DE3024281A1

DE3024281A1 - Neue tetra- oder pentapeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE3024281A1
Application number: DE19803024281
Authority: DE
Inventors: Jean Bouchaudon; Daniel Farge; Claude James
Original assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Current assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Priority date: 1979-06-29
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1981-01-08
Also published as: IT8023072A0; ZA803887B; SE8004792L; LU82567A1; AU5970080A; SE448302B; IE51058B1; NL8003762A; JPS5636440A; BE884077A; DK154940C; AU544863B2; US4742048A; DK154940B; CH651577A5; FR2460290B1; GB2053231B; IT1131395B; DK277780A; FR2460290A1

Description

SC 4679/4708/4709

EHONE-POULEKC INDUSTRIES, Paris/Frankreich

Neue Tetra- oder Pentapeptide, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft neue Tetra- oder Pentapeptide der allgemeinen Formel

R-NH-CH-Co-NH-CH-CO-R₁ (I)

CH₃ ^CH2^CH2 ~ ^C0 ~ ^m ~ ^CH ~ ^R2

i ^{2 3}

R₃-NH-CH-R₄

gegebenenfalls deren Salze, deren Herstellung und Arzneimittel, die diese enthalten.

Die Wandungen der Eakterien, beispielsweise die Wandungen von Mykobakterien bestehen im wesentlichen aus einem Peptidoglycan, gebildet aus der N-Acetyl-muraminsäure, an d.13 Peptide fixiert sind, die die Verknüpfung L-AIa-D-GIu-DAP enthalten. Darüber hinaus sind die Wandungen der Bakterien sehr reich an Lipiden,

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von denen einige frei und extrahierbar sind und andere an die Wandungsstruktur gebunden sind und aus Mykolsäuren (riesige oi -verzweigte und ß-hydroxyliebte Fettsäuren) bestehen. Die Gesamtheit der Bestandteile der Zellwandungen bildet eine kovalente Struktur, zusammengesetzt aus einem Peptidoglycan und einem Arabinogalactan-mycolat, die untereinander durch Phosphodiesterbindungen verknüpft sird. Die Bakterienwandungen weisen die Mehrzahl der biologischen Eigenschaften von Gesamtzellen auf, wenn sie an ein mineralische.=; oder pflanzliches Öl gebunden sind und nach dem Suspendieren in einer physiologischen Lösung verabreicht werden.

In den BE-PSen 821 385, 852 348 und 852 349 werden Peptide beschrieben, die mit N-Äcetylmuraminsäure gekuppelt sind, die Verknüpfungen L-Ala-D-Glu oder L-Ser-D-Glu enthalten und die wirksam als immunologische Adjuvantien und als antiinfektiöse Mittel sind.

In der FR-PS 75.24440, veröffentlicht unter der Nummer 2 320 107 werden Kupplungsprodukte zwischen einer Fettsäure und einem Saccharid-heptapeptid, isoliert, ausgehend von einem Mykobakterium, enthaltend ein Wachs "D", beschrieben, die dargestellt werden können durch die folgende Formel:

NAG - NAM

AIa
I

GIu
DAP

NAG - NAM

AIa

i
GIu

DAP

(R COOH)

CiD

·» πι

worin insbesondere:

NAG = N-Acetylglucosamin;
NAM = N-AcetyimUiaminsaure;

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R = Alkylrest mit 9-17 Kohlenstoffatomen.

Diese Verbindungen sind immunologische Adjuvantien von eier Erzeugung von Antikörpern und der verzögerten Hypersensibilität, die dazu geeic,_iet sind, allein zu wirken, d. h. ohne dass es notwendig wäre, sie in öliger Lösung zu verabreichen.

Alle diese Verbindungen sind durch die Anwesenheit von N-Acetylmur amins äure gekennzeichnet, die nach Kasumoto <_c al. , Tetrahedron Letters 49, 4899 (1978) mit der immunologischen Wirksamkeit in Verbindung gebracht wird.

Es wurde nunmenr gefunden, daß die Peptide der allgemeinen Formel I trotz der Abwesenheit von N-Acetylmuraminsäure ausgezeichnete Adjuvanswirkung und immunstimulierende Wirkung aufweisen. Darüber hinaus können die Verbindungen, die wohl definiert sind, leicht in ausreichender Reinheit , wie sie für die therapeutische Anwendung erforderlich ist, erhalten werden.

In der allgemeinen Fornel I

stellt R ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest dar,

stellt R₃ ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Amin-Punktion gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurerest, dar, wobei minde=tens eines der Symbole R und R₃ einen Fettsäurerest darstellt oder enthält,

bedeutet R₁ einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest,

bedeutet eines der Symbole R„ oder R. ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonyl-Rest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert

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ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycylrest (-CO-NH-CH₂-COOH) oder N-Carbonyl-D-alanylrest ^"-CO-NH-CH(CH₃)-C00H_7/ gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durcn einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) und das andere bedeutet ein Wasserstoff atom oder einen Carboxy-, Carbamoy¹.- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-1 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, wobei ?_ und R. nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom bedeuten können,

und wobei mindestens eines der Symbole R„, R- oder R. einen Glycyl- oder D-Alanylr^st darstellt oder enthält.

In der allgemeinen Formel I liegt das Alanin, das an die Glutaminsäure gebunden ist, in der L-Form vor, die Glutaminsäure liegt in der D-Form vor, das Lysin oder seine Derivate, wenn eines der Symbole R„ oder R. ein Wasserstoffatom darstellen, liegt in der L-Form vor und die 2,6-Diamino-pimelinsäure oder ihre Derivate liegen, wenn P und R₄ einen Carboxyrest oder ein Derivat der Säurefunktion darstellen, in der D,D-, L,L-, 3)3).LL-(razemisch) oder D,L-(meso)-Form vor·

Unter Fettsäurerest ist ein Alkanoylrest mit 1-45 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Hydroxy·-, Phenyl- oder Cyclohexylrest, ein Alkenoylrest iuit 3-30 Kohlenstoffatomen, der mehr als eine Doppelbindung enthalten kann, oder ein Mykolsäurerest, wie man ihn in der Struktur der Bakterienwandungen von Mykobakterien, von Nocardia oder Csr/nebakterien antrifft, zu verstehen.

Erfindungsgemäß können die neuen Peptide der allgemeinen Formel I hergestellt werden nach allgemein in der Peptidchemie verwendeten Methoden. Die verschiedenen Reaktionen werden nach Blockierung der Amin- oder Säurefunktionen. die an der Reaktion nicht teilnehmen dürfen, durch geeignete Schutzgruppen durchführt, worauf man

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gebenenfalls eine Freisetzung (Entblockierung) dieser Funktionen folgt.

Erfindungsgemäß können die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I erhalten werden durch Einwirken einer Aminosäure der allgemeinen Formel

R.--NH-CH-CO R'
⁰ i (III)

worin Rg ein Wasserstoffatom, einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, wie den Benzyloxycarbonyl- odert-Butyloxycarbonylrest - darstellt, R_fi ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest bedeutet, wobei in diesem Falle das Alanin in der D-Form vorliegt, und R¹ einen Hydroxy- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, auf ein Tri- oder TeLrapeptid der allgemeinen Formel

R -NH -CH -CO -NH-CU-CÖ" ¹R₈

CH CH CH₉-CO-NH-CH-R^ viv;

'2'3

R₁₀-NH-CH-R₄

worin R_ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, wie den Benzyloxycarbcnyl- oder t-Butyloxycarbonylrest darstellt, Rg einen Hydroxy- oder Aminorest oder einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, eines der Symbole R^ oder R_g ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkvloxycarbonylrest, dessen Alkylceil 1-4 Kohlenstoffatome enthält, und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder

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N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-/ Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält, und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, wobei R. und R„ nicht gleichzeitig ein Wasserstoff atom darstellen können und R., _ ei¹" Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, wie den Benzyloxycarbony1- oder t-Butyloxycarbony lrest, oder einen Glycyi- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, wie den Benzyloxycarbony 1- oder t-Butyloxycarbonylrest, darstellt, wobei mindestens einer der Reste R_ oder R₁₀ einen Fettsäurerest darstellt oder enthält, und wenn R^ und R~ wie vorstehend definiert sind, R₁₀ ein Wasserstoffatom darstellt, und wenn eines der Symbole R^ oder Rg einen Carboxyrest bedeutet, das andere ein Wasserstoffatom oder eiv.en Carbamoyl- oder Alky loxycarbony Ire st mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest bedautet, R₁₀ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyi- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen FettSc'urerest oder durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt, worauf gegebenenfalls der Ersatz der Reste R₁-, R₇ und/oder R_1n (wenn sie eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten) durch ein Wasserstoffatom und der Ersatz der Reste R¹ und R₀

(falls sie einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophanylrest, bedeuten), durch einen Hydroxyrest und der Reste R. und/oder R„ (falls sie einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest bedeuten), durch einen Carboxyrest, folgt.

Insbesondere können die neuen Peptide der allgemeinen Formel I, worin R, R^ und R₃ wie vorstehend definiert sind, und eines der

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Symbole R„ oder R. einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest darstellt, erhalten werden durch Einwirken einer Aminosäure der allgemeinen Formel III, worin R^ und R¹ ^Le vorstehend definiert sind und R₅ ein Wasserstoffatom darstellt, auf ein Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel IV, worin R_ wie vorstehend definiert ist, Rg einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durci: einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, eines der Symbole R, oder R_g einen Carboxyrest und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylres+- bedeuten und R_1n einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aninfunktion, wobei mindestens eines der Symbole R₇ oder R^₀ einen FeLtsäurerest darstellt oder enthält, worauf gegebenenfalls der Rest R_ oder Rh₀/ wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält, durch ein Wassers to ff atom ersetzt wird, die Ret-r.e.

R₀ und/oder R¹, falls iiie einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohleno

stoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) bedeuten, durch einen Hydroxyrest ersetzt werden, und der ?.est R. oder R_>v, wenn er einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrept, darstellt oder enthält, durch einen Carboxyrest ersetzt wird.

Im allgemeinen ist es notwendig, die freie Säurefunktion des Peptids der allgemeinen Formel IV vor der Ei'.-'tfirkung der Aminosäure der allgemeinen Formel III zu schützen. Vorzugsweise ist das aktivierte Derivat des Peptids der allgemeinen Formel1V ein gemischtes Anhydrid, hergestellt in situ durch Einwirken eines Alkylhaiogenformiats, wie Isobutylchlorformiat, auf ein Peptid der allgemeinen Formel IV. Die Kondensation des aktiven Derivats erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Chloroform, Toluol oder Dimethylformamid in wässrig-

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organischem Milieu, in Anwesenheit einer Base (anorganisch , wie Natriumhydroxid/ oder organisch, wie Triäthylamin) bei einer Temperatur von -10 bis +30°C.

Der gegebenenfa LIs mögliche Ersatz der Schutzgruppen R_ oder R₁ durch ein Wasserstoffatom und der Schutzgruppen R„ und R¹ durch Hydroxyreste und von R. oder R_g durch einen Carboxyrest kann nach bekannten bzw. üblichen Methoden je nach der Natur der Gruppen erfolgen. Es ist besonders vorteilhaft, oie Reste R₇ oder R. R„, R¹ und R. oder R_g derart zu wählen, daß ihr Ersatz durch ain Wasserstoffatom oder durch einen Hydroxy- oder Carboxyrest in einer einzigen Stufe erfolgen kann. Beispielsweise können R₇ oder R₁ einen Benzyloxycarbonylrest darstellen, und die Symbole Rg, R¹ und R₄ oder R_Q einen Benzyloxy- oder Benzyloxycarbonylrest darstellen, und unter diesen Bedingungen erfolgt der Ersatz der Reste durch Wasserstoffatome oder durch einen- Hydroxy- bzw. Carboxyrest durch Hydrogenolyse, wobei man in einem geeigneten organischen Lösungsmittel arbeitet, wie Essigsäure (gegebenenfalls im Gemisch mit einem anderen organischen Lösungsmittel, wie Methanol) oder in einem wässrig-organischen Lösungsmittel, in Anwesenheit eines Katalysators, wie Palladium, beispielsweise Palladium auf Kohle, bei einer Temperatur, von etwa 20 C und bei einem Druck von etwa 1 bar (760 mmHg). Jedoch kann es notwendig sein, ain oder mehrere Schutzgruppen zu entfernen, ohne die anderen anzugreifen. In diesem Falle können die Schutzgruppen der Aminfunktionen beispielsweise eine' ein t-Butyloxycarbonylrest (entfernbar durch saure Hydrolyse) und die andere ein Benzyloxycarbonylrest (entfernbar durch Hydrogenolyse) sein, und die Schutzgruppen der sauren Funktionen könnten beispielsweise eine ein Methyl- oder t-Butylrest (entfernbar durch saure oder basische Hydrolyse) und die andere ein Benzylrest (entfernbar durch Hydrogenolyse) sein.

Insbesondere können die neuen Peptide der aligemeinen Formel I, worin R, R., R„ und R. wie vorstehend definiert sind, und R-einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt, dessen Aminfunktion

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gegebenenfalls substituiert ist, durch einen Fettsäurerest, erhalten werden durch Einwirken einer Aminosäure der allgemeinen-Formel III, worin R, wie vorstehend definiert ist, R₁- einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet und R¹ einen Hydroxyrest darstellt, auf ein Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel IV, worin R₄, R₇, R„ und R_g wie vorstehend definiert sind und R. ein Wasserstoffatom darstellt, wob^i es sich versteht, daß zumindest eines der Symbole R₁. und R_ einen Fettsäurerest darstellt, worauf gegebenenfalls der Ersatz des Rests R₅ oder R_, wenn es sich um eine Schutzgruppe der Aminfunktion handelt, durch ein Wasserstoffatom und des Rests Rg, falls es sich um einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) handelt, durch einen Hydroxyrest und der Reste R₄ und/oder R_g, falls sie einen .Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) darstellen oder enthalten, durch einen Carboxyrest, folgt.

Im allgemeinen ist es notwendig, di^ Säurefunktion der Aminosäure der allgemeinen Formel III vor ihrer Einwirkung auf das Peptid der allgemeinen Formel IV zu aktivieren. Im allgemeinen ist das aktive Derivat der Aminosäure der allgemeinen Formel III ein gemischces Anhydrid, hergestellt in situ, durch Einwirken eines Alkylhalogenformiats (wie Isobutylchlorformiat) auf eine Aminosäure der allgemeinen Formel IXI. Die Kondensation des aktivierten Derivats erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, ■ Tetrahydrofuran, Chloroform, Toluol oder Dimethylformamid oder in einem wässrig-organischen Medium in Anwesenheit einer Base (anorganisch, wie Natriumhydroxid,oder organisch, wie Triäthylamin) bei einer Temperatur von -10 bis +30⁰C.

Verwendet man eine Säure der allgemeinen Formel III, so erfolgt die Kondensation im allgemeinen in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, wobei man in einem organischen Lösungsmittel arbeitet, wie Methylenchlorid oder Dimethylformamid, bei einer Temperatur von -10 bis +30 C.

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Der Ersatz der Schutzgruppen R₅ oder R_ durch ein Wasserstoffatom und der Schutzgruppen R_R und/oder R₄ und/oder R» durch einen Hydroxy- oder Carboxyrest, je nach dem vorliegenden Fall, erfolgt nach bekannten bzw. üblichen Methoden in Abhängigkeit von der Natur dieser Gruppen. Es ist besonders vorteilhaft, diesen Ersatz unter den voretehend genannten Bedingungen durchzuführen.

Erfindungsgemäß können die neuen Peptide der allgemeinen Formel I erhalten werden durch Einwirken eines Dipeptids der allgemeinen Formel

R -NH-CH-CO-NH-CH-CO-Ro

⁷J I (V)

CH₃ CH₂CH₂COOH

worin R^ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und R_ß einen Amino- oder- Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrcphenylrest, darstellt, auf ein Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel

H₂N-CH-R₉

⁽f^H2⁾3 (VI)

worin eines der Symbole R₄ oder R- ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonyl- dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenyirest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen

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Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und der andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- ode^ Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, wobei es sich versteht, daß R. und R_g nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können und R₁₀ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion ouer einen Glycyl- oder D-Alanylre£t (dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion) darstellt, wobei mindestens eines der Symbole R. oder Rg und R₁ einen Glycyl- oder D-Alanylrest, wie vorstehend definiert, darstellt oder enthält und mindestens eines der Symbole R_ und R₁ einen Fettsäurerest darstellt oder enthält, worauf gegebenenfalls der E:c«atz des Rests R- oder R₁₀ (falls er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält) durch ein Wasserstoffatom und der Reste R„ und/oder R. und/oder R„ (falls sie gegebenenfalls einen Alkyloxy- oder Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellen) durch eine Hydroxy- oder Carboxygruppe folgt.

Im allgemeinen ist es notwendig, die freie Säurefunktion des Dipeptids der allgemeinen Formel V vor ihrer Einwirkung auf das Peptid der allgemeinen Formel VI zu aktivieren. Vorzugsweise ist das aktivierte Derivat des Dipeptids der allgemeinen Formel V ein gemischtes Anhydrid, hergestellt in situ, durch Einwirken eines Alkylhalogenformiats, wie Isobut^Ichlorformiat. Unter diesen Bedingungen erfolgt die Kondensation wie vorstehend für die Einwirkung einer Aminosäure der allgemeinen FormelIII auf ein Tripeptid der allgemeinen Formel IV beschrieben.

Der mögliche Ersatz der Schutzgruppen R₇ oder R₁₀ durch ein Wassers to ff atom und der Schutzgruppen R_R und/oder R₄ und/oder R₀ durch einen"Hydroxy- oder Carboxyrest erfolgt gegebenenfalls nach bekannten b^w. üblichen Methoden, wie vorstehend angegeben.

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Erfindungsgemäß können die neuen Peptide der allgemeinen Formel I hergestellt werden durch Einwirken eines Derivats von L-Alanin der allgemeinen Formel

R-NH-CH-COOH
CH₀

worin R₇ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, auf ein Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel

H₂N-CH-CO-Rg

CH CH₂-CO-NH-CH-R₉ (VIII)

R₁₀-NH-CH-R₄

worin eines der Symbole R. oder R_g ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonyl- dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenTalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder w-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1 - \ Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyx- oder Nitropnenylrest, bedeutet, und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, wobei es sich versteht, daß R- und Rg nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können, Rg einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrect mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder

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Nitrophenylrest bedeutet und R₁ einen Fettsäurerest, eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminteil substituiert ist durch einen Fettsäurer°st oder durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, wobei mindestens eines ier Symbole R₄ oder R_q und R₁₀ einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt oder enthält, wie vorstehend definiert, und mindestens eines der Symbole R₇ und R₁₀ einen Fettsäurerect darstellt oder enthält, worauf gegebenenfalls der Ersatz des Restes R- oder R._ (wenn er eine Schutzgruppe dur Aminfunktion darstellt oder enthält) durch ein Wasserstoffatom und der Reste Ro und/oder R. und/oder R_q (falls sie einen Alkyloxy- oder Alkyloxycarbonylres+- mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert duren einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeuten oder enthalten) durch eine Hydroxy- oder Carboxygruppe, je nach dem vorliegenden Fall, erfolgt, unter den vorstehend für die Einwirkung einer Aminosäure der allgemeinen Formel III auf eiλ Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel IV beschriebenen Bedingungen.

Erfindungsgemäß können die neuen Peptide der allgemeinen erhalten werden durch JJinwirken einer Säure der allgemeinen Formel

R"-CO-OH (IX)

(worin R"-CO- einen Fettsäurerest wie vorstehend definiert darstellt) auf ein Tetra— oder Pentapeptid der allgemeinen Formel

₁ -NH-CH-CO-NH-CH-CO-CH-, C

CH., CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₉ (Χ)

R₁₀-NH-CH-R₄

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worin eines der Symbole R₄ oder R_g ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonyl- dessen AlkylteiI 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest/ aegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durcn einen Phenyl - oder Nitrophenylxest, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkylo.r/carbonylrest, dessen Alkyli-eil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, wobei es sich versteht, daß R, und R_g nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darsteilen können, R_g einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, R₁ ein Wasserstoffatom, einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen freie AmInfunktion gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder durch eine Schutzgruppe der Ami π f. unk ti on, darstellt und R₁₁ ein Wasserstoffatom, einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet, wobei es sich verstel·+-, daß mindestens eines der Symbole R₄ oder R» und R₁ einen Glycyl- oder D-Alanylrest, wie vorstehend definiert, darstellt oder enthält und daß mindestens eines der Symbole R₁₀ und R₁₁ ein Wasserstoffatom bedeutet oder R.. einen Glycyl·- oder D-Alanylrest,dessen Aminfunktion frei ist, darstellt, und daß, falls einer der Reste R_1n oder R₁₁ einen Fettsäurerest darstellt oder enthält, dieser und der Rest R"-CO- gleich oder verschieden sind, worauf gegebenenfalls der Ersatz des Rests R₁ oder R₁₁ (falls er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält) durch ein Wasserstoffatom und der Reste Rg und/oder R₄ und/oder R_g/ falls sie einen Alxyloxy- oder Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest darstellen) je nachdem durch einen Hydroxy- oder Carboxyrest folgt.

Wenn in der allgemeinen Formel X das Symbol R_g einen Amino- oder

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Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, eines der Symbole R₄ oder R_g einen N-Carbonylglycyl- oder N-Orbonyl-D-alanylrest, verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert· durch einen Phony1- oder Nitrophenylrest, bedeutet und dz.3 andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoylrest oder Alkyloxycarbönylrt-ot mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, erfolgt die Kondensation der Säure der allgemeinen Formel IX im allgemeinen in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid, wobei man in einem organischen Lösungsmittel arbeitet, wie Methylenchlorid oder Dimethylformamid, bei einer Temperatur von -10 bis +30⁰C.

Wenn in der allgemeinen Formel X eines der Symbole R_fi einen Hydroxyrest darstellt oder enthält und R, und/oder R„ einen Carboxyrest darstellt oder enthält, so ist es notwendig, die Säure der allgemeinen Formel IX vor ihrer Einwirkung auf das Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel X zu aktivieren. Als aktiviertes Derivat der Säure der allgemeinen Formel IX ist es besonders vorteilhaft, ein Säurehalogenid oder ein gemischtes Anhydrid, hergestellt in situ durch Einwirken eines Alkylhalogenformiats, wie Isobutylchlorformiat in Anwesenheit einer Base, zu verwenden.

Wenn man eine Säure der allgemeinen Formel IX in Form des Säurehalogenids, vorzugsweise des Ci.iorids verwendet, so erfolgt die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel, wie Diäthylather oder Methylenchlorid in Anwesenheit einer Base (anorganisch, wie Natriumhydroxid, oder organisch, wie Triäthylamin), bei einer Temperatur von 0 bis 30 C.

Wenn man die Säure der allgemeinen Formel IX in Form eines gemischten Anhydrids verwendet, so erfolgt die Reaktion in einem

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organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Chloroform, ^oluol oder Dimethylformamid in einem wässrig-organischen Medium in Anwesenheit einer Base (anorganisch, wie Natriumhydroxid, oder organisch, wie Triäthylamin) bei einer Temperatur von -10 bis +30⁰C.

Der mögliche Ersatz der Reste R_1n und/oder R₁₁ durch ein Wasserstoff atom und der Reste R₀ und/oder P₁ und/oder R_n durch einen

ο Ί ν

Hydroxy- bzw. Carboxyrest erfolgt nach bekanntem bzw. üblichen Methoden, wie vorstehend angegeben.

Zur Erzielung einer Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R einen Rest e.Lner Fettsäure und R^ den gleichen Fettsäurerest oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt, dessen Aminfunktion substituiert ist durch den gleichen Fettsäurerest, so erfolgt die Kondensation der Säure der allgemeinen Formel IX mit einer Verbindung der allgemeinen Formel X, worin R_1n ein Wasserstoff atom oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt, und R₁₁ ein Wasserstoffatom bedeutet oder auf eine Verbindung der allgemeinen Formel X, worin R₁ einen Rest einer Fettsäure, identisch mit der eingesetzten. Säure der allgemeinen Formel IX darstellt oder enthält ^nd R₁₁ tm Wasserstoffatom bedeutet oder auf eine Verbindung der allgemeinen Formel X, worin R_1n ein Wasserstoffatom oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt und R₁₁ einen Rest einer Fettsäure, identisch mit der eingesetzten Säure der allgemeinen Formel IX bedeutet, wobei man unter üblichen Bedingungen arbeitet.

Zur Erzielung einer Verbindung der allgemeinen Formel I,worin die Symbole R und R_n. unterschiedliche Fettsäurereste darstellen oder enthalten, ist es notwendig, die Kondensation einer Säure der allgemeinen Formel IX mit einer Verbindung der allgemeinen Formel X worin R_1n einen Fettsäurerest unterschiedlich zu dem der eingesetzten Säure der allgemeinen Formel IX oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält und R₁₁ ein Wasserstoffatom bedeutet, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel X,

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- 3b -

worin R₁₀ ein Wasserstoffatom oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt und R₁₁ einen Rest einer Fettsäure unterschiedlich zu der eingesetzten Säure der allgemeinen Formel IX oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, durchzuführen, worauf gegebenenfalls nach Entfernung dieser Schutzgruppe die Kondensation einer anderen Fettsäure der allgemeinen Formel IX folgt, wobei man unter üblichen Bedingungen arbeitet.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel III, worii. R_fi ein Wasserstoff atom oder einen Methylrest darstellt, R¹ einen Hydroxy- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Mitrophenylrest bedeutet, und R_g einen Fettsaurerest darstellt, kann erhalten werden durch Einwirken einer Säure der allgemeinen Formel IX oder eines aktiven Derivats dieser Säure auf Glycin oder D-Alanin, dessen Säurefunktion gegebenenfalls in Form eines Esters geschützt ist, worauf gegebenenfalls die Entfernung der Schutzgruppe von der Säurefunktion folgt.

Unabhängig davon, ob d;'.e Säurefunktion des Glycins oder des D-Alanins geschützt ist oder nicht, erfolgt die Kondensation unter gleichen Bedingungen, w? e vorstehend für die Kondensation der Säure der allgemeinen Formel IX mit dem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel X,beschrieben.

Das Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel IV, worin eines der Symbole R und R_g einen Carboxyrest darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest bedeutet,-R₇ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, Rg einen Amino- oder Alkyioxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet und R₁₀ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, substituiert durch einen Fettsäurerest oder durch eine Schutzgruppe der

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Aminfunktion darstellt, kann erhalten werden durch Einwirken unter üblichen Bedingungen eines Dipeptide der allgemeinen Formel V, worin R₇ und R₈ wie vorstehend definiert sind, auf eine Aminosäure oder ein Dipeptid der allgemeinen Formel VI, worin R. wie vorstehend definiert ist und eines der Symbole R. oder R_g einen Carboxyrest odar einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkvloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, worauf gegebenenfalls der Ersatz eines der Reste R. oder Rq, wenn es sich um einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) handelt, durch einen Carboxyrest folgt, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen.

Insbesondere kann es, falls R_R mit der Carbonylgruppe,an die es gebunden ist, eine Esterfunktion bildet, und R, und R„ eine Esterfunktion darstellen, notwendig sein, daß die Reste R₀, R. und R_n

ο 4 y

unterschiedlich sind und derart ausgewählt sind, daß.der Ersatz eines der Reste R. odei. R~ durch einen Carboxyrest erfolgt, ohne den Rest R_R und den anderen Rest R₄ oder R„ zu beeinträchtigen. Beispielsweise kann einer der Reste R. oder R~ einen Bfinzyloxycarbonylrest, der durch Hydrogenolyse eliminierbar ist, und der Rest Kq und der andere Rest R₄ oder R„ ein Methoxyrest sein, der gegenüber der Hydrogenolyse nicht empfindlich ist.

Das Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel IV, worin R₇ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfun.'tion darstellt, Rq einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet und eines der Symbole R₄ oder R_ ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch

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einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest mit 1- 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, wobei R. und R_q nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können, und R_1n ein Wasserstoffatom bedeutet, erhalten werden durch Einwirken unter übli chen Bedingungen eines Dipeptide der allgemeinen Formel V, worin R₇ uni. Rg wie vorstehend definiert sind, auf eine Aminosäure oder ein Dipeptid der allgemeinen Formel VI, worin R. und R_ wie vorstehend definiert sind und R₁₀ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, worauf der Ersatz dieser Schutzgruppe durch ein Wasserstoffatom,ohne den Rest des Moleküls anzugreifen, folgt. Insbesondere sollten die Schutzgruppen der Aminfunktion, definiert für R_ und R₁ unterschiedlich sein und derart gewählt werden, daß der Ersatz des Rests R₁₀ durch ein Wasserstoffatom erfolgt, ohne den Rest R₇ anzugreifen.

Das Dipeptid der allge\ieinen Formel V kann erhalten werden durch Einwirken eines aktivierten Derivats von L-Alanin der allgemeinen Formel VII, worin R₇ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktior darstellt, auf ein Derivat der D-Glutaminsäure der allgemeinen Formel

H₀N-CH-CO-R₀

² I ⁸ (χι)

worin R_ß einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1 - 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt unter den vorstehend für die Einwirkung der Aminosäure für die allgemeine Formel VII auf das Peptid

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der allgemeinen Formel VIII beschriebenen Bedingungen.

Das Dipeptid der allgemeinen Formel V, worin R₇ einen Fettsäurerest darstellt, kann erhalten werden durch Einwirken einer Säure der allgemeinen Formel IX auf ein Dipepcid der allgemeinen Formel

- CH - CO - NH - CH - CO - R₈ CH₃ CH₂CH₂COOH

worin R₀ einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, ο

gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, unter den vorstehend für die Einwirkung einer Säure der allgemeinen Formel IX auf ein Tetia- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel X beschriebenen Bedingungen.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel VI, worir. R, einen Carbamoylrest darstellt, R_g einen Carboxyrest bedeutet, und R₁₀ einen Benzyloxycarbonylres t bedeutet ir. der meso-Form ^,nd genauer das D-Monoamid der Benzyloxycarbon/l-D-meso- 2 , 6-diarnino-pimeIinsäure darstellt, kann nach dem in der BE-PS 821 385 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Die Aminosäure oder das Dipeptid der allgemeinen Formel VI, worin R. einen Carbamoylrest darstellt, R_q einen Carboxyrest bedeutet und R₁ einen Fettsäurerest, eine Schutzgruppe der Aminrunktion oder den Glycyl·- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion

substituiert ist, durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt, in razemischer Form, D,D- oder L/L-Form, kann hergestellt werden, ausgehend von der entsprechenden 2,6-Diaminopimelinsäure. Zu diesem Zwecke stellt man nach bekannten bzv/. üblichen Methoden den Dibenzy!ester der 2,6-Dibenzyloxycarbonylaminopimelinsäure her, der monoverseift

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wird nach der von A. Arendt et al., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum, 48, 1305 (1974), /"ehem. Abstr., 82, 31497g (1975)_/ beschriebenen Methode, der anschließend durch Hinwirken von ammonikalischem Methanol in ein Monoamid umgewandelt wird der allgemeinen.Formel

Z - NH - CH - COOH

C)

Z - NH - CH - CONH₂

(worin Z den Benzyloxycarbonylrest darstellt), welches nach der Hydrogenolyse in Anwesenheit von Palladium auf Kohle zum 2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamid führt.

Durch Einwirken eines Kupfersalzes, wie Kupfer-II-bromid oder das basische Carbonat von Kupfer auf das 2,6-Diamino-pimelinsäuremonoamid bildet sich ein Komplex, der dargestellt v/erden kann durch die Formel

- CH - CONII₂
(CH₂)3

H„N -CH-

(XIV)

OCO - CH -

(CH₂)₃

I₂N - Cu - CH - NH₂

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worin der Aminorest in der u. -Stellung zur Carbamoylgruppe acyliert sein kann durch Einwirken eines aktivierten Derivats einer Säure der allgemeinen Formel IX oder einer Aminosäure der allgemeinen Formel III, worin R₁- einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und R¹ einen Hydroxyresc bedeutet oder geschützt sein kann durch Einwirken eines Alkyl-•oder Benzylhalogenformiats. Der so gebildete Komplex' wi rd zersetzt durch Einwirken von Schwefelwasserstoff unter Bildung der Aminosäure oder des Dipeptide der allgemeinen Foiniel VI,- worin R_Q einen Carboxyrest darstellt,, R. einen Carbamoylrest bedeutet und R₁₀ wie vorstehend definiert ist.

Zur Erzielung einer Verbindung der allgemeinen Formel VI, worin R. einen Carboxyrest bedeutet, R„ einen Carbamoylrest darstellt und R₁₀ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunkticn oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Arainfunktion, bedeutet, schützt man die Aminfunktion in oC -Stellung zur Carbamoylgruppe der Verbindung der allgemeinen Formel XIV durch Einwirken eines Alkyl- oder Benzylhalogenformiats, Der so gebildete Komplex wird zersetzt durch Einwirken von Schwefelwasserstoff, unter Bildung der Aminosäure der allgemeinen FormeL VI, worin R. ein Carbamoylrest ist, R_ ein Carboxyrest ist und R₁₀ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt. Der Aminorest in der d -Stellung zur Carboxygruppe kann geschützt sein durch eine Schutzgruppe oder acylie^t sein durch Einwirken eines aktivierten Derivats einer Säure der allgemeinen Formel IX oder einer Aminosäure der allgemeinen Formel III, worin Rj. einen Fettsäurefest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und R¹ eine Kydroxygruppe bedeutet. Nach dem Ersatz des Restes R₁ durch ein Wasserstoffatom nach Methoden, die den Rest des Moleküls nicht angreifen, erhält man die Verbindung der allgemeinen Formel VI, worin R₄ einen Carboxyrest darstellt, R_q einen Carbaxncylrest bedeutet und R_1n einen Fettsäurarest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion ode ^ einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Äminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder durch

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eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt.

