DE2033703A1

DE2033703A1 - Peptidverbmdungen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2033703A1
Application number: DE19702033703
Authority: DE
Inventors: David de Prof Dr Bilthoven Greven Hendrik Marie Heesch Wied, (Nieder lande)
Original assignee: N V Organon, Oss (Niederlande)
Priority date: 1969-07-09
Filing date: 1970-07-07
Publication date: 1971-01-21
Also published as: NL7010052A; GB1301738A; FR2059499A1; DK128531B; FR2059499B1; HU163599B; CH553162A; JPS4843351B1

Description

"Peptidverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Die Erfindung betrifft kurzkettige Peptidverbindungen mit einer Aminosäuresequenz, die erhebliche Ähnlichkeit mit einem bestimmten Teil der Molekülkette von adrenpcorticotropen Hormonen aufweist. " ·

Diese PeptidvSrbindungen sovrie deren Salze, Derivate und Komplexe besitzen starke, psychopharmakologische Wirksamkeit.

Es ist aus Science, Bd. 153ι Seite 318 (1966), bekannt, daß das Decapeptid der Aminosäuresequenz 1 bis 10 der adrenocorticotropen Hormone, wobei die Aminosäure Phenylalanin in D-Konfiguration auftritt, eine bestimmte Wirkung auf das zentrale nervensystem besitzt.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die viel kleineren Peptide der allgemeinen Formel:

X-(L oder D)-Met-L-Glu-(oder Gln)-L-His-D-Phe-Ir-Arg-(oder L-Lys)-L-Trp-I,

wobei X ein Wasserstoffatom oder die Gruppe

009884/2250 "² ~

H-(L oder D)-Ser- oder H-GIy₇- und Y eine Hydroxylgruppe oder die Gruppe -GIy-OH "bedeutet, und deren Salze, Derivate und Komplexe eine größere oder wenigstens ähnliche Wirkung auf.das zentrale Nervensystem besitzen, verglichen mit dem bekannten Decapeptid bei Verabreichung der gleichen Dosierung, wobei die Wirksamkeit dieser Verbindungen viel spezifischer ist.

Die Peptidverbindungen gemäß der obigen allgemeinen Formel sind insbesondere sehr aktiv bezüglich der Beschleunigung der Auslöschungsgeschwindigkeit von Hemmungsreaktionen. Aus diesem Grunde sind sie bei der Behandlung bestimmter geistiger Störungen sehr brauchbar.

Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäßen Peptidverbindungen sind solche der Formel:

X-(L oder D)-Met-L~Glu-(oder Gln)-L-His-D-Phe-L-Arg-(oder L-Lys)-L-Trp-OH, . .

wobei X die genannte Bedeutung hat und deren Salze, Derivate und Komplexe.*

Diese Gruppe von Peptidverbindungen hat die höchste Spezifität und ist auch aus wirtschaftlichen Gründen (als kürzestes Peptid) bevorzugt.

Gemäß den obigen allgemeinen Formeln kann anstelle der Aminosäure-Glutaminsäure auch Glutamin zur Herstellung dieser Peptidverbindungen verwendet werden« Es ist natürlich ebenfalls möglich, das gleiche Ergebnis dadurch zu erzielen, daß die Carboxylgruppe in der Seitenkette des Glutaminsäurerestes in eine Amidgruppe bei der Synthese dieser Peptiaverbindungen überführt wird. .

• ■

Die Aminosäure "Arginin" kann gemäß den Formeln durch Lysin

0O9884V2250 ' " ⁵ "

ersetzt werden,ohne daß die .Wirksamkeit der Peptide geändert wird. Diese Abänderung ist hinsichtlich der leichteren Synthese bevorzugt.

Hie neuen Peptidverbindungen können mit Hilfe üblicher Verfahren hergestellt werden, die bei der Herstellung der bekannten Peptidverbindungen verwendet werden. Zu diesem Zweck werden die Aminosäuren mit Schutzgruppen an den geeigneten Stellen versehen und in der richtigen Reihenfolge miteinander gekoppelt oder es werden kleinere Peptide zu größeren Einheiten verbunden. Nach der Synthese werden die Schutzgruppen, die im Peptidmolekül vorhanden sind, in üblicher Weise entfernt, wonach gegebenenfalls das erhaltene Peptid in das Salz, Derivat oder den Komplex überführt werden kann.

Peptide werden gewöhnlich durch folgende Verfahren hergestellt:

a) Eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer geschützten

_a_Aminogruppe und einer aktivierten endständigen Carboxy-* gruppe wird mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier α-lminogruppe kondensiert;

b) eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer aktivierten a-Aminogruppe und einer geschützten Carboxylgruppe wird

mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien endständigen Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe kondensiert;

c) eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer freien Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe wird mit einer

" Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien a-Aminogruppe und einer geschützten Carboxylgruppe kondensiert.

Die Akt-ivierung der Carboxylgruppe kann z.B. dadurch vorge-

009884'/225Ov'

1A-38 227 2Q33703

_ /j. —

nommen werden, daß die Carboxylgruppe in ein Säurehalogenid, ein Azid, Anhydrid ader Imidazolid oder in einen aktivierten Ester, wie dem Cyanomethylester oder p-Nitrophenylester überführt wird.

Die Aminogruppe kann z.B. durch Überführen in ein Phosphatamid aktiviert werden.

Die üblichsten Verfahren zur Kondensation von Aminosäuren oder Peptiden sind die folgenden: Das Carbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das Anhydridverfahren und das Verfahren mittels aktivierter Ester, wie z.B. in "THE PEPTIDES" von E. Schröder und K. Lübke, Bd. I, 1965 (Academic Press) beschrieben ist. Weiterhin kann das sog. Verfahren in "fester Phase" von Merrifield gemäß J. Am. Chem. Soc, Bd. 85, Seite 214-9 (1963) zur Herstellung der erfindungs gemäß en Peptide verwendet werden.

