DE69021079T2

DE69021079T2 - Verfahren und reagens zur herstellung der aminosäure thiohydantoin.

Info

Publication number: DE69021079T2
Application number: DE69021079T
Authority: DE
Inventors: Victoria Boyd; David Hawke
Original assignee: Applied Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2010-12-21
Also published as: JPH05500421A; WO1991009868A1; EP0506846A4; EP0506846B1; DE69021079D1; ATE125267T1; JP2602461B2; EP0506846A1; US5041388A

Description

1. Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung der Aminosäure Thiohydantoin, zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure eines Peptids, zur Sequenzierung eines Peptids von seinem C- terminalen Peptidende und auf Reagentien, die für die Verfahren nützlich sind.

2. Literatur

Cromwell, L.D., et al., Biochemistry 8 : 4735 (1969).
Edman, P., Acta Chem Scand, 4 : 277 (1950).
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Yamashita, S., Biochimica et Biophysica Acta, 229 : 301-209 (1971)

3. Hintergrund der Erfindung

Die Bestimmung der Aminosäuresequenz, d. h. der primären Struktur eines Peptids, ist entscheidend für das Verständnis der Peptidstruktur sowie für die Manipulation des Peptids, um die gewünschten Eigenschaften in einer modifizierten oder veränderten Form zu erreichen. Zusätzlich ist die Aminosäuresequenz eines Peptids bei verschiedenen rekombinanten DNA-Verfahren zur Identifikation der Gencodierungssequenz des Peptids, zur rekombinanten Herstellung des Peptids und/oder zur Herstellung ortsspezifischer Veränderungen des Peptids nützlich.
Verfahren zur Anwendung bei der N-terminalen Sequenzierung sind bekannt (z. B. Edman). Trotz der relativ einfachen und zuverlässigen N-terminalen Sequenzierverfahren ist es oft gewünscht, Informationen zur C-terminalen Aminosäurensequenz zu erhalten, die mit diesem Verfahren möglicherweise unzu-gänglich oder nur schwer zu erhalten sind. Informationen zur carboxy-terminalen Sequenz können für bestimmte Arten rekombinanter DNA-Verfahren nützlich sein, vor allem da das C-terminale Ende des Codierbereichs eines Proteins dem Ende entspricht, das am nächsten an einer Poly-A-Kette liegt, die wahrscheinlich in cDNA-Clones vorhanden ist.
Drei allgemeine Ansätze wurden für die C-terminale Peptidsequenzierung vorgeschlagen: enzymatisch, physikalisch und chemisch. Diese Verfahren und ihre inhärenten Beschränkungen wurden zu den oben genannten ursprünglichen Anmeldungen zusammengefaßt. Weder die enzymatische noch die physikalische Bestimmung waren bisher zufriedenstellend. Angesichts dieser Tatsache wurden beträchtliche Anstrengungen bei der Entwicklung chemischer Verfahren zur Bestimmung von C- terminalen Aminosäureresten und zur C-terminalen Sequenzierung unternommen. Eine inhärente Schwierigkeit bei der C-terminalen Sequenzierung ist die relativ schwache Reaktivität der Carboxyl-Gruppe, im Gegensatz zur relativ einfachen Zugabe bei der N- terminalen Aminogruppe. Unter den Reaktionsverfahren, die für die C-terminale Sequenzierung vorgeschlagen wurden, wurden drei besonders beachtet.
Das erste Verfahren beinhaltet die Erzeugung eines Carboxyamid-Derivats am C-terminalen Ende des Peptids, gefolgt von der Reaktion mit bis(1'1- trifluoroacetoxy)iodobenzen zur Bildung eines Derivats, das zu einem verkürzten Carboxyamidopeptid und dem Aldehydderivat der C-terminalen Aminosäure umordnet und hydrolisiert (Parham). Das Verfahren wurde nur 3-6 Zyklen lang erfolgreich durchgeführt, bevor die Reaktion anhielt. In einem zweiten, ähnlichen Ansatz reagiert das Carboxy-Ende mit Pivaloylhydroxamat und bewirkt so eine Lossen-Umordnung. Eine Beschränkung des Verfahrens ist, daß beim chemischen Verfahren keine Asparagin- und Glutaminsäurereste abgebaut werden (Miller, 1977).
Das am gründlichsten untersuchte C-terminale chemische Verfahren ist die Thiohydantoin(TH)-Reaktion. In einem allgemeinen Verfahren zur Ausführung des TH- Verfahrens wird die Carboxyl-Gruppe mit einem Anhydrid, z. B. Azetylanhydrid, in Anwesenheit von Isothiocyanat(ITC)-Salz oder -Säure aktiviert, so daß sie über ein C-terminales ITC-Zwischenglied ein C- terminales Peptidyl TH bildet (Stark, 1972). Das Peptidyl TH kann abgespalten werden, so daß ein verkürztes Peptid und eine C-terminale Aminosäure TH erzeugt werden, die z. B. durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) identifiziert werden können. Die Ankoppelungsbedingungen dieses Verfahrens erfordern üblicherweise 90 Minuten bei 60-70ºC (Meuth) und führen oft zum Abbau einiger der Aminosäuren-Seitenketten im Peptid. Außerdem ist das Anhydrid-Reagens relativ instabil und erzeugt daher Lagerungsprobleme.
Ein C-terminales TH-Sequenzierverfahren, das unter gemäßigteren Bedingungen durchgeführt werden kann, wurde von einem der Erfinder und Mitarbeiter (Hawke) beschrieben. Bei Verwendung von Trimethylsilyl- Isothiocyanat (TMSITC) als Reagens wurde die Bildung von TH durch Aktivierung des Peptids mit Azetylanhydrid 15 Minuten lang bei 50ºC, gefolgt von der Reaktion mit TMS-ITC weitere 30 Minuten lang bei 50ºC erreicht. Das Verfahren hat den Nachteil, wie oben erwähnt, daß das Peptid einem hochreaktiven, anhydrid-aktivierenden Wirkstoff ausgesetzt wird. Außerdem werden wie bei den ähnlichen, oben beschriebenen TH-Herstellungsverfahren die Reaktionsprodukte der Aminosäure TH racemisiert, und dadurch kann das Verfahren nicht angewandt werden, um zwischen D- und L-förmigen Aminosäuren zu unterscheiden.
Die eben beschriebenen C-terminalen Sequenzierverfahren mit TH-Bildung führen normalerweise zu racemisierten Produkten. Eine Veränderung der C-terminalen Reaktion mit Phosphoryl-Isothiocyanatidat-Reagens wurde vorgeschlagen (Kenner). Obwohl TH hergestellt wurde, war die Reaktion zu langsam, um nützlich zu sein. Miller et al. haben ein ähnliches Verfahren vorgeschlagen, aber ein Mercaptobenzothiazolderivat verwendet. Die Gründe für die Verwendung dieser Verbindung sind, daß die Zyklisierung von einer Öffnung des Thiazol-Rings begleitet sein könnte.

4. Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein allgemeines Ziel der Erfindung, ein Sequenzierverfahren für ein C-terminales Peptid vor zusehen, das eine relativ schnelle C-terminale Bildung des Peptidyls TH bei relativ gemäßigten Reaktionsbedingungen ermöglicht, und das insbesondere keine Verwendung eines Anhydrid-Aktivierungsreagens erfordert.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein neues Reagens zur Verwendung bei der C-terminalen Sequenzierung vorzusehen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein C-terminales Sequenzierverfahren vorzusehen, das unter Bedingungen durchgeführt werden kann, in denen wenigstens einige der Reaktionsprodukte der Sequenzierreaktion auf einem Festträger isoliert werden.
Es ist ein allgemeineres Ziel der Erfindung, ein Verfahren und ein immobilisiertes Reagens zur Herstellung einer Aminosäure TH vorzusehen.
Die Erfindung umfaßt unter einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Thiohydantoin (TH) einer geschützten Aminosäure mit einer freien Carboxylsäuren- Gruppe. Die geschützte Aminosäure reagiert mit einem gemischten Anhydrid aus Isothiocyansäure und einer Carboxyl-, Carbon- oder Sulfonsäure, unter Bedingungen, bei denen die Carboxylsäure-Gruppe der Aminosäure de-protoniert wird. Unter einem ähnlichen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des C-terminalen Aminosäurerests eines Peptids. Das Peptid reagiert mit einem gemischten Anhydrid aus Isothiocyansäure und einer Carboxyl-, Carbon- oder Sulfonsäure, unter Bedingungen, bei denen die Carboxylsäure-Gruppe der C-terminalen Aminosäure deprotoniert wird, um das entsprechende C-terminale Peptidyl Thiohydantoin (TH) herzustellen. Die C- terminale Hydrolyse der Peptidyl-TH-Bindung setzt die Aminosäure TH frei, die anschließend, z:B. mit HPLC, als Addukte der Aminosäure TH identifiziert werden kann.
Bei einer Ausführung hat das im Verfahren verwendete Anhydrid-Reagens die Form:
wobei A eine Alkyl-, Aryl- oder Aryloxy-Gruppe ist.
Bei einer allgemeinen Ausführung reagiert die N- geschützte Aminosäure oder das Peptid mit einem gemischten Anhydrid-Reagens in Lösungsphase.
Bei einer anderen allgemeinen Ausführung der Erfindung wird die N-geschützte Aminosäure oder das Peptid mit einem Festträger in Kontakt gebracht, der mit einem gemischten Anhydrid aus Isothiocyansäure und Carboxyl-, Carbon- oder Sulfonsäure derivatisiert wurde, unter Basisbedingungen, bei denen die Carboxyl-Gruppe der Aminosäure de-protoniert wird. Die Aminosäure TH, die in Lösung gebildet wird, wird vom Festträger getrennt, z. B. durch Elution des Produkts vom Träger.
Der Aryl-ITC-Träger hat vorzugsweise die Form: Festträger
wobei A eine Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Aryloxy- Gruppe ist, die am Festträger befestigt ist. Der Festträger kann durch Aktivierung mit dem Woodwards- Reagens K oder einem Anhydrid-Reagens derivatisiert sein, in beiden Fällen gefolgt von der Reaktion mit einem ITC, oder durch Reaktion mit einem Lösungsphasen-Acyl-ITC des hierin beschriebenen Typs.
Zur Verwendung bei der Sequenzierung von C-terminalen Peptiden umfaßt das Verfahren der Erfindung außerdem die Abspaltung der C-terminalen Aminosäure TH vom Restpeptid und die Identifizierung der abgespaltenen Aminosäure TH, z. B. durch HPLC. Bei der Ausführung mit einem Festphasen-Reagens wird das Peptidyl TH vorzugsweise mit einem zweiten Festträger in Kontakt gebracht, der einen Abspaltungswirkstoff hat, der das Peptidyl TH vom Restpeptid abspalten kann. Das Peptid wird vorzugsweise auf dem Festträger zurückgehalten, entweder durch Ionenaustauschbindung oder durch kovalente Bindung, die während der Abspaltungsreaktion entsteht. Nach Elution der Aminosäure TH in der Lösungsphase kann das Restpeptid freigesetzt und zur weiteren Sequenzbestimmung zurückgeführt werden.
Unter einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung einen aktivierten Träger, der aus einem mit einem gemischten Anhydrid aus Isothiocyansäure und Carboxyl- oder Carbonsäure derivatisierten Festträger besteht und vorzugsweise folgende Form hat: Festträger
wobei A eine Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Aryloxy- Gruppe ist, die am Festträger befestigt ist.
Ein ebenfalls bildender Teil der Erfindung ist ein System zur C-terminalen Sequenzierung der Lösungsphase. Das System umfaßt einen aktivierten Träger des oben beschriebenen Typs und vorzugsweise einen zweiten Festträger, der (i) ein Peptidyl TH abspalten kann, um die Aminosäure TH freizusetzen, und (ii) das Restpeptid an den Träger binden kann. Das Restpeptid kann wahlweise vom Träger freigesetzt werden, nachdem die Aminosäure TH gewonnen wurde. Das System kann für nachfolgende C-terminale Peptidbestimmungen eine Reihe solcher Träger umfassen.
Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung werden offensichtlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt gemischte Anhydride aus Isothiocyansäure (Verbindungen I-V), die bei Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können;
Fig. 2 zeigt den erfindungsgemäß vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus einer Peptid-Carboxyl-Gruppe mit einem Alkyl-Acyl-ITC-Reagens zur Bildung einer Peptidyl-ITC-Verbindung;
Fig. 3 zeigt einen vorgeschlagenen Mechanismus zur Bildung eines Peptidyls Thiohydantoin (TH) und zur Hydrolyse der terminalen Aminosäure TH zur Herstellung einer Aminosäure TH und eines verkürzten Peptids;
Fig. 4A und 4B sind HPLC-Chromatogramme, welche die vergleichenden Ergebnisse von C-terminalen Aminosäuren TH zeigen, die mit einem Verfahren hergestellt wurden, das TMS-ITC als Azetylanhydrid verwendet, gemäß Verfahren der bisherigen Technik (4A), und ein gemischtes Reagens aus Benzoyl-ITC und Anhydrid gemäß der vorliegenden Erfindung (4B);
Fig. 5A und 5B zeigen HPLC-Chromatogramme von Aminosäuren-TH-Verbindungen, die für C-terminale Leucine (L) bzw. C-terminale Methionine (M) gebildet werden;
Fig. 6A und 6B zeigen HPLC-Chromatogramme des ersten bzw. zweiten Zyklus bei der C-terminalen Sequenzierung der Pentapeptide Leucin-Enkephalin (TGGFL);
Fig. 7A und 7B zeigen HPLC-Chromatogramme von Ile-TH, das durch Reaktion von Ile mit TMS-ITC als Azetylanhydrid gemäß Verfahren der bisherigen Technik (7A) hergestellt wurde, und durch Reaktion mit dem gemischten Anhydrid Benzoyl-ITC gemäß dem vorliegenden Verfahren (7B);
Fig. 8 stellt die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Sequenzierung von C-terminalen Peptiden dar;
Fig. 9 zeigt die Synthese einer Mercaptobenzothiazol- Verbindung, die zur Erzeugung von C-terminalen Aminosäuren-Phenyl-TH-Derivaten verwendet werden kann;
Fig. 10 zeigt die vorgeschlagene Reaktion einer Mercaptobenzothiazol-Verbindung mit einer C- terminalen Aminosäure und anschließende Abspaltung zur Herstellung der Aminosäuren-Phenyl-TH-Verbindung;
Fig. 11 zeigt die Reaktionsschritte bei der Herstellung eines aktivierten Festträgers unter Verwendung des Woodwards-Reagens K, um Carboxyl-Gruppen auf dem Träger zu aktivieren;
Fig. 12 zeigt die Reaktionsschritte bei der Herstellung eines Festträgers unter Verwendung eines Säureanhydrids zur Aktivierung der Carboxyl-Gruppen auf dem Träger;
Fig. 13 zeigt die Reaktionsschritte bei der Herstellung eines aktivierten Festträgers unter Verwendung eines Lösungsphasen-Acyl-ITC zur Aktivierung der Carboxyl-Gruppen auf dem Träger;
Fig. 14 zeigt die Reaktionsschritte bei der Herstellung eines aktivierten Festträgers, der mit einem gemischten Anhydrid aus Carbonsäure und ITC derivatisiert wird;
Fig. 15A und 15B zeigen Reaktionspläne zur erfindungsgemäßen Herstellung eines Peptidyls TH durch Peptid-Reaktion mit einem aktivierten Acyl-ITC-Träger (ISA) und die Zyklisierung des Peptidyl-ITC zur Bildung des Peptidyls TH (15B);
Fig. 16 zeigt eine Vielzahl gemischter Anhydrid-ITC- Verbindungen, mit der berechneten Atomladung auf dem Carbonylcarbon-, Sulfonylsulfur- und ITC-Carbon-Atom, das für jede Verbindung angegeben ist;
Fig. 17 stellt die Schritte bei der Abspaltung eines Peptidyls TH durch ein Kationenaustauschharz und der Bindung des Restpeptids an den Harzträger dar;
Fig. 18 stellt die Schritte bei der Abspaltung eines Peptidyls TH durch einen Festträger, der mit Hydroxylamin-Gruppen derivatisiert wurde, und die nachfolgende hydrolytische Freisetzung des Restpeptids vom Harzträger dar; und
Fig. 19 stellt die Schritte bei einer erfindungsgemäßen C-terminalen Sequenzierung dar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

I. Lösungsphase - Verfahren und Reagentien

Bei einer allgemeinen Ausführung der Erfindung erfolgt die Herstellung der Aminosäure TH, indem eine N-geschützte Aminosäure oder ein Peptid mit einem gemischten Anhydrid-Reagens in Lösungsphase reagiert. Das bedeutet, das gemischte Anhydrid aus Isothiocyansäure und einer Carboxyl-, Carbon- oder Sulfonsäure ist in freier (nicht-immobilisierter) Form. Die N- geschützte Aminosäure oder das Peptid kann in Lösung oder auf einem Festträger immobilisiert sein, wie unten beschrieben. Die bei diesem Verfahren verwendeten gemischten Anhydrid-Reagentien werden hierin als Reagentien in Lösungsphase bezeichnet, um zwischen diesen Reagentien und den gemischten Anhydrid- Reagentien in Festphase zu unterscheiden, die unten in Abschnitt 11 beschrieben werden. Ähnlich wird das allgemeine Verfahren, bei dem eine N-geschützte Aminosäure oder ein Peptid mit einem Reagens in Lösungsphase reagiert, als Lösungsphasenverfahren bezeichnet. Das "Lösungsphasenverfahren" kann mit einem Festphasenträger durchgeführt werden, auf dem eine Aminosäure oder, üblicher, ein Peptid immobilisiert wird.

IA. Gemischtes Anhydrid-Reagens

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens ist ein gemischtes Anhydrid aus Isothiocyansäure (ITC) und Carboxyl-, Carbon oder Sulfonsäure. In Fig. 1 sind verschiedene gemischte Anhydrid- Reagentien beispielhaft dargestellt. Dies sind:
(a) eine Alkyl- oder Aryl-Acyl-ITC-Verbindung, wie durch das Acetyl-ITC (I) und Benzoyl-ITC (II) beispielhaft dargestellt. Die Alkyl-Gruppe kann aus der Gruppe der Alkyl- und Cycloalkyl-Verbindungen ausgewählt werden, z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, t-Butyl und zugehörige Hydrocarbonverbindungen, einschließlich ungesättigter Verbindungen, die mit dem Acylcarbon durch eine Carbon-Carbon-Bindung verbunden sind. Die Aryl-Gruppe kann ein Benzen, ein substituiertes Benzen oder eine zugehörige Verbindung sein, die mit dem Acylcarbon durch ein Carbonatom auf dem Aryl-Ring verbunden ist. Diese beiden Klassen von Verbindungen werden hier auch als gemischte Anhydride aus ITC und Carboxylsäuren bezeichnet, da die Hydrolyse der CO-N- Verbindung zu einer Carboxylsäure und HNCS führt;
(b) eine Alkoxy- oder Aryloxy-Carbonyl-ITC- Verbindung, wie von Ethoxy-Acyl-ITC (III) oder Benzoxy-Carbonyl-ITC (IV) beispielhaft dargestellt. Die mit Äther verbundenen Alkyl- oder Aryl-Gruppen in den Verbindungen werden unter (a) beschrieben. Diese beiden Klassen von Verbindungen werden hier auch als gemischte Anhydride aus ITC und Carbonsäuren bezeichnet, da die Hydrolyse der CO-N-Verbindung zu Carbonsäure und HNCS führt; und
(c) eine Alkyl- oder Aryl-Sulfonyl-ITC-Verbindung, wie von Benzylsulfonyl-ITC (V) beispielhaft dargestellt. Die Alkyl- oder Aryl-Gruppen in den Verbindungen werden unter (a) beschrieben. Diese beiden Klassen von Verbindungen werden hier auch als gemischte Anhydride aus ITC und Sulfonsäuren bezeichnet, da die Hydrolyse der CO-N-Verbindung zu einer Sulfonsäure und HNCS führt;
Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das Lösungsphasenreagens ein gemischtes Anhydrid aus Carboxylsäure und ITC, wie unter (a) beschrieben, und hat die allgemeine Formel:
wobei A eine beliebige carbonhaltige Gruppe sein kann, z. B. eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe, die die Löslichkeit des Reagens in dem nicht-wäßrigen Lösungsmittel, das bei der TH-bildenden Reaktion verwendet wird, und Reaktivität gegenüber einer Peptid-Acyl- Gruppe, bei der zu beschreibenden Isothiocyanationsreaktion ermöglicht.
Einige Verbindungen in dieser Klasse können im Handel erworben oder nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein Verfahren zur Herstellung von acylsubstituiertem ITC ist die Auflösung eines Isothiocyamats in einem trockenen, inerten Lösungsmittel, das eine Base enthält, und die langsame Zugabe des gewünschten Acylchlorids. Bei einer Synthese aus Benzoyl-ITC wird beispielsweise Benzoylchlorid in Azetonitril oder Dichlormethan oder Toluen als inertes Lösungsmittel und Diisopropylethylamin als Base verwendet.
Gemischte Anhydride aus ITC und Carbonsäure (ROC(O)NCS) können mit entsprechenden Verfahren hergestellt werden, wobei ein ausgewähltes Alkyl- oder Arylesterchlorid verwendet wird, das mit dem ITC-Salz reagiert. Ahnlich werden gemischte Anhydride aus ITC und Sulfonsäure durch Reaktion des gewünschten Benzensulfonylchlorids mit einem ITC hergestellt, wie in Beispiel 7 kurz beschrieben.