Die Aminosäure oder das Dipeptid der allgemeinen Formel VI, worin R. einsn Carbamoylrest bedeutet-, R_q einen Carboxyrest darstellt und R. einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert, ist durch einen Ftttsäurerest oder durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, in der meso-Form, worin daj die Reste R. und R_1n tragende Kohlenstoffatom in der D-Form vorliegt , kann hergestellt v/erden durch Einwirken eines aktivierten Derivats * einer Säure der allgemeinen Formel IX oder einer Aminosäure der allgemeinen Formel III, worir R₅ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder eines Alkyl- oder Benzylhalogenformiats auf den Kupfer-II-Komplex des D-Monoamids der meso-2,6-Diaminopimelinsäure (erhalten ausgehend von dtm D-Monoamid der Benzyloxycarbonyl-D-meso^fG-diaminopimelinsäure, durch Hydrogenolyse).

Die Aminosäure oder das Dipeptid der allgemeinen Formel· VI, worin R. einen Carboxyrest darstellt, R_g einen Carbarioylrest bedeutet und R^ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunkoder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fattsäurere^t oder durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, in meso-Form, worin das Kohlenstoffatom, das die Reste R. und R.._Q trägt, in der L-Form vorliegt, kann hergestellt werden durch Einwirken eines Blockierungsmi-ctels für die Aminfunktion oder eines aktivierten Derivats einer Säure der allgemeinen Formel IX oder ein^r Aminosäure der allgemeinen Formel III, worin R,- einen FettScl^rerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, auf das D-Monoamid der Benzyloxycarbonyl-D-meso-2,6-diamino-pimelinsäure, gefolgt von dem Ersatz des Benzyloxycarbonylrests, durch ein Wasserstoffatom, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen.

Die Aminosäure, das Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel VI, worin R^ einen Carbamoylrest bedeutet, R_q einen Alkyloxycarbonyl-

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rest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-narbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet und R₁₀ einen Fettsäurerest oder eine Cchutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminf^nktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Aminschutzgruppe, kanu erhalten wurden durch Einwirken unter üblichen Bedingungen einer Aminosäure der allgemeinen Formel III, worin Rj- ein Wasserstoffatom darstellt oder eines entsprechenden Aminoesters oder eines aliphatischen Alkohols, der 1-4 KoEilenstoffatome enthält, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder eines seiner Derivate, auf eine Aminosäure oder ein Dipeptid der allgemeinen Formel

Y - NH - CH - COOH

(CH.)- (XV)

I ^{2 3}

R - NH - CH -CONH

worin R_1Q wie vorstehend definxert ist und Y eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei men unter üblichen Bedingungen ■ arbeitet, worauf der Ersatz der Schutzgruppe Y durch ein Wasse^- stoffatom und gegebenenfalls der Estergruppe (die von dem Glycyl- oder n-Alanylrest getragen wird) durch eine Hydroxygruppe, ohne den Rest des Moleküxs anzugreifen, folgt. Insbesondere, wenn R₁₀ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält, sollte Y so gewählt sein, daß sein Ersatz durch das Wasserstoffatom erfolgt, ohne den Rest R₁₀ anzugreifen.

Das Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel VI, worin R. einen Carbanioylrest darstellt, R_Q einen Alkyloxycarbcnylrest mit 1-4

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Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest/ oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert, bedeutet und R₁ einen Fettsäurerest oder einen Glycyl- oder D-Alanyirest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fetts äur.erest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, kann erhalten werden durch Einwirken unter üblichen Bedingungen eines aktivierten Derivats einer Säure der allgemeinen Formel IX oder einer Aminosäure dor allgeme.vren Formel III, worin Rj. einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und R¹ einen Hydroxyrest bedeutet, auf eine Verbindung der allgemeinen Formel

Y-NH-CE-Rg

(CH ) (XVI)

NH₂ - CH - CONH₂

worin R_g wis vorstehend definiert ist und Y eine Schutzgruppe der Aiainfunktion bedeutet, wobei man unter üblichen Bedingungen arbeitet, worauf man die Gruppe Y durch ein Wasserstoffatom ersetzt, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen.

Die Aminosäure, das Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel Vi, worin Rg einen Carbamoylrest darstellt, R. einen Alkyloxycarbonylrest .nj t 1 - 4 Kohlenstoffatomen oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanyli-est, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen ggf. substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet und R._Q einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion substituiert ist, darstellt, kann erhalten werden durch Einwirken unter übli-

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chen Bedingungen einer Aminosäure der allgemeinen Formel III, worin !>.- ein Wasserstoff atom bedeutet und R¹ einen Hydroxyrest darstellt oder eines entsprechenden Aminoesters oder eines aliphatischen Alkohols mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest oder eines seiner Derivate auf eine Aminosäure oder ein Dipeptia der allgemeinen Formel *

Y-NH-CH-CONH

CH-COOH

worin R_1n wie vorstehend definiert ist und Y eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei man unter üblichen Bedingungen arbeitet, worauf man die Schutzgruppe Y durch ein Wasserstoflacom ersetzt und gegebenenfalls die Estergruppe (die von dem Glycyl- oder D-Alanylrest getragen wird) durch, einen Hydroxyrest ersetzt, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen. Insbesondere falls R₁₀ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält, sollte man Y derart wählen, daß sein Ersatz durch ein Wasserstoffatom erfolgt, -eisie den Rest R^_ anzugreifen.

Läßt man eine Aminosäure der allgemeinen Formel III, die gegebenenfalls verestert ist, auf eine Aminosäure der allgemeinen Formel XVa einwirken, so arbeitet man unter bekannten bzw. üblichen Bedingungen, die die Bildung einer Peptidbindung gestatten, ohne den Rest des Moelküls anzugreifen. Wenn man einen aliphatischen Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, reagieren läßt, so arbeitet man unter milden Veresterungsbedingungen, um die Schutzgruppen Y und R₁ nicht anzugreifen, und insbesondere nach der Methode von V. Bocchi, Synthesis, Seite 961 (1979).

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Das Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel VI, worin R_q einen Carbamoylrest darstellt, R. einen Alkyloxycarbonylrest oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrer-t, gegebenenfalls verestert, darstellt, und R. einen Fettsäurerest oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, kann erhalten werden durch Einwirkung unter üblichen Bedingungen eines aktivierten Derivats einer Säure der allgemeinen Formel IX oder siner Aminosäure der allgemeinen Formel III, worin R_g einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, und R¹ einen Hydroxyrest bedeutet, auf eine Aminosäure oder ein Dipeptid der allgemeinen Formel

Y-NH-CH-CONH₂

I _x (XVIa)

(CH₂)₃

H₂N-CH-R₄

worin R₄ wie vorstehend definiert ist und Y eine Schutzgruppe der Aminfvnktion daidtellt, wobei man unter üblichen Bedingungen arbeitet, worauf der Ersatz der Gruppe Y durch ein Wasserstoffatom folgt.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel XVI und XVIa können hergestellt werden nach üblicherweise in der Peptidchemie verwendeten Methoden zur Einführung einer Schutzgruppe der Aminfunktion, ausgehend von einer Aminosäure oder einem Dipeptid der allgemeinen Formel VI, worin einer der Reste R₄ oder R_g einen Carbamoylrest darstellt und der andere einen Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält, und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest oder einen N-Carbonyl-glycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls

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verestert, bedeutet, und R₁ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, gefolgt von dem Ersatz der Schutzgruppe R₁₀ durch ein Wassei3toffatom, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen. Insbesondere sind die Schutzgruppen der Aminfunktionen des 2,6-Diaminopimelinsäure-monoamids unterschiedlich und derart.gewählt, daß der Ersatz vor R₁ keinen Ersatz von Y mit sich bringt.

Das Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel VI, worin einer der Reste R.oder R „ein Wasserstoffatom darstellt und der andere einon GIycyl- oder D-Alan^lrest bedeutet und R_1Q einen Fettsäurerest oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion durch einen Fettsäurerest oder durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion substituiert ist, darstellt, kann hergestellt werden, ausgehend von L-Lysin, unter Anwendung der für die Herstellung des Di- oder Tripeptids der allgemeinen Formel VI, worin R_g einen Cavbamoylrest darstellt und R. und R₁₀ die entsprechenden Bedeutungen aufweist, angewendeten Methoden.

Die Aminosäure der allgemeinen Formel VII, worin R₇ einen Fettsäurerest darstellt, kann hergestellt werden durch Einwirken einer Säure der allgemeinen Formel IX oder eines aktivierten Derivats dieser Säure auf das L-Alanin, dessen Säurefunktion gegebenenfalls geschützt ist in Form eines Esters, gefolgt gegebenenfalls vom Ersatz der Esterfunktion durch die Carboxyfunktion, wobei man unter den vorstehend für die Einwirkung der Säure der allgemeiner Formel IX auf das Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel X beschriebenen Bedingungen arbeitet.

Das Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel VIII /.ann hergestellt werden durch Einwirkung unter üblichen Bedingungen eines Derivats der D-Glutaminsäure der allgemeinen Formel XI, deren Aminfunktion geschützt ist und worin R_R einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen" Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, auf ein Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel VI, worin eines der Symbole R. oder R_g ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-,

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Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonyl-rest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-'T'arbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und das andere ein Wassers to ff atom oder einen Carboxy-, Carbairoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkyltcil 1-4 Kohlenstoffatome enthält, und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, wobei es sich versteht, daß R. und Rg nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen und R₁₀ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt( wobei mindestens eines der Symbole R. oder R_Q und R._ einen Glycyl oder D-Alanylrest, wie vorstehend definiert, bedeutet) worauf gegebenenfalls der Ersatz des Rests Rg und/oder R₄ und/oder R_g (falls sie einen Alkyloxyrest mit 1-4 Köhlerstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenylrest darstellen oder enthalten) durch eine Hydroxy- oder Carboxygruppe, je nach fern vorliegenden Fall, onne den Rest des Moleküls anzugreifen, folgt. Falls R„ mit der Carbonylgruppe. an die es gebunden ist, eine Esterfunktion bildet und F.. und Rq eine Esterfunktion darstellen, kann es notwendig sein, daß die Reste Rg und R. und/oder R_q unterschiedlich sind und derart ausgewählt sind, daß der Ersatz eines der Reste R. oder R_ durch eine Carboxygruppe erfolgt, ohne den Rest R_ft und den anderen Rest R, oder R₀ anzugreifen. Beispielsweise kann einer der Reste R, oder R_Q einen Benzyloxycarbonylrest, eliminierbar durch Hydrogenolyse, darstellen und der Rest Rg kann einen Alkoxyrest bedeuten und der andere Rest R. oder R_g einen Alkyloxycarbonylrest, die unempfindlich gegenüber der Hydrogenolyse sind.

Das Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel X kann hergestellt werden unter üblichen Bedingungen durch Einwirken eines aktivierten Derivats des L-Alanins der allgemeinen Formel VII,

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worin R₇ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, auf ein Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Forme.¹ VIII, worin R_fi einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, eines der Symbole R₄ oder R„ ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonylrest, dessin Alkylteil 1 - 4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, wobei es &ich versteht, daß R. und R_q nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können und R₁₀ einen Fettsäurcrest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktiun substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt, ^T-.⁷obei es sich versteht, daß mindestens e:\ner der Reste R. oder R_g und R₁₀ einen Glycyl- oder D-Alanylrest, wie vorstehend definiert, darstellt und einer der Reste R-, oder R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält, worauf der ersatz des Rests R_ und/oder R₁ (falls sie eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten) durch ein Wasserstoffatom folgt und gegebenenfalls der Ersatz der Reste R~ und/oder R₄ und/oder R_g (falls sie eir.2n Alkyloxy- oder Alkylcxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch e.nen Phenyl-

oder ^enthalten oder Nitrophenylrest, darstellen^durcn eine Hydroxyl- oder Carboxygruppe, je nach dem vorliegenden Fall, ohne den Rest des Moleküls anzugreifen, folgt. Wenn die Symbole R₇ und R₁₀ Schutzgruppen der Aminfunktion darstellen oder enthalten, so ist es möglich, verschiedene Schutzgruppen zu wählen und sie so zu wählen, daß der Ersatz einer der Gruppen erfolgt, ohne die andere anzugreifen.

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Rp, R. und Rg eine Esterfunktion bilden, ist es möglich,

daß die Reste R₀, R. und R_ unterschiedlich sind und derart gewählt sind, daß der Ersatz eines der Reste R^ oder R_g durch einen Carboxyrest erfolgt, ohne den Rest R₀ und den anderen Rest

R₄ oder R₉ anzugreifen. Beispielsweise kann einer der Reste R. oder Rg einen Benzyloxycarbonylrest, der durch Hydrogenolyse eliminierbar ist, darstellen und der Rest R₀ einen Methoxyrest und

der andere Rest R, oder R_g einen Alkyloxycarbonylrest darstellen, die gegenüber der Hydr^oenolyse unempfindlich sind.

Das Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel X kann erhalten werden durch Einwirkung unter üblichen Bedingungen eines Dipeptids der allgemeinen Formel V, auf das Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel VI unter den vorstehend für die Herstellung des Tr-I- oder Tetrapeptids der allgemeinen Formel IV angegebenen Bedingungen, gefolgt von einer Entfernung der Schutzgruppen R₇ und/ oder R₁₀ unter den vorstehend angegebenen Bedingungen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I durch Peptidsynthese von Merrifield in fester Phase.

daß man Das Vorfahren besteht im wesentlichen darin,van einen geeigneten

Träger ein Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel

R₁₃-NH-CH-R₉

CH₂)₃ (XVII)

R₁₂-NH-CV-R₄

worin eines der Symbole R₄ und Rg einen Carbcxyrest oder N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonyl-

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rest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, R₁ „ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe für die Aminfunktion oder einer Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eix.a Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, und R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei es =;ich versteht, daß, wenn R_1? und R₁^ -^ine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enhalten, diese Schutztj^uppen unterschiedlich sind, fixiert, worauf man nach der Entblockierung der durch R₁- geschützten Aminfunktion kondensiert:

a)~entweder D-Glutaminsäure, deren Amin- und oC-Carboxyfunktionen in geeigneter Weise geschützt sind, d. h. die Verbindung der allgameinen Formel

,--NH-CH-CO-R₀

¹³ I ⁸ (XVIII)

CH₂CH₂-COOH

worin R., -, wie vorstehend definiert ist und R₀ einen Araino- oder

I ο ο

Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und anschließend nach der Entblockierung der durch R₁₃ geschützten Aminfunktion,

- entweder ein Derivac des L-Alanins der allgemeinen Formel

R₁₃-NH-CH-COOH

I (XIX)

^CH3

worin R₁₃ wie vorstehend definiert ist, und anschließend nach

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-*52 -

Entblockierung der durch R₁- und/oder R._? geschützten Aminfunktionen gegebenenfalls die Fettsäure der allgemeinen Formel IX,

- oder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R-NH-CH-COOH '

I (XX)

worin R einen Fettsäurerest darstellt, b)-oder das Dipeptid der allgemeinen Formel

R. . -NH-CH-CO-NH-CH-CO-R^

¹⁴ I I

CHCONH

I I

CH-

CH CH.-COOH

worin R_R wie vorstehend definiert ist und R.. . einen F?.ttsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei es sich versteht, daß,wenn R₁₄ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, diese unterschiedlich von der Schutzgruppe R₁- des

kann '²

Peptids der allgemeinen Formel XVII sain Vünd daß man anschlit_ssenä gegebenenfalls die Säure der allgemeinen Formel IX nach Entblockierung der durch die Reste R₁₄ und/oder R _ geschützten Aminfunktionen reagieren läßt, worauf man das erhaltene Produkt von seinem Träger trennt und, falls notwendig, Schutzgruppen von den Amin- und Carboxygruppen abspaltet.

Nach einer Abänderung des Verfahrens ist es möglich, an einen geeigneten Träger zu fixieren, das Peptid der allgemeinen Formel

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R₁-NH-CH-CO-R₀
Ij ι ο

CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₉

(CH^)₂

R₁₂-NH-CH-R₄

worin R., R, R_n und R,„ wie vorstehend definiert sind und R._c 4 ο y ._ Ij

eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei es sich versteht, daß, falls R_{1 ?} und R₁₁- jede eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten, diese Schutzgruppen unterschiedlich sind, worauf man die durch R₁^ geschützte Amiηfunktion entblockiert und kondensiert:

- entweder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel XIX und anschließend nach Entblockierung der durch R₁- und/oder R₁₂ geschützten Aminfunktionen gegebenenfalls die Fettsäure der allgemeinen Formel IX,

- oder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel XX, worauf man das erhaltene Produkt von seinem Träger trennt und falls notwendig die Schutzgruppen der Amin- und Carboxyfunktionen entfernt.

Gemäß einer weiteren Vatiante aes Verfahrens ist es mög.iich, an einen geeigneten Träger zu fixieren, das Peptid der allgemeinen Formel

R NHCHaO

CH- CH CH -CO-NH-CH-R₉

^J » (XXIII)

R₁₂-NH-CH-R₄

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worin R., Rgr R₉ und R₁ wie vorstehend definiert sind und R_{1 g} eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei es sich versteht/ daß, falls R₁ „ und R₁, jeder eine Schutzgruppe d<_r Aminfunktion darstellen und enthalten, diese Gruppen unterschiedlich sein können, worauf man nach Entblockieren der durch R₁, und/oder R₁₂ geschützten Aminfunktionen die Säure der allgemeinen Formel IX kondensiert und anschließend das erhaltene Produkt von dem Träger entfernt und falls notwendig die Schutzgruppen der Amin- und Carboxyfunktionen abspaltet.

Die Peptidsynthese. von Merrifield kann auch durchgeführt werden durch Fixieren an einen geeigneten Träger eines Produktes der allgemeinen Formel XVIII oder XXI, worin R₈ einen Hydroxyrest d?rstellt und die Symbole R₁^ und R₁. jeweils wie vorstehend definiert sind undder /-Carboxyrest geschützt ist, worauf man nach Entfernung der Schutzgruppe und anschließender Aktivierung der Säurefunktion das Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel XVII, dessen Amin- und Carboxyfunktionen in geeigneter Weise geschützt sind, einwirken läßt und anschließend gegebenenfalls eine Säure der allgemeinen Formel IX.

Wenn in der allgemeinen Formel I eines der Symbole R„ oder R. einen N-Carbonylglycyl- oder N--Carbonyl-D-alany lrest darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest substituiert, ist, bedeutet, so ist es möglich, an ejnen geeigneten Träger das Glycin oder das D-Alanin, dessen Aminfunktion geschützt ist, zu fixieren und anschließend nach Entblockierung der Aminfunktion eine Aminosäure ode_" ein Peptid der allgemeinen Formel

R₁₇-NH-CH-R₉

2⁾3 . (XXIV)

R₁₂-NH-CH-R

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worin R₁₂ wie vorstehend definiert ist und eines der Symbole R. oder R einen Carboxyrest darstellt und das andere ein Wasserstof fatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet und R₁₇ eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Rest einer D-Aminosäure der allgemeinen Formel

R. _ -NH-CiI CO -R_
18 j 8 _(XXV)

CH₂CH₂-COOH

worin Ii_R wie vorstehend definiert ist und R_{1 R} eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet oder einen Rest einer L-Aminosäure der allgemeinen Formel

R, Q-NH -CH -COOH
¹⁹ J (XXVI)

CH₃

worin R₁ _q eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder einen wie vorstehend definierten Fettsäurcrest, bedeutet, darstellt, wobei es sich versteht, daß, wenn R₁T, R₁₀ oder R_1n eine Schut^-

i / its ιy

gruppe der Aminfunktion, darstellen, diese Gruppe unterschiedlich von R.- ist, wenn diese eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält, wobei jedoch R₁ ~ identisch mit R_1q sein kann, zu kondensieren und:

- wenn R„_ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, diese Schutzgruppe abzuspalten und anschließend ?u kondensieren:

- entweder ein Derivat der D-Glutaminsäure der allgemeinen For-

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mel XXV₇ worin R₁₈ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, und anschließend nach Entfernung von'R._g ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel XXVI, worin R..- wie vorstehend definiert ist, zu kondensieren und, wenn R. und/oder R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, die Reste R.. ο und/oder R₁- zu entfernen und anschließend die Säure der allgemeinen Formel IX zu kondensieren,

- oder ein Derivat der D-Glutaminsäure der allgemeinen Formel

XXV, worin R„_o ein L-Aminosäurerest der allgemeinen Formel τ ο

XXVI ist, worin R₁- wie vorstehend definiert ist, und, wenn

R_1n und/oder R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt \ /.

len oder enthalten, die Reste R₁- und/oder R₁ „ zu entfernen und anschließend die Fettsäure der allgemeinen Formel IX zu kondensieren,

- wenn R₁- einen Rest einer Aminosäure der allgemeinen Formel XXV darstellt, worin R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet, diese Schutzgruppe zu entfernen und ein Derivat des L-Alanino der allgemeinen Formoi XXVI, worin R_1n wie vorstehend definiert ist, zu kondensieren, und, wenn R.._o und/oder R₁₂ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten, die Reste R₁O und/oder P _ zu entferne ι und anschließend die Fettsäure der allgemeinen Formel IX zu kondensieren und

- wenn R₁₇ einen Rest einer Aminosäure der allgemeinen Formel XXV

darstellt, "orin R₁₀ einen Rest einer L-Aminosäure der allge-

i ο

meinen Formel XXVI darstellt, worin R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet, die Roste R_1q und/o^er R₁ zu entfernen und anschließend die Fettsäure der allgemexnen Formel IX zu kondensieren.

Wenn in der allgemeinen Formel I R- einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt, dessen Aminfunktion gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurerest, so kann die Einführung eines derartigen Rests in irgendeiner Stufe der Merrifield-Synthese erfol-

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gen. Beispielsweise ist es möglich, an einen geeigneten Träger die Verbindung der allgemeinen Formel XVII zu fixieren, worin R eine Schutzgruppe der Aminfunktion unterschiedlich von Γ₁₃ ist, anschließend R.„ zu entfernen, ohne R₁₃ zu beeinträchtigen und ein Derivat des Glycins oder D-Alanins, dessen Aminfunktion substituiert ist durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder ein^n Fettsäurerest, zu kondensieren und nach Entfernung von R₁₃ das ProdukL der allgemeinen Formel XVIIIoder XXI unter Bedingungen identisch wie die vorstehenden zu kondensieren oder ist es auch möglich, an einen geeigneten Träger die Verbindung der allgemeinen Formel XVII zu fixieren, worin R₁ „ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt,und anschließend eine Verbindung der allgemeinen Formel XVITi oder XXI unter den vorstehend angegebenen Bedingungen zu kondensieren, worauf man R>₂ entfernt, das Glycin oder das D-Alanin, dessen Aminfunkt-xon durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Fettsäurerest substituiert ist, zu kondensieren.

Die Träger, die insbesondere geeignet sind, sind die Copolymeren von Styrol-DivinylbenzoJ, die chlormethyliert oder hydroxymethyliert sind. Vorzugsweise wird das chlormethylxerte Copolymere von Styrol-Divinylbenzol (98-2 oder 99-1) verwendet.

Die Fixierung der Peptide der allgemeinen Formel XVII, XVIII, XXI, XXII oder XXIII an den chlormethylierten Träger erfolgt nach üblichen Methoden, insbesondere durch Einwirken des Peptids der allgemeinen Formel XVII, XVIII, XXI, XXII oder XXIII, gelöst in einem organischen Lösungsmittel, wie Äthanol, in Anwesenheit eines Säureakzeptors, wie Triethylamin. Es ist bosonders vorteilhaft, das Reaktionsgemisch bis auf eine Temperatur von etwa der Siedetemperatur des Lösungsmittels zu erwärmen.

Die Schutzgruppen der Aminfunktionen der Peptide der allgemeinen Formel XVII, XVIII, XXI, XXII oder XXIII sind so zu wählen, daß ihre Entfernung erfolgt,. ohne die .Bindung Peptid-Träger zu beeinträchtigen. Insbesondere sollten die Reste R₁O/ ^Ri /' ^Ri κ

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R.g unterschiedlich vom Rest R^₂ sein, wenn letzterer eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält und sollten derart sein, daß ihre Entfernung erfolgen kann, ohne daß die Schutzgruppe R₁₂ und die Bindung von Peptid-Träger beeinträchtigt werden.

Im allgemeiner werden die Esterfunktionen, die durch R., R₀ oder

4 O

Rq dargestellt werden, so gewählt, daß bei der Aufspaltung der Bindung Peptid-Träger die Reste R,, R_g oder R_g entweder beibehalten werden können oder umgewandelt werden können in Carboxy- oder Carbamoylreste, je nachdem, ob die Spaltung eine saure Hydrolyse, eine Alkoholyse oder eine Ammonolyse ist.

Insbesondere wird die Bindung Peptid-Trüger, die benzylischer Natur ist, durch Behandlung mittels eines Gemischs von Bromwasserstoffsäure-Trifluoressigsäure unter Regenerierung einer Säurefunktxon gespalten.

Die neuen Tetra- oder Pentapeptide der allgemeinen Forir-el II können gegebenenfalls nach physikalischen Methoden (wie die Kristallisation oder Chromatographie) oder chemischen Methoden (wie die Salzbildung, dtssen Kristallisation una anschließende Zersetzung) gereinigt werden.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen können in ihre Additionssalze mit Säuren oder in Metallsalze oder Additionssalze mit organischer Basen, je nach der Natur der Substituenten umgewandelt werden.

Die Additionssalze mit Säuren können erhalten werden dvrch Einwirkung der neuen Verbindungen auf Säuren in einem geeigneten Lösungsmittel. Im allgemeinen macht man die Verbindung in Wasser löslich durch Zusatz der theoretischen Säuremenge und lyophilisiert anschließend die erhaltene Lösung.

Die Metallsalze oder die Additionssalze mit organischen Basen können hergestellt werden durch Einwirken der neuen Verbindungen

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auf anorganische oder organische Basen in einem geeigneten Lösungsmittel. Im allgemeinen macht man das Produkt in Wasser löslich durch Zusatz der theoretischen Basenmenge, worauf man die erhaltene Lösung lyophilisiert.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen sind Iiomunitats-Adjuvantien und -Stimulantien: sie steigern die Hypersensibilitätsreaktionen und/oder die Produktion zirkulierender Antikörper gegenüber Antigenen, mit denen sie verabreicht werden, und sie stimulieren in unspezifischer Weise die Abwehrreaktionen gegen bestimmte Infektionen, beispielsweise die Infektion der Maus mit dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes.

In vitro sind sie bei molaren Konzentrationen im allgemeinen von

— 3 — 8

10 bis 10 und insbesondere bei folgenden Untersuchungen wirksam:

- Stimulierung der DNS-Synthese (mitogene Wirksamkeit) nach der Technik von G. Marchai, Ann. Immunol. (Inst . Pasteur) 125 C, 519 (1974).

- Stimulierung der allogenen Re * „ion (Histo-Unvarträglichkeitsreaktion) nach de.: Technik von R. W. Dutton, J. exp. !!ed., 122, 759 (1966) und A. B. Peck und F. H. Bach, J. Immunol. Methods, 3, 147 (1973)

- Stimulierung der Antikörperproduktion nach der Technik von P. H. Klesius, Proc. Soc. exp. Biol. Med. (N.Y.), 135, 155

(1970) und H. van Dijk und N. Bloksma, J. Immunol. Methods, 14, 325 (1977)

- Vermehrung der Anzahl der phagozytären Makrophagen nach der Technik von Michl et al., J. exp. Med., 144,- 1465 (1976)

- Stimulierung der Aktivität der sauren Phosphatase und der N-Acetylglucosamidinase (lysosomiale Enzyme der Makrophagen)

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ohne Vermehrung der Milchsäuredeshydrogenase nach der Technik von P. Davies et al., J. exp. Med., 139, 1262 (1974).

In vivo steigern sie bei der Maus.bei Dosierungen von 1 bis 30 mg/kg die verzögerte Hypersensibilität und die Antikörperproduktion, insbesondere nacb der Technik vor» T. E. Miller et al. , J. Nath. Cancer Inst., 51, 1669 (1973).

Beim Meerschweinchen steigern sie die Hypersensibilitätsreaktion und die Produktion von Antikörpern gegenüber Rinder-gammaglcbulin, gekoppelt mit Hapten-Dinitrophenol nach der Technik von F. Floc'h et al., Immunol. Communic., 7, 41 (1978).

Bei der Maus stimulieren sie die Abwehrreaktionen gegenüber Infektioner, der Maus' durch Listeria monocytogenes bei Dosierungen von 1 - 100 mg/kg nach der Technik von R. M. Fauve und B. Hevin, CR. Acad. Sei. (D), 285, 1589 (1977).

Bei der Maus stimulieren sie das Veniögen zur Ausscheidung von kolloidaler Kohle durch das reticulo-endotheliale System nach der Technik von B. N. Halpern et al., Ann. Institut Pasteur, 80, 582 (1951).

Beim Kaninchen stimulieren sie in Dosierungen im allgemeinen von 0,1 bis 3 mg/kg die Bildung von Grippe-Antivirus-Serumantikörpern nach der Technik von G. H. Werner et al., Biomedicine, 22, 440 (1975).

Ein besonderes Interesse besteht an Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin R einen Alkanoylrest mit 8-16 Kohlenstoffatomen bedeutet, R₁ einen Hydroxyrest darstellt, R„ einen Carboxy-- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest darstellt, R. ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoylrest bedeutet und R_ ein Wasserstoffatom oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest darstellt.

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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können Komplexe mit den Alkali metallen oder Erdalkalimetallen bilden; daraus resultiert, daß Ergebnisse der Elementaranalysen der Vcrbindindungen stark von den theoretischen Werten abweichen können. Jedoch wird die Struktur der Verbindungen durch das Verhältnis C/N bestätigt, das mit der Theorie iibereinsti.nrvt_f sowie durch den Gehalt an Aminosäuren und durch ihre Homogenität bei der Chromatographie an einer SiIiciumdioxidgel-Dünnschicht.

Beispial 1

Man fügt 0,27 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf -5°C gehaltenen Lösung von 363 mg N-t-Butyloxvcarbonylglycin in 4o ecm Tetrahydrofuran und 0,29 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, worauf man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 1,26 g M - (N-Lauroy 1-L-alanyl-/-D-glutamyl>-DD,LL-2 ,6-diaminopimelinsäure-monoamid-hydrochlorid in einem Gemisch von 14,5 ecm Wasser und 6,2 ecm 1n-Natriumhydroxid zufügt. Das Reakt.ionsgemiscr. wird 20 h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40°C; ^.as Konzentrat wird auf etwa 10 C gekühlt, durch Zusatz von 1n-Chlorwasserstoffsäure auf deu pH-Wert 2 angesäuert und anschließend viermal mit insgesamt 400 cciii Äthylacetat extrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit 20 ecm Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene Rückstand wird in 50 ecm Äther trituriert, bis zur völligen Pulverisierung. Nach dem Filtrieren und Trocknen unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) erhält nan 1,11 g eines Pulvers, zu dem man 440 mg einer Verbindung fügt, die unter den gleichen Bedingungen hergestellt

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wurde und man chromatographiert an 77 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,0635-0,20 mm), enthalten in einer Säule von 2,3 cm Durchmesser. Man eluiert nacheinander mit 120 ecm Äthylacetac., 210 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (9-10 VoI)^ 120 ecm eines Gemischs von Ät-hylacetat-Methanol (85-15 VoI), 120 ecm eines Gemichs von Äthylacetat-Methanol (8-2 VoI), 90 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (7-3 VoI), 240 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (6-4 VoI) und 150 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 30 ecm gewinnt. Die Fraktionen 15-34 werden vereint, unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40⁰C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 50 ecm Äther trituriert, durch FiI-

2 trieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 1,12 g N -(N-Lauroyl-L-alanyl-5-D-glutamyl)-N -(N-t-butyloxycarbonylglycyl)-DD,LL-2, 6-diamino-pimelinsäure-inonoamid.

Rf = 0,56 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Man löst 1,12 g N²-(N-Lauroyl-L-alanyl-# -D-glutamyl)-N⁶-(N-tbutyloxycarbonylglycyl) -DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid 'in 5 ecm einer wasserfreien 1,65 n-Chlorwasserscoffsäurelösung in EssigsLure. Man rührt 4 h bei einer Temperatur von etv?a 20 C und fugt anschließend das Reaktionsgemisch zu 100 ecm wasserfreiem Äther. Die erhaltene weiße Ausfällung wird durch .!filtrieren

abgetrennt, mit 20 ecm Äther gewaschen und unter verringerten Druck (20 ininHg; 2,7 kPa) getrocknet. Man erhält so 1,05 g eines weißen Pulvers, das man an einer Säule von Sephadex G 15 (Durchmesser 2 cm, Höhe 2 m) chromatographiert. Man eluiert mit Wasser und sammelt Fraktionen von 14 ecm. Die Fraktionen 26 bis 29 werden vereint und lyophilisiert. Man erhält so 0,5 g des Hydrochlorids von N -(N-Lauroyl-L-alanyl- 0 -D-glutamyl)-N -giycyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid).