Die freiaafunktionellen Gruppen in der Aminosäure oder dem Peptid, die bei der·Kondensationsreaktion nicht teilnehmen sollen, werden wirksam durch sog. Schutzgruppen geschützt, die sehr leicht d\irch Hydrolyse oder Eeduktion wieder abgespalten werden können. Z.B. kann die Carboxylgruppe wirksam durch Verestern mit Methanol, Äthanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol oder durch Umsetzen zu einem Amid geschützt werden. Die letztgenannte Gruppe ist jedoch sehr schwierig zu"entfernen, so daß sie vorzugsweise nur zum Schutz der endständigen Hydroxylgruppe in dem als Endprodukt erhaltenen Peptid verwendet wird, z.B. für die Carboxylgruppe von Glycin oder Tryptophan. Die N-Schutzgruppen sind im allgemeinen Säuregruppen, z.B. eine von einer aliphatischen, aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, wie Essigsäure, Chloressigsäure, Buttersäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure oder Pyridincarbonsäure abgeleitete. Säuregruppe oder eine Säuregruppe, die von der Kohlensäure abgeleitet ist, wie eine Athoxycarbonyl-, Benzyl-

00988A/2250 -5-

oxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl- oder p-Methyloxybenzyloxycarbonylgruppe oder eine Säuregruppe, die von einer SuIfonsäure abgeleitet ist, wie die Benzolsulfonyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe. Es können jedoch auch andere Gruppen verwendet werden, wie substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen, z.B. Benzyl- und Triphenylmethylgruppen.

Die Guanidingruppe von Arginin sollte vorzugsweise durch eine Nitrogruppe geschützt werden, während die Iminogruppe von Histidin vorzugsweise durch eine Benzyl- oder Tritylgruppe" geschützt werden sollte. Im allgemeinen ist es bevorzugt, einen tertiären Butylester zum Schutz der Carboxylgruppe zu verwenden und eine Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe oder eine Tosylgruppe zum Schutz der Aminogruppe.

Die Schutzgruppen können durch verschiedene übliche Verfahren abgespalten werden, je nach der Art dieser Gruppe, z.B. mit Hilfe von Trifluoressigsaure oder durch milde Reduktion, z.B. mit Wasserstoff und einem Katalysator, wie Palladium oder mit Bromwasserstoff in Eisessig.

Unter den Salzen, Derivaten und Komplexen der erfindungsgemäßen Peptidverbindungen werden folgende verstanden:

1) Additionssalze des Peptids gemäß der allgemeinen Formel mit Säuren;

2) Acylsubstituenten von einer oder von mehreren Aminogruppen des Peptids, z.B. Acetyl-, Benzoyl- oder Phenylpropionylsubstituenten;

3) unsubstituierte Amide, substituierte Amide, vorzugsweise mit Alkylgruppen mit mehr als 8 Kohlenstoffatomen und Ester, vorzugsweise längere Ester, die von aliphatischen, aromatischen oder araliphatischen Alkoholen mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind;

009884/2250· " ⁶ ~

4) Komplexe, die durch Zusatz bestimmter organischer oder anorganischer Verbindungen zum Peptid gebildet werden, wodurch eine verlängerte Aktivität erhalten wird.

Als Säureadditionssalze kommen erfindungsgemäß besonders die Salze von pharmakologiach unbedenklichen Säuren in Frage, wie z.B. die Halogenwasserstoffsäuren, Phosphorsäure, Essigsäure, Phenylpropionsäure, Maleinsäure, Weinsäure und Zitronensäure.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Peptide in Verbindungen mit verlängerter Aktivität überführt, nicht nur weil die gefundene psychopharmakologische Wirksamkeit länger erhalten bleibt sondern auch weil die Wirkung dieser Verbindungen stärker ist, verglichen mit der Wirkung der meisten erfindungsgemäßen Peptidverbindungen. » ■

Derartige Verbindungen mit verlängerter Aktivität können dadurch hergestellt werden, daß das Peptid mit einer organischen polymeren Substanz kombiniert wird, wie Oxypolygelatine, Carboxymethylcellulose, Dextranen, Polyphenolen, Polyalkoholen und Polymerenoder Copolymeren von Aminosäuren, insbesondere solchen Polymeren oder Copolymeren mit einer großen oder überwiegenden Zahl saurer a-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Aspariginsäure, die nicht endständig sind. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Peptidverbindungen sind jedoch die Metallkomplexe mit verlängerter Aktivität besonders bevorzugt. Diese Metallkomplexe können durch kombinieren der Peptidverbindungen mit schwer löslichen biologisch geeigneten Metallsalzen, Metallhydroxiden oder Metalloxiden erhalten werden. Als schwer lösliche Metallsalze kommen im allgemeinen die Metallphosphate, Metallpyrophosphate und Metallpolyphosphate in Frage«

Metalle., die hierbei Verwendung finden können, sind solche

— 1 — . . 009884/2250·

• . 7 - ■ /

der Nebengruppen des periodischen Systems, wie Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen und vorzugsweise Zink, sowie Metalle, die zu den Hauptgruppen des Periodensystems gehören und als Chelatbildner in Frage kommen, wie Magnesium und Aluminium·. Die Herstellung dieser Metallkomplexe wird in üblicher Weise vorgenommen. .

Z.B. können die Metallkomplexe durch Zugabe des Peptids und eines schwer löslichen Metallsalzes, Metallhydroxids oder Metalloxids zu einem wäßrigen Medium erhalten werden. Der Metallkomplex kann auch durch Zugabe eines alkalischen Mediums zu einer wäßrigen Lösung des Peptids und einem löslichen Metallsalz erhalten werden, wodurch der unlösliche Peptid-Metallhydroxidkomplex gebildet wird.

Der Metallkomplex kann durch Zugabe des Peptids, eines löslichen Metallsalzes und eines löslichen Salzes zu einer wäßrigen, vorzugsweise alkalischen Lösung erhalten werden, wodurch der unlösliche Peptid-Metallsalzkomplex in situ gebildet wird.

Der Komplex kann unmittelbar als Suspension verwendet werden oder er kann aus dem wäßrigen Medium isoliert und anschließend erneut zur Herstellung einer injizierbaren Suspension suspendiert 'werden.

Die erfindungsgemäßen Peptidverbindungen und deren Salze, Derivate und Komplexe werden vorzugsweise als Präparate zum Injizieren in Form von Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen angewendet. Gemischt mit geeigneten Hilfsstoffen können sie auch in eine Form gebracht werden, die zur oralen Verabreichung geeignet ist oder in die Form von Suppositorien oder Sprühpräparaten. Vorzugsweise wird der Wirkstoff in einer Dosierung von 1 mg bis 1 g je Dosierungseinheit angewendet,' je nach der Form, in der er verabreicht werden soll.

009884/2250

Das Verfahren zur Bestimmung der psychopharmakologiselien Wirkung wird wie folgt durchgeführt.

Es werden männliche weiße Ratten von 14-0 bis 160 g Gewicht in einem sog. Pendelkäfig gehalten. Der konditionierte Reiz (CS) war ein Summerton über 5 see. Der unkonditionierte Reiz (US) war ein elektrischer Schock, der durch den Gitterboden des Käfigs auf die Füsse des Tieres aufgebracht wurde, bis es reagiert hatte. Jeden Tag wurden die Konditionsversuche durchgeführt, wobei zwischen den Versuchen ein Intervall von durchschnittlich 60 see belassen wurde, bis das Tier die Konditionskriterien von 80 % oder mehr Hemmung an drei aufeinanderfolgenden Tagen erreicht hatte. Die Hemmungslöschung wurde während der nächsten 8 Tage studiert unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie bei der Annahme der Ausweichreaktion mit der Ausnahme, daß kein US angewendet wurde.