IB. Lösungsphasen-Reaktionsverfahren

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens reagiert eine N-geschützte Aminosäure oder das Peptid, dessen C-terminale Aminosäure identifiziert werden soll, mit dem gemischten Anhydrid-Reagens unter Basisbedingungen, bei denen die Carboxyl-Gruppe der C-terminalen Aminosäure de-protoniert wird. Die C- terminale Aminosäure wird in eine C-terminale Aminosäure TH umgewandelt, die an die vorletzte C- terminale Aminosäure (wo die Reaktion mit einem Peptid erfolgt) im Peptid durch eine Ring-Stickstoff- Amid-Bindung gebunden ist.
Wie oben verwendet soll der Begriff "Peptid" sowohl Peptide als auch Proteine umfassen, die sich allgemein dadurch unterscheiden, daß sie weniger bzw. mehr als 100 Aminosäuren und N-geschützte Aminosäuren besitzen. Das Verfahren wird besonders für die Verwendung bei der Bestimmung einer C-terminalen Aminosäure eines Peptids beschrieben. Natürlich kann das Verfahren jedoch auch auf die Herstellung der Aminosäure Thiohydantoin aus freien, N-geschützten Aminosäuren angewandt werden.
Wenn das Verfahren angewandt wird, um nur den C- terminalen Aminosäurerest des Peptids zu identifizieren, kann das Peptid in freier Form reagieren, d. h. nicht an einen Festträger gebunden, wo der Aminoterminus geschützt ist. Wenn nachfolgende Runden der Identifikation von C-terminalen Aminosäuren gewünscht sind, wird das Peptid üblicherweise zu Zwecken der C-terminalen Sequenzierung zuerst an seinem N- Terminus oder seiner inneren Seitenkette an einem Festträger befestigt.
Verfahren zur Befestigung von Peptiden an Festträgern, z. B. aktivierten Glaskugeln, carboxylierten oder aminierten Harzkugeln und ähnlichem, sind bekannt. In einem bevorzugten Ansatz, der bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren verwendet wird, wurde das Dipeptid Leu-Val durch Benzyldiisothiocyanat an aminiertem Harz immobilisiert.
Das Peptid wird in freier oder immobilisierter Form in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst oder fein verteilt, vorzugsweise unter nicht-wäßrigen Bedingungen, die die C-terminale Carboxylsäure-Gruppe deprotonieren können. Das Lösungsmittel enthält vorzugsweise auch Pyridin, das eine wichtige Katalysatorrolle bei der Bildung eines Thiohydantoin(TH)- Rings erfüllen kann, wie unten besprochen wird. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist anhydrisches Azetonitril, das 10% anhydrisches Pyridin enthält. Ein übliches Reaktionsvolumen ist ca. 100 ul Reaktionslösungsmittel pro 1-3 mg Peptid.
Das gemischte Anhydrid-Reagens von oben wird nun der Peptidsuspension zugegeben, vorzugsweise bei Molarüberschuß der Peptid-Carboxyl-Gruppe, die für die Reaktion in der Reaktionssuspension zur Verfügung steht. Üblicherweise werden 10 ul Reagens pro 100 ul Reaktionslösung zugegeben.
Die TH-bildende Reaktion wird vorzugsweise 10-60 Minuten lang bei 50-70ºC durchgeführt, vorzugsweise 15-30 Minuten lang bei ca. 50ºC, um die Reaktion des ITC-Reagens mit Nicht-Carboxyl-Gruppen im Peptid zu minimieren. Anschließend wird die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt und das Peptidyl TH gewonnen. Wenn das Peptid an einem Festträger befestigt ist, wird der Träger durch Waschen des Trägers, z. B. mit mehreren Volumina Azetonitril, und Trocknen des gewaschenen Trägers, z. B. durch Vakuumzentrifugierung, einfach wiederhergestellt. Wenn das Peptid in freier Form reagiert, kann das Peptidyl TH durch chromatographische Separation oder ähnliches in einem Lösungsmittelsystem gewonnen werden, das zu keiner terminalen Abspaltung der Aminosäure TH vom Peptid führt.
Fig. 2 und 3 zeigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Reaktion für Bildung des Peptidyls TH in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. In dem oben in Fig. 2 gezeigten Reaktionsmechanismus reagiert das gemischte Anhydrid-Reagens über ein instabiles ITC-Zwischenglied VI und bildet so das mit Peptidyl gemischte Anhydrid, das in der Figur mit VII bezeichnet ist. Das Anhydrid reagiert anschließend mit einem freien Thiocyanat-Ion, das bei der Anhydridreaktion hergestellt wird und bildet so über das tetraedrische Zwischenglied IX die Peptidyl-ITC- Verbindung, die in der Figur mit VIII bezeichnet ist.
Bei diesem vorgeschlagenen Mechanismus fungiert das gemischte Anhydrid-Reagens sowohl als aktivierendes Reagens, um ein reaktives Peptidylanhydrid zu bilden, als auch als Quelle für Thiocyanat-Ionen für die Reaktion mit dem Anhydrid.
Ein alternativer Reaktionsmechanismus ist in der zweiten Zeile in Fig. 2 dargestellt. Hier wandert die Thiocyanat-Gruppe im tetraedrischen Zwischenglied X in der Figur zum Peptid Carbonylcarbon und bildet so das tetraedrische Zwischenglied IX, das schnell zusammenbricht und so die Peptidyl-ITC-Verbindung bildet, die mit VIII bezeichnet ist.
Immer noch unter Bezugnahme auf Fig. 2 gibt es zwei mögliche elektrophile Reaktionsstellen des mit Peptidyl de-protonierten (nukleophilen) Sauerstoff-Atoms. Die erste Stelle, die auch im Reaktionsplan in Fig. 2 dargestellt ist, ist das Carbonylcarbon. Die zweite Stelle ist das Thiocarbonylcarbon, das zu den falschen Reaktionsprodukten führen würde. Experimente, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, daß eine elektrophilere Substitution auf dem Carbonylcarbon die Reaktion auf dem Thiocarbonylcarbon fördert, basierend auf dem Anteil der gebildeten Aminosäure-TH-Verbindung. Daher ergeben beispielsweise Alkyl- und Arylcarbonyl-Gruppen (die gemischten Anhydride aus Isothiocyansäure und Carboxylsäuren) den höchsten Anteil des gewünschten TH-Produkts, und elektrisch negativere Ester- Reagentien (gemischte Anhydride aus Isothiocyansäure und Carbonsäure) einen geringeren Anteil des gewünschten Produkts. Unter den vorliegenden Bedingungen ergibt das mit Sulfonsäure gemischte Anhydrid- Reagens den geringsten Anteil des gewünschten TH- Produkts.
Die Reaktion der Peptidyl-ITC-Verbindung XI zur Bildung des gewünschten Peptidyls TH ist in Fig. 3 dargestellt und bedeutet wahrscheinlich einen elektrophilen Angriff durch das Thiocyanatcarbon auf den Amidstickstoff in der Peptid-ITC-Verbindung bei schneller Zyklisierung zur Bildung des Peptidyls TH, das in der Figur mit XII bezeichnet ist. Die Zyklisierungsreaktion kann durch Pyridin katalysiert werden, was zeigt, daß Pyridin mit der Thiocyanathälfte reagieren kann, um die Reaktivität des reaktiven Carbonzentrums zu verbessern, wie vorgeschlagen wurde (Miller 1988).
Spezielle Reaktionsbedingungen zur erfindungsgemäßen Bildung einer Aminosäure oder eines Peptidyls TH sind in den Beispielen IA, 2, 3 und 6 für Benzoyl-ITC angegeben, in Beispiel 4 für Trimethylacetyl-ITC, in Beispiel 5 für Ethoxycarbonyl und in Beispiel 7B für Benzensulfonyl-ITC.

IC. Bildung und Identifikation des Aminoacyls Hydantoin

Dieser Abschnitt beschreibt die letzten Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, zu denen (a) die Behandlung des Peptidyls TH unter Abspaltungsbedingungen, bei denen die Amidbindung abgespalten werden kann, die das TH mit dem Peptid verbindet, (b) die Isolierung des Aminoacyls TH, das durch die Abspaltungsreaktion freigesetzt wird, und (c) die Identifikation des isolierten Aminoacyls TH gehören.
Eine Vielzahl von Bedingungen von Abspaltungsreaktionen ist bekannt. Es wurde von hydrolytischer Abspaltung mit 12 N HCl, dünnflüssiger Lauge (Kenner) oder gesättigtem wäßrigen Triethylamin berichtet. Diese Abspaltungsreaktionen sollen bis zu 70% Abspaltung erreichen, aber die extremen pH-Bedingungen können zur Ringöffnung und/oder Beschädigung der inneren Peptid-Seitenketten führen. Kürzlich wurde von Abspaltung durch Behandlung mit Azetohydroxamat in Pyridin bei pH-Wert 8,0 berichtet (Meuth). Das Verfahren erzielt eine Gewinnung von bis zu 60-80% des C- terminalen TH (Miller, 1988). Ein ähnliches Verfahren ist die Behandlung mit primären oder sekundären Aminen in Azetonitril.
Die Abspaltungsreaktionen werden üblicherweise bei Raumtemperatur oder darüber 15-60 Minuten lang durchgeführt, je nach verwendetem Abspaltungsstoff. Der Verlauf der Reaktion kann leicht verfolgt werden, um die Freisetzung des TH zu optimieren und die Ringöffnung und Beschädigung der verkürzten Peptide zu minimieren, indem die Integrität des freigesetzten Aminoacyls TH und/oder der verkürzten Peptide gemäß unten beschriebener Analysemethoden während des Reaktionsverlaufs untersucht wird.
Bei einem bevorzugten Abspaltungsverfahren, das in den Beispielen 1-4 beschrieben wird, wird das Peptidyl TH mit 10% Propylamin in Azetonitril bei Raumtemperatur 15 Minuten lang behandelt. In einem ähnlichen Verfahren, das in Beispiel 5 beschrieben wird, wurde das Peptidyl TH mit Tetra-N-butyl-Ammoniumhydroxid in Wasser mit 1 mg/ml Dithiothreitol (DTT) abgespalten.
Unter einem Aspekt der Erfindung wurde herausgefunden, daß das Verfahren zur Herstellung von TH bei Durchführung unter sauren Bedingungen die stereoisomerische Form der C-terminalen Aminosäure beibehält. Dies wird in Beispiel 6 dargestellt, wo der Schutz von durch t-BOC geschütztem Ile durch Trifluoroazetylsäure (TFA) aufgehoben wird, in 25% H&sub2;O, um eine einzige L-förmige Ile-TH-Verbindung zu erzielen, wie in Fig. 7B zu sehen ist. Im Gegensatz dazu produzierte die Reaktionsbildung von ungeschütztem Ile-TH durch Reaktion mit Trimethylsilyl-Isothiocyanat (TMS- ITC) und Aufhebung des Schutzes (Abspalten) mit 12 N HCl in Übereinstimmung mit C-terminalen Analysemethoden der bisherigen Technik (Hawke) die beiden diastereoisomerischen Formen, die in Fig. 7A als Doppelspitze abgebildet sind.
Die Ergebnisse der Abspaltungsreaktion sind unten in Fig. 3 abgebildet. In der Reaktion aus Fig. 3 erzeugt die Abspaltung ein Peptid, das um eine Aminosäure verkürzt ist (Verbindung XIII), und eine Aminosäure TH (XIV), deren R&sub1;-Gruppe natürlich die Aminosäuren- Seitenkette der ursprünglichen C-terminalen Aminosäure ist.
Das Aminoacyl TH, das aus dem Peptid oder dem verkürzten Peptid, oder beiden, freigesetzt wurde, wird analysiert, um die N-terminale Aminosäure zu identifizieren. Wenn das Peptid an-einen Festträger gebunden ist, kann das freigesetzte TH leicht durch Entfernung des Reaktionslösungsmittels für die Abspaltung abgetrennt werden, z. B. durch Vakuumzentrifugierung und Extrahieren des freigesetzten TH in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Azetonitril, wie genauer in Beispiel 1 dargelegt. Wenn das Peptid in der Abspaltungs-Reaktionsmischung frei ist, kann die Mischung, z. B. durch HPLC, als Teil des Verfahren zur Identifizierung der Verbindung abgetrennt werden.
Die freigesetzte Aminosäuren-TH-Verbindung kann mit bekannten chromatographischen Verfahren, z. B. Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), nach Standardverfahren identifiziert werden. Die Identifizierung von Verbindungen kann bequem durchgeführt werden, wenn die Laufzeiten in den Säulen mit den Laufzeiten der TH von bekannten Referenz-Aminosäuren verglichen werden, die gemäß Standardverfahren vorbereitet wurden. Die in Beispiel 1 genau dargelegten HPLC-Verfahren sind geeignet. Fig. 5A und 5B zeigen HPLC-Profile von Leucin-TH (L-TH) und Methionin-TH (M-TH), Fig. 6A und 6B zeigen L-TH und Phenylalanin- TH (F-TH).
Alternativ kann die freigesetzte und isolierte Aminosäure TH mit anderen verfügbaren Mitteln identifiziert werden, z. B. Massenspektrometrie oder NMR.

