DE2311786A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von peptiden

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Description

  • Verfahren zur Herstellung von Peptiden Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung verschiedener Peptide. Es ist bekannt, Peptide nerzuste]]en, indem man Aminosäuren oder Peptide, deren N-endständige Amino- oder Iminogruppe geschützt worden ist, mit einer N-Hydroximidverbindung in Gegenwart einer Carbodiimidverbindung zu N-Hydroximidestern von Aminosäuren oder Peptiden, deren N-endständige Gruppe geschützt ist, umsetzt und die hierbei gebildeten N-Hydroximidester mit Aminosäuren, Peptiden oder deren Derivaten umsetzt, deren N-endständige Aminogruppe oder Iminogruppe ( die "Amino- oder Iminogruppe'§ wird nachstehend der Einfachheit ha3ber aus "aminogruppe" bezeichnet) frei ist, und wahlweise das Produkt, d.h. das geschützte Peptid, in die freie Form überführt.
  • Bei den Peptidchemikern gelten N-Hydroxyphthaiirnid und N-Hydroxysuccinimid als bevorzugte N-Hydroxyimidverbindunger, die für die Peptidbidung verwendet werden.
  • Nefkens und Mitarbeiter berichteten über die Peptidsynthese unter Verwendung von N-Hydroxyphthalimid. N-Hydroxyphtha -imid hat jedoch den großen Nachteil, daß es die Racemisierung in der Poptidbildungsrcaktion bewirkt. N-llydroxysuccinimid hat den Nachteil, daß es in Lösungsmitteln schwer Zös-Stich und hierdurch seine Verwendung und sein Wert begrenzt ist.
  • Später berichteten F. Weygand und Mitarbeiter über ein Vefahren, bei dem N-Hydroxysuceinimid verwendet wird (Z.
  • Naturf., 216, (1966), S. 426-428). Es ist bemerkenswert, daß bei diesem Verfahren die Neigung zur Racemisierung vermindert werden kann und die Bildung von N-Acylharnstoff als Nebenprodukt vermieden wird. Durch dieses Merknial von N-Hydroxysuccinimid ist das unter seiner Verwendung durch ge£uhrte Verfahren zum wichtigsten aller bekannten Verfahren zur Peptidsynthese geworden.
  • Xürzlicb wurde jedoch darauf hingewiesen, daß-die Verwendung von N-Hydroxysuccinimid zu der ungünstigen Bildung von Succinimidoxycarbonyl-ß-alanin-N-hydroxysucoinimidester als Nebenprodukt führt, der die gewünschte Peptidbildungsreaktion stört (Tetrahedron Letters Vol. 24, s. 6935 - 6939).
  • In dem Bemühen, die Nachteile der bekannten Verfahren auszuschalten, gelang der Anmelderin die Synthetisierung der neuen N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester von Aminosäuren und Peptiden, deren N-endständige Aminogruppe geschützt worden ist, wobei gefunden wurde, daß die hierbei gebildeten N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester sehr reaktionsfreudig mit Aminosäuren oder Peptiden sind, deren N-endständige Aminogruppe frei ist Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß gleichzeitig alle genannten Nachteile der bisher bekannten Verfahren ausgeschaltet werden.
  • Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von Peptiden nach einem verbesserten Verfahren, bei dem im wesentlichen keine Racemisierung stattfindet, und das die Herstellung von Peptiden ermöglicht, ohne daß die Bildung des unerwünschten Nebenprodukts vom ß-Alanintyp ausgelöst und begünstigt wird.
  • Das verbesserte Verfahren gemäB der Erfindung wird durchgeführt, indem man Aminosäuren oder Peptide, deren N-endständige Gruppe geschützt worden ist, mit N-Ifydroxy-5-norbornen-2;3-dicaIboximid in Gegenwart eines Carbodiimidreagenz zu N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidestern von Aminosauren oder Peptiden, deren N-endständige Gruppe geschützt ist, umsetzt und die so gebildeten N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester mit Aminosäuren oder Peptiden oder deren Derivaten umsetzt, deren N-endständige Gruppe frei ist, und wahlweise das geschützte Peptid in die freie Form überführt.
  • Die vorstehend als Aminosäuren mit geschützter N-endständiger Aminogruppe bezeichneten Aminosäuren können belieb5-ge Aminosäuren sein, die bei üblichen Verfahren verwendet werden. Mit anderen Worten, geeignet sind alle Verbindungen, die wenigstens eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe im Molekül enthalten. Wenn die Aminosäuren asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten, können auch alle optischen Isomeren verwendet werden. Ferner können diese Aminosäuren basisch, neutral oder sauer sein. Außerdem können nicht nur a-Aminosäuren, sondern auch ß- und y-Aminosäuren verwendet werden. Geeignet sind ferner Aminosäuren, die nur auf synthetischem oder halbsynthetischem Wege herstellbar sind, z.B. D-Phenylglycin, α-Methylalanin, ß-Chloralanin, CyclohexyAaZanin und D-cyclohexylglycin.
  • A]s Peptide, die vorstehend als Peptide mit geschützter N-endständiger Aminogruppe bezeichnet wurden, eignen sich alle Peptide, die bisher bei üblichen Verfahren verwendet wurden. Es können somit zweckmäßig alle Verbindungen verwendet werden, die gebildet werden, wenn die vorstehend genannten Aminosäuren eine oder mehrere Peptidbindungen zwischen den gleichen oder verschiedenen Aminosäuren bi3-den.
  • Wenn diese Aminosäuren oder Peptide zum Schutz wenigstens ihrer N-endständigen Aminogruppe nach einem der üblichen Verfahren behandelt werden, werden die vorstehend genannten Aminosäuren oder Peptide mit geschützter N-endständiger Aminogruppe erhalten. Diese Verfahren sind ausgereift und können erfolgreich im Rahmen der Erfindung angewandt werden.
  • Als Beispiele von Schutzgruppen für die N-endständige Aminogruppe sind die Carbobenzoxygruppe, tert. - Butyloxycarbonylgruppe, tert. -Amyloxycarbonylgruppe, p-Methoxybenzyloxycarbonyl gruppe, o-Nitropheny3sulfeny7gruppe und die Isobornyl.oxycarbonyl gruppe zu nennen.
  • Die N-endständige Aminogruppe kann durch intramolekulare Acylierung mit der Carboxy3gruppe im Molekül geschützt werden. Es ist daher zu bemerken, daß die N-endständige Aminogruppe von Pyrogl utaminsäure nicht durch Verwendung eines Schutzmittels, sondern durch die intramolekulare Acylierung geschützt wird.
  • Die Reaktion zwischen Aminosäuren oder Peptiden, deren N-endständige Aminogruppe geschützt worden ist, und N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-carboximid in Gegenwart eines Carbodiimidreagenz kann nach dem bekannten Verfahren unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid durchgeführt werden. Als Carbodiimidverbindungen kommen die Verbindungen infrage, die routinemäßig vom Peptidchemiker verwendet werden, z.B.
  • Dicyc30hexy3carbodiimid, Diisopropylcarbodiimid und wasserlösliche Carboiimide, z.B. N-Cyclohexyl-N-[ß-(N-methylmorpholinium)-äthyl]-carbodiimid-p-toluolsulfonat. Hierbei beträgt das Molverhältnis von N-Hydroxy-5-norbornen-2,)-dicarboximid zur Aminosäure oder zum Peptid mit geschütztei N-endständiger Aminogruppe gewöhnlich etwa ]:] bis 2:J-, vorzugsweise etwa ]:] bis 1,4:1. Der Anteil der Carbodiimid verbindung beträgt gewöhnlich etwa :; bis 2 Mol pro Mol Aminosäure oder Peptid mit geschützter N-endständiger Aminogruppe. Die zur Bildung solcher Ester rührende Reaktion wird gewöhnlich be etwa -20° bis 4o0c, vorzugsweise bei 1.00 bis 300C durchgeführt. Al 5 Reaktionslösungsmittol eignen sich für diese Reaktion beispielsweise Tetrahydrofuran, Äthylacetat, Dioxan, AcetonitriZ, Chloroform, Dichlormethan, Dichloräthan und Dimethylformamid sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Die Reaktion ist im allgemeinen in 1 bis 6 Stunden vollendet. Nach beendeter Reaktion kann der N-Hydroxy-5-norbonen-2,3-dicarboximidester der Aminosäure oder des Peptids mit geschützter N-endständiger Aminogruppe in üblicher Weise, z.B. durch Konzentrierung, Phasenübergang, Kristallisation und Umkristal)isation, isoliert werden. Das Reaktionsgemisch kann jedoch auch unter Umgehung der Stufe der Isolierung des Esters unmittelbar in die nächste Poptidbildungsrcaktion eingesetzt werden.
  • Die Reaktion zwischen N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester von Aminosäuren oder Peptiden, deren N-endständige Aminogruppe geschützt ist, und Aminosäuren oder Peptiden oder deren Derivaten, deren N-endständige Aminogruppe frei ist, kann nach dem bekannten Verfahren unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid als N-Hydroximidverbindung durchgeführt werden.
  • Als Aminosäuren oderPeptide, deren N-endständige AminogruppG frei ist, und die mit den vorstehend genannten N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidestern von Aminosäuren oder Peptiden mit geschützter N-endständiger Aminogruppe umzusetzen sind, kommen die vorstehend beschriebenen Aminosäuren oder Peptide infrage. Als Derivate von Aminosäuren oder Peptiden mit freier N-endständiger Aminogruppe eignen sich alle Verbindungen, die durch Einführung von Substituenten, die die Reaktion nicht hemmen, in Aminosäuren oder Peptide hergestellt werden können. Bevorzugt werden beispielsweise die entsprechenden Salze und Amide.
