DE69031623T2

DE69031623T2 - Thioacylierungsmittel und zwischenprodukte, thiopeptide, und verfahren zu deren herstellung und anwendung

Info

Publication number: DE69031623T2
Application number: DE69031623T
Authority: DE
Inventors: Bernard Belleau, Deceased; Denis Laval Quebec H7N 2Y6 Brillon; Gilles Laval Quebec H7M 3X9 Sauve; Boulos Laval Quebec H7N 4A1 Zacharie
Original assignee: IAF BioChem International Inc; Biochem Pharma Inc
Current assignee: Shire Canada Inc
Priority date: 1989-08-04
Filing date: 1990-08-03
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2010-08-04
Also published as: US5371185A; ES2109236T3; AU6064290A; US5138061A; OA09561A; ATE159521T1; CA2059647C; EP0485458B1; CA2059647A1; AU651557B2; HU220756B1; HUT63395A; WO1991001976A1; DE69031623D1; JP3165698B2; EP0485458A1; HU9200338D0; JPH05501865A; DK0485458T3

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft neuartige, als Thioacylierungsmittel verwendete α-Aminosäurederivate, als Vorläufer für diese Derivate gebildete Zwischenprodukte und ihre Anwendung bei der Herstellung von Thiopeptiden von biologischer und medizinischer Bedeutung. Dabei leiten die Thioacylierungsreagenzien Thioamidbindungen in das wachsende Peptid ein. Die hier offenbarten Thiopeptide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie in vivo eine besonders gute Wirkung als Modifiziermittel biologischer Antworten, Neuroeffektoren und Immunmodulatoren aufweisen. Darüber hinaus sind sie aufgrund der Einführung einer Thioamidbindung in die Hauptkette des Peptids beständiger gegen enzymatischen Abbau. Die Thiopeptide werden hier als Peptide beschrieben, die eine Thioamidbindung zwischen benachbarten Aminosäurerückständen enthalten. Mindestens eine solche Substitution eines Sauerstoffatoms durch ein Schwefelatom in der Amidbindung der Hauzptkette der Peptidstruktur ist erwünscht. Wie aus der folgenden Offenbarung hervorgeht, können die Thioacylierungsmittel dazu verwendet werden, diese Thioamidbindung auf einfache Weise und mit wesentlich größerer Ausbeute als bei früheren Verfahren in ein wachsendes Peptid einzuführen und dabei gleichzeitig die optische Integrität des Peptids aufrechtzuerhalten. Der Begriff "wachsendes Peptid" bedeutet, daß eine Verlängerung der Aminosäureketten stattfinden, wodurch die Größe des Peptids durch Inkorporierung zusätzlicher Rückstände in die Peptidsequenz zunimmt.

Hintergrund der Erfindung

Die Anzahl biologisch aktiver Peptide ist ziemlich groß. Jedoch ist ihre mögliche Eignung als Mittel zur Modifizierung von Antworten, Neuroeffektoren oder Immunmodulatoren stark durch ihre nachgewiesene kurze Halbwertzeit in vivo und ihre mangelnde Wirkung bei oraler Verabreichung stark eingeschränkt. Letzteres pHänomen ist hauptsächlich auf die starke Labilität biologisch aktiver Polypeptide in Gegenwart der normalerweise im Verdauungstrakt vorhandenen Peptidasen und Proteasen zurückzuführen.
Es ist wünschenswert, die Amidbindungen der Hauptkette dieser biologisch aktiven Peptide gegen solche proteolytischen Enzyme zu stabilisieren, um ihre pharmakokinetischen Eigenschaften zu verbessern. Eine verbesserte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau würde den Nutzen dieser Peptide als Therapeutika steigern.
Kürzlich erzielte Fortschritte in der chemischen Ersetzung oder Modifizierung von Peptidbindungen deuten darauf hin, daß eine Stabilisierung der Bindung möglich ist. Durch Ersetzen der Peptidbindungen durch Thioamidbindungen an den Stellen der Peptidhauptkette, die für die die biologische Antwort einschränkende Spaltung durch Peptidasen und Proteasen verantwortlich ist, erzielt man für viele Thiopeptidanaloge eine verbesserte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau. Reid und von der Emden [W. Reid und W. von der Emden, "Aminosäurethionester und Endothiopeptide, II", Liebigs Ann. Chem., 642, 128 (1961)] erörtern die Bildung von racemischen Thioamid durch das Thionesterthioacylierungsmittel:
wobei R und R¹ aus Niedrigalkyl und Aryl ausgewählt sind. Außerdem weisen viele dieser Analoge eine verbesserte pharmakologische Aktivität auf [Lajoie et al. (G. Lajoie, F. Lepine, S. LeMaire, F. Jolicoeur, C. Aube, A. Turcotte und B. Belleau) "synthesis and Biological Activity of Monothionated Analogs of Leucin-enkephalin", Int. J. Pept. Protein Res., 24, 316 (1984)]. Thiopeptidderivate haben im Vergleich mit ihren oxygenierten Analogen in vivo eine gesteigerte Aktivität als biologische Mittel zur Modifizierung von Antworten, Neuroeffektoren und Immunmodulatoren gezeigt. Beispielsweise weisen Clausen et al., [K. Clausen, A. Spatola, C. Lemieux, P. Schiller und S. Lawesson in "Evidence of a Peptide Backbone Contribution Toward Selective Receptor Recognition for Leucine Enkephalin Thioamid Analogs", Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 305 (1984)] die gesteigerte pharmakologische Aktivität eines solchen Thiopeptidanalogs gegenüber seinem oxygenierten Gegenstück nach.
Verfahren zum Ersatz des Carbonylsauerstoffatoms einer Carboxylkomponente durch ein Schwefelatom sind bekannt. Clausen et al. [K. Clausen, M. Thorsen und S. Lawesson "Studies on Amino Acids and Peptides. Part 6. Methods for Introducing Thioamide Bonds into the Peptide Backbone: Synthesis of the Four Monothio Analogues of Leucine Enkephalin"., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 785 (1984)] beschreiben die Thioacylierung durch die Verwendung von Dithioestern der Formel:
in der Z Carbobenzyloxy und R aus Wasserstoff, Niedrigalkyl und Aryl ausgewählt ist. Es wird jedoch keine Racemisierung beschrieben. Ferner ist bekannt, daß die auf diese Weise gebildeten Thioeptide nützliche Reagenzien und Zwischenprodukte für die weitere Thiopeptidsynthese sind [siehe P. Campbell und N. Nashed "Carboxypeptidase A Catalyzed Hydrolysis of Thiopeptide and Thionester Analogues of Specific Substrates. An Effect on Kcat for Peptide, but not Ester, Substrates", J. Am. Chem. Soc., 104, 5221 - 5226 (1982); P. Bartlett, K. Speer und N. Jacobsen "A Thioamide Substrate of Carboxypeptidase A", Biochemistry, 21, 1608 - 1611 (1982); sowie L. Maziak, G. Lajoie und B. Belleau "Productive Conformation in the Bound State and Hydrolytic Behavior of Thiopeptide Analogues of Angiotensin-converting Enzyme Substrates", J. Am. Chem. Soc., 108, 182 - 183, 1986)]. Solche Thiopeptidderivate haben sich als als beständig gegen eine enzymatische Hydrolyse erwiesen. Beispielsweise offenbaren W. Reid und E. Schmidt in "N- acylierte α-Aminoimidosäureester, Iminodipeptide und Endothiodipeptide", Liebigs Ann. Chem., 695, 217 (1966) die Synthese eines geschützten Aminosäurethionesters als Zwischenprodukt bei der Herstellung eines Thiopeptids in mäßiger Ausbeute.
Die Thionierung von Peptiden oder der Ersatz eines Sauerstoffatoms durch ein Schwefelatom an der Carbonylfunktionalität ihrer Peptidbindungen hat bisher einen Mangel an Spezifität der Reaktionsstelle gezeigt. Es waren verringerte Gesamtausbeuten zu beobachten. Dies liegt an Nebenreaktionen und den dabei gebildeten Nebenprodukten, die die Reinheit des Produkts und die Wirksamkeit der Reaktion beeinträchtigen. Außerdem bleibt die optische Integrität des fertigen Produkts aufgrund des Reaktionsmechanismus der zuvor verwendeten Thioacylierungsreagenzien oft nicht erhalten. Die begrenzte Effektivität dieser Thioacylierungsmittel schränken das Potential von Thiopeptiden als pharmakologische Mittel stark ein. Das Fehlen eines effizienten Verfahrens zur Herstellung reiner, optisch aktiver Thiopeptide hat die Bewertung der pharmakologischen Aktivität, der Stabilität gegenüber enzymatischem und pH- Abbau und der Toxizität solcher Verbindungen sehr schwierig gemacht, da bisher keine ausreichenden Mengen dieser Materialien zur Verfügung standen.
Die optische Integrität der Verbindung bezieht sich auf ihre Fähigkeit, Licht rotieren zu lassen. Diese Fähigkeit wird mit einem als Polarimeter bezeichneten Instrument gemessen, das einen Bezugspunkt null verwendet. Der Grad, zu dem eine chemisch reine Substanz Licht rotieren läßt, zeigt ihre relative optische Reinheit an. Die Menge der bei einer Substanz beobachteten Aktivität hängt oft von ihrer optischen Reinheit ab. Zwei Enantiomere können zwar identische chemische Formeln haben, aber eine ganz unterschiedliche biologische Aktivität aufweisen. Bei medizinischen Anwendungen ist es üblich, daß eine Verbindung einer optischen Konfiguration wirksam und nützlich ist, während ihr optisches Rotamer oder komplementäres Enantiomer eine andere Wirkung zeigt oder ganz inert ist. Deshalb ist in Fällen, wo die optische Konfiguration von Bedeutung ist, nicht nur die chemische, sondern auch die optische Reinheit von großer Bedeutung.
