、脱離し単離されたアミノ酸ＴＨは他の入手できる器具、例えばマススペク トロメトリーやＮＭＲによって同定することが上のセクションＩＣに記述された 方法は、ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基を決定するために設計されている。繰 り返し適用する方法がペプチドのＣ−末端アミノ酸配列決定のために使用できる ことは高く評価されるだろう。

図８は配列決定方法を示している。配列決定されるペプチドは図に示されるよう に固体支持体Ｓに結合している。次にペプチドは第１周の工程によって運ばれて 、（ａ）Ｃ−末端ペプチジルＴＨを生成し、（ｂ）末端ＴＨを開裂し、Ｃ−末端 アミノアシルＴＨ（ＡＡ、、）およびＣ−末端アミノ残基がＡＡ、、となって短 くなったペプチドを生成し、（Ｃ）脱離したアミノアシルＴＨが同定される。

ペプチド支持体を洗浄した後、短くなったペプチドを上記工程の第２周で処理し て、アミノ酸ＴＨ（ＡＡ−＋）として次のアミノ酸を脱離し、２個のＣ−末端残 基によって短くなったペプチドを生成する。この方法はペプチドが配列決定され るまで、または不完全なＴＨ生成と脱離による分割ロスがさらに配列決定するこ とを不可能にするまで繰り返される。この配列決定法は、ロイシンエンケファリ ン（ＹＧＧＦＬ）の２個のＣ−末端アミノ酸残基の決定に対して、実施例５に示 されている０図６Ａに示される分析の第１周からのＨＰＬＣクロマトグラフは、 Ｃ−末端Ｌ−ＴＨピークを示す０図６Ｂに示される第２周からのクロマトグラフ は、予想されたＦ−ＴＨを示す。

上述した手法はペプチドのＮ−末端残基の自動化配列決定のために知られている 技術を用いて容易に自動化される。Ｃ−末端からペプチドを自動的に配列決定す るための装置の一例では、反応容器に含まれる固体支持体を用い、この容器に溶 媒と試薬を添加し、そこから反応混合物と洗浄溶媒を除去する。脱離したアミノ 酸ＴＨは後のＨＰＬＣによる同定のために貯蔵物質がら単離される。

ＩＥ、［わ　の゛ム無 本発明はセフシランＩＡに記述したカルボン酸、炭酸およびスルホン酸の混合無 水物を包含するが、さらに下記のような混合無水物もＣ−末端アミノ酸−ＴＨ化 合物を生成するために適当である。

代わりの試薬の一つは一般式： Ａ−Ｃ−Ｎ−Ｃ＝Ｓ　（式中のＡは任意のアミンであり、好ましくはトリメチル アミンのような４級アミンである）で表されるイソチオシアン酸のカルバメート 混合無水物である。この試薬はカーボネート混合無水物と殆ど同じ電気陰性度を もつことが期待され、従って、妥当な収率の所望のペプチジル−ＴＨ生成物を与 える必要がある。

別の代わりの混合無水物は、図９の右側に示したようなベンゾイルメルカプト− ベンゾチアゾール（ＭＢＴ）ＸＶである。この化合物は実施例８に記述された合 成方法に従って調製することができる。簡単に述べると、ＭＢＴ　ＸＶＩを乾燥 した不活性溶媒に例えばジイソプロピルエチルアミンのような適当な塩基の存在 で溶解する。次いで選ばれたアシルクロライド、例えばベンゾイルクロライド（ Ｘ■）を、低い温度でゆっくりと添加し、所望の生成物を形成する。関連したア シルＭＢＴ化合物、例えばアセチルＭＢＴを、所望のアシルクロライド出発物質 を用いて同様の方法によって調製することができる。

図１０はＭＢＴ試薬を用いるペプチジルフェニルＴＨの形成ニオいて提案された 反応工程を示す。この反応条件はセフシランＢに記述したものと殆ど同じであり 、必要に応じて、ＴＨ形成反応を完全に行なうように反応時間を適当に調製する 。代表的な反応条件は実施例８に与えられている。

図１Ｏを参照すると、脱プロトン化したペプチド（Ｘ■）をベンゾイル−ＭＢＴ 　（ＢｚＭＢＴ）と反応させて、提案された反応経路において、ＸＩＸで示され た中間体のペプチドベンゾチアゾール化合物を形成する。中間体の形成はベンゾ チアゾールイオンによって引続き攻撃して活性化無水物を経て行なわれるか、あ るいは図２に関連して記述したように、−斉に行なわれる再配列反応を含むこと ができる。

ペプチジルアリールＴＨを形成するための中間体ベンゾチアゾールの環化は、図 ３に記載されたと同じ経路に沿って、アミドの窒素と反応する親電子的なチオ環 炭素を用いて行なわれ、次いで環化して所望のペプチドフェニルＴＨ化合物Ｘｒ Ｖを形成する。

さらに別の可能な混合無水物は、ベンゾイルイソシアネートのようなイソシアン 酸とカルボン酸の混合無水物である。実施例９に記載されているような反応は、 ｑの実施例で報告されているように妥当な収率の所望のアミノ酸−ＴＨ生成物を 生成する。

前記から、どのようにして本発明の種々の目的と特色が達成されるかを高く評価 することができる０本発明の方法は、ペプチドのカルボキシル基の無水物の活性 化をあてにする従来技術の方法よりは実質的に穏和な条件下にペプチジルＴＨを 生成することができる。同時に、ＴＨ形成反応は、比較的早く、例えば１５〜３ ０分で行なうことができ、従って自動化システムにおいて迅速に配列決定を行な うことができる。

さらに、本方法での開裂反応が酸性の条件下に行なわれるとき、本方法はＣ−末 端アミノ酸の立体化学を保持し、従ってＬ−またはＤ−形態のアミノ酸を決定す るために使用することができる。

ｎ、Ｉ■１塁上塁上 底光明の第２の一般的な例では、アミノ酸ＴＨの形成はＮ−保護アミノ酸または ペプチドを固相混合無水物試薬と反応させて行なわれる。特に、イソチオシアン 酸とカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物と、この混合無水物を誘導 する固体支持体で行われる。この方法で使用される混合無水物試薬は、ここでは 固相試薬と呼ばれ、Ｎ−保護アミノ酸またはペプチドを固相試薬と反応する一般 的方法は固相方法と呼ばれる。

ＩＩＡ、皿批上工旦跋果 本発明の方法は、アシルＩＴＣ１すなわちカルボン酸または炭酸、およびイソチ オシアン酸の混合無水物を用いて誘導されるアシルＩＴＣ固相（固定化した）試 薬を用いる。