Die Gesamtzahl positiver Ausweichreaktionen, die von jeder Ratte während der Annahme der Ausweichreaktion angenommen wurde, oder die Extinktion diente als Index für die psychopharmakologische Wirkung.

Die Behandlung mit den betreffenden Peptidverbindungen wurde an dem Tag begonnen, an dem die Tiere das Konditionskriterium erreicht hatten, unmittelbar nach dem letzten Vei^ch der Serie. Die Tiere wurden subkutan jeden zweiten. Tag während der Extinktionsperiode indiziert.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Hinsichtlich der folgenden Eeispiele wird folgendes bemerkt mit Bezug auf die Peptidverbindungen gemäß der Erfindung.

A. Wenn'keine optische Konfiguration erwähnt ist, ist die L-Form gemeint.

* I

_ 9 — 00 9 88A /22 SO

1A-38 227

B. Für die Schutzgruppen wurden die folgenden Abkürzungen verwendet: '

Z	: Benzyloxycarbonyl
BOC	: tert.-Butyloxycarbonyl
t-Bu	: tert.-Butyl
Me	Methyl ·
NP	p-Nitrophenyl
N₂H₃	Hydrazid
T	Trityl

C, Die folgenden Abkürzungen wurden für die verwendeten Lösungsmittel verwendet:

Bz	Benzol
EtOH	Äthanol
Ac	Essigsäure
Py	Pyridin
Wa	Wasser
Bu	Butanol
DMF	Dimethylformamid
Am	Amylalkohol

D. Die folgenden Abkürzungen wurden für die Aminosäuren verwendet: .

Ser	-0098847 22 BO
Met
GIu
GIn
His
Phe
Arg
Ly s
Trp '
GIy .

: Seryl
: Methionyl
: Glutamyl
Glutaminyl
: Histidyl
: Phenylalanyl
Arginyl
Lysyl
Tryphtophyl
Glycyl

- 10 -

E. Andere Abkürzungen wurden wie folgt verwendet:

DCCI : DiCyclohexylcarbodiimid • .DCHA : Dicyclohexylamin.

Herstellung der Ausgangsstoffe

A1) Synthese von Boc-Met-Glu-(OtBu)-N₂H

Es wurden 24,9 g (100 mMol) Boc-Met-OH, das aus dem Dicyclohexylaminsalz erhalten worden war, in JOO ml gereinigtem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 26,75 g H-GIu-(OtBu)-OEt. HCl zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde auf O⁰C gekühlt, wonach 14 ml Triäthylamin zugefügt wurden. Das Gemisch wurde auf -5⁰C gekühlt und es wurden 20,6 g DCCI zugefügt und diese Suspension bei O⁰C 20 h gerührt. Der Rückstand, der aus Dicyclohexylharnstoff und Triäthylamin · HCl bestand, wurde filtriert und gewaschen. Anschließend wurde das Methylenchlorid mit 0,1n Salzsäure, Wasser, 5 /oiger Natriumbicarbonatlosung und erneut mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat wurde das Methylenchlorid unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde aus Äthylacetat/Petroläther gleich 40/60 kristallisiert. P. 95 bis 98⁰C; </~a_7_D = ~¹⁸° (c = 1 in Äthanol); Rf-Wert in Bz-EtOH (9:1) *= 0,74. ' '

Es wurden 4,6 g des Dipeptids, das wie oben erhalten worden war, in 25 ml Äthanol gelöst und die Lösung wurde auf 0⁰C gekühlt. Es wurde 1 ml Hydrazinhydrat zugefügt. Das Gemisch wurde 18 h bei O⁰C stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und aus'Äthanol 3mal kristallisiert» F. 215 bis 216⁰C (Zersetzung); 'füJ-Q · -15° (c = 2 in Äthanol),

00988472250 /.

A2) Synthese von Boc-D-Met-Glu-(OtBu)-N₂H₅

Ausgehend von Boc-D-Met, einem Öl, das aus dem Dicyclohexylaminsalz (F.137,5 bis 139°C; /~cx_7_D = -11,2° (c = 1 in Methanol) erhalten worden war, wurde gemäß A1 Boc-D-Met-GIu-(OtBu)-OEt erhalten. Rf-Werfc in Bz-EtOH (9:1) = 0,70.

Dieses Öl wurde in gleicher Weise wie das Dipeptid gemäß A1 in das Hydrazid überführt. /""a__7_D = -3 in Äthanol; F. 200 bis 204⁰C.

A3)Synthese von

Es wurden 6g (3 mMol) H-Met-OMe«HCl in 100 ml Methylenchlorid suspendiert. Nach dem Kühlen auf O⁰C wurde ein Strom von trockenem Ammoniakgas durch die Suspension 1/2 h durchperlen gelassen, wobei gekühlt wurde. Die Suspension wurde anschliessend über einer Filtrierhilfe (Hyflo) filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 40⁰C zur Trockene eingedampft. Das erhaltene Öl wurde in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf 0 C gekühlt, wonach 8,9 g Boc-Gly-OKP zugefügt wurdest Das erhaltene Gemisch wurde 3 h bei O⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde 2mal mit peroxidfreiem Äther gewaschen. Das Gemisch wurde filtriert und der erhaltene Rückstand wurde" in 100 ml«wäßrigem Äthylacetat aufgenommen und mit 0_r5n Salzsäure, Wasser, 10%iger NatriumMcarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen. Danach wurde die Äthylacetatlösung getrocknet und unter vermindertem Druck abdestilliert. Der kristalline Rückstand wurde aus Methanol/Äther/Petrolather umkristallisiert.

F. 80 bis 83⁰C; /~a_7 ₌ __?o (in Methanol); Rf-Wert in Bz-EtOH (9:1) = 0,74. Es wurden 5 g Dipeptidmethylester in 10 ml Ilethanol gelöst, wonach 1 ml Hydrazinhydrat zugefügt wurde. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 20 h gerührt.

- 12 009884/2250

Die hellgelbe Suspension wurde noch 1 h bei O⁰C gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde 3mal mit peroxidfreiem Äther gewaschen und dann aus Methanol umkristallisiert.