Wünschenswert ist, daß ein Thiopeptid verschiedene Kriterien erfüllt, um für eine pharmakologische Studie in Frage zu kommen. Als erstes sollte es eine verbesserte Beständigkeit gegenüber einem enzymatischen Abbau aufweisen. Zweitens sollte das Thiopeptid im Vergleich mit seinem oxygenierten Gegenstück eine verbesserte biologische Antwort geben. Als drittes muß es vom Menschen gefahrlos aufgenommen werden können. Viertens sollte es möglich sein, das Thiopeptid in solchen Mengen herzustellen, daß klinische Studien durchgeführt werden können.
Bezüglich der ersten drei Punkte sollte das Thiopeptid von Natur aus die beschriebenen Eigenschaften aufweisen, welche es anderen Peptiden, die keine Thioamidbindung zwischen benachbarten Aminosäurerückständen aufweisen, überlegen macht. Was das letzte Kriterium angeht, ist es von Vorteil, wenn man das Material in großer Menge produzieren kann. In diesem Hinblick sind verschiedene Faktoren wichtig. Das Verfahren zur Herstellung des Thiopeptids ist vorzugsweise einfach, effizient und wirtschaftlich. Das heißt, das Reaktionsschema des Verfahrens sollte nur wenige Schritte aufweisen, eine hohe Gesamtausbeute zur Verfügung stellen und nur eine minimale Menge an Nebenprodukten erzeugen. Darüber hinaus sollten vorzugsweise preiswerte Reagenzien und Materialen verwendet werden. Außerdem sollte das Verfahren die optische Integrität des wachsenden Peptids dadurch sicherstellen, daß Reaktionen, mit denen die Verbindung racemisiert wird, vermieden werden. Das heißt, eine racemische Mischung wird die erwünschte pharmakologische Antwort wahrscheinlich nicht im vollen Umfang geben.
Frühere Thioacylierungsverfahren hatten den Nachteil, daß sie aufwendig und kompliziert waren. Außerdem lieferten sie Produkte mit einem zu geringen optischen Integritätsgrad und in nicht ausreichender Menge.
Demnach besteht Bedarf nach Thioacylierungsreagenzien, die die selektive Inkorporierung von Thioamidbindungen in wachsende Peptide an spezifischen Rückstandsbindungen ermöglichen und sich gleichzeitig effiziente Reaktionsbedingungen zunutze machen können. Ferner besteht Bedarf nach einem Thioacylierungsverfahren, das die optische Integrität des resultierenden Peptids erhält und ein solches Peptid in hoher Ausbeute herstellt. Ferner sind Verfahren zur Herstellung von Thioacylierungsreagenzien gefragt, die mit den Aminosäuren und Peptiden eine einfache und wirtschaftliche Reaktion zur Herstellung von Thiopeptiden durchlaufen können. Ferner besteht Bedarf nach Thiopeptiden und Verfahren zu ihrer Herstellung, welche über eine verbesserte enzymatische Stabilität und eine verbesserte biologische Aktivität gegenüber ihren oxygenierten Analogen verfügen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Thioacylierungsmittel zur Verfügung zu stellen, die Thioamidbindungen in hoher Ausbeute in wachsende Peptide einführen und die optische Integrität des so gebildeten Peptids erhalten. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, neuartige Zwischenprodukte zur Herstellung der Thioacylierungsmittel zur Verfügung zu stellen. Ferner ist es eine Aufgabe der Erfindung, Thiopeptide zur Verfügung zu stellen, die in bezug auf ihre Aktivität und ihre Beständigkeit gegen Zersetzung im Vergleich mit ihren oxygenierten Analogen über eine größere pharmakologische Effektivität verfügen. Außerdem ist es eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Synthese dieser Thioacylierungsmittel, neuartigen Zwischenprodukte und Thiopeptide zur Verfügung zu stellen.
Diese und weitere Aufgaben werden durch Thioacylierungsmittel der folgenden Formel gelöst:
in der
R¹ Wasserstoff, ein ggf. verzweigtes C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, das durch Amino, Carboxy, Guanidino, Hydroxy, Hydroxymethyl oder Hydroxyphenyl substituiert sein kann, sowie funktionalitätsgeschützten Derivaten desselben oder ein aus einer Gruppe ausgewählter Substituent ist, die besteht aus:
(a) -(CH&sub2;)n - - A - D
worin A -O- oder -NH--
D Benzyl oder Xanthenyl und
n 1 oder 2 ist,
(b) - H - G - J - L
worin E -H oder -CH&sub3;,
G -CH&sub2;-, -O- oder -S-,
J -S- oder -CH&sub2;- und
L -CH&sub3; oder Phenyl ist,
worin M und T gleich oder verschieden sein können und Elemente darstellen, die aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom und bd bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und Q Wasserstoff, Hydroxy oder 2,6-Dichlorbenzoxy bedeutet,
worin V für Carbobenzyloxy oder Tosyl steht, oder
in der
R² aus der aus t-Butoxy, Carbobenzyloxy, Chlorbenzyloxy, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Tosyl, Trityl und Xanthenyl bestehenden Gruppe gewählt ist,
R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet oder in der R¹ und R³, zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 3 bis 5 Kohlenstoffatome enthaltende Kohlenwasserstoffring bilden,
R&sup4; Wasserstoff bedeutet oder in der R¹ und R&sup4;, zusammengenommen mit dem Kohlenstoff- bzw. Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 2 bis 6 Ringkohlenstoffatome enthaltenden, gesättigten Heterocyclus (d.h. einen Aziridin-, Azetidin-, Pyrrolidin- oder Piperidinring) bilden, und R&sup5; aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, bd, Amino, Amido, Hydroxy, Hydroxymethyl, Carboxyl, Carboxymethyl, Cyano, Guanidino, Mercapto und Nitro bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Die Erfindung stellt auch neuartige Zwischenverbindungen zur Verfügung, die sich sehr gut zur Herstellung des erfindungsgemäßen Thioacylierungsreagenz eignen.
Außerdem stellt die Erfindung Thiopeptide zur Verfügung, die eine verbesserte Beständigkeit gegenüber einem enzymatischen Abbau und im Vergleich mit ihren sauerstoffhaltigen Gegenstücken in vivo eine verbesserte biologische Aktivität aufweisen.
Ferner stellt die Erfindung Verfahren zur Synthese dieser Thioacylierungsreagenzien und neuartiger, für die Herstellung dieser Reagenzien geeigneter Zwischenprodukte sowie Verfahren zur Herstellung der hier beschriebenen Thiopeptide zur Verfügung.
Erfindungsgemäß stellen wir eine Klasse von Reagenzien für die Thioacylierung zur Verfügung, die auf einfache, effiziente und wirtschaftliche Weise Thioamidbindungen in großer Menge in Peptide oder andere geeignete Verbindungen einbringen. Die unter Verwendung dieser Reagenzien durchgeführte Thioacylierung erhält außerdem die optische Integrität der neu gebildeten Verbindung.
Ebenfalls erfindungsgemäß stellen wir ein Verfahren zur Herstellung dieser Reagenzien sowie neuartige, für die Herstellung der Thioacylierungsmittel geeignete Zwischenprodukte zur Verfügung.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung stellen wir eine Reihe von Thiopeptiden zur Verfügung, die im Vergleich mit entsprechenden, nur Amidbindungen zwischen benachbarten Rückständen enthaltenden Peptiden eine verbesserte Beständigkeit gegenüber einem enzymatischen Abbau und einer verbesserte pharmakologische Aktivität aufweisen. Diese Thiopeptide sind nützlich als Mittel zur Modifizierung der biologischen Antwort, Neuroeffektoren und Immunmodulatoren.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die erfindungsgemäß hergestellten Thiopeptide durch die folgende Formel
und deren Salze dargestellt,
in der
R¹ Wasserstoff, ein ggf. verzweigtes C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, das durch Amino, Carboxy, Guanidino, Hydroxy, Hydroxymethyl oder Hydroxyphenyl substituiert sein kann, sowie funktionalitätsgeschützten Derivaten desselben oder ein aus einer Gruppe ausgewählter Substituent ist, die besteht aus:
(a) -(CH&sub2;)n - - A - D
worin A -O- oder -NH--
D Benzyl oder Xanthenyl und
n 1 oder 2 ist,
(b) - H - G - J - L
worin E -H oder -CH&sub3;,
G -CH&sub2;-, -O- oder -S-,
J -S- oder -CH&sub2;- und
L -CH&sub3; oder Phenyl ist,
worin M und T gleich oder verschieden sein können und Elemente darstellen, die aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom und bd bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und Q Wasserstoff oder Hydroxy bedeutet,
worin V für Carbobenzoxy oder Tosyl steht, oder
in der
R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet oder in der R¹ und R³, zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 3 bis 5 Kohlenstoffatome enthaltenden gesättigten Kohlenwasserstoffring bilden,
R&sup4; Wasserstoff bedeutet oder in der R¹ und R&sup4;, zusammengenommen mit dem Kohlenstoff- bzw. Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 2 bis 6 Ringkohlenstoffatome enthaltenden, gesättigten Heterocyclus (d.h. einen Aziridin-, Azetidin-, Pyrrolidin- oder Piperidinring) bilden, und n 1 bis 4 ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Thioacylierungsreagenzien