この試薬は次式で表される。

（式中のＡはアルキル、アルコキシ、了り−ル、またはアリールオキシ基であり 、ＩＴＣはイソチオシアネートであり、図面ではＮ−Ｃ−３またはＮＣ３で表し た）。アルキル基は、例えばメチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル、および炭 素炭素結合によってアシルの炭素に結合した関連する炭素含有化合物のようなア ルキルおよびシクロアルキル化合物の群から選ぶことができる。アリール基はベ ンゼン、置換したベンゼン、またはアリール環の炭素原子によってアシールの炭 素に結合した関連する芳香族またはヘテロ芳香族化合物であることができる。ア ルコキシおよび了り−ルオキシ基は類似の０−アルキルおよび０−了り−ル基を 含む。

Ａで示された化合物の基はまた、ここではＣｏ−Ｎ結合での加水分解がカルボン 酸とＩＴＣを生成するので、ＩＴＣとカルボン酸の混合した無水物と呼ばれる。

Ｂで示された化合物の基は同様に、化合物の加水分解による開裂が炭酸エステル とＮＣＳを生成するので、イソチオシアン酸と炭酸の混合した無水物と呼ばれる 。

固体支持体は、アシルＩＴＣを含むように機能できる表面化学基と共に誘導され る粒子ビーズ、または膜支持体等であってもよい。複数のビーズまたは膜支持体 材料、例えばガラスまたは多くのポリマー材料、例えば、種々の既知の方法によ って所望の反応性ＩＴＣに変換できるアミン、カルボキシル、および水酸基のよ うな反応性化学基を有するナイロン、ポリスチレン、ポリエチレン、テフロン（ 登録商標）は商業的に入手することができる。

図１１はアシルＩＴＣ基を用いて誘導された活性化固体支持体の形成の工程を示 す、固体支持体（１）は表面のアミン基を有するＳで示された粒子ビーズ等であ る。これらのビーズはまず、適当な溶媒中でＦＭＯＣ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕのよう な側鎖保護ジカルボン酸およびカルボジイミドとビーズの反応によってカルボン 酸表面基を含むように誘導され、アミド結合によってアミノ表面基にジカルボン 酸誘導体を結合する。この保護されたカルボキシル化支持体は図１１において（ Ｉ［）で示される０反応条件は実施例１０に詳述する。官能基は、例えばＴＦＡ を用いて脱保護化される。

同様に支持体は他の経路を使用してカルボキシル化支持体を生成するように調製 することも認められるだろう。

この支持体（ＩＩ）はウッドワード試薬Ｋ（ウッドワード）（■）のようなイソ キサゾリウムと反応させて活性化される。トリアルキルアミンのような適当な塩 基の存在で、イソキサゾリウム塩はケテンイミン（ＩＶ）を形成し、これは支持 体の遊離のカルボキシル基と反応して活性化エノールエステル（Ｖ）を形成する ことができる。活性化したエステルは、トリメチルシリルＩＴＣ（ＴＭＳ［ＴＣ ）のようなＩＴＣ化合物と反応し、所望の活性化したアシルＩＴＣ固体支持体（ Ｖｔ）を形成する。特定の反応条件を実施例１０に与える。好まし７いＩＴＣ化 合物はトリアルキルシリル−ＩＴＣ化合物、例えばＴＭＳ−ＩＴＣｌまたはピリ ジニウムチオシアネートである。構造式Ｖおよび■の括弧は構造式■で示される 支持体のグルタル酸結合を示す。

図１２はベンゾイルＩＴＣを用いて活性化された固体支持体を形成するための第 ２の一般法を示す。ここで支持体（ｎ）は無水酢酸のような無水物を用いて無水 の条件下に反応し、仮定された活性化無水物支持体（■）を生成する。さらにＴ ＭＳＩＴＣのようなＩＴＣ化合物との反応は所望のベンゾイルＩＴＣ活性化支持 体（Ｖｌ）を生成する。

活性化した混合無水物ＴＴＣ固体支持体を形成するための第３の方法を図１３に 示す、この方法では、溶液相アシル■ＴＣ化合物、例えばベンゾイルＩＴＣ（■ ）は、固体支持体上のカルボキシル基と直接反応し、所望の活性化アシルＩＴＣ 支持体を形成する。

反応の詳細は実施例１２に述べる。

溶液相ＩＴＣ化合物は市販品として得られ、または上に引用した親出願に記載し たように調製することができる。アシル■ＴＣを調製する方法のひとつは、ＩＴ Ｃ塩を塩基を含む乾燥した不活性溶媒中で酸クロライドに添加する。

図１４は炭酸とＩＴＣの混合無水物を用いて誘導された活性化固体支持体を形成 する方法を示している。この方法で使用される固体支持体（ＩＸ）は、既知の方 法に従って、アルキルまたはアリール（Ａ）アルコール基を用いて誘導される。

この支持体は、トリホスゲンのようなホスゲンと同等のものを用いて活性化され 、相当する活性化された炭酸塩誘導体（ＸＩ）を形成する。さらにＩＴＣｌ例え ばＴＭＳＩＴＣとの反応は所望の活性化支持体（ＸＩ）を与える。

活性化支持体は安定な形で使用されるまでベンゼンまたはトルエンのような乾燥 したあるいは非プロトン性の非求核溶媒中で保管することができる。

Ｉ［Ｂ、ペプチジル−ＴＨ） 本発明方法を実施する際に、Ｃ−末端アミノ酸を同定するためのペプチドは、塩 基性条件下にアシルＩＴＣ試薬と、好ましくはピリジンの存在で反応させ、アミ ノ酸のＣ−末端の酸基を脱プロトン化する。Ｃ−末端アミノ酸はＣ−末端アミノ 酸ＴＨに変換され、これは環−窒素アミド結合によってペプチド中の次のＣ−末 端アミノ酸に結合する。

ペプチドのアミノ基はまず、標準法（グリーン）に従って、アシル化またはＢＯ Ｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）またはＦＭＱＣ（フルオレニルメトキシカル ボキシル）誘導体の生成で保護される。Ｎ−保護ペプチドは適当な溶媒、例えば アセトニトリル中１０％のピリジンで、一般に０．１〜１０μｇ／ｍｌの最終ペ プチド濃度にて溶解される。次にペプチド溶液は混合した無水物固相試薬に、好 ましくは過剰のモルの活性化した混合無水物基において添加される。一般には、 約１００μｌのペプチド溶液を１０μｇの固相試薬に添加する。