ID. C-terminale Aminosäurensequenzierung

Das oben in Abschnitt IC beschriebene Verfahren ist für die Bestimmung des C-terminalen Aminosäurerests eines Peptids vorgesehen. Die wiederholte Anwendung des Verfahrens kann für die C-terminale Aminosäurensequenzierung des Peptids verwendet werden.
Fig. 8 stellt das Sequenzierverfahren dar. Das zu sequenzierende Peptid ist an einen Festträger S gebunden, wie angegeben. Das Peptid wird dann durch eine erste Runde von Schritten geführt, um (a) das C-terminale Peptidyl TH zu produzieren, (b) das terminale TH abzuspalten, was zum C-terminalen Aminoacyl TH (AAn) und einem verkürzten Peptid führt, dessen C-terminaler Rest nun AAn-1 ist, und (c) das freigesetzte Aminoacyl TH zu identifizieren.
Nach dem Waschen dem Peptidträgers wird das verkürzte Peptid mit einer zweiten Runde der oben genannten Schritte behandelt, um die nächste Aminosäure als eine Aminosäure TH (AANn-1) freizusetzen und ein Peptid herzustellen, das um zwei C-terminale Reste verkürzt ist. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis das Peptid sequenziert wurde oder bis der Verlust der Auflösung aufgrund der unvollständigen Bildung und Freisetzung von TH eine weitere Sequenzierung unmöglich macht. Das Sequenzierverfahren ist in Beispiel 5 dargestellt, zur Bestimmung der beiden C-terminalen Aminosäurereste von Leucin-Enkephalin (YGGFL). Das HPLC- Chromatogramm aus der ersten Analysereihe, das in Fig. 6A angegeben ist, zeigt die C-terminale L-TH- Spitze. Das Chromatogramm aus der zweiten Runde, das in Fig. 6B angegeben ist, zeigt das erwartete F-TH.
Die oben genau beschriebene Technik kann leicht automatisiert werden, wenn eine Technologie verwendet wird, die aus der automatischen Sequenzierung von N-terminalen Resten von Peptiden bekannt ist. Bei einer Ausführung der Vorrichtung zur automatischen Sequenzierung eines Peptids vom C-terminalen Ende wird ein Festträger verwendet, der sich in einem Reaktionsgefäß befindet, dem frisches Lösungsmittel und Reagentien zugegeben werden, und aus dem Reaktionsmischungen und Lösungsmittelspülungen entnommen werden. Die freigesetzten Aminosäuren TH werden aus dem gespeicherten Material isoliert, um später mit HPLC identifiziert zu werden.

IE. Alternative gemischte Anhydrid-Reagentien

Obwohl die vorliegende Erfindung die gemischten Anhydride aus Carboxyl-, Carbon- und Sulfonsäure umfaßt, die in Abschnitt IA beschrieben wurden, können zusätzliche gemischte Anhydride, die nachfolgend beschrieben werden, für die Bildung der C-terminalen Aminosäure-TH-Verbindungen geeignet sein.
Eines der alternativen Reagentien ist ein mit Carbamat gemischtes Anhydrid aus Isothiocyansäure mit der allgemeinen Formel:
wobei A ein beliebiges Amin sein kann, vorzugsweise ein quartäres Amin, z. B. Trimethylamin. Von diesem Reagens würde man erwarten, daß es elektrisch ungefähr gleich negativ ist wie mit Carbonat gemischte Anhydride. Es müßte daher eine ausreichende Herstellung des gewünschten Peptidyl-TH-Produkts ermöglichen.
Ein anderes alternatives gemischtes Anhydrid ist ein Benzoylmercaptobenzothiazol (MBT) XV, wie rechts in Fig. 9 abgebildet. Diese Verbindung kann nach dem synthetischen Verfahren hergestellt werden, das in Beispiel 8 beschrieben ist. Kurz, MBT XVI wird in einem trockenen, inerten Lösungsmittel in Anwesenheit einer geeigneten Base, z. B. Diisopropylethylamin, aufgelöst. Ein ausgewähltes Acylchlorid, z. B. Benzoylchlorid XVII, wird dann langsam bei niedriger Temperatur zugefügt, damit sich das gewünschte Produkt bildet. Ahnliche Acyl-MBT-Verbindungen, z. B. Acetyl-MBT, können nach einem ähnlichen Verfahren hergestellt werden, wobei das Ausgangsmaterial für das gewünschte Acylchlorid verwendet wird.
In Fig. 10 sind die vorgeschlagenen Reaktionsschritte bei der Herstellung eines Peptidyl-Phenyl-TH mit einem MBT-Reagens dargestellt. Die Reaktionsbedingungen können im wesentlichen denen in Abschnitt B beschriebenen ähneln, bei entsprechender Anpassung der Reaktionszeit, falls erforderlich, um den Abschluß der TH-Herstellung sicherzustellen. Typische Reaktionsbedingungen sind in Beispiel 8 angegeben.
Unter Bezugnahme auf Fig. 10 reagiert das deprotonierte Peptid (XVIII) mit Benzoyl-MBT (BzMBT) und bildet so auf dem Weg der vorgeschlagenen Reaktion das Zwischenglied der Peptid-Benzothiazol- Verbindung, die mit XIX bezeichnet ist. Die Bildung des Zwischenglieds kann über ein aktiviertes Anhydrid mit nachfolgendem Angriff durch ein Benzothiazol-Ion erfolgen oder kann eine gemeinsame Umordnungsreaktion beinhalten, wie unter Bezugnahme auf Fig. 2 besprochen wurde.
Die Zyklisierung des Benzothiazol-Zwischenglieds zur Bildung des Peptidylaryls TH verläuft wahrscheinlich auf demselben Weg wie in Fig. 3 beschrieben, wobei das elektrophile Thio-Ring-Carbon mit dem Amidstickstoff reagiert, gefolgt von einer Zyklisierung, um die gewünschte Peptid-Phenyl-TH-Verbindung XIV zu bilden.
Ein weiteres mögliches gemischtes Anhydrid ist ein gemischtes Anhydrid aus Isocyansäure und Carboxylsäure, z. B. Benzoylisocyanat. Eine solche Reaktion, die in Beispiel 9 beschrieben wird, erzeugt eine ausreichende Menge des gewünschten Aminosäuren-TH-Produkts, wie im Beispiel berichtet.
Dem Vorangegangenen ist zu entnehmen, wie unterschiedliche Ziele und Merkmale der Erfindung erreicht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Bildung des Peptidyls TH unter wesentlich gemäßigteren Bedingungen als Verfahren der bisherigen Technik, die auf der Anhydridaktivierung der Carboxyl-Gruppe des Peptids beruhten. Gleichzeitig kann die Reaktion der TH-Bildung relativ schnell ausgeführt werden, z. B. in 15-30 min, wodurch eine schnelle Durchführung der Sequenzierung in einem automatischen System ermöglicht wird.
Zusätzlich bewahrt das Verfahren die Stereochemie der C-terminalen Aminosäure, wenn die Abspaltungsreaktion im Verfahren unter sauren Bedingungen durchgeführt wird, und kann daher verwendet werden, um L- oder D-Aminosäuren zu bestimmen.

II. Festphasenverfahren und -reagentien

Bei einer zweiten allgemeinen Ausführung der Erfindung wird die Bildung der Aminosäure TH ausgeführt, indem eine N-geschützte Aminosäure oder ein Peptid mit einem gemischten Anhydrid-Reagens in Festphase reagiert, speziell ein gemischtes Anhydrid aus Isothiocyansäure und einer Carboxyl-, Carbon- oder Sulfonsäure sowie ein Festträger, auf den das gemischte Anhydrid derivatisiert wird. Die gemischten Anhydrid- Reagentien, die bei diesem Verfahren verwendet werden, werden hier als Festphasen-Reagentien bezeichnet, und das allgemeine Verfahren, bei dem eine N- geschützte Aminosäure oder ein Peptid mit dem Festphasen-Reagens reagiert, als Festphasenverfahren.

IIA. Festphasen-ITC-Reagens

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet ein (immobilisiertes) Acyl-ITC-Festphasen-Reagens, das mit einem Acyl-ITC derivatisiert wird, d. h. ein gemischtes Anhydrid einer Carboxyl- oder Carbonsäure, und Isothiocyansäure. Das Reagens hat die Form: Träger
wobei A eine Alkyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Aryloxy- Gruppe und ITC ein Isothiocyanat ist, in den Figuren auch bezeichnet als N=C=S oder NCS. Die Alkyl-Gruppe kann aus der Gruppe von Alkyl- und Cycloalkyl- Verbindungen gewählt werden, z. B. Methyl, Ethylpropyl, t-Butyl und zugehörige carbonhaltige Verbindungen, die durch eine Carbon-Carbon-Verbindung mit dem Acylcarbon verbunden sind. Die Aryl-Gruppe kann ein Benzen, substituiertes Benzen oder eine zugehörige aromatische oder heteroaromatische Verbindung sein, die durch ein Carbon-Atom auf dem Aryl-Ring mit dem Acylcarbon verbunden ist. Die Alkoxy- und Aryloxy- Gruppe umfaßt analoge O-Alkyl und O-Aryl-Gruppen. Die Gruppe von Verbindungen, die unter A angegeben sind, wird hier auch als gemischte Anhydride aus ITC und Carboxylsäuren bezeichnet, da die Hydrolyse an der CO-N-Bindung zu einer Carboxylsäure und ITC führt. Die Gruppe von Verbindungen, die unter B angegeben sind, werden entsprechend hier als gemischte Anhydride aus Isothiocyansäure und Carbonsäure bezeichnet, da die hydrolytische Abspaltung der Verbindungen zu einem Carbonsäureester und NCS führt.
Der Festträger kann aus Partikelkugeln oder einem Membranträger oder ähnlichem bestehen, die mit oberflächenchemischen Gruppen derivatisiert werden, durch die der Träger so funktionalisiert werden kann, daß er Acyl-ITC enthält. Eine Vielzahl von Kugel- oder Membran-Trägermaterialien, z. B. Nylon, Polystyrol, Polyethylen, TeflonTM, mit reaktiven chemischen Gruppen, z. B. Amin-, Carboxyl- und Hydroxyl-Gruppen, die durch eine Vielzahl bekannter Verfahren in die gewünschten reaktiven ITCs umgewandelt werden können, sind im Handel erhältlich.
Fig. 11 zeigt die Schritte bei der Bildung eines aktivierten Festträgers, der mit Acyl-ITC-Gruppen derivatisiert wurde. Der Festträger (I) ist eine Partikelkugel oder ähnliches, mit S bezeichnet, und hat Amin-Gruppen an seiner Oberfläche. Die Kugeln werden zuerst derivatisiert, so daß durch Reaktion der Kugeln mit einer seitenkettengeschützten Dicarboxylsäure, z. B. FMOC-Glu-OtBu, Carboxylsäure-Gruppen auf der Oberfläche und ein Carbodiamid-Reagens in einem geeigneten Lösungsmittel entstehen, um das Dicarboxylsäurederivat mit den Amino-Oberflächen-Gruppen durch eine Amidbindung zu verbinden. Der geschützte carboxylierte Träger ist in Fig. 11 unter (II) abgebildet. Die Reaktionsbedingungen sind in Beispiel 10 detailliert beschrieben. Der Schutz der funktionalen Gruppe ist aufgehoben, z. B. durch TFA.
Ein carboxylierter Träger kann auf anderen Wegen ähnlich hergestellt werden.
Der Träger (II) wird durch Reaktion mit einem Isoxazoliumsalz aktiviert, z. B. Woodwards-Reagens K (Woodward) (III). In Anwesenheit einer geeigneten Base, z. B. Trialkylamin, bildet das Isoxazoliumsalz ein Ketenimin (IV), das mit der freien Carboxyl- Gruppe des Trägers reagieren kann, so daß ein aktivierter Enolester (V) gebildet wird. Der aktivierte Ester reagiert mit einer ITC-Verbindung, z. B. Trimethylsilyl-ITC (TMSITC), und bildet so den gewünschten, mit Acyl-ITC aktivierten Träger (VI). Spezielle Reaktionsbedingungen sind in Beispiel 10 angegeben. Bevorzugte ITC-Verbindungen sind Trialkysilyl- ITC-Verbindungen, z. B. TMS-ITC oder Pyridiniumthiocyanat. Die Klammern in den Strukturen V und VI stellen die glutamische Säureverbindung in dem in Struktur 11 abgebildeten Träger dar.
Fig. 12 stellt ein zweites allgemeines Verfahren zur Bildung eines Festträgers dar, der mit Benzoyl-ITC aktiviert wird. Hier reagiert der Träger (II) mit einem Anhydrid, z. B. einem Azetylanhydrid, unter anhydrischen Bedingungen und bildet so einen mutmaßlich aktivierten Anhydridträger (VII). Eine weitere Reaktion mit einer ITC-Verbindung, z. B. TMSITC, führt zum gewünschten, mit Benzoyl-ITC-aktivierten Träger (VI).
Eine dritte Methode zur Bildung eines gemischten, mit Anhydrid-ITC aktivierten Festträgers ist in Fig. 13 abgebildet. Bei diesem Verfahren reagiert eine Acyl- ITC-Verbindung in Lösungsphase, z. B. Benzoyl-ITC (VII), direkt mit den Carboxyl-Gruppen auf dem Festträger und bildet so den gewünschten, mit Acyl-ITC aktivierten Träger. Einzelheiten dieser Reaktion sind in Beispiel 12 angegeben.
ITC-Verbindungen in Lösungsphase können im Handel erworben oder wie in der oben genannten ursprünglichen Anmeldung hergestellt werden. In einem Verfahren für die Herstellung von Acyl-ITC wird ein ITC-Salz in einem trockenen, inerten Lösungsmittel, das eine Base enthält, einem Säurechlorid zugegeben.
Fig. 14 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Festträgers, der mit einem gemischten Anhydrid aus Carbonsäure und ITC derivatisiert wird.
Der bei dem Verfahren verwendete Festträger (IX) wird mit Alkyl- oder Aryl(A)-Alkohol-Gruppen nach bekannten Verfahren derivatisiert. Dieser Träger wird mit einem Phosgen-Äquivalent, z. B. Triphosgen, aktiviert, so daß das entsprechende aktivierte Carbonatderivat (XI) gebildet wird. Eine weitere Reaktion mit einem ITC, z. B. TMSITC, ergibt den gewünschten aktivierten Träger (XII).
Der aktivierte Träger kann bis zur Verwendung in fester Form getrocknet oder in einem aprotischen, nicht-nukleophilen Lösungsmittel, z. B. Benzen oder Toluen, gelagert werden.