Erfindungsgemäß werden die Thioacylierungsreagenzien durch folgende Formel dargestellt:
in der
R¹ aus der Gruppe Wasserstoff, ein ggf. verzweigtes C&sub1;- C&sub4;-Alkyl, das durch Amino, Carboxy, Guanidino, Hydroxy, Hydroxymethyl oder Hydroxyphenyl substituiert sein kann, sowie funktionalitätsgeschützten Derivaten desselben oder ein aus einer Gruppe ausgewählter Substituent ist, die besteht aus:
(a) -(CH)n - - A - D
worin A -O- oder -NH--
D Benzyl oder Xanthenyl und
n 1 oder 2 ist,
(b) - H - G - J - L
worin E -H oder -CH&sub3;,
G -CH&sub2;-, -O- oder -S-,
J -S- oder -CH&sub2;- und
L -CH&sub3; oder Phenyl ist,
worin M und T gleich oder verschieden sein können und Elemente darstellen, die aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom und bd bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und Q Wasserstoff oder Hydroxy bedeutet,
worin V für Carbobenzyloxy oder Tosyl steht, oder
in der
R² aus der aus t-Butoxycarbonyl, Carbobenzyloxy, Chlorbenzyloxy, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Tosyl, Trityl und Xanthenyl bestehenden Gruppe gewählt ist,
R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet oder in der
R¹ und R³, zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 3 bis 5 Kohlenstoffatome enthaltenden Cycloalkylring bilden,
R&sup4; Wasserstoff bedeutet oder in der R¹ und R&sup4;, zusammengenommen mit dem Kohlenstoff- bzw. Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 2 bis 6 Ringkohlenstoffatome enthaltenden, gesättigten Heterocyclus (d.h. einen Aziridin-, Azetidin-, Pyrrolidin- oder Piperidinring) bilden, und R&sup5; aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Amido, Amino, Carboxyl, Carboxymethyl, Cyano, Guanidino, Hydroxyl, Hydroxymethyl, Mercapto und Nitro bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
R¹ sind typischerweise Substituenten, wie man sie im allgemeinen unter natürlichen α-Aminosäuren findet. Besonders bevorzugte Gruppen sind unter anderem verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen, die unsubstituiert oder durch Amino, Carboxy, Guanidino, Hydroxy, Hydroxymethyl oder Hydroxyphenyl substituiert sein können.
Der Begriff Thioacylierungsmittel schließt auch Verbindungen ein, die mit Hydroxy und Aminogruppen reagieren, um eine Thioacylgruppe in den nudeophilen Substituenten einbringen zu können, und sich kovalent daran binden. Der Einschluß von Thiocarbonylen in die Amidbindungen der Peptide führt im Vergleich zu Peptiden der gleichen allgemeinen Struktur, die herkömmliche Carbonylkomponenten in ihren Amidbindungen aufweisen, zu einer verbesserten Beständigkeit gegenüber einer Hydrolyse oder einer Zersetzung durch Enzyme.
Die erfindungsgemäßen Aminosäure-ortho-aminothioanilide werden durch folgende Formel dargestellt:
in der R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; in der Verbindung die gleiche Definition haben wie oben. Bevorzugte Werte für R¹ in diesen Thioanilidzwischenprodukten sind Substituenten, wie man sie üblicherweise unter den natürlichen Aminosäuren findet. Besonders bevorzugte Gruppierungen umfassen verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen, die unsubstituiert oder durch Amino, Carboxy, Guanidino, Hydroxy, Hydroxymethyl oder Hydroxyphenyl substituiert sein können.
Der Begriff Aminosäure-ortho-aminothioanilid schließt auch Verbindungen mit einer ortho-disubstituierten Aminobenzolstruktur und eine durch eine Thioamidbindung an diese ortho-disubstituierte Aminobenzolstruktur gebundene Aminosäure ein, wobei diese Aminosäure am Aminoende durch eine geeignete, wie vorstehend für R² definierte Schutzgruppe geschützt ist.
Die erfindungsgemäßen Aminosäure-ortho-aminoanilide werden durch folgende Formel dargestellt,
in der R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; in der Verbindung die gleiche Definition haben wie oben. Bevorzugte Werte für R¹ sind solche Substituenten, wie man sie üblicherweise unter den natürlichen α-Aminosäuren findet. Besonders bevorzugte Gruppierungen umfassen verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppen, die unsubstituiert oder durch Amino, Carboxy, Guanidino, Hydroxy, Hydroxymethyl. oder Hydroxyphenyl substituiert sein können.
Der Begriff Aminosäure-ortho-aminoanilid schließt auch Verbindungen mit einer ortho-disubstituierten Aminobenzolstruktur und eine durch eine Amidbindung an diese ortho-disubstituierte Aminobenzolstruktur gebundene Aminosäure ein, wobei diese Aminosäure am Aminoende durch eine geeignete, wie vorstehend für R² definierte Schutzgruppe geschützt ist.
Die erfindungsgemäßen Thioacylierungsmittel können durch eine erste Reaktion eines ortho-Phenylendiamins, am besten mit einer Aminosäure, nach folgendem Schema hergestellt werden: Dichlormethan Carbonylditriazoldichlormethan, ºC
in der R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; die gleiche Bedeutung haben wie oben.
Die hier beschriebenen ortho-Phenylendiamine und Aminosäuren können in Gegenwart eines Peptidkopplungsmittels in einem geeigneten Lösungsmittel unter Rühren oder Schütteln zur Umsetzung gebracht werden, um Aminosäureortho-aminoanilide 1 zu bilden. Überraschend findet die selektive Amidbildung jedoch nur an einem der beiden Aminosubstituenten auf dem Benzolring statt. Wenn man Verbindungen der allgemeinen Formel I in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels bei -78ºC bis 0ºC unter Rühren oder Schütteln mit einem Thionierungsreagenz in Kontakt bringt, erhält man die Aminosäure-ortho-aminothioanilide II. Die anschließende Behandlung der Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem Reagenz, das einen internen Ringschluß in einem geeignet inerten Lösungsmittel bewirkt, unter Rühren oder Schütteln ergibt die erwünschten Verbindungen der allgemeinen Formel III. Das Reaktionsschema zur Herstellung der Thioacylierungsmittel ist vorstehend gezeigt.
Das Verfahren der Peptidsynthese erfordert eine Reaktion spezifischer funktioneller Gruppen mit anderen Substituenten, um Aminosäurerückstände auf erwünschte Weise zu verbinden und ein Peptid mit einer angestrebten und bekannten Sequenz zu bilden. Da die Aminosäuren mindestens zwei reaktive Substituenten aufweisen, nämlich die Amin- und Carbonsäureanteile, ist ein entsprechender Schutz bzw. eine Blockierung dieser Funktionalitäten erforderlich, um sicherzustellen, daß die Reaktion nur an den erwünschten Stellen stattfindet.
Diese Schutzgruppen sollten wirksam in die Komponente eingebracht werden. Ihre Entfernung sollte dagegen unter Bedingungen erfolgen, die keine anderen Teile des Moleküls beeinträchtigen. Auf diese Weise können bestimmte Reaktionen und Modifizierungen an der Aminosäure, dem Peptid oder einer anderen Verbindung vorgenommen werden in der Gewißheit, daß die geschützte Funktionalität die erwünschte Reaktion nicht stört. Indem man darüber hinaus eine Schutzgruppe wählt, die für bestimmte Reaktionsbedingungen sensibel und labil ist, läßt sich ein Reaktionsschema skizzieren, das diese Eigenschaften zum Vorteil einsetzt und die Schutzgruppe nach Abschluß der Synthese effektiv entfernt.
Zahlreiche auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannte und anhand ihrer hier verwendeten Abkürzungen zu identifizierende Schutzgruppen sind bei T. Greene "Protective Groups in Qrganic Synthesis", Academic Press (1981) aufgeführt. Zu den bevorzugten Schutzgruppen, die zum entsprechenden Schutz reaktiver nudeophiler Substituenten von R¹ verwendet werden können, sind Benzyl, Carbobenzyloxy oder Xanthenyl und für R² tert- Butoxycarbonyl oder Carbobenzyloxy.
Eine Kopplung von ortho-Phenylendiamin mit Aminosäuren wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I kann durch auf dem Gebiet der Peptidchemie eingeführte Techniken erfolgen. In E. Gross' und J. Meinhofers "The 4 Peptides: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide and Amino Acid Analysis", John Wiley & Sons (1981) und M. Bodanszkys "Principles of Peptide Syfithesis", Springer Verlag (1984), sind zahlreiche geeignete Reaktionen beschrieben. Die Peptidkopplungsmittel, die zur Unterstützung der Kondensation von Amino- und Carbonsäurekomponenten verwendet werden können, umfassen unter anderem N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Carbonyldumidazol (CDI), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), Ethylchlorformiat u.ä. In einer bevorzugten Technik wird DCC als Kopplungsreagenz verwendet. Das DCC-Verfahren kann mit oder ohne katalytische Additive wie 4- Dimethylaminopyridin (DMAP), Kupfer(II)-chlorid oder HOBt eingesetzt werden, um die Reaktion zu beschleunigen und die Racemisierung der erwünschten Verbindung zu unterdrücken.
Die DCC-Reaktion wird oft bei Raumtemperatur durchgeführt, kann jedoch auch bei Temperaturen zwischen etwa -78ºC und leichtem Rückfluß in verschiedenen den Reaktanten gegenüber inerten Lösungsmitteln ablaufen. Die Lösungsmittel sind normalerweise organisch, polar und aprotisch. Bevorzugte Lösungsmittel sind unter anderem Dichlormethan, Chloroform, Diethylether, Tetrahydrofuran (THF) und N,N'-Dimethylformamid (DMF) Besonders bevorzugte Lösungsmittel sind Dichlormethan und DMF. Im allgemeinen können die Kopplungsreaktionen bei atmosphärischem Druck und einer Temperatur von -78ºC bis zum Rückfluß über einen Zeitraum von 1 bis 48 Stunden durchgeführt werden. Vorzugsweise läuft die Reaktion bei -10 bis 25ºC unter Rühren oder Schütteln über einen Zeitraum von 4 bis 6 Stunden ab.
Verbindungen der allgemeinen Formel II werden typischerweise unter wasserfreien Bedingungen hergestellt. Dabei setzt man Verbindungen der allgemeinen Formel I in einem inerten Lösungsmittel mit einer Mischung von Phosphorpentasulfid und wasserfreiem Natriumcarbonat um. Die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise etwa 0ºC, kann jedoch auch zwischen -78ºC und leichtem Rückfluß schwanken. Das Lösungsmittel ist vorzugsweise wasserfreies THF. Andere geeignete Lösungsmittel sind Dichlormethan, Diethylether und DMF.
Verbindungen der allgemeinen Formel III können dadurch hergestellt werden, daß man Verbindungen der allgemeinen Formel II in einem inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von -78ºC bis zum leichten Rückfluß, vorzugsweise bei Raumtemperatur mit Carbonylditriazol oder Phosgen in Kontakt bringt. Das Lösungsmittel kann aus Dichlormethan, Diethylether, DMF und THF ausgewählt werden, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
In jedem der vorstehend beschriebenen Syntheseverfahren können die erwünschten Produkte durch Kristallisation aus der Reaktionsmischung isoliert werden. Alternativ können auch chromatographische Techniken wie z.B. Normalphase-, Reverse-Phase-, Ionenaustausch-, Affinitäts- oder Gelpermeationschromatographie sowie Elektrophorese, Extraktion oder andere Verfahren verwendet werden.