  • Die Erfindung hat unter anderem den Vorteil, daß die Salze, die in wässrigen Lösungsmitteln allein selektiv löslich sind, z.B. die Salze der Aminosäuren oder Peptide mit anorganischen oder organischen Basen, beispielsweise die Salze von Natrium, Kalzium Magnesium, Calcium, Triäthyl.-amin, Tributylamin, N-Methylmorpholin, N-Athyl.morphol in> Trimethylamin, N-Methyl piperazin und Dicyclohexylamin, verwendet werden können Als Amide können die durch Kondensation der Carboxylgruppe von Aminosäuren oder Peptiden mit Ammoniak herstellbaren Amide sowie die entsprechenden primären oder sekundären Amide verwendet werden.
  • Alle dem Reaktionssystem zugesetzten Aminosäuren und Peptidverbindungen, d.h. Aminosäuren oder Peptide mit geschützter N-endständiger Aminogruppe sowie Aminosäuren, Peptide oder ihre Derivate, deren N-endständige Aminogruppe frei ist, können zusätzlich zur N-endständigen Aminogruppe und zur C-endständigen CarboxyJgruppe funktionelle Gruppen in ihren Seitenketten enthalten, z.B. die -Aminogruppe in Lysin, die-Guanidingruppe in Arginin, die y-Carboxylgruppe in Glutaminsäure, CarboxyJgruppen, Thiolgruppen und Hydroxylgruppen, und einige oder alle dieser funktionellen Gruppen sind zweckmäßig geschützt. Die mit den vorstehend genannten N-geschützten Aminosäuren oder Peptiden umzusetzende C-endständige Carboxylgruppe der Aminosäuren oder Peptide mit freier N-endständiger Aminogruppe kann geschützt sein. Bezüglich der Schutzgruppen wurde bereits weitgehend Klarheit für jede zu schützende funktionelle Gruppe ge-.
  • schaffen, und die bisher gemachten Feststellungen können im Rahmen der Erfindung ausgenutzt werden. Einige typische Schutzgruppen für die N-endständige Aminogruppe wurden bereits vorstehend erwähnt. Als geeignete Schutzgruppen für andere-Aminogruppen werden gewöhnlich Substituentengruppen wie Carbobenzoxygruppen, tert. - Amyloxycarbonylgruppen, tert. - Butyloxynarhonylgruppen, Taobornyloxyarbonylgruppen o-Nitropheny3sulfinyIruppen, p-Nitrocarbobenzoxygruppen, p-Chlorcarbobenzoxygruppen, p-Mothoxycarhbobenzoxygruppen, Formyl gruppen und Diphenylmethyloxycarbonylgruppen verwendet.
  • Als Schutzgruppen für Carboxylgruppen können natürlich die gebräuchlichen esterbildenden Gruppen wie Methylreste, Äthylreste, Butylreste, tert.-Butylreste, Benzylreste, p-Methoxybenzylreste, tert. - Amylreste, Phenylreste und p-Nitrobenzylreste verwendet werden. Außer den vorstehend genannten Gruppen können auch gewisse polymere Harze, z.B. Polyhydroxymethylstyrol, als Schutzgruppen verwendet werden.
  • Als Schutagruppen für Thiol eignon sich thloätherbildende Gruppen wie Benzylreste und p-Methoxybenzylreste sowie thiocarbonylbildonde Gruppen, z.B. Benzoylgruppen, tort. -Butyloxycarbonyl gruppen und Carbobenzoxygruppen. Al s Schutzgruppen für Hydroxylgruppen werden gewöhnlich die Benzyl- und tert.-Butyläther verwendet, jedoch sind in gewissen Fällen auch O-Acylreste, z.B. acetylreste und benzoylreste, geeignet, Ale Schutzgruppen für die #-Guanidingruppe von Arginin eignen sich nicht nur die Carbobenzoxygruppe und Isobornyloxycarbonylgruppe, sondern auch die Nitrogruppe und Tosylgruppe.
  • Im allgemeinen genügt die Verwendung von etwa 1 Mol einer Aminosäure oder eines Peptids oder eines reaktionsfähigen Derivats mit freier N-endständiger Aminogruppe pro Mol des N-Hydroxy-5-morbornen-2,3-dicarboximidesters einer Aminosäure oder eines Peptids mit geschützter N-endständiger Aminogruppe, jedoch kann das Verhältnis nach Belieben erhöht oder erniedrigt werden.
  • Die Reaktion kann im allgemeinen in einem geeigneten Lösungsmittel, das in der Peptidchemie gebräuchlich ist, durchgeführt werden. Coeignet sind beispiclsweisc Wasser, Äther, Äthyl acetat, Acetone, Dioxan, Tetrahydrofuran, Chloroform, Dicghlormethn, Dichloräthan, Tetrachlorkchlenstoff, Dimethylacetamid, Dimethy] formamid, Pyridin, dimethylsulfoxyd, Phosphorsaure- Tris(Diäthyl)amid, Acetonitril, N-Methyl -, pyrrolidon sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von etwa -20obis 500C und zur Erzielung besserer Ergebnisse zwischen etwa -50 und 300C. Die Reaktionszeit liegt im allgemeinen im Bereich von 30 Minuten bis zwei Tage.
  • Wenn das gebildete Peptid in Wasser schwer löslich ist, ist es nach beendeter Reaktion natürJich vorteilhaft, das Produkt durch Verdünnung des Reaktionsgemisches mit Wasser oder durch Zusatz von verdünntem wässrigen Ammoniak, einer verdünnten wässrigen Natriumhydrogencarbonatl ösung oder einer wässrigen Kaltumbicarbonatlösung auszufällen. Wenn das gebildete Peptid in organischen Lösungsmitteln schwer löslich ist, kann das geschützte Peptid durch Zusatz eines Lösungsmittels, z.B. Äthylacetat, Alkoho3, Aceton und Chloroform, ausgefällt werden. Das Produkt kann jedoch auch ohne Isolierung in die nächste Reaktion eingesetzt werden. Das N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid kann aus der Lösung wiedergewonnen werden.
  • Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung können in einen einzelnen Reaktor alle Materialien, d.h. eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter N-endständiger Aminogruppe, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-carboximid, ein Carbodiimidreagenz und eine Aminosäure oder ein Peptid oder deren Derivat mit freier N-endständiger Aminogruppe CE'-geben werden. In diesem Fall reagiert zunächst die Aminosäure oder das Peptid mit geschützter N-endständiger Aminogruppe mit dem N-Hydroxy-5-morbornen-2,3-dioarboximid mit Hilfe des Carbodiimidreagenz, worauf der hierbei gebildete N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester der Aminosäure oder des Peptids mit geschützter N-endständiger Aminograppe mit einer Aminosäure, einem Peptid oder deren Derivat mit freier N-endständiger Aminogruppe reagiert. Auf diese Weise wird die Peptidhildungsreaktion in einem Einstufeiiverfahren durchgeführt. Die Mengenanteile der Reaktion teil nehmer werden aus den vorstehend genannten Bereichen gewählt Ebenso kann mit den vorstehend genannten Reaktionszeiten, Reaktionstemperaturen und Verfahren zur Isoleerung der gebildeten Verbindung gearbeitet werden.
  • Wie aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, enthält das als Reaktionsprodukt erhaltene Peptid gewöhnlich im Molekül eine oder mehrere Schutzgruppen, die zum Schutz der funktionellen Gruppen, nämlich der Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen und Thiolgruppen, verwendet worden sind. Falls gewünscht, kann das geschützte Peptid durch Entfernung einer oder mehrerer Schutzgruppen in die freie Form überführt werden. Die Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppen sind auf dem Gebiet der Peptidsynthese allgemein bekannt. Beim Verfahren gemäß der Erfindung können die Schutzgruppen ebenfalls nach diesen bekannten Methoden (z.B. Behandlung mit HF, CF3COOH, HBr/CH3COOH oder dgl. oder durch kata3ytische Reduktion unter Verwendung von Palladiumschwarz) entfernt werden.
  • Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht die Herstel-Jung der verschiedensten Peptide, die eine beliebige Anzahl oder beliebige Arten von Aminosäureeinheiten enthalten. Als Beispiele dieser Peptide sind zu nennen: therapeutisch wertvolle Peptide, z.B. Oxytocin, Vasscprescin, Glucagon, ACTH (adrenocorticotropes Hormon) und ihre Analogen, Secretin, Calcitonin, Insulin, Gastrin, Bradykinin, Eledoisin, LH-RK (luteinizing hormone-releasing hormone = luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon), acyclische Peptidantibiotika (z.B. Penicilline und CephaAosporine) und ihre Derivate, TRH (thyrotropin releasing hormone = Thyrotropin freisetzendes Hormon), MIF (melanocyte stimulating hormone inhibiting factor) sowie Zwischenprodukte für die Herstellung dieaer Peptide.
  • Das verbesserte Verfahren gemäß der Erfindung zeichnet sich durch die folgenden Merkmale aus: (3) Es findet keine Racemisierung sowie keine Nebenreaktion als Begleitersc?neinung der Verwendung von N-Hydroxysuccinimid statt.
  • (2) Das gewünschte Peptid wird schne]l in hoher Ausbeute gebil det.
  • (3) Die Peptidbildungsreaktion kann in wässriger Lösung durchgeführt werden, weil die N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester von Aminosäuren oder Peptiden mit geschützter N-endständiger Gruppe stabil und in einem Maße, wie es für die bekannten N-Hydroximidester fast undenkbar ist, hydrolysenbeständig sind.