F. 170 bis 174⁰C; /~a_7 = -7° (c = 1 in DMF); Ef-Wert in Bu-Py-Ac-Va ^4:0,75:0,25:1) = 0,62.

A4) Synthese von Boc-Ser-Met-N₂H, '

Es wurden 7,72 g Boc-Ser-OH-DCHA in 50 ml gereinigtem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Suspension von 4 g H-Met-OMe*HCl in 15 ml Methylenchlorid zugefügt. Die Suspension wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt und anschließend auf O⁰C gekühlt. Es wurden 4,2 g DCCI zugefügt und das erhaltene Gemisch wurde 4 h bei O⁰C und danach 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Verfahrensstufe kann gegebenenfalls etwas Lösungsmittel zugefügt werden. Das Gemisch wurde filtriert und der Niederschlag wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die gesammelten Methylenchloridfiltrate wurden auf 250 ml eingedampft, wonach 100 ml Äther zugefügt wurden, um das Dipeptid auszufällen.

F. 68 bis 69°C; /"cxj^ = -30,7° (c = 2 in Methanol) Rf-Wert in Bz-EtOH (8r2) = 0,70.

2,3 6 des Dipeptids wurden in 15 ml Methanol gelöst, wonach 1 ml Hydrazinhydrat zugefügt wurde. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 18 h gerührt, danach der erhaltene Niederschlag abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und aus Methanol/Wasser umkristallisiert. F. 189 bis 191⁰C; /~a_7_D = 13,9° (c = 1 in DMF).

A5) Synthese von Boc-D-Ser-Met-N₂H,

Ausgehend von Boc-D-Ser-OH-DCHA, F. 138 bis Ί40°0; /~<χ_7_Ώ =

- 13-

-12,8° in Methanol, wurde der Boc-D-Ser-Met-methylester

00988AV22B0

in gleicher Weise wie gemäß A4 hergestellt. F. 68 "bis 7O°C; /~"olJ7t) = -1,5° (c = 1 in Methanol). Durch Umsetzung dieses Dipeptidesters mit Hydrazinhydrat in der genannten Weise wurde Boc-D-Ser-Met-^H^ vom F, 14-5 bis 147°C erhalten.

A6) Synthese von Boc-Ser-Met-Glu-(OtBu)-N₂H,

Es wurden 1,15· g (3,3 mMol) Boc-Ser-Met-^H*, das gemäß A4 erhalten worden war, in 10 ml reinem DMF gelöst und auf -10 C abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 6,6 Moläquivalente Salzsäure in frisch hergestelltem Tetrahydrofuran zugefügt. Danach wurde die Lösung weiter auf -20⁰C gekühlt. Zu der Lösung wurden tropfenweise 0,48 ml Isoamylnitrit zugegeben und die Lösung wurde 5 min heftig gerührt. Die Temperatur sollte zwischen -20 und -25°C hierbei bleiben. In der Zwischenzeit wurden 0,88 g (3,3 mMol) H-GIu-(OtBu)-OEt-HCl in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde auf 0⁰C abgekühlt, wonach 1,4 ml Triethylamin zugefügt wurden. Die Lösung wurde weiter auf -20⁰C gekühlt und danach die Azidlösung zugefügt. Das Gemisch wurde 73 h bei O⁰C umgesetzt. Dänach wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 40 C abgedampft und der Rückstand wurde in wäßrigem Äthylacetat aufgenommen. Das Äthylacetat wurde mit 0,1n Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlosung und erneut mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat«getrocknet. Nach dem Filtrieren wurde die^lthylacetatlösung unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wurde aus Ättiylacetat/Petroläther = 40/60 umkristallisiert. F, 182 bis 184⁰C; /"aJ7 = -17,4° (c = 1 in DMF) Rf-Wert in Bz-EtOH (8:2) = 0,70.

Es wurde 1 g des erhaltenen Tripeptidderivats in das Hydrazid gemäß A4 überführt. F. 217°C (Zers.); Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) ■«= 0,58.

- 14 -

0 0988kl2 25D ' .

In gleicher Weise wie gemäß-A6 wurden folgende Verbindungen hergestellt:

A7) Boc-D-Ser-Met-Glu-(QtBu)-N₂H₅; /~a__7_D = +1,1° in DMF; * · F. 190 bis 195°G (Zers.).

A8) Boc-Gly-Met-Glu-(OtBu)-N₂H₃; Γα.J^ = -5,3° in DMJ; F. 187 bis 190⁰C (Zers.).

B ) Synthese von T(T)-His-D-Phe-Arg-Trp-OH

1) Es wurden 8 g (10 mMol) Ditrityl-His-D-Phe-N^ in 35 ml reinem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde auf -2O°C gekühlt. Anschließend wurden 2 Äquivalente Salzsäure in Tetrahydrofuran (frisch hergestellt durch Einperlen von trockenem Chlorwasserstoffgas durch Tetrahydrofuran) zugefügt, wonach die Lösung erneut auf -2O°C gekühlt wurde. Bei dieser Temperatur wurden 1,48 ml Isoamylnitrit (11 mMol) zugegeben und danach die Lösung 5 min gerührt. . Während dieser Verfahrensstufe sollte die Temperatur unterhalb -20⁰C bleiben.

In der Zwischenzeit wurde eine Lösung von 3»7 g H-Arg-Trp-OMe-DiHCl (8,3 mMol) in 20 ml Dimethylformamid hergestellt. Diese Lösung wurde gekühlt und anschließend mit 4 ml Triäthylamin versetzt. Die beiden Lösungen wurden gemischt, wonach die Azidkondensation 72 h bei 0^GC durchgeführt wurde. Die gefärbte Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und anschließend wurde der erhaltene Niederschlag in wäßrigem Athylacetat aufgenommen und mit etwas 2n Essigsäure, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und erneut mit Wasser gewaschen.

Das Gemisch wurde über Natriumsulfat getrocknet und danach

- 15 -

0098 8 k 7 2 250 '■-

das Äthylacetat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol/Äther umkristallisiert. F. 202 bis.210⁰C (Zers.); C^kJ^q = -39*8° (c = 1 in Methanol); Rf-Wert in Bz-EtOH (8:2) = 0,82.

2) Verseifung des Tetrapeptide zu Ditrityl-His-D-Phe-Arg-Trp-OH

Es wurden 2,3 g des oben erhaltenen Tetrapeptide»HCl-Salzes in einem Gemisch aus 1715 ml Methanol und 2,5 ml Wasser gelöst. Bei einer Temperatur von 4-⁰C wurden 2,3 ml 4n Natriumhydroxidlösung von ebenfalls 4°C zugefügt. Die alkalische Lösung wurde 1 h bei Raumtemperatur, gerührt, erneut auf 4⁰C gekühlt und dann schnell tropfenweise zu 100 ml n-Essigsäure zugefügt, die heftig gerührt und ebenfalls auf 4⁰C gekühlt worden war, um die Tetrapeptxdsaure auszufällen. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 0 C stehengelassen und filtriert. P. 225 bis 234-⁰C (Zers.); /~a_7_D = -39,1° (c = 1 in Methanol); Rf-Wert in Bz-EtOH (8:2) = 0,2?.