Thiopeptide

Eine neuartige Klasse von Thiopeptiden, die durch die Erfindung hergestellt werden können, wird durch folgende Formel dargestellt,
in der X S oder O ist (wobei mindestens ein X s ist), R¹, R³, R&sup4; die gleiche Definition haben wie oben und n 1 bis 4 ist. Bevorzugte Thiopeptidklassen werden durch die Peptide mit folgender Sequenz dargestellt,
wobei X, R¹, R³ und R&sup4; die gleiche Definition haben wie oben.
Für Verbindungen der Formel V können die Peptide vier, drei oder zwei Thiocarbonylkomponenten haben. Bevorzugt ist jedoch ein Thiocarbonyl vorhanden, wobei die übrigen durch X dargestellten Werte Sauerstoff sind. Ein besonders bevorzugtes Thiopeptid der Formel V, das verbesserte Stabilität und eine erhöhte pharmakologische Aktivität bietet, wird durch die Formel VII ausgedrückt:
Ähnlich sind für Tetrapeptide der Formel VI besonders bevorzugte Ausführungsformen solche, in denen nur ein X ein Schwefelatom darstellt und die übrigen zwei Werte für X jeweils ein Sauerstoffatom bedeuten. Eine besonders bevorzugte Serie von Thiopeptiden der Formel VI mit verbesserter Beständigkeit gegenüber einer Zersetzung durch Enzyme und verbesserter biologischer Aktivität wird durch die Formel VIII dargestellt:
Die Inkorporierung von Thioamidbindungen an Stellen auf der Peptidhauptkette, die anfällig für eine Zersetzung sind, kann erfolgen, um die Beständigkeit des Peptids gegen enzymatisches Abdauen zu verbessern. Diese erhöhte Stabilität kann den Peptiden eine verlängerte Existenz mit größerer biologischer Wirkung verleihen. Beispielsweise kann Thymopentin, das lediglich ein biologisch aktives Fragment des Polypeptids Thymopoietin ist, so modifiziert werden, daß es diese Antwort gibt. Ein solches Thymopentinderivat, 4-Thiothymopentin, das durch die Formel VII dargestellt wird, hat eine Steigerung seiner biologischen Aktivität um etwa das Dreifache gezeigt. Einer Kontrollgruppe von nackten athymischen Mäusen verabreichte man nach allgemein bekannten Versuchstechniken 20 Mikrogramm Thymopentin pro Tier (siehe z.B. O. Archer, T. Pierce, B. Papermanter und R. Good "Reduced Antibody Response in Thymectomised Rabbits", Nature, 195, 191 (1962); D. Osoba und J. Miller "Evidence for a Humeral Thymus Factor Responsible for the Maturation of Immunological Faculty", Nature, 199, 653 (1963); G.E. Ranges et al., "T-Cell Development in Normal and Thymopentin-treated Nude Mice", J. Exp. Med., 156, 1057 (1982)). Die Ergebnisse dieses Tests zeigten eine durchschnittliche Zunahme von 43 % für die Reifung von T-Zellen und verwandte Immunantworten. Wenn die Mäuse der Testgruppe jedoch die gleiche Dosis unter den gleichen Testbedingungen erhielten, war eine durchschnittliche Zunahme von 128 % für die T-Zellenreifung festzustellen. Somit bestätigt der erhöhte Potenzeffekt, daß die Einleitung eines Schwefelatoms als Ersatz des Carbonylsauerstoffatoms einer Amidbindung die Geschwindigkeit der enzymatischen Zersetzung verringern, die Affinität für relevante Rezeptoren verbessern oder beide Phänomene unterstützen kann.
Andere Peptide, die modifiziert werden können, damit nach der erfindungsgemäßen Thioacylierungstechnik Thioamidbindungen in die Peptidhauptkette eingebracht werden können, sind unter anderem Vasopressin (9 Aminosäurerückstände), Somatostatin (14 Aminosäurerückstände), α-Melanotropin (13 Aminosäurerückstände), Leutienizing Hormone Releasing Hormone (LHRH, 10 Aminosäurerückstände), Adrenocorticotropin (ACTH, 39 Aminosäurerückstände), β-Endorphin (31 Aminosäurerückstände) und Atrial Natriuretic Factor (ANF, 33 Aminosäurerückstände).
Für die jeweilige Stelle spezifische und einfache Bedingungen, die die effiziente Einführung einer Thioamidbindung in die Hauptkette einer wachsenden Peptidkette in großer Menge unterstützen, können durch die Verwendung von 1-Thioacyl-2-benzimidazolonen als erfindungsgemäße Thioacylierungsreagenzien geschaffen werden. Die resultierenden Thiopeptide zeigen eine erhöhte Stabilität und eine größere pharmakologische Potenz, erhalten jedoch gleichzeitig die optische Integrität der ihre Bestandteile ausmachenden Aminosäurerückstände.
Die erfindungsgemäßen Thioacylierungsmittel ermöglichen die Bildung von Thioamidbindungen in wachsenden Peptidketten, und zwar in wesentlich größerer Menge als bei den Thioamideinleitungen, über die bisher berichtet wurde. Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben Thiopeptide, die in bezug auf ihre Beständigkeit gegen eine enzymatische Zersetzung eine bisher unbekannte Stabilität aufweisen. Außerdem weisen die erfindungsgemäßen Thiopeptide gegenüber den Peptidanalogen, die durch eine Amidbindung zwischen Rückständen verknüpft sind, eine wesentliche Steigerung der pharmakologischen Wirkung auf.
Erfindungsgemäß kann eine Thioamidkomponente an einer spezifischen Stelle in der Peptidsequenz in ein wachsendes Peptid eingebracht werden, indem man ein erfindungsgemäßes Thioacylierungsmittel mit einer Aminosäure oder einem Peptid zur Umsetzung bringt. Die endständige Aminogruppe des Peptids muß an der endständigen Aminofunktionalität geschützt sein. Vorteilhafterweise erfolgt die Reaktion in einem geeigneten, den Reaktanten gegenüber inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines geeigneten Peptidkopplungsmittels. Bevorzugte Lösungsmittel sind unter anderem Dichlormethan, Chloroform, Diethylether, THF, DMF u.ä. Besonders bevorzugte Lösungsmittel sind Dichlormethan und DMF. Die bevorzugten Reaktionsbedingungen liegen zwischen -78ºC und leichtem Rückfluß; die Reaktionszeit beträgt zwischen 1 und 48 Stunden. Besonders bevorzugte Reaktionsbedingungen sind 4 bis 6 Stunden Rühren bei -10 bis 25ºC.
Bis die Thioamidbindung eingeführt werden soll, kann das Peptid unter jeder geeigneten Peptidkopplungsbedingung synthetisiert werden. Alternativ kann die Thioamidbindung auch zuerst eingebracht und dann das auf diese Weise gebildete Peptid unter Einsatz allgemein anerkannter Peptidkopplungstechniken vergrößert werden.
Wenn die Inkorporierung der Thioamidbindung abgeschlossen und das Thiopeptid hergestellt worden ist, kann die auf diese Weise gebildete Verbindung nach allgemein bekannten Techniken wie z.B. Behandlung mit flüssigem Fluorwasserstoff (HF) vollständig von den Schutzgruppen befreit werden. Wo jedoch das so erzeugte Peptid oder Thiopeptid die selektive Entfernung der Schutzgruppen erfordert, üblicherweise an einem Aminoende, müssen geeignete Reaktionsbedingungen verwendet werden.
Die mit tert-Butoxycarbonyl (Boc) geschützte Aminofunktionalität von Aminosäurederivaten und endständigen Ammen von Peptiden kann beispielsweise durch Behandlung mit kalter Trifluoressigsäure (TFA) bei 0ºC unter geeigneten atmosphärischen Bedingungen durchgeführt werden, z.B. unter Einstellung des pH auf etwa 8 bis 9. Das TFA-Salz des Aminosäurederivats oder geschützten Peptids kann in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gemischt und leichten wäßrigen basischen Bedingungen ausgesetzt werden. Die organische Lösung, die dieses Aminosäurederivat oder das geschützte Peptid mit der freien Aminofunktionalität enthält, kann dann getrocknet und konzentriert werden, um das freie Aminoderivat zu ergeben.
Im Fall von mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützten Aminosäuren sind Thiopeptide oder Merrifield- Harzderivate vorhanden. Die entsprechende freie Aminogruppe kann selektiv durch Behandlung mit Piperidin in DMF unter geeigneten atmosphärischen und thermischen Bedingungen erzeugt werden.
Ein alternativer Syntheseansatz für die Einführung von Thioamidbindungen kann über die Merrifield-Festphasenmethode und ihre bekannten Varianten umgesetzt werden. So wird ein Merrifield-Harz durch allgemein bekannte Festphasenpeptidsynthese-Verfahren hergestellt. Ein kovalent gebundener α-Aminosäurerückstand, der an seiner Carboxylfunktion befestigt ist, oder auch ein Peptid mit einer freien endständigen Aminofunktionalität wird durch dieses Harz geträgert. Die Behandlung des Harzes mit dem Thioacylierungsreagenz unter Standardbedingungen für die Festphasenpeptidsynthese ergibt das erwünschte Produkt.
In Fällen, wo dieses Verfahren die Thioamidbindung als letzten Schritt der Thiopeptidbildung einbringt, kann das Thiopeptid mit allgemein anerkannten Verfahren aus dem Harz freigesetzt werden. Durch Verwendung von flüssigem HF, der Dialkylsulfid enthält, mit Anisol und Thioanisol unter geeigneten Bedingungen bei einer Temperatur von -78ºC bis 0ºC kann das Thiopeptid von allen individuellen Schutzgruppen der ihre Bestandteile bildenden Aminosäurerückstände befreit werden.
Die Menge der Reaktanten, die in der vorstehenden Reaktion verwendet werden, kann in einem weiten Bereich schwanken. Das gleiche gilt für die Reaktionsbedingungen, die die Reaktion erleichtern und ihren effizienten Abschluß fördern sollen. Jedoch sind die Mengen, die zur Auslösung einer Reaktion in den vorstehend erörterten Verfahren verwendet werden, im allgemeinen stöchiometrisch, wenn nichts anderes angegeben ist. In den folgenden Beispielen wurden die Reaktionskonzentrationen im allgemeinen bei 0,1 M zu den Reaktanten gehalten, wenn nicht eine höhere Konzentration oder Verdünnung besonders dazu geeignet war, die Richtung einer spezifischen Reaktion zu beeinflussen. In der Praxis verändern sich die Mengen je nach wechselnden Reaktionsbedingungen und der Beschaffenheit der Reaktanten.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Synthese von 1-(α-N-Boc-L-seryl-O-benzylthioacyl)-2- benzimidazolon

a) Herstellung von α-N-Boc-L-seryl-O-benzyl-orthoaminoanilid

N-Boc-L-serin-O-benzylether (8,02 mMol) und ortho- Phenylendiamin (11,6 mMol) wurden bei 0ºC gründlich in Dichlormethan (21 ml) aufgelöst und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (8,27 inmol) versetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde bei konstanter Eistemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde in einen Trenntrichter umgefüllt und nacheinander mit gesättigter Salzlösung/5%iger wäßriger Citronensäure, gesättigter Salzlösung/5%igem wäßrigem Natriumcarbonat und Salzlösung allein gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend getrocknet, konzentriert und der Rückstand durch Flash-Chromatographie auf Kieselsäuregel unter Verwendung eines Hexan-Ethylacetat-Lösungsmittels im Verhältnis von 3 : 1 als Elutionsmittel gereinigt. Dabei erhielt man das α-N-Boc-L-seryl-O-benzyl-orthoaminoanilid als Feststoff in hoher Ausbeute (97 %) Dieser wurde dann mit einer Dichlormethan-Pentan- Mischung auf analytische Reinheit umkristallisiert. Bei der Verbindung waren folgende physikalische Eigenschaften zu beobachten:
Schmelzpunkt 60 bis 63ºC, [α]D²&sup0; (CHCl&sub3;) -0,9; UV (CH&sub3;CN) lambdamax 293
Elementarzusammensetzung (C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub7;N&sub3;O&sub4;) :
Theoretisch: C 65,43, H 7,06, N 10,89
Gefunden: C 65,82, H 7,42, N 10,60
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens und der entsprechenden Ausgangsmaterialien wurden folgende weitere ortho-Aminoanilide synthetisiert:
a1 α-N-Boc-L-alanyl-ortho-amino anilid
a2 α-N-Boc-L-arginyl-di-N-Cbz-ortho-aminoanilid
a3 α-N-Boc-L-arginyl-N-tosyl-ortho-aminoanilid
a4 α-N-Boc-L-asparaginyl-N-xanthenyl-ortho-aminoanilid
a5 α-N-Boc-L-aspartyl-β-benzylester-ortho-aminoanilid
a6 a-N-Fmoc-L-aspartyl-β-tert-butylester-orthoaminoanilid
a7 α-N-Boc-L-cysteinyl-S-benzylether-ortho-aminoanilid
a8 α-N-Boc-L-glutamyl-γ-benzylester-ortho-aminoanilid
a9 α-N-Boc-L-glutaminyl-N-xanthenyl-ortho-aminoanilid
a10 α-N-Boc-glycyl-ortho-aminoanilid
a11 α-N-Boc-L-histidyl-N-benzyl-ortho-aminoanilid
a12 α-N-Boc-L-histidyl-N-tosyl-ortho-aminoanilid
a13 α-N-Boc-L-isoleucyl-ortho-aminoanilid
a14 α-N-Boc-L-leucyl-ortho-aminoanilid
a15 α-N-Boc-a-N-2ClZ-L-lysyl-ortho-aminoanilid
a16 α-N-Boc-L-methionyl-ortho-aminoanilid
a17 α-N-Boc-L-phenylalanyl-ortho-aminoanilid
a18 α-N-Boc-L-prolyl-ortho-aminoanilid
a19 α-N-Boc-L-threonyl-O-benzylether-ortho-aminoanilid
a20 α-N-Boc-L-tryptophyl-ortho-aminoanilid
a21 α-N-Boc-L-tyrosinyl-O-2,6-dichlorbenzylether-orthoaminoanilid
a²² α-N-Boc-L-valyl-ortho-aminoanilid
Die Eigenschaften dieser Verbindungen sind in Tabelle A charakterisiert.