ＴＨ形成反応は好ましくは５０〜６０℃にて約１０〜６０分間、さらに好ましく は約５０℃にて１５〜３０分間行われ、ＩＴＣ試薬とペプチド中の非カルボキシ ル基の反応を最小にする。代表的な反応条件は実施例１４に示される。

図１５は本発明の活性化支持体を用いる反応によってペプチジルＴＨを形成する ための反応機構を示す。図１５Ａの左側に示される機構では、ペプチド（ＸＩ） は混合した無水物試薬（Ｖｒ）のカルボニル炭素にて反応し、中間体Ｘ■を経て 、図中のＸＩＶで示されたペプチジルアシルＩＴＣを形成する。無水物は反応中 に生成した遊離のチオシアネートイオンと反応し、ペプチジルＩＴＣ（Ｘ■）を 形成する。この提案された機構では、混合した無水物試薬は、反応性ペプチジル 無水物を形成するように活性化試薬としても、また無水物との反応に対するチオ シアネートイオン源としても作用する。

代わりの反応機構は図１５Ａの右側に示される。ここでは図中の四面体の中間体 Ｘ■のチオシアネート基は可能な変換された形でペプチドカルボニル炭素に移動 し、四面体の中間体ｘｖを形成し、これは迅速にこわれて相当するペプチドＩＴ Ｃ化合物（ＸＶＩ）を形成する。

さらに図１５Ａを引続いて参照すると、ペプチジル脱プロトン化（求核性）酸素 原子の反応の２つの可能な親電子的部位がある。

第１の部位、および図１５Ａの反応図に示されたものは、カルボニルの炭素であ る。第２の部位はチオカルボニル（チオシアネート）の炭素である。先に出願し た親出願に報告したように、溶液相混合無水物を含む反応の研究では、アルキル と了り−ルのカルボニル基（イソチオシアン酸とカルボン酸の混合無水物）は高 率の所望の炭素部位の反応生成物を特定の反応条件（ピリジンの存在）下に与え 、そして、対応して、低率の反応生成物はチオシアネートの炭素での核的攻撃か ら得られる。スルホン酸混合無水物試薬は低率の所望の生成物を与える。

分子軌道計算は、図１６に示された混合無水物で行なわれ、これはカルボン酸の アルキル（Ａ）およびアリール（Ｂ）混合無水物、炭酸のアルキル（Ｃ）および アリール（Ｄ）無水物、およびスルホン酸（Ｅ）のアリール混合無水物を含む。

この計算は、クオンタム・ケミストリイ・プログラム・イクスチェンジ（ブルー ミングトン、ＩＮ）から入手できるＭＯＰＡＣプログラムを用いて、二原子軌道 のモディファイドネグレクト（ＭＮＤＯ）方法（デヮー）によって行なわれた。

プログラムによってカルボニルとシアネートの炭素原子に対して計算された部分 電荷は、図におｐｈで５個の分子について示され、同じくカルボニル／シアネー ト炭素原子電荷の比は増加する順番で並べた。この計算は、ペプチジルアシル応 のアリールまたはアルキル置換体のありそうな効果を試験するために用いること ができる０例えば、ベンゾイルＩＴＣの電荷比の計算は、電子を強く引きよせる 置換体、例えばフェニル環のＦまたはＮ　Ｏｘが相対部分電荷比にあまり影響せ ず、反応生成物の比にあまり影響しないことを示している。

混合生成物の収率は図１６に示された５個の化合物について観察した。化合物に ついて計算された電荷の割合は、シアネートの炭素が高い部分電荷によってカル ボニルの炭素（またはスルホニルの硫黄）にて活性化され、従って核的攻撃に対 して一層可能性のある部位になることを示している。これは、アルファーベータ 不飽和ケトンの観察された反応性に類似しており、そこではケトンの炭素での一 層大きい部分電荷が核的攻撃に対してベータの炭素の反応性を高めることになる 。この反応図は、アルキルカルボン酸の混合無水物（例えば、化合物Ａ）が最良 の生成物の収率を与えることを予想しているが、アルキルカルボニルの炭素の反 応性が一層高いと混合無水物を一層加水分解を受けやすくするが、これはアリー ルカルボン酸混合無水物と共に観察された所望のペプチジル−ＩＴＣ生成物の収 率が若干大きいことを説明することができる。

所望のペプチジルＴＨを形成するためのペプチジルＩＴＣ化合物の環化は図１５ Ｂに示されており、恐らくペプチド［ＴＣ化合物中のアミドの窒素にチオンアネ ートの炭素による親電子的攻撃、および図中のＸＩＸで示されるペプチジルＴＨ を形成する迅速な環化を含むであろう。この環化反応はピリジンによって触媒作 用され、以前に提案されたように（ミラー、１９８９）　、ピリジンがチオシア ネート部位と反応し反応性の炭素中心の反応性を高めることができることを示唆 している。

ペプチドと活性化固体支持体の反応に続いて、得られたペプチジルＴＨは固体支 持体から、反応混合物を固体支持体から洗浄または溶出することによって、分離 される。本発明の重要な特徴によれば、保護されたペプチドをペプチジル−ＴＨ に変換するための唯一の反応成分は固体支持体上に運ばれ、反応生成物はペプチ ジルＴＨを形成する際に支持体によって脱離されない。すなわち、固体支持体か ら分離したペプチジルＴＨはＴＨ形成反応の活性化試薬または試薬副生成物を含 まない。

また、図１５Ａの下部に見られるように、反応は元（活性化前）の酸の形の固体 支持体を再生する。固体支持体は図１１〜１３に関連して上述した活性化反応の いずれかによって活性化することができる。

別の観点では、本発明はＮ−保護アミノ酸からアミノ酸ＴＨを生成する方法を含 む。この方法は上記のものと類似しており、Ｎ−保護ペプチドの代わりにＮ−保 護アミノ酸を使用する。アミノアシル−ＩＴＣの形成および相当するアミノ酸Ｔ Ｈを生成するための環化に続いて、生成物を固体支持体から分離し、反応物およ び副反応生成物を含まない保護アミノ酸ＴＨを生成する０分離されたアミノ酸Ｔ Ｈは、例えば既知の方法にしたがって酸または塩基の条件下に、脱保護すること ができる。

ｎｃ、アミノ　ＴＨの　と口 このセクションは、本発明の方法の最終工程を記載しており、（ａ）ペプチジル ＴＨを残りのペプチドに結合するアミド結合を開裂するために有効な開裂条件下 にペプチジルＴＨを処理し、そして（ｂ）単離し、単離したアミノ＃ＴＨを同定 する。