Rf = 0,29 /"siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

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Analyse:

berechnet: C 52,36, H 8,03, N 12,63 gefunden: C 52,5, H 7,0.- N 12,4

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse an einem Technicon-Autoanalysator die Anwesenheit der folgenden Aminosäuren:

AIa 1,10 (Theorie = 1)

Dap 1,01 (I'i'.eorie = 1)

GIu 1,12 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Das N -(N-Lauroyl-L-alanyl-C -D-glutamyl)-DD,LL-2,6-diaminopimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 4,07 g N²-/~O¹--Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)- /f -D-glutamyl /-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monc ■ amid in 200 ecm Essigsäure. Man fügt 4 g Palladium auf Kohle (mit 3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 7 h durch. Nach dem Filcrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,1 kPa) zur Trockne bei 60 C wird die erhal^-^e Meringe insgesamt mit 45 ecm Methylcyclohexan aufgenommen und jedesmal unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60°C zur Trockne gebracht. Das so erhaltene Pulver wird unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 50⁰C getrocknet. Man erhälL 2,76 g N-(N-Lauroyl-L-alanyl-f-D-glutamyl)-DD,LL-2,6-diaminopimelinsäure-monoamid. Rf=O,49( Siliziumdioxid: Essigsäure).

Anal' se: berechnet: %C 56,72 H 8,64 N 12,25 gefunden ; 53,4 -8,5 10,9

Nach der Gesamthydrolyse ergibt die Analyse am Technicon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren: AIa 1,00 (Theorie = 1)

Dap 0,99 (Theorie = 1) . GIu 1,05 (Theorie = 1)

Das N -/~0¹-Benz:'1-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- 0-D-glutamyl_7-N⁶-

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benzyloxycarbonyl-DD/LL-2/6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 3,17 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei etwa 1O°C gehaltenen Lösuag von 11,96 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 490 ecm Dioxan und 3,43 ecm Triäthylamin. Die Lösung wird 20 Minuten bei etwa 1O°C gerührt, und anschließend fügt man eine Lösung von 8,87 g N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoarid von 88,d % (Perchlorbestimmung) in einem Gemisch von 219 ecm Wasser und 24,4 ecm In-Natriumhydroxid zu. Bas Reaktionsgemisch wird 2 h bei einer Temperatur von etwa 10 C und anschließend 15 h bei einer Temperatur von etwa 2ⁿ C gerührt und anschließend filtriert. Zu dem Filtrat fügt man 360 ecm Wasser und trennt einen geringen Anteil an unlöslichem Produkt durch Filtrieren ab. Das Filtrat wird durch Zusatz von 49 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 angesäuert. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 750 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 16,3 g eines weißen Pulvers, das man an 800 g neutralem Silicimdioxidgel (0,0635-0,20 mm) , das sich in einer Säule von 6 cm Durchmesser befindet, Chromatographiert. Hierfür löst man die 16,3 g Pulver in 800 ecm Methanol und fügt zu der erhaltenen Lösung 160 ecm Fontainebleau-Sand. Man verdampft; das Gemisch unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 kPa) bei 60 C zur Trockne und bringt den so erhaltenen Rückstand auf die Siliciumdioxidsäule auf. Man eluiert nacheinander mit 1 1 Äthylacetat, 4 1 eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (9-1 VoI), 7 1 eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (85-15 VoI) und 4 1 eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 250 ecm sammelt. Die Fraktionen 45 bis 60 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 9,4 g des N -£~0 -Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)- ]f -D-glutamyl_7-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamids.

Rf = 0,83 [_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-

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Wasser (50-20-6-24 VoI) J

Das Ber.zyl-N-lauroyl-L-alanyl- u -D-glutamat kann nach einer der beiden folgenden Methoden hergestellt werden:

a) Zu einer Lösung von 12,75 g des Hydrochloride von Benzyl-L-alanyl- oL -D-glutamav in 75 ecm In-Natriumhydroxid fügt man gleichzeitig während 37 Minuten 8 g Lauroylchlorid, gelöst in 75 ecm Äther und 37,4 ecm In-N^criumhydroxid, so daß der pH-Wert des Reaktionsgemischs bei 8-9 gehalten wird. Das Gemisch wird 1 h 20 Min. gerührt. Nach dem Dekantieren wird die wässrige Phase auf den pH-Wert 2 durch Zusatz von 60 ecm 1n-Chlorwas<=2rstoffsäure angesäuert und dreimal mit insgesamt 300 ecm Äthylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereint, mit 25 ecm Wasr-er gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bt=i 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 7,4 g eines weißen Feststoffs, den man an 80 g neutralem Siliciumdioxidgel, enthalten in einer Säule von 2 cm Durchmesser, chromatographiert. Vzn eluiert nacheinander mit 100 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (8-2 VoI) und 200 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm sar"-.ielt. Die Fraktion 1 wird unter verringertem Druck {20 mmHg; 2,7 kPa) bei45°C zur Trockne verdampft. Man erhält so 2 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl- ti -D-glutamat vom Fp = -73O⁰C. Die Fraktionen 2-4 werden in gleicher Weise ?ur Trockne konzentriert und an 100 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,063-0,2C mm), enthalten in einer Säule von 2 cm Durchmesser, chromatographiert. Man elui.*rc mit 250 ecm Aceton und sammelt Fraktionen von 25 ecm. Die Fraktionen 1 uiJ 2 werden unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Ma.u erhält so 4,07 g Benzyl-N-lauroyl-L-alany 1-Ct -D-glutamat Vi
angegeben sind:

Ct-D-glutamat vom Fp 130°C, dessen Charakteristika im folgenden

Rf =0,9 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-

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Wasser (50-20-6-24 VoI) J

Analyse:

berechnet: C 66,10 H 8,63 N 5,71 gefunden: C 66,3 H 8,8 N 5-fJ

b) Man fügt 31 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei einer Temperatur von etwa 10°C gehaltenen Lösung von 47,75 g Laurinsäure in 3 1 Dioxan und 33,3 ecm TriäLhylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 10⁰C gerührt und anschließend fügt man während 10 Minuten eine auf 10⁰C gekühlte Lösung von 88,95 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-c/-D-glutamat in einem Gemisch von 1 1 Dioxan, 476 ecm Wasser und 476 ccmfn-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h .bei 10 C und anschließend 18h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Schließlich verdünnt man durch Zusatz von 4 1 Wasser, angesäuert durch Zusatz von etwa 475 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 und hält 2 h bei 0 C. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, nacheinander mi c 500 ecm Wasser und 500 ecm Äther gewaschen und anschließend unter verringerten» Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20⁰C getrocknet. Das Produkt wird in 800 ecm Äther suspendiert, 1 h gerührt, durch Filtrieren abgetrennt und zweimal mit insgesamt 200 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C erhält man 71,79 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-Od-D-glutaroat vom Fp = 130°C.

Rf = 0,77 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol H-1 VoI)J

Das Hydrochlorid des Benzyl-L-alanyl-«C-D-glutamats kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 9 7,16 g Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl-^d.-D-glutamat in 970 cot einer wasserfreien Lösung von 1,7n-Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure. Man rührt 2 h und fügt anschließend

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rasch 3,8 1 wasserfreien Äther zu und läßt während 2 h auf O C. Die ölrge Ausfällung, die sich bildet, wird von der. übrigen Flüssigkeit durch Dekantieren abgetrennt und in 500 ecm Aceton gelöst. Die so erhaltene Lösung wird unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 ^vPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 88,9 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-öl -D-glutamat.

Das Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-L-alpnyl-o£--D-glutamat kann nach der Methode von E. Bricas et al·, Biochemistry ?, 823 (1970) hergestellt werden.

Das N -Benzyloxycarbonyl-DDiLL^^-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Zu einer Lösung von 9,7 g des Dihydrochlorids des DD,LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamids in 63 ecm Wasser, das durch 37 ecm 1n-Natriumhydroxid auf den pH-Wert 10 gebracht worden war, fügt man 4,35 g Kupfer-II-bromid, gelöst in 44 ecm Wasser. Man rührt das Reaktionsgemisch 2 h bei etwa 20⁰C. Man trennt durch Filtrieren eine geringe Menge unlöslichen Materials ab und kühlt anschließend das Filtrat auf eine Temperatur von -3 bis 0⁰C. Man fügt 9,2 g Natriumbicarhonat unu anschließend tropfenweise während 30 Minuten 7,9 ucm Benzylchlorformiat zu. Das Reaktionsgemisch wird 18h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Der gebildete blaue Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 15 ecm Wasser,zweimal mit insgesamt 30 ecm Äthancl und 15 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter verringerter. Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C erhält man 9,6 g des Kupfer-II-komplexes des N - Be η zy Io xy carbonyl-DD, LL-2 , 6-diaiaino-pimelinsäuremonoamids, den man zu 60 ecm 1n-Chlorwassersroffsäure fügt. Man rührt 1 h bei einer Temperatur von etwa 20°C. Das unlösliche Material wird durch Filtrieren abgetrennt. Zu dem Filtrat fügt man 30 ecm Methanol und läßt anschließend einen Strom von Schwefelwasserstoff während 1,5 h durchleiten. Man läßt 16 h stehen. Die erhaltene schwarze Brühe wird filtriert und viermal mit insgesamt 160 ecm Wasser gewaschen. Die vereinten Filtrate werden

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bis auf ein Volumen von 30 ecm unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C konzentriert, durch Zusatz von 7,5 ecm Triäthylamin auf den pH-Wert 9 gebracht, durch Zusatz von 20 cc:u Wasser verdünnt und durch Zusatz von 5,5 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wer+- 6 gebracht. Die erhaltene weiße Brühe wird zwei Stunden bei 0⁰C stehengelassen. Das Produkt, das sich abscheidet, wird durch Filtrieren abgetrennt und nacheinander mit 20 ecm Wasser una 20 ecm Äthanol gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet. Man erhält so 5,8 g des N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-piiaelinsäure-monoamids, 96 % (Perchlorbestimmung) .

Das Dihydrochlorid des DD,LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamids kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 83 g DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäuremonoamid in einem Gemisch von 1,6 1 Methanol und 14,6 ecm konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (d = 1,19). Man fügt 83 g Palladium auf Kohle (mit 3 % Palladium) zu und läßt einen Wasserstoffstrom 10 h durchleiten. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) zur Trockne bei 60 C erhält man 40,5 g des Dihydrochlorids des DD,LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoaraids in der Form einer Meringe.

Das DD,LL-2,e-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 168 g des Monobenzylesters der DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäure in 1,68 1 Methanol. Man

kühlt diese Lösung auf etwa 0 C und sättigt ^ie mit Ammoniak. Wenn sie gesättigt ist, füllt man sie in drei Autoklaven von 1 1 um. Nach dem Schließen der Autoklaven läßt man 40 h bei etwa 20 C. Nach dem Entgasen wird die so erhaltene Lösung unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 60°C kenzentriert -Der Rückstand wird in 2 1 Wasser· gelöst, und die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 4n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 gebracht. Es bildet sich ein gummiartiger Niederschlag, den man

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durch Dekantieren isoliert, mit 2 1 Äther trituriert, durch Filtrieren abtrennt, zweimal mit insgesamt 400 ecm Äthe->- und zweimal mit insgesamt 400 ecm wasser wäscht. Nach dem Trocknen erhält man 83,5 g DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäuremonoamid vom Fp = 145-15O°C.

Rf = 0,69 l_ Siliciumdicxidgel; n-Butanol-Äthanol-Wasser-konzentriertes Ämironiak (4-4-1-1 VoI) _/

Den Monobenzylester der DD,LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylaminopimelinsäure stellt man her nach der Methode von A. Arendt et al., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 1305 (1974) [_ Chem. Abstr., 82, 31497 g (1975)_/.

Beispiel 2

Man fügt 0,42 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei O⁰C gehaltenen Lösung von 557 mg N-t-Butyloxycarbonylglycin in einem Gemisch von 60 ecm Tetrahydrofuran und 0,45 ecm Triäthylamii:. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0⁰C gerührt, worauf man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 1,68 g No^-£N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glut£.myl_7~L-lysin in einem Gemisch von 14 ecm Wasser und 6,36 ecm 1n-Natriumhydroxid zufügt. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei 0 C und anschließend 18h bei etwa 20°C gerührt. Es wird anschliessend unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40⁰C zur Trock-c konzentriert. Der Rückstand wird mit 60 ecm Wasser aufgenommen, durch Zusatz von 7 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 gebracht. Die so erhaltene wässrige Phase, die eine ölige Ausfällung enthält, wird viermal mit insgesamt 20. Äthylacetat extrahiert. Die organischen vereinten Phasen werden mit 25 ecm Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat: getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kP?) bei 40°C zur Trockne erhält man 2,9 g eines Produkts, das man an einer Säule von 2 cm Durchmesser mit 60 g

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neutralem Siliciumdioxidgel chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 150 ecm Äthylacet^t, 200 ecm eines Gemische von ÄthylrtCetat-Methanol (95-5 VoIj, 50 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (9-1 VoI) und 300 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (8-2 VoI) , wobei r^an Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Traktionen 9-15 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40°C zur Tiockne konzentriert. Man erhält so 1,44 g No^- / N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-/-D-gluteTiyl_7- - (t-butyloxycarbonyIgJycyl)-L-Iysin.

Rf = 0,55 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Man löst 1,44 g N©6 -/~N- (N-Lauroyl-L-alanyl)- ί -D-glutamyl_7-N£

-(t-butyloxycarbonylglycyD-L-lysin in 22 ecm einer wasserfreien Lösung von 1,7 η-Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure. Man rührt 2 h und anschließend fügt man 2 20 ecm wasserfreien Äther zu. Die erhaltene Ausfällung wird abfiltriert, mit 20 ecm wasserfreiem Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,15 mmHg; 0,02 kPa) bei 20°C getrocknet. Man erhält so 1,31 g einer, weißen Pulvers, das man in 5 ecm Wasser löst und an Sephadex G 10 (Säule von 2,5 cir. Durchmesser und 2 m Höhe) chromatographiert. Man elui^rt mit 400 ecm Wasser, wobei man Fraktionen von 14 ecm sammelt. Die Fraktionen 23 bis 28 werden vereint und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 50 ecm Wasser und 1,5 ecm In-Chlorwasserstoffsäure gelöst und erneut lyophilisiert. Man erhält so 710 mg des Hydrochlorids von N-c£ -(_ N-(N-Lauroyl-L-alanyl) -/-D-glutamyl_7-N£' -glycyl-L-lysin.

Rf = 0,25 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J.

Analyse:

berechnet: C 54,05 H 8,42 Cl 5,70 N 11,26 % gefunden: C 54,0 H 7,9 Cl 5,4 N 11,2 ξ

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Nach Gesamthydrolyse zeigt die Technikon-Autoanalysatoranalyse die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 0,99 (Theorie = 1)

GIu 1,04 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

T.ys 0,97 (Theorie = 1)

Das No^ ~/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-If-D-glutamyl_7-L-lysin kann nach einer der folgenden Methoden hergestellt werden:

a) Man löst 1,77 g Nod -/~0¹-Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)-/*-D-glutamyl_/-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysin in 177 ecm Methanol. Man fügt 1,77 g Palladium auf Kohle (mit 3 % Palladium) zu und leitet anschließend einen leichten Wasserstoffstzom während 4 h durch. Nach dem Filtrieren, Konzentrieren des Filtrats zur Trockne wird der ölige Rückstand mit 20 ecm Aceton aufgenommen. Man erhält so 1,06 g eines weißen Feststoffs, den man aus einer;; Gemisch von 12 ecm Äthanol und 24 ecm Aceton umkristallisiert. Man erhält so 0,9 g No<j -/ N- (N-Lauroyl-L-alanyl)-ö -D-glutamyl_7-L-lys-^;" vom Fp 18O-186°C (pastenform!- ges Schmelzen).

Rf = 0,29 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse: berechnet: %C 59,07 H 9,15 N 10,60 gefunden : 58,4 8,8 10,0

— 1

b) Man löst 2,65 g Benzyl-Nt^ - [_ 0 -benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)-

J -D-glutamyl7-Nff -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in L^Ii ecm Essigsäure. Man fügt 2,65 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h ein. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 1,81 g NoC -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7-L-lysin, identisch mit dem vorstehend unter a) erhaltenen Produkt.

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Das NoC ~i 0 -Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-ö -D-glutamyl_7-N£' benzyloxycarbonyl-L-lysin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 1,88 ecm Isobutylchlorformiat zu einer Lösung, die bei 1O°C gehalten wird, von 7,03 g Benzyl-^T-lauroyl-L-alanyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 280 ecm Dioxan und 2,0 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 10⁰C gerührt und anschliessend fügt man eine Lösung von 4,04 g N£~ -Benzyloxycarbonyl-L-lysin in einem Gemisch von 30 ecm Dioxan und 14,4 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 20 h bei etwa 18 C gerührt. Das gebildete unlösliche Material wird durch Zugabe von 280 ecm Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird noch 1 h gerührt und anschließend durch Zusatz von 20 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 3 angesäuert. Das gebildete unlösliche Material wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 20 ecm Wasser gewaschen und unter einem verringertem Druck von 0,3 mmHg (0,04 kPa) bei 20 C getrocknet. Man erhält so 7,72 g eines weißen Feststoffs, den man an einer Säule von 3,5 cm Durchmesser, die 230 g neutrales Siliciumdioxidgel enthält, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 700 ecm eines Aceton-Cyclohexan-Geiiischs (9-1VoI) , 1,1 1 Aceton und 1,7 1 Methanol, wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 22 bis 35 werden vereint, unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 5,97 g Nr>£ ~l~0 -Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7~N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysin.

Rf = 0,84 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das n£ -Benzyloxycarbonyl-L-lysin kann nach der Methode von A. Neuberger et al., Biochem. J., 37, 515 (1943) hergestellt werden.

Das Benzyl-Noi. -/~N-(0 -benzyl-N-lauroyl-L-aianyl)-/ -D-glutamyl_7~ N£" -benzyloxycarbonyl-L-lysinat kann auf folgende Weise hergestellt

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— *7 ·" —

werden:

Man fügt 0,65 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf-10°C gehaltenen Lösung von 2,45 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 80 ecm Tetrahydrofuran und 0,70 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -1O°C gerührt, und anschließend fügt man eine; auf -10⁰C gekühlte Lösung von 2,24 g des Hydrochlorids von Benzyl-N£ -ben^yloxycarbonyl-L-lysinat i-ⁿ einem Gemisch von 40 ecm Tetrahydrofuran und 0,77 ecm Triäthylamin zu. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei -10 C und anschließend 2 Tage bei etwa20 C gerührt. Man konzentriert darauf das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40°C zur Trockne. Der erhaltene weiße Feststoff wird in 100 ecm Äthylacetat bei 40 C aufgenommen, bis zur Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt, erneut in 50 ecm 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druok (0,3 mniHg; 0,02 kPa) getrocknet. Man erhält so 2,69 g Benzyl-IStoo -/~N- (0¹-benzyl-N-lauroyl-L-alanyl)- f-O-glutamyl_/-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat.

Rf = 0,80 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (9-1 Vol)_7

Das Benzyl-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat kann nach der Methode von T. Shiba et al., Bull. Chem. Soc. Japan, 33, 1721 (1960) hergestellt werden.

Beispiel 3

Man fügt 0,48 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei etwa -10°C gehaltenen Lösung von 1 ,82 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-ö^ -D-glutamat in einem Gemisch von 90 ecm Tetrahydrofuran und 0,52 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -10°C gerührt und anschließend fügt nan eine auf -1O°C gekühlte Lösung von 1,74 g Benzyl-N£ -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysinat in 90 ecm Tetra-

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OR!O!MAL INSPECTED

hydrofuran zu. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei einer Temperatur von -1O bis O⁰C und anschließend 18 h bei etwa 2Ö°C gerührt. Man erhält eine Reaktionsmasse von gelatineartigem Aussehen/ die man unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40⁰C zur Trockne konzentriert. Man nimmt den Rückstand in einem Gemisch von 50 ecm Äthylacetat , und 50 ecm Wasser auf, rührt, trennt das unlösliche Material durch Filtrieren ab und wäscht nacheinander zweimal mit insgesamt 50 ecm 0,1 n-Natriumhydroxdd und mit 25 ecm Wasser. Nach dem Trocknen wird das unlösliche Material vierrad¹, mit insgesamt 100 ecm Äthylacetat bei 20⁰C und anschließend mit 25 ecm Äthylacetat von 75°C gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 1,51 g Benzvl-Nc*l· -/ 0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- Q -D-glutamyl_7-N£! -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysinat.

Die Äthylacetat-Waschphase (125 ecm) wird auf eine Säule von 3 cm Durchmesser mit 150 g neutralem Siliciumdioxidgel aufgebracht. Man eluiert mit 835 ecm Äthylacetat, 320 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Essigsäure (95-5 VoI) und 400 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Essigsäure (90-10 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 34 - 38 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 0,42 g Benayl-NoC- -[_ 0'-benzyl--N-(N-lauroyl-L-alany])- Q -D-ülutamyl_7-N£ -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysinat.

Rf = 0,84 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (8-2 VoI) J/

Man löst 1,93 g Benzyl-Noc -/~0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-β -D-glutamyl_/-N£ -(benzyloxyoarbonylglycyl)-L-lysinat in 100 ecm Essigsäure. Man fügt 1,93 g Palladium auf Koule (mit 3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne wird das verbleibende Öl in 50 ecm Äther triturisi-t. Man erhält eine Ausfällung, die durch Fi-ltrieren abgetrennt und in 15 ecm Essigsäure gelöst wird. Diese Lösung wird filtriert, und man fügt an-

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schließend zu dem Filtrat 100 ecm Äther. Nach 3Ominütigem Rühren wird die erhaltene Ausfällung -furch Filtrieren abgetrennt. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (0,15 mitiHg; 0,02 kPa) bei 2O°C erhält man 1,16 g Νβ6 -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_/-N£ -glycyl-L-lysin vom Fp = 140 - 142°C (pastenförmiges Schmelzen)

Rf = 0,31 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 vol)J

Analyse:

berechnet: C 57,41 H 8,78 N 11,96 % gefunden: C 55,3 H8,6 Ν1Ί,2 %

Nach Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Abwesenheit von folgenden Aminosäuren:

AIa 1,00 (Theorie = 1)

CIu 1,11 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Lys 0,95 (Theorie = 1)

Das Benzyl-N£ -(N-benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysinat kann hergestellt werden nach der Methode von M. Khosla et al., J. Sei. Ind. Res. (India) 21 B, 318 (1962).

Beispiel 4

Man fügt 0,13 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf -10 C gehaltenen Lösung von 491 mg Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-d-D-glutamat in einem Gemisch von 25 ecm Tetrahydrofuran und 0,14 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 10 Minuten bei -1O°C gerührt,und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 337 mg N£ -(Benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysin in 25 ecm Tetrahydrofuran

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und 1 ecm In-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsmedium wird 2 h bei 1CC und anschließend 20 h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Es wird anschließend durch Zusatz von 2 ecm InChlorwasserstoff säure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40⁰C. Die wässrige verbleibende Lösung wird mit 50 ecm Äthylacetat extrahiert, die organische Phase wird zweimal mit insgesamt 20 ecm 0,1 n-Chlorwasscrstoffsäure und 10 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40°C zur Trockne erhält man 600 ma eines weißen Feststoffs, der an einer Säule von 2 cm Durchmesser mit 30 g neutralem Siliciumdioxid chromatographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 60 ecm Äthylacetat, 100 ecm eines Gemischs von Äth^lacetat-Methanol (9-1 VoI), 60 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (8-2 VoI) und 80 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Methanol (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 10-13 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45 C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 430 mg Ne£ -/ 0 Benzy1-N-(N-lauroy1-L-alanyl)-f-D-glutamy1_7~N£ -(benzyloxycarbonylglycyl) -L-lysin

Rf = 0,77 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Essigsäure-Wasser (7-1-2 voi)_7

Man löst 420 mg N©6 -/"θ -Benzy1-N-(N-lauroy1-L-alanyI)- /-D-glutamyl_/-N£ -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysin in 25 ecm Methanol. Man fügt 420 mg Palladium auf Kohl~ (mit 3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom 3 h durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats zur Trockne erhält man 270 mg Nod- -/ N- (N-Lauroyl-L-alanyl)- Q -D-glutamy1_7~ ^NC -glycyl-L-lysin.

Das NC. -(Benzyloxycarbonylglycyl·)-L-lysin kann nach der Methode von D.Theodoropoulos J.Org.Chem. 23, 140 (1958) hergestellt werden.

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Beispiel 5

Man fügt 1,2 ecm Isobutlychlorformiat zu einer, auf 1O°C gehaltenen Lösung von 4,4° g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-öc-D-glutair.at in einem Gemisch von 180 ecm Dioxan und 1,3 ecm Triäthylamin. Die Lösung wird 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 1O°C gerührt und anschließend fügt man eine auf 1O°C gekühlte Lösung von 4,09 g des Hydrochlorids von Benzyl-N£ -benzyloxycarbcnyl-L-lysyl-D-aj.aninat in einem Gemisch von 30 ecm Dioxan und 5 ecm Wasser und 1,3 ecm Triäthylamin zu. Das Reaktionsgemisch wird 20 h bei einer Temperatur von etwa 20⁰C gerührt. Man fügt darauf 500 ecm Wasser zu und kühlt das Gemisch auf 0⁰C. Nach 2 h bei 0⁰C wird das unlösliche Material durch Filtrieren abgetrennt, mit 100 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 7,86 g Benzyl-Nco

- 1 J-

-/ 0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-q -D-glutamyl_/-N^ -benzyl-

oxycarbonyl-L-lysyl-D-alaninat.

Rf = 0,92 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol-(4-1- Voⁿ)_7

Man löst 7,80 g Benzyl--N<si -/_ 0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-

j-D-glutamyl_/-N6 -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-D-alaninat in einem Gemisch von 250 cun Methanol und 530 ecm Dioxan. Man fügt 7,80 c Palladium auf Kohle (miⁱ: 3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom 5 h durch. Man stellt eine Kristallisation am Palladium auf Kohle fest. Der Katalysator wir^. durch Filtrieren abgetrennt, mit 100 ecm eines Gemischs von Methanol-Dioxan (1-2 VoI) und anschließend mit fünfmal insgesamt 500 ecm Methanol gewaschen, wodurch dar. kristallisierte Produkt mitgeschleppt wird. Die methanolische Phase wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält 1,5 g eines Pulvers, das chromatographiert wird an einer Säule von Sephadex LH 20 (Durchmesser 2 cm, Höhe 2 m). Man eluiert mit Methanol und gewinnt Fraktionen von 5 ecm. Die Fraktionen 41 bis 69 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,-7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Men löst den Rückstand in

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50 ecm siedendem Methanol und fügt anschließend 120 ecm Dioxan zu. Man läßt auf eine Temperatur von etwa 20 C ansteiger. Nach 5tägigem Stehen wird der aufgetretene Niederschlag durch Filtrieren abgefällt, mit 10 ecm Diox?n gewaschen und anschließend unter verringertem Druck (0,2 mmHg; 0,027 kPa) bei 60⁰C getrocknet. Mr.n erhält so 1,37 g Ne£ -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- (-D-glutamyl_7-L-lysyl-D-alanin vom Fp = 170°C (pas⁴-unförmiges Schmelzen) .

Rf = 0,26 / Siliciumdio:d.dgel; n-Butanol-Pyridin-Ecsigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 58,07 H 8,91 N 11,68 % gefunden: C 57,4 H8,9 N 11,4 %

Nacn der Gesamthydrolyse ergibt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 2,00 (Theorie = 2)
GIu 1,04 (Theorie = 1)
Lys 1,01 (Theorie = 1)

Das Hjdrochlorid von Benzyl-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-D-alaninat kann hergestellt werden nach der Methode von S. Kusumoto et al., Bull. Chem. Soc. Japan- 49, 533 (1976).

Beispiel 6

Man fügt 1,3 ecm Isobutylchlorformxat zu einer bei 10°C gehaltenen Lösung von 4,91 g Beiizyl-N-lauroyl-L-alanyl-o^-D-glutamat in einem Gemisch von 200 ecm Dioxan und 1,4 ecm Tritähylamin. Die Lösung wird 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa. 10⁰C gerührt, worauf man eine Lösung von 4,64 g des Hydrochlorids von Benzyl-

Q30062/0905

302Α281

Ν£ -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-glycinat in einem Gemisch von 30 ecm Dioxan und 5 ecm Wasser und 1,4 ecm Triäthylamin zufügt. Das Reaktionsgemisch wird 20 h bei etwa 20 C gerührt. K_on gießt darauf das Reaktionsgemisch in 500 ecm Wasser. Das gebildete unlösliche Material wird abfiltriert, mit 50 ecm Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 8,94 g eines weißen Pulvers, das in 500 ecm Dimethylformamid bei 60^cC gelöst wird. Man fügt 500 ecm Wasser zu. Nach dem Abkühlen auf 0 C wird das unlösliche Material abfiltriert, abgesaugt, mit '00 ecm Wasser gewaschen and schließlich getrocknet. Man erhält so 6,26 g

— 1 / —

-N^c -/ 0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-Q ~D-glutamyl_/-

-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-glycinat.

Rf = 0,89 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (5-1 VoI)J

— 1

Man löst 6,20 g Benzyl-Nei -/ 0 -benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl) -<j D-glutamyl_/-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-glycinat in einem Gemisch von 425 ecm Dioxan und 125 ecm Methanol bei 60°C. Man kühlt die Lösung auf 40°C und fügt 6,20 g Ealladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet anschließend einen Wasserstoffstrom 4 h durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 ir.-nHg; 2,7 kPa, ~ur Trockne bei 50°C erhält man 5,44 σ eines Gemischs, das noch Ausgangsprodukt enthält. Der Rückstand wird in einem Gemisch von 1 1 Methanol und 200 ecm Dioxan bei 60⁰C gelöst. Man kühlt die Lösung auf 30°C und fügt 5,44 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einem Wasserstoffstrom 4 h durch. Man filtriert das Reaktionsgemisch, wäscht das Fiitrat zweimal mit insgesamt 200 ecm Methanol und viermal mit insgesamt 800 ecm siedendem Methanol. Die mit dem siedenden Methanol erhaltene Waschphase wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7kPa) bei 40°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ecm Äther bis zur Pulverisierung trituriert. Nach dem Abtrennen des Pulvers durch Filtrieren und Trocknen erhält man 1,74 g Ntjc -{_ N-(N-Lauroyl-L-alanyl) - J-D-glutamyl_7~L-lys'yl-glycin vom Fp = 165-17O°C (pastenförmiges Schmelzen).

030062/0905

Rf =0,39 / Siliciumdioxidgel; Methanol_/

Analyse:

berechnet: C 57,41 H 8,78 N 11,96 % gefunden: C 57,4 H9,1 N Γ,8 %

Nach der Ges-'-irithydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa
GIu
GIy
Lys

—Hydrochlor5d

Das Benzyl-N€. -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-glycinatYkann hergestellt werden nach der Methode von V. Bondar et al., Dokl. Akad. Nauk. Tadzh. SSR 13 14 (1970), (Chem.Abstr. 73, 66884 e).

1,00	(Theorie =	1)
1,01	(Theorie =	D
1,01	(Theorie =	D
0,84	(Theorie =	D

Beispiel 7

Man fügt 0,85 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf -4 C gehaltenen Lösung von 1,67 g N-Lauroyl-glycin in 150 ecm Tetrahydrofuran und 0,91 ecm Triäthylaniin. Die Lösung wird 20 Minuten bei -4°C gerührt und anschließend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösung von 3,74 g Nod- ~l N-(N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyD-jf-D-glutamyl_/-L-lysin in einem Gemisch von 50 ecm Tetrahydrofuran und 13 ecm "i.i-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei 0°C und anschliessend 18h bei etwa 20°C gerührt. Man verdampft darauf das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 40 C); das Konzentrat wird verdünnt durch Zusatz von 50 ecm Wasser, auf den pH-Wert^angesäuert durch Zusatz von In-Chlorwasserstoffsäure. Der unlösliche Anteil wird durch Filtrieren entfernt, mit 50 ecm Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 5,8 g eines Pulvers, das an einer Säule von 12 mm Durchmesser,

030062/0905

die 50 g neutrales Siliciumdioxidgel (0/04 - 0,063 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 220 ecm Äthylacetat, 120 ecm eines Äthylacetat-Methanol-Gemischs (95-5 VoI), 80 ecm eines Äthylacetat-Methanol-Gemischs (9-1 VoI), 180 ecm eines Äthylacetat-Methanol-Gemischs (8-2 VoI), 100 ecm eines Äthylacetat-Methanol-Gemischs (7-3 VoI) und 60 ecm eines Äthylacetat-Methanol-Gemischs (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 21 - 38 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C ^ur Trockne konzentriert. Man erhält so 780 mg eines Pulvers, zu dem man 270 mg einer Verbindung fügt, die unter den gleichen Bedingungen erhalten wurde, und man löst das ganze in 25 ecm Methanol, das 5 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt das ganze auf eine Säule von 12 mm Durchmesser mit 50 g neutralem Siliciumdioxidgel, (0,04 - 0,063 mm) auf. Man eluiert nacheinander mit 200 ecm Äthylacetat, 200 ecm Äthylacetat-Methanol-Gemisch (98-2 VoI), 560 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (96-4 VoI), 680 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (9-1 VoI) und 280 ecm Methanol, wobei r.an Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 43 - 44 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 850 mg Νσ£- -/~N- (N- t-Butyloxycarbonyl-L-alanyl)-Όί-D-glutamyl-7-N£ - (N-lauroyl-glycyl )-L-lysin.

Rf = 0,50 /"siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Man löst 830 mg No6 -/~N-(N-t-hutyloxycarbonvl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_/-N£ -(N-lauroyl-glycyl)-L-lysin iu 20 ecm einer wasserfreien 1,7n-Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Man rührt 2 h und fügt darauf 100 ecm Äther zu. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 50 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,2 mmHg; 0,027 kPa) bei 50⁰C getrocknet. Man erhält so 790 mg des Hydrochlorids von Nod -{_ N-L-Alanyl-/ -D-glutamyl_7~N5T - (N-lauroyl-glycyl)-L-lysin.