IIB. Bildung von Peptidyl-FH

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens reagiert ein Peptid, dessen C-terminale Aminosäure identifiziert werden soll, mit dem Acyl-ITC-Reagens unter Basisbedingungen, vorzugsweise in Anwesenheit von Pyridin, bei dem die C-terminale Säure-Gruppe der Aminosäure de-protoniert ist.
Die C-terminale Aminosäure wird in eine C-terminale Aminosäure-TH umgewandelt, die im Peptid durch eine Ring-Stickstoff-Amid-Bindung an die nächste C- terminale Aminosäure gebunden ist.
Die Amino-Gruppen eines Peptids werden zuerst gemäß Standardverfahren (Green) durch Azetylierung oder Bildung von BOC (t-Butyloxycarbonyl)- oder FMOC (Fluorenylmethoxycarboxyl)-Derivaten geschützt. Das N-geschützte Peptid wird in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst, z. B. 10% Pyridin in Azetonitril, wobei die Endkonzentration des Peptids üblicherweise zwischen 0,1 und 10 ug/ml liegt. Die Peptidlösung wird dann dem Festphasen-Reagens aus gemischtem Anhydrid zugegeben, vorzugsweise bei Molarüberschuß der aktivierten gemischten Anhydrid-Gruppe. Üblicherweise werden ca. 100 ul der Peptidlösung zu 10 ug des Festphasen-Reagens gegeben.
Die TH-bildende Reaktion wird vorzugsweise ca. 10-60 Minuten lang bei 50-60ºC durchgeführt, vorzugsweise 15-30 Minuten lang bei ca. 50ºC, um die Reaktion des ITC-Reagens mit Nicht-Carboxyl-Gruppen im Peptid zu minimieren. Übliche Reaktionsbedingungen sind in Beispiel 14 angegeben.
Fig. 15 zeigt Reaktionsmechanismen für die Bildung eines Peptidyls TH durch Reaktion mit dem aktivierten Träger der Erfindung. In dem links in Fig. 15A dargestellten Mechanismus reagiert das Peptid (XII) über das Zwischenglied XIII am Carbonylcarbon des gemischten Anhydrid-Reagens (VI) und bildet so das Peptidyl- Acyl-ITC, das in der Figur mit XIV bezeichnet ist. Das Anhydrid reagiert mit einem freien Thiocyanat- Ion, das bei der Reaktion produziert wird, und bildet so ein Peptidyl-ITC (XVI). Bei diesem vorgeschlagenen Mechanismus fungiert das gemischte Anhydrid-Reagens sowohl als aktivierendes Reagens, um ein reaktives Peptidyl-Anhydrid zu bilden, als auch als Quelle von Thiocyanat-Ionen für die Reaktion mit dem Anhydrid.
Ein alternativer Reaktionsmechanismus ist rechts in Fig. 15A gezeigt. Hier wandert die Thiocyanat-Gruppe im tetraedrischen Zwischenglied XVII in der Figur möglicherweise umgekehrt in das Peptid- Carbonylcarbon, wobei sie das tetraedrische Zwischenglied XV bildet, das schnell zusammenbricht und die entsprechende Peptid-ITC-Verbindung (XVI) bildet.
Immer noch unter Bezugnahme auf Fig. 15A gibt es zwei mögliche elektrophile Reaktionsstellen des mit Peptidyl de-protonierten (nukleophilen) Sauerstoffatoms. Die erste Stelle, die im Reaktionsschema in Fig. 15 abgebildet ist, ist das Carbonylcarbon. Die zweite Stelle ist das Thiocarbonyl-(Thiocyanat-)Carbon. Wie in der vorher eingereichten ursprünglichen Anmeldung beschrieben, zeigen Reaktionsstudien mit gemischten Anhydriden in Lösungsphase, daß die Alkyl- und Aryl- Carbonyl-Gruppen (die gemischten Anhydride aus Isothiocyansäure und Carboxylsäuren) den höchsten Anteil des gewünschten Carbonstellen-Reaktionsprodukts unter den angegebenen Reaktionsbedingungen (in Anwesenheit von Pyridin) ergeben und entsprechend den geringsten Anteil von Reaktionsprodukten, die aus dem nukleophilen Angriff auf das Thiocyanatcarbon resultieren. Das mit Sulfonsäure gemischte Anhydrid-Reagens ergibt den niedrigsten Anteil des gewünschten Produkts.
Molekulare Orbitalberechnungen wurden an den gemischten Anhydriden durchgeführt, die in Fig. 16 abgebildet sind, und zwar mit Alkyl (A) und Aryl (B) gemischte Anhydride aus Carboxylsäure, Alkyl(C)- und Aryl(D)-Anhydride aus Carbonsäure, und ein mit Aryl gemischtes Anhydrid aus Sulfonsäure (E). Die Berechnungen wurden mit dem Verfahren Modified Neglect of Diatomic Orbitals (MNDO) (Dewar) unter Verwendung des vom Quantum Chemistry Program Exchange (Bloomington, IN) verfügbaren MOPAC-Programms, durchgeführt. Die partiellen Ladungen, die vom Programm für die Carbonyl- und Cyanat-Atome berechnet wurden, sind für die fünf Moleküle in der Figur abgebildet, sowie das Verhältnis zwischen Carbonyl- und Cyanatcarbon- Atomladung, in aufsteigender Reihenfolge. Die Berechnungen können verwendet werden, um die wahrscheinliche Auswirkung von Aryl- oder Alkyl-Substituenten auf die Peptidyl-TH-Reaktion zu untersuchen. Beispielsweise zeigen Berechnungen der Ladungsverhältnisse von Benzoyl-ITC an, daß stark elektronen-entziehende Substituenten, z. B. F oder NO&sub2; auf dem Phenyl-Ring wenig Auswirkung auf das jeweilige partielle Ladungsverhältnis haben, wodurch eine geringe Auswirkung auf das Verhältnis der Reaktionsprodukte angezeigt wird.
Die entstandenen gemischten Produkte, die für die fünf Verbindungen beobachtet wurden, sind in Fig. 16 dargestellt. Die für die Verbindungen berechneten Ladungsverhältnisse zeigen an, daß das Cyanatcarbon durch hohe partielle Ladung auf dem Carbonylcarbon (oder Sulfonylsulfur) aktiviert wird und dadurch eine wahrscheinlichere Stelle für einen nukleophilen Angriff wird. Dies entspricht der beobachteten Reaktivität eines α-β-ungesättigten Ketons, wo eine größere partielle Ladung auf dem Ketoncarbon zu verbesserter Reaktivität des β-Carbons gegenüber nukleophilem Angriff führt. Obwohl dieses Reaktionsschema vermuten läßt, daß das gemischte Anhydrid aus einer Alkyl- Carboxylsäure (z. B. Verbindung A) beste Produktergebnisse erzielen würde, kann die höhere Reaktivität des Alkyl-Carbonylcarbons auch das gemischte Anhydrid empfänglicher für die Hydrolyse machen, und dies kann die etwas größere Ausbeute an gewünschten Peptidyl- ITC-Produkten erklären, die bei dem mit Aryl- Carboxylsäure gemischten Anhydrid beobachtet wurden.
Die Zyklisierung der Peptidyl-ITC-Verbindung zur Herstellung des gewünschten Peptidyls TH ist in Fig. 15B dargestellt und umfaßt vermutlich einen elektrophilen Angriff durch das Thiocyanatcarbon auf dem Amidstickstoff in der Peptid-ITC-Verbindung, bei schneller Zyklisierung zur Herstellung des Peptidyls TH, das in der Figur mit XIX bezeichnet ist. Die Zyklisierungsreaktion kann durch Pyridin katalysiert werden, was nahelegt, daß Pyridin mit der Thiocyanathälfte reagiert, und so die Reaktivität des reaktiven Carbonzentrums verbessert, wie vorgeschlagen wurde (Miller, 1989).
Nach der Reaktion des Peptids mit dem aktivierten Festträger wird das resultierende Peptidyl TH vom Festträger getrennt, indem die Reaktionsmischung vom Festträger abgewaschen oder eluiert wird. Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung befinden sich die einzigen Reaktionskomponenten zur Umwandlung eines geschützten Peptids in ein Peptidyl TH auf dem Festträger, und bei der Herstellung des Peptidyls TH werden keine Reaktionsprodukte vom Träger freigesetzt.
Das bedeutet, das Peptidyl TH, das vom Festträger abgesondert wird, ist frei von aktivierenden Reagentien oder Reagens-Nebenprodukten aus der TH- Herstellungsreaktion.
Wie auch unten in Fig. 15A zu sehen ist, regeneriert die Reaktion die ursprüngliche (voraktivierte) Säureform des Festträgers. Der Festträger kann durch jede der oben unter Bezugnahme auf Fig. 11-13 beschriebenen Aktivierungsreaktionen reaktiviert werden.
Unter einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure TH aus einer N-geschützten Aminosäure. Das Verfahren ist dem oben beschriebenen ähnlich, bei dem ein N-geschütztes Peptid durch eine N-geschützte Aminosäure substituiert wird. Nach der Herstellung eines Aminoacyl-ITC und Zyklisierung zur Herstellung der entsprechenden Aminosäure TH wird das Produkt vom Festträger abgesondert, wodurch eine geschützte Aminosäure TH frei von Reaktionsprodukten und Reaktions-Nebenprodukten gewonnen wird. Der Schutz der isolierten Aminosäure TH kann aufgehoben werden, z. B. nach bekannten Verfahren unter sauren oder basischen Bedingungen.