好ましい方法では、開裂反応は適当な溶媒中でペプチジルＴＨを固相開裂試薬と 接触させて行なわれる。すでに報告された（ヤマシタ）ひとつの固相開裂試薬は アルトリフチ（ミルウォーキー、ＷＩ）から入手できるカチオン交換樹脂アンバ ーライト（登録商標）　ＩＲ−１２０（プロトン化された形）である０図１７に 示したように、樹脂はペプチジルＴＨの酸接触加水分解を促進し、所望のアミノ 酸ＴＨ（ＸＸＩ）および残基ペプチド（Ｘ　Ｘ）を生成する。

代表的には、ペプチジルＴＨサンプルを樹脂（樹脂１グラムにつき入手できる約 ２ミリグラム当量のＨ゛）に添加し、混合物を２〜６時間室温にてインキユベー トする。ペプチド溶液は真空によってペプチジルＴＨ形成に使用される溶媒を除 去し、ペプチジルＴＨを水性媒体に再溶解することによって一般に調製される。

残りのペプチドはカチオン交換樹脂に結合することができ、樹脂を低いイオン強 度の条件下に洗浄することによって、遊離のアミノ酸ＴＨを残りのペプチドから 分離する。支持体に結合した残りのペプチドを用いて、遊離のアミノ＃ＴＨは実 質的に精製された形で洗浄または溶離によって得ることができる。引続いて残り のペプチドは高いイオン強度またはｐＨで溶離することによって脱離することが できる。

代わりに上記のように形成された残りのペプチドおよびアミノ酸ＴＨを、必要な らば、アニオン交換樹脂を通る経路によって、またはクロマトグラフィーによっ て、例えばＨＰＬＣまたは分子ふるいクロマトグラフィーを用いて分離すること ができる。

第２の一般的な実施例では、開裂試薬をペプチジルＴＨと反応できる化学基と共 に誘導し、遊離アミノａＴＨを脱離し、残りのペプチドを共有結合する。次に遊 離アミノ酸ＴＨを洗浄または溶離によって実質的に純粋な形で単離することがで き、残りのペプチドは支持体からペプチドを加水分解して脱離することができる 。

１例となる固相開裂試薬は図１８に示したＮ−アルキル誘導固体支持体（ＸＸｎ ）である０図中のＲ基は好ましくはメチル基または他の低級アルキル基である０ 図に示されるように、固体支持体上のヒドロキシルアミン基によるペプチジルＴ Ｈの加水分解は、遊離アミノ酸ＴＨを脱離すると共に、残りのペプチドの支持体 へのＯ−ヒドロキサメートエステル結合を形成する。反応は好ましくはアプロチ ック溶媒、例えばＭｅＣＮ中で、トリエチルアミン（ＴＥＡ）のような有機塩基 の存在で行なわれる。

アミノ酸ＴＨを回収した後、残りのペプチドは、図１８の下部に示したように、 酸性にした水性媒体と接触させて支持体から加水分解により開裂することができ る。このようにして本方法はアミノ酸ＴＨおよび残りのペプチドを、それぞれ反 応物や副生成物を含まない実質的に精製された形で、分離して単離する。加水分 解はヒドロキシアミン支持体を再生する。

脱離したアミノ酸ＴＨ化合物は既知のクロマトグラフィーによる方法、例えば高 圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ”）によって、標準の操作に従って、 同定することができる。化合物の同定はカラム中の走行時間を、標準法に従っで あるいは上記アミノ酸ＴＨの調製法によって、調製された既知の参照アミノｆｉ ＴＨの走行時間と比較して簡便に行なうことができる。代わりに、脱離して単離 したアミノ酸ＴＨを、マススペクトロメトリーまたはＮＭＲのような、他の用い 得る方法によって同定することができる。

さらに一般的に、本発明は一般式： （式中のＲ＋、Ｒｚはそれぞれアルキルまたはアリール基、好ましくはアルキル 基であり、Ｎ置換体の一つは固体支持体に結合することができる）を有する２級 ヒドロキシアミンを用いてペプチジル＝ＴＨ試薬を加水分解することが考えられ る。このさらに一般的な実施例では、溶液中のあるいは固体支持体に固定化され たペプチジル−ＴＨを、水中でまたはアセトニトリルのような有機溶媒中で、そ れ自体が溶液中にある（例えばペプチジル−ＴＨが固定化されている場合）、ま たは固定化されている（ペプチジル−ＴＨが溶液中にある場合）２級ヒドロキシ ルアミンと反応させる。

好ましい２級ヒドロキシルアミンは、ジアルキルヒドロキシルアミン、例えばジ メチルまたはジエチルヒドロキシルアミンであり、これらは市販されている。ア リールヒドロキシアミンもまた適当であるが、アミノｊｌｌＴＨ検出を妨害する かも知れない、また、アリールヒドロキシルアミンは酸性条件下に望ましくない アミノフェノールに転位するかもしれない。Ｒ＋　、Ｒｚはまたアシル基でもよ いが、これらの化合物は水性の条件下に過度に加水分解を受けやすい。

ＨＤ、Ｃ−ｒ４’　＋ このセクションは上記方法を、自動化または半自動化操作に適するＣ−末端溶液 相配列決定に応用することについて述べる。ここで使用されるように、“溶液相 配列決定”は、ペプチドを溶液中に保存し、順次固相試薬を介して再循環する配 列決定反応である。これはペプチドを固体支持体に固定化する固相配列決定とは 対照的であり、溶液相Ｃ−末端残基活性化および開裂試薬に繰り返し反応させる 。

図１９は、ペプチドＰｅｐ−ＡＡ、、すなわち、ｎ残基とＣ−末端残基ＡＡ、を 有するペプチドに応用する一般の配列決定図である。マスペプチドはピリジンの アセトニトリル溶液のような適当な非求核性溶媒に溶解し、１２で示した充填カ ラムに含まれる活性化固体支持体樹脂に添加する。カラム１２は好ましくは、固 体支持体開裂試薬を含むカラム１６も含む２段階カートリッジ１４の一部である 。

ペプチドを活性化支持体と反応させた後、ペプチジルＴＨを含む反応溶液はカラ ム１２からカラム１６に溶出する。オブシツンとして、２つのカラムを中間室（ 図には示していない）によって分離することができ、そこではカラム１２の溶媒 を真空によって除去し、サンプルをカラム１６に導入する前に第２の溶媒によっ て置換する。