030062/0905

Rf = 0/34 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)_7

Nach Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

Ala 1,04 (Theorie =1)

GIu 1,02 (Theorie =1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Lys 1,00 (Theorie = 1)

Das Ne£ -/ N- (.''-t-Butyloxycarbonyl-L-alanyl)- ο -D-glutamyl_7-L-lysin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 4,95 g Benzyl-No6-ZÖ -benzyl-N-( N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl)- ζ -D-glutamyl_/-N(i' -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in 250 ecm Essigsäure. Man fügt 4,95 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats uncer verringertem Druck (0,2 mmHg; 0,027 kPa) zur Trockne erhält man 3,74 g NoI -/~N-(N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanyl)-/ -D-glutamy Ij-L- lysin.

Rf = 0,20 /_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das Benzyl-N<>- -/ 0 -benzyl-N- (N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl)- ο D-glutaniyl_7-Nif -benzyloxycarbonyl-L-lysinat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 1,95 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf -10 C gehaltenen Lösung von 6,13 g Benzyl-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl- οά-Ό-glutamat in 200 ecm Tetrahydrofuran und 2,1 ecm Triäthylamin. Die Lösung wird 20 Minuten bei -10°C gerührt, worauf man eine Lösung von 6,71 σ des Hydrochloride von Benzyl-N>£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in 100 ecm Tetrahydrofuran und 2,3 ecm Triäthylamin zu-

030062/090 5

302A281

setzt. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei -5 C und anschließend 66 h bei etwa 20⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird schließlich unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 30°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 15,95 g eines Öls, das an einer Säule von 3 cm Durchmesser mit 150 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,063 - 0,20 mm) chromatographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 400 ecm Äthylacetat-Cyclohexangamisch (4-6 VoI), 240 ecm Äthylacetat-Cyclohexangemisch (6-4 VoI) und 560 ecm Äthylacetat,, wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 15-23 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg 2,7 kPa) bei 40⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 9,25 g eines teilweise kristallisierenden Öls, das in 40 ecm Äthylacetat bei 45°C gelösL wird. Man fügt 100 ecm Cyclohexan zu. Man läßt auf eine Temperatur von etwa 20°C ansteigen. Der unlösliche Anteil wird durch Filtrieren entfernt, mit 25 ecm Äthylacetat-Cyclohexangemisch (4-6 VoI) gewaschen und schließlich getrocknet.

_ -1

Man erhält so 4,99 g Benzyl-Nc^ -/ 0 -benzyl-N-(N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl)-fl -D-glutamyl_/-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat.

Rf = 0,80 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (9-1 VoI)J Massenspektroskopie: M - 760 (Theorie = 760).

Beispiel 8

Man fügt 0,41 ecm Isobutylchlorformiat in ei^e Lösung von -5°C von 808 mg N-Lauroylglycin in 50 ecm Tetrahydrofuran und 0,44 ecm Triäthylamin. Die Lösung wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, worauf man eine Lösung von 0⁰C von 1,81 g Npi- -/ N- (N-Lauroyl-L-alanyl)-5 -D-glutamyl_7~L-lysin in einem Gemisch von 20 ecm Tetrahydrofuran und 6,3 ecm 1n-Natriumhydroxid zusetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei etwa -5°C und anschließend 18 h bei etwa 20°C gerührt. Man säuert schließlich das Reaktionsgemisch durch Zusatz

030062/0905

von 10 ecm 1η-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert von etwa 1 an und verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45 C, worauf man zu dem Konzentrat 50 ecm Äthylacetat und 30 ecm Wasser fügt. Der unlösliche Anteil wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 20 ecm Äthylacetat und 10 ecm Wasser gewaschen und unter verringertem Druck (20 mratig; 2,7 kPa) getrocknet. Man erhält so 1,18 g eines Pulvers, das an einer Säule vou 12tntti Durchmesser mit 50 g neutralem Siliciumdioxid (0,063 - 0,20 mm) chromatographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 80 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (75-25 VoI), 320 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (1-1 VoI) und 120 ecm Methanol, wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 4-8 werden vereint und un^er verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 50 ecm Äther trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält 0,88 g eines Pulvers, das an einer Säule von 12 mm Durchmesser mit 20 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04 - 0,063 mm) chromatographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 180 ecm Äthylacetat, 60 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (99-1 VoI), 100 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (98-2 VoI), 260 ecm Ätbylacetat-Methanolgemisch (95-5 VoI), 120 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (9-1 VoI), 60 ecm Äthylacetat-Methanolgeraisch (85-15 VoI), 280 ecm Äthylacetat-Methanolgenisch (8-2 VoI), 40 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (7-3 VoI), 40 ecm Äthylscetat-Methanolgemisch (6-4 VoI) und 60 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm gewinnt. Die Fraktionen 41-60 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 740 mg Νσ6 -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- Q -D-gritamyl_7~ Nt£ -(N-lau
Schmelzen).

-(N-lauroylglycyl)-L-lysin vom Fp 167 - 171°C (pastenartiges

Rf = 0,58 / Siliciumdioxidgel·; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-2o-6-24Vol)J

Q30062/0905

Analyse:

berechnet: C 62,55 H 9,58 N 9,12 % gefunden: C 62,5 H9,6 N9,3 %

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 1,01 (Theorie =1)

GIu 0,95 (Theorie = 1)

GIy 1,uO (Theorie = i)

Lys 0,97 (Theorie = 1)

Beispiel 9 '. .

Man fügt 0,5 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf 12 C gehaltenen Lösung von 1,89 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-ad-D-glutamat in 75 ecm Dioxar. und 0,54 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten unter 12°C gerührt, worauf man eine auf 10⁰C gekühlte Lösung von 1,95 g des Evdrochlorids von Benzyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-glycinat in 20 ecm Dioxan, 1,5 ecm Wasser und 0,54 ecm Trxäthylamin zusetzt. Das Meaktionsgemisch wird 18h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt, worauf man mit 150 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 5 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 ansäuert. Der so erhaltene Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 75 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. V.an erhält 3,36 g eines weißen Produkts, das an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser, enthaltend 60 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04 0,063 mm),chromatographiert wird. Hierzu wird das Produkt in 30 ecm Essigsäure gelöst. Zu der erhaltenen Lösung fügt man 20 g Siliciumdioxid und anschließend konzentriert man unter verringertem Druck (20 jnmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne. Der so erhaltene Rückstand wird auf die Säule aufgebracht und nacheinander mit 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 1040 ecm

030062/0905

Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 360 ecm Äthylacetat-EssigF,öuregemisch (8-2 VoI) und 360 ecm Essigsäure eluiert, unter Gewinnung von Fraktionen von 40 ecm. Die Fraktionen 10 - 16 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 k.Pa) bei 45°C zur Trockue konzentriert. Man erhält so 1,09 g Benzyl-N /~0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-ö -D-glutamyl_7-N⁶-benzyl-O2cyca3-.Iionyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-glycinat vom Fp = 2O4-2O6°C. Die Fraktionen 17-48 weiden verein+- und zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird an einer Säule von 2 cm Durchmesser mit 40 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) chromatographiert. Man eluiert mit 280 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 4 und 5 werden vereint und zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird in 20 ecm Äther trituriert, durch Filtrieren

2 — 1 abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 0,7 g Eanzyl-N -/ 0 benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-glycinat vom Fp = 204-206 C.

Rf = 0,83 ^"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI)_/

Man löst 1,74 g Benzy 1-N²-/~O¹-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-N -benzylcycarbonyl-DD ,LL-2,6-dia-nlno-pimelamoylglycinat in 50 com Essigsäure. Man fügt 1,74 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet anschließend einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h durch. Nach dem Filtrieren fügt man 200 ecm Äther zum Filtrat. Nach 1 h bei 20⁰C wird die gebildete Ausfällung durch Filtrieren abgetrennt, mit 25 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,2 mmHg; 0,027 kPa) bei 50°C getrocknet. Man erhält so I ,09 g N -/*"κ (N-Lauroyl-L-alanyl)-0 -D-glutamyl_7-DD,LL-2,6-diamino~pimelamoyl-glycin vom Fp = 180 - 182°C (pastenform!ges Schmelzen), enthaltend 1,4 % Wasser (Fischer-Methode).

Rf = 0,30 ^"siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

030062/09 05

O /

Analyse:

berechnet: C 55,40 H 8.34 N 13,36 % gefunden: C 53,4 H8,5 N 12,4 %

Schwefelsäureasche % = 0,8

Nach Gesamthvdrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa = 1,02 (Theorie = 1)

GIu = 1,01 (Theorie = 1)

GIy =1,00 (Theorie = 1)

Dap = 0,98 (Theorie =1)

Das Hydrochlorid von Benzyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelanioyl-glycinat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

2 fi

Man löst 2,48 g Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-r^Ii?.mino-pimelamoyl-glycinat in 12,5 ecm einer wasserfreien 1,7 η-Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigse'.ure. Man rührt 2 h und fügt anschließend 7CO ecm Äther zu. Der pastenförmige Niederschlag, der sich bildet, wird durch Dekantieren von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und in 150 cm heißem Aceton gelöst. Nach dem Abkühlen fügt man 150 ecm Äther zu. Die gebildeten Kristalle werden durch Filtrieren abgetrennt, mit zweimal insgesamt 40 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,2 itunHg; 0,027 kPa) bei 20°C getrocknet. Man erhält so 1,95 g des Hydrochlorids von Benzyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-glycinat.

Rf = 0,61 l_ Silxciumdxoxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)_/ \

Das Benzyl-N '-t-butyloxycarbonyi-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimeiamoyl-glycinat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

030062/0905

3Q24281

Man fügt 1,17 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei -1 C gehaltene

2 6

Lösung von 3,81 g N -t-Butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DDjLL, 2,6-diamino-pimelinsäure-monoaniid in 90 ecm Tetrahydrofuran und 1,26 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -1°C gerührt und anschließend fügt man eine auf -1°C gekühlte Lösung von 3,028 g p-Toluolsulfonat des Benzylglycinats in 90 ecm Tetrahydrofuran und 1,3 ecm Triäthylamin zu. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei -1°C gerührt und anschließend 70 h bei etwa 20°C. Anschließend v;ird es untev verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 35°C zur Trockne konzentriert. Man nimmt den Rückstand in 100 ecm Äthylacetat auf. Die erhaltene Lösung wird nacheinander mit 20 ecm Wasser, dreimal insgesamt mit 60 ecm einer 5 %igen Natriumbicarbonatlösung, dreimal mit insgesamt 60 ecm einer gesättigten Zitronensäurelösung und schließlich mit 10 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C getrocknet. Man erhält so 4,8 g einer cremefarbenen Meringe, die an einer Säule von 2 cm Durchmesser, enthaltend 1oo g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) chromatographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 320 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (1-1 VoI), 360 ecm Cyclohexan-Äthyiacetatgemisch (1-3 VbI) und 640 ecm Äthylacetat, wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 13-23 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 2,29 g Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-N°-benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelamoyl-glycinat.

Rf = ),26 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

2 6

Das N -t-Butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DDiLL^^-diamincpimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Zu einer Suspension von 8,08 g N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pime.linsäure-monoamid und 2,65 g Natriumcarbonat in einem Gemisch von 50 ecm Wasser und 150 ecm Dioxan fügt man 6 g Di-t-

030062/0 9 05

butyl-dicarbonat, gelöst in 50 ecm Dioxan. Das Reaktionsgemisch wird 1^h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Der unlösliche Anteil wird durch Filtrieren abgetrennt, und das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzenLriert. Der Rückstand wird mit 50 ecm Wasser und 50 ecm Äthylacetat aufgenommen. Die wässrige Phase wird durch Zusatz von 20 ecm einer gesättigten Zitronensäurelösung auf den pH-Wert 3 gebracht. Die organische Phase wird durch Dekantieren abgetrennt, und anschließend wird die wässrige Tliase zweimal mit insgesamt 50 ecm Äthylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereint, mit 20 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen- über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne

2 S

konzentriert. Man erhält so 7,47 g N -t-Butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in Form einer weißen Meringe.

Rf = 0,62 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (1-1 VoI) J

Beispiel 10

Man fügt 0,30 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 484 mg N-Benzyloxycarbonylglycin in 50 ecm Tetrahydrofuran und 0,323 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5 C gerührt, und anschließend fügt man 1,32 g N -[_ N-(N-Lauroy3 L-alanyl)-D-isoglutaminy 1_/-DD,.lL-2, 6-diamino-pimelinsäure-monoamid, gelöst in einem auf 2°Cgekühlten Gemisc.i von 50 ecm Wasser, 25 ecm Tetrahydrofuran und 2,31 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Gemisch wird 1 h bei 5°C und 18h bei etwa 20°C gerührt. Anschließend verdampft man das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C und säuert das Konzentrat durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 30 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man er-

030062/0905

hält so 1,57 g eines beigen Pulvers, das man an 30 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 itin) , enthalten in einer Säule von 15 mm Durchmesser, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 6G ecm eines Athylacetat-Methanolgrmischs (9-1 VoI), 60 ecm eines Äthylacetat-Methanolgemischs (8-2 VoI), 60 ecm eines Äthylacetat-Methanolgemischs (7-3 VoI), 60 ecm eines Äthylacetat-Methanolgemi^chs (6-4 VoI), 60 ecm eines Äthylacetat-Methanolgemischs (1-3 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Frakteionen 11-17 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Der ölige Rückstand wird in 50 ecm Äther trituriert. Nach dem Filtrieren

2 _
und Trocknen erhält man 1,02 g N -/ N- (iT-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_/-N - (benzyloxycarbonylglycyl)-DD.rLL-2 ,6-diaminopimelinsäure-monoamid in Form eines weißen Feststoffs vom Fp = 115-12O°C (pastenförmiges Schmelzen).

Rf = O,41 ^"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (1-1 Vol)_7

Man löst 1 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_7"N (benzyloxycarbonylglycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pim^linsäure-monoamid in 25 ecm Essigsäure. M^an fügt 1 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und anschließend leitet man einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa> bei 50 C zur Trockne wird der erhaltene Rückstand in 30 ecm Äther trituriert durch Filtrieren abgetrennt, mit 10 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,2 mmHg; 0,0027 kPa) bei 50⁰C ge-

2 _
trocknet. Man erhält so 790 mg N -[_ N- (N-Lauroyl-L-alaryl)-D-isoglutaminyl_/-N -(glycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid vom Fp = 170 - 174°C (pastenförmiges Schmelzen).

Rf = 0,34 (_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

030062/0905

Analyse:

berechnet: C 55,48 H 8,51 N 15,62 % gefunden: C 54,25 H 8,31 N 14,82 %

Schwefelsäv'easche % = 3,7

Nach der Gesamthydrolyce zeigt die Analyse am Technikon-Autoa^alysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 1,02 (Theorie = 1)

Dap 0,98 (Theorie = 1)

GIu 1,05 (Theorie = 1)

1/00 (Theorie =1)

0 — —

Das N ~l_ N- (N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 1,76 g N -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_/· N⁶-benzyloxycarbony 1-DD₇IT-J-2, 6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 80 ecm Essigsäure. Man fügt 1,76 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet anschließend einen Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat auf etwa 5 ecm konzentriert und durch Zusatz von 100 ecm Äther verdünnt. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 40 ecm Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält so 1,37 g N -/~N-(N-Lauroyl-L-alany DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

hält so 1,37 g N -/ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_/-

Rf = 0,40 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (40-20-6-24 VoI) J

2 _ _ c

Das N -[_ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-isoglutaminyl_/-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsaure-monOcimid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

030062/0905

Man fügt O₇81 ecm Isobutylchlorformiat in eine Lösung, die bei -5°C gehalten wird/ von 2,5 g N-Lauroyl-L-alanyl-D-isogTutamin in 150 ecm Dimethylformamid und 0,87 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf +2 C gekühlte Lösung von 2,02 g N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamiu. in einem Gemisch von 62,5 "ecm Wasser und 6,25 ecm 1 η-Natriumhydroxid zu. Das Reak+-.ionsgemisch wird 1 h bei 0°C und anschließend 18h bei etwa 20°C gerührt und schließlich .^c\ltriert. Das durch Zusatz von 300 ecm Wasser verdünnte Filtrat wird durch Zusatz von 15 ecm 1n-Chiorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die erhaltene Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 30 ecm Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält t,o 2/03 g eines weißen Feststoffs, zu dem man 680 mg einer Verbindung fügt, die unter analogen Bedingungen erhalten wurde. Das Gemisch wird in 30 ecm Essigsäure, enthaltend 5 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) gelöst. Man konzentriert zur Trockne und bringt anschließend den Rückstand auf eine Säule von 2 cm Durchmesser auf, die 60 g neutT-?!es Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 400 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Essigsäure (9-1 VoI), 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 240 ecm Äthylacetat-Essigaäuregemisch (7-3 VoI), 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI) und 480 ecm Essigsäure, wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 17 - 4ü werden vereint und zur Trockne

p —

konzentriert. Man erhält so 1,78 g N-^ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-D-· isoglutaminyl_7-N -benzyloxycarbonyl-DD/LL^^-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0/65 / Siliciuiiidioxidgel; Äthylacetat-Essig säure (3-1 VoI) J

Das N-Laugoyl-L-alanyl-D-isoglutamin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 6,6 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat in 330 ecm Essigsäure. Man fügt 6/6 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium)

030062/0905

zu und leitet anschließend einen langsamen Wasserstoffstrom während 2 h hindurch. Wach dem Filtrieren des Reaktions^emischs gießt man das Filtrat in 3 1 Wasser. Nach 2 h Stehen bei O⁰C wird die erhaltene Ausfällung durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 80 ecm Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 5,16 g eines Produkts, zu dem man 0,5 g eines unter analogen Bedingungen erhaltenen Produkts füVt. Dieses Gemisch wird in 90 ecm siedendem Methanol gelöst und zu der erhaltenen Lösung fügt man 45 ecm Wasser. Nach 2 h Stehen bei einer Temperatur von etwa 20⁰C werden die aufgetretenen Kristalle durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt SD ecm Wasser gewaschen und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) getrocknet. Man erhält so 5,1 g N-Lauroyl-L-alanyl-D-isoglutamin vom Fp = 163°C.

Rf = 0,18 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Methanol (4-1 Vol)_7

Analyse:

berechnet: C 60,12 H 9,33 ti 10,52 % gefunden: C 60,2 H 9,5 N 10,9 %

Das Benzyl-iSI-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat kann auf folgende Weise erhalten werden:

Man fügt 2,54 ecm Isobutylchlorformiat in eine Lösung, die bei 0 C gehalten wird, von 3,9 g Laurinsäure in 156 ecm wasserfreiem " Toluol und 2,7 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung rjn 6,7 g des ^ydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-D-isoglutaminat in 52 ecm Wasser und 2,7 ecm Triäthylamin zu. Das Reaktionsgemisch wird 65 h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Man erhält eine Reaktionsmasse von gelatineartigern Aussehen, zu der man 150 ecm Äthylacetat fügt. Die Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 30 ecm Wasser gewaschen und anschließend getrocknet. Man erhält 7,6 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat in der Form eines weißen Pulvers. Die wässrige Phase des vorstehen-

030062/0905

den Piltrats mit zweimal mit insgesamt 100 ecm Äthylacetat extrahiert, diese Äthylacetatphase wird mit der organischen Phase des Filtrars vereint, mit 125 ecm 0,In-Chlorwasserstoffsäure, 120 ecm Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschliessend unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält erneut 1,5 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat. Das Produkt (7,6 g und 1,5 g) wird in 12¹^ ecm Methanol umkristallisiert. Man erhält so 6,6 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-D-isoglutaminat vom Fp = 16t»°C.

Rf = 0,13 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Das Hydrochloric! des Benzyl-L-alanyl-D-isoglutaminats kann erhalten werden nach der Verfahrensweise von S. Kusumoto, Bull. Chem. Soc. Japan 49, 533 (1976).

Beispiel 11

Man fügt 0,44 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei -5 C gehaltene Lösung von 710 mg N-Ben^yloxycarbonyl-glycin in 67 ecm Tetrahydrofuran und 0,475 ecm Triäthylamtn. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man 1,75 g N ~/~N- (Ν,-Octanoyl-L-alanyl)- ^-D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäur^-monoamid gelost in einem auf 2°C gekühlten Gemisch von 6,7 ecm Wasser und 6,78 ecm In-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1/2 h bei 0°C und 18 h bei etwa 20°C berührt. Anschließend verdampft man das Tetrahydrofuran unter verringertem Dxuck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45 C. Die verbleibende wässrige Phase wird mit 50 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 30 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 1,65 g eines fast weißen Produkts, das man an 33 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,053 mm), enthalten in einer Säule von 22 mm Duchmesser, chromatographiert.

030062/090 5

Hierfür löst man es in 20 ecm Essigsäure, fügt 5 g Siliciumdioxid zu und konzentriert unter verringertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne. Der so erhaltene Rückstand wird auf die Säule aufgebracht, und man eluiert nacheinander mit 28C ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-15 VoI), 560 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 11 bis 24 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Der ölige Rückstand wird in 40 ecm Äther trituriert. Nach dem Filtrieren und Trocknen

2 — J —

erhält man 1,37 g N -£ N-(N-Octanoyl-L-alanyl)- 0 -D-glutamyl_/-N -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-DD,LL-2fe-diamino-pimelinsäurexnonoamid in der Form eines weißen Feststoffs vom Fp = etwa 100⁰C (pastenförmiges Schmelzen).

Rf = 0,47 / Siliciumdioxidgelj Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI)_/

Man löst 1,35 g N²-/~N-(N-Octanoyl-L-alanyl)- /-D-glutamy1_7~N⁶-(benzyloxycarbonyl-glycyl) -DD,LL-2,6-diamino-pirnelinsäure-mOi.ioamid in 30 ecm Essigsäure. Man fügt 1,35 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h hindurch. Nach dem filtrieren und Konzentration des Filtrats zur Trockne unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C, wird der erhaltene Rückstand in 50 ecm Äther trituriert, durch Filtrieren abgetrennt, mit 10 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck(0,2 mmHg; 0,027 kPa) bei 50°C getrocknet. Man erhält so 1,05 g N²-₍/~N-(N-Octanoyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-N⁶-(glycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid vom Fp = 170-174 C (pastenförmiges Schmelzeii).

Rf = 0,24 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 52,44 H 7,74 N 14,68 % gefunden: C 51,29 H 7,96 N 14.00 %

030062/0905

Schwefelsäureasche % = 4

AIa 1,01 (Theorie - 1)

Dap 0,98 (Theorie = 1)

GIu 1,03 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Das N²-/~N-(N-0ctanoyl-L-alanyi)- / -D-glutamyl_7-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 2,82 g N²-_//"o¹-Benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl) - /-D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 80 ecm Essigsäure. Man fügt 2.82 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet anschließend einen Wasserstoffstrom wahren^ 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren wird das FiI-trat auf etwa 5 ecm unter verringertem Druck (2J mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C konzentriert und durch Zusatz von 100 ecm Äther verdünnt. Man erhält eine Ausfällung, die durch Filtrieren abgetrennt, mit 20 ccra Äther gewaschen und schließlich getrocknet wird. Man erhält so 2,0 g N²-/N-(N-Octanoyl-L-axanyl)- ί-D-glutamyl_7-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid vom Fp = 160 - 164°C (pastenförmiges Schmelzen).

Rf = 0,30 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 53,58 H 8,02 N 13,58 % gefunden: C 53,05 H 8,17 N 13,06 %

Schwefelsäureasche % =1,8

Q30062/0905

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit von folgenden Aminosäuren:

AIa 1,00 (Theorie = 1)
Dap 0,95 (Theorie = 1)
GIu 1,02 (Theorie = 1)

Das N -/~0¹-Benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_7~N benzyloxycarbonyl-DD,L.^r.-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 0,91 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei 0⁰C gehaltene Lösung von 3,04 g Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-ai. -D-glutamat in 150 ecm Tetrahydrofuran und 0,9 8 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 2 C gekühlte Lösung von 2,?6 g N -Benzyloxycarbonyl-DDjLL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 70 ecm Wasser und 7 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei 0 C und anschließend 2ⁿ h bei einer Temperatur von etwa 20 C gerührt. Das Tetrahydrofuran wird darauf unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C verdampft. Das Konzentrat wird durch Zusatz von 50 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wsrt 1 gebracht. Die erhaltene weiße Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 75 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 4,73 g eines weißen Feststoffs, der an einer Säule von 2,2 cm Durchmesser, enthaltend 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm), chromatographiert wird. Hierzu löst .n?.n das Produkt in 20 ecm Essigsäure. Zu der erhaltenen Lösung fügt man 10 g neutrales Siliciumdioxidgel und konzentriert unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne. Der so erhaltene Rückstand wird auf die Säule aufgebracht und man eluiert nacheinander mit 280 ecm Äthylacetat, 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregerü.LSch (9-1 VoI) , 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 13-23

030062/0905

werden vereint und unter verringertem Druck (20 mniHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Man erhält ein Öl, das in Äther fest wird. Nach dem Abtrennen durch Filtrieren und Trock-

2 — 1 J^

nen erhält man 2,84 g N -/ 0 -Benzyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl)-/ D-glutamyl_7~N -benzyloxycarbonyl-DD ,LT.--2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid.

Rf = 0,68 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI) _J

Das Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-öd-D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden.:

Man fügt 3,6 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei -1°C gehaltene Lösung von 3,95 g Octansäure in 140 ecm Tetrahydrofuran und 3,8 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20. Minuten bei -1°C gerührt und anschließend fügt man eine auf O⁰C gekühlte Lösung von 9,45 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-a£-D-glutamat in einem Gemisch von 54,8 ecm 1n-Natriumhydroxid und 30 ecm Wasser hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei -1°C gerührt und anschließend 20 h bei etwa 20°C. Es wird anschließend durch Zusatz von 1n-ChIorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Das Tetrahydrofuran wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C verdampft, und das Konzentrat wird mit 100 ^cm Äthylacetat extrahiert. Die so erhaltene organische Phase wird zweimal mit insgesamt 50 ecm In-Chlorwasserstoffsäure und mit 25 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und unter verringertem Druck (20 mmHg: 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne verdampft. Man erhält so 10 g eines blaßgelben Öls, das chromatographiert an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser, enthaltend 200 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,20 mm). Man eluiert mit Äthylacetat, wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 7-9 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ecm eines Gemischs Äther-Petroläther (Kp =35-60 C) (1-4 VoI) trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 3,27 g Benzyl-N-octanoyl-L-alanyl-ö£.-D-glutamat in

030062/0905

der Form eines weißen Pulvers.

Rf = 0,56 /"Siliciumdioxidgel; äthylacetat-Methanol (8-2 VoI)J

Beispiel 12

Man fügt 0,32 ecm Isobctylchlorformiat in eine bei -5°C gehaltene Lösung von 512 mg N-Benzyloxycarbonyl-glycin in 25 ecm Tetrahydrofuran und 0,35 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man 1,54 g N -/~N-(N-Palmit^yl- L-alanyl)-Q -D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid zu, gelöst in einem auf 2°C gekühlten Gemisch von 5 ecm Wasser und 4,9 ecm In-Natriumhydroxid. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei -5°C gerührt und 18 h bei etwa 20°C. Schließlich verdampft man das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C. Die verbleibende wässrige Phase wird mit 50 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 10 ccr.; In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 30 ccn Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so Ί,80 g eines beigen Pulvers, das man ai 36 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm), enthalten in einer Säule von 22 mm Durchmesser, chromatographiert. Hierzu löst man es in 20 ecm Essigsäure, fügt 5 g f^iliciumdioxidgel zu und konzentriert unter verringertem Druck (20mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne. Der so erhaltene Rückstand wird auf die Säule aufgebracht und nacheinander eluiert mit 120 ecm Äthylacetat-Essigt-üuregemisch (°-1 VoI) , 60 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 60 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (7-3 VoI), 6θ ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI) und 80 ecm Essigsäure, wobei man Fraktionen von 20 ecm gewinnt. Die Fraktionen 10 - 16 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Das verbleibende Öl wird in 50 ecm Äther trituriert. Nach dem Filtrieren und Trocknen erhält man 0,83 g N²-/~N-(N-Palmitoyl-L-alanyl)-$■-D-glutamyl_7-N⁶-

03G062/0905

(benzyloxycarbonylglycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid vom Fp = 124 - 128°C (pastenförmiges Schmelzen).

Rf = 0,50 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (1-1Vol)_7

Man löst 1,14 g N²-/~N-(N-Palmitoyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-N⁶-(benzyloxycarbonyl-glycyl) -DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 30 ecm Essigsäure. Man fügt 1,14 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h hindurch. Anschließend erwärmt man das Reaktionsmedium auf etwa 65 C, filtriert und konzentriert unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne. Der erhaltene Rückstand wird in 50 ecm Äther trituriert, durch filtrieren abgetrennt, mit 10 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,2 mmHg; 0,027 kPa) bei 50°C getrocknet. Man erhält so 880 mg N²-/~N-(N-Palmitoyl-L-alanyl)-{ -D-glutarayl_7~N -(glycyl)-DD,LL-2,6-diaminopimelinsäure-monoamid vom Fp 198 - 200 C (pastenförmiges Schmelzen)

Rf = 0,28 ^ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)_y

Analyse.:

berechnet: C 57,87 H 8,83 N 12,27
gefunden: C 54,64 H 8,67 N 10,98

Schwefelsäureasehe % =4,7

Nach Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit von folgenden Aminosäuren:

AIa 1,00 (Theorie = 1)

Dap 1,02 (Theorie = 1)

GIu 1,05 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Das N-^ N-(N-Palmitoyl-L-alanyl)-^f -D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-

030062/0905

pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man lost 2,14 g Ν²-/~Ο¹ -Benzyl- N- (N-palmitoyl-L-alanyl) -/ -D-glutamy1_/-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid in 80 ecm Essigsäure. Man fügt 2,14 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet anschließend einen langsamen Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat auf etwa 5 ecm unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 kPa) bei 50 C konzentriert und durch Zusatz von 100 ecm Äther verdünnt. Man erhält eine Ausfällung, die duj-ch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 20 ecm Äther gewaschen und getrocknet wird. Man erhält so 1,58 g N²-^~N-(N-Palmitoy 1-L-alanyl)-/-D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0. 30 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das N²-/~0 -Benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)-0 -D-glutamyl_7~N benzyloxy carbonyl-DD, LL-2, 6-diamino-Oi.melinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 0,⁷O ecm Isobutylchlorformiat in einen bei 2°C gehaltene Lösuno von 2,91 g Benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl- <y -D-glutamat in 120 ecm Tetrahydrofuran und 0,75 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 2 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösung von 1,726 g N -Benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 53,4 ecm Wasser und 5,34 ecm In-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird < α bei 2°C und anschließend 18h bei einer Temperatur von etwa 20 C gerührt. Cas Tetrahydrofuran wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C verdampft. Das Konzentrat wird durch Zusatz von 50 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die erhaltene weiße 'uis fällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 75 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 4,15 g eines weißen Feststoffs, der an einer Säule

030062/0905

- 1Ω? -

von 3 cm Durchmesser, die 85 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04- 0,06.3 mm) enthält, chromatographiert wird. Hierzu löst man das Produkt in Essigsäure bei 60°C. Zu der erhaltenen Lösung fügt man 10 g neutrales Siliciumdioxidgel und konzentriert anschliessend unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Der so erhaltenen Rückstand wird auf die Säule aufgebracht, und man eluiert nacheinander iait 320 ecm Äthyxacetat, 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 320 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 14-22 werden vereint und unter verringerter^ Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 50 ecm Äther trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 2,20 g N²-/~0 -Benzyl-N-(N-palmitoyl-L-alanyl)- Q-D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäuremonoaraJ.d.

Rf = 0,75 ^"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 YoI)JJ

Das Benzyl-N-palmitoyl-L-alanyl-oi-b-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 3,6 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei O⁰C gehaltene Lösung von 7,03 g Palmirinsäure in 140 ecm Tetrahydrofuran und 3,8 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei C⁰C gerührt und anschließend fügt man eine auf O⁰C gekühlte Lösung von 9,45 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-a£.-D-glutamat in einem Gemisch von 54,8 ecm 1n-Natriumhydroxid und 30 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei O⁰C und anschließend 18 h bei ettra 20°C jerührt; es wird darauf durch Zusatz von 70 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure au-F den pH-Wert 1 angesäuert. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, fünfmal mit insgesamt 200 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 12,11 g eines weißen Pulvers, das an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser, enthaltend 200 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,20 mm) , chromatographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 200 ecm Äthylacetat, 300 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (9-1 VoI), 1,6

030062/0905

Äthylacetat-Methanolgemisch (8-2 VoI), 400 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (6-4 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 5-23 werden vereint, unter verringerten.. Druck (20 mmllg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 5,18 g eine? Feststoffs, den man in 15 ecm siedendem Äther 1/2 h trituriert. Nach dem Abkühlen auf eine Temperatur von etwe 20°C wird das unlösliche Material durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 75 ecm Äther gewaschen und schließlich getrocknet. Man erhält so 2,94 g Benzyi-N-palmitojl-L-alanyl-«· -D-glutamat.