b) Synthese von α-N-Boc-L-seryl-O-benzyl-ortho-aminothioanilid

Zu frisch destilliertem Tetrahydrofuran (THF) (67 ml) gab man Phosphorpentasulfid (6,26 inmol) und wasserfreies Natriumcarbonat (6,26 mMol). Diese Mischung rührte man 0,3 Stunden bei 20ºC. Anschließend wurde sie auf 0ºC gekühlt und dann mit dem N-Boc-L-seryl-O- benzyl-ortho-aminoanilid (von Schritt a) (0,71 mMol) versetzt. Nachdem man die Mischung 5 bis 6 Stunden bei 0ºC stehengelassen hatte, gab man langsam erst 10%iges wäßriges Natriumphosphat (tribasisch, 22 ml) und dann Ethylacetat (20 ml) und Hexan (10 ml) zu. Die organische Phase wurde getrennt, mit Salzlösung gewaschen und zu einem Öl konzentriert, das durch Flash- Chromatographie auf Kieselsäuregel unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung aus Hexan, Ethylacetat und Methylenchlorid im Verhältnis 6 : 1 : 2 als Elutionsmittel. Dabei erhielt man N-Boc-L-seryl-O-benzyl-orthoaminothioanilid als kristallinen Feststoff in mäßiger Ausbeute (50 %). Bei der Verbindung waren folgende physikalische Eigenschaften zu beobachten:
Schmelzpunkt 40 bis 43ºC, [α]D²&sup0; (CHCl&sub3;) -26,5; UV (CH&sub3;CN) lambdamax 271
Elementarzusammensetzung (C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub7;N&sub3;O&sub4;)
Theoretisch: C 62,82, H 6,80, N 10,48, S 7,98
Gefunden: C 63,06, H 7,06, N 10,42, S 8,23
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens und der entsprechenden Ausgangsmaterialien wurden folgende weitere ortho-Aminothioanilide synthetisiert:
b1 α-N-Boc-L-alanyl-ortho-aminothioanilid
b2 α-N-Boc-L-arginyl-di-N-Cbz-ortho-aminothioanilid
b3 α-N-Boc-L-arginyl-N-tosyl-ortho-aminothioanilid
b4 α-N-Boc-L-asparaginyl-N-xanthenyl-orthoaminothioanilid
b5 α-N-Boc-L-aspartyl-β-benzylester-orthoaminothioanilid
b6 α-N-Fmoc-L-aspartyl-β-tert-butylester-orthoaminothioanilid
b7 α-N-Boc-L-cysteinyl-S-benzylether-orthoaminothioani lid
b8 α-N-Boc-L-glutamyl-γ-benzylester-orthoaminothioanilid
b9 α-N-Boc-L-glutaminyl-N-xanthenyl-orthoaminothioanilid
b10 α-N-Boc-glycyl-ortho-aminothioanilid
b11 α-N-Boc-L-histidyl-N-benzyl-ortho-aminothioanilid
b12 α-N-Boc-L-histidyl-N-tosyl-ortho-aminothioanilid
b13 α-N-Boc-L-isoleucyl-ortho-aminothioanilid
b14 α-N-Boc-L-leucyl-ortho-aminothioanilid
b15 α-N-Boc-&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-ortho-aminothioanilid
b16 α-N-Boc-L-methionyl-ortho-aminothioanilid
b17 α-N-Boc-L-phenylalanyl-ortho-aminothioanilid
b18 α-N-Boc-L-prolyl-ortho-aminothioanilid
b19 α-N-Boc-L-threonyl-O-benzylether-ortho-aminothioanilid
b20 α-N-Boc-L-tryptophyl-ortho-aminothioanilid
b21 α-N-Boc-L-tyrosinyl-O-2,6-dichlorbenzylether-orthoaminothioanilid
b22 α-N-Boc-L-valyl-ortho-aminothioanilid
Die physikalischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind in Tabelle B aufgeführt.

(c) Synthese von 1-(α-N-Boc-L-seryl-O-benzylthioacyl)- 2-benzimidazalon

Das α-N-Boc-L-seryl-O-benzyl-ortho-aminothioanilid (von Schritt b) (3,11 inmol) und Carbonylditriazol (4,36 mmol) wurden in THF (45 ml) aufgelöst. Nach 6,5 Stunden Rühren bei 25ºC wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der verbleibende Rückstand wurde in Dichlormethan (2 ml) aufgelöst und durch Flash-Chromatographie gereinigt. Das Produkt wurde mit Hexan-Ethylacetat im Verhältnis 4 : 1 eluiert und ergab reines 1-(N-Boc-L- seryl-O-benzyl-2-thioacyl)-2-benzimidazolon in hoher Ausbeute (91 %) Die Verbindung wurde durch Protonen-NMR charakterisiert. Dabei wurden folgende physikalische Eigenschaften festgestellt:
Schmelzpunkt 119 bis 122ºC, [α]D²&sup0; (CHCl&sub3;) -25,5; UV (CH&sub3;CN) lambdamax 265
Elementarzusammensetzung (C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub4;S)
Theoretisch: C 61,81, H 5,90, N 9,82, S 7,50
Gefunden: C 62,00, H 6,01, N 10,18, S 7,30
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens und der entsprechenden Ausgangsmaterialien wurden folgende weitere 1-(α-Aminosäurethioacyl)-2-benzimidazolonderivate synthetisiert:
c1 1-(α-N-Boc-L-alanylthioacyl)-2-benzimidazolon
c2 1-(α-N-Boc-L-arginyl-di-N-Cbz-thioacyl)-2- benzimidazolon
c3 1-(α-N-Boc-L-arginyl-N-tosylthioacyl)-2-benzimidazolon
c4 1-(α-N-Boc-L-asparaginyl-N-xanthenylthioacyl)-2- benzimidazolon
c5 1-(α-N-Boc-L-aspartylbenzylesterthioacyl)-2- benzimidazolon
c6 1-(α-N-Fmoc-L-aspartyl-tert-butylesterthioacyl)-2- benzimidazolon
c7 1-(α-N-Boc-L-cysteinyl-S-benzyletherthioacyl)-2- benzimidazolon
c8 1-(c(-N-Boc-L-glutamyl-γ-benzylesterthioacyl)-2- benzimidazolon
c9 1-(α-N-Boc-L-glutaminyl-N-xanthenylthioacyl)-2- benzimidazolon
c10 1-(α-N-Boc-glycylthioacyl)-2-benzimidazolon
c11 1-(α-N-Boc-L-histidyl-N-benzylthioacyl)-2- benzimidazolon
c12 1-(α-N-Boc-L-histidyl-N-tosylthioacyl)-2- benzimidazolon
c13 1-(α-N-Boc-L-isoleucylthioacyl)-2-benzimidazolon
c14 1-(α-N-Boc-L-leucylthioacyl)-2-benzimidazolon
c15 1-(α-N-Boc-L-lysyl-&epsi;-N-2ClZ-thioacyl)-2- benzimidazolon
c16 1-(α-N-Boc-L-methionylthioacyl)-2-benzimidazolon
c17 1-(α-N-Boc-L-phenylalanylthioacyl)-2-benzimidazolon
c18 1-(α-N-Boc-L-prolylthioacyl)-2-benzimidazolon
c19 1-(α-N-Boc-L-threonyl-O-benzyletherthioacyl)-2- benzimidazolon
c20 1-(α-N-Boc-L-tryptophylthioacyl)-2-benzimidazolon
c21 1-(α-N-Boc-L-tyrosinyl-O-2,6-dichlorbenzyletherthioacyl)-2-benzimidazolon
c22 1-(α-N-Boc-L-valylthioacyl)-2-benzimidazolon
Diese Verbindungen sind in Tabelle C physikalisch charakterisiert.

Beispiel 2

Synthese von 4-Thiothymopentin

a) Lösungssynthese

1) Herstellung von α-N-Boc-L-valyl-L-tyrosyl-O- benzyletherbenzylesterthioamid

α-N-Boc-L-tyrosyl-O-benzylether-benzylester wurde bei 0ºC unter Stickstoff eine halbe Stunde mit Trifluoressigsäure (TFA) behandelt. Die TFA wurde im Vakuum entfernt, so daß L-Tyrosyl-O-Benzyletherbenzylester- TFA-Salz entstand. Dieses Aminosäurederivat wurde in Dichlormethan gemischt und mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat behandlet. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet und konzentriert, um das freie Aminoderivat in quantitativer Ausbeute herzustellen.
L-Tyrosyl-O-benzyletherbenzylester (2 mMol) wurde bei 0ºC unter N&sub2; in wasserfreiem N,N'-Dimethylformamid (DMF) (0,5 ml) aufgelöst. Dann gab man über den Zeitraum von 0,3 Stunde bei 0ºC 1-(α-N-Boc-valyl-thioacyl)- 2-benzimidazolon (2,2 Inmol) aus Beispiel 1 portionsweise zu. Die Mischung wurde bei 0ºC zwei Stunden kontinuierlich gerührt und dann über 15 bis 17 Stunden auf 25ºC erwärmen gelassen. Dann wurde die Reaktion filtriert, im Vakuum konzentriert, der Rückstand erneut in Ethylacetat (15 ml) aufgelöst und die Lösung nacheinander mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser, 5%iger wäßriger Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet. Nach dem Verdampfen wurde der Rückstand zur Reinigung auf eine Flash- Kolonne aufgebracht. Das geschützte Dithiopeptid wurde mit einer Lösungsmittelmischung aus Ethylacetat und Hexan im Verhältnis von 3 : 2 eluiert. Dadurch erhielt man α-N-Boc-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzylthioamid in guter Ausbeute (80 %). Die Verbindung hatte folgende physikalische Eigenschaften: Schmelzpunkt 56 bis 58ºC,
IR (CHCl&sub3;) 2972, 1735, 1500 cm&supmin;¹,
UV (CHCl&sub3;) lambamax 272.