IIC. Bildung und Identifizierung von Aminosäure TH

Dieser Abschnitt beschreibt die letzten Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich (a) Behandlung des Peptidyls TH unter Abspaltungsbedingungen, bei denen die Amidbindung, die das TH am Restpeptid bindet, abgespalten werden kann, und (b) Isolierung und Identifizierung der isolierten Aminosäure TH.
Bei einem bevorzugten Verfahren wird die Abspaltungsreaktion ausgeführt, indem das Peptidyl TH in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem Festphasen- Abspaltungsreagens in Kontakt gebracht wird. Ein Festphasen-Abspaltungsreagens, von dem berichtet wurde (Yamashita) ist ein Kationenaustauschharz Amberlite® IR-120 (protonierte Form), erhältlich bei Aldrich (Milwaukee, WI). Wie in Fig. 17 abgebildet, fördert das Harz die durch Säure katalysierte Hydrolyse des Peptidyls TH, wodurch die gewünschte Aminosäure TH (XXI) und Restpeptid (XX) entstehen. Üblicherweise wird die Probe des Peptidyls TH dem Harz zugefügt (ca. 2 meq H&spplus; pro Gramm Harz verfügbar), und die Mischung wird 2-6 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Peptidlösung wird üblicherweise hergestellt, indem das bei der Bildung des Peptidyls TH verwendete Lösungsmittel durch Vakuum entzogen wird und das Peptidyl TH in wäßrigem Medium erneut aufgelöst wird.
Das Restpeptid kann an das Kationenaustauschharz gebunden werden, wodurch die freie Aminosäure TH vom Restpeptid getrennt werden kann, indem das Harz bei geringer Ionenstärke gewaschen wird. Wenn das Restpeptid am Träger gebunden ist, kann die freie Aminosäure TH durch Waschen oder Elution in hochreiner Form gewonnen werden. Das Restpeptid kann anschließend durch Elution bei erhöhter Ionenstärke oder erhöhtem pH-Wert freigesetzt werden.
Das Restpeptid und die Aminosäure TH, die wie oben hergestellt wurden, können bei Bedarf alternativ durch Passage durch ein Anionenaustauschharz oder durch Chromatographie getrennt werden, beispielsweise mit HPLC oder molekularer Sieb-Chromatographie.
Bei einer zweiten allgemeinen Ausführung wird das Abspaltungsreagens mit einer chemischen Gruppe derivatisiert, die mit dem Peptidyl TH reagieren kann, so daß die freie Aminosäure TH freigesetzt und das Restpeptid kovalent gebunden wird. Die freie Aminosäure TH kann dann in hochreiner Form durch Waschen oder Elution isoliert werden, und das Restpeptid kann durch hydrolytische Abspaltung des Peptids vom Träger freigesetzt werden.
Ein exemplarisches Festträger-Abspaltungsreagens ist der mit N-Alkyl derivatisierte Festträger (XXII), der in Fig. 18 abgebildet ist. Die R-Gruppe in der Figur ist vorzugsweise eine Methyl- oder eine andere Gruppe mit wenig Alkyl. Wie dargestellt, bildet die hydrolytische Abspaltung des Peptidyls TH durch die Hydroxylamin-Gruppe auf dem Festträger einen O- Hydroxamatester-Anhang des Restpeptids an den Träger, bei Freisetzung der freien Aminosäure TH. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem aprotischen Lösungsmittel, z. B. MeCN, in Anwesenheit einer organischen Base, z. B. Triethylamin (TEA), durchgeführt.
Nach Herstellung der Aminosäure TH kann das Restpeptid hydrolytisch durch Kontakt mit dem angesäuerten wäßrigen Medium vom Träger abgespalten werden, wie unten in Fig. 18 angegeben. Dadurch ermöglicht das Verfahren die getrennte Isolierung der Aminosäure TH und des Restpeptids, jeweils in hochreiner Form, frei von Reaktionsprodukten und Nebenprodukten. Die hydrolytische Abspaltung regeneriert den Hydroxylaminträger.
Die freigesetzte Aminosäure-TH-Verbindung kann nach Standardverfahren mit bekannten Chromatographie- Verfahren identifiziert werden, z. B. Hochdruck- Flüssigchromatographie (HPLC). Die Verbindung kann bequem identifiziert werden, indem die Laufzeiten in den Säulen mit den Laufzeiten bekannter Bezugs-Aminosäuren TH verglichen werden, die nach Standardverfahren oder mit dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure TH hergestellt wurden. Alternativ kann die freigesetzte und isolierte Aminosäure TH durch andere verfügbare Verfahren, z. B. Massenspektrometrie oder NMR, identifiziert werden.
Allgemeiner beschreibt die Erfindung die hydrolytische Abspaltung eines Peptidyl-TH-Reagens mit einem sekundären Hydroxylamin nach der allgemeinen Formel:
wobei R&sub1; und R&sub2; Alkyl- oder Aryl-Gruppen sind, vorzugsweise Alkyl, wobei einer der N-Substituenten an einem Festträger befestigt werden kann. Bei dieser allgemeineren Ausführung reagiert ein Peptidyl TH, das in Lösung befindlich oder auf einem Festträger immobilisiert ist, in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel, z. B. Azetonitril, mit dem sekundären Hydroxylamin, das selbst in Lösung (z. B. wenn das Peptidyl TH immobilisiert ist) oder immobilisiert sein kann (wenn das Peptidyl TH in Lösung ist).
Bevorzugte sekundäre Hydroxylamine sind Dialkylhydroxylamine, z. B. Dimethy- oder Diethyl-Hydroxylamine, die im Handel erhältlich sind. Aryl-Hydroxylamine sind ebenfalls geeignet, können jedoch mit dem Nachweis der Aminosäure TH interferieren. Außerdem können sich Aryl-Hydroxylamine unter sauren Bedingungen zu unerwünschten Aminophenolen umordnen. R&sub1; und R&sub2; können auch Acyl-Gruppen sein, obwohl diese Verbindungen übermäßig empfänglich für die Hydrolyse unter wäßrigen Bedingungen sein können.

IID. C-terminale Lösungsphasen-Sequenzierung

Dieser Abschnitt beschreibt die Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens auf ein C-terminales LöSungsphasen-Sequenzierverfahren, das für den automatisierten oder halbautomatisierten Betrieb geeignet ist. Der hier verwendete Begriff "Lösungsphasen- Sequenzierung" bezieht sich auf Sequenzierreaktionen, bei denen das Peptid in Lösung verbleibt und anschließend durch Festphasen-Reagentien aufbereitet wird. Dieses Verfahren steht im Gegensatz zur Festphasen-Sequenzierung, bei der das Peptid auf einem Festträger immobilisiert und wiederholt einer Aktivierung durch einen C-terminalen Rest in Lösungsphase und Abspaltungsreagentien ausgesetzt wird.
Fig. 19 zeigt das allgemeine Sequenzierschema, das auf ein Peptid Pep-AAn zutrifft, d. h. ein Peptid mit n Resten und einem C-terminalen Rest AAn. Anfangs wird das Peptid in einem geeigneten, nicht-nukleophilen Lösungsmittel, z. B. Pyridin in Azetonitril, aufgelöst und einem aktivierten Festträgerharz zugegeben, der sich in einer gefüllten Säule befindet, die mit 12 bezeichnet ist. Die Säule 12 ist vorzugsweise Teil einer zweistufigen Patrone 14, in der sich auch eine Säule 16 mit einem Festträger-Abspaltungsreagens befindet.
Nachdem das Peptid mit dem aktivierten Träger reagiert hat, wird die Reaktionslösung, die Peptidyl TH enthält, von Säule 12 in Säule 16 eluiert. Optional können die beiden Säulen durch eine Zwischenkammer (nicht abgebildet) getrennt werden, wobei das Lösungsmittel in Säule 12 vor Einführung der Probe in Säule 16 durch Vakuum entfernt und durch ein zweites Lösungsmittel ersetzt werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführung ist das Festträger-Reagens von der in Fig. 18 abgebildeten Art. Dieser Träger hat die Vorteile, daß (a) die Abspaltungsreaktion im selben nicht-wäßrigen Lösungsmittel oder derselben Lösungsmittelmischung durchgeführt werden kann, die in der Reaktion in Säule 12 verwendet wird, und (b) die Bindung an den und Freisetzung vom Träger des Restpeptids kovalent und daher nicht abhängig von den Ladungseigenschaften des Peptids ist.
Die Abspaltungsreaktion wird unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt, woraufhin die C- terminale Aminosäure TH (AAn-TH) von der Säule eluiert und identifiziert wird, z. B. durch HPLC. Anschließend wird die Säule mit einem wäßrigen Medium gewaschen, um das gebundene Restpeptid (Pep-AAn-1) freizusetzen.
Wenn die Reaktionssäulen erneut verwendet werden sollen, werden sie ausführlich gewaschen, und die erste Säule wird zu einer Acyl-ITC-Form wie oben beschrieben reaktiviert. Alternativ können die Doppelsäulen- Patronen wegwerfbar sein, wobei in neuen Patronen zusätzliche Sequenzierreaktionen auftreten.
Das aus dem ersten Sequenzierzyklus erhaltene Restpeptid wird getrocknet, erneut in einem geeigneten Reaktionspuffer aufgelöst und in eine neue oder reaktivierte Patrone eingeführt. Im zweiten Sequenzierzyklus werden eine Aminosäure TH aus dem vorletzten C-terminalen Rest (AAn-1-TH) und ein um zwei C- terminale Reste verkürztes Restpeptid gewonnen. Der Sequenzierzyklus wird wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von C-terminalen Resten identifiziert wurde. Die Gesamtzahl an C-terminalen Resten, die mit hoher Zuverlässigkeit identifiziert werden können, variiert je nach dem Grad, zu dem das Peptid in das gewünschte Peptidyl TH in der ersten Reaktionssäule umgewandelt wird, und dem Grad, in dem das Peptidyl-TH in der zweiten Reaktionssäule abgespalten wird. Allgemein werden die Reaktionsbedingungen so gewählt, daß die Produktausbeute verbessert wird, wenn eine Sequenzierung mit mehr als 3-5 Resten gewünscht wird.
Unter einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Festphasensystem zur Verwendung bei Bestimmung des C-terminalen Aminosäurerests eines Peptids. Das System umfaßt einen aktivierten Träger, der aus einem Festträger besteht, der mit einem gemischten Anhydrid aus Isothiocyansäure und Carboxyl- oder Carbonsäure derivatisiert wurde, und einen zweiten Träger aus einem Festträger, der mit einem Abspaltungswirkstoff derivatisiert wurde, der ein Peptidylhydantoin abspalten kann, so daß eine freie Aminosäure Thiohydantoin und ein Restpeptid entstehen. Bevorzugte Träger sind Partikelträger, z. B. in eine Säule gefüllte Partikelträger, oder Filtermembranen, durch die die Peptidlösung passieren kann.
Aus dem vorhergehenden ist zu sehen, wie verschiedene Ziele und Merkmale mit dieser Ausführung der Erfindung erreicht werden. Das Verfahren zur Herstellung des Peptidyls TH bietet die Vorteile des Acyl-ITC- Reaktionsverfahrens, das in der oben genannten ursprünglichen Anmeldung beschrieben ist: Die Reaktion (a) ist relativ schnell, (b) kann unter gemäßigten Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, und (c) behält die Stereochemie der C-terminalen Aminosäure bei, wenn die Abspaltungsreaktion unter sauren Bedingungen durchgeführt wird, und kann daher verwendet werden, um L- oder D-Aminosäuren zu bestimmen.
Die folgenden Beispiele sollen die Synthese verschiedener Acylverbindungen und ihre Verwendung bei der Bestimmung von C-terminalen Aminosäure-Gruppen und bei der C-terminalen Sequenzierung zeigen. Die Beispiele sollen auf keinen Fall das Ziel der Erfindung beschränken.