  • (4) Das Peptid kann außerdem in hoher Reinheit gewonnen werden, weil das N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, das bei Bildung der Peptidbindung freigesetzt wird, aufgrund seiner guten Löslfchkeit in Wasser und in gebräuchlichen Lösungsmitteln, die routinemäßig in der Peptidsynthese verwendet werden, leicht und vol]-ständig aus dem Reaktionssystem entfernt werden kann.
  • Es ist ferner zu bemerken, daß das N Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid in äußerst hoher Ausbeute zurückgewonnen werden kann.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Falls nicht anders angegeben, haben alle bei den dort beschriebenen Versuchen verwendeten Aminosäuren oder Aminosäurereste die L-Konfiguration. Ferner werden die folgenden Abkürzungen verwendet: H- (Pyr)G] u-OH = Pyrogl utaminsäure H-Glu(OH)-Oh = Clutaminsäure H-Ala-OH = Alanin H-Cly-OH = Glycin H-Val-OH = Valin H-Phe-OH = Phenyla]anin H-ILe-OH = Isoleucin H-Gln-OH = Glutamin H-Asn-OH = Asparagin H-His-OH = Histidin H-Trp-OH = Trypsin H-Arg-OH = Arginin H-Ser-OII - Serin H-Tyr-OH = Tyrosin H-Phe-OH = Phenylalanin H-Met-OH = Methionin H-Lys-OH = Lysin H-Orn-OH = Ornithin Z- = Carbobenzoxy BOC- = tert. - Butyloxycarbonyl -OMe = Methylester -OET = Äthylester -OBz] = Benzylester -OtBu = tert.-Butylester -ONBI = N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester -OPCP = Pentachlorphenylester IBOC- = Isobornyloxycarbony] -ONP - p-Nitrophenylester HONBI = N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid DCC = N,N1- Dicyhclohexylcarbodiimid DMF = Dimethylformamid THF -= Tetrahydrofuran Für die Dünnschichtchromatographic wurden die folgenden Entwicklerlösunjgsmittelgemische verwendet : Rf 3 - Chloroform-methanol-Eisessig (9:1:0,5) Rf 2 - Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60:20:6:11) Rf 3 - n-Butanol-Äthylacctat-Essigsäure-Wasser (]:]:]:]) Rf 4 - n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1) Rf 5 - n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (30:20:6:24) Bezugsbeispiel Herstel 3 ung von N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid In 120 ml Wasser werden 52,6 g Hydroxylaminhydrochlorid gelöst. In der Lösung werden unter ständigem Schütteln 41 g Natriumcarbonat gelöst. Der Lösung erden 300 g 5-Norbhornen-2,3-dicarbonsäureanhydrid zugesetzt.
  • Nach Auflösung des Anhydrids wird die Lösung eine Stunde auf dem Wasserbad bei 600 bis 700C gehalten. Nach der Heaktion wird das Reaktionsgemisch über Nacht in der Kälte stehen gelassen, so daß es gut auskühlt. Die hierbei gebildeten Kristalle werden abfiltriert (Schmelzpunkt 165,5-)670c, Ausbeute 98%). Diese Kristalle werden in der möglichen Tetrahydrofuranmenge gclöst, worauf in der Wärme / zugesetzt wird. Wenn Kristallbildung beginnt, wird der Zusatz von Äther abgebrochen und das Gemisch in der Kälte stehen gelassen. Die Kristalle werden abfiltriert und mit Ather gewaschen. Ausbeute 92,6 g (84,9%). Schmelzpunkt 167° bis 167,5°C (Literaturwert 165° bis 167°C).
  • Beispiel 3 Z - (Pyr)Glu-ONBI In 200 ml Tetrahydrofuran und 200 ml Dioxan werden 24 g (90mM) Z-(Pyr)Glu-OH gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 17,8 g HONBI und ?l g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei Kristalle zurückbleiben. Diese Kristalle werden aus Äthylacetat-Erdölbenzin umkristallistiert, wobei 36 g (94%) Nadeln vom Schmelzpunkt 143,5°bis 1440C erhalten werden, [α]26D = -41,9°C (c = 0,2, Äthanol).
  • E] ementaranal yse: C H N Berechnet für C22H20O7N2 (424,40) 62,26 4,75 6,60 Gefunden: 62,47 4,73 6,55 Beispiel 2 Z-Glu(OtBu)-ONBT Zu einer Lösung von 16,82 g (50 mMol) Z-Clu(OtBu)-OH und 9,76g (55 mMol) HONBI in 200 ml Dioxan werden 11,35 g (55 mMol) DCC gegeben, während mit Eis gekühlt wird. Das Gemisch wird vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf der gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das erhaltene l wird mit Petroläther verrieben, wobei Kristalle gebildet werden, die abfiltriert und aus Äthylacetat-Petroläther umkrista)lisiert werden, wobei feine Nadeln erhalten werden.
  • Ausbeute 20,4 g(82%). schmelzpunkt 120° bis 121°c.
  • [α]D23= -32,0° (c = o,g6 in Methanol).
  • Elementarananalyse : C H N Berechnet für C26H3008N2 62,64 6,07 5,62 Gefunden: 62,81 6,05 5,78 Bcispiel 3 Z-(Pyr)Glu-Glu(OBzl)-OH In einem Gemisch von 50 m] Dioxan und 40 ml Wasser werden 2,6 g (],] mMol) H-Clu(OBzl)-OH suspendiert, Unter Zugabe von 1,5 m7 Triäthylamip wird die Suspension erhitzt, wobei eine Lösung gebildet wird. Die Lösung wird mit Eiswasser schnell geküh]t und mit 3,4 g (8 mMol) Kristallen von Z-(Pyr)Glu-ONBI gemäß Beispiel 1 versetzt. Das Gemisch wird fünf Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Dioxan wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Zum Rückstand werden 35 ml N-Salzsäure gegeben, worauf zweimal mit je 20 ml Äthylacctat oxtrahiert wird. Die Äthylacctatschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Die als Rückstand verb]eibenden Kristalle werden mit Petroläther behandelt, abfiltriert und getrocknet, wobei 3,6 g (92,8%) Nadeln vom Schmelzpunkt 127° bis 1280C erhalten werden. [α]D21= 17,90 (c = 3,02, Äthanol).
  • Elementaranalyse : C H N Berechnet für C25H2608N2 (482,47) 62,23 5,43 -5,83 Gefunden: 62,21 5,40 5,83 Beispiel 4 Z-Ala-NH2 In 30 ml Äthylacetat und 40 ml Tetrahydrofuran werden 4,5 g (20 mMol) Z-Ala-OH und 3,6 g HONBI gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 4,5 g DCC zugesetzt. Das Gemisch'wird 30 Minuten unter Küh]ung mit Eis und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Zum Filtrat werden 20 ml konzentriertes wässriges Ammoniak gegeben. Das Gemisch wird drei Stunden gerührt, während mit Eis gekühlt wird. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Durck zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird durch Zusatz von ]50 ml Athylacetat gelöst. Die Lösung wird zweimal mit Je 300 ml 1N-Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der hierbei erhaltene kristalline Rückstand wird aus fithylacetat-Petroläther umkristallisiert, wobei 3,6 g (81%) Nadeln vom Schmelzpunkt 128°bis 129°C erhalten werden.
  • Elementaranalyse : C H N Berechnet für: C11H14O3N2 (222,24) 59,45 6,35 12,60 Gefunden: 59,69 6,25 32,50 Beispiel 5 Z-Ala-Cly-OBzl In 40 m3 Äthylacetat und 30 m3 Tetrahydrofuran werden 4,5 g (20 mMol) Z-Ala-Oh und 3,6 g HONBI gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 4,5 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und der Rückstand unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der ölige Rückstand wird in einem ]:]-Cemisch von Athylacetat und Petroläther gelöst. Der unlösliche Harnstoff wird abf iltriert.
  • Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 40 ml Dioxan gelöst. Zur Lösung werden 6,8 g (20 mMol) H-Gly-OBzl-p-Toluolsulfonat und 3,0 ml Triäthylamin gegeben. Das Gemisch wird vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
  • Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und 1N-salzsäure gewaschen. Nach dem Waschen mit Wasser wird über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
  • Der kristalline Rückstand wird aus Athylacetat-Erdölbezzin umkristallisiert, wobei 6,62 g (92,0%) Nadeln vom Schmelzpunkt 109° bis 110°C (Literaturwert 111°C) erhalten werden.
  • Elementaranalyse: C H~ N Berechnet für: C20H2205N2 64,85 5,99 7,56 Gefunden: 64,79 5,93 7,61 Beispiel 6 Z-Val-Val-OBzl In 30 m) AthyZacetat und 30 ml Tetrahydrofuran werden 5,0 g (20 mMol) Z-Va3-OH und 3,6 g HONBI gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 4,5 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 000 und dann eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 40 ml Tetrahydrofuran gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 7,6 g (20 mMol) H-Val-OBzl-p-Toluolsulfonat und 2,9 ml Triäthylamin zur Lösung gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird es unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in l50ml Athylacetat gelöst und die Lösung mit einer 4%igen wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und lN-Salzsäure gewaschen. Nach einer Wäsche mit Wasser wird die Lösung über Natriumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Zum öligen Rückstand wird Petroläther gegeben, worauf das Gemisch gekühlt wird, wobei sich Kristalle abscheiden. Durch Umkristallisation aus Äthylacetat-Petroläther werden 8,10 g (92%) Nadeln vom Schmelzpunkt 134°bis 116°C (iteraturwert 116°C0 erhalten.