Rf = 0,77 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Beispiel 13

Man fügt 0,46 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -7°C gehaltenen Lösung von 738 mg N-Benzyloxycarbonyl-glycin in 65 ecm Tetrahydrofuran und 0,494 ecm Tr.iäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -7 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösung von 2,02 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-i -D-glutamyl_/-DD,LL-2,6-diamino-pimeiinsäure-monoatnid in 10 ecm Wasser und 7,06 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei etwa -5°C und 18h bei etwa 20°C gerührt. Schließlich verdampft man das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Die verbleibende wässrige Phase wird durch Zusatz von 50 ecm Wasser verdünnt und durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 25 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Der erhaltene Rückstand wird in 5 ecm Essigsäure gelöst. Man fügt 10 ecm Siliciumdioxid zu und konzentriert anschließend unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne. Der erhaltene Rückstand wird auf eine Säule von 35 mm Durchmesser, die 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04 0,063 mm) enthält, aufgebracht. Man eluiert nacheinander mit

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160 ecm Äthylacetat, 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI)/ 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 200 ccjh Äthylacetat-Essigsäuregemisch (7-3 VoI) , 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (6-4 VoI) und 440 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 23 - 32 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Das verbleibende öl wird in 50 ecm Äther trituriert, bis zur völligen Pulverisierung des Produkts. Das Produkt wird durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält so in der Form

2 — J

eines weißen Pulvers 1,7 g N -[_ N-(N-Lauroyl-L-alanyl) - if -D-glutamyl_/-N -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid vom Fp = 134- 136 C (pastenförmiges Schmelzen).

Rf = 0,76 l_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI) _/

Analyse:

berechnet: C 58,25 H 7,66 N 11,02 gefunden: C 55,7 H 7,6 N 10,2

AIa 1,00 (Theorie = 1)

Dap 0,93 (Theorie = 1)

GIu 1,02 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Man löst 1,7 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutam-l_7-N⁶-(benzyloxycarbonyl-glycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 45 ecm Essigsäure. Man fügt 1,7· g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Konzentrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne trituriert man den erhaltenen Rückstand in 50 ecm Äther, trennt durch Filtrieren ab, wäscht mit 10 ecm Äther und

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trocknet unter verringertem Druck (0,2 mitiHg; 0,027 kPa) bei 50°C. Man erhält so 1,32 g N²-/~N~(N-Lauroyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_7~ N -(glycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid vom Fp 180-184 C (pastenform!ges Schmelzen).

Rf = 0,23 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 55,40 H 8,74 N 13,36 % gefunden: C 54,31 H 7,96 N 12,55 %

Nach'Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 0,99 (Theorie = 1)

Dap 0,96 (Theorie = 1)

GIu 1,01 (Theorie = 1)

CIy 1,00 (Theorie = 1)

Beispxel 14

Man fügt 0,52 ecm Iscbutylchlorformiat in eine bei 12°C gehaltene Lösung von Ί',96 g Benzyl-|\|-lauroyl~L-alanyl- U -D-glutamat in 80 ecm Dioxan und 0,56 ecm Triethylamin. Die Lösung wird 20 Minuten bei 12°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 1,78 g des Hydrochloride von n£ -Benzyloxycarbonylglycyl-L-lysyl-D-alanin in einem Gemisch von 10 ecm Wasser und 8 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 20 h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Man säuert anschließend das Reaktionsgemiscii/clurcn Zusatz von 10 ecm In-Chlorwasserstoffsäure an und fügt 150 ecm Wasser zu. Das unlösliche Material wird durch Filtrieren abgetrennt und mit 100 ecm Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen erhält 3,14 g eines weißen Pulvers, das aus

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- 1C6 -

einem siedenden Gemisch von 500 ecm Äthylacetat und 60 ecm Methanol umkristallisiert wird. Nach 18stündigern'Stehen bei 5°C werden die erhaltenen Kristalle durch Filtrieren abg3trennt und getrocknet. Man erhält so 2,26 g Nc*- -/~0 -Benzyl-N-(N- lauroyl-L-alanyl)-i -D-glutamyl_7-N£. -benzyloxycarbonyl-glycyl-L-lysyl-D-alanin vom Pp 193 - 196°C.

Rf = 0,76 {_ Silicxumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Man löst 2,23 g Ne^ -/~0¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_/-N£ -benzyloxycarbonyl-glycyl-L-lysyl-D-alanin in 250 ecm Methanol bei 60⁰C. Man kühlt die Lösung auf 40°C ab und fügt anschließend 2,23 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen langsamen Wasserstoffstrom während 5 h hindurch. Man filtriert das Reaktionsgemische wäscht das Palladium auf Kohle fünfmal mit insgesamt 300 ecm siedendem Methanol. Die vereinten Filtrate werden unter verringertem Druck (20 mmHg; bei 50⁰C) zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ecm Äther triturie.M.. Nach dem Filtrieren, Waschen mit 100 ecm Äther und Trocknen erhält man 1,31 g Nod, -(_ N- (N-Lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-N£ -glycyl-L -lysyl-D-alanin vom Fp = 155 - 158°C.

Rf = 0,48 /"siliciumdioxidgel; Methanol_7

Analyse:

berechnet: C 56,69 H 8,59 N 12,80 % gefunden: C 57,0 H 9.· 1 N 13,1 %

AIa 1,98 (Theorie = 2)
GIu 1,06 (Theorie = 1)
GIy 1,00 (Theorie = 1)

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Lys 1,00 ( Theorie = 1)

Das Hydrochloric! von n£ -Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-lysyl-D-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 3,20 g No£- -t-Butyloxycarbonyl-Ni -benzyloxycarbonylglycyl-L-lysyl-D-alanin in 15 ecm einer wasserfraien Lösung von 1,7 n-Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure. Nach 5minütigem Rühren des Reaktionsgemischs bildet sich eine Ausfällung. Nach 2stündigem Stehen fügt man 50 ecm Äther zu, trennt die Ausfällung durch Filtrieren ab, wäscht sie zweimal mit insgesamt 50 ecm Äther und trocknet sie. Man erhält so 2,73 g des Hydrochlorids von Ncf -Benzy]oxycarbonyl-glycyl-L-lysyl-D-alanin.

Rf = 0,40 [_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

Das No6 -t-Butyloxycarbonyl-NcF -benzyloxycarbonyl-glycyl-L-lysyl-D-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 2,60 ecm Isobucylchlorformiat in eine bei 10⁰C gehaltene Lösung von 3,54 g N-Benzyloxycarbonyl-glycin in 200 ecm Dioxan und 2,8 ecm Triäthylamir. Die Lösung wird 20 Minuten bei etwa 10 C tjerührt, worauf man eine auf 10⁰C gekühlte Lösung von 6,35 g Nci- -t-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-D-alanin in einem Gemisch von ecm Wasser und 20 ecm 1n-Natriumhydroxid zufügt. Das Reaktionsgemisch wird 20 h bei etwa 20°C gerührt. Anschließend wird es auf den pH-Wert 3 durch Zusatz von 1n-Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Man verdampft das Dioxan durch 3£onzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C. Man extrahiert das Konzentrat dreimal mit insgesamt 300 ecm Äthylacetat; die organische Phase wird zweimal mit insgesamt 100 ecm einer gesättigten Zitronensäurelösung und mit 20 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und schließlich unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält 12,89 g eines Öls, das an einer Säule von 3 cm Durchmesser, die 200 g neutrales

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- 1C8 -

Siliciumdioxidgel (0,063-0,2 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert mit Aceton unter Gewinnung von Fraktionen von 100 ecm. Die Fraktionen 5 und 6 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält 10,15 c eines Öls, das an einer Säule von 3 cm Durchmesser, die 200 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,2 mm) enthält, chromatographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 100 ecm eines Gemischs von Cyclohexan-Aceton (9-1 VoI), 500 ecm Cyclohexan-Acetongemisch (8-2 VoI), 500 ecm Cyclohexan-Acetongemisch (7-3 VoI), 400 ecm Cyclohexan-Acetongemisch (6-4 VoI), 500 ecm Cyclohexan-Acetongemisch (1-1 VoI), 1 1 Cyclohexan-Acetongemisch (4-6 VoI) und 200 ecm Aceton, wobei man Fraktionen von 100 ecm sa..imelt. Die Fraktionen 25 - 32 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 3,21 g N-c^ -t-Butyloxycarbonyl-Nc- benzyloxycarbonyl-glycyl-L-lysyl-D-alanin.

Rf = 0,69 /"Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das N^^ -t-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-D-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 16,23 g Benzyl-Ne6 -t-butyloxycarbonyl-Ncf -benzyloxycarbonyl-L-lysyl-D-alaninat in 200 ecm Methanol. Man fügt 16,23 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen langsamen Wasserstoffstrom während 4 h hindurch. Man filtriert das Reaktionsgemisch und wäscht anschließend das Palladium auf Kohle dreimal mit insgesamt 60 ecm ethanol. Die vereinten Filtrate werden unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,"/ kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 8,87 g No£ -t-Butyloxycarbonyi-L-lysyl-D-alanin in Form einer Meringe.

Rf = 0,08 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Mcthanol (4-1 VoI)J

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Beispiel 15

Man fügt 0,5 ecm Isobutylchlorformiat in eine bei 13 C gehaltene Lösung von 1,91 g Benzyl-N-(N-lauroyl-T-alanyl)c£ -D-glutamat in 80 ecm Dioxan und 0,55 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 13 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 4°C gekühlte Lösung von 1,90 g des Hydrochlorids von N -(Benzyloxycarbonylglycyl) -DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin in 7,8 ecm 1n-Natriumhydroxid zu. Das Reaktionsgemisch wird 18h bei etwa 20⁰C gerührt und anschließend durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert und durch Zusatz von 120 ecm Wasser verdünnt. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 20 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 3,21 g eines weißen Pulvers, das man an einer Säule von 3 cm Durchmesser mit 60 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) chromatographiert. Man eluiert mit 40 ecm Essigsäure und 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 5-10 werden vereint una unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 2,88 g eines weißen Pulvers, das man an einer ^cäule von 3 cm Durchmesser, die 60 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthalt, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit l30 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 180 ecm Äthylacetat-Essigsäuregeraisch (8-2 VoI) und 100 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (6-4 VoI) wobei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 4-17 werden vereint, unter verringertem Druck zur Trockne konzentriert (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C. Der Rückstand wird In 25 ecm siedender Essigsäure gelöst, und die erhaltene Lösung wxrd mit 0,2 g Entfärbungskohle versetzt und in der Wärme filtriert. Das FiItrat wird durch Zusatz von 100 ecm Äthylacetat verdünnt. Nach 1 h Stehen bei etwa 20°C werden die erhaltenen Kristalle durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 10 ecm Äthylacetat

2 — 1

gewaschen und getrocknet. Man erhält so 1,53 g N -/ 0 -Benzyl-N- ... ^_ _ _α_, . -D-glutamyl_/-N - (benzyloxycarbonylglycyl)-

DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin vom Fp =· 225 - 227°C.

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Rf = 0,71 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI) J

Man löst 1,51- g N²-/~O¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7~N -(benzyloxycarbonylglycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin in 75 ecm Essigsäure. Man fügt 1,51 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen langsamen Wasserstoffstrom 2 h hindurch. Nach dem Filtrieren fügt man 500 ecm Äther zum Filtrat. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 50 ucm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,2 mmHg; 0,027 kPa) bei 20⁰C getrocknet. Man erhält so 710 mg N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_/-N⁶-glycyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin, enthaltend 0,4 % Wasser ( Methode nach Fischer).

Rf = 0/32 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 54,92 H 8,21 N 14,01 % gefunden: C 52,C Ηδ,Ο Ν 12,3 %

Schwefelsäureasche % = 1,1

Nach äer Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 2,00 (Theorie =2)

Dap 0,98 (Theorie.= 1)

GIu 1,05 (Theorie = 1)

GIy 0,95 (Theorie =1)

Das Hydrochlorid von N -(Benzyloxycarbonylglycyl)-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

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2 6

Man löst 2,21 g N -t-Butyloxycarbonyl-N - (benzyloxycarbonylglycyl) -DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin in 20 ecm einer wasserfreien Lösung von 1,7 η-Chlorwasserstoff säure in .essigsäure. Man rührt 2 h bei etwa 20°C und fügt anschließend 250 ecm Äther zu. Die gebildete Ausfällung wird durch Dekantieren abgetrennt und in 100 ecm Aceton trituriert. Nach dem Filtrieren, Waschen mit 25 ecm Äther und Trocknen erhält man 1,96 g des Hydrochloride von N ■
pimelamoy1-D-alanin.

Hydrochloride von N -(Benzyloxycarbonylglycyl)-DD,LL-2,6-diamino-

Rf = 0,46 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)_/

Das N -t-Butyloxycarbonyl-N -(benzyloxycarbonylglycyl)-DD,LL-2, 6-di araino-pimelamoy 1-D-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 0,89 ecm Isobutyl-chlorformiat zu einer bei 1°C gehaltenen Lösung von 1,20 g N-Benzyloxyrprbonyl-glycin in 68 ecm Tetrahydrofuran und 0,95 ecm Triäthylamin, Das Gemisch wird 20 Minuten bei 1°C gerührt, und anschließend füg¹: man eine auf 2°C gekühlto Lösung von 2,45 g N -t-Butyloxycarbonyi-DD^LL-pimelamoyl-D-alanin in 13,6 ecm 0,5n-Natriumhydroxid zu« Das Reaktionsgemisch wird 4 h bei etwa 5 C gerührt. Man verdampft anschließend das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45^OC Die wässrige verbleibende Phase wird durch Zusatz von ^K0 ecm Wasser verdünnt, auf den pH-Wert 3 durch Zusatz von gesättigter Zitronensäurelösung anges^.ert und fünfmal mit insgesamt 125 ecm Äthylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereint und mit 10 ecm einer gesättigen Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg? 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält eine weiße Meringe, die an einer Säule von 2 cm Durchmesser, die 90 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,06 3 mm) enthält, chroma tographiert wird. Man eluiert nacheinander mit 800 ecm Äthyl-

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acetat, 200 ecm Äthy1acetat-Methanolgemisch (9-1 VoI), 400 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 25-28 werden vereint uud unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 2,4 g N -t-Butyloxycarbonyl-N -(benzyloxycarbonylglycyI)-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin.

Rf = 0,67 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das N -t-Butyloxycarbonyl-DD,LL-2, 6-diandno-pimelamoyl-D-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden.:

"? 6

Man löst 4,52 g Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL--2,6-diamino-pimelamoyl-D-alaninat in 45 ecm Essigsäure. Man fügt 4,52 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und läßt einen langsamen Wasserstoffstrom 3 h durchströmen. Nach dem Filtrieren gießt man das Filtrat in 800 ecm Äther; nach 30minütigem Rühren trennt man die gebildete Ausfällung (furch Filtrieren ab, wäscht

2 sie mit 100 ecm Äther und trocknet sie. Man erhält so 2,5 g N -t-Butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alanin.

Rf = 0,37 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

2 6

Das Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alaninat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 1,53 ecm Iciobutylchlorformiat zu einer bei -1°C gehal-

2 6

tenen Lösung von 5 g N -t-Butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD_rLL-2,6-diamino-pimelaminsäure-monoamid in 120 ecm Tetrahydrofuran und 1,65 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -1°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf O⁰C gekühlte Lösung von 4,15 g des p-Toluolsulfonats von Benzyl-D-alaninat in 120 ecm Tetrahydrofuran und 1,65 ecm Triäthylamin zu. Das

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Reaktionsgemisch wird 1 h bei -1°C und anschließend 18h bei etwa 2O°C gerührt. Es wird anschließend unter verringertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 45°C konzentriert. Man nimmt den Rückstand in 100 ecm Äthylacetat auf. Die erhaltene Lösung wird nacheinander mit 25 ecm Wasser, viermal mit insgesamt 80 ecm einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung, viermal mit insgesamt 80 ecm einer gesättigten Zitronensäurelösung und 10 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und Anschließend in der Trockne unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45 C konzentriert. Man erhält 6,64 g einer rosefarbenen Meringe, die an einer Säule von 2 cm Durchmesser chromatographiert wird, die 120 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04 - 0.063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 40 ecm Äthylacetat-Cyclohexangemisch (1-1 VoI), 80 can Äthylacetat-Cyclohexangemsich (3-1 VoI), 1,16 1 Äthylacetat und 520 ecm Aceton, wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 10 - 39 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man

2 6

erhält 4,52 g Benzyl-N -t-butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelamoyl-D-alaninat.

Rf = 0,37 /Siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Beispiel 16

Man fügt 0,52 ecm Isobutylchlorformiat zu einer auf 10 C gehaltenen Lösung von 2,52 g Benzyl-N-docosanoyl-L-alanyl- od-D-glutamat in einem Gemisch von 120 ecm Tetrahydrofuran und 0,56 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 6°C gerührt und anschließend fügt man eine auf 6 C gekühlte Lösung von 1,484 g

-Benzyloxycarbonylglycyl-L-lysin in einem Gemisch von 4,4 ecm 1n-Natriumhydroxid und 4,4 ecm Wasser zu. Dac Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei 6 C gerührt und anschließend 2 Tage bei etwa 20 C. Man verdampft darauf das Tetrahydrofuran unter verrin-

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gertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 45°C. Das Konzentrat wird mit 10 ecm In-Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Das nach 1stündigem Rühren erhaltene unlösliche Material wird durch Filtrieren abgetrennt, fünfmal mit insgesamt 50 ecm 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure und mit 10 ecm Wasser gewaschen und anschließend unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) Lei 20 C getrocknet. Man erhält so 5,46 g eines Pulvers, das in 40 ecm Essigsäure, die 20 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, gelöst wird. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne und Deschickt das ganze auf eine Säule 38 mm Durchmesser, die 200 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 6OO ecm Äthylacetat, 440 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 360 ecm Äthylscetat-Essigsäuregemisch (7-3 VoI), 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (6-4 VoI) und 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1—1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt.

Die Fraktionen 26 - 57 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Das Konzentrat wird in 50 ecm Äther trituriert, durcn Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 1,71 g N²-/ 0 -Benzyl-N- (N-docosanoyl-L-alanyl·)-Q -D-glutamyl_7~N -benzyloxycarbonylglycyl-L-lysin.

Rf = 0,76 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)_7

2—1 \t~

Man löst 2,17 g N -/ 0 -Benzyl-N-(N-docosanoyl-L-alanyl)- 0 -D-glutamyl_7~N -benzyloxycarbonylglycyl-L-lysinsäure in 80 ecm überschlagener Essigsäure von 30⁰C. Man fügt 2,17 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom 2,5 h durch. Man erwärmt anschließend das Reaktionsmedium auf 50 C, filtriert as, wäscht das unlösliche Material dreimal mit insgesamt 30 ecm auf 50 C erwärmter Essigsäure. Die Filtrate werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa)

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bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält 1,74 g eines Pulvers, das an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser, enthaltend 35 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) chromatographiert wird. Man eluiert mit Essigsäure, wobei man Fraktionen von 20 ecm gewinnt. Die Fraktionen 23 - 41 werden vereint, unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Feststoff wird in 50 ecm Äther aufgenommen, bis zur Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 410 mg N -/ N-(N-Docosanoyl-L-alanyl)-0 -D-glutamyl_7~ N -glycyl-L-lysin.

Rf = 0,30 / Siliciumdioxidgel; Essigsäure__7

Analyse:

berechnet: C 62,87 H 9,86 N 9,64 % gefunden: C 61,5 H9,3 N9,2 %

Schwefelsäureasche % = 0,5

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren;

AIa 1,00 (Theorie = 1)

GIu 0,95 (Theorie = 1)

GIy 1,03 (Theorie = 1)

Lys 1,00 (Theorie = 1)

Das Benzyl-N-docosanoyl-L-alan/l-öd-D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 1,95 ecm Isobutyl-chlorformiat zu einer auf 25°C gehaltenen Lösung von 5,19 g Docosansäure in einem Gemisch von 150 ecm Tetrahydrofuran und 2,1 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 25 C gerührt, und anschließend fügt man eine Lösung von 5,69 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-^i-D-glutamat

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in einem Gemisch von 33 ecm 1n-Natriumhydroxid und 17 ecm Wasser hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei etwa 30 C und anschließend 18h bei etwa 20°C gerührt. Man fügt darauf 100 ecm Wasser zu und säuert auf den pH-Wert 1 an. Man erhält eine Ausfällung, die man durch Filtrieren abtrennt, wäscht sie dreimal mit insgesamt 75 ecm Wasser und trocknet unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) beJ. 20°C. Man erhält so 6,53 g eines weißen Pulvers. Man löst 6 g in 50 ecm Tetrahydrofuran, das 20 g neutrales Siliciumdioxidgel <.G,04 - 0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne und beschickt das Ganze auf eine. Säule von 3,5 cm Durchmesser, die 180 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 1300 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (1-1 VoI), 600 ecm Äthylacetat, 500 ecm Äthylacetat-Tetrahvdrofurangemisch (95-5 VoI), 900 ecm Äthylacetat-Tetrahydrofurangemisch (9-1 VoI), 800 ecm Äthylacetat-Tetrahydrofurangemisch (8-2 VoI), 1000 ecm Äthylacetat-Tetrahydrofurangemisch (6-4 VoI), 900 ecm Äthylacetat-Tetrahydrofurangemisch (4-6 VoI), 500 ecm Äthylacetat-Tetrahydrofurangemisch (2-8 VoI) und 600 ecm Tetrahydrofuran, wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt.

Die Fraktionen 17 - 68 v/erden vereint, unter verringertem Druck (20 mrüg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhäl so 3,31 g Benzyl-N-docosanoyl-L-alanyl- (/- -D-glutamat.

Rf = 0,54 /_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Tetrahydrofuran (8-2 voi)_7

Beispiel 17

Man fügt 0,94 ecm Isobutylchlorformiat zu einer aur -2 C gehaltenen Lösung von 3,23 g Benzyl-N-(3-cyclohexylpropionyl)-L-alanyl-a^-D-giutamat in einem Gemisch von 200 ecm Tetrahydrofuran und 1 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -2°C gerührt, und an-

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- ! 17 -

schließend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösung von 2,44 g

-Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-lysin in einem Gemisch von 7,23 ecm In-Natxuumhydroxid und 7 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgeiuisch wird 15 Minuten bei -2°C gerührt und anschließend 20 h bei etwa 20°C. Schließlich wi">~d es durch Zusatz von 20 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentratxon unter verringertem Druck (20 mmHg; 2-7 kPa) bei 45°C. In dem Konzentrat tritt eine Ausfällung auf, die durch Filtrieren abgetrennt, fünfmal mit insgesni\t 50 ecm Wasser gewaschen und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20 C getrocknet wird. Das so erhaltene Produkt (5,3 g) wird in 50 ecm Essigsäure, die 10 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthalt, gelöst. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt das Gesamte auf eine Säule 2,2 cm Durchmesser auf, die 100 g neutrales Siliciumdiexidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 100 ecm Äthylacetat, 700 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1VoI) und 1,2 1 Essigsäure, wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt»

Die vereinten Fraktionen 5-13 werden unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Das Konzentrat wird in 50 ecm Äther trituri2rt, durch j'iltrieren abgetrennt und getrocknet, "an erhalt so 4,21 g KP / -0 -Benzyl-N-^~N-

_ /6

(3-cyclohexylpropionyl)-L-alanyl_/-o£ -D-glutamyl s· -N -benzyloxycarbonylglycy1-L-lysin.

Rf =0,84 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-WasFer (50-20-6-24 Vol)_7

2 Γ 1
Man löst 2 g N -/-0 -Benzyi-N-^ N-(3-cyclohe^ylpropionyl)-L-alanyl_7~ 0-D-glutamyl i-N -benzyloxycarbonylglycy1-L-lysin in 50 ecm Essigsäure. Man fügt 2 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h hindurch. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 15 ecm Essigsäure gewaschen; die vereinten Filtrate werden unter verringertem Druck (20 mniHg;2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne

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konzentriert. Man erhält 1,42 g eines Pulvers, das an einer Säule von 2,3 cm Durchmesser, die 28 g neutrales Sxliciumdioxidgel
(0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert wird. Man eluiert
nacheinander mit 560 ecm Essigsäure und 120 ecm n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wassergemisch (50-20-6-24 VcI), wobei man Fraktionen
von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 8-32 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHcj; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne
konzentriert. Der erhaltene Rückstand (990 mg) wird in 30 ecm
Essigsäure gelöst, die 5 g neutrales Sxliciumdioxidgel (0,04 0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 5ü°C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 2,3 cm Durchmesser auf, die 20 g neutrales
Sxliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthalt. Man eluiert nacheinander mit 8ß0 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (3-1 VoI), 320 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), 240 ecm Äthylaoetat-EssigEMuregemisch (1-3 VoI) und 440 ecm Essigsäure, wobei man
Fraktionen von 40 ecm sammelt.

Die Fraktionen 35 - 46 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Das Konzentrat wird bis zur Pulverisierung in 40 ecm Äther trituriert, durch

? f
Filtrieren abgetrennt und getrocknet. Man erhält so 840 mg N -y N-

— — J ? 6

/~N-(3-Cyclohexylpropionyl)-L-alanyl_/- /-D-glutamylJ· -N -glycyl-

L-lysin, vom Fp = 147 - 150°C (schmieriger Schmelzpunkt).

Rf = 0,23 /""Sxliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 55,44 H 8,00 N 12,93 %
gefunden: C 53,8 H7,4 N 11,8 %

Schwefelsäureasehe % = 1,6

Nach der Gesarathydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit von folgenden Aminosäuren:

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Ala 1,00 (Theorie = 1)

.1 GIu 0,97 (Theorie =1)

->„ ' GIy 1,00 (Theorie = 1)

f· Lys 0,98 (Theorie = 1)

Das Benzyl-N- (3-cyclohexy l-propionylJ-L-alanyl-oc. -D-glutamat kann auf fo"¹ gende Weise hergestellt werden:

I-'an fügt 3 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 3,605 g S-Cyclohexan-propionsäure in einem Gemisch von 100 ecm Tetrahydrofuran und 3,23 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 7,96 g des Hydrochlorids von Benzyl-L-alanyl-ci -D-glutamat in einem Gemisch von 46,2 ecm 1n-Natriumhydroxid und 13,8 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei O⁰C gerührt und anschließend 2 Tage bei etwa 20 C. Man verdampft darauf das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. Das Konzentrat wird zweimal mit insgesamt 80 ecm Äther extrahiert, auf den pH-Wert 1 durch Zusatz von 50 ecm 1n-Chlorwasrerstoffsäure angesäuert. Das Öl, das sich vom Reaktionsgemisch dekantiert, wird viermal mit insgesamt 200 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Äthy lace L-atphasen werden vereint und mit 25 ecm einer gesättxgten N.itriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren zur Trockne unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C erhält man ein Öl, das spontan kristallisiert. Die Kristalle (7,3 g¹! werden in 40 ecm Essigsäure, die 20 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, gelöst. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt dae Ganze auf eine Säule von 2,5 cm Durchmesser auf, die 50 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert mit Äthylacetat, wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die 4. Fraktion wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 1,86 g Benzyl-N-(3-cyclohexyIpropionyi)- L-alanyl-οι -D-glutamat vom Fp = 126-128°C. Die Fraktionen 3 und werden vereint und zur Trockne konzentriert. Der amorphe Feststoff

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wird an einer Säule von 2,5 cm Durchmesser chromatographiert, die 68 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluierl- nacheinander mit 520 cdci Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (1-1 VoI) und 520 ecm Äthylacetat, wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 11 bis 28 v/erden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 1,37 g Benzyl-N-(3-cycloh^xyl-propionyD-L-alanyl-(/-D-glutamat vom Fp = 128-130°C.

Rf = 0,14 /"Siliciurudioxidgel; Äthylacetat_7

Beispiel 18

Man fügt 0,468 ecm Isobuty.lchlorformiat zu einer bei -3 C gehaltenen Lösung von 753 mg N-Benzyloxycarbonylglycin in einem Gemisch von 36 ecm Tetrahydrofuran und 0,5 ecm Triäthylarcin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -3 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf O⁰C gekühlte Lösung von 2,07 g W^-N-£~S- (3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanyl_7-/ -D-glutamyl ( -DD,LL-2,6-diamino-pimelJnsäure-monoamid in einem Gemisch von 7,2 ecm In-Katriumhydroxid und 30 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bed etwa O⁰C gerührt und anschließend 20 h bei etwa 20°C. Anschließend säuert man durch Zusatz von 12 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Das Konzentrat wird viermal mit insgesamt 100 ecm Äthyü?cetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen werden vereint, mit 23 ecm 0,In-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne erhält man 2,13 g eines amorphen Feststoffs, den man in 20 ecm Essigsäure löst, die 5 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne und beschickt das Ganze

030062/0905

auf eine Säule von 2 cm Durchmesser, die 40 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 400 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch {ⁿ~3 VoI), 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 9-19 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene amorphe Feststoff wird mit 40 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg) getrocknet. Man erhält so 1,49 g N²-/ N-/~N-(-3,5,5-Trimethyl-hexanoyl)-L-alanyl_7-/-D- -N -benzyloxycarbonylglycyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,70 / Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Rf = 0,53 l_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI) JJ

löst 1,45 g N²- !-^-/"n-(3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanyl_7~ 0 -D-glutamylC -N -benzyloxycarbonylglycyl-DD,LL~2,6-diaminopimelinsäure-monoamid in 40 ecm Essigsäure. Man fügt 1,45 g Palladium auf Kohle (3 0 Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 1,5 h durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats zur Trockne unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C wird der amorphe Feststoff in 5C ecm Äther trituriert.Man erhält so 1,18 g Feststoff, den man in 150 ecm Wasser suspendiert. Nach 68stündigem Rühren erhält man eine klare Lösung, die man auf eine Säule von 2,3 cm Durchmesser, die 250 cm Sephadex G-10 enthält, aufbringt. Man eluiert mit Wasser, wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 2 und 3 werden vereint und lyophilisiert und im Vakuum (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 930 mg N -/ N-^^-N-(3,5,5- Trimethylhexanoyl) L-alanyl_7~ / -D-glutamyl ( -N -glycyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

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Rf = 0,23 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (5O-2C 6-24 VoI) J

Analyse:

berechnen C 53,23 H 7,90 N 14,33 %

gefunden: C 49,9 H6,5 N 13,3 %

Schwefelsäureasche = 12,4 %

AIa 1,01 (Theorie =1)

Dap 0,95 (Theorie = 1)

GIu 1,00 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Das N²- yN~/~N-(3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanyl_7- ο -D-glutamyl£- DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 2,76 g N²- j O^Benzoyl-N-^N- (3,5 ,5-trimethylhexanoyl)-

_ j -^ 6

L-alariyl_/- Q-D-glutamy ±J-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diaminopimelinsäure-monoamid in 100 ecm Essigsäure. Man fügt 2,76 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne wird das öl in 50 ecm Äther trituriert. Man erhält eine Ausfällung, dit= man durch Filtrieren abtrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20⁰C trocknet. Man erhält so 2,07 g N²- /N-/~N-(3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanyl_7~ fl-D-glutamyl ( -DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf =0,32 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

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Rf = 0,31 l_ Siliciumdioxidgel; Essigsäure_/

2^1-

Das N - y O -Benzyl-N-/ N- (3 ,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl_/- -D-glutamyl ( -N -benzyloxycarbonyl-DD^L^^-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 0,91 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei 0⁰C gehaltenen Lösung von 3,14 g Benzyl-N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 150 ecm Tetrahydrofuran und 0,98 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 2,263 g N -Benzyloxycarbonyl-DDiLL^^-diamino-pimelinsäuremonoamid in einem Gemisch von 7 ecm 1n-Natriumhydroxid und 70 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei etwa 0 C und anschließend 20 h bei etwa 22°C gerührt. Schließlich entfernt man einen geringen Anteil an unlöslichem Material durch Filtrieren, säuert durch Zusatz von 12 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50^Γ. Das Konzentrat wird dreimal mit insgesamt 150 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatphasen werden mit 20 ecm 0,1n-Chlorwa.iserstoff säure gewaschen, und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 5,14 g eines amorphen Feststoffs, den man in 60 ecm Äthylacetat-Essigsäure-Gemisch (1-1 VoI), das 10 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne und beschickt; das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser, die 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, kan eluiert nacheinander mit 400 ecm Äthylacetat, 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (6-4 VoI), 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 15-25 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C konzentriert. Das erhaltene Öl wird mit 50 ecm

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Äther aufgenommen, bis zur Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhä±t 2,85 g N²/ -0¹-Benzyl-N-/~N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl_/-/ -D-glutamyl^ -N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,82 /"Siliciumdioxidgel; Äthylscetat-Essigsäure-(?-1 Vol)_7

Das Benzy1-N-(3,5,5-trimethy1-hexanoy1)-L-alany1-ot -D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 4,3 ecm Isobutylchlorforiniat zu einer bei -6°C gehalteilen Lösung von 7,59 g N-(3,5,5-Trimethylhexanoyl)-L-alanin in einem Gemisch von 4O0 ecm Tetrahydrofuran und 4,63 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -6°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 3°C gekühlte Lösung von 9,06 g des Hydrochlorids von Benzyl- U,-D-glutamat in einem Gemisch von 66,2 ecm 1n-Natriumhydroxid und 14 ecm Wasser zu. Das -Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei etwa -5°C und anschließend 66 h bei etwa 18°C gerührt. Es wird anschließend durch Zusatz von 75 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 200 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatphasen werden mit 40 ecm 0,In-Chlorwasserstoffsäure gevaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren unter verringertem Druck (20mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C erhält man 14,8 g eines Öls, das man in 50 ecm Äthyl^cetat, das 30 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 2,8 cm Durchmesser, die 280 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, auf. Man eluiert nacheinander mit 2 1 Cyclohexan, 1 1 Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (95-5 VoI), 1,5 1 Cyclchexan-Äthylacetatgemisch (SO-10 VoI), 5 Cyclohexan-Äthyiacetatgemiscli (80-20- VoI), 1,5 1 Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (70-30 l⁷ol) und 3.5 1 Cyclohexan-Äthylacetat-

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gemisch (50-50 VoI), wobei man Fraktionen von 500 ecm sammelt. Die Fraktionen 23-29 werden vereint und unter verringertem Druck '20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 10,86 g Benzyl-N- (3 ,5 ,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl-,c£.-D-glutamat in der Form eines Öls, das kristallisiert.