Materialien

Pyridin, Methylenchlorid, Ethylenoxid, BF&sub3;, Ethylether, Triethylamin, Woodward-Reagens K, Trimethylsilyl-ITC, Triphosgen und Benzoyl-ITC wurden von Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen, Leucin- Enkephalin von Sigma, Dipeptide von Bachem Biosciences. Polydimethyl-Acrylamidharz wurde nach J. Sparrow hergestellt und enthielt ca. 0,7 meq/g Amino-Gruppen. Die Umwandlung dieser Amino-Gruppen in Isothiocyanate wurde mit Thiocarbonyl-Diimidazol und Diisopropylethylamin (DIPEA) in Azetonitril durchgeführt. Magnetische Kern-Resonanzspektren wurden auf einem Jeol? HX90-Spektrometer gesammelt. Massen-Spektralanalysen wurden vom Berkeley Mass Spectrometry Laboratory unter Leitung von Dr. J. Leary durchgeführt.
Peptide wurden an Harz auf zwei Arten gebunden: (1) durch Harnstoff-Bindung oder (2) durch Thiourea- Bindung (mit lsothiocyanat-Harz, siehe oben).
(1) Harnstoff-Bindung: Das Harz wird mit dem überschüssigem DIPEA neutralisiert und die Reaktion mit überschüssigem DSC in 10% Pyridin/NMP 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur ermöglicht. Nach mehreren Spülungen, die letzte mit ACN, wird dem feuchten Harz eine Lösung des Peptids in 10%igem Pyridin/Wasser zugegeben und über Nacht stehengelassen. Das Harz wird ausführlich gewaschen und im Vakuum getrocknet. Eine übliche Beladung ist > 100 nmol/ml. Bestätigung erfolgt durch die Aminosäurenanalyse und eine Reihe C-terminale Analysen.
(2) Thiourea-Bindung: Eine Lösung des Peptids wird entweder ITC- (s. o.) oder DITC-Harz zugegeben und bei 45ºC über Nacht inkubiert. Nach Spülen und Trocknen wird die Befestigung durch TFA- Abspaltung des Peptids (abzüglich der aminoterminalen Aminosäure) vom Harz bestätigt, gefolgt von Kennzeichnung auf HPLC und durch Sequenzanalyse.

Beispiel 1

C-terminale Analyse eines Leu-Val-Dipeptids

A. Bindung:
Peptidylharz (ca. 1 mg, Leu-Val durch Harnstoff- Bindung befestigt) wurde in 100 pl 10%igem Pyridin/Azetonitril suspendiert. 10 ul Benzoyl- Isothiocyanat (BITC) wurden zugegeben, durch Schütteln gemischt und die Reaktion 30 Minuten lang bei 60ºCermöglicht. Das Harz wurde ausführlich mit mehreren Volumina Azetonitril gewaschen und im Vakuum getrocknet.
B. Hydrolyse:
Das Harz von oben wurde mit 10 ul 10%igem Propylamin in Azetonitril befeuchtet. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden die flüchtigen Stoffe entfernt und die Aminosäure TH mit Azetonitril zur Analyse extrahiert.
C. HPLC:
Die Trennung der hydrophoben Aminosäuren Thiohydantoine wurde einfach auf einem System mit kleinem Bohrloch (Modell 120A, Applied Biosystems) mit einer PTH-C18-Säule (2,1 mm · 22 cm, ABI) und einem TFA-Wasser-Azetonitril-Gefälle erreicht. Die Säule wurde zuerst in Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) äquilibriert, nach Einspritzung 5 Minuten lang in 100$ A gehalten, dann wurde ein Gefälle auf x% Lösungsmittel B (0,85% TFA in 70% Azetonitril) über x Minuten entwickelt. Der Anteil von B wurde über 5 Minuten auf 90% erhöht und dort 20 Minuten lang gehalten. Die Fließgeschwindigkeit betrug bei Raumtemperatur 200 ul/min. Der Abfluß wurde bei 269 nm für TH und bei 214 nm für die Peptide überwacht
Das Thiohydantoin wurde durch Vergleich mit der Elution von authentischem Material bestimmt (siehe Teil D, unten). Die HPLC aus dem Auszug in Teil B ist in Fig. 4B dargestellt. Die höchste Spitze ist leicht als TH-V zu erkennen. Die Zuweisung wurde durch Coinjektion bestätigt. Fig. 4A zeigt das in einem Kontrollexperiment, bei dem das Harz mit Trimethylsilyl- Isothiocyanat (Hawke) reagierte, erzeugte TH-V- Produkt.

D. Herstellung authentischer Standards:

Aminosäure Thiohydantoine der hydrophoben Reste können nach klassischen Verfahren hergestellt werden (z. B. Cromwell). Dabei wird die Aminosäure in Azetylsäure/Azetylanhydrid 30 Minuten lang bei bis zu 90ºC mit einem Thiocyanatsalz behandelt. Nach dem Trocknen im Vakuum wird der Rest in 12 N HCl aufgenommen und bei Raumtemperatur bis zu einer Stunde stehengelassen. Die Mischung wird erneut im Vakuum getrocknet, der Rest wieder kristallisiert, normalerweise durch kochendes Wasser. Die Strukturen waren nach NMR und Massenspektrometrie konsistent.

Beispiel 2

C-terminale Analyse eines Ala-Met-Dipeptids

Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde immobilisiertes Ala-Met (Harnstoff-Bindung) für einen Zyklus mit BITC und PA abgebaut. Das resultierende Chromatogramm ist in Fig. 4D abgebildet. Die Zuweisung von Methionin-TH (M-TH) wurde durch Coinjektion bestätigt.

Beispiel 3

C-terminale Analyse von Leucin-Enkephalin

Leu-Enkephalin (YGGFL), durch eine Thiourea-Bindung an Harz gebunden, wurde mit BITC und PA wie in Beispiel 1 behandelt. Das freigesetzte L-TH wurde mit HPLC erfaßt.
Das Harz wurde außerdem mit Azetonitril gespült und getrocknet, dann mit 2%igem TFA in Wasser 10 Minuten lang bei 60ºC behandelt, um die Peptid-Bestandteile aus dem Harz freizusetzen. Die HPLC-Analyse, gefolgt von Isolierung und sowohl Sequenzierung als auch FAB- Massenspektrometrie zeigte eine dem Desleucinpeptid entsprechende höchste Spitze, die den Verlust der C-terminalen Aminosäure bestätigte.

Beispiel 4

C-terminale Analyse von N-geschütztem Phe-Gly

N-geschütztes t-Boc Phe-Gly wurde im Handel erworben. Das Peptid wurde in 100 ul 10%igem Pyridin/Azetonitril (PA) suspendiert. Trimethylazetyl ITC (10 ul) wurde zugegeben, durch Schütteln vermischt und die Reaktion 30 Minuten lang bei 60ºC ermöglicht. Das Harz wurde ausführlich mit mehreren Volumina Azetonitril gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Die Abspaltung der t-Boc-Gruppe und des Gly-TH wurde durch Erhitzung auf 60ºC in 25%igem TFA/Wasser erreicht. Die mit HPLC verfolgte Reaktion zeigte einen raschen Verlust des Ausgangsmaterials (bewertet nach 15minütiger Reaktion), zusammen mit dem Auftreten von G-TH und einem geringeren Bestandteil (wahrscheinlich das Depeptidyl TH, dessen Schutz von Boc aufgehoben wurde). Nach einer zweistündigen Reaktion war nur G-TH nachzuweisen.

Beispiel 5

C-terminale Analyse von Leu-Enkephalin

Immobilisiertes Leucin-Enkephal in (Harnstoff-Bindung) wurde über zwei Chemiezyklen abgebaut. Die Verbindungen wurden mit Ethoxycarbonyl-Isothiocyanat (anstelle von BITC) 5 Minuten lang bei 60ºC durchgeführt. Abspaltungen wurden durch Zugabe von 10 ul 10%igem Tetra-N-butyl-Ammoniumhydroxid in Wasser mit 1 mg/ml DTT zum trockenen Harz und eine 45minütige Erhitzung auf 60ºC durchgeführt. Die Chromatogramme sind in Fig. 5A und 5B abgebildet. Die Zyklen wurden als Leucin bzw. Phenylalanin zugewiesen. Die Zuweisungen wurden durch Coinjektion bestätigt.

Beispiel 6

Herstellung eines einzelnen Isomers aus Isoleucin

Ca. 10 umol t-Boc-Isoleucin wurde in 100 ul 10%igem Pyridin/Azetonitril aufgelöst. Diese Mischung wurde mit 10 ul BITC 20 Minuten lang auf 60ºC erhitzt. Die HPLC-Analyse des Produkts zeigte eine einzige neue höchste Spitze, das t-Boc-Ile-Thiohydantoin. Ein kleiner Teil dieser Mischung wurde in 25%igem TFA bei 60ºC 10 Minuten lang abgespalten. Die Reaktionsmischung wurde mit Azetonitril verdünnt und mit HPLC analysiert. Das Ergebnis war eine einzige Spitze, die der bei Ile-TH entsprach. Wurde die Spitze isokratisch durchgeführt (11% B), ergab dies eine verbesserte Auflösung der Isomere, dargestellt in Fig. 7B, und ermöglicht eine Schätzung der oberen Grenze von ca. 2% Epimerisierung.
T-Boc-Isoleucin (10 umol) wurde in 100 ul 10%igem TMS-ITC in Azetylanhydrid aufgelöst. Die Reaktion wurde 20 Minuten lang auf 60ºC erhitzt. Das Material wurde in 25%igem TFA bei 60ºC 10 Minuten lang abgespalten, die Reaktionsmischung wurde mit Azetonitril verdünnt und mit HPLC wie oben analysiert. Das Ergebnis war eine Doppelspitze, die den diasteromerischen Formen von Ile-TH entsprach, wie in Fig. 7A dargestellt.