C) Synthese von T(T)-His-D-Phe-Arg-Trp~-Gly-OH

1) Synthese von T(T)-His--D-Phe-Arg-Trp-hydrazid^eHCl .

Es wurden 4,6 g des gemäß B1 erhaltenen Esters in 30 ml Methanol gelöst und anschließend mit 1 ml Hgrdrazinhydrat zersetzt. Das Gemisch wurde 20 h- bei 20⁰C stehengelassen und 1 h bei O⁰C belassen und danach filtriert. Das Rohprodukt wurde aus warmem Methanol umkristallisiert, um das Hydrazid zu erhalten.

F. 253⁰C (Zers.); Γα.J^ = -44° (c = 1 in DMF); Rf-Wert in Am-Py-Wa (5:3:2) = 0,4. ·

2) Synthese von T(T)-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly~OH·HCl.

Von dem erhaltenen Hydrazid wurden 2,24g 02 mMol) unter Er-

00988472250

wärmen gelöst und danach auf -2O⁰O gekühlt. Danach wurden 4 mMol HCl in Tetrahydrofuran und 0,3 ml Isoamylnitril (22 mMol) zugefügt und das Gemisch wurde 5 min bei 2O⁰C gerührt. Diese Lösung wurde zu einer Lösung von 300 mg Glycin (4mMol) und 1,12 ml Triäthylamin (8 mMol) in 10 ml Dimethyl formamid, die ebenfalls auf -20°C .gekühlt war, zugefügt. Anschließend wurde die Lösung bei O⁰C gerührt und in 300 ml Wasser, das Essigsäure enthielt, zur Ausfällung des Pentapeptids gegossen. .

F. 21O⁰C (Zers.); /~a_7_D = -35,3° (C + 1 in DMF); Rf-Wert in Bz-EtOH (8:2) = 0,24.

D) Synthese von
1) Synthese von H-

Es wurden 2,09 g Z-GIy-OH (10 mMol) zum Sulfitester von Hexadecylalkohol, der aus 4,8 ml Alkohol erhalten worden war, und auf -10⁰C gekühlt war sowie 2,4 ml reinem Thionylchlorid zugefügt. Das Gemisch wurde 4 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen, wonach ein Chromatogramm zeigte, daß der größte Teil der Säure umgesetzt war. Das Thionylchlorid wurde abgedampft, wonach das Gemisch auf Eis gegossen wurde. Das erhaltene Öl wurde in Äthylacetat aufgenommen. Nach der Extraktion der Lösung mit 5%iS^er Bicarbonatlösung und Wasser wurde die Lösung über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wurde abgedampft. Der erhaltene ölige Rückstand, der immer noch C ,.,--Alkohol enthielt, aber kein Carbobenζoxyglycin, wurde chromatographisch gereinigt. Der isolierte Ester (6,4 g) konnte nicht in kristalliner Form erhalten werden«,

Die Hydrierung des geschützten Esters in Wasser, das Salzsäure enthielt, ergab den Glycinester als HCl-SaIz. Nach dem Gefriertrocknen und Kristallisieren aus einem Gemisch

00988 kl 22 5 0 . -17-.

aus Wasser und Methanol wurde Glycinester-HCl erhalten. i¹. 235 bis 240⁰G; Rf-Wert in Am-Py-Wa (5:3:2) = 0,50.

2) Es wurden 2 mMol T(T)-His-D-Phe-Arg-Trp-N₂H₅.HC1 in der genannten Weise in das Azid überführt und mit 0,67 g (2mMol) H-GIy-OC₁₆H₃₅-HCl gelöst in 20 ml Dimethylformamid und

0,84 ml Triethylamin nach dem Kühlen auf -20⁰C kondensiert.

Das Reaktionsgemisch wurde 96 h bei 0⁰C stehengelassen, wonach es in Wasser gegossen wurde, das Essigsäure enthielt (500 ml), um das Pentapeptid auszufällen. Zwei Tage später wurde das Pentapeptid als amorpher Stoff isoliert.

Rf-Wert in Am-Py-Wa (5:3:2) = 0,71; /""a_7_D = -32° (c = 1/2 in

E) Abspaltung der Tritylgruppen aus den Tetra- und Pentapeptiden gemäß den Beispielen B2, 02 und D2.

Die beiden Tritylgruppen wurden abgespalten durch Lösen oder Suspendieren der genannten geschützten Peptide in Essigsäure in einer Menge von 1 mMol Substanz in 5 ml Säure und Erhitzen auf einem Dampfbad über 10 min. Die Lösung oder Suspension wurde gekühlt und in 100 ml Äther gegossen, wonach der gebildete Niederschlag in Wasser gelöst und mit einem Ionenaustauscher Amberlite, IRA 410", gerührt wurde, um etwa vorhandene Säure zu entfernen. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet. Aus dem Hexadecylesterpeptid wurde das HCl-SaIz hergestellt.

Die Aminosäureanalyse gemäß Stein und Mohr ergab folgende Werte:

Peptid Rf-Wert (1*) /~oc 7 (C) His Phe Arg GIy

~ ~D

H-His-Phe-Arg-

Trp-OH 0,25 -16 In-HCl (1)1,00 0,95 1»°3 —

H-His-D-Phe-Arg-

Trp-Gly-OH 0,22 -15 In-HCl (1)0*95.1,01 1,02 1,00 H-His-D-Phe-Arg-

Trp-Gly-OR (2*) 0,33 -1ß,7 In-HCl 0,95 1,01 0,99 1,00

009884/225

h/2) ^T - 18 -

fr

(1*) Bu-Py-Ac-Wa (4:O,75:O,.25:1)

(2*) R = C₁₆H₃₃ . .