Rf = 0,37 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Das N-(3,5,5-Trimethyl-hexanoyl)-L-alanin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 6,5 ecm Isobutylchlorformxat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 7,9¹2 g 3,5,5-Trimethylhexansäure in einem Gemisch von 125 ecm Tetrahydrofuran und 7 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, worauf man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 4,495 g L-Alanin in 50 ecm 1n-Natriumhydroxid zusetzt. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa O⁰C und anschliessend 18h bei etwa 25°C gerührt. Man verdampft darauf das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Das Konzentrat wird zweimal mit insgesamt 40 ecm Äther konzentriert, durch Zusatz von 55 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Die ölige Ausfällung, die sich bildet, wird fünfmal mit insgesamt 2^0 ecm Athylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen werden vereint, mxt 25 ecm gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren unter verringertem Druck (20mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne erhält man 11,79 g eines Öls, das man in 40 ecm Äthylacetat, das 20 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,20 mm) enthält, löst. Kan konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20mmHg; 2,7 kPa) bei 50"'_ zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser, die 120 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,063-0,20 mm) enthält, auf. Man eluiert nacheinander mit 600 ecm Cyclohexan, 300 ecm Cyclohexan-Äthylacetat-gemisch (95-5 VoI), 300 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (90-10 VoI), 300 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (80-20 VoI) , 700 ecm Cyclohexan-Äthylacetatgemisch (50-EJO VoI) , 300 ecm

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Äthylacetat-und 300 ecm Äthylacetat-Methanolgemisch (90-10 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 17-28 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 10,16 g eines Öls, das man in 25 ecm Äther löst. Durch Zusatz von 150 ecm Petroläther erhält man ein Öl, das man durch Dekantieren abscheidet. Nach dem Trocknen j.m Vakuum (0,2 mmHg; 0,027 kPa) erhält man 7,59 g N-(3,5,5-Trimethyl-hexanoyl)-L-alanin.

Rf = 0,43 {_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Beispiel 19

Man fügt 0,91 ecm Isobuty!chlorformiat zu einer bei 0⁰C gehaltenen Lösung von 3,14 g Benzyl-N-(3,5,5-trimethyl-hexanoyl)-L-alanyl- oi-D-glutamat in einem Gemisch von 150 ecm Tetrahydrofuran und 0,98 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -2°C gerührt und anschließend fügt man eine auf 2°C gekühlte Lösung von 2,36 g

-Benzyloxycarbonylglycyl-L-lysin in einem Geiaisch von 7 ecm 1n-Natriumhydroxid und 20 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bv?.i etwa O⁰C und anschließend 20 h bei 20°C gerührt.. Man säuert schließlich durch Zusatz von 12 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 125 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatphasen werden mit 25 ecm 0,1n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren unter verringertem Druck (20mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 4,41 g amorphen Feststoff, den man in 50 ecm Äthylacetat löst, das 15g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20⁰C zur Trockne und bringt das Gcnze auf eine Säule von 3,5 cm Durchmesser, die 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, auf.

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ORIGINAL INSPECTED

Man eluiert nacheinander mit 480 ecm Äthylacetat, 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 440 ecm Äthylacetat-Essigsäuregomisch (9-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 16-46 v/erden vereint, unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 KPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 4,38 g Ntjt - £ O¹-Benzyl-N-/~N-(3,5,5-trimethylhexanoyl)-L-alanyl_/-/-D-glutamyl [ -Nr? -benzyloxycarbonyIgjycyl- L-lysin in der Perm eines Öls.

Rf = 0,84 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 Vol)_7

Man löst 2,14 g No^ -^f 0 -Benzy1-N-/~N- (3 ,5 ,S-trimethylhexanoylJ-L-alanyl-^ -D-clutamyl ( -Ncf -benzyloxycarbonylglycyl-L-lysin in 100 ecm Essigsäure. Man fügt 2,14 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 1 h 40 Min. durch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne wird der amorphe Feststoff in 50 ecm Äther trituriert. Man erhält eine Ausfällung, die durch Filtrieren abgetrennt urd unter verringertem Drurh (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20⁰C getrocknet wird. Man erhält so 1,ί'ι g Ncj/ -/ N-/ N- (3,5,5-Trimethylhexanoyl)-

— > Ir

L-alanyl_/-§ -D-glutamyl> -Ne -glycyl-L-lysin. Rf = 0,37 / Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Rf = 0,28 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

Analyse:	C	55	,23	H	8,	35	N	1	2	,88
berechnet:	C	52	,2	H	7,	7	W	1	1	,3
gefunden:

Schwefelsäureasche = 2 %

Nach Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Amines

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-128- 302A281

Ala 1,00 (Theorie = 1)

GIu 0,94 (Theorie = 1)

GIy 1,02 (Theorie = 1)

Lys 1,02 (Theorie = 1)

Beispiel 20

Man fügt 1,26 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei 1O°C gehaltenen Lösung von 1,52 g Nonansäure in einem Gemisch von 120 ecm Dioxan und 1,35 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 10⁰C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 10°C gekühlte Lösung von 3,5 g des Hydrochlorids von No£_ -/ 0 -Benzyl-N-L-alanyl-Ϊ -D-glutamyl_/-N-ci - ^benzyloxycarbonylglycyl) -L-lysinin einem Gemisch von 9,6 ecm 1n-Natriumhydroxid und 10 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei etwa 10°C und anschließend 15 Minuten bei etwa 20°C gerührt. Man konzentriert anschließend das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C. Zu dem Konzentrat fügt man 160 ecm Wasser und säuert durch Zusatz von 5 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 an. Man extrahiert dreimal mit insgesamt 150 ecm Äthylacetat. Die vereinten Äthylacetatphasen werden mi-': 100 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C zur Trockne konzentriert. Die so erhaltene gelatinöse Masse wird mit 100 ecm Äther aufgenommen, bis zur völligen Pulverisievung trituriert und durch Filtrieren abgetrennt, viermal mit insgesamt 200 ecm Äi-her gewaschen und an der offenen Luft getrocknet. Man erhält 2,2 g eines weißen Pulvers, das man in 30 ecm Essigsäure löst, die 4 g neutrales Siliciumdioxidgel· (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck bei 50°C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert mit einem Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die

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Fraktionen 8-22 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Das erhaltene Öl wird mit 100 ecm autgenommen, bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 50°C getrocknet. Man erhält so 1,3 g iST-ς^. -(_ 0 -Benzyl-N-(N-nonanoyl-L-alanyl)- ο -D-glutamyl_/-Nr£. - (benzyloxycarbcnylglycyl)-L-lysin.

Rf = 0,74 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

In eine Losung von 1,2 g Nti£ -/ 0 -Benzyl-N-(N-nonanoyl-L-alanyl)- { -D-glutamyl_/-Ncⁱ' - (benzyloxycarbonyxglycyl)-L-lysin in 100 ecm Trifluoressigsäure bläst man Bromwasserstoffsäure während 20 Minuten ein. Anschließend konzentriert man die Lösung untor verringerten Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne. Man erhält ein Öl, das man mit 50 ecm Äthylacetat aufnimmt, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert,durch Filtrieren abtrennt, dreimal mi··- insgesamt 150 ecm Äther wäscht und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20⁰C trocknet. Kan erhält so 0,9 g eines Pulvers, das man en einer Säule von 2,5 cm Durchmesser, die 50 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert mit einem Äthylpcetat-Lssigsäuregemisch (1-1 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktionen 21 - 57 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält ein Öl, das man in 50 ecm Äthylacetat aufnimm+-, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abtrennt, zweimal mit insgesamt 60 ecm Äther aufnimmt und unter verringertem Oruck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20°C trocknet. Man erhält so 0,49 g des Hydrobromids von No/ -(_ N-(N-Nonanoyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl/-Ncf -glycyl-L- lysin.

Rf = 0,30 (_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

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Analyse:

berechnet: C 48,07 H 7,42 N 11,21 % gefunden: C 45,3 H7,3 N 10,5 %

Schwefelsäureasehe =5,1 %

AIa 1,00 (Theorie = 1)

GIu 1,03 (Theorie --=1)

GIy 1,00 (Theorie =1)

Lys 1,04 (Theorie =1)

— 1 J —

Das Hydrochlorid von N&6- -{_ 0 -Benzy1-N-L-alanyl- ξ -D-glutamyl_/-N^ -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 3,5 g Ntg£ -/ 0 -Benzy1-N-t-butyloxycarbonyi-L-alany1-6 D-glutamyl_/-N <f -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysin in 20 ecm einer gesättigten wasserfreiem Chlorwasserstoff-Essigsäurelösung. Man beläßt 1 h bei 20 C im Kontakt und gießt anschließend die Lösung in 1 1 Äther ein. Man erhält eine Ausfällung, die man durch Filtrieren abtrennt, zweimal mit insgesamt 200 ecm Äther wäscht und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C trocknet. Man erhält so 3,5 g des Hydrochlorids von N-a£-^ 0 -Benzyl-N-L-alanyl}- ( -D-glutamyl_7-Nc£ - (benzy loxy carbonyl)-L-lysin.

Beispiel 21

Man fügt 0,27 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -4°C gehaltenen Lösung von 425 mg N-Benzyloxycarbonylglyein in einem Gemisch von 40 ecm Tetrahydrofuran und 0,28 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -4°C gerührt, und anschließend fügt man eine

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auf O⁰C gekühlte Lösung von 1,16 g N -[_ N- (N-Lauroyl-L-alanyl)- 0 -D-glutamyl_/-LL-2,6-diainino-pimelinsäure-inonoainid in 4 ecm In-Natriumhydroxid und 6 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei etwa -5°C gerührt und anschließend 20 h bei etwa 20⁰C. Anschließend entfernt eine Richte Trübung durch Filtrieren, konzentriert das Filtrat unter verringertem Druck (20 minHg; 2,7 kPa) bei 45°C und fügt zu dem Konzentrat 30 ecm Wasser. Es bildet sich langsam eine Ausfällung. Man trennt sie durch Filtrieren ab und wäscht sie mit 20 ecm Wasser und trocknet sie an der freien Luft. Man erhält so 1,38 g eines cremefarbenen Pulvers, das man an 70 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) chromatographiert, das in einer Säule von 2,8 cm Durchmesser enthalten ist. Man eluiert nacheinander mlc 250 ecm Äthylacetat, 950 ecm eines Äthylacetat-Essigsäuregemischs (95-5 VoI), 800 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemischs (9-1 VoI), 800 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemischs (8-2 VoI), 350 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemischs (7-3 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktionen 38 - 62 werden vereint und unter verringertem Druck (2O mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Das erhaltene Öl wird mit 100 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 40⁰C getrocknet. Man erhält so 1,03 g N -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- y-D-qlutamyl_7~ N -benzyloxycarbonyl-glycyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = O,54 ^"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI)J

Man löst 1,18 g N²~/~N-(N-Lauroyl-L-a±anyl)- / -D-glutamyl_7-N⁶-benzyloxycarbonyl-glycyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-moPoamid in 32 ecm Essigsäure. Man fügt 1,18 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 5 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) zur Trockne bei 50⁰C wird das erhaltene amorphe Produkt in 30 ecm Äthylacetat trituriert, durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 40 ecm Äthylacetat und 20 ecm Äther gewaschen. Man erhält so 0,88 g eines

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cremefarbenen Pulvers, das man in 20 ecm Essigsäure löst, die 1,6 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne und beschickt das Ganze auf eine Säule von 1,8 cm Durchmesser, die 16 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 650 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI) und 1,4 1 Äthylacetat-Essigsäure-Gemisch (1-3 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Di^ Fraktionen 15-30 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) Dei 50°C zur Trockne konzentriert. Das erhaltene amorphe Produkt wird in 50 ecm Äthylacetat aufgenommen, durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 40 ecm Äthylacetat und anschließend mit 30 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kl?a) bei 40°C erhält man 0,44 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-V --D-glutamyl /-N -glycyl-LL-2.- 6-diamino-pimelinsäure-monoainid.

Analyse:

berechnet: C 55,40 H 8,34 N 13,36 % gefunden: C 53,0 H8,3 N 12,6 %

Schwefelsäureasche = 3,2 %

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoan^lysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 1,04 (Theorie = 1)

Dap 0,98 (Theorie = 1)

GIu 1,00 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Das N -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- f-D-glutamyl_7_LL-2,6-diaminopimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

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Man löst 1,36 g N²-/~O¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutaipyl_/-N -benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 40 ecm Essigsäure. Man fügt 1,4 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 4 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 kPa) bei 55 C zur Trockne wird das erhaltene Öl in 100 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren ab-

2 — getrennt und an der Luft getrocknet. Man erhält z>o 0,96 g N -/_ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-f -D-glutamyl_/-LL-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid.

Rf = 0,38 / Sixiciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das N²-/"O¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- { -D-glutamyl_7-N⁶-benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt v/erden:

Man fügt 0,69 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 2,57 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-eAi'-D-glutamat in einem Gemisch von 120 ecm Tetrahydrofuran uni 0,74 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0 C gekühlte Lösung von 1,7 g N Benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 5,25 ecm 1n-Natriumhydroxid und 35 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei etwa -2°C gerührt und anschließend 22 h bei etwa 20°C. Schließlich säuert man durch Zusatz von 20 ecm 1n-Chlorwasserstoffailure auf den ^H-Wert 2 an. Die gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 60 ecm 0,1n-Chlorwasserstoffsäure und dreimal mit insgesamt 60 ecm Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen an der freien Luft erhält man 3,97 g eines weißen Pulvers, das man an 200 g neutralem Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm), das in einer Säule von 3,8 cm Durchmesser enthalten ist, chromatographiert.

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Man eluiert nacheinander mit:

600 c-ϊΐι Äthylacetat, 500 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI) , 800 ecm Äthylacetat-Essigsäure^emisch (9-1 VoI) , wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktionen 24 - 30 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) zur Trockne konzentriert bei 50°C- Das erhaltene Öl wird in 100 ecm aufgenommen,bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg;

2 — 1 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 1,24 g N .-/ 0 -Benzyl-N-(N- lauroyl-L-alanyl)-ο -D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,85 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Rf = 0,76 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI)J

Das N -Ben2.yIoxycarbonyl-I₎L-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Zu einer Lösung von 5 g des Dihydrochlorids von LL-2,6-Diaminopimelinsäure-monoamid in 15 cc:n Wasser, das durch 45 ecm InNatriumhydroxid auf den pH-Wert 10 gebracht worden war, fügt man 2,14 g Kupfer-II-Bromid, gelöst in 20 ecm Wasser. Man rührt das Reaktionsgeinisch 2 h bei etwa 20°C. Man trennt durch Filtrieren eine geringe Menge an unlöslichem Material ab und kühlt anschliessend das Filtrat auf eine Temperatur von -3 bis O⁰C. Me:* fügt 4,8 g Natriumbicarbonat und anschließend tropfenweise während 30 Minuten 4,1 ecm Benzylchlorformiat zu. Das Reaktionsgemisch wird 18h bei einer Temperatur von etwa 20°C gerührt. Die erhaltene blaue Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 90 ecm Wasser, dreimal mit insgesamt 90 ecm Äthanol und dreimal mit insgesamt 90 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C erhält man 4,18 g des Kupfer-II-komplexes von N -Benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-

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pimelinsäure-monoamid, den man zu 28 ecm In-Chlorwasserstoffsäure fügt. Man rührt. 1 h bei einer Temperatur von etwa 20 C. Ein unlösliches Material wird durch Filtrieren abgetrennt. Zu dem FiI-trat fügt man 14 ecm Methanol und leitet anschließend einen Schwefelwasserstoffstrom während 6 h hiudurch. Man läßt 16h stehen. Die erhaltene schwarze Brühe wird filtriert und dreimal mit insgesamt 15 ecm Wasser gev^raschen. Die vereinten Filtrate v/erden unter verringertem Druck (20 mmllg; 2,7 kPa) bei 50°C auf ein Volumen von 10 r.cm konzentriert, durch Zusatz von 5 ecm Triäthylamin auf den pH-Wert 7 gebracht und durch Zusatz von 5 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 6,8 gebracht. Die so erhaltene weiße Brühe wird 2 h bei 0°C stehengelassen. Das Produkt, das durch Filtrieren abgetrennt wird, Vvxrd nacheinander dreimal mit insgesamt 30 ecm Wasser, dreimal mit insgesamt 30 ecm Äthanol und dreimal mit insgesamt 30 ecm Äther gewaschen. Nach dem Trocknen bei 60⁰C unter verringertem Druck (0,3 mmHg ; 0,04 kPa) erhält man 1,78 g N -Benzyloxycarbonyl-LL-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid.

£Uj ²° = +11° (c = 1, In-HCl)

Rf = C,45 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das Dihydrochlorid des LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamids kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 17g LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 300 ecm Methanol und 5,9 ecm konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (d = 1,19). Man fügt 17 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen Wasserstoffstrom während 4 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren den Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 55°C zur Trockne erhält man 8,8 g des Dihydrochlorids von LL-2,6-Diamino-pimelinsäure-monoamid in Form einer Meringe.

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Das LL-2,ö-Dibenzyloxycarbonyl-amino-pimelinsäüre-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 19 g saures Benzyl-LL-N²,N⁶-dibenzyloxycarbonyl-2, 6-diamino-pimelat in 190 ecm Methanol. Man kühlt diese Lösung auf etwa 0 C ab und sättigt sie mit Ammonick. Nach der Sättigung bringt man sie in einer: 11-Autoklaven ein. Nach dem Schließen dieses Autoklaven beläßt man 6 Tage bei etwa 20⁰C. Nach dem Entgasen wird die so erhnJtene Lösung unter verringertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C konzentriert. Der Rückstand wird in 250 ecm Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 30 ecm 4n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 gebracht, dreimal mit insgesamt 300 ecm Äthylacetat extrahiert, und die organische Phase wird mit 100 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 17 g LL-2,6-Dibenzyloxycarbonylaminopimelinsäure-monoamid in der Form eines Öls.

Rf = 0,68 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Das saure Benzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diamino-pimelat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

2 6

Man löst 55 g Benzyl-LL,N ,N -diben^yloxycarbonyl-2,6-diaminopimelat in 400 ecm auf 40°C angewärmter" Benzylalkohol. Anschliessend gießt man auf diese etwa 1 h bei 4O⁰C gehaltene Lösung währeid 6,5 h eine Lösung von 4,8 g Kaliumhydroxid in Plätzchen von 86 % in 400 ecm Benzylalkohol. Man beginnt das Reaktionsmedium bei etwa 20°C weitere 16 h zu rühren und konzentriert anschließend unter verringertem Druck (0,5 mmHg; 0,066 kPa) bei 90 C zur Trockne. Man erhält so ein Öl, das man in 1 1 Wasser löst und dreimal mit insgesamt 900 ecm Äthylacetat extrahiert. Die so extrahierte wässrige Phase wird durch Zusatz von 45 ecm 4n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 2 gebracht und dreimal

Q30062/0905

mit insgesamt 1,5 1 Äthylacetat extrahiert. Die so erhaltene Äthylacetatphase wird mit 500 ecm einer gesättigen Natr^umchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abtrennen durch Filtrieren des Natriumsulfats fügt man 17 ecm Dicyclohexylamin zu und konzentriert unter verringerter Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 40°C zur Trockne. Man erhält ein gelbes Öl, das man in 100 ecm Äthanol löst, wozu man 100 ecm Wasser fügt. Nach 20stündigem Stehen bei O⁰C erhält man einen weißen Feststoff, den .^-Jn durch Filtrieren abtrennt, zweimal mit insgesamt 100 ecm Wasser wäscht und in einem Gemisch von 200 ecm Äthylacetat und 200 ecm Wasser aufnimmt. Man säuert die wässrige Phase durch Zusatz von 40 ecm einer 1n-Methansulfonsäurelösung an. Nach dem Dekantieren wird die organische Phase zweimal mit insgesamt 100 ecm Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 15 g saures

2 6

Benzyl-LL-N ,N - dibenzyloxycarbonyl-2, 6~diamino-pimelat in Form eines Öls.

Rf = 0,76 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

2 6

Das Dibenzyl-LL-N ,N- dibenzyioxycarbonyl-2, 6-diamino-pimelat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

In einen Dreihalskolben von 500 ecm, ausgerüstet mit einem zentralen Rührer und einer Dean-Stark-Vorrichtung, fügt man ein Gemisch von 44,7 g LL-N²,N⁶- dibenzyloxycarbonyl-2 , 5-diamino-pimelinsäure, 3 g ρ-Toluolsulfonsäure, 30 ecm Benzylalkohol und 300 ecm Toluol. Man bringt das Reaktionsgemisch 5 h unter Rückfluß. Anschließend trennt man nach 16stündigem Rühren bei 20°C das unlösliche weiße Material durch Filtrieren ab und wäscht es zweimal mit insgesamt 400 ecm einer 5 %igen Natriumcarbonatlösung und zweimal mit insgesamt 400 ccin Wasser. Nach dem Trocknen an der freien Luft erhält man 55,4 g Dibenzyl-LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diaminopimelat vom Fp = 118°C.

0 30 062/0905

Rf = 0,53 (_ Siliciumdioxidgel; Essigsäure-Äthylacetat (8-2 VoI) _/

Die LL-N ,N -dibenzyloxycarbonyl-2,6-diamino-pimelinsäure kann hergestellt werden nach der Methode von A. Arendt et al-, Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 635 (1974).

Beispiel 22

Man fügt 0,45 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°c gehaltenen Lösung von 410 mg N-Acetylglycin in einem Gemisch von 70 ecm Tetrahydrofuran und 0,49 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, urd anschließend fügt man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 2 g N -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-f-D-glutamyl_7-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 7 ecm 1 η-Natriumhydroxid und 10 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei 0⁰C gerührt und anschließend 20 h bei etwa 20°C. Man säuert anschließend durch Zusatz von 10 ecm In-Cilorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Man konzentriert unter verringertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne. Man nimmt den amorphen Rückst3.nd mit 2.0 ecm Essigsäure auf, die 5 g neutrales Siliciumdioxidgel· (O,04-O,o63mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne und beschickt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser, die 70 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 280 ecm Äthyiacetat, 160 ecm Äuhylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 440 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (75-25 VoI), 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 Voi), 920 ecm Äthyiacetat-Essigsäuregemisch (1-4 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt.

Die Fraktionen 33 - 41 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene amorphe Feststoff wird mit 50 ecm Äther aufgenommen,

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bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 920 mg eines weißen Pulvers, da;* man an einer Säule von 2 cm Durchmesser, die 25 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 50 ecm Äthylacetat, 1C0 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 Vol)_/, 100 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (3-1 VoI), 200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), 200 ecm Äthylacetat-EssigsHuregemisch (1-3 VoI), und 75 ecm Essigsäure eluiert, wobei man Fraktionen von 25 ecm gewinnt. Die Fraktionen 17-27 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene amorphe Feststoff wird in 50 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 60°C getrocknet. Man erhält so 720 mg N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7~ N - (N-acetylglycyI)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid, das von 135°C an schmilzt (schmieriger Schmelzpunkt).

Rf = 0,45 l_ Siliciumdioxidgel; Essigsäure_/

Analyse:

berechnet: C 55,51 H δ,11 Ν 12,53 % gefunden: C 54_;3 H8,0 N 12,3 %

Schwefelsäureasehe = 4,36 %

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator flie Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 1,04 (Theorie = 1)

Dap 0,9 7 (Theorie = 1)

GIu 1,02 (Theorie = 1)

GIy 1,OC (Theorie = 1)

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Beispiel 23

Man fügt 0,45 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 781 mg N-Benzyloxycarbonyl-D-alanin in einem Gemisch von 70 ecm Tetrahydrofuran und 0,49 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 5 C gekühlte Lösung von 2 g N -/ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-J -D-glutamyl_/-DD,LL-2, 6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 7 ccrn 1n-Natriumhydroxid und 10 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei etwa 0 C und anschließend 20 h bei etwa 20°C gerührt. Man säuert darauf durch Zusatz von 10 ecm In-Chlorwasserstoffsr.ure auf den pH-Wert 1 an. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. Das Konzentrat wird dreimal mit insgesamt 180 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äihylacetatphasen werden mit 20 ecm 0,In-Chlorwasserstoffsäure, 20 ecm Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren zur Trockne unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bfc-i 50°C erhält man ein Pulver, das man in 60 ecm Essigsäure löst, die 6 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C zur Trockne und beschickt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser, die 82 g neutraler» Siliciumdioxidgel (0,04—0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinandert mit 250 ecm Äthylacetat, 250 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 25O ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 300 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-15 VoI), 750 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), 250 ecm Äthylacetat-Essigpcuregemisch (7-3 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktionen 23 - 34 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene amorphe Feststoff wird mit 100 ecm Äther aufgenommen, bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält 1,15.g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- lf-D-glutamyl_7-N⁶-(N-benzyloxycarbonyl-D-alanyI)-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-mono-

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amid in der Form eines weißen Pulvers.

Rf = 0,68 l_ Siliciumdioxidgel; Üthylacetat-Essigsäure (ί-1 Vol)_/

Man löst 1,09 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7~N⁶-(N-benzyloxycarbonyl-D~alanyl)-DD,LL-2.6-diamino-pimelinsäuremonoamid in 26 ecm Essigsäure. Man fügt 1,09 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h hindurch. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt, das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 imnHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Das so erhaltene öl wird in 40 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit incgesamt 20 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20⁰C getrocknet. Man erhält so 820 mg eines Pulvers, das man an einer Säule von 2 cm Durchmesser, die 25 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 120 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI) , 240 ecm zithylacetat-Essigsäuregemisch (75-25 VoI),240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-3 VoI), woboi man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktionen 18-33 werden vereint und unter verringertem Druck (20 minHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Das so erhaltene Öl wird mit 40 ecm aufgenommen, bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Drurk (0,3 irjmHg; 0,04 kPa) bei 60⁰C getrocknet. Man erhält so 480 mg N -/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- Q -D-glutamyl_7~N -D-alanyl-DD,I.L-2, 6-aiamino-pimelinsXure-monoamid.

Rf = 0,14 l_ Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Analyse:

berechnet: C 56,06 H 8,47 N 13,07 % gefunden: C 52,5 H 8,0 N 12,5 %

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Schwefelsäureasche = 5,3 %

Nach dor Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 2,01 (Theorie =2)
Dap 1,00 (Theorie -- 1)
GIu 1,10 (Theorie = 1)

Beispiel 24

Man fügt 0,42 ecm Isobutylchlorfomiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 670 mg N-Benzyloxycarbonyl-glycin in einem Gemisch von 60 ecm Tetrahydrofuran und o,45 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt

2 — man eine auf 5 C gekühlte Lösung von 1,87 g N -(_ N- (N-ündecanoyl-L-alanyl)-$-D-glutamyl_7-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 6,4 ecm In-Natriumhydroxia und 10 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei etwa 0°C und anschließend 18h bei etwa 20⁰C gerührt. Man säuert anschließend durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Das Konzentrat wird mit 1ü0 ecm Äthylacetat extrahiert· Die Äthylacetatphase wird mit 50 ecm 0,In-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 2,3 g eines Feststoffs, den man in 20 ecm Essigsäure, die 5 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 2,3 cm Durchmesser, die 50g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, auf. Man eluiert nacheinander mit 140 ecm

030062/0905

Äthylacetat, 80 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI) , 80 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-1b VoI) 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI),320 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (7-3 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm gewinnt. Die Fraktionen 29 - 46 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C konzentriert. Das erhaltene Öl wird mit 60 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 1,32 g N -/~N-(N-Undecanoyl-L-alanyl)- <j -D-glutamyl_7~N - (benzyloxycarbonylglycyl)-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,85 l_ Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Rf = 0,68 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI)_7

Man löst 1,32 g N²-/~N-(N-ündecanoyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7-N⁶-(benzyloxycarbonylglycyl)-LL,DD-2 ,6-cliamino-pimelinsäure in 1 8 ecm Essigsäure. Man fügt 1,32 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne wird das erhaltene Öl in 50 ecm Äther bis zur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20°C getrocknet. Man 1,16 g Pulver·, das man an einer Säule von 1,8 cm Durchmesser, die 25 g neutra]es Siliciumdioxidgel enthält, (0,04-0,063 mm) chromatographiert. Man eluie.-t mit Essigsäure und gewinnt Fraktionen von 20 ecm. Die Fraktionen 5-19 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Feststoff wird mit 40 ecm Äther aufgenommen, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 60°C getrocknet. Man erhält so 580 rr.g N²-/~N-(N-Undecanoyl-L-alanyl)-Jj -D-glutamyl_7-N -glycyl-LL,DD-2, 6~dianino-pimelinsäure-monoamid.

030062/0905

302A281

Rf = 0,24 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24VoI) J

Analyse:

berechnet: C 54,71 H 8,20 N 13,67 % gefunden: C 53,2 H8,2 N 13,6 %

Schwefelsäureasche = 1,7 %

AIa 1,01 (Theorie =1)

Dap 0,94 (Theorie = 1)

GIu 1,00 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie =1)

Das N -/~N-(N-Undecanoyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_7-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 2,55 g N²-/~O¹-Benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)- /-nglutarayl_/™N -benzyloxycarbonyl-LL ,DD-2,6-diamiPO-pimelinsäuremonoamid in 35 ecm Essigsäure. Man fügt ^,55 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt und dreimal mit insgesamt 30 ecm Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der amorphe Feststoff wird mit 50 ecm Äther aufgenommen, filtriert und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20⁰C getrocknet. Man erhält so 1,87 g N²-/~N-(N-Undecanoyl-L-alanyl)- (f -D-glutamyl_7-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,75 (Siliciumdioxidgel; Essigsäure).

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2—1 J —

Das N-^O -Benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_/-N -ber.«:yloxycarbonyl-LL,DD-2 ,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 0,65 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 2/383 g Benzyl-N-undecanoyl-L-alanyl-al -D-glutairic.t in einem Gemisch von 100 ecm Tetrahydrofuran und 0,7 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -5°C gerührt Ui:.d anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von 1,617 gN Benzyloxycarbonyl-LL-DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 5 ecm 1n-Natriumhydroxid und 50 ecm Wasser hinzu. Das Ree^tionsgemisch wird einige Minuten bei etwa 0 C und anschließend 40 h .bei etwa 20⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend durch Zusatz von 10 ecm In-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. In dem Konzentrat bildet sich eine Ausfällung, die man durch Filtrieren abtrennt, dreimal mit insgesamt 60 ecm 0,1 n-Chlorwasserstoffsäure und 20 ecm Wasser wäscht. Nach dem Trocknen unter verringertem Druck (0,3 itinHg; 0,04 kPa) bei 20°C erhält man 3,66 g eines weißen Feststoffs, den man in 20 ecm Essigsäure löst, die 10 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3,5 cm Durchmesser auf, die 75 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 600 ccr. Äthylacetat-C/clohexangemisch (1-1 VoI), 600 ecm Äthylacetat-Cyclohexangemisch (3-1 VoI), 400 ecm Äthylacetat, 600 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 500 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 1200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-15 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 22 - 32 werden vereint und unter verringertem Druck (20mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene amorphe Feststoff wird mit 80 ecm Äther aufgenommen, bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so

030062/0905

O - 1 J-

2/58 g N-/ O -Benzyl-N-(N-undecanoyl-L-alanyl)- J -D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,62 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (9-1 VoI) J

Das Benzyl-N-undecanoyl-L-alanyl- i>C -D-glutamat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 3,56 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 5,1 g Undecansäure in einem Gemisch von 140 ecm Tetrahydrofuran und 3,84 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0⁰C gekühlte Lösung von.9,45 g Hydrochxorid von Benzyl-L-alanyΙοί -D-glutamat in einem Gemisch von 54,8 ecm 1n-Natriumhydroxid und 30 ecm Wasser hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa -5°C und anschließend 20 h bei etwa 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend durch Zusatz von 60 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. Das Konzentrat wird zweimal mit insgesamt 80 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen werden vereint und mit 40 ecm Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren und Konzentriere-n unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne erhält man 11,89 g eines Öls, das man an einer Säule von 4,5 cm Durchmesser, die 250 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält,chromatographiert. Man eluiert mit Äthylacetat, wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 3 - ^ς werden vereint, und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20 C zur Trockne konzentriert. Man erhält 5,85 g eines teigigen Feststoffs, den man an einer Säule von 3,2 cm Durchmesser, die 115 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chroma tographiert. Man eluiert nacheinander mit 1 1 Äthylacetat-Cyclohexangemisch (1-1 VoI), 1,7 1 Äthylacetat· und 600 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (99—1 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 11-30 v/erden vereint und unter

030062/0905

verringertem Druck (20 mitiHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 2,47 g Benzyl-N-undecanoyl-L-alanyl-a^ D-glutamat in der Form eines weißen Feststoffs.