  • [α]D21= -44,2° (c = 2,06, Methanol) (Literaturwert: -44,3°) Elementaranlyse : C H N Berechnet für : C25H32O5n2 68,16 7,32 6,36 Gefunden: 67,76 7,08 6,47 Beispiel 7 Z-Gly-Phe-Gly-OEt (Anderson-Young-Test) a) Herstellung der Ausgangsverbindung Z-Gly-Phe-OH In 100 ml Tetrahydrofuran werden 8,4 g (40mMol) Z-Gl y-OH und 7,2 g HONBI gelöst. Zur Lösung werden 9 g DCC gegeben, während mit Eis gekühlt wird. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 00C und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukü gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und der Rückstand unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Inzwischen werden 7,4 g (45 mMol) H-Phe-OH in 80 ml Dimethylformamid, das 40% Wasser enthält, gelöst. Zur Lösung werden 3,7 g Natriumhydrogencarbonat gegeben. Anschließend wird dieser Lösung das in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellte Z-Gly-ONBI zugesetzt. Das Gemisch wird eine Stunde unter Kühlung mit Eis und vier Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zum erhaltenen Reaktionsgemisch werden 150 ml Äthylacetat und 50 ml 1N-Salzsäure gegeben, worauf mit 100 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen wird.
  • Die wässrige Schicht wird zweimal mit Je 80 ml Äthylacetat extrahiert. Die A'thylacetatschicht wird mit 100 ml 1N-Salzsäure gewaschen und nach einer Wäsche mit Wasser über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die dehydratisierte Flüssigkeit wird dann unter vermindertem Druck zur Trocltene eingedampft, wobei ein kristalliner RUckstand erhalten wird. Die Kristalle werden mit Erdölbenzin behandelt und aus Athy)acetat-Erdölbenzin umkristallisiert. Hierbei werden 14,2 g (100%) Nadeln vom Schmelzpunkt 125°bis 126°C 9Literaturwert 126°C erhalteu. [α]D21=+35,2°, (c = 1,7 in Äthanol) (Literaturwert: [α]D20=+33,9°, c = 4,7, in Äthanol).
  • Elementaranalyse : C H N Berechnet für: C19H20O5N2 (356,37) 64,03 5,66 7,86 Gefunden: 64,01 5,72 7,90 b) Racemisierungstest In 10 ml Dimethylformamid werden 1,78 g (5 mMol) Z-G]y-Phe-OH und 700 mg (5 mMol) H-Gly-OEt-hydrochlorid gelöst. Nach Zusatz von 0,64 ml N-Äthylmorpholin wird die Lsung auf -2°C gekühlt. Zur Lösung werden ],] g (1,2 Äquivalente) HONBI und 1,] g DCC gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 1 Std. bei -20C und dann 1 Stunde bei 50C und schließlich 6 Stunden bei 20°C gerührt. Nach Zusatz von 100 ml Athylacetat wird das Reaktionsgemisch mit einer 4%igen wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und 1N-=Salzsäure gewaschen. Es wird weiter mit Wasser gewaschen, dchydratisert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
  • Der kristalline Rückstand wird mit Petroläther behandelt und isoJiert. Ausbeute 2,20 g (300%). Schmelzpunkt: 113° bis 115°C. [α]D19=-12,2° (c = 2,0, Äthanol).
  • 1,0 g dieses Produkts wird in 50 ml Äthanol gelöst, wâhrend erhitzt wird. Dann wird eine geringe Menge an Impfkristallen von Z-Gly-D-Phe-Gly-OEt zugesetzt. Das Gemisch wird eine Woche bei 200 stehen gelassen, jedoch wird keine Abscheidung von DL-Tryptophan festgestellt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck uf 20 ml eingeengt und dann bei 2°C stehen gelassen, wobei sich Nadeln abscheiden.
  • Diese Kristalle werden abfiltriert. Die Ausbeute beträgt 650 mg. schmelzpunkt 116° bis 118°C. [α]D19=-12,5° (c = 2,0, Äthanol), Es handelt sich offensichtlich um eine optisch reine L-Verbindung. Das Filtrat wird ebenfalls unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird Ather gegeben, Die hierbei gebildeten Kristallg werden abfiltriert Ausbeute 170 mg. Schmelzpunkt 116°bis 118°C.
  • [α]D19= 12,30 (c = 2,0, Äthanol). Dieses Produkt besteht ebenfal]s aus der L-Verbindung. Gesamtausbeute: 82%.
  • Hieraus kann der Schluß gezogen werden, daß keinerlei Racemisierung beim Verfahren gemäß der Erfindung stattfindet.
  • Wenn die vorstehend beschriebene Reaktion in der gleichen Weise, Jedoch ohne HONBI durchgeführt wird, wird Z-Gly-DL-Phe-G3y-OEt in einer Ausbeute von 7,05% entsprechend einer Reaktionsausbeute von 86% erhalten.
  • Ebenso wird bei Verwendung von 20 ml Tetrahydrofuran als Reaktionslösungsmittel nicht das DL-Peptid bei Verwendung von HONBI gebildet, während ohne HCNBI 5,05% des DL-Peptids gebildet werden.
  • Beispiel 8 Racemisierungstest durch Synthese von Z-PHe-ILe-Gly-OBxl a) Synthese der Ausgangsverbindung Z-Phe-ILe-OH.
  • In 40 ml Tetrahydrofuran und 20 m7 Äthylacetat werden 6,0 g (20 mMol) Z-Phe-0H und 3,6 g HONBI gelöst. Zur Lösung werden 4,4 g DCC gegeben, während mit Eis gekühlt wird.
  • Das Gemisch wird dann 70 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Der as Nebenprodukt gebi]dete Harnstoff wird abfiltrlert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
  • Der Rückstand wird in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und gekühlt. Getrennt hiervon werden 2,88 g (22 mMol) H-ILe-GTl in einem Gemisch von 30 ml Dimethylformamid und 22 ml einer wäßrigen lN-Natriumhydroxydlösung gelöst.
  • Während mit Eis gekühlt wird, wird die zuerst hergestellte Lösung von Z-Phe-ONBI zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 30 ml 1N-Saizsäure und 60 ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung zugesetzt werden. Das Gemischwird dann dreimal mit je 100 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft0 Der kristalline Rückstand wird mit Petroläther behandelt und aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert, wobei 7,80 g (94ç0) Nadeln vom Schmelzpunkt 152-154°C erhalten werden.
  • r 72 6o (c= 1,06 Äthanol) Elementaranalyse: C H N Berechnet für C23H2805N2 (412,47) 66,97 6,84 6,79 Gefunden: 66,95 6,89- 6,79 b) Synthese von Z-Phe-ILe-Gly-OBzl (Racemisierungstest) In 20 ml Dimethylformamid werden 1,03 g (2,5 mMol) Z-Phe-ILe-OH und 840 mg (2,5 mMol)R-Gly-Orzl-p-toluolsulfonat gelöst. Zur Lösung werden 0,32 ml (2,5 mMol) N-Äthylmorpholin und 540 mg-(1,2 Äquivalente) lIONSI gegeben. Während mit Eis gekühlt wird, werden 600 mg DCC zugesetzt0 Das Gemisch wird 2 Stunden unter Küblung mit Eisund dann 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 100 ml Wasser zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit je 80 ml Äthylacetat extrahiert Die Äthylacctatschicht wird mit einer 4%igen wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und iN-Salzsäure gewaschen0 Nach einer Wäsche mit Wasser wird das Produkt dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit Erdölbenzin behandelt und abfiltriort.
  • Ausbeute 1,52 g (100%). Dieses Produkt wird zur Analyse auf Aminosäuren 20 Stunden mit 5,7N-CHI. bei 11000 hydrolysiert.
  • 0,96 Phe, 0,98 Ile, 0,0048 allo-ILe, 1,00 Gly Die während dieser Reaktion gebildete D-Verbindung macht nicht mohr als 0,7 aus.
  • Die vorstehend beschriebene Reaktion wird unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne HONBI wiederholt. Ausbeute 1,28 g (84). Aminosäure-Analyse: 0,93 Phe, 0,62 Ile, 0,54 allo-Ihe, 1,00 Gly. Der Anteil der in diesem Fall gebildeten D-Verbindung beträgt bis zu 300 Beispiel 9 Z-Gln-Ala-OBzl In einem Gemisch von 30 ml Dioxan und 40 ml DMF werden 5,6 g (20 mMol) Z-Gln-OH und 7,05 g (20 mMol) H-Ala-OBzlp-toluolsulfonat gelöst0 Nach Zusatz von 2,8 ml Triäthylamin wird die Lösung mit Eis gekühlt. Dann werden 4 g HONBI und 4,2 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und dann 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Dioxan wird abdestilliert. Zum Rückstand werden 150 ml Wasser gegeben, wobei sich sofort Kristalle abscheiden. Diese Kristalle werden abfiltriert und aus Äthanol umkristallisiert. Hierbei werden 8,0 g (90,5%) Nadeln vom Schmelzpunkt 188°-189°C erhalten.