好適例では、固体支持体試薬は図１８に示したタイプのものである。

この支持体は（ａ）開裂反応をカラム１２の反応に使用したものと同じ非水溶媒 または溶媒混合物中で行うことができ、そして（ｂ）残りのペプチドと支持体の 結合及び支持体からの脱離は共有結合によるものであり、従ってペプチドの荷電 特性に依存しないという利点をもつ。

開裂反応は上述のような条件下に行なわれ、その後にＣ−末端アミノ酸ＴＨ（Ａ Ａｌｌ−ＴＨ）がカラムから溶出し、例えばＨＰＬＣによって同定される。続い て、カラムを水性媒体で洗浄し、結合した残りのペプチド（Ｐ　ｅ　ｐ　−Ａ　 Ａ−＋）を脱離する。

反応カラムを再使用しようとする場合、良く洗浄し、第１のカラムを、上記のよ うに、アシル■ＴＣの形態まで再活性化する。

代わりに、２つのカラムカートリッジは、新しいカートリッジで生じる追加の配 列決定反応と共に、使い捨てにすることができる。

第１の配列決定サイクルから得られた残りのペプチドを乾燥し、適当な緩衝液中 に溶解し、新しいまたは再活性化したカートリッジに導入する。第２の配列決定 サイクルは終りから２番目のＣ−末端残基（Ａ、Ａ、、　−Ｔ　Ｈ）のアミノ酸 ＴＨおよび２個のＣ−末端残基によって短くなった残りのペプチドを生成する。

配列決定サイクルは所望の数のＣ−末端残基が同定されるまで繰り返される。高 い信鎖で同定できるＣ−末端残基の全体の数は、第１の反応カラムにおいてペプ チドを所望のペプチジル−ＴＨに変換する度合、および第２の反応カラムにおい てペプチジル−ＴＨを開裂する度合に応じて変化するだろう、一般に、反応条件 は３〜５以上の残りの配列決定が望ましいところの生成物収率を高めるように選 択されるだろう。

別の観点では、本発明はペプチドのＣ−末端アミノ酸残基を決定するのに使用す るための固相システムを含む。このシステムはイソチオシアン酸とカルボン酸ま たは炭酸の混合無水物を用いて誘導される固体支持体から成る活性化支持体、お よび遊離アミノ酸チオヒダントインおよび残りのペプチドを形成するようにペプ チジルヒダントインを開裂するために有効な開裂剤を用いて誘導された固体支持 体から成る第２の支持体を含む。好ましい支持体は、例えばカラムに充填された 粒子支持体、またはペプチド溶液を通すことができるフィルター膜である。

前述のことから、本発明のこの実施例の種々の目的および特色をいかにして達成 するかを理解することができる。ペプチジルＴＨ形成の方法は上に引用した親出 願において開示されたアシルＩＴＣ反応法の利点を提供する。特に：本反応は（ ａ）比較的迅速であり、（ｂ）！和な反応条件下に行なうことができ、そして（ ｃ）開裂反応を酸性条件下に行う場合、Ｃ−末端アミノ酸の立体化学を保持し、 従ってＬ−またはＤ−形態のアミノ酸を決定するために使用できる。

次の実施例は種々のアシル化合物の合成、およびＣ−末端アミノ酸基を決定する ためのそれらの使用、およびＣ−末端配列決定を説明するためのものである。こ れらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。

林料 ピリジン、塩化メチレン、エチレンオキサイド、Ｂ　Ｆ　ｘ、エチルエーテル、 トリエチルアミン、ウッドワード試薬Ｋ、トリメチルシリルＩＴＣ、トリホスゲ ン、およびベンゾイルＩＴＣはアルドリッチ（ミルウォーキー、Ｗｌ）から得ら れた。ロイシンエンケファリンはシグマから、ジペプチドはバシエム・バイオサ イエンシーズから得られた。ポリジメチルアクリルアミド樹脂はジエイ・スパロ ウに従って調製され、約０．７ｍｅｑ／ｇのアミノ基を有していた。これらアミ ノ基のイソチオシアネートへの変換はチオカルボニルジイミダゾールおよびジイ ソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）のアセトニトリル溶液を用いて行われた 。核磁気共鳴スペクトルはＪｅｏｌ？　ＨＸ９０スペクトロメーターで集められ た。

マススペクトル分析はジエイ・レアリイの指導のもとにバークレイ・マススペク トロメトリー・ラボラトリ−によって行われた。

ペプチドは２つの方法のひとつ：　（１）尿素結合によって、または（２）チオ 尿素結合によって（上記のイソチオシアネートー樹脂を用いて）樹脂に結合させ た。

（１）尿素結合：樹脂は過剰のＤＩＰＥＡを用いて中和し、１０％ピリジン／Ｎ ＭＰ中に過剰にＤＳＣを用いて１〜２時間、室温にて反応させた。数回洗浄後、 最後にＡＣＮを用いて洗浄し、ペプチドの１０％ピリジン／水溶液を湿った樹脂 に添加し、そのまま終夜放置した。樹脂は良く洗浄し真空下に乾燥させた。代表 的な充填量は〉１００ナノモル／ｍｌである。アミノ酸分析および１周のＣ−末 端分析によって確認する。

（２）チオ尿素結合：ペプチドの溶液をＩＴＣ（上記）またはＤＩＴＣ樹脂に添 加し、４５℃で終夜インキニーベートする。洗浄し乾燥した後、ペプチド（アミ ノ末端アミノ酸を減らして）のＴＦＡ開裂によって、続いてＨＰＬＣの特徴とシ ーケンス分析によって結合を確認する。

裏立勇上 Ｌｅｕ−Ｖａ　１ジペプチドのＣ− Ａ、カップリング： ペプチジル樹脂（約ｌａｇｓ尿素結合を介して結合したＬｅｕ−■ａｌ）ヲ１０ ０ＩＪｌの１０％ピリジン／アセトニトリルに懸濁させる。ベンゾイルイソチオ シアネート（Ｂ　Ｉ　ＴＣ）　（１０μｍ）を添加し、かきまぜて混合し、３０ 分間、６０℃にて反応させた。樹脂を数容量のア七ト二トリルで洗浄し、真空下 に乾燥させた。

Ｂ、加水分解： 上述で得られた樹脂を１０μｌの１０％プロピルアミンのアセトニトリル溶液で 湿潤させた。室温で１５分後に揮発性物質を除去し、アミノ酸ＴＨを分析のため にアセトニトリルを用いて抽出した。