II) Herstellung von α-N-Boc-L-aspartylbenzylester-L- valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-3-thioamid

α-N-Boc-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyl-thioamid (Verbindung aus Schritt (i)) wurde bei 0ºC unter Stickstoff eine halbe Stunde mit TFA behandelt, so daß man nach der Konzentration im Vakuum L-Valyl-L-tyrosyl-O-benzylthioamid TFA-Salz erhielt. Die Verbindung wurde in Dichlormethan gemischt und mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat behandelt. Die organische Phase wurde getrennt, getrocknet und konzentiert, so daß man das freie Aminoderivat in quantitativer Ausbeute erhielt.
L-Valyl-L-tyrosyl-O-benzyl-thioamid (2 inmol) wurden bei 0ºC unter N&sub2; in wasserfreiem DMF (0,5 ml) aufgelöst und die Lösung unter Rühren mit α-N-Boc-L-aspartyl-β- benzylester (2 mMol) versetzt. HOBt (2 mMol) und DCC (2 ramol) wurden bei 0ºC langsam zugesetzt. Dann wurde die Mischung über Nacht gerührt. Die Mischung wurde mit 8 Volumen Ethylacetat verdünnt und der so gebildete N,N'- Dicyclohexylharnstoff aus der Lösung abfiltriert. Das Filtrat wurde in einen Trenntrichter umgefüllt und nacheinander mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, 5%iger wäßriger Citronensäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde gesammelt und über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie auf Kieselsäuregel unter Verwendung von einer Lösungsmittelmischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 1 : 1 als Eluant gereinigt. So erhielt man das α-N-Boc-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O- benzyletherbenzylester-3-thioamid in guter Ausbeute (74 %). Die folgenden physikalischen Eigenschaften wurden für die Verbindung festgestellt:
Schmelzpunkt 112 - 114ºC und UV (CHCl&sub3;) lambdamax 271.

iii) Herstellung von α-N-Boc-&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-Q-benzyletherbenzylester-L-3-thioamid

α-N-Boc-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O- benzyletherbenzylester-2-thioamid (Verbindung aus Schritt (ii)) wurde mit TFA behandelt, um die Boc- Gruppe wie in (ii) zu entfernen. Dadurch erhielt man L- Aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-2-thioamid in quantitativer Ausbeute.
L-Aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-2-thioamid wurde bei 0 ºC unter N&sub2; in trockenem DMF (0,5 ml) aufgelöst und die Lösung unter Rühren mit mit α-N-Boc-s-2ClZ-L-lysin (2 mMol) versetzt. HOBt (2 mMol) und DCC (2 ramol) wurden bei 0ºC langsam zugesetzt. Dann wurde über Nacht weitergerührt. Die Mischung wurde mit 8 Volumen Ethylacetat verdünnt und der so gebildete N,N'-Dicyclohexylharnstoff aus der Lösung abfiltriert. Das Filtrat wurde in einen Trenntrichter umgefüllt und nacheinander mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, 5 %iger wäßriger Citronensäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde gesammelt und über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie auf Kieselsäuregel unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 1 : 1 gereinigt. Dabei erhielt man das α-N-Boc-6-N-2ClZ-L-lysyl-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-3- thioamid in guter Ausbeute (73 %). Die folgenden physikalischen Eigenschaften wurden für die Verbindung festgestellt:
Schmelzpunkt 71 bis 73ºC und UV (CHCl&sub3;) lambdamax 272.

iv) Herstellung von α-N-Boc-N-tosyl-L-arginyl-α-N- 2ClZ-L-lysyl-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L- tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-4-thioamid

α-N-boc-E-N-2ClZ-L-lysyl-L-aspartyl-β-benzylester-L- valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-3-thioamid (Verbindung aus Schritt (iii)) wurde mit TFA behandelt, um die Boc-Gruppe wie in Schritt (ii) zu entfernen, und man erhielt &epsi;-N-2ClZ-L-Lysyl-L-aspartyl-β-benzylester- L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-43thioamid in quantitativer Ausbeute.
α-N-2ClZ-L-Lysyl-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L- tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-3-thioamid (2 mMol) wurde bei 0ºC unter N&sub2; in trockenem DMF (0,5 ml) aufgelöst. Dann gab man unter Rühren α-N-Boc-N-tosyl-L- arginin (2 mMol) zu der Lösung. HOBt (2 mMol) und DCC (2 mMol) wurden bei 0ºC langsam zugesetzt. Dann rührte man über Nacht weiter. Die Mischung wurde mit 8 Volumen Ethylacetat verdünnt und der so gebildete N,N'-Dicyclohexylharnstoff aus der Lösung abfiltriert. Das Filtrat wurde in einen Trenntrichter umgefüllt und nacheinander mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, 5%iger wäßriger Citronensäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde gesammelt und über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Chloroform und Methanol im Verhältnis von 9 : 1 als Elutionsmittel gereinigt. Dadurch erhielt man α-N-Boc-N-tosyl-L-arginyl-α-N-2ClZ-L-lysyl-L-aspartyl- β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzylester-4-thioamid in guter Ausbeute (78 %). Die folgenden physikalischen Eigenschaften wurden für die Verbindung festgesetellt: Schmelzpunkt 105 bis 107ºC,
IR (CHCl&sub3;) 1756, 1490 cm&supmin;¹, UV (CHCl&sub3;) lambdamax 271.
Elementare Zusammensetzung (C&sub7;&sub1;H&sub8;&sub4;Cl&sub3;N&sub9;O&sub1;&sub4;S&sub2;)
Theoretisch: C 58,13, H 5,65, N 8,34, S 4,79
Gefunden: C 58,54, H 5,81, N 8,65, S 4,40

v) Herstellung von 4-Thiothymopentin

α-N-Boc-N-tosyl-L-arginyl-L-lysyl-&epsi;-N-2ClZ-L-aspartyl- β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherbenzyl ester-4-thioamid wurde in flüssigem Fluorwasserstoff mit 10 Vol.-% Anisol, Ethylmethylsulfid und Thioanisol aufgelöst. Nach einer Stunde bei 0ºC wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und das Thiopeptid, dessen Schutzgruppe entfernt worden war, durch Reversphasenchromatographie auf einer Vydac C&sub1;&sub8;-Kolonne unter Verwendung von 12%iger wäßriger Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt. Das Thiopeptid wurde durch Protonen- NMR charakterisiert und besaß folgende physikalische Eigenschaften:
Schmelzpunkt 146 bis 148ºC, UV (CHCl&sub3;) lambdamax 268, M/e 696.
Unter Verwendung der geeigneten Sequenz von Aminosäurekondensationsreaktionen wurden folgende Monothiothymopentinanaloge hergestellt:
d1 L-Arginyl-L-lysyl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-1- thioamid
d2 L-Arginyl-L-lysyl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-2- thioamid
d3 L-Arginyl-L-lysyl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-3-- thioamid
Die physikalischen Charakterisierungen dieser Thiopeptide sind in Tabelle D aufgeführt.

b) Festphasensynthese

1) Herstellung von α-N-L-Boc-L-valyl-L-tyrosyl-O- benzylthioamidharzester

α-N-Boc-L-tyrosyl-O-benzylether, der an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes befestigt war, wurde bei Raumtemperatur eine Stunde mit einer 55%igen Dichlormethanlösung behandelt. Dann wurde das Harz gesammelt, nacheinander viermal mit je 10 ml Dichlormethan und je 10 ml Isopropanol (IPA) gewaschen und dann zur weiteren Verwendung getrocknet.
L-Tyrosyl-O-benzylether, der an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes (0,632 mMol/g Harz) hing, wurde unter Rühren bei 25ºC zu einer Lösung aus 1-(α-N-Bocvalyl-thioacyl)-2-benzimidazolon (0,948 mMol) in trokkenem DMF (7 ml) gegeben. Die Reaktion wurde 16 Stunden gerührt. Dann gab man einen weiteren Anteil Benzimidazolon (0,948 mMol) dazu und rührte noch 18 Stunden weiter. Das Harz wurde gesammelt, viermal mit je 10 ml DMF und viermal mit je 10 ml IPA gewaschen und dann zur Vorbereitung auf weitere Reaktionen getrocknet.

II) Herstellung von α-N-L-Boc-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyl-1-thioamidharzester

α-N-Boc-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyl-etherthioamid, das an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes hing, wurde bei Raumtemperatur eine Stunde mit einer 55%igen Dichlormethanlösung von TFA behandelt. Das Harz wurde dann gesammelt, nacheinander viermal mit je 10 ml Dichlormethan und 10 ml IPA gewaschen und zur weiteten Verwendung getrocknet. L-Valyl-L-tyrosyl-O-benzyletherthioamid, das an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes (0,632 mMol/g Harz) hing, wurde unter Rühren bei 25ºC zu einer Lösung von α-N-Boc-L-aspartyl-β-benzylester (0,632 mMol) in DMF (7 ml) gegeben. Dann gab man unter Rühren langsam HOBt (0,632 mMol) und DCC (0,632 mMol) zu. Man ließ die Reaktion 1 bis 2 Stunden ablaufen, sammelte dann das Harz, wusch es viermal mit je 10 ml DMF und 10 ml IPA und trocknete es zur weiteren Reaktion.

iii) Herstellung von α-N-Boc-&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-L- aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyl- 3-thioamidharzester

α-N-Boc-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O- benzyl-ether-2-thioamid, das an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes hing, wurde bei Raumtemperatur eine Stunde mit einer 55%igen Dichlormethanlösung von TFA behandelt. Das Harz wurde dann gesammelt, nacheinander viermal mit je 10 ml Dichlormethan und 10 ml IPA gewaschen und zur weiteten Verwendung getrocknet.
L-Aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzylether-2-thioamid, das an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes (0,632 mMol/g Harz) hing, wurde unter Rühren bei 25ºC zu einer Lösung von α-N-Boc-N-&epsi;-2ClZ-L- lysin (0,632 mMol) in DMF (7 ml) gegeben, und man ließ die Reaktion 1 bis 2 Stunden ablaufen. Dann sammelte man das Harz, wusch es viermal mit je 10 ml DMF und 10 ml IPA und trocknete es zur weiteren Reaktion.

iv) Herstellung von α-N-Boc-N-tosyl-L-arginyl-L-Lysyl- &epsi;-N-2ClZ-L-aspartyl-β-benzylester-L-valyl-L- tyrosyl-O-benzyl-4-thioamidharzester