  • Elementaranalyse: C H N Berechnet für C23H2706N3: 62,75 6,16 9,52 Gefunden: 62,72 6,20 9,38 Beispiel 10 Z-Asn-Gly-OEt In 40 ml Dimethylformamid werden 2,7 g (10 mMol) Z-Asn-OH und 1,4 g (10 mMol) H-Gly-OEt-hydrochlorid gelöst. Zur Lösung werden 1,4 ml Triäthylamin und 2 g HONBI gegeben, während mit Eis gekühlt wird0 Anschließend werden 21 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Nach Zugabe von kaltem Wasser in ungefähr der doppelten Menge des Dimcthylformamids wird das Gemisch in einem Küblschrank stehen gelassen Die hierbei gebildeten Kristalle werden abfiltriert und aus Äthanol umkristallisiert. Hierbei werden 3,26 g (92%) Nadeln vom Schmelzpunkt 184-185°C (Literaturwert 18400) erhalten0 Elementaranalyse: C H N Berechnet für C16H2106N3: 54,69 6,02 11,96 Gefunden: 54,63 6,11 12,04-Beispiel 11 H-(Pyr)Glu-Glu-Ala-NH2 In 60 ml Methanol werden 1,14g (5 mMol) Z-Ala-NH2 gelöst0 Die Lösung wird 3 Stunden der Hydrierung unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen0 Der Katalysator wird abfiltriert und der Rückstand unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der hierbei erhaltene Rückstand und das gemäß Beispiel 2 hergestellte Z-(Pyr)-Glu-Glu(OBzl)-OX (2,41 g oder 5 mMol) werden in 30 ml Tetrahydrofuran und 10 ml Dimethylformarnid gelöst.
  • Die Lösung wird auf 0°O gekühlt. Dieser Lösung werden ig HONBI und 1,1 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei OOC und dann 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Tetrahydrofuran abdestilliert wird0 Der Harnstoff wird abfiltriert, worauf 50 ml Äther und 40 ml Äthylacetat zum Filtrat gegeben werden. Hierbei scheiden sich Kristalle ab. Diese Kristalle werden abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert. Als Produkt werden 2,41 g (87) Z-(Pyr)Glu-Glu(OBzl)-Ala-NH2 vom Schmelzpunkt 2120 bis 214°C erhalten.
  • # 21 =-27,9° (c = 1,05, Eisessig) Elementaranalyse: C H N Berechnet für C28H32O8N4(552,57) 60,86 5,84 10,14 Gefunden: 60,78 5,67 10,16 2 g des vorstehend genannten Produkts Z-(Pyr)Glu-Glu-(OBzl)-Ala-NH2 werden in 40 ml Eisessig gelöst. Die Lösung wird 5 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei sich nadeln abscheiden0 Nach Zusatz von Methanol werden die, Kristalle abfiltriert und mit kaltem Methanol.
  • gewaschen. Ausbeute 1,05 g0 Elementaranalyse : C H N Berechnet für C13H20O6N4: 47,55 6,14 17,07 Gefunden: 47,17 6,11 17,00 Bei der Papierchromatographie zeigt dieses Produkt bei Rf 5 = 0,37 einen einzelnen Flecken, der positive Peptidreaktionen ergibt0 Beispiel 12 Z0-(Pyr)Glu-His-OH In einem Gemisch von 50 ml Dioxan, 40 ml Wasser und 20 ml Dimethylformamid werden 3,6 g (24 mMol) H-His-OH-hydrochlorid- und 2,5 g (24 mMol) wasserfreies Natriumcarbonat gelöst, während erhitzt wird. Die Lösung wird schnell gekühlt, worauf 8,49 a (20 mMol) Z-(Pyr)Glu-ONBI zugesetzt werden. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Dioxan unter vermindertem Druck abdestilliert wird. Dann werden genau 24 ml 1N-Salzsäure um Rückstand gegeben, worauf zweimal mit Äthylacetat gewaschen wird, Die wässrige Schicht wird unter vermindertem Druck auf etwa 20 ml eingeengt, Der Rückstand wird über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die hierbei abgeschiedenen stäbchenförmigen Kristalle werden abfiltriert und mit kaltem Wasser gewaschen. Ausbeute 6,9 g (86%). Die Kristalle werden aus Wasser, das eine geringe Methanolmenge enthält, umkristallisiert. Ausbeute 6,67 g (78%).
  • Schmelzpunkt 146-147°C (Zers.).
  • [α]D21=-6,4° (c - 1,12, Methanol) - - -Elementaranalyse: O H N Berechnet für C19H20O6N1. 1,5 H2O : 53,42 5,42 13,11 Gefunden: 53,50 5,25 13,02 Beispiel 13 (Pyr)Glu-His-Pro-NH2 (TRH) In 30 ml Dimethylformamid werden 2,15 g (5 mMol) Z-(Pyr)Glu-Xis-OH, das in Beispiel 11 beschrieben wurde; zusammen mit H-Pro-NH2 gelöst. (Zur Herstellung der letztgenannten Verbindung werden 1,25 g (5 mMol) Z-Pro-NH2 in 50 ml Methanol unter Verwendung von Palladiumschwarz katalytisch reduziert. Nach Entfernung des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft0) Nach gugabe von 1 g HONBI wird das Gemisch auf OOC gekühlt, worauf 1,1 g DCC zugesetzt werden.
  • Das Gemisch wird 2 Stunden bei 000 und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, worauf der als Nebenprodukt gebildete ticyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Dann wird das Dimethylformamid unter hohem Vakuum abdestilliert, Der Rückstand wird mit 30 ml Äther verrieben, worauf der Äther entfernt wird0 Der Rückstand wird in 20 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit 60 g Kieselgel gefüllt ist0 Die Säule wird mit 300 ml 5% Methanol-Chloroform gewaschen und dann mit 20% Methanol-Chloroform eluiert. Die mit 20% Methanol-Chloroform erhaltene Fraktion wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, Der Rückstand wird mit Äther behandelt und filtriert0 Hierbei werden 2,4 g (96%) Z-(Pyr)Glu-His-Pro-NH2 als weißes Pulver erhalten.
  • Bei der Dünnschichtchromatographie ergibt dieses Produkt einzelne Flecken, die mit Pauli-Reagens positiv reagieren (bei Rf 3 = 0,43 und bei Rf = 0, 10, entwickelt mit Chloroform-Methanol = 6:1).
  • Das oben genannte Produkt (2 g) wird in 40 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird 4 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird mit 30 ml Äther acetat behandelt, durch Filtration isoliert und getrocknet.
  • Hierbei werden 1,45 g (quantitativ) einer Probe von synthetischem TRH erhalten, das mit einer authentischen Probe von T1111 völlig überinatimmt.
  • [α]D25=-42,0° (c - 1,0, Methanol) [α]D25 = -43,2° (c = 0,6, Essigsäure).
  • Aminosäure-Analyse: 0,98 Glu, 1,00 His, 1,00 Pro0 Papierchromatographie (n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser = 30:6:20:24): Rf = 0,40.
  • Beispiel 14 Herstellung von ß-(1-24)Cortieotropin In 20 ml Dimethylformamid werden 1,6 g (1 mMol) Z-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His.-Phe-Arg-Trp-Gly-OH-p-tcluolsulfonat gelöst. Während die Lösung mit Eis gekühlt wird, werden 270 mg HONBI und 240 mg DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zusatz von weiteren 240 mg DCC wird das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
  • Dann werden 40 ml Äthylacetat und 80 ml Äther gekühlt und zum Reaktionsgemisch gegeben. Die hierbei gebildeten Kristalle werden abfiltriert und mit 50 ml Äthylacetat gewaschen. Getrennt hiervon werden 2,28 g (1 mMol) BOC-Lys(Z)-Pro-Val-Gly-Lys (Z)-Lys(Z)-Arg(N02)-Arg (N02)-Pro-Val-Lys(Z)-Val-Tyr-Pro-OH (hergestellt nach dem Verfahren, das in Chem. Pharm. Bull. 18, 1288 (1970) beschwieben wird) in 30 ml Trifluoressigsäure gelöste während mit Eis gekühlt wird. Die Lösung wird 25 Minuten bei 1000 gerührt, wobei die Substituentengruppe BOC entfernt wird.
  • Nach Zusatz von Äther wird die gebildete Fällung abfiltriert und getrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 25 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 0,28 ml N-thylmorpholin wird die Lösung mit Eis gekühlt. Dieser Lösung wird die erstgenannte Fällung zugesetzt0 Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt0 Dem Reaktionsgemisch werden 120 ml oxydfreier Ather zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und nach der Trocknung erneut aus 10% Wasser-Methanol ausgefällt, wobei 3,7 g rohes geschütztes Tetracosapeptid erhalten werden. Dieses Produkt- wird zur Entfernung der Schutzgruppen in an sich bekannter Weise mit Fluorwasserstoff behandelt. Nach Entfernung des Fluorwasserstoffs durch Destillation wird das Produkt mit dem Ionenaustauscherharz IRA-400 (Acetatform) behandelt, wobei rohes ß(1-24)-Corticotropinacetat erhalten wird. Die Verbindung wird durch übliche Säulenchromatographie- an Carboxymethylcellulose in einem Gradienten-Elutionssystem von Ammoniumacetatlösungen (von 0,01 bis 0,4 -Mol) gereinigt. Nach Gefriertrocknung wird ß(1-24)Corticotropin in einer Gesamtausbeute von 30 bis 40 erhalten. Der Titer beträgt 95-120 I.E., bestimmt durch Ermittlung der Erniedrigung der Konzentration an andrenaler Ascorbinsäure.
  • [α]D21 =-84,0 + 2° (c = 0,5, 1% Essigsäure) Bei der Papierelektrophorese und Papierchromatographie ergibt dieses Produkt jeweils einen einzelnen zusammenhängenden Flecken, der positive Reaktionen bei den Ehrlich-, Ninhydrin-, Pauli- und- Sakaguchi-Tests zeigt0 Aminosäure-Analyse (24 Stunden in 5,7N-HCl bei 10500 hydrolysiert): His 1,00; Lys 4,08; Arg 3,10; Glu 1,02; Ser 1,89; Gly 2,00, Pro 2,95, Val 3,00, Met 0,89, Tyr 1,97; Phe 1,00.