F) Synthese von His-D-Phe-(Boc)-Lys-Trp-OMe

1) Synthese von Z-(Boc)-Lys-Trp-OMe

Es wurden 11,6 g (46 mMol) H-Trp-OMe.HCl in 150 ml Methylenchlorid suspendiert. Die Suspension wurde auf O⁰C abgekühlt, wonach Ammoniakgas durch die Suspension 1/2 h eingeperlt vnirde. Nach dem Filtrieren über eine Filtrierhilfe wurde das Filtrat zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft (Badtemperatur 40⁰C) und der Rückstand wurde in 150 ml Methylenchlorid aufgenommen, in welchem 17,6 g Z-(Boc)-Lys-OH gelöst worden waren. Das Gemisch wurde auf O⁰C gekühlt, wonach 9*5 S Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 65 h bei 0 C gerührt. Danach wurden 150 ml Äthylacetat zugesetzt und das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat mit 0,1n Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und wieder mit Wasser gexvaschen. Die organische Schicht wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde aus siedendem Benzol umkristallisiert. F. 114 bis 122⁰C; /~a_7_D = -30° (c = 1 in Methanol); Rf-Wert in Bz-EtOH (8:2)·= 0,83.

Durch Hydrieren mit Palladium auf Kohle (10.%) in Methanol in Gegenwart von 1 Äquivalent Salzsäure wurde der Dipeptidester als Hydrochlorid erhalten. Rf-Wert in Am-Py-Wa (5=3:2) = 0,71.

2) Synthese von Z-His-D-Phe-(Boc)-Lys-Trp-OMe

Aus 10 mMol Z-His-D-Phe-^fr, wurde nach dem vorgenannten Verfahren das Azid hergestellt. Das erhaltene Produkt wurde zu einer Lösung von 8,3 mMol H-(Boc)-Lys-Trp-OMe.HCl in 20 ml DMF und 4 ml Triethylamin zugefügt. «Das Gemisch wurde

. -19-

009884/2250

70 h bei O⁰C stehengelassen. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der erhaltene ölige Rückstand wurde in wäßrigem Ä'thylacetat aufgenommen. Die erhaltene Substanz wurde mit 5%iger Zitronensäure, Wasser, 5%iger ITatriumbicarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt und das lösungsmittel wurde abgedampft (Badtemperatur 40⁰C), wonach der erhaltene Rückstand aus Äthylacetat/ Petroläther gleich 4-0/60 kristallisiert wurde. F. 185 bis 190⁰C; /~α_7^ -14° (c = 1 in Methanol); Rf-Wert in Bz-EtOH (9:1) = 0,70. .

3) Durch Hydrieren in Gegenwart von Palladium auf Kohle und 1 Äquivalent Salzsäure in Methanol wurde das Hydrochloridsalz des Tetrapeptidesters erhalten.

Rf-Wert in Bu-Ac-Wa (4:1:1) = 0,42.

Beispiel 1

H-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH und HCl-SaIz

A) Synthese von Boc-Met-Glu-(OtBu)-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-0H

Es wurden 1,97 g (4 mMol) Boc-Met-Glu-(OtBu)-N₅H₅ (Al) in 10 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde auf O⁰C gekühlt und dann mit 8 mÄqu frisch bereiteter Lösung von- HCl in Tetrahydrofuran versetzt. Die erhaltene Lösung wurde weiter auf -20⁰C gekühlt, wonach zur Herstellung des Azids 0,6 ml (4,4 mMol) Isoamylnitrit zugefügt wurden. Die Lösung wurde

5 min gerührt und zu einer Lösung von 2,8 g His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (E) in 15 ml DMF zugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde erneut auf -20⁰C gekühlt, wonach 1,68 ml Triäthylamin zugefügt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 96 h stehengelassen, in Wasser gegossen, das Essigsäure enthielt (pH-Wert

6 bis 7) und der erhaltene Niederschlag wurde mit Dimethylformamid/Wasser gleich 1/10 gewaschen und isoliert.

F. 21O⁰C (Zersetzung); Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) = 0,72. (Schwefelpositiv, Pauly positiv, Ehrlich positiv).

" - 20 ■

00 988 4/22 50

- 20 - -

B) Abspaltung der Schutzgruppen

Das erhaltene Heptapeptid wurde in 90%iger Trifluoressigsäure in Wasser (100 mg je 2 ml) gelöst. Die rosalösung wurde 1/2 h stehengelassen und anschließend unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft (Badtemperatur 2O°C). Der Rückstand wurde über Nacht über festem Kaliumhydroxid getrocknet. Der erhaltene schaumige Rückstand wurde in Wasser/ tert.-Butanol gleich 1/1 gelöst und absatzweise mit einem Ionenaustauscher (Dowex) behandelt, wonach die Trifluoressigsäure gegen Essigsäure ausgetauscht wurde. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete erhaltene Peptid enthielt etwa 2 Mol Essigsäure. Rf-Wert: Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) =0,24. Äminosäureanalyse: His 0,90; Arg 1,02; GIu 1,06; GIy 1,08; Met 0,9; Phe 1,04.

Zu einer wäßrigen Suspension des erhaltenen Peptids wurden 2 Äqu Salzsäure zugefügt. Danach wurde das Gemisch gefriergetrocknet und das Hydrochloridsalz wurde isoliert. Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) = 0,24.

Beispiel 2

In gleicher Weise gemäß Beispiel 1 wurden die folgenden Peptidverbindungen erhalten: «

1) H-D-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH.HCl aus Boc-D-Met-Glu-(OtBu)-N₂H₅ (A2) und H-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (E). Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) =0,26.

2) H-D-Ser-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH aus Boc-D-Ser-Met-GIu-(OtBu)-N₂H₃ (A7) und H-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (E). Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) =0,22.

■ ·

009884/2250

• - 21 - .

3) H-Gly-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH aus Boc-Gly-Met-(OtBu)-N₂H₅ (A8) und H-His-D-Phe-Arg-Trp-GIy-OH (E). Ef-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,74:0,25:1) = 0,23.

Beispiel 3

1) Synthese von H-Ser-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OH und dem entsprechenden

Ausgehend von Boc-Ser-Met-Glu-(OtBu)-N₂H^ (A6) wurde das · Octapeptid in der beschriebenen Weise hergestellt. Die zur Kupplung der Ausgangsprodukte erforderliche Reaktionszeit wurde auf 1 Woche gemäß den Ergebnissen der chromatographischen Prüfung ausgedehnt. Das geschützte Octapeptid wurde dadurch erhalten, daß das Reaktionsgemisch in Essigsäure enthaltendes Wasser (pH-Wert 6 bis 7) gegossen wurde und der erhaltene Niederschlag mit Dimethylformamid/Wasser gleich 1/9 gewaschen wurde. Danach wurde das Peptid durch Waschen mit Methanol/Wasser gleich 9/1 gereinigt. F. des Peptide 215°C (Zers.); /~oc_7_D = -62,8° in DMi¹, Amino säure analyse: Ser 0,94; GIu 0,94; His 1,01; Arg 1,02; Phe 1,05; GIy 1,00.