Ｃ，ＨＰＬＣ： 疏水性のアミノ酸チオヒダントインの分離は、ＰＴＨ−Ｃ１８カラム（２，１ａ 細Ｘ２２ｃｓ＋、　Ａ　Ｂ　Ｉ　＞を用いる狭いボアシステム（モデル１２０　 Ａ、アプライド・バイオシステムズ）およびＴＦＡ−水一アセトニトリルこう配 システムで容易に達成された。ますカラムを注入後、５分間１００５　Ａに保持 したＡ溶媒（水中０．１％ＴＦＡ。

ｖ　／　ｖ　）中で平衡させ、次いでＸ分以上Ｘ％のＢ溶媒（７０％アセトニト リル中、０．８５％ＴＦＡ）に対し勾配を展開させた。Ｂのパーセンテージを次 に９０％まで５分以上増加させ、そこで２０分間保持した。流速は室温で２００ μｌ／分であった。流出液をＴＨに対して２６９ｎｍにて、またペプチドに対し て２１４ｎ＋ｍにてモニターした。

チオヒダントインは標品物質の溶出と比較して同定した（下記のパートＤを参照 ）。パートＢでの抽出物のＨＰＬＣは図４Ｂに示される。主ピークは容易にＴＨ −Ｖとして同定される。その帰属はコインジェクシッン（Ｃｏｉｎｊｅｃｔｉｏ ｎ）によって確認した０図４Ａは樹脂のトリメチルシリルイソチオシアネート（ ホウク）と反応させるコントロール実験で生成したＴＨ−Ｖ生成物を示す。

Ｄ、標品の調製： 疏水性残基のアミノ酸チオヒダントインは、古典的方法（例えばクロムウェル） によって調製することができる。簡単に述べると、アミノ酸を酢酸／無水酢酸中 のチオシアネート塩で９０℃まで３０分間処理する。真空乾燥した後、残渣を１ ２ＮのＨＣＩに溶解し、室温にて１時間までの間装置した。再び混合物を真空乾 燥し、通常のように沸騰水から残渣を再結晶した。構造式はＮＭＲおよびマスス ペクトロメトリーによって矛盾しなかった。

大血拠１ Ａｌａ−ＭｅｔジペプチドのＣ−末「 実施例１に記載した方法に従って、固定化Ａｌａ−Ｍｅｔ　（尿素結合）はＢ　 ｉＴｃとＰＡを用いて１サイクルにて分解した。得られたクロマトグラムは図４ Ｄに示される。メチオニンＴＨ（Ｍ＝ＴＨ）の帰属はコインジェクションによっ て確認した。

災施■ユ ロイシンエンケファリンＣ−ｙ　＼ チオ尿素結合を介して樹脂に結合したＬｅｕ−エンケファリン（ＹＧＧＦＬ）を 実施例１と同様にＢＩＴＣおよびＰＡを用いて処理した。脱離したＬ−ＴＨはＨ ＰＬＣによって検出した。

さらに樹脂をアセトニトリルを用いて洗浄し、乾燥し、次に水中の２％ＴＦＡを 用いて６０℃にて１０分間処理し、ペプチド成分を樹脂から脱離させた。単離に 続＜ＨＰＬＣ分析および配列決定およびＦＡＢマススペクトロメトリーはデスロ イシンペプチドに相当する主ピークを示し、Ｃ−末端アミノ酸の損失を確認した 。

災胤阻↓ Ｎ−ＰｈｅＧｌ　のＣ−ｒ Ｎ−保護ｔ−Ｂｏａ　Ｐｈｅ−Ｇｌｙを市販品により得た。ペプチドを１００μ ｍの１０％ピリジン／アセトニトリル（ＰＡ）に懸濁させた。トリメチルアセチ ルＩＴＣ（１０μｌ）を添加し、撹拌しながら混合し、３０分間６０℃にて反応 させた０ｗｉ脂を数容量のアセトニトリルで洗浄し、真空下に乾燥させた。

ｔ−１３ｏｃ基とＧ　１　Ｆ−ＴＨの両者の開裂は６０°にて２５％ＴＦＡ／水 中で加熱して行われた０反応はＨＰＬＣによって追跡し、出発物質の速い損失が 示され（反応の１５分後に判定した）、またＧ−ＴＨと少量の成分（多分Ｂｏｃ −説保護脱ペブチジル−ＴＨ）の出現が示された。２時間反応したあとは、Ｇ− ＴＨのみが検出された。

清ｍ Ｌｅｕ−エンケファリンのＣ−ｒ 固定化されたロイシンエンケファリン（尿素結合）を２サイクルの化学作用に対 して分解させた。エトキシカルボニルイソチオシアネート（ｔ３ＩＴｃの代わり ）を用いて５分間６０℃にてカップリングを行った。１＋ｑ／ｍｌのＤＴＴを含 む水中の１０μｍの１０％テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムヒドロキサイドを、 乾燥樹脂に添加して、４５分間６０℃にて加熱して開裂を行った。クロマトグラ ムは図５Ａと５Ｂに示される。このサイクルはロイシンとフェニルアラニンをそ れぞれ帰属させた。この帰属はコインジエクションによって確認された。

実崖■旦 イソロイシンの　−　の８′１ 約１０Ｎモルのｔ−Ｂｏｃ−イソロイシンを１００μｌの１０％ピリジン／アセ トニトリルに溶解させた。これを６０℃にて２０分間、１０μｌのＢＩＴＣと共 に加熱した。生成物のＨＰＬＣ分析は単一の新しい主ピーク、ｔ−Ｂｏａ−ＩＩ ｓ−チオヒダントインを示した。少量のこの混合物を２５％ＴＦＡ中で６０℃に て１０分間開裂させた。反応混合物をアセトニトリルを用いて希釈し、ＨＰＬＣ によって分析した。その結果、ｌｌ５−ＴＨに相当する単一のピークがあった。

イソクラチックに（１１％Ｂ）ピークを走行させると、図７Ｂに示されるように 、異性体の改善された分解能を与え、約２％のエピマー化の上部結合を予想させ た。

Ｔ−Ｂｏｃ−イソロイシン（１０Ｎモル）を１００μｌの１０％ＴＭＳ−ＩＴＣ 無水酢酸溶液に溶解した。６０ｍで２０分間加熱して反応させた。物質を２５％ ＴＦＡ中で６０℃にて１０分間開裂させ、反応混合物をアセトニトリルを用いて 希釈し、上述のように、ＨＰ　Ｌ、Ｃによって分析した。その結果、図７Ａに示 すように１ｉｅ−ＴＨのジアステレオマーの形にに相当する二重のピークがあっ た。