Rf = 0,71 l_ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (9-1 VoI) _/

Beispiel 25

Man fügt 1,14 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 1,83 g N-Benzyloxycarbonyl-glycin in einem Gemisch von 165 ecm Tetrahydrofuran und 1,22 ecm Triäthylamin. Das Gemiscn wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 5 g N -/ N-(N-Lauroyl-L-alanyl)-j) -D-glutamyl_7-meso-2 (L) , 6(D)-diamino-pimelinsäuremonoamid in einem Gemisch von 17,5 ecm 1n-Natriumhydroxid und 25 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa 0⁰C und anschließend 70 h bei etwa 20°C gerührt. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2-7 kPa) bei 50°C. Das durch Zusatz von 21 ecm 1n-Chlorv;asserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuerte Konzentrat ergibt eine weiße Ausfällung, die man durch Filtrieren abtrennt, mit 200 ecm Wasser wäscht und an der freien Luft trocknet. Man erhält so 5,9 7 g eines Pulvers, das man in 100 ecm Essigsäure, die 12 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch unter verlängertem Druck (20 minHg, 2/7 k?a) bei 50°C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 4 cm auf, die 290 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 1360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 320 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-15 VoI) 3840 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), wobei man Fraktionen von f>0 ecm sammelt. Die Fraktionen 41 - 6 8 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Das erhaltene Öl wird mit 150 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisieruna

030062/0905

trituriert und durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei oO°C getrocknet. Man erhält so 2,37 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7-N⁶-(benzyloxycarbonylglycyl) -meso-2 (L) ,6 (D)-diamino-r>imelinsäure-monoamid.

Rf = 0,47 l_ Sxlicxumdioxidgel ; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-2^-6-24 VoI)J .

Rf = 0,55 / Siliciuir.dioxidgel·; Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI)_/

Man löst 2,35 g N²-/~N- (N-Lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_/-N⁶-(benzyloxycarbonylglycyl)-meso-2(L),6(P)-diamino-pimelinsäuremonoamid in 70 ecm Essigsäure. Man fügt 2,4 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 4 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtra'cs unter verringertem Druck (20 mmHg? 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne wird das erhaltene Öl in 100 ecm Äther trituriert, bis zur vollständigen Pulverisierung, durch Filtrieren abgetrennt, zwfcxmal mit insgesamt 100 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 55^CC getrocknet. Man erhält 1,91 g eines beiaen Pulvers, das man in 30 ecm Essigspure löst und an einer Säule von neutralem Sxlicxumdioxidgel· (0,04-0,0G3 mm) von 2 cm Durchmesser und 2 cm I-iöhe filtriert. Das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) zur Trockne konzentriert bei 50 C. Das erhaltene Öl wird in 100 ecm Äther bis ?.ur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 58°C getrocknet. Man erhält so 1,62 g N²-^~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- j -D-glutamyl_/-N -glycyl-meso-2(L),6(D)-diamino-pimelinsäure-monoamid.

Rf = 0,28 / Siliciumdioxidgel ; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Analyse:

berechnet: C 55,40 H 8,34 N 13,36

030062/0905

gefunden: C 52,0 H 7,7 N 12,1 Schwefelsäureasche =9,1 %

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysafcor folgende Aminosäaren:

AIa 1,05 (Theorie = 1)

Dap 0,9 8 (Theorie = 1)

GIu 1,00 (Theorie = 1)

GIy 0,9 6 (Theorie = 1)

Das N²-/N- (N-Lauroyl-L-alanyl) -^D-glutamyl7-meso-2 (L) ,6 (D) diamino-pimelinsäuremonoamid kann wie folgt hergestellt v/erden.

Man fügt 1,6 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5⁰C gehaltenen Lösung von 6,07 g Benzyü-N-lauroyl-L-alanyl-od-D-glutamat in einem Gemisch von 280 ecm Tetrahydrofuran und 1,74 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt. Anschließend fügt man eine auf 3°C granite Lösung von 4 g N Benzyloxycarbonyl-mesc-2 (L), 6 (D)-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von ?2,4 ecm 1n-Natriumhydroxid und 124 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa O⁰C und anschließend 70 h bei etwa 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend durch Zusatz von 20 ecm In-ChLorwasserstoff säure auf den pH-Wert 1 angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C. In dem Konzentrat tritt eine weiße Ausfällung auf, die man durch Filtrieren abtrennt, dreimal .Mit insgesamt 150 ecm 0, In-Chlorwasserstoffsäure und dreimal mit insgesamt 150 ecm Wasser wäscht und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 20°C trocknet. Man erhält so 9,15 g eines weißen Pulvers, das man in 100 ecm Essigsäure, die 20 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Genisch zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 5 cm Durchmesser auf, die 400 g neutrales Sr.liciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält.

030062/0905

Man eluiert nacheinander mit 1,6 1 Äthylaceta.t, 900 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (97/5-2,5 VoI), 1200 ecm Äthylacetat-Essi7^cäuregemisch (95-5 VoI), 900 ecm Äthylacetät-Essigsäuregemifach (92,5-7,5 VoI), 900 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (§0-10 VoI), 300 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (85-J5 VoI), 3200 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (80-20 VoI), wobei man Fraktionen von 100 ecm sammelt. Die Fraktionen 61-90 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmKg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene weiße Feststoff wird zweimal mit insgesamt 100 ecm Äther gewaschen cad unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 60°C getrocknet. Man erhält so 6,3 g N^/'o^-Benzyl-N-iN-lauroyl-L-alanyl)-/-D-glutamyl_7-N -benzyloxycG.rbonyl-meso-2 (L) ,6 (D) -diamino-pimelinsäure-monoamid. . ·

Rf = 0,77 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI)_/

Man löst 8,2 g N²-/~O¹-Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- ( -D-glutamyl_7~N -benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)-diamino-pimelinsäuremönoamid in 225 ecm Essigsäure. Man fügt 8,2 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) hinzu und leitet einen leichten Wasserstoffs trom während 3,5^-hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2/7 k?a) bei 50°c zur Trockne wird das erhaltene Öl in 100 ecm Äther bis zu völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmH.g; 0,04 kPa) bei 50°C getrocknet. Man erhält so 5,9 g eines Pulvers. 0,9 g dieses Pulvers werden gelöst in Essigsäure und über eine Säule von neutralem Siliciumdioxidg^i (0,04-0,063 mm) von 2 cm Durchmesser und 2 cm Höhe .filtriert. Das Filtrat wird unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird mit 50 ecm Äther aufgenommen, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0-3 mmHg; 0,04 kPa) bei 55°C getrocknet. Man erhält so 0,75 g N²-/~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- l -D-glutamyl_7-meso-2(L),6(D)-diamino-pimeiinsäuro-monoamid.

Rf = 0,38 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-2^- Vol)_7 030062/0905

Analyse: ΟΠΟ / OQ 1

berechnet: C 56,72 H 8,64 N 12,25 % J U^4^ö I

gefunden: C 52,8 H 8,1 N 11,6 % Schwefalsäureasche = 6,9 %

Nach der Gesa.-thydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

Ala 1,02 (Theorie =1)
Dap O,96 (Theorie = 1)
GIu 1,00 (Theorie =1)

Das N⁶-Benzyloxycarbonyl-meso-2(L),6(D)-diamino-pimelinsäuremonoamid kann hergestellt werden nach dem in der BE-PS 821 385 beschriebenen Verfahren.

Beispiel 26

Man fügt 0,433 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 698 mg N-Benzyloxycarbonylglycin in einem Gemisch von 65 ecm Tetrahydrofuran und 0,467 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 0°C gekühlte Lösung von 1,81 g Metnyl-Na -/~N-(N-lauroyl-L-alanyJ)-/-D-glutamyl_7-L-lysinat in einem Gemisch von 3,33 ecm 1n-Natriumhydroxid und 10 ecm Wasser zu. Das Peaktions-

o
gemisch wird 40 Minuten bei etwa -5 C und anschließend 36 h bei etwa 19 C gerührt, worauf es durch Zusatz von 6 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 angesäuert wird. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verrxngertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 150 ecm Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatphasen werden mit 30 ecm O,1n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 2,5 3 g eines öls, das man in 100 ecm Äthylacetat, das 6 cm neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, löst. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 50 9- neu tr&Ies -SlLisiumdioxidgel (0,04-0,063

030062/0905

nun) enthält.

Man elaiert nacheinander mit 80 ecm Äthylacetat, 280 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die Fraktionen 4-8 werden vereint und unter verringertem Druck (20 inmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält 2,33 g eines Öls, der erneut chromatographiert wird. Man löst dieses in 60 ecm Essigsäure, die 5 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04- 0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält.

Man eluiert nacheinander mit 680 ecm Äthylacetat, 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (97,5-2,5 VoI), 360 ecm Äthylacetat-Essigsäure gemisch (95-5 VoI), 360 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (90-10 VoI), 240 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (80-20 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 32 bis 41 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert.

Man erhält so 1,35 g Methyl-Nc^ -/~N- (N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_7-N£ -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysinat in der Form eines Öls.

Rf = 0,47 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (1-1 Vol)_/

Man löst 1,3 g Methyl-Nai -/~N- (N-lauroyl-L-alanyl) - /-D-glutamyl_7-N£ -(benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysinat in 35 ecm Essigsäure. Man 1,3 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2,5 h hindurch. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne erhält man einen öligen Rückstand, den man bis zur Pulverisierung in 50 ecm Äther trituriert. Man trennt das Pulver durch Filtrieren ab und trocknet es an der Luft. Man erhält so 910 mg eines Rohprodukts, das man an einer Säule von 2 cm Durchmesser chromatographiert, die 40 g

030062/0905

neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 160 ecm Äthylacetat, 80 ecm Äthylacetat-Essigsäuregexnisch (50-50 VoI) und H-IO ecm Essigsäure, v/obei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 14-20 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wild in 40 ecm Äther trituriert. Nach dem Filtrieren und Trocknen an der Luft erhält man 37o mg Methyl-Ife/ -/~N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_/-N£ glycyl-L-lysinat in de.r Form eines cremefarbenen Pulvers.

Rf = 0,50 [_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-5-24 VoI)J

Rf = 0,27 /"Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Analyse:

berechnet: C 58,07 H 8,91 N 11,68 % gefunden: C 57,0 H 8,6 N 11,1 %

Schwefelsäureasche = 22 %

Nach der Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminsauren:

AIa 1,00 (Theorie = 1)

Giu 1,01 (Theorie =1)

GIy 0,98 (Theorie =1)

Lys 0,96 (Theorie = 1)

Das Methyl-Nixl -/~N- ^N-lauroyl-L-alanyl)- ^^r-D-glutamyl_7-L-lysinat kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 1,3 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 4,31 Bens/1-N-lauroyl-L-alanyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 250 ecm Tetrahydrofuran und 1,4 ecm Triäthylamin. Das Gemisch v/ird 20 Minuten bei -5 C gerührt, und anschließend

030062/0905

fügt man eine -auf O C gekühlte Lösung von 3,32 g des Hydrochloride von Methyl-Nc -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in einem Gemisch von 10 ecm In-Natriumhydroxid und 10 ecm Wasser hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei etwa -5 C und anschließend 4 Tage bei einer Temperatur von etwa 20 C gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch durch Zusatz von 20 ecm In-Chlorwasserstoffsäure =uif den pH-Wert ! angesäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg, 2,7 kPa) bei 45 C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 150 ecm Chloroform extrahiert. Die vereinten Chloroformphasen werden in 40 ecm O,1n-Chlorwasserstoffsäure gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg,- 7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man ein blaßgelbes öl, das man in 60 ecm Chloroform löst, das 15 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 150 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 2,5 1 Äthylacetat und 400 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), wobei man ?raktionen von 100 ecm gewinnt. Die Fraktionen 6-27 werden vereint, zur Trockne unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa> bei 50°C konzentriert. Man erhält so 3,47 g Methyl-N^ -/~0 -benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_7-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in der Form eines weißen Pulvers.

Rf = 0,70 / Siliciumdixidgel; Äthylacetat-Essigsäure (95-5 VoI)_7 Rf = 0,40 /"Siliciumdioxidgel; .1thylacetat_7

Man löst 3,43 g Methyl-N^ -/~0¹-benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- / D-glutamyl_/-N£ -benzyloxycarbonyl-L-lysinat in 70 ecm Essigsäure. Man fügt 3,43 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet anschließend einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h ein. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, zweimal mit insgesamt 20 ecm Essigsäure gewaschen, die Filtrate werden vereint

030062/0905

und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 5O°C zur Trockne konzentriert. Der Rückptand wird in 50 ecm Äther trituriert. Man erhält so ein Pulver, das man durch Filtrieren abtrennt und an der Luft trocknet. Man erhält so 1 ,89 g Methyl-N*£ / N-(N-lauroyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl_/-L-lysinat.

Rf = 0,50 / Piliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI)J

Rf = 0,29 / Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Beispiel 27

Man fügt 1,07 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5 C gehaltenen Lösung von 4,026 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-^~D-glutamat in einem Gemisch von 135 ecm Tetrahydrofuran und 1,15 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei-7 C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 4 C gekühlte Lösur.g des Hydrochloric^ von N & -(Benzyioxycarbonyl)-L-lysinamid in einem Gemisch von 8,2 ecm 1n-Natriumhydrnxid und 2 2 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wir 10 Minuten bei etwa -5°C und anschließend 65 h bei etwa 20 C gerührt, worauf man es mit 11 ecm In-Chlorwasserstof fsc.ure auf den pH-Wert 1 ansäuert. Man verdampft das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45°C).Das Konzentrat v/ird durch Zusatz von 50 ecm Wasser verdünnt. Die in dem Konzentrat gebildete Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, dreimal mit insgesamt 75 ecm Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält so 5,58 g eines weißen Feststoffs, den man in 70 ecm Essigsäure löst, die 12g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 3 cm Durchmesser auf, die 100 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält.

Man eluiert nacheinander mit 350 ecm Äthylacetat, 250 ecm Äthyl-

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acetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI),850 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 450 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (75-25 VoI), 350 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-1VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt. Die Fraktionen 34 v/erden vereint und unter verringertem Pruck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Die erhaltene Meringe wird mit 50 ecm Äther aufgenommen, bis f.ur vollständigen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 1,43 g N*>£ - (Benzyloxycarbonylglycyl) -N£- (_
alanyl)-f-Ώ-glutamyl_7~L-Iysinamid.

-(Benzyloxycarbonylglycyl)-N£- (_ 0 -benzy1-N-(N-lauroyl-L-

Rf = 0,88 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoV)J

Rf = Of37 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI)_/ Man löst 1,43 g N#£ - (Benzyloxycarbonylglycyl) -N£ -/ 0 -benzy1-(N-lauroyl-L-alanyl) -/'-D-glutamylJ-L-lysinamid in 85 ecm Essigsäure. Man fügt 1,4-3 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2 h durch. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt« zweimal mit insgesamt 20 ecm Essigsäure gewaschen, die Filtrate weiden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Der ölige Rückstand, den man so erhält, wird in 75 ecm Äther trituriert und ergibt einen Feststoff, den man durch Filtrieren abtrennt. Man erhält so 990 mg eines weißen Feststoffs, zu dem man 490 g eines in gleicher Weise erhaltenen Produkts fügt und an einer Säule von 2 cm Durchmesser, die 29 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert mit Essigsäure, wobei man Fraktionen von 40 ecm sammelt. Die Fraktionen 13-32 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 510 mg Ν<^ -Glycyl-N^ -£ N-(N-lauroyl"L-alanyl) - 0 -D-glutamyl_/-L-lysinarnid.

030062/0905

Rf = 0,42 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI) J

Analyse:

berechnet; C 57,51 H 8,97 N 14,37 % gefunden: C 54,9 H8,6 N 13,3 %

Schwefelsäureasche = 1,6 %

AIc 1,04 (Theorie =1)

GIu 0,9 9 (Theorie =1)

GIy 1,00 (Theorie ^ 1)

Lys 0,95 (Theorie = 1)

Das Hydrochlorid von Nc* - (Benzyloxycarbonylglycyl)-L-lysinamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man löst 4,18 g Nod - (Benzyioxycarbonylglycyl) -N£ -t-butyloxycarbonyl-L-lysinamid in 80 ecm einer wasserfreien Lösung von 1, 7n-Chlorwasserstoffsä<_jre in Essigsäure. Man rührt 2 h bei einer Temperatur von etwa 20 C und fügt anschließend das Reaktionsgemisch zu 400 ecm wasserfreiem Äther. Die ölige Ausfällung v/ird durch Dekantieren abgeschieden, mit 200 ecm Äther gewaschen und unter verringertem Druck (0,3 mroHg, 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 3,16 g des Hydrochlorids von N*. - (Benzyxoxycarbonylglycyl)-L-lysinamid in der Form einer Paste.

Rf = 0,48 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

Das Ncd - (Benzyloxycarbonylglycyl)-N£ -t-butyloxycarbonyl-L-lysinamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

030062/0905

Man fügt 1,267 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -1°C gehaltenen Lösung von 2,397 g N-Beniyloxycarbonylglycin in einem Gemisch von 35 ecm Tetrahydrofuran und 1,365 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -3°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 3,25 g N£ -t-Butyloxycarbonyl-L-lysinämid in 50 ecm Tetrahydrofuran,zu. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei -5°C gerührt und anschließend während 20 h bei etwa 20°C. Man trennt das unlösliche Material durch Filtrieren ab und verdampft anschließend das Tetrahydrofuran unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 45 C. Das Konzentrat wird durch Zusatz von 150 ecm Wasser verdünnt, dreimal mit insgesamt 225 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen v/erden vereint und nacheinander mit 60 ecm eisgekühlter 0, InChlorwasserstoff säure, 60 ecm einer 10 %igen Natriumcarbonatlösung und zweimal insgesamt 120 ecm einer gesättigten rfatriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren zur Trocke unter verringertem Druck (20 mmHg; 2/7 kPa) bei 45°C erhält man 4,18 g No^ -(Benzyloxycarbonylglycyi)-N£ -t-buty2o;:ycarbonyl-L-lysinamid in der Form eines Öls.

Rf = 0,77 / Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VoI)_J

Das Nf -t-Butyloxycarbonyl-L-lysinamid k^nn auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 1,3 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 3,8 g N«:-Benzyloxycarbonyl-N£ -t-butyloxycarbonyl-L-lysin in einem Gemisch von 38 ecm Chloroform und 1,4 Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -5°C gerührt und anschließend leitet man einen leichten Ammoniakstrom während 3 h ein. Anschließend wird das Reaktionsgemisch durch Zusatz von 100 ecm Chloroform verdünnt, zweimal mit insgesamt 100 ecm einer 10 %igen Natriumcarbonatlösung und fünfmal mit insgesamt 250 ecm Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem DrucJc (20 mrnilg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne erhält man 3,76 g N«*.-Benzyloxycarbonyl-N£ -t-butyloxycarbonyl-

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L-lysinamid vom Fp = 142-144°C.

Rf = 0,52 /"siliciumdioxidgel; Äthylacetat_7

Man löst 3,7 g Nod-Bensyloxycarbonyl-Ni -t-butyloxycarbonyl-L-lysinamid in 130 ecm Essigsäure. Man fügt 3, 7 g Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasstrstoffstrom während 2 h ein. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt, zweimal mit insgesamt 20 ecm Essigsäure yewaschen; die vereinten Filtrate werden unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Der ölige Rückstand wird in 200 ecm Äther trituriert. Nach dem Dekantieren und Trocknen erhält man 3,25 g N£ -t-Butyloxycarbonyl-L-lysinamid.

Rf = 0,60 (_ Siliciumdicxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (5C-2O-6-24 VoI)J

Beispiel 28

Man fügt 0,31 ecm Isobütylchlorformiat zu einer bei -11 C gehaltenen Lösung von 506 mg N-Benzyloxycarbonyl-glycin in einem Gemisch von 40 ecm Tetrahydrofuran und 0,34 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -11°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 5°C gekühlte Lösung von 1,69 g des Hydrochiorids von N ~l~0 -Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_/-DD,LL-2_/6-diamiiiü-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 4,84 ecm InNatriumhydroxid und 40 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei etwa -10°C und anschließend 65 h bei etwa 20 C gerührt. Anschließend säuert man durch Zusatz von 10 ecm 1n-Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 1 an. Man verdampft das Tetrahydrofuran, durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C. Die in dem Konzentrat aufgetretene weiße Ausfällung wird durch Filtrieren abgetrennt, viermal mit insgesamt 80 ecm Wasser gewaschen und an der freien Luft getrocknet. Man er-

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hält 1,74 g eines braunen Produkts, das man in 30 ecm Essigsäure löst, die 5 g neutrales Siliciiimdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 30 mm Durchmesser, die 60 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mir.) enthält, auf.

Man eluiert nacheinander mit 160 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), 560 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (8-2 VoI), wobei man Fraktionen von 20 ecm sammelt. Die Fraktionen 16-25 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert.

Der erhaltene amorphe Feststoff wird in 30 ecm Äther aufgenommen, bis zur vollständigen Pulverisierung .trituriert, durch I'iltrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) getrocknet. Man erhält so 320 mg N -(_ 0 '-Benzyl-N- (N-lauroyl-L-ala-

; — 2

nyl)~o -D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-glycyl-DDiLL-^ödiamino-pimelinsäure-monoamid.

Man löst 320 mg N -(_ 0 -Benzyl-N- (N-lauroy 1-L-alanyI)- / -D-glutamyl_/-N -benzyloxycarbonyl-glycyl-DD,LL-2, 6-diaminc-pimelinsc.uremonoaiväd in 25 ecm Essigsäure. Man fügt 320 mg Palladium auf Kohle (3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 2 1/4 h ein. Nach dem Filtrieren und Konzentrieren des Filtrats unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur.Trockne erhält man 290 mg eines Feststoffs, den man an einer Säule von 1 cm Durchmesser, die 6 g neutrales Siliciumidoxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert. Man eluier.- mit Essigsäure und gewinnt Fraktionen von 5 ecm. Die Fraktionen 25 - 32 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene amorphe Feststoff wird mit 20 ecm Äther aufgenommen, durch Filtrieren abgetrennt und unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20⁰C getrocknet. Man erhält so 30 mg N -^~N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- /-D- -

_ 2
glutamyl_/-N -glycyl-DD,LL-2, 6--diamino-pimelinsäure-monoamid.

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Rf = 0,22 l_ Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 VoI) J

AIa 0,95 (Theorie = 1)

GIu 1,04 (Theorie = 1)

GIy 1,00 (Theorie = 1)

Dap 1,00 (Theorie = 1)

Das Hydrochlorid von N -(_ 0 -Benzyl-N- (N-lauroyl-L-alanyl) - /-D-glutamyl_/-LL,DD-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid kann wie folgt hergestellt werden:

Man fügt 0,56 ecm Isobutylchlorformiat zu einer bei -5°C gehaltenen Lösung von 2,12 g Benzyl-N-lauroyl-L-alanyl-^-D-glutamat in einem Gemisch von 86 ecm Tetrahydrofuran und 0,6 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 30 Minuten bei -5°C gerührt, und anschließend fügt man eine auf 2 C gekühlte Lösung von 1,25 g N -t-Butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in einem Gemisch von 4,32 ccn In-Natriuinhydroxid und 43 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird einige Minuten bei -5 C und anschließend 18h bei etwa 20 C gerührt. Schließlich säuert man es durch Zusatz von 50 ecm gesättigter Zitronensäurelösung an. Man verdampft das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg;· 2,7 kPa) bei 50⁰C. Das Konzentrat wird fünfmal mit insgesamt 200 ecm Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphasen werden vereint und mit 25 ecm Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Konzentrieren unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne erhält man ein öl, das man in einem Gemisch von 50 ecm Äthylacetat und 10 ecm Essigsäure löst, das 10 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04 - 0,063 mm) enthält. Man konzentriert das Gemisch unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne und bringt das Ganze auf eine Säule von 2 cm Durchmesser auf, die 50 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04 -

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-162- 302A281

0,063 mm) enthält.

Man eJuiert nacheinander mit 200 ecm Äthylacetat, 280 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (95-5 VoI), 320 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (9-1 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die Fraktionen 5-13 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,ⁿ kPa) bei 50°C zu?; Trockne konzentriert. Man erhält so 2,23 g N -/~0 -Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-/ -D-glutamyl_7-

2
N -t"butyloxycarbonyl-Lj-i,DD-2_/ 6-diamino-pimelinsäure-monoamid in Form eines Öls.

Rf = 0,39 /"Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (9-1 VoI)J

ζ· Λ

Man löst 2,19 g N -/~0 -Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)-^-D-glutamyl_/-

2
N -t-butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 22 ccra einer gesättigten v/asserfreien Chlorwasserstoffsäurelösung in Essigsäure. Man läßt 3 h bei 20 C im Kontakt und konzentriert anschließend unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne. Man erhält so 1,74 g des Hydrochlorids von N -/ 0 Benzyl-N-(N-lauroyl-L-alanyl)- / -D-glutamyl_7-DO,LL-2,6-diaminopimelinsäure-monoamid in Form eines teilweise kristallisierten Öls.

Rf = 0,47 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

Rf = 0,26 / Siliciumdioxidgel; Essigsäure^/

Das N -t-Butyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäui:c.-monoamid kann auf folgende Weise hergestellt werden:

9 6

Man löst 4 g N~-t-Butyloxycarbonyl-N -benzyloxycarbonyl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid in 100 ecm Essigsäure. Man fügt 4 g Palladium auf Kohle {3 % Palladium) zu und leitet einen leichten Wasserstoffstrom während 3 h hindurch. Der Katalysator wird durch Filtrieren abgetrennt, mit 10 ecm Essigsäure gewaschen, die FiI-

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träte werden vereint und unter verringertem Druck (20 itunHg; 2,7 kPa) bei 5O°C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene ölige Rückstand wird in 50 ecm Äther bis zur völligen Pulverisierung tritu-

2 riert. Man erhält so nach dem Filtrieren und Trocknen 3 g N -t-

Butyloxycarbopvl-DD,LL-2,6-diamino-pimelinsäure-monoamid. Rf = 0,34 / Siliciumdioxidgel; Essigsäure_7

Beispiel 29

Zu einer Lösung von 7,87 g No/ -t-Butyloxycarbonyl-Ν,τ -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-lysin in 70 ecm Äthanol fügt man 15g chlormethyliertes Styrol-Divinylbenzol-Copolymeres (98-2), das 1,2 mÄquivalente Chlor pro g enthält. Man rührt das Reaktionsmedium 10 Minuten bei 20 C und fügt anschließend 2,25 ecm Triäthylamin hinzu und rührt weitere 65 h bei 78°C. Das Polymere wird filtriert, nacheinander nit dreimal insgesamt 300 ecm Äthanol und dreimal insgesamt 300 ecm Meth/lenchlorid gewaschen, anschließend unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20⁰C getrocknet. Man erhält das N U- -t-Butylo;;ycarbonyl-N£ - (benzyloxycarbonyl-glycyl) L-Iysy1-polymere.

GIy 0,35 mMol pro <~ Polymeres Lys 0,33 mMol pro g Polymeres

Die D-Glutaminsäure wird an das blockierte Dipeptid-Polymere gekuppelt, wobei man folgende Reaktionsfolge in einem Reaktionsgefäßt, ausgerüstet mit einem Rührer und einem Glasfritten-Filter an seiner Basis, durchführt:

1. Man nimmt drei aufeinanderfolgende Wäschen des blockierten

G3Q062/0905

Dipeptid-Polyitieren jeweils mit 100 ecm Methylenchlorid vor. Auf jeden LosungsmitteIzusatζ folgt ein 3minütiges Rühren, worauf abgesaugt wird.

2. Die t-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe wird anschließend durch Zusatz von 1CO ecm Trifluoressigsäure-Methylchloridgemisch (1-1 VoI) und 20minütiges Rühren und anschließendes Absaugen abgespalten.

3. Das Harz wird dann nacheinander gewaschen mit:

a) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

b) dreimal 100 ecm Methanol,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

wobei man 3 Minuten nach jeder LösungsmitteIzugabe rührt und anschließend jedesmal absaugt.

4. Man neutralisiert dann das Dipeptid-Polymere durch Zusatz von 100 ecm eines Gemischs von Methylenchlorid-IViäthylainin (9-1 VoI), rührt 10 Minuten und saugt schließlich ab.

5. Das gewaschene Harz wird anpchließend gewaschen mit dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

wobei man 3 Minuten nach jeder Lösungsmittelzugabe rührt und jedesmal absaugt.

6. Man fügt 5,2 g N-t-Butyloxycarbonyl-0 -benzyl-0 -succinimido-D-glutaminsäure, gelöst in 100 ecm Methylenchlorid, zu und 18h und saugt ab.

7. Man wäscht das Harz nacheinander mit
a) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

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b) dreimal 100 ecm Essigsäure,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

wobei man nach jeder Lösungsmittelzugabe 3 Minuten rührt und jedesmal absaugt.

1

8. Man fügt 5,2 g N-t-Eutyloxycarbonyl-O -benzyl-0 -sueeinimido-

D-glutaminsäure, gelöst in 100 ecm Methylenchlorid zu und rührt 18 h und saug^ ab.

9. Man wäscht das Harz nacheinander mit

a) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

b) dreimal 100 ecm Essigsäure,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

Man erhält so das NoC^-(O -Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-D-glutamyl) N£ -(benzyloxycarbonyl-glycylJ-L-lysyl-Polymere.,

Das L-Alanin wird an das blockierte Tripeptid-Polymere gekuppelt, wobei man die vorstehenden Arbeitsgänge 1, 2, 3, 4, 5, 6 und wiederholt.

Der Arbeitsgang 6 v/ird wie folgt modifiziert: Man f"c,t nacheinander zu:

a) 4,7 g N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanin, gelöst in 100 ecm Methvlenchlorid und rührt 10 Minuten,

b) 5,16 g Dicyclohexvlcarbodiimid und rührt 16 h und saugt ab. Man erhält so das Ni/-/ 0 -Bensyl-N- (t-butyloxycarbonyl-L-alanyl) -

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$ -D-glutamyl_/-N£ -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-L-lysyl-Polymere.

Die Ocbansäure wird an das blockierte Tetrapeptid-Polymere gekuppelt, wobei man die vorstehenden Arbeitsgänge 1, 2, 3, 4, 5, und 9 wiederholt.

Der Arbeitsgang 6 wird wie folcj'.: modifiziert: Man fügt nacheinander hinzu:

a) 1/64 g Octansäure, gelöst in 100 ecm Methylenchlorid und rührt 10 Minuten,

b) 2,35 g Dicyclohexylcarbodiimid und rührt 16h und saugt ab.

— 1 ?

Man eiliält so das N₀/-/ 0 -Benzyl-N- (N-octanoyl-L-alanyl)- /-D-glutamyl-N £ -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-L-lysyl-Polymere.

Dieses Pol^fasre wird in 100 ecm Trxfluoressigsäure suspendiert, die in einem Reaktor enthalten ist, der mit einem Rührer und an seiner Basis nit einem Glasfritten-Filter ausgerüstet ist. In diese Suspension leitet man einen Bromwasserstoffstrom während 90 Minuten ein. Anschließend saugt man dets Harz ab und wäscht es dreimal mit insgesamt 300 ecm Essigsäure, wobei man nach jeder Essigsäurezugabe 3 Minuten rührt und jedesmal absaugt. Die Filtrate werden vereint und unter verringertem Druck (20 rniriHg; 2,7 kPa) bei 50 C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene ölige Rückstand wird zweimal mit insgesamt 50 ecm Methanol aufgenommen und jedesmal unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so etwa 2 g Öl, das man an einer Säule von 1,6 cm Durchmesser, die 15 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04- 0,063 mm) enthält, chromatographiert.

Man eiuiert nacheinander mit:

300 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (3-1 VoI), 250 ecm Äthyl-

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acetat-Essigsäuregemisch (1-1 VoI), 250 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (1-3 VoI) und 350 ecm Essigsäure, wobei man Fraktionen von 50 ecm sammelt.

Die Fraktionen 8-23 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 0,94 g eines cremefarbenen Pulvers- das man erneut an einer Säule von 1,5 cm Durchmesser chromatographiert, die 10 g neutrales Siliciumdioxidgel (Ο,ΟΊ - 0,063 mm) enthält. Man eluiert nacheinander mit 100 ecm Äthylacetat und 500 ecm eines Äthylacetat-Methanolgemischs (9-1 VoI), wobei man Fraktionen von 50 ecm gewinnt. Die Fraktionen 6-10 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhälu so 390 mg des Hydrobromids von Methyl-Nod-/ 0 -methyl-N-(N-octanoyl-L-alanyl) - (j -D-glutamyl_/-Ncr -glycyl-L-lysinat.

Rf =0,69 / Siliciumdioxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

Rf = 0,75 l_ Siliciumdioxidgel; Isoamylalkohol-Pyridin-Wasser (35-35-30 VoI)_7

Analyse:

berechnet: C 48,90 H 7,58 N 10,97 % gefunden: C 45,3 H6,8 N 10,1 %

Schwefelsäureasche =5,21 %

Nach i?p.r Gesamthydrolyse zeigt die Analyse am Technikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa 1,00 (Theorie = 1)

GIu 0,90 (Theorie = 1)

GIy 1,16 (Theorie = 1)

Lys 1,1 ο (Theorie = 1)

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Das N t^ -t-Butyloxycarbonyl-N^ - (benzyloxycarbonyl-glycyl) -L-lysin kann hergestellt werden nach der Methode von M. Khosla et al, Indian J. Chem. 5, 237 (1967).

Beispiel 30

Zu einer Lösung von 10 g N₀^-/ 0 -Benzyl-N- (t-butyloxycarbonyl-L-alanyl)-{ -D-glutamyl_7-N£ -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-L-lysin in 50 ecm Äthanol fügt man 15 g Styrol-Divinylbenzol-Copolymeres (98-2)₇ das chlorine thy Ii ert ist und 1,2 mÄquivalent Chlor pro g enthält. Man rührt das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 20°C und fügt anschließend 1,92 ecm Triethylamin zu und rührt das Reaktionsgemisch 65 h bei 78°C. Das Polymere wird filtriert, nacheinander dreimal mit insgesamt 300 ecm Äthanol und dreimal mit insgesamt 300 ecm Methylenchlorid gewaschen und schließlich unter verringertem Druck (0,3 mmHg; 0,04 kPa) bei 20°C getrocknet. Man erhält so 18,8 g No£ ~/_ 0 -Benzyl-N-(t-butyloxycarbonyl-L-alanyI) ■-0 -D-glutamyl_/-N£ -(benzyloxycarbonyl-glycyl)L-lysyl-Polymeres.