Durch Abspalten der Schutzgruppe in der beschriebenen Weise wurde das freie Octapeptid erhalten, das weiter durch Aminosäureanalyse identifiziert wurde. ' Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) =0,26.

Durch Kondensation von Boc-Ser-Met-Glu-(OtBu)-azid (A6) mit H-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-hexadecylester (E) wurde das geschützte Octapeptidderivat erhalten. Durch Abspalten der Schutzgruppen mit 90%iger Trifluoressigsäure wurde H-Ser-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OC₁₆H₃₅ erhalten, das in das Acetat in der oben beschriebenen Weise überführt wurde.

- 22 009884/2250

Aminosäureanalyse: Ser 0,94; Met 0,90; GIy 0,98; His 1,02; Arg 0,97; GIy 1,00."Hf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) = 0,32.

Im Infrarot-Spektrum zeigte diese Substanz eine charakteristische Bande bei 1736 cm - -

In gleicher Weise wurden

2) H-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-OC₁₆H₃₃ und

3) H-D-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-TrP-GIy-OG^₆H₅₅ durch Kondensieren von Boc-Met-Glu-(OtBu)-N₂H₅ (A1) bzw. Boc-D-Met-

GIu-(OtBu)-N₂H₅ (A2) mit H-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-0C₁₆H₅₅(E) und Abspalten der Schutzgruppen in 90%iger Trifluoressigsäure erhalten.
Eigenschaften: Heptapeptidester (2): Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa

(4:0,75:0,25:1) = 0,36; D-Met-heptapeptidester (3): Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75=0,25:1) = 0,38·. Die Stein-Mohr-Analysen von beiden Substanzen waren nahezu identisch.

Beispiel 4

1) Synthese von H-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-OH

Es wurden 4 mMol Boc-Met-Glu-(OtBu)-N₂H₅ (Al) in gleicher Weise wie gemäß Beispiel 1A in das Azid überführt. Das erhaltene Produkt wurde zu einer Lösung von 2,57 g H-His-D-Phe-Arg-Trp-OH (E) in 15 ml DMF und 1,68 ml Triethylamin gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 96 h bei O⁰C stehengelassen, wonach ■ die rosa gefärbte Lösung in wäßrige Essigsäure (pH-Wert 5) gegossen wurde. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. .

Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) =0,65·

- 23 -

009884/2250

Das erhaltene geschützte Hexapeptid wurde mit Trifluoressigsäure in der genannten Weise behandelt, wonach das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trpckene eingedampft · wurde. Nach dem Behandeln der Peptid-trifluoracetatverbindung mit einem Ionenaustauscher Dowex in tert.-Butanol/Wasser = 1/1, wobei die Trifluoressigsauregruppen gegen Acetatgruppen ausgetauscht wurden, wie dies in Beispiel 1B beschrieben ist, wurde die erhaltene Lösung gefriergetrocknet und weiter getrocknet.
Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) = 0,24.

In der gleichen Weise wurden die folgenden Peptide hergestellt:

Rf-Wert * ) Ausgangsprodukte

2) H-D-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-OH**) 0,21 A2 und E

3) H-Ser-Met-Glu-His-rD-Phe-Arg-Trp-OH 0,19 A6 und E

4) H-D-Ser-Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-0H**)0,20 A? und E

5) H-Gly-Met-^lu-His-D-Phe-Arg-Trp-OH 0,23 A8 und E

■*) Rf-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) **). Die Reaktion mit Leucin-aminopeptidase zeigte keinen Abbau (Hydrolyse) des Produkts. «

Beispiel 5

1) Synthese von H-

Es wurden 4,4 mMol des gemäß Beispiel 4 erhaltenen Azids zu einer Lösung von 2,92 g H-His-D-Phe-(Boc)-Lys-Trp-OMe.HGl (F) in 12 ml DMF und 1,68 ml Triäthylamin gegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch 65 h stehengelassen worden war, wurde es zu einem Sirup eingedampft und der Sirup wurde¹'in Äthylacetat/ \

0 0 988 I* /22 5 0

Wasser gleich 9/1 gelöst. Die Lösung wurde mit 5%iger Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen. Danach wurde die organische Schicht unter vermindertem Druck eingedampft. Der geschützte Hexapeptidester wurde weiter getrocknet.
F. 137 bis 141⁰C; Ef-Wert in Bz-EtOH (8:2) = 0,75.

Der erhaltene Hexapeptidester wurde mit Trifluoressigsäure behandelt und anschließend wurden die Trifluoressigsäuregruppen gegen Essigsäuregruppen in der genannten Weise ausgetauscht.
Ef-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) = 0,42.

In der beschriebenen Weise wurden die folgenden Peptid-Methylester hergestellt: .

Ef-Wert ·.	) Ausgangs produkte
0,40	A7 und F
0,39 ·	A6 und I¹
0,42	A2 und F
0,45	A8 und F

2) H-D-Ser-Met-Glu-His-D-Phe-Lys-Trp-OMe

3) H-Ser-Met-Glu-His-D-Phe-Lys-Trp-OMe

4) H-D-Met-Glu-His-D-Phe-Lys-Trp-OMe

5) H-Gly-Met-Glu-His-D-Phe-Lys-Trp-OMe

*) Ef-Wert in Bu-Py-Ac-Wa (4:0,75:0,25:1) . Beispiel 6 «

Es wurde eine Lösung des Heptapeptids gemäß Beispiel 1 (10 mg/ ml) und Zinkchlorid entsprechend 8,33 mg Zink/ml sowie Dinatriumhydrogenphosphat'2H20 in einer Menge von 3,5 mg/ml mit 1n Salzsäure auf einen pH-Wert 2 eingestellt. 1-5 ml dieser Lösung und 0,5m Natriumhydroxidlösung (zur Einstellung eines pH-Wertes 8 in der erhaltenen Suspension) wurden gleichzeitig unter Eühren zu 25 ml eines Gemisches der folgenden Zusammensetzung zugefügt:

- 25 -

009884/2250

Benzylalkohol - -20 mg/ml NaCl 4'mg/ml

Um einen pH-Wert 8,0 hierbei aufrechtzuerhalten, waren 8,2 ml 0,5m Natriumhydroxid erforderlich. Das Volumen der Suspension wurde mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Die Zusammensetzung der Suspension am Ende war die folgende:

Benzylalkohol 10 mg/ml

NaCl 6,8 mg/ml

Heptapeptid ■ 3 mg/ml ·

Zink . 2,5 mg/ml

0,56 mg/ml

Beispiel ; 7

Es wurde eine Lösung des freien Octapeptids von Beispiel 3 in einer Menge von 10 mg/ml, Zink 8,33 mg/ml und Dinatriumhydrogenphosphat^HoO 3,5 mg/ml mit 1 η Salzsäure auf einen pH-Wert 2 gebracht. Zink wurde als Zinkchlorid eingesetzt.