  • Beispiel 15 Mit LH-RH verwandte Verbindungen (I) 1) Z-(Pyr)Glu-His-Trp-OBzl In 60 ml Dimethylformamid werden 4,27 g (10 mMol) Z-(Pyr)Glu-His-OH, 4,66 g (10 zol) H-Trp-OBzl-p-toluolsulfonat und 1,38 ml N-thylmorpholin gelöst. Die Lösung wird auf OOC gekühlt, worauf 3 g HONBI und 3,1 g Dicyclchexylcarbodiimid zugesetzt werden0 Das Gemisch wird 2 Stunden bei 0°C und dann 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Zum Rückstand wird Äther gegeben. Das hierbei gebildete Pulver wird abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Das Pulver wird in 20 ml 5% Methanol-Chloroform gelöst0 Die Lösung wird durch eine Kieselgelsäule (500 ml) geleitet, die mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen worden ist. Die Säule wird mit 1,2 1 5 Methanol-Chloroform gewaschen. Das Tripeptid wird mit Chloroform, das 15% Methanol enthält, eluiert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert und-der Rückstand mit Äther behandelt. Das Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 5,82 g (86ffi).
  • Elementaranalyse: C H N Berechnelt für C37H36o7N6.2 H2O : 62,35 5,66 11,79 Gefunden: 62,54 5,82 11,43 Bei der Dünnschichtcbromatographie an Kieselgel ergibt dieses Produkt jeweils einen Flecken bei Rf 4 = 0,64 und bei Rf 3 = 0,79. Beide Flecken zeigen positive Ehrlich-und Pauli-Reaktionen. Verunreiniguugen sind nicht nachzuweisen.
  • 2) H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu In 50 ml Methanol werden 3,40 g (5 mMol) Z-(Pyr)Glu-His-Trp-OBzl gelöst. Die Lösung wird 4 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft. Getrennt hiervon werden 2,60 g (5 mMol) Z-Ser-Tyr-Gly-OtBu in 80 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird 3 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der TSatalysator wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene ne eingedampft, wobei Kristalle abgeschieden werden. Die beiden in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Materialien werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 1,1 g HONBI gegeben, worauf mit Wasser gekühlt wird0 Nach Zusatz von 1,30 g Dicyclohexylcarbodiimid zur Lösung wird das Gemisch 3 Stunden unter Kühlung mit Eis und 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt0 Zum Rückstand wird Äther gegeben. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, gut gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Pulver kann unmittelbar in die nächste Reaktion eingesetzt werden, oder man kann es durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Lösungsmittelsyetem : .thylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser = 30:20:6:10) reinigen, die Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdampfen und den Rückstand mit Äther waschen, oder man kann das Pulver in Äthanol erhitzen, Äthylacetat zusetzen, das Gemisch kühlen und die gebildeten Kristalle abfiltrieren0 Ausbeute 3,10 g (75ffi). Dünnschichtchromatographie: Rf 2 = 0,42. Aminosäure-Analyse: Glu 1,00; His 0,94; Ser 0,96; Tyr 1,01; Gly 1,01; Trp (W) 1,03.
  • 3) Z-Arg (NO2)-Pro-Gly-NH2 In 100 ml Dimethylformamid werden 24,8 g Z-Arg(NO2)-Pro-OH gelöst. Während die Lösung bei OOC gehalten wird, werden 10,7 g HONBI und 12,3 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden gerührt, worauf der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat ,wird gekühlt und mit 7,3 g H-Gly-NH2-Acetat und 7,7 ml Triäthylamin versetzt. Das Gemisch wird 8 Stunden gerührt0 Das Dimethylformamid wird unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf n-Butanol zugesetzt wird0 Das Gemisch wird dann mit einer gesättigten wässrigen Natriumchlorid--lösung gewaschen. Die n-Butanolschicht wird unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf Äther zugesetzt wird0 Hierbei wird ein Pulver erhalten. Durch erneute Ausfällung aus Äthanol-Äther werden 26,5 g (96o) der gewünschten Verbindung vom Schmelzpunkt 10V-11G°C erhaltene (Dieses feinteilige Produkt zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt unS zersetzt sich.) Elementaranalyse: C H N Berechnet für C21H3007N8: 49,79 5,97 22,12 Gefunden: 49,81 6,12 21,75 4) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 In 25 ml Eisessig, der 25 HBr enthält, werden 3,5 g (7 mMol) Z-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 gelöst. Die Lösung wird 40 Minuten geschüttelt und dann mit 200 ml trockenem Äther versetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das hierbei erhaltene Pulver wird in einem Gemisch von 20 ml Dimethylformamid und 20 ml Dioxan gelöst, worauf 1,4 ml Triäthylamin zugesetzt werden.
  • -Getrennt hiervon werden 2,12 g (8 mMol) Z-I.eu-OH und 1,6 g HONBI in einem Gemisch von 20 ml Äthylacetat und 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 1,7 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten unter Kühlung mit Eis und dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerUhrt, worauf der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff abfiltriert wird. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 10 ml Dioxan gelöst. Diese Lösung wird zu der oben beschriebenen Lösung der Aminkomponente gegeben. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann zur Entfernung des Dioxans unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Wasser zugesetzt wird0 Das Gemisch wird zweimal mit Äthylacetat gewaschen. Die wässrige Schicht wird dreimal mit je 100 ml n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolschicht wird mit Wasser gewaschen, unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, mit Äther gewaschen und filtriert. Ausbeute 3,8 g. Schmelzpunkt 1350 bis 15300 (ZersO, -kein scharfer Schmelzpunkt).
  • Elementaranalyse: C H Berechnet für C27H41O8N9 : 52,33 6,66 20,31 Gefunden: 52,41 6,83 19,97 Dünnschichtchromatographie: Das Produkt ergibt je einen einzelnen Flecken von Rf 1 = 0,16 und Rf 2 = 0,66. Beide Flecken zeigen positive Peptidreaktionen0 5) Z-Lys(IBOC)-Pro-Gly-NH2 In 50 ml Acetonitril werden 11,8 g Z-Lys(IBOC)-OH-dicyclohexylaminsalz und 3,6 g H-Pro-OMe-hydrochlorid gelöst0 Während mit Eis gekühlt wird, werden 4,5 g DCC zugesetzt0 Das Gemisch wird 10 Stunden gerührt, worauf der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird.
  • Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand werden 150 ml Äthylacetat gegeben, wobei sich eine weitere geringe Menge einer Harnstoffverbindung abscheidet. Die Fällung wird abfiltriert. Die Äthylacetatlösung wird mit einer zeigen wässrigen NaHCO3-Lösung und mit O,1N-HCl und dann mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels bleiben 9,8 g eines öligen Rückstandes zurück. Dieses Öl wird in 40 ml Methanol gelöst. Zur Lösung werden 20 ml 1N-Natriumhydroxyd gegeben0 Die Lösung wird zur Verseifung des Esters 1 Stunde gerührt und nach Neutralisation mit 22 ml 1N-HCl mit 100 ml Äthylacetat extrahiert, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird abdestilliert, wobei 5,9 g eines öligen Rückstandes erhalten werden0 Dieses Öl (5 g) wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst0 Während mit Eis gekühlt wird, werden 1,35 ml Triäthylamin und 4,45 g Trichloressigsäurepentachlorphenylester zugesetzt. Das Gemisch wird 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt0 Dann werden 1,34 g H-Gly-Nn2-acetat und 1,5 ml Triäthylamin dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das dann 8 Stunden gerührt wird. Die durch Zusatz von Äther gebildete Fällung wird abfiltriert und aus Äthanol-Äther erneut ausgefällt. Ausbeute 3,5 g. Schmelzpunkt 90°-91°C (Zers.).
  • r 721 = -20,0° (C = 0,5, Methanol.
  • 6) Z-Leu-Lys(IBOC)-Pro-Gly-NH2 In 50 ml Methanol werden 3,0 g Z-Lys-(IBOC)-Pro-Gly-NH2 gelöst. Die Lösung wird der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen0 Nach 4-stündiger Hydrogenolyse wird der Katalysator abfiltriert und das Methanol abdestilliert0 Der Rückstand wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 2,8 g Z-Leu-OPCP gegeben. Das Gemisch wird 8 Stunden gerührt, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und Äther zugesetzt wird0 Das hierbei gebildete Pulver wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und aus Äthanol Äther ernent ausgefällt. Ausbeute 3,0 g (82,6%). schmelzpunkt 124° bis 125°C (Zers.)l.
  • [α]D21=-44,2° (c = 0,5, Methanol).
  • Elementaranalyse: C H N Berechnet für C38H58O8N6: 62,78 8,04 11,56 Gefunden: 62,64 8,20 11,39 7) BOO-Leu-Orn(Z)-Pro-Gly-NH2 In 50 ml Dioxan werden 6,5 g IBOC-Orn(Z)-OH gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 1,8 g N-Hydroxysuccinimid und 3,1 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Dem Filtrat werden 2,5 g H-Pro-OMe-hydrochlorid zugesetzt. Nach Zusatz von 2,2 ml Triäthylamin wird das Gemisch 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert wird.
  • Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst, mit 4%igem Natriumhydrogencarbonat und 0,1N-HCl und dann mit Wasser gewaschen und schließlich über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
  • Das nach Entfernung des Äthylacctats erhaltene Öl (7,0 g0 wird in 20 ml Methanol gelöst und, während mit Eis gekühlt wird, durch Zusatz von 12,5 ml 1N-Natrium1ydroxyd verseift. Das Gemisch wird 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 1N-Salzsäure neutralisiert0 Es wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert und mit Wasser gewaschen0 Die Äthylacetatschicht wird dehydratisiert und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2 g eines Öls erhalten werden. Dieses Öl (1,5 g) wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und 30 Minuten deisobornyloxyearbonyliertO Dem Reaktionsgemisch wird Äther zugesetzt0 Die gebildete Fällung wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das erhaltene Pulver wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Während auf OOC gekühlt wird, werden 0,6 ml Triäthylamin und dann 1,04 g BOC-Leu-OPCP zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Dimethylformamid wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit O,1N-HCl und Wasser gewaschen, getrocknet und zur Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck destilliert. Der erhaltene ölige Rückstand wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 368 mg HONBI, 420 mg DCC und 290 mg H-Gly-NH2-hydrobromid zugesetzt0 Nach Zusatz von 0,26 ml N-Äthylmorpholin wird das Gemisch 8 Stunden gerührt. Das Dimethylformamid wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 0,1N-Salzsäure und 4%igem Natriumhydrogencarbonat gewaschen0 Nach einer Wäsche mit Wasser wird die Lösung dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Erdölbenzin behandelt und filtriert, wobei ein Pulver erhalten wird.
  • Ausbeutc 740 mg (62%). Schmelzpunkt 93°-95°C (Zers.).
  • r 721= ~33,o° (c = 0,5, Methanol).
  • 8) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 In 50 ml Bisessig werden 1,86 g (3 mMol) Z-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 gelöst. Die Lösung wird 20 Stunden der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen, Dem Reaktionsgemisch werden 7 ml 1N-HUl-Eisessig zugesetzt, worauf es unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft wird. Der Rückstand wird über Natriumhydroxyd gut getrocknet. Getrennt hiervon werden 2,50 g (3 mMol) H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu in 20 ml Trifluoressigsäure (die 0,1 ml Mercaptoäthanol und 3 ml 1N-HCl-Eisessig enthält) gelöst. Die Lösung wird 50 Minuten bei Raumtemperatur unter strömendem Stickstoff stehen gelassen.
  • Bei gesenkter Temperatur wird die Trifluoressigsäure unter vermindertem Druck abdestilliert. Dem Rückstand wird Äther zugesetzt. Die erhaltene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und über Matriumhydroxyd getrocknet. Die in der beschriebenen Weise hergestellten beiaen trockenen Pulver werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst.
  • Zur Lösung werden 0,75 ml N-Äthylmoholin und 600 mg HONBI gegeben. Dann werden bei 500 700 mg DCC zugesetzt.
  • Das Gemisch wird 2 Stunden bei 5°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf 50 ml Äther zugesetzt werden. Das hierbei gebildete Pulver wird abfiltriert und in 0,05-molarem wässrigem Ammoniumacetat gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule des Ionenaustauscherharzes Amberlite XAD-II (62-74 µ) geleitet. Die Säule wird in einemGradienten-Elutionssystem aus einer wässrigen 0,05-molaren Ammoniumacetatlösung und 80g Äthanol eluiert. Das gewünschte LH-RH erscheint in der Nähe einer Äthanolkonzentration von 50%0 Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Entfernung des Äthanols wird der Rückstand eefriergetrocknet, wobei 2,21 g einer chromatographisch homogenen Probe des Hormons als reinweißes Pulver erhalten werden. [α]D21=-43° bis 49° (c = 0,5, 1%ige Essigsäure; je nach dem Trocknungsgrad etwas veränderlich)¢ Papierchromatographie (Toyo Roshi Nr.50): Rf5 = 0,70 bis 0,720 Papierelektrophorese(Toyo Roshi Nr.50) : PH 6,5, Pyridinessigsäure, 500 V, 3 Stunden: Rf (Arg) = 0,58 bis 0,60.
  • Das Produkt ergibt einen einzelnen Flecken, der bei den Ehrlich-, Sakaguchi- und Pauli-Tests positiv reagiert, Aminosäure-Analyse: His 0,98; Arg 0,97; Glu 1,00, Ser 0,96; Pro 1,08; Gly 2,00; Leu 1,03; Tyr 1,02; Trp (durch W) 1,08.
  • Wenn dieses Produkt Ratten subkutan injiziert wird, wird Ovulation bei einer Dosis von 40 g/100 g Körpergewicht ausgelöst. Bei intravenöser Injektion tritt die Ovulation bei einer Dosis von 20 µg ein.
  • In 2 1 destilliertem Wasser für Injektionen werden 100 mg dieses Produkts und 200 g Mannit gelöst. Die Lösung wird durch ein bakterienfreies Membranfilter filtriert, in 1 nil-Ampullen gefüllt und gefriergetrocknet. Hierbei wird ein Präparat erhalten, das 50 pg LH-RH pro Ampulle enthältO 9) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Lys-Pro-Gly-NH2 In 20 ml Methanol werden 500 mg Z-Leu-Lys(IBOC)#-Pro-Gly-NH2 gelöst. Die Lösung wird der, katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol abdestilliert. Dem Rückstand wird Äther zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, wobei 400 mg H-Leu-Lys-(IBOC-Pro-Gly-NH2 erhalten werden. Dieses Pulver (188 mg) wlrd in 300 ml Dimethylformamid gelöst, Während bei 0°C gehalten wird, werden 240 mg H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-HCI, 0,084 ml Triäthylamin, 80,6 mg DCC und 70,2 mg HONBI zugesetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bei OOC und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt0 Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Dem Filtrat wird Äthylacetat zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert. Ausbeute 270 mg. Bei der Dünnschichtchromatographie zur Identifizierung dieses Produkts ergeben sich Anzeichen von Verunreinigungen. Das Produkt wird durch Chromatographie an einer Säule des Ionenaustauscherharzes Amberlite XAD-II (2,4 x 19 cm) in einem Gradienten-Elutionssystem von 0,05 molarem Ammoniumacetat und 5 bis 70igem Äthanol gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung des Äthanols unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei werden 147 mg reines Produkt erhalten.
  • Dieses Produkt (100 mg) wird mit 3 ml Trifluoressigsäure, die 0,1 ml Anisol enthält, gerührt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen und in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule des Ionenaustauscherharzes IRA-400 (Acetatform) geleitet, wobei das entsprechende Acetat erhalten wird, das dann gefriergetrocknet wird. Ausbeute 88 mg.
  • r 721 = 55,40 (c = 0,5, 5 Essigsäure).
  • Papierchromatographie: Rf5 = 0,51.
  • Aminosäure-Analyse: Lys 0,96; His 1,04; Ser 0,85; Glu 1,00; Pro 1,00; Gly 2,00; Leu 1,00; Tyr 1,04;' Trp(UV) 0,980 10) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Orn-Pro-Gly-NH2 In 5 ml 50% Trifluoressigsäure-Dichlormethan werden 380 mg BOO-Leu-Orn(Z)-Pro-Gly-EH2 gelöst. Die Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Dem Rückstand wird 1 ml 3N-HCl-Eisessig zugesetzt. Das Gemisch wird mit Äther behandelt und das gebildete Pulver abfiltriert. Hierbei werden 280 mg H-Leu-Orn(Z)-Pro-Gly-HOl erhalten0 Dieses Produkt (170 mg) wird in 3 ml Dimethylformamid gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 240 mg H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Cly-OH-HCI, 0,084 ml Tri.äthylamin und 64,4 mg HONBI zugesetzt. Nach Zusatz von 74,2 mg DOC wird das Gemisch 2 Stunden bei 0°C und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert0 Dem Filtrat werden 20 ml Äthylacetat zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 290 mgO Ein Teil von 280 mg dieses Produkts wird an einer Säule~ (2,4 x 19 cm) Amberlite XAD-II adsorbiert und in einem Gradienten-Elutionssystem von 5%igem Äthanol und 70igem Äthanol desorbiert0 Die [Orn(Z)]8-LH-RH-Fraktionen werden vereinigt und zur Entfernung des Äthanols unter vermindertem Druck.destilliert und anschließend gefriergetrocknet. Hierbei werden 170 mg einer reinen Probe erhalten. Hiervon werden 150 m in 20 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 1 ml Essigsäure wird die Lösung der katalytischen Hydrierung mit-Palladiumschwarz unterworfen0 Nach 6-stündiger Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Wasser gel-öst und gefriergetrocknet.
  • Ausbeuts 120 mg. [α]D21=-61,0° (c = 0,5, 5% Essigsäure).
  • Papierchromatographie : Rf5 = 0,51.
  • Aminosäure-Analyse: His 1,09; Orn 1,05; Ser 0,93; Glu 0,93; Pro 0,93; Gly 1,90; Leu 1,01; Tyr 0,93; Trp (VU) 0,970 Beispiel 16 Mit, LH-RH verwandte Verbindungen (II) 1) IBOU-Gly-Arg(N02)-Pro-Gly--NH2 In 5 m Dimethylformamid werden 1.8 E IBOC-Gly-OH und 1,76 g p-Nitrophenol gelöst. Während mit Eis gekühlt wird, werden 1,6 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, wobei eine Lösung von IBOC-Gly-ONP erhalten wird. Getrennt hiervon werden 1,8 g Z-Ar(N02)-Pro-Gly-NH2 auf die vorstehend beschriebene Weise behandelt, um ein Z-freies pulverförmiges Produkt zu bilden, das dann in 5 ml Dimethylformamid gelöst wird. Während mit Eis gekühlt wird, werden 0,6 ml Triäthylamin und dann das vorstehend genannte IBOC-Gly-ONP zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht gerührt0 Dem Reaktionsgemisch wird Äther zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und erneut aus Äthylacetat-Äther ausgefällt.
  • Ausbeute 1,8 g (82/o). Schmelzpunkt 1290 bis 13100 (Zers.).
  • Rf1 = 0,6.