Nach der Gesamthydrolyst* zeigt die Analyse am Tt,chnikon-Autoanalysator die Anwesenheit folgender Aminosäuren:

AIa = 0,19 mMol pro g Polymeres GIu = 0_f18 mMol pro g Polymeres G±y =0,18 mMol pro g Polymeres Lys =0,17 mMol pro g Polymeres

Die Hexansäure wird an des blockierte Tetrapeptid-Polymere gekuppeil wobei man folgende Reaktionsfolge in einem Reaktor durchführt, der mit einem Rührer und an seiner Basis mit einem Glasfritten-Filter ausgerüstet ist:

1. Man führt drei aufeinanderfolgende Wäschen des blockierten Tetrapeptid-Polymeren mit jeweils 100 ecm Methylenchlorid durch. Auf

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jede Lösungsmittelzugabe folgt ein 3minütiges Rühren, worauf abgesaugt wird.

2. Die t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe des Alanins wird anschliessend abgespalten durch Zusatz von 1CJ ecm eines Gemischs von Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (1-1 VoI). 20minütiges Rühren und Absaugen.

3. Das Harz wird anschließend nacheinander gewaschen mit:

a) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

b) dreimal 100 ecm Methanol,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

4. Man neutralisiert anschließend das Tetrapeptid-Polymere durch Zusatz voii 100 ecm Methylenchlorid-N-Methylmorpholin-Gemisch (9-1 VoI), wobei man 10 Minuten rührt und ar schließend absaugt.

5. Das Harz wird anschließend gewaschen mit dreimal 100 ecm Methylenchljrid,

6. Man fügt anschließend nacheinander zu:

a) 1,16 g Hexansäure, gelöst in 100 ecm Methylenchloiid und rührt 10 Minuten,

b) 2,06 g Dicyclohexylcarbodiimid und rührt 20 h und saugt ab.

7. Man wäscht das H£.rz nacheinander mit: a) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

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b) dreimal 100 ecm Essigsäure,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

8. Man fügt anschließend nacheinander zu:

a) 1/16 g Hexansäuro und rührt 10 Minuten,

b) 2,06 g Dicyclohexylcarbodiimid und rührt 20 h und saugt ab.

9. Man wäscht das Harz nacheinander mit:

a) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

b) dreimal 100 ecm Essigsäure,

c) dreimal 100 ecm Methylenchlorid,

Man erhält so das Ni-/ 0 -Benzyl-N- (N-hexanoyl-L-alanyl) - /-D-glutamyl_/-N <£ - (benzyloxycarbonyl-glycyl) -L-lysyl-Polyiaere. Dieses Polymare suspendiert man in 100 ecm Trifluoressigsäure, die in einem Reaktor, ausgerüstet mit einem Rührer und an seiner Basis mit einem Glasfrittenfilter, enthalten ist. In diese Suspension leitet man einen Bromwasserstoffstrom während 90 Minuten-ein. Anschließend saugt man das Harz ab und wäscht es dreimal mit insgesamt 300 ecm Essigsäure, wobei man 3 Minuten nach jeder Essigsäure^ugabe rührt nra jedesmal absaugt.

Die Filtrate werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 55°C zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene ölige Rückstand wird in 50 ecm Äthylacetat bis zur völligen Pulverisierung trituriert, durch Filtrieren abgetrennt und dreimal mit insgesamt 90 ecm Äther gewaschen. Man erhält so 1,15 g beiges Pulver, das man an einer Säule von 1,8 cm Durchmesser, die 15 g neutrales

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Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm) enthält, chromatographiert. Man eluiert mit einem Gemisch von Äthylacetat-Essigsäure (1-1 VoI), wobei ran Fraktionen von 20 ecm gewinnt. Die Fraktionen 13-24 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird in 5 ecm Essigsäure gelöst und durch Zusatz von 300 ecm Äther avsgefällt. Nach dem Abtrennen durch Filtrieren und Trocknen erhält man 47C mg des Hydrobromids von NoC-/ N- (N-Hexanoyl-L-alanyl)- Y -D-glutamyl_7~N £ -glycyl-L-lysin.

Rf = 0,26 / Siliciumdicxidgel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50-20-6-24 Vol)_7

Analyse:

berechnet: C 45,36 H 6,92 N 12,02 % gefunden: C 42,3 H7_f0 N 11,2 %

AIa 1,05 (Theorie = 1)

GIu 0,i5 (Theorie -■ i;

GIy 1,CO (Theorie =- 1)

Lys 0,9 7 (Theorie = 1)

Das N,>i--/ 0 -Benzyl-N-(t-butyloxycarbonyl-L-alanyl)- <T-D-glutamyl_7-N£ -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-L-lysin kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Man fügt 4,5 7 ecm Isobutylchlorformiat zu eir.ar bei -8°C gehaltenen Lösung von 14,3 g Benzyl-N-t-butyloxycarbonyl-L-alanyl- «C-D-giutamat in einem Gemisch von 420 ecm Tetrahydrofuran und 4,92 ecm Triäthylamin. Das Gemisch wird 20 Minuten bei -8°C gerührt und anschlagend -fügt mä.n eine auf 5°C gekühlte Lösur.g von 11,8 g N£ - (Benzyloxycarbonyl-glycyl)-L-lysin in einem Gemisch von 35 ecm In-Natriumhydroxid und 35 ecm Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wird

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10 Minuten bei etwa O⁰C gerührt und anschließend 16 h bei etwa 2O°C.

Schließlich verdampft man das Tetrahydrofuran durch Konzentrieren unter verringertem Druck (20 itimHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C. Man säuert das auf O⁰C gekühlte Konzentrat durch Zusatz von 70 ecm In-Chlorwasscrstoffsäure auf den pH-Wert 2 und extrahiert dreimal mit insgesamt 600 ecm Äthylacetat. Die vereinten Äthylacetatphasen werden mit 100 ecm Wasser und 100 ecm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, unter verringertem Druck (20 romHg; 2,7 kPa) bei 50°C zur Trockne konzentriert. Man erhält so 24,3 g einer Meringe, die man an einer Säule von 4,8 cm Durchmesser, enthaltend 450 g neutrales Siliciumdioxidgel (0,04-0,063 mm), chromatographiert. Man eluiert nacheinander mit 520 ecm eines Gemischs von Äthylacetat-Cyclohexan (1-1 VoI), 360 ecm Äthylacetat-Cyclohexangemisch (3-1 VoI) 480 ecm Äthylacetat, 520 ecm ÄthylaceLat-Essigsäuregemisch (S5-5 VoI),1040 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (90-10 VoI), 520 ecm Äthylacetat-ü-ssigsäuregemisch (80-20 VoI) , 1080 ecm Äthylacetat-Essigsäuregemisch (70-30 VoI), wobei man Fraktionen von 40 ecm gewinnt. Die Fraktionen 57 - 101 werden vereint und unter verringertem Druck (20 mmHg; 2,7 kPa) bei 50⁰C zur Trockne konzentriert. Das so erhaltene Produkt wird aus Äthylacetat umkristallisiert.

Man erhält so 13,9 g Ν<* -/"θ -Benzyl-N- (t-butyloxycarbonyl-L-

alanyl)-/ -D-giutamyl_7-N£ -(benzyloxycarbonyl-glycyl)-L~lysin, das bei etwa 90 C (schmieriger Schmelzpunkt) schmilzt.

Rf = 0,55 /~ Siliciumdioxidgel; Äthylacetat-Essigsäure (3-1 VOl)_J

AIa 1,00 (Theorie =1)
GIu 1,03 (Theorie = 1)

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GIy 1,00 (Theorie = 1)
Lys 0,94 (Theorie = 1)

Die Erfindung betrifftauch pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine Verbindung gemäß der Erfindung, zusammen mit einem oder mehreren Verdünnungsmitteln oder Trägern bzw. Exzipienten enthält, die verträglich und pharmazeutisch brauchbar sind. Diese Zusammensetzungen können entweder als Adjuvantien von Vakzinen oder als unspezifische Stimulatien für die antiinfektiöse und antitumorale Immunität verwendet werden.

Zur Verwendung als Adjuvantien von Vakzinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen gleichzeitig und auf gleichem Wege wie das Antigen (viral, bakteriell, parasitär oder anderer Natur),gegen das man die zellulären Immunitätsreaktionen (Hypersensibilität der verzögerten Typs) des zu imrnusierenden Patienten (Menschen oder Haustier) zu erhöhen sucht oder dessen zirkulierende oder lokale Antikörperproduktion man zu erhöhen versucht.

Die Verbindungen werden in relativ geringen Dosierungen (in der Größenordnung von mg) verabreicht, vermischt mit dem Antigen und auf gleichem Wege (intramuskulär, subkutan, intravenös, intranasal, bukal). falls notwendig können die Verbindung und das Antigen in einem geeigneten öligen Exzipienten emulgierL oder in Liposome eingearbeitet werden.

Als unspezifische Immunstimulantien werden sie in Dosierungen von 0|1 - 50 mg/kg auf parenteraleti Wege (intravenös, subkutan, intramuskulär), intranasal, bukal, rektal oder gegebenenfalls intratumoral verabreicht.

Als feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können TabIr ^ ten, Pillen, Pulver oder Granulate verwendet werden. In diesen Zusammensetzungen ist die aktive Verbindung vermischt mit einem oder mehreren Verdünnungsmitteln, wie Saccharose, Lactose oder

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Stärke. Die Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als Verdünnungsmittel, beispielsweise ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, enthalten.

Als flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung kann man pharmazeutisch brauchbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups oder Elixiere verwenden, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, wie Wasser oder Paraffmöl. Diese Zusammensetzungen können andere Substanzen außer den Verdünnungsmitteln enthalten, beispielsweise benetzende Mittel, Süßstoffe oder aromatisierende Mittel.

Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Vehikel in dem letzteren Fall kann man das Polyäthylenolykol, das Polypropylenglykol, pflanzliche Öle, insbesondere Olivenöl, und injizierbare organische Ester, beispielsweise Äthyloleat, verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien bzw. Zusätze enthalten, insbesondere Benetzungsmittel, Emulgiermittel oder Dispergiermittel .

Die Sterilisation kann auf verschiedene Weise erfolgen, beispielsweise mittels eines bakteriologischen Filters, durch Einarbeiten in die Zusammensetzung von sterilisierenden Mitteln oder durch Erhitzen. Sie können auch hergestellt werden in der Form von 'festen Zusammensetzungen, die durch beispielsweise Bestrahlen steril gemacht wurden, und in sterilem Wasser gelöst oder in jeglichen anderen injizierbaren sterilen Medien dispergiert werden können, gegebenenfalls zum Zeitpunkt der Verwendung.

Die Zusammensetzungen zur intranasalen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein, die gegebenenfalls mit einem brauchbaren bzw. verträglichen Treibmittel kombiniert sind.

Die Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung sind Supposito-

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rien, die außer dem wirksamen Produkt, Exzipienten, wie Kakaobutter oder Supposxtorienwachs enthalten können.'

Die folgenden Beispiele, die keine Einschränkung darstellen sollen, veranschauliehen erfindungsgemäße Zusammensetzungen:

Formulierungsbeispiel 1

Man stellt in üblicher Weise eine intravenös verabreichbare Lösung mit der folgenden Zusammensetzung her:

N -QN-(N-Lauroyl-L-alanyl)-^ -D-glutamylJ-DD_fLL-N -glycyl-2,6-diamino-pimelinsäuremonoamid 0,5 g

injizierbares Lösungsmittel 5 ecm

Formulierungsbeiapiel 2

Man stellt in üblicher Weise eine auf intravenösem Wege verabreichbare Lösung folgender Zusammensetzung her:

Methyl-Noi ~L N-(N-Lauroyl-L-alanyl)- J-D-glutamyl_7-

N/ -glycyl-L-lysinat 0,5 g

injizierbares Lösungsmittel 5 ecm

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Z.u s ammenfass. ung

Neue Tetra- oder Pentapeptide, Verfahren zu deren Herstellung . und diese enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft neue Tetra- oder Pentapeptide der allgemeinen Formel I, worin R ein Wasserstoffatom oder ein Fettsäurerest ist, R-. ein Wasserstoff atom, ein Fettsäurerest, ein Glycyl- oder D-Alanylrest, gegebenenfalls substituiert durch einen Fettsäurerest ist, (wobei mindestens einer der Reste R und R_ ein Fettsäurerest ist oder einen solchen enthält), R₁ Hydroxy, Amino, Alkyloxy, gegebenenfalls substituiert durch Phenyl oder Nitrophenyl,ist; eines der Symbole R₀ oder R. ein Wasserstoffatom, ein Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonyl- (gegebenenfalls substituiert durch Phenyl oder Nitrophenyl), N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest ist, und der andere ein Wasserstoffatom, ein Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonylrest (gegebenenfalls substituiert durch Phenyl oder Nitrophenyl) ist, wobei R₀ und R. nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom sein können (wobei mindestens eines der Symbole R^, R₂ und/oder R₄ einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt); wobei das an die Glutaminsäure gebundene Alanin in der L-Form vorliegt, die Glutaminsäure in der D-Form vorliegt, das Lysin (R₀ oder R = Wasserstoff) in der L-Form vorliegt und die 2,6-Dxamino-pimelinsäureoder ihre Derivate (R₂ und R. unterschiedlich von Wasserstoff) in der D,D-; L,L-; DD₇LL- oder D,L-Form vorliegt; die Erfindung betrifft auch deren Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel. R-NH-CH-CO-NII-Ch-CO-R₁

_i CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₂ (i)

(CH₉)_

R₃-NH-CH-R,

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Claims

"V. R. KcenigsbWger ^ ' Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann Π*·. R. Kcenigsberg« Dipl.-Phys. R. Hoizbauer - Dipl.-Ing. F. Klingoeicen - Dr. F. Zumste'n jun. PATENTANWÄLTE München 2 · Bräuhausstraße 4 · Telefon Sammel-Nr. 22 53 41 · Telegramme Zumpai Telex 529979 SC 4679/47O8/4709 Patentansprüche

1./Neues Tetra- oder Pentapeptid mit der allgemeinen Formel

R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-R,

CH₀ CH„CH„-CO-NH-CH-I

R,-NH-CH-R. ■i 4

worin R ein Wasserstoff atom oder einen Fette "urerer.t dar- l stellt, R₁ einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest mit *

1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, eines der Symbole R„ oder R₄ ein Wasse-rstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbony!rest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substi-uiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen (gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest) bedeutet und das andere ein Wasserstoff atom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxy-

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carbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, R_ ein Wasserstoffacom oder einen Fettsäurerest oder einen Glycyl- oder D-AlanyTrest, dessen- Ami.-.funktion gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurerest, darstellt/ wobei die Symbole R_ und R₄ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können, und wobei eines der Symbole R-, P._; und R. einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt oder enthält, und mindestens eines der Symbole R und R., einen Fettsäurerest darstellt oder enthält und wobei das an die Glutaminsäure gebundene Alanin in der L-Form vorliegt, die Glutaminsäure oder ihre Derivate in der D-Form vorliegen, das Lysin oder seine Derivate, falls, eines der Symbole R₃.oder R₄ ein Wasserstoffatom darstellt, in der L-Form vorliegen und die 2,6-piaminopimelinsäure oder ihre Derivate,. wenn R„ und R₄ einen Carboxyrest oder ein Derivat der Säurefunktion darstellen, in der D,D-, L,L-, DD,LL- (racemisch) oder DL-meso-Form vorliegen, sowie seine Salze.

2. Neues Tetra- oder Pentapeptid nach Anspruch 1, in dem der Fettsäurerest ein Alkanoylrest mit 1-45 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Hydroxy-, Phenyloöer Cyclohexylrest, einen Alkenoylrest mit 3-30 Kohlenstoff atoir.2n, der mehr als eine Doppelbindung enthalten kann, oder einen Mykolsaurerest darstellt.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure der allgemeinen Formel

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R-NH-CH-COR¹

worin R₅ ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Ami nf unk tion darstellt, R_fi eir. Wasserstoff atcn. oder den Methylrest bedeutet, wobei in diesem Falle das Alanin i*: der D-Form vorliegt und R¹ einen Hydroxy- oder einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, auf ein Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel

R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-R.,
7 I I 8

CH₃ CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₉

einwirken läßt, worin R₇ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, R„ einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenyl— rest, darstellt, eines der Symbole R. oder R_ ein Wasserstoff atom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycorbonylrest dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest dessen Alkylteil 1-4

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Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, wobei R. und R nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können und R₁-. ein Wasserstoff atom oder einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest dessen Aminfunktxon gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurer-^st oder durch eine Schutzgruppe flor Aminfunktion, darstellt/ wobei mindestens einer der Reste R₇ oder χΊ_1π einen Fettsäurerest darstellt oder enthält, und, wenn R, oder R„ wie vorstehend definiert sind, R. ein Wasserstoffatom darstellt, und wenn eines der Symbole R. oder Rq einen Carboxyrest darstellt, das andere ein Wasserstoff atom oder einen Carbamoylrest oder Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, R₁₀ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt, wo^aaf man gegebenenfalls die Reste Rp- ,RyUid/oder R₁₀ (falls sie eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten) durch er.n Wasserstoffatom ersetzt und die Reste r'und R₀ (wenn sie einen Alkyl-

oxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeuten) durch einen Hydroxylrest ersetzt und die Reste R. und/oder R_ (wenn sie einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellen oder enthalten) durch einen Carboxyrest ersetzt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in Salzform isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, in deren Formel R» oder R. einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest darstellt,

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dadurch gekennzeichnet/ daß man eine Aminosäure der allgemeinen Formel

NH₀-CH-COR¹
^R6

worin R¹ einen Hydroxy- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und R_fi ein Wasserstoffatom oder den Methylrest bedeutet, auf ein Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel

R-NH-Ch-CONH-CH-CO-R₀
7 I I ö

CH₃ CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₉

₂₃

R₁₀-NH-CH-R₄

einwirken läßt, wocin R₇ exnen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, R„ einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatoraen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, eines der Symbole R. oder R„ einan Carboxyrest und das andere' ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch ei~en Phenyl- oder Nitrophenylrest bedeutet und R₁ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder durch eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt, wobei mindestens eines der Symbole R_ oder R_1n einen Fettsäurerest bedeutet, worauf man gegebenenfalls den Rest R₇ oder R_1n/ wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder

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enthält, durch ein Wasserstoffatom ersetzt, die Reste R' und/oder R_ft, wenn sie einen Alkyloxyrest mit Ί - 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch eineii Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeuten, durch einen Hydroxyrest ersetzt .und ^on Rest R. oder R_, wenn er einen Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrost, darstellt oder enthält, durch einen Carboxyrest ersetzt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in der Form eines Salzes isoliert.

5. Verfahren ^.ach Anspruch 3 zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, in deren Formel R^ einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt, dessen Aminfunktion gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurerest, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure der allgemeinen Formel

--NH-CH-COOH
^R6

worin R,- eir^n Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und R_fi ein Wasserstoffatom oder den Methylrest bedeutet, mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel

R^-NH-CH-CO-NH-^l-CO-R-7 ι [ 8

CH₃ CH₂CH₂-CO-NH-CH-K₉

(CHO

NH₀-CH-R-

Q30062/090 5

umsetzt, worin R- einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, R₀ einen Hydroxy-, Amine- oder

Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, eines der Symbole R. oder R„ ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält Ui^₁ gegebenenfalls substituiert ist durc> einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-c.lanyl, deren Säurefunktion gegebenenfalls geschützt ist, darstellt und das andere ein Wasserstoffa.tom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest bedeutet, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, wobei R. und R_q nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können und wobei mindestens eines der Symbole R₁- und R_ einen Fettsäurerest darstellt, worauf man gegebenenfalls den Rest R,- und R₇, wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, durch ein Wasserstoffatom ersetzt, den Rest R₀, wenn er einen Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, durch einen Hydroxyrest ersetzt und d:'.e Reste R. und/oder R„, wenn sie einen A.lkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gagebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellen oder enthalten, durch einen Carboxyrest ersetzt = und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in Salzform isoliert.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß man ein Dipeptid der allgemeinen Formel

R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-Rg

CH CH₂CH₂-COOH

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worin R- einen Rest einer Fettsäure oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt und R₀ einen Amino- oder Alkyl-

ox^rest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, mit einem Di- oder Tripeptid der a."¹ !gemeinen Formel

H₂N-CH-R₉

R₁₀-NH-GH-R

umsetzt, worin eines der Symbole R. oder R_Q ein Wasoerstoffatom oder einen Carboy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest substituiert ist, eine^ N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phanyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alxylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, wobei R. und R_ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können und R_1n einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunkticn substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt, wobei mindestens eines der Symbole R. oder R_g und R₁₀ einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt oder enthält und mindestens eines der Symbole R₇ und R₁ einen Fettsäurerest darstellt oder enthält, worauf man gegebenenfalls den Rest R- oder R_1n/ wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält, durch ein

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302A281

Wasserstoffatom ersetzt und die Reste R₀ und/oder R.

ο 4

und/öder R_q, wenn sie einen Alkyloxyrest bzw. einen A.ll:yloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellen/ durch eine Hydroxy- oder Carboxygruppe, ersetzt, und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in Salzform isoliert.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 ,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R-NH-CH-COOH
CH₃

worin R_ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt,, mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel

H₀N-CH-CO-Rg

CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₉

R₁.-NH-CH-R. 10 4

umsetzt, worin R_R einen Hydroxy-, Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, eines der Symbole R. oder R„ ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist

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durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitropheny^est, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Aikyloxycarbonylrest/ dessen AlkyItGiI 1-4 Kohlenstoffatom^ enthält und gegebenenfalls substituiert ist r"urch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, wobei R. und R_g nicht gleichzeitig ein Wasserstoff atom darstellen können und R.. einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, mindestens eines der Symbole R. oder Rg und R₁ einen Glycyl- oder D-Alanylrest bedeutet oder enthält und mindestens eines der Symbole R- und R_1n einen Fettsäurerest darstellt oder enthält, worauf man gegebenenfalls den Rest R₇ oder R₁₀/ wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, oder enthält, durch ein WasserstoffatCTi ersetzt und die Re.'ite R„ und/oder R, und/oder R_g, wenn sie einen Alkyloxy- oder Alkyloxycarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenylodcr Nitropb^Q.nylrest., bedeuten oder enthalten, durch einen Hydroxy- bzw. Carboxyrest ersetzt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in Salzform isoliert.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Säure der allgemeinen Formel

R"-CO-OH

worin R"-CO- einen Fettsäurerest darstellt oder ein aktiviertes

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Derivat dieser Säure, mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel

R-. -NH-CH-CO-NH-CH-CO-Ro
11 I ι 8

CH₃ CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₉

₂₃

R₁₀-NH-OH-R₄

umsetzt, worin eines der Symbole R. oder R_g ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl-, Alkyloxycarbonyl-Rest, dessen Alk^lteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, oder einen N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest, gegebenenfalls verestert durch einen Alkylres··-· mit

1-4 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carb='J".oyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, wobei R- und R_g nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können, R₀ einen

Hydroxy-, Amino- oder Alkylcxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, und R₁₀ ein Wasserstoffatom, einen Fettsäurerest, eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion gegebenenfalls substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt, R₁₁ ein Wasserstoffatom, einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet, wobei mindestens eines der Symbole R^ oder R_g und R.. einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt 'oder enthält und mindestens eines der Symbole R_1n und R₁₁ ein Wasserstoffatom darstellt oder R₁ einen Glycyl- oder D-Alanylrest darstellt, dessen Aminfunktion frei ist und falls

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einer der Reste R₁₀ oder R₁₁ einen Pettsäurerest darstellt oder enthält, dieser und der Rest R"-CO- identisch oder unterschiedlich sind, worauf man gegebenenfalls den Rest R₁₀ oü3r R₁₁, wenn er eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, oder enthält, durch ein Wasserstofratom ersetzt und die Reste

R₀ und/o^er R_A und/oder R_n, wenn sie einen M-kyloxy- oder ο 4 y

Alkylox^-jarbonylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrebt, darstellen, durch eintva Hydroxy- bzw. Carboxyiest ersetzt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls .in Salzform isoliert.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man an einem geeigneten Träger ein Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel

R₁₃-NH-CH-R₉

(CH,),

R₁₂-NH-CH-R₄

fixiert, worin sines der Symbole R. oder R~ einen Carboxy-, N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoylrest oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 K.chlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, R₁₂ eine Fettsäure oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion substituiert ist, darstellt und R₁, eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet, wobei, wenn R₁- und R₁₃ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten, diese

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Schutzgruppen unterschiedlich sind, worauf man nach Freisetzung der durch R₁-, geschützten Aminfunktion kondensiert:

a) ~-entweder die D-Glutaminsäure, deren Amin- und o£-Carboxyfunktionen in geeigneter Weise geschützt sind, d. h. die Verbindung der allgemeinen Formel

^B..-NH-CH-CO-R-jj j ö

CH₂CH₂-COOH

worin R₁₃ wie vorstehend definiert ist und R_fi einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls sußstituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, und anschließend n?.ch der Freisetzung der durch R₁^ geschützten Aminfunktion:

— entweder ein Derivat des L-Al-^nins der allgemeinen Formel

R₁ ,-NH-CH-COOH

worin R₁- wie vorstehend definiert ist, und anschließend nach Freisetzung der durch R₁- und/oder R.„ geschützten Aminfunktionen gegebenenfalls eine Fettsäure der allgemeinen Formel

R"-COOH
—oder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R-NH-CH-COOH
CH-,

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worin R einen Fettsäurerest darstellt, b) — O(5'3r das Dipeptid der allgemeinen Formel

R₁--MH-CH-CO-NH-CH-CQ-Rq
¹⁴ [ I ⁸

CH₃ CH₂CF₂-COOH

worin Rg wie vorstehend definiert ist und R.. einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei, wenn R... eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, diese von der vorstehend definierten Schutzgruppe R₁₂ verschieden ist, ^und dann gegebenenfalls nach Freisetzung der durch den Rest R.. und/oder R_1? geschützten Aminfunktionen dia Säure der allgemeinen Formel R"-COOH₇ worauf man das erhaltene Produkt von seinem Träger abtrennt und falls notwendig Schutzgruppen von Amin- und Carboxyfunktionen entfernt und daz erhaltene Produkt gegebenenfalls in Salzform isoliert.

10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß irian auf einem 9oeigneten Träger das Peptid der allgemeinen Formel

R₁₅-NH-CH-CO-R₈

CH₂CH₂-CO-NH-CH-R₉

_L2-NH-CH-R₄

fixiert, worin eines der Symbole R. oder R_q einen Carboxy-, N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-D-alanylrest darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil .1-4 Kohlenstoffatome

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— 1 ι

enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, R₁₂ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen GIycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aminfunktion durch einen Fettsäurerest ~ler eine Schutzgruppe der Aminfunktion geschützt ist, darstellt und R_R einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls subslituiert durci"» einen Phenyl- oder Nitrophenylrest darstellt, R₁₅ eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeutet, wobei, falls R₁ „ und R₁₁-eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten, diese Schutzgruppen unterschiedlich sind, worauf man nach Freisetzung der durch R₁ ^ geschützten Aminfunktion kondensiert:

- entweder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R₁₅-NH-CH-COOH
CH₃

worin R₁₅ wie vorstehend definiert ist und anschließend gegebenenfalls nach Freisetzung der durch R₁₅ und/oder R₁₂ geschützten Aminfunkcionen, die Säure der allgemeinen Formel R"-COOH,

— oder ein Derivat des L-Alanins der allgemeinen Formel

R-NH-CH-COOH

CH,

worin R einen Fettsäurerest darstellt, worauf man das erhaltene Produkt von seinem Träger abtrennt und falls notwendig die Schutzgruppen der Amin- und Carboxyfunktionen entfernt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls m Salzform gewinnt.

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11. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man auf einem geeigneten Trelger das Peptid der allgemeinen Formel

R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-Rg

CH₃ CH₂-CH₂-CO-Nh-CH-IL

₂₃

R₁₂-NH-CH-R₄

fixiert/ worin eines der Symbole R^ oder R» einen Carboxy-, N-Carbonylglycyl- oder N-Carbonyl-L-alanylrest darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, bedeutet, R₁- einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen GIycyl-Or¹Or D-Alanylrest, dessen Aminfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, bedeutet, und R„ einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitroplienylrest, bedeutet, R.., eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, wobei, falls R.,» und R-_fi eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten, diese Schutzgruppen unterschiedlich sein können, und anschließend nach der Freisetzung der durch R₄- und/oder R_1n geschützten Aminfunktionen die Säure der allgemeinen Formel R"-C0-0H kondensiert, worin R"-C0 einen Fettsäurerest darstellt und schließlich das erhaltene Produkt von seinem Träger abtrennt, falls notwendig die Schutzgruppen der Amin- und Carboxyfunktionen entfernt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in Salzform isoliert.

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12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, worin eines der Symbole R₂ oder R. einen N-Carbony]^lycyl- oder N-Carbony1-D-alanyIre?t darstellt und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carboxy-, Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoffatome enthält und gegebenenfalls durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest substituiert ist, darstellt, dadurch gekennzeichnet, daf man auf einem geeigneten Träger Glycin oder D-Alanin, dessen Aminfunktion geschützt ist, fixiert, anschließend nach der Freisetzung der Aminfunktion eine Aminosäure oder ein Peptid der allgemeinen Formel

R₁₇-NH-CH-R₇

(ck₂)₃

R₁₂-NK-CH-R₄

kondensiert, worin eines der Symbole R. oder R_q einen Carboxyrest und das andere ein Wasserstoffatom oder einen Carbamoyl- oder Alkyloxycarbonylrest, dessen Alkylteil 1-4 Kohlenstoff atome enthält und gegebenenfalls substituiert ist durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest, darstellt, R„₂ einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen ' Glycyl- oder D-Alanylrest, dessen Aainfunktion substituiert ist durch einen Fettsäurerest oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion, darstellt und R₁₇ eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder exnen Rest einer D-Aminosäure der allgemeinen Formel

R₁₈-NH-CH-CO-R₈

C
CH₂CH₂-COOH

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— ι ο —

darstellt/ worin R„ einen Amino- oder Alkyloxyrest mit 1 -· 4 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen Phenyl- oder Nitrophenylrest darstellt, und R._o eine

1 ö

Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Rest einer L-Aminosäure der allgemeinen Formel

R₁ Q-NH-CH-COOH
CH₃

darstellt, worin R_1Q eine Schutzgruppe der Aminfunktion oder einen Fett=äurerest, wie vorstehend definiert, bedeutet, wobei fallt» R₁₇/ R₁O oder R₁ „ jeweils eine Schutzgruppe der Aminfunktion bedeuten, diese Gruppen unterschiedlich von R₁₂ sind, wenn dieses eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt oder enthält, wobei R₁₂ jedoch identisch rr.it R_1Q sein kann, und:

falls R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, diose Schutzgruppe entfecnt, worauf man kondensiert,

— entweder ein Derivat der D-Glutaminsäure, wie vorstehend definiert., worin R₁O eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, und anschließend nach der Entfernung von R_1R ein Derivat des L-Alanins, wie vorstehend definiert, worin R_1C. wie vorstehend definiert ist, kondensiert, und weim R₁Q und/oder R₁₂ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen, diese Reste R_1r und/oder R₁₂ entfernt und anschließend die Säure der allgemeinen formel R''CO-ΟΗ kondensiert,

—oder ein Derivat der D-Glutaminsäure, wie vorstehend definiert, worin R₁₈ den Rest einer L-Aminosäure, wie vorstehend definiert ist, worin R_1g wie vorstehend definiert ist, und, wenn R₁Q und/oder R₁₂ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten, diese Reste R_1Q

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302A281

_ j y _

und/oder R_1? entfernt, worauf man die Fettsäure der allgemeinen Formel R"-CO-OH kondensiert,

wenn R₁₇ einen Rest der D-Glutaminsäure, wie vorstehend definiert, darstellt, worin R₁₈ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, diese Schutzgruppe entfernt, worauf man ein Derivat des L-Alanins, wie vorstehend definiert, worin R₁P wie vorstehend definiert ist, kondensiert, und wenn P.„ und/oder R₁- eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellen oder enthalten, diese Reste R₁₀ und/oder R₁ „ entfernt, worauf man die Fettsäure der allgemeinen Formel R"-CO-OH kondensiert, und

wenn R₁₇ einen D-Glutaminsäurerest, wie vorstehend definiert, darstellt, worin R., _o einen L-Aminosäurerest, wie vorstehend

I ο

definiert, bedeutet, worin R₁ „ eine Schutzgruppe der Aminfunktion darstellt, man die Reste R₁ „ und/oder R₁ ~ entfernt, und anschließend die Fettsäure der allgemeinen Formal R"-CO-OH kondensiert, worauf man das erhaltene Produkt von seinem Träger entfernt, falls notwendig die Schutzgruppen der Amin- und Carboxyfunktionen entfernt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls in Salzform isoliert.

13. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 in reinem Zustand, oder zusammen mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch brauchbaren Verdünnunasmitteln oder Zusätzen bzw. mit üblichen Hilfs- und Trägerst~>ffen.

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