Beispiel 7

Reaktion von Sulfonyl-ITC-Reagens mit N-geschützter Aminosäure

A. Herstellung von Benzensulfonyl-Isothiocyanat (BzS-ITC)

Benzensulfonylchlorid wurde von Aldrich Chemical Co. bezogen. Die Verbindung (1 mmol) wurde in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; mit 3 mmol Pyridinethylamin zu einem Endvolumen aufgelöst. Dieser Mischung wurde 1 mmol TMSITC zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 25ºC gerührt. Das Benzylsulfonyl-Isothiocyanat (BzSITC) wurde durch Filtern der sich bildenden Salze und Entfernung des Lösungsmittels und der flüchtigen Nebenprodukte gewonnen.

B. Reaktion zur Herstellung der Aminosäure TH

1 mmol t-Boc-Leu wurde in Dichloromethan mit Pyridin aufgelöst und 1 mmol BzSITC wie oben unter A. angegeben hergestellt. Nach der Reaktion über Nacht wurde das Lösungsmittel durch umlaufende Verdunstung entfernt und das sich bildende t-Boc-Leu-TH durch Chromatographie auf Kieselgel gereinigt. Die Identität der TH- Verbindung wurde mit NMR und HPLC bestätigt.

Beispiel 8

Reaktion von BzMBT mit Peptidylharz

A. Herstellung von BzMBT

Mercaptobenzothiazol (1 mmol) und Diisopropylethylamin (1 mmol) wurden in 5 ml Azetonitril aufgelöst. Benzoylchlorid (1 mmol) wurde langsam mit einer Spritze zugegeben, wobei gleichzeitig schnell gerührt wurde. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur war das Lösungsmittel teilweise entfernt, so daß eine Ausfällung des Aminsalzes ermöglicht wurde. Der Überstand wurde weiter konzentriert und auf Kieselgel (9 : 1, Heptan: Ethylazetat) chromatographiert.

B. Reaktion

Peptidylharz (1 mg Lenk, Thiourea-Bindung) wurde in 100 ul 10%igem Pyridin in Azetonitril mit 1 mg Bz-MBT suspendiert. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang auf 60ºC erhitzt, dann gewaschen und wie zuvor getrocknet. Das Arylthiohydantoin wurde mit 10%igem Propylamin bei Raumtemperatur 15 Minuten lang abgespalten. Die Behandlung mit TFA setzte die restlichen Peptidfragmente aus dem Harz frei, was durch den Verlust des C- terminalen Rests bestätigt wurde, der mit HPLC gemessen wurde.

Beispiel 9

Reaktion mit Benzoyl-Isothiocyanat

1 mol t-Boc-Leu reagierte mit einem leichten Überschuß von Benzoyl-Isothiocyanat in einer der in Beispiel 7 ähnlichen Reaktionsmischung. Das t-Boc-Leu wurde chromatographiert, dann der Schutz entfernt, um einen leichten Gewinn an Hydantoin zu erzielen, wie von NMR bestätigt wurde.

Beispiel 10

Herstellung eines aktivierten Festträgers:

Verfahren 1

Das p-Aminomethylpolystyrolharz (1%iges querverbundenes Divinylbenzen) (2 g, 1,10 mmol/g) quoll in CH&sub2;Cl&sub2; vor. FMOC-Glu-OtBu (3 mmol, 0,8 mol Überschuß) wurde in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; aufgelöst und dem Harz zugegeben. N,N- Diisopropylcarbodiimid (0,46 ml, 3 mol) wurde unmittelbar zugegeben und die Reaktion für ca. 1 Stunde geschüttelt. Das Harz wurde gründlich mit Lösungsmittel gewaschen und ein Teil mit Ninhydrin getestet (kein Amin blieb übrig). Die Gruppe zum Schutz von tBu auf dem Gammacarboxyl wurde mit Trifluoroazetylsäure TFA (50%iges H&sub2;Cl&sub2;/TFA) in ca. 0,4 Stunden entfernt. Das Harz wurde mit Lösungsmittel gewaschen und mit Diisopropylethylamin (DIPEA) neutralisiert.
In der Zwischenzeit wurde Woodwards-Reagens K (WRK, 3 mmol) über ca. 2 Stunden in Ketenimin mit 3 Äquivalenten in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; umgewandelt. Die Lösung wurde fast homogen und gelb und wurde dann dem Polystyrolharz zugegeben. Nach 2 Stunden wurde das Harz gewaschen, und 3 mmol TMSITC wurden zugegeben. Nach Rühren über Nacht wurde das Harz mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Das funktionalisierte Harz wurde 0,74 g schwerer. Die theoretische Gewichtszunahme wäre 0,87 g gewesen.

Beispiel 11

Herstellung von Ala-TH

BOC-Ala (10 mg) wurde in 2 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 12 ul Pyridin aufgelöst. Dieses wurde bei 40ºC über 100 mg frisch hergestelltem Harz inkubiert. Die Lösungsphase wurde vom Harz abpipettiert und durch Vakuum- Zentrifugierung konzentriert. Das Restöl wurde mit HPLC und ¹H NMR geprüft. Die Integration zeigte an, daß ca. 50% des BOC-Ala in entsprechendes TH umgewandelt wurden. Die BOC-Gruppe wurde mit wäßrigem TFA entfernt. Die HPLC-Rückstandszeit stimmte mit der von authentischem AIaTH überein.
Die hergestellte Aminosäure TH wurde mit HPLC identifiziert, auf einem System mit kleinem Bohrloch (Modell 120A, Applied Biosystems) mit einer PTH-C18-Säule (2,1 mm · 22 cm, ABI) und einem TFA- Wasser-Azetonitril-Gefälle. Die Säule wurde zuerst in einem Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) äquilibriert, in 100% A und 0% B 5 Minuten lang nach Einspritzung gehalten, dann wurde ein lineares Gefälle auf 40% Lösungsmittel B (0,85% TFA in 70% Azetonitril) über 30 Minuten erzeugt. Der Anteil von B wurde dann über 5 Minuten auf 90% erhöht und dort 20 Minuten lang gehalten. Die Fließgeschwindigkeit betrug 200 ul/min bei Raumtemperatur. Der Abfluß wurde bei 269 nm überwacht.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung einer Thiohydantoin (TH) einer geschützten freien Aminosäure oder einer C-Ende-Aminosäure mit einer freien Carboxylsäuregruppe, aufweisend

das Kontaktieren der Aminosäure in Lösung mit einem gemischten Anhydrid der Isothiocynansäure und Carbonsäure, Kohlensäure oder Sulfonsäure, und zwar unter Basisbedingungen, in welchen die Karbolsäuregruppe der Aminosäure de-protoniert ist und

Bilden der TH der Aminosäure durch das Kontaktieren.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gemischte Anhydrid in Lösung ist und die Form hat:

wobei A eine Alkyl-, eine Alkoxy-, eine Aryl- oder eine Aryloxygruppe darstellt.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das gemischte Anydrid ein Benzoylisothiocyanat ist.

4. Das Verfahren nach Anspruch 2 zur Verwendung der Bestimmung der C-Ende-Aminosäure eines Peptids, wobei das Kontaktieren wirksam ist, um ein C-Ende-Peptidylthiohydatoin zu bilden, in welchem eine C-Ende-Aminosäurethiodantoin mit der zum C-Ende vorletzten Aminosäure in dem Peptid über eine Amidbindung gebunden ist, und weiterhin umfassend die Behandlung des Peptidylthiohydantoin unter Bedingungen, die wirksam sind die Amidbindung aufzutrennen, um dadurch eine C-Ende- Aminosäurethiohydantoin und ein Peptid verringert er Länge freizugeben und das Identifizieren der freigegebenen Aminosäurethiohydantoin.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Peptid an einem Nicht-C-Ende-Rest mit einem festen Träger verbunden ist und weiter das ein oder mehrmalige Wiederholen der Kontaktier, der Bildungs-, der Behandlungs- und der Identifizierungsstufe umfaßt, um die Sequenz der Aminosäuren in dem Peptid von dem C- Ende-Peptidendstück her zu identifizieren.

6. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gemischte Anhydrid mit einem festen Träger derivatisiert ist und die Form hat: Träger

wobei A eine Alkyl-, eine Alkoxy-, eine Aryl- oder eine Aryloxygruppe darstellt, die an dem festen Träger befestigt ist, und wobei die geschützte freie Aminosäure oder die C-Ende- Aminosäure sich in Lösung befindet.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, weiterhin gekennzeichnet durch die Separation der Aminosäure-TH, die durch das Kontaktieren mit dem festen Träger gebildet ist.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Aminosäure die C- Ende-Aminosäure in einem Peptid ist, wobei das Kontaktieren eine Lösungshphase-Peptyl-TH bildet, in welcher das C-End-Peptid eine Aminosäure TH ist und die Separation die Trennung der Peptidyl- Th von dem festen Träger, das Abspalten der C-Ende-Aminosäure-TH von dem Restpeptid und die Isolierung der freien Aminosäure TH von dem Restpeptid umfaßt.

9. Das Verfahren nach Anspruch 8 zum Einsatz bei der C-Ende- Peptidsequenzierung, weiterhin die Stufe der Identifizierung der Aminosäure-TH umfassend, um die C-Ende Aminosäure des Peptids zu bestimmen.

10. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Abspalten das Kontaktieren einer Lösung der Peptidyl-TH mit einem zweiten festen Träger umfaßt, der mit einem Trennagenz derivatisiert ist, welches wirksam ist, um die Peptidyl-TH abzutrennen, um die freie Aminosäure-TH und das Restpeptid, beide in der Lösungsphase, zu bilden.

11. Ein aktivierter Träger, der einen festen Träger umfaßt, der mit einem gemischten Anhydrid der Isothiocyansäure und Carbon- oder Kohlensäure derivatisiert ist.

12. Der Träger nach Anspruch 11, welcher die Form hat; Festträger

13. Ein Festphasensystem zur Verwendung bei der Bestimmung des C-Ende-Aminosäurerestes eines Peptids, aufweisend

einen aktivierten Träger, der aus einem festen Träger gebildet ist, der mit einem gemischten Anhydrid der Isothiocyansäure und Carbon- oder Kohlensäuresäure derivatisiert ist, und

einen zweiten Träger, der aus einem festen Träger gebildet ist, der mit einem Trennagenz derivatisiert ist, welches wirksam ist, um eine Peptidyl-TH abzutrennen, um eine freie Aminosäure TH und ein Restpeptid zu bilden.

14. Das System nach Anspruch 15, wobei der zweite Träger ein Ionenaustauschharz ist, welches wirksam ist, um selektiv das Restpeptid unter geeignet ausgewählter Ionenstärke und pH- Bedingungen zu binden.

15. Das System nach Anspruch 14, wobei der zweite feste Träger mit einer Hydroxylamingruppe derivatisiert ist, welche wirksam ist, um (a) die Peptidyl -TH abzuspalten, um eine freie Aminosäure- TH zu bilden, und um (b) diese kovalent an dem Restpeptid zu binden.

16. Verfahren zur Präparation eines Acylisothiocyanats, welches wirksam ist, um ein Peptid, wenn es mit dem Träger in Berührung tritt, in ein C-Ende-Peptidylthiohydantoin (TH) umzuwandeln, aufweisend

Bereitstellen eines festen Trägers, der mit Carboxylgruppen funktionalisiert ist,

Reagieren des festen Trägers mit einer Isoxazoliumzusammensetzung unter Basisbedingungen, um aktivierte Enolester der Carboxylgruppen zu bilden, und

Reagieren des Trägers mit einem Isothiocyanat (ITC), welche aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Trialkylsilyl-ITC und Pyridin-ITC umfaßt, um ein gemischtes Anhydrid der Isothiacyansäure und der Carbonsäure auf dem Träger zu bilden.

17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei das ITC Trimethyl-ITC ist.

18. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Isoxazolium 2-ethyl-5'-phenylisoxazoliumsulfonat ist.