  • Elementaranalyse: C X N Berechnet für C26H43O8N9.H2O: 49,73 7,22 20,09 Gefunden: 49,93 7,13 19,34 2) Z-Phe-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 Auf die in beispiel 15 (6) beachriebene Weise werden 0,50 g (1 mMol) Z-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 behandelt, wobei pulveförmiges H-Arg-(NO2)-Pro-Gly. NH2.HBr erhalten wird.
  • Dieses Produkt wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 0,30 g (1 mMol) Z-Phe-OH und 0,18 g (1 mMol) HON3I gegeben0 Dann werden 0,15 ml Triäthylamin zugesetzt.
  • Das Gemisch wird auf 0°O gekühlt und mit 0,22 g DCC versetzt. Das Gemisch wird 8 Stunden gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert.
  • Zum Rückstand werden Äthylacetat und Äther gegeben, worauf die gebildete Fällung abfiltriert wird, Ausbeute 0,50 g (90%). Dieses Produkt zeigt einen einzelnen Flecken, der positive Peptidreaktionen bei Rf1 = 0,20 zeigt.
  • 3) Z-Ala-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 Z-Arg(NH2)-Pro-Gly-NH2 wird auf die in Beispiel 15 (6) beschriebene Weise behandelt, wobei H-Arg-(N02)-Pro-Gly-NH2 erhalten wird, das mit Z-Ala-0H ah dem N-Hydroxy succinimidverfahren kondensiert wird. Das Reaktionsgemisch wird mit Ather behandelt und die hierbei gebildete Fällung aus Chloroform-Äthylacetat erneut ausgefällt. Hierbei wird z-Ala-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 (84,8%) erhalten0 Bei der Identifizierung durch Dünnschichtchromatographie zeigt dieses Produkt einen einzelnen Flecken, der positive Peptidreaktionen bei Rf1 = 0,10 zeigt0 4) IBC-Val-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 Z-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 (450 mg) wird mit 25° Bromwasserstoff-Eisessig 50 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemiscb wird mit Äther behandelt0 Die hierbei gebildete Fällung, das Hydrobromidsalz von H-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2, wird in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung werden 0,14 ml N-Äthylmorpholin gegeben. Dann wird das IBOC-Val-ONBI (aus 320 mg IBOC-Val-OH synthetisiert) zugesetzt, worauf das Gemisch 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt wirdo Zum Reaktionsgemisch wird Äther gegeben. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und in Chloroform gelöst.
  • Die Lösung wird mit 4%igem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wird über Magnesiumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Ausbeute 330 mg (60%).
  • Rf1 = 0,24.
  • 5) Z-ILe-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 Dieses Produkt, wird in der vorstehend unter (1) beschriebenen Weise aus H-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2, das durch Behandlung von Z-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 mit Bromwasserstoff-Eisessig erhältlich ist, und Z-Ile-ONBI hergestellt. In der vorstehend beschriebenen Weise wird eine reine Probe des Tetrapeptidderivats erhalten (Ausbe-ute 77,0%). Dieses Produkt ergibt jeweils einen einzelnen Flecken bei Rf1 = 0,17 und Rf2 = O,680 6) H-(Pyr )-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-G-ly-Arg--Pro-Gly-N112 H-(Pyr)Gly-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu (488 mg) wird zur Abspaltung des tertO-Butylesters in üblicher Weise imid 0,5 ml 5N-HCl und 10 ml Trifluoressigsäure, die Eisessig ~enthält, behandelt, wobei die freie Verbindung als trockenes Pulver erhalten wird. Getrennt hiervon werden 366 mg IBoc-Gly-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 in 2 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten gerührt und dann mit 0,1 ml 6,67N-HCl-Dioxan versetzt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Äther zugesetzt wird. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und getrocknet. Dieses Pulver und das erstgenannte Pulver werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 0,17 ml Triäthylamin, 129 mg HONBI und 148,6 mg DQC zugesetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden gerührt. Der abgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestillierte Dem Rückstand wird Äthylacetat zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und aus Äthanol-Äthylacetat erneut ausgefällt. Ausbeute 1,0 g0 Dieses [Gly7, Arg(N02)87-LH-RH (150 mg) wird mit 0,1 ml Anisol und 0,05 ml Mereaptoäthanol benetzt und dann in 10 ml trockenem Fluorwasserstoff gelöst. Die Lösung wird 60 Minuten gerührt und hierbei gekühlt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der Rückstand über Natriumhydroxyd getrocknet. Der getrocknete Rückstand wird in Wasser gelöst und mit Äther extrahiert. Der Extrakt wird durch eine Säule des Ionenaustauscherharzes Amberlite IRA-400 (Acetatform) geleitet und dann an einer Säule von Amberlite XAD-II chromatographiert.
  • Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingedampft und getrocknet. Hierbei werden 107 mg [Gly7]-LH-RH erhalten.
  • [α]D20= -40,0 + 4° (c = 1,0, 5* Essigsäure) Aminosäure-Analyse: Ser 0,91; Glu 0,87; Pro 0,93; Gly 3,00; Tyr 1,01; His 1,10; Arg 1,15; Trp(UV) 1,03.
  • Elementaranalyse: a H N Berechnet für C51H64O12N17.3CH3COOH. - - -8H2O: 48,92 6.63 17,02 Gefunden: 48,70 6,39 16,92 7) H-(Pyr)Clu-His-Trp-Sor-Tyr-Gly-Phe-Arg-Pro-Gly-NH2 Z-Phe-ARg(NO2)-Pro-Gly-NH2 wird der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz in üblicher Weise unterworfen, wodurch die Substituentengruppe Z entfernt wird. Das e-rhaltene H-Phe-Arg-Pro-Gly-NH202HCl (92,1 mg) und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-HCl werden in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 36 mg HONBI und 0,44 ml 10% N-Äthylmorpholin-Dimethylformamid zugesetzt. Dann werden bei OOC 41 mg DCC zugesetzt0 Das Gemisch wird 4 Stunden bei 0°C und dann 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 15 ml Äthylacetat behandelt0 Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen, getrocknet und in Wasser gelöst.
  • Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert. Das Filtrat wird durch eine Säule (1,5 x 22 cm) des Ionenaustauscherharzes Amberlite XAD-II geleitet. Das gewünschte Produkt wird in einem Gradienten-Elutionssystem von 5%igem Äthanol bis 70%igem Äthanol desorbiert. Dis [Phe7]-LH-RH-Fraktionen werden vereinigt. Das Äthanol wird abdestilliert. Durch Gefriertrocknung des Rückstandes werden 82 mg einer reinen Probe der gewünschten Verbindung erhalten. Aminosäure-Analyse: His 0,93; Arg 0,93; Ser 0,97 ; Glu 1,00; Pro 1,03; Gly 2,00; Tyr 1,00; Phe 0,97; Trp(UV) 0;98, 8) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Ala-Arg-Pro-Gly-NH2 Diese Verbindung wird aus Z-Ala-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 und (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu in ähnlicher Weise, wie vorstehend in Abschnitt (7) beschrieben, hergestellt. Das Produkt wird durch Chromatographie an einer Säule von Carboxymethylcellulose (in einem Gradienten-Elutionssystem von 0,005 bis 0,1 Mol Ammoniumphosphatpuffer, pH 6,8) weiter gereinigt, fi 721= 48,20 (c = 0,35, 5 Essigsäure).
  • Papierchromatographie: Rf5 = 0,55.
  • Aminosä.ureanalyse: His 0,94; Arg 1,00; Ser 1,00; Glu 1,00; Pro 1,06; Gly 2,00; Ala 1,06; Tyr 1,00; Trp (UV) 1,06.
  • 9) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Val-Arg-Pro-Gly-NH2 Dieses Produkt wird aus IBOC-Val-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 und (Pyr)Glu-HIs-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH in ähnlicher Weise, wie vorstehend unter (6) beschrieben, hergestellt.
  • [α]D21=-47,8° (c = 0,56, 5% Essigsäure).
  • Papierchromatographie: Rf5 = 0,57.
  • Aminosäure-Analyse: His 1,06; Arg 0,93; Ser 0,94; Glu 1,00; Pro 0,94; Gly 2,06; Val 0,94; Tyr 1,03; Trp(UV) 1,08.
  • 10) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-ILe-Arg-Pro-Gly-NH2 Unter Verwendung von Z-ILe-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 wird diese Verbindung in der gleichen Weise synthetisiert, wie vorstehend unter (7) beschrieben.
  • [α]D21=-84,0 (c = 0,5, 5% Essigsäure).
  • Papierchromatographie :Rf5 = 0,52.
  • Aminosäure-Analyse: His 1,04; Arg 1,00; Ser 0,97; Glu 0,89; Pro 0,92; Gly 1,89; ILe 1,08; Tyr 1,00; Trp(UV) 1,01.

Claims (3)

  1. P a t e n t n n s p r ü ü c h e
    iVerfahren zur Herstellung von Peptiden, wobei man Aminosäuren oder Peptide, deren N-endständige Aminogruppe oder Iminogruppe geschützt worden ist, mit N-Hydroximidverbindungen in Gegenwart eines Carbodiimidreagens zu N-Hydroximidestern von Aminosäuren oder Peptiden mit geschützter N-endständiger Gruppe umsetzt und die hierbei gebildeten N-Hydroximidester mit Aminosäuren, Peptiden oder deren Derivaten, deren N-endständige Aminogruppe oder Iminogruppe frei ist, umsetzt und wahlweise das geschützte Peptid in die freie Form überführt, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-Hydroximidverbindung N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid verwendet.
  2. 2) Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von L-Pyrogutamyl-L-histidyl-L-prolinami-d, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-Hydroximidverbindung N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid verwendet.
  3. 3) Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-glycyl-L leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-Hydroximidverbindung N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid verwendet.
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