夫施拠１ スルホニル■ＴＣ゛パとＮ−アミノ　の　・、Ａ、ベンゼンスルホニルイソチオ シアネート（ＢｚＳ−ＩＴＣ）の調製 ベンゼンスルホニルクロライドをアルトリフチ・ケミカル社から入手した。化合 物（１ミリモル）を最終容量１０ｍ１の３ミリモルのピリジンエチルアミンを含 むＣＨ，ＣＩ□に溶解した。この混合物に１ミリモルのＴＭＳＩＴＣを添加し、 反応混合物を１時間２５℃にて撹拌した。ベンジルスルホニルイソチオシアネー ト（ＢｚＳＩＴＣ）を、生成した塩を濾過することによって回収し、溶媒を除去 し、真空で副生成物を揮発させた。

Ｂ、アミノ酸ＴＨを生成するための反応１ミリモルのｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕを、ピ リジンを含むジクロロメタン、次に上記のへのように調製した１ミリモルの１３ ｚｓＩＴＣに溶解した。終夜反応させた後、溶媒をロータリーエバポレーターに よって除去し、生成したｔ−Ｂｏｃ−Ｌｓｕ−ＴＨをシリカゲルのクロマトグラ フィーによって精製した。ＴＨ化合物の同定はＮＭＲとＨＰＬＣによって行った 。

叉施勇よ り　ｚ　Ｍ　Ｂ　Ｔとペプチジル　の Ａ、ＢＺＭＢＴの調製 メルカプトベンゾチアゾール（１ミリモル）とジイソプロピルエチルアミン（１ ミリモル）を５曽ｌのアセトニトリルに溶解した。

ベンゾイルクロライド（１ミリモル）を迅速に撹拌しながら注射器によってゆっ くりと添加した。室温にて２時間後、溶媒を一部除去してアミン塩を沈殿させた 。上澄み液をさらに濃縮し、シリカゲルのクロマトグラフにかけた（９：１、ヘ プタン：酢酸エチル）。

Ｂ９反応 ペプチジル樹脂（１ｍｇレンク、チオ尿素結合）を１００　μｍの１０％ピリジ ンを溶かした１ｍｇＢｚ−ＭＢＴ含有アセトニトリル溶液に懸濁させた。反応液 を６０℃にて３０分間加熱し、次いで前述のように洗浄し乾燥した。アリールチ オヒダントインを１０％のプロピルアミンを用いて室温にて１５分間開裂させた 。ＴＦＡを用いた処理では、ＨＰＬＣによって評価されたと同様にＣ−末端残基 の喪失によって確認されたように、残りペプチドフラグメントは樹脂から脱離さ れた。

スｍ ペンソイルイソチオシアネート　いた　・１モルのｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕを僅かに 過剰のベンゾイルイソチオシアネートと実施例７のものと［（１した反応混合物 中で反応させた。ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｓｕにクロマトグラフを行い、次に、脱保護し て適度の収率のヒダントインを与え、ＮＭＲによって確認した。

ス１１九則 ・　の！　ｌ：　法１ ｐ−アミノメチルポリスチレン樹脂（１％ジビニルベンゼン架橋）（２ｇ、１． １０ミリモル／ｇ）をＣＨｚＣｌｇ中で予備膨潤させた。

ＦＭＯＣ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ　（３ミリモル、０．８モル過剰）を１０１のＣＨ ｚＣｌｇに溶解し、樹脂に添加した。Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ ０，４６ｍ１．３モル）を直ちに添加し、反応物を約１時間振盪した。樹脂を溶 媒で良く洗浄し、ニンヒドリンを用いて一部分テストした（アミンは残ってぃな かった）。ガンマカルボキシルのｔＢｕ保護基をトリフルオロ酢酸ＴＦＡ（５０ ％Ｕ、Ｃ＋。

／ＴＦＡ）を用いて約０．４時間内に除去した。樹脂を溶媒で洗浄し、ジイソプ ロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いて中和させた。

その間に、ウッドワード試薬Ｋ　（ＷＲＫ、３ミリモル）を、約２時間にわたっ て２０１ＣＨｚＣｈ中で３当量のケテンイミンに変換した。溶液はほぼ均一に黄 色くなり、次いでポリスチレン樹脂に添加した。２時間後、樹脂を洗浄し、３ミ リモルのＴＭＳＩＴＣを添加した。終夜撹拌した後、樹脂をＣＨｚＣｈを用いて 洗浄した。

機能的になった樹脂は０．７４ｇ重量増であった。理論的な重量増は０．８７． である。

叉血班Ｕ Ａ　Ｉ　ａ　−ＴＨの− ＢＯＣ−Ａ　１　ａ　（１０＋ｓｇ）を２ｍｌのＣＨｚＣｈおよび１２μｌのピ リジンに溶解した。これを４０℃にて１００ｍｇの新しく調製した樹脂上でイン キュベートした。溶液相を樹脂からピペットで取り出し真空遠心分離によって濃 縮した。残りのオイルをＨＰＬＣと’ＨＮＭＲによってチェックした。約５０％ のＢＯＣ−Ａｌａを示した積分は対応するＴＨに変換されていた。ＢＯＣ基を水 性ＴＦＡを用いて除去した。ＨＰＬＣ保持時間は標品のＡｌａＴＨのそれと一致 した。

生成したアミノ酸ＴＨは、ＰＴＨ−ＣＩ８カラム（２，１ｍｍ　Ｘ２２ｃ曽、Ａ Ｂ　Ｉ）を用いる狭いボアシステム（モデル１２０Ａ・アブライドバイオシステ ムズ）およびＴＦＡ−水−アセトニトリルグラディエンドシステムを用いて、Ｈ ＰＬＣによって同定した。カラムは最初、Ａ溶媒（０，１％ＴＦＡ水、ｖ　／　 ｖ　）中に平衡させ、注入後５分間、１００％Ａ、０％溶溶媒円内保持し、次い でリニアーグラディエンドを３０分にわたって４０％Ｂ溶％（７０％アセトニト リル中に０．８５％ＴＦＡ）に対して展開させた。次にＢの割合を９０％まで５ 分間にわたって増加させ、そこで２０分間保持した。流速は室温で２００μｌ１ 分であった。溶出液を２６９ｎｎ＋にてモニターした。