α-N-Boc-&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-L-aspartyl-β-benzylester-Lvalyl-L-tyrosyl-O-benzyl-ether-3-thioamid, das an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes hing, wurde bei Raumtemperatur eine Stunde mit einer 55%igen Dichlormethanlösung von TFA behandelt. Das Harz wurde dann gesammelt, nacheinander viermal mit je 10 ml Dichlormethan und 10 ml IPA gewaschen und zur weiteren Verwendung getrocknet.
α-N-2ClZ-L-Lysyl-L-aspartyl-β-benzylester-L-Valyl-L- tyrosyl-O-benzylether-3-thioamid, das an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield-Harzes (0,632 mMol/g Harz) hing, wurde unter Rühren bei 25ºC zu einer Lösung von α-N-Boc-N-tosyl-L-arginin (0,632 mMol) in DMF (7 ml) gegeben. Man gab HOBt (0,632 mMol) und DCC (0,632 mMol) langsam unter Rühren zu und ließ die Reaktion 1 bis 2 Stunden ablaufen. Dann sammelte man dann das Harz, wusch es viermal mit je 10 ml IPA und trocknete es zur endgültigen Entfernung der Schutzgruppe.

v) Herstellung von 1-Thiothymopentin durch Entfernung aus dem Harz

α-N-Boc-N-tosyl-L-arginyl-&epsi;-2ClZ-L-lysyl-L-aspartyl-β- benzylester-L-valyl-L-tyrosyl-O-benzyl-ether-4-thioamid, das an einer Benzyloxygruppe eines Merrifield- Harzes hing, wurde bei 0ºC eine Stunde mit flüssigem Fluorwasserstoff (5 ml) mit Anisol; Dimethylsulfid und Thioanisol (0,5 ml, 1 : 1 : 1 v/v) behandelt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in 10%iger wäßriger Essigsäure aufgelöst. Die wäßrige Lösung wurde mit Diethylether (30 ml) gewaschen, mit Wasser eluiert und bis zur Trockenheit lyophilisiert. Das rohe Thiopeptid wurde in 92%iger wäßriger Essigsäure (25 ml) aufgelöst und durch Reversphasenchromatographie unter Verwendung einer gepackten C&sub1;&sub8;-Kolonne und dem gleichen Essigsäurelösungsmittel als Elutionsmittel gereinigt.

Beispiel 3

Herstellung von 3-Thiotuftsin

a) Lösungssynthese

i) Synthese von α-N-Boc-L-prolyl-N-tosyl-L-arginylbenzylesterthioamid

α-N-Boc-N-tosyl-L-arginyl-benzylester wurde 0,5 Stunden bei 0 ºC unter Stickstoff mit TFA behandelt. Das TFA wurde im Vakuum entfernt, so daß N-Tosyl-L-arginylbenzylester-TFA-Salz entstand. Dieses Aminosäurederivat wurde in Dichlormethan gemischt und mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat behandelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet und konzentriert, um das freie Aminoderivat in quantitativer Ausbeute zu ergeben.
N-Tosyl-L-arginyl-benzylester (2 mMol) wurde bei 0ºC unter N&sub2; in wasserfreiem DMF (0,5 ml) aufgelöst und bei 0ºC unter Rühren über den Zeitraum von 0,3 Stunden portionsweise mit 1-(α-N-Boc-L-thioprolyl)-2-benzimidazolon (2,2 inmol) (aus Beispiel 1) versetzt. Die Mischung wurde bei 0ºC kontinuierlich 2 Stunden gerührt und über 15 bis 17 Stunden auf 25ºC erwärmt. Dann wurde die Reaktion filtriert, im Vakuum konzentriert, der Rückstand in Ethylacetat (15 ml) aufgelöst und die Lösung nacheinander mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, Wasser, 5%iger Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet, verdampft und der Rückstand zur Reinigung auf eine Flash-Kolonne aufgebracht. Das geschützte Thiodipeptid wurde mit einer Lösungsmittelmischung aus Ethylacetat und Hexan im Verhältnis 3 : 2 eluiert, um α-N-Boc-L-thioprolyl-N-tosyl- L-arginyl-benzylester in hoher Ausbeute zu ergeben.
Die so gewonnene Verbindung hatte folgende physikalische Eigenschaften:
Schmelzpunkt 64 bis 66ºC und UV (CHCl&sub3;) lambdamax 270.

ii) Synthese von α-N-Boc-&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-L-prolyl-N- tosyl-L-arginyl-benzylester-2-thioamid

α-N-Boc-L-thioprolyl-N-tosyl-L-arginyl-benzylester wurde bei 0ºC unter Stickstoff eine halbe Stunde mit TFA behandelt. Das TFA wurde im Vakuum entfernt und ergab L-Thioprolyl-N-tosyl-L-arginyl-benzylester-TFA-Salz. Dieses Thiodipeptid wurde in Dichlormethan vermischt und mit wäßrigem Natriumbicarbonat behandelt. Die organische Phase wurde getrennt, getrocknet und konzentriert, um das freie Aminoderivat in quantitativer Ausbeute zu ergeben.
L-Thioprolyl-N-tosyl-l-arginyl-benzylester (2 mMol) wurde unter N&sub2; bei 0ºC in wasserfreiem DMF (0,5 ml) aufgelöst und mit α-N-boc-&epsi;-N-2ClZ-lysin (2 mMol) versetzt. HOBt (2 mMol) und DCC (2 mMol) wurden bei 0ºC unter Rühren langsam zugesetzt. Dann ließ man die Reaktion über Nacht ablaufen. Die Reaktion wurde mit 8 Volumen Ethylacetat verdünnt und der so gebildete N,N'- Dicyclohexylharnstoff aus der Mischung abfiltriert. Das Filtrat wurde in einen Trenntrichter umgefüllt und nacheinander mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, 5%iger wäßriger Citronensäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde gesammelt und über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash- Chromatographie auf Kieselsäuregel unter Verwendung von Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 1 : 1 als Elutionsmittel gereinigt. So erhielt man das α-N-Boc-&epsi;-N-2ClZ- L-lysyl-L-prolyl-N-tosyl-L-arginyl-benzylester-2- thioamid in hoher Ausbeute.
Die folgenden physikalischen Eigenschaften wurden für die gereinigte Verbindung festgestellt:
Schmelzpunkt 77 bis 80ºC, IR (CHCl&sub3;) 1758, 1380 cm&supmin;¹; UV (CHCl&sub3;) lambdamax 271.
Elementare Zusammensetzung (C&sub5;&sub5;H&sub7;&sub1;ClN&sub8;O&sub1;&sub1;S&sub2;)
Theorie: C 60,75, H 7,10, N 9,29
Gefunden: C 60,34, H 7,07, N 9,65

III) Synthese von α-N-Boc-L-threonyl-O-benzylether-α-N- 2ClZ-L-lysyl-L-propyl-N-tosyl-L-arginyl-benzylester-3-thioamid

α-N-Boc-α-N-2ClZ-lysyl-L-prolyl-N-tosyl-L-arginylbenzylester-2-thioamid wurde bei 0ºC unter Stickstoff eine halbe Stunde mit TFA behandelt. Das TFA wurde im Vakuum entfernt und ergab α-N-2ClZ-L-lysyl-L-prolyl-N- tosyl-L-arginyl-benzylester-2-thioamid-TFA-Salz. Dieses Aminosäurederivat wurde in Dichlormethan vermischt und mit wäßrigem Natriumbicarbonat behandelt. Die organische Phase wurde getrennt, getrocknet und konzentriert, um das freie Aminoderivat in quantitativer Ausbeute zu ergeben.
&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-L-prolyl-N-tosyl-l-arginyl-benzylester-2-thioamid(2 mMol) wurde unter N&sub2; bei 0ºC in wasserfreiem DMF (0,5 ml) aufgelöst und mit α-N-bocthreonin-O-benzylether (2 mMol) versetzt. HOBt (2 inmol) und DCC (2 mMol) wurden bei 0ºC unter Rühren langsam zugesetzt. Dann ließ man die Reaktion über Nacht ablaufen. Die Reaktion wurde mit 8 Volumen Ethylacetat verdünnt und der so gebildete N,N'-Dicyclohexylharnstoff aus der Lösung abfiltriert. Das Filtrat wurde in einen Trenntrichter umgefüllt und nacheinander mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, 5%iger wäßriger Citronensäure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde gesammelt und über MgSO&sub4; getrocknet, futriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie auf Kieselsäuregel unter Verwendung einer Lösungsmittelmischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 1 : 1 als Elutionsmittel gereinigt. So erhielt man das α-N-Boc-L-threonyl-O- benzylether-&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-L-prolyl-N-tosyl-L- arginyl-benzylester-3-thioamid in hoher Ausbeute.

iv) Herstellung von 3-Thiotuftsin

α-N-Boc-L-threonyl-O-benzylether-&epsi;-N-2ClZ-L-lysyl-L- prolyl-N-tosyl-L-arginylbenzylester-l-thioamid wurde in flüssigem Fluorwasserstoff mit 10 Vol.-% Anisol, Ethylmethylsulfid und Thioanisol aufgelöst. Nach einer Stunde bei 0ºC wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Thiopeptid, dessen Schutzgruppe entfernt worden war, durch flüssige Reversphasenchromatographie auf einer Vydac C&sub1;&sub8;-Kolonne mit 12%iger wäßriger Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt.
Das Thiopeptid wies folgende physikalische Charakteristika auf:
Schmelzpunkt 169 - 171ºC und UV (50%iges wäßriges Ethanol) lambdamax 268.
Die folgenden Monothiotuftsinanaloge wurden unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien und der korrekten Sequenz von Aminosäurekopplungsreaktionen hergestellt:
e1 L-Threonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginin-2-thioamid
e2 L-Threonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-arginin-1-thioamid
Die physikalischen Charakterisierungen für diese Thiopeptide sind in Tabelle E aufgeführt.