* ■

Es wurden 45 ml dieser Lösung und 0,5m Natriumhydroxidlösung gleichzeitig unter Rühren zu 75 ml des Gemisches zugesetzt (vgl. Beispiel 6). Zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes 8,0 während dieses Verfahrens waren 25,2 ml 0,5m Natriumhydroxidlösung erforderlich. Das. Volumen der Suspension wurde mit destilliertem Wasser auf 150 ml gebracht. Die Zusammensetzung der schließlich erhaltenen Suspension war die folgende:

Benzylalkohol 10 mg/ml

NaCl 6,9 mg/ml

Octapeptid 3 mg/ml

Zink 2,5 mg/ml

0,56 mg/ml

. - 26 -

009884/2250

1A-38. 227

2Q337Q3

- 26 -

Beispiel

Es wurde eine Suspension gemäß Beispiel 7 hergestellt, jedoch anstelle von 10 mg des Octapeptids 6,67 mg/ml Octapeptid verwendet. Es wurden 30 ml der Lösung des Octapeptids, Zink und Dinatriumhydrogenphosphat sowie 0,5m Natriumhydroxidlösung gleichzeitig zu 50 ml des Gemisches aus Benzylalkohol und Natriumchlorid gegeben. Das Volumen der Suspension wurde mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt; um einen pH-Wert der Suspension von 8 aufrechtzuerhalten, waren 16 ml 0,5m Natriumhydroxidlösung erforderlich. Die Zusammensetzung der schließlich erhaltenen Suspension war die folgende:

Benzylalkohol

Octapeptid

10 mg/ml

6,7 mg/ml

2 mg/ml

2,5 mg/ml

0,56 mg/ml

Beispiel 9

Es wurde eine Lösung von Octapeptid-C.r-H^-ester von Beispiel 3 mit 1n Salzsäure auf einen pH-Wert 2 eingestellt. Zink wurde als Zinkchlorid zugesetzt. Unter Rühren .wurden 30 ml dieser Lösung und 0,5m Natriumhydroxidlösung gleichzeitig, zu 50 ml des' Gemisches aus Benzylalkohol und Natriumchlorid zugesetzt. Zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes 8,0 hierbei wurden 16,6 ml der Natriumhydroxidlösung zugefügt. Die Zusammensetzung der schließlich erhaltenen Lösung war die folgende:

Benzylalkohol
NaCl

Octapeptidester
(Beispiel 3)

Zink
PO,.

10 mg/ml
6,9 mg/ml

3 mg/ml

2,5 mg/ml

0,56 mg/ml

009884/2250

20337Ό3

- 27 - Beispiel 10 '· * ■

In der gleichen Weise wie gemäß Beispiel 6 wurde der Zinkkomplex der folgenden Peptide hergestellt:

a) Hexapeptid: Met-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-OH (Beispiel 4, 1),

b) Hexapeptid: D-Het-Glu-His-D-PherArg-Trp-OH (Beispiel 4,2),

PATENTANSPRÜCHE :

78/61XXlV ' .

- 28 -

0 09884/22 SO

Claims

PATENT. ANSP EUGH E.

Peptidverbindungen der allgemeinen Formel:

X-Met-L-Glu- (oder L-Gln)-L-His-D-Phe-L-Arg-(oder L-Lys)-L-Trp-X ., .

in der X ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe H-Ser- oder H~Gly- und Y eine Hydroxylgruppe oder die Gruppe -GIy-OH. bedeutet, wobei Met und Ser in der L-Form oder der D-Form auftreten, sowie deren Salze, Derivate und Komplexe«,
2) Peptidverbindungen nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel:

X-Met-L-Glu-(oder L-Gln)-L-His-D-Phe-L-Arg~L-Trp-OH ,

in der X die genannte Bedeutung hat und Met und Ser in einer der Formen L oder D auftreten, und deren Salze, Derivate und Komplexe_%
3) Peptidverbindungen nach Anspruch 1 der allgemeinen ' Formel: -

X-Met-L-Glu(oder L-GIn)-L-His-D-Phe-L-Lys-L-Trp-OH ;

in der X die genannte Bedeutung hat und Met und Ser in einer der Formen L oder D auftreten, und deren Salze, Derivate und Komplexe.
4) Peptidverbindungen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß sie als Komplex aus einem Peptid der genannten allgemeinen Formeln mit einer organischen polymeren Substanz oder einem 'schwer löslichen Metallsalz, Metallhydroxid oder Metalloxid vorliegen. - 29 -

00988 4/2250
5) Peptidverbindungen nach Anspruch 4-, dadurch g e -

k e η η ζ ei ohne t , daß die schwer lösliche Metallverbindung ein schwer lösliches Salz, Hydroxid oder Qxid von Zink ist,
6) Peptidverbindungen nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet , daß die organische polymere Substanz Gelatine, Carboxymethylcellulose, ein Dextran, ein Polyphenol, ein Polyalkohol oder eine Polyaminosäure ist. ■ .
7) Verfahren zur Herstellung der Peptidverbindungen nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennz eichnet, daß man in an sich bekannter Weise

a) eine entsprechende Aminosäure oder ein entsprechendes Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter endständiger Carboxylgruppe mit einer entsprechenden Aminosäure oder einem entsprechenden Peptid mit freier a-Aminogruppe, oder

b) eine entsprechende Aminosäure oder ein entsprechendes Peptid mit'einer aktivierten a-Aminogruppe und einer geschützten Carboxylgruppe mit einer entsprechenden Aminosäure oder einem entsprechenden Peptid mit freier endständiger Carboxylgruppe und geschützter*a-Aminogruppe, oder

c) eine entsprechende Aminosäure oder ein entsprechendes Peptid mit einer freien Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe mit einer entsprechenden Aminosäure oder einem entsprechenden Peptid mit freier a-Aminogruppe und einer geschützten Carboxylgruppe,

kondensiert und das erhaltene Peptid in bekannter Weise in · ein Salz, Derivat oder einen Komplex überführt.

- 30 009884/2250

. - 30 -
8) Verfahren nach Anspruch 7 τ 'dadurch gekennzeichnet , daß man das Peptid, ein Salz oder Derivat davon mit einer organischen polymeren Substanz oder einer schwer löslichen Metallverbindung in den entsprechenden Komplex überführt.
9) Verfahren nach Anspruch 7,-dadurch gekennzeichnet , daß man als Metallverbindung ein.schwer lösliches Salz, Hydroxid oder Oxid von Zink verwendet.

78/6TXXIV