本発明は特定の試薬と方法に関して記載されているが、本発明から離れることな く種々の改変および変更を行うことができることは認められるだろう。

Ｆｉｇ、１ 工Ｘ Ｆｉｇ、２ −ＴＨ −ＴＩＥ 瓦−ＩｌｒＴ１ Ｌ−ＴＥ Ｆｉｇ、９ Ｆｉｃ２．　１０ Ｆｉｇ、ｌｌ Ｖ工 Ｖ工 冨ニ オ閤 Ｏ０工３３４ ０．ニス４０ Ｆｉｇ、１６ Ｆｉｃｚ、１Ｂ Ｐ＠ｐ−門、 Ｆｉｇ、１９ 要　約　書 アミノ酸チオヒダントインの生成方法。ペプチドのＮ−保護遊離アミノ酸または 末端アミノ酸を、イソチオシアン酸およびカルボン酸、炭酸、またはスルホン酸 の混合無水物と共に、塩基性の条件下に反応させて、アミノ酸またはペプチジル チオヒダントインを生成する。混合無水物は溶液相または固相試薬であることが できる０本方法はＣ−末端ペプチド配列決定のために使用することができる。ま た本方法に使用するための新規の固相試薬が開示されている。

国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．遊離カルボン酸基を有する保護された遊離またはＣ−末端アミノ酸のチオヒ ダントイン（ＴＨ）を製造する方法が、溶液中の該アミノ酸とイソチオシアン酸 およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物とを、該アミノ酸の該カ ルボン酸基が脱プロトン化される塩基性の条件下に接触させ、前記接触によって 該アミノ酸の該ＴＨを生成する工程からなる製造方法。
2. ２．該混合無水物が溶液中にあり、 次式： ▲数式、化学式、表等があります▼（式中のＡはアルキル、アルコキシ、アリー ルまたはアリールオキシ基である）で表される請求項１記載の方法。
3. ３．前記混合無水物がベンゾイルイソチオシアネートである請求項２記載の方法 。
4. ４．ペプチドのＣ−末端アミノ酸を決定するのに使用するため、前記接触が、Ｃ −末端アミノ酸チオヒダントインをペプチド中の終りから２番目のＣ−末端アミ ノ酸にアミド結合によって結合するＣ−末端ペプチジルチオヒダントインを生成 するために有効であり、そしてさらに前記アミド結合を開裂するために有効な条 件下にペプチジルチオヒダントインを処理し、これによってＣ−末端アミノ酸チ オヒダントインおよび長さの短くなったペプチドを脱離し、該脱離したアミノ酸 チオヒダントインを同定する工程を含む請求項２記載の方法。
5. ５．前記ペプチドが非Ｃ−末端残基にて固体支持体に結合し、さらに前記接触、 生成、処理および同定の工程を１回またはそれ以上の回数で繰り返し、該Ｃ−末 端ペプチド端から、該ペプチド中のアミノ酸の配列を同定する請求項４記載の方 法。
6. ６．該混合無水物が固体支持体に対して誘導され、次式：支持体▲数式、化学式 、表等があります▼（式中のＡは固体支持体に結合したアルキル、アルコキシ、 アリールまたはアリールオキシ基である）で表され、該保護された遊離またはＣ −末端アミノ酸が溶液中にある請求項１記載の方法。
7. ７．さらに前記接触によって生成された該アミノ酸ＴＨを該固体支持体から分離 する工程を含む請求項６記載の方法。
8. ８．該アミノ酸がペプチド中の該Ｃ−末端アミノ酸であり、前記接触が該Ｃ−末 端ペプチドがアミノ酸ＴＨである溶液相ペプチジルＴＨを生成し、前記分離が該 ペプチジルＴＨを前記固体支持体から分離し、該Ｃ−末端アミノ酸ＴＨを該残り のペプチドから開裂し、そして該残りのペプチドを含まない該遊離アミノ酸ＴＨ を単離する工程を含む請求項７記載の方法。
9. ９．Ｃ−末端ペプチドの配列決定に使用するために、さらに該ペプチドの該Ｃ− 末端アミノ酸を決定するため該アミノ酸ＴＨを同定する工程を含む請求項８記載 の方法。
10. １０．前記開裂が該ペプチジルＴＨの溶液を、該ペプチジルＴＨを開裂し共に溶 液相にある該遊離アミノ酸ＴＨと該残りのペプチドを形成するために有効である 開裂剤を用いて誘導された第２の固体支持体と接触させる工程を含む請求項８記 載の方法。
11. １１．イソチオシアン酸およびカルボン酸または炭酸の混合無水物を用いて誘導 された固体支持体からなる活性化支持体。
12. １２．次式： 固体支持体▲数式、化学式、表等があります▼（式中のＡは固体支持体に結合し たアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリールオキシ基である）で表される 請求項１１記載の支持体。
13. １３．イソチオシアン酸およびカルボン酸または炭酸の混合無水物を用いて誘導 された固体支持体からなる活性化支持体、およびペプチジルＴＨを開製して遊離 アミノ酸ＴＨおよび残りのペプチドを生成するために有効な開製剤を用いて誘導 された固体支持体からなる第２の支持体 から成る、ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基を決定するのに使用するための固相 装置。
14. １４．該第２の支持体が選択されたイオン強度とｐＨ条件下に該残りのペプチド を選択的に結合するために有効なイオン交換樹脂である請求項１３記載の方法。
15. １５．該第２の支持体が、（ａ）該ペプチジルＴＨを開裂して該遊離アミノ酸Ｔ Ｈを生成し（ｂ）該残りのペプチドに共有結合するために有効なヒドロキシアミ ン基を用いて誘導される請求項１４記載の装置。
16. １６．カルボキシル基を用いて機能化された固体支持体を供給し、該固体支持体 をイソキサゾリウム化合物と共に塩基性条件下に反応させて、該カルボキシル基 の活性化エノールエステルを生成し、そして 該支持体を、トリアルキルシリルＩＴＣおよびピリジン−ＩＴＣからなる群から 選ばれたイソチオシアネート（ＩＴＣ）と反応させて、該支持体上にイソチオシ アン酸とカルボン酸の混合無水物を生成する 各工程からなる、ペプチドを該支持体と接触させた際にＣ−末端ペプチジルチオ ヒダントイン（ＴＨ）に変換するために有効なアシルイソチオシアネートを調製 する方法。
17. １７．前記ＩＴＣがトリメチル−ＩＴＣである請求項１６記載の方法。
18. １８．イソキサゾリウム化合物が２−エチル−５′フェニルイソキサゾリウムス ルホネートである請求項１６記載の方法。