Beispiel 4

Bewertung von Thymopentin und 4-Thiothymopentin auf die T-Zellenentwicklung nackter athymischer Mäuse

Dieser Versuch wurde nach dem von Lau und Goldstein entwickelten Protokoll durchgeführt (siehe C. Lau und G. Goldstein "Functional Effects of Thymopoietin&sub3;&sub2;&submin;&sub3;&sub6; (TP5) on Cytotoxic Lymphocyte Precursor Units (CLP-U)", J. Immun., 124, 1861 (1980); G.E. Ranges et al., "T- Cell Development in Normal and Thymopentin-treated Nude Mice", J. Exp. Med., 156, 1057 (1982)).
Die immunmodulatorische Wirkung von Thymopentin und 4- Thiothymopentin auf die Entwicklung unreifer T-Zellen durch die Expression von de novo Antigenen auf T-Lymphocyten nach täglichen subkutanen Injektionen über zwei Wochen an vier Wochen alten athymischen Nacktmäusen wurde gemessen. Nach der letzten Injektion wurden die Splenocyten präpariert und radioaktiv markiert, um den Prozentsatz aller Zellen mit der radioaktiven Markierung zu bestimmen. Zwei verschiedene Experimentreihen wiesen nach, daß das 4-Thiothymopentin im Vergleich zu Kontrolltieren, denen man Thymopentin in der gleichen Konzentration, Geschwindigkeit und unter den gleichen Bedingungen wie in diesem Experiment verabreicht hatte, Steigerungen von 128 % und 227 % in den Zellen mit diesen Markierungen bewirkte.
Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, daß Thiothymopentinanaloge einen sehr starken Differenzierungsprozeß im Zusammenhang mit einer Zunahme der Markierungen an der Zelloberfläche von T-Lymphocyten auslösen können.
Aus der vorstehenden Offenbarung und den Beispielen liegen für Fachleute zahlreiche Abwandlungen und zusätzliche Ausführungsformen auf der Hand. Beispielsweise haben Thiopeptide mit mehr als fünf Aminosäurerückständen wie hier beschrieben verbesserte Eigenschaften und können vorteilhaft nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Alle diese offenkundigen Abwandlungen und weiteren Ausführungsformensind im Rahmen der Ansprüche enthalten. TABELLE A TABELLEA (Forts.) TABELLE B TABELLE B (Forts.) TABELLE C TABELLE C (Forts.) Tabelle D Tabelle E

Claims

1. Thioacylierungsmittel der Formel:

in der

- R¹ Wasserstoff, ein ggf. verzweigtes C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, das durch Amino, Carboxy, Guanidino, Hydroxy, Hydroxymethyl oder Hydroxyphenyl substituiert sein kann, sowie ein geschütztes Derivaten desselben oder ein aus einer Gruppe ausgewählter Substituent ist, die besteht aus:

(a) -(CH&sub2;)n - - A - D

worin A -O- oder -NH--

D Benzyl oder Xanthenyl und

n 1 oder 2 ist,

- H - G - J - L

worin B -H oder -CH&sub3;,

G -CH&sub2;-, -O- oder -S-,

J -S- oder -CH&sub2;- und

L -CH&sub3; oder Phenyl ist,

worin M und T gleich oder verschieden sein können und Elemente darstellen, die aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom und Jod bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und Q Wasserstoff, Hydroxy oder 2,6-Dichlorbenzoxy bedeutet,

worin V für Carbobenzyloxy oder Tosyl steht, und

- R² aus der aus t-Butoxycarbonyl, Carbobenzyloxy, Chlorbenzyloxy, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Tosyl, Trityl und Xanthenyl bestehenden Gruppe gewählt ist,

- R³ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet oder in der R¹ und R³, zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine 3 bis 5 Kohlenstoffatome enthaltende Cycloalkylgruppe bilden,

- R&sup4; Wasserstoff bedeutet oder in der R³ und R&sup4;, zusammengenommen mit dem Kohlenstoff- bzw. Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen nicht weniger als 2, aber nicht mehr als 6 Ringkohlenstoffatome enthaltenden, gesättigten Heterocyclus bilden, und

- R&sup5; aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Amino, Amido, Hydroxy, Hydroxymethyl, Carboxy, Carboxymethyl, Cyano, Guanidino, Mercapto und Nitro bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

2. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, in dem R¹ ein ggf. verzweigtes Alkyl, R² t-Butoxycarbonyl und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

3. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 2, in dem R¹ und R&sup4;, zusammengenommen mit dem Kohlenstoff- bzw. Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 4 Ringkohlenstoffatome enthaltenden, gesättigten Heterocyclus bilden, R² t-Butoxycarbonyl ist und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

4. Tbioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, in dem R¹ der Formel

-(CH&sub2;)n - - A - D

entspricht, worin

A -O- oder -NH--

D Benzyl oder Xanthenyl und

n 1 oder 2 ist,

R² t-Butoxycarbonyl ist und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

5. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, in dem R¹ der Formel

- H - G - J - L

entspricht, worin

E -H oder -CH&sub3;,

G -CH&sub2;-, -O- oder -S-,

J -S- oder -CH&sub2;- und

L -CH&sub3; oder Phenyl ist,

R² t-Butoxycarbonyl ist und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

6. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, in dem R¹ der Formel

entspricht, worin M und T gleich oder verschieden sein können und Elemente darstellen, die aus der aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom und Jod bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und Q Wasserstoff, Hydroxy oder 2,6-Dichlorbenzoxy bedeutet, R² t-Butoxycarbonyl ist und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

7. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, in dem R¹ der Formel

entspricht, worin

worin V für Carbobenzyloxy oder Tosyl steht,

R² t-Butoxycarbonyl ist und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

8. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, in dem R¹ der Formel

entspricht, R² t-Butoxycarbonyl ist und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

9. Thioacylierungsmittel gemäß Ansprüch 1, in dem R¹ der Formel

(a) -(CH&sub2;)- - O - t-Butyl

entspricht, R² 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl ist und R³ und R&sup5; Wasserstoff bedeuten.

10. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, in dem R¹ aus der aus den Seitenketten der natiirlich auftretenden Aminosäuren sowie deren geschützten Derivaten bestehenden Gruppe ausgewählt ist und R², R³, R&sup4; und R&sup5; gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert sind.

11. Thioacylierungsmittel gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus der aus

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-alanyl-thloacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-arginyl-di-N-carbonbenzyloxy-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-arginyl-N-tosyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-asparaginyl-N-xanthenyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-apartyl-β-benzylester-thioacetyl)-2-enzimidazolon,

1-(α-N-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-aspartyl-β-t-butylester-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-S-benzylester-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-glutaminyl-γ-benzylester-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-glutaminyl-N-xantenyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-glycyl-thloacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-histidyl-N-benzyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-histidyl-N-tosyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-isoleucyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-leucyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-lycyl-&epsi;-N-dichlorbenzyloxycarbonyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-methionyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-phenylalanyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-seryl-O-benzylether-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-threonyl-O-benzylether-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-tryptophyl-thioacetyl)-2-benzimidazolon,

1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-tyrosinyl-O-2,6-dichlorbenzylether-thioacetyl)-2-benzimidazolon und 1-(α-N-t-Butoxycarbonyl-L-valyl-thioacetyi)-2-benzimidazolon bestehenden Gruppe.

12. Aminosäure-orthoaminothioanilid der Formel:

in der R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert sind.

13. Aminosäure-orthoaminothioanllid gemäß Anspruch 12, ausgewählt aus der aus

α-N-t-Butoxycarbonyl-Lalanyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-arginyl-di-N-carbobenzyloxy-orthoaminothioahilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-arginyl-N-tosyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-asparaginyl-N-xanthenyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-aspartyl-β-benzylester-orthoaminothioinlid,

α-N-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-aspartyl-β-t-butylester-orthoaminothioahilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-S-benzylether-orthoaminothioahilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-glutaminyl-γ-benzylester-orthoaminothioahilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-glutaminyl-N-xanthenyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-glycyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-histidyl-N-benzyl-orthoaminothioahilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-histidyl-N-tosyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-isoleucyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-leucyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-&epsi;-N-dichlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-methionyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-phenylalanyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-seryl-O-benzylether-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-threonyl-O-benzylether-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-tryptophyl-orthoaminothioanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-tyrosinyl-O-benzylether-orthoaminothioanilid und

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-valyl-orthoaminothioanilid bestehenden Gruppe.

14. Aminosäure-orthoaminoanilid der Formel:

15. Aminosäure-orthoaminoanilid gemäß Anspruch 14, ausgewählt aus der aus

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-arginyl-di-N-carbobenzyloxy-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-arginyl-N-tosyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-asparaginyl-N-xanthenyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-aspartyl-β-benzylester-orthoaminoanilid,

α-N-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-aspartyl-β-t-butylester-orthoantinoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-S-enzylether-orthoaminoahilid,

α-N-t-Butoxycarbonyf-L-glutaminyl-γ-benzylester-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarboflyl-L-glutaminyl-N-xanthenyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-glycyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-histidyl-N-benzyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-utoxycarbonyl-L-histidyl-N-tosyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-isoleucyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-leucyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-&epsi;-N-dichlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-methionyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-phenylalanyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-seryl-O-benzylether-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-threoflyl-O-benzylether-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-tryptophyl-orthoaminoanilid,

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-tyrosinyl-O-2,6-dichlorbenzylether-orthoaminoanilid und

α-N-t-Butoxycarbonyl-L-valyl-orthoaminoanilid bestehenden Gruppe.

16. Verfahren zur Herstellung des Aminosäure-orthoanilids gemäß Anspruch 14, bei dem man ein Orthophenylendiamin der Formel

mit einer geschützten α-Aminosäure der Formel

oder einem geschützten Polypeptid in Kontakt bringt, wobei R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert sind, und zwar in Anwesenheit eines Peptidkupplungsmittels in einem inerten organischen Lösungsmittel.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem das organische Lösungsmittel aus der aus Dichlormethan, Chloroform, N,N'-Dimethylformamid und Tetrahydrofuran bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem das Pepfidkupplungsmittel aus der aus N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-Carbonyldiimidazol, 1-Hydroxybenzotriazol, Ethylchlorformiat und Benzylchlorformiat bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

19. Verfahren zur Herstellung des Aminosäure-orthoaminothioanilids gemäß Anspruch 12, bei dem man das Aminosäure-orthoaminoanilid gemäß Anspruch 14 mit einem Reagenz in Kontaat bringt, das eine Zusammensetzung von Phosphorpentasulfid und Natriumcarbonat in einem inerten organischen Lösungsmittel umfaßt.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, bei dem das Lösungsmittel aus der aus Diethylether und Tetrahydrofuran bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

21. Verfahren zur Herstellung des Thioacylierungsmittels gemäß der in einem der Ansprüche 1 bis 10 gegebenen Formel, bei dem man das der Formel aus Anspruch 12 entsprechende Aminosäure-orthoaminothioanilid mit Carbonylditriazol in einem inerten Etherlösungsmittel oder Phosgen in Anwesenheit eines inerten Lösungsmittels in Kontakt bringt.

22. Verfahren zur Erzeugung einer Thiopeptidbindung, umfassend den Schritt des In-Kontaktbringens einer geschützten α-Aminosäure oder eines geschützten Peptids, wobei die geschützte α-Aminosäure oder das geschützte Peptid eine freie Aminofunktion aufweist, mit dem Thioacylierungsmittel mit einer Formel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 in Anwesenheit eines inerten Lösungsmittels.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei das Verfahren Methoden der Festphasenpeptidsynthese umfaßt und wobei die geschützte Aminosäure oder das geschützte Peptid über den Carboxyterminus passend an ein unlösliches und inertes Harz gebunden ist.

24. Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, bei dem das Lösungsmittel aus der aus Acetonitril, Dichlormethan, Diethylether, N,N'-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Tetrahydrofuran bestehenden Gruppe ausgewählt ist.